( PDF ) Estudo da evolução molecular de seqüências de rDNA 18S aplicado à investigação de fatores de patogenicidade do filo Ascomycota

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ANA CAROLINA BARBOSA PADOVAN

Estudo da evolução molecular de seqüências de rDNA

18S aplicado à investigação de fatores de

patogenicidade do filo Ascomycota

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo – Escola Paulista de Medicina,

para obtenção do Título de Doutor em

Ciências.

SÃO PAULO

2008

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ANA CAROLINA BARBOSA PADOVAN

Estudo da evolução molecular de seqüências de rDNA

18S aplicado à investigação de fatores de

patogenicidade do filo Ascomycota

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo – Escola Paulista de Medicina,

para obtenção do Título de Doutor em

Ciências.

Orientador:

Profº Dr. Marcelo Ribeiro da Silva Briones

SÃO PAULO

2008

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iii

Padovan, Ana Carolina Barbosa.

Estudo da evolução molecular de seqüências de rDNA

18S aplicado à investigação de fatores de patogenicidade do

filo Ascomycota/Ana Carolina Barbosa Padovan - São Paulo,

2008. xxv. 170p

Tese (Doutorado)-Universidade Federal de São Paulo. Escola

Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em

Microbiologia, Imunologia e Parasitologia

Study of the molecular evolution of 18S rDNA sequences

applied to the investigation of pathogenicity factors of the phylum

Ascomycota

1. Evolução e datação de Ascomycota 2. Análise Bayesiana

do rDNA 18S 3. proteínas de biofilme de Candida albicans 4.

Expressão da enolase 5. Novo alelo de HWP1

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

Chefe do departamento:

Profº. Dr. José Daniel Lopes

Coordenador do Curso de Pós-Graduação:

Profº. Dr. Renato Arruda Mortara

ANA CAROLINA BARBOSA PADOVAN

Estudo da evolução molecular de seqüências de rDNA

18S aplicado à investigação de fatores de

patogenicidade do filo Ascomycota

Presidente da banca: Prof. Dr.__________________________

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr.____________________________________________

Aprovada em: ____/____/____

Este trabalho foi financiado pela bolsa Capes de

doutorado, CNPq, FAPESP, Howard Hughes

Medical Institute e WHO

vii

Aos meus amados pais

Durvalino e Neide Padovan

e ao meu querido irmão, Gustavo

viii

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Marcelo R. S. Briones pela oportunidade de trabalhar em seu

laboratório sob sua orientação nesses quase oito anos de convivência e pelas

discussões que tanto enriqueceram meu trabalho e minha vida pessoal.

Às Dras. Analy S. A. Melo e Gerdine F. O. Sanson pelo apoio quando me

acolheram ainda na iniciação científica, pela amizade e companheirismo incondicionais

e colaboração ativa nos meus trabalhos.

À Dra. Adriana Brunstein pela amizade, puxões de orelha e discussões.

À Beatriz Schnabel pela amizade, ajuda nos sequenciamentos e na formatação

dos trabalhos.

À Adriana, Beatriz e Gerdine (amigas da Confraria) pela amizade sincera e

incondicional, risadas e choros compartilhados, piadas, cafés, pães de queijo, doces-

de-leite...

À Silvia Y. Kawashita, Maria Carolina S. Moraes e Carolina Jaqueta pela

amizade e companheirismo durante os cursos da Pós e no dia-a-dia do laboratório.

À Paloma Hernandez pelo companheirismo e ajuda constante nos experimentos

e sequenciamentos.

Aos Drs. Cláudio V. Silva, Guilherme Chaves e Luciano Puzer pela ajuda nos

experimentos, nos trabalhos, nas prontas respostas às minhas dúvidas e pela amizade.

Ao Dr. Daniel Pimenta (Butantã) pela inestimável ajuda nas análises de

espectrometria de massa.

Ao Prof. Francisco Bosco pelos sábios conselhos sobre o trabalho e a vida.

Ao Dr. Arnaldo Colombo pelas amostras clínicas e críticas importantes para este

trabalho.

Aos amigos do LEMI Analy, Cledja, Daniel, Guilherme e Patrício pelo

companheirismo e ajuda nos experimentos.

Aos amigos do laboratório Luiz Fernando, Melissa, Paloma, Renata, Richard e

Silvia e aos da disciplina de Microbiologia, Arthur, Cátia, Maria Carolina, Martín, Nilce e

Viviane (Lab. BC), Cristina, Camila, Michele e Rosângela (Lab SL) e Denise, Fábia e

Rodrigo (Lab TG) pela valiosa amizade, solidariedade e companheirismo durante este

período do doutorado e a ajuda em várias etapas desta tese.

À Vitória Amorim pelo apoio de “mãe” nas horas mais necessárias e pela ajuda

no dia-a-dia do laboratório.

Às “assessoras” Paola, Magda e Mércia que sempre me ajudaram prontamente

nos mais diversos assuntos, principalmente os burocráticos.

Aos professores, alunos e funcionários da disciplina de Microbiologia que

colaboraram direta ou indiretamente para esta tese.

Às famílias Queiroz e Vicentini pela amizade e amor com que sempre me

trataram e por todas as vezes que estiveram ao meu lado me apoiando.

Aos meus amigos eternos e incondicionais Marcelo, Camila, Silene e Gláucio

pelo entusiasmo com que sempre acompanharam e incentivaram meu trabalho.

À Neide, Durvalino, Gustavo, Ediceu e Marcelo, minha amada família, pelo amor,

apoio e compreensão em todas as horas.

E a todos aqueles que mesmo não citados, de alguma forma contribuíram para a

realização deste trabalho.

“A scientist in his laboratory is not a mere technician:

he is also a child confronting natural

phenomena that impress him

as though they were

fairy tales”

Marie Curie

SUMÁRIO

Dedicatória................................................................................................................vii

Agradecimentos........................................................................................................ viii

Lista de Figuras ........................................................................................................ xv

Lista de Tabelas........................................................................................................ xvii

Lista de Fórmulas ..................................................................................................... xviii

Lista de Abreviaturas ................................................................................................ xix

Resumo..................................................................................................................... xxi

Abstract..................................................................................................................... xxiii

Glossário...................................................................................................................xxv

CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................. 01

1.1. Evolução de fungos......................................................................................... 03

1.1.1. A Evolução do filo Ascomycota.................................................................... 05

1.1.2. Marcadores Moleculares e a Evolução dos Ascomycota............................. 07

1.1.3. Datação e relógio molecular ........................................................................ 09

1.1.4. Pontos de calibração na datação de fungos ................................................ 11

1.1.5. Métodos de inferência filogenética no estudo da Evolução dos fungos....... 12

1.2. Biofilmes........................................................................................................... 16

1.2.1. Formação de biofilmes: problema industrial................................................. 17

1.2.2. Formação de biofilmes fúngicos patogênicos e resistência ......................... 19

1.2.3. Regulação gênica e formação de biofilmes de Candida albicans ................ 22

1.2.4. Fenótipos e metabolismo de células de C. albicans formadoras de

biofilmes ...................................................................................................... 27

1.2.5. A matriz extracelular de biofilmes de C. albicans......................................... 28

1.3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 31

CAPÍTULO 2. Fungi evolution revisited: application of the penalized

likelihood method to a Bayesian fungal phylogeny provides a new

perspective on phylogenetic relationships and divergence dates of

Ascomycota groups ............................................................................................... 32

CAPÍTULO 3. Estudo de fatores de patogenicidade de Candida albicans

pela identificação e caracterização de proteínas de matriz de biofilme e

análise de sua expressão gênica ......................................................................... 43

xii

3.1. Material e Métodos .......................................................................................... 44

3.1.1. Microrganismos............................................................................................ 44

3.1.2. Seleção da linhagem de C.albicans mais produtora de biofilme.................. 44

3.1.2.1. Indução de biofilme .......................................................................... 44

3.1.2.2. Quantificação de biofilme por coloração com cristal violeta ............. 47

3.1.2.3. Quantificação de biofilme por redução de XTT ................................. 47

3.1.2.4. Análise dos dados ............................................................................ 47

3.1.3. Análise da fração protéica da matriz de biofilme de C.albicans ................... 47

3.1.3.1. Indução de biofilme ........................................................................... 47

3.1.3.2. Extração da matriz extracelular......................................................... 48

3.1.3.3. Gel “SDS-PAGE” para separação de proteínas ................................ 48

3.1.3.4. Análise das bandas por espectrometria de massa............................ 49

3.1.4. Clonagem e sequenciamento de fragmentos de DNA ................................. 50

3.1.4.1. Oligonucleotídeos.............................................................................. 50

3.1.4.2. Extração de DNA genômico de C. albicans....................................... 50

3.1.4.3. Tratamento do DNA com RNAse ......................................................51

3.1.4.4. Quantificação do DNA ................................................................... 51

3.1.4.5. Amplificação por PCR de fragmentos de interesse........................... 52

3.1.4.6. Tratamento do DNA e ligação .......................................................... 52

3.1.4.7. Preparação de bactérias competentes ............................................. 52

3.1.4.8. Transformação de bactérias competentes por CaCl

........................ 53

3.1.4.9. Extração de DNA plasmidial por Mini Prep........................................ 53

3.1.4.10. Sequenciamento dos insertos clonados nos plasmídeos................ 54

3.1.5. Montagem das seqüências consenso ("contigs")......................................... 55

3.1.6. Análise das seqüências por comparação em bancos genômicos................ 55

3.1.7. Análise das seqüências para predição de estrutura, modificações

pós-traducionais, localização e função celular.............................................. 56

3.1.8. Expressão heteróloga de proteínas recombinantes da matriz de biofilme... 56

3.1.8.1. Ligação, clonagem e sequenciamento .............................................. 56

3.1.8.2. Expressão da proteína recombinante................................................ 56

3.1.8.3. Purificação da proteína recombinante............................................... 57

3.1.8.4. Quantificação de proteínas................................................................ 58

3.1.9. Produção de soro de coelho anti-enolase.................................................... 58

3.1.10. “Western blot”............................................................................................. 58

xiii

3.1.10.1. Preparo dos extratos protéicos........................................................ 58

3.1.10.2. Degradação da enolase nativa........................................................ 59

3.1.10.3. Preparação da membrana e incubação ..........................................59

3.1.11. Imunofluorescência.................................................................................... 60

3.1.11.1. Preparação de amostras ................................................................. 60

3.1.11.2. Protocolo de incubação................................................................... 60

3.1.12. Citometria de fluxo ..................................................................................... 61

3.1.12.1. Enolase na superfície celular .......................................................... 61

3.1.12.1. Recaptação da enolase................................................................... 61

3.1.13. Manipulação de RNA ................................................................................. 62

3.1.13.1. Linhagens de C. albicans ................................................................ 62

3.1.13.2. Oligonucleotídeos............................................................................ 62

3.1.13.3. Condições de crescimento .............................................................. 64

3.1.13.3.1. Indução de biofilme ................................................................... 64

3.1.13.3.2. Microaerofilia............................................................................. 64

3.1.13.3.3.Levedura em meio rico (YPD) e em meio pobre (SD) ................ 64

3.1.13.3.4. Indução de Hifas ....................................................................... 64

3.1.13.4. Extração de RNA total e tratamento com DNAse............................ 65

3.1.13.5. Quantificação do RNA total ............................................................. 65

3.1.13.6. Reação de Transcriptase Reversa (RT-PCR) ................................. 65

3.1.13.7. Verificação da integridade do cDNA por RT-PCR........................... 66

3.1.13.8. RT-PCR multiplex semi-quantitativo................................................ 66

3.1.13.9. Análise dos resultados dos ensaios de RT-PCR............................. 67

3.1.14. Reagentes utilizados.................................................................................. 67

3.1.14.1. Meios de cultura.............................................................................. 67

3.1.14.2. Soluções e tampões........................................................................ 67

3.2. Resultados........................................................................................................ 69

3.2.1. Seleção da linhagem de C.albicans mais produtora de biofilme.................. 69

3.2.2. Identificação das principais proteínas da matriz de biofilme de

C.albicans .................................................................................................... 71

3.2.3. Análise da seqüência de DNA da enolase e da proteína predita da

linhagem SC5314......................................................................................... 74

3.2.4. Expressão da enolase recombinante para produção de soro policlonal ...... 79

3.2.5. Presença da enolase na matriz de biofilme e sua degradação.................... 81

xiv

3.2.6. Presença da enolase na superfície de C. albicans ...................................... 84

3.2.7. Teste da atividade da enolase ..................................................................... 90

3.2.8. Expressão da enolase em células de biofilme ............................................. 90

CAPÍTULO 4: A novel allele of HWP1, isolated from a clinical strain of

Candida albicans with defective hyphal growth and biofilm formation,

has deletions of Gln/Pro and Ser/Thr repeats involved in cellular adhesion .... 102

CAPÍTULO 5: DISCUSSÃO .................................................................................... 134

5.1. Evolução de fungos......................................................................................... 135

5.2. Biofilmes........................................................................................................... 140

CAPÍTULO 6: CONCLUSÕES ................................................................................ 148

CAPÍTULO 7: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................. 151

CAPÍTULO 8. PUBLICAÇÕES................................................................................. 171

8.1. Melo A.S., Padovan A.C.B., Serafim R.C., Puzer L., Carmona A.K., Juliano Neto

L., Brunstein A., Briones M.R.S. 2006. The Candida albicans AAA ATPase homologue

of Saccharomyces cerevisiae Rix7p (YLL034c) is essential for proper morphology,

biofilm formation and activity of secreted aspartyl proteinases. Genetics and Molecular

Research. 5(4):664-87.

8.2. Hernandes R.T., Silva R.M., Carneiro S.M., Salvador F.A., Fernandes M.C.C.,

Padovan A.C.B., Yamamoto D., Mortara R.A., Elias W.P., Briones M.R.S., Gomes

T.A.T. 2008. The localized adherence pattern of an atypical enteropathogenic

Escherichia coli is mediated by intimin omicron and unexpectedly promotes HeLa cell

invasion. Cellular Microbiology. 10(2): 415–25.

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1

Figura 1. Principais ramos do reino Fungi.............................................................04

Figura 2. Morfologia dos ascocarpos dos ascomicetos filamentosos.....................06

Figura 3. Esquema da formação de biofilme bacteriano em rede de tratamento

de água....................................................................................................18

Figura 4. Microscopia eletrônica de biofilme de C. albicans formado no interior

de cateter implantado em modelo murino.................................................20

Figura 5. Esquema da formação de biofilme de C.albicans em caterter de PVC...23

Capítulo 2

Figura 1. SSU rDNA fungal phylogeny inferred by Bayesian analysis

corresponding to the consensus of 10.000 trees.....................................38

Figura 2. Schematic phylogenies locating the estimated dates for the main events

of fungal radiation.....................................................................................39

Capítulo 3

Figura 1. Quantificação de biofilme de 14 linhagens de C.albicans .......................70

Figura 2. Gel “SDS-PAGE” 10% para a padronização das condições de indução

e desenvolvimento de biofilme................................................................72

Figura 3. Gel “SDS-PAGE” 10% para selecionar as bandas protéicas da matriz

de biofilme...............................................................................................72

Figura 4. Gel de agarose 1% para verificar a amplificação do gene completo da

enolase da linhagem de C.albicans SC5314. .........................................75

Figura 5. Alinhamento das seqüências de DNA do gene completo da enolase da

linhagem de C. albicans SC5114............................................................76

Figura 6. Análise de predições da estrutura secundária da enolase da linhagem

SC5314...................................................................................................78

Figura 7. Seqüência protéica predita da enolase da linhagem SC5314 (deste

trabalho) e as possíveis modificações pós-traducionais.........................79

Figura 8. Géis “SDS-PAGE” 10% da indução e purificação da enolase

recombinante ..........................................................................................80

Figura 9. “Western Blots” confirmando a presença da enolase em biofilme e

lisados celulares de C. albicans..............................................................82

xvi

Figura 10. “Western Blots” da meia-vida da enolase nativa de C.albicans

SC5314 secretada ou proveniente de lise celular................................83

Figura 11. “Western Blot” da proteína intracelular Sui2p em extratos celulares de

S. cerevisiae e C.albicans .....................................................................84

Figura 12. Citometria de fluxo para marcação da enolase na superfície de

leveduras...............................................................................................85

Figura 13. Localização da enolase em leveduras e hifas de C.albicans ................87

Figura 14. Localização da enolase em células de biofilmes de C.albicans ...........88

Figura 15. Citometria de fluxo da recaptação da enolase ......................................89

Figura 16. Gel de agarose 2% da RT-PCR de cDNAs de biofilme.........................91

Figura 17. Gráficos da norma de reação de 9 genes relacionados à regulação e

formação de biofilme e à Via glicolítica .................................................94

Figura 18. Gel de agarose 1% da PCR de HWP1 a partir de DNA genômico........101

Figura 19. Gel de agarose 2% da RT-PCR dos alelos de ALS3 e HWP1, a partir

de linhagens crescidas em biofilmes e induzidas as hifas.....................101

Capítulo 4

Figura 1. Micromorphology of C. albicans hyphal gowth of strains SC5314, L296

and L757.................................................................................................124

Figura 2. Biofilm quantitation of C. albicans strains SC5314, L296 and L757........125

Figura 3. Semi-quantitative RT-PCR of HWP1 alleles visualized in 2% agarose

gel, using 40ng of cDNA per reaction......................................................126

Figura 4. Amplification of HWP1 alleles of 14 C. albicans strains, visualized in

2% agarose gel .......................................................................................127

Figura 5. Alignment of nucleotide and putative protein sequences of HWP1

alleles......................................................................................................128

Figura 6. Representations of the secondary structures of the putative HWP1

allele proteins..........................................................................................129

Figura 7. Diagram of putative Hwp1 protein domains ............................................130

xvii

LISTA DE TABELAS

Capítulo 2

Tabela 1. Sampled fungal taxon classification according to Alexopoulos et al.

(1996) and respective accession numbers .............................................36

Tabela 2. Divergency dates estimates and 95% confidence intervals, as

calculated by the penalized likelihood method, of fungal clades

depicted in Fig.2a....................................................................................40

Tabela 3. Divergency dates estimates and 95% confidence intervals, as

calculated by the penalized likelihood method, of fungal clades

depicted in Fig.2b....................................................................................40

Capítulo 3

Tabela 1. Linhagens de Candida albicans testadas quanto à produção de

biofilme e estudo de expressão de genes em diversas condições de

crescimento ...........................................................................................46

Tabela 2. Oligonucleotídeos utilizados na RT-PCR Multiplex e para o controle da

integridade do cDNA...............................................................................63

Tabela 3. Identificação por espectrometria de massa das 12 bandas protéicas

selecionadas da matriz de biofilme de Candida albicans........................73

Tabela 4. Valores da expressão dos genes nas 5 condições de crescimento das

14 linhagens de C.albicans.....................................................................98

Capítulo 4

Tabela 1. C. albicans isolates from Brazil and reference strains used to screen

the HWP1-2 allele ..................................................................................131

Tabela 2. Percentage of germ tube formation at 3h of incubation in FBS at

37ºC .......................................................................................................132

Tabela 3. Expression levels of HWP1 alleles in hyphal induced cells and

biofilm ....................................................................................................132

xviii

LISTA DE FÓRMULAS

Capítulo 1

Fórmula 1. Taxa de substituição de nucleotídeos .............................................09

xix

LISTA DE ABREVIATURAS

ALS3 - Agglutinin-Like Sequence 3 gene

ATCC – American Type Culture Collection

ATP - trifosfato de adenosina

BCR1 - Biofilm and Cell wall Regulator 1 gene

°C – Graus Celsius

C – Carbono

cDNA – Ácido desoxiribonucléico complementar

Contig – “contiguous”.

dATP – Desoxiadenosina trifosfato

dCTP – Desoxicitosina trifosfato

dGTP – Desoxiguanosina trifosfato

dTTP – Desoxitimidina trifosfato

dNTP – Desoxinucleosídeo

DEPC - Dietilpirocarbonato

DNA – Ácido desoxiribonucléico

D.O. – Densidade óptica

DTT - ditiotreitol

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético

EFB1 - Translation elongation factor EF-1 beta gene

ENO1 – Enolase gene

FBA1 – Fructose biphosphate gene

g – aceleração da gravidade

GTR - "general time reversible" (modelo geral de tempo reversível)

h – hora

HXK1 – Hexokinase 1 gene

HXK2 - Hexokinase 2 gene

HWP1 - Hyphal cell wall protein 1 gene

IPTG –Isopropil-D-tiogalactopiranosídeo

kDa – Quilodaltons

kb – Quilobase

LEMI – Laboratório Especial de Micologia

LSU 28S - "Large Subunit rRNA 28S" (rRNA da subunidade maior do ribossomo)

M – Molar

Ma - milhões de anos antes do presente

MAPK - Mitogen-activated protein kinase

mg – Miligrama

ML – “Maximum Likelihood” – Máxima verossimilhança (MV)

min – Minuto

ml – Mililitro

mm - Milímetro

mM – Milimolar

!g – Micrograma

!l – Microlitro

N – Nitrogênio

ng – Nanograma

NJ – “Neighbor-Joining”

nm – Namômetro

ORF – Open reading frame (fase aberta de leitura)

pb – Pares de bases

pH – potencial de hidrogênio

pmol – Picomol

PBS – Phosphate buffered saline

PCR – Reação de polimerização em cadeia

PYK1 - Pyruvate kinase 1 gene

rpm – Rotações por minuto

RNA – Ácido ribonucléico

rRNA – RNA ribossômico

RT-PCR – Reação de polimerização em cadeia – transcriptase reversa

SD – Meio de cultura mínimo contendo dextrose

SFB – Soro fetal bovino

SSU 18S - "Small Subunit rRNA 18S" (rRNA da subunidade menor do ribossomo)

TAE – Tris acetato EDTA

TEC1 - Transposon Enhancement Control 1 gene

U.V. – Luz ultravioleta

YPD – Yeast extract peptone dextrose

xxi

RESUMO

O tema deste trabalho é estudar alguns fatores importantes de patogenicidade de

fungos do Filo Ascomycota e sua correlação com padrões da dinâmica da expressão gênica na

perspectiva da Evolução Molecular. Decidimos concentrar nossos esforços iniciais nas

questões de sistemática deste grupo, uma vez que a sistemática do Filo Ascomycota, tal como

inferida por métodos atuais, apresenta politomias basais, indicando portanto, controvérsias na

reconstrução dos eventos de radiação evolutiva de seus principais taxa. A análise molecular

descrita neste trabalho sugere a existência de dois grupos na posição basal entre os

ascomicetos filamentosos: os Discomycetes e os Pyrenomycetes. Foram propostos dois

cenários para os principais eventos de radiação daquele filo, o primeiro localizando os

principais eventos na era Proterozóica e o segundo, na era Paleozóica. Para tanto, geramos

um alinhamento de 166 seqüências da subunidade menor do gene ribossômico 18S (SSU

rDNA 18S), representativas de todos os filos de Fungi e utilizamos como base para uma

análise filogenética Bayesiana. A filogenia sugeriu que os Discomycetes são o grupo basal

dentre os ascomicetos ﬁlamentosos e provavelmente mantém caracteres ancestrais visto que

seus representantes estão espalhados entre outros grupos de fungos ﬁlamentosos. Verificamos

que a taxa evolutiva de heterogeneidade do filo Ascomycota rejeita a hipótese nula de um

relógio molecular global. Para datar os principais eventos da radiação deste filo, foi utilizado o

método “penalized likelihood”, e para calibração, foram incluídos um fóssil de Pyrenomycete

datado em 400 Ma e considerados dois diferentes cenários encontrados na literatura, um com

uma data estimada de 1.576 Ma para a separação entre planta-animal-fungo e outro, com data

estimada de 965 Ma para a separação entre animal-fungo. Estimativas baseadas no primeiro

cenário são mais antigas do que datas propostas em estudos anteriores baseados em

seqüências do rDNA 18S, mas corroboram estimativas baseadas em análises de multi-

proteínas, sugerindo que a radiação dos principais grupos de Ascomycota ocorreu na era

Proterozóica. Durante o processo evolutivo, fatores de patogenicidade surgiram dentro do filo

Ascomycota e são encontrados em fungos dos grupos Pezizomycetes, Archiascomycetes e na

Ordem Saccharomycetales. Candida albicans, o patógeno humano oportunista mais

frequentemente isolado, é um representante desta ordem. Sua capacidade de formar biofilmes

confere propriedades importantes para processos infectivos e colonização de diversos

substratos, sendo ainda muito efetiva na resistência às drogas antifúngicas. A descrição e

dinâmica dos componentes moleculares da matriz do biofilme, associados com as mudanças

no metabolismo celular, poderiam explicar, pelo menos em parte, as propriedades em macro

escala desta importante estrutura. Utilizando espectrometria de massa identificamos a enolase

como um dos principais componentes da matriz do biofilme de Candida. Ainda, a presença de

enolase na superfície celular foi confirmada por imunofluorescência. Caracteristicamente, por

ser uma enzima citosólica que participa da via glicolítica, a enolase não possui sinal de

xxii

secreção, no entanto, verificamos que a proteína é possivelmente glicosilada e fosforilada.

Análises de degradação e recaptação mostraram que a proteína é degradada a 37

C e não é

recaptada pela parede celular, sugerindo que exista uma via de secreção não-clássica por

onde a enolase possa ser secretada para o biofilme e para a superfície celular sem ser

degradada no meio externo. A expressão da enolase (ENO1) e das enzimas da via glicolítica

como a hexoquinase, piruvatoquinase e aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 e FBA1) de 14

diferentes linhagens de C. albicans que foram cultivadas em condições de crescimento como

biofilme, microaerofilia, hifas e leveduras, não mostraram variação significativa, sugerindo que

a condição de crescimento não afeta a expressão desses genes nas diferentes linhagens

analisadas. Os genes ALS3 e HWP1 codificadores de adesinas tiveram a expressão diminuída

em pelo menos 4 vezes em resposta a diminuição da expressão dos genes TEC1 e BCR1 que

controlam a formação biofilme. Este tipo de regulação sugere que mecanismos de

“feedforward” possam estar presentes nesta rede regulatória. A principal adesina da parede

celular das hifas é Hwp1p, necessária para a formação apropriada de hifas e virulência em

candidíase sistêmica. Nós descrevemos um novo alelo de HWP1 (HWP1-2), que não possui

três importantes regiões, em comparação com o alelo descrito anteriormente (HWP1-1). As

regiões 1 e 2 consistem de 10 aminoácidos repetidos em seqüência, importantes para a

conformação funcional de cadeias peptídicas e a adesão das células de C. albicans ao epitélio

de mamíferos. A região 3 é composta de 34 aminoácidos que promovem a ligação cruzada

com outras proteínas na superfície de C. albicans. As linhagens homozigota para HWP1-2

(L757) e heterozigota (L296) têm níveis significativamente mais baixos na expressão de HWP1

durante a formação de hifas e biofilme, em comparação com a linhagem SC5314 (homozigota

para HWP1-1). L757 teve crescimento na forma de hifa reduzido (40,4%) e diminuída a

formação de biofilme (90,8%), sugerindo que a Hwp1-2p é menos eficiente para manter a

adesão célula-célula e célula-superfície durante a formação do biofilme. Em conjunto nossos

resultados mostram que as propriedades patogênicas de fungos não podem ser seriamente

estudadas sem uma sólida base em sistemática molecular apoiada, por sua vez, nos métodos

explicitamente quantitativos das áreas de Estatística, Teoria de Sistemas Dinâmicos e

algoritmos computacionais.

xxiii

ABSTRACT

The aim of this work is the study of factors that are important for the pathogenicity of

the main fungi within phylum Ascomycota and its correlation with expression patterns on the

perspective of Molecular Evolution. We decided to elucidate questions concerning the

systematics of this group, since the actual systematics of the Ascomycota phylum is depicted as

basal polytomies. The molecular analysis described in this work indicates two groups in the

basal position among filamentous ascomycetes: Discomycetes and Pyrenoycetes. Also, two

scenarios are proposed for the major radiation events within that phylum, one places the major

events in the Proterozoic era and the other, in the Paleozoic era. Accordingly, we generated a

dataset of 166 small subunit (18S) rDNA sequences, representative of all groups of Fungi and

used as input in a Bayesian phylogenetic analysis. This phylogeny suggests that Discomycetes

are a basal group of ﬁlamentous ascomycetes and probably maintain ancestor characters since

their representatives are intermingled among other ﬁlamentous fungi. Also, we show that the

evolutionary rate heterogeneity within Ascomycota rejects the null hypothesis of a global

molecular clock. To estimates the dates of major radiation events, we used the penalized

likelihood method and for calibration we included a 400 My Pyrenomycete fossil. Two distinct

scenarios were considered, being, one with an estimated date of 1.576 Myr for the

plant–animal–fungus split and the other with an estimated date of 965 Myr for the

animal–fungus split. Estimates under the ﬁrst scenario are older than dates proposed in

previous studies based on small subunit rDNA sequences but support estimates based on

multiprotein analysis, suggesting that the radiation of the major Ascomycota groups occurred

into the Proterozoic era. Pathogenic factors have evolved within Ascomycota and can be found

in fungi of Orders Pezizomycetes, Archiascomycetes and Saccharomycetales. Candida

albicans, the most frequently isolated human opportunistic pathogen, is representative of this

Order. Its ability to form biofilms is a very important factor during the infection process,

colonization of several solid substrates and confers significant resistance to antifungal drugs.

Components of the biofilm matrix associated with changes in the cellular metabolism could, at

least in part, explain its macro-scale properties. We identified that enolase is a major component

of the Candida biofilm matrix by using mass espectrometry and confirmed its presence in the

cell surface by immunefluorescence. Characteristically of cytosolic enzymes that participate of

the glycolytic pathway, enolase does not possess signal for secretion, however, we verified that

this protein can be putatively glycosylated and phosphorylated. Degradation and reuptake

analyses of enolase demonstrated that it is degraded at 37

C and it is not reuptaked by the cell

wall, which suggests that there is a non-classical secretory pathway by where enolase can be

sent to the biofilm matrix and the cell surface protected against the external medium

degradation. No significant variation in the expression of enolase (ENO1) and glycolytic

pathway enzymes hexokinase, pyruvate kinase and aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 and FBA1)

xxiv

were observed among 14 different lineages of C. albicans grown in biofilm, microaerophilia,

hyphal induced and yeast induced conditions. Adhesin encoding genes ALS3 and HWP1

showed diminished expression levels (at least 4-fold) in response to the down regulation of

biofilm control genes TEC1 and BCR1. This suggests that expression levels of ALS3 and

HWP1 can be regulated by feedforward mechanisms. The major C. albicans hyphae cell wall

adhesin, Hwp1p, is necessary for hyphae formation and virulence in systemic candidiasis. We

described a novel HWP1 allele (HWP1-2) lacking three important regions as compared to the

previously described allele, HWP1-1. Regions 1 and 2 consist of 10 amino acid repeats

important for functional conformation of peptide chains and attachment of C. albicans cells to

the mammalian epithelia. Region 3 consists of 34 amino acid that promote the cross-linking with

other proteins on C. albicans surface. The HWP1-2 homozygous (L757) and heterozygous

(L296) strains have significantly lower levels of HWP1 expression during hyphal growth and

biofilm formation compared to the strain SC5314 (HWP1-1). L757 has reduced hyphal growth

(40.4%) and impaired biofilm formation (90.8%), suggesting that the HWP1-2p is less efficient to

maintain cell-to-cell and cell-to-surface adhesion during biofilm formation. Our results clearly

show that any study of fungal pathogenicity factors have to be solidly based on molecular

systematics, which in turn, has to be grounded on the explicitly quantitative methods of

Statistics, Dynamic Systems Theory and computational algorithms.

xxv

GLOSSÁRIO

Análogo: aquele que tem a mesma função ou apresenta o mesmo aspecto exterior de outro,

mas não compartilham origem ou ancestralidade comuns

Contig – “contiguous”: quando uma coleção de fragmentos de DNA clonados são

arranjados de maneira que se sobreponham e formem uma seqüência contínua.

Homólogo (genes) : aqueles que compartilham ancestralidade comum

Homoplasia: estado ou caracter derivado que aparece pelo processo de convergência

Microarray assay = ensaio de micro-arranjo; ensaio no qual DNA ou cDNAs marcados são

incubados contra chips de vidro ou silicone contendo milhares de seqüências de nucleotídeos

em fita simples, a fim de se ligarem a suas respectivas fitas complementares.

MIC: Concentração Inibitória Mínima de dado antimicrobiano capaz de inibir o crescimento do

microorganismo em 50%

Monofilético: taxon natural composto de duas ou mais espécies que inclui o ancestral dessas

espécies e todos os seus descendentes

Ortólogo (gene): aquele que é homólogo e conserva a mesma função em todos os organismos

que o contém

Parálogo (gene): aquele que é homólogo porém derivado de duplicação gênica num mesmo

organismo ou ramo na evolução

Parafilético: grupo monofilético que não incluiu todos os grupos descendentes de um único

ancestral comum

Polifilético: grupo de espécies classificadas juntamente mas originadas a partir de diferentes

populações ancestrais

CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO

Esta tese abrange o tema da patogenicidade de um grupo específico de

leveduras da Ordem Saccharomycetales na perspectiva da Biologia Molecular e

Evolução. Este tema foi subdividido em dois itens onde procuramos abordar o tema

central usando o método dedutivo, ou seja, partindo do geral para o específico. O

primeiro item trata da evolução do filo Ascomycota, que inclui a Ordem

Saccharomycetales, e dos principais eventos de radiação desse filo. Para tanto,

utilizamos a análise Bayesiana para inferência filogenética e verossimilhança

penalizada para estimativa de tempos de divergência. Esta metodologia foi utilizada de

forma pioneira no estudo destes fungos e propiciou uma nova perspectiva no estudo da

sistemática do filo Ascomycota. O segundo item trata do estudo de biofilmes em

leveduras patogênicas, mais especificamente, a identificação de proteínas de matriz de

biofilme de Candida albicans. O trabalho neste item teve início pela busca de

correlação entre evolução e patogenicidade das leveduras da Ordem

Saccharomycetales. A tese é composta, portanto, de uma Introdução e Discussão geral

e as partes convencionais de Material e Métodos e Resultados divididas em 3 seções

correspondendo a uma publicação, um manuscrito submetido e resultados adicionais

em via de preparação de manuscrito.

1.1. A EVOLUÇÃO DE FUNGOS

Os fungos (Fungi), animais (Animalia) e plantas (Viridiplantae) fazem parte do

único grupo a se desenvolver a partir de um ancestral aquático, como organismos

multicelulares em ambiente terrestre, tendo seu tempo de divergência estimado em

1.500 Ma (Wang et al., 1999 e Bruns, 2006). Estima-se que o reino Fungi pode agrupar

até 1,5 milhão de espécies, mas somente 100.000 estão catalogadas e classificadas

dentro do reino (Hawksworth, 2001). Os fungos estão divididos em filos

tradicionalmente conhecidos como Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota e

Chytridiomycota (Alexopoulos et al., 1996 e Berbee e Taylor, 2001). As leveduras, ou

fungos anamorfos, compreendendo cerca de 20.000 espécies, não eram facilmente

identificadas e classificadas por não possuírem corpos de frutificação. Por isso, por

muito tempo, foram agrupadas em um filo onde não existia nenhuma relação de

parentesco entre os organismos, uma classe-forma (“form-class”) denominada

Deuteromycota (Alexopoulos et al., 1996). Devido aos estudos moleculares, essas

leveduras puderam ser localizadas em um contexto evolutivo, muitas vezes associadas

às suas formas sexuadas ou teleomórficas (Taylor, 1995), sendo agrupadas, em sua

maioria, na Ordem Saccharomycetales dentro do filo Ascomycota.

A figura 1 sumariza os principais filos e ramos dos fungos. O filo

Chytridiomycota compreende fungos verdadeiros que produzem esporos flagelados

(zoósporos) para se reproduzirem (Alexopoulos et al., 1996). Na evolução do Reino

Fungi, Berbee e Taylor (2001) propuseram que houve pelo menos 3 perdas de flagelo

dentro do grupo dos Chytridiomycota e Zygomycota. James et al. (2006) inferiram que

houve de 4 a 6 perdas de flagelo e teriam ocorrido nos ramos em que divergem

Hyaloraphydium curvatum (o único fungo que cresce superficialmente como uma alga

planctônica), os Microsporidia e de 2 a 4 perdas nos grupos derivados de Zygomycota.

Liu et al. (2006) propuseram que houve apenas uma perda de flagelo, quando o

ancestral dos Chytridiomycota ganhou o ambiente terrestre. Todos os trabalhos

concluem que o filo Chytridiomycota não é monofilético, ou seja, o filo não deriva de um

ancestral único comum, implicando em nova classificação na base da evolução dos

fungos (Berbee e Taylor, 2001; James et al., 2006 e Liu et al., 2006).

Figura 1: Principais ramos do reino Fungi. Esquema simplificado da árvore filogenética gerada

a partir de seqüências do gene SSU rDNA 18S, mostrando os principais filos: Ascomycota e

Basidiomycota, conhecidos por terem em parte do seu ciclo de vida, núcleos pareados

(dikarya), Glomeromycota (anteriormente classificados dentro dos Zygomycota), representantes

dos Zygomycota e Chytridiomycota misturados na base da árvore, indicando parafilia desses

grupos, compartilhando apenas a morfologia primitiva. Fonte: James et al.(2006).

Os fungos do filo Zygomycota compreendem cerca de 1.000 espécies que

produzem zigósporo na reprodução sexuada e assexuada, contidos em um

zigosporângio de parede espessa e ricamente ornamentada. Caracterizam-se por

serem filamentosos saprofíticos com hifas cenocíticas (Alexopoulos et al., 1996).

Os “dikaria”, representados pelos filos Ascomycota e Basidiomycota agrupam

cerca de 98% dos fungos descritos. Inúmeras inferências filogenéticas baseadas em

diversos marcadores moleculares corroboram a monofilia dos grupos-irmãos (James et

al., 2006; Liu et al., 2006 e Hibbett et al., 2007). Os Ascomycota são fungos que

produzem meiósporos (ascósporos) na reprodução sexuada em estruturas

especializadas denominadas asci (Alexopoulos et al., 1996) e são importantes pois

incluem os principais patógenos humanos, de animais e plantas, sendo amplamente

utilizados na indústria alimentícia (fabricação de pães e bebidas) e como modelos para

estudos em eucariotos (Alexopoulos et al., 1996). Os Basidiomycota agrupam cerca de

30.000 espécies e produzem seus esporos sexuais (basidiósporos) em estruturas em

forma de clava, chamadas de basidia. São importantes decompositores e fonte

alimentícia (cogumelos) (Alexopoulos et al., 1996).

1.1.1. A Evolução do filo Ascomycota

No filo Ascomycota são classificados mais da metade dos fungos identificados

que estão divididos em três principais subfilos: Taphrinomycotina (ou

Archiascomicetos), Pezizomicotina (ou ascomicetos filamentosos; também chamados

de Euascomicetos) e Saccharomycotina (Ordem Saccharomycetales) (James et al.,

2006). Em detalhe, os Archiascomicetos foram o primeiro grupo a se divergir dentre os

Ascomycota e incluem patógenos de plantas na forma de micélios rústicos e leveduras

que se reproduzem por fissão binária (fission yeasts) (Alexopoulos et al., 1996).

Diferentemente dessas últimas, as leveduras da Ordem Sacchromycetales

reproduzem-se por brotamento e muitas delas, são as formas assexuadas de

ascomicetos filamentosos. Esse último grupo, também conhecido como

Euascomicetos, por muito tempo foi classificado de acordo com características

morfológicas e de formação de seus asci em diferentes tipos de ascocarpos. De acordo

com a forma do ascocarpo, os ascomicetos filamentosos eram classificados em:

Discomycetes, Pyrenomycetes, Plectomycetes e Loculomycetes (Alexopoulos et al.,

1996). A figura 2 mostra os diferentes ascocarpos de acordo com o grupo a que

pertencem.

Figura 2: Morfologia dos ascocarpos dos ascomicetos filamentosos. Os Discomycetes formam

os asci em ascocarpo aberto, em formato de prato, chamado de apotécio; os Loculomycetes

formam seus asci em um estroma celular, denominado ascostroma; os Plectomycetes formam

asci em ascocarpos fechados em formato de bola, chamado de cleistotécio; por fim, os

Pyrenomycetes formam asci em ascocarpos no formato de pêra, chamados de peritécio. As

setas amarelas destacam os asci no interior dos ascocarpos. Fonte: Alexopoulos et al. (1996)

Estudos moleculares confirmaram a monofilia de diversos desses grupos de

Ascomycota, como os Pyrenomycetes, Plectomycetes, Archiascomycetes, e a ordem

Saccharomycetales (Berbee e Taylor, 1992b; Gargas e Taylor, 1995; Berbee et al.,

2000; Lumbsch, 2000 e Berbee, 2001). Contudo, outros grupos como os Discomycetes

e Loculomycetes possuem sistemática incerta, visto que não é sabido se formam um

agrupamento artificial de organismos, causado pela convergência de caracteres

morfológicos ou se foram analisados caracteres moleculares insuficientes para resolver

as relações filogenéticas dos mesmos (Gargas e Taylor, 1995 e Berbee, 1996).

Diversas análises moleculares foram feitas na tentativa de se elucidar a sistemática

desse grupo, mas sempre encontravam dois possíveis cenários para a sua radiação:

um favorecendo a posição basal dos Discomycetes (Gargas e Taylor, 1995 e Lutzoni et

al., 2001) e outro favorecendo os Pyrenomycetes (Berbee e Taylor, 2001).

1.1.2. Marcadores moleculares e a Evolução do filo Ascomycota

A análise de marcadores moleculares como seqüências de DNA tem sido muito

importante na reclassificação taxonômica e estudo da evolução dos fungos. A

taxonomia tradicional é conhecida por utilizar-se de caracteres únicos morfológicos

(como corpo de frutificação, forma do ascocarpo, etc) para classificar novos

organismos, mesmo considerando que existam homoplasias (Alexopoulos et al., 1996 e

Bruns, 2006).

A grande maioria dos estudos filogenéticos de grandes grupos de fungos e de

diversos outros organismos utilizou-se de seqüências do gene SSU rDNA 18S (Small

subunit rDNA 18S). Este gene é arranjado em cerca de 200 cópias repetidas

seqüencialmente no genoma (“tandem repeats”) com tamanho estatisticamente bom

(>1.500 bp) para análise, e ainda, possui estrutura e função universalmente

conservadas (Butler e Metzenberg, 1989). São portanto, simultaneamente, genes

homólogos (derivados de um único ancestral comum), análogos (mesma função em

organismos diferentes), e por isso, ortólogos. Por estar presente em todos os seres

vivos e o acúmulo de mutações em suas seqüências ser proporcional ao “ranking”

taxonômico dos organismos, o tornam um “padrão-ouro” para estudos evolutivos

(Woese, 1987 e Bruns, Vilgalys et al., 1992). O rDNA 18S foi utilizado em diversos

estudos de macro-evolução de fungos. Bruns et al. (1992) e Berbee e Taylor (1992a)

mostraram que os Plectomycetes, Pyrenomycetes, a Ordem Saccharomycetales e os

Archiascomycetes são grupos monofiléticos. Já os Loculomycetes e Discomycetes

mostraram-se parafiléticos e polifiléticos, respectivamente (Bruns et al., 1992; Gargas e

Taylor, 1995 e Berbee, 1996). Lutzoni et al. (2001) concluíram que o ancestral dos

ascomicetos filamentosos era um formador de líquens.

Para estudos intraespecíficos de sistemática são necessários marcadores que

acumulem um maior número de mutações em um espaço curto de tempo (Metzenberg

et al., 1985). Os marcadores mais utilizados são as regiões ITS dos genes

ribossômicos, que compreendem o espaçador transcrito interno 1 (ITS1), o gene

ribossômico 5.8S (rDNA 5.8S) e o espaçador transcrito interno 2 (ITS2); as regiões

D1/D2 do gene rDNA 28S e genes do genoma mitocondrial (Kurtzman, 2000 e Borman

et al., 2008). Por exemplo, dentro da Ordem Saccharomycetales, Sanson e Briones

(2000) verificaram que o gene mitocondrial COX2 (Citocromo oxidase 2) poderia

ser utilizado na discriminação de linhagens de Candida glabrata de origens

geográficas distantes. Também investigaram se poderiam encontrar a seqüência

de COX2 de Candida albicans a partir da seqüência de C. glabrata, mas não

obtiveram sucesso, sugerindo que a distância genética entre a primeira e a

segunda poderia ser maior que a observada entre gêneros diferentes, como entre

C. albicans e Saccharomyces cerevisiae.

Com o aumento de genomas completamente seqüenciados em bancos de dados

e a conseqüente identificação de genes homólogos, aqueles codificadores de proteínas

têm sido cada vez mais utilizados em estudos de sistemática de fungos (James et al.,

2006 e Liu et al., 2006). A vantagem em utilizá-los é que seqüências homólogas de

proteínas tendem a ter tamanhos constantes, visto que deleções e inserções no DNA

podem mudar a fase de leitura e conseqüentemente, eliminar a proteína por seleção.

Já o rDNA 18S pode variar de tamanho entre 1.800 a 2.300 nucleotídeos (Berbee e

Taylor, 2001). A desvantagem da utilização dessas seqüências é que justamente pela

seleção atuar na manutenção de um código de 20 aminoácidos (codificados em

tripletes) e não somente sobre 4 nucleotídeos independentes, a maioria das mutações

tende a ser sinônima, e algumas podem ser na realidade, homoplasias (Berbee e

Taylor, 2001).

Liu et al. (2006) utilizando seqüências das subunidades maiores da RNA

polimerase II (Rpb1p e Rpb2p) corroboraram a monofilia dos Ascomycota e de seus

três subfilos (Taphrinomycotina, Pezizomicotina e Saccharomycotina). Outros autores

utilizaram tanto análises de genes ribossômicos quanto de proteínas para estudos de

sistemática. James et al. (2006) analisaram as seqüências de 6 genes: rDNA 18S,

rDNA 28S, rDNA 5.8S, o fator de elongação 1-_ (Ef1_p) e as mesmas seqüências de

RNA polimerase II (Rpb1p e Rpb2p). Também observaram a monofilia dos Ascomycota

e de seus subfilos. As relações filogenéticas dentro do subfilo Pezizomycotina

corroboraram a posição basal dos Discomycetes entre os ascomicetos filamentosos

(Gargas e Taylor, 1995 e Lutzoni et al., 2001), sendo o grupo dos Pezizomycetes, que

não formam líquens, os primeiros a divergirem, contrariando análises prévias (Lutzoni

et al., 2001), que sugeriam que o ancestral desse subfilo associava-se às algas ou

cianobactérias para formar líquens.

1.1.3. Datação e relógio molecular

O processo básico da evolução de seqüências de DNA é a mudança ou

substituição de nucleotídeos com o tempo (revisto em Li e Graur, 1991). Essas

substituições ou mutações vão aumentando sua freqüência na população

vagarosamente, até que sejam fixadas e são essas seqüências que observamos

ao isolar um DNA específico nos dias de hoje. Ao compararmos duas seqüências

de DNA podemos inferir a taxa de substituição de nucleotídeos (r), que é definida

como o número de substituições por sítio por ano e é calculada, dividindo-se o

número de substituições entre essas seqüências de DNA (K), por duas vezes o

tempo de divergência passado entre um ancestral comum e elas (2T):

(1) r = K/(2T)

O gene rRNA 18S é muito utilizado para estimar os tempos de divergência

entre espécies de grupos nos quais não existe registro fóssil, como é o caso da

ordem Saccharomycetales (Berbee e Taylor, 1992b). Escalante e Ayala (1995)

estimaram a taxa para este gene entre 0,85-2% de divergência de seqüência a

cada 100 Ma. Contudo, esta estimativa não foi confirmada por registros fósseis,

entre eles o de um fungo do grupo dos Pyrenomycetes, datado em 400 Ma

(Taylor et al., 1999). Pelas datas inferidas a partir de análise do gene rDNA 18S,

o grupo dos Pyrenomycetes teria uma origem muito mais recente (310 Ma)

(Berbee e Taylor, 2001), e há 400 Ma ainda não teria ocorrido à divergência entre

os filos Ascomycota e Basidiomycota.

Wang et al. (1999) reportaram que o coeficiente de variação das

estimativas de tempo de divergência entre diferentes genes estaria entre 25 a

35%. Eles atribuíram esse fato em parte à variação das metodologias

empregadas nas datações, a utilização de um único ou de vários pontos de

calibração, se são analisadas seqüências de DNA ou de proteínas, de genes

nucleares ou mitocondriais, o tamanho das seqüências, e ainda, o número de

genes empregados para estimar o tempo de divergência, propondo que diversos

genes devem ser analisados independentemente.

Na datação dos principais eventos de radiação de fungos, a diferença nas

estimativas de tempo de divergência remonta dois cenários evolutivos: um em

que esses eventos ocorreram no período Pré-Cambriano antigo, era Proterozóica

(1.000 a 700 Ma) (Heckman et al., 2001), e outro, muito mais recente, na era

Paleozóica (entre 500 e 200 Ma) (Berbee e Taylor, 2001). No primeiro cenário,

Heckman et al. (2001) utilizaram 119 seqüências de genes codificadores de

proteínas, que possuíam variação de taxa muito pequena entre elas, ou seja, poderia

ser considerada uma taxa média e constante na análise (evolução como “relógio

molecular”). Como pontos de calibração, foram utilizadas as datas do fóssil de

Pyrenomycete (400 Ma) e a estimativa da divergência de plantas, animais e fungos,

datada em 1.576 Ma (Wang et al., 1999). Berbee e Taylor (2001) utilizaram cerca de 40

seqüências de rDNA 18S e como ponto de calibração, foi usada a data do fóssil

representativo de Glomaceae (família relacionada aos Zygomycota e Chytridiomycota),

datado em 390 Ma e a estimativa da divergência de animais e fungos, datada em 965

Ma. Comparativamente, a radiação do Filo Ascomycota teria ocorrido, respectivamente

entre 1.400 e 1.200 Ma nas análises de multi-proteínas e 590 Ma na análise do rDNA

18S. A separação entre Pyrenomycetes e Plectomycetes teria ocorrido em 670 Ma e

310 Ma, e Candida e Saccharomyces, principais gêneros de leveduras da Ordem

Saccharomycetales, 841 Ma e 140 Ma.

