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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CAMPUS DE BOTUCATU
MASTOCITOMA CANINO: ABORDAGEM
HISTOPATOLÓGICA E IMUNOISTOQUÍMICA NA
BUSCA DE BIOMARCADORES PROGNÓSTICOS
PEDRO PINCZOWSKI
Dissertação apresentada à Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Estadual Paulista “Julio
de Mesquita Filho”, Campus Botucatu,
para obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profª. Ass. Drª. Renée Laufer Amorim
Botucatu, SP
Março, 2008
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2
PEDRO PINCZOWSKI
MASTOCITOMA CANINO: ABORDAGEM HISTOPATOLÓGICA E
IMUNOISTOQUÍMICA NA BUSCA DE BIOMARCADORES
PROGNÓSTICOS
Banca examinadora:
_____________________________________
Prof. Ass. Drª. Renée Laufer Amorim
_____________________________________
Prof. Ass. Dr. Luiz Henrique de Araújo Machado
____________________________________
Prof. Ass. Dr. Paulo César Maiorka
Botucatu, 07 de Março de 2008.
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3
Dedico este trabalho:
Aos meus pais por sempre me apoiarem e incentivarem a dar o melhor de
mim.
Aos meus primos André e Ana Paula Kipnis por serem uma das principais
razões por eu me tornar um Médico Veterinário.
Ao meu Zeide por ser minha primeira grande inspiração na vida, sendo o
responsável pelo meu ingresso na área médica.
4
AGRADECIMENTOS:
A minha orientadora, professora, mãe, amiga Renée Laufer Amorim por
sempre me ajudar de uma forma alegre e me acompanhar desde o início.
A todos meus amigos da XXXVII por muitos anos de aprendizado e amizade.
Aos meus colegas de residência da Unifeob: Rick, Lê, Van, Lu P., entre
outros, que proporcionaram um ano tanto fantástico quanto surpreendente.
Aos meus tutores e amigos em São João da Boa Vista: Profª. Veridiana,
Profº. Ênio e Helder.
Aos Professores Luiz Henrique de Araújo Machado, Cláudia Valéria Seullner
Brandão, João Carlos Pinheiro Ferreira, Paulo César Maiorka por toda ajuda
proporcionada durante estes 2 anos.
Aos Residentes e também amigos da Patologia: Giu, Arita, Didier, Anita e
Tici, pelas horas de trabalho sempre com muita descontração.
Aos Residentes da CCPA pela ajuda na coleta do material.
Aos amigos PGs da patologia, pois só sendo PG pra saber como é a vida:
Giovana, Celmira, Marcela, Oba, Sandra, Fabito, Caio, Luciano, Galega, Gui,
Ana Paula e Camila.
Ao Rafa pelos momentos de ajuda, risadas e brigas! Conviver todos os dias
trabalhando junto não é fácil!
Ao meu amigo Leandro por uma ótima convivência.
A Profª. Drª. Noeme Souza Rocha por sempre estar presente para qualquer
tipo de ajuda.
Ao Profº. Andrigo Barboza de Nardi, Sabryna Calazans e José Carlos
Barbosa pela ajuda no momento final da dissertação.
Ao Maury Raul e Noel. Pessoas como vocês que fazem o “barco” andar.
A Kelly, Joyce, Mariana e Renata por toda ajuda disponibilizada.
5
A Lu, Ju, Gus, Jana, Bern, Vitória e Acácia por muitas e muitas horas de
risadas!
A Fabiana por sempre ser um exemplo na minha vida.
A D.M. por quebrar paradigmas.
Ao Baggins, Dumbo, Kuna, K-bo, Pensa, Tele, Bico por muitos momentos de
descontração.
A Eliana por ser uma pessoa especial na minha vida.
Ao Draco e Magnus por serem fiéis e companheiros.
A Atlética da veterinária por dois anos de muito trabalho e diversão
Aos meus mais novos amigos da XLII e XLIII.
Aos funcionários da Pós-Graduação por toda ajuda, facilitando todo o
andamento do mestrado.
A Fapesp pela bolsa concedida e apoio financeiro ao projeto.
6
“A vida é uma bela fantasia que vestimos juntos”
Charles Chaplin
7
SUMÁRIO
Página
RESUMO viii
ABSTRACT x
INTRODUÇÃO 1
OBJETIVOS 2
REVISÃO DE LITERATURA 3
O Mastocitoma 3
Diagnóstico 4
Histopatologia e Citologia 5
Prostaglandia E
2
(PGE2) 6
Fator de Crescimento do Endotélio Vascular 8
c-KIT 10
MASTOCITOMA CUTÂNEO CANINO: VARIAÇÃO ENTRE
OBSERVADORES NA GRADUAÇÃO HISTOPATOLÓGICA. 12
Resumo 13
Abstract 13
Resumen 14
Introdução 15
Material e Métodos 16
Resultados 16
Discussão e Conclusão 19
Referências 21
EXPRESSÃO DE C-KIT COMO CRITÉRIO DE DIFERENCIAÇÃO DOS
MASTOCITOMAS CUTÂNEOS CANINOS 22
Resumo 23
Introdução 24
Material e Métodos 25
Resultados 27
Discussão e Conclusão 32
Referências 36
EXPRESSÃO DE PGE2 E VEGF EM MASTOCITOMAS CUTÂNEOS
CANINOS 38
Resumo 39
Introdução 40
Material e Métodos 41
Resultados 43
Discussão 51
Conclusões 54
Referências 55
DISCUSSÃO GERAL 57
CONCLUSÕES GERAIS 62
REFERÊNCIAS 63
8
PINCZOWSKI, P. Mastocitoma canino: abordagem histopatológica e
imunoistoquímica na busca de biomarcadores prognósticos. Botucatu, 2008,
68p., Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”.
RESUMO
O mastocitoma ou tumor de mastócitos é a neoplasia cutânea mais
comum em cães. O sistema de graduação histopatológico proposto por Patnaik
et al. (1984), é um importante critério preditivo para o estadiamento da
neoplasia e determinação de terapia adjuvante. O grau I representa a neoplasia
bem diferenciada, o grau II a moderadamente diferenciada e o grau III a pouco
diferenciada ou anaplásica. Alguns autores demonstraram a discrepância
entres observadores quando realizadas comparações nas graduações
histopatológicas, devendo-se principalmente a subjetividade do sistema
atualmente utilizado. A busca de biomarcadores prognósticos pode ser feita
utilizando-se anticorpos primários contra as proteínas envolvidas no processo
de iniciação, promoção e progressão tumoral, angiogênese, além mediadores
inflamatórios. Estudos foram realizados avaliando-se a expressão de c-KIT
(indutor de proliferação celular), VEGF (indutor de angiogênese), PGE2
(mediador inflamatório), com a graduação histopatológica. Além de uma
avaliação do próprio sistema de graduação. Foi observada uma discrepância
ao avaliar 42 casos de mastocitomas, onde em 21,4% dos casos houve
concordância entre os quatro observadores envolvidos no estudo. Em 45
mastocitomas avaliados não houve correlação entre a intensidade de
expressão de c-KIT com a graduação histopatológica. No entanto o padrão de
marcação de c-KIT apresenta correlação com a graduação histopatológica,
sendo a membranosa mais frequente no grau I, citoplasmática difusa no grau II
e citoplasmática focal no grau III. Ao correlacionar o percentual de células
marcadas por campo e a intensidade de coloração do VEGF e PGE2 com a
graduação histopatológica de 53 mastocitomas, não houve correlação
estatística da expressão de VEGF, visto que todos mastocitomas expressam
altas quantidades de VEGF. Quanto ao PGE2 há correlação estatística do
percentual de células marcadas quando comparados os graus I e III. Frente
9
aos resultados apresentados é possível concluir que o mastocitoma cutâneo
canino é uma neoplasia potencialmente maligna, independente do grau
histopatológico e que critérios como padrão de imunomarcação do c-KIT
podem auxiliar na graduação e que o percentual de células marcadas para
PGE2 possa servir como biomarcador prognóstico.
10
PINCZOWSKI, P. Canine mast cell tumor: Histopathologic and
imunoistochemic approach in the search for prognostical biomarkers. Botucatu,
2008, 68p., Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Julio de
Mesquita Filho”.
ABSTRACT
The mast cell tumor is the most common cutaneous neoplasia in dogs. The
histopathologic grading system proposed by Patnaik et al. (1984) is an
important predictive criteria for stablishing the neoplasia staging and therapy.
The grade I represents a well diferentiated neoplasia, grade II a moderate
differentiated, and grade III a poorly diferentiated or anaplasic. Some authors
demonstrated a disagreement among pathologists when comparing
histopathologic grading, due mainly to the subjective grading system in use.
The search for prognostic biomarkers can be made using primary antibodies
against proteins involved in the process of tumor initiation, promotion and
progression, angiogenesis and inflammatory mediators. Studies were made
evaluating c-KIT (cellular proliferation inductor), VEGF (angiogenesis inductor)
and PGE2 (inflammatory mediator) expression and its correlation with the
histopathologic grading. A evaluation of the grading system itself was also
performed. It was found a disagreement when evaluating 42 canine cutaneous
mast cell tumors, where 21,4% of the tumors had agreement of all four
pathologists. In 45 mast cell tumors evaluated, there was no correlation
between the c-KIT expression intensity and the histopathologic grading.
However the expression pattern of c-KIT presented a correlation with the
histopathologic grading, where the membrane pattern was more frequent in
grade I, diffuse citoplasmatic in grade II and focal citoplasmatic in grade III.
When correlating the percentual of marked cells and the expression intensity of
VEGF and PGE2 with the histopathologic grading of 53 mast cell tumors, there
was no statistical correlation of VEGF, due to all mast cell tumors express high
levels of VEGF. The PGE2 presented correlation between the percentual of
marked cells when comparing grades I and III. Due to the results found it is
possible to conclude that the canine cutaneous mast cell tumor is a potentially
11
malignant neoplasia, no matter the histopathologic grading, and that criterias
such as c-KIT imunolabelling pattern can aid in grading and the percentual of
PGE2 marked cells can be used as prognostic biomarker.
12
1.Introdução
O mastocitoma é a neoplasia maligna constituída por mastócitos, que
corresponde de 11 a 27% de todas as neoplasias cutâneas em cães. O
mastocitoma aparece mais freqüentemente em membros pélvicos e torácicos,
abdômen, tórax e cabeça. No entanto a neoplasia pode se metastatizar para
linfonodos regionais e outros órgãos (ROGERS, 1996).
A compreensão total do diagnóstico, tratamento e comportamento
biológico do mastocitoma é de extrema importância, portanto muitos estudos
tem sido desenvolvidos que objetivam a obtenção de valores preditivos, que
possam auxiliar na escolha do tratamento e na obtenção de um prognóstico
acurado (LONDON e SEGUIN, 2003).
De todos os métodos de classificação de mastocitomas e estabelecimento
do prognóstico, a graduação histopatológica parece ser a de maior consistência
preditiva. O esquema proposto por Patnaik et al. (1984), utiliza informações
derivadas da análise de diferentes atributos histomorfológicos (tamanho do
tumor, celularidade, morfologia celular, índice mitótico e reação estromal). No
entanto, o comportamento clínico dos mastocitomas é imprevisível e melhores
técnicas prognósticas são necessárias para identificação de pacientes com alto
risco de recorrência e óbito (GROSS et al., 2005).
As prostaglandinas são os principais metabólitos do ciclo do ácido
aracdônico, responsáveis por inúmeros processos fisiológicos (RANDY et al,
2001) além de estudos mostrarem grandes concentrações de prostaglandinas
E
2
produzidas por células neoplásicas (LUPULESCU, 1996; ARA et al., 1996).
Assim como demonstraram Doré et al. (2003) a COX-2 tem uma estreita
relação com neoplasias, estimulando a proliferação celular, a angiogênese e
inibindo a apoptose, havendo uma maior concentração em neoplasias malignas
do que em benignas, portanto, a PGE2 por ser metabólito da COX, também
deve possuir uma relação com o desenvolvimento neoplásico maligno.
O VEGF também conhecido como fator de permeabilidade vascular é
uma potente citocina angiogênica indutora de mitoses, reguladora da
permeabilidade celular endotelial (FERRARA, 1996), além de prolongar a
sobrevivência de neovascularizações pela indução da expressão de proteínas
como o Bcl-2 (RANIERI et al., 2001). Sendo assim, mostra sua intensa relação
com a carcinogênese e progressão tumoral.
13
A proteína KIT (fator de crescimento de mastócitos, Steam cell factor -
SCF), codificada pelo proto-oncogene c-KIT estimula a maturação celular,
proliferação e ativação de mastócitos (HILL, 2002). A fosforilização da proteína
KIT resulta em uma ativação de receptores tirosina quinase em mastócitos e
uma subseqüente proliferação celular (LONGLEY e METCALFE, 2000).
Três padrões de marcação para o c-KIT foram identificados no
mastocitomas, sendo eles membranoso, citoplasmático focal e citoplasmático
difuso. Esse padrões foram correlacioandos com a graduação histopatológica
mostrando haver uma intensa relação com o prognóstico dos mastocitomas
caninos (WEBSTER et al. 2007).
