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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação tecnológica e atividade antioxidante de produtos
secos por spray-drying de Ilex paraguariensis A. St. Hil. –
Aquifoliaceae (erva-mate)
FRANCILENE AMARAL DA SILVA
Porto Alegre, 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação tecnológica e atividade antioxidante de produtos
secos por spray-drying de Ilex paraguariensis A. St. Hil. –
Aquifoliaceae (erva-mate)
Tese apresentada por
FRANCILENE AMARAL DA SILVA para
obtenção do título de DOUTOR
EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Orientadora: Prof. Dra. Valquiria Linck Bassani
Co-orientador: Prof. Dr. José Cláudio Fonseca Moreira
Tese defendida e aprovada em 11 de outubro de 2007, no Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, perante comissão Examinadora constituída por:
Profa. Dr. ÂNGELA MACHADO DE CAMPOS
Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Dr. FABIO KLAMT
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Profa. Dr. HELGA WINGE
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Profa. Dr. LETÍCIA SCHERER KOESTER
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO
S586a
Silva, Francilene Amaral da
A
valiação tecnológica e atividade antioxidante de produtos
secos por spray-drying de Ilex paraguariensis A. St. Hil. –
Aquifoliaceae (erva-mate). Porto Alegre: UFRGS, 2007. –xx, 243p.
:graf., tab.
Tese (doutorado). UFRGS. Faculdade de Farmácia.
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas.
1.Ilex paraguariensis. 2.Erva-mate. 3.Polifenóis.
4.Antioxidante. 5.Produtos secos. I. Bassani, Valquiria Linck. II.
Moreira, José Cláudio Fonseca. III. Título
CDU:615.4:582.766
Bibliotecária Responsável:
Margarida Maria C. F. Ferreira – CRB 10/480
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Desenvolvimento Galênico e
Central Analítica do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Faculdade de Farmácia da UFRGS, no Centro de Estudos em Estresse Oxidativo do
Departamento de Bioquímica da UFRGS e no Laboratório de Tecnologia
Farmacêutica da UFG, com financiamento do CNPq. O autor recebeu bolsa de
estudos do CNPq.
Não estamos mais cansados por causa do ontem.
Somos outros, não mais quem
éramos antes.
As calamidades de ontem, as
dificuldades de ontem, eram válidas
para o dia de ontem.
Não para o dia de hoje!”
Cinema Uenebê
À minha família: Meu esposo Marcus
que sempre entendeu e apoiou meu sonho, mesmo que isso implicasse na
ausência.
Meu filho Davi,
por ser o grande estímulo para a conclusão de mais esta etapa.
AGRADECIMENTOS
A Deus, acima de tudo, por Ser presença constante em minha vida.
À professora Dr. Valquiria Linck Bassani não apenas por ter concedido, a mim, a
oportunidade de desenvolver este trabalho, mas principalmente pela orientação,
exemplo profissional e pessoal, pela atenção, convivência produtiva, confiança,
ensinamentos que certamente procurarei transmiti-los. A ti, meu profundo respeito,
admiração e amizade.
Ao Professor Dr. José Cláudio Fonseca Moreira, do Centro de Estudo em Estresse
Oxidativo do Departamento de Bioquímica da UFRGS, pela orientação, oportunidade
e atenção com que me recebeu em seu laboratório.
Ao Professor Dr. Pedro Ros Petrovick, pelo exemplo ético e docente, bem como
auxílio e disponibilidade de seu laboratório e equipamentos.
A todos os professores da Faculdade de Farmácia da UFRGS, pelos ensinamentos
e valores partilhados ao longo destes anos.
Às professoras Dr. Eliana Martins Lima e Danielle Guimarães Almeida Diniz do
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da UFG, pelo auxílio na obtenção dos
espectros de CLAE MS/MS.
Aos amigos de ontem, hoje e amanhã do Laboratório de Desenvolvimento Galênico,
minha casa durante onze anos. Tantos são, que seria injusto citar nomes. Obrigada
pelo convívio, auxílio e amizade!
Aos colegas do Laboratório 32 do Departamento de Bioquímica da UFRGS, pelo
convívio, auxílio e momentos de descontração proporcionados.
Aos amigos Virgínia Kappel e Gustavo Scola pelo auxílio no aprendizado das
técnicas de avaliação da atividade antioxidante.
Aos funcionários da Faculdade de Farmácia da UFRGS, pela disponibilidade e
amizade.
De forma especial aos amigos Cabral Pavei, Deise Réus, Cléverson Vigo, Edson
Carvalho, Greice Borghetti, Kellen Souza, Sotero Mengue, Luiz Alberto Soares,
Roseli do Nascimento, Tatiane de Souza, Tania Amador, Wellington Barros pela
amizade que, certamente, atravessa o tempo e a distância.
A todos os amigos adquiridos em Porto Alegre, gaúchos e nordestinos, pela
convivência e amizade criada, que tornaram este período muito mais agradável.
Carinhosamente à Karina e Sidnei (“...só vocês...”), amigos, irmãos, padrinhos e
compadres, pela amizade ao longo de tantos anos.
Ao meu irmão do coração Diogo, sempre presente, pela amizade e carinho.
Aos meus pais Maria e José e a minha irmã Ivana pelo amor incondicional.
Ao meu amado Marcus, obrigada pela amizade, paciência, companheirismo,
carinho...enfim, pelo amor, hoje frutificado em nosso filho Davi.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, auxiliaram para que este trabalho
fosse realizado, os meus profundos sentimentos de gratidão e respeito.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................... 1
CAPÍTULO 1: Ilex paraguariensis: desenvolvimento e caracterização tecnológica de
frações polifenólicas e produtos secos por spray-drying, em escala semi-industrial.
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................... 9
2. OBJETIVOS.............................................................................................. 11
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Aspectos botânicos........................................................................... 12
3.2. Aspectos fitoquímicos e analíticos.................................................... 12
3.3. Aspectos tecnológicos...................................................................... 14
4. MATERIAIS EMPREGADOS
4.1. Equipamentos e acessórios.............................................................. 17
4.2. Solventes, reagentes e soluções....................................................... 17
4.3. Adjuvantes farmacêuticos................................................................. 18
4.4. Substâncias referência..................................................................... 18
5. METODOLOGIA
5.1. Preparação e caracterização da matéria-prima vegetal..................... 19
5.1.1. Coleta e Identificação botânica......................................................... 19
5.1.2. Determinação da perda por dessecação........................................... 19
5.1.3. Determinação do teor de extrativos............................................................ 19
5.1.4 Análise granulométrica por tamisação...................................................... 20
5.2. Preparação e caracterização da solução extrativa (SEI).......................... 20
5.2.1. Preparação da solução extrativa....................................................... 20
5.2.2. Determinação do resíduo seco.......................................................... 21
5.2.3. Determinação do pH................................................................................. 21
5.2.4. Determinação da densidade............................................................. 21
5.3. Validação de metodologia analítica para doseamento dos constituintes
polifenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).............
22
5.3.1. Equipamentos............................................................................................. 22
5.3.2. Condições cromatográficas....................................................................... 22
5.3.3. Validação do método analítico.................................................................. 23
5.3.4 Identificação dos picos...................................................................... 25
5.3.5 Análise quantitativa................................................................................... 25
5.4. Fracionamento e purificação das frações polifenólicas presentes no
extrato seco liofilizado.................................................................................
26
xii
5.4.1.
Preparação do extrato seco liofilizado (ESLI)............................................. 26
5.4.2. Caracterização do extrato seco liofilizado (ESLI)..................................... 27
5.4.2.1 Determinação da perda por dessecação.................................................. 27
5.4.2.2. Rendimento do processo de liofilização.................................................... 27
5.4.2.3. Determinação do pH......................................................................... 27
5.4.2.4. Análise quantitativa por CLAE........................................................... 27
5.4.3. Preparação do extrato para fracionamento....................................... 27
5.4.4. Caracterização das frações.............................................................. 28
5.4.4.1. Determinação do pH........................................................................... 28
5.4.4.2. Avaliação macroscópica..................................................................... 28
5.4.4.3. Análise qualitativa por CLAE.............................................................. 28
5.4.4.3.1. Preparação das amostras................................................................... 28
5.5. Produção e caracterização dos produtos secos por spray-drying.............. 28
5.5.1. Preparo das dispersões a partir da solução extrativa.......................... 28
5.5.2. Caracterização dos produtos PSI-A, PSI-B, PSI-C e PSI-D................. 29
5.5.2.1. Determinação da perda por dessecação............................................. 29
5.5.2.2. Avaliação do rendimento da operação de secagem............................ 29
5.5.2.3. Avaliação por microscopia eletrônica de varredura............................. 30
5.5.2.4. Avaliação do ângulo de repouso......................................................... 30
5.5.2.5. Determinação das densidades brutas e de compactação, fator de
Hausner, índice de compressibilidade e de densificação....................
31
5.5.2.6. Análise das partículas por microscopia eletrônica de varredura 31
5.6. Validação de método de cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) para doseamento de constituintes polifenólicos presentes
nos produtos secos por spray-drying..................................................
32
5.6.1. Condições cromatográficas................................................................ 32
5.6.2. Validação do método analítico............................................................ 32
5.6.2.1 Curva padrão...................................................................................... 32
5.6.2.2. Curva de calibração do PSI-A............................................................. 32
5.6.2.3. Repetibilidade.................................................................................... 32
5.6.2.4. Precisão intermediária........................................................................ 33
5.6.2.5. Limite de detecção............................................................................. 33
5.6.2.6. Limite de quantificação....................................................................... 33
5.6.2.7 Exatidão............................................................................................. 33
5.6.3 Identificação dos picos....................................................................... 33
xiii
5.6.4. Análise quantitativa............................................................................ 34
5.6.4.1. Condições cromatográficas................................................................ 34
5.6.4.2. Preparação das amostras................................................................... 34
5.7. Avaliação da estabilidade frente à luz UV (254 nm e 352 nm)............. 34
5.7.1. Características Sensoriais.................................................................. 35
5.7.2. Avaliação da perda dor dessecação................................................... 35
5.7.3. Avaliação dos polifenóis por CLAE..................................................... 35
5.7.3.1. Condições cromatográficas................................................................ 35
5.7.3.2. Preparação das amostras................................................................... 35
5.8 Produção e caracterização de produto seco por spray-drying para a
realização dos ensaios in vivo...........................................................
36
5.8.1 Caracterização do produtos PSI-A L02 36
5.8.1.1 Determinação da perda por dessecação............................................. 36
5.8.1.2 Avaliação do rendimento da operação de secagem............................ 36
5.8.1.3 Avaliação do ângulo de repouso 36
5.8.1.4 Determinação das densidades brutas e de compactação, fator de
Hausner, índice de compressibilidade e de densificação....................
36
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. Preparação e caracterização da matéria-prima vegetal de Ilex
paraguariensis....................................................................................
37
6.2. Preparação e caracterização da solução extrativa de Ilex
paraguariensis....................................................................................
39
6.3. Validação da metodologia analítica por cromatografia liquida de alta
eficiência............................................................................................
40
6.4. Obtenção de frações polifenólicas a partir de extrato seco liofilizado
de Ilex paraguariensis (ESLI)..............................................................
47
6.5. Produção e caracterização dos produtos secos por spray-drying........ 54
6.5.1. Validação de método de cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) para doseamento de constituintes polifenólicos presentes
nos produtos secos por spray-drying..................................................
62
6.5.2. Avaliação preliminar da estabilidade frente à luz................................ 68
6.5.3. Produção e caracterização de produto seco por spray-drying para
realização dos ensaios in vivo............................................................
75
7. CONCLUSÕES................................................................................... 78
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................... 79
CAPÍTULO 2 : Avaliação da atividade antioxidante de produtos secos por
spray- drying e frações polifenólicas de Ilex paraguariensis.
xiv
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 91
2. OBJETIVOS................................................................................................... 94
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Estresse Oxidativo e Defesas Antioxidantes e Espécies redoxi-ativas 95
3.2. Atividade antioxidante de polifenóis...................................................... 101
3.3. Atividade antioxidante de Ilex paraguariensis........................................ 105
4. MATERIAL
4.1. Equipamentos e acessórios................................................................... 108
4.2. Solventes, reagentes e soluções........................................................... 108
4.3. Adjuvantes............................................................................................ 108
4.4. Substâncias de referência..................................................................... 109
4.5. Material biológico.................................................................................. 109
5. METODOLOGIA
5.1. Avaliação da atividade antioxidante in vitro do PSI-A, PSI-B, PSI-C,
PSI-D e FPI...........................................................................................
110
5.1.1. Potencial Antioxidante Total (TRAP)..................................................... 110
5.1.2. Medida da lipoperoxidação (TBARS) in vitro......................................... 111
5.1.3. Ensaio da atividade scavenger de radicais hidroxila (•OH).................... 113
5.2. Avaliação da atividade antioxidante ex vivo dos PSI e FPI.................... 115
5.2.1. Material biológico.................................................................................. 115
5.2.2. Obtenção de fatias de fígado e preparação do homogeneizado............. 115
5.2.3. Ensaio de citotoxicidade via estresse oxidativo - quantificação da
lactato-desidrogenase (LDH).................................................................
118
5.2.4. Medida da lipoperoxidação (TBARS)..................................................... 119
5.2.5. Dano protéico........................................................................................ 120
5.3. Avaliação da atividade antioxidante in vivo do PSI................................ 121
5.3.1. Material biológico.................................................................................. 121
5.3.2. Preparação das amostras e tratamento dos animais............................. 121
5.3.3. Preparação do homogeneizado............................................................. 122
5.3.4. Medida da lipoperoxidação (TBARS)..................................................... 123
5.3.5. Dano protéico........................................................................................ 123
5.3.6. Medida da atividade enzimática............................................................ 123
5.4. Análise estatística................................................................................. 125
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................. 126
7. CONCLUSÕES..................................................................................... 142
xv
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 143
DISCUSSÃO GERAL......................................................................................... 151
CONCLUSÕES GERAIS..................................................................................... 157
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 161
ANEXOS
Anexo 1 – Artigo publicado: Validation of a LC method for polyphenol assay in
extractive solution from Ilex paraguariensis (Mate)………………………………….. 167
Anexo 2 - Tabelas de distribuição granulométrica dos produtos secos por
spray-drying por microscopia óptica.................................................................... 183
Anexo 3 - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFRGS.......................... 191
Anexo 4 – Tabelas de Protocolos de Tratamento no ensaio de atividade
antioxidante in vivo............................................................................................. 195
PARECERES DA BANCA EXAMINADORA....................................................... 201
BIOGRAFIA........................................................................................................ 207
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema geral das etapas de produção e avaliação tecnológica e
farmacológica de produtos de Ilex
paraguariensis.................................................................................
05
Figura 1.1. Distribuição granulométrica da matéria-prima vegetal Ilex
paraguariensisis, folhas e talos.......................................................
38
Figura 1.2. (A) Perfil cromatográfico das substâncias de referência, ácido
clorogênico (ACLO) e rutina (RUT). (B) Perfil cromatográfico da
solução extrativa (SEI) de Ilex paraguariensis...............................
41
Figura 1.3. Espectro de massas dos picos P1, P3, P4, P5 e P6 presentes
solução extrativa (SEI) de Ilex paraguariensis.................................
42
Figura 1.4. Perfil cromatográfico de extrato seco liofilizado (ESLI) de Ilex
paraguariensis, obtido a partir de solução extrativa preparada por
decocção..........................................................................................
48
Figura 1.5. Perfis cromatográficos comparativos das frações obtidas pela
separação em fase sólida, em diferentes sistemas de eluição, no
fracionamento preliminar do extrato seco liofilizado de Ilex
paraguariensis (ESLI)....................................................................
51
Figura 1.6. Aspecto macroscópico dos produtos secos por spray-drying de
Ilex paraguariensis, preparados com diferentes adjuvantes de
secagem.........................................................................................
58
Figura 1.7. Fotomicrografia eletrônica de varredura de produtos secos por
spray-drying de Ilex paraguariensis (PSI) (aumento 500 x),
preparados com diferentes adjuvantes de secagem......................
59
Figura 1.8. Fotomicrografia eletrônica de varredura de produtos secos por
spray-drying de Ilex paraguariensis (PSI) (aumento 2500 x),
preparados com diferentes adjuvantes de secagem.......................
60
Figura 1.9. Distribuição granulométrica dos produtos secos por spray-drying
de Ilex paraguariensis, preparados com diferentes adjuvantes de
secagem...........................................................................................
61
Figura 1.10. Perfil cromatográfico da solução extrativa aquosa (SEI) (A) e dos
produtos secos por spray-drying (PSI) de Ilex paraguariensis (B)
obtidos com diferentes adjuvantes de
secagem........................................................................................
63
Figura 1.11. Polifenóis em produtos secos por spray-drying de Ilex
paraguariensis em teste de fotoestabilidade: exposição à luz, 254
nm...................................................................................................
69
Figura 1.12. Polifenóis em produtos secos por spray-drying de
Ilexparaguariensis, em teste de fotoestabilidade: exposição à luz,
254 nm..........................................................................................
70
Figura 1.13. Polifenóis em produtos secos por spray-drying de
Ilexparaguariensis, em teste de fotoestabilidade: exposição à luz,
352 nm...........................................................................................
72
xviii
Figura 1.14. Polifenóis em produtos secos por spray-drying de
Ilexparaguariensis, em teste de fotoestabilidade: exposição à luz,
352 nm...........................................................................................
73
Figura 1.15. Distribuição granulométrica do produto seco por spray-drying de
Ilex paraguariensis PSI-A lote 02, produzido em escala semi-
industrial.........................................................................................
76
Figura 2.1. Reações de formação do radical hidroxila (
•
OH). ......................... 96
Figura 2.2. Vias de geração de espécies redoxi-ativas e mecanismo de
defesa enzimática. .........................................................................
97
Figura 2.3. Representação esquemática das reações de iniciação e
propagação da LPO........................................................................
101
Figura 2.4. Núcleo fundamental dos flavonóides (A) e ácidos cafeoilquínicos
(B)...................................................................................................
102
Figura 2.5. Cinética antioxidante, in vitro, dos produtos secos de Ilex
paraguariensis, medida por quimiluminescência.........................
127
Figura 2.6. Cinética antioxidante, in vitro, do produto seco liofilizado e
frações polifenólicas, medida por quimioluminescência......... ..
128
Figura 2.7. Inibição da peroxidação lipídica em homogeneizado de
gema de ovo..........................................................................
130
Figura 2.8. Porcentagem de inibição da peroxidação lipídica em
homogeneizado de gema de ovo............................................
131
Figura 2.9. Substâncias geradas pela reação de Fenton na presença de
FeSO
4
.7H
2
O..................................................................................
133
Figura 2.10. Capacidade scavenger de radical hidroxila pelos produtos
secos..............................................................................................
134
Figura 2.11. Capacidade scavenger de radical hidroxila pelo produto seco
liofilizado e frações polifenólicas.....................................................
135
Figura 2.12. Níveis de TBARS em homogeneizado de fatias de fígado........ 137
Figura 2.13. Efeito do produto seco por spray-drying PSI-A na peroxidação
lipídica hepática induzida por CCl
4
..................................................
139
Figura 2.14. Efeito do produto seco por spray-drying nos níveis de
carbonilação protéica hepática induzida por CCl
4
...........................
140
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 Descrição do gradiente de eluição em função do
tempo.........................................................................................
23
Tabela 1.2 Condições operacionais empregadas na liofilização da
solução extrativa aquosa de Ilex
paraguariensis...........................................................................
26
Tabela 1.3 Composição percentual dos produtos secos de Ilex
paraguariensis...........................................................................
29
Tabela 1.4. Características da matéria-prima vegetal de Ilex
paraguariensis, após secagem e
moagem...................................................................................
37
Tabela 1.5. Características da solução extrativa de Ilex
paraguariensis...........................................................................
39
Tabela 1.6. Parâmetros de linearidade para as substâncias de referência
ácido clorogênico (ACLO) e rutina (RUT), analisadas por
CLAE.........................................................................................
43
Tabela 1.7. Parâmetros de linearidade na análise de solução extrativa de
Ilex paraguariensis por CLAE....................................................
44
Tabela 1.8. Precisão intermediária, na análise por CLAE das substâncias
de referência e solução extrativa de Ilex paraguariensis...........
45
Tabela 1.9. Repetibilidade na análise por CLAE das substâncias de
referência e solução extrativa de Ilex paraguariensis................
45
Tabela 1.10. Resultado do ensaio de exatidão do ácido clorogênico............ 46
Tabela 1.11. Resultado do ensaio de exatidão da rutina............................... 46
Tabela 1.12. Teor de polifenóis presentes na solução extrativa de Ilex
paraguariensis, obtida por decocção.........................................
47
Tabela 1.13 Características do extrato seco liofilizado (ESLI) de Ilex
paraguariensis...........................................................................
48
Tabela 1.14. Teor de polifenóis presentes no extrato seco liofilizado (ESLI)
de Ilex paraguariensis comparativamente aos teores
encontrados na solução extrativa que lhe deu origem (SEI). ...
49
Tabela 1.15. pH das frações fenólicas obtidas por separação em fase
sólida pelo sistema de eluição SV do extrato seco liofilizado
de Ilex paraguariensis................................................................
52
Tabela 1.16. Rendimento percentual das frações obtidas no processo de
fracionamento do extrato seco liofilizado de Ilex
paraguariensis...........................................................................
53
Tabela 1.17. Teor de polifenóis presentes nas frações obtidas a partir do
extrato seco liofilizado de Ilex
paraguariensis...........................................................................
54
xx
Tabela 1.18. Características tecnológicas de produtos secos por spray-
drying de Ilex paraguariensis, em escala semi-
industrial...................................................................................
56
Tabela 1.19. Comparação entre rendimentos bruto e corrigido dos
produtos secos por spray-drying contendo somente dióxido
de silício coloidal........................................................................
57
Tabela 1.20. Comparação dos rendimentos bruto e corrigido dos produtos
secos por spray-drying contendo a mistura dióxido de silício
coloidal e celulose microcristalina (1:1).....................................
58
Tabela 1.21. Diâmetro médio de partícula e desvio padrão granulométrico
dos produtos secos por spray-drying de Ilex
paraguariensis..........................................................................
62
Tabela 1.22. Parâmetros de linearidade da análise de produto seco por
spray-drying de Ilex paraguariensis analisada por
CLAE.........................................................................................
64
Tabela 1.23. Precisão intermediária do produto seco por spray-drying de
Ilex paraguariensis....................................................................
65
Tabela 1.24. Exatidão do método de doseamento de ácido clorogênico em
produtos secos de Ilex paraguariensis.....................................
66
Tabela 1.25. Exatidão do método de doseamento de rutina em produtos
secos de Ilex paraguariensis....................................................
66
Tabela 1.26. Teor de polifenóis presentes nos produtos secos por spray-
drying de Ilex paraguariensis....................................................
67
Tabela 1.27. Percentual de degradação dos polifenóis, nos produtos secos
por spray-drying expostos à luz em 254 nm, ao final de 48
horas.........................................................................................
71
Tabela 1.28. Polifenóis, nos produtos secos por spray-drying de Ilex
paraguariensis em teste de fotoestabilidade: 352 nm, ao final
de 48 horas...............................................................................
74
Tabela 1.29. Parâmetros tecnológicos de produto seco por spray-drying de
Ilex paraguariensis empregado nos ensaios in
vivo...........................................................................................
75
Tabela 1.30. Comparação do teor de polifenóis presentes nos produtos
secos por spray-drying de Ilex
paraguariensis.........................................................................
77
Tabela 2.1. Principais espécies redoxi-ativas.............................................. 96
Tabela 2.2. Grupos de tratamentos testados.............................................. 110
Tabela 2.3. Grupos de tratamentos testados no ensaio de
lipoperoxidação........................................................................
112
Tabela 2.4. Grupos de tratamentos testados no ensaio da atividade
scavenger de radicais hidroxila.................................................
114
Tabela 2.5. Grupos de tratamentos testados no ensaio ex vivo................. 116
xxi
Tabela 2.6. Teor de polifenóis totais (TPT) e capacidade antioxidante
equivalente ao trolox (mM)(CAET) dos extratos secos e
frações polifenólicas obtidos pelo TRAP..................................
129
Tabela 2.7. Concentração inibitória da peroxidação lipídica para os
produtos secos e frações polifenólicas de Ilex
paraguariensis.........................................................................
132
Tabela 2.8. Efeito do pré-tratamento com PSI-A na atividade das enzimas
antioxidantes hepáticas em ratos tratados com
CCl
4
.........................................................................................
141
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
SEI
solução extrativa aquosa de I. paraguariensis obtida por decocção
ESLI
produto seco por liofilização preparado a partir do decocto
PSI-A
produto seco por spray-drying contendo 70 % de resíduo seco + 30 %
Aerosil
®
PSI-B
produto seco por spray-drying contendo 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
PSI-C
produto seco por spray-drying contendo 70 % de resíduo seco + 30 %
Glucidex
®
PSI-D
produto seco por spray-drying contendo 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
FAB
fração polifenólica
FF
fração polifenólica
PSI-A L02
produto seco por spray-drying lote 02 contendo 70 % de resíduo seco +
30 % Aerosil
®
ABAP
2,2′-azobis(2-amidinopropano)
TRAP
potencial antioxidante total
TBA
ácido tiobarbitúrico
TBARS
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TMP
1,1,3,3-tetrametoxipropano
t-BHP
ter-butilhidroperóxido
LDH
lactato desidrogenase
CAT
catalase
SOD
superóxido desmutase
RESUMO
Avaliação tecnológica e atividade antioxidante de produtos secos por
spray-drying de Ilex paraguariensis A. St. Hil. – Aquifoliaceae (erva-mate)
Ilex paraguariensis A. St. Hil. é uma espécie popularmente conhecida
como erva-mate. O presente trabalho refere-se ao desenvolvimento e
caracterização tecnológica de produtos secos por spray-drying, a partir de
solução extrativa aquosa de I. paraguariensis, bem como de frações
polifenólicas. Adicionalmente foi desenvolvido e validado um método de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para a quantificação de
polifenóis presentes tanto na matéria-prima vegetal como nos produtos secos.
O método mostrou-se adequado para a quantificação de polifenóis em todas
as preparações de I. paraguariensis. Quatro produtos secos por spray-drying
foram preparados a partir do decocto. Entre os quatro produtos, o produto
contendo 30 % de Aerosil® (PSI-A) apresentou as melhores características
tecnológicas e de estabilidade frente à fotodegradação. Na avaliação da
atividade antioxidante, no modelo experimental in vitro, tanto os produtos
secos como as frações polifenólicas demonstraram atividade antioxidante, de
maneira dose-dependente, caracterizada pela redução da quimiluminescência
no ensaio de TRAP, baixos níveis de TBARS e aumento da atividade
scavenger de radicais hidroxila. Fatias de fígado de ratos foram utilizadas
como modelo ex vivo. Entre os produtos por spray-drying testados PSI-A e
PSI-D e a fração FAB foram eficazes na redução da produção de TBARS
quando comparados ao controle pré-incubado com ter-butilhidroperóxido (t-
BHT), corroborando os ensaios in vitro. Para o ensaio in vivo empregou-se o
modelo de dano hepático induzido por tetracloreto de carbono (CCl
4
), sendo o
produto seco PSI-A selecionado para avaliação com base nos resultados
obtidos na caracterização tecnológica. A administração de PSI-A, por via oral,
durante 30 dias, na dose de 386 mg/kg, resultou em dano hepático menor,
evidenciado por níveis menores de lipoperoxidação e maior atividade das
enzimas superóxido desmutase e catalase, quando comparados ao controle.
xxvi
O conjunto de resultados sugere que o desenvolvimento tecnológico dos
produtos secos, bem como de frações purificadas apresentou atividade
antioxidante significante medida em ensaios in vitro e ex-vivo. Adicionalmente,
os resultados também evidenciam efeito hepatoprotetor frente ao estresse
oxidativo e dano hepático provocado pelo tetracloreto de carbono, medidos
em ensaios in vivo. Estudos adicionais visando a investigar o papel destes
produtos em patologias em que o estresse oxidativo parece estar envolvido
são necessários.
Palavras-chave: Ilex paraguariensis, produtos secos por spray-drying,
polifenóis, atividade antioxidante, erva-mate.
ABSTRACT
Technological evaluation and antioxidant activity of Ilex paraguariensis
A. St. Hil.- Aquifoliaceae (Maté) spray-dried extracts
Ilex paraguariensis A. St. Hil. is a plant specie traditionally known as
maté. The present work was designed in view to develop, in semi-industrial
scale, spray-dried extracts of Ilex paraguariensis from aqueous extracts as
well as polyphenol fractions. Four spray-dried extracts were prepared from the
aqueous extract using different excipients. In order to quantify the polyphenols
present in raw plant material, spray-dried extracts and polyphenol fractions, a
liquid chromatography (LC) method was validated. The spray-dried extract
containing 30% of Aerosil® (SPD-A) presented the best technological
characteristics and photostability. In vitro antioxidant activity evaluation of both
spray-dried extracts and polyphenolic fractions showed a dose-dependent
antioxidant activity. Quimiluminescence reduction in TRAP assay, low TBARS
content and hydroxyl free radicals scavenger activity were observed. Rats liver
slices were used for antioxidant test in ex vivo model. SPD-A and SPD-D
(containing 15% of Aerosil® and 15% of Avicel®) spray-dried extracts and
polyphenol fraction FAB were able to reduce TBARS production when
compared to the control group preincubated with ter-butylhydroperoxide
(t-
BHT). Based on the technological characteristics and photostability, PSI-A
spray-dried extract was selected for in vivo antioxidant activity evaluation using
carbon tetrachloride (CCl
4
) induced hepatic damage as a model. Oral
administration of 386 mg/kg of SPD-A during 30 days resulted in decreased
liver damage as a consequence of lower lipoperoxidation levels and higher
activity of superoxide dismutase and catalase enzymes when compared to a
control group. In synthesis, the results suggest that both spray-dried extracts
and purified fractions presented significant in vitro and ex vivo antioxidant
activity. Additionally, in vivo antioxidant activity evaluation demonstrated a
hepatic protection effect against oxidative stress and carbon tetrachloride-
xxviii
induced damage. Further experiments aiming to investigate both spray-dried
extracts and polyphenol fractions function in diseases involving oxidative
stress represent a very interesting perspective.
Key-words: Ilex paraguariensis, spray-dried extracts, polyphenols,
antioxidant activity, erva-mate.
INTRODUÇÃO GERAL
3
Ilex paraguariensis é conhecida popularmente como erva-mate. O mesmo
nome é dado ao produto industrializado preparado a partir das folhas e pequenos
ramos, por estabilização, secagem rápida e moagem.
No Brasil o setor ervateiro compreende cerca de 450 municípios dos
Estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná e Mato Grosso do Sul,
englobando 750 indústrias, gerando um total de aproximadamente 700.000
empregos diretos e indiretos, para uma produção anual aproximada de 650.000
toneladas (MOSELE, 2002; VALDUGA, 2002). Dentre a tríade dos países
produtores, o Brasil figura como maior produtor e a Argentina como maior
exportador. O Paraguai produz basicamente para o consumo interno (RUCKER,
1996).
O conjunto de países que fazem parte do Mercado Comum do Sul (Mercosul)
é o principal mercado importador, sendo o Uruguai o maior importador (ANDRADE,
2004).
A partir de 1988, as exportações para outros países aumentaram
significativamente. Hoje atingem os mercados da Síria, Alemanha, Japão e Estados
Unidos, que passaram a demonstrar interesse pelo produto, principalmente como
alimento e nutracêutico.
No entanto, ainda hoje, o maior consumo de erva-mate (92 %) ocorre na
forma de produtos tradicionais, como o chimarrão, que apresenta mercado limitado
às regiões onde é produzida. Quanto ao mercado externo, nos últimos anos,
também apresentou uma demanda estável de cerca de 25 mil toneladas anuais.
Como se trata de uma planta de composição química diversificada, esta espécie tem
motivado pesquisadores a investir na melhoria da qualidade do produto, visando
agregar valor a esta importante matéria-prima regional (VALDUGA, 2002).
