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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
ASPECTOS BIOMECÂNICOS, BACTERIOLÓGICOS E
MICOLÓGICOS DE DIÁFISES FEMORAIS CANINAS
CONSERVADAS EM GLICERINA A 98% OU MEL
TESE DE DOUTORADO
Gustavo Frassetto Amendola
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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ASPECTOS BIOMECÂNICOS, BACTERIOLÓGICOS E
MICOLÓGICOS DE DIÁFISES FEMORAIS CANINAS
CONSERVADAS EM GLICERINA A 98% OU MEL
por
Gustavo Frassetto Amendola
Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em
Cirurgia Experimental, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS),
como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Medicina Veterinária.
Orientador: Dr. Alceu Gaspar Raiser
Santa Maria, RS. Brasil
2007
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Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa De Pós-graduação Em Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Tese de Doutorado
ASPECTOS BIOMECÂNICOS, BACTERIOLÓGICOS E
MICOLÓGICOS DE DIÁFISES FEMORAIS CANINAS CONSERVADAS
EM GLICERINA A 98% OU MEL
elaborada por
Gustavo Frassetto Amendola
como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Medicina Veterinária
COMISÃO EXAMINADORA:
Alceu Gaspar Raiser, Dr.
(Presidente/Orientador)
Renato Borges Fagundes, PhD. (UFSM)
Alexandre Mazzanti, Dr. (UFSM)
João Cesar Dias Oliveira, Dr. (UFSM)
Renato Xavier Faria, Dr. (URCAMP)
Santa Maria, 12 de março de 2007.
4
Dedico a presente tese a três pessoas que eu gostava muito,
aos meus avós Romeu e Haydée,
que sempre foram bons comigos e também
ao meu querido amigo Ricardo Alexandre Hippler,
colega de graduação, mestrado e departamento.
Um forte abraço para vocês aí em cima.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por ter proporcionado tantas oportunidades com que fui
agraciado.
Aos meus genitores, Delmo e Miriam, por terem sido bons pais e pela a ajuda que
sempre me foi prestada.
Ao meu orientador, Doutor Alceu Gaspar Raiser, por ter ensinado de forma tão
magistral a maior parte do ensinamento sobre cirurgia que absorvi tanto no período de
graduação como pós-graduação e também pelos votos de confiança que sempre me foram
prestados.
Aos meus tios Fernando e Carmen, além das minhas primas, que sempre me ajudaram,
principalmente nos momentos de extrema dificuldade e me acolheram de forma paternal
quando necessitei.
Aos distintos Doutores Ney Pippi, João Eduardo e Alexandre, sumidades consagradas
em Medicina Veterinária e que contribuíram não somente para a minha formação, mas
também para a de uma miríade de profissionais competentes que se encontram no país e além
dele.
Ao Doutor Jânio, à Daniela, ao Ayrton e à Estela, que me ajudaram muito na etapa
micológica do meu trabalho, sempre atenciosos e compreensivos.
À Doutora Agueda, a Franciele e a Nilra, além dos outros estagiários que, de forma
excepcional, contribuíram para que fosse realizada com sucesso a avaliação bacteriológica do
presente estudo.
Ao Doutor José Mário e ao João do LMCC, por terem me permitido utilizar as
dependências do referido laboratório e que sempre me ajudaram quando as dúvidas se fizeram
presentes.
Aos Doutores Cláudio e João Francisco, atual e último coordenador do PPGMV, por
terem proporcionado a oportunidade de eu poder opinar nas decisões do pujante programa, na
qualidade de representante dos discentes doutorandos.
Aos colegas com que convivi, e que provavelmente não conseguirei enumerá-los por
completo, pois foram tantos. Vamos lá: Ventura, Fabiano, Savassi, Ademar, Josaine, Adamas,
De Conti, Juca, Raquel, Mário, Douglas, Bolson, Rafael, Alievi, Liege, Débora, Polydoro,
6
Sandro, Soraya, Charles, Fighera, Márcia, Cardona, Marina, Letícia, Graziela, Guilherme,
Eduardo, Daniel, Tatiana, Fabíola, Denise, Kleber, Lucas, Rosana e outros tantos.
A todos os funcionários do Hospital Veterinário, em especial ao Cézar da Radiologia e
o Alvarino, que sempre foram amigos cordiais.
Aos amigos que fiz na Medicina, os doutores Ignácio, Chariff, Copetti e a doutora
Sandra e também aos seus funcionários, que permitiram que fosse possível a coleta dos ossos
dos cães por eles utilizados.
Ao Doutor Adriano, amigo que me auxiliou na estatística do trabalho realizado.
A todos os estagiários, especialmente ao Diego, hoje mestrando, que me ajudou de
forma importante na coleta dos materiais.
Até ao Fabrício, que é muito chato, mas é meu amigo e colega e que nos conhecemos
há muito tempo.
A Capes pela bolsa, sem a qual não teria sido possível a realização desse estudo.
Aos freqüentadores do LACE, pelas brincadeiras, discussões científicas, coleguismo e
festas realizadas.
A Universidade Federal de Santa Maria, instituição que me acolheu em 1993 e que até
hoje estive vinculado, seja como aluno ou professor.
A todos os que de alguma forma contribuíram na realização deste trabalho, o meu
agradecimento e desejo de eterno sucesso.
A todos os cães que participaram e participam dos estudos científicos e aulas práticas,
por terem doado seu único e precioso bem, a vida.
7
“O único lugar onde o sucesso vem antes do trabalho é no dicionário”
Albert Einstein (1879-1955)
8
RESUMO
Tese de Doutorado
Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
ASPECTOS BIOMECÂNICOS, BACTERIOLÓGICOS E
MICOLÓGICOS DE DIÁFISES FEMORAIS CANINAS CONSERVADAS
EM GLICERINA A 98% OU MEL
AUTOR: GUSTAVO FRASSETTO AMENDOLA
ORIENTADOR: ALCEU GASPAR RAISER
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 12 de março de 2007.
Os implantes ósseos corticais desempenham função basicamente de sustentação
mecânica. A exigência fundamental para que ocorra a osteointegração do enxerto é a
estabilidade, sendo a resistência um fator de extrema relevância. O objetivo do presente
estudo foi comparar a resistência compressiva axial de diáfises femorais caninas conservadas
em glicerina a 98% ou mel, mantidas por um período de 30 dias. Foram formados três grupos,
cada um contendo 50 amostras. O primeiro grupo apresentou como agente conservante a
glicerina a 98%, o segundo o mel e ainda houve um terceiro grupo onde os ossos foram
coletados a fresco e imediatamente testados. Os ossos foram obtidos de maneira não asséptica,
utilizando serra manual e realizou-se a remoção do periósteo e medula óssea. Posteriormente
cada implante teve definido seu comprimento, diâmetro e espessura de cortical e foi
determinado que o comprimento seria o dobro do diâmetro de cada diáfise. Os testes
biomecânicos foram realizados em uma prensa de compressão axial, na qual as diáfises foram
submetidas até a carga máxima quando houve fissura. Os grupos da glicerina a 98% e mel
foram hidratados por um período de seis horas antes do teste compressivo, enquanto que no
grupo de ossos testados a fresco não houve hidratação. No estudo bacteriológico, a
contaminação foi avaliada usando três grupos, cada um com 35 amostras de um segmento
femoral. O primeiro grupo foi analisado no momento da coleta e nos grupos da glicerina a
98% e do mel, após 30 dias de armazenamento. A mesma metodologia foi usada para a
avaliação micológica. Os resultados demonstraram que a glicerina a 98% foi mais eficiente na
manutenção da resistência óssea e também mais eficiente em eliminar bactérias e fungos.
Palavras-chave: enxerto ósseo; resistência; contaminação
9
ABSTRACT
Doctor Thesis
Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
BIOMECHANICAL, BACTERIOLOGICAL AND MYCOLOGICAL
ASPECTS OF CANINE FEMORAL SHAFTS CONSERVED IN 98%
GLYCERIN OR HONEY:
AUTHOR: GUSTAVO FRASSETTO AMENDOLA
ADVISER: ALCEU GASPAR RAISER
Date and place: Santa Maria, March 12
th
, 2007.
The most important function of bone cortical allograft is basically of mechanical
sustentantion. The stability and resistance have an important signification in the success of
bone grafting. The aim of this study was to compare the axial compressive resistance of
canine femoral shafts conserved in 98% glycerin or honey, kept for 30 days. Three groups had
been formed, each one with 50 samples. The first group presented the 98% glycerin as agent,
the second group had the honey as way to conserve and still there was one third group where
the bones had been fresh collected and immediately tested. The bones had been collected
without asseptical care with manual saw and the periosteal layer and bone marrow were
removed. Later, the length, diameter and cortical thickness of each implant were measured
and then
was determined that the length would be twice the diameter of each femoral shaft.
The biomechanical evaluation were tested in a press of axial compression, where the shafts
had been submitted until the maximum load, when the first fracture point happened. The
98%glycerin and honey groups were moisturized for six hours before the compressive test
while the fresh bone group received no hydration. In the bacteriologic study, the
contamination was evaluated using three groups, each one with 35 samples of a femoral
segment. The first group was analyzed at the harvest time and in the 98% glycerin and honey
groups, after 30 days of storage. The same methodology was used for the mycological
evaluation. The results showed that the 98% glycerin was more efficient in keeping bone
resistance and also more efficient in eliminating bactaeria and fungi.
Key-words: bone graft; resistance; contamination
10
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Demonstrando a prensa de compressão axial marca Solotest e as medições
realizadas com paquímetro digital no sentido crânio - caudal e médio - lateral..................
53
FIGURA 2 - Exemplo de agentes encontrados. Na foto A tem-se o crescimento de um
bacilo, enquanto que na foto B é possível observar a presença de Aspergillus niger, os
quais estavam presentes nos ossos conservados em mel......................................................
66
FIGURA 3 - Gráfico da regressão linear entre mel e glicerina em relação ao volume
versus resistência dos ossos..................................................................................................
77
11
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - Os grupos dos ossos examinados a fresco (F), conservados em mel (M) e
os ossos conservados em glicerina (G), além dos agentes que foram isolados através dos
testes realizados em Ágar sangue. Avaliação bacteriológica...............................................
72
QUADRO 2 - Os grupos dos ossos examinados a fresco (F), conservados em mel (M) e
os ossos conservados em glicerina (G), além dos agentes que foram isolados através dos
testes realizados em Ágar Saboraud. Avaliação micológica................................................
74
12
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Resultado do volume dos grupos nos quais os ossos foram conservados em
glicerina (G), mel (M) e dos ossos avaliados a fresco (F) relacionados com a carga (em
Newton) que cada um dos ossos dos grupos suportaram. No final tem-se a relação
Volume x Newton de cada grupo.........................................................................................
61
TABELA 2 - r significa o coeficiente de regressão, r
2
coeficiente de regressão linear,
y=a+bx equação de regressão linear, a é a constante onde a reta encosta em N e b é o
slope, que é a inclinação das retas no gráfico, onde mostra que a glicerina foi mais
eficiente que o mel................................................................................................................
76
TABELA 3 - Resultado do Teste Qui-quadrado demostrando que a glicerina foi mais
eficiente que o mel na inibição do crescimento de bactérias (P < 0.0001)...........................
77
TABELA 4 - Resultado do Teste Qui-quadrado demostrando que a glicerina foi mais
eficiente que o mel na inibição do crescimento de fungos (P < 0.0317)..............................
78
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 16
2.1 Implantes ósseos................................................................................................... 16
2.2 Comportamento biomecânico ósseo................................................................... 18
2.3 Glicerina e mel como conservantes.................................................................... 38
2.3.1 Glicerina..............................................................................................................
38
2.3.2 Mel como agente conservante e terapêutico.......................................................
43
3 MATERIAL E MÉTODO...................................................................................... 52
3.1 Coleta e conservação............................................................................................ 52
3.2 Ensaios biomecânicos........................................................................................... 52
3.3 Avaliação bacteriológica...................................................................................... 54
3.4 Avaliação micológica............................................................................................ 54
3.5 Avaliação estatística............................................................................................. 55
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 56
4.1 Propriedades biomecânicas................................................................................. 56
4.2 Glicerina como agente bactericida e fungicida.................................................. 63
4.3 Mel como agente bactericida e fungicida........................................................... 65
4.4 Avaliação estatística............................................................................................. 76
4.4.1 Ensaios biomecânicos..........................................................................................
76
4.4.2 Avaliação bacteriológica......................................................................................
77
4.4.3 Avaliação micológica...........................................................................................
78
5 CONCLUSÕES........................................................................................................ 79
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 80
14
1 INTRODUÇÃO
Enxertos ósseos diafisários são de extrema importância para a correção de grandes
falhas ósseas e vários autores citam formas de preservação. O óxido de etileno foi utilizado
por SCHENA et al. (1984) e a liofilização por JOHNSON et al. (1985) na conservação de
ossos. Entretanto alguns autores, como GOLDBERG & STEVENSON (1987), preferiram
utilizar ossos coletados a fresco. Todavia, podem ser citados ainda o congelamento
(DUELAND et al., 1989; KERVIN et al., 1991), tintura de iodo a 2% (PINTO JÚNIOR,
1995), glicerina a 98% (COSTA, 1996) e o mel (AMENDOLA, 2001).
Testes biomecânicos têm se tornado cada vez mais comuns para avaliar a performance
da rigidez de ossos. Cargas fisiológicas são aplicadas aos implantes para avaliar a sua
estabilidade mecânica (SEDLIN, 1966; KOMANDER, 1976; BUCHARDT et al., 1978;
PELKER et al.,1984; MALININ et al., 1989; KANG & KIM, 1993; CONRAD, 1993;
SCHIMIDT et al., 1994; DUARTE & SCHAEFFER, 2000; BECKMANN et al., 2005).
O risco de transmissão de doenças infecciosas e de contaminação cirúrgica para os
pacientes que recebem implantes de tecidos é de grande interesse na formação de um banco
para estocagem de tecidos. Microorganismos são introduzidos durante a coleta,
processamento e estocagem. Condições de assepsia fazem com que a possibilidade de
transmissão de doenças bacterianas, fúngicas ou víricas seja praticamente excluída. Portanto,
para minimizar os riscos de transmissão de doenças, deve-se monitorar rigorosamente todas as
etapas, incluindo-se a cuidadosa seleção do doador, o processo de coleta e os meios de
esterilização e/ou conservação dos tecidos a serem implantados (DZIEDZIC &
STACHOWICZ, 1997).
Vários autores, como PIGOSSI et al. (1971), DALECK (1992), ALMEIDA (1996),
NETO et al. (2000), OKAMOTO et al. (2000), CONTESINI et al. (2001) e STAINKI et al.
(2001) realizaram experimentos utilizando a glicerina 98% como método ou meio conservante
de diferentes materiais biológicos. Dentre eles citam-se a dura-máter, o peritônio, o
pericárdio, a tíbia e a cartilagem, mostrando a eficácia de seu uso como meio conservante,
ocorrendo, contudo divergência quanto ao tempo de conservação e a análise bacteriológica.
Embora o mel como conservante de ossos seja pouco utilizado, MSCHIVIDOBADSE
(1978) comentou que utilizou em humanos implantes alogênicos esterilizados através de
formaldeído e conservados em solução diluída contendo 50% de mel, obtendo resultados
15
satisfatórios, chegando a conclusão de que essa é uma forma de se obter um banco de ossos de
alta qualidade.
Apoiando-se na evidência de que o mel possui propriedades anti-sépticas (EFEM et
al., 1992), ossos têm sido mantidos nesse material por um período mínimo de 30 dias e
posteriormente implantados em animais, proporcionando resultados satisfatórios, tal como
relataram AMENDOLA (2001), GAIGA (2002) e ALIEVI (2006).
Os objetivos do presente estudo foram:
- Comparar biomecanicamente, através de compressão axial, diáfises femorais
conservadas em glicerina ou mel para avaliar qual método permite uma maior
manutenção da resistência óssea;
- Comparar os dois métodos anteriormente citados com ossos colhidos a fresco;
- Verificar se o modelo experimental demonstrou ser adequado para esse tipo de
teste biomecânico;
- Avaliar bacteriologicamente e micologicamente qual o meio mais eficiente para a
descontaminação de ossos colhidos de forma não asséptica;
16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Implantes ósseos
Desde a atigüidade existem relatos sobre enxertos e sua origem muitas vezes se
encontra mesclada com episódios lendários. Os primeiros indivíduos a realizarem tal tipo de
transplante seriam Cosme e Damião, nascidos no terceiro século do ano do Nosso Senhor.
Cosme, clínico, e Damião, cirurgião, teriam realizado muitas curas e práticas médicas não
usuais ao longo dos anos, desagradando o imperador romano Diocleciano, que acabou por
sentenciá-los à morte no ano de 287 d.C. Supostamente, no século V, Cosme e Damião teriam
patrocinado um milagre na Basílica de Roma: o administrador sofria muito devido a um
tumor em um membro pélvico e, exausto, adormeceu durante suas orações. São Cosme e São
Damião apareceram-lhe em sonho, removeram o membro doente e o substituíram pelo o de
um homem que havia falecido no mesmo dia. Os relatos afirmam que tal cidadão havia
acordado completamente sanado. Essa suposta operação milagrosa foi incorporada à tradição
Católica e retratada por artistas tais como Fra Angelico, podendo suas pinturas ser observadas
no Museu de São Marco em Florença (MANKIN et al., 1983).
Em 1688 um cirurgião holandês, Job van Meekeren, descreveu um procedimento em
que transplantou com sucesso um fragmento de crânio canino para a abóbada craniana de um
soldado que servia ao exército que atualmente protege o território russo. Isso não foi praticado
sem algumas preocupações éticas e conseqüências morais. O paciente, posteriormente,
solicitou que o enxerto fosse removido, visto que o procedimento resultou em sua
excomunhão da Igreja Católica. Na segunda intervenção o referido militar veio a óbito
(WEIGEL, 1993). O mesmo autor relatou que o auto-enxerto experimental de ossos em
coelhos e cães foi conduzido primeiramente pelo francês Ollier, em 1867 e que o primeiro
manual cirúrgico sobre enxerto ósseo, de autoria de F.H. Albee, foi publicado nos Estados
Unidos, em 1915.
A partir da segunda metade do século XIX houve um incremento no interesse sobre o
potencial biológico dos ossos e periósteo, sendo que através de uma intervenção cirúrgica em
1881, Macewen obteve a reconstrução da diáfise umeral de uma criança utilizando enxerto
ósseo (FRIEDELANDER, 1987).
Enxertos e implantes ósseos são amplamente utilizados em humanos e animais para
corrigir falhas ósseas que não seriam passíveis de síntese mediante simples aproximação dos
17
segmentos afetados. A diferença entre os dois termos está no fato de que enxertos são
praticados com material viável ou vivo, enquanto que implante está relacionado com tecido
não vivo ou ainda com material não biológico (STEVENSON, 1998).
Fraturas de ossos em membros locomotores são freqüentes em pequenos animais.
Fraturas cominutivas ou multifragmentares são os traumatismos que apresentam maior
dificuldade de tratamento. Em geral, a osteossíntese nesses casos não apresenta boa evolução
pós-operatória. No entanto, a enxertia óssea na ortopedia veterinária tem sido uma alternativa
segura e de eleição na reposição de perdas e falhas ósseas (REYNOLDS et al., 1951). Para
isso torna-se necessário que os implantes homólogos sejam previamente retirados do animal
doador e preservados em meio adequado (PINTO JÚNIOR, 1990).
Tradicionalmente os cirurgiões veterinários preferem o uso de ossos autógenos devido
a superior capacidade osteogênica, facilidade de incorporação, e ausência de problemas
imunológicos (ALEXANDRE, 1983). Os enxertos tubulares (cilindro completo) estão
indicados para: fraturas diafisárias múltiplas ou cominutivas graves que não se prestam para a
reconstituição anatômica; perdas de segmentos ósseos; para a reposição de segmentos
removidos através de cirurgias, (neoplasias); reconstituição de não união óssea
(PEIRMATTEI & FLO, 1999). AMENDOLA (2001) descreveu em um trabalho experimental
que em cirurgias ortopédicas muitas vezes é impossível reparar o tecido ósseo devido a
grandes perdas ósseas e para isso os implantes são extremamente importantes.
Alguns autores atribuíram algumas desvantagens em se utilizar enxerto alógeno a
fresco. JOHNSON & STEIN (1988), utilizando ossos submetidos ao óxido de etileno, citaram
que o enxerto ósseo conservado é superior ao enxerto ósseo cortical recentemente colhido,
uma vez que este último é muito imunogênico, necessita de duas equipes cirúrgicas, dois
procedimentos cirúrgicos simultâneos, implica no sacrifício de um doador a cada enxertia e
acrescentou ainda a dificuldade de se obter doador saudável de porte compatível com o do
receptor.
Porém, há uma série de fatores limitantes na obtenção dos implantes ósseos. Devido à
grande variação dos tamanhos dos esqueletos dos animais, as possibilidades de se encontrar
um doador que seja compatível com a conformação física do animal receptor diminui
consideravelmente (PINTO JÚNIOR, 1990; 1995). Também é difícil obter ossos de cães
doadores imediatamente para a cirurgia de enxertia, pois é necessária a remoção total de
periósteo e restos teciduais aderidos ao osso para que não haja rejeição ao implante,
procedimento que atrasaria consideravelmente o início da cirurgia. Além disso, é preciso que
18
o método de preservação seja viável, de fácil utilização, baixo custo e que seja acessível a
clínicas e ambulatórios cirúrgicos de pequenos animais (ROE et al., 1988).
