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G
RACIELA
A
PARECIDA
B
ROCARDO
Avaliação do comprimento dos telômeros em células
infectadas pelo vírus HTLV-I utilizando a técnica Hibridização
in situ Fluorescente e Citometria de Fluxo (Flow-FISH)
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Área de concentração: Distúrbios do
Crescimento Celular, Hemodinâmicos e da
Hemostasia
Orientadora: Dra. Juliana Pereira
São Paulo
2008
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G
RACIELA
A
PARECIDA
B
ROCARDO
Avaliação do comprimento dos telômeros em células
infectadas pelo vírus HTLV-I utilizando a técnica Hibridização
in situ Fluorescente e Citometria de Fluxo (Flow-FISH)
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Área de concentração: Distúrbios do
Crescimento Celular, Hemodinâmicos e da
Hemostasia
Orientadora: Dra. Juliana Pereira
São Paulo
2008
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Dedico este trabalho aos meus pais
Aristides e Maria Marlene, por sempre
me incentivarem aos estudos, por
serem os meus exemplos de
honestidade e fortaleza, pelo amor
incondicional e pela segurança de ter
um braço forte e amigo ao meu lado.
Agradecimentos
À minha orientadora Dra. Juliana Pereira, por quem tenho grande
sentimento de admiração e respeito, agradeço pelo carinho, oportunidade e
orientação na realização deste trabalho.
À Dra Beatriz e Dra. Gracia, as quais tenho enorme carinho e
admiração, agradeço pela confiança, incentivo e oportunidade de realização
deste trabalho.
Ao Dr. Luis Fernando Pracchia que gentilmente me auxiliou nas
análises estatísticas do meu trabalho
Aos colegas de trabalho Carla, Adriano, Lis, Lorena, Satiko e Nadia
pelo suporte na realização das tarefas de trabalho, sem o qual seria inviável
realizar esta dissertação.
Aos alunos e estagiários do Laboratório de Imunopatologia,
especialmente a Ana Luísa, pela amizade e colaboração no
desenvolvimento deste trabalho.
Às amigas Deise e Sheila, pelo apoio e carinho que recebi nos
momentos íngremes da caminhada.
Ao Ambulatório de HTLV-I Hospital das Clínicas da FMUSP pelo
auxílio na seleção dos portadores do vírus HTLV-I.
À D. Clara e Alzira que sempre prontamente e carinhosamente
realizavam as coletas dos indivíduos estudados.
Ao Setor de Aférese e Doadores Especiais da Fundação Pró Sangue
- Hemocentro de São Paulo que carinhosamente me auxiliou na coleta dos
doadores de aférese.
Ao serviço de Biologia Molecular da Divisão de Sorologia da
Fundação Pró-sangue pela presteza em fornecer os resultados de carga
proviral dos indivíduos estudados, possibilitando a complementação deste
estudo.
Aos amigos do Laboratório de Imunologia do InCor, em especial à
Sandra Drigo, Simone, Iolanda, Sandra Emiko, Elcio, Carlos e Kellen
pelo auxílio à expansão das células de cultura e esclarecimento de dúvidas,
além dos momentos de descontração.
Aos amigos da Superintendência da Pesquisa, pelos auxílios à
pesquisa, pela descontração e amizade.
Ao Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo pelo apoio financeiro, fundamental
para a realização deste projeto de pesquisa.
À Biogen, representante da empresa Dako, pela cooperação científica
estabelecida para a aquisição dos reagentes pertencentes aos
procedimentos de Fluorescence in situ hybridization.
À Teresinha dos Anjos, carinhosamente chamada de Tê, por ser
uma pessoa maravilhosa e por sempre ter uma palavra amiga.
As minhas amigas Carla e Débora, que vivenciaram boa parte da
realização deste projeto e me apoiaram nos momentos difíceis, todo meu
carinho.
Aos amigos do Fretado, em especial Sarita, Vera e Sr. Rubens,
pelas conversas agradáveis e palavras reconfortantes nos momentos mais
difíceis, elementos que me encorajaram na realização deste sonho.
Aos amigos Ana Flávia, Ana Marcia, Marcos, Danielle e Ricardo
Sebem, a amizade de vocês é um bem precioso, indispensável para
completar minha vida.
A amiga Regina, pelo apoio e incentivo nos caminhos que trilhei.
A Lécio Jardim Bidu, sua amizade e atenção me fortaleceram na
caminhada, seu incentivo salientou minha capacidade, sua mão amiga me
trouxe segurança, seu amor e carinho completaram minha felicidade.
Aos meus irmãos Marcelo, Aline e Josiane e, aos meus sobrinhos
Laura, Letícia e Francisco, que mesmo estando distantes fisicamente
completaram minha vida pela presença de coração.
A todos que participaram desta etapa tão importante da minha vida,
pelas palavras e expressões de carinho, incentivos e atenções, contribuições
essenciais para meu crescimento profissional e pessoal.
Sumário
Lista de Abreviaturas
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Summary
1. INTRODUÇÂO.......................................................................................... 1
2. REVISÃO DA LITERATURA..................................................................... 6
2.1 Vírus Linfotrópico T Humano tipo I (HTLV-I)........................................... 7
2.1.1 Histórico................................................................................................
7
2.1.2 Epidemiologia....................................................................................... 7
2.1.3 Transmissão do vírus HTLV e sua relação com ATL e
HAM/TSP.......................................................................................................
9
2.1.4 Formas de prevenção da infecção pelo vírus HTLV ........................... 10
2.1.5 Fisiopatologia da infecção pelo vírus HTLV-I ...................................... 10
2.1.6 Diagnóstico Laboratorial do vírus HTLV-I.............................................
13
2.1.7 Carga Proviral.......................................................................................
14
2.1.8 ATL....................................................................................................... 16
2.1.8.1 Epidemiologia.................................................................................... 16
2.1.8.2 Fisiopatologia.................................................................................... 17
2.1.8.3 Oncoproteína Tax e patogênese da ATL.......................................... 18
2.1.8.4 Critério Diagnóstico de ATL...............................................................
24
2.1.8.5 Formas de ATL e relação com diagnóstico....................................... 28
2.1.8.6 Tratamento da ATL............................................................................
30
2.1.8.7 Complicações associadas à ATL...................................................... 31
2.2 O telômero............................................................................................... 31
2.2.1 Histórico................................................................................................
31
2.2.2 A estrutura telomérica.......................................................................... 32
2.2.3 Problema de replicação final e suas conseqüências........................... 36
2.2.4 Senescência celular............................................................................. 40
2.2.5 Telomerase...........................................................................................
40
2.2.6 Telômero e resposta imune.................................................................. 43
2.2.7 Implicação do telômero e desenvolvimento.........................................
45
2.2.8 Implicação dos telômeros em doenças humanas................................ 46
2.3 Determinação do comprimento telomérico.............................................. 51
3. OBJETIVOS.............................................................................................. 55
4. MÉTODOS................................................................................................ 57
4.1 Casuística................................................................................................ 58
4.2 Métodos................................................................................................... 59
4.2.1 Coleta e processamento das amostras................................................ 59
4.2.2 Separação celular.................................................................................
61
4.2.3 Hibridização in situ Fluorescente..........................................................
62
4.2.4 Citometria de Fluxo.............................................................................. 65
4.2.4.1 FluoroSphere..................................................................................... 66
4.2.4.2 Aquisição e análise das reações de mensuramento do
comprimento do telômero.............................................................................. 67
4.2.5 Avaliação do comprimento dos telômeros............................................
68
4.2.5.1 Índice de DNA................................................................................... 70
4.2.6 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para
determinação de carga proviral..................................................................... 71
4.3 Análise estatística....................................................................................
71
5. RESULTADOS.......................................................................................... 73
5.1 Análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD4+ de
portadores do vírus HTLV-I e indivíduos saudáveis......................................
80
5.2 Análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD8+ de
portadores do vírus HTLV-I e indivíduos saudáveis......................................
81
5.3 Análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD4+ em
portadores de ATL e indivíduos saudáveis .................................................. 83
5.4 Análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD8+ de
portadores de ATL e indivíduos saudáveis .................................................. 85
5.5 Análise do comprimento telomérico dos subtipos linfocitários TCD4+ e
TCD8+ em portadores de ATL e portadores do vírus HTLV-I....................... 86
5.6 Análise da relação do comprimento telomérico entre os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ dos portadores do vírus HTLV-
I......................................................................................................................
88
5.7 Análise da relação do comprimento telomérico entre os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ dos portadores de ATL................................... 89
5.8 Análise da relação do comprimento telomérico entre os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ dos indivíduos saudáveis............................... 89
5.9 Avaliação dos efeitos da idade no comprimento de telômero de
portadores do vírus HTLV-I...........................................................................
90
5.10 Avaliação dos efeitos da idade no comprimento de telômero de
portadores de ATL.........................................................................................
95
5.11 Avaliação dos efeitos da idade no comprimento de telômero entre
portadores do vírus HTLV-I e portadores de ATL.........................................
99
5.12 Análise do comprimento telomérico, forma clínica de ATL e DNA
Ploidia em doentes........................................................................................
102
5.13 O estudo dos valores de comprimento telomérico do subtipo
linfocitário TCD4+ em função da carga proviral............................................
104
5.14 O estudo dos valores de comprimento telomérico do subtipo
linfocitário TCD8+ em função da carga proviral............................................
105
5.15 Definição do potencial diagnóstico do comprimento do telômero......... 106
5.16. Validação do protocolo nº 3..................................................................
108
5.17 Valores de referência de comprimento de telômero para os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+.........................................................................
111
6. DISCUSSÃO..............................................................................................
113
7. CONCLUSÕES..........................................................................................
133
8. ANEXOS....................................................................................................
135
9. REFERÊNCIAS......................................................................................... 155
Lista de Abreviaturas
AA – Anemia aplásica
AcMo - Anticorpo monoclonal
AICD - Morte celular induzida por ativação
ALT - Alternative Lengthening of Telomeres
APC - Complexo promotor de anáfase
AS β-Gal - Biomarcador associado à senescência
ATL - Leucemia/linfoma de células T do adulto
AZT – Azidotimidina ou 3’-azido-2’,3’-dideoxythymidine ou zidovudina
BSA - Albumina bovina fração V
CAPPesq - Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa
Cdk - Quinases dependentes de ciclina
CDKI - Inibidores de CDK
CEN - Chicken Erythrocyte Nuclei
CREB – Elementos responsivos ao AMP cíclico
CTL – Linfócitos T citotóxicos
CTN - Calf Thymocyte Nuclei
DHL – Desidrogenase lática
DMSO – Dimethylsulfoxide
dNTP - Deoxinucleosideo trifosfato
ECACC - European Collection of Cell Cultures
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
env - Gene de envelope
FasL - Fas ligante
FBS - Soro Fetal Bovino
FDA - Food and Drug Administration
FISH - Hibridização in situ fluorescente
FITC - Isoticioanato de fluoresceína
Flow – Citometria de fluxo
FSC - Dispersão frontal da luz
gag - Antígeno grupo específico
Glut-1 - Transportador de glicose 1
GM-CFS - Fator estimulador de colônia de granulócito e macrófago
GPI - Glicosilfosfatidilinositol
HAM/TSP - Mielopatia Associada ao HTLV-I/ Paraparesia Espástica Tropical
HC-FMUSP - Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo
HIV - Vírus da imunodeficiência humana
HLA – Antígenos leucocitários humanos
HPN - Hemoglobinúria paroxística noturna
hTERT - Subunidade catalítica da telomerase
HTLV-I - Vírus linfotrópico T humano do tipo 1
IL – Interleucina
IMF - Intensidade média de fluorescência
Kb - kilobases
LCTC - Linfoma de células T cutâneo
LLC - Leucemia linfóide crônica
LMA - Leucemia Mielóide Aguda
LMC - Leucemia mielóide crônica
LTR - Long Terminal Repeats
MESF - Moléculas de fluorocromo solúvel equivalente
MF - Micose fungóide
MHC – Complexo principal de histocompatibilidade
MM - Mieloma múltiplo
MO - Medula óssea
NF-κB – Fator nuclear κB
PBMC - Células mononucleares do sangue periférico
PBS - Solução salina tamponada com fosfato
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PE – Phycoerythrin
PI - Iodeto de propídeo
pro/pol - Protease/polimerase
PTH-rP - Peptídeo relacionado ao hormônio da paratireóide
Rb - Proteína do retinoblastoma
RC – Remissão completa
ROC - Receive Operator Caracteristic Curve
S. stercoralis - Strongyloides stercoralis
SB - Southern blot
SMD – Síndrome mielodisplásica
SNC - Sistema nervoso central
SRF – Fator responsivo ao soro
SS - Síndrome de Sézary
SSC - Dispersão lateral da luz
T.A. – Temperatura ambiente
TAC - Cadeia α do receptor de IL-2
TCR – Receptor de célula T
TGI - Trato gastrointestinal
TNF-α - Fator de necrose tumoral α
TRF - Fragmentos de restrição terminal
Lista de Figuras
Figura 1 -
Infecção / proliferação do vírus HTLV I in vivo e
transformação leucêmica (ATL)............................................... 13
Figura 2 - Ações da proteína viral Tax na proliferação
celular.......................................................................................
20
Figura 3 - Distensão de sangue periférico em aumento de 1000X
evidenciando Flower cell de paciente com ATL forma aguda,
acompanhado no Serviço de Hematologia do Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo........................................................................................ 25
Figura 4 - Citogramas apresentando controle isotípico (A), intensidade
de expressão dos antígenos CD3 e CD4 (B), CD25 (C) e
CD7 (D) em paciente com ATL forma aguda, acompanhado
no Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo...........
26
Figura 5 - Organização de cromossomo humano.................................... 34
Figura 6 - Heterogeneidade do comprimento do telômero devido à
proliferação celular................................................................... 39
Figura 7 - Células de linhagem 1301 em cultura celular (aumento de
40X e 100X)............................................................................. 63
Figura 8 - Valores de idade dos portadores do vírus e dos indivíduos
saudáveis.................................................................................
74
Figura 9 - Valores de idade dos portadores de ATL e dos indivíduos
saudáveis.................................................................................
75
Figura 10 - Valores de idade dos portadores do vírus e portadores de
ATL...........................................................................................
75
Figura 11 - Eficiência da separação celular dos subtipos linfocitários
TCD4+ e TCD8+......................................................................
76
Figura 12 - Histograma apresentando as IMF para cada população de
pérola de calibração (A). Valores MESF e de IMF para cada
população de pérola de calibração (B). Curva de regressão
linear estabelecida pela correlação entre os valores MESF e
IMF (C)..................................................................................... 77
Figura 13 - Procedimento com solução de hibridização sem sonda
telomérica. Citograma de FSC e SSC (A). Citograma
apresentando no eixo das abscissas a marcação de DNA
com PI e na ordenada marcação das células com solução de
hibridização (B). Histograma (vermelho) apresentando a IMF
das células em estudo e estatística do histograma das
células em estudo (G1=R1) (C). Histograma (verde)
apresentando a IMF das células de linhagem 1301 e a
estatística do histograma das células de linhagem 1301
(G2=R2) (D)............................................................................. 79
Figura 14 - Procedimento utilizando sonda telomérica conjugada a FITC.
Citograma de FSC e SSC (A). Citograma apresentando no
eixo das abscissas a marcação de DNA com PI e no eixo
das ordenadas marcação das células com sonda telomérica
(B). Histograma (vermelho) apresentando a IMF das células
em estudo e a estatística do histograma das células em
estudo (G1=R1) (C). Histograma (verde) apresentando a IMF
das células de linhagem 1301 e a estatística do histograma
das células de linhagem 1301 (G2=R2) (D).............................
80
Figura 15 - Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido
pelo protocolo nº 1 para portadores do vírus e indivíduos
saudáveis, nos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+............ 91
Figura 16 - Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido
pelo protocolo nº 2 para portadores do vírus e indivíduos
saudáveis, nos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+............ 93
Figura 17 - Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido
pelo protocolo nº 3 (x 100) para portadores do vírus e
indivíduos saudáveis, nos subtipos linfocitários TCD4+ e
TCD8+...................................................................................... 94
Figura 18 - Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido
pelo protocolo nº 1 para portadores de ATL e indivíduos
saudáveis, nos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+............ 96
Figura 19 - Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido
pelo protocolo nº 2 para portadores de ATL e indivíduos
saudáveis, nos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+............ 97
Figura 20 - Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido
pelo protocolo nº 3 (X 100) para portadores de ATL e
indivíduos saudáveis, nos subtipos linfocitários TCD4+ e
TCD8+...................................................................................... 98
Figura 21 - Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido
pelo protocolo nº 1 para portadores de ATL e portadores do
vírus, nos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+.................... 100
Figura 22 - Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido
pelo protocolo nº 2 para portadores de ATL e portadores do
vírus, nos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+.................... 101
Figura 23 - Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido
pelo protocolo nº 3 (X 100) para portadores de ATL e
portadores do vírus, nos subtipos linfocitários TCD4+ e
TCD8+...................................................................................... 102
Figura 24 - Curvas ROC para os subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+
de portadores do vírus HTLV-I, avaliando os três protocolos
empregados............................................................................. 107
Figura 25 - Curvas ROC para os subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+
de portadores de ATL, avaliando os três protocolos
empregados.............................................................................
108
Figura 26 - Regressão e ajuste do protocolo nº 3 (X 100) para valores de
comprimento de telômero obtidos por meio do protocolo nº 1.
109
Figura 27 - Regressão e ajuste do protocolo nº 3 (X 100) para valores de
comprimento de telômero obtidos por meio do protocolo nº 2.
110
Figura 28 - Regressão e ajuste do protocolo nº 2 para valores de
comprimento de telômero obtidos por meio do protocolo nº 1.
111
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Critérios para definição de ATL....................................................
27
Tabela 2 - Análise das aquisições em duplicata em IMF e dos valores de
fluorescência telomérica em IMF das células de linhagem 1301
utilizadas nos experimentos analisados por períodos..................
78
Tabela 3 - Valores do comprimento de telômero nos subtipos linfocitários
TCD4+ e TCD8+ em portadores do vírus HTLV-I e
indivíduos saudáveis pelos protocolos nº 1, nº 2 (MESF) e nº
3................................................................................................... 83
Tabela 4 - Valores de comprimento telomérico nos subtipos linfocitários
TCD4+ e TCD8+ em portadores de ATL e indivíduos saudáveis
pelos protocolos nº 1, nº 2 (em MESF) e nº 3.............................. 86
Tabela 5 - Valores de comprimento telomérico dos subtipos linfocitários
TCD4+ e TCD8+ dos portadores de ATL e portadores do vírus
HTLV-I+ pelos protocolos nº 1, nº 2 (em MESF) e nº 3............... 87
Tabela 6 - Valores do comprimento telomérico entre os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ dos portadores do vírus HTLV-I
pelas técnicas nº 1, nº 2 (em MESF) e nº 3................................. 88
Tabela 7 - Valores de comprimento telomérico entre os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ de portadores de ATL pelos
protocolos nº 1, nº 2 (em MESF) e nº 3........................................
89
Tabela 8 - Valores de comprimento telomérico entre os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ de indivíduos saudáveis pelos
protocolos nº 1, nº 2 (em MESF) e nº 3........................................
90
Tabela 9 - Valores de idade, índice de DNA e comprimento telomérico de
portadores de ATL por subtipo linfocitário e forma clínica da
doença..........................................................................................
104
Tabela 10 - Comparação da influência da carga viral no comprimento do
telômero........................................................................................
106
Tabela 11 - Valores de referência de comprimento de telômero para os
subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ em indivíduos saudáveis,
segundo as diferentes faixas etárias, estabelecidos no
Laboratório de Imunopatologia do HC-FMUSP............................
112
Resumo
Brocardo GA. Avaliação do comprimento dos telômeros em células
infectadas pelo vírus HTLV-I utilizando a técnica Hibridização in situ
Fluorescente e Citometria de Fluxo (Flow-FISH) [dissertação]. São Paulo:
Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2008. 177p.
INTRODUÇÃO: A Leucemia/Linfoma de células T do adulto (ATL) é uma doença
linfoproliferativa crônica com transformação clonal predominantemente de linfócitos
TCD4+, causada pelo vírus linfotrópico T humano do tipo I (HTLV-I). A ATL se
desenvolve em 3-5% dos portadores do vírus HTLV-I, após longo período de
latência clínica, acompanhado de expansão clonal dos linfócitos infectados. As
células da ATL apresentam várias anormalidades cromossômicas, semelhantes
àquelas resultantes de disfunção telomérica e a instabilidade genômica contribui
para o desenvolvimento da ATL. Para entender o papel do encurtamento telomérico
na oncogênese da ATL, avaliamos o comprimento dos telômeros de linfócitos TCD4
e TCD8 em portadores do vírus HTLV-I e em portadores de ATL. RESULTADOS:
Não foi evidenciada diferença significativa no comprimento de telômero dos
subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ entre portadores do vírus HTLV-I e indivíduos
saudáveis, assim como, entre portadores de ATL e indivíduos saudáveis.
Entretanto, quando incluímos na análise a variável idade, evidenciamos redução
significativa do comprimento do telômero com a idade em portadores do vírus
HTLV-I e maior perda telomérica nos portadores do vírus HTLV-I e portadores de
ATL em relação aos indivíduos saudáveis de mesma idade, embora a diferença
entre os grupos não atinja o nível de significância estatística. Estes resultados
podem ser explicados pelo fato de que as células dos indivíduos infectados pelo
vírus HTLV-I apresentam maior taxa proliferativa devido à ação viral, mesmo em
estado de latência clínica. A perda telomérica em função da idade nos portadores
de ATL não demostrou-se significativa devido ao pequeno número de casos
analisados em decorrência da raridade da doença. Entretanto, quando analisamos
o comprimento telomérico nos subtipos linfocitários de portadores de ATL,
evidenciamos acentuada perda telomérica na célula maligna e valores próximos ao
limite superior esperado para a idade no subtipo linfocitário não transformado,
demonstrando que a disfunção telomérica deve estar associada à transformação
celular. Estabelecemos valores de referência de comprimento telomérico dos
subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ de indivíduos saudáveis, definidos por faixa
etária. CONCLUSÃO: Nossos resultados demonstram que portadores do vírus
HTLV-I apresentam maior perda telomérica em função da idade que indivíduos
saudáveis, mas, sem refletir significância estatística e clínica. Entretanto,
portadores de ATL apresentam perda acentuada de comprimento de telômero na
célula maligna, demonstrando que a determinação do comprimento de telômero
pode auxiliar futuramente o monitoramento dos indivíduos infectados pelo HTLV-I,
indicando conversão à doença.
Descritores: Vírus Linfotrópico de células T humanas tipo 1, Leucemia-linfoma
de células T do adulto, Telômero, Hibridização in situ Fluorescente, Citometria
de Fluxo.
Summary
Brocardo, GA. Telomere length measurements on Human T-cell leukemia
virus type I (HTLV-I) infected cells using fluorescence in situ hybridization
and flow cytometry (Flow-FISH) [Dissertation]. São Paulo: Faculdade de
Medicina, Universidade de São Paulo; 2008. 177p.
INTRODUCTION: Adult T-cell Leukemia/Lymphoma (ATL) is a chronic
lymphproliferative disease with clonal transformation predominantly of the TCD4+
lymphocytes, caused by the Human T lymphotropic virus type-I (HTLV-I). ATL
develops itself in 3-5% of HTLV-I carriers after a long period of clinical latency
accompanied by clonal expansion of the infected lymphocytes. The ATL cells
present several chromosomic abnormalities, similar to those resulting from telomere
dysfunction and the genomic instability contributes to the development of ATL. In
order to understanding the role of telomeric shortening in the ATL oncogenesis, we
assessed the length of telomeres of lymphocytes TCD4 and TCD8 in HTLV-I
carriers and in ATL carriers. RESULTS: No significant difference was evidentiated in
the telomere length of lymphocytary subtypes TCD4+ and TCD8+ between HTLV-I
carriers and healthy subjects, as well as, between ATL carriers and healthy
subjects. However, when the age variable was included in the analysis, we
observed significant decrease of telomeric length with age progression in HTLV-I
carriers and higher telomeric loss in HTLV-I carriers and ATL carriers when
compared to healthy subjects of the same age, although the difference between
groups does not reach the level of statistic relevance. These results may be
explained by the fact that the cells of HTLV-I infected subjects present higher
proliferative rate due to the viral action, even during clinical latency. Age-related
telomeric loss in ATL carriers did not manifest itself as significant due to the small
number of analyzed cases as a consequence of the disease’s rareness. However,
when the telomere length on the lymphocytary subtypes of ATL carriers was
analyzed, we evidentiated accentuated telomeric loss in the malignant cell and
values close to the age-expected upper limit in the nontransformed lymphocytary
subtype, demonstrating that the telomere dysfunction may be associated to the
cellular transformation. We have determined reference values of telomere length for
lymphocytary subtypes TCD4+ and TCD8+ on healthy subjects, defined by age
range. CONCLUSION: Our results demonstrate that HTLV-I carriers present higher
telomeric loss due to age than healthy subjects, however, with no reflection in
clinical and statistical significance. Nevertheless, ATL carriers present accentuated
loss of telomere length in the malignant cell, demonstrating that the telomere length
determination may, in the future, assist in the monitoring of HTLV-I infected
subjects, indicating conversion to the disease.