Paralelamente, iniciou-se a demanda da matéria-prima para indústrias químicas e
farmacêuticas, com interesse na produção de produtos de higiene e limpeza
(MOSELE, 2002).
A presença de elevados teores de metilxantinas (principalmente cafeína),
saponinas e flavonóides fazem desta espécie uma matéria-prima promissora para a
4
elaboração de diversos produtos tais como fitoterápicos, cosméticos e alimentos
funcionais. Para isso, torna-se necessário o estabelecimento de critérios de
qualidade para a matéria-prima ou o desenvolvimento de produto padronizado, com
características físicas, químicas, físico-químicas e tecnológicas definidas, que possa
servir de base para a obtenção de produtos derivados.
No que se refere à atividade biológica, extratos de Ilex paraguariensis têm
demonstrado atividade antioxidante in vitro, com correlação entre esta atividade e a
presença de constituintes polifenólicos, sugerindo que os derivados cafeoilquínicos e
os flavonóides (como rutina, quercetina e canferol) sejam os responsáveis pelas
propriedades antioxidantes e/ou seqüestradoras de radicais livres evidenciadas
(SCHINELLA et al., 2000, FILIP et al., 2000, CHANDRA e MEJIA, 2004; RAMIREZ-
MARES et al., 2004). A importância desta atividade está relacionada com o potencial
da erva-mate, ou de produtos derivados, de proteção frente à lipoperoxidação,
radicais livres e glicação envolvidos em várias doenças tais como diabetes e
aterosclerose (GUGLIUCCI e STAHL, 1995; FILIP et al., 2000; GUGLIUCCI e
MENINI, 2002).
Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo geral a preparação,
em escala semi-industrial, de extratos secos por spray-drying e frações polifenólicas
de Ilex paraguariensis e a avaliação da atividade antioxidante dos produtos obtidos.
Para sua apresentação foi dividido em dois capítulos, de acordo com os assuntos
abordados:
Capítulo 1: Ilex paraguariensis: desenvolvimento e caracterização tecnológica
de frações polifenólicas e produtos secos por spray-drying, em escala semi-
industrial;
Capítulo 2: Avaliação da atividade antioxidante in vitro, ex vivo e in vivo de
produtos secos por spray-drying e frações polifenólicas de Ilex paraguariensis.
5
A Figura 1 apresenta um esquema geral das etapas experimentais
empregadas na preparação e avaliação biológica dos produtos secos por spray-
drying e frações polifenólicas Ilex paraguariensis investigados no presente trabalho.
Extrato seco liofilizado (ESLI)
Extrato seco nebulizado
PSI
Atividade antioxidante in vivo
Caracterização tecnológica
Solução extrativa (SEI)
Extrato seco
PSI-A, PSI-B, PSI-C, PSI-D
Frações polifenólicas (FPI)
Matéria-prima vegetal (MPVI)
Estabilização e secagem
Moagem e caracterização
Decocção
Spray-drying
Liofilização
Secagem
Folhas e talos de Ilex paraguariensis
Fracionamento
Caracterização tecnológica
Atividade antioxidante in vitro e ex vivo
Seleção Extrato seco
Produção em Spray-drying Niro Atomizer
Avaliação tecnológica
Extrato seco liofilizado (ESLI)
Extrato seco nebulizado
PSI
Atividade antioxidante in vivo
Caracterização tecnológica
Solução extrativa (SEI)
Extrato seco
PSI-A, PSI-B, PSI-C, PSI-D
Frações polifenólicas (FPI)
Matéria-prima vegetal (MPVI)
Estabilização e secagem
Moagem e caracterização
Decocção
Spray-drying
Liofilização
Secagem
Folhas e talos de Ilex paraguariensis
Fracionamento
Caracterização tecnológica
Atividade antioxidante in vitro e ex vivo
Seleção Extrato seco
Produção em Spray-drying Niro Atomizer
Avaliação tecnológica
Figura 1. Esquema geral das etapas de produção e avaliação tecnológica e
farmacológica de produtos de Ilex paraguariensis.
CAPÍTULO 1
Ilex paraguariensis: desenvolvimento e caracterização tecnológica
de frações polifenólicas e produtos secos por spray-drying, em
escala semi-industrial.
9
1. INTRODUÇÃO
Ilex paraguariensis A. St Hil. é uma espécie do gênero Ilex, nativa
principalmente de regiões subtropicais e temperadas da América do Sul, onde é
popularmente conhecida como erva-mate. O gênero Ilex possui cerca de 705
espécies (GILBERT, 1995), sendo Ilex paraguariensis a espécie que apresenta
a maior importância do ponto de vista econômico e cultural, devido ao hábito
cultural do preparo de bebidas, denominadas chimarrão e tererê.
A literatura relata para Ilex paraguariensis a presença de diversos
metabólitos como metilxantinas (FILIP et al., 1998), saponinas (GOSMANN et
al., 1989; 1995; KRAEMER, et al., 1996) e polifenóis (RICCO et al., 1991; FILIP
et al., 2001). Os estudos in vitro realizados, até o presente momento, apontam
para o importante papel dos polifenóis nas atividades antioxidante e scavenger
de radicais livres demonstradas para esta espécie (FILIP et al., 2000; RAMIREZ-
MARES, 2004). Neste sentido a obtenção de uma fração enriquecida em polifenóis
ou de produto seco padronizado em polifenóis, parece ser uma estratégia relevante.
Por outro lado, o grande número de vantagens apresentadas por extratos
secos (produtos secos), comparativamente a extratos líquidos, tais como fácil
manipulação, maior estabilidade química e microbiológica, homogeneidade de
distribuição de constituintes e possibilidade de padronização (LIST e SCHIMIDT,
1989), evidenciam o potencial de utilização de produtos secos derivados de Ilex
paraguariensis na indústria Agroalimentar, Farmacêutica ou Cosmética.
Atualmente, a erva-mate para chimarrão e tererê e o chá mate ou mate solúvel
são os alguns produtos comerciais derivados de Ilex paraguariensis, atendendo
apenas consumidores das regiões Sul e Centro-Oeste.
A carência de produtos padronizados e de métodos que levem à
certificação de qualidade dos produtos à base de Ilex paraguariensis tem sido
um obstáculo para a ampliação do mercado.
Os estudos tecnológicos realizados, até o presente momento, no sentido
do desenvolvimento e caracterização de produtos secos por spray-drying de Ilex
10
paraguariensis demonstram sua viabilidade de obtenção (CAMPOS, 1996;
GNOATTO, 2002), em escala laboratorial.
A quantificação dos marcadores químicos potencialmente ativos tem como
finalidade avaliar a influência da operação de secagem e do uso de adjuvantes
sobre os constituintes presentes na solução extrativa inicial. No que se refere à
quantificação de polifenóis em Ilex paraguariensis a literatura menciona diversos
trabalhos (RICCO et al., 1991; CARINI et al.,1998, FILIP et al., 2001, BRAVO et al.,
2007) mas ainda é escassa, principalmente no que se refere à validação de método
analítico para avaliação e controle de qualidade tanto na matéria-prima vegetal
quanto em preparações derivadas.
Sendo assim, o Capítulo 1 do presente trabalho tem por objetivo geral o
desenvolvimento e caracterização tecnológica de produtos secos por spray-drying
em escala semi-industrial e de frações polifenólicas, todos estes obtidos a partir de
solução extrativa aquosa de Ilex paraguariensis.
11
2. OBJETIVOS
1. Validar o método de doseamento de polifenóis por CLAE, através da
análise da linearidade de resposta, precisão (repetibilidade e precisão intermediária),
e exatidão do método (teste de recuperação), aplicado à análise de solução
extrativa, obtida a partir das folhas e talos de Ilex paraguariensis;
2. Desenvolver um método de separação de frações polifenólicas mediante
emprego de resina adsorvente;
3. Preparar e caracterizar produtos secos por spray-drying, a partir da solução
extrativa de Ilex paraguariensis, em escala semi-industrial;
4. Validar o método para a análise quantitativa de compostos polifenólicos
presentes nos produtos secos por spray-drying, preparados a partir da solução
extrativa de Ilex paraguariensis;
5. Avaliar a estabilidade dos produtos secos frente à luz ultravioleta.
12
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. Aspectos botânicos
A família Aquifoliaceae compreende os gêneros Ilex, Phelline e
Nemopanthus (EDWIN e REITZ, 1967), sendo o primeiro o de maior importância
econômica. Este gênero apresenta cerca de 705 espécies relatadas e
distribuídas em todo o mundo, principalmente na América do Sul e na Ásia. No
Brasil, estima-se a ocorrência de 68 espécies sendo que, para o Rio Grande do
Sul são descritas oito espécies nativas (GILBERT, 1995).
A erva-mate é conhecida, também, como mate, chá-mate, chá-do-
Paraguai, chá-argentino, chá-do-Brasil, congonha, congonha-das-missões,
congonheira, erva, mate-legítimo e mate-verdadeiro (CORREA, 1969).
Apresenta-se como árvore perene dióica, alcançando cerca de 15 metros
de altura e 40 centímetros de diâmetro de tronco. Apresenta folhas alternadas,
simples, inteiras, do tipo coriáceo ou subcoriáceo, com bordos dentados e
pouco profundos (SCHULTZ, 1985). O período de floração ocorre de setembro a
dezembro. Suas flores são brancas, pequenas, em inflorescência em pequenos
fascículos com até cinco flores, dispostas na axila das folhas superiores.
A frutificação ocorre no período de dezembro a março. O fruto é uma
baga-drupa globular, em geral com quatro sementes, medindo de 6 a 8
milímetros, de cor verde, quando novo, passando a vermelho arroxeado e
violáceo quando maduro (REITZ et al., 1983).
3.2. Aspectos fitoquímicos e analíticos
Dentre os principais compostos estudados e isolados destacaram-se,
inicialmente, as xantinas, devido à facilidade de isolamento por técnicas de
cristalização e possibilidade de quantificação gravimétrica (TAKETA, 1997).
Dentre as metilxantinas, a presença de cafeína foi identificada em 1943,
por STENHOUSE e LLOYD BULLOCK. A partir daí, muitas análises têm sido
13
realizadas tanto em produtos comerciais como nas folhas de Ilex
paraguariensis, verificando a sua presença sob aspectos qualitativos e
quantitativos. Segundo MAZZAFERA (1994) e FILIP e colaboradores (1998) os
teores de cafeína em folhas de Ilex paraguariensis variam de 0,16 em folhas
velhas a 1,4 % em folhas jovens. Também tem sido relatada a presença de
teobromina em teores de 0,03 a 0,6 % (SIESTO, 1959; GARCIA PAULA, 1962;
BALTASSAT et al., 1984). A ocorrência de teofilina é controversa; baixos teores
foram relatados por MAZZAFERA (1994), porém, outros pesquisadores não
detectaram a presença desta metilxantina (FILIP et al., 1998; REGINATTO et
al., 1999; COELHO, 2002). Mais recentemente, GNOATTO e colaboradores
(2007) reportaram estudo comparativo entre diversos métodos empregados,
verificando que as diferenças anteriormente relatadas entre os teores de cafeína
e teobromina podem, também, estar relacionadas com os métodos de extração
empregados.
Com relação à pesquisa de saponinas no gênero Ilex, diversos trabalhos
foram desenvolvidos no Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da UFRGS objetivando caracterizar quimicamente espécies de
Ilex de ocorrência regional com vistas ao desenvolvimento de métodos de
identificação que permitam diferenciar as espécies. Até o momento foram
isoladas e identificadas das folhas de Ilex paraguariensis saponinas
triterpênicas pentacíclicas denominadas matessaponinas 1, 2, 3, 4 e 5
(GOSMANN et al., 1989; KRAEMER et al., 1996) e J1a/b, J2a/b e J3a/b
(MONTANHA, 1990; SCHENKEL et al., 1996). Destas, somente as quatro
últimas saponinas são monodesmosídicas e ácidas; as demais são
bidesmosídicas e neutras. As agliconas destas saponinas são o ácido ursólico
ou o ácido oleanólico e os açúcares são a glicose, arabinose e/ou ramnose.
SANTAMOUR JR. (1973) identificou nos frutos as antocianinas cianidina-
3-O-xilosilglicosídeo e cinanidina 3-O-glicosídeo. As mesmas antocianinas
foram isoladas de folhas adultas de árvores jovens de erva-mate (RICCO et al.,
1991).
No que se refere aos polifenóis, GARCIA PAULA e BROOKS (1953)
isolaram duas substâncias fenólicas das folhas de Ilex paraguariensis por
14
cromatografia em papel: o ácido clorogênico (ácido 3-cafeoilquínico) e o
resinotanol, um produto resultante da oxidação parcial e condensação do ácido
clorogênico. Em 1956, ROBERTS separou três substâncias por cromatografia
em papel do extrato de Ilex paraguariensis: os ácidos clorogênico,
neoclorogênico (ácido 5-cafeoilquínico) e isoclorogênico. Quanto aos
flavonóides, foram detectados nas folhas quercetina-3-O-rutinosídeo (rutina)
(RICCO et al., 1991), quercetina-3-O-rutinosídeo glicosídeo (isoquercetrina),
canferol-3-O-glicosídeo, canferol-3-O-rutinosídeo (OHEM e HOLZL, 1988) e
quercetina livre (RICCO et al., 1991).
CARINI e colaboradores (1998) identificaram dez constituintes
polifenólicos em Ilex paraguariensis por CLAE/MS entre eles os ácidos
cafeoilquínico, clorogênico, cripto-clorogênico, rutina e um derivado da luteolina.
Os mesmos compostos foram identificados pelo método analítico de
quantificação de polifenóis por CLAE MS/MS desenvolvido, recentemente, por
BRAVO e colaboradores (2007).
Em estudo realizado FILIP e colaboradores (2001), em oito espécies do
gênero Ilex, foram identificados e quantificados os teores dos flavonóides
canferol, quercetina e rutina, bem como dos derivados cafeoilquínicos (ácidos
caféico, clorogênico, 3-4-dicafeoilquinico, 3-5-dicafeoilquinico e 4-5-
dicafeoilquinico). Os autores relataram teores de derivados cafeoilquínicos e
flavonóides significativamente superiores em Ilex paraguariensis.
3.3. Aspectos tecnológicos
A transformação de soluções extrativas em produtos secos vem sendo
amplamente realizada no desenvolvimento tecnológico de produtos derivados de
plantas. Os objetivos desta operação têm sido especialmente a obtenção de
produtos com maior concentração de constituintes químicos e com melhores
características tecnológicas. Os produtos secos têm apresentado vantagens
relacionadas com a homogeneidade de distribuição dos constituintes da preparação,
estabilidade, facilidade de pesagem e manuseio, bem como sua utilização como
produto intermediário na obtenção de produtos farmacêuticos derivados, alimentos
15
funcionais ou cosméticos. Entre as técnicas de secagem empregadas encontra-se a
secagem por spray-drying (LIST e SCHMIDT, 1989; GAUDY, 1991).
Esta técnica baseia-se na secagem de soluções e suspensões por divisão
destes em finas gotículas, no interior de uma torre de secagem provida de ar quente
circulante (MASTERS, 1976; BASSANI, 1990; SENNA, 1993). A grande utilização da
secagem por spray-drying deve-se às vantagens de baixos riscos de degradação
química durante a operação, devido ao curto tempo de contato do líquido disperso
com a fonte de calor; a versatilidade na obtenção de pós, grânulos ou aglomerados
e o elevado rendimento por tempo de produção. Consiste numa técnica de baixo
custo, quando comparada a outras técnicas que empregam calor (MASTERS, 1976;
LIST e SCHMIDT, 1989).
A necessidade de utilizar adjuvantes de secagem foi colocada em evidência
por diversos autores, tanto como fator crítico no rendimento do processo, como na
padronização da qualidade e manutenção da estabilidade de produtos secos por
spray-drying. Entre os adjuvantes já testados estão o dióxido de silício coloidal, a
celulose microscristalina, a goma arábica, o fosfato tricálcico e maltodextrina
(JACOB et al., 1976; SOERTANO, 1980; CASADEBAIG, 1987; BASSANI, 1990;
GAUDY et al., 1991, PUECH, 1991). Estudos realizados sobre o emprego de
adjuvantes de secagem têm demonstrado uma melhora nas propriedades físico-
químicas, bem como proporciona um aumento no rendimento da operação, além de
contribuir, positivamente, para a reconstituição em água do produto e para a
estabilidade frente à umidade (GAUDY, 1987; PUECH, 1991; MOURA et al., 1996).
O desenvolvimento de produtos secos por spray-drying vem sendo estudado
no Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRGS,
destacando-se entre as espécies vegetais estudadas Achyrocline satureoides
(BASSANI, 1990; SENNA, 1993, TEIXEIRA, 1996, DE PAULA, 1997; DE SOUZA,
2002; DA SILVA, 2003); Passiflora edulis (DE SOUZA, 1997); Maytenus ilicifolia
(CARVALHO, 1997; MARTINS, 1998; DE SOUZA, 1999); Phyllanthus niruri
(SOARES, 1997; COUTO, 2000), Cecropia glazioi (HEBERLÉ, 2000) e Ilex
paraguariensis (CAMPOS, 1996; GNOATTO, 2002).
16
CAMPOS (1996) avaliou a influência dos processos de secagem por sapeco e
ao ar livre de Ilex paraguariensis sobre as características de produtos secos por
spray-drying em escala laboratorial. A autora observou que os produtos preparados
a partir da erva-mate sapecada (ESA-A) e seca ao ar (ESE-A) apresentaram
características físicas e organolépticas semelhantes, diferenciando-se, no entanto,
quanto ao teor dos marcadores químicos do vegetal. A erva-mate sapecada
apresentou um conteúdo menor de cafeína e teobromina nas folhas secas, soluções
extrativas e produto seco final em relação ao material seco ao ar livre. No entanto,
os teores de extrativos, flavonóides e polifenóis da erva-mate sapecada foram
superiores aos encontrados na erva-mate seca ao ar. Ainda, o mesmo trabalho,
avaliou a viabilidade tecnológica de formulações obtidas com e sem adjuvante de
secagem (dióxido de silício coloidal), observando que a formulação sem adjuvante
originou um produto com características tecnológicas pouco satisfatórias e elevada
higroscopia. A adição de dióxido de silício coloidal mostrou-se necessária para a
obtenção de produtos secos com teor de umidade residual e estabilidade física
frente à atmosfera úmida satisfatórios.
GNOATTO (2002) preparou dois produtos secos por nebulização em escala
laboratorial a partir de extrato aquoso: um empregando apenas Aerosil
®
200 (ESN1)
e outro utilizando Aerosil
®
200 e Avicel
®
pH101 (ESN2) como adjuvantes. Ambos os
extratos foram caracterizados tecnologicamente e quantificados quanto aos
rendimentos de metilxantinas e saponinas. A caracterização tecnológica demonstrou
que o ESN1 apresentou rendimento bruto superior e teor de umidade inferior ao
ESN2, este último, no entanto, apresentou melhores características de fluxo. Não
houve diferença significativa nos teores de metilxantinas e saponinas entre os dois
extratos.
17
4. MATERIAIS EMPREGADOS
4.1. Equipamentos e acessórios
Balança analítica PM 200 (Mettler); agitador magnético Fisatom 725 A;
balança analítica Sartorius 2402; banho de água Biomatic modelo 869; bomba e
sistema de vácuo LiChrolut (Merck); - câmara de fotoestabilidade espelhada (1 x
0,17 x 0,17 m) com lâmpada em 254nm PRS416PH Helfont 127V/40W/60HZ;
câmara de fotoestabilidade espelhada (1 x 0,17 x 0,17 m) com lâmpada em
352nm RE130 RCG 127V/33W/60HZ; coluna de aço inoxidável Shimadzu (CLC-
ODS (M)) RP-18, 5 μm (250 mm x 4mm d.i.); Cromatógrafo líquido Shimadzu
(LC-10 AD) equipado com controlador de gradiente (FCV-10 AL), injetor
automático (SIL-10 A) e detector de UV/VIS (SPD-10 A) controlado por software
(CLASS LC-10); espectrofotômetro Hewlett Packard HP; estufa de ar circulante
Heraeus RVT 360; evaporador rotatório Büchi R 114; liofilizador Edwards
Modulyo 4K; manta aquecedora termostatizada Fisatom 402; membrana para
filtração de fluoreto de polivinilideno Millipore–GVHP-0,45μm; membrana para
filtração de fluoreto de polivinilideno Millipore–HVHP-0,5μm; microscópio
eletrônico de varredura Jeol modelo JSM 5800; microscópio óptico Jena; moinho
de facas Retsch SKI, com abertura de malha de saída de 1 mm; potenciômetro
pH-metro B374 Micronal; pré-coluna com fase estacionária Lichrosorb RP-18 ,10
μm; prensa hidráulica manual Hafico, capacidade 5 L; purificador de água Milli-
Q Plus Millipore; tanques e filtro-prensa; torre de secagem por aspersão NIRO –
Production Minor.
4.2. Solventes, reagentes e soluções
Todos os reagentes utilizados, a não ser os que constam com
especificação contrária, apresentaram grau de pureza pró-análise (p.a).
Acetato de etila; ácido acético glacial; água destilada; água ultrapura;
álcool etílico; metanol (HPLC).
18
4.3. Adjuvantes farmacêuticos
Celulose microcristalina - Avicel
®
Dióxido de silício coloidal - Aerosil
®
200
Maltodextrina - Glucidex
®
.
4.4. Substâncias de referência
Ácido caféico (Merck); Ácido clorogênico (Sigma); Rutina (Sigma).
19
5. METODOLOGIA
5.1. Preparação e caracterização da matéria-prima vegetal
5.1.1. Coleta e Identificação botânica.
A matéria-prima vegetal, composta de folhas e talos de Ilex
paraguariensis estabilizadas por sapeco, foi coletada na empresa ervateira Fino
Mate, em Mato Leitão – RS durante o período de safra (julho de 2004). O
material vegetal foi identificado botanicamente pela Profa. Dr. Lílian Auler Mentz
sendo, posteriormente, depositado um espécime no Herbário do Departamento
de Botânica do Instituto de Biociências da UFRGS (ICN 133726).
O material vegetal coletado foi separado manualmente e, após a seleção,
determinada a perda por dessecação de uma amostra. O material foi, então,
submetido à secagem em estufa com ar circulante em temperatura de 45 + 2
0
C
até um teor de perda por dessecação entre 10 a 12 %. Após a secagem, o
material foi cominuído em moinho de facas e acondicionado, ao abrigo da luz,
em recipiente fechado.
5.1.2. Determinação da perda por dessecação (FARMACOPÉIA, 1988)
Amostras de 300,0 mg de droga vegetal moída foram exatamente
pesadas, em pesa-filtros tarados, e colocadas em estufa, por 2 horas, em
temperatura de 105 +
2
0
C. Após resfriamento em dessecador os pesa-filtros
foram pesados e recolocados em estufa por mais 30 minutos. Este
procedimento foi repetido até as amostras alcançarem peso constante. Os
resultados foram expressos em perda de massa percentual, pela média de três
determinações.
5.1.3. Determinação do teor de extrativos (DEUTSCHES, 1986)
Uma amostra de cerca de 1,0 g, exatamente pesado, da matéria-prima
vegetal, foi submetido à extração com 100,0 ml de água, por decocção, durante 10
20
min. Após resfriamento, o volume foi reconstituído e a mistura filtrada, desprezando-
se os primeiros 20,0 ml do filtrado. Cerca de 20,0 g, exatamente pesados, do filtrado
foram colocados em pesa-filtro, previamente tarado, e evaporado à secura em
banho de água, com agitação ocasional. Após evaporação, o pesa-filtro contendo a
amostra foi levado a estufa por duas horas a 105
0
C, resfriado em dessecador e
pesado. A amostra foi recolocada em estufa por 30 minutos, repetindo-se o processo
até peso constante. O resultado foi expresso pela média de três determinações,
segundo a equação 1.
m
500g
TE
×
=
(1)
Onde: TE = teor de extrativos (%, m/m); g = massa (g) do resíduo seco; m =
massa (g) da amostra inicial, considerando o teor de umidade.
5.1.4 Análise granulométrica por tamisação (VOIGT, 2005)
Cerca de 100 g, exatamente pesados, da matéria-prima vegetal
cominuída foram submetidos à passagem através de tamises, previamente
tarados, com abertura de malha de 0,800; 0,600; 0,355; 0,250; 0,105 e 0,062
mm. A tamisação foi realizada a 60 vibrações por segundo durante 15 minutos.
As frações retidas nos tamises e coletor foram pesadas. Os dados foram
analisados por método gráfico, construindo-se curvas de retenção e passagem,
e histograma de distribuição, determinando-se o diâmetro médio de partículas e
amplitude granulométrica do pó. Os resultados foram expressos pela média de
três determinações.
5.2. Preparação e caracterização da solução extrativa (SEI)
5.2.1. Preparação da solução extrativa
A solução extrativa aquosa, denominada SEI, foi obtida por decocção da
matéria-prima vegetal
seca e moída, por 10 minutos, numa relação
droga:solvente de 1,5:10 (m/v). Foram utilizados cerca de 750g de matéria-
21
prima vegetal. A solução foi filtrada e o marco prensado. Após resfriamento até
temperatura ambiente, o volume foi reconstituído até a proporção inicial.
5.2.2. Determinação do resíduo seco (DEUTSCHES, 1986)
Uma amostra de 20,0 g de solução extrativa foi exatamente pesada em
pesa-filtro tarado e evaporada, até secura, em banho de água, sob agitação
ocasional. O pesa-filtro foi colocado em estufa por 2 horas, em temperatura de
aproximadamente 105 + 2 °C, resfriado em dessecador e pesado. O resultado
foi expresso em relação a 100 g da solução extrativa, pela média de seis
determinações.
5.2.3. Determinação do pH (FARMACOPÉIA, 1988)
A determinação do pH de uma amostra de 10,0 ml de solução extrativa foi
realizada em potenciômetro calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0. O
resultado foi expresso pela média de cinco determinações.
5.2.4. Determinação da densidade (FARMACOPÉIA, 1988)
A densidade da solução extrativa foi determinada com auxílio de
picnômetro, a 25 °C. Os resultados foram expressos em g/ml e corresponderam
à média de três determinações.
22
5.3. Validação de metodologia analítica para doseamento dos constituintes
polifenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
5.3.1. Equipamentos
Cromatógrafo líquido Shimadzu (LC-10 AD) equipado com controlador de
gradiente (FCV-10 AL), injetor automático (SIL-10 A) e detector de UV/VIS (SPD-10
A) controlado por software (CLASS LC-10). Para avaliar a pureza e identidade dos
picos foi empregado, adicionalmente, um detector de arraste de diodo Waters
Millenium (Milford, MA, USA). Depois de analisadas por CLAE, as amostras foram
analisadas por ESI-MS e MS/MS em um espectrômetro de massas Varian 1200
(WAlnut Creek, CA, USA), equipado com triplo quadrupolo, do Laboratório de
Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal de Goiás. Cerca de 20 μl de cada
amostra foi inserida via injetor em fluxo de 0,5 ml/min, utilizando-se como solvente
MeOH/H
2
O 50 % (v/v). O gás de nebulização e dessolvatação foi N
2
. Os
experimentos de MS/MS foram feitos utilizando-se como gás de colisão argônio. A
energia ótima de colisão utilizada foi de 10 e 30 eV. Todas as amostras foram
injetadas em triplicata.
5.3.2. Condições cromatográficas
As condições cromatográficas desenvolvidas foram: pré-coluna como fase
estacionária Lichrosorb RP-18 10 μm e coluna Shimadzu CLC-ODS (M) RP-18, (5
μm, 250 mm x 4 mm) detecção em ultravioleta (λ= 340 nm com sensibilidade de 0,05
AUFS) e injeção de 20 μl de amostra.
Como sistema de eluição foi empregado gradiente linear constituído de: (A)
ácido acético 2 % (v/v); (B) metanol: água 85 % (m/m). As análises foram realizadas
empregando fluxo de eluição de 0,7 ml/min, seguindo o regime de eluição descrito
na tabela 1.1.
23
Tabela 1.1 Descrição do gradiente de eluição em função do tempo.
Tempo (min) A (%) B (%)
0,00 69 31
10,0 69 31
25,0 44 56
33,0 44 56
45,0 23 77
50,0 44 56
55,0 69 31
A: ácido acético 2 % (v/v); B: metanol: água 85 % (m/m)
5.3.3. Validação do método analítico
A validação analítica foi realizada considerando como fonte de variação da
amostra, a matéria-prima vegetal, o analista e o dia de realização da análise.
A validação analítica consistiu de avaliação de linearidade, exatidão, precisão
(repetibilidade e precisão intermediária), robustez, determinação dos limites de
detecção e quantificação (ICH, 2005; SWARTZ e KRULL, 1998).
5.3.3.1. Curva padrão
Para obtenção das curvas padrão de ácido clorogênico e rutina foram
preparadas soluções metanólicas 50 % (v/v) nas concentrações de 2,0; 4,0; 6,0 8,0
e 10,0 μg/ml. As soluções foram filtradas em filtro de membrana de polivinilideno de
0,45 μm de diâmetro de poro. Os resultados foram expressos pela área média dos
picos obtidos em três injeções. Este procedimento foi repetido em três dias
consecutivos.
5.3.3.2. Curva de calibração da solução extrativa de Ilex paraguariensis (SEI)
Uma alíquota de 5,0 mL da SEI foi diluída a 50,0 ml com água, constituindo
a solução-mãe (SM). Desta SM, uma alíquota de 5,0 ml foi diluída a 25,0 ml com
metanol:água (50:50 v/v) . A partir desta solução, alíquotas de 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 e 5,0
24
ml foram diluídas em balões de 10,0 ml com metanol:água (50:50 v/v). Os resultados
foram expressos pela área média dos picos obtidos em três injeções. Este
procedimento foi repetido em três dias consecutivos.
As curvas de calibração obtidas foram submetidas à análise por regressão
linear e os resultados expressos pelo coeficiente de regressão, limites de confiança
no ponto de interseção e pelo coeficiente de inclinação da reta.
5.3.3.3. Repetibilidade
Foi realizada para a solução extrativa mediante análise de nove diluições de
mesma concentração, correspondente ao ponto central da curva de calibração da
solução extrativa. Os resultados foram expressos como desvio padrão relativo
percentual.
5.3.3.4. Precisão intermediária
Foi verificada através da análise de uma concentração escolhida a partir da
curva de calibração da solução extrativa, sendo analisada em três dias deferentes,
em triplicata, sendo os resultados expressos como coeficiente de variação
percentual.
5.3.3.5. Limite de detecção
Foi calculado a partir da curva de calibração das substâncias de referência
usando a equação 2.
i
3,3di
LD
×
=
(2)
Onde di = desvio padrão do coeficiente linear (intercepto); i = inclinação da
curva de calibração.
5.3.3.6. Limite de quantificação
Foi calculado a partir da curva de calibração das substâncias de referência
usando a equação 3.
i
10di
LQ
×
=
(3)
25
Onde di = desvio padrão do coeficiente linear (intercepto); i = inclinação da
curva de calibração.
5.3.3.7. Exatidão
A exatidão foi avaliada através da recuperação do ácido clorogênico e rutina
adicionados à solução extrativa com concentração de 6,7 μg/ml. O ensaio foi
executado obedecendo à faixa de linearidade da metodologia, por meio de três
níveis de concentrações de ácido clorogênico (67, 100 e 133 %) e rutina (50, 100 e
150 %), com três repetições cada. A exatidão foi expressa pela relação entre a
concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica
correspondente, de acordo com a equação 4.
10
teórica ãoconcentraç
alexperiment média ãoconcentraç
Exatidão ×= (4)
Os resultados foram analisados por ANOVA, considerando-se:
• variação de tempo de retenção bruto dos picos (inferior a 5 %);
• variação de área dos picos.
5.3.4. Identificação dos picos
Os picos foram identificados considerando a correspondência dos tempos de
retenção e o aumento das áreas dos picos presentes na amostra, mediante adição
quantitativa de pequenas quantidades da substância de referência à amostra. Para
avaliar a pureza e identidade dos picos foi empregado, adicionalmente, um detector
de arranjo de diodo.
