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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS
-
GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E RECURSOS NATURAIS
Interação entre a matéria orgânica natural, o cobre e microorganismos
heterotróficos: implicações na dinâmica do met
al e sua disponibilização para a
biota aquática
PATRÍCIA FRANKLIN MAYRINK NOGUEIRA
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ecologia e Recursos Naturais, da
Universidade Federal de São Carlos, como parte
dos requisitos para obtenção do título de Doutor
em Ciências, com ênfase em Ecologia e Recursos
Naturais.
São Carlos
-
SP
2007
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Milhares de livros grátis para download.
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária/UFSCar
N778ie
Nogueira, Patrícia Franklin Mayrink.
Interação entre a matéria orgânica natural, o cobre e
microorganismos heterotróficos : implicações na dinâmica
do metal e sua disponibilização para a biota aquática /
Patrícia Franklin Mayrink Nogueira. -- São Carlos : UFSCar,
2007.
163 f.
Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,
2007.
1. Limnologia. 2. Ecotoxicologia. 3. Cadeia trófica. 4.
Cobre. 5. MOD (Matéria Orgânica Dissolvida). I. Título.
CDD: 574.52632 (20
a
)
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Patrícia Franklin Mayrink Nogueira
INTERAÇÃO ENTRE A l\1ATÉRIA ORGÂNICA NATURAL, O
COBRE E MICROORGANISMOS HETEROTRÓFICOS:
IMPLICAÇÕES NA DINÂMICA DO METAL E SUA
DISPONIBILIZAÇÃO PARA A BIOTA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Carlos, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Aprovada em 28 de fevereiro de 2007
BANCA EXAMINADORA
Presidente
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Profa. Dra. Maria da Graça Dama Melão
(Orientadora)
1° Examinador
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Prata. Dl:a~-~ Teresa Lombardi
PPG ERNfUFSCar
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2° Examinador
Prof. Df. Armando Augusto Henriques Vieira
PPG ERN/UFSCar
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3° Examinador ~.,\",-,-_,.X0\..,-,-- ...,) 1(,.. :):~.'\",t'L '--=\'( -" ~.~-(.
Profa. Dra. Hedda Elisabeth Kolm
UFPR/Curitiba-PR
/f'/
4° Examinador
-~. ~-
Prof. Df. Eval
USP/Sã
AGRADECIMENTOS
Durante o desenvolvimento desse trabalho, o apoio dos amigos, profissionais e
familiares foi fundamental. Deixo aqui meus sinceros agradecimentos:
À Profa. Dra. Maria da Graça Gama Melão, pela orientação e pela oportunidade de
realização deste projeto.
À Prof. Dra. Ana Teresa Lombardi, pela amizade, companheirismo, paciência nas
correções e acima de tudo por ter contribuído para minha formação profissional através
de seus conhecimentos e ensinamentos, os quais com certeza foram valiosos e
imprescindíveis para o meu crescimento.
Às amigas de laboratório Irene, Twiggy, Alessandra e Inessa que deixaram meus dias de
trabalho mais alegres.
Ao Prof. Dr. Armando A. H. Vieira, pela permissão de utilização da infra-estrutura do
Laboratório de Fisiologia de Algas e pelas sugestões fornecidas no exame de
qualificação.
Ao técnico Luís Sartori, pela amizade e auxílio na realização dos cultivos da alga,
extração dos polissacarídeos, e análises de TOC.
Ao Prof. Dr. Evaldo Gaeta Espíndola, pelo uso do espectrofotômetro de absorção
atômica.
À Profa. Dra. Mirna Helena Regali Seleghin pela permissão da coloração de filtros no
Laboratório de Microbiologia e pelas sugestões fornecidas no exame de qualificação.
Ao Prof. José Eduardo dos Santos pelas sugestões fornecidas no exame de qualificação.
Ao CNPq, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela
concessão da bolsa de Doutorado.
Ao meu marido Marcelo, pela ajuda nas análises de cobre total, pelo apoio
incondicional e por me fazer sentir cada vez mais realizada ao seu lado.
Aos meus filhos que tanto amo, Lorena e Diego, que me fazem sentir emoções fortes
com gestos tão pequenos.
A presença e o apoio constante de meus pais, Roseny e Flávio, e meus irmãos, Rodrigo
e Luiza.
RESUMO
O aumento da eutrofização e da contaminação de ambientes aquáticos levam ao
interesse em estudos sobre a interação entre a matéria orgânica dissolvida, metais traços e a
biota. Os metais são lançados nos ambientes aquáticos principalmente através dos processos
industriais, enquanto que a eutrofização deve-se principalmente à entrada de esgotos
domésticos. A união desses dois processos em um só ambiente causa riscos ainda pouco
conhecidos à biota. Neste estudo, avaliou-se a capacidade de complexação da água do
Reservatório do Monjolinho (eutrofizado), de onde os organismos teste foram obtidos para o
desenvolvimento desta pesquisa. Os resultados mostraram que, com pelo menos dois sítios
distintos para associação com o cobre, a concentração de cobre livre no reservatório é baixa.
Sabe-se que a MOD natural é constituída por substâncias de natureza húmica e compostos
recém produzidos pela biota. Neste estudo, foi usada matéria orgânica natural do Suwanee River
(padrão comercial) como modelo de substância húmica e, como substância recém produzida,
exopolissacarídeos de cianobactérias (obtidos em laboratório). Foi investigada a influência da
interação entre MOD-Cu-organismos sobre a dinâmica de cobre e sua biodisponibilização. Os
resultados mostraram a degradação de material húmico pelas bactérias heterotróficas e, ainda,
que esses organismos são resistentes ao cobre, tolerando uma concentração de cobre total de 10
-
6
mol.L
-1
. Através da atividade das bactérias sobre o complexo MOD-Cu, o cobre foi
disponibilizado e magnificado na cadeia trófica. No entanto, não foi detectada liberação do
cobre mediante a degradação do complexo exopolissacarídeo-cobre. De modo geral, os
resultados mostraram que cobre complexado à MOD ou ao exopolissacarídeo foi menos tóxico
aos organismos do que o íon livre. Os resultados aqui apresentados vêm contribuir para o
conhecimento sobre a especiação, disponibilidade e interação do cobre com organismos
aquáticos considerando a presença da MOD natural, importantes para o gerenciamento de
ecossistemas aquáticos.
ABSTRACT
The increasing eutrophication and contamination of aquatic ecosystems motivates the
study of interactions between natural dissolved organic matter (DOM), metals and the biota.
Metals are mainly released into the environment by industrial processes, whereas organic
materials through municipal sewage sludge. The association of these two processes and its
effect on the environment poses unknown risks to aquatic communities. The support capacity of
aquatic systems is related to its ability to associate with dissolved elements. In this study, the
complexation capacity of Monjolinho Reservoir (eutrophic), from which the test organisms
were obtained, was evaluated. The results showed that two copper-complexing sites were
present, what contributes to the low free copper ion concentration in such environment. It is
known that natural DOM is formed by humic like and recently produced organic compounds.
Suwannee River natural organic matter was used throughout this investigation as models of
humic substance – DOM (commercial standard), whereas as model substance of recently
produced organic material, cyanobacteria (Anabaena spiroides) exopolysaccharides were used.
Considering that the environmental fate and chemical speciation of copper are dominated by
natural DOM and that heterotrophic bacteria processes are responsible for nutrient regeneration,
carbon transfer and energy, it was also investigated the influence of the interaction DOM-Cu-
organisms on copper dynamic and bioavailability. The results showed that the natural bacteria
population was copper resistant, tolerating up to 10
-6
M total copper concentration. The
degradation of DOM by heterotrophic bacteria, detected by fluorescence spectroscopy, revealed
that after Cu-complexed DOM degradation, the metal was liberated into the environment,
causing toxicity and bioaccumulation in the microbial food chain. Nevertheless, this was less
pronounced when the organic materials were exopolysaccharides. In general, the results showed
that copper complexed to natural DOM or exopolysaccharides was less toxic to the organisms
than free copper ions. The present results are a contribution to aquatic ecosystems management
and to the knowledge of copper speciation, availability and interaction with aquatic organisms,
as it relates to dissolved organic materials in aquatic ecosystems.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................................. 01
1.1. ÁGUA E POLUIÇÃO.........................................................................................01
1.2. ESPECIAÇÃO DO METAL E A MATÉRIA ORGÂNICA DISSOLVIDA (MOD)..........05
1.3. BIODISPONIBILIDADE E TOXICIDADE..............................................................09
2. OBJETIVO GERAL........................................................................................................15
3. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................16
CAPÍTULO 01- ESPECIAÇÃO QUÍMICA DO COBRE NO RESERVATÓRIO DO MONJOLINHO
(SÃO CARLOS, S.P.).........................................................................................................23
RESUMO................................................................................................................24
INTRODUÇÃO........................................................................................................25
OBJETIVO..............................................................................................................26
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................26
1.
O RESERVATÓRIO DO MONJOLINHO................................................................. 26
2.
ESPECIAÇÃO DE COBRE NO RESERVATÓRIO DO MONJOLINHO...........................27
3. COMPLEXAÇÃO DO COBRE NO RESERVATÓRIO DO MONJOLINHO......................31
R
ESULTADOS........................................................................................................32
D
ISCUSSÃO...........................................................................................................34
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................39
CAPÍTULO 02- EFEITO DA DEGRADAÇÃO BACTERIANA SOBRE A FLUORESCÊNCIA DA
MATÉRIA ORGÂNICA DISSOLVIDA NATURAL
..................................................................45
RESUMO................................................................................................................46
INTRODUÇÃO........................................................................................................47
OBJETIVO..............................................................................................................49
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................49
1. A MATÉRIA ORGÂNICA DISSOLVIDA NATURAL................................................49
2. CRESCIMENTO POPULACIONAL BACTERIANO..................................................50
3. UTILIZAÇÃO DA MOD PELA POPULAÇÃO BACTERIANA.....................................51
RESULTADOS........................................................................................................54
D
ISCUSSÃO...........................................................................................................58
R
EFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................62
CAPÍTULO 03- INFLUÊNCIA DE MICROHETERÓTROFOS NA DINÂMICA DO COBRE
COMPLEXADO À
MOD.....................................................................................................71
RESUMO................................................................................................................72
INTRODUÇÃO........................................................................................................73
OBJETIVO..............................................................................................................77
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................77
1. RESISTÊNCIA BACTERIANA AO COBRE.............................................................78
2. INFLUÊNCIA DA POPULAÇÃO BACTERIANA SOBRE A DINÂMICA DE COBRE......79
R
ESULTADOS........................................................................................................81
D
ISCUSSÃO...........................................................................................................85
R
EFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................89
CAPÍTULO 04- INFLUÊNCIA DA DEGRADAÇÃO DA MATÉRIA ORGÂNICA DISSOLVIDA
NATURAL NA BIODISPONIBILIZAÇÃO DO COBRE EM UMA CADEIA ALIMENTAR
AQUÁTICA
........................................................................................................................99
RESUMO..............................................................................................................100
I
NTRODUÇÃO......................................................................................................101
O
BJETIVO............................................................................................................102
MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................103
1. O METAL COBRE..............................................................................................103
2. A MATÉRIA ORGÂNICA DISSOLVIDA NATURAL.................................................103
3. DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE DE COMPLEXAÇÃO DA MOD COM O
COBRE
.................................................................................................................104
4. OS ORGANISMOS..............................................................................................104
4.1.
BACTERIOPLÂNCTON.....................................................................................104
4.2.
CILIADO........................................................................................................105
4.3. COPEPODA....................................................................................................105
5. DESENHO EXPERIMENTAL................................................................................106
6. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE COBRE..............................................107
6.1. COBRE LIVRE................................................................................................107
6.2. COBRE TOTAL...............................................................................................108
7. EXPERIMENTOS DE DINÂMICA DO COBRE ATRAVÉS DA INTERAÇÃO ENTRE OS
ORGANISMOS E O COMPLEXO
MOD-CU..............................................................108
7.1. INTERAÇÃO ENTRE MOD-CU E BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS.....................109
7.2.
INTERAÇÃO ENTRE MOD-CU - BACTÉRIAS E CILIADOS................................109
7.3.
INTERAÇÃO ENTRE MOD-CU - BACTÉRIAS – CILIADOS E COPEPODAS..........110
RESULTADOS......................................................................................................110
D
ISCUSSÃO.........................................................................................................118
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................122
CAPÍTULO 05- INFLUÊNCIA DE EXOPOLISSACARÍDEOS DE ANABAENA SPIROIDES NA
BIODISPONIBILIDADE DO COBRE EM UMA CADEIA ALIMENTAR AQUÁTICA
.................131
R
ESUMO..............................................................................................................132
I
NTRODUÇÃO......................................................................................................133
OBJETIVO............................................................................................................135
MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................135
1. O METAL COBRE..............................................................................................135
2. OS ORGANISMOS.............................................................................................136
2.1. CULTIVO DE ANABAENA SPIROIDES E EXTRAÇÃO DE
POLISSACARÍDEOS
...............................................................................................136
2.2.
BACTERIOPLÂNCTON...................................................................................137
2.3.
CILIADO.......................................................................................................138
2.4. COPEPODA...................................................................................................138
3. DESENHO EXPERIMENTAL...............................................................................139
4. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE COBRE.............................................140
4.1. COBRE LIVRE...............................................................................................140
4.2. COBRE TOTAL..............................................................................................141
5. EXPERIMENTOS DE DINÂMICA DO COBRE ATRAVÉS DA INTERAÇÃO ENTRE OS
ORGANISMOS E O COMPLEXO POLISSACARÍDEO
-CU............................................141
5.1. INTERAÇÃO ENTRE POLISSACARÍDEO-CU E BACTÉRIAS
HETEROTRÓFICAS
................................................................................................142
5.2.
INTERAÇÃO ENTRE POLISSACARÍDEO-CU - BACTÉRIAS E CILIADOS..............142
5.3.
INTERAÇÃO ENTRE POLISSACARÍDEO-CU - BACTÉRIAS – CILIADOS E
COPEPODES
.........................................................................................................143
RESULTADOS......................................................................................................143
DISCUSSÃO.........................................................................................................150
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................155
4.
CONCLUSÃO GERAL..................................................................................................163
1
1.
INTRODUÇÃO GERAL
1
.1
. Á
GUA E POLUIÇÃO
A água, constituinte da hidrosfera e
da
atmosfera, infiltra-se através dos solos
,
regula as condições climáticas do planeta e representa uma parte essencial de todos os
organismos vivos, inclusive o homem. A distribuição da água no planeta é heterogênea,
sendo 97,5% água salgada e 2,5% água doce. Dos 2,5% de água doce, cerca de 69,8%
constituem as calotas polares e geleiras, 29,9% são águas subterrâneas, 0,3% são rios e
lagos e 0,9% são referentes a outros reservatórios (Wetzel, 2001). Assim, a
disponibilidade da água sofre variações no tempo e no espaço, sendo que muitas vezes
não se encontra disponível onde é necessária (IETEC, 2001). Como pode ser
demonstrado na figura 01, sua distribuição e utilização no Brasil não é homogênea
(ANA, 200
3
).
Figura 01
-
Distribuição e utilização de
água doce no Brasil.
Adaptado de ANA (200
3
).
O ciclo hidrológico (figura 02) representa a circulação da água nos diversos
ecossistemas e envolve os estados gasoso, líquido e sólido. Segundo o Programa
2
Hidrológico Internacional (UNESCO,
2003
), o ciclo hidrológico é responsável pela
circulação de um volume de água de aproximadamente 577.200 km
3
/ano. Para a
população mundial, lagos, reservatórios e rios são as fontes mais valiosas de água
potável, sendo que a água doce é fonte de água para uso doméstico, agricultura e
indústria. No entanto, os usos múltiplos da água tornam os ecossistemas de água doce
vulneráveis à poluição e degradação (Tundisi, 2003).
Figura 02
-
Cicl
o hidrológico.
Adaptado de
UNESCO,
2003
.
A entrada de contaminantes nos ecossistemas aquáticos, tais como os esgotos
domésticos, ainda que resultantes de tratamento secundário, leva ao desenvolvimento
acelerado do processo de eutrofização. Este, por sua v
ez
, leva à degradação da
qualidade hídrica. Dentre os sintomas da eutrofização, encontram-se o aumento
exagerado de algas e suas toxinas, infestações maciças de alguns vegetais aquáticos,
aumento da incidência de doenças hidricamente transmissíveis, águas turvas, odores
fétidos e alteração da palatabilidade da água, depleção dos níveis de oxigênio dissolvido
e mortalidade da biota (Tundisi, 2003).
De acordo com sensos produzidos pelo IETEC (2001) e UNESCO (2003), cerca
de 1/3 da população mundial vive em países onde a falta de água oscila de moderada a
3
altamente impactante. Mais de 1 bilhão de pessoas têm problemas de acesso à água
potável; 2,4 bilhões não tem acesso ao saneamento básico, resultando em casos de
doenças de veiculação hídrica, com ocorrência de aproximadamente 5 milhões de
mortes a cada ano. Estima-se que entre 10.000 e 20.000 crianças morrem por dia
vítima
s de doenças de veiculação hídrica. Em algumas regiões da Índia, o lençol
freático afunda de 2 a 3 metros anualmente e 80% dos rios são muito tóxicos para
suportar peixes e outros organismos aquáticos. Mais de 20% de todas as espécies de
organismos de água doce estão ameaçadas ou em perigo em razão da construção de
barragens, diminuição do volume de água e danos causados por poluição e
contami
nação. Aproximadamente 120
.000 Km
3
de água estão contaminados e para 2050
espera
-se uma contaminação de 180
.000
Km
3
caso persista a taxa de contaminação
atual.
Os sistemas de abastecimento público, que levam água para as cidades a partir
de grandes reservatórios centrais, são susceptíveis à propagação de doenças. Tem-
se
,
por exemplo, o tifo e a cólera, doenças causadas por bactérias que podem ser
disseminadas através da água. Ainda, diversas formas de desinteria amébica são
transmitidas por águas contaminadas, bem como enterobactérias e rotavírus. Muitas
doenças podem ser transmitidas através de invertebrados aquáticos, como a
esquistosomos
e, a infecção do verme-
da
-
Guiné
e a malária cuja transmissão dá-
se
através de insetos cujos estágios larvais ocorrem em ambientes aquáticos eutróficos
(IETEC, 2001).
Além da eutrofização, a contaminação da água por metais também é um
problema global. De acordo com Nriagu (1990), à partir do século XIX, com a expansão
do desenvolvimento tecnológico, sócio-econômico e industrial teve início a descarga de
quantidades significativas de metais tóxicos no ambiente.
Esta
poluição ambiental está
4
associada à atividade extrativista mineral, à indústria em geral e à agricultura através do
uso de defensivos agrícolas (Nriagu, 1990). Se
us principais indicadores são os aumentos
das concentrações de metais traço, organoclorados, organofosforados e pesticidas no
solo, na água, no sedimento e respectivas comunidades. Diferentemente de alguns
poluentes orgânicos, como por exemplo, o herbicida 2,4-D, que pode ser degradado às
custas de organismos heterotróficos (Van Demark e Batzing, 1987), os metais não são
degradados química, nem biologicamente (Alloway, 1993), tendendo assim a sofrer um
acúmulo no ambiente.
Muitos dos metais traços introduzidos no ambiente como resultado de atividades
humanas são nutrientes, no entanto, quando presentes em concentrações pouco mais
elevadas do que a natural, passam a exercer efeito tóxico em organismos autotróficos e
heterotróficos. Como parte da cadeia alimentar, o homem também é atingido e sofre
suas conseqüências, apresentando diversas doenças (Lacerda e Salomons, 1998;
Chapman et al., 19
77
; Laws, 2000). O modo principal de ação pelo qual os metais
tóxicos exercem efeitos adversos no ser humano consiste em reações com átomos
doadores de enxofre das proteínas, resultando muito comumente em desativação
enzimática. Além disso, competindo com elementos essenciais tais como cálcio e
magnésio, os metais tóxicos podem desestabilizar a estrutura de biomoléculas,
res
ultando em efeitos mutagênicos e genotóxicos, ocasionando doenças genéticas e
câncer. Exemplos clássicos de contaminação por metais são a “Doença de Itai-
Itai”,
causada por exposição crônica ao cádmio, e a “Doença de Minimata”, pela exposição
crônica ao me
rcúrio (Laws, 2000).
Os metais traços encontrados no ambiente podem ser essenciais ou não para
sobrevivência dos organismos. Dentre os essenciais encontra-se o cobre, que
está
presente
naturalmente no ambiente (Lewis e Cave, 1982). A essencialidade do cob
re
5
relaciona
-
se à sua habilidade em se converter entre os estados reduzido e oxidado, sendo
assim usado como cofator em um grande número de atividades enzimáticas, como por
exemplo, transferência e transporte de elétrons. No entanto, devido à sua capacidad
e
redox, o cobre em altas concentrações pode ser deletério à biota aquática.
Conseq
üentemente, o funcionamento saudável das células é dependente da perfeita
regulação deste metal como transporte, estocagem e distribuição dentro da célula
(Edding
e
Tala, 19
96).
No ambiente, um metal pode seguir diversos caminhos, tais como interações
iônicas simples, associação com partículas, precipitação e acúmulo no sedimento,
oxidações e reduções químicas e biológicas, complexação com ligantes e adsorção e
absorção por microorganismos dentro da cadeia alimentar (
Sigg
e Behra, 2005). No
entanto, segundo
Worms
et al. (2006), os modelos disponíveis que visam esclarecer
sobre o transporte e a transformação desses elementos em ecossistemas aquáticos são
incompletos, em grande parte por falharem ao considerar a complexidade das interações
biológicas com os metais.
1.2
. E
SPECIAÇÃO DO METAL E
A MATÉRIA ORGÂNICA
DISSOLVIDA
(MOD)
A forma em que um metal é encontrado na natureza (Figura 03), definida como a
especiação do elemento, pode ser classificada sob dois aspectos: (a) a especiação física,
que compreende os metais nas formas dissolvida, coloidal e particulada, e (b) a
especiação química, que compreende as formas complexada ou iônica, considerando-
se
os diferentes estados de o
xidação do metal (Leppard, 1983).
6
Figura 03
-
Esquema representativo da especiação dos metais (M).
A especiação dos metais em ecossistemas de água doce, assim como a sua
concentração, transporte, transformação e destino, é c
ontrolada
por fatores ambientais
tais como características biológicas, químicas e físicas do ecossistema e as propriedades
dos compostos com os quais os metais interagem (Leppard, 1983; Twiss
et al.
, 2000). A
temperatura atua sobre a solubilização de muitas substâncias, influenciando a forma
química ou especiação dos metais
complexadas
com elas (Leppard, 1983). O pH do
ambiente atua sobre o processo de ionização de compostos e elementos específicos. No
caso do cobre, por exemplo, sabe-se que sua forma iônica livre tende a ser favorecida
em valores baixos de pH (pH<5) (Tessier
e
Turner,1995).
