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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA
ASSOCIAÇÃO DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO COM O
CARCINOMA COLORRETAL
Dissertação de Mestrado
Márcio Brahm Caetano
Orientador: Prof. Dr. Daniel de Carvalho Damin
Porto Alegre, 2005
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Livros Grátis
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Agradecimentos
Este estudo foi realizado graças à participação de muitas pessoas.
Agradeço:
Ao amigo e extraordinário orientador Prof. Dr. Daniel de Carvalho Damin pela
fundamental presença em todos os momentos e etapas do trabalho. Pelo seu exemplo de
inquietude e entusiasmo frente à pesquisa e à vida.
À Dra. Andréa Damin, pela disposição, experiência e participação essencial no
trabalho.
Ao Laboratório de Biologia Molecular da Fundação Faculdade Federal de Ciências
Médicas de Porto Alegre, coordenado pelo Prof. Dr. Cláudio Alexandre.
Ao Serviço de Coloproctologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, em que
conheci profissionais muito especiais.
Ao Prof. Dr. Mário Antonello Rosito, pela experiência, pelo exemplo de paixão e
dedicação ao trabalho.
Aos Drs. Paulo Contu e Cláudio Tarta pelo estímulo constante e amizade.
Aos colegas de residência médica e amigos Anderson Rech Lazzaron e Paula
Mancopes.
Ao curso de Pós Graduação em Cirurgia da UFRGS, pela oportunidade de
crescimento pessoal e científico.
Às funcionárias Estela Araripe e Helena Costa, do curso de Pós Graduação em
Cirurgia, pela alegria e eficiência.
Ao Hospital de Clínicas de Porto Alegre que foi parte da minha casa por onze anos.
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Às funcionárias do bloco cirúrgico, Adriana da Silva Rosa e Ana Lúcia
A.Gonçalves, exemplos de vida.
Aos pacientes com quem convivi e cresci durante estes anos.
À minha amada esposa Ângela Beatriz John.
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Lista de Abreviaturas
ASCO- Sociedade Americana de Oncologia Clinica
CCR- Câncer colorretal
CEA- carcinoembryonic antigen
DNA- Deoxyribonucleic Acid - Ácido Desoxirribonuclêico
DP- Desvio Padrão
DB- Dot Blot
FFFCMPA – Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre
HCPA- Hospital de Clínicas de Porto Alegre
HCS- Sistema de Captura Híbrida
HNPCC – Hereditary nonpoliposes colorectal câncer
HPV – Papilomavírus Humano
IARC- International Agency for Research on Cancer
INCA- Instituto Nacional do Câncer
ISH- Hibridização in situ
LCR - Long Control Region – Região Controladora não Codificante
MMR – Mismatch repair genes
μm – Micrômetro
PAF- Polipose adenomatosa familiar
PCR – Polymerase Chain Reaction - Reação em Cadeia da Polimerase
pRB- Proteína do Retinoblastoma
RB- Gene do Retinoblastoma
RNA- Ribonucleic Acid – Ácido Ribonucléico
SPSS- Statistical Package for the Social Sciences for Windows
SB- Southern Blot
TP53 - Tumor Protein 53 – Proteína Tumoral 53
TNM- Tumor, Node and Metastasis
URR- Upstream Regulatory Region- Região Controladora Não Codificante
5
Sumário
1. RESUMO 10
2. ABSTRACT 11
3. INTRODUÇÃO 12
4. REVISÃO DA LITERATURA 14
2.1. CÂNCER DE CÓLON E RETO 14
2.1.1. Epidemiologia 14
2.1.2. Patogênese 15
2.2. PAPILOMAVÍRUS HUMANO 18
2.2.1. Estrutura e classificação viral 18
2.2.2. Métodos de detecção do HPV 21
2.2.3. Papel oncogênico do HPV 24
2.2.4. HPV e câncer colorretal 30
5. JUSTIFICATIVA 33
6. OBJETIVOS 34
3.1. OBJETIVO GERAL 34
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 34
7. PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS 35
4.1. DELINEAMENTO DA PESQUISA 35
4.2. POPULAÇÃO ESTUDADA 35
4.3. AMOSTRA ESTUDADA 36
4.4. MÉTODOS 37
4.4.1. Avaliação clínico-patológica 37
4.4.2. Coleta das amostras de tecido colorretal 40
4.4.3. Processamento e análise das amostras 41
4.4.4. Análise estatística 44
4.4.5. Ética 45
8. RESULTADOS 45
5.1. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS 45
5.2. CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-PATOLÓGICAS 46
5.3. DETECÇÃO DO HPV 48
6
5.4. VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS EM RELAÇÃO AO HPV 51
9. DISCUSSÃO 53
10. CONCLUSÕES 61
7.1. CONCLUSÃO GERAL 61
7.2. CONCLUSÕES ESPECÍFICAS 61
11. PERSPECTIVAS 62
12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63
7
Lista de Figuras
FIGURA 1. Fotografia do Genoma do papiloma vírus humano 16, localização e
organização dos genes.................................................................................. 19
FIGURA 2. Representação esquemática da atuação do gene E6 do HPV 16/18 sobre
o gene p53 ....................................................................................................26
FIGURA 3. Representação esquemática da atuação do gene E7 do HPV16/18 sobre
o gene RB......................................................................................................27
FIGURA 4. Seqüenciamento do HPV 16 - primer E6...................................50
8
Lista de Quadros
QUADRO 1. Tipos de HPV classificados conforme sua homologia na seqüência de DNA
e associação com lesões clínicas ...........................................................................20
9
Lista de tabelas
TABELA 1. Classificação TNM dos tumores malignos da cólon e reto 38
TABELA 2. Estadiamento por grupos 39
TABELA 3. Diferenciação histopatológica 39
TABELA 4. Distribuição dos pacientes por idade 46
TABELA 5. Distribuição dos pacientes por sexo 46
TABELA 6. Localização das amostras coletadas 47
TABELA 7. Estadiamento dos tumores (TNM) observados 48
TABELA 8. PCR positivo nas amostras coletadas em pacientes com tumor 49
TABELA 9. Relação entre idade e presença do HPV 51
TABELA 10. Relação entre sexo e presença do HPV 51
TABELA 11. Presença do HPV conforme estadiamento do tumor 52
TABELA 12. Presença do HPV conforme localização do tumor 52
10
RESUMO
OBJETIVO: Investigar a presença do papiloma vírus humano no adenocarcinoma de cólon
e reto. MÉTODOS: Setenta e dois pacientes com adenocarcinoma de cólon e reto foram
analisados. Foram coletadas duas amostras de cada paciente: uma amostra do tumor e outra
de mucosa não neoplásica distante 15 cm do tumor. Como grupo de controle, também
foram estudadas amostras de mucosa de quinze pacientes sem câncer colorretal. Os tecidos
foram analisados por “auto nested” PCR usando o primer consensus GP5+/GP6+. Dois
primers específicos para região E6 dos HPV 16 e HPV 18 também foram utilizados.
RESULTADOS: O DNA do HPV foi detectado em tecidos de cólon e reto de 60 pacientes
com câncer ( 83 por cento), enquanto que este não foi encontrado em nenhum dos pacientes
controles sem tumor ( p<0,001). Em vinte e três pacientes, o DNA do HPV estava presente
tanto no tecido tumoral como na mucosa não neoplásica adjacente. Em vinte e três
pacientes o DNA do HPV foi encontrado apenas no tumor, enquanto que em quatorze, só
foram encontrados nos tecidos normais coletados próximos ao tumor de cólon e reto. Em
setenta e cinco por cento dos casos positivos foram identificados os HPV tipo 16 ou 18 por
PCR com primers E6 específicos. Os achados positivos obtidos por PCR foram
confirmados por seqüenciamento viral. CONCLUSÃO: O HPV está presente no cólon e
reto da maioria dos pacientes com carcinoma de cólon e reto estudados, sugerindo que este
vírus pode estar relacionado à patogênese do câncer colorretal. Serão necessários mais
estudos para determinar o papel do HPV na carcinogênese colorretal.
11
ABSTRACT
PURPOSE: This study was design to investigate the relationship between human
papillomavirus (HPV) infection and colorectal cancer. METHODS: Seventy-two patients
with primary colorectal carcinoma were included in the study. From each patient two tissue
samples were collected: one sample of the tumor and one sample of noncancerous intestinal
tissue from an area 15 cm away from the tumor. As a nonmalignant control group,
colorectal tissue samples obtained from 15 patients without cancer were also studied.
Tissues were analyzed through auto-nested polymerase chain reaction (PCR) using the
consensus GP5+/GP6+ primers. Two different specific primer sets targeting E6 region of
the HPVs 16 and 18 were used for typing. Direct DNA sequence analysis was conducted to
confirm positive PCR results. RESULTS: HPV DNA was detected in colorectal tissues of
60 patients with cancer (83 percent), but in none of the colorectal tissues obtained from
controls without cancer (p<0.001). Twenty-three patients contained HPV DNA in both
tumor and noncancerous colorectal tissue, 23 had HPV only in the tumor, and 14 had HPV
only in the noncancerous tissue sample. Seventy-five percent of the positive cases had
either HPV16 or HPV18 identified by PCR with specific primers E6. Positive PCR results
were confirmed by the amplified viral sequences. CONCLUSION: HPV is present in the
colon and rectum of most patients with colorectal carcinoma, suggesting that this virus may
be related to the pathogenesis of colorectal cancer. Further studies to determine the ultimate
role of HPV in colorectal carcinogenesis are warranted.