Descriptors: Human T-lymphotropic virus 1, Leukemia-Lymphoma T-cell acute
HTLV-I-associated, Telomere, In Situ Hybridization Fluorescence, Flow Cytometry
1. Introdução
Introdução
2
Durante o século 20, várias pesquisas foram realizadas com o objetivo
de identificar vírus oncogênicos humanos. No início da década de 80,
pesquisadores americanos analisando uma linhagem de célula T obtida de
paciente com linfoma de células T cutâneo (LCTC), descreveram o
vírus
linfotrópico T Humano do tipo I (HTLV-I) (Poiesz et al., 1980). Neste mesmo
período, pesquisadores japoneses descreveram um tipo de leucemia que
apresentava freqüente infiltração do sangue periférico por células
pleomórficas e membrana nuclear irregular, denominada de
leucemia/linfoma de célula T do adulto (ATL). A análise de amostras destes
pacientes demonstrou anticorpos anti-HTLV-I e o retrovírus HTLV-I. Este foi
o primeiro relato associando um retrovírus e um câncer humano (Yoshida et
al., 1984).
O vírus HTLV-I é transmitido pela transferência de linfócitos TCD4+
infectados verticalmente via aleitamento materno; ou horizontalmente por via
sexual, principalmente de homem para mulher e, parenteral, por transfusão
de sangue e derivados, agulha e seringa contaminada (Kannagi et al., 2004;
Li et al., 2004).
Cerca de 3% a 5% dos portadores do vírus HTLV-I desenvolvem
alguma doença associada ao vírus (Azran et al., 2004; Semmes et al., 2005),
sendo as mais comuns ATL e a mielopatia associada ao HTLV-I ou
paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) (Barmak et al., 2003; Azran et al.,
2004). Os sinais e sintomas podem demorar anos ou décadas para se
manifestarem após a infecção (Azran et al., 2004).
Introdução
3
A ATL é uma doença linfoproliferativa crônica T, em geral de fenótipo
TCD4+ em função do tropismo viral (Barmak et al., 2003). Embora acometa
1% a 5% dos indivíduos infectados e, se desenvolva após longo período de
exposição ao vírus, tem prognóstico ruim e curta sobrevida. Apesar de ter
mecanismo iniciador obscuro, inicialmente há integração do vírus ao genoma
da célula infectada e posterior transformação leucêmica (Marriott & Semmes,
2005).
A
baixa incidência e o longo tempo de latência da ATL sugerem que,
em adição à infecção viral, eventos genéticos secundários tenham papel
importante em seu desenvolvimento e/ou progressão (Marriott & Semmes,
2005). Estudos demonstraram que diferentemente do encontrado em outras
leucemias e linfomas, as células da ATL apresentam anormalidade
cromossômica complexa, à semelhança das neoplasias resultantes de
disfunção telomérica, frequentemente encontradas em tumor sólido (Azran et
al., 2004).
O telômero é um complexo nucleoprotéico localizado no final do
cromossomo, destinado a proteger esta região da degradação enzimática
(Dahse et al., 1997), facilitar a replicação (Cerone et al., 2001) e manter a
estabilidade cromossômica (Meeker et al., 2002). Em cada divisão celular há
perda de DNA cromossomal do telômero e, quando este alcança
comprimento crítico, a célula pára de proliferar e adquire fenótipo de
senescência (Dahse et al., 1997).
Existem evidências de que a oncoproteína Tax, específica do HTLV-I,
desempenha papel fundamental no desenvolvimento da ATL. Por ação da
Introdução
4
Tax, a célula infectada pelo vírus permanece em estado metabolicamente
ativo, favorecendo a replicação viral e conseqüente perda telomérica. Essa
oncoproteína também reprime a expressão de genes envolvidos com
apoptose e reparo do DNA. Estas ações conduzem a célula para um estado
proliferativo que, quando têm a expressão de genes de apoptose e de reparo
do DNA bloqueados, conseguem ultrapassar o limite crítico de perda
telomérica, gerando ambiente facilitador de transformação celular e de
desenvolvimento da ATL (Barmak et al., 2003).
Desta forma, é provável que o encurtamento telomérico seja um do
passo importante na oncogênese da ATL. A partir desta premissa, surgem
algumas dúvidas ainda não respondidas na literatura.
O longo período de latência viral promove alteração do comprimento do
telômero do linfócito TCD4+, habitualmente infectado pelo HTLV-I e do
linfócito TCD8+, um dos responsáveis pela resposta imune anti-viral?
Há diferença no comprimento telomérico do linfócito TCD4 e TCD8
entre portadores do vírus HTLV-I e indivíduos saudáveis?
Durante a progressão da doença, os subtipos linfocitários TCD4 e
TCD8 diminuem o comprimento telomérico em virtude do aumento da taxa
de proliferação celular devido à transformação leucêmica?
De forma pragmática, após infecção primária, a soroconversão é
assintomática, dificultando sua identificação. Por outro lado, a minoria dos
soropositivos desenvolve manifestação clínica, não havendo justificativa
para serem tratados.
Introdução
5
Desta forma, formulamos estudo clinico-laboratorial para identificar se o
mensuramento do comprimento do telômero associado à carga proviral pode
ser utilizado como marcador de progressão de portador assintomático para
ATL e para separar formas graves e indolentes de doença.
Em nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho realizado em
indivíduos infectados pelo vírus HTLV-I, analisando o comprimento de
telômero e carga proviral como possível marcador de progressão de doença.
2. Revisão da Literatura
Revisão da Literatura
7
2.1 Vírus Linfotrópico T Humano tipo I (HTLV-I)
2.1.1 Histórico
No início da década de 70, estudos voltados ao descobrimento do
papel dos retrovírus como agentes etiológicos nas leucemias animais
impulsionaram os estudos com retrovírus humanos. A descoberta da enzima
transcriptase reversa e dos fatores de crescimento de células T (IL-2)
possibilitaram, em 1980, a Poiesz e colaboradores o isolamento do HTLV-I
em cultura de células de LCTC (Poiesz et al., 1980; Gallo RC, 2005a,b).
Simultaneamente pesquisadores japoneses isolaram um retrovírus de
linhagem celular de ATL (Yoshida et al., 1984). Posteriormente verificou-se
tratar-se do mesmo vírus o qual foi denominado HTLV-I (Yoshida et al.,
1984; Gallo RC, 2005a).
2.1.2 Epidemiologia
O vírus HTLV-I é ubiquitário, porém ocorre preferencialmente em áreas
geográficas definidas no mundo (Proietti et al., 2005). Estima-se que 15 a 20
milhões de pessoas estejam infectadas pelo vírus no mundo (Edlich et al.,
2000; Edlich et al., 2003; Mortreux et al., 2003), com maior prevalência no
Japão, África, Caribe e América do Sul (Shuh & Beike, 2005; Proietti et al.,
2005).
Com 2,5 milhões de indivíduos infectados, o Brasil é o país com maior
número absoluto de casos (Carneiro-Proietti et al., 2002; Mahieux &
Gessain, 2003), predominando nos estados da Bahia, Pernambuco e Pará,
Revisão da Literatura
8
embora tenha sido encontrado em todos os estados onde foi pesquisado
(Carneiro-Proietti et al., 2002).
A prevalência da infecção pelo vírus HTLV-I é maior em adultos, mais
acentuadamente após os 40 anos de idade e no sexo feminino (Proietti et
al., 2005). Estudos demonstram que o baixo status sócio-econômico está
associado à infecção pelo HTLV-I/II em áreas endêmicas e não endêmicas
(Proietti & Carneiro-Proietti, 2006).
Ao contrário do vírus da imunodeficiência humana (HIV), que possui
considerável variabilidade genômica entre os subtipos, as diferentes cepas
isoladas de HTLV-I mostram alto grau de conservação entre si, com 4% de
divergência de nucleotídeos, dependendo da região do genoma analisado.
De acordo com a análise genética, o HTLV-I é classificado em subtipo a ou
cosmopolita, encontrado no Japão e nas em áreas endêmicas; subtipo b, d e
f da África Central, subtipo e identificado em uma amostra de pigmeu da
República Democrática do Congo e o subtipo c encontrado na Melanésia. O
subtipo g foi recentemente descrito na população do sul de Camarões
(Proietti et al., 2005; Carneiro-Proietti et al., 2006). A maioria das infecções
humanas é causada pelo subtipo a cosmopolita (Proietti, 2000; Proietti et al.,
2005). Este subtipo é dividido em cinco subgrupos, de acordo com a
distribuição geográfica: transcontinental (A), japonês (B), oeste da África (C),
África do Norte (D) e negros peruanos (E) (Carneiro-Proietti et al., 2006).
Cerca de 3% a 5% dos portadores do vírus HTLV-I desenvolve doença
associada ao HTLV-I em um período de 10 a 40 anos (Azran et al., 2004;
Semmes et al., 2005). A ATL e a HAM/TSP são as mais estudadas e melhor
Revisão da Literatura
9
caracterizadas clínica e biologicamente (Azran et al., 2004; Barmak et al.,
2003). Embora de baixa incidência, são frequentemente graves, conduzindo
à incapacitação progressiva ou morte (Carneiro-Proietti et al., 2006).
2.1.3 Transmissão do vírus HTLV e sua relação com ATL e HAM/TSP
O HTLV-I é transmitido verticalmente, via aleitamento materno, ou de
maneira horizontal, por transfusão de sangue e derivados, agulha e seringas
contaminadas, ou transmissão sexual (Li et al., 2004; Kannagi et al., 2004;
Yoshida, 2005; Taylor & Matsuoka, 2005; Nicot, 2005). Apesar de possível, a
transmissão de DNA proviral pela saliva não foi comprovada (Proietti et al.,
2005). A via parenteral é a forma mais eficaz de transmissão, com risco
estimado de soroconversão após transfusão de produto contaminado de
40% a 60%, com intervalo de soroconversão de 51 a 65 dias (Proietti et al.,
2005; Nicot, 2005).
A via de infecção pelo HTLV-I contribui para o tipo de doença
associada ao vírus. A contaminação com sangue está associada à
HAM/TSP e, a contaminação via aleitamento materno associa-se à ATL.
Experimentos realizados em ratos demonstraram que a exposição ao vírus
via mucosa, correlaciona-se à ausência de resposta imune celular e humoral
contra o HTLV-I, o que possibilitaria a sobrevida e a eventual transformação
das células infectadas e, conseqüente desenvolvimento de ATL. Por outro
lado, a inoculação intravenosa resultou na formação de anticorpos anti-
Revisão da Literatura
10
HTLV-I e forte resposta imunológica das células T (Barmak et al., 2003;
Lairmore et al., 2005).
2.1.4 Formas de prevenção da infecção pelo vírus HTLV
Em 1988, a Food and Drug Administration (FDA) recomendou a
realização de triagem sorológica para o vírus HTLV-I, em doadores de
sangue (Nicot, 2005). Nos últimos 20 anos esta triagem foi implantada em
muitos países, tornando-se obrigatória no Brasil, a partir de 1993, pela
portaria 1.376 de 19 de novembro de 1993, do Ministério da Saúde
(Ministério da Saúde, 1993). A triagem dos doadores de sangue é uma
estratégia efetiva na prevenção da infecção pelo HTLV-I; porém, em muitos
países das Américas, esta intervenção não é realizada sistematicamente
(Proietti & Carneiro-Proietti, 2006). Cerca de 0,5% dos doadores de sangue
brasileiros apresentam sorologia positiva para HTLV, predominando o
subtipo"I" (Catalan-Soares et al., 2004).
A prevenção da transmissão de mãe para o filho também é importante
e, a inclusão da sorologia para HTLV-I na rotina pré-natal deveria ser
implantada em países com alta soroprevalência (Proietti & Carneiro-Proietti,
2006).
2.1.5 Fisiopatologia da infecção pelo vírus HTLV-I
O HTLV-I é um retrovírus complexo, do gênero Deltaretrovirus e da
subfamília Orthoretrovirinae (Bangham, 2003). In vitro, infectam linfócitos B e
T, fibroblasto, macrófago, células endotelial e epitelial (Coskun & Sutton,
Revisão da Literatura
11
2005; Manel et al., 2005).
Após a infecção, o vírus se adere e penetra nas células do hospedeiro,
pela interação entre a glicoproteína de superfície viral gp46 e o transportador
de glicose 1 (glut-1) da célula alvo (Coskun & Sutton, 2005; Manel et al.,
2005). A infecção por partícula viral livre no plasma é ineficaz e o contato
intercelular é essencial para a transmissão do vírus (Magrath, 1997;
Grassmann et al., 2005; Matsuoka et al., 2005). Quando a célula infectada
entra em contato com a não infectada (alvo) ocorre polarização do centro
organizador dos microtúbulos, na região de junção intercelular, formando-se
uma sinapse, com acúmulo de proteínas do genoma RNA viral que,
subsequentemente, se transferem para a célula alvo (Bangham, 2003;
Taylor & Matsuoka, 2005; Matsuoka, 2005). Ao entrar na célula, a
transcriptase reversa do capsídio viral sintetiza DNA viral a partir do RNA
genômico. Este DNA viral é transportado para o núcleo da célula alvo,
integrando-se em seu genoma aleatoriamente (Taylor & Matsuoka, 2005).
Subseqüentemente, há replicação do genoma, transcrição gênica, tradução
de proteínas virais, fechando-se o ciclo com a formação de um novo vírus.
Após a infecção, o HTLV-I permanece em estado de latência clínica no
portador soropositivo, o qual permanece assintomático (Barmak et al., 2003).
O genoma do vírus HTLV-I contém elementos comuns a todos os
retrovírus que se replicam, como o antígeno grupo específico (gag), protease
(pro)/polimerase (pol), e o gene de envelope (env), além de uma região que
codifica produtos específicos do vírus HTLV-I (região pX). O genoma viral é
flanqueado nas extremidades por regiões repetidas, denominadas long
Revisão da Literatura
12
terminal repeats (LTRs), compostas das regiões U3, R e U5, essenciais para
a integração do DNA proviral dentro do DNA cromossômico do hospedeiro e
na regulação transcricional do genoma do HTLV (Magrath, 1997; Barmak et
al., 2003).
A região gag inicialmente é traduzida como precursor poliproteico p55,
que ao ser clivado origina as proteínas da matriz (p19), do capsídio (p24) e
do nucleocapsídio (p15) (Magrath, 1997; Proietti, 2000). A região pol codifica
a transcriptase reversa e a integrase (Proietti, 2000). A protease é codificada
pela seqüência de nucleotídeos que compreende a parte 3’ da região gag e
a parte 5’ da região pol (Magrath, 1997; Proietti, 2000). A região env codifica
as proteínas do envelope viral, como a glicoproteína de superfície gp46 e a
proteína transmembrana p21 (Magrath, 1997; Proietti, 2000; Barmak et al.,
2003).
A região pX codifica vários genes acessórios, como p12, p21, p30, p13,
HBZ, Tax e Rex, porém não é considerada oncogene típico por não
apresentar seqüência homóloga ao DNA da célula do hospedeiro (Matsuoka,
2005). A proteína Tax é um ativador transcricional do genoma viral,
essencial para a replicação viral e a transformação celular (Barmak et al.,
2003; Bangham, 2003). Potencializa a expressão de citocinas e de
receptores envolvidos no crescimento e na proliferação de linfócito T, além
de bloquear genes reparadores de DNA e de apoptose, facilitando a
transformação da célula T e o desenvolvimento de ATL (Barmak et al., 2003)
(Figura 1). A proteína Rex, diferente da Tax, não influencia a transcrição
viral. Atua a nível pós-transcricional regulando a expressão de genes virais
Revisão da Literatura
13
(Magrath, 1997; Kashanchi & Brady, 2005).
Figura 1. Infecção / proliferação do vírus HTLV-I in vivo e transformação leucêmica
(ATL) (Matsuoka, 2005. Adaptado pela autora)
2.1.6 Diagnóstico Laboratorial do vírus HTLV-I
O diagnóstico sorológico da infecção pelo HTLV-I/II requer a detecção
de anticorpos no soro do indivíduo. Os antígenos mais utilizados nos testes
disponíveis no mercado são aqueles encontrados no lisado viral do HTLV-I e
HTLV-II, além das proteínas recombinantes derivadas dos genes env (rp21 e
gp46) e gag (p24) (Proietti, 2000).
Os ensaios sorológicos para detectar anticorpos anti-HTLV-I/II dividem-
se em duas etapas: as reações de triagem sorológica e as reações
confirmatórias ou diagnósticas. Os testes de triagem utilizam a metodologia
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ou aglutinação e não
discriminam a infecção pelo HTLV-I ou HTLV-II. O teste confirmatório é o
Western blot, que também utiliza lisado viral. (Proietti, 2000).
Alterações
do genoma
Supressão da Tax
Célula
infectada
Transmissão
célula-
célula
Expressão da Tax
ATL
Expansão de
células T CD4
infectadas
Período de latência entre 10 a 40 anos
Revisão da Literatura
14
O teste de Western blot não consegue confirmar e/ou discriminar
alguns casos, sendo necessário utilizar técnica de biologia molecular. Esta
última detecta a presença de ácidos nucléicos virais por reação em cadeia
da polimerase (PCR) (Proietti, 2000).
2.1.7 Carga Proviral
O provirus HTLV-I é encontrado principalmente na célula T CD4+, mas
até um quarto da carga proviral pode ser encontrada em linfócito T CD8+.
Desta maneira, a carga proviral é mantida pela proliferação da célula TCD4+
infectada pelo vírus (Bangham, 2003). Considerando que a maioria das
células infectadas contém uma cópia do provirus, a carga proviral indica a
porcentagem das células infectadas entre os linfócitos (Matsuoka, 2005).
Na maioria das infecções virais, as células TCD8+ limitam a replicação
viral por meio da morte das células infectadas pelo vírus. Na infecção pelo
HTLV-I, as células TCD8+ específicas contra o vírus são abundantes e,
cronicamente ativadas. Por lisarem as células infectadas, determinam o
equilíbrio da carga proviral. A variação individual também depende da
eficiência da resposta da célula TCD8+ citotóxica (Matsuoka, 2005).
Polimorfismos em genes do Complexo Principal de
Histocompatibilidade (MHC) classe I, que influenciam a eficiência de
resposta dos linfócitos T citotóxicos (CTL), estariam associados com a
variação individual da carga proviral. Genes dos Antígenos Leucocitários
Humanos (HLA) Classe I, especialmente os alelos HLA A02 e HLA Cw08
foram associados com menor carga proviral e menor risco de HAM/TSP
Revisão da Literatura
15
(Vine et al., 2004; Matsuoka, 2005). Enquanto o alelo HLA B5401 estaria
associado com significativo aumento da carga proviral e maior prevalência
de HAM/TSP (Asquith & Bangham, 2007).
A eficiência dos próprios CTLs, em responder à infecção pelo HTLV-I,
também influencia a variação da carga proviral. Estudos demonstram que
pequeno grupo de genes distingue indivíduos com baixa carga proviral
daqueles com alta carga viral. Esse grupo contém entre 9 a 40 genes
altamente expressos em células TCD8+ em indivíduos com baixa carga
proviral. Estes genes codificam proteínas envolvidas no mecanismo efetor
de lise mediada por CTLs, incluindo granzima, perfurina, granulizina e
NKG2D. Alto nível de expressão desses genes foi associado com efetivo
controle da carga proviral (Bangham, 2003; Bangham & Osame, 2005). Em
contrapartida, a baixa expressão desses genes líticos poderia ser a causa da
manutenção de alta carga proviral, apesar do aumento quantitativo das CTLs
(Vine et al., 2004; Bangham & Osame, 2005). Por outro lado, indivíduos com
baixa carga proviral apresentaram hiper-regulação do gene da perfurina
(Vine et al., 2002). Provavelmente, o alelo 418C da perfurina está associado
à maior eficiência da lise de células infectadas pelo vírus mediada por CTLs
(Bangham & Osame, 2005).
A resposta imune ao HTLV-I é forte. O título sérico de anticorpo
correlaciona-se à carga proviral. Contudo, não está claro se este alto título
protege ou contribui para patogênese das doenças associadas ao HTLV-I
ou, para o equilíbrio da carga proviral (Bangham, 2003).
Revisão da Literatura
16
2.1.8 ATL
A ATL é uma doença linfoproliferativa crônica T (Barmak et al., 2003; Li
et al., 2004), descrita em Kyoto em pacientes do sudoeste do Japão. No
ocidente, sua primeira descrição foi em imigrantes provenientes do Caribe,
residentes na Inglaterra (Magrath, 1997; Proietti et al., 2005).
2.1.8.1 Epidemiologia
Estudos soroepidemiológicos demonstram que a ATL é endêmica em
áreas de alta prevalência do vírus HTLV-I (Proietti et al., 2005). O risco das
doenças associadas ao HTLV-I entre portadores difere entre as áreas
geográficas. Devido ao rápido curso da doença, a dificuldade de confirmação
diagnóstica e superposição de sinais clínicos com outras doenças
linfoproliferativas, como Síndrome de Sézary (SS), micose fungóide (MF) e
linfoma, é provável que a ATL seja subdiagnosticada em vários países,
inclusive no Brasil (Magrath, 1997; Carneiro-Proietti et al., 2002; Proietti,
2005).
No Japão, a ATL incide em indivíduos acima da 5ª década de vida. Na
Jamaica e no Brasil é mais comum na 4ª década, sugerindo que fatores
locais podem influenciar a patogênese da doença (Proietti et al., 2005).
A ATL se desenvolve após longo período de exposição ao vírus,
especialmente em indivíduos infectados via aleitamento materno (Proietti et
al., 2005). A chance de transmissão via amamentação é de 20% e está
associada à alta carga proviral, altos títulos de anticorpos maternos e
amamentação prolongada (Li et al., 2004). A transmissão intra-uterina e peri-
Revisão da Literatura
17
parto são menos importantes
e casos de
ATL pós transfusionais são
excepcionais (Proietti et al., 2005).
2.1.8.2 Fisiopatologia
Apesar do HTLV-I infectar células TCD8+ e TCD4+, o fenótipo mais
comum da célula leucêmica da ATL é TCD4+. Menos frequentemente
apresenta fenótipo duplo-positivo TCD4+/TCD8+ ou TCD8+ (Azran et al.,
2004). Os dois tipos celulares apresentam expansão clonal e vantagens no
crescimento em relação às células não infectadas (Semmes, 2006).
O genótipo do HLA do hospedeiro, a via e a idade da infecção viral e, a
carga proviral do HTLV-I, são fatores relacionados ao risco de
desenvolvimento de ATL (Barmak et al., 2003; Proietti et al., 2005).
Indivíduos com HLA-A*26, HLA-B*4002, HLA-B*4006 e HLA-(B4801) têm
predisposição para desenvolverem ATL, por terem seqüências de ligação
incapazes de reconhecer a proteína Tax. Conseqüentemente, não geram
CTLs anti-Tax, não eliminam as células TCD4/HTLV-I+ que sobrevivem e
podem sofrer transformação (Barmak et al., 2003). Portadores com alto título
de anti-HTLV-I e baixa reatividade a Tax são mais propensos a
desenvolverem ATL (Proietti et al., 2005).
