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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM TECIDO
ENDOMETRIAL TÓPICO E LESÕES ENDOMETRIÓTICAS
Daniel Blassioli Dentillo
Ribeirão Preto
2007
1
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM TECIDO
ENDOMETRIAL TÓPICO E LESÕES ENDOMETRIÓTICAS
Daniel Blassioli Dentillo
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo para concorrer ao título de Doutor,
pelo curso de Pós-Graduação em
Genética.
Ribeirão Preto
2007
2
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM TECIDO
ENDOMETRIAL TÓPICO E LESÕES ENDOMETRIÓTICAS
Daniel Blassioli Dentillo
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo para concorrer ao título de Doutor,
pelo curso de Pós-Graduação em
Genética.
Orientadora: Profa. Dra. Lúcia R. Martelli
Ribeirão Preto
2007
3
F
ICHA CATALOGRÁFICA
1. Endometriose, 2. RaSH, 3. Expressão gênica, 4. LOXL1, 5. HTRA1
Orientadora: Martelli, Lúcia R.
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/
USP – Área de concentração: Genética.
83 p.: il. ; 30cm
Expressão gênica diferencial em tecido endometrial e lesões endometrióticas.
Ribeirão Preto, São Paulo, 2007.
Dentillo, Daniel Blassioli
4
Data da Defesa: ____/____/____
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr._____________________________________________________________
Julgamento:__________________________Assinatura:________________________
Prof. Dr._____________________________________________________________
Julgamento:__________________________Assinatura:________________________
Prof. Dr._____________________________________________________________
Julgamento:__________________________Assinatura:________________________
Prof. Dr._____________________________________________________________
Julgamento:__________________________Assinatura:________________________
Prof. Dr._____________________________________________________________
Julgamento:__________________________Assinatura:________________________
5
Vim pelo caminho difícil,
a linha que nunca termina,
a linha que bate na pedra,
a palavra quebra uma esquina,
mínima linha vazia,
a linha, uma vida inteira,
palavra, palavra minha.
Paulo Leminski
6
DEDICATÓRIA
Dedico a minha família e meus amigos
que sempre me participaram de todas as
decisões de minha vida.
7
AGRADECIMENTOS
A Deus...
À Profa. Dra. Lúcia Regina Martelli, agradeço pela orientação e apoio...
Ao Prof. Dr. Rui Alberto Ferriani e Dr. Júlio César Rosa e Silva, agradeço a atenção e
amostras cedidas...
Ao Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, agradeço ao suporte técnico...
Ao Prof. Dr. Luiz Gonzaga Tone, agradeço ao suporte técnico
À Profa. Dra. Silvana Giuliatti e o mestrando Renato Puga, do Grupo de Bioinformática
(GBI), agradeço pelo suporte estatístico...
Aos Profs. Dr. Raysildo Lôbo e Dra. Ester Silveira Ramos, agradeço pelo convívio
agradável...
Ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP- USP).
Ao Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
Aos técnicos do Laboratório de Genética do Bloco C, em especial Sílvio A. Santos, Marli A.
V. Galerani e Reginaldo A Vila.
Ao meu grupo de pesquisa Ana Carolina Laus, Fábio R Pablos, Fernando H Biase, Gismar
Vieira, Juliana Cuzzi, Juliana Meola, Luciana C. Veiga, Maria Silvina J. de Vozzi e
Reginaldo Justino Ferreira.
Aos amigos Adriane, Alejandro, Álvaro, Andrea, Dante, Fernanda, Flávia, Francielle, Hélida,
Jair, Jaqueline, Jéferson, Kéllen, Lisandra, Marcelo, Marcus Vinícius, Maurício, Murilo,
Patrícia, Bloco C do Departamento de Genética (FMRP).
8
À equipe do Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática (LGMB), em especial
Lidiane C. Melato, Fernanda G. Barbuzano, Anemari Ramos Dinarte dos Santos e Daniel G.
Pinheiro.
À equipe do Laboratório de Oncologia Pediátrica, em especial Profa. Dra. Agda Karina
Brodoloni Eterovic, Prof. Dr. Carlos Alberto Scrideli, Profa. Dra. Rosane de Paula Gómes
Queiroz e aos doutorandos Fábio Motta, Vanessa Andrade, Maria Angélica Abdalla de Freitas
Cortez.
À minha Família...
À minha namorada...
Ao Programa de Excelência Acadêmica da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (PROEX/CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX/CNPq) e
Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência (FAEPA) pelo apoio financeiro.
9
RESUMO
DENTILLO, D.B. Expressão gênica diferencial em tecido endometrial tópico e lesões
endometrióticas. 2007. 83 p. Tese de Doutorado - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
– Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
Perdas gestacionais podem ser determinadas por vários fatores, dentre eles a
endometriose, doença ginecológica comum caracterizada pela presença e crescimento de
glândulas e estroma endometrial fora da cavidade uterina. Os principais sintomas da doença
envolvem, além de problemas de fertilidade, dismenorréia, dispaneuria, dor pélvica crônica e
irregularidades menstruais. Os locais mais freqüentes das lesões endometrióticas são o
peritônio e os órgãos pélvicos, principalmente ovários. A incidência da endometriose é difícil
de ser determinada devido à grande variabilidade de sintomas e à dificuldade para
confirmação diagnóstica, que requer método cirúrgico. Estima-se que 15% da população
feminina em idade reprodutiva seja afetada pela doença, sendo sua patogênese pouco
conhecida. A hipótese mais aceita é a da menstruação retrógrada, onde os fragmentos
endometriais descamados durante a fase menstrual seriam transportados através das tubas
uterinas até a cavidade peritonial com implantação, crescimento e invasão local e de órgãos
adjacentes. No entanto, apenas o refluxo não é suficiente para o estabelecimento da doença,
sendo necessário que as células endometriais possuam certas características moleculares que
favoreçam o aparecimento e a progressão da implantação ectópica. Vários estudos na
literatura evidenciam que as principais divergências moleculares entre portadoras e não
portadoras de endometriose estão relacionadas a processos envolvidos na apoptose, adesão
celular, angiogênese, biosíntese de estrógeno, sistema imune, além de fatores de crescimento
e metaloproteinases. Sendo assim, as pesquisas buscam a investigação de genes que se
expressem diferencialmente (maior ou menor expressão) nas células de lesões
endometrióticas por meio de várias técnicas. A hibridação subtrativa é uma metodologia de
10
screening gênico que compara dois grupos celulares distintos, permitindo isolar moléculas de
cDNA representantes do genoma de somente um dos dois grupos, pois remove as seqüências
comuns entre eles. A técnica de hibridação subtrativa rápida (RaSH) simplifica e torna mais
eficiente esse processo de subtração, identificando grande quantidade de seqüências
diferencialmente expressas. Com objetivo de determinar possíveis marcadores moleculares
para diagnóstico e tratamento da doença, aplicamos a técnica de RaSH para identificação de
genes com expressão diferencial em 11 amostras de lesões endometrióticas (cinco de origem
ovariana e seis de origem peritonial) e em 11 amostras de tecido endometrial tópico de
mulheres sem a doença. Após análise dos dados referentes a 166 sequências de referência, os
genes HTRA1, LOXL1, SPARC e SSAT foram selecionados para validação por meio da técnica
de RT-PCR quantitativa em tempo real, sendo que apenas os dois primeiros mostraram
diferença significativa entre os dois grupos estudados. Os genes HTRA1 e LOXL1
apresentaram expressão aumentada em lesões endometrióticas de pacientes afetadas, quando
comparada aos níveis de expressão no tecido endometrial de mulheres não afetadas. Os
resultados obtidos sugerem que os genes HTRA1 e LOXL1 podem ser considerados candidatos
a marcadores moleculares para o diagnóstico.
11
ABSTRACT
DENTILLO, D.B. Genes differentially expressed in topic endometrium and
endometriotic lesions. 2007. 83 p. Tese de Doutorado - Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto – Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
Gestational losses can be determined by a number of factors including endometriosis,
a common gynecological disease characterized by endometrial tissue found outside the uterine
cavity. The main symptoms of the disease involve dysmenorrhea, dyspaneuria, chronic pelvic
pain and menstrual irregularities, besides fertility problems. Endometriotic lesions are more
frequently found in the peritoneum and in pelvic organs, mainly ovaries. Endometriosis
incidence is difficult to be determined due to the wide variability of the symptoms and the
difficult diagnostic confirmation, which requires a surgical method. Nevertheless, it is
believed that around 15% of the female population in reproductive age is affected by the
disease, although its pathogenesis remains unclear. The most accepted hypothesis is the
retrograde menstruation, where endometrial fragments from the menstrual phase are
transported through the uterine tubes to the peritoneal cavity, where they undergo
implantation, growth, and adjacent tissues invasion. However, only reflux is not enough for
the disease establishment, and it is necessary that endometrial cells present molecular
characteristics favoring rise and progression of ectopic implantation. In the literature, a
number of studies highlight that the main molecular divergences between women with and
without endometriosis are related to processes involved in apoptosis, cellular adhesion,
angiogenesis, estrogen biosynthesis, immunological system, growth factors and
metalloproteinases. In doing so, a number of researches seek for the investigation of genes
differently expressed (up or down regulated) in endometriotic lesions cells using a variety of
methodologies. The subtractive hybridization is a gene screening methodology that compares
two distinct cellular groups, allowing the isolation of cDNA molecules representative from
12
the genome of only one of the two groups, because it removes common sequences among
them. The rapid subtractive hybridization methodology (RaSH) makes the process of
subtraction easier and more efficient, identifying a large amount of differently expressed
sequences. In this study, RaSH was used to identify differently expressed genes in 11 samples
of endometriotic lesions (five from ovarian origin and six from peritoneum origin), and in 11
samples from topic endometrial tissue from women without the disease to determine possible
molecular markers for diagnosis and treatment. After data analysis related to 166 reference
sequences, genes HTRA1, LOXL1, SPARC and SSAT were selected for validation using real
time quantitative RT-PCR. Only HTRA1 and LOXL1 presented significant difference
between the two studied groups. Genes HTRA1 and LOXL1 were up regulated in
endometriotic lesions from affected patients when compared with the expression levels in the
endometrial tissue of non-affected women. Our results suggest that the genes HTRA1 and
LOXL1 can be considered candidate molecular markers for the diagnosis of endometriosis.
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: A) Amostras de cDNAs obtidos a partir dos tecidos analisados transcrição reverva,
restrição enzimática com DpnII e ligação dos adaptadores; B) PCR com primers XDPN-18 e
restrição enzimática somente da amostra tester, representada pela lesão endometriótica; C)
Mistura das amostras tester e driver, seguida de reação de hibridação; D) Representação dos
híbridos gerados, ligação do híbrido tester-tester ao plamídeo tratado com a enzima de
restrição XhoI, transformação bacteriana, plaqueamento e seqüenciamento dos insertos
clonados.
Figura 2: Curva de calibração do gene LOXL1. Foi plotada a fluorescência da amplificação
versus o número de ciclos da PCR
Figura 3: Curva-padrão do gene LOXL1 obtida a partir da curva de calibração.
Figura 4: Diagrama de pontos interativos (interactive dot) para o gene HTRA1 obtido a partir
do software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os
pontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres
sem endometriose (representados no eixo horizontal como “Normal=0”) e nas amostras do
grupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Normal=1”). A
barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos grupos.
Figura 5: Diagrama de pontos interativos (interactive dot) para o gene LOXL1 obtido a partir
do software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os
pontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres
sem endometriose (representados no eixo horizontal como “Normal=0”) e nas amostras do
grupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Normal=1”). A
barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos dois grupos.
14
LISTA DE TABELAS
Tabela I: Seqüências de referência obtidas pela RaSH nas bibliotecas RHENDI e RHENDW.
Tabela II: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão
endometriótica para o gene SPARC.
Tabela III: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão
endometriótica para o gene SSAT.
Tabela IV: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão
endometriótica para o gene HTRA1.
Tabela V: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão
endometriótica para o gene LOXL1.
15
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
11β-HSD2 - Hydroxysteroid (11-beta) Dehydrogenase 2
AGDE - Ambulatório de Dor Pélvica e Endoscopia
ASRM - American Society for Reproductive Medicine
B61 – aliase do gene EFNA1 (epherin A1)
Bcl-2 - B-cell CLL/lymphoma 2
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool
BSEP – Bile Salt Export Pump
C4BP - Complement Component 4 Binding Protein
CA 19-9 - Carbohydrate Antigen 19-9
CA-125 - Carbohydrate Antigen 125
cDNA – complementary Deoxyribonucleic Acid
CEP - Comitê de Ética em Pesquisa
c-Myc - cellular Myelocytomatosis oncogene
CYP1A1 - cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1
DC21- aliase do gene SSAT (Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase)
DEPC - Dietil Pirocarbonato
DLX5 - Distal-Less Homeobox 5
DNA - Deoxyribonucleic Acid
EGF - Epidermal Growth Factor
EST - Expressed Sequence Tag
FBLN1 - Fibulin 1
FGF - Fibroblast Growth Factor
FMRP-USP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
GALT - Galactose-1-Phosphate Uridylyltransferase
GAPDH – Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Geap - Generic EST Annotation Pipeline
GlcNAc6ST - N-acetylglucosamine 6-O-sulfotransferase
GMST1 - Macrophage Stimulating 1
GnRH - Gonadotropin-Releasing Hormone
H
2
O
2
- Peróxido de Hidrogênio
HCl – Cloreto de Hidrogênio
16
HLA – Major Histocompatibility Complex
HTRA1 - High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase 1
ICAM-1 - Intercellular Adhesion Molecule-1
IGFBP5– Insulin-Like Growth Factor Binding-Protein 5
IL-1 - Interleukin 1
IL-15 - Interleukin 15
IL2RG - Interleukin 2 Receptor, Gamma
IL-6 – Interleukin 6
IL-8 – Interleukin 8
KFSD - keratosis Follicularis Spinulosa Decalvans (aliase do gene Spermidine/Spermine
N(1)-Acetyltransferase)
KH
2
PO
4
- Fosfato de Potássio Monobásico
L56 - aliase do gene HTRA1 (High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase 1)
LB- Lysogeny Broth
LIF - Leukemia Inhibitory Factor
LOL – aliase do gene LOXL1 (Lysyl Oxidase-Like 1)
LoTE – Low Tris-EDTA
LOXL1 - Lysyl Oxidase-Like 1
MEC - Matriz Extracelular
MMP11 - Matrix Metalloproteinase 11
MMP12 - Matrix Metalloproteinase 12
MMP-2 - Matrix Metalloproteinase 2
MMP3 - Matrix Metalloproteinase 3
Na
2
HPO
4
.12H
2
O - Fosfato de Sódio Monobásico Dodecahidratado
NaCl - Cloreto de Sódio
NAT2 - N-Acetyltransferase 2
NCBI - National Center for Biotechnology Information
NLM - National Library of Medicine
OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man
ON – aliase do gene SPARC (Secreted Protein, Acidic, Cysteine-rich (Osteonectin))
ORF480 - aliase do gene HTRA1 (High Temperature Requirement Factor A1 - serine
peptidase 1)
p53 – aliase do gene TP 53 (Tumor Protein p53)
PBS - Phosphate-Buffered Saline
17
PCR - Polymerase Chain Reaction
PRSS11- aliase do gene HTRA1 (High Temperature Requirement Factor A1 - serine peptidase
1)
PSAP – Prosaposin
PTEN – Phosphatase and Tensin Homolog
RaSH – Rapid Subtraction Hybridization
RefSeq – Reference Sequences
RHENDI – biblioteca de cDNAs do grupo de mulheres com endometriose (tester)
RHENDW - biblioteca de cDNAs do grupo de mulheres não afetadas pela endometriose
(tester)
RhoE - Ras Homolog Gene Family, Member E
RNA- Ribonucleic Acid
ROC - Receiver-Operating Characteristic
RQ - Relative Quantification
RT-PCR – Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction
SAT – aliase do gene SSAT (Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase)
SPARC - Secreted Protein, Acidic, Cysteine-rich (Osteonectin)
SSAT - Spermidine/Spermine N(1)-Acetyltransferase
TGF-α – Transforming Growth Factor Alfa
TGF-β – Transforming Growth Factor Beta
TIMP-3 – Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 3
TNF-α – Tumor Necrosis Factor Alfa
TP53 - Tumor Protein p53
UniGene – link do site www.ncbi.nlm.nih.gov que contém informações a respeito de
conjuntos de seqüências (gene ou pseudogene) que aparentemente são transcritos no mesmo
locus.
VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor
18
LISTA DE SÍMBOLOS
% - porcentagem
°C – graus Celsius
µg – microgramas
µL – microlitros
g – gramas
L – litros
M – molar
mg – miligramas
mL – mililitros
mM - milimolar
RPM – rotações por minuto
U – unidades
19
SUMÁRIO
RESUMO
A
BSTRACT
I.
INTRODUÇÃO 01
I.1. ENDOMETRIOSE 02
I.1.1.
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS 02
I.1.2. ASPECTOS GENÉTICOS DA ENDOMETRIOSE 07
I.1.3.
ASPECTOS MOLECULARES E PATOGÊNESE 08
I.2.
METODOLOGIA DE INVESTIGAÇÃO MOLECULAR 11
I.3.
JUSTIFICATIVA 14
II.
OBJETIVOS 15
III. MATERIAL E MÉTODOS 16
III.1.
AMOSTRAS 16
III.2.
METODOLOGIA 17
III.2.1 ISOLAMENTO DO RNA TOTAL 17
III.2.2.
RAPID SUBTRACTION HYBRIDIZATION (RASH) 18
III.2.2.1.
SÍNTESE DE CDNA 21
III.2.2.2. DIGESTÃO ENZIMÁTICA E LIGAÇÃO DOS ADAPTADORES 21
III.2.2.3. PCR E PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS 21
III.2.2.4.
DIGESTÃO DO TESTER E HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA 22
III.2.2.5.
TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA E GERAÇÃO DAS BIBLIOTECAS
DE C
DNA 22
III.2.2.6.
ANÁLISE DAS COLÔNIAS E OBTENÇÃO DOS DADOS 23
III.2.3.
VALIDAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS GENES SELECIONADOS 26
III.2.3.1. SÍNTESE DE CDNA 26
III.2.3.2. EFICIÊNCIA DA REAÇÃO 26
III.2.3.3.
QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA 28
III.2.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 28
IV.
RESULTADOS 30
IV.1.
OBTIDOS PELA TÉCNICA DE RASH 30
20
IV.2. GENES SELECIONADOS 47
IV.3.
RT-PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL 48
IV.4.
ANÁLISE ESTATÍSTICA 50
V.
DISCUSSÃO 53
V.1. HTRA1 – Htra (High Temperature Requirement Factor A1) Serine Peptidase 1 54
V.2. LOXL1 – lysyl oxidase – like 1 57
V. 3. SPARC – secreted protein, acidic, cystein – rich (osteonectin) 60
V.4. SSAT – spermidine/spermine N1 – acetyltranferase 62
VI.
CONCLUSÕES 65
VII.
REFERÊNCIAS 66
ANEXOS 84
21
I. INTRODUÇÃO
Infertilidade é definida como a incapacidade do casal em obter gravidez após um ano de
relacionamento sexual, sem uso de métodos anticoncepcionais (Healy et al., 1994; Gnoth et
al., 2005). Cerca de 10 a 15% dos casais são inférteis e aproximadamente 70% das gestações
não chegam a termo, sendo que 50 a 60% das perdas fetais ocorrem no primeiro mês e 1% dos
casais apresentam perdas recorrentes (Bulletti et al., 1996; Mercorio et al., 2006). Estima-se
que 48% dos casos de infertilidade sejam causados por fatores femininos e que 28% não
tenham etiologia estabelecida (Jose-Miller et al., 2007). Diversos fatores podem ser
responsáveis por perdas gestacionais, dentre eles: anormalidades uterinas, alterações
genéticas; disfunções endócrinas e imunológicas; agentes infecciosos; poluentes ambientais e
endometriose. Embora em muitos casos seja possível reconhecer a causa, mais de 50% das
perdas gestacionais recorrentes permanecem sem explicação após investigação ginecológica,
hormonal e citogenética (Lissalde-Lavigne et al., 2005). Pressupõe-se que os casos de
infertilidade sem causa aparente sejam conseqüência da baixa receptividade endometrial,
considerando o endométrio como fator prevalecente na determinação da fertilidade da mulher
(Strowitzki et al., 2006). Corroborando essa hipótese, Bernabeu e colaboradores (2005)
relataram que, em reprodução assistida, o maior fator limitante para o sucesso da fertilização
in vitro era a implantação embrionária.
Nas últimas décadas, muitas pesquisas vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de
identificar genes e proteínas expressos pelo endométrio e que possam estar relacionados à sua
receptividade. Embora no processo implantacional a função individual dessas moléculas não
seja totalmente conhecida, os dados resultantes desses estudos forneceram informações
complementares, revelando uma complexa via de regulação gênica para que o endométrio
22
atinja o estado receptivo (Horcajadas et al., 2004; Strowitzki et al., 2006; Horcajadas et al.,
2007).
Dentre os genes estudados estão, por exemplo, os que codificam receptores de
progesterona e estrógeno, o fator inibidor da leucemia (LIF), moléculas adesivas, como a
integrina αvβ3; TGF-β (transforming growth factor-β), interleucinas, como as IL-1 e IL-6 e
metaloproteinases, como as MMP11 e MMP12 (Puri et al., 2000; Popovici et al., 2006).
A expressão diferencial desses genes parece determinar tanto a condição uterina saudável,
propícia para a gestação, quanto condições patológicas que variam desde a baixa
receptividade endometrial até o desenvolvimento da endometriose.
I. 1. ENDOMETRIOSE
I. 1. 1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
Endometriose é uma doença ginecológica comum, crônica, benigna, porém agressiva,
caracterizada pela presença e crescimento de glândulas e estroma endometrial fora da
cavidade uterina, onde é denominado tecido ectópico (Giudice & Kao, 2004; Yang et al.,
2004; Sharpe-Timms, 2001).
Os principais sinais clínicos e sintomas da endometriose são dismenorréia (dor pélvica
durante a menstruação), dispaneuria (dor durante o ato sexual), dor pélvica crônica,
irregularidades menstruais e infertilidade (Poliness et al., 2004; Arya & Shaw, 2005; Wu et
al., 2005). Outros sintomas podem estar relacionados à doença, como dor durante a ovulação
e fadiga crônica (Kenedy et al., 2005). Em aproximadamente 4% dos casos há queixa de
disúria, causada pelo envolvimento da bexiga (Hassa et al., 2005), sendo que 3 a 34% das
23
mulheres afetadas apresentam sintomas relacionados ao trato gastrointestinal (Gustofson et
al., 2006). Entretanto, muitas pacientes podem ser assintomáticas (Nap et al., 2004).
O tecido ectópico responde a hormônios e drogas de maneira similar ao endométrio
situado no local original, denominado de tecido eutópico. Desta forma, está sujeito às
alterações que se manifestam no decurso do ciclo sexual feminino e o sangramento das lesões
endometrióticas parece contribuir para desencadeamento de reação imunológica local,
inflamação e formação de adesões fibróticas, que podem ser responsáveis pela sintomatologia
das pacientes (Arya & Shaw, 2005).
A incidência exata da endometriose é desconhecida e difícil de ser determinada, devido à
variabilidade dos sintomas e à definição diagnóstica, que requer abordagem cirúrgica (Prowse
et al., 2005). Entretanto, acredita-se que aproximadamente 15% da população feminina em
idade reprodutiva seja afetada pela doença, sendo que 30 a 40% das mulheres inférteis
apresentam endometriose. Tem sido também identificada como causa de dor pélvica e
abdominal em 15 a 32% dos casos submetidos a diagnóstico laparoscópico. Nas pacientes
com endometriose que apresentam dor pélvica, infertilidade ou ambas, a freqüência é de 35-
50% (Hassa et al., 2005; Giudice & Kao, 2004).
Os locais mais freqüentes de lesões endometrióticas são o peritônio e os órgãos pélvicos,
principalmente ovários, seguidos pelo septo reto-vaginal. Menos de 12% das lesões
localizam-se em regiões extra pélvicas, localizadas com maior freqüência nos tratos
gastrointestinal (sigmóide, reto, área ileocecal e apêndice) e urinário. Raramente pode
acometer outras partes do corpo, como pulmões, tórax, pericárdio e cérebro. Sua distribuição
é variável, desde poucas regiões afetadas e lesões pequenas até implantes difusos e profundos
envolvendo extensas áreas e órgãos pélvicos, além da formação de cistos endometrióticos
(endometriomas) e de aderências, as quais causam distorção da anatomia pélvica (Kennedy et
al., 2005; Barlow & Kennedy, 2005).
24
Segundo a American Society for Reproductive Medicine (ASRM, 1997), a endometriose
pode ser classificada em quatro estágios (de I a IV), em forma mínima, leve, moderada e
severa, conforme a extensão ou tamanho das lesões encontradas. Este método ajuda a avaliar
a severidade da doença e quantificar o volume das lesões, além de auxiliar na avaliação da
resposta das pacientes ao tratamento (Arya & Shaw, 2005; Kennedy et al., 2005).
Adicionalmente, as lesões endometrióticas do peritônio, ovário e septo reto-vaginal
podem ser subdivididas em três tipos distintos, de acordo com a fase de desenvolvimento da
doença. As lesões vermelhas são caracterizadas por atividade celular intensa e ampla
vascularização, correspondendo aos estágios iniciais da endometriose, quando ocorre
implantação ectópica do tecido endometrial. O sangramento deste tecido, seguido de novo
crescimento tecidual, desencadeia resposta inflamatória ao redor da lesão, formando uma
escara de aparência escura, passando então a ser classificada como lesão negra. A seguir, a
fibrose resultante do processo inflamatório e a conseqüente redução de vasos sanguíneos no
foco endometriótico deixam-na opaca, com aspecto cicatricial, sendo denominada de lesão
branca. Acredita-se que nesta última fase as lesões possam permanecer em estado latente
(Nisolle & Donnez, 1997).
A endometriose possui ainda características celulares comuns a neoplasias, como por
exemplo proliferação clonal, tendência a metástase e invasão tecidual. Transformações
malignas parecem estar associadas a 0,7-1,0% dos casos, sendo 70% deles adenocarcinomas
endometrióides. Vários estudos demonstram que as pacientes têm risco aumentado de
desenvolver certos tipos de câncer, predominantemente o ovariano, que abrange 76% das
ocorrências (Barlow & Kennedy, 2005; Kitajima et al., 2005; Judson et al., 2000; Swiersz,
2001). Contudo, esse risco parece ser extremamente baixo para pacientes jovens, tornando-se
maior em períodos próximos à menopausa, tornando, dessa forma, importante o diagnóstico
precoce das lesões endometrióticas. Outros sítios de implantação relacionados a processos
25
malignos são o intestino, bexiga, parede peritonial, vagina e tubas uterinas (Zanetta et al.,
2000; Bergqvist et al., 2004).
Apesar de ser uma das doenças humanas mais freqüentes e ser bem caracterizada, sua
patogênese permanece pouco conhecida (Redwin, 2002; Bischoff & Simpson, 2004). Segundo
revisão de Knapp (1999) com dados históricos sobre a doença, a primeira descrição pelo
médico alemão Daniel Shroen data de 1690, já sugerindo ser esta uma doença comum que
acometia mulheres sexualmente maduras. Porém, somente em 1927, Sampson caracterizou a
endometriose como é conhecida atualmente, elaborando a hipótese etiológica mais aceita. A
hipótese, denominada metastática, é de que por meio da menstruação retrógrada fragmentos
endometriais, descamados durante a fase menstrual, contendo células viáveis, são
transportados através das tubas uterinas até a cavidade peritonial onde se implantam, crescem
e invadem tecidos de órgãos adjacentes (Arya & Shaw, 2005). Algumas evidências sustentam
tal hipótese, como a presença de células endometriais viáveis no efluente menstrual e fluido
peritonial, o endométrio ser capaz de se implantar e crescer dentro da cavidade peritonial e
cerca de 70 a 90% das mulheres apresentarem menstruação retrógrada (Guo et al., 2004;
Kyama et al., 2003). Dessa maneira, algumas características têm sido consideradas fatores de
risco para o desenvolvimento da endometriose, como: ciclos menstruais de curta duração;
maior duração da menstruação e menarca precoce, pois aumentam o tempo de exposição às
células endometriais (Mounsey et al., 2006).
No entanto, apenas o refluxo não é suficiente para estabelecer a doença, sendo necessárias
outras condições que permitam que as células endometriais permaneçam funcionais no local
da lesão. Apesar do tecido ectópico ser histogicamente e morfologicamente similar ao
eutópico (endométrio situado no local original, ou seja, revestindo a cavidade uterina), eles
apresentam diferenças qualitativas ou quantitativas em vários aspectos, como expressão de
distintas de moléculas (Gaetje et al., 1995; Sharpe-Timms, 2001). Acredita-se que
26
determinadas características moleculares favoreçam o aparecimento e a progressão da
implantação ectópica, e podem explicar o motivo pelo qual somente algumas mulheres
desenvolvem a doença (Viganò et al., 2006).
Estabelecer o diagnóstico da endometriose somente com base na sintomatologia é uma
tarefa bastante difícil devido a sua variabilidade, além do que a gravidade da doença nem
sempre está relacionada ao quadro clínico. Assim, pode haver um intervalo de anos entre o
aparecimento de sintomas e o diagnóstico definitivo (Kennedy et al., 2005). Apesar das
imagens de ultra-sonografia e ressonância magnética serem utilizadas como testes
diagnósticos, elas são úteis somente para detecção de endometriomas ovarianos e implantes
endometrióticos extrapélvicos, respectivamente (Spaczynski & Duleba, 2003; Arya & Shaw,
2005). O procedimento padrão para determinação da localização, estadio, extensão e tipo das
lesões é a laparoscopia, mesmo que algumas lesões não sejam reconhecidas devido ao
pequeno tamanho ou por estarem atrás de estruturas de adesão (Brosens et al., 2004). Mesmo
sendo considerado invasivo, oneroso e com determinado risco para as pacientes, atualmente
não existe diagnóstico confiável que não utilize esse método cirúrgico (Spaczynski & Duleba,
2003; Barlow & Kennedy, 2005).
Considerando a dificuldade diagnóstica, muitos estudos têm sido elaborados na tentativa
de identificar marcadores séricos para a endometriose (Brosens et al., 2003). Nesse contexto,
muitos autores estudaram a correlação entre a doença e os antígenos tumorais CA-125 e CA
19-9, os quais são detectados em maiores quantidades no soro de portadoras, principalmente
em estágios mais avançados (Harada et al., 2002). No entanto, apesar destes marcadores
terem alta especificidade, ambos possuem baixa sensibilidade, e têm sido utilizados de forma
eficaz apenas no monitoramento de pacientes em tratamento (Harada, 2002; de Sá Rosa e
Silva, 2006). O tratamento para a doença também é um desafio. Em geral tem com objetivo
27
eliminar e prevenir o reaparecimento dos implantes endometrióticos, cujos sintomas estão
principalmente relacionados a dor e subfertilidade (O’Callaghan, 2006).
Atualmente, o tratamento consiste de drogas como análgésicos, pílulas contraceptivas
orais e análogos de GnRH, cirurgia ou ambos (Mounsey et al., 2006). Embora nenhuma
terapia tenha se demonstrado eficaz, as lesões são erradicadas com sucesso através de
procedimentos cirúrgicos, como eletrocauterização e destruição a laser. Em 47% dos casos há
recorrência das lesões (Esfandiari et al., 2007; Marcoux et al., 1997). Em pacientes com
endometriose mínima ou média associada a problemas de fertilidade, tanto a retirada das
lesões e lise de adesões quanto a inseminação intra-uterina são métodos que aumentam a
probabilidade de gravidez (Kennedy et al., 2005; Tummon et al., 1997). Condutas radicais,
como a histerectomia, podem ser indicadas para casos mais severos, sendo que a taxa de
recorrência nessas pacientes é de 5 a 10% (Arya & Shaw, 2005).
