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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DE CÉLULAS
TRONCO AUTÓLOGAS DE MEDULA ÓSSEA EM
ASSOCIAÇÃO COM TÉCNICA DE TUBULIZAÇÃO
POR PRÓTESE DE SILICONE NA REGENERAÇÃO
DO NERVO TIBIAL DE COELHOS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Lucas Marques Colomé
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DE CÉLULAS TRONCO
AUTÓLOGAS DE MEDULA ÓSSEA EM ASSOCIAÇÃO COM
TÉCNICA DE TUBULIZAÇÃO POR PRÓTESE DE SILICONE
NA REGENERAÇÃO DO NERVO TIBIAL DE COELHOS
por
Lucas Marques Colomé
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em
Cirurgia Veterinária, da Universidade Federal de Santa Maria
(UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária.
Orientador: Prof. Ney Luis Pippi
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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___________________________________________________________________
© 2007
Todos os direitos autorais reservados a Lucas Marques Colomé. A reprodução de
partes ou do todo deste trabalho só poderá ser feita com autorização por escrito do
autor. Endereço: Rua Faria Santos, 512/204 – Bairro Petrópolis, Porto Alegre – RS,
CEP. 90670150 Fone (0xx)51 21039747; End. Eletr: lucascolome@hotmail.com
___________________________________________________________________
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DE CÉLULAS TRONCO AUTÓLOGAS DE
MEDULA ÓSSEA EM ASSOCIAÇÃO COM TÉCNICA DE TUBULIZAÇÃO POR
PRÓTESE DE SILICONE NA REGENERAÇÃO DO NERVO TIBIAL DE COELHOS
elaborada por
Lucas Marques Colomé
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária
COMISÃO EXAMINADORA:
Ney Luis Pippi, Dr.
(Presidente/Orientador)
Emerson Antonio Contesini, Dr. (UFRGS)
Elizabeth Obino Cirne Lima, Dra. (UFRGS)
Santa Maria, 05 de março de 2007.
DEDICATÓRIA
Acreditar que é possível, pesar e assumir os riscos, cerrar os punhos e
partir pra luta. Aliada ao desejo de alçar o objetivo, a fé torna-se a força mais
poderosa do mundo e com ela ao seu lado, tudo se torna possível. Mais essa
importante etapa vencida em minha vida, eu dedico com todo o amor que
tenho em meu peito a meus pais Teodoro e Clara, por terem me ensinado,
sempre através do exemplo, a lutar com esforço, dedicação e perseverança.
Que eu possa estar sempre perto de vocês, mesmo que pelo pensamento,
pois assim terei a certeza que continuam iluminando minha vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao meu Orientador, Dr. Ney Luis Pippi pelo crédito a
mim concedido, pelos relevantes conselhos e preocupação profissional. Enfim, por
ser um exemplo a ser seguido e pela característica de reconhecer as pessoas como
únicas, com suas melhores virtudes e suas dificuldades próprias.
Ao “supervisor” da fase experimental de meu mestrado, Dr. Emerson
Contesini, obrigado por aceitar o desafio de observar meu desempenho longe de
minha instituição de origem. Agradeço pelo estímulo firme e cobrança responsável
durante a realização da fase prática deste curso.
À Dra. Elizabeth Obino Cirne Lima, agradeço muito pela sempre pronta
disposição em auxiliar, pela oportunidade única em trabalhar com este tema tão
relevante e pela abertura das portas do Laboratório de Embriologia e Diferenciação
Celular do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
À Dra. Dominguita Luhers Graça, pelo carinho, compreensão e pela mão
sempre disposta em ajudar. Agradeço de coração pela orientação sobre os
procedimentos e técnicas com as amostras e pela dedicação na avaliação dos
resultados finais.
À Dra. Luise Meurer, pelo compromisso assumido e valiosa orientação nas
diferentes etapas de realização do experimento.
Aos colegas Cristiano Gomes e Nádia Crossignani pela amizade e ajuda
durante todas as etapas de execução do projeto. Acredito que as palavras para
agradecer a atenção dispensada por vocês tem um significado muito pequeno diante
de seus esforços, mesmo assim deixo aqui meu mais sincero muito obrigado.
Aos meus queridos estagiários e bolsistas, Karina, Liziane e Jardel, da
mesma forma, obrigado pela ajuda e pelo empenho nas horas em que mais precisei.
Sou muito grato a vocês por muitas vezes até mesmo abdicarem de suas atividades
rotineiras em beneficio de nossa pesquisa. Vocês foram fundamentais para tornar
este trabalho possível.
À equipe do Laboratório de Embriologia e Diferenciação Celular, Ana Helena
e Ana Ayala, obrigado pelas conversas e orientações; e por cuidaram com tanto
carinho das “tão cobiçadas e aguardadas” células tronco.
À equipe do Centro de Microscopia Eletrônica (CME), principalmente ao
Professor Dr. Luis Frederico Pinheiro Dick e a Moema pelo crédito e dedicação no
preparo das amostras.
À equipe envolvida com toda a “logística” e preparação de material para a
execução das cirurgias: Gisele, Marcos, Michele (HCV/UFRGS) e Eduardo e Tânia
(HCPA).
Agradeço também ás pessoas que através do contato profissional tornaram-
se meus amigos, como o Professor Igor e o funcionário Paulo da Escola Técnica
Agrícola de Viamão. Muito obrigado pela ajuda, cuidado e orientação na
manipulação com esta espécie tão “diferente” para mim e tão agradável de trabalhar.
Aos meus pais, a quem dediquei este estudo, acima e além de tudo amigos e
conselheiros, minha eterna gratidão pelo esforço, preocupação constante e
abnegação imensuráveis.
À Letícia, uma espécie de “irmã-mãe”, sempre extremamente lúcida, justa,
correta e imparcial, que apesar de ter também suas dificuldades e contratempos
rotineiros, achava tempo para conversar sobre as coisas boas e nem tão boas assim
da vida. Obrigado pelo socorro, pela mão carinhosa e compreensiva. Meu muito
obrigado também ao Eduardo, pela enorme compreensão e disposição instantânea
em ajudar em tudo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq,
pelo apoio à pesquisa e pela bolsa cedida.
E finalmente, aos animais, meu mais sincero respeito e gratidão, por
emprestar a vida em benefício de minha pesquisa, da ciência e da humanidade.
Muito obrigado!
“... não basta o compromisso, vale
mais o coração... ninguém sabia e
ninguém viu que eu estava ao teu
lado então...”.
(Cássia Eller)
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
CÉLULAS TRONCO AUTÓLOGAS DE MEDULA ÓSSEA NA
REGENERAÇÃO DO NERVO TIBIAL
DE COELHOS MEDIANTE TÉCNICA DE TUBULIZAÇÃO COM
PRÓTESE DE SILICONE
AUTOR: LUCAS MARQUES COLOMÉ
ORIENTADOR: NEY LUIS PIPPI
Santa Maria, 05 de março de 2007.
Este estudo apresenta um modelo experimental de defeito agudo em nervo
periférico para avaliação da regeneração nervosa mediante técnica de tubulização
associada à inoculação de células tronco autólogas de medula óssea. No trabalho
foram utilizados 12 coelhos Nova Zelândia albinos, submetidos à secção bilateral do
nervo tibial e posterior reparo mediante utilização de câmara de silicone.
Internamente à prótese de tubulização do nervo tibial esquerdo em todos os animais,
foram inoculadas as células tronco autólogas de medula óssea, coletadas a partir do
úmero. Como grupo controle (nervo tibial direito), mediante aplicação de mesma
técnica de reparo, solução de NaCl foi administrada internamente à prótese. Após 30
dias de observação os animais foram eutanasiados e procedeu-se a avaliação
histológica dos segmentos nervosos através das colorações de hematoxilina-eosina,
luxol fast blue e azul de toluidina. Com os resultados, foi possível concluir que o
transplante de células tronco autólogas associada à técnica de tubulização
apresenta vantagens no processo de regeneração nervosa periférica.
Palavras-chave: células tronco; nervo tibial; tubulização; coelhos
ABSTRACT
MS dissertation
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
AUTOLOGOUS STEM CELLS FROM BONE MARROW IN THE
REGENERATION OF TIBIAL NERVE OF RABBITS USING THE
TUBULIZATION TECHNIQUE WITH SILICONE TUBE
AUTHOR: LUCAS MARQUES COLOMÉ
ADVISER: NEY LUIS PIPPI
Santa Maria, march, 05, 2007.
This study presents an experimental model of an acute defect in a peripheral nerve
to evaluate neural regeneration using a tubulization technique associated with the
inoculation of autologous stem cells from bone marrow. A total of 12 New Zealand
white rabbits underwent a bilateral dissection of the tibial nerve followed by repair
with silicone tubulization. On the left tibial nerve of all animals, the tube was filled with
autologous bone marrow-derived stem cells collected from the humerus. For control,
using the same repair technique, tubes were filled with a NaCl solution in the right
tibial nerve. After 30 days of observation, the animals were euthanized and a
histological evaluation of the collected nerve segments was performed by staining
with hematoxylin-eosin, luxol fast blue, and toluidine blue. From the results it is
possible to conclude that the transplanted autologous stem cells associated with the
tubulization technique present an advantage in the peripheral nerve regeneration
process.
Key-words: stem cells, tibial nerve, tubulization, rabbits
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Representação esquemática da propriedade das células tronco de se
dividirem dando origem a células que permanecem indiferenciadas ou células que se
diferenciam e amadurecem ..........................................................................................20
FIGURA 2 - Representação esquemática do procedimento de isolamento da porção
mononuclear a partir de fração total de medula óssea (MO) .......................................25
FIGURA 3 - Representação esquemática das estruturas nervosas microscópicas
demonstradas em corte transeccional esquemático de nervo periférico. Observar a
disposição e ordenamento dos feixes e fascículos nervosos.......................................27
FIGURA 4 – Representação esquemática de A) técnica de tubulização para reparo de
secção nervosa. B) formação da ponte não celular entre as extremidades nervosas
......................................................................................................................................33
FIGURA 5 - Representação esquemática da extremidade do axônio e seu cone de
crescimento. Observar a presença dos lamelipódios e filopódios................................37
FIGURA 6 - Fotografia demonstrando a coleta de medula óssea a partir do
tubérculo maior do úmero utilizando-se agulha de Osgood (25x10) acoplada à seringa
de 10 mL previamente heparinizada............................................................................40
FIGURA 7 – Fotografia demonstrando a prótese de silicone fixada às extremidades
nervosas seccionadas e injeção da fração de células tronco (1.10
6
células em
0,1mL)
no interior da câmara...................................................................................................44
FIGURA 8 – Fotografia demonstrando o crescimento nervoso dentro da prótese de
silicone. O fio de sutura amarrado à extremidade serviu como marcação para porção
proximal do nervo tibial................................................................................................51
FIGURA 9 - Fotografia demonstrando infiltração por eosinófilos (seta) no tecido
nervoso regenerado da porção média do nervo tibial (corte longitudinal com coloração
de HE e aumento de 400X)..........................................................................................54
FIGURA 10 - Fotografia demonstrando presença de degeneração Walleriana pela
formação das câmaras de digestão (seta inferior) no tecido nervoso regenerado da
porção média do nervo tibial. A seta superior demonstra o orifício deixado pelo
material de sutura (corte longitudinal com coloração de luxol fast blue e aumento de
400X)............................................................................................................................59
FIGURA 11- Fotografia demonstrando o padrão de regeneração das fibras nervosas
na porção distal do nervo tibial direito (corte longitudinal ultra-fino com coloração de
azul de toluidina 0,25% e aumento de 400X).............................................................61
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Volume de medula óssea aspirada a partir do tubérculo umeral direito
(UD) e esquerdo (UE) para posterior processamento e separação da fração
mononuclear...............................................................................................................41
TABELA 2 - Avaliação das diferentes variáveis (granuloma, eosinófilos e
hemossiderina) observadas e seus respectivos valores referentes ao nervos direito
(controle) e esquerdo (tratamento) nos cortes corados com
HE.............................................................................................................................52
TABELA 3 -Valores em % da observação de degeneração Walleriana pela presença
de câmaras de digestão nos cortes corados com luxol fast blue...............................57
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - Representações gráficas dos valores individuais (A) e médios (B)
para a variável eosinófilos nos grupos controle (D) e tratamento (E).......................54
GRÁFICO 2 - Representações gráficas dos valores individuais (A) e médios (B)
para a variável hemossiderina nos grupos controle (D) e tratamento (E).................56
GRÁFICO 3 - Representações gráficas dos valores individuais (A) e médios (B)
para a variável degeneração Walleriana nos grupos controle (D) e tratamento
(E)..............................................................................................................................58
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - Metodologia de avaliação das alterações encontradas nos cortes
histológicos corados com HE e luxol fast blue..............................................................46
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1 - Solução fixadora para a base de glutaraldeído objetivando a
estabilização dos tecidos.......................................................................................... 71
ANEXO 2 – Protocolo de preparação de amostras biológicas para realização de
cortes ultra-finos.........................................................................................................72
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA.....................................................................................................
AGRADECIMENTOS...........................................................................................