12
1. INTRODUÇÃO
O câncer colorretal é um dos tumores malignos mais prevalentes no mundo,
com mais de um milhão de novos casos diagnosticados anualmente.
1
Apesar de
vários fatores de risco para a doença já terem sido identificados, como a
predisposição genética e o papel de alguns fatores ambientais, os mecanismos
moleculares relacionados à carcinogênese colorretal continuam em investigação.
2,3
Até o momento, a etiologia do chamado câncer colorretal esporádico, que representa
90% dos casos diagnosticados, ainda não está esclarecida. Neste contexto, estudos
recentes têm sugerido que alguns tipos de vírus podem estar envolvidos na
patogênese do câncer colorretal, especialmente o papiloma vírus humano (HPV).
4-8
O HPV é um vírus DNA reconhecidamente envolvido na carcinogênese da
cérvice uterina e da região anogenital
9,10
. Mais de duzentos tipos diferentes de
HPV já foram identificados
11
. Os tipos 16 e 18, considerados como de alto risco
para o desenvolvimento do câncer de colo uterino, são classificados como
carcinógenos humanos pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer
(IARC).
12
Estudos clínico-laboratoriais sugerem que o efeito oncogênico do HPV
seja resultante da integração do material genético viral no DNA da célula hospedeira
e expressão das oncoproteínas E6 e E7, que antagonizam as funções de conhecidos
13
genes supressores tumorais, como o p53 e o pRb. Através destes mecanismos
moleculares, o HPV transforma e imortaliza células epiteliais, determinando
proliferações não controladas e formação de tumores.
13,14,15
Baseado em testes realizados em mais de mil amostras de câncer de colo
uterino em pacientes de vinte e dois países (Biological Study of Cervical Câncer),
verificou-se que o HPV está presente em mais de 99,7% dos carcinomas de colo
uterino.
16
Em relação à patogênese de outras neoplasias, como o câncer de mama,
de esôfago e de trato respiratório, uma potencial influência do HPV tem sido
pesquisada. Os HPVs dos tipos 16 e 18, mais freqüentemente associados aos
carcinomas anogenitias, também são os mais identificados em outros tipos de
câncer.
17,18,19, 20
Recentemente, o papel do HPV no câncer de cólon e reto tem sido
investigado. Até o momento, os resultados são conflitantes. Enquanto alguns autores
têm identificado o DNA do HPV em amostras de câncer colorretal por diferentes
técnicas laboratoriais, como a hibridização in situ e a reação em cadeia da
polimerase (PCR), outros falharam em identificar a presença do vírus, mesmo
usando as mesmas técnicas de detecção.
21,22
O objetivo principal deste estudo foi avaliar, por uma combinação de
técnicas de biologia molecular, a presença do HPV em uma amostra de carcinomas
colorretais, assim como em tecidos de cólon e reto obtidos de pacientes operados
por patologias não malignas. Os resultados obtidos foram correlacionados com as
14
características demográficas dos pacientes estudados e com fatores prognósticos
conhecidos para o câncer colorretal.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CÂNCER COLORRETAL
2.1.1 Epidemiologia
O carcinoma colorretal é o segundo câncer mais prevalente em todo o
mundo, depois do câncer de mama, com cerca de meio milhão de óbitos anuais
relacionados. Estima-se que, globalmente, 2,4 milhões de pessoas tenham recebido
este diagnóstico nos últimos 5 anos. A taxa de incidência global por 100.000
indivíduos é de 19 para homens e 14 para mulheres.
23,24
O risco acumulado de desenvolvimento do câncer colorretal é de 6% ao
longo da vida. No ano de 2000, a neoplasia representou 9,4% do total de novos
casos de câncer. As mortes causadas por câncer de cólon e reto representam 8% de
todos os óbitos que ocorrem por câncer.
23
Estimativas para o ano de 2005 no Brasil apontam o câncer colo-retal como
o 4º tumor maligno mais freqüente para ambos os sexos. A maior incidência de
casos ocorre na faixa etária entre 50 e 70 anos. Estima-se que no ano de 2000,
15
20.000 novos casos tenham sido diagnosticados no Brasil. As taxas de incidência
são de 13 e 14 por 100.000 em homens e mulheres, respectivamente. No Rio Grande
do Sul a incidência anual é muito alta, ocorrendo cerca de 28 novos casos por
100.000 habitantes. A doença representa 5,47% e 7,94%, nos homens e nas
mulheres, respectivamente, do total de mortes causadas por câncer.
23,25
2.1.2 Patogênese
A patogênese do câncer colorretal é resultado de uma complexa interação de
variáveis, incluindo fatores ambientais e fatores hereditários.
26
As diferenças entre populações de diversas nações inspirou a hipótese de
Denis Burkitt de que uma dieta pobre em resíduos e rica em carbohidratos e
gorduras representa um fator predisponente para este tipo de câncer. Segundo este
autor, a maior incidência da doença é verificada em nações com populações
predominantemente urbanas e com padrão dietético ocidental. Entretanto, as
evidências epidemiológicas da associação do câncer colorretal com o consumo
aumentado de açúcar e gorduras permanecem conflitantes. Da mesma forma, o
papel do consumo de fibras na proteção contra o câncer colorretal é ainda
controverso.
23,27
As influências genéticas são atualmente reconhecidas como fatores
independentes de risco para o câncer colorretal. Fearon e Vogelstein sugeriram que
o surgimento deste tumor seria o resultado de um acúmulo seqüencial de mutações
16
genéticas distintas, correspondendo cada uma destas a um estágio histológico
diferente na seqüência adenoma- carcinoma. Mutação dos genes APC, K-ras , DCC
(delleted in colorectal cancer) e p53 ocorreriam cumulativamente, levando à
formação da maioria dos carcinomas esporádicos de cólon e reto.
26, 29
Os chamado carcinomas esporádicos, que representa mais de 90% dos casos
diagnosticados, são os adenocarcinomas colorretais não relacionados a síndromes
genéticas específicas, a exemplo da polipose adenomatosa familiar (PAF) e da
sídrome de Lynch. Mutações pontuais no gene ras, amplificação gênica do c-myc,
deleção de alelos em sítios específicos dos cromossomos 5, 17 e 18 estão envolvidos
no processo de desenvolvimento destes tumores. A deleção de alelos está presente
em mais de 70 % dos casos, causando alterações na ação de genes supressores
tumorais e prejudicando os principais mecanismos de defesa da célula, como a
interrupção do ciclo celular e a apoptose.
27
Atualmente, há duas síndromes genéticas principais relacionadas ao
desenvolvimento do câncer colorretal. A primeira é a PAF, que contribui para 1 a
3% dos casos de neoplasias malignas do cólon e reto. Esta é uma doença hereditária,
de herança autossômica dominante, com penetrância de quase 100%, causada por
uma mutação no gene APC. A PAF se caracteriza pelo desenvolvimento de centenas
a milhares de pólipos adenomatosos no cólon e reto que surgem na adolescência e
início da vida adulta. Estes pólipos tendem a permanecerem assintomáticos até os
pacientes atingirem cerca de 30 anos de idade, quando se manifestam por
sangramento e diarréia. Virtualmente, todos os pacientes acometidos irão
17
desenvolver adenocarcinoma colorretal se não forem tratados. O câncer ocorre
precocemente por volta dos 36 a 39 anos de idade na PAF, enquanto na população
ocorre em média aos 65 anos.
27,28
A segunda doença hereditária é a chamada síndrome Lynch ou HNPCC
(hereditary nonpolyposis colorectal cancer). Esta é uma patologia de herança
autossômica dominante na qual há tendência ao desenvolvimento de múltiplos
tumores primários colônicos envolvendo predominantemente o cólon proximal, que
tem início em idade precoce (antes dos 40 anos). Além disso, há também
predisposição marcada para o desenvolvimento de adenocarcinomas em outros
órgãos, como endométrio, ovário, estômago, trato urinário e intestino delgado. A
principal alteração estrutural nesta síndrome é a perda da função dos genes
responsáveis pelo reparo do DNA (mismatch repair genes – MMR), incluindo o
hMSH2, hMLH1, hPMS1, hPMS2 e hMSH6. Como resultado desta incapacidade
de reparo, ocorre um acúmulo de mutações levando a formação do carcinoma. O
diagnóstico deste estado de reparo defeituoso é feito a partir da comparação entre
microssatélites (seqüências repetidas do DNA) existentes nas células. Quando estas
seqüências são diferentes entre si, diz-se que há uma instabilidade de
microssatélites, sendo então estes tumores classificados como positivos para erros
de replicação.
26,28
No presente estudo, apenas carcinomas colorretais esporádicos foram
incluídos na investigação, uma vez que os tumores hereditariamente determinados
18
têm comportamento clínico diverso e que a infecção pelo HPV representaria um
potencial fator etiológico ambiental.
2.2 Papilomavírus Humano
2.2.1 Estrutura e Classificação Viral
O HPV pertence à família papovavírus, sendo um vírus icosaédrico, não
envelopado e composto por ácido desoxirribonuclêico (DNA) circular de dupla fita
com 7.900 bases de comprimento. O genoma viral é organizado em três regiões.
