( PDF ) Expressão imunohistoquímica das proteínas P53 e Ki67 no epitélio esofágico de pacientes com doença do refluxo gastroesofágico, exôfago de Barrett e adenocarcinoma

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA: CIRURGIA

EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS P53 E Ki-67

NO EPITÉLIO ESOFÁGICO DE PACIENTES COM DOENÇA DO

REFLUXO GASTROESOFÁGICO, ESÔFAGO DE BARRETT E

ADENOCARCINOMA

Autor: MARCELO BINATO

Orientador: Prof. Dr. Richard Ricachenevsky Gurski

Co-Orientador: Prof. Dr. Renato Borges Fagundes

Tese de Doutorado

2007

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Livros Grátis

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA: CIRURGIA

EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS P53 E Ki-67

NO EPITÉLIO ESOFÁGICO DE PACIENTES COM DOENÇA DO

REFLUXO GASTROESOFÁGICO, ESÔFAGO DE BARRETT E

ADENOCARCINOMA

Autor: MARCELO BINATO

Orientador: Prof. Dr. Richard Ricachenevsky Gurski

Co-Orientador: Prof. Dr. Renato Borges Fagundes

Tese de Doutorado

2007

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A minha família: Wiviane, Isabelle e Bernardo,

que compartilharam juntos comigo muitos momentos

desta jornada

Aos meus irmãos Silvio e Alexandre,

que sempre buscaram a sabedoria

e as melhores idéias

Aos meus pais Roberto Binato e Vaneza Binato,

pelo amor, pelo exemplo, pela dedicação

e ainda pelo esforço de sempre estimular seus filhos a encontrar

a felicidade e a realização profissional

“A mente que se abre a uma nova idéia,

jamais voltará ao tamanho original“

Albert Einstein

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Richard Ricachenevsky Gurski, Professor do Programa de Pós-

Graduação em Medicina: Cirurgia da UFRGS: grande amigo, notável orientador e

mestre na ciência de ensinar. “O pensamento é a grandeza do Homem” (Pascal).

Ao Dr. Renato Borges Fagundes, Professor do Programa de Pós-Graduação

em Medicina Gastroenterologia da UFRGS: pelo apoio e pela orientação na trajetória

de minha formação profissional.

Às Professoras Doutoras em Patologia (UFRGS) Maria Isabel Edelweiss e

Luise Meurer, que colaboraram na realização deste trabalho com simplicidade e

sinceridade, principalmente, pela sabedoria no conhecimento da patologia

gastrointestinal.

Ao Laboratório de Anatomia-Patológica da UFSM cujos patologistas Carlos

Renato Melo, Ivanir S. Melo, Melissa Daubermann, Marta P. da Rocha muito

contribuíram para a realização deste trabalho. Em especial, ao técnico em

imunohistoquímica Aílton P. de Quadros, pelo tempo despendido na preparação das

lâminas.

Ao programa de Pós-graduação em Medicina: Cirurgia, pela oportunidade e

pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho. Agradecimento, em especial, à

secretária do curso Estela Maris Emer Araripe.

Ao Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação (GPPG) do HCPA, particularmente,

ao setor estatístico pela disponibilidade e pela ajuda. Em especial à Vânia Naomi

Hirakata.

Ao Dr. Roberto Lemos, Professor do Departamento de Cirurgia da UFSM,

pelo seu exemplo, pelo conhecimento e por sua dedicação à vida médica.

Ao Dr. Glauco da Costa Alvarez, Professor Doutor do Departamento de

Cirurgia da UFSM a quem devo diretamente a oportunidade de iniciar e concluir este

projeto.

Ao Dr. Alberto da Costa Stein, amigo e mestre em cirurgia, um exemplo na

busca da idealização profissional. “O homem é aquilo que sabe” (Francis Bacon).

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Artigo I. Análise da expressão da proteína p53 e do antígeno Ki-67(MIB-1) na

mucosa esofágica de pacientes na seqüência doença do refluxo gastroesofágico –

esôfago de Barrett – adenocarcinoma.

Tabela 1. Pacientes excluídos antes da realização da biópsia

preconizada pelo estudo ................................................................................. 29

Tabela 2. Características demográficas dos pacientes .................................. 30

Figura 1. Microfotografia da mucosa esofágica: (A) mucosa escamosa normal;

(B) esofagite crônica (hiperplasia da camada basal, alongamento das papilas e

infiltrado de células inflamatórias no epitélio e na lâmina própria); (C) mucosa

colunar com células caliciformes; (D) adenocarcinoma., (x 200) ..................... 25

Figura 2. Microfotografia da expressão imunohistoquímica da proteína p53

(setas): Esofagite (A), Epitélio colunar sem metaplasia intestinal (B), (x 100);

Epitélio colunar com metaplasia intestinal (C) e Adenocarcinoma (D),

(x 200) .............................................................................................................. 31

Figura 3. Imunorreatividade p53 na seqüência epitélio normal –

esofagite – colunar s/ MI – colunar c/ MI – adenocarcinoma ........................... 31

Figura 4. Correlação p53 e progressão epitélio normal – esofagite –

colunar s/ e c/ MI – adenocarcinoma. Coeficiente de Kendall 0,4.................... 32

Figura 5. Microfotografia da expressão imunohistoquímica do antígeno

Ki-67 (MIB-1) – setas: Esofagite (A), Epitélio colunar sem MI (B), (x 100);

Epitélio colunar com MI (C) e adenocarcinoma (D), (x 200)............................. 32

Figura 6. Atividade Ki-67 na seqüência epitélio normal – esofagite –

colunar s/ MI -colunar c/ MI – adenocarcinoma ............................................... 33

Figura 7. Correlação entre Ki-67 e progressão epitélio normal –

esofagite – colunar s/ MI – colunar c/ MI – adenocarcinoma ........................... 34

Artigo II. Análise da expressão imunohistoquímica da proteína p53 e do antígeno Ki-

67(MIB-1) no epitélio escamoso de pacientes com DRGE e na esofagite crônica

Figura 1. Microfotografia da expressão imunohistoquímica da proteína p53 –

setas: mucosa normal (A) (x400), esofagite leve (B), esofagite moderada (C)

e esofagite acentuada (D) , (x 200). ................................................................ 92

Figura 2. Atividade da proteína p53 na seqüência epitélio normal –

esofagite leve – esofagite moderada – esofagite acentuada .......................... 93

Figura 3. Correlação entre p53 e progressão epitélio normal –

esofagite leve – esofagite moderada – esofagite acentuada. Coeficiente de

Kendall 0,4. ..................................................................................................... 93

Figura 4. Microfotografia da expressão imunohistoquímica do antígeno Ki-67

(MIB-1) – setas: epitélio normal (A) e esofagite leve (B) com aumento de 200X,

esofagite moderada (C) e esofagite severa (D), em aumento de 200X .......... 94

Figura 5. Atividade Ki-67 na seqüência epitélio normal – esofagite

leve – esofagite moderada – esofagite acentuada ......................................... 94

Figura 6. Correlação entre Ki-67 e progressão epitélio normal – esofagite

leve – esofagite moderada – esofagite acentuada ......................................... 95

Artigo III. Avaliação da expansão da proliferação celular na mucosa colunar do

esôfago distal: análise imunohistoquímica do antígeno Ki-67 (MIB-1) em mucosa

colunar com e sem metaplasia intestinal

Tabela 1. Prevalência da atividade e índice de proliferação Ki-67 nos

compartimentos proliferativos da mucosa colunar ....................................... 144

Figura 1. Atividade proliferativa Ki-67 (MIB-1) nos compartimentos

proliferativos da mucosa colunar com metaplasia intestinal (terço inferior e

terço médio da glândula – setas vermelhas; superfície epitelial –

seta azul)....................................................................................................... 144

Figura 2. Estratificação da imunorreatividade (Ki-67) nos compartimentos

proliferativos da cripta intestinal nos pacientes com e sem metaplasia

intestinal ....................................................................................................... 145

LISTA DE ABREVIATURAS

DRGE - Doença do refluxo gastresofágico

NERD - Non erosive reflux disease

DNA - Ácido desoxirribonucleico

Ki-67 - Antígeno Ki-67 (MIB-1)

MI - Metaplasia intestinal

Tp53 - Gene P53

p53: - Proteína p53

APC - Adenomatous poliposis coli

ABC - Avidina-biotina-peroxidase

PCR - Polymerase Chain Reaction

(Reação em Cadeia da Polimerase)

ACE - Adenocarcinoma de esôfago

PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen

(Antígeno Nuclear de Proliferação Celular)

JEG - Junção esofagogástrica

HUSM - Hospital Universitário de Santa Maria

HCPA - Hospital de Clínicas de Porto Alegre

UFSM - Universidade Federal de Santa Maria

SUMÁRIO

Introdução ................................................................................................................ 10

Objetivos ................................................................................................................. 16

Artigo Científico I Redigido em Português ............................................................... 17

Artigo Científico I Redigido em Inglês ..................................................................... 51

Artigo Científico II Redigido em Português .............................................................. 84

Artigo Científico II Redigido em Inglês .................................................................. 111

Artigo Científico III Redigido em Português ........................................................... 137

Artigo Científico III Redigido em Inglês ................................................................. 157

Conclusões ............................................................................................................ 176

Anexos

Anexo 1. Consentimento informado .............................................................178

Anexo 2. Ficha de registro dos pacientes ................................................... 180

Anexo 3. Mapa esquemático do esôfago .................................................... 181

INTRODUÇÃO

A doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) é uma das condições clínicas

mais freqüentes na prática médica, caracterizada tanto por sintomas típicos, pirose e

regurgitação, quanto por atípicos como dor torácica, asma e tosse, associadas a

lesões teciduais esofágicas e ou extra-esofágicas (1). Na forma típica da

enfermidade, as manifestações estão diretamente relacionadas à ação do conteúdo

gastroduodenal refluído sobre a mucosa esofágica; enquanto os casos atípicos

devem-se à ação do material refluído sobre os órgãos adjacentes ao esôfago,

podendo ambas estar associados a lesões teciduais no esôfago (2).

A prevalência atual da DRGE é medida pela presença de sintomas típicos da

enfermidade (4). Nos Estados Unidos cerca de 44% da população referem pirose

mensalmente, 14% apresentam sintomas semanalmente e 7% relatam pirose

diariamente (3). No Brasil, a DRGE ocorre em cerca de 12% da população, sem

levar em consideração as manifestações atípicas da doença (4).

A avaliação endoscópica do esôfago tem sido empregada como método de

escolha para o diagnóstico das lesões da mucosa causadas pelo refluxo

gastroesofágico, principalmente pela dificuldade em detectar as lesões baseadas

somente nos sintomas dos pacientes refluidores (5,6). O espectro dos achados

endoscópicos varia desde uma mucosa esofágica normal (non erosive reflux disease

– NERD), até uma doença erosiva, esôfago de Barrett, estenose ou adenocarcinoma

(7).

A razão de alguns refluidores apresentarem endoscopia normal, enquanto

outros evoluem para a forma erosiva e/ou esôfago de Barrett permanece

desconhecida. Nesse contexto o grupo com NERD pode representar, dentro das

diversas etapas da DRGE, a fase inicial da doença, ou apenas significar tal grupo

tem maiores fatores de proteção da mucosa do que aqueles que desenvolvem as

formas complicadas da DRGE (7). O surgimento da esofagite representa à falha dos

mecanismos defensivos da mucosa do esôfago. Uma vez que o ácido altera a

estrutura normal do epitélio esofágico, produzindo dilatação dos espaços

intercelulares, a penetração do ácido causará mudança no pH tissular, troca de íons

com as células e, finalmente, aumento da acidez intracelular. Este último fato

representa o início da morte celular. Quando as alterações celulares progridem,

observa-se dano tecidual que afeta, inicialmente, as células do compartimento

superficial do epitélio escamoso. Uma vez estabelecido o quadro inflamatório, pode-

se, através da endoscopia, visualizar a forma erosiva da esofagite (1,2). A

complicação mais importante desse processo inflamatório ocorre em conseqüência

da cicatrização desordenada das lesões erosivas da mucosa esofágica, quando as

células da camada basal do epitélio escamoso, ou dos ductos das glândulas

submucosas esofágicas, diferenciam-se em células colunares, que recobrem o

esôfago distal em substituição ao epitélio escamoso (2,8).

Sabe-se que o epitélio metaplásico no esôfago pode progredir para o câncer

através de processo inflamatório contínuo, mas ainda se desconhece o modo exato

pelo qual a seqüência metaplasia – displasia – adenocarcinoma se desenvolve.

Esse mecanismo pode ocorrer por causa da ação mitogênica secundária à injuria

crônica sobre a mucosa esofágica, ou pela mutagênese secundária à exposição a

um agente danoso à célula (9). Assim, o aumento na produção a partir dos radicais

de oxigênio, com subseqüente dano ao DNA das células e o permanente estímulo

de proliferação sobre a mucosa do esôfago, induzido pelo refluxo, são fatores

fisiopatológicos importantes na carcinogênese esofágica (10).

O desenvolvimento do câncer está associado ao aparecimento de mutações

genéticas, que conferem à célula de um determinado tecido a característica de

crescimento descontrolado, com formação tumoral (11). Sabe-se que a seqüência

metaplasia-displasia-adenocarcinoma surge a partir de alterações histológicas

caracterizadas, inicialmente, por um processo inflamatório crônico conseqüente ao

refluxo gastroesofágico sobre a mucosa esofágica, que acompanha ou precede o

desenvolvimento das alterações moleculares presentes na evolução desta neoplasia

(11,12). A partir do processo inflamatório sobre a mucosa esofágica, a(s) célula(s)

pode(m) adquirir, ao longo do tempo, alterações funcionais como resistência a

apoptose, aumento da proliferação celular e instabilidade genômica, com amento da

expressão de diversas proteínas específicas, relacionadas ao controle do ciclo

celular. Portanto, a via de carcinogênese do esôfago de Barrett apresenta

semelhança, do ponto de vista histopatológico e molecular, àquela observada na

doença inflamatória intestinal (13).

De acordo com a teoria da expansão clonal, as alterações moleculares são

gradativamente acumuladas, no interior das células, até a formação de tumores

malignos (14). Dessa forma, os eventos moleculares que levam às anormalidades

funcionais, em determinadas áreas histológicas (clones de células), geralmente

surgem ou precedem a formação de tumores sólidos, especialmente, nas etapas

iniciais do processo de carcinogênese do esôfago (inflamação-metaplasia-neoplasia)

(11). A identificação dessas alterações moleculares em tecido não neoplásico é da

maior importância, na seleção de subgrupos de pacientes com maior risco de

transformação maligna (13,14).

A proteína p53 e o antígeno Ki-67 têm se mostrado como importantes

marcadores moleculares tanto em neoplasias malignas de esôfago, estômago e reto,

como nas condições clínicas associadas a processos inflamatórios crônicos da

mucosa gastrointestinal (esofagite, acalasia e retocolite ulcerativa). A partir dessas

observações e, considerando as limitações da análise histológica convencional da

biópsia esofágica em determinar a evolução dos pacientes com esôfago de Barrett,

na seqüência metaplasia-displasia-adenocarcinoma, a avaliação da expressão

imunohistoquímica da proteína p53 e da atividade proliferativa pelo Ki-67 (MIB-1), na

mucosa esofágica dos pacientes, poderá demonstrar, com mais clareza o momento

em que o estímulo inflamatório gera a alteração neoplásica (11,15-17).

O estudo das alterações histológicas e moleculares, nas etapas iniciais da

DRGE, passando pelas fases do processo inflamatório, metaplasia intestinal,

displasia e adenocarcinoma, por meio de marcadores moleculares tem sido a forma

mais investigada para elucidar estas perguntas (11,18-20).

Apresentam-se, a seguir, os resultados de uma análise prospectiva de uma

população de pacientes avaliados dentro do espectro da doença, desde a DRGE até

o adenocarcinoma do esôfago. Tais resultados geraram três artigos científicos que

analisaram as diferentes fases de apresentação da DRGE e objetivam, ainda,

analisar e discutir as modificações histopatológicas e/ou moleculares que

acompanham, ou precedem, o desenvolvimento do adenocarcinoma do esôfago.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO

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reflux disease: prevalence, clinical, endoscopic and histopathological findings in

1128 consecutive patients referred for endoscopy due to dyspeptic and reflux

symptoms. Dig 2000, 61:6-13.

2. Orlando RC. Pathogenesis of Gastroesophageal reflux disease. Am J Med Sci

2003; 326(5): 274-278.

3. Gallup survey on heartburn across America. Princeton, NJ: The Gallup

Organization, 1988.

4. Moraes-Filho JPP, Cecconello I, Gama-Rodrigues J, Castro LP, Henry MA,

Meneghelli UG, Quigley E, Brazilian Consensus Group. Brazilian consensus on

gastroesophageal reflux disease: proposals for assessment, classification, and

management. Am J Gastroenterol 2002; 97:241-248.

5. Lagergren J, Bergstrom R, Lindgren A, Nyren O. Symptomatic gastroesophageal

reflux as a risk factor for esophageal adenocarcinoma. N Engl J Med 1999;

340(11):825-831.

6. Reid BJ, Haggitt RC, Rubin CE, Rabinovitch PS. Barrett's esophagus. Correlation

between flow cytometry and histology in detection of patients at risk for

adenocarcinoma. Gastroenterol 1987; 93(1):1-11.

7. Achem SR. Endoscopy negative gastroesophageal reflux disease. The

hypersensitive esophagus. Gastroenterol Clin North Am 1999; 28:893-904.

8. Gillen P, Keeling P, Byrne PJ, West AB, Hennessy TP. Experimental columnar

metaplasia in the canine oesophagus. Br J Surg 1988; 75: 113-115.

9. DeMeester SR, DeMeester TR. Columnar mucosa and intestinal metaplasia of

the esophagus: fifty years of controversy. Ann Surg 2000; 231(3):303-321.

10. Wetscher GJ, Hinder RA, Kingler P, et al. Reflux esophagitis in humans is a free

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11. Bernstein C, Bernstein H, Payne CM, Garewal H. Field defects in progression to

adenocarcinoma of the colon and esophagus. Elect J Biotech 2000; 3(3):1-14.

12. Manson RJ, Bremner CG. Gastritis in Barrett’s esophagus. World J Surg 1995,

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13. Jankowski JA, Wright, NA, Meltzer, SJ, Triadafilopoulos, G, Geboes K, Casson,

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adenocarcinoma sequence in the esophagus. Am J Pathol 1999; 154(4): 965-73.

14. Nowell PC. The clonal evaluation of tumor cell populations. Sci 1976; 194: 23-28.

15. Ribeiro Jr. U, Alves VA, Souza PMSB, Ribeiro AVS, Rawet V, Nonogaki S,

Rodrigues JG, Habr-Gama A. Correlação das proteínas p53 e Ki-67 com o

prognóstico de pacientes com adenocarcinoma de reto distal. Rev Bras Coloproct

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16. O’Riordan JM, Abdel-latif MM, Ravi N, MacNamara D, Byrne PJ, McDonald GS,

Keeling PW, Kelleher D, Reynoulds JV. Proinflammatory cytokine and nuclear

factor kappa-B expression along the inflammation-metaplasia-dysplasia-

adenocarcinoma sequence in the esophagus. Am J Gastroenterol 2005; 100(6):

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17. Chino O, Kijima H, Shimada H, Nishi T, Tanaka H, Oshiba G, Kise Y, Kenmochi

T, Himeno H, Tsuchida T, Kawai K, Tanaka M, Machimura T, Tajima T, Makuuchi

H. Clinic pathological studies of esophageal carcinoma in achalasia: analyses of

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18. Chen X, Ouyang Q, Zhang WY, Li XS, Liang HL. The clinical, pathological

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19. Fujiwara Y, Higuchi K, Hamaguchi M, Takashima T, Watanabe T, Tominaga K,

Oshitani N, Matsumoto T, Arakawa T. Increased expression of transformation

growth factor-alpha and epidermal growth factor receptors in rat chronic reflux

esophagitis. J Gastroenterol and Hepatol. 2004; 19: 521-527.

20. Fitzgerald RC, Onwuegbusi BA, Bajaj-Elliott M, Saeed IT, Burnham WR, Farthing

MJ. Diversity in the oesophageal phenotypic response to gastro-oesophageal

reflux: immunological determinants. Gut 2002; 50(4): 451-9.

OBJETIVOS

Artigo I

1. Avaliar a expressão da proteína p53 e Ki-67 (MIB-1) na mucosa esofágica de

pacientes com doença do refluxo gastroesofágico, esôfago de Barrett e

adenocarcinoma do esôfago.

2. Analisar a correlação da expressão da proteína p53 e Ki-67 com os diversos graus

de lesão histológica, na mucosa esofágica destes pacientes.

Artigo II

1. Avaliar a expressão da proteína p53 e Ki-67 (MIB-1) na mucosa esofágica de

pacientes com doença do refluxo gastroesofágico e que apresentem esofagite

crônica.

2. Analisar a correlação da expressão da proteína p53 e Ki-67 com os graus de

esofagite crônica destes pacientes.

Artigo III

1. Avaliar o índice Ki-67 (MIB-1) nos diferentes compartimentos proliferativos da

mucosa colunar no esôfago distal com ou sem metaplasia intestinal em pacientes

com doença do refluxo gastroesofágico.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA P53 E DO ANTÍGENO KI-67 (MIB-1) NA

MUCOSA ESOFÁGICA DE PACIENTES COM DOENÇA DO REFLUXO

GASTROESOFÁGICO – ESÔFAGO DE BARRETT – ADENOCARCINOMA

* (pré-artigo para ser enviado à revista Gastroenterology)

Versão em Português

Autores:

Marcelo Binato

Renato Borges Fagundes

Luise Meurer

Maria Isabel Edelweiss

Richard Ricachenevsky Gurski

Local de Realização:

Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Serviços de Cirurgia Geral e de Patologia.

Rua Ramiro Barcelos, 2350 – CEP 90035-003. Bairro Rio Branco – Porto Alegre –

RS – Brasil. Fone: (51) 2101.8000.

