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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Rhodococcus
equi DE POTROS PELA PCR MULTIPLEX DOS
GENES DA FAMÍLIA VAP
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Fernanda Monego
Santa Maria, RS, Brasil.
2008
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2
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Rhodococcus equi DE
POTROS PELA PCR MULTIPLEX DOS GENES DA FAMÍLIA
VAP
por
Fernanda Monego
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em
Medicina Veterinária Preventiva, da Universidade Federal de Santa Maria
(UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária.
Orientadora: Prof
a
. Agueda Castagna de Vargas
Santa Maria, RS, Brasil.
2008
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3
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Rhodococcus equi DE POTROS
PELA PCR MULTIPLEX DOS GENES DA FAMÍLIA VAP
elaborada por
Fernanda Monego
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária
Comissão Examinadora:
___________________________________
Agueda Castagna de Vargas, Dra.
(Presidente/Orientador)
___________________________________
Márcio Garcia Ribeiro, Dr. (UNESP)
___________________________________
Elgion Lucio da Silva Loreto, Dr. (UFSM)
Santa Maria, 19 de fevereiro de 2008.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Leinor e Cleonice e meu irmão Mauren, que apesar da
enorme distância sempre se fizeram presentes, me apoiando em todas as etapas de minha vida.
A professora Agueda, que foi um exemplo de pessoa e profissional, e quem despertou
em mim o interesse pela pesquisa.
A todos os professores do mestrado, que foram essenciais para minha formação e
aprendizado nesta etapa importante da vida profissional.
A todos os colegas do Laboratório de Bacteriologia de Santa Maria por todos os
momentos vividos, de trabalho e de amizade.
Ao Mateus, que foi um excelente professor, me ajudando e orientando em todas as
etapas na execução deste trabalho.
A Lílian, Cari, Cris, Lu, Niura, Soninha e Rose, que muito mais que colegas, foram
amigas de todas as horas, fundamentais para enfrentar todos os problemas e das quais eu irei
lembrar sempre com muito carinho.
Ao Rafa, meu amor, companheiro, amigo e conselheiro, que me apoiou e auxiliou em
todos os momentos, sendo o incentivo crucial nas horas de desânimo. Obrigada pela
paciência, lealdade e amor.
5
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Rhodococcus equi DE POTROS PELA PCR
MULTIPLEX DOS GENES DA FAMÍLIA VAP
AUTOR: FERNANDA MONEGO
ORIENTADORA: AGUEDA CASTAGNA DE VARGAS
Santa Maria, 19 de fevereiro de 2008.
O presente estudo tem por objetivo a caracterização molecular de isolados de
Rhodococcus equi de eqüinos pela padronização de uma técnica de PCR multiplex para
detecção dos genes da família vap (vapA, B, C, D, E, F, G e H). Foram analisadas 180
amostras de Rhodococcus equi de diferentes origens: fezes (112), solo (12) instalações (23) e
isolados clínicos (33). A técnica foi padronizada e confirmada pelo sequenciamento da cepa
padrão de R. equi (ATCC 33701), e de uma amostra de paciente humano contendo o gene
vapB. Trinta e dois (17,8%) foram positivos para vapA e carregavam no mínimo 4 genes vap
associados. Os 147 isolados oriundos de fezes, instalações e sola não apresentavam genes vap.
Trinta e dois (97.0%) dos isolados clinicos foram positivos na PCR multiplex e demonstraram
seis padrões moleculares, 100% com vapA, vapD and vapG, 86.6% vapF, 76,6% vapH,
43.3% vapC, 36.6% vapE e nenhum com vapB. O perfil molecular mais freqüente foi vap A,
D, F, G eH presente em 37.5% das cepas. foram obtidos, sendo que os genes vapA, vapD e
vapG estavam presentes em todas as amostras. Não foi obtido nenhum padrão molecular para
cada propriedade estudada. Esta nova técnica constitui-se um método prático e eficaz para
condução de estudos clínicos e epidemiológicos, bem como, por relevar os aspectos
moleculares da infecção.
Palavras – chave: Rhodococcus equi; vap; PCR multiplex; potros; fezes.
6
ABSTRACT
Master´s Dissertation
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF Rhodococcus equi FROM
FOALS BY MULTIPLEX PCR FOR VAP GENES
AUTHOR: FERNANDA MONEGO
ADVISER: AGUEDA CASTAGNA DE VARGAS
Santa Maria, February 19
th
, 2008.
This study evaluated molecular characteristic of Rhodococcus equi isolates obtained
from horses and standardized by PCR multiplex assay, which amplifies the vap gene family
(vapA, B, C, D, E, F, G e H). One hundred eighty Rhodococcus equi isolates from different
sources: healthy horse’s feces (112), soil (12), stalls (23) and clinical isolates (33) of horse-
breeding farms, were studied. The technique was standardized and confirmed by sequencing
of amplified vap gene family controls. Thirty-two (17.8%) R. equi isolates evaluated were
positive for vapA gene and carried at least three another vap genes associated. All 147
isolates from equine feces, stalls and soil from horse-breeding farms did not demonstrate any
virulence-associated proteins genes. Thirty-two (97.0%) out of 33 clinical equines isolates
were positive to multiplex PCR assay for vap gene family and demonstrated six molecular
profile, 100% with vapA, vapD and vapG genes, 86.6% vapF, 76,6% vapH, 43.3% vapC,
36.6% vapE and none vapB. The most frequent molecular profile was vap A, D, F, G and H
present in 37.5% of strains. Morever, there was no molecular epidemiological pattern for R.
equi isolates from each horse-breeding farm studied. Thus this technique allows the
identification of eight vap genes family (vapA, B, C, D, E, F, G e H), it is a practical an
efficient method of conducting clinical and epidemiological studies on R. equi isolates.
Key-words: Rhodococcus equi; vap genes; PCR multiplex; foals; feces.
7
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Árvore filogenética dos genes vap da cepa de R. equi p33701 e do vapB
identificado em um isolado de virulência intermediária de R. equi........................................
18
FIGURA 2. Mapa do plasmídeo de virulência do R. equi
p33701. O circulo mostra a
orientação das ORFs, com a direção da leitura. Genes com uma função conhecida ou
suspeita são nomeados............................................................................................................
19
CAPÍTULO 1
FIGURA 1. FIGURA 1. (a) Molecular profile obtained by vap
genes family amplifying in
32 R. equi isolates. (b) Molecular samples frequency of vap
genes family founded on
isolates obtained on the seven studied farms........................................................................
36
8
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Níveis de virulência encontrados em cepas de R. equi
, com o respectivo
antígeno codificado e fontes de origem..................................................................................
16
TABELA 2. Similaridade
de aminoácidos da VapB, C, D e E em relação a
VapA.......................................................................................................................................
17
CAPÍTULO 1
TABELA 1. TABLE 1. Primers utilized on multiplex PCR for vap gene family
amplification………………………………………………………………………………...
35
9
SUMÁRIO
AGRADECIMENTO............................................................................................................
4
RESUMO...............................................................................................................................
5
ABSTRACT...........................................................................................................................
6
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................................
7
LISTA DE TABELAS..........................................................................................................
8
SUMÁRIO.............................................................................................................................
9
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................
11
2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA..........................................................................................