2. Objetivos
Visto a ambiguidade na graduação histopatológica e a necessidade da
utilização de biomarcadores para a determinação de um prognóstico acurado
nos mastocitomas caninos, os objetivos deste estudo foram:
- Avaliar a expressão da PGE2 no mastocitoma cutâneo canino.
- Avaliar a expressão do VEGF no mastocitoma cutâneo canino.
- Correlacionar o escore de imunomarcação da PGE2 com a graduação
histopatológica do mastocitoma cutâneo canino.
- Correlacionar o escore de imunomarcação da VEGF com a graduação
histopatológica do mastocitoma cutâneo canino.
- Avaliar a expressão de c-KIT no mastocitoma cutâneo canino
- Correlacionar a intensidade e o padrão de marcação do c-KIT (CD117)
com a graduação histopatológica no mastocitoma cutâneo canino
- Avaliar se esses anticorpos poderão ser usados como biomarcadores
prognósticos no mastocitoma cutâneo canino.
14
2. Revisão de Literatura
O Mastocitoma
O mastocitoma ou tumor de mastócitos é a neoplasia cutânea mais
comum em cães, não havendo predileção por sexo, mas sim por raça, sendo o
Buldogue Inglês, Bull Terrier Inglês, Boxer, Boston Terrier, Pug, American Pitt
Bull Terrier, Weimaraner, Bullmastiff, Labrador Retriever, Setter Inglês, Beagle
e Golden Retriever os mais acometidos (ROGERS, 1996, THAMM e VAIL,
2007).
Nos cães, os mastocitomas ocorrem com maior freqüência nos membros
pélvicos (24,6%), no abdômen (17,2%), tórax (14,7%), membros torácicos
(13,6%) e cabeça (9,8%). Podem aparecer também em vísceras, como baço,
fígado e rins. O tumor surge de forma saliente na pele, normalmente como um
nódulo, podendo variar de 2 a 5 cm de diâmetro e de 1 a 3 cm de altura
(JONES et al., 2000). As formas mais malignas ou mais indiferenciadas
crescem rapidamente no início e causam metástases por via linfática e
hematógena.
O mastocitoma pode tornar-se muito infiltrativo, levando a dificuldade de
identificação das margens cirúrgicas, por isso a importância de uma ampla
excisão cirúrgica, além da associação a algum tipo de terapia conservativa
(quimioterapia, radioterapia, etc.) (JONES et al., 2000, THAMM e VAIL, 2007).
Os sinais clínicos do mastocitoma dependem muito da região acometida,
da evolução da neoplasia, assim como de suas complicações secundárias. O
mastocitoma cutâneo é a forma mais comum, podendo mostrar-se pruriginoso,
ulcerativo, edematoso e eritematoso, devido à liberação de histamina pelas
células neoplásicas. Além disso, a degranulação dos mastócitos causa
disfunções gastroentéricas como vômitos, anorexia, melena e ulcerações.
Úlceras duodenais são muito comuns, aparecendo em 80% dos casos. As
úlceras gastroentéricas podem romper-se levando a um quadro de peritonite.
Mais ocasionalmente, podem ocorrer hipergamaglobulinemia, coagulopatias e
glomerulonefrites. Animais com mastocitoma mostram-se imunossuprimidos,
ou seja, mais propensos a infecções secundárias. A linfadenomegalia aparece
comumente em casos de metástases (THAMM e VAIL, 2007).
15
Várias classificações histopatológicas foram propostas para identificar o
grau de diferenciação do mastocitoma canino, porém nenhum método de
classificação é mais amplamente utilizado que o de Patnaik et al. (1984), no
qual parâmetros morfológicos subjetivos são considerados. O sistema de
graduação histopatológico de Patnaik é um importante critério preditivo para o
estadiamento da neoplasia e determinação de terapias adjuvantes (FAN e
LORIMIER, 2005). O grau I representa a neoplasia bem diferenciada, o grau II
a moderadamente diferenciada e o grau III a pouco diferenciada ou anaplásica.
Variações intra e interobservadores tem sido o principal problema desta
classificação, Northup et al. (2005) demonstraram uma diferença significativa
entre patologistas na graduação histopatológica do mastocitoma, utilizando o
sistema de Patnaik. Apesar da graduação de Patnaik apresentar valor preditivo,
quanto ao tempo de sobrevida nos tumores bem diferenciados e nos
indiferenciados, os tumores de grau intermediário (grau II) trazem dificuldades
de avaliação (KIUPEL et al., 2004).
Diagnóstico
Para que haja um diagnóstico eficiente é necessário que se faça uma
boa anamnese, exame clínico, citologia aspirativa ou biópsia da massa, assim
como radiografia ou ultra-sonografia, nos casos de suspeita de neoplasias
viscerais. A citologia aspirativa e a biópsia servem para graduação dos
mastocitomas, sendo de extrema importância para a escolha terapêutica e
determinação do prognóstico. Muitos fatores têm sido usados para prever o
comportamento biológico do mastocitoma. Dentre eles a graduação histológica
parece ser o fator mais importante no auxílio à determinação do prognóstico.
Neoplasias mais diferenciadas tendem a possuir um prognóstico mais favorável
e as indiferenciadas um prognóstico reservado (ROGERS, 1996).
Com um exame físico detalhado é possível localizar as massas existentes.
Alterações sistêmicas como esplenomegalia e/ou hepatomegalia podem ser
sinais de metástase. Ainda, os linfonodos devem ser palpados
meticulosamente. O quadro 1 mostra possíveis classificações por estágios
clínicos de cães com mastocitoma, de acordo com a classificação da
Organização Mundial de Saúde.
16
Quadro 1 – Possíveis classificações por estágios clínicos de cães com
mastocitoma de acordo com a Organização Mundial de Saúde e descrito por
Ladue et al. (1998).
Estágio
Clínico
Descrição
0
Uma lesão confinada a derme sem envolvimento de linfonodos
regionais, sendo possível à ressecção cirúrgica. Não há evidência
de metástase e raramente se desenvolve doença sistêmica.
I
Uma lesão confinada a derme sem envolvimento de linfonodos
regionais
II
Uma lesão confinada a derme com envolvimento de linfonodos
regionais.
III
Lesões dérmicas múltiplas ou uma grande neoplasia infiltrativa com
ou sem envolvimento de linfonodos regionais. Não há evidencia de
metástase a distância ou de sinais de doenças sistêmicas.
IV
Qualquer neoplasia com envolvimento metastático a distância ou
recidiva com metástase. Há evidências de sinais sistêmicos.
Histopatologia e Citologia
O diagnóstico dos tumores de mastócitos é relativamente simples, de
forma que naqueles bem diferenciados, normalmente não há problema em sua
identificação histológica. Os mastocitomas formam normalmente folhetos
difusos de cordões densamente compactados de células redondas ou
poligonais, contendo um núcleo redondo, posicionado no centro da célula e
quantidades moderadas de citoplasma basofílico grosseiramente granular
(JONES et al., 2000). Normalmente, os cordões celulares estão separados por
feixes de colágeno. Além disso, é possível à visualização de um número
variável de eosinófilos, devido à quimiotaxia destes, em resposta aos grânulos
dos mastócitos. As células neoplásicas exibem um grau variado de
diferenciação celular, baseado na presença e proeminência dos grânulos.
17
O pleomorfismo e o índice mitótico têm sido úteis para gradação da
neoplasia, podendo variar de grau I a grau III. O grau I (bem diferenciado)
possui células tumorais uniformes, núcleo redondo, com um núcleo e
granulações evidentes, havendo assim um melhor prognóstico. Já no grau III
(pouco diferenciado ou indiferenciado), que possui um prognóstico
desfavorável, há maior pleomorfismo celular, podendo haver de pouca a
nenhuma granulação citoplasmática, núcleos aberrantes, grande relação
núcleo/citoplasma, e algumas vezes binucleação, mostrando uma maior
indiferenciação celular. O grau II possui características intermediárias aos
graus I e III.
Prostaglandina E
2
(PGE2)
As prostaglandinas desempenham papéis importantes em processos
fisiológicos normais, tendo participação em diversos tecidos do organismo com
funções distintas como regulador do fluxo renal, mediador de agregação
plaquetária, portanto regulando a homeostase, regulador da reprodução,
formação e reabsorção óssea. Além do mais as PG também afetam a resposta
imune, o que interfere de forma considerável na carcinogênese e progressão
dos tumores (MOHAMMED et al., 2001).
Muitos estudos nas últimas duas décadas têm sido de extrema
importância para demonstrar o elo entre o desenvolvimento e progressão do
câncer e os metabólitos do ácido aracdônico. Um desses metabólitos, a
prostaglandina E2 (PGE2), merece uma atenção considerável, devido a sua
implicação na carcinogênese, progressão neoplásica e metástases (EARNEST
et al., 1992; FOLKMAN et al., 1997). A PGE2 possui também capacidade
angiogênica, onde se observa aumento na produção de VEGF pelo estímulo de
PGE2 (ABDEL-MAJID et al., 2004, SPINELLA et al., 2004).
Grandes concentrações de prostaglandinas E
2 são produzidas por
células neoplásicas, macrófagos associados a tumores e monócitos do sangue
periférico em pessoas com câncer de pulmão, mama, cólon, cabeça e pescoço
e experimentalmente em tumores induzidos em animais, mostrando assim sua
íntima ligação com o comportamento biológico do câncer (HUBBARD et al.,
1988; MARNETT et al., 1992).
18
A inibição farmacológica de PGEs e COX estão sendo avaliadas com
alvos para prevenção do câncer e em seu tratamento em animais com
neoplasias ocorridas naturalmente, usados como modelos para humanos
(KNAPP et al., 2000).
Mohammed et al. (2001) demonstraram que as concentrações de PGE2
eram mais elevadas em tecidos tumorais quando comparados com tecidos
normais, principalmente em carcinomas transicionais, prostáticos e de células
escamosas em caninos.
Estudos mostraram a correlação da expressão de COX-2 com VEGF,
angiogênese e mortalidade. COX-2 catalisa a produção de PGE2 e altos níveis
de PGE2 foram encontrados em adenocarcinomas colo-retais, quando em
comparação a tecidos adjacentes normais (Chianchi et al., 2001).
Os mecanismos pelas quais a PGE2 estimula o VEGF ainda continuam
indefinidos, no entanto Eibl et al. (2003) sugerem que o ácido aracdônico é
convertido em PGE2 através da ação específica da COX-2, o qual aumenta os
níveis de VEGF, de forma autócrina e parácrina, estimulando a migração de
células endoteliais. Mostrando que a PGE2 possui um papel importante na
expressão de COX-2 em células neoplásicas como mostrado em neoplasias
pancreáticas.
A PGE2 como um importante mediador inflamatório, foi o maior indutor
da potente isoforma proangiogênica VEGF-A em mastócitos de humanos. A
PGE2 induziu VEGF-A em culturas de mastócitos como relatado por Abdel-
Majid et al., (2004).
Grande interesse tem sido demonstrado na descoberta de uma possível
ligação da COX e de seus metabólitos (PGE2) no desenvolvimento e
progressão do câncer. Mesmo que o exato mecanismo pelo qual a PGE2 e
outros metabólitos do acido aracdônico não estejam totalmente elucidados
alguns possíveis mecanismos incluem: papel na mutação celular; efeitos
diretos e indiretos da PGE2 e outros produtos da COX na proliferação e
apoptose em células neoplásicas; PGE2 induz a imunossupressão que dificulta
o sistema imune do indivíduo em combater células neoplásicas além do efeito
da PGE2 nos mecanismos de metástase (colagenólise, angiogênese,
hipercoagulabilidade) e por final, como mediador inflamatório que recruta
19
fatores de crescimento que contribuem para a progressão neoplásica.
(LUPULESCU et al., 1996; ARA et al., 1996).
Fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF)
A angiogênese é um processo pelo qual novos vasos se desenvolvem a
partir de vasos sanguíneos já existentes. A angiogênese fisiológica ocorre
durante o crescimento fetal e desenvolvimento, mas é rara em adultos exceto
em episódios de reparação de feridas e no trato reprodutivo de fêmeas. A
angiogênese ocorre regularmente no corpo lúteo e no endométrio como parte
do rápido crescimento e regressão desses tecidos durante o ciclo ovulatório. A
angiogênese patológica ocorre em processos malignos e inflamatórios crônicos
(GARGETT et al., 2001).
O complexo controle angiogênico depende do balanço entre fatores
estimulatórios e inibitórios que afetam a proliferação e diferenciação de células
endoteliais (HANAHAN e FOLKAMAN, 1996). Um desses fatores é o VEGF, o
qual é o mais potente indutor de angiogênese e permeabilidade vascular
(LEUNG et al., 1989).
Muitos trabalhos sugerem que a angiogênese é extremamente
importante na carcinogênese, crescimento e progressão dos tumores (ALBINI
et al., 2001; VERMEULEN et al., 2002; RANIERI et al., 2002). Dentre esses
fatores o mais investigado e estudado pela oncologia humana é o VEGF (DE
JONG et al., 1998).
O VEGF é uma proteína que estimula a migração e proliferação de
células endoteliais vasculares, extremamente importantes para a angiogênese.
É produzido por células neoplásicas, macrófagos, plasmócitos e algumas vezes
por linfócitos (LUI et al., 1995).