O HTLV-I é aleatoriamente integrado ao DNA humano, mas como os
clones leucêmicos da ATL provêm de uma única célula inicialmente
transformada, todas possuem integração proviral no mesmo sítio (Marriott &
Semmes, 2005; Yoshida, 2005).
Revisão da Literatura
18
2.1.8.3 Oncoproteína Tax e patogênese da ATL
A oncoproteína Tax é essencial para o desenvolvimento da ATL,
apesar de não se ligar diretamente ao DNA. Ativa a transcrição de genes
virais e celulares, facilitando a transformação celular e o desenvolvimento da
ATL (Kashanchi & Brady, 2005).
A Tax aumenta a transcrição de genes virais por interagir com
proteínas ligadoras de elementos responsivos ao AMP cíclico (CREB) e
ativar fatores de transcrição, como o fator responsivo ao soro (SRF), AP-1 e
fator nuclear κB (NF-κB) (Kashanchi & Brady, 2005; Matsuoka, 2005). Desta
maneira, induz à expressão de genes de crescimento e proliferação T,
incluindo o fator estimulador de colônia de granulócito e macrófago (GM-
CSF), fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 15 (IL-15),
interleucina 2 (IL-2) e a cadeia α do receptor de interleucina 2 (IL-2Rα)
(Barmak et al., 2003). Concomitantemente desregula a transcrição de genes
que controlam o ciclo celular e apoptose (Taylor & Matsuoka, 2005; Hall &
Fujii, 2005).
As células Tax+ progridem diretamente para a fase G
1
do ciclo celular,
ativando a transcrição das ciclinas D e E e a expressão das quinases
dependentes de ciclina (Cdks4/6 e Cdk2). Devido à ativação de CDK4 e
CDK6, facilita a hiperfosforilação da proteína do retinoblastoma (Rb). Esta
ação facilita a degradação do complexo Rb/E2F, ativa o fator de transcrição
E2F e libera a célula para prosseguir no ciclo celular. A Tax pode reprimir a
transcrição dos inibidores de CDK (CDKI) p18INK4c e p19INK4d e ligar-se
Revisão da Literatura
19
diretamente à p16INK4a, impedindo a ligação desses inibidores à Cdk4 e
Cdk6 (Marriott & Semmes, 2005).
Na fase S do ciclo celular, a Tax inibe a apoptose ao ativar a expressão
de p21, independentemente de p53. A p21 se liga ao complexo ciclina D-
Cdk4/6/Cdk2, estabilizando-o, com conseqüente progressão do ciclo celular
(Marriott & Semmes, 2005). A Tax também interfere com a função de
transativação da proteína supressora tumoral p53, envolvida na regulação
do ciclo celular, apoptose e reparo do DNA. Vários mecanismos têm sido
propostos para explicar a ação da Tax na inativação do p53. Este gene está
mutado em pequena porcentagem das ATL, ao contrário de outros tumores
humanos, nos quais se encontra mutado em 60% dos casos. O gene p53
está inativo na maior parte das ATL e das células HTLV-I transformadas. Por
inativação do p53, a Tax pode imortalizar as células infectadas pelo HTLV-I
e desestabilizar seu genoma (Tabakin-Fix et al., 2006).
A ação da Ciclina A na fase S do ciclo celular é afetada pela proteína
Tax, gerando replicação redundante do DNA, contribuindo para a
aneuploidia observada nas células infectadas. Da mesma forma, durante a
mitose, a Tax liga-se e ativa prematuramente o complexo promotor de
anáfase (APC), promovendo a degradação de securina e, a separação
inapropriada das cromátides irmãs, causando aneuploidia. Embora a Tax
interfira em várias funções celulares, não há evidências que exerça danos
diretos ao DNA (Marriott & Semmes, 2005) (Figura 2).
Revisão da Literatura
20
Figura 2. Ações da proteína viral Tax na proliferação celular. GM-CSF (fator
estimulador de colônia de granulócito e macrófago); TNF-α (fator de necrose
tumoral alfa); IL-15 (interleucina 15); IL-2 (interleucina 2); IL-2Rα (cadeia α do
receptor de interleucina 2); CDK (quinase dependente de ciclina); Rb (proteína do
retinoblastoma); APC (complexo promotor de anáfase).
A análise do provirus HTLV-I demonstra escape de uma Tax mutante
durante o desenvolvimento da ATL. Esta Tax mutante tem capacidade
reduzida de transativação, o que impede seu reconhecimento pelo sistema
imune, permite sua completa replicação e a manutenção da carga proviral
(Yoshida, 2005).
Mecanismos epigenéticos contribuem para a diminuição da expressão
da Tax na célula da ATL. A metilação completa da região 5’-LTR do DNA
viral pode estar associada à ausência de transcrição de genes virais, como o
gene da Tax, facilitando sua evasão do sistema imune do hospedeiro
(Tanaguchi et al., 2005).
Outras proteínas virais também estão envolvidas na patogênese da
ATL. A proteína viral p12 possui variantes que regulam a apresentação de
proteínas virais na superfície da célula infectada, por atuar na ação
Tax
Genes transcricionalmente
ativados pela Tax:
GM-CSF
TNF-α
αα
α
IL-15
IL-2
IL-2Rα
αα
α
Função do p53 no
reparo do DNA
Progressão do ciclo celular:
ativação de ciclina/CDK
gene Rb
APC
G1
S
M
G1
Apoptose
(ação do p21)
Revisão da Literatura
21
reguladora da expressão das moléculas de MHC-I. A variante de p12,
encontrada em pacientes com ATL e portadores do vírus HTLV-I, carrega
uma arginina no aminoácido 88 (R88), o que a torna estável e reduz a
expressão de moléculas MHC classe I na superfície da célula infectada,
permitindo a replicação do HTLV-I e a evasão da resposta imune (Barmak et
al., 2003; Nicot et al., 2005).
A transformação da célula T pelo vírus HTLV-I também envolve a
desregulação de fatores de transcrição celular, incluindo membros da família
NF-κB. A proteína viral Tax atua como estimulador intracelular do IKK, uma
quinase celular envolvida na ativação do NF-κB por diversos estímulos. A
Tax interage fisicamente com o IKK, ativando-a e, consequentemente, ativa
a via NF-κB (Sun & Yamaoka, 2005). A ativação do NF-κB pela Tax ativa a
expressão de genes de proliferação celular (Hall & Fujii, 2005), induz a
transcrição de genes anti-apoptóticos como bcl-xL e survivina (Matsuoka,
2005) e inibe genes envolvidos no reparo de DNA e na regulação dos pontos
de checagem do ciclo celular, especialmente aqueles que codificam a β-
polimerase e o p53. Estudos recentes sugerem que o NF-κB está envolvido
na inativação funcional de p53. (Sun & Yamaoka, 2005).
AP-1 é um grupo de fatores de transcrição envolvidos na proliferação e
na transformação de linfócito T, na prevenção da apoptose e produção de
citocina. Em célula T não estimulada, o nível basal de AP-1 é baixo, mas a
ativação de linfócito T resulta em rápida formação do complexo de fatores de
transcrição AP-1. A célula infectada pelo vírus HTLV-I tem proteína do
complexo AP-1 ativada via Tax de forma independente de estímulo externo,
Revisão da Literatura
22
o que pode contribuir para iniciar a transformação leucêmica (Hall & Fujii,
2005).
Uma característica comum às células ATL é a não expressão
detectável de Tax, sugerindo que a partir de determinado ponto sua
expressão não é mais necessária. As células ATL adquirem um “fenótipo
Tax”, com NF-κB e AP-1 ativado constitutivamente, p53 estabilizado e
funcionalmente prejudicado na ausência de mutação e hiperexpressão de
p21, survivin e Bcl-xL (Nicot, 2005). A supressão de Tax evita a geração de
resposta imune do hospedeiro, impedindo a morte da célula infectada
(Taylor & Matsuoka, 2005).
Da mesma forma, a célula transformada torna-se independente de IL-2
(Barmak et al., 2003). A p12 interage com as cadeias β e γ do receptor de IL-
2, altera sua sinalização e ativa constitutivamente a via JAK/STAT. Esta
ação dispara a sinalização do IL-2R à revelia de IL-2 (Proietti, 2000; Nicot et
al., 2005). A mensuração dos níveis de expressão do receptor solúvel de IL-
2 (CD25) tem importância clínica por se correlacionar com a progressão de
doença na fase precoce da ATL (Kamihira et al., 1994).
Alterações somáticas, genéticas e epigenéticas em células ATL podem
causar mudança na transcrição ou na função de genes do hospedeiro que
facilitam a proliferação da célula transformada na ausência da proteína Tax.
O antígeno Fas é um receptor que traduz o sinal de morte pela ligação ao
seu ligante, o Fas ligante (FasL). As células ATL têm alta expressão de Fas,
mas não produzem FasL, o que as permitem escapar da morte celular
induzida por ativação (AICD) ou apoptose autócrina. Nessas células o gene
Revisão da Literatura
23
EGR3, fator transcricional essencial para transcrição do FasL, encontra-se
hipermetilado, o que impede sua transcrição e expressão (Matsuoka, 2005).
A fusão entre as extremidades das cromátides irmãs durante a divisão
celular é comum em câncer, devido ao encurtamento crítico do telômero e
também observada em células transformadas pelo HTLV-I. Uma das formas
de proteção contra esta fusão é a adição de repetições teloméricas nos
cromossomos e nas regiões de quebra de DNA pela telomerase humana.
Entretanto, alguns estudos demonstram que a Tax suprime sua expressão,
facilitando o aparecimento de instabilidade cromossômica (Grassmann et al.,
2005).
Estudos em pacientes com ATL e células HTLV-I transformadas in vitro
demonstram várias anormalidades cromossômicas clonais complexas,
numéricas e estruturais. Não se conhece ao certo qual o mecanismo
específico pelo qual a integração proviral influencia estas anormalidades, e
não há descrição de anormalidade cromossômica específica associada à
ATL (Marriott & Semmes, 2005).
Existe discrepância entre o número de células contendo provirus e a
expressão de RNAm viral. É possível que as células latentes infectadas, ou
que expressam antígenos virais, sejam rapidamente eliminadas pelo sistema
imune. A expansão monoclonal na ATL é possivelmente adquirida após
estabelecimento de reservatório latente que pode ser amplificado pela
replicação celular. Possivelmente a ação da proteína viral p30 pode prevenir
a exportação nuclear do RNA de Tax e Rex (Nicot, 2005),
evitando
Revisão da Literatura
24
reconhecimento pelo sistema imune durante a replicação viral (Nicot et al.,
2005; Kashanchi & Brady, 2005).
2.1.8.4 Critério Diagnóstico de ATL
O diagnóstico de ATL baseia-se em critérios clínico, laboratorial e
histológico. Hipercalcemia é uma característica biológica freqüente em ATL
aguda e ocorre em 20-30% na apresentação da doença e em mais de 50%
durante a evolução (Magrath, 1997). Nestes pacientes há elevação do
número de osteoclastos na medula óssea. O ligante RANK, expresso em
osteoclastos e M-CSF agem sinergicamente nas células precursoras
hematopoiéticas, induzindo a diferenciação dos osteoclastos (Matsuoka,
2005). Em adição, o nível sérico do peptídeo relacionado ao hormônio da
paratireóide (PTH-rP) está elevado na maioria dos pacientes ATL
hipercalcêmicos (Magrath, 1997; Matsuoka, 2005).
A infiltração da pele por células da ATL é freqüente, ocorrendo em 20%
a 40% das ATL e em mais de 50% da forma indolente (smoldering). Várias
lesões cutâneas são descritas, incluindo pápula, nódulo, eritroderma, placa,
tumor e úlcera. Quando as lesões cutâneas dominam o quadro clínico, a
doença é frequentemente referida como ATL cutânea. Nestes casos a
diferenciação clinicopatológico dessas lesões com outros LCTC é difícil e
requer estudos moleculares para detectar inclusão viral clonal na célula
neoplásica (Magrath, 1997).
Revisão da Literatura
25
Avaliação citológica do sangue periférico pode demonstrar infiltração
por células linfóides cerebriformes, de núcleo convoluto e citoplasma
basofílico (flower cell) (Figura 3).
Figura 3. Distensão de sangue periférico em aumento de 1000X evidenciando
Flower cell de paciente com ATL forma aguda, acompanhado no Serviço de
Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo
Na ATL clássica a célula neoplásica apresenta imunofenótipo T maduro
(CD2+, CD3+, CD4+, CD7−, CD8−) e marcadores de ativação (CD25+, HLA
DP+, DQ+, DR+). ATL de fenótipo duplo negativo CD4−/CD8− e CD8+/CD4−
são raras. Geralmente há diminuição da expressão de CD3 e do receptor de
célula T (TCR) em membrana (Magrath, 1997)
(Figura 4).
Revisão da Literatura
26
Figura 4. Citogramas apresentando controle isotípico (A), intensidade de expressão
dos antígenos CD3 e CD4 (B), CD25 (C) e CD7 (D) em paciente com ATL forma
aguda, acompanhado no Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
A histologia do linfonodo demonstra infiltração por células de tamanho
médio a grande, núcleo irregular e perda da arquitetura, consistente com
diagnóstico de linfoma de célula T grande pleomórfica. Contudo, não existe
padrão histológico específico de ATL (Magrath, 1997).
Segundo Levine et al. (1994), a hipercalcemia, envolvimento de pele e
presença pelo menos 2% de células linfóides maduras e anormais sugerem
ATL. Do ponto de vista laboratorial, a presença de anticorpo anti-HTLV-I,
célula T de fenótipo aberrante (CD2+, CD3+/−, CD4+, CD25+, CD7−),
integração monoclonal do HTLV-I ao genoma da célula tumoral e a
expressão de TAC (cadeia α do receptor da IL-2) corroboram o diagnóstico
(Levine et al., 1994).
A
C
B
D
Revisão da Literatura
27
Pacientes que preenchem os critérios de Levine perfazendo sete ou
mais pontos são classificados como ATL “clássica”. Cinco ou seis pontos
como “provável” ATL, três a quatro como “possível” ATL e, menos de três
pontos como “inconsistente” com o diagnóstico de ATL (Tabela 1)
(Levine et
al., 1994).
Fatores que indicam pior prognóstico incluem altos níveis séricos de
timidina kinase, receptor de IL-2 solúvel, β
2
-microglobulina e PTH-rP, além
da alta taxa de expressão do antígeno Ki-67 (Nicot, 2005).
Tabela 1 - Crítérios para definição de ATL
Definição de ATL
Crítérios Clínicos
Hipercalcemia 1 ponto
Envolvimento de pele 1 ponto
Fase leucêmica (> 2% de célula linfóide
anormal)
1 ponto
Critérios Laboratoriais
Presença de anticorpo anti-HTLV-I 2 pontos
Célula T com fenótipo aberrante 2 pontos
Integração monoclonal do HTLV-I ao genoma
da célula tumoral
2 pontos
Expressão da cadeia α do receptor da IL2
1 ponto
Classificação ATL
Clássica
≥7 pontos
Provável 5 ou 6 pontos
Possível 3 ou 4 pontos
Inconsistente com ATL <3 pontos
Fonte: Levine et al. 1994.
Revisão da Literatura
28
2.1.8.5 Formas de ATL e relação com diagnóstico
Clinicamente existem quatro formas de ATL: aguda, linfomatosa,
crônica e smoldering ou indolente, que diferem na apresentação, progressão
e resposta ao tratamento. A diferenciação entre leucemia ou linfoma
depende do comprometimento do sangue periférico. ATL aguda é
caracterizada pela infiltração maciça do sangue periférico por células
neoplásicas, enquanto a ATL linfomatosa é caracterizada pela presença de
menos de 1% de células T neoplásicas na distensão sanguínea, e maior
envolvimento de órgãos linfóides (Nicot, 2005).
A ATL aguda representa 55% a 75% dos casos e cursa com linfocitose,
lesões de pele, óssea e/ou visceral, linfoadenomegalia generalizada,
hepatoesplenomegalia, infiltrado pulmonar, fraqueza e febre (Nicot, 2005;
Carneiro-Proietti et al., 2006). Os pacientes também apresentam
hipercalcemia, frequentemente associada a lesões osteolíticas e reabsorção
óssea generalizada, níveis altos da enzima desidrogenase lática (DHL) e IL-
2Rα solúvel (Nicot, 2005).
A forma linfoma caracteriza-se por proeminente linfoadenomegalia,
ausência de linfocitose e menos de 1% de linfócito T anômalo no sangue
periférico (Levine et al., 1994). Não há hipercalcemia (Nicot, 2005).
Na ATL crônica, os sinais e sintomas clínicos são moderados e o curso
clínico mais longo. A contagem de linfócitos é relativamente alta,
representando mais de 10% das células leucêmicas circulantes, porém com
atipia celular menos proeminente (Nicot, 2005). Os níveis séricos de cálcio
Revisão da Literatura
29
são normais e os de DHL podem estar aumentados até duas vezes o limite
normal. O paciente não apresenta ascite, efusão pleural, envolvimento do
sistema nervoso central (SNC), medula óssea (MO) ou do trato
gastrointestinal (TGI), porém pode apresentar lesões de pele, infiltrado
pulmonar, linfoadenomegalia e hepatoesplenomegalia discreta (Levine et al.,
1994; Nicot, 2005).
Na forma smoldering há mais de 5% de linfócito T com fenótipo
aberrante no sangue periférico, ausência de sinais clínicos e anormalidades
laboratoriais de ATL, com ou sem envolvimento de pele (Levine et al., 1994).
As formas smoldering e crônica podem progredir para ATL aguda. A
progressão pode estar associada à elevação da carga proviral,
possivelmente pela estimulação antigênica crônica (Nicot, 2005).
Na maioria dos casos o diagnóstico clínico e biológico de ATL pode ser
realizado facilmente. Porém, o diagnóstico diferencial entre as formas
smoldering e crônica, e outras linfoproliferações T pós-tímicas, incluindo
LCTC, pode ser difícil. Por vezes, são necessários testes moleculares e a
aplicação do sistema de pontuação de Levine para o correto diagnóstico
(Magrath, 1997).
Nenhuma anormalidade cariotípica específica está associada à ATL,
podendo ser encontradas trissomias dos cromossomos 3, 7 e 21,
envolvimento dos cromossomos 6 e 14 e perda do cromossomo Y. As
anormalidades cromossômicas são mais freqüentes na ATL aguda e linfoma
(Magrath, 1997; Nicot, 2005). Mutações no gene p53 têm sido detectadas
Revisão da Literatura
30
em 30% dos pacientes com ATL, principalmente os casos avançados,
sugerindo que estas mutações ocorram durante a progressão tumoral
(Magrath, 1997). Ainda não está bem estabelecido se estas alterações
genéticas causam ATL (Nicot, 2005).
2.1.8.6 Tratamento da ATL
Apesar de serem adotados inúmeras estratégias de tratamento para a
ATL, a mesma permanece com prognóstico ruim. Fatores associados à pior
resposta e sobrevida são DHL elevada, hiperleucocitose e pior estado
funcional do paciente (Magrath, 1997). A quimioterapia convencional, ativa
contra outras neoplasias linfóides, é ineficaz para as formas agressivas de
ATL (Proietti et al., 2005).
O tratamento para ATL tem se tornado alvo para vários estudos clínicos
com o propósito de melhorar os resultados terapêuticos (Proietti et al., 2005).
Várias drogas como os análogos de nucleosídeos, inibidores da
topoisomerase, interferon, anti-retrovirais e imunoterapia (anti-CD25 e anti-
CD52), mostraram-se pouco eficazes. Embora tratamentos iniciais possam
resultar em remissão completa (RC), todos os pacientes recaem e morrem
usualmente em menos de um ano, nas formas aguda e linfoma (Magrath,
1997). A combinação terapêutica de zidovudina (AZT) e interferon α tem
sido utilizada, porém não impede a recidiva. O mecanismo para os efeitos
anti-tumorais dos antiretrovirais não é claro, pois a proliferação do HTLV-
ocorre por proliferação da célula infectada e não por replicação viral. Estudo
Revisão da Literatura
31
recente sugere que o AZT e o interferon α suprimem a atividade do NF-κB e
induzem expressão de TRAIL, respectivamente (Kannagi et al., 2005).
Um dos mecanismos de resistência à droga seria a ativação de NF-κB
e consequente transcrição de genes anti-apoptóticos como o bcl-xL e a
survivina (Matsuoka, 2005).
2.1.8.7 Complicações associadas à ATL
A maior complicação da ATL é a imunodeficiência, que predispõe às
infecções oportunistas por bactéria, fungo, protozoário e vírus. As infecções
mais comuns incluem Pneumocystis jiroveci, aspergilose, candidíase,
pneumonia por citomegalovírus e Strongyloides stercoralis (Nicot, 2005;
Matsuoka, 2005). A estrongiloidíase é comum em pacientes com ATL e
possível cofator para transformação leucêmica induzida pelo HTLV-I. O
Strongyloides stercoralis induz à proliferação clonal de linfócitos HTLV-I+,
aumentando a carga proviral (Proietti et al., 2005).
2.2 O telômero
2.2.1 Histórico
A presença de estruturas especializadas no final dos cromossomos foi
descrita por Hermann J Muller em 1938. Em seus estudos com mosca de
frutas, notou que cada cromossomo tinha que ser selado no final com um
gene terminal especializado para garantir a estabilidade cromossômica. A
palavra telômero, proveniente das palavras gregas “telos” (fim) e “meros”
Revisão da Literatura
32
(parte) (Hultdin, 2003), foi inicialmente usada por Bárbara McClintock’s em
1940. Desde então são reconhecidos como essenciais para a estabilidade
cromossômica durante a divisão celular (Stewart & Weinberg, 2006).
Até 1960, achava-se que as células eram capazes de se proliferar
indefinidamente. Entretanto, Leonard Hayflick’s demonstrou que fibroblastos
possuíam potencial proliferativo limitado, mudando esse paradigma.
Concluiu-se que a célula possui mecanismo de controle interno, capaz de
estabelecer o número total de divisão celular durante sua existência,
limitando o número de divisão celular denominado de limite de Hayflick
(Stewart & Weinberg, 2006). Atualmente, sabe-se que o limite do número de
divisão celular é determinado pelo comprimento do telômero e que ao
alcançar este limite são disparados mecanismos de parada de crescimento
celular de forma irreversível (Katakura, 2006).
2.2.2 A estrutura telomérica
O telômero ou porção final do cromossmo é um complexo
nucleoprotéico composto de DNA, de fita simples e dupla, permeados por
proteínas (Dahse et al., 1997; Engelhardt & Finke, 2001; Hathcock et al.,
2003) que se interagem mantendo a estrutura estável (Stewart & Weinberg,
2006). O DNA telomérico da maioria dos eucariontes consiste de repetições
curtas ricas em guanina (G) na fita que contém o final 3’, referida como fita
G. A fita complementar, contendo o final 5’, é rica em citosina (C) e
denominada de fita C. A fita G corre na direção 5’ - 3’ do cromossomo e é
Revisão da Literatura
33
mais longa que a sua fita complementar C, devido à saliência no final 3’ da
fita simples (Hug & Lingner, 2006).
A primeira seqüência de DNA telomérico foi descrita no protozoário
ciliado Tetrahymena thermophila em 1978, composto de repetições
TTGGGG (Hultdin, 2003). Na maioria dos insetos, a região telomérica tem
seqüência TTAGG e na maior parte das plantas, a sequência TTTAGGG. O
número típico de seqüências repetidas varia entre as espécies. Alguns
ciliados têm 20 pares de base, algumas leveduras têm menos de 100 pares
de base e os vertebrados podem ter mais de 100.000 pares de base
(Monaghan & Haussmann, 2006). Porém, na maioria dos organismos
estudados, as seqüências teloméricas consistem de 5 a 8 repetições de
pares de bases. Em humanos, a região telomérica possui seqüências
repetidas e não codificadas de hexanucleotídeos TTAGGG, no total de 1000
a 2000 repetições ligadas a proteínas (Dahse et al., 1997; Meeker et al.,
2002) (Figura 5).
Revisão da Literatura
34
Figura 5. Organização de cromossomo humano (Dahse et al., 1997. Adaptado pela
autora).
No ser humano, o telômero possui comprimento de 8 a 14 kbp, porém,
na fase final de cada ciclo celular há perda de pequena quantidade de DNA
telomérico (Dahse et al., 1997), acarretando, após sucessivas divisões
celulares, redução do comprimento telomérico (Engelhardt & Finke, 2001;
Meeker et al., 2002).