11
2.1 R. equi...............................................................................................................................
12
2.2 Infecção por R. equi..........................................................................................................
13
2.3 Plasmídeos de virulência e genes da família vap..............................................................
15
2.4 R. equi em humanos..........................................................................................................
20
2.5 Diagnóstico microbiológico da infecção por R. equi........................................................
21
2.6 Tratamento e profilaxia das infecções por R. equi............................................................
23
10
3. CAPÍTULO 1.....................................................................................................................
24
Molecular characterization of Rhodococcus equi from horse-breeding farm by multiplex
PCR for vap gene family........................................................................................................
25
Abstract...................................................................................................................................
25
Introduction............................................................................................................................
25
Materials e Methods...............................................................................................................
27
Results....................................................................................................................................
28
Discussion...............................................................................................................................
29
References...............................................................................................................................
32
4. CONCLUSÃO...................................................................................................................
37
5. REFERÊNCIAS................................................................................................................
38
6. APÊNDICE........................................................................................................................
44
11
1 INTRODUÇÃO
A criação de eqüinos no Brasil é uma atividade em crescimento constante,
apresentando um plantel de 5,9 milhões de animais. O elevado número de animais, associado
à necessidade de produção crescente, gera aumento no número de enfermidades, levando a
prejuízos econômicos significativos para a atividade (FAO, 2002).
Dentre as enfermidades que afetam eqüinos, o segundo grupo com maior prevalência é
formado por doenças associadas ao aparelho respiratório, implicando em importantes perdas
no rendimento, gastos com o tratamento e, ocasionalmente, em alguns casos, morte dos
animais. As enfermidades respiratórias mais freqüentes em eqüinos são as causadas por
agentes bacterianos, como Rhodococcus equi (R. equi), que está associado à mortalidade de
aproximadamente 3% dos potros em todo o mundo e a prejuízos devido principalmente ao
fraco desempenho dos animais nas corridas (CHANTER et al.,1997).
R. equi é um importante patógeno de potros jovens entre três e cinco meses de idade,
onde as manifestações clínicas mais comuns são broncopneumonia piogranulomatosa, enterite
ulcerativa e linfadenite supurativa em potros (GIGUÈRE & PRESCOTT, 1997). Nesta última
década, R. equi tem sido descrito também em humanos como um importante agente de
pneumonia, abscessos pulmonares e infecções sistêmicas em pacientes imunocomprometidos,
em especial os portadores de HIV (vírus da imunodeficiência humana) (BYRNE et al., 2001).
Várias técnicas tem sido utilizadas para o diagnóstico e caracterização da
patogenicidade bacteriana do R. equi, entre elas os testes sorológicos, os quais são de
eficiência questionada. A cultura e isolamento do agente é realizada a partir de animais
enfermos, de fezes de animais e de ambiente, como solo contaminado por fezes. O isolamento
de R. equi é adotado como método diagnóstico padrão na maioria dos estudos de
caracterização dessa bactéria.
A caracterização da virulência dos isolados é principalmente realizada pelo ensaio em
camundongos. Essa técnica, contudo, vem sendo substituída por testes de detecção de
plasmídeos associados à patogenicidade, bem como pela detecção de genes da família vap
presentes nestes plasmídeos.
O reconhecimento de plasmídeos e antígenos de virulência (Vap) em R. equi associada
aos testes de patogenicidade em camundongos, tem sido de grande importância para o
esclarecimento de aspectos relacionados a patogenia da doença causada por essa bactéria em
eqüinos. Assume-se que esses antígenos são responsáveis pela inibição da fusão
12
fagolisossômica, resistência à fagocitose e pela multiplicação bacteriana no interior de
macrófagos (HONDALUS & MOSSER, 1994). As proteínas Vap são codificadas em um
operon de 27,5kb, onde foram identificados sete membros de genes desta família (vapA, C, D,
E, F, G, e H). As proteínas VapA e VapB são consideradas isoformas. Linhagens vapA tem
sido associada à patogenicidade para eqüinos, a VapB tem sido encontrada em isolados
clínicos de R. equi de suínos e humanos (TAKAI et al., 2000). Nenhum dos outros genes
dessa família tem sua função plenamente compreendida. Contudo, estudos têm demonstrado
que esses genes têm expressão induzida durante as fases iniciais da fagocitose, o que pode
indicar sua participação na resistência da bactéria à destruição no interior dos macrófagos
(RAHMAN et al., 2005).
Assim, cumpre destacar que a identificação precisa dos isolados de R. equi é
extremamente importante para o diagnóstico definitivo e caracterização da enfermidade,
adoção de medidas de controle e tratamento, bem como para compreensão dos mecanismos
biológicos de patogenicidade da bactéria para eqüinos e demais espécies animais. Mas
principalmente nos fornece um método para traçarmos um perfil epidemiológico de uma
propriedade ou região a ser estudada. Diante disso, o presente trabalho teve por objetivo a
caracterização molecular de isolados de R. equi de eqüinos pela padronização de uma técnica
de PCR multiplex para detecção dos genes da família vap (vapA, B, C, D, E, F, G e H).
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 R. equi
As bactérias do gênero Rhodococcus são actinomicetos nocardioformes, membros da
família Mycolata, que contém também gêneros importantes em medicina veterinária como
Corynebacterium, Mycobacterium, Arcanobacterium e Nocardia. Existem aproximadamente
27 espécies do gênero R. equi classificadas pela diversidade de metabolismo, aplicação
industrial ou potencial em biorremediação (GYLES et al., 2004). Dentre essas, uma espécie é
reconhecida como patógeno em mamíferos: Rhodococcus equi (BELL et al., 1998).
13
No primeiro relato de isolamento esta bactéria foi denominada Corynebacterium equi
(TAKAI et al., 1994b). Com novos métodos usados para classificar os actinomicetos
nocardioformes, este microrganismo foi então reclassificado dentro do gênero Rhodococcus
(cocos com pigmento vermelho). Esses métodos incluem a análise das seqüências parciais
16S do rRNA, onde organismos com similaridade de 97% ou mais podem ser considerados da
mesma espécie; e a hibridização DNA-DNA, onde valores de 70% de associação definem a
identidade da espécie (BELL et al., 1998).
R. equi apresenta sua multiplicação em forma de micélio com fragmentação em
elementos cocóides ou coco-bacilares (HOLT et al., 1994). É também observado como
organismos pleomórficos e capsulados, que em cultivo por períodos prolongados demonstram
pigmento salmão, de onde decorre o nome Rhodococcus (QUINN et al., 1994). É um
microrganismo intracelular facultativo, provocando o desenvolvimento de lesões
piogranulomatosas nos animais graças à sua habilidade de sobreviver e se multiplicar no
interior dos macrófagos. A presença do ácido micólico na parede celular está estritamente
relacionada com a capacidade do microrganismo em sobreviver em condições adversas do
meio ambiente (MEIJER & PRESCOTT, 2004).
O microrganismo é predominantemente telúrico e apresenta requerimento nutricional
simples, o qual é suprido pelas fezes dos animais (PRESCOTT & HOFFMAN, 1993). R. equi
é aeróbico estrito, encontrado normalmente no trato gastrintestinal de eqüinos, multiplicando-
se no intestino delgado. A multiplicação ocorre apenas nas primeiras 12 semanas de vida do
potro e não é observada em cavalos adultos (TAKAI, 1997), provavelmente devido ao
desenvolvimento da microbiota intestinal.