RESUMO..............................................................................................................
ABSTRACT..........................................................................................................
LISTA DE FIGURAS............................................................................................
LISTA DE TABELAS...........................................................................................
LISTA DE GRÁFICOS.........................................................................................
LISTA DE QUADROS..........................................................................................
LISTA DE ANEXOS.............................................................................................
SUMÁRIO.............................................................................................................
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................
2.1 Terapia celular................................................................................................
2.2 Conceitos e fisiologia das células tronco .......................................................
2.3 Obtenção de células tronco autólogas de medula óssea...............................
2.4 Considerações anatomo-fisiológicas sobre o sistema nervoso......................
2.5 Lesões nervosas periféricas...........................................................................
2.6 Técnicas de reparação de nervos periféricos.................................................
2.7 Cicatrização dos nervos periféricos................................................................
2.7.1 Modificações na região proximal á lesão....................................................
2.7.2 Modificações no corpo celular.....................................................................
2.7.3 Modificações na região distal à lesão..........................................................
04
05
07
08
09
10
11
12
13
14
16
18
18
19
23
25
28
30
33
34
35
36
2.7.4 Modificações no local da lesão....................................................................
3 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................
3.1 Animais...........................................................................................................
3.2 Coleta de medula óssea.................................................................................
3.3 Separação e manipulação das células tronco autólogas de medula óssea...
3.4 Procedimento cirúrgico e transplante de células tronco autólogas de
medula óssea.......................................................................................................
3.5 Processamento, análise das amostras e tratamento estatístico dos dados...
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................
5 CONCLUSÃO...................................................................................................
6 REFERÊNCIAS.................................................................................................
7 ANEXOS...........................................................................................................
36
39
39
39
41
42
45
47
64
65
74
16
1 INTRODUÇÃO
As áreas ligadas à pesquisa em experimentação, no âmbito da medicina e
biologia, vêm estudando as células tronco há mais de duas décadas (FILIP et al.,
2004). No entanto, é nos dias de hoje que a terapia celular vive seu momento de
máxima visibilidade, incitando a inquietante investigação científica e ocupando
quase que diariamente o foco da imprensa do mundo inteiro. A grande atenção
dispensada a esta unidade terapêutica, explica-se devido ao fato de muitas doenças,
alvos potenciais desses tratamentos, constituírem-se nas principais causas de morte
e morbidade da sociedade moderna (ZAGO & COVAS, 2006). Inseridas dentro deste
contexto, encontram-se as variadas alterações e lesões do sistema nervoso
periférico, que há bastante tempo vem sendo objeto de inúmeros estudos visando a
compreensão e entendimento do processo de reparação nervosa, visto que estas
alterações podem ocasionar transtornos importantes à função dos membros
(GRECCO et al., 2003).
Lesões traumáticas vasculares, inflamações e neoplasias podem produzir
ruptura de alguns ou todos os neurônios em um nervo periférico, resultando em
disfunção sensitiva e/ou motora focal. Chrisman (1996) destacou que as causas
mais comuns de disfunção aguda de nervos periféricos são, sem nenhuma dúvida,
as lesões traumáticas.
A regeneração funcional que ocorre após uma reparação de secção nervosa é
um processo bastante complexo que envolve tanto fatores locais quanto sistêmicos.
Neste particular, os mecanismos básicos de controle da mielinização das fibras
regeneradas e dos seus processos de crescimento e orientação encontram-se ainda
parcialmente determinados (DAZA et al., 1999).
Estudos envolvendo a regeneração em defeitos nervosos conseguidos através
do emprego de materiais biológicos e não biológicos como as câmaras de silicone e
o envelope venoso cada vez mais vêm sendo desenvolvidos. No entanto, a
capacidade de regeneração nervosa conseguida através desses materiais pode
ainda ser melhorada na opinião de diversos autores (DOURADO et al., 2003; SILVA
et al., 2006). Visando a superação das dificuldades na aplicação de técnicas
reparadoras de nervos periféricos, pesquisas vêm objetivando conhecer o benefício
da associação de técnicas já rotineiramente utilizadas, por apresentarem resultados
17
consolidados, com alternativas relativamente novas dentro do âmbito da engenharia
tecidual. Como exemplo, podemos citar a utilização de substâncias exógenas
administradas para promover um acréscimo na qualidade e velocidade de
regeneração. No estudo em questão o emprego da técnica de tubulização associada
à terapia celular mononuclear autóloga de medula óssea representa bem esta
tendência.
A recente e promissora área da medicina regenerativa vem abrindo
perspectivas inovadoras para o tratamento de inúmeras doenças, utilizando terapias
celulares, fatores de proliferação e diferenciação celular e biomateriais que permitem
ao próprio organismo reparar tecidos e órgãos lesados (PINEDO et al., 2001;
BARTH, 2006).
Considerando o exposto, este trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade
de regeneração nervosa periférica, mais especificamente do nervo tibial de coelhos
Nova Zelândia, mediante a associação da terapia celular por transplante de células
tronco autólogas de medula óssea com a técnica de tubulização através de prótese
de silicone. O delineamento experimental foi desenvolvido baseando-se na revisão
de literatura realizada e na execução de projetos “piloto” de onde se puderam retirar
algumas prévias conclusões a respeito desse tema ainda tão insuficientemente
esclarecido. Devido ao fato das pesquisas nesta área e seus conseqüentes
resultados ainda se encontrarem incipientes ou em fase de afirmação, muita
dificuldade foi encontrada tanto no planejamento quanto na execução das diferentes
etapas do estudo. Para tanto, o desenvolvimento de algumas técnicas e
procedimentos baseados na tentativa e erro tornaram-se inevitáveis, pois ainda não
se encontram disponíveis, consolidadas ou publicadas pelos pesquisadores
dedicados à pesquisa com células tronco. Baseado nisso, torna-se importante
salientar, que inúmeras pesquisas ainda serão necessárias para concluir ou
confirmar achados de todos estes estudos que estão sendo hoje desenvolvidos.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
Neste tópico serão abordados os principais itens que direcionarão e
embasarão as discussões envolvendo a aplicação das células tronco de uma forma
bastante ampla. Importância maior será dada à utilização de células tronco
autólogas de medula óssea, tendo em vista que foi o tipo celular escolhido para o
desenvolvimento desta pesquisa.
2.1 Terapia celular
Células, tecidos e órgãos lesados por doenças ou traumas podem ser
recuperados espontaneamente pelo organismo saudável. A ocorrência deste
processo em geral exige a interrupção ou abrandamento da agressão seguida de
remodelação do tecido lesado, via de regra utilizando reservas de células tronco
tecido específicas de que o organismo dispõem.
Neste contexto, Zago (2006a) conceituou o termo terapia celular como um
conjunto de métodos e abordagens tecnológicas fundamentadas no conhecimento
de várias ciências que visam a utilização de células para tratamento de inúmeras
doenças. Historicamente, a forma mais antiga de terapia celular conhecida é a
transfusão de componentes sanguíneos de um indivíduo para outro, caracterizada
por ser hoje em dia, uma das alternativas terapêuticas mais utilizadas no mundo
inteiro.
Apenas exemplificando, o transplante de células tronco hematopoéticas
(transplante de medula óssea) é atualmente a única forma de tratamento com
células tronco humanas cuja aplicação faz parte do arsenal médico disponível.
Todas as outras formas de tratamento derivadas dessa metodologia ainda
encontram-se na fase experimental e, portanto, seus benefícios precisam ainda ser
demonstrados ou consolidados, principalmente naqueles casos onde existam
evidências marcantes e positivas de suas vantagens. Atualmente o principal foco de
interesse da terapia celular é a medicina regenerativa, que objetiva a substituição de
células e tecidos lesados, senescentes ou perdidos, por estruturas mais novas e
funcionais, restaurando assim sua capacidade orgânica (ZAGO, 2006a).
19
Uma questão polêmica gerada e incorporada às pesquisas com células tronco
é a fonte de onde elas são obtidas. Células tronco de origem embrionária, em
particular a partir de um embrião humano, são cercadas por uma questão de cunho
ético e até mesmo político que objetivam discutir a regulamentação da pesquisa e
manipulação destas células. Este impasse surge a partir do princípio de utilização
destes organismos, pois segundo Barth (2006), até o presente momento não
existem meios de se obter células tronco embrionárias humanas que não exijam a
produção e conseqüente destruição do embrião humano. Células tronco obtidas a
partir de outras fontes, como organismos adultos, cordão umbilical e placenta, já não
apresentam o mesmo entrave, pois não envolvem a manipulação de embriões. A
abordagem que será desenvolvida nesta revisão bibliográfica trará informações
relacionadas à coleta e manipulação de células tronco autólogas de medula óssea,
que por serem obtidas a partir de organismos adultos, não fazem parte da discussão
ética relacionada com as células tronco de origem embrionária.
2.2 Conceitos e fisiologia das células tronco
Células tronco são caracterizadas por serem células indiferenciadas, não
apresentarem função específica nos tecidos e serem capazes de se proliferar
mantendo-se no estado indiferenciado por longos períodos de tempo (tanto in vitro
quanto in vivo). Esta última propriedade é denominada de auto-regeneração e
permite que o compartimento de células tronco seja mantido constante ao longo do
tempo (SANTOS, 2004; NARDI & ALFONSO, 2006). Células tronco apresentam
também capacidade de se diferenciar em células maduras, demonstrando atividade
funcional normal como a de outras células do tecido em que se localizam; a este
processo denomina-se diferenciação (SANTOS et al., 2004). Em essência, células
tronco de uma forma geral são capazes de realizar as chamadas “divisões
assimétricas”, ou seja, podem originar células que permanecem indiferenciadas,
repondo o pool de células tronco ou alternativamente podem se diferenciar em
células especializadas (Figura 1) (ZAGO, 2006b).
20
Figura 1- Representação esquemática da propriedade das células tronco
de se dividirem dando origem a células que permanecem
indiferenciadas ou células que se diferenciam e amadurecem.
Fonte: Zago, 2006a.
Desde a década de 1940 sabia-se que na medula óssea existiam células
indiferenciadas capazes de repor as células maduras do sangue. No entanto, o
conceito de células tronco originou-se a partir dos estudos de Till e McCulloch que
em 1961, demonstraram a reconstituição do sistema hematopoético de
camundongos irradiados após o transplante de células da medula óssea de
camundongos singeneicos normais. Estes resultados indicaram a presença na
medula óssea de células capazes de originar todos os tipos celulares sangüíneos
(NARDI & ALFONSO, 2006). Devido a estes estudos preliminares, é que as
primeiras células tronco bem caracterizadas foram as progenitoras das células
sanguíneas. Essas células tronco, denominadas hematopoéticas (CTH), são
bastante raras e devido a este fato, sua identificação morfológica sempre foi muito
difícil (ZAGO, 2006a).
No organismo adulto, o processo de diferenciação hematopoética depende de
interações entre as células tronco progenitoras e seu microambiente. Esse
microambiente, é formado por células “fixas” (células do próprio tecido) e as células
acessórias, como linfócitos e monócitos. Ambos os tipos celulares podem regular a
hematopoese interagindo diretamente com as células tronco progenitoras ou
21
secretando as moléculas reguladoras que influenciam de uma maneira positiva ou
negativa sua diferenciação. Além das citocinas, as células estromais produzem e
secretam as macromoléculas que formam a complexa matriz extracelular (MEC). A
MEC possibilita através da interação de seus componentes, a geração de uma
estrutura tridimensional à qual as CTH aderem por receptores ou ligantes
específicos (NARDI & ALFONSO, 2006).
A medula óssea (MO) contém uma grande diversidade de células que
incluem: células maduras do sangue, linfócitos, fragmentos de estroma e gordura,
além das células tronco hematopoéticas. As CTHs, dentre o grande número de
células tronco de adultos atualmente conhecidas, ocupa a honrosa posição de ter
sido a primeira descrita, sendo também a melhor compreendida e a mais
amplamente aplicada em protocolos clínicos (NARDI & ALFONSO, 2006). Além
desta variedade celular, na medula óssea existe ainda uma população rara de
células tronco multipotenciais capazes de suportar a hematopoese e se diferenciar
em diversas linhagens celulares. Estas células foram originalmente identificadas a
partir de células mononucleares da medula óssea de camundongos por Alexander
Friedenstein e colaboradores em 1966, que as denominaram células formadoras de
colônias fibroblásticas (CFU-F, colony forming units- fibroblastic). Mais
recentemente, estas células passaram a ser chamadas de células tronco
mesenquimais (CTM). As CTMs correspondem a aproximadamente 0,001% a 0,01%
de todas as células nucleadas medulares. Podem ser facilmente isoladas a partir de
aspirados de medula óssea, separando-se a fração mononuclear em gradiente de
densidade, seguida de plaqueamento em concentrações variáveis. Em cultura,
apresentam propriedade de se aderir à placa de cultivo e se propagar por mais de
15 passagens sem sinais de senescência. Estas células expressam um amplo
espectro de citocinas, receptores de citocinas e fatores de crescimento. Também
produzem uma série de moléculas de matriz extracelular incluindo fibronectina,
laminina, colágenos e proteoglicanos (COVAS, 2006)
De acordo com o grau de diferenciação a que as células tronco podem se
submeter, são classificadas em diferentes categorias. Células tronco totipotentes
são as células que conseguem se diferenciar e originar todos os tecidos fetais.