WEIGEL (1993) comentou que ossos conservados apresentam vantagens em relação
ao material colhido a fresco, pois existe uma possibilidade menor de rejeição por parte do
receptor, além de poder haver a formação de um banco de ossos.
Os aloenxertos ósseos corticais são biodegradáveis e comumente usados no tratamento
de fraturas em mamíferos. Os enxertos podem ser conservados, resultando em morte celular,
sendo que eles funcionam principalmente como ocupantes de espaço e suporte para
crescimento de osso novo do hospedeiro. Os vários meios e métodos de conservação de ossos
corticais visam diminuir a antigenicidade das células do doador a serem implantadas no
hospedeiro, além de manter um estoque acessível de osso disponível (STEVENSON, 1998).
Quanto a métodos de conservação de implantes ósseos, numerosas são as alternativas
propostas, sendo citados a glicerina por PIGOSSI (1967), tintura de iodo a 2% por PINTO
JÚNIOR (1995) e o mel, por ALIEVI (2006), para conservar osso cortical alógeno em cães
em falhas ósseas de fêmur.
DEL CARLO et al. (1999), usando aloenxertos ósseos caninos, compararam diferentes
métodos de conservação: ossos autoclavados; glicerina; solução de tiomersal 1:1000;
cefalosporina a 0,5% diluída em soro fisiológico e mantida no congelador a –16
o
C e ossos
mantidos em refrigeração a 4
o
C. Os autores concluíram que o melhor resultado obtido foi
através da conservação óssea em solução fisiológica com cefalosporina em -16
o
C.
2.2 Comportamento biomecânico ósseo
De acordo com HULSE & HYMAN (1998), as quatro forças fisiológicas primárias
que podem ser aferidas sobre o osso são a compressão axial, a tensão axial, o envergamento
(flexão) e a torção. Cada uma destas forças, isoladamente ou em conjunto, resulta em um
padrão complexo de pressões e deformações internas no âmbito do osso.
Fatores importantes na gênese de fraturas são a magnitude, a duração e a direção das
forças atuando no osso. As forças podem ser de tração ou compressão, neste caso chamado de
forças axiais, pois são paralelas ao eixo longitudinal do osso. Estes esforços provocam
encurtamento ou alongamento ósseos. Nos esforços de torção, a deformação angular provoca
forças de cisalhamento, cuja tensão máxima ocorre no ponto mais distante do centro do eixo
maior do osso, ou seja, na superfície cortical. Observando uma secção transversal do osso, as
forças de reação no mesmo, quando submetido à torção, têm o sentido oposto ao da força de
19
torque aplicada. Contudo, quando se tem um defeito ósseo e este é submetido à tensão
torsional, o sentido da tensão no osso é o mesmo da força externa aplicada na porção central
de sua secção transversal. Neste caso, somente a superfície da região cortical do osso está
resistindo à tensão imposta (BURSTEIN et al., 1972).
Quando um osso for submetido a uma carga de compressão, sofre uma deformação,
que se divide em dois momentos. No primeiro, se for retirada a força deformadora, o osso
retornará a sua forma inicial; é chamada deformação elástica. Num segundo momento, se
maior estresse ou esforço for aplicado ao material, seu poder de retornar à forma original será
excedido, e a isso se denomina deformação plástica. O ponto que delimita a divisão entre a
deformação elástica da plástica é chamado de ponto de cessão ou limite de proporcionalidade
(HARKESS et al., 1993).
O osso cortical diafisário é um material composto basicamente por hidroxiapatita, uma
cerâmica de alta resistência, que lhe confere principalmente rigidez, e por uma matriz
basicamente composta por colágeno, uma proteína responsável por suas propriedades elásticas
e plásticas. Sua estrutura não homogênea, a existência de trabeculados ósseos com arquitetura
bem definida (alinhamento principal) e a interposição de fluídos conferem ao mesmo
características de anisotropia e de viscoelasticidade. Apresenta, in vivo, processo de
cicatrização e remodelação contínuas, regulados por mecanismos complexos, inclusive por
efeitos piezelétricos (MEARS, 1979). CAMARGO et al. (2002) comentaram que estas
características fazem com que o osso apresente uma resistência adaptada às tensões pontuais,
variáveis ao longo do tempo (idade, por exemplo), posição (localização anatômica) e às
solicitações externas (freqüência e intensidade de forças e nível de atividade).
Os ensaios mecânicos têm a finalidade de determinar as propriedades estruturais de
diferentes tipos de materiais. Basicamente existem dois tipos de ensaios, que são os
destrutivos e os não-destrutivos. O primeiro promove a ruptura ou inutilização do material e
nessa categoria estão incluídos os testes de tração, impacto, torção, compressão, flexão e
fadiga. Nos ensaios não destrutivos estão incluídos os testes de ultra-som, magnoflux, raios-X
e outros que podem determinar as propriedades físicas ou mecânicas do material analisado
(SOUZA, 1974).
O tipo de ensaio biomecânico empregado depende do tipo de material testado, da
finalidade a que se destina, do tipo de esforços a que será submetido e das propriedades
mecânicas a serem medidas. Para a análise de enxertos ósseos o principal teste a ser realizado
é o de compressão axial (CASTANIA, 2002).
20
AN & DRAUGHN (2004) relataram diferentes métodos de avaliação biomecânica de
ossos. Podem ser citados a medição da dureza óssea por meio de osteopenetrômetro, testes de
microdureza, análise de propriedades viscoelásticas, ultra-som, scanner acústico, simulação
computadorizada e identação, além de diversos outros tipos de estudos.
Baseando-se no fato de que a maioria dos métodos de conservação exercem efeito
deletério sobre a resistência óssea (DEL CARLO et al., 1999), vários testes biomecânicos têm
sido realizados em ossos visando analisar suas características estruturais, tal como estudaram
CORNU et al. (2003) e BALL et al. (2004).
Pesquisas sobre as propriedades dos ossos longos dos cães devem ser feitas para
melhor entender as forças e os movimentos que o esqueleto apendicular deve resistir. Este
tipo de estudo pode permitir aos cirurgiões substanciais avanços no restabelecimento de
fraturas e aumentar o seu entendimento do remodelamento ósseo e da ocorrência de fratura
com relação ao exercício e o trauma (MARKEL, 1994).
Diversas são as variáveis que irão proporcionar ou não o sucesso de um implante
ósseo. Entre elas estão a capacidade osteoindutora e osteocondutora, o grau de antigenicidade
e a contaminação do material implantado. Entretanto WEIGEL (1993) cita que um fator
imprescindível para uma boa implantação é a rigidez na fixação entre leito doador e leito
receptor, fato impossível quando realizado com ossos de baixa resistência mecânica.
WEIGEL (1993) comentou que a liofilização exerce efeito deletério significativo
sobre a resistência óssea no que diz respeito à torção e ao encurvamento, sendo indicado
apenas para enxertos trabeculares, coticotrabeculares ou ainda corticais de pequenas
dimensões.
Recorrer a banco de ossos tem sido cada vez mais necessário nos últimos anos em
virtude do aumento do número de cirurgias como: tumores ósseos, artrodeses de coluna,
revisões de artroplastia total de quadril e traumatismos com perda óssea. Tem-se tentado criar
alternativas de enxerto ósseo, como o uso de osso liofilizado, tanto bovino quanto humano. Os
processos de liofilização e o tempo de reidratação do osso antes de sua utilização
transoperatória têm sido implicados na alteração das propriedades biomecânicas do osso.
Desse modo, MACEDO et al. (1999) realizaram um trabalho que comparou a resistência à
compressão in vitro do osso bovino congelado e do osso bovino liofilizado reidratado.
Utilizaram-se cilindros de 10 x 8mm provenientes de côndilos femorais bovinos, que foram
testados em uma máquina de compressão automatizada. Não foi encontrada diferença
estatisticamente significativa entre os grupos estudados e também não houve diferença de
resistência entre ossos hidratados e não hidratados.
21
A análise da resistência de ossos conservados para a utilização futura em implante é de
extrema importância, já que esse material deve proporcionar adequado suporte estrutural.
COSTA (1996) citou que os ossos conservados em glicerina tornam-se mais frágeis e
quebradiços, porém a diminuição da resistência é um problema encontrado em todos os
métodos de conservação. DEL CARLO et al. (1999) relataram que os ossos conservados por
meio da glicerina e autoclavados sofreram decréscimo da resistência devido à desidratação e
desnaturação protéica, respectivamente.
MARX et al. (1998) comentaram que na implantologia oral apresenta-se como
condição fundamental a necessidade de uma quantidade suficiente de osso saudável no local
receptor, tanto em altura quanto em largura A partir dos avanços tecnológicos ocorridos no
diagnóstico por imagem, principalmente com a introdução da tomografia computadorizada
(TC), tem sido alcançada uma avaliação mais precisa e segura da quantidade, da qualidade e
da densidade óssea presentes para a reabilitação dentofacial com implantes dentários. A
capacidade tridimensional da TC permite também avaliar os resultados de cirurgias de
elevação do assoalho do seio maxilar, identificando inclusive a invaginação dos tecidos moles
nos locais de enxerto e diagnosticando doenças sinusais (GARG, 1999).
BALL et al. (2004) citaram que implantes osteocondrais utilizados em humanos
geralmente são coletados e mantidos em solução de Ringer lactato em temperatura de 4ºC
durante um período de dois a cinco dias. Em uma análise biomecânica, foi verificado que se
estes implantes tiverem um prazo de armazenamento estendido por duas semanas suas
propriedades estruturais serão mantidas, não havendo efeito deletério na resistência do
material biológico.
LI et al. (2004) utilizaram aloimplantes ósseos congelados nas faces laterais dos
fêmures de 50 coelhos da raça Nova Zelândia. Estes animais foram avaliados durante duas,
quatro, oito, 16 e 24 semanas após o ato cirúrgico e verificou-se que até a 16
a
semana a
resistência óssea havia declinado a um nível de 38% de seu estado original. A partir deste
período o osso transplantado progressivamente readquiria sua resistência a medida que o leito
doador ia sendo substituído pelo receptor.
Um estudo composto por dez cadáveres suínos foi realizado por KOH et al. (2004),
visando avaliar o comportamento biomecânico de implantes osteocondrais colocados em
membros pélvicos e submetidos a sete diferentes métodos de fixação. Foi utilizada uma
prensa calibrada para gerar 80 N de carga e como resultado final foi possível verificar que,
quanto maior o grau de incongruência que se apresentar na articulação, maior serão as forças
vetoriais que irão comprometer a futura deambulação.
22
MELLO & GOMIDE (2005) realizaram um estudo que investigou os efeitos do flúor
suplementar sobre as características dos ossos de ratas ovariectomizadas utilizadas como
modelo de osteoporose experimental, por meio da correlação entre os parâmetros
biomecânicos e as propriedades físicas e químicas desses ossos. No início do experimento, 78
ratas Wistar, com quatro meses de idade, foram divididas em oito grupos: grupo basal, que
gerou os parâmetros iniciais do experimento; grupo I, formado por ratas não
ovariectomizadas; e os grupos II a VII, constituídos por ratas ovariectomizadas submetidas a
dosagens de fluoreto de sódio (NaF) de 0, 20, 40, 60, 80 e 100mg/L em solução,
respectivamente, durante dois meses. Os resultados demonstraram que a ovariectomia
promoveu osteopenia, observada pelos parâmetros morfométricos, físicos e químicos,
provocando menor resistência biomecânica dos fêmures submetidos ao ensaio de flexão. Os
ossos das ratas que ingeriram 40mg de flúor demonstraram melhores características físicas,
bioquímicas e biomecânicas do que os das ratas submetidas a ooforectomia sem tratamento e
os das não submetidas a ooforectomia. Desse modo, foi concluído que, além de promover
uma proteção contra a perda óssea induzida pela deficiência de estrógenos causada pela
castração, o flúor melhorou a qualidade óssea, demonstrada pelos resultados biomecânicos
aumentados em relação ao grupo não ovariectomizado.
NAM et al. (2004) realizaram um experimento com 17 coelhos em que foram
utilizados enxertos osteocondrais na articulação do joelho. O objetivo foi avaliar, através de
impactação, o grau de resistência destes materiais cirurgicamente colocados em duas etapas
(seis ou 12 semanas). Foi verificado que a resistência das articulações coletadas após
eutanásia, em 12 semanas, era maior do que aquelas coletadas em seis semanas,
demonstrando que houve perda de propriedades estruturais do osso e cartilagem implantados
em um período breve, porém com o passar do tempo novamente houve acréscimo de
resistência. Os autores concluíram que este procedimento é apto para ser utilizado na prática
cirúrgica.
CUNHA (1998) estudou as propriedades biomecânicas do tecido ósseo cortico-
esponjoso metafisário do dorso do radio-distal, comparando-as com as do tecido ósseo
córtico-esponjoso da crista ilíaca e da superfície volar do escafóide. As amostras foram
testadas por compressão axial, até a falência. Após análise das resistências máximas da
elasticidade e das deformações, foi observada uma diferença significativamente menor entre
os enxertos do dorso do radio-distal e da crista ilíaca, quando comparados a superfície volar
do escafóide quanto à resistência máxima limite de elasticidade.
23
Os implantes, utilizados atualmente em ortopedia e ortodontia, apresentam inúmeros
inconvenientes, dentre os quais se destaca a rejeição biológica que provoca a redução do
desempenho biomecânico na região de tratamento. Uma alternativa para este problema seria a
utilização de um material para estes implantes que atue como elemento estrutural durante o
período de cura e que seja posteriormente absorvido pelo organismo, evitando assim a
necessidade de sua remoção. BENTO (2003) realizou um estudo onde foi investigado o
comportamento biomecânico de parafusos de osso cortical bovino liofilizado, implantados na
diáfise femoral de coelhos, através de análise experimental e numérica em três grupos de
fêmures: com implante de osso, com implante de titânio e sem implante. Na análise
experimental, os fêmures foram submetidos ao ensaio mecânico destrutivo de flexão por
quatro pontos. A simulação computacional dos ensaios foi realizada através de modelos de
elementos finitos de modo tridimensional para cada grupo, para a verificação das tensões e
deformações induzidas nos implantes e região próxima a este, em função da condição de
osteointegração. Os resultados obtidos demonstram que os implantes de osso cortical bovino
liofilizado apresentam requisitos biomecânicos satisfatórios.
URBAN et al. (2004) realizaram testes mecânicos compressivos em um novo tipo de
material utilizado em ortopedia, que se chama sulfato de cálcio modificado. O material foi
implantado em fêmures caninos e posteriormente coletados. Os resultados encontrados
demonstraram que este material é três vezes mais resistente do que o sulfato de cálcio comum,
além de apresentar ótimas características de biocompatibilidade.
FRANÇA (2002), através de testes compressivos, analisou a segurança e a resistência
mecânica de 30 corpos vertebrais, de cadáveres humanos, submetidos à vertebroplastia. O
autor injetou cimento acrílico no corpo vertebral por via transpedicular, observando seu
extravasamento e a temperatura do corpo vertebral. Testou a resistência e comparou com a da
própria vértebra quando íntegra. Esta técnica traz riscos às estruturas próximas, devido ao
extravasamento do cimento. Quanto à temperatura, ela é segura desde que não ocorra o
extravasamento. A resistência da vértebra, após o procedimento, depende do grau do
achatamento inicial. Aquelas que tiveram achatamento menor apresentaram resistência maior.
CURCELLI (1999) realizou um estudo experimental, em ratos, para avaliar o efeito de
anticoagulantes na consolidação óssea, conforme critérios clínicos, anatomopatológicos e
biomecânicos. Manualmente, após perfuração do osso, foi produzida fratura, na diáfise da
tíbia direita, mantida sem imobilização, em 72 ratos, divididos em três grupos. Doze horas
após a fratura, foi iniciado tratamento com anticoagulante ou água destilada. Um grupo
recebeu heparina sódica, outro, enoxaparina. O grupo controle recebeu água destilada.
24
Durante o experimento, os animais foram avaliados clinicamente e, após 28 dias, mortos para
análise anatomopatológica e biomecânica. O estudo biomecânico, realizado por meio de
ensaio de flexão, demonstrou coeficiente de rigidez e carga máxima semelhantes nos três
grupos. Nenhuma diferença clínica, anatomopatológica ou biomecânica foi encontrada,
resultando na consolidação de todas as fraturas de acordo com os critérios adotados,
concluindo-se, portanto, que a heparina sódica e a enoxaparina, nas doses, via e tempo de
administração utilizados, não interferiam na resistência da consolidação das fraturas de tíbia
de ratos.
VASTEL et al. (2004) avaliaram o efeito de três tipos de métodos de esterilização, no
quesito resistência, em ossos esponjosos provenientes de banco de ossos de doadores
humanos. Através de um aparelho que emitia ondas de ultra-som foi verificado que ossos
tratados com óxido de etileno ou extração lipídica apresentavam um decréscimo de resistência
estrutural de 2,4 a 2,5% em períodos curtos ou médios de armazenamento. Entretanto, o
produto chamado uréia 6M fez com que os ossos conservados tivessem um decréscimo de
30% em suas propriedades biomecânicas.
PENHA (2004) comentou que estudos in vitro demonstraram que a melatonina é capaz
de acelerar a diferenciação de osteoblastos, aumentando a síntese de colágeno e
conseqüentemente a resistência óssea. Considerando que a atividade de osteoblastos é
importante para a estrutura óssea e suas propriedades mecânicas, e que a melatonina tem
efeito estimulador sobre estas células, o autor realizou um estudo com objetivo de verificar a
influência da redução da produção de melatonina sobre características mecânicas dos ossos
em crescimento, analisada através de ensaios biomecânicos em flexão de três pontos. Foram
utilizados 32 ratos Wistar distribuídos em dois grupos experimentais: sham (cirurgia fictícia)
e pinealectomizados. Os animais pinealectomizados apresentaram ossos menos resistententes
e os resultados indicaram influência da ausência da melatonina, causando atraso na formação
da matriz do tecido ósseo, modificando alguns aspectos de suas características mecânicas.
MARTINS (2001) realizou um estudo visando avaliar o comportamento mecânico de
uma falha de 3,5 mm no rádio de dezenove coelhos em que comparou a utilização dos
biomateriais com o enxerto homólogo. Neste estudo foram utilizados enxerto ósseos orgânico
e inorgânicos bovino, pool de proteína morfogenética bovina e colágeno bovino, como
biomateriais em dez animais. Dois animais foram submetidos a retirada das asas ilíacas para
posterior congelamento e implantação em sete animais, como enxerto homólogo. Em seis
semanas estes animais foram submetidos a eutanásia e os rádios foram submetidos ao teste de
flexão em três pontos, com o uso da carga no sítio da regeneração, sendo avaliados a carga
25
máxima e o deslocamento gerado pela observação da curva carga-deformação. O grupo
controle foi o rádio não operado de todos os animais. Foi possível concluir que embora os
enxertos homólogos obtivessem consolidação satisfatória, os biomateriais apresentaram uma
variação mecânica intragrupo muito baixa, mostrando-se mais homogêneo.
CORNU et al. (2003) promoveram a impactação de 18 cabeças e colo femorais
conservadas congeladas ou apenas refrigeradas. Antes de serem realizados os testes houve um
período de reidratação de 30 minutos e então foi concluído que os espécimes conservados sob
congelamento eram mais resistentes do que aqueles apenas resfriados.
LENHARO (2003) efetuou um estudo em mandíbula de cães em que foram avaliados
implantes osseointegrados submetidos a carga imediata considerando a qualidade óssea
formada na interface implante-osso, como também foi medido o grau de contato ósseo da
referida interface. Foram utilizados quatro cães que, após as exodontias, receberam três
implantes Osseotite 3,75 x 8,5 (Implant Innovations Incorporation) e, após os procedimentos
de moldagem e de laboratório para a confecção da prótese em Níquel-Cromo. Após 240 dias,
os implantes medial e distal foram contra-torqueados medindo-se a resistência do tecido ósseo
neoformado. A média de contato ósseo foi de 77,5% e o teste de contratorque aplicado nos
implantes apresentou média de 76,13 N/cm. Considerando as limitações deste trabalho, foi
possível concluir que a carga imediata em segmentos parcialmente desdentados é uma técnica
viável para reabilitação bucal.
HOFMANN et al. (2003) realizaram um estudo biomecânico em pinos confeccionados
a partir de osso cortical proveniente de tíbias bovinas. Foram utilizados 40 pinos que
possuíam 3mm de diâmetro e 60mm de comprimento e conservados por diferentes formas.
Aplicando um esforço de arqueamento em três pontos dos pinos, os melhores resultados, no
que diz respeito a resistência, foram obtidos com o tratamento utilizando-se acetona, enquanto
os ossos tratados com óxido de etileno ou autoclavagem não mantiveram o mesmo grau de
rigidez.
VAN BOERUM et al. (2003) promoveram testes de resistência rotacional em 14
fêmures humanos visando analisar duas formas de fixação de aloimplantes sustentados por
pinos intramedulares. No primeiro grupo foi confeccionado um entalhe de 1 cm, permitindo
acoplamento entre as interfaces proximal e distal dos leitos doador e receptor. O segundo
grupo recebeu o mesmo tratamento, porém o tamanho do encaixe foi de 1,2cm. Houve
diferença significativa no grau de rigidez a favor da segunda metodologia, pois enquanto o
primeiro grupo apresentou um desvio angular de 23,3º, o segundo grupo rotou apenas 3º.
