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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO DE INATIVIDADE
OVARIANA EM GATAS DOMÉSTICAS
DÉBORA TRAMUJAS BALLAROTTI
CURITIBA
2005
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DÉBORA TRAMUJAS BALLAROTTI
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO DE INATIVIDADE OVARIANA EM
GATAS DOMÉSTICAS
Dissertação apresentada como requisito à
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias, pelo Curso de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias da Universidade
Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Nei Moreira
CURITIBA
2005
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DÉBORA TRAMUJAS BALLAROTTI
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO DE INATIVIDADE OVARIANA EM
GATAS DOMÉSTICAS
Dissertação aprovada no Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da
Universidade Federal do Paraná, como parte das exigências para obtenção do Título de
Mestre em Ciências Veterinárias, pela comissão formada pelos professores:
Orientador: Prof. Dr. Nei Moreira
Universidade Federal do Paraná
Campus Palotina
Examinador: Prof.
Examinador: Prof.
Curitiba, 08 de agosto de 2005
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Nei Moreira pelos ensinamentos, dedicação e
orientação.
Às gatas domésticas que tornaram possível o desenvolvimento deste estudo, e
merecem todo respeito.
Aos felídeos selvagens, que são a razão do desenvolvimento deste estudo, e o
incentivo para protegê-los nos leva ao desenvolvimento de mais pesquisas.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo apoio científico e financeiro.
Ao colega Médico Veterinário Wanderlei de Moraes pela dedicação,
disponibilidade e ensinamentos fundamentais para a realização deste trabalho.
À Itaipu Binacional pelo apoio e empréstimo do laparoscópio.
À Érika Cristiane Gutierrez Felippe, enquanto técnica do Laboratório de
Dosagens Hormonais da USP, pela grande ajuda na realização das dosagens
hormonais e pela dedicação e disponibilidade em receber-me.
Ao Prof. Dr. Cláudio Alvarenga de Oliveira, por permitir a realização das
dosagens hormonais no Laboratório de Dosagens Hormonais da USP.
Ao Prof. Dr. Roberto Rochadelli pelos ensinamentos e atenção.
À colega Elisângela pelo auxílio nas análises estatísticas.
Ao aluno Anderson Luiz de Carvalho, do Curso de Medicina Veterinária da
Universidade Federal do Paraná – Campus Palotina, pelo apoio.
Ao colega Médico Veterinário Julio Cezar Juvenal pelo apoio.
À amiga e Médica Veterinária Laura pelo auxílio.
Ao colega e Médico Veterinário Renato H. Erdmann pelo auxílio e apoio.
Aos meus padrinhos Maria Luiza e Romualdo pela atenção, amor e apoio.
À querida Thalita pelo grande apoio.
Ao meu avô Alceo pelo amor e apoio, sempre.
A todos os meus amigos que sempre me apoiaram para a concretização desta
meta.
Aos funcionários da Tolevet, Dna. Nair e Edvaldo, pela ajuda com a coleta das
fezes das gatas.
Aos secretários do Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da
Universidade Federal do Paraná, Francisco Gerber e Maria José.
DEDICATÓRIA
À minha mãe Adelaide, ao meu pai José, e
ao meu irmão Gustavo, pelo amor, apoio e
dedicação. Vocês são os principais
responsáveis pela minha formação
acadêmica e por hoje eu estar realizando
mais um sonho!
Ao meu marido e querido amigo, além de
tudo, colega Médico Veterinário Rodrigo.
Somente o seu apoio, companheirismo,
amor e dedicação tornaram possível a
concretização deste trabalho.
Principalmente nos momentos mais difíceis.
Obrigada!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
....................................................................................................... vii
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ x
LISTA DE QUADROS
..................................................................................................... xi
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS
................................................... xii
RESUMO
.........................................................................................................................xiii
ABSTRACT
....................................................................................................................xiv
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1
2 REVISÃO DE LITERATURA
........................................................................................ 4
2.1 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA OVARIANA ATRAVÉS DE LAPAROSCOPIA............ 7
2.2 CITOLOGIA VAGINAL ............................................................................................. ..8
2.3 CONTROLE DO CICLO ESTRAL E INIBIÇÃO OVARIANA PRÉVIA À
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL.................................................................................... ..9
2.4 PROGESTÁGENOS................................................................................................. 11
2.5 INDUÇÃO ARTIFICIAL DA OVULAÇÃO ................................................................. 15
2.6 MONITORAÇÃO HORMONAL NÃO-INVASIVA...................................................... 16
3 MATERIAL E MÉTODO.............................................................................................. 18
3.1 ANIMAIS................................................................................................................... 18
3.2 TRATAMENTO HORMONAL................................................................................... 19
3.3 ANESTESIA ............................................................................................................. 21
3.4 INSERÇÃO E REMOÇÃO DO IMPLANTE .............................................................. 21
3.5 ACESSO LAPAROSCÓPICO PARA VERIFICAÇÃO DA ATIVIDADE
OVARIANA............................................................................................................... 22
3.6 ANÁLISE HORMONAL FECAL ............................................................................... 24
3.7 CITOLOGIA VAGINAL ............................................................................................. 26
3.8 ANÁLISE HORMONAL SÉRICA ..............................................................................28
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................... 28
4 RESULTADOS
............................................................................................................ 29
4.1 INIBIÇÃO OVARIANA .............................................................................................. 29
4.2 PERÍODO DE ESTIMULAÇÃO OVARIANA COM GONADOTROPINAS E
PERÍODO APÓS A ESTIMULAÇÃO ....................................................................... 29
4.3 PERÍODO APÓS A ESTIMULAÇÃO COM AS GONADOTROPINAS
EXÓGENAS ............................................................................................................. 30
4.4 COMPARAÇÃO DENTRO DOS GRUPOS.............................................................. 30
4.4.1 Grupo Controle...................................................................................................... 30
4.4.2 Grupo Levonorgestrel............................................................................................. 31
4.4.3 Grupo Etonogestrel ............................................................................................... 31
4.5 CARACTERIZAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES HORMONAIS DURANTE O
CICLO ESTRAL DAS FÊMEAS ............................................................................... 32
4.6 RESULTADO DO EXAME LAPAROSCÓPICO ....................................................... 39
4.7 RESULTADO DA ANÁLISE HORMONAL SÉRICA .................................................39
4.8 RESULTADO DA CITOLOGIA VAGINAL ................................................................ 39
5 DISCUSSÃO
............................................................................................................... 41
6 CONCLUSÃO
............................................................................................................. 45
7 REFERÊNCIAS
........................................................................................................... 46
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - GATO-MARACAJÁ – Leopardus wiedii ........................................................3
FIGURA 2 - GATO-DO-MATO-PEQUENO - Leopardus tigrinus ...................................... 3
FIGURA 3 - JAGUATIRICA - Leopardus pardalis ............................................................. 3
FIGURA 4 - IMAGENS CAPTADAS POR SATÉLITE QUE MOSTRAM AS
MUDANÇAS QUE A TERRA PASSOU DEVIDO À AÇÃO
HUMANA – 1973........................................................................................... 4
FIGURA 5 - IMAGENS CAPTADAS POR SATÉLITE QUE MOSTRAM AS
MUDANÇAS QUE A TERRA PASSOU DEVIDO À AÇÃO
HUMANA – 2003........................................................................................... 5
FIGURA 6 - GATAS DOMÉSTICAS NOS GATIS
INDIVIDUAIS NAS DEPENDÊNCIAS TOLEVET (ANO 2004)....................19
FIGURA 7 -LEVONORGESTREL ORAL (Pilem
®
) ..........................................................20
FIGURA 8 - IMPLANTE ETONOGESTREL (Implanon
®
) ...............................................20
FIGURA 9 - INSERÇÃO DO IMPLANTE ETONOGESTREL EM GATA
DOMÉSTICA ..............................................................................................21
FIGURA 10 - GATA DOMÉSTICA APÓS A INSERÇÃO DO IMPLANTE .......................22
FIGURA 11 - VISUALIZAÇÃO DE FOLÍCULOS OVARIANOS
ATRAVÉS DE EXAME LAPAROSCÓPICO............................................. 23
FIGURA 12 - GATA DOMÉSTICA POSICIONADA
PARA O EXAME LAPAROSCÓPICO ......................................................23
FIGURA 13 - INSERÇÃO DA AGULHA DE VERRES .................................................... 23
FIGURA 14 - EXAME LAPAROSCÓPICO PARA VISUALIZAÇÃO DE ÚTERO E
OVÁRIOS EM GATA DOMÉSTICA (Felis catus) ......................................23
FIGURA 15 - PESAGEM DAS AMOSTRAS FECAIS ..................................................... 25
FIGURA 16 - PRIMEIRA ETAPA DE CENTRIFUGAÇÃO .............................................. 25
FIGURA 17 - AMOSTRA FECAL APÓS FERVURA....................................................... 25
FIGURA 18 - SEGUNDA ETAPA DE CENTRIFUGAÇÃO.............................................. 25
FIGURA 19 - CENTRÍFUGA ........................................................................................... 25
FIGURA 20 - EXTRATO EM SOLUÇÃO NO ETANOL................................................... 25
FIGURA 21 - FLUXO DE SECAGEM COM BANHO-MARIA.......................................... 25
FIGURA 22 - COLETA DE SANGUE EM GATA DOMÉSTICA ...................................... 26
FIGURA 23 - COLORAÇÃO COM PANÓTICO DAS LÂMINAS DO ESFREGAÇO
VAGINAL...................................................................................................27
FIGURA 24 - CÉLULA EPITELIAL VAGINAL PARABASAL
(400 X – COLORAÇÃO PANÓTICO)........................................................ 27
FIGURA 25 – CÉLULAS EPITELIAIS VAGINAIS SUPERFICIAIS
ANUCLEADAS (CORNIFICADAS)
(400 X - COLORAÇÃO PANÓTICO)........................................................ 27
FIGURA 26 – CÉLULA EPITELIAL VAGINAL SUPERFICIAL
NUCLEADA (400 X - COLORAÇÃO PANÓTICO) ...................................27
FIGURA 27 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DA GATA
DOMÉSTICA 1 DO GRUPO CONTROLE ................................................ 32
FIGURA 28 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DA GATA
DOMÉSTICA 2 DO GRUPO CONTROLE ................................................ 33
FIGURA 29 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DA GATA
DOMÉSTICA 3 DO GRUPO CONTROLE ................................................ 33
FIGURA 30 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DA GATA
DOMÉSTICA 4 DO GRUPO LEVONORGESTREL.................................. 34
FIGURA 31 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DA GATA
DOMÉSTICA 5 DO GRUPO LEVONORGESTREL.................................. 34
FIGURA 32 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DA GATA
DOMÉSTICA 6 DO GRUPO LEVONORGESTREL.................................. 35
FIGURA 33 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DA GATA
DOMÉSTICA 7 DO GRUPO ETONOGESTREL....................................... 35
FIGURA 34 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DA GATA
DOMÉSTICA 8 DO GRUPO ETONOGESTREL....................................... 36
FIGURA 35 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DA GATA
DOMÉSTICA 9 DO GRUPO ETONOGESTREL....................................... 36
FIGURA 36 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DAS GATAS
DOMÉSTICAS DO GRUPO C DURANTE O PERÍODO
DE INIBIÇÃO OVARIANA DOS GRUPOS L, E ........................................37
FIGURA 37 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DAS GATAS
DOMÉSTICAS DO GRUPO L DURANTE O PERÍODO DE
INIBIÇÃO OVARIANA COM O LEVONORGESTREL ORAL.....................37
FIGURA 38 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE ESTRÓGENOS DAS GATAS
DOMÉSTICAS DO GRUPO E DURANTE O PERÍODO DE
INIBIÇÃO OVARIANA COM O IMPLANTE ETONOGESTREL.................37
FIGURA 39 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE
ESTRÓGENOS DAS GATAS DOMÉSTICADO GRUPO C
APÓS A AMINISTRAÇÃO DAS GONADOTROPINAS .............................38
FIGURA 40 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE
ESTRÓGENOS DAS GATAS DOMÉSTICADO GRUPO L
APÓS A AMINISTRAÇÃO DAS GONADOTROPINAS .............................38
FIGURA 41 - PERFIL DA EXCREÇÃO FECAL DE
ESTRÓGENOS DAS GATAS DOMÉSTICADO GRUPO E
APÓS A AMINISTRAÇÃO DAS GONADOTROPINAS ............................38
FIGURA 42 - RESULTADOS DA CITOLOGIA VAGINAL REALIZADA NO
MOMENTO DO EXAME LAPAROSCÓPICO DAS GATAS
DOMÉSTICAS DOS GRUPOS C, L, E ..................................................... 40
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - IDENTIFICAÇÃO DAS GATAS DOMÉSTICAS DO EXPERIMENTO NAS
DEPENDÊNCIAS DA TOLEVET (ANO 2004) ............................................18
TABELA 2 - VALORES REFERENTES ÀS CONCENTRAÇÕES BASAIS
DE ESTRÓGENOS FECAIS DAS GATAS DOMÉSTICAS
DURANTE O ESTUDO ............................................................................... 32
TABELA 3 - RESULTADOS DO EXAME LAPAROSCÓPICO DAS GATAS DOS
GRUPOS ETONOGESTREL, LEVONORGESTREL E CONTROLE (3
GATAS DOMÉSTICAS / TRATAMENTO) ..................................................39
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - RESULTADO DA DIFERENÇA MÍNIMA SIGNIFICATIVA DURANTE
O PERÍODO DE INIBIÇÃO OVARIANA DOS GRUPOS C, L, E.............. 29
QUADRO 2 - RESULTADO DA DIFERENÇA MÍNIMA SIGNIFICATIVA DURANTE
O PERÍODO DE ESTIMULAÇÃO COM GONADOTROPINAS E APÓS
DOS GRUPOS C, L, E .............................................................................. 29
QUADRO 3 - RESULTADO DA DIFERENÇA MÍNIMA SIGNIFICATIVA DURANTE
O PERÍODO APÓS A ESTIMULAÇÃO COM GONADOTROPINAS
DOS GRUPOS C, L, E .............................................................................. 30
QUADRO 4 - RESULTADO DA DIFERENÇA MÍNIMA SIGNIFICATIVA DURANTE
O PERÍODO DE INIBIÇÃO OVARIANA, ESTIMULAÇÃO COM
GONADOTROPINAS E APÓS A ESTIMULAÇÃO DAS GATAS
DOMÉSTICAS DO GRUPO CONTROLE................................................. 30
QUADRO 5 - RESULTADO DA DIFERENÇA MÍNIMA SIGNIFICATIVA DURANTE
O PERÍODO DE INIBIÇÃO OVARIANA, ESTIMULAÇÃO COM
GONADOTROPINAS E APÓS A ESTIMULAÇÃO DAS GATAS
DOMÉSTICAS DO GRUPO LEVONORGESTREL .................................. 31
QUADRO 6 - RESULTADO DA DIFERENÇA MÍNIMA SIGNIFICATIVA DURANTE
O PERÍODO DE INIBIÇÃO OVARIANA, ESTIMULAÇÃO COM
GONADOTROPINAS E APÓS A ESTIMULAÇÃO DAS GATAS
DOMÉSTICAS DO GRUPO ETONOGESTREL ....................................... 31
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS
ANOVA - Análise de variância
CASIB - Criadouro de Animais Silvestres da Itaipu Binacional
CL - Corpo lúteo (corpus luteum)
CLs - Corpos lúteos
CV - Coeficiente de variação
DMS - Diferença mínima significativa
DP - Desvio padrão
E
2
- Estrógeno
eCG - Gonadotropina coriônica eqüina
EPM - Erro padrão da média
GL - Grau de liberdade
FIV - Fertilização in vitro
FSH - Hormônio folículo-estimulante
GnRH - Hormônio liberador de gonadotropinas
h - Horas
hCG - Gonadotropina coriônica humana
IA - Inseminação artificial
Kg - Quilogramas
LH - Hormônio luteinizante
ng - Nanogramas
P
4
- Progestágeno
RIA - Radioimunoensaio
SQ - Soma dos quadrados
LDH - Laboratório de Análises Hormonais
USP - Universidade de São Paulo
RESUMO
BALLAROTTI, D. T.