Análise por microscopia eletrônica revelou que o DNA telomérico forma
uma estrutura extremamente organizada, no qual a saliência G da porção 3’
se insere nas repetições teloméricas de fita dupla, conferindo aparência de
“volta”, conhecida como volta-T (Stewart & Weinberg, 2006). A volta-T é
estabilizada pela ligação do telômero às proteínas TRF1, TRF2 e Pot1. Esta
forma estrutural impede que o telômero seja reconhecido como quebra final
do cromossomo, suprimindo a ativação da cascata sinalização dos pontos
TELÔMERO
------
TTAGGG TTAGGG TTAGGG----
------
AATCCC AATCCC AATCCC----
Região
subtelomérica
Centrômero
Cromossomo
Revisão da Literatura
35
de checagem de danos ao DNA (Herbig & Sedivy, 2006). Esta saliência
também serve como substrato, no qual, a telomerase adiciona repetições
teloméricas, fornecendo um molde para a síntese de DNA de fita
descontínua (lagging) (Hultdin, 2003). A volta telomérica da posição 3’ tem
comprimento de 30-110 nucleotídeos em humanos (Hug & Lingner, 2006).
Em humanos, as proteínas TRF1, TRF2, hRap1, TIN2, TPP1 e Pot1
formam o complexo shelterin, componente constitucional do telômero. As
proteínas TRF1 e TRF2 ligam-se às repetições teloméricas de fita dupla
formando homodímeros, enquanto que a Pot1 liga-se à volta 3’ de fita
simples. A TIN2 conecta-se, por interação, às proteínas TRF1, TFR2 e
TPP1. A TPP1 liga-se à Pot1 e recruta Pot1 para a parte telomérica de fita
dupla. A hRAP1 associa-se ao telômero pela interação com TRF2. Foi
descrita também a interação direta entre Pot1 e TRF2 (Hug & Lingner,
2006).
O complexo shelterin está envolvido no controle do comprimento do
telômero. A inibição de TRF1, redução dos níveis de TIN2 e de Rap1,
supressão de TPP1 ou distúrbio na interação TPP1-Pot1 promove
alongamento do telômero, enquanto a hiperexpressão de TRF1 e TRF2
causa encurtamento do mesmo, sem afetar a atividade da telomerase in
vitro. Este complexo pode também inibir a telomerase, pela formação da
estrutura volta-T, deixando o final 3’ inacessível (Hug & Lingner, 2006). Além
disso, as proteínas associadas ao telômero exercem funções de reparo do
DNA, vitais para manutenção do telômero (Stewart & Weinberg, 2006).
Revisão da Literatura
36
O telômero protege a região final do cromossomo da degradação
enzimática (Dahse et al., 1997), facilita a replicação completa das moléculas
de DNA cromossomal e, é essencial para o exato posicionamento dos
cromossomos dentro do núcleo (Cerone et al., 2001). Também exerce papel
crítico na manutenção da estabilidade dos cromossomos e, da regulação da
capacidade replicativa celular (Meeker et al., 2002),
determinando a vida
média da célula humana (Cerone et al., 2001).
2.2.3 Problema de replicação final e suas conseqüências
Durante a duplicação do DNA, as fitas antiparalelas não são replicadas
de forma homogênea. A fita contínua (leading), que se estende no sentido
5’-3’ e do movimento de abertura das fitas, cresce continuamente. A fita
complementar ou descontínua (lagging), também é sintetizada no sentido 5’-
3’ mas, em direção oposta ao movimento de abertura das fitas, resultando
em replicação descontínua (Bonato, 2004). Para replicar a fita de DNA
descontínua, são necessários vários primers de RNA que se alongam para
gerar fragmentos de nucleotídeos, denominados fragmentos de Okasaki
(Dahse et al., 1997; Bonato, 2004). Estes fragmentos só começam a ser
sintetizados após o movimento de abertura da fita ter ocorrido em uma
extensão razoável da hélice, corroborando para o atraso da replicação em
relação à fita contínua. Posteriormente, os primers de RNA são degradados
e substituídos por seqüências de DNA. As aberturas entre os fragmentos de
Okazaki são ocupadas e ligadas. Como não existe molde para os últimos
Revisão da Literatura
37
fragmentos de Okasaki, a DNA polimerase não consegue replicar
completamente o final 3' do cromossomo (Baerlocher et al., 2002) e o final
da fita descontinua não pode ser sintetizado. Este fato é denominado de
problema de replicação final, justificando a perda progressiva de DNA
cromossomal na região final 3', após múltiplas divisões celulares (Granger et
al., 2002). Conseqüentemente, o telômero encurta em média 50-100 bp por
ano, de forma que o tamanho do telômero reflete a história proliferativa
celular, funcionando como “relógio mitótico” em direção à senescência
(Engelhardt & Finke, 2001).
Dentro das espécies, o comprimento do telômero e a sua razão de
encurtamento variam entre os cromossomos, tecidos, indivíduos e idade.
Nos vertebrados, o comprimento do telômero durante o desenvolvimento
embrionário é similar nas células da maioria dos tecidos, mas, após o
nascimento, os telômeros encurtam progressivamente nas células somáticas
proliferativas. Alguns tecidos como a mucosa intestinal e as células do
sangue que têm rápida renovação e requerem alta proliferação celular
apresentam maior encurtamento dos telômeros. Enquanto tecidos com baixa
taxa de proliferação, como músculo e cérebro, têm comprimento do telômero
bastante estável (Monaghan & Haussmann, 2006).
Quando os cromossomos atingem comprimento telomérico crítico, a
estrutura de volta-T protetora se perde, desencadeando o recrutamento de
sensores de danos ao DNA (Herbig & Sedivy, 2006). Conseqüentemente há
ativação e estabilização de p53, favorecendo a transcrição de genes como o
p21 (Lou & Chen, 2006). Este gene inibe a atividade das kinases
Revisão da Literatura
38
dependentes de ciclina, as quais não fosforilam (ativam) o oncogene pRb,
resultando na ativação do mecanismo antiproliferativo denominado “estágio
1 de mortalidade” (M1). Apesar das células neste estágio permanecerem
metabolicamente ativas, não entram em ciclo celular (Hathcock et al., 2003;
der-Sarkissian et al., 2004), mas adquirem característica típica de apoptose
(Shay & Wright, 2005). O estágio M1 previne a propagação de erros e
desenvolvimento tumoral (Stewart & Weinberg, 2006).
Entretanto, se os genes de resposta a danos do DNA, como p53 e/ou
p21 estiverem inativos, haverá escape em direção à persistência da
proliferação, além da senescência (estágio M1) (Baerlocher & Lansdorp,
2003; der-Sarkissian et al., 2004; Lou & Chen, 2006). As células continuam
se dividindo, os telômeros encurtam, criando ambiente propício ao
aparecimento de anormalidades cromossômicas, a exemplo dos ciclos
quebra-fusão-ponte cromossomal (Baerlocher & Lansdorp, 2003; der-
Sarkissian et al., 2004; Shin et al., 2006). Adquirem capacidade proliferativa
ilimitada, continuam se dividindo e encurtando o telômero até que um
segundo bloqueio denominado de “crise” ou “estágio 2 de mortalidade” (M2)
seja alcançado (Shay & Wright, 2005). O estágio de crise é caracterizado por
telômeros curtos, fusões cromossomais finais, pontes de anáfase e morte
celular por apoptose (Londoño-Vallejo, 2004; Stewart & Weinberg, 2006)
(Figura 6).
Revisão da Literatura
39
Figura 6. Heterogeneidade do comprimento do telômero devido à proliferação
celular (Londoño-Vallejo, 2004. Adaptado pela autora)
O ciclo de quebra-fusão-ponte inicia-se quando os cromossomos
encurtam o telômero, mas continuam a replicação, criando ambiente propício
para a fusão da porção final das cromátides irmãs. Durante a anáfase,
devido à presença de dois centrômeros, as cromátides irmãs fundidas
formam uma ponte e se fragmentam durante a separação dos centrômeros.
Desta forma, uma das células filha ganha um cromossomo com duplicação
final, sob a forma de repetição invertida, enquanto a outra célula filha fica
com um cromossomo contendo uma deleção terminal. Em decorrência da
falta de telômero, na próxima geração, as cromátides continuam se fundindo
e se fragmentando, a menos que os cromossomos readquiram novo
telômero e tornem-se estáveis (Murnane, 2006).
Revisão da Literatura
40
2.2.4 Senescência celular
A senescência (estágio M1) celular pode ser induzida por sinal
intrínseco e extrínseco. A senescência replicativa é desencadeada por
disfunção telomérica e a prematura por estímulo oncogênico e de estresse.
Ambas apresentam o mesmo fenótipo e atividade do biomarcador associado
à senescência (AS β-Gal), descrito em 1995 (Katakura, 2006). Na
senescência replicativa pode haver reativação da telomerase, o que não
ocorre na senescência prematura (Shay & Wright, 2005).
2.2.5 Telomerase
Existem dois mecanismos independentes, tentando equilibrar o
processo de encurtamento dos telômeros por proliferação celular. O mais
comum depende da síntese de novo DNA telomérico pela telomerase. O
segundo decorre de eventos de recombinação telomérica denominados
Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) (Cerone et al., 2001; Hultdin
2003; Villa et al., 2004; Damle et al., 2004).
A ALT não é um mecanismo fisiológico, e foi observada em tumores
humanos, como carcinoma, osteosarcoma e algumas células transformadas
em cultura, como fibroblastos. Acredita-se tratar-se de mecanismo que
auxilia a telomerase na manutenção telomérica. Entretanto, nem todas as
células que perdem telomerase expressam ALT (Fleisig & Wong, 2006).
A telomerase humana é uma transcriptase reversa (Baerlocher
&
Revisão da Literatura
41
Lansdorp, 2003) que sintetiza repetições de DNA telomérico. Possui
complexo enzimático denominado de hTR, rico em RNA, o qual liga-se ao
DNA telomérico, e serve de molde para a síntese das repetições
teloméricas; uma subunidade catalítica (hTERT) que impulsiona a adição de
nucleotídeos ao final 3’
(Dahse et al., 1997), e várias proteínas
(Villa et al.,
2004) que facilitam a ligação de deoxinucleosideo trifosfato (dNTPs) ou
seqüências de DNA
(Dahse et al., 1997). A telomerase sintetiza e adiciona
repetições teloméricas TTAGGG à região final 3’ do cromossomo, as quais
funcionam como molde para a síntese do DNA da fita lenta, alongando-a
(Baerlocher et al., 2002; Hultdin, 2003). Desta maneira, consegue manter o
comprimento do telômero íntegro, durante a divisão celular e,
conseqüentemente, a capacidade replicativa da célula
(Hathcock et al.,
2003).
A maior parte das células somáticas humanas possui capacidade
proliferativa limitada em decorrência da falta de atividade de telomerase
(Hathcock et al., 2003). Entretanto, é encontrada em sua forma ativa em
células germinativas, progenitoras, linfócitos T ativados, linfócitos B do
centro germinativo e em células malignas (Brümmendorf et al., 2001; Hultdin,
2003).
Estudos com células infectadas pelo HTLV-I demonstraram-se
divergentes quanto a ativação ou inibição da telomerase (Gabet et al., 2003;
Sinha-Datta et al., 2004). De qualquer forma, a expressão de hTERT causa
diferentes efeitos entre os subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+, que
resultarão em aumento do potencial replicativo e perda telomérica no
Revisão da Literatura
42
linfócito TCD4+ (Roth et al., 2005), efeito também observado em células com
inibição da telomerase (Gabet et al., 2003). Esta perda telomérica conduz a
célula à apoptose ou parada permanente do ciclo celular, no ponto de
checagem de p53, o qual também é inativado pela Tax. Desta forma, as
ações da Tax em célula em proliferação favorecem a ocorrência de
disfunção telomérica e acúmulo de anormalidades cromossômicas, criando
um genótipo maligno. Após a transformação leucêmica, há diminuição de
Tax e conseqüente reativação da telomerase, permitindo que as células
transformadas continuem proliferando, tornem-se imortais e estabeleçam a
ATL (Gabet et al., 2003).
O papel da telomerase na oncogênese é paradoxal. Em estádios
precoces, a proliferação contínua na ausência ou presença de atividade
desta enzima resulta em disfunção telomérica, contribuindo para a
instabilidade cromossômica e desenvolvimento de câncer. Em estadios
tardios, a atividade da telomerase é reativada para manter a proliferação
celular, resultando em progressão tumoral. Desta maneira, a telomerase não
é considerada oncogênica, pois sua expressão não é o fator iniciador da
transformação (Artandi, 2006; Fleisig & Wong, 2006).
Cerca de 90% dos cânceres humanos expressam telomerase. A
associação entre reativação da telomerase e desenvolvimento tumoral
conduziu ao desenvolvimento de estratégias de inibição da telomerase,
concomitante com terapias convencionais contra o câncer. O análogo da
timidina anti-viral AZT (3’-azido-2’,3’-dideoxythymidine) é usado no
tratamento de câncer associado a vírus. Em ATL, o tratamento prolongado
Revisão da Literatura
43
com AZT resulta em erosão telomérica, ativação de apoptose dependente de
p53 e aumento dos marcadores de senescência p14 e p21. Embora 30%
dos pacientes com ATL tratados com AZT tenham falha terapêutica, este
número coincide com a porcentagem de pacientes com mutação de p53
(Fleisig & Wong, 2006, Datta et al., 2006).
2.2.6 Telômero e resposta imune
No sistema imune e possivelmente em outros sistemas do organismo, a
capacidade de regeneração celular é central para a longevidade. A
renovação celular varia em diferentes tecidos. Anormalidade na capacidade
regenerativa tecidual está associada ao maior risco de doença
hiperproliferativa (Goronzy et al., 2006). A manutenção da homeostasia do
sistema imune depende da eficiência da manutenção do comprimento do
telômero (Goronzy et al., 2006).
Os linfócitos T e B proliferam para se auto-renovarem e exercerem
funções biológicas. A eficácia da resposta imunológica depende da rápida
expansão clonal de uma única célula precursora B e/ou T antígeno
específica. As células TCD4 e TCD8 têm pelo menos 10 a 15 duplicações
em poucos dias após a estimulação antigênica. Durante a infecção, há
elevação do número de células T antígeno específicas no sangue periférico
e posterior geração de células de memória (Goronzy et al., 2006).
A proliferação celular, necessária para que as células TCD4+ e TCD8+
executem suas funções, causa perda telomérica evidenciada no menor
Revisão da Literatura
44
comprimento de telômero nestes subtipos linfocitários de memória do que
nestas células naive. Desta forma, estas populações linfocitárias sofrem
perda de telômero em torno de 50bp por ano, acarretando no menor
comprimento de telômero evidenciado em indivíduos mais velhos (Akbar &
Vukmanovic-Stejic, 2007).
Estudos recentes demonstram que existe divergência nos padrões de
atividade da telomerase entre os subtipos TCD4 e TCD8. Durante o estímulo
antigênico inicial, células TCD4 naive e TCD8 apresentam cinéticas de
regulação da telomerase semelhantes. Entretanto, no quarto encontro com o
antígeno, células TCD8 não apresentam atividade de telomerase, enquanto
as TCD4 apresentam alta atividade de telomerase, o que se mantêm até
mesmo após o décimo encontro com o antígeno. O declínio da atividade da
telomerase ocorre em paralelo à perda de expressão de CD28, que ocorre
mais precocemente na célula TCD8+ (Effros, 2004). A limitação intrínseca
de indução de telomerase tem importante implicação clínica por reduzir a
capacidade de expansão clonal do linfócito TCD8+ (Effros et al., 2003).
Infecções virais crônicas e envelhecimento estão associados a
aumento da proporção de célula T CD28 negativa e menor telômero.
Portanto, a perda telomérica é maior na célula TCD8 que na TCD4 em
indivíduos da mesma idade (Effros et al., 2003).
Na infecção pelo HIV, a perda telomérica é mais precoce e pronunciada
na célula TCD8, uma das responsáveis pelo controle das infecções virais
(Effros et al., 2003, Dagarag et al., 2004). Uma vez geradas, as células
Revisão da Literatura
45
TCD8 senescentes não desaparecem, perdem CD28, hiperexpressam bcl2,
tornando-se resistentes à apoptose (Effros et al., 2003). Em idosos, as
células TCD8+CD28(-) não se proliferam, são vírus específicas, incapazes
de responderem a novo estímulo antigênico e sofrerem expansão clonal.
Têm reduzida atividade lítica, de produção de IFNγ e menor ação antiviral,
reduzindo o controle de infecções agudas (Effros, 2004).
Achados clínicos similares sugestivos de diminuição da função TCD8
foram reportados em indivíduos com síndrome de Down, considerado
modelo acurado de envelhecimento acelerado. Estes indivíduos têm
aumento de TCD8, maior susceptibilidade à infecção viral e bacteriana e de
desenvolverem leucemia aguda (Effros et al., 2003).
2.2.7 Implicação do telômero e desenvolvimento
Vários estudos correlacionam comprimento de telômero e
envelhecimento humano. Sugerem que o envelhecimento resulta de lento
acúmulo de danos que conduzem à deterioração celular e tecidual, orientado
pelo mecanismo de morte celular programada ou “relógio biológico”, regido
pelo comprimento do telômero (Stewart & Weinberg, 2006).
Os telômeros, por conter seqüências ricas em G, são sensíveis a danos
oxidativos. O reparo deste dano pela excisão de nucleotídeo é pouco eficaz
em regiões do DNA não codificante e o mecanismo de reparo por
recombinação homóloga é dificultado pela natureza de seqüências
Revisão da Literatura
46
repetitivas do telômero. Por essa razão, o encurtamento do telômeros
dependente da idade, pode ser significantemente acelerado por danos ao
DNA, erros de replicação e falta de reparo correto (Goronzy et al., 2006).
Neste contexto, crianças que recebem transplante de células tronco
hematopoiéticas de doadores mais velhos, têm telômeros menores que
crianças que recebem célula tronco de doadores jovens. Similarmente, foi
reportado que a ovelha clonada Dolly possuía telômero menor que dos
controles pareados pela idade. Investigadores sugerem que esta diferença
pode ser explicada pelo comprimento do telômero das células provenientes
da mãe e perda de telômero na cultura tecidual in vitro (Lauzon et al., 2000).
2.2.8 Implicação dos telômeros em doenças humanas
Defeitos na manutenção dos telômeros por deficiência de telomerase,
ou acelerado encurtamento telomérico, decorrente do aumento da
renovação celular, precipitará aparecimento de um fenótipo prematuro de
falência do organismo, observado em doenças humanas como a
disqueratose congênita e a anemia aplásica (Fleisig & Wong, 2006).
Um dos mais persuasivos dados neste campo é proveniente de
pacientes com disqueratose congênita (Stewart & Weinberg, 2006).
Mutações nos componentes da telomerase são a base da fisiopatologia da
doença (Artandi, 2006). A disqueratose congênita foi a primeira desordem
relacionada à manutenção dos telômeros identificada em humanos (Fleisig &
Wong, 2006). Estes pacientes apresentam sintomas relacionados com
envelhecimento e telômeros encurtados, quando comparados com
Revisão da Literatura
47
indivíduos saudáveis da mesma idade (Stewart & Weinberg, 2006). A
maioria dos sintomas clínicos é explicada pelo encurtamento dos telômeros
e conseqüente limitação da renovação celular (Fleisig & Wong, 2006).
Intervenções clínicas que mantenham ou estendam os telômeros
podem prevenir o seu encurtamento crítico e o aparecimento dos sintomas
da disqueratose congênita. Como a perda das repetições teloméricas nos
tecidos hematopoiéticos ocorre mais rapidamente dentro do primeiro ano de
vida, o aumento do comprimento dos telômeros em pacientes com esta
doença deve prover capacidade proliferativa suficiente para o resto da vida.
Terapias utilizando genes da telomerase poderiam ser aplicadas (Fleisig &
Wong, 2006).
Outra doença humana associada à insuficiência da telomerase é a
síndrome cri-du-chat, causada pela deficiência terminal do cromossomo 5p,
onde localiza-se o gene que codifica a transcriptase reversa da telomerase.
Estes pacientes vivem até a idade adulta, apresentando encurtamento
telomérico incomum, e desenvolvem fenótipo sugestivo de defeito de
envelhecimento proliferativo (Zucchero & Ahmed, 2006).
Acelerado encurtamento de telômero também acompanha o
envelhecimento em progerias como a Síndrome de Werner. A probabilidade
de uma ligação casual entre encurtamento de telômero e envelhecimento foi
fortalecida pelos recentes achados que a proteína helicase do DNA, mutada
nesta síndrome, é requerida para replicação eficiente e estabilidade do
telômero. A disfunção telomérica pode ser parcialmente responsável pelo
Revisão da Literatura
48
envelhecimento prematuro observado nesta síndrome e, por extensão, por
certos aspectos do envelhecimento normal humano (Artandi, 2006).
Outra síndrome de progeria segmentária é a de Hutchinson-Gilford que
resulta em sinais de envelhecimento prematuro em pacientes com um ano
de idade, os quais raramente atingem a adolescência. Similar à doença de
Werner, esta síndrome também apresenta acelerada erosão telomérica em
fibroblastos, mas a telomerase não consegue reverter o fenótipo celular de
senescência prematura (Zucchero & Ahmed, 2006).
Em doenças cardiovasculares, estudos demonstraram que as células
endoteliais coronarianas de pacientes com doença arterial coronariana
apresentam menor comprimento de telômero que controles saudáveis
pareados pelo sexo. Além disso, foram detectados baixos níveis de atividade
da telomerase em placas de células de músculo liso vascular e menor
comprimento de telômero em placas coronárias quando comparado com
veias normais do mesmo paciente. Os possíveis fatores causadores da
inibição da telomerase e acelerado encurtamento de telômero incluem
estresse oxidativo, hipertensão arterial e diabetes (Fuster & Andrés, 2006).
Em Leucemia Mielóide Crônica (LMC), o comprimento do telômeros
está significantemente reduzido em células Ph+ do sangue periférico em
comparação às células de indivíduos saudáveis (Rigolin et al., 2004).
Pacientes em fase blástica ou acelerada têm telômero significativamente
menor do que os de pacientes em fase crônica (Drummond et al., 2004;
Rigolin et al., 2004). Além disso, estudos demonstram que o grau de
Revisão da Literatura
49
encurtamento do telômeros correlaciona-se com prognóstico, sendo o
encurtamento significativamente maior nos pacientes com alto-risco do que
nos de baixo-risco (Drummond et al., 2004). Modelos de dinâmica de
telômero nesta doença sugerem que significativa perda dos telômeros ao
diagnóstico poderia levar à progressão precoce da doença, como resultado
da disfunção telomérica e da instabilidade genética (Drummond et al., 2004).
Hartmann et al. (2005), estudando pacientes com Leucemia Mielóide
Aguda (LMA), observaram que o grau de encurtamento dos telômeros
correlaciona-se com parâmetros clínicos. Pronunciado encurtamento dos
telômeros foi encontrado no subtipo de LMA-M5, concomitante a elevado
número de mutações ativadoras do gene FLT3, aumentando a proliferação.
O encurtamento no comprimento dos telômeros foi correlacionado à alta
proporção de anormalidades cariotípicas (Hartmann et al., 2005).
Estudos em granulócitos de pacientes com Anemia Aplásica (AA)
demonstram que os telômeros são significativamente menores que de
indivíduos saudáveis ajustados pela idade, embora sem diferença em
relação ao próprio controle obtido após o tratamento (Rigolin et al., 2004).
Dados provenientes de estudos em Síndrome Mielodisplásica (SMD)
demonstram menor comprimento de telômero em granulócitos do sangue
periférico e em células CD34+, sustentando a noção de que esta síndrome
seja uma doença do compartimento das células tronco e que os eventos
patogênicos que conduzem à doença podem envolver acelerado
encurtamento dos telômeros (Rigolin et al., 2004).
Revisão da Literatura
50
Em pacientes com Hemoglobinúria Paroxística Noturna (HPN), uma
síndrome adquirida que apresenta falência da medula óssea, vários estudos
constataram a diminuição do comprimento dos telômeros. Em estudo
realizado por Beier et al. (2005), a análise de granulócitos de pacientes que
não apresentavam a âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI), necessária para
ancorar proteínas extracelulares na membrana das células, demonstrou que
estas células possuem menor comprimento de telômero que as células que
possuem a GPI nestes pacientes (Beier et al., 2005).
