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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Biociências
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular
ESTRUTURA POPULACIONAL, FILOGEOGRAFIA E EVOLUÇÃO
DE Passiflora alata CURTIS (PASSIFLORACEAE) NO ESTADO DO
RIO GRANDE DO SUL
Patrícia Koehler-Santos
Orientador: Francisco Mauro Salzano
Co-Orientadora: Loreta Brandão de Freitas
Tese submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Genética e Biologia Molecular
da UFRGS como requisito parcial para a
obtenção do grau de Doutor em Ciências.
Porto Alegre
Março de 2005
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
2
INSTITUIÇÕES E FONTES FINANCIADORAS:
- Laboratório de Evolução Molecular, Departamento de Genética, Instituto de Biociências,
UFRGS
- Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, Faculdade de Biociências, PUCRS
- Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX)
- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS)
- Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PROPESQ-
UFRGS)
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3
"Semeia um pensamento e colherás um desejo; semeia
um desejo e colherás a ação; semeia a ação e colherás
um hábito; semeia o hábito e colherás o caráter."
(Tihamer Toth)
4
Dedico esta tese aos meus mais fiéis e verdadeiros
amigos, meus pais. Agradeço pelo amor, dedicação,
carinho e, acima de tudo, por sempre me incentivarem
a lutar pelos meus objetivos.
5
AGRADECIMENTOS
O desenvolvimento e a conclusão deste trabalho só foram possíveis porque pude
contar com o apoio e a colaboração de muitas pessoas, que atuaram direta ou
indiretamente.
À minha querida amiga Aline P. Lorenz-Lemke, pelo auxílio imprescindível em
praticamente todas as saídas de campo e em muitas outras etapas do desenvolvimento do
trabalho.
A todos que se dispuseram a me acompanhar pelas estradas do Rio Grande em
busca de amostras, ou que me forneceram após coletas pessoais.
Aos amigos A. C. Cervi e João R. Stehmann, pelo auxílio na obtenção de
exemplares de outros Estados brasileiros.
Às amigas Pakisa Togni e Valéria C. Muschner, pelo auxílio na obtenção de alguns
dados.
Aos amigos Eduardo Eizirik e Nelson J. R. Fagundes, pelo inestimável auxílio nas
análises estatísticas e interpretação dos dados, além de importantes sugestões.
Aos professores Andreas Kindel e Thales R. O. de Freitas, pelo auxílio na
interpretação das impressões dentárias nos frutos de P. alata.
Aos professores Cláudio Mondin e Sandro L. Bonatto, pelas leituras críticas dos
manuscritos e fundamentais considerações.
À Laci Krupahtz, pela amizade, carinho e auxílio constantes.
Ao Elmo Cardoso e à Ellen Mezzeck, pela presteza em resolver várias questões de
natureza oficial junto ao Programa de Pós-Graduação.
Aos orientadores Francisco M. Salzano e Loreta B. de Freitas, pela amizade,
compreensão, e pelo apoio e confiança depositados.
Aos amigos do laboratório de Evolução Molecular do Departamento de Genética,
Aline, Carlos André, Cláudia, Dânae, Franceli, Geraldo, Jaque, Joana, Pakisa, Valéria e
Verônica, pelo companheirismo, amizade, momentos de descontração, troca de idéias...
Aos muitos outros amigos e colegas do Departamento.
Aos amigos da Faculdade de Agronomia, Danielle, Emerson, Mariângela, Paulo,
Tatiana Boff, Vinícius e Prof. Sandra Milach, pelo auxílio laboratorial.
A todos vocês, um muito obrigado!
6
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................................... 07
ABSTRACT................................................................................................................. 09
CAPÍTULO I INTRODUÇÃO.................................................................................... 11
I.1. Invasões biológicas................................................................................................ 12
I.2. Filogeografia.......................................................................................................... 17
I.3. Marcadores moleculares........................................................................................ 18
I.4. As passifloras......................................................................................................... 24
I.5. Passiflora alata Curtis........................................................................................... 25
CAPÍTULO II OBJETIVOS........................................................................................ 29
CAPÍTULO III 1º ARTIGO: ECOLOGICAL-EVOLUTIONARY
RELATIONSHIPS IN Passiflora alata FROM RIO GRANDE DO SUL, BRAZIL
31
CAPÍTULO IV 2º ARTIGO: MOLECULAR GENETIC VARIATION IN
Passiflora alata (PASSIFLORACEAE), AN INVASIVE SPECIES IN
SOUTHERN BRAZIL
49
CAPÍTULO V DISCUSSÃO....................................................................................... 87
CAPÍTULO VI REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................... 92
7
RESUMO
______________________________________________________________
RESUMO
8
Passiflora alata apresenta uma ampla distribuição natural no território brasileiro,
ocorrendo na porção centro-leste do país; entretanto, no Estado do Rio Grande do Sul, a
espécie foi introduzida apenas como cultivada há aproximadamente 70 anos. Em anos
recentes, há registros de mudança de sua condição, caracterizando-a como subespontânea.
Com a finalidade de investigar a atual distribuição da espécie no Estado, comprovar o seu
status ecológico, bem como caracterizar a sua composição genética, foram realizadas
coletas intensivas em todo o Estado e desenvolvidos testes quanto às seqüências de onze
sistemas de marcadores genéticos, sendo oito pertencentes a regiões plastidiais [cinco locos
de microssatélites de cloroplasto (cpSSRs); espaçadores intergênicos trnL-trnF e psbA-
trnH; e o íntron do gene trnL], e três a regiões nucleares [espaçadores internos transcritos
do DNA ribossomal ou ITS; segmento parcial do gene gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase (gpd ou G3pdh); e o 2º íntron do gene LEAFY]. Foi coletado um total de 192
espécimes, e um número bem maior foi observado em praticamente todas as regiões
geomorfológicas do Estado, mas a maior abundância foi encontrada nas regiões da Planície
Costeira e Depressão Central. Espécimes de outros Estados brasileiros (onde a espécie
apresenta ocorrência natural) foram obtidos com o objetivo de se comparar as composições
genéticas destes indivíduos de ocorrência nativa com os de ocorrência não-nativa. Também
foram realizadas buscas em herbários do Estado para documentar a presença da espécie em
épocas anteriores à atual. Nos estudos genéticos, que envolveram 85 plantas, não foi
encontrada variação intraespecífica nas regiões plastidiais, mas os segmentos nucleares
forneceram importantes informações. A alta variação genética identificada e aspectos
específicos da mesma, combinados com os dados de campo e históricos, sugerem que a
espécie está em expansão populacional no território riograndense. A alta variabilidade
intrapopulacional e a ausência de um padrão filogeográfico indicam que está ocorrendo um
intenso fluxo gênico entre as populações, que os grupos fundadores devem ter sido
formados por um ou mais indivíduos geneticamente bem distintos, e que devem ter
ocorrido introduções sucessivas. Há indicações de que a espécie apresenta uma boa
plasticidade genética relacionada à ocupação de novos territórios.
9
ABSTRACT
______________________________________________________________
ABSTRACT
10
Passiflora alata presents a wide natural distribution in the Brazilian territory,
occurring in the center-east portion of the country; however, in the State of Rio Grande do
Sul, the species was introduced in cultivation form only at about 70 years ago. In recent
years there are reports of change in its condition, characterizing it as subspontaneous. The
present study was conducted to investigate the present distribution of the species in the
State, to check its ecological status, and to characterize its genetic composition. Intensive
collections were made in the entire State, and tests were performed in relation to the
sequences of eleven genetic systems, eight from plastid regions [five chloroplastic
microsatellites (cpSSRs); the trnL-trnF and psbA-trnH intergenic spacers; and the intron of
the trnL gene] and three from nuclear regions [ribosomal DNA internal transcribed spacers
or ITS; partial segment of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3pdh or gpd)
gene; and the second intron of the LEAFY gene]. A total of 192 specimens were collected,
and a much larger number was observed in practically all geomorphologic regions of the
State, but the species was more abundant in the Coastal Plain and Central Depression
regions. Specimens were also obtained from other Brazilian States, where P. alata occurs
in the wild state, to compare the native and non-native gene sequences. Searches were also
made in herbaria of the State to document its presence in previous times. In the genetic
studies, which involved 85 plants, no intraspecific variation was found in the plastid
regions, but the nuclear segments furnished important information. The high genetic
variability identified and specific aspects of it, combined to field and historical data,
suggest that the species is in population expansion in Rio Grande do Sul’s territory. The
high intrapopulation variability and the absence of a phylogeographic pattern indicated that
an extensive gene flow is occurring between populations, that the founder groups should
have been formed by one or more genetically well distinguished individuals, and that
successive introductions should have occurred. Indications have been found that the
species presents good genetic plasticity related to the occupation of new territories.
11
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
12
I.1. Invasões biológicas
Nos últimos 500 anos, muitas espécies de plantas têm sido introduzidas em novas e
distintas localidades, propositadamente ou inadvertidamente, pela horticultura, silvicultura,
aqüicultura, agricultura ou outras atividades humanas, determinadas pelo aumento do
comércio global e das atividades turísticas (Vitousek et al. 1997; Villablanca et al. 1998;
Kolar & Lodge 2001; McCauley et al. 2003; Daehler et al. 2004; Meyer & Lavergne 2004;
Müller-Schärer et al. 2004). Destas, muitas se tornaram culturas economicamente
importantes, como as plantas ornamentais, de crescimento bem sucedido, empregadas na
indústria verde (estufas comerciais, jardinagem e atividades horticulturais) e as utilizadas
na agricultura, mas outras tiveram um efeito nocivo na flora e fauna nativas, sendo
consideradas como pragas e/ou invasoras (McCauley et al. 2003; Meyer & Lavergne
2004).
Distintos biomas, como as de regiões de clima temperado utilizadas para a
agricultura, ou regiões urbanas, estão entre os mais susceptíveis à invasão, enquanto que
desertos e savanas são considerados os menos propensos (Lonsdale 1999). Nas florestas
tropicais, a freqüência de plantas invasoras é geralmente baixa, porque a grande maioria
das espécies exóticas, quando transportadas para os países tropicais, são deficientes de
características históricas específicas, principalmente a tolerância a locais sombreados,
necessárias para uma invasão bem-sucedida nestes ambientes não alterados. Por outro lado,
em florestas tropicais alteradas, as espécies exóticas são freqüentemente predominantes e
alteram, irreparavelmente, esses ecossistemas. O mesmo ocorre em florestas temperadas,
que são mais fragmentadas do que as tropicais e, por isso, mais susceptíveis às invasões
(Fine 2002).
Quando se fala em introdução, o que se quer dizer é que uma planta (ou seus
propágulos) foi transportada pelo homem através de uma grande barreira geográfica; a
naturalização começa quando barreiras abióticas e bióticas à sobrevivência do organismo
são superadas e quando várias barreiras para a reprodução regular são vencidas; invasão,
por outro lado, requer que plantas introduzidas produzam descendência reprodutiva em
áreas distantes dos locais de introdução (escalas aproximadas: mais de 100 m e menos de
50 anos para unidades taxonômicas propagadas por sementes ou outros propágulos; mais
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
13
de 6 m/3 anos para tais unidades que se propagam por raízes, rizomas, estolões ou ramos
rastejantes) (Richardson et al. 2000).
Uma teoria diz que uma comunidade de plantas torna-se mais susceptível à invasão
quando existe um aumento na quantidade de recursos não utilizados (Davis et al. 2000;
Fine 2002). Outra assume que espécies invasoras devem ter acesso aos recursos
disponíveis como luz, nutrientes e água, e que o maior sucesso ao invadir uma comunidade
é não encontrar uma intensa competição por esses recursos com as espécies residentes.
Também os níveis de nutrientes no solo são importantes na determinação da
susceptibilidade da comunidade à invasão (Davis et al. 2000).
A invasão efetiva em um ambiente por novas espécies é influenciada por três
fatores: o número de propágulos entrando no novo ambiente (pressão do propágulo), as
características das novas espécies e a susceptibilidade do ambiente à invasão por essas
novas espécies. A susceptibilidade à invasão é uma propriedade emergente de um
ambiente. É o resultado de diversos fatores, incluindo o clima da região, o regime de
perturbação do ambiente e as capacidades competitivas das espécies residentes. Esta
característica também pode ser afetada pela presença (ou ausência) de herbívoros,
patógenos, mutualistas e efeitos facilitadores da vegetação residente (Lonsdale 1999; Davis
et al. 2000).
Outros fatores também são amplamente aceitos para aumentar o desempenho
(abundância, vigor) de muitas plantas invasoras nos locais de introdução quando eles são
comparados com seus locais nativos. Primeiro: algumas espécies podem ser naturalmente
melhores competidoras porque elas evoluem em um ambiente mais competitivo. Em seu
local de introdução, as plantas invasoras podem competir com plantas que lhes são
inferiores, enquanto que em seus locais de origem, as vantagens podem não ser tão
evidentes. Segundo: plantas invasoras têm apresentado, freqüentemente, pequenas perdas
causadas por inimigos naturais, particularmente herbívoros, em seu local de introdução,
porque estes geralmente estão ausentes. Neste ambiente benigno, portanto, os recursos
normalmente gastos para a defesa podem ser alocados para o crescimento e/ou reprodução,
através de uma resposta fenotípica plástica (hipótese EICA, Evolution of Increased
Competitive Ability) (Siemann & Rogers 2001; Hänfling & Kollmann 2002; Keane &
Crawley 2002; Wolfe 2002; Müller-Schärer et al. 2004).
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
14
Invasões de plantas, portanto, podem ser descritas por uma seqüência de fases
distintas: a chegada de propágulos na nova área; o estabelecimento das populações
(usualmente coincidindo com uma fase de lento crescimento); e uma segura e rápida
expansão do tamanho e do número das populações. Além da dispersão, a chave para as
invasões de plantas é o estabelecimento bem sucedido nos novos locais de ocorrência.
Idealmente, os primeiros anos de desenvolvimento populacional devem levar a
distribuições de freqüência na idade, no número e no tamanho dos indivíduos que
possibilitem à população tornar-se residente e estável. Assim, investigações dos padrões de
desenvolvimento demográfico inicial, determinados pelas interações de características
históricas das plantas com importantes fatores locais, como intensidade dos distúrbios,
pode ser a chave de acesso para o entendimento de invasões vegetais (Dietz et al. 1999).
Além das características históricas específicas, a adaptabilidade fenotípica e genética às
novas condições ambientais também estão, freqüentemente, envolvidas nestas invasões
(Dietz et al. 1999; Bleeker 2003).
A composição genética de uma espécie introduzida e/ou invasora é influenciada
pela história de sua introdução, bem como pela história de suas características. Populações
de espécies naturalizadas, que foram intencionalmente introduzidas diversas vezes por um
período prolongado, podem ter uma maior diversidade genética do que espécies que foram
introduzidas, não intencionalmente, uma ou poucas vezes. Cada nova introdução, portanto,
pode aumentar a probabilidade de introduzir variabilidade genética adicional (Pappert et al.
2000; Petit et al. 2004) e, eventualmente, favorecer o sucesso no estabelecimento e na
invasão por espécies não-nativas (Ellstrand & Schierenbeck 2000; Fine 2002). Hibridação,
tanto interespecífica quanto entre populações previamente isoladas de uma mesma espécie,
e mudanças no nível de ploidia também podem ser fortes determinantes da aptidão nas
espécies invasoras (Ellstrand & Schierenbeck 2000; Hänfling & Kollmann 2002; Lee
2002; Bleeker 2003). Também a variância genética aditiva, as interações epistáticas, as
recombinações genéticas, a ação de poucos genes, bem como os rearranjos genômicos
podem facilitar o sucesso da invasão (Lee 2002).
Em estudos realizados com espécies ornamentais como Lathyrus latifolia (Godt &
Hamrick 1991) e Lonicera japonica (Schierenbeck et al. 1995), que foram
intencionalmente introduzidas diversas vezes no sudeste dos Estados Unidos, foi verificada
a existência de altos índices de variação genética nos locais em que elas foram
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
15
introduzidas. Pappert et al. (2000), ao estudarem a espécie Pueraria lobata (Fabaceae),
também verificaram que esta manteve altos índices de diversidade genética em todo o
sudeste dos Estados Unidos. Fatores que influenciaram estes níveis incluíram diversas
introduções por mais de cinco décadas, reprodução sexual bem sucedida, permitindo fluxo
gênico dentro e entre as populações, bem como populações fundadoras com mais de um
indivíduo geneticamente distinto. Também o estudo de Facon et al. (2003) documentou
múltiplos eventos de invasão da espécie do gênero Melanoides no Novo Mundo, sem
redução na variação molecular e morfológica da espécie (a diversidade molecular
encontrada foi alta e similar à da área original).
A introdução intencional de espécies de plantas pode também afetar padrões
regionais de variação genética se propágulos geneticamente diferenciados forem
introduzidos em regiões geográficas diferentes. A introdução pode relacionar-se a
tentativas de igualar habitats nativos nos locais recipientes, ou ser ocasionada pela
introdução acidental de propágulos geneticamente diferenciados nestes locais. Em
quaisquer dos casos, cada foco de introdução deve impactar a distribuição da variação
genética nas populações invadidas. Alternativamente, com múltiplas introduções aleatórias
em cada região, seguidas de troca gênica substancial entre as populações, não haverá um
padrão regional. Em todo o caso, o estabelecimento bem-sucedido de uma ou poucas
plântulas pode ser suficiente para introduzir genótipos novos/recentes em uma população.