Em estudos comparativos de proteínas de mamíferos, Zuckerkandl e

Pauling (1962) e Margoliash (1963) reportaram que a taxa de substituições de

aminoácidos destas proteínas era aproximadamente a mesma entre várias

linhagens analisadas. Propuseram que para qualquer proteína a taxa de evolução

molecular seria aproximadamente constante em todas as linhagens e portanto,

existiria um “relógio molecular”. Contudo, havia divergências pois o relógio

molecular não corroborava a existência de dados caracteres morfológicos e

fisiológicos (Li e Graur, 1991).

Considerando estudos de macroevolução do Reino Fungi, diferentemente

de algumas proteínas (exemplo, a DNA Topoisomerase I (Hedges et al., 2004)), a

taxa de substituições do rDNA 18S mostrou-se não constante, ou seja, não é

possível aceitar a hipótese de evolução como relógio molecular para datar os

principais eventos de sua radiação (Padovan et al., 2005). É sabido que alguns

grupos, como os Plectomycetes possuem taxa do gene ribossômico constante,

dizendo-se que existe ali, relógio molecular local (Berbee e Taylor, 1993 e Kasuga

et al., 2002). Atribuem-se parcialmente as diferenças nas taxas de substituição de

nucleotídeos à eficiência no sistema de reparação de DNA (Britten, 1986).

Para datar eventos de radiação considerando diferentes taxas de evolução ou

relógios locais, alguns métodos foram desenvolvidos como o “Penalized likelihood”

(Sanderson, 2002). Este método combina métodos paramétricos (assume que as taxas

de evolução seguem uma dada distribuição, como lognormal (Thorne et al., 1998), ou

de Poisson (Huelsenbeck et al., 2000), corrigidas por máxima verossimilhança), com

métodos não paramétricos (que penalizam taxas rápidas de mudança de nucleotídeos,

minimizando as mudanças de taxa entre os ramos ancestrais e descendentes em uma

árvore, como “Nonparametric rate smoothing” (NPRS) (Sanderson, 1997)). O

diferencial do método é determinar o valor ótimo de “smoothing” (!) para estimar a

penalização das taxas rápidas de evolução. Esse valor pode variar de muito pequeno,

quando cada ramo da filogenia tem uma taxa de substituição diferente, para muito

grande, quando os parâmetros mostram-se essencialmente como “relógio molecular”

(“clock-like”) (Bell e Donoghue, 2005). Dessa forma, é possível calcular a taxa média de

substituição de nucleotídeos e datar os eventos de radiação sem a necessidade de

assumir a “hipótese nula” de relógio molecular global. Esse método é ainda muito útil

pois permite a adição de pontos de calibração para as estimativas, como as datas de

registros fósseis.

1.1.4. Pontos de calibração na datação de fungos

A utilização de registros fósseis associados a dados moleculares para calibrar

datações pode ser feita de duas formas: pode’-se fixar os pontos de calibração e

calcular o valor absoluto dos ramos ou pode-se utilizá-los como tempos máximo e

mínimo em um dado ramo (Sanderson, 1997). Contudo, vale lembrar que tempos de

divergência derivados de registros fósseis sempre são subestimações da divergência

real (Benton e Ayala, 2003). Por isso, a escolha de fósseis apropriados e classificados

corretamente é muito importante para as análises.

Alguns fósseis classificados no grupo dos fungos ou chamados de “fungi-like”

não se enquadram em nenhuma das estimativas de tempo de divergência já propostas

(Berbee e Taylor, 2001; Heckman et al., 2001 e Hedges et al., 2004). Esse fato reflete

um problema circular na utilização de fósseis para calibrar as datações, visto que essas

últimas acabam sendo usadas para auxiliar na classificação do fóssil, essencialmente

baseada na morfologia, e colocá-lo em um contexto evolutivo mais apropriado. Fósseis

de tipo “levedura-like” (Pflug, 1978) e outro “líquen-like”, encontrado na África do Sul,

foram datados, respectivamente em 3.400 Ma e 2.500 Ma (Hallbauer et al., 1977),

sendo que nos ecossistemas atuais, os líquens são a simbiose entre ascomicetos

filamentosos e algas. As estimativas baseadas em análise de seqüências de multi-

proteínas (Heckman et al., 2001 e Hedges et al., 2004), e rDNA 18S (Berbee e Taylor,

2001) dataram as radiações das primeiras leveduras (Taphrinomycotina) e o filo

Ascomycota, respectivamente em 1.250 e 1.050 Ma e 390 e 280 Ma.

Infelizmente poucos fósseis dos grupos mais antigos são encontrados. Aqueles

melhor caracterizados e utilizados como pontos de calibração são: um fóssil “Glomus-

like”, associado à formação de micorrizas (Zygomycota), datado em 460 Ma, no

período Ordoviciano (Redecker et al., 2000); dois representantes do filo Basidiomycota

(caracterizados pela formação de “clamp-connections”), um datado em 290 Ma

(Dennis, 1970) e outro em 90 Ma, preso em âmbar (Hibbett et al., 1995), e o mais

antigo descoberto até hoje, um representante de Pyrenomycetes, datado em 400 Ma

(Taylor et al., 1999).

Estimativas de tempos de divergência já calculadas com diferentes métodos e

seqüências também são utilizadas para calibrar novas análises. No grupo dos fungos,

as datações mais utilizadas são as propostas por Wang et al. (1999), que datou a

divergência entre as plantas, animais e fungos em 1.576 Ma e a separação de animais

e fungos, datada em 965 Ma (Doolittle et al., 1996).

1.1.5. Métodos de inferência filogenética no estudo da Evolução dos fungos

Os objetivos dos estudos filogenéticos são inferir as relações genealógicas entre

organismos e estimar os tempos de divergência entre organismos que dividem uma

ancestralidade em comum (Li e Graur, 1991). Ao considerar a taxa de substituições de

nucleotídeos de dadas seqüências moleculares como ferramenta para reconstruir o

passado evolutivo desses organismos, é necessário considerar que as mutações

observadas são fruto de um acúmulo de substituições ao longo do tempo (Li e Graur,

1991). Por isso, em análises de marcadores moleculares de organismos

filogeneticamente distantes, é muito necessária a utilização de modelos probabilísticos

que corrijam para mutações superimpostas. Existem diversos modelos probabilísticos,

desde os mais simples, como o JC (Jukes e Cantor) (Jukes e Cantor, 1969), que

assume que as mutações ocorrem com a mesma probabilidade e ao acaso entre os 4

tipos de nucleotídeos, até os mais complexos, como o GTR (General Time Reversible)

(Tavare, 1986) que assume 6 diferentes valores de probabilidades instantâneas já

fixadas ou estimadas a partir do alinhamento, para correção das inferências

filogenéticas. Por exemplo, esses modelos mais complexos consideram que a terceira

posição dos códons de genes codificadores de proteínas tendem a evoluir mais

rapidamente que a primeira e a segunda, pois a maioria de suas mutações é silenciosa

(Li e Graur, 1991).

As inferências ou árvores filogenéticas são grafos matemáticos contendo ramos

que interligam os organismos estudados com seus respectivos possíveis ancestrais (os

nós) (Li e Graur, 1991). Elas podem ser inferidas por diversos métodos, considerando

ou não os modelos de substituição de nucleotídeos.

No método da parcimônia, é escolhida como a melhor árvore, ou a árvore que

melhor representa as relações entre os organismos, aquela que contiver o menor

número de passos evolutivos (substituições) para explicar as diferenças observadas

entre as seqüências (Fitch, 1977). Os problemas do método é que este não utiliza a

priori, correção de modelos de substituição de nucleotídeos, sendo intuitiva a escolha

da árvore (a que contiver o menor número de mutações). Geralmente são geradas

diversas árvores com pequenas diferenças na topologia, mas igualmente

parcimoniosas, sem que seja dado algum suporte estatístico para a escolha da

“verdadeira”. O princípio da parcimônia veio do pensamento lógico do frade franciscano

William de Ockham (século XIV), que diz que “se em tudo o mais forem idênticas as

várias explicações de um fenômeno, a mais simples é a melhor". Contudo, esse

pensamento conflita diretamente com o processo evolutivo: como é possível emergir da

natureza organismos mais complexos, se assumirmos que a mesma escolhe o

caminho mais econômico na evolução?

No método de distância considera-se para inferir filogenias uma matriz com o

número de diferenças entre duas seqüências comparadas par a par (Saitou e Nei,

1987). Esse método pode utilizar a correção de modelos de substituição de

nucleotídeos, visto que a razão para duas seqüências serem muito distantes entre si

não necessariamente é causada pelo tempo que passou desde a divergência entre

elas, mas sim, a taxa que é muito alta por conta das mutações superimpostas (Li e

Graur, 1991). O método fornece uma árvore filogenética em que as distâncias

(diferenças entre as seqüências) determinam o tamanho dos ramos. As análises de

distância tendem a ser as mais utilizadas como ponto de partida para outras análises

mais complexas em estudos de macroevolução, mas é muito útil em estudos

intraespecíficos, principalmente pela rapidez que gera os grafos (Hall, 2001). O

problema desse tipo de abordagem é a redução dos dados de seqüência (dados

biológicos), à uma distância numérica, o que leva a grande perda de informação

(Swofford et al., 1996).

A máxima verossimilhança (ML – “Maximum likelihood”) considera como a

melhor árvore, aquela que explica os dados observados (o alinhamento), dado um

modelo de substituição de nucleotídeos (Felsenstein, 1981). Em outras palavras, ML

procura por uma árvore (hipótese) que maximize o “valor de likelihood” (LnL) do dado

observado (o alinhamento), considerando parâmetros de um modelo markoviano

escolhido. Esse método utiliza-se de modelos complexos de substituição de

nucleotídeos e dá suporte estatístico para testar as hipóteses (as árvores) (Li e Graur,

1991). Assim, as estimativas de ML tornam-se consistentes (dado que existam dados

suficientes e um modelo adequando), visto que sempre apresenta a topologia

estatisticamente mais correta das relações entre os organismos (Rogers, 1997). As

vantagens da ML é que geralmente apresenta uma única árvore escolhida, com valor

de “likelihood” conhecido. As desvantagens são a prisão da busca heurística em

“morros” que contenham árvores com valores de “likelihood” sub-ótimos e a

implementação computacional do método, visto que a busca é lenta, não trata centenas

de seqüências em um alinhamento, tornando-se geralmente, um método limitado à

capacidade do processador do computador (Hall, 2001).

Considerado atualmente o mais eficiente e robusto método de inferência

filogenética, o método Bayesiano utiliza-se da ML na busca da melhor árvore, que é

dada não pela busca da árvore que maximize o “valor de likelihood” de dados

observados, mas sim, procura árvores que maximizem o “likelihood” dado os dados (o

alinhamento) (Huelsenbeck e Ronquist, 2001). A principal vantagem do método é

produzir uma série de árvores com valores de “likelihood” estatisticamente iguais, as

quais podem ser unidas por um consenso, resultando na freqüência (ou na

probabilidade a posteriori) de um dado agrupamento ou clado. Outras vantagens do

método é a capacidade em lidar com grande número de seqüências e calcular

rapidamente os valores de likelihood, corrigindo a busca para que esta não fique presa

em soluções sub-ótimas e armazene árvores que não sejam de fato as “melhores” ou

mais verossímeis (Huelsenbeck e Crandall, 1997)

No estudo da evolução de fungos, Heckman et al. (2001) utilizaram-se de

análises de distância, considerando a distância média de genes de proteínas

concatenados como dado comparativo para inferir e datar os eventos iniciais da

radiação do reino Fungi. Berbee e Taylor (1993 e 2001) utilizam geralmente

comparações de árvores de parcimônia e distância em suas inferências a partir de

seqüências de rDNA 18S. Lutzoni et al. (2001) foi o primeiro a utilizar a análise

Bayesiana pra inferir as relações filogenéticas de ascomicetos filamentosos. Taylor e

Berbee recentemente aderiram à utilização da análise Bayesiana para estimar

novamente os tempos de divergência dos principais eventos de radiação dos fungos

(Taylor e Berbee, 2006).

1.2. BIOFILMES

O estudo das interações dos fungos do filo Ascomycota com outros

microorganismos, animais e plantas, é crucial para se entender a co-evolução dos

mesmos e como eles puderam ocupar e se espalhar com grande sucesso pelos mais

diversos ecossistemas do planeta. A capacidade dos microorganismos, especialmente

dos fungos, em se aderir às superfícies abióticas e formar comunidades complexas

vem se tornanando objeto de estudo na Medicina por conta da disseminação de

microorganismos patogênicos e resistentes aos tratamentos em hospedeiros humanos

(Donlan, 2001).

A história da Microbiologia baseia-se basicamente na observação de

microorganismos isolados que vivem na forma livre ou planctônica e que são

transportados para condições “ideais” de crescimento em laboratório, como meio rico e

temperatura para se estudar seus fenótipos, genótipos e metabolismo. A partir das

décadas de 60 e 70 passadas, com os avanços principalmente na microscopia

eletrônica, verificou-se que mais de 99% dos microorganismos cresciam, na verdade,

nos mais diferentes ecossistemas, em comunidades complexas (Potera, 1999). Essas

comunidades microbianas quando agregadas ou aderidas a uma superfície são

conhecidas como biofilmes, e os organismos que nele vivem ficam protegidos contra

ressecamento e falta de nutrientes por uma matriz extracelular por eles secretada

(Donlan e Costerton, 2002 e Douglas, 2003).

O primeiro a reportar o fenômeno de formação de biofilme foi Anton van

Leeuwenhoek (1632-1723) no século 17, observando em um simples e rústico

microscópio que as bactérias que cresciam em forma de placas sobre dentes de

pacientes, possuíam fenótipo distinto das que cresciam na forma planctônica (Donlan e

Costerton, 2002). Contudo, os cientistas só prestaram a devida atenção à

complexidade e prevalência da formação do biofilme como um peculiar microambiente

nas últimas décadas.

1.2.1. Formação de biofilmes: problema industrial

Devido à facilidade de desenvolvimento de biofilme microbiano onde exista fluxo

de líquidos, a presença de colônias sésseis em tubulações de água e rejuntes se

tornou um problema para as indústrias que, por vezes, interrompe a produção e

contamina o produto final, principalmente na indústria alimentícia (Mittelman, 1998).

Prejuízos crescentes com corrosão e contaminação, bem como, a dificuldade em se

retirar o biofilme aderido (sensível apenas à força mecânica), fizeram com que pessoas

envolvidas na manutenção do sistema de abastecimento de água fossem as primeiras

a desenvolver métodos de coleta e aplicação de biocidas contra colônias de bactérias

sésseis (Donlan e Costerton, 2002), e de fungos filamentosos e leveduriformes,

principalmente aqueles que são resistentes ao tratamento com cloro (Doggett, 2000).

A formação de biofilmes em superfícies sólidas, geralmente abióticas, se dá em

4 etapas principais, esquematizadas na Figura 3. Células contidas em um fluxo de

líquidos encontram uma superfície, na qual podem se aderir através das proteínas que

recobrem suas células, bem como por forças físicas de interação com a superfície em

questão (como interações de Van der Waals) (Figura 3 - parte 1). Essa adesão primária

pode ser revertida. Contudo, a partir do momento em que as células passam a se

dividir e crescer em camadas, e ainda, a produzir e excretar uma matriz extracelular, a

adesão célula-célula e célula-substrato, passa a ser irreversível (partes 2 e 3). Tanto a

morfologia quanto o metabolismo celular é alterado e adaptado a esse novo

microambiente. O biofilme tende a crescer mais devido ao acúmulo de partículas que

estejam no meio e aos poucos, células passam a se desprender do biofilme, por erosão

(perda de células individuais) ou perda de agregados maiores, ainda protegidos pela

matriz (parte 4). No biofilme, a matriz extracelular é importante pois age como barreira

física contra a ação de antimicrobianos naturais, bacteriófagos e amebas fagocíticas

(Donlan e Costerton, 2002).

Figura 3. Esquema da formação de biofilme bacteriano em rede de tratamento de água. As

etapas de sua formação estão divididas em 1- adesão reversível ao substrato; 2- divisão celular

acelerada e matriz extracelular sendo secretada; 3- adesão célula-célula e delas ao substrato

torna-se irreversível; 4- células ou propágulos se desgrudam do biofilme, podendo contaminar

linhas de produção em indústrias e reservatórios hospitalares de água, por exemplo. Fonte:

Xavier et al. (2003)

Fungos filamentosos e leveduriformes do filo Ascomycota também são

encontrados nos sistemas de distribuição de água, podendo afetar diretamente a saúde

pública e contribuir para a ocorrência de intoxicações, reações alérgicas e infecções

em indivíduos imunocomprometidos (Doggett, 2000 e Warris et al., 2001). Anaissie et

al. (2002) realizaram coletas em diversos pontos do sistema de distribuição de águas

de Springfield (E.U.A) que servia em 1997 pelo menos 100.000 habitantes. Reportaram

a presença das espécies fúngicas dos gêneros Penicillium, Aspergillus, Mucor,

Alternaria, Cladosporium e Candida como as mais isoladas, formando biofilmes.

1.2.2. Formação de biofilmes fúngicos patogênicos e resistência

Na área da saúde, a aceitação de que as infecções fossem causadas por

microorganismos que se desenvolviam na forma de biofilme era reticente. Contudo,

hoje se acredita que em pelo menos 90% das infecções, o agente causador se

desenvolva como biofilme, sendo freqüentemente isolado de cateteres, conectores de

agulhas, tubos endotraqueais, válvulas cardíacas mecânicas, lentes de contato e

próteses dentárias (Donlan, 2001 e Murga et al., 2001).

Segundo US National Nosocomial Infections Surveillance System, quatro

espécies são as principais causadoras de infecções sistêmicas no atual cenário de

modernas e poderosas drogas e pacientes imunossuprimidos: as bactérias

Staphylococcus coagulase-negativo, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp e a

levedura Candida albicans (Douglas, 2003). C. albicans e, em menor número, outras

espécies patogênicas do gênero são responsáveis por infecções oportunistas

sistêmicas e de mucosas, associadas à alta mortalidade de 35% dos pacientes.

(Calderone e Gow, 2002b).

Além da alta taxa de mortalidade associada às infecções causadas por C.

albicans, ela tornou-se um excelente modelo para estudos de formação e regulação em

biofilme fúngicos patogênicos, devido à característica de ser um fungo polimórfico. A

figura 4 mostra um biofilme de C. albicans formado na luz de um cateter implantando

em rato. Podem ser observadas as duas morfologias características de C. albicans, a

levedura (célula oval que se reproduz por brotamento) e a hifa (filamento linear formado

de células separadas por septos, sem constrições visíveis nestes locais) (Calderone,

2002). Ainda existe uma terceira morfologia, a pseudo-hifa (cadeia de células

alongadas cuja separação da célula filha e da célula mãe não ocorreu durante o

processo de brotamento, com constrições visíveis na junção célula-célula). É possível

encontrar as 3 formas tanto no biofilme quanto em infecções, sendo esta a razão deste

fungo ser mais bem denominado como polimórfico em vez de dimórfico (Kobayashi e

Cutler, 1998).

Figura 4. Microscopia eletrônica de biofilme de C. albicans formado no interior de cateter

implantado em modelo murino. São observadas leveduras e hifas envoltas por material da

matriz extracelular. Em a, corte transversal do cateter mostrando o biofilme aderido, com

profundidade maior que 200!m, em um aumento de 1.000 vezes. No corte, em b, é possível

observar que o biofilme ocupa quase toda a superfície do cateter. Fonte: Nett e Andes (2006)

Além da formação de hifas, a produção de biofilme é um importante fator de

patogenicidade desse fungo, devido à sua intrínseca ligação com a resistência aos

antifúngicos de uso corrente (Calderone e Gow, 2002b). Estudos verificaram que a

progressão da resistência às drogas, como anfotericina B, fluconazol e caspofungina

era diretamente associada com o aumento da atividade metabólica no desenvolvimento

do biofilme, contrário ao que se pensava até então, que a resistência era promovida

unicamente pelas células com metabolismo reduzido no biofilme maduro (Ramage et

al., 2002; Lamfon et al., 2004 e Chandra et al., 2001). Hawser e Douglas (1995)

demonstraram que o biofilme de C. albicans crescido sobre discos de cateter de PVC

era cinco a oito vezes mais resistente do que células planctônicas, diante da

concentração inibitória mínima (MIC) de anfotericina B, fluconazol, flucitosina,

itraconazol e ketoconazol capaz de reduzir a atividade metabólica das células em 50%.

Esses autores ainda observaram que os MICs dos antifúngicos acima descritos de

biofilme eram 30 a 2.000 vezes mais altos que os MICs de células planctônicas.

Biofilmes de C. albicans e C. dubliniensis confirmaram sua resistência a

anfotericina B e fluconazol, quando crescidos sobre uma variedade de materiais

hospitalares, como filtro de celulose para diálise (Baillie e Douglas, 1998a), poliestireno

(Ramage et al., 2001a; Ramag et al., 2001b e Sánches-Souza et al., 2001), poliuretano

(Lewis et al., 2002), acrílico (Chandra et al., 2001 e Ramage et al., 2001a), e

elastômero de silicone (Chandra et al., 2001). Somente alguns antifúngicos atingem as

camadas mais inferiores e desmembram os biofilmes. Kuhn et al. (2002) mostraram

que o voriconazol e ravuconazol, quando formulados como lípides, apresentaram

atividade antibiofilme de C. albicans e C. parapsilosis, assim como a caspofungina, que

atua sobre a síntese de _ 1,3-glucana (componente de grande parte da parede celular).

Também foi mostrado que o efeito inibitório da caspofungina diminui em até 60% a

adesão de linhagens de C. albicans suscetíveis ao fluconazol (Soustre et al., 2004).

Além do problema da resistência intrínseca do biofilme, a propagação de células

tolerantes a partir dele vem preocupando quem o estuda. Lafleur et al. (2006)

reportaram a existência de subpopulações de células de C. albicans tolerantes a

tratamentos com anfotericina B e um anti-séptico largamente utilizado, a clorexidina.

Essas subpopulações eram encontradas somente em biofilmes de C. albicans e não

em células planctônicas, testadas em seu crescimento exponencial ou já na fase

estacionária. Ainda, quando reinoculadas para indução de biofilme, as células

resistentes ao tratamento com anfotericina B produziam nova subpopulação persistente

ao tratamento, indicando que essas células não eram mero produto de mutação, mas

sim, variantes fenotípicos da linhagem selvagem. Este trabalho também sugere que é a

adesão, mais do que a formação da estrutura complexa do biofilme, que propcia a

geração de células persistentes e tolerantes aos tratamentos com antimicrobianos.

Certamente a formação de biofilme influencia na geração de fenótipos diferenciados

em células planctônicas dele derivadas, tanto células resistententes, quanto sensíveis.

Jin et al. (2005) reportaram que pelo menos 1% de células derivadas de biofilmes da

linhagem de C. albicans 192887g possuía diminuição na formação de filamentos, na

assimilação de metil-"D-glicopiranosida como fonte de carbono, adesão e taxa de

crescimento.

Embora estudos mostrem que as células no biofilme de Candida spp são muito

mais resistentes, o mecanismo ou mecanismos que geram a resistência é muito pouco

conhecido. Presume-se que pelo menos três fatores possam influenciar ou agir

concomitantemente para promovê-lo, como 1- a expressão de genes sinalizada por

contato com determinadas superfícies; 2- modificações fenotípicas em decorrência da

queda na taxa de crescimento ou de nutrição e 3- a matriz extracelular presente como

barreira física contra a penetração das drogas (Douglas, 2003).

1.2.3. Regulação gênica e formação de biofilmes de Candida albicans

O contato com diferentes superfícies ocorre na fase de adesão celular (Figura 5

a e b), o material hospitalar como cateter está em contato com proteínas do hospedeiro

adsorvidas em sua superfície, o que pode promover a migração do patógeno

oportunista para o local. Imediatamente, proteínas de adesão do fungo passam a ser

secretadas. Em Saccharomyces cerevisiae foi mostrado que mutantes dos genes

FLO11, que codifica uma glicoproteína de superfície capaz de aderir em células de

mamíferos, e FLO8, que codifica uma proteína de regulação do primeiro, diminuíam

drasticamente a adesão célula-célula e célula-superfície (Reynolds e Fink, 2001). Em

C. albicans, uma classe de adesinas conhecidas como proteínas de parede celular

dependentes de glicosilfosfatidilinositol (GPI-CWPs) é responsável pela adesão a

diferentes substratos orgânicos e inorgânicos, como as proteínas codificadas pelos

genes EAP1 (Enhanced Adherence to Polystyrene), a família gênica ALS (Agglutinin-

Like Sequence) e HWP1 (Hyphal cell wall protein) (Li et al., 2007). A proteína Eap1p de

C. albicans restaurou a habilidade de mutantes nulos do gene FLO11 de S. cerevisiae,

drasticamente defectivos na floculação e adesão, de se aderir ao poliestireno e se

aderir e invadir células epiteliais de rins (Li e Palecek, 2003). Mutantes nulos de C.

albicans para Eap1p possuíam diminuição na adesão a cateter implantado em modelo

murino e célula-célula, na formação de bioflme in vitro (Figura 5 c). O mesmo foi

observado para adesão em células epiteliais (Li et al., 2007). Esse trabalho ainda

reportou que o gene EAP1 é superexpresso em células formadoras de biofilme em

comparação com as planctônicas.

Figura 5. Esquema da formação de biofilme de C. albicans em cateter de PVC. As etapas de

sua formação são semelhantes às de formação de biofilme bacteriano. a- superfície do cateter

contendo filme de proteínas do hospedeiro (pontos pretos); b- adesão inicial das células

leveduriformes (em vermelho); c- formação da lâmina basal de microcolônias de leveduras,

adesão célula-célula e célula superfíficie irreversíveis e d- formação completa do biofilme,

formado principalmente por lâmina rica em hifas (verde) e matriz extracelular secretada

(amarelo). Biofilmes maduros contém numerosas microcolônias entrecortadas por canais de

água que permitem a circulação de nutrientes. Fonte: Douglas (2003)

Os genes da família ALS também se mostraram superexpressos em células

formadoras de biofilmes em comparação com células planctônicas (Chandra et al.,

2001). Uma peculiaridade dessa família gênica faz com que seus genes sejam um dos

principais alvos de estudo de adesão e biofilme. Alguns dos genes, como ALS1, ALS5

e ALS9 apresentam formas longas e curtas dependendo do número de elementos

repetitivos entre cromossomos homólogos (Zhao et al., 2003). Isso significa que,

considerando apenas esses 3 genes, são produzidas 6 diferentes proteínas que, por

recombinação entre os elementos repetitivos do DNA, dobra o repertório de adesinas

de C. albicans (Verstrepen et al., 2004 e Verstrepen e Klis, 2006). Esse fato reflete-se

diretamente na geração de diferentes fenótipos da superfície da Candida, fazendo com

que esta possa se aderir a diferentes superfícies, dependendo dos genes ou alelos que

estão sendo expressos. Por exemplo, ALS2, 3, 6, 7 e 9 são altamente expressos e

ALS4 e ALS5 são reprimidos em modelo de candidíase vaginal (Cheng et al., 2005).

ALS3 mostrou ser necessário para a formação do biofilme crescido sobre silicone mas

dispensável em modelo de cateter implantado em rato. Isso, porque mutantes nulos

para este gene não formavam biofilmes in vitro, mas eram capazes de formar

normalmente biofilme in vivo (Nobile et al., 2006a).

Nas fases de formação e maturação do biofilme (Figura 5 c e d), genes que

controlam a transição levedura-hifa são requeridos, pois a partir da lâmina basal

celular, desenvolvem-se hifas e pseudo-hifas para estruturação de canais de água e

material polimérico da matriz extracelular passa a ser secretado (Figura 5 d) (Douglas,

2003). A proteína codificada pelo gene HWP1 mostrou-se importante para a adesão e

formação de biofilmes em cateteres impantados in vivo (Nobile et al., 2006a e Nobile et

al., 2006b). Esse gene possui expressão elevada em células formadoras de biofilme

em comparação com células planctônicas (Chandra et al., 2001 e Garcia-Sanchez et

al., 2004).

A proteína Efg1p que regula a formação de hifa em C. albicans mostrou ser

necessária para a formação do biofilme devido a ausência de filamentos e poucas

lâminas esparsas aderidas em mutantes para esta proteína (Ramage et al., 2002). A

filamentação, floculação e adesão desses mutantes eram aumentadas pela

superexpressão do gene ALS1, sugerindo que este atue na via abaixo de EFG1 (Fu et

al., 2002).

Além dos genes que compõe a via de controle da transição levedura-hifa, outros

genes foram recentemente descritos como reguladores principais para a formação e

manutenção de biofilme. Nobile e Mitchell (2005) identificaram o gene BCR1 (Biofilm

and Cell wall Regulator), como sendo um dos principais reguladores da formação

apropriada de biofilme, cuja proteína por ele codificada é um fator transcricional do tipo

“zinc finger”. A expressão de BCR1 é controlada diretamente por outro fator de

transcrição, o Tec1p (TEA/ATTS transcriptional factor). Mutantes nulos para ambos os

genes mostraram—se defectivos na formação de hifas em biofilmes, embora o mutante

nulo para BCR1 fosse capaz de formá-las em diferentes tipos de induções a partir de

células planctônicas (Nobile e Mitchell, 2005). Os autores concluíram que na condição

de biofilme o mutante nulo era capaz de induzir as hifas mas estas eram

funcionalmente defectivas. Ao comparar o perfil da expressão do mutante nulo com o

mutante heterozigoto para BCR1 por análises de “microarray” e RT-PCR, os autores

verificaram que diversos genes codificadores de adesinas, como a ALS3 e HWP1

estavam pelo menos 16 vezes menos expressos e ALS1 e ALS9, 2 vezes menos

expressos no mutante nulo crescido na forma de biofilme. Consequentemente, esse

mutante era incapaz de se aderir ao cateter e formar o biofilme mas poderia formar

hifas em outras situações. A habilidade de se aderir e formar assim o biofilme era

restaurada pela superexpressão do gene ALS3, sendo esse caracterizado como o

principal alvo da regulação transcricional de Bcr1p (Nobile et al., 2006a e Zhao et al.,

2006).

Ainda considerando o contato físico com uma superfície para a adesão uma das

possíveis causas para o aumento de resistência de biofilmes de C. albicans, Kumamoto

(2005) mostrou que a proteína Mkc1p (Mitogen-activated protein kinase) é a principal

sinalizadora para a adesão e formação de biofilme resistente ao fluconazol. Essa

proteína é a responsável por ativar uma cascata de sinalização de reconhecimento de

locais favoráveis no hospedeiro para a adesão, como ocorre de forma similar em

organismos multicelulares pela chamada “inibição por contato”, permitindo ou não a

ploriferação celular (Verstrepen e Klis, 2006). Mkc1p acumula-se na forma ativa

(fosforilada) em células aderidas e em hifas formadas em meio semisólido, desde as

primeiras horas de indução, diferentemente de células planctônicas, que não

apresentam a forma fosforilada. Mutantes nulos para o gene MKC1 produziam

biofilmes anormais e com poucos filamentos. Quanto à resistência, o biofilme desses

mutantes mostrou-se sensível ao fluconazol, o mesmo sendo observado quando

cresciam na forma planctônica e nas células selvagens. Já os biofilmes formados por

estas últimas eram extremamente resistentes ao fluconazol (Kumamoto, 2005).

Genes que codificam bombas de efluxo como CDR1, CDR2 (Candida Drug

Resistance) e MDR1 (MultiDrug Resistance) e que podem atuar na eliminação de

antifúngicos, apresentavam-se super expressos durante a formação e desenvolvimento

do biofilme (Ramage et al., 2002). Mutantes heterozigotos ou nulos desses genes eram

altamente susceptíveis ao fluconazol quando cresciam na forma planctônica e biofilme

formado por 6 horas. Contudo, biofilmes formados durante 12 a 48 horas e incubados

com fluconazol mostraram-se de 2 a 4 vezes mais resistentes que as células

planctônicas, sugerindo falta de envolvimento das bombas de efluxo em estágios

tardios de desenvolvimento do biofilme (Mukherjee et al., 2003 e Perumal et al., 2007).

Análises de “microarray” mostraram que diversos genes encontram-se

diferencialmente expressos em células formadoras de biofilmes em comparação com

células planctônicas de C. albicans. Garcia-Sanchez et al. (2004) reportaram a

superexpressão em biofilmes de genes relacionados à síntese protéica (proteínas

ribossomais), metabolismo de nucleotídeos e aminoácidos (genes da família MET,

TRP, ADE e CYS), metabolismo de lípides (ERG25 e 16), metabolismo de carboidratos

(ENO1, FBA1, GPM1 e PDC1), dentre outros. Nesse estudo, os genes relacionados à

bombas de efluxo não estavam superexpressos, ao contrário dos relacionados à

adesão, como a família ALS, principalmente ALS1. Murillo et al. (2005) estudaram a

expressão de genes no início da formação de biofilme e corroboraram os resultados

apresentados anteriormente, acrescentando à lista, genes envolvidos na virulência do

fungo como a família das SAPs (Secreted Aspartyl Proteinases). Já a comparação de

perfis transcricionais de biofilmes normais e biofilmes expostos ao farnesol (molécula

solúvel e sinalizadora, envolvida no controle populacional de C. albicans) revelou que

esse composto inibia drasticamente a formação de hifas, diminuindo a expressão de

diversos genes contoladores da via de filamentação (TUP1, EFG1 e CRK1), e genes

relacionados à hidrofobicidade da superfície celular (CSH1) (Cao et al., 2005). Genes

com expressão regulada por adesão, como PRA1, PGA7 e 23 e HWP1 mostraram-se

superexpressos em células de C. albicans aderidas em células epiteliais in vitro (Sohn

et al., 2006).

1.2.4. Fenótipos e metabolismo de células de C. albicans formadoras de biofilmes

As células do biofilme possuem diminuição na taxa de crescimento quando

comparadas às planctônicas devido ao gradiente nutricional e gasoso em que se

encontram (microaerofilia). As células da lâmina basal recebem muito menor

quantidade de nutrientes e oxigênio que as células mais superficiais do biofilme

(Douglas, 2003). A baixa taxa de crescimento sempre vem acompanhada de mudanças

na composição da superfície celular, que pode afetar a susceptibilidade do

microorganismo ao agente antimicrobiano (Douglas, 2003). Para correlacionar taxa de

crescimento com resistência, Baillie e Douglas (1998a) testaram a resistência a

anfotericina B de células planctônicas e em biofilme de C. albicans com diferentes

taxas de crescimento. Estes autores encontraram que o biofilme era resistente em

todos os estágios de crescimento em oposição às células planctônicas. Estes autores

também mostraram que a limitação nutricional de glicose e ferro na formação do

biofilme não alterou a resistência à anfotericina B (Baillie e Douglas, 1998b).

O número de células presentes no biofilme influencia diretamente na resistência.

Perumal et al. (2007) mostraram que inóculos de células planctônicas com 10

células/ml, como em biofilmes, possuíam valores de MIC para o fluconazol de 10 a 20

vezes maiores do que inóculos contendo 10

células/ml. Quando os biofilmes eram

ressuspensos antes do teste, a resistência permanecia, mas quando diluídos para 10

células/ml, eles tornaram-se sensíveis. Linhagens de C. albicans previamente

caracterizadas como resistentes ao fluconazol, mostraram-se ainda mais resistentes

em inóculos densos de células planctônicas, biofilmes e biofilmes resuspensos do que

células planctônicas em inóculos diluídos. Mutantes de genes codificadores de bombas

de efluxo (CDR1, CDR2 e MDR1), enquanto sensíveis a baixas concentrações do

azólico, tornavam-se resistentes em inóculos densos e biofilmes.

Moléculas envolvidas no controle populacional também chamadas de “quorum

sensing molecules” (QSM) são muito conhecidas em bactérias e vem sendo cada vez

mais estudadas em fungos. O farnesol e o tirosol são QSM produzidas por C. albicans

responsáveis respectivamente por bloquear e acelerar a transição levedura-hifa

(Hornby et al., 2001 e Chen et al., 2004). O farnesol inibiu nas células de biofilme a

conversão levedura-hifa e promoveu a diminuição da expressão da proteína de parede

de hifas Hwp1p (Hornby et al., 2001 e Ramage et al., 2002). Alem et al., (2006)

estudaram o papel da secreção do tirosol no desenvolvimento do biofilme. Eles

verificaram que as células do biofilme secretam 50% mais tirosol que células

planctônicas em relação ao peso seco. Ao ser adicionado tirosol exógeno, este

estimulou a produção de hifas já nos estágios iniciais de formação do biofilme (1 a 6

horas), enquanto que a adição de farnesol inibiu a formação de biofilme em 33%. A

adição simultânea de ambos compostos em diferentes concentrações mostrou que o

farnesol possui ação dominante na inibição de hifas do que o tirosol como indutor. Os

autores concluíram que o tirosol tem papel importante no início da formação de biofilme

(até 24h) e depois o farnesol aumenta sua concentração em biofilmes maduros (48 a

72 horas)

1.2.5. A matriz extracelular de biofilmes de C. albicans

O material secretado para formar a matriz extracelular possivelmente tem a

função de excluir ou retardar o acesso das drogas aos organismos encrustrados na

matriz do biofilme (Donlan e Costerton, 2002). Comparando a quantificação de peso

seco de diferentes espécies do gênero Candida foi verificado que C. albicans produz

mais material polimérico e é mais resistente aos antifúngicos do que C. parapsilosis, C.

tropicalis, C. lusitaniae, C. dubliniensis, C. glabrata e C. kefyr (Calderone e Gow,

2002b; Kumamoto, 2002 e Sánches-Souza et al., 2001).

O local de isolamento do fungo também interfere na quantidade de matriz

produzida. C. parapsilosis isolada de sangue ou de cateteres infectados possuem alta

probabilidade de produzirem biofilme do que isolados de outras localidades, assim

como, isolados de candidemias recorrentes (Kumamoto, 2002). Subpopulações de C.

albicans foram discriminadas através da resistência de seus biofilmes à clorexidina

(Suci e Tyler, 2003), e pela quantidade de material polimérico produzido (Li et al.,

2003). Para verificar se o aumento da quantidade de matriz era capaz de aumentar a

resistência, Baillie e Douglas (2000) desenvolveram biofilme em sistema estático e com

agitação suave e verificaram que no mesmo tempo de crescimento, o biofilme formado

sob agitação possuia mais matriz extracelular do que o formado no modo estático,

porém, não observaram diferenças significantes na susceptibilidade aos antifúngicos

testados. Em biofilmes mistos maduros (48 horas de crescimento), composto de C.

albicans e Staphylococcus epidermidis a matriz extracelular produzida por este último

impediu a penetração de fluconazol, ao passo que a matriz produzida por C. albicans

pareceu proteger o mutante S. epidermidis biofilme-negativo da ação da vancomicina

(Adam et al., 2002).

Além da matriz do biofilme atuar como barreira, os compostos secretados pelas

células para formá-la podem ter papel na resistência. Mccourtie e Douglas (1985)

mostraram que células planctônicas de C. albicans secretavam material polimérico para

promover a adesão em determinadas condições. Esses autores isolaram o

sobrenadante de culturas crescidas em meios contendo baixa concentração de glicose

e alta concentração de galactose e sacarose, e verificaram que o material polimérico

secretado era similar e composto de 65-82% manose e glicose, 7% de proteínas, 1,5%

de glicosaminas e 0,5% de fósforo. Por análises sorológicas verificaram que o

sobrenadante do crescimento em meio com galactose possuia mais determinantes

antigênicos em comparação com os outros meios. Ainda, observaram que a adesão de

células em superfícies de acrílico era favorecida pelo pré-tratamento com o

sobrenadante de material polimérico, em detrimento da adesão em células do epitélio

bucal pré-tratadas. Estes resultados sugerem que os compostos do material polimérico

secretado e contido na superfície celular, possivelmente manoproteínas, sejam as

responsáveis pela adesão em diferentes materiais dependendo da concentração de

nutrientes.

Posteriormente, Baillie e Douglas (2000) extraíram material polimérico de

células planctônicas e de biofilme de C. albicans. Verificaram que ambos possuíam os

mesmos compostos já citados, porém o biofilme possuía 16% mais glicose, 41%

menos carboidratos totais e 5% menos proteínas que as células planctônicas,

sugerindo que os compostos da matriz do biofilme sejam exclusivos. Recentemente,

Thomas et al. (2006) compararam o perfil protéico da matriz de biofilme com o material

secretado pelas células planctônicas e reportaram grande semelhança entre estes

perfis, sugerindo ser as mesmas proteínas secretadas pelas células tanto na forma

planctônica quanto no biofilme. De mais de 300 pontos protéicos detectados em

análises de gel bidimensional, 24 deles mostraram-se diferencialmente localizados e

foram identificados como quitinases e manoproteínas secretadas (Cht3p e Mp65p),

responsáveis pela manutenção da morfologia e morfogênese celulares (Lee et al., 2003

e Dünkler et al., 2005), e proteínas sem sinal “canônico” de secreção, como as

envolvidas no metabolismo de aminoácidos (Met3 e 15p) e metabolismo de açúcares

(Fba1p), todas diretamente relacionadas com a resposta antigênica contra C. albicans.

Também foram identificadas as proteínas oxidoredutase (Grp2p), fosfomanomutase

(Pmm1p) e malato desidrogenase mitocondrial (Mdh1p). A maioria dos genes

codificadores dessas proteínas, como já comentado, mostraram-se altamente

expressos em células formadoras de biofilmes (Garcia-Sanchez et al., 2004). Contudo,

até o presente momento pouco se sabe sobre o papel das proteínas secretadas para a

matriz do biofilme, seja na sua formação e maturação e ainda, como a expressão

diferencial dos genes pode interferir na adesão, resistência aos antifúngicos e

patogenicidade de C. albicans.

1.3 OBJETIVOS

1.3.1. Estudo da evolução do filo Ascomycota

Foram propostos dois cenários para explicar a sistemática e a radiação dos

ascomicetos filamentosos, um que favorece a posição basal dos Discomycetes e outro

que favorece a posição basal dos Pyrenomycetes, sendo que a radiação desse grupo é

representada por uma politomia. Dependendo do marcador molecular utilizado nas

análises e as metodologias empregadas, dois cenários para a datação dos principas

eventos de radiação do filo Ascomycota foram propostos. No primeiro esses eventos

teriam ocorrido na Era Proterozóica (1.000 Ma) e no segundo, na Era Paleozóica (500

Ma). Assim, devido ao baixo suporte das análises filogenéticas e na datação, esta parte

da tese teve como objetivos específicos:

1- elucidar as relações filogenéticas do filo Ascomycota e

2- datar os principais eventos de radiação nesse filo.

1.3.2. Estudo de fatores de patogenicidade de Candida albicans

A ordem Saccharomycetales agrupa as leveduras que podem tornar-se

patógenos oportunistas humanos, como o caso da Candida albicans, que possui

elevada taxa de mortalidade associada as suas infecções. A formação de biofilme e de

hifas são importantes fatores de patogenicidade desse fungo. O biofilme exibe alta

resistência aos antifúngicos de uso corrente, muito por conta da secreção de uma

matriz extracelular de componentes ainda não totalmente caracterizados e a expressão

diferencial de diversos genes, incluindo aqueles que controlam a transição levedura-

hifa. Assim sendo, os objetivos específicos desta parte da tese são:

1- identificar e caracterizar as proteínas que compõem a matriz extracelular de biofilme

de C. albicans e

2- estudar a expressão de genes relacionados à formação de biofilme e indução de

hifas a fim de correlacionar com a patogenicidade de diferentes linhagens de C.

albicans.

CAPÍTULO 2: Artigo publicado entitulado: Fungi evolution

revisited: application of the penalized likelihood method to a Bayesian

fungal phylogeny provides a new perspective on phylogenetic

relationships and divergence dates of Ascomycota groups.

Fungi Evolution Revisited: Application of the Penalized Likelihood Method to a

Bayesian Fungal Phylogeny Provides a New Perspective on Phylogenetic

Relationships and Divergence Dates of Ascomycota Groups

Ana Carolina B. Padovan, Gerdine F.O. Sanson, Adriana Brunstein, Marcel o R.S. Briones

Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Universidade Federal de Sa

o Paulo, Sa

o Paulo, Brazil

Received: 26 May 2004 / Accepted: 15 December 2004 [Reviewing Editor: Dr. Nicolas Galtier]

Abstract. The depiction of evolutionary relation-

ships within phylum Ascomycota is still controversial

because of unreso lved branching orders in the radi-

ation of major taxa. Here we generated a dataset of

166 small subunit (18S) rDNA sequences, represen-

tative of all groups of Fungi and used as input in a

Bayesian phylogenetic analysis. This phylogeny sug-

gests that Discomycetes are a basal group of ﬁla-

mentous Ascomycetes and probably maintain

ancestor characters since their representatives are

intermingled amon g other ﬁlamentous fungi. Also,

we show that the evolutionary rate heterogeneity

within Ascomycota precludes the assumption of a

global molecular clock. Accordingly, we used the

penalized likelihood method, and for calibration we

included a 400 million-year-old Pyrenomycete fossil

considering two distinct scenarios found in the liter-

ature, one with an estimated date of 1576 Myr for the

plant–animal–fungus split and the other with an

estimated date of 965 Myr for the animal–fungus

split. Our data show that the current classiﬁcation of

the fossil as a Pyrenomycete is not compatible with

the second scenario. Estimates under the ﬁrst sce-

nario are older than dates proposed in previous

studies based on small subunit rDNA sequences but

support estimates based on multiprotein analysis,

suggesting that the radiation of the major Ascomy-

cota groups occurred into the Proterozoic era.

Key words: Ascomycota evolution — Bayesian

inference — Penalized likelihood — Divergence date-

estimation — Fossil constra int

Introduction

Molecular sequences have been used to infer evolu-

tionary relationships among the main groups of Asc-

omycota phyla, namely, ﬁlamentous Ascomycetes or

Euascomycetes, Saccharomycetales, and Archiasco-

mycetes (Bruns et al. 1992; Berbee and Taylor 1993;

Gargas and Taylor 1995; Kurtzman 2000; Lumbsch

2000; Redecker et al. 2000; Berbee 2001). These studies

propose that morphological characters are often

insuﬃcient to infer the evolut ionary history of this

phylum because morphological similarity is in most

cases caused by convergence (Berbee and Taylor 1993).

Phylogenies based on molecular charact ers have been

useful in providing clues to the location of taxa with

uncertain taxonomic position (e.g., mitosporic fungi).

The most used marker is the nuclear small subunit

(SSU) rDNA (or 18S rDNA) (Bruns et al. 1992; Berbee

and Taylor 1993; Kurtzman 2000), although a few

studies have explored other genomic regions or protein

sequences (Liu et al. 1999; Heckman et al. 2001;

Hedges et al. 2004). The concerted evolution of SSU

rDNA copies within genomes precludes paralogy for

this gene and makes it a useful tool for phylogenetic

inference and subsequent molecular dating. These

points cannot be a priori guaranteed for oth er genes.

Correspondence to: Adriana Brunstein; email: [email protected]

J Mol Evol (2005) 60:726–735

DOI: 10.1007/s00239-004-0164-y

Several traditional taxa such as Pyrenomycetes,

Plectomycetes, Archiascomycetes, and Saccharomy-

cetales have been conﬁrmed by studies based on

molecular data (Berbee and Taylor 1992; Gargas and

Taylor 1995; Berbee et al. 2000; Lumbsch 2000;

Berbee 2001). In other cases, like Discomycetes and

Loculomycetes, it is not clear whether molecular

characters are insuﬃ cient or if these groups do not

represent a natural assemblage of organisms (Gargas

and Taylor 1995; Berbee 1996). In addition, there are

two proposed scenarios concerning the systematics of

Euascomycetes, one favoring the basal position of

Discomycetes (Gargas and Taylor 1995; Lutzoni

et al. 2001) and the other favoring the basal position

of Pyrenomycetes (Berbee and Taylor 2001). Conse-

quently, the Euascomycetes radiation is depicted as a

polytomy due to the lack of phylogenetic stability

obtained in the previously employed methodologies.

The earliest fungal fossils are from the Ordovician

and correspond to probable ancestors of Zyg omycota

or Chytridiomycota (Redecker et al. 2000). These

fossils have been useful to calibrate diverg ence date

estimates of Fungi based on phylogenetic trees (Ber-

bee and Taylor 2001). Unfortunately, there are few

fossil representatives of derivate Ascomycota groups.

Also, some groups of Fungi cannot be distinguished

from other organisms in the fossil records (Alexo-

poulos et al. 1996; Redecker 2002). Evidence of Ba-

sidiomycota is assigned to a 290-Myr fossil with

clamp connections (Dennis 1970). The oldest fossil

that resembles an extant derivate Ascomycota group

is 400 Myr old and presents characteristics of extant

Pyrenomycetes (Taylor et al. 1999). Given this scar-

city of fossil evidence, molecular evolution studies

have been useful to estimate divergence times be-

tween fungi (Berbee and Taylor 1993, 2001; Heckman

et al. 2001). Berbee and Taylor (1993) ﬁrst estimated

the divergence date between Ascomycota and Basid-

iomycota to be 390 Myr and the divergence date

between Euascomycetes and true yeasts (Saccharo-

mycetales order) 310 Myr by analysis of SSU rRNA

sequences. In a posterior reﬁnement these authors

included more sequences and adjusted the fossil cal-

ibrations to obtain respective estimates of 500 and

370 Myr (Berbee and Taylor 2001). Using a diﬀerent

approach, which averaged distances among protein

sequences, Heckma n et al. (2001) estimated the same

divergence dates to be 1200 and 1000 Myr respec-

tively, and Hedges et al. (2004), using protein se-

quence data and molecular clock methods, estimated

these same dates to be 968 and 982 Myr, respectively,

placing the main fungus radiation events into the

Proterozoic era.

Because of the disparity presented by these diver-

gence dates and the lack of support within Ascomy-

cota, we analyzed SSU rDNA previously published

sequences using Bayesian phylogeny reconstruction

methods. We estimated divergence dates among the

major phylogenetic groups of Fungi using the 400-

Myr-old Rhynie chert Ascomycota fossil as a ﬁrst

calibration point and considered two diﬀerent sce-

narios in order to deﬁne a second calibration point.