A temperatura ótima de desenvolvimento desta bactéria é de 30ºC, embora apresente
boa multiplicação a 37ºC. Em condições de campo ideais, a bactéria pode aumentar seu
número de 1 para 10.000 UFC em 2 semanas (PRESCOTT & HOFFMAN, 1993).
Segundo Lazzari et al. (1997) o microrganismo pode ser isolado das fezes de diversas
espécies animais, como bovinos, suínos, caninos, caprinos e aves. O isolamento também pode
ser realizado a partir de amostra de solo, água, ar circulante e parede de baias, sugerindo sua
ampla distribuição no ambiente eqüino. Também pode ser cultivado de locais nunca ocupados
por eqüinos, como solo de praças e parques (TAKAI et al., 1996).
14
2.2 Infecção por R. equi
R. equi ocasiona broncopneumonia piogranulomatosa e enterite ulcerativa em potros
com menos de seis meses de idade (TAKAI et al., 1996). A doença apresenta distribuição
mundial, sendo endêmica em determinadas regiões (TAKAI, 1997). Esta bactéria também
pode ser encontrada a partir de isolados de bovinos e suínos, nos quais leva ao
desenvolvimento de linfadenites, produzindo lesões semelhantes às da tuberculose (TAKAI et
al., 1996b; SOEDERMANTO et al., 1997). Outras espécies animais que podem ser infectadas
por R. equi são ovelhas, cabras, cervos, búfalos, gatos e cães, apresentando alterações nos
linfonodos e abscedação (HONDALUS et al., 1997). Nos últimos anos, R. equi tem sido
descrito como patógeno oportunista de pacientes humanos imunossuprimidos, particularmente
daqueles que apresentam a síndrome da imunodeficiência adquirida - AIDS
(SOEDERMANTO et al., 1997).
R. equi é caracterizado como um patógeno intracelular facultativo que se multiplica
dentro de macrófagos. A sobrevivência intracelular é considerada necessária para o
desenvolvimento da doença, que é caracterizada por severa e fatal pneumonia principalmente
em potros (DONISI et al., 1996).
A característica coprofágica dos potros (PRESCOTT & HOFFMAN, 1993), e a
inalação do microrganismo (TAKAI et al., 1994b) contribuem para a infecção dos animais. A
temperatura de multiplicação da bactéria faz com que a maior parte dos casos ocorra no verão,
período que também favorece a aerossolização, que favorecem sua inalação (TAKAI, 1997;
MEIJER & PRESCOTT, 2004).
Microrganismo foi considerado patógeno oportunista (TAKAI et al., 1995a) devido a
combinação de fatores que podem estar relacionados a suscetibilidade dos potros, estes
incluem: a) a quantidade de microrganismo inalada ou ingerida deve ser equivalente à dose
infectante, a qual parece ser bastante baixa para potros; b) a idade de maior suscetibilidade
dos animais está entre 1 e 6 meses, época que coincide com o declínio dos anticorpos
maternos adquiridos via colostro; c) o sistema imune do animal nessa idade encontra-se ainda
imaturo, principalmente em nível de resposta celular (PRESCOTT, 1991; CHAFFIN et al.,
2003).
A distribuição da infecção esta relacionada a fatores ambientais como umidade,
temperatura e pH do solo, os quais contribuem para a multiplicação do microrganismo
(MEIJER & PRESCOTT, 2004). As condições de manejo como o tamanho da fazenda,
15
número de animais, tipo de material encontrado no piso das cocheiras (terra ou concreto) e o
transporte dos potros entre fazendas também estão envolvidos com a ocorrência da doença
(COHEN et al., 2005). A maioria dos animais apresenta títulos para a infecção, sendo que os
anticorpos estão presentes em níveis maiores nas fazendas endemicamente afetadas
(PRESCOTT & HOFFMAN, 1993).
2.3 Plasmídeos de virulência e genes da família vap
Os principais fatores de virulência desta bactéria são os antígenos e plasmídeos
associados à virulência, que permitem a classificação dos isolados de R. equi em 3 tipos
(Tabela 1) (TAKAI et al., 1991). Isolados virulentos e de virulência intermediária são
caracterizados pela presença de antígenos associados à virulência VapA (15 a 17kDa) e VapB
(20kDa), cujos genes estão presentes em plasmídeos (RIBEIRO et al., 2005).
Cepas virulentas VapA positivas são amplamente distribuídas no ambiente eqüino e
causam principalmente broncopneumonia em potros com menos de seis meses de idade
(TAKAI et al., 1993). Estão descritos 11 tipos clássicos de plasmídeos de virulência em
isolados considerados VapA positivos, os quais apresentam tamanhos de 85 kb (tipos I-IV),
87 kb (tipos I e II) e 90 kb (tipos I-V). O plasmídeo de “87 kb tipo III” caracterizado nova
variante foi isolado de potros no Brasil (RIBEIRO et al., 2005).
Cepas com virulência intermediária, consideradas VapB positivas, são encontradas
especialmente em linfonodos submandibulares de suínos e em isolados de humanos
imunossuprimidos (TAKAI et al., 1996a). Inicialmente Ribeiro et al. (2005) descreveu 16
tipos de plasmídeos distintos nesses isolados, os quais variam em tamanho de 79 a 100 kb
(tipos 1-16). Recentemente, foi descrito novo tipo de plasmídeo que apresentou padrão de
digestão enzimática (EcoRI e EcoT22I) diferente dos reconhecidos (MAKRAI et al., 2005a).
Cepas avirulentas estão presentes principalmente no solo e não apresentam plasmídeo
relacionado à virulência (RIBEIRO et al., 2005).
16
Tabela 1 - Níveis de virulência encontrados em cepas de R. equi, com o respectivo antígeno
codificado e fontes de origem.
Nível de virulência Fonte principal
Antígeno com gene presente
em plasmídeo
Virulento Potros doentes, cães e gatos
VapA (15-17kDa)
Virulência intermediária Humanos e suínos VapB (20 kDa)
Avirulento Ambiente (solo) Nenhum
Fonte: Adaptada de TAKAI et al., 1991; RIBEIRO et al., 2005.
O principal antígeno de virulência relacionado com a infecção em eqüinos é, portanto,
a proteína VapA, sendo também a estrutura melhor caracterizada até o momento. É uma
proteína de superfície ancorada por sua porção N-terminal ao envelope celular (TAN et al,
1995), codificada por genes presente em plasmídeos de virulência que variam em tamanho de
85 a 90Kb (BYRNE et al., 2001). Sua expressão é termorregulada, ocorrendo entre 34 e 41ºC
e aumentando em condições de baixo pH (TAKAI et al., 1994b), situação igualmente
observada na expressão da proteína VapD (BENOIT et al., 2001).