5.3.5. Análise quantitativa
A análise quantitativa foi realizada mediante a utilização de um padrão
externo, utilizando-se a equação da reta obtida para as substâncias de referência
26
para determinar a concentração das substâncias a quantificar presentes na amostra,
conforme a equação 5.
b
)aAm(
C
−
=
(5)
onde: C = concentração da substância na amostra (μg/ml); Am = absorvância da
amostra; a = coeficiente linear; b = coeficiente angular.
As análises foram executadas ajustando-se, por diluição, o volume das
soluções padrão e amostras, a fim de se obter respostas do detector (áreas)
semelhantes. O resultado foi expresso pela média de seis determinações.
5.4 Fracionamento e purificação das frações polifenólicas presentes no extrato
seco liofilizado
5.4.1. Preparação do extrato seco liofilizado (ESLI)
A solução extrativa, em volume de 1000 ml, foi transferida para frascos de
liofilização, congelada e liofilizada nas condições descritas na tabela 1.2.
Tabela 1.2 Condições operacionais empregadas na liofilização da solução extrativa
aquosa de
Ilex paraguariensis.
Parâmetro Valor
Temperatura (
0
C) -60
Pressão (mbar) 10
-1
Tempo (horas) 96
Os frascos de liofilização contendo as soluções extrativas ficaram ao abrigo
da luz durante todo o procedimento de congelamento e secagem. Os liofilizados
obtidos foram acondicionados em frascos âmbar, armazenados em dessecador
recebendo a denominação ESLI – extrato seco liofilizado obtido a partir da solução
extrativa aquosa de
Ilex paraguariensis.
27
5.4.2 Caracterização do extrato seco liofilizado (ESLI)
5.4.2.1. Determinação da perda por dessecação (FARMACOPÉIA, 1988)
Conforme descrito no item 5.1.2.
5.4.2.2. Rendimento do processo de liofilização
O rendimento foi calculado pela diferença entre a massa teórica do resíduo
seco da solução extrativa e a massa de ESLI obtida, considerando o teor de
umidade residual.
5.4.2.3. Determinação do pH (FARMACOPÉIA, 1988)
Conforme descrito no item 5.2.3.
5.4.2.4. Análise quantitativa por CLAE
Foi realizada empregando-se as condições cromatográficas descritas no
item 5.3.2.
Uma amostra de 3,80 mg de ESLI foi dissolvida em metanol e o volume
completado a 20,0 ml, em balão volumétrico. Uma alíquota de 2,0 ml desta solução
foi diluída em metanol:água 50% (v/v) a 10,0 ml, obtendo-se concentração final de
38,0 μg/ml. Uma alíquota desta solução foi filtrada em membrana e injetada no
cromatógrafo. As injeções foram realizadas em triplicata. As áreas médias dos picos
foram comparadas às áreas dos padrões calculando-se a concentração dos
polifenóis presentes utilizando-se a equação da reta obtida para as substâncias.
5.4.3. Preparação do extrato para fracionamento
Para o fracionamento do extrato foi empregada a metodologia descrita por
PAVEI (2004), para os frutos da planta, adaptada para o extrato seco por liofilização
obtido a partir da solução extrativa de folhas de
Ilex paraguariensis (ESLI). A
metodologia está descrita no relatório descritivo que encontra-se em solicitação de
depósito de patente no EITT/UFRGS.
28
5.4.4. Caracterização das frações
5.4.4.1 Determinação do pH
Conforme descrito no item 5.2.3.
5.4.4.2. Avaliação macroscópica
Foi realizada por observação de cor e características gerais das frações
durante a eluição da coluna e após concentração e liofilização. As frações obtidas
foram denominada FA, FB e FF.
5.4.4.3. Análise qualitativa por CLAE
Foi realizada empregando a metodologia validada no item 5.3.2.
5.4.4.3.1. Preparação das amostras
Cerca de 2,5 mg do extrato liofilizado de cada uma das frações obtidas
foram diluídos em balão volumétrico de 10,0 ml com metanol 50% (v/v). As
soluções resultantes foram filtradas através de membrana e injetadas em CLAE.
As injeções foram realizadas em triplicata.
5.5. Produção e caracterização dos produtos secos por spray-drying
5.5.1 Preparo das dispersões a partir da solução extrativa
Os adjuvantes tecnológicos foram incorporados a um volume final de 5 litros
de SEI e a mistura foi mantida sob agitação por 30 minutos.
Foram preparadas quatro formulações equipamento –
Production Minor Spray
Dryer Plant, fabricado pela NIRO A/S, munido de atomizador rotatório, a partir da
solução extrativa. A composição percentual das formulações utilizadas na produção
dos produtos secos de
Ilex paraguariensis está descrita na tabela 1.3, sendo os
produtos obtidos, codificados como PSI-A, PSI-B, PSI-C e PSI-D.
29
Tabela 1.3 Composição percentual dos produtos secos de Ilex paraguariensis (PSI).
Composição PSI-A PSI-B PSI-C PSI-D
RS
*
70 % 70 % 70 % 70%
Aerosil
®
30 % 15 % - 15 %
Avicel
®
15 %
Glucidex
®
- 15 % 30 %
Aerosil
®
:
dióxido de silício coloidal
Avicel
®
:
celulose microcristalina
Glucidex
®
:
maltodextrina
RS* = concentração percentual de resíduo seco (m/m) do vegetal no produto seco final.
As condições de secagem empregadas na produção dos produtos secos por
aspersão foram: bomba de alimentação: 143,0 ml/min; velocidade do aspersor:
10900 rpm; temperatura de entrada: 177 +
1
0
C; temperatura de saída: 99,3 + 1
0
C;
diferença de pressão (∆p): 125.
A SEI foi mantida sob agitação constante durante toda a operação de
secagem, a fim de garantir homogeneidade ao produto final. Os PSI foram
acondicionados frascos de polietileno opacos e armazenados em dessecador.
5.5.2. Caracterização dos produtos PSI-A, PSI-B, PSI-C e PSI-D
5.5.2.1. Determinação da perda por dessecação (FARMACOPÉIA, 1988)
Determinada por gravimetria de acordo com a metodologia descrita no item
5.1.2.
5.5.2.2. Avaliação do rendimento da operação de secagem
Foi determinado por meio da diferença entre a massa teórica e a massa do
PSI obtida, considerando o teor de umidade residual.
30
5.5.2.3. Análise granulométrica
Realizado pela medida do diâmetro de Feret, no mínimo, 500 partículas, em
microscópio óptico com ocular provida de nônio com 10 vezes de aumento e objetiva
de 40 vezes. O nônio contém a escala de 1 mm que apresenta 100 divisões, onde
cada divisão do nônio corresponde a 3,4 μm. A lâmina foi preparada com uma
pequena quantidade de pó disperso a seco. O diâmetro médio e o desvio padrão
das das partículas foram determinados graficamente (EWLLS, 1988; LIEBERMAN
et
al., 1989; LANTZ, 1989). Os resultados foram obtidos a partir das curvas de
distribuição granulométrica em função da freqüência acumulada percentual.
Os valores de diâmetro médio e do desvio padrão granulométrico foram
calculados de forma aritmética por meio das equações 6 e 7.
n
x
x
n
i
i
∑
= (6)
)1n(
xn)x(
s
2
n
i
2
i
−
−
=
∑
(7)
onde:
x
= média; s = desvio padrão; n = número de partículas;
i
x = valor do
diâmetro da partícula;
∑
n
i
i
x = somatório dos valores do diâmetro da partícula;
∑
n
i
2
i
)x( = somatório do quadrado do diâmetro das partículas.
5.5.2.4. Avaliação do ângulo de repouso (PARTHIRANA e GUPTA, 1976)
Foi determinado através do escoamento dinâmico utilizando equipamento
dotado de módulo de descarga automática modificado por GUTERRES (1990). O
aparelho consiste de um cilindro móvel, ajustado a uma base fixa, acoplado a um
motor que, quando acionado, separa o cilindro da base pela ascensão do mesmo.
Uma superfície vertical dotada de planilha foi utilizada para registro das sombras
obtidas após a elevação do cilindro contendo as amostras. As medidas foram feitas
diretamente no registro das sombras projetadas nas planilhas e o ângulo de repouso
(α) foi calculado através de sua tangente, conforme a equação 8. Os resultados
expressam a média de três determinações, utilizando-se 30,0 ml de amostra.
31
(8)
onde: α = ângulo de repouso (
o
) e tg α = quociente entre os catetos oposto (h) e
adjacente (r)do triângulo.
5.5.2.5. Determinação das densidades brutas e de compactação, fator de Hausner,
índice de compressibilidade e de densificação (VOIGT, 2005; GUYOT et al., 1995;
PECK et al., 1989)
As determinações das densidades brutas e de compactação foram realizadas
em volúmetro de compactação, onde o pó, exatamente pesado, foi vertido numa
proveta e submetido a 10, 500 e 1250 quedas seqüenciais (DIN 5394). O ensaio foi
continuado em seqüências de 1250 quedas até que a diferença entre duas leituras
subseqüentes fosse inferior ou igual a 1,0 mL, sendo este considerado como volume
de compactação. A partir dos dados obtidos neste ensaio foram calculados o fator
de Hausner, índices de compressibilidade e de densificação, segundo as equações
9, 10 e 11, respectivamente.
db
dc
FH = (9) 100
dc
dcdb
IC ×
−
= (10)
50010
VVID −
=
(11)
onde: FH = fator de Hausner; db = densidade bruta (g/ml); dc = densidade de
compactação (g/ml); IC = índice de compressibilidade; ID = índice de densificação;
V
10
= volume do pó após 10 quedas; V
500
= volume do pó, após 500 quedas.
5.5.2.6. Análise das partículas por microscopia eletrônica de varredura
As amostras dos produtos secos foram previamente metalizadas em
metalizador Jeol Jee 4B (JVG-IN) utilizando-se um filtro de ouro em suporte de
metal. A análise foi realizada no Centro de Microscopia Eletrônica da UFRGS, em
microscópio eletrônico de varredura (JEOL-JSM 6060). A morfologia, a superfície e
homogeneidade de tamanho e forma das partículas foram observadas.
r
h
tg =α
32
5.6. Validação de método de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
para doseamento de constituintes polifenólicos presentes nos produtos secos
por spray-drying
5.6.1. Condições cromatográficas
As condições cromatográficas empregadas foram idênticas às descritas
na seção 5.3.2.
5.6.2. Validação do método analítico
5.6.2.1. Curva-padrão
Para obtenção das curvas padrão de ácido clorogênico e rutina foram
preparadas soluções destas substâncias de referência numa mistura metanol:água
(1:1 v/v) nas concentrações de 2,0; 4,0; 6,0 8,0 e 10,0 μg/ml. As soluções foram
filtradas em filtro de membrana de polivinilideno de 0,45 μm de diâmetro de poro. Os
resultados foram expressos pela área média dos picos obtidos em três injeções.
Este procedimento foi repetido em três dias consecutivos.
5.6.2.2. Curva de calibração do PSI-A
Uma amostra de 54,3 mg de PSI-A, exatamente pesada, foi dissolvida em
50,0 ml de água destilada, agitando-se sob proteção da luz por um período de 15
minutos. A partir desta solução, alíquotas de 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 e 5,0 ml foram diluídas
em balões de 10,0 ml com uma mistura metanol:água (1:1 v/v). Os resultados foram
expressos pela área média dos picos obtidos em três injeções. Este procedimento
foi repetido em três dias consecutivos.
As curvas de calibração foram submetidas à análise por regressão linear e
os resultados expressos pelo coeficiente de regressão, limites de confiança no ponto
de interseção e pelo coeficiente de inclinação da reta.
5.6.2.3. Repetibilidade
Foi avaliada por meio da análise de nove diluições de mesma concentração
de solução de PSI-A, correspondente ao ponto central da curva de calibração. Os
resultados foram expressos como coeficiente de variação percentual.
33
5.6.2.4. Precisão intermediária
Foi verificada por meio da análise de uma concentração escolhida a partir da
curva de calibração da solução de PSI-A, sendo analisada em três dias diferentes,
em triplicata, sendo os resultados expressos como coeficiente de variação
percentual.
5.6.2.5. Limite de detecção
Foi calculado a partir da curva de calibração das substâncias de referência
de acordo com a equação descrita no item 5.3.3.5.
5.6.2.6. Limite de quantificação
Foi calculado a partir da curva de calibração das substâncias de referência
de acordo com a equação no item 5.3.3.6.
5.6.2.7. Exatidão
A exatidão foi avaliada a partir da recuperação do ácido clorogênico e rutina
adicionados à solução com concentração de 6,7 μg/ml. O ensaio foi executado,
obedecendo a faixa de linearidade da metodologia, em três níveis de concentrações
(50, 100 e 150 %) das substâncias de referência e amostra com três repetições
cada. A exatidão foi expressa pela relação entre a concentração média determinada
experimentalmente e a concentração teórica correspondente, de acordo com a
equação descrita no item 5.3.3.7.
Os resultados foram analisados por ANOVA, considerando-se:
• variação de tempo de retenção bruto dos picos (inferior a 5 %);
• variação de área dos picos.
5.6.3. Identificação dos picos
Os picos foram identificados considerando-se a correspondência dos tempos
de retenção e o aumento das áreas dos picos presentes na amostra, mediante
adição quantitativa de pequenas quantidades da substância de referência à amostra.
34
5.6.4. Análise quantitativa
A análise quantitativa foi realizada mediante a utilização de padrões externos,
utilizando-se as equações das retas obtidas para determinar a concentração das
substâncias na amostra, de acordo com a equação descrita no item 5.3.5.
As análises foram executadas ajustando-se, por diluição, o volume das
soluções padrão e amostras, a fim de se obter respostas do detector (áreas)
semelhantes. O resultado foi expresso pela média de seis determinações.
5.6.4.1. Condições cromatográficas
As condições cromatográficas empregadas idênticas às descritas na
seção 5.3.2.
5.6.4.2. Preparação das amostras
Alíquotas de 54,3 mg de cada um dos produtos secos por spray-drying
(PSI-A, PSI-B, PSI-C e PSI-D) foram pesadas e dissolvidos em 50,0 ml de água
destilada e mantidas sob agitação durante 15 minutos sob proteção da luz,
constituindo a solução-mãe (SM). Desta SM, 5,0 ml foram diluídos em balões de
50,0 ml com água destilada. A partir desta solução uma alíquota de 5,0 ml foi
diluída a 25,0 ml com uma mistura metanol:água (1:1 v/v), constituindo a SA.
Para análise cromatográfica, 2,0 ml desta solução foram diluídos a 10,0 ml com
o mesmo solvente. As injeções foram realizadas em triplicata, para cada um dos
produtos secos por aspersão analisados.
5.7. Avaliação da estabilidade frente à luz UV (254 nm e 352 nm)
Para análise da influência da luz sobre a estabilidade dos produtos secos por
spray-drying estes foram colocados em câmara de fotoestabilidade PRS416PH
Helfont
(254 nm e 352 nm), por um período de dois dias. Foram preparadas três
amostras em vidro relógio aberto para cada dia de avaliação. Foram analisadas
amostras nos tempos de 0, 24 e 48 h.
35
5.7.1. Características sensoriais
As amostras foram avaliadas quanto às características de cor, odor e
aparência do pó após exposição à câmara.
5.7.2. Avaliação da perda por dessecação (FARMACOPÉIA, 1988)
Determinada por gravimetria de acordo com a metodologia descrita no item
5.1.2.
5.7.3. Avaliação dos polifenóis por CLAE
5.7.3.1. Condições cromatográficas.
As condições cromatográficas empregadas foram idênticas às descritas
na seção 5.3.2.
5.7.3.2. Preparação das amostras
Amostras de 21,7 mg de cada um dos produtos secos por spray-drying
(PSI-A, PSI-B, PSI-C e PSI-D) foram pesadas e dissolvidas, separadamente, em
20,0 ml de água destilada e a mistura mantida, sob agitação, durante 15
minutos, sob proteção da luz, constituindo a solução-mãe (SM). Para análise
cromatográfica 2,0 ml desta solução foram diluídos a 10,0 ml com uma mistura
metanol:água (1:1 v/v), constituindo a SA. As injeções no cromatógrafo foram
realizadas em triplicata, para cada um dos produtos secos analisados.
36
5.8 Produção e caracterização de produto seco por spray-drying para a
realização dos ensaios in vivo
Após a caracterização tecnológica e avaliação da atividade antioxidante in
vitro e ex vivo dos diferentes produtos secos por spray-drying, selecionou-se o
produto PSI-A como o mais promissor tanto quanto à atividade antioxidante como
quanto à viabilidade tecnológica de produção em escala semi-industrial. Assim, para
os testes de atividade antioxidante
in vivo, foram preparados 30 litros de solução
extrativa, a qual, após adição e mistura com Aerosil
®
200, foi submetida à secagem
obedecendo às condições descritas no item 5.6.1. O produto obtido após secagem
foi denominado PSI-A L02 sendo caracterizado tecnologicamente.
5.8.1. Caracterização do produtos PSI-A L02
5.8.1.1. Determinação da perda por dessecação (FARMACOPÉIA, 1988)
Determinada por gravimetria de acordo com a metodologia descrita no item
5.1.2.
5.8.1.2. Avaliação do rendimento da operação de secagem
Foi determinado por meio da diferença entre a massa teórica e a massa do
PSI-A L02 obtida de acordo com a metodologia descrita no item
5.5.2.2.
5.8.1.3. Avaliação do ângulo de repouso (PARTHIRANA e GUPTA, 1976)
Foi determinado através do escoamento dinâmico utilizando equipamento
dotado de módulo de descarga automática modificado por GUTERRES (1990) de
acordo com a metodologia descrita no item
5.5.2.4.
5.8.1.4. Determinação das densidades brutas e de compactação, fator de Hausner,
índice de compressibilidade e de densificação (VOIGT, 2005; GUYOT et al., 1995;
PECK et al., 1989)
As determinações das densidades brutas e de compactação foram realizadas
de acordo com a metodologia descrita no item
5.5.2.5.
37
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. Preparação e caracterização da matéria-prima vegetal de Ilex
paraguariensis
A etapa preliminar de caracterização da matéria-prima vegetal compreendeu
a identificação botânica do material fornecido pela Empresa Ervateira Fino Mate
(Mato Leitão-RS).
A qualidade da matéria-prima vegetal englobou, além da
identificação botânica, outros quesitos de análise visando à constância de sua
composição química e conseqüentes efeitos biológicos.
A umidade residual de matérias-primas constitui-se num parâmetro importante
relacionado com a estabilidade química e microbiológica das mesmas, uma vez que
a presença de água favorece a proliferação de microorganismos.
A perda por dessecação de matérias-primas contendo baixo conteúdo de
substâncias voláteis tem sido empregada como parâmetro indicativo do teor de
umidade residual de drogas, após a etapa de secagem, como é o caso de
Ilex
paraguariensis.
Tabela 1.4. Características da matéria-prima vegetal de
Ilex paraguariensis, após
secagem e moagem.
Perda por dessecação (% m/m)
X
(DPR %)
Teor de extrativos (% m/m)
X
(DPR %)
9,72 (2,08) 25,67 (0,46)
X
: valor médio; DPR (%): desvio padrão relativo percentual.
A matéria-prima vegetal apresentou, após secagem em estufa e moagem, um
valor de perda por dessecação superior ao encontrado por CAMPOS (1996) de 6,95.
Admitindo-se que estes valores correspondem à umidade residual, encontram-se
dentro dos limites farmacopéicos máximos preconizados de 8 a 14 % (ZHI-CHEN,
1980).
Em estudo preliminar sobre a influência de parâmetros de extração sobre as
principais características químicas e tecnológicas das soluções extrativas
resultantes, CAMPOS (1996) selecionou a decocção por 10 minutos como a
38
condição de maior eficiência de extração (medida pelo teor de extrativos). O teor de
extrativos apresentado pela matéria-prima vegetal empregada de 25, 7 % foi inferior
ao obtido por CAMPOS (1996), de 42,65. Tal fato pode estar relacionado às
variações inerentes à própria matéria-prima por proceder de época de coleta
diferente.
A análise granulométrica constitui um parâmetro auxiliar para determinação
da eficiência do processo de extração empregado. A moagem visa a aumentar a
superfície de contato da matéria-prima com o solvente, permitindo assim, maior
interação e maior dissolução de substâncias extratíveis (VOIGT, 2005). Na figura 1.1
visualiza-se o histograma de distribuição granulométrica da matéria-prima vegetal de
Ilex paraguariensis, moída em moinho de facas.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
0
,
0
-
0
,
0
6
2
0
,
0
6
2
-
0
,
1
0
5
0
,
1
0
5
-
0
,
2
5
0
0
,
2
5
0
-
0
,
3
5
5
0
,
3
5
5
-
0
,
6
0
0
0
,
6
0
0
-
0
,
8
0
0
>
d
e
0
,
8
0
0
classe granulométrica (mm)
fração tamisada (%)
Figura 1.1. Distribuição granulométrica da matéria-prima vegetal Ilex
paraguariensisis
, folhas e talos.
Os dados de distribuição granulométrica da matéria-prima demonstraram que
cerca de 27 % de todas as partículas apresentaram diâmetro entre 62 e 105 μm,
seguida de 22 % com diâmetro de partícula entre 355 e 600 μm. Os resultados
demonstram uma ampla faixa de distribuição granulométrica para a mesma.
39
6.2. Preparação e caracterização da solução extrativa de Ilex paraguariensis
A solução extrativa (SEI) foi preparada de acordo com a metodologia
desenvolvida por CAMPOS (1996) sendo, posteriormente, caracterizada e os
resultados comparados aos previamente descritos na literatura para soluções
extrativas de
Ilex paraguariensis (CAMPOS, 1992; GNOATTO, 2002).
Tabela 1.5. Características da solução extrativa de Ilex paraguariensis.
Ensaio
Resultado;
X
+ s
DPR (%)
Resíduo seco (% m/m) (n=3) 3,78 + 0,02 0,46
pH (n=3) 5,67 + 0,01 0,10
Densidade relativa (n=3) 1,01 + 0,00 0,00
X = valor médio; s= desvio padrão; DPR (%)= desvio padrão relativo percentual.
O valor de resíduo seco é um parâmetro que pode ser empregado como
medida para avaliação da eficiência de extração do solvente, sem avaliar,
geralmente, a extração específica de uma classe de substâncias ou de substâncias
isoladas. No caso da preparação de extratos secos, este parâmetro é empregado
também para o cálculo das concentrações de adjuvantes empregados na secagem.
O valor de resíduo seco determinado para a SEI, de 3,8 % (m/m), foi menor
quando comparado ao encontrado por CAMPOS (1996) de 5,11% (m/m) e
semelhante ao descrito por GNOATTO (2002) de 3,66% (m/m). O valor de pH e
densidade encontrados para a SEI foram próximos aos obtidos por CAMPOS (1996)
de, respectivamente, 5,30 e 1,019.
40
6.3. Cromatografia liquida de alta eficiência
6.3.1 Identificação dos picos no cromatógrafo
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tornou-se, nas últimas
décadas, uma das metodologias analíticas mais amplamente empregadas na análise
quantitativa, visto a possibilidade de separar constituintes e simultaneamente
quantificá-los com rapidez, simplicidade e confiabilidade. A aplicação desta técnica
na quantificação de substâncias de origem natural reveste-se de especial
importância na medida em que estas estão inseridas em matrizes de grande
complexidade.
Para
Ilex paraguariensis, foram descritos vários métodos de quantificação por
CLAE para compostos fenólicos (FILIP
et al., 2001; CARINI et al., 1998; BRAVO et
al., 2007). No presente trabalho, foi desenvolvida e validada metodologia analítica
por CLAE visando ao doseamento de compostos polifenólicos presentes na solução
extrativa e, numa segunda etapa, nos produtos secos derivados.
A figura 1.2 mostra os perfis cromatográficos a 340 nm, com os respectivos
espectros de UV com detector de arranjo de diodos (UV-DAD), obtidos para as
substâncias de referência (figura 1.2a) e solução extrativa (figura 1.2b) de
I.
paraguariensis. Oito picos foram identificados na solução extrativa, seis destes
(picos P1, P2, P3, P4, P5 e P6) apresentam espectros de UV típicos de derivados
cafeoilquínicos, com bandas de absorção em que o λ
máx
é de 328 nm. O pico P1
parece ser o constituinte majoritário na solução extrativa. Devido à complexidade da
matriz e ao longo tempo de análise requerido, optou-se pelo emprego de um sistema
de eluição em gradiente linear. A fase móvel constituída de uma mistura
metanol:água apresentou adequada resolução e separação dos picos, permitindo,
assim, a quantificação das substâncias de referência na matéria-prima vegetal em
um tempo inferior a 40 min.
A identificação destes compostos foi realizada empregando-se cromatografia
líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (CLAE-MS-MS).
Foram analisadas as substâncias de referência ácido clorogênico e rutina
isoladamente, bem como a solução extrativa diluída em metanol:água (50:50, v/v).
41
ACLO RUT
P1
P2 ACLO
P3
P4
P5
RUT
P6
A
B
ACLO RUT
P1
P2 ACLO
P3
P4
P5
RUT
P6
ACLO RUTACLO RUT
P1
P2 ACLO
P3
P4
P5
RUT
P6
P1
P2 ACLO
P3
P4
P5
RUT
P6
A
B
Figura 1.2. (A) Perfil cromatográfico das substâncias de referência, ácido clorogênico
(ACLO) e rutina (RUT). (B) Perfil cromatográfico da solução extrativa (SEI) de
Ilex
paraguariensis.
A análise por CLAE-MS-MS revelou que as estruturas dos picos P1 e P3
apresentaram íons idênticos com pico molecular em massa/carga (m/e) 353
e seus
fragmentos, quando colididos com gás reagente, resultam nos íons correspondentes
ao ácido cafeico (m/e 179) e ácido quínico (m/e 191) (figura 1.3), podendo ser
atribuídos a isômeros do acido clorogênico (acido 5-
O-dicafeoilquinico). A partir
destes dados e, considerando o perfil de eluição já previamente descrito na literatura
(CARINI
et al.,1998; BRAVO et al., 2007), pode-se inferir que os picos P1 e P3, são
42
os ácidos neo-clorogênico (ácido 3-O-dicafeoilquínico) e cripto-clorogênico (ácido 4-
O-dicafeoilquínico). Os picos P4, P5 e P6 apresentaram o mesmo pico do íon
molecular (m/e 515) indicativos de isômeros dicafeoilquínicos e fragmentos em m/e
179, 191 e 353 [m-H- cafeoil]
-
, correspondendo, provavelmente aos isômeros ácido
3,4-
O-dicafeoilquínico; 4,5-O-dicafeoilquínico; 3,5-O-dicafeoilquínico ou 1,5-O-
dicafeoilquínico.
ACLO
Figura 1.3. Espectro de massas dos picos P1, P3, P4, P5 e P6 presentes solução
extrativa (SEI) de
Ilex paraguariensis.
43
6.3.2 Validação de metodologia de quantificação dos polifenóis
Os teores dos picos P1, P3, P4, P5 e P6 foram expressos como ácido
clorogênico (ACLO), devido à similaridade de seus espectros de ultravioleta (DAD).
A validação do método analítico abrangeu a determinação dos parâmetros
linearidade, repetibilidade, precisão intermediária e exatidão preconizados pelo ICH
(2005).
A avaliação da linearidade foi realizada por meio da análise das curvas de
calibração para as substâncias de referência e soluções extrativas de
Ilex
paraguariensis, obtidas em três dias diferentes.
Os resultados da avaliação da linearidade para as substâncias de referência
são apresentados na tabela 1.6.
Tabela 1.6. Parâmetros de linearidade para as substâncias de referência ácido
clorogênico (ACLO) e rutina (RUT), analisadas por CLAE.
Pico r
2
a b DPR (%)
ACLO 0,9980 -5904,98 66.505,77 2,98
RUT 0,9992 -3515,26 36.407,72 1.53
r
2
=coeficiente de regressão linear; a= intersecção; b= inclinação; DPR (%) = desvio padrão relativo
percentual da inclinação da reta em três dias consecutivos; ACLO = ácido clorogênico; RUT = rutina.
As curvas de calibração obtidas, tanto para o ácido clorogênico como para a
rutina foram lineares na faixa de concentração de 2 a 10 μg/ml, com coeficientes de
regressão (r
2
) superiores a 0,998. A análise dos coeficientes de regressão linear
obtidos das curvas analíticas demonstra ausência de desvio de linearidade na faixa
de concentração testada. Os limites de confiança incluem o zero, o que demonstra a
ausência de erro sistemático constante. Os limites de detecção e quantificação
foram calculados de acordo com as equações preconizadas pela ICH (2005). Os
limites de detecção medidos para o ácido clorogênico e rutina foram,
repectivamente, 0,19 e 0,27 μg/ml. Os limites de quantificação obtidos foram,
respectivamente, 0,59 e 0,81 μg/ml, demonstrando a adequada sensibilidade do
método.
44
Na tabela 1.7 são apresentados os resultados da regressão linear para a
solução extrativa, considerando os mesmos parâmetros descritos para a análise de
regressão linear das substâncias de referência. A análise dos coeficientes de
regressão obtidos evidencia a ausência de desvios de linearidade na faixa de
concentração de 2,0 a 10 μg/ml. Os valores de r
2
foram menores aos observados
para as curvas das substâncias de referência, fato que pode ser atribuído à
complexidade da amostra.
Tabela 1.7. Parâmetros de linearidade na análise de solução extrativa de
Ilex
paraguariensis por CLAE.
Pico r
2
a b DPR (%)
ACLO 0,9978 -1290,63 712.700,52 4,69
RUT 0,9971 -634,10 125.150,42 6,08
r
2
= coeficiente de regressão linear; a= intersecção do eixo y; b= inclinação; DPR (%) = desvio padrão
relativo percentual da inclinação da reta em três dias consecutivos
; ACLO = ácido clorogênico; RUT =
rutina.
A análise dos resultados dos ensaios de precisão intermediária e
repetibilidade, tanto para os padrões como para a solução extrativa (tabelas 1.8 e
1.9) mostrou coeficientes de variação inferiores a 15%, limite máximo aceitável para
matrizes complexas (FDA, 2001).
45
Tabela 1.8. Precisão intermediária, na análise por CLAE das substâncias de
referência e solução extrativa de
Ilex paraguariensis.
Susbtâncias de referência Solução extrativa
Pico
Concentração
(mg/ml)
DPR (%)
Concentração
(mg/ml)
DPR (%)
ANEO - - 2,216
a
0,44
ACLO 0,098 2,14 1,669 0,82
ACPT - - 1,222
a
0,54
P4 - - 0,359
a
0,43
P5 - - 1,173
a
0,91
RUT 0,101 2,24 0,563 0,90
P6 - - 0,933
a
0,80
a
calculado como ácido clorogênico; DPR (%)= desvio padrão relativo percentual. ACLO = ácido
clorogênico; ANEO = ácido neo-clorogênico; ACPT = ácido cripto-clorogênico; RUT = rutina.
Tabela 1.9. Repetibilidade na análise por CLAE das substâncias de referência e
solução extrativa de
Ilex paraguariensis.
Susbtâncias de referência Solução extrativa
Pico
Concentração
(mg/ml)
DPR (%)
Concentração
(mg/ml)
DPR (%)
ANEO - - 2,058
a
0,91
ACLO 0,107 0,30 1,628 0,95
ACPT - - 1,288
a
1,11
P4 - - 0,388
a
1,13
P5 - - 1,081
a
1,33
RUT 0,103 0,25 0,563 1,02
P6 - - 1,009
a
0,75
a
calculado como ácido clorogênico; DPR (%) = desvio padrão relativo percentual. ACLO = ácido
clorogênico; ANEO = ácido neo-clorogênico; ACPT = ácido cripto-clorogênico; RUT = rutina.
A exatidão do método foi determinada por meio do teste de recuperação. Para
tanto, foram adicionadas à solução extrativa concentrações conhecidas de ácido
46
clorogênico (67, 100 e 133 %) e rutina (50, 100 e 150 %). Os resultados demonstram
uma taxa de recuperação média, respectivamente, de 97 e 104 % para o ácido
clorogênico e rutina, com coeficientes de variação inferiores a 1%, em todas as
concentrações analisadas.