In the ﬁrst scenario we used the plant–animal–fungus

divergence time (1576 Myr) estimated by Wang et al.

(1999). Although Wang et al. (1999) used a secondary

calibration point (Shaul and Graur 2002) and Hedges

et al. (2004) used an approach based on concatenated

datasets that passed the consistency test (Shaul and

Graur 2002), no signiﬁcantly diﬀerent dates for the

split were observed. In the second scenario we used

the animal–fungus divergence time (965 Myr) esti-

mated by Doolittle et al. (1996), which was also used

for date estimates of Berbee and Taylor (2001).

There were included in the analysis 169 taxa, of

which 166 are representative of all groups of Fungi, 2

are representatives of animal an d plants, and 1 is the

outgroup. Due to the large number of taxa a Bayes-

ian approach was employed since it possesses

advantages over other methods in terms of ability of

using complex models of evolution, ease of interpre-

tation of the results, and computational eﬃciency

(Huelsenbeck et al. 2002).

Nucleotide substitution rate constancy in fungal

SSU rDNA evolution was not supported by the data,

even in small groups such as Plectomycetes (Berbee

and Taylor 1993; Kasuga et al. 2002). Because of

this evolutionary rate heterogeneity we used the

penalized likelihood method (Sanderson 2002), a

semiparametric approach that combines likelihood

(parametric) and the nonparametric penalty func-

tion (Sanderson 1997), implemented in r8s (http://

ginger.ucdavis.edu/r8s). The method relaxes the

stringency of a clock assumption and permits the

addition of calibration points (fossil records and time

constraints), which allowed us to estimate divergence

dates of Fungal radiation events without the impo-

sition of a rate constant molecular clock.

Materials and Methods

A criterion of fungal taxa selection based on Alexopoulos et al.

(1996) was chosen. Our goal was to get at least one representative

of each Ascomycota group and some representatives of Basidi-

omycota, Chytridiomycota, and Zygomicota.

We used 276 complete sequences of SSU rDNA downloaded

from GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) that were

aligned using Clustal X (Jeanmougin et al. 1998) and adjusted by

eye using Seaview (Galtier et al. 1996). In order to recover the plant–

animal–fungus split there included the sequences of Clathrina

cerebrum (U42452) and Sphagnum cuspidatum (X80213), which

represent, respectively, phylum Porifera and phylum Streptophyta.

A stramenopile (Developayella elegans; (U37107)) was used as

outgroup. This outgroup was chosen due to its unambiguous po-

sition in the ribosomal tree of life (Patterson 1989; Leipe et al. 1994).

Some sequences that presented high levels of gaps and/or ambigu-

ities were excluded from the analysis. After this trial process we have

727

obtained an alignment of 169 taxa with 1474 bp (gaps excluded) and

the fungal sequences are described in Table 1 according to their

taxonomic classiﬁcation and respective accession numbers.

An unconstrained consensus phylogeny was inferred with Mr.

Bayes. A general time-reversible model of DNA substitution

(Rodrı

guez et al. 1990) with a c distribution to account for rate

variation among sites (Yang 1994) was used as input. As we had no

knowledge of the priors, uninformative ones were associated with

branch lengths and substitution parameters of the rate matrix and

all trees were considered equally probable a priori (Huelsenbeck

and Ronquist 2001).

As testing the molecular clock hypothesis in a Bayesian

framework is not straightforward, subsets of the total alignment

containing only speciﬁc groups, e.g., Pyrenomycetes and Saccha-

romycetales, were considered and subjected to maximum likelihood

analysis using PAUP* 4.0b10 (Swoﬀord 1998). Maximum likeli-

hood phylogenies were then inferred with and without enforcing a

molecular clock, and a likelihood ratio test could be performed for

each subset (Felsenstein 1988). The signiﬁcance level was assessed

by comparing d = 2D, where D is the diﬀerence between the like-

lihood scores (Ln likelihood) of the trees with a v

distribution with

n ) 2 degrees of freedom, where n is the respective number of taxa

of each subset.

The penalized likelihood method (Sanderson 2002) as imple-

mented in r8s (http://ginger.ucdavis.edu/r8s) was used to estimate

divergence dates of Fungi using the Bayesian phylogeny with all

169 taxa. Conﬁdence intervals for dates were estimated reapplying

the same procedure for 100 bootstrapped matrices obtained by

resampling the data using Seqboot as implemented in PHYLIP 3.5c

(Felsenstein 1993). The Pyrenomycete fossil (400 Myr) described by

Taylor et al. (1999) and the animal–plant–fungus divergence time

estimate (1576 Myr) by Wang et al. (1999) were used as calibration

points in the ﬁrst scenario as, respectively, minimal and maximal

constraints to corresponding nodes, in order to scale rates and

times to real units. In the second scenario, the Pyrenomycete fossil

and the animal–fungus divergence time estimate (965 Myr) by

Doolittle et al. (1996) were used in the same way as above as cal-

ibration points.

Results

A tree built by the neighbor-joining method (Saitou

and Nei 1987) with uncorrected distances was used to

start the Monte Carlo Markov chain in Mr. Bayes.

The chain length was 2 million and eight simulta-

neous chains were run and sampled every 100 gen-

erations. A consensus tree was built from the 10,000

trees corresponding to the last 1 million generations

for which the likelihood scores had converged to a

stable value. During the run the parameters of the

GTR model and the shape parameter of the gamma

distribution were estimated by Mr. Bayes with

respective 95% conﬁdence intervals. Nucleotide fre-

quencies were f

= 0.2166, f

= 0.2220, f

0.2901, and f

= 0.2713; the parameters of the rate

matrix were R(A)C ) = 1.5826, R(A)G) = 3.3136,

R(A)T) = 1.6374, R(C)G) = 0.9357, R(C)T) =

4.4185, and R(G)T) = 1 and the shape parameter of

the gamma distribution was a = 0.3837.

The consensus phylogeny is shown in Fig. 1, where

groups are distinguished according to the classiﬁca-

tion scheme described elsewhere (Alexopoulos et al.

1996). The posterior probabilities (pp) of the main

Table 1. Sampled fungal taxon classiﬁcation according to Alex-

opoulos et al. (1996) and respective accession numbers

Taxon Accession No.

Ascomycota

Saccharomycetales

Arxula terrestris AB000663

Brettanomyces anomalus X83828

Candida albicans X53497

Candida anatomiae AB018159

Candida dubliniensis X99399

Candida glabrata X51831

Candida intermedia X89518

Candida ishiwadae AB018167

Candida karawaiewii AB018168

Candida krusei M55528

Candida lusitaniae M55526

Candida maltosa D14593

Candida parapsilosis AY055855

Candida populina AB018171

Candida rhagii AB018172

Candida sequanensis AB018173

Citeromyces matritensis AB018176

Debaromyces hansenii X62649

Dekkera bruxellensis X58052

Holleya sinecauda U53443

Kluyveromyces delphensis X83823

Kluyveromyces lactis X51830

Kluyveromyces marxianus X89523

Kluyveromyces polysporus X69845

Kluyveromyces thermotolerans X89526

Pichia anomala X58054

Pichia capsulata AB018178

Pichia methanolica AB018181

Saccharomyces bayanus X97777

Saccharomyces cerevisiae Z73326

Saccharomyces dairensis X99527

Saccharomyces kluyveri Z75580

Saccharomyces rosinii X99524

Saccharomyces sp. X99525

Saccharomyces transvaalensis X99522

Saccharomycodes ludwigii X69843

Saccharomycopsis capsularis X69847

Saccharomycopsis ﬁbuligera U10409

Williopsis saturnus Y11318

Zygosaccharomyces cidri X91085

Zygosaccharomyces mrakii X90757

Zygosaccharomyces rouxii X90758

Archiascomycetes

Pneumocystis carinii L27658

Protomyces lactucae–debilis D14164

Protomyces macrosporus D85143

Taphrina camea AB000948

Taphrina communis AB000949

Taphrina mirabilis AB000954

Taphrina nana AB000955

Taphrina populina D14165

Taphrina pruni (1/2) AB000956/AB000957

Taphrina robinsoniana AB000958

Taphrina virginica AB000960

Saitoella complicate D12530

Schizosaccharomyces pombe X54866

Discomycetes

Alectoria sarmentosa AF140233

Anamylopsora pulcherrima AF119501

Blumeria graminis sp. bromi (1/2) AB033475/AB033476

(Continues)

728

nodes of the tree, the location of the 400-Myr fossil,

and the plant–animal–fungus spli t are also depicted

in this ﬁgure.

The Bayesian phylogeny conﬁrmed Plectomycetes,

Pyrenomycetes, Saccharomycetales, and Archiasco-

mycetes as monophyletic groups as previously pro-

posed (Berbee and Taylor 1992; Bruns et al. 1992).

Paraphyletic Loculomycetes and polyphyletic Disco-

mycetes, as obse rved in our tree, are also supported

Table 1. Continued.

Taxon Accession No.

Blumeria graminis sp. hordei AB033480

Cladonia rangiferina AF184753

Cookeina tricholoma AF006311

Cyphelium inquinans U86695

Cyttaria darwinii U53369

Diploschistes rampoddensus AF274111

Diploschistes thunbergianus AF274112

Glaziella aurantiaca Z49753

Graphium rubrum AB007660

Graphis scripta AF038878

Graphium silanum AB007661

Helvetia lacunosa U42654

Heterodea muelleri AF184754

Lasallia rossica AF088238

Lecanora disperse L37535

Leiﬁdium tenerum U70959

Metus conglomeratus AF184755

Microsphaera friestii AB033478

Microstoma ﬂoccosum AF006313

Nanoscypha tetraspora AF006314

Neophyllis melacarpa AF117981

Orbilia ﬁmicola AF006307

Otidea onotica AF006308

Peltula obscurans AF282913

Pertusaria saximontana AF113720

Peziza echinospora AF006309

Phillipsia domingensis AF006315

Pilophorus cereolus AF184756

Pithya cupressina AF006316

Placopsis gelida AF119502

Pseudopithyella minuscula AF006317

Psora decipiens AF184759

Sarcoscypha custriaca AF006318

Sclerotinia sclerotiorum X69850

Spathularia ﬂavida 230239

Sphaerophorus globosus AF117983

Stereocaulon paschale AF140236

Terfezia terfezioides AF054900

Thelebolus stercoreus U49936

Tuber gibbosum U42663

Umula hiemalis Z49754

Verpa bohemica U42645

Wynnella silvicola U42655

Wynnea sp. AF006319

Loculomycetes

Aureobasidium pullulans M55639

Botryosphaeria ribis U42477

Capronia mansonii X79318

Catapyrenium lachneum AF412410

Coccodinium bartschii U77668

Dothidea insculpta U42474

Herpotrichia diﬀusa U42484

Jahnula siamensiae AF438180

Leptosphaeria doliolum U43447

Leptosphaeria maculans U04233

Mycosphaerella mycopappi U43449

Myriangium duriaei AY016347

Phaeococcomyces exophialae X80709

Pyrenophora trichostoma U43459

Plectomycetes

Arachnomyces kanei AF525308

Arachnomyces minimus AJ315167

Ascosphaera apis M83264

(Continues)

Table 1. Continued.

Taxon Accession No.

Aspergillus fumigatus M60300

Aspergillus nomius AB008404

Blastomyces dermatitidis AF320010

Coccidioides immitis M55627

Eremascus albus M83258

Eurotium rubrum U00970

Histoplasma capsulatum X58572

Merimbla ingelheimensis D14408

Penicillium chrysogenum M55628

Pyrenomycetes

Amphisphaeria umbrina AF225207

Ascovaginospora stellipala U85087

Ceratocystis ﬁmbriata U43777

Chaetomium elatum M83257

Colletotrichum gloeosporiodes M55640

Cornuvesica falcata AY271797

Cryphonectria parasitica L42441

Halosarpheia spartinae AF352076

Hypocrea lutea D14407

Kionochaeta spissa AB003790

Microascus cirrosus M89994

Nais inornata AF050482

Neurospora crassa X04971

Ophiostoma piliferum AJ243295

Podospora anserina X54864

Pseudallescheria boydii U43914

Sordaria ﬁmicola X69851

Verticillium dahliae U33637

Xylaria carpophila Z49785

Basidiomycota

Boletus satanas M94337

Cantharellus tubaeformis AF026636

Cronartium ribicola M94338

Cryptococcus neoformans X60183

Cryptococcus podzolicus AB032645

Eocronartium muscicola AY123323

Exobasidium vaccinii AJ271380

Lentinellus ursinus U59081

Microbotryum violaceum U77062

Tilletia caries U00972

Tulostoma macrocephala AF026625

Ustilago hordei U00973

Chytridiomycota

Allomyces macrogynus AMU23936

Blastocladiella emersonii M54937

Chytridium confervae M59758

Spizellomyces acuminatus M59759

Zygomycota

Mucor mucedo X89434

Mucor racemosus X54863

729

Fig. 1. SSU rDNA fungal phylogeny inferred by Bayesian anal-

ysis corresponding to the consensus of 10,000 trees. Values of

posterior probabilities are shown at nodes of interest. The main

groups of Fungi are depicted, namely, Chytridiomycota, Zygo-

mycota, Basidiomycota, and Ascomycota, represented by Archi-

ascomycetes, Saccharomycetales order (true yeasts), and the class

forms of Euascomycetes (ﬁlamentous Ascomycetes), which are

Discomycetes, Pyrenomycetes, Loculomycetes, and Plectomycetes.

In the current paper Discomycetes and Loculomycetes are subdi-

vided. Polyphyletic Discomycetes are subdivided into Discomycetes

(1) (mostly operculate Discomycetes), Discomycetes (2) (inoper-

culate Discomycetes and Erysiphales order), and lichen-forming

Discomycetes. Paraphyletic Loculomycetes are subdivided into

Loculomycets (1) and Loculomycetes (2). Sequences from C.

cerebrum (Porifera) and S. cuspidatum (Streptophyta) were in-

cluded to recover the 1576-Myr-old plant–animal–fungus split.

D. elegans (Stramenopile) is the outgroup. The 400-Myr fossil re-

cord that is used as a minimal age constraint to the date of Py-

renomycetes radiation is indicated by its own picture.

730

by previous studies (Bruns et al. 1992; Gargas and

Taylor 1995; Berbee 1996).

There are three distinct groups of Discomyce-

tes: Discomycetes (1), Discomycetes (2), and lichen-

forming Discomycetes. The ﬁrst two groups are

monophyletic and the third is polyphyletic. The ﬁrst

group is basal among Euascomycetes and contains

mostly Pezizales representatives, with the exception

of Orbilia ﬁmic ola, which belongs to Orbi liales

(Eriksson et al. 2004). The second one is a sister

group of Pyrenomycetes and most of its represen-

tatives are Erysiphales (Eriksson et al. 2004). All but

two (Leiﬁdium tenerum and Peltula obscurans) se-

lected lichen-forming Discomycetes form the third

Fig. 2. Schematic phylogenies locating the estimated dates for the

main events of fungal radiation using the calibration date of 1576

Myr for the plant–animal–fungus split (a) and the calibration date

of 965 Myr for the animal–fungus split (b). Triangles extending

from numbered nodes indicate the radiation of extant phyla Chy-

tridiomycota, Zygomycota, and Basidiomycota and the main

groups of Ascomycota. Nodes are numbered from 1 to 24 and node

dates taken from Tables 2 and 3, respectively. A representation of

the Rhynie chert fossil is mapped to the corresponding 400-Myr

point.

731

group, and most representatives are Lecanorales

(Eriksson et al. 2004).

Loculomycetes (1) are composed of Capronia

mansonii, Phaeococcomyces exophialae, and Catapy-

renium lachne um and form a monophyletic clade with

L. tenerum (pp=1). This grouping of some Loculo-

mycetes with Plectomycetes has already been ob-

served (Berbee 1996).

Archiascomycetes appeared as a sister group of

other Ascomycota (pp=1), which is consistent with a

previous analysis (Alexopoulos et al. 1996), and their

monophyly is highly supported (pp=0.97).

The molecular clock hypothesis was rejected for

the trees corresponding to the considered subsets with

p values less than 0.05 (results not shown). This has

already been suggested by others (Berbee and Taylor

1993; Kasuga et al. 2002), and therefore we have

discarded the use of local molecular clocks methods

(Hasegawa et al. 1989; Cooper and Penny 1997;

Rambaut and Bromham 1998; Bromham and Hendy

2000; Yoder and Yang 2000). For large philogenies

there is a vast number of ways to assign diﬀerent rates

to distinct subtrees, and we could therefore choose

groups to assign speciﬁc rates a priori. However, this

would certainly introduce bias in our analysis.

The penalized likelihood method was used to

estimate divergence dates. This method requires an

optimum smoothing value (k) that minimizes the

prediction error of the penalized likelihood function

and is given by the minimum score of a performed

cross-validation procedure (Sanderson 2002). For

our dataset, the minimum value of the cross-vali-

dation was attained for k = 12,589.58. In the ﬁrst

scenario the node in which the Ascomycota fossil is

located (Fig. 1) was constrained to have a minimum

age of 400 Myr and the root of the tree (the point

corresponding to the split plant–animal–fungus in

Fig. 1) was constrained to be no older than 1576

Myr. In the second scenario the animal–fungus split

was constrained to be no older than 965 Myr. Fig. 2

shows the estimated dates of nodes for both sce-

narios in schematic phylogenies and the corre-

sponding conﬁdence intervals are shown in Tables 2

and 3.

Discussion

High support for the major groups of Ascomycota

and respective splits was obtained from a large taxa

sample and a great number of analyzed positions

through the incorporation of a full model of nucle-

otide substitution. We chose to exclude taxa instead

of excluding positions to maintain the gene integrity

and consider as much as possible the evolutionary

information of the molecule.

The Bayesian phylogeny supports the basal position

of the order Pezizales of Discomycetes (Discomycetes

[1] in Fig. 1) among Euascomycetes that has already

been observed (Gargas and Taylor 1995; Berbee 1996,

Table 2. Divergence date estimates and 95% conﬁdence intervals,

as calculated by the penalized likelihood method, of fungal clades

depicted in Fig. 2a

Node Estimated date (Myr) 95% CI

1 803.24 801.67–1078.88

2 376.48 312.49–517.73

3 533.44 473.85–715.03

4 816.03 1053.00–836.37

5 653.55 591.79–850.16

6 677.61 613.43–1087.60

7 922.02 922.62–1130.17

8 871.44 817.03–1092.15

9 928.24 770.45–1188.76

10 1027.68 966.20–1166.62

11 156.19 110.98–204.24

12 1241.99 1152.70–1406.97

13 753.40 733.68–1007.54

14 887.66 929.69–1136.51

15 847.59 853.13–1076.05

16 883.19 888.32–1105.01

17 899.23 900.14–1114.14

18 930.37 921.10–1141.47

19 971.86 955.22–1162.58

20 1072.09 1051.23–1244.23

21 1147.78 1107.74–1306.29

22 1206.47 1164.78–1338.95

23 1286.61 1215.94–1410.88

24 1422.89 1269.69–1434.08

Table 3. Divergence date estimates and 95% conﬁdence intervals,

as calculated by the penalized likelihood method, of fungal clades

depicted in Fig. 2b

Node Estimated date (Myr) 95% CI

1 429.25 395.68–598.87

2 214.92 177.39–289.37

3 307.61 265.70–409.26

4 453.36 433.88–597.77

5 400.00 400.00–484.83

6 343.43 277.84–560.86

7 529.11 497.11–659.19

8 526.95 473.33–648.32

9 548.76 448.07–689.08

10 668.67 630.48–728.38

11 107.65 74.55–140.40

12 835.30 781.93–910.32

13 427.38 400.69–570.36

14 517.07 494.07–645.25

15 476.78 453.29–615.69

16 499.34 473.81–634.62

17 511.90 486.58–646.50

18 539.08 510.15–666.37

19 569.51 535.43–685.85

20 657.11 632.06–755.74

21 723.86 690.55–811.57

22 786.32 756.57–847.60

23 857.85 812.31–908.89

24 893.10 857.44–927.77

732

2001; Lumbsch 2000). We stress that all basal Disco-

mycetes, excluding Orbilia ﬁmicola, are operculate,

which could indicate that this is the ancestral form of

the ascus dehiscence. This grouping of O. ﬁmicola

among Pezizales has already been observed, and con-

sequently it has been purged from order Helotiales and

reclassiﬁed as Orbiliales (Eriksson et al. 2004). Other

representatives of Discomycetes that are interspersed

among Pyrenomycetes, Plectomycetes, and Loculo-

mycetes are inoperculate or lichen-forming.

The Discomycetes radiation also suggests that they

could still maintain other characters that resemble

those of ancestral forms. As we see in Fig. 2, all li-

chen-forming representatives, including Discomyce-

tes and Loculomycetes, descend from node 17, which

excludes the possibility that Pyrenomycetes, inoper-

culate Discomycetes, and Erysiphales descend from a

lichen-forming ancestor and contradicts the scenario

proposed by Lutzoni et al. (2001). In addition to this,

the estimated dates for node 17 and node 14, which

stand for the common ancestor of Pyrenomycetes and

Discomycetes (2), are extremely close to each other

(see Tables 2 and 3), which suggests that these extant

groups evolved in parallel.

Node 19 in Fig. 2 is the common ancestor of Eu-

ascomycetes, and although it is improbable that it

was lichen-forming, there remain s the possibility that

it could make associations since the descendent

groups englobe mycorrhyzal fungi (Discomycetes [1]),

plant pathogens (Pyrenomycetes and Erysiphales),

human opportunistic pathogens (Plectomycetes and

Loculomycetes), and animal pathogens (Loculomy-

cetes) (Alexopoulos et al. 1996; Berbee 2001).

Bayesian inference became a widely used method

of phylogenetic inference because it allows rapid

analysis of large datasets and incorporates full

models of sequence evolution. This method is

essential when considering taxa with ancient diver-

gence dates, such as the Fungi, in which homoplasy

is very frequent. The Bayesian analysis also has the

advantage of not being restrictive to a unique best

tree. Consequently, even in the presence of alter-

native topologies with comparable likelihood scores,

support is assigned to speciﬁc clades by means of

posterior probabilities that represent the probability

that a clade is true given the data, the model, and

the priors (Larget and Simon 1999). Bayesian sup-

port values are an alternative to nonparametric

bootstrapping (Felsenstein 1985), although the

measures cannot be directly compared (Douady et

al. 2003) since they consider diﬀerent data feature

(Alfaro et al. 2003). As pointed out by Wilcox et al.

(2002), Bayesian support values provide closer esti-

mates of clades accuracy than those provided by

nonparametric bootstrap estimat es. Besides, the last

procedure would require much more time and

computational resources.

Bayesian analysis provided strong support for the

main Euascomycetes radiation events. This could not

be accomplished in previous analyses of SSU rDNA

sequences that used other types of phylogenetic

inference methods (Gargas and Taylor 1995; Berbee

et al. 2000; Berbee and Taylor 2001). Even the

Bayesian analysis that placed Discomycetes as basal

among Euascomycetes (Lutzoni et al. 2001) did not

present enough support for subsequen t splits among

others Euascomycetes groups.

Saccharomycetales form a monophyletic group

(pp=1), but families within this group do not seem to

do so. According to Kurtzman (2000) there are 11

families in Saccharomycetales. In our tree the majority

of yeasts belongs to Saccharomycetaceae and there are

few members of other families (Arxula terrestris and

Candida spp. [Candidacea ], Saccharomycopsis capsu-

laris and Saccharomycopsis ﬁbuligera [Saccharomy-

copsidacea], Holleya sinecauda [Eremotheciaceae], and

Saccharomycodes ludwigii [Saccharomycodacea]). The

main splits in Saccharomycetaceae did present high

posterior probabilities (pp>0.89; not shown) even

with non-Saccharomycetac eae representatives inter-

spersed among them. Consequently , the phylogeny

does not support the current family level taxonomic

scheme (Kurtzman 2000).

The impossibility of assuming a global molecular

clock in our data was fully justiﬁed. Therefore, the

penalized likelihood method developed by Sanderson

(2002) was more appropriate because it allows that

every lineage evolve at a diﬀ erent rate, applying a

penalty that prevents large variations among rates in

the phylogeny.

Fossil record data are informative of minimum

ages of nodes (Doyle and Donoghue 1993) and con-

sequently constrain these nodes to a time interval,

providing boundaries for divergence dates (Sander-

son 1997; Cutler 2000). Incorporation of these

uncertainties is a great advantage of constrained

optimization methods.

In Fig. 2a we sketch a topology to show our esti-

mated dates that are described in Table 2. These

dates place most Ascomycota radiation events in the

Proterozoic era. Our estimated dates for splits among

major groups of Fungi could be directly compared

and corroborate estimates of Heckman et al. (2001)

and Hedges et al. (2004) that were based on multi-

protein analysis. Particularly comparisons inside

Ascomycota are not meaningful since lack of Disco-

mycetes and Loculomycetes in both analyses pro-

vided diﬀerent topologies and relationships.

The schematic phylogeny shown in Fig. 2b locates

the estimated dates detailed in Table 3. Although in

this scenario the estimated dates of Ascomycota

radiation events are more recent than those estimated

in the ﬁrst scenario, they do not accommodate the

dates of Berbee and Taylor (2001). Their estimat es

733

were obtained under the assumption of a global

clocklike evolution, which leads to very conservative

dates that do not take into accoun t the rate variation

among lineages observed in the SSU rDNA of Fungi.

Our analysis shows that even when the second scenario

is considered, the date for node 5, corresponding to the

fossil, is precisely 400 Myr. This opens the possibility

that the fossil classiﬁcation as a Pyrenomycete is

incorrect, as previously suggested by Berbee and

Taylor (2001). Nevertheless, even with the 400-Myr

constraint, all major events of Ascomycota radiation

are systematically older than the dates estimated based

on maximum parsimony methodology used by Berbee

and Taylor (2001). Accordingly, if node 5 (in Fig. 2b)

was not constrained to a minimum of 400 Myr, more

recent date intervals would certainly have been ob-

tained. Therefore, the acceptance of this second sce-

nario impos es a reclassiﬁcation of the fossil record.

The use of a derivate group fossil, instead of a basal

group, as a constraint allows more unbiased diver-

gence dates estimates. This counterbalances the

uncertainty associated with the substitution rate vari-

ation considered by penalized likelihood. Our date

estimates, based on SSU rDN A, suggest that the origin

of the main groups of Fungi occurred between the

Middle and the Late Proterozoic, which is supported

by independent evidence based on multiprotein anal-

ysis (Heckman et al. 2001; Hedges et al. 2004).

Although phylogenetic relationships among Asc-

omycota representatives are extremely sensitive to

taxa sampling and analyzed positions, we could sug-

gest an alternative scenario concerning ancestry, dat-

ing, and relationships among the main fungus groups.

Acknowledgments. We thank Beatriz Schnabel for excellent

technical assistance and help with the artwork. A.C.B.P. received a

fellowship from FAPESP (Brazil). G.F.O.S. was supported by a

Howard Hughes Medical Institute Post-Doctoral Fellowship

(USA). A.B. received grants from FAPESP (Brazil) and M.R.S.B.

received grants from FAPESP and CNPq (Brazil) and the Inter-

national Research Scholars Program of the Howard Hughes

Medical Institute (USA).

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735

CAPÍTULO 3: Estudo de fatores de patogenicidade de Candida

albicans pela identificação e caracterização de proteínas de matriz de

biofilme e análises de expressão gênica

3.1. MATERIAL E MÉTODOS

3.1.1. Microorganismos

As linhagens de Candida albicans estudadas nesse trabalho estão discriminadas

na Tabela 1 e foram fornecidas pelo LEMI (Laboratório Especial de Micologia –

UNIFESP). As linhagens isoladas de sangue e cateter foram crescidas em meio rico

pelo menos por 3 repiques antes de serem congeladas na presença de glicerol a -80

Para clonagem dos fragmentos de DNA para a finalidade de sequenciamento,

foram utilizados a bactéria Escherichia coli DH5! (Woodcock et al., 1989) e o

plasmídeo pMOSBlue (pMOSBlue Blunt Ended Cloning Kit – Amersham Pharmacia

Biotech, Piscataway, NJ, USA)

Para clonagem dos fragmentos de DNA para a finalidade de expressão

heteróloga, foram utilizados a bactéria Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) e o

plasmídeo pET28-a(+) (Novagen).

3.1.2. Seleção da linhagem de C. albicans mais produtora de biofilme

3.1.2.1. Indução de biofilme

Para selecionar a linhagem de C. albicans mais produtora de biofilme, foi

utilizado o protocolo de indução previamente descrito por Jin et al. (2003). Cada

linhagem foi semeada em meio ágar YPD e uma única colônia da placa foi

retirada, adicionada em 2ml de caldo SD e incubada “overnight” a 37ºC sob

agitação (200rpm) e aeração. As culturas foram transferidas para tubo de

microcentrifugação (“eppendorf”), sendo o mesmo centrifugado a 10.000rpm por

2min. As células foram lavadas em 1ml de PBS estéril por duas vezes.

Posteriormente, as células foram ressuspensas em PBS e foi medida a

absorbância das suspensões celulares em espectrofotômetro, para que a diluição

se encontrasse em 0.38 no comprimento de onda 520nm. 100!l das suspensões

foram aplicadas em placa de cultura de células de 96 amostras (Corning Incorporated –

Costar 3799), em 8 réplicas por linhagem e a placa foi incubada à 37

C, por 1h30min,

com agitação de 70rpm para permitir a adesão celular. Após duas lavagens com PBS

para retirar as células não aderidas, 110!l de meio SD foi adicionado por amostra e a

placa, incubada à 37

C, 70rpm por 3 dias para a produção de biofilme. Os meios de

cultura foram trocados uma vez por dia. Foram feitas duas placas por experimento pra

que os biofilmes fossem quantificados por duas metodologias diferentes, a coloração

com cristal violeta e pela redução do XTT.

Tabela 1: Linhagens de Candida albicans testadas quanto à produção de biofilme e estudo de expressão de genes em diversas condições

de crescimento

LINHAGEM

SÍTIO DE

ISOLAMENTO

HOSPITAL

ou LOCAL

DOENÇA DE BASE

IDADE

ANO DE

ISOLAMENTO

REFERÊNCIA

ATCC90029

Candidemia

E.U.A

Espinel-Ingroff et al. (1992)

ATCC24433

Infecção de unha

E.U.A

Pfaller et. al. (1994)

SC5314

Candidemia

E.U.A

Gillum et al. (1984)

34ptc

Ponta de cateter

L301A

Candidemia

HSP

Insuficiência Renal

1 ano

1997

L298

Candidemia

HSP

Diabetes

59 anos

1997

L297A

Candidemia

HSP

Prematuro

1997

L296

Candidemia

R.J.

1997 ?

L291

Candidemia

HSP

Prematuro

1997 ?

L757

Candidemia

CSSM

44 anos

2001

L663

Candidemia

HSP

8 meses

2001

L666

Candidemia

HSPE

2001

L667

Candidemia

H.RIM – SP

Insuficiência Renal

45 anos

2001

E.U.A. – Estados Unidos da América

HSP – Hospital São Paulo

R.J. – Rio de Janeiro

CSSM – Hospital Santa Marcelina

HSPE – Hospital Pernambuco

H.RIM – SP – Hospital de Rim de São Paulo

3.1.2.2. Quantificação de biofilme por coloração com cristal violeta

Para coloração com cristal violeta, o meio de cultura foi aspirado e os biofilmes

foram lavados duas vezes com 200!l de PBS estéril para se retirar as células não

aderidas. Os biofilmes na placa secaram por 45min em temperatura ambiente,

110!l de solução de cristal violeta 0,4% foram adicionados por amostra e a placa,

incubada por 45min. Após, os biofilmes foram lavados para se retirar o excesso de

cristal violeta com 200!l de água Milli-Q por quatro vezes e descorados com 200!l de

solução de etanol 95% por 45min. 100!l da solução descorante foi passada pala outra

placa e a absorbância foi medida em leitor de microplacas com comprimento de onda

de 540nm.

3.1.2.3. Quantificação de biofilme por redução de XTT

Após os três dias de crescimento, o meio de cultura foi aspirado e os biofilmes

foram lavados duas vezes com 200!l de PBS estéril e 200!l de PBS contendo 5

partes de XTT (sal de tetrazólio) (1mg/ml) (Sigma) e 1 parte de menadiona (0.4mM)

(Sigma) foram adicionados por amostra. A placa foi incubada 37

C por 1 a 2 h para

permitir a metabolização do XTT pelas células vivas, resultando em um precipitado

colorido denominado formazan. Após a incubação, 100!l da solução com o precipitado

foi passada pala outra placa e a absorbância foi medida em leitor de microplacas com

comprimento de onda de 490nm.

3.1.2.4. Análise dos dados

Os valores das absorbâncias foram anotados em planilhas do Excel (Pacote

Office) e foram analisados médias e desvio-padrão de duas placas por tipo de

quantificação (16 réplicas de cada linhagem ao todo).

3.1.3. Análise da fração protéica da matriz de biofilme de C. albicans

3.1.3.1. Indução de biofilme

O biofilme da linhagem mais produtora foi induzido segundo o protocolo de

Hawser e Douglas (1994). A linhagem foi semeada em meio ágar SD e uma única

colônia da placa foi retirada, adicionada em 20ml de caldo SD e incubada “overnight” a

37ºC sob agitação leve (70rpm) e aeração. A cultura foi passada para tubo “falcon” e o

mesmo foi centrifugado a 4.000rpm por 8min. As células foram lavadas em 5ml de

PBS estéril por três vezes e ressuspensas em PBS na diluição em que a absorbância

da suspensão celular fosse de 0.8 em comprimento de onda de 520nm. 25ml da

suspensão foi transferida para garrafas de cultura de células (75cm

- TPP) e

incubadas à 37

C por 1h30min para adesão. Para retirar as células não aderidas, 2

lavagens com 10ml de PBS foram feitas, 30ml de meio SD foi adicionado por garrafa e

as mesmas foram incubadas à 37

C por 66h para a produção de biofilme. O meio foi

trocado a cada 22h e para cada experimento (identificação por espectrometria de

massa e “western blot”), foram utilizadas em média 25 garrafas.

3.1.3.2. Extração da matriz extracelular

Após o período de crescimento, o meio foi retirado e os biofilmes foram lavados

com 20ml de PBS estéril gelado para se retirar o excesso de meio e as células não

aderidas. 10ml de PBS estéril gelado foram acrescentados e os biofilmes foram

raspados com auxílio de “cell scrapers” (TPP). As células foram separadas da matriz

por centrifugação a 4.000rpm, 8min, 4

C e posteriormente, o sobrenadante foi filtrado

(0,22!m - TPP) e concentrado pelo menos 500 vezes em Centricon Plus – 20 (5.000

MW - Millipore). A matriz concentrada foi congelada a -80

C até o momento do uso.

3.1.3.3. Gel “SDS-PAGE” (Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel

electrophoresis) para separação de proteínas

A resolução eletroforética das proteínas da matriz do biofilme, em mini-géis, foi

obtida utilizando-se “SDS-PAGE” 10%, de acordo com o protocolo descrito em

Sambrook et al. (1989).

Preparação do gel :

Gel de Separação

10%

Gel de empacotamento

Acrilamida/ Bisacrilamida

(30%/0,8%)

5ml

Acrilamida/Bisacrilamida

(30%/0,8%)

1,3ml

Água estéril

8,1ml

Água estéril

7,2ml

Tris-HCl 3M , pH 8,8

1,9ml

Tris-HCl 1M, pH 6,8

1,25ml

SDS 10%

150!l

SDS 10%

100!l

Persulfato de amônia

150!l

100!l

TEMED

40!l

TEMED

20!l

Para a eletroforese, foram adicionadas as amostras tampão de Laemmli (LB) 4X

para uma concentração final de 1X e estas foram fervidas por 5 min antes de serem

aplicadas no gel. A corrida foi realizada em tampão RB (“Running Buffer”) 1X a 30-

85mA. O gel para a padronização das condições de indução e desenvolvimento de

biofilme foi fixado (solução de fixação contendo: 10% ácido acético e 30% etanol

absoluto), corado com solução de nitrato de prata 0,1% revelado com solução de

carbonato de sódio 2,5% e formaldeído 0,02% e lavado com solução de ácido acético

1% segundo protocolo descrito em Sambrook et al. (1989). O gel para a seleção de

bandas foi corado com solução de azul de Coomassie (0,25% de Coomassie Blue

R250 (Sigma) em etanol 50% e ácido acético 7,5%), descorado e fixado (solução

contendo: 10% ácido acético e 20% etanol absoluto). Posteriormente, as bandas

protéicas foram cortadas do gel para a análise por espectrometria de massa.

3.1.3.4. Análise das bandas por espectrometria de massa

As análises de massa foram realizadas em colaboração com o Dr. Daniel C.

Pimenta (CAT/ CEPID - Instituto Butantã), seguindo o protocolo de processamento

descrito em (Westermeier e Naven, 2002). Brevemente, as bandas selecionadas foram

descoradas com solução de bicarbonato de amônio (75mmol/l) em etanol 40%. As

proteínas no gel foram reduzidas em solução de DDT (5mM em 25mM de bicarbonato

de amônio) e alquiladas em solução de iodoacetamida (55mM em 25mM de

bicarbonato de amônio). Posteriormente, as proteínas foram digeridas com Tripsina e

solubilizadas em bicarbonato de amônio (50mM) e acetonitrila em banho de ultra-som.

2!l das amostras foram utilizados para as análises de massa, em fase sólida,

utilizando-se MALDI–TOF/Pro (Ettan – Amersham Biosciences). Para a análise, as

amostras foram co-cristalizadas com ácido sinapínico (preparado com uma solução

supersaturada em 50% acetonitrila, contendo 0,1% ácido trifluoroacético) e depositadas

sobre uma lâmina metálica, secando a temperatura ambiente. As amostras foram

analisadas utilizando o modo de aquisição automático do software de controle do

espectrômetro.

3.1.4. Clonagem e sequenciamento de fragmentos de DNA

3.1.4.1. Oligonucleotídeos

Os oligonucleotídeos utilizados para a amplificação completa do gene da

enolase para a expressão e sequenciamento das extremidades foram:

EnoexpresF: 5´ CGG GAT CCA TGT CTT ACG CCA CTA AAA TC 3´

EnoexpresR: 5´ATA GTT TAG CGG CCG CTT ACA ATT GAG AAG CCT TT 3´

Os oligonucleotídeos utilizados para sequenciamento das partes internas do

fragmento e fechamento de “contig” foram:

EnoRTF: 5’ CTGCCGCTGCTGCTCAAG 3’

EnoRTR: 5’ CCGGATCTGTGGGAAACC-3’

3.1.4.2. Extração de DNA genômico de C. albicans

Na extração do DNA genômico de C. albicans SC5314 foi utilizado o

protocolo de isolamento rápido e em pequena escala (Wach et al., 1994). Para

este procedimento, a levedura foi semeada em meio Agar YPD e uma única

colônia da placa foi retirada, adicionada em 2ml de caldo YPD e incubada

“overnight” a 37ºC sob agitação (200rpm) e aeração. Foi transferido 1,5ml da

cultura para tubo de microcentrifugação (“eppendorf”) de 2ml, sendo o mesmo

centrifugado a 6.000rpm por 3min. As células foram lavadas em 1ml de água

Milli-Q esterilizada e ressuspensas no agitador de tubos.

Após nova centrifugação, o sobrenadante foi removido e as células

homogeneizadas em 200!l de tampão protoplasto e incubadas por 2h à 37ºC em

banho-maria. Após a incubação, foram adicionados à suspensão 200µL de

tampão de lise, que posteriormente foi incubada à 65ºC por 20min e em seguida

resfriada rapidamente no gelo. Para precipitar as proteínas e restos celulares,

foram adicionados 200!l de acetato de potássio 5M pH 5,4 ao “eppendorf” e

incubado no gelo por 15min. A suspensão foi centrifugada em velocidade máxima

(13.000rpm) por 3min e o sobrenadante transferido para outro “eppendorf”.

Quando necessário, a centrifugação era repetida.

Foi adicionado 0,6 volume de isopropanol (MERCK) ao sobrenadante, ou

seja, para 500µL de centrifugado obtido, foram adicionados 300!l de isopropanol

e misturado gentilmente por inversão e incubado à temperatura ambiente por

5min. Após centrifugação em velocidade máxima por 5min, o sobrenadante era

desprezado sendo 1ml de etanol (MERCK) 70% adicionado ao precipitado

(“pellet” de DNA), homogeneizado por inversão e incubado à temperatura

ambiente por 10min e novamente centrifugado por 10min em velocidade máxima.

A lavagem com etanol era repetida, o “pellet” seco por 10min e o DNA

dissolvido em 50!l de água Milli-Q esterilizada.

3.1.4.3. Tratamento do DNA com RNAse

Para a purificação do DNA, foi adicionado 48µl de água Milli-Q estéril, 1!l

de Tris-HCl 1M pH 7,5 e 1!l de RNAseA (Sigma-Aldrich) ao tubo de “eppendorf”

contendo o “pellet” e colocado em banho-maria à 37ºC por 1h. O DNA foi

precipitado com a adição de 10µl de acetato de sódio (NaOAc) 3M e 220!l de

etanol absoluto gelado. A suspensão foi homogeneizada, incubada por 10 min no

gelo e centrifugada por 15min a 13.000rpm. Após desprezar o sobrenadante,

foram adicionados 500! l de etanol 80% para tirar o excesso de sal. O

“eppendorf” foi novamente centrifugado por 15min a 13.000rpm, o etanol retirado

e o “pellet” seco durante 5 a 10min. A dissolução completa do “pellet” foi

realizada em 50!l de água Milli-Q esterilizada.

3.1.4.4. Quantificação do DNA

Foram diluídos 5µl de DNA em 1ml de água destilada esterilizada. Em

seguida, a absorbância foi medida em 260nm de comprimento de onda em

espectrofotometria. Segundo Sambrook et al. (1989), a absorbância igual a 1,

contém uma concentração de 50!g/ml de DNA de dupla fita, 40!g/ml de DNA de

fita simples e ! 20!g/ml de oligonucleotídeos de fita simples. Também foi medida

a absorbância em 280nm de comprimento de onda para verificar a presença de

proteínas e calcular a pureza do DNA. A razão entre as leituras DO

260

/DO

280

permite uma estimativa da pureza do DNA, sendo que valores da razão entre 1,8

e 2,0 indicam extrações puras. A razão abaixo de 1,6 indica grande quantidade

de proteínas e contaminantes, e na sua ocorrência, a extração de DNA foi

realizada novamente.

3.1.4.5. Amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) de fragmentos

de interesse

Para a amplificação de fragmentos para a clonagem e sequenciamento, foi

utilizado o MasterMix (2x) (Promega), oligonucleotídeos na concentração final de

500nM e 1!l de DNA genômico (40ng/!l) para reações contendo volume final de

25!l. Duas PCR´s foram feitas para minimizar erros introduzidos nos fragmentos

pela Taq DNA polymerase. Condições do ciclo: 94ºC por 5min; 35 ciclos de 94ºC por

1min, 50ºC por 1 min e 72ºC por 2 min; 72ºC por 10 min. Os fragmentos gerados das

PCR´s foram purificados com GFX e quantificados em gel de agarose 1%.

3.1.4.6. Tratamento do DNA e ligação

As extremidades dos fragmentos foram tratadas e ligadas utilizando-se o

protocolo do "pMOSBlue Blunt Ended Cloning Kit" (Amersham Pharmacia Biotech,

Piscataway, NJ, USA). Assim, adicionou-se a 7,5!l de DNA, 1!l 10x tampão pk, 0,5!l

100mM de DTT, 1!l mix das enzimas pk (fragmento Klenow e PNK

(polinucleotídeoquinase)), Esta reação foi incubada a 22ºC por 40min e inativada a

75ºC por 10min. Desta maneira, o DNA tratado ficou com extremidades "blunt" e

fosforiladas. Foram feitas duas reações de ligação a partir das duas PCR´s. Nas

reações utilizou-se todo o DNA tratado e adicionou-se 1!l de vetor desfosforilado

pMOSBlue (50ng) e 1!l deT4 DNA ligase (4 unidades); as reações foram incubadas a

22ºC “overnight”.

3.1.4.7 Preparação de bactérias competentes

A linhagem E.coli DH5" foi preparada para a transformação de acordo com

metodologia descrita (Sambrook et al., 1989). Inoculamos uma pequena quantidade de

E.coli em 2ml de meio LB. Após incubação "overnight" a 37°C sob agitação (200rpm),

uma alíquota de 500!l do meio de cultura foi diluído (1:100) em 50ml de meio LB em

um erlenmeyer. A cultura foi incubada sob agitação por um período de 2h à

temperatura de 37ºC, para que as células entrassem em fase logarítmica de

crescimento. A absorbância da solução foi medida em espectrofotômetro em

comprimento de onda de 560nm. Após leitura entre 0,5 e 0,7, a cultura foi colocada em

gelo e centrifugada a 6.000rpm por 5min à 4ºC. Em seguida o sobrenadante foi

removido e o precipitado ressuspendido em 5ml de CaCl

100mM gelado. Completado

o volume para um total de 50ml, a suspensão foi incubada em gelo por 10min e depois

centrifugada por 5min a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e foi adicionado CaCl

100mM gelado em volume correspondente a 10 vezes a D.O. da cultura. A suspensão

foi incubada no gelo por 30min e depois conservada em geladeira até o dia seguinte

quando glicerol foi adicionado até a concentração de 15% do volume. Após a adição do

glicerol alíquotas foram preparadas de 200!l que foram estocadas em freezer -70ºC até

o momento do uso.

3.1.4.8. Transformação de bactérias competentes por CaCl

A transformação foi feita de acordo com metodologia previamente descrita

(Sambrook, Fritsch et al., 1989). Duas alíquotas de bactérias competentes foram

descongeladas e em cada uma, foi acrescentado todo o volume da reação da ligação

prosseguindo uma incubação de 30min no gelo. As células foram submetidas ao

choque térmico à 42ºC por 90seg e retornadas ao gelo por 2 min. A suspensão foi

transferida para tubo contendo 1ml de meio SOC e 40!l de IPTG (Isopropyl-B-D-

Thiogalactopyranoside) e incubadas à 37ºC durante 1h com agitação suave (125 rpm),

para permitir a expressão do gene de resistência a ampicilina. Uma placa de Petri

contendo meio LB sólido acrescido de ampicilina 100!g/ml foi recoberta com 40!l de

Bluo-Gal 20mg/ml (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), para permitir a

visualização das bactérias transformantes. As bactérias foram transferidas para a placa

e incubada à 37ºC, "overnight".

3.1.4.9. Extração de DNA plasmidial por Mini Prep

As colônias brancas obtidas nos plaqueamentos das bactérias transformadas

foram utilizadas para extração do plasmídeo através da técnica de Mini Prep

(Sambrook et al., 1989), com menores adaptações. Cada colônia isolada foi crescida

em meio LB contendo ampicilina (100!g/ml) durante 18 horas a 37ºC, 200rpm. 1,5ml

da cultura foi transferido para um “eppendorf”, centrifugado durante 2min a 13000rpm

em temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado. O “pellet” de células foi

ressuspenso com 100!l de Solução I contendo 1!l de RNAse A 10mg/ml (Sigma

Chemical, St. Luois, MO, USA) utilizando vortex. Foram adicionados 200!l da Solução

II (de lise), homogeneizado suave e brevemente em vortex e acrescentados 200!l da

Solução III (de neutralização). O tempo entre a adição das Soluções II e III deve ficar

entre 3,5 a 5 min. A suspensão foi homogeneizada novamente e incubada por 30min

no gelo. Após a incubação, o tubo foi centrifugado durante 15min a 13.000rpm à

temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido para um tubo novo, adicionado

de 300!l de isopropanol, misturado suavemente por inversão e centrifugado por 10 min

a 13000 rpm. O “pellet” de DNA plasmidial foi lavado com etanol 70% gelado,

centrifugado por 5min a 13000rpm, seco à temperatura ambiente e ressuspenso em

30µl de água Milli-Q estéril. 2!l de cada amostra foram aplicados em gel de agarose

1% para eletroforese em tampão TAE, com marcador # HindIII e um plasmídeo pUC18

como referência de tamanho, para verificar se havia inserto nos plasmídeos extraídos.

Naqueles plasmídeos selecionados, uma digestão enzimática para liberação do inserto

era feita segundo protocolo do fabricante de cada enzima. A digestão era então

aplicada em gel de agarose para confirmar o tamanho do inserto clonado.

3.1.4.10. Sequenciamento dos insertos clonados nos plasmídeos

O seqüenciamento dos fragmentos de DNA clonados foram feitos em

seqüênciador automático de capilar ABI PRISM 3100 (Applied Biosystem, Foster City,

CA, USA). Em cada reação eram utilizados os oligonucleotídeos que hibridam no

plasmídeo externamente ao fragmento clonado ou internamente ao fragmento (“primer

walking”) e o seqüenciamento procedeu de acordo com o método de terminação de

cadeia por dideoxinucleotídeo (Sanger, Nicklen et al., 1977) modificado para

seqüenciamento utilizando terminadores de cadeia dideoxinucleotídeos fluorescentes

BigDye

. Para tanto, 1!g de plasmídeo (aproximadamente 1!l) foram colocados em

uma reação padrão contendo 2!l “Big Dye

Terminator Ready Reaction Mix” – DNA

polimerase AmpliTaq, tampão Tris-HCL pH 9,0, Mg CL

, deoxinucleotídeos trifosfato

(dATP,dCTP, dITP, dUTP) e dideoxinucleotídeos marcados com um doador e um

aceptor de fluorescência, 2!l de tampão “Save Money”, 1!l de oligonucleotídeo

3,2pmoles/!l e água Milli-Q para completar 10!l. As condições de ciclagem foram: 96ºC

por 5min, 25 ciclos de 96ºC por 10seg, 50ºC por 5seg e 60ºC por 4min. Após PCR, as

reações de seqüênciamento foram procipitadas com etanol 80% e 70%, secas e

adiciondas de 10!l de tampão de corrida HI-DI. No momento da corrida, as amostras

eram incubadas 5min a 90°C para desnaturação do DNA, seguidos de 5min no gelo.