Como exemplo, pode-se mencionar uma célula-ovo, um óvulo fecundado ou uma
célula híbrida obtida a partir da transferência de núcleo somático. Este tipo celular se
encontra no ápice da hierarquia das células tronco. Células tronco pluripotentes
22
conseguem se diferenciar em todos os tipos teciduais de um indivíduo adulto com
exceção das membranas embrionárias, placenta e anexos embrionários. Células
tronco multipotentes são células isoladas de vários órgãos adultos auto-renováveis e
diferenciadas em múltiplos tipos celulares de órgãos específicos. Finalmente,
células com nenhum ou limitado poder de renovação e diferenciação em apenas um
único e definido tipo celular são chamadas “células precursoras” ou “células
progenitoras” (DEL CARLO, 2005; LAKSHMIPATHY & VERFAILLIE, 2005; ZAGO,
2006a;).
Atualmente existem numerosas demonstrações de que vários ou talvez todos
tecidos humanos possuam células tronco como constituintes de reserva para repor
as células maduras desgastadas. Por isso, tradicionalmente, células tronco adultas
são consideradas pelo fato de produzirem células a partir do tecido de origem, mas
não células de tecidos não relacionados (LAKSHMIPATHY & VERFAILLIE, 2005).
Desta forma, são bem conhecidas as células tronco da pele, mucosa
intestinal, epitélio olfativo, cérebro, fígado, gordura, córnea, retina, polpa dentária,
pulmões e músculos esquelético e cardíaco. Todos estes são exemplos de um tipo
de célula tronco denominado de células tronco somática (soma=corpo). Como estas
células podem dar origem a um único ou alguns poucos tipos de células
diferenciadas, são classificadas como células tronco unipotentes, oligopotentes ou
multipotentes (ZAGO, 2006b).
A capacidade de células tronco de um tecido de originar células diferenciadas
maduras de outros tecidos vem sendo denominada de plasticidade. Uma questão
chave ainda não respondida através dos estudos até então realizados, é o grau de
plasticidade das células tronco adultas. Para Nardi & Alfonso (2006), uma das
razões para que esta dúvida continue sem uma resposta definitiva é a dificuldade na
experimentação envolvida. Enquanto se observa relativa facilidade de avaliar o
potencial de diferenciação celular in vitro, o mesmo não acontece para a situação in
vivo, pois o significado fisiológico e a correspondência destes processos é
questionável.
Diante do exposto, a resposta final depende da avaliação de quanto um
determinado tipo de célula tronco, após administração in vivo, pode originar tipos
celulares de diferentes tecidos. Para se obter esta resposta, geralmente a
metodologia dos estudos científicos envolve a administração de células juntamente
com algum marcador para posterior avaliação da presença do mesmo. Além da
23
expressão deste marcador, considera-se necessária a determinação da identidade
celular por análise morfológica, imunofenotípica e/ou funcional. Na opinião de Nardi
& Alfonso (2006), a avaliação funcional demonstra significado muito importante,
principalmente em tecidos mais complexos como nervoso, pois muitas vezes a
determinação desta identidade apresenta-se incompleta.
Diferentes correntes explicam a teoria da plasticidade. Em algumas
referências encontra-se a explicação para transformação de células da medula
óssea em células diferenciadas de outros tecidos adultos na fusão celular.
Diferentemente, outros estudos responsabilizam o fenômeno da transdiferenciação
na geração de células diferenciadas maduras.
Em estudos in vitro, Alvarez-Dolado et al. (2003) observaram que as células
derivadas da medula óssea fundiam-se espontaneamente com progenitores neurais.
Já nas experimentações in vivo, fusão com hepatócitos e neurônios de Purkinje no
cérebro e músculo cardíaco foi observada, resultando na formação de células
multinucleadas. Utilizando modelos experimentais para doenças hepáticas, os
autores observaram que o transplante de células da medula óssea de animais
normais protegia os doentes e revertia o quadro de doença, provocando
regeneração do órgão afetado. Posteriormente, observaram as células nos nódulos
hepáticos em regeneração dos animais doentes e notaram a existência de
marcadores biológicos das células do doador, cogitando a ocorrência de
“transdiferenciação” de células de medula óssea em células hepáticas. No entanto,
estudos subseqüentes demonstraram que estas células na verdade apresentavam
tanto marcadores biológicos específicos do doador quanto do receptor, o que
remetia à idéia de fusão celular das células de ambos os indivíduos.
Em suma, nos experimentos realizados por Alvarez-Dolado et al. (2003),
nenhuma evidência de transdiferenciação foi observada. Apesar de existir
considerável controvérsia na validade dos achados das pesquisas que trabalham
nesta área, é importante tomar a posição de apoiar a continuidade destes estudos
visando confirmar ou rejeitar a teoria da plasticidade de células tronco adultas.
2.3 Obtenção de células autólogas de medula óssea
Apesar da variedade de fontes passíveis de se obter células tronco somáticas,
como por exemplo o sangue periférico, sangue da placenta ou cordão umbilical,
24
células tronco adultas cultivadas e tecido fetal, esta revisão abordará exclusivamente
a coleta através da medula óssea.
A medula óssea de humanos e animais é composta por muitos constituintes
celulares, dentre os quais existe uma fração de células mononucleares
representadas principalmente pelas células tronco hematopoéticas, blastos,
monócitos e linfócitos. Contém também uma rara população de células
multipotenciais, as células tronco mesenquimais. Para que se possa realizar a
purificação de células tronco hematopoéticas ou mesenquimais, ou ainda trabalhar
clínica ou experimentalmente com a própria fração de células mononucleares,
necessita-se realizar o procedimento de separação desta fração dos outros
constituintes da medula óssea (FONTES et al. 2006).
Estes autores explicam de forma bastante clara e resumida o procedimento de
separação da fração mononuclear, originalmente descrito por Boyum no ano de
1968. O objetivo do procedimento é a separação celular através do gradiente de
Ficoll-Hypaque de densidade 1.077g/mL. A solução de Ficoll é constituída por uma
mistura de polímeros de carboidratos Ficoll e composto iodado de metrizamida.
Após centrifugação a baixa velocidade, as hemácias e os leucócitos granulócitos
atravessam a fase orgânica (Ficoll-Hypaque) e sedimentam, as células
mononucleares localizam-se na interface entre as duas soluções, enquanto as
plaquetas e proteínas plasmáticas localizam-se na fase aquosa. Em geral, o
procedimento inicia-se com diluição do sangue em solução salina tamponada
(phosphate buffer saline - PBS), o qual é transferido para tubo cônico tipo Falcon.
Em seguida é adicionada vagarosamente a solução de gradiente Ficoll-Hypaque ao
fundo do tubo. A separação de células sangüíneas ocorre à temperatura ambiente e
após centrifugação a 700g por 30 minutos. Após esse processo, observa-se um anel
celular na interface entre as fases orgânica (Ficoll-Hipaque, fase inferior) e aquosa
(fase superior), onde estão presentes as células mononucleares. Desta forma, as
células da interface são coletadas cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur,
transferidas para outro tubo, submetidas à lavagem em salina e em seguida
ressuspensas em pequeno volume de PBS para posterior contagem em câmara de
Neubauer. Todo esse processo realizado com a fração total de medula óssea,
objetivando a separação da porção mononuclear, encontra-se ilustrado na Figura 2.
25
2.4 Considerações anatomo-fisiológicas sobre o sistema nervoso
O sistema nervoso de uma forma geral pode ser dividido em dois sistemas
fundamentais: o sistema nervoso central (SNC) e o sistema nervoso periférico
(SNP). O SNP é constituído pelos nervos periféricos cujos corpos celulares se
encontram no SNC, pelos gânglios periféricos e seus nervos (da raiz dorsal e dos
pares cranianos), plexos e células neuro-endócrinas. Todas as estruturas exclusivas
do SNP tem origem a partir da crista neural. Nos gânglios periféricos existem
neurônios, células de Schwann e células satélites.
Os nervos periféricos são formados por axônios, células não neurais e
componentes da matriz extracelular (MEC). O axônio juntamente com sua bainha de
mielina denomina-se fibra nervosa, representando a unidade básica do sistema
nervoso periférico e constituindo-se em uma extensão do corpo celular nervoso
situado na medula espinhal ou em suas proximidades (SHORES, 1996; PIERUCCI,
2004).
26
Figura 2- Representação esquemática do procedimento de isolamento
da porção mononuclear a partir de fração total de medula
óssea (MO). Fonte: Fontes et al., 2006.
Os axônios apresentam axoplasma fluido no interior da membrana celular e
podem apresentar-se mielinizados ou não mielinizados. Esse sistema tem a função
de receber estímulos e os traduzir na forma de potenciais de ação transmitindo estas
informações para o SNC (RODKEY, 1998; HIATT & GARTNER, 1997).
Dentre os componentes da MEC podemos citar o colágeno (COL), a
fibronectina (FN) e a laminina (LAM), presentes no nervo e também reorganizados
após a lesão. Esses componentes desenvolvem um papel fundamental no processo
regenerativo nervoso, auxiliando o brotamento axonal que cresce do coto proximal
em direção ao coto distal. Neste processo, os macrófagos presentes no nervo
iniciam a fagocitose dos elementos em degeneração. No início os macrófagos
sintetizam e liberam interleucinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6), as quais atuam como agentes
quimiotáxicos para as células de Schwann. Estas por sua vez, sintetizam compostos
fundamentais para o processo regenerativo, dentre eles os fatores neurotróficos
(PIERUCCI, 2004; VIOTT, 2006).
Viott (2006) destacou que as células de Schwann são exclusivamente
encontradas no SNP e apenas em situações especiais podem ser vistas no SNC.
São células extremamente lábeis, desempenhando um papel crucial na formação
dos nervos. Auxiliam o SNC e periférico nos processos regenerativos, além de
possuir a função de mielinizar ou envolver axônios do SNP (MIRSKY & JESSEN,
2001). As áreas juncionais existentes entre as células de Schwann são
denominadas nodos de Ranvier e encontram-se localizadas em pequenos intervalos,
sem mielina, ao longo de cada axônio mielinizado. A mielina de cada um destes
axônios é formada a partir da membrana plasmática da célula de Schwann, enrolada
múltiplas vezes ao redor do axônio (TOOP & BOYD, 2006). Nas fibras mielinizadas o
potencial de ação salta de um nodo de Ranvier para o seguinte, resultando em
rápida velocidade de condução. Em axônios não mielinizados, a velocidade é mais
lenta, pois o potencial de ação é contínuo ao longo de toda extensão da fibra
nervosa (RODKEY, 1998).
Observando a anatomia transeccional do nervo periférico (Figura 3), pode-se
visualizar melhor o descrito anteriormente sobre a histofisiologia nervosa.
27
Cada nervo contém grupos múltiplos de axônios dispostos em três camadas
de tecido conjuntivo. Circundando as fibras nervosas e apresentando-se como a
camada mais externa encontra-se o epineuro, formado de tecido conjuntivo frouxo
com fibras de colágeno tipo I, vasos e fibroblastos. A camada média de tecido
conjuntivo, denominada de perineuro, apresenta células pavimentosas fortemente
unidas por junções íntimas e dispostas em camadas concêntricas em relação às
fibras nervosas. Entre as sucessivas camadas celulares são encontradas fibras de
COL tipo I e tipo III. Esta camada é importante na manutenção da homeostase do
nervo, pois atua como uma barreira seletiva no trânsito de substâncias com alto
peso molecular. A camada mais interna de tecido conjuntivo é denominada
endoneuro, apresentando íntimo contato com as fibras nervosas. O endoneuro é
composto por fibroblastos e fibras de colágeno III do tipo reticular dispostas
longitudinalmente em relação à fibra nervosa, vasos sanguíneos, barreira nervo
sangue e mastócitos. Nesse tecido conjuntivo podem residir macrófagos, poucos
fibroblastos dispersos ao acaso e eventualmente mastócitos (SHORES, 1996; SEIM
III, 2005; TOPP & BOYD, 2006).
28
Figura 3- Representação esquemática das estruturas nervosas
microscópicas demonstradas em corte transeccional
esquemático de nervo periférico. Observar a disposição
e ordenamento dos feixes e fascículos nervosos.
Fonte: Shores, 1996.
O nervo periférico possui um sistema microvascular bem desenvolvido no
epineuro, perineuro e endoneuro. Seus vasos encontram-se distribuídos em várias
camadas no nervo que são interligadas através de várias anastomoses. O sistema
microvascular possui uma grande capacidade de reserva para compensar a
mobilização ou lesão dos vasos regionais locais. No epineuro, vasos orientados
longitudinalmente exibem um padrão característico, ou seja, os vasos estão
presentes em todas as camadas epineurais, bem como entre os feixes fasciculares e
camadas profundas do nervo. A importância da vascularização dos nervos
periféricos se deve ao fato dos axônios dos nervos periféricos serem vulneráveis a
isquemia pela grande distância que existe entre o corpo neuronal e a extensão do
axônio (PACHIONI, 2006).