A regulação da expressão do gene vapA, assim como os outros genes da família,
ocorre no endossoma do macrófago sendo considerado parte do mecanismo pelo qual o
organismo sobrevive à morte intracelular (BENOIT et al, 2002). Estudos in vitro têm
mostrado que a expressão de alguns genes vap seja mediada quando concentrações de
micronutrientes estão restritas, semelhante ao ambiente do endossoma (REN & PRESCOTT,
2003). Ainda que a regulação dos genes vap é estimulada no ambiente intracelular dos
macrófagos, ela pode ocorrer a níveis reduzidos sob severas condições ambientais,
possivelmente contribuindo para a sobrevivência e replicação do R. equi fora do hospedeiro
(MUSCATELLO et al., 2006).
Uma variante de VapA, apresentando um peso de 20 kDa, foi classificada como VapB,
pela sua maior similaridade em relação à VapA, como mostra a Tabela 2 (BYRNE et al,
2001).
17
Tabela 2 – Similaridade
a
de aminoácidos da VapB, C, D e E em relação a VapA
b
.
Proteína Vap Identidade (%) Similaridade (%)
Similaridade da posição
carboxi-terminal
c
(%)
VapB 76 79 94 (82-187)
VapC 39 46 79 (85-196)
VapD 43 50 76 (53-164)
VapE 41 51 79 (95-206)
Fonte: BYRNE et al. (2001)
a
Similaridade determinada pelo GCG programa GAP.
b
Seqüências do R. equi 33701.
c
Região de maior similaridade. O número entre parênteses é a posição de aminoácido de cada Vap
usada para comparação.
As proteínas VapC, VapD e VapE são aproximadamente 50% similares a VapA e a
VapB. Como conseqüência, provavelmente tem funções distintas em relação a VapA. Essa
proposição é suportada pela observação de que estas proteínas são secretadas para o meio o
que não ocorre com a VapA, já que esta fica ancorada na parede celular (BYRNE et al.,
2001).
Uma árvore filogenética dos genes vap, incluindo o gene vapB obtido de uma cepa de
R. equi de virulência intermediária, é mostrada na Figura 1. Esta estrutura pode ser
significante para o entendimento das funções de virulência das proteínas Vap, principalmente
na observação de que os genes vapA e vapB estão intimamente relacionados (TAKAI et al.,
2000). O gene vapI, o último identificado, apresenta 57% de homologia com o gene vapE
(POLIDORE et al., 2006). Esta similaridade é próxima a encontrada por outros genes vap
como vapC, vapD e vapE e difere da alta similaridade (79%) entre vapA e vapB (BYRNE et
al., 2001).
18
Fonte: TAKAI et al (2000)
Figura 1 – Árvore filogenética dos genes vap da cepa de R. equi p33701 e do vapB
identificado em um isolado de virulência intermediária de R. equi.
A análise dos dados do sequenciamento de dois plasmídeos de virulência (Figura 2)
contendo o gene vapA, forneceu 64 quadros abertos de leitura (ORFs). A maioria (37,
excluindo os sete genes vap) tinham função desconhecida, baseada na falta de homologia
destas seqüências com genes de função conhecida no GenBank. Como resultado deste estudo
três regiões funcionais do plasmídeo foram identificadas (TAKAI et al., 2000).
Duas regiões funcionais continham genes similares aos codificadores de proteínas
envolvidas em conjugação, replicação plasmideal, estabilidade e segregação. A similaridade
destes genes em relação àqueles adquiridos por conjugação sugere que o plasmídeo pode
mover-se entre as cepas virulentas e avirulentas. Podendo esse fato estar relacionado com o
mecanismo pelo qual o plasmídeo se propague em uma população de cepas avirulentas
(TAKAI et al., 2000).
A terceira região é formada por no mínimo 25 ORFs incluindo a presença de 7
membros da família de genes vap (vapA, C, D, E, F, G, e H), todos eles codificando proteínas
(TAKAI et al., 2000). Esta região apresenta características típicas de uma ilha de
patogenicidade, tendo conteúdo GC mais baixo que o resto do plasmídeo e um tamanho de
27,5 kb. Apresenta-se limitada por duas ORFs (ORF61 e ORF22) com função de transposon.
As outras ORFs, que não as da família vap, não apresentaram similaridade com genes de
função conhecida de outros microrganismos (TAKAI et al., 2000).
Os sete genes vap estão localizados em uma seqüência de 19000 pb em seis sub-
regiões, em uma direção positiva, com exceção de vapG. vapA, vapC e vapD são agrupados
19
muito próximos um com o outro, e vapE e vapF são imediatamente adjacentes. Já vapG e
vapH estão presentes como genes individuais (TAKAI et al., 2000).
No total 11 genes codificadores foram identificados, os sete genes membros da família
vap e mais quatro que potencialmente também codificam proteínas, as quais parecem ser
importantes para a virulência, uma vez que podem interagir com o hospedeiro (TAKAI et al.,
2000; MEIJER & PRESCOTT, 2004).
Fonte: TAKAI et al. (2000)
Figura 2 – Mapa do plasmídeo de virulência do R. equi p33701. O circulo mostra a
orientação das ORFs, com a direção da leitura. Genes com uma função conhecida ou suspeita
são nomeados.
Apesar da descoberta de que a virulência do R. equi depende de um plasmídeo, o
subseqüente sequenciamento do mesmo não ofereceu muitas informações novas em relação
ao conhecimento dos mecanismos de virulência do microrganismo. Um dos motivos seria a
ausência de similaridade das proteínas codificadas dentro da ilha de patogenicidade com
20
proteínas de outros organismos, sugerindo que o R. equi emprega um novo mecanismo de
virulência que não se assemelha ao de nenhum microrganismo já descrito (MEIJER &
PRESCOTT, 2004).
Vários trabalhos relatam que o antígeno VapA é encontrado em todos os isolados
clínicos de R. equi obtidos de potros, bem como em algumas amostras ambientais (TAKAI et
al., 1996b; COSTA et al., 1999). Entretanto, existem relatos de amostras desprovidas de
plasmídeo de virulência ocasionando doenças no homem e animais, especialmente bovinos e
caprinos (CANTOR et al., 1998). Takai et al. (1991) descreveu que isolados sem plasmídeo
perdem a capacidade de sobreviver e replicar no interior de macrófagos, mostrando queda
acentuada na letalidade para camundongos (TAKAI et al., 1991). Estes achados é similar a
outros autores que verificaram que a perda do plasmídeo de virulência que codifica para
VapA coincide também com a diminuição da patogenicidade do R. equi para camundongos e
eqüinos (TAKAI et al., 1995b; WADA et al., 1997).
Além disso, cultivo in vitro a 37°C com repetidas passagens eliminou o fenótipo de
virulência devido à perda do plasmídeo, indicando que as proteínas codificadas por eles são
realmente necessárias para a virulência (TAKAI et al., 1991).
2.4 R. equi em humanos
A imunossupressão em pacientes humanos, principalmente naqueles submetidos a
transplantes ou ainda portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (aids) torna-se
um fator predisponente para a infecção. Porém, pacientes imunocompetentes também têm
sido acometidos (MIZUNO et al., 2005). Supõe-se que o solo contaminado com R. equi seja
uma potencial fonte da infecção para esses hospedeiros (TAKAI et al., 1994a).