Avaliação de protocolos para indução de inatividade ovariana
em gatas domésticas.
Curitiba, 2005. 65 f. Dissertação (Mestrado em Ciências
Veterinárias) – Universidade Federal do Paraná.
Os pequenos felídeos neotropicais apresentam baixo desempenho reprodutivo em
cativeiro e estão ameaçados de extinção. Como conseqüência do variável ambiente
endócrino após a estimulação com gonadotropinas, os índices de prenhez após a
inseminação artificial em felídeos selvagens não são satisfatórios. Atualmente, o
controle do ciclo estral tem melhorado significativamente os índices de nascimento após
a inseminação artificial em várias espécies. Devido ao gato doméstico ser utilizado
extensivamente como animal modelo, apresentar similaridade na biologia reprodutiva,
disponibilidade e por ser dócil, este estudo foi conduzido com esta espécie. O objetivo
deste estudo consistiu em avaliar protocolos para aumentar a taxa de sucesso em
programas de inseminação artificial em gatas domésticas, além de testar novos
princípios ativos para indução da inatividade ovariana, como o levonorgestrel e
etonogestrel prévia ao protocolo para inseminação artificial (eCG/hCG) em gatas
domésticas. As fêmeas (n=9) foram divididas em três grupos, cada um com três animais,
sendo: 1) controle (C), somente administração de eCG/hCG; 2) levonorgestrel oral (L)
(0,075 mg) durante 37 dias + eCG/hCG; 3) etonogestrel (E), implante subdérmico
durante 37 dias + eCG/hCG. As fêmeas foram submetidas ao exame laparoscópico 29-
39 horas após a administração de hCG para verificação da resposta ovariana. No
momento da laparoscopia foi realizado esfregaço vaginal para monitoração da fase do
ciclo estral. Foram coletadas amostras de fezes 60 dias antes e 60 dias após a
laparoscopia para dosagem hormonal de estrógenos. Os resultados foram avaliados
através de análise estatística (comparação de médias). Para isto foi realizado Teste
ANOVA, analisando-se os níveis de significância, os quais mostraram que o Grupo E
(implante) apresentou inibição ovariana durante a sua utilização. Em contraste com o
Grupo C e o Grupo L oral, o Grupo E apresentou inibição satisfatória das concentrações
de estrógenos durante a sua utilização. O grupo L não apresentou inibição ovariana
durante o tratamento, apresentando picos de estrógenos, e não apresentou diferença
significativa em relação ao Grupo C. Todas as fêmeas do experimento apresentaram
células epiteliais superficiais anucleadas e nucleadas características de estro no
momento do exame laparoscópico. Ao exame laparoscópico foi observado que todas as
fêmeas apresentaram folículos e 77% das gatas apresentaram corpo lúteo. No grupo
etonogestrel as fêmeas apresentaram 7,6 ± 3,4 folículos / gata e 2,0 ± 0,6 corpos lúteos
/ gata, no grupo levonorgestrel foram observados 4,0 ± 0,6 folículos / gata e 5,0 ± 1,5
corpos lúteos, e no grupo controle 6,3 ± 1,4 folículos / gata e 1,5 ± 0,5 corpo lúteo.
Concluiu-se que a utilização de implantes de etonogestrel em gatas domésticas
mostrou-se eficaz, possibilitando a sua utilização prévia aos programas de inseminação
artificial, aspiração folicular, bem como para a contracepção.
Palavras-chave: Inseminação artificial; ovário; felídeos selvagens; contracepção;
ABSTRACT
BALLAROTTI, D. T.
Protocols evaluation for ovarian inactivity induction in
domestic cats.
Curitiba, 2005, p. 65. Dissertation (Master's degree in Veterinary
Sciences) - Federal University of Parana.
Reproductive success in endangered captive neotropical small felids species is very low.
Due to great variability in endocrine environment post gonadotropin treatment,
pregnancy rates are very low. Nowadays, ovarian activity controll improves the AI
success in many species. The domestic cat is a comon model in programs of assisted
reproducive technology for wild felids. In this study, new protocols were compared to
improve the fertilization rates in artificial insemination programs in domestic cat. To
induce ovarian inhibition, levonorgestrel and etonogestrel were used previous to
gonadotropin treatment (eCG/hCG). Female domestic cats were divided in three
treatments: 1) control (eCG/hCG); 2) levonorgestrel (0.075 mg) orally during 37 days +
eCG/hCG; 3) etonogestrel subdermal implant during 37 days + eCG/hCG: laparoscopies
were done 29-39 hours post hCG treatment to verify ovarian activity. Vaginal swabs were
collected at laparoscopic procedures. Fecal samples were colected 60 days before and
60 days after the gonadotropin treatment for estradiol assay. Means comparisons were
done by ANOVA test. Results demonstrated that etonogestrel (implant) and not oral
levonorgestrel successfully suppressed ovarian activity. The levonorgestrel group did not
show ovarian inactivity during the administration, presenting oestradiol peaks and without
significative diference coparing to controll group. All females presented anuclear and
nuclear superficial vaginal epithelial cells at laparoscopies. At the laparoscopics
etonogestrel females group showed 7.6 ± 3.4 ovarian follicles/cat, 2.0 ± 0.6 corpora
lutea/ cat, levonorgestrel group 4.0 ± 0.6 ovarian follicles/cat, 5.0 ± 1.5 corpora lutea, and
control group 6.3 ± 1.4 ovarian follicles/cat, 1.5 ± 0.5 corpora lutea. In conclusion, the
etonogestrel implant used in the domestic cat it was efficient and can be used previous
to gonadotropin protocol in artificial insemination programs, follicular aspiration and
contraception .
Key-words: Artificial insemination; ovary; wild felids; contraception
1 INTRODUÇÃO
A família Felidae é um dos grupos de carnívoros com maior diversidade de
espécies fenotipicamente díspares que vivem em diversas regiões geográficas. Há 37
espécies de felídeos selvagens no mundo, sendo que 23 destas (e suas subespécies)
estão ameaçadas em pelo menos alguma porção de seu ambiente natural (OLIVEIRA,
1994).
Existem dez espécies de felídeos neotropicais, das quais oito ocorrem no Brasil:
Leopardus pardalis, jaguatirica; Leopardus tigrinus, gato-do-mato-pequeno; Leopardus
wiedii, gato-maracajá; Oncifelis geoffroyi, gato-do-mato-grande; Herpailurus
yagouaroundi, gato-mourisco; Oncifelis colocolo, gato-palheiro; Panthera onca (onça-
pintada) e Puma concolor (onça-parda), sendo que as duas últimas pertencem ao grupo
dos grandes felídeos (OLIVEIRA, 1994). Em muitas espécies ameaçadas, determinadas
populações devem ser mantidas em cativeiro, para permanecerem seguras do perigo da
extinção, com a possibilidade de reintrodução futura. Para outras espécies, populações
selvagens são mantidas em vida livre, mas muitas vezes o hábitat está fragmentado,
limitando o intercâmbio genético (SWANSON e WILDT, 1997). As espécies de
pequenos felídeos sul americanos apresentam baixo desempenho reprodutivo em
cativeiro e estão sob alto risco de extinção na natureza. Segundo a Lista Nacional das
Espécies da Fauna Brasileira situam-se na categoria ameaçada (BRASIL, 2005).
As taxas de reprodução de pequenos felídeos nas populações de zoológicos
brasileiros mostram que há baixos índices de nascimento, associados com alta
mortalidade de filhotes nos primeiros trinta dias de vida. Considerando o alto valor
genético da população de pequenos felídeos em cativeiro na América do Sul, e em
razão de muitos indivíduos provenientes de vida livre serem de origem conhecida,
aumenta obrigatoriamente, a necessidade de um programa de conservação destas
espécies (SWANSON e WILDT, 1997).
A jaguatirica (Leopardus pardalis) tem reproduzido melhor em cativeiro do que
as outras espécies de pequenos felídeos neotropicais, como o gato-do-mato-pequeno
(Leopardus tigrinus) e o gato-maracajá (Leopardus wiedii) (SIMON et al., 1997). No
entanto, as instituições que mantêm esses animais dispõem de poucos recintos, o que
caracteriza a urgente necessidade da utilização de biotécnicas de reprodução para
manutenção da variabilidade genética da população cativa.
2
As técnicas de reprodução assistida utilizada em felídeos consistem em coleta
de sêmen pelo método de eletro-ejaculação, avaliação da função espermática,
inseminação artificial (IA), coleta e maturação de oócitos, fertilização e cultivo,
transferência de embriões, formação de bancos de genoma e monitoração de hormônios
através de técnicas não invasivas (SWANSON e WILDT, 1997).
Embora as técnicas de reprodução assistida venham sendo aplicadas em
diversos zoológicos do mundo, poucos trabalhos em felinos selvagens foram
desenvolvidos até o momento no Brasil (MORATO e BARNABE, 1998).
O desenvolvimento efetivo de técnicas reprodutivas requer o conhecimento da
fisiologia reprodutiva da espécie. A fisiologia reprodutiva de pequenos felídeos
neotropicais não tem sido estudada extensivamente. A maioria dos estudos biológicos
de felídeos tem focalizado o gato doméstico, que tornou-se modelo intensivamente
utilizado (SWANSON e WILDT, 1997).
Em razão do gato doméstico ser utilizado extensivamente como um animal
modelo, graças à similaridade na biologia reprodutiva, disponibilidade e por ser mais
dócil que os felídeos selvagens (GOODROWE e WILDT, 1987), este estudo foi
conduzido com essa espécie.
A meta deste estudo foi propiciar um melhor desempenho de gatas domésticas
em programas de inseminação artificial com o controle sobre o ciclo reprodutivo.
Tratamentos hormonais inéditos foram testados para a inativação ovariana temporária
antes do protocolo para desenvolvimento folicular e indução da ovulação para a
inseminação artificial. Sabe-se que a supressão do ciclo estral é indispensável para
melhorar as taxas de fertilização em programas de inseminação artificial, em razão dos
hormônios (secretados pelo ovário), interferirem com a terapia hormonal estabelecida.
Portanto, neste estudo os esforços foram para desenvolver uma resposta hormonal mais
uniforme, proporcionando um ambiente uterino mais adequado para a sobrevivência
embrionária.
Este estudo integra um trabalho conjunto com o Criadouro de Animais Silvestres
da Itaipu Binacional (CASIB), o qual possibilita a futura aplicação dessas biotécnicas,
desenvolvidas em gato doméstico, nas espécies ameaçadas de felídeos selvagens.
O CASIB destaca-se nos cenários nacional e mundial na manutenção e
reprodução de pequenos felídeos neotropicais, especialmente a jaguatirica (Figura 1),
gato-do-mato-pequeno (Figura 2) e gato-maracajá (Figura 3).
3
Através de contínuos avanços em reprodução assistida com espécies de
felídeos selvagens ameaçados de extinção, cada vez mais, procedimentos têm sido
efetuados para a propagação e manejo destas espécies (SWANSON, 2003).
Fig. 1 - Gato maracajá - Leopardus Fig. 2 - Gato-do-mato-pequeno –
wiedii. Leopardus tigrinus .
Fig. 3 - Jaguatirica - Leopardus pardalis.
2 REVISÃO DE LITERATURA
As 10 espécies de felídeos selvagens que ocorrem na América Latina estão em
extinção devido à perda de hábitat, caça e condições de cativeiro inapropriadas. Nos
últimos 10 anos, a conservação desses felídeos tem sido o foco primário de pesquisas
em reprodução e programas de treinamento no Brasil, México e Estados Unidos
(SWANSON e BROWN, 2004).
Na tríplice fronteira, as pressões agrícola e urbana extinguiram o verde na
porção paraguaia e ameaçam o Parque Nacional do Iguaçu, no Brasil (Figuras 4 e 5)
(AMORIM, 2005).
FONTE: Pnuma, USGS, Nasa, apud AMORIM (2005)
Fig. 4 - Imagens captadas por satélite que mostram as mudanças
que a terra passou devido à ação humana – 1973
5
FONTE: Pnuma, USGS, Nasa, apud AMORIM (2005)
Fig. 5 - Imagens captadas por satélite que mostram as mudanças
que a terra passou devido à ação humana – 2003
As técnicas de reprodução assistida, como a inseminação artificial, consistem
em uma ferramenta auxiliar para o manejo de espécies ameaçadas de extinção ( e
indivíduos com dificuldade de acasalamento devido à incompatibilidade comportamental
ou impedimento físico/médico). Essa técnica pode aumentar a diversidade genética de
uma população e expandir o “pool” genético através de cruzamentos de indivíduos
selecionados, além de possibilitar o intercâmbio seguro entre diferentes localizações
geográficas, sem o risco e o custo do transporte de animais vivos (GOODROWE e
WILDT, 1987).