Tabela 1.10. Resultado do ensaio de exatidão do ácido clorogênico.
Acido Clorogênico
Concentração
teórica
(
μg/ml)
Concentração
experimental
(μg/ml)
Recuperação (%)
X
(DPR %)
Recuperação
média (%)
X
(DPR %)
10,60 10,41 98,2 (0,89)
12,60 11,96 94,9 (0,65) 97,4 (2,09)
14,60 14,45 99,0 (0,33)
X = valor médio; DPR (%) = desvio padrão relativo percentual.
Tabela 1.11. Resultado do ensaio de exatidão da rutina.
Rutina
Concentração
teórica
(
μg/ml)
Concentração
experimental
(μg/ml)
Recuperação (%)
X (DPR %)
Recuperação
média (%)
X (DPR %)
3,20 3,43 107,2 (0,87)
4,20 4,40 104,8 (0,24) 103,9 (3,91)
5,20 5,19 99,8 (0,19)
X = valor médio; DPR (%) = desvio padrão relativo percentual.
Na tabela 1.12 são apresentados os teores de ACLO, RUT e demais picos
(P1, P3, P4, P5 e P6) na solução extrativa de
Ilex paraguariensis, medidos pelo
método CLAE anteriormente validado.
47
Tabela 1.12. Teor de polifenóis presentes na solução extrativa de
Ilex
paraguariensis, obtida por decocção.
Pico
SEI (mg/ml)
X (s)
ANEO 2,15
a
(0,014)
ACLO 1,53 (0,008)
ACPT 1,01
a
(0,007)
P4 0,29
a
(0,001)
P5 1,13
a
(0,010)
RUT 0,49 (0,016)
P6 0,75
a
(0,015)
a
calculado como ácido clorogênico; s = desvio padrão. ACLO = ácido clorogênico; ANEO = ácido
neo-clorogênico; ACPT = ácido cripto-clorogênico; RUT = rutina.
Após a validação da metodologia analítica para a quantificação de polifenóis
na solução extrativa aquosa, a mesma foi aplicada à quantificação de outras
soluções extrativas obtidas por diferentes métodos de extração.
Os resultados desta análise estão descritos no artigo aceito para publicação
no
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies (Anexo 1.1).
6.4. Obtenção de frações polifenólicas a partir de extrato seco liofilizado de
Ilex
paraguariensis
(ESLI)
Com o objetivo de viabilizar o estudo de isolamento da fração polifenólica
presente na SEI optou-se pela liofilização da mesma, considerando que a técnica de
liofilização preserva, de um modo geral, os constituintes químicos termolábeis. Além
disto o produto resultante (extrato seco liofilizado, ESLI), por tratar-se de extrato
seco, apresenta a perspectiva de maior estabilidade, comparativamente à solução
extrativa.
48
O ESLI apresentou aspecto cristalino, com coloração esverdeada. O produto
liofilizado foi mantido em dessecador, provido de sílica, até o momento de sua
utilização.
Na tabela 1.13 são apresentados os resultados da análise do teor de umidade
e pH do ESLI.
Tabela 1.13. Características do extrato seco liofilizado (ESLI) de
Ilex paraguariensis.
Ensaio
Resultado;
X
+ s
DPR (%)
Teor de umidade (% m/m) (n=3) 6,78 + 0,36 5,36
pH (n=3) 5,37 + 0,01 0,19
X = valor médio; s = desvio padrão; DPR (%) = desvio padrão relativo percentual.
O rendimento percentual da operação de secagem por liofilização a partir de
um volume de 1000 ml de solução extrativa foi de 99,70 %. Este valor levou em
conta a umidade residual do extrato seco.
A análise do perfil cromatográfico por CLAE do ESLI demonstrou a
manutenção dos picos presentes na solução extrativa primária, não sendo
observado o aparecimento ou desaparecimento de picos no perfil cromatográfico
(figura 1.4).
Figura 1.4. Perfil cromatográfico de extrato seco liofilizado (ESLI) de
Ilex
paraguariensis, obtido a partir de solução extrativa preparada por decocção.
49
No doseamento do ESLI por CLAE observou-se que os teores de polifenóis
foram maiores do que aqueles encontrados para a SEI, quando expressos,
comparativamente, pelo resíduo seco da SEI original. Esta diferença foi
estatisticamente significativa, através ANOVA (p<0,001) (tabela 1.14).
Tabela 1.14. Teor de polifenóis presentes no extrato seco liofilizado (ESLI) de
Ilex
paraguariensis comparativamente aos teores encontrados na solução extrativa que
lhe deu origem (SEI).
Pico
SEI (mg/g)
*
X
(s) ESLI (mg/g)
**
X
(s)
ANEO 56,55
a
(0,366) 62,22
a
(0,361)
ACLO 40,37
a
(0,205) 45,41 (0,206)
ACPT 26,45
a
(0,183) 30,80
a
(0,147)
P4 7,59
a
(0,108) 10,19
a
(0,046)
P5 29,75
a
(0,258) 36,23
a
(0,119)
RUT 12,99
a
(0,420) 14,23 (0,098)
P6 19,73
a
(0,400) 25,32
a
(0,075)
a
calculado como ácido clorogênico; s = desvio padrão.
*
Concentração expressa em mg de polifenóis/ g de resíduo seco.
**
Concentração corrigida considerando o valor de perda por dessecação de 6,78 % (m/m).
ACLO = ácido clorogênico; ANEO = ácido neo-clorogênico; ACPT = ácido cripto-clorogênico; RUT =
rutina.
Neste contexto, pode-se inferir que a secagem por liofilização da SEI permitiu
a obtenção de extrato seco que, apesar da higroscopia característica, manteve a
composição polifenólica original, cumprindo, assim, o seu objetivo.
Para a etapa de obtenção das frações polifenólicas, empregou-se uma resina
adsorvente polimérica, de alta porosidade, com matriz de poliestireno. A escolha
tanto do processo de purificação como da resina adsorvente fundamentou-se nos
resultados obtidos por PAVEI (2004) que, ao desenvolver a metodologia de
purificação da fração saponosídica presente no extrato liofilizado de frutos imaturos
de
Ilex paraguariensis detectou, nas porções iniciais do fracionamento, a presença
de compostos polifenólicos.
A metodologia descrita por PAVEI (2004) e os respectivos parâmetros como a
quantidade de resina utilizada, solvente, massa de ESLI aplicada na coluna, regime
50
e fluxo de eluição dos solventes foram adaptados ao fracionamento do extrato seco
liofilizado obtido a partir de folhas e talos de
Ilex paraguariensis, e estão sendo
submetidos a registro de patente na SEDETEC/UFRGS.
O monitoramento do processo de fracionamento, quanto à separação e
pureza das frações obtidas nos diferentes sistemas de eluição testados foi realizada
por meio da análise do perfil cromatográfico por CLAE, obtido empregando-se o
mesmo sistema descrito para análise da matéria-prima vegetal.
Na figura 1.5 são apresentados os perfis cromatográficos por CLAE das
frações obtidas nos cinco sistemas de eluição testados. Pode-se observar que o
fracionamento não alterou o perfil cromatográfico do ESLI inicial visto que os picos
estão presentes nas frações purificadas, fornecendo indícios de ausência de
degradação, durante o processo de purificação.
Na análise qualitativa do perfil cromatográfico dos sistemas testados observa-
se que a fração FA foi eficiente em separar os compostos polifenólicos mais polares,
caracterizados pelos picos compreendidos entre 0 e 15 minutos, os quais
correspondem aos derivados do ácido cafeoilquínico. Não foram evidenciadas, nesta
fração, as demais substâncias polifenólicas presentes no ESLI.
As frações eluídas em FE e FF, caracterizaram-se pela presença de
compostos menos polares, com tempos de retenção superiores a 25 minutos.
51
SI
SII
SIII
SIV
SV
FA
FA
FA
FA
FA
FC
FE
FC
FD FF
FD
FF
FC
FF
FB FF
SI
SII
SIII
SIV
SV
SI
SII
SIII
SIV
SV
FA
FA
FA
FA
FA
FC
FE
FC
FD FF
FD
FF
FC
FF
FB FF
Figura 1.5. Perfis cromatográficos comparativos das frações obtidas pela separação
em fase sólida, em diferentes sistemas de eluição, no fracionamento preliminar do
extrato seco liofilizado de
Ilex paraguariensis (ESLI).
No perfil cromatográfico do sistema SV observa-se um acúmulo de picos
correspondentes aos derivados cafeoilquínicos nas frações FA e FB e a ausência de
compostos de menor polaridade, que são eluídos separadamente na fração FF,
correspondendo aos derivados do ácido dicafeoilquínico e rutina. Esta condição
52
permitiu selecionar o sistema de eluição codificado como SV como sendo o mais
seletivo para a purificação de compostos polifenólicos uma vez que permitiu a
separação nítida dos constituintes fenólicos por diferença de polaridade. Este
sistema compreende um regime de eluição simples, com separação eficiente em
curto tempo de fracionamento, além de não requerer grande volume de solvente.
Após separação em fase sólida pelo sistema de eluição SV, as frações
coletadas foram caracterizadas quanto aos aspectos macroscópicos e determinação
do pH. Os resultados da determinação do pH são apresentados na tabela 1.15.
Tabela 1.15. pH das frações fenólicas obtidas por separação em fase sólida pelo
sistema de eluição SV do extrato seco liofilizado de
Ilex paraguariensis.
Fração
pH (
X
+ s)
DPR (%)
FA 6,83 + 0,00 0,08
FB 5,78 + 0,01 0,16
FF 6,52 +
0,00 0,08
X = valor médio; s = desvio padrão; DPR (%) = desvio padrão relativo percentual.
O rendimento do processo de purificação, considerando a massa de liofilizado
obtida nas frações FA, FB e FF, representa aproximadamente 80 % da massa de
liofilizado submetida ao processo de fracionamento, o que denota que o extrato seco
liofilizado que lhe deu origem (ESLI) é um produto rico em polifenóis.
53
Tabela 1.16. Rendimento percentual das frações obtidas no processo de
fracionamento do extrato seco liofilizado de
Ilex paraguariensis.
Amostras
Massa (g) (
X + s)
Rendimento (%)
*
ESLI 0,4003 + 0,000 100,00
FA 0,2074 + 0,012 51,81
FB 0,0376 +
0,004 9,40
FF 0,0721 +
0,002 18,02
Rendimento total
79,23
*
rendimento percentual em relação à massa de liofilizado submetido ao processo de fracionamento.
Como as frações FA e FB apresentaram perfis semelhantes no que se refere
aos constituintes fenólicos, estas duas frações foram misturadas com a fim de
constituir uma única fração denominada fração FAB contendo os compostos
polifenólicos de maior polaridade a qual foi, paralelamente com a fração FF, testada
em ensaios de determinação de atividade antioxidante (testes
in vitro e ex vivo). Os
resultados dos teores de polifenóis presentes nas frações obtidas pelo
fracionamento empregando o sistema de eluição SV são apresentados na tabela
1.17.
A análise comparativa do fracionamento enquanto rendimento e pureza
demonstra que a fração FAB, apesar de apresentar maior rendimento percentual em
termos de massa, apresenta menor teor de polifenóis totais, sendo a fração FF,
portanto, mais pura.
54
Tabela 1.17. Teor de polifenóis presentes nas frações obtidas a partir do extrato
seco liofilizado de
Ilex paraguariensis.
Fração Pico Teor de polifenóis
(mg/g)
X (s)
Teor de polifenóis totais
na fração
(mg/g)
Pico 1 91,30
a
(0,142)
ACLO 60,98 (0,219) 192,70
FAB
Pico 3 40,42
a
(0,166)
Pico 4 57,56
a
(1,652)
Pico 5 184,87
a
(4,223) 422,04
RUT 57,76 (1,763)
FF
Pico 6 121,85
a
(1,067)
FAB: fração FA e FB
a
calculado como ácido clorogênico; s = desvio padrão.
ACLO = ácido clorogênico; RUT = rutina.
6.5. Produção e caracterização dos produtos secos por spray-drying
A produção de produtos secos por spray-drying a partir de soluções extrativas
vegetais resulta na maioria dos casos, em produtos higroscópicos, inadequados
para o uso ou processamento. A literatura relata que a utilização de adjuvantes de
secagem representa uma alternativa viável para a melhoria das características
tecnológicas destes produtos. Dentre os adjuvantes mais comumente mais
empregados destacam-se o dióxido de silício coloidal, celulose microcristalina,
dextrina e outros (CASADEBAIG
, 1989).
A produção dos produtos secos por
spray-drying foi efetuada em torre de
secagem, em escala semi-industrial, diferentemente das utilizadas por CAMPOS
(1996) e GNOATTO (2002).
Com a finalidade de selecionar o melhor adjuvante foram empregados como
adjuvantes de secagem o dióxido de silício coloidal isoladamente (CAMPOS, 1996),
uma mistura (1:1) deste com celulose microcristalina (GNOATTO, 2002), uma
55
mistura (1:1) de dióxido de silício coloidal com maltodextrina e maltodextrina
isoladamente. A escolha da maltodextrina deu-se ao seu amplo emprego na
indústria alimentícia como adjuvante de secagem para sucos de frutas e alimentos
(CHRONAKIS, 1998; AL-KHATIB
et al., 2001).
Os resultados da caracterização tecnológica observados para os quatro
produtos secos por
spray-drying, contendo diferentes proporções destes adjuvantes,
estão apresentados na tabela 1.18.
Observa-se que o extrato produzido somente com Aerosil
®
(PSI-A)
apresentou rendimento superior, seguido do extrato contendo a mistura Aerosil
®
+
Avicel
®
(PSI-D), fato já relatado anteriormente, e estando provavelmente relacionado
com a menor aderência das partículas às paredes da câmara de secagem, durante a
nebulização (CAMPOS, 1996; GNOATTO, 2002).
O Fator de Hausner (FH), Índice de Carr (IC) e Índice de densificação (ID)
são parâmetros vinculados à capacidade de empacotamento do pó. O Fator de
Hausner é um indicador indireto da estabilidade de empacotamento. Quanto mais
próximo de 1, mais estável é o sistema de empacotamento (THOMAS e
POURCELOT, 1991).
A determinação do Índice de Carr (IC), mede, indiretamente, o fluxo e
empacotamento dos pós. Quanto menor o índice de Car, melhor o fluxo e o
empacotamento (THOMAS e POURCELOT, 1991).
O Índice de densificação (ID) ou Índice de compactabilidade fornece
informações sobre o comportamento do pó, quando submetido à movimentação.
Valores superiores a 20 ml sugerem que o pó apresenta razoável propriedade de
fluidez (GUYOT
et al., 1995).
Embora os índices acima citados sejam largamente empregados como
indicadores de escoamento para materiais particulados, a literatura tem sugerido o
emprego de metodologias onde haja a determinação direta da fluidez. Materiais
particulares, apresentando valores de ângulo de repouso inferior a 30
0
caracterizam-
se como materiais de fluxo livre (HERZFELDT e SCHERER, 1987). A determinação
56
do ângulo de repouso foi possível somente para o produto PSI-A devido à ausência
de escoamento livre nos demais produtos secos.
O conjunto de resultados obtidos para os diferentes produtos secos permitiu
a caracterização dos mesmos como materiais de empacotamento e fluxo pobres,
sendo o produto PSI-A caracterizado como material de fluxo bom.
Tabela 1.18. Características tecnológicas de produtos secos por
spray-drying de Ilex
paraguariensis, em escala semi-industrial.
Característica PSI-A PSI-B PSI-C PSI-D
Rendimento (%) 60 40 50 52
Características
físicas
Pó amarelo,
claro, fino
Pó amarelo,
claro, pouco
aderente
Pó amarelo,
aderente,
tende a
aglutinar
Pó amarelo,
claro, pouco
aderente
Teor de umidade (%) 5,43 8,26 6,75 6,61
Densidade bruta
(g/ml)
0,586 0,456 0,467 0,474
Densidade de
compactação (g/ml)
0,816 0,669 0,701 0,729
Fator de Hausner 1,39 1,47 1,51 1,54
Índice de Carr (%) 28,57 31,83 33,51 34,87
Índice de
densificação (ml)
3,83 4,00 4,33 5,10
Ângulo de repouso 28,55 nm nm nm
PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
PSI-B: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
PSI-C: 70 % de resíduo seco + 30 % Glucidex
®
PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
*nm: não mensurável em função de o pó não ter apresentado escoamento livre
57
A fim de traçar um perfil comparativo apresentamos os resultados de
rendimento bruto de PSI-A obtido neste trabalho em escala semi-industrial com os
anteriormente encontrados por CAMPOS (1996) e GNOATTO (2002) em escala
laboratorial. Os resultados estão apresentados nas tabelas 1.19 e 1.20. Muito
embora esses valores não possam ser comparados com precisão, por tratarem-se
de processos de secagem empregando equipamentos distintos, uma discussão
preliminar revela-se possível. Observa-se que o PSI-A, obtido em escala semi-
industrial, apresentou contrariamente ao esperado, rendimento inferior ao relatado
por CAMPOS (1996) e GNOATTO (2002), ambos obtidos em escala laboratorial. O
mesmo resultado foi observado para o PSI-D. Tal fato pode ser explicado pelo
reduzido teor de sólidos presentes na dispersão a ser seca, bem como pelo pequeno
volume de solução extrativa empregado (5 litros) na secagem em escala semi-
industrial.
Tabela 1.19. Comparação entre rendimentos bruto e corrigido dos produtos secos
por
spray-drying contendo somente dióxido de silício coloidal.
Produto Resíduo
seco
(g/100 ml)
Aerosil
®
(g/100 ml)
Rendimento
bruto (%)
Rendimento
corrigido
(%)
*
Características
físicas
ESA-A
(Campos,
1996).
5,11 2,19 72,40 68,70 Pó fino amarelo
claro
ESN1
(Gnoatto,
2002).
3,66 1,57 68,32 67,04 Pó fino amarelo
claro
PSI-A
(Silva,
2007).
3,78 1,63 60,00 54,57 Pó fino amarelo
claro
*
Perda por dessecação: ESA-A=3,67 %; ESN1=1,87 %; PSI-A=5,43 % m/m.
ESA-A = extrato seco nebulizado obtido em escala laboratorial (
70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
).
ESN1 = extrato seco nebulizado obtido em escala laboratorial (70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
).
PSI-A = extrato seco nebulizado obtido em escala semi-industrial (70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
)
58
Tabela 1.20. Comparação dos rendimentos bruto e corrigido dos produtos secos por
spray-drying contendo a mistura dióxido de silício coloidal e celulose microcristalina
(1:1).
Produto Teor de
resíduo seco
(g/100 ml)
Rendimento
bruto (%)
Rendimento
corrigido
(%)
*
Características
físicas
ESN2
(GNOATTO,
2002)
3,66 68,32 67,04 Pó fino amarelo
claro
PSI-D
(SILVA, 2007)
3,78 52 49,06 Pó fino amarelo
claro
*
Perda por dessecação: ESN2=6,990 %; PSI-D=6,61 % m/m.
ESN1 = extrato seco nebulizado obtido em escala laboratorial (70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
).
PSI-A = extrato seco nebulizado obtido em escala semi-industrial (70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
)
O aspecto macroscópico dos produtos secos revelou a obtenção de pós finos,
de cor amarelo clara. Observa-se que o extrato obtido apenas com Aerosil
®
(PSI-A)
apresentou-se mais fino e não aderente. Característica diversa foi observada pelo
extratos obtidos com Glucidex
®
(PSI-B e PSI-C), que apresentaram maior aderência
e formação de grumos, com grande tendência à compactação (figura 1.6).
Figura 1.6. Aspecto macroscópico dos produtos secos por
spray-drying de Ilex
paraguariensis, preparados com diferentes adjuvantes de secagem: PSI-A (70 % de
resíduo seco + 30 % Aerosil
®
); PSI-B (70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 %
Glucidex
®
); PSI-C (70 % de resíduo seco + 30 % Glucidex
®
); PSI-D (70 % de resíduo
seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
).
Todos os produtos secos apresentaram teor de umidade residual inferiores ao
limite máximo estabelecido de 7 % (LIST e SCHIMIDT, 1989), exceto o PSI-B.
59
O Índice de Carr e o fator de Hausner são parâmetros vinculados à
capacidade de empacotamento do pó. Valores superiores a 20 % no índice de Carr
e 1,25 para o Fator de Hausner denotam materiais com características de
empacotamento mais estáveis dificultando a capacidade de escoamento. O Índice
de densificação informa sobre o comportamento do pó quando em movimento.
Valores inferiores a 20 ml sugerem que o pó apresenta razoável propriedade de
fluidez. Este parâmetro não diferenciou os produtos analisados. Embora os índices
acima citados sejam largamente empregados como indicadores de escoamento para
materiais particulados, a literatura tem sugerido o emprego de metodologias em que
a determinação da fluidez seja direta.
A análise por microscopia eletrônica de varredura demonstra que o PSI-A
apresenta-se como partículas esféricas com superfície rugosa, característica do
adjuvante de secagem, Aerosil
®
, no entanto, as demais formulações (PSI-B, PSI-C e
PSI-D) apresentaram-se com forma irregular, devido à influência física dos
adjuvantes Glucidex
®
e Avicel
®
(figuras 1.7 e 1.8).
Figura 1.7. Fotomicrografia eletrônica de varredura de produtos secos por
spray-
drying de Ilex paraguariensis (PSI) (aumento 500 x), preparados com diferentes
adjuvantes de secagem: PSI-A (70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
); PSI-B (70 %
de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
); PSI-C (70 % de resíduo seco +
30 % Glucidex
®
); PSI-D (70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
).
60
Figura 1.8. Fotomicrografia eletrônica de varredura de produtos secos por
spray-
drying de Ilex paraguariensis (PSI) (aumento 2500 x), preparados com diferentes
adjuvantes de secagem: PSI-A (70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
); PSI-B (70 %
de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
); PSI-C (70 % de resíduo seco +
30 % Glucidex
®
); PSI-D (70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
).
61
As distribuições granulométricas dos produtos secos por spray-drying podem
ser visualizadas na figura 1.9.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
1
0
,
3
-
1
3
,
6
1
3
,
7
-
1
7
,
0
1
7
,
1
-
2
0
,
4
2
0
,
5
-
2
3
,
8
2
3
,
9
-
2
7
,
2
2
7
,
3
-
3
0
,
6
3
0
,
7
-
3
4
,
0
3
4
,
1
-
3
7
,
4
3
7
,
5
-
4
0
,
8
Faixa granulométrica (μm)
Frequência relativa (%)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
1
0
,
3
-
1
3
,
6
1
3
,
7
-
1
7
,
0
1
7
,
1
-
2
0
,
4
2
0
,
5
-
2
3
,
8
2
3
,
9
-
2
7
,
2
2
7
,
3
-
3
0
,
6
3
0
,
7
-
3
4
,
0
3
4
,
1
-
3
7
,
4
3
7
,
5
-
4
0
,
8
Faixa granulom étrica (μm)
Frequência relativa (%)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
6
,
9
-
1
0
,
2
1
0
,
3
-
1
3
,
6
1
3
,
7
-
1
7
,
0
1
7
,
1
-
2
0
,
4
2
0
,
5
-
2
3
,
8
2
3
,
9
-
2
7
,
2
2
7
,
3
-
3
0
,
6
3
0
,
7
-
3
4
,
0
3
4
,
1
-
3
7
,
4
3
7
,
5
-
4
0
,
8
Faixa granulométrica (μm)
Frequência relativa (%)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
6
,
9
-
1
0
,
2
1
0
,
3
-
1
3
,
6
1
3
,
7
-
1
7
,
0
1
7
,
1
-
2
0
,
4
2
0
,
5
-
2
3
,
8
2
3
,
9
-
2
7
,
2
2
7
,
3
-
3
0
,
6
3
0
,
7
-
3
4
,
0
Faixa granulom étrica (μm)
Frequência relativa (%)
PSI-A
PSI-B
PSI-C PSI-D
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
1
0
,
3
-
1
3
,
6
1
3
,
7
-
1
7
,
0
1
7
,
1
-
2
0
,
4
2
0
,
5
-
2
3
,
8
2
3
,
9
-
2
7
,
2
2
7
,
3
-
3
0
,
6
3
0
,
7
-
3
4
,
0
3
4
,
1
-
3
7
,
4
3
7
,
5
-
4
0
,
8
Faixa granulométrica (μm)
Frequência relativa (%)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
1
0
,
3
-
1
3
,
6
1
3
,
7
-
1
7
,
0
1
7
,
1
-
2
0
,
4
2
0
,
5
-
2
3
,
8
2
3
,
9
-
2
7
,
2
2
7
,
3
-
3
0
,
6
3
0
,
7
-
3
4
,
0
3
4
,
1
-
3
7
,
4
3
7
,
5
-
4
0
,
8
Faixa granulom étrica (μm)
Frequência relativa (%)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
6
,
9
-
1
0
,
2
1
0
,
3
-
1
3
,
6
1
3
,
7
-
1
7
,
0
1
7
,
1
-
2
0
,
4
2
0
,
5
-
2
3
,
8
2
3
,
9
-
2
7
,
2
2
7
,
3
-
3
0
,
6
3
0
,
7
-
3
4
,
0
3
4
,
1
-
3
7
,
4
3
7
,
5
-
4
0
,
8
Faixa granulométrica (μm)
Frequência relativa (%)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
6
,
9
-
1
0
,
2
1
0
,
3
-
1
3
,
6
1
3
,
7
-
1
7
,
0
1
7
,
1
-
2
0
,
4
2
0
,
5
-
2
3
,
8
2
3
,
9
-
2
7
,
2
2
7
,
3
-
3
0
,
6
3
0
,
7
-
3
4
,
0
Faixa granulom étrica (μm)
Frequência relativa (%)
PSI-A
PSI-B
PSI-C PSI-D
Figura 1.9. Distribuição granulométrica dos produtos secos por
spray-drying de Ilex
paraguariensis, preparados com diferentes adjuvantes de secagem: PSI-A (70 % de
resíduo seco + 30 % Aerosil
®
); PSI-B (70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 %
Glucidex
®
); PSI-C (70 % de resíduo seco + 30 % Glucidex
®
); PSI-D (70 % de resíduo
seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
).
A análise dos histogramas dos produtos secos por
spray-drying revela
pequenas diferenças nos perfil de distribuição granulométrica entre os produtos.
Tratam-se de partículas de pequeno diâmetro e de perfil de distribuição
granulométrica não gaussiana. Os dados demonstram que as partículas do PSI-A e
PSI-B encontram-se distribuídas, respectivamente, entre 11,95 e 39,15 μm. No caso
dos produtos PSI-C e PSI-D, as partículas encontram-se distribuídas,
respectivamente, na faixa de 8,55 a 39,15 e 8,55 a 32,35 μm (anexos 1.2-1.5).
A tabela 1.21 apresenta os valores de diâmetro-médio de partícula e desvios
padrão obtidos pelo método aritmético. Pode-se observar que todos os produtos
secos por
spray-drying apresentaram tamanho de partícula em torno de 20 μm com
exceção do PSI-D cujo valor foi de 17 μm, evidenciando que a natureza dos
adjuvantes de secagem não foi um fator determinante neste parâmetro. O produto
seco somente com Aerosil
®
(PSI-A) apresentou diâmetro médio inferior ao obtido por
62
CAMPOS (1966), 53,6 μm, aspecto provavelmente relacionado ao menor teor de
resíduo seco da solução de origem (SEI) encontrado no presente trabalho.
Tabela 1.21. Diâmetro médio de partícula e desvio padrão granulométrico dos
produtos secos por
spray-drying de Ilex paraguariensis.
Ensaio PSI-A PSI-B PSI-C PSI-D
Diâmetro médio (μm)
21,86 21,93 20,02 17,00
Desvio padrão (μm)
+
5,57 + 5,00 + 5,79 + 5,25
6.5.1. Validação de método de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
para doseamento de constituintes polifenólicos presentes nos produtos secos
por
spray-drying
A fim de avaliar a influência da operação de secagem, bem como o uso de
adjuvantes sobre os constituintes presentes na solução extrativa inicial, foi realizada
a quantificação de polifenóis nos produtos secos, empregando ACLO e RUT como
marcadores químicos. Para tanto, empregou-se a mesma metodologia analítica
empregada para caracterização da solução extrativa, conforme descrito no item
5.3.1. No entanto, considerando que a SEI foi submetida à secagem por
spray-
drying, na presença de diferentes adjuvantes, fez-se necessária a adequação e
validação do método analítico para a quantificação dos constituintes fenólicos nos
produtos secos.
A figura 1.10 mostra o perfil cromatográfico em 340 nm da SEI (figura 1.10a) e
dos quatro PSI (figura 1.10b), nos quais não foi evidenciada nenhuma alteração no
perfil qualitativo dos polifenóis presentes.
63
A
B
A
B
Figura 1.10. Perfil cromatográfico da solução extrativa aquosa (SEI) (A) e dos
produtos secos por
spray-drying (PSI) de Ilex paraguariensis (B) obtidos com
diferentes adjuvantes de secagem: PSI-A (70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
);
PSI-B (70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
); PSI-C (70 % de
resíduo seco + 30 % Glucidex
®
); PSI-D (70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15
% Avicel
®
). Ácido clorogênico (ACLO), rutina (RUT).
Apesar do método analítico ter sido validado para a SEI, nova validação foi
requerida para os produtos secos, devido à adição de novos adjuvantes
farmacêuticos de secagem e a etapa de secagem por
spray-drying. As melhores
características tecnológicas do PSI-A determinaram a sua seleção e a validação da
metodologia analítica para este extrato seco.
Os resultados da avaliação da linearidade da curva de calibração do PSI-A
estão apresentados na tabela 1.22. A curva de calibração foi construída de modo
64
que cada ponto analisado estivesse na mesma concentração, em termos de resíduo
seco, que a solução extrativa. Considerando os coeficientes de regressão obtidos,
evidencia-se ausência de desvios de linearidade na faixa de concentração de 2,0 a
10 μg/ml. Os valores de r
2
foram ligeiramente superiores aos encontrados para SEI,
resultado que pode ser considerado excelente, considerando a complexidade da
amostra e as etapas envolvidas na análise.
Tabela 1.22. Parâmetros de linearidade da análise de produto seco por
spray-drying
de
Ilex paraguariensis analisada por CLAE.
Pico r
2
a b DPR (%)
ACLO 0,9990 -16535,79 2287347,45 3,26
RUT 0,9980 853,41 387731,40 3,91
r
2
=coeficiente de regressão linear; a= intersecção; b= inclinação; DPR (%) desvio padrão relativo da
inclinação da reta em três dias consecutivos; ACLO = ácido clorogênico; RUT = rutina.
A análise dos resultados dos ensaios de precisão intermediária e
repetibilidade do PSI-A de
Ilex paraguariensis (tabela 1.23) demonstrou coeficientes
de variação inferiores a 2 % para ambos os ensaios, o que demonstra a boa
reprodutibilidade do método para análise dos polifenóis no PSI-A.
65
Tabela 1.23. Precisão intermediária do produto seco por spray-drying de Ilex
paraguariensis.
Precisão intermediária Repetibilidade
Pico
Concentração
Y(mg/ml)
DPR (%)
Concentração
X
(mg/ml)
DPR (%)
ANEO
44,84
a
0,57
44,81
a
0,58
ACLO
32,92 0,60
32,89 0,58
ACPT
22,38
a
0,73
22,37
a
0,58
P4
7,09
a
1,03
7,00
a
0,84
P5
24,65
a
1,23
24,33
a
0,97
RUT
11,33 0,86
11,54 0,60
P6
18,42
a
0,92
18,34
a
1,18
a
calculado como ácido clorogênico; DPR (%): desvio padrão relativo percentual.
Y
= média de três determinações
X = média de três determinações
ACLO = ácido clorogênico; ACNEO = ácido neo-clorogênico; ACPT = ácido cripto-clorogênico; RUT =
rutina.