I. 1. 2. ASPECTOS GENÉTICOS DA ENDOMETRIOSE
A origem genética da endometriose foi baseada em estudos familiais, que evidenciaram
maior incidência da doença em parentes de primeiro grau de mulheres afetadas, de 4,3 a 6,9%,
em relação a parentes de mulheres não afetadas, de 0,6 a 2,0% (Simpson & Bischoff, 2002).
No entanto, a grande quantidade de alterações moleculares e celulares detectadas sugere
origem poligênica da doença (Hu et al., 2005). Sendo assim, o fenótipo resultante pode
decorrer das interações entre produtos da expressão de determinados alelos de genes
específicos envolvidos (Barlow & Kennedy, 2005). É verossímil também a idéia de que o
ambiente peritonial de mulheres susceptíveis à enfermidade possa favorecer modificações na
integridade genômica das células endometriais que provêm do efluente menstrual e, assim,
ocasionar o surgimento das lesões (Guo et al., 2004).
28
Já a associação entre endometriose e câncer está baseada principalmente no conhecimento
adquirido por estudos cromossômicos. Regiões com ganho de material possivelmente abrigam
oncogenes, enquanto que os genes supressores tumorais encontram-se em regiões de perda
cromossômica. As alterações observadas foram descritas em regiões onde há perdas de
seqüências de DNA, como nas regiões 1p, 5p, 6q e 22q (Gogusev et al., 2000). Entre os genes
com possível desencadeamento de malignidade, estão os supressores tumorais PTEN e TP53 e
os proto-oncongenes Bcl-2 e c-myc (Viganó et al., 2006).
I. 1. 3. ASPECTOS MOLECULARES E PATOGÊNESE
Considerando a alta incidência da doença na população feminina, as conseqüências do
processo e também a ausência de diagnóstico e tratamento efetivos, grande esforço científico
tem sido direcionado para pesquisas sobre a doença. Vários estudos na literatura evidenciam
que as principais divergências moleculares entre portadoras e não portadoras de endometriose
estão relacionadas a processos envolvidos na apoptose (Braun et al., 2002), adesão celular
(Béliard et al., 1997), angiogênese (Healy et al., 1998), biosíntese de estrógeno (Zeitoun &
Bulun, 1999), sistema imune, além de fatores de crescimento (Braun & Dmowski, 1998) e
metaloproteinases (Martelli et al., 1993).
Dessa forma, uma sequência determinada de eventos faz-se necessária para o
estabelecimento das lesões. Primeiramente, as células endometriais devem ter maior
capacidade para estabelecer interações célula-célula e entre células e matriz extracelular nos
locais onde se implantam. O fato de que o tecido endometriótico é capaz de expressar
diferentes integrinas pode explicar a habilidade desse tecido em aderir ao peritônio, uma vez
que essas moléculas servem como receptoras de laminina, fibronectina, colágeno tipo I e IV e
vibronectina. (Regidor et al., 1998). A expressão aumentada de moléculas de adesão, como
29
ICAM-1, em mulheres acometidas pela endometriose também auxilia na elucidação desse
fenômeno (Matalliotakis et al., 2001).
Após a fixação, as células que formam a lesão têm que ser hábeis para invadir o tecido ao
qual se ligaram. Logo, o aumento da expressão de metaloproteinases, como MMP-2, e a
expressão reduzida de seus inibidores, como TIMP-3, sugerem maior atividade proteolítica e
conseqüentemente maior potencial invasivo de células endometriais em pacientes com
endometriose (Chung et al., 2002; Cox et al., 2001).
Para sustentação das lesões endometrióticas, a neovascularização é um processo
importante e comumente observado ao redor delas. Atividade e quantidade aumentadas de
fatores angiogênicos no fluido peritonial de pacientes têm sido descritas na literatura, sendo
VEGF, a principal molécula envolvida, expressa nos implantes endometrióticos (Donnez et
al., 1998; Viganó et al., 2004).
Como a endometriose é uma doença estrógeno dependente, a síntese desse hormônio
auxilia a manutenção dos implantes ectópicos. Em 1999, Zeitoun e Bulun observaram alta
síntese de aromatase em cistos endometrióticos e implantes endometriais extra-ovarianos.
Considerando que a aromatase cataliza a biosíntese de estrógeno, os autores sugeriram que
essa expressão aberrante está relacionada à patogênese da doença.
O desenvolvimento da doença também depende da proliferação da lesão estabelecida, a
qual é mais alta nas células epiteliais, estromais e endoteliais do endométrio de mulheres
portadoras (Wingfield et al., 1995). Exemplos de fatores que intensificam o crescimento
celular incluem FGF, EGF, TGF-α, TGF-β e TNF- α (Hammond et al., 1993).
Outro fenômeno que ajuda a explicar a persistência das lesões endometrióticas fora da
cavidade uterina é a resistência à apoptose, devido à desregulação entre moléculas pró-
apoptóticas menos expressas, como por exemplo a p53, e moléculas anti-apoptóticas, como
Bcl-2, mais expressas (Braun et al., 2007; Jones et al., 1998).
30
Em relação à imunologia da endometriose, foi sugerido que as células dos implantes
ectópicos apresentam mecanismos de escape, quer seja pela modificação da expressão de
antígenos, como HLA classe I, que impedem o reconhecimento imunológico, ou pela secreção
de TGF-β e prostaglandina E2, que inibem a função linfocitária, quer seja pelo
comprometimento da atividade das células natural killer, levando à redução da vigilância
imunológica. Além disso, foi descrito um aumento no número de macrófagos ativos no fluido
peritonial das pacientes, os quais secretam citocinas, como IL-8 e TNF-α, promovendo
proliferação celular, adesão e angiogênese (Semino et al., 1995; Oosterlynck et al., 1991).
Adicionalmente, as alterações secundárias ou conseqüentes à endometriose também têm
sido estudadas em nível molecular. Quanto à infertilidade, considera-se que a causa principal
de baixas taxas de gravidez em pacientes afetadas pela doença está relacionada a
anormalidades na expressão de moléculas endometriais, resultando em falhas na implantação
embrionária (Kao et al., 2003). Essa consideração apóia-se no fato de que a expressão da
integrina αVβ3, importante durante o período de receptividade uterina ao embrião, está
ausente no endométrio tópico das mulheres afetadas pela patologia (Vernet-Tomás et al.,
2006), além do que os altos níveis de óxido nítrico endotelial encontrados nessas mulheres
podem ser responsáveis por efeitos citotóxicos, que tornam o útero menos receptivo ao
embrião (Khorram & Lessey, 2002). Outras investigações revelaram que o fluido peritonial de
mulheres com endometriose pode ser tóxico aos espermatozóides e exibe efeito adverso à
sobrevivência embrionária, pois quando inoculado em coelhos, ratos e hamsters, reduzia as
taxas de implantação embrionária nesses animais (Giudice et al., 2002). Além disso, os
produtos secretados pelo endométrio ectópico e/ou por células imunológicas contêm
substâncias com efeito prejudicial à fertilidade (como citocinas, fatores de crescimento,
prostaglandinas, espécies reativas de oxigênio e auto-anticorpos) que interferem na ovulação,
função endócrina, transporte de gametas e do embrião, fertilização e desenvolvimento
31
embrionário, aumentando assim a possibilidade de falhas de implantação do embrião
(Dmowski et al., 2002).
I. 2. METODOLOGIA DE INVESTIGAÇÃO MOLECULAR
Na última década, muitos estudos foram realizados na área de genética molecular com
objetivo de explorar o genoma dessas pacientes, visando a identificação de genes candidatos a
marcadores da endometriose (Taylor et al., 2002). Alguns autores tentaram associar a doença
a polimorfismos genéticos, relacionados, por exemplo, com os genes GALT, CYP1A1, NAT2 e
GMST1. Esses estudos, no entanto, apresentaram resultados controversos (Bischoff &
Simpson, 2004).
Atualmente, as pesquisas buscam a investigação de genes que se expressem
diferencialmente (maior ou menor expressão) nas células que correspondem às lesões
endometrióticas. Para isso, várias metodologias foram aplicadas para screening desses genes,
dentre elas as principais são microarrays, hibridação genômica comparativa e biblioteca
subtrativa (Gogusev et al., 1999; Gogusev et al., 2000; Kao et al., 2003; Guo et al., 2004; Hu
et al., 2005; Flores et al., 2006). Alguns autores buscaram esclarecer se existe diferença de
expressão gênica entre os tecidos eutópico e ectópico das mesmas pacientes. Com isso,
puderam avaliar quais genes influenciavam modificações nas células endometriais do útero,
tornando-as capazes de se implantar em locais e órgãos distintos.
A hibridação subtrativa é uma metodologia que compara dois grupos celulares
distintos denominados tester e driver, permitindo isolar genes mais expressos em somente um
dos dois grupos, pois remove seqüências comuns entre eles (Cho & Park, 1998; Taylor et al.,
2002). Segundo Jiang e colaboradores em 2000, a técnica de hibridação subtrativa rápida
(RaSH) simplifica e torna mais eficiente o processo de subtração, identificando grande
32
quantidade de seqüências diferencialmente expressas, o que inclui genes conhecidos, além de
seqüências ainda não descritas nos bancos de dados atuais. Resumidamente, o protocolo de
RaSH é baseado na digestão enzimática dos cDNAs das amostras dos dois grupos a serem
testados e os fragmentos gerados são ligados a adaptadores e amplificados por PCR. Após
esses passos, somente as amostras de um dos grupos (tester) são digeridos novamente, com a
enzima de restrição XhoI. Posteriormente as seqüências de ambos os grupos são incubadas
juntamente para que ocorra hibridação. Nesta etapa, as amostras do grupo denominado driver
são colocadas em excesso na reação, o que garante a subtração. O resultado do processo são
moléculas representadas por 3 tipos de cDNA fita dupla: driver-driver, driver-tester e tester-
tester. Somente a população de moléculas tester-tester é selecionada após ligação a
plasmídeos previamente tratados com a enzima XhoI. Então os plasmídeos recombinantes são
inseridos por transformação bacteriana, e as bactérias plaqueadas em meio de cultura.
Finalmente os insertos são retirados das colônias e seqüenciados.
Em 2002, Eyster e colaboradores empregaram a tecnologia de cDNA microarrays
comparando os níveis de expressão gênica em três pacientes, numa plataforma com 4133
genes. Oito deles foram considerados super-expressos nos implantes ectópicos, alguns
responsáveis por componentes do citoesqueleto (como vimentina) e os demais com funções
relacionadas ao sistema imune. Com o mesmo intuito, Hu, Tay & Zhao, em 2005, utilizaram
hibridação subtrativa de cDNA em 15 pacientes com a doença. Neste trabalho obtiveram 78
cDNAS diferentes, entre os quais 14 genes foram classificados como possíveis candidatos a
marcadores da doença. Entre os genes mais expressos nas lesões estavam o IGFBP5,
relacionado ao crescimento das lesões e PSAP e FBLN1, associados a câncer ovariano e de
mama. Entre os menos expressos, estavam os genes RhoE, ligado a adesão celular, DLX5, que
auxilia na persistência do estado proliferativo das células endometrióticas e 11β-HSD2,
33
responsável por estimular atividade da aromatase, atuando assim como mantenedor das lesões
em local ectópico.
Após terem evidenciado que o endométrio eutópico das pacientes com endometriose
possuía propriedades intrínsecas que provocavam seu desenvolvimento em lesões
endometrióticas (Gagné et al., 2003), pesquisadores procuraram estudar a expressão gênica
diferencial do endométrio de mulheres portadoras e não portadoras de endometriose, para
identificar possíveis genes de susceptibilidade à doença. Flores e colaboradores, em 2006,
aplicaram amostras de cDNA, obtidas a partir de RNA de linfócitos de sangue periférico dos
dois grupos estudados, em arrays contendo 14185 seqüências de genes conhecidos. Os
resultados incluíram genes envolvidos no metabolismo de colágeno, promoção da proliferação
celular e tumorigênese, mas diferenças de expressão mais significativas foram relacionadas
aos genes IL2RG e LOXL1, ligados ao sistema imunológico e supressão tumoral,
respectivamente. Também em 2006, Kyama e colaboradores aplicaram a técnica de PCR em
tempo real para avaliar a expressão de mRNAs de citocinas, metaloproteases, fatores de
crescimento e de adesão em biópsias endometriais e peritônio de mulheres com e sem a
doença. Foi detectado aumento da expressão de moléculas de mRNA referentes aos genes
TNF-α, IL-8 e MMP-3, principalmente na fase menstrual do ciclo sexual feminino. Esse
resultado significa maior capacidade do tecido endometrial das pacientes em proliferar, aderir
e formar vasos sanguíneos, promovendo o implante ectópico e o desenvolvimento das lesões
endometrióticas. Os autores sugeriram que a progressão da doença, bem como seu
estadiamento, podiam ser preditas de acordo com o nível de expressão gênica de citocinas
pró-inflamatórias e MMPs.
Em 2003, Kao e colaboradores usaram microarrays para pesquisa de genes associados a
falhas de implantação embrionária e infertilidade, utilizando amostra de tecido endometrial de
oito afetadas e 12 mulheres sem a doença. Os resultados sugeriram que a maior expressão dos
34
genes B61 e semaforina E, participantes do processo de neovascularização, determinaria o
estabelecimento das lesões. Além disso, foi postulado que a desregulação de outros genes,
como BSEP, C4BP, glicodelina, IL-15 e pentaxina II, provocaria respostas inflamatórias,
disfunção do sistema imune, toxicidade embrionária e apoptose, produzindo ambiente uterino
inóspito para o início da gravidez. Simultaneamente, a alteração da expressão de GlcNAc6ST
poderia bloquear mecanismos de adesão endometrial, resultando em falha implantacional.
Apesar da extensa investigação molecular descrita por diferentes grupos de pesquisa,
ainda não há consenso sobre quais genes e seus produtos são responsáveis pelo surgimento e
progressão da endometriose, assim como quais moléculas podem ser consideradas marcadoras
para diagnóstico e terapêutica.
I. 3. JUSTIFICATIVA
Apesar da extensa literatura sobre a determinação da origem da endometriose, sua
etiologia permanece desconhecida. Devido à alta freqüência da doença em mulheres em idade
reprodutiva, principalmente em pacientes inférteis, e aos métodos invasivos utilizados para
seu diagnóstico, torna-se importante a busca de novas metodologias de investigação. Este
projeto busca identificar genes envolvidos na fisiopatologia da endometriose, com objetivo de
determinar possíveis marcadores moleculares para diagnóstico e tratamento da doença.
35
II. OBJETIVOS
O objetivo principal do trabalho foi identificar por meio da técnica de RaSH (Rapid
Subtraction Hybridization), genes com expressão diferencial em lesões endometrióticas e em
tecido endometrial de mulheres não afetadas.
Os objetivos intermediários foram:
(1) identificar genes com maior ou menor expressão em lesões endometrióticas de pacientes
com diagnóstico firmado de endometriose;
(2) identificar genes com maior ou menor expressão em endométrio de mulheres não afetadas
pela doença, para análise comparativa;
(3) correlacionar os genes expressos diferencialmente com os processos fisiopatológicos
relacionados à endometriose.
36
III. MATERIAL E MÉTODOS
Este projeto foi desenvolvido no Laboratório de Genética Molecular e Citogenética
Molecular Humana do bloco C do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto (FMRP-USP), com apoio de equipe multidisciplinar da área de Genética
Reprodutiva, em colaboração com o serviço de Reprodução Humana do Departamento de
Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP, do Laboratório de Genética Molecular e
Bioinformática da Fundação Hemocentro da mesma instituição e do Laboratório de Oncologia
Pediátrica do Departamento de Pediatria e Puericultura da FMRP-USP. O projeto foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HCFMRP-USP, processo HCRP n
o
11736/2004. Todas as pacientes participantes da pesquisa assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido.