26
CASCIO et al. (2003) avaliaram de forma ex vivo em humanos o grau de resistência de
três tipos de encaixe de aloenxertos fixados por placas (transverso, com degrau ou sigmóide).
O escopo desse estudo foi avaliar qual método apresentava maior rigidez torsional e foi
verificado que a fixação de forma sigmóide apresentou os resultados mais consistentes.
YAMAMOTO et al. (2003) compararam o grau de resistência compressiva entre ossos
conservados sob congelamento ou autoclavagem, provenientes de um banco de aloenxertos
visando substituir falhas ósseas em pacientes humanos que apresentavam osteossarcoma. Foi
verificado que ambos proporcionaram bons resultados clínicos, porém as propriedades
biomecânicas do osso autoclavado eram bem menores.
DUNLOP et al. (2003) realizaram esforços compressivos em cabeças femorais
provenientes de cadáveres humanos. O objetivo deste estudo foi verificar o grau de influência
dos restos de tecido adiposo e medula óssea entre os leitos receptor e doador. No primeiro
grupo as cabeças femorais foram mantidas com os tecidos anteriormente citados, enquanto
que no segundo grupo houve a remoção total dos mesmos. O resultado foi favorável
significativamente para a segunda metodologia.
Em certas situações a perda de segmento ósseo fibular distal em humanos promove
instabilidade da articulação do tornozelo. PACELLI et al. (2003) avaliaram
biomecanicamente em 11 cadáveres qual a porcentagem do comprimento fibular que pode ser
removido sem promover alterações angulares nesta articulação. A conclusão que os autores
chegaram foi de que é necessário permanecer distalmente somente 10% do comprimento total
da fíbula, o que significa em média seis centímetros ou menos.
BLOM et al. (2002) citaram que uma substância chamada hidroxiapatita tricálcica
fosfatada é utilizada conjuntamente com aloenxertos ósseos visando incrementar as
propriedades mecânicas em artroplastias coxofemorais em humanos. Para confirmar tal
afirmação foram procedidos ensaios compressivos entre um primeiro grupo que continha
apenas o aloenxerto e outros dois grupos com proporções variadas do material supracitado
associado ao implante ósseo. O resultado obtido foi de que a resistência óssea era menor no
primeiro grupo e maior nos dois seguintes.
HU et al. (2002) promoveram testes compressivos e de arqueamento em um composto
formado por matriz óssea desmineralizada associada ao cemento ósseo. Estes materiais são
utilizados como implantes para reparar perdas ósseas e o resultado dos testes comprovou que
a sua resistência é suficiente para serem utilizados em humanos.
RANDAL et al. (2002) estudaram o efeito de dois métodos de conservação de ossos
de ratos no que diz respeito aos efeitos causados sobre a sua resistência. Mediante um esforço
27
torsional foi verificado que os ossos que foram esterilizados por radiação eram
significativamente menos rígidos do que os que sofreram congelamento.
TANG et al. (1998) utilizaram aloenxertos nas faces laterais das duas ulnas de 40
coelhos, sendo que nos membros direitos havia uma carga aquém da fisiológica e nos
membros esquerdos havia suporte total. Ao final do período do experimento foram realizados
testes biomecânicos destrutivos em três pontos do osso, sob forma de arqueamento. Foi
possível concluir que em uma primeira fase a interface entre leito receptor e doador perde
resistência, porém posteriormente ela é recuperada. Foi verificado também que os ossos
obtidos dos membros onde a carga funcional foi fisiológica eram mais resistentes.
ORR et al. (2001) estudaram em coelhos, mediante esforço compressivo, as
propriedades biomecânicas entre xenoenxerto bovino trabecular e o uso de hidroxiapatita
sintética. Eles verificaram que, de forma ex vivo, o implante bovino apresentava
características estruturais superiores, enquanto que, após 26 semanas de implantação do
material, haviam melhores resultados nos ossos combinados com hidroxiapatita.
Aloimplantes ósseos são as principais fontes para a substituição de grandes falhas
ósseas (WHEELER et al., 2001). Os autores coletaram sítios de implantação de uma tíbia,
dois fêmures e dois úmeros de indivíduos variando entre dois a 13 anos. Foram realizados
ensaios biomecânicos de arqueamento em quatro pontos dos referidos ossos e foi verificado
que quando maior fosse a idade, menor seria a resistência óssea.
KARACHALIOS et al. (2000) avaliaram biomecanicamente a implantação de
autoenxertos de 5mm nas ulnas direitas de 40 coelhos da raça Nova Zelândia. Os grupos
tiveram os enxertos fixados por fios de Kirschner em posição fisiológica ou rotados em um
ângulo de 180º. Após dois meses foi verificado que na primeira metodologia o grau de
resistência óssea demonstrou ser mais eficiente.
HALASZ & KOVACZ (2000) analisaram as propriedades estruturais de diferentes
ossos coletados de 18 cadáveres humanos. Estes ossos foram a crista ilíaca, o rádio, a face
lateral e a espinha da escapula, a fíbula e seis diferentes partes da mandíbula. Foi verificado
que a resistência da mandíbula e da fíbula eram aproximadas, enquanto todos os outros ossos
apresentavam características estruturais inferiores.
BENEVENIA et al. (2000) avaliaram o efeito estrutural de dois métodos de fixação de
aloenxertos ósseos em tíbias de cães (placas ou pinos intramedulares). Ambos os sistemas
foram satisfatórios na formação de calo ósseo. Nos testes de arqueamento e torção os ossos
que foram submetidos a fixação por placas demonstraram ser sustentados por um método
mais eficiente, porém a significância estatística entre os dois grupos foi irrelevante.
28
SICA (1998) avaliou três métodos de fixação de fraturas em ossos zigomáticos de
caninos, aplicando forças de flexão e tensão de cisalhamento. Foram utilizados 36 cães
divididos em três grupos (fixação por fio de aço inoxidável, adesivo cirúrgico ósseo e grupo
controle com ossos intactos). O resultado foi que nos ensaios de cisalhamento não houve
diferença entre os grupos, enquanto que nos testes de flexão o grupo que apresentou união por
adesivo foi o mais frágil, sendo o grupo controle o mais resistente.
SILVA & VOLPON (2004) pesquisaram os efeitos da falta de uso dos membros sobre
o grau de resistência óssea em tíbias de ratos. Foram utilizados 53 animais que permaneceram
durante 21 dias suspensos pelas caudas sem que os membros dos mesmos tocassem qualquer
superfície. Após este período foi verificado biomecanicamente que os ratos apresentavam
significativa perda da resistência óssea, comprovado por testes de flexão em três pontos.
WIDJAJA & HARTUNG (2001) verificaram que o uso de pinos intramedulares
associados à parafusos eram superiores para o tratamento de fraturas de fêmures se
comparados somente aos parafusos. Essa conclusão tem maior confirmação quando a fratura
em questão for proveniente de um paciente osteoporótico. Em testes aplicando um esforço
compressivo e destrutivo do osso e implantes metálicos, os autores verificaram que a
associação das duas metodologias demonstrou maior resistência e também observaram que o
ponto crítico da coesão estrutural dos ossos são os orifícios confeccionados para a introdução
dos parafusos. Como resultado final recomendaram o uso desse método na rotina cirúrgica.
KADOYA et al. (2001) desenvolveram um novo tipo de disco intervertebral artificial
para ser utilizado experimentalmente na coluna lombar de ovinos. Foram avaliadas as
propriedades estáticas, viscoelásticas e de fadiga desses discos novos e também de discos
submetidos à seis meses de uso nas vértebras dos ovinos. Foi possível verificar que o disco
intervertebral artificial se mostrou semelhante ao esforço compressivo se comparado àqueles
encontrados in vivo dos ovinos. Quando a análise foi em relação ao esforço torsional, os
discos naturais demonstraram serem mais rígidos do que os artificiais. Os seis meses de uso
pós-cirúrgico dos discos artificiais demonstraram que não houve nenhum tipo de deterioração
e nem perda dos parâmetros biomecânicos. A conclusão final foi que o disco intervertebral
protético apresentou potencial para ser aplicado na substituição de discos intervertebrais em
humanos.
SCHENA et al. (1984) realizaram um estudo radiográfico e histológico comparando
enxerto a fresco e implante ósseo liofilizado mantido a 70ºC na reconstrução de falha
segmentar diafisária em caninos. Os melhores resultados no quesito resistência foram obtidos
29
com o enxerto recentemente coletado, enquanto que com o implante houve retardo na
consolidação e diminuição da resistência do material à compressão.
ZAHNG et al. (2005) realizaram um estudo em que compararam a compressão axial
sobre a cabeça do fêmur de ratos com um modelo que simulava a condição de queda lateral,
sendo que o tipo de fratura encontrada comumente em pacientes osteoporóticos é da segunda
categoria. Para induzir a condição de osteoporose as ratas foram castradas em um grupo
enquanto o outro grupo foi o controle. Após três meses os animais foram submetidos a
eutanásia e seus fêmures foram coletados. Verificou-se que os fêmures dos animais do grupo
controle foram mais resistentes e também foi possível concluir que o modelo de queda natural
necessitou menor carga para que ocorresse a fratura.
DATTA et al. (2006) estudaram as propriedades viscoelásticas de enxertos ósseos
mediante esforço compressivo. Foram utilizados ossos provenientes de seres humanos, suínos
e ovinos, sendo que foram comparados ossos com e sem cartilagem articular. Concluiu-se que
não houve diferença significante entre os ossos com e sem cartilagem e também os autores
aconselharam utilizar ossos ovinos quando forem realizar estudos ex vivo, visto que os
resultados foram bastante semelhantes aos dos ossos humanos.
CRIPTON et al. (2001) utilizaram um método minimamente invasivo para estudar a
pressão no interior de discos intervertebrais cervicais de humanos. O presente trabalho foi
realizado de forma ex vivo e os discos foram submetidos a carga compressiva axial máxima
de 800 N. Foi verificado que a pressão no interior dos discos aumenta linearmente a medida
que a compressão também cresce e que as pressões máximas encontradas no interior dos
discos estudados variaram de 2,4 a 3,5 Mpa.
LERNER et al. (1998) avaliaram se alterações morfológicas das placas de crescimento
de fêmures de coelhos têm relação com a resistência a fratura das mesmas. Foram utilizados
cinco grupos de coelhos com um, sete, 14, 21 e 42 dias e cada grupo era composto por seis
animais. No dia anterior à eutanásia os animais receberam calceína por via intravenosa. Foram
realizadas micro-tomografias computadorizadas de diferentes partes das cartilagens de
crescimento para analisar suas diferenças e chegou-se a conclusão que ossos que crescem
mais lentamente são menos resistentes ao esforço compressivo. Contudo, os autores relataram
que não conseguiram descobrir na totalidade por que os ossos crescem de forma diferente e
que as maiores disparidades de resultado aconteceram no grupo de 42 dias quando submetidos
a esforço compressivo no sentido antero-posterior, em que houve uma maior correlação entre
a taxa de crescimento ósseo e o grau de resistência dos fêmures.
30
GOH et al. (1995) avaliaram o grau de resistência óssea de cabeças e colos femorais
provenientes de seres humanos. Foram utilizados 40 pares de fêmures divididos em três
grupos. O primeiro grupo foi de controle, o segundo (grupo fraturado) foi considerado o
grupo onde houve osteotomia e posterior fixação por parafusos e placas compressivas e o
terceiro (grupo consolidado) apresentou o mesmo tipo de fixação, porém sem a osteotomia,
visando simular a condição de uma fratura consolidada mas ainda com os implantes metálicos
presentes. Como conclusão observou-se que os ossos do segundo grupo apresentaram
resistência 43,5% inferior ao grupo controle e o terceiro grupo apresentou resistência 15,2%
inferior ao primeiro grupo.
OUYANG et al. (1997), visando compreender como a densidade de osso trabecular
em vértebras humanas pode ser correlacionada com fraturas, avaliaram segmentos vertebrais
(T
12
-L
4
) de três indivíduos orientais masculinos. Os valores de densidade óssea oscilaram
entre 0,46 a 0,71 g/cm³. Os autores puderam concluir que a densidade de osso esponjoso
apresenta correlação linear com a resistência óssea quando for estudada uma forma cilíndrica
tal como um corpo vertebral, porém alertaram que o número de amostras foi pequeno para
que se chegasse a conclusões mais confiáveis.
BANSE et al. (1996) comentaram que os resultados de testes de resistência óssea
podem variar entre ossos contralaterais de um mesmo doador, mesmo que não haja nenhum
processo de conservação nesse processo. Para tanto avaliaram a simetria mecânica de dez
pares de cabeças femorais obtidas a partir de seres humanos que não apresentavam nenhuma
enfermidade óssea. As cabeças femorais foram submetidas a um posicionamento exatamente
simétrico e secções das mesmas foram realizadas visando estudar as propriedades mecânicas
da porção óssea trabecular através de teste de resistência compressiva. Como resultado foi
verificado que, apesar de haver diferenças entre ossos do mesmo doador, nenhuma delas
demonstrou ser de grau significativo e que quando um modelo de teste de resistência for de
comprovada confiança, ossos contralaterais de um mesmo doador podem ser utilizados de
forma a proporcionar resultados precisos.
BAYRAKTAR et al. (2004) realizaram um estudo visando comparar a propriedades
biomecânicas das porções trabecular e cortical de cabeças femorais provenientes de 11
doadores humanos. Os autores comentaram que a razão para que este estudo fosse realizado é
que existem dados que sugerem que as propriedades elásticas e compressivas são bastante
similares entre as duas partes desse osso. Foi possível concluir que a porção de osso
esponjoso da cabeça do fêmur apresenta resistência 25% inferior ao osso cortical.
31
RAPILLARD et al. (2006) comentaram que existe uma grande correlação entre a
idade de seres humanos e a incidência de fraturas compressivas não traumáticas em corpos
vertebrais. Neste estudo os autores avaliaram o grau de resistência da porção óssea trabecular
de vértebras torácicas e lombares provenientes de quatro doadores, variando entre 29 e 86
anos. Os autores concluíram que quanto maior for a idade menor será a resistência óssea
vertebral perante esforço compressivo e que, maior volume de massa óssea trabecular
apresentado em indivíduos jovens, contribui para uma maior resistência neste segmento
etário.
A dinâmica axial contribui para a formação de calo ósseo e conseqüente consolidação
óssea de fraturas. LIU et al. (2005) procuraram avaliar biomecanicamente a eficácia de dois
sistemas de fixação externa de fraturas (Dynafix e Orthofix). A avaliação foi feita de forma
computadorizada visando pesquisar os efeitos axiais. Os autores concluíram que significantes
movimentos não axiais ocorreram durante as avaliações, porém mediante regulagens
periódicas estes movimentos podem ser minimizados. Também ficou evidenciado que o
sistema Dynafix demonstrou ser mais eficiente na capacidade de reduzir movimentos não
axiais não desejáveis.
MÜLLER et al. (2004) comentaram que alguns trabalhos experimentais investigaram
a ação dos AINH (antiinflamatórios não hormonais) no processo de consolidação de fraturas,
por meio de estudos clínicos e histológicos, porém são escassas as análises biomecânicas.
Para tanto, foram avaliados 20 ratos da linhagem Wistar, divididos aleatoriamente em dois
grupos iguais: grupo A (controle) e grupo B (tratado com diclofenaco sódico). Em ambos os
grupos foram realizadas fraturas abertas, após perfuração, na tíbia direita. A administração da
droga foi por via intramuscular, dose única diária, por 28 dias. Os animais foram pesados
semanalmente. Após a eutanásia as tíbias foram dissecadas, pesadas e submetidas a ensaio
biomecânico de flexão analisando-se carga máxima, deformação e coeficiente de rigidez.
Observou-se que no grupo tratado com AINH não houve aumento do peso corpóreo a partir
da segunda semana e as tíbias fraturadas foram mais pesadas. Neste grupo o calo ósseo
suportou menor carga máxima, apresentando maior deformação e menor coeficiente de
rigidez. Nos animais tratados, o osso não fraturado também se mostrou menos rígido.
Concluiu-se, nas condições estudadas, que o diclofenaco sódico alterou o processo de
consolidação e o metabolismo ósseo, levando a retardo na maturação do calo e menor rigidez
do osso intacto, respectivamente.
CAMARGO et al. (2002) objetivaram avaliar o enfraquecimento causado pela
confecção de janela óssea cortical. Os autores confeccionaram uma janela circular no osso
32
cortical da diáfise de oito fêmures caninos e uma janela quadrada nos oito pares dos fêmures
contralaterais, com diagonal semelhante ao diâmetro da janela circular primariamente
confeccionada. As peças anatômicas foram submetidas a teste de tensão torsional em uma
máquina de ensaios mecânicos, obtendo-se o torque máximo e a rigidez à torção. Os
resultados mostraram que, para o fêmur com janela circular, o torque máximo médio foi de
13,65 ± 5,12 Nm, e a rigidez média foi de 1,18 ± 0,45 Nm/grau, enquanto que para a janela
quadrada o torque máximo médio foi de 13, 39 ± 5,23 Nm, e a rigidez média foi de 1,05 ±
0,41 Nm/grau. A resistência nos ossos com janela circular e quadrada submetidos à tensão
torsional foi praticamente igual, fato este corroborado pela análise estatística que não revelou
diferença significativa.
As propriedades bifásicas biomecânicas compressivas que atuam sobre discos
intervertebrais de bovinos ainda não foram descritas, sendo de grande importância para o
entendimento do funcionamento dessas estruturas. PÉRIÉ et al. (2005), mediante um método
de compressão confinada e um módulo linear e outro não linear bifásico avaliaram o grau de
permeabilidade hidráulica e modulo compressivo. Ficou concluído que uma resistência
compressiva menor e uma maior permeabilidade hidráulica foram encontradas no núcleo
pulposo em relação ao anel fibroso e também que os esforços impostos a essas estruturas
simulam danos irreparáveis em uma simulação que mimetizou condições de indivíduos in
vivo.
MORGAN & KEAVENY (2001) procuraram comparar a resistência de ossos
esponjosos de diferentes partes de humanos. Os testes realizados foram de resistência
compressiva e força tênsil. Para tanto foram coletados corpos vertebrais, tíbias proximais,
trocanteres maiores e colos femorais provenientes de 61 indivíduos com idade média de 67
anos. Como resultado observou-se que o osso trabecular do trocanter maior é menos resistente
do que o colo femoral no que diz respeito ao quesito compressão. Comparando o trocanter
com corpo vertebral o resultado foi que o último foi mais resistente a tensão, enquanto que o
primeiro suportou maior carga compressiva. O colo femoral demonstrou ser o mais resistente
de todos em relação a compressão enquanto que a vértebra foi o mesmo para a tensão. Como
conclusão foi inferido que a resistência varia entre sítios ósseos mas não entre mesmos sítios.
KRISCHAK et al. (2003) avaliaram a resistência de cabeças de fêmures e a densidade
mineral óssea das mesmas antes de serem substituídas por próteses de titânio. Após um
período de sete anos os autores compararam como se encontrava a osteointegração com o
implante. As cabeças femorais foram submetidas a esforço compressivo destrutivo. Foi
possível concluir que a resistência é um importante fator para prever se haverá afrouxamento
33
do implante enquanto que a densidade mineral não demonstrou ser um parâmetro de grau
confiável.
As fraturas ósseas são muito sensíveis aos diferentes movimentos as quais são
submetidas durante as primeiras fases de consolidação, no que diz respeito ao tipo de
diferenciação tecidual. A compressão axial é considerada um importante adjuvante para a
união dos segmentos ósseos e EPARI et al. (2006) compararam este efeito com os vetores
torsionais que agem sobre fraturas. Foram avaliadas as pressões que existem entre as
interfaces ósseas e também o fluxo de fluídos na fase inicial de formação de calo ósseo, além
da categoria de formação tecidual. Como resultado o movimento torsional apresentou um
ambiente de fratura interfragmentar com menor fluxo de líquidos e menor resistência,
enquanto que moderada compressão axial obteve melhores resultados. A somatória dos dois
efeitos não apresentou nenhuma potencialização de efeitos.
Metástases ósseas apresentam um grau significativo de relação com fraturas
patológicas da articulação coxo-femural em seres humanos. KANEKO et al. (2004) visaram
avaliar o comportamento de ossos trabeculares afetados por metástases mediante tomografia
computadorizada. Foram obtidos 16 fêmures provenientes de indivíduos que vieram a óbito
devido a neoplasias (câncer de próstata, pulmão e glândula mamária) e quatro em que não
ocorreu nenhuma enfermidade cancerosa. Os ossos foram coletados de porções esponjosas
dos fêmures e submetidos a esforço compressivo. Como resultado final foi possível verificar
que a relação entre os achados em tomografia computadorizada não são compatíveis com os
resultados encontrados em testes de resistência. Desse modo, a resistência biomecânica
continua sendo um modelo mais fiel a esse tipo de avaliação.
CONNOLLY et al. (1989) relataram que a resistência tênsil é proporcional ao tempo
de cura. A possibilidade de precocidade de preenchimento de falha na consolidação possibilita
sustentação e estabilização ósseas, favorecendo a reparação e com isso diminuindo o tempo
total de restabelecimento do paciente.