Há evidências que os níveis de expressão do VEGF em tumores
primários podem refletir nas características biológicas destes em termos de
agressividade e com isso contribuir com informações para o prognóstico
(GASPARINI et al., 1998; RANIERI et al., 2001; PARADISO et al., 2001;
RANIERI et al., 2003). O VEGF também conhecido como fator de
permeabilidade vascular é uma potente citocina angiogênica que induz
mitoses, regula a permeabilidade das células endoteliais (FERRARA, 1996) e
20
prolonga a sobrevivência de neovascularizações pela indução da expressão de
proteínas como a Bcl-2 (RANIERI et al., 2001).
Cinco isoformas do VEGF foram identificadas e seqüenciadas VEGF-A,
VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e o fator de crescimento da placenta (NICOSIA,
1998). A forma isofórmica solúvel da VEGF é uma glicoproteína induzida por
hipóxia e pela mutação oncogênica (BALSARI et al., 1999).
Em trabalhos publicados, os níveis séricos de VEGF em pacientes com
vários tipos histológicos de câncer se encontraram muito mais elevados do que
em pacientes saudáveis (ACHEN et al., 1998). Estudos preliminares sugeriram
o alto nível de VEGF associado ao estagio tumoral, demonstrando pior
prognóstico, em pacientes com câncer gastrointestinal (ADAMS et al., 2000).
A expressão de VEGF por tumores sólidos, especialmente tumores
mamários foram correlacionados com um prognóstico reservado (SLEDGE &
MILLER, 2003).
Ranieri et al. (2003) demonstraram uma maior concentração de VEGF
em humanos com câncer gastrointestinal do que em saudáveis, e ainda
sugeriram que o VEGF possui um papel importante como marcador
angiogênico em câncer gastrointestinal.
Em tumores, o aumento da síntese de VEGF é considerado uma das
primeiras influências para a angiogênese, contribuindo assim para o
desenvolvimento de características malignas como crescimento acelerado e
metástases. Um aumento na produção de VEGF foi observado em tumores
malignos, especialmente aqueles menos diferenciados (CONNOLY et al., 1989;
DE JONG et al., 1998).
A proliferação de células endoteliais induzida pela VEGF produz
metástases por diversos motivos, entre eles: a neovascularização, produção de
colagenase e outras enzimas degradativas que facilitam a célula neoplásica em
desprender-se da massa e cair na corrente sangüínea além de estimular o
crescimento celular neoplásico (MOSCATELLI et al., 1981).
De acordo com Takahashi et al. (1995 e 1997) a densidade
microvascular é um fator determinante para metástase de tumores como o
câncer de cólon em humanos e de sua mortalidade. A expressão de VEGF é o
melhor determinante da densidade microvascular sendo portanto intimamente
relacionado à metástase e mortalidade.
21
Restucci et al. (2003) demonstraram um aumento da expressão de
receptores para VEGF em células endoteliais em tumores malignos. Stitt et al.
(1998) sugeriram uma função autócrina para VEGF, um meio pelo qual células
neoplásicas malignas podem atuar simultaneamente como produtor e alvo de
VEGF, contribuindo para o crescimento neoplásico independentemente de
fatores angiogênicos de células endoteliais normais. Demonstraram ainda que
VEGF e seus receptores em neoplasias malignas, estimulados por hipóxia,
possuem um papel na indução de células endoteliais e proliferação de células
neoplásicas, contribuindo para o crescimento tumoral. Restucci et al. (2000),
em contraste, demonstraram que a síntese de outros fatores angiogênicos
necessários para maturação de novos vasos pode ser inadequada, resultando
na produção de vasos pequenos e esporadicamente mal formados.
Em um estudo conduzido por Sales et al. (2001), foi observada
expressão de VEGF em inflamação e em áreas de CIN (neoplasia intraepitelial
cervical), mas relativamente rara e fraca, no entanto houve uma grande
expressão em áreas de carcinoma e em células inflamatórias adjacentes e
fibroblastos.
Vários autores reportam que o VEGF, COX-2 e as prostaglandinas,
como PGE2, possuem uma íntima relação, assim como demonstrou Gallo et al.
(2001) e Cianchi et al. (2001) onde a expressão de VEGF e COX-2 tiveram
uma correlação positiva com a densidade microvascular, além de uma
associação entre VEGF e COX-2 na angiogênese.
Mitsutoshi et al., (2002), demonstraram que VEGF regula positivamente
a atividade de RNAm, proteína e níveis de atividade enzimática da COX-2 em
células endoteliais humanas. Pai et al. (2001) reportaram a indução da
expressão gênica de VEGF pela PGE2 em células endoteliais microvasculares
gástricas de ratos. Juntos, esses achados sugerem um possível “feedback”
positivo para uma produção local contínua de VEGF e COX-2 dependentes de
PGE2 nas células endoteliais.
A partir dessas informações o estudo do VEGF em mastocitomas é
inédito e importante para avaliar a carcinogênese e progressão tumoral
baseada na angiogênese.
22
c-KIT
Foi reportado em várias espécies animais a importância da interação de
fatores de crescimento de mastócitos (Steam cell factor - SCF) com receptores
específicos da proteína KIT, estimulando a maturação celular, proliferação e
ativação de mastócitos (HILL, 2002). A proliferação de mastócitos em humanos
foi associada a mutações de proto-oncogenes c-KIT, que codifica a proteína
KIT (CD 117), um receptor da tirosina quinase. A fosforilação da proteína KIT
resulta em uma ativação de receptores tirosina quinase em mastócitos e uma
subseqüente proliferação celular (LONGLEY & METCALFE, 2000).
Uma via de estimulação autócrina formada pelo receptor KIT e o seu
ligante tem sido implicado no desenvolvimento dos mastocitomas e nas
mastocitoses no homem (LONDON et al. 1999; WEBSTER et al. 2007). A KIT é
uma proteína transmembrânica que atua como receptor para o fator de células-
tronco, codificada pelo proto-oncogene c-KIT (LONDON et al. 1999). Sua
expressão é normalmente detectada em células-tronco hematopoiéticas, entre
elas os mastócitos. Mutações e padrões de expressão de c-KIT têm sido
correlacionados com o prognóstico do mastocitoma (LONDON et al. 1999;
ZEMKE et al. 2002; REGUERA et al. 2002; WEBSTER et al. 2007).
Zemke et al. (2002) sugeriram uma relação entre a graduação
histopatológica dos mastocitomas e a presença de mutações no c-KIT. Ao
avaliarem diversos mastocitomas caninos viram que não houve mutações em
mastocitomas grau I e menos de 10% de mutações em mastocitomas grau II.
No entanto 66% dos mastocitomas grau III possuíam alterações genéticas.
Com isso, assim como em humanos, mastocitomas caninos foram associados
com mutações do proto-oncogene c-KIT, resultando em uma ativação e
proliferação dos mastócitos.
23
Mastocitoma cutâneo canino: variação entre observadores na graduação
histopatológica.
Pedro Pinczowski
1
, Rafael Torres Neto
2
, Celmira Calderón
3
, Viciany E.
Fabris
4
, Renée Laufer-Amorim
5
.
1 – Pós-graduando, Departamento de Clínica Veterinária, Serviço de
Patologia Veterinária. FMVZ, Unesp, Botucatu, Distrito de Rubião Jr. s/n
014-38116293, [email protected]
2 – Pós-graduando, Departamento de Clínica Veterinária, Serviço de
Patologia Veterinária. FMVZ, Unesp, Botucatu, Distrito de Rubião Jr. s/n
014-38116293, [email protected]
3– Pós-graduanda, Departamento de Clínica Veterinária, Serviço de
Patologia Veterinária. FMVZ, Unesp, Botucatu, Distrito de Rubião Jr. s/n
014-38116293, celmiracal[email protected]
4 – Professor Assistente Doutor, Departamento de Patologia, Faculdade
de Medicina, Unesp, Botucatu, Distrito de Rubião Jr. s/n 014-38116238
5 – Professora Assistente Doutora, Departamento de Clínica Veterinária,
Serviço de Patologia Veterinária. FMVZ, Unesp, Botucatu, Distrito de
Rubião Jr. s/n, 014-38116293, [email protected]
Trabalho enviado para revista Clínica Veterinária
Apoio financeiro: Fapesp
24
Mastocitoma cutâneo canino: variação entre observadores na graduação
histopatológica.
Resumo: O mastocitoma ou tumor de mastócitos é a neoplasia cutânea mais
comum em cães, não havendo predileção por sexo, mas sim por raça, sendo o
Buldogue Inglês, Bull Terrier Inglês, Boxer, Boston Terrier, Pug, American Pitt
Bull Terrier, Weimaraner, Bullmastiff, Labrador Retriever, Setter Inglês, Beagle
e Golden Retriever os mais acometidos. O sistema de graduação
histopatológico é um importante critério preditivo para o estadiamento da
neoplasia e determinação de terapia adjuvante O grau I representa a neoplasia
bem diferenciada, o grau II a moderadamente diferenciada e o grau III a pouco
diferenciada ou anaplásica. Alguns autores demonstraram a discrepância
entres observadores quando realizadas as graduações histopatológicas,
devendo-se principalmente a subjetividade do sistema de graduação
atualmente utilizado. Frente a isso um estudo com 4 observadores foi realizado
em 42 casos de mastocitomas cutâneos caninos. Onde foi demonstrado existir
uma discrepância na graduação principalmente quando se trata de
mastocitomas grau II.
Palavras chave: classificação, cão, histopatologia, neoplasia
Cutaneous mast cell tumor: Variaton among pathologists in the
histopathologic grading
Abstract: The mast cell tumor is the most common cutaneous neoplasia in
dogs, where the English Bulldog, English Bull Terrier, Boxer, Boston Terrier,
Pug, American Pitt Bull, Weimaraner, Bullmastiff, Labrador Retriever, Setter,
Beagle and Golden Retriever are the most affected breeds. The histopathologic
grading is an important predictive criteria for neoplasia staging and therapy
choice. The grade I represents a well-differentiated neoplasia, grade II
moderate differentiated neoplasia and grade III poorly differentiated. Some
authors showed a few degree of agreement among pathologists in grading mast
cell tumors, mainly for the subjectivity of the graduation system. A study with 4
25
pathologists was performed in 42 cases of canine mast cell tumors, where it
was demonstrated a disagreement among the graduation, mainly in grade II
tumors.
Key Words: classification, dog, histopathology, neoplasia
Mastocitoma cutáneo canino: variación entre observadores en el
graduación histopatológica
Resumen: Mastocitoma o tumor de mastocitos es ela neoplasia más comúm
em canes, sin prelección sexual pero sí social, siendo el Buldog Inglés, Bull
Terrier Inglés, Boxer, Boston Terrier, Pug, American Pitt Bull Terrier,
Weimaraner, Bullmastiff, Labrador Retriever, Setter Inglés, Beagle e Golden
Retriever los más afectados. El sistema de graduación histopatológico es un
importante criterio predictivo para determninar el estado de la neoplasia y su
terapia adyuvante. Mastocitoma grado I representa una neoplasia bien
diferenciada, el grado II una moderadamente diferenciada y el grado III una
poco diferenciada o anaplásica. Algunos autores demonstraron la discrepancia
entre los observadores cuando se realizan las graduaciones histopatológicas,
lo cual se debe principalmente a la subjetividad del sistema de graduación
utilizado en el actualidad. Ante este hecho foi realizado un estudo com quatro
observadores em 42 casos de mastoctioma cutáneo canino. Fue demonstrado
la existencia de uma discrepancia en la graduación principalmente cuando se
trata de mastocitomas de grado II.
Palabras clave: clasificación, canes, histopatologia, neoplasia
26
Introdução:
O mastocitoma cutâneo é uma neoplasia constituída de mastócitos
observado frequentemente nos cães. Apesar de alguns mastocitomas
apresentarem comportamento biológico benigno, todos devem ser encarados
como potencialmente malignos
1,2,3
.
Considerando sua variação histopatológica, alguns sistemas de
graduação foram estabelecidos e correlacionados com o tempo de sobrevida
do paciente e o mais utilizado na rotina oncológica divide o mastocitoma em
três graus
4
. O sistema de graduação histopatológico é um importante critério
preditivo para o estadiamento da neoplasia e determinação de terapia
adjuvante
2
. O grau I representa a neoplasia bem diferenciada, o grau II a
moderadamente diferenciada e o grau III a pouco diferenciada ou anaplásica.
Estudos demonstraram uma diferença significativa entre patologistas na
graduação histopatológica do mastocitoma, utilizando o sistema de Patnaik.
Dez patologistas graduaram em testes “as cegas”, 60 casos de mastocitomas
caninos. Houve uma concordância total em menos de 7% dos casos. Além de
10% destes terem recebido as 3 graduações. Isto demonstra uma falha na
graduação histopatológica hoje empregada. Algumas hipóteses foram geradas
tentando justificar essa discrepância, como a própria subjetividade da
graduação, dificuldade em determinar ou distinguir entre algumas
características da classificação ou até mesmo a heterogenicidade na
população celular em diferentes áreas de um mesmo mastocitoma
5
.
Foram realizados dois estudos sobre a discrepância na graduação
histopatológica. No qual um deles foram usadas várias referências para a
graduação dos mastocitomas e outro usando somente uma classificação
4
. No
trabalho o qual somente uma referência foi usada, houve uma menor
discrepância na graduação, no entanto ainda houve uma diferença
considerável na graduação, mostrando que uma uniformidade no sistema de
graduação histopatológica aumenta o consenso entre os patologistas na
classificação dos mastocitomas, mas não resolve as discrepâncias
5
.