Os ligantes presentes em ecossistemas aquáticos e capazes de complexar os
metais incluem elementos inorgânicos, compostos orgânicos de diversas massas
moleculares e propriedades químicas, complexos orgânicos excretados pelos
organismos ou mesmo introduzidos na água por atividades antropogênicas,
macromoléculas e partículas coloidais, além de grupos funcionais na superfície dos
organismos (Sigg e Behra, 2005). Os ligantes inorgânicos que influenciam a especiação
dos metais compreendem os hidróxidos e carbonatos, cloretos, fosfatos e sulfatos,
Metal
Coloidal
Complexos
M-
orgânicos
Metal iônico
(M
n+
)
Metal
particulado
Complexos
M-
inogânicos
7
dentre outros (Sigg e Behra, 2005). Nas células, biomoléculas como as fi
toquelatinas,
glutationinas
e metalotioninas contribuem para a concentração e acúmulo de metais em
seu interior (Sigg
e
Behra, 2005).
A matéria orgânica natural (MON) encontra-se entre os compostos orgânicos de
maior importância ambiental capazes de complexação com os metais (Kaiser, 2002). De
acordo com o critério
arbitrário do tamanho das partículas, a MON pode ser dividida em
três tipos principais: solutos (<0,001 m), colóides (~0,001 a 0,45 m) e sólidos (>0,45
m) (Thurman,1985). Moléculas orgânicas como os ácidos carboxílicos (oxalato,
acetato, malonato e citrato), aminoácidos, fenóis e “catecóis” são ligantes de metais que
podem ser disponibilizados através da decomposição da matéria orgânica ou excretados
pelos organismos (Tessier e Turner, 1995). Do total da MON, a parcela dissolvida é de
grande importância ambiental, destacando-se as substâncias húmicas (SH), que
contribuem com cerca de 50% do carbono orgânico dissolvido em águas naturais.
Segundo Buffle (1990), a capacidade das substâncias húmicas (SH)
de
se
associar
em
a
os
metais relaciona-se às suas propriedades polifuncionais e
polieletrolíticas, além da conformação espacial da molécula. Das propriedades
polifuncionais, pode-se dizer que as SH possuem cerca de 35% de oxigênio e 1-2% de
nitrogênio e enxofre, os quais são os principais responsáveis pelas características de
complexação dessas moléculas. O oxigênio encontra-se principalmente nas formas de
grupos carboxílicos e fenólicos, enquanto que o nitrogênio e enxofre estão alocados em
grupos peptídicos, sulfônicos e tióis. Os grupamentos com nitrogênio e enxofre
possuem maior força de ligação por certos metais do que os grupamentos oxigenados
(Buffle, 1990). Da conformação espacial da SH, pode-se afirmar que fatores ambientais
como força iônica, pH e hidratação são aspectos importantes em relação à compl
exação
de metais.
8
Também constituinte da MON, os polissacarídeos são importantes na regulação
dos elementos metálicos nos ecossistemas aquátic
os
através da formação de complexos
(Lombardi
et al., 2002, 2007). No entanto, diferentemente das substâncias húmi
cas,
moléculas de difícil degradação, os polissacarídeos são degradados mais facilmente pela
biota. Colombo et al. (2004) observaram que a degradação dos polissacarídeos ocorre
em duas fases. Na primeira, parte do polissacarídeo (41%) é degradado rapidamen
te
enquanto que na segunda fase, a degradação do polissacarídeo restante (59%) ocorre
mais lentamente. Tais macromoléculas
contribuem
de 1 a 30% para a concentração de
carbono orgânico dissolvido em ecossistemas aquáticos ( Hellebust, 1974). A maior
parte
dos carboidratos excretados por microalgas é polimérica e podem ser estruturais,
de reserva e/ou extracelulares. Os polissacarídeos extracelulares, além de formarem
cápsulas e bainhas de muitas espécies de algas (Brook, 1981), podem sofrer processo de
diss
olução para o meio circundante (Boney, 1981; Paulsen
e
Vieira, 1994).
A complexação de íons metálicos com polissacarídeos apresentando grupos
funcionais com cargas negativas, tais como ácidos urônicos, piruvatos, fosfatos,
hidroxilas, além de proteínas (K
ieras
et al., 1977), pode ser quantitativamente
importante (Lombardi e Vieira, 1999), uma vez que consideráveis quantidades desses
compostos são produzidos nos ambientes aquáticos.
A importância ambiental dos exopolissacarídeos produzidos pelas microalgas
e
cianobactérias
tem sido demonstrada na literatura. Sua degradação pela microbiota foi
documentada por Colombo et al. (
2004
),
assim como sua contribuição como matriz para
a formação de agregados gelatinosos orgânicos (TEP) que, por sua vez, podem ser
uti
lizados como substrato alimentar por vários organismos (Cho e Azam, 1988).
Choueri
et al. (2007) demonstraram a utilização de exopolissacarídeos de cianobactérias
como fonte alimentar para cladóceros, aumentando a produção secundária e as taxas de
9
crescime
nto desses microcrustáceos filtradores
.
Além disso, os exopolissacarídeos são
importantes reguladores da disponibilidade de íons metálicos (Sigg et al., 1987;
Lombardi et al, 2002; 2007).
1.3
. B
IODISPONIBILIDADE E
TOXICIDADE
O impacto dos metais sobre os invertebrados aquáticos está ligado direta ou
indiretamente à interação entre o elemento químico e os organismos, sendo esta
interação fortemente dependente da especiação dos metais (Rainbow, 2002). De acordo
com Sigg e Behra (2005), a biodisponibilidade dos metais precisa ser discutida como
uma função dos complexos fortes e fracos na solução, sua solubilidade, precipitação,
co
-precipitação e/ou adsorção em superfícies. Para evidenciar a biodisponibilidade dos
metais, fatores como a estabilidade termodinâmica dos complexos e o resultado da
atividade dos íons livres, a labilidade cinética, o tamanho e as propriedades hidrofílicas
e hidrofóbicas dos complexos devem ser considerados (Sigg e Behra, 2005).
Adicionalmente, segundo Rainbow (2002), a captura dos metais é dependente de fatores
biológicos como as taxas de crescimento dos organismos e o metabolismo celular.
A biodisponibilidade ambiental é definida por Rand (1995) e Rainbow e
Darllinger (1993b) como o metal que está disponível para ser capturado pelos
organismos passando a fazer parte de seus processos metabólicos. Já a
biodisponibilidade toxicológica é definida como a fração da concentração do metal que
é absorvida e/ou adsorvida pelo organismo e, necessariamente, interage com receptores
e sítios fisiológicos fundamentais ao metabolismo do organismo, causando desse modo,
possíveis danos celulares.
Sabe
-se, por exemplo, que as mitocôndrias possuem enzimas e proteínas ligadas
às funções respiratórias, as quais ao se ligarem a metais, perdem sua eficiência na
10
conversão de energia e paralisam a fosforilação oxidativa, causando danos à célula
(Rand, 1995). Laws (2000) demonstrou que, em nível celular, há sítios de ligação de
metais que agem regulando a disponibilidade tanto dos metais essenciais, como também
dos não essenciais. Esses sítios, como a metalotionina (MT) e a fitoquelatina, e o
seqüestramento de metais em vesículas de membrana, tais como lisossomos secundários
e terciários, possuem as funções de estocar, transportar ou compartimentalizar os
metais
, evitando seus efeitos tóxicos. Deste modo, a toxicidade celular tem início após a
saturação desses sítios. A figura 04 ilustra possíveis interações dos metais com as
células.
Figura 04- Esquema representativo da interação entre os metais e uma célula: L= ligante complexante de
metal (M), L
L
= ligante lipofílico, L
h
= ligante hidrofílico, L
bio
= ligante biológico, int = metal internalizado.
Adaptado de Worms
et al
. (2006).
11
De acordo com Rainbow (2002), o acúmulo de metais por invertebrados
aquáticos
é definido como a captura do metal menos sua eliminação pelo organismo e
pode ser dividida em três fases:
i
) captura do metal;
ii
) transporte e distribuição do metal
no corpo e
iii
) excreção do metal. A interação desses processos define a estratégia de
acumulaç
ão do metal no invertebrado. Há uma fração de metais que pode ser
passivamente adsorvida ao exoesqueleto, a qual é excluída dos metais descritos como
acumulados, uma vez que não entram em processos metabólicos.
A quantidade de metais traços que pode ser acumulada nos invertebrados, varia
com o animal. Assim, uma concentração de metal traço que é considerada tipicamente
alta para algumas espécies, pode ser baixa para outras (Eisler, 1981; Phillips e
Rainbow,
1994). Portanto, sempre que um metal traço é capturado por um invertebrado aquático,
seja diretamente do meio aquático circundante ou através do alimento, seu destino
dentro do organismo irá variar de acordo com as características do animal e com a
biodisponibilidade do metal (Rainbow
e
Wang, 2001).
Rai
nbow (2002) descreve alguns modelos com as possíveis rotas dos metais
essenciais nos invertebrados aquáticos. São elas:
(a)
Regulação da concentração do metal no corpo do indivíduo, como mostrado na
figura 05, onde observa-se que a captura do metal ocorre na proporção em que este é
disponibilizado para o organismo. No entanto, uma quantidade equivalente de metal é
excretado. Assim, a concentração intracelular do metal no invertebrado permanece
constante ao longo da exposição.
12
(b)
Acumulação sem excreção, como mostrado na figura 06, onde observa-se que o
metal acumulado e estocado em compartimentos não tóxicos é a forma mais comum de
desintoxicação utilizada pelos invertebrados. No entanto, quando a capacidade de
estocar metal desses compartimentos é excedida, os organismos sofrem os efeitos
tóxicos, uma vez que não são excretados.
(c)
Acumulação com excreção, como mostrado na figura 07. Esse modelo pode
apresentar duas rotas, uma na qual o organismo regula a taxa de metal necessária dentro
de seu corpo até o momento em que a captura excede a capacidade de regulação e, a
partir de então, o metal é detoxificado ou excretado (Figura 7A), e a outra rota dá-
se
através da acumulação líquida do metal e o metal excretado é aquele que se encontra
detoxificado (Figura 7B
).
Figura 06-
Esquema representativo da
acumulação de metal sem excreção pelo
invertebrado. [U]= captura, [A]= metal
acumulado e disponível metabolicamente,
subdividido em metal requerido [A
R
] e metal
em excesso [A
E
]. [S]= metal estocado, [D]=
desintoxicado. Adaptado de Rainbow
(2002).
Figura 05-
Esquema representativo da
regulação de metal por invertebrados.
[U]=captura, [E]=excreção, [A]=metal
acumulado e disponível
metabolicamente. Este é subdividido
em metal requerido [A
R
] e metal em
excesso [A
E
]. Adaptado de Rainbow
(2002).
13
A
B
Figura 07- Esquema representativo da acumulação de metal com excreção pelo invertebrado. [U]=
captura, [E]= excreção, [A]= metal acumulado e disponível metabolicamente, no qual é subdividido em
metal requerido [A
R
] e metal em excesso [A
E
]. [S]=metal estocado, [D]=desintoxicado. Adaptado de
Rainbow (2002).
A transferência de metais traços na cadeia alimentar pode ser significante para os
invertebrados aquáticos, uma vez que é controlada não somente pela quantidade de
metal acumulado pelo alimento, mas também pelos processos fisiológicos e químicos
que compreendem a interação invertebrado
-
metal (Rainbow, 2002).
Os metais interferem no ciclo de vida dos organismos, podendo causar
modificações sobre a reprodução e sobre os processos fisiológicos normais, tais como
crescimento e desenvolvimento. Além disso, os metais influenciam o comportamento
dos organismos, tendo como conseqüência uma variedade de efeitos em relação às
interações biológicas (Bruland et al
.,1991
). Desta forma, as interferências irão afetar a
longevidade e dinâmica de populações (Rand,1995; Laws et al., 2000), podendo causar
desequilibro ecológico no ecossistema aquático.
A acumulação dos metais nos consumidores aquáticos está intrinsecamente liga
da
ao destino e efeito dos poluentes na cadeia alimentar e nos ciclos biogeoquímicos. As
14
informações geradas através dos estudos sobre estas interações podem contribuir para a
geração de procedimentos que visem o controle da contaminação, além de servir co
mo
subsídio para avaliação da amplitude dos riscos de uma contaminação ambiental
ocasionada por metais com suas possíveis conseqüências para biota e para a saúde
pública em geral.
15
2. OBJETIVO GERAL
A interferência da matéria orgânica dissolvida natural sobre a biodisponibilidade
e toxicidade de elementos metálicos para
a
biota é amplamente reconhecida (Morel
et
al
., 1991; Rainbow e Darlinger, 1993; Laws, 2000; Nogueira et al., 2005; Lombardi
et
al
., 2007). A maioria dos trabalhos relata uma redução significativa nos efeitos tóxicos
de metais quando complexados à MOD. No entanto, este efeito parece ser dependente
da natureza da MOD e dos organismos em questão, permanecendo incerto os efeitos do
metabolismo dos organismos heterotróficos sobre a MOD natural e sobre a
biodisponibilização de metais no ambiente aquático.
Assim, o objetivo principal deste trabalho foi verificar os efeitos da matéria
orgânica dissolvida natural (
substância
húmica e exopolissacarídeos de cianobactéria)
sobre a disponibilidade de um elemento metálico para microheterotróficos,
considerando
-se as reações fisiológicas e químicas relacionadas com a interação MOD –
METAL
– ORGANISMO. Para verificar tal interação, fez-se uso do elemento metálico
cobre, nutriente essencial requerido em quantidades traço e dotado de grande afinidade
por materiais orgânicos. Desse modo, a hipótese delineada para suportar esta pesquisa
foi a de que o metal, ainda que complexado à MOD, seja passível de ser
biodisponibilizado
para organismos de outros níveis tróficos através de processos
microheterotróficos sobre a MOD e o ambiente circundante, alterando a
disponibilização do elemento químico.
16
3. REFERÊNCIAS
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C
C
A
A
P
P
Í
Í
T
T
U
U
L
L
O
O
0
0
1
1
23
Especiação do cobre no reservatório do
M
onjolinho (São Carlos, SP)
2007
24
RESUM
O
Os metais traços estão naturalmente presentes nos ecossistemas aquáticos. A
forma ou espécie química em que o metal se encontra no ambiente relaciona-se aos seus
efeitos sobre a biota, biodisponibilidade e toxicidade. Esta parte da pesquisa teve como
objetivo verificar a especiação do cobre no reservatório do Monjolinho, local onde os
organismos foram obtidos. Além disso, avaliou-se a capacidade de complexação da
água do reservatório, quantificando-se a força de associação (K’) e a concentração de
sítios (CL) disponíveis para ligação com o cobre. Foram determ
in
adas as espécies de
cobre
livre, total dissolvido e total particulado. Os resultados mostraram que grande
parte do cobre encontra-se na forma particulada, e que praticamente todo o cobre
dissolvido encontra-se complexado. Através da titulação complexométri
ca
, dois ligantes
distintos foram detectados na água do reservatório, um mais forte
(
Log K’
1
= 6.6; CL
1
=
2.8x10
-6
mol.L
-1
) e outro mais fraco (Log K’
2
= 4.8; CL
2
= 6.2x10
-5
mol.L
-1
).
25
INTRODUÇÃO
Os ecossistemas de água doce superficiais são fundamentais para a humanidade,
atendendo
a
um amplo espectro de suas necessidades. No entanto, o aumento das
atividades antrópicas tem levado ao desequilíbrio desses ambientes, tornando-os cada
vez mais impróprios para sobrevivência de muitas espécies, e para os vários usos
necessários para a qualidade de vida humana (Nriagu, 1990).
O cobre é um elemento traço encontrado naturalmente no ambiente e essencial
aos seres vivos, uma vez que é requerido para o crescimento normal de plantas e
animais (Lewis e Cave, 1982). Isso se deve em grande parte à habilidade do cobre em
converter
-se entre os estados reduzido e oxidado, sendo assim usado como cofator em
um considerável número de atividades enzimáticas, como por exemplo, transferência e
transporte de elétrons. No entanto, em altas concentrações o cobre pode ser deletério à
biota aquática (Edding e Tala, 1996). Conseqüentemente, o funcionamento saudável das
células é dependente da perfeita regulação desse metal considerando seu transporte,
estocagem e distribuição den
tro da célula.
O impacto dos metais nos organismos aquáticos está relacionado à interação
entre o metal e os organismos, sendo esta interação controlada pela espécie química, ou
especiação, do metal (Leppard, 1983). Sabe-se que a biodisponibilidade dos me
tais
traços no ambiente é controlada pela presença de vários ligantes, os quais são capazes
de formar complexos com esses elementos (Sigg
e
Behra, 200
5
).
Os ligantes atuantes na especiação dos metais em ecossistemas aquáticos podem
apresenta
r grande diversidade, podendo ser orgânicos e/ou inorgânicos. Dentre os
ligantes orgânicos, pode-se citar as substâncias húmicas, compostos produzidos pelos
organismos (autóctones), compostos introduzidos na água por atividades
26
antropogênicas, macromoléculas e partículas coloidais, e ainda grupos funcionais
localizados na superfície dos organismos (Leppard, 1983; Sigg e Behra, 2005). Assim,
os metais são distribuídos nos ambientes aquáticos em formas dissociadas ou em
complexos com diferentes propriedades, tais como a estabilidade termodinâmica,
labilidade cinética e tamanho do composto.
O estudo da especiação dos metais traços nos ambientes aquáticos é importante
para o entendimento da reatividade, mobilidade, biodisponibilidade e principalmente
toxicidade dos metais para biota (Tessier e Turner, 1995; Nogueira et al., 2005;
Lombardi
et al., 2007), contribuindo para o conhecimento a respeito dos impactos
ecológicos dos metais sobre os ecossistemas aquáticos.
OBJETIVO
O objetivo principal deste
estudo
foi inferir sobre a especiação do cobre na água
do reservatório do Monjolinho, onde os organismos da pesquisa foram obtidos. Para
tanto,
foram delineados
os
seguintes
objetivos específicos:
» Determinar as concentrações de cobre livre, cobre total dissolvido e cobre particula
do
no reservatório Monjolinho;
» Determinar a constante de estabilidade condicional e a concentração de ligantes para o
cobre presentes no reservatório Monjolinho
,
através de titulações complexométricas.
MATERIAIS E MÉTODOS
1.
O
RESERVATÓRIO DO
M
ONJOLINHO
De acordo com Sé (1992), a bacia hidrográfica do rio Monjolinho é
caracterizada, na sua maior parte, por área rural com solo arenoso. No entanto, no trecho
do rio que antecede a represa do Monjolinho, pode-se distinguir duas áreas: uma
27
compreende a nascente, localizada em área rural com pastagens, sendo o leito do rio
preservado por mata ciliar, com ponto de captação de água para abastecimento ao
público; a segunda área possui uma ocupação sub-urbana (margem esquerda), além da
ocupação rural (margem direita)
.
O reservatório do Monjolinho é um ambiente eutrófico tropical, construído com
objetivo paisagístico em 1970 no campus da Universidade Federal de São Carlos, São
Carlos (47
53’W e 22
01’S), SP.
Segundo Nogueira e Matsumura-Tundisi (1996), o reservatório do Monjolinho
está localizado a uma altitude de 816 m, apresenta área superficial de 4,6 ha, volume de
73.251,0
m
3
, largura máxima de 150,0 m, comprimento máximo de 510,0
m,
profundidade máxima de 3,0 m, profundidade média de 1,54 m, área inundada de
47.15
7 m
3
, tempo de retenção no período de seca de 22,9 dias e tempo de retenção n
o
período de
chuva de 2,1 dias.
2.
E
SPECIAÇÃO DO COBRE N
O RESERVATÓRIO
M
ONJOLINHO
Três formas do metal cobre foram determinadas no presente estudo: íons cobre livre,
cobre total dissolvido e cobre total particulado. Para tanto, 50 mL de água coletada do
reservatório do Monjolinho foram filtradas em filtros de acetado de celulose com 0,45
m de diâmetro de poro previamente lavado com ácido
nítrico
(HNO
3
1,0 mol.L
-1
). O
filtrado foi separado para análise de íons cobre livre (30 mL) e cobre total dissolvido
(20 mL), enquanto que o filtro seguiu para análise de cobre total particulado. Três
réplicas deste procedimento foram realizadas no mês de outubro/2006.
O cobre livre (mol.L
-1
) foi determinado através da técnica de potenciometria,
usando
-se um eletrodo seletivo ao íon cobre (ANALION – SP, Brasil) em conjunto com
um eletrodo de referência de vidro de dupla junção Ag/AgCl (ANALION – SP, Brasil).
28
Para a quantificação foi utilizado um potenciômetro ANALION 2000. A força iônica
das amostras foi ajustada para 0,1 mol.L
-1
com NaNO
3
ultrapuro (MicroSelect, Fluka
Chemie). Sabe-se que a estabilidade na resposta do eletrodo seletivo varia com a
concentração do metal em solução (Lombardi et al., 2007) e, para uma concentração da
ordem de 10
-8
mol.L
-1
,
foi requerido um tempo de 4h para estabilização. Esse t
empo
diminui com o aumento da concentração de cobre. Todas as medições foram realizadas
em temperatura constante de 25
C.
O limite de detecção em técnicas potenciométricas pode restringir seu uso em
concentr
ações ambientalmente relevantes. No entanto, quando a calibração do
equipamento é realizada com tampões metálicos, estende-se o limite de detecção para
concentrações na faixa de 10
-
12
- 10
-
11
m
ol.L
-1
(Jardim et al., 1986; Lombardi et al.
,
2007). Um tampão metálico atua de maneira similar ao tampão de pH, como descrito a
seguir.
Em uma solução contendo o metal (M) e o ligante (L), um tampão metálico pode ser
formado desde que exista um excesso de ligantes e, assim, o metal iônico encontrar-
se
-
á
na forma de complexo ML (Eq. 1). Nesta situação, o metal pode ser tamponado da
mesma maneira que os íons de hidrogênio em tampões de pH,
M +
n
L
ML
n
(1)
com o início do equilíbrio expresso quantitativamente pela constante de estabilidade
apropriada
n
=
(ML
n
) (2)
(M)(L)
n
29
o qual pode ser escrito
pM = log
n
+
log(L)
n
(3)
(ML
n)
onde pM é o logaritmo negativo da atividade do metal livre análogo ao pH. A
similaridade entre pM e pH é maior para sistemas contendo metal e complexos na
proporção de 1:1 pois, na presença de excesso de ligantes e pH constante, a razão [L] :
[ML] não é significantemente alterada sob diluição e, ainda, através da Eq. 3, observa-
se que pM permanece essencialmente constante. Usando-se tampão metálico, as
espécies de metal livre variam com a função da razão metal : metal - ligante, assim
como com pH, desde que a protonação do metal não seja afetada (Perrin e Dempsey,
1979).