Devido à inseminação artificial vaginal ou transcervical em gatos domésticos
raramente resultar em prenhez, a maioria dos procedimentos de inseminação artificial é
realizado através de laparoscopia. A inseminação artificial laparoscópica permite a
visualização dos ovários, a certificação da ocorrência da ovulação e a deposição
espermática dentro do corno uterino adjacente ao ovário com corpo(s) lúteo(s). O
procedimento básico de inseminação artificial por laparoscopia é similar entre as
6
espécies, utilizando o mesmo equipamento e gonadotropinas exógenas. A
gonadotropina coriônica eqüina (eCG) pode ser utilizada para induzir o desenvolvimento
folicular e a gonadotropina coriônica humana (hCG) para induzir a ovulação. As
dosagens dessas gonadotropinas e o tempo de inseminação devem ser determinados
para cada espécie (SWANSON e WILDT, 1997).
A inseminação artificial foi amplamente utilizada para produzir filhotes viáveis
em várias espécies de felídeos. Como conseqüência da variável resposta ovariana após
a estimulação com gonadotropinas, os índices de prenhez ainda não são satisfatórios.
Atualmente, o controle do ciclo estral tem melhorado significativamente os índices de
fertilidade na IA (PELICAN et al., 2002).
Apesar de pesquisas com o gato doméstico serem válidas para o
desenvolvimento de técnicas de reprodução assistida, variações espécie-específicas
determinam a necessidade de pesquisa básica para cada espécie de felídeo selvagem.
A IA tem alcançado maior sucesso em guepardos do que nas outras espécies
de felídeos selvagens, pois, durante os últimos quinze anos, esta espécie tem sido o
foco de intensivo estudo multi-disciplinar e cooperativo que inclui análises genéticas,
estudos reprodutivos, endócrinos e sobrevivência individual em alta escala, tanto em
cativeiro, quanto em vida livre (WILDT e ROTH, 1997).
Uma das razões para as fêmeas de guepardo terem apresentado maior índice
de sucesso em programas de inseminação artificial, é o fato de que os ovários desta
espécie estão freqüentemente quiescentes (WILDT e ROTH, 1997). Esta inatividade faz
com que o ovário responda de forma mais consistente à administração de
gonadotropinas exógenas (eCG/hCG), talvez devido à presença de alguns folículos
ativos e nenhum tecido lúteo produzindo esteróides endógenos, os quais potencialmente
interferem na ação das gonadotropinas exógenas (BROWN et al., 1995).
No presente estudo foram utilizados o levonorgestrel e o etonogestrel,
progestágenos que atuam em receptores intracelulares no cérebro, inibindo
indiretamente a função pituitária e com efeitos na função ovariana. A verificação dos
efeitos destes hormônios sobre a atividade ovariana de gatas domésticas foi realizada
através da análise de estrógenos fecais, laparoscopia e citologia vaginal.
7
2.1 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA OVARIANA ATRAVÉS DE LAPAROSCOPIA
Atualmente, procedimentos minimamente invasivos são rotineiramente
utilizados em Medicina com o objetivo de diminuir alguns inconvenientes relacionados à
cirurgia convencional. Entre estes procedimentos, encontra-se a cirurgia laparoscópica.
Estudos demonstram sua superioridade em relação à aparência estética, aos custos
hospitalares, à dor pós-operatória, às complicações trans e pós-operatórias, à
recuperação pós-operatória e ao período de hospitalização. Em Medicina Veterinária,
poucos estudos descrevem o emprego da cirurgia laparoscópica em casos clínicos,
porém bons resultados têm sido observados (BRUN & BECK, 1999).
A laparoscopia tem sido adaptada para espécies de diversos tamanhos, desde
ratos até gorilas. A primeira utilização da laparoscopia na maioria das espécies,
incluindo o cão e o gato, foi para o estudo das funções reprodutivas. Uma ampla
variedade de instrumentos está disponível para a laparoscopia de caninos e felinos.
Para exames de rotina, são necessários a ótica, cânula, trocáter, agulha de Verres,
fonte de luz e cabo flexível de fibra ótica (WILDT, 1980).
Para a inseminação artificial laparoscópica, o animal deve ser anestesiado,
posicionado na mesa cirúrgica e ajustado num ângulo de 30 graus, com a região
posterior elevada. Por meio deste posicionamento, os órgãos abdominais movem-se
cranialmente, dessa forma há uma melhor visualização dos órgãos reprodutivos. A
agulha de Verres é inserida através do lado abdominal direito para o interior da cavidade
e um insuflador é adaptado à agulha de Verres para insuflar CO
2
ou ar ambiente para
dentro da cavidade abdominal. Um pneumoperitônio é estabelecido antes da inserção
do trocáter. Após a insuflação do abdômen é realizada uma incisão mediana,
cranialmente à cicatriz umbilical para a inserção do trocáter em um ângulo de 30 graus,
no plano longitudinal do animal. O insuflador é removido da agulha de Verres e inserido
na cânula. Desta forma, a agulha pode ser utilizada para a manipulação dos órgãos
(WILDT, 1980).
O procedimento laparoscópico permite um rápido e simples acesso à atividade
ovariana em gatas domésticas e tem facilitado estudos relacionando a morfologia
ovariana a fatores da reprodução.
Inicialmente, a laparoscopia era utilizada para observar as seqüências de
mudanças dos folículos ovarianos e corpos lúteos (CLs) através do ciclo reprodutivo.
Atualmente, as informações obtidas são utilizadas para o estudo dos efeitos das
8
gonadotropinas exógenas na atividade ovariana, a relação entre a morfologia ovariana e
o comportamento sexual, e mudanças endócrinas durante o estro, fase lútea e prenhez.
Os exames através de laparoscopia em gatas não produziram nenhum efeito no ciclo
estral ou funções endócrinas. Em programas de inseminação artificial, a laparoscopia é
extremamente útil, pois possibilita a deposição espermática diretamente no útero
(WILDT, 1980).
2.2 CITOLOGIA VAGINAL
A citologia vaginal é uma técnica simples que pode ser utilizada para monitorar
a progressão do ciclo estral em cadelas e gatas (THRALL & OLSON, 1999).
Em razão da necessidade de métodos não invasivos tratando-se de felídeos
selvagens, a citologia vaginal é muito utilizada em pesquisas. O epitélio vaginal é
responsivo às mudanças do estrógeno circulante e as mudanças na citologia vaginal
podem ser interpretadas como uma mensuração indireta das concentrações de
estrógeno circulante. A partir do aumento da concentração de estrógeno circulante, as
células aumentam e o núcleo diminui, podendo algumas vezes desaparecer
(PARAKKAL e GREGORIE, 1972).
As avaliações diárias ou em dias alternados da mucosa vaginal são muito
importantes para o manejo de fêmeas, pois possibilitam a definição do momento
apropriado para o acasalamento e manejo reprodutivo. As mudanças das células
esfoliativas da vagina são observadas em esfregaços simples e rápidos que permitem
estimar a progressão do desenvolvimento folicular e secreção de estrógenos durante o
proestro e estimar dessa forma o início e o final do período fértil (BURKE, 1986).
Em razão de ser alvo dos hormônios ovarianos, o epitélio vaginal modifica-se de
duas a quatro camadas de espessura a multicamadas de epitélio durante o estro,
resultando numa esfoliação de um grande número de células do epitélio superficial. As
células são obtidas através da passagem de um swab na região caudal da vagina. O
swab deve ser direcionado crânio dorsalmente quando estiver na vagina. Uma vez
cranial ao orifício uretral, o swab é friccionado contra a parede vaginal. O vestíbulo e a
fossa clitorial devem ser evitados, pois as células superficiais destas áreas podem
alterar a interpretação citológica. As células devem então ser transferidas para uma
lâmina de vidro através de rolamento gentil do swab (THRALL & OLSON, 1999).
9
O esfregaço pode ser fixado imediatamente (1 a 2 segundos) através da
imersão da lâmina em um líquido fixador ou com a utilização de spray fixador de uso
comercial (BURKE, 1986).
Após secas, as lâminas podem ser coradas com a técnica de Schorr (1940) ou
Wright’s-Giemsa (Diff-QuiK). São contadas 100 células epiteliais por lâmina, incluindo
células superficiais nucleadas e anucleadas, células intermediárias e células parabasais,
segundo a classificação de HERRON (1977).
As características da citologia vaginal em gatas domésticas são similares às de
cadelas, no entanto, hemácias não são visualizadas na fase de proestro e os neutrófilos
são raramente encontrados na fase de diestro. No período de estro as células
superficiais anucleadas são predominantes e as células parabasais e intermediárias são
presentes em pequeno número. As células epiteliais vaginais tornam-se
progressivamente cornificadas quando as concentrações de estradiol aumentam. A
proporção de células anucleadas superficiais aumenta 10% no primeiro dia do estro, e
em torno de 40% no quarto dia, atingindo 60% do total de células durante este período.
As células intermediárias diminuem em torno de 10% durante os quatro primeiros dias
do estro. No início da fase de prenhez ou pseudoprenhez, as células parabasais
reaparecem. Na fase final do estro ou no início da pseudoprenhez, pouca quantidade de
neutrófilos pode ser verificada (THRALL e OLSON, 1999).
2.3 CONTROLE DO CICLO ESTRAL E INIBIÇÃO OVARIANA PRÉVIA À
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL
Atualmente, em programas de IA com felídeos selvagens observa-se alta
variabilidade de resposta ovariana às gonadotropinas exógenas, utilizadas para
estimular o crescimento folicular e a ovulação (ROTH et al., 1997).
As gonadotropinas exógenas interferem no ambiente endócrino, interrompendo
a maturação de oócitos, o desenvolvimento e a implantação embrionária. Estudos em
várias espécies têm mostrado que perfis endócrinos anormais podem resultar em um
ambiente folicular anormal, causando qualidade inferior de oócitos, redução da
implantação embrionária e, conseqüentemente, insucesso nos resultados de prenhez
(SMITZ et al., 2001). Os parâmetros associados com a diminuição da fertilidade em
algumas espécies incluem hiperestimulação ovariana, causando elevadas
10
concentrações de estradiol, produção prematura e excessiva de progesterona e luteólise
prematura (FOSSUM et al., 1989).
Para o maior sucesso em programas de reprodução assistida deve-se buscar o
controle do ciclo ovariano. A ovulação pode ser induzida por vários métodos em gatas,
controlando assim a fertilidade (COLBY, 1970).
A estimulação com gonadotropinas em felídeos é comumente associada ao
desenvolvimento de CLs e folículos acessórios, resultando em prolongadas e elevadas
concentrações de estradiol (ROTH et al., 1997) e excessiva produção de progesterona.
As pesquisas realizadas com gatos domésticos indicaram que elevações prolongadas
nas concentrações de estradiol inibem o transporte de embriões no oviduto (GRAHAM
et al., 2000).
Apesar da gata doméstica ser classificada como uma ovuladora induzida e ovular
aproximadamente 24 horas após o coito, recentes pesquisas demonstraram que várias
espécies de felídeos podem apresentar ovulações espontâneas (GUDERMUTH et al.,
1997).
Em casos de ovulação espontânea, há formação do CL, o qual bloqueia a
resposta ovariana à subseqüente estimulação com gonadotropinas (BROWN et al.,
1995).
Em humanos, efetuando-se a inibição do ciclo antes da indução da ovulação
obtém-se um efeito mais uniforme e efetivo em programas de fertilização in vitro (FIV),
resultando em altas taxas de recuperação de oócitos, melhorando a embriogênese e
sucesso da gestação (BARBIERI e HORNSTEIN, 1999).
A inibição folicular é a maneira mais lógica para a regulação da função ovariana
em felídeos. A habilidade em suprimir a atividade cíclica, prévia à estimulação ovariana
via terapia hormonal, tem aumentado o sucesso da reprodução assistida em ruminantes
domésticos e não-domésticos (MORROW et al., 2000), eqüinos (LOFSTEDT e PATEL,
1989), suínos (WOOD et al., 1992), primatas (KENIGSBERG et al., 1984) e humanos
(DAMARIO et al., 1997).
Algumas pesquisas demonstraram que a resposta do gato doméstico às
gonadotropinas exógenas pode ser otimizada quando as fêmeas são pré-tratadas para
induzir a inatividade ovariana, prévia ao estímulo com gonadotropinas exógenas
(DONOGHUE et al., 1992).
Há também evidência de que o guepardo, uma espécie que
cicla intermitentemente, e que apresenta-se em anestro durante a maior parte do ano,
possui alto sucesso de fertilização em programas de IA, com a utilização de
gonadotropinas exógenas (HOWARD et al., 1997; 1992). Portanto, o controle do ciclo
11
estral associado com a resposta do ovário ao estímulo às gonadotropinas em felídeos,
poderia ser testado em gata doméstica, buscando uma resposta similar ao que ocorre
naturalmente no guepardo (PELICAN et al., 2002).
Em resumo, a inativação ovariana é utilizada para a obtenção de resposta mais
homogênea ao estímulo das gonadotropinas exógenas. Na ausência da manutenção de
gonadotropinas, o ovário que sofreu a reação de feedback negativo contém folículos
primários, assim como os folículos que continuam desenvolvendo-se, independente da
ação de gonadotropinas. O resultado é uma população de folículos antrais recentes
altamente suscetíveis à estimulação por gonadotropinas (ZELEZNIK, 2001).
2.4 PROGESTÁGENOS
Os agentes mais comuns utilizados para o controle do ciclo estral em outras
espécies são os implantes contendo progestágenos na forma de dispositivos
intravaginais ou subcutâneos em ruminantes (MORROW et al., 2000), progestágenos
orais em eqüinos e suínos (RHODES, 1991), e análogos do GnRH, provocando o
feedback negativo na pituitária antes da estimulação ovariana em mulheres (SAUER et
al., 1997).
Os progestágenos têm sido muito utilizados em programas de reprodução para
controlar e sincronizar o estro. Em bovinos e outros ungulados, a progesterona, o
acetato de melengestrol ou o acetato de medroxiprogesterona têm sido utilizados em
combinação com prostaglandinas e estrógenos para suprimir a ovulação e sincronizar o
estro em programas de IA ou transferência de embriões (CHAGAS et al., 2002).