A tabelas 1.24 e 1.25 apresentam os resultados da recuperação do ácido
clorogênico e rutina no PSI-A de
Ilex paraguariensis, demonstrando uma
recuperação média de 98,88 % e 99,91 %, respectivamente para ACLO e RUT, e
valores de CV% inferiores a 1 %, em todas as concentrações analisadas. Esses
resultados permitem inferir que o adjuvante de secagem presente no PSI-A de
Ilex
paraguariensis
não interferiu no doseamento dos marcadores em questão.
66
Tabela 1.24. Exatidão do método de doseamento de ácido clorogênico em produtos
secos de
Ilex paraguariensis.
Acido clorogênico
Concentração
teórica
(
μg/ml)
Concentração
experimental
(μg/ml)
Recuperação (%)
X (DPR %)
Recuperação média
(%)
X (DPR %)
11,31 11,21 99,12 (0,29)
13,31 12,91 97,02 (0,07) 98,88 (1,73)
15,31 15,39 100,49 (0,32)
X : valor médio; DPR (%): desvio padrão relativo percentual.
ACLO = ácido clorogênico; RUT = rutina.
Tabela 1.25. Exatidão do método de doseamento de rutina em produtos secos de
Ilex paraguariensis.
Rutina
Concentração
teórica
(
μg/ml)
Concentração
experimental
(μg/ml)
Recuperação (%)
X (DPR %)
Recuperação média
(%) X (DPR %)
3,37 3,40 100,83 (0,32)
4,37 4,42 101,19 (0,43) 99,91 (0,25)
5,37 5,25 97,71 (0,93)
X
: valor médio; DPR (%):desvio padrão relativo percentual.
ACLO = ácido clorogênico; RUT = rutina.
Os resultados dos teores de polifenóis presentes nos diferentes PSI são
apresentados na tabela 1.26. Comparando-se os resultados, observa-se que entre
as diferentes formulações de PSI, não houve diferenças significantes nos teores dos
polifenóis analisados, sugerindo que os adjuvantes de secagem empregados não
interferiram neste parâmetro. Observa-se, também, que a secagem determinou a
67
concentração destes constituintes, apresentando-se estes em concentrações cerca
de 20 vezes superiores nos produtos secos, comparativamente à solução extrativa
que lhes deu origem (tabela 1.12).
Tabela 1.26. Teor de polifenóis presentes nos produtos secos por
spray-drying de
Ilex paraguariensis.
Pico PSI-A
Concentração
(mg/g)
X
(s)
PSI-B
Concentração
(mg/g)
X
(s)
PSI-C
Concentração
(mg/g)
X
(s)
PSI-D
Concentração
(mg/g)
X
(s)
ANEO 44,71 (0,416) 47,04 (0,200) 48,04 (0,045) 52,82 (0,204)
ACLO 32,83 (0,287) 35,30 (0,226) 35,57 (0,217) 39,03 (0,174)
ACPT 22,33 (0,191) 24,96 (0,164) 24,05 (0,614) 26,84 (0,131)
P4 7,07 (0,077) 8,22 (0,235) 8,45 (0,070) 9,07 (0,026)
P5 24,58 (0,295) 26,33 (0,187) 29,17 (0,106) 30,95 (0,133)
RUT 11,50 (0,104) 10,76 (0,045) 11,23 (0,060) 12,13 (0,045)
P6
18,57 (0,268) 19,83 (0,094) 21,20 (0,067) 22,58 (0,099)
X : valor médio; s: desvio padrão.
ACLO = ácido clorogênico; ANEO = ácido neo-clorogênico; ACPT = ácido cripto-clorogênico; RUT =
rutina.
68
6.5.2. Avaliação preliminar da estabilidade frente à luz
A luz é um fator ambiental que pode desencadear reações de degradação,
tais como oxidação e redução, rearranjo de anéis, polimerização, rupturas de
ligações, isomerizações, racemizações e promover instabilidade em produtos
farmacêuticos, alimentícios ou cosméticos (LEITE, 2005).
Como os produtos secos por
spray-drying apresentam em sua composição
constituintes fenólicos, derivados do ácido clorogênico, que possuem hidroxilas
ligadas ao anel aromático e duplas ligações conjugadas, são passíveis de sofrer fácil
degradação, por oxidação. Sua labilidade os torna passíveis de serem eleitos,
também, como os constituintes indicadores de estabilidade dos produtos secos.
A análise dos cromatogramas obtidos por CLAE revelou que não houve
aparecimento de novos picos, bem como alteração nos tempos de retenção DOS
picos quantificados. É importante salientar que o método analítico desenvolvido
mostrou-se promissor como ferramenta para avaliação destes acontecimentos. A
figura 1.11 apresenta o comportamento dos constituintes fenólicos presentes nos
produtos secos por spray-drying, após exposição de luz em 254 nm, durante 48
horas.
Observa-se uma queda de concentração nas primeiras 24 horas seguida de
pequena estabilização em 48 horas para todos os produtos secos. Dentre os
produtos secos, PSI-B apresentou pior desempenho quanto à fotoproteção e,
comparativamente, o maior teor de umidade residual (8,26 %). Observa-se, ainda,
que nos extratos PSI-B, PSI-C e PSI-D o percentual de degradação dos constituintes
fenólicos, após 48 horas de exposição, variou de 12 a 31 %, em média. O perfil de
degradação tanto dos ácidos cafeoilquínicos, quanto dicafeoilquínicos foi bastante
semelhante. A degradação foi significativamente menor para o PSI-A, cujo
percentual situou-se entre 2 a 13 % (figura 1.12 e tabela 1.27), sendo este o produto
que apresentou menor teor de umidade residual (5,43 %). Entre os ácidos
cafeoilquínicos presentes no PSI-A, o ácido cripto-clorogênico (ACPT) parece sofrer
menor interferência desta fonte energética, seguido do ácido neo-clorogênico
(ANEO) e ácido clorogênico (ACLO). Para os ácidos dicafeoilquínicos, o pico P5
parece ser o menos sensível, seguido de P4 e P6.
69
PSI-A
0
10
20
30
40
50
02448
Tempo (h)
Concentração (mg/g)
Pico 1
AC LO
Pico 3
Pico 4
Pico 5
RUT
Pico 6
PSI-B
0
10
20
30
40
50
02448
Tempo (h)
Concentração (mg/g)
Pico 1
ACLO
Pico 3
Pico 4
Pico 5
RUT
Pico 6
PSI-C
0
10
20
30
40
50
02448
Tempo (h)
Concentração (mg/g)
Pico 1
AC LO
Pico 3
Pico 4
Pico 5
RUT
Pico 6
PSI-D
0
10
20
30
40
50
02448
Tempo (h)
Concentração (mg/g)
Pico 1
AC LO
Pico 3
Pico 4
Pico 5
RUT
Pico 6
Figura 1.11. Polifenóis em produtos secos por
spray-drying de Ilex paraguariensis
em teste de fotoestabilidade: exposição à luz, 254 nm. Pico1: ácido neo-clorogênico;
ACLO: ácido clorogênico; Pico 3: ácido cripto-clorogênico; Picos 4, 5 e 6: ácidos
dicafeoilquínicos; RUT: rutina.
70
PSI-D
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-B
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-A
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-C
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-D
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-B
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-A
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-C
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
Figura 1.12. Polifenóis em produtos secos por
spray-drying de Ilex paraguariensis,
em teste de fotoestabilidade: exposição à luz, 254 nm. Pico1: ácido neo-clorogênico;
Aclo: ácido clorogênico; Pico 3: ácido cripto-clorogênico; Picos 4, 5 e 6: ácidos
dicafeoilquínicos; Rut: rutina.
71
Tabela 1.27. Percentual de degradação dos polifenóis, nos produtos secos por
spray-drying expostos à luz em 254 nm, ao final de 48 horas.
Degradação após de 48 h (%)
X
*
Pico PSI-A PSI-B PSI-C PSI-D
ANEO 2,74 19,99 14,92 12,08
ACLO 5,21 24,27 17,04 14,55
ACPT 1,21 24,48 16,79 15,97
P4 9,91 27,61 20,56 17,72
P5 9,60 28,63 22,14 19,41
RUT 2,52 21,67 15,05 16,33
P6 13,95 31,50 25,37 22,96
*
Valores corrigidos com base na umidade residual dos extratos, admitida como perda por
dessecação.
ACLO = ácido clorogênico; ANEO = ácido neo-clorogênico; ACPT = ácido cripto-clorogênico; RUT =
rutina.
PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
PSI-B: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
PSI-C: 70 % de resíduo seco +
30 % Glucidex
®
PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
A figura 1.13 apresenta o comportamento dos compostos polifenólicos
presentes nos produtos secos por
spray-drying, após exposição de luz em 352 nm,
durante 48 horas.
Observa-se uma queda de concentração nas primeiras 24 horas
seguida de pequena estabilização em 48 horas para todos os produtos secos, sendo
ligeiramente mais acentuada para os produtos PSI-B e PSI-C. Observa-se, ainda,
que nos produto PSI-B houve degradação mais acentuada tanto dos ácidos
cafeoilquínicos e dicafeoilquínicos, como da rutina.
A degradação foi significativamente menor para o PSI-A, cujo percentual
situou-se entre 1 a 24 % (figura 1.14 e tabela 1.28). Entre os ácidos cafeoilquínicos
presentes no PSI-A, ácido neo-clorogênico (ANEO) parece sofrer menor
interferência desta fonte energética, seguido do ácido cripto-clorogênico (ACPT) e
ácido clorogênico (ACLO).
72
PSI-A
0
10
20
30
40
50
02448
Tempo (h)
Concentração (mg/g)
Pico 1
AC LO
Pico 3
Pico 4
Pico 5
RUT
Pico 6
PSI-B
0
10
20
30
40
50
02448
Tempo (h)
Concentração (mg/g)
Pico 1
AC LO
Pico 3
Pico 4
Pico 5
RUT
Pico 6
PSI-C
0
10
20
30
40
50
02448
Tempo (h)
Concentração (mg/g)
Pico 1
AC L O
Pico 3
Pico 4
Pico 5
RUT
Pico 6
PSI-D
0
10
20
30
40
50
02448
Tempo (h)
Concentração (mg/g)
Pico 1
AC L O
Pico 3
Pico 4
Pico 5
RUT
Pico 6
Figura 1.13. Polifenóis em produtos secos por
spray-drying de Ilex paraguariensis,
em teste de fotoestabilidade: exposição à luz, 352 nm. Pico1: ácido neo-clorogênico;
ACLO: ácido clorogênico; Pico 3: ácido cripto-clorogênico; Picos 4, 5 e 6: ácidos
dicafeoilquínicos; RUT: rutina.
73
PSI-D
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-B
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-A
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-C
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-D
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-B
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-A
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
PSI-C
50
60
70
80
90
100
Pico 1 Aclo Pico 3 Pico 4 Pico 5 Rut Pico 6
Picos
% de degradação
% t0
% t24
% t48
Figura 1.14. Polifenóis em produtos secos por
spray-drying de Ilex paraguariensis,
em teste de fotoestabilidade: exposição à luz, 352 nm. Pico1: ácido neo-clorogênico;
Aclo: ácido clorogênico; Pico 3: ácido cripto-clorogênico; Picos 4, 5 e 6: ácidos
dicafeoilquínicos; Rut: rutina.
74
Tabela 1.28. Polifenóis, nos produtos secos por spray-drying de Ilex paraguariensis
em teste de fotoestabilidade: 352 nm, ao final de 48 horas.
Degradação após de 48 h (%)
X
Pico PSI-A PSI-B PSI-C PSI-D
ANEO 1,21 19,66 1,79 4,72
ACLO 11,18 31,18 12,05 13,25
ACPT 5,53 28,80 44,75 12,89
P4 16,46 33,13 15,18 17,84
P5 15,57 34,98 17,45 18,55
RUT 3,66 21,04 8,99 9,31
P6 24,35 42,04 28,37 25,89
*
Valores corrigidos com base na umidade residual dos extratos, admitida como perda por
dessecação.
ACLO = ácido clorogênico; ANEO = ácido neo-clorogênico; ACPT = ácido cripto-clorogênico; RUT =
rutina.
PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
PSI-B: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
PSI-C: 70 % de resíduo seco +
30 % Glucidex
®
PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
Em suma, pode-se concluir que o produto seco contendo somente Aerosil
®
em sua composição (PSI-A) mostrou-se o mais estável frente ao teste de
estabilidade a que os PSI foram submetidos, no que se refere à fração polifenólica
presente, sugerindo um efeito protetor do dióxido de silício coloidal, utilizado como
adjuvante. Ainda não é possível inferir sobre o mecanismo pelo qual ocorre esta
proteção, no entanto, a hipótese de forte interação das hidroxilas fenólicas com as
hidroxilas presentes no dióxido de silício coloidal não pode ser descartada.
75
6.5.3 Produção e caracterização de produto seco por spray-drying para a
realização dos ensaios
in vivo
O rendimento da operação de secagem apresentado para o produto PSI-A
L02 (tabela 1.29) foi consideravelmente superior quando comparado ao produto PSI-
A (tabela 1.18). Este rendimento pode ser justificado pelo volume maior de solução
extrativa que foi atomizada.
Tabela 1.29. Parâmetros tecnológicos de produto seco por
spray-drying de Ilex
paraguariensis empregado nos ensaios in vivo.
Característica PSI-A L02
Rendimento (%) 78,98
Características físicas Pó amarelo, claro, fino
Teor de umidade (%) 3,36 +
0,002
Densidade bruta (g/ml) 0,642 +
0,022
Densidade de compactação (g/ml) 0,860 +
0,007
Fator de Hausner 1,34 +
0,037
Índice de Carr (%) 25,36 +
2,020
Índice de densificação (ml) 3,33 +
0,629
Ângulo de repouso 33,50 +
2,446
PSI-A L02: produto seco lote 02 (70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
)
Através da análise do histograma do produto seco por
spray-drying produzido
no lote 02 podemos constatar que as partículas do PSI-A encontram-se distribuídas
entre 10,50 e 17,50 μm (Anexo 1.6).
76
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0
–
3
,
5
3
,
5
–
7
,
0
7
,
0
–
1
0
,
5
1
0
,5
–
1
4
,
0
1
4
,0
–
1
7
,
5
1
7
,5
–
2
1
,
0
2
1
,0
–
2
4
,
5
2
4
,5
–
2
8
,
0
2
8
,0
–
3
1
,
5
3
1
,5
–
3
5
,
0
3
5
,0
–
3
8
,
5
3
8
,5
–
4
2
,
0
4
2
,0
–
4
5
,
5
4
5
,5
–
4
9
,
0
4
9
,0
-
5
2
,
5
Faixa Granulométrica (
μ
m)
Frequência Relativa (%)
Figura 1.15. Distribuição granulométrica do produto seco por spray-drying de Ilex
paraguariensis PSI-A (70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
) lote 02, produzido em
escala semi-industrial.
O diâmetro médio, calculado pelo método matemático foi de 14,42 e o
desvio-padrão (σ
g
) de + 1,25, caracterizando a distribuição granulométrica para
o PSI-A L02 como estreita (WELLS, 1988).
Na tabela 1.30 são apresentados os resultados dos teores de polifenóis
apresentados pelo PSI-A L02 em comparação ao PSI-A. Observa-se que apesar
das diferenças apresentadas na composição dos derivados cafeoilquínicos e
dicafeoilquínicos, no somatório dos picos não foram evidenciadas diferenças
entre os dois produtos.
77
Tabela 1.30. Comparação do teor de polifenóis presentes nos produtos secos por
spray-drying de Ilex paraguariensis.
Pico PSI-A
Concentração
(mg/g)
X (s)
Polifenóis
totais
(mg/g)
PSI-A L02
Concentração
(mg/g)
X (s)
Polifenóis
totais
(mg/g)
ANEO 44,71 (0,416) 37,29 (0,277)
ACLO 32,83 (0,287) 33,17 (0,616)
ACPT 22,33 (0,191) 30,95 (0,300)
P4 7,07 (0,077) 11,69 (0,046)
P5 24,58 (0,295) 17,61 (0,107)
RUT 11,50 (0,104) 10,04 (0,196)
P6
18,57 (0,268)
161,59
25,58 (0,079)
166,33
X : valor médio; s: desvio padrão.
ACLO = ácido clorogênico; ANEO = ácido neo-clorogênico; ACPT = ácido cripto-clorogênico; RUT =
rutina.
PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
obtido por secagem de 5 L de solução extrativa.
PSI-A L02: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
obtido por secagem de 30 L de solução extrativa.
78
7. CONCLUSÕES
• O método por cromatografia líquida de alta eficiência, desenvolvido e
validado, permitiu a detecção de ácido clorogênico (ACLO) e rutina (RUT)
tanto na matéria-prima vegetal, como nos intermediários de
processamento (solução extrativa, produtos secos por
spray-drying e
frações polifenólicas) obtidos de
Ilex paraguariensis.
• O processo de fracionamento levou à obtenção de duas frações distintas,
denominadas FAB e FF, as quais apresentaram maior teor de polifenóis
quando comparadas ao extrato seco liofilizado que as originou.
• A secagem da solução extrativa aquosa de
Ilex paraguariensis, em escala
semi-industrial, permitiu a obtenção de produtos secos cujos rendimentos
de processo variaram de 40 a 60 %. A adição de adjuvantes de secagem
mostrou-se necessária para a melhoria das características tecnológicas
dos produtos obtidos, no entanto não foi suficiente para evitar a
higroscopia dos mesmos.
• Não houve diferença significativa nos teores de polifenóis entre os quatro
extratos, denotando que a natureza dos adjuvantes empregados, bem
como a técnica de secagem não exercem influência sobre este
parâmetro.
• O produto seco por
spray-drying PSI-A, contendo 30 % de Aerosil
®
como
adjuvante de secagem, apresentou melhores características tecnológicas
que os demais produtos. Entre os parâmetros destaca-se menor teor de
umidade residual, maior rendimento operacional e proteção frente à
fotodegradação.
79
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
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CAPÍTULO 2
Avaliação da atividade antioxidante de produtos secos por spray-
drying e frações polifenólicas de Ilex paraguariensis
91
1. INTRODUÇÃO
A presença de espécies redoxi-ativas tem sido correlacionada com um grande
número de doenças, indicando que estas espécies não têm um papel etiológico na
grande maioria dos estados patológicos, mas que participam diretamente dos
mecanismos fisiopatológicos que determinam a continuidade e as complicações
presentes nesses processos (MELLO e MANEGHINI, 1984; HALLLIWEL, 2007).
Radical livre é qualquer espécie química que contém um ou mais elétrons
desemparelhados. O elétron desemparelhado que caracteriza esta molécula pode
estar centrado num átomo de hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, carbono, enxofre ou
em átomos de metais de transição. Na natureza existem duas importantes
substâncias que podem gerar espécies radicalares, o oxigênio no estado
fundamental (O
2
) e o óxido nítrico (NO
2
) (REBELO, 1996; FERREIRA e
MATSUBARA, 1997).
Todos os componentes celulares estão expostos às espécies redoxi-ativas
sendo a membrana a estrutura mais atingida, devido à ocorrência de peroxidação
lipídica (lipoperoxidação) que leva a alterações na sua estrutura e permeabilidade.
Como conseqüência, há perda de seletividade na troca iônica e liberação de
conteúdo das organelas (como enzimas hidrolíticas dos lisossomas), formação de
produtos citotóxicos (como malonaldeído), culminando com a morte celular
(HALLIWEL e GUTTERIDGE, 2007).
Em condições normais, as reações de formação de espécies redoxi-ativas
são mantidas sob controle por meio de um sistema de defesa antioxidante do
organismo, composto de substâncias que atuam em diferentes níveis. O sistema de
defesa primário é constituído de substâncias que impedem a geração ou seqüestram
espécies reativas de oxigênio, ou seja, bloqueiam a etapa de iniciação da cadeia
radicalar. Neste sistema, encontram-se as enzimas antioxidantes, quelantes,
proteínas e substâncias não enzimáticas. O sistema de defesa secundário é formado
por compostos fenólicos ou aminas aromáticas, como os tocoferóis, flavonóides,
principalmente flavonas e flavonóis (HALLIWEL e GUTTERIDGE, 2007).
92
Os polifenóis estão usualmente presentes em plantas como produtos do
metabolismo secundário, exercendo papel importante na sua morfologia e fisiologia,
na medida em que estão relacionados a diversos aspectos do crescimento e
reprodução das mesmas (BRAVO, 1998). A estes compostos são atribuídas diversas
propriedades biológicas tais como antiinflamatórias, antibióticas, antitrombóticas,
antimicrobianas, antialérgicas, antitumorais, antiasmáticas e antioxidantes (TRUEBA
e SÁNCHEZ, 2001).
Os flavonóides têm sido investigados extensivamente desde 1966, em
trabalhos que abordam aspectos clínicos e nutricionais destas substâncias,
demonstrando que estes constituintes fenólicos reduzem a oxidação de lipoproteínas
de baixa densidade (LDL) e protegem os tecidos da ação de radicais livres
sugerindo seu emprego como estratégia na redução do risco de doenças
cardiovasculares e risco de câncer (MOURE
et al., 2001).
A atividade antioxidante dos flavonóides resulta da combinação de suas
propriedades quelantes de metais e seqüestradoras de radicais livres, assim como
de inibir oxigenases tais como a lipoxigenase, a cicloxigenase, a mieloperoxidase, a
NADPH oxidase e a xantina oxidase. Outros mecanismos podem incluir a inibição de
enzimas envolvidas indiretamente nos processos oxidativos e a estimulação de
outras com propriedades antioxidantes como a catalase (CAT) e a superóxido
dismutase (SOD) (TRUEBA e SÁNCHEZ, 2001).
Os ácidos fenólicos são algumas das substâncias que constituem o grupo
dos compostos fenólicos. Caracterizam-se por terem um anel benzênico, um
grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na
molécula, conferindo propriedades antioxidantes tanto para os alimentos como para
o organismo, sendo, por isso, indicados para o tratamento e prevenção do câncer,
doenças cardiovasculares e outras doenças (SOARES, 2002). lsômeros do ácido
clorogênico e do ácido caféico são descritos como antioxidantes (BELITZ e
GROSCH, 1988; DURÁN e PADILLA, 1993; HARBORNE, 1973).
Embora outras
características também contribuam para a atividade antioxidante dos ácidos
fenólicos e seus ésteres, esta é, geralmente, determinada pelo número de hidroxilas
presentes na molécula (RAJALAKSMI e NARASIMHAN, 1995).
93
A literatura relata para Ilex paraguariensis a presença de flavonóides
derivados do núcleo canferol, quercetina, rutina, proantocianidina e de diferentes
ácidos fenólicos, como clorogênico, caféico, 3,4- e 3,5-dicafeoilquínico, substâncias
para as quais tem sido atribuído potencial antioxidante
in vitro (YOUNES e
SIEGERS, 1981; LARSON, 1998; FILIP
et al., 2000; KESSLER et al., 2003;
CHANDRA e MEJIA, 2004).
Considerando o potencial antioxidante de
Ilex paraguariensis, bem como dos
compostos polifenólicos descritos para a espécie, o Capítulo 2 do presente trabalho
tem por objetivo investigar, por meio de ensaios
in vitro, ex vivo e in vivo o potencial
antioxidante de produtos secos por liofilização,
spray-drying e de frações
polifenólicas, obtidos a partir de decocto de
Ilex paraguariensis, descritos no
Capítulo 1.
94
2. OBJETIVOS
1. Investigar a atividade antioxidante in vitro de produtos secos por spray-
drying e fração polifenólica de Ilex paraguariensis;
2. Investigar a atividade antioxidante
ex vivo de produtos secos por spray-
drying e fração polifenólica de Ilex paraguariensis em homogeneizado de fatias de
fígado;
3. Investigar a atividade antioxidante
in vivo de produto seco por spray-drying
de
Ilex paraguariensis em modelo de dano oxidativo hepático induzido por
tetracloreto de carbono.
95
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. Estresse oxidativo e defesas antioxidantes e espécies redoxi-ativas
Os efeitos dos radicais livres sobre os sistemas biológicos têm estado em
evidência nos últimos anos, especialmente nas doenças relacionadas com o
aumento destas espécies reativas no organismo e ao envelhecimento precoce.
Varias pesquisas têm demonstrado a participação dos radicais livres nos
mecanismos fisiopatológicos de algumas patologias de elevada incidência na
população ocidental. Assim, qualquer substância que demonstre ter capacidade
de neutralização destes radicais, torna-se um alvo importante, já que pode
prevenir ou amenizar os problemas causados pelo excesso de espécies redoxi-
ativas no organismo (CARBONARI, 2005).
Os radicais livres ou espécies redoxi-ativas são átomos ou moléculas que
possuem um ou mais elétrons não pareados na sua órbita externa, geralmente
formados pela perda ou ganho de elétrons (oxirredução). Em meio biológico, a
maioria das moléculas não se encontra na forma de radicais, permanecendo com
elétrons pareados. Entretanto, em determinadas situações, as espécies redoxi-ativas
são formadas e podem causar efeitos fisiológicos e patológicos (HALLIWELL e
GUTTERIDGE, 2007).
Espécie redoxi-ativa é um termo coletivo que inclui as espécies reativas de
oxigênio (ERO), bem como as espécies reativas de nitrogênio (ERN), como pode ser
observado na tabela 2.1. “Reativo” não é sempre o termo mais apropriado, uma vez
que H
2
O
2
, O
2
•-
e óxido nítrico (NO
•
) reagem, diretamente, com poucas moléculas no
corpo humano, enquanto o
•
OH pode reagir com qualquer molécula (HALLIWELL,
2007).
96
Tabela 2.1. Principais espécies redoxi-ativas.
Espécies redoxi-ativas de oxigênio
Radicais Não radicais
Superóxido (O
2
•-
) Peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
Hidroxila (
•
OH)
Ácido hipocloroso (HOCl)
Peroxila (RO
2
•
)
Ácido hipobromoso (HOBr)
Alcoxila (RO
•
)
Ozônio (O
3
)
Hidroperoxila (HO
2
•
)
Oxigênio singleto (
1
O
2
)
Espécies redoxi-ativas de nitrogênio
Radicais Não radicais
Óxido nítrico (NO
•
)
Peroxinitrito (ONOO
-
)
Dióxido de nitrogênio (NO
2
•
)
Alquil peroxinitrito (ROONO)
Fonte: adaptado de HALLIWELL, 2001.
As espécies redoxi-ativas são formadas pela redução parcial do oxigênio, por
meio de sucessivas reações. A transferência de um elétron para o O
2
produz o
primeiro intermediário reativo, o ânion superóxido (O
2
•-
), o qual sofre dismutação
espontânea a peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), que não é uma espécie redoxi-ativa. O
H
2
O
2
sofre uma reação de quebra das ligações entre os átomos de O
2
formando o
radical hidroxila (
•
OH), catalisada por metais de transição (reação de Fenton), ou
pela combinação do O
2
•-
com o H
2
O
2
(reação de Haber-Weiss) (figura 2.1),
(HALLIWELL e GUTTERIDGE,2007).
Figura 2.1. Reações de formação do radical hidroxila (
•
OH). Adaptada de
HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007.
97
A formação de ânion superóxido (O
2
•-
) originado pela adição de um elétron ao
oxigênio molecular (O
2
), pode ser mediado por enzimas como as NAD(P)H oxidase e
xantina oxidase (XO), e não enzimaticamente, por compostos redox-ativos tais como
as semi-ubiquinonas da cadeia mitocondrial de transporte de elétrons.
A enzima superóxido dismutase (SOD) converte enzimaticamente o O
2
•-
em
H
2
O
2
. Nos tecidos, o O
2
•-
também pode ser convertido não enzimaticamente em
H
2
O
2
e
1
O
2
, (DROGE, 2002). Na presença de metais de transição livres
(particularmente ferro ou cobre), O
2
•-
e H
2
O
2
podem gerar o radical
•
OH, que é
extremamente reativo via reações de Fenton e Haber-Weiss (Figura 2.1).
Alternativamente, o H
2
O
2
pode ser convertido em H
2
O, pelas enzimas catalase
(CAT) ou glutationa peroxidase (GPx). Na reação da GPx, a glutationa (GSH) é
oxidada a glutationa dissulfeto (GSSG), que pode ser novamente convertida a GSH
pela glutationa redutase (GR) num processo que consome NADPH (figura 2.2),
(DROGE, 2002; HADDAD, 2002).
Figura 2.2. Vias de geração de espécies redoxi-ativas e mecanismo de defesa
enzimática. Adaptada de DROGE, 2002; HADDAD, 2002 e BECKER, 2004.
98
O mecanismo de geração de espécies redox-ativas em sistemas biológicos
pode ocorrer por inúmeras reações bioquímicas, sendo que quatro destes têm
recebido maior atenção: o sistema de β-oxidação peroxisomal, as reações do
citocromo P450, a geração de NO
•
e HOCl no processo fagocítico, e a cadeia
transportadora de elétrons da mitocôndria, onde acredita-se ocorrer o mecanismo
responsável pela produção da maior parte das espécies redoxi-ativas no organismo
(BECKMAN e AMES, 1998; PRESTON
et al., 2001).
Para minimizar os efeitos deletérios associados à constante formação das
espécies redox-ativas, os organismos aeróbicos foram dotados, ao longo do tempo
evolutivo, de distintas defesas antioxidantes. Os antioxidantes podem ser definidos
como substâncias capazes de retardar ou inibir a oxidação de substratos oxidáveis,
podendo este ser enzimáticos, como notadamente a SOD, CAT e GPx, ou não
enzimáticos, tais como α-tocoferol (principal componente da vitamina E), β-caroteno,
ascorbato (vitamina C), polifenóis e GSH (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
Os principais sistemas de defesa antioxidantes enzimáticas celulares são
compostos pela SOD, CAT e GPx (figura 2.2), que constituem a primeira defesa
endógena de neutralização dos radicais livres. Secundariamente, a glutationa
redutase (GR) e a glutationa S-transferase (GST) auxiliam na regeneração da GSH
e na conjugação de metabólitos reativos. Através delas, as células tentam manter
baixas as quantidades do O
2
•-
e de H
2
O
2
, evitando assim, a formação do
•
OH, que
embora de vida curta, de fração de segundos, e em reduzida concentração, é
extremamente reativo e danoso às células (BOVERIS e CADENAS, 1997).
A SOD, uma metaloenzima, é considerada uma das mais importantes defesas
antioxidantes na neutralização das espécies redoxi-ativas e está presente
praticamente em todos os organismos eucarióticos, sendo responsável pela
conversão do O
2
•-
em H
2
O
2
e O
2
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007). As células
humanas apresentam, pelo menos, duas isoformas da SOD, uma mitocondrial que
contém manganês no seu sítio ativo (MnSOD), e outra citosólica com cobre e zinco
no seu sítio ativo (CuZnSOD) (HALLIWELL, 2001; STEHBENS, 2003).
O H
2
O
2
da célula pode ser convertido a H
2
O e O
2
por dois tipos de enzimas:
CAT e GPx. A CAT está presente na maioria das células aeróbicas, especialmente
99
concentradas nos hepatócitos e eritrócitos localizando-se, principalmente, em
organelas sub-celulares denominadas peroxissomos. Esta enzima é composta de
quatro subunidades proteicas, cada uma contendo um grupo heme (FeIII-
protoporfirina) ligado ao sítio ativo. Já a GPx, uma das poucas classes de enzimas
humanas que requer selênio para sua ação, remove H
2
O
2
oxidando a GSH à GSSG
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007) (figura 2.2).
A GR auxilia na manutenção do poder redutor intracelular, pois catalisa a
redução da GSSG por meio da oxidação de NADPH, permitindo a contínua
regeneração da GSH produzida pela ação da GPx (HALLIWELL, 2001).
As GSTs, também desempenham um papel fisiológico importante, iniciando a
detoxificação de agentes alquilantes potenciais, incluindo compostos
farmacologicamente ativos, entretanto não atuam diretamente contra as espécies
redoxi-ativas. Estas enzimas catalisam a conjugação de metabólitos reativos com os
grupamentos SH da GSH, neutralizando os sítios eletrofílicos destes compostos e
gerando produtos mais solúveis em água (HABIG
et al., 1974).