III. 1. AMOSTRAS
Para realização deste projeto, foram coletadas 22 amostras de tecido endometrial de
pacientes atendidas em ambulatórios especializados do HCFMRP-USP, divididas em dois
grupos.
O grupo I compreende 11 biópsias de lesões endometrióticas, sendo cinco de origem
ovariana e seis de origem peritonial, de pacientes encaminhadas aos Ambulatórios de Dor
Pélvica e Endoscopia (AGDE) e de Infertilidade Conjugal do HCFMRP-USP, diagnosticadas
com endometriose por meio de exame laparoscópico, confirmado por análise histológica.
O grupo II (grupo controle) compreende 11 amostras de endométrio tópico, sendo as
biópsias obtidas utilizando cureta de Novak, de pacientes sem diagnóstico de endometriose,
37
após serem submetidas à laparoscopia, encaminhadas pelo Ambulatório de Planejamento
Familiar para laqueadura tubária.
As amostras foram coletadas no centro cirúrgico do HCFMRP-USP e armazenadas em
freezer -80
0
C após tratamento com criopreservador Tissue-Teck
®
O.C.T. Compound (Sakura
Finetek USA. Inc., Torrance, CA).
O estadio da doença foi determinado de acordo com a classificação da American Society
for Reproductive Medicine (Revised American Society for Reproductive Medicine
classification of endometriosis: 1996). Os critérios de inclusão foram amostras de pacientes
com idade entre 18 e 40 anos, apresentando ciclos menstruais regulares de 25 a 35 dias, que
estivessem na fase proliferativa do ciclo menstrual e sem uso de anticoncepcional oral ou
qualquer outra forma de tratamento hormonal no período de três meses anterior à coleta.
III. 2. METODOLOGIA
III. 2. 1. ISOLAMENTO DO RNA TOTAL
Anteriormente à extração de RNA, eliminamos o criopreservador lavando os tecidos com
1mL de PBS (NaCl 8,50g/L; Na
2
HPO
4
1,11g/L; Na
2
HPO
4
.12H
2
O 2,81g/L; KH
2
PO
4
0,20g/L
pH7,0) por três vezes.
As amostras foram maceradas completamente com nitrogênio líquido e para cada 50mg de
tecido adicionamos 1mL de TRIZOL
®
Reagent (Invitrogen Life Technologies, USA –
Molecular Research Center, Inc.) até atingir consistência líquida. O RNA total de cada
amostra de tecido foi isolado adicionando 200μL de clorofórmio, seguido de centrifugação, de
acordo com as recomendações do fabricante. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo
38
e o RNA foi então precipitado com 500μL de álcool isopropílico. O pellet foi lavado com
1mL de etanol 75% e, após secagem, diluído em 12μL de água tratada com DEPC.
A integridade do RNA foi analisada em gel de agarose 1%, marcado com brometo de
etídeo e visualizada com luz ultra-violeta. A verificação de bandas de RNAs ribossômicos de
28S e 18S intactos foram usadas como critério para certificação de que os RNAs não estavam
degradados. As concentrações das soluções de RNA foram medidas em espectofotômetro
(Eppendorf) a DO
260
, depois de diluídas individualmente em 10μL de água livre de RNAse.
O RNA permaneceu armazenado à -80
0
C até o momento do uso.
III. 2. 2. RAPID SUBTRACTION HYBRIDIZATION (RaSH)
No presente trabalho, aplicamos o protocolo de RaSH (Jiang et al., 2000) com
modificações, utilizando RNA extraído de lesões endometrióticas e de endométrio tópico de
mulheres não afetadas pela endometriose. O protocolo foi executado duas vezes, sendo que
ambos os grupos serviram uma vez como tester e outra como driver.
39
Esquema ilustrativo da técnica de Rash:
Tecido de Endométrio
Normal
Tecido Ectópico
(Lesão endometriótica)
RNAm
RNAm
RT RT
cDNA cDNA
GATC
CTAG
GATC
CTAG
GATC
CTAG
GATC
CTAG
T4 ligase – adição dos adaptadores
T4 ligase – adição dos adaptadores
PCR (primer XDPN-18)
PCR (primer XDPN-18)
GATC
CTAG
GATC
CTAG
X
X
h
h
o
o
I
I – restrição enzimática
M
M
b
b
o
o
I
I – restri
ç
ão enzimática
M
M
b
b
o
o
I
I – restri
ç
ão enzimática
GATC
CTAG
GATC
CTAG
Hibridação tester e driver
A
B
C
Tester Driver
40
GATC
CTAG
tester
tester
GATC
CTAG
tester
driver
GATC
CTAG
driver
driver
Seqüenciamento
XhoI
D
Figura 1: A) Amostras de cDNAs obtidos a partir dos tecidos analisados, transcrição reverva,
restrição enzimática com MboI e ligação dos adaptadores; B) PCR com primers XDPN-18 e
restrição enzimática somente da amostra tester, representada, na figura, pela lesão
endometriótica; C) Mistura das amostras tester e driver, seguida de reação de hibridação; D)
Representação dos híbridos gerados, ligação do híbrido tester-tester ao plamídeo tratado com
a enzima de restrição XhoI, transformação bacteriana, plaqueamento e seqüenciamento dos
insertos clonados.
41
III.2.2.1. SÍNTESE DE cDNA
Para síntese de cDNA, foram escolhidas aleatoriamente seis amostras do grupo controle e
seis amostras de mulheres com endometriose. As amostras foram separadas de acordo com o
grupo ao qual pertenciam e misturadas, gerando dois conjuntos ou pools com 25μg de RNA
total. Cada amostra contribuiu com a mesma quantidade de RNA (4,17μg).
Obtivemos os cDNAs fita dupla utilizando 200U da enzima SuperScript
TM
II Reverse
Transcriptase (Invitrogen) e 0,50μg de oligo(dT)
12-18
, para síntese da primeira fita, além de
10U de E. coli DNA ligase (Invitrogen) e 40U de E. coli DNA Polymerase I (Invitrogen), para
síntese da segunda fita. Logo após, a qualidade da síntese do cDNA foi avaliada pela técnica
de PCR, usando primers para β–actina.
III.2.2.2. DIGESTÃO ENZIMÁTICA E LIGAÇÃO DOS ADAPTADORES
Os cDNAs foram incubados com 20U da enzima de restrição MboI por 1 hora a 37
0
C para
digestão. Os fragmentos produzidos foram extraídos com fenol/clorofórmio e precipitados
com etanol. Os sítios gerados nas extremidades dos fragmentos foram ligados aos adaptadores
XDPN-12 (GATCTCTCGAGT) e XDPN-14 (CTGATCACTCGAGA), usando 8,0μL de
tampão ligase 5X. Acrescentamos 9U de T4 ligase (Invitrogen) e em seguida incubamos a
14
0
C overnight, para efetuar a reação de ligação.
III.2.2.3. PCR E PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS
As amostras obtidas da reação anterior foram diluídas com LoTE (Invitrogen), em volume
final de 100μL e amplificadas por PCR, contendo 6,00μL do primer XDPN-18
(CTGATCACTCGAGAGATC), complementar aos adaptadores. Após a PCR, os produtos
foram misturados de acordo com o grupo ao qual pertenciam (grupo I e grupo II). Foi
42
realizada extração por fenol/clorofórmio e precipitação com etanol para obtenção dos
produtos da amplificação.
III.2.2.4. DIGESTÃO DO TESTER E HIBRIDAÇÃO SUBTRATIVA
Dez microgramas da amostra tester foram digeridos com 20U da enzima de restrição XhoI
(Gibco BRL). Os fragmentos obtidos foram então diluídos em 30μL de LoTE. Cem
nanogramas do produto da digestão foram misturados a 5μg da amostra driver. A reação de
hibridação foi realizada adicionando à mistura 16,60μl de tampão de ligação (0,5M de NaCl;
50mM de Tris/HCl; SDS 0,2%; formamida 40%) e após denaturação a 100
0
C durante 5
minutos, a solução foi incubada a 42
0
C por 48 horas.
Então foram aplicados 3μl do produto da hibridação à solução contendo 0,50μl do
plasmídeo pZErO
®
-1 (1μg/μL) pré-digerido com a enzima de restrição XhoI. A mistura foi
incubada a 16
0
C durante 3 horas para ligação do híbrido tester-tester com o plasmídeo.
III.2.2.5. TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA E GERAÇÃO DAS BIBLIOTECAS DE
cDNA
Dois microlitros do plasmídeo
recombinante foram adicionados a 50μl de
solução contendo bactérias competentes,
seguido de eletroporação (2,5 V, 25 μFD,
200 OHMS) (GenePulser, BioRad).
Acrescentamos 500μl de meio líquido SOC à
mistura, a qual foi mantida em shaker à
rotação de 200 RPM, por 1 hora, a 37
0
C.
43
Após incubação, adicionamos mais 500μl de
meio SOC e semeamos a solução em placas
de Petri contendo 40mL de meio ágar LB
Low Salt com 20μl do antibiótico zeocina
(100mg/mL). Seguiu-se incubação em estufa
a 37
0
C, overnight.
III.2.2.6. ANÁLISE DAS COLÔNIAS E OBTENÇÃO DOS DADOS
As colônias foram palitadas e semeadas em
microplacas de 96 poços. Cada poço
continha 150μl do meio líquido 2XYT com
zeocina (50mg/mL). Após incubação a 37
0
C
overnight, uma alíquota de 1μl de cada poço
foi usada para PCR, com primers M13,
complementares a seqüências internas do
plasmídeo, flanqueado aos insertos de
cDNA tester-tester. Os produtos das reações
foram visualizados em gel de agarose 1,5% e
seqüenciados em seqüenciador automático
MegaBace
TM
1000 (Amesham Biosciences,
Piscataway, NJ, USA) utilizando DYEnamic
ET Dye Terminator Sequencing Kit (Amesham
44
Biosciences, Piscataway, NJ, USA), segundo as
normas do fornecedor.
As seqüências obtidas foram analisadas e
armazenadas no banco de dados do
Laboratório de Genética Molecular e
BioInformática da Fundação Hemocentro
do HCFMRP-USP para posterior análise
com o programa Generic EST Annotation
Pipeline (Geap), desenvolvido no mesmo
laboratório, o qual utiliza os seguintes
valores padrões: phred cutoff de 0,09, valor de
qualidade 100pb, minmatch 10, minscore 20 e
BLAST (1e
-30
).
Foram selecionadas para composição do
banco de dados, as seqüências que tiveram,
no mínimo, 90% de homologia com as
depositadas no banco de dados GenBank
®
do
National Institute of Health
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank).
Após a geração desses dados, procedeu-se a leitura de informações sobre os genes, aos
quais as seqüências obtidas pela RaSH se referem, através de buscas nos sites de acesso
público Gene Ontology (http://fatigo.bioinfo.cnio.es) e, principalmente, no National Center
for Biotechnology Information - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Os textos analisados
pelo site da NCBI são encontrados através dos links:
45
- GENE: banco de dados para pesquisa de informações de genes específicos. O conteúdo é
atualizado constantemente, envolvendo nomenclatura, localização cromossômica, produtos
gênicos, fenótipos associados e links para citações, seqüências homólogas, expressão,
domínios protéicos e bancos de dados externos;
- OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man): banco de dados que abrange genes humanos
e doenças genéticas. As informações fornecidas por vários sites de armazenamento de dados
envolvem textos e referências bibliográficas;
- PubMed: banco de dados desenvolvido na
National Library of Medicine (NLM) que fornece
mais de 14 milhões de artigos científicos publicados em mais de 4800 jornais e revistas
especializadas em diversas áreas, principalmente a biomédica.
Para facilitar a seleção dos genes de interesse, o grupo de Bioinformática do bloco G do
Depto. de Genética da FMRP-USP elaborou um programa capaz de cruzar palavras dos textos
com as principais palavras-chave de eventos biológicos, fisiológicos e/ou patológicos que
poderiam estar envolvidos nas principais causas do estabelecimento e desenvolvimento da
endometriose. Após revisão da literatura, foi elaborada uma lista dos principais termos
provavelmente associados à patogênese da doença. As palavras utilizadas foram: “blood
supply”; “cell;cycle”; “celldeath”; “programmed cell death”; adherence; adhesion;
adhesions; angiogenesis; angiogenetic; antiangiogenic; antiapoptosis; apoptosis; attach;
attached; attaches; attachment; autoimmune; cancer; cancers; carcinogenesis; carcinoma;
chemoattractant; chemokin; chemokines; chemotactic; cyst; cysts; cytokine; cytokines;
differentiate; differentiates; differentiation; dissemination; endometrioma; endometriomas;
endometriosis; endometriotic; endothelial; endothelium; estrogen; female; fertile; fertility;
fertilization; gonad; gonadal; gonads; grow; growth; gynecologic; gynecology; hyperplasia;
hyperplasic; immune; immunologic; immunological; immunology; immunosuppression;
immunosuppressive; implant; implantation; implants; infertile; infertility; inflammation;
46
inflammatory; interleukin; invade; invading; invasion; lesion; lymphocyte; lymphocytes;
lymphoma; malignancies; malignancy; malignant; menstrual; menstruation; metaplasia;
metaplastic; metastasis; mitogen; mitogenic; mitosis; neoangiogenesis; neoplasia; neoplasm;
neoplastic; oestrogen; oncogenesis; oncogenic; ovarian; ovaries; ovary; ovulation; pelvic;
pelvis; peritonial; peritoneum; pregnancy; pregnant; proapoptotic; proinflammatory;
proliferate; proliferates; proliferation; proliferative; prostaglandins; reproduction;
reproductive; scatter; spread; spreading; spreads; steroid; steroids; survival; survive; tumor;
tumoral; tumorigenesis; tumors; tumour; tumours; uterine; uterus; vasculature; woman;
women.
Depois de executado o programa, as seqüências obtidas pela RaSH foram classificadas
em:
• Candidatas – seqüências referentes a genes que participavam de
processos que poderiam estar relacionados à endometriose;
• Não-candidatas - seqüências referentes a genes que participavam de
processos que não estavam relacionados à endometriose;
• Com informações insuficientes - seqüências referentes a genes cujas
informações da literatura eram escassas e portanto sem relação direta com a
endometriose;
• Com dados controversos na literatura - seqüências referentes a genes
cuja ação ou função ainda não estão bem estabelecidas.
47
III. 2. 3. VALIDAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS GENES SELECIONADOS POR
RT-PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL
III.2.3.1. SÍNTESE DE cDNA
Para obtenção do cDNA, usamos o High Capacity cDNA Reversion Transcription Kit
(Applied Biosystems), segundo instruções do fabricante. Um micrograma de cada a amostra de
RNA total foi adicionado a tampão 10X, dNTP 100mM, random primer 10X, 1,25μL da
enzima multiscribe e 2,5U de RNaseOUT
TM
(Invitrogen) em volume final de 25μL. A solução
foi submetida a 25
0
C por 10 minutos, seguido de 37
0
C por 2 horas e 85
0
C por 5 segundos.
Então cada amostra foi diluída em água DEPC na proporção 1 para 50. Os produtos das
reações foram armazenados em freezer -20
0
C até a realização da técnica de RT-PCR
quantitativo em tempo real.
III.2.3.2. EFICIÊNCIA DA REAÇÃO
Para todos os genes de interesse (SPARC, SSAT, HTRA1 e LOXL1) e controle endógeno
(GAPDH) foram construídas curvas de amplificação a partir da utilização de diluições
seriadas (não diluído, 10
-1
, 10
-2
e 10
-3
) em triplicata do cDNA da amostra calibradora.
Utilizamos como calibrador uma amostra de cDNA obtida a partir de RNA do tecido
endometrial normal de uma paciente sem endometriose. Para construção da curva-padrão,
foram usados pelo menos três pontos a partir da curva de amplificação. Consideramos as
curvas com slope entre -3,55 e -3,1, o que reflete eficiência de amplificação de, no mínimo,
48
90,5%. As figuras 2 e 3 mostram, respectivamente, a curva de amplificação e curva-padrão
construídas para o gene LOXL1.