Devido à importância da graduação histopatológica dos mastocitomas e
a possível discrepância da graduação entre observadores, objetivou-se fazer
um estudo comparativo de graduações de mastocitomas, entre quatro
observadores treinados em diagnóstico histopatológico.
27
Material e Métodos
Foram selecionados retrospectivamente 42 casos de mastocitomas
cutâneos caninos diagnosticados no Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ-
UNESP/Botucatu. As lâminas de cada caso, coradas por hematoxilina e eosina
e azul de toluidina, foram revisadas por um dos observadores para confirmar a
adequação dos cortes histológicos para a posterior graduação. Os quatro
observadores incluídos no estudo seguiram os mesmos critérios pré-
estabelecidos para a categorização dos mastocitomas em bem diferenciado
(grau I), moderadamente diferenciado (grau II) e pouco diferenciado (grau III),
seguindo o modelo proposto mais utilizado atualmente
4
. Os observadores não
tinham informações sobre a história do paciente, tamanho e localização do
tumor, bem como a graduação histopatológica anterior.
Resultados
Em 21,4% dos casos (n=9) houve concordância entre todos os
observadores, em 33,3% dos casos (n=14) houve concordância entre três
observadores e em 45,3% dos casos (n=19) houve concordância entre dois
observadores. Destes 45,3% (n=19), os dois outros observadores concordaram
em 79% dos casos (n=15) e discordaram entre si em 21% (n=4). Em 7,1% dos
casos (n=3) houve três graduações diferentes. Nas demais discordâncias, a
graduação variou entre grau I e II ou entre os graus II e III (Figura 1).
21%
28
Figura 1. Freqüência de concordância da graduação
histopatológica dos mastocitomas caninos (n=42) entre os
observadores.
As figuras 2 e 3 ilustram casos de mastocitomas com diagnósticos
discordantes entre os observadores. A primeira figura representa um
mastocitoma classificado como grau II por dois observadores e também como
grau I pelos outros dois. Tal fato ocorreu provavelmente, pelo fato de haver
menor quantidade de grânulos além de uma anisocitose evidente, que
evidenciariam um caráter mais maligno da neoplasia, no entanto a ausência de
mitoses, binucleações, nucléolos evidentes e numerosos eosinófilos
demonstram características benignas do tumor e a categorização no grau I. A
figura 3 representa um mastocitoma classificado como grau III e grau II. Tal
discordância ocorreu também pela presença de características de malignidade
como ausência de granulações e mitoses que caracterizam o potencial maligno
da neoplasia, mas a ausência de células multinucleadas demonstraria não se
tratar de uma neoplasia muito agressiva para alguns dos observadores.
29
Figura 2. Mastocitoma classificado como grau II por
dois observadores e como grau I pelos demais
observadores. (HE, Obj 40X).
Figura 3. Mastocitoma classificado como grau II por
dois observadores e como grau III pelos outros dois
observadores. (HE, Obj 40X).
30
Discussão e conclusão
Apesar de ser o mais aceito entre os patologistas, o sistema de
graduação de Patnaik apresenta limitações. Nesta sistematização feita para
graduar o mastocitoma há critérios objetivos, como número de multinucleações
e figuras de mitose, mas também há características subjetivas que independem
da análise de um observador treinado, como por exemplo, quantidade de
granulação intracitoplasmática. Outros aspectos pertinentes descrito é a
extensão da neoplasia na amostra, com infiltração nas porções mais profundas
da derme e subcutâneo
2
.
Mastocitomas apresentam características que variam amplamente,
podendo, um observador categorizar uma neoplasia bem diferenciada em grau
I mesmo com algumas figuras de mitose e binucleações, onde a mesma
poderia ser classificada como grau II por outro observador, por outro lado, caso
o observador não considere a quantidade de granulações intracitoplasmática
um caso de mastocitoma grau II pode muito bem ser classificado como grau III.
Tal dificuldade também foi demonstrada em um estudo onde houve a
necessidade de se estabelecer previamente se tumores localizados no
subcutâneo, ou com figuras de mitoses poderiam ser classificados com
tumores de baixo grau, caso isso não fosse estabelecido à discrepância na
graduação seria ainda maior
5
.
Em alguns casos de tumores pouco diferenciados foram observados
muitos eosinófilos, sendo que sua presença pareceu não possuir correlação
com a graduação. Assim como previamente descrito
6
, nosso trabalho também
demonstrou uma discrepância nas graduações com multi-observadores,
havendo neoplasias com até três graus (21% dos casos). Os autores deste
trabalho sugerem que novos critérios histopatológicos sejam estabelecidos e,
sempre que possível, correlacionando-se aspectos morfológicos,
imunoistoquímicos com o uso do anticorpo CD117, moleculares e clínicos, para
um melhor estadiamento do mastocitoma.
Foram demonstradas também dificuldades em classificar os
mastocitomas, mostrando seu alto índice de discordância, principalmente nos
graus I e II, onde apenas 63% do grau II e 63,1% dos graus I receberam a
mesma classificação. Com isso foi sugerido a classificação dos mastocitomas
em baixo e alto grau somente, podendo assim haver uma maior consistência e
31
um melhor prognóstico do que quando usado o sistema atual de graduação.
No entanto uma diminuição no número de graus para o mastocitoma traria uma
facilidade na classificação, mas não um prognóstico acurado, que necessita
uma investigação completa e minuciosa tanto da morfologia quanto do estado
geral do animal
7
.
Estudos avaliando a graduação histopatológica não são restritos ao
mastocitoma, vários estudos sobre a variabilidade das graduações já foram
realizados em inúmeros casos de neoplasias em humanos
8
, demonstrando
haver discordância entre os observadores, o que salienta a necessidade de
atributos objetivos para graduações histopatológicas.
Com os resultados obtidos neste experimento bem como na literatura
consultada, haja vista a diferença de graduação entre observadores, o
prognóstico dos mastocitomas caninos é imprevisível, tornando muitas vezes o
tratamento ineficiente. Frente a isto novas técnicas de diagnóstico e
estadiamento menos subjetivas devem ser desenvolvidas e testadas
32
Referências:
1-Jones, T.C.; Hunt, R.D.; King, N.W. A pele e seus apêndices. In:
Jones, T.C.; Hunt, R.D.; King, N.W. (Eds). Patologia veterinária. São Paulo:
Manole. p.831-886, 2000.
2-Gross, T.L.; Ihrke, P.J.; Walder, E.J.; Affolter, V.R.. Skin diseases of
the dog and cat: clinical and histopathologic diagnosis. Oxford: Blackwell,
932p. 2005.
3-Thamm D. H.; Vail, D.M.; Mast cell Tumors , In Withrow S.J.; Vail D.M.
Small Animal Clinical Oncology, 4
ed. Saunders, p. 402-24, 2007.
4-Patnaik, A.K., Ehler, W.J., & Macewen, E.G. Canine cutaneous mast
cell tumor: morphologic grading and survival time in 83 dogs. Veterinary
Patholology, 21:469-474, 1984.
5- Northup, N.C., Howerth E.W., Harmon, B.G., Brown, C.A., Carmichael,
K.P., Garcia, A., Latimer, K.S., Munday J.S., Rakich, P.M., Richey, L.J.,
Stedman, N.L., Gieger, T.L., 2005. Variation among pathologists in ther
histologic grading of canine cutaneous mast cell tumors with uniform use of a
single grading reference. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation V
17, p. 5 61-64.
6-Northup, N.C., Harmon, B.G., Gieger, T.L., Brown, C.A., Carmichael,
K.P., Garcia, A., Latimer, K.S., Munday, J.S., Rakich, P.M., Richey, L.J.,
Stedman, N.L., Cheng, A.L. & Howerth, E.W. 2005. Variation among
pathologists in histologic grading of canine cutaneous mast cell tumors. Journal
of Veterinary Diagnostic Investigation, 17:245-248.
7-Kiupel M.; Webster, J.D.; Kaneene, J.B.; Miller, R.; Yuzbasiyan-Gurkan
V. The use of KIT and tryptase expression patterns as prognostic tools for
canine cutaneous mast cell tumors. Veterinary Patholology, v.41, p. 371-377,
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8-Al-Synati M.; Chen V.; Salama S.; Shuhaibar H, Treleaven D, Vincic L.
Interobserver and intraobserver variability using Fuhrman grading system for
renal carcinoma. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. v 127, p.
593-96, 2003.
33
EXPRESSÃO DE C-KIT COMO CRITÉRIO DE DIFERENCIAÇÃO DOS
MASTOCITOMAS CUTÂNEOS CANINOS
Pedro Pinczowski, Rafael Torres Neto, Celmira Calderón, Renata Benedetti
Cepinho, Mariana Vilela Falaschi, José Carlos Barbosa, Reneé Laufer Amorim
FMVZ, Unesp, Botucatu
Departamento de Clínica Veterinária, Serviço de Patologia Veterinária
Rubião Jr. S/n
CEP 18618-000
Botucatu, SP, Brasil
Trabalho a ser enviado para a revista Veterinary and Comparative Oncology
Apoio finaceiro: fapesp
34
1. Resumo
O mastocitoma ou tumor de mastócitos é a neoplasia cutânea mais
comum em cães, não havendo predileção por sexo, mas sim por raça, sendo o
Buldogue Inglês, Bull Terrier Inglês, Boxer, Boston Terrier, Pug, American Pitt
Bull Terrier, Weimaraner, Bullmastiff, Labrador Retriever, Setter Inglês, Beagle
e Golden Retriever os mais acometidos. Foi reportado em várias espécies
animais a importância da interação de fatores de crescimento de mastócitos
(Steam cell factor - SCF) com receptores específicos da proteína KIT,
estimulando a maturação celular, proliferação e ativação de mastócitos (HILL,
2002). A proliferação de mastócitos em humanos foi associada a mutações de
proto-oncogenes c-KIT, que codifica a proteína KIT (CD 117), um receptor da
tirosina quinase. A fosforilação da proteína KIT resulta em uma ativação de
receptores tirosina quinase em mastócitos e uma subseqüente proliferação
celular. A ligação dos receptores KIT possuem múltiplos efeitos em mastócitos,
incluindo proliferação, maturação, migração, degranulação, supressão da
apoptose e adesão a fibronectina Foram selecionados 45 casos de
mastocitomas cutâneos caninos e realizadas colorações de HE, AT e
imunomarcação por c-KIT. Foram correlacionados o padrão de marcação por c-
KIT (membranoso, citoplasmático focal e citoplasmático difuso) e a intensidade
de coloração com a graduação histopatológica dos mastocitomas cutâneos
caninos. Não houve uma correlação estatística pelo teste de Tukey (p>0,05)
entre a intensidade de expressão e a graduação histopatológica e entre a
intensidade e o padrão de marcação dos mastocitomas. O padrão de marcação
de c-KIT apresentou correlação estatística pelo teste de qui-quadrado (p<0,05)
com a graduação histopatológica, sendo a membranosa mais freqüente no
grau I, citoplasmática difusa no grau II e citoplasmática focal no grau III. Com
isso o padrão de marcação para o c-KIT pode ser usado como um provável
biomarcador prognóstico.
Palavras chave: Cão, c-KIT, Mastocitoma, Padrão de marcação
35
2. Introdução
O mastocitoma ou tumor de mastócitos é a neoplasia cutânea mais
comum em cães, não havendo predileção por sexo, mas sim por raça, sendo o
Buldogue Inglês, Bull Terrier Inglês, Boxer, Boston Terrier, Pug, American Pitt
Bull Terrier, Weimaraner, Bullmastiff, Labrador Retriever, Setter Inglês, Beagle
e Golden Retriever os mais acometidos (ROGERS, 1996, THAMM e VAIL,
2007).
Nos cães, os mastocitomas ocorrem com maior freqüência nos membros
pélvicos (24,6%), torácicos (13,6%), no abdômen (17,2%), tórax (14,7%) e
cabeça (9,8%). Podem acometer também órgãos, como baço, fígado e rins. As
formas mais malignas ou indiferenciadas crescem rapidamente no início e
causam metástases por via linfática e hematógena (GROSS et al., 2005).
O diagnóstico do mastocitoma é realizado com o exame citopatológico
da lesão e, após excérese cirúrgica, confirmado pelo exame histopatológico,
que além de fornecer a graduação permite avaliar o acometimento das
margens cirúrgicas (LONDON E SEGUIN, 2003).
Foi reportado em várias espécies animais a importância da interação de
fatores de crescimento de mastócitos (Steam cell factor - SCF) com receptores
específicos da proteína KIT, estimulando a maturação celular, proliferação e
ativação de mastócitos (HILL, 2002). A proliferação de mastócitos em humanos
foi associada a mutações de proto-oncogenes c-KIT, que codifica a proteína
KIT (CD 117), um receptor tirosina quinase. A fosforilação da proteína KIT
resulta em uma ativação de receptores tirosina quinase em mastócitos e uma
subseqüente proliferação celular (LONGLEY & METCALFE, 2000).
Zemke et al. (2002) sugeriram uma relação entre a graduação
histopatológica dos mastocitomas caninos e a presença de mutações no c-KIT.