No presente estudo, foi usado um tampão metálico para confecção da curva de
calibração. A solução de tampão metálico usada foi composta de cobre, NTA (ácido
nitril
o triacético) e um ajustador da força iônica (NaNO
3
) para trabalhar com coeficiente
de atividade fixo. O tampão metálico foi preparado como descrito em Jardim et al
.
(1986) e a curva de calibração obtida é mostrada na figura 01. O limite de detecção do
aparelho estendeu
-
se para 10
-
12
mol.L
-1
de cobre livre.
30
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-50
0
50
100
150
200
ISE-Calibração
Regressão linear
Y = A + B * X
A = 312,49937
B = 30,5478
R = 0,99999
Potencial (mV)
log[Cu
++
]
Figura 01- Exemplo da regressão linear resultante da curva de calibração do ISE com uso do tampão
metálico. O potencial de leitura do aparelho (mV) é plotado em função do log da concentração de cobre
livre (M).
Cobre total dissolvido (mol.L
-1
) inclui todas as espécies de cobre não retidas pelo
filtro, quer seja íon livre, ligado a compostos orgânicos ou inorgânicos. Neste trabalho,
as determinações de cobre total dissolvido foram realizadas em espectrofotômetro de
absorção atômica com auxílio de forno de grafite (VARIAN, Spectra A.A 220,
Austrália), após terem sido fixadas com HNO
3
em uma concentração final de 2,0 mol.L
-
1
.
Para a determinação do cobre total particulado, os filtros de acetado usados no
processo de filtração foram previamente numerados e pesados em balança
microanalítica com legibilidade de 1 µg (Sartorius MC21S, Alemanha). Posteriormente,
esses filtros contendo todo o material particulado retido no processo de filtração, foram
colocados em estufa a uma temperatura de 60 °C por 48 h para secagem do material e
determinação do peso seco (PS). Assim, cobre total particulado é reportado como
µgCu.µgPS
-1
.
Em seguida, o material particulado sofreu processo de digestão ácida
31
adicionando
-se 2 mL de HNO
3
concentrado e tran
sferindo
-o para uma estufa a 90
C
onde permaneceram por 48 h, seguindo a metodologia descrita por
Lores
et al. (
1999).
Após digestão, o volume da amostra foi completado para 50 mL com água deionizada e
seguiu para determinação em espectrofotômetro de absorção atômica com auxílio de
forno de grafite. A curva de calibração do espectro de absorção atômica é mostrada na
figura 02.
0 1 2 3 4
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
EAA - Calibração
Regresão linear
Y = A + B * X
A = -0,01038
B = 0,00949
R = 0,99997
Absorbância (U.A.)
Cobre Total (x 10
-7
mol. L
-1
)
Figura 02- Exemplo da curva de calibração do espectro de absorção atômica a partir de uma regressão
linear onde a concentração de cobre total é plotada em função da leitura de absorbância do aparelho.
3. C
OMPLEXAÇÃO DO COBRE
NO RESERVATÓRIO
M
ONJOLINHO
As propriedades de complexação da água do reservatório do Monjolinho em
relação ao cobre foram obtidas em amostras filtradas através de filtros de acetato de
celulose com 0,45 m de diâmetro de poro previamente lavados com HNO
3
1,0 mol.L
-1
.
As amostras foram submetidas ao processo de titulação complexométrica através da
adição de solução padrão de cobre (1 mg.
mL
-1
CuCl
2
, Titrisol, Merck) em
concentrações crescentes do metal. A força iônica foi mantida constante através da
32
adição de NaNO
3
(MicroSelect, Fluka) em concentração final de 1x10
-1
mol.L
-1
. O pH
foi mantido constante utilizando-se o tampão orgânico PIPES (sal disódio hidratado,
98%, Aldrich) em concentração final de 7,5x10
-
3
mol.L
-1
. A concentração total de
ligantes (CL) e a constante de estabilidade condicional (K’) foram obtidas analisando-
se
a curva de titulação através do Modelo de Scatchard (Scatchard et al, 1957), onde a
concentração do metal ligado (ML) dividido pela concentração do metal iônico (M
2+
) é
plotado como uma função de ML. Como resultado desse tratamento ma
temático,
quando mais de um sítio de ligação está presente, uma curva côncava é obtida. Quando
há apenas um sítio presente, uma reta é obtida.
RESULTADOS
As concentrações das três espécies de cobre determinadas no reservatório do
Monjolinho são apresentadas na Tabela 01. Os resultados mostram que grande parte do
cobre encontra-se na forma particulada (8,1x10
-
3
µgCu. µgPS
-1
), enquanto que na forma
dissolvida foram encontrados 4,8x10
-8
mol.L
-1
, cerca de 100 vezes mais do que a
concentração de íons cobre liv
re (5,1x10
-
10
mol.L
-1
).
Tabela 01- Valores das concentrações das formas químicas de cobre (cobre livre, total
dissolvido, total particulado) determinadas na água do reservatório do Monjolinho. Na última linha da
tabela é apresentado o valor médio
+
o desvi
o padrão.
Cu
2+
(mol.L
-1
)
Cu Total dissolvido
(mol.L
-1
)
Cu Total particulado
(
gCu.
gPS
-1
)
4,3x 10
-
10
5,3x10
-8
6,2x10
-3
5,9x10
-
10
5,1x10
-8
9,6x10
-3
5,1x10
-
10
3,9x10
-8
8,5x10
-3
5,1x10
-
10
+
8x10
-
11
4,8x10
-8
+
7,6x10
-9
8,1x10
-3
+
1,7x10
-3
33
Na figura 03, pode-se visualizar os resultados da titulação complexométrica da
água com o cobre (Fig. 3A), assim como a análise de Scatchard (Fig. 3B). O gráfico
mostra duas classes de ligantes, uma com ligantes mais fortes, Log K’
1
= 6,6 em
concentração de CL
1
= 2,
8x10
-6
mol.L
-1
. Os ligantes mais fracos foram encontrados em
concentração de CL
2
= 6,
2x10
-5
mol.L
-
1
e com força de associação Log K’
2
= 4,
8,
portanto apresentando menor afinidade para o cobre.
140
120
100
80
pCu
-7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5
Log [Cu total]
10
8
6
4
CuL/Cu
2+
30x10
-6
252015
10
50
CuL
Figura 03-
Capacidade de complexação da água do reservatório do Monjolinho. A = Curva de titulação
complexométrica com cobre, obtida a partir da água do reservatório; B = Modelo de Scatchard
obtido a partir
dos dados da curva de titulação. Parâmetros obtidos: Log K’1 = 6.6 CL1 = 2.8x10
-6
mol.L
-1
; Log K’2 = 4.8 CL2
= 6.2x10
-5
mol.L
-1
.
34
DISCUSSÃO
A especiação dos metais em ambientes aquáticos possui grande influência na
biodisponibilidade desses elementos (Sigg e Behra, 2005) e conseqüentemente em sua
toxicidade. As formas em que um metal se encontra no ambiente podem ser física
(particulado e dissolvido) e qui
micamente fracionada
s (livres ou complexados).
A distribuição dos metais entre as formas particuladas e dissolvidas é regulada
por fatores físicos e químicos da água, pela atividade biótica e pelas propriedades do
próprio elemento (Leppard, 1983). No presente trabalho, a concentração de metal
particulado
(8,1x10
-3
+
1,7x10
-3
) foi superior ao dissolvido (
4,8x10
-8
+
7,6x10
-9
)
.
Segundo Sigg et al. (1995) os metais traços ligados à partículas abióticas são removidos
da coluna d´água através da sedimentação. Neste estudo, as amostras de água foram
coletadas na superfície da região mais profunda do reservatório, em um período com
ausência de chuvas e pouca variação de temperatura. Estas características dão
estabilidade à dinâmica de movimentação das águas no referido reservatório. Seguindo
discutido por Sigg et al. (1995), podemos considerar que a maior contribuição para os
valores de metal particulado neste estudo foi de origem biótica.
Além do cobre ser um metal essencial requerido em diminutas quantidades pela
biota, de acordo com Rand (1995), a proporção entre a razão da concentração do metal
na biota em relação ao seu habitat é sempre maior que 1, fazendo com que os metais
sejam acumulados e biomagnificados na cadeia trófica. Os resultados apresentados aqui
estão de acordo com estudos relacionados com análises sobre concentrações de metais
em vários compartimentos ambientais (Blanchard et al.1999; Wastras et al. 1998; Twiss
et al., 1996). Blanchard et al. (1999), estudando o impacto das atividades industriais e
urbanas do rio Sena, verificaram que a biota continha uma concentração de cobre 40 x
maior do que a encontrada na água. Wastras et al. (1998), ao estudarem a
35
biomagnificação do mercúrio ao longo de uma cadeia alimentar aquática observaram
que uma concentração maior de mercúrio foi encontrado na biota (47 x maior) em
relação à fração dissolvida. Twiss et al. (1996) verificaram que, no lago Erie, tanto a
concentração de zinco quanto a de cádmio estavam presentes em valores mais elevados
na biota (> 70 %) do que na forma dissol
vida.
Dependendo da concentração e
do
grau de complexação, os metais essenciais
podem tanto limitar o crescimento dos organismos quanto causar toxicidade (Meylan
et
al
., 2004; Rainbow, 2000). Para o entendimento da dinâmica desses elementos nos
ambientes aquáticos é importante a determinação da habilidade dos ambientes em
complexar o metal. Em relação à toxicidade, a força dos ligantes assim como sua
concentração têm grande significado, uma vez que ligações fracas são ineficientes em
reduzir a toxicidade. Deste modo, esses dois parâmetros, a constante de estabilidade
(relacionada com a força de associação) e a concentração de ligantes determinam a
capacidade complexante de uma amostra de água (Jin
e
Gogan, 2000).
A capacidade complexante da água do reservató
rio
do
Monjolinho foi
determinada através da titulação complexométrica na qual verificou-se duas classes de
ligantes, onde a constante de estabilidade correspondente a associações mais fortes
(logK’
1
= 6.6) apresentou concentração de ligantes CL
1
= 2.8x10
-6
mol.L
-1
, ou seja,
superior à concentração de cobre total dissolvido (4,8x10
-8
+
7,6x10
-9
).
Considerando a
equação (4), demonstra-se que praticamente todo o cobre dissolvido (4.7x10
-8
mol.L
-1
)
enco
ntra
-
se na forma de complexos orgânicos e/ou inorgânicos
.
CuTC = CuTD
–
CuL
(4)
o
nde:
36
CuTC = cobre total complexado; CuTD = cobre total dissolvido; CuL = íons cobre
livre
.
No reservatório
do
Monjolinho, cerca de 98,9% do cobre total dissolvido foi
encontrado na forma complexada, enquanto que somente 1,1% do cobre total dissolvido
foi encontrado na forma iônica livre. Estes resultados estão de acordo com outros da
literatura, que mostram que em ambientes naturais, a especiação do cobre é dominada
pela formação de complexos (Achterberg et al., 1997; Hellebu
sch
et al., 2003, Mylon et
al., 2003; Meylan et al., 2004).
Achterberg
et al. (1997) ob
serva
ram que 94% do cobre
no lago Esthwaite encontrava-se complexado por ligantes naturais. Similarmente,
Hullebusch
et al. (2003), ao estudarem a especiação do cobre no reservatório Sant
German Les Belles, verificaram que de 84 a 99% do cobre encontrava-se na forma
complexada. Mylon et al. (2003), encontr
aram
no lago de Connecticut (Hannonasset) o
mesmo comportamento, onde somente 8,8% do cobre estavam na forma iônica. O
mesmo foi verificado no lago Suíço Greifen, por Meylan et al. (2004), onde 99,9% do
cobre dissolvido estava
complexado.
A complexação do cobre nos ecossistemas aquáticos pode ocorrer através de
elementos inorgânicos e compostos orgânicos (Sigg e Behra, 2005). No entanto, são os
compostos orgânicos os de maior importância na complexação desse elemento (
Apte
et
al
., 2000; Jin e Gogan, 2000; Kaiser, 2002; Unsworth et al., 2006), principalmente em
ambientes eutrofizados (Xue et al., 2004; Gouvêa et al., 2005) onde a atividade do
fitoplâncton pode ser ele
vada.
Apte
et al. (2000), ao estudarem os com
plexos
dissolvidos de cobre, demonstraram que a destruição da matéria orgânica das amostras
através de luz UV, resultou em perda da capacidade complexante dessas amostras,
confirmando que a complexação do cobre estava mais associada a ligantes orgânicos do
que aos inorgânicos.
37
Através do estudo da capacidade complexante do cobre em águas naturais, Jin e
Gogan (2000) demonstraram que a existência de complexos com alta constante de
estabilidade condicional (log k’
1
= 15,68 - 18,25) para cobre devia-se a comp
ostos
orgânicos.
Xu
et al. (2004), ao estudarem a especiação de cobre em alguns lagos da
Suíça
, concluíram que este metal é fortemente complexado por ligantes orgânicos
produzidos provavelmente por processos biológicos, como indicado pela variação
sazonal
nos lagos eutróficos e pela relação entre a complexação do cobre e a atividade
algal nesses ambientes. Esses autores encontraram a constante de estabilidade com
associações mais fortes para o lago Greifen de Log K’
1
= 14,5, para o lago Sempach de
Log K’
1
= 1
5,5 e para o lago Lucerne de K’
1
= 13,0.
Gouvêa
et al. (2005) encontraram correlação entre os ligantes de cobre e a
matéria orgânica dissolvida excretada por cianobactérias (log K
1
= 9,2 – 9,5) e a MOD
isolada da água de um reservatório eutrofizado (log K
1
= 8,6 – 8,8), indicando que as
fortes associações do cobre em ambientes eutrofizados podem ser devid
as
principalmente aos polissacarídeos excretados pelo fitoplâncton.
Unsworth
et al. (2006), ao detectarem as espécies de cobre no lago Greifen e no
rio Wyre, através das técnicas de filme de gradiente difuso (DGT) e voltametria com gel
integrado ao microeletrodo, observaram que 99% do cobre dissolvido do rio Wyre
estava complexado aos ácidos fúlvios, e que mais do que 99% do cobre dissolvido do
lago Greifen e
stava ligado às substâncias húmicas.
Os valores de constante de estabilidade condicional (K’) obtidos pelos autores
citados acima são superiores àqueles encontrados no presente estudo. Isto pode ser
devido ao fato de que os ambientes aquáticos possuem uma variedade de ligantes com
diferentes características. Além disso, essas variáveis são dependentes do méto
do usado,
da composição da água e do tratamento dos dados (Jin e Gogan, 2000), uma vez que os
38
valores de K’ obtidos são relacionados à amplitude de concentração do metal utilizada
na titulação complexométrica.
A determinação da concentração total de um metal no ambiente não é suficiente
para predizer seus efeitos tóxicos. A importância da determinação da especiação dos
metais no ambiente refere-se principalmente à necessidade de avaliar-se o impacto
ambiental desses elementos. Ainda, para a correta interpretação do destino e impacto
ambiental dos metais e seus complexos, é necessário considerar a importância do fluxo
e reatividade dos compostos, além das trocas dos metais entre o ambiente e a biota (van
Leeuwen
et al., 2005). Assim, as análises da dinâmica de especiação de metais em
ecossistemas aquáticos podem ser consideradas um dos passos para a tomada de base ao
desenvolvimento de modelos de biodisponibilidade e de estratégias de gerenciamento
dos riscos ambientais.
39
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____________________________________________________________
C
C
A
A
P
P
Í
Í
T
T
U
U
L
L
O
O
0
0
2
2
45
Efeito da degradação bacteriana sobre a fluorescência da matéria orgânica dissolvida
natural
2007
46
RESUMO
A matéria orgânica dissolvida (MOD) natural é importante em ambientes
aquáticos. Seu fluxo nas cadeias tróficas é dependente das características físicas e
químicas de suas moléculas constituintes. Sua concentração nos ecossistemas é
dependente das taxas de entrada e de sua degradação por organismos heterotróficos,
além da degradação fotoquímica. Esta pesquisa avaliou a degradação da MOD natural
(substância húmica) por bactérias heterotróficas. A espectroscopia de fluorescência
(espectros de emissão e excitação sincronizada) foi utilizada para a caracterização da
MOD e acompanhamento do processo de degradação. Em experimentos contendo uma
solução de 15 mg.L
-1
de MOD natural, foi inoculada uma população natural de bactérias
e, em intervalos de tempo regulares (0, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 168 h), as amostras foram
retiradas para o acompanhamento do crescimento das bactérias, através de absorbância
(540 nm), e caracterização fluorimétrica da MOD. Os resultados demonstraram que as
bactérias cresceram durante o tempo de incubação e usaram a MOD como substrato,
fato este comprovado através das mudanças na intensidade de fluorescência e
deslocamento dos máximos de emissão.
47
INTRODUÇÃO
Nos ambientes aquáticos há dois tipos principais de matéria orgânica natural:
biomassa e matéria abiótica (Wetzel, 2001). Dentre a matéria a biótica estão
compreendidas a matéria orgânica particulada (MOP) e a matéria orgânica dissolvida
(MOD) (Müster e Chróst, 1990), as quais servem como recurso alimentar e energia para
os organismos dos ambientes aquáticos (Pomeroy, 1984). A MOD é a fração
predominante da matéria orgânica total presente nesses ambientes (Müster e Chróst,
1990), podendo ter origem de recursos alóctones e/ou autóctones. É formada por uma
mistura complexa de compostos orgânicos, cada qual com uma composição elementar,
massa molecular e propriedades físicas e químicas únicas (Perdue e Ritchie, 2003). A
MOD natural dos ecossistemas aquáticos inclui aminoácidos livres, peptídeos,
proteínas, carboidratos, ácidos carboxílicos, ácidos nucléicos e substâncias húmicas
(Thomas, 1997).
O fluxo de matéria orgânica em lagos é dominado pela sua produção
fotossintética e subseqüente transformação e decomposição por organismos
heterotróficos (Azam, 1983). De 10 a 50 % do carbono orgânico fotossintético é
transformado em biomassa bacteriana (Larsson e Hagström, 1982, Sondergaard et al.,
1988), canalizado para a cadeia alimentar denominada alça microbiana e,
posteriormente, transferido para níveis tróficos superiores. Assim, há evidências de que,
em ambientes aquáticos, as bactérias podem ocupar o primeiro nível trófico
(Overbeck,1975; Azam, 1983).
Devido ao fato de a MOD ser um importante recurso para as bactérias
heterotróficas, esses organismos são dependentes tanto da sua composição quanto de
sua quantidade (Chróst et al., 1989). Segundo Müster e Chróst (1990), há três teorias
tróficas sobre a utilização da MOD por bactérias heterotróficas: (a) a primeira relata que
48
parte da MOD capturada é rapidamente utilizada e resulta em um aumento da taxa de
crescimento e biomassa bacteriana (a MOD é usada como substrato para a produção
secundária bacteriana); (b) a segunda propõe que a MOD é utilizada em taxas baixas e é
suficiente somente para manter a sobrevivência das bactérias (isso decorre do baixo
grau de assimilação das estruturas poliméricas pelas bactérias ou ainda pela baixa
produção de substratos orgânicos pelas bactérias); (c) a terceira teoria propõe que alguns
compostos orgânicos não podem ser utilizados sozinhos para a produção e manutenção
das bactérias, necessitando de outros para serem metabolizados.
Uma vez que a ciclagem da MOD via bactérias é regulada por sua qualidade e
quantidade (Kirchman et al., 2001; Pullin et al., 2004), a forma química da MOD
influencia seu destino e a taxa na qual é consumida e transformada dentro de uma
cadeia trófica (Carlson et al.,1998). Os estudos das características bioquímicas da MOD
são complexos devido às dificuldades em se concentrar a MOD para análises e
facilidade de contaminação das amostras (Mopper et al., 1996). No entanto, as
propriedades ópticas da MOD, como sua fluorescência, podem fornecer informações
significativas sobre sua composição em concentrações naturais. Sem a necessidade de
concentração do material, há uma redução significativa dos riscos de contaminação da
amostra. A espectroscopia de fluorescência na modalidade excitação sincronizada é
particularmente sensível e pode ser usada em estudos de fracionamento ou degradação
da MOD (Mayer et al., 1999). Na espectroscopia de fluorescência, alterações do
comprimento de onda de máxima emissão são devidas tanto à presença de diferentes
constituintes, como também à diferentes origens. Assim, a fluorescência da MOD pode
ser usada como um traçador entre ecossistemas diferentes, distinguindo MOD de
origens distintas (Lombardi e Jardim, 1999; McKnight et al., 2001; Sierra et al., 2005).
49
Devido à grande importância ambiental da MOD nos ecossistemas aquáticos,
estudos que visam o entendimento da interação MOD-organismo-ambiente fornecem
informações importantes para o conhecimento e gerenciamento de ecossistemas
aquáticos, principalmente no que se refere a dinâmica de metais traços.
OBJETIVO
O principal objetivo deste trabalho foi demonstrar a utilização da MOD por
bactérias heterotróficas utilizando-se a fluorescência de emissão e excitação
sincronizada antes e após o contato da MOD com as bactérias.
MATERIAIS E MÉTODOS
1. A MATÉRIA ORGÂNICA DISSOLVIDA NATURAL
Os experimentos de laboratório foram conduzidos utilizando-se matéria orgânica
dissolvida natural em uma concentração de 15 mg L
-1
. O material orgânico (Suwannee
River NOM – RO isolation) foi adquirido através da Sociedade Internacional de
Substâncias Húmicas (IHSS). De acordo com a IHSS, a composição elementar da
matéria orgânica dissolvida natural, assim como seus grupos funcionais ácidos, estão
presentes nas seguintes proporções: 52,47% de carbono, 4,19% de hidrogênio, 42,69%
de oxigênio, 1,10% de nitrogênio, 0,65% de enxofre e 0,02% de fósforo. Segundo
Thurman (1985), em águas continentais, a concentração de MOD encontra-se em um
limite entre 1 - 15 mg C.L
-1
, sendo que concentrações de MOD na faixa de 10 - 15
mg.L
-1
são características de ambientes eutrofizados.
50
2. CRESCIMENTO POPULACIONAL BACTERIANO
Os experimentos foram efetuados utilizando-se água reconstituída (APHA,
1998), tendo como base água bi-destilada em vidro. A água foi autoclavada a 120 ºC
por 30 min. para esterilização e, posteriormente, foi adicionada a matéria orgânica
dissolvida natural em uma concentração de 15 mg.L
-1
.