As células também exibem antioxidantes não-enzimáticos que incluem
compostos endógenos como a GSH, e outros exógenos como a vitamina E, C e A
(além de outros carotenóides como o licopeno e o β-caroteno), polifenóis e outras
pequenas moléculas derivadas de fonte vegetais (SCANDALIOS, 1997).
Antioxidantes não-enzimáticos podem ser definidos como qualquer substância que,
quando presente, mesmo em baixas concentrações comparadas com o substrato
oxidável, são capazes de retardar ou inibir a oxidação deste substrato (HALLIWELL
e GUTTERIDGE, 2007).
A GSH, um tripeptídeo composto de glutamato, cisteína e glicina, é o principal
tiol celular não protéico, mais abundante em células eucariotas, e desempenha um
importante papel em muitos tipos de reações de bioredução e conjugação, tais
como: integridade do citoesqueleto, síntese de proteínas (tradução) e de DNA
(replicação), transporte de aminoácidos,
scavenger de radicais livres, transdução de
sinais, cofator de enzimas essenciais e defesa contra moléculas oxidantes e
xenobióticos potencialmente tóxicos (PEÑA
et al., 2000; STEHBENS, 2003). Este
tripeptídeo pode conferir proteção contra todas as formas de estresse oxidativo
100
através de, pelo menos, dois mecanismos: i) nos primeiros momentos do dano
oxidativo, a GSH pode agir bloqueando o potencial tóxico das EROs; ii) pode
também ajudar a ativar muitos genes que têm a função de extinguir o dano oxidativo
(NEBERT, 2000; STEHBENS, 2003).
Em organismos aeróbios saudáveis, a relação entre a produção de espécies
redoxi-ativas com os sistemas de defesas antioxidantes estão aproximadamente em
equilíbrio. Entretanto, esse equilíbrio nem sempre é perfeito. O estresse oxidativo
ocorre como um desequilíbrio entre o balanço pró-oxidante / antioxidante, em favor
da situação pró-oxidante, promovendo um dano potencial (SIES, 1993; HALLIWELL
e GUTTERIDGE, 2007).
O efeito do estresse oxidativo pode resultar em três diferentes processos: i)
adaptação por regulagem do sistema de defesa antioxidante; ii) lesão tecidual,
podendo causar dano a qualquer molécula alvo (DNA, proteínas e lipídios); iii) morte
celular por apoptose (HALLIWELL, 2001).
As espécies redox-ativas podem reagir com biomoléculas tais como
proteínas, carboidratos, lipídeos e ácidos nucléicos (HALLIWELL e GUTTERIDGE,
2007). Tanto a ligação peptídica quanto as cadeias laterais podem ser o alvo do
ataque de espécies redoxi-ativas (LEVINE, 2002).
O processo de peroxidação lipídica da membrana celular leva a alterações na
estrutura e na permeabilidade, levando a perda da seletividade na troca iônica e
liberação de conteúdo das organelas (como enzimas hidrolíticas dos lisossomas),
podendo tornar o ambiente favorável ao ataque ao DNA da cromatina por outros
tipos de espécies radicalares, culminando com a morte celular (HALLIWEL e
GUTTERIDGE, 2007).
A lipoperoxidação é utilizada como um sinal do estresse oxidativo celular e
auxiliar no reconhecimento de danos oxidativos em organismos com algumas
patologias, ocorrendo numa seqüência de reações já conhecida. Inicialmente, um
átomo de hidrogênio é seqüestrado do ácido graxo contendo, ao menos, duas
duplas ligações separadas por metilenos intercalados (LH), originando um radical
livre centrado no carbono (radical lipídico) (L
•
) com um rearranjo das duplas ligações
(conjugação de dienos). Esta fase é seguida pela interação do L
•
com o oxigênio
101
molecular (O
2
), para formar um radical peroxila (LOO
•
), que pode então retirar um
átomo de hidrogênio tanto do LH adjacente (induzindo uma reação de propagação),
como de outro doador de hidrogênio como, por exemplo, um antioxidante (figura
2.3). Em ambas as circunstâncias, um hidroperóxido de ácido graxo (LOOL) é
formado (ERNSTER e HOCHSTEIN, 1994; HERMES-LIMA
et al., 1995; HALLIWELL
e GUTTERIDGE, 2007).
Figura 2.3. Representação esquemática das reações de iniciação e propagação da
LPO. Adaptada de HERMES-LIMA
et al., 1995.
As conseqüências mais comuns da lipoperoxidação correspondem à
perturbação das funções essenciais das membranas celulares e organelas, incluindo
o processo de transporte transmembrana, a transdução de sinais mediada por
receptores, e a preservação do gradiente de íons e metabólitos (ERNSTER e
HOCHSTEIN, 1994).
Os níveis elevados de espécies redoxi-ativas no organismo parecem ser um
dos maiores contribuintes para o envelhecimento (HARMAN, 1992), e para muitos
processos degenerativos como o câncer, aterosclerose, doenças
neurodegenerativas, cataratas dentre outros (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
3.2. Atividade antioxidante de polifenóis
Em condições normais, as reações de formação de espécies reativas de
oxigênio são mantidas sob controle por meio de um sistema de defesa antioxidante
do organismo composto de substâncias que atuam em diferentes níveis. O sistema
de defesa primário é constituído de substâncias que impedem a geração ou
102
seqüestram espécies reativas de oxigênio, ou seja, bloqueiam a etapa de iniciação
da cadeia radicalar. Neste sistema encontram-se as enzimas antioxidantes,
quelantes e proteínas e substâncias não enzimáticas. O sistema de defesa
secundário é formado por compostos fenólicos ou aminas aromáticas, como os
tocoferóis, flavonóides, principalmente flavonas e flavonóis (HALLIWEL e
GUTTERIDGE, 2007).
Os polifenóis são constituintes amplamente distribuídos em plantas, aos quais
são atribuídas diversas propriedades biológicas tais como antiinflamatórias,
antibióticas, antitrombóticas, antimicrobianas, antialérgicas, antitumorais,
antiasmáticas e antioxidantes. Os flavonóides, por exemplo, dividem-se em 13
subclasses, que apresentam em comum um esqueleto hidrocarbonado do tipo C
6
-
C
3
-C
6
(difenilpropano), cada porção de seis carbonos compreende um anel
aromático e a de três carbonos um heterociclo, conforme mostrado na figura 2.4
(TRUEBA e SÁNCHEZ, 2001).
Figura 2.4. Núcleo fundamental dos flavonóides (A) e ácidos cafeoilquínicos (B).
Exatamente por se constituírem em fundamentais contribuintes da dieta,
os primeiros estudos dos polifenóis estavam em sua maioria relacionados aos
efeitos nutricionais destes como, por exemplo, à diminuição na absorção e
digestibilidade de alimentos devido à capacidade destes constituintes químicos
de se ligar e precipitar minerais e macromoléculas tais como proteínas e
carboidratos (YANG
et al., 2001).
103
O interesse principal recente tem recaído sobre o fato de que diversos
constituintes deste grupo revelaram atividades antioxidantes, antiinflamatória e
anticarcinogênicas. Diversos estudos epidemiológicos têm sugerido associações
entre uma dieta com alimentos ricos em polifenóis e à prevenção de doenças.
Muitos destes efeitos benéficos relacionados à prevenção de diversas
enfermidades estão associados à própria natureza química deste grupo de
substâncias (MOURE
et al., 2001).
Deste modo, a habilidade destas substâncias em prevenir doenças
conhecidamente associadas ao estresse oxidativo, tais como cardiopatias,
alguns tipos de câncer e processos inflamatórios podem estar vinculadas às
propriedades antioxidantes dos polifenóis reportadas. A prevenção da
peroxidação de lipoproteinas de baixa densidade pode estar relacionada com a
proteção de doenças cardíacas, enquanto que a proteção contra danos
oxidativos ao DNA pode ser relacionada à prevenção de cânceres ou disfunções
genômicas (MAURICIO, 2006).
A atividade antioxidante dos polifenóis resulta da combinação de suas
propriedades
scavenger de espécies redoxi-ativas e quencher de metais, assim
como de inibir oxigenases tais como a lipoxigenase, a cicloxigenase, a
mieloperoxidase, a NADPH oxidase e a xantina oxidase. Outros mecanismos podem
incluir a inibição de enzimas envolvidas indiretamente nos processos oxidativos e a
estimulação de outras com propriedades antioxidantes com a catalase (CAT) e a
superóxido dismutase (SOD) (TRUEBA e SÁNCHEZ, 2001).
Os polifenóis são reconhecidos por apresentar atividade antioxidante
devido a sua habilidade
scavenger de espécies redox-ativas, interrompendo, por
exemplo, a reação radicalar em cadeia da peroxidação lipídica (RICE-EVANS,
1996). Estes constituintes químicos interferem nas reações de oxidação de
lipídios e outras moléculas por meio de uma rápida transferência de átomos de
hidrogênio aos radicais como, por exemplo, hidroxila e peroxila.
Em termos estruturais, os principais responsáveis por esta atividade são
os dois grupos hidroxila na posição 3´,4´ do anel B, a dupla ligação em
104
conjugação com um grupo cetônico no carbono 4 do anel C e os grupos
hidroxila dos carbonos 5 e 7 do anel A, no caso dos flavonóis (figura 2.4A).
Considerando o caso dos derivados do ácido cafeoilquínico, a estrutura
hidroxifenólica conjugada com a dupla ligação da cadeia de ramificação lateral,
tem sido reportada como o principal componente responsável pela atividade
antioxidante (RICE-EVANS, 1996) (figura 2.4B).
Nos casos em que polifenóis têm sua capacidade antioxidante devida a
sua ação como
scavenger de radicais, pode-se dizer que, em geral, a eficiência
dos mesmos em prevenir danos oxidativos depende, diretamente, da sua
habilidade em formar intermediários estáveis após reação com os radicais.
Outro mecanismo de ação antioxidante dos compostos polifenólicos de
especial relevância é a sua capacidade de se ligar a metais tais como íons ferro
e cobre, impedindo ou minimizando a participação destes em reações de Fenton
(TRUEBA e SÁNCHEZ, 2001). No entanto, em alguns casos, a interação dos
polifenóis com metais pode conferir aos mesmos uma característica pró-
oxidante. Compostos dos grupos dos flavonóides e ácidos fenólicos demonstraram
ser antioxidantes inibindo a formação de radicais peroxila e hidroxila em diferentes
sistemas oxidantes, porém na presença de Cu
2+
os mesmos se revelaram pró-
oxidantes (CAO
et al., 1997; YAMANAKA, 1997), provavelmente devido a reações
de redução de Cu
2+
a Cu
+
induzidas por estes compostos, abrindo caminho para
reações do tipo Fenton. ANDRADE JR (2004) em estudos sobre a capacidade do
ácido tânico em prevenir danos oxidativos ao DNA induzidos por íons cobre,
verificou um efeito pró-oxidante deste polifenol e, também, do complexo ácido
tânico-Cu em presença de DNA.
É importante ressaltar que uma proteção contra a ação de algumas espécies
redox-ativas
in vitro, não necessariamente implica em proteção contra danos
oxidativos em células. POOL-ZOBEL (1999) observou que, tanto substâncias
isoladas quanto amostras complexas de plantas contendo várias antocianinas e
antocianidinas mostraram-se potentes antioxidantes
in vitro. Porém, pelo menos em
células tumorais do colon humano, este grupo de substâncias não foi capaz de
minimizar o dano oxidativo endógeno ao DNA.
105
Da mesma forma, pequena atividade antioxidante in vitro também não
necessariamente significa que uma substância não seja responsável por ação
antioxidante
in vivo. Flavonóides tais como quercetina e catequina, com espécies
antioxidantes intracelulares do tipo glutationa peroxidase (GPx) pode aumentar
significativamente a atividade antioxidante destas (FERGUSON, 2001; NAGATA,
1999).
3.3. Atividade antioxidante de Ilex paraguariensis
A erva-mate também é utilizada com fins terapêuticos, constando nas
Farmacopéias Portuguesa (1876), Francesa (1884), Brasileira, (1929), Venezuelana
(1939), Paraguaia (1949) e Mexicana (1952) (IMBESI, 1964), sendo atribuídas ao
produto ações sobre os sistemas cardiovascular e respiratório (COSTA e BADINI,
1939), tecido muscular (SIQUEIRA
et al., 1953) e trato gastrintestinal (EDWIN e
REITZ, 1967). Também lhe são atribuídas as propriedades estimulante do sistema
nervoso central, anti-reumática e diurética (BRITISH HERBAL PHARMACOPOEA,
1983).
Os estudos referentes à atividade antioxidante de
Ilex paraguariensis inciaram
com GUGLIUCCI e STAHL (1995) ao demonstrarem que extratos aquosos e
etanólicos das folhas de
Ilex paraguariensis inibiram a oxidação de lipoproteínas de
baixa densidade
– LDL, em ensaios in vitro. Os extratos aquosos apresentaram
atividade antioxidante superior ao ácido ascórbico e ao butil-hidroxitolueno
in vitro.
Posteriormente, examinando a oxidação de LDL no plasma de indivíduos sadios,
antes e após a ingestão de extratos aquosos de
Ilex paraguariensis, foi constatada a
mesma atividade, observando que as substâncias antioxidantes são absorvidas e
alcançam níveis suficientemente altos no plasma humano para inibir a auto-oxidação
das LDL (GUGLIUCCI, 1996). Os extratos também inibiram a peroxidação
enzimática e não-enzimática de lipídios microssomais empregando diferentes
modelos experimentais
in vitro (SCHINELLA et al., 2000).
FILIP e colaboradores (2000) avaliaram a atividade antioxidante de
Ilex
paraguariensis e de espécies relatadas como adulterantes, por meio da medida da
lipoperoxidação
in vitro. Ainda neste estudo, foram quantificados os conteúdos de
106
derivados cafeoilquínicos visando ao estabelecimento de uma possível correlação
entre a atividade farmacológica e a composição química. Os autores observaram
que todas as espécies inibiram a oxidação lipídica, porém os extratos de
Ilex
paraguariensis obtiveram uma correlação altamente significante entre a atividade
antioxidante e o teor de derivados cafeoilquínicos.
BRACESCO e colaboradores (2003) analisaram a atividade antioxidante da
infusão de
Ilex paraguariensis utilizando dois modelos experimentais: indução de
ruptura da cadeia de DNA por peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e indução da oxidação
de LDL. Os autores observaram que a infusão reduziu significativamente, de
maneira dose-dependente, tanto o número de quebras na cadeia de DNA e
letalidade induzida por H
2
O
2
, como a oxidação de LDL humano. Os autores
concluíram que a infusão apresentou atividade antimutagênica e antigenotóxica
in
vitro.
GORZALCZANY e colaboradores (2001) investigaram o efeito de quatro
espécies de
Ilex sobre o fluxo da bile e o trânsito intestinal de ratos Wistar. Os
autores observaram um aumento significativo, do tipo dose-dependente, no fluxo da
bile sem alterações no trânsito intestinal em ratos tratados com decocto de
Ilex
paraguariensis, dando suporte ao uso desta espécie, na medicina popular, como
digestivo e hepatoprotetor.
GUGLIUCCI e MENINI (2002), estudando o possível efeito antiglicante de
extratos aquosos de
Achyrocline satureoides e Ilex paraguariensis, observaram um
efeito significante e dose-dependente destes na indução da perda da atividade
in
vitro
de metilglioxal, utilizando como modelos o plasminogênio e antitrombina III. Os
autores observaram que o efeito antiglicante foi significante em concentrações que
corresponderam a uma diluição de 1:100 das preparações usualmente ingeridas,
indicando que os extratos são candidatos promissores para estudos de
suplementação natural no tratamento de diabetes. Efeito similar foi observado para
os extratos de
Ilex paraguariensis quando comparados à amostra comercial de chá
verde (LUNCEFORD, 2005).
A inibição da nitração de proteínas é descrita por BIXBY e colaboradores
(2005). Ao avaliar a citotoxidade induzida por peroxinitrito utilizando como modelo
107
células mamárias, os autores observaram uma acentuada inibição do estresse
nitrosativo para extratos de
Ilex paraguariensis.
A composição polifenólica descrita para a espécie, associada às atividades
biológicas descritas para estes constituintes, tem levado à realização de estudos
in
vitro e in vivo a fim de entender o papel desta espécie na formação ou prevenção de
câncer. RAMIREZ-MARES e colaboradores (2004) avaliaram a atividade
quimiopreventiva
in vitro de infusos de Ilex paraguariensis, Camellia sinensis e
Ardisia compressa comparando com padrões de polifenóis em modelo de
citotoxicidade em células HepG2 e atividade antitopoisomerase. O infuso de
Ilex
paraguariensis
apresentou elevada citotoxicidade e inibiu signitivamente a
topoisomerase II, um bio-marcador da proliferação de células cancerígenas.
Segundo os autores, este resultado faz desta espécie um candidato promissor para
estudos de atividade quimiopreventiva. Pesquisadores do mesmo grupo, ao avaliar
os extratos de
Ilex paraguariensis, em modelo de carcinoma oral, in vitro,
observaram a inibição da proliferação celular (MEJIA, 2005).
108
4. MATERIAL
4.1. Equipamentos e acessórios
Balança analítica Sartorius 2402; centrífuga Eppendorf 5403;
espectrofotômetro Hewlett Packard HP; espectrofotômetro Shimadzu UV 190;
evaporador rotatório Büchi R 114; guilhotina para animais de porte pequeno Ugo
Basile; homogeneizador – Sonicator ultrasonic processor Heat Systems;
liofilizador Edwards Modulyo 4K; manta aquecedora termostatizada Fisatom
402; pipetas reguláveis Gilson Pipetman, P10,P20, P100, P200 e P 1000.
agitador Vortex Phoenix AT 56; potenciômetro pH-metro B374 Micronal.
4.2. Solventes, reagentes e soluções
Todos os reagentes utilizados, a não ser nos casos de especificação contrária
devem apresentaram grau de pureza pró-análise (p.a).
Ácido acético glacial; ácido ascórbico; ácido clorídrico; ácido fórmico; ácido
tricloroacético; adrenalina; água destilada; álcool etílico; álcool n-butílico, carbonato
de potássio; catalase; ciclo-hexano; cloreto de sódio; clorofórmio;
dinitrofenilhidrazina – DNPH; éter de octilpolietilenoglicol - Triton® X-100; fosfato
dibásico de potássio; fosfato dibásico de sódio hepta-hidratado; fosfato monobásico
de potássio; hidróxido de sódio; luminol; malondiadeído – MDA; metanol; metanol
(CLAE); nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato reduzida – NADPH; peróxido de
hidrogênio; sal de sódio do ácido etilnodiamina tetra-acético – EDTA; solução
aquosa de metanamina 0,5 % (m/v); solução de ácido fosfórico 0,16M; solução
etanólica de polietilenoglicol 400 30 %; solução tampão glicina; solução tampão pH
4,0; solução tampão pH 7,0; sulfato ferroso hepta-hidratado; 1,1,3,3-
tetrametoxipropano; tetracloreto de carbono.
4.3. Adjuvantes
celulose microcristalina (Avicel
®
)
dióxido de silício coloidal (Aerosil 200
®
)
109
maltodextrina (Glucidex
®
)
4.4. Substâncias de referência
2,2’-azo-bis(2-amidinopropano)(ABAP); ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-
cromo-2-carboxilico (Trolox); ácido ascórbico; ácido caféico (Merck); ácido
clorogênico (Sigma).
4.5. Material biológico
Foram utilizados ratos Wistar, machos, com dois meses de idade, pesando de
250 a 350 g, provenientes do biotério do Centro de Reprodução e Experimentação
de Animais de Laboratório do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Os animais foram mantidos em
condições normais de biotério, com livre acesso à ração e água.
110
5. METODOLOGIA
5.1. Avaliação da atividade antioxidante
in vitro do PSI-A, PSI-B, PSI-C, PSI-D,
ESLI e FPI
Os estudos in vitro foram realizados com a finalidade de auxiliar na seleção
do extrato a ser desenvolvido em escala semi-industrial, comparado às frações
polifenólicas obtidas.
5.1.1. Potencial Antioxidante Total (TRAP) (WAYNER et al., 1985)
Para a contagem de quimioluminescência basal adicionou-se 4,0 ml de
solução de ABAP 10 mM em tampão glicina 0,1 M (pH 8,6). A seguir, adicionou-se
10 μl de solução de luminol 4 mM à mistura anterior como padrão externo para
monitorar a produção de radicais livres. Este meio foi previamente incubado a 25
o
C
durante 2 horas para estabilização da leitura de quimiluminescência.
Após a incubação foram adicionados ao meio reacional 10 μl dos diferentes
extratos, as frações polifenólicas e o padrão antioxidante, constituindo os diferentes
grupos de tratamentos, conforme descrito na tabela 2.2.
Tabela 2.2. Grupos de tratamentos testados.
Grupo Concentrações testadas
ESLI
0,125; 0,25; 0,625 μg/ml
PSI-A
0,125; 0,25; 0,625 μg/ml
PSI-B
0,125; 0,25; 0,625 μg/ml
PSI-C
0,125; 0,25; 0,625 μg/ml
PSI-D
0,125; 0,25; 0,625 μg/ml
FAB
0,025; 0,0625; 0,125 μg/ml
FF
0,025; 0,0625; 0,125 μg/ml
Trolox 200 nM
ESLI: extrato seco liofilizado; PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
; PSI-B: 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
; PSI-C: 70 % de resíduo seco + 30 % Glucidex
®
; PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
; FAB e FF: frações polifenólicas – processo submetido a registro de patente.
111
Todos os adjuvantes empregados no preparo dos produtos secos por spray-
drying foram ensaiados na concentração equivalente a maior dose testada de
produto seco para cada grupo.
A quimioluminescência produzida foi quantificada e registrada em cintilador,
após 60 minutos da adição dos tratamentos. Após os diferentes tratamentos, a
intensidade de quimioluminescência foi medida. O tempo necessário para que a
contagem retornasse ao valor inicial foi comparado ao tempo de indução do trolox no
mesmo sistema. A capacidade antioxidante foi expressa como capacidade
antioxidante equivalente ao Trolox (CAET, mM).
5.1.2. Medida da lipoperoxidação (TBARS)
in vitro
Para o ensaio, foi empregada como fonte de lipídios homogeneizados de
gema de ovo (RUBERTO
et al., 2000).
Procedimento
Em tubos Pirex
®
com tampa de rosca foram adicionados 1000 μl de
homogeneizado de gema de ovo 1% (v/v) em solução salina. A este meio foram
pipetados 100 μl dos diferentes extratos e frações polifenólicas, constituindo os
diferentes grupos de tratamentos (tabela 2.3).
112
Tabela 2.3. Grupos de tratamentos testados no ensaio de lipoperoxidação.
Grupo Concentrações testadas
ESLI
0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 μg/ml
PSI-A
0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 μg/ml
PSI-B
0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 μg/ml
PSI-C
0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 μg/ml
PSI-D
0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 μg/ml
FAB
0,1; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 μg/ml
FF
0,1; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 μg/ml
ESLI: extrato seco liofilizado; PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
; PSI-B: 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
; PSI-C: 70 % de resíduo seco + 30 % Glucidex
®
; PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
; FAB e FF: frações polifenólicas – processo submetido a registro de patente.
Todos os adjuvantes empregados no preparo dos produtos secos por
spray-
drying foram ensaiados na concentração equivalente a maior dose testada de
produto seco para cada grupo.
Após a adição das amostras foram pipetados 100 μl de AAPH (120 mM) em
tampão TBA. Ao final foi adicionado tampão TBA até volume de 1,2 ml. Esta mistura
foi incubada a 37
0
C por 30 minutos. Passado este período retirou-se 300 μl de cada
tubo e transferiu-se para tubos tipo
eppendorf. 600 μl de TCA 15% foram
adicionados aos tubos
eppendorfs e centrifugados a 10000 g a 4
0
C. 500 μl do
sobrenadante de cada
eppendorf foram transferidos para tubos de reação e
acrescidos de 500 μl de TBA 0,67 % em água Milli-Q. A mistura final foi aquecida em
banho-maria durante 30 minutos. Após este período a absorvância foi medida a 532
nm.
A atividade antioxidante foi calculada como porcentagem de inibição da
peroxidação de lipídeos, segundo a equação 1.
113
100
Abs
AbsAbs
(%) lipídica operoxidaçã da Inibição
CONT
AMOSCONT
×
−
= (1)
Onde Abs
cont
é a absorvância do controle que não recebeu tratamento e
Abs
amos
a absorvância das amostras incubadas com diferentes concentrações dos
tratamentos.
A concentração do extrato (mg/mL) necessária para inibir 50% da
peroxidação lipídica (IC
50
) foi calculada.
Preparação da curva padrão de 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP)
A curva padrão de TMP foi preparada a partir de uma solução aquosa na
concentração de 2,0 nmol/ml. Alíquotas de 30; 60; 120 e 180 μl da solução TMP
foram transferidas para tubos de vidro e o volume completado para 500 μl com água
destilada. As soluções foram preparadas em triplicata.
5.1.3. Ensaio da atividade scavenger de radicais hidroxila (
•
OH)
Em tubos Pirex
®
com tampa de rosca foram adicionados 100 μl de 2-
deoxirribose (50 mM) em água Milli-Q (substrato), 100 μl de FeSO
4
(60 mM), 100 μl
H
2
O
2
(1 mM) em água Milli-Q (sistema gerador). A este meio foram adicionados 100
μl dos diferentes extratos, frações polifenólicas e o padrão antioxidante, constituindo
os diferentes grupos de tratamentos, conforme descrito na tabela 2.4.
114
Tabela 2.4. Grupos de tratamentos testados no ensaio da atividade scavenger de
radicais hidroxila.
Grupo Concentrações testadas
ESLI
0,1; 0,5; 1,0 ; 5,0 μg/ml
PSI-A
0,5; 1,0; 5,0; 50 μg/ml
PSI-B
0,5; 1,0; 5,0; 50 μg/ml
PSI-C
0,5; 1,0; 5,0; 50 μg/ml
PSI-D
0,5; 1,0; 5,0; 50 μg/ml
FAB
0,5; 1,0; 5,0; 50 μg/ml
FF
0,5; 1,0; 5,0; 50 μg/ml
Trolox 200 nM
ESLI: extrato seco liofilizado; PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
; PSI-B: 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
; PSI-C: 70 % de resíduo seco + 30 % Glucidex
®
; PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
; FAB e FF: frações polifenólicas – processo submetido a registro de patente.
Todos os adjuvantes empregados no preparo dos produtos secos por spray-
drying foram ensaiados na concentração equivalente a maior dose testada de
produto seco para cada grupo.
Após a adição das amostras foi adicionada solução tampão fosfato de sódio
20 mM (pH 7,2) até volume de 900 μl. Ao final foi adicionado 100 μl de H
2
O
2
(10
mM) em água Milli-Q. Esta mistura foi incubada a 27
0
C por 15 minutos. Passado
este período a reação foi interrompida mediante a adição de 500 μl de ácido
fosfórico 4 % (v/v). Após a incubação 500 μl de TBA (1,0 %) em NaOH 50 mM, foi
adicionados. A mistura final foi aquecida em banho-maria durante quinze minutos.
Após este período a absorvância foi medida a 532 nm.
O percentual de inibição de radicais hidroxila (atividade
scavenger de radicais
hidroxila) será expresso pela equação 2.
100
Abs
AbsAbs
(%) Inibição
CONT
AMOSCONT
×
−
=
(2)
115
5.2. Avaliação da atividade antioxidante ex vivo dos PSI e FPI
A partir dos resultados obtidos na avaliação da atividade antioxidante in vitro
dos produtos secos PSI-A, PSI-B, PSI-C e PSI-D, foram previamente selecionados
os produtos PSI-A e PSI-D, os quais demonstraram-se promissores tanto quanto a
atividade antioxidante como quanto a viabilidade tecnológica de produção em escala
semi-industrial. Estes extratos foram avaliados quanto à atividade antioxidante
ex
vivo, juntamente com as frações polifenólicas FAB e FF.
5.2.1 Material biológico
Foram utilizados ratos Wistar, machos, com 2 a 3 meses de idade, pesando
de 250 a 350 g.
5.2.2 Obtenção de fatias de fígado e preparação do homogeneizado
(RUDNICKI,
2005)
Procedimento
Os fígados dos animais foram retirados, cirurgicamente, sendo transferidos
para placas de Petry contendo tampão Krebs-Ringer 10 mM de glicose (pH 7,4) em
gelo, onde foram cortados e selecionados pedaços próximos às bordas. Os fígados
foram fatiados em
chopper, em fatias de 400 μm de espessura. As fatias foram
separadas e colocadas em copo de becker contendo 2,0 ml de tampão Krebs-Ringer
10 mM de glicose (pH 7,4). Cada grupo foi constituído por 5 fatias. A seguir os
grupos foram pré-incubados por 10 minutos em 37
0
C, em atmosfera de carbogênio
(95% O
2
/5% CO
2
), equilibrado com tampão fosfato Krebs-Ringer 10 mM de glicose
(pH 7,4), em banho de água sob agitação (60 oscilações/min). Após este período o
tampão foi trocado por um volume de 1,0 ml e incubado novamente por um período
de 30 minutos para lavagem das fatias. Ao final de 30 minutos o tampão foi
substituído por 1,0 ml dos tratamentos constituindo os diferentes grupos (tabela 2.5).
116
Tabela 2.5. Grupos de tratamentos testados no ensaio ex vivo.
Grupo Tratamentos
Controle incubação com tampão fosfato Krebs-Ringer
Controle induzido incubação com t-BHP 0,5 mM
Antioxidante pré-incubadação com Trolox 10 mM
Antioxidante induzido pré-incubadação com Trolox 10 mM seguida de indução
com
t-BHP 0,5 mM
PSI-A
pré-incubação com 0,25 μg/ml
PSI-A induzido
pré-incubadação 0,25 μg/ml seguida de indução com
t-BHP
0,5 mM
Adjuvante PSI-A pré-incubação com dióxido de silício coloidal
Adjuvante PSI-A
induzido
pré-incubação com dióxido de silício coloidal seguida de
indução com
t-BHP 0,5 mM
PSI-D
pré-incubação com 0,25 μg/ml
PSI-D induzido
pré-incubadação 0,25 μg/ml seguida de indução com
t-BHP
0,5 mM
Adjuvante PSI-D pré-incubação com com dióxido de silício colidal e celulose
microcristalina
Adjuvante PSI-D
induzido
pré-incubação com dióxido de silício colidal e celulose
microcristalina seguida de indução com
t-BHP 0,5 mM
FAB
pré-incubação com F100+10 0,125 μg/ml
FAB induzido
pré-incubação com F100+10 0,125 μg/ml seguida de
indução com
t-BHP 0,5 mM
FF
pré-incubação com F50 0,125 μg/ml
FF induzido
pré-incubação com F50 0,125 μg/ml seguida de indução
com
t-BHP 0,5 mM
PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
; PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
; FA e
FF: frações polifenólicas – processo submetido a registro de patente.
Os diferentes grupos de tratamentos foram mantidos sob incubação por mais
30 minutos, quando foi adicionado 20 μl do indutor de dano
ter-butilhidroperóxido (t-
BHP) 0,5 mM aos grupos correspondentes e mantidos sob incubação por 30
minutos.
117
Após a incubação final, as fatias de fígado foram removidas e o meio foi
centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos. A porção superior foi retirada com
auxílio de pipeta automática e conservada em temperatura ambiente até utilização
nos ensaios de quantificação da lactato desidrogenase (LDH).
Para o ensaio de lipoperoxidação e ensaio de dano protéico, as fatias de
fígado foram homogeneizadas em tampão fosfato, pH 7,0 e congeladas a -75
0
C até
análise.
Determinação da concentração de proteínas (LOWRY et al., 1951)
A concentração de proteínas totais no homogeneizado do fígado foi
determinada pelo método de LOWRY e colaboradores (1951), adaptado para leitor
de placas, utilizando albumina de soro bovino (BSA) como proteína padrão.