Endereço para Correspondência:

Marcelo Binato

Rua Francisco Manoel Nº 01/ AP 202 CEP 97015-260

Santa Maria – RS – Brasil. Fone: (55) 32225693

Email: [email protected].br

RESUMO

Introdução: A doença do refluxo gastroesofágico é considerada um dos principais

fatores de risco, para o desenvolvimento do adenocarcinoma do esôfago. Muitas

alterações moleculares ocorrem na carcinogênese esofágica, mas o exato mecanismo

do desenvolvimento do adenocarcinoma permanece desconhecido.

Objetivos: Determinar a expressão da proteína p53 e do índice Ki-67 na mucosa

esofágica em pacientes com DRGE e correlacionar esses marcadores com a seqüência

epitélio escamoso normal – esofagite crônica – epitélio colunar sem ou com metaplasia

intestinal – adenocarcinoma.

Métodos: A expressão da proteína p53 e do índice Ki-67 foi determinada pela análise

imunohistoquímica de 235 pacientes, divididos em cinco grupos: G1- 58 pacientes com

epitélio escamoso normal, G2: 80 pacientes com esofagite crônica, G3: 30 pacientes

com epitélio colunar s/ MI, G4: 32 pacientes com epitélio colunar com MI e G5: 35

pacientes com adenocarcinoma. O material estudado foi proveniente de biópsia

endoscópica de pacientes com DRGE, entre janeiro de 2003 e dezembro de 2006.

Resultados: A expressão aumentada da proteína p53 foi encontrada em 7% no G1,

37,5% no G2, 30% no G3, 62,5% no G4 e 71,4% no G5 (p<0,001). O aumento no

índice de proliferação celular Ki-67 também foi proporcionalmente maior, de acordo com

a piora do diagnóstico histopatológico, sendo de 21,3±19,5% no G1, 38,8±24,9% no G2,

37,7±26,3% no G3, 52,8±24,6% no G4 e 57,1±25,1% no G5 (p<0,001). Foi observada

correlação linear entre o aumento de ambos marcadores moleculares (p53 e Ki-67) e o

avanço na seqüência epitélio escamoso – adenocarcinoma (p<0,001 e p<0,05).

Conclusão: A expressão aumentada da proteína p53 e do índice de proliferação celular

Ki-67 (MIB-1) demonstraram ter correlação com a progressão para o adenocarcinoma,

em pacientes com DRGE. A alteração na atividade proliferativa avaliada pelo Ki-67

(MIB-1), acompanhou as mudanças moleculares do gene Tp53, e pode estar associada

às mudanças desse marcador.

Palavras-Chave: p53. Ki-67 (MIB-1). DRGE. Esôfago de Barrett. Adenocarcinoma.

INTRODUÇÃO

O refluxo gastroesofágico é uma das condições clínicas mais freqüentes na

prática médica, uma vez que acomete mais de 30% da população adulta (1;2).

Estudo populacional nacional estima que, aproximadamente, 12% da população

brasileira têm doença do refluxo gastroesofágico, sem considerar os indivíduos com

manifestações atípicas (3). A avaliação endoscópica do esôfago, nos pacientes com

DRGE, apresenta um amplo espectro de achados, sendo os principais: mucosa

esofágica sem lesões (non erosive reflux disease – NERD), doença erosiva, esôfago

de Barrett, estenose e câncer, especialmente, o adenocarcinoma (4;5).

Trabalhos experimentais e ensaios clínicos apóiam a teoria de que a mucosa

colunar no esôfago distal surge em conseqüência da exposição do epitélio

escamoso esofágico ao conteúdo gastroduodenal (6;7). A importância desse epitélio

no esôfago é decorrente da possibilidade de evoluir para metaplasia intestinal, o que

caracteriza o esôfago de Barrett, e finalmente para o adenocarcinoma (3). Portanto,

o esôfago de Barrett é definido pela presença de mucosa colunar em esôfago distal,

visível na endoscopia digestiva alta, com qualquer extensão e que demonstre, no

exame anátomo-patológico, metaplasia intestinal com células caliciformes (8).

Estima-se que 6 a 12% dos pacientes com sintomas de refluxo gastroesofágico,

submetidos à avaliação endoscópica, tenham esôfago de Barrett (9;10).

Cerca de 64 a 86% dos adenocarcinomas de esôfago originam-se a partir do

epitélio colunar com metaplasia intestinal. Em vista disso, o esôfago de Barrett torna-

se o fator de risco mais importante na avaliação dos pacientes com doença do

refluxo gastroesofágico (11;12). A natureza pré-maligna do esôfago de Barrett atribui

aos pacientes um risco anual de desenvolvimento do adenocarcinoma de esôfago

de 0,5 a 2%, representado um risco 30 a 125 vezes maior que o da população em

geral (13;14). O adenocarcinoma de esôfago tem apresentado incidência crescente

nos países desenvolvidos, superando o carcinoma epidermóide e tornando-se o tipo

histológico mais comum das neoplasias de esôfago em algumas populações. Apesar

dos avanços terapêuticos, o prognóstico dos casos avançados é ruim (15-17).

Devido ao risco de progressão do esôfago de Barrett para o adenocarcinoma

de esôfago, um seguimento racional nesses pacientes, que permita a identificação

precoce da transformação maligna é de fundamental importância. Ao longo do

processo da carcinogênese esofágica, uma seqüência de múltiplas alterações

genéticas torna a célula epitelial não responsiva aos mecanismos reguladores de

proliferação e morte celular programada. Com isso, a célula adquire capacidade de

proliferação descontrolada, com potencial invasor, tornando-se uma célula

neoplásica (14).

A evolução do esôfago de Barrett para o adenocarcinoma de esôfago está,

freqüentemente, associada com mudanças estruturais no DNA celular (18). Diversas

alterações moleculares são identificadas na progressão do epitélio escamoso com

DRGE, passando pela metaplasia intestinal até o aparecimento do adenocarcinoma.

As mais importantes incluem a alteração na regulação do ciclo celular, por disfunção

nos genes supressores tumorais (p53, APC), nos oncogenes e nas células de

adesão molecular (E-caderina e Cateninas) (18).

O gene Tp53 é um dos mais estudados no desenvolvimento e progressão de

diversas neoplasias. Localizado no braço curto do cromossomo 17, mais

precisamente na região 17p13.1, o gene Tp53 codifica a proteína p53, cuja

finalidade é retardar o ciclo celular e reparar um eventual dano ao DNA das células,

ou mesmo induzir a apoptose e impedir mutações nas linhagens celulares

subseqüentes (19). A inativação do gene Tp53 pode ocorrer por mutação ou

interação com oncogenes específicos. Basicamente, os dois principais eventos

moleculares que alteram o gene Tp53, durante a progressão tumoral, são a deleção

de um dos alelos do cromossomo 17p e/ou mutações do segundo. As perdas

alélicas, geralmente, estão associadas com formas mutantes do Tp53 (19;20).

A mutação do gene Tp53 e a expressão aumentada da proteína p53 estão

entre as anormalidades genéticas mais comumente encontradas nas neoplasias

humanas (5;21). Essas alterações têm sido relatadas em vários tipos de câncer -

incluindo cólon, esôfago, estômago, pulmão, mama, bexiga e outros -, e nas

condições pré-malignas como no esôfago de Barrett (20). O aumento da expressão

da proteína p53 parece ocorrer, precocemente, na gênese tumoral. Essa proteína

está presente nas diferentes fases da seqüência metaplasia-adenocarcinoma, sendo

detectada em, aproximadamente 50 a 90% dos adenocarcinomas de esôfago

(18;20).

Associada à disfunção do gene Tp53, o aumento da proliferação celular

pode preceder o aparecimento de lesões displásicas no esôfago de Barrett

(19;22;23). O Ki-67 é uma proteína nuclear expressa em todas as fases ativas do

ciclo celular (G1, S, G2 e M), mas ausente na fase G0 – repouso celular (24;25),

sendo empregado como marcador de proliferação em diferentes tipos de neoplasias

(26-28). A exata função do antígeno Ki-67 não é bem conhecida. Entende-se que

tenha papel importante na regulação do ciclo celular (29). Os mecanismos e

interações da expressão da proteína p53 com o aumento do índice de proliferação

celular (Ki-67), na carcinogênese esofágica, permanecem em estudo. A identificação

de marcadores tumorais de fácil acesso e baixo custo, com boa representatividade

clínico-patológica, que permita a seleção de subgrupos de pacientes com esôfago

de Barrett e perfil molecular para desenvolver displasia e/ou câncer é fundamental. A

proposta deste estudo é avaliar a expressão imunohistoquímica da proteína p53 e o

índice de proliferação celular pelo Ki-67 (MIB-1), na mucosa esofágica de indivíduos

com doença do refluxo gastroesofágico, em todo o seu espectro de doença: mucosa

esofágica com e sem esofagite, mucosa colunar com e sem metaplasia intestinal e

adenocarcinoma do esôfago.

MATERIAIS E MÉTODOS

População em estudo

Foram investigados, prospectivamente e de forma consecutiva, pacientes

com idade igual ou superior a 30 anos, encaminhados ao Serviço de Endoscopia

entre janeiro de 2003 e dezembro de 2006, com sintomas típicos de refluxo

gastroesofágico, como pirose e/ou regurgitação, pelo menos uma vez por semana,

com duração mínima de cinco anos, e pacientes com adenocarcinoma de esôfago,

diagnosticados por endoscopia e biópsia. Não tiveram a biópsia realizada conforme

protocolo de pesquisa os pacientes com as seguintes condições: coagulopatia, uso

de anticoagulantes ou anti-adesivos plaquetários, AINES, tratamento quimioterápico ou

radioterápico prévios, varizes esofagogástricas, recusa do paciente ao procedimento

endoscópico, esôfago de Barrett já diagnosticados,

hemorragia digestiva, hepatopatia,

neoplasia associada, hipersensibilidade iodo, supressão ácida nos últimos 60 dias,

cirurgia sobre o esôfago/estômago, adenocarcinoma tipo III Siewert.

Antes do exame endoscópico de cada paciente, foi obtido o Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido e realizado o questionário para definir as

características demográficas e clínicas dos pacientes (Anexo 1 e 2).

Endoscopia digestiva alta

Foi utilizado endoscópio Fujinon 2200, introduzido mediante manobras

convencionais, para a inspeção do esôfago, estômago e duodeno. Com o

endoscópio posicionado próximo a linha Z, foi realizada a cromoscopia com Solução

de Lugol a 3%, com o objetivo de colocar em evidência os marcos anatômicos e as

lesões da mucosa esofágica. Os principais marcos anatômicos, as alterações na

mucosa esofágica como erosões, úlceras, ilhotas, lingüetas e áreas circunferenciais

de mucosa colunar, e os locais biopsiados foram registrados em mapa esquemático

do esôfago (Anexo 3). O parâmetro utilizado para avaliar o tamanho das lesões da

mucosa foi a pinça de biópsia aberta (7 milímetros).

Definições endoscópicas

O pinçamento diafragmático correspondeu à impressão do músculo diafragma

visto à endoscopia digestiva alta. A linha Z definiu a junção escamocolunar, já a junção

esofagogástrica foi determinada pela margem proximal das pregas gástricas. O tamanho

da hérnia hiatal foi demarcado pela distância da linha Z ao pinçamento diafragmático. A

graduação endoscópica da esofagite erosiva foi definida pela classificação de Los

Angeles (3). A característica endoscópica do esôfago recoberto por mucosa colunar foi

determinada pela presença de mucosa “cor salmão” ou “cor vermelho-róseo”, semelhante

à mucosa gástrica, que recobre a porção proximal da junção esofagogástrica. A extensão

da mucosa colunar foi delimitada pela distância entre a margem proximal e distal da

lesão, em relação aos incisivos (arcada dentária superior).

Biópsia

As amostras teciduais foram obtidas com o auxílio de pinça fórceps, com

estilete central. Após a cromoscopia com Solução de Lugol foram coletados no

mínimo dois fragmentos de mucosa, iniciando do ponto mais distal da lesão em

direção proximal. Dependendo do achado endoscópico, os fragmentos foram obtidos

dois centímetros acima da junção escamocolunar na ausência de lesão, no sítio de

erosão ou na área não corada, e em intervalos de um a dois centímetros nos quatro

quadrantes na presença de mucosa colunar visível no esôfago distal, de acordo com

o protocolo de Seattle. As amostras teciduais foram fixadas em solução de formalina

a 10% e incluídas em blocos de parafina.

Critérios diagnósticos histológicos

Os cortes dos blocos de parafina foram corados pelos métodos de

Hematoxilina-Eosina (H&E) e Alcian-blue pH 2.5, para posterior análise em

microscópio óptico, por duas patologistas do Serviço de Patologia do HCPA.

Os achados histológicos foram classificados em epitélio escamoso normal,

presença de células da camada basal atingindo mais do que 15% da camada

epitelial total, alongamento das papilas com extensão até 2/3 da camada epitelial

total, exocitose (presença de neutrófilos e/ou eosinófilos e/ou monócitos intra-

epiteliais) (FIGURA 1), ectasia vascular ou extravasamento (dilatação das vênulas

das papilas com congestão ou extravasamento de hemácias para o epitélio

circunjacente). O diagnóstico histopatológico de esofagite foi definido pela presença

de um ou mais dos achados citados acima, conforme descrição prévia (30).

O epitélio colunar no esôfago distal foi classificado pela ausência da célula

caliciforme à biópsia. O esôfago de Barrett foi definido pela presença de epitélio

colunar com células caliciformes (padrão viliforme típico), na coloração pela

Hematoxilina-Eosina e por apresentar reatividade na coloração pelo Alcian-blue. O

diagnóstico de adenocarcinoma foi estabelecido ao identificar-se a presença de

glândulas atípicas com acentuada perda da estrutura habitual, com células isoladas

ou em grupos que invadiam a lâmina própria e a camada submucosa.

Figura 1 Microfotografia com achados histológicos da mucosa

esofágica: (A) mucosa escamosa normal; (B) esofagite crônica

(hiperplasia da camada basal, alongamento das papilas e infiltrado

de células inflamatórias no epitélio e na lâmina própria); (C)

mucosa colunar com células caliciformes; (D) adenocarcinoma.

Conforme o método utilizado por Cameron et al (16), que verifica a distância

entre o centro da lesão tumoral e a junção escamocolunar, para classificar os

adenocarcinomas de esôfago e de cárdia, e segundo a classificação proposta por

Siewert (31), os pacientes com adenocarcinoma, analisados no presente estudo

foram classificados em três tipos. Tumores cujos centros se localizavam a mais de

dois centímetros acima da junção escamocolunar foram classificados como

adenocarcinoma de esôfago (Tipo I de Siewert). Tumores que se localizavam até

dois centímetros da junção escamocolunar, cranial ou caudalmente, foram

considerados adenocarcinoma da JEG (Tipo II de Siewert). Tumores localizados

abaixo desse nível, foram denominados carcinomas gástricos subcárdicos (Tipo III

de Siewert). Foram incluídos no estudo os tumores tipo I e II. A exclusão dos

tumores tipo III da análise justifica-se em virtude da sua origem, provavelmente,

diferente do adenocarcinoma de esôfago e do adenocarcinoma da JEG (17).

Análise imunohistoquímica

O estudo imunohistoquímico foi realizado no Laboratório de

Imunohistoquímica do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa

Maria (UFSM). Foram efetuados quatro cortes histológicos com três micrômetros de

cada bloco designado.

Para a análise imunohistoquímica, foram utilizadas duas lâminas tratadas

com poli-L-lisina, com dois selos histológicos cada, uma lâmina para o anticorpo p53

e outra para o Ki-67 (MIB-1). Para a determinação da positividade desses anticorpos

foi empregado o método ABC (avidin-biotin-peroxidase complex, ExtrAvidin Sigma).

Os cortes foram desparafinizados por imersão em xilol e desidratados em álcool de

diferentes concentrações em temperatura ambiente (ATA). Após a inativação da

peroxidase endógena e o bloqueio das reações inespecíficas, foi realizada a

recuperação antigênica em forno de microondas.

O anticorpo primário p53 (DAKO, código M7001 mouse anti-p53; clones DO-

7) foi incubado por 15 horas, a 4

C, na diluição 1:700. O anticorpo reconhece a

forma selvagem e a mutante da proteína p53. Entretanto, em virtude da meia-vida

extremamente curta da forma selvagem, a coloração do núcleo da célula tumoral

sugere o acúmulo anormal da proteína p53. O anticorpo primário Ki-67 (DAKO,

código MU2970397 mouse anti Ki-67; clones MIB-1) foi incubado por 15 horas, a

C, na diluição 1:400. O complexo estreptavidina-biotina foi utilizado para

localização do anticorpo primário em ambos marcadores, enquanto a

diaminobenzidina-tetrahidrocloreto foi empregada como cromógeno. A contra-

coloração foi realizada com Hematoxilina-Haans. Foram utilizados como controle

positivo materiais provenientes de câncer de mama para a proteína p53 e de

apêndice cecal para a proteína Ki-67; e como controle negativo, foi usada uma

lâmina sem a inclusão do anticorpo primário.

A avaliação da proteína p53 foi realizada pela proporção de células coradas,

em um mínimo de 10 campos visuais de grande aumento (400X). O parâmetro

usado para definir a expressão da proteína p53, foi a presença de coloração nuclear,

conforme estabelecido por Wang et al (32). Foram considerados casos positivos

aqueles com mais de 10% de células coradas, por campo microscópico de alta

magnificação.

Em relação ao antígeno Ki-67 (MIB-1), o resultado foi avaliado com base no

índice do Ki-67, para cada caso. O índice é calculado a partir da média de células

coradas e o total de células analisadas com contagem de, no mínimo, 500 células,

conforme descrito previamente por Feith et al (33).

A leitura imunohistoquímica das lâminas foi realizada por duas patologistas

com experiência em patologia gastrointestinal, do Departamento de Patologia do

HCPA de forma independente e sem o conhecimento das informações clínicas e

endoscópicas. Quando discordantes, o resultado final foi obtido por consenso entre

as patologistas, assim como descrito por Weston et al (34).

Cálculo amostral

Para o cálculo amostral foi utilizada a fórmula para comparação de

proporções entre amostras. Para que fosse possível encontrar uma diferença de 10

a 45% de p53 positivo e Ki-67 alterados nos diversos grupos (graus de esofagite e

metaplasia intestinal), foi calculado um tamanho amostral de aproximadamente de

210 pacientes (alfa=0,05 e poder de 90%).

Análise estatística

Para armazenamento e processamento dos dados, foi utilizado o Statistical

Package for Social Science (SSPS), versão 12.0. O teste estatístico aplicado para

análise comparativa da proteína p53, entre os grupos, foi o qui-quadrado de

tendência linear. Os dados para o Ki-67 foram apresentados em médias e desvios-

padrão. As variáveis contínuas foram comparadas entre categorias através da

análise de variâncias (ANOVA). A localização das diferenças, quando presentes, foi

realizada pelo teste Tukey. A correlação linear das variáveis p53 e Ki-67, com seus

respectivos grupos, foram analisadas pelo coeficiente de correlação Kendall e

Pearson, respectivamente. Foi considerado significativo p<0,05. Para o controle da

concordância interobservador foi utilizado o teste kappa.

Considerações éticas

Este trabalho teve seu projeto previamente avaliado e aprovado pelo Grupo

de Pesquisa e Pós-Graduação (GPPG) do HCPA, seguindo todas as normas éticas

preconizadas. Os pacientes foram submetidos à endoscopia digestiva alta junto ao

atendimento assistencial do Serviço de Gastroenterologia do HUSM. Foi utilizado o

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) para todos os pacientes, os

quais tiveram a privacidade dos dados coletados protegida. Para os pacientes com

adenocarcinoma de esôfago provenientes do HCPA o material utilizado foi obtido do

Serviço de Patologia do HCPA, sem a participação direta dos pacientes, bem como

não houve modificação no protocolo de tratamento em decorrência da pesquisa. Os

dados clínicos coletados por revisão de prontuários nesse grupo, foram utilizados de

forma sigilosa e anônima, garantido pelo Termo de Compromisso para Utilização de

Dados. O estudo seguiu as normas emanadas da resolução 196/96 do Conselho

Federal de Medicina e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do CCS da

UFSM e pelo GPPG/HCPA.

RESULTADOS

No período de janeiro de 2003 a dezembro de 2006, foram avaliados 511

pacientes que preencheram os critérios de seleção. Foram excluídos 262 pacientes

que não seguiram o protocolo de biópsia a que se propunha o estudo (tabela 1), e

15 perdas das quais, 9 casos por diagnóstico histológico não conclusivo e 6 casos

por dificuldade na avaliação dos núcleos marcados para a proteína p53 pela técnica

imunohistoquímica.

Tabela 1. Pacientes excluídos antes da realização da biópsia preconizada pelo

estudo

À História coagulopatia (13)

À Anticoagulantes/antiadesivos (11)

À AINES (12)

À QTX e RTX (17)

À Varizes esofagogástricas (10)

À Recusa do paciente (6)

À EB já diagnosticados (21)

À Hemorragia Digestiva (9)

À Hepatopatia (7)

À Neoplasia associada (24)

À Hipersensibilidade iodo (4)

À Supressão ácida (92)

À CRG Esôfago/Estômago (18)

À ACE Tipo III Siewert (17)

Os 235 pacientes incluídos no estudo foram divididos em cinco grupos de

acordo com o estudo anátomo-patológico das amostras esofágicas: 58 pacientes

com epitélio escamoso normal (grupo 1), 80 pacientes com esofagite crônica (grupo

2), 30 pacientes com epitélio colunar sem metaplasia intestinal (grupo 3), 32

pacientes com epitélio colunar com metaplasia intestinal (grupo 4) e 35 pacientes

com adenocarcinoma de esôfago (grupo 5).

As características demográficas dos 235 pacientes estão apresentadas na

Tabela 1. Houve predomínio do sexo feminino, no grupo 1, em relação aos demais

(p<0,05). Houve uma média de idade mais avançada no grupo com

adenocarcinoma, em relação aos demais (p<0,05), com exceção dos pacientes com

mucosa colunar com metaplasia intestinal. Não houve diferença significativa entre os

grupos em relação à raça.

Tabela 2. Características demográficas dos pacientes.