A infecção pulmonar por R. equi em pacientes imunossuprimidos é a forma mais
comum de ocorrência da enfermidade. Grande parte destas infecções (aproximadamente 85%)
é relacionada com o comprometimento do sistema imunológico, sendo que um substancial
aumento no número de casos ocorreu desde 1981 com a endemia da aids (VERVILLE et al.,
1994). Mesmo sendo os pacientes imunossuprimidos os mais atingidos, podendo estar
relacionada com algum agente primário, como parasitas ou outras bactérias, assim como
ocorre nos eqüinos (NAPOLEÃO et al., 2005).
21
A exposição ao solo contaminado com fezes de herbívoros é a principal fonte do
microrganismo tanto para o homem como para os animais (PRESCOTT, 1991; TAKAI et al.,
1994a). Pessoas expostas ao ambiente de criações de animais domésticos em especial eqüinos,
estão expostos ao risco de contrair a infecção (VERVILLE et al., 1994).
A taxa de mortalidade nestas infecções está em torno de 11% para pacientes
imunocompetentes e 20 a 55% para pacientes imunocomprometidos. Esses altos valores estão
geralmente relacionados ao uso de terapia inadequada no início do tratamento, quando o
diagnóstico laboratorial ainda não foi realizado (KEDLAYA et al., 2001).
A presença de cepas contendo o plasmídeo de virulência não parece ser o único fator
para o desenvolvimento da infecção, já que muitos isolados humanos são avirulentos (TAKAI
et al., 1994a). A maioria das cepas isoladas de pacientes humanos com aids são virulentas ou
de virulência intermediária (vapB), enquanto que as cepas isoladas de pacientes com outros
tipos de imunossupressão são avirulentas (MAKRAI et al., 2005a).
2.5 Diagnóstico microbiológico da infecção por R. equi
Devido ao fato da infecção pulmonar por R. equi ser insidiosa e pela capacidade dos
potros em compensar a progressiva perda da função pulmonar, o diagnóstico clínico precoce
torna-se difícil. Dessa forma, o diagnóstico laboratorial da enfermidade apresenta grande
importância, tornando-se indispensável.
O diagnóstico definitivo deve ser realizado pela cultura microbiológica combinada
com o exame citológico do exsudato traqueobronquial. A presença de cocobacilos
pleomórficos, Gram positivos, é sugestivo de infecção por R. equi (VARGAS, 2001). As
colônias em ágar sangue ovino apresentam-se com aspecto liso, mucóide e não hemolíticas
(QUINN et al., 1994), embora já tenha sido relatado o isolamento de colônias hemolíticas
(PATE et al., 2004).
Uma das provas diferenciais para a identificação do microrganismo é o teste de CAMP
(Christie, Atkins, Munch, Petersen Test), no geral se observa a hemólise sinérgica entre R.
equi e Staphylococcus aureus. Porém a identificação definitiva é realizada pelas provas
bioquímicas, onde o patógeno mostra-se incapaz de fermentar açúcares como glicose, maltose
e sacarose, mas demonstrando capacidade de reduzir nitrato a nitrito e produzir urease
22
(QUINN et al., 1994). No entanto, trabalho realizado por VIANA et al. (2007) evidencia a
variabilidade fenotípica dos isolados dentro da espécie, obtendo-se distintos perfis
bioquímicos para esta bactéria. No mesmo estudo, refere que os testes fenotípicos
rotineiramente utilizados são insuficientes para a identificação e a diferenciação entre isolados
de R. equi e Dietzia maris, sendo o teste da utilização do ONPG (orthonitrophenyl-β-D-
galactopyrannoside) a única prova que demonstrou capacidade discriminatória
Além dos testes convencionais, existem outros testes realizados com meios de cultivo
seletivos que promovem o isolamento do R. equi a partir de materiais contaminados como
fezes ou solo. Dentre eles, os principais são o meio NANAT (“nalidixic acid novobiocin
actidione-cycloheximide potassium telurite”) (WOLCOOK et al., 1979) e os recentemente
descritos CAZ-NB (agar ceftazidima-novobiocina) e TCP (trimethoprim, cefoperazone,
polymyxin B), ambos contendo antimicrobianos que inibem contaminantes e favorecem o
isolamento do R. equi (MAKRAI et al., 2005b).
As técnicas moleculares para a detecção do R. equi em lavados bronquiais de potros
representam um avanço para o diagnóstico laboratorial da doença (SELLON et al., 1997). O
teste da PCR (reação em cadeia da polimerase) apresenta rapidez, sensibilidade e
especificidade, facilitando o tratamento precoce da infecção. A grande vantagem desta técnica
é o reconhecimento do fragmento do gene que codifica a região 16S do rRNA do R. equi,
sendo portanto uma técnica bastante específica (BELL et al., 1996).
A PCR não somente identifica o microrganismo como também pode identificar cepas
virulentas pela amplificação de genes relacionados à virulência, como a identificação do gene
vapA descrito por Takai et al. (1995b). Este diagnóstico ainda pode ser feito simultaneamente
pela técnica de PCR multiplex, na qual se identifica cepas de R. equi e avaliar a presença de
genes vapA (HALBERT et al., 2005; KREWER, 2006). Quando comparada com outros testes
diagnósticos como análise de plasmídeo, padrão de proteínas e patogenicidade para
camundongos, a técnica de PCR apresenta vantagens na diferenciação de isolados virulentos e
avirulentos para eqüinos (TAKAI et al., 1997).
Estudos epidemiológicos sobre a rododocose também podem ser beneficiados por
técnicas de PCR que permitem a identificação do tipo de plasmídeo (vapA ou vapB positivo),
como a técnica descrita por Oldfield et al. (2004). Uma maior eficiência pode ser obtida pela
PCR “real time” para detecção e quantificação de isolados de R. equi virulentos (vapA),
realizada a partir de fluido traqueo-bronquial (HARRINGTON et al., 2005).
O isolamento de R. equi, tanto pelo cultivo como pela técnica de PCR, não indica
doença já que o animal pode ser apenas um portador. Portanto, o diagnóstico definitivo desta
23
enfermidade deve sempre estar relacionado ao estado clínico dos animais (GIGUÈRE et al.,
2003).
2.6 Tratamento e profilaxia das infecções por R. equi
O R. equi é sensível a uma variedade de agentes antimicrobianos in vitro, mas in vivo a
maioria destas drogas torna-se ineficiente devido a natureza intracelular do microrganismo. A
combinação da eritromicina e rifampicina tem se mostrado útil no tratamento da pneumonia
por R. equi em potros, embora já existam relatos de resistência do microrganismo a estas
drogas (GIGUÈRE & PRESCOTT, 1997). Nesses casos a azitromicina e a claritromicina têm
sido utilizadas como drogas alternativas (JACKS et al., 2007).
A vacinação dos potros nem sempre é eficiente, pois a imunidade mediada por células
parece ser importante na prevenção da infecção por R. equi. Por outro lado, vacinas que
estimulam a imunidade de mucosas (IgA) têm se mostrado bastante eficiente. A vacinação
com peptídeos presentes no antígeno VapA induziram a produção de uma forte resposta de
mucosas no trato respiratório de animais vacinados (TAOUJI et al., 2002).
Evitar o excesso de poeira nas instalações, realizar a remoção de fezes, promover o
isolamento de potros que retornaram de criações onde a doença é endêmica e exame
cuidadoso e regular dos animais pode contribuir para o controle da enfermidade (PRESCOTT
& HOFFMANN, 1993; CHAFFIN et al., 2003; COHEN et al., 2005).