Ao avaliarem diversos mastocitomas caninos, aferiram que não houve
mutações em mastocitomas grau I e menos de 10% de mutações em
mastocitomas grau II. No entanto 66% dos mastocitomas grau III possuíam
alterações genéticas. Com isso, assim como em humanos, mastocitomas
caninos foram associados com mutações do proto-oncogene c-KIT, resultando
em uma ativação e proliferação dos mastócitos.
36
A identificação de mutações no gene que codifica a proteína KIT em
neoplasias é um ótimo meio diagnóstico para tumores indiferenciados, assim
como demonstraram Zemke et al. (2001). Em um exame histopatológico
identificaram uma neoplasia de células redondas, sem grânulos, levando ao
diagnóstico diferencial de linfoma. No entanto o painel imunoistoquímco para
linfomas T e B foi negativo. Frente a isso foram realizados testes moleculares
para identificação de alterações gênicas no proto-oncogene c-KIT, o qual
revelou possuir tais alterações. Com isso foi possível o diagnóstico de um
mastocitoma indiferenciado.
Reguera et al., 2000, demonstraram a direta correlação entre a
expressão da proteína KIT com graus mais avançados de mastocitoma,
portanto, a detecção do KIT é útil tanto no diagnóstico de mastocitomas,
principalmente nos indiferenciados, quanto na determinação do prognóstico.
A ligação dos receptores KIT possui múltiplos efeitos em mastócitos,
incluindo proliferação, maturação, migração, degranulação, supressão da
apoptose e adesão a fibronectina (YEE et al., 1994).
Recentemente foram identificados três padrões para localização da
proteína KIT em mastócitos neoplásicos, sendo eles membranosa,
citoplasmática focal e citoplasmática difusa. Estes padrões foram
correlacionados com o prognóstico, sendo que animais que possuíam os
padrões citoplasmáticos possuíam um pior prognóstico que aqueles que
possuíam padrões membranosos (WEBSTER et al., 2004).
Esse trabalho tem por objetivo avaliar o padrão e intensidade de
imunomarcação de c-KIT (CD117) em mastocitomas cutâneos caninos e
correlacioná-los com a graduação histopatológica proposta por Patnaik et al.,
(1984).
3. Material e Métodos
Foram selecionados 33 casos de mastocitoma cutâneo canino do
arquivo do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ, Unesp, Botucatu e 12
casos novos atendidos no Hospital Veterinário, durante a realização do
trabalho, totalizando 45 casos, dos quais anotaram-se dados como: raça, idade
e sexo dos animais. Os blocos, devidamente identificados, foram separados e
novos cortes histológicos realizados e corados pelo método de hematoxilina e
37
eosina (HE), azul de toluidina (AT) e pelo método imunoistoquímico com o
anticorpo anti-CD117 (c-KIT), com o objetivo de confirmar o diagnóstico de
mastocitoma, graduar a lesão e correlacionar o grau histopatológico com a
imunoexpressão de c-KIT.
Para a graduação dos tumores foram levados em conta os critérios
morfológicos protocolados por Patnaik et al. (1984), e adaptados por Gross
(2005).
A técnica de imunoistoquímica seguiu o protocolo do Laboratório de
Imunoistoquímica do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ – UNESP –
Botucatu, que constituiu resumidamente na desparafinização, desidratação,
recuperação antigênica com citrato 10mM, pH 6,0 em microondas por 15
minutos em potência máxima, bloqueio da peroxidase endógena com água
oxigenada 3% por 20 minutos, incubação por 18h a 4ºC com anticorpo primário
(anti-CD117, Dako, Cód. A4502) diluído 1:400 em solução diluidora (Dako, cód.
S3022) . Como sistema de amplificação utilizou-se o Envision Dual Link (Dako,
cód. K4065) por 1 hora à temperatura ambiente, DAB (Dako, cód. K3468) por 5
minutos, e contra-coloração com hematoxilina de Harris.
Como controle negativo da reação, substitui-se o anticorpo primário por
Imunoglobulina de coelho (Dako, cód. X0903) na mesma concentração de
imunoglobulinas que o anticorpo primário e submetido ao mesmo protocolo.
O padrão de marcação de c-KIT também foi avaliado de acordo com
Kiupel et al. (2004), sendo eles membranoso, citoplasmático difuso e
citoplasmático focal.
A avaliação da expressão de c-KIT foi feita com o auxílio de um
programa de análise de imagens Qwin V3 (Leica) em todos os campos no
aumento de 200x. Atribui-se escores de + a ++++ para intensidade de
marcação para o CD 117, sendo + marcação fraca e ++++ intensa.
O teste de Tukey (com 5% de significância) foi utilizado para verificar a
relação estatística entre a intensidade de marcação com o padrão de marcação
e com o grau histopatológico. Para avaliação da correlação estatística do grau
histopatológico com o padrão de marcação utilizou-se o teste do qui-quadrado
com grau de significância de 5%, pelo sistema SAS (Statistical Analysis System
v 9.1)
38
4. Resultados
Foram avaliados 45 mastocitomas cutâneos caninos. Destes, a maior
porcentagem ocorreu em cães com raça definida (75%), sendo o Boxer a raça
mais afetada (31%), machos (62%) e adultos. Selecionaram-se 7 casos de
mastocitomas grau I, 26 grau II e 12 grau III.
As figuras 1, 2, 3 e ilustram respectivamente as freqüências do sexo,
idade e raças dos animais acometidos com mastocitoma cutâneo canino.
Figura 1. Porcentagem de animais do sexo feminino e
masculino acometidos pelo mastocitoma cutâneo canino
(n=45).
Figura 2. Freqüência de Idade dos animais acometidos
pelo mastocitoma (n=45).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a 12a
62%
38%
Macho
Fêmea
39
Figura 3. Distribuição das raças de cães (com raça definida)
acometidos pelo mastocitoma cutâneo (n=45).
Dos sete mastocitomas grau I, seis deles apresentaram marcação
membranosa e um citoplasmático difuso. Dos 24 mastocitomas grau II, cinco
apresentaram marcação membranosa, um marcação citoplasmática focal e 18
marcação citoplasmática difusa. No caso dos mastocitomas grau III um
apresentou marcação membranosa, cinco apresentaram marcação
citoplasmática focal e seis citoplasmática difusa (Tabela 1 e figuras 4 a 8).
Houve relação estatística significativa (p<0,05) entre a graduação
histopatológica estabelecida e o padrão de marcação.
25%
18%
12%
6%
6%
6%
6%
3%
3%
6%
3%
6%
Boxer
Labrador
Pitt Bull
Fox Paulistinha
Pinscher
Pastor Alemão
Teckel
Malamute do Alaska
Poodle
Setter
Rottweiler
Fila Brasileiro
40
Tabela 1. Freqüência dos padrões de marcação membranosa,
citoplasmática focal e citoplasmática difusa do c-KIT nas diferentes
graduações histopatológicas dos mastocitomas cutâneos caninos
(n=45).
Padrão Grau I Grau II Grau III
Membranosa 86% 23% 8%
Citoplasmática focal 0% 4% 42%
Citoplasmática difusa 14% 73% 50%
Total n=7 n=26 n=12
Figura 4. Freqüência do padrão de marcação para c-KIT em
mastocitomas cutâneos caninos de acordo com a graduação
histopatológica.
Nos mastocitomas grau I avaliados, 42,85% apresentaram +++ de
intensidade de marcação, 42,85% ++++ e 14,3 % +. Nos mastocitomas grau II
foi observada uma distribuição homegênea entre as diferentes intesidades de
marcação. Nos mastocitomas grau III o maior percentual encontrado foi de
+++, com 41,6% (tabela 2). Não houve diferença estatística entre o grau
histopatológico e a intensidade de marcação (p>0,05).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Membranosa Citoplasmática
focal
Citoplasmática
difusa
Grau I
Grau II
Grau III
41
Quando avaliou-se a correlação entre a intensidade e o padrão de
marcação do c-KIT (CD117) não foi observada diferença estatística
significativa utilizando-se o teste de Tukey (p>0,05).
Tabela 2. Freqüência das intensidades de expressão de c-KIT
nas diferentes graduações histopatológica dos mastocitomas
cutâneos caninos (n=45).
Figura 5. Mastocitoma cutâneo canino grau III.
Imunomarcação positiva moderada, com padrão
citoplasmático focal, para CD117. (Imunoistoquímica,
CD117, Envision, DAB, contra coloração Hematoxilina, Obj
40x).
Intensidade Grau I Grau II Grau III
+ 14,30% 30% 16,70%
++ 0% 23% 25%
+++ 42,85% 27% 41,60%
++++ 42,85% 20% 16,70%
Total n=7 n=26 n=12
42
Figura 6. Mastocitoma cutâneo canino grau III.
Imunomarcação positiva intensa para CD117, com padrão
citoplasmático difuso. (Imunoistoquímica, CD117,
Envision, DAB, contra coloração Hematoxilina, Obj 20x).
Figura 7. Mastocitoma cutâneo canino grau II.
Imunomarcação positiva moderada para CD117, com
padrão citoplasmático difuso. (Imunoistoquímica, CD117,
Envision,DAB, contra coloração Hematoxilina, Obj 40x).
43
Figura 8. Mastocitoma cutâneo canino grau I.
Imunomarcação positiva intensa para CD117, com padrão
membranoso. (Imunoistoquímica, CD117, Envision, DAB,
contra coloração Hematoxilina, Obj 40x).
5. Discussão e Conclusão
O maior percentual geral de animais acometidos foi SRD (25%), uma
vez que estes representam a maior população de cães encaminhados ao
Hospital Veterinário da FMVZ, Unesp, Botucatu. No entanto quando se
consideram apenas cães com raça definida o Boxer, Pitt Bull e Pinscher
também apresentaram uma alta incidência de mastocitomas, assim como
demonstra a literatura (ROGERS, 1996; GROSS et al. 2005).
Não houve diferença entre o sexo dos animais acometidos por
mastocitomas, onde 17 (38%) eram fêmeas e 28 (62%) eram machos. A
maioria dos animais (22 cães) acometidos pela neoplasia era adulta, dos 4 aos
8 anos, fatos esses que também estão de acordo com a literatura (ROGERS,
1996; GROSS et al. 2005).
A classificação histopatológica dos mastocitomas cutâneos caninos é o
critério mais importante na determinação do estágio e escolha da terapia,
44
sendo a quimioterapia recomendada para cães com mastocitomas de alto grau
(grau III) e não para os de baixo grau (grau I) (NORTHRUP et al., 2005).
A coloração de azul de toluidina (AT) nem sempre marca os grânulos de
mastócitos e os tumores indiferenciados podem não apresentar granulações
citoplasmáticas, por isso é necessária a realização da técnica de
imunoistoquímica com o anticorpo CD117.
A imunomarcação com CD117 permitiu a confirmação diagnóstica de
casos duvidosos nas colorações de HE e AT.
Em estudo realizado por Zemke et al. (2002), a intensidade de marcação
dos mastocitomas foi maior em graus menos diferenciados da neoplasia,
mostrando que estes devem apresentar uma alteração gênica mais significativa
para o aumento da produção e consequentemente expressão do onco-gene c-
KIT. No entanto, neste trabalho observaram-se resultados discordantes, onde
os mastocitomas grau I apresentaram os maiores percentuais de tumores com
+++ e ++++ de intensidade de marcação.
Contudo, devem-se considerar as limitações da técnica de
imunoistoquímica, uma vez que o tempo de fixação da amostra interfere
diretamente na intensidade de marcação dos diferentes anticorpos. Neste
estudo, como utilizou-se material de arquivo não se pode aferir sobre o tempo
de fixação de cada uma das amostras.
Ao avaliar a expressão de c-KIT, está sendo investigado um provável
gene alterado, um proto-oncogene que se tornou um onco-gene, com isso já é
de se esperar que a produção da proteína KIT esteja intensificada, levando a
uma progressão maior da neoplasia e assim levando á um pior prognóstico.
De acordo com Webster et al. (2007), mastocitomas mais
indiferenciados tendem a apresentar um padrão de marcação citoplasmático,
que está relacionado a um menor intervalo livre da doença e menor tempo de
sobrevida. No caso dos mastocitomas diferenciados há um predomínio de
marcação membranosa. Tal fato foi corroborado em nosso trabalho, onde foi
encontrado um número maior de mastocitomas grau I com marcação
membranosa, com um total de 86% (6 casos de 7). Mastocitomas grau II
obtiveram um número maior de marcação citoplasmática, totalizando 79% (19
de 24), sendo destes 75% (18 de 24) de marcação citoplasmática difusa. Em
mastocitomas grau III também, conforme a literatura, observou-se uma maior
45
expressão citoplasmática de c-KIT, com um total de 92% de marcação (11 de
12), sendo destes 42% (5 de 12) de marcação focal e 50% (6 de 12) de
marcação difusa.
O comportamento biológico dos mastocitomas é muito variável, e a
habilidade de se estabelecer um prognóstico preciso para tais tumores é
comprometida pelo grande número de neoplasias de graus intermediários.
Sendo assim, a avaliação imunoistoquímica, como demonstrado por Kiupel et
al. (2004) é de fundamental importância para definição de tal prognóstico.