O acetato de megestrol tem sido prescrito para diversas situações terapêuticas
em gatas domésticas, incluindo a supressão do estro, como contraceptivo. Os implantes
de acetato de megestrol foram utilizados como contraceptivos em 23 espécies de
felídeos, incluindo o gato doméstico, leão, tigre e guepardo (TURNER & KIRKPATRICK,
1991).
As altas doses de progesterona causam feedback negativo no eixo hipotalâmico
– hipofisário, alterando a produção de GnRH e a síntese e liberação de FSH e LH. Há
também a diminuição da população de receptores de GnRH e a afinidade do GnRH aos
seus receptores (TURZILLO e NETT, 1999).
Em ovuladores induzidos, a inibição do feedback requer concentrações basais
de estrógeno para sintetizar receptores de progesterona em tecidos-alvos. De acordo
12
com o aumento das doses de progesterona (mimetizando aumento endógeno de
atividade luteal), diminui a freqüência dos pulsos de GnRH e da gonadotropina
subseqüente, com posterior diminuição da amplitude do pulso (WOLFE et al., 1989). Os
progestágenos também agem nos tecidos periféricos diminuindo o número de
receptores de estrógeno, alterando a fisiologia renal, adrenal e gastrintestinal,
influenciando o comportamento reprodutivo e induzindo a consistentes alterações como
a hipertrofia uterina, aumento das secreções uterinas e supressão do crescimento
folicular. Também agem diretamente no ovário causando moderada esteroidogênese
(GRAHAM e CLARKE, 1997).
Há também evidências dos efeitos deletérios ao organismo associados à terapia
com progestágenos. Em felídeos, a longa exposição (> 5 anos) tem sido associada à
piometra, hiperplasia endometrial e neoplasia uterina. O uso durante curto período de
acetato de megestrol causa disfunção endócrina, incluindo supressão adrenocortical,
ganho de peso, desenvolvimento mamário, perda de pêlo e diabetes melitus (MUNSON
e MANSON, 1991).
Em felídeos, a presença de folículos pode prevenir uma resposta uniforme ao
protocolo de indução da ovulação em programas de reprodução assistida (GOODROWE
et al., 1989).
Para suprimir a atividade ovariana, o protocolo hormonal deve inibir qualquer
atividade cíclica dos ovários durante a sua utilização e então retornar à atividade normal
após a supressão de sua utilização. Em razão dos protocolos hormonais serem testados
em animais, devem ser seguros e de fácil administração. Os progestágenos seguem
estes critérios, os quais inibem a atividade reprodutiva via feedback negativo do eixo
hipotalâmico-hipofisário-ovariano (PELICAN et al., 2002).
Os progestágenos sintéticos têm sido desenvolvidos para minimizar estes
efeitos colaterais, como por exemplo, o levonorgestrel, o qual é mais seguro comparado
aos antigos progestágenos, como o acetato de megestrol (SIVIN, 1994).
Os implantes de levonorgestrel têm sido utilizados extensivamente para a
contracepção em humanos, mostrando grande eficácia e segurança. Após a colocação
do implante, a contracepção é rapidamente atingida, com níveis de levonorgestrel no
sangue algumas horas após a sua inserção, atingindo concentrações de contracepção
em três dias. Os níveis de liberação são altos (60-85 microgramas/dia) durante o
primeiro mês, diminuindo durante o primeiro ano a aproximadamente 30
microgramas/dia (devido à encapsulação e fibrose de tecido em torno do implante)
13
(FOTHERBY, 1995). Em mulheres, após a remoção do implante, o levonorgestrel é
rapidamente eliminado da circulação e o término do tratamento é atingido dentro de 96
horas e a ovulação pode ocorrer em torno de 4 dias.
Estudos utilizando implantes de levonorgestrel em gatas domésticas indicaram
que o mesmo inibe picos de estradiol e ovulação espontânea, apresentando resultados
satisfatórios ao melhorar a resposta ovariana ao estímulo com gonadotropinas em
programas de reprodução assistida. Em gatas domésticas, a supressão do ciclo estral
através da utilização do hormônio levonorgestrel, prévia ao protocolo de inseminação
artificial, melhora a resposta ovariana ao eCG e hCG (PELICAN et al., 2002).
Verificou-se em um experimento com quatro gatas domésticas, as quais foram
tratadas com levonorgestrel e agrupadas com a presença de um macho, que o estro foi
suprimido e não houve nenhuma prenhez. Outros estudos realizados com gatas
domésticas revelaram que os implantes de levonorgestrel inibiram o comportamento de
estro e a ovulação durante um ano, com poucas alterações uterinas e nenhum distúrbio
endócrino, como os que ocorrem com a utilização do acetato de megestrol. Uma injeção
de levonorgestrel de longa ação previne a gestação por 36 semanas em gatas, e diminui
as concentrações de estradiol circulante. Apesar do levonorgestrel na forma de implante
(Norplant
) estar associado com o crescimento folicular e até mesmo a ovulação em
algumas mulheres, há evidências de que altas doses causam maior inibição ovariana.
Enquanto que baixas doses de progesterona podem estimular a pituitária e aumentar o
número de pulsos de LH, o aumento da dose de progesterona provoca um progressivo
aumento dos intervalos e amplitude dos pulsos de GnRH e LH (BALDWIN et al., 1994).
Inicialmente, os implantes subdérmicos impediam a ovulação somente durante
o primeiro ano. Após este período, a proteção contraceptiva era fornecida
principalmente pelo aumento da viscosidade do muco cervical. O implante de bastonete
único com etonorgestrel foi desenvolvido com o intuito de realizar a completa inibição da
ovulação. Com o desenvolvimento dos polímeros sintéticos, foi possível desenvolver
sistemas de liberação com longa duração de ação, os quais liberam continuamente
quantidades baixas de hormônios. O desenvolvimento desse tipo de sistema, sob a
forma de um implante subdérmico (Implanon
, Organon do Brasil), baseado no
progestágeno etonogestrel, ilustra a contínua pesquisa de métodos contraceptivos
inovadores. As vantagens desse método contraceptivo incluem eficácia não superada,
independência da aderência da usuária e imediato retorno à fertilidade após a remoção
(CROXATTO e MAKARAINEN, 1998).
14
Em mulheres, a fim de manter uma taxa de liberação requerida de 30
microgramas do etonogestrel ao dia, para uma duração projetada de uso de três anos,
determinou-se que era necessária uma taxa de liberação inicial de aproximadamente 60
microgramas ao dia. O perfil da taxa de liberação “in vitro” deste implante é de
aproximadamente 60-70 microgramas ao dia de etonogestrel durante a semana 5-6,
diminuindo para aproximadamente 35-45 microgramas ao dia no final do primeiro ano,
30 a 40 microgramas ao dia no final do segundo ano e 25-30 microgramas ao dia no
final do terceiro ano. As concentrações séricas de etonogestrel aumentam rapidamente
nos primeiros quatro dias após a inserção, atingindo no primeiro dia níveis suficientes
para a inibição da ovulação. (HUBER, 1998).
Os contraceptivos a base de progestinas obtêm sua eficácia através do efeito
inibidor da ovulação sobre o hipotálamo e a glândula pituitária. A supressão da secreção
de gonadotropinas (LH e FSH) evita a ovulação. Conseqüentemente, o corpo lúteo está
ausente e as concentrações de progesterona natural estão baixos. A inibição da
ovulação pode ser determinada pela ausência de um pico de LH, supressão do
desenvolvimento folicular e da produção de estradiol (MCCANN e POTTER, 1994).
Embora a ovulação seja efetivamente inibida por etonogestrel (Implanon
,
Organon do Brasil), pode ainda estar presente uma substancial atividade ovariana. Em
mulheres, a atividade ovariana pode ser avaliada pelas concentrações de gonadotropina
(FSH, LH), E
2
e P
4
, pela monitoração do desenvolvimento folicular por ultra-sonografia.
Nos estudos farmacodinâmicos de Implanon, foi constatado que as concentrações
séricas de FSH eram comparáveis às observadas na fase folicular normal. Além disso,
as concentrações séricas de E
2
diminuíram acentuadamente durante as primeiras
quatro semanas após a inserção do implante, mas começaram gradualmente a se
elevar seis meses após a inserção. A presença de folículos pré-ovulatórios que
secretam quantidades normais de E
2
sugere bioatividade normal de FSH durante o uso
do etonogestrel (Implanon
, Organon do Brasil), e que a atividade ovariana está
presente. A ausência de ovulação e a alta eficácia contraceptiva assegurada por
Implanon
(Organon do Brasil) sugerem que o etonogestrel previne adequados picos de
LH. Isso resulta em uma situação na qual a ovulação é inibida e o E
2
endógeno é
normalmente sintetizado. Portanto, durante o uso de Implanon
(Organon do Brasil) não
foram observados em mulheres sintomas e efeitos de deficiência estrogênica sobre a
densidade mineral óssea (DAVIES et al., 1993).
15
2.5 INDUÇÃO ARTIFICIAL DA OVULAÇÃO
O interesse pelo ciclo estral e indução da ovulação em gatas domésticas está
principalmente relacionado ao comportamento sazonal e atividade sexual. Normalmente
gatas domésticas exibem estros irregulares, períodos interrompidos, ou nenhum
comportamento sexual. Os métodos para induzir o estro e a ovulação podem ser
particularmente importantes para a reprodução de fêmeas que apresentam prolongados
períodos de inatividade sexual ou falhas durante a ovulação (WILDT et al., 1978).
O objetivo da administração de hormônios é estimular a função reprodutiva,
incluindo estro e ovulação. A administração de estrógenos ou compostos relacionados
podem produzir intensa influência no estro, os quais podem também estimular a função
ovariana, incluindo a ovulação. O processo de ovulação em todas as espécies de
mamíferos inclui dois componentes distintos: o desenvolvimento e maturação de
folículos ovarianos e subseqüente ovulação e formação de corpo lúteo (CL). A formação
e o desenvolvimento de folículos ovarianos são ocasionados primeiramente através de
estímulos da secreção de FSH pela glândula pituitária. A pituitária também regula o
processo ovulatório pela secreção de LH durante o estágio avançado do período pré-
ovulatório do ciclo estral. O comportamento de estro e a receptividade sexual são
conseqüências diretas do aumento de estrógenos foliculares na gata doméstica. Muitas
preparações hormonais podem mimetizar as atividades endógenas de FSH e LH e têm
sido utilizadas extensivamente para este propósito em várias espécies de mamíferos.
Estes compostos hormonais incluem FSH suíno, gonadotropina coriônica eqüina (eCG),
gonadotropina coriônica humana (hCG) e hormônio liberador de gonadotropinas
(GnRH). O hCG isolado da urina de mulheres grávidas tem sido utilizado rotineiramente
para induzir a ovulação, freqüentemente em combinação com o eCG. Foi observado que
a combinação da administração de eCG e hCG induz estro em fêmeas em anestro. Em
um estudo com 25 gatas domésticas, a administração de injeções intramusculares de
250 a 500 UI de eCG/dia (20 UI de eCG/Kg/dia) durante dez dias combinada com 500
UI de hCG no décimo dia induziu o estro e a ovulação em 14 das 25 fêmeas de gatas
domésticas (SEAGER et al., 1980).
A administração de gonadotropinas exógenas para induzir a ovulação, visando
otimizar as taxas de fertilização em programas de inseminação artificial, resultaram em
prenhez em gato-do-mato-pequeno e jaguatirica, representando a primeira inseminação
16
artificial com sucesso na América Latina e o primeiro nascimento de filhote de gato-do-
mato-pequeno por IA. Os índices de prenhez, taxas de fertilização e filhotes viáveis
ainda são baixas em felídeos tratados com gonadotropinas exógenas (eCG/hCG). As
dosagens são espécie-específicas e requerem o ajuste de acordo com a espécie. As
doses baixas são ineficazes, enquanto superdosagens podem causar o risco de
superovulação e desequilíbrio hormonal (MORAES et al., 1997).
Pesquisas realizadas com objetivo de obter bons resultados em programas de
IA para felídeos identificaram dois aspectos cruciais para melhorar os índices de
prenhez: a realização da inseminação artificial após o início da ovulação e o uso de
mínimas doses de eCG e hCG para ocorrer a ovulação, desta forma prevenindo a
hiperestimulação ovariana, a qual impede a ovulação (HOWARD et al., 1996).
2.6 MONITORAÇÃO HORMONAL NÃO-INVASIVA
As técnicas de reprodução assistida, como a inseminação artificial, estão
aumentando sua importância para o manejo de espécies selvagens em cativeiro,
portanto, a monitoração de metabólitos esteróides tem sido especialmente útil para
verificar a eficiência das terapias com associações hormonais. A habilidade em atingir a
atividade gonadal é essencial para o entendimento dos fundamentos da reprodução. A
monitoração dos metabólitos esteróides através das fezes foi estabelecida como
ferramenta para a avaliação dos processos reprodutivos em diversas espécies de
mamíferos, incluindo os felídeos. Foram utilizados gatos domésticos como modelo para
análises fecais (radioimunoensaio) de metabólitos de estradiol, progesterona,
testosterona e cortisol, revelando que mais de 85% dos metabólitos foram excretados
através das fezes. Uma das principais vantagens da monitoração dos metabólitos
hormonais através das fezes é de ser um método não-invasivo, possibilitando a coleta
da amostra sem que o animal seja submetido à anestesia ou sedação. Além disso, os
cientistas não se deparam com limitações com relação ao número de amostras a serem
obtidas, as quais podem ser coletadas rotineiramente, possibilitando o acesso à
atividade reprodutiva de um indivíduo ou de uma população. O entendimento da
endocrinologia básica dos felídeos ameaçados pode ser utilizado para melhorar
estratégias de manejo. A técnica não invasiva de monitoração de hormônios fecais é
uma das mais importantes ferramentas disponíveis em centros de pesquisas em
zoológicos nos dias de hoje (BROWN et al., 2001).
17
O radioimunoensaio (RIA) é um método desenvolvido para medir a
concentração de um hormônio particular ou proteína (ex.: esteróides, receptores, etc.)
em uma determinada amostra (urina, extrato fecal, soro, etc.). O método utiliza a
especificidade dos anticorpos para ligarem-se a certas estruturas denominadas
antígenos (CHARD, 1989).