Preparação dos reativos
Para a preparação do reagente CTC (cobre-tartarato-carbonato) foram
preparadas três soluções. Para a solução A, 20,0 g de Na
2
CO
3
foram transferidos
para um béquer de plástico e dissolvidos em 100 ml de água. A solução B foi obtida
pela dissolução de 0,2 g de CuSO
4
.5 H
2
O em 40 ml de água. A solução C foi
preparada adicionou-se 0,4 g de KNaC
4
H
4
O
6
. 4H
2
O em 40 ml de água. O reagente
CTC foi obtido pela mistura das soluções 2, 3 e 1, respectivamente.
O reativo de Lowry foi obtido pela mistura de 10 ml de CTC, 10 ml de SDS 10
%, 8 ml de NaOH 1N e 12 ml de água.
Preparação da curva padrão
A curva padrão de BSA foi preparada a partir de uma solução aquosa na
concentração de 0,5 mg/ml. Em placas de poliestrireno de 96 poços foram pipetadas
alíquotas de 10, 20, 30, 40 e 60, 70, 80, 90 e 100 μl da solução de BSA e o volume
completado para 100 μl com água. As soluções foram preparadas em triplicata.
A cada poço contendo as diferentes concentrações de BSA foram
adicionados 100 μl do reativo Lowry. Após 10 minutos, foram adicionados 100 μl do
reativo de Folin-Cicalteau 0,4N, seguido de agitação em placa. Trinta minutos após
118
adição do reativo de Folin-Cicalteau, placa foi transferida para leitor de placas e a
leitura realizada em 750 nm.
Procedimento para o homogeneizado
Em placas de poliestireno cristalino de 96 poços e fundo plano (Alfesa -São
Paulo/Brasil) foram pipetados 5,0 μl de homogeneizado, em seguida foram
acrescentados 95 μl de água e 100 μl do reativo de Lowry. Após 10 minutos, foram
adicionados 50 μl do reativo de Folin-Cicalteau 0,4 N seguido de agitação. Trinta
minutos após adição do reativo de Folin-Cicalteau, placa foi transferida para leitor de
placas e a leitura realizada em 750 nm. Cada homogeneizado foi preparado em
triplicata.
5.2.3. Ensaio de citotoxicidade via estresse oxidativo - quantificação da lactato-
desidrogenase (LDH)
O potencial citotóxico dos extratos foi avaliado por meio da determinação da
lactato-desidrogenase, uma enzima citosólica indicadora de dano celular. Sua
determinação é feita empregando o método espectrofotométrico, o qual que se
baseia na oxidação do lactato a piruvato na presença do NAD que é reduzido a
NADH, frente a um agente que cause dano oxidativo (FeSO4). Foi realizada
empregando um kit comercial (LDH Labtest
®
Diagnóstiva S.A).
A porção superior do homogeneizado de fígado de rato foi centrifugada a
5000 rpm durante 2 minutos. Após este período o sobrenadante foi transferido para
tubos tipo
eppendorf em duplicata correspondendo ao branco (B) e teste (T) para
cada grupo de tratamento analisado. O teste foi realizado conforme protocolo do
fornecedor seguindo esquema abaixo ilustrado:
119
Branco Teste Padrão
Tampão
320 μl
-
320 μl
Substrato
-
320 μl
-
Amostra
25 μl 25 μl 16 μl
Incubação por 2 minutos a 37
o
C
Reagente de cor
*
64 μl 64 μl
-
Incubação por 5 minutos a 37
o
C
Estabilizador
**
640 μl 640 μl 640 μl
Incubação por 5 minutos a temperatura ambiente
*
Reagente de cor: contém INT (cloreto de iodofenil-nitrofenil tetrazolio) 4 nmol/l; NAD 7,5 nmol/l; fenazida 4,6
nmol/l e azina sódica 7,7 nmol/l.
**
Estabilizador: contém ácido cloródrico 200 nmol/l.
Após este período a absorvância foi medida em 500 nm utilizando água
destilada como branco. O cálculo foi expresso pela equação 3.
150
Abs
AbsAbs
(U/L) Láctica aseDesidrogen
padrão
controleteste
×
−
= (3)
Onde: Abs= absorvância (teste, controle e padrão)
5.2.4. Medida da lipoperoxidação (TBARS) (DRAPER E HADLEY,1990)
Alíquotas do homogeneizado do fígado contendo 1,0 mg de proteínas foram
pipetadas em tubos de ensaio e o volume completado a 300 μL com tampão PBS. A
seguir foram adicionados 600 μl de ácido tricloroacético 15% (TCA) e a mistura
centrifugada a 11000 rpm, durante 10 minutos. Após centrifugação, 500 μl do
sobrenadante foram transferidos para tubos de reação acrescidos de 500 μl de TBA
0,67% em água purificada Milli-Q. A mistura final foi aquecida em banho-maria
durante 20 minutos. Após este período a absorvância foi medida em 532 nm,
120
utilizando-se o malonaldeído (MDA) como padrão (ε = 1,56. 10
5
M
-1
. cm
-1
). Os
resultados foram expressos como nmol MDA/mg proteína em cada amostra.
As concentrações de MDA foram determinadas pela comparação à curva
padrão de 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP).
Preparação da curva padrão de 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP)
A curva padrão de TMP foi preparada a partir de uma solução aquosa na
concentração de 2,0 nmol/ml. Alíquotas de 30; 60; 120; 220; 300; 500 μl da solução
de TMP foram transferidas para tubos de vidro e o volume completado para 500 μl
com água destilada. As soluções foram preparadas em triplicata.
5.2.5. Dano protéico (LEVINE et al., 1990)
Em tubos de ensaio foram adicionados 500 μL do homogeneizado de fatias
de fígado de rato e centrifugados a 6000 rpm durante 3 minutos. Após centrifugação,
300 μL da fase superior foram submetidos à precipitação com igual volume de TCA
20 %. A mistura foi novamente centrifugada a 7000 rpm durante 5 minutos, sendo o
sobrenadante descartado ao final. As proteínas precipitadas foram ressuspensas em
500 μl de tampão KCl (120 mM), KH
2
PO
4
(30 mM, pH 7,4) para determinação da
concentração de proteínas (conforme descrito no item 5.2.2).
Uma alíquota de 200 μL da proteína ressuspensa foi pipetada para o preparo
do branco e da amostra, sendo o volume final completado a 500 μl de tampão KCl
(120 mM), KH
2
PO
4
(30 mM, pH 7,4). A esta mistura foram adicionados 500 μl de HCl
2 M ao tubo contendo o branco e, 500 μl de DNPH 10 mM (diluído em HCl 2N) ao
tubo contendo a amostra. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 30
minutos. Após este período, foram adicionados 250 μL de TCA 20 %, a mistura foi
novamente centrifugada a 22000 rpm durante 3 minutos. Após a centrifugação o
sobrenadante foi descartado e as proteínas precipitadas foram lavadas três vezes
com 1000 μL de uma mistura de etanol:acetato de etila (1:1, v/v) sendo, novamente,
121
centrifugadas a 22000 rpm durante 3 minutos. O resíduo sólido resultante foi
dissolvido em 1000 μl de uréia 8,0 M, pH 2,3 e mantido em banho-maria a 37
0
C por
15 minutos, sendo posteriormente centrifugado. A absorvância da solução obtida
após centrifugação, foi lida em 370 nm para quantificar o conteúdo de carbonila
protéica.
O conteúdo total de carbonila é estimado pela diferença entre os valores de
absorvância das amostras tratadas com DNPH e amostras tratadas somente com
HCL sem DNPH. Os dados foram expressos como nM de carbonila/mg de proteína,
utilizando o coeficiente de extinção de 22000 mM
-1
cm
-1
.
5.3. Avaliação da atividade antioxidante
in vivo do PSI
Todos os experimentos abaixo discriminados estão em concordância com o
estabelecido no
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals promulgado pelo
NIH (1985) e de acordo com princípios éticos na experimentação animal adotados
pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA),
tendo sido aprovado
pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
em reunião n
o
12, ata n
o
78, de 09/11/2006, sob número de registro: 2004321.
5.3.1 Material biológico
Foram utilizados ratos Wistar, machos, com dois meses de idade, pesando de
250 a 350 g, provenientes do biotério do Centro de Reprodução e Experimentação
de Animais de Laboratório do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Os animais foram mantidos em
condições normais de biotério, com livre acesso à ração e água.
5.3.2. Preparação das amostras e tratamento dos animais
Para a escolha do tamanho da população em estudo, protocolos pré-
estabelecidos e previamente descritos na literatura para avaliação da atividade
122
antioxidante in vivo (SAMUEL et al. 2005; TIEPPO et al., 2006) foram considerados.
Grupos de animais (n=10) foram tratados com PSI-A, disperso em solução
salina a 0,9 %. A dose de 386 mg de produto seco por
spray-drying por kg de animal
foi administrada por via oral, empregando sonda gástrica.
Um segundo grupo de animais (n=10) foi tratado, por via oral, com dióxido de
silício coloidal, disperso em solução salina a 0,9 %, na dose de 166 mg por kg de
animal, por via oral empregando sonda gástrica.
O grupo controle (n=10) recebeu o veículo empregado para dissolução das
amostras testadas, por via oral.
Todos os grupos foram tratados por um período de 30 dias em horário fixo,
pré-estabelecido, entre 15 e 16 horas, no período da tarde.
A atividade antioxidante
in vivo do PSI-A e dióxido de silício coloidal foi
avaliada empregando o modelo de dano oxidativo hepático induzido por tetracloreto
de carbono (CCl
4
), um potente agente hepatóxico que é biotransformado a radical
triclorometila (CCl
3
- e/ou CCl
3
OO-) pelo sistema P450, o qual desencadeia o
processo de peroxidação lipídica das membranas (McCAY
et al., 1984;
RECKNAGEL
et al., 1989; ALEYNIK et al., 1997). Ao final do tratamento de 30 dias,
os animais receberam, por via intra peritonial, CCl
4
em dose única de 1,0 ml/kg de
animal, previamente dissolvido em óleo vegetal. Após o período de seis horas da
administração de CCl
4
, os animais foram sacrificados em câmara de CO
2
. Após o
sacrifício o fígado dos animais foi removido, cirurgicamente, para obtenção do
homogeneizado.
Após sacrifício, os animais foram congelados e encaminhados para o Centro
de Controle de Zoonoses da PMPA-SMS para descarte.
5.3.3. Preparação do homogeneizado
Após a remoção do fígado dos animais, o órgão foi homogeneizado em
tampão fosfato pH 7,0 e congelado a -75
0
C até análise.
123
5.3.4. Medida da lipoperoxidação (TBARS)
Realizada conforme descrito na seção 5.2.4.
5.3.5. Dano protéico
Realizada conforme descrito na seção 5.2.5.
5.3.6. Medida da atividade enzimática
Preparação do homogenezado de fígado.
Realizada conforme descrito na seção 5.3.3.
Medida da atividade da enzima catalase (CAT).
A atividade da catalase (CAT) foi determinada em homogeneizado de fatias
de fígado de rato pelo método de AEBI (1984).
Procedimento
Uma alíquota de 100 μl da porção superior do homogeneizado de fígado de
rato foram suspensos em 1,0 ml de tampão PBS. Retirou-se uma alíquota de 100 μl
da suspensão que foi diluída em 1,0 ml de tampão catalase (D1). Desta solução,
uma aliquota de 100 μl foi diluída a 1,0 ml com tampão catalase(D2). A solução
resultante foi sonicada e centrifugada a 6000 rpm, durante 10 minutos.
O meio reacional foi preparado adicionando-se 40 μl de H
2
O
2
a 8,8 M a 25,0
ml de tampão catalase. Foram pipetados 1,0 ml deste meio em cubeta de quartzo, e
o espectrofotômetro calibrado com um branco de mesma composição, porém sem a
adição de H
2
O
2
. Após a adição de 100 μl de amostra, foi realizada a leitura em
espectrofotômetro a 240 nm, em temperatura ambiente (22 ± 2°C), durante 0; 30, 60
e 90 segundos.
124
A atividade da catalase foi expressa em U/mg de proteína, considerando que
cada unidade (1 U) equivale à quantidade de catalase necessária para decompor 1,0
μmol de H
2
O
2
num minuto, nas condições indicadas no ensaio, de acordo com a
equação 4.
[]
=
−
=
proteínaxABS
)ABSAbs(361,2
UCat
I
FI
U /mg de proteína (4)
Onde: Abs
I
= absorvância inicial (nm); Abs
F
= absorvância final (nm); [proteína] =
mg.
Medida da atividade da enzima superóxido desmutase (SOD).
A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi determinada em
homogeneizado de fígado de rato pelo método de BANISTER E CALABRESE
(1987), o qual consiste na medida da formação do adrenocromo proveniente da
oxidação da adrenalina em presença de ácido clorídrico (HCl), adaptado para leitor
de placas.
Preparação da amostra.
Uma alíquota de 100 μl da porção superior do homogeneizado foi diluída em
200 μl de tampão glicina 50 mM (pH 10,2).
Procedimento
Primeiramente, foram realizadas leituras da auto-oxidação da adrenalina. Em
placas de poliestrireno de 96 poços foram pipetadas alíquotas de 5 μl de catalase 10
mM e 195 μl de tampão glicina 50 mM (pH 10,2). Realizou-se a leitura do branco,
adicionando-se, em seguida 5,0 ml de adrenalina 60 mM. Para a leitura das
amostras foram colocados nos poços 5 μl de catalase 10 mM, alíquotas de 5, 10, 15
e 20 μl de de amostra a ser analisada, completando-se o volume para 195 ml com
tampão glicina 50 mM (pH 10,2). Realizou-se a leitura do branco, adicionando-se,
em seguida 5,0 ml de adrenalina 60 mM. A leitura da absorvância foi realizada a 480
nm, durante 10 minutos, com intervalos de 10 segundos de leitura, em temperatura
125
ambiente (37 ± 2
0
C), sendo a atividade da enzima expressa em U/mg de proteína.
5.4. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e analisados
estatisticamente pelo Teste “t” de Student e Análise da Variância (ANOVA)
seguida do teste de Tukey para as variáveis distribuídas normalmente. Os
dados com distribuição não-normal foram analisados pelo teste não-paramétrico
de Kruskal-Wallis seguido do teste de comparações múltiplas de Dunn.
126
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Avaliação da capacidade antioxidante
in vitro
Vários métodos têm sido desenvolvidos para medir a capacidade
seqüestradora de espécies redoxi-ativas, como um indicador da atividade
antioxidante
in vitro. Tais métodos são, geralmente, baseados na inibição da
acumulação de produtos oxidados, visto que a geração de espécies redoxi-
ativas é bloqueada pela adição de antioxidantes (CHOI
et al., 2002).
Um dos procedimentos mais empregados para avaliar a capacidade
antioxidante de uma substância é a análise de seu potencial de captura de
radicais (
Total Radical Potential-TRAP) (WAYNER et al., 1985).
Este método se baseia na medida dos tempos de indução da oxidação de
uma dispersão de lipídios expostos a uma fonte de radiais livres com
velocidade, constante e conhecida, de produção de radicais livres em condições
anaeróbias. O ABAP (2,2’-azo-bis(2-amidinopropano) é empregado como fonte de
radicais livres e a diminuição na concentração de oxigênio é usada para medir a
velocidade de oxidação. A quimiluminescência do luminol é utilizada para avaliar os
níveis de TRAP, sendo estendida à determinação da capacidade de uma substância
em provocar a diminuição da concentração estacionária de radicais livres, formados
a partir do ABAP (LISSI
et al., 1995).
No presente trabalho o potencial antioxidante total (TRAP) de produtos secos
e frações polifenólicas de
Ilex paraguariensis foi avaliado empregando-se o método
de quimiluminescência emitida por luminol. A adição de concentrações crescentes
dos diferentes produtos secos por
spray-drying ao meio reacional ocasionou
significativa redução na quimiluminescência emitida por luminol, em todas as
concentrações testadas. Esta redução foi mais acentuada e duradoura para a maior
concentração testada (0,625 μg/ml), a qual ocasionou uma diminuição de cerca de
20 % na intensidade da luminescência, superando o efeito observado pelo trolox
(Figura 2.5), sendo um pouco mais acentuada para o produto PSI-D. Os diferentes
adjuvantes empregados na secagem não demonstraram efeito redutor de
127
quimiluminescência descartando, assim, um possível efeito antioxidante dos
mesmos.
Figura 2.5. Cinética antioxidante,
in vitro, dos produtos secos de Ilex
paraguariensis, medida por quimiluminescência. PSI-A: 70 % de resíduo seco +
30 % Aerosil®; PSI-B: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil®+ 15 % Glucidex®;
PSI-C: 70 % de resíduo seco + 30 % Glucidex®; PSI-D: 70 % de resíduo seco +
15 % Aerosil®+ 15 % Avicel.
Na figura 2.6 observa-se o perfil de quimiluminescência emitida por luminol
após a adição de concentrações crescentes de frações polifenólicas e do
produto seco liofilizado que as originou. Semelhante ao observado para os
produtos secos por
spray-drying houve significativa redução na
quimiluminescência emitida por luminol, sendo esta redução proporcional ao
aumento nas concentrações testadas. No entanto, cabe salientar que a semelhança
no perfil cinético das frações em relação aos produtos secos foi obtida empregando
concentrações cerca de 10 vezes menores tanto para a fração FAB como FF, o que
sugere um potencial antioxidante superior para as frações.
PSI-D
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,125 ug/ml
0,25 ug/ml
0,625umg/ml
adjuvante
trolox 0,5 ug/ml
PSI-A
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,125 ug/ml
0,25 ug/ml
0,625 ug/ml
adjuvante
trolox 0,5 ug/ml
PSI-B
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,125 ug/ml
0,25 ug/ml
0,625 ug/ml
adjuvante
trolox 0,5 ug/ml
PSI-C
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,125 ug/ml
0,25 ug/ml
0,625 ug/ml
adjuvante
trolox 0,5 ug/ml
128
LIO
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,125 ug/ml
0,25 ug/ml
0,625 ug/ml
trolox 0,5 ug/ml
FPI 50
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,025 ug/m
0,0625 ug/ml
0,125 ug/ml
trolox 0,5 ug/ml
FPI 100+10
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,025 ug/ml
0,0625 ug/m
0,125 ug/ml
trolox 0,5 ug/ml
LIO
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,125 ug/ml
0,25 ug/ml
0,625 ug/ml
trolox 0,5 ug/ml
FPI 50
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,025 ug/m
0,0625 ug/ml
0,125 ug/ml
trolox 0,5 ug/ml
FPI 100+10
0
20
40
60
80
100
02468
número de ciclos
% CPM
Sistema
0,025 ug/ml
0,0625 ug/m
0,125 ug/ml
trolox 0,5 ug/ml
F100+10
F50
ESLI
FAB
FF
Figura 2.6. Cinética antioxidante,
in vitro, do produto seco liofilizado e frações
polifenólicas, medida por quimioluminescência.
ESLI: extrato seco liofilizado;
FAB: fração polifenólica I - processo submetido a registro; FF: fração
polifenólica II - processo submetido a registro.
A tabela 2.6 apresenta os valores de capacidade antioxidante total
calculada para os diferentes extratos testados. Observa-se que o efeito
antioxidante apresentado foi proporcional ao teor de polifenóis dos produtos
testados. Entre os produtos secos por
spray-drying PSI-C e PSI-D apresentaram
atividade antioxidante mais pronunciada. As frações foram mais ativas, na
ordem FF>FAB, comparativamente ao extrato liofilizado que lhes deu origem.
129
Tabela 2.6. Teor de polifenóis totais (TPT) e capacidade antioxidante
equivalente ao trolox (mM)(CAET) dos extratos secos e frações polifenólicas
obtidos pelo TRAP.
Extratos
ESLI PSI-A PSI-B PSI-C PSI-D FAB FF
TPT
(mg/g)
240,71 161,59 172,44 177,71 193,42 192,70 422,04
CAET
(mM)
0,24 0,13 0,14 0,21 0,22 0,37 0,41
TPT: determinado por CLAE. ESLI: extrato seco liofilizado; PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
; PSI-B:
70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
; PSI-C: 70 % de resíduo seco + 30 % Glucidex
®
; PSI-D:
70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
; FAB e FF: frações polifenólicas – processo submetido a
registro de patente.
Embora os resultados obtidos neste ensaio tenham sido promissores, em que
as amostras mostraram-se potencialmente antioxidantes ensaios adicionais foram
realizados com o intuito de aprofundar a investigação.
A avaliação da peroxidação lipídica foi realizada. A proteção contra a
peroxidação lipídica
in vitro foi avaliada por meio da detecção de derivados
lipoperóxidos formados, empregando como substrato alvo homogeneizado de
gema de ovo (RUBERTO
et al., 2000). Dentre outros produtos formados destaca-se
o malondialdeido (MDA), o qual reage em meio ácido com o ácido tiobarbitúrico
(TBA) na proporção de 2:1 formando um éster com absorção característica a 532 nm
(OHKOWA
et al., 1979).
Todos os produtos secos diminuíram a peroxidação lipídica, de maneira
dose-dependente (figura 2.7). Entre os produtos secos por
spray-drying PSI-A e
PSI-D mostraram-se mais efetivos em todas as concentrações testadas, sendo
o potencial em reduzir a peroxidação lipídica mais expressivo na concentração
de 5,0 μg/ml.
130
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
P
S
I
-
A
0
,
1
P
S
I
-
A
0
,
5
P
S
I
-
A
1
,
0
P
S
I
-
A
5
,
0
P
S
I
-
B
0
,
1
P
S
I
-
B
0
,
5
P
S
I
-
B
1
,
0
P
S
I
-
B
5
,
0
P
S
I
-
C
0
,
1
P
S
I
-
C
0
,
5
P
S
I
-
C
1
,
0
P
S
I
-
C
5
,
0
P
S
I
-
D
0
,
1
P
S
I
-
D
0
,
5
P
S
I
-
D
1
,
0
P
S
I
-
D
5
,
0
E
S
L
I
0
,
1
E
S
L
I
0
,
5
E
S
L
I
1
,
0
E
S
L
I
5
,
0
amostras (
μ
g/ml)
% inibição da lipoperoxidaçã
o
Figura 2.7. Inibição da peroxidação lipídica em homogeneizado de gema de ovo. Os
resultados representam a média +
o desvio-padrão. (n=3). ESLI: extrato seco
liofilizado; PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil®; PSI-B: 70 % de
resíduo seco + 15 % Aerosil®+ 15 % Glucidex®; PSI-C: 70 % de resíduo seco +
30 % Glucidex®; PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil®+ 15 % Avicel.
O mesmo comportamento foi observado para as frações polifenólicas
(figura 2.8). As frações polifenólicas testadas apresentaram importante efeito
protetor da lipoperoxidação, sendo que a fração FF mostrou-se ligeiramente
mais eficiente quando comparada à fração FAB. No entanto, considerando que
a concentração de polifenóis é mais que o dobro em FF do que FAB, o efeito
sobre a lipoperoxidação
in vitro não se revelou proporcional.
131
0
20
40
60
80
100
120
F
A
B
1
,
0
F
A
B
2
,
0
F
A
B
3
,
0
F
A
B
5
,
0
F
F
1
,
0
F
F
2
,
0
F
F
3
,
0
F
F
5
,
0
amostras (
μ
g/ml)
% inibição da lipoperoxidaçã
o
Figura 2.8. Porcentagem de inibição da peroxidação lipídica em homogeneizado
de gema de ovo. Os resultados representam a média +
o desvio-padrão. (n=3);
FAB e FF: frações polifenólicas – processo submetido a registro de patente.
Na tabela 2.7 são apresentados as concentrações dos produtos testados
(μg/ml) necessárias para inibir 50 % da peroxidação lipídica (IC 50%). Tais valores
corroboram que, entre os produtos secos por
spray-drying, PSI-A e PSI-D mostram-
se mais promissores, uma vez que apresentam menores valores de IC 50%,
seguidos das frações polifenólicas.
132
Tabela 2.7. Concentração inibitória da peroxidação lipídica para os produtos
secos e frações polifenólicas de
Ilex paraguariensis.
Extratos IC 50%
ESLI
3,52
PSI-A
1,26
PSI-B
2,77
PSI-C
3,09
PSI-D
0,92
FAB
2,27
FF
1,94
ESLI: extrato seco liofilizado; PSI-A: 70 % de resíduo seco + 30 % Aerosil
®
; PSI-B: 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Glucidex
®
; PSI-C: 70 % de resíduo seco + 30 % Glucidex
®
; PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 %
Aerosil
®
+ 15 % Avicel
®
; FAB e FF: frações polifenólicas – processo submetido a registro de patente.
A lipoperoxidação é, caracteristicamente, uma reação em cadeia iniciada pela
abstração de um átomo de hidrogênio de um ácido graxo poliinsaturado por um
radical livre. Esta etapa leva à formação de outros radicais que propagam a reação
peroxidativa e carbonilas tóxicas, como o malondialdeído, a diversas estruturas
celulares. Pode-se, então, afirmar que
in vitro, tantos os produtos secos quantos as
frações polifenólicas demonstraram atividade antioxidante promissora, podendo
auxiliar na prevenção e combate aos danos celulares causados pela lipoeroxidação.
O radical hidroxila (•OH) é a espécie mais reativa encontrada em meios
biológicos, reagindo no próprio sítio onde foi gerado, sendo responsável por grande
parte dos danos celulares provenientes das espécies redoxi-ativas, causando
quebras na estrutura do DNA, lipoperoxidação de membranas e também, oxidação
protéica (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
Para determinar se os produtos secos e frações polifenólicas poderiam, de
alguma forma, afetar a formação ou os efeitos deste radical, utilizou-se um método
de geração de •OH que se baseia na oxidação da 2-deoxirribose provocada por •OH,
133
produzido pela reação de H
2
O
2
com o ferro, descrito por CHUNG e colaboradores
(1997). Esta técnica espectofotométrica determina a degradação oxidativa da 2-
deoxirribose (2-DR) mediada por radicais hidroxila. Os radicais hidroxila são gerados
pela reação de Fenton na presença de Fe
2+
. O princípio do ensaio é a quantificação
do produto de degradação da 2-DR, o malondialdeído (MDA), através de sua
condensação com o ácido tiobarbitúrico (TBA) (figura 2.9).
Figura 2.9. Substâncias geradas pela reação de Fenton na presença de
FeSO
4
.7H
2
O.
Todos os extratos testados apresentaram atividade antioxidante neste ensaio,
pois foram capazes de inibir a degradação da 2-deoxirribose de maneira dependente
da concentração. Todos os produtos secos por
spray-drying apresentaram forte
potencial
scavenger de radicais •OH, de maneira dose-dependente, em relação ao
controle, entretanto apresentaram atividade menor que o Trolox. Na concentração
mais elevada PSI-C e PSI-D apresentaram uma atividade
scavenger
significativamente maior quando comparados ao PSI-A e PSI-B (figura 2.10). Esta
diferença pode ser associada e correlacionada ao maior teor de polifenóis totais
encontrados para estes produtos secos (PSI-A: 161,59; PSI-B: 172,44; PSI-C:
177,71; PSI-D: 193,42 mg/g).
134
0
20
40
60
80
100
120
140
T
ro
lo
x
PSI
-
A
0,
5
PSI-B 0,5
P
SI
-
C
0,
5
P
SI-D
0,
5
PSI-A
1,
0
PSI-B 1,0
P
SI
-
C
1,
0
P
SI-D 1,0
PSI-A
5,
0
PS
I
-
B
5,0
P
SI
-
C
5,
0
PSI-D 5,0
PSI-A 50
P
S
I
-
B
50
PSI
-
C
50
PSI-D 50
ADJ A 50
ADJ B
50
A
DJ
C
50
ADJ D 50
Concentração (
μ
g/ml)
% de MDA
Figura 2.10. Capacidade
scavenger de radical hidroxila pelos produtos secos.
Resultados expressos como média +
desvio padrão do percentual de produção de
malondialdeído. P< 0,05.
Entre todos os produtos testados, as frações polifenólicas exibiram atividade
scavenger de radicais •OH mais intensa, quando comparadas aos produtos secos
por
spray-drying, bem como ao produto seco liofilizado que as originou (figura 2.11).
Diferente do observado para os produtos secos por
spray-drying a atividade
scavenger foi maior que aquela apresentada pelo trolox, para ambas as frações, na
concentração de 5,0 μg/ml para FAB e a partir da concentração de 0,5 μg/ml para
FF. Esta redução, no entanto, foi estatisticamente significativa apenas para a
concentração de 5,0 μg/ml. A diferença observada entre as duas frações
polifenólicas testadas, demonstrou que, neste caso, o maior teor de polifenóis totais
apresentados para a fração FF parece ser o fator determinante na atividade (FAB:
192,7; FF: 422,04 mg/g).
135
0
20
40
60
80
100
120
Trol
o
x
E
S
LI
0,
1
E
S
LI 0,5
E
S
L
I
1,
0
ESLI 5,
0
FAB 0,1
FAB 0,5
FAB 1,0
FAB 5,0
F
F
0,
1
F
F
0,
5
F
F
1,0
F
F
5,
0
Concentração (
μ
g/ml)
% MDA
**
*
Figura 2.11. Capacidade
scavenger de radical hidroxila pelo produto seco liofilizado
e frações polifenólicas. Resultados expressos como média +
desvio padrão do
percentual de produção de malondialdeído. P< 0,05.
FAB e FF: frações polifenólicas
– processo submetido a registro de patente.
A partir dos resultados exibidos pelos ensaios
in vitro com relação à atividade
antioxidante dos diferentes extratos analisados, foram selecionados os produtos
secos por
spray-drying que revelaram melhor potencial antioxidante, associado às
melhores características tecnológicas e de estabilidade demonstradas no Capítulo 1.
Como todos os produtos secos por
spray-drying testados apresentaram potencial
antioxidante i
n vitro selecionaram-se, então, os que demonstraram viabilidade
tecnológica de produção em escala semi-industrial, no caso, PSI-A e PSI-D,
juntamente com as frações polifenólicas FAB e FF para avaliação subseqüente da
atividade antioxidante
ex vivo.
6.2 Avaliação da capacidade antioxidante ex vivo
A atividade antioxidante ex vivo dos produtos secos PSI-A e PSI-D, bem
como das frações FAB e FF foi avaliada por meio do modelo de estresse
oxidativo induzido por
ter-butilhidroperóxido (t-BHT) em homogeneizado de fatias
de fígado de ratos (FRAGA e TAPPEL, 1988). As concentrações testadas foram
previamente determinadas no ensaio de TRAP
in vitro.
136
O emprego de modelos de homogeneizado de tecidos tem sido
empregado por diversos autores para avaliação do dano oxidativo, pois permite
mimetizar as condições fisiológicas. A adição de um indutor de dano oxidativo
em homogeneizados de tecido leva ao aumento substancial de morte celular
(FRAGA e TAPPEL, 1988, RUDNICK, 2005). A quantificação da lactato
desidrogenase (LDH) nos homogeneizados vem sendo empregada por diversos
autores como indicador de morte celular (PEÑA
et al., 2004; CAMPO et al.,
2005). A co-incubação tanto com os produtos secos PSI-A e PSI-D, como as
frações polifenólicas FAB e FF demonstraram a diminuição da liberação de
LDH, quando comparadas ao controle.
A fim de avaliar se a pré-incubação com PSI-A, PSI-D, FAB e FF era
capaz de inibir o dano oxidativo hepático induzido por
t-BHT, determinou-se,
nos homogeneizados, os níveis de TBARS. No presente trabalho, os produtos
PSI-A; PSI-D e FAB foram capazes de reduzir a produção de TBARS quando
comparados ao controle pré-incubado com
t-BHT, conforme previamente
encontrados nos ensaios de lipoperoxidação
in vitro. Esta redução, no entanto,
não diferiu significativamente do controle antioxidante (figura 2.12A e 2.12B).
Curiosamente, a fração FF não comprovou os resultados obtidos
in vitro (figura
23 C). A ausência de trabalhos na literatura referentes à avaliação da atividade
antioxidante
ex vivo para produtos derivados de Ilex paraguariensis, tais como
produtos secos e frações enriquecidas em compostos polifenólicos, não nos permite
ainda encontrar explicação para a divergência observada nos resultados
in vitro e ex
vivo
, revelando a necessidade de aprofundamento da investigação.