BINI et al. (2002) realizaram ensaios visando avaliar a resistência em cabeças
femorais provenientes de seres humanos. Os parâmetros utilizados para avaliar o grau de
resistência dessas estas estruturas foram os testes envolvendo os esforços compressivos e
tênseis porque os mesmos demonstram apresentar maior confiabilidade em relação aos testes
de arqueamento. Foi possível concluir que os ossos foram mais resistentes aos esforços tênsis
do que aos esforços compressivos.
RAMASAMY & AKKUS (2006) visaram analisar variações de propriedades
micromecânicas em diferentes porções femorais de ratos. Os autores inferiram, através de
34
estudos anteriores, que a porção anterior femoral de ratos seria mais resistente que a posterior
no quesito tensão enquanto que a posterior seria mais resistente a compressão. Foi verificado
que a deposição de minerais não variou conforme o local de estudo, porém a orientação das
fibras colágenas demonstrou apresentar uma configuração mais homogenia na porção anterior
em comparação a porção posterior. Dessa forma foi possível concluir que a orientação das
fibras presta relevante importância para o mecanismo das fraturas.
Placas de crescimento epifisárias apresentam uma grande variação em sua composição
e morfologia. A carga mecânica pode alterar o crescimento de ossos longos conforme agir
sobre estas estruturas cartilaginosas. VILLEMURE et al. (2006) avaliaram o efeito da
compressão axial sobre o disco de crescimento da tíbia proximal de ratos comparando
microscopicamente com os efeitos sobre condrócitos. Foram avaliadas as zonas de
condrócitos em repouso, hipertróficos e proliferativos. Como resultado evidenciou-se que,
mesmo comparando as três regiões submetidas a mesma carga compressiva, a variação de
crescimento ósseo é muito grande.
WACHTER et al. (2001) avaliaram a porosidade e a densidade mineral de ossos
corticais através de tomografias computadorizadas visando comparar o grau de resistência
dessas estruturas. Foram utilizados segmentos ósseos provenientes de diáfises femorais de 24
pacientes humanos sendo que todos foram submetidos a implantação de prótese da articulação
desse osso com o acetábulo. O tamanho da amostra foi padronizado em 4,5mm. Os resultados
demonstraram que não existem correlações entre porosidade e elasticidade. Entretanto, ficou
evidenciada que as propriedades biomecânicas apresentam estreita relação com a densidade
mineral. Este estudo pode ser considerado um eficiente meio de prever a resistência femoral
de uma forma não destrutiva, importante para prever qual procedimento ortopédico será mais
indicado para o tipo de osso em questão.
MEAKIN et al. (2001) avaliaram biomecanicamente a substituição do núcleo pulposo
do disco intervertebral de ovinos por material compatível, porém sintético. A razão para a
realização de tal estudo é que, quando o material central discal é removido, o anel fibroso
torna-se muito mais sensível a lesões originadas por esforço compressivo devido a precoce
degeneração do mesmo. Foram utilizados 33 discos intervertebrais que foram submetidos ao
congelamento. Em um grupo o núcleo pulposo foi somente extraído, enquanto que no outro,
além de ser submetido a esse procedimento, também recebeu a substituição por material
polimérico e os dois foram comprimidos mediante ensaio axial. Ficou demonstrado que a
reposição do núcleo pulposo por material sintético previne a degeneração da porção fibrosa
dessas estruturas.
35
O tipo de união vertebral mais realizado em medicina humana é a artrodese
dorsolateral dos processos transversos da coluna lombar, devido a presença de abundante
suprimento sanguíneo proveniente da musculatura adjacente e a fatores biomecânicos, como a
ausência de excessiva carga compressiva sobre o enxerto (MUSCHLER & LANE, 1992;
FEIGHAN et al., 1995).
BRIANZA et al. (2006) realizaram um ensaio não destrutivo em porções distais de
rádios e ulnas caninos visando comparar o grau de resistência proporcional desses ossos em
cães de porte pequeno, médio e grande. O objetivo desse estudo foi avaliar porque as lesões
nessas porções ósseas ocorrem devido a diferentes causas conforme o porte do animal. Foi
verificado que raças de pequeno porte são mais susceptíveis a descontinuidade óssea por
apresentarem proporcionalmente um canal medular menor.
HADDOCK et al. (2004) realizaram um estudo visando analisar se a arquitetura e
densidade da porção esponjosa de corpos vertebrais em humanos apresentavam influência no
percentual de fraturas dos mesmos. Os autores basearam-se em um estudo realizado em
porções trabeculares de tíbias provenientes de bovinos. Foram utilizadas 35 vértebras
provenientes de nove doadores humanos com uma idade média de 74 anos e submetidas
biomecanicamente a esforço compressivo. Como a estrutura e a densidade esponjosa óssea
bovina é muito diferente da humana, ficou evidenciado que os mecanismos de fratura dessas
estruturas se deve a constituição ultraestrutural dos mesmos.
ROBINSON et al. (2005) avaliaram de forma ex vivo a resistência de aloenxertos
usados em próteses de quadril. Para tanto foram utilizados ossos sem adição de cemento ósseo
e ossos com diferentes proporções de cemento. O estudo constou de 14 ossos e a carga a qual
os ossos foram submetidos foi de 750, 1500 e 2250 N. O tipo de ensaio biomecânico realizado
foi através de esforço compressivo axial no interior de um tubo de alumínio. Foi possível
concluir que a introdução de moderada quantidade de cemento apresenta um comportamento
similar ao de uma grande quantidade e que ossos sem este material são pouco resistentes para
a utilização in vivo.
Microfraturas representam importante fator para a perda de resistência óssea, porém
não se sabe qual a relação com o tipo de vetor originário. REILLY & CURREY (2000)
procuraram estudar os efeitos de microfraturas sobre a resistência ao impacto em tíbias e
úmeros bovinos. Foram utilizados animais com idade oscilando de um a um ano e seis meses
e os danos causados puderam ser evidenciados mediante o estudo microscópico, associados à
fluoresceína, após os ensaios biomecânicos realizados. Os autores submeteram os ossos a
forças de arqueamento de 27%, fazendo assim com que ocorresse os referidos microdanos.
36
Posteriormente os espécimes foram submetidos a impacto destrutivo. O achado foi de que os
ossos submetidos previamente ao esforço de arqueamento apresentaram sua resistência
severamente reduzida na superfície onde houve compressão enquanto que onde houve tensão
a redução não apresentou grau relevante.
REMIGER et al. (1997) procuraram avaliar a resistência ao esforço rotacional entre
tíbias que apresentaram fixação de placas através de parafusos atravessando somente uma
cortical óssea com outros que atingiram ambas. Foram utilizados três grupos. No primeiro
grupo foram comparados osso íntegro com perfurações unicorticais, no segundo houve o
mesmo tipo de comparação mas com orifícios bicorticais e no terceiro foi comparado o grupo
unicortical com o bicortical. Os achados revelaram que houve um decréscimo na resistência
de respectivamente 21,6, 31,4 e 26,7% em detrimento do segundo elemento de cada grupo. A
conclusão foi de que tíbias com orifícios unicorticais são menos resistentes a rotação do que
ossos intactos, porém apresentaram uma significante maior resistência do que os que tiveram
as duas corticais perfuradas.
COOK et al. (2006) avaliaram de forma não destrutiva a resistência da cabeça de
fêmures através de ultra-som periférico e também de modulo de compressão para avaliar as
propriedades compressivas e o risco de fratura dessa estrutura. Foram utilizadas amostras
provenientes de 20 indivíduos que apresentaram fratura nesta região. O resultado demonstrou
que existe uma grande correlação entre o ensaio compressivo e o ultra-som para a análise da
integridade das cabeças femorais, porém o mesmo não acontece com outros ossos tais como
rádio, tíbia, falanges e calcâneo. Também foi concluído que o estudo foi importante não
somente à analise da densidade óssea mas também evidenciou os mecanismos de fratura.
Microfissuras produzem importante efeito deletério sobre a qualidade óssea e
aumentam de forma significativa o risco de fraturas. MULLER et al. (2006) visaram comparar
o uso de ultra-som linear, que é um método não destrutivo, com a compressão mecânica em
diáfises femorais humanas afetadas por esse tipo de dano. O estudo avaliou qual o grau de
correlação possível entre os dois métodos para que não seja necessária a destruição do osso.
Os autores comprovaram estatisticamente que o método ecográfico pode ser utilizado de
forma confiável para substituir o teste compressivo.
CLARO NETO (1997) realizou a reconstrução de segmentos diafisários utilizando a
poliureatana de mamona associada ao enxerto e comentou que a adição de carbonato de cálcio
ao implante aumentou a resistência e a porosidade, favorecendo sua indicação como material
de implantação óssea.
37
NETO et al. (1999) realizaram um estudo utilizando diferentes segmentos de porções
de tíbia e fêmures. Um orifício central foi confeccionado em cada porção óssea e então
acoplado a um parafuso metálico, que foi inserido nas duas porções corticais. Os espécimes
foram submetidos a um teste biomecânico de extração que revelou que a resistência da
cavidade proporcionada pela espiral dos parafusos depende significativamente do local em
que o mesmo é inserido. Além disso, o osso diafisário é qualitativamente e quantitativamente
mais resistente do que o osso metafisário.
RABELO (2003) comentou que várias técnicas cirúrgicas utilizando implantes têm
sido empregadas com o intuito de criar alternativas para a reconstituição da parede abdominal
ventral em bovinos. O autor avaliou a viabilidade do centro tendíneo difragmático homólogo,
conservado em glicerina a 98% e no glutaraldeído a 4% e mantidos por 30 dias, na
hernioplastia umbilical de bovinos. Inicialmente, realizou-se testes físicos de tração e
alongamento até ruptura, em dez tiras com 5 a 6 mm de largura, do exemplar in natura e dos
respectivos exemplares conservados em glicerina a 98% e glutaraldeído a 4% para a avaliação
da influência de ambos os conservantes sobre o tecido biológico a ser implantado. Os testes
físicos realizados mostraram que em sete amostras conservadas em glutaraldeído a 4%
suportaram maior força de tensão, quando comparadas com os respectivos exemplares in
natura e conservados em glicerina a 98%. Duas amostras apresentaram comportamento
semelhante quanto ao ponto de rompimento, para ambos os conservantes. Apenas em uma
amostra, verificou-se que o material in natura, apresentou um ponto de rompimento superior
às amostras conservadas.
REYES (1999) objetivou comparar experimentalmente o grau de cicatrização e a
resistência à tração axial livre, obtidos no tendão das unidades músculo-tendíneas do extensor
ulnar do carpo de cães, submetidos à tenectomia parcial e tenoplastia substitutiva com
pericárdio de eqüino preservado em glicerina 98%, através de análise histológica e testes
físicos de resistência à tração. Foram utilizados 42 cães, divididos em oito grupos
experimentais e avaliados em diferentes períodos. Aos 168 dias de pós-operatório observou-se
completa e adequada reparação cicatricial, com matriz extracelular densamente colagenizada
que substituiu totalmente o pericárdio, quando as unidades músculo-tendíneas mostraram,
através de análise dos alongamentos (mm) em função das cargas (N) aplicadas no limite de
resistência máxima, o seguinte comportamento: necessitaram de carga 175.70+47.67 N e
174,13+33.73 N para produzir alongamentos de 9.32+1.96 mm e 9.88+1.98 mm,
respectivamente. As respostas obtidas, tanto quanto a resistência à tração até ruptura nos
permitem concluir que o pericárdio serviu de arcabouço para orientação e desenvolvimento de
38
novo tecido de reparação de tipo modelado semelhante ao tendão submetido à tenectomia
parcial.
2.3 Glicerina e mel como conservantes
2.3.1 Glicerina
A glicerina faz parte dos lipídios, compostos de origem biológica que se dissolvem em
solventes apolares como o clorofórmio ou o éter dietílico. Somente pequena parcela da fração
total de lipídios extraídos por solvente apolar é constituída de ácidos carboxílicos de cadeia
longa. A maior parte desses ácidos orgânicos encontra-se na forma de ésteres de glicerol
(SOLOMONS, 1996). Segundo FERREIRA (1999), a glicerina, sinônimo glicerol, é uma
substância orgânica, triálcool, que se une aos ácidos graxos para formar as gorduras; líquido
incolor, higroscópico, espesso e xaroposo; funde a 17°C e entra em ebulição a 290°C. Entre
os meios químicos de conservação de tecidos, a glicerina tem oferecido bons resultados
conservando a integridade celular mesmo que provocando a desidratação tecidual
(OKAMOTO et al., 2000).
A glicerina tem sido utilizada com sucesso na conservação de ossos, tal como
realizaram DEL CARLO et al. (1999) e ZILIOTTO et al. (2003) na reconstrução de falhas
ósseas em membros de caninos.
Por ser um poderoso anti-séptico, além de atuar como agente fixador e desidratante, a
glicerina é indicada para a conservação não somente de ossos, mas também de diferentes
materiais biológicos (PINTO JÚNIOR et al., 1996).
PIGOSSI et al. (1971) comentaram que, em alguns casos de cirurgias reconstrutivas,
se torna necessária a utilização de enxertos e os materiais devem ser conservados para
preservar sua viabilidade para que ocorra a reação biológica desejada de reparação. No
referido trabalho foi verificado um efeito positivo da glicerina no efeito de manter o material
biológico em condições aptas à substituição tecidual.
Diversas técnicas têm sido desenvolvidas no intuito de se tornar possível a
conservação dos tecidos ósseos por longos períodos de tempo. Dentre estas, a conservação em
glicerina tem merecido destaque pois, além de ser um método acessível economicamente, não
é necessário empregar a autoclavagem e tampouco o congelamento, técnicas que causam
danos ao tecido ósseo, e prejudicam a formação de calo ósseo no pós-cirúrgico; além disso,
não foi observada diferença considerável quanto ao crescimento de microorganismos na
39
glicerina a 98% autoclavada e in natura, num período igual ou menor a 24 meses (ROE et al.,
1988), tampouco rejeição do organismo ao meio conservante na evolução pós-operatória.
CAVASSANI et al. (2001) avaliaram a função osteoindutora atribuída aos fragmentos
ósseos conservados em glicerina a 98%, por 30 dias, à temperatura ambiente. Esses
fragmentos foram obtidos de fêmures e tíbias de ratos doadores. O implante desta matriz
óssea foi realizado no tecido subcutâneo e intramuscular de ratos receptores. A análise
histopatológica foi realizada no 30º, 60º e 90º dia após o implante. Aos 30 dias, notou-se
resposta osteogênica positiva, inclusive com mielogênese, que aos 60 e 90 dias foram
efetivamente concluídas. Nesses períodos, observou-se a presença de fragmentos de matriz
óssea calcificada, sugerindo que fossem tecido ósseo neoformado a partir da atividade
osteoblástica observada aos 30 dias. Diante desses resultados, concluiu-se que a glicerina é
um bom meio para conservação de fragmentos ósseos para uso em enxertos, uma vez que a
função osteoindutora foi preservada.
As intervenções cirúrgicas oncológicas, devido às suas ressecções amplas,
freqüentemente tornam necessário o uso de osso para transplantação. O transplante autólogo
poderia ser substituído por osso conservado, o que condiciona o cirurgião a previamente
armazenar o osso preservado e transplantável, sendo a glicerina pura um bom método de
manutenção deste tecido. Porém, não se sabia ainda se era possível manter durante longo
período de tempo os ossos conservados na glicerina, e, além disso, não se sabiam quais
microorganismos eventualmente poderiam desenvolver-se nas amostras armazenadas por
longos períodos de tempo (PINTO JÚNIOR, 1990; 1995). GIOSO et al. (2002) realizaram um
estudo onde ossos caninos foram mantidos em glicerina a 98% por um período de até nove
anos e não houve crescimento bacteriano significativo.
DEL CARLO et al. (1999), utilizando aloimplantes ósseos, observaram que de seis
métodos de conservação estudados a glicerina a 98% em temperatura ambiente e o método de
congelamento foram os que proporcionaram melhores resultados em caninos.
ZILIOTTO et al. (2003) utilizaram implante ósseo cortical alógeno conservado em
glicerina visando reconstituir membros pélvicos de caninos afetados por osteossarcoma.
Foram utilizadas placas compressivas para a osteossíntese e para aumentar a resistência do
material implantado foi introduzido no canal medular poliuretana de mamona, pois a glicerina
exerce efeito deletério sobre a integridade óssea. Como resultado foi verificado que a
glicerina foi eficiente como método de conservação, pois não houve sinais de infecção e nem
rejeição, além de haver adequado grau de osteoindução e osteocondução.
40
CORONADO et al. (2000) testaram a capacidade viricida do óxido de etileno e da
glicerina em implantes ósseos alógenos de felinos. O banco era composto por ossos de
animais comprovadamente contaminados por retrovírus felino. Foi concluído que houve
adequada osteointegração em ambos os grupos, porém a glicerina não foi eficiente no quesito
de evitar a infecção, ao contrário do óxido de etileno.
PAULO (1997) realizou um experimento onde foram avaliados os resultados da
aplicação da membrana amniótica de eqüinos, conservada em glicerina a 98% e em ácido
acético a 0,25% sob congelamento, sobre feridas experimentais produzidas no dorso de cães.
Foram provocadas três feridas circulares em cada animal e elas foram observadas durante 20
dias. Nas culturas obtidas antes do processamento das membranas amnióticas houve o
crescimento de Pseudomonas spp., Enterobacter agglomerans e Streptococcus spp., o que não
foi observado nas amostras coletadas após a conservação. As bactérias mais freqüentemente
isoladas das secreções purulentas das feridas foram Staphylococcus aureus e Streptococcus
spp.. Baseado nos resultados obtidos concluiu-se que a membrana amniótica eqüina,
conservada em glicerina a 98% e em ácido acético a 0,25%, não promove a aceleração da
cicatrização mas impede a retração das bordas das feridas cutâneas experimentais no cão e
não impede o desenvolvimento de microorganismos nestas feridas. Concluiu-se ainda que
fatores climáticos provavelmente influam na viabilidade das membranas conservadas.
PIGOSSI et al. (1971) evidenciaram que a glicerina reduz a antigenicidade de
membranas biológicas e recomendaram o armazenamento do material por um período não
inferior a 30 dias. Também foi verificada a ação bactericida da glicerina sobre bactérias como
Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.
KRAUSPENHAR et al. (2002) testaram os efeitos in vitro da glicerina sobre tendões
inoculados com bactérias gram negativas e gram positivas e verificaram 100% de eficácia,
porém são necessários ao menos 30 dias para a completa esterilização. Foi também observado
que bactérias gram positivas são mais resistentes à ação do conservante.
PINTO JUNIOR et al. (1996) relataram que em estudo microbiológico de glicerina
onde não houve nenhum tipo de processamento ou glicerina autoclavada como meio de
conservação não houve crescimento bacteriano e fúngico.
Essa capacidade antimicrobiana se deve ao fato de que a glicerina a 98% é um agente
fixador e desidratante de atuação rápida, agindo como um poderoso antisséptico
(ALVARENGA, 1992).
FRANCISCO (2001) avaliou aloenxerto de cartilagem auricular de cães, conservado
em glicerina a 98%, no reparo de defeito palatino produzido experimentalmente em cães.
41
Foram empregados 15 cães adultos, sem raça definida, divididos aleatoriamente em cinco
grupos de três animais cada, e submetidos a procedimento cirúrgico para criação de defeito no
palato secundário e posterior reparo com aloenxerto de cartilagem auricular. As observações
clínicas e macroscópicas realizadas durante o período experimental, demonstraram que não
houve deiscência de sutura, edema ou necrose de tecidos. A avaliação microbiológica revelou
ser negativa para bactérias. Os resultados obtidos permitem concluir que o aloenxerto de
cartilagem auricular pode ser utilizado para reparação de defeitos palatinos, pois propicia bom
isolamento entre cavidade nasal e oral.
SAMPAIO (2004) utilizou membrana amniótica xenógena a fresco e conservada em
glicerina a 98% no recobrimento de úlceras corneanas experimentais. Para o desenvolvimento
da metodologia proposta foram utilizados 70 coelhos. A avaliação clínica revelou que a
membrana amniótica xenógena conservada em glicerina, apesar de não apresentar nenhum
agente contaminante, estimulou uma resposta inflamatória aguda maior que a membrana
aplicada a fresco. O autor concluiu que a epitelização do defeito foi mais rápida nas córneas
que receberam o enxerto de membrana a fresco, indicando que o método conservante não foi
eficiente para reduzir a antigenicidade.
OLIVEIRA (2002), em um estudo experimental, propôs como alternativa do
tratamento cirúrgico de defeitos traqueais em eqüinos, o emprego de pericárdio homólogo
preservado em glicerina a 98% mantido à temperatura ambiente. Foram utilizados doze
eqüinos adultos, machos e fêmeas e 42 do período pós-operatório. A boa evolução clínica dos
animais associada aos achados laboratoriais de que a glicerina agiu como bom
descontaminante, permitiu concluir ser a traqueoplastia em eqüinos, utilizando pericárdio
homólogo preservado em glicerina a 98%, uma boa alternativa ao tratamento de lesões
traqueais, obtendo-se cura por primeira intenção.