Para o inóculo da bactéria, foi coletada água do ambiente natural (Reservatório
do Monjolinho) em três réplicas de 500 mL. Esta foi primeiramente filtrada em filtro
GF\C (Whatman) para retirada de predadores e, posteriormente, filtrada em filtros com
poros de 0,2 µm (Gelman GA-8) para retenção das bactérias. O filtro com a população
bacteriana foi inoculado em água reconstituída (500 mL) contendo a matéria orgânica
natural (15 mg.L
-1
). Durante o experimento, a comunidade bacterioplanctônica foi
mantida em sala com temperatura controlada de 25 ºC + 2, no escuro e sob agitação
constante (60 – 100 rpm) (Tranvik e Sieburth, 1989) em mesa agitadora (Nova Ética,
modelo 109, Brasil).
O crescimento populacional bacteriano foi acompanhado através da
determinação da turbidez da amostra em espectrofotômetro (Shimadzu, Japão) em
comprimento de onda de 540 nm. Para tanto, em tempos distintos de incubação (0, 24 h,
48 h, 72 h, 96 h e 168 h), foram retiradas alíquotas de 5 mL, homogeneizadas e
analisadas no espectrofotômetro. Como a solução de MOD apresenta coloração
ligeiramente amarelada, foi realizada uma varredura para a escolha do comprimento de
onda na qual a interferência da MOD fosse minimizada durante as leituras de
absorbância para a quantificação do crescimento populacional bacteriano. Além disso,
uma solução de MOD (10 mg.L
-1
) sem bactéria foi usada para calibrar o
espectrofotômetro.
51
Durante o período de incubação, toda manipulação das amostras foi realizada em
fluxo laminar (Pachane, Brasil) dotado de luz ultravioleta para minimizar
contaminações.
3. UTILIZAÇÃO DA MOD PELA POPULAÇÃO BACTERIANA
Para acompanhar a degradação bacteriana da MOD, determinações através de
espectroscopia de fluorescência foram realizadas durante o período experimental. Para
tanto, utilizou-se um espectrofluorímetro (Jasco 6500) dotado de lâmpada de xenônio de
150 W para excitação da amostra. Monocromadores foram usados para seleção do
comprimento de onda de emissão e de excitação, sendo que os comprimentos de 5 nm e
10 nm foram escolhidos para emissão e excitação, respectivamente.
O espectro de emissão é produzido através do registro da intensidade de luz
emitida em função de seu comprimento de onda, com excitação realizada em um
comprimento de onda fixo. Neste trabalho, os espectros de emissão foram registrados
em uma amplitude de comprimento de onda entre 370 nm a 600 nm para excitação fixa
em 350 nm, e amplitude de registro de emissão de 470 nm a 600 nm para excitação fixa
em 450 nm.
O espectro de excitação sincronizada é uma combinação dos espectros de
excitação e emissão, resultando em um espectro mais estruturado. A varredura
simultânea da excitação e emissão foi realizada em uma amplitude de comprimento de
onda de 300 a 600 nm. A diferença entre os comprimentos de onda de excitação e
emissão (δ = 18 nm) foi mantida constante. Todo o procedimento experimental utilizado
para as determinações de fluorescência encontra-se descritos em Lombardi e Jardim
(1997, 1999).
52
Os comprimentos de onda usados neste trabalho para caracterizar a matéria
orgânica dissolvida natural durante o processo de degradação são típicos de estudos de
fluorescência de substâncias húmicas (Lombardi e Jardim,1999; Belzile, 2006; Misic,
2006).
Alíquotas de 5 mL foram retiradas das culturas em períodos de tempo regulares
(0, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h) e filtradas em membranas de 0,2 μm (Gelman GA-8). Uma
vez que o pH influencia na fluorescência da MOD (Saadi et al., 2006), este foi
monitorado durante o experimento e permaneceu constante entre 6,7-7,0. De acordo
com Pegau et al. (1997), a absorção de luz por soluções aquosas é dependente da
temperatura, assim tomou-se o cuidado de aclimatar as amostras com a temperatura da
sala (19 °C) onde a fluorescência foi detectada. O experimento foi realizado com três
réplicas. A estabilidade e perfeito funcionamento do espectrofluorímetro foi verificada a
cada dia de leitura através do pico Raman utilizando-se água deionizada.
A calibração do espectrofluorímetro foi realizada através da emissão de
fluorescência dos espectros sincronizado (Fig. 01) e de emissão (Fig. 02), este com
ex
fixo em 350 nm e λ
ex
450 nm utilizando-se concentrações de carbono orgânico
dissolvido referentes às concentrações de MOD de 5, 10, 15 e 20 mg.L
-1
(Fig. 03). O
carbono orgânico total dissolvido foi determinado nas amostras da calibração após
terem sido filtradas em membranas de 0,2 μm de abertura de poro (Gelman GA-8) e
guardadas em frascos de vidro lavados em ácido clorídrico a 20% e deixados em mufla
por 2h a 550 ºC para eliminar qualquer contaminação por matéria orgânica. As
determinações foram realizadas utilizando-se um analisador de carbono (TOC-5000
Shimadzu - Japão).
53
24681012
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Intensidade (U.A.)
Carbono orgânico dissolvido (mg.L
-1
)
Sincronizado (450,0 nm)
Y = A + B * X
A= 0,27535
B= 0,37278
R= 0,996
24681012
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Intensidade (U.A.)
Carbono orgânico dissolvido (mg. L
-1
)
Sincronizado (540,0 nm)
Y = A + B * X
A= 0,15237
B= 0,46102
R= 0,978
Figura 01- Calibração do espectrofluorímetro entre as concentrações do carbono orgânico dissolvido e a
intensidade de fluorescência do espectro sincronizado para os picos detectados em 450,0 nm e 540,0 nm.
24681012
20
24
28
32
36
Intensidade (U.A.)
Carbono orgânico dissolvido (mg.L
-1
)
Em 350 (451,8 nm)
Y = A + B * X
A= 4,5279
B= 2,706
R= 0,981
24681012
2
4
6
8
10
Intensidade (U.A.)
Carbono orgânico dissolvido (mg.L
-1
)
Em 450 (520,0 nm)
Y = A + B * X
A= -0,10112
B= 0,82118
R= 0,9915
Figura 02- Calibração do espectrofluorímetro entre as concentrações do carbono orgânico dissolvido e a
intensidade de fluorescência dos espectros de emissão excitados em 350 nm e 450 nm com máximos de
emissão detectados em 451,8 nm e 520,0 nm, respectivamente.
54
5 1015202530
4
6
8
10
12
14
16
Carbono orgânico (mg.L
-1
)
Concentração de MOD (mg.L
-1
)
y=1,75133+0,4564.X
r= 0,99976
Figura 03- Reta proveniente da regressão linear onde o carbono orgânico (mg. L
-1
) foi plotado em função
da concentração nominal de MOD (5, 10, 15, 20, 25 e 30 mg. L
-1
).
RESULTADOS
O aumento da população bacteriana pode ser visualizado na figura 04. Pode-se
perceber que ocorreu um crescimento em 24 h de incubação, seguido de uma
estabilização (24-72 h) e, após esse tempo, as bactérias voltaram a apresentar
crescimento (72-168 h).
Inicial24487296168
0
1
2
3
4
5
Absorbância (U.A.) x 1000
Tempo (h)
Figura 04- Aumento populacional bacteriano detectado através de absorbância (540 nm) em
função do tempo.
55
A caracterização da degradação da MOD pode ser visualizada na figura 05
através dos espectros sincronizado e de emissão nos tempos inicial, 24 h e 168 h.
300 400 500 600
0
5
10
15
20
Intensidade (U.A.)
Comprimento de onda (nm)
Sincronizado
400 450 500 550 600
0
5
10
15
20
25
30
35
Intensidade (U.A.)
Comprimento de onda (nm)
Emissão (ex350)
500 550 600
0
2
4
6
8
10
Intensidade (U.A.)
Comprimento de onda (nm)
Emissão (ex450)
Figura 05- Espectros sincronizado e de emissão com excitação a 350 nm e 450 nm, detectados
nos tempos (_.._) Inicial, (___) 24 h, e (......) 168 h durante a degradação bacteriana sobre a MOD.
56
Na tabela 01 apresenta-se a localização de todos os picos com suas respectivas
intensidades de fluorescência. Deve ser considerado um deslocamento de +10 nm no
comprimento de onda de máxima emissão dos picos como erro de leitura para amostras
de MOD.
Tabela 01- Valores de comprimento de onda (nm) e intensidade (I) de fluorescência (U.A) dos espectros
sincronizado e emissão (λ
ex
350 e λ
ex
450) durante a degradação da MOD em cada tempo (t) experimental
amostrado. Os valores representam a média e desvio padrão de três replicas. Os valores destacados em
negrito representam os picos que apareceram durante a incubação.
a
) pico e intensidade encontrados
somente na réplica A,
b
) pico e intensidade encontrados somente na réplica B,
c
) pico e intensidade
encontrados somente na réplica C.
t 0 t 24 h t 48 h t 72 h t 96 h t 168 h
nm I (U.A) nm I (U.A) nm I (U.A) nm I (U.A) nm I (U.A) nm I (U.A)
Sincronizado
417,9
b
5,85
b
329,5
b
1,81
b
426,1
c
5,56
c
450,3
+ 0,0
3,53
+ 0,0
450,9
+ 2,3
7,31
+ 0,7
450,2
+ 1,7
5,80
+ 0,5
447,8
+ 5,9
5,76
+ 0,4
451,2
b
5,66
b
427,5
a
6,76
a
548,1
+ 0,0
7,12
+ 0,0
465,0
a
7,92
a
540,4
+ 1,0
7,11
+ 0,9
539,7
+ 1,0
6,93
+ 0,6
497,1
a
6,50
a
450,9
+ 0,9
7,28
+ 0,3
496,4
a
7,16
a
587,8
+ 1,8
7,82
+ 1,6
587,7
+ 0,1
7,35
+ 0,8
532,1
+ 11,6
6,52
+ 0,5
541,3
+ 6,3
8,55
+ 1,6
541,1
+
0,4
7,85
+ 1,8
587,5
+
0,6
8,50
+ 1,0
587,5
+ 0,4
6,97
+ 1,0
582,2
+ 4,8
10,0
+ 3,2
Em (
λ
ex
350)
451,8
+
0,0
29,18
+ 0,0
451,3
+0,4
26,69
+ 0,1
451,5
+ 0,1
27,44
+ 0,7
451,5
+ 0,1
28,52
+ 0,7
451,4
+ 0,3
28,18
+ 1,1
451,1
+ 0.1
31,0
+1,2
473
+ 0,0
28,37
+ 0,0
473
+ 0,0
25,78
+ 0,1
473
+ 0,0
26,42
+ 0,6
473
+ 0,0
27,46
+ 0.6
473
+ 0,0
27,10
+ 0,1
473
+ 0,0
28,97
+ 0,1
499,9
b
31,06
b
Em (
λ
ex
450)
520,6+
0,0
7,05
+ 0,0
521,8+
7,5
6,59
+ 0,1
518,2+
0,5
6,64
+ 0,2
517,8+
3,8
6,80
+ 0,1
518,5
+ 0,0
6,45
+ 0,3
518,1+
0,8
7,23 + 0,2
0,39
c
57
Em relação ao espectro sincronizado, pode-se observar a existência de dois picos
localizados em 450,0 (Intensidade = 3,53 A.U.) e 548,0 nm (Intensidade = 7,12 U.A.).
Esses picos se mantiveram durante todo o experimento. No entanto, um aumento na
intensidade de fluorescência ao final da incubação foi observado nos dois picos, sendo
mais pronunciada no pico localizado em 450,0 nm (Intensidade = 7,28). À partir de 24 h
de incubação houve o aparecimento de um pico localizado em 587,5 nm (Intensidade =
8,5) em todas as réplicas experimentais, o qual permaneceu com intensidade
praticamente constante durante 96 h de incubação. Em 168 h, esse pico teve sua
intensidade aumentada (Intensidade = 10).
Durante o período experimental, alguns picos apareceram somente em uma das
réplicas experimentais. Para a réplica A, esses picos se localizaram em 465,0 nm em 24
h, 496,0 nm em 24 h e 96 h, 427,5 nm em 168 h. Para réplica B, os picos foram
encontrados em 417,9 nm em 24 h, 329,5 nm em 72 h. Na réplica C, o pico foi
encontrado em 426,0 nm em 96 h.
Nos espectros de emissão excitados em 350 nm e 450 nm, os picos não
apresentaram deslocamento em relação ao comprimento de onda durante a incubação. A
intensidade de fluorescência teve uma diminuição ao início da incubação (24 h), após a
qual permaneceu constante, até que em 168 h a intensidade de fluorescência atingiu
valores pouco superiores em relação ao inicial. Exceção ocorreu na réplica C, onde a
intensidade chegou próxima de zero em 168 h de incubação no espectro de emissão
excitado em 450 nm. Na réplica B, houve o desaparecimento do pico localizado em 473
nm detectado no espectro de emissão com λ
ex
fixo em 350 nm. Novo pico surgiu no
mesmo espectro, em 499,9 nm.
58
DISCUSSÃO
O crescimento populacional bacteriano observado na figura 04 sugere que a
população bacteriana utilizou a MOD como recurso de carbono, apesar desta ser
considerada de difícil degradação. Estudos em ambientes aquáticos relacionados à
dinâmica da MOD são unânimes em concluir que a MOD lábil é mais importante que a
refratária para sustentar a produção bacteriana (Moran e Hodson,1990; Ellis et al.,
2000). De acordo com Moran e Hodson (1990), a fração lábil da MOD suporta quatro
vezes mais a produção secundária das bactérias do que as substâncias húmicas do
mesmo ambiente. Ainda, Ellis et al. (2000) mostraram que o crescimento microbiano
foi menor utilizando-se ácido húmico em relação a aminoácidos e carboidratos. No
entanto, Tranvik e Sieburth (1989) demonstraram que as substâncias húmicas podem ser
degradadas pela população bacteriana. Estudos recentes que combinam análises
moleculares de comunidades microbianas com a caracterização da MOD chamaram a
atenção para generalização dos pesquisadores em relação aos microorganismos que
predominantemente metabolizam a fração lábil da MOD (Wehr et al.,1999; Eiler et al.,
2003; Docherty et al.,2006). De acordo com Eiler et al. (2003), o peso molecular da
MOD pode ter menos relação com a produtividade do que a capacidade metabólica da
comunidade bacteriana. Esses autores verificaram que o crescimento da população
bacteriana em lagos húmicos foi limitado pela concentração da MOD e não por sua
massa molecular. Adicionalmente, Wehr et al. (1999) ao estudarem o metabolismo
bacteriano observaram que as comunidades microbianas se diferenciavam em relação às
diferentes concentrações de carbono. Docherty et al. (2006) verificaram uma grande
interação entre concentração e composição química da MOD e a composição e atividade
da comunidade bacteriana. Esses autores, ao acompanharem a biodegradação de MOD
de várias massas moleculares, concluíram que as comunidades microbianas crescem
59
sobre uma variedade de MOD possuindo versatilidade no ajuste ao novo recurso de
carbono do ambiente. Além disso, esses autores demonstraram que as bactérias
consomem MOD de alta massa molecular, geralmente consideradas refratárias. Assim, a
MOD pode ser considerada como um importante recurso em ecossistemas aquáticos.
Devido à sua importância ambiental, cresce a necessidade de caracterização da
MOD. Assim, muitas análises químicas e físicas (ex: absorção de luz, concentração de
carbono orgânico, aromaticidade, fluorescência, fracionamento e massa molecular,
dentre outros) estão sendo utilizadas para esse fim. Na MOD estão incluídas moléculas
orgânicas com cromóforos (absorvem luz) e fluoróforos (emitem luz), de modo que a
espectroscopia de fluorescência tem sido usada como recurso para investigar a
composição química da MOD devido à sua habilidade em distinguir diferenças
estruturais na MOD, ser uma técnica não destrutiva e limpa (não há necessidade de pré-
concentração da amostra) (Lombardi, 1995). Essa técnica possui alta resolução óptica
(Baker, 2001), onde a fluorescência em diferentes regiões espectrais está associada com
diferentes tipos de grupos funcionais (Sharpless et al.,1999).
Os resultados desta pesquisa concordam com outros da literatura (Lombardi,
1995; Hayakawa et al., 2003) que mostram a existência de linearidade entre a
intensidade de emissão de fluorescência e a concentração de carbono orgânico
dissolvido. Destes resultados, conclui-se que há uma relação diretamente proporcional
entre fluoróforos e carbono orgânico na MOD.
Os grupos de fluorescência contidos na MOD são representados pelos ácidos
fúlvicos, húmicos e proteínas (Senesi et al., 1991; Yamashita e Tanoue, 2003, Leenheer
e Croué, 2003). De acordo com a classificação de Leenheer e Croué (2003), a
fluorescência entre 420-480 nm/300-350 nm e 380-480/250-260 nm (λem/λex) está
associada com material húmico, enquanto que a fluorescência compreendida entre os
60
comprimentos de onda de 300-350 nm/ 270-280 nm (λem/λex) está relacionada com a
presença de proteínas na estrutura da MOD. Outros estudos também demonstram que os
picos de fluorescência na faixa entre λex/λem 340–350 nm/420–450 nm de lagos e rios
são devidos às substâncias húmicas (Senesi et al. 1991; Coble 1996, Suzuki et al. 1998,
Yoshioka et al., 2002). Esses picos são similares aos encontrados neste trabalho,
indicando a natureza húmica da MOD usada.
O surgimento de novos máximos de emissão de fluorescência durante a
degradação microbiana da MOD, assim como as diferenças em suas intensidades são o
resultado da modificação na estrutura e composição da matéria orgânica dissolvida
pelas bactérias. Como na MOD há uma grande variedade de fluoróforos, cujos sinais
fluorimétricos se sobrepõem, mediante o processo de degradação, fluoróforos distintos
são degradados e assim, outros fluoróforos que já estavam presentes na MOD passam a
ser detectados. Este processo é análogo àquele observado através da complexação
diferencial com metais paramagnéticos (Lombardi e Jardim, 1997).
A variação na intensidade de fluorescência dos picos de emissão da MOD
durante o processo de degradação observado neste estudo está de acordo com outros da
literatura. De modo similar, Saadi et al. (2006), ao estudarem a biodegradação da MOD
de um efluente, verificaram que a intensidade de fluorescência mudou durante a
biodegradação, no entanto os picos permaneceram estáveis no mesmo comprimento de
onda. Esses autores concluíram que a redução da fluorescência é uma indicação, ou da
degradação do material fluorescente, ou do aparecimento de novas moléculas orgânicas.
Estas seriam formadas através do processo de degradação e capazes de diminuir o sinal
de fluorescência da MOD. Assim, a degradação bacteriana da MOD pode resultar em
aumento da fluorescência, através da formação de novo material fluorescente ou ainda
61
através da degradação de grupos e/ou elementos químicos que ocasionavam redução do
sinal fluorescente.
Outros autores também verificaram mudanças nos espectros de fluorescência da
MOD devido à sua biodegradação (Mayer et al.,1999; Ogawa et al., 2001; Misic et al.,
2006). Mayer et al. (1999) comprovou a utilização da MOD por atividade heterotrófica
através do sinal fluorescente, verificando a liberação de moléculas de proteínas durante
a biodegradação. Ainda, de acordo com Misic et al. (2002), a lise de proteínas através
da enzima bacteriana, leucina aminopeptidase, contribui para a liberação de
aminoácidos da molécula orgânica. Similar aos nossos resultados, Misic et al. (2006)
mostraram, através da variação na fluorescência da MOD, que bactérias da Antártica
(Terra Nova), foram capazes de capturar e degradar a MOD. Esses autores
demonstraram que a maior parte do desaparecimento da MOD fluorescente ocorreu
devido ao ataque microbiano, e que somente 7% do desaparecimento da MOD foi
devido à fotodegradação. Ogawa et al. (2001) reportaram sobre a produção de MOD
refratária a partir de compostos lábeis, como glicose e glutamato, por bactérias
marinhas. Os autores chamam a atenção ao fato de que um aumento parcial da
fluorescência associada com a formação de nova MOD pode ser mascarado pela
degradação de outros constituintes fluorescentes.
Assim, através dos resultados deste trabalho, pode-se concluir que as bactérias
heterotróficas possuem habilidade em usar a matéria orgânica dissolvida natural de
origem mais refratária como substrato alimentar, influenciando na dinâmica de carbono,
micronutrientes e poluentes associados à este tipo de MOD.
62
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C
C
A
A
P
P
Í
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T
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U
L
L
O
O
0
0
3
3
71
Influência de microheterótrofos na dinâmica do cobre complexado à matéria orgânica
dissolvida (MOD)
2007
72
RESUMO
A introdução de metais traços no ambiente aquático pode produzir modificações
nas comunidades microbianas e em suas atividades. Por sua vez, essas modificações
irão influenciar a dinâmica e destino desses elementos na cadeia trófica aquática. Sabe-
se que uma considerável diversidade de bactérias heterotróficas possui mecanismos
fisiológicos capazes de conferir resistência aos metais potencialmente tóxicos.
Consequentemente, tais organismos suportam concentrações relativamente elevadas de
metal no meio. Este estudo investigou a resposta de uma população natural de bactérias
à contaminação por cobre. Inicialmente a tolerância bacteriana ao metal foi testada
utilizando-se três concentrações de cobre (10
-5
, 10
-6
e 10
-7
mol.L
-1
). Posteriormente os
organismos foram expostos a uma concentração de cobre total dissolvido de 10
-6
mol.L
-
1
, e foi realizado um estudo de especiação do metal no meio (cobre total dissolvido e
íons cobre livre) e da compartimentalização do cobre nas bactérias (cobre total
internalizado ou absorvido e cobre total adsorvido) durante o crescimento dos
microorganismos. Os resultados mostraram que as bactérias foram resistentes ao cobre
em uma concentração de 10
-6
mol.L
-1
. Ainda, uma oscilação sincronizada entre cobre
absorvido, adsorvido e cobre total dissolvido ocorreu durante o período de
experimentação, sugerindo a existência de um mecanismo pelo qual a população
bacteriana libera cobre ao meio externo, conferindo-lhe resistência ao metal.
73
INTRODUÇÃO
A concentração de metais no ambiente é decorrente de processos naturais e
antrópicos. No entanto, são as atividades antrópicas, principalmente as industriais, que
mais contribuem para o desequilíbrio desses elementos nos ecossistemas (Nriagu,
1990). O cobre, por exemplo, é um metal essencial à sobrevivência dos organismos, no
entanto em altas concentrações pode causar danos à célula (Edding e Tala, 1996),
desestabilizando comunidades biológicas (Hassen et al., 1998).