137
0
0,5
1
1,5
2
2,5
C
o
n
t
r
o
l
e
C
o
n
t
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-
B
H
P
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,
5
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+
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-
B
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A
B
+
t
-
B
H
P
F
F
+
t
-
B
H
P
nmol MDA
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0,2
0,4
0,6
0,8
1
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C
on
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ol
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C
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-
B
H
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5
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B
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P
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+
t
-
B
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B
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B
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B
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B
H
P
nmol MDA
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
C
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1
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B
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5
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P
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H
P
A
D
J
P
S
I
-
A
+
t
-
B
H
P
nmol MD
A
A
B
C
Figura 2.12. Níveis de TBARS em homogeneizado de fatias de fígado. Os
resultados representam a média +
o desvio-padrão (n=3). PSI-A: 70 % de
resíduo seco + 30 % Aerosil®; PSI-D: 70 % de resíduo seco + 15 % Aerosil®+
15 % Avicel; FAB e FF: frações polifenólicas – processo submetido a registro de
patente.
138
A dosagem protéica nos homogeneizados demonstrou valores de
proteínas abaixo dos limites mínimos necessários para a determinação do dano
protéico, desta forma, os níveis de carbonilação protéica nos homogeneizados
não puderam ser quantificados.
6.3 Avaliação da capacidade antioxidante
in vivo
Como não foi evidenciada diferença significativa em relação à atividade
antioxidante
in vitro para os produtos secos analisados, selecionaram-se, para
avaliação da atividade antioxidante
in vivo, o produtos PSI-A, por este ter
demonstrado melhor viabilidade tecnológica de produção em escala semi-
industrial, além de melhor proteção frente a fotoestabilidade.
No presente trabalho utilizamos um modelo clássico de indução de dano
hepático por tetracloreto de carbono (CCl
4
). Os efeitos tóxicos do CCl
4
no fígado
já foram extensivamente documentados na literatura. Este agente hepatotóxico
sofre metabolização no fígado pelo complexo de enzimas oxidativas
denominado complexo enzimático citocromo P-450. Este processo gera o
radical triclorometila (CCl3
-
). Parte do radical triclorometila gera o radical
triclorometil-peroxila (CCl3OO
-
) o qual desencadeia o processo de peroxidação
lipídica das membranas (McCAY et al., 1984; RECKNAGEL
et al., 1989;
ALEYNIK
et al., 1997).
A dose de PSI-A a ser administrada aos ratos foi determinada pelo cálculo
da quantidade de produto seco equivalente a uma ingestão de 500 ml de
decocto, em uma proporção droga:solvente de 15 % (m/v), por um homem de 70
kg.
Entre os métodos de avaliação da degradação peroxidativa por CCl
4
está
o ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, através da
quantificação do malondialdeído (MDA). Os níveis de MDA são utilizados como
indicador de dano oxidativo. O CCl
4
foi eficiente na geração de dano hepático,
induzindo lipoperoxidação, uma vez que houve um aumento significativo da
concentração de MDA neste grupo. Observou-se que o pré-tratamento com PSI-
139
A foi capaz de reverter este índice de lipoperoxidação hepática causada pelo
CCl
4
, sugerindo que este produto conferiu proteção às membranas celulares
contra o ataque oxidativo de espécies reativas, corroborando os ensaios
in vitro
e ex vivo realizados, os quais evidenciam para o PSI-A atividade. A avaliação
dos valores encontrados pelo método de TBARS (Figura 2.13) demonstra que o
pré-tratamento com PSI-A foi efetivo na prevenção ao dano lipídico em fígado
de rato. Observa-se, também, que o pré-tratamento com o adjuvante de
secagem não exerceu atividade protetora, demonstrado pelos altos índices de
MDA encontrados em relação ao controle.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Controle Controle
induzido
Aerosil Aerosil
induzido
PSI-A PSI-A
induzido
nmol equivalents MDA/mg protein
*
Figura 2.13. Efeito do produto seco por
spray-drying PSI-A na peroxidação lipídica
hepática induzida por CCl
4
. Resultados expressos como média média + desvio
padrão da produção de malondialdeído.
*
p< 0,05. PSI-A: grupo tratado sem
administração de CCl
4
; PSI-A induzido: grupo tratado submetido ao dano com
administração de CCl
4
.
Dados existentes na literatura sugerem que o CCl
4
induz a carbonilação das
proteínas dos hepatócitos de camundongos. Os resultados obtidos mostraram que a
administração de CCl
4
causou um aumento na carbonilação de proteínas, quando
comparado ao controle que não recebeu o indutor de dano hepático. No entanto,
140
nenhum efeito protetor significante frente à cabonilação protéica hepática foi
constatado com o pré-tratamento com PSI-A (Figura 2.14). Resultados semelhantes
foram encontrados por RUDNICKI (2005) ao avaliar o efeito protetor de extrato de
Passiflora alata em modelo semelhante de dano hepático, em que a administração
do extrato foi eficaz somente na redução da lipoperoxidação, falhando na proteção
frente à carbonilação protéica.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
controle controle
induzido
Aerosil Aerosil
induzido
PSI-A PSI-A
induzido
nmol carbonil/ mg protein
Figura 2.14. Efeito do produto seco por
spray-drying nos níveis de carbonilação
protéica hepática induzida por CCl
4
. Resultados expressos como média média +
desvio padrão da produção de malondialdeído.
*
p< 0,05. PSI-A: grupo tratado sem
administração de CCl
4
; PSI-A induzido: grupo tratado submetido ao dano com
administração de CCl
4
.
Outra característica do dano oxidativo induzido por CCl
4
é a deficiência do
sistema de defesa enzimático, resultante da inativação das mesmas pelos peróxidos
de lipídios e/ou pela produção elevada de espécies reativas (SZYMONIK-LESIUK
et
al., 2003). Assim sendo, avaliou-se a atividade enzimática hepática das enzimas
superóxido desmutase (SOD) e catalase (CAT). A atividade da SOD foi determinada
segundo metodologia descrita por BANNISTER e CALABRESE (1987), em que a
atividade enzimática é mensurada por meio da formação do adenocrono resultante
da oxidação da adrenalina pelo radical superóxido. A atividade da CAT foi
141
determinada segundo método de AEBI (1984), o qual se baseia na decomposição de
H
2
O
2
nas amostras. A taxa de decomposição de H
2
O
2
é determinada em
espectrofotômetro, sendo diretamente proporcional à atividade da CAT.
Os resultados demonstram que o CCl
4
causou uma pequena elevação nos
níveis de CAT e SOD, porém não significativa estatisticamente, em relação ao
controle negativo (dado não apresentado). No entanto, o tratamento prévio com PSI-
A elevou, significativamente, a atividade da SOD quando comparada ao grupo
controle (p<0,05) (tabela 2.8).
Resultados semelhantes já foram descritos na literatura utilizando o mesmo
modelo
in vivo, demonstrando que o pré-tratamento com extratos ricos em polifenóis
pode impedir a inativação das enzimas antioxidantes, possivelmente por um
mecanismo de seqüestro de espécies reativas ou indução da expressão destas
enzimas (CHIADAMBARA
et al., 2002).
Tabela 2.8. Efeito do pré-tratamento com PSI-A na atividade das enzimas
antioxidantes hepáticas em ratos tratados com CCl
4
.
Enzima Controle (n=05) PSI-A (n=05) Aerosil
®
(n=05)
SOD (U/mg proteína) 19,24 + 3,41
31,47 +
7,12
*
18,47 +
5,54
CAT (U/mg proteína) 28,46 + 6,34 34,88 + 22,93
27,38 + 11,00
Os resultados representam a média + erro padrão da média. * p< 0,05 comparado com o grupo
controle.
142
7. CONCLUSÕES
• Os resultados obtidos na determinação do potencial antioxidante total (TRAP)
dos produtos secos ESLI, PSI-A, PSI-B, PSI-C, PSI-D, permitiram verificar
que todos foram eficientes na redução da quimiluminescência, de maneira
dose-dependente. O mesmo foi constatado para as frações FAB e FF,
revelando uma correlação direta entre potencial antioxidante e teor de
polifenóis.
• Tanto os produtos secos por
spray-drying, como as frações polifenólicas
apresentaram atividade antioxidante, de maneira dose-dependente, através
da medida da proteção frente à lipoperoxidação (TBARS)
in vitro;
• De maneira semelhante, tanto os produtos secos por
spray-drying, como as
frações polifenólicas apresentaram atividade
scavenger de radicais hidroxila
in vitro.
• Na investigação da atividade antioxidante
ex vivo os produtos PSI-A e PSI-D
apresentaram atividade antioxidante, expressa pela redução da produção de
TBARS em homogeneizado de fatias de fígado de rato, resultados
corroborando os obtidos nos ensaios
in vitro.
• Os animais pré-tratados, por via oral, na dose de 386 mg/kg com PSI-A em
modelo de dano oxidativo hepático induzido por CCl
4
, apresentaram níveis de
TBARS significativamente menores em relação aos animais do grupo
controle.
• A atividade enzimática das enzimas catalase e superóxido desmutase foi
significativamente maior nos animais pré-tratados com PSI-A, em relação aos
animais do grupo controle.
• Não foi evidenciada atividade antioxidante
in vivo para o grupo de animais
tratados com o adjuvante empregado na obtenção do PSI-A, sugerindo que
sua adição ao processo de secagem não interferiu na atividade biológica dos
produtos derivados.
143
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DISCUSSÃO GERAL
No que tange ao desenvolvimento de novos produtos de Ilex paraguariensis,
a evolução é lenta. Desde que a erva-mate passou a ser processada
industrialmente, o seu principal consumo se dá na forma de produtos tradicionais,
como o chimarrão, tererê ou chá. A possibilidade de ampliação de mercado depende
da priorização do aprimoramento tecnológico no processamento da erva-mate,
pormeio de planejamento estratégico de sua produção e transformação, que atenda
as atuais exigências de qualidade e amplie seu uso em novos produtos tais como
fitoterápicos, cosméticos ou alimentos funcionais.
As recentes descobertas sobre os mecanismos de oxidação celular têm
estimulado a realização de uma pesquisas sobre a ação antioxidante de
constituintes polifenólicos, presentes em algumas plantas e alimentos. A atividade
antioxidante,
in vitro e ex vivo, de infusões de erva-mate tem sido objeto de estudos
publicados, sugerindo que os derivados cafeoilquínicos e os flavonóides (como
rutina, quercetina e canferol) sejam os responsáveis pelas propriedades
antioxidantes e/ou seqüestradoras de radicais livres demonstradas
(FILIP et al.,
2000; SCHINELLA
et al., 2000; CHANDRA e MEJIA, 2004; RAMIREZ-MARES et al.,
2004).
Neste contexto, o potencial terapêutico de preparações extrativas de erva-
mate, o desenvolvimento de produto padronizado, com parâmetros conhecidos, tais
como composição química, atividades biológica e toxicológica, apresenta especial
importância, na medida em que constitui produto intermediário para a preparação de
novos produtos de aplicação farmacêutica, cosmética ou alimentar, além de
propiciar o estabelecimento de metodologias de controle de qualidade da matéria-
prima e produtos derivados.
O capítulo 1 do presente trabalho abordou o desenvolvimento e
caracterização tecnológica de produtos secos por
spray-drying e fração polifenólica
obtidos a partir de solução extrativa aquosa de
Ilex paraguariensis. Para isto,
realizou-se a caracterização tecnológica tanto da matéria-prima vegetal, como da
solução extrativa, por meio de ensaios físicos e físico-químicos e químicos.
A matéria-prima vegetal, constituída de folhas e talos de
Ilex paraguariensis,
apresentou, características semelhantes às relatadas por outros autores (CAMPOS,
1996; GNOATTO, 2002), que empregaram matéria-prima de mesma origem. O
154
método de decocção, para extração da matéria-prima vegetal, foi selecionado com
base nos resultados obtidos por Campos (1996).
Sendo assim, realizou-se o desenvolvimento de metodologia analítica por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para a quantificação de polifenóis,
aplicada à matéria-prima vegetal e produtos derivados, empregando como
substâncias de referência ácido clorogênico e rutina. A validação do método foi
realizada tanto para o decocto (SEI) como para os produtos secos por
spray-drying
(PSI). O método apresentou linearidade e elevada precisão intermediária,
caracterizada pelos baixos coeficientes de variação obtidos nos testes. O ensaio de
exatidão evidenciou que o método em estudo permitiu a recuperação de mais de
99% das substâncias de referência. A validação do método para o PSI-A
demonstrou que o adjuvante de secagem empregado não interferiu na análise dos
polifenóis, viabilizando, assim, a sua aplicação nas demais etapas do processo de
elaboração de produtos derivados.
O emprego da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência associada à
espectrometria de massas para a identificação e quantificação de polifenóois em
Ilex
paraguariensis foi previamente descrito por CARINI e colaboradores (1998) e FILIP
e colaboradores (2001). No presente trabalho esta técnica foi empregada com o
objetivo de identificar os polifenóis presentes nos produtos desenvolvidos. Foram
identificados os picos correspondentes ao ácido neo-clorogênico e ao ácido cripto-
clorogênico. Estas substâncias, bem como as demais que apresentaram espectros
de UV característicos de derivados cafeoilquínicos foram quantificados espressando-
se sua concentração em ácido clorogênico.
A SEI e o PSI-A apresentaram, respectivamente, concentrações de polifenóis
totais de 7,33 mg/ml e 161,59 mg/g denotando a obtenção de um produto seco
concentrado em polifenóis. Em ambos, predominou a presença de derivados
cafeoilquínicos.
O fracionamento do extrato liofilizado de
Ilex paraguariensis demonstrou-se
eficaz quanto à separação dos compostos polifenólicos. Na análise do perfil
cromatográfico das frações obtidas, observou-se a presença dos ácidos
cafeoilquínicos (ácido clorogênico, cripto-clorogênico e iso-clorogênico) nas
frações codificada FAB, já os derivados dicafeoilquínicos e rutina concentraram-se
na fração FF.
155
Quatro produtos secos por spray-drying foram produzidos, em escala semi-
industrial, e caracterizados quanto aos parâmetros de viabilidade tecnológica, como
fluxo, densidades bruta e de compactação, além da realização de um estudo
preliminar de estabilidade frente à luz UV em 254 nm e 352 nm. O produto PSI-A,
contendo dióxido de silício coloidal em sua composição, apresentou as melhores
características de rendimento e fluxo, além de exibir melhor fotoestabilidade, uma
vez que apresentou menor percentual de degradação dos compostos polifenólicos,
após 48 horas de exposição (2 a 13 %), comparativamente aos demais produtos
secos.
No capítulo 2, foi abordada a avaliação da atividade antioxidante in vitro, ex
vivo e in vivo
dos produtos secos por spray-drying e da fração polifenólica de Ilex
paraguariensis. Cabe ressaltar que a literatura relata a realização de estudos com
ensaios
in vitro e ex vivo de infusões, por se constituir na forma tradicionalmente
consumida. Verifica-se que os resultados encontrados são bastante heterogêneos, o
que pode ser explicado tanto pela utilização de diferentes maneiras para o preparo
das infusões, bem como pela variação que pode ocorrer na composição da matéria-
prima em função da variedade, região, clima e fatores de manejo da planta
(BASTOS e TORRES, 2003). Até o presente não foram encontrados relatos de
investigação de atividade antioxidante para produtos secos derivados de
Ilex
paraguariensis, ou de frações enriquecidas em constituintes polifenólicos, o que
revela o ineditismo do estudo.
Os estudos de avaliação da atividade antioxidante
in vitro foram realizados
com os produtos secos por
spray-drying, por liofilização, bem como com as frações
polifenólicas FAB e FF. Tanto os produtos secos, como as frações analisadas,
apresentaram um alto potencial antioxidante
in vitro, de maneira dose-dependente,
em todas as concentrações analisadas.
Os resultados obtidos revelam que há uma correlação direta entre o teor de
polifenóis e sua atividade antioxidante
in vitro; os produtos que apresentaram maior
potencial antioxidante apresentaram maior teor de polifenóis. Resultados
semelhantes foram obtidos para as frações polifenólicas (FAB e FF), as quais
apresentaram atividade antioxidante equivalente à apresentada pelo liofilizado que
lhes deu origem, porém em concentrações cerca de dez vezes menores, sugerindo
que o processo de fracionamento foi efetivo na concentração desta classe de
156
substâncias. Não foi evidenciada atividade antioxidante para os adjuvantes de
secagem testados separadamente, o que sugere que sua adição ao processo de
secagem não interferiu na atividade biológica dos produtos derivados.
Como não foi evidenciada diferença significativa em relação à atividade
antioxidante
in vitro para os produtos secos analisados, selecionaram-se, para
avaliação da atividade antioxidante
ex vivo, os produtos PSI-A e PSI-D, por
apresentarem melhor viabilidade tecnológica de produção em escala semi-industrial,
além de melhor fotoestabilidade. Também as frações polifenólicas FAB e FF foram
testadas. Como modelo experimental empregou-se o homogeneizado de fatias de
fígado de rato, sendo o dano oxidativo induzido por
ter-butilhidroperóxido (t-BHT).
Apesar dos níveis de TBARS serem reduzidos nos grupos pré-incubados com
produtos secos PSI-A e PSI-D e fração polifenólica FAB, esta redução não diferiu
significativamente do grupo controle, demonstrando que o pré-tratamento nas
concentrações testadas não foi suficiente para reverter o dano oxidativo causado por
t-BHT.
A literatura relata que o efeito antioxidante
in vivo de polifenóis é
dependente de diversos fatores tais como via de administração e
biodisponibilidade (KAPLAN
et al., 2001; VILSON et al., 2004). A
biodisponibilidade de constituintes polifenólicos pode ser influenciada pela
estrutura química, absorção intestinal, interação com outros alimentos e
metabolismo intestinal e hepático (MANACH
et al., 2004). O efeito antioxidante
in vivo do produto seco por spray-drying PSI-A foi investigado empregando um
modelo clássico de dano oxidativo hepático induzido por CCl
4
(McCAY et al.,
1984; RECKNAGEL
et al., 1989; ALEYNIK et al., 1997). Os resultados encontrados
demonstraram que o pré-tratamento dos animais com PSI-A foi capaz de inibir o
dano induzido por CCl
4
, demonstrado através da redução nos níveis de TBARS
hepático e aumento da atividade enzimática de catalase e superóxido
desmutase, quando comparados ao grupo controle. Testes
in vivo das frações
FAB e FF constituem perspectiva para a continuidade da investigação. Os
resultados sugerem que o efeito hepatoprotetor frente ao dano oxidativo
demonstrado no ensaio
in vivo, pode ser atribuído à capacidade antioxidante do
PSI-A, já anteriormente demonstrada nos ensaios
in vitro e ex vivo.
CONCLUSÕES GERAIS
159
Os resultados apresentados nos Capítulo 1 e Capítulo 2 do presente trabalho
permitem concluir que:
• A metodologia analítica empregada na quantificação de polifenóis mostrou-se
eficiente para a detecção e quantificação destes constituintes em preparações
obtidas a partir de
Ilex paraguariensis;
• A secagem da solução extrativa aquosa de
Ilex paraguariensis, em escala
semi-industrial, permitiu a obtenção quatro de produtos secos, com
características tecnológicas diferenciadas;
• Dentre os produtos desenvolvidos o produto PSI-A apresentou melhores
características tecnológicas e de fotoestabilidade;
• Todos os produtos secos e frações polifenólicas testadas apresentaram
capacidade antioxidante
in vitro, de maneira dose-dependente, sugerindo que
os polifenóis sejam os responsáveis pela atividade antioxidante demonstrada;
• O pré-tratamento com PSI-A determinou proteção de fígado de rato frente ao
estresse oxidativo e dano celular induzido por tetracloreto de carbono (CCl
4
),
medido por ensaios TBARS
in vivo e pela atividade das enzimas catalase e
superóxido desmutase.
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ANEXO 1
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
ANEXO 2
185
Tabela A2.1. Distribuição granulométrica do PSI-A por microscopia óptica.
Faixa
Granulométrica
(μm)
Diâmetro
médio
(μm)
Freqüência
absoluta
(n)
Freqüência
relativa
(%)
Freqüência
acumulada
(%)
10,3 - 13,6
13,7 - 17,0
17,1 - 20,4
20,5 - 23,8
23,9 - 27,2
27,3 - 30,6
30,7 - 34,0
34,1 - 37,4
37,5 - 40,8
11,95
15,35
18,75
22,15
25,55
28,95
32,35
35,75
39,15
6
104
205
78
85
67
37
5
6
1,01
17,54
34,57
13,15
14,33
11,30
6,24
0,84
1,01
1,01
18,55
53,12
66,27
80,61
91,91
98,15
98,99
100,00
TOTAL - 593 100 -
186
Tabela A2.2. Distribuição granulométrica do PSI-B por microscopia óptica.
Faixa
Granulométrica
(μm)
Diâmetro
médio
(μm)
Freqüência
absoluta
(n)
Freqüência
relativa
(%)
Freqüência
acumulada
(%)
10,3 - 13,6
13,7 - 17,0
17,1 - 20,4
20,5 - 23,8
23,9 - 27,2
27,3 - 30,6
30,7 - 34,0
34,1 - 37,4
37,5 - 40,8
11,95
15,35
18,75
22,15
25,55
28,95
32,35
35,75
39,15
8
118
106
110
176
34
22
1
3
1,38
20,42
18,34
19,03
30,45
5,88
3,81
0,17
0,52
1,38
21,80
40,14
59,17
89,62
95,50
99,31
99,48
100,00
TOTAL - 578 100 -
187
Tabela A2.3. Distribuição granulométrica do PSI-C por microscopia óptica.
Faixa
Granulométrica
(μm)
Diâmetro
médio
(μm)
Freqüência
absoluta
(n)
Freqüência
relativa
(%)
Freqüência
acumulada
(%)
6,9 - 10,2
10,3 - 13,6
13,7 - 17,0
17,1 - 20,4
20,5 - 23,8
23,9 - 27,2
27,3 - 30,6
30,7 - 34,0
34,1 - 37,4
37,5 - 40,8
8,55
11,95
15,35
18,75
22,15
25,55
28,95
32,35
35,75
39,15
10
96
93
146
133
97
36
19
6
2
1,57
15,05
14,58
22,88
20,85
15,20
5,64
2,98
0,94
0,31
1,57
16,61
31,19
54,08
74,92
90,13
95,77
98,75
99,69
100,00
TOTAL - 638 100 -
188
Tabela A2.4. Distribuição granulométrica do PSI-D por microscopia óptica.
Faixa
Granulométrica
(μm)
Diâmetro
médio
(μm)
Freqüência
absoluta
(n)
Freqüência
relativa
(%)
Freqüência
acumulada
(%)
6,9 - 10,2
10,3 - 13,6
13,7 - 17,0
17,1 - 20,4
20,5 - 23,8
23,9 - 27,2
27,3 - 30,6
30,7 - 34,0
8,55
11,95
15,35
18,75
22,15
25,55
28,95
32,35
70
212
170
149
188
55
9
9
8,12
24,59
19,72
17,29
21,81
6,38
1,04
1,04
8,12
32,71
52,44
69,72
91,53
97,91
98,96
100,00
TOTAL - 862 100 -
189
Tabela A2.5. Distribuição granulométrica do PSI-A lote 02 por microscopia
óptica.
Faixa
Granulométrica
(μm)
Diâmetro
médio
(μm)
Freqüência
absoluta
(n)
Freqüência
relativa
(%)
Freqüência
acumulada
(%)
0 – 3,5
3,5 – 7,0
7,0 – 10,5
10,5 – 14,0
14,0 – 17,5
17,5 – 21,0
21,0 – 24,5
24,5 – 28,0
28,0 – 31,5
31,5 – 35,0
35,0 – 38,5
38,5 – 42,0
42,0 – 45,5
45,5 – 49,0
49,0 - 52,5
1,75
5,25
8,75
12,25
15,75
19,25
22,75
26,25
29,75
33,25
36,75
40,25
43,75
47,25
50,75
14
47
208
658
475
184
91
27
18
4
8
1
2
2
1
0,80
2,70
11,95
37,82
27,30
10,57
5,23
1,55
1,03
0,23
0,46
0,06
0,11
0,11
0,06
0,80
3,51
15,46
53,28
80,57
91,15
96,38
97,93
98,97
99,20
99,66
99,71
99,83
99,94
100
TOTAL - 1740 100 -
ANEXO 3
193
PARECER COMISSÃO DE ÉTICA
ANEXO 4
197
Tabela A4.1. Protocolo Experimental: Avaliação da atividade antioxidante in vivo PSI-A erva-mate.
Grupo: Controle Início: 11/06/07 Hora tratam: 16h
Dose: 5,0 ml/1000g Sacrifício:
Animal: rato Sexo: macho
Massa corporal dos ratos em gramas
Data
Rato
Dia
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
198
Tabela A4.2. Protocolo Experimental: Avaliação da atividade antioxidante in vivo PSI-A erva-mate.
Grupo: Adjuvante Início: 11/06/07 Hora tratam: 16h
Dose: 116 mg/1000g Sacrifício:
Animal: rato Sexo: macho
Massa corporal dos ratos em gramas
Data
Rato
Dia
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
199
Tabela A4.3. Protocolo Experimental: Avaliação da atividade antioxidante in vivo PSI-A erva-mate.
Grupo: PSI-A Início: 11/06/07 Hora tratam: 16h
Dose: 386 mg/1000g Sacrifício:
Animal: rato Sexo: macho
Data
Rato
Dia
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
PARECERES
203
204
205
206
BIOGRAFIA
209
Francilene Amaral da Silva
FORMAÇÃO ACADÊMICA
1992-1995 Graduação em Farmácia
Universidade Federal do Pará (UFPA)
Belém, PA
1997 -1999 Bolsista da Cnpq nível mestrado
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS
1999 Obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas com a
dissertação: Obtenção, caracterização e avaliação do extrato seco
liofilizado de
Portulaca pilosa L. (Portulacaceae) sobre a fertilidade e
reatividade uterina de ratas Wistar.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS
1996-2001 Aperfeiçoamento em Habilitação Em Farmácia Industrial.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS
2003-2007 Bolsista da Cnpq nível doutorado
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre, RS
210
PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Trabalhos apresentados em Congressos
SILVA, Francilene Amaral da; KAPPEL, Virginia De Marchi; MOREIRA, Jose Cláudio
Fonseca; BASSANI, Valquiria Linck. Antioxidant and free radical scavenging
potential of Mate (Ilex paraguariensis) powders. In: Free Radicals in Montevideo
2007, Montevideo, 2007.
SILVA, Francilene Amaral da; KAPPEL, Virginia De Marchi; MOREIRA, Jose Cláudio
Fonseca; BASSANI, Valquiria Linck. Avaliação do potencial antioxidante de Ilex
paraguariensis (erva-mate): extratos secos por spray-drying e frações polifenólicas.
In: XIX Simpósio de Plantas medicinais do Brasil, Salvador, 2006.
SILVA, Francilene Amaral da; PAVEI, Cabral; ORTEGA, Geoge González;
MOREIRA, José Cláudio Fonseca; BASSANI, Valquiria Linck . Desenvolvimento de
extratos secos por spray-drying de Ilex paraguariensis (A. St. Hil.): caracterização
tecnológica e determinação do teor de polifenóis por CLAE. In: 4o Congreso
Sudamerica de la Yerba Mate, Posadas, 2006.
SILVA, Francilene Amaral da; BASSANI, Valquíria Linck. Análise de constituíntes
fenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência em preparações de Ilex
paraguariensis. In: XVIII Simpósio de Plantas medicinais do Brasil, Manaus, 2004.
SILVA, Francilene Amaral da; AMARAL, Karine Medeiros Do; MANTESE, Fabiane;
LANGELOH, Augusto . Efeito do extrato seco liofilizado de Portulaca pilosa L. sobre
o desenvolvimento ponderal e parâmetros reprodutivos de ratas Wistar. In: IV
Jornada Paulista de Plantas Medicinais, Ribeirão Preto, 1999.
SILVA, Francilene Amaral da; AMARAL, Karine Medeiros Do; MANTESE, Fabiane;
LANGELOH, Augusto . Estudo de toxicidade reprodutiva de Passiflora edulis forma
flavicarpa em ratas Wistar.. In: IV Jornada Paulista de Plantas Medicinais, Ribeirão
Preto, 1999.
SILVA, Francilene Amaral da; DALSENTER, Paulo Roberto; LANGELOH, Augusto .
Exposição pré e perinatal ao endossulfano: avaliação dos efeitos sobre o trato
reprodutivo masculino. In: XIII Reunião Anual da Federação de Sociedades de
211
Biologia Experimental, 1998, Caxambu, 1998.
SILVA, Francilene Amaral da; ORTEGA, George Gonzáles; PETROVICK, Pedro
Ros; LANGELOH, Augusto. Obtenção e caracterização de extratos de Portulaca
pilosa L. In: XV Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, Águas de Lindóia, 1998.
SILVA, Francilene Amaral da; DALSENTER, Paulo Roberto; LANGELOH, Augusto .
Efeitos do pesticida endossulfano sobre o trato reprodutivo masculino de ratos
Wistar expostos durante a prenhez e lactação. In: XIII Jornada Nacional Y VIII
Latinoamericana de Farmacología Vaterinaria, Santa Fé, 1998.
SILVA, Francilene Amaral da; DALSENTER, Paulo Roberto; LANGELOH, Augusto;
DALLEGRAVE, Eliane. Toxicidade reprodutiva do endossulfano em ratos expostos
durante a prenhez e lactação. In: II Congresso de Medicina Veterinária do Cone Sul,
XIII Congresso Estadual de Medicina Veterinária, XXV Congresso Brasileiro de
Medicina Veterinária, Gramado, 1997.
Artigos completos publicados em periódicos
SILVA, Francilene Amaral da; PAVEI, Cabral; ORTEGA, George González; LIMA,
Eliana Martins; DINIZ, Danielle Guimarães Almeida; MOREIRA, José Cláudio
Fonseca; BASSANI, Valquiria Linck. Validation of a LC method for polyphenol assay
in extractive solution from Ilex paraguariensis (Mate).
Journal of Liquid
Chromatography & Related Technologies
, v.30, p.1-13, 2007.
SILVA, Evandro Gomes da; BEHR, Guilherme Antonio; ZANOTTO-FILHO, Alfeu;
LORENZI, Rodrigo; PASQUALI, Matheus Augusto de Bittencourt; RAVAZOLO, Luis
Gustavo; BORDIGNON Jr., Celso Luis; SILVA, Francilene Amaral da; ABOY, Ana
Lucia; BASSANI, Valquiria Linck; HENRIQUES, Amelia Teresinha; REGINATTO,
Flavio Henrique; DAL-PIZZOL, Felipe; MOREIRA, Jose Claudio Fonseca. Antioxidant
Activities and Free Radical Scavenging Potential of Bauhinia microstachya (RADDI)
MACBR. (Caesalpinaceae) Extracts Linked to Their Polyphenol
Content(Pharmacognosy).
Biological & pharmaceutical bulletin, v, 30; (8), p.1488-
1496, 2007.
212
SILVA, Francilene Amaral da; PETROVICK, Pedro Ros; LANGELOH, Augusto.
Efeito do extrato seco liofilizado de Portulaca pilosa L. (Portulacaceae) sobre a
reatividade uterina à oxitocina de ratas Wistar.
Acta Farmacêutica Bonaerense,
Buenos Aires, v. 20, n. 1, p. 47-52, 2001.
PETRY, Raquel Denise; SOUZA, Tatiane Pereira de; SILVA, Francilene Amaral da;
HEBERLÉ, Graziela; SILVA, Welington Barros da; FLECK, Juliane D; BASSANI,
Valquiria Linck; ORTEGA, George Gonzáles; PETROVICK, Pedro Ros. Influência de
adjuvantes e técnica de enchimento sobre as características farmacêuticas de
cápsulas de gelatina dura contendo teofilina.
Caderno de Farmácia, Porto Alegre, v.
14, n. 1/2, p. 13-20, 1998.
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