RABELO (2003) utilizou centro frênico homólogo, conservado em glicerina a 98% e
no glutaraldeído a 4% e mantidos por 30 dias para a correção de hérnias umbilicais em 10
bovinos. Foi avaliada a atividade anti-séptica dos conservantes, por meio de exames
microbiológicos de fragmentos colhidos do material in natura e dos respectivos exemplares
submetidos à conservação. Observou-se crescimento bacteriano apenas em quatro amostras no
material in natura. Os mesmos exames realizados em amostras conservadas não revelaram
nenhum crescimento. Com base nestes resultados, conclui-se que o centro tendíneo
diafragmático de bovino conservado em glicerina a 98% e no glutaraldeído a 4% demonstrou
ser uma opção eficiente na correção de hérnias umbilicais em bovinos jovens.
42
LUCCI (1998) comentou que a esclera humana é freqüentemente usada em cirurgias
oftalmológicas e deve ser preservada em desinfetante que evite sua contaminação e que a
descontamine. O objetivo de seu estudo foi determinar a eficácia das substancias: glicerina,
álcool absoluto e cloreto de benzalcônio (1:5000) como desinfetantes da esclera humana. Seis
escleras humanas foram trepanadas em 174 discos de esclera de 6 mm de diâmetro.
Fragmentos de esclera frescos, provenientes de cada globo ocular, foram submetidos à cultura
para determinar a existência de um microrganismo. Os discos de esclera foram divididos em
três grupos. Foi estudada a ação dos três meios de desinfecção para descontaminar a esclera
humana: glicerina, álcool absoluto e cloreto de benzalcônio. Para controle da viabilidade dos
microrganismos, um grupo de discos de esclera contaminados foi imerso em meio de cultura
TSB e submetido à cultura nos mesmos intervalos de tempo dos discos de esclera imersos nos
meios desinfetantes. Dois discos de esclera foram removidos de cada tubo nos dias um, dois,
três, quatro, sete, 10 e 14 deste estudo. Um disco escleral foi macerado com homogenizador
de tecidos e semeado em ágar sangue, utilizando-se alça calibrada 0,001 ml, e o outro foi
semeado inteiro. As placas de ágar sangue foram incubadas a 37ºC e colônias bacterianas
foram contadas com 24 e 48 horas. Staphylococcus aureus foi recuperado da esclera
preservada em glicerina por até quatro dias; Pseudomonas aeruginosa foi recuperada até dois
dias e Bacillus cereus foi recuperado durante os 14 dias deste estudo. Todas as três bactérias
foram recuperadas nos dias de esclera que permaneceram imersos no TSB durante todo o
estudo. O cloreto de benzalcônio demonstrou ser melhor desinfetante in vitro que a glicerina.
Entretanto, o autor comentou que estudos in vivo são necessários para provar a utilidade do
cloreto de benzalcônio como desinfetante de esclera.
FARIA (2003) utilizou membranas biológicas conservadas em glicerina a 98% ou mel
envolvendo lesões ósseas femorais. Foram realizados exames bacteriológicos semeados em
meio Agar Sangue Ovino 5% e Agar Mac Conkey incubados a 37ºC por 48 horas, sendo
todos os resultados negativos. Nas amostras onde o meio foi enriquecido com Thioglicolato e
BHI (infusão de cérebro e coração) e incubados a 37ºC por 48 horas somente o meio glicerina
não desenvolveu Bacillus spp..
COSTA (1996) realizou um estudo utilizando aloenxerto ósseo cortical conservado em
glicerina 98% e fixado com placas e parafusos de aço inoxidável 304 para a reconstrução de
falha óssea (quatro centímetros) experimental em cães. As amostras foram coletadas sem
preocupação com a contaminação. Foi concluído que os ossos não precisavam ser colhidos
sob cuidados assépticos, uma vez que a glicerina apresentou ação bactericida e fungicida.
43
Além disso, a glicerina mostrou-se eficiente como meio de conservação de ossos à
temperatura ambiente, mantendo o material livre de contaminação durante a estocagem.
2.3.2 Mel como agente conservante e terapêutico
O mel tem sido utilizado no tratamento de enfermidades em seres vivos há pelo menos
4000 anos, conforme evidências encontradas no Egito (GREENWOOD, 1993). Nessa época
já eram conhecidos os benefícios desse substrato no processo de reparação de feridas,
promovendo absorção de edema, limpeza de contaminação, promoção do crescimento de
tecido de granulação e diminuição de odores desagradáveis (POSTMES et al., 1993).
Nos tempos pré-históricos e primitivos o referido substrato apícola foi utilizado como
meio conservante de cadáveres. No antigo Egito e na Grécia o mel foi muito usado em
embalsamamento. Quando Alexandre, o Grande, veio à óbito durante sua conquista ao
oriente, seu corpo foi conduzido em um caixão dourado imerso em mel até a Macedônia, sua
terra natal (IOIRISH, 1981; CRANE, 1983). Herodes I, Rei da Judéia, que executou sua
esposa Mariamne, manteve seu corpo preservado em mel por sete anos e, ainda no mundo
antigo, trechos da Odisséia comentam que o corpo de Aquiles foi embalsamado em uma
profusão de ungüentos e mel doce (CRANE, 1983).
O mel tem sido utilizado desde a antigüidade como substância capaz de conservar
tecidos. IOIRISH (1981) comentou que tribos indígenas do Ceilão, atual Sry Lanka, após
coletarem a carne de animais e a impregnarem com mel, mantinham as mesmas em troncos de
árvores à cerca de um metro do solo e o alimento mantinha-se apto ao consumo por um
período de até um ano.
Além das propriedades nutricionais, a utilização do mel na medicina popular se deve
também às suas propriedades farmacológicas. Dentre estas propriedades, a atividade
antimicrobiana tem despertado interesse entre os pesquisadores devido ao seu potencial de
aplicabilidade em casos clínicos (EFEM, 1988; ZULMA & LULAT, 1989; MOLAN, 1992;
WILLIX et al., 1992; EFEM et al., 1992; EFEM, 1993; KROL, et al., 1993). PEREIRA et al.
(1995) comentaram também que o mel possui numerosas propriedades terapêuticas, tais como
poder antimicrobiano, antiinflamatório e efeito antipirético.
Propriedades cicatrizante (KUMAR et al., 1993) e antioxidante (OSZMIANSKI &
LEE, 1990) estão também relacionadas a este derivado apícola.
GONÇALVES et al. (2005) , comentaram que diversas propriedades medicinais, tais
como ação antimicrobiana, antifúngica, cicatrizante e antioxidante são popularmente relatadas
44
ao mel. Poucos estudos têm sido realizados sobre a atividade antimicrobiana do mel. Para tal
estudo foi empregado o método da difusão em ágar, utilizando-se discos de 6 mm de diâmetro
em presença de diferentes microorganismos, obtidos todos de focos de infecções clínicas. Os
testes indicaram resitência em: Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Proteus
mirabilis, Staphilococcus aureus, Streptococcus alfa-hemolítico; e indicaram sensibilidade
em: Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus Pyogenes bem
como Staphylococcus spp. coagulase. Vinte e três antibióticos comerciais distintos foram
também avaliados no presente estudo. Os resultados obtidos revelaram um excelente potencial
terapêutico deste produto apícola.
SUBRAHMANYAN (1993) utilizou o mel como conservante de pele para implante
em 28 humanos acometidos por queimaduras ou úlceras. Os implantes foram acondicionados
em frascos com mel e mantidos à temperatura de 4°C e os resultados obtidos ao final do
estudo foram satisfatórios, ainda que três pacientes necessitassem nova intervenção para que
houvesse adesão da pele implantada.
Comparando o tratamento através de antibióticos convencionais ou mel em gangrena
do tecido escrotal em humanos, EFEM (1993) verificou que o segundo método demonstrou
ser bem mais eficaz, pois os pacientes tratados com mel não apresentaram mortalidade,
enquanto que os tratados com amoxicilina e metronidazole apresentaram um índice de
mortalidade de 15%.
FASIKA et al. (1996) utilizaram enxertos na cavidade oral de humanos contendo gel
impregnado com mel e obtiveram bons resultados no que diz respeito à permanência do
material implantado ao leito receptor. Salientaram ainda que esse substrato possui as
vantagens de ser obtido com facilidade e apresenta custo acessível.
Várias substâncias tais como açúcares, ácidos orgânicos e diversos elementos
químicos (WHITE, 1975) foram identificadas no mel. Algumas enzimas secretadas por
glândulas do aparelho digestório das abelhas são introduzidas no néctar já a partir de sua
coleta, tendo como exemplo a glicose oxidase, que converte a glicose em glicolactona,
produzindo também o peróxido de hidrogênio. Este último é considerado por muitos autores
como sendo o responsável pela atividade antimicrobiana constatada no mel (MENDES &
COELHO, 1983). Também foram encontradas vitaminas e alguns flavonóides com ação
antimicrobiana (SABATIER et al., 1992).
A gangrena de Fournier é uma afecção que acomete seres humanos na região perineal,
genital ou até mesmo na parede abdominal. THAMAZ et al. (2006), em um estudo com 33
pacientes humanos, compararam o tratamento de tal enfermidade utilizando antibióticos
45
isoladamente ou antibióticos associados ao mel. Os autores concluíram que a adição de mel ao
tratamento desta enfermidade diminuiu de forma significativa os índices de morbidade e
mortalidade.
CASTRO (2004) utilizou 30 coelhas da raça Nova Zelândia para comparar o uso
tópico do mel, da oxitetraciclina e da hidrocortisona, combinadas e isoladas, na reparação de
feridas cutâneas por segunda intenção. Os animais foram divididos aleatoriamente em seis
grupos. Realizaram-se seis feridas com saca bocado (Punch) de 8mm em cada animal, sendo
três de cada lado da região dorso caudal ao osso coxal, com espaçamento entre as lesões de
quatro centímetros. Os grupos foram constituídos na seguinte ordem: grupo T - grupo
controle; grupo C - hidrocortisona; grupo V - vaselina (veículo); grupo M - mel; grupo Tco -
Terracortril; grupo Oxi - oxitetraciclina. Os fragmentos de pele contendo as feridas foram
colhidos com uma incisão elíptica na seguinte ordem: no segundo, quinto, nono, 15º, 21º e 30º
dia pós-cirúrgico. As avaliações, clínicas e histopatológicas revelaram que os animais tratados
com o mel apresentaram menor tamanho das feridas. Nos animais tratados com hidrocortisona
e Terracortril foi visualizado retardo na cicatrização das feridas.
Baseado no fato de que o mel possui numerosos componentes e propriedades
curativas, foram estudadas as suas características antineoplásicas e verificou-se a ação
inibitória do crescimento de carcinomas cutâneos em ratos. Isso foi atribuído ao fato de
ocorrer diminuição da síntese de DNA, reduzindo assim o crescimento da massa tumoral.
(MITAMURA et al., 1996).
GRIBEL & PASHISNKII (1990), estudando as propriedades antitumorais do mel em
ratos, verificaram que esse componente apresenta moderada ação antineoplásica e grande
atividade antimetastática. Outra contribuição foi a exacerbação do efeito de certas drogas
usadas nesse tipo de enfermidade. O 5-fluoruracil e a ciclofosfamida tiveram seus efeitos
potencializados quando usados em conjunto com o mel.
Tecidos biológicos têm sido conservados em mel para posterior implantação, tais
como vasos sangüíneos (PIPIA, 1968), pele (GUPTA, 1977) e córneas (ABRAMOV &
MARKICHEVA, 1983; MOHAN et al., 1996).
ABRAMOV & MARKICHEVA (1983) analisaram os resultados da ceratoplastia
lamelar usando córneas conservadas em mel. A intervenção com propósitos curativos foi
realizada em 43 humanos acometidos de queimaduras oculares, úlceras corneanas e ceratites.
Os resultados obtidos foram satisfatórios, sendo que na maioria dos casos a córnea tornou-se
transparente. Os autores recomendaram esse material para o uso em pacientes clínicos.
46
Diversos autores avaliaram enxertos ósseos e mel, tais como CAHPMAN & VILLAR
(1992) e MOLLAN & ALLEN (1996).
POSTMES et al. (1993) comentaram que o mel não pode ser tratado como substância
estéril, sendo necessária a análise microbiológica antes de ser utilizado com propósitos
medicinais. SUBRAHMANYAM (1993) utilizou mel resfriado a 4°C para o armazenamento
de enxertos de pele, porém realizou exames laboratoriais que confirmaram que esse composto
se encontrava livre de microorganismos. POSTMES et al. (1993) ainda citaram como
alternativa o uso de irradiação para promover a esterilização de mel contaminado.
GREENWOOD (1993) e POSTMES (1993) comentaram que as propriedades
antibacterianas do açúcar e do mel são devidas a produção de um grande nível de
osmolaridade local, dificultando a proliferação microbiana. Entretanto, no caso do mel, a
atividade antimicrobiana pode ser atribuída também a um composto conhecido como peróxido
de hidrogênio, produto final de uma reação enzimática entre a glicose oxidase da abelha com
a glicose encontrada diluída no mel.
BARIZON et al. (1999) comprovaram o efeito antimicrobiano do mel através de testes
utilizando diluição inibitória máxima e comentaram que esse composto possui ação sobre
bactérias gram-positivas e gram-negativas. Se houver o acréscimo de própolis ao mel obtém-
se uma solução que também apresentará atividade sobre fungos na forma de levedura.
MATHEWS & BINNINGTON (2002) descreveram que o mel possui propriedades
bactericidas que são atribuídas não somente a sua alta osmolaridade, mas também por possuir
peróxido de hidrogênio, ácido fórmico e por sua acidez, além de conter diversas outras
substâncias em sua constituição.
VARDI et al. (1998) citaram que o mel é constituído por 40% de glicose, 40% de
frutose e 20% de água, com presença de ácidos orgânicos, vitaminas, minerais, enzimas e
apresenta em média um pH de 3,6.
Quando produzido pelas abelhas o mel é líquido, mas a cristalização, ou granulação, é
um processo natural, que acaba por acontecer com o decorrer do tempo. A temperatura de
armazenamento do mel tem grande influência na velocidade de cristalização, que também está
diretamente relacionada à sua composição, ou seja, à relação glicose/água. A cristalização do
mel consiste na separação da glicose, menos solúvel que a levulose, e na conseqüente
formação de hidratos de glicose, em formas sólidas. Em temperaturas de armazenamento de
10 a 18°C o mel cristaliza-se rapidamente. Em temperaturas superiores a 30°C a solidificação
ocorre muito lentamente. A consistência não afeta a composição do mel, entretanto
temperaturas superiores a 50°C podem destruir vitaminas e enzimas (ANGERAMI, 1991).
47
O mel tem demonstrado potente atividade antimicrobiana, efetiva frente a um amplo
espectro de bactérias, além de possuir propriedades antifúngicas. A atividade vista em
soluções diluídas de mel, claramente indica que a ação antibacteriana não se deve apenas a
alta concentração de açúcar contida no mel (MOLAN, 1992).
COOPER et al. (1999) verificaram que a concentração de mel para alcançar a
atividade de água necessária para inibir o crescimento de Staphylococcus aureus é de 22%.
Porém, em seu experimento, verificaram que o mel em concentrações variando entre 2 e 4%
já era capaz de inibir o crescimento desta bactéria, confirmando assim que o modo de ação do
mel não se dá exclusivamente pela sua osmolaridade.
PIGOSSI et al., (1971) comentaram que a glicerina não é capaz de impedir o
crescimento bacteriano de Clostridium botulinium e Clostridium perfringes. GREENWOOD
(1993) usou com bastante sucesso mel de abelhas em feridas e úlceras baseado no fato de que
essa substância possui propriedades inibitórias do crescimento bacteriano. POSTMES et al.
(1993) comprovaram, através de exames laboratoriais, semeando em ágar diluído com
diferentes concentrações de mel, que esse componente impediu o crescimento de
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus faecalis,
Clostridium botulinium e Clostridium perfringes. Foram utilizados méis oriundos de limeira,
árvores frutíferas, acácia e ainda houve um grupo controle onde não havia mel. O mel
proveniente de árvores frutíferas demonstrou ser o mais eficiente no quesito antimicrobiano.
Esta atividade antibacteriana adicional é devido à produção de peróxido de hidrogênio
pela ação das enzimas do mel, e também pelas substâncias antimicrobianas derivadas das
plantas que originaram o mel (MOLAN, 1992).
Abcessos piogênicos e feridas infectadas sendo tratados por aplicação tópica e diária
de mel sofrem regressão bastante rápida, através da eliminação de secreções, crescimento de
tecido de granulação e também através de uma melhor incorporação de enxertos de pele
quando esses forem utilizados, devido ao fato do mel ser capaz de inibir a ação de
microorganismos gram-positivos e gram-negativos (FAROUK et al., 1988).
BERGMAN et al., (1983) comentaram que o baixo pH do mel pode inibir o
crescimento bacteriano. EFEM et al. (1992) realizaram um estudo in vitro em que avaliaram o
espectro antibacteriano e antifúngico do mel. Para isso bactérias foram coletadas de abcessos
mamários, feridas cirúrgicas infectadas, gangrena e celulite, sendo depois isoladas e
incubadas em meios apropriados. Já as amostras de fungos foram obtidas de um laboratório de
micologia. As bactérias que foram mais sensíveis ao mel foram Streptococcus pyogenes,
Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Outras bactérias como Enterococcus faecalis,
48
Klebsiela pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus spp., Clostridium welchii e Clostridium
tetani também foram sensíveis ao mel, porém ele não inibiu o crescimento de Pseudomonas
aeruginosa e Clostridium oedematiens.
SMITH (1998) recomendou que as coletas devem ser realizadas sempre de forma
asséptica. AMENDOLA (2001) não coletou ossos de maneira asséptica e ao realizar exames
bacteriológicos do mel no qual segmentos ósseos haviam sido preservados, verificou que
houve o desenvolvimento de Bacillus spp., porém nenhum sinal clínico de infecção foi visto
quando o implante foi utilizado. FARIA (2003) utilizou membranas biológicas conservadas
em mel envolvendo lesões ósseas femorais. Foram realizados exames bacteriológicos
semeados em meio Agar Sangue Ovino 5% e Agar Mac Conkey incubados a 37ºC por 48
horas e foi verificado também o crescimento somente de Bacillus spp..
TURNBULL & KRAMER (1995) comentaram que Bacillus spp. são quase sempre
saprófitas e largamente distribuídos na natureza, particularmente no solo de onde são
espalhados pela poeira e água, e em materiais de origem animal e vegetal.
Para verificar que a ação antibacteriana do mel não se dá exclusivamente pela
propriedade hiperosmótica, EFEM et al. (1992) compararam a inoculação de material
infectado com o melado, substância de mesma osmolaridade. O resultado foi de que o melado
proporcionou apenas a inibição parcial de Streptococcus pyogenes.
POSTMES et al. (1993) comentaram que a adição de 5% de sangue de ovinos pode
eliminar a atividade antibacteriana do mel pela ação da enzima catalase. Porém, o que se sabe
é que a catalase vai atuar apenas sobre o peróxido de hidrogênio, inativando-o (COOPER et
al., 1999).
LEVY JÚNIOR (1997) comparou a atividade antomicrobiana entre méis e própolis
obtidos da abelha apis mellifera e de seis espécies de abelhas meliponinae. As amostras de
própolis analisadas, das diferentes espécies de abelhas, não apresentaram diferenças
significativas quanto à atividade antimicrobiana, no entanto, a numericamente mais ativa foi
obtida de apis mellifera. Os resultados demonstraram que o própolis possui maior atividade
antimicrobiana em presença de Staphylococcus aureus do que os méis.
BARIZON et al. (1999) comentaram que o mel é um substrato que possui ação
bactericida. COOPER et al. (1999) realizaram um estudo buscando avaliar a atividade
antibacteriana, através da concentração inibitória mínima (CIM), de dois tipos de mel. Para
isso utilizaram um mel produzido a partir das flores de Leptospermum scoparium e outro
originário de flores do campo. A bactéria utilizada para tal teste foi o Staphylococcus aureus,
obtido de feridas infectadas de pacientes atendidos em um hospital humano. Buscando testar
49
apenas a atividade antibacteriana advinda dos componentes fitoquímicos, os autores
submeteram o mel à ação da catalase, removendo assim qualquer quantidade de peróxido de
hidrogênio produzido pelo mel. A CIM de cada tipo de mel foi determinada pela técnica de
incorporação em Agar e a quantidade de Staphylococcus aureus inoculada foi de 1,25x10
8
unidades formadoras de colônias por mililitro. Houve, segundo os autores, uma surpreendente
similaridade entre os valores encontrados, sendo que a CIM do mel de Leptosmermum
scoparium variou entre 2 e 3% e a do mel obtido das flores do campo ficou entre 3 e 4%.
Esses valores foram muito menores que os 29% obtidos pelo açúcar para inibir o crescimento
do Staphylococcus aureus, mostrando que a ação do mel não se dá exclusivamente por sua
osmolaridade.
OLIVEIRA (2004) realizou um estudo que avaliou a qualidade bacteriológica e
micológica mediante análise de 40 amostras de mel sendo 20 coletadas assepticamente e 20
pelo próprio produtor que foram submetidas às determinações de coliformes fecais,
coliformes a 45ºC, Salmonella, esporos anaeróbios, bolores e leveduras. As amostras foram
coletadas de diversas cidades do Estado do Maranhão e sendo analisadas não apresentaram
bactérias do grupo coliforme e Salmonela. As contagens de bactérias anaeróbias esporuladas
estavam de acordo com a legislação americana. Quanto à contagem de bactérias mesófilas,
três (42,8 %) amostras coletadas pelo produtor e impróprias para consumo eram de mel da
cidade de Arari, das coletadas assepticamente, uma (14,8 %) era de Arari e uma (100 %) de
Peri Mirim. Na quantificação de bolores e leveduras, 13 (65 %) das amostras coletadas pelo
produtor, todas as de Anajatuba, São João Batista, São Luís e Vitória do Mearim e cinco (25
%) das amostras coletadas assepticamente as de Vitória do Mearim apresentaram contagens
mais elevadas para bolores e leveduras, portanto impróprias para consumo. Com a inclusão da
análise de mesófilos, segundo os padrões internacionais, há um aumento de 5 % nos índices
de rejeição nos dois grupos de amostras.