O suprimento sanguíneo para os nervos periféricos se origina a partir de veias
e artérias vizinhas de grande calibre, bem como dos vasos periosteais e musculares
adjacentes. Os ramos desses vasos dividem-se em ascendentes e descendentes e
quando alcançam o epineuro anastomosam-se com o sistema intrínseco. Esse
sistema é composto por plexos epineurais, perineurais e endoneurais juntamente
com seus vasos comunicantes (SHORES, 1996).
Dentre as estruturas nervosas do organismo, o nervo ciático ou isquiático
apresenta-se como o maior nervo em diâmetro do corpo. É um nervo misto
(sensitivo e motor) formado pelas raízes ventrais de L6-S1 e emerge da pelve
através do forame isquiático maior, continuando seu trajeto descendo entre o
trocânter maior do fêmur e a tuberosidade isquiática e ao longo da face dorsal da
coxa, cranial aos músculos bíceps femoral e semitendinoso. Segue até seu terço
distal onde se divide em dois grandes ramos denominados nervos fibular e tibial
comum (FONSECA, 2002), sendo que este último inerva os músculos flexores da
soldra e do jarrete (gastrocnêmio e flexores superficiais e profundos dos dedos)
(CHRISMAN, 1996; FOSSUM, 2005).
2.5 Lesões nervosas periféricas
29
Lesões em nervos periféricos são comuns e ocorrem mais frequentemente
como resultado de traumatismo, tais como contusões, fraturas, ferimentos por
projéteis, mordidas, lacerações e injeção de agentes no interior ou arredores de um
determinado nervo (RODKEY, 1998; NELSON & COUTO, 2001; SEIM III, 2005).
Os nervos radial e ciático, por exemplo, são as estruturas mais comumente
lesionadas resultando em disfunção bastante significativa de extremidades. As
causas mais comuns de lesão ao nervo ciático, e por conseqüência suas
ramificações, são as fraturas do corpo ilíaco, as lesões iatrogênicas decorrentes da
cirurgia do fêmur proximal, do quadril, reparo de hérnia perineal e o aprisionamento
nervoso secundário à aplicação de pino intramedular como método de fixação de
fraturas femorais (SEIM III, 2005).
Experimentalmente, diversos procedimentos vêm sendo usados para estudar
a regeneração nervosa periférica do nervo ciático e suas ramificações. Dentre estes
se ressaltam as lesões por esmagamento através de compressão, transecção,
ressecção, estiramento e congelamento (BLOCH, 2001; PACHIONI, 2006). A
ocorrência de lesão de um nervo periférico resulta em alterações significantes e
complexas nos segmentos proximal e distal do nervo periférico, no corpo celular, no
local de lesão, bem como no órgão-alvo (ROWSHAN et al., 2004; MARTINS et al.,
2005).
Dourado et al. (2003) classificaram as lesões nervosas periféricas em três
tipos principais. Desta forma, existe neuropraxia quando há interrupção da condução
nervosa devido à lesão da bainha de mielina do nervo. Já a axonotmese, é
caracterizada pela perda de continuidade do axônio, porém com a membrana
epineural intacta. Finalmente, neurotmese ocorre quando há o rompimento completo
do nervo, sendo este o tipo mais grave de lesão.
Os distúrbios dos nervos periféricos caracterizam-se clinicamente por um
grupo de sinais conhecidos como síndrome neuropática. Esses sinais são
comumente observados na prática clínica veterinária e estão frequentemente
associados ao traumatismo de nervos periféricos. Fazem parte desta síndrome, os
reflexos reduzidos ou ausentes (hiporreflexia ou arreflexia), tono muscular reduzido
ou ausente (hipotonia, atonia ou flacidez) debilidade (paresia) ou paralisia dos
músculos dos membros e ou cabeça e, após uma a duas semanas, atrofia muscular
30
neurogênica. Esses sinais podem ser ocasionados por lesões tanto do corpo celular
como dos axônios (BRAUND, 1997; GARIBALDI, 2003).
Diante de um traumatismo em um nervo periférico, pode-se recorrer a testes
eletrodiagnósticos, quando disponíveis, para se avaliar mais especificamente a
extensão da lesão neuronal (NELSON & COUTO, 2001). Quando esta avaliação
não é possível, alguns procedimentos técnicos específicos são realizados visando
se conhecer as respostas que permitirão observar a integração dos sistemas
nervoso central e periférico. Para indução específica do reflexo gastrocnêmico, que
é mediado pelo nervo tibial (vias aferente e eferente), Garibaldi (2003) indicou a
percussão do tendão proximal ao calcanhar com o tarso moderadamente flexionado,
objetivando obter como resposta a extensão do tarso. No entanto, na opinião do
próprio autor, este não consiste de um teste muito confiável quando comparado à
observação da resposta ao estímulo de outros nervos e portanto deve-se ter cuidado
ao avaliá-lo. Para ele, é importante não confundir o movimento resultante da
percussão tendínea com a atividade reflexa, o que muitas vezes não é uma tarefa
fácil.
2.6 Técnicas de reparação de nervos periféricos
Neste tópico será dada maior importância para a técnica de tubulização no
reparo de nervos periféricos, tendo em vista o aprofundamento no tema proposto e o
cuidado em abordar aspectos ligados ao desenvolvimento deste estudo, procurando
não tangenciar o assunto nem discutir em demasiado as outras técnicas possíveis
de serem empregadas.
O trauma por transecção de um nervo periférico invariavelmente resulta na
perda de função do órgão inervado. Esta estrutura quando lesada raramente
apresenta recuperação sem a intervenção cirúrgica para reparo nervoso periférico
(OLIVEIRA et al., 2004). Devido a este fato, para Martins et al. (2005), na grande
maioria das vezes a intervenção cirúrgica torna-se a única opção terapêutica
aplicável.
A literatura especializada cita numerosas técnicas cirúrgicas passíveis de
serem empregadas para reparação nervosa periférica. Dentre elas ressalta-se a
neurorrafia epineural, a neurorrafia fascicular, a neurorrafia epineural-fascicular
combinada, os enxertos nervosos (SHORES, 1996), a sutura em padrão axial central
31
(CONTESINI et al., 1992), a aplicação de adesivos de fibrina, a aplicação de laser
de CO
2
(DOURADO et al., 2003) e as técnicas de tubulização com câmaras
constituídas a partir de diferentes materiais (ELY & CALTEUX, 1983; LABRADOR et
al., 1998; STOPIGLIA et al., 1998; DAZA et al., 1999; MELLO et al., 2001; PINEDO
et al., 2001; ALLET et al., 2003; DOURADO et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2004;
DELISTOIANOV et al., 2006;).
Estudos envolvendo reparação e cicatrização de nervos periféricos datam de
muito tempo. De acordo com Grecco et al. (2003), o método de sutura epineural foi
descrito primeiramente por Heuter em 1873 e o primeiro enxerto nervoso
experimental por Philipeau e Vulpian em 1886. Ainda mais tardiamente, graças ao
aperfeiçoamento e conseqüente evolução de técnicas e materiais microcirúrgicos, é
que se conseguiu um avanço e um aperfeiçoamento na reconstrução das estruturas
nervosas lesadas com nítida melhora da recuperação funcional.
Na opinião de Pinedo et al. (2001) as técnicas cirúrgicas aceitas
tradicionalmente para reparação nervosa como as neurorrafias, elongações e
enxertos resultaram em escassa aplicação na rotina devido às limitações de seus
resultados. Para Torres et al. (2003), o emprego de suturas epineurais e perineurais
vem sendo questionado devido à maior possibilidade de dano ao tecido neural com
o material de sutura e como conseqüência resultando na formação de granulomas.
Na opinião deste autor essas técnicas evidenciam compressão pelo fio de sutura e
mau direcionamento do tecido endoneural nos exames hitopatológicos.
Há casos em que, apesar da grande capacidade regenerativa do SNP, a
extensão da lesão impossibilita a simples reunião dos cotos. Uma técnica de reparo
empregada nessa situação é a tubulização, que pode ser otimizada com acréscimo
de fatores neurotróficos, componentes da matriz extracelular ou componentes
celulares como as células de Schwann, aumentando assim a eficiência do processo
regenerativo (PACHIONI et al., 2006). Esta técnica, também chamada entubulação,
é um procedimento cirúrgico em que os cotos nervosos seccionados são
introduzidos e fixados dentro de uma prótese tubular, objetivando propiciar um
ambiente favorável à regeneração. Proporciona ainda o direcionamento do
crescimento nervoso das extremidades rompidas ou seccionadas (OLIVEIRA et al.,
2004) protegendo as fibras nervosas do tecido cicatricial e evitando a formação de
neuromas (PIERUCCI, 2004).
32
Avanços na reparação de nervos periféricos em substituição a implantes de
aloenxertos e autoenxertos têm sido conseguidos através da técnica de tubulização
(PINEDO et al., 2001). Numerosas referências relatam a utilização de diferentes
materiais para a confecção da câmara de tubulização, dentre eles pode-se citar o
uso do silicone (CONTESINI et al., 1992; DAZA et al., 1999), da celulose liofilizada
(MELLO et al., 2001), dos adesivos de fibrina (CHEM & CHEM, 2004), dos
envelopes venosos (ELY & CATEUX, 1983; ALLET et al., 2003) e de outros
materiais biológicos como a quitosana por exemplo (PINEDO et al., 2001). Oliveira
et al. (2004) citaram também a utilização rotineira dos tubos de ácido poliglicólico no
reparo de nervos mediano, ulnar e digitais em humanos.
No passado, esses condutos de origem biológica como as artérias, veias,
osso descalcificado, dura-máter e peritônio foram bastante estudados. No entanto,
falharam em propiciar um bom mecanismo de suporte que guiasse o crescimento
axonal e apresentaram dificuldades adicionais como a necessidade de lesionar
outras áreas do corpo para se obter o conduto e encontrar o diâmetro adequado
para se proceder o reparo nervoso (OLIVEIRA et al., 2004). Segundo este último
autor, o material usado como conduto deve satisfazer uma variedade de critérios. A
substância escolhida deve ser biocompatível para não induzir resposta imune
vigorosa que possa interferir com o processo de regeneração. O material deve
permanecer o menor tempo possível necessário para completar a regeneração
nervosa e fornecer sustentação para guiar o crescimento axonal de forma adequada.
Deve estimular a migração de células, a vascularização e o acúmulo de fatores
neurotróficos entre os cotos e desse modo aumentar a velocidade de regeneração.
Sob o ponto de vista cirúrgico deve ainda ser flexível e apresentar a parede o mais
fina e transparente possível, facilitando o procedimento de fixação e a orientação
dos cotos.
A regeneração através da prótese tubular está na dependência da formação
precoce de uma ponte não celular conectando as duas extremidades nervosas
(Figura 4). Esta conexão consiste de uma matriz de fibrina que provém substrato
inicial para migração de células não neuronais (OLIVEIRA et al., 2004; PIERUCCI,
2004).
33
Figura 4- Representação esquemática de A) técnica de
tubulização para reparo de secção nervosa. B)
formação da ponte não celular entre as
extremidades nervosas. Fonte: Oliveira et al., 2004.
A matriz de fibrina é posteriormente degradada e substituída por fibrilas de
colágeno de orientação longitudinal que servirão de substrato para o brotamento de
regeneração a partir da extremidade proximal. A ocorrência destes eventos fica na
dependência do tamanho do espaço entre os cotos nervosos e da dimensão da área
de secção transversal do tubo (OLIVEIRA et al., 2004). Estudando a regeneração do
nervo ciático de camundongos pelo processo de tubulização com prótese de
silicone, aplicada em defeitos de tamanhos crescentes de 2, 4, 6 e 8 mm, Buti et al.
(1996) observaram melhora muito significativa dos reparos realizados em pequenos
espaços (2 e 4 mm). No entanto, a melhora obtida com o processo de tubulização
não foi tão marcante com os intervalos maiores (6 e 8 mm).
2.7 Cicatrização dos nervos periféricos
O traumatismo por secção de um nervo acarreta modificações no corpo
celular, nos segmentos proximal e distal à lesão, no próprio local de lesão e nos
órgãos inervados pelo referido nervo (MARTINS et al., 2005). No processo de
34
regeneração do axônio lesado e seu retorno à função normal, estão envolvidos
vários fatores, dentre os quais se destacam a distância entre o local de lesão e o
órgão final, o mecanismo gerador do trauma, a duração do intervalo entre a lesão e
o reparo cirúrgico, a idade e a condição geral do paciente e a técnica cirúrgica
empregada no reparo (SEIM III, 2005). Ainda estão relacionados fatores como a
formação de neuromas, a extensão da lesão, o espaço criado entre os cotos
nervosos (“gap” nervoso) e os fatores tróficos (DOURADO et al., 2003). É de vital
importância o cuidado com o alinhamento anatômico das extremidades nervosas e a
atenção a detalhes cirúrgicos, assegurando que os axônios em regeneração
encontrem seu caminho ao longo do tubo neurilematoso até seu órgão final,
resultando em uma boa recuperação funcional. Com relação à natureza ou
mecanismo gerador do trauma, pode-se observar que lacerações agudas e limpas
geralmente recuperam-se melhor e mais rapidamente que lesões por avulsão,
esmagamento, abertas e/ou crônicas (SEIM III, 2005). Existe uma variabilidade
bastante grande na literatura especializada quanto a velocidade de crescimento
nervoso. Almeida (2006), referiu que o processo de regeneração em humanos
ocorre a uma taxa de 1mm/dia. No entanto outros autores como Seim III (2005)
relataram uma velocidade de regeneração nervosa em pequenos animais de até
4mm/dia.