Figura 2: Curva de amplificação do gene LOXL1. Foi plotada a fluorescência da
amplificação versus o número de ciclos da PCR.
Fonte: ABI PRISM
TM
7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems)
49
Figura 3: Curva-padrão do gene LOXL1 obtida a partir da curva de amplificação.
Fonte: ABI PRISM
TM
7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems)
III.2.3.3. QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
A quantificação da expressão gênica foi realizada por meio da RT-PCR quantitativa em
tempo real no aparelho ABI PRISM
TM
7500 Sequence Detection Systems (Applied
Biosystems) do Laboratório de Oncologia Pediátrica do Departamento de Puericultura e
Pediatria do HCFMRP-USP. As reações foram executadas utilizando o sistema TaqMan
®
(Applied Biosystems),
de acordo com as instruções do fabricante. Cada reação continha
Universal PCR Master Mix 2X, Gene Expression Assay Mix 20X e 9µL de cDNA em volume
final de 20µL. As condições da reação foram 95ºC por 10 minutos, seguidos de 95ºC por 15
segundos e 60ºC por 1 minuto, durante 40 ciclos.
As expressões dos genes de interesse foram calculadas de acordo com a fórmula 2
-ΔΔCT
, de
acordo com o trabalho de Livak & Schmittgen (2001), fornecendo os valores de RQ (Relative
Quantification), os quais foram utilizados na análise estatística.
III. 2. 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A comparação dos dados de expressão gênica foi realizada pelo o teste não-paramétrico de
soma de postos de Wilcoxon, para duas amostras independentes com nível de confiança de
95%, utilizando o programa STATDISK 9.1 (Triola, 2005).
Para os genes com diferença significativa no teste anterior, os valores dos níveis de
expressão gênica também foram avaliados a partir da análise da curva ROC (Receiver-
Operating Characteristic), através do software MedCalc (
http://www.medcalc.be). A curva
refere-se a valores de verdadeiros positivos (sensibilidade, verdadeiros-positivos / falsos-
50
negativos + verdadeiros-positivos) em função dos falsos positivos (especificidade,
verdadeiros-negativos / falsos-positivos + verdadeiros-negativos). A área abaixo da curva é a
medida de quanto é acurada a distinção entre os grupos analisados (Metz, 1978; Zweig &
Campbell, 1993). Adicionalmente, a partir da curva ROC foi gerado, pelo mesmo programa, o
diagrama de pontos interativos (interactive dot) para estudo da precisão da separação dos
grupos desse estudo. O diagrama indica o valor de RQ que permite melhor separação (mínimo
de falsos-positivos e de falsos-negativos) entre os grupos.
51
IV. RESULTADOS
IV.1. OBTIDOS PELA TÉCNICA DE RaSH
Os dados referentes às seqüências que seguiram os critérios de seleção permaneceram
disponíveis aos pesquisadores deste trabalho no site http://guarani.fmrp.usp.br/geap.
As seqüências analisadas das bibliotecas de cDNA foram divididas em 8 categorias:
mitocondrial; levedura; RefSeq (seqüências de referência) ; UniGene; outros; ribossômica;
ESTs e bactéria.
A tabela I sumariza os resultados referentes às seqüências de referência: a coluna RHENDI
apresenta os dados obtidos quando o conjunto de cDNAs do grupo de mulheres com
endometriose foi utilizado como tester e a coluna RHENDW é referente aos resultados
obtidos quando esse mesmo conjunto de cDNAs foi usado como driver. Os números à direita
correspondem à quantidade de colônias contendo os insertos referentes às seqüências anotadas
à esquerda. As demais categorias de seqüências estão relacionadas nos anexos A e B.
Tabela I: Seqüências de referência obtidas pela RaSH nas bibliotecas RHENDI e RHENDW
RefSeq
RHENDI RHENDW
NM_013349
Homo sapiens SCIRP10-related protein
(SCIRP10), mRNA
1
NM_001001894
Homo sapiens tetratricopeptide repeat
domain 3 (TTC3), transcript variant 2,
mRNA
4
NM_001008897
Homo sapiens t-complex 1 (TCP1),
transcript variant 2, mRNA
1
continua
continuação
52
NM_000291
Homo sapiens phosphoglycerate kinase
1 (PGK1), mRNA
1
NM_153000
Homo sapiens adenomatosis polyposis
coli down-regulated 1 (APCDD1),
mRNA
1
NM_002668
Homo sapiens proteolipid protein 2
(colonic epithelium-enriched) (PLP2),
mRNA
1
NM_006732
Homo sapiens FBJ murine
osteosarcoma viral oncogene homolog
B (FOSB), mRNA
3
NM_000518
Homo sapiens hemoglobin, beta (HBB),
mRNA
3
NM_001961
Homo sapiens eukaryotic translation
elongation factor 2 (EEF2), mRNA
2
NM_003118
Homo sapiens secreted protein, acidic,
cysteine-rich (osteonectin) (SPARC),
mRNA
7
NM_004530
Homo sapiens matrix metalloproteinase
2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase,
72kDa type IV collagenase) (MMP2),
mRNA
2
NM_001780
Homo sapiens CD63 antigen
(melanoma 1 antigen) (CD63), mRNA
12
continuação
continua
53
XM_929146
PREDICTED: Homo sapiens
hypothetical protein LOC646190
(LOC646190), mRNA
1
NM_002568
Homo sapiens poly(A) binding protein,
cytoplasmic 1 (PABPC1), mRNA
1
XM_496985
PREDICTED: Homo sapiens similar to
transcription elongation factor B
polypeptide 3 binding protein 1
(LOC441363), mRNA
1
NM_000918
Homo sapiens procollagen-proline, 2-
oxoglutarate 4-dioxygenase (proline 4-
hydroxylase), beta polypeptide (protein
disulfide isomerase-associated 1)
(P4HB), mRNA
1
NM_207521
Homo sapiens reticulon 4 (RTN4),
transcript variant 5, mRNA
3
NM_013974
Homo sapiens dimethylarginine
dimethylaminohydrolase 2 (DDAH2),
mRNA
5
NM_198976
Homo sapiens TH1-like (Drosophila)
(TH1L), transcript variant 1, mRNA
1
NM_014300
Homo sapiens SEC11-like 1 (S.
cerevisiae) (SEC11L1), mRNA
1
continua
continuação
54
NM_001013702
Homo sapiens similar to p40
(LOC440258), mRNA
12 1
NM_006367
Homo sapiens CAP, adenylate cyclase-
associated protein 1 (yeast) (CAP1),
mRNA
1
NM_017733
Homo sapiens GPI7 protein (GPI7),
mRNA
1
NM_004109
Homo sapiens ferredoxin 1 (FDX1),
nuclear gene encoding mitochondrial
protein, mRNA
1
NM_024293
Homo sapiens chromosome 2 open
reading frame 17 (C2orf17), mRNA
1
NM_004786
Homo sapiens thioredoxin-like 1
(TXNL1), mRNA
1
NM_145702
Homo sapiens tigger transposable
element derived 1 (TIGD1), mRNA
1
NM_203392
Homo sapiens family with sequence
similarity 27-like (FAM27L), mRNA
1
NM_002775
Homo sapiens protease, serine, 11 (IGF
binding) (PRSS11), mRNA
1
NM_052996
Homo sapiens PR domain containing 7
(PRDM7), mRNA
1
continua
continuação
55
NM_003017
Homo sapiens splicing factor,
arginine/serine-rich 3 (SFRS3), mRNA
1
NM_021141
Homo sapiens X-ray repair
complementing defective repair in
Chinese hamster cells 5 (double-strand-
break rejoining; Ku autoantigen,
80kDa) (XRCC5), mRNA
2
XM_926493
PREDICTED: Homo sapiens
hypothetical protein LOC643121
(LOC643121), mRNA
1
NM_005575
Homo sapiens leucyl/cystinyl
aminopeptidase (LNPEP), transcript
variant 1, mRNA
2
NM_005016
Homo sapiens poly(rC) binding protein
2 (PCBP2), transcript variant 1, mRNA
3
NM_003155
Homo sapiens stanniocalcin 1 (STC1),
mRNA
1
NM_016015
Homo sapiens leucine carboxyl
methyltransferase 1 (LCMT1), mRNA
1
NM_006476
Homo sapiens ATP synthase, H+
transporting, mitochondrial F0 complex,
subunit g (ATP5L), nuclear gene
encoding mitochondrial protein, mRNA
2
continuação
continua
56
NM_015917
Homo sapiens glutathione S-transferase
kappa 1 (GSTK1), mRNA
1
NM_003079
Homo sapiens SWI/SNF related, matrix
associated, actin dependent regulator of
chromatin, subfamily e, member 1
(SMARCE1), mRNA
1
NM_005801
Homo sapiens putative translation
initiation factor (SUI1), mRNA
2
NM_001001522
Homo sapiens transgelin (TAGLN),
transcript variant 1, mRNA
1
XM_938374
PREDICTED: Homo sapiens
hypothetical protein LOC648101,
transcript variant 1 (LOC648102),
mRNA
1
NM_032376
Homo sapiens hypothetical protein
MGC4251 (MGC4251), mRNA
2
NM_000801
Homo sapiens FK506 binding protein
1A, 12kDa (FKBP1A), transcript
variant 12B, mRNA
1
XM_498789
PREDICTED: Homo sapiens
LOC440645 (LOC440645), mRNA
4
continuação
continua
57
NM_006098
Homo sapiens guanine nucleotide
binding protein (G protein), beta
polypeptide 2-like 1 (GNB2L1), mRNA
11
NM_000198
Homo sapiens hydroxy-delta-5-steroid
dehydrogenase, 3 beta- and steroid
delta-isomerase 2 (HSD3B2), mRNA
1
NM_014380
Homo sapiens nerve growth factor
receptor (TNFRSF16) associated
protein 1 (NGFRAP1), transcript
variant 3, mRNA
1
NM_201428
Homo sapiens reticulon 3 (RTN3),
transcript variant 2, mRNA
1
NM_005097
Homo sapiens leucine-rich, glioma
inactivated 1 (LGI1), mRNA
1
NM_017794
Homo sapiens KIAA1797 (KIAA1797),
mRNA
1
NM_198252
Homo sapiens gelsolin (amyloidosis,
Finnish type) (GSN), transcript variant
2, mRNA
1
NM_006472
Homo sapiens thioredoxin interacting
protein (TXNIP), mRNA
1
continuação
continua
58
NM_002778
Homo sapiens prosaposin (variant
Gaucher disease and variant
metachromatic leukodystrophy)
(PSAP), mRNA
1
NM_001418
Homo sapiens eukaryotic translation
initiation factor 4 gamma, 2 (EIF4G2),
mRNA
1
NM_001014795
Homo sapiens integrin-linked kinase
(ILK), transcript variant 3, mRNA
1
NM_005780
Homo sapiens lipoma HMGIC fusion
partner (LHFP), mRNA
1
NM_003825
Homo sapiens synaptosomal-associated
protein, 23kDa (SNAP23), transcript
variant 1, mRNA
1
NM_002211
Homo sapiens integrin, beta 1
(fibronectin receptor, beta polypeptide,
antigen CD29 includes MDF2, MSK12)
(ITGB1), transcript variant 1A, mRNA
1
NM_006435
Homo sapiens interferon induced
transmembrane protein 2 (1-8D)
(IFITM2), mRNA
2
NM_003590
Homo sapiens cullin 3 (CUL3), mRNA 1
continuação
continua
59
NM_000884
Homo sapiens IMP (inosine
monophosphate) dehydrogenase 2
(IMPDH2), mRNA
1
NM_138793
Homo sapiens calcium activated
nucleotidase 1 (CANT1), mRNA
1
XM_929760
PREDICTED: Homo sapiens
hypothetical protein LOC646803
(LOC646803), mRNA
2
NM_014719
Homo sapiens KIAA0738 gene product
(KIAA0738), mRNA
1
NM_003295
Homo sapiens tumor protein,
translationally-controlled 1 (TPT1),
mRNA
17
NM_030789
Homo sapiens histocompatibility
(minor) 13 (HM13), transcript variant 1,
mRNA
2
NM_006196
Homo sapiens poly(rC) binding protein
1 (PCBP1), mRNA
1
NM_001878
Homo sapiens cellular retinoic acid
binding protein 2 (CRABP2), mRNA
1
NM_001101
Homo sapiens actin, beta (ACTB),
mRNA
6
continuação
continua
60
NM_001749
Homo sapiens calpain, small subunit 1
(CAPNS1), transcript variant 1, mRNA
7
NM_014320
Homo sapiens heme binding protein 2
(HEBP2), mRNA
2
NM_014799
Homo sapiens hephaestin (HEPH),
transcript variant 2, mRNA
2
NM_021103
Homo sapiens thymosin, beta 10
(TMSB10), mRNA
4
NM_001540
Homo sapiens heat shock 27kDa protein
1 (HSPB1), mRNA
1
XM_498786
PREDICTED: Homo sapiens
LOC440642 (LOC440642), mRNA
3
NM_018382
Homo sapiens hypothetical protein
FLJ11292 (FLJ11292), mRNA
1
NM_181353
Homo sapiens inhibitor of DNA binding
1, dominant negative helix-loop-helix
protein (ID1), transcript variant 2,
mRNA
11
NM_021109
Homo sapiens thymosin, beta 4, X-
linked (TMSB4X), mRNA
61
NM_000942
Homo sapiens peptidylprolyl isomerase
B (cyclophilin B) (PPIB), mRNA
15
continuação
continua
61
NM_006769
Homo sapiens LIM domain only 4
(LMO4), mRNA
1
XM_943152
PREDICTED: Homo sapiens
KIAA1245, transcript variant 12
(KIAA1245), mRNA
1
NM_203380
Homo sapiens acyl-CoA synthetase
long-chain family member 5 (ACSL5),
transcript variant 3, mRNA
1
XM_292160
PREDICTED: Homo sapiens similar to
Serine/threonine-protein kinase Nek1
(NimA-related protein kinase 1)
(MGC75495), mRNA
1
NM_198334
Homo sapiens glucosidase, alpha;
neutral AB (GANAB), mRNA
1
NM_001280
Homo sapiens cold inducible RNA
binding protein (CIRBP), mRNA
1
NM_018155
Homo sapiens hypothetical protein
FLJ10618 (FLJ10618), mRNA
1
NM_001681
Homo sapiens ATPase, Ca++
transporting, cardiac muscle, slow
twitch 2 (ATP2A2), transcript variant 2,
mRNA
1
NM_003746
Homo sapiens dynein, cytoplasmic,
light polypeptide 1 (DNCL1), mRNA
1
continuação
continua
62
NM_005347
Homo sapiens heat shock 70kDa protein
5 (glucose-regulated protein, 78kDa)
(HSPA5), mRNA
2
NM_002423
Homo sapiens matrix metalloproteinase
7 (matrilysin, uterine) (MMP7), mRNA
2
NM_000516
Homo sapiens GNAS complex locus
(GNAS), transcript variant 1, mRNA
3
NM_147184
Homo sapiens tumor protein p53
inducible protein 3 (TP53I3), transcript
variant 2, mRNA
1
NM_001256
Homo sapiens cell division cycle 27
(CDC27), mRNA
4
NM_002817
Homo sapiens proteasome (prosome,
macropain) 26S subunit, non-ATPase,
13 (PSMD13), transcript variant 1,
mRNA
1
NM_012287
Homo sapiens centaurin, beta 2
(CENTB2), mRNA
1
NM_148923
Homo sapiens cytochrome b-5 (CYB5),
transcript variant 1, mRNA
1
NM_175744
Homo sapiens ras homolog gene family,
member C (RHOC), mRNA
3
continuação
continua
63
NM_138473
Homo sapiens Sp1 transcription factor
(SP1), mRNA
2
NR_002836
Homo sapiens phosphoglucomutase 5
pseudogene 2 (PGM5P2) on
chromosome 9
2
NM_022454
Homo sapiens SRY (sex determining
region Y)-box 17 (SOX17), mRNA
1
NM_001001937
Homo sapiens ATP synthase, H+
transporting, mitochondrial F1 complex,
alpha subunit, isoform 1, cardiac muscle
(ATP5A1), nuclear gene encoding
mitochondrial protein, transcript variant
1, mRNA
2
NM_002970
Homo sapiens spermidine/spermine N1-
acetyltransferase (SAT), mRNA
7
NM_015937
Homo sapiens phosphatidylinositol
glycan, class T (PIGT), mRNA
1
NM_005566
Homo sapiens lactate dehydrogenase A
(LDHA), mRNA
2
NM_004425
Homo sapiens extracellular matrix
protein 1 (ECM1), transcript variant 1,