3.1.5. Montagem das seqüências consenso ("contigs")

Os “contigs” dos fragmentos seqüenciados foram montadas utilizando os

programas Phred, Phrap e Consed (Ewing e Green, 1998; Ewing et al., 1998 e Gordon

et al., 1998). O programa Phred é um programa de identificação de bases que gera

dois tipos de arquivos de saída: um com a seqüência de nucleotídeos propriamente

dita, e outro com um escore de qualidade atribuído para cada nucleotídeo de um

cromatograma, valor que é utilizado pelo programa Phrap para a montagem de

“contigs” com um escore associado. O programa Phrap foi implementado para a

montagem de seqüências de DNA obtidas por “shotgun” e permite a utilização de

seqüências inteiras ao invés de apenas as regiões de boa qualidade, pois ao invés de

determinar uma seqüência consenso a partir das parciais, constrói um mosaico

utilizando as regiões de melhor qualidade de cada uma. O programa Consed permite

editar as montagens das seqüências consenso feitas pelo Phrap.

3.1.6. Análise das seqüências por comparação em bancos genômicos

A análise de contigs foi feita por comparação em bancos genômicos nos “sites”

NCBI (National Center for Biotechnology Information - http://ncbi.nlm.nih.gov) e

Candida Stanford Genome (Stanford Genome Technology Center – http://sequence-

www.stanford.edu/group/candida/search.html) utilizando o serviço “blast” (Basic Local

Alignment Search Tool). Esta ferramenta se caracteriza por programas de procura de

similaridade que são designados para identificar e classificar os “homólogos em

potencial” para uma determinada seqüência. Estes programas são capazes de analisar

seqüências de DNA e aminoácidos. Há diferentes programas de “blast”, como por

exemplo: “blastx” permite ao usuário que uma seqüência de nucleotídeos seja

traduzida e comparada contra um banco de dados de proteínas; “blastn” faz a

comparação da seqüência de nucleotídeos em questão contra um banco de dados de

nucleotídeos. Estas duas análises foram utilizadas neste trabalho.

3.1.7. Análise das seqüências para predição de estrutura, modificações pós-

traducionais, localização e função celular

Foram utilizados os programas do pacote DNAstar (DNASTAR Inc., Madison,

Wis.), em especial, o programa Protean que permite analisar diversas características

de proteínas a partir de sua seqüência primária. Neste trabalho, esse programa foi

principalmente utilizado para verificar as regiões de maior hidrofilicidade e potencial

antigênico da proteína predita da matriz extracelular de biofilme, a partir da seqüência

gerada no sequenciamento. Também foram feitas buscas por sinais para peptídeo

sinal, secreção e modificações pós-traducionais (glicosilação e fosforilação) na

seqüência da proteína predita da matriz de biofilme. Essa busca foi feita por servidores

de predição disponíveis na página http://www.cbs.dtu.dk/services/.

3.1.8. Expressão heteróloga de proteínas recombinantes da matriz de biofilme

3.1.8.1. Ligação, clonagem e sequenciamento

O fragmento de DNA codificador da enolase foi digerido do plasmídeo

pMOSBlue com NotI e BamHI e ligado em fase correta para leitura na tradução em

plasmídeo pET28-a(+), também digerido com estas enzimas. Esse plasmídeo possui

uma seqüência que codifica uma cauda de 6 histidinas em fase na porção N´terminal

da proteína recombinante, permitindo sua purificação em coluna de níquel. Na ligação,

utilizou-se aproximadamente 500ng (6!l) de DNA digerido e purificado em coluna de

purificação do kit GFX (DNA and Gel band Purification kit - GE Healthcare), a partir da

seleção da banda em gel de agarose 0,8%, 1!l de plasmídeo desfosforilado (50ng),

10!l de tampão de ligação, 1!l de DTT 10mM, 1!l de ligase e 1!l de água MilliQ. A

incubação foi realizada à 16ºC “overnight”. A clonagem em bactéria competente E.coli

BL-21 para expressão, seleção de plasmídeos por Mini-Prep e sequenciamento para

confirmação da fase de leitura foram realizados segundo protocolos descritos nos itens

acima.

3.1.8.2. Expressão da proteína recombinante

A enolase recombinante foi expressa e purificada segundo protocolo a seguir

(Novagen). Pré-inóculos de bactérias contendo plasmídeos com insertos de interesse

foram feitos em meio LB adicionado de canamicina (15mg/ml), crescidos "overnight" a

37°C sob agitação (200rpm). O pré-inóculo foi diluído 50 vezes no mesmo meio. A

cultura foi incubada a 37

C, com agitação a 200 rpm, até atingir a absorbância de 0,8

em comprimento de onda de 550nm. Nesse ponto foi realizada a indução da expressão

protéica com IPTG (para uma concentração final de 1mM) a 37

C, 200rpm, por 2h, em

frascos de no mínimo 4 vezes o volume da cultura. A cultura pós-indução foi

centrifugada (Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge, rotor GSA) a 6000

rpm por 10 minutos e o precipitado foi ressuspenso em tampão de lise gelado

(sacarose 10%, NaCl 0,2 M, Tris-HCl 50 mM pH 7,5) ou em PBS 1X gelado, na

proporção 1,5 ml tampão:100 ml cultura. A amostra foi congelada em gelo seco e, após

descongelamento, foi incubada no gelo com lisozima (para uma concentração final de

1mg/ml) por 30min, e em seguida sonicada (sonicador Branson Sonifier 450) e

centrifugada (Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge, rotor SS-34) a

10.000rpm por 10min. O sobrenadante (fração solúvel) e o precipitado ressuspenso em

tampão com uréia 8 M (fração insolúvel) foram aliquotados e guardados a –80

3.1.8.3. Purificação da proteína recombinante

O extrato contendo a enolase solúvel foi selecionado para se proceder a

purificação em resina quelante de níquel (QIAGEN), em que esta foi lavada em água

Milli-Q, carregada com 5 volumes de solução NiSO4 50mM e equilibrada com 3

volumes de tampão de ligação (imidazol 5mM, NaCl 500mM, Tris-HCl 20mM pH 8,0). O

extrato foi aplicado à resina e incubado por 4h a 4

C, sob agitação. Após a incubação,

o tubo foi centrifugado a 2.000rpm por 2min pra separar o “flow through” da resina e

esta foi lavada 4 vezes com 4 volumes de tampão de ligação. Posteriormente, a resina

foi lavada 4 vezes com 4 volumes de solução imidazol 30mM, NaCl 500mM, Tris-HCl

20 mMpH 8,0 e a eluição da proteína recombinante foi feita com 6 volumes de solução

de eluição (imidazol 200mM, NaCl 500mM, Tris-HCl 20mM pH 8,0). O eluato foi

dialisado contra solução Tris-HCl 20mM pH 8,0 e glicerol 5%. Contudo a proteína

precipitou e por isso optou-se por cortar a banda da proteína de interesse de um gel

preparativo SDS-PAGE. A banda correspondente foi cortada, eluída em água Milli-Q.

3.1.8.4.Quantificação de proteínas

Quantidades variáveis da proteína recombinante purificada foram adicionadas de

1ml de solução de “Coomassie Brilliant Blue” e a absorbância a 595nm foi determinada

em espectrofotômetro. A concentração da proteína foi determinada utilizando uma

curva-padrão de BSA (1-10!g). Diluiu-se a proteína para uma concentração final de

uso de 1!g/!l.

3.1.9. Produção de soro de coelho anti-enolase

O soro hiper-imune de 2 coelhos foi produzido por injeção subcutânea de 150µg

de His6-enolase, purificada de E. coli, com adjuvante completo de Freund’s (Sigma),

seguida de 2 injeções de 150!g da proteína em adjuvante incompleto de Freund’s

(Sigma) a cada 20 dias depois da administração inicial. Uma alíquota de sangue foi

coletada no dia da primeira administração com a finalidade de ser obtido o soro “Pré-

Imune”. O sangue total foi coletado 55 dias depois da primeira imunização por punção

cardíaca. Para a preparação do soro, o sangue foi incubado durante 30 minutos a

37°C, e em seguida durante 18h a 4°C; posteriormente, o sangue foi centrifugado a

1.000rpm durante 15min a 4

C e o soro obtido foi aliquotado e estocado a –80

3.1.10. “Western blot”

3.1.10.1. Preparo dos extratos protéicos

Culturas de linhagens de C. albicans mais e menos produtoras de biofilme

(SC5314, ATCC90029 e L296) e cultura de S.cerevisiae 288c foram feitas em meio

YPD e 5x10

células foram ressuspensas em solução para lise (Tris 20mM pH8,0,

MgCl

2mM, EGTA 2mM, NaCl 150mM) e inibidores de proteases (PMSF 1mM,

benzamidina 2mM, leupeptina 1!g/ml, pepstatina A 10!g/ml, aprotinina 4!g/ml e

antipaína 1!g/ml) e fosfatases (pirofosfato de sódio 10mM e fluoreto de sódio 1mM). As

suspensões celulares foram vortexadas e a lise foi feita por

congelamento/descongelamento. Após centrifugação a 13.000rpm por 15min a 4

separou-se o sobrenadante (fração solúvel) dos restos celulares e o primeiro foi

armazenado a –80

Culturas em meio SD e YPD foram feitas a 37

C por um e três dias com a

finalidade de se obter o extrato protéico dos meios condicionados. Para isso, após a

incubação, os meios foram separados das células por centrifugação e estes foram

filtrados e concentrados em pelo menos 500x e congelados a –80

O extrato protéico da matriz do biofilme foi obtido como descrito anteriormente e

mantido armazenado a –80

3.1.10.2.Degradação da enolase nativa

Uma cultura de C. albicans SC5314 foi feita em meio SD, 37

C, 200rpm por 20h,

até a fase estacionária, e separada em duas partes. Na primeira, a cultura foi

centrifugada para se separar as células do meio condicionado, que foi filtrado e a na

segunda parte, foram mantidas as células no meio mas sem agitação durante 5 horas.

Dividiram-se mais uma vez as partes em duas metades, a primeira foi mantida a

temperatura ambiente e a segunda a 37

C durante o experimento. Alíquotas de 5ml

foram retiradas nos tempos “zero”, 30min, 1h, 2h, 3h, 4h e 5h, concentradas 500x (para

10!l) e armazenadas a –80

3.1.10.3. Preparação da membrana e incubação

Após resolução em géis de acrilamida (SDS-PAGE), as proteínas foram

transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra, Amersham

Biosciences). A membrana foi então bloqueada com solução de leite 5% em PBS, e

incubada 2 à 3h a temperatura ambiente com anticorpo primário (soros) e “over night” (anti-

His6Tag)

- Soro pré-imune - diluição 1:500 em PBS.

- Soro anti-His6-enolase – diluição 1:2.000 em PBS.

- Anticorpo anti-His6Tag (Santa Cruz Biotechnology) - diluição 1:1.000 em PBS.

- Soro anti-Sui2 de S. cerevisiae – diluição 1:1.000 em PBS.

As membranas foram lavadas 3 vezes de 5min com PBS-Tween 0,1%. Após as

lavagens, as membranas foram incubadas anticorpo secundário anti-coelho (soros) ou anti-

camundongo (anti-His6Tag) conjugados a HRP (“horseradish peroxidase”) (Kit ECL -

“ECLTM Western Blotting Analysis System”, Amersham Biosciences) na diluição 1:1.500

(PBS) por 1 hora a temperatura ambiente. Foram repetidas as lavagens com PBS-Tween

e, então, com água para a retirada do detergente. As membranas foram reveladas com o

reagente ECL e filmes “HyperfilmTM MP” (Amersham Biosciences).

Quando necessário reutilizar a mesma membrana para incubação com outro

anticorpo, a membrana após a primeira revelação foi incubada por 30min a 55

C com

solução de “stripping” (Tris-HCl 62,5mM pH6,7; SDS 2%; _-mercaptoetanol 100mM).

Após, repetidas lavagens com água, a membrana foi bloqueada e o protocolo foi

seguido como descrito acima para o soro ou anticorpo em questão.

3.1.11. Imunofluorescência

3.1.11.1. Preparação de amostras

Culturas de C.abicans SC5314 foram feitas em meio YPD e em SFB (soro fetal

bovino) com dextrose 5mg/ml, “overnight”, a 37

C, 200rpm pra se obter,

respectivamente, leveduras e hifas (detalhes, vide itens 3.1.4.2 e 3.1.13.3.4). As

culturas foram centrifugadas e lavadas com PBS e fixadas com formaldeído 3,5% em

PBS por 1h. Após incubação, as células foram lavadas pelo menos 5 vezes com PBS

para ser retirado o excesso do fixador e em seguida, 10!l foram gotejados sobre

lâminas para secar em temperatura ambiente.

Para formação de biofilmes, lamínulas de vidro foram recobertas com Poli-lisina

A (10mg/ml) (Sigma), secas e o biofilme foi formado sobre elas de acordo com o

protocolo previamente descrito (item 3.1.3.1) por 66h.

3.1.11.2. Protocolo de incubação

As lâminas contendo leveduras, hifas e biofilmes foram permeabilizadas com

saponina 1% (BDH, Amersham, U.K.) em PGN (0,2% gelatina, 0,1% NaN

em PBS) ou

incubadas somente com PGN para bloqueio (não-permeabilizadas), por 15min. As

lamínulas foram incubadas com soro anti-His6-enolase (diluído 1:80 em PGN +

saponina ou PGN) “overnight”, a 4ºC e lavadas com PBS. Foram posteriormente

incubadas com IgG anti-coelho conjugado com Cy3 (Sigma), diluído 1:100 em

calcoflúor (10mg/ml) por 1h no escuro. Após lavagens com PBS, as lamínulas foram

montadas em glicerol tamponado com 0,1M de Tris pH 8.6 e 0,1% de p-

fenilenodiamina. As lâminas foram examinadas em microscópio confocal (BioRad 1024-

UV) acoplado a um microscópio Zeiss Axiovert 100. Alternativamente as imagens foram

adquiridas em microscópio de epifluorescência.

3.1.12. Citometria de fluxo

3.1.12.1. Enolase na superfície celular

Para a marcação da enolase na superfície de leveduras, uma cultura de

C.abicans SC5314 foi feita em meio YPD “overnight”, a 37

C, 200rpm e duas alíquotas

de 10

células foram separadas. A primeira foi fixada com formaldeído 3,5% por 1h,

lavada em PBS e incubada “overnight” com soro contra a His6-enolase (diluído 1:80 em

PGN + saponina 1%) (células permeabilizadas). A segunda alíquota foi primeiramente

incubada com soro hiper-imune sem saponina e depois foi fixada (não-

permeabilizadas). Após lavagens em PBS, as leveduras foram incubadas com IgG anti-

coelho marcado com fluoresceína (FITC) (diluído 1:100 em PBS) por uma hora em

temperatura ambiente. Após duas lavagens, o número de leveduras fluorescentes foi

estimado com um citômetro Becton-Dickinson (Cortez et al., 2003), com leitura de

10.000 eventos, ou 10

células. Como controle, foi utilizado o soro pré-imune de coelho

em células permeabilizadas e não-permeabilizadas.

3.1.12.2. Recaptação da enolase

Para a recaptação da enolase, uma cultura de C.abicans SC5314 foi feita em

meio YPD “overnight”, a 37

C, 200rpm. Após lavagens com PBS para se retirar o meio,

cinco alíquotas de 2x10

células foram separadas. A primeira foi incubada com o

tampão de eluição da purificação da proteína recombinante e as outras quatro, com

concentrações diferentes da His6-enolase: 1,25; 2,5; 5 e 10!g “overnight”, a 4

C, sob

agitação. Após lavagens com PBS, as células foram fixadas com paraformaldeído 3,5%

por 1h. Novas lavagens foram feitas para se retirar o fixador e as leveduras foram

incubadas com anticorpo anti-His6-Tag (diluído 1:20 em PGN) por 1h, lavadas e

incubadas com IgG anti-coelho marcado com FITC (diluído 1:50 em PBS) para ser feita

leitura em citômetro de fluxo. Como controle da recaptação, a enolase recombinante foi

acoplada à “beads” de látex (100!g da His6-enolase para 10

“beads”) e incubadas em

tampão de acoplamento (Carbonato de sódio 0,2M, Cloreto de sódio 0,5M, pH 8,5)

“overnight”, a 37

C, 200rpm. Posteriormente, foram lavadas e bloqueadas com solução

em PBS de BSA (20mg/ml) e as “beads” foram incubadas com anticorpo anti-His6-Tag

(diluído 1:20 em PGN), por 1h. Após esse período, foram lavadas e incubadas com IgG

anti-camundongo marcado com FITC (diluído 1:50 em PGN). Após duas lavagens, o

número de leveduras fluorescentes e de “beads” foi estimado com um citômetro

Becton-Dickinson (Cortez et al., 2003) com leitura de 10.000 eventos.

3.1.13. Manipulação de RNA

3.1.13.1.Linhagens de C. albicans

Para análise da expressão de genes em diferentes condições de crescimento,

foram utilizadas as linhagens descritas na Tabela 1 (item 3.1.2.1).

3.1.13.2. Oligonucleotídeos

Os oligonucleotídeos utilizados e os fragmentos dos genes que eles amplificam

estão descritos na Tabela 2. Os oligonucleotídeos foram construídos segundo

orientação do manual QUIAGEN$ Multiplex PCR o qual permite a amplificação

concomitante de até 16 bandas em um mesmo tubo. As combinações dos mesmos

foram feitas de acordo com os critérios de amplificação de bandas com diferença nos

tamanhos entre si de pelo menos 100 pares de base e temperatura de hibridação

superior a 56

Tabela 2: Oligonucleotídeos utilizados na RT-PCR Multiplex e para o controle da integridade do cDNA:

GENES

Oligonucleotídeos

ACT1

355

Fw 5’-GAACGTCCAATGAATCCAAAATC-3’ / Rv 5’-GTTCGAAATCCAAAGCAACGTAAC-3’

ALS3

875(1) / 804(2)

Fw 5’-CTGACACTGTTTTAATCAGAGAGCCAC-3’ / Rv 5’-CACTATTAGCAGTTGTAGTTGTAGATGGAG-3’

BCR1

699

Fw 5’-GAAGACCCGAACCATTGGCATTAC-3’ / Rv 5’-CATTACCATTACTCGTACCACCACC-3’

ENO1

775

Fw 5’-CTGCCGCTGCTGCTCAAG-3’ / Rv 5’-CCGGATCTGTGGGAAACC-3’

FBA1

514

Fw 5’-AGACAACAAGGCTCCAATCATC-3’ / Rv 5’-AAAAGCAGCAGCAATAGAAAAGTT-3’

HWP1

630(1) / 528(2)

Fw 5’-CATCACATCTAAAGATACTATTTACACCAC-3’ / Rv 5’-GATTTTGGAGAAGAAGAAGCACCTG-3’

HXK1

1.009

Fw 5’-AGGCGACGAGCATGGACAGTA-3’ / Rv 5’-GCGCGCCCGCTTGATAAT-3’

HXK2

856

Fw 5’-ATTGCCATTGGGTTTCACATTT-3’ / Rv 5’-AGCTTGGGCAGTTCTTTCTTTG-3’

PYK1

745

Fw 5’-TTACCCAATTCCACCAAACCAC-3’ / Rv 5’-CATCATAGAGACGGCTTCAACTG-3’

TEC1

443

Fw 5’-GAGAATTTATACCGGGATTTTGGAAG-3’ / Rv 5’-CATTGATGCTGAATGAATGGTGTCTC-3’

EFB1

Apro.900 / 550

Fw 5’-ATTGAACGAATTCTTGGCTGAC-3’ / Rv 5’-CATCTTCTTCAACAGCAGCTTG-3’

Pares de bases amplificados por cada par de oligonucleotídeos;

O maior valor em Pb refere-se ao alelo 1 e o menor, ao alelo 2 do gene ALS3;

O maior valor em Pb refere-se ao alelo 1 e o menor, ao alelo 2 do gene HWP1;

O maior valor em Pb refere-se ao fragmento amplificado do DNA e o menor, do cDNA.

3.1.13.3. Condições de crescimento

3.1.13.3.1 Indução de biofilme

Foi utilizado o protocolo de Hawser e Douglas (1994) já descrito (item 3.1.3). Foi

modificado o tempo de incubação para formação do biofilme, em vez de 66h, o biofilme

foi crescido por 24h. Após o tempo de incubação, o biofilme foi lavado com PBS gelado

para retirar as células não aderidas e este foi extraído como previamente descrito (item

3.1.3.2). As células foram centrifugadas e imediatamente processadas segundo o

protocolo de extração de RNA total.

3.1.13.3.2. Microaerofilia

As linhagens foram crescidas em placa de meio YPD (meio rico) por 72h à 37

em garrafas para microaerofilia hermeticamente fechadas, com concentração de

oxigênio próxima de 5%. Um raspado contendo aproximadamente 5x10

células foi

lavado uma vez com PBS e as células foram centrifugadas e imediatamente

processadas segundo o protocolo de extração de RNA total.

3.1.13.3.3.Levedura em meio rico (YPD) e em meio pobre (SD)

Foram feitos inóculos de cada linhagem no respectivo meio de cultura líquido

(3ml) e incubados “overnight” à 37

C, 200 rpm. Após lavagem com PBS, as células

foram centrifugadas e imediatamente processadas segundo o protocolo de extração de

RNA total.

3.1.13.3.4. Indução de Hifas

As linhagens foram previamente cultivadas em meio YPD líquido a 37°C

"overnight”, 200rpm. Uma alíquota das culturas foi centrifugada e lavada 3 vezes com

PBS e ressuspensa em 1ml de PBS. A absorbância foi medida a 660nm para se obter

a concentração das leveduras. A concentração foi estimada a partir da curva pré-

estabelecida de densidade ótica x concentração de leveduras. As células foram então

diluídas para a concentração de 10

células/ml no SFB (Soro Fetal Bovino) com

dextrose 5mg/ml. As leveduras foram incubadas por 3h a 37°C, 200rpm. Após esta

incubação, as células foram observadas ao microscópio para aferir a proporção hifas x

leveduras. Foi encontrada a porcentagem aproximada de 80% de hifas em relação às

leveduras. As hifas assim induzidas foram lavadas com PBS e processadas segundo o

protocolo de extração de RNA total.

3.1.13.4 Extração de RNA total e tratamento com DNAse

Para a extração de RNA total as células de cada condição de crescimento foram

lavadas e tratadas com tampão protoplasto, segundo descrito previamente (item

3.1.4.2.). Em seguida, os “eppendorfs” foram centrifugados e os esferoplastos foram

ressuspensos em tampão de lise do Kit RNAspin Mini (GE Healthcare) e processados

segundo protocolo do fabricante. Brevimente, o lisado foi filtrado em coluna do kit por

1min, 11.000xg. Ao filtrado, foram acrescentados 350!l de etanol 70%, misturados e

adicionados em coluna de extração de RNA do kit para posterior centrifugação. A

membrana com RNA ligado foi lavada e incubada com DNAse do Kit por 15min. Após a

incubação, a membrana foi lavada com tampões do kit e os RNAs foram ressuspensos

em 50!l de água DEPC e imediatamente congelados à -80ºC até o momento do uso.

3.1.13.5. Quantificação do RNA total

Para a quantificação do RNA, 5!l da suspensão foi diluída em 1ml de água

bidestilada esterilizada. A absorbância foi medida em comprimento de onda de 260nm

e obedecida à proporção de 40!g/ml de RNA para absorbância de 1. Também foram

efetuadas medidas a 280nm para avaliar a pureza do RNA. A relação dos valores

obtidos a 260 e 280nm (razão 260nm/280nm) deveria estar em torno de 1,9 para que o

material fosse considerado puro o bastante para análise. Caso esta relação não fosse

atingida, procedia-se nova extração de RNA.

3.1.13.6 Reação de Transcriptase Reversa (RT-PCR)

O RNA total extraído das 14 linhagens de C. albicans, nas 5 condições de

crescimento foram submetidos ao ensaio de RT-PCR para a síntese da primeira fita de

cDNA (DNA complementar) utilizando-se a enzima Superscript II (Life Technologies)

segundo o protocolo sugerido pelo fabricante. Nesta reação adicionou-se a 1!g de

RNA, 1!l de oligonucleotídeo dT

12-18

50!M, 1!l da mistura dNTP 10mM, incubou-se a

65ºC por 5min e esfriou-se no gelo. Foi adicionado 10!l da mistura: 4!l de 5x First-

Strand Buffer, 2!l de MgCl

10mM, 2!l de DTT 0,1M, 1,4!l de RNAguard

RNAse

Inhibitor (Porcine) (Amersham Pharmacia Biotech Piscataway, NJ, USA) e 1!l da

enzima SuperScript

II (RNAse H Reverse Transcriptase) (Life Technologies, Grand

Island, NY, USA). A mistura foi incubada à 42ºC por 50min, em seguida à 70ºC por

15min. O material era estocado à -20ºC até a realização da PCR.

3.1.13.7. Verificação da integridade do cDNA por RT-PCR

Para verificação da integridade do cDNA e da ausência de contaminação de

DNA nas amostras, o produto do ensaio de RT foi submetido a PCR utilizando-se

oligonucleotídeos que hibridam no gene EFB1, o qual possui um intron no fragmento

selecionado para a amplificação. Caso existisse contaminação com DNA seriam

amplificadas duas bandas pela PCR, com tamanhos aproximados de 550 pb (referente

ao cDNA) e 950 pb (DNA contaminante). O RNA da amostra contaminada era

novamente tratado com DNAse e feita nova RT-PCR.

Na PCR adicionou-se 15,3!l de água bidestilada estéril, 2,5!l de tampão para

Taq DNA polimerase 10 x concentrado, 2!l de dNTP (10mM de cada nucleotídeo), 2!l

de MgCl

50mM, 1!l de cDNA, 1!l de oligonucleotídeo EFB1Fw 10!M, 1 !l de

oligonucleotídeo EFB1Rv 10!M e 0,2!l de Taq DNA polimerase (Life Technologies,

Grand Island, NY, USA). Condições do ciclo: 94ºC por 5min; 35 ciclos de 94ºC por

1min, 56ºC por 1min e 72ºC por 1:30min; 72ºC por 7min.

3.1.13.8. RT-PCR multiplex semi-quantitativo

Diversas diluições e quantidades de cDNA foram testadas a fim de padronizar a

quantificação para que a intensidade das bandas nos géis não ficasse saturada.

Foi utilizado o Kit Multiplex PCR (QUIAGEN!) para amplificação de no mínimo

cinco bandas de diferentes genes por tubo. As reações foram padronizadas utilizando-

se 3 diluições de cDNA por amostra, em cada condição de crescimento. Para volume

final de 40!l foi utilizado 1!l de cDNA sem diluir, diluído 1/10 e 1/20, 20!l do Master Mix

Multiplex, 4!l do Mix de primers 10X (2!M de cada) e 15!l de água bidestilada estéril.

As condições do ciclo foram 95°C por 15min; 30 ciclos de 94°C por 30seg, 56 ou 58°C

por 1:30min, 72°C por 1:30min e extensão final de 72°C por 10min. Os produtos destas

reações foram visualizados em gel de agarose 2% posteriormente corados com

brometo de etídio (10mg/ml).

3.1.13.9. Análise dos resultados dos ensaios de RT-PCR

As imagens dos géis foram digitalizadas e as bandas quantificadas usando os

programas Molecular Imaging Software (Kodak) e Excel (Microsoft). Utilizando-se as

massas de cada banda foi calculado o número de moléculas de cada gene por célula.

Posteriormente, esse número foi corrigido de acordo com a diluição do cDNA inicial

(40, 4 e 2ng), e foram normalizadas utilizando os valores da amplificação do gene da

actina como controle. Quando não havia detecção de banda, era atribuído valor “zero”

de número de moléculas para a expressão de dado gene.

3.1.14. Reagentes utilizados

3.1.14.1 Meios de cultura

YPD - Extrato de levedura (DIFCO) 1%, dextrose (MERCK) 2%, peptona

(DIFCO) 2%, agar 2% (para meio sólido).

LB: - Triptona (DIFCO) 1%, NaCl (Synth), 0,5% extrato de levedura

(DIFCO) 1%, ágar (DIFCO) 2% (para meio sólido).

LB Amp:- Meio LB, ampicilina sódica (WYETH) 100!g/ml.

SOC: - Triptona (DIFCO) 2%, NaCl (Synth) 0,05%, KCl (Synth) 2,5mM,

MgCl

(MERCK) 7mM, glicose (DIFCO) 20mM, pH 7,0.

SD: - YNB (DIFCO , Sparks, USA) 0,67%, dextrose (Merck) 2%, Agar

(DIFCO) 2% (para meio sólido).

3.1.14.2.Soluções e tampões

-Solução CBB: 10mg Coomassie Brilliant Blue G (Sigma) foram dissolvidos

em 5ml etanol 95%. Adicionou-se 10ml H

e o volume foi

completado para 100ml com água Milli-Q. A solução foi

filtrada em papel de filtro grosso (250g) e guardada a 4

C em

frasco escuro.

-Solução I: Glicose 0,05M, Tris-Hcl 0,025M pH 8,0, EDTA 0,01M.

-Solução II (lise): NaOH 0,2N, SDS 1%.

-Solução III (neutralização): Acetato de potássio 5M e ácido acético glacial 12%.

-Tampão TAE: Tris-acetato 40mM, EDTA 1mM pH 8,0.

-Tampão de amostra para DNA (6x): Orange G 0,25%, ficol (type 400, GE) 15%,

diluídos em água.

-Tampão protoplasto: 10!l _-mercaptoetanol (GE), 100!l Tris - HCl 1M

pH 7,4, 20!l EDTA 10mM, 100!l zimoliase 100U/80!l

(GE), 770!l água Milli-Q estéril.

-Tampão de lise: 20!l NaOH 10N, 100!l SDS 10%, 880!l água Milli-Q

estéril.

-Tampão LB 4X: 0,625M Tris-HCl pH 6,8; 10% glicerol; 3% SDS;

5% _-mercaptoetanol, 0,1% azul de bromofenol).

-Tampão RB 10X (“Running Buffer”): 30g de Tris-base, 144g de glicina, 10% SDS e

água Milli-Q para completar 1l.

3.2. RESULTADOS

3.2.1. Seleção da linhagem de C. albicans mais produtora de biofilme

Para selecionar a linhagem mais produtora de biofilme, 14 linhagens de C.

albicans, incluindo isolados de hemocultura e ponta de cateter e linhagens de bancos

de referência, foram testadas. O biofilme foi induzido e quantificado por coloração com

cristal violeta e redução do XTT (Figura 1). A partir da coloração com cristal violeta

(Figura 1A) as linhagens foram classificadas em altamente produtoras de biofilme, as

que obtiveram medida de absorbância maior que 2, médio-produtoras; entre 1 e 2 e

pouco produtoras as medidas de absorbância menores que 1. Entre as altamente

produtoras foram agrupadas as linhagens SC5314, L301A, L296, L667 e L669. As

médio-produtoras foram as L291 e L666; as pouco produtoras foram a ATCC90029,

ATCC24433, 34ptc, L298, L297A, L757 e L663. A metodologia de redução do XTT

(Figura 1B) auxiliou na separação das linhagens mais ou menos produtoras de biofilme

mas não separou as linhagens intermediárias. Isso se deve ao fato de que o cristal

violeta cora toda a massa celular no biofilme enquanto que a redução do XTT só é

realizada pelas células ativas (vivas) do biofilme.

Através da comparação entre as linhagens mais produtoras foi escolhida a

SC5314 para os experimentos de extração de matriz extracelular de biofilme também

pela vantagem desta ter sido a linhagem a ter seu genoma completamente

seqüenciado e montado no projeto genoma da Candida (www.candidagenome.com), o

que facilitaria a manipulação genética, bem como a comparação com dados de

patogenicidade e virulência em outros estudos.

Cristal violeta

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

ATCC90029

ATCC24433

SC5314

34ptc

L301A

L298

L297A

L296

L291

L757

L663

L666

L667

L669

Absorbância

XTT

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

ATCC90029

ATCC24433

SC5314

34ptc

L301A

L298

L297A

L296

L291

L757

L663

L666

L667

L669

Absorbância

Figura 1. Quantificação de biofilme de 14 linhagens de C. albicans utilizando o protocolo de Jin

et al. (2003). As barras nos gráficos representam as médias de 16 réplicas experimentais de

cada linhagem e a barra de erros, o desvio-padrão. Em A, a quantificação foi feita através da

coloração com cristal violeta 0,4% e em B, pela redução do XTT em formazan. Foram

classificadas como altamente produtoras de biofilme aquelas linhagens que obtiveram medida

de absorbância maior que 2, na quantificação com cristal violeta, médio-produtoras, entre 1 e 2

e pouco produtoras as medidas de absorbância menores que 1.

3.2.2. Identificação das principais proteínas da matriz de biofilme de C. albicans

A partir da seleção da linhagem SC5314 como altamente produtora de biofilme,

testaram-se condições de indução e materiais plásticos para a padronização de

crescimento de biofilme, segundo protocolo descrito por Hawser e Douglas (1994).

Primeiramente, padronizou-se o crescimento em garrafas de cultura de células ou

placas de 24 amostras sem agitação durante o período de adesão celular.

Posteriormente foi testado o meio SD contendo duas concentrações diferentes de

glicose, 50mM e 500mM. Padronizou-se o uso do meio SD contendo 50mM de glicose

visto que os biofilmes, embora esses crescessem mais densamente com mais glicose,

se desprendiam do fundo das garrafas e das placas nas trocas do meio. A Figura 2

mostra um gel "SDS-PAGE” de matrizes de biofilmes concentradas a partir da indução

em placas de 24 amostras e garrafas de cultura de células. Foram observadas bandas

de tamanhos entre 150kDa e 15kDa, e as mais fortes estão presentes entre 75 e

20kDa. Não foi possível distinguir bandas presentes somente nos biofilmes em

comparação com o lisado celular. O meio condicionado apresentava poucas bandas

mais concentradas abaixo do marcador de 20kDa indicando possível degradação de

proteínas. Novas induções de biofilme em garrafas de cultura de células foram feitas e

12 bandas foram selecionadas a partir de gel “SDS-PAGE” para identificação por

espectrometria de massa (Figura 3).

Das 12 bandas selecionadas, somente a banda 9 obteve identificação confiável

(Tabela 3) de acordo com o “E-value” da busca pelo Blastp (NCBI website -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) (5.8e-07). A banda de aproximadamente

45kDa foi identificada como “phosphopyruvate hydratase” ou enolase que em C.

albicans é codificada pelo gene de cópia única ENO1 e possui 1.323 nucleotídeos. A

identificação da proteína foi confirmada com nova extração de matriz de biofilme e nova

análise de espectrometria de massa. A enolase, uma proteína citosólica de

aproximadamente 48kDa, é um componente central da via glicolítica que catalisa a

desidratação de 2-fosfoglicerato para gerar fosfoenolpiruvato, mas pode catalisar a

reação inversa na gliconeogênese (Sundstrom e Aliaga, 1992).

Figura 2. Gel “SDS-PAGE” 10% para a padronização das condições de indução e

desenvolvimento de biofilme, corado com nitrato de prata 0,1%. As amostras são (M) Marcador;

biofilmes concentrados a partir da indução em placas de 24 amostras (P) e garrafas de cultura

de células (G); meio SD com crescimento celular por 3 dias, também chamado de meio

condicionado (MC) e lisado de 10

células da linhagem SC5314.

M Biofilme

Figura 3. Gel “SDS-PAGE” 10% para selecionar as bandas protéicas da matriz de biofilme

corado com azul de Coomassie. As amostras são (M) Marcador e o biofilme concentrado a

partir de garrafas de cultura de células. Os números indicam as 12 bandas selecionadas para

identificação por análise de espectrometria de massa.

Tabela 3. Identificação por espectrometria de massa das 12 bandas protéicas selecionadas da matriz de biofilme de Candida

albicans

Banda

Identificação

Organismo

N. de acesso GenBank

Score (bits)

E value

Hypothetical protein ECU08_1170

Encephalitozoon cuniculi

Q8SUP0

5.7

Gal80p

Saccharomyces cerevisiae

CAA86725

Putative protein

Candida glabrata

Q6FSG4

Hypothetical protein CaO19.8522

Candida albicans SC5314

EAL02334

5.8

Putative protein

Ashbya gossypii

Q75D11

L-aminoadipate-semialdehyde

dehydrogenase-phosphopantetheinyl

transferase

Saccharomyces cerevisiae

P50113

Hypothetical protein

Neurospora crassa

Q7RXM3

1.2e+02

Hypothetical protein

Candida albicans

Q9P821

3e+03

phosphopyruvate hydratase

(EC 4.2.1.11)

Candida albicans

A61017

110

5.8e-07

Putative protein

Candida glabrata

Q76IP9

Putative protein

Candida glabrata

Q6FWY0

Putative protein

Candida glabrata

Q6FNR3

Além de participar da via glicolítica, é sabido que enolases codificadas por

genes parálogos em peixes, anfíbios, répteis e aves é componente fundamental na

formação de seus cristalinos (Piatigorsky, 2003). Ainda, já foi reportada a presença de

enolase na superfície celular de C. albicans (Angiolella et al., 1996). Tendo em vista

que o biofilme, assim como o cristalino, é uma estrutura gelatinosa, então, a

identificação da enolase como uma das proteínas majoritárias de sua matriz nos fez

levantar as seguintes questões:

1- poderia a enolase ser ativamente secretada pelo fungo ou estaria presente na matriz

e na superfície das células devido à morte e lise celular? 2- poderia a enolase estar

ativa, hidratando ou hidrolisando componentes na matriz? 3- visto que só existe um

gene codificando a enolase (ENO1) nessa levedura, sua expressão estaria alterada

nas células de biofilme?

3.2.3. Análise da seqüência de DNA da enolase e da proteína predita da linhagem

SC5314

Para se testar a primeira hipótese, foram feitas análises das seqüências de DNA

e de proteína, bem como, foi gerado soro policlonal contra a enolase recombinante

para ensaios de “western blots” e citometria de fluxo. Para tal, o gene ENO1 foi

amplificado por completo em duas PCR´s da linhagem SC5314 (Figura 4), clonado e

seqüenciado. O “contig” obtido após montagem pelos programas Phred-Phrap-Consed

obteve “score” de Phred menor que 40 e 0,11 erros para cada 10

bases. A Figura 5

mostra o “contig” de DNA da enolase seqüenciada em nosso trabalho alinhado com a

seqüência depositada no genoma da Candida (orf19.395). Entre as seqüências foram

encontradas 4 substituições de nucleotídeos, nas posições 41, 217, 713 e 1.215. As

duas primeiras originaram troca de aminoácidos de mesmo grupo, respectivamente,

ácido aspártico por glicina (polares) e isoleucina por valina (hidrofóbicos); a terceira

originou troca de um aminoácido hidrofóbico por um polar (glicina por valina) e a última

substituição foi sinônima, mantendo o aminoácido alanina.

A análise da seqüência predita de aminoácidos no programa Protean (pacote

DNAstar) (Figura 6) mostrou que a enolase é uma proteína rica em alfa-hélices,

altamente hidrofílica e por isso, possui elevado índice antigênico. Análises de predição

de sinal de peptídeo sinal, secreção, glicosilação e fosforilação foram realizadas no

website do Center for Biological Sequence Analysis (CBS). Não foi predito peptídeo

sinal canônico (SignalP 3.0 server - Signal peptide probability: 0.000) e por isso,

analisou-se a seqüência quanto à possibilidade de ser secretada por via não-clássica

(SecretomeP Server). Pelo NNscore = 0.433 da análise, a enolase foi classificada como

não secretada por via não-clássica (necessário NNscore > que 0,5 para ser secretada).

Contudo, foram preditos resíduos N-glicosilados (NetNGlyc Server) nas posições 18,

103, 137 e 330; O-glicosilados (YinOYang Server) em proteínas intracelulares nas

posições 2, 34, 179, 269, 329, 366, 407 e 438 e fosforilados (NetPhosYeast Server)

nas posições 2, 101, 160, 179, 222, 269, 359 e 379 (Figura 7).

Figura 4. Gel de agarose 1% para verificar a amplificação do gene completo da enolase

(ENO1) da linhagem de C. albicans SC5314. As amostras correspondem ao marcador (M) e as

duas reações de amplificação (1 e 2).

01 ATGTCTTACGCCACTAAAATCCACGCCAGATACGTCTACGACTCCAGAGGTAACCCAACC SC5314genoma

M S Y A T K I H A R Y V Y D S R G N P T 20

01 ATGTCTTACGCCACTAAAATCCACGCCAGATACGTCTACGGCTCCAGAGGTAACCCAACC SC5314

61 GTTGAAGTTGATTTCACCACCGACAAAGGTTTATTCAGATCAATTGTCCCATCTGGTGCC

V E V D F T T D K G L F R S I V P S G A 40

61 GTTGAAGTTGATTTCACCACCGACAAAGGTTTATTCAGATCAATTGTCCCATCTGGTGCC

121 TCTACTGGTGTCCACGAAGCTTTGGAATTGAGAGATGGTGACAAATCCAAATGGTTAGGT

S T G V H E A L E L R D G D K S K W L G 60

121 TCTACTGGTGTCCACGAAGCTTTGGAATTGAGAGATGGTGACAAATCCAAATGGTTAGGT

181 AAAGGTGTTTTGAAAGCCGTTGCCAATGTTAATGACATCATTGCCCCAGCTTTAATAAAA

K G V L K A V A N V N D I I A P A L I K 80

181 AAAGGTGTTTTGAAAGCCGTTGCCAATGTTAATGACGTCATTGCCCCAGCTTTAATAAAA

241 GCCAAGATCGATGTTGTCGACCAAGCTAAGATTGATGAATTCTTGTTGTCCTTGGACGGT

A K I D V V D Q A K I D E F L L S L D G 100

241 GCCAAGATCGATGTTGTCGACCAAGCTAAGATTGATGAATTCTTGTTGTCCTTGGACGGT

301 ACTCCAAACAAATCCAAATTGGGTGCCAATGCTATCTTGGGTGTTTCTTTGGCTGCTGCC

T P N K S K L G A N A I L G V S L A A A 120

301 ACTCCAAACAAATCCAAATTGGGTGCCAATGCTATCTTGGGTGTTTCTTTGGCTGCTGCC

361 AATGCTGCCGCTGCTGCTCAAGGCATTCCATTGTACAAACACATTGCCAACATTTCCAAT

N A A A A A Q G I P L Y K H I A N I S N 140

361 AATGCTGCCGCTGCTGCTCAAGGCATTCCATTGTACAAACACATTGCCAACATTTCCAAT

421 GCCAAGAAAGGTAAATTCGTTTTGCCAGTTCCATTCCAAAACGTTTTGAACGGTGGTTCC

A K K G K F V L P V P F Q N V L N G G S 160

421 GCCAAGAAAGGTAAATTCGTTTTGCCAGTTCCATTCCAAAACGTTTTGAACGGTGGTTCC

481 CATGCTGGTGGTGCTTTAGCTTTCCAAGAATTTATGATTGCCCCAACTGGTGTCTCCACT

H A G G A L A F Q E F M I A P T G V S T 180

481 CATGCTGGTGGTGCTTTAGCTTTCCAAGAATTTATGATTGCCCCAACTGGTGTCTCCACT

541 TTCTCTGAAGCTTTGAGAATTGGTTCAGAAGTTTACCACAACTTGAAATCTTTGACCAAG

F S E A L R I G S E V Y H N L K S L T K 200

541 TTCTCTGAAGCTTTGAGAATTGGTTCAGAAGTTTACCACAACTTGAAATCTTTGACCAAG

601 AAGAAATACGGTCAATCCGCTGGTAACGTCGGTGACGAAGGTGGTGTTGCTCCAGATATC

K K Y G Q S A G N V G D E G G V A P D I 220

601 AAGAAATACGGTCAATCCGCTGGTAACGTCGGTGACGAAGGTGGTGTTGCTCCAGATATC

661 AAAACTCCAAAGGAAGCTTTGGACTTGATCATGGATGCCATTGACAAAGCCGGTTACAAA

K T P K E A L D L I M D A I D K A G Y K 240

661 AAAACTCCAAAGGAAGCTTTGGACTTGATCATGGATGCCATTGACAAAGCCGTTTACAAA

721 GGTAAGGTTGGTATTGCCATGGATGTTGCTTCATCTGAATTCTACAAGGACGGTAAATAC

G K V G I A M D V A S S E F Y K D G K Y 260

721 GGTAAGGTTGGTATTGCCATGGATGTTGCTTCATCTGAATTCTACAAGGACGGTAAATAC

781 GACTTGGACTTTAAAAACCCAGAATCCGACCCATCTAAATGGTTGTCTGGCCCACAATTG

D L D F K N P E S D P S K W L S G P Q L 280

781 GACTTGGACTTTAAAAACCCAGAATCCGACCCATCTAAATGGTTGTCTGGCCCACAATTG

841 GCTGACTTATATGAACAATTGATTTCCGAATACCCAATTGTTTCTATTGAAGATCCATTC

A D L Y E Q L I S E Y P I V S I E D P F 300

841 GCTGACTTATATGAACAATTGATTTCCGAATACCCAATTGTTTCTATTGAAGATCCATTC

901 GCTGAAGATGACTGGGATGCTTGGGTCCACTTCTTTGAAAGAGTTGGTGACAAGATCCAA

A E D D W D A W V H F F E R V G D K I Q 320

901 GCTGAAGATGACTGGGATGCTTGGGTCCACTTCTTTGAAAGAGTTGGTGACAAGATCCAA

961 ATTGTCGGTGATGATTTGACTGTCACTAACCCTACCAGAATCAAGACTGCCATTGAAAAG

I V G D D L T V T N P T R I K T A I E K 340

961 ATTGTCGGTGATGATTTGACTGTCACTAACCCTACCAGAATCAAGACTGCCATTGAAAAG

1021 AAAGCCGCTAATGCTTTGTTGTTGAAGGTTAACCAAATTGGTACTTTGACTGAATCTATA

K A A N A L L L K V N Q I G T L T E S I 360

1021 AAAGCCGCTAATGCTTTGTTGTTGAAGGTTAACCAAATTGGTACTTTGACTGAATCTATA

1081 CAAGCTGCTAACGATTCTTACGCTGCTGGTTGGGGTGTCATGGTTTCCCACAGATCCGGT

Q A A N D S Y A A G W G V M V S H R S G 380

1081 CAAGCTGCTAACGATTCTTACGCTGCTGGTTGGGGTGTCATGGTTTCCCACAGATCCGGT

1141 GAAACCGAAGATACTTTCATTGCTGACTTGTCAGTTGGTTTAAGATCTGGTCAAATCAAG

E T E D T F I A D L S V G L R S G Q I K 400

1141 GAAACCGAAGATACTTTCATTGCTGACTTGTCAGTTGGTTTAAGATCTGGTCAAATCAAG

1201 ACTGGTGCTCCAGCTAGATCTGAAAGATTGGCCAAATTGAACCAAATCTTGAGAATCGAA

T G A P A R S E R L A K L N Q I L R I E 420

1201 ACTGGTGCTCCAGCCAGATCTGAAAGATTGGCCAAATTGAACCAAATCTTGAGAATCGAA

1261 GAAGAATTAGGTTCTGAAGCTATCTACGCTGGTAAAGATTTCCAAAAGGCTTCTCAATTG

E E L G S E A I Y A G K D F Q K A S Q L 440

1261 GAAGAATTAGGTTCTGAAGCTATCTACGCTGGTAAAGATTTCCAAAAGGCTTCTCAATTG

1321 TAA

---

1321 TAA

Figura 5. Alinhamento das seqüências de DNA do gene completo da enolase da linhagem de

C. albicans SC5114. Foram alinhadas as seqüências provenientes do projeto genoma da

Candida (orf19.395) (SC5314genoma) e a seqüência originada neste trabalho (SC5314). Entre

elas está a seqüência predita de aminoácidos. Os números à direita referem-se à posição do

primeiro nucleotídeo em cada linha e os à esquerda referem-se à posição do último

aminoácido. Estão marcadas em vermelho as substituições de nucleotídeos nas posições 41,

217, 713 e 1.215, e em negrito, a troca de aminoácidos.

Figura 6. Análise de predições da estrutura secundária da enolase da linhagem SC5314 a

partir do sequenciamento do gene ENO1 neste trabalho. As letras à esquerda referem-se a

regiões de alfa-hélice (A), folha beta (B), giro (turn -T) e espiral (coil - C) de acordo com

diferentes métodos listados à direita. Regiões hidrofóbicas e flexíveis estão identificadas com

as respectivas letras (G e F). Todos os métodos foram implementados pelo programa Protean

(DNAstar, Madison, Wisconsin).

MSYATKIHAR YVYGSRGNPT VEVDFTTDKG LFRSIVPSGA STGVHEALEL RDGDKSKWLG

KGVLKAVANV NDVIAPALIK AKIDVVDQAK IDEFLLSLDG TPNKSKLGAN AILGVSLAAA

NAAAAAQGIP LYKHIANISN AKKGKFVLPV PFQNVLNGGS HAGGALAFQE FMIAPTGVST

FSEALRIGSE VYHNLKSLTK KKYGQSAGNV GDEGGVAPDI KTPKEALDLI MDAIDKAVYK

GKVGIAMDVA SSEFYKDGKY DLDFKNPESD PSKWLSGPQL ADLYEQLISE YPIVSIEDPF

AEDDWDAWVH FFERVGDKIQ IVGDDLTVTN PTRIKTAIEK KAANALLLKV NQIGTLTESI

QAANDSYAAG WGVMVSHRSG ETEDTFIADL SVGLRSGQIK TGAPARSERL AKLNQILRIE

EELGSEAIYA GKDFQKASQL

Figura 7. Seqüência protéica predita da enolase da linhagem SC5314 (deste trabalho)

mostrando em negrito as asparaginas preditas como N-glicosiladas (N-Xaa-S/T, NetNGlyc

Server), nas posições 18, 103, 137 e 330; em caixas cinza, as serinas e treoninas preditas

como O-glicosiladas em proteínas intracelulares (YinOYang Server), nas posições 2, 34, 179,

269, 329, 366, 407 e 438 e em vermelho/itálico, as serinas e treoninas preditas como

fosforiladas em proteínas de leveduras (NetPhosYeast Server), nas posições 2, 101, 160, 179,

222, 269, 359 e 379.