Em ecossistemas aquáticos, as bactérias heterotróficas são fundamentais aos
processos de regeneração de nutrientes e transferência trófica de carbono (Münster e
Chróst, 1990; Twiss et al., 1996), podendo afetar o destino de diversos elementos. No
caso dos metais, esta influência ocorre principalmente devido aos processos de captura,
e\ou liberação (Ford e Mitchell, 1990), o que pode afetar a distribuição desses
elementos no ecossistema e consequentemente sua relação com o restante da biota. A
partir dos mecanismos de defesa desses organismos, os metais podem ser acumulados
ou disponibilizados novamente para o meio através de processos como o efluxo. Assim,
através desses organismos os metais podem ser biodisponibilizados e biomagnificados
ao longo da cadeia trófica (Mansouri-Aliabadi e Sharp, 1985; Lores e Pennock, 1999;
Lores et al., 1999; Miranda e Rojas, 2006; Worms et al., 2006).
As bactérias heterotróficas são afetadas pela descarga de metais no ambiente
tanto através do contato com a fração ligada do metal, como também ao metal livre e/ou
lábil (Silver, 1996; Miranda e Rojas, 2006). Esta dupla exposição ocorre principalmente
pela degradação de materiais orgânicos dissolvidos, normalmente agentes complexantes
de metais e utilizados como fonte energética pelas bactérias (Sherr e Sherr, 1988; Azam
et al., 1983; Pomeroy, 1974; Silver e Phung, 2005), ou pela adsorção desses complexos
em sua parede celular (Campbell et al., 1997). Os metais traços e seus complexos
74
podem difundir-se do meio externo para a superfície dos organismos e, dada a natureza
dinâmica dos complexos, estes podem sofrer associações e dissociações quando na
superfície celular (Worms et al., 2006).
A matéria orgânica dissolvida (MOD) é a fração predominante da matéria
orgânica total presente em águas naturais (Azam et al., 1983), podendo seqüestrar e/ou
liberar íons para o ambiente (Lombardi e Jardim, 1997; Lombardi et al.,1997; de
Oliveira et al., 1995), atuando de maneira diversificada e dinâmica sobre a especiação e
conseqüentemente sobre a biodisponibilidade dos metais nos ecossistemas aquáticos
(Lombardi et al., 2002; Nogueira et al., 2005; Lombardi et al., 2007).
Como conseqüência da exposição aos metais, as bactérias desenvolveram
mecanismos de resistência, dentre elas pode-se citar o acúmulo intracelular de metal
através do seu seqüestro por moléculas quelantes, impedindo-os de atingir sítios vitais,
associação com a parede celular, mecanismos de volatilização do metal (Ford e
Mitchell, 1990; Bosecker, 1997; Gordon et al., 2000; Markwiese e Colberg, 2000), e
ainda o efluxo de metal (Rosen, 1996; White et al., 1997; Mirimanoff e Wilkinson,
2000; Franke et al., 2003; Resing e Grass, 2003; Bertinato e Abbé, 2004).
Um estudo sobre a resistência de metais pesados em Ralstonia metallidurans
(linhagem CH34) efetuado por Nies (2003) mostrou que o efluxo é um dos mecanismos
utilizados por estas bactérias para conferir-lhes uma maior resistência aos metais. Várias
pesquisas em nível molecular vêm sendo realizadas para esclarecimento dos
mecanismos celulares que participam desse processo. Sabe-se que três famílias de
proteínas atuam no mecanismo (Rosen, 1996; Grass e Resing, 2001; Resing et al., 2003;
Outten et al., 2001; Nies, 2003; Kittleson et al., 2006). São elas, (i) proteínas da
superfamília RND, responsáveis pela resistência, nodulação e divisão celular e
envolvidas no transporte de metais e compostos hidrofóbicos, (ii) proteínas de fusão de
75
membrana (MFB), também designadas como proteínas de efluxo periplasmático, e
finalmente (iii) proteínas da membrana externa (OMF). Esses três grupos de proteínas
fazem parte do sistema Cus que juntamente com proteínas do “tipo P” da família das
ATPases (CopA e CopB) podem exportar os metais do citoplasma, da membrana
citoplasmática ou do periplasma através da membrana externa do interior para o exterior
da célula. No entanto, os mecanismos envolvendo o transporte de fora para dentro das
células bcterianas não estão totalmente elucidados. Sabe-se somente que os metais
dissolvidos no meio ligam-se às proteínas da membrana e são transportados para o
interior das células, onde então se unem a diversos ligantes (Rainbow, 2002).
De acordo com Outten et al. (2001), o complexo Cus é induzido pela presença
de cobre, onde em condições aeróbicas o sistema CueR (CuCFBA) entra em atuação
juntamente com as proteínas CopA e CueO. A CueO é uma proteína oxidase localizada
no periplasma. A proteína CopA transporta Cu
+
do citoplasma para o periplasma e,
neste local o cobre reage com algumas moléculas para formar Cu
2+
. A molécula que
doou elétron para o cobre fica então danificada. Neste momento, a proteína CueO entra
em ação, reduzindo e repararando a molécula danificada. Este processo é ilustrado na
figura 01.
76
Figura 01 – Mecanismo de efluxo de cobre estudado em duas bactérias: Escherichia coli e Enterococcus
hirae. Retirado de Silver e Phung (2005).
Os mecanismos envolvidos na resistência bacteriana apresentam grande
importância ecológica e vários estudos em nível genético e de biologia celular têm sido
desenvolvidos para elucidar os processos celulares envolvidos nessa resistência
(Mirimanoff e Wilkinson 2000; Nies, 2003; Franke et al., 2003; Resing e Grass, 2003;
Bertinato e Abbé, 2004, Silver e Phung, 2005). No entanto, estudos com enfoque sobre
a dinâmica ambiental de metais resultante do metabolismo microbiano são raros
(Mirmanoff e Wilkinson, 2000; Croot et al., 2003).
Esta pesquisa se distingue por enfocar o metabolismo de uma população
heterotrófica em relação ao ambiente externo, onde a única fonte de cobre é através do
complexo MOD-Cu, mostrando a dinâmica desse elemento resultante da interação
MOD-Cu-organismo.
77
OBJETIVO
O objetivo principal deste trabalho foi verificar a influência de uma população
de bactérias sobre a dinâmica do cobre complexado à matéria orgânica dissolvida
(MOD).
MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos em água de cultivo preparada com água
reconstituída (APHA, 1995) e autoclavada (120 °C, 30 min.). A esta água reconstituída
foram acrescidos a matéria orgânica dissolvida (MOD - Suwannee River Natural
Organic Matter) comercialmente disponível através da Sociedade Internacional de
Substâncias Húmicas em uma concentração final de 10 mg.L
-1
. A escolha da
concentração de MOD baseou-se no fato de que de acordo com Thurman (1985), em
águas continentais, a concentração de MOD encontra-se em um limite entre 1 - 15 mg
C.L
-1
, sendo que concentrações de MOD na faixa de 10 - 15 mg.L
-1
são características
de ambientes eutrofizados. A solução de MOD empregada equivale a aproximadamente
7.0 mg.L
-1
de carbono orgânico total (TOC), determinada usando-se um analisador de
carbono orgânico (TOC-5000 Analyzer, Shimadzu, Japan). Três réplicas experimentais
foram realizadas e no presente trabalho, a água contendo a MOD será chamada de
solução de trabalho.
A população bacteriana foi obtida através de filtração seqüencial de uma amostra
de água coletada no Reservatório do Monjolinho. Para tanto, foram utilizados filtros
previamente autoclavados (120 °C, 30 min.) e lavados em HNO
3
1,0 mol.L
-1
por 24 h.
Primeiramente a água foi filtrada em filtro GF\C com poros de 1,2 µm (Whatman) para
remoção de predadores, e posteriormente filtrada em filtros com poro de 0,2 µm
78
(Gelman GA-8) para retenção das bactérias. Todo esse procedimento foi realizado em
condições assépticas sob fluxo laminar, dotado de luz ultravioleta.
1. RESISTÊNCIA BACTERIANA AO COBRE
As concentrações de cobre nominais selecionadas (10
-7
, 10
-6
e 10
-5
mol. L
-1
)
escolhidas para exposição das bactérias foram baseadas no teste de resistência
bacteriana ao cobre por Thompson e Waltling (1983). Como efeito de toxicidade
considerou-se a inibição do crescimento desses organismos (Mills, 2002) sob uma
determinada concentração de cobre. O controle foi constituído da solução de trabalho
sem adição de cobre. Todos os tratamentos foram realizados com três réplicas.
Análises de cobre total foram realizadas antes do inóculo de bactérias retirando-
se 10 mL de amostra, a qual foi acidificada com HNO
3
(1 mol.L
-1
) e posteriormente o
cobre foi determinado em espectrofotômetro de absorção atômica em forno de grafite
(VARIAN, Spectra A.A 220, Austrália).
Os filtros contendo a população bacteriana foram inoculados em frasco de
policarbonato com capacidade de 1000 mL, contendo 200 mL da solução de trabalho e
as concentrações variadas de cobre a partir de uma solução estoque de concentração 1
mg.mL
-1
(CuCl
2
Titrisol, Merck). Os frascos contendo a população bacterioplanctônica
foram mantidos em sala com temperatura controlada de 25 ºC +
2, no escuro e sob
agitação constante (60 – 100 rpm) (Tranvik e Sieburth, 1989) em mesa agitadora (Nova
Ética, modelo 109, Brasil). O crescimento populacional bacteriano foi acompanhado
diariamente através de leitura em espectrofotômetro (Shimadzu, Japão) a 540 nm (Lores
et al., 1999).
Todo o procedimento foi realizado em fluxo laminar (Pachane, Brasil) dotado de
luz ultravioleta para minimizar contaminações.
79
2. INFLUÊNCIA DA POPULAÇÃO BACTERIANA SOBRE A DINÂMICA DE COBRE
Após a filtração seqüencial, os filtros contendo a população bacteriana foram
inoculados em frascos de policarbonato com capacidade de 1000 mL contendo um
volume de 700 mL de solução de trabalho e uma concentração total final de cobre de 10
-
6
mol.L
-1
(CuCl
2
, Titrisol, Merck). Em seguida, os frascos experimentais foram
colocados em mesa agitadora (60-100 rpm, Nova Ética, Brazil), em sala climatizada a
uma temperatura de 25 °C ± 2 no escuro, seguindo o procedimento descrito em Tranvik
e Sieburth (1989). Amostras foram retiradas em intervalos regulares de tempo: 0, 0,16
h, 0,5 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h e 72 h, para determinações da densidade
bacteriana e das concentrações de cobre nas formas livre, cobre total dissolvido, cobre
adsorvido na superfície da célula bacteriana e cobre total particulado.
O crescimento populacional bacteriano foi acompanhado através de leitura em
espectrofotômetro (Shimadzu, Japão) a 540 nm (Lores et al., 1999). No entanto, para
reportar as concentrações de cobre adsorvido e internalizado em número de células,
estas foram contadas em microscópio de fluorescência seguindo a metodologia de Jones
(1979). A preparação das lâminas foram feitas seguindo o protocolo sugerido por Porter
e Feig (1980).
Para as determinações do cobre em suas várias formas, alíquotas de 50 mL foram
filtradas em filtros de 0,2 μm (Gelman GA-8) previamente autoclavados (120 °C, 30
min.) e lavados com HNO
3
1.0 mol.L
-1
. Do filtrado foram separadas duas alíquotas: 10
mL foi acidificado com HNO
3
em concentração final de 2.0 mol.L
-1
para determinação
de cobre total dissolvido e 40 mL teve sua força iônica ajustada para 0,1 mol.L
-1
com
NaNO
3
e seguiu imediatamente para quantificação do cobre livre.
80
Para obtenção do cobre adsorvido na superfície celular, as células retidas durante o
processo de filtração em cada tempo experimental foram ressuspendidas em 5 mL de
solução quelante constituída de EDTA (etilenodiamina acida tetraacética) em
concentração de 0,01 mol.L
-1
e pH 7.0, por 30 s (Miramanoff e Wilkinson, 2000).
Posteriormente o volume foi ajustado com água deionizada para 50 mL, onde a
concentração final de EDTA foi de 2.0x10
-2
mol.L
-1
. A amostra foi novamente filtrada
em filtros de 0,2 μm de diâmetro de poro (Gelman GA-8) previamente autoclavados
(120 °C, 30 min.) e lavados com HNO
3
1.0 mol.L
-1
. O filtrado (solução quelante mais
45 mL de água deionizada) foi acidificado para uma concentração final de 2 mol.L
-1
com HNO
3.
O filtro contendo as bactérias foi usado para determinação de cobre
intracelular e submetido à digestão ácida adicionando-se sobre os mesmos 2 mL de
HNO
3
concentrado, e posteriormente transferidos para uma estufa a 90°C, onde
permaneceram por 48 h. Após a digestão, o volume da amostra foi ajustado para 50 mL
com água deionizada. As concentrações de cobre total dissolvido e cobre intracelular
foram determinadas através de espectrofotômetro de absorção atômica com forno de
grafite (AAS-GF) utilizando-se um equipamento Varian AA220, (Mulgrave, Vic.,
Australia).
O cobre livre foi determinado através da técnica de potenciometria, usando-se
eletrodo seletivo ao íon cobre (ISE). O tempo de equilíbrio foi determinado de acordo
com a resposta do eletrodo, que variou com a concentração do metal na amostra. Quanto
menor a concentração de cobre, maior foi o tempo requerido para estabilização do
eletrodo. O eletrodo seletivo ao íon cobre (ANALION) foi utilizado conjuntamente com
um eletrodo de referência Ag/AgCl (ANALION) de dupla junção. A temperatura de 25
o
C foi mantida constante durante as leituras das amostras.
81
Para aumentar o limite de detecção do ISE, foi feito uso de tampões metálicos de
modo que foi possível estender o limite de detecção do sistema para 10
-12
mol.L
-1
de
cobre livre. A metodologia seguiu procedimento descrito em Jardim et al. (1986) e
modificado por Lombardi et al. (2007).
RESULTADOS
O teste de resistência bacterioplanctônica pode ser visualizado na figura 02,
onde se observa que a concentração de 7,0x10
-6
mol.L
-1
de cobre total causou inibição
do crescimento nas bactérias após 225h de incubação, e que o maior crescimento
populacional bacteriano, detectado no final da incubação, ocorreu na concentração de
1,7x10
-6
mol. L
-1
. No tratamento controle, não foi observado crescimento até 125 h de
incubação, onde a partir de então a população bacteriana apresentou crescimento
comparado ao do tratamento com adição de 1,8 x10
-7
mol.L
-1
de cobre.
O crescimento populacional bacteriano no teste de dinâmica de cobre é
apresentado na figura 03, mostrando que em 72 h ocorreu crescimento em todos as
réplicas (A, B e C) experimentais. Sendo que na réplica C, em 4 h de incubação,
percebe-se um aumento do crescimento seguido de decréscimo, onde á partir de então a
população começa a apresentar novo crescimento.
82
Figura 02- Absorbância da cultura bacteriana em 540 nm em função do tempo experimental. Teste de
resistência bacterioplanctônica verificado através da curva de crescimento dos microorganismos. Os
símbolos representam as várias concentrações de cobre testadas.
00,160,52 4 6 12244872 --
3
4
5
6
7
8
9
10
Absorbância (U.A.) x 1000
Tempo (h)
A
B
C
Figura 03- Crescimento populacional bacteriano no experimento com concentração de cobre de 1x10
-6
mol.L
-1
, detectado através de espectroscopia de absorção em 540 nm, onde a absorbância é plotada em
função do tempo experimental, nas três réplicas experimentais (A, B, C).
0 50 100 150 200 250
0
4
8
12
16
20
Absorbância (U.A.) x 1000
Tempo (h)
Controle
1,8x10
-7
mol.L
-1
1,7x10
-6
mol.L
-1
7,0x10
-6
mol.L
-1
83
A dinâmica do cobre durante o crescimento populacional bacteriano é mostrada
nas figuras 04 (cobre adsorvido), figura 05 (cobre livre), figura 06 (cobre intracelular) e
figura 07 (cobre total dissolvido).
00,160,52 4 6 12244872 --
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
Cobre adsorvido (x 10
-8
μg Cu. Cel
-1
)
Tempo (h)
A
B
C
Figura 04- Concentração de cobre adsorvido em função do tempo experimental nas três réplicas
experimentais (A, B, C).
0 0,16 0,5 2 4 6 12 24 48 --
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
Cobre Livre (x 10
-7
mol.L
-1
)
Tempo (h)
A
B
C
Figura 05- Concentração de cobre livre em função do tempo experimental nas três réplicas experimentais
(A, B, C).
84
-- 00,160,52 4 6 12244872 --
0
1
2
3
4
5
6
Cobre intracelular (x 10
-8
μg Cu. Cel
-1
)
Tempo (h)
A
B
C
Figura 06- Concentração de cobre intracelular em função do tempo experimental nas três réplicas
experimentais (A, B, C).
00,160,52 4 6 12244872 --
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Cobre total dissolvido (x10
-6
mol.L
-1
)
Tempo (h)
A
B
C
Figura 07- Concentração de cobre total dissolvido em função do tempo experimental nas três réplicas
experimentais (A, B, C).
A figura 04 mostra que a adsorção do cobre na superfície celular deu-se ao início
do experimento nas amostras B e C (1,2x10
-8
μgCu.Cel
-1
), como pode ser visualizado na
figura 04. Na amostra A ocorreu uma diminuição da adsorção de cobre (9,7x10
-9
→
7,4x10
-9
μgCu.Cel
-1
) com aumento simultâneo do metal internalizado (6,5x10
-9
→
85
5,9x10
-8
μgCu.Cel
-1
) (fig. 06). Na figura 05 observa-se que em 2h de incubação, em
todas as réplicas experimentais (A, B, C), houve um aumento da concentração de cobre
livre (A= 4,2x10
-8
→ 2,1x10
-7
mol.L
-1
; B= 2,4x10
-8
→ 1,1x10
-7
mol.L
-1
; C= 2,6x10
-8
→
5,7x10
-8
mol.L
-1
), precedido por uma redução do cobre adsorvido nas bactérias (A=
9,2x10
-9
→ 6,1x10
-9
μgCu.Cel
-1
; B= 9,1x10
-9
→ 7,0x10
-9
μgCu.Cel
-1
; C= 9,4x10
-9
→
3,0x10
-9
μgCu.Cel
-1
). Posteriormente, em 6 horas experimentais, um novo aumento na
concentração de cobre adsorvido (A= 1,3x10
-8
μgCu.Cel
-1
; B= 1,7x10
-8
μgCu.Cel
-1
; C=
1,5x10
-8
μgCu.Cel
-1
) pode ser observado na figura 04, seguido de aumento da
concentração de cobre intracelular ( A= 12 h → 4,6x10
-9
μgCu.Cel
-1
; B= 48 h →
1,0x10
-8
μgCu.Cel
-1
; C= 24 h → 3,9x10
-8
μgCu.Cel
-1
) (figura 06) e diminuição do cobre
livre em todas as réplicas experimentais. A concentração de cobre total dissolvido
permaneceu praticamente constante durante todo o período experimental, como
observado na figura 07.
DISCUSSÃO
O maior crescimento populacional bacteriano ocorrido nos tratamentos com
concentração de cobre de 1,7x10
-6
mol.L
-1
indica a tolerância desses organismos ao
metal, fato que é confirmado por resultados da literatura (Hassen et al., 1998;
Mirimanoff e Wilkinson, 2000; Solioz et al., 2003; Remonsellez et al.,2006). Hassen et
al. (1998) encontrou tolerância bacteriana ao cobre total em concentrações de até 8x10
-4
mol.L
-1
. Mirimanoff e Wilkinson (2000) verificou tolerância ao zinco e cádmio por
bactérias gram-positivas. Esses autores verificaram que Rhodococcus opacus foi
resistente ao zinco e cádmio nas concentrações de 5x10
-6
mol.L
-1
. Solioz et al. (2003) ao
estudarem a homeostase do cobre em Enterococcus hirae, observaram que esses
organismos eram resistentes ao cobre em uma concentração total de 10
-6
mol.L
-1
.
86
Remonsellez et al. (2006) registrou tolerância ao cobre em concentração de 2x10
-6
mol.L
-1
de cobre total pela bactéria Sulfolobus metallicus.
Vários são os mecanismos adotados pelas bactérias para tolerar altas
concentrações de metal no meio (Worms, 2006). No presente trabalho, a detecção do
cobre em suas várias formas durante o crescimento populacional bacteriano, mostra que
o efluxo de metal para o meio externo foi um mecanismo de resistência empregado
pelas bactérias durante o tempo de incubação. Neste processo, observa-se um aumento
do cobre adsorvido seguido de uma diminuição, ao mesmo tempo em que se observa
aumento da concentração de cobre intracelular ou de cobre livre no meio. Isto indica
que o metal aderido à parede celular das bactérias pode se tornar tanto intracelular como
também liberado de volta ao meio. As concentrações de cobre total dissolvido no meio
indicam que as bactérias estão excretando concentrações semelhantes de cobre
capturado, permanecendo a nível intracelular somente o suficiente para o bom
funcionamento celular.
O comportamento de efluxo pelas bactérias tem sido descrito na literatura (Croot
et al., 1999; Mirimanoff e Wilkinson, 2000; Gregor et al., 2005; Adle et al., 2007).
Croot et al. (1999) verificaram o efluxo de cobre por uma cianobactéria marinha,
Synechococcus. Mirimanoff e Wilkinson (2000) estudaram a regulação de zinco e
cádmio por Rhodococcus opacus (bactéria gram-positiva) e também verificaram que
esses organismos utilizam o efluxo como estratégia de regulação de metais. Adle et al.
(2007) verificaram o efluxo de cádmio pela levedura Saccharomyces cerevisiae, e
Gregor et al. (2005) verificaram que Cupriviadus metallidurans possui mecanismos de
efluxo de níquel quando este penetra no periplasma.
Existem duas maneiras de captura de metal complexado à MOD pelas bactérias:
além da biodisponibilização do metal através da degradação bacteriana sobre a MOD
87
contaminada, há o processo de adsorção da MOD na parede celular das bactérias
(Campbell et al., 1997), o que pode levar ao aumento da captura de metais, aderidos à
MOD, por esses organismos (Pempkowiak et al.,1994, Penttinem et al. 1995; Worms,
2006).
No presente trabalho, após a captura do metal complexado a MOD, as bactérias
liberaram íons cobre ao meio como resultado do processo de efluxo, sendo detectado
um aumento da concentração dessa forma de metal em 2h de incubação em relação à
concentração inicial.
A captura de metais pelos organismos está associada a sua labilidade (Köster e
van Leeuwen, 2004), tornando assim, o tempo de difusão através da parede celular um
processo importante nos sistemas ambientais. De acordo com van Leeuwen et al.