Grupo 1

(normal)

N=58

Grupo 2

(esofagite)

n=80

Grupo 3

(colunar s/ MI)

n=30

Grupo 4

(colunar c/ MI)

n=32

Grupo 5

(ACE)

n=35

Total

n=235

Valor p

Idade

(média±DP)

50,4±13,8 53,4±15,2 54,2±16,8 58,2±12,6 64±8,6 55±14,5

0,041

Sexo (%)

<0,05

Masculino 13 (22,4) 42 (52,5) 17 (56,7) 21 (65,6) 30 (85,7) 123 (52,3)

Feminino 45(77,6)∞ 38 (47,5) 13 (43,3) 11 (24,4) 5 (14,3) 112 (47,7)

Raça

0,503

Caucasiana 55 (95) 72 (90) 25 (83,3) 28 (87,5) 32 (91,4) 212 (90,2)

Negra/Mista 3 (5) 8 (10) 5 (16,7) 4 (12,5) 3 (8,6) 23 (9,8)

∞ G1 difere dos demais grupos (p<0,05)

Com relação à expressão da proteína p53, 4 (7%) pacientes com epitélio

normal apresentaram positividade para a proteína p53. Dos 80 pacientes com

esofagite crônica, 30 (37,5%) mostraram-se positivos. Houve positividade para a

proteína p53 em 9 (30%) dos 30 pacientes com epitélio colunar sem metaplasia

intestinal e 20 (62,5%) dos 32 pacientes com epitélio colunar com metaplasia

intestinal. Dos 35 pacientes com diagnóstico de adenocarcinoma 25 (71,4%)

revelaram positividade para a proteína p53 (Figura 1).

Figura 2. Microfotografia da expressão imunohistoquímica da proteína p53

(setas): Esofagite (A), Epitélio colunar sem metaplasia intestinal (B), (x 100);

Epitélio colunar com metaplasia intestinal (C) e Adenocarcinoma (D), (x 200).

A análise comparativa da positividade da expressão imunohistoquímica da

proteína p53 demonstrou uma diferença estatisticamente significativa entre todos os

grupos com relação ao grupo epitélio normal (Figura 2). O grupo esofagite também

diferiu do grupo adenocarcinoma. Houve diferença ainda entre o grupo colunar sem

metaplasia intestinal em relação ao grupo adenocarcinoma (p<0,01).

Figura 3

. Atividade p53 na seqüência epitélio normal - esofagite - colunar s/ e c/ MI -

adenocarcinoma:  p<0,001 G1 entre G2, G3, G4 e G5;  p<0,05 entre G2 e G5; À

p<0,01 entre G3 e G5

37,5

62,5

71,4

100

p53

(%)

Epitélio normal Esofagite Colunar s/ MI Colunar c/ MI ACE

Identificou-se correlação linear positiva entre o aumento da proteína p53 e a

evolução na seqüência epitélio normal–esofagite–colunar sem metaplasia intestinal–

colunar com metaplasia intestinal–adenocarcinoma (p<0,001) (Figura 3).

Figura 4. Correlação p53 e progressão epitélio normal – esofagite – colunar s/ e c/

MI – adenocarcinoma. Coeficiente de Kendall 0,4.

O índice médio de células coradas para o Ki-67 foi de 39±26,7%. As médias

foram de 21,3±19,5% nos pacientes com epitélio escamoso normal; 38,8±24,9% nos

pacientes com esofagite crônica; 37,7±26,3% nos pacientes com epitélio colunar

sem metaplasia intestinal; 52,8±24,6% nos pacientes com epitélio colunar com

metaplasia intestinal e 57,1±25,1% nos pacientes com adenocarcinoma (Figura 4).

Figura 5. Microfotografia da expressão imunohistoquímica do antígeno Ki-67

(MIB-1) – setas: Esofagite (A), Epitélio colunar sem metaplasia intestinal (B),

(x 100); Epitélio colunar com metaplasia intestinal (C) e adenocarcinoma (D),

(x 200). O escore Ki-67 representa a porcentagem de núcleos corados em

cada campo analisado.

37,5

62,5

71,4

Epitélio Normal Esofagite Colunar s/ MI Colunar c/ MI ACE

Imunorreatividade p53 (%)

21,3

38,8

37,7

52,8

57,1

100

Ki-67(%

)

Esofagite

Colunar s/ MI

Epitélio Normal

Colunar c/ MI

ACE

Houve diferença significativa no índice do Ki-67 entre o grupo epitélio

escamoso normal e os demais grupos (p<0,001). O grupo esofagite crônica

diferiu de todos os outros exceto do grupo colunar sem metaplasia intestinal

(p=1,000). Não houve diferença significativa entre o grupo colunar sem

metaplasia intestinal e o grupo colunar com metaplasia intestinal (p=0,096), o

qual também não diferiu dos pacientes com adenocarcinomas (p=0,948). Houve

diferença significativa no índice do Ki-67 entre os pacientes com adenocarcinoma

e aqueles com epitélio colunar sem metaplasia intestinal (p<0,05) conforme

Figura 5.

Figura 6. Atividade Ki-67 na seqüência epitélio normal – esofagite –

colunar s/ e c/ MI – adenocarcinoma.  p<0,001 G1 entre G2, G3, G4 e

G5; p<0,05 G2 entre G4 e G5; ¥ p<0,05 entre G3 e G5

Identificou-se uma correlação linear positiva entre o aumento do Ki-67 e a

evolução na seqüência epitélio normal – esofagite – colunar sem metaplasia

intestinal – colunar com metaplasia intestinal – adenocarcinoma (p<0,05) (Figura 6).

Figura 7. Correlação entre Ki-67 e progressão epitélio normal – esofagite – colunar s/ e c/ MI

– adenocarcinoma. Coeficiente de Pearson = 0,4.

DISCUSSÃO

A doença do refluxo gastroesofágico representa o fator de risco mais

importante e específico da carcinogênese do esôfago, especialmente relacionado ao

adenocarcinoma de esôfago (35). A correlação inflamação-carcinoma tem sido

estudada através da mensuração da elevação do índice de proliferação celular e da

alteração na função dos genes que controlam o ciclo celular, como o gene supressor

tumoral p53 (19;23;36;37). Com os recentes avanços na biologia molecular, há uma

intensificação dos esforços para caracterizar os eventos moleculares específicos que

ocorrem durante as fases da doença do refluxo gastroesofágico.

Método

A técnica escolhida, para analisar as amostras da mucosa esofágica, foi o

estudo imunohistoquímico. Este método vem sendo empregado na investigação de

inúmeros genes, por exemplo no estudo do papel do gene supressor tumoral Tp53 e

do antígeno nuclear Ki-67, na carcinogênese gastrointestinal (20;21;38-40). Em

condições normais, o gene Tp53 gera uma proteína com meia-vida curta (p53

normal), sendo indetectável por estudo imunohistoquímico. Na presença de

21,3

38,8

37,7

52,8

57,1

Epitélio

Normal

Esofagite Colunar s/ MI Colunar c/ MI ACE

Ïndice Ki-67 (%)

mutação, o gene Tp53 alterado produz uma proteína mais estável, com

prolongamento da meia-vida por até 6 horas, e o acúmulo intra-nuclear torna

possível sua identificação pelo método imunohistoquímico (19;22;34;38). As

principais razões para o emprego do método imunohistoquímico decorre da sua

praticidade, disponibilidade e possibilidade de comparação dos resultados com

outras técnicas como a citometria de fluxo (36). Entretanto, a utilização da

imunohistoquímica deve ser vista com cautela, uma vez que a ausência de

expressão da proteína p53 não, necessariamente, exclui a existência de mutações.

Além disso, alguns tipos de vírus (adenovírus, papilomavírus) podem causar

alterações na estabilidade da proteína p53, permitindo que ela possa ser detectada

pela imunohistoquímica determinando resultados falso-positivos (20;22). Para alguns

autores, uma outra limitação importante da técnica é a dificuldade de reproduzir a

avaliação entre diferentes patologistas (27), fato que não foi observado na presente

casuística, onde a concordância entre os patologistas foi elevada (valor

kappa=0,66).

A técnica de citometria de fluxo permite a análise de grandes números de

células, sendo utilizada para avaliar a proliferação celular (Ki-67) e as mudanças no

conteúdo do DNA. Os resultados desse método não mostraram diferenças

significativas na contagem total do Ki-67, quando da estratificação dos pacientes em

esôfago de Barrett com e sem displasia e adenocarcinoma (46;47). Além disso, a

técnica de citometria de fluxo tem outras limitações, como a necessidade de uso de

amostras de tecido fresco, o comprometimento da arquitetura tecidual não sendo por

isso capaz de distinguir as zonas individuais, e necessita de equipamento

dispendioso e mão-de-obra especializada por ser uma técnica de execução

trabalhosa (36;48). Neste estudo, a expressão imunohistoquímica da proliferação

celular foi avaliada pela utilização do anticorpo monoclonal MIB-1, capaz de detectar

o antígeno Ki-67 em tecidos fixados em formalina e incluso na parafina.

As amostras teciduais da mucosa esofágica foram obtidas através de

endoscopia digestiva, com o auxílio de pinça fórceps com estilete central. Como

relatado por Nishiyama et al (43), utilizou-se a pinça fórceps com estilete central, que

permite uma maior precisão na realização da biópsia com menor viés de

amostragem. Além disso, obteve-se uma maior quantidade de tecido com inclusão

da lâmina própria, sem que houvesse maiores complicações, como sangramento.

A cromoscopia com Solução de Lugol tem sido utilizada por muitos

pesquisadores como um método auxiliar no diagnóstico endoscópico de lesões que,

potencialmente, podem passar despercebidas no exame endoscópico convencional,

especialmente, na população com maior risco de apresentar câncer esofágico

(49;50). É um método fácil, de baixo custo, que não determina grande aumento de

tempo na realização do exame, podendo ser empregado de rotina nos serviços de

endoscopia digestiva. A Solução de Lugol reage com os constituintes da célula

escamosa e define, com precisão, a presença e o limite distal do epitélio escamoso,

melhorando a avaliação visual das características da linha Z no esôfago. Todos

esses aspectos fizeram com que se definisse por utilizar, rotineiramente, esse

corante em todos os pacientes do estudo.

Resultados

O desenvolvimento do adenocarcinoma esofágico está associado ao

acúmulo progressivo de anormalidades genéticas que envolvem diversos oncogenes

e genes supressores tumorais. De acordo com a teoria de Nowell, tal processo

pressupõe o aparecimento precoce da instabilidade genômica, seguida da expansão

clonal de células geneticamente alteradas (14). Pouco se sabe sobre as alterações

moleculares que ocorrem no esôfago de Barrett; provavelmente, a perda da função

do gene Tp53, associada ao aumento da proliferação celular, tenha importante papel

na seqüência metaplasia-displasia-adenocarcinoma (18;27).

A vigilância endoscópica nos pacientes com esôfago de Barrett, para

detectar alterações displásicas, é a estratégia atual para prever o risco de

progressão para o adenocarcinoma de esôfago (8;18). A displasia é considerada a

expressão histológica do dano ao DNA celular, que precede a transformação

maligna. Infelizmente, os dados da literatura indicam que a displasia é um marcador

imperfeito do risco de câncer, especialmente o relacionado ao esôfago de Barrett,

por várias razões, entre as quais a variação intra e interobservador, na interpretação

das alterações displásicas, e o baixo valor preditivo na evolução da displasia

(progressão, persistência ou regressão) (8;22;42). Portanto, a busca por novos

marcadores biológicos e o melhor entendimento da patogênese da doença do

refluxo gastroesofágico podem auxiliar na identificação dos pacientes com risco

aumentado de transformação maligna. No presente estudo, procurou-se analisar a

expressão da proteína p53 e o índice de proliferação celular Ki-67 (MIB-1), ao longo

da seqüência mucosa escamosa – esofagite crônica – epitélio colunar sem

metaplasia intestinal – epitélio colunar com metaplasia intestinal – adenocarcinoma.

A análise imunohistoquímica da expressão da proteína p53, no presente

estudo, identificou uma positividade nos grupos epitélio normal, esofagite crônica,

epitélio colunar sem metaplasia intestinal, epitélio colunar com metaplasia intestinal

e adenocarcinoma de 7%, 37,5%, 30%, 62,5% e 71,4%, respectivamente. Tais

resultados demonstraram haver uma correlação linear da positividade da proteína

p53 ao longo dos eventos que envolvem pacientes sem alteração epitelial, pacientes

com processo inflamatório na mucosa escamosa, pacientes portadores de mucosa

colunar com e sem metaplasia intestinal e pacientes com câncer. Um aspecto a ser

salientado é o número expressivo de pacientes na amostra estudada e o alto índice

de significância estatística demonstrado pelo teste qui-quadrado para tendência

linear (p<0,001). Além disso, observamos que a expressão da proteína p53 se eleva,

significativamente, a partir do surgimento da metaplasia intestinal, ressaltando a

importância desse achado na progressão para o adenocarcinoma de esôfago.

Nosso trabalho identificou 7% de positividade para a proteína p53 nos

pacientes histologicamente normais. Neste grupo a distribuição da imunorreatividade

ficou restrita à camada basal do epitélio escamoso e a maioria dos casos

apresentaram fraca intensidade de coloração ao microscópio óptico. De forma

semelhante, Krishnadath et al (18) estudaram a expressão imunohistoquímica da

proteína p53 (DO-7) em mucosa normal, e detectaram fraca coloração nuclear na

camada basal, em 24 amostras de mucosa esofágica utilizadas como grupo controle.

A positividade da proteína p53 de 62,5% nos pacientes com epitélio colunar

com metaplasia intestinal, e de 71,4% entre aqueles com adenocarcinoma

corroboram os resultados obtidos por Casson et al (51), que identificaram uma

expressão alterada da proteína p53 em 50% dos pacientes com metaplasia intestinal

sem displasia; enquanto Krishnadath et al (18) observaram imunorreatividade para a

proteína p53 em até 83% dos pacientes com adenocarcinoma de esôfago. Segal et

al (52) estudaram a expressão da proteína p53 pelo método imunohistoquímico (DO-

7) e análise molecular do gene Tp53 (PCR) em 68 pacientes com diagnóstico de

esofagite crônica (27 pacientes), esôfago de Barrett (21 pacientes) e Metaplasia

Intestinal da Cárdia (20 pacientes). Identificaram positividade total da proteína p53

em 56,1%. Nos pacientes com esôfago de Barrett e Metaplasia Intestinal da Cárdia a

positividade foi de 60,9% e 39,1%, respectivamente. Embora tenham ressaltado as

limitações do método imunohistoquímico na interpretação da imunorreatividade da

proteína p53, os autores concluíram que a expressão aumentada da proteína p53 é

comum nos pacientes com esôfago de Barrett e Metaplasia Intestinal da Cárdia.

Ramel et al (36), estudaram a expressão imunohistoquímica da proteína p53

nas etapas de progressão do esôfago de Barrett, e detectaram positividade da

proteína p53 em 5% dos pacientes com esôfago de Barrett sem displasia, 15% na

displasia de baixo grau, 45% na displasia de alto grau e 53% no adenocarcinoma.

Kim et al (53) analisaram, juntamente com o PCNA e c-erB-2, a expressão

da proteína p53 em 43 peças de esofagectomia por adenocarcinoma ou displasia de

alto grau. Identificaram 36% de positividade da p53 em áreas de esôfago de Barrett

sem displasia, 30% na displasia de baixo grau, 85% na displasia de alto grau e 90%

no adenocarcinoma de esôfago. Esses autores concluíram que a expressão

aumentada da proteína p53 é um evento relativamente precoce na carcinogênese do

esôfago de Barrett, e relacionada ao aumento da proliferação celular avaliada pelo

PCNA.

Rice et al (54) estudaram a expressão da proteína p53 em 28 peças de

esofagectomia e não detectaram imunorreatividade para a proteína p53 nos

pacientes com esôfago de Barrett sem ou com displasia de baixo grau. Os estudos

que não identificaram imunorreatividade da proteína p53 nestes pacientes, podem

ter seus resultados explicados pela utilização de diferentes metodologias no

emprego da técnica de imunohistoquímica, como diluição do anticorpo, tempo de

permanência na parafina e interpretação da intensidade da coloração nuclear

(5;54;55). Tal circunstancia pode gerar uma variabilidade metodológica que interfira

na comparação dos resultados.

Weston et al (34) estudaram a expressão da proteína p53 através do método

imunohistoquímico, em 48 pacientes com esôfago de Barrett e displasia de baixo

grau durante 81 meses de vigilância endoscópica. Demonstraram que o número de

pacientes p53 positivos foi significativamente maior nos casos com displasia

persistente (25%) e progressiva (60%) em relação aos pacientes que regrediram

(13%). Constataram também que a porcentagem de células positivas na mucosa

glandular, ao redor de áreas displásicas, foi fator preditivo na progressão do esôfago

de Barrett para displasia de alto grau e adenocarcinoma. Alguns questionamentos

sobre esse estudo são a utilização de um pequeno número de casos em cada grupo

analisado e o fato de não ter aferido a positividade da proteína p53 em um grupo

controle. Esses dados são coincidentes aos relatados por Younes et al (22) que

também demonstraram a importância da imunorreatividade da proteína p53, na

evolução das alterações histológicas, em pacientes com esôfago de Barrett.

A expressão alterada do gene supressor tumoral Tp53 ocorre em uma ampla

variedade de tumores humanos (20;38;41). A sua freqüente associação com um

prognóstico reservado destas neoplasias indica o papel importante desse gene, na

progressão tumoral (22;42). O elevado índice de positividade na expressão da

proteína p53 encontrado nas amostras com adenocarcinoma (71,4%), no presente

estudo, sugere que a expressão alterada desse gene seja um evento, entre outros,

importante no desenvolvimento do câncer esofágico. Nosso estudo também

demonstrou um percentual de positividade da proteína p53 semelhante entre os

grupos esofagite crônica e mucosa colunar sem metaplasia intestinal de 37,5% e

30%, respectivamente (p>0,05). Talvez a ação do refluxo tenha papel importante na

positividade desse marcador biológico nos pacientes analisados. Diversas alterações

inflamatórias, como a esofagite em áreas adjacentes a tumores, esofagite por

acalasia e esofagite por refluxo gastroesofágico, estão intimamente relacionadas ao

processo de carcinogênese esofágica, o que pode alterar a função das proteínas

reguladoras do ciclo celular, entre elas a proteína p53 (38;50). Até o momento,

poucos trabalhos analisaram a imunorreatividade da proteína p53, na mucosa

escamosa complicada por processo inflamatório, especialmente, relacionado ao

refluxo gastroesofágico. Fagundes et al (50) conduziram um estudo prospectivo com

o objetivo de estabelecer a imunorreatividade da proteína p53, em um protocolo

rigoroso de biópsias esofágicas seriadas, em pacientes com alto risco para

carcinoma epidermóide do esôfago. Demonstraram um aumento progressivo da

expressão imunohistoquímica da proteína p53 em pacientes com esofagite crônica,

displasia e câncer esofágico.

Nos pacientes com mucosa colunar sem metaplasia intestinal, a prevalência

da imunorreatividade da proteína p53 foi de 30%, enquanto no epitélio colunar com

metaplasia intestinal foi de 62,5%. Embora não tenha havido significância estatística

entre esses dois grupos, fica evidente que a imunorreatividade da proteína p53

esteve fortemente associada ao processo de intestinalização da mucosa metaplásica

no esôfago distal. O desenvolvimento da mucosa colunar no esôfago distal é uma

condição benigna, que adquire potencial de transformação maligna com o

surgimento da metaplasia intestinal (56). O mecanismo molecular específico que

induz a tal mudança é desconhecido. A mucosa colunar no esôfago distal é o

primeiro passo na seqüência mucosa colunar-Barrett-adenocarcinoma, e muitos

trabalhos publicados nos últimos dez anos demonstraram que o controle adequado

do refluxo gastroesofágico pode associar-se com a regressão histológica do esôfago

de Barrett (56;57;58). Gurski et al (59) demonstraram que a cirurgia anti-refluxo foi

fator preditivo importante para a regressão histológica em pacientes com esôfago de

Barrett. A regressão histológica ocorreu em 36% dos pacientes operados. Carlson et

al (60) avaliaram a importância da imunorreatividade da proteína p53, em biópsias

endoscópicas, na evolução de pacientes com esôfago de Barrett sob terapia

supressora ácida. Os autores concluíram que o acúmulo da proteína p53 foi um

marcador de progressão neoplásica, mesmo na vigência do tratamento clínico. Os

achados evidenciaram que os pacientes p53 positivos progrediram para maiores

graus de displasia ou ploidia do DNA, e que a instalação precoce da anormalidade

genética do gene Tp53 não modificou a evolução neoplásica dos pacientes com

esôfago de Barrett, sob terapia ácida supressora. Portanto, a identificação de

pacientes com esôfago de Barrett e maior chance de progressão histológica é

campo promissor para pesquisas futuras.

O alto índice de positividade da proteína p53, identificado neste estudo,

entre os pacientes com epitélio colunar com metaplasia intestinal (62,5%), e o risco

relativamente baixo de progressão dessa lesão precursora para o adenocarcinoma

de esôfago (0,5 a 2%), sugere que, embora necessário para o desenvolvimento

dessa neoplasia, o gene supressor tumoral Tp53, por si só, não seria suficiente para

a progressão tumoral. Possivelmente, outros fatores mediadores do processo de

proliferação celular e de apoptose, como o bcl-2 e o c-Myc, atuariam sobre as

células com alterações moleculares, impedindo a sua transformação neoplásica

(19;43;61;62).

O antígeno nuclear Ki-67 é um dos marcadores de atividade proliferativa

mais estudado devido a sua boa representatividade clínico-patológica em diversas

condições clínicas, como as doenças linfoproliferativas, doença do refluxo

gastroesofágico, câncer de cólon, esôfago e próstata (23;27). O Ki-67 está presente

nas células em proliferação e sua positividade aumentada tem sido demonstrada em

carcinomas esofágicos, gástricos, colônicos e retais (44).