Segundo a descrição de BROWN et al. (1995), os esteróides são extraídos do
material fecal úmido ou através da liofilização, pulverização da amostra colhida e a
padronização do peso do material fecal a ser utilizado. As amostras são liofilizadas
durante 24 h com auxílio do aparelho evaporador giratório. Em seguida, uma alíquota de
0,2 g de fezes secas é fervida em 5 mL de etanol 90% (90% etanol: 10% água destilada)
por 25 minutos. Durante este tempo, o etanol evaporado é gradativamente reposto para
que nenhuma amostra fique seca, de forma que ao final desta etapa o volume inicial
seja mantido. Após centrifugação por 15 minutos a 500G, o sobrenadante é recuperado
e o pellet resultante é ressuspendido em 5 ml de etanol (90%) e homogeneizado em
aparelho vortex e recentrifugado. Os dois sobrenadantes são combinados e secos
completamente sob ar comprimido, e então redissolvidos em 1 ml de metanol. Os
extratos são homogeneizados durante 1 min e levados para o banho ultrasônico por 15
min. Uma alíquota de 100
µ
l do extrato reconstituído em metanol é transferida para
tubos contendo 2 ml de líquido de cintilação e levados para contagem em contador de
cintilação durante 10 min. A taxa de recuperação obtida a partir desta contagem será
utilizada como fator de correção para as concentrações de estradiol e progesterona de
cada amostra fornecida pelo radioimunoensaio (RIE). As amostras são diluídas em
tampão gelatina pH 7,0 [NaPO4 (13,8 g), NaCl (0,9 g), azida sódica (1,0 g), gelatina (1,0
g) e água destilada (1000 ml)] antes das análises para validação do RIE. Este método é
utilizado para ilustrar a diversidade das características do ciclo estral, resposta gonadal
ao fotoperíodo e sensibilidade ovulatória da família Felidae. As análises demonstram
que o estradiol fecal aumenta com a manifestação de estro e que a duração do ciclo
estral varia de acordo com a espécie (BROWN e WILDT, 1997).
3 MATERIAL E MÉTODO
3.1 ANIMAIS
Foram estudadas nove fêmeas de gato doméstico, com idade entre 2 a 3,5 anos,
consideradas sadias ao exame clínico, laboratorial (hemograma) e com histórico
reprodutivo conhecido (Tabela 1). Foram mantidas em gatis individuais nas
dependências da Clínica Tolevet em Toledo – PR e divididas em três grupos, cada um
com três animais (Figura 6). Durante o estudo receberam ração comercial para gato
doméstico (Garfield
, Nutron, Toledo - PR) e água ad libitum.
TABELA 1 - Identificação das gatas domésticas do experimento nas dependências
da Tolevet (Ano 2004)
IDENTIFICAÇÃO DO
ANIMAL
IDADE (ANOS) PESO CORPORAL (Kg)
GESTAÇÕES
ANTERIORES
Gata 1 3,0 3,4 2
Gata 2 2,5 2,5 1
Gata 3 3,5 2,9 2
Gata 4 3,0 2,4 2
Gata 5 2,0 2,5 1
Gata 6 2,5 2,9 1
Gata 7 3,0 2,8 2
Gata 8 2,5 3,3 1
Gata 9 3,5 2,4 2
19
Fig. 6 - Gatas domésticas nos gatis individuais nas dependências da Tolevet (ano 2004)
3.2 TRATAMENTO HORMONAL
No grupo C (controle), as fêmeas foram tratadas com uma única dose
intramuscular (IM) de 200 UI de eCG (gonadotropina coriônica eqüina, (Novormon
5000
)
1
para estimular o desenvolvimento folicular ovariano. Oitenta horas após, cada
fêmea recebeu uma única injeção de 100 UI IM (intramuscular) de hCG (gonadotropina
coriônica humana, Vetecor 5000 UI
)
2
, para induzir a ovulação. Essas dosagens foram
baseadas em experiências prévias, utilizando essas gonadotropinas em várias espécies
felinas, incluindo o gato doméstico, sendo essas dosagens suficientes para induzir a
foliculogênese e a ovulação (HOWARD et al., 1992).
Os tratamentos de inibição ovariana foram estabelecidos para atingir a
supressão ovariana por 37 dias, como o tempo médio equivalente à fase lútea de
pseudoprenhez na gata doméstica (WILDT et al., 1998).
No grupo L, as fêmeas receberam levonorgestrel (progestágeno, Pilem
)
3
via
oral, o qual foi administrado na dose de 0,075 mg/gata, uma vez ao dia durante 37 dias,
1
Syntex S.A / Tecnopec, Av. João Pedro Cardoso 76, Parque Jabaquara, São Paulo-SP.
2
Laboratório Calier do Brasil LTDA, Rua Manoel Pedro Pimentel, 15, Portão 1, Osasco-SP.
3
União Química, Rua Cel. Luiz Tenório de Brito, 90, Embu-Guaçu-SP.
20
com o objetivo da indução da inatividade ovariana (Figura 7). Dois dias após o término
da administração essas fêmeas receberam as mesmas doses anteriormente
mencionadas de eCG e hCG.
Fig. 7 - Levonorgestrel oral (Pilem
®
).
No grupo E, as fêmeas receberam um implante contendo 68 mg de etonogestrel
(Implanon
)
4
, o qual permaneceu durante 37 dias, com o objetivo da indução da
inatividade ovariana (Figura 8). Dois dias após a retirada do implante foram
administrados eCG e hCG conforme protocolo anteriormente descrito.
Fig.8 - Implante etonogestrel (Implanon®).
4
Orgnanon do Brasil Indústria e Comércio, São Paulo - SP.
21
3.3 ANESTESIA
As fêmeas foram anestesiadas entre 29-39 h após a administração de hCG para
o exame laparoscópico. Antes da administração da medicação pré-anestésica, foi
realizado jejum hídrico e alimentar de 12 h. Para a laparoscopia das fêmeas, um plano
cirúrgico de anestesia foi induzido com xilazina (Calmium
, Agener União, 0,5 mg/Kg
IM)
5
e hidrocloridrato de cetamina (Ketamina
, Agener União, 15 mg/Kg IM)
6
e mantido
com anestesia inalatória com halotano (Fluothane
)
7
.
Para a inserção e remoção dos implantes de etonogestrel, as fêmeas foram
induzidas ao plano anestésico administrando-se 3-10 mg/Kg de hidrocloridrato de
cetamina combinado com 0,5-1,5 mg/Kg de xilazina IM.
3.4 INSERÇÃO E REMOÇÃO DO IMPLANTE
Após instituído plano anestésico, as fêmeas foram posicionadas em decúbito
esternal. Uma incisão de 1,5 cm foi realizada na região cervical dorsal, cranial à
escápula, para a inserção do implante (Figuras 9 e10). Os implantes foram removidos
37 dias após a sua inserção.
Fig. 9 - Inserção do implante etonogestrel em gata doméstica.
5
União Química, Rua Cel. Luiz Tenório de Brito, 90, Embu-Guaçu - SP.
6
União Química, Rua Cel. Luiz Tenório de Brito, 90, Embu-Guaçu - SP.
7
Astra Zeneca do Brasil, Rod. Raposo Tavares Km 26,9, Cotia - SP.
22
Fig. 10 - Gata doméstica após a inserção do implante.
3.5 ACESSO LAPAROSCÓPICO PARA VERIFICAÇÃO DE ATIVIDADE OVARIANA
As gatas domésticas foram submetidas à laparoscopia para verificação da
eficiência dos protocolos e resposta ovariana (presença de corpo lúteo, número e
tamanho dos folículos e ovulação) (Figura 11). Todos os aspectos ovarianos e uterinos
foram avaliados. A agulha de Verres (diâmetro de 2 mm) foi utilizada para a
manipulação das estruturas internas e mensuração precisa das estruturas anatômicas
(ovariana e uterina). As gatas domésticas foram anestesiadas e posicionadas na mesa
cirúrgica, a qual foi ajustada num ângulo de 30 graus (Figura 12). Por meio deste
posicionamento, os órgãos abdominais movem-se cranialmente, desta maneira há uma
melhor visualização dos órgãos reprodutivos. Os ovários foram visualizados diretamente
através de um endoscópio rígido com 7 mm de diâmetro, inserido na cavidade peritonial
através de uma cânula de 10 mm colocada médio-ventralmente (Figura 13). Uma agulha
de Verres inserida através da parede abdominal (Figura 14) foi utilizada para manipular
o ovário, dessa forma permitindo o exame de todos os aspectos e a determinação do
número de folículos e corpos lúteos (CLs). Devido ao diâmetro da agulha de Verres ser
conhecido, foi possível mensurar o diâmetro dos folículos, CLs e cornos uterinos. Após a
laparoscopia, as fêmeas receberam uma injeção profilática subcutânea de amoxicilina
trihidrato 30 mg/Kg (Agemoxi
)
8
(Figura 15).
8
União Química Farmacêutica Nacional, S.ª, Rua Cel. Luiz Tenório Brito, 190, Embu-Guaçu - SP.
23
FONTE: PELICAN (2004)
Fig. 11 - Visualização de folículos ovarianos através de
exame laparoscópico.
Fig. 12 - Gata doméstica posicionada Fig. 13 – Inserção da agulha de Verres.
para o exame laparoscópico.
Fig. 14 - Exame laparoscópico para visualização de útero
e ovários em gata doméstica (Felis catus).
24
3.6 ANÁLISE HORMONAL FECAL
Foram coletadas amostras fecais para dosagens de estrógenos, 60 dias antes e
60 dias após a instituição dos protocolos hormonais. As amostras foram mantidas
congeladas a -20°C até a realização da análise. O processamento da amostra (extração
e análise por RIA) foi realizado no Laboratório de Dosagens Hormonais (LDH) da
Universidade de São Paulo (USP), seguindo o padrão já descrito por BROWN et al.
(1995). Primeiramente as fezes foram pesadas (0,3 g) e fervidas em 5 ml de etanol 90%
(90% de etanol: água destilada) por 20 minutos. Durante este tempo, o etanol
evaporado foi gradativamente reposto para que nenhuma amostra ficasse seca, de
forma que ao final desta etapa o volume inicial fosse mantido. Após centrifugação por 15
minutos a 500G, o sobrenadante foi recuperado e o pellet resultante foi ressuspendido
em 5 ml de etanol (90%) e homogeneizado em aparelho Vortex (Phoenix, modelo At 56)
e recentrifugado. Os dois sobrenadantes foram combinados e secos completamente sob
ar comprimido, e então redissolvidos em 1 ml de metanol. Os extratos foram
homogeneizados por 1 minuto, e levados para o banho ultrassônico (Ultra Sonic
Cleaner, USC – 1450 – Unique) por 15 minutos. Uma alíquota de 100 µl do extrato
reconstituído em metanol foi transferida para tubos contendo 2 ml de líquido de
cintilação e levados para contagem em contador de cintilação por 10 minutos. A taxa de
recuperação obtida a partir desta contagem foi utilizada como fator de correção para as
concentrações de estradiol de cada amostra fornecida pelo radioimunoensaio. As
amostras foram diluídas em tampão gelatina pH 7,0 [NaPO4 (13,8 g), NaCl (9,0 g), azida
sódica (1,0 g), gelatina (1,0 g) e água destilada (1000 ml)] antes das análises para
validação do RIE. As amostras preparadas foram dosadas por meio de kits comerciais
de radioimunoensaio em fase sólida, desenvolvidos para avaliação quantitativa de
estradiol no soro humano, previamente validado para extratos de fezes de felinos
(BROWN et al., 1995). As Figuras 15 a 21 ilustram as etapas de extração. Devido
à
problemas ocorridos durante a metodologia do estudo, somente
nas gatas do grupo E
foram coletadas amostras de sangue para dosagem de estrógeno sérico (RIA-LDH
/USP) (Figura 22).
25
Fig. 15 - Pesagem das amostras fecais.
Fig. 16 - Primeira etapa de centrifugação.
Fig. 17 - Amostra fecal após fervura. Fig. 18 - Segunda etapa de centrifugação.
Fig. 19 - Centrífuga (Quimis
®
). Fig. 20 - Extrato em solução no etanol.
Fig. 21 - Fluxo de secagem com banho-maria.
26
Fig. 22 - Coleta de sangue em gata doméstica.
3.7 CITOLOGIA VAGINAL
No momento da laparoscopia foram realizados esfregaços vaginais utilizando-se
swabs estéreis, previamente imersos em solução salina estéril. Para a a realização do
esfregaço, o swab foi direcionado crânio dorsalmente na vagina. Uma vez cranial ao
orifício uretral, o swab foi friccionado contra a parede vaginal. O vestíbulo e a fossa
clitorial devem ser evitados, pois as células superficiais destas áreas podem alterar a
interpretação citológica. As células foram então transferidas para uma lâmina de vidro
através de rolamento gentil do swab (THRALL & OLSON, 1999). Os esfregaços foram
fixados com spray fixador para cabelos e, após secas, as lâminas foram coradas com a
técnica de Wright’s-Giemsa (Diff-QuiK, Panótico) (Figura 23) e observadas em
microscópio óptico com aumento de 400 X para caracterizar a morfologia das células
epiteliais. Para cada exame, 100 células foram contadas em duplicata e classificadas
com base na morfologia, coloração e tamanho do núcleo como: superficial (cornificada),
intermediária ou parabasal (THRALL e OLSON, 1999) (Figuras 24, 25, 26).
27
Fig. 23 - Coloração com panótico das lâminas do Fig. 24 - Célula epitelial vaginal parabasal
esfregaço vaginal. (400 X – coloração Panótico).
Fig. 25 – Células epiteliais vaginais superficiais
Fi
g. 26 – Célula epitelial vaginal superficial
anucleadas (cornificadas) nucleada
(400X – coloração Panótico).
(400X
–
coloração Panótico).
28
3.8 ANÁLISE HORMONAL SÉRICA
Durante o exame laparoscópico foram coletadas amostras sanguíneas de
todas as gatas domésticas do estudo (Grupos C, L e E). Devido a problemas com o
processamento do sangue coletado das fêmeas do grupo C e L, somente o sangue
das gatas domésticas do grupo E foi submetido à análise para dosagem de estradiol
através de RIA no LDH - USP.