A composição química de méis e própolis provenientes de duas espécies de abelhas,
Apis mellifera e Tetragonisca angustula foi analisada, tendo sido encontrados alguns
compostos típicos de própolis brasileiras, tanto em méis quanto em própolis. Quanto à sua
atividade antibacterianas frente a Staphylococcus aureus, foram encontradas concentrações
inibitórias mínimas (CIM) de distintos valores, sendo >= 126 mg/mL (méis) e >= 0,36 mg/mL
(própolis) evidenciando a atividade antimicrobiana desta resina. A análise estatística mostrou
não haver diferença significativa entre as CIM dos méis (p <= 0,05) ocorrendo o mesmo para
as CIM das própolis. Os resultados da análise estatística multivariada mostraram que existem
correlações entre a composição química e a CIM dos méis e própolis de Apis mellifera e
50
Tetragonista angustula. No presente trabalho foi avaliada a atividade antibacteriana de
própolis em dois tipos de cepas de Staphylococcus aureus. O própolis desempenha um papel
de assepsia na colméia, então é lógico esperar uma atividade antibacteriana in vitro. Este
estudo demonstrou o potencial que a própolis apresenta como um agente antimicrobiano e
confirma a sua ação como um medicamento natural (MIORIN, 2003)
COOPER et al. (2002) procuraram avaliar se a atividade antimicrobiana do mel de
Manuka se dá exclusivavente devido a sua alta osmolaridade ou devido a outros fatores. Para
tanto foram coletadas 18 amostras provenientes de feridas humanas contendo Staphylococcus
aureus resistente a meticilina, sete amostras de Enterococci resistentes a vancomicina também
de feridas e sete amostras de Enterococci resistententes a vancomicina colhidas em
superfícies hospitalares. Foram comparadas as atividades antimicrobianas do mel in natura
anteriormente citado com o mel artificial, que não apresenta a enzima peroxidase. Foi
verificado que mesmo os dois tipos de méis sendo diluídos em até três vezes seu volume em
água, o mel natural demonstrou apresentar significativa maior eficiência no quesito
bactericida. Isto comprova que ação sobre microorganismos não ocorre exclusivamente pela
osmolaridade, mas sim também por outros fatores.
A origem dos esporos que irão ocasionar a enfermidade conhecida como botulismo
muitas vezes é desconhecida, entretanto é um fato constatado que o mel de abelhas age como
veiculador de tal enfermidade. Casos dessa enfermidade foram relatados com freqüência em
diversas nações, especialmente nos Estados Unidos da América. Apesar dessas informações,
em 1984, na França foi diagnosticado somente um caso em um indivíduo de idade reduzida
(PATY et. al., 1987). DELMAS et al. (1994) comentaram que o botulismo é uma
enfermidade que pode ser transmitida através de feridas cutâneas abertas e também de
alimentos contaminados, geralmente mal armazenados em recipiente metálicos. Comumente
encontra-se paralisia em indivíduos acometidos por esse clostridio. Os autores avaliaram
microbiologicamente 90 amostras de méis do leste da França e mais 26 amostras de méis
provenientes de diferentes partes do planeta visando avaliar a presença de Clostridium
botulinum. O resultado encontrado foi que embora oito amostras foram encontradas positivas
para a clostridio, nenhuma revelou apresentar o agente patogênico anteriormente referido.
Para avaliar a ação antifúngica do mel, EFEM et al. (1992) incorporaram no meio de
cultura diferentes proporções de mel (1:1, 1:2, 1:5). Foi observado que no grupo com maior
quantidade de mel (1:1) não houve crescimento fúngico, porém no grupo 1:2 houve
crescimento esparso e no grupo 1:5 crescimento considerável. Da mesma forma que em
experimento com bactérias, foi efetuado outro experimento com melado, onde houve
51
crescimento fúngico. Os fungos testados foram Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus,
Penicillium citricum, Tricophyton rubrum, Tricophyton tonsurans e Candida albicans.
Em um estudo, dois lotes de mel foram testados para verificar a presença de
contaminação. Um lote estava contaminado com 520 unidades formadoras de colônia (UFC)
por 100g de mel, no qual foram identificados Clostridium perfringes, enquanto que em outro
havia Bacillus spp. (4200 UFC/100g de mel). O uso de radiação gama tornou ambos os lotes
esterilizados, sem afetar a atividade antibacteriana. O uso do mel esterilizado provou ter
grande poder medicinal (POSTMES et al., 1993).
O ar ambiente possui consideráveis quantidades de esporos de diversos tipos de
fungos. Desde que as condições do meio sejam favoráveis, será possível o desenvolvimento
desses seres em alimentos como farinhas, massa, açúcares e fruta. O mel, pelo contrário, caso
bem conservado nunca se cobre de bolores. Essa característica foi comprovada através de um
estudo contendo 20 amostras de mel de trigo sarraceno contaminado por dez tipos diferentes
de fungos retirados de gêneros alimentícios. Nesse experimento não houve proliferação
fúngica apesar do mel ser rico em proteínas, carboidratos, vitaminas e sais minerais,
comprovando também a capacidade antifúngica do mel (IOIRISH, 1981).
52
3 MATERIAL E MÉTODO
3.1 Coleta e conservação
Foram coletadas diáfises femorais provenientes de 100 caninos provenientes do Setor
de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). A coleta foi
realizada somente em cães hígidos, sem histórico clínico de doenças sistêmicas ou
infectocontagiosas que pudessem interferir na pesquisa. Os ossos que apresentaram alguma
deformidade foram excluídos.
Os fêmures direito e esquerdo de cada canino tiveram suas diáfises coletadas de forma
não asséptica e com serra manual. Foram removidos a medula óssea e o periósteo e cada um
dos espécimes foi acondicionado em glicerina ou mel, respectiva e alternadamente. O
intervalo entre a coleta e a realização dos ensaios biomecânicos foi 30 dias.
3.2 Ensaios biomecânicos
Foram formados dois grupos, cada um contendo 50 ossos, denominados:
G
(1-50)
: glicerina
M
(1-50)
: mel,
ou seja, houveram 50 ossos conservados em glicerina (25 do membro esquerdo e 25
do membro direito) e outros 50 (25 do membro esquerdo e 25 do membro direito),
conservados em mel. Sempre foram comparados diretamente os ossos do mesmo animal de
ambos os grupos.
Para fins da obtenção de um parâmetro, houve a formação de um terceiro grupo, onde
os ossos foram coletados à fresco (F
(1-50)
) e imediatamente testados,
composto também por 50
corpos de prova, termo utilizado para as unidades experimentais utilizadas em testes de
resistência.
Os testes de resistência foram realizados no Laboratório de Materiais da Construção
Civil (LMCC) desta Universidade. Foi utilizada uma prensa de compressão axial (Figura 1A)
que exerceu uma força sobre os ossos, revelando um valor de leitura (L) que posteriormente
foi convertido para a unidade Newton (N) mediante a fórmula P= 15,322 x L + 4,45 onde P
significa o resultado final em N.
53
Foi padronizado que quando aparecesse o primeiro sinal de fissura ou falta de
continuidade, devido a impactação em suportar a carga aplicada, esse seria o momento de
interromper a compressão e aferir o valor obtido.
A referida prensa possui um anel de deformação que foi comprimido contra o osso
testado. Quanto maior fosse a mudança na conformação do seu perímetro, maior foi o valor na
leitura (L).
Os ossos foram medidos com paquímetro digital no sentido cranio-caudal e médio-
lateral e após foi feita uma média de seu diâmetro (Figura 1B). Para fins de padronização
ficou estabelecido que comprimento do implante testado foi o dobro do diâmetro externo.
Também foi mensurada a espessura média da camada cortical óssea. Com todos esses dados
foi possível calcular o volume de cada osso através da fórmula do cilindro oco que é:
V = π x h x (R
2
- r
2
)
Onde o significado de cada elemento é:
V: volume em cm
3
π: 3,14159
h: altura (o comprimento)
R: Raio maior (metade do diâmetro externo)
r: Raio menor (metade do diâmetro interno)
Também foi realizado o alinhamento entre as porções superior e a inferior do cilindro
ósseo, de modo que o ângulo reto formado entre o eixo maior e a base fosse consistente com o
mesmo e a porção superior.
Antes da realização dos ensaios foi promovida a hidratação dos ossos em solução
fisiológica a 0,9% por um período de seis horas, quando foram mantidos em mel ou glicerina.
A
B
Figura 1 – Demonstrando a prensa de compressão axial marca Solotest e as
medições realizadas com paquímetro digital no sentido crânio –
caudal e médio – lateral de fêmures caninos.
54
3.3 Avaliação bacteriológica
Os ossos foram coletados de forma não asséptica, lavados com água corrente em
profusão e mantidos em Eppendorf esterilizado em todos os grupos. Para que houvesse
padronização das amostras foi estipulado que cada amostra medisse 8 mm
3
.
Foram constituídos três grupos, cada um contendo 35 amostras. Um grupo foi
constituído por amostras recém coletadas e diretamente enviadas ao Laboratório de
Bacteriologia (LABAC) da UFSM (B
(1-35)
), outro onde os ossos foram mantidos em glicerina
por 30 dias (BG
(1-35)
) e um terceiro onde as amostras foram mantidas em mel pelo mesmo
período (BM
(1-35)
).
As porções de ossos provenientes dos referidos caninos recém coletados foram
acondicionadas em microtubos estéreis sendo acrescido a eles, 500µl de água peptonada
0,1%. Após 30 segundos de agitação no vórtex, 100µl da água peptonada foram semeados em
placas de Agar Sangue e Agar Mac Conkey, ambas com o auxílio de espátula de Drigalsky.
As amostras foram então incubadas a 37ºC durante 48 horas. Com relação aos segmentos
ósseos conservados os procedimentos foram os seguintes: semeadura de 100µl da glicerina e
do osso nos meios de cultura Agar Sangue e Agar Mac Conkey com auxílio de espátula de
Drigalsky. Os tubos contendo osso e mel foram submetidos ao banho-maria (37ºC) por 2
minutos e em seguida, da mesma forma como aconteceu com o grupo da glicerina, semeados
para a pesquisa bacteriológica. Todos os cultivos foram incubados a 37°C por 48 horas, sendo
posteriormente identificados a partir das características tintorias e bioquímicas.
3.4 Avaliação micológica
Quanto à coleta, a metodologia foi idêntica ao que aconteceu com os espécimes
enviados ao exame bacteriológico. Os ossos foram coletados de forma não asséptica, lavados
com água corrente em profusão e mantidos em Eppendorf esterilizado em todos os grupos.
Para que houvesse padronização das amostras foi estipulado que cada amostra medisse 8
mm
3
.
Foram constituídos três grupos, cada um composto por 35 amostras. O primeiro grupo
(F
(1-35)
) foi constituído por amostras recém coletadas e diretamente enviadas ao laboratório de
micologia (LAPEMI), outro onde os ossos foram mantidos em glicerina por 30 dias (FG
(1-35)
)
e um terceiro onde as amostras foram mantidas em mel pelo mesmo período (FM
(1-35)
).
55
As amostras foram semeadas em placas de Petri contendo Agar Sabouraud dextrose,
acrescido de cloranfenicol, ficando incubadas a 30
0
C, por um período de 30 dias, sendo
inspecionadas diariamente para visualização de crescimento de colônias fúngicas. Com o
objetivo de estimular a formação de estruturas fúngicas para posterior caracterização, as
colônias que cresceram nas placas com Agar Sabouraud, foram repicadas para tubos contendo
agar batata, ficando incubados a 30
0
C, durante 15 dias. Procedeu-se, então, a identificação do
fungo, avaliando-se as características macro e micromorfológicas das colônias. As
características macromorfológicas consideradas foram: tempo de crescimento do fungo,
tamanho, cor e aspecto das colônias e presença de pigmentos. Já, nas características
micromorfológicas, considerou-se a morfologia e cor das hifas, e presença de macroconídeos
e microconídeos.
A avaliação micromorfológica das colônias foi feita através do exame direto entre
lâmina e lamínula utilizando-se corante azul de algodão e observação em microscopia óptica
em aumento de 40X. Nas colônias onde não foi possível realizar-se a identificação por meio
de exame direto, realizou-se a técnica do microcultivo.
3.5 Avaliação estatística
O programa utilizado para avaliar estatisticamente os dados foi PRISM 4.0 for
Windows GraphPad, Califórnia. Os dados referentes à análise biomecânica foram avaliados
através dos testes t pareado e regressão linear entre volume (cm
3
) e carga (N), enquanto que o
estudo bacteriológico e micológico foram avaliados pelo teste Qui-quadrado.
56
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Propriedades biomecânicas
Nos três grupos avaliados foi verificado que os ossos que suportaram maior força
compressiva em N por cm
3
foi o grupo onde as diáfises foram mantidas em glicerina por 30
dias. O segundo grupo mais resistente foi o do mel e o último foi quando os ossos foram
colhidos à fresco. Cada grupo suportou em média por centímetro cúbico, respectivamente,
6339,939 N/cm
3
, 5906,387 N/cm
3
e 4888,532 N/cm
3
. A dimensão volumétrica de cada
amostra e a respectiva carga que cada uma suportou pode ser visualizada na Tabela 1.
Os ossos coletados a fresco, mantidos em mel ou glicerina 98% foram eleitos por
serem utilizados em ampla escala em procedimentos ortopédicos. GOLDBERG &
STEVENSON (1987) comentaram que o método que proporciona melhores resultados no que
diz respeito a biomecânica óssea é a colheita á fresco. Entretanto enxertos frescos têm
demonstrado serem insatisfatórios devido a resposta imunogênica e a lenta incorporação
decorrente. Métodos de preservação e modificações nos enxertos têm sido desenvolvidas
visando diminuir a antigenicidade dos enxertos.
Apesar dos achados no presente estudo revelarem que o grupo de ossos coletados a
fresco suportou menor carga compressiva não infere que essa categoria óssea seja menos
resistente que ossos conservados. O que aconteceu foi que no grupo da glicerina e do mel
foram usados ossos contralaterais de um mesmo animal, enquanto que no outro grupo foram
utilizados outros caninos. BRIANZA et al. (2006) comentaram que se for avaliada a
resistência de uma amostra óssea de volume padronizado, de animais de mesmas dimensões e
pesos, entretanto de raças diferentes, os valores ainda assim seriam diferentes. Isto ocorre
devido à geometria óssea distinta, pois, por exemplo, uma secção transversal mais cilíndrica
ou mais ovalada e um canal medular mais estreito ou mais amplo influem de forma
importante para a resistência. No presente estudo foi verificado que matematicamente os
ossos do grupo controle eram maiores e suportaram maior carga em valores totais, porém
proporcionalmente suportaram menor carga compressiva por cm
3
. Pode ser inferido então que
no presente estudo os ossos menores foram mais resistentes, porém isto não pode ser
extrapolado para outros estudos, e também não afirma que ossos maiores sempre serão menos
resistentes proporcionalmente, pois deve haver uma padronização entre raça e tamanho para
que a comparação seja confiável.
57
MELO et al. (1998) observaram que as características biológicas de ossos conservados
em glicerina eram de um osso mais esbranquiçado e quebradiço à manipulação, sendo mais
pronunciadas nos implantes conservados por períodos mais longos. Para evitar que os
enxertos quebrassem os autores indicaram a reidratação, sendo que quanto maior o tempo
menos quebradiço seria o osso. No presente estudo realizado na UFSM apenas poucas
amostras do grupo da glicerina apresentaram microfissuras (quatro ossos), porém após a
hidratação as mesmas visivelmente desapareceram.
LUCAS et al. (2001) compararam três métodos de conservação de ossos, que foram o
congelamento, a glicerina e o mel. Os fêmures foram mantidos por um período não inferior a
30 dias e após foram submetidos a um ensaio compressivo destrutivo. Foi possível verificar
que os ossos provenientes do grupo do mel eram significativamente mais resistentes do que o
dos outros meios, enquanto que a glicerina proporcionava até mesmo fraturas espontâneas nas
diáfises femorais. Entretanto estes autores mantiveram os ossos inteiros e não apenas
segmentos diafisários como aconteceu na presente pesquisa.
A glicerina tem demonstrado ser um eficiente meio de conservação de ossos (PINTO
JÚNIOR et al., 1996; COSTA, 1996; MELO et al., 1998). Ela acarreta, todavia, problemas
relacionados as propriedades biomecânicas de ossos conservados nesse material, tornando-os
quebradiços e exigindo longo tempo de hidratação (MELO et al., 1998), além de não
promover uma esterilização efetiva dos mesmos (MELO et al., 1998; DEL CARLO et al.,;
1999).
Outros métodos que causam efeito deletério sobre as propriedades biomecânicas de
ossos são a esterilização por óxido de etileno (JOHNSON & STEIN, 1988; WAGNER et al.,
1994) e a liofilização (DEL CARLO et al., 1999). ALIEVI (2006), em estudo utilizando
fêmures caninos, comentou que o mel, além de ser um adequado meio de conservação, não
causou fragilidade aos implantes ósseos quando os mesmos foram perfurados e fixados a
placas metálicas. Deve ser salientado que, ao contrário do presente estudo, os achados foram
baseados em fatos subjetivos.
O período de hidratação eleito foi baseado em BECKMANN et al. (2005), que
avaliaram a resistência de diáfises ósseas femorais conservadas em glicerina e submetidas a
diferentes períodos de hidratação anteriormente ao ensaio compressivo axial destrutivo. Os
ossos foram distribuídos em um primeiro grupo que não foi submetido a nenhum processo de
hidratação e a outros três grupos que foram hidratados por uma, seis, e 24 horas,
respectivamente. O grupo de seis horas foi o que apresentou melhores resultados no quesito
resistência.
58
Um fator associado ao desempenho estrutural de um enxerto ósseo é a reidratação do
mesmo antes do implante. Existem trabalhos que mostram tanto a diminuição (SEDLIN,
1966; KOMANDER, 1976) como o aumento (BURCHARDT et al., 1978;) da resistência a
compressão de corpos de prova liofilizados e até mesmo a não alteração significativa desta
propriedade (PELKER et al., 1984; MALININ et al., 1989). Os estudos realizados por
CONRAD et al. (1993) não demostraram diferenças significativas quanto a força de
compressão entre enxertos ósseos liofilizados reidratados por 24 horas e enxertos congelados,
porém no mesmo estudo, enxertos liofilizados não reidratados pareceram ser mais resistentes
à compressão. Esta incerteza de comportamento levou DUARTE & SCHAEFFER, (2000) a
realizar um trabalho que apontou a relação direta entre a força máxima de compressão
esperada e a razão de deformação ou rigidez do enxerto ósseo, utilizando ossos liofilizados ou
congelados, independente do processo de armazenamento utilizado e da reidratação ou não
do enxerto pré-ensaio. O tempo de reidratação de enxertos liofilizados mostrou, também, não
desempenhar um papel significativo, sugerindo a não necessidade de reidratação durante o ato
cirúrgico. No atual trabalho o período de hidratação de seis horas demonstrou ser eficiente e
importante, pois o aspecto ressecado no momento da retirada do osso do conservante
desaparecia após esse tempo de imersão em solução fisiológica.
Neste trabalho foi utilizada solução fisiológica a temperatura ambiente, pois
obviamente os ossos não seriam implantados em animais. SCHENA et al. (1984) e MELO et
al., (1998) hidrataram ossos em soro fisiológico morno por longos períodos. ALIEVI (2006)
utilizou a hidratação prévia de ossos conservados em mel por um período de 15 minutos antes
de sua implantação em fêmures caninos. Este autor relatou que o tempo de hidratação,
utilizando solução salina morna, foi menor que o utilizado pelos autores anteriormente
citados. Mesmo assim os resultados foram satisfatórios para a remoção do meio conservante e
parcial impregnação de fluídos no implante, haja visto que não houveram fissuras nem
fraturas durante o tempo de conservação e nem na perfuração por brocas e parafusos.
GAIGA (2002) avaliou o emprego de pinos absorvíveis confeccionados a partir de
tíbia e fíbula canina e conservados em glicerina 98% ou mel, no tratamento de fraturas
transversais umerais de pombos domésticos. Ele constatou que o pino conservado em mel
apresentava mais fácil manuseio que o mantido em glicerina, já que esse era mais quebradiço
e de mais difícil confecção. Não foram observados sinais clínicos de rejeição nem infecção
em ambos os grupos, porém houve reabsorção mais rápida e menor resposta inflamatória
quando os pinos eram mantidos em mel. Com isso foi possível concluir que o mel foi superior
na manutenção das características biomecânicas de ossos quando comparado à glicerina.
59
Entretanto o presente estudo biomecânico demonstrou ser necessário um período de
hidratação bem maior para que a manipulação de ossos conservados em glicerina seja
satisfatória.