Os resultados, no presente estudo, demonstraram que o índice de

proliferação celular (Ki-67) foi significativamente maior, à medida que progrediam as

alterações histológicas. A análise imunohistoquímica do Ki-67 identificou uma

positividade crescente, no epitélio escamoso e glandular, da expressão do antígeno

nuclear, nos grupos epitélio escamoso normal, esofagite crônica, epitélio colunar

sem metaplasia intestinal, epitélio colunar com metaplasia intestinal e

adenocarcinoma de 21,3%, 38,8%, 37,7%, 52,8% e 57,1%, respectivamente.

Feith et al (33) detectaram um índice de proliferação celular de 20,4±6,4%

no epitélio normal do esôfago, 39±11,1% na metaplasia colunar sem displasia, e

60,8±17,9% nos adenocarcinomas. Nossos resultados também mostraram um alto

índice de proliferação pelo Ki-67, na zona proliferativa, dos pacientes com

metaplasia intestinal sem displasia, quando comparado ao grupo epitélio escamoso

normal (p<0,001). Tais achados são concordantes com o trabalho de Hong et al (23),

que analisaram a expansão do Ki-67 pelos compartimentos proliferativos por método

imunohistoquímico com anticorpo monoclonal Ki-67 (MIB-1), e observaram uma

maior taxa de proliferação (33,5%) na zona glandular dos pacientes com esôfago de

Barrett sem displasia. Com esses dados, pode-se também concluir que a distribuição

e o aumento da imunorreatividade pelo Ki-67, nos compartimentos proliferativos,

correlacionam-se com os achados histológicos na seqüência esôfago de Barrett sem

displasia – displasia de baixo grau – displasia de alto grau.

Chen et al (45) estudaram a expressão imunohistoquímica do Ki-67 e COX-2

em 10 pacientes com mucosa escamosa normal, 15 pacientes com esofagite de

refluxo severa e 25 pacientes com esôfago de Barrett. Os autores não encontraram

diferença significativa do índice Ki-67 entre os pacientes com esofagite e esôfago de

Barrett, mas ambos os grupos diferiram estatisticamente dos pacientes com mucosa

escamosa normal.

Quando comparamos em nosso trabalho os grupos esofagite crônica,

mucosa escamosa normal e epitélio colunar com metaplasia intestinal, observamos

diferença significativa entre os mesmos (p<0,01). Além disso, observamos também

que índices elevados da proliferação celular surgiram, principalmente, na presença

da metaplasia intestinal, demonstrando que essa atividade proliferativa está também

relacionada ao processo de intestinalização da mucosa colunar no esôfago distal.

Os achados do presente estudo, nos permitem afirmar que as alterações

moleculares medidas pela expressão da proteína p53 foram progressivamente

maiores, quanto pior a alteração histológica decorrente da DRGE. Paralelamente, as

alterações proliferativas, medidas pela expressão do Ki-67, comportaram-se da

mesma forma, havendo em ambos marcadores uma correlação positiva entre o

aumento de sua expressão e a piora histológica. É possível que os mecanismos de

lesão que produzem o aumento da atividade proliferativa sejam os mesmos que

produzem as alterações moleculares que levam ao câncer.

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ANALYSIS OF P53 PROTEIN AND KI-67 (MIB-1) ANTIGEN EXPRESSION IN THE

ESOPHAGEAL MUCOSA OF PATIENTS IN THE GASTROESOPHAGEAL REFLUX

DISEASE – BARRETT’S ESOPHAGUS – ADENOCARCINOMA

* (pré-artigo em Inglês para ser enviado à Revista Gastroenterology)

Authors:

Marcelo Binato

Renato Borges Fagundes

Luise Meurer

Maria Isabel Edelweiss

Richard Ricachenevsky Gurski

Place:

Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) – General Surgery and Pathology Unit.

Rua Ramiro Barcelos, 2350 – CEP 90035-003. Bairro Rio Branco – Porto Alegre –

RS – Brasil. Fone: (51) 2101.8000.

Correspondence Address:

Marcelo Binato

Rua Francisco Manoel Nº 01/ AP 202 CEP 97015-260

Santa Maria – RS – Brasil. Fone: (55) 32225693

Email: [email protected].br

ABSTRACT

Introduction: Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a main risk factor for the

development of esophageal adenocarcinoma. Many molecular alterations occur in

esophageal carcinogenesis, yet the exact mechanism of adenocarcinoma

development remains unknown.

Objectives: Determine p53 protein and Ki-67 (MIB-1) expression in the esophageal

mucosa of patients with GERD and establish a correlation between these markers

and the normal squamous epithelium – chronic esophagitis – columnar epithelium

with or without intestinal metaplasia – adenocarcinoma sequence.

Methods: The p53 protein and Ki-67 (MIB-1) expression was determined by

immunohistochemical analysis of 235 patients, divided into five groups: G1- 58

patients with normal squamous epithelium, G2: 80 patients with chronic esophagitis,

G3: 30 patients with columnar epithelium without intestinal metaplasia (IM), G4: 32

patients with columnar epithelium with intestinal metaplasia and G5: 35 patients with

adenocarcinoma. The materials used in the study were obtained from endoscopic

biopsy specimens from GERD patients and from patients with esophageal

adenocarcinoma, between January 2003 and December 2006.

Results: p53 protein overexpression was found in 7% in G1, 37.5% in G2, 30% in

G3, 62.5% in G4 and 71.4% in G5 (p<0.001). The increase of the Ki-67 index was

also proportionally higher in accordance with the more severe results of the

histopathological diagnosis, being of 21.3±19.5% in G1, 38.8±24.9% in G2,

37.7±26.3% in G3, 52.8±24.6% in G4 and 57.1±25.1% in G5 (p<0.001). Linear

correlation between the increase of both molecular markers and the evolution of the

squamous epithelium – adenocarcinoma sequence (p<0.001 and p<0.05) was

noticed.

Conclusion: Overexpression of the p53 protein and Ki-67 (MIB-1) index of cell

proliferation were found to be correlated with the evolution of adenocarcinoma in

patients suffering from GERD. Alteration in cell proliferation activity, as assessed by

Ki-67, corresponded to molecular alteration of the p53 gene, which suggests it may

be associated to alterations of this marker.

Keywords: p53. Ki-67 (MIB-1). GERD. Barrett’s esophagus. Adenocarcinoma.

INTRODUCTION

Gastroesophageal reflux is one of the most frequent clinical conditions in

medical practice affecting more than 30% of the adult population (1;2). A nationwide

population-based study estimates that approximately 12% of Brazilian population

suffers from gastroesophageal reflux, not including individuals with atypical

manifestations (3). Endoscopic evaluation of the esophagus in patients with GERD

showed a wide range of findings, such as: esophageal mucosa with no lesions (non-

erosive reflux disease – NERD), erosive disease, Barrett’s esophagus, stenosis and

cancer, specially, adenocarcinoma (4;5).

Experimental studies and clinical essays support the theory according to which

the columnar mucosa in the distal esophagus is a consequence of the exposure of the

squamous epithelium of the esophagus to gastroduodenal contents (6;7). The

importance of the squamous epithelium of the esophagus lies in the fact that it may be

replaced by abnormal intestinal epithelium, leading to the development of intestinal

metaplasia, which characterizes Barrett’s esophagus, and to adenocarcinoma (3).

Therefore, Barrett’s esophagus is defined by the presence of columnar mucosa in the

distal esophagus, visible in upper endoscopy, at any length, with intestinal metaplasia

with caliciform cells (8) when submitted for anatomopathological examination. It is

estimated that 6 to 12% of patients with gastroesophageal reflux symptoms submitted to

endoscopic evaluation suffer from Barrett’s esophagus (9;10).

Around 64 to 86% of esophageal adenocarcinomas arise from columnar epithelium

with intestinal metaplasia, indicating that Barrett’s esophagus is by far the most important

risk factor in the evaluation of patients with gastroesophageal reflux (11;12). Patients with

Barrett’s esophagus, which is a premalignant condition, are at a 0.5 to 2% annual risk of

developing esophageal adenocarcinoma, that is, a risk 30 to 125 times greater than the

general population (13;14). Esophageal adenocarcinoma is rapidly increasing in developed

countries, overcoming the epidermoid carcinoma, and becoming the most common

histological type of esophageal neoplasia in some populations. In spite of therapeutic efforts,

prognosis in most advanced stages of the disease is bad (15-17).

Due to the risk of evolution to adenocarcinoma of patients with Barrett’s

esophagus, early identification of malignant changes is of utmost importance.

Throughout the carcinogenesis process of the esophagus, a series of multiple

genetic alterations causes the epithelial cell to become non-responsive to

proliferation and programmed cell death regulation mechanisms. Thus, the cell

acquires the ability to proliferate uncontrollably, becoming a neoplastic cell (14).

The evolution of Barrett’s esophagus to esophageal adenocarcinoma is often

associated to structural changes of cell DNA (18). Several molecular alterations are

identified in the evolution of squamous epithelium with GERD, to intestinal metaplasia

and finally to adenocarcinoma. The most important alterations include change in the

cell cycle regulation caused by a malfunction of tumor suppressor genes (p53, APC),

oncogenes and cell adhesion molecules (E-cadherin and Catenines) (18).

The Tp53 gene is one of the most studied genes in the evolution of several

neoplasias. Located on the short arm of chromosome17, more precisely in the

17p13.1 region, the Tp53 gene encodes the p53 protein, which aims at delaying the

cell cycle and repairing a cell DNA damage, or even inducing apoptosis and

preventing mutations in subsequent cell lines (19). Deactivation of Tp53 gene may

occur by mutation or interaction with specific oncogenes. The two main molecular

events that change the Tp53 gene during tumor progression are the deletion of one

allele of chromosome 17p and/or mutation of the second one. Allelic losses are

generally associated to mutant forms of Tp53 (19;20).

Mutation of Tp53 gene and p53 protein overexpression are some of the

genetic abnormalities most commonly found on human neoplasias (5;21). These

alterations have been reported in various types of cancer, including colon,

esophagus, stomach, lung, breast, bladder, among others, and in premalignant

conditions such as Barrett’s esophagus (20). Protein p53 protein overexpression

seems to occur early in tumor genesis, is present in the different stages of the

metaplasia-adenocarcinoma sequence, being detected in approximately 50 to 90% of

adenocarcinomas in Barrett’s esophagus (18;20).

Associated to a Tp53 gene malfunction, the increase of cell proliferation may

precede the occurrence of dysplastic lesions in Barrett’s esophagus (19;22;23). Ki-67

is a nuclear protein expressed in all active stages of the cell cycle (G1, S, G2 e M),

but absent in G0 stage – cell rest (24;25), being used as a proliferation marker in a

variety of neoplasias (26-28). The exact function of Ki-67 antigen is not well known

and it is suggested it may play a significant role in cell cycle regulation. (29). The

mechanisms and interactions of the p53 protein expression with the increase of the

(Ki-67) index of cell proliferation in esophageal carcinogenesis are still being studied.

It is of utmost importance the identification of easily accessible and low-cost tumor

markers, which can be used in a wide variety of clinical and pathological situations

and allow the selection of subgroups of Barrett’s esophagus patients with a molecular

profile that indicates they are more prone to develop dysplasia and/or cancer. The

present study aims at evaluating the immunohistochemical expression of the p53

protein and the proliferation index by Ki-67 (MIB-1) in the esophageal mucosa in

individuals who present all characteristics of gastroesophageal reflux disease:

esophageal mucosa with and without esophagitis, columnar mucosa with and without

intestinal metaplasia and esophageal adenocarcinoma.

MATERIALS AND METHODS

Study Population

Patients aged 30 or over, referred to the Digestive Endoscopy Unit of the

Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM), between January 2003 and

December 2006, with typical symptoms of gastroesophageal reflux such as pyrosis

and/or regurgitation (at least once a week for a minimum five years) and patients with

esophageal adenocarcinoma diagnosed by endoscopy and biopsy were

prospectively and consecutively examined. Patients with esophageal

adenocarcinoma from the Esophageal, Stomach and Small Intestine Surgery Group

at Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) with the same diagnosis were also

included. Exclusion criteria were as follows: coagulopathy, esophageal stenosis,

esophageal varices, hepatopathy, digestive hemorrhage at least over the last 30

days, esophageal epidermoid cancer, previous radiotherapy or chemotherapy

treatment, hypersensitiveness to iodine, use of acid suppressor therapy over the last

60 days, esophageal or stomach surgery.

Prior to endoscopic examination, a free and informed consent was obtained

from every patient. Also, a questionnaire was completed to help define the

demographic and clinical characteristics of the patients (annexes 1 and 2).

Upper Gastrointestinal Endoscopy

A Fujinon 2200 endoscope, inserted by means of a conventional technique,

was used for inspection of the esophagus, stomach and duodenum. With the

endoscope placed near Z line, chromoscopy was performed with a 3% lugol solution,

with the purpose of highlighting the anatomical markers and esophageal mucosal

lesions. The main anatomical markers, the alterations in the esophageal mucosa

such as erosions, ulcers and surrounding areas of columnar mucosa and the biopsy

areas were recorded in a chart of the esophagus (annex 3). The parameter used to

evaluate the size of mucosal lesions was the open biopsy forceps (7 millimeters).

Endoscopic definitions

The detachment of the diaphragm corresponded to the endoscopic impression

of the diaphragm muscle. Z line defined the squamous-columnar junction, while the

gastro-esophageal junction was defined by the proximal margin of the gastric folds. The

size of the hiatus hernia was defined by the distance of Z line to diaphragmatic

detachment. The endoscopic graduation of erosive esophagitis was defined by the Los

Angeles classification (3). The endoscopic characteristic of the esophagus covered by

columnar mucosa was defined by the presence of “salmon color” or “red rosy color”

similar to the gastric mucosa, covering the proximal portion of the gastro-esophageal

junction. The length of the columnar mucosa was determined by the distance between

the proximal and distal margin of the lesion in relation to the incisors (upper dental arch).

Biopsy

Tissue samples were obtained with the help of a forceps with a central stylet.

After chromoscopy with lugol solution at least two mucosal fragments were collected,

from the more distal point of the lesion to the proximal direction. Depending on the

endoscopic finding the fragments were collected two centimeters above the

squamous-columnar junction without lesion, at the erosion site or unstained area,

and at intervals of 1 to 2 centimeters, in the four quadrants, if the columnar mucosa is

visible above the gastro-esophageal junction, according to Seattle protocol. Tissue

samples were fixed in 10% formalin solution and embedded in paraffin.

Histological diagnosis criteria

Cuts of sections of the paraffin blocks were stained with Hematoxylin-Eosin

(H&E) and Alcian-blue pH 2.5 methods for later analysis in optical microscope by two

pathologists of the HCPA Pathology Unit.

The histological findings were classified as follows: normal squamous

epithelium, presence of basal layer cells reaching more than 15% of the total epithelial

layer, elongation of papillae up to 2/3 of the total epithelial layer, exocitosis (presence of

neutrophils and/or eosinophils and/or intraepithelial monocytes), vascular ectasia or

extravasation (dilation of venules of the papillae with congestion or extravasation of

blood cells into the surrounding epithelium). The histopathological diagnosis of

esophagitis was supported by the presence of one or more findings reported above,

according to a previous description (30).

The columnar epithelium in the distal esophagus was classified according to the

absence of intestinal metaplasia. Barrett’s esophagus was defined by the presence of

columnar epithelium with caliciform cells (typical villiform pattern), stained with

Hematoxylin-Eosin and for the presence of reactivity with Alcian-blue staining. The

diagnosis of adenocarcinoma was established by the presence of atypical glands with

significant loss of the normal structure, with isolated cells or groups of cells invading the

slide itself and the submucosal layer. According to a method established by Cameron et al

(16), which used the distance between the core of the tumoral lesion and the squamous-

columnar junction to classify adenocarcinomas of the esophagus and cardia, and

according to a classification proposed by Siewert (31), patients with adenocarcinoma

examined in the present study were classified into three types. Tumors with cores located

more than two centimeters above the squamous-columnar junction were classified as

adenocarcinoma of the esophagus (Siewert’s Type I). Tumors located up to two

centimeters from the squamous-columnar junction, cranial or caudally, were considered to

be an adenocarcinoma of the JEG (Siewert’s Type II). Tumors located below this level

were called subcardial gastric carcinomas (Siewert’s Type III). The study included types I

and II tumors. Type III tumors were excluded from the analysis because their origin may

be other than adenocarcinoma of the esophagus or adenocarcinoma of the JEG (17).

Immunohistochemical analysis

The immunohistochemical study was conducted in the Immunohistochemistry

Laboratory of the Department of Pathology of the Universidade Federal de Santa Maria

(UFSM). 3-micrometer sections were cut from each designed tissue block for histological

analysis. For immunohistochemical analysis two poly-L-lysine coated glass microscope

slides were used, embedded in paraffin, one slide for p53 antibody and the other one for

the Ki-67 (MIB-1). For the determination of the positive reactivity of the referred antibodies,

the ABC method was used (avidin-biotin-peroxidase complex, ExtrAvidin Sigma). Sections

were deparaffinized by immersion in xylol and dehydrated in alcohol, at different

concentrations, and under room temperature (ATA). After deactivation of endogenous

peroxidase and blockage of non-specific reactions, antigen recovery was performed in a

microwave oven.

The primary antibody p53 (DAKO, code M7001 mouse anti-p53; clones DO-

7), was incubated for 15 hours, at 4

C, in the dilution 1:700. The antibody recognizes

the wild-type and the mutant form of p53 protein. However, due to the extremely

short duration of the wild -type, staining in the core of the tumor cell suggests

abnormal accumulation of p53 protein. The primary antibody Ki-67 (DAKO, code

MU2970397 mouse anti Ki-67; clones MIB-1) was incubated for 15 hours, at 4

C, in

the dilution 1:400. The streptavidine-biotin complex was used to locate the primary

antibody in both markers, whereas the diaminobenzidine-tetrahydrochloride was

used as chromogen. Counterstaining was performed with the use of Hematoxylin-

Haans. Material from breast cancer for the p53 protein and from caecal appendix for

the Ki-67 protein was used as positive control. As negative control a slide was used

without the inclusion of the primary antibody.

The evaluation of the p53 protein considered the proportion of stained cells in

a minimum 10 visual fields of high magnification (400X). The parameter used to

define the p53 protein expression was the presence of staining in the core as shown

by Wang et al (32). The positive cases were those with more than 10% of stained

cells by microscopic field of high magnification.

Concerning the Ki-67 (MIB-1) antigen, the result was assessed with the use

of the Ki-67 index for every case, which is calculated from the average of stained

cells and the total analyzed cells, with a minimum count of 500 cells, as previously

described by Feith et al (33).

Immunohistochemical reading of the slides was independently performed by two

pathologists from the Department of Pathology of the HCPA, with experience in

gastrointestinal pathology, who had no previous knowledge of related clinical and

endoscopically information. In case of disagreement, the final result was obtained by

consensus between both pathologists, as described by Weston et al (34).

Sample Calculation

The formula for comparison of sample proportions was used here. For alpha=

0.05 and 90% power, an approximate sample of 210 patients was calculated, to make it

possible to obtain a difference of 10 to 45% of p53 positive and a modified Ki-67 in the

several groups (degrees of esophagitis and specialized intestinal metaplasia).

Statistical Analysis

The Statistical Package for Social Science (SSPS) 12.0 version was used for

data processing and storage. The statistical test used for comparative analysis of the

p53 protein between the groups was the chi-square test of linear trend. The Ki-67

data was shown in averages and standard deviations. The continuous variables were

compared between categories of the variance analysis (ANOVA). The identification of

differences, whenever present, was made by the Tukey test. Linear correlation of p53

and Ki-67 variables with their respective groups were analyzed by the Kendall and

Pearson correlation coefficient, respectively. It was considered to be significant when

p<0.05. Kappa test was used to control interobserver agreement.

Ethical considerations

The Project of the present study was previously evaluated and approved by the

Group of Research and Post graduation (GPPG) of the HCPA, according to all

recommended ethical norms. Patients were submitted to upper endoscopy and received

the care of the Inpatient Gastroenterology Unit of the HUSM. All patients gave their free

and informed consent by signing the Informed Consent form (TCLE), with privacy of the

collected data being ensured. For patients with adenocarcinoma of the esophagus from

the HCPA the material used was obtained from the HCPA’s Pathology Unit, without the

direct participation of patients. Also, there was no change in the protocol of treatment

following the research. The clinical data used in this study, collected from records of

patients of this group, was made anonymous and kept secret, according to the Term of

Commitment to Data Use The study was conducted in compliance with the norms

established under the resolution 196/96 of the Brazilian Medical Council and approved

by the UFSM Research Ethics Committee and the GPPG/HCPA.

RESULTS

From January 2003 to December 2006, 511 patients who met the selected criteria

were examined. Of this total, were excluded 262 patients that did not follow the biopsy

protocol proposed the study (table 1 ), and also 15 losses of which, 9 cases for diagnosis

histological not conclusive and 6 cases for difficulty in evaluation marked by the technical

imunohistoquímica.

Tabela 1 . Excluded situations before upper gastrointestinal endoscopy

À Coagulopathy (13)

À Use Anticoagulants or AINES (23)

À Radiotherapy or chemotherapy (17)

À Gastro-esophageal varices (10)

À Refusal of the patient (6)

À Barrett’s esophagus diagnosed (21)

À Digestive hemorrhage (9)

À Hepatopathy (7)

À Associate Neoplasia (24)

À Hypersensitiveness to iodine (4)

À Use of acid suppressor therapy (92)

À Esophageal or stomach surgery (18)

À Adenocarcinoma Siewert’s type III (17)

235 patients were included and divided into five groups according to the

anatomopathological examination of esophageal samples, as follows: 58 patients with

normal squamous epithelium (group 1), 80 patients with chronic esophagitis (group 2), 30

patients with columnar epithelium without intestinal metaplasia (group 3), 32 patients with

columnar epithelium with intestinal 235 patients were selected and divided into five groups

according to the anatomopathological examination of esophageal samples, as follows: 58

patients with normal squamous epithelium (group 1), 80 patients with chronic esophagitis

(group 2), 30 patients with columnar epithelium without intestinal metaplasia (group 3), 32

patients with columnar epithelium with intestinal metaplasia (group 4) and 35 patients with

adenocarcinoma of the esophagus (group 5).