Duas regiões codificadoras que expressam 8 proteínas virais: duas proteínas de
aparecimento tardio no ciclo de vida viral denominadas L1 e L2, que formam o
capsídeo, e seis proteínas de aparecimento precoce denominadas E1, E2, E4, E5, E6
e E7, que estão relacionadas à infectividade, manutenção do vírus na célula
hospedeira e proliferação viral. A terceira região não tem capacidade de codificação
protéica, mas atua como reguladora, sendo denominada LCR (long control region)
ou URR (upstream regulatory region) que, por sua vez, controla a transcrição dos
genes virais.
Todos os tipos de HPV possuem a estrutura do genoma basicamente
organizada com as mesmas características (figura 1).
14,30
19
FIGURA 1: Genoma do papiloma vírus humano 16, localização e organização dos
genes.
31
Mais de 230 tipos de HPV já foram identificados até o momento.
32
Estes
tipos são definidos pela análise da seqüência de DNA que apresentam, sendo uma
seqüência considerada nova quando a composição de bases de uma região específica
(E6, E7 e L1) difere em mais de 10% das seqüências originais já estudadas.
33
A
maioria dos HPVs conhecidos já foi completamente seqüenciada e agrupada
conforme a superfície epitelial que costuma infectar no hospedeiro e conforme a
homologia da seqüência de seu DNA (Quadro 1).
20
QUADRO 1. Tipos de HPV classificados conforme sua homologia na seqüência de
DNA e associação com lesões clínicas.
Lesões Clínicas Tipos de HPV
Cutâneos/associados à epidermodisplasia 14,19,29,46,21,25
Verruciforme 9,15,17,37,38
5,8,12,36,47
22,23,24,
49,50
Cutâneos 1,63
4,48,60,65
41
Cutâneos/mucosos 2,27,57
3,10,28,29
7,40,43
61,72
Mucosos 6,11,13,44,55
16,31,33,35,52,58,67
18,39,45,59,68,70
26,51,69
30,53,56,66
32,42
34,64,73,
54
A contaminação pelo HPV pode ocorrer através de vários mecanismos.
Os
tipos virais causadores de lesões cutâneas são geralmente adquiridos por micro
traumas na pele, por auto-inoculação ou por contato direto com lesões de outra
pessoa. Em lesões anogenitais, a transmissão sexual é a mais freqüente.
10
A
transmissão através de fômites já foi documentada, com a detecção do DNA viral
em toalhas, roupas e materiais utilizados por pacientes infectados.
Finalmente, há
fortes evidências da transmissão transplacentária e hematogênica do vírus.
14,34
21
A infecção pelo HPV pode se manifestar de três formas. A primeira ocorre
como uma infecção latente quando o genoma do HPV estabiliza-se de forma não
integrada, como um epissoma, e permanece na célula hospedeira sem determinar
dano. A segunda, como uma infecção ativa na qual o vírus sofre multiplicação
vegetativa, manifestada por uma proliferação celular acelerada característica dos
tumores benignos. A terceira, de caráter oncogênico, ocorre quando o DNA viral
integra-se ao genoma da célula hospedeira alterando o controle da proliferação
celular pela ação sobre os genes supressores de tumor.
35
2.2.2 Métodos de Detecção do HPV
Os métodos de detecção do HPV têm se tornado gradualmente mais precisos
e específicos, com a identificação direta do DNA ou ácido ribonucleico (RNA)
viral. Existem técnicas que não amplificam o DNA antes da análise molecular, a
exemplo do Southern blot (SB), do Dot blot (DB), da hibridização in situ (ISH) e do
sistema de captura híbrida (HCS). Com estes procedimentos, a identificação do
vírus depende da presença de uma grande quantidade de DNA viral nos tecidos ou
sistemas celulares analisados. Estes testes apresentam, portanto, menor sensibilidade
quando comparados com técnicas que utilizam a amplificação do DNA, a exemplo
da reação em cadeia da polimerase (PCR).
36
A PCR representa um dos maiores avanços técnicos da medicina
contemporânea. O método consiste, em linhas gerais, na amplificação enzimática in
vitro de um segmento específico de DNA a partir de quantidades mínimas de
22
material genético presente em um determinado meio ou tecido. Basicamente, é um
processo termo-cíclico que inclui três etapas.
A primeira etapa é a desnaturação por ação térmica, com separação das fitas
de DNA. A estabilidade das fitas é mantida por pontes de hidrogênio entre as bases
complementares. As fitas se separam a uma temperatura específica, quando a
mobilidade térmica excede a força de ligação das pontes de hidrogênio, geralmente
entre 90 e 95°C.
Uma vez separadas as fitas que compõem a molécula de DNA, inicia-se a
fase de anelamento, que depende da presença das seqüências iniciadoras ou primers.
Estas seqüências irão parear com suas respectivas seqüências de bases
complementares no DNA-alvo de fita simples, a 37-55°C. Os primers se constituem
de oligonucleotídeos compostos de 20-25 bases de comprimento agrupados em uma
seqüência determinada. No caso do HPV, existem variações na sensibilidade da
PCR dependendo do tipo de primer empregado.
37,38
Entre os primers mais utilizados para o diagnóstico de HPV estão os
denominados primers consensus, MY09/MY11 e GP5+/GP6+. Estes são pareados
com regiões de L1, que se constituem em uma seqüência de DNA comum aos
diversos tipos de HPV. Desta forma, estes primers podem identificar diferentes
tipos de HPV em uma mesma reação, e também podem ser utilizados para detecção
de novos tipos virais. Entretanto, estes primers apresentam menor sensibilidade em
lesões nas quais o DNA viral tem a seqüência de bases de L1 interrompida, o que
23
pode ocorrer quando o vírus se integra ao genoma da célula hospedeira, como
freqüentemente ocorre nas lesões malignas.
38,39
Em contraste, os primers chamados de específicos tem a propriedade de
detectar determinados tipos de HPV, por identificarem os genes E6 ou E7 que têm
sua expressão aumentada após a integração viral ao genoma do hospedeiro. Desta
forma, são altamente sensíveis e específicos para os tipos virais analisados, em
particular os HPVs 16 e 18 que apresentam o maior potencial oncogênico.
38
Após a fase de anelamento, à temperatura de 37-55°C, inicia-se a fase de
extensão do primer através de uma enzima termoestável denominada de Taq
polimerase. A ação desta enzima é a de reproduzir um segmento da fita de DNA a
partir da região onde houve a ligação entre o primer e o segmento de DNA
correspondente. Ambas as fitas simples iniciais de DNA, por conseguinte, são
convertidas em quatro fitas pareadas, as quais servem de modelo para um novo ciclo
de PCR que se iniciará. Este processo passa a ocorrer sucessivamente por 35 a 40
ciclos havendo em conseqüência um crescimento exponencial no número de cópias
do DNA-alvo formadas. Após a amplificação, o produto da PCR é submetido à
eletroforese em gel de agarose com brometo de etídio, o que permite então a
visualização do DNA amplificado à luz ultra-violeta.
37
24
2.2.3 Papel Oncogênico do HPV
As novas técnicas de biologia molecular foram fundamentais para melhor
esclarecer o papel do HPV no processo de desenvolvimento de tumores malignos. A
ação oncogênica deste vírus foi primeiramente reconhecida na década de 1930,
quando estudos experimentais mostraram que lesões benignas em coelhos podiam
ser induzidas à transformação maligna e ao carcinoma invasivo por ação de um tipo
específico de papilomavírus (cottontail rabbit papillomavirus) .
40
Em seres humanos, a associação entre HPV e câncer foi inicialmente
sugerida na epidermodisplasia verruciforme, uma doença genética rara caracterizada
por deficiência no sistema imune. Os pacientes acometidos desenvolvem lesões
verrucosas características na pele, que em 30 a 60% dos casos evoluem para
transformação maligna nas áreas expostas ao sol. Nesta doença, em mais de 90%
das lesões que progridem para o carcinoma de células escamosas, são encontrados o
HPV tipo 5 e o HPV tipo 8 .
30
O mecanismo oncogênico do HPV tem sido objeto de vários estudos.
Diferentes tipos de HPV possuem capacidade variável de indução maligna dos
tecidos que infectam. Desta forma, os mais de 30 tipos de HPV que acometem a
região anogenital são classificados de acordo com seu potencial oncogênico como
grupo de alto risco, a exemplo dos tipos 16 e 18, e grupo de baixo risco,
correspondendo principalmente aos HPVs 6 e 11.
11
Sabe-se que em lesões benignas e pré-malignas o DNA viral é mantido de
forma epissomal, ou seja, não integrado ao genoma da célula hospedeira. O
25
contrário se observa nos carcinomas, onde o genoma viral está geralmente integrado
ao genoma do hospedeiro. Esta integração provoca a ruptura dos genes L1, L2, E1 e
E2 do vírus. Sendo o gene E2 responsável pelo controle da transcrição dos genes E6
e E7, sua inativação leva a superexpressão destes dois genes.
O aumento da
expressão dos genes E6 e E7 é fundamental para carcinogênese induzida pelo HPV
16 e 18. O gene E6 forma um complexo com o gene p53 e o degrada pela via da
ubiquitina, o que resulta na inativação deste gene supressor tumoral.
39
O gene p53 é denominado o “guardião do genoma” porque atua sempre que
ocorre um dano ao DNA. Nesta situação, há um aumento na sua expressão, o que
ocorre com o objetivo de promover a interrupção do ciclo celular em G1 para reparo
do DNA ou promover a indução de apoptose, a morte celular programada (figura
2).