24
3. CAPÍTULO 1
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF Rhodococcus equi FROM FOALS BY
MULTIPLEX PCR FOR VAP GENES
Fernanda Monego, Agueda Castagna de Vargas
Artigo submetido à revista Current Microbiology
25
Molecular characterization of Rhodococcus equi from horse-breeding farm by multiplex
PCR for vap gene family
Abstract
This study evaluated molecular characteristic of R. equi (Rhodococcus equi) isolates
obtained from horses and standardized by PCR multiplex assay, which amplifies the vap gene
family (vapA, B, C, D, E, F, G e H). One hundred eighty Rhodococcus equi isolates from
different sources: healthy horse’s feces (112), soil (12), stalls (23) and clinical isolates (33) of
horse-breeding farms, were studied. The technique was standardized and confirmed by
sequencing of amplified vap gene family controls. Thirty-two (17.8%) R. equi isolates
evaluated were positive for vapA gene and carried at least three another vap genes associated.
All 147 isolates from equine feces, stalls and soil from horse-breeding farms did not
demonstrate any virulence-associated proteins genes. Thirty-two (97.0%) out of 33 clinical
equines isolates were positive to multiplex PCR assay for vap gene family and demonstrated
six molecular profile, 100% with vapA, vapD and vapG genes, 86.6% vapF, 76,6% vapH,
43.3% vapC, 36.6% vapE and none vapB. The most frequent molecular profile was vap A, D,
F, G and H present in 37.5% of strains. Morever, there was no possibility of demonstrating a
molecular epidemiological pattern for R. equi isolates from each horse-breeding farm studied.
Thus this technique allows the identification of eight vap genes family (vapA, B, C, D, E, F, G
e H), it is a practical an efficient method of conducting clinical and epidemiological studies on
R. equi isolates.
Key-words: Rhodococcus equi; vap genes; PCR multiplex; foals; feces.
Introduction
Rhodococcus equi is a gram-positive and a facultative intracellular pathogen,
associated to suppurative bronchopneumonia, lymphadenitis and enteritis in foals, usually on
26
the first months of life [26]. This organism has been recognized as an opportunistic pathogen
in both immunocompetent and immunocompromised humans, specially causing infection in
HIV infected patients [13, 15].
Finding out virulent plasmids and antigens in R. equi have a great importance to
enlighten epidemiological and pathogenic aspects of this disease in equines. These antigens
are responsible for suppression of phagolysosomal activity, intracellular survival and
replication in macrophages cells [2,6]. The discovery of virulence-associated antigens allowed
the virulence of R. equi strains classification in at least three levels [21]. Virulent and
intermediately virulent R. equi presented virulence-associated antigens VapA (15-17kDa) and
VapB (20-kDa) respectively. In contrast, non-virulent R. equi strains show no virulence-
associated antigens nor contain plasmid DNA [18]. All R. equi isolates virulent from mouse
and foals contain a large plasmid that is highly correlated with VapA protein expression. The
vapB gene has been described on isolates from pigs [26] and human isolates [24]. The greatest
advancement in understanding R. equi pathogenesis has been the description of a novel vap
genes family. Sequencing of the virulence plasmid showed a putative pathogenicity island,
i.e., a family novel of nine vap genes (vapA, B, C, D, E, F, G, H e I). However the importance
of this gene besides vapA, need be investigated because their roles in virulence are not clear.
The PCR technique has potential to identify virulent R. equi through the amplification
of gene sequences which are unique for virulence plasmids, and useful not only in
epidemiological investigations but also for early infection diagnosis [25]. This method was
compared to other tests such as plasmid analyses, protein pattern and pathogenicity for mouse
and showed advantages in differentiating virulent and non-virulent isolates [10].
Little is known about the epidemiological characteristics of vap genes family carried
by R. equi isolates. This research aim to characterization of vap gene family (vapA, B, C, D,
27
E, F, G e H) in R. equi isolates from Brazilian horse-breeding farm by multiplex PCR assay
standardization.
Materials and Methods
Bacterial samples and growth conditions. One hundred-eighty R. equi isolates from
Bacteriology Lab Collection, at Federal University of Santa Maria, Brazil, were selected and
analised in this work. The bacterial reference strains used in this study were R. equi ATCC
33701 (vap A, vap C, vap D, vap E, vap F, vapG e vapH) and a clinical isolate from human
(vapB). The bacteria were stored at -20°C, transferred to ovine blood agar (5%) and incubated
at 37°C for 48 h.
One hundred and eighty samples of seven horse-breeding farms (Fig. 1) from South
of Brazil were used, 178 (98,8%) were from Bagé city, one (0,6%) from São Borja city and
one (0,6%) from Foz do Iguaçu city, (Fig. 1). We evaluated 112 (62.2%) isolates from healthy
horses feces, 33 (18.6%) from clinical samples of equines, 23 (12.8%) from horse-breeding
farms and 12 (6.7%) from soil. Of 33 clinical isolates analyzed, 20 (60.6%) were obtained
from lung, three (9.1%) from tracheal wash, two (6.0%), from inguinal abscess, two (6.0%)
from lymph nodes, two (6.0%) from abdominal cavity, one (3.0%) from subcutaneous
abscess, one (3.0%) from nasal discharge, one (3.0%) from joint secretion and one (3.0%)
from mammary gland.
DNA Preparation. DNA was isolated from R. equi by lyses with cetyltrimethylammonium
bromide (CTAB) following Sambrook and Roussel [19] with minor modification (the
bacterial culture was previously digested with 5µL of proteinase K (20mg/mL) for 60 min at
37°C).
PCR assay for 16S rRNA of R. equi. The PCR assay was perform according with
procedures described by Krewer et al [10]. The amplification products (15µl) was submitted
28
to a 1,0% gel agarosis electrophoresis for 40 min at 100 V. DNA fragment was visualized by
UV fluorescence after staining with ethidium bromide.
Multiplex PCR assay for vap gene family. The primers for PCR amplification were
designed with Vector NTI 8.0 software (InforMax Inc. 2002) based on sequences published at
GenBank (Table 1). PCR amplification was performed as described previously by Takai et al
[25] with some modifications. The samples were subjected to 30 cycles of amplification in a
thermal cycler. The cycling conditions consisted of denaturation for 90 seg at 94
o
C, primer
annealing for 1 min at 55
o
C, and extension for 2 min at 72
o
C, following the final extension of
10 min at 72
o
C. For each reaction were used 4 µl (50ng) of DNA preparation in a 25µl
reaction mixture containing 10 mM Tris, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl
2
, 200 mM (each)
deoxynucleoside triphosphates, 1 µM each primer (30 pmol) and 1 U of Taq DNA
polymerase.
Sequencing. The control strains were sequenced in an automatic auto sequencer (MegaBace
500). Each vap gene was separately submitted to PCR and the products obtained were purified
with polietilenoglicol (PEG 8000). The sequences were submitted to a consensus analyses
based on reliability presented on the cromatograms obtained and by using Staden Package
Gap 4 program [20]. Afterwards, samples were compared to vap gene sequences stored at
GenBank by ChromasPro program, version 1.34.