mRNA
2
NM_007273
Homo sapiens prohibitin 2 (PHB2),
mRNA
1
continuação
continua
64
NM_005507
Homo sapiens cofilin 1 (non-muscle)
(CFL1), mRNA
1
XM_928061
PREDICTED: Homo sapiens similar to
Rho-associated protein kinase 1 (Rho-
associated, coiled-coil containing
protein kinase 1) (p160 ROCK-1)
(p160ROCK) (LOC653559), mRNA
5
NM_021034
Homo sapiens interferon induced
transmembrane protein 3 (1-8U)
(IFITM3), mRNA
3
NM_014402
Homo sapiens low molecular mass
ubiquinone-binding protein (9.5kD)
(QP-C), nuclear gene encoding
mitochondrial protein, mRNA
1
NM_001743
Homo sapiens calmodulin 2
(phosphorylase kinase, delta)
(CALM2), mRNA
1
NM_080594
Homo sapiens RNA binding protein S1,
serine-rich domain (RNPS1), transcript
variant 2, mRNA
1
NM_020378
Homo sapiens K562 cell-derived
leucine-zipper-like protein 1 (KLP1),
mRNA
1
continuação
continua
65
NM_153280
Homo sapiens ubiquitin-activating
enzyme E1 (A1S9T and BN75
temperature sensitivity complementing)
(UBE1), transcript variant 2, mRNA
1
NM_033161
Homo sapiens surfeit 4 (SURF4),
mRNA
1
NM_198335
Homo sapiens glucosidase, alpha;
neutral AB (GANAB), mRNA
2
NM_006801
Homo sapiens KDEL (Lys-Asp-Glu-
Leu) endoplasmic reticulum protein
retention receptor 1 (KDELR1), mRNA
1
NM_001349
Homo sapiens aspartyl-tRNA
synthetase (DARS), mRNA
1
NM_002567
Homo sapiens prostatic binding protein
(PBP), mRNA
4
NM_004356
Homo sapiens CD81 antigen (target of
antiproliferative antibody 1) (CD81),
mRNA
2
NM_005576
Homo sapiens lysyl oxidase-like 1
(LOXL1), mRNA
1
NM_019111
Homo sapiens major histocompatibility
complex, class II, DR alpha (HLA-
DRA), mRNA
1
continuação
continua
66
NM_080546
Homo sapiens CDW92 antigen
(CDW92), mRNA
1
NM_000733
Homo sapiens CD3E antigen, epsilon
polypeptide (TiT3 complex) (CD3E),
mRNA
1
XM_932180
PREDICTED: Homo sapiens
hypothetical protein LOC644424
(LOC644424), mRNA
1
NM_031157
Homo sapiens heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein A1 (HNRPA1),
transcript variant 2, mRNA
1
XM_498569
PREDICTED: Homo sapiens
hypothetical gene supported by
AY338954 (LOC440155), mRNA
1
NM_001009570
Homo sapiens chaperonin containing
TCP1, subunit 7 (eta) (CCT7),
transcript variant 2, mRNA
1
NM_001428
Homo sapiens enolase 1, (alpha)
(ENO1), mRNA
1
NM_020320
Homo sapiens arginyl-tRNA
synthetase-like (RARSL), mRNA
1
NM_001614
Homo sapiens actin, gamma 1
(ACTG1), mRNA
1
continuação
continua
67
NM_003164
Homo sapiens syntaxin 5A (STX5A),
mRNA
1
XM_935538
PREDICTED: Homo sapiens similar to
postmeiotic segregation increased 2-like
2 (LOC442573), mRNA
1
NM_013234
Homo sapiens eukaryotic translation
initiation factor 3, subunit 12
(EIF3S12), mRNA
1
NM_005762
Homo sapiens tripartite motif-
containing 28 (TRIM28), mRNA
3
NM_014042
Homo sapiens DKFZP564M082 protein
(DKFZP564M082), mRNA
1
XM_928302
PREDICTED: Homo sapiens
hypothetical protein LOC643817
(LOC643817), mRNA
2
XM_496061
PREDICTED: Homo sapiens similar to
FLJ44796 protein (LOC440264),
mRNA
7 1
NM_004568
Homo sapiens serine (or cysteine)
proteinase inhibitor, clade B
(ovalbumin), member 6 (SERPINB6),
mRNA
1
continuação
continua
68
NM_002166
Homo sapiens inhibitor of DNA binding
2, dominant negative helix-loop-helix
protein (ID2), mRNA
2
NM_021129
Homo sapiens pyrophosphatase
(inorganic) (PP), mRNA
1
NM_003064
Homo sapiens secretory leukocyte
protease inhibitor (antileukoproteinase)
(SLPI), mRNA
8
NM_021005
Homo sapiens nuclear receptor
subfamily 2, group F, member 2
(NR2F2), mRNA
2
NM_006585
Homo sapiens chaperonin containing
TCP1, subunit 8 (theta) (CCT8), mRNA
1
Total de seqüências de referência 65 317
TOTAL DE COLÔNIAS ANALISADAS 524 537
69
Entre as seqüências RefSeq, referentes a genes bem caracterizados na literatura,
obtivemos um total de 31 seqüências diferentes na biblioteca RHENDI e 135 na RHENDW.
As classes levedura, bactéria e outros (vide ANEXO A) foram consideradas como
contaminantes das reações. Já as classes mitocondrial, ribossômica, ESTs e Unigene não
foram analisadas neste estudo (ANEXO B).
IV. 2. GENES SELECIONADOS
Os genes selecionados para validação dos dados de expressão gênica foram: SPARC
(secreted protein, acidic, cysteine-rich); SSAT (spermidine/spermine N1-acetyltransferase);
HTRA1 [(high temperature requirement factor A1) serine peptidase 1] e LOXL1 (lysyl
oxidase-like 1).
IV. 3. RT-PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL
As tabelas II, III, IV e V mostram os valores de RQ (Relative Quantification), referentes
às expressões dos genes selecionados, em cada amostra, obtidos pela RT-PCR quantitativa em
tempo real.
Tabela II: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão
endometriótica para o gene SPARC
SPARC
ENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA
70
AMOSTRA RQ AMOSTRA RQ
11 0,63 O11 0,65
3.2 0,85 O3 0,98
6 0,88 P6 1,10
2 0,92 O10.2 1,32
5 1,24 O9 1,32
12 1,31 P10 () 1,41
4 1,39 O6 1,83
9 1,97 P1 2,32
8 2,08 P3 3,02
1 2,25 P8 4,01
7 3,95 P7 6,21
Média 1,59 Média 2,20
Desvio padrão 0,95 Desvio padrão 1,66
Tabela III: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão
endometriótica para o gene SSAT
SSAT
ENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA
AMOSTRA RQ AMOSTRA RQ
4 0,44 O10.2 0,18
1 0,64 O3 0,30
2 0,65 O9 0,37
7 0,65 O11 0,56
3.2 0,96 O6 0,79
9 1,17 P6 0,99
5 1,44 P10() 1,12
12 2,38 P1 1,16
6 2,45 P3 1,38
8 4,50 P8 1,50
11 8,44 P7 2,11
Média 2,16 Média 0,95
Desvio padrão 2,40 Desvio padrão 0,59
71
Tabela IV: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e lesão
endometriótica para o gene HTRA1
Gene HTRA1
ENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA
AMOSTRA RQ AMOSTRA RQ
11 0,55 O11 0,79
2 0,98 P6() 0,87
3.2 1,55 P10(2) 1,68
6 2,02 P3 4,77
5 2,33 P1 5,87
4 2,69 P8 6,09
9 3,06 P7 6,52
1 4,23 O3 10,96
7 4,42 O10.2 11,66
12 5,40 O9 12,59
8 5,50 O6 15,70
Média 2,97 Média 7,04
Desvio padrão 1,71 Desvio padrão 5,06
Tabela V: Valores de RQ, médias e desvios-padrão dos grupos de tecido normal e
lesão endometriótica para o gene LOXL1
Gene LOXL1
ENDOMÉTRIO NORMAL LESÃO ENDOMETRIÓTICA
AMOSTRA RQ AMOSTRA RQ
1 1,12 O11 1,58
11 2,18 P1() 5,097
6 2,36 O3 5,62
4 2,59 P6() 6,87
2 2,62 P3 7,47
5 2,63 P10() 9,05
3.2 3,11 P7() 9,35
9 3,38 O10.2 10,96
12 3,93 O9 11,03
8 4,98 O6 12,84
7 11,51 P8() 36,76
Média 3,67 Média 10,60
Desvio padrão 2,78 Desvio padrão 9,24
IV. 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
72
O teste da soma de postos de Wilcoxon mostrou que os genes SSAT e SPARC não
apresentaram diferença significativa de expressão entre os grupos de mulheres com e sem
endometriose, enquanto que os genes HTRA1 e LOXL1 apresentaram diferença quanto a sua
expressão nos dois grupos.
Para o gene HTRA1, foi obtida área abaixo da curva ROC de 0,75, mostrando
sensibilidade de 63,6% e especificidade de 100% para separação entre os grupos de mulheres
com e sem endometriose. Para o gene LOXL1, a área abaixo da curva ROC foi de 0,85,
determinando sensibilidade e especificidade de 90,9% para distinção entre os grupos. O
diagrama de pontos interativos mostra valor de corte de RQ do gene HTRA1 de 5,5 e de 5,0
para o gene LOXL1. As figuras 4 e 5 representam o diagrama de pontos interativos para os
genes HTRA1 e LOXL1, respectivamente.
Figura 4: Diagrama de pontos interativos (interactive dot) para o gene HTRA1 obtido a partir
do software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os
pontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres
sem endometriose (representados no eixo horizontal como “Normal=0”) e nas amostras do
73
grupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Endometriose=1”).
A barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos grupos.
74
Figura 5: Diagrama de pontos interativos (interactive dot) para o gene LOXL1 obtido a partir
do software MedCalc (http://www.medcalc.be). O eixo vertical representa valores de RQ. Os
pontos do gráfico mostram a distribuição dos valores das RQs obtidas nos grupos de mulheres
sem endometriose (representados no eixo horizontal como “Normal=0”) e nas amostras do
grupo de mulheres com a doença (representados no eixo horizontal como “Endometriose=1”).
A barra horizontal mostra o melhor ponto de corte para separação dos dois grupos.
75
V. DISCUSSÃO
A confecção de biblioteca subtrativa é aplicada com sucesso para clonar seqüências de
RNA mensageiro mais abundantes em uma determinada amostra, quando comparada à outra
(Cho & Park, 1998). A técnica de hibridação subtrativa rápida (RaSH) identifica genes
diferencialmente expressos, incluindo seqüências descritas e não descritas nos bancos de
dados disponíveis (Jiang et al., 2000). Uma das vantagens da RaSH sobre as demais técnicas é
que ela elimina vários passos de subtração e amplificação, fazendo com que a metodologia
tenha menor complexidade e seja mais rápida e econômica. Além disso, é efetiva para
obtenção da fração tester-tester da reação e para reduzir os backgrounds, gerando resultados
confiáveis (Jiang et al., 2000; Boukerche et al., 2004).
No entanto, os métodos baseados em hibridação subtrativa possuem certas limitações,
pois nem sempre todas as seqüências de cDNA comuns entre os grupos são completamente
removidas, levando a alguns resultados falso-positivos (Hu et al., 2006). O sucesso da técnica
requer remoção efetiva dos híbridos tester-driver para assegurar boa eficiência da reação, a
qual pode ser influenciada por vários fatores, como concentrações de DNA e sal, além da
quantidade de tester-driver gerada (Cho & Park, 1998). Dessa maneira, deve-se estabelecer
uma boa metodologia para validação dos resultados. A RT-PCR quantitativa em tempo real é
considerada a metodologia padrão para quantificação da expressão gênica, pois consegue
medir desde grandes até quantidades muito pequenas de transcritos, mostrando alta
sensibilidade além de alta especificidade quando comparadas a outras técnicas, como, por
exemplo, Northern blot (Goodsaid et al., 2003).
Em nosso trabalho, as bibliotecas RHENDI e RHENDW foram geradas a partir da
subtração de moléculas de cDNA entre os grupos de mulheres com e sem endometriose.
Consideramos que o conjunto de cDNAs presentes em uma biblioteca são referentes a genes
76
superexpressos no grupo tester em relação ao grupo driver, onde esses genes foram menos
expressos.
As seqüências selecionadas como candidatas para validação por RT-PCR quantitativa em
tempo real foram referentes aos genes HTRA1, LOXL1, SPARC e SSAT, os quais
apresentaram baixa expressão no grupo de mulheres com endometriose.
V. 1. HTRA1 - HtrA (high temperature requirement factor A1) serine peptidase 1
O gene HTRA1, conhecido também como L56, HtrA, ORF480 e PRSS11, codifica uma
enzima secretada pertencente à família das serino-proteases, altamente conservada em várias
espécies (GeneID 5654; OMIM 602194). A alta expressão desta proteína inibe a proliferação
celular in vivo e in vitro. Além disso, o locus 10q26, onde se encontra o gene, está sujeito à
perda de heterozigosidade e inativação epigenética, sugerindo assim função de supressor
tumoral para o mesmo (Baldi et al., 2002; Chien et al., 2004). Alguns trabalhos confirmaram
essa hipótese, mostrando que sua baixa expressão está relacionada a certos tipos de câncer,
como o endometrial, além de estar fortemente associado à transformação maligna e metástase
de câncer ovariano e melanoma maligno (Bowden et al., 2006; Tsuchiya et al., 2005). A
observação de que ocorre regulação hepática da transcrição de HTRA1 entre a fase fetal e pós-
natal propõe que o gene participa do controle do crescimento celular não apenas em
neoplasias, como também de processos fisiológicos normais (Nagata et al., 2003). Outro fato
importante é que a proteína HTRA1 é produzida em quantidade proeminente pelo endométrio
na fase proliferativa do ciclo menstrual e, por isso, sugere-se que sua expressão possa ser
importante na preparação endometrial para a implantação embrionária (Bowden et al., 2006;
De Luca et al., 2003).
77
Selecionamos este gene para validação considerando que estava menos expresso no grupo
de mulheres com endometriose, segundo dados obtidos pela RaSH, sendo que sua baixa
expressão tem sido relacionada a neoplasias comumente associadas à doença, como câncer
ovariano e endometrial. Adicionalmente, a proteína codificada por ele, quando altamente
expressa, provoca inibição do crescimento celular e, dessa forma, a baixa expressão geraria
ambiente propício para que as células endometriais se proliferassem, produzindo lesões.
Ponderamos também o fato de que a baixa expressão desse gene na fase proliferativa do ciclo
menstrual poderia causar alteração da receptividade endometrial durante a fase de
implantação do embrião, prejudicando, assim, a função reprodutiva de pacientes com
endometriose.
Todavia, quando executamos a RT-PCR quantitativa em tempo real, a média de RQ deste
gene para mulheres com endometriose foi de 7,04, enquanto que para as mulheres sem
endometriose foi de 2,97, contrariando os dados obtidos pela RaSH. Tendo em vista que a
RT-PCR quantitativa em tempo real é a técnica padrão para determinação dos níveis de
expressão gênica, consideramos esse resultado como verdadeiro.