41
26
A: Condições Fisiológicas B: Infecção pelo HPV 16/18
p53-E6
DNA danificado degradação dependente da
ubiquitina
p 53 estímulo de fatores de inibição p53 baixos níveis
parada do ciclo celular/apoptose progressão do ciclo celular
(reparo do DNA) (mutações genômicas)
FIGURA 2. Representação esquemática da ação do gene E6 do HPV 16/18 sobre o
gene p53.
Em conjunto com a ação do E6, o gene E7 irá se ligar a outro gene supressor
tumoral da célula hospedeira, o gene do retinoblastoma (RB). Este codifica uma
proteína, a pRB, que tem a função de manter o ciclo celular quiescente através de
sua ligação com o fator de transcrição E2F na fase G1. Para que ocorra a progressão
do ciclo celular a partir de G1, a pRB sofre uma fosforilação que leva à
desintegração do complexo com E2F. A proteína E7 do HPV liga-se às formas
hipofosforiladas da pRB, liberando o fator de transcrição E2F e promovendo deste
modo a síntese de DNA não programada biologicamente pelos mecanismos
Ciclo celular
G1
M G2
S
G0
Ciclo celular
G1
G0
M G2
S
27
celulares do hospedeiro.
A interação destas duas proteínas virais com os genes
supressores tumorais leva a instabilidade do genoma celular com conseqüente
imortalização da célula infectada (figura 3).
41,42,43
A: Condições Fisiológicas B: Infecção pelo HPV 16/18
E2F E2F
Inativa Ativa
Bloqueio Progressão
G0 S G1 S
G0 Ciclocelulra
M G2 M G2
FIGURA 3. Representação esquemática da atuação do gene E7 do HPV 16/18
sobre o gene RB.
A ação carcinogênica do HPV foi extensivamente investigada com relação
ao câncer de colo uterino. No estudo pioneiro de Dürst e colaboradores (1983), tipos
específicos de HPV, particularmente o 16 e o 18, foram isolados de biópsias de
tumores de colo uterino. Vários estudos posteriores confirmaram este achado,
pRb pRb
E7
Genes dependentes
de E2F ativados
Genes dependentes de
E2F bloqueados
Ciclo celular
G1
Ciclo celular
28
detectando material genético do HPV na grande maioria dos tumores cervicais e
indicando um papel crítico do vírus nesta neoplasia.
41
A mais forte evidência epidemiológica da ação carcinogênica do HPV no
colo uterino foi fornecida pela Agência Internacional para Pesquisa no Câncer-
International Agency for Research on Câncer (IARC). A pesquisa consistiu de
estudos multicêntricos de casos e controles que compararam 2000 mulheres com
carcinoma de colo uterino com 2000 mulheres saudáveis. Foram incluídos pacientes
da Espanha, Colômbia, Brasil, Paraguai, Marrocos, Mali e Filipinas. A análise dos
dados demonstrou uma razão de chances (odds ratio) para associação da presença
do HPV e câncer de colo uterino que variou entre 17 e 156, obtidas na Colômbia e
nas Filipinas respectivamente, sendo a razão de chances comum de 60% (95%,
intervalo de confiança de 49-73). A associação foi observada tanto nos tumores
escamosos (razão de chances de 62) quanto nos adenocarcinomas (razão de chances
de 51).
9
A razão de chances foi de 129 para o HPV 16 e de 104 para o HPV 18,
sendo também elevada para tipos virais menos comuns. Para se dimensionar a
importância destes achados, cita-se o fato de que mesmo a menor razão de chances
observada foi maior do que aquela verificada na associação entre tabagismo e
câncer de pulmão, sendo similar àquela entre hepatite infecciosa e câncer hepático,
ambas aceitas universalmente como relações causais estabelecidas.
44
29
Finalmente, foi detectado DNA viral através de PCR com primers consenso
MY09/MY11 em 93% de mais de 1000 biópsias de carcinoma de colo uterino
obtidas de 22 países. Após a análise inicial, as biópsias negativas (7%) foram
testadas novamente com primers consensos mais sensíveis (GP5+/GP6+) e com
primer específico E7, sendo então constatada a prevalência do HPV em 99,7% das
amostras. Estes resultados, marcantes do ponto de vista epidemiológico, permitiram
aos autores concluírem que o HPV representa uma causa necessária para o
surgimento do câncer cervical.
9
O HPV também é fator de risco definido para as neoplasias da região
anogenital como o carcinoma epidermóide de vulva e pênis, nos quais o vírus está
presente em cerca de 50% dos casos.
14
A relação com câncer de canal anal é ainda
mais importante. Num estudo de casos e controles, Frisch e colegas encontraram
DNA de HPV em 88% de 388 pacientes com a doença. Em contrapartida, não
houve a identificação do vírus em nenhum dos 20 casos de adenocarcinoma de reto
usados como controles. Tal qual se dá no câncer de colo uterino, o tipo 16 foi
encontrado em 73% dos carcinomas invasivos.
10
O possível papel oncogênico do HPV também tem sido investigado em
neoplasias extragenitais, a exemplo dos carcinomas de laringe, faringe, esôfago,
pulmão, bexiga e mama.
Embora com menor significância epidemiológica, o DNA
viral foi identificado tanto em tumores de células escamosas, quanto em tumores de
células transicionais e adenocarcinomas, com graus variáveis de positividade de
acordo com o tipo histológico e a origem anatômica do tumor.
17-20
30
2.3 HPV e Câncer Colorretal
Kirgan e colaboradores, no começo da década de 1990, foram um dos
primeiros a investigar o papel potencial do HPV na etiologia do câncer colorretal.
Em seu estudo inicial, foi testada a presença de antígenos do HPV através de imuno-
histoquínica em amostras teciduais de diferentes pacientes armazenadas em blocos
de parafina. Em 97% dos 30 casos de câncer colorretal estudados foram detectados
antígenos virais, bem como em 60% de adenomas tubulovilosos e em 23% de
amostras teciduais de mucosa colônica normal (p< 0,001).
4
Cheng e colaboradores, em 1991, estudaram a presença de seqüências de
DNA do HPV usando a técnica de hibridização por Southern blot em três linhagens
celulares de adenocarcinoma colorretal obtidas de pacientes chineses. Seqüências de
DNA dos HPVs 16 e 18 foram detectadas nas colônias de células tumorais, mas não
em amostras de tecido colônico não neoplásico usadas como controle. Além disso,
foi sugerida uma potencial associação entre a infecção viral e alterações no
oncogene c-myc.
45
McGregor e colaboradores estudaram tecidos colorretais armazenados em
parafina e detectaram a região L1 do genoma do HPV através de PCR e Southern
Blotting em 32% dos 38 carcinomas colorretais analisados, em 38% dos adenomas e
em 8% das biópsias de mucosa normais. No estudo publicado por Lee e
colaboradores, foram analisados tecidos coletados de 38 pacientes com CCR na sala
de cirurgia e mantidos congelado a menos 70 graus centígrados. De cada um dos
31
pacientes eram obtidas uma amostra do tumor colorretal e uma amostra de mucosa
colônica normal, posteriormente testadas por PCR e Southern Blotting. O HPV18
foi encontrado em 53% (10/19) dos fragmentos de mucosa colônica normal e em
84% (16/19) dos tumores (p<0,01).
5
Novamente Cheng e colaboradores, em 1995, demonstram haver relação
significativa entre os graus de displasia de uma série de os adenomas e a presença
do HPV-16 através da análise por PCR e Southern blot. Foram analisadas 109
adenomas colorretais em parafina. A infecção pelo HPV 16 foi detectada em 8%
dos adenomas com displasia leve, em 25% dos adenomas com displasia moderada e
em 58% dos adenomas com displasia severa.
6
Recentemente, Bodaghi e colaboradores utilizaram as técnicas de PCR
(nested e in situ) e seqüenciamento em um estudo controlado para investigação da
presença do HPV em tecidos colorretais. O vírus foi detectado em 55% (28 de 55)
das amostras de tecidos obtidas de pacientes com CCR, não sendo detectado em
nenhuma das amostras de cólon normal obtidas de controles sem câncer.
46
O maior estudo em número de pacientes foi conduzido por Weinberger e
colaboradores, que utilizaram a técnica de microrarray para detectar a expressão
tecidual da oncoproteína E6 dos HPVs 16 e 18. Foram analisados tecidos
neoplásicos de 447 pacientes com câncer de cólon e reto. Este estudo não foi
publicado como artigo original, mas sob a forma de resumo por ter sido apresentado
no congresso anual da Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO). Os
32
autores não relatam em que percentagem de pacientes o HPV foi detectado. Não
foram analisadas amostras de tecido colorretal normal como controles. Foi
demonstrado, no entanto, que há expressão significativamente maior da proteína E6
em tumores com estadiamento mais precoce e com localização anatômica mais
distal no intestino grosso. Baseando-se na maior expressão protéica observada nos
tumores de reto e sigmóide os autores sugeriram que a infecção pelo HPV ocorreria
a partir da transmissão retrograda do vírus do períneo para trato gastrointestinal
baixo.