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para avaliação do desempenho dos três grupos foi utilizado o método
estatístico de comparação de médias ANOVA. A análise estatística foi dividida em três
etapas, nas quais os grupos que receberam tratamento para supressão ovariana
(grupos L, levonorgestrel e E, etonogestrel) foram comparados com o grupo C (controle)
durante o período de tratamento para supressão ovariana (37 dias). Os grupos L e E
foram também comparados com o grupo C durante e após o período de estimulação
com as gonadotropinas exógenas.
Os grupos também foram avaliados individualmente através da comparação de
médias ANOVA. Em cada grupo comparou-se o período de inibição ovariana com o
período após a administração de gonadotropinas exógenas e o período durante e após
a administração de gonadotropinas.
Para verificar o ciclo estral de cada fêmea, foram quantificadas as
concentrações de estrógenos fecais, sendo calculados os valores médios (± erro padrão
da média). Os valores basais de estradiol foram calculados utilizando um processo
iterativo, no qual os valores que excederam a média + 2,0 DP (desvio padrão) foram
excluídos. A média então foi recalculada e o processo de eliminação foi repetido até que
nenhum valor excedesse a média + 2,0 DP. A média dos valores restantes foi
considerada como valor basal.
4 RESULTADOS
4.1 INIBIÇÃO OVARIANA
Durante a utilização do tratamento para supressão ovariana, o Grupo E
apresentou diferença significativa (p<0,05) em relação aos Grupos C e L (Quadro 1),
observando diminuição significativa das concentrações de estradiol durante a utilização
de etonogestrel. O grupo L não apresentou diferença significativa (p>0,05) em relação
ao Grupo C (Quadro 1).
QUADRO 1 - Resultado da diferença mínima significativa durante o período de
inibição ovariana dos grupos C, L, E
DMS= 0,058 T
α
5%= 2,01
(Grupo C - Grupo E) = 0,07 > DMS ⇒
Grupo C # Grupo E
(Grupo L - Grupo E) = 0,117 > DMS ⇒
Grupo L # Grupo E
(Grupo L - Grupo C) = 0,047 < DMS ⇒ Grupo C = Grupo L
4.2 PERÍODO DE ESTIMULAÇÃO OVARIANA COM GONADOTROPINAS E PERÍODO
APÓS A ESTIMULAÇÃO
Durante e após a administração das gonadotropinas (eCG/hCG), os Grupos L e
E não apresentaram diferença significativa em relação ao grupo C (p>0,05) (Quadro 2),
ou seja, os grupos que receberam tratamento hormonal para inibição ovariana prévia à
administração de gonadotropinas (Grupos L e E) não apresentaram diferença
significativa em relação ao Grupo C, durante e após o período de estimulação ovariana.
QUADRO 2 - Resultado da diferença mínima significativa durante o período de
estimulação com gonadotropinas e após dos grupos C, L, E
DMS= 0,12 T 5% = 1,99
(Grupo C - Grupo E) = 0,11< DMS ⇒
Grupo C = Grupo E
(Grupo L - Grupo E) = 0,005 < DMS
⇒
Grupo L = Grupo E
(Grupo C - Grupo L) =0,11 < DMS
⇒
Grupo C = Grupo L
30
4.3 PERÍODO APÓS A ESTIMULAÇÃO COM AS GONADOTROPINAS EXÓGENAS
Durante o período após a administração das gonadotropinas (eCG / hCG) os
Grupos L e E não apresentaram diferença significativa em relação ao grupo C (p>0,05)
(Quadro 3), ou seja, os grupos que receberam tratamento hormonal para inibição
ovariana prévia à administração de gonadotropinas (Grupos L e E), não apresentaram
diferença significativa em relação ao Grupo C, após o período de estimulação ovariana.
QUADRO 3 - Resultado da diferença mínima significativa durante o período após a
estimulação com gonadotropinas dos grupos C, L, E
DMS= 0,134 T 5% = 1,99
(Grupo C - Grupo E) = 0,09 < DMS ⇒
Grupo C = Grupo E
(Grupo L - Grupo E) = 0,02 < DMS
⇒
Grupo L = Grupo E
(Grupo C - Grupo L) = 0,07 < DMS
⇒
Grupo C = Grupo L
4.4 COMPARAÇÃO DENTRO DOS GRUPOS
4.4.1 Grupo Controle
As gatas do grupo controle apresentaram diferença significativa (p<0,1) no
período de 37 dias anterior à administração das gonadotropinas (Período i) (supressão
dos Grupos L e E), em relação ao período de estimulação com as gonadotropinas (est)
e após a estimulação com as gonadotropinas (est+ap) (Quadro 4).
Já durante o período de estimulação com as gonadotropinas em relação ao
após, não houve diferença significativa (p>0,1) entre as gatas.
QUADRO 4 - Resultado da diferença mínima significativa durante o período de
inibição ovariana, estimulação com gonadotropinas e após a
estimulação das gatas domésticas do grupo controle
DMS= 0,15 T 10%= 1,67
G C (es+ap)
2
– G C (i)
1
= 0,21>DMS ⇒
G C (i)
≠
G C (es+ap)
2
G C (es+ap)
2
– G C (ap)
3
= 0,05 < DMS⇒
G C (est+ap)
2
= G C (ap)
3
G C (ap)
3
– G C (i)
1
=0,17 > DMS ⇒
G C (ap)
3
≠
G C (i)
1
Nota:
G C (i)
1
: Gatas do grupo controle no período de inibição ovariana dos grupos L e E.
G C (es+ap)
2
: Gatas do grupo controle no período de estimulação com gonadotropinas e após a estimulação.
G C (ap)
3
: Gatas do grupo controle no período após a estimulação com as gonadotropinas.
T
α
(10%): 1,67
31
4.4.2 Grupo Levonorgestrel
As gatas deste grupo não apresentaram diferença significativa (p>0,1) no
período de inibição (i) com o levonorgestrel oral em relação ao período estimulação com
as gonadotropinas (est) e período após a estimulação com as gonadotropinas (est + ap)
(Quadro 5).
QUADRO 5 - Resultado da diferença mínima significativa durante o período de
inibição ovariana, estimulação com gonadotropinas e após a
estimulação das gatas domésticas do grupo levonorgestrel
DMS= 0,05 T α(10%)= 1,67
G L (es+ap)
2
–G L (i)
1
= 0,027 < DMS
⇒
G L (i)
1
= G L (es+ap)
2
G L (es+ap)
2
-G L (ap)
3
= 0,008 < DMS⇒
G L (es+ap)
2
= G L (ap)
3
G L (ap)
3
– G L (i)
1
=0,019 < DMS ⇒
G L (ap)
3
= G L (i)
1
Nota:
G L (i)
1
: Gatas do grupo L no período de inibição ovariana com levonorgestrel oral.
G L (es+ap)
2
: Gatas do grupo L no período de estimulação com gonadotropinas e após a estimulação.
G L (ap)
3
: Gatas do grupo L no período após a estimulação com as gonadotropinas.
4.4.3 Grupo Etonogestrel
As gatas deste grupo, durante o período de supressão ovariana (i) com o
implante (etonogestrel), apresentaram diferença significativa (p<0,1) em relação ao
período estimulação com as gonadotropinas (est) e após a estimulação (est+ap)
(Quadro 6). Durante o período de estimulação com as gonadotropinas e período após a
estimulação com as gonadotropinas, as gatas não apresentaram diferença significativa
(p>0,1) entre si (Quadro 6).
QUADRO 6 - Resultado da diferença mínima significativa durante o período de
inibição ovariana, estimulação com gonadotropinas e após das gatas
domésticas do grupo etonogestrel
DMS= 0,09 T 10%= 1,66
GE (es+ap)
2
-GE (i)
1
= 0,146>DMS ⇒
GE (i)
1
≠
GE (es+ap)
2
GE (es+ap)
2
-GE (ap)
3
= 0,042 < DMS⇒GE (es+ap)
2
= GE (ap)
3
GE (ap)
3
- GE (i)
1
=0,10 >DMS ⇒ GE (ap)
3
≠ GE (i)
1
Nota:
G E (i)
1
: Gatas do grupo E no período de inibição ovariana com levonorgestrel oral.
G E (es+ap)
2
: Gatas do grupo E no período de estimulação com gonadotropinas e após a estimulação.
G E (ap)
3
: Gatas do grupo E no período após a estimulação com as gonadotropinas.
32
4.5 CARACTERIZAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES HORMONAIS DURANTE O CICLO
ESTRAL DAS FÊMEAS
Os valores basais de estrógenos fecais do grupo E foram menores que os
valores do grupo C e L. A seguir (Tabela 2) observamos os valores referentes à média
±
EPM
das concentrações de estrógenos fecais (valores basais) das gatas domésticas
durante o estudo.
TABELA 2 - Valores referentes às concentrações basais de estrógenos fecais das
gatas domésticas durante o estudo
Grupo Animal
Média
±
/ EPM
Controle Gata 1
0,03 ± 0,01
Controle Gata 2
0,06 ± 0,005
Controle Gata 3
0,04 ± 0,003
Levonorgestrel Gata 4
0,07
±
0,005
Levonorgestrel Gata 5
0,07
±
0,01
Levonorgestrel Gata 6
0,03 ± 0,02
Etonogestrel Gata 7
0,01 ± 0,002
Etonogestrel Gata 8
0,01 ± 0,002
Etonogestrel Gata 9
0,01 ± 0,002
Os perfis de estrógenos fecais das gatas domésticas do estudo (grupos C,L e E)
estão representados nas Figuras de 27 a 35.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1/2
8/2
15/2
22/2
1/3
8/3
15/3
22/3
29/3
5/4
12/4
19/4
26/4
3/5
10/5
17/5
Estrógenos fecais ng/g
eCG
hCG
laparoscopia
valor basal
eCG
hCG
Laparoscopia
Fig. 27 - Perfil da excreção fecal de estrógenos da gata doméstica 1 do grupo controle
33
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1/3
8/3
15/3
22/3
29/3
5/4
12/4
19/4
26/4
3/5
10/5
17/5
Estrógenos fecais ng/g
Laparoscopia
hCG
eCG
eCG
hCG
laparoscopia
valor basal
Fig. 28 - Perfil da excreção fecal de estrógenos da gata doméstica 2 do grupo controle
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
02/02/03
18/02/03
19/02/03
23/02/03
27/02/03
06/03/03
12/03/03
15/03/03
17/03/03
21/03/03
31/03/03
09/04/03
11/04/03
13/04/03
18/04/03
2704/2003
01/05/03
08/05/03
13/05/03
22/05/03
Estrógenos Fecais ng/g
eCG
hCG
laparoscopia
valor basal
Laparoscopia
hCG
eCG
Fig. 29 - Perfil da excreção fecal de estrógenos da gata doméstica 3 do grupo controle
34
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
27/07/03
04/08/03
05/08/03
08/08/03
16/08/03
17/08/03
26/08/03
30/08/03
02/09/03
08/09/03
14/09/03
18/09/03
21/09/03
26/09/03
05/10/03
08/10/03
13/10/03
19/10/03
31/11/03
07/11/03
Estrógenos Fecais ng/g
Laparoscopia
eCG
hCG
Inibição Ovariana
eCG
hCG
laparoscopia
valor basal
inibição
Fig. 30 - Perfil da excreção fecal de estrógenos da gata doméstica 4 do grupo levonorgestrel
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
29/7
5/8
12/8
19/8
26/8
2/9
9/9
16/9
23/9
30/9
7/10
14/10
21/10
28/10
4/11
Estrógenos Fecais ng/g
eCG
hCG
laparoscopia
valor basal
inibição
Laparoscopia
Inibição Ovariana
eCG
hCG
Fig. 31 - Perfil da excreção fecal de estrógenos da gata doméstica 5 do grupo levonorgestrel
35
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
24/7
31/7
7/8
14/8
21/8
28/8
4/9
11/9
18/9
25/9
2/10
9/10
16/10
23/10
30/10
6/11
Estrógenos fecais ng/g
eCG
hCG
laparoscopia
valor basal
inibição
Laparoscopia
eCG
hCG
Inibição Ovariana
Fig. 32 - Perfil da excreção fecal de estrógenos da gata doméstica 6 do grupo levonorgestrel
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
16/3
23/3
30/3
6/4
13/4
20/4
27/4
4/5
11/5
18/5
25/5
1/6
8/6
15/6
22/6
29/6
6/7
Estrógenos Fecais ng/g
Laparoscopia
eCG
hCG
Inibição Ovariana
eCG
hCG
laparoscopia
valor basal
inibição
Fig. 33 - Perfil da excreção fecal de estrógenos da gata doméstica 7 do grupo etonogestrel
36
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
13/3
20/3
27/3
3/4
10/4
17/4
24/4
1/5
8/5
15/5
22/5
29/5
5/6
12/6
19/6
26/6
3/7
Estrógenos Fecais ng/g
eCG
hCG
laparoscopia
valor basal
inibição
Laparoscopia
eCG
hCG
Inibição Ovariana
Fig. 34 - Perfil da excreção fecal de estrógenos da gata doméstica 8 do grupo etonogestrel
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
23/2
1/3
8/3
15/3
22/3
29/3
5/4
12/4
19/4
26/4
3/5
10/5
17/5
24/5
31/5
7/6
14/6
21/6
28/6
5/7
Estrógenos Fecais ng/g
eCG
hCG
laparoscopia
valor basal
inibição
Laparoscopia
eCG
hCG
Inibição Ovariana
Fig. 35 - Perfil da excreção fecal de estrógenos da gata doméstica 9 do grupo etonogestrel
A seguir, estão representados os perfis de excreção fecal das gatas
domésticas dos grupos C (Figura 36 e 39), grupo L (Figura 37 e 40) e grupo E
(Figura 38 e 41) durante o período de inibição ovariana (37 dias) dos grupos L e E e
período após a administração das gonadotropinas. Verificou-se que os níveis de
estrógenos durante o período de inibição ovariana do grupo E foram
37
significativamente inferiores aos níveis de estrógenos dos grupos L e C. Após a
administração das gonadotropinas não houve diferença significativa entre os grupos.
Fig. 36 – Perfil da excreção fecal de estrógenos do Grupo C durante o período de inibição dos grupos
E e
L.
Fig. 37 – Perfil da excreção fecal de estrógenos do Grupo L durante o período de inibição com o
levonorgestrel oral
.
Fig. 38 – Perfil da excreção fecal de estrógenos do grupo E durante o período de inibição com implante de
etonogestrel.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Estrogenos fecais ng/g
Controle
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
estrógenos fecais ng/g
Levonorgestrel
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Estrógenos fecais ng/g
Etonogestrel
38
Fig. 39 – Perfil da excreção fecal de estrógenos do Grupo C após a administração das gonadotropinas.