Kiupel et al. (2004) propõem o uso do padrão de expressão do c-KIT
como uma nova variável para classificação dos mastocitomas, uma vez que
observaram a marcação membranosa em mastocitomas com melhor
prognóstico clínico (sem recorrência e maior tempo de sobrevida) e marcação
citoplasmática associada com aumento de recorrência e menor tempo de
sobrevida.
A graduação baseada na coloração de HE com os parâmetros propostos
por Patnaik et al. (1984) serviram como base até o momento, porém Kiupel et
al. (2004) e Northrup et al. (2005) ressaltaram que há uma ambigüidade no
sistema de graduação histológica usado atualmente na classificação dos
mastocitomas, o mesmo ocorreu neste estudo, principalmente nos
mastocitomas grau II.
A graduação dos mastocitomas caninos tendo como base critérios
morfológicos, não é a mais adequada quando se procura o estabelecimento de
ferramentas prognósticas, devendo-se levar em consideração a correlação de
aspectos morfológicos, moleculares, imunológicos e clínicos.
A realização da técnica de imunoistoquímica com o anticorpo primário
anti c-KIT (CD-117) é de fácil execução e não necessita de amostras
especialmente preparadas para esta técnica, o que torna viável seu uso
rotineiro como auxílio na graduação dos mastocitomas e sua possível
correlação com o prognóstico.
De acordo com o tipo de marcação pode-se tentar estabelecer uma
classificação mais acurada, pois mastocitomas que apresentaram marcação
citoplasmática focal foram classificados predominantemente em grau III, e os
que apresentaram marcação membranosa foram predominantemente
classificados como grau I, portanto mastocitomas grau II que apresentarem
46
marcação citoplasmática focal devem apresentar um comportamento biológico
mais agressivo quando comparados aqueles com marcação citoplasmática
difusa. Da mesma forma os mastocitomas grau II que apresentarem marcação
membranosa devem possuir um comportamento biológico menos agressivos,
podendo talvez ser inclusos no grau I.
Com isso pode-se subdividir os mastocitomas grau II em três categorias,
o mastocitoma grau II com marcação membranosa, menos agressivo, podendo
ser incluso no grau I, o mastocitoma com marcação citoplasmática difusa,
sendo o de agressividade moderada e os com marcação citoplasmática focal,
esses com comportamento biológico mais agressivo e talvez devessem ser
classificados como grau III.
A coloração pelo método de HE, onde a morfologia da neoplasia é
avaliada, ainda é o melhor método de classificação dos mastocitomas, no
entanto a técnica de imunoistoquímica, onde o padrão de marcação de c-KIT é
demonstrado, serve como uma ferramenta extremamente importante para
auxiliar em casos dúbios (que ocorrem frequentemente nos mastocitomas grau
II) e estabelecer portanto um prognóstico acurado da neoplasia.
47
6. Referências
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NORTHUP, N.C., HARMON, B.G., GIEGER, T.L., BROWN, C.A.,
CARMICHAEL, K.P., GARCIA, A., LATIMER, K.S., MUNDAY, J.S., RAKICH,
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48
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tumors in dogs. Vet. Pathol. 2002 v. 39, p. 529-535.
49
EXPRESSÃO DE PGE2 E VEGF EM MASTOCITOMAS CUTÂNEOS
CANINOS
P. Pinczowski, R. Torres-Neto, C. Calderón, K.S. Matilde, J.C. Barbosa, R.
Laufer-Amorim.
Serviço de Patologia Veterinária, Departamento de Clínica Veterinária,
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Unesp, Botucatu, SP
Trabalho preparado para ser enviado para o jornal: Veterinary Pathology
Apoio Financeiro: Fapesp
50
1. Resumo
O mastocitoma ou tumor de mastócitos é a neoplasia cutânea mais
comum em cães, não havendo predileção por sexo, mas sim por raça, sendo o
Buldogue Inglês, Bull Terrier Inglês, Boxer, Boston Terrier, Pug, American Pitt
Bull Terrier, Weimaraner, Bullmastiff, Labrador Retriever, Setter Inglês, Beagle
e Golden Retriever os mais acometidos. Muitos estudos nas últimas duas
décadas têm sido de extrema importância para demonstrar o elo entre o
desenvolvimento e progressão do câncer e os metabólitos do ácido aracdônico.
Um desses metabólitos, a prostaglandina E2 (PGE2), merece uma atenção
considerável, devido a sua implicação na carcinogênese, progressão
neoplásica e metástases. A PGE2 possui também capacidade angiogênica,
onde observa-se aumento na produção de VEGF pelo estímulo de PGE2.
Muitos trabalhos sugerem que a angiogênese é extremamente importante na
carcinogênese, crescimento e progressão dos tumores. Dentre esses fatores o
mais investigado e estudado pela oncologia humana é o VEGF. O VEGF é uma
proteína que estimula a migração e proliferação de células endoteliais
vasculares, extremamente importantes para a angiogênese. É produzido por
células neoplásicas, macrófagos, plasmócitos e algumas vezes por linfócitos.
Foram selecionados 53 casos de mastocitomas cutâneos caninos e realizadas
colorações de HE e AT para confirmação do diagnóstico e graduação
histopatológica. Em seguida técnicas imunoistoquímicas foram empregadas de
acordo com o protocolo do laboratório de Imunoistoquímica do Serviço de
Patologia da FMVZ/Unesp, Botucatu. Foram avaliadas as expressões de PGE2
e VEGF, sendo sua intensidade de expressão e percentual de células contadas
correlacionada com a graduação histopatológica. Quando avaliada a
intensidade de expressão não houve correlação estatística com a graduação
histopatológica tanto com o VEGF quanto o PGE2. Mas quando avaliado o
percentual de células somente o PGE2 apresenta uma correlação estatística
com a graduação histopatológica, sendo estes valores significativos quando
comparados os graus I e III.
Palavras chave: cão, graduação histopatológica, mastocitoma, PGE2, VEGF,
51
2. Introdução
O mastocitoma é a neoplasia maligna constituída por mastócitos, que
corresponde de 11 a 27% de todas as neoplasias cutâneas em cães. O
mastocitoma aparece mais frequentemente em membros pélvicos e torácicos,
abdômen, tórax e cabeça. No entanto, a neoplasia pode metastatizar para
linfonodos regionais e outros órgãos (ROGERS, 1996, THAMM & VAIL, 2007).
As prostaglandinas são metabólitos importantes do ciclo do ácido
aracdônico, responsáveis por inúmeros processos fisiológicos além do que,
estudos mostram que grandes concentrações de prostaglandinas E2 são
produzidas por células neoplásicas, responsáveis por atuar na mutação celular,
proliferação, apoptose além de produzir efeitos imunosupressores
(LUPULESCU, 1996; ARA et al., 1996).
Como demonstraram Doré et al., (2003) a COX-2 tem uma estreita relação
com neoplasias, havendo uma maior concentração em tumores malignos do
que em benignos, o que também foi visto por Calderón (2005) onde
mastocitomas grau III apresentavam valores superiores de COX-2 quando
comparados com mastocitomas grau I. Portanto sendo a PGE2 um metabólito
da COX-2, esta deve apresentar também uma estreita relação com o
desenvolvimento neoplásico maligno.
O fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), também
conhecido como fator de permeabilidade vascular é uma potente citocina
angiogênica indutora de mitose, reguladora da permeabilidade endotelial
(FERRARA, 1996) além de prolongar a sobrevida das células endoteliais na
neovascularização pela indução da expressão de proteínas inibidoras da
apoptose como a Bcl-2 (RANIERI et al., 2001).
Os estudos da expressão de PGE2 e VGEF em mastocitomas cutâneos
caninos auxiliarão na compreensão do comportamento biológico dessas
neoplasias uma vez que há ligação com a carcinogênese e progressão tumoral.
Objetiva-se, neste trabalho avaliar a imunomarcação de VEGF e PGE2
nos mastocitomas cutâneos caninos e correlacioná-la com a graduação
histopatológica, proposta por Patnaik et al. (1984).
52
3. Material e Métodos
Os casos de mastocitoma cutâneo canino foram selecionados de duas
formas: por meio de análise retrospectiva dos livros de registro do Serviço de
Patologia Veterinária da FMVZ, Unesp, Botucatu e pela seleção de novos
casos enviados ao Serviço. Foram anotados os dados como: raça, idade e
sexo dos animais.
Os blocos, devidamente identificados, foram separados e novos cortes
histológicos foram realizados e corados pelo método de hematoxilina e eosina
(HE), azul de toluidina (AT) e pelo método imunoistoquímico com os anticorpos
primários anti-VEGF e anti-PGE2.
Para a graduação dos tumores foram levados em conta os critérios
morfológicos propostos por Patnaik et al. (1984), e adaptados por Gross et al.
(2005).
As neoplasias foram graduadas da seguinte forma: grau I, grau II e grau
III, Sendo o grau I neoplasias bem diferenciadas, grau II moderadamente
diferenciadas e o grau III indiferenciada.
A técnica de imunoistoquímica seguiu o protocolo do Laboratório de
Imunoistoquímica do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ – UNESP –
Botucatu, que constituiu na desparafinização, desidratação, recuperação
antigênica, onde para o anticorpo anti-PGE2, foi utilizada solução de Citrato
10mM, pH 6,0 em forno microondas por 15 minutos (Três ciclos de cinco
minutos em potência máxima). Para o anticorpo anti-VEGF a recuperação
antigênica foi feita com solução pré-aquecida de Tris-EDTA pH 9,0 em banho-
maria a 96 ºC, por 30 minutos. Posteriormente foram colocadas em
temperatura ambiente por 20 minutos para resfriamento. O bloqueio da
peroxidase endógena foi feito com água oxigenada 3% por 20 minutos, e a
incubação com anticorpo primário por 18h a 4ºC. Os anticorpos foram diluídos
na proporção 1:25 para o VEGF (Dako, M7273, Clone VG1) e 1:200 para o
PGE2 (Oxford Biomedical Research, Clone PG31), em diluente para anticorpos
com propriedades redutoras de fundo (Dako-S3022). Como sistema de
amplificação utilizou-se o Envision Dual Link (Dako cód. K4065) por uma hora a
temperatura ambiente, DAB (Dako, cód. K3468) por 5 minutos, e contra-
coloração com hematoxilina de Harris. Como controle negativo substituiu-se o
anticorpo primário por imunoglobulina de coelho (Dako cód. X0903) para as
53
reações com PGE2 e imunoglobulina de camundongo (Dako cód. N1698) para
as reações com VEGF, nas mesmas condições das lâminas com anticorpo
primário.
Para determinar a expressão dos anticorpos nos mastocitomas cutâneos
caninos, foram avaliados todos os campos de cada corte com o auxílio do
programa de imagens Qwin V3 (Leica) em um aumento de 400x. Em cada
campo foi mensurado o percentual de células marcadas (Figura 1 e Tabela 1) e
a intensidade de coloração (Tabela 2), conforme preconizado por DE NARDI
(2007).
Figura 1. Método de graduação para determinar o percentual de
imunomarcação dos anticorpos VEGF e PGE2 nos mastocitomas cutâneos
caninos (De Nardi, 2007).
Tabela 1. Pontuação atribuída ao percentual de células marcadas por campo,
em mastocitomas cutâneos caninos.
Percentual de células marcadas Pontuação
< 5% 0
5 – 25 % 1
26 – 50% 2
51 – 75% 3
> 75% 4
Tabela 2. Pontuação atribuída à intensidade de coloração das células
marcadas por campo, em mastocitomas cutâneos caninos.
Intensidade de coloração
Pontuação
Fraca 1
Moderada 2
Forte 3
54
Ao final, estabeleceu-se um escore de 0 a 12 pontos, obtido a partir do
produto da pontuação do percentual de células marcadas pela pontuação da
intensidade de coloração.
A análise estatística foi feita pelo sistema SAS, utilizando-se o teste de
Tukey, com grau de confiança de 0,05.
4. Resultados
Foram avaliados 53 mastocitomas cutâneos caninos. Destes, a maior
porcentagem ocorreu em cães sem raça definida, machos e adultos (figuras 2 a
4).
Figura 2. Porcentagem de animais do sexo feminino
e masculino acometidos pelo mastocitoma cutâneo
canino (n=53).
40%
60%
Fêmeas
Machos
55
Figura 3. Distribuição de idade dos animais acometidos pelo
mastocitoma cutâneo canino (n=53).
Figura 4. Distribuição das raças de cães (com raça definida) acometidas pelo
mastocitoma cutâneo canino (n=53).
0
1
2
3
4
5
6
7
2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a 12a
31%
15%
15%
5%
5%
5%
3%
3%
3%
3%
3%
3%
3%
3%
Boxer
Labrador
Pitt Bull
Fox Paulistinha
Pinscher
Rottweiller
Cocker
Fila Brasileiro
Malamute do Alaska
Mastiff Inglês
Pastor Alemão
Pastor Canadense
Setter
Teckel
56
A graduação histopatológica dos mastocitomas cutâneos caninos foi
feita de acordo com Patnaik et al. (1984) e adaptadas por Gross et al. (2005).
Nove mastocitomas foram grau I, 26 mastocitomas grau II e 18 mastocitomas
grau III.