47
Em contraposição aos autores que sugeriram a participação do HPV no
desenvolvimento do câncer colorretal, alguns estudos falharam em demonstrar a
presença do vírus em pacientes com este tipo de neoplasia. Boguszakova e
colaboradores analisaram biópsias de 13 pacientes com adenocarcinoma de cólon e
de 10 pacientes com adenomas para a presença de DNA de citomegalovírus,
epstein-Barr vírus e HPV (tipos 2, 6, 16 e 18). A técnica utilizada foi Southern blot,
tendo uma sensibilidade estimada de 0.05 equivalentes de genoma viral por célula.
Não foi encontrado DNA viral em nenhuma das amostras teciduais testadas.
48
Shah e cols. analisaram a DNAs obtidos de 50 tumores colorretais para a
presença de seqüências de HPV através da técnica de PCR utilizando primers
consensus L1 para a amplificação. Os produtos da PCR eram também rastreados
com um probe genérico de HPV que consistia de amplímeros dos HPVs 16 e 18.
Todas as amostras foram negativas para a presença do vírus, sendo estes resultados
33
confirmados por seqüenciamento. Em sua conclusão, os autores questionaram a
associação entre a infecção pelo HPV e o câncer colorretal.
21
No estudo conduzido por Shroyer e colaboradores foi utilizada PCR
(primers consensus L1 – MY11) e hibridização in situ para investigar a presença do
HPV (tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33 e 35) em secções de tecido em parafina. Foi
detectado DNA viral em todos os 5 casos de carcinoma escamoso de canal anal, mas
em nenhuma das 22 amostras de adenocarcinoma colônico estudadas. Os autores
concluíram com isso que o HPV está uniformemente presente no carcinoma anal,
mas não parece ter qualquer participação na carcinogênese colônica.
22
3. JUSTIFICATIVA
Baseado nos resultados controversos da literatura quanto a potencial
associação entre o HPV e o desenvolvimento do carcinoma colorretal e
considerando a alta prevalência desta infecção viral no Brasil, decidimos realizar um
estudo prospectivo em nosso meio investigando a presença do vírus no cólon e reto
de pacientes com este tipo de câncer. A definição de um papel etiológico do HPV
no processo de carcinogênese colorretal poderá mudar significativamente a
compreensão da biologia desta neoplasia, abrindo novas perspectivas de diagnóstico
e prevenção da doença.
34
4.OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Determinar se o HPV está presente no adenocarcinoma de cólon e reto.
3.2. Objetivos específicos
1. Comparar a prevalência do HPV em amostras de adenocarcinoma
colorretal com a prevalência em amostras de tecido colorretal não
neoplásico obtidas de 2 fontes diferentes:
A) Cólon ou reto de pacientes sem câncer operados para tratamento
de doenças intestinais benignas.
B) Áreas de tecido intestinal sem tumor obtidas do próprio cólon ou
reto dos pacientes com câncer colorretal.
2. Correlacionar a presença do HPV nos adenocarcinomas colorretais com as
seguintes variáveis clínico-patológicas da doença:
A) idade dos pacientes
B) sexo dos pacientes
C) localização do tumor no intestino grosso
D) estadiamento da doença
35
4. PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Delineamento da pesquisa
Trata-se de um estudo transversal controlado, com unidade de estudo
individual.
4.2. População estudada
Foram considerados elegíveis pacientes com diagnóstico de adenocarcinoma
primário de cólon ou reto, comprovado por exame anatomopatológico, que foram
tratados por ressecção cirúrgica eletiva no Serviço de Coloproctologia do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre (HCPA) no período de março de 2004 a fevereiro de 2005.
Para que fossem estudados apenas casos de câncer colorretal esporádico,
foram excluídos os pacientes com diagnóstico de PAF ou HNPCC. Da mesma forma,
pacientes com câncer associado à doença inflamatória intestinal não foram avaliados.
Nenhum dos participantes foi submetido a tratamento neo-adjuvante quimio ou
radioterápico. A recusa em participar do estudo, embora não tenha ocorrido em
nenhum caso, era também considerada critério de exclusão do estudo. Todos os
participantes concordaram formalmente em participar da pesquisa através da
assinatura de consentimento informado, previamente aprovado pela Comissão de
Ética do Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação do HCPA.
36
Como controles, foram incluídos pacientes escolhidos ao acaso provenientes
do Serviço de Coloproctologia do HCPA submetidos a ressecções colorretais não
relacionadas a câncer, tais como tratamento da doença diverticular, doença
inflamatória intestinal, colite isquêmica. Nenhum dos pacientes do grupo controle
tinha história prévia de câncer de cólon ou reto ou apresentava suspeita clínica ao
exame físico, exames de imagem ou revisão transoperatória de neoplasia maligna. A
participação no estudo destes pacientes foi também autorizada mediante termo de
consentimento informado.
4.3. Amostra estudada
Após a aplicação dos critérios de inclusão e exclusão de pacientes, a amostra
em estudo ficou constituída 72 pacientes com câncer colorretal. Este grupo era
formado por 36 homens e 36 mulheres, com idade média de 64,1 anos (variação de 39
a 75 anos).
Como grupo controle, foram analisados 15 pacientes com doenças
colorretais não malignas. Foram estudados 8 homens e sete mulheres. A idade média
destes pacientes foi 52,3 anos (variação de 25 a 75 anos). As indicações cirúrgicas
nestes pacientes foram: doença diverticular (5 casos), colite isquêmica (2 casos),
doença inflamatória (5 casos), endometriose colônica (1 caso), correção de prolapso
de colostomia (2 casos).
37
4.4. Métodos
4.4.1. Avaliação clínico-patológica
Todas os pacientes foram avaliadas no período pré-operatório através de
uma seqüência de exames para diagnóstico e estadiamento da doença conforme a
rotina do Serviço de Coloproctologia do HCPA. Após a realização de história e
exame físico completo, os pacientes eram investigados por colonoscopia. A
localização anatômica dos tumores era a seguinte: 39 tumores (54,17%) localizados
no reto, 17 (23,61%) no cólon sigmóide, 13 (18,06%) no cólon ascendente ou ceco, 2
(2,78%) no cólon transverso e 1 (1,39%) no cólon descendente. Sempre era realizada
biópsia da lesão tumoral, mesmo nos casos encaminhados ao Serviço já com
diagnóstico histológico, para confirmação anatomopatológica do carcinoma.
A extensão da doença era avaliada por ultrassonografia e/ou tomografia de
abdominal total e radiografia e/ ou tomografia de tórax. Para todos os pacientes
eram solicitados eletrocardiograma, hemograma, bioquímica completa, provas de
função renal e dosagem sérica do antígeno carcinoembriônico (CEA).
O estadiamento de cada paciente de acordo com a classificação TNM
(tabelas 1 e 2) era estabelecido após a revisão trans-operatória da cavidade
abdominal e a realização de exame anatomopatológico da peça cirúrgica. Os
tumores encontrados eram classificados conforme o grau de diferenciação
histológica (tabela 3).
49
38
TABELA 1 –Classificação TNM
Tumor primário (T)
Tx Tumor primário não pode ser avaliado
T0 Sem evidências de tumor primário
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor invade a submucosa
T2 Tumor invade a muscular própria
T3 Tumor invade através da muscular própria a subserosa ou tecido pericólico ou peritrretal
não peritonializado
T4 Tumor invade diretamente outros órgãos ou estruturas e/ou perfura peritônio visceral.
Linfonodos regionais
NX Linfonodos regionais não podem ser avaliados
N0 Ausência de metástases nos linfonodos regionais
N1 Metástases em 1 a 3 linfonodo(s) regional(is)
N2 Metástases em 4 ou mais linfonodos
Metástases à distância
MX A presença de metástases à distância não pode ser avaliada
M0 Ausência de metástases à distância
M1 Metástases à distância
39
TABELA 2. Estadiamento por Grupos
ESTÁDIO 0 Tis N0 M0
ESTÁDIO I T1 N0 M0
T2 N0 M0
ESTÁDIO II T3 N0 M0
T4 N0 M0
ESTÁDIO III
qualquer T N1 M0
qualquer T N2 M0
ESTÁDIO IV
qualquer T qualquer N M1
TABELA 3. Graduação histopatológica
Bem diferenciado
Moderadamente diferendiado
Pouco diferendiado
Os pacientes do grupo controle eram também submetidos à colonoscopia
com biópsia, sempre que este exame não estava clinicamente contra-indicado. A
presença de doença colorretal maligna era afastada pela avaliação endoscópica,
pela revisão intra-operatória do intestino grosso e da cavidade abdominal e pelo
exame anatomopatológico definitivo da peça cirúrgica.
40
4.4.2. Coleta das amostras de tecido colorretal
Todos as amostras de tecido colorretal foram coletadas na sala de cirurgia
pelos cirurgiões da equipe de Coloproctologia diretamente envolvidos no estudo, logo
após a ressecção do segmento de intestino grosso. Foram coletadas duas amostras de
tecido de cada caso de câncer colorretal: uma amostra da lesão tumoral e uma
amostra de tecido intestinal não neoplásico obtida de uma área localizada a 15 cm do
tumor.
A coleta de tecidos era realizada de acordo com um protocolo padronizado
para evitar a contaminação cruzada entre as amostras durante a manipulação do
espécime cirúrgico. Luvas e instrumentos cirúrgicos esterilizados eram utilizados. O
segmento ressecado de intestino era sempre aberto longitudinalmente a partir da
extremidade proximal, exceto quando o tumor se localizava no ceco. A amostra de
tecido não neoplásico era então coletada da luz intestinal. Na seqüência, após a troca
de luvas, novos instrumentos cirúrgicos eram usados para completar a abertura da
peça e coleta da amostra de tecido tumoral.