Enquanto sob condições favoráveis para a produção e recrutamento de sementes, a
reprodução sexual pode incrementar significantemente a diversidade genética de
populações individuais (Pappert et al. 2000).
A variação genética em populações fundadoras é em geral baixa porque
normalmente migraram poucos indivíduos de uma população, e repetidas colonizações são
usualmente infreqüentes (Novak et al. 1993; Villablanca et al. 1998). Devido a esta baixa
diversidade genética inicial, um alto grau de plasticidade fenotípica deve ser uma forma
alternativa de povoar os novos ambientes (Hänfling & Kollmann 2002). Além disso,
populações naturalizadas devem apresentar uma maior diferenciação genética
interpopulacional se elas surgirem de fundadores diferentes, em locais muito separados e
com diferentes ambientes. Por outro lado, quando existem múltiplas introduções de
genótipos diferentes em um mesmo local (ou áreas adjacentes), seguida por migração local,
a variação genética em populações fundadoras pode ser alta. Este cenário também pode
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
16
minimizar a diferenciação genética entre populações introduzidas em locais amplamente
separados. Desta forma, séries de genótipos que não são encontrados juntos no ambiente
nativo podem estar reunidos dentro de uma mesma população no ambiente da introdução
(Novak et al. 1993). A estrutura genética de espécies introduzidas neste novo ambiente,
portanto, depende (ao menos em parte) do seu padrão de introdução, tal como o tamanho
da(s) população(ões) fundadora(s), do número de introduções, da diferenciação genética
entre populações originais, do nível de fluxo gênico pós-imigração, dos efeitos fundadores,
do isolamento geográfico e das pressões seletivas nos pontos de introdução (Novak et al.
1993; Dietz et al. 1999).
Merilä et al. (1996) encontraram níveis similares de variabilidade genética em
populações nativas (Europa) e introduzidas (Nova Zelândia) de Carduelis chloris, uma
espécie de ave, consistentes com as expectativas teóricas de que o tamanho da população
fundadora foi relativamente grande (mais de 60 indivíduos). Foi documentado também um
aumento rápido no tamanho populacional diretamente após a colonização, além da
ocorrência de múltiplas introduções.
Le Page et al. (2000), no entanto, ao estudarem populações de Macropus
rufogriseus rufogriseus, uma espécie de canguru existente na Nova Zelândia, e as
compararem com a população original da Tasmânia, verificaram que o número de
fundadores desta espécie introduzida no século XIX foi extremamente baixo, e que um
forte efeito fundador fez com que os níveis de diversidade alélica e de heterozigosidade
fossem reduzidos.
Também Ye et al. (2004) verificaram que um freqüente efeito fundador teria sido a
principal causa da estrutura genética observada em Chromolaena odorata (Asteraceae):
toda a população exibiu baixos níveis de variação genética e não foi detectada qualquer
variação intrapopulacional.
Marston & Villalard-Bohnsack (2002) concluíram que a baixa diversidade genética
observada dentro da população de Grateloupia doryphora (Halymeniaceae, Rhodophyta),
introduzida nas águas de Rhode Island, teria sido causada ou pela sua pequena população
fundadora ou pelo fato de que esta era derivada de uma fonte geneticamente uniforme.
Diversidade dentro de uma espécie pode ser convertida em divergência entre
populações quando a espécie torna-se fragmentada, porque eventos fundadores amostram
apenas uma pequena proporção da variação ancestral e tendem a incluir alelos do clado
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
17
filogenético dominante. Estrutura filogeográfica entre populações fundadoras recentes
também pode ocorrer se cada população derivada for fundada a partir de uma população
diferente da população original filogeograficamente estruturada (Davies et al. 1999).
I.2. Filogeografia
Métodos filogeográficos oferecem uma maneira de determinar os tipos de
processos contemporâneos e históricos que têm influenciado a atual distribuição geográfica
da variação considerada (Avise 2000).
Muitas espécies com distribuição geográfica ampla podem ser compostas por
populações cujos membros ocupam diferentes ramos de uma árvore filogenética
intraespecífica. O processo de subdivisão de populações pode levar, também, a uma
distribuição geográfica de linhagens, tanto em um nível infragenérico como em um
intraespecífico (Avise et al. 1987; Avise 1994). Espécies que não mostram uma estrutura
populacional filogeográfica geralmente tiveram uma história de vida onde predominaram
dispersão e fluxo gênico a longas distâncias. Por outro lado, espécies com grupos
monofiléticos bastante distintos geralmente experimentaram longos períodos de barreira ao
fluxo gênico. Portanto, com o aumento do tempo desde o isolamento geográfico, espera-se
que o grau de diferenciação filogeográfica entre grupos genealógicos aumente (Avise
1994).
A filogeografia, de acordo com Avise et al. (1987), é baseada na distribuição
espacial de linhagens filogenéticas e permite a detecção de correlação entre a distribuição
geográfica de haplótipos e a sua relação genealógica. Assim, a separação filogeográfica
dentro das espécies pode estar correlacionada com os limites entre províncias
biogeográficas (Avise 1992, 1994).
Esta área da ciência, conseqüentemente, propicia um novo discernimento do papel
do fluxo gênico na estruturação de populações vegetais. Especificamente, fornece uma
maneira de detectar eventos de fluxo gênico histórico e recorrente e pode potencialmente
discriminar entre fluxo gênico e padrões causados por polimorfismo ancestral. No nível
intrapopulacional, a troca genética, ao invés das relações históricas, tem sido enfatizada
como o determinante na estrutura genética, que por sua vez reflete um equilíbrio entre
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
18
deriva genética e fluxo gênico. No nível interpopulacional, entretanto, o relacionamento
histórico tem sido enfatizado como o determinante da similaridade genética (Schaal et al.
1998).
Análises filogeográficas contam com uma interpretação de padrões de congruência
ou falta de congruência entre a distribuição geográfica dos haplótipos e suas relações
genealógicas. Um padrão de congruência é visto se clados de haplótipos proximamente
relacionados são geograficamente restritos e ocorrem próximos uns aos outros. Cada
congruência indica um padrão antigo de fluxo gênico altamente restrito. A maioria dos
haplótipos antigos deve estar localizada no centro da árvore gênica e ter uma distribuição
mais ampla geograficamente, enquanto que os haplótipos mais recentes devem estar nas
extremidades desta árvore e ter uma distribuição mais localizada. Este padrão de
congruência pode ser violado se os polimorfismos persistirem e se forem fixados
diferencialmente, seguindo a divergência das populações, ou se ocorrer o fluxo gênico
interpopulacional (Schaal et al. 1998).
Muitos estudos baseiam-se na variabilidade dos genomas de organelas, alguns dos
quais são mais conservados quando comparados ao genoma nuclear. Além disso, eles não
apresentam recombinação, como o cloroplasto para plantas (cpDNA) e a mitocôndria para
animais (mtDNA) (Birky 1988; Swofford & Olsen 1990; Avise 1994). Desta forma,
espera-se que a estrutura genética do genoma nuclear seja mais influenciada por fatores
históricos como o fluxo gênico no passado, além de eventos geológicos como as glaciações
e mudanças climáticas que afetam a distribuição geográfica das espécies e portanto a ação
de fatores seletivos (Avise et al. 1987; Avise 1994; Schaal et al. 1998). A análise do DNA
de cloroplastos, que geralmente possui herança uniparental em angiospermas, juntamente
com o estudo do DNA genômico, com herança biparental, permite obter informações sobre
a importância relativa do fluxo gênico, via pólen (DNA nuclear) e semente (cpDNA), na
estrutura das populações (McCauley 1995; Schaal et al. 1998).
I.3. Marcadores moleculares
A biologia molecular tem fornecido ferramentas valiosas para uma rápida e
detalhada análise genética de organismos superiores. Talvez a mais importante dessas
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
19
ferramentas seja o uso de marcadores baseados em DNA, que detectam diferenças simples
na informação genética presente em dois ou mais indivíduos, e servem para diversos
propósitos, tais como: testes de paternidade, identificação de genes responsáveis por
doenças genéticas, estudos de evolução e construção de mapas genéticos, bem como em
estudos de caracterização de variabilidade e estrutura populacional (Paterson et al. 1991;
Plaschke et al. 1995; Liou et al. 1996; Guilford et al. 1997; Russell et al. 1997; Coletta
Filho et al. 1998, 2000; Fajardo et al. 1998; Struss & Plieske 1998; Pestsova et al. 2000).
Diferentes experimentos no início dos anos 80 demonstraram que os genomas
eucariotos apresentam diferentes classes de seqüências repetidas, umas mais complexas
(minissatélites) e outras mais simples, denominadas de Simple Sequence Repeats (SSR) ou
microssatélites (Hamada et al. 1982; Tautz & Renz 1984).
Microssatélites ou seqüências microssatélites são seqüências de DNA
moderadamente repetitivas que estão presentes e igualmente distribuídas na eucromatina
do genoma de vertebrados, insetos e plantas (Charlesworth et al. 1994). Estas seqüências
apresentam herança mendeliana codominante e são, presumivelmente, neutros em termos
seletivos. Consistem de pequenas seqüências com um a quatro nucleotídeos de
comprimento, repetidas em tandem e localizadas entre os genes ou dentro de íntrons;
apresentam polimorfismo derivado da variação do número de repetições das subunidades e
da alta taxa de mutação. Este polimorfismo é acessado por Reação em cadeia da DNA
Polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction - PCR) e é de fácil interpretação, o que
tem permitido seu emprego com as mais diferentes finalidades, como para caracterizar
linhagens endocruzadas, mapear genes, investigar a ligação com diversos marcadores
citogenéticos, estudos forenses, genética médica, estudos que comparam o seu
polimorfismo com o de locos protéicos, e estudos populacionais (Engel et al. 1996;
Ferreira & Grattapaglia 1998; Lima-Rosa 1998).
Os microssatélites são comparativamente raros no DNA organelar. O único tipo de
seqüência simples encontrado no genoma do cloroplasto de plantas superiores é constituído
por pequenas seqüências de poli(A) ou poli(T), com tamanho máximo de 20 pb. A
variabilidade resultante dos resíduos de A e T demonstraram que as seqüências simples
repetidas podem fornecer um eficiente sistema para avaliar a estrutura genética de
populações de plantas, bem como para o estudo da herança do cloroplasto (Weising &
Gardner 1999).
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
20
Os genomas organelares são considerados valiosas ferramentas nos estudos
evolutivos, devido à não-recombinação e à herança uniparental. Entretanto, em plantas a
detecção de polimorfismo útil em nível de população é muito difícil devido ao pequeno
número de substituições no genoma do cloroplasto, às baixas taxas de substituição e à
recombinação intramolecular do DNA mitocondrial (mtDNA). Os microssatélites de
cloroplasto representam um marcador potencial para transpor este problema, e estudos têm
demonstrado altos níveis de variabilidade intraespecífica. Os marcadores específicos de
cloroplasto são bons indicadores da ocorrência de reduções populacionais (bottlenecks),
deriva genética e efeitos do fundador (Provan et al. 2001).
O DNA cloroplasmático (cpDNA) consiste de uma molécula circular com peso
molecular variável de 83 a 128x10
6
(1,21 a 1,93x10
5
pares de bases), com cerca de 85% de
suas seqüências apresentando-se em cópia única. Existem de 30 a 200 cópias de DNA por
cloroplasto. Vários genes foram identificados neste DNA circular, e uma de suas principais
características é a presença de duas cópias das seqüências de DNA ribossomal. Essas
seqüências estão presentes freqüentemente, embora nem sempre, em grandes repetições
invertidas (Mantell et al. 1994).
Böhle et al. (1994) verificaram que o DNA de cloroplasto vem sendo bastante
empregado em inferências filogenéticas relacionadas a níveis taxonômicos baixos em
angiospermas, embora a maioria das investigações tenha utilizado a variação de sítios de
restrição. De acordo com Sánchez et al. (1999), o cpDNA é especialmente útil para
análises taxonômicas devido à sua natureza conservadora e sua relativa abundância na
célula, quando comparado com o DNA nuclear. A baixa taxa de trocas estruturais no seu
genoma é particularmente apropriada para inferir relações interespecíficas. Seqüências de
partes não codificadoras do genoma cloroplasmático têm sido utilizadas em estudos de
sistemática em níveis taxonômicos baixos por serem relativamente mais variáveis (Small et
al. 1998; Friesen et al. 1999). As regiões não codificadoras tendem, portanto, a evoluir
mais rapidamente do que regiões codificadoras. Mutações do tipo inserção/deleção nas
regiões não codificadoras ocorrem em uma taxa quase igual à de substituição nucleotídica,
acelerando a divergência destas regiões (Clegg & Zurawski 1991; Gielly & Taberlet 1994).
Dentre as seqüências codificadoras mais utilizadas para a reconstrução filogenética
em níveis taxonômicos acima de família estão os genes rbcL, que codificam a subunidade
maior da proteína RuBisCo (Clegg 1993), bem como ndhF e matK (Gielly et al. 1996).
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
21
O espaçador intergênico trnL-trnF tem sido o mais amplamente utilizado em
estudos de regiões não codificadoras do cpDNA (Böhle et al. 1994; Gielly & Taberlet
1994; Mes & Hart 1994; van Ham et al. 1994; Sang et al. 1997; Bayer & Starr 1998;
McDade & Moody 1999; Renner 1999; Bakker et al. 2000; Schwarzbach & Ricklefs
2000). Também os espaçadores psbA-trnH e atpB-rbcL e o íntron do gene trnL têm
mostrado um número considerável de variações parcimoniosas e informativas que
auxiliaram nas inferências sobre as relações evolutivas de muitas espécies (Manen &
Natali 1995; Sang et al. 1997; Bayer & Starr 1998; McDade & Moody 1999; Renner
1999).
A variação intraespecífica do cpDNA tem facilitado também estudos de fenômenos
como o fluxo gênico, a dispersão de sementes e a diversidade genética dentro e entre
populações, bem como os que envolvem os processos de diferenciação geográfica e
estimativas da quantidade de fluxo gênico entre taxa (Soltis et al. 1991; McCauley 1994,
1995).
O DNA ribossomal nuclear (nrDNA) é encontrado em todos os organismos vivos,
apresenta um grande número de cópias repetidas em tandem no genoma e é conhecido por
ser bastante conservado, exercendo uma função essencial para a manutenção da célula na
tradução do RNA em proteínas. Essas diversas cópias repetidas, que estão em regiões que
possuem diferentes taxas de mudança em suas seqüências, são de grande utilidade em
estudos filogenéticos (Suh et al. 1993; Baldwin et al. 1995; Buckler et al. 1997).
Os genes que formam as subunidades 18S, 5,8S e 26S dos ribossomos estão
separados no DNA por duas regiões espaçadoras que são transcritas junto com o gene, mas
não incorporadas ao transcrito maduro. Estas regiões são conhecidas como Internal
Transcribed Spacers (ITSs), mais precisamente ITS1 e ITS2. O gene 5,8S é flanqueado
pelos espaçadores internos transcritos 1 e 2 (ITS1 e ITS2) e está localizado entre os genes
18S e 26S (Suh et al. 1993; Baldwin et al. 1995).
A região ITS, assim como os outros componentes da família multigênica do
nrDNA, é altamente repetida no genoma nuclear. O nrDNA completo está presente em
mais de mil cópias arranjadas em repetições em tandem em um ou mais loci
cromossômicos. Este grande número de cópias promove a fácil detecção, amplificação e
seqüenciamento do nrDNA. O pequeno tamanho da região espaçadora (ITS1 + ITS2 < 700
pb em angiospermas) e a presença de regiões conservadas flanqueando os dois espaçadores
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
22
faz com que essa região seja facilmente amplificada utilizando-se primers universais
(White et al. 1990; Baldwin et al. 1995).
A família gênica ITS tem uma rápida evolução em concerto via crossing-over
desigual e conversão gênica, que promovem uniformidade intragenômica de unidades
repetidas e acurada reconstrução para espécies correlacionadas. Apesar de evolutivamente
conservada, tem ela alta variabilidade em sua seqüência nucleotídica, o que possibilita que
as seqüências de DNA desses espaçadores sejam utilizadas para resolver questões
filogenéticas de níveis taxonômicos mais baixos, como os infragenéricos (Arnhein 1983;
Hamby & Zimmer 1992; Baldwin et al. 1995).
O modo e o tempo da evolução em concerto do nrDNA varia muito entre diferentes
grupos de plantas e, por isto, os espaçadores internos transcritos do DNA ribossomal (ITS)
podem apresentar variação interespecífica, interpopulacional e até intraindividual (Baldwin
et al 1995; Mayer & Soltis 1999). Geralmente, a diversidade intraindividual é baixa, mas
algumas espécies podem apresentar heterogeneidade nesta região (Buckler et al. 1997;
Denduangboripant & Cronk 2000). Isto pode ocorrer se o processo não for suficientemente
rápido na homogeneização de diferentes cópias devido à hibridação recente, às altas taxas
de mutação, à formação de pseudogenes, ao grande número de loci, à presença em
cromossomos não homólogos, ou à ausência de recombinação sexual (Campbell et al.
1997; Zhang & Sang 1999). Após a hibridação intra-específica (entre diferentes linhagens)
ou interespecífica, as diferentes cópias de ITS (ribotipos) podem evoluir de diferentes
maneiras: perda de uma das cópias parentais com a fixação da outra (evolução em concerto
unidirecional), formação de um novo tipo por meio da recombinação dos tipos parentais,
ou a manutenção de ambos em híbridos recentes (Koch et al. 2003). Neste último caso, o
seqüenciamento direto pode revelar um padrão aditivo (sinal de dois nucleotídeos
diferentes; Fuertes Aguilar & Nieto Feliner 2003).