WEIGEL (1993) comentou que a liofilização exerce efeito deletério significativo
sobre a resistência óssea no que diz respeito à torção e encurvamento, sendo indicada apenas
para enxertos trabeculares, corticotrabeculares ou ainda corticais de pequenas dimensões.
COSTA (1996) citou que os ossos conservados em glicerina tornam-se mais frágeis e
quebradiços, porém a diminuição da resistência é um problema encontrado em todos os
métodos de conservação. DEL CARLO et al. (1999) relataram que os ossos conservados por
meio de glicerina ou autoclavados sofreram decréscimo de resistência devido à desidratação e
desnaturação protéica, respectivamente.
WADSWORTH & HENRY (1981) comentaram que a resistência óssea de enxertos
mantidos sob o congelamento demonstrou que esse método foi adjuvante no insucesso de
alguns procedimentos ortopédicos realizados. Os autores utilizaram aloenxertos obtidos sob
condições de assepsia em sala cirúrgica, esterilizados em autoclave e mantidos em freezer
doméstico (-15°C a -20°C) até a sua utilização em cães e gatos. Nos gatos, o percentual de
sucesso na osteointegração foi de 90%, devendo-se as fraturas dos enxertos a falha de 10%.
Já no caso dos cães a taxa de sucesso foi de apenas 36%, atribuindo-se as falhas à não união
do enxerto por formação de seqüestro ósseo, infecção e fixação inadequada.
Uma das vantagens dos métodos de conservação utilizados foi que o custo demonstrou
ser bastante acessível e o processo de armazenagem revelou ser simples. SCHENA et al.
(1984) realizaram um estudo comparando autoenxerto mantido a fresco, aloenxerto fresco e
aloenxerto liofilizado mantido a -70°C na reconstrução de falha óssea diafisária segmentar em
fêmures caninos. Os enxertos foram fixados mediante o uso de placas e parafusos. Os
resultados permitiram concluir que o autoenxerto fresco é superior aos demais quanto ao
tempo de consolidação, embora o aloenxerto fresco também promova união consistente.
Verificou-se que o processo de liofilização fragiliza o enxerto, sujeitando o mesmo mais
facilmente a fraturas por compressão, além da desvantagem representada pelo elevado custo
do equipamento e o longo tempo para o processamento do material.
JOHNSON & STEIN (1988) avaliaram aloenxertos frescos com segmentos ósseos
esterilizados pelo óxido de etileno. Os autores relataram que aloenxertos ósseos corticais
esterilizados com óxido de etileno na concentração de 12% e mantidos na temperatura de
22°C tornam-se bastante quebradiços, ocorrendo pequenas fissuras ou lascas durante a
preparação para a fixação dos parafusos, o que exige um número maior de ossos para
60
substituir os danificados. Possivelmente se os autores tivessem hidratado os ossos por um
período de pelo menos seis horas os resultados seriam melhores.
WAGNER et al. (1994) reportaram a ocorrência de dois casos de fraturas em
aloenxertos ósseos corticais conservados pelo óxido de etileno, bem como o encurvamento
das placas que os fixavam. Apesar dos autores não justificarem a falha no método de
esterilização, não houve instabilidade durante o período de observação.
No presente estudo a glicerina foi comparada com o mel, porém outros autores
estudaram o comportamento deste agente com outros meios conservantes. Segundo ZILIOTO
et al. (2003), os implantes ósseos conservados em glicerina tornam-se menos resistentes que
os fragmentos ósseos frescos, podendo sofrer fraturas no momento da colocação dos
parafusos. Porém, esta queda na resistência também ocorre quando a conservação é feita por
congelamento. Para aumentar a resistência dos implantes ósseos, especificamente na técnica
preservadora do membro, o canal medular dos fragmentos ósseos a serem implantados foram
preenchidos com poliuretana de mamona e fixados por meio de placas de compressão
dinâmica, obtendo bons resultados no quesito resistência compressiva.
Deve ser levado em conta que o presente estudo foi realizado com ossos coletados de
cadáveres. Um dos problemas dos testes de avaliação das propriedades biomecânicas é que
estes são realizados in vitro; conseqüentemente são negligenciados os processos biológicos
aos quais o osso é submetido in vivo. Tais processos seriam: a revascularização, a
remodelação (PELKER et al.,1984), necrose do enxerto e algumas alterações bioquímicas do
colágeno (KANG & KIM, 1993). Por isso, a maioria dos dados provenientes de avaliações
biomecânicas ao serem extrapoladas para a prática clínica requer confirmações in vivo,
necessitando de novos trabalhos.
61
Tabela 1 - Resultado do volume em cm
3
dos grupos nos quais os ossos foram conservados em glicerina (G), mel (M) e dos ossos avaliados a fresco (F) relacionados com a
carga (em Newton) que cada um dos ossos dos grupos suportaram.
No final tem-se a relação Volume x Newton de cada grupo.
Grupo G volume G N G Grupo M volume M N M Grupo F volume F N F
g1 1,62559 12721,71 m1 1,62561 10959,68 f1 3,92071 10270,19
g2 1,79071 6240,59 m2 1,79082 7267,07 f2 1,84254 7359,01
g3 1,03949 6439,69 m3 1,03945 6822,74 f3 1,50796 5567,4
g4 0,58258 5338,21 m4 0,58251 3095,79 f4 1,12155 5724,84
g5 0,39628 4564,96 m5 0,39619 5260,89 f5 0,91892 6746,13
g6 0,48818 4688,68 m6 0,48825 4487,64 f6 1,9635 9810,53
g7 0,42412 3482,41 m7 0,42415 3559,74 f7 2,474 9963,75
g8 0,8405 7512,23 m8 0,8401 6899,35 f8 0,83635 7052,57
g9 1,64934 8120,71 m9 1,64939 8278,33 f9 0,64139 5724,84
g10 2,14414 12108,83 m10 2,14419 11802,39 f10 2,73319 9963,75
g11 1,46869 8661,38 m11 1,46871 7512,23 f11 1,37288 5879,49
g12 1,58179 7588,84 m12 1,58175 7971,89 f12 1,62559 8431,55
g13 0,63617 5879,49 m13 0,63612 5879,49 f13 3,6521 11036,29
g14 0,96057 5879,49 m14 0,96052 6669,52 f14 3,14316 9657,31
g15 3,99912 12874,93 m15 3,99917 8584,77 f15 0,93946 4796,94
g16 0,75448 7052,57 m16 0,75451 6133,25 f16 1,80208 7895,28
g17 0,56096 4023,69 m17 0,56099 3559,74 f17 1,34327 6133,25
g18 0,76661 4332,99 m18 0,76657 3250,44 f18 0,89535 6592,91
g19 1,07801 3405,09 m19 1,07805 6286,47 f19 2,34583 8278,33
g20 0,69429 6746,13 m20 0,69433 5260,89 f20 1,50796 7895,28
g21 0,90323 6439,69 m21 0,90321 7818,67 f21 0,98696 5724,84
g22 1,95093 11342,73 m22 1,95095 7665,45 f22 1,48044 7895,28
g23 0,98696 7818,67 m23 0,98689 4951,59 f23 0,66765 5415,54
g24 0,79168 5260,89 m24 0,79171 6592,91 f24 1,1365 6034,14
g25 0,50822 5260,89 m25 0,50817 4642,29 f25 1,24407 7971,89
g26 1,20468 5567,4 m26 1,20472 7052,57 f26 0,84446 5910,42
g27 1,64934 8814,6 m27 1,64929 8431,55 f27 0,8405 5647,51
Continua...
62
g28 2,0071 10959,68 m28 2,0065 11419,34 f28 1,43498 9657,31
g29 2,76313 10116,97 m29 2,76309 9274,26 f29 1,89344 9810,53
g30 1,42616 11266,12 m30 1,42621 7971,89 f30 1,79699 9504,09
g31 0,68041 5879,49 m31 0,68035 4178,34 f31 0,96057 5802,16
g32 0,44485 4796,94 m32 0,44479 3869,04 f32 0,49009 4796,94
g33 0,71063 4487,64 m33 0,71058 4874,26 f33 1,45318 6592,91
g34 0,74022 5260,89 m34 0,74018 5724,84 f34 1,33807 8048,5
g35 0,82158 6822,74 m35 0,82164 6034,14 f35 1,29176 6133,25
g36 0,63632 4642,29 m36 0,6367 4487,64 f36 2,45044 7205,79
g37 0,75197 6286,47 m37 0,75191 6034,14 f37 2,06365 11189,51
g38 0,68787 6286,47 m38 0,68795 5724,84 f38 2,73319 15556,28
g39 1,44199 5879,49 m39 1,44192 6899,35 f39 1,26806 8891,21
g40 2,41023 11495,95 m40 2,41017 11342,73 f40 1,14555 6332,43
g41 0,71063 3559,74 m41 0,71068 3869,04 f41 1,38299 9550,05
g42 1,07801 9197,65 m42 1,07795 7971,89 f42 1,54887 7282,4
g43 1,07801 8737,99 m43 1,07809 8891,21 f43 2,30195 7052,57
g44 1,38431 9963,75 m44 1,38427 9657,31 f44 2,0071 9121,04
g45 0,53087 6439,69 m45 0,53092 4023,69 f45 1,60949 7282,4
g46 0,56077 6945,96 m46 0,56082 6363,08 f46 0,73287 3714,39
g47 0,41017 4332,99 m47 0,41015 4023,69 f47 0,79149 5567,4
g48 1,24426 10883,07 m48 1,24431 9044,43 f48 0,48617 5106,24
g49 0,63617 4951,59 m49 0,63614 4487,64 f49 0,88656 6363,08
g50 0,79168 4023,69 m50 0,79172 4487,64 f50 0,89535 5260,89
Total 55,424 351384,8 55,42336 327351,8 76,75118 375200,6
rel VxN 6339,939 5906,387 4888,532
63
4.2 Glicerina como agente bactericida e fungicida
A manutenção da esterilidade é preocupação fundamental, qualquer que seja o método
de conservação (SLATTER, 1998).
PIGOSSI (1964) efetuou estudo experimental de implante ortotópico de dura-máter
homógena, conservada em glicerina. Segundo esse autor a glicerina desidrata o tecido
substituindo a maior parte de água intracelular. Entretanto, não altera a concentração iônica
das células, atuando como eficaz protetor da integridade celular. Pela avaliação histológica do
implante, o pesquisador constatou ausência de processo inflamatório agudo, o que assegura a
esterilidade do produto e a ausência de antigenicidade. No atual estudo utilizando caninos a
glicerina isoladamente como meio conservante, foi semeada em Agar Sangue e não houve
crescimento bacteriano, porém não pode ser afirmado que se encontrou estéril, pois poderia
haver a presença de outros agentes microscópicos.
Foi possível verificar no presente estudo que das 35 amostras analisadas no exame
bacteriológico 16 apresentaram contaminação quando avaliadas no momento da coleta e a
glicerina foi capaz de inibir o crescimento bacteriano em 14 espécimes. PIGOSSI (1967)
realizou pesquisa sobre a ação anti-séptica e antigênica da glicerina na conservação de dura-
máter humana e de caninos. Concluiu que a glicerina reduz a antigenicidade de peças nela
conservadas e, que além de outras propriedades, ela é um agente desidratante de atuação
rápida e age como poderoso anti-séptico de amplo espectro de ação.
PINTO JUNIOR et al. (1996) comentaram que a glicerina, mesmo sem ser processada
ou esterilizada apresenta atividade antifúngica. No atual estudo micológico foi verificado que
das 35 amostras obtidas e analisadas no momento da coleta, oito apresentaram contaminação
por fungos e que a glicerina foi eficiente em eliminar todos esses agentes.
Os resultados das avaliações bacteriológicas e micológicas da glicerina podem ser
visualizados nos Quadros 1 e 2.
PIGOSSI et al. (1971) pesquisaram a ação bactericida da glicerina, realizando testes
em peças de dura-máter espontaneamente contaminadas e testes in vitro, adicionando à
glicerina, a mais ou menos 98%, inóculos de colônias de diversos microorganismos
escolhidos principalmente entre os patógenos mais prevalentes na rotina médica como
Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus mirabilis, Micrococcus spp, Staphylococcus aureus
entre muitos outros. Entretanto no atual estudo realizado com segmentos ósseos os agentes
encontrados na maior parte foram contaminantes ambientais, tal como Bacillus spp. e Coccus
spp..
64
MELO et al., (1998) avaliaram de forma bacteriológica aloenxertos ósseos
conservados em glicerina e observaram o crescimento de microorganismos em 21,4% das
amostras de segmentos ósseos. Staphyloccocus intermedius e Staphyloccocus spp. foram os
agentes encontrados. O resultado sugere que a glicerina não permitiu o crescimento, mas
também não eliminou as bactérias presentes nos ossos. Os achados deste autor não concordam
com o que foi encontrado no presente estudo com diáfises femorais, pois em 45,71% das
amostras recém coletadas houve presença de contaminação e após os 30 dias de conservação
somente 5,71% permaneceram contaminadas, demonstrando a ação bactericida da glicerina.
Uma grande vantagem encontrada foi que para todo o experimento realizado foi
necessário somente um litro de glicerina e o processo de armazenagem foi bastante simples,
concordando com CAVASSANI et al., (2001), os quais comentaram que a evidência da
preservação da atividade osteogênica de fragmentos ósseos pela glicerina possibilita que
bancos de ossos destinados à enxertia estoquem fragmentos de matriz óssea mineralizada ou
matriz óssea desmineralizada em lugar de peças íntegras e grandes, otimizando a utilização de
espaço de armazenamento e a quantidade de glicerina.
Foram realizados experimentos com um banco de ossos preservados em glicerina,
confirmando ser este um método de preservação simples, barato e bactericida, pois é possível
armazenar os ossos imersos em glicerina à temperatura ambiente, não sendo necessário o
congelamento e outros métodos lesivos (SCHENA & MCURNING, 1983; BLOOMBERG et
al., 1984; HART et al., 1984); esta é outra vantagem da utilização da glicerina, pois
armazenando-se à temperatura ambiente não há formação de cristais intra e extracelulares,
além de alterações eletrolíticas deletérias às células e potencialmente destrutivas à matriz
óssea. Seu efeito asséptico na conservação de tecido ósseo deve-se particularmente às suas
propriedades físicas (SCHENEIDER & MAZUR, 1984), e, portanto não há problema quanto
ao fenômeno da resistência bacteriana, assim como ocorre com o tiomersal.
Os ossos conservados em glicerina foram mantidos por um período de 30 dias, porém
alguns autores avaliaram este e outros métodos por maior tempo, tal como o óxido de etileno
como meio de conservação de fragmentos ósseos (PHILLIPS et al, 1988; ROE et al., 1988;
JOHNSON et al., 1992; TSCHAMALA et al., 1994; WAGNER et al., 1994; PINTO
JÚNIOR, 1995). Porém sua viabilidade é questionável após 32 semanas de estocagem, sendo
que o período máximo de estocagem aceitável é de seis a 18 meses.
GIOSO et al. (2002) inferiram que a glicerina também é um meio de preservação
simples, barato e asséptico, tal como o tiomersal, e o substitui com sucesso. Pelo trabalho
anteriormente citado pôde-se constatar que a glicerina é capaz de conservar o tecido ósseo
65
por um prazo de nove anos de armazenamento (108 meses aproximadamente), superando o
óxido de etileno neste aspecto. Levando-se em consideração que o número de amostras
positivas para crescimento microbiano foi estatisticamente muito pequeno em comparação
com as amostras negativas, deve-se considerar, portanto, a glicerina como um excelente meio
de conservação de tecido ósseo, mantendo o tecido isento de microorganismos por um
período de até nove anos.
Algumas formas esporuladas dos agentes apresentados foram encontradas no presente
estudo. GIOSO et al. (2002) trabalharam com ossos conservados em glicerina a 98%, por
nove anos. Através de testes microbiológicos foram pesquisadas bactérias, nas epífises e no
canal medular e não foi encontrado um número estatisticamente significativo para que
interferissem na enxertia óssea. A flora bacteriana presente no implante biológico de tendão
calcâneo comum após a ação da glicerina a 98% foi avaliada e este meio segundo
KRAUSPENHAR (2003) previne a proliferação bacteriana.
Para PIGOSSI et al. (1971) embora a glicerina seja um poderoso anti-séptico ela não
atua sobre algumas formas esporuladas mais resistentes. Apesar da glicerina ter apresentado
bom efeito bactericida, algumas bactérias permaneceram viáveis, porém a maior parte dos
agentes encontrados não eram de caráter patogênico. Isso explica porque, em estudos
experimentais, a glicerina mostrou ser um meio adequado para a conservação de implantes
ósseos, obtendo altos índices de incorporação, tal como quando foram reconstruídas com
sucesso as porções diafisárias de ossos longos substituídas por segmentos corticais
conservados em glicerina, sendo todos os procedimentos realizados em caninos (PINTO
JÚNIOR et al., 1996; COSTA, 1996; MELO et al., 1998).
4.3 Mel como agente bactericida e fungicida
Foi possível verificar que das 35 amostras analisadas no exame bacteriológico
coletadas a fresco, 16 apresentaram contaminação. Nas 35 amostras avaliadas
bacteriologicamente foi evidenciada a presença de Bacillus spp. no mel, pois o meio de
cultura encontrava-se contaminado por esse agente. Também houve o crescimento de Coccus
spp. em dois casos e Proteus spp. em uma amostra. Dessa forma houve crescimento
bacteriano em todas as amostras.
No atual estudo micológico foi verificado que das 35 amostras obtidas e analisadas no
momento da coleta oito apresentaram contaminação por fungos e que o mel foi eficiente em
eliminar apenas três agentes, permanecendo cinco fungos. Dessa forma o mel não foi 100%
66
eficiente como fungicida, ao contrário do que aconteceu com a glicerina. Alguns desses
agentes encontrados no mel podem ser observados na Figura 2.
A
B
Figura 2 – Exemplo de agentes encontrados. Na foto A tem-se o crescimento de um bacilo
enquanto que na foto B, é possível observar a presença de Aspergillus niger, os
quais estavam presentes nos ossos conservados em mel.
Os resultados das avaliações bacteriológicas e micológicas do mel podem ser
visualizados nos Quadros 1 e 2.
Baseando-se no fato anteriormente citado pode ser inferido que não se pode considerar
o mel como substância livre de patógenos. POSTMES et al. (1993) comentaram que o mel
não pode ser tratado como substância estéril, sendo necessária a análise microbiológica antes
de ser utilizado com propósitos para a conservação de materiais biológicos ou uso terapêutico
em seres vivos. SUBRAHMANYAM (1993) utilizou mel resfriado a 4°C para o
armazenamento de enxertos de pele, porém realizou exames laboratoriais para verificar a
ausência ou não de bactérias. POSTMES et al. (1993) ainda citaram como alternativa o uso de
irradiação para promover a esterilização de mel contaminado. RAGAZANI (2004) realizou
um estudo que teve por objetivo verificar a qualidade microbiológica do mel comercializado
em alguns estados brasileiros (SP, MG, GO, CE, MT, SC). Cem amostras de méis oriunda dos
referidos locais foram submetidas a análise laboratorial. Como resultado 7% foram positivas
para Clostridium botulinum; 2% para Staphylococcus aureus coagulase positivo e 5% para
67
Staphylococcus spp. coagulase negativo; bolores e leveduras encontraram-se fora dos padrões
recomendados pela legislação brasileira. Nenhuma amostra revelou a presença de Escherichia
coli, Salmonella spp., Shigella spp.. Concluiu-se ser importante avaliar a qualidade
microbiológica do mel, sobretudo a presença destes microrganismos uma vez que podem ser
veiculadores de toxiinfecção alimentar, e principalmente causar o botulismo infantil, que
representa um alto risco à saúde do consumidor infantil, principalmente aqueles menores de
um ano de idade, faixa etária em que a incidência é maior devido às características específicas
absortivas do trato digestório destes indivíduos.
O mel utilizado foi submetido à análise de umidade e foi verificado um percentual de
18,2%, estando em conformidade com a literatura. LENGLER (1999) comentou que um
componente do mel que representa fator limitante na sua estocagem é a água. Devido a sua
alta higroscopicidade, o mel apresenta facilidade em absorver e ceder água. Mel com umidade
superior a 25% fermentará com facilidade. Em geral o conteúdo de água do mel varia de 13%
a 25%, aquele que apresenta umidade inferior torna-se difícil de ser manipulado, mas presta-
se para ser misturado com outros méis. Quando o armazenamento acontecer em ambiente com
umidade relativa do ar superior a 60% a água é absorvida; quando a estocagem é feita em
ambiente com umidade relativa inferior a essa porcentagem ele libera água.
Através de exames laboratoriais foi possível comprovar que o mel utilizado era
completamente natural, não apresentando nenhum tipo de adulteração. O mel é um produto
natural elaborado pelas abelhas (Apis mellifera e Meliponídeos), sendo que para a produção
do mesmo elas extraem o néctar das flores, transformam e combinam com substâncias
próprias armazenando em favos, em suas colméias. O mel possui uma baixa atividade de água
o que dificulta o desenvolvimento microbiano, porém na sua manipulação às vezes aumenta
esta atividade de água, propiciando o desenvolvimento de bactérias como Escherichia coli,
Salmonella spp., Shigella spp., e ocasionalmente Staphylococcus aureus coagulase positivo, e
esporos de Clostridium botulinum que, em condições ideais, podem germinar e serem agentes
causadores do botulismo infantil (RAGAZANI, 2004).