The demographic characteristics of the 235 patients are shown in Table 1. Most

patients in group 1 were females compared to the other groups (p<0.05). The average

age was higher in the adenocarcinoma group compared to the other groups (p<0.05),

except for patients with metaplastic columnar mucosa. There was no significant

difference between the groups concerning race.

Table 2. Demographic characteristics of patients.

Group 1

(normal)

n=58

Group 2

(esophagitis)

n=80

Group 3

(columnar)

n=30

Group 4

(columnar IM)

N=32

Group 5

(ACE)

n=35

Total

n=235

Value p

Age

(average±DP)

50.4±13,8 53.4±15.2 54.2±16.8 58.2±12.6 64±8.6 55±14.5

0.041

Sex (%)

<0.05

Male 13 (22.4) 42 (52.5) 17 (56.7) 21 (65,6) 30 (85,7) 123 (52,3)

Female 45(77.6)∞ 38 (47.5) 13 (43.3) 11 (24.4) 5 (14.3) 112 (47,7)

Race

0,503

Caucasian 55 (95) 72 (90) 25 (83.3) 28 (87.5) 32 (91.4) 212 (90,2)

Black/Mixed 3 (5) 8 (10) 5 (16.7) 4 (12.5) 3 (8.6) 23 (9.8)

∞ G1 is different from the other groups (p<0.05)

Concerning the p53 protein expression, 4 (7%) patients with normal epithelium

showed positive reactivity for p53 protein. 30 (37.5%) out of the 80 patients with chronic

esophagitis were positive. p53 protein was positive in 9 (30%) out of the 30 patients with

columnar epithelium without intestinal metaplasia and 20 (62.5%) out of the 32 patients with

columnar epithelium with intestinal metaplasia. 25 (71.4%) patients, out of the 35 patients

with adenocarcinoma diagnosis were found to be positive for the p53 protein (Figure 1).

Figure 1. Micro photography of the immunohistochemical expression of the

p53 protein (arrows): Esophagitis (A), Columnar epithelium without

intestinal metaplasia (B), (x 100); Columnar epithelium with intestinal

metaplasia (C) and Adenocarcinoma (D), (x 200).

The comparative analysis of positive reactivity of the immunohistochemical

expression of the p53 protein showed a statistically significant difference between all

groups in relation to the normal epithelium group (Figure 2). The esophagitis group

also differed from the adenocarcinoma group. Differences were also found between

the group with columnar epithelium without intestinal metaplasia and the

adenocarcinoma group (p<0.01).

Figure 2. p53 activity in the normal epithelium- esophagitis – columnar without and with IM

– adenocarcinoma sequence:  p<0,001 G1 between G2, G3, G4 and G5;  p<0.05 between

G2 and G5; À p<0.01 between G3 and G5.

A positive correlation between p53 protein increase and the evolution of the

normal epithelium – esophagitis – columnar without intestinal metaplasia – columnar

with intestinal metaplasia adenocarcinoma sequence (p<0.001) (Figure 3).

Figure 3. Correlation p53 and evolution normal epithelium – esophagitis –

columnar without and with intestinal metaplasia/IM – adenocarcinoma and 0.4

Kendall Coefficient.

37,5

62,5

71,4

100

p53

(%)

Normal epithelium Esophagitis Columnar Columnar IM

37,5

62,5

71,4

Normal

epithelium

Esophagitis Columnar

without IM

Columnar

with IM

ACE

Immunoreactivity p53 (%)

The average index of stained cells for the Ki-67 was 39±26.7%. The averages

were 21.3±19.5% in patients with normal squamous epithelium, 38.8±24.9% in patients

with chronic esophagitis 37.7±26.3% in patients with columnar epithelium without

intestinal metaplasia, 52.8±24.6% in patients with columnar epithelium with intestinal

metaplasia and 57.1±25.1% in patients with adenocarcinoma (Figure 4).

There was a significant difference in the Ki-67 index between the normal

squamous epithelium group and the other groups (p<0.001). The chronic esophagitis

group differed from all other groups except the columnar epithelium without intestinal

metaplasia group (p=1.000). No significant difference was found between the

columnar epithelium without intestinal (p=0.096), which did not differ either from the

patients with adenocarcinomas (p=0.948). There was a significant difference in the

Ki-67 index between patients with adenocarcinoma and those with columnar

epithelium without intestinal metaplasia (p<0.05) according to Figure 5.

Figure 4 Microphotography of the immunohistochemical expression of Ki-67

(MIB-1) antigen – arrows: Esophagitis (A), columnar epithelium without

intestinal metaplasia (B), (x 100); columnar epithelium with intestinal

metaplasia (C) and adenocarcinoma (D), (x 200). The Ki-67 score represents

a percent of stained cores in every field analyzed.

21,3

38,8

37,7

52,8

57,1

100

Ki-67(%

)

Esophagitis

Columnar Normal e

ithelium Columnar IM ACE

21,3

38,8

37,7

52,8

57,1

100

Ki-67(%

)

Figure 5. Ki-67 activity in the normal epithelium- esophagitis – columnar

epithelium without and with IM – adenocarcinoma sequence:  p<0.001 G1

between G2, G3, G4 and G5;  p<0.05 G2 between G4 and G5; ¥ p<0.05

between G3 and G5

A positive correlation was identified between the increase of Ki-67 and the

evolution normal epithelium – esophagitis – columnar without intestinal metaplasia –

columnar with intestinal metaplasia – adenocarcinoma sequence (p<0.05) (Figure 6).

Figure 6. Correlation between Ki-67 and evolution normal epithelium- esophagitis

– columnar epithelium without and with IM – adenocarcinoma. Pearson’s

Coefficient = 0.4.

21,3

38,8

37,7

52,8

57,1

Normal

epithelium

Esophagitis Columnar

without IM

Columnar with

ACE

Index Ki-67 (%)

DISCUSSION

The gastroesophageal reflux disease constitutes the most important and

specific risk factor for carcinogenesis of the esophagus, particularly the

adenocarcinoma of the esophagus (35). The inflammation-carcinoma correlation has

been studied through the measurement of increase and the alteration in the function

of genes that control the cell cycle, such as the p53 tumor suppressor gene

(19;23;36;37). Recent advances in molecular biology have encouraged efforts to

characterize specific molecular events occurring during the stages of the

gastroesophageal reflux disease.

Method

The technique chosen to analyze samples of the esophageal mucosa was

the immunohistochemical study. This method has been used in the investigation of

various genes, including the study of the Tp53 tumor suppressor gene and the Ki-67

nuclear antigen in gastrointestinal carcinogenesis (20;21;38-40). Under normal

conditions, the Tp53 gene generates a short-lived protein (p53 normal), which cannot

be detected by the immunohistochemical method. In case of mutation, the altered

Tp53 gene produces a more stable protein which extends the short life by 6 hours,

and the intra-nuclear accumulation makes it possible its identification by the

immunohistochemical method (19;22;34;38). The main reasons for the use of the

immunohistochemical method include its practicability, availability and the possibility

of comparing results with other techniques such as flow cytometry (36). However, the

use of immunohistochemistry should be carefully considered once the absence of the

p53 protein expression does not necessarily exclude the existence of mutations.

Besides, some types of viruses (adenoviruses and papillomaviruses) may cause

alterations in p53 protein stability, allowing its detection by immunohistochemistry

and determining false positive results (20;22). For some authors, another significant

limitation of this technique is the difficulty in reproducing the evaluation results in

order to obtain the agreement of different pathologists (27). In the present study,

however, there was a high level of agreement between pathologists (kappa

value=0.66).

The flow cytometry technique allows the analysis of a large number of cells,

being used to assess cell proliferation (Ki-67) and the changes in DNA contents. The

results of this method did not show significant differences in the total Ki-67 count

considering the stratification of patients in Barrett’s esophagus with and without

dysplasia and adenocarcinoma (46;47). Also, the flow cytometry technique has other

limitations such as the need of fresh tissue samples, tissue architecture compromise,

and the fact that it requires expensive equipment and skilled labor since it is a more

sophisticated technique (36;48). In the present study, the immunohistochemical

expression of cell proliferation was assessed by the use of the monoclonal MIB-1

antibody which is capable to detect the Ki-67 antigen in tissues fixed in formalin and

embedded in paraffin.

The tissue samples of the esophageal mucosa studied here were obtained

from digestive endoscopy performed with the help of a forceps with a central stylet.

Like Nishiyama et al (43), we have used the forceps with a central stylet that allows a

more accurate biopsy, with a less unbiased sample. Besides, we obtained a larger

amount of tissue with the inclusion of the slide without any further complications,

such as bleeding.

Chromoscopy with Lugol solution has been used by many researchers as an

ancillary method of investigation in the endoscopic diagnosis of lesions which may

not be detected by conventional endoscopic examination, particularly in the

population at a higher risk of developing esophageal cancer (49;50). It is a simple,

low-cost method that does not take very long and can be routinely used in digestive

endoscopy units. Lugol solution reacts with the squamous cell constituents and

defines with accuracy the presence and the distal limit of the squamous epithelium,

improving the visual evaluation of Z line characteristics in the esophagus. The

referred aspects led us to select this coloring solution for routine use in the study

patients.

Results

The development of esophageal adenocarcinoma is associated to the

progressive accumulation of genetic abnormalities involving several oncogenes and

tumor suppressor genes. According to Nowell’s theory, this process presupposes the

early occurrence of genomic instability followed by clonal expansion of genetically

modified cells (14). Little is known about molecular alterations that occur in Barrett’s

esophagus. The loss of Tp53 gene function associated to the increase of cell

proliferation is likely to play a significant role in the metaplasia-dysplasia-

adenocarcinoma (18;27) sequence.

Endoscopic surveillance of patients with Barrett’s esophagus to detect

dysplastic alterations is the current strategy to anticipate the risk for progression to

adenocarcinoma of the esophagus (8;18). Dysplasia is considered to be a

histological expression of damage to cell DNA that precedes malignant

transformation. Unfortunately, the medical literature suggests dysplasia is an

imperfect marker of cancer risk, particularly that related to Barrett’s esophagus, for

many reasons, such as intra and interobserver variations in the interpretation of

dysplastic alterations and low predictive value in dysplasia evolution (progression,

persistency or regression) (8;22;42). Consequently, the search for new biological

markers and the better understanding of the pathogenesis of the gastroesophageal

reflux disease can help identify patients with increased risk for malignant

transformation. The present study aimed at analyzing the p53 protein expression and

proliferation index Ki-67 (MIB-1) along the squamous mucosa – chronic esophagitis –

columnar epithelium without intestinal metaplasia – columnar epithelium with

intestinal metaplasia – adenocarcinoma sequence.

Immunohistochemical analysis of the p53 protein expression identified a

positive reactivity in the normal epithelium, chronic esophagitis, columnar epithelium

without intestinal metaplasia, columnar epithelium with intestinal metaplasia and

adenocarcinoma groups of 7%, 37,5%, 30%, 62.5% and 71.4%, respectively. Such

results showed a linear correlation of the positive p53 protein along the events

experienced by patients without epithelial alteration, patients with inflammatory

process of the squamous mucosa, patients with columnar mucosa with and without

intestinal metaplasia and patients with cancer. The large number of patients of the

studied sample and the high index of statistical significance showed by the chi-

square test for linear trend (p<0.001) must be mentioned here. We also noticed that

the p53 protein expression increases significantly after the occurrence of intestinal

metaplasia, which emphasizes the importance of this finding in the progression to

adenocarcinoma of the esophagus.

Our study identified 7% of positive reactivity for the p53 protein in

histologically normal patients. Immunoreactivity distribution in this group was

restricted to the basal layer of the squamous epithelium and in all cases it showed a

faded color when examined in an optical microscope. In a similar way, Krishnadath et

al (18) have studied the immunohistochemical expression of the p53 protein (DO-7)

in a normal mucosa and detected a faded nuclear color in the basal layer, in 24

samples of esophageal mucosa used as control group.

The 62.5% positive reactivity of the p53 protein in patients with columnar

epithelium with intestinal metaplasia and of 71.4% among those patients with

adenocarcinoma corroborate the results obtained by Casson et al (51), who identified

a modified expression of the p53 protein in 50% of the patients with intestinal

metaplasia without dysplasia, whereas Krishnadath et al (18) reported

immunoreactivity for the p53 protein in 83% of the patients with adenocarcinoma of

the esophagus. Segal et al (52) have studied the p53 protein expression using the

immunohistochemical method (DO-7) and molecular analysis of the Tp53 gene

(PCR) in 68 patients with diagnosis of chronic esophagitis (27 patients), Barrett’s

esophagus (21 patients) and Cardia Intestinal Metaplasia (20 patients). They have

identified total positive reactivity of the p53 protein in 56.1%. In patients with Barrett’s

esophagus and Cardia Intestinal Metaplasia positive reactivity was 60.9% and

39.1%, respectively. Although the authors stressed the limitations of the

immunohistochemical method in the interpretation of the immunoreactivity of the p53

protein, they concluded that p53 protein overexpression is common in patients with

Barrett’s esophagus and Cardia Intestinal Metaplasia. Ramel et al (36), who have

also studied the immunohistochemical expression of the p53 protein in the stages of

progression of Barrett’s esophagus, detected positive reactivity of p53 protein in 5%

of the patients with Barrett’s esophagus without dysplasia, 15% in low degree

dysplasia, 45% in high degree dysplasia and 53% in adenocarcinoma.

Kim et al (53) have analyzed, together with the PCNA and c-erB-2, p53

protein expression in 43 pieces of esophagectomy by adenocarcinoma or high

degree dysplasia. They have identified a 36% positive reactivity of the p53 in areas of

the Barrett’s esophagus without dysplasia, 30% in low degree dysplasia, 85% in high

degree dysplasia and 90% in adenocarcinoma of the esophagus. These authors

concluded that the p53 protein overexpression is a relatively precursor event in

Barrett’s esophagus carcinogenesis, and is related to the increase of cell proliferation

assessed by the PCNA.

Rice et al (54) have studied the p53 protein expression in 28 pieces of

esophagectomy. They did not detect immunoreactivity for the p53 protein in patients

with Barrett’s esophagus without dysplasia or with low degree dysplasia. The reason

why the referred studies did not identify immunoreactivity of the p53 protein in the

abovementioned patients could be the use of variations of the immunohistochemical

method to perform antibody dilution, paraffin fixation, and interpret the nuclear color

intensity (5;54;55). Such variations may interfere with the results.

Weston et al (34) have studied the p53 protein expression, using the

immunohistochemical method, in 48 patients with Barrett’s esophagus and low

degree dysplasia during 81 months of endoscopic surveillance. According to them,

the number of p53 positive patients was significantly higher in patients with persistent

dysplasia (25%) and progressive dysplasia (60%) compared to patients with

regression (13%). They also found that the percent of positive cells in the glandular

mucosa around the dysplastic areas was a predictive factor in the evolution of

Barrett’s esophagus to high degree dysplasia and adenocarcinoma. Some questions

could be posed here concerning the use of a small number of cases in each analysis

group and the fact that p53 protein expression was not calculated in a control group.

Such data is consistent with the data reported by Younes et al (22) who have also

shown the importance of immunoreactivity of the p53 protein in the evolution of

histological alterations of patients with Barrett’s esophagus.

The modified expression of the Tp53 tumor suppression gene occurs in a

wide variety of human tumors (20;38;41). Its frequent association with a reserved

prognosis of such neoplasias indicates the important role of this gene in tumor

progression (22;42). The high index of positive reactivity of the p53 protein

expression found in adenocarcinoma samples (71.4%) in the present study suggests

that the modified expression of this gene is an important event, among others, in the

development of esophageal cancer. Our study has also shown a percent of positive

reactivity of the p53 protein similar between the chronic esophagitis and columnar

mucosa without intestinal metaplasia groups of 37.5% and 30%, respectively

(p>0.05). The reflux action may play an important role in the positive reactivity of this

biological marker in these patients. Several inflammatory alterations such as

esophagitis in tumor surrounding areas, acalasia esophagitis and esophagitis by

gastroesophageal reflux are closely related to the esophageal carcinogenesis

process, being capable of modifying the function of many proteins that regulate the

cell cycle, such as the p53 protein (38;50). So far, a few studies have analyzed the

immunoreactivity of the p53 protein in the squamous mucosa affected by

inflammatory process, particularly related to gastroesophageal reflux. Fagundes et al

(50) conducted a prospective study with the purpose of establishing the

immunoreactivity of the p53 protein in a rigorous protocol of serial esophageal

biopsies, in patients at high risk for epidermoid carcinoma of the esophagus. They

showed a progressive increase of the immunohistochemical expression of the p53

protein in patients with chronic esophagitis, dysplasia and esophageal cancer.

In patients with columnar mucosa without intestinal metaplasia, the

prevalence of the immunoreactivity of the p53 protein was 30%, whereas in the

columnar epithelium with intestinal metaplasia it was 62.5%. Although no statistical

significance was found in these two groups, the immunoreactivity of the p53 protein

was evidently associated to the process of intestinalization of the metaplastic mucosa

in the distal esophagus. The development of the columnar mucosa in the distal

esophagus is a benign condition with a potential to malignant transformation with the

occurrence of intestinal metaplasia (56). The specific molecular mechanism that

induces this alteration is unknown. The columnar mucosa in the distal esophagus is

the first stage of the columnar mucosa-Barrett-adenocarcinoma, and many other

studies published over the last 10 years have shown that the adequate control of

gastroesophageal reflux may be associated to histological regression of Barrett’s

esophagus (56;57;58). Gurski et al (59) have shown that anti-reflux surgery was an

important predictive factor in the histological regression in patients with Barrett’s

esophagus. Histological regression occurred in 36% of the operated patients. Carlson

et al (60) assessed the importance of the immunoreactivity of p53 protein, by

endoscopic biopsies, in the evolution of patients with Barrett’ Esophagus under acid

suppression therapy. The authors showed that the accumulation of p53 protein was a

marker if the neoplastic progression even during clinical treatment. These findings

demonstrated that p53 positive patients progressed to higher degrees of dysplasia or

DNA ploidy, and that early occurrence of the genetic abnormality in the Tp53 gene

did not interfere with the neoplastic evolution in patients with Barrett’s esophagus

under acid suppression therapy. Thus, the identification of patients with Barrett’s

esophagus and the greater chance of histological progression is a promising field for

future research.

The high index of positive reactivity of the p53 protein identified in the present

study in patients with columnar epithelium with intestinal metaplasia (62.5%), and the

relatively low risk of progression of this precursor lesion to adenocarcinoma of the

esophagus (0.5 to 2%) suggest that, although necessary for the development of this

neoplasia, the Tp53 suppressor gene alone cannot lead to tumor progression. It is

possible that other mediating factors in the cell proliferation process and apoptosis,

such as the bcl-2 and the c-Myc, act on these cells with molecular alterations,

preventing their neoplastic transformation (19;43;61;62).

The Ki-67 nuclear antigen is one of the most studied markers of the cell

proliferation activity because it can be used in several clinical conditions such as

lymphoproliferative diseases, gastroesophageal reflux disease, colon esophagus and

prostate cancer (23;27). The Ki-67 is present in proliferative cells and its increased

positive reactivity has been shown in esophageal, gastric, colon and rectal

carcinomas (44).

The present study demonstrated that the proliferation index (Ki-67) was

significantly higher when histological alterations progressed Ki-67

immunhistochemical analysis identified a growing positive reactivity in the squamous

and glandular epithelium of the nuclear antigen expression in the normal squamous

epithelium, chronic esophagitis, columnar epithelium without intestinal metaplasia,

columnar epithelium with intestinal metaplasia and adenocarcinoma groups of 21.3%,

38.8%, 37.7%, 52.8% and 57.1%, respectively.

Feith et al (33) detected a proliferation index of 20.4±6.4% in the normal

epithelium of the esophagus, 39±11.1% in the columnar metaplasia without

dysplasia, and 60.8±17.9% in the adenocarcinomas. Our results also demonstrated a

high proliferation level of the Ki-67 in the proliferative zone of patients with intestinal

metaplasia without dysplasia, when compared to the normal squamous epithelium

group (p<0.001). Such findings are consistent with the studies of Hong et al (23) who

analyzed Ki-67 expansion in the proliferative compartments by using the

immunohistochemical method with Ki-67 (MIB-1) monoclonal antibody and reported a

higher proliferation rate (33.5%) in the glandular zone of patients with Barrett’s

esophagus without dysplasia. Based on such data we have also concluded that the

distribution and increase of immunoreactivity by Ki-67 in the proliferative

compartments correlated with the histological findings in the Barrett’s esophagus

without dysplasia – low degree dysplasia – high degree dysplasia.

Chen et al (45) have studied the immunohistochemical expression of Ki-67

and COX-2 in 10 patients with normal squamous mucosa, 15 patients with severe

reflux esophagitis and 25 patients with Barrett’s esophagus. The authors found no

significant difference in the Ki-67 index among the patients with esophagitis and

Barrett1s Esophagus, with both groups being statistically different from patients with

normal squamous mucosa.

Comparison of the groups of chronic esophagitis, normal squamous mucosa

and columnar epithelium with intestinal metaplasia of our study showed a significant

difference between them (p<0.01). Besides, high indexes of cell proliferation were

noticed, particularly when intestinal metaplasia was present, indicating that this

proliferative activity was also related to the intestinalization of the columnar mucosa

in the distal esophagus.

Based on the findings of the present study we can affirm that molecular

alterations measured by the p53 protein expression were progressively greater when

histological alterations caused by GERD grew progressively worse. Likewise,

proliferative alterations measured by the Ki-67 expression had the same pattern, with

both markers showing a positive correlation between the increase of their expression

and the histological worsening. It is possible that the lesion mechanisms that

increase proliferative activity are the same mechanisms that produce molecular

alterations that lead to cancer.

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ANÁLISE DA EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DA PROTEÍNA P53 E DO

ANTÍGENO KI-67 (MIB-1) NO EPITÉLIO ESCAMOSO DE PACIENTES COM

DRGE E ESOFAGITE CRÔNICA

* (pré-artigo para ser enviado à revista Endoscopy)

Versão em Português

Autores:

Marcelo Binato

Renato Borges Fagundes

Luise Meurer

Maria Isabel Edelweiss

Richard Ricachenevsky Gurski

Local de Realização:

Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Serviços de Cirurgia Geral e de Patologia.