Além dos genomas organelares e das regiões não codificadoras das repetições
nucleares ribossômicas, a análise de regiões não codificadoras de genes nucleares de cópia
única, com número pequeno de cópias, pode potencialmente fornecer uma amostra
alternativa de variação genética intraespecífica em estudos de plantas (Strand et al. 1997;
Olsen & Schaal 1999; Wall 2002). Os estudos realizados com estes tipos de seqüências
têm demonstrado que os genes nucleares fornecem caracteres adicionais e também são
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
23
filogeneticamente úteis por conter altas porcentagens de caracteres filogeneticamente
informativos (Oh & Potter 2003).
O gene cópia única gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (G3pdh ou gpd) tem sido
utilizado em alguns poucos estudos envolvendo plantas, como no entendimento do período
em que as angiospermas evoluíram (Martin et al. 1989), e na sistemática de plantas (Strand
et al. 1997; Schaal & Olsen 2000), mais especificamente na demonstração de que este gene
possui variabilidade apropriada para estudos filogeográficos intraespecíficos (Olsen &
Schaal 1999) e em reconstruções filogenéticas (Wall 2002).
O gene G3pdh codifica uma enzima catalítica (GAPDH) responsável pela
conversão de glideraldeído 3-fosfato em 3-fosfoglicerato, e é fundamental para a glicólise
e o ciclo de Calvin em plantas e algas. Os dois genes pertencentes à família GAPDH de
eucariotos, GapC e GapAB, são codificados no núcleo. GapAB codifica a GAPDH do ciclo
de Calvin cloroplasmático em plantas e é altamente divergente (mais de 50%) do outro
membro da família, GapC. GapC codifica a GAPDH citosólico da função glicolítica-
gluconeogênica (Shih et al. 1991; Wall 2002).
Também o segundo íntron do gene cópia única LEAFY tem sido utilizado em
reconstruções filogenéticas entre espécies relacionadas, por apresentar uma grande
variação de tamanho e possivelmente por evoluir a altas taxas (Frohlich & Meyerowitz
1997; Oh & Potter 2003).
LEAFY é um gene homeótico que regula o estabelecimento da identidade do
meristema floral e do tempo de florescimento em Arabidopsis. Parálogos do gene em Pinus
radiata, PRFLL e NEEDLY, também estão envolvidos na determinação das identidades dos
primórdios do cone masculino e feminino. Estes genes estão distribuídos por todas as
plantas com sementes, incluindo Gnetales, Cicadaceae, Ginkgo, coníferas e angiospermas.
As análises filogenéticas de seqüências de aminoácidos formadas a partir de seqüências de
LEAFY de várias plantas com sementes sugeriram que LEAFY foi duplicado na linhagem
basal que resultou nas mesmas, mas uma das cópias foi perdida nas angiospermas,
tornando este um gene de cópia única nas espécies diplóides. A estrutura deste gene é
relativamente simples e bem conservada entre as plantas com sementes; existem três exons
e dois íntrons, e a localização destes últimos é bem conservada (Frohlich & Meyerowitz
1997; Oh & Potter 2003).
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
24
I.4. As passifloras
A família Passifloraceae está dividida em duas tribos, Paropsieae e Passiflorieae. A
tribo Paropsieae, com seis gêneros, está representada somente no Velho Mundo, África e
Madagascar. A tribo Passiflorieae é composta por 14 gêneros. Na América Latina, ocorrem
cinco gêneros desta tribo: Tetrastylis, gênero monoespecífico; Ancistrotyrsus, com duas
espécies; Mitostemma, com três; Dilkea, com seis, e Passiflora, com mais de 400 espécies.
A imensa maioria das passifloras está restrita à América Latina, particularmente nas zonas
que não sofrem geadas fortes e nevadas. Somente duas espécies (P. incarnata L. e P.
affinis Engelm.) são encontradas em estado nativo no sul dos Estados Unidos da América
do Norte (Sacco 1980; Escobar 1988; Cervi 1996, 1997; Cervi & Santos 2000).
O gênero Passiflora L. compreende trepadeiras herbáceas ou lenhosas, podendo
apresentar-se como ervas e arbustos de hastes cilíndricas ou quadrangulares, angulosas,
suberificadas, glabras ou pilosas (Feller 1967). Apresentam elas estruturas especializadas
como gavinhas, nectários extraflorais e flores características, sendo conhecidas
popularmente como maracujás, nome de origem tupi-guarani que significa fruta de sugar
(Giavina-Bianchi et al. 1997).
O gênero foi descoberto durante a expansão européia no Novo Mundo, tornando-se
a planta americana mais admirada entre os colonizadores espanhóis dos séculos XVI e
XVII. Primeiramente, esta planta era conhecida com o nome de “Granadilla” mas,
posteriormente, foi denominada de Passiflora ou flor-da-paixão por jesuítas que
relacionaram as estruturas florais da primeira espécie descoberta (P. incarnata) com alguns
instrumentos da paixão de Cristo (Cervi 1997).
Killip (1938) reconheceu 350 espécies de Passiflora com ocorrência nas Américas,
das quais 101 foram citadas para o Brasil, um dos principais centros de diversidade deste
gênero. Armando C. Cervi (comunicação pessoal) reconhece 130 espécies do gênero com
ocorrência no Brasil, o maior número sendo encontrado na Bacia Amazônica. Para o
Estado do Rio Grande do Sul, são reconhecidas 15 espécies (Mondin 2001).
Algumas espécies possuem grande importância econômica por possuírem frutos
comestíveis, propriedades medicinais e serem admiradas como plantas ornamentais (Feller
1967). O suco do maracujá oferece ao organismo que o ingere boa quantidade de vitaminas
hidrossolúveis, especialmente A e C, sais minerais e fibras. Mas o principal prestígio do
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
25
maracujá advém de suas propriedades calmantes e sedativas. De seus frutos, folhas e
sementes extrai-se a passiflorina, um sedativo natural (Silva & Tassara 1996). As folhas
também são usadas na farmacologia brasileira para combater febres intermitentes,
inflamações cutâneas e erisipela, e a casca do fruto e as sementes são utilizadas na
alimentação animal (SEAGRI 2001), além de serem consumidas na forma de farinha
torrada para o combate da diabetes (Srur & Junqueira 2003). Três espécies destacam-se por
sua importância econômica e utilização na alimentação humana: Passiflora edulis Sims f.
flavicarpa Deg – maracujá amarelo, azedo ou peroba; P. edulis Sims – maracujá roxo; e P.
alata Curtis – maracujá doce.
O gênero Passiflora, assim como outros representantes das Passifloraceae,
apresenta uma grande diversidade em suas estruturas florais, e esta diversidade pode ser
interpretada como resultado da seleção natural, sendo os agentes polinizadores um dos
fatores seletivos (Koschnitzke 1993). O sistema reprodutivo funciona predominantemente
por fecundação cruzada. A autofecundação é muito rara e, quando ocorre, são formados
frutos menores e com poucas sementes (Semir & Brown Jr. 1975). Várias classes de
animais são agentes polinizadores, mas em geral a melitofilia (abelhas) é a síndrome floral
predominante; também ocorrem, em um número menor de espécies, as síndromes da
ornitofilia (beija-flores), quiropterofilia (morcegos) e esfingofilia (mariposas) (Semir &
Brown Jr. 1975; Koschnitzke 1993; Koschnitzke & Sazima 1997; Varassin & Silva 1999;
Varassin et al. 2001). A dispersão das sementes é freqüentemente feita por aves e
morcegos, que são atraídos pela coloração e pelo cheiro dos frutos maduros (Semir &
Brown Jr. 1975), embora pequenos mamíferos já tenham sido observados alimentando-se
dos frutos de algumas passifloras (Williams et al. 2000).
I.5. Passiflora alata Curtis
Passiflora alata é uma espécie heliófita e seletiva higrófila que ocorre
principalmente nas capoeiras e capoeirões, situados em solos úmidos e de pouca altitude, e
em áreas de restinga litorânea; mais raramente é encontrada em orlas de florestas. É
amplamente cultivada pela beleza de suas ramagens, flores e frutos, que são comestíveis
(Sacco 1980; Cervi 1996, 1997; Cervi & Santos 2000; Bernacci 2003) (Figura 1).
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
26
Figura 1: Flor de Passiflora alata (foto de A.P. Lorenz-Lemke)
A espécie caracteriza-se por ser uma planta escandente, de caule quadrangular com
os ângulos alados, folhas ovadas ou ovado-oblongas, com flores vermelhas-rosadas de 10-
12 cm de diâmetro, apresentando quatro séries na corona de filamentos, e frutos maduros
de coloração marrom (Sacco 1962, 1980; Feller 1967; Cervi 1996, 1997; Cervi & Santos
2000; Deginani 2001). O florescimento ocorre praticamente durante todo o ano, com
algumas variações conforme o Estado brasileiro; a frutificação restringe-se a períodos que
variam de mais de um a menos de cinco meses, sendo variável em distintas regiões (Sacco
1962, 1980; Koschnitzke 1993; Cervi 1996, 1997; Varassin & Silva 1999; Cervi & Santos
2000; Bernacci 2003). A síndrome floral reconhecida para a espécie é a melitofilia, visto
que esta apresenta uma série de atributos que favorecem este tipo de síndrome, como flores
grandes e filamentos odoríferos; estes são importantes elementos atrativos para as abelhas,
agindo como guias visuais e olfativos. As mamangavas do gênero Xylocopa
(Hymenoptera, Anthophoridae) estão entre os seus principais agentes polinizadores
(Sazima & Sazima 1989; Koschnitzke 1993; Koschnitzke & Sazima 1997; Varassin &
Silva 1999; Varassin et al. 2001). O número cromossômico é 2n = 18 (Guerra 1986; De
Melo et al. 2001), e não foram descritas variantes morfológicas no território brasileiro.
Os frutos possuem um sabor doce e a polpa é utilizada para sucos, geléias e
sorvetes. As folhas são utilizadas na farmacologia sob a forma de chá em situações de
excitações nervosas, histerismo e neurastenia, por apresentarem substâncias sedativas e
hipnóticas. Provoca sono natural, sem produzir depressão nervosa. O constituinte principal
é a passiflorina, composto cianídrico, encontrado na proporção de 0,048% nas folhas. De
acordo com a Farmacopéia Brasileira, recomenda-se utilizar o material obtido em infusões,
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
27
extratos, tintura, xarope e poções. Tanto as raízes como as folhas e sementes são anti-
helmínticas (Sacco 1980; Cervi 1996; Deginani 2001).
P. alata possui uma ampla distribuição no território brasileiro, tendo sido
encontrada nos seguintes estados: Bahia, Distrito Federal, Espírito Santo, Mato Grosso do
Sul, Minas Gerais, Paraná, Pará, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, São Paulo, Santa
Catarina, bem como em outros países da América Latina, como Argentina, Paraguai e Peru
(Killip 1938; Feller 1967; Sacco 1980; Cervi 1996, 1997; Cervi & Santos 2000; Deginani
2001; Bernacci 2003) (Figura 2).
Figura 2
: Mapa da América do Sul
indicando os locais onde existem registros
de Passiflora alata. A sua distribuição
geral não necessariamente é interrompida,
como pode ser sugerido pela figura.
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
28
No Brasil, P. alata é conhecida por diferentes nomes populares como maracujá-de-
refresco (Brasil em geral), maracujá-guaçú (Paraná), maracujá-açú (São Paulo e Paraná),
maracutão e/ou maracutango (Santa Catarina), maracujá-amarelo (Rio de Janeiro e Espírito
Santo), maracujá-grande (Bahia e Minas Gerais), e maracujá-melão (Minas Gerais). No
Peru, é conhecida como granadilla-morada, e no Paraguai, como mburucuyá (Sacco 1962,
1980; Feller 1967; Cervi 1996; Cervi & Santos 2000; Deginani 2001; Bernacci 2003).
Os primeiros registros de P. alata no Brasil datam de 1938, quando E. P. Killip a
descreveu como uma espécie aparentemente nativa na sua obra “The American Species of
Passifloraceae”. Rambo (1951), Sacco (1962, 1980) e Feller (1967) a definem como uma
espécie cultivada no Rio Grande do Sul, com possibilidades de se asselvajar. Cervi (1996)
nada menciona a respeito do tipo de ocorrência no Estado do Rio Grande do Sul, mas
Mondin (2001) a cita como uma espécie subespontânea. De acordo com A. P. Lorenz-
Lemke (comunicação pessoal), esta espécie apresenta uma ampla distribuição no Estado,
sendo especialmente observada em ambientes alterados e bem iluminados (como bordas de
floresta e capoeiras). É uma espécie abundante e não seletiva em relação ao tipo de
formação vegetal ao qual está associada.
Filogeneticamente P. alata possui como grupo irmão a espécie P. quadrangularis,
ambas pertencentes ao subgênero Passiflora, série Quadrangulares. Espécies pertencentes
a este subgênero possuem flores grandes, que variam de 1 a 14,5cm de diâmetro, são
predominantemente de fecundação cruzada, e apresentam mecanismos de auto-
incompatibilidade e herança paterna no genoma do cloroplasto (Cervi 1997; Koschnitzke
& Sazima 1997; Varassin & Silva 1999; Muschner 2001; Lorenz 2002; Muschner et al.
2003).
29
CAPÍTULO II
OBJETIVOS
_________________________________________________________
CAPÍTULO II - OBJETIVOS
30
II.1. Gerais
Como parte de um programa de longo alcance de investigação do gênero
Passiflora, este estudo tem por objetivo geral contribuir para o entendimento da biologia e
evolução de Passiflora alata Curtis no Estado do Rio Grande do Sul e outras áreas do país
por meio da análise de sua estrutura genética e filogeográfica.
II.2. Específicos
a. Avaliar a distribuição da espécie no Rio Grande do Sul por intermédio de
coletas nas diferentes regiões do Estado;
b. Correlacionar o padrão de distribuição com as formações ecológicas
encontradas no Rio Grande do Sul;
c. Verificar a variabilidade genética da espécie por meio do uso de marcadores
moleculares nucleares e plastidiais;
d. Verificar a ocorrência de variação filogeográfica na espécie a partir da variação
encontrada com os marcadores nucleares e plastidiais, comparando as
populações encontradas no Estado com amostras oriundas de outras localidades
e formações vegetais brasileiras.
31
CAPÍTULO III
1º Artigo: “ECOLOGICAL-EVOLUTIONARY RELATIONSHIPS IN
Passiflora alata FROM RIO GRANDE DO SUL, BRAZIL”
P. Koehler-Santos, A.P. Lorenz-Lemke, F.M. Salzano and L.B. Freitas
______________________________________________________________
Manuscrito submetido à revista BRAZILIAN JOURNAL OF BIOLOGY
CAPÍTULO III - 1º ARTIGO
32
ECOLOGICAL-EVOLUTIONARY RELATIONSHIPS IN Passiflora alata FROM RIO
GRANDE DO SUL, BRAZIL
KOEHLER-SANTOS, P., LORENZ-LEMKE, A.P., SALZANO, F.M. and FREITAS, L.B.
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS, Brazil
Correspondence to: Loreta B. Freitas, Departamento de Genética, Instituto de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Caixa Postal 15053, 91501-970,
Porto Alegre, RS, Brazil, e-mail: [email protected]
(With 2 figures)
Running title: ECOLOGY OF Passiflora alata
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
33
ABSTRACT
The geographical distribution, ecological characteristics, flowering and fructification
times, and pollinating agents of Passiflora alata are considered and related to molecular
genetic investigations performed simultaneously. The first report about this species in Rio
Grande do Sul was made in 1934, but in cultivated gardens. About 20 years latter,
however, the species was already classified as efferata (wild) in Porto Alegre’s suburbs.
The data to be presented here, together with the DNA investigations, indicate that P. alata
is actively colonizing previously unoccupied areas of this region.
Key words: Passiflora alata, geographical distribution, phenology, colonization process,
plant evolution.
RESUMO
Relações ecológico-evolutivas em Passiflora alata do Rio Grande do Sul, Brasil
A distribuição geográfica, características ecológicas, épocas de florescimento e
frutificação, e agentes polinizadores de Passiflora alata são considerados e relacionados a
estudos genético-moleculares desenvolvidos simultaneamente. O primeiro registro da
espécie no Rio Grande do Sul foi feito em 1934, mas em área cultivada. Cerca de 20 anos
depois, no entanto, a espécie já era classificada como efferata (selvagem) nos subúrbios de
Porto Alegre. Os dados a serem aqui apresentados, junto com as investigações de DNA,
indicam que P. alata está colonizando ativamente áreas previamente não ocupadas desta
região.
Palavras-chave: Passiflora alata, distribuição geográfica, fenologia, processo colonizador,
evolução vegetal.
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
34
INTRODUCTION
As part of a long-term project of investigation of the genus Passiflora by our group
(Muschner et al., 2003; Lorenz-Lemke et al., 2005) we decided to study in detail
Passiflora alata Curtis in the territory of the Brazilian state of Rio Grande do Sul. The
geographical proximity with the place where we work would provide an opportunity to
make detailed field and ecological observations, that could be related to the genetic-
molecular studies that we were conducting in this and related species.