A seguir serão descritos detalhadamente os principais eventos que ocorrem
nas diferentes regiões envolvidas com o trauma em um determinado nervo
periférico.
2.7.1 Modificações na região proximal a lesão
Proximalmente à lesão, os axônios sofrem um processo de degeneração
semelhante ao que ocorre no coto distal, porém geralmente estendendo-se apenas
até o nódulo de Ranvier mais próximo (MARTINS et al., 2005). Na porção distal do
coto proximal, devido ao transporte anterógrado de moléculas sinápticas e
estruturais do citoesqueleto, observa-se um acúmulo de material citoplasmático
(ZOCHODNE, 2000), que segundo Terenghi (1999), pode vazar em virtude do
rompimento da membrana celular desses axônios.
Todas as células do organismo necessitam de fatores tróficos para sobreviver,
prevenindo a apoptose celular. Fator neurotrófico é a substância que regula e
35
mantém a função do neurônio promovendo seu crescimento. No processo de
regeneração nervosa, receptores específicos são expressos em maior quantidade
na região do cone de crescimento, aos quais se unem fatores neurotróficos
específicos. Esses fatores são transportados retrogradamente ao corpo celular e
atuam modulando a interação entre enzimas denominadas caspases e proteínas
pró-apoptóticas mediante a ocorrência de reações de fosforilação.
Consequentemente, é a inibição dessas enzimas, consideradas as principais
efetoras da morte celular, que possibilitarão a manutenção da fisiologia normal da
célula. Geralmente, os fatores neurotróficos exercem seus efeitos diretamente sobre
o metabolismo celular, no entanto, outra forma destes fatores atuarem neste
mecanismo é indiretamente, pela ação no metabolismo de células de suporte, cujo
representante principal é a célula de Schwann (MARTINS et al., 2005).
Várias substâncias que são produzidas no local da lesão atuam como fatores
neurotróficos, dentre as quais destacam-se o brain-derived neurotrophic factor
(BDNF), o nerve growth factor (NGF), o glial cell line derived neurotrophic factor
(GDNF), o ciliar neurotrophic factor (CNF) (ZOCHODNE, 2000), o transforming
growth factor-β (TGF- β), o insulin-like growth factor (IGF), o platelet-derived growth
factor (PGF) e as neurotrofinas (NF) (MARTINS et al., 2005).
O padrão de produção de NGF alcança sua concentração máxima
rapidamente 24 horas após o estabelecimento de uma lesão nervosa. Com relação
ao BDNF, sua produção inicia-se um pouco mais tardiamente, cerca de quatro dias
após uma axonotomia, apresentando sua concentração máxima em quatro semanas
após a lesão. O BDNF é mais eficaz em promover a sobrevida de axônios motores
em crescimento, em comparação a manutenção da sobrevivência dos neurônios
sensoriais e simpáticos. Desta forma, esses dois fatores neurotróficos exercem suas
atividades de maneira complementar, o que também provavelmente se repita com
outros fatores no processo de regeneração (MARTINS et al., 2005).
2.7.2 Modificações no corpo celular
Logo nas primeiras horas após a lesão axonal o corpo celular apresenta
algumas modificações chamadas de cromatólise, que se caracterizam
histologicamente por ingurgitamento da célula, desintegração da substância de Nissl
e migração nuclear do centro para a periferia (PIERUCCI, 2004). As alterações
36
presentes no corpo celular são interpretadas como um incremento do metabolismo
celular visando produção de proteínas relacionadas à regeneração do citoesqueleto
axonal em detrimento da produção de neurotransmissores. Essas proteínas,
representadas principalmente pela actina e tubulina, estão relacionadas ao
transporte intracelular e a movimentação do cone de crescimento (MARTINS et al.,
2005).
2.7.3 Modificações na região distal a lesão
As alterações que ocorrem na extremidade distal do axônio iniciam com a
degeneração axonal, denominada de degeneração Walleriana (FENRICH &
GORDON, 2004). Durante este evento, o citoesqueleto e o axoplasma se
degeneram deixando o correspondente tubo endoneural vazio. A destruição da
bainha de mielina estimula a atividade dos macrófagos e células de Schwann
resultando na remoção da maioria dos seus fragmentos. As células de Schwann
desempenham importância fundamental na regeneração, atuando como condutores
físicos que possibilitam o direcionamento dos axônios durante o crescimento em
direção ao órgão-alvo. Essas células ainda apresentam a propriedade de produzir
elementos da matriz extracelular como proteinoglicanas, colágeno e fatores
neurotróficos (PIERUCCI, 2004; MARTINS et al., 2005).
A regeneração que ocorre no sistema nervoso periférico está diretamente
relacionada à possibilidade de manutenção das células de Schwann
independentemente da degeneração do axônio. Essa sobrevida, que pode atingir
meses no coto distal de animais submetidos à axoniotomia, ocorre pela existência
de uma série de sinais celulares produzidos pelas próprias células de Schwann
independente do contato com os axônios (MARTINS et al., 2005).
2.7.4 Modificações no local da lesão
Nervos periféricos que sofrem lesão suficiente para causar axonotmese e
neurotmese sofrem degeneração imediatamente no local de lesão. Este evento pode
ser observado já nas primeiras 24 horas após a lesão (SEIM III, 2005). Ao
rompimento do nervo, a primeira nítida alteração que se observa é a retração do
mesmo (PIERUCCI, 2004). O intervalo formado entre os cotos é preenchido por
37
sangue formando-se um coágulo de fibrina. Na extremidade do coto proximal, os
axônios formam protrusões axoplasmáticas que são denominadas de brotos de
crescimento. Por este processo, cada axônio pode originar vários outros axônios
delimitados pelo perineuro. Este brotamento axonal está presente precocemente,
podendo ser observado em apenas três horas após a ocorrência da lesão nervosa
(MARTINS et al., 2005).
Logo após a formação dos brotamentos axonais observa-se um aumento na
presença de mitocôndrias e vesículas e estas estruturas passam a ser denominadas
cones de crescimento. Um cone de crescimento possui marcadamente duas
porções: a região do lamelipódio e os filopódios (Figura 5).
Figura 5- Representação esquemática da extremidade
do axônio e seu cone de crescimento.
Observar a presença dos lamelipódios e
filopódios. Fonte: Martins et al., 2005.
A região do lamelipódio é definida como a área central da extremidade do
cone, apresentando constante remodelamento pela formação e retração dos
filopódios. Os filopódios por sua vez, caracterizam-se por expansões em forma de
espículas que se estendem e se retraem a partir da superfície do lamelipódio,
movimentados pela contração dos filamentos de actina e formando uma rede
poligonal complexa no seu interior. Por meio desta disposição, o cone de
crescimento atua de forma semelhante ao movimento amebiano, explorando o
38
microambiente extracelular até que pela interação de receptores de superfície com
estímulos adequados, tais como fatores de crescimento, haja uma reorientação
apropriada que possibilite o crescimento axonal em direção ao coto distal e órgão-
alvo (MARTINS et al., 2005).
39
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
No desenvolvimento do estudo foram utilizados 12 coelhos (Oryctolagus
cuniculus) raça Nova Zelândia albinos, de ambos os sexos (6 machos e 6 fêmeas),
com aproximadamente cinco meses de idade, pesando entre 1,8 e 2,5kg (média de
2,1kg) provenientes da Escola Técnica Agrícola (ETA) de Viamão-RS. Após período
de adaptação às condições ambientais, os animais foram albergados, operados e
mantidos durante o período pós-operatório na Unidade de Experimentação Animal
(UEA) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). As dependências da referida
instituição dispõem de salas com temperatura controlada (18 a 20ºC), gaiolas
individuais específicas para coelhos e alimentação baseada em ração comercial
peletizada e água ad libittum.
3.2 Coleta de medula óssea
Para se realizar a coleta das células tronco autólogas de medula óssea,
optou-se pela extração a partir do tubérculo maior do úmero, em ambos os
membros, utilizando-se agulha de Osgood
1
(25x10) acoplada à seringa de 10mL
previamente heparinizada (Figura 6). Neste procedimento submeteu-se o animal a
decúbito lateral e através da flexão da articulação escápulo-umeral procedeu-se a
penetração da agulha em movimentos rotacionais. Para realização deste
procedimento aplicou-se cetamina
2
(40mg.kg
-1
), midazolan
3
(2mg.kg
-1
) e citrato de
fentanila
4
(0,8µg.kg
-1
), todos por via intramuscular. A manutenção do plano
anestésico foi feita com a administração de oxigênio a 100% (2 L/min) e isofluorano
5
em vaporizador universal aplicado através de mascara facial.
1
B-D, Becton e Dickinson Ind. Cirúrgicas S/A, São Paulo, SP, Brasil.
2
Ketamina – Agener União Química Farmacêutica Nacional, SP, Brasil.
3
Dormire – Cristália, Itapira, SP, Brasil.
4
Fentanest – Cristália, Itapira, SP, Brasil.
5
Isoforine - Cristália, Itapira, SP, Brasil.
40
Figura 6 – Fotografia demonstrando a coleta de medula óssea a partir
do tubérculo maior do úmero utilizando-se agulha de
Osgood (25x10) acoplada à seringa de 10 mL previamente
heparinizada.
As coletas foram realizadas no turno da manhã de forma seriada, sendo que
todas as amostras foram manipuladas individualmente mas no mesmo tempo de
processamento. O tempo de execução do protocolo anestésico e da técnica de
coleta conjuntamente foi de aproximadamente 30 minutos para cada animal. Após
serem obtidas as frações de medula óssea, as mesmas foram imediatamente
acondicionadas em tubos Falcon de 15mL e encaminhadas, sob refrigeração, ao
Laboratório de Embriologia e Diferenciação Celular do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre (HCPA) para proceder-se a separação da fração mononuclear. A fração total
de medula óssea coletada de ambos os membros de cada animal variou entre 0,95
e 2,20 mL. Na tabela 1, encontra-se de forma individualizada o volume total de
medula óssea aspirada a partir do tubérculo maior do úmero em cada animal.
41
Tabela 1- Volume de medula óssea aspirada a partir do tubérculo umeral direito
(UD) e esquerdo (UE) para posterior processamento e separação da
fração mononuclear.
Identificação Sexo Volume (mL) Volume total (mL)
UD UE
01
F 0,80 0,90 1,70
02
F 0,60 1,00 1,60
03
M 0,25 0,70 0,95
04
F 0,80 1,40 2,20
05
M 1,00 1,00 2,00
06
M 1,00 0,90 1,90
07
F 1,60 1,00 2,60
08
F 0,50 1,50 2,00
09
M 2,10 2,00 4,10
10
M 1,20 1,60 2,80
11
F 1,00 1,50 2,50
12
M 2,00
1,70 3,70
3.3 Separação e manipulação das células tronco autólogas de medula
óssea
O aspirado total de medula óssea de cada animal foi processado com Ficoll
6
densidade 1.077g/mL objetivando separar a fração celular mononuclear do restante
dos constituintes da fração total de medula óssea. Inicialmente o aspirado medular
foi homogeneizado e lavado duas vezes utilizando-se meio de cultura D-MEM com
1% de penicilina. A suspensão celular foi então centrifugada
7
por 5 minutos a 2000
rpm.
Após a centrifugação, o pellet de células resultante foi ressuspendido em 3
mL de meio D-MEM. Em um novo tubo Falcon foi adicionado 3mL de Ficoll na
proporção de 1:1 e a suspensão celular foi adicionada pela parede do tubo, evitando
6
Histopaque 1077 – Sigma Aldrich, St. Louis, EUA.
7
Refrigerated Multipurpose Centrifuge 5804 R – Eppendorf, Hamburgo, Alemanha.
42
desta forma a mistura das frações. As células foram centrifugadas por 20 minutos a
uma velocidade de 1500rpm e a uma temperatura de 18ºC. As células
mononucleares ficaram localizadas na interface criada com a centrifugação
formando um halo levemente mais denso.
Após ser retirada esta fração (localizada na interface), foi colocada em um
novo tubo Falcon sendo centrifugada por mais 5 minutos a uma velocidade de 2000
rpm. Finalmente, o pellet celular foi ainda ressuspendido em 1mL de meio D-MEM e
esta suspensão celular foi posteriormente incubada em estufa a 5% de CO
2
e
umidificada durante 20 minutos. Após o período de incubação a suspensão celular
foi lavada uma única vez com 5 mL de PBS e centrifugada por 5 minutos a 2000rpm.
O pellet celular foi ressuspendido em 1mL de PBS e então as células foram
quantificadas e avaliadas quanto a sua viabilidade pelo emprego do azul de Trypan.