No grupo controle sem câncer, a coleta de tecidos era também realizada na
sala de cirurgia pelos mesmos médicos logo após a remoção da peça e em condições
estéreis. A abertura do intestino era iniciada a partir da extremidade proximal e a
amostra de tecido era obtida de uma área central do espécime.
41
Após a coleta, as amostras eram armazenadas em tubos de ensaio de vidro
sem reagentes químicos e congelados a – 30 graus centígrados.
4.4.3 Processamento e análise das amostras
O DNA das diferentes amostras foi extraído usando o NucleoSpin
®
Tissue
Kit ( Macherey & Nagel, Solana Beach CA, USA), de acordo com as instruções do
fabricante. A quantificação do DNA foi feita com o dispositivo GeneQuantII
(Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd. England).
A integridade do DNA das amostras foi verificada pela amplificação de uma
região com 280 pares de bases do gene da β-globina humana. O conjunto de primers
utilizados foi: PC04 (CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC) e GH 20 (GAA GAG
CCA AGG ACA GGT AC).
52
Todas amostras tiveram esta reação positiva, ou seja,
apresentavam DNA viável.
As amostras foram inicialmente submetidas a PCR com primers consenso
GP5+/GP6+, que permitem a detecção de um amplo espectro de tipos de HPV. As
amostras que foram negativas com o uso do PCR GP5+/GP6+ foram re-amplificadas
através de PCR “auto-nested ” usando os mesmos primers. Por definição, a técnica de
nested-PCR consiste na utilização de primers em combinação na mesma reação com
objetivo de aumentar a sensibilidade da análise.
50
42
Neste estudo, foi realizada, pela primeira vez em pacientes com câncer
colorretal, a técnica de auto-nested PCR conforme descrita por Remmerbach e cols.
Em resumo, após a primeira amplificação usando os primers GP5+/GP6+, coleta-se 1
microlitro do produto da PCR e realiza-se uma nova amplificação com os mesmos
parâmetros de tempo e temperatura utilizando-se o mesmo kit de primers previamente
empregado, o que aumenta a sensibilidade desta PCR em até 65,1% em comparação à
chamada single-round PCR.
51
Os produtos amplificados do PCR foram analisados por eletroforese em gel
de agarose a 2% e visualizados a partir da incorporação de brometo de etídio. Os
controles negativos incluíram todos os reagentes com exceção do DNA. Os controles
positivos para presença do HPV se constituíram no DNA isolado de células das
linhagens SiHa, que contém 1-2 cópias do HPV 16 integrado ao genoma, e de células
da linhagem HeLa, que contém 10-50 cópias do HPV 18 integrado ao seu genoma.
52
Para a genotipagem viral foram conduzidas PCRs com primers específicos
E6 para os HPVs 16 e 18. As seqüências utilizadas para os primers específicos foram:
HPV16 E6 – CAG GAC CCA CAG GAG CGA CC / ATC GAC CGG TCC ACC
GAC CC e HPV 18 E6 – GCT TTG AGG ATC CAA CAC GG / TGC AGC ACG
AAT GGC ACT GG.
53
Cada reação com volume de 25μl, continha uma solução
tampão para PCR (20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl), aproximadamente 0,2 μg
de DNA amostral, 10 picomóis de cada primer, 1 unidade da enzima PLATINUM®
Taq DNA Polymerase e 200 μM de cada desoxirribonucleotídeo trifosfatado (dNTP).
A concentração de MgCl
2
variou com os diferentes primers. Para os primers E6
43
específicos foi utilizado 1,5 mM de MgCl
2
e para o primer consenso foi utilizado 2,5
mM MgCl
2
. Os reagentes, com exceção dos primers, foram de origem GIBCOBRL®
(Grand Island, NY USA).
As amostras foram amplificadas no termociclador modelo PTC – 100
TM
(MJ
Researchs, Watertown, Massachusetts, USA) com o primeiro ciclo de desnaturação a
94°C por 4 min e com o ciclo final de extensão a 72°C por 10 min. As condições e o
número de ciclos de desnaturação-anelamento-extensão variaram com os diferentes
conjuntos de primers. Para o primer consenso foram utilizados 35 ciclos com os
seguintes parâmetros: 94°C por 30 segundos; 42°C por 30 segundos e 72°C por 30
segundos. Para os primers específicos a PCR consistiu de 35 ciclos com os seguintes
parâmetros: 94°C por 1 minuto; 58°C por 2 minutos e 72°C por 3 minutos.
Os produtos da PCR foram analisados em gel de Agarose–1000
(GIBCOBRL®) e visualizados a partir da incorporação de brometo de etídio. Os
fragmentos de L1 amplificados continham aproximadamente 140 pb e os fragmentos
da região E6 do HPVs 16 e 18 continham respectivamente 380 e 440 pb. As células
SiHa e HeLa foram usadas como controles positivos. As reações nas quais não foi
adicionado DNA, foram consideradas como controles negativos.
As amostras positivas na PCR foram submetidas a seqüênciamento direto do
DNA com objetivo de confirmar os resultados. Os produtos da PCR foram
purificados com kit específico (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Após purificação,
os produtos foram marcados com o BigDye
®
V3.1 Cycle Sequencing Kit. Desta
44
forma, cada nucleotídeo era marcado como uma cor específica, que era detectada no
seqüenciador automático 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e
traduzida graficamente como eletroferograma. Os resultados obtidos eram
posteriormente comparados com as seqüências de E6 dos respectivos HPVs,
publicada on-line pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI -
Bethesda, MD, USA).
Para evitar possíveis contaminações com os amplicons, as análises das
amostras amplificadas foram realizadas em outro local do laboratório. Houve controle
rigoroso com relação às pipetas, tubos e aventais entre os dois locais do laboratório.
Todas as análises positivas foram repetidas para confirmação do achado.
4.4.4. Análise estatística
As variáveis quantitativas foram descritas pela média e desvio padrão. Para
análise dos dados qualitativos foram utilizados percentual e freqüência absoluta. As
comparações entre o grupo de pacientes positivos para a presença do HPV e os
pacientes negativos foram realizadas através do teste t de Student (dados
quantitativos) e pelo teste de qui-quadrado. Nas situações em que os valores
esperados foram pequenos nas tabelas de contingência foi utilizado o teste exato de
Fisher. O nível de significância adotado foi de alfa = 0,05. Os dados foram
analisados com o auxílio do programa SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences for Windows ) versão 12.0.
45
4.4.5. Ética
Os pacientes foram instruídos verbalmente sobre os objetivos do estudo.
Todos autorizaram a sua participação através de assinatura de termo de
consentimento informado. Foram garantidas a preservação dos dados, a
confidencialidade e o anonimato dos indivíduos pesquisados. Em nenhuma etapa do
estudo houve risco para os paciente participantes. O estudo não provocou mudança
nos tratamento dos pacientes.
O presente estudo foi avaliado pelo Grupo de Pesquisa e Pós Graduação do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre, tendo sido aprovado no processo de número
02-264.
5. RESULTADOS
5.1. Características demográficas
A amostra estudada foi constituída de 72 pacientes com câncer colorretal e
15 pacientes analisados como controles. A média das idades nos pacientes com
câncer foi de 64,08 anos com desvio padrão de 12,99 anos. No pacientes sem câncer
a media de idade foi inferior, 52,27 anos com desvio padrão de 13.3 anos. A
distribuição dos pacientes por idade está demonstrada na tabela 4. A diferença entre
a média de idade dos grupos foi significativa (p=0,02).
46
TABELA 4. Distribuição por idade
Grupo Média* DP Amplitude*
Câncer 64,08 12,98 35-90
Controle 52,27 13,29 25-75
*valores expressos em anos; DP = desvio padrão
teste T, p=0,02
Dos 72 paciente com câncer, 36 pacientes (50%) eram do sexo masculino e
36 eram do sexo feminino. Dos 15 pacientes sem câncer, 8 (53,3%) eram homens e
7 (46,7%) eram mulheres. Não houve diferença significativa entre os grupos quanto
a distribuição dos sexos (tabela 5).
TABELA 5. Distribuição por sexo
Grupo Masculino Feminino
Câncer 36 36
Controle 8 7
*teste exato de fischer, p=1,0
5.2. Características clínico-patológicas
Nos pacientes com câncer, as amostras foram coletas do reto em 39
pacientes (54,2%); do cólon sigmóide ou descendente em 18 pacientes (25%); do
cólon trasnverso, descendente ou ceco em 15 pacientes (20,8%). Nos pacientes sem
47
câncer, as amostras foram coletadas do reto em 7 pacientes (46,7%), do cólon
sigmóide ou descendente em 5 pacientes (33.3%); do cólon trasnverso, descendente
ou ceco em 3 pacientes ( 20%). Não houve diferença significativa (p=0,794) entre
os grupos ao se analizar os locais de onde foram coletadas as amostras. Estes dados
são apresentados na tabela 6, sendo as regiões anatômicas classificadas para fins de
análise em três grupos: 1) cólon proximal, incluindo o ceco, cólon ascendente e
transverso; 2) cólon distal, englobando os cólons descendente e sigmóide e 3) reto.