P. alata is classified in the Passifloraceae family, occurring in the Atlantic Rain
Forest, especially at the periphery of humid woods of low altitude, as well as in wood spots
of varied size, and near the littoral. The species has a wide distribution in the Brazilian
territory, and was observed in lands of the states of Bahia, Espírito Santo, Federal District,
Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraná, Pará, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, São
Paulo, and Santa Catarina. Additionally, it was found in Argentina, Paraguay, and Peru
(Killip, 1938; Feller, 1967; Sacco, 1980; Pessoa, 1994, 1997; Cervi, 1996, 1997; Cervi &
Santos, 2000; Deginani, 2001; Bernacci, 2003).
The first published report of P. alata in Brazil date from 1938, when E.P. Killip
described it as an apparently native species in the majority of the Brazilian states. Rambo
(1951), Sacco (1962, 1980) and Feller (1967), however, referred to it as a cultivated
species in Rio Grande do Sul, with the possibility of becoming wild; some years later
Mondin (2001) classified it as subspontaneous. The decisive factor that determined the
present study was our observation that the species was abundant in the wild condition in
many places of the state, characterizing a possible case of a taxon in the active process of
colonizing open spaces. Additionally, since the species is concentrated mainly in the
central-eastern portion of the Brazilian territory, the populations studied could represent a
good model of groups living at the borderline of their geographical range.
MATERIAL AND METHODS
The territory of Rio Grande do Sul is situated between 49º42’41’’ and 57º40’57’’
of longitude west, and between 27º03’42’’ and 33º45’09’’ of latitude south, and represents
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
35
the extreme south of the distribution of many tropical or temperate species, being described
as a transition area between biogeographical provinces (Mondin & Baptista, 1996;
Jarenkow & Sobral, 2000). According to Teixeira et al. (1986) Rio Grande do Sul is
divided in six geomorphologic (Araucaria’s Plateau, Campanha’s Plateau, Central
Depression, Coastal Plain, Missions’ Plateau, and South of Rio Grande Plateau) (Fig. 1)
and seven phytoecologic (Decidual Seasonal Forest, Dense Rainy Forest, Mixed Rainy
Forest, Savannah, Semideciduous Seasonal Forest, Steppe, and Steppic Savannah) regions,
as well as two areas under special ecological conditions (Ecologic Tension and Pioneer
Formations). The latter roughly coincide with the geomorphologic division.
The six geomorphologic and the nine phytoecologic regions of the state were
searched, and P. alata’s material collected. For each specimen a sample was pressed and
dried, and subsequently deposited at the ICN Herbarium, Botany Department, Biosciences
Institute, Federal University of Rio Grande do Sul. Subsamples were used for DNA
studies, reported elsewhere (Koehler-Santos et al., 2005). Each collection point was
georeferenced in accordance with standard procedures, using a GPS Garmin apparatus.
To assess previous records of P. alata’s occurrence in Rio Grande do Sul, a survey
was conducted (either by electronic mail or personal visit) in the following herbaria: 1.
HAS (Rio Grande do Sul’s Zoobotanical Foundation); 2. HUCS (Caxias do Sul
University); 3. HURG (Federal University of Rio Grande Foundation); 4. ICN (Federal
University of Rio Grande do Sul); 5. MPUC (Pontifical Catholic University of Rio Grande
do Sul); 6. PACA (Anchieta’s Research Institute); 7. PEL (Federal University of Pelotas);
8. RSPF (Passo Fundo University); and 9. SMDB (Federal University of Santa Maria).
For each plant observed, besides the geographical coordinates, the following
observations were registered: (a) presence/absence of floral buds, or open flowers; (b)
presence/absence of fruits; (c) when fruits were present, indications of predation; (d)
presence/absence of pollinators and/or flower visitors; (e) environmental characterization
(type of associated vegetation; evidence of human interference); and (f) presence/absence
of associated Passiflora species.
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
36
RESULTS AND DISCUSSION
No records of P. alata were found in the HAS and MPUC herbaria, but a total of
37 occurrences are registered in the seven institutions listed in Table 1. The earliest dates
from March 15, 1934, a record made by B. Rambo, that found it in cultivated form in the
locality of São Leopoldo, about 34 km north of Porto Alegre (PACA registration number
1275); while the same researcher found wild P. alata in the suburbs of Porto Alegre in
November 22, 1956 (PACA no. 59215). After 1956 a series of occurrences have been
documented of the species both in cultivated and wild plots.
Table 2 presents the places where we have collected P. alata, and Table 3 the
routes we followed without finding it (see also Fig. 1). Listed in Table 2 are the 50 places
of collection, with their geographical coordinates, that are shown graphically in Fig. 1. A
total of 192 specimens were collected, but many more were observed. In many instances
only one individual was sampled by collecting site. P. alata was found in five of the six
geomorphologic regions (exception: Campanha’s Plateau), and in eight of the nine
phytoecologic regions (exception: Steppic Savannah). No morphologic variant was found
in the state, confirming observations reported for other places of the Brazilian territory.
Practically all plants were observed or collected in well lighted places disturbed by
humans, as the small woods near the roads. No association with a specific type of
vegetation was recorded.
The majority of the plants seen or collected occur in the Coastal Plain and Central
Depression geomorphologic regions, in soils of the textural horizon B type. In the Coastal
Plain the main vegetation is of the Pioneer Formation type, and P. alata occurs in the more
inland subtype, of riverine influence. In the Central Depression plants of this species occur
mainly in areas of Decidual Seasonal Forests and Ecologic Tension (with interpenetrating
floras of two or more plant formations). Individuals were also collected in the South of Rio
Grande Plateau, region characterized by a savannah type of vegetation, but also in eastern
areas of the Semideciduous Seasonal Forest. In Araucaria’s Plateau P. alata was seen or
collected only in low altitude places. The lower number observed in the Mission’s Plateau
region may be related to the type of economic activity prevalent there, grain cultivation,
that extends the fields quite near the roads. Both the human presence (at the north grain
production, at the south cattle raising), and the type of dry climate prevalent in the
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
37
Campanha’s Plateau may explain the absence of P. alata records there. This species occurs
mainly in soils of the textural horizon B type, and, in lesser degree in the litholic neosoils.
The first are characterized by higher concentrations of clay than those found in under or
upper strata, while the latter are very recent deep or plain formations which occur in
several conditions of altitude and drainage (Streck et al., 2002).
The plants were collected mainly along paved roads, and were seldom seen near
unpaved ones, even when they occurred in nearby orchards. For example, our first trip
along the RS 474 road, that connects Santo Antônio da Patrulha to RS 239, occurred just
after it was paved, in November, 2001, and no P. alata specimens were found, even some
distance from it. Two years later, in October, 2003 several young plants, without flowers,
were seen and collected. The difference may be due to the fact that along the paved roads
the cleaning of the adjacent terrain is more drastic, leading to the extinction of competitive
species and opening of space for P. alata.
Figure 2 shows information about the phenology of P. alata, as observed in Rio
Grande do Sul. The presence of just the vegetative state was observed in four months, two
in the winter (July, August) and two in the summer (December, January). Floral buds and
flowers were consistently seen in practically all months, while fruits occurred in March,
May, September, October, and November. Previous records by other authors indicated
some variation among Brazilian regions both in flowering or frutification times, with
flowers present almost all the year, and fruits along five months (Sacco, 1962, 1980;
Koschnitzke, 1993; Cervi, 1996, 1997; Varassin & Silva, 1999; Cervi & Santos, 2000;
Bernacci, 2003).
The large flowers and odoriferous filaments of P. alata favor pollination by bees,
and one of its main pollinating agents are bees of the Xylocopa genus (Hymenoptera,
Anthophoridae) (Sazima & Sazima, 1989; Koschnitzke, 1993, Koschnitzke & Sazima,
1997; Varassin & Silva, 1999; Varassin et al., 2001). On the other hand, Varassin & Silva
(1999) and Varassin et al. (2001) verified that bees of the Apis genus (Hymenoptera,
Apidae) are predatory to P. alata plants, since they take pollen from it, but do not perform
the pollinization process. Our observations partially agree with this information. We
followed up continuously one P. alata plant cultivated at the campus of our university
where our Department is located, which is commonly visited by Apis bees and verified that
although fruits are formed they have never matured in the four years (2000-2004) of our
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
38
observation. However, in wild specimens distributed in woods at the periphery of the
campus fertile plants occur, that are visited both by Apis and Xylocopa bees.
Seed dispersion in the Passifloraceae is generally made by birds and bats, attracted
by the color and smell of the mature fruits (Semir & Brown, 1975); however, small
terrestrial mammals were also observed eating Passiflora fruits (Williams et al., 2000).
Fruits collected by us during the trips showed teeth marks, in P. alata fruits, that were
identified by our colleagues A. Kindel and T.R.O. Freitas as being made by the opossum
Didelphis albiventris and the arboreal rodent Oryzomys subflavus. Therefore, these animals
should be considered as seed disseminators and predators in our region, in addition to
other, still unidentified agents.
The molecular-genetic studies we performed in P. alata are being reported
elsewhere (Koehler-Santos et al., 2005). However, description of the main findings related
to the present observations are in order. Briefly, we studied representatives of all
populations found in Rio Grande do Sul in relation to three nuclear DNA systems
[ribosomal Internal Transcribed Spacers or ITS; a partial segment of the glyceraldehyde 3-
phosphate dehydrogenase (G3pdh or gpd), and the second intron of the LEAFY genes], as
well as eight plastid regions. While the latter did not show variability, the three nuclear
genes provided important information. Characteristics of variability from all of them
clearly indicated that P. alata is experiencing a population expansion. In addition, their
high intrapopulation variance, and the absence of a clear geographic structure, also suggest
that the P. alata populations sampled should have recently arrived to their present area of
distribution.
The effective invasion of an environment by new species is influenced by three
factors: the number of individuals (or their gametes) which are introduced; the inner
characteristics of the invading species; and the environmental susceptibility to the invasion
of new species. The latter involves many factors, such as climate, the amount of
environmental disturbance due to human presence or its products, and the competitive
ability of the resident species. Other factors are soil type, presence or absence of
herbivores, pathogenic agents, and facilitating effects of the resident vegetation (Decker,
1936; Lonsdale, 1999; Davis et al., 2000). In the specific case under discussion it is
possible that the presence of dispersion and pollinization agents that are already acting in
relation to other native species of Passiflora present in Rio Grande do Sul may have
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
39
facilitated the colonization process of P. alata. It is important to mention that although
these other species of Passiflora occur in the territory, they are never found in association
with P. alata. Therefore, the latter should be competing with other taxa. Historical, genetic,
morphologic, and the ecologic characteristics presented in this paper, together with the
easy adaptation of P. alata to cultivation, all indicate its plastic nature and suggest that the
taxon is undertaking an active process of territory colonization.
Acknowledgments - We thank Drs. Andreas Kindel (Department of Ecology, Biosciences
Institute, Federal University of Rio Grande do Sul) and Thales R.O. Freitas (Department of
Genetics of the same Institute) for help in the identification of the teeth marks found in P.
alata fruits; and Dr. Cláudio A. Mondin (Biosciences Faculty, Pontifical Catholic
University of Rio Grande do Sul) for the critical reading of a first version of this
manuscript. Our research is supported by Programa de Apoio a Núcleos de Excelência
(PRONEX), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS), and Pró-
Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PROPESQ-UFRGS).
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
40
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CAPÍTULO III - 1º ARTIGO
43
TABLE 1
Herbarium information of the presence of P. alata in Rio Grande do Sul.
Herbarium
identification
Registration
number
Locality Date of
collection
Status
HUCS 1771 Caxias do Sul 22/07/1986 cultivated
000723 Arroio Bolacha, Rio Grande 26/10/1983 wild
000990 Vila da Quinta, Rio Grande 02/11/1982 wild
001034 St. Hillaire, Viamão 17/03/1982 wild
HURG
001998 Reserva Ecológica do Taim, Rio Grande 12/09/2000 wild
67234 Belém Velho, Porto Alegre 04/1987 no data
94457 Estação Experimental, Viamão 09/01/1990 no data
94773 Agronomia, Porto Alegre 06/1987 no data
117541 Dom Pedro de Alcântara 24/05/1997 cultivated
115084 Morro Grande, Viamão 21/10/1998 wild
117715 Morro do Côco, Dom Pedro de Alcântara 05/12/1997 cultivated
94775 Lomba do Pinheiro, Porto Alegre 07/1987 cultivated
Nº II
27/26/1/3
Schultz 374
Porto Alegre 19/04/1938 cultivated
4827 Viamão 06/1967 cultivated
62573 Porto Alegre 20/03/1985 no data
ICN
132158 Ponta Grossa, Porto Alegre 17/04/2003 wild
1275 São Leopoldo 15/03/1934 cultivated
7183 São Leopoldo 06/09/1954 cultivated
59215 Vila Manresa (Morro da Glória), Porto Alegre 22/11/1956 wild
PACA
69744 I.A.S. (Instituto Agronômico do Sul), Pelotas 14/02/1962 cultivated
4548 São Lourenço do Sul 29/05/1963 cultivated
PEL
10018 Between Km 321 and BR 116, Tapes 20/06/1988 wild
6362 Espumoso 20/10/1998 wild
RSPF
7232 Montenegro 16/03/2003 wild
4775 Boca do Monte, Santa Maria 31/10/1993 wild
6510 Santa Maria 01/1996 wild
3201 Jardim Botânico, UFSM 09/06/1987 no data
8388 São João do Polêsine 27/01/2000 wild
8384 São João do Polêsine 15/04/2000 wild
8390 São João do Polêsine no data wild
8391 São João do Polêsine 11/06/2000 wild
8392 São João do Polêsine 01/11/1999 wild
8394 São João do Polêsine 22/10/1999 wild
8395 São João do Polêsine 27/11/1999 wild
8397 São João do Polêsine 14/01/2000 wild
8386 São João do Polêsine 29/02/2000 wild
SMDB
8400 São João do Polêsine 30/05/2000 wild
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
44
TABLE 2
Places of collection of P. alata in Rio Grande do Sul.
Locality Geographical coordinates Geomorphologic region
Águas Claras, Viamão 30º08'11''S/50º54'40''W Coastal Plain
Balneário Pinvest, Tapes 30º40'00''S/51º22'59''W Coastal Plain
Barra do Ribeiro 30º17'37''S/51º24'60''W South of Rio Grande Plateau
Bom Princípio 29º25'51''S/51º21'03''W Araucaria Plateau
Butiá 30º08'13''S/52º00'27''W Central Depression
Caçapava do Sul 30º36'33''S/53º31'43''W South of Rio Grande Plateau
Cachoeira do Sul 30º13'52''S/52º41'43''W Central Depression
Canoas 29º53'14''S/51º13'10''W Central Depression
Capané, Cachoeira do Sul 30º16'11''S/53º05'51''W Central Depression
Capão da Porteira, Viamão 30º06'35''S/50º40'16''W Coastal Plain
Cerrito Alegre, Pelotas 31º32'25''S/52º14'08''W South of Rio Grande Plateau
Cruz Alta 28º38'48''S/53º37'51''W Missions’ Plateau
Eldorado do Sul 30º05'06''S/51º36'60''W Central Depression
Eldorado do Sul 31º03'04''S/51º20'05''W South of Rio Grande Plateau
Esquina Gaúcha 27º26'44''S/54º11'55''W Missions’ Plateau
Estrela 29º33'15''S/51º53'48''W Araucaria Plateau
Fazenda Vilanova 29º35'09''S/51º50'03''W Araucaria Plateau
Glorinha 29º53'29''S/50º43'07''W Coastal Plain
Gravataí 29º56'37''S/50º56'13''W Coastal Plain
Guaíba 30º12'03''S/51º24'01''W South of Rio Grande Plateau
Ibirubá 28º38'14''S/53º05'37''W Missions’ Plateau
Igrejinha 29º35'22''S/50º48'04''W Transition zone (CD-AP)
Itacolomi, Gravataí 29º51'52''S/50º58'10''W Costal Plain
Marques de Souza 29º16'42''S/52º08'11''W Araucaria Plateau
Minas do Leão 30º08'47''S/52º03'31''W Central Depression
Montenegro 29º49'02''S/51º23'17''W Central Depression
Morungava, Gravataí 29º51'60''S/50º54'08''W Costal Plain
Navegantes, Crissiumal 27º30'00''S/54º07'00''W Missions’ Plateau
Nova Santa Rita 29º52'27''S/51º14'46''W Central Depression
Novo Cabrais 29º44'59''S/53º02'49''W Central Depression
Pinheirinhos, Santo Antônio da Patrulha 29º43'54''S/50º36'33''W Coastal Plain
Portão 29º39'41''S/51º15'59''W Transition zone (CD-AP)
Porto Alegre 30º01'60''S/51º12'00''W Coastal Plain
Restinga Seca 29º43'55''S/53º26'58''W Central Depression
Rolante 29º39'19''S/50º39'15''W Costal Plain
Santa Maria 29º42'32''S/53º40'04''W Central Depression
Santo Antônio da Patrulha 29º52'58''S/50º32'06''W Coastal Plain
São Lourenço do Sul 31º13'20''S/52º00'35''W South of Rio Grande Plateau
São Sebastião do Caí 29º37'35''S/51º18'36''W Transition zone (CD-AP)
São Vendelino 29º21'46''S/51º22'50''W Araucaria Plateau
Sarandi 27º57'49''S/52º54'32''W Missions’ Plateau
Sentinela do Sul 30º38'22''S/51º33'24''W South of Rio Grande Plateau
Tabaí 29º39'24''S/51º44'58''W Araucaria Plateau
Taquara 29º41'20''S/50º48'41''W Costal Plain
Taquari 29º42'05''S/51º50'60''W Central Depression
Três Coroas 29º31'36''S/50º46'27''W Transition zone (CD-AP)
Venâncio Aires 29º38'44''S/52º11'09''W Central Depression
Viamão 30º05'57''S/50º58'46''W Coastal Plain
Vila Arroio Teixeira, Tapes 30º40'00''S/51º22'59''W Coastal Plain
Vila Assumpção, Pelotas 31º46'00''S/52º19'60''W South of Rio Grande Plateau
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
45
TABLE 3
Places where P. alata was not found in Rio Grande do Sul
1
.