A proteína HTRA1 também interage com alguns fatores reguladores da proliferação
celular, como IGFs e TGF-β1 (Zumbrunn & Trueb, 1996; Tocharus et al., 2004). As IGFs
(Insuline Growth Factors) atuam em diversos tecidos, estimulando divisão e diferenciação
celulares. Sua atividade é modulada por moléculas inibidoras, as IGFBPs, que se ligam às
IGFs e controlam a disponibilidade desses fatores de crescimento (Clemmons, 1998). No
entanto, existem enzimas, como HTRA1, que podem clivar essas IGFBPs e dessa maneira
aumentar os níveis de IGFs bioativas (Zumbrunn & Trueb, 1996; Ferry et al., 1999; Hou et
al., 2005). Uma vez livres para agirem, as IGFs promoveriam crescimento celular, efeito
compatível com os achados científicos em lesões endometrióticas.
78
Já TGF-β1 é um regulador negativo da proliferação celular, cuja expressão está reduzida
em células de endométrio tópico de pacientes com endometriose, sugerindo que a diminuição
desse fator possa favorecer a proliferação dessas células (Johnson et al. 2005). Foi proposto
que HTRA1 se liga a TGF-β1, inibindo as vias de sinalização dessa molécula (Kresse &
Schönherr, 2001; Oka et al., 2004). Desse modo a maior expressão de HTRA1 neutralizaria a
ação de maior quantidade de moléculas TGF-β1, propiciando maior multiplicação de células
endometriais ectópicas.
Além disso, as mulheres apresentam normalmente alta expressão de HTRA1 na fase
proliferativa do ciclo reprodutivo (De Luca et al., 2003). Visto que estudamos mulheres com e
sem endometriose na mesma fase do ciclo, podemos sugerir que o aumento ainda maior da
expressão do gene HTRA1 em mulheres com a enfermidade causaria conseqüências
reprodutivas graves para elas, como falhas de implantação.
Quanto à análise da curva ROC, HTRA1 mostrou especificidade alta, porém sua
sensibilidade, de 63,6%, foi baixa para discriminar mulheres com daquelas sem a doença.
Provavelmente os níveis de expressão de HTRA1, muito discrepantes entre as pacientes,
provocou grande aumento do desvio-padrão, contribuindo para esse resultado.
Analisando o gráfico de pontos interativos, podemos observar que para valores de RQ
abaixo de 5,5, foi possível separar mulheres sem endometriose daquelas com endometriose,
apesar de duas amostras do grupo de mulheres não afetadas pela doença apresentarem RQs
muito próximas a esse ponto de corte. Já no grupo de mulheres afetadas, existe uma diferença
muito variável entre RQs. Quatro pacientes desse grupo possuem RQs abaixo de 5,5,
apresentando, portanto, expressão do gene HTRA1 igual à das mulheres não afetadas pela
endometriose. Dessa forma, podemos afirmar que no grupo amostral estudado, pela análise da
expressão de HTRA1, não foi possível diferenciar todas as pacientes com endometriose. Como
a proteína HTRA1 interage com moléculas reguladoras do crescimento celular, estimulando-
79
o, podemos supor que, nessas quatro pacientes, a baixa expressão do gene que a codifica
tenha conferido um potencial de crescimento menor que o das demais pacientes. Podemos
presumir também que as 2 mulheres não afetadas pela endometriose com RQs de 5,40 e 5,50,
por apresentarem expressão gênica de HTRA1 muito próximas ao padrão de expressão das
afetadas, apresentavam células endometriais com atividade proliferativa maior que as outras
mulheres do seu grupo. Provavelmente isso acarretaria predisposição dessas células em
crescer em locais ectópicos, como ovário e/ou peritônio e, assim, desenvolverem
endometriose. Porém, somente o acompanhamento clínico a longo prazo dessas mulheres com
concomitante quantificação da expressão de HTRA1 poderia corroborar para a hipótese.
V. 2. LOXL1 - lysyl oxidase-like 1
O gene LOXL1, também denominado LOL e LOXL, codifica uma amino oxidase essencial
na biogênese de tecido conjuntivo por catalisar, na matriz extracelular, o primeiro passo para
formação de ligações covalentes cruzadas de fibras de colágeno e de elastina, necessárias para
homeostase de diversos tecidos, incluindo órgãos pélvicos femininos, principalmente durante
a gestação e parto (GeneID 4016; OMIM 153456; Kagan & Li, 2003; Liu et al., 2004). Wu et
al., em 2007, descreveram genes hipermetilados, isto é, silenciados, em células cancerosas de
bexiga humana, dentre os quais LOXL1 estava presente. Além disso, foi encontrada baixa
expressão do gene em câncer de próstata e carcinomas de células escamosas de cabeça e
pescoço, sugerindo ação supressora tumoral para ele (Ren et al., 1998; Rost et al., 2003). Em
2006, Flores e colaboradores, usaram microarrays, identificando baixa quantidade de
transcritos de LOXL1 a partir de RNAs mensageiros isolados de linfócitos de sangue
periférico de pacientes com endometriose quando comparadas a pacientes sem a doença,
sugerindo ser esse gene candidato a marcador sanguíneo para a doença.
80
O gene LOXL1 foi selecionado para validação uma vez que foi menos expresso no grupo
de mulheres com endometriose, segundo dados obtidos pela RaSH, o que é coerente com o
resultado do trabalho que analisou linfócitos de sangue periférico de mulheres afetadas pela
doença. Também consideramos o fato de que se trata de um gene candidato a supressor
tumoral e, assim, sua baixa expressão poderia aumentar a taxa de multiplicação celular,
permitindo estabelecimento da doença. Entretanto, analisando os resultados de expressão
obtidos pela RT-PCR quantitativa em tempo real, observamos maior média dos níveis de
expressão de LOXL1 em mulheres com a doença (10,60) em comparação com mulheres não
afetadas (3,67), contrapondo o dado obtido pela RaSH.
Quanto à função do gene, sugerimos que um aumento da expressão poderia aumentar a
biogênese de tecido conjuntivo, levando ao aparecimento de lesões endometrióticas. Assim, a
alta expressão de LOXL1 poderia contribuir para o estabelecimento das células endometriais
fora da cavidade uterina por permitir que elas mantenham-se ligadas, em contato, com outros
tecidos.
Em relação ao valor diagnóstico, consideramos que os dados obtidos em nosso trabalho
foram mais fidedignos que os descritos por Flores e colaboradores (2006), que pesquisaram
alterações de expressão gênica no sangue periférico de pacientes com e sem endometriose.
Apesar de se tratar de uma doença de caráter inflamatório e as células decorrentes desse
processo poderem circular no sangue, a metodologia executada envolveu pesquisa de genes
não específicos do tecido endometriótico. Logo, a investigação da expressão de genes sem
uma pesquisa prévia referente ao local da lesão não permite a obtenção de dados consistentes
para afirmar que LOXL1 tem baixa expressão em portadoras da doença
Levando em conta que a endometriose possui características similares a processos
neoplásicos, outro fato interessante é que no câncer de mama metastático, LOXL1 encontra-se
81
altamente expresso, o que está de acordo com nossos resultados obtidos pela RT-PCR
quantitativa em tempo real para as mulheres com endometriose (Wu et al., 2007).
Em relação à análise da curva ROC, LOXL1 apresentou especificidade e sensibilidade
altas (90,9%), o que pode ser considerado bom parâmetro para distinção entre mulheres
afetadas e não afetadas pela endometriose, permitindo-nos sugerir que o gene pode ser
candidato a marcador da doença.
Examinando o gráfico de pontos interativos, observamos que o valor de corte de RQ de
5,0 pode ser considerado eficiente para separação entre as mulheres com e sem endometriose.
No entanto, no grupo afetado, uma paciente mostrou RQ abaixo de 5,0, em conformidade com
as RQs da maioria das mulheres sem a doença, e no grupo não afetado, uma mulher teve valor
de RQ acima do ponto de corte, considerado como pertencente à maioria do grupo das
mulheres com endometriose analisadas neste estudo. Além disso, no grupo I, uma paciente
apresentou valor de 5,09 e no grupo II, uma mulher apresentou valor de 4,98, valores muito
próximos ao de corte. Esses dados demonstraram que 9,09% das mulheres (2 em 22) não
foram discriminadas com sucesso entre os dois grupos e a mesma porcentagem incluiu
mulheres com RQs próximas ao limite de separação entre os dois grupos.
Paralelamente, houve maior dispersão de RQ no grupo de mulheres com endometriose em
relação aos valores das RQs de mulheres sem a doença, sendo que um dos dados obtidos foi
muito alto em relação à média (RQ = 36,76). A alta expressão de LOXL1 pode significar que
essa paciente possa ser mais resistente ao desenvolvimento da doença em relação às outras
pacientes estudadas, uma vez que nela seria necessária expressão muito alta do gene para que
as lesões se estabelecessem.
Torna-se necessário aumentar o número de mulheres em estudos posteriores, visando
avaliar se os níveis de expressão de LOXL1 podem ser eficazes para a separação de mulheres
afetadas das não afetadas pela doença.
82
Se os resultados de nosso estudo estiverem em concordância com a distribuição real das
RQs de LOXL1 da população de mulheres com e sem endometriose, para a amostra 7 do
grupo não afetado (RQ = 11,50) em que o gene LOXL1 está se expressando igual ao grupo de
mulheres afetadas pela endometriose, podemos especular que essa mulher pode não ter focos
endometrióticos visíveis, mas é portadora da doença. Também podemos hipotetizar que a
paciente com expressão de LOXL1 igual à média das mulheres sem endometriose, apesar de
ser afetada, possui células endometriais cujo estabelecimento em locais ectópicos seja mais
fácil de ocorrer, já que nesta bastaria baixa expressão do gene em questão para
desenvolvimento da doença.
V. 3. SPARC - secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin)
O gene SPARC, ou ON, codifica uma glicoproteína secretada multifuncional que está
associada à matriz extracelular (MEC) onde se liga a um grande número de moléculas e
exerce ação antiadesiva, o que inclui habilidade em desfazer adesões locais (Hudson et al.,
2005). Além disso, SPARC atua estimulando alterações no formato celular, inibindo a
progressão do ciclo celular, influenciando a síntese de elementos da MEC e modulando
interações célula-matriz (GeneID 6678; OMIM
182120). Também foi demonstrado que
SPARC reforça o sistema de sinalização de TGF-β, citocina responsável, dentre outras
funções, pela ativação da síntese de componentes da MEC, como colágeno, pela supressão da
expressão de metaloproteinases de matriz e indução de expressão de inibidores teciduais
dessas enzimas (Schiemann et al., 2003; Poncelet et al., 1998).
Em relação ao câncer, em células de carcinoma ovariano humano foi encontrada baixa
expressão de SPARC e nessas células a expressão dessa molécula induz apoptose (Mok et al.,
1996; Yiu et al., 2001). Esses resultados foram corroborados pelo fato de que, em ratos, na
83
ausência da expressão desse gene ocorria a formação de ambiente permissivo para o
crescimento e invasão tumorais de células ovarianas (Said & Motamed, 2005). Além do mais,
em ratos com mutação nula para SPARC e inoculados com células de câncer pancreático ou
pulmonar, foram encontradas alterações na produção e organização de componentes da MEC
no interior e na cápsula dos implantes tumorais, gerando menor restrição para a progressão
tumoral e metástase (Brekken et al., 2003).
Outra informação interessante é o fato de que SPARC possui ação antiangiogênica por se
ligar diretamente a VEGF, inibindo a proliferação celular endotelial e por bloquear o efeito
mitogênico de bFGF, um potente estimulador da angiogênese (Chlenski et al., 2006).
Devido ao fato de SPARC ter sido menos expresso no grupo das pacientes com
endometriose, a partir dos dados obtidos pela RaSH, selecionamos esse gene para validação,
uma vez que a redução de sua expressão pode gerar proliferação celular, angiogênese e
redução de apoptose, processos importantes para estabelecimento de lesões endometrióticas.
Outrossim, colabora para o desenvolvimento da doença, processos semelhantes aos que
ocorrem durante o aparecimento e desenvolvimento de tumores, tais como adesão,
crescimento e invasão. Além disso, quanto menor a expressão de SPARC, menor interação
com TGF-β, regulador negativo da proliferação celular, o que favorece a formação de lesões.
Outra conseqüência dessa baixa interação é o aumento da produção de enzimas proteolíticas
da MEC, o que facilita a invasão tecidual e, conseqüentemente permite estabelecimento das
células endometriais em local ectópico. Em nossa amostra, não detectamos diferença
significativa nos níveis de expressão de SPARC entre os grupos de mulheres com e sem
endometriose, por meio da RT-PCR quantitativa em tempo real. Esse resultado sugere que
provavelmente esse gene não represente a classe de moléculas com expressão alterada que
atuam no desenvolvimento da endometriose. Assim, acreditamos que devam existir outros
elementos que desempenhem funções semelhantes a SPARC nos processos dos quais essa
84
molécula participa, tais como adesão, invasão, angiogênese e resistência à apoptose, e que
possivelmente estejam relacionados ao estabelecimento da doença.
V. 4. SSAT - spermidine/spermine N1-acetyltransferase
O gene SSAT, cujas aliases são SAT, DC21 e KFSD, codifica a enzima
spermidina/spermina N1-acetiltransferase, que promove N(1)-acetilação de spermidina e
spermina na via catabólica de poliaminas, que são moléculas requeridas para o crescimento e
diferenciação normais da célula (GeneID 6303; OMIM 313020; Huang et al., 2005). Em
Escherichia coli, a indução de SSAT converte rapidamente espermidina em N1-
acetilespermidina, resultando em redução da taxa de crescimento celular (Parry et al., 1995).
Em 2005, Pledgie e colaboradores observaram efeito antiproliferativo de células de câncer de
mama quando a expressão de SSAT foi induzida. Além disso, nesse mesmo trabalho foi
elaborada a hipótese de que outro produto decorrente da catálise de poliaminas, o peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
), espécie reativa conhecida por provocar danos no DNA, teria efeito
inibitório no crescimento celular. Dessa maneira, pode-se concluir que a baixa expressão de
SSAT promoveria redução da catálise de poliaminas, e conseqüente diminuição da produção
de peróxido de hidrogênio, aumentando, assim, a taxa de proliferação celular.
Os dados acima concordam com os obtidos em nosso trabalho por meio da RaSH, já que a
baixa expressão de SSAT em mulheres com endometriose poderia aumentar a quantidade de
poliaminas ativas no interior de células endometrióticas, levando-as a uma maior proliferação.
Adicionalmente, nesse caso, a quantidade de H
2
O
2
estaria reduzida, o que impediria que a
multiplicação dessas células fosse prejudicada. Por esses motivos selecionamos também SSAT
para validação.
85
Não foi observada, por RT-PCR quantitativa em tempo real, diferença significativa na
expressão de SSAT entre os grupos de afetadas e não afetadas pela endometriose, sugerindo
que essa molécula não participe do processo responsável pelo início e manutenção da doença.
Assim, acreditamos que outras moléculas participam de vias relacionadas à proliferação
celular nos mecanismos que levam ao desencadeamento da endometriose.
A partir da análise das seqüências diferencialmente expressas entre as mulheres com e
sem endometriose, podemos dizer que a grande maioria das seqüências de referência obtidas
foi identificada neste estudo pela primeira vez e que nossos resultados não confirmaram
alguns dados publicados anteriormente sobre a expressão de genes específicos na doença.
A biblioteca RHENDW identificou seqüências referentes aos genes das metaloproteinases
MMP2 e MMP7, ambos descritos em publicações anteriores. As metaloproteinases são
enzimas proteolíticas que atuam em conjunto com seus inibidores, denominados TIMPs, para
remodelamento e renovação da matriz extracelular (Yang et al., 2004). A expressão
desregulada de qualquer uma dessas moléculas tem sido associada a doenças que envolvem
fenômenos invasivos, como processos tumorais e endometriose (Roughley & Lee, 1994;
Sillem et al., 1998).