A marcação de PGE2 nos mastócitos neoplásicos foi citoplasmática em
todos os casos (Figuras 5,6 e 7)
Não houve diferença estatística na intensidade de coloração de PGE2
entre os graus de mastocitoma cutâneo canino, onde o grau I obteve uma
média de 1,78, o grau II 1,56 e o grau III 1,94. Quanto ao percentual de células
marcadas houve diferença estatística entre o grau I e grau III, onde o grau I
obteve 2,11 e o grau III 3,39. Já o grau II obteve 3,11. (Tabela 3, figura 8)
Tabela 3 . Média dos percentuais de células marcadas
(PCM), intensidade de coloração (IC) e escore final de
marcação (PCM x IC) de PGE2 nos mastocitomas cutâneos
caninos (n=53).
PCM IC Escore
Grau I 2,11 A 1,78 A 4,22 A
Grau II 3,11A.B 1,56 A 4,81 A
Grau III 3,39
B 1,94 A 6,94 A
Médias em uma mesma coluna e seguidas por mesma letra maiúscula
não diferem entre si ao nível de 1% de probabilidade pelo teste de
tukey.
57
.
Figura 5. Mastocitoma Grau I. Imunomarcação positiva
fraca, com menos de 25% de células marcadas.
(Imunoistoquímica, PGE2, Envision, DAB, contra
coloração Hematoxilina, Obj 40x).
Figura 6. Mastocitoma Grau II. Imunomarcação positiva
moderada, com 100% de células marcadas.
(Imunoistoquímica, PGE2, Envision, DAB, contra
coloração Hematoxilina, Obj 20x).
58
Figura 7. Mastocitoma Grau III. Imunomarcação positiva
moderada , com mais de 75% de células marcadas.
(Imunoistoquímica, PGE2, Envision, DAB, contra
coloração Hematoxilina, Obj 20x).
Figura 8. Média dos percentuais de células marcadas (PCM),
intensidade de coloração (IC) e escore final (PCM x IC), da
marcação imunoistoquímica para PGE2 nos três graus do
mastocitoma cutâneo canino (n=53).
0
1
2
3
4
5
6
7
PCM IC Escore
Grau I
Grau II
Grau III
59
A imunomarcação do VEGF foi citoplasmática em todos os mastócitos
neoplásicos, ainda havendo marcação em estroma e células endoteliais
(Figuras 9 a 11)
O percentual de células marcadas para VEGF foi, no grau I 3,7, no grau
II 3,68 e no grau III 4,0. Quanto à intensidade de coloração, o grau I obteve 2,1,
o grau II 1,86 e o grau III 1,89. Não houve diferença estatística no percentual
de células marcadas nem na intensidade de coloração entre os três graus. O
escore final também não variou, onde o grau I obteve 7,8, o grau II 6,89 e o
grau III 6,94 (tabela 4 , figura 12).
Tabela 4. Média do percentual de células marcadas (PCM),
intensidade de coloração (IC) e escore final de marcação
(PCM x IC) de VEGF nos mastocitomas cutâneos caninos
(n=53).
Médias em uma mesma coluna e seguidas por mesma letra maiúscula
não diferem entre si ao nível de 1% de probabilidade pelo teste de
tukey.
PCM IC Escore
Grau I (n=9) 3,7 A 2,1 A 7,8 A
Grau II (n=26) 3,68 A 1,86 A 6,89 A
Grau III (n=18) 4,0 A 1,89 A 6,94 A
60
Figura 9. Mastocitoma Grau I. Imunomarcação positiva
intensa para VEGF, 100% das células marcadas.
Marcação intensa nos mastócitos (
*
) e no endotélio
(seta) (Imunoistoquímica, VEGF, Envision, DAB, contra
coloração Hematoxilina, Obj 40x).
Figura 10. Mastocitoma Grau II. Imunomarcação positiva
intensa para VEGF, 100% das células marcadas
(Imunoistoquímica, VEGF, Envision, DAB, contra
coloração Hematoxilina, Obj 20x).
61
Figura 11. Mastocitoma Grau III. Imunomarcação
positiva intensa para VEGF. 100% de mastócitos
marcados. (Imunoistoquímica, VEGF, Envision, DAB,
contra coloração Hematoxilina, Obj 40x).
Figura 12 . Média dos percentuais de células marcadas
(PCM), intensidade de coloração (IC) e escore final (PCM x
IC) da marcação imunoistoquímica para VEGF nos três
graus do mastocitoma cutâneo canino (n=53).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
PCM IC Escore
Grau I
Grau II
Grau III
62
5. Discussão
O maior percentual geral de animais acometidos foi SRD (27%), uma
vez que estes representam a maior população de cães encaminhados ao
Hospital Veterinário da FMVZ, Unesp, Botucatu. Considerando-se apenas
animais com raça definida o Boxer, Labrador e Pitt Bull apresentaram uma alta
incidência de mastocitomas, assim como demonstra a literatura (ROGERS,
1996; GROSS et al. 2005).
Não houve diferença entre o sexo dos animais acometidos por
mastocitomas, onde 21 eram fêmeas (40%) e 32 eram machos (60%). A
maioria dos animais acometidos pela neoplasia era adulta, dos 4 aos 8 anos,
fato esse que também está de acordo com a literatura (ROGERS, 1996;
GROSS et al. 2005).
Na contagem de PGE2 não houve diferença estatística na intensidade
de coloração, onde o grau I obteve uma média de 1,78, o grau II 1,56 e o grau
III 1,94. Quanto ao percentual de células marcadas houve diferença entre o
grau I e grau III, onde o grau I obteve 2,11 e o grau III 3,39. Já o grau II obteve
3,11.
No entanto no caso do PGE2 a diferença estatística se mostrou
significativa no percentual de células marcadas quando comparados os graus I
e III, sendo maior no grau III, demonstrando o intenso potencial maligno dessa
neoplasia, como era de se esperar, pois os resultados se correlacionam com o
de COX2 (Calderón, 2005). Com isso sugere-se que a expressão de PGE2
quando considerado o percentual de células marcadas, é uma ferramenta
prognóstica.
O PGE2 possui um importante papel na mutação celular, proliferação e
apoptose em células neoplásicas, induz a imunossupressão prejudicando o
sistema imune do indivíduo em combater células neoplásicas, além de produzir
efeitos nos mecanismos de metástase (colagenólise, angiogênese,
hipercoagulabilidade) e por final, como mediador inflamatório que recruta
fatores de crescimento que contribuem para a progressão tumoral
(LUPULESCU et al., 1996; ARA et al., 1996). Com isso é de se esperar que o
aumento da expressão de PGE2 acompanhe o potencial maligno da neoplasia,
contribuindo dessa forma a um comportamento biológico mais agressivo e
portanto, um prognóstico mais reservado, sendo assim a avaliação da
63
expressão de PGE2 se torna uma ferramenta útil na elaboração de um
prognóstico acurado.
Este fato é corroborado pelos resultados obtidos na correlação
estatística significativa, entre os anticorpos primários PGE2 e VGEF, que só foi
verificada para os mastocitomas cutâneos caninos grau II.
O fato do PCM para o anticorpo PGE2 não ser estatisticamente diferente
entre os graus I e II, e entre os graus II e III se baseia no variável
comportamento biológico dessa neoplasia, especialmente nos moderadamente
diferenciados. Este grupo (grau II) apresenta tanto tumores mais diferenciados
(mais próximos do grau I) como aqueles com mais critérios de malignidade,
mas ainda não incluídos no grau III. Talvez os resultados fossem mais
significativos se os mastocitomas grau II fossem melhor caracterizados
histologicamente ou subdivididas em dois grupos, uma vez que há uma
população celular heterogênea, que contém desde células mais diferenciadas
até células com um certo grau de anaplasia, mas tais critérios são subjetivos e
dependem fundalmentemente do observador.
Os mastocitomas possuem um comportamento biológico muito variável,
ainda mais quando considerado os tumores moderadamente diferenciados
(grau II) o que foi observado neste trabalho, pela correlação da intensidade de
coloração entre os anticorpos primários PGE2 e VEGF, que foi significativa,
diferentemente dos outros graus.
De acordo com Calderón (2005), a expressão de COX-2 foi maior em
mastocitomas grau III do que nos outros graus, mostrando a estreita relação da
COX-2 com mecanismos de progressão tumoral, invasividade e capacidade
metastática, ou seja, maior potencial maligno. Com isso já era de se esperar
que a PGE2 seguisse o mesmo caminho, sendo este um metabólito da COX-2.
Fato este, que ocorreu neste trabalho, onde a expressão de PGE2 mostrou-se
maior em mastocitomas grau III quando comparadas com grau I. Portanto,
neoplasias mais agressivas expressam uma maior quantidade tanto de COX-2
(Calderón, 2005) quanto PGE2, quando comparadas com neoplasias menos
agressivas.
A intensidade de expressão não manteve uma uniformidade quanto à
graduação histopatológica, ou seja não houve um aumento ou diminuição
progressiva conforme o grau histopatológico. Isso foi demonstrado pela
64
expressão ser menor nos mastocitomas grau II, seguido pelo grau I e III. A
técnica de imunoistoquímica avalia a expressão dessas proteínas, sendo esta
relacionada à quantidade de proteínas já sintetizadas. Ou seja, essa técnica
avalia o produto final, naquele momento determinado da síntese protéica,
portanto não fornece subsídios para se avaliar a dinâmica de todo o processo.
Na contagem de VEGF não houve diferença estatística entre os graus,
tanto na intensidade de coloração quanto no percentual de células marcadas.
Pesquisas recentes demonstraram a expressão de VEGF e receptores
de VEGF em tumores sólidos e hematopoéticos, sendo que essas células
neoplásicas normalmente utilizam o VEGF como um fator de crescimento
autócrino. No entanto, o mastocitoma não parece utilizar o VEGF de forma
autócrina e sim como estímulo à angiogênese (Shinkrauk et al. 2003). Neste
estudo não foi verificada a presença de receptores para VEGF, porém
afirmações como esta devem ser melhor estudada para comprovar o porquê da
não estimulação autócrina, uma vez que os mastocitomas possuem tanto o
receptor para VEGF como o próprio VEGF de acordo com Shinkrauk etal.
(2003). Webster et al. (2007), demonstraram o ganho de uma função autócrina
dos mastócitos neoplásicos quanto à produção e forforilação da proteína
transmembrânica KIT, que estimula a proliferação, maturação, migração,
degranulação e supressão da apoptose, sendo assim sugere-se que nos
mastocitomas, as células neoplásicas ganhem uma função autócrina quanto à
produção e expressão do VEGF.
Estudos prévios mostraram que mastócitos normais expressam VEGF, o
qual está diretamente envolvido no processo de angiogênese (Szukiewiez et
al., 2005). Rebuzzi et al. (2007), demonstraram a imunomarcação de VEGF em
todos os mastocitomas caninos avaliados, independente da graduação
histopatológica, resultado corroborado por esse trabalho, onde 100% dos
mastocitomas apresentaram expressão positiva para VEGF. No entanto, não
houve variação na intensidade de coloração nem no percentual de células
marcadas, resultados estes contraditórios ao de Rebuzzi et al. (2007), que
concluíram haver diferença na intensidade de coloração e percentual de células
marcadas nos mastocitomas avaliados, principalmente nos graus II e III, que
apresentaram uma maior marcação para VEGF.
65
Altos índices e PGE2 estimulam a produção de diversos fatores como
FGFα (Fator de crescimento fibroblástico), EGF (Fator de crescimento
epidermal), HGF (Fator de crescimento hepatocitário), que estimulam a
proliferação celular, bFGF (Fator de crescimento fibroblástico básico), que
estimula a angiogênese. Sendo assim, como há uma relação tanto da COX2,
quanto da PGE2 com a graduação histopatológica dos mastocitomas caninos,
é de se esperar que tais fatores também possuam algum tipo de relação,
portanto estudos que utilizem esses biomarcadores podem vir a ajudar quanto
ao entendimento do comportamento biológico dos mastocitomas e de um
prognóstico mais acurado.
6. Conclusões
- Os mastocitomas expressam VEGF independente da graduação
histopatológica.
- Os mastocitomas expressam PGE2 independente da graduação
histopatológica.
- A intensidade de coloração e o numero de células marcadas para VEGF não
está relacionada à graduação histopatológica.
- A intensidade de coloração de PGE2 não está relacionada à graduação
histopatológica.
- O percentual de células marcadas por PGE2 está relacionada à graduação
histopatológica, quando comparados os graus I e III.
- Os escores (produto do PCM e IC) não se correlacionam com a graduação
histopatológica, tanto para PGE2 como para VEGF.
- A Imunomarcação de VEGF não pode ser utilizada como parâmetro de auxílio
do grau de diferenciação dos mastocitomas cutâneos caninos, quando se
considera o percentual de células marcadas, a intensidade de coloração e o
escore final (PCM x IC), portanto não contribui para avaliação do prognóstico.
- A expressão imunoistoquímica de PGE2 pode ser utilizada na diferenciação
dos mastocitomas cutâneos caninos graus I e III, devendo-se avaliá-la como
possível biomarcador prognóstico.
66
7. Referências:
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cancer therapy. Prostaglandins, Leukot Esset Fatty Acids; v. 54: p3-16,
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Universidade Estadual Paulista, Câmpus de Jaboticabal, 2007.
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68
Discussão geral
O mastocitoma cutâneo canino é uma das neoplasias cutâneas mais
freqüentes desta espécie, representando 10 a 15% de todos os tumores
cutâneos (GROSS et al., 2005). Esta neoplasia é formada por mastócitos que
podem variar desde células bem diferenciadas até anaplásicas.