Road Detail Date
RS 030 Between BR 290 and Santo Antônio da Patrulha nov/2001
RS 474 Between Santo Antônio da Patrulha and RS 239 nov/2001
BR 101 Between Capivari do Sul and Maquiné mar/2002
RS 484 Between Maquiné and Barra do Ouro mar/2002
BR 386 Between Pouso Novo and Carazinho apr/2002
RS 223/BR 377 Between Tio Hugo and Cruz Alta apr/2002
BR 158 Between Cruz Alta and RS 155 apr/2002
RS 155 Between Ijuí and BR 468 apr/2002
BR 285 Between Ijuí and Entre-Ijuis apr/2002
RS 344 Between Entre-Ijuis and Santa Rosa apr/2002
BR 468 Between RS 155 and Palmeira das Missões apr/2002
RS 569 Between Palmeira das Missões and Sarandi apr/2002
BR 290 Between Porto Alegre and Uruguaiana jul/2002
BR 293 Between Pelotas and Santana do Livramento aug/2002
BR 158 Between BR 293 and BR 290 aug/2002
BR 392 Between Pelotas and BR 290 sep/2002
BR 153 Between BR 290 and BR 392 oct/2002
BR 392 Between BR 153 and Caçapava do Sul oct/2002
RS 625 Between RS 353 and BR 392 oct/2002
RS 020 Between São Francisco de Paula and Cambará do Sul jun/2003
RS 110 Between São Francisco de Paula and Bom Jesus jul/2003
RS 334 Between BR 386 and RS 223 oct/2003
VRS 24 Between Ibirubá and Fortaleza dos Valos oct/2003
BR 158 Between Cruz Alta and Santa Maria nov/2003
RS 389 Between Imbé and Torres feb/2004
RST 470 Between São Vendelino and Bento Gonçalves mar/2004
RS 324 Between Veranópolis and Passo Fundo mar/2004
RST 453 Between Bento Gonçalves and Farroupilha mar/2004
RS 122 Between Farroupilha and Caxias do Sul mar/2004
RST 453 Caxias do Sul mar/2004
BR 116 Between Caxias do Sul and Vacaria mar/2004
BR 285 Between Vacaria and Lagoa Vermelha mar/2004
RS 122 Between Ipê and Caxias do Sul mar/2004
BR 116 Between Caxias do Sul and Nova Petrópolis mar/2004
RS 235 Between Nova Petrópolis and Gramado mar/2004
1
The information given refers to field notes registered during the trips; some local roads without
identification could not be included in this list. The roads’ code could have changed in the intervening years.
CAPÍTULO III - 1º ARTIGO
46
Fig. 1 − Map of South America (upper left) and enlarged map of Rio Grande do Sul,
showing the places of collection (circles), the state’s geomorphologic regions (AP:
Araucaria’s Plateau; CaP: Campanha’s Plateau; CD: Central Depression; CP: Coastal
Plain; MP: Missions’ Plateau; SRG: South of Rio Grande Plateau) separated by full lines,
and the routes followed in our field trips (dotted lines).
Fig. 2 − Phenology of P. alata observed in the state of Rio Grande do Sul.
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
47
Figure 1
CAPÍTULO III – 1º ARTIGO
48
Figure 2
49
CAPÍTULO IV
2º Artigo: “MOLECULAR GENETIC VARIATION IN Passiflora alata
(PASSIFLORACEAE), AN INVASIVE SPECIES IN SOUTHERN BRAZIL”
P. Koehler-Santos, A.P. Lorenz-Lemke, V.C. Muschner, S.L. Bonatto,
F.M. Salzano and L.B. Freitas
______________________________________________________________
Manuscrito submetido à revista BIOLOGICAL JOURNAL OF THE
LINNEAN SOCIETY
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
50
Molecular genetic variation in Passiflora alata (Passifloraceae),
an invasive species in southern Brazil
PATRÍCIA KOEHLER-SANTOS
1
, ALINE P. LORENZ-LEMKE
1
, VALÉRIA C.
MUSCHNER
1
, SANDRO L. BONATTO
2
, FRANCISCO M. SALZANO
1
and LORETA
B. FREITAS
1*
1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Glali
rande do Sul, Caixa Postal 15053, 91501-970, Porto Alegre, RS, Brazil
2
Centro de Biologia Genômica e Molecular, Faculdade de Biociências, Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Ipiranga 6681, 90610-001, Porto Alegre,
RS, Brazil
Corresponding author:
Loreta B. Freitas
Departamento de Genética
Instituto de Biociências, UFRGS
Caixa Postal 15053
91501-970 Porto Alegre, RS, Brazil
Tel. no.: 55 51 3316-6715
Fax no.: 55 51 3316-7311
E-mail: [email protected]
Running title: GENETIC VARIATION IN PASSIFLORA ALATA
_____________________
* Corresponding author. E-mail: [email protected]
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
51
ABSTRACT
A total of 85 wild plants were collected in different areas of southern and southeastern
Brazil, and studied for nrDNA Internal Transcribed Spacers (ITS). Thirty-two of them
were also investigated for two other nuclear (G3pdh and LEAFY), as well as eight plastid
systems. Sixty-one ITS sequence types were identified, in a region of 412 base pairs (bp),
while forty-two G3pdh haplotypes were found in a 1010 bp region, and 23 LEAFY
haplotypes in a region of 565 bp. GC content was higher in ITS (65%) than in the two
other nuclear regions (40%-42%), while nucleotide diversity was markedly higher in
G3pdh than in the other two. But no variability was found in the plastid systems. Most of
the nuclear molecular diversity (56%-86%) occurs at the intrapopulation level, there are
clear evidences of population expansion, and little geographic structure in it. P. alata can
therefore be characterized as a species that is actively colonizing previously unoccupied
areas in southern Brazil. High indices of intrapopulation variability were found in the
region that is being colonized, similar to those found in areas where P. alata is native.
Multiple introductions, as well the species’ genetic structure and human interference may
explain these findings.
ADDITIONAL KEYWORDS: Passiflora alata – ITS - G3pdh - LEAFY -
intrapopulation diversity - colonization process
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INTRODUCTION
Humans move species beyond their native ranges both deliberately and inadvertently, and
many of these species become established and spread in their new habitats (Vitousek et al.,
1997; Kolar & Lodge, 2001; Daehler et al., 2004; Müller-Schärer, Schaffner & Steinger,
2004). The genetic architecture of the invading species and its ability to respond to natural
selection should play a major role in the ultimate establishment of these invasive species
(Lee, 2002). Multiple introductions are often correlated with the eventual success of non-
native species establishment, since they provide genotypes from diverse sources (Ellstrand
& Schierenbeck, 2000).
The genus Passiflora has about 400 species, distributed from the southern part of
the United States all over the American continent, in areas which do not have extreme cold
temperatures. Our group has been investigating this genus for several years now, recent
analyses being provided by Muschner et al. (2003) and Lorenz-Lemke et al. (2005). The
former study analyzed the relationships of 61 species, verifying that P. alata can be
classified as a sister species of P. quadrangularis in the same Passiflora clade. Our interest
in P. alata derived from the fact that, although being a well-distributed species which
occurs from the Amazon region (approximate latitude 6ºS) up to the southern part of the
Brazilian state of Rio Grande do Sul (31ºS), and from longitude 38ºW to 54ºW, no genetic
investigation had been performed in it. Particularly, it was verified that P. alata is widely
distributed along the above-indicated state, where we have been actively working. This
species was introduced in this region in 1934 (first historical registration), that represents
the extreme south of distribution, mainly through human cultivation, but starting around
the 60s indications were found that it was invading open territories, leading to its
classification as a subspontaneous species.
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The present study was developed with the following questions in mind: (a) do
plants from different regions (non-indigenous and native) show different genetic
architectures? (b) are the patterns different when diverse kinds of genetic markers are
used? and (c) do the data furnish any clue about the invasion process that had been inferred
from the field observations?
MATERIALS AND METHODS
SAMPLE COLLECTION AND DNA EXTRACTION
A total of 85 wild specimens of Passiflora alata were collected, of which 66 occur in the
Brazilian state of Rio Grande do Sul, while the remainder 19 were obtained from places
located in six other states of Brazil (Fig. 1). Voucher specimens were deposited in the ICN
Herbarium, Botany Department, Biosciences Institute, Federal University of Rio Grande
do Sul. Total DNA was extracted from young leaves and dried in silica gel, using the Roy
et al.’s (1992) method with some adaptations.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) AMPLIFICATION, LABORATORY
TESTS, AND SEQUENCING
The nuclear regions studied were: (a) ribosomal DNA (nrDNA Internal Transcribed Spacer
or ITS); (b) a partial segment of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3pdh or
gpd) gene; and (c) the second intron of the LEAFY gene, which regulates the establishment
of the floral meristem and the flowering time in Arabidopsis. The fragments were
amplified using the primers and conditions described by Desfeux & Lejeune (1996), Olsen
& Schaal (1999), and Oh & Potter (2003), respectively, with slight changes. Dimethyl
sulphoxide (DMSO) was used in the PCRs of the three systems to exclude the presence of
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silenced alleles (Buckler, Ippolito & Holtsford, 1997; Fuertes Aguilar, Risselló & Nieto
Feliner, 1999). Additionally, the following chloroplast systems were analyzed: (a) five
microsatellite loci, using primers and conditions established by Weising & Gardner (1999);
(b) the trnL-trnF and psbA-trnH intergenic spacers, as determined by Taberlet et al. (1991)
and Sang, Crawford & Stuessy (1997), respectively; and (c) the intron of the trnL gene,
with the method established by Taberlet et al. (1991).
The amplified material was enzymatically purified using a pre-sequencing kit
(Amersham Biosciences US 70995, Buckinghamshire, UK); afterwards the marker
reaction was performed using the BigDye Terminator Sequencing Kit (PE Applied
Biosystems, Foster City, USA) or the DYEnamic
TM
ET Terminator Sequencing Premix Kit
(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK); and subsequently the material was
purified with ethanol/sodium acetate to eliminate the unincorporated fluorescent
terminators. Sequencing was done on the automatic ABI PRISM 310 (Perkin Elmer,
Wellesley, USA) and MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)
machines.
DATA ANALYSIS
In the nuclear regions a site was classified as heterozygote when more than one peak was
present in the electropherogram and the weakest signal reach at least 25% of the strength
of the strongest signal (Fuertes Aguilar, Risselló & Nieto Feliner, 1999; Fuertes Aguilar &
Nieto Feliner, 2003). To minimize the inclusion of bad reads as polymorphisms, as
suggested by the above-indicated authors, we added the restriction that double peaks had to
occur approximately in the same position in both strands. Additionally, the amplification
product of some of these possible heterozygotes were cleaved with the AluI, HinfI, and
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MunI endonucleases, to confirm their heterozygosity at specified sites. The same procedure
was adopted when possible homozygotes showed a rare site variant.
The sequences were aligned using ClustalX 1.81 program (Thompson et al., 1997)
with manual correction. Haplotypes (and types of sequences) were determined using the
PHASE, version 1.0 software (Stephens, Smith & Donnelly, 2001) also with manual
correction when necessary. Relationships between sequences were inferred using median-
joining networks (e=0, Bandelt, Forster & Röhl, 1999) using NETWORK, version 3.1.1.1.
Nucleotide and haplotype diversities were estimated with MEGA, version 2.1 (Kumar et
al., 2001) and DnaSP, version 3.99.5 (Rozas et al., 2003). The latter was also used to
obtain Tajima’s D (Tajima, 1989) e Fu e Li’s D* and F* (Fu & Li, 1993), as well as the
mismatch distributions. Transition/transversion ratios were calculated with Modeltest,
version 3.6 (Posada & Crandall, 1998). Excoffier, Smouse & Quattro’s (1992) Analysis of
Molecular Variance (AMOVA) was calculated using ARLEQUIN, version 2.0 (Schneider,
Roessli & Excoffier, 2000). The latter was also employed for the performance of Mantel’s
(1967) test, for the comparison between genetic and geographic distances. Rates of
population growth were obtained by maximum likelihood estimation based on the
coalescent with FLUCTUATE (Kuhner, Yamato & Felsenstein, 1998). Five runs for the
estimation of each parameter were carried out, and their average recorded. Tests to detect
possible recombinant sequences were performed using TOPALi (Milne et al., 2004).
RESULTS
FIELD STUDIES
Table 1 presents the places of collection in detail, with respective geographical
coordinates, from where the eighty-five plants were obtained. A total of 54 localities is
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included, of which 39 are in Rio Grande do Sul, the non-indigenous region, and the
remainder are spread over six other Brazilian states, the native regions. In relation to the
Rio Grande do Sul samples, they are evenly spread along five geomorphologic regions
(Teixeira et al., 1986), plus a transition zone between two of them.
MOLECULAR VARIABILITY
ITS intraindividual sequence variability was found in 48 of the 85 plants, suggesting
incomplete concerted evolution. Afterwards, sixty-one ITS sequence types were obtained,
derived from the analysis of 412 (232 in ITS1; 180 in ITS2) nucleotides. They contained
10 variable (nine parsimony informative) sites, as well as 15 gaps (Appendix 1).
Corresponding numbers for a subsample of 32 plants (including both representatives of the
non-indigenous and native regions) were 24 sequence types, and five variable (all
parsimony informative) sites, plus 14 gaps (Appendix 2). These 32 plants were chosen for
the investigation of two other nuclear systems, namely G3pdh and LEAFY. Sixteen G3pdh
heterozygote plants were found. The G3pdh segment contains four introns and three exons,
in a total of 1010 bp. All four introns start with GT and end with GC, a motif which is
typical of nuclear introns, and present 15 indels. The three exons codify 107 amino acids,
and the eight polymorphisms at these exons are composed by synonymous mutations. A
comparison of this coding region with the equivalent in other dicotyledonous species
Manihot esculenta (Olsen & Schaal, 1999) showed variation in 10 (9.3%) of the 107 amino
acids. Forty-four polymorphic (34 parsimony informative) sites, plus 15 gaps, were found
in the region as a whole, arranged in 42 haplotypes (Appendix 3). Twenty LEAFY
heterozygote plants were observed. The LEAFY segment includes one partial exon and one
intron, in a total of 565 bp. The partial exon codifies 28 amino acids and differ from the
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amino acid sequences of Neillia and Stephanandra (Rosaceae) (Oh & Potter, 2003) in just
one position. The two polymorphisms at the exon are composed by synonymous mutation.
A total of eight polymorphic (five parsimony informative) sites were detected, plus one
indel, distributed among 23 haplotypes (Appendix 4). No recombinant sequences were
founded in the tree nuclear systems analyzed.
Some of the main features of these systems are displayed in Table 2. The GC
content was higher in ITS (65%) than in the two other segments (40%-42%), while the
nucleotide diversity was markelly higher (2.5x) in G3pdh, as compared to the other
markers. The difference, however, was not as high for the haplotype diversity (0.97 vs
0.89-0.73). The transition/transversion rate was low for G3pdh (1.4 only). The neutrality
tests, although all positive, were not statistically significant.
FLUCTUATE simulation results by region are shown in Table 3. Comparison of g
and theta (1) with their standard deviations show values at least 4x higher; this suggests
population growth, the signal for it being especially evident in the total ITS sample. These
results were corroborated by the mismatch distribution (Fig. 2), that in all cases present
single waves that are in accordance with models of population growth.
The AMOVA results indicate that most of the molecular diversity (in the three sets
involving the 32 plants 76% to 86%) occurs within populations (Table 4). G3pdh departs
somewhat from the two other markers by showing a much lower diversity among groups
(introduced region vs the native regions; 1%) than among populations within groups
(16%), while for the other markers this relationship is reversed.
Figures 3-6 show the neighbor-joining trees for the four sets of data that are being
analyzed. No clear relationship between genetics and geography regions is discerned, and a
similar lack of structure was observed when the median-joining network methodology was
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used (data not shown), suggesting that the distribution of sequences represents the random
sorting of species polymorphism. However, Fig. 3 shows a distinct branch composed
mainly by the Minas Gerais sequence types. Of these only H17 was found in Rio Grande
do Sul, in one plant, although several others occur both in Minas Gerais and other P. alata
native places. Sequence types 55 and 56 (MG+BA) and 61 (MG+ES) are absent in Rio
Grande do Sul. All this suggests that the contribution of these three regions to the area that
is being invaded is limited. The contribution of sequence types from Santa Catarina,
Paraná and São Paulo is more extensive (Fig. 3, Appendix 1) as would be expected by
geography. Genetic and geographical distances among the 32 plants analyzed for the three
nuclear systems were only weakly (though significantly) correlated, as indicated by
Mantel’s test (r: 0.37; P=0.004).
In contrast with the nuclear data, no variability was observed in the eight
chloroplast systems investigated (five microsatellites in 53 plants; trnL-trnF, psbA-trnH,
and intron of the trnL gene in 20 individuals analysed each).