Um total de 1.10
6
células em um volume de 0,1mL foi transplantada à prótese de
silicone fixada ao nervo tibial esquerdo previamente transeccionado. O tempo total
de processamento celular das frações coletadas foi de aproximadamente 1 hora e
50 minutos.
3.4 Procedimento cirúrgico e transplante das células tronco autólogas
de medula óssea
No período da tarde, imediatamente após manipulação das frações celulares
mononucleares a serem inoculadas em cada câmara siliconada (nervo tibial
esquerdo), os animais foram novamente anestesiados utilizando-se cetamina
(40mg.kg
-1
), midazolan (2mg.kg
-1
) e meperidina
8
(5mg.kg
-1
) por via intramuscular.
Neste momento foi realizada tricotomia ampla na região lateral de ambos os
membros posteriores. O acesso venoso foi realizado através de punção da veia
marginal da orelha e objetivou a administração fluidoterápica de 5mL/kg/h de
solução fisiológica de cloreto de sódio (NaCl) 0,9%.
Na seqüência, instilou-se 0,2mL de lidocaína 1%
9
na região da glote e através
de hiperextensão atlanto-occipital para facilitar a abertura da epiglote e palpando-se
a cartilagem laríngea, os animais foram intubados. Procedeu-se então a vaporização
8
Dolosal – Cristália, Itapira, SP, Brasil.
9
Lidol – Hipolabor, Sabará, MG, Brasil.
43
de isofluorano em oxigênio 100% a 1L/min para indução e manutenção do plano
anestésico.
Preconizou-se a instituição de um período de jejum de apenas 2 a 3 horas de
sólidos e líquidos, visando apenas impedir a repleção gástrica antes do
procedimento anestésico-cirúrgico. Todos os animais receberam ampicilina sódica
10
,
(10mg.kg
-1
) por via subcutânea (SC) 30 minutos antes do procedimento como
antibioticoprofilaxia. Efeito antiinflamatório e analgésico foi obtido a partir da
administração de cetoprofeno
11
(4mg.kg
-1
) também por via SC, 30 minutos antes do
início da cirurgia de forma a se estabelecer um padrão de analgesia preemptiva e
multimodal.
Com o animal posicionado em decúbito lateral, realizou-se anti-sepsia de pele
com álcool-povidine-álcool e promoveu-se acesso cirúrgico pela face lateral da coxa
(bilateralmente). Após incisão da fáscia lata e afastamento dos ventres dos
músculos vasto lateral e bíceps femoral, localizou-se o nervo isquiático e suas
ramificações e com auxílio de instrumental microcirúrgico dissecou-se-o de seu leito
isolando a porção tibial. Através de secção aguda com tesoura de íris criou-se o
defeito nervoso no terço médio de seu trajeto. Após, uma câmara siliconada
12
oca
medindo 1,5mm e 2,42mm de diâmetro interno e externo, respectivamente, e 15mm
de comprimento foi fixada com fio monofilamentar de náilon calibre 6-0
13
em padrão
isolado simples na camada epineural. O espaço criado entre as extremidades
nervosas foi de 5mm de comprimento. No espaço entre os cotos nervosos do
membro esquerdo, foi injetada (seringa de 1mL e agulha calibre 13x04) a fração de
células tronco autólogas de medula óssea na concentração de 1.10
6
células em um
volume de 0,1mL. (Figura 7).
10
Cilinon- Cristália, Itapira, SP, Brasil.
11
Ketofen- Rhodia Mérieus, Paulínia, SP, Brasil.
12
Medicone Projetos e Soluções para a Indústria e a Saúde Ltda. – Cachoeirinha, RS, Brasil.
13
Technofio - Ace Ind. e Com., Goiânia, GO, Brasil.
44
Figura 7– Fotografia demonstrando a prótese de silicone fixada às
extremidades nervosas seccionadas e a injeção da fração de
células tronco (1.10
6
células em
0,1mL) no interior da câmara.
Internamente a prótese fixada no membro direito, foi injetado o mesmo
volume de solução de NaCl 0,9%. Durante todo procedimento utilizou-se uma lupa
cirúrgica de cabeça
14
, objetivando a magnificação da imagem, promovendo desta
forma, aumento de aproximadamente 4 vezes.
Como tratamento das feridas cirúrgicas, realizou-se limpeza com solução de
NaCl 0,9% e aplicou-se tintura de benjoin ao redor da lesão. A aplicação de
micropore objetivou a proteção mecânica contra sujidades, sendo que esta não foi
trocada enquanto não se soltasse ou fosse retirada pelo próprio animal. Na grande
maioria dos casos ela permaneceu durante os primeiros 3 ou 4 dias, período
necessário para solução da incisão de pele. Desta forma, a limpeza diária e
realização de curativo não foi necessária.
Os animais foram observados por um período de 30 dias, quando então foram
submetidos à eutanásia para coleta, processamento e avaliação histológica da
14
Head Magnifying Glass, China.
45
amostra de nervo tibial (porção da prótese de silicone). As eutanásias foram
realizadas aplicando-se cetamina (40mg.kg
-1
) via intramuscular, seguida de
sobredose de tiopental sódico via catéter na veia auricular mariginal. As amostras
obtidas foram separadas de forma aleatória e fixadas em dois tipos de soluções para
posterior processamento; solução contendo glutaraldeído como base (Anexo 1) (12
nervos de 6 animais) e formol tamponado a 10% (12 nervos de 6 animais).
3.5 Processamento, análise das amostras e tratamento estatístico dos
dados
Doze segmentos de nervos tibiais (direito e esquerdo) de seis animais
(numerados 7, 8, 9, 10, 11, 12) foram coletados e fixados com a solução de
glutaraldeído para serem processados através de cortes histológicos semifinos
medindo 1µm de espessura. As amostras depois de fixadas foram incluídas em
resina pura e clivadas em ultra-micrótomo. Posteriormente as lâminas foram coradas
com azul de toluidina 0,25% objetivando avaliação da regeneração das estruturas
nervosas através de microscopia de luz. O Anexo 2 mostra as etapas de preparação
dos cortes semifinos de forma mais detalhada.
Outras doze amostras de nervos tibiais (direito e esquerdo) de seis animais
(numerados 1, 2, 3, 4, 5, 6) foram coletadas e fixadas em formol tamponado a 10%,
incluídas em blocos de parafina e clivadas com 3µm de espessura. Posteriormente
foram coradas pelo método de luxol fast blue e hematoxilina-eosina (HE) para
posterior observação em microscópio de luz. As amostras coradas com HE e luxol
fast blue foram avaliadas de acordo com algumas variáveis e observadas
comparativamente. Esta análise histológica levou em consideração principalmente a
presença de células inflamatórias (eosinófilos), de câmaras de digestão
(degeneração Walleriana), presença de grânulos de hemossiderina e granulomas ou
células gigantes nas diferentes porções nervosas, ou seja, no sítio de regeneração
(local de fixação da prótese de silicone) e nas porções cranial e caudal a ele.
Para se atribuir pontuações a partir das variáveis observadas, as lâminas
histológicas foram avaliadas de forma seriada, sempre pelo mesmo observador, de
forma que este não identificasse o animal nem o segmento de nervo (direito ou
esquerdo) a ser analisado. A metodologia de avaliação contemplou diferentes
46
formas de observação para as variáveis estudadas, e as possíveis alterações
encontradas durante a avaliação estão listadas e pontuadas no Quadro 1.
Variáveis Escore
Presença 1
Granuloma
Ausência 0
Eosinófilos
Número absoluto; contagem de eosinófilos pelo
escaneamento da lâmina histológica.
Hemossiderina
Número absoluto; contagem dos focos de
hemossiderina pelo escaneamento da lâmina
histológica.
Degeneração Walleriana
Estimativa (%) do processo de degeneração
Walleriana pela contagem de câmaras de digestão
através do escaneamento da lâmina histológica.
Quadro 1- Metodologia de avaliação das alterações encontradas nas lâminas
histológicas coradas com HE e luxol fast blue.
Após a tabulação dos dados, realizou-se a análise estatística (SPSS versão
14.0 para Windows) aplicando-se o teste de McNemar para a variável granuloma e o
teste de Wilcoxon para as variáveis eosinófilos, hemossiderina e degeneração
Walleriana. O nível de significância considerado para o teste foi de 5% (p<0.05).
47
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Discutindo sobre as observações e resultados obtidos com a experimentação,
inicia-se justificando a escolha da espécie utilizada como modelo experimental.
Desta forma, levaram-se em consideração alguns critérios de seleção como por
exemplo a facilidade de manipulação e manutenção dos animais em biotério; o porte
físico dos animais, diretamente relacionado ao tamanho das estruturas nervosas; a
facilidade em estabelecer a anestesia e os cuidados pós-operatórios; os custos com
a manutenção dos animais e a rapidez com que seriam obtidos os resultados,
diretamente relacionada à velocidade do metabolismo do animal. Levando em
consideração todas essas questões, decidiu-se pela utilização de coelhos Nova
Zelândia albinos (Oryctolagus cuniculus) como modelo experimental na pesquisa em
questão.
Quanto aos procedimentos anestésicos em coelhos, Quinton (2005) afirmou
que esta espécie apresenta-se normalmente refratária às anestesias fixas ou
injetáveis. Para ele, a anestesia inalatória produz efeito rápido, seguro,
proporcionando bom miorrelaxamento e analgesia quando combinada com outras
drogas. A aplicação desta técnica é especialmente necessária em procedimentos
cirúrgicos longos ou dolorosos, e para tanto, o isofluorano é bastante seguro e
constitui-se no anestésico mais indicado para manutenção do plano anestésico
nesta espécie (QUESENBERRY, 1998; VILARDO, 2007). Este anestésico apresenta
uma potência relativamente alta e seu baixo coeficiente de solubilidade sangue-gás
permite uma indução e recuperação anestésicas rápidas (FANTONI, 2002). A
aplicação da técnica de anestesia inalatória em coelhos é dificultada pelo
procedimento de intubação, porém uma alternativa é o emprego de máscara facial
para indução e manutenção anestésica (QUINTON, 2005). A administração de
isofluorano em máscara demonstrou ser bastante conveniente e segura para o
procedimento de coleta de medula óssea na pesquisa em questão. No entanto, para
realização do procedimento cirúrgico, optou-se pela intubação dos animais,
concordando com Hillyer (1994) que recomendou a sonda endotraqueal quando a
cirurgia a ser desenvolvida necessite tempo superior a 20 minutos. A técnica de
intubação, realizando hiperextensão atlanto-occipital para facilitar a abertura da
epiglote e palpando-se a cartilagem laríngea como mencionado por Thurmon (1996),
48
foi aperfeiçoada pela anestesista responsável através dos vários procedimentos
anestésico-cirúrgicos prévios (procedimentos piloto) realizados antes das cirurgias
propriamente contabilizadas no presente estudo.
A cetamina foi incluída no protocolo escolhido devido ao seu efeito
anestésico, anti-hiperalgésico e anti-alodínico comprovados em modelos de dor
neuropática (RODRIGUEZ, 2003). Já o midazolam, foi utilizado com o intuito de
proporcionar o relaxamento muscular necessário para os procedimentos efetuados,
potencializando o efeito da cetamina e objetivando a rápida perda do reflexo laríngeo
para posterior intubação (CALVO et al., 1997). O fentanil, foi escolhido por ser um
opióde agonista no receptor µ, aconselhado para uso trans-operatório como
analgésico pelo seu rápido início de ação, curta duração e alta potência
(FLECKNELL & WATERMAN-PEARSON, 2000).
Ainda comparando as afirmações encontradas na literatura pertinente com o
protocolo anestésico estabelecido, Tranquilli et al. (2005) afirmou que dor
neuropática pode resultar de traumatismo, inflamação ou sensibilização de nervos
periféricos ou medula espinhal. É definida como queimação, dor lancinante ou dor
intermitente e costuma ser fracamente responsiva a um tratamento. Apesar do
exposto pelo referido autor, procurou-se através da administração de diferentes
fármacos minimizar a dor pós-operatória nos animais submetidos aos
procedimentos.
O termo analgesia preemptiva se refere à aplicação de técnicas analgésicas
antes do paciente ficar exposto a estímulos nocivos, como por exemplo, invasão
cirúrgica. Isto reduz a intensidade e a duração da dor pós-procedimento e minimiza
a probabilidade de um estado de dor crônica que estaria sendo estabelecido. Apesar
da analgesia preemptiva não conseguir eliminar a dor pós-operatória, tem o objetivo
de ajudar a evitar a sensibilização dos sistemas nervoso periférico e central durante
o procedimento cirúrgico (TRANQUILLI et al., 2005). A aplicação de medicação
anestésica baseada na administração de cetamina/fentanil para coleta de células
tronco e cetamina/meperidina para realização do procedimento cirúrgico, adicionada
do uso de medicação antiinflamatória e analgésica a partir do uso de cetoprofeno e
citrato de fentanila, demonstrou ser uma técnica analgésica bastante eficaz.