Statistical analysis. The data analysis was perform comparing two larger groups using of qui-
square tes
t
and Fisher exact test for small samples. The level of significance was established
at a P value of 0.05.
Results
The 180 isolates analyzed with PCR procedure, amplified a 16S rRNA sequence and
showed a 458 pb product characteristic of R. equi.
29
The DNA sequence from amplifications of vap gene family of the controls, presented
Phred above 20 showing similarity with vap gene already existent at GenBank, which had a
variability of 93 to 100%, with E= 1e -100, confirming the PCR accuracy for the genes
evaluated.
Thirty-two (17.8%) R. equi isolates evaluated were positive for vapA gene and carried
at least three another vap genes associated. All 147 isolates from equine feces, stalls and soil
from horse-breeding farms did not demonstrate any virulence-associated antigen genes.
Thirty-two (97.0%) out of 33 clinical equines isolates were positive for at least four vap gene
and demonstrated six molecular profile (Fig. 1). One (3.0%) out of 33 clinical isolates was
negative for vap gene.
The positive multiplex PCR assay for vap gene family demonstrated 100% of isolates
with vapA, vapD and vapG genes, 86.6% vapF, 76,6% vapH, 43.3% vapC, 36.6% vapE and
none vapB, (data not shown). The most frequent molecular profile of vap gene family was
vap A, D, F, G and H present in 37.5% of positive strains. The vap gene family molecular
profile of seven horse-breeding farms did not demonstrate an epidemiological pattern for R.
equi isolates from each horse-breeding farm studied (Fig. 1).
Discussion
The significant presence of vapA gene in R. equi foals clinical isolates demonstrated
the virulence potential of the strains. This was according with previous studies that describe
the virulence in majority of isolates from foals [27,10]. Jain et al showed a mutant R. equi
which had a lack at five vap genes (vapA, C, D, E e F). This strain was attenuated for
virulence in mice and failed replication in macrophages, but when complemented with vapA
restored full virulence, whereas complementation with vapC, vapD or vapE didn’t restore the
30
virulence [9]. These results may suggest that vapA gene function is irreplaceable for R. equi
virulence in equines, therefore founded practically in all virulent isolates.
The absence of vap genes in one clinical case agrees with other reports, whose
samples were out of virulent plasmids but caused disease in human and animals [3,12]. Other
bacterial virulence factors like capsular antigens, cholesterol oxidase and fosfolipase C
enzymes, and micolic acid from cellular membrane can interact to develop this disease [7].
Others genes who potentially codes interaction proteins with the host [28], are important for
developing the pathology in equines which isolates from R. equi do not report vap gene.
Guiguère et al [4] showed that R. equi strains containing vapA in absence of other virulent
genes were avirulent for foals. Based on this data it could be suggested that although
important to R. equi pathology, vapA need to interact with other plasmid genes to concur to
cause this disease. Otherwise, there is not only the presence of plasmids containing vap genes
family that causes R. equi pathology
None out of 32 isolates vapA positive shows vapB gene that agree with Takai et al [24]
statement that clinical isolates express VapA or VapB, but not both proteins and presumably
carried the gene for only one of them. Other researches reported that strains from horses bring
up only vapA gene [16,12]. However, an experimental study which had a strain containing
vapB caused a disease similar to virulent strains when inoculated by trachea [29]. VapC,
VapD and VapE are structurally around 50% similar to VapA and VapB. Consequently,
VapC, VapD and VapE must have divergent functions in respect to VapA [2]. The different
functions of Vap proteins can explain the presence of others vap genes in association to vapA,
so each gene has a special action in illness.
The majority positive samples for any vap gene came from a region with acid soil pH
4,7 – 5,6 [11] which can contribute to increase the virulent strains within R. equi population
[1,14], but despite of this all isolates from equine feces, stalls and soil from horse-breeding
31
farms were negative for vap genes. Other study analyzed nine isolates came out environment
and they were negative for both vapA and vapB genes [16]. However, Makrai et al [12]
showed 26 (54,2%) soil samples positive for vapA, but not for vapB, indicating that farm
environment studied was heavily contaminated with virulent R. equi. The samples collected
from stalls and equine feces, in our study, were taken during hot and dry seasons, so it didn’t
answer to ideal conditions of temperature and humidity for maintaining microorganism
virulence. An inappropriate environment and culture condition excludes phenotypic for
virulence due to plasmid loss [21].
The molecular profile of vap gene family found in our study presented vapA, vapC,
vapD, vapE, vapF, vapG and vapH genes. Data indicate that vapA, vapD and vapG are the
most biologically relevant vap genes, because they are preferentially induced during infection
in natural host [8]. This can explain the presence of these genes on 32 isolates obtained from
illness equine and bring to believe that genes presented on this study contributed to the
development of this disease.
Byrne et al [2] only demonstrated isolates positive for vapA, vapC, vapD, and vapE
genes. These results indicated greater variability on vap genes family distribution and it can
be explained by samples length, which represents a bigger geographic region. These would
suggest that probably there is no genetic region highly conserved in virulent plasmids for R.
equi.
The vap gene molecular profile of seven horse-breeding farms did not demonstrate an
epidemiological pattern for each one. Sample size in our study was too small to permit any
significant conclusion concerning to distribution of molecular profile and isolates sources.
The multiplex PCR assay for vap gene family allowed identification and
characterization of virulent isolates in only one step of reaction, representing such a big
advantage in comparation to Halbert et al [5] diagnoses methodology, which allows
32
identification of R. equi strains and simultaneously evaluates the presence of vapA gene. The
PCR technique has potential for identifying virulent R. equi rapidly by amplification of gene
sequences who are unique for virulent plasmids, and it will be useful not only in
epidemiological investigations but also in early diagnosis [23].
Thus this is the first analyses involving identification of eight vap gene family,
realized with R. equi isolates at Brazil. After obtaining six different molecular patterns, more
epidemiological studies will be necessary to correlate this molecular results and disease
occurrence.
Acknowledgements
This research has been funded by the Conselho Nacional de Pesquisa e
Desenvolvimento Tecnológico, CNPq/ Brazil grant 471694/2007-0 and Fundação de Apoio a
Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul, Fapergs/ Brazil grant 07/50917.0.
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35
TABLE 1. Primers utilized on multiplex PCR for vap gene family amplification.
Identification
GeneBank
Access
Sequence size
(pb)
Tm
(
o
C)
VAPF-F AF116907 AGAATATGCCTGGTATGGGC 350 50,8
VAPF-R AF116907 TCGTCGTATAGCTGCTGCAG 350 51,7
VAPD-F AF118814 GGTGGTGCGATGTCAGAATG 400 53,5
VAPD-R AF118814 TGGAACGTCTTGCCCTTCTT 400 53,7
VAPG-F AF116907 TCATTGCCACCCTCCGGTTC 450 55,7
VAPG-R AF116907 GCGAACGCGGAAACTTCAAT 450 56,6
VAPH-F AF116907 AATTCCTATCAAGGACAGC 500 45,1
VAPH-R AF116907 ATACCGATTACGGAGCTCAC 500 48,5
VAPA-F AF116907 ACAAGACGGTTTCTAAGGCG 550 51,3
VAPA-R AF116907 TTGTGCCAGCTACCAGAGCC 550 55,2
VAPE-F AF116907 ATATGACGACCGTTCACAAG 600 47,3
VAPE-R AF116907 CTCCGATGCCCACCAAACTA 600 54,9
VAPB-F RER20KDAVA
GAATTCGAAAGCGCAAAGGT
650 53,7
VAPB-R RER20KDAVA
TTCCGTGAACATCGTACTGC 650 50,9
VAPC-F AF116907 GGGTCGTCCATCCAAATCGA 700 56,8
VAPC-R AF116907 GGTCAGGCCTATCACCCTTG 700 53,4
36
FIGURA 1. (a) Molecular profile obtained by vap genes family amplifying in 32 R. equi
isolates. (b) Molecular samples frequency of vap genes family founded on isolates obtained
on the seven studied farms.