DISCUSSION
Intra-individual nrDNA polymorphism, as we have found here, is indicative of incomplete
concerted evolution and suggestive of sequence paralogy at all levels (intra-individual to
interspecific). However, intra-individual polymorphism may also be due to heterozygosity
at a locus or to homeology [orthologous sequences secondarily combined into the same
genome through hybridization (Wendel, Schnabel & Seelanan, 1995)]. Any duplicate copy
of a DNA sequence found at a different position in the same genome is paralogous to any
other such copy. Nevertheless, paralogy restricted to individuals or single species is not
necessarily of concern in organismal phylogeny reconstruction (Bailey et al., 2003). The
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ITS polymorphisms found in Passiflora do not negatively interfere in the establishment of
the interspecific relationships observed in this genus (Muschner et al., 2003).
ITS intraindividual sequence variability was already found in many plant species,
indicating that the rate of this region’s homogenization is not high. This rate depends on
the number of copies, number of loci, and chromosomes on which the gene copies are
found, as well as the location of the loci along the chromosomes and the rate of DNA
exchange within and between chromosomes (Quijada et al., 1998). In terminal positions of
the chromosomes the interchromosomal exchanges are facilitated, as was seen in
Gossypium, Paeonia and Thinopyrum (Wendel, Schnabel & Seelanan, 1995, Zhang &
Sang, 1999, Li & Zhang, 2002), but Melo & Guerra (2003), mapped the 45S gene (where
the ITS region is located) at the subterminal position of chromosomes V and VIII of P.
alata. Therefore, one of the factors that could contribute to homogenization, genetic
interchange, is not facilitated in this species due to the occurrence of the ITS sites in a
place relatively far from the extremity, where crossing-over is less frequent. The presence
of four sites in chromosomes V and VIII also make possible the amplification of distinct
copies.
In principle, there are three different ways in which two different ITS copies evolve
within a single individual: (1) unidirectional concerted evolution leads to the loss of one
copy and fixation of the second; (2) concerted evolution leads to a new ITS type that
represents a mixture of the two original ITS sequences; and (3) both ITS copies are still
present, which might be mostly the case in young hybridogenous taxa. In some case these
paralogues are old and might have lost their function and turned into pseudogenes (Koch,
Dobes & Mitchell-Olds, 2003). It is unlikely, however that the ITS sequences analyzed
here are pseudogenes, since: (a) DMSO was added to the PCR to diminish the possibility
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of amplification of less stable forms, as was done by Buckler, Ippolito & Holtsford (1997)
and Fuertes Aguilar, Risselló & Nieto Feliner (1999); (b) the transition/transvertion rates
and the GC content are not different from those found in the Passiflora clade (Muschner et
al., 2003) and for two other species of Passiflora (Lorenz-Lemke et al., 2005); and, (c)
both homozygous forms of the possible heterozygots were always found.
The ITS intraspecific variability found in P. alata is mainly due to indels; this type
of change seems to be common in Passiflora, since it was also frequently found in other
species of the genus by Muschner et al. (2003) and Lorenz-Lemke et al. (2005).
As in P. alata, G3pdh and LEAFY intraspecific variability also occur in four other
genera of plants (Olsen & Schaal, 1999; Wall, 2002; Oh & Potter, 2003).
High genetic variability may be decisive for the sucess of an invasion. Two
scenarios can be envisaged that could lead to a large number of genotypes in some
populations, with few shared types: (a) establishment of some populations from several
individuals of different origins; or (b) populations which start with few founders, but that
subsequently gain additional variability due to gene flow from other gene pools, or
seedling propagation (Pappert, Hamrick & Donovan, 2000). P. alata’s results can fit both
scenarios, since there is sharing between sequences present in both the non-indigenous and
native regions, as well as arrangements that only occur in the region that is being invaded.
The intrapopulation variance was always high, in the three systems of P. alata
studied, suggesting high levels of gene flow, also evidenced by the absence of a clear
geographic structure, or large number of local founders. Lorenz-Lemke et al. (2005) in
Passiflora elegans and Mäder et al. (2004) in nine other species of Passiflora also
observed high levels of intrapopulation variance. Multiple introductions in the same area
may have also occurred, as was observed by Novak & Mack (1993) and Novak, Mack &
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Soltis (1993) in populations of Bromus tectorum, by Dietz, Fischer & Schmid (1999) in
Bunias orientalis, by Bleeker (2003) in Rorippa austriaca, and by Walker, Hulme &
Hoelzel (2003) in Heracleum mantegazzianum. The first historical records mention P.
alata as a cultivated species in Rio Grande do Sul, the introduced area, but native in other
Brazilian regions (Killip, 1938). Only recently (Mondin, 2001) its subspontaneous status
was recorded, suggesting a native distribution also in this area since around the end of the
fifties.
The possibility that P. alata experienced a population expansion was suggested in
the three nuclear systems investigated by the analysis of different parameters, such as g,
theta (1) and mismatch distribution. G3pdh was the system which presented the largest
number of pairwise mismatch differences. Two explanations can be given to this finding,
either an older expansion, or, more probably, a higher mutation rate.
The absence of intraspecific variability in the plastid markers could be due to their
haploid condition or to their species-specific nature. Other species of Passiflora also show
interspecific variation only with these markers (unpublished data). Similar results were
obtained, in relation to psbA-trnH and trnL-trnF, in Actinidia eriantha, A. chinensis and A.
melandra (Jung et al. 2003); and by Sang, Crawford & Stuessy (1997) in 32 species of
Paeonia. Weising & Gardner (1999), on the other hand, verified limited or absent
intraspecific variation in Actinidia chinensis, Lycopersicon esculentum and Nicotiana
tabacum using 10 microsatellite loci.
The general conclusion that can be inferred from the nuclear molecular variability,
as well as by field and historical observations, is that P. alata kept high indices of
intrapopulation genetic diversity probably due to the many introductions that should have
taken place in southern Brazil in the last 50 years. These events could have occurred due to
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human influence, that facilitated the transfer of plants from one place to another, as well as
by an intense intra and interpopulation gene flow, coupled with adaptive genetic plasticity.
All results obtained here suggest that P. alata is in an active process of colonization,
invading areas previously unoccupied especially in Rio Grande do Sul.
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank Eduardo Eizirik and Nelson J.R. Fagundes for important help in the statistical
analyses and interpretation of the findings. Financial help was provided by Programa de
Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX), Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio
Grande do Sul (FAPERGS), and Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul (PROPESQ-UFRGS).
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CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
69
Figure 1. A: Map of southern and southeast Brazil, indicating the localities from which
Passiflora alata was sampled (BA: Bahia; ES: Espírito Santo; MG: Minas Gerais; SP: São
Paulo; PR: Paraná; SC: Santa Catarina; RS: Rio Grande do Sul); B: Enlarged map of Rio
Grande do Sul, showing the places of collection.
Figure 2. Mismatch distribution indicating the observed and expected (in an expanding
population) numbers of pairwise differences between P. alata plants.
Figure 3. Neighbor-joining dendrogram (p distances, 1,000 bootstraps) for the total
number of ITS types of sequences found in 85 plants, indicating the places from which
they have been found. Abbreviations as indicated in the legend of Fig. 1.
Figure 4. Neighbor-joining dendrogram (p distances, 1,000 bootstraps) for the ITS types
of sequences found in 32 plants, indicating the places from which they have been found.
Abbreviations as indicated in the legend of Fig. 1.
Figure 5. Neighbor-joining dendrogram (p distances, 1,000 bootstraps) for the G3pdh
haplotypes found in 32 plants, indicating the places from which they have been found.
Abbreviations as indicated in the legend of Fig. 1.
Figure 6. Neighbor-joining dendrogram (p distances, 1,000 bootstraps) for the LEAFY
haplotypes found in 32 plants, indicating the places from which they have been found.
Abbreviations as indicated in the legend of Fig. 1.
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
70
Table 1. Places of collection with geographical coordinates, by individual, of Passiflora alata
Geographical location
a
GenBank accessions
Plant’s
code
Locality Geographical coordinates
Geomorphologic region
or state
Collector’s
code
ITS 1 ITS 2 G3pdh LEAFY
AL1 Gravataí, RS 29º56'37''S/50º56'13''W Coastal Plain/RS PASS 152 AY858145 AY858263 - -
AL3 Gravataí, RS 29º56'37''S/50º56'13''W Coastal Plain/RS PASS 154 AY858146 AY858264 - -
AL5 Gravataí, RS 29º56'34''S/50º55'02''W Coastal Plain/RS PASS 156 AY858147 AY858265 - -
AL8 Gravataí, RS 29º56'35''S/50º54'49''W Coastal Plain/RS PASS 160 AY858148 AY858266 AY858231 AY858113
AL9 Gravataí, RS 29º5 5'21''S/50º50'52''W Coastal Plain/RS PASS 161 AY858149 AY858267 AY858232 AY858114
AL10 Glorinha, RS 29º53'29''S/50º43'07''W Coastal Plain/RS PASS 162 AY858150 AY858268 AY858233 AY858115
AL12 Santo Antônio da Patrulha, RS 29º52'58''S/50º32'06''W Coastal P lain/RS PASS 166 AY858151 AY858269 AY858234 AY858116
AL15 Taquara, RS 29º41'20''S/50º48'41''W Coastal Plain/RS PASS 178 AY858165 AY858283 - -
AL16 Morungava, Gravataí, RS 29º52'17''S/50º54'13''W Coastal Plain/RS PASS 181 AY858166 AY858284 AY858237 AY858119
AL18 Morungava, Gravataí, RS 29º51'60''S/50º54'08''W Coastal Plain/RS PASS 183 AY858167 AY858285 - -
AL20 Morungava, Gravataí, RS 29º51'37''S/50º54'13''W Coastal Plain/RS PASS 186 AY858168 AY858286 AY858238 AY858120
AL22 Itacolomi, Gravataí, RS 29º51'52''S/50º58'10''W Coastal Plain/RS PASS 189 AY858169 AY858287 AY858239 AY858121
AL24 Gravataí, RS 29º53'46''S/51º00'54''W Coastal Plain/RS PASS 191 AY858170 AY858288 AY858240 AY858122
AL26 Vila Assumpção, Pelotas, RS 31º46'00''S/52º19'60''W South of Rio Grande Plateau/RS N. Mega AY858201 AY858319 AY858251 AY858133
AL27 Porto Alegre, RS 30º01'60''S/51º12'00''W Coastal Plain/RS PKS 24 AY858152 AY858270 - -
AL30 Eldorado do Sul, RS 30º03'17''S/51º27'20''W Central Depression/RS PASS 196 AY858171 AY858289 AY858241 AY858123
AL31 Eldorado do Sul, RS 30º03'33''S/51º30'57''W Central Depression/RS PASS 197 AY858172 AY858290 - -
AL34 Eldorado do Sul, RS 30º05'06''S/51º36'60''W Central Depression/RS PASS 201 AY858173 AY858291 AY858242 AY858124
AL35 Eldorado do Sul, RS 30º05'31''S/51º38'03''W Central Depression/RS PASS 204 AY858174 AY858292 - -
AL36 Butiá, RS 30º08'13''S/52º00'27''W Central Depression/RS PASS 208 AY858175 AY858293 - -
AL38 Cachoeira do Sul, RS 30º13'52''S/52º41'43''W Central Depression/RS PASS 218 AY858176 AY858294 - -
AL39 Viamão, RS 30º05'44''S/50º59'29''W Coastal Plain/RS PASS 222 AY858153 AY858271 - -
AL42 Viamão, RS 30º05'57''S/50º58'46''W Coastal Plain/RS PASS 228 AY858154 AY858272 AY858235 AY858117
AL43 Viamão, RS 30º05'60''S/50º58'38''W Coastal Plain/RS PASS 229 AY858155 AY858273 - -
AL45 Viamão, RS 30º06'07''S/50º57'59''W Coastal Plain/RS PASS 231 AY858156 AY858274 - -
AL47 Águas Claras, Viamão, RS 30º08'11''S/50º54'40''W Coastal Plain/RS PASS 235 AY858157 AY858275 AY858236 AY858118
AL48 Viamão, RS 30º06'22''S/50º46'20''W Coastal Plain/RS PASS 236 AY858158 AY858276 - -
AL49 Viamão, RS 30º06'21''S/50º46'17''W Coastal Plain/RS PASS 237 AY858159 AY858277 - -
AL50 Capão da Porteira, Viamão, RS 30º06'11''S/50º41'35''W Coastal Plain/RS PASS 238 AY858160 AY858278 - -
AL52 Capão da Porteira, Viamão, RS 30º06'35''S/50º40'16''W Coastal Plain/RS PASS 240 AY858161 AY858279 - -
AL54 Canoas, RS 29º53'14''S/51º13'10''W Central Depression/RS PASS 242 AY858177 AY858295 - -
AL56 Canoas, RS 29º52'52''S/51º14'16''W Central Depression/RS PASS 244 AY858178 AY858296 AY858243 AY858125
AL60 Nova Santa Rita, RS 29º52'28''S/51º14'45''W Central Depression/RS PASS 249 AY858179 AY858297 - -
AL62 Nova Santa Rita, RS 29º52'27''S/51º14'46''W Central Depression/RS PASS 251 AY858180 AY858298 - -
AL63 Nova Santa Rita, RS 29º51'09''S/51º15'54''W Central Depression/RS PASS 252 AY858181 AY858299 - -
AL65 Nova Santa Rita, RS 29º50'59''S/51º16'03''W Central Depression/RS PASS 254 AY858182 AY858300 AY858244 AY858126
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
71
Table 1 (cont.)
Geographical location
a
GenBank accessions
Plant’s
code
Locality Geographical coordinates
Geomorphologic region
or state
Collector’s
code
ITS 1 ITS 2 G3pdh LEAFY
AL66 Montenegro, RS 29º49'02''S/51º23'17''W Central Depression/RS PASS 256 AY858183 AY858301 - -
AL67 Montenegro, RS 29º48'55''S/51º24'32''W Central Depression/RS PASS 257 AY858184 AY858302 - -
AL69 Tabaí, RS 29º39'24''S/51º44'58''W Araucaria Plateau/RS PASS 259 AY858193 AY858311 AY858247 AY858129
AL70 Fazenda Vilanova, RS 29º35'09''S/51º50'03''W Araucaria Plateau/RS PASS 263 AY858194 AY858312 AY858248 AY858130
AL72 Fazenda Vilanova, RS 29º35'07''S/51º50'05''W Araucaria Plateau/RS PASS 265 AY858195 AY858313 AY858249 AY858131
AL74 Estrela, RS 29º33'15''S/51º53'48''W Araucaria Plateau/RS PASS 268 AY858196 AY858314 AY858250 AY858132
AL77 Marques de Souza, RS 29º16'42''S/52º08'11''W Araucaria Plateau/RS PASS 272 AY858197 AY858315 - -
AL78 Cruz Alta, RS 28º38'48''S/53º37'51''W Missions’ Plateau/RS PASS 281 AY858205 AY858323 AY858254 AY858136
AL81 Cruz Alta, RS 28º37'10''S/53º37'49''W Missions’ Plateau/RS PASS 284 AY858206 AY858324 AY858255 AY858137
AL83 Sarandi, RS 27º57'49''S/52º54'32''W Missions’ Plateau/RS PASS 294 AY858207 AY858325 AY858256 AY858138
AL88 Cachoeira do Sul, RS 30º04'53''S/52º52'27''W Central Depression/RS APL 155 AY858185 AY858303 - -
AL93 Cachoeira do Sul, RS 30º04'34''S/52º52'34''W Central Depression/RS APL 160 AY858186 AY858304 AY858245 AY858127
AL99 Cachoeira do Sul, RS 30º03'40''S/52º54'08''W Central Depression/RS APL 166 AY858187 AY858305 - -
AL101 Centro Politécnico, Curitiba, PR 25º25'00''S/49º15'00''W PR APL 172 AY858215 AY858333 AY858258 AY858141
AL102 Universidade Livre do Meio Ambiente,
Curitiba, PR
25º25'00''S/49º15'00''W PR APL 231 AY858216 AY858334 AY858259 AY858142
AL103 Águas de Lindóia, SP 22º28'60''S/46º39'00''W SP PASS 307 AY858217 AY858335 AY858260 AY858143
AL106 Capané, Cachoeira do Sul, RS 30º16'11''S/53º05'51''W Central Depression/RS PASS 322 AY858188 AY858306 AY858246 AY858128
AL107 Caçapava do Sul, RS 30º36'33''S/53º31'43''W South of Rio Grande Plateau/RS PASS 341 AY858202 AY858320 AY858252 AY858134
AL108 Porto Alegre, RS 30º04'29''S/51º07'04''W Coastal Plain/RS PASS 357 AY858162 AY858280 - -
AL111 Pq. Municipal das Galhetas, Praia de
Bombas, SC
27º09'24''S/48º32'49''W SC A.C. Cervi AY858211 AY858329 AY858261 -
AL112 Praia do Pinho, SC 27º00'17''S/48º36'49''W SC A.C. Cervi AY858212 AY858330 - AY858140
AL113 Praia do Cabeço, Itapema, SC 27º05'57''S/48º36'54''W SC A.C. Cervi AY858213 AY858331 - -
AL114 Tijucas, SC 27º14'28''S/48º37'53''W SC A.C. Cervi AY858214 AY858332 - -
AL122 Eldorado do Sul, RS 31º03'04''S/51º20'05''W South of Rio Grande Plateau/RS PASS 374 AY858203 AY858321 AY858253 AY858135
AL145 Cerrito Alegre, Pelotas, RS 31º32'25''S/52º14'08''W South of Rio Grande Plateau/RS PASS 411 AY858204 AY858322 - -
AL151 Pinheirinhos, Santo Antônio da Patrulha,
RS
29º43'54''S/50º36'33''W Coastal Plain/RS PASS 448 AY858163 AY858281 - -
AL153 Rolante, RS 29º38'42''S/50º31'13''W Coastal Plain/RS PASS 450 AY858164 AY858282 - -
AL155 Ibirubá, RS 28º38'14''S/53º05'37''W Missions’ Plateau/RS PKS 02 AY858208 AY858326 AY858257 AY858139
AL158 Santa Maria, RS 29º42'32''S/53º40'04''W Central Depression/RS PKS 05 AY858198 AY858316 - -
AL159 Santa Maria, RS 29º42'41''S/53º39'17''W Central Depression/RS PKS 06 AY858199 AY858317 - -
AL171 Taquari, RS 29º42'05''S/51º50'60''W Central Depression/RS PKS 22 AY858200 AY858318 - -
AL174 Gonçalves, MG 22º41'11''S/45º54'04''W MG * AY858218 AY858336 - -
AL176 Gonçalves, MG 22º41'41''S/45º53'28''W MG * AY858219 AY858337 - -
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
72
Table 1 (cont.)