3.2.4. Expressão da enolase recombinante para produção de soro policlonal

Através das análises da seqüência predita da enolase, verificou-se que ela não

apresentava sinais de peptídeo sinal nem de secreção. Passamos a testar a hipótese

de que a enolase estava na matriz por conta da lise celular nas camadas mais

inferiores do biofilme. Para tal, o gene da enolase foi subclonado em vetor pET28-a(+),

inserido em bactéria competente (BL21) para a expressão da proteína recombinante

fundida a uma cauda de histidina. A enolase recombinante (His6-enolase) foi purificada

em coluna de níquel e injetada em coelhos para a obtenção de soro hiper-imune. A

Figura 8 mostra géis “SDS-PAGE” da indução (Figura 8A) e purificação (Figura 8B) da

His6-enolase.

Figura 8. Géis “SDS-PAGE” 10% da indução e purificação da enolase recombinante, corados

com azul de Coomassie. Em (A), indução da enolase recombinante (His6-enolase) em que M

refere-se ao marcador de peso molecular; Nl ao lisado da bactéria de expressão BL21 não-

induzida com IPTG; l ao lisado da bactéria induzida com IPTG por 2h a 37

C; Sol ao extrato

celular solúvel e Ins, ao extrato celular insolúvel. Em (B), purificação em coluna de níquel da

His6-enolase em que NL refere-se à fração não-ligada à coluna; TLi à última lavagem com

tampão de ligação; TLa à última lavagem com tampão de lavagem e os números de 1 a 4

referem-se às 4 extrações com tampão de eluição. A seta vermelha destaca as bandas da

His6-enolase.

3.2.5. Presença da enolase na matriz de biofilme e sua degradação

O soro hiper-imune foi posteriormente utilizado em ensaios de “western blot”

(Figura 9). Na Figura 9A a membrana foi incubada com anticorpo contra a cauda de

histidina, mostrando reconhecimento da proteína recombinante de Tripanosoma cruzi

(canaleta 2), bem como a His-6-Enolase (canaleta 1), confirmando sua purificação

correta. Na Figura 9B, a membrana foi incubada com soro pré-imune de coelho e sua

análise mostra que não houve reconhecimento de proteínas fúngicas, podendo esse

soro ser usado como controle negativo em experimentos de imunofluorescência e

citometria de fluxo. Na Figura 9C, a membrana foi incubada com soro hiper-imune de

coelho e mostra reconhecimento da enolase no biofilme concentrado da linhagem

SC5314 (canaleta 7, seta vermelha) e em extratos celulares de 3 linhagens de C.

albicans, respectivamente, SC5314 (canaleta 4); ATCC90029 (canaleta 5), L296

(canaleta 6). Ainda, foi observado reconhecimento da enolase homóloga em extrato

celular de Saccharomyces cerevisiae 288c (canaleta 3). Contudo, não foi verificado

reconhecimento da enolase em sobrenadante de cultura de 1 e 3 dias em meio pobre

(SD) (meio condicionado), assim como, no meio rico (YPD) de 1 dia. Houve fraco

reconhecimento em sobrenadante em YPD de 3 dias.

Por conta da observação contrária ao que esperávamos, de que existiria enolase

nos meios condicionados por causa da lise celular, especialmente em culturas de 3

dias, fomos verificar em quanto tempo a enolase nativa poderia ser degradada. Para

isso, a linhagem SC5314 foi crescida em meio SD até atingir a fase estacionária da

cultura e alíquotas do meio com e sem células presentes foram retiradas de tempos em

tempos para verificar se havia a presença da enolase nativa, ou sendo secretada ou

vinda da lise celular, e por quanto tempo ela não estaria sendo degradada. A Figura 10

mostra “western blots” da meia-vida da enolase nativa feitos a partir de membranas

incubadas com soro hiperimune de coelho contra His6-enolase. Foi observado que na

temperatura ambiente a enolase nativa degrada-se mais lentamente que a 37

especialmente no meio condicionado, ausente de células. No meio ainda com células

incubado à temperatura ambiente, foi observada a presença da enolase mesmo que

fracamente, seja por degradação mais lenta, seja por contínua secreção da proteína

pelas células. Já a 37

C não foi observada enolase em ambos os sobrenadantes após

meia hora de incubação.

Figura 9. “Western blots” confirmando a presença da enolase em biofilme e lisados celulares

de C. albicans. As amostras referem-se respectivamente a: Nl, lisado da bactéria de expressão

BL21 não-induzida com IPTG; l ao lisado da bactéria induzida com IPTG por 2h, à 37

C; 1,

His6-Enolase; 2, proteína recombinante de Tripanosoma cruzi com cauda de histidina; extratos

celulares de 10

células de Saccharomyces cerevisiae 288c (3); C. albicans SC5314 (4);

ATCC90029 (5), L296 (6); 7, matriz concentrada de biofilme induzido da SC5314; Meios com

crescimento celular da linhagem SC5314 ou condicionados: em 8, meio SD com crescimento

celular por 1 dia; em 9, meio SD com crescimento por 3 dias; 10, YPD com crescimento celular

por 1 dia e em 11, YPD com crescimento celular por 3 dias. Conforme indicado, no painel A, a

membrana foi incubada com anticorpo contra a cauda de histidina; em B, com soro pré-imune

do coelho 1 e em C, com soro hiper-imune do coelho 1, gerado contra a enolase recombinante.

A seta vermelha indica o reconhecimento da enolase na matriz de biofilme de C. albicans.

Figura 10. “Western blots” da meia-vida da enolase nativa de C. albicans SC5314 secretada ou

proveniente de lise celular. Os números a cima referem-se aos tempos de retirada de alíquotas

de meio em horas, a partir do tempo “zero” (cultura estacionária em meio SD com 20h de

crescimento a 37

C). Foram retiradas alíquotas de meio condicionado e meio ainda contendo

células a partir de culturas mantidas à temperatura ambiente (22

C) (A) e 37

C (B), sem

agitação.

Sabendo que a enolase se degrada rapidamente no meio de cultura, ainda nos

faltava confirmar se outras proteínas e, eventualmente a própria enolase, não estariam

presentes por conta da lise celular na matriz do biofilme. Para responder esse ponto, foi

feito um “western blot” (Figura 11) em que a membrana foi incubada com soro

policlonal contra Sui2p (eIF2_ – eukaryotic Innitiation factor 2 – subunit alpha) de S.

cerevisiae por conta de não haver disponível no momento do experimento, anticorpo ou

soro contra proteínas intracelulares de C. albicans. A proteína de S. cerevisiae possui

alta similaridade (84%) e identidade (70%) (E value da busca= 4.4e-111) com sua

homóloga de C. albicans, a CaSui2p (orf19.6213). Houve o reconhecimento da Sui2p

em extratos celulares de S. cerevisiae e de C. albicans, mais fracamente, mas não

houve reconhecimento na matriz de biofilme e tão pouco nos meios condicionados,

sugerindo que de alguma forma a enolase está na matriz por conta de outros

mecanismos que não a lise celular.

Figura 11. “Western blot” da proteína intracelular Sui2p em extratos celulares de S. cerevisiae

(34 kDa) e C. albicans (28 kDa). Os números representam as amostras, respectivamente:

extratos celulares de 10

células de S. cerevisiae 288c (1); C. albicans SC5314 (2);

ATCC90029 (3), L296 (4); 5, matriz concentrada de biofilme induzido da SC5314; Meios com

crescimento celular da linhagem SC5314 ou condicionados: em 6, meio SD com crescimento

celular por 1 dia; em 7, meio SD com crescimento por 3 dias; 8, YPD com crescimento celular

por 1 dia e em 9, YPD com crescimento celular por 3 dias.

3.2.6. Presença da enolase na superfície de C. albicans

Alguns autores já haviam reportado a presença da enolase na superfície de

leveduras de C. albicans (Angiolella et al., 1996 e Angiolella et al., 2002). Para verificar

se o soro policlonal contra a His6-enolase reconheceria a enolase nativa na superfície

das células, foram feitos experimentos de citometria de fluxo (Figura 12). A Figura 12

mostra experimentos realizados com leveduras não permeabilizadas com saponina 1%,

havendo marcação somente da enolase na superfície de 14% das células (retângulo

vermelho, descontando-se a medida do controle pré-imune). Nas células

permeabilizadas, a enolase interna e da superfície foram marcadas em

aproximadamente 40% das células (retângulo verde, descontando-se a medida do

controle pré-imune).

Figura 12. Citometria de fluxo para marcação da enolase na superfície de leveduras. 10

células de C. albicans SC5314 foram incubadas com soros de coelho pré-imune ou hiper-imune

(contra his6-enolase) e fixadas com formaldeído 3,5% (Não-Permeabilizadas). Outro grupo de

células foi primeiramente fixado e depois incubado com os respectivos soros na presença de

saponina 1% (Permeabilizadas). Após incubação, foi utilizado anti-IgG de coelho conjugado a

FITC para revelar marcação. Foram analisadas 10

células por experimento. Na média, 10%

delas exibiram autofluorescência, sendo esse valor descontado das medidas experimentais

destacadas nos retângulos em vermelho (células não-permeabilizadas) e verde (células

permeabilizadas).

Para verificar se as células no biofilme também possuíam enolase em sua

superfície, foram feitas imunofluorescências de leveduras e hifas (Figura 13) em

comparação com biofilmes (Figura 14) de C. albicans SC5314 utilizando o soro hiper-

imune gerado neste trabalho. A Figura 13A mostra que não houve reconhecimento

intracelular ou da superfície de C. albicans permeabilizadas com saponina 1%,

utilizando o soro pré-imune de coelho. A (Figura 13B) mostra a enolase recobrindo a

superfície celular das leveduras que não foram permeabilizadas. Foi observada

marcação difusa e pontuada e algumas células não apresentaram marcação. A Figura

13C mostra a enolase marcada e filamentos permeabilizados e leveduras brotantes

periféricas, sendo portanto, uma marcação mais forte do que nos painéis da Figura

13C. A Figura 14 mostra a enolase marcada em células formadoras de biofilme, tanto

na camada basal, rica em formas leveduriformes aderidas à lâmina, como na porção

superior do biofilme, rica em hifas e brotos celulares. Em células de biofilme não

permeabilizadas, a co-localização da enolase com o calcoflúor (Figura 14B), que é um

corante muito usado em fungos por corar quitina na parede celular, ocorre em poucas

células. Na verdade, foi observado que nem todas as células apresentam enolase em

sua superfície devido à falta de marcação e em algumas delas é o oposto, apresentam

marcação da enolase mas não do calcoflúor (seta verde). Mesmo em células

permeabilizadas com saponina esse fenômeno já havia sido observado. Os dados

sugerem que a enolase está presente na superfície de Candida em camadas muito

mais próximas da membrana plasmática do que nas camadas externas da parede

celular, visto que células jovens e brotos, que ainda não possuem suas paredes

ricamente recobertas de mananas, permitem marcação muito mais intensa da proteína.

Nesse ponto do trabalho, fomos verificar se a enolase não poderia

eventualmente ser liberada por lise celular e recapturada pela parede de algumas

células. Para testar essa hipótese, culturas de C. albicans foram incubadas com 4

concentrações da His6-enolase e posteriormente, com anticorpo anti-His6-Tag para se

prosseguir com o protocolo para leitura em citômetro de fluxo. A Figura 15 mostra que

não houve reconhecimento da enolase recombinante na superfície das Candidas nas

concentrações mínima e máxima testadas, 1,25 e 10!g de His6-enolase para cada

2x10

células, exemplificando o que ocorreu em todas as concentrações (1,25; 2,5; 5 e

10!g), diferentemente das beads recobertas com His6-enolase.

Figura 13. Localização da enolase em leveduras e hifas de C. albicans. SC5314. Em A,

imunofluorescência utilizando o soro pré-imune de coelho em leveduras permeabilizadas com

saponina 1%. Em B, imunofluorescência utilizando o soro de coelho hiper-imune (contra his6-

enolase) e anti-IgG de coelho conjugado a Cy3 em leveduras não permeabilizadas. Em C,

filamentos permeabilizados com saponina 1%. Imagens obtidas por microscopia de

fluorescência e contraste de fase. As barras indicam 10!m.

Figura 14. Localização da enolase em células de biofilmes de C. albicans. SC5314. Em A,

imunofluorescências sobrepostas com microscopia de contraste de fase, tanto da porção

inferior, quanto da superior, em células permeabilizadas com saponina 1%. Em B ,

imunofluorescência utilizando o soro de coelho hiper-imune (contra his6-enolase) e anti-IgG de

coelho conjugado a Cy3 em biofilmes não permeabilizados e corados com calcoflúor (corante

de manas da parede do fungo). As setas verdes mostram marcação da enolase em brotos

jovens, sem co-localização com o calcoflúor. As imagens foram obtidas a partir de secções em

microscópio confocal. As barras indicam 10!m.

Figura 15. Citometria de fluxo da recaptação da enolase. Em A, controle da recaptação em que

“beads” recobertas com His6-enolase foram incubadas com anticorpo anti-His6-Tag (linha azul)

em comparação com leveduras (SC5314) incubadas com o tampão de eluição da His6-enolase

(linha preta); em B, leveduras incubadas com 1,25!g de His6-enolase e posteriormente, com

incubadas com anticorpo anti-His6-Tag e em C, leveduras incubadas com 10! g de His6-

enolase e posteriormente, com incubadas com anticorpo anti-His6-Tag.

Considerando a primeira questão levantada no início do trabalho: poderia a

enolase ser ativamente secretada pelo fungo ou estaria presente na matriz e na

superfície das células devido à morte e lise celular, a análise dos resultados reforça a

idéia de que a proteína não é recaptada pela parede das células mas sim, é secretada

para a superfície de forma programada pelo fungo. Mesmo que a seqüência protéica

predita não contenha peptídeo sinal, a enolase parece seguir o mesmo caminho de

secreção ainda não caracterizado, para ser encontrada na matriz do biofilme, visto que

não houve resultados que suportem a hipótese de lise celular.

3.2.7. Teste da atividade da enolase

No início do trabalho também foi levantada a hipótese de que a enolase poderia

estar ativa, hidratando ou hidrolisando componentes na matriz. Para testá-la, tivemos a

idéia de extrair a matriz de biofilme como previamente descrito (item 3.1.3.2) e incubar

com os dois substratos em que atua a enzima na via glicolítica, tanto na hidrólise do 2-

fosfoglicerato, vendido comercialmente na forma de ácido fosfoglicérico (D(+)2-

Phosphoglyceric acid sodium salt hydrate, C

P H

O), quanto na hidratação do

fosfoenolpiruvato (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate, C

NaO

O). Contudo, tentamos por mais de dois anos conseguir o primeiro composto que

teve sua importação descontinuada no Brasil no início de 2005, impedindo que

pudéssemos dar prosseguimento a estes experimentos interessantíssimos, deixando a

pergunta ainda em aberto para ser respondida numa eventual colaboração com

laboratórios no exterior. Consideramos a opção de sintetizar os compostos, porém o

trabalho passou a ser focado em outras perguntas tão interessantes quanto a da

atividade da enolase que optamos por não concluir essa parte em prol das seguintes.

3.2.8. Expressão da enolase em células de biofilme

Ainda resta uma pergunta para ser respondida: havendo apenas um gene

codificando a enolase (ENO1) em C. albicans, sua expressão estaria alterada nas

células de biofilme? Para responder esta pergunta foram amplificados por RT-PCR não

só o gene que codifica a enolase, mas outros genes da via glicolítica (FBA1, PYK1,

HXK1 e HXK2, respectivamente codificadores das enzimas aldolase, hexoquinases e

fosfopiruvato quinase), para verificar se haveria diferença na expressão em outros

pontos da via ou somente na enolase. Também foi estudada a expressão de genes

previamente relacionados com a regulação de biofilme e transição levedura-hifa como

BCR1 e TEC1 (fatores de transcrição) e genes codificadores de proteínas de superfície

ligados à adesão celular (ALS3 e HWP1). Esses 9 genes foram amplificados das 14

linhagens de C. albicans testadas inicialmente quanto à produção de biofilme,

crescidas em 5 condições diferentes para efeito comparativo: biofilme, leveduras

crescidas em meio rico (YPD), em meio pobre (SD), indução de hifas (SFB) e

microaerofilia. Foi utilizado na RT-PCR o kit Multiplex (Quiagen) que permitiu a

amplificação simultânea de até 6 bandas nos experimentos. A Figura 16 mostra um gel

da amplificação de fragmentos de 6 dos genes (ENO1-enolase, TEC1-fator de

transcrição, HWP1-hyphal wall protein, ALS3-“agglutinin-like sequence”, FBA1-fructose-

bisphosphate aldolase e ACT1-actina) a partir de cDNAs das linhagens crescidas

formando biofilmes. Pela comparação visual das intensidades das bandas amplificadas,

foram observadas diferenças na expressão dos genes TEC1 e HWP1 entre as

linhagens, como por exemplo, entre a ATCC90029, ATCC24433 e a L757.

Figura 16. Gel de agarose 2% da RT-PCR de cDNAs de biofilme. Na ordem, as amostras são:

M, marcador; 1-ATCC90029; 2-ATCC24433; 3-SC5314; 4-34ptc; 5-L301A; 6-L298; 7-L297A; 8-

L296; 9-L291 e 10-L757. Os fragmentos dos genes, listados à direita (ENO1-enolase, TEC1-

fator de transcrição, H W P1 -hyphal wall protein, ALS3-“agglutinin-like sequence”, FBA1-

fructose-bisphosphate aldolase e ACT1-actina), foram amplificados a partir da diluição 1:10 de

cDNA (4ng). As bandas dos fragmentos dos genes amplificados das 14 linhagens de C.

albicans, crescidas nas 5 condições de crescimento, foram quantificadas pelo programa

Molecular Imaging Software (Kodak).

Foram feitas quantificações das amplificações por RT-PCR para cada diluição de

cDNA (1, 1:10 e 1:20 – 40ng, 4ng e 2ng) a fim de minimizar o efeito da saturação da

PCR nas intensidades das bandas. A média das 3 quantificações foi corrigida pela

média da expressão da actina, considerado gene de expressão constante. Assim,

chegou-se no valor médio da expressão de cada gene, em cada uma das 14 linhagens

crescidas nas 5 condições já descritas. A Figura 17 mostra gráficos da expressão de

cada gene nas condições de crescimento de biofilme, microaerofilia, levedura em meio

rico (YPD), levedura em meio pobre (SD) e indução de hifas de cada uma das 14

linhagens de C. albicans (norma de reação do gene). Não foi observada diferença na

expressão média do gene da enolase entre as linhagens de C. albicans, em nenhuma

das 5 condições de crescimento. Isso sugere que não existe correlação entre a

expressão da enolase e a formação de biofilme por linhagens altamente produtoras e

pouco produtoras de biofilme. Também não foi observada variação da expressão nas

diferentes condições de crescimento quando comparados os outros genes que compõe

a via glicolítica (Tabela 4, vide desvio padrão). Houve apenas diferenças menores entre

linhagens, como L666 (linha amarela) e L667 (linha roxa clara) para os genes HXK1 e

HXK2, por exemplo.

Quando analisada a via de indução de biofilme em que BCR1 (Biofilm and Cell

wall Regulator) regula a expressão de adesinas da superfície do fungo (HWP1 e ALS3)

e tem como seu próprio regulador, TEC1, foi observado que o sinal da diminuição da

expressão deste último era amplificado ao percorrer a via, ou seja, a variação na

expressão média dos genes regulados abaixo de TEC1 aumentava pelo menos duas

vezes na maioria das linhagens, independente da condição de crescimento. Como

exemplo, a linhagem L298 (linha laranja) teve como valor médio da expressão de

TEC1, BCR1, H W P 1 e ALS3 respectivamente: -1, -2, -4 e -8. Ao olhar mais

proximamente para a linhagem L291 na condição de levedura crescida em meio rico

(YPD) (linha verde), observou-se que a expressão de TEC1 era próxima de -4,

enquanto que a BCR1 era -6 e H W P 1 caía para -16, tendendo a ausência de

expressão. Esses dados sugerem que a regulação nessa via ocorre por “feed-forward”

em vez de “feed-back” como geralmente descrito (Lee et al., 2002). A expressão dos

genes das adesinas não pôde ser correlacionada com as linhagens altamente

produtoras, médio e pouco produtoras de biofilme. Linhagens altamente produtoras

como a L296 apresentava expressão de ALS3 menor (-8) que uma linhagem pouco

produtora, como a L297A (-2). Contudo, verificou-se que as células formadoras de

biofilme expressavam pelo menos 2x mais ALS3 do que as células planctônicas,

crescidas em meio rico (YPD).

Figura 17. Gráficos da norma de reação de 9 genes relacionados à regulação e formação de

biofilme e à Via glicolítica. Os genes tiveram sua expressão medida por RT-PCR em 14

linhagens de C. albicans (linhas coloridas) crescidas em 5 condições laboratoriais (eixo “x” dos

gráficos): microaerofilia, biofilme, indução de hifas, levedura em meio rico (YPD) e levedura em

meio pobre (SD). A expressão (eixo “y” dos gráficos) foi corrigida para escala Log

, em que “0”

(zero) representa ausência de expressão e os valores negativos ou positivos foram

determinados pela divisão da expressão média de cada gene pelo valor médio da expressão da

actina. Assim sendo, -2 representa duas vezes menos moléculas de RNA de dado gene em

relação ao da actina naquela linhagem e condição de crescimento.

Tabela 4: Valores da expressão dos genes nas 5 condições de crescimento das 14

linhagens de C. albicans.

MICRO

BIOFILME

HIFA

LEV-YPD

LEV-SD

Média

Desv Pad

HXK1

ATCC90029

-1,683

-1,952

-1,840

-1,140

-2,481

-1,819

0,484

ATCC24433

-1,442

-1,575

-2,452

-1,232

-1,707

-1,682

0,465

SC5314

-1,192

-1,568

-1,776

-5,325

-2,005

-2,373

1,677

34ptc

-1,950

-2,167

-2,243

-1,385

-1,829

-1,915

0,339

L301A

-1,711

-1,557

-1,789

-0,931

-1,712

-1,540

0,351

L298

-2,304

-1,672

-2,193

-1,973

-1,696

-1,968

0,285

L297A

-1,670

-1,836

-1,980

-1,555

-1,800

-1,768

0,162

L296

-1,583

-1,765

-1,871

-1,253

-1,694

-1,633

0,237

L291

-1,898

-1,768

-2,028

-1,131

-1,967

-1,758

0,364

L757

-1,681

-1,858

-2,447

-1,824

-2,151

-1,992

0,306

L663

-2,144

-2,941

-2,371

-3,134

-4,093

-2,937

0,762

L666

-5,015

-5,377

-3,175

-3,277

-3,640

-4,097

1,026

L667

-2,876

-4,537

-3,321

-2,937

-4,864

-3,707

0,930

L669

-2,953

-4,164

-2,184

-2,948

-2,779

-3,006

0,720

HXK2

ATCC90029

-2,941

-3,446

-2,802

-5,517

-3,798

-3,701

1,090

ATCC24433

-3,887

-2,987

-2,623

-1,930

-4,035

-3,092

0,881

SC5314

-3,968

-2,343

-2,384

-4,358

-4,475

-3,506

1,060

34ptc

-3,710

-3,393

-2,761

-3,127

-4,071

-3,412

0,507

L301A

-3,290

-4,518

-2,619

-2,070

-4,319

-3,363

1,058

L298

-4,486

-3,337

-3,973

-5,809

-4,120

-4,345

0,917

L297A

-2,734

-3,911

-2,555

-2,295

-4,970

-3,293

1,123

L296

-2,742

-3,123

-2,078

-1,755

-4,177

-2,775

0,951

L291

-3,607

-3,558

-2,263

-2,122

-4,950

-3,300

1,156

L757

-3,368

-2,213

-2,466

-2,384

-4,038

-2,894

0,781

L663

-4,976

-4,059

-2,656

-6,265

-5,084

-4,608

1,343

L666

-6,000

-5,704

-5,782

-5,873

-4,357

-5,543

0,672

L667

-5,549

-5,755

0,000

-5,716

-4,685

-4,341

2,465

L669

-6,342

-4,976

-2,310

-5,423

-4,493

-4,709

1,504

FBA1

ATCC90029

-0,190

-0,483

-0,398

1,161

-0,539

-0,090

0,712

ATCC24433

-0,105

-0,223

-0,307

-0,121

-0,471

-0,245

0,150

SC5314

0,341

-0,338

-0,322

-0,724

-0,619

-0,332

0,415

34ptc

-0,443

-0,512

-0,391

-0,108

-0,474

-0,385

0,161

L301A

-0,287

-0,203

-0,364

0,096

-0,373

-0,226

0,193

L298

-0,476

-0,213

-0,413

-0,311

-0,376

-0,358

0,100

L297A

-0,254

-0,287

-0,398

-0,145

-0,511

-0,319

0,140

L296

-0,156

-0,334

-0,415

-0,003

-0,470

-0,276

0,193

L291

-0,455

-0,204

-0,432

0,091

-0,689

-0,338

0,295

L757

-0,419

-0,470

-0,620

-0,390

-0,632

-0,506

0,113

L663

-0,400

-0,201

-0,253

-0,315

-0,271

-0,288

0,075

L666

-0,222

-0,422

-0,256

-0,252

-0,343

-0,299

0,082

L667

0,032

-0,214

-0,002

0,090

-0,076

-0,034

0,117

L669

-0,320

-0,516

0,004

-0,192

-0,159

-0,237

0,194

ENO1

ATCC90029

-1,307

-1,422

-0,818

-1,248

-1,447

-1,248

0,254

ATCC24433

-1,017

-1,103

-1,223

-0,956

-1,357

-1,131

0,161

SC5314

-1,093

-0,933

-1,017

-1,743

-1,174

-1,192

0,321

34ptc

-1,217

-1,475

-1,114

-0,888

-1,331

-1,205

0,222

L301A

-1,030

-1,135

-1,012

-0,677

-1,093

-0,989

0,181

L298

-1,195

-1,170

-1,009

-1,056

-1,162

-1,118

0,081

L297A

-1,168

-1,181

-1,038

-1,098

-1,099

-1,117

0,058

L296

-0,979

-1,304

-0,948

-0,846

-1,042

-1,024

0,172

L291

-1,159

-1,236

-1,139

-0,752

-1,128

-1,083

0,190

L757

-1,289

-1,219

-1,330

-1,550

-1,312

-1,340

0,125

L663

-1,553

-1,648

-1,283

-1,583

-1,592

-1,532

0,143

L666

-1,536

-2,575

-1,316

-1,341

-1,728

-1,699

0,517

L667

-1,206

-2,199

-1,170

-1,121

-1,565

-1,452

0,453

L669

-1,411

-2,659

-1,242

-1,444

-1,625

-1,676

0,566

PYK1

ATCC90029

-1,741

-2,101

-1,965

-1,058

-1,793

-1,732

0,403

ATCC24433

-1,446

-1,580

-2,072

-1,410

-1,513

-1,604

0,269

SC5314

-1,174

-1,618

-1,515

-3,479

-1,615

-1,880

0,912

34ptc

-1,508

-1,649

-1,797

-1,028

-1,456

-1,488

0,289

L301A

-1,694

-1,594

-1,709

-1,275

-1,538

-1,562

0,175

L298

-2,084

-1,651

-1,890

-1,839

-1,468

-1,786

0,235

L297A

-1,451

-1,645

-1,720

-1,391

-1,580

-1,558

0,136

L296

-1,709

-1,628

-1,837

-1,361

-1,621

-1,631

0,174

L291

-1,837

-1,501

-1,887

-1,145

-1,788

-1,632

0,311

L757

-1,670

-2,007

-2,462

-1,596

-2,115

-1,970

0,351

L663

-1,429

-1,860

-1,907

-1,854

-1,620

-1,734

0,204

L666

-1,474

-2,265

-1,682

-1,659

-1,511

-1,718

0,318

L667

-1,305

-1,798

-1,651

-1,284

-1,301

-1,468

0,240

L669

-1,396

-1,650

-1,185

-1,358

-1,223

-1,362

0,184

TEC1

ATCC90029

-0,572

-0,673

-0,765

-0,465

-0,229

-0,541

0,207

ATCC24433

-0,634

-0,531

-0,647

-0,988

-0,284

-0,617

0,253

SC5314

-0,369

-0,726

-1,027

-0,332

-0,369

-0,565

0,304

34ptc

-0,695

-0,493

-0,612

-1,435

-0,514

-0,750

0,391

L301A

-0,741

-0,627

-1,158

-0,974

-0,337

-0,767

0,317

L298

-0,834

-0,702

-1,419

-1,598

-0,368

-0,984

0,512

L297A

-0,647

-0,490

-0,817

-1,881

-0,395

-0,846

0,600

L296

-1,449

-0,922

-0,686

-2,110

-0,574

-1,148

0,635

L291

-1,172

-0,731

-0,763

-2,753

-0,366

-1,157

0,937

L757

-0,645

-0,682

-0,815

-0,998

-0,537

-0,736

0,177

L663

-0,526

-0,413

-0,368

-0,881

-0,352

-0,508

0,219

L666

-0,386

-0,051

-0,246

-0,322

-0,299

-0,261

0,127

L667

0,000

0,040

-0,328

-0,123

0,285

-0,025

0,225

L669

-0,502

0,177

-0,795

-0,150

0,074

-0,239

0,405

BCR1

ATCC90029

-1,800

-2,289

-2,778

-1,893

-1,789

-2,110

0,426

ATCC24433

-3,035

-3,973

-3,387

-3,040

-3,695

-3,426

0,411

SC5314

-2,888

-3,624

-7,306

-1,769

-2,655

-3,648

2,149

34ptc

-2,716

-2,145

-2,887

-5,121

-2,064

-2,987

1,245

L301A

-2,878

-3,969

-3,169

-4,881

-3,364

-3,652

0,795

L298

-2,540

-2,352

-2,410

-4,010

-1,729

-2,608

0,844

L297A

-2,585

-3,878

-3,643

-5,781

-2,623

-3,702

1,301

L296

-3,497

-4,177

-2,522

-6,079

-3,585

-3,972

1,319

L291

-3,662

-3,705

-3,383

-6,786

-3,076

-4,122

1,510

L757

-1,623

-2,245

-2,354

-2,802

-1,849

-2,175

0,458

L663

-2,450

-2,279

-3,711

-2,511

-2,142

-2,619

0,628

L666

-2,065

-2,609

-2,457

-2,200

-1,808

-2,228

0,317

L667

-3,967

-2,902

-4,643

-2,276

-1,730

-3,104

1,197

L669

-2,326

-1,702

-4,348

-1,936

-1,868

-2,436

1,093

HWP1

ATCC90029

-7,123

-3,934

-3,594

-15,386

-8,646

-7,737

4,778

ATCC24433

-2,812

-1,526

-2,350

-1,427

-1,585

-1,940

0,610

SC5314

-4,151

-1,181

-1,453

-1,651

-1,485

-1,984

1,223

34ptc

-3,659

-1,469

-2,693

-1,900

-2,502

-2,445

0,835

L301A

-2,724

-1,869

-1,849

0,000

-1,792

-1,647

0,998

100

L298

-5,147

-2,456

-3,486

-1,465

-4,426

-3,396

1,479

L297A

-3,100

-2,291

-2,757

-2,403

-3,363

-2,783

0,454

L296

-3,938

-2,692

-3,057

-2,323

-1,406

-2,683

0,932

L291

-3,521

-2,171

-1,741

-2,843

-1,327

-2,321

0,874

L757

-1,992

-1,756

-1,430

-1,474

-1,903

-1,711

0,251

L663

0,000

-12,747

-8,381

0,000

-4,226

5,989

L666

0,000

-3,657

0,000

-0,731

1,635

L667

0,000

-7,921

-4,383

0,000

-2,461

3,594

L669

0,000

-6,423

-3,573

0,000

-5,489

-3,097

3,008

ALS3

ATCC90029

-4,693

-2,917

-3,894

-3,151

-3,857

-3,702

0,701

ATCC24433

-10,462

-5,867

-8,168

-8,734

-6,924

-8,031

1,756

SC5314

-5,765

-1,888

-2,429

-3,908

-2,185

-3,235

1,614

34ptc

-10,970

-5,984

-10,777

-9,291

-7,975

-8,999

2,078

L301A

-9,687

-6,844

-9,663

-11,552

-8,132

-9,176

1,780

L298

-10,609

-7,094

-12,772

-10,367

-7,277

-9,624

2,416

L297A

-3,049

-2,553

-4,590

-7,131

-2,965

-4,057

1,884

L296

-10,213

-8,738

-3,984

-4,465

-7,865

-7,053

2,720

L291

-11,078

-7,727

-9,811

-15,745

-6,986

-10,269

3,467

L757

-3,843

-3,038

-4,768

-3,956

-3,452

-3,811

0,645

L663

-8,047

-7,804

-7,938

-9,157

-7,884

-8,166

0,561

L666

-15,082

-11,882

-9,461

-10,538

-10,307

-11,454

2,206

L667

-15,433

-11,952

-6,266

-10,564

-4,335

-9,710

4,451

L669

-13,571

-8,510

-10,607

-9,001

-7,767

-9,891

2,306

média aritmética dos valores médios da expressão de cada gene, nas 5 condições de crescimento

desvio-padrão dos valores médios da expressão de cada gene, nas 5 condições de crescimento

OBS.: os valores da expressão dos genes são em sua maioria negativos por terem sido divididos pelo

valor médio da expressão do gene da actina (considerado um gene de expressão constante em

diferentes linhagens, em qualquer condição de crescimento) e corrigidos para Log

. “0.000” significa que

não houve detecção de banda em gel de agarose, portanto, não houve expressão do gene naquela

condição

Enquanto eram processadas as RT-PCR´s Multiplex, notou-se que uma das

linhagens, a L757 não apresentava amplificação do fragmento correspondente ao gene

HWP1 em nenhuma condição de crescimento. Contudo, ao amplificar-se somente esse

fragmento, fizemos a descoberta de um novo alelo ainda não descrito (Figura 18) e que

na verdade, a banda correspondendo ao alelo menor sobrepunha-se a banda do

fragmento do gene ALS3. Por isso, novos oligonucleotídeos foram pedidos (tabela 2), e

novas RT-PCR´s Multiplex foram feitas. Curiosamente, foi possível amplificar

fragmentos de ambos alelos do gene ALS3 e HWP1 das 14 linhagens, dependendo da

condição de crescimento (Figura 19). As quantificações foram feitas considerando-se a

soma da expressão dos alelos. A descrição da descoberta e estudo do novo alelo do

gene HWP1 originou manuscrito submetido para publicação que se segue no Capítulo

101

Figura 18. Gel de agarose 1% da PCR de HWP1 a partir de DNA genômico. Na ordem, as

amostras são: M, marcador; 1-L296; 2-L757 e 3-SC5314. A PCR amplificou fragmento menor

que o tamanho esperado em diferentes linhagens, identificando um novo alelo deste gene.

Figura 19. Gel de agarose 2% da RT-PCR dos alelos de ALS3 e HWP1, a partir de linhagens

crescidas em biofilmes (1 a 4) e induzidas hifas (5 a 8). Na ordem, as amostras são: M,

marcador; 1 e 5-L663; 2 e 6-L666, 3 e 7-L667 e 4 e 8-L669. A diluição dos cDNAs utilizados

para amplificação e visualização neste experimento foi 1:10 (4ng).

102

CAPÍTULO 4: Manuscrito submetido para publicação

entitulado: A novel allele of HWP1, isolated from a clinical strain of

Candida albicans with defective hyphal growth and biofilm formation,

has deletions of Gln/Pro and Ser/Thr repeats involved in cellular

adhesion

103

A novel allele of H W P 1, isolated from a clinical strain of Candida

albicans with defective hyphal growth and biofilm formation, has

deletions of Gln/Pro and Ser/Thr repeats involved in cellular adhesion

Ana Carolina B. Padovan

, Guilherme M. Chaves

, Arnaldo L. Colombo

and

Marcelo R. S. Briones

Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, and

Departamento de

Doenças Infecciosas e Parasitárias, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo,

S.P., Brazil.

Running title: A novel HWP1 allele of C. albicans.

*To whom correspondence should be addressed:

Marcelo R. S. Briones

Ed. Ciências Biomédicas, Universidade Federal de São Paulo, Rua Botucatu, 862, 3º

andar. CEP 04023-062, São Paulo, S.P., Brazil

e-mail: [email protected]

Tel: (55)(11) 5576-4537, FAX: (55)(11) 5572-4711

104

Abstract

Gene HWP1 encodes a major Candida albicans hyphae cell wall protein

important for hyphae formation and virulence in systemic candidiasis. Hwp1p is a

substrate of mammalian transglutaminases which promotes the cross-link of C.

albicans to epithelial cells. HWP1 is homozygous in all strains characterized so far,

including the genome project strain SC5314. Here, we describe a novel HWP1 allele,

isolated from C. albicans blood isolates. Analysis of the translated sequence shows that

three important regions are absent in the novel allele, HWP1-2, relative to the

previously described allele, HWP1-1. Regions 1 and 2 are located in the N-terminus of

the protein, consist of 10 amino acid repeats important for functional conformation of

peptide chains and attachment of C. albicans cells to the mammalian epithelia. Region

3 is in the C-terminus, consists of 34 amino acid residues rich in threonine and serine,

with O-glycosylation sites that promote the cross-linking with other proteins on C.

albicans surface. The HWP1-2 homozygous strain L757 and the heterozygous strain

L296 (HWP1-1/HWP1-2) have significantly lower levels of HWP1 expression during

hyphal growth and biofilm formation compared to strain SC5314 (HWP1-1/HWP1-1).

However, strain L296 properly forms hyphae and biofilms in vitro while strain L757 has

reduced hyphal growth (40.4%) and impaired biofilm formation (90.8%). Our results

indicate that the HWP1 locus has biofilm specific allelic differential expression and

suggest that the HWP1-2 encoded protein is less efficient to maintain cell-to-cell and

cell-to-surface adhesion during biofilm formation. This is the first report of a natural

variant of HWP1.

Keywords: Novel Allele, HWP1, Candida albicans, Adhesion, Biofilm and Hyphae

105

Introduction

Candida albicans is a widespread human commensal fungus that colonizes the

gastrointestinal tract (Odds, 1988; Calderone, 2002a). Also, it is an opportunistic

pathogen that causes superficial mucosal diseases as well as life threatening systemic

infections (Odds, 1988; Calderone, 2002a). C. albicans grows in three different

morphologies, i.e. budding yeasts or blastoconidia, pseudohyphae and hyphae

(Calderone, 2002b). The hyphal growth is essential for pathogenicity and disease

dissemination. In many cultures and in sections of infected tissue, it is usual to see a

mixture of morphologies (Odds, 1988). However, mutant strains that lack filamentous

forms can not evade phagocytosis and are avirulent in a mouse model of systemic

infection (Lo et al., 1997).

Transition from blastoconidia to hyphae depends on several environmental

conditions and activation of specific signaling pathways including the transcription

factors Tup1p, Efg1p and Cph1p which regulate the expression of cell surface proteins

(Sharkey et al., 1999; Braun and Johnson, 2000; Liu, 2001). The ALS (Agglutinin-Like

Sequence) gene family is thought to be involved in adhesion and determines enormous

variations within different strains of the same species of Candida. Currently, eight ALS

genes have been found (Hoyer, 2001; Zhao et al., 2004). Als3p is a cell-surface

glycoprotein involved in endothelial cell invasion and a member of the gene family of C.

albicans,

associated with diverse adhesive and invasive functions (Hoyer et al., 1998;

Sheppard et al., 2004). Hwp1p (Hyphal Wall Protein 1) is a hyphae specific cell wall

protein required for proper hyphal growth and virulence in systemic candidiasis and is

encoded by a single copy gene (Staab et al., 1999; Tsuchimori et al., 2000). Hwp1p is a

substrate for mammalian transglutaminases, which promotes the cross-link of C.

albicans to epithelial cells (Staab et al., 1999). Laboratory generated null mutants of

HWP1 poorly forms biofilms in vitro and their cells maintained the yeast morphology in

catheter model assays, both in vitro and in vivo. These artificial mutants were obtained

by sequential mutagenesis of SC5314 derived strains, such as CAI4 and BWP17

(Tsuchimori et al., 2000; Nobile et al., 2006a; Nobile et al., 2006b).

C. albicans biofilm formation is another very important virulence factor particularly

in infections due to the use of invasive medical devices such as catheters and prosthetic

heart valves (Calderone and Gow, 2002; Douglas, 2003). These biofilms seem to

contribute to multiple drug resistance to amphotericin B, fluconazole and caspofungin

(Baillie and Douglas, 1998; Soustre et al., 2004). The extent of resistance varies

106

according to the Candida species and the type of material on which the biofilm is formed

(Mateus et al., 2004). In catheter grown biofilms, all morphologies of C. albicans are

found. In a bilayer structure, blastoconidia and hyphae are enclosed by an extracellular

matrix favored by proteins responsible for host attachment which are also required for

cell-to-cell and cell-to-plastic adhesion (Staab and Sundstrom, 1998; Sheppard et al.,

2004; Nobile et al., 2006b). Clinical strains of C. albicans vary significantly in their ability

to form biofilms which explains, in part, their differential pathogenicity and drug

resistance (Jin et al., 2003; Li et al., 2003; Soustre et al., 2004).

Heterozygosity is observed among natural isolates and strains, although the

sexual reproduction mechanisms of Candida species remain unclear (Cowen et al.,

2002). It is likely that in nature mating may occur among different strains resulting in

much more genetic diversity than usually observed in laboratory strains (Lockhart et al.,

2003; Samaranayake et al., 2003). A clinical isolate of C. albicans, SC5314, a parental

of several strains widely used in molecular genetics, had its genome completely

sequenced and the diploid assembly finished (Jones et al., 2004). Almost 50% of

SC5314 ORFs are heterozygous and most sequences differences between alleles are

nonsynonymous.

Here we compared the expression of HWP1 during hyphal growth and in biofilm

cells and in C. albicans blood isolates and strain SC5314. We discovered a novel

natural allele of HWP1, named HWP1-2, which lacks two regions of acidic repeats in the

N-terminus portion and a third region in the C-terminus, related to cross-linking with

other proteins on fungal cell surface and attachment of C. albicans to the host. The

HWP1-2 homozygous strain has very reduced HWP1 expression, biofilm production

and hyphal formation. Although it is expected that HWP1-2 carrying strains would be

significantly less virulent, heterozygote and HWP1-2 homozigote strains were readily

isolated from human blood infections. Our results support that the HWP1 locus has

allelic differential expression, similar as other C. albicans genes such as SAP2 and

CHS7 (Staib et al., 2002; Sanz et al., 2007). Interestingly, our data also indicate that the

allelic differential expression is restricted to biofilm cells and not observed during hyphal

growth. This suggests that, at least regarding HWP1 regulation, the hyphae induction

pathway is uncoupled from the biofilm induction pathway.

107

Material and Methods

Candida albicans strains

Fourteen C. albicans strains are discribed in the Table 1. SC5314 was kindly

provided by Dr. A. Mitchell, Columbia University, USA. The blood isolates of C. albicans

and the isolate from the top of catheter were obtained from LEMI (Laboratório Especial

de Micologia, Universidade Federal de São Paulo, Brazil). Cells were grown in YPD

(1% wt/vol yeast extract; 2% wt/vol peptone, 2% wt/vol dextrose) media plates at 30

before experiments.

Hyphae induction and microscopy analysis

C. albicans SC5314, L296 and L757 strains were grown in a rotary shaker at

30°C in YPD media overnight. To induce hyphae formation, blastoconidia were diluted

to 10

cells/ml in Pure Fetal Bovine Serum (FBS) (100%) containing dextrose 5 mg/ml

and incubated at 37°C with agitation for 3 h and overnight in the different assays. Cells

morphologies were examined by phase-contrast microscopy at 400X magnification (BX

60 System Microscope, Olympus Optical Co., Tokyo, Japan) and photographed (PM 30

Automatic Photomicrographic System, Olympus Optical Co., Tokyo, Japan). A total of

100 cells were counted using a Neubauer chamber (Hirschmann EM Techcolor) and the

percentage of blastoconidia and cells that had evaginated as germ tubes per ml was

recorded after the incubation period.

Biofilm formation and quantitation by crystal violet staining and XTT-reduction assay

Growth conditions and biofilm quantitation using crystal violet staining and XTT

(tetrazolium salt 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -5-[(phenylamino) carbonyl] -

2H-tetrazolium hydroxide) (Sigma, St. Louis, Mo) reduction assay were performed as

previously described (Jin et al., 2003). To standardize, strains were grown in SD media

containing 110 mM glucose (0,67% wt/vol YNB, 2% wt/vol dextrose) in 96-wells cell

culture plates. Biofilms were incubated at 37ºC for 66 h at 75 rpm and medium changed

every 24 h. For quantitation, a microtiter plate reader was used (Multiskan MS,

Labsystems, Finland) at 540 nm and 492 nm for crystal violet staining and XTT

reduction measurements, respectively. The absorbance values of the controls were

subtracted from the values of the test wells to minimize background interference. Two

independent experiments were assayed with 8 replicates for each strain (a total of 16

replicates).

108

RNA extraction of C. albicans hyphae and biofilms

Total RNA extraction of hyphae induced cells was performed as described for

microscopy during 3 h. We considered successful hyphae induction above 80% germ

tube formation. RNA extraction was preferred after 3 h of induction in order to minimize

RNA from blastoconidia that bud from hyphae during overnight incubations. Two ml of

culture from each strain were treated with 400 µl 1 M sorbitol/Zymoliase (20,000UI) and

incubated at 37°C for 2 h with mild agitation. After centrifugation, pellets were

suspended in RNAspin Mini kit lysis buffer (GE Healthcare). Total RNA was extracted

and treated with DNAse accordingly to manufacturer protocol.

Biofilm formation was induced as described by Hawser and Douglas (1994). Cells were

grown in SD 50 mM glucose (0,67% wt/vol YNB, 0,9% wt/vol dextrose) media overnight

at 37ºC. After a brief centrifugation, pellets were suspended in PBS (phosphate buffered

saline) to an optical density of 0.8 at 520 nm and 500 µl of each cell suspension was

added into 24 wells tissue culture plates for an adhesion period of 90 min. Culture

plates wells were washed once with PBS to remove non-adherent cells and 1 ml of SD

50 mM glucose media was added. Plates were incubated at 37ºC overnight to allow

biofilms formation. The culture medium was removed, cells were scraped mechanically

with a Gilson Pipetman plastic tip and PBS was added to suspend the biofilms. Biofilms

of 12 wells of each strain were transferred to eppendorfs and centrifuged briefly. Cells

were treated with 400 µl 1 M sorbitol/Zymoliase (20,000UI), incubated at 37ºC for 2 h

with mild agitation and the total RNA was extracted and treated with DNAse accordingly

to the protocol of RNAspin Mini (GE Healthcare).

Synthesis of cDNA and semi-quantitative RT-PCR

Hyphal and biofilm cDNA were produced using Superscript! II (Invitrogen)

following the manufacturer protocol. Each reaction contained 1 µg of total RNA, 1 µl

oligo dT

12-18

, 50 µM and 1 µl dNTP 10 mM in 10 µl final volume. Reactions were

incubated at 65°C for 5 min and cooled on ice. To each reaction tube, 10 µl the

following mixture was added: 4µl of 5x First-Strand Buffer, 2 µl MgCl

10 mM, 2 µl DTT

0.1 M, 1.4µl RNAguard! RNAse Inhibitor (Porcine) (GE Healthcare) and 1 µl

Superscript! II. Reactions were incubated at 42ºC for 50 min and then at 70°C for 15

min and the resulting cDNAs stored at -20°C.

109

Primers for amplification of HWP1 alleles were Hwp1expF (5’-CAT CAC ATC

TAA AGA TAC TAT TTA CAC CAC) and HwpexpR (5’-GAT TTT GGA GAA GAA GAA

GCA CCT G) and for amplification of ACT1 (C. albicans actin gene) primers ActinF (5’-

GAA CGT CCA ATG AAT CCA AAA TC) and ActinR (5’-GTT CGA AAT CCA AAG CAA

CGT AAC) were used. Both primer pairs were designed using the genome sequences

of strain SC5314 (www.candidagenome.org) and, as expected, amplify fragments of

625 and 355 bp, close to the 3´ end of HWP1 and ACT1 genes, respectively. Semi-

quantitative RT-PCRs were performed accordingly to the PCR Multiplex protocol

(QUIAGEN"). Three different cDNA dilutions (40 ng, 4 ng and 2 ng) were used in order

to yield amplicons that were in the linear range of the PCR and therefore would not

saturate the signal and still would be visible in the ethidium bromide/agarose gel

electrophoresis. The PCR consisted of 1 µl cDNA, 20 µl of Multiplex Master Mix and 4 µl

of Primer Mix 10X (2 µM of each primer). Cycling conditions were as followed: 95°C for

15 min; 30 cycles of 94°C for 30 sec, 58°C for 90 min, 72°C for 90 min and final

extension at 72ºC for 10 min. As control for genomic DNA contamination, the same

reactions were prepared with 1 µl of total RNA treated with DNAse by the ending of

RNAspin Mini (GE Healthcare) protocol. Products of those reactions were separated by

ethidium bromide/agarose gel electrophoresis 2% and gel images were scanned.

Amplicons were quantified using Molecular Imaging Software (Kodak) and Excel

(Microsoft) programs and band intensities normalized using actin amplification as a

control.

DNA extraction and allelic frequency analysis

C. albicans strains were grown in a rotary shaker at 30°C in YPD media overnight

and total DNAs were extracted using the small scale and quick protocol previously

described (Wach et al., 1994). For the amplification of the HWP1 alleles was used the

Hwp1exp primer pair cited above and the PCR was performed in a total volume of 25 µl

with 1 µl DNA (40 ng) or cDNA (4 ng), 2 x Master Mix (Promega) and 10 #mol of each

primer. Cycling conditions were as followed: 95ºC for 5 min; 35 cycles of 94ºC for 1min,

58ºC for 45 sec, 72ºC for 1 min and final extension at 72ºC for 10 min. Products of

those reactions were separated by ethidium bromide/agarose gel electrophoresis 2%. It

was used the formula p + q = 100% to calculate the allelic frequencies of HWP1-1 (p)

and HWP1-2 (q).