Rua Ramiro Barcelos, 2350 – CEP 90035-003. Bairro Rio Branco – Porto Alegre –

RS – Brasil. Fone: (51) 2101.8000.

Endereço para Correspondência:

Marcelo Binato

Rua Francisco Manoel Nº 01/ AP 202 CEP 97015-260

Santa Maria – RS – Brasil. Fone: (55) 32225693

Email: [email protected].br

RESUMO

Introdução: Pacientes com DRGE e esôfago de Barrett apresentam risco aumentado

para desenvolver adenocarcinoma de esôfago. Nesses dois grupos de pacientes, já é

relativamente bem conhecida a maior prevalência de alterações proliferativas e

moleculares decorrentes do refluxo gastroesofágico. Existe ainda uma questão em

aberto, ou seja, se em fases anteriores, já estão presentes essas alterações na mucosa

esofágica e em qual grau.

Objetivos: Avaliar a expressão da proteína p53 e do índice Ki-67 na mucosa esofágica

de pacientes com DRGE sem alterações da mucosa e nos casos com esofagite nos

vários graus.

Métodos: Foram estudados 138 pacientes com sintomas típicos de refluxo

gastroesofágico, submetidos à endoscopia digestiva e biópsia da mucosa esofágica,

entre janeiro de 2003 e dezembro de 2006. A expressão da proteína p53 e do índice Ki-

67 foi determinada por estudo imunohistoquímico. Os pacientes foram divididos em

quatro grupos após diagnóstico histopatológico: G1: 58 pacientes com epitélio

escamoso normal, G2: 42 pacientes com esofagite leve, G3: 23 pacientes com

esofagite moderada, G4: 15 pacientes com esofagite acentuada.

Resultados: Expressão aumentada da proteína p53 foi encontrada em 7% no G1;

21,4% no G2; 52,2% no G3 e 60% no G4. Houve diferença significativa na positividade

da proteína p53 do G1 em relação aos grupos G3 e G4 (p<0,001), e também entre o G2

e o G4 (p<0,05). O índice médio do Ki-67 foi de 21,3±19,5% no G1; 30,8±23,4% no G2;

47,1±23,2% no G3 e 48,3±25,7% no G4. Diferenças significativas do Ki-67 entre

grupos: G1xG3 (p<0,001); G1xG4 (p<0,001); G2xG3 (p=0,026); G2xG4 (p=0,046). Foi

observada correlação positiva e crescente entre ambos marcadores e a piora do grau

de esofagite (p<0,001).

Conclusão: A expressão aumentada da proteína p53 e do índice Ki-67

correlacionaram-se com os achados histológicos da mucosa esofágica complicada por

processo inflamatório, especialmente, nas formas moderada e acentuada da esofagite

crônica. Esses achados demonstram que as alterações moleculares e proliferativas

ocorrem em fases anteriores ao surgimento da metaplasia intestinal, em pacientes com

DRGE.

Palavras-Chave: p53. Ki-67 (MIB-1). DRGE. Esofagite. Adenocarcinoma.

INTRODUÇÃO

A doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) apresentou acentuado

aumento de prevalência nas últimas décadas. Estima-se que 40% da população

adulta experimentem sintomas de refluxo gastroesofágico em alguma fase da vida,

com cerca de 20% referindo pirose semanalmente e 10% com sintomas diários (1).

Esse fato faz da DRGE uma das doenças gastrointestinais mais freqüentes nos

países do Ocidente, afetando de alguma forma 30% dos indivíduos adultos nos

Estados Unidos (2). No Brasil, aproximadamente 12% da população adulta têm

sintomas típicos de refluxo gastroesofágico, como pirose e/ou regurgitação (3). A

freqüência e a severidade dos sintomas de refluxo nem sempre estão associadas

com as alterações inflamatórias na mucosa esofágica (4). Entretanto, observa-se

uma maior prevalência da esofagite erosiva em pacientes com mais de 50 anos (1).

O estudo endoscópico do esôfago é o método de escolha para o diagnóstico

das lesões macroscópicas da mucosa esofágica causadas pelo refluxo

gastroesofágico (3). A esofagite de refluxo pode progredir para complicações como

erosões, úlceras, estenose, esôfago de Barrett e progredir ao adenocarcinoma de

esôfago (5;6). Entretanto, muitos pacientes refluidores têm um aspecto normal da

mucosa esofágica (non erosive reflux disease – NERD) (1). A irritação e a

inflamação crônica são carcinógenos conhecidos em muitos tecidos. Estudos

experimentais evidenciam que o refluxo, especialmente, o biliar tem importante papel

na carcinogênese esofágica (7;8).

A análise histológica da mucosa esofágica pode ajudar no diagnóstico de

refluxo gastroesofágico ao mostrar alterações epiteliais como a hiperplasia da

camada basal e o alongamento de papilas, assim como a presença de células

inflamatórias (neutrófilos e eosinófilos) (9;10). A hiperplasia da camada basal

decorre da maior renovação celular, enquanto o alongamento das papilas é

conseqüente do maior fluxo de nutrientes para as células epiteliais. Essas alterações

histológicas são características da forma crônica do refluxo gastroesofágico,

presente na maioria dos pacientes com esofagite (9).

As condições pré-malignas do esôfago, na presença de inflamação crônica,

podem estar associadas com uma pronunciada resposta inflamatória e humoral

durante a progressão da doença (11). Como em outras condições inflamatórias

crônicas, a elevação de mediadores inflamatórios (imunoglobulinas e células

inflamatórias do plasma) e a produção de radicais livres de oxigênio estão

vinculados à esofagite de refluxo; ambas contribuem para aumentar o risco de

câncer esofágico, especialmente quando associados ao esôfago de Barrett (11;12).

Diversos marcadores moleculares (p53, Ki-67, Bcl-2, TGF-alfa, EGF-R) têm

sido pesquisados em várias alterações inflamatórias, como esofagite por refluxo

gastroesofágico, acalasia e carcinoma epidermóide do esôfago, com a finalidade de

estudar o comportamento biológico do epitélio esofágico associado à inflamação,

especialmente, em áreas de alto risco para câncer esofágico (13-15,31). O Tp53 é o

gene supressor tumoral mais comumente estudado nos carcinomas humanos. Ele é

responsável por regular o ciclo celular, reparar o DNA das células e induzir a morte

celular programada, quando necessário (16;17). O gene Tp53 codifica a proteína

p53 (normal), responsável pelo controle da transição durante a fase G1-S do ciclo

celular, a fim de prevenir a duplicação do DNA, principalmente, na presença de

mutações (18). A mutação no gene Tp53 gera uma proteína p53 alterada com uma

meia vida maior (6 horas) do que a proteína p53 normal (6 a 20 minutos). O acúmulo

intra-nuclear da proteína p53 torna possível a sua identificação pelos métodos

imunohistoquímicos (19). Dessa forma, a expressão aumentada da proteína p53 tem

sido detectada em todas as etapas de progressão neoplásica (mucosa escamosa

normal-esofagite-metaplasia-displasia-carcinoma), sendo considerada um possível

marcador no processo da carcinogênese do esôfago (13;19-21).

Pouco se sabe como o processo regenerativo da mucosa escamosa

inflamada modula a proliferação das células no epitélio esofágico. O antígeno Ki-67

é uma proteína nuclear utilizada como marcador da proliferação celular, em muitos

tecidos (22). De função ainda incerta, o antígeno Ki-67 está presente em todas as

fases (ativas) do ciclo celular (G1, S, G2, e M), mas ausente na fase de repouso –

G0 (23;24). Na literatura, tem sido descrito que o índice de proliferação celular,

avaliado pelo antígeno Ki-67, juntamente com outras proteínas reguladoras do ciclo

celular (p21, p27), acompanha a progressão das alterações inflamatórias sobre o

epitélio esofágico, em pacientes com sintomas de refluxo gastroesofágico (10).

O objetivo do nosso estudo foi avaliar a expressão da proteína p53 e a atividade

proliferativa pelo Ki-67 (MIB-1) no epitélio escamoso do esôfago e na esofagite crônica,

em pacientes com sintomas de refluxo gastroesofágico de longa duração.

MATERIAIS E MÉTODOS

População em estudo

Foram avaliados prospectivamente e de forma consecutiva, pacientes com

idade igual ou superior a 30 anos, encaminhados ao Serviço de Endoscopia

Digestiva entre janeiro de 2003 e dezembro de 2006 com sintomas típicos de refluxo

gastroesofágico, como pirose e/ou regurgitação, pelo menos uma vez por semana

no mínimo há cinco anos. Foram excluídos do estudo os pacientes portadores de

coagulopatia, estenose de esôfago, varizes esofágicas, hepatopatia, hemorragia

digestiva com menos de 30 dias, câncer de esôfago, tratamento radioterápico ou

quimioterápico prévios, hipersensibilidade ao iodo, uso atual de terapia ácida

supressora nos últimos 60 dias ou cirurgia sobre o esôfago ou estômago. Do

subtotal de 235 pacientes, foram selecionados e incluídos no estudo, apenas casos

sem lesão da mucosa esofágica ou com esofagite de qualquer grau, mas sempre

comprovada histologicamente. Excluíram-se os pacientes com mucosa colunar e os

casos de adenocarcinoma de esôfago.

Antes da realização da endoscopia digestiva alta foi obtido o consentimento

informado e respondido um questionário para definir as características demográficas

e clínicas de cada paciente (Anexo 1 e 2).

Endoscopia digestiva alta

O endoscópio (Fujinon 2200) foi introduzido mediante manobras

convencionais para a inspeção do esôfago, estômago e duodeno. Com o

endoscópio posicionado próximo a linha Z, foi realizada a cromoscopia com Solução

de Lugol a 3% com a finalidade de colocar em evidência o limite distal do epitélio

escamoso e as lesões decorrentes do refluxo gastroesofágico. Nesse momento,

foram coletados, no mínimo, dois fragmentos de mucosa, aproximadamente, dois

centímetros acima da junção esofagogástrica na ausência de lesão, e no(s) sítio(s)

de erosão (ões) ou área(s) não corada(s).

O pinçamento diafragmático correspondeu à impressão endoscópica do

músculo diafragma, a linha Z definiu a junção escamocolunar e a junção

esofagogástrica foi delimitada pela margem proximal das pregas gástricas. A

distância de dois centímetros ou mais entre a linha Z e o pinçamento diafragmático

definiu o diagnóstico de hérnia hiatal. A presença de solução de continuidade

(erosão) na mucosa escamosa determinou o diagnóstico de esofagite erosiva. A

classificação de Los Angeles foi utilizada para a graduação endoscópica da

esofagite endoscópica (grau A: uma ou mais erosões menor que 5 mm em sua maior

extensão, grau B: uma ou mais erosões maior que 5 mm não contínuas, grau C:

erosões contínuas que envolvem menos que 75% da circunferência do órgão, grau

D: erosões contínuas envolvendo mais de 75% da circunferência do órgão).

A biópsia da mucosa esofágica foi realizada com o auxílio de pinça fórceps com

estilete central, cuja abertura das cúspides é de sete milímetros (7mm). As amostras

teciduais foram fixadas em formalina a 10% e as alterações da mucosa esofágica e as

áreas biopsiadas foram registradas em mapa esquemático do esôfago (Anexo 3).

Análise histopatológica

Os fragmentos da mucosa do esôfago, corados com Hematoxilina-Eosina

(H&E), foram analisados, em microscópio óptico, por duas patologistas do

Departamento de Patologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Os

achados histológicos foram classificados nas seguintes categorias:

1. epitélio escamoso;

2. presença de células da camada basal que atingem mais do que 15% da

camada epitelial total;

3. alongamento das papilas com extensão mais da metade da camada

epitelial total;

4. exocitose: presença de neutrófilos e/ou eosinófilos e/ou monócitos intra-

epiteliais;

O diagnóstico histopatológico de esofagite foi definido pela presença de um

ou mais dos achados descritos acima conforme estabelecido por Flora-Filho et al (9).

A esofagite foi classificada em leve, moderada e acentuada, de acordo com o grau

das alterações inflamatórias descritas a seguir (35): para neutrófilos e eosinófilos as

categorias são: Leve (média de uma célula por secção de tecido); Moderada (mais

de uma célula por secção de tecido), Acentuada (infiltração maciça de células

inflamatórias). Para linfócitos as categorias são: leve (menos de 3 células por campo

de grande aumento- CGA); Moderada (10 a 50 células CGA); Acentuada (mais de 50

células CGA).

Análise imunohistoquímica

A técnica imunohistoquímica foi realizada no Laboratório de

Imunohistoquímica do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa

Maria (UFSM). Para cada bloco de parafina, foram realizados dois cortes

histológicos com três micrômetros, e montados em lâminas revestidas por poli-L-

lisina. Em seguida, os cortes foram desparafinizados por imersão em xilol por 30

minutos e hidratados em álcool de diferentes concentrações (70 a 100%) à

temperatura ambiente (ATA). Após a hidratação no álcool, os cortes foram

novamente lavados em água corrente por três minutos e mergulhados em água

destilada por mais um minuto. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada

por imersão das lâminas em peróxido hidrogênio a 3% por dez minutos. Após a

recuperação antigênica em forno de microondas, com três ciclos na potência

máxima (800 W) por oito minutos e vinte segundos procedeu-se o bloqueio da

peroxidase endógena e das reações inespecíficas.

O anticorpo primário p53 (DAKO, código M7001 mouse anti p53; clones DO-

7), foi encubado por quinze horas, a 4

C, na diluição 1:700 e reconhece a forma

normal e a alterada da proteína p53. O anticorpo primário Ki-67 (DAKO, código

MU2970397 mouse anti Ki-67; clones MIB1) que reconhece o antígeno nuclear Ki-67

foi incubado por quinze horas, a 4

C, na diluição 1:400. As lâminas ficaram por

quinze a dezoito horas na geladeira (10ºC). Elas foram lavadas e banhadas no PBS,

com aplicação posterior do LSAB (Avitina-Biotina); após nova lavagem, foi utilizado o

cromógeno diaminobenzidina (DAB) cuja característica é a de fornecer coloração

castanha à reação. Finalmente, após a coloração pela Hematoxilina-Haas e

passagem em amônia a 2% e álcool, as lâminas foram montadas.

Foram utilizados como controle positivo material proveniente de câncer de

mama para a proteína p53 e apêndice cecal para o Ki-67, e como controle negativo

foi utilizada uma lâmina sem a inclusão do anticorpo primário. Foi considerada

reativa a célula cujo núcleo apresentou coloração castanha evidente, semelhante ao

controle positivo em ambos os marcadores.

A avaliação da expressão da proteína p53 foi realizada pela proporção de

células coradas em um mínimo de 10 campos visuais de grande aumento (400X). O

parâmetro para definir a expressão da proteína p53 foi a presença da coloração

nuclear, conforme estabelecido por Wang et al (25). Foram considerados casos

positivos aqueles com mais de 10% de células coradas, por campo microscópico de

alta magnificação. Para o Ki-67 (MIB-1), o resultado foi avaliado pelo índice de

proliferação celular para cada caso, que é calculado a partir da média de células

coradas e o total de células analisadas com contagem de no mínimo 500 células,

conforme descrito previamente por Feith et al (26).

A leitura imunohistoquímica das lâminas foi realizada por duas patologistas,

com experiência em patologia gastrointestinal do Departamento de Patológica do

HCPA, de forma independente e sem o conhecimento dos dados clínicos. Quando

discordante, o resultado final foi obtido por consenso entre as patologistas conforme

descrição prévia por Weston et al (27).

Análise estatística

Para armazenamento e processamento dos dados, foi utilizado o Statistical

Package for Social Science (SSPS) versão 12.0. O teste estatístico aplicado para

análise comparativa da proteína p53 entre os grupos, foi o qui-quadrado de

tendência linear. Os dados para o Ki-67 foram apresentados em médias e desvios-

padrão. As variáveis contínuas foram comparadas entre categorias por meio da

análise de variâncias (ANOVA). A localização das diferenças, quando presentes, foi

realizada pelo teste Tukey. A correlação linear das variáveis p53 e Ki-67 com seus

respectivos grupos, foi analisada pelo coeficiente de correlação Kendall e Pearson,

respectivamente. Foi considerado significativo p<0,05.

Considerações éticas

Este trabalho teve seu projeto previamente avaliado e aprovado pelo Grupo

de Pesquisa e Pós-Graduação (GPPG) do HCPA, e seguiu todas as normas éticas

preconizadas. Os pacientes foram submetidos à endoscopia digestiva alta junto ao

atendimento assistencial do Serviço de Gastroenterologia do HUSM. Foi obedecido

o consentimento informado e os pacientes tiveram a privacidade dos dados

coletados protegida. O estudo seguiu as normas emanadas da resolução 196/96 do

CFM e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do CCS da UFSM e pelo

GPPG/HCPA.

RESULTADOS

No período de Janeiro de 2003 a dezembro de 2006 foram selecionados 138

pacientes que preencheram os critérios de inclusão previamente citados. Os

pacientes selecionados, após estudo anátomo-patológico, foram divididos em quatro

grupos: 58 pacientes com epitélio normal (grupo 1), 42 pacientes com esofagite leve

(grupo 2), 23 pacientes com esofagite moderada (grupo 3) e 15 pacientes com

esofagite acentuada (grupo 4). A prevalência de epitélio histologicamente normal foi

42% (58/138) e de esofagite histológica foi 58% (80/138).

A análise imunohistoquímica dos 138 pacientes demonstrou

imunorreatividade em 34 pacientes (24,6%) para a proteína p53. Nos pacientes com

epitélio normal, 4 (7%) apresentaram expressão aumentada (mais de 10% de células

coradas) da proteína p53. Dos 42 pacientes com esofagite leve, 9 (21,4%)

apresentaram imunorreatividade à proteína p53, 12/23 (52,2%) dos pacientes com

esofagite moderada foram considerados positivos para a proteína p53 e 9/15 (60%)

dos pacientes com esofagite acentuada apresentaram expressão aumentada da

proteína p53 (Figura 1).

Figura 1. Microfotografia da expressão imunohistoquímica da proteína p53 –

setas: mucosa normal (A) (x400), esofagite leve (B), esofagite moderada (C) e

esofagite acentuada (D) , (x 200).

Houve diferença significativa na positividade da proteína p53 do grupo 1 em

relação aos grupos 3 e 4 (p<0,001), assim como entre o grupos 2 e 4 (p<0,05) (Figura 2).

Figura 2. Atividade da p53 na seqüência epitélio normal – esofagite leve – esofagite

moderada – esofagite acentuada

Foi identificada correlação positiva e progressivamente crescente entre os

grupos estudados para a proteína p53 (p<0,001) (Figura 3).

Figura 3. Correlação entre p53 e progressão epitélio normal – esofagite leve –

esofagite moderada – esofagite acentuada. Coeficiente de Kendall 0,4.

Com relação ao Ki-67, o índice médio de proliferação celular, avaliado na

camada basal, foi de 31,4±24,3%. As médias foram de 21,3±19,5% nos pacientes

com epitélio normal; 30,8±23,4% nos pacientes com esofagite leve; 47,1±23,2% nos

p53(%)

21,4

52,2

100

Epitélio

Normal

Esofagite

Leve

Esofagite

Moderada

Esofagite

Acentuada

p<0,001

p<0,05

21,4

52,2

Epitélio normal Esofagite leve Esofagite

moderada

Esofagite

acentuada

Imunorreatividade do p53 (%)

21,33

30,8

47,1

48,3

100

Índice Ki-67(%)

pacientes com esofagite moderada e 48,3±25,7% nos pacientes com esofagite

acentuada (Figura 4).

Figura 4. Microfotografia da expressão imunohistoquímica do antígeno Ki-67

(MIB-1) – setas: epitélio normal (A) e esofagite leve (B) com aumento de

200X, esofagite moderada (C) e esofagite severa (D), em aumento de 200X.

O Ki-67 apresentou distribuição crescente do grupo 1 ao grupo 4. Houve

diferença significativa no índice de proliferação (Ki-67) entre o grupo 1 e os grupos 3

e 4, assim como entre o grupo 2 e os grupos 3 e 4 (Figura 5).

Figura 5. Atividade Ki-67 na seqüência epitélio normal – esofagite leve –

esofagite moderada – esofagite acentuada. G1xG3 (p<0,001); G1xG4

(p<0,001); G2xG3 (p=0,026); G2xG4 (p=0,046).

Mucosa

normal

Esofagite

leve

Esofagite

moderada

Esofagite

acentuada

Identificou-se correlação linear moderada entre o índice de proliferação

celular (Ki-67 MIB-1) e a seqüência epitélio normal – esofagite leve – esofagite

moderada – esofagite acentuada (p<0,001) (Figura 6).

Figura 6. Correlação entre Ki-67 e progressão epitélio normal – esofagite leve –

esofagite moderada – esofagite acentuada. Coeficiente de Pearson 0,4

DISCUSSÃO

Cada vez são maiores as evidências que indicam associação dos processos

inflamatórios crônicos com o desenvolvimento da carcinogênese do aparelho

digestivo (10;12;28;31). A história natural da DRGE demonstra que 40% dos

pacientes com esofagite melhoram espontaneamente, 50% apresentam esofagite

persistente e cerca de 10% progridem para o esôfago de Barrett (29;30). Hillmann et

al (31) estudaram, de forma prospectiva, o impacto dos achados endoscópicos em

pacientes com esôfago de Barrett. Os autores concluíram que a presença de

esofagite erosiva severa, no diagnóstico endoscópico inicial; a persistência do

processo inflamatório, apesar do tratamento instituído; a nodularidade da mucosa

colunar e a estenose foram fatores que indicaram um maior risco dos pacientes em

desenvolver alterações displásicas e adenocarcinoma esofágico. Boni et al (32)

demonstraram por estudo imunohistoquímico, que mediadores inflamatórios, como

21,3

30,8

47,1

48,3

Epitélio normal Esofagite leve Esofagite

moderada

Esofagite

acentuada

Índice Ki-67 (MIB-1)

IL-8 e MCP-1, estimularam a proliferação celular através de receptores específicos

diretamente sobre o epitélio esofágico. Diversos autores apóiam a teoria da

associação entre o aumento de mediadores inflamatórios e as mudanças

histológicas do epitélio esofágico (hiperplasia da camada basal e alongamento de

papila) na esofagite por refluxo gastroesofágico, elevando o índice de proliferação

celular, um mecanismo molecular com importante papel na carcinogênese do

esôfago (11;12;33).