Geographical location
a
GenBank accessions
Plant’s
code
Locality Geographical coordinates
Geomorphologic region
or state
Collector’s
code
ITS 1 ITS 2 G3pdh LEAFY
AL179 Gonçalves, MG 22º41'41''S/45º53'28''W MG * AY858220 AY858338 - -
AL185 São Mateus de Minas, Camanducaia, MG 22º42'10''S/45º58'33''W MG * AY858221 AY858339 - -
AL186 RPPN Caraça, Catas Altas, MG 20º02'15''S/43º29'19''W MG * AY858222 AY858340 - -
AL187 RPPN Caraça, Catas Altas, MG 19º59'58''S/43º28'08''W MG * AY858223 AY858341 - -
AL188 Estação Ecológica UFMG, Belo
Horizonte, MG
19º55'00''S/43º55'60''W MG * AY858224 AY858342 - -
AL190 Estação Ecológica UFMG, Belo
Horizonte, MG
19º55'00''S/43º55'60''W MG * AY858225 AY858343 - -
AL193 Serra do Tabuleiro, MG 19º06'48''S/43º35'06''W MG * AY858226 AY858344 - -
AL194 Retiro das Pedras, Belo Horizonte, MG 19º55'00''S/43º55'60''W MG * AY858227 AY858345 - -
AL195 Parque de Setiba, Setiba, ES 20º40'00''S/40º30'00''W ES G. Gonçalves AY858228 AY858346 AY858262 AY858144
AL197 Portão, RS 29º39'41''S/51º15'59''W Transition zone (CD-AP)/RS PASS 452 AY858189 AY858307 - -
AL204 São Vendelino, RS 29º21'46''S/51º22'50''W Araucaria Plateau/RS PASS 459 AY858190 AY858308 - -
AL208 Três Coroas, RS 29º31'36''S/50º46'27''W Transition zone (CD-AP)/RS PASS 463 AY858191 AY858309 - -
AL213 Igrejinha, RS 29º35'22''S/50º48'04''W Transition zone (CD-AP)/RS PASS 468 AY858192 AY858310 - -
AL216 Rio de Contas, BA 14º18'00''S/39º00'00''W BA T.S.N. Sena
38
AY858229 AY858347 - -
AL217 Navegantes, Crissiumal, RS 27º30'00''S/54º07'00''W Missions’ Plateau/RS S.B.F.
Almeida
AY858209 AY858327 - -
AL219 Esquina Gaúcha, RS 27º26'44''S/54º11'55''W Missions’ Plateau/RS S.B.F.
Almeida
AY858210 AY858328 - -
a
The abbreviations BA, ES, MG, PR, RS, SC indicate the Brazilian states of Bahia, Espírito Santo, Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul, and Santa Catarina, respectively.
*A.P. Lorenz-Lemke & J.R. Stehmann
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
73
Table 2. GC content, diversity indices, and neutrality tests by system for the 32 plants
from which data are available for the three nuclear systems tested, as well as for the total
number of individuals tested for ITS
ITS G3pdh LEAFY
Characteristic
n=85 n=32 n=32 n=32
GC content (%) 65 65 40 42
Haplotype diversity 0.807 0.735 0.968 0.871
Nucleotide diversity 0.00439 0.00358 0.01051 0.00406
Transition/transversion rate 6.0913 4.4584 1.3945 4.3276
Neutrality Tests
Tajima’s D 0.24607 0.80175 0.49751 0.91777
Fu & Li’s D* 1.28359 1.07505 1.13621 0.53820
Fu & Li’s F* 1.09025 1.15931 1.07023 0.78243
All the neutrality tests yielded statistically non-significant values.
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
74
Table 3. FLUCTUATE simulation results by system for the 32 plants from which data are
available for the three nuclear systems tested, as well as for the total number of individuals
tested for ITS
ITS G3pdh LEAFY
Characteristic
n=85 n=32 n=32 n=32
g 935.38 1230.48 299.77 1231.63
SD g 83.48 261.02 44.42 198.99
theta (1)
0.02 0.01 0.08 0.02
SD theta (1)
0.001 0.001 0.011 0.003
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
75
Table 4. Analysis of molecular variance (AMOVA) for the 32 plants from which data are
available for the three nuclear systems tested, as well as for the total number of individuals
tested for ITS
Source of variation d.f. Sum of
squares
Variance
components
Percentage
variation
ITS (n=85)
Among groups
a
1 26.580 0.40828 35.15
Among populations
within groups
9 17.326 0.09708 8.36
Within populations 159 104.315 0.65607 56.49
ITS (n=32)
Among groups
a
1 3.283 0.14286 17.21
Among populations
within groups
7 7.044 0.05437 6.55
Within populations 55 34.798 0.63270 76.24
G3pdh (n=32)
Among groups
a
1 9.603 0.07754 1.42
Among populations
within groups
7 72.661 0.84818 15.48
Within populations 55 250.429 4.55326 83.10
LEAFY (n=32)
Among groups
a
1 3.879 0.15187 11.24
Among populations
within groups
7 9.798 0.03409 2.52
Within populations 55 64.105 1.16554 86.24
a
Group 1: Rio Grande do Sul; Group 2: all the other states.
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
76
A
B
Figure 1
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
77
ITS (n=85) ITS (n=32)
G3pdh (n=32) LEAFY (n=32)
Figure 2
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
78
Figure 3
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
79
Figure 4
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
80
Figure 5
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
81
Figure 6
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
82
Appendix 1. Sequences identified in ITS regions 1 and 2 of the full set of Passiflora alata studied
a
Nucleotide positions
ITS 1
ITS 2
1
1
2
2
2
4
4
1
1
1
2
3
3
5
5
5
6
6
9
9
9
9
0
6
0
2
6
0
0
Sequence types
2
4
0
2
8
4
0
7
0
3
9
6
7
4
6
8
9
9
1
8
0
9
8
9
Numbers
observed
Plants showing
the sequences
H1 t
g
a
c
a
a
c
c
a c - t g t
t t
c
a
t
g
a
- c
t
2 AL1
H2 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c -
-
.
.
.
.
. .
.
18 1
H3 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
24 2
H4 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
. .
.
.
.
.
g
. .
.
3 3
H5 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
29 4
H6 .
-
.
.
-
-
-
-
- g . . . .
c .
.
.
.
.
.
. .
.
1 AL10
H7 .
-
.
.
-
-
-
-
- g . . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
1 AL10
H8 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . c . .
c .
.
c
.
.
g
. .
.
1 AL12
H9 -
.
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
. .
.
c
.
.
.
. .
.
2 AL27
H10 .
.
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
.
.
.
.
. .
.
3 5
H11 .
.
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
3 6
H12 .
-
.
.
-
.
-
-
- g . . . .
. t
c
.
.
.
.
. .
.
2 AL45
H13 .
-
-
.
-
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
2 AL50
H14 .
-
-
.
-
.
-
-
. g . . - .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
2 AL151
H15 .
.
.
.
-
.
-
-
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
2 AL153
H16 .
-
.
.
.
.
.
.
. g t . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
3 7
H17 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
g
. .
c
5 8
H18 -
-
.
.
.
.
.
.
. g t . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
1 AL35
H19 -
-
.
.
.
.
.
.
. g t . . .
c .
.
.
.
.
.
. .
.
1 AL35
H20 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
. .
.
c
.
.
.
. .
.
6 9
H21 .
-
.
.
.
.
.
.
- g . . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
1 AL63
H22 .
-
.
.
.
.
.
.
- g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
1 AL63
H23 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
. t
c
.
.
.
.
. .
.
2 AL65
H24 .
-
.
.
.
.
.
.
. g t . . .
c .
.
c
.
.
g
. .
c
1 AL67
H25 -
-
-
.
.
.
.
.
. g . . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
2 AL88
H26 .
-
.
-
-
.
-
-
. g . . . .
. t
c
.
.
-
.
. .
.
2 AL106
H27 .
-
.
-
-
.
-
-
. g . . . .
. t
c
.
.
.
.
. .
.
2 AL204
H28 .
-
.
-
-
.
-
-
. g . . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
2 AL213
H29 .
-
-
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
2 AL72
H30 .
-
.
-
-
.
-
-
. g . . . .
. .
.
c
.
.
.
. .
.
2 AL158
H31 .
.
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
2 AL171
H32 .
.
.
.
-
.
-
.
. g . . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
2 AL26
H33 .
.
-
.
-
.
-
.
. g t . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
c
1 AL122
H34 .
.
-
.
-
.
-
.
. g t . . .
c .
.
.
.
.
.
. .
c
1 AL122
H35 .
-
.
-
-
.
-
.
. g . . . .
. t
c
.
.
.
.
. .
.
2 AL83
H36 -
-
-
.
.
.
-
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
1 AL155
H37 -
-
-
.
.
.
-
.
. g . . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
1 AL155
H38 .
-
.
t
.
.
.
-
. g . . . .
. .
.
c
.
.
.
. .
.
1 AL217
H39 .
-
.
t
.
.
.
-
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
1 AL217
H40 .
-
.
t
.
.
.
-
. g . . . .
. .
.
.
.
.
g
. .
.
1 AL219
H41 .
-
t
.
.
.
-
. g . . . .
. .
.
.
.
.
.
. .
.
1 AL219
H42 .
-
.
-
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
2 AL112
H43 .
-
.
.
-
.
.
.
. g . . . .
c .
.
.
.
.
.
. .
.
2 AL114
H44 -
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
.
.
.
.
. .
.
1 AL101
H45 -
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. .
.
1 AL101
H46 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
g
t .
.
1 AL102
H47 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . c . .
c .
.
c
.
.
g
t .
.
1 AL102
H48 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . g
c .
.
c
.
.
.
. t
.
1 AL174
H49 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
.
. t
.
1 AL174
H50 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
c
.
.
. .
.
2 AL176
H51 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
c
.
g
. t
.
1 AL179
H52 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
c
.
.
. t
.
1 AL179
H53 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . g
c .
.
c
c
.
.
. .
.
1 AL185
H54 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
.
g
. .
.
1 AL185
H55 .
-
.
-
-
.
-
-
. g . c . .
c .
.
c
.
.
g
. .
c
2 10
H56 .
-
.
-
-
.
-
-
. g . . . .
c .
.
c
.
.
g
. .
c
2 11
H57 .
-
.
-
-
.
-
-
. g . c . .
c .
.
c
.
.
g
t .
c
2 AL187
H58 .
-
.
-
.
.
.
.
. g . c . .
c .
.
c
.
-
g
. .
c
1 AL188
H59 .
-
.
-
.
.
.
.
. g . . . .
c .
.
c
.
-
g
. .
c
1 AL188
H60 .
-
.
-
.
.
-
-
. g . c . .
c .
.
c
.
.
g
. .
c
2 AL190
H61 .
-
.
.
.
.
.
.
. g . c . .
c .
.
c
.
.
g
. .
c
2 12
a
A point indicates agreement, a dash a deletion, in relation to the nucleotide present in a given site of H1. Plants are identified by their code numbers, as
presented in Table 1. When more than one plant showed the indicated sequence type they were grouped as follows: 1: AL3, AL9, AL43, AL18, AL20, AL54,
AL60, AL66, AL208, AL69, AL70, AL81, AL111, AL113; 2: AL5, AL8, AL9, AL12, AL42, AL47, AL49, AL52, AL108, AL15, AL16, AL24, AL34, AL38,
AL54, AL56, AL60, AL62, AL197, AL159, AL107, AL103; 3: AL5, AL56, AL66; 4: AL8, AL42, AL43, AL47, AL49, AL52, AL108, AL15, AL16, AL18,
AL20, AL22, AL24, AL31, AL93, AL99, AL197, AL208, AL69, AL70, AL74, AL77, AL78, AL103; 5: AL39, AL145; 6: AL39, AL48; 7: AL30, AL67; 8:
AL34, AL193, AL194, AL195; 9: AL36, AL38, AL62, AL77, AL78; 10: AL186, AL216; 11: AL186, AL216; 12: AL194, AL195
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
83
Appendix 2. Sequences identified in ITS regions 1 and 2 in the subsample of 32 Passiflora alata plants
investigated
a
Nucleotide positions
ITS 1
ITS 2
1
2
2
2 4
1
1
1
2 3 3
5
5
6
9
9
9 0
0
2
6 0
Sequence types
2 4
0
2
8
4 0 7
0
9
6
6
8
9 9
7
0
8 9
Numbers
observed
Plants showing
the sequences
H1 t - a c a a c c a - t c - - c g a
- t 11
1
H2 . . . . . . . . . . . t . . a . .
. . 17
2
H3 . . . . . . . . . . . . . . a . .
. . 8
3
H4 . . . . - - - - - . . . . . a . .
. . 1 AL10
H5 . . . . - - - - - . . t . . a . .
. . 1 AL10
H6 . . . . . . . . . . c . . . . . g
. . 1 AL12
H7 . . . . . . . . . t . . . . . . .
. . 2 AL30
H8 . . . . . . . . . . . . . . . . g
. c 2
4
H9 . . . . . . . . . . . . . . . . g
. . 1 AL56
H10 . . . . . . . . . . . t t c a . .
. . 2 AL65
H11 . . . - - . - - . . . t t c a - .
. . 2 AL106
H12 . . - . . . . . . . . . . . . . .
. . 2 AL72
H13 . g . . - . - . . . . t . . a . .
. . 2 AL26
H14 . g - . - . - . . t . . . . . . .
. c 1 AL122
H15 . g - . - . - . . t . . . . a . .
. c 1 AL122
H16 . . . . . . . . . . . t . . . . .
. . 1 AL78
H17 . . . - - . - . . . . t t c a . .
. . 2 AL83
H18 - . - . . . - . . . . t . . a . .
. . 1 AL155
H19 - . - . . . - . . . . . . . . . .
. . 1 AL155
H20 - . . . . . . . . . . . . . a . .
. . 1 AL101
H21 - . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 1 AL101
H22 . . . . . . . . . . . . . . . . g
t . 1 AL102
H23 . . . . . . . . . . c . . . . . g
t . 1 AL102
H24 . . . . . . . . . . c . . . . . g
. c 1 AL195
a
A point indicates agreement, a dash a deletion, in relation to the nucleotide present in a given site of H1. Plants are identified by their code numbers, as
presented in Table 1. When more than one plant showed the indicated sequence type they were grouped as follows: 1: AL8, AL9, AL12, AL42, AL47,
AL16, AL24, AL34, AL107, AL103; 2: AL8, AL42, AL47, AL16, AL20, AL22, AL24, AL56, AL93, AL69, AL70, AL74, AL78, AL103; 3: AL9, AL20,
AL69, AL70, AL81, AL111; 4: AL34, AL195
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
84
Appendix 3. Sequences identified in the G3pdh gene of the Passiflora alata plants investigated (first 574
sites)
a
Nucleotide positions
G3pdh
Exon B
Intron B
Exon C
Intron C
1
1
1 1 1
1 1 1
1
1
1 2 2 2
2
3
3 3 4
4
4 4 5 5
5
5 5
3 4 9
1
2
3 4 4
6 6 6
7
8
9 2 4 4
6
0
3 8 5
6
6 8 6 6
6
7 7
Haplotypes
6 8 9
4
7
6 1 3
1 2 8
6
4
7 0 0 6
0
3
8 5 1
5
6 9 4 7
9
3 4
H1 t a g c g - t a a t a t c c c a g c a t t c
c a a g - a - t
H2 . c . . . . . . . . . . . . . . . . c c . t
. . . . g . a .
H3 . c . . . . . . . . . . . . . . . . c . . .
. . . . g . a .
H4 . . t . . . . . . . . . t . t c a . c c c t
. . . . . . . .
H5 . . t . . . . . . . . . . . t c a . c c c .
. . . . . . . .
H6 . . t . . . . . . . . . t . t c a . c c c .
. . . . . . . .
H7 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c c . t
. . g . g - a -
H8 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c c . t
. . g . g - a -
H9 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c . . .
. . g . g - a -
H10 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c c . t
. . g . g - a -
H11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . c . . .
. . . . . . . .
H12 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c c . t
. . g . g . a .
H13 . . t . . . . . . . . . t . . c a . c c c t
. . g . g . a .
H14 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c c . t
. . . . g - . .
H15 . . t . . . . . . . . . t . t . a . c c c t
. . . . g - . .
H16 . . t . . t . . . . . . t . t c a t c . . .
. . . . . . .
H17 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c c . t
. . g . g - a -
H18 g . . . a . . . . c g g t . t c a . c . . t
. g g . g - . .
H19 g . . . . . . . . . . g t . t c a . c c c t
. . . . g - . .