Estudos realizados em pacientes com linfoproliferações crônicas
demonstram que Linfoma Folicular, Linfoma de Burkitt e Linfoma Difuso de
Grandes Células B apresentam telômeros maiores que pacientes com
Linfoma de Células do Manto e Leucemia Linfóide Crônica (LLC). Em LLC, o
comprimento dos telômeros está associado com a mutação no gene da
região variável da cadeia pesada da imunoglobulina (gene V
H
), sendo que,
pacientes que apresentam o gene V
H
mutado apresentam telômeros maiores
que os casos não mutados. Em trabalho realizado por Grabowski et al.,
(2005) verificou-se que entre os pacientes com LLC com gene V
H
mutado foi
encontrado um grupo com telômeros mais longos e resultado mais favorável,
além de um grupo com telômeros menores e um pior resultado (Grabowski
et al., 2005). Em Mieloma Múltiplo (MM) verificou-se que as células malignas
têm comprimento de telômero significativamente menor que granulócitos e
linfócitos do mesmo paciente e que o subgrupo de pior prognóstico
apresenta alta atividade da telomerase e menor telômero (Wu et al., 2003).
Revisão da Literatura
51
2.3 Determinação do comprimento telomérico
O comprimento médio do telômero é tradicionalmente determinado pelo
método de Southern blot (SB), descrito por Southern em 1975, utilizado para
análise de estrutura de DNA e telômero. Nesta técnica, o DNA é
fragmentado por enzimas de restrição, separado por eletroforese em gel de
agarose e transferido para membrana de nitrocelulose ou nylon.
Subsequentemente, fragmentos de DNA são hibridizados com sonda
específica para a seqüência telomérica, ligada a isótopo radioativo ou
quimioluminescência. O tamanho dos fragmentos de restrição telomérica é
medido quantitativamente por densitometria. Porém, esta técnica tem
desvantagens como dificuldade de obter DNA não fragmentado, pois este
possui alto peso molecular e alta viscosidade, dificultando o manuseio, além
de requerer quantidades difíceis de serem obtidas a partir de número
pequeno de células e, longo tempo de execução (Lin & Yan, 2005).
Adicionalmente, não permite verificar informação de células individuais
quando realizada em extrato de tecido, pois combina diferentes tipos de
células (Lauzon et al., 2000; Ferlicot et al., 2003) e não permite o cálculo
exato do comprimento das repetições teloméricas devido à contribuição de
seqüências de DNA subteloméricas, que podem variar entre indivíduos,
resultando em menor acurácia. Isto ocorre porque as enzimas de restrição
cortam o DNA na região subtelomérica e os fragmentos teloméricos
detectados após adição da sonda contém DNA não telomérico. Os
fragmentos obtidos contêm DNA telomérico de comprimento variável e DNA
Revisão da Literatura
52
sub-telomérico de 2,5 a 4kb, o que contribui para menor acurácia do cálculo
do tamanho do telômero (Hultdin et al., 1998).
Recentemente foi desenvolvida nova metodologia para a análise do
comprimento do telômero denominada Flow-FISH, baseada na hibridização
in situ fluorescente (FISH), com leitura por citometria de fluxo (Flow). Dois
grupos independentes descreveram duas aplicações similares desta técnica
na determinação do comprimento telomérico, mas é impossível comparar
seus resultados. Hultdin et al. (1998) reportaram a fluorescência telomérica
como valor relativo calculado como a razão entre o valor médio de
fluorescência do telômero de cada amostra e da célula de linhagem 1301,
com compensação pelo índice de DNA de ambas as células em G
0
/G
1
(Hultdin et al., 1998). Rufer et al. (1998) usaram inicialmente, nível de
fluorescência arbitrária e, posteriormente, a quantidade de moléculas de
fluorocromo solúvel equivalente (MESF) (1999) (Rufer et al., 1998; Rufer et
al., 1999; Law & Lau, 2001).
Na técnica de Flow-FISH utiliza-se uma sonda composta de peptídeo
de ácido nucléico (PNA)(CCCTAA)
3
telômero específica, conjugada a um
marcador fluorescente, que se hibridiza de maneira quantitativa às
repetições teloméricas. A sonda PNA contém uma coluna de glicina de carga
elétrica neutra, no lugar da coluna de ribose/desoxiribose fosfato da sonda
oligonucleotídica tradicional. Isto suprime a interferência do re-anelamento
da sonda de DNA genômico. A sonda PNA hibridiza o DNA complementar
em soluções de baixa força iônica, desfavorecendo o re-anelamento da fita
alvo. As interações PNA-DNA são mais estáveis que as interações DNA-
Revisão da Literatura
53
DNA ou DNA-RNA sob condições de hibridização (Lansdorp et al., 1997). A
sonda PNA possui a mesma distância entre as bases do DNA, facilitando a
hibridização ao DNA (Nielsen et al., 1991), aumentando a sensibilidade e a
especificidade comparativamente às sondas de DNA (Landsdorp et al.,
1996). Esta propriedade se traduz em resultado mais reprodutível e sinal
fluorescente mais intenso (forte brilho) do que o obtido com oligonucleotídeo
DNA convencional (Lauzon et al., 2000). Além disso, a sonda PNA tem
pouca ligação inespecífica de DNA, maior resistência a nucleases (Kapoor &
Telford, 2004) e ligação forte e estável às repetições teloméricas. A
associação matemática entre quantidade de ligação da sonda PNA,
intensidade de fluorescência e número aproximado de repetições
teloméricas foi determinada por comparação com dados obtidos por SB.
Entretanto, a quantificação do número de sondas PNA ligadas à repetição
telomérica de forma não covalente necessita ser calibrada e padronizada
para cada citômetro de fluxo. Desta forma, as unidades arbitrárias obtidas
podem ser convertidas para comprimento de telômero em unidades kbp
(Kapoor & Telford, 2004).
Em contraste à medida dos fragmentos de restrição terminal (TRF) por
SB, a técnica de Flow-FISH permite estimar o comprimento do telômero sem
a inclusão de regiões subteloméricas. Possibilita também que as células
sejam marcadas com anticorpo monoclonal (AcMo) específico e
consequentemente discriminar diferentes subpopulações em cada uma das
fases do ciclo celular. É factível, sofisticada e reprodutível e pode ser
aplicada em amostras de tecido e fluido corporal (Saldanha et al., 2003).
Revisão da Literatura
54
Requer pequena quantidade de células (Hultdin et al., 1998) e o resultado
está disponível em 24 horas (Baerlocher et al., 2002)
A célula de linhagem 1301 é utilizada na técnica de Flow-FISH como
controle interno para monitorar a acurácia das diferentes etapas do
procedimento. Por ser adicionada antes das etapas de fixação, hibridização
e marcação de DNA, erros associados às múltiplas etapas são minimizados
(Hultdin et al., 1998) e variações diárias do instrumento podem ser
controladas (Ross & Hultdin, 2001). Funciona também como padrão interno
para o comprimento de telômero, permitindo a comparação precisa entre
diferentes amostras. Estas células são tetraplóides, possuem telômero longo
(>25kb) e são facilmente distinguidas dos outros tipos de células. É
identificada nos citogramas de citometria de fluxo pelo seu conteúdo de
DNA, analisado no detector FL3 e apenas amostras humanas anormais
podem se sobrepor às mesmas (Hultdin et al., 1998).
3. Objetivos
Objetivos
56
• Analisar o comprimento do telômero nos subtipos linfocitários TCD4
e TCD8 de portadores do vírus HTLV-I, comparando com indivíduos
saudáveis;
• Analisar o comprimento do telômero nos subtipos linfocitários TCD4
e TCD8 de pacientes com ATL, comparando com indivíduos
saudáveis;
• Analisar o comprimento do telômero nos subtipos linfocitários TCD4
e TCD8 de pacientes com ATL, comparando com portadores do
vírus HTLV-I;
• Verificar a relação entre comprimento de telômero e carga proviral
do HTLV-I em portadores do vírus HTLV-I e com ATL.
4. Métodos
Métodos
58
4.1 Casuística
De julho de 2006 a março de 2007 foram estudados de forma
prospectiva 52 portadores do vírus HTLV-I, com mediana de idade de 49,5
anos (idades entre 18 e 71 anos), identificados na triagem pelo teste
sorológico de ELISA e confirmados por Western blot ou PCR em amostras
colhidas durante a doação voluntária de sangue, no serviço de Hematologia
do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo (HC-FMUSP). Foram incluídos seis pacientes com ATL com mediana
de idade de 39 anos (idades entre 18 e 59 anos), provenientes do serviço de
Hematologia HC-FMUSP. Paralelamente, foram estudados como grupo
controle, 58 indivíduos saudáveis, doadores de plaqueta por aférese, com
sorologias negativas, pareados pelo sexo e idade com os portadores do
vírus HTLV-I e com os portadores de ATL. A amostragem foi determinada
em estudo piloto realizado previamente. O estudo foi realizado de julho de
2006 a março de 2007.
Inicialmente, foi explicado aos possíveis participantes do estudo a
justificativa e os procedimentos a serem realizados para obtenção da
amostra. Ao ser aprovada a sua participação, a mesma foi formalizada pelo
preenchimento do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Esta
pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de
Pesquisa (CAPPesq) da Diretoria Clínica do HC-FMUSP sob Protocolo de
Pesquisa nº 656/04.
Métodos
59
4.2 Métodos
4.2.1. Coleta e processamento das amostras
Foram coletados 30ml de sangue periférico de cada indivíduo
participante do estudo, em tubos contendo heparina como anticoagulante.
Todas as amostras foram processadas para obtenção de células
mononucleares do sangue periférico (PBMC) com Ficoll-Paque Plus (GE
Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, United Kingdom) (Baerlocher et al.,
2002). Para tanto, as amostras foram diluídas com solução salina
tamponada com fosfato (PBS) em proporção 1:1. Em um tubo, devidamente
identificado, adicionou-se 3 partes de Ficoll-Paque para cada 4 partes de
sangue total diluído. O sangue total diluído foi cuidadosamente vertido pelas
paredes do tubo sobre o Ficoll-Paque, criando uma interface entre o Ficoll-
Paque e a amostra de sangue diluída, sem homogeneização do tubo. O tubo
foi centrifugado a 400g, à temperatura ambiente (T.A.) por 30’ a 40’, sem
utilização de freio ao final da centrifugação. Após a centrifugação, a camada
de PBMC foi aspirada e transferida para outro tubo de centrífuga,
devidamente identificado. Em seguida foi adicionado PBS à camada de
PBMC, seguido de homogeneização e procedida a centrifugação em
velocidade de 100g por 10’ à T.A. O sobrenadante foi removido e as células
novamente lavadas em PBS e centrifugadas nas mesmas condições
anteriores, removendo-se posteriormente o sobrenadante.
Para fins de estudo, quando necessário, as amostras foram
congeladas a -80
o
C em solução de congelamento. Para este procedimento,
as células foram ressuspendidas em meio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island,
Métodos
60
USA) suplementado com 20% de Soro Fetal Bovino (FBS) (Gibco, Grand
Island, USA) inativado, quantificadas em câmara de Neubauer e congeladas
em meio contendo FBS inativado e 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-
Aldrich, Steinheim, Germany). Em seguida foram acondicionadas em tubos
específicos para congelamento, congeladas e armazenadas à -80
o
C.
Para descongelar as células, os tubos específicos para congelamento
foram homogeneizados rapidamente em Banho Maria à 37
o
C e, em seguida,
as células foram transferidas para tubos contendo meio RPMI 1640 seguido
de centrifugação a 100g por 10’. O sobrenadante foi removido e o botão
celular ressuspendido em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de FBS
para quantificação em câmara de Neubauer e realização do teste de
viabilidade.
Para o teste de viabilidade, foram adicionados 10µl da suspensão
celular a 10µl de solução azul de Tripan (Sigma-Aldrich, Steinheim,
Germany) diluído 1:10. Em microscópio optico, foram contadas as células
vivas, não coradas e as mortas coradas em azul pelo azul de Tripan. Todas
as amostras apresentaram viabilidade superior a 80%.
Para estudar o comprimento de telômero nos diferentes subtipos
linfocitários, os mesmos foram separados pelo método de cell sorting, a
partir do imunofenótipo celular, utilizando-se pérolas magnéticas. Isso
possibilitou a obtenção dos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+
separadamente.
Métodos
61
4.2.2 Separação celular
Para a obtenção de linfócitos TCD4+, a suspensão de PBMC, contendo
1 X 10
7
células, foi centrifugada a 300g por 10’. O botão celular foi
ressuspendido em 80µl de tampão de separação, contendo PBS
suplementado com 0,5% albumina bovina fração V (BSA) (Biotest). Em
seguida foi adicionado 20µl de CD4 MicroBeads human (Miltenyi Biotec,
Bergisch Gladbach, Germany) e incubado por 15’ entre 4-8
o
C. Quando
trabalhamos com maior número de células, os volumes dos reagentes foram
escalonados gradativamente. As células foram lavadas pela adição de
tampão de separação e centrifugadas por 300g por 10’, seguido do descarte
do sobrenadante. O botão celular foi ressuspendido em 500µl de tampão de
separação. Para a separação magnética, adicionou-se a uma coluna LS
(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), colocada no campo
magnético de um separador magnético MidiMacs (Miltenyi Biotec, Bergisch
Gladbach, Germany), 3ml de tampão de separação. A suspensão celular foi
aplicada na coluna e as células não ligadas, que passavam diretamente pela
coluna, foram coletadas em tubos identificados como células não-TCD4+. A
coluna foi lavada três vezes com 3ml de tampão de separação, coletando-se
as células no mesmo tubo. A coluna foi removida do separador magnético,
colocada em tubo coletor identificado como células TCD4+. Aplicou-se 5ml
de tampão de separação na coluna e a fração de células ligadas
magneticamente foi removida da coluna com o auxílio de um pistão
fornecido junto com a coluna e coletadas em tubos identificados como
células TCD4+.
Métodos
62
Para a obtenção de linfócitos TCD8+ utilizou-se a mesma técnica
descrita para obter células TCD4+, mas com 20µl de CD8 MicroBeads
human (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany).
A eficiência de cada separação celular foi avaliada por marcação de
uma alíquota de amostra proveniente dos tubos identificados como células
TCD4+ e células TCD8+, com AcMo anti-CD3 FITC (isoticioanato de
fluoresceína)(IMMUNOTECH, Marseille, France), anti-CD4 PE
(Phycoerythrin)(Becton Dickinson/PharMingen, San Jose, CA) e anti-CD8 PE
(Becton Dickinson/PharMingen, San Jose, CA), adquiridos e analisados em
citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA), utilizando
o software CELL-Quest Pro (Becton Dickinson, San Jose, CA).
4.2.3 Hibridização in situ Fluorescente
O procedimento de hibridização in situ fluorescente foi realizado
separadamente para linfócitos TCD4+ e TCD8+. A padronização da técnica
de Flow-FISH foi efetuada no Laboratório de Imunopatologia do Serviço de
Hematologia e Hemoterapia do HC-FMUSP.
Para determinar o comprimento dos telômeros, adicionou-se em todos
os experimentos, células de linhagem 1301 (Figura 7) de mesmo lote, para
controle interno da técnica. Por possuírem telômeros longos e serem
tetraplóides, são utilizadas como controle em testes de determinação de
comprimento de telômero. As células foram compradas da European
Collection of Cell Cultures (ECACC), disponível no site:
www.ecacc.org.uk
sob número 01051619, representando células de leucemia de células T
Métodos
63
humanas. As células foram expandidas em cultura celular utilizando meio
RPMI 1640 contendo os seguintes os antibióticos Gentamicina 40mg/ml
(Novafarma, Brasil) e Ciprofloxacina 0,2% (Sachana, Gujarat, Índia), L.
Glutamina 2mM/l (Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA) e 10% de
FBS. O congelamento das mesmas foi realizado em meio contendo FBS
suplementado com 40% de RPMI 1640 e 10% de DMSO, acondicionadas
em tubos de congelamento e armazenadas à -80
o
C até o momento do uso.
Figura 7. Células de linhagem 1301 em cultura celular (aumento de 40X e 100X).
O comprimento médio dos telômeros foi medido utilizando o kit
comercial Telomere PNA Kit/FITC (Dako K5327, Glostrup, Denmark). A
aquisição dos kits foi feita por cooperação científica com a empresa Dako,
produtora do kit (CTC Nº 03) e a empresa Biogen, representante brasileira,
de colaboração clínica e auxílio à pesquisa. A parte técnica foi executada
seguindo as instruções descritas no kit.
Como procedimento prático, as células de interesse e da linhagem
1301 foram lavadas em PBS e contadas em câmara de Neubauer. Após a
Métodos
64
contagem, as células de interesse, em concentração de 2 X 10
6
células,
foram adicionadas às células de linhagem 1301, em igual concentração (1:1)
(Hultdin et al., 1998). A mistura das células em suspensão foi dividida em
quatro tubos de 1,7 ml e centrifugada a 500g por 5'. Após remoção do
sobrenadante, adicionou-se a dois tubos, intitulados A e B, 300µl de solução
de hibridização (reagente 1) e aos outros dois, intitulados C e D, 300µl da
sonda PNA telomérica (reagente 2). Os tubos foram homogeneizados por
agitação contínua e colocados em blocos de aquecimento pré-aquecido a
82
o
C por 10' para desnaturação. Em seguida, os tubos foram
homogeneizados e incubados no escuro à T.A., durante a noite, para
hibridização. As temperaturas de desnaturação e de hibridização são
parâmetros críticos no procedimento e não devem variar mais que 2
o
C
(Kapoor & Telford, 2004).
Após a incubação, adicionou-se aos tubos 1ml de solução de lavagem
(reagente 3) diluída 1:10 em água MiliQ, seguido-se homogeneização por
agitação contínua e nova incubação em bloco de aquecimento pré-aquecido
a 40
o
C por 10'. Na seqüência, os tubos foram homogeneizados e
centrifugados a 500g por 5', seguido de descarte do sobrenadante. Este
procedimento de lavagem foi repetido mais uma vez. Os passos de lavagem
destinam-se a remover o excesso e a ligação inespecífica da sonda
específica ao telômero (Baerlocher et al., 2002).
Por fim, foi adicionado aos tubos 0,5ml de solução de marcação de
DNA (reagente 4) diluído 1:10 em água MiliQ. Os tubos foram
homogeneizados por agitação contínua e a suspensão celular foi transferida
Métodos
65
para tubos próprios para leitura em citômetro de fluxo. Os tubos foram
mantidos no escuro a 2-8
o
C por no mínimo 2 horas antes da leitura em
citômetro de fluxo.
4.2.4. Citometria de Fluxo
Para monitorar o desempenho do aparelho utilizou-se o reagente
CaliBRITE Beads (Becton Dickinson, San Jose, CA), adquirido com software
FACSComp (Becton Dickinson, San Jose, CA). Este reagente é composto
de pérolas não marcadas destinadas a ajustar a voltagem dos tubos
fotomultiplicadores e de pérolas marcadas para compensação das
fluorescências e avaliação da sensibilidade do aparelho.
Para corrigir flutuação na intensidade do laser, variações diárias do
instrumento, a linearidade do aparelho e, possibilitar a quantificação do
comprimento telomérico pelo estabelecimento da curva de calibração
utilizou-se pérolas de calibração ligadas a FITC, do reagente FluoroSpheres
(Dako K0110, Glostrup, Denmark).
A aquisição e a análise das pérolas de calibração e, da fluorescência
telomérica proveniente da marcação com os reagentes do kit Telomere PNA
Kit/FITC, de todas as amostras realizou-se em citômetro de fluxo
FACSCalibur utilizando o software CELLQuest Pro.
Métodos
66
4.2.4.1 FluoroSphere
Este reagente é composto de uma mistura de cinco populações de
pérolas, ligadas a quantidades progressivas de moléculas de fluorocromo
FITC e, de uma população de pérolas não marcadas. Cada população
apresenta quantidades conhecidas de moléculas de fluorocromo solúvel
equivalente (MESF), o que possibilitou determinar a intensidade média de
fluorescência (IMF), para cada um dos seis picos fluorescentes, e
estabelecer a curva de calibração. Esta curva permitiu a transformação das
unidades arbitrárias de IMF obtidas, em unidades absolutas de valores
MESF (Rufer et al., 1999; Baerlocher et al., 2002).
Deste modo, o valor de IMF, obtido no citômetro de fluxo, pode ser
correlacionado com número de moléculas de fluorocromo. Ou seja, um sinal
fluorescente, proveniente da sonda telomérica PNA ligada a FITC, se
correlacionará com o número de sondas PNA ligadas ao telômero e,
consequentemente, ao número de repetições teloméricas por célula (Kapoor
& Telford, 2004).
Inicialmente, a população de pérolas não ligadas foi ajustada para sua
visualização em citograma, formado pela dispersão frontal da luz (FSC) e
dispersão lateral da luz (SSC), no log 10
1
do histograma, correspondente ao
detector de FL1, em amplificação logarítmica. Estabeleceu-se um gate
eletrônico em torno da população de pérolas visualizadas em FSC por SSC
e, adquiridos 5000 eventos nesta região. Em seguida, a mistura de pérolas,
com diferentes quantidades de fluorocromo, foi adquirida na mesma
calibração anteriormente estabelecida. Seis picos de diferentes IMF foram
Métodos
67
obtidos em histograma unidimensional, com FL1 no eixo da abscissa e,
número de células no eixo das ordenadas. Marcadores individuais foram
utilizados para delimitar cada uma das populações, e calcular a IMF
correspondente. Estes valores de IMF foram utilizados para construir a curva
de calibração, correlacionando IMF e valores MESF, estabelecidos no kit
para cada população de pérola.
O fluorocromo ligado às pérolas de calibração (FITC) foi o mesmo
utilizado para marcação da sonda específica para a região telomérica. A
aquisição das amostras marcadas com a sonda telomérica, realizou-se na
mesma calibração estabelecida diariamente com as pérolas de calibração,
para o referido detector (FL1). A voltagem dos demais detectores pôde ser
alterada da voltagem estabelecida pelas pérolas fluorescentes.
4.2.4.2. Aquisição e análise das reações de mensuramento do
comprimento do telômero
Inicialmente as células foram visualizadas em citograma bidimensional
em escala linear com FSC na abscissa e SSC na ordenada. Em outro
citograma bidimensional, com FL1 em escala logarítmica na ordenada,
representando o sinal fluorescente da sonda PNA telomérica fluorescente e,
no eixo da abscissa, em escala linear (FL3) representando o sinal
fluorescente da marcação de DNA com iodeto de propídeo (PI).
Para a aquisição, foi estabelecido um gate eletrônico em torno das
células em fase G
o
/G
1
do ciclo celular, utilizando como base a disposição
Métodos
68
das células em FL3. Desta maneira, as células dos indivíduos em estudo e
dos controles saudáveis se posicionavam na posição (canal) 200,
correspondente à localização das células diplóides, onde se estabeleceu a
região 1 (R1). As células de linhagem 1301 se posicionavam na posição
(canal) 400 e delimitadas pela região 2 (R2). A partir destas regiões, foram
plotados dois histogramas unidimensionais, em escala logarítmica, com FL1
na abscissa e número de células na ordenada, para determinação das IMF
resultantes da marcação com e sem sonda telomérica de R1 e R2,
respectivamente (Hultdin et al., 1998). Estes valores de IMF foram utilizados
para medir o comprimento do telômero.
4.2.5 Avaliação do comprimento dos telômeros
A avaliação do comprimento telomérico realizou-se por três diferentes
protocolos. O valor médio de fluorescência telomérica foi definido como a
média das IMF obtidas das células marcadas com a sonda telomérica,
subtraído da média das IMF obtidas das células com solução de hibridização
(procedimento sem sonda telomérica). Os procedimentos com e sem sonda
telomérica foram realizados em duplicata (Baerlocher et al., 2002).
No protocolo nº 1, de Hultdin et al. (1998), utilizaram-se os valores
médios de fluorescência telomérica em IMF. Estes foram calculados como a
razão entre o valor médio de fluorescência telomérica de cada amostra e o
valor médio de fluorescência telomérica da célula controle (linhagem 1301),
corrigidas pelo índice de DNA. Como representam razões, não existe
unidade para este valor.