110

Complete amplification of HWP1-2 allele

Primers for amplification of the complete HWP1 gene from L757 were Hwp1F (5’-

GAT GAG ATT ATC AAC TGC TCA AC) and Hwp1R (5’-TTA GAT CAA GAA TGC

AGC AAT ACC). PCR was performed in a total volume of 25 µl with 1 µl DNA (40 ng), 2

x Master Mix (Promega) and 10 #mol of each primer. Cycling conditions were as

followed: 95ºC for 5 min; 35 cycles of 94ºC for 1min, 50ºC for 45 sec, 72ºC for 2 min

and final extension at 72ºC for 10 min. PCR products were purified, ligated in pUC18

and used to transform Escherichia coli DH5-$. Plasmids were extracted using the

MiniPrep alkali lysis protocol (Sambrook et al., 1989).

DNA sequencing and contig assembly

Inserts from different clones were sequenced using dideoxynucleotide BigDye

Terminators v3.1 (Applied Biosystems) in an ABI3100 automated sequencer. The

complete sequence was obtained using RT-PCR primers and an internal primer of

HWP1, Hwp1Fseq (5’-CTG ATT GGA TCC CAG ATA TTC C). Contigs were assembled

using Phred-Phrap-Consed programs (Ewing and Green, 1998; Ewing et al., 1998;

Gordon et al., 1998).

The complete HWP1-2 allele sequence here described is deposited in GenBank

with accession number EU044787.

Computational analyses

Nucleotide sequences were submitted to blast analysis (Blastx) at the NCBI –

National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) site. The

putative amino acid sequence of the HWP1 proteins were obtained using EditSeq

program (DNAstar, Madison, Wisconsin) considering the standard codon usage except

for CTG, which encodes Serine instead of Leucine in C. albicans (Santos and Tuite,

1995). Sequences were aligned using MegAlign program (DNAstar, Madison,

Wisconsin) and the protein sequences were analyzed using Protean program (DNAstar,

Mad ison , Wis cons in). Post -tra nsl a tio nal m o dif icat ions such as

glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor (DGPI tool), N-glycosylation (NetNGlyc tool)

and O-glycosylation sites (NetOGlyc tool) were predicted at the Expasy website

(http://expasy.org/tools/). To search for conserved functional motifs, protein sequences

were analyzed at the ProDom website, a database of domain families generated from

111

th e SW IS S -P RO T an d Tr EMB L pr ot ein seq ue nc e da tab as es

(http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php) (Servant et al., 2002).

Results

Microscopy analysis of hyphae induction and biofilm formation

To verify if two different blood isolates (L296 and L757) were able to proper form

hyphae and biofilms in vitro compared to strain SC5314, we analyzed hyphal induced

cells in Fetal Bovine Serum (FBS) and quantified their biofilms using crystal violet

staining and XTT reduction assay. By microscopy analysis (Figure 1) we verified that

L296 properly produced germ tubes after 3h of induction (Figure 1B) and long hyphae

were observed in the overnight induction (Figure 1E). L757 strain (Figure 1C) formed

short germ tubes as compared to SC5314 (Figure 1A) and L296 after 3h and formed

short hyphae, pseudohyphae and many cells remained as blastoconidia after an

overnight induction (Figure 1F). These results showed an impairment of germ tube

induction in the L757 strain of approximately 40% (Table 2).

The biofilm formation was quantified by the crystal violet assay and showed that

L757 had significantly reduced the biofilm production in 90.8% and 95.7% as compared

respectively with SC5314 and L296 (Figure 2). In the XTT reduction assay, which

consists in XTT salt conversion to formazan by cell metabolism, the same impairment

was observed in L757 (Figure 2B). This decrease was not so expressive when this

method because it quantitates only active cells while crystal violet stains the whole cell

mass within the biofilm matrix.

Because of strain L757 hyphal induction and biofilm formation impairment we

verified whether the L757 cells were attaching to the plastic surface of the cell culture

plate during biofilm formation. Cells were scrapped from two wells after overnight biofilm

growth and just before the biofilm quantitation (66 h gowth). Figure 2C shows that there

were a few blastoconidia and pseudohyphal attached to the surface and some cells

possessed abnormal morphology after overnight growth, slightly resembling the

pseudohyphal morphology. In the mature biofilm (Figure 2D), few cells were able to

switch from yeast form to hyphae or pseudohyphae and sustain poorly the attachment.

The morphology was very close to that observed in the hyphal induction. These results

suggest that the ability of attachment and consequently biofilm formation is reduced

112

mainly because hyphae are not being properly produced by L757 strain in those growth

conditions.

Expression of HWP1

Based on morphologies observations, we hypothesized that the genes related to

hyphal adhesins could not be appropriate expressed or down-regulated in the L757

strain. To test this hypothesis we measured by RT-PCR (Figure 3) the expression level

of HWP1 gene, which codifies the main hyphal surface protein. Specific primers were

designed based on the HWP1 gene sequence from SC5314 deposited in the Candida

Genome Database and was expected an amplicon of 625 bp, using hyphae and biofilms

cDNAs as templates and actin cDNA amplification as positive control (ACT1, 355 bp).

Unexpectedly, we observed the amplification of a third band between HWP1 and ACT1

genes in the L296 strain, with approximately 510 bp and the amplification of only the

small band in the L757 strain. By sequencing of the 5´terminus of the small band from

L296 and L757 using Hwp1expF primer and the submission to Blastx analysis at the

NCBI site (sequences not shown), the amplicons showed to be identical and

demonstrated a high similarity with C. albicans HWP1 (E value= 3x10

-30

and 96%

identity). Analysis of hyphae cDNAs amplicons showed that strain SC5314 expressed

only the “larger” allele, named HWP1-1, while L757 expressed only the “small” allele,

named HWP1-2. Strain L296 expresses both alleles. Similarly, biofilm cDNA amplicons

show that SC5314 and L296 expressed respectively, HWP1-1 and HWP1-2 as

observed in the hyphal amplification although strain L296 expressed only HWP1-1.

Subsequently, we proceeded with the densitometry of the bands analysis by

using Molecular Imaging Software (Kodak) program. Table 3 shows the expression

values for bands intensity previously normalized with actin amplicons. The HWP1

alleles from L296 and L757 appeared up-regulated in hyphae compared with biofilms,

probably due to the high quantities of blastoconidia within the biofilm, while SC5314,

that forms biofilms enriched with hyphal cells (data not shown), up-regulated the

expression during biofilm formation compared to hyphae. The expression of only the

HWP1-1 allele by L296 during biofilm formation had no relation with RNA degradation

since it was discarded by gel electrophoresis (data not shown) and the proper

amplification of actin gene (Figure 3). Probably, it could be explained by an allelic

differential regulation in heterozygous isolates but further studies must be done in order

to investigate this finding. These results show that L757 strain is able to express HWP1

113

gene during both growth conditions but, due to the amplification of an unexpected

smaller, probably the protein product and function can be affected.

In order to screen for HWP1-2 allele in other blood isolates and reference strains

of C. albicans (Table 1) we have amplified from DNA and cDNAs of biofilms and hyphae

the HWP1 alleles. Figure 4 shows that strains ATCC90029 and L663 were also

heterozygous and revealed that the frequency of HWP1-1 and HWP1-2 alleles are

respectively, 84,52% and 15,48%.

Analysis of the complete HWP1–2 sequence

The HWP1-2 complete sequence (1,710 bp) was amplified from L757 genomic

DNA using primers Hwp1F and Hwp1R. The assembly was done using 35 reads,

averaging 500 to 600bp, generating a final high quality contig sequence with phred

score > 40 or 0.65 estimated errors per 10

kb as calculated by Phred-Phrap-Consed

programs. Figure 5 shows the DNA alignment of complete sequence from L757 HWP1-

2 and SC5314 HWP1-1 (1,905 bp) obtained from Candida Genome Database

(orf19.1321). Putative protein sequences were generated by EditSeq program and

aligned together by Megalign program using the SC5314 protein sequence as

reference. Sixteen mutations were found, including twelve synonym and four

nonsynonymous substitutions, corresponding at the alignment to amino acid 259 (P to

Q), 297 (A to T), 442 (S to P) and 459 (P to S). A deletion of 3 consecutive bases in the

SC5314 HWP1-1 allele was observed and corresponded to a Serine codon deletion at

the position 220.(Staab et al., 1996) have previously described that the N-terminus of

Hwp1p is composed of an acidic repeated motif, rich in proline and glutamine residues.

We verified that two repeats in strain L757 HWP1-2 sequence are missing. The first

repeat is located between residues 58 and 71 and corresponded to "EPCDYPQQQQQ"

sequence. The second repeat is located between positions 141 and 162 and is

composed of two "IPCDNPPQPD" in tandem repeats. In bold were marked the common

amino acids in the repeats aligned along the protein sequence. The third region lacks

34 amino acids and is located between positions 462 and 597 at the C-terminus portion,

highly rich in Threonine and Serine residues.

Predictions of post-translational processing show that Hwp1-1p and Hwp1-2p are

GPI-anchored and that threonine and serine residues at the C-terminus contain several

O-glycosylation sites. Three putative asparagines are predicted to be N-glycosylated

114

and are located in positions 241, 286 and 601 in the SC5314 protein sequence and

positions 210, 255 and 536 in strain L757 sequence.

Secondary structure of the putative proteins encoded by HWP1-1 and HWP1-2

(Figure 6) were predicted by Protean program. The lack of the repeats and the 34aa

region in Hwp1-2p (strain L757) change the conformation and interactions along the

protein. The most noticeable modification is the increase of the beta-sheet regions and

decrease in coil regions accordingly to Garnier-Robson prediction method (Garnier and

Robson, 1989). Alpha-helix and turn segments differ slightly between alleles and are

intermingled among beta and coil regions. The hydrophobicity and surface probability

are also altered due to the lack of N-terminus repeats and the 34aa segment, especially

those containing sites with consecutive glutamine residues and glutamines bordered by

prolines.

Putative funtional domains of Hwp1p were previously defined at Prodom site and

correspond to Hwp1-1p from SC5314 strain (UniProtKB/Swiss-Prot entry number

P46593). Searches for functional motifs in Hwp1-2p and comparison with Hwp1-1p

(Figure 7) revealed that 5 out of 8 motifs are conserved between proteins. Conserved

domains are 1, 3 and 5 and are present in Hwp1p sequences from C. albicans and C.

dubliniensis (UniProtKB/Swiss-Prot entry number Q6KCA6). Domains 2 and 4 are

partially conserved in Hwp1-2p (Figure 7B) and have high similarity with S. cerevisiae

cell wall agglutinin-like protein (100% identity) and repeats from S-Layer domain from

Synechococcus spp cell wall glycoprotein (84% indentity). Three domains are absent in

Hwp1-2p. The first was identified as a repeat region presented in the high molecular

weight subunit glutenin from Aegilops comosa. The second and the third domains were

repeated regions presented only in Hwp1p. Although the last one (PD953013 domain) is

conserved between putative protein primary sequences (Figure 5), it is not graphically

represented in the Figure 7B because the e-value for the search was 3x10

-4

and

Prodom site just shows domain matches with e-values < 10

-6

115

Discussion

Hwp1p is a hyphal cell wall protein with a critical role as an adhesin during biofilm

formation (Nobile et al., 2006b). Previous studies on laboratory generated null mutants

of HWP1 have shown that they poorly formed biofilms in vitro and that their cells

maintained the yeast morphology in catheter model assays, both in vitro and in vivo. All

of these artificial mutants were obtained by sequential mutagenesis of SC5314 derived

strains, such as CAI4 and BWP17 (Tsuchimori et al., 2000; Nobile et al., 2006a; Nobile

et al., 2006b). We observed that naturally occuring C. albicans isolates significantly

differ in biofilm production (Figure 2). Similarly to what was observed in artificial null

HWP1 mutants, strain L757 presents defective germ tube formation (Figure 1),

supporting the idea that hyphae serve as a scaffold and support for the extracellular

matrix, preserving the yeast cells within robust biofilms (Nobile et al., 2006b).

The expression analysis of HWP1 (Figure 3) revealed that a second allele is

expressed in the C. albicans population here studied. Strain L296, a high level biofilm

producer, expressed both alleles during hyphal growth but only HWP1-1 in biofilms.

This result suggests that differential allelic regulation occurs in the initial phase of biofilm

formation, because RNA was extracted from overnight induced cells and not from

mature biofilms (grown during 48 h). Allelic differential regulation has been reported for

other genes, such as SAP2 (Staib et al., 2002) and CHS7 (Sanz et al., 2007). In

addition, genes in the same family can be differentially regulated according to growth

condition variations, such as observed for SAPs (Hube et al., 1994; White and Agabian,

1995) and ALS gene family (Hoyer, 2001). The activation of HWP1-2 and its regulatory

pathway will be the subject for future studies. Strain L757 expressed only HWP1-2

during hyphal induction and biofilm formation, suggesting that the defects observed

were probably due to variations in gene and protein sequences and not because of

HWP1 transcriptional silencing. Our data strongly indicate that the allelic differential

expression is restricted to cells in the biofilm and is not observed during hyphal growth.

This suggests, that at least regarding the HWP1 regulation, the hyphae induction

pathway is uncoupled from the biofilm induction pathway. We believe that future studies

on HWP1-1 and HWP1-2 transcritptional regulation might help to elucidate whether

regulatory signal transduction pathways that control hyphal growth and biofilm formation

are coupled or uncoupled (Kumamoto, 2005; Richard et al., 2005; Nobile et al., 2006b).

Comparison of HWP1-1 and HWP1-2 sequences revealed 16 mutations. 12 of

which are synonymous and only 4 change the amino acid sequence (Figure 6). This

116

suggests that this locus is under purifying selection (“negative selection”) and therefore

changes in the peptide are in principle deleterious (Bartolome et al., 2005; Loewe et al.,

2006). The block deletions in HWP1-2 therefore might contribute to the fungus fitness. It

is paradoxical to suppose that in such a negatively selected gene some major mutations

occur that enable not only the strain viability but its pathogenicity. It is important to note

that the strains that contain the HWP1-2 allele were isolated from human blood

infections and therefore their frequency in the population is sufficient for representation

in such a small sampling. If these alterations were fully deleterious to the fungus we

have to assume that the mutations are very recent, and therefore still not near allelic

exclusion by fixation of the HWP1-1, or that HWP1-2 is interesting to the fungus in its

ongoing adaptation to become a full commensal as proposed by the attenuation theory

of pathogens (McGraw et al., 2002; Dyddahl and Stofer, 2003).

Differences in repeat number between alleles were observed in other adhesins of

the ALS family. ALS1, ALS5 and ALS9 of SC5314 possess long and short forms

depending on the number of the repeats, which means that 6 different adhesins can be

expressed (Zhao et al., 2003). ALS7 possesses more than 60 alleles identified in clinical

isolates, which could be implicated in the pathogenicity of the fungus (Zhang et al.,

2003).

The peptide encoded by HWP1 had its primary and secondary structures

previously analyzed by Staab et al. (1996). They described that the N-terminus of the

putative Hwp1p possessed 14 in tandem repeats composed of 10 amino acids with

common features such as proline residues at positions 2 and 6, cysteine in position 3,

aspartic acid in position 4 and glutamine in position 8. Also, this analysis suggested that

proline residues in the repeats maintain the peptide chains in functional conformation

and mediate noncovalent interaction between protein chains, whereas cysteine residues

form disulfide bonds, important for Hwp1p surface conformation and the formation of

cross-linking with other proteins on the Candida surface. The deletion of the 34aa

region rich in serine and threonine in the C-terminus of the strain L757 Hwp1-2p relative

to Hwp1-1p does not interfere with the prediction of the GPI-anchor, which suggests

that Hwp1-2p is properly cross-linked to the cell wall polysaccharides. The deletion of

serine and threonine rich repeats in fungal adhesins, e.g. proteins of S. cerevisiae FLO

family, is associated with loss of flocculation, which indicates that the repeat number

directly interferes with cell-to-cell adhesion (Sato et al., 2001; Verstrepen et al., 2004).

Comparison of secondary structures of Hwp1-1p and Hwp1-2 from strain SC5314 and

117

L757 (Figure 6), shows that Hwp1-2p have increased beta-sheet regions. This suggests

significant alterations in the formation of protein quaternary structures, protein-to-protein

interactions and protein aggregation (Nandi, 1996). Regions that are predicted to be at

the protein surface, especially those in the N-terminus repeats, are missing in Hwp1-2p

(Figure 6 and Figure 7). Previous studies readily demonstrated that these repeats

mediate the binding of C. albicans to host epithelial cells, serving as a substrate for

mammalian transglutaminase (Staab et al., 1999; Staab et al., 2004). We hypothesize

that because of the Hwp1-2p characteristics described above, clinical HWP1-2

homozygote strains would be less invasive in epithelial tissues, since a major

component of their surface would not properly form covalent cross-links to the host cell

surfaces.

Comparative analysis of functional domains indicates that other functions might

significantly differ between Hwp1-1p and Hwp1-2p (Figure 7). The complete loss of the

domain similar to glutenins in Hwp1-2p would be implicated in the decrease of hyphal

growth due to the loss of cell wall elasticity in strain L757. Glutenins, with glycine rich

repeats, are responsible for the elastic properties of gluten, allowing the accommodation

of deformations without breakage (Tiley et al., 2001). The partial loss in Hwp1-2p of the

domains similar to S. cerevisiae agglutinins and a bacterial S-layer domain glycoprotein,

would affect adhesion of strain L757. Agglutinins are proteins required for cell-to-cell

binding in the mating process (Suzuki, 2003), while the S-layer domain glycoproteins

are implicated in bacterial binding to host molecules, including associations with

macrophages (Couture-Tosi et al., 2002). It must be emphasized that mutations in other

genes in strain L757 might contribute to the phenotype.

Besides sheer functional studies on Hwp1p in laboratory strains, our work

justifies an extensive comparative analysis of Hwp1p diversity in natural C. albicans

populations. The diversity of Hwp1p structure and expression in clinical strains of C.

albicans might be an important epidemiological marker in the future. Our report on the

first natural variant is just a first step in this direction.

118

Acknowledgments

We thank Paloma Hernandez for technical assistance. A.C.B.P. received a PhD

fellowship from Capes (Brazil); G.M.C. received a post-doctoral fellowship from

FAPESP (Brazil) and A.L.C. and M.R.S.B. are supported by grants from FAPESP and

CNPq (Brazil). M.R.S.B received an International Research Scholar grant from the

Howard Hughes Medical Institute (USA).

119

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124

Figures

Figure 1. Micromorphology of C. albicans hyphal gowth of strains SC5314, L296 and L757.

Strains were cultured in FBS (Fetal Bovine Serum) after incubation at 37ºC, 200 rpm for 3 h and

overnight. Photos of phase-contrast microscopy at 800X magnification.

125

Figure 2. Biofilm quantitation of C. albicans strains SC5314, L296 and L757. In panel A, biofilm

production was quantified using the crystal violet staining. In panel B, biofilm production was

quantified using the XTT reduction assay. Bars indicate the average of 8 measurements and

error bars the standard deviation. In panels C and D, phase-contrast microscopy (800X

magnification) of cells scrapped from L757 biofilm grown during overnight and 66 h at 37ºC,

respectively.

126

Figure 3. Semi-quantitative RT-PCR of HWP1 alleles visualized in 2% agarose gel, using 40ng

of cDNA per reaction. Hyphae and biofilm cDNAs of C. albicans strains were used in three

different quantities (40ng, 4ng and 2ng). Actin gene amplification was used to normalize the

signal. The left panel shows hyphae cDNA amplicons and the right panel shows biofilm cDNA

amplicons. In both panels, lane 1 (M) is 100bp ladder, lane 2 (SC) is SC5314 strain, lane 3 (L2)

is L296 and lane 4 (L7) is L757.

127

Figure 4. Amplification of HWP1 alleles of 14 C. albicans strains, visualized in 2% agarose gel.

Panels show the PCR amplicons from genomic DNA (A); hyphae cDNAs (B) and biofilm cDNAs

(C). Lane 1 (M) is Low mass ladder and strains are numbered as following: 1-ATCC90029, 2-

ATCC24433, 3- SC5314, 4- 34ptc, 5- L301A, 6- L298, 7- L297A, 8- L296, 9- L291, 10- L757,

11- L663, 12- L666, 13- L667 and 14- L669.

129

Figure 5. Alignment of nucleotide and putative protein sequences of HWP1 alleles. Differences

between sequences are boxed and mutations are shaded in gray. The strain SC5314 HWP1

sequence, named HWP1-1, has 1,905 bp and 634 aa and was taken from the Candida Genome

Database (orf19.1321) and the strain L757 sequence, named HWP1-2, was determined in this

work and has 1,710 bp and 569 aa.

130

Figure 6. Representations of the secondary structures of the putative HWP1 allele proteins.

Main differences between Hwp1-1p (SC5314) and Hwp1-2p (L757) are marked with stars (*) for

the SC5314 plots. Letters in the left refer respectively to protein regions alpha (A), beta (B), turn

(T) and coil (C) according to the Garnier-Robinson method (Garnier, Osguthorpe et al., 1978).

Hydrophobic regions is identified with (G) according to the Hoop-Woods method (Hoop e K.R.,

1981) and the surface probability is giving according to Emini method (Emini, Hughes et al.,

1985). All methods were implemented by Protean program (DNAstar, Madison, Wisconsin).

131

Figure 7. Diagram of putative Hwp1 protein domains. In A Hwp1-1p sequence of strain SC5314

and B Hwp1-2p sequence of strain L757. Numbered squares represent common domains and

painted squares in the Hwp1-1p only domains. Significance levels assume e-value <10

-6

PD166632 (1), PD504713 (black), PD893465 (3) and PD387419 (5) domains are present

exclusively in C. albicans and C. dubliniensis or only in C. albicans (PD953013 – vertical

stripes) Hwp1p. The grey square represents the PD004462 domain with 575 members in the

family. PD004233 (2) and PD387419 (5) domains, possessed 110 and 310 members in the

family, respectively. The e-value of the domain matches in Hwp1-2p were: (1) 2x10

-14

, (2) 9x10

, ( 3) 2x 10

-17

, ( 4) 5x 10

-14

, ( 5) 4x 10

-31

, inferred by Prodom analysis

(http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php).

Table 1: C. albicans isolates from Brazil and reference strains used to screen the HWP1-2 allele.

Strains

Isolation site

Desease

Age

Year

Source

ATCC90029

Reference

strain

(Espinel-Ingroff et al., 1992)

ATCC24433

Reference

strain

(Pfaller et al., 1994)

SC5314

Reference

strain

(Gillum et al., 1984)

34ptc

Top of catheter

Present study

L301A

Blood

Kidney failure

1 year old

1.997

Present study

L298

Blood

Diabetes

59 years old

1.997

Present study

L297A

Blood

Neonate

1.997

Present study

L296

Blood

1.997

Present study

L291

Blood

Neonate

1.997

Present study

L757

Blood

44 years old

2.001

Present study

L663

Blood

8 months

2.001

Present study

L666

Blood

2.001

Present study

L667

Blood

Kidney failure

45 years old

2.001

Present study

L669

Blood

Pneumonia

2.001

Present study

133

Table 2. Percentage of germ tube formation at 3 h of incubation in FBS at 37ºC.

C. albicans strains

% of hyphae / blastoconidia

SC5314

82.26 / 17.74

L296

81.65 / 18.35

L757

41.83 / 58.17

a few pseudohyphae were found. When present, they were counted as blastoconidia since doughter-

cells were not separeted from the mother-cells by a real septum and the expression pattern of the germ

tube implies in the commitment of the cell in the formation of hyphal filaments, not yeasts.

Table 3. Expression levels

of HWP1 alleles in hyphal induced cells and biofilm.

C. albicans strains and alleles

Hyphae expression (SD

)

Biofilm expression

SC5314 (HWP1-1)

0.687 (±0.010)

0.745 (±0.040)

L296 (HWP1-1 / HWP1-2)

0.261 / 0.351 (±0.067 / ±0.059)

0.116 / 0 (±0.015)

L757 (HWP1-2)

0.534 (±0.054)

0.357 (±0.057)

Average of three measurements considering the cDNA dilutions described in Material and Methods

section and previously normalized with actin amplicons.

SD means Standard Deviation of three measurements

134

CAPÍTULO 5: DISCUSSÃO

135

5.1. EVOLUÇÃO DE FUNGOS

Na base da radiação entre plantas, animais e fungos, os primeiros a se divergir

foram fungos ancestrais dos filos Chytridiomycota e Zygomycota. Liu et al. (2006)

utilizando seqüências das subunidades maiores da RNA polimerase II (Rpb1p e Rpb2p)

em análise Bayesiana mostraram que os Zygomycota e Chytridiomycota são

polifiléticos e que a perda do flagelo teria ocorrido uma vez na evolução do Reino

Fungi, na passagem do ambiente aquático para o terrestre e por isso, assim como as

plantas e os animais, os fungos são em sua maioria, não-flagelados.

Comparativamente, James et al. (2006), utilizando marcadores protéicos e genes

ribossômicos em análises Bayesianas, também reportaram a polifilia desses filos, mas

inferindo que a perda do flagelo teria ocorrido de 4 a 6 vezes durando a evolução dos

fungos. Em nossas análises, utilizando como marcador o gene rDNA 18S foram

utilizados poucos representantes dos filos Zygomycota e Chytridiomycota e por esta

razão, os mesmos aparecem como filos parafiléticos e não polifiléticos, com

probabilidade a posteriori de 1 (Figura 1, Capítulo 2)

Alto suporte foi dado para a monofilia do clado “dikaria”, composto pelos filos

Basidiomycota e Ascomycota, e para os principais grupos de Ascomycota, os subfilos

(Taphrinomycotina, Pezizomycotina e Saccharomycotina), como já reportado

anteriormente (Berbee e Taylor, 2001; Heckman et al., 2001; James et al., 2006 e

Sugiyama et al., 2006). O grande salto no estudo da evolução dos Ascomycota, foi que

a filogenia Bayesiana de nosso trabalho foi a primeira a dar suporte estatístico para o

grupo dos Pezizales, membros dos Discomycetes, na base da radiação dos

ascomicetos filamentosos, como previamente observado, mas sem suporte (Gargas e

Taylor 1995; Berbee, 1996; Berbee e Taylor, 2001; Lumbsch, 2000 e Eriksson et al.,

2004). Ainda, a filogenia proposta excluiu como ancestral do grupo um ascomiceto

formador de líquens, refutando observações de Lutzoni et al. (2001), Reeb et al. (2004)

e Grube e Hawksworth (2007). A Figura 2 (Capítulo 2) mostra que todos os

ascomicetos formadores de líquens derivam do nó 17, excluindo outros Discomycetes e

Pyrenomycetes da descendência de um ancestral capaz de formar simbiose com algas

e cianobactérias, corroborado por análises de multi-proteínas (Spatafora et al., 2006).

Dentro dos ascomicetos filamentosos, mais especificamente dentro das classes

dos Discomycetes, nossas análises mostraram que é um agrupamento polifilético de

uma série de morfologias e associações com outros organismos. Estão agrupados

136

discomicetos inoperculados, operculados, formadores de líquens, parasitas de plantas

e saprófitas. Assim como observado por Wang et al. (2006) por análises de parcimônia

das seqüências dos genes ribossômicos 18S, 28S e 5.8S, nossas análises forneceram

suporte para a divergência primeira da Ordem Orbiliales (Orbilia fimicola) e para a

ausência de monofilia da ordem Helotiales, corroborando análises posteriores de

Spatafora et al. (2006). Hofstetter et al. (2007) corroboraram nossas análises dos

Discomycetes formadores de líquens. Estes autores analisaram por máxima

verossimilhança, marcadores protéicos e genes ribossômicos e mostraram que tratava-

se de um grupo polifilético, sendo comparável apenas, a monofilia da ordem

Lecanorales.

Na Ordem Saccharomycetales, não foi possível fornecer suporte para a

monofilia das 11 famílias previamente descritas dentro desse grupo por Kurtzman,

(2000 e 2003) e Suh et al. (2006), em análises de seqüências de genes ribossômicos e

protéicos, utilizando o método Bayesiano, reportaram a existência de monofilia da

família Saccharomycetaceae. Em nossos dados, o principal ramo que separa a maioria

dos membros dessa família das outras famílias caracterizadas possui alta

probabilidade a posteriori de 0.89, o que exclui a ancestralidade em comum de todos

os representantes da Saccharomycetaceae. Esse fato pode indicar que algumas das

classificações das leveduras dessas famílias foram baseadas em caracteres

morfológicos homoplásicos.

Para a datação dos principais eventos de radiação dos fungos a hipótese de

relógio molecular foi rejeitada. Assim, nosso trabalho foi pioneiro na utilização do

método de “penalized likelihood” (Sanderson, 2002), implementado pelo programa r8s

(http://ginger.ucdavis.edu/r8s) para análises considerando diferentes taxas de evolução

do gene rDNA 18S dos principais grupos de fungos. Foram utilizados como pontos de

calibração o fóssil de Pyrenomycete datado em 400 Ma descrito por Taylor et al. (1999)

e mais duas datas de divergência previamente estimadas: a separação de plantas,

animais e fungos, datada em 1.576 Ma por Wang et al. (1999) e a separação de

animais e fungos, datada em 965 Ma por Doolittle et al. (1996).

A Figura 2 e a Tabela 2 (Capítulo 2) mostram as datações dos principais eventos

de radiação considerando os dois cenários como pontos de calibração da análise.

Nossos dados corroboram as análises prévias de multi-proteínas de Heckman et al.

(2001) e Hedges et al. (2004) em que os principais eventos de radiação dentro do

Reino Fungi ocorreram entre entre 1200 e 600 Ma, enquanto que as datações

137

anteriores baseadas em seqüências de rDNA 18S colocam esses eventos muito mais

recentemente na evolução, de 660 a 370 Ma (Berbee e Taylor, 2001). Quando

consideramos em nossas análises como pontos de calibração a data de divergência

entre animais e fungos (965 Ma) e o fóssil de Pyrenomycete (400 Ma), as estimativas

de tempos de divergência, mesmo que mais recentes que as do primeiro cenário, não

acomodavam as datas de Berbee e Taylor (2001).

Esse fato deve-se possivelmente ao uso incorreto de metodologias de

inferências filogenéticas e datação. Berbee e Taylor (2001) inferiram sua filogenia a

partir de um pequeno número de taxa (cerca de 40), utilizando métodos de parcimônia

e distância (Neighbor-Joining). Ocasionalmente, quando os genes ribossômicos

evoluem com taxas muito diferentes em diferentes espécies, ocorre o fenômeno de

atração de ramos longos (“long branch attraction”), em que os grupos que possuem

taxas rápidas de substituição de nucleotídeos são atraídos nas análises filogenéticas,

compartilhando ancestralidade, mas podendo excluir organismos muito mais

relacionados mas que estão evoluindo com taxa mais lenta (Felsenstein, 1978). Dessa

forma, as filogenias erroneamente sugerem que essas seqüências estejam evoluindo

como relógio molecular local. Ainda, em suas análises, Berbee e Taylor (2001)

consideraram a hipótese de relógio molecular global, mesmo já tendo eles mesmos e

outros autores (Berbee e Taylor, 1993 e Kasuga et al., 2002) verificado que na maioria

dos testes da hipótese para os grupos de fungos e seqüências de rDNA 18S, esses

não davam suporte estatístico para a constância de taxas. Como suas datações eram

muito mais recentes do que as inferidas por análises de multi-proteínas, o fóssil de

Pyrenomycete não se enquadrava nas análises e os autores sugeriram uma

classificação equivocada do mesmo.

Na tentativa de dar suporte para o cenário mais recente dos principais eventos

de radiação dos fungos, Taylor e Berbee (2006) utilizaram diferentes fósseis para a

calibração dos tempos de divergência desse reino. Para isso, analisaram filogenias

inferidas pelo método Bayesiano (Huelsenbeck e Ronquist, 2001), considerando 50

seqüências de proteínas concatenadas de 25 organismos, sendo 15 deles, fungos

representantes dos filos Ascomycota (9), Basidiomycota (5) e Zigomycota (1). Para

fornecer a localização de pontos de calibração da datação, utilizaram seqüências de

arroz (Oryza sativa); Arabidopsis thaliana; galo (Gallus gallus) e mosquito (Anopheles

gambiae); na base da divergência dos fungos, utilizaram seqüêcia de Rhizopus oryzae

e como grupo externo, Plasmodium falciparum. Os pontos de calibração foram

138

utilizados isoladamente ou combinados, e seguem-se: a data de divergência entre

galos e humanos, estimada em 300 Ma (Peterson et al., 2004); a divergência do

mosquito e da Drosophila com idade mínima de 235 Ma e idade máxima de 417 Ma

(Blagoderov et al., 2002; Peterson et al., 2004; Gaunt e Miles, 2002 e Douzery et al.,

2004); a divergência de angiospermas, com idade mínima de 144 Ma e máxima de 206

Ma (Sanderson e Doyle, 2001 e Dou zery et al., 2004) e por fim, o fóssil de

Pyrenomycete datado em 400 Ma. Dessa vez, a hipótese de relógio molecular testada

foi rejeitada, então, utilizaram para datação o método de “penalized likelihood”

(Sanderson, 2002).

Taylor e Berbee (2006) reportaram que se consideradas as calibrações de 300

Ma para a divergência de aves e mamíferos e 235 Ma para a de Drosophila e mosquito,

a divergência dos animais e fungos seria datada respectivamente em 2.635 Ma e 944

Ma, o que implicaria no surgimento de organismos consumidores de oxigênio em uma

atmosfera terrestre ainda redutora no primeiro cenário, mas totalmente corroborada por

nossas análises no segundo cenário. Considerando a data de divergência entre plantas

dicotiledôneas e monocotiledôneas, a divergência entre animais e fungos seria datada

em 579 Ma e a de aves e mamíferos em 66 Ma, ambas muito mais recentes do que

qualquer datação prévia (Heckman et al., 2001 e Padovan et al., 2005).

Embora tenha sido classificado como um proto-Pyrenomycete (da classe dos

Sordariomycetes), os autores permitiram interpretar que sua classificação poderia

remeter ao grupo dos Archiascomycetes e portanto, sua localização como tempo

mínimo de existência de dado grupo, poderia ocorrer em outros ramos, como na

divergência de todos os ascomicetos filamentosos ou mesmo na divergência de todo o

filo Ascomycota. Considerando o fóssil no nó dos Pyrenomycetes, a divergência entre

os Ascomycota e Basidiomycota foi datada em 1.489 Ma; quando considerado o fóssil

respectivamente nos nós de divergência dos Pezizomycotina e filo Ascomycota, as

datações para a separação de Asco-Basidio foram estimadas em 843 Ma e 452 Ma.

Nosso resultado, corroborado por análises prévias de multi-proteínas (Heckman et al.,

2001 e Hedges et al., 2004), estimou a divergência entre esses filos em 1.200 Ma

(Tabelas 2 e 3, Capítulo 2).

Para Taylor e Berbee (2006), considerando somente o terceiro cenário para a

divergência entre Asco-Basidio, seria possível acomodar as estimativas de divergência

dos Glomeromycota (formadores de micorrizas em plantas terrestres) de forma

consistente com a radiação das plantas terrestres. Se considerados os dois cenários

139

anteriores, os Glomeromycota teriam divergido muito antes dos principais grupos de

plantas e ainda, muitos dos membros dos Ascomycota e Basidiomycota que são hoje

parasitas ou decompositores de plantas obrigatórios teriam se estabelecido na terra

muito antes de surgirem as primeiras plantas. Por outro lado, verificaram que se

considerado o terceiro cenário, a divergência entre aves e mamíferos seria muito mais

recente que registros fósseis, 75 Ma.

Os fósseis devem ser utilizados com cautela como pontos de calibração de

estimativas de tempos de divergência, pois essas datas indicam o tempo mínimo de

existência de dado grupo (Li e Graur, 1991). Mesmo que o fóssil mais antigo de plantas

terrestres tenha sido datado entre 480 e 460 Ma, não significa que o grupo das plantas

tenha surgido tão recentemente e que as associações entre elas e os fungos tenham

ocorrido desde o início da colonização do ambiente terrestre. Assim como (Heckman et

al., 2001 e Hedges et al., 2004), acreditamos que os principais eventos de radiação dos

fungos tenha ocorrido na era Proterozóica, em paralelo com a colonização do ambiente

terrestre pelas plantas.

140

5.2. BIOFILMES

A levedura Candida albicans é o modelo mais utilizado para o estudo da

patogenicidade em fungos, principalmente devido à capacidade de se manipular em

laboratório as diferentes morfologias (levedura ou filamentos) e se induzir diversos

fatores de virulência (Gow et al., 2002). Dentre eles, destacam-se a produção e

secreção de proteinases e fosfolipases, a transição levedura-hifa e a produção de

biofilmes como resposta aos estímulos ambientais, tais como nutrientes disponíveis, pH

e temperatura, que ativam as redes de vias de sinalização para que o organismo se

adapte ao meio (Wu et al., 2000), (Gow et al., 2002).

Diferenças na patogenicidade entre espécies de Candida já foram reportadas. C.

albicans é considerada a mais patogênica e a mais isolada de todos os tipos de

infecções causadas por leveduras, seguida de C. glabrata, C. parapsilosis e C.

tropicalis (Kirkpatrick et al., 2000 e Pfaller et al., 2001). Na formação de biofilme ocorre

o mesmo fenômeno. Kirkpatrick et al., 2000 e Kuhn et al., 2002 mostraram que C.

albicans produz mais biofilme do que C. parapsilosis e C. dubliniensis in vitro e

diferentes linhagens de C. albicans também exibem quantidades diferentes na

produção de biofilme, quantificados pela coloração com cristal violeta e redução do

XTT (Hawser e Douglas, 1994; Shin et al., 2002 e Jin et al., 2003), como observado na

Figura 1 (Capítulo 3).

Na formação do biofilme, a matriz extracelular secretada pelas células exerce

papel fundamental no aumento da resistência aos antifúngicos (Douglas, 2003).

Acredita-se que a matriz atue como barreira física contra a penetração de drogas e que

os componentes contidos na matriz possam auxiliar na patogenicidade do fungo e

persistência da infecção (Baillie e Douglas, 2000 e Douglas, 2003). Para identificar e

estudar o papel das proteínas na matriz do biofilme de C. albicans, foi selecionada a

linhagem SC5314 como uma das mais produtoras de matriz e esta foi separada das

células, concentrada e aplicada em gel de acrilamida para a seleção das bandas

protéicas e identificação das mesmas por espectrometria de massa (Figura 3, Capítulo

3).

Dentre 12 bandas selecionadas, somente a 9ª banda obteve identificação

confiável (Tabela 3, Capítulo 3), com “E-value” = 5.8e-07. A banda, identificada como

enolase (2-fosfo-D-glicerato hidrolase) de C. albicans, é codificada pelo gene cópia

única ENO1. Esta proteína de aproximadamente 48 kDa é um componente central da

141

via glicolítica que catalisa a desidratação de 2-fosfoglicerato para gerar

fosfoenolpiruvato, mas pode catalisar a reação inversa na gliconeogênese (Sundstrom

e Aliaga, 1992). Em Saccharomyces cerevisiae foram identificados 2 genes

codificadores da enolase, o ENO1 e o ENO 2, que são regulados diferencialmente

dependendo da fonte de carbono e da fase de crescimento da levedura, sendo que a

somente a deleção dos alelos de ENO2 é letal (Mcalister e Holland, 1982).

A enolase é uma proteína abundante no citoplasma da célula de C. albicans mas

já foi encontrada em sobrenadante de culturas (Sundstrom et al., 1994) e em sangue

de pacientes com candidemia (Walsh et al., 1991). Também foi descrita a sua presença

associada à glucanas da parede celular (Thomas et al., 2006), sendo amplamente

incorporada nas lâminas internas da parede (Angiolella et al., 1996 e Angiolella et al.,

2002), mesmo não possuindo sinal para secreção por via clássica, como aqui reportado

por análises em programas de predição (SignalP 3.0 server e SecretomeP Server)

(item 3.2.3).

Por conta dessas observações, passamos a nos perguntar se a enolase não

estava presente no biofilme por conta de lise celular e na superfície das células em

decorrência da recaptação da proteína pela parede rica em mananas como

previamente sugerido (Eroles, Sentandreu et al., 1997). Para testar estas hipóteses, foi

gerado soro hiperimune utilizando-se enolase recombinante (Figura 8, Capítulo 3), e o

soro foi usado em experimentos de imunofluorescências, citometria de fluxo e “western

blots”.

A Figura 9 (Capítulo 3) confirma a presença da enolase na matriz do biofilme e

mostra que não há reconhecimento da proteína em meios condicionados gerados a

partir de 1 e 3 dias de incubação com as células planctônicas. Diferentemente de

nossas observações, Thomas et al. (2006) encontraram enolase em sobrenadante de

culturas planctônicas de 1 dia de crescimento da linhagem de C. albicans 3153A,

crescidas em meio RPMI-1640. Podemos supor que não foi possível detectar enolase

em sobrenadante de culturas planctônicas nas nossas condições de crescimento

porque utilizamos meios e linhagem diferentes nos experimentos ou porque a enolase

secretada em culturas a 37ºC era degradada. De fato, foi observado que a enolase

secretada ou proveniente de lise celular em culturas planctônicas de 1 dia em meio SD

era rapidamente degradada nesta temperatura (30 min) (Figura 10, Capítulo 3). A 22ºC

a enolase podia ser detectada (mesmo que fracamente) em sobrenadante de cultura,

sem a presença das células.

142

Houve reconhecimento da proteína intracelular Sui2p em extratos celulares de S.

cerevisiae e C. albicans (mesmo que fracamente), mas não houve reconhecimento em

biofilme e meios condicionados (Figura 11, Capítulo 3). Vale ressaltar que mesmo

existindo um reconhecimento fraco, a quantidade de matriz de biofilme concentrada e

aplicada no gel para ser transferida para a membrana era pelo menos 10 vezes

superior a quantidade de proteínas nos extratos celulares de 10

células.

Thomas et al. (2006) fizeram um estudo no qual compararam através de análise

de gel bidimensional o perfil protéico da matriz de biofilme e as proteínas secretadas

para o meio condicionado. Eles relataram o encontro de 2 bandas altamente expressas

em biofilme identificadas por espectrometria de massa como enolase, sugerindo que a

proteína fosse modificada e de alguma forma, secretada. Análises de predição de

modificação pós-traducional (Figura 7, Capítulo 3) mostrou que a enolase pode ser

glicosilada e fosforilada em diversos aminoácidos, o que explicaria a migração de duas

diferentes proteínas no gel bidimensional. Foi realizado um ensaio de desglicosilação

com endoglicosidase H (SIGMA) de uma alíquota da matriz de biofilme mas não foi

possível observar diferença no padrão de migração da enolase em gel “SDS-PAGE” e

“western blot” (dados não mostrados), sugerindo que se houver diferentes modificações

na proteína, as mesmas só poderiam ser separadas por seus pontos isoelétricos e não

por tamanho. Ainda, pela comparação da seqüência predita da enolase da linhagem

SC5314 seqüenciada em nosso laboratório e a depositada no Candida Genome

Databank (Figura 5, Capítulo 3), encontramos 4 substituições de nucleotídeos, sendo

uma sinônima e 3 que resultaram em troca de aminoácidos. As diferenças observadas

entre as seqüências da mesma linhagem podem ser explicadas pelo fato de

possivelmente ter sido clonado e seqüenciado em nosso laboratório o segundo alelo do

gene que codifica a enolase pois é sabido que C. albicans possui pelo menos 50% de

seu genoma diplóide heterozigoto (Jones et al., 2004).

De acordo com os resultados apresentados, sugerimos que a enolase presente

no biofilme possivelmente não é originada da lise celular, pois seria rapidamente

degradada no meio, mas sim, sofre modificações pós-traducionais diferentes da

proteína intracelular e é liberada pela célula através de via não-clássica de secreção

(Via Retículo-Golgi). Porém, sua função no biofilme ainda permanece desconhecida.

O soro hiperimune reconhecia a enolase na superfície e no interior das

leveduras e hifas da linhagem SC5314, bem como nas células formadoras de biofilme

(Figuras 12, 13 e 14, Capítulo 3). Porém, somente 14% das leveduras não

143

permeabilizadas tinham a enolase de sua parede reconhecida pelo soro (Figura 12,

Capítulo 3). Observando as células no biofilme (Figura 14, Capítulo 3), verificou-se que

poucas delas co-localizavam a marcação da enolase com o calcoflúor (que cora os

açúcares da parede, principalmente as mananas) e as que possuíam marcação forte

da enolase na superfície eram brotos jovens. Essas observações nos sugeriu que o

acesso dos anticorpos à enolase ficou prejudicado quando as células já possuem a

parede inteiramente formada (células com marcação somente do calcoflúor),

corroborando estudos anteriores que mostraram a presença preferencial de enolase

próxima à membrana e não nas porções externas da parede (Angiolella et al., 1996 e

Thomas et al., 2006).

Para confirmar se enolase não poderia ser recapturada pela parede, o que

justificaria o fato de não haver reconhecimento da enolase nativa nos meios

condicionados ainda com células (Figura 10), foi feito o teste da recaptação da enolase

(Figura 15). Verificamos que não houve recaptação da enolase recombinante pelas

leveduras quando co-incubadas “overnight” , mesmo em diferentes concentrações da

proteína. Pode-se especular que não houve recaptação da His6-enolase devido a sua

conformação não ser a mesma da enolase nativa e ainda, que esta última possua

modificações pós-traducionais que não estão presentes na enolase recombinate

(expressa em E. coli). Contudo, acreditamos que de fato a enolase, da mesma forma

que no biofilme, seja ativamente secretada para a superfície celular.

A enolase é altamente conservada em bactérias, leveduras, drosófilas, anfíbios,

aves, plantas e humanos (Van Der Straten et al., 1991). Além da via glicolítica, a

proteína desempenha outras funções em diferentes tipos celulares, fenômeno este

conhecido como “gene sharing”: é antígeno imunodominante secretado em infecções

por C. albicans (Figura 6, Capítulo 3) (Martinez et al., 1998 e López-Ribot et al., 2004),

é toxina de bactérias (Bisseret et al., 1991), forma o cristalino de peixes, anfíbios,

répteis e aves (Piatigorsky, 2003) e estuda-se seu papel em carcinomas humanos e

doenças degenerativas do cérebro (Kakinuma H T et al., 2003 e Collini et al., 2003).

Nesse ponto do trabalho nos perguntamos se a enolase não poderia estar ativa no

biofilme, hidratando ou hidrolisando compostos ou ainda, se em altas concentrações,

como ocorre no cristalino, ela em si formaria o biofilme. Infelizmente não foi possível

testar essas hipóteses devido à falta de substrato para ensaios de atividade, como

previamente comentado. A enolase recombinante purificada foi dialisada contra tampão

Tris-HCl 20mM pH 8,0 para se retirar o imidazol e uma alíquota foi concentrada em

144

Speed Vac para testar se em altas concentrações ela poderia tornar-se um gel.

Contudo, a proteína recombinante precipitava em temperaturas baixas (dados não

mostrados), impedindo que se concluísse o experimento.

Análises de “microarray” comparando a expressão de genes em biofilme de C.

albicans com células planctônicas mostraram que os genes codificadores das enzimas

da via glicolítica, tais como: ENO1, FBA1, GPM1, PDC1, dentre outros, encontravam-

se superexpressos no biofilme (Garcia-Sanchez et al., 2004). Com base nessas

observações, decidimos estudar a expressão de genes da via glicolítica nas 14

linhagens de C. albicans previamente testadas quanto à produção de biofilme (Tabela

1). Foram escolhidos os genes ENO1, FBA1, PYK1, HXK1 e HXK2, respectivamente

codificadores das enzimas enolase, aldolase, hexoquinases e fosfopiruvato quinase,

para verificar se linhagens menos produtoras de biofilme possuíam diminuição da sua

expressão ou se linhagens altamente produtoras, superexpressavam esses genes.

Nobile e Mitchell (2005) recentemente reportaram que a cascata principal de

regulação do biofilme se dá pelo controle de fatores de transcrição codificados pelos

genes BCR1 (Biofilm and Cell wall Regulator) e TEC1 (TEA/ATTS transcriptional

factor), sendo que os principais alvos da via são as adesinas codificadas pelos genes

ALS3 e HWP1. Decidimos analisar a expressão desses genes relacionados ao controle

da formação de biofilme e adesão, juntamente com os genes da via glicolítica.

A matriz extracelular do biofilme possui papel antagônico no metabolismo das

células. Essa protege contra ressecamento e a ação de antimicrobianos naturais mas

cria um gradiente nutricional e gasoso em suas diferentes camadas. Quanto mais

interna no biofilme estiver a camada celular, menor a concentração de glicose e

oxigênio disponível (Donlan, 2001; Donlan e Costerton, 2002 e Douglas, 2003). O

mesmo ocorre na infecção de tecidos vivos, em que as células de C. albicans não

encontram alimento e oxigênio livres à disposição. Considerando esses fatores, foram

comparadas à expressão dos genes das 14 linhagens de C. albicans crescidas na

forma de biofilme, forma planctônica (em meio rico e em meio pobre) e em

microaerofilia. Além do biofilme, outro fator de patogenicidade importante de C.

albicans, a produção de hifas foi testada, visto que a filamentação tem papel

reconhecido na invasão de tecidos e estruturação de biofilmes (Chandra et al., 2001 e

Calderone e Gow, 2002a).

Foram feitas RT-PCRs Multiplex das 14 linhagens de C. albicans em três

diluições diferentes de cDNA para cada condição de crescimento (biofilme, levedura

145

em meio rico, levedura em meio pobre, microaerofilia e hifa) (Figura 16, Capítulo 3). As

diluições de cDNA e o número de ciclos da RT-PCR foram padronizados a partir de

uma curva-padrão de saturação previamente testada (dados não mostrados), para

garantir que a quantificação das bandas ocorresse antes da saturação da reação.