(2005), o coeficiente de difusão efetiva do metal complexado a substâncias orgânicas é
menor do que o do metal livre. Deste modo, o metal na forma iônica além de se difundir
com maior velocidade através de membranas biológicas está apto para se interagir com
macromoléculas no interior das células. Isso faz com que o metal livre seja a forma de
maior toxicidade e biodisponibilidade (Nogueira et al., 2005), pois os organismos que
não utilizam a MOD como recurso alimentar não terão acesso ao metal complexado a
ela.
Os metais traços essenciais são precisamente regulados pelos organismos, seja
em ambientes com deficiência ou excesso do metal. Uma vez que os complexos de
metais são as formas predominantes desses elementos nos ambientes aquáticos (> 90
%), assume grande importância ecológica a determinação quantitativa da contribuição
desses complexos para os processos de captura biológica dos metais (Worms, 2006).
Neste estudo, os resultados demonstraram que o cobre complexado à MOD pode
ser capturado e biodisponibilizado novamente para o meio na forma livre e de maior
88
toxicidade, pela população bacteriana, através do efluxo desses elementos para fora da
célula. No entanto, existem outros organismos que possuem capacidade de excretar os
metais na forma de complexos, tal como a microalga Thalassiosira sp estudada por Lee
et al. (1996). Esses estudos, assim como o presente trabalho, demonstram que
organismos unicelulares como bactérias e microalgas são capazes de modificar a
especiação química dos metais através da excreção desses elementos complexados ou
livres, interferindo assim na sua disponibilização para outros organismos aquáticos.
Assim. Deste modo, os processos resultantes da interação entre bactérias e metais
complexados são importantes para o entendimento da dinâmica desses elementos nos
ambientes aquáticos e suas conseqüências para biota em geral.
89
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____________________________________________________________
C
C
A
A
P
P
Í
Í
T
T
U
U
L
L
O
O
0
0
4
4
99
Influência da degradação da matéria orgânica dissolvida natural na biodisponibilização
do cobre em uma cadeia alimentar aquática
2007
100
RESUMO
A introdução de metais em ambientes aquáticos através das atividades antrópicas
pode levar à bioacumulação e magnificação desses elementos em cadeias tróficas e,
conseqüentemente, à toxicidade para a biota. Tanto a biodisponibilidade quanto a
toxicidade dos metais nos ambientes aquáticos sofrem influência da concentração de
matéria orgânica dissolvida (MOD), uma vez que estas possuem sítios quelantes de
metais. Este trabalho visou elucidar a influência da atividade de microheterótrofos sobre
o complexo MOD-Cu na dinâmica do cobre em uma cadeia alimentar aquática,
levando-se em conta as implicações ecotoxicológicas de cada organismo estudado. Para
tanto, a cadeia alimentar (bactéria → ciliado → Copepoda) foi exposta aos tratamentos
“Cu”, “DOM”, “DOM+Cu” e controle (água reconstituída), cada qual com 3 réplicas.
Os resultados demonstraram que a população bacteriana utilizou a MOD como
substrato, e que o cobre complexado foi disponibilizado e biomagnificado dentro da
cadeia alimentar, causando toxicidade aos ciliados. Ainda, os resultados demonstraram
que íons cobre livres foram mais intensamente acumulados do que o cobre complexado.
101
INTRODUÇÃO
O aumento das descargas de metais em ambientes aquáticos, resultantes de ações
antrópicas, tem como conseqüências alterações no fluxo e distribuição dos metais no
ecossistema (Nriagu, 1990). O comportamento dos metais em ambientes aquáticos é
controlado por características físicas e químicas do elemento, e pelas propriedades
físicas, químicas e biológicas do ecossistema (Leppard, 1983). A interação dessas
propriedades irá determinar a forma predominante em que um metal pode ser
encontrado no ambiente, o que, por sua vez, determinará seu efeito sobre a biota.
A concentração e tipo de matéria orgânica dissolvida (MOD) são características
do ecossistema e são de grande importância em relação ao comportamento dos metais.
A MOD é a fração predominante da matéria orgânica total presente em águas naturais
(Azam et al., 1983), e que pode seqüestrar ou liberar íons para o ambiente (Lombardi e
Jardim, 1997), atuando de maneira dinâmica sobre a especiação e, conseqüentemente,
sobre a acumulação e toxicidade dos metais nos ecossistemas aquáticos (Nogueira et al.,
2005).
A acumulação de metais por invertebrados é definida como a captura do metal
menos sua eliminação pelo organismo. No entanto, existe uma fração de metais que
pode ser passivamente adsorvida ao exoesqueleto. A captura dos metais dissolvidos no
meio ocorre quando estes se ligam às proteínas de membrana e são transportados para o
interior das células (Rainbow e Darllinger, 1993). Ainda, de acordo com Reinfelder et
al. (1998), os metais podem ser capturados pelos organismos através da ingestão de
alimento contaminado. Dentro das células, os metais se ligam a macromoléculas
biologicamente importantes causando danos celulares (Laws, 2000).
Os microorganismos heterotróficos são competidores entre si e, sendo redutores
dos recursos de carbono, afetam o metabolismo do ecossistema aquático como um todo
102
(Sherr, 1988; Azam et al., 1983; Pomeroy, 1974). Através do processo de degradação
da MOD, os microheterótrofos podem transferir tanto o carbono orgânico, quanto
disponibilizar os micro e macroelementos contidos na matéria orgânica para outros
níveis tróficos (degradação da MOD pela bactéria → fitoplâncton e organismos
predadores) (Overbeck e Chróst, 1990). Assim, através da degradação microbiana,
alguns nutrientes retornam para os produtores primários (Pomeroy e Wiebe, 1988), o
que tem sido denominado de alça microbiana (“microbial loop”), ou são
disponibilizados para outros níveis tróficos, através do alimento ou meio circundante.
De acordo com dados da literatura, a interferência da matéria orgânica na
especiação química de metais está relacionada com sua biodisponibilidade e toxicidade
(Morel et al., 1991; Rainbow e Dallinger, 1993; Laws, 2000; Nogueira et al., 2005). No
entanto, são raros os estudos (Lores e Pennock, 1999; Lores et al, 1999) sobre a
regeneração e biodisponibilização desses elementos a partir da interação do complexo
MOD+Cu com microorganismos heterotróficos.
OBJETIVO
O objetivo principal deste estudo foi avaliar o efeito da MOD e de sua
degradação por uma população bacteriana na dinâmica do cobre e sua
biodisponibilização em uma cadeia alimentar aquática. Para tanto, foram usadas
bactérias heterotróficas (população natural), ciliados (Paramecium caudatum) e
copépodes (Metacyclops mendocinus). Foram verificados a dinâmica do cobre e as
implicações ecotoxicológicas sobre os três grupos de organismos.
103
MATERIAIS E MÉTODOS
1. O METAL COBRE
O metal utilizado nos experimentos deste estudo foi o cobre em uma
concentração de 1x10
-6
mol.L
-1
(1 mg mL
-1
CuCl
2
, Titrisol, Merck). Sua escolha
baseou-se no fato de que, em concentrações naturais, atua como um micronutriente
requerido ao crescimento saudável dos organismos, enquanto que em concentrações
pouco mais elevadas este metal é tóxico (Lewis e Cave, 1982). Além disso, o cobre é
um metal que tem considerável afinidade com a matéria orgânica natural, como tem
sido demonstrado na literatura (Chau et al., 1974; Lombardi e Jardim, 1997; Lombardi e
Vieira, 1998; Lores e Pennock, 1999; Lores et al, 1999).
2. A MATÉRIA ORGÂNICA DISSOLVIDA NATURAL
Os experimentos de laboratório foram conduzidos utilizando-se matéria orgânica
dissolvida natural (Suwannee River NOM – RO isolation) obtida pela Sociedade
Internacional de Substâncias Húmicas (IHSS) em uma concentração de 10 mg.L
-1
. De
acordo com Thurman (1985), em águas continentais, a concentração de MOD em
ambientes eutrofizados encontra-se normalmente em um limite entre 10 – 15 mg C.L
-1
.
Os experimentos foram efetuados utilizando-se água reconstituída (APHA, 1998), que
possui baixa concentração de matéria orgânica dissolvida e de metais. A água foi
autoclavada a 120 ºC por 30 min. para esterilização. A concentração de carbono
orgânico na solução de 10 mg.L
-1
de MOD foi determinada usando-se um analisador de
carbono (TOC-5000 Shimadzu - Japão).
104
3. DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE DE COMPLEXAÇÃO DA MOD COM O COBRE
Uma vez que se deseja que todo o cobre esteja quelado, a capacidade de
complexação da MOD com o metal foi estimada através de titulações complexométricas
para determinar qual a concentração inicial de cobre a ser usada nos experimentos,
seguindo a metodologia descrita por Lombardi e Jardim (1997).
A capacidade de complexação da MOD com o metal refere-se à quantidade de
sítios disponíveis no composto orgânico para a ligação com o mesmo. Dessa maneira, a
quantidade de metal capturado por uma amostra é uma medida da quantidade de
ligantes ativos disponíveis para a complexação (Chau et al., 1974). No presente estudo,
as propriedades complexantes da MOD com o cobre foram determinadas através da
técnica de potenciometria, usando-se eletrodo seletivo ao íon cobre (ISE). Foram feitas
titulações complexométricas através da adição crescente de metal mantendo-se
constante o pH e a força iônica da amostra. A concentração total de ligantes (CL =
quantidade de sítios disponíveis para o respectivo K’) e a constante de estabilidade
condicional (K’ = força de associação entre MOD natural e cobre) foram obtidas
analisando-se a curva de titulação através do Modelo de Scatchard (Scatchard et al,
1957).
4.
OS ORGANISMOS
4.1.B
ACTERIOPLÂNCTON
A água coletada do ambiente natural (três réplicas de 500 mL) foi primeiramente
filtrada em filtro GF\C (Whatman) para retirada de predadores e, posteriormente,
filtrada em filtros com 0,2 µm de diâmetro de poro (Gelman GA-8) para retenção das
bactérias. O filtro que então continha a população bacteriana foi inoculado em água
reconstituída (500 mL). Não houve cultura-estoque para a comunidade
105
bacterioplanctônica, uma vez que o cultivo em laboratório pode selecionar espécies,
ignorando aquelas com maior eficiência na assimilação da MOD. As coletas foram
realizadas na primaveira. Durante o experimento, a comunidade bacterioplanctônica foi
mantida em sala com temperatura controlada de 25 ºC ± 2, no escuro e sob agitação
constante (60 – 100 rpm) (Tranvik e Sieburth, 1989) em mesa agitadora (Nova Ética,
modelo 109, Brasil). Todo o procedimento foi realizado em fluxo laminar (Pachane,
Brasil) dotado de luz ultravioleta para minimizar contaminações.
4.2. CILIADO
O ciliado escolhido para o presente estudo foi o Paramecium caudatum. Esta
espécie é de fácil adaptação às condições de cultivo em laboratório, é comumente
encontrado no Reservatório do Monjolinho, e se alimenta basicamente de bactérias. A
água foi coletada do ambiente natural e concentrada em rede de 20 µm de abertura de
malha. No laboratório, os organismos foram triados por capilaridade com auxílio de
uma pipeta Pasteur (técnica de microaspersão) sob microscópio óptico (Leica DMLS).
O ciliado foi mantido no laboratório em água reconstituída enriquecida com pó de
alface, grãos de arroz e levedura (Sipaúba-Tavares e Rocha, 2003), sob condições
controladas de temperatura (25 °C ± 2) e foto-período de 12/12 h luz/escuro. A cada três
dias, a água de cultivo era renovada.
4.3. COPEPODA
Entre os organismos zooplanctônicos, foi escolhida uma espécie de Copepoda
Cyclopoida, Metacyclops mendocinus, que é um organismo predador e possue hábito
alimentar variado. O zooplâncton foi coletado no ambiente com auxílio de rede de
plâncton de 68 µm de abertura de malha, fazendo-se arrastos horizontais e verticais. Os
106
organismos foram acondicionados em galões de polietileno com água do próprio
ambiente para o transporte. No laboratório, a espécie escolhida foi triada e aclimatada.
O uso de populações monoclonais foi evitado, procurando-se sempre cultivar uma
amostra representativa da população. Para os cultivos, foram seguidas as
recomendações feitas por Vijverberg (1989).
Os organismos foram mantidos em aquários com capacidade de 60 L, com água
do próprio ambiente filtrada em filtros GF\C (Whatman) e aeração constante, em sala
aclimatada à temperatura de 25 °C ± 2 e foto-período 12/12 h luz/escuro. O alimento
fornecido foi água reconstituída enriquecida com o protozoário P. caudatum, ração de
peixe fermentada com levedura na proporção 1:1 (Rojas et al., 2001) e alga cultivada no
laboratório, à concentração de 10
5
cél.mL
-1
. As algas (Scenedesmus sp e
Chlamydomonas sp) utilizadas como fonte alimentar do zooplâncton estavam em fase
exponencial de crescimento e foram cultivadas em meio W.C. (Guillard e Lorenzen,
1972).
5.
DESENHO EXPERIMENTAL
A cadeia microbiana (bactéria → ciliado → copépode) foi exposta aos
tratamentos “Cu”, “DOM”, “DOM+Cu” e controle (água reconstituída), cada qual
realizado com 3 réplicas. Primeiramente foi realizado o experimento com a população
bacteriana, onde, após crescimento da mesma, foi introduzido o P. caudatum e,
posteriormente, o M. mendocinus, como mostrado a seguir.
107
Figura 01 - Esquema representativo da metodologia utilizada no experimento de avaliação da
biodisponibilidade do cobre na cadeia alimentar microbiana com ou sem MOD natural.
6. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE COBRE
6.1. COBRE LIVRE
A determinação de íons Cu
2+
foi feita através da técnica de potenciometria, usando-
se eletrodo seletivo ao íon cobre (ISE). O eletrodo seletivo ao íon cobre (ANALION)
foi utilizado conjuntamente com um eletrodo de referência de dupla junção Ag/AgCl
(ANALION). A temperatura de 25
o
C foi mantida constante durante a determinação. A
força iônica das amostras foi ajustada para 0,1 M com NaNO
3
. O tempo de equilíbrio
foi determinado de acordo com a resposta do eletrodo. Para uma concentração na ordem
de 10
-8
M, foi requerido um tempo de 4 h, o qual foi diminuindo com o aumento das
[C]
[M]T e [M]L
Bacterioplâncton
Ciliado
Copepoda
[
M
]
T e
[
M
]
L
MOD MOD + Cu [M]L Controle
Legenda:
[M]T e [M]L = concentrações
de metal total e livre
[C] = concentração de
carbono orgânico
MOD = matéria orgânica
dissolvida
108
concentrações de cobre. Para a calibração do sistema ISE, foram utilizados tampões
metálicos como descrito em Jardim et al. (1986) com modificações de Lombardi et al.
(2007).
6.2. COBRE TOTAL
Cobre total inclui todas as espécies de cobre. Neste trabalho, as determinações
de cobre total na água de cultivo foram realizadas em espectrofotômetro de absorção
atômica (VARIAN, Spectra A.A 220, Austrália), após terem sido fixadas com HNO
3
em
uma concentração final de 2,0 M. Para a determinação do cobre total nos organismos
(cobre total particulado), ao final dos experimentos, esses foram transferidos para filtros
de acetato celulose previamente numerados e pesados em balança microanalítica
(Sartorius MC21S, Alemanha). Posteriormente, os filtros contendo os organismos foram
colocados em estufa a uma temperatura de 60 °C por 48 h. Após este procedimento,
esses filtros foram pesados novamente para estimativa de peso seco e transferidos para
frascos de policarbonato onde foi feita a digestão ácida adicionando-se 2,0 mL de HNO
3
concentrado em cada amostra. As amostras contendo os organismos e HNO
3
foram
transferidas para uma estufa a 90 °C onde permaneceram por 48 h (Lores et al., 1999).
Após digestão ácida, o volume da amostra foi completado para 50 mL com água
deionizada, para posterior determinação em espectrofotômetro de absorção atômica com
auxílio do forno de grafite.
7. EXPERIMENTOS DE PREDAÇÃO/BIOACUMULAÇÃO
No início dos experimentos foram tomados alguns cuidados:
a. Para a realização dos experimentos, foram utilizados exclusivamente frascos
de policarbonato, lavados previamente com HNO
3
1.0 M;
109
b. Tudo o que foi adicionado aos frascos experimentais teve seu volume
especificado para que a diluição do metal fosse considerada posteriormente;
7.1. INTERAÇÃO MOD- CU E BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS
Um inóculo da população natural de bactérias, coletada como descrito no item
4.1, foi submetido aos tratamentos Cu, MOD, Cu+MOD e controle, cada qual com três
réplicas. O crescimento bacteriano foi acompanhado diariamente através de leitura em
espectrofotômetro (Shimadzu, Japão) em 540 nm. Após o crescimento, parte da cultura
(100 mL) foi separada e filtrada em filtros com poros de 0,2 µm (Gelman GA-8) para
retenção das bactérias. O filtrado foi submetido à análise de cobre livre (30 mL), cobre
total (20 mL) e análise de carbono orgânico - TOC (50 mL). O filtro contendo as
bactérias foi preparado para análise de cobre total particulado. Os 400 mL restantes
foram distribuídos em placas de policarbonato multiescavadas, onde em cada orifício
(10 mL) foram adicionados os ciliados como descrito a seguir.
7.2. INTERAÇÃO MOD- CU-BACTÉRIAS E CILIADOS
A água de cultivo (100 mL) estoque contendo os ciliados P. caudatum foi
filtrada com auxílio de rede de 10 μm de abertura de malha e os organismos retidos
foram re-suspendidos em água reconstituída. Uma alíquota da água de cultivo de 1,0
mL foi retirada e fixada com lugol para contagem dos organismos (Lores et al., 1999).
Um inóculo de 1,0 mL da cultura de P. caudatum foi adicionado a cada reservatório das
placas multiescavadas contendo a cultura bacteriana de cada tratamento. Após 72 h,
parte da cultura (100 mL de cada réplica experimental) foi filtrada em membrana
durapore com 5 μm de diâmetro de poro (Millipore) para retenção dos protozoários. O
filtrado foi separado para determinação de íons cobre livre (80 mL) e cobre total
110
dissolvido (20 mL), enquanto o filtro contendo os ciliados foi preparado para análise de
cobre total particulado. Os 300 mL de água de cultivo restantes foram usados no
experimento seguinte, onde os copépodes foram adicionados. O crescimento
populacional dos ciliados foram avaliadas através de contagem em lâmina de
Sedgewick-Rafter. Para tanto, alíquotas de 1mL das culturas foram retiradas
diariamente e fixadas com lugol.
7.3. INTERAÇÃO MOD-CU-BACTÉRIAS-CILIADO E COPÉPODES
Em cada reservatório das placas de policarbonato (10 mL) contendo os
organismos dos níveis tróficos inferiores, foram adicionados 2 copépodes adultos. Após
72 h, os copépodes foram retirados e os sobreviventes contados. Os organismos vivos
foram preparados para análise de cobre particulado e as amostras, então sem os
copépodes, foram filtradas em filtros de acetato de celulose com 0,45 μm de diâmetro
de poro. Parte do filtrado foi preparado para análise de íons cobre livre (30 mL) e a
outra parte preparada para determinação de cobre total dissolvido (20 mL).
RESULTADOS
Um dos fatores que controlam a biodisponibilidade do cobre é sua capacidade de
complexação com a matéria orgânica natural. A MOD (Suwannee River NOM – RO
isolation) usada no presente estudo demonstrou ter dois tipos de ligantes capazes de
complexar com o cobre. Um mais forte com logK’
1
=7,52, CL
1
=3,6x10
-6
mol.L
-1
, e outro
ligante mais fraco com logK’
2
=5,44 and logCL
2
=4,7x10
-6
mol.L
-1
. Esses resultados são
mostrados na figura 02.
111
120
100
80
60
40
20
CuL/Cu
2+
35x10
-6
302520151050
CuL
Figura 02 – Scatchard Plot para a titulação do complexo DOM-Cu. Força iônica= 2x10
-2
(NaNO
3
),
pH=6.8. Log K’1=7.52; CL1=3.6x10
-6
mol.L
-1
; Log K’2=5.44; CL2=4.7x10
-5
mol.L
-1
.
A curva de crescimento populacional das bactérias é mostrada na figura 03.
Pode-se observar que o maior crescimento ocorreu no tratamento com a MOD
contaminada com cobre, enquanto que os menores ocorreram nos tratamentos onde não
houve adição da MOD. O consumo da MOD pelas bactérias foi verificado através de
determinações de carbono (TOC) e mostrou que aproximadamente 4 mgC.L
-1
foi
consumido durante o crescimento (57% do total de carbono). Esses resultados
demonstraram que tais microorganismos são capazes de degradar a MOD e que a
presença do cobre não inibiu o crescimento da comunidade bacteriana.
Figura 03 – Curva de crescimento populacional das bactérias quantificado pela densidade
óptica a 540 nm. Os valores representam a média +
desvio padrão de três replicas
experimentais.
0 50 100 150 200 250
0
2
4
6
8
10
Absorbância (540nm) X1000 (A.U.)
Tempo(h)
Controle
DOM
DOM+Cu
Cu
112
A dinâmica do cobre nos experimentos com bactéria é mostrada na figura 04. No
tratamento “DOM+Cu” (Figura 4A), uma diferença significativa ocorreu entre a
concentração de cobre livre inicial e final (teste t, p < 0.05). No entanto, as
concentrações de cobre total inicial e final não tiveram diferenças significativas (teste t,
p > 0.05) (figura 4B). No tratamento “Cu”, a concentração de cobre total final foi
significativamente menor do que a inicial (teste t, p < 0.01). A figura 4C mostra uma
acumulação significante de cobre (ANOVA, p < 0.05) pelas bactérias nos tratamentos
onde foi adicionado o metal (DOM+Cu; Cu).
A dinâmica do cobre no experimento com ciliados está documentada na figura
05. Em relação ao cobre livre, as concentrações de cobre final foram estatisticamente
(teste t, p < 0.0001) menores que as iniciais (Figura 5A) nos tratamentos em que o metal
foi adicionado. No entanto, as concentrações de cobre total dissolvido iniciais e finais
não apresentaram diferenças significativas (teste t, p > 0.05) em nenhum dos
tratamentos. Similarmente ao ocorrido com as bactérias, nos tratamentos onde foram
adicionados o cobre (DOM+Cu; Cu) houve uma acumulação estatisticamente
significante (ANOVA, p < 0.05) do metal (Figura 5C).
A curva de crescimento populacional dos ciliados nos diferentes tratamentos é
mostrada na figura 06. Pode-se observar que o cobre afeta o crescimento dos
organismos e que no tratamento “Cu” houve 100% de mortalidade dos indivíduos.