TABELA 6. Localização das Amostras Coletadas
Pacientes com tumor Pacientes sem tumor
Cólon Proximal 15 (20,8%) 3 (20%)
Cólon distal 1 8 (25%) 5 (33,3%)
Reto 39 (54,2%) 7 (46,7%)
Total 72 15
teste Chi-Quadrado ( Pearson ), p = 0,794
A classificação dos tumores de acordo com o estadiamento (sistema TNM) é
mostrado na tabela 7. Sessenta e três casos (87,5%) foram classificados como
moderadamente diferenciados, sete casos (9,7%) e dois casos (2,78%) foram
classificados como pouco e bem diferenciados, respectivamente.
48
TABELA 7. Estadiamento dos tumores ( TNM)*
Estadio I 13 (18,05%)
Estadio II 21 (29,17%)
Estadio III 22 (30,55%)
Estádio IV 16 (22,2%)
Total 72 (100%)
* número absoluto e porcetagem de casos da amostra de pacientes com tumor analisada.
5.3 Detecção do HPV
Todas as amostras analisadas mostraram reação da PCR positiva para ß-
globina, evidenciando a viabilidade do DNA dos espécimens.
O DNA do HPV foi detectado nas amostras de 60 dos 72 pacientes com
câncer (83,3%) usando a PCR auto-nested com primers GP5+/GP6+, não sendo
identificado em nenhuma das amostras do grupo controle sem neoplasia (p<0.001).
No grupo com câncer, o DNA do HPV foi encontrado em 61,1% (44 de 72)
das amostras de tumor e em 50% (36 de 72) das amostras de tecido não tumoral
(p=0.25). A comparação de cada um destes resultados isoladamente com o resultado
da análise do grupo controle sem câncer, no qual não foi detectado o HPV, alcançou
diferença estatisticamenete significativa (p<0.001). Vinte e três pacientes (31,94%)
49
tiveram o HPV detectado somente nas amostras de tecido tumoral, 14 pacientes
(19,44%) tiveram o vírus detectado somente no tecido não neoplásico e 23 (31,94%)
tiveram o HPV identificado em ambos os tipos de amostra.
Os resultados obtidos com a análise dos diferentes tipos de amostras
coletadas dos pacientes com tumor através dos primers GP5+/ GP6+ e primers
específicos para HPV16 e para HPV18 são apresentados na tabela 8. Estes não
alcançaram significância estatística, apesar de uma tendência a maior positividade
para os PCR GP5+/GP6+ e PCR para HPV 16 nos tecidos neoplásicos em relação
aos tecidos não tumorais coletados. Os resultados foram idênticos nestas amostras
ao se comparar o HPV 18.
TABELA 8. PCR + nas amostras coletadas em pacientes com tumor
Tumor
Mucosa adjacente ao Tumor p-valor
GP5+/6+ 61,11% 50% 0,24
HPV16 34,72% 25% 0,275
HPV 18 18,06% 18,06% 1,0
Dos 60 casos positivos identificados através da PCR com os primers
consenso (GP5+/GP6+), 45 casos tiveram identificada a presença dos HPVs 16 ou
18 através de PCR com primers específicos. O HPV 16 foi o tipo viral mais
freqüente, sendo o único tipo diagnosticado em 22 casos (36,67%). O HPV 18 foi o
único tipo identificado em 12 casos (20%). Em 11 casos (18,33%) verificou-se a
50
ocorrência de uma infecção mista, estando presentes concomitantemenete o HPV16
e o HPV18. Em 15 paciente (25%), no entanto, não se identificou nem o HPV16
nem o HPV 18, indicando que infecção detectada através dos primers consenso era
causada por tipos virais diversos.
O seqüenciamento direto confirmou os resultados da PCR com primers
específicos. As seqüências das amostras positivas eram as mesmas seqüências E6
publicadas para os HPVs 16 (figura 4) e 18.
Figura 4. Seqüenciamento do HPV 16 – primer E6.
51
5.4. Variáveis clínico-patológicas em relação à presença do HPV
Não houve associações estatisticamente significativas entre positividade para
o papiloma vírus humano e a idade (Tabela 9) e o sexo (Tabela 10) dos pacientes
estudados.
TABELA 9. Relação entre idade e presença do HPV
Grupo
Nºde Pacientes Média de idade Desvio Padrão
HPV+ 60 64,30 13,44
HPV- 12 63,0 13,045
*teste T, p=0,76
TABELA 10. Relação entre sexo e presença do HPV
HPV Masculino Feminino
HPV+ 31 (86,1%) 29 (80,6%)
HPV- 5 (13,9%) 7 (19,4%)
*teste exato de fischer, p=0,753
Não houve associação estatisticamente significativa entre positividade para o
HPV e a progressão do estadiamento tumoral (tabela 11). O mesmo aconteceu ao se
analisar a presença do HPV em comparação à região anatômica onde se localizava o
tumor (tabela 12).
52
TABELA 11. Presença do HPV conforme estadiamento do Tumor
HPV +
HPV-
I 9 (69,2%) 4 (30,8%)
II 17(81%) 4 (19%)
III 21(95,5%) 1 (4,5%)
IV 13 (81,3%) 3 (18,8%)
teste exato de Fisher, p= 0,202
TABELA 12. Presença do HPV conforme localização do Tumor
HPV +
HPV- Total %
Cólon Proximal 13 2 15 20,8
Cólon distal 15 3 18 25
Reto 32 7 39 54,2
Total 60 12 72 100
teste Chi-Quadrado, p= 0,920
53
6. DISCUSSÃO
Estimativas apontam o câncer de cólon e reto como o quarto mais freqüente
no Brasil, tanto em homens como em mulheres. Apesar da melhora crescente da
tecnologia médica, incluindo novos métodos diagnósticos e tratamento adjuvante, a
taxa de mortalidade e cura não têm sofrido alterações consideráveis. A pesquisa em
biologia molecular no câncer colorretal parece ser o caminho fundamental para
melhora deste panorama.
Até o momento, a patogênese do assim chamado carcinoma colorretal
esporádico, que representa mais de 90% dos casos diagnosticados, ainda necessita
ser esclarecida. Neste contexto, a identificação de um agente infeccioso como parte
do processo de carcinogênese colorretal representaria uma mudança radical no
entendimento da biologia desta neoplasia, abrindo novas possibilidades diagnósticas
e terapêuticas.
A partir do início dos anos 90, surgiram as primeiras publicações sugerindo
um papel do HPV na etiologia do câncer colorretal.
4-8
Os resultados na literatura
até o momento são divergentes. Enquanto alguns autores têm identificado o DNA
do HPV em amostras de câncer colorretal por diferentes técnicas laboratoriais,
como a hibridização in situ e a PCR, outros falharam em identificar a presença do
vírus, mesmo usando as mesmas técnicas de detecção.
54
Este é o primeiro estudo realizado no Brasil que investiga a relação entre a
infecção pelo HPV e o câncer de cólon e reto. Nosso principal achado foi a detecção
do vírus em 83,3% das amostras de tecido colorretal dos pacientes com câncer. Em
contraste, não houve detecção de DNA viral em nenhum dos pacientes do grupo
controle sem neoplasia (p<0.001).
Como pode ser observado na tabela 4, houve diferença significativa na
média de idade do grupo câncer (64,1 anos) em comparação à média do grupo
controle (52,3 anos). Esta diferença já era esperada no início do estudo, tendo em
vista que o câncer colorretal tem uma tendência a aumentar com idade, acometendo
principalmente indivíduos com mais de 60 anos.
1,27
Em contrapartida, algumas das
doenças que determinaram a indicação cirúrgica nos pacientes do grupo controle, a
exemplo da endometriose colônica e da doença inflamatória, costumam ocorrer
preferencialmente em pacientes mais jovens.
A diferença observada nas médias de idade dos grupos, o que inicialmente
poderia representar um fator de confusão na interpretação dos dados, na verdade
serve para reforçar o resultado obtido de positividade para o HPV nos pacientes com
câncer. Esta colocação é sustentada por estudos epidemiológicos que demonstraram
uma relação inversa da infecção pelos tipos oncogênicos de HPV com a progressão
da idade dos pacientes.
54, 55
Em pesquisa realizada no Instituto Ludwig para Pesquisa do Câncer (São
Paulo, Brasil) incluiu 1425 mulheres, demonstrou-se através da PCR uma clara
55
diminuição na positividade para tipos oncogênicos de HPV com o aumento da
idade. Houve uma redução de 24.3% de positividade na faixa etária de 18 a 24 anos
para apenas 8.7% na faixa etária entre 45 a 60 anos. Este fenômeno parece refletir
uma maior resposta imunológica do hospedeiro ao vírus desenvolvida após um
tempo prolongado, levando a uma redução nos índices de infecção latente no colo
uterino.
56
Quando nosso estudo foi iniciado, em março de 2004, não havia nenhum
outro estudo publicado avaliando a presença do HPV em três grupos diferentes de
amostras teciduais: amostras de tecido tumoral, de tecido não neoplásico obtidas do
próprio paciente com câncer e amostras não neoplásicas de coletadas de pacientes
sem câncer. Em abril de 2005, Bodaghi e colaboradores, do Instituto Nacional do
Câncer (NCI-NIH, USA) publicaram estudo com o mesmo desenho por nós
proposto.