Enquanto as bandas amplificadas dos cDNAs da linhagem L757 eram

quantificadas, notou-se que o gene HWP1 não era amplificado em nenhuma condição

de crescimento, em nenhuma diluição de cDNA. Para explicar o resultado, três

hipóteses foram levantadas: 1- o par de oligonucleotídeos não estava hibridando no

cDNA dessa linhagem por mutação na seqüência de anelamento; 2- o gene era

expresso mas a amplificação do fragmento para quantificação possuía o mesmo

tamanho de outra banda na RT-PCR Multiplex e 3- o gene de fato não era expresso por

essa linhagem. Para testar a primeira hipótese, foi amplificado por PCR, a partir do

DNA genômico, o fragmento do gene HWP1 das 14 linhagens do estudo com o par de

oligonucleotídeos utilizados na RT-PCR Multiplex (Tabela 2, Capítulo 3). A Figura 18

mostra as bandas amplificadas das linhagens L296, L757 e SC5314. A amplificação

dos fragmentos corrobora a primeira hipótese e ainda sugere que o fragmento HWP1/2

possui o mesmo tamanho aparente do fragmento amplificado do gene ALS3.

Para garantir a não sobreposição de bandas na RT-PCR Multiplex e a

amplificação dos dois alelos de HWP1, um novo oligonucleotídeo “forward” para o gene

ALS3 foi desenhado (Tabela 2, Capítulo 3). Foi verificado no website do genoma da

Candida SC5314 (www.candidagenome.org) que o próprio gene ALS3 possuía dois

alelos previamente depositados (Oh et al., 2005), assim como descrito para vários

genes dessa família (Zhao et al., 2003). Optou-se por um novo oligonucleotídeo que

amplificasse ambos os alelos de ALS3. A Figura 19 mostra RT-PCR Multiplex de

biofilme e hifa, a qual amplificou os fragmentos dos dois alelos dos genes HWP1 e

ALS3 de 4 das 14 linhagens de C. albicans.

A amplificação de dois alelos de HWP1 corrobora a segunda hipótese levantada

e revela a descoberta de linhagens clínicas heterozigotas, como a L296 e L663 e

homozigotas para o alelo menor (H W P 1 / 2 ), como a L757, discutido mais

profundamente no Capitulo 4.

A descoberta de um novo alelo baseado na amplificação por PCR e análise de

fragmentos em gel reforça a utilização do método semiquantitativo em vez do método

de RT-Real Time PCR para a análise de nossos dados. Sabe-se que as sondas

utilizadas neste último método possuem tamanhos reduzidos (60 a 100 nucleotídeos) e

146

no caso do gene HWP1, se desenhadas próximas ou na parte ausente do alelo HWP1-

2, certamente concluir-se-ia que a linhagem L757 não expressa o gene em questão,

em nenhuma condição de crescimento. Ainda, essa metodologia exige acurada

padronização da medida da expressão para cada gene e possivelmente não seriam

discriminados os dois diferentes alelos, tanto de ALS3 quanto de HWP1 com a mesma

sonda (Peirson e Butler, 2007).

Estudar o quanto diferentes genes respondem aos diferentes sinais ambientais e

como estes genes interagem para determinar a expressão final de uma dada

característica é de fundamental importância para se entender fenômenos complexos

como o aumento da resistência aos antifúngicos pelos biofilmes de C. albicans (Wu et

al., 2007). A Figura 17 (Capítulo 3) mostra gráficos da expressão dos genes (valores já

corrigidos pela expressão média da actina) em função das 5 diferentes condições de

crescimento, para as 14 linhagens analisadas. Garcia-Sanchez et al. (2004) reportaram

que a maioria dos genes da via glicolítica eram superexpressos em células de biofilme

quando comparadas com células planctônicas. Nossas análises não identificaram tais

diferenças na expressão, mesmo quando comparadas outras condições de

crescimento. A concentração de glicose no meio pareceu não afetar a expressão dos

genes da via, comparando-se o meio rico (YPD) e meio pobre (SD), sendo que tais

diferenças na expressão foram reportadas quando células eram crescidas em meios

com fonte não-fermentável de carbono em S. cerevisiae (Raamsdonk et al., 2001).

Também não foi possível correlacionar a expressão da enolase e a formação de

biofilme por linhagens altamente produtoras e pouco produtoras de biofilme. Foram

observadas diferenças na expressão entre linhagens, nas 5 condições de crescimento

para os genes HXK1 e HXK2. Em S. cerevisiae foi reportado que ambos homólogos

participam da via da metabolização da glicose mas de formas diferentes. Hxk2p é

induzida na presença de altas concentrações de glicose e reprime HXK1 ao mesmo

tempo em que auto-regula o aumento da expressão de seu gene HXK2 (Rodriguez, De

La Cera et al., 2001). Como em C. albicans não é claro como ocorre a regulação entre

esses dois genes na via, podemos especular que o gene HXK1 tem participação mais

ativa na degradação da glicose, visto que este se apresentava pelo menos 2 vezes

mais expresso na média entre as linhagens do que HXK2 em todas as condições de

crescimento.

147

A microaerofilia parece não afetar diferencialmente a expressão dos genes da

via glicolítica e nem os da via de indução do biofilme, quando comparadas com as

outras condições de crescimento. Já a indução de hifas parece afetar os genes da via

de indução de biofilme que se apresentaram na média entre linhagens, pelo menos 1

vez mais expressos do que em leveduras crescidas em meio rico (YPD). Isso é

esperado para os genes das adesinas, como ALS3 e HWP1 (Garcia-Sanchez et al.

2004 e Nobile et al., 2006a). Ainda, verificou-se que as células formadoras de biofilme

possuíam expressão pelo menos 2x mais alta de ALS3 do que as células planctônicas,

crescidas em meio rico (YPD), corroborando análises prévias (Nobile e Mitchell, 2006),

(Zhao et al., 2006). Também foi observado que determinadas linhagens possuíam

menor ou maior plasticidade para se adaptar aos diferentes meios de cultura, como o

caso da L757 e SC5314, respectivamente, visto que o ruído na expressão dos genes

era muito maior na segunda do que na primeira (Ferreira et al., 2007). Esse fato sugere

ter implicações na patogenicidade das linhagens, mas estudos posteriores devem ser

feitos para confirmar essa hipótese.

Na via de indução de biofilme foi observado que a variação na expressão média

dos genes aumentava pelo menos 2 vezes na maioria das linhagens,

independentemente da condição de crescimento, em resposta ao sinal da diminuição

da expressão de TEC1. Esse fenômeno, previamente reportado por Lee, et al. (2002),

ocorre em pelo menos 10% da regulação transcricional de S. cerevisiae (240 genes). O

modelo trata de uma via na qual um gene regulador (TEC1) controla um segundo

regulador (BCR1) que se liga ou controla a expressão de diversos outros genes-alvo

(ALS3 e HWP1). Pequenas alterações nos níveis ou na atividade do regulador principal

são somadas às alterações nos níveis do segundo regulador e assim, quando o sinal

chega no destino, os genes-alvo devem responder com uma variação em sua

expressão muito maior proporcionalmente ao sinal inicial. Isso fica claro ao observar o

comportamento da expressão dos genes da via, da linhagem L298, nas 5 condições de

crescimento que teve como valor médio da expressão de TEC1, BCR1, HWP1 e ALS3

respectivamente: -1, -2, -4 e -8.

148

CAPÍTULO 6: CONCLUSÕES

149

Capítulo 2:

1- A análise filogenética Bayesiana, utilizando 166 seqüências de rDNA 18S dos

principais representantes do reino Fungi corrobora a hipótese dos Discomycetes na

base da evolução dos ascomicetos filamentosos, com alto suporte estatístico

(probabilidade a posteriori = 1). Ainda, diversos Discomycetes encontram-se

espalhados entre os outros grupos de ascomycetos filamentosos, sugerindo que

mantenham características ancestrais;

2- O ancestral do grupo dos Ascomicetos filamentosos não pode ser fomador de líquen

visto que os representantes da ordem Pezizales (que não se associam às algas e

cianobactérias) são os primeiros a divergir dentre os Discomycetes;

3- A hipótese de relógio molecular global foi rejeitada para o gene rDNA 18S devido a

heterogeneidade de taxas deste gene no reino Fungi, mas confirmou a existência de

relógios locais, como no grupo dos Plectomycetes;

4- As datações dos principais eventos de radiação do filo Ascomycota utilizando o

método de “penalized likelihood” e a calibração por registro fóssil corroboraram o

cenário proposto por análises de multi-proteínas, onde esses eventos teriam ocorrido

na era Proterozóica e não na era Paleozóica;

Capítulo 3:

1- As quantificações por cristal violeta e XTT mostraram diferenças na capacidade de

adesão e formação de biofilme de linhagens de Candida albicans, como já descrito

para espécies diferentes do gênero Candida;

2- A enolase foi identificada por espectrometria de massa, como sendo uma das

principais proteínas da matriz de biofilme. Análises de sua seqüência sugerem que a

proteína pode ser glicosilada e fosforilada, mesmo não possuindo sinal para secreção

por via clássica;

150

3- De acordo com a observação da rápida degradação da enolase secretada por

células planctônicas e da confirmação da presença da enolase na matriz por “western

blot”, acredita-se que a enolase do biofilme deva receber alguma modificação pós-

traducional para então ser secretada por via não-clássica. Contudo, a função da

enolase fora da célula permanece desconhecida;

4- A análise de dados de imunofluorescência e citometria de fluxo confirma a presença

de enolase nas camadas mais internas da parede celular, principalmente em células

jovens. Isto sugere que a enolase pode ser mais ativamente secretada ou “descamada”

a partir da superfície de brotos em crescimento;

5- A expressão da enolase, assim como das enzimas da via glicolítica, manteve-se

relativamente inalterada, sugerindo que as linhagens de C. albicans não regulam

diferencialmente estes genes em diferentes condições de crescimento, a ponto de

serem detectadas por nossa metodologia de estudo;

6- A diminuição exponencial da expressão de genes codificadores de adesinas em

resposta a diminuição da expressão de genes regulatórios da formação de biofilme,

sugere que a regulação ocorra por “feedforward”.

Capítulo 4:

1- Foi identificado um novo alelo do gene HWP1 em linhagem isolada de candidemia

(L757). A análise da seqüência protéica mostrou a ausência de 3 regiões repetitivas

ricas em serinas e treoninas responsáveis pela interação intramolecular e

intermolecular. Isso sugere que a proteína codificada por este alelo seja deficiente na

interação interproteínas na superfície celular e na adesão ao epitélio de mamíferos;

2- A linhagem L757, que é homozigota para o novo alelo de H WP 1, é

conseqüentemente menos eficiente na formação de biofilme e indução de hifas,

sugerindo que a mesma possa ser menos patogênica em infecções.

151

CAPÍTULO 7: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO 8: PUBLICAÇÕES

A.S.A. Melo et al.

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The Candida albicans AAA ATPase homologue

of Saccharomyces cerevisiae Rix7p (YLL034c)

is essential for proper morphology, biofilm

formation and activity of secreted aspartyl

proteinases

A.S.A. Melo

, A.C.B. Padovan

, R.C. Serafim

, L. Puzer

A.K. Carmona

, L. Juliano Neto

, A. Brunstein

and M.R.S. Briones

Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,

Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de São Paulo,

São Paulo, SP, Brasil

Corresponding author: M.R.S. Briones

E-mail: [email protected]

Genet. Mol. Res. 5 (4): 664-687 (2006)

Received June 26, 2006

Accepted September 4, 2006

Published November 9, 2006

ABSTRACT. Proper morphology is essential for the ability of Can-

dida albicans to switch between yeast and hyphae and thereby sustain

its virulence. Here we identified, by differential screening, a novel C.

albicans AAA ATPase encoding gene, CaYLL34 (RIX7), with enhanced

expression in hyphae. Phylogenetic analysis suggests that CaYLL34

belongs to a “VCP-like” subgroup of AAA ATPases essential for yeast

viability and contains a bipartite nuclear localization signal. Inactivation

of one copy of CaYLL34, by the URA-Blaster method, generated the

heterozygous mutant strain M61. This strain has severe phenotypic al-

terations, such as a highly increased vacuole, abnormal cell shape and

reduced growth in different conditions. Also, major pathogenicity fac-

tors are affected in M61, for instance, a significant decrease of hypha

formation (>90%), surface biofilm adhesion (86%) and secreted aspar-

tyl proteinase activity (76.5%). Our results show that the partial impair-

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Candida albicans Rix7/YLL34 gene

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ment of CaYll34p cellular levels is sufficient to affect the proper cellular

morphology and pathogenicity factors and suggest that this protein is

required for biogenesis of ribosomal subunits. Accordingly, we propose

that the product of CaYLL34 could be tested as a novel target for anti-

fungal drugs.

Key words: AAA ATPases, Candida albicans, CottonPrep, YLL34,

RIX7, Differential screening, Insertional mutagenesis

INTRODUCTION

The yeast Candida albicans is commensal in humans, where it predominantly colo-

nizes the mucosal surfaces of the gastrointestinal tract. However, especially in immunocompro-

mised patients, C. albicans develops into an opportunistic pathogen that can cause superficial

as well as life-threatening disseminated infections (Odds, 1988; Fidel and Sobel, 1996). The

opportunistic infections in immunocompromised hosts represent an increasingly common cause

of mortality and morbidity (Fisher-Hoch and Hutwagner, 1995; Groll et al., 1998). C. albicans

can switch its morphology from budding yeast to pseudohyphae (chains of elongated cells with

visible constrictions at the sites of septa) and hyphae (linear filaments without visible constric-

tions at the septa) (Mitchell, 1998). The pathogenicity of C. albicans seems to be dependent on

this capacity for yeast to hypha transition and also, the formation of biofilms and secretion of

aspartyl proteinases.

Hyphae are considered the more invasive forms because they are frequently identified

in infected tissues and because mutant strains defective in hyphal growth are avirulent (Leberer

et al., 1996; Lo et al., 1997; Stoldt et al., 1997). Yeast to hyphae transition depends on environ-

mental conditions and could be controlled by transcriptional regulators such as the products of

genes TUP1, CPH1 and EFG1 (Braun and Johnson, 2000). TUP1 represses genes responsible

for carrying out filamentous growth and EFG1 and CPH1 (an orthologue of Saccharomyces

cerevisiae STE12) are putative transcriptional activators of hyphae (Braun and Johnson, 2000).

Under different growth conditions, a network of signalling pathways is employed to simulta-

neously assess the multiple nutrients available, cell density and other growth conditions. The

integrated output of these pathways determines gene expression and dimorphic transition (Liu,

2001). Different signalling pathways and transcriptional factors seem to converge to regulate

the transcription of a common set of hyphal-specific genes (Liu, 2001). Several genes have

been identified whose expression is induced during hyphal growth. Such genes include HYR1,

ALS3, HWP1, and ECE1, most of which encode cell wall proteins. HYR1 is activated in re-

sponse to hyphal development (Bailey et al., 1996). ECE1 is associated with cell elongation

(Birse et al., 1993). ALS3 is a hyphal-specific gene and its feature suggests that Als3p is a cell

surface glycoprotein (Hoyer et al., 1998). HWP1 encodes a hyphal-specific surface protein that

is implicated in adhesion to human oral epithelial cells (Staab et al., 1999).

Biofilm formation by Candida spp is a major pathogenicity factor and has gained con-

siderable interest recently (Calderone and Gow, 2002). Infections by Candida involve biofilm

formation on implanted devices such as indwelling catheters and prosthetic heart valves (Haw-

A.S.A. Melo et al.

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ser and Douglas, 1994; Douglas, 2003). Biofilms of C. albicans formed in vitro on catheter

material consist of matrix-enclosed microcolonies of yeasts and hyphae, arranged in a bilayer

structure. These biofilms seem to contribute to multiple resistance to drugs in current clinical

use, including amphotericin B and fluconazole (Baillie and Douglas, 1999). The extent of resis-

tance varies according to the Candida species and the nature of the material on which the

biofilm is formed, and apparently, the bloodstream is constantly seeded with cells from within

the biofilm formed on implanted devices.

Another important pathogenicity factor of C. albicans is the extracellular proteolylic

activity of the secreted aspartyl proteinases (SAPs) which are encoded by at least 10 genes

whose expression varies with morphogenesis and environment (Hube et al., 1994; Monod et al.,

1998; Naglik et al., 1999). These SAPs have different pH optima and specificity for distinct

substrates and participate in host protein digestion for nutritional supplement, escape from im-

munity, adhesion and tissue degradation during invasion (Hube et al., 1998; Koelsch et al., 2000).

Inactivation of SAP1 to SAP3 genes influences the course of superficial infections, while SAP4

to SAP6 are important for systemic infections (Sanglard et al., 1997; De Bernardis et al., 1999;

Schaller et al., 1999; Felk et al., 2002). These proteinases are expressed in distinct stages of

systemic infections and are responsible for the damage of different tissues and organs (Felk et

al., 2002). Although all factors that regulate the expression of each specific proteinase have not

yet been identified, these authors propose that impaired proteinase expression is responsible for

the decreased virulence of hypha defective mutants.

Differential screening has been used to search for differentially expressed genes in

distinct phases of organismal development (Van De Loo et al., 1995; Thipyapong et al., 1997).

Also, antifungal drugs currently used are based on a relatively small number of targets, and

therefore, the characterization of novel, fungal-specific functions, preferentially related to fun-

gal pathogenicity, could contribute to the discovery of new drug targets (Whiteway, 2000).

Here, to discover novel genes differentially expressed in C. albicans hyphae, we used a differ-

ential screening method and characterized CaYLL34, a gene with enhanced expression in hy-

phae of C. albicans and a putative member of the AAA ATPase (

ATPase associated with

various cellular

activities) family. Insertional inactivation of this gene leads to impairment of

several cellular functions related to morphology and pathogenicity.

MATERIAL AND METHODS

Candida albicans genomic library construction

Candida albicans ATCC 90029 strain was grown on a rotary shaker at 30°C in YPD

medium (1% yeast extract, 2% dextrose, 2% peptone) overnight. Total DNA was extracted

using the small scale and quick protocol (Wash et al., 1994) and fragmented by sonication.

Fragments from 1 to 4 kb were isolated by preparative agarose electrophoresis, ligated in pUC18

vector and used to transform E. coli DH5-α. DNA from 552 clones was extracted using a

“CottonPrep” method, a modification of the MiniPrep protocol (Sambrook et al., 1989) adapted

for 96-well plates. Briefly, after growth for 16 h at 37ºC, lysis in a 200-µL solution II (0.2 N

NaOH, 1% SDS) and neutralization in a 200-µL solution III (3 M potassium, 5 M potassium

acetate), the plates were incubated for 30 min on ice. A small amount of hydrophobic cotton

was added to each well and the plates were centrifuged for 45 min at 4,000 rpm at 10°C and 250

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

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µL of the supernatant was collected, transferred to other 96-well plates (1 mL capacity) con-

taining 200 µL cold isopropanol and briefly homogenized. After plate centrifugation at 4,000 rpm

for 20 min at 10°C, the supernatant was discarded and the plate inverted on absorbent paper.

Pellets were washed with 200 µL cold ethanol, centrifuged for 15 min at 4,000 rpm at 10°C and

dried at 60°C for 15 min, and plasmids were suspended in 20 µL sterile water and homogenized

by vortexing for 3 min.

Differential screening

Plasmids from individual clones of the genomic library described above were spotted on

six Hybond-N+ membranes using a dot-blot vacuum system. These membranes contained as

controls an actin gene clone, a plasmid with no inserts (pUC18) and a dot with no plasmid.

Radiolabeled yeast and hyphal cDNA probes were prepared from total RNA by RT-PCR (de-

scribed below) in which dCTP was substituted by [α-

P]-dCTP. The six library membranes

were incubated with 20 mL hybridization solution (6X SSC, 50% formamide, 5X Denhardt’s

solution, 1% SDS, and 1.5 mg salmon sperm DNA) at 42°C for 2 h. Yeast cDNA probe was

added and the membranes were hybridized overnight. Membranes were washed three times for

10 min at room temperature with 1X SSC/1% SDS and exposed to X-ray film for 48 h. The

second hybridization, using hyphal cDNA probe, was performed after the removal of yeast

probe checked by autoradiography. Autoradiograms were scanned and analyzed by the

ImageQuant program (Molecular Dynamics) and data processed using Excel (Microsoft).

Probes for library screening were prepared from yeast and hyphal cDNA. For this, C.

albicans ATCC 90029 was grown on YPD medium overnight at 30ºC with constant agitation to

produce yeast cells. To obtain hyphae, yeasts were diluted to 1.0 x 10

cells/mL in fetal bovine

serum containing 5 mg/mL dextrose and incubated at 37°C with agitation for 3 h. Hyphal induc-

tion was 80% (germ tube formation). RNA was extracted from 1.5 mL of yeast or hyphal

culture where cells were treated with 200 µL 1 M sorbitol/Zymoliase (20,000 IU) and incubated

at 37°C for 120 min with mild agitation. After centrifugation the pellets were resuspended in 1

mL Trizol

(Life technologies) and the RNA extracted according to the manufacturer. After

checking integrity by agarose gel electrophoresis, RNA samples were treated with DNAse-

RNAse free (Promega).

Yeast and hyphal cDNA were produced using Superscript

II enzyme (Life Technolo-

gies) following the manufacturer’s protocol. Each reaction contained 1 µg of total RNA, 1 µL

oligo dT

12-18

, 50 mM and 1 µL 10 mM dNTP in 10 µL final volume. Reactions were incubated at

65°C for 5 min and cooled on ice. To each reaction tube, 10 µL of the following mixture was

added: 4 µL of 5X first-strand buffer, 2 µL 10 mM MgCl

, 2 µL 0.1 M DTT, 1.4 µL RNAguard

(Amersham Pharmacia Biotech), and 1 µL Superscrip

II. Reactions were incubated at 42°C

for 50 min and then at 70°C for 15 min, and the resulting cDNAs stored at -20°C.

Reverse transcriptase-polymerase chain reaction

Primers for amplification of CaYLL34 3’ region were YLL34F (5’-ACG CCG TGT

ATT ATT TTC TTT G) and YLL34R (5’-ATT TCT TGT ATT TTT GGG TTT GG), and for

amplification of ACT1 (C. albicans actin gene) primers ACT1F (5’-AGA ATT GAT TTG GCT

GGT AGA GAC) and ACT2R (5’-AGA AGA TGG AGC CAA AGC AGT AAT) were used.

A.S.A. Melo et al.

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RT-PCRs were performed in a total volume of 25 µL with 1 µL cDNA (approximately 2.5 ng for

radiolabeling and 0.06 ng for expression analysis), 1 U Taq DNA pol (Gibco), 25 ρmol of each

primer, 1X Taq buffer, 0.8 mM each dNTP and 4 mM MgCl

. Cycling conditions were as

followed: 94°C for 5 min; 35 cycles of 94°C for 1 min, 50°C for 1 min, 72°C for 1:30 min, and

final extension at 72°C for 5 min. Products of these reactions were separated by ethidium

bromide/agarose gel electrophoresis and gel images were scanned. Amplicons were quantified

using the ImageQuant (Molecular Dynamics) and Excel (Microsoft) programs and band inten-

sities normalized using actin amplification as control.

DNA sequencing and contig assembly

For sequencing, clones of interest were subcloned because the average insert sizes

were above 2,000 bp. Clone plasmids were extracted and fragmented by sonication. Fragments

between 300 and 1,000 bp were isolated from preparative 1% agarose gels, ligated into pUC18

and cloned in E. coli DH5-α. Inserts were sequenced using dideoxy-nucleotide BigDye Termi-

nators (Applied Biosystems) in an ABI377/96 automated sequencer. Contigs were assembled

using Phred-Phrap-Consed programs (Ewing and Green, 1998; Ewing et al., 1998; Gordon et

al., 1998).

Computational sequence analysis

Nucleotide sequences were submitted to BLAST analysis (Blastn and Blastx) at the

NCBI - National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) and Can-

dida Stanford Genome - Stanford Genome Technology Center (http://sequence-www.stanford.

edu/group/candida/search.html) sites. To search for conserved functional motifs, protein se-

quences were analyzed at the Pfam website, a database of protein families and HMMs, Wash-

ington University in St. Louis (http://pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml), and to search for trans-

membrane domains, sequences were submitted to CBS, Center for Biological Sequence Anal-

ysis, BioCentrum-DTU, Technical University of Denmark (http://www.cbs.dtu.dk/services/

TMHMM). The amino acid sequence of the CaYLL34 protein was obtained using EditSeq

program (DNAstar, Madison, WI, USA) and the standard codon usage except for CTG, which

encodes serine instead of leucine in C. albicans (Santos and Tuite, 1995). Sequences were

aligned using MEGALIGN program (DNAstar) and the Clustal method (Higgins and Sharp,

1989). The alignments and the corresponding accession number tables are available upon re-

quest to: [email protected].

Phylogenetic inference

The amino acid sequence of CaYLL34p (GenBank accession No. AAR84642) was

used as query on TBLASTN search. The amino acid sequences of the 100 best hits were

selected and aligned by eye using SEAVIEW (Galtier et al., 1996). Removal of sequences with

large number of gaps resulted in the alignment of 505 positions from 75 sequences, excluding

gaps. Phylogenetic tree was inferred using MrBayes program (Huelsenbeck and Ronquist,

2001) with the JTT model (Jones et al., 1992) for amino acid substitution with gamma distribu-

tion (Yang, 1994), alpha shape parameter = 0.899821 and 95% confidence interval of 0.794562-

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

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1.020755. The chain length was 100,000 and four simultaneous chains were run and sampled

every 100 generations. A consensus tree was built from 600 trees corresponding to 60,000

generations for which the likelihood scores converged to a stable value. Bootstrap values were

obtained from 100 pseudo-replicates generated by the neighbor-joining method in PAUP 4.0.

(Swofford, 1998).

Candida albicans transformation and isolation and characterization of mutants

Transformation was performed using a slight modification of the lithium acetate method

described elsewhere (Fonzi and Irwin, 1993). Briefly, C. albicans CAI4 (ura3∆::imm434/

ura3∆::imm434) was incubated in YPD-uridine at 30°C for 48 h. A single colony was isolated

and used to inoculate 2 mL YPD-uridine. After growth overnight at 30°C, 0.5 mL of this suspen-

sion were transferred to 50 mL YPD-uridine and incubated at 30°C for 6 h. When the absorb-

ance (600 nm) increased 4-fold, cells were pelleted by centrifugation, washed in sterile water

and resuspended in 0.5 mL TE/LiOAc. For transformation, 5 to 10 µL cassette DNA and 10 µg

salmon sperm DNA were added to 0.1 mL of competent cells which were prepared as de-

scribed above, and then incubated for 30 min at room temperature. After addition of 0.7 mL

PLATE mix the suspension was incubated for 16 h at room temperature. The suspension was

incubated at 42°C for 1 h and cells pelleted (30 s) were resuspended in 0.1 mL sterile water,

plated on SD-agar and incubated for 5 days. After replating for 48 h, the DNA of transformants

was extracted.

Southern blot analysis was performed using genomic DNA of ATCC 90029, CAI4 and

M61 that was digested with BamHI and BglII. After separation by agarose gel electrophoresis,

fragments of the digestion products were transferred to a nylon membrane as described else-

where (Sambrook et al., 1989). A sequence of CaYLL34 3’ region labeled with [α-

P]-dCTP

using Random Primers DNA Labeling System (Life Technologies) was used as a probe (555

bp) (Figure 6A). This sequence was also present in cassette construction to CaYLL34 inactiva-

tion, and therefore hybridizes to the cassette and the wild-type gene.

Growth curves of the ATCC 90029, CAI4, L296, and M61 strains were determined for

cultures in YPD agar at 30°C for 72 h and then incubated in 2X YPD overnight in a shaker at

200 rpm at 37°C. The cultures were diluted with fresh medium and the cell suspensions were

set to 0.5 optical density (OD) at 600 nm. An inoculum of 5 mL of each strain was added to 45

mL of 2X YPD, in 2 replicates. Afterward, one replicate was incubated at 30°C and the other at

37°C in a shaker at 200 rpm. To estimate the doubling time of strains in both growth conditions,

the cultures were measured (OD

600

) every 3 h in the first 30 h. After that, the cultures were

measured at 36 and 48 h.

Counter-selection was used to select Ura3

–

auxotrophs as described elsewhere [Fonzi

and Irwin, 1993 #82], on minimal medium containing 5-fluoroorotic acid (5-FOA, 625 µg/mL)

and uridine (100 µg/mL). Prior to selection, M61 mutant was plated on YPD medium supple-

mented with uridine and incubated for 48 h at 30°C. One individual colony was taken from the

plate and suspended in H

O (1 mL). Dilutions of the suspension were spread on SD with uridine

to determine the number of colony forming units present and portions were spread on 5-FOA

medium to select Ura3

–

cells. The 5-FOA plates were scored after 3-4 days of incubation at

30°C. DNA of some colonies was extracted and submitted to PCR with primers URA3-F and

URA3-R to confirm URA3 split.

A.S.A. Melo et al.

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Microscopy analysis and phenotypic tests for species identification

To analyze the phenotypic changes of M61 mutant strain, CAI4 (parental strain) and

M61 were grown in YPD, SD 50 (minimum medium containing 50 mM glucose), and fetal

bovine serum (FBS), overnight at 37°C in a shaker. The morphology was examined by phase-

contrast microscopy (BX 60 System Microscope, Olympus Optical Co., Tokyo, Japan) and

photographed (PM 30 Automatic Photomicrographic System, Olympus Optical Co.). Micro-

morphology analysis was used to confirm species identification, ATCC 90029, CAI4 and M61

strains were cultured for 48 h in Sabouraud-Dextrose agar (Difco Laboratories, Detroit, MI,

USA). One colony of each strain was striated on cornmeal agar Tween-80, covered with ster-

ilized coverslips and incubated at 25-28°C for 48 to 96 h. The cultures were examined daily with

an optical microscope (phase-contrast) (BX 60 System Microscope, Olympus Optical Co.)

using 10X and 40X lenses to observe blastoconidia, artroconidia, hyphae, pseudohyphae, and

chlamydoconidia. The presence of chlamydoconidia in all three cultures was confirmatory for

C. albicans identification. Species identification was further confirmed for these three strains

by culturing on CHROMagar Candida medium (CHROMagar, Paris, France), and all of them

produced green colonies, which is diagnostic of C. albicans. Classical biochemical analysis of

sugar assimilation and fermentation also confirmed the C. albicans profile in all three strains.

Biofilm production measurement by crystal violet staining and XTT reduction assays

The growth conditions and biofilm formation for crystal violet staining and XTT (tetra-

zolium salt 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino) carbonyl]-2H-tetrazolium

hydroxide) reduction assay used in this study were adapted from that described elsewhere (Jin

et al., 2003). The ATCC 90029, CAI4, L296, and M61 strains were cultured in YPD agar at

30°C for 48 h and then incubated in SD 110 mM glucose broth overnight on a shaker at 200 rpm

for 18 h at 37°C. The cultures were harvested and washed twice with PBS, the cell suspensions

were set to an absorbance of 0.4 at 520 nm, and 100 µL of these suspensions were tranferred to

a 96-well cell culture plate. No cells were added to one row to be used as control. The plate was

incubated at 37°C for 1 h 30 min at 75 rpm (adhesion period). The wells were washed twice

with PBS and 100 µL of SD 110 mM glucose was added. The plate was incubated at 37°C for

66 h at 75 rpm (biofilm formation).

For the crystal violet staining, each well was washed twice with PBS and dried for 1 h

at room temperature. Next, each of the washed wells was stained with 110 µL of 0.4% aqueous

crystal violet solution for 45 min. Afterwards, the wells were washed four times with 200 µL MilliQ

sterile water and destained with 200 µL of 95% ethanol. After 45 min, 100 µL of destaining solution

of each sample was transferred to a new plate that was measured with a microtiter plate reader

(Multiskan MS, Labsystems, Finland) at 540 nm. The absorbance values of the controls were

subtracted from the values of the test wells to minimize background interference. Two inde-

pendent experiments were performed with 7 replicates for each strain (a total of 14 replicates).

For the XTT reduction assay, an XTT solution was prepared (1 mg/mL in PBS) and

filter-sterilized through a 0.22-µm pore size filter. Menadione solution (0.4 mM in acetone) was

filtered and mixed with XTT solution at a ratio of 1 to 5 by volume before the assay. After

biofilm formation, the wells were washed three times with 200 µL PBS. To each well, 200 µL of

PBS and 12 µL of the XTT-menadione solution were added. The culture plate was incubated in

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

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Genetics and Molecular Research 5 (4): 664-687 (2006) www.funpecrp.com.br

the dark for 2 h at 37°C, and then, 100 µL of solution of each sample was transferred to a new

plate and measured with a microtiter plate reader at 492 nm. The absorbance values of the

controls were subtracted from the values of the test. The experiment was performed using 7

replicates for each strain.

Aspartyl proteinase assays

The growth conditions for biofilm induction was modified from that described by Haw-

ser and Douglas (1994). The ATCC 90029, CAI4, L296, and M61 strains were cultured in SD

50 mM (YNB medium supplemented with 50 mM glucose) plates at 30°C for 72 h. A loopful

was inoculated in 20 mL of SD 50 mM and cultured on a shaker at 37°C for 24 h at 70 rpm. The

cells were washed twice with PBS and suspended to an absorbance of 0.8 at 520 nm. One

milliliter of each cell suspension was added to the wells of 24-well tissue culture plates and

incubated for 1 h 30 min on a shaker at 37°C (adhesion period) at 70 rpm. The wells were

washed once with 2.5 mL PBS and 1 mL of SD 50 mM was added. For the CAI4 strain, the

medium was supplemented with 0.1 M uridine. The plates were incubated in a shaker at 37°C

for 48 h at 70 rpm to allow biofilm formation. The medium was changed after 24 h. The medium

was removed and 100 µL PBS was added to resuspend the biofilms. The biofilms of 8 wells of

each stain were transferred to an Eppendorf tube and centrifuged briefly. Fifty microliters of the

supernatant was used in the aspartyl proteinase assays.

The internally quenched fluorogenic peptide Abz-AIKFFARQ-EDDnp flanked by ortho-

aminobenzoic acid (Abz) and N-[2,4-dinitrophenyl] ethylenediamine (EDDnp) was used to test

the aspartyl proteinase activity following the method previously described (Pimenta et al., 2001). The

peptide was synthesized by solid-phase in an automated bench-top simultaneous multiple solid-phase

peptide synthesizer (PSSM 8 system, Shimadzu, Japan) as described elsewhere (Hirata et al.,

1994). The molecular weight and purity of the synthesized peptide was checked by amino acid

analysis and MALDI-TOF mass spectrometry, using a TofSpec-E from Micromass, Manches-

ter, UK. Stock solutions of the substrate were prepared in DMSO, and the concentration was

measured spectrophotometrically using the molar extinction coefficient of 17,300 M

-1

365 nm. Abz-AIKFFARQ-EDDnp (5 µM) was assayed in 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.0,

at 37°C. The reaction was followed by measuring the fluorescence at λ

= 320 nm and λ

420 nm continuously in a Hitachi F-2500 spectrofluorometer. The slope was converted into

nmols of substrate hydrolyzed per minute based on a calibration curve obtained from the com-

plete hydrolysis of peptide. For inhibition studies, 2 µM of pepstatin was added to the reaction.

RESULTS

Differential screening and clone selection

To identify genes that are differentially expressed in yeast-to-hypha transition, we used

a differential screening method where six Hybond-N+ membranes were spotted with 540 clones

of C. albicans genomic library and screened sequentially with radiolabeled yeast and hyphal

cDNA probes as previously described (Melo et al., 2003). Hybridization signals were quantified

by scanning of the autoradiogram and analysis by the ImageQuant program (Molecular Dynam-

ics) with signal normalization using actin gene sequences. Putative differentially expressed clones

A.S.A. Melo et al.

672

Genetics and Molecular Research 5 (4): 664-687 (2006) www.funpecrp.com.br

were blotted in another membrane for confirmatory hybridization which revealed that three

clones, G3, D4 and E4, had 1.7-, 1.5- and 3.1-fold increased signals with the hyphal probe,

respectively (Figure 1). Clone E4 was selected for further analysis because it was the only

clone of our set to show an estimated hyphal expression level above 2-fold compared to yeast

forms. The full-length sequence of clone E4 insert is 2274 bp and was determined by shotgun

sequencing. The contig of clone E4 was assembled using 208 reads ranging between 500 and

600 bases and yielding a high-quality contig sequence (phred score >40 as calculated by Phred-

Phrap-Consed programs) (Ewing and Green, 1998; Ewing et al., 1998; Gordon et al., 1998).

Figure 1. Differential gene expression of Candida albicans calculated from membrane VII used for differential screening.

The intensity of the two images produced by membrane VII (A and B) was analyzed by ImageQuant (Molecular Dynamics)

program, using actin gene expression as reference. Positive values on scale indicate 2- and 4-fold increases in gene

expression in hyphae and negative values indicate increased gene expression in yeast forms. Clones G3, D4 and E4 contain

genes with increased expression in hyphae.

To identify genes contained in clone E4, potential open-reading frames (ORF) were

sought using the “Find ORF” tool in the NCBI website. Two ORFs were found in clone E4

(frame -3). The first ORF, E4.1, corresponded to 507 bp in the central region (positions 1142 to

1648) and another ORF, E4.2’, was in the contig end, positions 1 to 376 (Figure 2). Blastx

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

673

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analysis of ORF E4.1 showed no significant similarities to GenBank whereas ORF E4.2’ showed

a significant similarity with the Saccharomyces cerevisiae YLL034c, which encodes for a

protein that belongs to the AAA ATPase family and is required for cell viability (e-value = 4 x 10

, 71% identity). ORF 4.2’ also matched with contig6-2158 of the Stanford University Candida

albicans Genome Project (SUCGP), which contained the preliminarily annotated YLL34 gene.

These results suggest that ORF 4.2’ corresponds to a part (376 bp) of gene YLL34 included in

contig6-2158 (SUCGP).

Figure 2. Diagram of assembly by alignment of several different clones containing YLL34 gene sequences. These

sequences were obtained from two strains of Candida albicans ATCC 90029 (this study) and C. albicans SC5314 (Stanford

University Candida Genome Project, SUCGP), and S. cerevisiae YLL034c open-reading frame (ORF). The SUCGP

“YLL34 gene” at the time of assembly 6 preliminary annotation.

Subsequently, the complete YLL34 ORF was obtained from analysis of contig6-2158 of

SUCGP (11,352 bp) using the “Find ORF” program. Five ORFs were found at frame +2. ORFs

1, 2 and 3 were not significant (less than 100 codons) and ORF 4 (positions 743 to 2347) had

1605 bp but was of no interest because it did not overlap clone E4. ORF 5 had 2484 bp (positions

7877 to 10,360) encoding a putative peptide of 827 amino acids and overlapping with 100%

identity the 575 bp at the 5’ end of clone E4, containing ORF E4.2’. The complete YLL34 ORF

was therefore assembled using the high quality sequence of clone E4 and the contig6-2158. This

ORF corresponds to the gene we named CaYLL34 and has 2484 bp (Figure 2). The diagram in

Figure 2 also depicts the alignment between (1) Clone E4, (2) ORFs E4.1 and E4.2’, (3) contig6-

A.S.A. Melo et al.

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Genetics and Molecular Research 5 (4): 664-687 (2006) www.funpecrp.com.br

2158 (SUCGP), (4) our inferred CaYLL34 ORF, (5) the YLL34 gene annotated by SUCGP, and

(6) ScYLL034c ORF (GenBank Z31692). This result shows that the CaYLL34 ORF is fully

located in contig6-2158.

Characterization of the putative CaYLL34 gene product

The CaYLL34 ORF (GenBank accession No. AY493662) encodes a putative protein

of 827 amino acids and 91.8 kDa (Figure 3A) and was compared to similar proteins that belong

to the AAA ATPase family, namely, protein ScYLL034cp (837 amino acids, from GenBank

Z731339 and NP013066), S. cerevisiae valosin-containing protein (VCP) (NP010157), Homo

sapiens VCP (NP009057) and Schizosaccharomyces pombe AAA ATPase (NP596710) (Figure

3B). The pairwise identities between CaYll34p and these proteins were: 58.3% to ScYLL034cp,

37.2% to S. cerevisiae VCP, 36.7% to Homo sapiens VCP, and 29.3% to S. pombe AAA

ATPase. The alignment depicted in Figure 3B also suggests that the AAA ATPase family has at

least two groups of members containing two AAA motifs: one group containing the CDC48

domain (proteins 4 and 5, Figure 3B) and the other without a CDC48 domain (proteins 1, 2 and

3, Figure 3B). This analysis suggests that CaYll34p and ScYLL034cp are encoded by ortholo-

gous genes and that CaYll34p does not belong to the CDC48 plus, valosin group.

Analysis of CaYll34p using Pfam indicates the presence of two domains common to

the AAA ATPase family (P-loop) (Iyer et al., 2003). The scores of each domain were E = 2.7

x 10

-85

and E = 5.5 x 10

-89

respectively. These domains were localized between residues 229-

420 and 558-746 (Figure 3A). Other proteins similar to CaYLL34p were also submitted to Pfam

analysis. The VCP proteins contain two AAA ATPase domains and one CDC48 (cell division

protein 48) domain (Figure 3A). These results indicate that all of these proteins belong to the

AAA ATPase family.

Because the AAA ATPases are a vast family of very ancient and related proteins we

investigated whether CaYLL34p belongs to a subgroup within this family with a more specific

or defined cell role. One hundred members of AAA ATPases were considered in the analysis

from which 75 provided high-quality alignment with CaYll34p (available upon request to

[email protected]). This dataset was used as input for phylogeny inference using a Baye-

sian method. In Figure 4, the resulting phylogenetic tree depicts 9 major groups clustered by

function. At least two types, or groups, of plant, mammalian and nematode AAA ATPase are

observed while only one group of yeasts is present. The yeast group is most closely related to

the mammalian nuclear group, thus suggesting that CaYll34p might be located in the nucleus. So

far, no functions or properties have been attributed to this group of AAA ATPases in C. albi-

cans although the deletion of the S. cerevisiae homolog ScYLL034cp encoding gene is lethal in

haploid yeasts (El-Moghazy et al., 2000). In addition, the S. cerevisiae mutant rix7-1 is comple-

mented by YLL034c, and therefore, YLL34 and RIX7 are synonymous (http://db.yeastgenome.org/

cgi-bin/locus.pl?locus=Rix7, accessed December 10, 2004) (Cherry et al., 1998). Gene RIX7

encodes a member of the AAA ATPase family, which contains a bipartite nuclear localization

signal and which is required for biogenesis and nuclear export of 60S ribosomal subunits (Gadal

et al., 2001). Accordingly, CaYll34p has a potential bipartite nuclear localization signal (http://

bo.expasy.org/prosite/) in residues 165-182 at the N-terminus (Prosite sequence PS00015) (Hulo

et al., 2004) (Figure 3B). Our results suggest that CaYLL34 is an essential gene encoding an

AAA ATPase functionally related to “Mammalian type 2” and “Nematode type 2” (Figure 4)

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

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that may have a function related to RIX7 in ribosome biogenesis. Because CaYll34p has only

30-40% identity to human VCP-like AAA ATPases, it may be possible in the long run to find

drugs that will interfere with CaYll34p function but not with the human homologs.

Figure 3. Sequence analysis of the putative CaYll34p protein. In A the two AAA ATPase domains of CaYll34p (216

amino acids each) are underlined. In B depiction of Pfam HMM search result of 1) CaYll34p, 2) ScYLL034cp, 3) S.

pombe AAA ATPase (gi|19113502|ref|NP_596710.1), 4) Homo sapiens valosin containing protein (VCP) (gi|6005942|ref|

NP_009057.1) and 5) S. cerevisiae VCP (gi|6320077||NP_010157.1). In all of these proteins, two AAA ATPase motifs

of 216 amino acids were found. The e-value of these matches were e<1.1 x 10

-82

. CDC48 motif matched only to VCP

proteins. Bipartite nuclear localization signals are present only in CaYll34p and ScYLL034cp (RIX7) as determined using

Prosite search (http://bo.expasy.org/prosite/). The sequences of CaYll34p nuclear localization signals (KRKAKGLAKT

QLKKQKR) and the corresponding ScYLL034cp (RIX7) (KKSKKRSKEGTCKVKRQKIK) are indicated in the corre-

sponding domains.

A.S.A. Melo et al.

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Figure 4. Phylogenetic relationship of CaYLL34 to other members of AAA ATPases. Phylogenetic analysis based on

amino acid sequences of 75 members of the AAA ATPases identifies 9 subtypes, namely: plant types 1 and 2, nematode

types 1 and 2, mammalian types 1 and 2, insect, yeasts and Archaea. These subtypes represent clusters by function.

Numbers in italics indicate the bootstrap frequency in 100 pseudo-replicates and numbers in parentheses indicate the

posterior probabilities obtained by Bayesian analysis using MrBayes program (Huelsenbeck and Ronquist, 2001). The

phylogeny was inferred using amino acid sequences and 505 aligned positions, excluding gaps, and JTT amino acid

substitution model (Jones et al., 1992). VCP = valosin containing protein.

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

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Differential expression of CaYLL34

The increased expression level of CaYLL34 in hyphae was confirmed by RT-PCR.

Specific primers for CaYLL34 were designed based on the regions for this gene contained in

clone E4 (ORF 4.2’) (Figure 2), yielding an expected amplicon of 432 bp, using yeast and hyphal

cDNAs as templates and actin cDNA amplification as positive control (ACT1, 443 bp) (Figure

5). We observed that the expression of CaYLL34 is 3.6-fold increased in hyphae compared to

yeast forms, as estimated by densitometry in 14 independent experiments. The typical ampli-

cons used are shown in Figure 5A and the densitometry was performed using the ImageQuant

program and normalization with actin amplicons. This result confirmed the analysis shown in

Figure 1 and shows the consistency between estimates obtained by autoradiogram densitometry

and RT-PCR. The cDNA concentration used in this RT-PCR (approximately 0.06 ng) was

standardized by preliminary assays (data not shown) in order to yield amplicons that are in the

linear range of the PCR and therefore will not saturate the signal and still be visible in the

ethidium bromide/agarose gel electrophoresis. In Figure 5B cDNA control with mock RT reac-

tion shows that bands in Figure 5A are mRNA derived and not due to genomic DNA contami-

nation.

Figure 5. Semi-quantitative RT-PCR of CaYLL34 gene visualized on agarose gel. Yeast and hypha cDNA of C. albicans

ATCC 90029 were diluted 1:400 and 1 µL was used in each sample as indicated above the numbers. Actin gene amplifica-

tion was used to normalize the signal (in A, lanes 4 and 5). In panel A, primers YLL34F and YLL34R amplified part of

CaYLL34 gene in yeasts (Y) and hyphae (H) (lanes 1 and 2) and primers ACT1 and ACT2 amplified part of actin gene in

yeasts (Y) and hyphae (H) (lanes 4 and 5), and lane 3 (M) is 100-bp ladder. In panel B, ACT1 and ACT2 amplified part

of actin gene in an RT-dependent reaction only (RT) and not in mock reactions without RT (N) (lanes 2 to 5, lane 1 is

100-bp ladder) to show that the RNA preparations of yeast (Y) and hyphae (H) used in RT-PCR analysis are not affected

by contamination with genomic DNA.

Partial disruption of CaYLL34

To investigate the role of CaYLL34 in C. albicans, we inactivated one allele of the

gene in the diploid parental strain C. albicans CAI4 (Ura

–

), consequently generating the mutant

A.S.A. Melo et al.

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Genetics and Molecular Research 5 (4): 664-687 (2006) www.funpecrp.com.br

strain M61. Inactivation was carried out using the “URA-Blaster” method (De Backer et al.,

2000). For this we generated a URA3-HisG-CaYLL34 cassette in two steps (Figure 6A). Firstly,

a fragment corresponding to 420 bp of the 5’ end of the CaYLL24 gene was amplified (from C.

albicans genomic DNA), digested with BglII and BamHI and ligated to BglII digested plasmid

p5941 (Fonzi and Irwin, 1993), thus generating plasmid pYLL34-2. Secondly, a fragment corre-

sponding to 570 bp of the 3’ end of CaYLL34 was amplified (from C. albicans genomic DNA),

digested with BglII and BamHI and ligated to BamHI digested pYLL34-2, thus generating

plasmid pYLL34-4. Digestion of pYLL34-4 with BglII and BamHI released the HUH-CaYLL34

cassette containing respectively the 250 bp 5’ end region of CaYLL34, HisG, Ura3 gene, HisG,

and 555 bp of the 3’ end region of CaYLL34.

Figure 6. Schematics of the insertional inactivation of CaYLL34 and verification of mutant genotype. In panel A,

construction of HUH-YLL34 cassette with resulting expected integration and location of primers HisG-F and C21583-R.

Numbering is relative to the 5’ end of contig6-2158 of the Stanford University Candida Genome Project. In panel B,

amplicon using primers HisG-F and C21583-R in genomic DNA of Candida albicans strains where HUH-YLL34 inte-

grated correctly. The resulting amplicon, 1457 bp, was completely sequenced confirming the structure. Gel lanes are 1 -

100-bp ladder (Gibco); 2 - ATCC 90029; 3 - CAI4; 4 - M61, and 5 - negative control (blank). Amplification was observed

only in M61 thus confirming that M61 has one copy inactivated by HUH-YLL34 cassette. PCR was from 40 ng of

genomic DNA in panels B and C. In panel C, amplification of the wild-type YLL34 allele in M61, ATCC90029 and CAI4.

Gel lanes are 1 - lambda-HindIII; 2 - ATCC 90029; 3 - CAI4; 4 - M61, and 5 - negative control (blank). Amplification was

observed in all strains, although approximately half in M61 confirming that it has only one wild-type allele as opposed to

two observed in ATCC90029 and CAI4.

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

679

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The HUH-YLL34 cassette was used to transform the C. albicans CAI4 (Ura

–

) strain

using the lithium acetate method and three different concentrations of DNA (18, 10 and 5 µg).

After five days of incubation, 98 Ura

colonies were observed. Transformant colonies were

analyzed by PCR using primers HisG-F and C21583-R, which amplified a fragment of 1457 bp

in the mutant containing the correctly integrated cassette (Figure 6B). The 1457-bp amplicon

from mutant M61 (yll34∆::hisG-CaURA3-hisG/YLL34/ura3∆::imm434/ura3∆::imm434) was

sequenced and the expected structure, generated by homologous recombination, was confirmed.