A figura 07 se refere à dinâmica do cobre nos experimentos com o copépode
Metacyclops mendocinus. A concentração de cobre livre final foi significativamente
(teste t, p < 0.001) maior do que a inicial, enquanto que não houve diferenças
significativas (teste t, p > 0.05) entre as concentrações de cobre total (Figura 7B), em
todos os tratamentos. As concentrações de cobre particulado foram similares entre os
113
tratamentos (ANOVA, p > 0.05), o que sugere que os copépodes podem ser reguladores
de cobre.
A figura 08 reporta a mortalidade dos copépodes, a qual foi inferior a 50% para
todos os tratamentos.
114
A)
C)
Figura 04 - Concentrações de cobre particulado e dissolvido nos experimentos com
bactéria: (A) Cobre livre; (B) Cobre total dissolvido; (C) Cobre particulado. Os valores são
a média +
desvio padrão de três replicas experimentais.
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
0
3
6
9
12
15
18
Cobre Total dissolvido (x10
-7
M)
Tratamentos
Inicial
Final
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Cobre Livre (x10
-8
M)
Tratamentos
Inicial
Final
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
0
2
4
6
8
10
12
14
[Cu] Bacteria (x10
-4
ugCu.ugPS
-1
)
Tratamentos
B)
115
A)
B)
C)
Figura 05 – Concentrações de cobre particulado e dissolvido nos experimentos com
ciliados: (A) Cobre livre; (B) Cobre total dissolvido; (C) Cobre particulado. Os valores são
a média +
desvio padrão de três replicas experimentais.
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
0
1
2
3
4
Cobre livre (x10
-7
M)
Tratamentos
Inicial
Final
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
0
4
8
12
16
Cobre total dissolvido (x10
-7
M)
Tratamentos
Inicial
Final
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
0
1
2
3
4
[Cu] Ciliado (x10
-3
ugCu.ugPS
-1
)
Tratamentos
116
Figura 06 – Curva de crescimento dos ciliados nos diferentes tratamentos. Os valores são a
média +
desvio padrão de três replicas experimentais.
0 1020304050607080
0
10
20
30
40
50
Densidade (cel.mL
-1
)
Tempo (h)
Controle
DOM
DOM +Cu
Cu
117
A)
B)
C)
Figura 07 – Concentrações de cobre particulado e dissolvido nos experimentos com
copépodes: (A) Cobre livre; (B) Cobre total dissolvido; (C) Cobre particulado. Os valores
são a média +
desvio padrão de três replicas experimentais.
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
0
5
10
15
20
25
30
35
Cobre livre (x10
-9
M)
Tratamentos
Inicial
Final
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
0
30
60
90
120
150
180
Cobre total dissolvido(x10
-8
M)
Tratamentos
Inicial
Final
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
[Cu] copepoda (x10
-3
ugCu.ugPS
-1
)
Tratamentos
118
Figura 08 – Porcentagem de mortalidade de M. mendocinus adultos como uma função das
concentrações de cobre livre e total após 72h de exposição nos diferentes tratamentos.
DISCUSSÃO
Os resultados deste trabalho demonstraram que o crescimento populacional das
bactérias ao final do tempo de incubação (230 h) foi três vezes maior nos tratamentos
em que houve adição de MOD em relação à sua ausência. De fato, Capone E Bauer
(1992) mostraram que, em ecossistemas aquáticos, as bactérias heterotróficas utilizam a
MOD natural como fonte de energia. Tranvik e Sieburth (1989) demonstraram que a
MOD, como por exemplo as substâncias húmicas, podem ser degradadas pela
população bacteriana. Similarmente ao demonstrado nos nossos resultados, esses
CONTROLE MOD MOD+Cu Cu
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Mortalidade (%)
Tratamentos
119
autores encontraram maior densidade bacteriana nas amostras com adição de material
orgânico do que na sua ausência.
Os resultados deste estudo demonstraram que a captura de cobre, quantificada
como cobre particulado (acumulado e adsorvido) nas bactérias foi maior quando o metal
estava presente na forma livre em relação à complexada com a MOD. Esses resultados
estão de acordo com dados encontrados na literatura, onde a menor concentração de
cobre livre (Cu
2+
) detectada em culturas com presença de MOD, sugere uma menor
biodisponibilidade do metal (Nogueira et al., 2005; Lombardi et al, 2002; Lores e
Pennock, 1999; Lores et al., 1999; Parent et al., 1996).
O maior crescimento bacteriano ocorrido nos tratamentos com cobre pode ser
considerado uma indicação de tolerância desses organismos ao metal. Esses dados são
similares aos encontrados na literatura (Rosen,1996; Hassen et al., 1998; Mirimanoff e
Wilkinson, 2000; Nies, 2003), onde é descrita a tolerância aos metais por bactérias.
Hassen et al (1998) encontrou tolerância bacteriana ao cobre em concentrações de até
8x10
-4
mol.L
-1
, e Mirimanoff e Wilkinson (2000) verificaram tolerância ao zinco por
bactérias gram-positivas. De acordo com Nies (2003), a tolerância de metais pesados
pela comunidade bacteriana é resultado da ação de vários mecanismos de resistência.
Rosen (1996) relatou através de seus estudos que tanto a homeostase do cobre quanto
do zinco é mantida por um par de sistemas de transportes, no qual um catalisa a captura
do metal, enquanto o outro fica responsável pela sua excreção.
Os resultados aqui obtidos sugerem que o efluxo de cobre foi o mecanismo
adotado pelas bactérias como estratégia de tolerância a este metal, pois uma maior
concentração de Cu
2+
final no tratamento DOM+Cu foi encontrada após consumo da
DOM. Dados da literatura (Lee et al., 1990; Silver e Phung, 1996; Nies, 2003;
120
Albergoni et al., 1980; Rosen, 1996) reportam o processo de efluxo como um dos
mecanismos mais comum de tolerância utilizados pelas bactérias.
Similarmente ao ocorrido com as bactérias, os resultados deste estudo
demonstraram que o cobre acumulado pelos ciliados foi menor no tratamento
“DOM+Cu” em relação ao tratamento “Cu”. Uma acumulação duas vezes maior foi
quantificada no tratamento “Cu”. Provavelmente, neste caso, uma maior concentração
de Cu
2+
no meio, aliada às bactérias contaminadas com metal e provavelmente
consumidas pelos ciliados, contribuíram para uma maior concentração do cobre
acumulado por esses organismos. A transferência de metais a partir das bactérias para P.
caudatum foi descrita por Mansoure-Aliabadi e Sharp (1985), que demonstraram a
acumulação de Zn, Ni e Pb por P. caudatum após a ingestão de bactérias contaminadas
por esses metais.
No presente estudo, os ciliados foram os organismos que apresentaram
sensibilidade ao cobre. Uma concentração de 3,6x10
-7
mol.L
-1
Cu
2+
foi capaz de causar
100% de mortalidade nos organismos após 48 h do início do experimento. Os dados da
literatura demonstram que a sensibilidade dos ciliados ao cobre é variável e dependente
do organismo e das condições experimentais. Mandoni et al. (1996) observaram que
uma concentração total de cobre de 9.6x10
-5
mol.L
-1
causou 89% de mortalidade na
população de protozoários e que 7 das 16 espécies estudadas desapareceram. Coppelloti
(1998) reportou que Euplotes vannus tolerou uma concentração de cobre total de
3.1x10
-6
mol.L
-1
e que a acumulação do metal ocorreu após os organismos terem sido
expostos a uma concentração total de cobre de 6.2x10
-6
mol.L
-1
.
A permanência dos níveis de cobre acumulado (10
-3
µgCu.µg.peso seco
-1
) em M.
mendocinus e o aumento de cobre livre no meio após a exposição, sugerem que esses
animais podem ser reguladores de cobre. Os níveis de cobre nos organismos
121
mantiveram-se independentes das concentrações externas do metal. Esses resultados
sugerem que, similarmente aos organismos reguladores de metal, M. mendocinus possui
mecanismos de excreção de metal. Sabe-se que alguns organismos regulam a
concentração interna de metal, permanecendo estas dentro de um nível definido
(Albergoni, et al., 1980). De acordo com Albergoni et al. (1980), dois mecanismos
participam da regulação interna de metal: a) decréscimo da internalização através da
diminuição da permeabilidade e/ou adsorção na superfície dos organismos e, b) a
expulsão do metal de dentro do organismo através de sistemas excretores. Rainbow e
Darllinger (1993) demonstraram que tanto os organismos reguladores quanto os
excretores possuem moléculas capazes de regular a concentração interna de metais. No
entanto, esses autores relatam que, apesar desses processos não serem raros em
invertebrados, eles são restritos a certos metais essenciais como o cobre e o zinco.
Através dos resultados deste estudo, pode-se concluir que parte do Cu
2+
foi
regenerado para o meio através do efluxo bacteriano e biodisponibilizado para os outros
organismos. O Cu
2+
foi biomagnificado dentro da cadeia em uma intensidade maior que
o cobre complexado na MOD.
122
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C
C
A
A
P
P
Í
Í
T
T
U
U
L
L
O
O
0
0
5
5
131
Influência de exopolissacarídeos de Anabaena Spiroides na biodisponibilidade do cobre
em uma cadeia alimentar aquática
2007
132
RESUMO
A poluição aquática por metais decorrente principalmente de atividades
antrópicas é um problema global. A bioacumulação e a magnificação de metais em
cadeias tróficas podem levar à toxicidade para a biota com conseqüências para saúde
pública. Tanto a toxicidade quanto a biodisponibilidade dos metais nos ambientes
aquáticos sofrem influência da concentração dos materiais orgânicos dissolvidos, dentre
eles os exopolissacarídeos originados de microalgas e cianobactérias. Esses compostos
formam complexos com os metais e podem ser encontrados em concentrações
significantes nos ambientes dulcícolas. Este estudo teve como objetivo principal
verificar o efeito de exopolissacarídeos de Anabaena spiroides na dinâmica do cobre em
uma cadeia microbiana. Para tanto, a cadeia alimentar (bactéria → ciliado → copepoda)
foi exposta a tratamentos com cobre e exopolissacarídeos em várias combinações. Os
resultados demonstraram que a população bacteriana usou o exopolissacarídeo como
substrato, mas o cobre complexado não foi disponibilizado dentro da cadeia. O cobre
livre foi acumulado pelas bactérias e ciliados. No entanto, efeito tóxico foi observado
somente nos ciliados.
133
INTRODUÇÃO
O aumento das descargas de metais em ambientes aquáticos, resultantes de ações
antrópicas, especialmente industriais, tem como conseqüência alterações no fluxo e
distribuição dos metais (Niragu, 1990). O comportamento dos metais em ambientes
aquáticos é controlado por características físicas e químicas do elemento, e pelas
propriedades físicas, químicas e biológicas do ecossistema (Leppard, 1983). A interação
destas propriedades irá determinar a forma predominante em que um metal pode ser
encontrado no ambiente, o que, por sua vez, determinará seu efeito sobre a biota.
A concentração e tipo de matéria orgânica dissolvida (MOD) são aspectos
ambientais importantes em relação ao comportamento dos metais (Lombardi, 1995). Em
ambientes dulcícolas, um dos contribuintes da MOD são os polissacarídeos excretados
pelo fitoplâncton, os quais podem contribuir de 1 a 30% para a concentração de carbono
orgânico dissolvido no ecossistema (Vieira e Myklestad, 1986; Paulsen e Vieira, 1994).
Os polissacarídeos apresentam importante significado ecológico, pois, além de seu uso
como fonte alimentar para microheterótrofos (Choueri et al., 2007), são constituintes de
cápsulas mucilaginosas que envolvem as células de algumas microalgas (Brook, 1981)
que, por sua vez, servem de proteção contra predadores (Stutzman, 1995). Além disso,
podem atuar como agentes complexantes de metais (Lombardi e Vieira, 1998, 1999,
2000) e constituírem as matrizes para a formação de agregados gelatinosos orgânicos
(TEP), os quais podem ser utilizados como substrato por vários organismos (CHO e
AZAM, 1988; SIGG et al., 1987).
A acumulação de metais por invertebrados é definida como a captura do metal
menos sua eliminação pelo organismo. No entanto, há uma fração de metais que pode
ser passivamente adsorvida ao exoesqueleto. A captura dos metais dissolvidos no meio
ocorre quando estes se ligam às proteínas de membrana e são transportados para o
134
interior das células. A ligação do metal traço com a proteína de transporte na membrana
ocorre com o metal na forma iônica, que é a espécie química de maior
biodisponibilidade (Rainbow e Darllinger, 1993a). Ainda, de acordo com Reinfelder et
al. (1998), os metais podem ser capturados pelos organismos através da ingestão de
alimento contaminado. Dentro das células, os metais podem se ligar à macromoléculas
biologicamente importantes causando assim danos celulares (Laws, 2000).
Os microorganismos heterotróficos são competidores entre si e, sendo redutores
dos recursos de carbono, afetam o metabolismo do ecossistema aquático como um todo
(Sherr e Sherr, 1988; Azam et al., 1983; Pomeroy, 1974). Através do processo de
degradação da MOD, os microheterótrofos podem transferir tanto o carbono orgânico,
quanto disponibilizar os micro e macroelementos associados ao carbono para outros
níveis tróficos (Overbeck e Chróst, 1990). Assim, a degradação microbiana tem por
conseqüência a disponibilização de nutrientes para outros níveis tróficos ou seu retorno
aos produtores primários (Pomeroy e Wiebe, 1988), fato conhecido como alça
microbiana (“microbial loop”).
Dentre outras, a importância ambiental da relação MOD – metais reside
principalmente na alteração da especiação do elemento químico e, conseqüentemente,
em sua biodisponibilidade e toxicidade à biota (Morel et al., 1991; Rainbow e
Dallinger, 1993; Laws, 2000; Nogueira et al., 2005;). Os polissacarídeos algais
apresentam natureza predominantemente hidrofílica e comportam-se similarmente à
MOD em relação aos elementos metálicos, alterando sua biodisponibilidade (Lombardi
et al., 2002; Lombardi et al., 2007).
Estudos sobre a biodisponibilização de metais à partir da interação do complexo
MOD – metal e atividade de microorganismos heterotróficos mostram que, dependendo
135
do organismo e tipo de MOD, essa interação pode tanto reduzir quanto aumentar a
biodisponibilidade desses elementos (Lores e Pennock, 1999; Lores et al, 1999).
Em ambientes eutrofizados, os polissacarídeos algais e de cianobactérias podem
constituir fração significativa da MOD. Considerando que os ambientes eutrofizados
são comuns nos dias atuais, o estudo da interação polissacarídeos – metais apresenta
considerável significado ecológico e vem contribuir com informações sobre a dinâmica
de metais em ecossistemas eutróficos.
OBJETIVO
Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito da degradação bacteriana
sobre os polissacarídeos excretados pela cianobactéria Anabaena spiroides na
biodisponibilização e destino do cobre dentro de uma cadeia alimentar aquática
(bactérias heterotróficas → ciliados → copépode) e suas implicações ecotoxicológicas
sobre os três grupos de organismos especificados. Assim, foi determinado o fluxo de
cobre a partir dos polissacarídeos através de experimentos de predação e especiação de
cobre em cada elo da cadeia.
MATERIAIS E MÉTODOS
1. COBRE
Cobre foi o metal utilizado nos experimentos desta proposta numa concentração de
1x10
-6
mol.L
-1
(1 mg mL
-1
CuCl
2
, Titrisol, Merck). Sua escolha baseou-se no fato de
que em concentrações naturais atua como um micronutriente requerido ao crescimento
saudável dos organismos, enquanto que em concentrações pouco mais elevadas este
metal é tóxico (Lewis e Cave, 1982). Além do fato de que, o cobre é um metal que tem
considerável afinidade com MOD em geral, inclusive polissacarídeos de origem algal,
136
como tem sido demonstrado na literatura (Chau et al., 1974; Lombardi e Jardim, 1996;
Lombardi e Vieira, 1998, 1999, 2000; Lores e Pennock, 1999; Lores et al, 1999;
Lombardi et al., 2002, 2007).
2. ORGANISMOS
2.1. CULTIVO DE ANABAENA SPIROIDES E EXTRAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS
Os experimentos de laboratório foram conduzidos utilizando-se polissacarídeos
excretados por Anabaena spiroides em uma concentração de 40 mg L
-1
, o que
corresponde à concentração de 15mg. L
-1
de carbono orgânico. De acordo com Thurman
(1985), em águas continentais, a concentração de MOD encontra-se em um limite entre
1 - 15 mg C.L
-1
. Sendo que concentrações de MOD na faixa de 10-15 mgL
-1
são
características de ambientes eutrofizados. Os experimentos foram efetuados usando-se
água reconstituída (APHA, 1998). A água foi autoclavada a 120 ºC por 30 min para
esterilização. A concentração de carbono orgânico dissolvido foi determinada
utilizando-se um analisador de carbono (TOC-5000 Shimadzu - Japão).
O cultivo de Anabaena spiroides foi feito em garrafões com capacidade para 10 L.
Foram preparados 7 L de meio ASM-1 (GORHAM et al, 1964) tamponado com 500 mg
L
-1
de tampão TRIS em pH 7,0. O meio foi autoclavado por 30 min a 120 °C. Após
resfriado, foi inoculado com 15 mL de cultura da cianobactéria em fase exponencial de
crescimento. A cultura foi mantida em sala com temperatura controlada (23 °C + 1) e
fotoperíodo de 12/12 h luz/escuro. As culturas foram gentilmente aeradas utilizando-se
ar filtrado. Condições assépticas foram mantidas em todas as fases experimentais.
Os polissacarídeos extracelulares provenientes de Anabaena spiroides são aqueles
excretados e encontrados dissolvidos no meio de cultura. As culturas tiveram suas
células separadas no início da fase estacionária através de filtração tangencial em
137
cartuchos de fibras ocas com poros de 0,65 μm. O filtrado foi concentrado em
rotaevaporador a 40 °C e dialisado em membranas com poro de 14 Kd durante quatro
dias em água destilada, para a remoção dos sais. A fração assim obtida conteve
materiais orgânicos de alta massa molecular, os exopolissacarídeos, os quais foram
liofilizados e armazenados em freezer e no escuro até o momento do uso, não
excedendo o tempo de 10 dias.
2.2. BACTERIOPLÂNCTON
A população bacteriana foi obtida do ambiente natural, Reservatório do
Monjolinho na UFSCar. A água coletada do ambiente natural (tréplicas de 500 mL) foi
filtrada em filtro GF/C (Whatman) para retirada de predadores e, posteriormente,
filtrada em filtros com poros de 0,2 µm (Gelman GA-8) para retenção das bactérias. O
filtro com a população bacteriana foi inoculado em água reconstituída (APHA, 1995)
(500 mL). Não houve cultura-estoque para a comunidade bacterioplanctônica, uma vez
que o cultivo em laboratório poderia selecionar espécies ignorando aquelas com maior
eficiência na assimilação de polissacarídeos. As coletas foram realizadas na época da
experimentação, procurando-se trabalhar sempre na mesma estação do ano para evitar
variação na população de bactérias. Durante o experimento, a comunidade
bacterioplanctônica foi mantida em sala com temperatura controlada de 25 ºC ± 2, no
escuro e sob agitação constante (60 – 100 rpm) (Tranvik e Sieburth, 1989) em mesa
agitadora (Nova Ética, modelo 109, Brasil). Todo a manipulação dos frascos
experimentais foi realizada em fluxo laminar (Pachane, Brasil) dotado de luz
ultravioleta para minimizar contaminações.
138
2.3. CILIADO
O ciliado escolhido para ser estudado no presente trabalho foi o Paramecium
caudatum. Esta espécie é de fácil adaptação às condições de cultivo em laboratório, é
comumente encontrado no Reservatório do Monjolinho e sua alimentação é basicamente
constituída de bactérias. Eles possuem grande capacidade reprodutiva e são o elo de
ligação trófica entre bactérias e metazooplâncton, atuando assim no fluxo de carbono e
outros elementos minerais dentro da cadeia alimentar.
Para obtenção dos organismos, a água foi coletada do ambiente natural e
concentrada em rede de 20 µm de abertura de malha. No laboratório, os organismos
foram triados por capilaridade com auxílio de uma pipeta Pasteur (técnica de
microaspersão) sob microscópio óptico (Leica DMLS). Os ciliados foram mantidos no
laboratório em água reconstituída enriquecida com pó de alface, grãos de arroz e
levedura, sob condições controladas de temperatura (25 °C + 2) e foto-período de 12/12
h luz/escuro (Sipaúba-Tavares e Rocha, 2003). A cada três dias a água de cultivo era
renovada.
2.4.
COPEPODA
Como organismo topo da cadeia alimentar neste estudo, o Copepoda Cyclopoida,
Metacyclops mendocinus foi o animal escolhido. Esses organismos são predadores,
possuem hábitos alimentares variados e servem como fonte alimentar para muitos
animais (Vijverberg, 1989). Além disso, os copépodes são importantes na regeneração
de nutrientes como nitrogênio, fósforo, carbono, dentre outros microelementos
(O‘Doherty, 1985).
O zooplâncton foi coletado do ambiente natural com o auxílio de rede de plâncton de
68 µm de abertura de malha, fazendo-se arrastos horizontais e verticais. Os organismos
139
foram acondicionados em galões de polietileno com água do próprio ambiente para o
transporte. No laboratório, a espécie escolhida foi triada e aclimatada. O uso de
populações monoclonais foi evitado, procurando-se sempre cultivar uma amostra
representativa da população. Para os cultivos, foram seguidas as recomendações feitas
por Vijverberg (1989).
Os organismos foram mantidos em aquários com capacidade de 60 L, com água
do próprio ambiente filtrada em filtros GF/C (Whatman), com aeração constante em
sala climatizada à temperatura de 25 °C ± 2 e foto-período 12/12 h luz/escuro. O
copépode foi alimentado com uma solução feita de água reconstituída enriquecida com
o protozoário P. caudatum, ração de peixe fermentada com levedura na proporção 1:1
(Rojas et al., 2001), e alga cultivada no laboratório, à concentração de 10
5
cél.mL
-1
(Sipaúba-Tavares e Rocha, 2003). As algas usadas como fonte alimentar ao zooplâncton
foram Scenedesmus sp e Chlamydomonas sp cultivadas em meio W.C. (Guillard e
Lorenzen, 1972) e fornecidas aos animais quando em fase exponencial de crescimento.
3.
DESENHO EXPERIMENTAL
A cadeia microbiana (bactéria → ciliado → copépode) foi exposta aos
tratamentos adição de cobre (“Cu”), adição de polissacarídeo (“MOD”), adição de
polissacarídeos e cobre (“MOD+Cu”) e o controle constituído água reconstituída sem
adição de matéria orgânica dissolvida e sem adição de cobre. Cada tratamento foi
realizado com 3 réplicas. Primeiramente, foi realizado o experimento com a população
bacteriana, onde após crescimento da mesma, P. caudatum foi introduzido e,
posteriormente, o M. mendicinus, como mostrado a seguir.