Fig. 40 – Perfil da excreção fecal de estrógenos do Grupo L após a administração das gonadotropinas.
Fig. 41 – Perfil da excreção fecal de estrógenos do Grupo E após a administração das gonadotropinas.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Estrógenos fecais ng/g
Controle
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Estrógenos fecais ng/g
Levonorgestrel
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Estrógenos fecais ng/g
Etonogestrel
39
4.6 RESULTADO DO EXAME LAPAROSCÓPICO
De acordo com o exame laparoscópico, verificou-se que as gatas domésticas do
grupo E apresentaram um maior número de folículos (
7,6 ± 3,4)
em relação às gatas
domésticas dos grupos C
(6,3
±
1,4) e L (4,0
±
0,57)
. Com relação ao número de CLs as
gatas do grupo L tiveram maior número (5,0 ± 1,52) em relação ao grupo C (1,5 ± 0,5) e
E (2,0 ± 0,57).
As médias (± EPM) dos resultados do exame laparoscópico estão apresentadas
na Tabela 3.
TABELA 3 - Resultados do exame laparoscópico das gatas dos grupos
etonogestrel, levonorgestrel e controle
(3 gatas domésticas/tratamento)
CONTROLE LEVONORGESTREL ETONOGESTREL
Diâmetro uterino (mm)
7,0 ± 0,3 5,3 ± 0,2 5,5 ± 0,3
Diâmetro ovariano (mm)
9,0 ± 0,8 9,0 ± 0,3 6,4 ± 0,2
Número de folículos / gata
6,3 ± 1,4 4,0 ± 0,5 7,6 ±3,4
Diâmetro dos folículos (mm)
1,7 ± 1,1 1,5 ± 0,2 1,3 ± 0,1
Número de CLs / gata
1,5 ± 0,5 5,0 ± 1,5 2,0 ± 0,6
Diâmetro dos CLs (mm)
2,5 ± 0,5 3,5 ± 0,16 2,16 ± 0,3
4.7 RESULTADO DA ANÁLISE HORMONAL SÉRICA
Através da análise hormonal sérica (RIA), verificou-se que todas as fêmeas do
grupo E estavam com as concentrações de estradiol acima de 150 pg/ml no momento
da laparoscopia indicando período de estro, coincidindo com os resultados da análise
fecal e da citologia vaginal.
4.7 RESULTADO DA CITOLOGIA VAGINAL
Os resultados da citologia vaginal realizada no momento do exame
laparoscópico das gatas domésticas dos grupos C, L e E estão apresentados na
Figura 39. Verificou-se que todas as gatas domésticas do estudo apresentaram
células epiteliais vaginais características de estro (superficiais anucleadas e
superficiais nucleadas) no momento do exame laparoscópico. As fêmeas do Grupo
40
C e L apresentaram 45% de células epiteliais superficiais anucleadas (cornificadas) /
55% de células epiteliais superficiais nucleadas e 72% de células epiteliais
superficiais anucleadas (cornificadas) / 28% de células epiteliais superficiais
nucleadas, respectivamente. No grupo E as fêmeas apresentaram 20% de células
intermediárias, 25% de células epiteliais superficiais nucleadas e 55% de células
epiteliais superficiais anucleadas (cornificadas).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
CONTROLE
LEVONORGESTREL
ETONORGESTREL
Células Epiteliais (%
)
Cornificadas
Epiteliais Superficiais
Parabasais
Fig.42 – Resultados da citologia vaginal realizada no momento do exame laparoscópico das
gatas domésticas dos grupos C, L e E
5 DISCUSSÃO
Os resultados mostraram que a inibição ovariana foi atingida nas gatas
domésticas que receberam o implante de etonogestrel prévio ao protocolo de
estimulação com as gonadotropinas exógenas (eCG/hCG). Foi verificado que o grupo E
(etonogestrel) apresentou diferença significativa (p<0,05) em relação ao grupo C
(controle) durante o período de inibição ovariana. Durante este período, as fêmeas do
Grupo E apresentaram inatividade ovariana com baixas concentrações de estrógenos e
ausência de picos. Desta forma, verifica-se que o implante de etonogestrel provocou
supressão ovariana durante a sua utilização, indicando que a dose de 68 mg/implante
foi eficaz em gatas domésticas no estudo. Segundo MCCANN & POTTER (1994), os
contraceptivos apenas com progestágeno obtêm sua eficácia através do efeito inibidor
da ovulação do progestágeno sobre o hipotálamo e a glândula pituitária. A supressão da
secreção de gonadotropinas (LH e FSH) evita a ovulação. Conseqüentemente, o corpo
lúteo está ausente e as concentrações de progesterona natural estão baixos. A inibição
da ovulação pode ser determinada pela ausência de um pico de LH, supressão do
desenvolvimento folicular e da produção de estradiol. De acordo com DAVIES et al.
(1993), a ausência de ovulação e a alta eficácia contraceptiva assegurada por
Implanon
(Organon do Brasil) sugerem que o etonogestrel previne adequados picos de
LH. Isso resulta em uma situação na qual a ovulação é inibida e o E
2
endógeno é
sintetizado.
Segundo PELICAN et al. (2002), estudos utilizando implantes de levonorgestrel
em gatas domésticas indicaram que o mesmo inibe picos de estradiol e ovulação
espontânea, apresentando resultados satisfatórios ao melhorar a resposta ovariana ao
estímulo com gonadotropinas em programas de reprodução assistida. Em gatas
domésticas, a supressão do ciclo estral através da utilização do hormônio
levonorgestrel, prévio ao protocolo de inseminação artificial, melhora a resposta
ovariana ao eCG e hCG. Ao contrário do resultado obtido por PELICAN (2004), no
presente estudo, o grupo L não apresentou diferença significativa (p>0,05) em relação
ao grupo C durante o período de inibição ovariana. Durante a administração do
levonorgestrel oral, as fêmeas não apresentaram inibição ovariana, verificando-se a
presença de picos de estradiol em todas as fêmeas tratadas. Conseqüentemente o
Grupo L não teve diferença em relação ao grupo C, não demonstrando a supressão
ovariana desejada. Este resultado pode estar relacionado com o método de
42
fracionamento do medicamento prévio à administração, ou dose utilizada, o que pode ter
influenciado de forma negativa nos resultados observados. Deve-se também levar em
consideração a taxa de absorção do progestágeno oral, pois vários fatores podem
influenciar, como a ingestão diária de pêlos. Novos estudos podem ser realizados
utilizando doses diferentes, ou na mesma dose já utilizada com a manipulação do
hormônio propriamente dito. Levando-se em consideração a relação custo/benefício, a
utilização de levonorgestrel oral em novos estudos deve ser investigada devido ao
menor custo e facilidade de administração, podendo ser adicionado ao alimento.
As fêmeas dos grupos E e L não apresentaram diferença significativa (p>0,05)
em relação ao grupo C durante e após a administração de gonadotropinas exógenas.
Segundo PELICAN (2004), os estímulos com gonadotropinas aumentam o tempo de
duração do estro e das concentrações de estradiol, comparado aos níveis do período
pré-inibição. Sabe-se que a estimulação com as gonadotropinas induz a uma segunda
onda folicular em gatas, levando à prolongada exposição aos estrógenos. De acordo
com a análise fecal, durante o período de estimulação com gonadotropinas, duas das
três fêmeas do grupo E estavam com concentrações basais de estradiol, e no momento
do exame laparoscópico, todas as fêmeas deste grupo apresentaram picos de estradiol.
De acordo com a análise sérica, as concentrações de estradiol foram acima de 150
pg/ml no momento da laparoscopia indicando período de estro, coincidindo com os
resultados da análise fecal. Após a laparoscopia apresentaram diminuição das
concentrações de estradiol. Verifica-se desta forma, que as gatas deste grupo
apresentaram uma resposta uniforme e constante dos ovários à estimulação com as
gonadotropinas exógenas,
não havendo interferência de gonadotropinas endógenas na
resposta ovariana. A ausência de um aumento excessivo nas concentrações de
estradiol após a laparoscopia é benéfica, não ocorrendo o hiperestrogenismo, o qual
alteraria o ambiente uterino e diminuiria a taxa de prenhez. Nenhuma das fêmeas do
grupo L apresentou picos de estradiol no momento da laparoscopia. Das três fêmeas
deste grupo, duas apresentaram concentrações de estradiol aumentadas antes da
laparoscopia, período da estimulação ovariana com as gonadotropinas exógenas. Após
a laparoscopia, duas das três fêmeas do grupo L apresentaram concentrações de
estradiol superiores às encontradas no momento da laparoscopia. Estas concentrações
de estradiol permaneceram aumentadas por aproximadamente 4 dias. Apenas uma, das
três fêmeas deste grupo, não apresentou picos de estradiol durante e após a
estimulação com as gonadotropinas. Dessa forma, verifica-se uma resposta não
43
uniforme das fêmeas à estimulação, ocorrendo hiperestrogenismo após a laparoscopia
em duas das três fêmeas tratadas com levonorgestrel oral. No grupo C foi verificado que
todas as fêmeas apresentaram aumento das concentrações de estradiol no momento do
exame laparoscópico e que uma das fêmeas deste grupo apresentou concentrações
basais de estradiol no momento da estimulação com as gonadotropinas. Em uma das
três fêmeas, as concentrações de estradiol após a laparoscopia (± 5 dias) foram
superiores às concentrações no momento da laparoscopia. As concentrações de
estradiol permaneceram elevadas por ± 9,3 dias, ocorrendo hiperestrogenismo nesta
fêmea.
A presença de folículo acessório e CL após a indução da ovulação contribui
para baixos índices de fertilização em programas de IA em felídeos. Alguns fatores que
resultam na diminuição das taxas de fertilização e de nidação embrionária em felídeos,
são elevadas e prolongadas concentrações de estradiol, elevada secreção de
progesterona ou luteólise prematura, as quais são ocasionadas pela hiperestimulação
ovariana. Outro contribuinte para a baixa eficiência reprodutiva seguida de estimulação
com gonadotropinas em felídeos selvagens é o desenvolvimento de uma segunda onda
folicular e ovulação após 5–7 dias da primeira onda folicular. O desenvolvimento do
folículo acessório e desenvolvimento luteal resultam numa elevada e prolongada
concentração de estradiol e progesterona, os quais estão associados à interferência no
transporte do embrião pelo oviduto e diminuição das taxas de prenhez (PELICAN,
2004).
Apesar da gata doméstica ser classificada como uma ovuladora induzida e
ovular aproximadamente 24 horas após o coito, recentes pesquisas com gatas
domésticas demonstraram que essas podem apresentar ovulações espontâneas
(GUDERMUTH et al., 1997). Neste estudo, todas as fêmeas do grupo L e
duas das três
fêmeas do grupo E apresentaram picos de estradiol fora do período de tratamento
(inibição e estimulação com gonadotropinas).
Verifica-se então que cinco das nove
fêmeas do estudo apresentaram picos de estradiol em períodos que não foram
administrados hormônios exógenos (antes do período de supressão ovariana e após o
período de estimulação com gonadotropinas).
As concentrações de estradiol dos picos
das fêmeas que responderam ao estímulo com gonadotropinas foram maiores que as
concentrações de estradiol de outros picos apresentados fora do período dos
tratamentos (inibição ovariana e gonadotropinas exógenas).
44
No exame laparoscópico realizado 29-39 h após a administração de hCG, foi
observado que as fêmeas do grupo C apresentaram uma média de 6,3 folículos/gata,
totalizando 19 folículos. Apenas duas das três fêmeas deste grupo apresentaram CL,
uma com um e outra com dois CLs. As fêmeas do grupo L apresentaram em média 4,0
folículos/gata, totalizando 12 folículos. Todas as fêmeas deste grupo apresentaram CL,
em média 5,0 CLs/gata, totalizando 15 CLs. As fêmeas do grupo E apresentaram em
média 7,6 folículos/gata, totalizando 23 folículos. Com relação à presença de CL, duas
das três fêmeas apresentaram 2,0 CLs/gata, totalizando 6 CLs. Segundo PELICAN
(2004), os ovários com múltiplos e recentes pontos de ovulação, geralmente resultam
nos melhores índices de prenhez em gatas domésticas, fazendo com que ocorra a
presença de múltiplos folículos recentes no momento da IA. Recentes pesquisas em
felídeos indicaram que fêmeas com a presença de CL maduro no momento da IA não
atingem a prenhez. No grupo E foi observado grande número de folículos no momento
do exame laparoscópico. Isto comprova que as fêmeas deste grupo apresentavam seus
ovários quiescentes no momento da estimulação com as gonadotropinas, obtendo uma
resposta mais uniforme.
Ao exame microscópico de citologia vaginal, foi observado que todas as fêmeas
do estudo apresentaram células epiteliais vaginais características de estro. No grupo C,
45,3% das células epiteliais eram superficiais anucleadas (cornificadas) e 54,7% das
células eram superficiais nucleadas. No grupo L, 71% das células observadas eram
células superficiais anucleadas (cornificadas) e 29% eram células superficiais
nucleadas. Isto indica que nesses dois grupos as fêmeas estavam em estro de período
avançado. Já no grupo E, houve a presença de células intermediárias (20%), o que
segundo THRALL e OLSON (1999), no período de estro as células intermediárias estão
presentes em pequeno número e as células epiteliais vaginais tornam-se
progressivamente cornificadas quando as concentrações de estradiol aumentam. Neste
grupo 54,7% das células eram epiteliais superficiais anucleadas (cornificadas) e 75%
das células eram superficiais nucleadas, classificando-se como início de estro nas
fêmeas deste grupo no momento da laparoscopia.
6 CONCLUSÃO
A partir do estudo realizado concluiu-se que:
• A utilização do implante de etonogestrel (68 mg / implante / 37 dias) prévia à
administração de gonadotropinas exógenas em gatas domésticas induziu
inatividade ovariana, mostrando-se eficaz, sugerindo a possibilidade de
utilização prévia em programas de inseminação artificial em felídeos
selvagens.
• O progestágeno levonorgestrel oral na dose de 0,075 mg/dia durante 37
dias/gata, não provocou supressão ovariana durante a sua utilização no
estudo.