A proliferação em nódulo único ou múltiplo ocorre em todas as espécies
animais, sendo mais comum nos cães. Quando são observados,
microscopicamente, numerosos mastócitos bem diferenciados, deve-se ter
cautela no diagnóstico de mastocitoma, e alguns patologistas consideram este
crescimento como mastocitose cutânea (GINN et al., 2007).
Esse é um dos primeiros problemas no diagnóstico histopatológico dos
mastocitomas: a diferenciação de mastocitose cutânea de um mastocitoma
bem diferenciado, ou grau I, que tendo esse diagnóstico, implica em uma
neoplasia potencialmente maligna.
Inúmeros trabalhos correlacionarem a evolução clínica com a raça,
localização do tumor, taxa de crescimento tumoral, contagem de regiões
organizadoras de nucléolos (AgNOR), ploidia do DNA, avaliação de alterações
no gene p53, mutações no c-KIT, mas mesmo com o advento destas técnicas
moleculares mais avançadas, a classificação histopatológica, por enquanto, é o
melhor critério para a determinação do prognóstico.
No entanto, o estabelecimento da graduação histopatológica, mesmo
que baseado em critérios pré-estabelecidos, como os propostos por Patnaik et
al. (1984), é subjetivo, especialmente quando se consideram tumores de
diferenciação intermediária.
Tal fato foi bem apontado no primeiro trabalho desta dissertação
(Mastocitoma cutâneo canino: variação entre observadores na graduação
histopatológica), aonde em 21,4% houve concordância na graduação entre os
observadores, que compreendiam mastocitomas muito bem diferenciados (grau
I) e aqueles indiferenciados (grau III). O restante dos 42 mastocitomas
avaliados (33 casos - 78,6%) teve diagnósticos discordantes, seja por um dos
observadores (33,3% de diagnósticos concordantes entre três observadores)
ou por dois deles (45,3% de diagnósticos concordantes entre dois
observadores), sendo que destes, 7,1% tiveram as três graduações
histopatológicas possíveis no mesmo tumor.
69
Esse grande grupo de mastocitomas com diagnósticos discordantes
(78,6%) compreende tumores não tão bem diferenciados, que sem dúvida
nenhuma não seriam categorizados no grau I, nem no grau III (anaplásicos e
positivos para c-KIT), mas aqueles com alguns critérios de malignidade, que os
categorizariam em grau II, porém, por exemplo, com muita granulação
citoplasmática e numerosos eosinófilos, sem células gigantes ou figuras de
mitose, que para um dos observadores poderia se encaixar no grau I.
O mesmo foi observado por Northup et al. (2005) que sugerem ainda
que novos critérios histopatológicos sejam adotados e correlacionados a
aspectos moleculares e clínicos. Talvez por esta dificuldade, a maioria dos
mastocitomas caninos tenha prognóstico imprevisível e deva ser considerado
como potencialmente maligno.
Dentro deste contexto, na busca de uma ferramenta mais acurada para
a graduação dos mastocitomas caninos, Kiupel et al. (2004) e Webster et al.
(2007) correlacionaram o padrão de marcação de c-KIT com a graduação
histopatológica e sugeriram que a imunomarcação membranosa se
correlaciona a um bom prognóstico, a citoplasmática difusa a um prognóstico
moderado e a citoplasmática focal a um prognóstico ruim.
A avaliação da expressão de c-KIT pode vir a se tornar uma ferramenta
fundamental na adequação da graduação histopatológica, isso se deve ao fato
de que o mastocitoma apresenta três padrões de marcação para o KIT
(membranoso, citoplasmático focal e citoplasmático difuso).
Ao correlacionar o padrão de marcação do c-KIT com a graduação
histopatológica fica evidente tal correlação. Neste estudo (segundo trabalho
apresentado: Expressão de c-KIT como critério de diferenciação dos
mastocitomas cutâneos caninos), 86% dos mastocitomas grau I avaliados
possuíam marcação membranosa, e somente 14% apresentavam marcação
citoplasmática difusa. 75% dos mastocitoma grau II apresentaram marcação
citoplasmática difusa, 21% membranosa e 4% citoplasmática focal, e nos
mastocitomas grau III, 50% apresentavam marcação citoplasmática difusa,
42% marcação citoplasmática focal e 8% membranosa. Com tais resultados e
com a correlação estatística significativa pelo teste do qui-quadrado (p<0,05)
pode-se concluir que conforme o padrão de marcação muda, há um aumento
na malignidade da neoplasia na ordem de membranoso, citoplasmático difuso e
70
citoplasmático focal, bem como talvez existam tumores grau II (com marcação
membranosa) que poderiam ser classificados como grau I e que tumores grau
I, com marcação citoplasmática poderiam ser considerados grau II na
histopatologia e assim por diante.
Outro ponto a ser considerado é o ganho de uma função autócrina dos
mastócitos neoplásicos quanto a produção e fosforilação da proteína KIT, que
estimula a proliferação celular, migração de células, degranulação e supressão
da apoptose dos próprios mastócitos, sendo esses aspectos importantes na
progressão tumoral e maior potencial maligno (WEBSTER et al., 2007). Pelos
nossos resultados, em que todos os mastocitomas caninos expressaram c-KIT,
independente do grau do tumor, devemos considerar todos os mastocitomas
com potencial maligno.
Zemke et al. (2002) observaram que a mutação no gene c-KIT nos
mastocitomas caninos é mais freqüente nos tumores indiferenciados (grau III),
explicando o maior potencial maligno deste grupo, bem como Reguera et al.
(2000) que demonstraram a direta correlação da expressão da proteína KIT
com graus mais avançados de mastocitoma. No nosso estudo, independente
do grau, todos os mastócitos neoplásicos apresentaram imunomarcação para
c-KIT (com padrões de marcação diferentes).
Sem dúvida, pelos resultados apresentados, a imunomarcação do c-KIT
(CD117) é uma ferramenta útil no diagnóstico dos mastocitomas
indiferenciados, como proposto por Zemke et al. (2002) e Reguera et al. (2000),
além da correlação estatística do padrão de marcação (membranoso,
citoplasmático difuso, citoplasmático focal) com o grau de diferenciação do
tumor, observada no segundo trabalho apresentado.
A realização da técnica de imunoistoquímica para a verificação do
padrão de marcação de c-KIT é viável no uso rotineiro, pois utiliza um anticorpo
policlonal, em diluição grande (1:400) e os cortes podem ser obtidos do mesmo
bloco de parafina em que o material foi incluído para histopatologia. O tempo
de realização do exame não é superior a 48 horas e o custo final é razoável
(somando-se R$3,75 de anticorpo primário por lâmina, mais o kit secundário -
R$3,60 por lâmina, DAB e demais reagentes, totalizando, não mais que
R$15,00 por lâmina).
71
Além disso, como parte de nosso grupo de pesquisa em mastocitoma
canino, a imunomarcação com c-KIT está sendo feita em preparados
citológicos, com resultados promissores.
Para dar continuidade nesta linha, que parece mais promissora na
graduação dos mastocitomas, trabalhos que correlacionem o tipo de expressão
do c-KIT com aspectos clínicos, sobrevida, recorrência do tumor e tempo livre
de doença devem ser feitos.
O uso de marcadores de proliferação celular, apoptose, angiogênese,
mediadores inflamatórios, fatores de crescimento, oncogenes, entre outros é
fundamental para o entendimento do comportamento biológico das neoplasias.
Essas proteínas podem ser pesquisadas por imunoistoquímica ou por técnicas
como PCR, ELISA, citometria de fluxo, entre outras. Cada uma destas tem
suas indicações e limitações. A imunoistoquímica permite avaliar a presença ou
ausência de determinado antígeno no tecido fixado em formol e incluído em
parafina, o que é uma vantagem na rotina dos laboratórios de anatomia
patológica. Porém, este método é qualitativo e não quantitativo. As demais
técnicas permitem a quantificação da proteína no tecido, porém, normalmente,
em amostras frescas ou congeladas.
A busca de biomarcadores para o prognóstico pode ser feita utilizando-
se anticorpos primários contra as proteínas envolvidas no processo de
iniciação, promoção e progressão tumoral. Nosso grupo de pesquisa vem
procurando biomarcadores para os mastocitomas caninos que auxiliem na
graduação do tumor (como o c-KIT), na possível indicação do uso de drogas
anti neoplásicas (como os inibidores seletivos da COX-2, no estudo da
expressão de COX-2 em mastocitomas caninos) e entendimento de
mecanismos de metástase, inibição da apoptose, estímulo a proliferação
celular e angiogênese como a imunomarcação para PGE2 e VEGF.
O mastocitoma canino apresenta alta produção de VEGF, o que
demonstra sua capacidade em estimular a angiogênese pelos mastócitos
neoplásicos. Não é claro se o VEGF age de forma autócrina, estimulando a
multiplicação dos próprios mastócitos neoplásicos, via receptores para este
fator de crescimento (SHINKRAUK et al., 2003) ou se há o estímulo a
angiogênese, que de qualquer forma, contribui para o crescimento tumoral,
72
além de facilitar a metástase, pelos vasos neoformados serem mais
permeáveis às células neoplásicas (KUSEWITT e RUSH, 2007).
Tal fato foi demonstrado no terceiro trabalho desta dissertação
(Expressão de PGE2 e VEGF em mastocitomas cutâneos caninos) aonde os
53 mastocitomas caninos avaliados apresentaram marcação positiva para
VEGF. Ao avaliar o percentual de células marcadas e a intensidade de
expressão não houve correlação estatística com a graduação histopatológica
dos mastocitomas, demonstrando o potencial de estímulo à angiogênese do
mastocitoma, mas independente da sua graduação. No entanto, ressaltamos
que a avaliação da intensidade de expressão é extremamente subjetiva, pois
esta é uma reação tintorial que está sujeita a diversos fatores, desde aqueles
ligados ao processamento do material, como o tempo de fixação, até fatores
externos, como ao padrão utilizado pelo pesquisador (na classificação de forte,
moderado ou fraco) que pode facilmente ser prejudicado pelo equipamento
usado na análise, como o digitalizador de imagens, que possui um programa
de visualização que pode ter sua intensidade de coloração alterada pela
quantidade de luz usada no microscópio.
Devido a estas variáveis, a avaliação da quantidade de proteína (VEGF)
produzida deve ser realizada com técnicas quantitativas como ELISA,
Citometria de fluxo, PCR, entre outras.
A produção de substâncias como a COX2 já foi relacionada com a
progressão neoplásica (DORÉ et al., 2003), e em mastocitoma canino,
Calderón (2005), verificou uma relação estatística da imunomarcação de COX-
2 com os tumores grau I e III, porém sem diferença entre os graus I-II e II-III,
sendo de se esperar que a PGE2 também possua tal comportamento, sendo
este um dos principais metabólitos da COX2.
O mastocitoma canino também produz grande quantidade de PGE2,
demonstrado pela marcação de quase 100% dos tumores avaliados. No
entanto, assim como a expressão de VEGF, não houve correlação estatística
entre a intensidade de expressão de PGE2 com a graduação histopatológica,
tal fato é justificado pela limitação da técnica, já explicado para o VEGF.
Ao correlacionar o percentual de células marcadas por PGE2 com a
graduação histopatológica há uma correlação estatística significativa quanto se
comparam os graus I e III. Com essas informações pode pensar na utilização
73
do PGE2 como um biomarcador prognóstico, pois sua expressão é baixa em
mastocitomas diferenciados e alta nos indiferenciados. Portanto sua avaliação
ajuda na elaboração do prognóstico, como foi observado para o COX2 por
Calderón (2005). No entanto a ausência de correlações estatísticas positivas
nas quais o grau II está envolvido demonstra a complexidade desse grau e que
novos critérios devem ser estabelecidos para a acurada classificação dos
mastocitomas caninos e conseqüentemente estabelecimento de tratamento
adequado e prognóstico.
A oncologia veterinária vem se desenvolvendo rapidamente, pelo
aumento da expectativa de vida dos animais de companhia, e a patologia
veterinária deve acompanhar este processo, com o desenvolvimento de
técnicas avançadas de diagnóstico para fornecer subsídios seguros para o
diagnóstico, prognóstico e até mesmo indicação do uso de drogas menos
agressivas (como os inibidores seletivos de COX2) ou terapia gênica.
Conclusões gerais
A histopatologia convencional pela coloração por HE ainda é a
ferramenta mais útil para determinação do prognóstico dos mastoctiomas
caninos utilizando-se a graduação histopatológica proposta por Patnaik et al.
(1984). No entanto com a crescente utilização de biomarcadores, o material
rotineiramente corado por HE e avaliado com os critérios pré-estabelecidos traz
informações limitadas sobre o comportamento biológico do tumor, uma vez que
estes parâmetros são subjetivos e passíveis de avaliações individuais.
Portanto, a utilização de biomarcadores de proliferação, angiogênese,
mediadores inflamatórios entre outros, são necessários quando se busca
prognósticos acurados, visto que independente da graduação histopatológica,
os mastocitomas apresentam alta produção de VEGF, PGE2 e c-KIT e devem
ser sempre encarados como neoplasias potencialmente malignas.
74
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Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista
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