Método

A endoscopia digestiva alta é um dos principais métodos de avaliação das

complicações da DRGE, principalmente, se for associada ao exame histopatológico

da mucosa esofágica. Muitos estudos têm demonstrado alterações microscópicas da

mucosa do esôfago, obtidas por biópsias endoscópicas, em pacientes com esofagite

de refluxo (9;34;35). Desde os trabalhos de Ismail-Beiji et al (34), sedimentados por

Weinstein et al (36) quanto à padronização do local ideal para a obtenção dos

fragmentos esofágicos, poucas mudanças ocorreram nos achados da histologia do

esôfago distal em pacientes com DRGE (9).

No presente trabalho, limitamos a obtenção das amostras da mucosa

esofágica em pacientes endoscopicamente normais a, aproximadamente, 2

centímetros acima da junção escamocolunar, portanto acima do segmento do

esôfago afetado pelo chamado refluxo fisiológico. O refluxo gastroesofágico contínuo

leva as alterações inflamatórias da mucosa esofágica, como eritema, erosões e

úlceras (35). Histologicamente, o alongamento das papilas e a hiperplasia da

camada basal representam a resposta regenerativa do epitélio esofágico associado

à intensa atividade mitótica localizada na camada basal (31). Embora os critérios

diagnósticos (clínicos, endoscópicos, funcionais) da DRGE sejam muito dinâmicos,

há o consenso de que a esofagite histológica, isolada ou juntamente com outros

critérios, seja um dos principais achados para o diagnóstico da DRGE (9).

Uma das principais limitações do método imunohistoquímico ao avaliar a

expressão da proteína p53, ocorre quando a mutação do gene Tp53 não determina

aumento da proteína p53 ou, no caso de imunorreatividade quando da ausência de

mutação do gene Tp53 (37;38). Apesar de o seqüenciamento de DNA (PCR) ser o

método mais seguro para avaliar a mutação do gene Tp53, o estudo

imunohistoquímico é considerado mais exeqüível na avaliação do estado funcional

do gene Tp53; pois com a estabilização na meia vida da proteína p53, qualquer que

seja o mecanismo, torna-se possível a sua identificação pelos métodos

imunohistoquímicos. A imunohistoquímica ainda apresenta como fator positivo, ser

um método fácil e largamente disponível, com possibilidade de associar a

observação topográfica da expressão do marcador (39).

Nossos resultados foram obtidos por estudo imunohistoquímico em amostras

de biópsias endoscópicas da mucosa esofágica. A relação entre mutação real e

expressão elevada da proteína p53 não foi analisada neste momento, pois a técnica

adotada não permite tais observações. A utilização do anticorpo DO-7 possibilita o

reconhecimento da forma normal e alterada da proteína p53. Entretanto,

considerando a meia-vida extremamente curta da proteína p53 normal, a coloração

positiva da célula tem uma forte correlação com o acúmulo anormal da proteína p53

(39). Além disso, o aumento progressivo na concentração da proteína alterada

poderá determinar efeito negativo (dominante) sobre a atividade da proteína normal,

por meio da formação do complexo protéico: proteína alterada versus proteína

normal (49;50). Este estudo faz parte de uma linha de pesquisa que investiga a

100

carcinogênese esofágica em pacientes com DRGE. Outros marcadores moleculares

estão sendo estudados, simultaneamente, com a finalidade em estudar os

mecanismos envolvidos na seqüência inflamação – metaplasia – câncer do esôfago.

A atividade proliferativa tem recebido grande atenção nesse contexto. Pode

ser analisada por técnicas como a incorporação timidina tritiada ao DNA celular, pelo

antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), e pela avaliação imunohistoquímica

do antígeno nuclear Ki-67 (40). O Ki-67 tem-se tornado o marcador de eleição para

avaliar a proliferação celular, pela elevada acurácia e maior factibilidade técnica que

os métodos anteriormente citados. Sua aferição por análise de imagem tem sido

também empregada, porém esse método no nosso meio não é usual. A contagem

convencional pelo percentual de células marcadas/total das células avaliadas, é

amplamente realizada e utilizada para quantificar a atividade proliferativa de

determinado tumor ou tecido. Uma das limitações da utilização do anticorpo

monoclonal Ki-67 é a perda de parte do antígeno nuclear em amostras fixadas em

formalina, sendo necessário o uso de amostras de tecido fresco. Entretanto, a

utilização do clone MIB-1, um verdadeiro anti-Ki67, possibilita a detecção do

antígeno mesmo em amostras teciduais conservadas na parafina e, rotineiramente

processadas, com recuperação antigênica em forno de microondas (23;24).

Resultados

Os eventos moleculares que caracterizam a seqüência inflamação-

metaplasia-displasia-adenocarcinoma não estão totalmente esclarecidos (12). O

adenocarcinoma do esôfago é o câncer esofágico com maior incidência nos Estados

Unidos e na Europa Ocidental (41-43). Uma das principais hipóteses para o rápido

crescimento do adenocarcinoma, nos países desenvolvidos, é o aumento na

101

prevalência da DRGE. Provavelmente, um dos mecanismos envolvidos no processo

da carcinogênese nos portadores de refluxo gastroesofágico, é o aumento do

estresse oxidativo sobre a mucosa esofágica (44). Muitos pacientes com

adenocarcinoma do esôfago apresentam um histórico de refluxo gastroesofágico

crônico; assim, o aumento na produção de radicais livres de oxigênio, na presença

de esofagite, determina um maior dano ao DNA das células (12). Além disso, o

permanente estímulo da proliferação celular, induzido pelo refluxo, também é um

fator fisiopatológico importante na progressão da carcinogênese esofágica (45). A

escolha dos marcadores moleculares p53 e Ki-67 (MIB-1), no presente estudo, foi

devido ao importante papel que ambos desempenham no controle da proliferação

celular e sua participação no processo da carcinogênese esofágica.

Nossas observações indicaram que a mucosa escamosa do esôfago,

complicada pelo processo inflamatório decorrente do refluxo gastroesofágico,

apresentou expressão da proteína p53 de 7% na mucosa escamosa normal; 21,4%

na esofagite leve; 52,2% na esofagite moderada e 60% na esofagite acentuada.

Notamos positividade para a proteína p53 em 4 pacientes com epitélio escamoso

sem alteração histológica. A expressão aumentada da proteína p53, raramente, é

detectada em mucosa normal do esôfago. Alguns autores têm relatado o acúmulo

dessa proteína em mucosa normal e na hiperplasia da camada basal do epitélio

esofágico, em pacientes com maior risco de adenocarcinoma esofágico. Além disso,

sabe-se que mesmo na ausência de lesões da mucosa, o refluxo crônico pode

produzir alterações proliferativas e moleculares (15;25). Em relação à estratificação

dos níveis de intensidade da esofagite, nosso estudo imunohistoquímico demonstrou

uma maior prevalência de casos positivos nos grupos esofagite moderada e

acentuada, em relação aos grupos esofagite leve e epitélio escamoso normal,

102

demonstrando também uma correlação evidente entre a expressão aumentada da

proteína p53 e a progressão do grau histológico da esofagite crônica. Tais achados

apontam para uma clara correlação entre a gravidade da esofagite e o início de

alterações desse marcador, ainda em fases anteriores às alterações morfológicas

pré-malignas da mucosa esofágica.

Fagundes et al (20) estudaram a expressão imunohistoquímica da proteína

p53, na mucosa esofágica, em 182 pacientes alcoolistas/tabagistas sem sintomas

esofágicos, porém com alto risco de carcinoma epidermóide do esôfago e em 20

voluntários saudáveis, não tabagistas e abstêmios. Todos os participantes foram

submetidos ao estudo endoscópico do esôfago associado à cromoscopia com

Solução de Lugol a 3%. A expressão aumentada da proteína p53 foi detectada em

12% dos pacientes com mucosa escamosa normal; em 14% com esofagite leve; em

22% com esofagite moderada e em 33% com esofagite severa; em 36% com

displasia de baixo grau, em 100% com displasia de alto grau e em 100% com

carcinoma epidermóide do esôfago. Os autores demonstraram associação da

expressão da proteína p53 na mucosa esofágica e seu aumento progressivo, de

acordo com a piora dos diferentes níveis de intensidade da esofagite crônica,

displasia e câncer esofágico.

No presente estudo, a expressão média do antígeno Ki-67, na camada basal

dos pacientes com epitélio normal, foi 21,4%, o que está de acordo com a literatura

(26;46). Iftihar et al (46) ao estudarem o índice de proliferação celular (Ki-67) nas

mucosas escamosa, colunar metaplásica e gástrica de 23 pacientes com esôfago de

Barrett, detectaram índices de proliferação maiores que 15% em amostras

histologicamente normais do epitélio esofágico. Ribeiro et al (47), em estudo

prospectivo, avaliaram o grau de inflamação, hiperplasia e displasia em 128

103

amostras endoscópicas de 16 pacientes com acalasia avançada. Os autores

concluíram que a inflamação presente nos pacientes correlacionou-se com a

expressão aumentada da proteína p53 e com o aumento no índice de proliferação

celular (PCNA). Todas as amostras analisadas expressaram positividade para o

PCNA na camada basal do epitélio esofágico. Nosso estudo também demonstrou

que a proliferação celular, avaliada pelo antígeno Ki-67 (MIB-1), esteve presente

apenas na camada basal em todos os grupos com exceção de 6 pacientes que

apresentaram positividade no terço médio do compartimento proliferativo do epitélio

escamoso do esôfago: esofagite leve – 2 casos, esofagite moderada – 3 casos e

esofagite acentuada – 1 caso.

Nos pacientes com esofagite leve, moderada e acentuada, o índice de

proliferação celular, avaliado pelo Ki-67, foi de 30,8%, 47,1% e 48,3%,

respectivamente. Os valores encontrados são mais marcantes do que na literatura,

que apresentam índices de proliferação (Ki-67) entre 10 e 24% na maioria das

amostras de esofagite analisadas (48). Essas diferenças podem ser, em parte,

causadas pelas diferenças metodológicas nesses estudos, tais como: amostras

pequenas e pouco representativas e/ou estudos baseados em diferentes áreas

histológicas de peças de esofagectomias, nos quais um paciente contribuiu com

vários cortes histológicos. Variações na realização do método imunohistoquímico,

como diferentes tipos de anticorpos e aferição do marcador, também podem explicar

discordância nos resultados encontrados. Em nosso estudo, a obtenção dos

fragmentos de mucosa esofágica foi através da pinça de biópsia com estilete central

que possibilita maior precisão e maior quantidade de tecido esofágico. O número de

amostras avaliadas foi coincidente com o número de pacientes, representando assim

cada paciente um único diagnóstico.

104

Demonstramos correlação significativa entre o aumento da atividade

proliferativa, aferida pelo Ki-67, e os diferentes níveis de intensidade da esofagite

crônica. Houve diferença no índice de proliferação entre os pacientes com esofagite

leve e os pacientes com esofagite moderada e acentuada (p<0,05). Estudo

imunohistoquímico realizado por Nishiyama et al (10) analisou, por meio de biópsias

endoscópicas as proteínas reguladoras do ciclo celular (p21, p27 e Ki-67), em 46

pacientes com evidências de refluxo e em 10 pacientes normais. A proliferação

celular foi detectada, principalmente, na camada basal do epitélio esofágico, e os

autores demonstraram uma correlação significativa da imunorreatividade do

antígeno Ki-67, nos compartimentos proliferativos da mucosa escamosa com as

alterações histológicas e endoscópicas da esofagite. Os nossos resultados

corroboram tais resultados demonstrando que o índice de proliferação celular Ki-67,

obtido por amostras endoscópicas, esteve associado às lesões inflamatórias da

mucosa esofágica, especialmente, nos casos mais acentuados de esofagite crônica

decorrente do refluxo gastroesofágico.

O impacto dos fatores fisiopatológicos sobre as alterações moleculares da

mucosa esofágica complicada por esofagite não estão totalmente esclarecidos. Há

poucos trabalhos sobre o estudo das anormalidades em nível molecular da mucosa

escamosa em pacientes com NERD e com doença erosiva. A maioria dos trabalhos

relaciona o esôfago de Barrett e sua progressão até o adenocarcinoma do esôfago.

Com um melhor conhecimento da biologia molecular, durante as etapas iniciais da

DRGE, é possível estabelecer uma terapêutica mais adequada para o controle dos

mediadores inflamatórios sobre a mucosa esofágica, antes do surgimento das

alterações moleculares, na tentativa de prevenir a progressão da DRGE para a

metaplasia e, finalmente, para o adenocarcinoma esofágico.

105

Nossos resultados, no presente estudo, permitem concluir que a expressão

da proteína p53 e o índice de proliferação celular, medido pelo Ki-67 (MIB-1)

correlacionaram-se com os achados histológicos da mucosa esofágica associada ao

processo inflamatório, sendo progressivamente maiores conforme a piora do grau de

esofagite. Além disso, são relevantes dois aspectos: o primeiro é que há uma

associação entre o aumento da proliferação e a alteração molecular; o segundo

sustenta que essas alterações já são significativamente importantes a partir da fase

de esofagite moderada. Tais resultados poderão ter um impacto no nível de

acompanhamento endoscópico que deveremos dispensar a esses pacientes,

visando diagnosticar, precocemente, a evolução de sua doença. Provavelmente, o

uso desses marcadores de forma prospectiva, em pacientes com esofagite

moderada e acentuada, poderia proporcionar uma melhor vigilância e, até mesmo,

permitir intervenções no processo seqüencial da progressão para o adenocarcinoma.

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111

ANALYSIS OF IMMUNOHISTOCHEMICAL EXPRESSION OF THE P53 PROTEIN

AND KI-67 ANTIGEN IN THE SQUAMOUS EPITHELIUM OF THE ESOPHAGUS IN

PATIENTS WITH GERD AND CHRONIC ESOPHAGITIS

* (pré-artigo em Inglês para ser enviado à Revista Endoscopy)

Authors:

Marcelo Binato

Renato Borges Fagundes

Luise Meurer

Maria Isabel Edelweiss

Richard Ricachenevsky Gurski

Place:

Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) – General Surgery and Pathology Unit.

Rua Ramiro Barcelos, 2350 – CEP 90035-003. Bairro Rio Branco – Porto Alegre –

RS – Brasil. Fone: (51) 2101.8000.

Address for Correspondence:

Marcelo Binato

Rua Francisco Manoel Nº 01/ AP 202 CEP 97015-260

Santa Maria – RS – Brasil. Fone: (55) 32225693

Email: [email protected].br

112

ABSTRACT

Introduction: Patients with GERD and Barrett’s esophagus are at a greater risk of

developing adenocarcinoma of the esophagus. Both groups of patients are more

prone to proliferative and molecular alterations caused by the gastroesophageal

reflux. There is no certainty whether such alterations are present in early stages of

the disease and to what degree.

Objectives: Evaluate the p53 protein and Ki-67 expression in the esophageal

mucosa in patients with GERD without mucosal alterations and in patients with

esophagitis at different degrees.

Methods: The study involved 138 patients with typical GER symptoms who were

subjected to digestive endoscopy and biopsy of the esophageal mucosa, between

January 2003 and December 2006. The p53 protein and Ki-67 antigen expression

was determined by immunohistochemical study. Patients were divided into four

groups following histopathological diagnosis: G1: 58 patients with normal squamous

epithelium, G2: 42 patients with mild esophagitis, G3: 23 patients with moderate

esophagitis, G4: 15 patients with severe esophagitis.

Results: p53 protein overexpression was found in 7% in G1, 21.4% in G2, 52.2% in

G3 and 60% in G4. There was a significant difference in p53 positive in G1 in relation

to groups 3 and 4 (p<0.001), which was also found concerning G2 and G4 (p<0.05).

The average index of Ki-67 was 21.3±19.5% in G1, 30.8±23.4% in G2, 47.1±23.2%

in G3 and 48.3±25.7% in G4. Significant difference of Ki-67 were found between

groups: G1xG3 (p<0.001); G1xG4 (p<0.001); G2xG3 (p=0.026); G2xG4 (p=0.046). A

positive and progressively increasing correlation was found between both markers

and the worsening of esophagitis (p<0.001).

Conclusion: The overexpression of p53 protein and Ki-67 index were found to be

correlated to the histological findings of the esophageal mucosa affected by

inflammatory process, particularly in the moderate and severe forms of chronic

esophagitis. Such findings showed that molecular and proliferative alterations occur

in stages that precede the occurrence of intestinal metaplasia in GERD patients.

Keywords: p53. Ki-67 (MIB-1). GERD. Esophagitis. Adenocarcinoma.

113

INTRODUCTION

The Gastroesophageal Reflux Disease (GERD) showed a great increase over

the last decades. It is estimated that 40% of the adult population experiences symptoms

of gastroesophageal reflux at some time during their lives, with 20% of this population

having pyrosis symptoms once a week and 10% every day. (1). Therefore, GERD is

one of the most frequent gastrointestinal diseases in Western countries, which affects

somehow 30% of adults in the United States (2). In Brazil, approximately 12% of the

adult population has typical symptoms of gastroesophageal reflux such as pyrosis and/or

regurgitation (3). The frequency and severity of reflux symptoms are not always

associated to inflammatory alterations in the esophageal mucosa (4). However, erosive

esophagitis is found to be predominant in patients over 50 years old (1).

The method chosen for the diagnosis of macroscopic lesions of the esophageal

mucosa caused by gastroesophageal reflux was the endoscopic study of the esophagus

(3). Reflux esophagitis may lead to complications such as erosions, ulcers, stenosis,

Barrett’s esophagus and the development of adenocarcinoma of the esophagus (5; 6).

However, the esophageal mucosa of many patients with reflux has a normal aspect (non

erosive reflux disease – NERD) (1). Irritation and chronic inflammation are known

carcinogens of many tissues and experimental studies affirm that reflux, in particular,

biliary, plays an important role in esophageal carcinogenesis (7;8).

Histological analysis of the esophageal mucosa may support the diagnosis of

gastroesophageal reflux by showing epithelial alterations such as hyperplasia of the

basal layer and elongation of papillae, as well as the presence of inflammatory cells

(neutrophils and eosinophils) (9; 10). Hyperplasia of the basal layer is caused by

increased cell recovery, whereas the elongation of papillae is caused by the

increased flow of nutrients into epithelial cells. Such alterations characterize the

114

gastroesophageal reflux in most patients with esophagitis. (9).

Premalignant conditions of the esophagus in chronic inflammation may be

associated to a severe inflammatory and humoral response during the evolution of the

disease (11). As in other chronic inflammatory conditions, the elevation of inflammatory

mediators (immunoglobulins and plasma cells) and the production of oxygen free

radicals are related to reflux esophagitis, and both contribute to increase the risk of

esophageal cancer, particularly when associated to Barrett’s esophagus (11; 12).

Molecular markers (p53, Ki-67, Bcl-2, TGF-alpha, EGF-R) have been studied in

various inflammatory alterations such as reflux esophagitis, achalasia and epidermoid

carcinoma of the esophagus, with the purpose of assessing the biological behavior of the

esophageal epithelium associated to inflammation, particularly in high-risk areas for

esophageal cancer (13-15,31). The Tp53 gene is one of the most studied tumor suppressor

genes in human carcinomas, being responsible for regulating the cell cycle, repairing cell

DNA damage and inducing programmed cell death, when necessary (16; 17). The Tp53

gene encodes the p53 protein (normal) responsible for transition control during stage G1-S

of the cell cycle, in order to prevent DNA duplication, mostly in case of mutations (18). The

mutation of Tp53 gene generates an altered p53 protein with a longer half-life (6 hours) than

normal p53 protein (6 to 20 minutes). The intranuclear accumulation of p53 protein makes

its identification possible by immunohistochemical methods (19). Therefore, the p53 protein

overexpression has been detected in all stages of neoplastic progression (normal

squamous mucosa – chronic esophagitis – metaplasia – dysplasia – carcinoma), and is

considered a possible marker of the esophagus carcinogenesis process (13;19-21).

Little is known about how the regenerative process of the inflamed squamous

mucosa modulates cell proliferation in esophageal epithelium. The Ki-67 antigen is a

nuclear protein used as marker of cell proliferation in many tissues (22). The Ki-67

115

antigen, of uncertain function, is present in all stages of the cell cycle (G1, S, G2, e M),

but absent in the resting stage – G0 (23;24). According to the medical literature, the cell

proliferation index, measured by the Ki-67 antigen, together with other cell cycle

regulating proteins (p21, p27), follows the progression of inflammatory alterations on the

esophageal epithelium in patients with gastroesophageal reflux symptoms (10).

Our study aimed at evaluating the p53 protein expression and the Ki-67

(MIB-1) antigen proliferative activity in the squamous epithelium of the esophagus

and in chronic esophagitis in patients with long-standing gastroesophageal reflux.

MATERIALS AND METHODS

Study Population

Patients aged 30 or over, who were referred to the Digestive Endoscopy Unit

of the Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM) between January 2003 and

December 2006, with typical symptoms of gastroesophageal reflux such as pyrosis

and/or regurgitation at least once a week, for a minimum five years, were

prospectively and consecutively examined.

Patients with coagulopathy, esophageal stenosis, esophageal varices,

hepatopathy, digestive hemorrhage at least over the last 30 days, esophageal

cancer, previous radiotherapy or chemotherapy treatment, hypersensitiveness to

iodine, use of acid suppressor therapy over the last 60 days or esophageal or

stomach surgery were excluded from the study.

Out of the 235 patients (sub-total), only those without esophageal mucosal

lesion or with esophagitis of any degree, but histologically confirmed, were selected.

Patients with columnar mucosa and adenocarcinoma of the esophagus were excluded.