H20 g . t . . . . . . . g g t . t c a . c c c t
. g g . g - . .
H21 g . . . a . . . . c g g t . t c a . c . . t
. g g . g - . .
H22 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c c . t
. . g . g - a .
H23 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . g . g - a .
H24 . . . t . . . . . . . g t . . . a . c c . t
. g g . g - . .
H25 . . . . a . . . . c g g t . . c . . c . . t
. g g . g - . .
H26 g . . . a . . . . c g g t . . c a . c . . t
. g g . g - . .
H27 g . . . . . . . . . . g t . . . . . c c . t
. g g . g - . .
H28 . . t . . . . . . . . . t . t c a . c c c t
. . g . . . . .
H29 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c c . t
. . g . g - a -
H30 . . . . . . . . . . . . t . . . . . c c . t
. . g . g - a -
H31 . . . . . . . . . . . . t . t c a . c . . t
. . g . g - . .
H32 . . t . . . . . . . . . t . t c a . c c c t
. . g . g - . .
H33 g . . . a . . . . c g g . . . c . . c . . .
. g . . g . a .
H34 g . . . . . . . . . . g . . . c . . c . . .
. . . . g . a .
H35 g . . . . . . . . . . g t . . c . . c c . t
. g g . g - . .
H36 . . . . a . . . . c g g t . . c . . c . . t
. g g . g - . .
H37 . . t . . t . . . . . . t . t c a t c . . .
. . . . . . . .
H38 . . t . . . . . . . . . t . t c a . c c c t
. . . . . . . .
H39 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . .
H40 . . . . . . . . . . . . t . . c a . c c . t
. . . . g - . .
H41 . . . . . . . . . . . . t . . c . . c c . t
. . . . g - . .
H42 . . . t . . - - t c g g t t t c a . c . . t
t . g a g - . .
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
85
App 3 (cont.) (sites 578-1010)
Nucleotide positions
G3pdh
Intron C Exon D Intron D
5
5
5
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
8 8
8
8
8
9
9
9
9
9
9
9
7
8
9
0
0
1
2
3
4
5
5
6
7
8
9
0
0 5
8
9
9
1
1
3
3
4
7
9
Haplotypes
8
2
0
5
8
4
4
5
1
0
2
6
8
8
0
9
5 8
0
2
8
1
9
4
8
9
3
8
Numbers
observed
Plants
showing
the
sequences
H1 a
g
t - g
a
a
a
a
a
g
c
a
t -
t c g
c g - t t c a a c t 4
1
H2 . . . . . . . . . . . t c
. g
. . . g - . . . . . t - a 1 AL9
H3 . . . . . . . . . . . t c
. g
. . . g - . . . . . t - a 1 AL9
H4 g
. . . . . . . g
. . t . . . . . a
g . . . . . c t t . 4
2
H5 g
. . . . . . . . . . . . . . . . a
g . . . . . c t t . 1 AL12
H6 g
. . . . . . . g
. . t . . . . . a
g . . . . . c t t . 1 AL12
H7 . a
. t t . . . . . . t . . g
. . a
g - a . . . c t t . 4
3
H8 . . . t t . . . . . . t . . g
. . a
g . . . . . c t t . 2 AL46
H9 . . . . . . . . . . . . . -
g
. . a
g - a . c . c t t . 1 AL16
H10 . . . . . . . . . . . . . -
g
. . a
g - a . . . c t t . 1 AL16
H11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . g . . . c . c . t . 1 AL20
H12 g
. . . . . . . g
. . . . -
g
. . a
g . . . . . c t t . 1 AL24
H13 g
. . . . . . . g
. . . . -
g
. . a
g . . . . . c t t . 1 AL24
H14 . . . . . . . . . . . t . -
g
. . a
g . . . . . c t t . 1 AL30
H15 g
. . . . . . . . . . t . -
g
. . a
g . . . . . c t t . 1 AL30
H16 . . . . . . . . . . . . . . . . . a
g - a . . . c t t . 6
4
H17 . . . t t . . . . . . t . . g
. . a
g - a . . . c t t . 2 AL57
H18 g
. . . . . . . g
. . t . . . . . a
g . . . . . c t t . 1 AL65
H19 g
. . . . . . . g
. . t c
. . . . a
g . . . . . c t t . 1 AL65
H20 g
. - . . . . . g
. . t c
. . . . a
g - a . . . c t - . 1 AL106
H21 g
. - . . . . . g
. . t . . . . . a
g - a . . . c t - . 1 AL106
H22 . . . . . . . . . . . . . -
g
. . . g . . . . . c . . . 1 AL69
H23 . . . . . . . . . . . . . -
g
. . . . . . . . . . . t . 1 AL69
H24 . a
. t t . . . . c
. . . . g
. . a
g . . . . . . t t a 1 AL70
H25 . a
. t t . . . . c
. . . . g
. . a
g . . . . . c t t a 1 AL70
H26 . . . t . . . . . . . t . -
g
. . a
g - a . . . c t t . 1 AL72
H27 . . . t t . . . . . . t . -
g
. . a
g - a . . . c t t . 1 AL72
H28 g
. . . . . . . g
. . t . . . . . a
g . . . . . . t t a 2 AL75
H29 . . - t t -
. . . . . t . . g
. . a
g - a . . . c t t . 2 AL26
H30 . . . t t . . . . . . t . . g
. t a
g - a . . . c t t . 2 AL107
H31 g
. . t . -
. c
. c
. . . . g
. . a
g . . a . . . t . . 1 AL122
H32 g
. . t . -
. c
. c
. . . . g
. . a
g . . . . . c t . . 1 AL122
H33 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a . . . c . . . 1 AL81
H34 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a . . . . . . . 1 AL81
H35 . a
- t t -
. c
. c
. . . . g
. . a
g - a . . . c t t . 1 AL155
H36 . a
- t t -
. c
. c
. . . . g
. . a
g - a . . . c t t . 1 AL155
H37 . . . . . . . . . . . . . . . . . a
g . . . . . c t - . 2 AL111
H38 g
. - . . . . . g
. . t . -
g
a
. a
g . . . . . c t . . 2 AL101
H39 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . t . . t . 1 AL102
H40 . . . t t . c
. . . c
t . . g
. . . . - a . . . c t . . 1 AL103
H41 . . . t t . . . . . . t . . g
. . . . - a . . . c t . . 1 AL103
H42 . . . t . . . . . . . t . . g
. . . g . . . . . c t . . 2 AL195
a
A point indicates agreement, a dash a deletion, in relation to the nucleotide present in a given site of H1. Plants are identified by their code numbers, as
presented in Table 1. When more than one plant showed the indicated sequence type they were grouped as follows: 1: AL8, AL20, AL102; 2: AL10, AL93;
3: AL41, AL22; 4: AL33, AL78, AL83.
CAPÍTULO IV – 2º ARTIGO
86
Appendix 4. Sequences identified in LEAFY’s 2
nd
intron of the Passiflora alata plants investigated
a
Nucleotide positions
LEAFY
Exon 2
Intron 2
1 1 2 2 4 4 5
6 6
4 9 5 6 9 9 0
Haplotypes
0 6
3 5 2 8 3 7 4
Numbers observed Plants showing the
sequences
H1 g t c c g g t t t 15
1
H2 . c . . . a c . . 3
2
H3 a . . . . . . . . 10
3
H4 a . . . . . c . . 3
4
H5 . . . . . . . - . 4
5
H6 a c . . . a c . . 7
6
H7 a . . . . a . . . 2
7
H8 . . . . . . . . g 2
8
H9 . c . . . . c . g 1 AL24
H10 . c . . . a . . g 1 AL30
H11 a . . a . . . . g 2
9
H12 a c . . . a . . . 2 AL65
H13 . c . . . . c - g 1 AL74
H14 . . . . . . . - g 1 AL74
H15 a c . . . a . - . 1 AL81
H16 a c . . . a c - . 1 AL81
H17 a c . . a a c . . 2 AL83
H18 a . . . . . c . g 1 AL112
H19 a . . . . . . . g 1 AL112
H20 a c . . . a . . g 1 AL102
H21 a . . . . a . . g 1 AL102
H22 a c . . . . . . . 1 AL103
H23 . . g . . . . . . 1 AL195
a
A point indicates agreement, a dash a deletion, in relation to the nucleotide present in a given site of H1. Plants are identified by their code numbers, as
presented in Table 1. When more than one plant showed the indicated sequence type they were grouped as follows: 1: AL8, AL10, AL20, AL22, AL30,
AL93, AL26, AL107, AL155, AL195; 2: AL8, AL78, AL155; 3: AL9, AL46, AL16, AL33, AL93, AL69, AL72, AL101, AL103; 4: AL9, AL106, AL69; 5:
AL12, AL122; 6: AL41, AL57, AL106, AL70, AL72; 7: AL46, AL70; 8: AL24, AL78; 9: AL33, AL101.
87
CAPÍTULO V
DISCUSSÃO
______________________________________________________________
CAPÍTULO V - DISCUSSÃO
88
Os registros históricos indicam que P. alata foi introduzida no Estado do Rio
Grande do Sul em 1934 e, após 20 anos aproximadamente, foram encontrados espécimes
selvagens. Embora em anos posteriores ambas as formas tenham sido encontradas,
atualmente a espécie é reconhecida sob a forma subespontânea. Este status pôde ser
comprovado nos três anos em que saídas de campo foram realizadas em praticamente todo
o território do Rio Grande do Sul. Preferencialmente, a espécie foi encontrada ao longo de
rodovias pavimentadas, em ambientes bem iluminados e alterados pela atividade humana,
sem co-existir com outras espécies de Passiflora, e sem apresentar associação com
qualquer tipo específico de formação vegetal. A maior abundância de espécimes foi
registrada nas regiões geomorfológicas da Planície Costeira e Depressão Central, uma
localização centro-leste também ocupada pela espécie no âmbito nacional. Também não foi
registrada qualquer variação morfológica nas diferentes regiões amostradas do Estado,
corroborando dados para o restante do Brasil.
Diferentes fatores, bióticos e abióticos, contribuem para o sucesso de uma espécie
que será introduzida em um novo ambiente, como: o número de propágulos (vegetativos ou
sexuais) introduzidos; as características internas das novas espécies, ou seja, a
adaptabilidade fenotípica e genotípica às novas condições ambientais; a susceptibilidade do
ambiente à invasão; e a presença (ou ausência) de herbívoros, patógenos e mutualistas
neste novo ambiente (Dietz et al. 1999; Lonsdale 1999; Davis et al. 2000; Gaskin & Schaal
2002; Wolfe 2002; Bleeker 2003; Schaal et al. 2003).
O sistema reprodutivo e o efeito fundador (o pequeno número não-aleatório de
indivíduos que migram para os novos locais) estão entre as principais causas da redução da
variação genética em populações invasoras, quando comparada às das populações nativas;
também o pequeno número de indivíduos que migram para os novos locais é responsável
por essa perda de variação (Novak et al. 1993; Amsellem et al. 2000; Chapman et al. 2000;
Walker et al. 2003). Diversos autores, como Amsellem et al. (2000), Le Page et al. (2000),
Marston & Villalard-Bohnsack (2002), e Ye et al. (2004), verificaram em seus estudos esta
baixa, e até mesmo ausente, variação nas populações introduzidas. Espécies
autofecundadas, bem como as que apresentam mecanismos de autocompatibilidade, são
propensas a apresentar baixa diversidade genética intrapopulacional quando comparadas
com espécies de fecundação cruzada; também cada população autofecundada tende a ser
mais diferenciada que as outras, porque o fluxo de pólen é mais limitado (Maki et al.
CAPÍTULO V - DISCUSSÃO
89
1999). P. alata, no entanto, apresenta fecundação cruzada e mecanismos de auto-
incompatibilidade, que contribuem para uma considerável variação genética
intrapopulacional.
Por outro lado, se ocorrerem múltiplas introduções de diferentes genótipos em um
mesmo local ou em áreas adjacentes, seguido de migração local, a variação genética em
populações fundadoras pode ser grande (Novak et al. 1993). Correlação entre a
distribuição geográfica e a variação genética pode existir se alguma fecundação cruzada
ocorrer na espécie, se o fluxo gênico for uma simples função da distância geográfica, e se
cada efeito do fluxo gênico não for compensado pela deriva genética ou pela seleção;
também pode ocorrer estruturação filogeográfica entre populações fundadoras recentes se
cada população derivada tenha sido fundada por diferentes populações de uma fonte
filogeograficamente estruturada (Davies et al. 1999; Müller-Schärer & Fischer 2001).
Devido a isto, muitos autores verificaram uma variação genética considerável em espécies
que foram introduzidas em novos locais (maior diferenciação genética entre as populações
que dentro das mesmas), bem como um padrão filogeográfico (Novak et al. 1993; Müller-
Schärer & Fischer 2001; Onyabe & Conn 2001; Walker et al. 2003).
A inexistência de um padrão geográfico, todavia, está condicionada à ocorrência de
múltiplas introduções não-seletivas em diferentes regiões, seguida por uma troca gênica
substancial entre as populações. Também está relacionada ao fato de que, em certos casos,
existe pouco tempo para ocorrerem mutações, e as relações existentes entre os alelos
refletem eventos evolutivos na população ancestral da espécie, e não a história desta
espécie nas novas áreas ocupadas.(Villablanca et al. 1998; Davies et al. 1999; Pappert et
al. 2000). Estudos realizados com diferentes espécies vegetais (Novak & Mack 1993; Dietz
et al. 1999; Pappert et al. 2000; Palmé et al. 2003; Ruggiero & Procaccini 2004)
comprovaram a repetida introdução em novos locais, além da manutenção de altos índices
de diversidade genética, como os encontrados nas populações nativas.
Os estudos que investigam a diversidade genética existente em uma população
invasora utilizam marcadores protéicos ou de DNA porque estes podem fornecer uma
indicação da quantidade de variação genética que eventualmente foi perdida durante o
processo de colonização (gargalo populacional) ou fornecer evidências de origens
múltiplas (Sakai et al. 2001).
CAPÍTULO V - DISCUSSÃO
90
A estrutura genética de P. alata no Estado do Rio Grande do Sul foi estimada ao se
investigar seqüências de oito regiões plastidiais [cinco locos de microssatélites de
cloroplasto (cpSSR); espaçadores intergênicos trnL-trnF e psbA-trnH; e o íntron do gene
trnL], e de três sistemas nucleares [espaçadores internos transcritos do DNA ribossomal ou
ITS; segmento parcial do gene gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (gpd ou G3pdh); e o
2º íntron do gene LEAFY] e ao se comparar as mesmas com seqüências de indivíduos
provenientes de locais nativos de outras regiões do território brasileiro.
Não foi evidenciada variação intraespecífica nos marcadores plastidiais, o que pode
ser explicado pela sua natureza haplóide e pelo componente espécie-específico da variação,
mesmo existindo evidências de intenso fluxo gênico entre os indivíduos analisados de P.
alata, que apresenta herança paterna do cloroplasto (Lorenz-Lemke et al., 2005). Estudos
desenvolvidos pelo nosso grupo de trabalho com outras espécies de Passiflora também não
evidenciaram variação intraespecífica ao se utilizar esses e outros marcadores
cloroplasmáticos.
A análise da região ITS em 85 indivíduos (66 pertencentes ao Rio Grande do Sul e
19 a outros Estados brasileiros) demonstrou a existência de diferentes tipos de seqüência.
O polimorfismo intra-individual é indicativo de uma evolução em concerto incompleta e
sugere a existência de paralogia de seqüência nos níveis intra-individual, intraespecífico e
interspecífico (Bailey et al. 2003). Na presença de altos níveis de fluxo gênico, também
podem ser introduzidas novas variantes que se dispersam dentro de uma população a taxas
mais rápidas que a sua homogeneização (Ruggiero & Procaccini 2004). Ao analisar as
seqüências dos outros dois sistemas nucleares, G3pdh e LEAFY, em uma subamostra de 32
indivíduos, também foram identificados diversos tipos de haplótipos.
Dois cenários poderiam produzir grande número de genótipos em algumas
populações, com poucos tipos em comum entre as mesmas: (a) estabelecimento de
algumas populações a partir de vários indivíduos de diferentes origens, apresentando,
portanto, altos níveis de diversidade genotípica; ou (b) populações que iniciam com alguns
fundadores, mas o fluxo gênico subseqüente e o estabelecimento das plântulas introduzem
diversidade genotípica adicional na população (Pappert et al. 2000). Ambas as situações
podem explicar a existência dos vários genótipos encontrados em P. alata, porque estes
foram compartilhados entre os indivíduos do RS e de outros Estados brasileiros, além de
ocorrerem genótipos exclusivos no RS.
CAPÍTULO V - DISCUSSÃO
91
Nosso estudo demonstra que P. alata manteve altos índices de diversidade genética
intrapopulacional no território riograndense, com a inexistência de padrão filogeográfico
tanto entre indivíduos pertencentes às diferentes regiões geomorfológicas do RS, quanto
entre indivíduos do RS e representantes dos outros Estados brasileiros. Os fatores que
podem ter contribuído para isto devem incluir múltiplas introduções nas últimas cinco
décadas; reprodução sexual, que permitiu fluxo gênico dentro e entre as populações;
grupos fundadores geneticamente distintos; rápido crescimento populacional; interferência
humana nesta introdução, permitindo a criação de uma conexão contínua entre a área
invadida e a (as) área (s) de ocorrência natural; e uma plasticidade genética à adaptação.
92
CAPÍTULO VI
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
______________________________________________________________
CAPÍTULO VI – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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