37,5%
15,6%
12,5%
9,4%
3,1%
0
2
4
6
8
10
12
14
Molecular Pattern
Samples number
Profile 1 (vapA, D, F, G, H)
Profile 2 (vapA, C, D, E, F, G)
Profile 3 (vapA, D, G, H)
Profile 4 (vapA, C, D, E, F, G, H)
Profile 5 (vapA, C, D, F, G, H)
Profile 6 (vapA, D, E, F, G, H)
21,9%
% Molecular Profile
Horse-
Breeding
Farms
Samples
number
Profile
1
Profile
2
Profile
3
Profile
4
Profile
5
Profile
6
1 19 31.60 21.00 21.00 10.60 10.60 5.20
2 7 57.10 14.30 0.0 14.30 14.30 0.0
3 2 0.0 0.0 50.00 0.0 50.00 0.0
4 1 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
5 1 0.0 100 0.0 0.0 0.0 0.0
6 1 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
7 1 0.0 100 0.0 0.0 0.0 0.0
(a)
(b)
37
4. CONCLUSÃO
Com os resultados obtidos neste trabalho é possível concluir que:
A PCR multiplex descrita tem potencial para ser utilizada na identificação de genes
associados à virulência em amostras de R. equi.
A padronização desta técnica é um método eficaz para condução de estudos clínicos e
epidemiológicos.
A caracterização molecular permitiu observar que existem diferenças nos isolados
quanto à presença de genes vap.
Os padrões moleculares nos estabelecimentos não diferem estatisticamente quanto a
presença dos diferentes genes vap.
38
5. REFERÊNCIAS
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44
6. APÊNDICE
APÊNDICE A – Amostras de R. equi utilizadas no estudo
Haras Identificação Origem Haras Identificação Origem
54/97 Linfonodo 506/95 Fezes
80/99 Pulmão 506/95 Fezes
557/96 Pulmão 506/95 Fezes
353/93 Pulmão 506/95 Fezes
489/95 Pulmão 506/95 Fezes
025/03 Cavidade Abdominal 506/95 Fezes
400/02 Abscesso Subcutâneo 506/95 Fezes
412/02 Pulmão 506/95 Fezes
411/02 Linfonodo 506/95 Fezes
485/99 Secreção articular 506/95 Fezes
85/00 Pulmão 506/95 Fezes
96/93 Cavidade abdominal 506/95 Fezes
389/93 Pulmão 506/95 Fezes
561/99 Pulmão 506/95 Fezes
703/06 Lavado Traqueal 506/95 Fezes
558/06 Swab nasofaringeano 506/95 Fezes
164/94 Pulmão 506/95 Fezes
459/95 Swab 506/95 Fezes
459/95 Swab 506/95 Fezes
459/95 Swab 506/95 Fezes
480/95 Swab 506/95 Fezes
20/96 Swab 506/95 Fezes
1
20/96 Swab
1
288/07 Pulmão
48
46
APÊNDICE A – Amostras de R. equi utilizadas no estudo
Haras Identificação Origem Haras Identificação Origem
54/98 Pulmão 490/95 Fezes
583/98 Pulmão 490/95 Fezes
452/01 Pulmão 490/95 Fezes
473/02 Pulmão 490/95 Fezes
535/04 Lavado Traqueal 490/95 Fezes
535/04 Lavado Traqueal 490/95 Fezes
481/05 Gl. mamária 490/95 Fezes
490/95 Solo 490/95 Fezes
490/95 Solo 490/95 Fezes
490/95 Solo 490/95 Fezes
490/95 Fezes 490/95 Fezes
490/95 Fezes 490/95 Fezes
490/95 Fezes 490/95 Fezes
490/95 Fezes 490/95 Fezes
490/95 Fezes 490/95 Swab
490/95 Fezes 490/95 Swab
490/95 Fezes 490/95 Swab
490/95 Fezes 490/95 Swab
2
490/95 Fezes
2
47
APÊNDICE A – Amostras de R. equi utilizadas no estudo
Haras Identificação Origem Haras Identificação Origem
491/95 Pulmão 491/95 Fezes
491/95 Pulmão 491/95 Fezes
491/95 Swab 491/95 Fezes
491/95 Swab 491/95 Fezes
491/95 Swab 491/95 Fezes
491/95 Swab 491/95 Fezes
491/95 Solo 491/95 Fezes
491/95 Solo 491/95 Fezes
491/95 Solo 491/95 Fezes
491/95 Fezes 491/95 Fezes
491/95 Fezes 491/95 Fezes
491/95 Fezes 491/95 Fezes
491/95 Fezes 491/95 Fezes
491/95 Fezes 491/95 Fezes
491/95 Fezes 491/95 Fezes
3
491/95 Fezes
3
491/95 Fezes
48
APÊNDICE A – Amostras de R. equi utilizadas no estudo
Haras Identificação Origem Haras Identificação Origem
592/98 Abscesso Inguinal 492/95 Fezes
492/95 Solo 492/95 Fezes
492/95 Solo 492/95 Fezes
492/95 Swab 492/95 Fezes
492/95 Swab 492/95 Fezes
492/95 Fezes 492/95 Fezes
492/95 Fezes 492/95 Fezes
492/95 Fezes 492/95 Fezes
492/95 Fezes 492/95 Fezes
492/95 Fezes 492/95 Fezes
492/95 Fezes 492/95 Fezes
492/95 Fezes 492/95 Fezes
492/95 Fezes 492/95 Fezes
492/95 Fezes 492/95 Fezes
4
492/95 Fezes
4
492/95 Fezes
49
APÊNDICE A – Amostras de R. equi utilizadas no estudo
Haras Identificação Origem Haras Identificação Origem
490/02 Pulmão 456/95 Fezes
456/95 Solo 456/95 Fezes
456/95 Solo 456/95 Fezes
456/95 Solo 456/95 Fezes
456/95 Fezes 456/95 Fezes
456/95 Fezes 456/95 Fezes
456/95 Fezes 456/95 Fezes
456/95 Fezes 456/95 Swab
456/95 Fezes 456/95 Swab
5
456/95 Fezes
5
456/95 Swab
Haras Identificação Origem
6
27/98 Pulmão
7
17/91 Pulmão
455/95 Swab
455/95 Swab
455/95 Swab
455/95 Solo
447/95 Fezes
455/95 Fezes
455/95 Fezes
455/95 Fezes
455/95 Fezes
8
455/95 Fezes
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