Prior to endoscopic examination, an informed consent was obtained from

116

every patient. Also, a questionnaire was completed to define the demographic and

clinical characteristics of the patients (annexes 1 and 2).

Upper Digestive Tract Endoscopy

A Fujinon 2200 endoscope, inserted by means of a conventional technique,

was used for inspection of the esophagus, stomach and duodenum. With the

endoscope placed near Z line, chromoscopy was performed with a 3% lugol solution,

with the purpose of highlighting the distal limit of the squamous epithelium and the

lesions caused by gastroesophageal reflux.

At least two fragments of mucosa were collected approximately two

centimeters above the gastro-esophageal junction without lesion and in the erosion

site(s) or unstained area(s).

The detachment of the diaphragm corresponded to the endoscopic impression

of the diaphragm muscle. The Z line defined the squamous-columnar junction, while the

gastro-esophageal junction was defined by the proximal margin of the gastric folds. The

size of the hiatal hernia was defined by the distance of Z line to diaphragmatic

detachment. The endoscopic graduation of erosive esophagitis was defined by the Los

Angeles classification. (degree A: one or more erosions less than 5 mm long, degree B :

one or more non-continuous erosions more than 5 mm long, degree C: continuous

erosions involving less than 75% of the organ’s circumference degree D: continuous

erosions involving more than 75% of the organ’s circumference).

Biopsies of the esophageal mucosa were performed with the use of an open

biopsy forceps (7 millimeters) with a central stylet. Tissue samples were fixed in 10%

formalin and the biopsied areas were recorded in a chart of the esophagus (annex 3).

117

Histopathological analysis

The fragments of the esophageal mucosa, stained with Hematoxylin-Eosin

(H&E), were analyzed in optical microscope by two pathologists of the Department of

Pathology of Hospital das Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Histological findings

were classified as follows:

1. squamous epithelium

2. presence of basal layer cells reaching more than 15% of the total epithelial layer;

3. elongation of papillae to more than half of the total epithelial layer;

4. exocitosis: presence of neutrophils and/or eosinophils and/or intraepithelial

monocytes;

The histopathological diagnosis of esophagitis was defined by the presence

of one or more findings described above, as established by Flora-Filho et al (9).

Esophagitis was classified into mild, moderate and severe forms of the disease,

according to the degree of the described inflammatory alterations to follow (35):

a) Neutrophils and eosinophils the categories are: mild (average of a cell

for field of high magnification); moderated (more than one cell for field of high

magnification), severe (massive infiltration of inflammatory cells).

b) Lymphocytes the categories are: mild (less than 3 cells for great

increase field); moderated (10 to 50 cells field of high magnification); severe (more

than 50 cells field of high magnification).

Immunohistochemical analysis

The immunohistochemical technique was conducted in the

Immunohistochemistry Laboratory of the Department of Pathology of the

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Two 3-micrometer sections were cut

118

for every paraffin block and mounted in poly-L-lysine coated glass microscope slides.

Sections were then deparaffinized by immersion in xylol for 30 minutes and hydrated

in alcohol, at different concentrations (70 a 100%), at room temperature (ATA).

After hydration in alcohol, sections were washed again under running water

for three minutes and immersed in distilled water for one more minute.

Endogenous peroxidase activity was blocked by immersion of the slides in

hydrogen peroxide at 3% for 10 minutes. After antigen recovery in a microwave oven

(3 cycles at maximum power output (800 W), for 8 minutes and 20 seconds),

blockage of endogenous peroxidase and non-specific reactions was performed.

The primary antibody p53 (DAKO, code M7001 mouse anti p53; clones DO-

7), that recognizes the normal and altered forms of the p53 protein, was incubated for

15 hours, at 4

C, in the 1:700 dilution. The primary antibody Ki-67 (DAKO, code

MU2970397 mouse anti Ki-67; clones MIB-1), that recognizes the nuclear antigen Ki-

67, was incubated for 15 hours, at 4

C, in the 1:400 dilution. Slides were kept in the

refrigerator for 15 to 18 hours (10ºC), washed and bathed in PBS, and treated with

SLAB (Avidin-Biotin). They were washed again and treated with diaminobenzidine

(DAB), which produces a dark brown color reaction. Finally, slides were stained with

Hematoxylin, immersed in ammonia at 2% and alcohol, and mounted.

Material from breast cancer for the p53 protein and from caecal appendix for the Ki-

67 antigen was used as positive control. As negative control a slide was used without the

inclusion of the primary antibody. When the color of the cell nucleus was a dark brown color,

similar to the positive control, in both markers, the cell was considered reactive.

The evaluation of p53 protein expression considered the proportion of

stained cells in a minimum 10 visual fields of high magnification (400X). The

parameter used to define the p53 protein expression was the presence of staining in

119

the nucleus, as shown by Wang et al (25).

The positive cases were those with more than 10% of stained cells by

microscopic field of high magnification. Concerning the Ki-67 (MIB-1) antigen, the

result was assessed by the proliferation index for every case, which is calculated

from the average of stained cells and the total analyzed cells, with a minimum count

of 500 cells, as previously described by Feith et al (33).

The immunohistochemical reading of slides was independently performed by

two pathologists from the Department of Pathology of the HCPA, with experience in

gastrointestinal pathology, and who had no previous knowledge of related clinical

and endoscopically information. In case of disagreement, the final result was

obtained by consensus between both pathologists, as described by Weston et al

(27).

Statistical analysis

The Statistical Package for Social Science (SSPS) 12.0 version was used for

data processing and storage. The statistical test used for comparative analysis of the

p53 protein between the groups was the chi-square test of linear trend. The Ki-67

data was shown in averages and standard deviations. The continuous variables were

compared between categories of the variance analysis (ANOVA). The identification of

differences, whenever present, was made by the Turkey test. Linear correlations of

p53 and Ki-67 variables with their respective groups were analyzed by the Kendall

and Pearson correlation coefficient, respectively. It was considered to be significant

when p<0.05. Kappa test was used to control interobserver agreement.

Ethical considerations

The project of the present study was previously evaluated and approved by

the Group of Research and Post graduation (GPPG) of the HCPA, according to all

120

recommended ethical norms. Patients were subjected to upper digestive tract

endoscopy and placed under the care of the Inpatient Gastroenterology Unit of the

HUSM. All patients gave their free and informed consent with privacy of the collected

data being ensured. The study was conducted in compliance with the norms

established under the resolution 196/96 of the Brazilian Medical Council and

approved by the UFSM Research Ethics Committee and the GPPG/HCPA.

RESULTS

From January 2003 to December 2006, 138 patients who met the inclusion

criteria were examined. Following an anatomopathological examination, the selected

patients were divided into four groups, as follows: 58 patients with normal squamous

epithelium (group 1), 42 patients with mild esophagitis (group 2), 23 patients with

moderate esophagitis (group 3) and 15 patients with severe esophagitis (group 4).

The percent of histologically normal epithelium was 42% (58/138) and of histological

esophagitis was 58% (80/138) in the selected patients.

Immunohistochemical analysis of the 138 patients showed immunoreactivity

in 34 patients (24.6%) for the p53 protein. 4/58 (7%) patients with normal epithelium,

9/42 (21,4%) patients with mild esophagitis, 12/23 (52.2%) of the patients with

moderate esophagitis and 9/15 (60%) of the patients with severe esophagitis were

considered positive for the p53 protein and showed overexpression (more than 10%

stained cells) of p53 protein (Figure 1).

There was a significant difference in p53 protein positive reactivity in group 1

compared to groups 3 and 4 (p<0.001), as well as between group 2 and 4 (p<0.05),

as shown in Figure 2.

121

Figure 1. Microphotography of the immunohistochemical expression of the p53

protein – arrows: normal mucosa (A) (x400), mil esophagitis (B), moderate

esophagitis (C) and severe esophagitis (D), (x 200).

Figure 2. p53 activity in the normal epithelium – mild esophagitis – moderate esophagitis –

severe esophagitis.

A linear correlation was identified between the studied groups for the p53

protein (p<0.001) (Figure 3).

p53(%)

21,4

52,2

100

Normal

epithelium

Mild

esopha

itis

Moderate

esophagitis

Severe

esophagitis

p<0,001

p<0,05

122

Figure 3. Correlation between p53 and normal epithelium – mild esophagitis – moderate

esophagitis – severe esophagitis progression. 0.4 Kendall Coefficient.

Concerning the Ki-67 antigen, the average cell proliferation index measured

in the basal layer was 31.4±24.3%. Averages were 21.3±19.5% in patients with

normal epithelium, 30.8±23.4% in patients with mild esophagitis, 47.1±23.2% in

patients with moderate esophagitis and 48.3±25.7% in patients with severe

esophagitis (Figure 4).

Figure 4. Microphotography of the immunohistochemical expression

of the Ki-67 (MIB-1) antigen – arrows: normal epithelium (A) and mild

esophagitis (B) with a 200X increase, moderate esophagitis (C) and

severe esophagitis (D), 200X increase.

21,4

52,2

Normal

epithelium

Mild esophagitis Moderate

esophagitis

Severe

espohagitis

Immunoreactivity p53 (%)

123

21,33

30,8

47,1

48,3

100

Index Ki-67(%)

The Ki-67 antigen showed increased distribution from group 1 to group 4.

There was a significant difference in the proliferation index (Ki-67) between group 1

and groups 3 and 4, and also between group 2 and groups 3 and 4 (Figure 5).

Figure 5. Ki-67activity in the normal epithelium – mild esophagitis – moderate

esophagitis – severe esophagitis sequence. G1xG3 (p<0.001); G1xG4

(p<0.001); G2xG3 (p=0.026); G2xG4 (p=0.046).

A moderate linear correlation was identified between the proliferation index

Ki-67 (MIB-1) and the normal epithelium- mild esophagitis – moderate esophagitis –

severe esophagitis sequence (p<0.001) (Figure 6).

Figure 6. Correlation between Ki-67 and normal epithelium – mild esophagitis

– moderate esophagitis- severe esophagitis progression. 0.4 Pearson

Coefficient.

Normal

epithelium

Mild

esophagitis

Moderate

eso

itis

Severe

eso

itis

21,3

30,8

47,1

48,3

Normal

epithelium

Mild esophagitis Moderate

esophagitis

Severe

esophagitis

Index Ki-67 (%)

124

DISCUSSION

Chronic inflammatory processes are being increasingly associated to the

development of carcinogenesis in digestive organs (10;12;28;31). According to the

natural history of GERD, 40% of patients with esophagitis show spontaneous

improvement, 50% have persistent esophagitis and around 10% develop Barrett’s

esophagus (29;30). Hillmann et al (31) conducted a prospective study of the impact of

endoscopic findings on patients with Barrett’s esophagus. The authors findings are as

follows: presence of severe erosive esophagitis in initial endoscopic diagnosis;

persistency of inflammatory process in spite of treatment; nodularity of columnar mucosa

and stenosis indicated that patients were at a greater risk of developing dysplastic

alterations and esophageal adenocarcinoma. Boni et al (32) showed in their

imnmunohistochemical study that inflammatory mediators such as IL-8 and MCP-1

stimulated cell proliferation through the direct action of specific receptors on the

esophageal epithelium. Several authors support the theory of association between

inflammatory mediators and histological alterations of the esophageal epithelium (basal

layer hyperplasia and elongation of the papilla) in esophagitis caused by

gastroesophageal reflux, increasing the cell proliferation index, a molecular mechanism

that plays an important role in carcinogenesis of the esophagus (11;12;33).

Method

Upper digestive tract endoscopy is one of the most important methods of

evaluating GERD complications, particularly when associated to histopathological

examination of the esophageal mucosa. Several studies have shown microscopic

alterations of the esophageal mucosa obtained in endoscopic biopsies of patients

with reflux esophagitis (9;34;35). Since the studies of Ismail-Beiji et al (34),

125

complemented by Weinstein et al (36), concerning the definition of the ideal site for

obtaining esophageal fragments, distal esophagus histology findings in patients with

GERD have changed very little (9). In the present study, we have limited the samples

of esophageal mucosa in endoscopically normal patients to the location

approximately 2 centimeters above the squamous-columnar junction, that is, above

the esophagus segments affected by the so-called physiological reflux. Continuous

gastroesophageal reflux leads to various inflammatory alterations of the esophageal

mucosa such as erythema, erosions and ulcers (35). Histologically, elongation of

papillae and basal layer hyperplasia are the regenerative response of the esophageal

epithelium associated to the intense mitotic activity in the basal layer (31). Although

the criteria for diagnosis of GERD (clinical, endoscopic and functional) are very

dynamic, there is consensus that histological esophagitis, alone or with other criteria,

is one of the main findings in the diagnosis of GERD (9).

One of the main limitations of the immunohistochemical method in the

evaluation of the p53 protein expression occurs when mutation of the Tp53 gene

does not determine p53 protein increase, or when there is immunoreactivity in the

absence of mutation of the Tp53 gene (37;38). Although DNA (PCR) sequencing is

the safest method for evaluating the mutation of the Tp53 gene,

immunohistochemistry is considered a more feasible technique for evaluating the

functional state of the Tp53 gene because the stabilization of p53 protein half-life, by

any mechanism, allows its identification by immunohistochemical methods. Another

positive aspect of immunohistochemistry is the fact that it is a simple, largely

available method that allows association of topographic observation of the marker

expression (39).

Our results were obtained by immunohistochemical study of endoscopic

126

biopsy samples of the esophageal mucosa. The relationship between real mutation

and overexpression of p53 protein were not examined now, since this technique does

not allow such observations. The use of DO-7 antibody allows the recognition of the

normal and altered forms of p53 protein. Nevertheless, since the normal p53 protein

has an extremely short half life, positive cell staining has a strong correlation with the

abnormal accumulation of p53 protein. (39). Besides, the progressive increase of the

altered protein concentration may determine a negative (predominant) effect on the

normal protein activity, through the formation of a protein complex: altered protein

versus normal protein (49;50). The present study follows a line of research that

investigates esophageal carcinogenesis in patients with GERD. Other molecular

markers are also being studied in order to throw light on the mechanisms related to

the inflammation – metaplasia- esophageal cancer sequence. Proliferative activity

has been given much emphasis in this regard. It can also be assessed by other

techniques, as follows: incorporation of tritiated thymidine into cell DNA, nuclear

antigen of cell proliferation (PCNA) and immunohistochemical evaluation of Ki-67

nuclear antigen (40). The Ki-67 antigen has become the most common marker in the

evaluation of cell proliferation, due to its great accuracy and better technical feasibility

compared to the previously mentioned methods. Though not very often,

measurement of the referred antigen by image analysis has been reported. The

conventional count using the percent of marked cells/total evaluated cells is largely

performed and used to quantify the proliferative activity of a given tumor or tissue.

One of the limitations to the use of the Ki-67 monoclonal antibody is the loss of the

nuclear antigen in samples fixed in formalin, which makes it necessary to use fresh

tissue samples. However, the use of MIB-1 clone, a real anti-Ki67, makes it possible

to detect this antigen in microwave-processed formalin fixed paraffin section (23;24).

127

Results

The molecular events that characterize the inflammation-metaplasia-

dysplasia-adenocarcinoma sequence are not yet completely clear (12).

Adenocarcinoma of the esophagus is the most common esophageal cancer in the

United States and in Western Europe (41-43). One of the main hypotheses to explain

the fast growth of adenocarcinoma in developed countries is the prevalence of

GERD. Thus, one of the mechanisms involved in the carcinogenesis process in

individuals with gastroesophageal reflux would be the increase of oxidative stress on

the esophageal mucosa (44). Many patients with adenocarcinoma of the esophagus

have a history of chronic gastroesophageal reflux, and the increased production of

oxygen free radicals in the presence of esophagitis determine a greater damage to

cell DNA (12). Also, the permanent stimulus of cell proliferation induced by reflux is

an important physiopathological factor in the progression of esophageal

carcinogenesis (45). The choice of p53 and Ki-67 (MIB-1) molecular markers in the

present study was due to the important role played by both markers in cell

proliferation control and their participation in the process of esophageal

carcinogenesis. It was found in the present study that the squamous mucosa of the

esophagus, when affected by inflammatory process caused by gastroesophageal

reflux, showed a p53 protein expression of 7% in the normal squamous mucosa,

21.4% in mild esophagitis, 52.2% in moderate esophagitis and 60% in severe

esophagitis. We detected positive reactivity for the p53 protein in 4 patients with

squamous epithelium without histological. The overexpression of p53 protein is

seldom detected in the normal mucosa of the esophagus. Some authors have

reported the accumulation of this protein in the normal mucosa and in basal layer

hyperplasia of the esophageal epithelium in patients at higher risk of developing

128

esophageal adenocarcinoma. Also, it is known that even in the absence of mucosal

lesions, chronic reflux may produce proliferative and molecular alterations (15;25).

Concerning the stratification of esophagitis intensity levels, of immunohistochemical

demonstrated a higher prevalence of positive cases in the moderate esophagitis and

severe esophagitis groups compared to mild esophagitis and normal squamous

epithelium groups, also indicating an evident correlation between the p53 protein

overexpression and the progression of the histological degree of chronic esophagitis.

According to these findings, there was a clear correlation between the degree of

esophagitis severity and the initial alterations in this marker before the occurrence of

premalignant morphological alterations of the esophageal mucosa.

Fagundes et al (20) have studied the immunohistochemical expression of the

p53 protein in the esophageal mucosa in 182 patients (alcoholics/smokers) with no

esophageal symptoms but at high risk of epidermoid carcinoma of the esophagus

and in 20 healthy volunteers (non-smokers and non-alcoholics). All participants were

subjected to endoscopy study or the esophagus associated to chromoscopy with a

3% Lugol solution. Overexpression of p53 protein was detected in 12% of the

patients with normal squamous mucosa, 14% of patients with mild esophagitis, 33%

of patients with severe esophagitis, 36% in patients with low grade dysplasia and

100% in patients with epidermoid carcinoma of the esophagus. The authors

demonstrated association of p53 expression in the esophageal mucosa and its

progressive increase to worsening of chronic esophagitis, dysplasia and esophageal

cancer.

In the present study, the average expression of Ki-67 antigen in basal layer in

patients with normal epithelium was 21.4%, in accordance to the literature (26;46). In

their study of the (Ki-67) proliferation index in the squamous mucosa, metaplastic

129

columnar mucosa and gastric mucosa of 23 patients with Barrett’s esophagus, Iftihar

et al (46) detected proliferation score over 15% in histologically normal samples of

the esophageal epithelium. In a prospective study, Ribeiro et al (47) assessed the

degree of inflammation, hyperplasia and dysplasia in 128 endoscopic samples of 16

patients with achalasia in an advanced stage. They concluded that inflammation in

those patients correlated to the overexpression of p53 protein and to the increase of

cell proliferation index (PCNA). All studied samples expressed positive reactivity for

PCNA in the basal layer of the esophageal epithelium. Our study has also

demonstrated that cell proliferation measured by the Ki-67 (MIB-1) antigen occurred

only in the basal layer in all groups except for 6 patients who showed positive

reactivity in the middle layer of the proliferative compartment of the squamous

epithelium of the esophagus: mild esophagitis – 2 cases, moderate esophagitis – 3

cases and severe esophagitis – 1 case.

The proliferation index, as measured by the Ki-67, in patients with mild,

moderate and severe esophagitis was 30.8%, 47.1% and 48.3%, respectively. The

values found are more significant that those in the medical literature, which varied

between 10 and 24% in most of the analyzed samples of esophagitis, concerning the

proliferation indexes measured by the Ki-67 (48). Such discrepancies may be partly

caused by methodological differences between studies, e.g. small and not very

representative samples and/or studies based on different histological sites of the

esophagectomies, where one patient provided several histological sections.

Variations in the immunohistochemical method such as the use of different types of

antibodies and marker measurement can also explain the divergence of results. In

our study, the obtaining of fragments from the esophageal mucosa was performed by

a biopsy forceps with central stylet, which allows greater accuracy and use of a larger

130

portion of esophageal tissue, and also a number of samples based on the same

number of patients. Each patient was given a unique diagnosis.

Our study demonstrated a significant correlation between the increase of

proliferative activity measured by the Ki-67 antigen and the different levels of chronic

esophagitis. There was a difference in the proliferation index between patients with

mild esophagitis and patients with moderate and severe esophagitis (p<0.05). The

immunohistochemical study conducted by Nishiyama et al (10) examined, by means

of endoscopic biopsies, regulation proteins of the cell cycle (p21, p27 and Ki-67), in

46 patients with evidence of reflux and in 10 normal subjects. Cell proliferation was

mostly detected in the basal layer of the esophageal epithelium, and the authors

showed a significant correlation between immunoreactivity of the Ki-67 antigen in the

proliferative compartments of the squamous mucosa and histological and endoscopic

alterations of esophagitis. Our results corroborate such findings indicating that the Ki-

67 proliferation index, obtained by endoscopic samples, was associated to

inflammatory lesions of the esophageal mucosa, specially in the most severe cases

of chronic esophagitis caused by gastroesophageal reflux.

The impact of physiopathological factors on molecular alterations of the

esophageal mucosa affected by esophagitis are not completely clear. Few studies

have addressed squamous mucosa abnormalities in patients with NERD and erosive

disease. Most studies relate Barrett’s esophagus and its progression up to

adenocarcinoma of the esophagus. A better understanding of molecular biology

during the initial stages of GERD may help establishing a more suitable therapeutics

of control of inflammatory mediators on the esophageal mucosa, prior to occurrence

of molecular alterations, in an attempt to prevent progression of GERD to metaplasia

and then esophageal adenocarcinoma.

131

Our findings led us to conclude that the p53 protein expression and the

proliferation index measured by the Ki-67 (MIB-1) antigen correlated to histological

findings of the esophageal mucosa associated to the inflammatory process, getting

progressively higher as esophagitis gets progressively worse. Besides, two aspects

were clarified, as follows: first, there is an association between the increase of

proliferation and molecular alteration and, second, such alterations become more

evident in the moderate esophagitis stage. These results may have an impact on the

required level of endoscopic follow-up of patients, aiming at the early diagnosis of

their diseases. The prospective use of these markers in patients with moderate and

severe esophagitis is likely to provide a better control and also allow intervention to

prevent the sequence of events that lead to adenocarcinoma.

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