Em discordância com nossos dados, alguns trabalhos evidenciaram aumento de expressão
de MMP2 tanto em tecido ectópico quanto tópico de mulheres com diagnóstico de
endometriose, quando comparada a mulheres não afetadas (Wenzl & Heinzl, 1998; Chung et
al., 2002). Entretanto, Sharpe-Timms (1997) descreveram altos níveis de expressão de MMP7
no endométrio tópico, mas expressão constitutiva desta metaloproteínase em lesões
endometrióticas, durante o ciclo menstrual.
86
Desta maneira, apesar de termos obtido resultados discordantes da literatura, acreditamos
que a RaSH foi eficiente na identificação de transcritos diferencialmente expressos entre as
amostras analisadas.
Prova disso é a observação de que entre os dois grupos estudados, houve diferença
significativa na expressão dos genes HTRA1 e LOXL1, após validação por RT-PCR
quantitativa em tempo real. Investigações futuras envolvendo maior número de amostras
podem confirmar nossos resultados em relação ao aumento de expressão de HTRA1 e LOXL1
em pacientes com endometriose, quando comparadas a mulheres sem a doença, estabelecendo
valores de corte mais confiáveis para separação desses dois grupos. Sugerimos que esses dois
genes possam estar envolvidos nos processos biológicos de desenvolvimento da doença,
podendo ser selecionados como marcadores moleculares para diagnóstico de endometriose.
87
VI. CONCLUSÕES
1) A técnica de RaSH foi eficaz na identificação de genes diferencialmente expressos
no tecido endometrial de mulheres sem endometriose, em comparação a genes expressos em
lesões endometrióticas de pacientes analisadas neste trabalho;
2) Os genes HTRA1 e LOXL1 mostraram diferença significativa entre o tecido
endometrial tópico e ectópico, sugerindo possível envolvimento entre expressão aumentada
desses genes e desenvolvimento da endometriose;
3) Os genes HTRA1 e LOXL1 podem ser considerados candidatos a marcadores
moleculares para o diagnóstico não invasivo de endometriose.
4) Apesar de ter sido possível a identificação dos genes SSAT e SPARC,
diferencialmente expressos pela técnica de RaSH, os resultados obtidos pela técnica de PCR
em tempo real não confirmaram diferença de expressão desses genes nos dois grupos
analisados;
88
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Zumbrunn, J & Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for
IGF-binding proteins. FEBS Letters, v. 398, p. 187–92, 1996.
Zweig, MH & Campbell, G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a
fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clinical Chemistry, v. 39(4), p. 561-77.
Erratum in: Clinical Chemistry, v. 39(8), p. 1589, 1993.
107
ANEXO A
Seqüências consideradas contaminantes obtidas das bibliotecas RHENDI e RHENDW
Bactérias
RHENDI RHENDW
U00096
Escherichia coli K-12 MG1655 complete
genome
37 5
Total 37 5
Leveduras
RHENDI RHENDW
T38386
T38386 EST103859 Saccharomyces cerevisiae
cDNA 3' end. 1/95
4
Total 0 4
Outros
RHENDI RHENDW
ZP_00377153
TonB-dependent receptor [Erythrobacter
litoralis HTCC2594]
1
ZP_00302656
COG0346: Lactoylglutathione lyase and related
lyases [Novosphingobium aromaticivorans
DSM 12444]
1
ZP_00304057
COG1506: Dipeptidyl
aminopeptidases/acylaminoacyl-peptidases
[Novosphingobium aromaticivorans DSM
12444]
1
AAA36590
ORF1; putative 1
Total 4 0
Total de contaminantes 41 9
108
ANEXO B
Seqüências de RNA das categorias: mitocondrial, ribossômica, ESTs e Unigene
Mitocondrial
RHENDI RHENDW
J01415
Human mitochondrion, complete genome 368 19
Total 368 19
Ribossômica
RHENDI RHENDW
U09953
gp|U09953|1323733|E3F957CA13F7BFEF
ribosomal protein L9 [Homo sapiens]
22
AB007158
gp|AB007158|3088342|E6A62203E15257C1
ribosomal protein S23 [Homo sapiens]
1
M90054
gp|M90054|337580|E9F238D9F8CA0D67
ribosomal protein L3 [Homo sapiens]
5
BC000802
tn|BC000802|AAH00802|E9CE3CBD59524F81
Similar to ribosomal protein S9.[Homo sapiens]
2
BC000523
tn|BC000523|AAH00523|E0764D60A6DD576E
Similar to ribosomal protein S24.[Homo
sapiens]
1
U14966
gp|U14966|550013|25F3BC2C6F674442
ribosomal protein L5 [Homo sapiens]
1
AF348700
tn|AF348700|AAK31162|2FE469F736571002
(UBA52)Ubiquitin A-52 residue ribosomal
protein fusion product 1 (Fragment).[Homo
sapiens]
5
X69391
gp|X69391|36138|3E209D02DFF365D9
ribosomal protein L6 [Homo sapiens]
14
XM_371853
PREDICTED: Homo sapiens similar to 60S
ribosomal protein L27a (LOC389435), mRNA
16
NM_000979
Homo sapiens ribosomal protein L18 (RPL18),
mRNA
2
NM_001002
Homo sapiens ribosomal protein, large, P0
(RPLP0), transcript variant 1, mRNA
4
NM_001012
Homo sapiens ribosomal protein S8 (RPS8),
mRNA
2
NM_000661
Homo sapiens ribosomal protein L9 (RPL9),
mRNA
3
NM_002952
Homo sapiens ribosomal protein S2 (RPS2),
mRNA
1
NM_000992
Homo sapiens ribosomal protein L29 (RPL29),
mRNA
5
NM_006013
Homo sapiens ribosomal protein L10 (RPL10),
mRNA
3
NM_022551
Homo sapiens ribosomal protein S18 (RPS18),
mRNA
2
continua
109
continuação
NM_000998
Homo sapiens ribosomal protein L37a
(RPL37A), mRNA
4
NM_007104
Homo sapiens ribosomal protein L10a
(RPL10A), mRNA
1
NM_000970
Homo sapiens ribosomal protein L6 (RPL6),
mRNA
4
NM_000991
Homo sapiens ribosomal protein L28 (RPL28),
mRNA
2
NM_033022
Homo sapiens ribosomal protein S24 (RPS24),
transcript variant 1, mRNA
1
NM_001009
Homo sapiens ribosomal protein S5 (RPS5),
mRNA
13
NM_001007074
Homo sapiens ribosomal protein L32 (RPL32),
transcript variant 3, mRNA
1
NM_000981
Homo sapiens ribosomal protein L19 (RPL19),
mRNA
6
NM_001021
Homo sapiens ribosomal protein S17 (RPS17),
mRNA
47
NM_001015
Homo sapiens ribosomal protein S11 (RPS11),
mRNA
11
Total 0 179
ESTs
RHENDI RHENDW
BE078764
QV2-BT0619-160400-144-f07_1 BT0619
Homo sapiens cDNA, mRNA sequence
1
CN288604
17000583181938 GRN_PRENEU Homo
sapiens cDNA 5', mRNA sequence
1
AW063430
TN0915 KRIBB Human TN intrathymic T-cell
cDNA library Homo sapiens cDNA 3', mRNA
sequence
2
AW023412
df54e06.y1 Morton Fetal Cochlea Homo
sapiens cDNA clone IMAGE:2487251 5',
mRNA sequence
1
AW166933
xg68e10.x1 NCI_CGAP_Ut4 Homo sapiens
cDNA clone IMAGE:2633514 3' similar to
TR:P97365 P97365 ZINC FINGER PROTEIN
64 ;, mRNA sequence
1
DA513180
DA513180 FEBRA2 Homo sapiens cDNA
clone FEBRA2000391 5', mRNA sequence
1
BF979590
602288061F1 NIH_MGC_97 Homo sapiens
cDNA clone IMAGE:4373847 5', mRNA
sequence
1
AU120065
AU120065 HEMBA1 Homo sapiens cDNA
clone HEMBA1007256 5', mRNA sequence
1
continua
110
continuação
CF597202
AGENCOURT_15657637 NICHD_Hs_Ov1
Homo sapiens cDNA clone IMAGE:30705289
5', mRNA sequence
5
BX402096
BX402096 Homo sapiens
NEUROBLASTOMA COT 25-NORMALIZED
Homo sapiens cDNA clone CS0DC012YB18 3-
PRIME, mRNA sequence
2
CB999662
AGENCOURT_13652348 NIH_MGC_186
Homo sapiens cDNA clone IMAGE:30323605
5', mRNA sequence
1
AA253227
zr76b03.s1 Soares_NhHMPu_S1 Homo sapiens
cDNA clone IMAGE:669293 3', mRNA
sequence
1
CR737055
CR737055 Soares_pregnant_uterus_NbHPU
Homo sapiens cDNA clone
IMAGp998B211198 ; IMAGE:502196 5',
mRNA sequence
1
AA586724
nn67c06.s1 NCI_CGAP_Lar1 Homo sapiens
cDNA clone IMAGE:1088938 3' similar to
contains Alu repetitive element;contains
MER27.b2 MER27 repetitive element ;, mRNA
sequence
1
AI906423
RC-BT108-140399-075 BT108 Homo sapiens
cDNA, mRNA sequence
1
CN284794
17000531650825 GRN_ES Homo sapiens
cDNA 5', mRNA sequence
1
BU570422
AGENCOURT_10401461 NIH_MGC_82
Homo sapiens cDNA clone IMAGE:6618678 5',
mRNA sequence
1
AA174078
zp18g12.s1 Stratagene fetal retina 937202
Homo sapiens cDNA clone IMAGE:609862 3',
mRNA sequence
1
AA176858
zp10c01.r1 Stratagene fetal retina 937202
Homo sapiens cDNA clone IMAGE:609024 5'
similar to contains Alu repetitive
element;contains element THR repetitive
element ;, mRNA sequence
1
BE439881
HTM1-470F HTM1 Homo sapiens cDNA,
mRNA sequence
3
CV572711
od27h01.y1 Human keratoconus cornea,
unamplified, (od/oe) Homo sapiens cDNA clone
od27h01 5', mRNA sequence
1
DA160554
DA160554 BRAMY2 Homo sapiens cDNA
clone BRAMY2020574 5', mRNA sequence
1
continua
111
continuação
CV571660
oe15f10.y1 Human keratoconus cornea,
unamplified, (od/oe) Homo sapiens cDNA clone
oe15f10 5', mRNA sequence
2
BI463414
603204458F1 NIH_MGC_97 Homo sapiens
cDNA clone IMAGE:5269982 5', mRNA
sequence
1
CX783776
HESC3_25_H02.g1_A036 NIH_MGC_260
Homo sapiens cDNA clone IMAGE:7478237 5',
mRNA sequence
1
CV427484
RC6-FN0082-271000-021-E10 FN0082 Homo
sapiens cDNA, mRNA sequence
1
DA627771
DA627771 KIDNE2 Homo sapiens cDNA
clone KIDNE2008378 5', mRNA sequence
1
Total 28 8
Unigene
RHENDI RHENDW
AK131511
tgnl|UG|Hs#S19862974 Homo sapiens cDNA
FLJ16729 fis, clone UTERU3017176
/cds=p(3512,3913) /gb=AK131511
/gi=47077535 /ug=Hs.544147 /len=3913
4
AK125512
tgnl|UG|Hs#S16887192 Homo sapiens cDNA
FLJ43524 fis, clone PLACE5000297
/gb=AK125512 /gi=34531632 /ug=Hs.369042
/len=3591
2
DB275414
tgnl|UG|Hs#S29666869 DB275414 UTERU3
Homo sapiens cDNA clone UTERU3000431 5',
mRNA sequence /clone=UTERU3000431
/clone_end=5' /gb=DB275414 /gi=83216722
/ug=Hs.586927 /len=570
1
AK024881
tgnl|UG|Hs#S2652760 Homo sapiens cDNA:
FLJ21228 fis, clone COL00739, mRNA
sequence /gb=AK024881 /gi=10437293
/ug=Hs.306716 /len=1869
1
BG818416
tgnl|UG|Hs#S3604358 602779974F2
NCI_CGAP_Brn67 Homo sapiens cDNA clone
IMAGE:4915530 5', mRNA sequence
/clone=IMAGE:4915530 /clone_end=5'
/gb=BG818416 /gi=14166003 /ug=Hs.434023
/len=744
1
AF370457
tgnl|UG|Hs#S15632048 Homo sapiens ovarian
epithelial carcinoma-related protein mRNA,
complete cds /cds=p(3715,4461) /gb=AF370457
/gi=30314934 /ug=Hs.131226 /len=4737
1
continua
112
continuação
CA313852
tgnl|UG|Hs#S6103412 UI-CF-FN0-afo-g-20-0-
UI.s1 UI-CF-FN0 Homo sapiens cDNA clone
UI-CF-FN0-afo-g-20-0-UI 3', mRNA sequence
/clone=UI-CF-FN0-afo-g-20-0-UI
/clone_end=3' /gb=CA313852 /gi=24531950
/ti=159720155 /ug=Hs.574529 /len=760
1
AK022877
tgnl|UG|Hs#S2650933 Homo sapiens cDNA
FLJ12815 fis, clone NT2RP2002546, mRNA
sequence /gb=AK022877 /gi=10434526
/ug=Hs.49476 /len=2267
1
BQ924623
tgnl|UG|Hs#S4693338 AGENCOURT_8821514
Lupski_sciatic_nerve Homo sapiens cDNA
clone IMAGE:6203471 5', mRNA sequence
/clone=IMAGE:6203471 /clone_end=5'
/gb=BQ924623 /gi=22339654 /ti=141988287
/ug=Hs.573780 /len=963
2
XM_496387
tgnl|UG|Hs#S21591497 PREDICTED: Homo
sapiens similar to tripartite motif-containing 43
(LOC440610), mRNA /cds=p(1,1701)
/gb=XM_496387 /gi=51459269 /ug=Hs.497543
/len=1774
2
NM_014643
tgnl|UG|Hs#S2140692 KIAA0222 gene product
[Homo sapiens], mRNA sequence
/cds=(318,3809) /gb=NM_014643 /gi=7662009
/ug=Hs.48450 /len=6033
1
NM_017737
tgnl|UG|Hs#S2293714 hypothetical protein
FLJ20275 [Homo sapiens], mRNA sequence
/cds=(54,1046) /gb=NM_017737 /gi=8923248
/ug=Hs.239681 /len=3320
1
N23897
tgnl|UG|Hs#S321444 yw46h10.s1 Weizmann
Olfactory Epithelium Homo sapiens cDNA
clone IMAGE:255331 3', mRNA sequence
/clone=IMAGE:255331 /clone_end=3'
/gb=N23897 /gi=1138047 /ug=Hs.144186
/len=454
1
BX641141
tgnl|UG|Hs#S16819731 Homo sapiens mRNA;
cDNA DKFZp686N19169 (from clone
DKFZp686N19169) /gb=BX641141
/gi=34365471 /ug=Hs.449601 /len=3129
1
continua
113
continuação
BM141654
tgnl|UG|Hs#S3994991 if24c05.x1 Melton
Normalized Human Islet 4 N4-HIS 1 Homo
sapiens cDNA clone IMAGE:5677424 3',
mRNA sequence /clone=IMAGE:5677424
/clone_end=3' /gb=BM141654 /gi=17151719
/ug=Hs.571918 /len=543
3
AL833386
tgnl|UG|Hs#S4622005 Homo sapiens mRNA;
cDNA DKFZp667N0414 (from clone
DKFZp667N0414), mRNA sequence
/gb=AL833386 /gi=21734021 /ug=Hs.376868
/len=3219
1
XM_498786
PREDICTED: Homo sapiens LOC440642
(LOC440642), mRNA
2
BG941030
tgnl|UG|Hs#S3751839 ax08h09.y1 Proliferating
Human Erythroid Cells (LCB:ax library) Homo
sapiens cDNA clone ax08h09 random, mRNA
sequence /clone=ax08h09 /gb=BG941030
/gi=14340402 /ug=Hs.574458 /len=272
1
Total 22 5
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