140
Figura 01 – Fluxograma ilustrando o desenho experimental utilizado no experimento de avaliação da
biodisponibilidade ao longo da cadeia alimentar microbiana.
4. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE COBRE
4.1.
COBRE LIVRE
O cobre livre, conhecido também como cobre hidratado ou iônico foi determinado
através da técnica de potenciometria, usando-se eletrodo seletivo ao íon cobre
(ANALION, SP - Brasil). O eletrodo seletivo ao íon cobre foi utilizado conjuntamente
com um eletrodo de referência Ag/AgCl de dupla junção (ANALION, SP - Brasil). A
temperatura de 25
o
C foi mantida constante durante a determinação. A força iônica das
amostras foi ajustada para 0,1 M com NaNO
3
. O tempo de equilíbrio para as
determinações de cobre livre variou de acordo com a resposta do eletrodo, entre 4 h para
[C]
[M]T e [M]L
Bacterioplâncton
Ciliado
Copepoda
[
M
]
T e
[
M
]
L
MOD MOD + CuCu Controle
Legenda:
[M]T e [M]L = concentrações
de metal total e livre
[C] = concentração de carbono
orgânico
MOD = matéria orgânica
dissolvida
141
uma concentração de 10
-8
M e 20 min. para concentrações da ordem de 10
-6
M de íons
cobre livre nas amostras. A calibração do sistema foi realizada utilizando-se tampões
metálicos de acordo com os procedimentos descritos em Jardim et al. (1986) e
Lombardi et al. (2007).
4.2. COBRE TOTAL
Cobre total dissolvido inclui todas as espécies de cobre presentes em uma amostra.
Neste trabalho, as determinações de cobre total dissolvido na água de cultivo foram
realizadas em espectrofotômetro de absorção atômica (VARIAN, Spectra A.A 220,
Austrália), após terem sido fixadas com HNO
3
em uma concentração final de 2,0 M.
Para a determinação do cobre total nos organismos (cobre total particulado), ao
final dos experimentos, esses foram transferidos para filtros de acetato celulose
previamente numerados e pesados em balança microanalítica (Sartorius MC21S,
Alemanha). Posteriormente, os filtros contendo os organismos foram colocados em
estufa a uma temperatura de 60 °C por 48 h. Após este procedimento, esses filtros foram
pesados novamente para estimativa de peso seco e transferidos para frascos de
policarbonato onde foi feita digestão ácida adicionando-se 2,0 mL de HNO
3
concentrado em cada amostra. As amostras contendo os organismos e HNO
3
foram
então transferidas para uma estufa de secagem a 90 °C, onde permaneceram por mais 48
h (Lores et al., 1999). Após digestão, o volume da amostra foi completado para 50 mL
com água deionizada, para posterior determinação em espectrofotômetro de absorção
atômica com auxílio de forno de grafite.
5. EXPERIMENTOS DE DINÂMICA DO COBRE ATRAVÉS DA INTERAÇÃO ENTRE OS
ORGANISMOS
, E O COMPLEXO MOD-CU
142
No início dos experimentos foram tomados alguns cuidados:
a. Para a realização dos experimentos foram utilizados exclusivamente frascos
de policarbonato, lavados previamente com HNO
3
1.0 M;
b. Tudo o que foi adicionado aos frascos experimentais teve seu volume
especificado, para que a diluição do metal fosse considerada posteriormente;
5.1. INTERAÇÃO POLISSACARÍDEO- CU E BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS
Um inóculo da população natural de bactérias coletada como descrito no item 2.2,
foi submetido aos tratamentos (Cu, MOD, Cu+MOD e controle) em três réplicas. O
crescimento bacteriano foi acompanhado diariamente através de leitura em
espectrofotômetro (Shimadzu, Japão) em comprimento de onda de 640 nm. Após o
crescimento, parte da cultura (100 mL) foi separada, filtrada em filtros com poros de 0,2
µm (Gelman GA-8) para retenção das bactérias e o filtrado foi submetido à
determinação de íons cobre livre (30 mL), cobre total dissolvido (20 mL) e carbono
orgânico total - TOC (50 mL), enquanto que o filtro contendo as bactérias foi preparado
para análise de metal total particulado. Os 400 mL restantes foram distribuídos em
placas de policarbonato multiescavadas, onde em cada orifício (10 mL) foram
adicionados os ciliados como descrito a seguir.
5.2. INTERAÇÃO POLISSACARÍDEO- CU-BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS E CILIADOS
A água de cultivo (100 mL) estoque contendo os ciliados P. caudatum foi
filtrada com auxílio de rede de 10 μm de abertura de malha e os organismos retidos
foram re-suspendidos em água reconstituída. Uma alíquota da água de cultivo de 1,0
mL foi retirada e fixada com lugol para contagem dos organismos (Lores et al., 1999).
Um inóculo de 1,0 mL da cultura de P. caudatum foi adicionado à cada reservatório das
143
placas multiescavadas contendo a cultura bacteriana de cada tratamento. Após 72 h,
parte da cultura (100 mL de cada réplica experimental) foi filtrada em membrana
durapore com 5 μm de diâmetro de poro (Millipore) para retenção dos protozoários. O
filtrado foi separado para determinação de íons cobre livre (80 mL) e cobre total
dissolvido (20 mL), enquanto o filtro contendo os ciliados foi preparado para análise de
cobre total particulado. Os 300 mL de água de cultivo restantes foram usados no
experimento seguinte, onde os copépodes foram adicionados. As taxas de crescimento
dos ciliados foram avaliadas através de contagem em lâmina de Sedgewick-Rafter. Para
tanto, alíquotas de 1mL das culturas foram retiradas diariamente e fixadas com lugol.
5.3. INTERAÇÃO POLISSACARÍDEO-CU-BACTÉRIAS-CILIADO E COPÉPODES
Em cada reservatório das placas de policarbonato (10 mL) contendo os
organismos dos níveis tróficos inferiores, foram adicionados 2 copépodes adultos. Após
72 h, os copépodes foram retirados e os sobreviventes contados. Os organismos vivos
foram preparados para análise de cobre particulado e as amostras, então sem os
copépodes, foram filtradas em filtros de acetato de celulose com 0,45 μm de diâmetro
de poro. Parte do filtrado foi preparado para análise de íons cobre livre (30 mL) e a
outra parte preparada para determinação de cobre total dissolvido (20 mL).
RESULTADOS
A densidade bacteriana em função do tempo experimental é mostrada na figura 02.
Observa-se que, em todos os tratamentos, foi detectado crescimento bacteriano, no
entanto na presença dos exopolissacarídeos de Anabaena spiroides quer na ausência ou
presença de cobre, o crescimento foi ligeiramente superior. Como mostrado na Tabela
01, as bactérias consumiram cerca de 7 mg C.L
-1
, totalizando uma média de consumo de
144
aproximadamente 39% do total de carbono durante o crescimento. Esses resultados
demonstram que as bactérias foram capazes de degradar os polissacarídeos produzidos
por Anabaena spiroides e que a presença de cobre não inibiu o crescimento da
comunidade bacteriana.
0 24 48 72 120
0
5
10
15
20
25
30
Absorbância (U.A.)
Tempo (h)
Controle
MOD
MOD+Cu
Cu
Figura 02- Curva de crescimento da população bacteriana quantificada através de densidade óptica
em 640 nm (x 1000). Os valores representam média +
desvio padrão de três replicas
experimentais.
Tabela 01- Concentrações de carbono orgânico (mg.L
-1
) antes e após o crescimento bacteriano nos
tratamentos com adição de polissacarídeos (MOD, MOD+Cu).
MOD MOD+Cu
Amostra
Inicial Final Consumido Inicial Final Consumido
A
22,64 19,77 11,18 14,43 11,18 2,87
B
15,84 7,7 9,5 22,53 9,5 8,14
C
15,16 9,3 8,2 16,86 8,2 5,86
Média + DV
17,9+4,1 12,3+6,6 9,6+1,5 17,9+4,2 9,6+1,5 5,6+2,6
145
A dinâmica do cobre nos experimentos com as bactérias é mostrada na figura 03. No
tratamento “Cu”, a concentração de íons cobre livre (Figura 3A) e cobre total dissolvido
(Figura 3B) ao início dos experimentos foram estatisticamente superiores à
concentração detectada ao final (teste t, p<0.05). No entanto, considerando os outros
tratamentos não foram detectadas diferenças significativas (teste t, p>0.05) para as
concentrações de cobre, quer íons livre ou total. A figura 3C mostra uma acumulação
significante de cobre (ANOVA, p<0.05) nas bactérias no tratamento onde foi
adicionado o metal sem a presença dos exopolissacarídeos.
A dinâmica de cobre no experimento com ciliados está documentada na figura 04.
Em relação ao metal livre, no tratamento “Cu”, a concentração de cobre final foi
estatisticamente (teste t, p<0.05) menor que a inicial (Figura 4A), enquanto que nos
outros tratamentos não houve diferenças significativas (teste t, p>0.05). Em relação ao
cobre total dissolvido, nenhum dos tratamentos apresentou diferenças significativas
entre as contrações iniciais e finais (teste t, p>0.05) de cobre. Similarmente ao ocorrido
com as bactérias, no tratamento onde foi adicionado cobre sem exopolissacarídeo
(“Cu”) houve uma acumulação estatisticamente significante (ANOVA, p<0.05) do
metal (Figura 5C), com 100% de mortalidade dos indivíduos.
A curva de crescimento dos ciliados nos diferentes tratamentos é mostrada na figura
05 e mostra que o cobre interferiu no crescimento dos organismos.
A figura 06 refere-se à dinâmica do cobre nos experimentos com o copépode
Metacyclops mendocinus e mostra que a concentração final de íons cobre livre foi
significativamente (teste t, p<0.001) menor do que a inicial. Por outro lado, não houve
diferenças significativas (teste t, p>0.05) entre as concentrações de cobre total
dissolvido em nenhum dos tratamentos (Figura 6B). As concentrações de cobre
particulado foram similares entre os tratamentos (ANOVA, p>0.05).
146
A)
Controle MOD MOD+Cu Cu
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Cobre Livre (x 10
-7
M)
Tratamentos
Cu
++
inicial
Cu
++
final
B)
Controle MOD MOD+Cu Cu
0
2
4
6
8
10
Cobre Total disolvido (x10
-6
M)
Tratamentos
[Cu]T inicial
[Cu]T final
C)
Controle MOD MOD+Cu Cu
0
1
2
3
[Cu] Bacteria (x10
-2
μg.μgPS
-1
)
Tratamentos
Figura 03- Concentrações de cobre particulado e dissolvido nos experimentos com bactéria: (A)
Cobre livre; (B) Cobre total dissolvido; (C) Cobre particulado. Os valores são a média +
SD de três
replicas experimentais.
147
A)
Controle DOM DOM+Cu Cu
0
1
2
3
4
5
Cobre Livre (x 10
-8
M)
Tratamentos
[Cu]
++
inicial
[Cu]
++
final
B)
Controle DOM DOM+Cu Cu
0
2
4
6
8
10
Cobre total dissolvido (x 10
-6
M)
Tratamentos
[Cu]T inicial
[Cu]T final
C)
Controle DOM DOM+Cu Cu
0
1
2
3
4
5
[Cu] ciliado (x 10
-2
μg.μgPS
-1
)
Tratamentos
Figura 04- Concentrações de cobre particulado e dissolvido nos experimentos com ciliados: (A) Cobre
livre; (B) Cobre total dissolvido; (C) Cobre particulado. Os valores são a média +
SD de três replicas
experimentais.
148
0 244872
0
4
8
12
16
20
Ciliado (célula.mL
-1
)
Tempo (h)
Controle
DOM
DOM+Cu
Cu
Figura 05- Curva de crescimento dos ciliados nos diferentes tratamentos. Os valores
representam a média +
desvio padrão de três replicas experimentais.
149
A)
Controle MOD MOD+Cu Cu
0
1
2
3
4
5
Cobre livre (x 10
-8
M)
Tratamentos
[Cu]
++
inicial
[Cu]
++
final
B)
Controle MOD MOD+Cu Cu
0
2
4
6
8
10
12
Cobre Total dissolvido (x10
-6
M)
Tratamentos
[Cu]T inicial
[Cu]T final
C)
Controle MOD MOD+Cu Cu
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
[Cu] Copepoda (x 10
-2
μg.μgPS
-1
)
Tratamentos
Figura 06- Concentrações de cobre particulado e dissolvido nos experimentos com copépodes: (A)
Cobre livre; (B) Cobre total dissolvido; (C) Cobre particulado. Os valores são a média +
desvio
padrão de três replicas experimentais.
150
DISCUSSÃO
A dinâmica do cobre nos experimentos mostrou que na presença do
exopolissacarídeo, houve uma redução significativa de íons cobre livre, diferentemente
daquele obtido nos experimentos sem o material orgânico, o que demonstra o seqüestro
do cobre pelo exopolissacarídeo. Estudos encontrados na literatura estão de acordo com
estes resultados e confirmam que exopolissacarídeos e materiais orgânicos de baixa
massa molecular produzidos por microalgas são capazes de associar-se ao cobre e
outros metais (Lombardi e Vieira, 1999; Lombardi e Vieira, 2000; Gouvêa et al., 2005;
Nogueira et al., 2005; Lombardi et al., 2005), exercendo desse modo significante papel
ambiental em relação à especiação e disponibilização de metais.
O crescimento bacteriano obtido neste estudo, foi maior nos tratamentos em que
houve adição de exopolissacarídeo em relação à sua ausência. O consumo de
polissacarídeos excretados por Anabaena spiroides por bactérias heterotróficas já foi
comprovado por Colombo et al. (2004). Capone E Bauer (1992) mostraram que em,
ecossistemas aquáticos, as bactérias heterotróficas utilizam a MOD natural como fonte
de energia. Tranvik e Sieburth (1989) demonstraram que a matéria orgânica, como por
exemplo, as substâncias húmicas, podem ser degradadas pela população bacteriana.
Similarmente ao demonstrado nos nossos resultados, esses autores encontraram maior
densidade bacteriana em amostras com adição de material orgânico do que em sua
ausência.
Nesta pesquisa, a captura de cobre pelas bactérias, quantificada como cobre
particulado (acumulado e adsorvido), ocorreu em maior quantidade quando o metal
estava presente na forma livre. Na forma complexada, não houve acúmulo significativo
do metal nos organismos. Esses resultados estão de acordo com os dados encontrados
151
na literatura, os quais mostram que íons cobre livre (Cu
2+
) é uma das formas químicas
do metal que se encontra biodisponível, tanto para adsorção na superfície celular dos
organismos como também para absorção pelos mesmos (Lores e Pennock, 1999; Lores
et al., 1999; Parent et al., 1996 Lombardi et al., 2002; Nogueira et al., 2005).
Provavelmente, o cobre complexado no exopolissacarídeo não foi capturado pelas
bactérias devido ao pouco tempo de incubação, onde somente 39% do material foi
degradado. De acordo com Colombo et al. (2004), a composição monomérica dos
polissacarídeos de Anabaena spiroides é 29,3% de glicose, 24,2% de manose, 21,9% de
raminose, 7,8% de xilose, 6,6% de ácido glicurônico, 5,6% de fucose, 2,0% de
galactose, 1,8% de ácido galacturônico e 0,8% de arabinose. De acordo com esses
autores, o consumo dos polissacarídeos pelas bactérias heterotróficas é caracterizado
por duas fases. A primeira, de degradação mais rápida, acontece nos 5 dias iniciais de
incubação, onde a maior atividade enzimática ocorre para a glicose, que são
monossacarídeos de pouca capacidade complexométrica com o cobre. Ao término desta
fase ocorre sucessão bacteriana, onde inicia-se uma segunda fase de degradação do
polissacarídeo, mais lenta que a primeira. Nos estudos de Colombo et al. (2004), 29 dias
de incubação foram necessários para que todo o polissacarídeo fosse degradado pelas
bactérias.
O crescimento bacteriano ocorrido no tratamento com concentração de cobre
livre de 1x10
-7
mol.L
-1
pode ser considerado uma indicação de tolerância desses
organismos ao metal. A tolerância bacteriana aos metais tem sido mostrada na literatura
(Rosen,1996; Hassen et al., 1998; Mirimanoff e Wilkinson, 2000; Nies, 2003). Hassen
et al (1998) encontrou tolerância bacteriana ao cobre total dissolvido em concentrações
de até 8x10
-4
mol.L
-1
. Mirimanoff e Wilkinson (2000) verificou tolerância ao zinco por
bactérias gram-positivas. De acordo com Nies (2003) a tolerância aos metais pesados
152
pela comunidade bacteriana é resultado da ação de vários mecanismos de resistência,
dentre elas pode-se citar o acúmulo intracelular de metal através do seu seqüestro por
moléculas quelantes, impedindo-os de atingir sítios vitais, associação com a parede
celular, mecanismos de volatilização do metal, e efluxo. Rosen (1996) relatou, através
de seus estudos, que tanto a homeostase do cobre quanto a do zinco são mantidas
através de dois sistemas de transportes, no qual um é responsável pela captura do metal,
enquanto o outro pela sua excreção ou efluxo.
Similar ao ocorrido com as bactérias, os resultados deste estudo demonstraram
que o cobre acumulado pelos ciliados ocorreu no tratamento em que o cobre foi
adicionado sem a presença do exopolissacarídeo. Uma acumulação doze vezes maior foi
quantificada no tratamento “Cu” em relação ao tratamento “DOM+Cu”. Neste caso,
uma concentração de Cu
2+
de 3,9 x 10
-8
mol. L
-1
que permaneceu no meio após o
crescimento bacteriano, aliada às bactérias contaminadas (2,1x10
-2
µg Cu . µg PS
-1
) e
utilizadas como fonte alimentar pelos ciliados, foram os fatores que ocasionaram a
toxicidade nesses organismos. A transferência de metais de bactérias para P. caudatum
foi descrita na por Mansoure-Aliabadi e Sharp (1985), que mostraram a acumulação de
Zn, Ni e Pb após a ingestão de bactérias contaminadas por esses metais.
Os dados da literatura demonstram que a sensibilidade dos ciliados ao cobre é
variável e dependente do organismo, das condições experimentais e da forma do metal
ao qual o organismo é exposto. Mandoni et al. (1996) observou que uma concentração
de cobre total de 9.6x10
-5
mol.L
-1
causou 89% de mortalidade na população de
protozoários e que 7 das 16 espécies estudadas desapareceram. Coppelloti (1998)
reportou que Euplotes vannus tolerou uma concentração de cobre de 3.1x10
-6
mol.L
-1
e
que a acumulação do metal ocorreu após os organismos terem sido expostos a uma
concentração de 6.2x10
-6
mol.L
-1
. Stoecker et al (1986) demonstrou que uma
153
concentração de 10
-10
mol.L
-1
Cu
2+
causou mortalidade em Favella sp e Balanion sp em
5 h de exposição, enquanto que 1.6x10
-13
mol.L
-1
Cu
2+
foi suficiente para diminuir a
taxa de crescimento em exposições mais longas. Shakoori et al. (2004) demonstrou
resistência em Vorticella microstoma em uma concentração de 3.4x10
-3
mol.L
-1
Cu
2+
.
Os resultados deste estudo sugerem que o cobre associado ao exopolissacarídeo
pode não ter sido disponibilizado através da degradação bacteriana, e o cobre livre
detectado no experimento referente ao final da cadeia trófica (2x10
-8
mol.L
-1
Cu
2+
) não
foi acumulado por M. mendocinus. Este fato pode ser decorrente de uma capacidade
reguladora de metal exibida por M. mendocinus. Sabe-se que alguns organismos
regulam a concentração interna de metal, permanecendo estas dentro de um nível
definido (Albergoni, et al., 1980). De acordo com Albergoni et al. (1980), dois
mecanismos participam da regulação interna de metal, o decréscimo da internalização
através da diminuição da permeabilidade e/ou absorção na superfície dos organismos e,
a expulsão do metal de dentro do organismo através de sistemas excretores. Rainbow e
Darllinger (1993) demonstraram os organismos reguladores possuem moléculas capazes
de regular a concentração interna de metais. No entanto, esses autores relatam que
apesar desses processos não serem raros em invertebrados, eles são restritos a certos
metais essenciais como o cobre e zinco.
Os resultados deste estudo demonstraram que o cobre associado ao
exopolissacarídeos de Anabaena spiroides não é acumulado pelos organismos e que
íons cobre livre foi acumulado em maior quantidade pela população bacteriana e pelo
ciliado. O organismo zooplanctônico M. mendocinus não acumulou íons cobre livre,
nem tampouco o cobre associado ao exopolissacarídeo, sugerindo ser regulador do
metal. Estes resultados apresentam importante significado ecológico, pois tanto o
ciliado quanto o copépode são organismos bastante comuns em ambientes eutrofizados,
154
ricos em materiais orgânicos dissolvidos e que exercem grande influência na especiação
do cobre.
155
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163
4.
CONCLUSÃO GERAL
A interação entre a matéria orgânica dissolvida, o metal traço cobre e os
organismos microheterotróficos, assim como os efeitos dessa interação sobre a dinâmica
e a
biodisponibilidade do cobre, foram avaliadas no presente trabalho. Através dos
resultados apresentados, demonstrou-se que as águas do Reservatório do Monjolinho
possuem dois sítios de complexação para o cobre, o que leva à uma baixa concentração
de íons cobre livre nesse ambiente. Conclui-
se
, ainda, que as bactérias heterotró
ficas
possuem habilidade em usar a matéria orgânica dissolvida natural como substrato
alimentar, e que o cobre complexado à essa matéria pode ser capturado e
biodisponibilizado pela população bacteriana. Deste modo, as bactérias heterotróficas
podem influenciar na dinâmica do cobre, assim como na sua disponibilidade para a
biota aquática.
A matéria orgânica dissolvida mostrou diminuir a toxicidade e
a
acumulação do
cobre nos organismos em relação ao metal iônico livre. No entanto, a influência do
complexo
MOD
-Cu sobre a disponibilidade de metal depende do tipo de matéria
orgânica e do tempo de exposição a esses complexos como demonstrado através dos
resultados experimentais onde utilizou
-
se material húmico e exopolissacarídeo.
Assim, os processos resultante
s da interação entre as bactérias heterotróficas e os
metais complexados à MOD são importantes para o entendimento da dinâmica desses
elementos nos ambientes aquáticos e suas conseqüências para biota em geral. Ainda,
para a correta interpretação do destino
e impacto ambiental dos metais e seus complexos
é necessário considerar a especiação dos metais, assim como as trocas dos metais entre
os complexos, o ambiente e a biota.
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