Métodos
69
Técnica 1
⇒
⇒⇒
⇒ Comprimento telomérico =
valor médio de fluorescência telomérica em IMF da amostra analisada X índice de DNA da célula controle
__________________________________________________________________________________________
valor médio de fluorescência telomérica em IMF da célula controle X índice de DNA da amostra analisada
No protocolo nº 2, de Rufer et al. (1999), foram utilizados os valores
médios de fluorescência telomérica em IMF da amostra, convertidos em
MESF sem célula de controle (linhagem 1301) e compensação pelo índice
de DNA. Os valores são expressos em MESF.
Técnica 2 ⇒
⇒⇒
⇒ Comprimento telomérico em MESF =
valor médio de fluorescência telomérica em IMF da amostra convertido em valores MESF
Para assegurar resultados mais confiáveis e que permitissem a
comparação entre as diferentes instituições, estabelecemos o protocolo nº 3,
resultante da junção dos protocolos de Hultdin et al. (1998) e Rufer et al.
(1999). Neste protocolo utilizamos a linhagem celular 1301 como controle
interno, correção do número de telômeros por célula pelo índice de DNA e
conversão dos valores médios de fluorescência telomérica obtidos em IMF
para valores MESF.
O cálculo do comprimento de telômero foi determinado pela razão entre
o valor médio de fluorescência telomérica de cada amostra e da amostra
controle (células de linhagem 1301) convertidos em MESF, com correção
pelo índice de DNA das respectivas células. Como representam razões, não
existe unidade para este valor.
Métodos
70
Técnica 3
⇒
⇒⇒
⇒ Comprimento telomérico =
valor médio de fluorescência telomérica em MESF da amostra analisada X índice de DNA da célula controle
_____________________________________________________________________________________________ X 100
valor médio de fluorescência telomérica em MESF da célula controle X índice de DNA da amostra analisada
4.2.5.1 Índice de DNA
Para o estudo do índice de DNA, foi utilizado o reagente Cycle-Test
TM
plus DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA) e leitura por
citometria de fluxo no programa ModFit LT (Becton Dickinson, San Jose,
CA). As PBMC foram obtidas por Ficoll-Paque Plus, lavadas com solução
tampão (Cycle Test
TM
plus Buffer Solution), contadas e ajustadas para a
concentração de 1 X 10
6
células. Foram adicionados em tubos diferentes,
linfócitos de individuo normal, linfócitos da amostra em pesquisa e uma
mistura de linfócitos de indivíduo normal e da amostra em pesquisa na
proporção 1:4. Foi adicionado a cada tubo 250µl da solução A (Cycle
Test
TM
plus solution A), seguido de homogeneização manual e incubação por
10’ à T.A. Na seqüência adicionou-se 200µl da solução B (Cycle Test
TM
plus
solution B) a cada tubo, os quais foram homogeneizados e incubados 10’ à
T.A., com posterior adição de 200µl da solução C (Cycle Test
TM
plus solution
C) contendo iodeto de propídeo (PI) que se intercalava ao DNA das células
em suspensão. Após cuidadosa homogeneização, as células foram
incubadas 10’ a 2-8
o
C e mantidas nesta temperatura e no escuro, até o
momento da aquisição no aparelho FACSCalibur.
Métodos
71
Para o ajuste dos detectores do citômetro de fluxo, antes da aquisição
do reagente Cycle-Test
TM
plus DNA Reagent Kit, foram utilizadas partículas
CEN (chicken erythrocyte nuclei) e CTN (calf thymocyte nuclei) diluídas em
solução de PI do reagente DNA QC Particles (Becton Dickinson, San Jose,
CA). As partículas CEN são compostas por núcleos isolados e agregados
(doublets, triplets, ou agregados maiores) e utilizadas para calibrar a
linearidade e a resolução do aparelho, enquanto que as partículas CTN são
formadas por núcleos em várias fases do ciclo celular para discriminar
agregados celulares.
O índice de DNA foi calculado pela razão entre o canal de G
0
/G
1
da
amostra em pesquisa e o canal de G
0
/G
1
do indivíduo saudável (Vielh,
1991).
4.2.6 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) para
determinação de carga proviral
O protocolo para determinação de carga proviral foi realizado conforme
descrito por Lee et al. (2004). Os testes de quantificação de carga proviral
por RT-PCR foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular da
Divisão de Sorologia e gentilmente cedidos para complementar este estudo.
4.3 Análise estatística
A análise da variação dos resultados da aquisição da célula de
linhagem 1301, realizadas em duplicata, foi efetuada pelo teste não
Métodos
72
paramétrico de Wilcoxon. A avaliação da reprodutibilidade das aquisições
destas células ao longo do tempo foi realizada pelo teste não paramétrico de
Kruskal-Wallis. Todos os testes foram bi-caudais com nível de significância
alfa de 5%. Os testes estatísticos foram realizados utilizando o programa
SPSS for Windows version 10.0 (SPSS Inc, Chicago, IL).
Para verificar se as variáveis determinadas seguiam distribuição
normal, empregou-se a prova estatística de Shapiro-Wilk e a inspeção dos
gráficos de quantis. Uma vez que as distribuições dos dados não podiam ser
aproximadas pela distribuição normal, calculou-se a mediana, como
estimador da medida de tendência central, além disso, foram calculados os
quartis 1 e 3 que indicam a mediada de dispersão. Empregou-se um modelo
de regressão robusta como estimadores determinados por meio do método
MM (Venables & Ripley, 2002) para avaliar os efeitos dos grupos (dois
níveis: portadores do vírus e indivíduos saudáveis ou portadores de ATL e
indivíduos saudáveis), do subtipo linfocitário avaliado (dois níveis: TCD4+ e
TCD8+) e da idade, bem como a interação entre grupos e idade. Aceitou-se
significância estatística em ≤ 0,05. A análise estatística foi realizada no
software R versão 2.6.0 (R Development Core Team, 2007).
5. Resultados
Resultados
74
Foram incluídos no estudo 52 portadores do vírus HTLV-I, seis
pacientes com ATL e 58 indivíduos saudáveis pareados pelo sexo e idade.
Entre os indivíduos infectados pelo vírus HTLV-I pertencentes a este estudo,
93,1% foram pesquisados para a presença de infecção pelo Strongyloides
stercoralis (S. stercoralis) e apenas 3,7% apresentou co-infecção HTLV-I
com S. stercoralis.
Os portadores do vírus HTLV-I apresentaram para ambos os subtipos
linfocitários média ± desvio padrão de idade de 49,00 ± 11,1 anos, com
mediana de 49,50 anos e quartis de 40,75 anos e 57 anos. A média ± desvio
padrão de idade para ambos os subtipos linfocitários dos indivíduos
saudáveis, pareados aos portadores do vírus HTLV-I, foi de 48,04 ± 9,85
anos, com mediana de 50,00 anos e quartis de 40 anos e 56 anos (Figura 8).
Figura 8. Valores de idade dos portadores do vírus e dos indivíduos saudáveis
A média ± desvio padrão de idade para ambos os subtipos linfocitários
em portadores de ATL foi 39,33 ± 17,42 anos, com mediana de 39 anos e
quartis de 25,75 anos e 54,5 anos. Os indivíduos saudáveis, pareados aos
Resultados
75
portadores de ATL, apresentaram para ambos os subtipos linfocitários média
± desvio padrão de idade de 39,5 ± 16,32 anos, com mediana de 39 anos e
quartis de 26,5 anos e 54,5 anos. (Figura 9).
Figura 9. Valores de idade dos portadores de ATL e dos indivíduos saudáveis
A comparação do comprimento de telômero entre portadores do vírus
HTLV-I e portadores de ATL foi prejudicada devido à variação de quase 10
anos de idade entre os grupos que inferiu em diferença estatística
significativa (p = 0,0165) (Figura 10).
Figura 10. Valores de idade dos portadores do vírus e portadores de ATL
Resultados
76
Nos indivíduos ATL, a análise do comprimento de telômero da célula
TCD4+ foi realizada em todas as amostras e da célula TCD8+ em cinco
casos, devido à ineficiência de obtenção deste subtipo linfocitário em uma
amostra. Todas as amostras utilizadas no estudo após separação celular por
subtipos linfocitários apresentaram mais de 90% de células específicas
(Figura 11).
Figura 11. Eficiência da separação celular dos subtipos linfocitários TCD4+ e
TCD8+
Os valores MESF das pérolas de calibração utilizadas no estudo e
definidas no kit foram 0 (marcador M1), 2.500 (M2), 6.500 (M3), 19.000 (M4),
55.000 (M5) e 150.000 (M6). A correlação entre os valores de MESF e os
valores de IMF de cada marcador foi utilizada para construir a curva de
calibração. A figura 12 demonstra o histograma resultante da aquisição das
pérolas de calibração, o pareamento dos valores de IMF e de MESF para
cada marcador e a curva de regressão linear obtida com estes valores.
Subtipo TCD4+ Subtipo TCD8+
Resultados
77
Figura 12. Histograma apresentando as IMF para cada população de pérola de
calibração (A). Valores MESF e de IMF para cada população de pérola de
calibração (B). Curva de regressão linear estabelecida pela correlação entre os
valores MESF e IMF (C)
Subsequentemente, o valor da IMF da amostra marcada com a sonda
telomérica e da amostra não marcada foi interpolado na curva de regressão
linear para obter as unidades MESF. Os valores MESF permitem que nossos
resultados possam ser comparados com os obtidos em pesquisas realizadas
em outras instituições.
A análise das aquisições das células de linhagem 1301 em duplicata
nos procedimentos com sonda telomérica não apresentou diferença
estatística (p = 0,613). A análise dos resultados obtidos durante a primeira
aquisição apresentou média e desvio padrão de 1616,16 ± 244,46 IMF e
mediana de 1606,16 IMF (valor mínimo: 956,44 IMF e valor máximo:
Resultados
78
2179,08 IMF). A média ± desvio padrão da segunda aquisição da duplicata
foi 1621,92 ± 257,38 IMF e mediana de 1609,71 IMF (valor mínimo: 1078,93
IMF e valor máximo: 2267,54 IMF). Os valores de fluorescência telomérica
das células de linhagem 1301 de cada experimento foram analisados em
períodos de dois meses para avaliar variações dos valores ao longo do
tempo. A análise de três períodos demonstrou não haver diferenças entre as
medições (p = 0,057). A média ± desvio padrão do primeiro período foi
1501,22 ± 155,67 IMF e mediana, 1518,23 IMF (valor mínimo: 1251,1 IMF e
valor máximo: 1736,62 IMF); do segundo período foi 1507,62 ± 297,56 IMF,
mediana de 1456,46 IMF (valor mínimo: 944,57 IMF e valor máximo:
2105,32 IMF); do terceiro período foi 1643,32 ± 191,81 IMF, mediana de
1627,20 IMF (valor mínimo: 1306,23 IMF e valor máximo: 2024,26 IMF).
(Tabela 2).
Tabela 2 - Análise das aquisições em duplicata em IMF e dos valores de
fluorescência telomérica em IMF das células de linhagem 1301 utilizadas nos
experimentos analisados por períodos
Aquisições em duplicata das células controle
Aquisições
Média Desvio padrão Mediana
Mínimo Máximo
p*
primeira 1616,16 244,46 1606,16 956,44 2179,08
segunda 1621,92 257,38 1609,71 1078,93
2267,54
0,613
Valores médios de fluorescência telomérica das células de linhagem 1301
analisados por períodos
Período Média Desvio padrão Mediana
Mínimo Máximo
p**
primeiro 1501,22 155,67 1518,23 1251,1 1736,62
segundo 1507,62 297,56 1456,46 944,57 2105,32
terceiro 1643,31 191,81 1627,20 1306,23
2024,26
0,057
* teste não paramétrico pareado de Wilcoxon
** teste não paramétrico de Kruskal-Wallis
Resultados
79
A aquisição das reações de hibridização in situ fluorescente resultou
em citogramas e histogramas estabelecidos para o procedimento sem sonda
(Figura 13) e com sonda telomérica ligada a FITC (Figura 14).
Figura 13. Procedimento com solução de hibridização sem sonda telomérica.
Citograma de FSC e SSC (A). Citograma apresentando no eixo das abscissas a
marcação de DNA com PI e na ordenada marcação das células com solução de
hibridização (B). Histograma (vermelho) apresentando a IMF das células em estudo
e estatística do histograma das células em estudo (G1=R1) (C). Histograma (verde)
apresentando a IMF das células de linhagem 1301 e a estatística do histograma
das células de linhagem 1301 (G2=R2) (D)
Solução de
hibridização –
procedimento
sem sonda
telomérica
A
C
D
B
Resultados
80
Figura 14. Procedimento utilizando sonda telomérica conjugada a FITC. Citograma
de FSC e SSC (A). Citograma apresentando no eixo das abscissas a marcação de
DNA com PI e no eixo das ordenadas marcação das células com sonda telomérica
(B). Histograma (vermelho) apresentando a IMF das células em estudo e a
estatística do histograma das células em estudo (G1=R1) (C). Histograma (verde)
apresentando a IMF das células de linhagem 1301 e a estatística do histograma
das células de linhagem 1301 (G2=R2) (D)
5.1 Análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD4+
de portadores do vírus HTLV-I e indivíduos saudáveis
A média ± desvio padrão do comprimento telomérico do subtipo
linfocitário TCD4+ pelo protocolo nº 1 em portadores do vírus HTLV-I foi de
0,1006 ± 0,0178. A mediana foi de 0,1001 com quartil 1 de 0,0912 e quartil 3
de 0,1122. O valor da média e desvio padrão dos indivíduos saudáveis foi de
0,1000 ± 0,0151. A mediana foi de 0,0978 com quartil 1 de 0,0933 e quartil 3
Procedimento
com sonda
telomérica
conjugada a
FITC
A
B
C
D
Resultados
81
de 0,1017. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os dois
grupos (p = 0,1336) (Tabela 3).
A análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD4+ pelo
protocolo nº 2 em portadores do vírus HTLV-I, demonstrou média ± desvio
padrão de 4271,00 ± 1007,37 MESF. A mediana foi de 4060,85 MESF com
quartil 1 de 3649,23 MESF e quartil 3 de 4778,43 MESF. Em indivíduos
saudáveis, a média ± desvio padrão do comprimento de telômero
encontrada foi 3989,81 ± 671,91 MESF. A mediana foi 3896,81 MESF com
quartil 1 de 3586,79 MESF e quartil 3 de 4366,17 MESF. A comparação
entre estes dois grupos não demonstrou diferença estatisticamente
significativa (p = 0,1136) (Tabela 3).
A análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD4+ pelo
protocolo nº 3 em portadores do vírus HTLV-I evidenciou média ± desvio
padrão de 10,60 ± 1,86. A mediana foi de 10,57 com quartil 1 de 9,65 e
quartil 3 de 11,74. A média ± desvio padrão dos indivíduos saudáveis foi de
10,52 ± 1,58. A mediana foi de 10,33 com quartil 1 de 9,76 e quartil 3 de
10,65. Não houve diferença estatisticamente significativa entre estes grupos
(p = 0,1377) (Tabela 3).
5.2 Análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD8+
de portadores do vírus HTLV-I e indivíduos saudáveis
A média ± desvio padrão do comprimento telomérico do subtipo
linfocitário TCD8+ em portadores do vírus HTLV-I pelo protocolo nº 1 foi
0,0968 ± 0,0180. A mediana foi 0,0957 (quartil 1: 0,0860 e quartil 3: 0,1078).
Resultados
82
Nos indivíduos saudáveis, a média ± desvio-padrão foi 0,1017 ± 0,0198. A
mediana foi 0,0972 (quartil 1: 0,0888 e quartil 3: 0,1092). A comparação
entre os valores de comprimento de telômero determinados nos grupos por
este protocolo não apresentou diferença estatisticamente significativa (p =
0,1336) (Tabela 3).
A média ± desvio padrão do comprimento telomérico no subtipo
linfocitário TCD8+ em portadores do vírus HTLV-I pelo protocolo nº 2 foi de
3939,27 ± 831,33 MESF. A mediana foi de 4006,61 MESF (quartil 1: 3359,59
MESF e quartil 3: 4466,9 MESF). Nos indivíduos saudáveis, a média ±
desvio padrão foi 3892,12 ± 811,1 MESF. A mediana foi de 3612,79 MESF
(quartil 1: 3275,21 MESF e quartil 3: 4375,85 MESF). A comparação entre os
valores de comprimento de telômero entre os dois grupos não apresentou
diferença estatisticamente significativa (p = 0,1136) (Tabela 3).
A média ± desvio-padrão do comprimento telomérico para o subtipo
linfocitário TCD8+ pelo protocolo nº 3 em portadores do vírus HTLV-I foi
10,21 ± 1,88. A mediana foi de 10,15 (quartil 1: 9,16 e quartil 3: 11,43). Nos
indivíduos saudáveis, a média ± desvio padrão foi 10,70 ± 2,07 com mediana
de 10,24 (quartil 1: 9,27 e quartil 3: 11,39). A comparação entre os valores
de comprimento de telômero entre os dois grupos por este protocolo não
apresentou diferença estatisticamente significativa (p = 0,1377). (Tabela 3).
Conforme indicado na tabela 3, não foram observadas diferenças
significativas entre portadores do vírus HTLV-I e indivíduos saudáveis em
nenhum dos protocolos para determinação do comprimento de telômero
Resultados
83
para ambos os subtipos linfocitários. Além disso, não foi observada interação
entre grupo e subtipo linfocitário analisado.
Tabela 3 - Valores do comprimento de telômero nos subtipos linfocitários TCD4+ e
TCD8+ em portadores do vírus HTLV-I e indivíduos saudáveis pelos protocolos nº
1, nº 2 (MESF) e nº 3
TCD4+ TCD8+
Grupos
Média ±
±±
± DP
Mediana [Q1;Q3]
Média ±
±±
± DP
Mediana [Q1;Q3]
Protocolo nº 1
HTLV-I+
0,1006 ± 0,0178
0,1001
[0,0912; 0,1122]
0,0968 ± 0,0180
0,0957
[0,0860; 0,1078]
saudáveis
0,1000 ± 0,0151
0,0978
[0,0933; 0,1017]
0,1017 ± 0,0198
0,0972
[0,0888; 0,1092]
p-valor 0,1336 0,1336
Protocolo nº 2 (MESF)
HTLV-I+
4271,00 ± 1007,37
4060,85
[3649,23; 4778,43]
3939,27 ± 831,33
4006,61
[3359,59; 4466,9]
saudáveis
3989,81 ± 671,91
3896,81
[3586,79; 4366,17]
3892,12 ± 811,1
3612,79
[3275,21; 4375,85]
p-valor 0,1136 0,1136
Protocolo nº 3
HTLV-I+
10,60 ± 1,86
10,57
[9,65; 11,74]
10,21 ± 1,88
10,15
[9,16; 11,43]
saudáveis
10,52 ± 1,58
10,33
[9,76; 10,65]
10,70 ± 2,07
10,24
[9,27; 11,39]
p-valor 0,1377 0,1377
p-valores obtidos a partir dos fatores principais de grupos e subtipos linfocitários na
análise de regressão robusta.
5.3 Análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD4+
em portadores de ATL e indivíduos saudáveis
Em portadores de ATL, a análise do comprimento telomérico do subtipo
linfocitário TCD4+ pelo protocolo nº 1 apresentou média ± desvio padrão de
0,0826 ± 0,0339. A mediana foi de 0,0768 (quartis 1 e 3: 0,0637 e 0,1064).
Para o protocolo nº 2, esta mesma análise apresentou média ± desvio
Resultados
84
padrão de 3124,49 ± 1686,78 MESF e mediana de 2869,40 MESF (quartis 1
e 3: 2320,22 e 3236,17 MESF). A análise realizada pelo protocolo nº 3
apresentou média ± desvio padrão de 8,7 ± 3,53 e mediana de 8,12 (quartis
1 e 3: 6,68 e 11,22).
Em indivíduos saudáveis, pareados aos portadores de ATL, a análise
do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD4+ pelo protocolo nº 1
apresentou média ± desvio padrão de 0,1035 ± 0,0158. A mediana foi de
0,1005 (quartis 1 e 3: 0,0931 e 0,1125). Para o protocolo nº 2, esta mesma
análise apresentou média ± desvio padrão de 4241,56 ± 951,13 MESF e
mediana de 3897,66 MESF (quartis 1 e 3: 3714,59 e 4365,08 MESF). A
análise realizada pelo protocolo nº 3 apresentou média ± desvio padrão de
10,89 ± 1,63 e mediana de 10,6 (quartis 1 e 3: 9,81 e 11,84).
A comparação dos valores de comprimento de telômero do subtipo
linfocitário TCD4+ entre portadores de ATL e indivíduos saudáveis pelos
diferentes protocolos não demonstrou diferença estatisticamente
significativa. Estas análises apresentaram para os protocolos nº 1, 2 e 3
valores de p de 0,4199; 0,2497 e 0,5169, respectivamente.
Os valores de comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD4+
dos portadores de ATL e indivíduos saudáveis pelos diferentes protocolos
estão apresentados na Tabela 4.
Resultados
85
5.4 Análise do comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD8+
de portadores de ATL e indivíduos saudáveis
O comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD8+ em portadores
de ATL pelo protocolo nº 1 apresentou valores de média ± desvio padrão de
0,098 ± 0,0356 e mediana de 0,0935 (quartis 1 e 3: 0,0775 e 0,1261). Para o
protocolo nº 2, média ± desvio padrão foi de 3664,82 ± 1522,90 MESF e
mediana de 3078,43 MESF (quartis 1 e 3: 3060,36 e 3521,05 MESF). A
análise realizada pelo protocolo nº 3 apresentou média ± desvio padrão de
10,28 ± 3,71 e mediana de 9,73 (quartis 1 e 3: 8,17 e 13,3).
O comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD8+ em indivíduos
saudáveis, pareados aos portadores de ATL, pelo protocolo nº 1 apresentou
valores de média ± desvio padrão de 0,108 ± 0,0114 e mediana de 0,1084
(quartis 1 e 3: 0,1061 e 0,1131). Para o protocolo nº 2, média ± desvio
padrão foi de 4217,38 ± 855,5 MESF e mediana de 4027,92 MESF (quartis 1
e 3: 3518,45 e 5103,72 MESF). A análise realizada pelo protocolo nº 3
apresentou média ± desvio padrão de 11,35 ± 1,17 e mediana de 11,41
(quartis 1 e 3: 11,15 e 11,84).
A comparação dos valores de comprimento de telômero entre
portadores de ATL e indivíduos saudáveis pelos diferentes protocolos não
demonstrou diferença estatisticamente significativa. As análises
apresentaram para os protocolos nº 1, 2 e 3 valores de p não significativos,
0,4199, 0,2497 e 0,5169, respectivamente. Também não foi observada
interação entre grupo e subtipo linfocitário considerado.
Resultados
86
Os valores de comprimento telomérico do subtipo linfocitário TCD8+
dos portadores de ATL e indivíduos saudáveis pelos diferentes protocolos
estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4 - Valores de comprimento telomérico nos subtipos linfocitários TCD4+ e
TCD8+ em portadores de ATL e indivíduos saudáveis pelos protocolos nº 1, nº 2
(em MESF) e nº 3
TCD4+ TCD8+
Grupos
Média ±
±±
± DP
Mediana [Q1;Q3]
Média ±
±±
± DP
Mediana [Q1;Q3]
Protocolo nº 1
ATL
0,0826 ± 0,0339
0,0768
[0,0637; 0,1064]
0,098 ± 0,0356
0,0935
[0,0775; 0,1261]
saudáveis
0,1035 ± 0,0158
0,1005
[0,0931; 0,1125]
0,108 ± 0,0114
0,1084
[0,1061; 0,1131]
p-valor 0,4199 0,4199
Protocolo nº 2 (MESF)
ATL
3124,49 ± 1686,78
2869,4
[2320,22; 3236,17]
3664,82 ± 1522,9
3078,43
[3060,36; 3521,05]
saudáveis
4241,56 ± 951,13
3897,66
[3714,59; 4365,08]
4217,38 ± 855,5
4027,92
[3518,45; 5103,72]
p-valor 0,2497 0,2497
Protocolo nº 3
ATL
8,7 ± 3,53
8,12
[6,68; 11,22]
10,28 ± 3,71
9,73
[8,17; 13,3]
saudáveis
10,89 ± 1,63
10,6
[9,81; 11,84]
11,35 ± 1,17
11,41
[11,15; 11,84]
p-valor 0,5169 0,5169
p-valores obtidos a partir dos fatores principais de grupos e subtipos linfocitários na
análise de regressão robusta
5.5 Análise do comprimento telomérico dos subtipos linfocitários
TCD4+ e TCD8+ em portadores de ATL e portadores do vírus HTLV-I
Os valores de comprimento telomérico dos subtipos linfocitários TCD4+
e TCD8+ dos portadores de ATL e portadores do vírus HTLV-I, pelos
diferentes protocolos são apresentados na tabela 5.