46
Nosso estudo, no entanto, tem certas características metodológicas que
devem ser ressaltadas. Este é o único estudo no qual todas as amostras a serem
analisadas foram coletadas exclusivamente pelos cirurgiões diretamente envolvidos
na pesquisa de acordo com um protocolo pré-estabelecido de manipulação dos
espécimes cirúrgicos, com objetivo de evitar a contaminação cruzada entre amostras
de tecido. Cuidados semelhantes não foram adotados por outros pesquisadores. A
maioria dos estudos analisou tecidos conservados em blocos de parafina que foram
coletados e manipulados sem cuidados para evitar a potencial contaminação pelo
DNA viral. No estudo conduzido por Bodaghi e colaboradores, foram também
56
avaliados tecidos coletados a fresco na sala de cirurgia. Foram investigados 55
pacientes com câncer colorretal, porém um protocolo de coleta para evitar a
contaminação cruzada só foi aplicado aos últimos 10 pacientes incluídos no
estudo.
46
Em nosso trabalho, todas as amostras mostraram-se adequadas para a análise
molecular (teste da ß-globina humana positivo). Provavelmente obtivemos esta
condição por terem sido analisados tecidos frescos que foram prontamente
congelados após a coleta. Sabe-se que a degradação do DNA é o problema mais
significativo encontrado ao se estudar peças fixadas em parafina .
57
Neste estudo, foi realizada, pela primeira vez em pacientes com câncer
colorretal, a técnica de auto-nested PCR. A técnica foi descrita por Remmerbach e
cols. que demonstram uma maior sensibilidade com os na detecção do HPV (51
copias/
μl) em comparação a PCR single round com GP5+/GP6+ (170 copies/μl).
Portanto, a auto-nested PCR é uma técnica útil para ser utilizada na detecção do HPV
em tumores malignos não genitais, nos quais há presença de baixa carga viral.
51
Nosso índice de detecção do HPV nos pacientes com câncer, que foi de
83,3%, está em concordância com resultados relatados por outros autores, que
identificaram o HPV em amostras de carcinoma colorretal, com índices variando
entre 31 e 84%. A maior prevalência do vírus foi relatada por Cheng e colaboradores,
que estudaram espécimes de câncer colorretal obtidas de pacientes chineses,
detectando o vírus em 16 de 19 casos estudados.
6
Diferenças nos índices de detecção
57
entre os estudos podem ser explicadas por variações no desenho do estudo, tamanho
amostral, técnica de coleta de amostras, diferentes métodos de detecção utilizados e
mudanças no padrão da infecção pelo HPV de acordo com região geográfica e
características étnicas da população analisada. Da mesma forma, acredita-se que a
falha na detecção do vírus em tumores colorretais, relatada por uns alguns autores no
início da década de 1990, seja resultado de diferenças técnicas no método de
investigação empregado ou de tamanho amostral reduzido.
Em nosso estudo, nos pacientes com câncer, observou-se uma tendência de
detecção do vírus mais comumente no tecido tumoral do que na amostra
correspondente de tecido colorretal sem câncer. A ausência de diferença nestes
índices de detecção do HPV entre os dois tipos de amostra provavelmente reflete o
tamanho amostral deste estudo, podendo ser alterado com a inclusão de um maior
número de pacientes.
O DNA viral foi identificado na maioria dos casos de carcinoma. A ausência
do HPV nas amostras do grupo controle sem neoplasia sugere fortemente que a
presença do vírus nos carcinomas colorretais não seja meramente um achado
incidental, mas um potencial co-fator para o desenvolvimento da doença. Além disso,
75% das infecções virais detectadas foram causadas pelos HPVs 16 e 18, que são os
tipos virais com papel oncogênico definitivamente estabelecido. À semelhança do
achado de Bodaghi e colaboradores, o HPV 16 foi o tipo viral mais freqüente, estando
presente em 55% das amostras positivas (33 casos).
58
A infecção concomitante por mais de um tipo de HPV, observada em 11
pacientes, sugere um possível papel da co-infecções nesta neoplasia. Bachtiary e
cols. e van der Graaf e cols., ao estudarem lesões pré-malignas do colo uterino,
observaram que a presença de mais de um tipo de HPV, que parece refletir
exposição repetida ao vírus, está relacionada a um aumento da chance de progressão
das alterações patológicas para a condição de carcinoma invasor.
58,59
Em 25% dos casos positivos para o HPV, a infecção não foi causada pelos
tipos 16 e 18, mas por outros tipos virais. Este achado provavelmente resulta da já
mencionada alta sensibilidade da auto-nested PCR, que permite a detecção de um
amplo espectro de tipos de HPV, incluindo até novos tipos virais ainda não
documentados. Também pode refletir variações regionais no padrão de infecção
pelo HPV, que sabidamente é influenciada pela origem étnica e geográfica dos
indivíduos investigados. Já foi demonstrado que os países latino-americanos tem
maiores incidências de infecção pelo HPV que a Europa e os Estados Unidos da
América.
33
Várias características demográficas das áreas em desenvolvimento
podem explicar essas diferenças, tais como: baixos índices de nutrição, alta
fertilidade, más condições de higiene e acesso limitado aos serviços de saúde. Neste
contexto, é possível que a alta incidência da infecção pelo HPV no Brasil possa
estar, de alguma forma, contribuindo para a também alta incidência do carcinoma
colorretal no país.
Não foi encontrada diferença estatísticamente significativa na compração da
presença do HPV com a localização do tumor. O vírus teve índices de detecção
59
semelhantes nos diferentes segmentos do intestino grosso analisados, sugerindo que
a infecção colorretal não ocorra por contaminação retrógrada do vírus a partir da
região anogenital. Outros autores acharam resultados semelhantes. Em
contrapartida, Weinberger e colaboradores relataram que há expressão
significativamente maior da proteína E6 do HPV em tumores com localização
anatômica mais distal no intestino grosso.
47
A via hemática de disseminação viral poderia explicar a equidistribuição do
vírus nos segmentos dos intestino grosso analisados. A detecção de DNA do HPV
em amostras séricas de pacientes com doenças associadas a infecção pelo vírus tem
sido descrita. De acordo com a hipótese da “genometástase”, proposta por Garcia-
Olmo e Garcia-Olmo em 2001, a transformação maligna pode se desenvolver como
resultado de uma “transinfecção” em orgãos alvo por tipos virais oncogênicos
dominantes que circulam no plasma e que são derivados de um tecido
primariamente alterado (exemplo: colo uterino). Dessa forma, o HPV circulante
poderia alcançar órgãos distantes e determinar a transformação maligna daqueles
tecidos.
60
Widschwendter e cols., ao estudarem a infecção pelo HPV no câncer de
mama, sugeriram que o DNA do HPV pode ser transportado pela via sanguínea de
um tecido originalmente infectado para o tecido mamário, onde o vírus
desempenharia um papel no processo de carcinogênese.
61
A presença do HPV não predominou em nemhum estadio do
adenocarcinoma na amostra estudada ou em tumores pouco diferenciados. Isso
parece indicar que as alterações moleculares causadas pelo HPV não tornam a
60
neoplasia mais agressiva. Como já sugerido por Cheng e cols, as alterações
causadas pelo DNA do HPV não parecem estar envolvidas na invasão tumoral ou na
disseminação metastática.
6
Ourtros autores também falharam em demonstrar a
relação da presença do HPV com fatores prognósticos do câncer colorretal. Em
contraste, estudos em pacientes com câncer de pulmão e de cabeça e pescoço
demonstraram que infecção pelo HPV está associada a tumores em estadios mais
precoces e com melhor prognóstico.
62
Em resumo, neste estudo nós apresentamos evidência da associação entre a
infecção pelo HPV e o câncer colorretal. Nossos achados podem potencialmente
representar uma importante mudança na atual compreensão da biologia desta
freqüente neoplasia, abrindo novas perspectivas diagnósticas e terapêuticas para
pacientes com a doença.
61
7.CONCLUSÕES
7.1. Conclusão geral
O HPV está presente no cólon e reto de pacientes com adenocarcinoma
colorretal estudados.
7.2. Conclusões específicas
1. O HPV não está presente no cólon e reto de pacientes sem carcinoma
colorretal estudados.
2. Não existe associação significativa entre a presença do HPV e a idade
dos pacientes com carcinoma de colorretal estudados.
3. Não existe associação entre a presença do HPV e o sexo dos pacientes
com carcinoma de cólon e reto estudados.
4. Não existe associação entre a presença do HPV e a localização
anatômica dos tumores colorretais estudados.
5. Não existe associação entre a presença do HPV e o estadiamento dos
tumores estudados.
62
6. PERSPECTIVAS
A partir deste estudo surgiram novas perspectivas para a ampliação da
investigação do papel do HPV na carcinogênese colorretal. Neste sentido, novos
projetos de pesquisa estão sendo preparados, devendo, mais uma vez contar com a
participação do Serviço de Coloproctologia do HCPA e do Laboratório de Biologia
Molecular da FFFCMPA. São eles:
1) Pesquisa das alterações nos genes p53 e pRB em carcinomas
colorretais positivos para a presença do HPV.
2) Pesquisa do HPV na região anogenital e no sangue de pacientes
com carcinomas colorretais positivos para a presença do HPV.
3) Pesquisa do HPV em metástases de adenocarcinoma e cólon e
reto.
4) Estudo do papel carcinogênico do HPV em cultura de células
colorretais.
5) Impacto da vacinação para tipos específicos de HPV na
prevalência do câncer de cólon e reto.
63
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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