Amostras de mel foram avaliadas para encontrar a atividade de água e foi obtido um
valor de 0,645, ou seja, um pouco mais alto do que o preconizado pela literatura.
ANGERAMI (1991) comentou que o mel pode eventualmente fermentar devido ao
desenvolvimento de leveduras osmófilas, capazes de se desenvolver nele. As leveduras
normalmente estão presentes no mel, mas só se desenvolvem se encontram condições de
umidade e de temperatura adequadas. O mel pode eventualmente absorver umidade do
ambiente, contribuindo para que a sua fermentação ocorra. O segredo disso esconde-se por
68
detrás da sigla Aa, que significa atividade de água. O mel é um composto de baixa Aa.
Alimentos com Aa igual ou superior a 0,85 apresentam uma facilidade para o
desenvolvimento de vários microorganismos, entretanto o mel apresenta 0,6 ou menos dessa
atividade. Geralmente as bactérias são mais exigentes na quantidade de água do que os fungos
para que ocorra o seu desenvolvimento.
Durante o período em que o presente estudo foi realizado, devido às condições
climáticas deste estado, houve uma grande variação de temperatura e umidade, o que pode ter
afetado as propriedades do mel, visto que esse mel não foi armazenado em temperatura
constante. LENGLER (1999) comentou que um fator importante na estocagem do mel é a
temperatura, pois as oscilações tanto podem causar mudanças na sua composição física como
química. Temperaturas acima de 20°C podem destruir enzimas e o mel torna-se mais escuro.
Mesmo no mel cristalizado quando em ambiente com temperatura superior a 20°C a parte
superficial pode tornar-se líquida, ocasionando em muitos casos a fermentação. A estocagem
deve ocorrer entre 10 e 11°C, em ambiente com umidade relativa do ar abaixo de 60%. O mel
com umidade inferior a 17,1% independentemente do grau de contaminação não fermentará
em 12 meses. Com umidade de 17,1 a 18% com a presença de até 1000 esporos de levedura
por grama de mel também não fermentará por esse período e quando a umidade for superior a
19% com apenas um esporo de levedura haverá fermentação antes dos 12 meses.
As amostras do meio conservante mel foram periodicamente testadas e não foi
avaliada a presença de fungos. SCHUCH et al. (2003) realizaram um trabalho que objetivou
detectar presença de esporos de Paenibacillus larvae subsp. larvae em produtos de um
entreposto do interior do Estado do Rio Grande do Sul, para a identificação de possíveis
fontes de contaminação e a avaliação da possibilidade da transferência de esporos para
colméias de apiários adjacentes a partir de produtos importados contaminados. Foram
analisados mel e pólen importados disponíveis no entreposto, favo do ninho (crias, pólen e
mel) colhido de uma colméia sadia, mel estocado em um dos apiários e abelhas adultas. Os
resultados foram positivos na presença dos referidos esporos em relação ao mel e pólen
importados, a três grupos de abelhas adultas e ao mel do favo.
O mel utilizado foi obtido através de árvores silvestres e sendo da procedência de um
único produtor, sendo que para a realização do estudo foram necessários dois quilos deste
produto. GREENWOOD (1993) relatou que méis oriundos de diferentes floradas possuem
maior ou menor grau de ação sobre germes, além de atuar de forma seletiva em alguns casos,
não destruindo um agente que o de outra florada destruiria. POSTMES et al. (1993)
comentaram ainda que é muito importante o tipo de florada em que o mel foi obtido, sendo de
69
menor importância o grau de diluição desse material. Em um estudo utilizando o método de
diluição em ágar e tendo como agente Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginoa e
Escherichia coli, foi considerado que o produto originário de floradas de limeira demonstrou
maior e mais ampla atividade bactericida do que aqueles originários de floradas de outras
árvores frutíferas e de acácia. Não houve crescimento de nenhum dos microorganismos
anteriormente citados quando foi utilizado o mel obtido pela limeira.
O fato de um determinado tipo de mel possuir maior poder antimicrobiano do que o de
outra florada é explicado por IOIRISH (1981) e GREENWOOD (1993), que comentaram que
essas flores possuem diferentes substâncias antimicrobianas e conforme o tipo de mel a ser
produzido pelas abelhas também apresentarão diferentes graus de atividade germicida.
IOIRISH (1981) relatou que o mel preserva os produtos orgânicos da decomposição
não somente porque isola do ar ambiente, mas também porque possui ácido fórmico, outro
produto derivado da secreção das abelhas. Comentou ainda que foi verificado através de
exames laboratoriais que as substâncias bactericidas existentes no mel tinham como origem
não apenas o néctar ou pólen de flores, mas também um produto secretado através das
próprias abelhas.
Os únicos agentes bacterianos encontrados nas amostras periodicamente enviadas ao
exame bacteriológico do mel na presente pesquisa foram bacilos. POSTMES et al. (1993)
comentaram que muitas vezes são encontrados bacilos não patogênicos em diferentes tipos de
méis, entretanto também é evidenciada, por vezes, a presença de esporos clostridiais que
podem vir a causar botulismo e gangrena. Os mesmos autores comentaram ainda que o mel
utilizado para propósitos de conservação de tecidos deve ser obtido através de colméias livres
de pesticidas e antibióticos, como a tetraciclina, pois estes produtos podem apresentar-se de
forma residual nos méis. Também citaram que é importante a remoção de qualquer fração de
sangue, pois comprovaram, através de exames laboratoriais, que a adição de 5% de sangue
ovino ao mel apresentou como resultado completa inibição da atividade antibacteriana.
Assim como preconizado por MATHEWS & BINNINGTON (2002), o mel utilizado
nesse experimento não foi submetido ao processo de pasteurização e nenhum outro tratamento
de esterilização, pois segundo os autores tais procedimentos poderiam afetar-lhe suas
propriedades antimicrobianas.
Conforme POSTMES et al. (1993), o mel utilizado com propósitos medicinais deve
ser sempre submetido à análise microbiológica antes de sua utilização, pois pode conter
esporos clostridiais, podendo causar posteriormente botulismo ou gangrena.
70
Uma alternativa eficiente seria submeter o mel a esterilização mediante radiação gama
(CHAPMAN & VILLAR, 1992), o que não afeta sua atividade bactericida (MOLAN &
ALLEN, 1996). Neste experimento, porém, optou-se por não esterilizá-lo, para afastar o risco
de tornar inativa alguma substância essencial a sua qualidade de composto conservante.
Endente-se necessária a realização de estudos para avaliar a conservação de tecido ósseo em
mel submetido a esterilização via radiação gama.
Apesar das propriedades antimicrobianas do mel, MSCHIVIDOBADSE (1978),
submeteu os implantes ósseos à esterilização utilizando formaldeído diluído na concentração
de 1% e posteriormente mantidos em solução contendo 50% de mel. Todavia, tal projeto foi
realizado a mais de 25 anos quando as bases científicas acerca das propriedades do mel ainda
eram bastante frágeis e, como os implantes foram obtidos em condições não estéreis e eram
aplicados em seres humanos, exigiam-se cuidados mínimos de assepsia para não submeter o
paciente a riscos possivelmente fatais.
Baseando-se no fato de que houve a presença de agentes infecciosos, ainda que não
patogênicos, ossos conservados nesse agente e posteriormente implantados devem ser imersos
em substância degermante e os animais receptores necessitam antibioticoterapia. ALIEVI
(2006) realizou com sucesso a reconstrução da diáfise femoral de caninos utilizando
implantes ósseos corticais conservados em mel por um período de 28 dias e fixados por placas
compressivas e parafusos. Em tal estudo foi utilizada antibiótico profilático, pois, conforme
SMITH (1998), em todos os procedimentos ortopédicos onde houver material implantado
deve ser utilizada tal medicação. A cefalexina foi eleita para este fim devido ao fato de
possuir amplo espectro, rápida concentração tecidual máxima e boa penetração óssea,
características importantes segundo o autor. Além dessas, também foi considerada sua
cômoda via de administração, o longo intervalo entre cada administração e o baixo custo.
O congelamento é um meio de armazenamento amplamente utilizado em Medicina
Veterinária no que diz respeito a armazenagem de segmentos ósseos (DUELAND et al.,
1989). Apesar disso, o risco da permanência de alguns agentes infecciosos viáveis (bactérias
e/ou fungos) quando se utiliza o congelamento como método de conservação é presente
(KERVIN et al., 1991). Os resultados obtidos em diferentes estudos têm sido satisfatórios,
mas o método exige equipamento especializado para manter a temperatura sempre de forma
constante, energia elétrica e ampla área para a permanência dos refrigeradores, o que dificulta
sua utilização em hospitais veterinários e em algumas clínicas e hospitais. Por outro lado, a
formação de um banco de ossos utilizando o mel como meio de conservação dispensa tais
71
necessidades, tornando assim a sua utilização muito mais acessível aos profissionais
envolvidos com tal tipo de procedimento.
Os recipientes contendo ossos conservados em mel foram mantidos em local com
temperatura amena e longe da luz solar direta, porém não houve isolamento total de luz.
MATHEWS & BINNINGTON (2002), recomendaram, porém, que haja um bloqueio
completo de luz nos frascos contendo os implantes ósseos e que eles sejam mantidos em local
com temperatura amena, pois tanto a luz como as altas temperaturas podem afetar as
propriedades conservantes do mel
Não houve a manutenção de uma temperatura fixa no atual estudo, visto que a
armazenagem ocorreu em temperatura ambiente, o que obviamente permitiu oscilações.
GUPTA (1977) avaliou a preservação da pele de cobaios (Cavia porcellus) conservadas em
mel, autoclavado ou não, à temperatura ambiente ou a 4°C. Ao final de seis semanas, tanto no
mel esterilizado quanto naquele que não foi submetido a autoclavagem mantido a 4°C, 90%
das amostras encontravam-se adequadamente preservadas. Nas amostras conservadas em
temperatura ambiente foi obtido 100% de eficácia. Não foram observados sinais de autólise
em nenhuma das amostras, mas elas apresentavam aspecto compacto e denso, o que foi
justificado pela ação higroscópica do mel. Apesar de não ser utilizada tal técnica na prática, o
autor comentou que o implante, mesmo não sendo material viável, poderia ser comparado a
um implante liofilizado, proporcionando cobertura temporária a feridas, prevenido a dor e
perda de fluídos e também agindo como agente antimicrobiano.
SUBRAHMANYAM (1993) preservou segmentos de pele em mel não processado,
não diluído e estéril em diferentes temperaturas. Um grupo foi mantido em temperatura
ambiente e o outro a 4°C. O autor verificou que quando os espécimes eram removidos do
meio conservante a consistência era firme e a coloração era amarela escurecida, voltando a
coloração e texturas normais após o período de hidratação em solução salina estéril. No
presente estudo com ossos também foi possível verificar essas evidências com relação a
coloração e textura.
72
F
ISOLADO M ISOLADO G ISOLADO
B1 cocus spp. BM1 bacillus spp. BG1 Ausente
B2 bacillus spp. BM2 bacillus spp. BG2 Ausente
B3 bacillus spp., coccus spp. BM3 bacillus spp. BG3 Ausente
B4 Ausente BM4 bacillus spp. BG4 Ausente
B5 Ausente BM5 bacillus spp. BG5 Ausente
B6 Ausente BM6 bacillus spp. BG6 Ausente
B7 Ausente BM7 bacillus spp., coccus spp. BG7 Ausente
B8 bacillus spp., coccus spp. BM8 bacillus spp. BG8 Ausente
B9 bacillus spp., diplococcus spp. BM9 bacillus spp. BG9 Ausente
B10 bacillus spp. BM10 bacillus spp. BG10 Ausente
B11 bacillus spp. BM11 bacillus spp. BG11 Ausente
B12 bacillus spp. BM12 bacillus spp. BG12 Ausente
B13 coccus spp. BM13 bacillus spp. BG13 Ausente
B14 Ausente BM14 bacillus spp. BG14 Ausente
B15 bacillus spp. BM15 bacillus spp. BG15 Ausente
B16 bacillus spp., coccus spp. BM16 bacillus spp. BG16 Ausente
B17 bacillus spp. BM17 bacillus spp. BG17 Ausente
B18 Ausente BM18 bacillus spp. BG18 Ausente
B19 Ausente BM19 bacillus spp. BG19 Ausente
B20 Ausente BM20 bacillus spp. BG20 Ausente
B21 Ausente BM21 bacillus spp. BG21 Ausente
B22 Ausente BM22 bacillus spp. BG22 Ausente
B23 Ausente BM23 bacillus spp. BG23 Ausente
B24 Ausente BM24 bacillus spp. BG24 Ausente
B25 Ausente BM25 bacillus spp. BG25 Ausente
B26 Ausente BM26 bacillus spp., proteus spp. BG26 Ausente
B27 Ausente BM27 bacillus spp. BG27 Ausente
B28 Ausente BM28 bacillus spp., coccus spp. BG28 Ausente
B29 bacillus spp., coccus spp. BM29 bacillus spp. BG29 bacillus spp., coccus spp.
73
B30 coccus spp. BM30 bacillus spp. BG30 coccus spp.
B31 coccus spp. BM31 bacillus spp. BG31 Ausente
B32 coccus spp. BM32 bacillus spp. BG32 Ausente
B33 Ausente BM33 bacillus spp. BG33 Ausente
B34 Ausente BM34 bacillus spp. BG34 Ausente
B35 Ausente BM35 bacillus spp. BG35 Ausente
Quadro 1 - Os grupos dos ossos examinados a fresco (F), conservados em mel (M) e os ossos conservados em glicerina (G), além dos agentes que foram isolados através
dos testes realizados em Agar sangue. Avaliação bacteriológica.
74
F ISOLADO M ISOLADO G ISOLADO
F1 Alternaria spp. FM1 Ausência FG1 Ausência
F2 Ausência FM2 Thermomyces spp. FG2 Ausência
F3 Penicillium spp. FM3 Ausência FG3 Ausência
F4 Fusarium spp. FM4 Ausência FG4 Ausência
F5 Ausência FM5 Ausência FG5 Ausência
F6 Ausência FM6 Ausência FG6 Ausência
F7 Ausência FM7 Ausência FG7 Ausência
F8 Ausência FM8 Ausência FG8 Ausência
F9 Ausência FM9 Ausência FG9 Ausência
F10 Trichoderma spp. FM10 Ausência FG10 Ausência
F11 Ausência FM11 Ausência FG11 Ausência
F12 Ausência FM12 fungo fil. s/ identif. FG12 Ausência
F13 Cladosporium spp. FM13 Ausência FG13 Ausência
F14 Ausência FM14 Ausência FG14 Ausência
F15 fungo fil. s/ identif FM15 Ausência FG15 Ausência
F16 Ausência FM16
Aspergillus niger.
FG16 Ausência
F17 Phoma spp. FM17 Ausência FG17 Ausência
F18 Ausência FM18 Chaetomium spp. FG18 Ausência
F19 Ausência FM19 Ausência FG19 Ausência
F20 Ausência FM20 Ausência FG20 Ausência
F21 Ausência FM21 Ausência FG21 Ausência
F22 Ausência FM22 Ausência FG22 Ausência
F23 Ausência FM23 Ausência FG23 Ausência
F24 Ausência FM24 Ausência FG24 Ausência
F25 Ausência FM25 Ausência FG25 Ausência
F26 Ausência FM26 Ausência FG26 Ausência
F27 Ausência FM27 Ausência FG27 Ausência
F28 Ausência FM28 Ausência FG28 Ausência
F29 Ausência FM29 Ausência FG29 Ausência
F30 Ausência FM30 Ausência FG30 Ausência
75
F31 Ausência FM31 Ausência FG31 Ausência
F32 Ausência FM32 Ausência FG32 Ausência
F33 Ausência FM33 Ausência FG33 Ausência
F34 Ausência FM34 Syncephalastrum spp. FG34 Ausência
F35 Rhodotorulla spp. FM35 Ausência FG35 Ausência
Quadro 2 - Os grupos dos ossos examinados a fresco (F), conservados em mel (M) e os ossos conservados em glicerina (G), além dos agentes que foram isolados através dos
testes realizados em Ágar Saboraud. Avaliação micológica.
76
4.4 Avaliação estatística
4.4.1 Ensaios biomecânicos
No teste t pareado foi estipulado que o grupo onde os ossos foram mantidos em
glicerina possuíam as mesmas dimensões volumétricas do grupo onde o mel foi utilizado, pois
não houve diferença estatística nestas medidas, visto que eram ossos contralaterais de um
mesmo animal. Dessa forma foi possível comparar de forma confiável as médias de carga (N)
que cada grupo suportou. A média do grupo da glicerina foi de 7027,7N , com desvio padrão
de 2630,7, para mais ou para menos e a do mel foi 6547,0N, com desvio padrão de 2256,7,
para mais ou para menos. Isto significa que houve diferença significativa, assim sendo, são
dois grupos diferentes estatisticamente, pois o valor obtido foi P =0,0155. Levando-se em
consideração que qualquer resultado onde P for menor que 0,05 representa resultado
significativo, foi possível verificar que os ossos conservados em glicerina suportaram um
esforço maior que os ossos mantidos em mel.
No teste de regressão linear também foi evidenciado que o grupo da glicerina foi mais
eficiente na manutenção da resistência do que o agente mel. Isto pode ser evidenciado pela
Tabela 2 e pela Figura 3, onde a reta azul (glicerina) se encontra sobre a reta vermelha (mel),
demonstrando que existe diferença significativa da relação volume versus resistência a favor
do grupo onde os ossos foram mantidos em glicerina a 98%. A presente avaliação também
demonstrou que quanto proporcionalmente maior for o volume estudado, sempre a glicerina
irá suportar maior esforço compressivo axial.
Tabela 2 - r significa o coeficiente de regressão, r
2
coeficiente de regressão linear, y= a+bx equação de
regressão linear, a é a constante onde a reta encosta em N e b é o slope, que é a inclinação das retas no
gráfico, onde mostra que a glicerina foi mais eficiente que o mel
CONSERVANTE
n
r
r
2
Y = a + b . x
MEL
50
0,74
0,55
Y = 3878 + 2,407.x
GLICERINA
50
0,78
0,60
Y = 3767 + 2,490.x
77
Figura 3 – Gráfico da regressão linear entre mel e glicerina em
relação ao volume versus resistência dos ossos
4.4.2 Avaliação bacteriológica
Na avaliação estatística dos achados bacteriológicos foi utilizado como parâmetro o
teste Qui-quadrado. Foi verificado que a glicerina demonstrou ser um agente bactericida
muito mais eficaz que o mel, pois apresentou um P < 0.0001 , sendo que abaixo de P < 0,01 já
se considera extremamente significativa esta diferença. Tal comparação pode ser visualizada
na Tabela 3.
Tabela 3 - Resultado do Teste Qui-quadrado demonstrando que a glicerina foi mais eficiente que o mel na
inibição do crescimento de bactérias (P < 0.0001).
AGENTE CRESCIMENTO AUSÊNCIA TOTAL
GLICERINA
2 (3%)
33 (47%)
35 (50%)
MEL
35 (50%)
0 (0%)
35 (50%
TOTAL
37 (53%)
33 (47%)
70 (100%)
78
4.4.3 Avaliação micológica
Na avaliação estatística dos achados micológicos também foi utilizado como
parâmetro o teste Qui-quadrado. Foi verificado que a glicerina demonstrou ser um agente
fungicida mais eficaz que o mel, pois apresentou um P < 0.0317, sendo que abaixo de P <
0,05 já se considera significativa esta diferença. Tal comparação pode ser visualizada na
Tabela 4.
Tabela 4 – Resultado do Teste Qui-quadrado demostrando que a glicerina foi mais eficiente que o mel na
inibição do crescimento de fungos (P < 0.0317).
AGENTE CRESCIMENTO AUSÊNCIA TOTAL
GLICERINA
0 (0%)
35 (50%)
35 (50%)
MEL
5 (7%)
30 (43%)
35 (50%
TOTAL
5 (7%)
65 (93%)
70 (100%)
79
5 CONCLUSÕES
- Com relação aos ensaios biomecânicos compressivos foi possível concluir que a
glicerina é estatisticamente mais eficiente que o mel, pois foram comparados ossos
provenientes de mesmos animais, mesmas dimensões e ainda assim o primeiro
agente manteve fêmures mais íntegros. Por outro lado, foi verificado que não é
possível comparar de forma biomecânica ossos provenientes de animais diferentes,
devido as diferenças raciais e individuais citadas no estudo;
- A prensa compressiva utilizada foi eficiente na obtenção dos valores encontrados,
concordando com os modelos descritos na literatura. Também o parâmetro
estipulado para as medições ósseas demonstrou ser eficiente nos grupos
anteriormente citados, visto que não houve diferenças significativas de volume
entre amostras contralaterais de um mesmo animal;
- Na avaliação bacteriológica a glicerina foi superior como agente bactericida. O
mel, apesar de possuir agentes não patogênicos, não é eficiente nesse aspecto e não
pode ser recomendado como agente conservante sem prévio processamento;
- Na avaliação micológica, embora o crescimento fúngico não fosse tão grande, a
glicerina eliminou todos os agentes estudados, fato não acontecido com o mel;
- Para finalizar, ficou demonstrado que as coletas de segmentos ósseos devem ser
sempre através de modo asséptico, pois por menor que seja a porcentagem, sempre
há o risco de permanecerem patógenos. Os meios devem sempre ser testados antes
da coleta e o material a ser implantado deve ser analisado para que não haja dúvida
da presença de patógenos.
80
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