Analgesia balanceada ou multimodal é obtida através da administração
simultânea de duas ou mais classes de fármacos ou técnicas analgésicas. O
fundamento da analgesia multimodal surge do objetivo de inibir a nocicepção em
49
diferentes pontos ao longo do trajeto da dor aferente por intermédio de mecanismos
distintos (TRANQUILI et al., 2005). As combinações farmacológicas escolhidas para
serem usadas no período peri-anestésico forneceu além de uma técnica de
anestesia preemptiva, também uma forma de analgesia multimodal contribuindo
para uma melhor recuperação do paciente, isenta de dor e bastante confortável.
Através da ausência de sinais de dor referenciados por Hillyer (1994) e Jenkins
(2004) para a espécie em questão como sendo: inatividade, anorexia, “ringir” de
dentes e pobreza de resposta a estímulos, pôde-se observar que as medidas e
técnicas utilizadas para evitar a instalação do processo doloroso foram eficazes.
A antibioticoprofilaxia baseada na administração de ampicilina sódica não
demonstrou qualquer efeito colateral nos animais em questão, apesar de algumas
referências não recomendarem o uso deste fármaco em coelhos. A ampicilina se
torna prejudicial para coelhos, bem como a administração de alguns outros
antibióticos, quando é aplicada por via oral, pois apresenta atividade contra a flora
normal intestinal destes animais, deixando-os expostos a infecções intestinais fatais
(GONZALO, 2007). Sulc et al. (1992) demonstraram a ausência de toxicidade e
eficácia da aplicação de ampicilina em seus experimentos. Esses pesquisadores
reduziram drasticamente os índices de meningite por Haemophilus influenzae em
seus modelos experimentais com aplicações de ampicilina na dose de 50mg.kg
-1
via
intravenosa.
As drogas e os métodos anestésicos utilizados tanto para coleta das células
tronco, quanto para realização do procedimento cirúrgico foram baseados nas
técnicas desenvolvidas nas Universidades da Califórnia
(http://www.iacuc.ucsf.edu/Proc/awRbtFrm.asp) e de Cornell
(http://www.research.cornell.edu/care/CARE103.pdf). Em suma, o protocolo
escolhido demonstrou ser seguro e eficaz para utilização na espécie em questão,
possibilitando pronta recuperação, livre de excitação ou qualquer outra intercorrência
clínica.
A respeito do período de jejum a ser instituído nesta espécie, Quinton (2005)
explicou que devido ao piloro do coelho ser muito estreito, este animal não
apresenta capacidade de vomitar. Este autor recomendou um período de jejum
máximo de 3 a 4 horas e concluiu que um intervalo maior que 4 ou 5 horas sem
alimento e sem líquido torna-se prejudicial ao retorno do transito intestinal. O período
50
de jejum instituído, de concordância com Quinton (2005), colaborou para que o
procedimento anestésico-cirúrgico não evidenciasse qualquer alteração significativa.
Em relação à técnica de reparo a ser empregada principalmente nos casos de
perda extensa de tecido nervoso periférico, Costa et al. (2006) relataram alguns
fatores relevantes que encorajam a escolha da técnica de tubulização em detrimento
da aplicação de enxertos nervosos periféricos. Dentre estes fatores, destacam-se: a
necessidade de produzir maior morbidade com a retirada de tecido autólogo de uma
área doadora; a retirada extensa de tecido autólogo, que algumas vezes não se
apresenta disponível; o maior tempo de execução da técnica de enxertia e a
observação de resultados ainda insatisfatórios obtidos com o emprego de enxertos.
Da-Silva et al. (2003) e Oliveira et al. (2004) relataram em numerosos estudos que
avaliaram esta técnica, demonstraram uma significativa melhora do processo de
cicatrização pela possibilidade de manipulação do microambiente das fibras
nervosas a serem regeneradas. Dentre as substâncias testadas no interior da
câmara, eles destacaram o uso dos adesivos de fibrina, gel de colágeno tipo I, gel
de laminina, preparações contendo ácido hialurônico, fibronectina e mais
recentemente as glicosaminoglicanas. Da mesma forma, citaram que os
biopolímeros, as células gliais purificadas e os fatores neurotróficos também estão
sendo testados.
Em concordância com estes autores e acreditando nas vantagens já
consolidadas da aplicação da técnica de tubulização, objetivou-se promover o
estudo dos possíveis efeitos benéficos da administração de substâncias exógenas
internamente a prótese, neste caso em particular, as células tronco autólogas de
medula óssea.
Durante a avaliação dos resultados do experimento, algumas observações
não apresentaram diferenças entre os grupos controle e tratamento (membro
posterior direito - MPD e membro posterior esquerdo – MPE, respectivamente),
como por exemplo, déficit de apoio, presença de exudato no local da incisão
cirúrgica e deiscência da sutura de pele. Observou-se neste trabalho, uma rápida
cicatrização cutânea no local da incisão cirúrgica, sendo que com aproximadamente
4 ou 5 dias de evolução a ferida apresentava-se quase completamente solucionada
e apenas alguns pontos precisaram ser retirados (os pontos de pele caiam ou eram
retirados pelo próprio animal).
51
Durante a necropsia realizada para coletar o segmento do nervo tibial a ser
analisado, nenhum animal demonstrou deiscência do local de fixação da câmara de
silicone ao nervo. O exame macroscópico do sítio cirúrgico também não demonstrou
diferença entre os grupos observados no que se refere à presença de tecido nervoso
formado internamente à prótese, pois todos os nervos tibiais em ambos os membros
apresentaram a “ponte” interligando as duas extremidades (Figura 8). Também
nenhuma diferença significativa foi evidenciada entre os grupos com relação à
aderência da prótese ao tecido muscular relacionado.
Estas observações vão ao encontro dos achados de Da-Silva et al. (2003),
que utilizando como modelo experimental um espaçamento entre os cotos nervosos
de 4mm em nervos ciáticos de ratos e 4 semanas de período pós-operatório,
também observaram crescimento de “ponte” nervosa internamente à prótese em
todos os animais dos grupos do experimento. Contrariamente, Chen et al. (2006)
encontraram diferença entre os grupos estudados em seu trabalho. Com uma
metodologia de 15mm de espaçamento criado entre os cotos nervosos de ratos e 10
semanas de recuperação pós-operatória, foi observada uma taxa de crescimento
(ponte) nervoso de 50% (8/16) nos tubos do grupo controle e 81,2% (13/16) nos
tubos do grupo tratado com células tronco mesenquimais de medula óssea.
52
Figura 8– Fotografia demonstrando o crescimento nervoso dentro da
prótese de silicone. O fio de sutura amarrado à extremidade
serviu como marcação para porção proximal do nervo tibial.
Algumas variáveis como o teste dermatômico (que consiste no agulhamento
das porções musculocutâneas inervadas pelo tibial, objetivando detectar níveis
variáveis de hipoestesia) e a avaliação da marcha, não puderam ser diferenciadas
nos dois grupos de estudo (MPD e MPE) pela dificuldade e subjetividade
demonstradas nos procedimentos “piloto” com a espécie estudada.
Com relação ao procedimento de aspiração de medula óssea, Grindem et al.
(2002), citaram como possíveis locais de se coletar amostras medulares, a crista
ilíaca, o trocânter maior do fêmur e o tubérculo maior do úmero. Optou-se pela
coleta a partir dos dois tubérculos umerais devido a dois motivos principais: extrair
uma quantidade de aspirado de medula óssea suficiente para se manipular e
separar a concentração total pré-estabelecida de 1.10
6
células e também para
estabelecer uma padronização do traumatismo gerado pela coleta nos dois
membros anteriores do animal. Procurou-se não realizar a coleta envolvendo os
membros posteriores a fim de não mascarar qualquer sinal de claudicação (dor)
neste local, interferindo com uma possível avaliação clínica.
Utilizaram-se três métodos de coloração dos cortes histológicos (HE, luxol fast
blue e azul de toluidina) para avaliação das variáveis, com intuito de ratificar os
resultados encontrados, excluindo as dúvidas inerentes a apenas um único tipo de
avaliação. Além disso, como métodos distintos de análise histológica possibilitam
avaliar diferentes variáveis, procurou-se observar aquelas que cada coloração
apresentasse com mais clareza. A Tabela 2 demonstra as variáveis analisadas pela
coloração com HE e a pontuação gerada para as alterações observadas nos cortes
histológicos.
Tabela 2- Avaliação das diferentes variáveis (granuloma, eosinófilos e hemossiderina)
observadas e seus respectivos valores referentes ao nervos direito (controle)
e esquerdo (tratamento) nos cortes corados com HE.
Animais
Granuloma Eosinófilos Hemossiderina
Controle
(D)
Tratamento
(E)
Controle
(D)
Tratamento
(E)
Controle
(D)
Tratamento
(E)
1
1 0 9 3 22 135
53
2
1 1 161 1,5 0 15
3
1 1 174 25 1 43
4
1 1 26 73 121 75
5
0 1 17 28 57 63
6
1 1 2 3,5 16 10
Média
0,83
0,83
64,83
22,33
36,16
56,83
Desvio
padrão
0,40
0,40
80,03
27,45
46,43
46,07
Nas lâminas coradas pelo HE foi observada a presença de granulomas
compostos de macrófagos, células epitelióides e células gigantes associados à
presença do fio de sutura. Este achado vai ao encontro do exposto por Thompson
(1983), que incluiu como componentes presentes na reação granulomatosa, os
macrófagos, as células epitelióides e as células gigantes, além de um componente
cicatricial difuso formado de tecido conjuntivo. Não foi encontrada diferença entre os
grupos a partir desta variável, segundo o teste estatístico de McNemar. Isto pode ser
explicado devido o fato da reação granulomatosa estar diretamente ligada a
presença de material estranho (fio de sutura) no tecido nervoso, o que ocorreu em
ambos os grupos. Esta alteração indica a reação prolongada entre o hospedeiro e o
material estranho, apresentando grande dificuldade de ser removido (THOMPSON,
1983).
Relacionando as outras alterações observadas nos cortes corados com HE,
Karanth et al. (2006) relataram que a degeneração no segmento distal de um nervo
transeccionado vem acompanhada pela infiltração de monócitos, macrófagos,
alguns poucos linfócitos e leucócitos polimorfonucleares. Complementa que a
resposta imune facilita a remoção de debris mielínicos e axonais e incita a produção
de citocinas e fatores neurotróficos, benéficos para o processo de regeneração
axonal. Constituinte desta reação imunológica resultante, a infiltração por eosinófilos
foi observada na grande maioria das secções histológicas (Figura 9), apresentando
variação numérica entre os grupos controle (direito) e tratamento (esquerdo).
Eosinófilos reagem de forma específica a estímulos como reações antígeno-
anticorpo, aparecendo em resposta à infecção por bactérias piogênicas e na
54
presença de tecido necrótico. São geralmente proeminentes na resposta à migração
parasitária nos tecidos e nas reações alérgicas (THOMPSON, 1983).
Figura 9- Fotografia demonstrando infiltração por eosinófilos (seta) no tecido
nervoso regenerado da porção média do nervo tibial (corte
longitudinal com coloração de HE e aumento de 400X).
Para este autor, se torna difícil fazer uma associação entre a presença de eosinófilos
e a ocorrência de qualquer doença, a exceção das infecções parasitarias.
Observando-se os resultados apresentados na Tabela 2, constatam-se valores
inferiores no grupo tratamento para a variável eosinófilos. Contudo, tal diferença
demonstrou não ser significativa, segundo o teste estatístico de Wilcoxon. De uma
forma geral, infere-se que a presença em menor quantidade de células inflamatórias
(como os eosinófilos) no grupo tratado com células tronco autólogas de medula
óssea, esteja ligada a uma maior velocidade de resolução deste processo e,
portanto, sua produção e permanência na lesão estariam em fase de declínio. O
gráfico 1 (a e b), expressa de forma individual e generalizada os resultados da
presença de eosinófilos obtidos a partir da análise das lâminas coradas com HE.
55
Gráfico 1- Representações gráficas dos valores
individuais (A) e médios (B) para a
variável eosinófilos nos grupos controle
(D) e tratamento (E).
Em todas as lâminas observaram-se macrófagos carregados de
hemossiderina em quantidades discretas. Os macrófagos são derivados dos
monócitos no sangue, produzidos na medula óssea, possuindo a função principal de
fagocitar, eliminar ou degradar parcialmente o material fagocitado. Processam
muitos antígenos antes de entregá-los aos linfócitos para que estes realizem sua
função específica. Quando os antígenos são degradados rapidamente, os
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
D E
Tratamentos
Eosinófilos (n absolutos)
1
2
3
4
5
6
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Eosinófilos
Valores absolutos
D
E
(A)
(B)
56
macrófagos desaparecem na mesma velocidade. No entanto, se muito antígeno se
acumula em seu citoplasma, não sendo completamente degradado, estes residem
por mais tempo na lesão. A presença destas células no tecido lesado pode ter duas
principais interpretações: indicar uma lesão crônica ou ainda um estágio de limpeza
após a cessação da batalha aguda (THOMPSON, 1983).