Amplification of CaYLL34 shows that strain M61 is a heterozygote. Specific primers for

CaYLL34 were used for PCR from M61 strain genomic DNA, generating the 2040-bp amplicon

(Figure 6C). The amplification signal in M61 as compared to CAI4 suggests that the number of

copies of CaYLL34 per diploid genome is approximately half in M61. Also, Southern blot anal-

ysis shows that the HUH-YLL34 cassette integrated only one the CaYLL34 allele (Figure 7A)

and in no other part of the genome, thereby confirming the results obtained by PCR (Figure 6C)

and showing that no other genes were disrupted. The 6.1-kb band in the BamHI/BglII digest of

M61 corresponds to the CaYLL34 allele with the HUH-YLL34 integrated and the 2.4-kb band

in CAI4, M61 and ATCC90029 represents the wild-type allele (Figure 7A).

Figure 7. Genotype analysis on mutant M61 and M61-01 by Southern blot and PCR. In A Southern blot of digested DNA

of CAI4, M61 and ATCC 90029 with BamHI and BglII. The probe was CaYLL34 3’ (555 bp) region labeled with [α-

P]-

dCTP. This probe hybridized with CaYLL34 (~2000 bp) present in all strains. In M61 the ~6500-bp fragment corresponds

to the cassette inserted in CaYLL34 gene. The cassette size is 4648 bp. PCR of genomic DNA of CAI4, M61 and M61-01

(URA3

–

). In B amplicon of 213 bp of URA3 gene using primers URA3-F and URA3-R showing that URA3 was not present

in M61-01 mutant. In C amplicon of 1457 bp using primers HisG-F and C21583-R showing that HisG sequence interrupts

CaYLL34 in M61-01 mutant.

M61 was then used to generate another mutant, M61-01, by counter-selection with 5-

FOA rendering M61-01 Ura minus but still having one allele of CaYLL34 inactivated by inter-

vening HisG sequence (Figure 7B) (Fonzi and Irwin, 1993). In all the phenotypic analysis dis-

cussed below we did not observe differences between M61 and M61-01, and therefore, the

phenotypic alterations in M61 do not seem to be a consequence of the “Ura effect” (Lay et al.,

1998; Brand et al., 2004).

A.S.A. Melo et al.

680

Genetics and Molecular Research 5 (4): 664-687 (2006) www.funpecrp.com.br

Phenotypic analysis of M61 mutant strain

To analyze the morphologic changes that occurred in M61-01 due to insertional inacti-

vation of CaYLL34, this strain was examined by phase-contrast microscopy and compared to

its parental strain CAI4 under different growth conditions (Figure 8). The comparison between

CAI4 (Ura

–

) and M61-01 (Ura

–

) in SD medium at 37ºC is striking and shows that failure to

induce filamentation is not caused by any effects involving the Ura

marker and strongly sug-

gests that inactivation of only one allele of CaYLL34 is sufficient to impair hyphal formation

(Figure 8). There was no difference in morphology when M61-01 (Ura

–

) and M61 (Ura

) were

compared. In YPD and SD50 media (no hyphal inducers) CAI4 exhibited blastoconidia and

minor hyphal formation while M61 just showed blastoconidia and no hyphae at all. In FBS

medium (hyphal inducer) CAI4 showed abundant hypha formation and few blastoconidia while

M61 formed very short hyphae, pseudohyphae and many blastoconidia. Also, M61 blastoconidia

have a very large central vacuole. These cells showed a significant increase relative to the

parental phenotype suggesting an abnormal vacuolar accumulation. These enlarged cells have

buds with identical morphology in all growth conditions tested.

Figure 8. Micromorphology of CAI4 (parental strain) and M61-01 (URA3

–

mutant) cultured in SD 50 (50 mM glucose)

and FBS (fetal bovine serum), after incubation at 37°C, 70 rpm for 24 h. Photographs with phase-contrast microscopy at

400X magnification.

Strains ATCC90029, CAI4 and M61 were subjected to species identification tests such

as micromorphologic analysis, culture on CHROMagar Candida, sugar assimilation and fer-

mentation, and RAPD which readily identified them as C. albicans (Melo et al., 1998), thus

ruling out any possible contamination with other fungal species (data not shown).

Growth curves of the mutant M61, the parental strain CAI4, the C. albicans reference

strain ATCC 90029, and the L296 strain (clinical isolate from hemoculture) were also compared

(data not shown). The exponential phase of the curves at 30°C suggests that M61 growth is

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

681

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slower than in CAI4, ATCC and L296. The exponential growth phase at 37°C indicates that

CAI4 and M61 grow at approximately the same rates and much more slowly than ATCC and

L296.

The expression level of CaYLL34 (Rix7) mRNA in the mutant strains M61 and M61-

01 is approximately half of the expression level in the CAI4 strain (Figure 9) as expected

because of the deletion of one of the copies. This shows that the effects observed in the mutant

are due to the decreased level of CaYLL34 (Rix7) expression.

Figure 9. Steady-state levels of CaYLL34 (Rix7) mRNA in parental and mutant strains M61 and M61-01. Panel A, total

RNA (approximately 200 ng) was reverse transcribed and used for amplification with CaYLL34-specific primers. Lane 1,

genomic DNA, lane 2, M61 total RNA, lane 3, M61-01 total RNA, and lane 4, CAI4 total RNA. Panel B shows the same

samples as in A where actin-specific primers were used for amplification. As confirmed by densitometry the band intensity

in lane 3, panel A is half the intensity in lane 4, which indicates that the partial deletion inactivated one copy and that the

other remains fully functional.

A significant difference in ribosomal numbers per cell would explain at least in part the

effects in the Rix7 mutants here described, because Rix7 is involved in ribosomal export. We

observed that there was no significant difference in the total cellular rRNA levels of CAI4 and

the M61 and M61-01 mutants. However, this does not imply that the number of ribosomes in the

cytoplasm of Rix7 mutant cells and CAI4 is identical.

Biofilm production and aspartyl proteinase activity of mutant M61

Biofilm production and aspartyl proteinase activity are known pathogenicity factors of

A.S.A. Melo et al.

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C. albicans and therefore were compared in M61, CAI4, ATCC 90029, and L296 strains (Fig-

ure 10). Biofilm production was quantified by the violet crystal assay which indicated that M61

has significantly reduced (86%) biofilm production as compared to CAI4 (Figure 10A) which

has in turn the same level as compared to an authenticated pathogenic strain isolated from a

patient.

Figure 10. Biofilm and aspartyl-proteinase activity in Candida albicans strains ATCC 90029, L296, CAI4, and M61. In

panel A, biofilm production was quantified using crystal violet staining. In panel B, biofilm production was quantified using

the XTT reduction assay. Bars indicate the average of 4 measurements and error bars the standard deviation. In panel C,

aspartyl-proteinase activity was determined using fluorogenic peptides as described in experimental procedures. In panel

D, rate of aspartyl-proteinase activity/biofilm production quantified by crystal violet staining and XTT reduction assay.

Strain M61 also has a significant decrease in aspartyl proteinase activity in biofilms as

compared to CAI4 (76.5%) and L296 (72.4%) strains, suggesting that M61 may be less patho-

genic (Figure 10C). We hypothesize that strain ATCC 90029 has lower levels of biofilm produc-

tion and aspartyl protease activity because of its long-term storage and in vitro culturing.

The difference in biofilm quantitation using crystal violet staining and XTT reduction

methods can be explained by the fact that the cristal violet stains the whole cell mass in the

biofilm, while XTT reduction, where XTT is converted to formazan by cell metabolism, corre-

sponds only to living cells (Figure 10). Therefore, we demonstrated that the secretion of aspartyl

proteinases is reduced in M61 mutant when compared to the parental CAI4 as shown by XTT

reduction data, which indicates that only living cells would be producing and secreting aspartyl

proteinase.

DISCUSSION

Here, we characterized a novel C. albicans gene, CaYLL34, and a corresponding

subtype of Ascomycota AAA ATPases. AAA ATPases define a very broad category of pro-

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

683

Genetics and Molecular Research 5 (4): 664-687 (2006) www.funpecrp.com.br

teins which comprise the P-loop NTPases, a very abundant class which accounts for 10-18% of

the predicted gene products in the sequenced prokaryotic and eukaryotic genomes (Iyer et al.,

2003). CaYll34p contains two AAA domains and belongs to the “Cell Division/Centrosome/ER

Homotypic Fusion” group according to the Fröhlich classification (Fröhlich, 2001), or the “D1

and D2” group according to the Frickey and Lupas classification (Frickey and Lupas, 2004).

Also, CaYll34p is not related to the SEC18, a secretion AAA ATPase previously characterized

in C. albicans (Nieto et al., 1993), because it has only 32% similarity in the 254 carboxyl-

terminal residues while the remainder is completely different. The closest relative of CaYLL34

with a known function is the C. elegans MAC-1 gene encoding a cell survival CED-4-interact-

ing protein (NM064413) (Wu et al., 1999) located in the “Nematode type 2, Caenorhabditis

elegans (1)” cluster in our phylogeny (Figure 4). Our phylogenetic analysis indicates that

CaYll34p is not closely related to the cdc48 group and is probably functionally related to the

mammalian nuclear VCP-like AAA ATPases (Figure 4). Accordingly, CaYll34p has a bipartite

nuclear localization signal in the N-terminus, which further supports the phylogenetic pattern

that groups this gene product with other nuclear related family members (Figure 3). Although

CaYll34p is similar to this subset of mammalian ATPases (30-40% identity), there are still se-

quence differences that can be explored to design specific inhibitors for these C. albicans

ATPases, which could be tested in antifungal therapy. The closest relatives of CaYll34p are

other fungal proteins forming a robust clade (>95% bootstrap frequency and posterior probabil-

ity = 1) of “Ascomycota cdc48 minus” AAA ATPases including the S. cerevisiae ScYLL034c,

Eremothecium gossypii (Saccharomycetales) and Gibberella zeae (Hypocreales). This group

was until now uncharacterized by functional data other than cell viability.

The identity of CaYLL34 ORF with S. cerevisiae YLL034c (58.3%) suggests that they

are homologous (Figure 3). These genes encode a protein similar to the VCP (member of the

AAA ATPase family) (Dai and Li, 2001). VCP is highly conserved and the orthologues in yeast,

pig and human have already been identified. This protein is involved in seemingly unrelated

functions. It was reported to associate with clathrin, a structural protein of coated membranes

involved in receptor-mediated endocytosis (Pleasure et al., 1993). VCP and co-factor p47 have

been shown to mediate the regrowth of Golgi cisternae from mitotic Golgi fragments, and is

likely to mediate other membrane fusion reactions (Dai and Li, 2001). VCP is required for

ubiquitin-proteasome (Ub-Pr) degradation (Ghislain et al., 1996; Dai et al., 1998; Meyer et al.,

2000; Dai and Li, 2001). In these reactions, VCP is proposed to have a chaperone role in

modifying protein conformation and/or disassembling protein complexes to facilitate their trans-

location into the proteasome (Dai and Li, 2001). ScYLL034c is essential for cell growth and

along with CaYLL34, its putative homolog, is probably necessary for membrane fusion and

protein degradation. Hyphae of C. albicans have a great number of vacuoles that contain

proteinases necessary for tissue invasion, and CaYll34p may have an important role in their

fusion and ubiquitin-proteasome degradation.

The CaYll34p is probably a nuclear protein involved in ribosome biogenesis. The homo-

logue of CaYLL34 in S. cerevisiae complements defective mutants of RIX7 (Brown, 2001;

Gadal et al., 2001). Also, in S. cerevisiae, YLL034c/Rix7p interacts with Apc9c, as shown by

results of a large-scale two hybrid study (Hazbun et al., 2003). Therefore, the analogy between

CaYll34p and Rix7p functions and protein-protein interactions constitute an interesting working

hypothesis for investigation in order to understand the cellular role of CaYll34p. Indeed, if CaYll34p

participates in the biogenesis and export of 60S ribosomal subunits this would explain the drastic

A.S.A. Melo et al.

684

Genetics and Molecular Research 5 (4): 664-687 (2006) www.funpecrp.com.br

impairment and pleiotropic effects due to the inactivation of only one CaYLL34 allele as ob-

served in mutant M61 (and M61-01 accordingly).

Hyphal over-expression of CaYLL34 observed in the initial screening (Figure 1) was

confirmed by semi-quantitative RT-PCR (Figure 5A). Although, it is not possible from our re-

sults to determine which hypha activation pathway controls CaYLL34 expression and which

transcriptional factors are involved in its expression, we show that CaYLL34 is essential for

proper hypha formation in different inducing media (Figure 8). Characterization of regulatory

sequences and transcriptional regulation of CaYLL34 could therefore provide new insights into

yeast to hyphae transition. Analysis of the differential screening result indicates that the great

majority of genes spotted are expressed more in the yeast form (the negative bars in Figure 1),

and when yeast to hyphae transition occurs, few genes show increased expression while the

expression of the majority is reduced. Although it was not our aim to propose a general model

for yeast stage gene repression with concomitant increased expression of few hyphal genes, it

seems that our results support, at least in part, models suggesting that filamentation genes are

under negative control by genes such as TUP1 and RBF1 (Magee, 1997; Braun and Johnson,

2000; Whiteway, 2000).

The insertional inactivation of one copy of CaYLL34 generated the heterozygous mu-

tant M61 and M61-01 after counter-selection to eliminate the Ura

marker (Figures 6 and 7).

This mutant has much slower growth and very limited hyphal induction ability (Figures 8 and 9).

As observed in S. cerevisiae, this gene is essential, and therefore, inactivation of all genomic

copies (null allele homozygous) is lethal (El-Moghazy et al., 2000). Despite the fact that M61

has one wild-type allele, it has severe phenotypic alterations in morphology and impairment in

biofilm production and aspartyl proteinase activity, which are major pathogenicity factors (Fig-

ure 10). Interestingly, our study shows for the first time a quantitative analysis of aspartyl pro-

teinases in biofilms of C. albicans. These results indicate that even a partial effect on gene

dose is sufficient to affect C. albicans growth, morphological changes and pathogenicity.

As far as we know, this is the first description of an AAA ATPase gene expressed

differentially in hyphae. Also, our phylogenetic analysis suggests that CaYLL34 is an important

gene subfamily of Ascomycota (yeasts). Genes of this subfamily may be involved in processes

with major implications in morphological changes associated, more specifically in C. albicans,

with pathogenicity. Therefore, because CaYll34p is necessary for the switching of yeast to

hyphal form, it would be a candidate target for development of antifungal drugs (Whiteway,

2000). Cellular localization and biochemical characterization of this essential protein (CaYll34p)

is a future perspective. Our results on the pleiotropic effects of inactivation of CaYLL34 and its

homology with RIX7 suggest that CaYll34p has a nuclear localization, is required for biogenesis

and export of 60S ribosomal subunits and interacts with protein Apc9c. Testing of this hypo-

thesis could elucidate the specific role of this AAA ATPase in C. albicans survival and patho-

genicity and contribute in the long-term to providing a novel target for antifungal therapy.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Beatriz Schnabel and Gerdine Sanson for technical assistance, Dr. Marcelo

Avedissian for critical reading of the manuscript and Dr. W. Fonzi for strains and plasmids used

for insertional inactivation. A.S.A. Melo was the recipient of a graduate fellowship from CNPq

(Brazil). A. Brunstein and M.R.S. Briones are supported by grants from FAPESP (Brazil) and

Candida albicans Rix7/YLL34 gene

685

Genetics and Molecular Research 5 (4): 664-687 (2006) www.funpecrp.com.br

M.R.S. Briones is a recipient of an International Research Scholar grant from the Howard

Hughes Medical Institute (USA).

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The localized adherence pattern of an atypical

enteropathogenic Escherichia coli is mediated by

intimin omicron and unexpectedly promotes HeLa

cell invasion

Rodrigo Tavanelli Hernandes,

Rosa Maria Silva,

Sylvia Mendes Carneiro,

Fábia Andréia Salvador,

Maria Cecília Di Ciero Fernandes,

Ana Carolina Barbosa Padovan,

Denise Yamamoto,

Renato Arruda Mortara,

Waldir Pereira Elias,

Marcelo Ribeiro da Silva Briones,

and

Tânia Aparecida Tardelli Gomes

Departamento de Microbiologia, Imunologia e

Parasitologia da Universidade Federal de São Paulo,

Escola Paulista de Medicina, São Paulo, Brazil.

Laboratório de Biologia Celular do Instituto Butantan,

São Paulo, Brazil.

Laboratório de Bacteriologia do Instituto Butantan,

São Paulo, Brazil.

Summary

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) forms

attaching and effacing lesions in the intestinal

mucosa characterized by intimate attachment to the

epithelium by means of intimin (an outer membrane

adhesin encoded by eae). EPEC is subgrouped into

typical (tEPEC) and atypical (aEPEC); only tEPEC

carries the EAF (EPEC adherence factor) plasmid that

encodes the bundle-forming pilus (BFP). Characteris-

tically, after 3 h of incubation, tEPEC produces local-

ized adherence (LA) (with compact microcolonies) in

HeLa/HEp-2 cells by means of BFP, whereas most

aEPEC form looser microcolonies. We have previ-

ously identiﬁed nine aEPEC strains displaying LA in

extended (6 h) assays (LA6). In this study, we analy-

sed the kinetics of LA6 pattern development and the

role of intimin in the process. Transmission electron

microscopy and confocal laser microscopy showed

that the invasive process of strain 1551-2 displays a

LA phenotype. An eae-defective mutant of strain

1551-2 prevented the invasion although preserving

intense diffused adherence. Sequencing of eae

revealed that strain 1551-2 expresses the omicron

subtype of intimin. We propose that the LA phenotype

of aEPEC strain 1551-2 is mediated by intimin

omicron and hypothesize that this strain expresses

an additional novel adhesive structure. The present

study is the ﬁrst to report the association of compact

microcolony formation and an intense invasive ability

in aEPEC.

Introduction

Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) comprises one

of the six categories of diarrhoeagenic E. coli (DEC).

EPEC colonizes the intestinal mucosa, causing attaching

and effacing (A/E) lesions characterized by intimate

attachment of the bacteria to the host intestinal epithe-

lium, localized effacement of the brush border microvilli

and actin polymerization underneath adherent bacteria.

As a result of the A/E lesions, infecting bacteria rest on

raised pedestals formed on the apical surface of epithelial

cells (Knutton et al., 1987).

The establishment of A/E lesions depends on a type

III secretion system (T3SS) (Jarvis et al., 1995), the

outer membrane adhesive protein intimin (Jerse et al.,

1990) and the translocated intimin receptor (Tir) (Kenny

et al., 1997). All these elements are encoded in a patho-

genicity island called LEE (locus of enterocyte efface-

ment) (McDaniel et al., 1995). The ability to promote A/E

lesions is also observed among strains of another DEC

category called enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), a

subgroup of Shiga toxin-producing E. coli (STEC) that

can cause bloody diarrhoea, haemorrhagic colitis and

haemolytic-uraemic syndrome (reviewed by Karch et al.,

2005).

The T3SS comprises a complex of proteins that trans-

locate bacterial effectors into the host cells in a contact-

dependent manner. One secreted translocator protein,

EspA, forms a long ﬁlamentous extension to the T3SS

needle complex (Daniell et al., 2001; Sekiya et al., 2001),

whereas two other translocator proteins, EspB and EspD,

are thought to provide a pore in the host cell membrane,

thereby allowing translocation of effector proteins into the

host cell cytosol (Frankel et al., 1998). As EspA ﬁlaments

interact directly with the host cell membrane at the

Received 8 August, 2007; revised 4 September, 2007; accepted

7 September, 2007. *For correspondence. E-mail tatg.amaral@

unifesp.br; Tel. (+55) 11 5576 4537; Fax (+55) 11 5572 4711.

Cellular Microbiology (2008) 10(2), 415–425 doi:10.1111/j.1462-5822.2007.01054.x

First published online 2 October 2007

beginning of A/E lesion formation (Knutton et al., 1998), it

has been suggested that these structures could function

as an additional transitory EPEC adherence factor, mainly

among atypical EPEC strains which are devoid of EAF

plasmids (Cleary et al., 2004).

Currently, EPEC is divided into two subcategories,

typical EPEC (tEPEC) and atypical EPEC (aEPEC), where

EPEC adherence factor plasmid (pEAF) is found only in the

former group (Kaper, 1996; Trabulsi et al., 2002).

Typical EPEC adheres to the surface of HeLa/HEp-2

cells, forming the so-called localized adherence (LA)

pattern which is characterized by the development of

compact bacterial microcolonies after 3 h of incubation

(Scaletsky et al., 1984). The growth of these compact

microcolonies is mediated by the bundle-forming pilus

(BFP), a type IV ﬁmbrial adhesin encoded by pEAF that

promotes adherence among bacteria that form microcolo-

nies (Giron et al., 1991). In contrast, most aEPEC strains

are unable to produce LA as they are devoid of BFP. In

general, they form loose bacterial microcolonies that are

detected only after prolonged assays (6 h assays),

forming the LA-like pattern of adherence (Rodrigues

et al., 1996).

Although the presence of tEPEC inside enterocytes has

been detected in natural intestinal infections of man and

animals (Donnenberg and Kaper, 1992), tEPEC is not

generally regarded as an invasive pathogen, as the extent

of the invasive process is limited when compared with that

of true invasive pathogens. Furthermore, neither the

mechanism nor the clinical signiﬁcance of this invasive

process is well understood.

In the characterization of a collection of 59 aEPEC

strains belonging to non-traditional EPEC serogroups,

Vieira et al. (2001) identiﬁed nine strains that produced LA

(with compact microcolonies) only after 6 h of infection

(LA6). Besides the fact that they lacked BFP, further

studies demonstrated that the LA6 phenotype was not

associated with any of the adhesins recently described in

the different DEC categories, i.e. Saa (STEC autoagglu-

tinating adhesin), Paa (porcine A/E-associated), ToxB (a

plasmidial locus found in EHEC O157:H7 implicated in

adhesion), Iha (IrgA homologous adhesin), Lpf (long polar

ﬁmbria) and Lda (locus for diffuse adherence) (Hernandes

et al., 2006).

As the key determinants of compact microcolony

formation in aEPEC strains expressing LA6 remain

unknown, in this study we sought to determine, in a

selected aEPEC strain, the kinetics of LA6 pattern devel-

opment and the role of intimin in its establishment.

Results and discussion

The LA6 phenotype of aEPEC strain 1551-2 rather than

an adherence pattern is in fact the outcome of an

invasion process

As aEPEC strains lack BFP, we were interested in iden-

tifying the adhesin(s) responsible for LA6 expression in

HeLa cells in the nine aEPEC strains in our collection

(Vieira et al., 2001). For that purpose, aEPEC strain

1551-2 was selected for further studies because it was

isolated from a child with diarrhoea in the absence of

other recognized pathogens and was devoid of plasmids

thus making molecular analysis straightforward. Strain

1551-2 has been previously shown to produce A/E lesions

in vivo in the rabbit ileal loop model (M.A.M. Vieira et al.,

unpublished), and intimin was the only known potential

adhesive structure expressed by this strain (Hernandes

et al., 2006).

To better understand the development of the LA6

pattern, an adherence kinetic study of strain 1551-2 was

performed in parallel with that of the tEPEC prototype

strain E2348/69, and the preparations were analysed

by light microscopy (Fig. 1) and transmission electron

microscopy (TEM) (Fig. 2). Examination by light micros-

copy revealed that while strain E2348/69 formed small

and compact microcolonies after 2 h of incubation, a ten-

dency to form compact microcolonies in strain 1551-2

could only be observed after 4 h (data not shown). After

6 h of infection, strain 1551-2 formed microcolonies indis-

tinguishable from those of tEPEC strain E2348/69 in 3 h,

whereas in the same period of time the latter strain formed

Fig. 1. Comparative kinetic study of the development of compact

microcolonies in HeLa cells by typical EPEC prototype strain

E2348/69 (A, B and C) and atypical EPEC strain 1551-2 (D, E and

F). After 6 h of infection, strain 1551-2 formed microcolonies

indistinguishable from those of tEPEC strain E2348/69 in 3 h,

characteristics of the LA pattern.

416 R. T. Hernandes et al.

larger microcolonies (Fig. 1B and F). As expected, these

data revealed that tEPEC strain E2348/69 is more effi-

cient in producing LA in vitro, probably due to its ability to

express BFP. However, TEM analysis of the same prepa-

rations revealed that the bacteria that composed the

microcolonies of strain 1551-2 were internalized within

vacuoles, while tEPEC E2348/69 seemed to remain

mostly attached to the cell surface in an intimate manner

(Fig. 2A and 2B).

To conﬁrm the invasive ability of strain 1551-2, quanti-

tative HeLa cell invasion assays were performed in the

presence of gentamicin. As it has been shown that BFP

can prevent bacterial internalization of the tEPEC strain

B171 (serotype O111:Non-Motile) (Riley et al., 1990), we

used strain JPN15 (a derivative E2348/69 strain that lacks

BFP expression due to the spontaneous loss of pEAF) to

compare the invasive ability of aEPEC strain 1551-2 to

that of strain E2348/69. Moreover, the less efficient micro-

colony development of strain JPN15 (due to lack of BFP)

as compared with the wild-type original strain E2348/69

could favour the comparison of the invasive ability of both

strains in the same period of time (6 h). Quantitative HeLa

cell invasion assays revealed that aEPEC strain 1551-2

was approximately three times more invasive than strain

JPN15 (Fig. 2C).

Intimin is responsible for the intense invasive ability of

aEPEC strain 1551-2

As intimin was the only known adhesive factor found in

aEPEC strain 1551-2, we initially speculated that this

adhesive molecule could be involved in the establishment

of the LA6/invasive phenotype of this strain. To examine

this hypothesis, the suicide vector pJP5603 was used to

obtain a non-polar mutant in the eae gene (encoding

intimin) of strain 1551-2, generating the mutant strain

1551-2(eae::pRT2). The lack of intimin expression in the

latter strain was conﬁrmed by immunoblotting, and inte-

gration into the homologous eae gene was conﬁrmed by

Southern blotting (data not shown).

In the absence of intimin, the mutant strain 1551-

2(eae::pRT2) displayed a diffuse pattern of adherence to

HeLa cells, instead of the LA pattern of the wild-type strain

(Fig. 3A and 3B). Thus, the presence of eae was essential

to the formation of compact microcolonies in strain

1551-2, despite the fact that its adherence ability was

Fig. 2. Transmission electron microscopy (TEM) of HeLa cells

infected with tEPEC E2348/69 for 3 h (A), aEPEC 1551-2 for 6 h

(B) and quantitative invasion assays of HeLa cells by E2348/69

(3 h), JPN15 (6 h) and aEPEC 1551-2 (6 h) strains (C). The

bacteria that comprised the microcolonies of strain 1551-2 were

internalized within vacuoles, while tEPEC E2348/69 seemed to

remain mostly attached to the cell surface in an intimate manner.

Quantitative HeLa cell invasion assays revealed that aEPEC strain

1551-2 (in 6 h) was approximately three times more invasive than

strain E2348/69 (in 3 h) and JPN15 (in 6 h). Bar = 2 mm.

Fig. 3. HeLa adherence assay (6 h).

A and B. Micrographs illustrating the different adherence pattern

phenotypes produced by aEPEC 1551-2 (localized adherence in

6 h) and the eae mutant 1551-2(eae::pRT2) (diffuse adherence).

C and D. Transmission electron microscopy (TEM) of HeLa cells

infected with aEPEC 1551-2 (C) and 1551-2(eae::pRT2) (D) shows

that the wild-type strain produced the LA6 pattern and was able to

invade HeLa cells, while mutant strain 1551-2(eae::pRT2) was

non-invasive and adhered in a diffuse adherence pattern.

Bar = 10 mm.

Atypical EPEC invades HeLa cells 417

maintained in the mutant strain (Fig. 3B). As expected,

mutant strain 1551-2(eae::pRT2) was unable to promote

actin accumulation (a characteristic of A/E lesions which

are dependent on intimin) as detected by a negative ﬂuo-

rescence actin staining (FAS) assay (Fig. 5G).

As visualized by TEM, the mutant strain 1551-

2(eae::pRT2) was unable to invade HeLa cells (Fig. 3D).

These observations suggested that intimin of strain

1551-2 was responsible for both compact microcolony

formation and the potential to invade these cells, thus

conﬁrming that the LA6 pattern of strain 1551-2 is the

result of an invasion process dependent on intimin.

Data in the literature have shown that intimin may play

diverse roles in bacterial interaction with epithelial cells.

Pelayo et al. (1999) managed to reduce the capacity of

strain JPN15 and four aEPEC strains to adhere to HEp-2

cells by at least 80% in the presence of a speciﬁc polyclonal

antibody against intimin. Similarly, when using antibody

against the C-terminal region of the intimin molecule, Car-

valho et al. (2005) observed an inhibition of almost 90% in

the adhesion of strain JPN15 to HEp-2 cells.

Studies conducted by Cleary et al. (2004) showed that

an eae mutant strain of E2348/69 (CVD206) maintained

the LA phenotype, but could no longer promote the accu-

mulation of actin ﬁlaments underneath adherent bacteria.

In this same study, the authors demonstrated that adhe-

siveness was drastically reduced in a bfpA (encoding the

BFP monomers) mutant of strain E2348/69 (mutant

UMD901). Moreover, using a double mutant (bfpA and

eae) called UMD886, these authors also emphasized the

importance of EspA (a protein that participates in the

T3SS) as a transitory adhesin.

In contrast to the results reported by Cleary et al.

(2004), we observed that even in the absence of intimin,

aEPEC strain 1551-2 retained the ability to adhere in

large numbers to HeLa cells in a diffuse pattern. However,

as observed by TEM, loss of intimin expression in strain

1551-2 led to inhibition of compact cluster formation and

of invasiveness. Furthermore, the fact that the ability of

the aEPEC strain 1551-2 to adhere to HeLa cells was

retained in mutant strain 1551-2(eae::pRT2) suggests the

presence of another adhesive structure that could be

responsible for its diffuse adherence.

The recombinant plasmid pCVD438 (carrying the eae

gene of tEPEC strain E2348/69) (Donnenberg and Kaper,

1991) was used in an attempt to restore intimin expres-

sion in strain 1551-2(eae::pRT2). Despite the fact that this

recombinant plasmid restored intimin expression in strain

1551-2(eae::pRT2) as evaluated by immunoblotting (not

shown), neither microcolony formation nor FAS positivity

was re-established when this strain adhered to HeLa

cells, probably due to incompatibility between intimin

alpha of strain E2348/69 and the Tir molecule translo-

cated by the 1551-2 strain.

A recombinant plasmid carrying the eae gene of strain

1551-2 was then constructed (pRTH10) and introduced

into the mutant strain 1551-2(eae::pRT2). However, no

polypeptide compatible in size with intimin was observed

by immunoblotting in the complemented strain, despite

the fact that a laboratory strain E. coli HB101 carrying

pRTH10 was capable of expressing intimin on its surface

(not shown). Moreover, when strain HB101(pRTH10),

was analysed for adherence in HeLa cells, no bacteria

could be detected, suggesting that the intimin subtype

expressed by aEPEC strain 1551-2 has no receptor mol-

ecule in this cell line. Thus, the LA6/invasiveness pheno-

type in this strain requires intimin and the translocation of

the Tir molecule.

Omicron is the intimin subtype of aEPEC strain 1551-2

One recent work developed by Garrido et al. (2006)

reported the existence of at least 25 intimin subtypes

based on the sequence of the last 280 amino acids of the

C-terminal region (Int280) of the molecule, which is both

the variable region of the protein and the region that is

recognized by Tir (Frankel et al., 1994; Adu-Bobie et al.,

1998). As we have shown that intimin is responsible for

the invasive ability of aEPEC strain 1551-2, the portion of

the eae gene corresponding to the C-terminal region of

the molecule was cloned and sequenced. The resulting

sequence showed 99% identity to the recently reported

intimin subtype omicron (o) and 85% identity to the

subtype alpha (a) expressed by the tEPEC strain E2348/

69. The analysis of the predicted protein sequence of the

C-terminal region between intimin alpha (from E2348/69 –

Accession No. AF022236) and intimin omicron (from

AEEC-IH2997f – Accession No. AJ876648 and aEPEC

1551-2 – EU016188) demonstrated approximately 29%

distinct amino acids (Fig. 4). So far, the presence of

intimin subtype o has been described in two aEPEC

strains (serotypes O129:H

–

and O84:H

–

) (Blanco et al.,

2006; Garrido et al., 2006), but whether these strains are

able to invade HeLa cells remains to be determined. Thus

far, the association of this intimin subtype with the LA6

pattern or the capacity of EPEC strains to invade HeLa

cells has not yet been reported.

Subversion of actin dynamics by aEPEC 1551-2

involves Tir phosphorylation

Aconfocal laser ﬂuorescence microscopy analysis of strain

1551-2 interacting with HeLa cells allowed the distinction

between intracellular and extracellular bacteria and

revealed that bacteria in the intracellular compartment

were capable of promoting actin accumulation around

the vacuoles (Fig. 5). Moreover, using phosphotyrosine-

418 R. T. Hernandes et al.

speciﬁc antibodies, we showed tyrosine phosphorylation

activity in the regions of actin accumulation underneath

adherent 1551-2 bacteria in HeLa cells (Fig. 6B).

It has been reported that an essential stage in the

tEPEC-induced actin accumulation in vitro requires clus-

tering of membrane-associated Tir by intimin (Campellone

et al., 2004) and subsequent phosphorylation of a tyrosine

residue (Y474) at the C-terminus of the Tir molecule

(Kenny, 1999) by host cell kinases (Phillips et al., 2004;

Swimm et al., 2004). Phosphorylation of Y474 leads to

binding of the Tir molecule to Nck (Campellone and Leong,

2005), a host cell adaptor protein that recruits and activates

N-WASP, which is a member of the Wiskott–Aldrich syn-

drome protein/Scar family. Activated N-WASP then recruits

and triggers the Arp2/3 protein complex to promote actin

nucleation engendering an extensive polymerization of

actin ﬁlaments, thus leading to pedestal formation (Gruen-

heid et al., 2001; Campellone and Leong, 2003; Campel-

lone et al., 2004). In contrast, Tir of EHEC (serotype

O157:H7) is not tyrosine phosphorylated (DeVinney et al.,

1999) and N-WASP recruitment is independent of Nck

(Gruenheid et al., 2001; Lommel et al., 2004). Recently, it

was demonstrated that EHEC injects its own adaptor

protein, Tir cytoskeleton-coupling protein (TccP/EspF

into the host cell, which in turn connects EHEC Tir to

N-WASP and the actin ﬁlaments of the cytoskeleton

Fig. 4. Predicted protein sequence of the C-terminal region of the eae gene (Int280) encoding intimin. The analysis of the predicted protein

sequence of the C-terminal region between intimin alpha (from E2348/69 – Accession No. AF022236) and intimin omicron (from

AEEC-IH2997f – Accession No. AJ876648 and aEPEC 1551-2 – EU016188) demonstrated approximately 29% distinct amino acids

represented in grey box.

Atypical EPEC invades HeLa cells 419

(Campellone et al., 2004; Garmendia et al., 2004). Further

studies showed that tEPEC strains of serotype O119:H6

can promote actin aggregation by both pathways (Whale

et al., 2006), and that the EPEC-2 strain used the product

of a tccP homologue gene, tccP2, to mediate subversion of

actin dynamics (Whale et al., 2007).

In the present study, we showed that the mechanism of

actin accumulation used by aEPEC strain 1551-2 in the

formation of A/E lesion is dependent on Tir

1551-2

phospho-

rylation. Campellone et al. (2002) identiﬁed in an EPEC Tir

molecule a 12-amino-acid sequence containing the Y474

residue, which is essential for the actin-signaling capability.

Nck binds this 12-amino-acid sequence, in a Y474

phosphorylation-dependent manner. Sequencing data of

the region of the Tir

1551-2

molecule encompassing a Y474-

equivalent matched exactly the sequence of a recently

reported new Tir molecule expressed by another aEPEC

strain of serotype O104:H12 of our collection (Fig. 6A)

(Ooka et al., 2007). As it has been recently published that

aEPEC strain 1551-2 is devoid of tccP or tccP2 (Ooka

et al., 2007), it is apparent that strain 1551-2 recruits actin

by means of the Tir–Nck pathway. However, a question that

remains to be answered is whether additional differences

regarding the use of the Tir–Nck pathway between aEPEC

strain 1551-2 and tEPEC strains is responsible for the

invasion capability of the former strain in vitro.

Concluding remarks

In the present study, we demonstrated that in the aEPEC

strain 1551-2 the formation of compact microcolonies

(characteristic of the LA pattern) observed in the LA6

pattern in HeLa cells is in fact the outcome phenotype of an

invasive process mediated by intimin subtype omicron.

Furthermore, our studies also showed that in the absence

of intimin omicron, aEPEC strain 1551-2 could still adhere

in large numbers to this cell line by means of a putative new

adhesive structure which remains to be characterized.

There is growing evidence in the literature that aEPEC is a

very diverse group of strains (Gomes et al., 2004) that are

becoming important pathogens both in developed and in

developing countries (Trabulsi et al., 2002; Kaper et al.,

2004). Thus, the occurrence of an invasion mechanism

among aEPEC strains in vivo emerges as a major subject

to be addressed in future studies.

Experimental procedures

Bacterial strains and plasmids

The bacterial strains used in this study are listed in Table 1.

E. coli strains were grown in Luria–Bertani (LB) broth and incu-

bated aerobically at 37°C overnight.

HeLa cell adherence and FAS assay

The assay described by Cravioto et al. (1979) was used with some

adaptations, to determine the adherence pattern of the strains.

HeLa cells at 60% conﬂuence were cultivated in 24-well tissue

culture plates containing glass coverslips and Dulbecco’s modiﬁed

Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine

serum. After one wash with phosphate-buffered saline (PBS)

pH 7.4, 1.0 ml of fresh medium (DMEM supplemented with 2%

D-mannose) was added to the cell monolayers. E. coli strains were

grown overnight in LB broth without shaking and then diluted 1:50

in the medium contained in the microplates. After an incubation

period of 3 h at 37°C, monolayers were washed once with PBS,

fresh medium was added to the wells, and an additional incubation

period of 3 h was allowed (6 h assay). After six washes with PBS,

the preparations were ﬁxed with methanol, stained with May

Grünwald-Giemsa stain and examined by light microscopy.

Fig. 5. Confocal microscopy of HeLa cells infected with aEPEC

1551-2 (A, B, C and D) and 1551-2(eae::pRT2) (E, F, G and H).

Cells were labelled with anti-1551-2 antisera and the primary

antibody was visualized by using anti-rabbit secondary antibody

(green). For actin accumulation, cells were labelled with phalloidin

(red), and for bacterial and HeLa cell DNA with DAPI (blue). Arrow

in (D) indicates 1551-2 strain internalized in the HeLa cell. The

1551-2 strain in the intracellular compartment was able to promote

actin accumulation around the vacuoles (bar = 10 mm).

420 R. T. Hernandes et al.

Fig. 6. A. Amino acid alignment of EPEC Tir,

EHEC Tir and aEPEC (4051-6 and 1551-2)

Tir. Phosphorylated tyrosines (Y) appear

in bold. Only tEPEC and aEPEC are

tyrosine-phosphorylated at the Y474 or

Y474-equivalent residues.

B. Immunoﬂuorescence of HeLa cells infected

with tEPEC (E2348/69), EHEC (EDL 933) and

aEPEC (1551-2). Cells were labelled with

anti-PY antiserum and the primary antibody

was visualized by using anti-mouse

secondary antibody (green). For actin

accumulation, cells were labelled with

phalloidin (red). Yellow signals observed

with combined staining are caused by

colocalization of actin accumulation and

Tir-PY. Like tEPEC, aEPEC 1551-2 promotes

actin accumulation via the Tir–Nck pathway.

Bar = 10 mm.

Table 1. Bacterial strains and plasmids used in this study.

Bacterial strain or plasmid Relevant genotype and/or description Reference

E. coli strains

1551-2 Wild-type aEPEC (ONT:H

–

) which expresses LA6 Vieira et al. (2001); Hernandes et al. (2006)

1551-2(eae::pRT2) 1551-2 eae mutant This study

E2348/69 Wild-type EPEC (O127:H6) isolated from an outbreak in Taunton, UK Levine et al. (1978)

JPN15 Strain E2348/69 spontaneously cured of pEAF Jerse et al. (1990)

CVD206 eae (intimin) gene deletion mutant of E2348/69 Donnenberg and Kaper (1991)

HB101 Non-pathogenic laboratory E. coli K-12 strain Louie et al. (1994)

DH5a(lpir) DH5a transduced with lpir Elliott and Kaper (1997)

S17-1(lpir) pro res mod

RP4-2, Tc::Mu-Km::Tn7 Simon et al. (1983)

Plasmids

pJP5603 3.1 kb R6K-based suicide vector, Km

Penfold and Pemberton (1992)

pACYC184 Low-copy-number cloning vector, Cm

/Tc

New England Biolabs

pCVD438 eae gene from E2348/69 in pACY184 background, Cm

Donnenberg and Kaper (1991)

pGEM-T Easy Cloning vector, Ap

, f1 ori, lacZ Promega

pMOSBlue Cloning vector, Ap

, f1 ori, lacZ Amersham Pharmacia Biotech

pRT1 pGEM-T Easy harbouring a 924 bp fragment of eae, Ap

This study

pRT2 pJP5603 harbouring an EcoRI fragment from pRT1, Km

This study

pRTH1 eae gene from 1551-2 in pMOS background, Ap

This study

pRTH10 EcoRV/HindIII fragment from pRTH1 in pACY184 background, Cm

This study

Atypical EPEC invades HeLa cells 421

The FAS assay for ﬁlamentous actin accumulation was per-

formed on HeLa cells after 3 or 6 h of incubation with the bacte-

ria, as described previously (Knutton et al., 1989).

Immunoﬂuorescence microscopy and confocal

microscopy

Following infection, coverslips were ﬁxed in 2% glutaraldehyde

in PBS (10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, 0.15 M NaCl),

for 1 h at room temperature. After three washes in PBS, the

coverslips were incubated with 50 mM NH

Cl in PBS for 30 min

at room temperature to quench excess aldehyde groups. HeLa

cells were washed with PBS, and soaked in PBS containing

0.25% gelatin and 0.05% NaN

(PGN) (Procopio et al., 1998).

The coverslips were probed with rabbit anti-1551-2 antibodies,

washed three times with PBS and developed with goat anti-rabbit

Ig-coupled to Cy3 (Sigma). The coverslips were then washed

three times in PBS, and F-actin was then stained with 2 mg ml

-1

rhodamine-phalloidin (Sigma) and 50 mM DAPI (4′,6-diamidino-

2-phenylindole dihydrochloride; Molecular Probes, Eugene,

Oregon) to stain bacterial and host cell DNA. After further wash-

ings, coverslips were mounted in buffered glycerol in the pres-

ence of p-phenylenediamine as antifade agent and viewed in a

Bio-Rad 1024UV confocal system attached to a Zeiss Axiovert

100 microscope. Images were acquired with a 100¥ 1.4 NA

PlanApochromatic objective and processed with ImageJ

(http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Quantitative invasion assays

Quantitative assessment of bacterial invasion of HeLa cells was

performed as described previously (Luck et al., 2005). Brieﬂy,

washed semi-conﬂuent cell monolayers were infected in the pres-

ence of 1%

D-mannose with 10

colony-forming units (cfu) of each

bacterial test strain for 6 h, after which monolayers were washed

ﬁve times with PBS, and lysed in 1% Triton X-100 for 30 min

at room temperature. Following cell lysis, bacteria were

re-suspended in LB broth and quantiﬁed by plating serial dilutions

onto MacConkey agar plates to obtain the total number of cell-

associated bacteria. To obtain the number of intracellular bacteria,

a second set of infected wells was washed ﬁve times and incu-

bated with 100 mg ml

-1

gentamicin for 1 h. Following this incuba-

tion period, cells were washed ﬁve times with PBS, lysed with 1%

Triton X-100 and re-suspended in LB broth for quantiﬁcation by

plating serial dilutions. Assays were carried out in triplicate, and

the results from at least three independent experiments were

expressed as the percentage of the total cell-associated bacteria

that were intracellular (mean Ϯ standard deviation).

Transmission electron microscopy

After the adherence assays, preparations on the coverslips were

washed six times with PBS, and processed as described in

Bozzola and Russell (1998). Brieﬂy, ﬁxation was carried out over-

night in 1% paraformaldehyde, 1.5% glutaraldehyde in phos-

phate buffer 0.1 M pH 7.3. Post-ﬁxation was performed with 1%

osmium tetroxide for 30 min in the same buffer. Following dehy-

dration in a graded ethanol series, and two quick passes in

propylene oxide, the cells were covered with a 1:1 mixture of

propylene oxide and Epon resin for 5 min. Gelatin capsules ﬁlled

with Epon embedding medium were then inverted on top of the

coverslips containing the preparations, and placed in a 60°C

oven for 24–48 h. Following resin polymerization, the capsules

were snapped off of the glass substrate after being cooled with

liquid nitrogen. The area on the capsule containing the cells was

then trimmed, and ultrathin sections (about 70–80 nm thick) were

obtained in a Sorvall MT 6000 ultramicrotome. The sections were

stained with 2% uranyl acetate and lead citrate and examined in

a LEO 906E transmission electron microscope (Zeiss, Germany)

at 80 kV.

Search for tyrosine phosphorylation of Tir

HeLa cells were cultivated in DMEM supplemented with 10%

fetal bovine serum and 2.5 mM glutamine, in 24-well plates

(1 ¥ 10

cells per well) with glass coverslips (12 mm diameter) at

37°C in 5% CO

. Overnight bacterial cultures grown in LB at 37°C

were added to the microplates at a dilution of 1:20. Monolayers

were infected for 6 h, ﬁxed in formalin and permeabilized in 0.1%

Triton X-100. The cells were then incubated for 24 h at

4°C with mouse monoclonal antiphosphotyrosine clone PT-66

(Sigma) (diluted 1:50), washed, and incubated with ﬂuorescein

isothiocyanate-conjugated goat anti-mouse antibody (Sigma)

(diluted 1:100) for 60 min. Coverslips were washed, mounted in

glycerol (1:9 in PBS) and analysed using an Olympus optical

BX60F5 ﬂuorescence microscope (Rosenshine et al., 1992).

DNA and genetic manipulations

Cloning was performed according to standard DNA manipulation

methods (Sambrook and Russell, 2001). Plasmid extraction of the

recombinant clones was carried out with the Plasmid Mini-Prep kit

(Promega). Restriction enzymes and other modifying enzymes

(Invitrogen) were used in accordance with protocols supplied by

the manufacturers. Puriﬁcation of DNA fragments and extraction

from agarose gel slices were performed with Wizard DNA

Clean-Up kit (Promega). Plasmid DNA was introduced into E. coli

DH5a by electroporation of competent cells by use of an E. coli

Pulser apparatus (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Selec-

tion of recombinant clones was performed on LB agar containing:

ampicillin (100 mg ml

-1

), kanamicin (50 mg ml

-1

), cloramphenicol

(30 mg ml

-1

), X-gal (5-bromo-4chloro-3indolyl-b-D-galactoside –

40 mg ml

-1

) or IPTG (Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside –

0.1 mM) when appropriate.

The complete eae gene was ampliﬁed by PCR (Elongase

ampliﬁcation system – Invitrogen, USA) using the AE9/EscD

primers (ACGTTGCAGCATGGGTAACTC/CAGAACATTCAGCC

GTAC) and cloned in the pMOSBlue vector, thus obtaining

pRTH1. This plasmid was digested with HindIII/SphI and the

segment of interest was cloned into the corresponding sites in

pACYC184 vector, resulting in the recombinant plasmid

pRTH10.

Sequencing analysis of the eae gene sequence of

aEPEC 1551-2

The C-terminal region of the eae gene (Int280) in the pRTH10 and

the ampliﬁed tir gene were sequenced using dideoxy-nucleotide

422 R. T. Hernandes et al.

BigDye Terminators as modiﬁed by Sanger et al. (1977) (Applied

Biosystems) in an ABI377/96 automated sequencer. Contigs were

assembled using Phred-Phrap-Consed programs (Gordon et al.,

1998; Ewing et al., 1998; Ewing and Green, 1998).

The sequences derived from the analysis performed in

this study were deposited in GenBank under Accession

No. EU016188 (eae gene) and EU057954 (tir gene).

Directed insertional mutagenesis in the eae gene

Internal segments of the eae gene were prepared by PCR using

the AE11/AE12 primers (CCCGGCACAAGCATAAGCTAA/

ATGACTCATGCCAGCCGCTCA) (Gannon et al., 1993) and

cloned in the pGEM-T Easy vector thus obtaining pRT1. This

plasmid was digested with EcoRI, and the segment of interest

was cloned into the corresponding sites in suicide vector

pJP5603 (Penfold and Pemberton, 1992), resulting in the re-

combinant plasmid pRT2. After transformation of pRT2 into

DH5a(lpir), transformants were selected on LB agar plates con-

taining kanamycin and X-Gal; plasmid DNA of transformants

harbouring the correct insert was transformed into strain S17-

1(lpir) for mobilization into a nalidixic acid-resistant derivative of

strain 1551-2 via ﬁlter mating on cellulose nitrate membranes.

Transconjugants were selected on

L-agar plates containing kana-

mycin and nalidixic acid as previously described (Elliott and

Kaper, 1997; Elias et al., 1999; Keller et al., 2002).

The correct site of integration was conﬁrmed by Southern blot

analysis of genomic DNA digested with HindIII and XhoI using the

eae amplicon as a gene probe (Miller and Mekalanos, 1988;

Steiner et al., 2000).

Acknowledgements

This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de São Paulo (FAPESP) Grants 02/00987-5 and

04/11926-2, and by Programa de Apoio a Núcleos de Excelência

– PRONEX MCT/CNPq/FAPERJ. R.T.H. received a fellowship

from FAPESP (06/54359-6). M.R.S.B. is supported by grant from

FAPESP (Brazil) and is recipient of an International Research

Scholar grant from the Howard Hughes Medical Institute (USA).

We are grateful to Mônica A.M. Vieira for technical assistance,

Marcia R.M. dos Santos and José Franco da Silveira for provid-

ing the pMOSBlue Blunt Ended Cloning Kit, and Gad Frankel for

providing the pCVD438 plasmid.

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