Resultados
87
A comparação dos valores de comprimento de telômero dos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+, entre os portadores de ATL e os portadores do
vírus HTLV-I não apresentou diferença estatistica para nenhum dos
protocolos de análise (p-valores de 0,4700; 0,1070; 0,4770,
respectivamente). Adicionalmente, não foi observada interação entre o grupo
e o subtipo linfocitário analisado.
Tabela 5 - Valores de comprimento telomérico dos subtipos linfocitários TCD4+ e
TCD8+ dos portadores de ATL e portadores do vírus HTLV-I+ pelos protocolos nº 1,
nº 2 (em MESF) e nº 3
TCD4+ TCD8+
Grupos
Média ±
±±
± DP
Mediana [Q1;Q3]
Média ±
±±
± DP
Mediana [Q1;Q3]
Protocolo nº 1
ATL
0,0826 ± 0,0339
0,0768
[0,0637; 0,1064]
0,098 ± 0,0356
0,0935
[0,0775; 0,1261]
HTLV-I+
0,1006 ± 0,0178
0,1001
[0,0912; 0,1122]
0,0968 ± 0,0180
0,0957
[0,0860; 0,1078]
p-valor 0,4700 0,4700
Protocolo nº 2 (MESF)
ATL
3124,49 ± 1686,78
2869,4
[2320,22; 3236,17]
3664,82 ± 1522,9
3078,43
[3060,36; 3521,05]
HTLV-I+
4271,00 ± 1007,37
4060,85
[3649,23; 4778,43]
3939,27 ± 831,33
4006,61
[3359,59; 4466,9]
p-valor 0,1070 0,1070
Protocolo nº 3
ATL
8,7 ± 3,53
8,12
[6,68; 11,22]
10,28 ± 3,71
9,73
[8,17; 13,3]
HTLV-I+
10,60 ± 1,86
10,57
[9,65; 11,74]
10,21 ± 1,88
10,15
[9,16; 11,43]
p-valor 0,4770 0,4770
p-valores obtidos a partir dos fatores principais de grupos e subtipos linfocitários na
análise de regressão robusta
Resultados
88
5.6 Análise da relação do comprimento telomérico entre os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ dos portadores do vírus HTLV-I
Apesar de não termos evidenciado interação entre grupo e subtipo
linfocitário analisado, em nenhuma das comparações dos grupos realizadas
anteriormente, assumimos esta interação e realizamos a análise entre os
subtipos linfocitários em cada grupo estudado com o objetivo de analisar
possíveis diferenças de comprimento telomérico dentro de cada grupo.
Os valores de média, desvio padrão, mediana, quartil 1 e quartil 3 de
comprimento telomérico dos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ dos
portadores do vírus HTLV-I pelos diferentes protocolos são apresentados na
tabela 6.
A análise comparativa dos valores de comprimento de telômero entre
os subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ em portadores do vírus HTLV-I não
demonstrou diferença estatisticamente significativa pelos diferentes
protocolos. Estas análises apresentram para os protocolos nº 1, 2 e 3
valores de p de 0,2432, 0,1712, 0,2229, respectivamente.
Tabela 6 - Valores do comprimento telomérico entre os subtipos linfocitários TCD4+
e TCD8+ dos portadores do vírus HTLV-I pelas técnicas nº 1, nº 2 (em MESF) e nº
3
TCD4+ TCD8+
Grupos
Média ±
±±
± DP
Mediana
[Q1;Q3]
Média ±
±±
± DP
Mediana
[Q1;Q3]
p-valor
Protocolo nº 1
HTLV-I+
0,1006 ± 0,0178
0,1001
[0,0912; 0,1122]
0,0968 ± 0,0180
0,0957
[0,0860; 0,1078]
0,2432
Protocolo nº 2 (MESF)
HTLV-I+
4271,00 ± 1007,37
4060,85
[3649,23; 4778,43]
3939,27 ± 831,33
4006,61
[3359,59; 4466,9]
0,1712
Protocolo nº 3
HTLV-I+
10,60 ± 1,86
10,57
[9,65; 11,74]
10,21 ± 1,88
10,15
[9,16; 11,43]
0,2229
p-valores obtidos a partir da interação entre subtipo linfocitário e o grupo derivados da
análise de regressão robusta
Resultados
89
5.7 Análise da relação do comprimento telomérico entre os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ dos portadores de ATL
Os valores de média, desvio padrão, mediana, quartil 1 e quartil 3 de
comprimento telomérico dos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ dos
portadores de ATL pelos diferentes protocolos são apresentados na tabela 7.
A comparação dos valores de comprimento de telômero entre os
subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ nos portadores de ATL não
demonstrou diferença estatisticamente significativa pelos diferentes
protocolos. As análises apresentaram para os protocolos nº 1, 2 e 3 valores
de p de 0,5368, 0,5368, 0,5368, respectivamente.
Tabela 7 - Valores de comprimento telomérico entre os subtipos linfocitários TCD4+
e TCD8+ de portadores de ATL pelos protocolos nº 1, nº 2 (em MESF) e nº 3
TCD4+ TCD8+
Grupos
Média ±
±±
± DP
Mediana
[Q1;Q3]
Média ±
±±
± DP
Mediana [Q1;Q3]
p-valor
Protocolo nº 1
ATL
0,0826 ± 0,0339
0,0768
[0,0637; 0,1064]
0,098 ± 0,0356
0,0935
[0,0775; 0,1261]
0,5368
Protocolo nº 2 (MESF)
ATL
3124,49 ± 1686,78
2869,4
[2320,22; 3236,17]
3664,82 ± 1522,9
3078,43
[3060,36; 3521,05]
0,5368
Protocolo nº 3
ATL
8,7 ± 3,53
8,12
[6,68; 11,22]
10,28 ± 3,71
9,73
[8,17; 13,3]
0,5368
p-valores obtidos a partir da interação entre subtipo linfocitário e o grupo derivados da
análise de regressão robusta
5.8 Análise da relação do comprimento telomérico entre os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ dos indivíduos saudáveis
Os valores de média, desvio padrão, mediana, quartil 1 e quartil 3 de
comprimento telomérico dos subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ de
Resultados
90
indivíduos saudáveis pelos diferentes protocolos são apresentados na tabela
8.
A comparação dos valores de comprimento de telômero entre os
subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ nos indivíduos saudáveis, não
demonstrou diferença estatisticamente significativa pelos diferentes
protocolos. Estas análises apresentaram para os protocolos nº 1, 2 e 3
valores de p de 0,8479, 0,1323, 0,8632, respectivamente.
Tabela 8 - Valores de comprimento telomérico entre os subtipos linfocitários TCD4+
e TCD8+ de indivíduos saudáveis pelos protocolos nº 1, nº 2 (em MESF) e nº 3
TCD4+ TCD8+
Grupos
Média ±
±±
± DP
Mediana
[Q1;Q3]
Média ±
±±
± DP
Mediana
[Q1;Q3]
p-valor
Protocolo nº 1
saudáveis
0,1000 ± 0,0151
0,0978
[0,0933; 0,1017]
0,1017 ± 0,0198
0,0972
[0,0888; 0,1092]
0,8479
Protocolo nº 2 (MESF)
saudáveis
3989,81 ± 671,91
3896,81
[3586,79; 4366,17]
3892,12 ± 811,1
3612,79
[3275,21; 4375,85]
0,1323
Protocolo nº 3
saudáveis
10,52 ± 1,58
10,33
[9,76; 10,65]
10,70 ± 2,07
10,24
[9,27; 11,39]
0,8632
p-valores obtidos a partir da interação entre subtipo linfocitário e o grupo derivados da
análise de regressão robusta
5.9 Avaliação dos efeitos da idade no comprimento de telômero de
portadores do vírus HTLV-I
A análise do comprimento de telômero em função da idade de
portadores do vírus HTLV-I pelo protocolo nº 1 demonstrou redução
significativa de 0,0005 por ano para o subtipo linfocitário TCD4+ (p-
valor=0,0224) e 0,0008 por ano para o subtipo linfocitário TCD8+ (p-valor =
0,0224). Não foi evidenciada diferença significativa na redução do
comprimento do telômero em função da idade entre os indivíduos saudáveis
Resultados
91
e portadores do vírus HTLV-I. Os indivíduos saudáveis perderam 0,0002 por
ano para TCD4+ e 0,0003 por ano para TCD8+ a menos que portadores do
vírus HTLV-I, sendo que esta análise apresentou valores de p de 0,4645
para TCD4+ e 0,9074 para TCD8+ (Figura 15).
Figura 15. Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido pelo
protocolo nº 1 para portadores do vírus e indivíduos saudáveis, nos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+
Resultados
92
Pelo protocolo nº 2, os portadores do vírus HTLV-I demonstraram
uma redução significativa no comprimento do telômero em função da idade
de 22,2 kMESF por ano (p-valor = 0,0246) e 35,01 kMESF por ano (p-valor =
0,0246) para TCD4+ e TCD8+, respectivamente. Ainda assim, a análise da
perda de comprimento de telômero em função da idade entre os grupos
analisados não atingiu o nível de significância estatística, pois os indivíduos
saudáveis perderam 0,6 kMESF por ano (TCD4+) e 25,8 kMESF por ano (
TCD8+) de comprimento de telômero a menos que portadores do vírus
HTLV-I, apresentando p-valor de 0,9672 para TCD4+ e 0,2177 para TCD8+
(Figura 16).
Resultados
93
Figura 16. Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido pelo
protocolo nº 2 para portadores do vírus e indivíduos saudáveis, nos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+
A análise do comprimento telomérico em função da idade de
portadores do vírus HTLV-I pelo protocolo nº 3 indicou que nos linfócitos
TCD4+ e TCD8+ houve redução significativa de comprimento de telômero de
0,05/ano (p = 0,0185) e 0,09/ano (p = 0,0185), respectivamente. A perda do
comprimento de telômero dos linfócitos TCD4+ e TCD8+ de portadores do
vírus HTLV-I foi 0,03/ano e 0,04/ano superior à perda dos indivíduos
saudáveis. Porém, a variação de perda do comprimento de telômero entre
Resultados
94
os grupos não atingiu nível de significância estatística (p-valores = 0,4016 e
0,8269, respectivamente) (Figura 17)
Figura 17. Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido pelo
protocolo nº 3 (x 100) para portadores do vírus e indivíduos saudáveis, nos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+
Resultados
95
5.10 Avaliação dos efeitos da idade no comprimento de telômero de
portadores de ATL
As análises dos portadores de ATL foram compostas de pacientes
com ATL CD4+. Pacientes com ATL CD4+/CD8+ (um caso) e ATL CD8+
(um caso) não foram incluídos na análise, mas foram identificados
graficamente.
A analise do comprimento de telômero em função da idade em
portadores de ATL pelo protocolo nº 1 evidenciou uma redução não
significativa de 0,0009 por ano para TCD4+ (p-valor = 0,8214) e, 0,0014 por
ano para TCD8+ (p-valor = 0,8214). A analise da redução do comprimento
de telômero em função da idade entre grupos, evidenciou que a perda do
comprimento de telômero dos indivíduos saudáveis foi 0,0009 por ano para
TCD4+ e 0,0015 por ano para TCD8+ menor que nos portadores de ATL (p-
valores de 0,8568 e 0,9431, respectivamente)(Figura 18).
Resultados
96
Figura 18. Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido pelo
protocolo nº 1 para portadores de ATL e indivíduos saudáveis, nos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+
A análise do comprimento de telômero em função da idade dos
portadores de ATL pelo protocolo nº 2, encontrou-se uma redução não
significativa de 7,26 kMESF por ano para TCD4+ (p-valor = 0,9957) e 27,82
kMESF por ano para TCD8+ (p-valor = 0,9957). A diferença na redução do
comprimento dos telômeros entre os grupos demonstrou que no subtipo
linfocitário TCD4+, os indivíduos saudáveis perderam 7,96 kMESF por ano a
menos que portadores de ATL e, no subtipo linfocitário TCD8+, indivíduos
Resultados
97
saudáveis perderam 9,90 kMESF por ano a menos que portadores de ATL.
Apesar das diferenças, nenhum destes fatores mostrou-se significativo (p-
valor de 0,9962, respectivamente)(Figura 19).
Figura 19. Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido pelo
protocolo nº 2 para portadores de ATL e indivíduos saudáveis, nos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+
Nos linfócitos TCD4+ e TCD8+ de portadores de ATL analisados pelo
protocolo nº 3, observou-se redução do comprimento telomérico de 0,10/
ano (p = 0,8340) e 0,14 por ano (p = 0,8340), respectivamente. A análise da
Resultados
98
perda de comprimento de telômero entre os grupos não evidenciou diferença
estatística, pois demonstrou que indivíduos saudáveis perdem 0,10/ano
(linfócitos TCD4+) e 0,016/ano (linfócitos TCD8+) de comprimento de
telômero a menos que portadores de ATL. (p-valores = 0,8656,
respectivamente) (Figura 20).
Figura 20. Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido pelo
protocolo nº 3 (X 100) para portadores de ATL e indivíduos saudáveis, nos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+
Resultados
99
5.11 Avaliação dos efeitos da idade no comprimento de telômero entre
portadores do vírus HTLV-I e portadores de ATL
A análise do comprimento de telômero em função da idade entre
portadores do vírus HTLV-I e portadores de ATL não demonstrou diferença
significativa pelo protocolo nº 1. Para o subtipo linfocitário TCD4+ observou-
se que os portadores de ATL perderam 0,0004 por ano de comprimento de
telômero a mais que portadores do vírus HTLV-I (p-valor = 0,4372), e para o
subtipo linfocitário TCD8+ os portadores de ATL perderam 0,0006 por ano
de comprimento de telômero a mais que portadores do vírus HTLV-I (p-valor
= 0,4372)(Figura 21).
Resultados
100
Figura 21. Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido pelo
protocolo nº 1 para portadores de ATL e portadores do vírus, nos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+
A analise do comprimento de telômero em função da idade entre os
portadores do vírus HTLV-I e portadores de ATL pelo protocolo nº 2 não
evidenciou diferença significativa. No subtipo linfocitário TCD4+ evidenciou-
se que portadores de ATL perdem 13,7 kMESF por ano a mais que
portadores do vírus HTLV-I mas, para no subtipo linfocitário TCD8+
evidenciou-se perda de 2,6 kMESF a mais para o grupo de portadores do
vírus HTLV-I em relação aos portadores de ATL (p-valor = 0,6475,
respectivamente)(Figura 22).
Resultados
101
Figura 22. Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido pelo
protocolo nº 2 para portadores de ATL e portadores do vírus, nos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+
A análise do comprimento de telômero em função da idade entre os
portadores do vírus HTLV-I e portadores de ATL pelo protocolo nº 3 também
não demonstrou diferença significativa. No subtipo linfocitário TCD4+
evidenciamos que portadores de ATL perdem 0,04 por ano de comprimento
de telômero a mais que portadores do vírus HTLV-I e, no subtipo linfocitário
TCD8+, os portadores de ATL perdem 0,06 a mais que portadores do vírus
HTLV-I (p-valor = 0,4325, respectivamente)(Figura 23).
Resultados
102
Figura 23. Relação entre comprimento de telômero e a idade, definido pelo
protocolo nº 3 (X 100) para portadores de ATL e portadores do vírus, nos subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+
5.12 Análise do comprimento telomérico, forma clínica de ATL e DNA
Ploidia em doentes
Demonstrou-se por meio do protocolo nº 3 que a célula maligna dos
portadores de ATL apresenta menor comprimento de telômero e, que a
célula não transformada apresenta comprimento de telômero próximo ao
limite superior esperado para a idade (Tabela 9).
Resultados
103
O índice de DNA dos portadores do vírus HTLV foi previamente
determinado por Mesquita em 2001. Este estudo demonstrou valores médios
de 0,98 (mediana 1,00), o qual foi definido como diplóide em todos os casos
(Mesquita, 2001).
O índice de DNA dos subtipos linfocitários dos indivíduos doentes
demonstrou valores aneuplóides (média <0,96 ou > 1,04) e diplóides (média
= 1,00). Estes valores foram utilizados no cálculo de comprimento telomérico
para corrigir o número de telômeros final por célula da população estudada.
Não foi possível determinar o índice de DNA dos pacientes 1 e 4 por
falta de material biológico. Para o cálculo do comprimento telomérico desses
pacientes foi estabelecido valor diplóide de índice de DNA.
O paciente nº 2 com ATL smoldering CD4+ apresentou hipoploidia no
linfócito TCD8+ e diploidia no TCD4+ e, o paciente nº 6 com ATL forma
crônica CD4+ apresentou diploidia no subtipo linfocitário TCD4+. O paciente
nº 5 com ATL smoldering CD4+ apresentou diploidia em ambos os subtipos
linfocitários. O paciente nº 3 com ATL forma aguda CD8+ apresentou subtipo
linfocitário TCD8+ hiperdiplóide e subtipo linfocitário TCD4+ hipodiplóide A
tabela 9 apresenta os valores de comprimento telomérico, de DNAploidia e
as respectivas idades dos indivíduos ATL por subtipo linfocitário e forma
clínica de ATL.
Resultados
104
Tabela 9 - Valores de idade, índice de DNA e comprimento telomérico de
portadores de ATL por subtipo linfocitário e forma clínica da doença
Subtipo linfocitário TCD4+
Subtipo linfocitário TCD8+
Pacientes Idades
Comprimento
telomérico
Índice de
DNA
Comprimento
telomérico
Índice de
DNA
Forma clínica da
doença
1 47 6,248 ** 9,731 **
ATL crônica CD4+
/CD8+
2 18 8,279 0,99 13,298 0,84
ATL smoldering CD4+
3 24 12,202 0,94 5,576 1,62 ATL aguda CD8+
4 31 13,398 ** 14,643 **
ATL smoldering CD4+
5 59 7,971 1,03 8,169 1,00
ATL smoldering CD4+
6 57 4,084 0,96 * * ATL crônica CD4+
* valor não utilizado devido à ineficiência de obtenção deste subtipo linfocitário
** não foi possível à determinação do índice de DNA devido à falta de material biológico
5.13 O estudo dos valores de comprimento telomérico do subtipo
linfocitário TCD4+ em função da carga proviral
Considerou-se como carga proviral elevada (cutoff) valores superiores
a 100 cópias / 1000 PBMC. Todas as amostras de portadores de ATL
apresentaram carga proviral acima do limite estabelecido, enquanto somente
10,71% dos portadores do vírus HTLV-I apresentaram valores acima deste
limite. A média ± desvio padrão do comprimento telomérico do grupo de
indivíduos com carga proviral baixa para o subtipo linfocitário TCD4+ pelo
protocolo nº 1 foi de 0,1013 ± 0,0166 e mediana de 0,1001 (quartis 1 e 3:
0,0916; 0,1118), pelo protocolo nº 2 foi de 4284,4 ± 948,8 MESF e mediana
de 4049 MESF (quartis 1 e 3: 3688,7 MESF; 4752,1 MESF) e, pelo protocolo
nº 3 foi de 10,67 ± 1,72 com mediana de 10,57 (quartis 1 e 3: 9,68; 11,66). A
média ± desvio padrão do comprimento telomérico dos indivíduos com carga
proviral alta para o protocolo nº 1 foi de 0,0968 ± 0,0255 e mediana de
Resultados
105
0,0992 (quartis 1 e 3: 0,0802; 0,115), para o protocolo nº 2 foi de 4027 ±
1473 MESF com mediana de 3665,9 MESF (quartis 1 e 3: 3100,1 MESF;
4874 MESF) e, para o protocolo nº 3 foi de 10,22 ± 2,7 com mediana de
10,48 (quartis 1 e 3: 8,48; 12,15). A comparação do comprimento de
telômero no subtipo linfocitário TCD4+ dos indivíduos com carga proviral
baixa e alta não demonstrou diferença significativa para os protocolos nº 1 e
3 (p-valores = 0,3861 e 0,3730, respectivamente) mas, apresentou diferença
significativa pelo protocolo nº 2 (p-valor= 0,001787) (Tabela 10).
5.14 O estudo dos valores de comprimento telomérico do subtipo
linfocitário TCD8+ em função da carga proviral
A média ± desvio padrão do comprimento telomérico do grupo de
indivíduos com carga proviral baixa para o subtipo linfocitário TCD8+ pelo
protocolo nº 1 foi de 0,0977 ± 0,0183 e mediana de 0,0961 (quartis 1 e 3:
0,0854; 0,1094), pelo protocolo nº 2 foi de 3975,9 ± 845,5 MESF e mediana
de 4006,6 MESF (quartis 1 e 3: 3326,1 MESF; 4633,3 MESF) e, pelo
protocolo nº 3 foi de 10,29 ± 1,91 com mediana de 10,22 (quartis 1 e 3: 9,09;
11,46). A média ± desvio padrão do comprimento telomérico dos indivíduos
com carga proviral alta para o protocolo nº 1 foi de 0,0938 ± 0,0264 e
mediana de 0,0941 (quartis 1 e 3: 0,0798; 0,1029), para o protocolo nº 2 foi
de 3719,7 ± 1127,6 MESF com mediana de 3578,8 MESF (quartis 1 e 3:
3153,2 MESF; 4125,2 MESF) e, para o protocolo nº 3 foi de 9,9 ± 2,76 com
mediana de 9,96 (quartis 1 e 3: 8,43; 10,95). Não foram verificadas
diferenças significativas no comprimento do telômero para o subtipo
Resultados
106
linfocitário TCD8+ nos indivíduos definidos por carga viral alta ou baixa pelos
protocolos nº 1 e 3 (p-valores = 0,3861 e 0,3730, repectivamente). Porém ao
se considerar o protocolo nº 2, foi possível observar uma redução importante
no comprimento de telômero nos indivíduos que apresentavam carga
proviral alta (p-valor = 0,001787). Não foram observadas diferenças
significativas entre os subtipos linfocitários e interação entre carga proviral e
subtipo linfocitário (Tabela 10)
Tabela 10 - Comparação da influência da carga viral no comprimento do telômero
TCD4+ TCD8+
Carga viral
Média ± DP Mediana [Q1; Q2]
Média ± DP Mediana [Q1; Q2]
p-
valor
Idade (anos)
baixa 48,5 ± 11,2 48,5
[40,3; 56,5]
48,5 ± 11,2 48,5
[40,3; 56,5]
alta 44,9 ± 16,6 53
[31,5; 58,5]
44,9 ± 16,6 53
[31,5; 58,5]
Protocolo nº 1
baixa 0,1013 ± 0,0166
0,1001
[0,0916; 0,1118]
0,0977 ± 0,0183
0,0961
[0,0854; 0,1094]
0,1522
alta 0,0968 ± 0,0255
0,0992
[0,0802; 0,115]
0,0938 ± 0,0264
0,0941
[0,0798; 0,1029]
0,1522
p-valor 0,3861 0,3861
Protocolo nº 2
baixa 4284,4 ± 948,8 4049
[3688,7; 4752,1]
3975,9 ± 845,5 4006,6
[3326,1; 4633,3]
0,4212
alta 4027 ± 1473 3665,9
[3100,1; 4874]
3719,7 ± 1127,6
3578,8
[3153,2; 4125,2]
0,4212
p-valor 0,001787 0,001787
Protocolo nº 3
baixa 10,67 ± 1,72 10,57
[9,68; 11,66]
10,29 ± 1,91 0,1022
[9,09; 11,46]
0,1376
alta 10,22 ± 2,7 10,48
[8,48; 12,15]
9,9 ± 2,76 9,96
[8,43; 10,95]
0,1376
p-valor 0,3730 0,3730
p-
valores obtidos a partir dos fatores principais de grupos e subtipos linfocitários na análise de
regressão robusta
5.15 Definição do potencial diagnóstico do comprimento do telômero
Utilizamos à análise por meio de curva Receive Operator Caracteristic
Curve (ROC) para estabelecer o ponto de corte de comprimento de telômero
Resultados
107
indicativo de doença. Esta curva permite optimizar a sensibilidade e
especificidade do teste diagnóstico.