Ainda discutindo sobre as alterações microscópicas encontradas, conceitua-
se hemossiderina como sendo um pigmento marrom contendo ferro e usualmente
observado nos macrófagos do sistema retículo-endotelial. Este ferro encontra-se
estocado na forma de ferritina (um complexo de proteína: apoferritina-ferro) em
muitos locais do organismo como medula óssea e fígado. A ferrritina está difusa na
célula e não é visível, porém se o armazenamento é suficientemente concentrado
nos lisossomos ela é conhecida como hemossiderina (agregados insolúveis de
ferritina). É um achado bastante comum, aparecendo na forma de manchas
amarronzadas nos tecidos corados por HE. A quantidade de hemossiderina pode
portanto, dependendo das circunstâncias que deram início ao acúmulo, ser uma
indicação das reservas de ferro corporal ou de degradação sanguínea. Assim,
concentração acentuada de hemossiderina numa área de tecido, como neste caso,
pode indicar hemorragia prévia (THOMPSON, 1983; GRINDEM et al., 2002).
No estudo em questão, observam-se focos de hemosiderina em
concentrações variadas, observando-se uma maior taxa nas lâminas oriundas do
grupo tratado com células tronco. No entanto, esta diferença não apresentou-se
significativa segundo o teste estatístico de Wilcoxon. O gráfico 2 (a e b), expressa de
forma individual e generalizada os resultados do aparecimento de focos de
hemossiderina nas lâminas coradas com HE.
57
Gráfico 2- Representações gráficas dos valores
individuais (A) e médios (B) para a
variável hemossiderina nos grupos
controle (D) e tratamento (E).
Outras observações notadas com a avaliação dos cortes histológicos foi a
expansão do perineuro pela deposição de colágeno ou formação de edema,
juntamente com a formação de numerosas câmaras de digestão (em focos ou ao
longo do corte). A presença de câmaras de digestão indica a existência de
degeneração Walleriana (DW) nos diferentes segmentos da fibra nervosa. A Tabela
3 demonstra os valores encontrados neste estudo com relação à presença de
câmaras de digestão ou degeneração Walleriana, coradas pelo método de luxol fast
0
20
40
60
80
100
120
140
160
D E
Tratamentos
Hemossiderina (n absolutos)
1
2
3
4
5
6
0
20
40
60
80
100
120
Hemossiderina
Valores absolutos
D
E
(A)
(B)
58
blue, uma vez que essas alterações são melhor visualizadas com este método de
coloração.
Tabela 3- Valores em % da observação de degeneração Walleriana (DW) pela
presença de câmaras de digestão nos cortes corados com luxol fast blue.
1 2 3 4 5 6 Média Desvio
padrão
Controle (D)
15 30 30 20 20 20 22,5 6,1
Tratamento (E)
15 20 20 10 10 15 15 4,5
A degeneração Walleriana ocorre através da mediação do influxo de cálcio,
via canais de íons específicos, que ativam as proteases axonais.
Consequentemente, desintegração e degeneração do axolema e axoplasma
ocorrem entre 24 e 48 horas, em nervos de pequeno e grande calibre
respectivamente. Os macrófagos oriundos do sangue desenvolvem um papel
essencial na fagocitose da mielina seguida de lesão nervosa, formando as câmaras
de digestão. Essas células de defesa, são recrutadas para o coto distal da lesão em
amplo número já no terceiro dia após a injúria. A infiltração no coto nervoso se dá
como resposta a fatores de quimiotaxia que incluem citocinas como as interleucinas
1β, fator de necrose tumoral (TNF-α) e proteína-1 quimiotática para monócitos,
secretados pelas células de Schwann. Os macrófagos após penetrar principalmente
na extremidade nervosa distal, permanecem aí por um período de no mínimo 30
dias, sendo responsáveis por remover a maioria dos debris mielínicos. Esses debris
incluem a mielina associada à proteínas, como a mielina associada a glicoproteína
(MAG), que conforme vem sendo demonstrada, parece apresentar atividade
inibitória forte no crescimento axonal (FENRICH & GORDON, 2004). Concordando
com as afirmações deste autor, observou-se através das lâminas histológicas que o
processo de formação das câmaras de digestão, reconhecido por degeneração
Walleriana (DW), encontrava-se ainda em desenvolvimento no período de trinta dias
de observação pós-operatória (Figura 10).
59
Figura 10- Fotografia demonstrando presença de degeneração Walleriana
pela formação das câmaras de digestão (seta inferior) no tecido
nervoso regenerado da porção média do nervo tibial. A seta
superior demonstra o orifício deixado pelo material de sutura (corte
longitudinal com coloração de luxol fast blue e aumento de 400X).
Com a avaliação dos valores expostos na Tabela 3, foi observado segundo o
teste estatístico de Wilcoxon, diferença significativa entre os grupos estudados,
demonstrando valores médios menores para DW nos animais tratados com as
células tronco autólogas de medula óssea. O gráfico 3 (a e b), expressa de forma
individual e generalizada os resultados da análise da variável DW, obtidos a partir da
análise das lâminas coradas com luxol fast blue.
60
Gráfico 3- Representações gráficas dos valores individuais
(A) e médios (B) para a variável degeneração
Walleriana nos grupos controle (D) e tratamento
(E). (*p< 0.05 Wilcoxon).
Com os cortes histológicos semifinos, corados pelo azul de toluidina, foi
possível avaliar de forma qualitativa a regeneração nervosa, principalmente no que
se refere a regeneração da bainha de mielina (Figura 11). Diversos estudos
utilizaram este mesmo método de clivagem (1µm) e coloração para visualização das
estruturas nervosas regeneradas (BLOCH et al., 2001; CUNHA et al., 2001; CHEM &
CHEM, 2004). Esta metodologia possibilita a obtenção de lâminas histológicas com
imagens mais definidas e nítidas quando comparada com outros métodos de
0
5
10
15
20
25
30
35
D E
Tratamentos
Degeneração Walleriana (%)
1
2
3
4
5
6
0
5
10
15
20
25
30
35
Degeneração Walleriana
%
D
E
(A)
(B)
*
61
avaliação em microscopia óptica, permitindo uma avaliação mais minuciosa de
estruturas como a bainha de mielina por exemplo. Foram identificadas fibras
regeneradas ou remielinizadas com orientação longitudinal e mielina fina. Dando
segmento a esta linha de pesquisa, outros trabalhos utilizando a mesma
metodologia, poderão ser realizados posteriormente associando os resultados aqui
obtidos com avaliação funcional do potencial de ação do nervo regenerado. Estes
novos estudos poderão trazer contribuições importantes para uma determinação
comparativa mais precisa do processo regenerativo através do emprego das células
tronco autólogas de medula óssea.
Figura 11- Fotografia demonstrando o padrão de regeneração das
fibras nervosas na porção distal do nervo tibial direito
(corte longitudinal ultra-fino com coloração de azul de
toluidina 0,25% e aumento de 400X).
Chen et al. (2006) também observaram em seu estudo maturação e diâmetro
axonal incompleto em comparação com nervos saudáveis. Avaliações experimentais
com tempos adicionais, superiores e inferiores aos 30 dias de avaliação aqui
62
estudados, também colaborariam para melhor caracterizar o processo regenerativo
com o uso de terapia celular autóloga de medula óssea.
Observou-se ainda, através da avaliação dos cortes semi-finos, número
variável de neo-fascículos nas diferentes secções, independentemente de serem
esquerdas ou direitas. Muitas vezes, as fibras apresentaram-se desviadas por vasos
neoformados de parede fina e luz ampla. Estas mesmas observações são referidas
no estudo de Costa et al. (2006) para os grupos de tratamento com tubo de ácido
poliglicólico. Outro achado passível de ser descrito foi a identificação de células de
Schwann supranumerárias. Com relação à quantidade de colágeno, apresentou
ampla variabilidade entre os cortes. Através deste tipo de avaliação qualitativa, não
foi possível observar de forma fidedigna se existe alguma diferença estatísticamente
significativa entre os grupos avaliados. Por meio da avaliação morfométrica das
fibras nervosas regeneradas, a ser realizada em uma etapa posterior, será possível
mensurar de forma mais objetiva variáveis como: diâmetro das fibras mielínicas,
diâmetro dos axônios mielínicos, espessuras das bainhas de mielina e diâmetro dos
axônios amielínicos (STOPIGLIA et al., 1998; BLOCH et al., 2001; CHEM & CHEM,
2004, COSTA et al., 2006).
As pesquisas a cada dia confirmam os benefícios da administração exógena
de substâncias como os fatores neurotróficos, células e citocinas no microambiente
gerado através da tubulização nervosa (TERENGHI, 1999; HEINE et al., 2004;
CHEN et al., 2005; AQUINO et al., 2006). Até o presente momento, o foco da
engenhara tecidual ligado à regeneração nervosa periférica tem sido direcionado
primariamente para a implantação das células de Schwann isoladas, purificadas e
expandidas in vitro, transplantadas internamente nas câmaras de tubulização. No
entanto, devido à dificuldade de manipulação destas células, e à necessidade de
uma determinada quantidade e vigor das culturas requeridas, o emprego deste tipo
de terapia no reparo de nervos periféricos tem sido pequeno (HU et al., 2006). Cada
vez mais, estudos vêm demonstrando o desenvolvimento de Células de Schwann a
partir de células tronco mesenquimais in vitro com potencial de regeneração axonal
in vivo. Baseado nesta capacidade plástica, este último autor mencionado citou que
as células tronco mesenquimais podem ser usadas como substitutas para as
células de Schwann em câmaras de tubulização para regeneração nervosa
periférica.
63
O trabalho experimental demonstrado por Chen et al. (2006), mostrou o
benefício do emprego dos aspirados de medula óssea no tecido nervoso lesionado.
Este grupo demonstrou que células tronco derivadas de medula óssea, por
apresentarem população heterogênea com distinta plasticidade, podem diferenciar-se
numa variedade de tipos celulares, incluindo adipócitos, condrócitos, osteócitos,
miócitos, hepatócitos, astrócitos e neurônios. Concordando com estes, o experimento
em questão demonstrou através de seus resultados, vantagens no processo
regenerativo do nervo tibial seccionado, tubulizado e transplantado com células
tronco autólogas de medula óssea. Embora este estudo não venha elucidar qual o
mecanismo de plasticidade das células transplantadas ou fatores de crescimento
produzidos, conclui-se que através das condições microambientais fornecidas pela
transferência das células mononucleares de medula óssea interiormente à câmara e
o contato com as citocinas e fatores de crescimento expressos neste meio, a
regeneração nervosa ocorre de forma mais rápida.
64
5 CONCLUSÃO
1. Mediante os resultados obtidos neste experimento é possível concluir que a
técnica de tubulização em coelhos, em ambos os grupos de estudo, proporciona
uma boa evolução do processo de regeneração nervosa em um período de 30 dias
de observação pós-cirúrgica.
2. Pela análise das lâminas histológicas coradas pelo azul de toluidina, observa-se
remielinização com presença de bainha de mielina fina em ambos os grupos de
tratamento.
3. Existe diferença significativa entre a presença de degeneração Walleriana nos
dois grupos de estudo, oportunizando concluir que o tratamento com células tronco
autólogas de medula óssea apresenta vantagens no processo de regeneração do
nervo periférico sob a técnica de tubulização.
4. Com as outras variáveis analisadas, apesar da diferença entre os grupos não ser
estatísticamente significativa, é possível inferir que o processo regenerativo
acontece de uma forma mais rápida no grupo tratado com as células tronco
autólogas de medula óssea.
65
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74
7 ANEXOS
ANEXO 1 – Solução fixadora para a base de glutaraldeído objetivando a
estabilização dos tecidos.
Glutaraldeído 25% + Paraformaldeído 2% + Tampão fosfato 0,12
(Solução final)
Glutaraldeído 2,5%..................................................................................................1mL
Paraformaldeído 8%.............................................................................................2,5mL
Tampão fosfato 0,2 M..............................................................................................5mL
H
2
O.......................................................................................................................1,5mL
TOTAL...................................................................................................................10mL
75
ANEXO 2 – Protocolo de preparação de amostras biológicas para realização de
cortes ultra-finos.
1) Tratamento com a solução fixadora
2) Lavagens com tampão fosfato a 0,1M:
a. 3 banhos de 30 minutos cada
3) Pós-fixação com tetróxido de ósmio 2% com tampão 0,2M (1:1)
a. Tempo de duração de 30 a 45 minutos
4) Lavagens com tampão fosfato a 0,1M:
a. 3 banhos de 30 minutos cada
5) Desidratação
a. Acetona Pa. 30% - 10 minutos
b. Acetona Pa. 50% - 10 minutos
c. Acetona Pa. 70% - 10 minutos
d. Acetona Pa. 95% - 10 minutos
e. Acetona Pa. 95% - 20 minutos
f. Acetona Pa. 100% - 10 minutos
g. Acetona Pa. 100% - 20 minutos
6) Pré-embebição
a. São realizados banhos misturando o desidratante com a resina em
proporções gradativas e crescentes. Cada banho deve durar no
mínimo 2 horas.
7) Embebição
a. Realização de banhos de resina 100% durante 24 horas em rotater.
8) Inclusão
a. Aplicação em moldes de silicone, com resina pura e colocada em
estufa com temperatura constante de 60º C durante 72 horas.
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