• O controle do ciclo estral através da utilização de etonogestrel, prévio à
estimulação com gonadotropinas exógenas para a inseminação artificial,
resulta em uma resposta ovariana mais uniforme.
•
A inibição da atividade ovariana obtida pelo uso do etonogestrel em gata
doméstica possibilita sua utilização como contraceptivo.
REFERÊNCIAS
AMORIM, C. Cidades incham na Amazônia: para que o morador urbano perceba o
estrago.
O Estado de São Paulo
, a. 126, n. 40773, 2005.
BALDWIN, C. J.; PETER, A. T.; BOSU, W. T.; DUBIELZIG, R. R. The contraceptive
effects of levonorgestrel in the domestic cat .
Lab Anim Sci,
44: 261-269, 1994.
BARBIERI, R. L.; HORNSTEIN, M. D.; Assisted reproduction – in vitro fertilization
success is improved by ovarian stimulation with exogenous pituitary suppression with
gonadotropin – releasing hormone analogues. End Rev, 20: 249-252, 1999.
BENNINK, H. J. The pharmacokinetics and pharmacodynamics of Implanon, a single-rod
etonogestrel contraceptive implant. In: Europe Journal Contraceptive Reproduction
Health Care, 2000, Sep; 5, Suppl 2: 12-20, Free University, Brussels, Belgium.
BRASIL. Ministério do Meio Ambiente. Lista Nacional das Espécies da Fauna Brasileira
Ameaçadas de Extinção. Disponível em:
<http://www.agirazul.com.br/Especies/brasil.htm>. Acesso em: 22 maio 2005.
BROWN, J. L.; WILDT, D. E. Assessing reproductive status in wild felids by noninvasive
faecal steroid monitoring.
In Zoo Yb
., 35: 173-191, 1997.
BROWN, J. L.; WASSER, S. K.; WILDT, D. E.; GRAHAM, L. H. Comparative aspects of
steroid hormone metabolism and ovarian activity in felids, measured noninvasively in
feces.
Biol Reprod
, 51: 776-86, 1995.
BROWN, J. L.; GRAHAM, L. H.; WIELEBNOWSKI, N.; SWANSON, W. F.; WILDT, D. E.;
HOWARD, J. G.. Understanding the basic reproductive biology of wild felids by
monitoring of faecal steroids.
Reprod Fertil Suppl,
57: 71-82, 2001.
BRUN, M. V.; BECK, C. A. C. Aplicações clínicas e experimentais da laparoscopia em
cães – Artigo de revisão.
Rev Fac Zootec Vet Agro Uruguaiana
, v. 5/6, n. 1, p. 5-11,
1999.
BURKE, T. J. Canine vaginal cytology. In: Small Animal Reproduction and Fertility.
Philadelphia, PA: Lea & Febiger, 1986. p. 97-111.
CHAGAS, J.; SILVA, J.; LOPES, L.; ROBALO, S..Embrio yield and plasma progesterone
profiles in superovulated dairy cows and heifers. Anim Reprod Sci, 69:1-8, 2002.
CHARD, T. An introduction to radioimmunoassay and related techniques. Elsevier,
Amsterdam, 1989.
COLBY, E.
Laboratory Animal Care
, 20, 1970.
CROXATTO, H. B.; MAKARAINEN, L. The pharmacodynamics and efficacy of Implanon;
an overview of the data.
Contraception Supplement,
58: 91-99, 1998.
47
DAMARIO, M. A.; MOOMJY, M.; TORTORIELLO, D.; MOY, F.; DAVIS, O. K.;
ROSENWAKS, Z. Delay of gonadotropin stimulations in patients receiving gonadotropin-
releasing hormone agonist (GnRH-a) therapy permits increased clinic efficiency and may
enhance in vitro fertilization (IVF) pregnancy rates.
Fertil Steril,
68: 1004-1010, 1997.
DAVIES, G. C.; LI, X. F.; NEWTON, J. R.; BEEK AVAN. COELINGH HJT. Release
characteristics, ovarian activity and menstrual bleeding pattern with a single
contraceptive implant releasing 3-ketodesogestrel.
Contraception
, 47: 251-61, 1993.
DONOGHUE, A. M.; JONSTHON, L. A.; LUNSON, L.; BROWN, J. L.; WILDT, D. E.
Influence of gonadotropin treatment interval on follicular maturation, in vitro fertilization,
circulating steroid concentrations, and subsequent luteal function in the domestic cat.
Biol Reprod, 46: 972-980, 1992.
FOSSUM, G. T.; DAVIDSON, A.; PAULSON, R. J. Ovarian hyperstimulation inhibits
embryo implantation in the mouse. J in vitro Fert Embr Trans, 6: 7-10, 1989.
FOTHERBY, K. Levonorgestrel: clinical pharmacokinetics. Clin Pharmacokinet, 28:
203-215, 1995.
GOODROWE, K. L.; WILDT, D. E. Ovarian response to human chorionic gonadotropin or
gonadotropin hormone in cats in natural or induced estrus.
Theriogenology
, 25: 811-
817, 1987.
GOODROWE, K. L.; HOWARD, J. G.; SCHMIDT, P. M.; WILDT, D. E. Reproductive
biology of the domestic cat with special reference to endocrinology, sperm function and
in vitro fertilization.
J Reprod Fertil Suppl,
39: 73-90,
1989.
GRAHAM, J. D.; CLARKE, C. L. Physiology action of progesterone in target tissues.
Endocrine Review,
18: 502-517, 1997.
GRAHAM, L. H.; SWANSON, W. F.; BROWN, J. L. Chorionic gonadotropin
administration in domestic cats causes an abnormal endocrine enviroment that disrupts
oviductal embryo transport.
Theriogenology,
54: 1117-1131, 2000.
GUDERMUTH, D. F.; NEWTON, L.; DAELS, P.; CONCANNON, P. Incidence of
spontaneous ovulation in young, group-housed cats based on serum and faecal
concentrations of progesterone. J Reprod Fertil Suppl, 51: 177-184, 1997.
HERRON, M. A. Feline vaginal cytologic examination.
Feline Practice,
7: 36-39, 1977.
HOWARD, J. G.; ROTH, T. L.; BYERS, A. P.; SWANSON, W. F.; WILDT, D. E.
Sensitivity to exogenous gonadotropins for ovulation induction and laparoscopic artificial
insemination in the cheetah and clouded leopard.
Biol Reprod
, 56: 1059-1068, 1997.
HOWARD, J. G.; BYERS, A. P.; BROWN, J. L.; BARRET, S. J.; EVANS, M. Z.;
SCHWARTZ, R. J.; WILDT, D. E. Successful ovulation induction and laparoscopic
intrauterine in the clouded leopard (Neofelis nebulosa).
Zoo Biology,
15: 55-69, 1996.
HOWARD, J. G.; DONOGHUE, A. M.; BARONE, M. A.; GOODROWE, K. L.; BLUMER,
E. S.; SNODGRASS, K.; STARNES, D.; TUCKER, M.; BUSH, M.; WILDT, D. E.
48
Successful induction of ovarian activity and laparoscopic intrauterine artificial
insemination in the cheetah (Acinoyix jubatus).
J Zoo Wild Med,
23: 288-300, 1992.
HUBER, J. Pharmacokinetics of Implanon: an integrated analysis.
Contraceptive
Supplement,
58: vol. 6: 85-91, 1998.
KENIGSBERG, D.; LITTMAN, B. A.; WILLIAMS, R. F.; HODGEN, G. D. Medical
hypophysectomy: II, Variability of ovarian response to gonadotropin therapy.
Fertil
Steril,
42: 116, 1984.
LOFSTEDT, R. M.; PATEL, J. H. Evaluation of the ability of altrenogest to control the
equine estrous cycle. J Am Vet Med Assoc, 194: 361-364, 1989.
MCCANN, M. F.; POTTER, L. S. Progestin-only contraception: a comprehensive review.
Contraception, 50 (Suppl 1): S1-198, 1994.
MELLEN, J.; WILDT, D. E. AZA Taxon Advisory Group Profile Felids. Animal Kingdom,
2002.
MORAES, W et al. Succesful Artificial Insemination after exogenous gonadotropin
treatment in the ocelot (Leopardus pardalis) and tigrina (Leopardus tigrina),
Proceedings American Association of Zoo Veterinarians,
1997.
MORATO, R. G.; BARNABE, R. C. Biotécnicas de reprodução aplicadas à preservação
de felídeos selvagens,
Revista Clínica Vet
, 12, jan./fev. 1998.
MORROW, C. J; WOLFE, B. A.; ROTH, T. L.; WILDT, D. E.; BUSH, M.; BLUMER, E. S.;
ATKINSON, M. W.; MONFORT, S. L.; Comparing ovulation synchronization protocols for
artificial insemination in the scimitar-horned oryx (Oryx dammah).
Anim Reprod Sci
, 59:
71-86, 2000.
MUNSON, L.; MANSON, R. J. Pathological findings in the uteri of progestogen implanted
exotic felids.
American Association of Zoo Veterinarians,
p. 311, 1991.
OLIVEIRA, T. G.
Neotropical cats:
ecology and conservation.
São Luiz: EDUFMA,
1994.
ONCLIN, K.; VERSTEGEN, J. Termination of pregnancy in cats using a combination of
cabergolin, a new dopamine agonist, and a synthetic PGF 2 alfa, cloprostenol. J Reprod
Fertil, 51: 259 – 263, 1997.
PARAKKAL, S. R.; GREGORIE, A. I.; Differentiation of vaginal epithelium in the normal
and hormone treated rhesus monkey. Biology of Reproduction, 6: 117-130, 1972.
PELICAN, K. M.; WILDT, D. E.; OTTINGER, M. A.; HOWARD, J. G. Short-term ovarian
suppression with levonorgestrel before gonadotropin stimulation improves ovarian
response for IVF in the domestic cat.
Theriogenology
, 57: 679, 2002.
PELICAN, K. M. Ovarian suppression with the progestin levonorgestrel but not the GnRH
antagonis antide, induces a consistent response to exogenous gonadotropin in the
49
domestic cat.
Doctor Tesis National Zoological Park, Smithsonian Institution
,
Washington, DC, 2004.
RHODES, M. T.; DAVIS, D. L.; STENVESON, S. J. Flushing and altrenogest affect litter
traits in gilts.
J Anim Sci,
69: 34-40, 1991.
ROTH, T. L; WOLFE, B. A.; LONG, J. A.; HOWARD, J. G.; WILDT, D. E. Effects of
equine chorionic gonadotropin, human chorionic gonadotropin, and laparoscopic artificial
insemination on embryo, endocrine, and luteal characteristics in the domestic cat.
Biol
Reprod,
57: 165-171, 1997.
SAUER, M. V.; PAULSON, R. J.; LOBO, R. A. Comparing the clinical utility of GnRH
antagonist to GnRH agonist in an oocyte donation program. Gynecol Obstet Invest, 43:
215-318, 1997.
SEAGER, S. W. J.; WILDT, D. E.; CHAKRABORTY, P. K. Endocrinology, 107: 1212,
1980.
SHORR, E. Effect of concomitant administration of estrogens and progesterone on
vaginal smear in woman. PROCEEDINGS OF THE SOCIETY FOR EXPERIMENTAL
BIOLOGY AND MEDICINE, 43: 501-506, 1940.
SIMON, F; CASSARO, K; QUILLEN, P. Small felid breeding project at São Paulo Zoo.
International Zoo Yearbook,
35: 159-164, 1997.
SIVIN, I. Contraception with Norplant implants,
Hum Reprod,
9: 1818-1826, 1994.
SMITZ, J.; TAVANIOTOU, A.; BOURGAIN, C.; DEVROEY, P. Ovulation induction
disrupts luteal phase function.
Ann N Y Acad Sci
, 943: 55-63, 2001.
SWANSON, W. F; WILDT, D. E. Strategies and progress in reproductive involving small
cat species, Review Small Felids Reproduction Research.
InZoo Yb
,
35:152-159,1997.
SWANSON, W. F. Research in nondomestic spedies: experiences in reproductive
physiology research for conservation of endangered felids.
In ILAR J.
, 44(4): 307-16,
2003.
SWANSON, W. F.; BROWN, J. L. International training programs in reproductive
sciences for conservation of Latin American felids. Anim Reprod Sci, 21: 82-83, jul.
2004.
THRALL, M. A.; OLSON, P. N. The vagina. In: Diagnostic cytology and hematology of
the dog and cat. St Louis, MO: Ed. Mosby Inc., 1999. p. 240-248.
TURNER, J. W.; KIRKPATRICK, J. F. Reversible contraception in nondomestic animals.
J Zoo Wildl Med,
22: 392-408, 1991.
TURZILLO, A. M.; NETT, T. M. Regulation of GnRH receptor gene expression in sheep
and catlle.
J Reprod Fertil Suppl,
54:75-86, 1999.
50
ZELEZNIK, A. J. Follicle selection in primates: “Many are called but few are chosen”.
Biol Reprod,
65:
655- 659, 2001.
WILDT, D. E.
Animal laparoscopy
. Baltimore: Williams & Wilkins. 1980. p. 73-94.
WILDT, D. E.; ROTH, T. L. Assisted reproduction for managing and conserving
threatened felids.
In
Zoo Yb
, 1997, 35: 164-172.
WILDT, D. E.; BROWN, J. L.; SWANSON, W. F. Cats. In: KNOBIL, E.; NEIL, J. D.
(eds.).
Encyclopedia of Reproduction,
vol. 1. New York: Academic Press; 497-510,
1998.
WILDT, D. E.; PANKO, W. B.; SEAGER, S. W. J. Effect of prostaglandin F 2 alfa on
endocrine: ovarian function in the domestic cat. Prostaglandins, 18: 883-892, 1979.
WILDT, D. E.; KINNEY, G. M.; SEAGER, S. W. J. Gonadotropin induced reproductive
cyclicity in the domestic cat., Lab Anim Sci., 28:301, 1978.
WOLFE, M. W.; ROBERSON, M. F.; STUMPF, T. T.; KITTOK, R. J.; KINDER, J. E.
Luteinizing hormone secretion and corpus luteum function in cows receiving two levels of
progesterone.
Biol Reprod,
41: 997-1003, 1989.
WOOD, C. M.; KORNEGAY, E. T.; SHIPLEY, C. F. Efficacy of altrenogest in
synchronizing estrous in two swine breeding programs and effects on subsequent
reproductive performance in sows.
J Anim Sci,
70: 1357-1364, 1992.
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