Conforme observado nas figuras 24 e 25, a análise das Curvas ROC
demonstra o baixo poder diagnóstico do comprimento de telômero nos
subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+, independente do protocolo utilizado e
da amostragem analisada. Desta forma, observa-se que, na amostragem
analisada, o comprimento do telômero não se mostra uma boa ferramenta
de diagnóstico.
Figura 24. Curvas ROC para os subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ de
portadores do vírus HTLV-I, avaliando os três protocolos empregados
Resultados
108
Figura 25.
Curvas ROC para os subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ de
portadores de ATL, avaliando os três protocolos empregados
5.16. Validação do protocolo nº 3
Conforme indicado na figura 26, houve uma relação importante entre
os valores de comprimento obtidos pelo protocolo nº 1 e pelo protocolo nº 3,
sendo que o erro típico da estimativa esteve em 0,0007. O ajuste dos
valores do protocolo nº 3 de forma a representar o protocolo nº 1 foi de
0,9507; de tal forma que para cada aumento de uma unidade no
comprimento do telômero definido pelo protocolo nº 3, há um aumento de
Resultados
109
0,9507 unidades no comprimento do telômero definido pelo protocolo nº 1,
indicando a elevada representatividade do protocolo nº 3.
Figura 26. Regressão e ajuste do protocolo nº 3 (X 100) para valores de
comprimento de telômero obtidos por meio do protocolo nº 1
Ao se analisar a relação entre os valores de comprimento de telômero
obtidos pelos protocolos nº 2 e 3, verificou-se que apesar da relação entre
os protocolos, o coeficiente de determinação (R
2
) teve valor bastanete
modesto (0,3620). Além disso, o erro típico da estimativa foi definido em
Resultados
110
546,9 kMESF. O coeficiente angular mostrou que para o aumento de uma
unidade no comprimento de telômero obtido pelo protocolo nº 3, temos um
aumento de 44850,5 MESF no protocolo nº 2 (Figura 27).
Figura 27. Regressão e ajuste do protocolo nº 3 (X 100) para valores de
comprimento de telômero obtidos por meio do protocolo nº 2
A comparação entre protocolo nº 1 e nº 2, demonstrou coeficiente de
determinação bastante moderado (R
2
= 0,3642), sendo o erro padrão da
estimativa de 544,58 kMESF. O coeficiente angular observado foi de
46570,9, sendo os valores bastante similares àqueles obtidos na
comparação entre os protocolo nº 2 e nº 3 (Figura 28).
Resultados
111
Figura 28. Regressão e ajuste do protocolo nº 1 para valores de comprimento de
telômero obtidos por meio do protocolo nº 2
5.17 Valores de referência de comprimento de telômero para os
subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+
A análise dos valores de comprimento de telômero encontrado em
indivíduos saudáveis possibilitou determinar valores de referência de
comprimento de telômero para os subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ no
Laboratório de Imunopatologia do HC-FMUSP. Devido à variação de
comprimento de telômero com a idade, definimos os valores de referência de
Resultados
112
comprimento de telômero extratificado por faixa etária. Estes valores foram
padronizados pelo protocolo nº 3 e são representativos de uma população
saudável de brasileiros adultos.
Os valores de comprimento de telômero estabelecido nos limites de
5%, 50% e 95%, para os subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+, segundo
cada faixa etária são apresentados na tabela 11.
Tabela 11 - Valores de referência de comprimento de telômero para os subtipos
linfocitários TCD4+ e TCD8+ em indivíduos saudáveis, segundo as diferentes faixas
etárias, estabelecidos no Laboratório de Imunopatologia do HC-FMUSP
Subtipo
linfocitário
TCD4+ TCD8+
Faixa
etária
até 30
anos
até 40
anos
até 50
anos
até 60
anos
maior
que 60
anos
até 30
anos
até 40
anos
até 50
anos
até 60
anos
maior
que 60
anos
5%
8,71 9,98 9,69 9,00 10,33 9,73 9,47 9,15 7,32 9,95
50%
10,82 10,41 10,25 10,02 10,33 11,27 10,23 10,52 9,67 10,24
95%
12,25 12,06 12,43 12,58 14,26 13,29 13,51 12,87 14,00 13,10
6. Discussão
Discussão
114
Este é o primeiro estudo avaliando comprimento de telômero de
linfócitos TCD4 e TCD8 individualmente, em portadores do vírus HTLV-I e de
ATL, em comparação com indivíduos saudáveis pareados por sexo e idade.
O estudo do comprimento do telômero tem sido reportado em várias
doenças humanas, incluindo as hematológicas. Nestes estudos demonstrou-
se que há correlação entre encurtamento telomérico e progressão de doença
(Wu et al., 2003; Drummond et al., 2004; Hartmann et al., 2005; Rigolin et
al., 2004; Beier et al., 2005; Grabowski et al., 2005; Artandi, 2006; Fuster &
Andrés, 2006; Stewart & Weinberg, 2006; Zucchero & Ahmed, 2006). Em
portadores de
ATL, o progressivo encurtamento telomérico pode ser
explicado pela ação da proteína Tax, ativando a proliferação celular (Barmak
et al., 2003). Estudo com 13 casos de ATL aguda e três de ATL crônica
demonstrou valores de comprimento de telômero das PBMC
significativamente inferiores; média de 4,38 Kb na crônica e 5,39 Kb na
aguda, em relação aos portadores assintomáticos do HTLV-I, média de 7,69
e ao grupo controle, média de 7,06 Kb. No grupo com e sem ATL, a média
foi de 5,2 Kb e 7,3 Kb, respectivamente (p < 0,01). Os autores sugerem a
análise da atividade da enzima telomerase e do tamanho do telômero como
marcadores de prognóstico, pois observaram que os casos com menor
tamanho de telômero e maior atividade de telomerase apresentavam pior
prognóstico (Kubuki et al., 2005).
Apesar da difícil comparação dos nossos resultados com os obtidos
por Kubuki et al., devido à utilização de diferentes metodologias e, por
termos analisado separadamente linfócitos TCD4 e TCD8, também
Discussão
115
encontramos redução do comprimento telomérico em nossos casos de ATL.
Em nosso estudo utilizamos três diferentes protocolos para mensurar o
comprimento telomérico de linfócitos TCD4+ e TCD8+, por citometria de
fluxo. Não encontramos diferença estatisticamente significativa entre o
comprimento de telômero de portadores do vírus HTLV-I e indivíduos
saudáveis, em nenhum dos protocolos. O mesmo ocorreu quando
comparamos o comprimento de telômero, entre os linfócitos TCD4+ e
TCD8+, de portadores de HTLV-I. Entretanto, a análise do comprimento de
telômero, em função da idade, evidenciou redução significativa do tamanho
de telômero com a idade, em portadores do vírus HTLV-I. Nos portadores do
vírus HTLV-I, a perda telomérica foi maior do que a observada nos
indivíduos saudáveis, nos dois subtipos linfocitários e, pelos diferentes
protocolos de análise, embora esta última análise não tenha alcançado nível
de significância estatística.
Nossos resultados confirmam estudos anteriores, sugestivos de que a
ocorrência de eventos biológicos pré-leucêmicos, em células infectadas,
estimula a proliferação celular, facilitando a disseminação do vírus. Pois, ao
se dividir, as células HTLV-I infectadas aumentam em quantidade,
principalmente no compartimento TCD8+ (Sibon et al., 2006; Miyazato et al.,
2006), com conseqüente encurtamento do telômero (Sinha-Datta et al.,
2004). Desta forma, as células dos portadores do HTLV-I, mesmo com vírus
em estado de latência, têm maiores taxas proliferativas e, maior perda
telomérica do que as células de indivíduos não infectados. Entretanto, a taxa
de proliferação não é tão exacerbada a ponto de causar significância clínica,
Discussão
116
mas pode explicar a maior diminuição do comprimento telomérico dos
portadores do vírus HTLV-I, em relação aos indivíduos saudáveis, em ambos
os subtipos linfocitários TCD4 e TCD8.
Não encontramos diferença estatisticamente significativa entre
comprimento de telômero de linfócitos TCD4+ ou TCD8+ de pacientes com
ATL comparativamente a indivíduos saudáveis, nem entre os subtipos
linfocitários no grupo de portadores de ATL.
Devido à baixa amostragem e à ampla faixa etária dos portadores de
ATL, não evidenciamos redução significativa do comprimento de telômero
com a idade em portadores de ATL. Apesar disso, a maior perda de
comprimento de telômero em função da idade foi evidenciada nos casos de
ATL, quando comparado aos indivíduos saudáveis.
A análise isolada dos casos de ATL evidenciou acentuada diminuição
do comprimento dos telômeros nas células malignas e, valores próximos ao
limite superior de referência, esperados para sexo e idade, em linfócitos T
não neoplásicos. A perda de comprimento telomérico, acima do normal para
a idade, observada nas células malignas dos portadores de ATL,
possivelmente contribuiu para a transformação celular e o desenvolvimento
da doença (Barmak et al., 2003). Na análise do subtipo linfocitário TCD8+
não transformado evidenciamos que, embora a maioria dos casos
demonstre valores próximos ao limite superior de referência, com o avançar
da idade, o comprimento dos telômeros destes linfócitos também sofre
acentuada redução. Este fato acaba resultando, na maior perda telomérica
com a idade verificada no subtipo linfocitário TCD8+ não transformado, em
Discussão
117
comparação com a célula maligna TCD4+. Entretanto, necessitamos ampliar
nossa análise, para melhor conclusão de nossos resultados.
Em 2006, Sibon et al. demonstraram que, mesmo presente em
linfócitos TCD4+ e TCD8+, a proteína Tax atua de forma diferente em cada
um deles (Sibon et al., 2006). Ambos, linfócitos TCD4 e TCD8 infectados
pelo HTLV-I, podem apresentar expansão clonal e vantagem proliferativa,
mas com diferentes tipos de estímulo-resposta. Os linfócitos TCD4+
aumentam a capacidade de síntese de DNA e número de cópias virais, mas
não a capacidade de divisão e, por conseguinte, o número de células. Desta
forma, no compartimento de linfócitos TCD4+ infectado, observa-se alta
porcentagem de células multinucleadas, com ponte entre cromossomos,
indicando preservação das vias de sinalização da síntese de DNA, mas não
da citocinese (Semmes, 2006). Embora a Tax altere a citocinese e a divisão
TCD4+, o incremento na síntese de DNA pode explicar a redução do
comprimento telomérico destes linfócitos, na fase pré-leucêmica e de ATL.
As pontes entre cromossomos, observadas em linfócitos TCD4+
infectados, estão associadas à segregação cromossômica anormal e,
contribuem para a instabilidade genômica. Também observadas em tumor
sólido, essas pontes podem ser atribuídas às disfunções teloméricas e,
refletem recombinações cromossômicas anormais e potencialmente
oncogênicas, contribuindo para a transformação maligna (Sibon et al., 2006).
Aumento de atipia linfocitária, em portadores do vírus HTLV-I, foi
evidenciado por Mesquita em 2001 e em estudo realizado por nossa equipe
Discussão
118
em 2006, onde foi observado que 78,2% dos portadores do vírus HTLV-I,
apresentavam linfócitos atípicos (Mesquita, 2001; Pereira et al., 2006).
Apesar de haver expansão clonal TCD4 e TCD8 infectados, a perda de
integridade genômica é observada apenas em células TCD4, explicando por
que a transformação leucêmica é mais freqüente no linfócito TCD4+
(Semmes, 2006).
A ação da Tax induzindo a proliferação TCD4 e, a repressão da
transcrição de antioncogenes, de genes indutores de apoptose e de reparo
de DNA, facilita a perda telomérica e a transformação leucêmica (Barmak et
al., 2003; Verdonck et al., 2007). Por outro lado, a maior perda telomérica
das células malignas, pode decorrer da manutenção da expressão de NF-κB
e AP-1 e, consequentemente, das anormalidades celulares da fase pré-
leucêmica, mesmo sem expressão de Tax (Nicot, 2005).
Por outro lado, demonstrou-se previamente que a proteína Tax pode
reprimir a transcrição do promotor do gene hTERT, inibindo a atividade da
telomerase. A conseqüente erosão telomérica, corrobora para a ocorrência
das pontes cromossômicas dos linfócitos TCD4+ infectados e
multinucleados (Gabet et al., 2003). Outro estudo demonstrou que o NF-κB,
ativado pela Tax, induz à transcrição de hTERT e, por conseguinte ativa a
telomerase. Esta ativação estabiliza o comprimento do telômero, permitindo
que a célula infectada tenha maior sobrevida e, permaneça em proliferação,
facilitando a aquisição e o acúmulo de anormalidades cromossômicas
(Sinha-Datta et al., 2004). Entretanto, recentemente demonstrou-se que a
expressão de hTERT, induz efeitos distintos em linfócito TCD4+ e TCD8+.
Discussão
119
Em linfócitos TCD8+, a expressão de hTERT causa alongamento de
telômero e imortalização celular, mas em linfócitos TCD4+, estimula a
proliferação, sem impedir a perda telomérica (Roth et al., 2005).
Não realizamos ensaio de determinação de atividade da telomerase em
nossa casuística, mas, Kubuki et al., evidenciaram níveis mais elevados de
telomerase, em pacientes com ATL, que em portadores do vírus HTLV-I e
indivíduos saudáveis (Kubuki et al., 2005). Desta forma, a perda excessiva
dos telômeros dos linfócitos TCD4+ malignos, também pode ser causada
pela ação da telomerase e, contribui para o surgimento de anormalidades
cromossômicas e transformação celular (Roth et al., 2005). Entretanto, em
linfócitos TCD8+ infectados pelo HTLV-I, o alongamento do comprimento
dos telômeros pela telomerase, pode justificar o comprimento de telômero,
próximo ao limite superior de referência esperado para a idade (Barmak et
al., 2003; Kannagi et al., 2004; Roth et al., 2005).
As células TCD8+ infectadas, também aumentam a síntese de DNA,
mas de forma distinta dos linfócitos TCD4+, aumentam em número devido a
resistência à apoptose (Semmes, 2006), explicando a maior perda
telomérica dos linfócitos TCD8+, dos portadores do vírus HTLV-I, em
comparação ao grupo controle.
O fato de termos encontrado valores de comprimento de telômero
próximo ao limite superior de referência, esperado para sexo e idade, em
linfócitos TCD8+ não transformados, pode ser explicado pelo fato de que os
indivíduos HTLV-I positivos, de determinado genótipo HLA, são incapazes
de reconhecer proteínas virais e, consequentemente, não apresentam
Discussão
120
resposta imune celular contra células infectadas (Barmak et al., 2003; Sinha-
Datta et al., 2004). As células infectadas pelo HTLV-I, também podem não
expressar proteínas virais e, portanto, não estimular a resposta de CTLs
(Asquith & Bangham, 2007). Outros fatores não imunológicos, virais ou
epigenéticos, podem estar envolvidos na supressão da expressão do gene
da Tax, silenciando sua transcrição gênica, contribuindo para a ausência de
resposta imune celular do hospedeiro contra células infectadas (Nicot et al.,
2005; Tanaguchi et al., 2005; Miyazato et al., 2006). Desta forma, a ação da
telomerase em linfócitos TCD8+, alongando os telômeros, somada a
ausência de resposta imune celular do hospedeiro contra células infectadas,
pode justificar os valores de comprimento de telômero encontrado nestes
linfócitos TCD8+ não transformados (Roth et al., 2005).
Ainda não se conhece o papel dos linfócitos TCD8+ infectados no
desenvolvimento da ATL. Permanecem questões abertas, a respeito da
participação da infecção e da expansão TCD8+, na seleção de clones
TCD4+ específicos e, da relação entre os subtipos linfocitários TCD4 e
TCD8, no desenvolvimento dessa doença (Semmes, 2006). Em nosso
estudo, a maior perda de comprimento de telômero observada no subtipo
linfocitário TCD8+, que no subtipo linfocitário TCD4+, em portadores do
HTLV-I e a redução drástica do comprimento do telômero de linfócitos
TCD8+ não transformados com a idade, permanecem como questões a
serem esclarecidas.
Em nosso estudo, encontramos casos de ATL TCD8+ e TCD4+/CD8+.
Hasegawa et al., 2006, observaram casos de leucemia e linfoma de célula
Discussão
121
pré-TCD4−/CD8−, em camundongos transgênicos, portadores de timócito
Tax+. As características clínicas, patológicas e imunológicas foram
semelhantes às observadas em ATL (Hasegawa et al., 2006). Outro estudo,
também com camundongos transgênicos, com expressão de Tax em
timócito maduro e linfócito do sangue periférico, demonstrou
desenvolvimento de linfoma/leucemia de células TCD4+ ou TCD8+ (Ohsugi
et al., 2007). A população de células progenitoras CD34+ também pode ser
infectada pelo HTLV-I (Barmak et al., 2003). Desta forma, a proteína Tax
pode promover oncogênese, em células maduras e imaturas e, portanto, os
diferentes fenótipos de ATL devem refletir a expressão e a ação da Tax, nas
diferentes células e seus diferentes estadios de diferenciação. Entretanto, se
a base molecular para expansão clonal dos linfócitos TCD8+, evidenciadas
até o momento, não favorecem sua transformação neoplásica, qual o
racional para a existência de ATL TCD8+?
De acordo com a literatura, a análise dos nossos indivíduos saudáveis
evidenciou tendência de redução do comprimento do telômero com a idade,
para ambos, linfócitos TCD4+ e TCD8+, refletindo a perda telomérica a cada
divisão celular, devido ao “defeito” de replicação final. Embora não tenha
sido alcançado nível de significância estatística, os portadores do vírus
HTLV-I apresentaram maior perda telomérica do que os saudáveis, o que
pode ser explicado pelo fato de que, apesar de estar na forma latente, o
HTLV-I ativa a célula metabolicamente. Em portadores de ATL, a perda
telomérica da célula transformada foi maior do que a esperada para a idade.
Isto reflete a maior proliferação da célula maligna e, indica que a
Discussão
122
determinação do comprimento de telômero, pode futuramente ser utilizada
como marcador de progressão de doença.
A análise entre portadores de ATL e portadores do vírus HTLV-I
demonstrou que, apesar da diferença de idade de quase 10 anos entre estes
grupos, a maior redução do comprimento de telômero foi evidenciada no
grupo de portadores de ATL, embora sem atingir nível de significância
estatística, devido a baixa amostragem de portadores de ATL.
Na infecção pelo HTLV-I, raramente se detecta partícula viral
extracelular, de tal forma, que a quantificação da carga viral se faz via carga
proviral, representando a proporção de PBMC com cópia de DNA viral
integrada. Uma das formas de replicação do HTLV-I é por replicação
infecciosa, caracterizada pela transferência de partícula viral para a nova
célula hospedeira, subseqüente transcrição reversa e integração viral. Outra
forma requer replicação mitótica, na qual a divisão da célula do hospedeiro
portadora de cópia de DNA viral integrado resulta na replicação do provirus,
juntamente com a replicação cromossômica (Asquith & Bangham, 2007).
Devido a estabilidade genética do HTLV-I e, ao fato de que sua
transcriptase reversa possui alto índice de erro, sua principal via de
disseminação é por replicação mitótica (Asquith & Bangham, 2007). Desta
forma, espera-se que as células infectadas pelo HTLV-I, com maior taxa de
proliferação, tenham elevada carga proviral e menor comprimento
telomérico.
Conforme demonstrado em nosso trabalho, as células HTLV-I
infectadas têm diminuição do comprimento telomérico e, somente por um
Discussão
123
dos protocolos, apresentam correlação entre redução do comprimento
telomérico e carga proviral. Foram incluídos portadores do vírus HTLV-I e de
ATL. Nestes últimos a carga proviral ficou acima do limite de referência, mas
o mesmo foi observado em apenas 10,71% dos portadores do vírus HTLV-I.
A pequena quantidade de casos de ATL, devido a sua raridade, pode ter
prejudicado a comparação do comprimento telomérico dos indivíduos
infectados pelo vírus HTLV-I, de acordo com a carga proviral. Desta forma,
necessitamos de maior número de casos de ATL, para melhor conclusão.
Entretanto, a partir dos nossos resultados podemos inferir que a
resposta TCD8+ foi ineficaz no controle da carga proviral, assim como
descrito na literatura. Mesmo nas células malignas de ATL, com maior carga
proviral e linfócitos TCD4+ de menor comprimento de telômero, de forma
geral os linfócitos TCD8+ apresentaram comprimento de telômero próximo
ao limite superior de referência.
Conforme descrito por Vielh em 1991, células normais têm
estabilidade de conteúdo de DNA e de organização cromossômica,
contrastando com a instabilidade genética das células malignas, permitindo
alterações no conteúdo do DNA (Vielh, 1991).
Em estudo realizado em nosso serviço, Mesquita demonstrou maior
taxa de proliferação celular em portadores do vírus HTLV-I, determinada por
hiperexpressão do antígeno nuclear Ki-67 e, aumento da fração de células
na fase G
2
M do ciclo celular, porém sem evidência de aneuploidia (Mesquita,
2001). Por essa razão, em nosso estudo, estabelecemos o valor do índice
de DNAploidia diplóide para nossa casuística de portadores do vírus HTLV-I
Discussão
124
e, determinamos o índice de DNA dos linfócitos TCD4+ e TCD8+ dos casos
de ATL, para corrigir possíveis anormalidades do conteúdo de DNA destas
células, que pudessem interferir no mensuramento dos valores de
comprimento de telômero.
Surpreendentemente, não encontramos alteração de conteúdo de
DNA nas células malignas TCD4+, mas sim no subtipo linfocitário não
neoplásico TCD8+, nos casos de ATL TCD4+. Por outro lado, os casos de
ATL TCD8 apresentavam hiperdiploidia nas células malignas TCD8 e,
hipodiploidia nos linfócitos TCD4+ não neoplásicos.
Alguns estudos realizados com células de Saccharomyces cerevisiae,
roedores e de linhagem celular humana demonstram que a Tax está
associada à redução prematura dos níveis de Pds1p (securina) e Clb2p
mediado pelo APC. Ao ativar APC, a Tax inicia a ubiquitinação e degradação
de ambas, securina e Clb2p/Ciclina B e, consequentemente, liberam a Esp1
(separase), que por sua vez, degrada componentes do complexo de coesão,
necessários para a união das cromátides irmãs. Com a redução precoce da
securina, antes da mitose, haverá transição inapropriada da fase de
metáfase para a anáfase, acarretando separação cromossômica anormal,
podendo explicar à aneuploidia das células da ATL (Liu et al., 2003). Estes
dados foram confirmados em outro estudo, que demonstrou que linfócitos
TCD4+ infectados têm expansão clonal, citocinese e divisão celular
erráticas, além de elevada porcentagem de células nas fases G
2
M e S do
ciclo celular (Sibon et al., 2006).
Discussão
125
Por outro lado, outras pesquisas relatam que a superexpressão da
securina, em células normais e células neoplásicas, induz aneuploidia, com
formação de micronúcleos e múltiplos núcleos, que propicia a tumorigênese.
Entretanto, o mecanismo molecular deste processo, ainda não está
completamente elucidado (Tfelt-Hansen et al., 2006).
Embora existam explicações para a aneuploidia em ATL, este é o
primeiro estudo em que se realizou análise do conteúdo de DNA,
individualmente em linfócitos TCD3+/CD4+ e TCD3+/CD8+, de portadores
de ATL. Nossos resultados não confirmam relatos da literatura nos quais,
linfócitos TCD4+ sofrem eventos moleculares promotores de aneuploidia,
pois, não verificamos conteúdo de DNA anormal em células malignas
TCD4+, pela técnica utilizada, mas encontramos hiperploidia em células
TCD8+ neoplásicas. A partir dos nossos resultados evidenciamos a
necessidade de complementarmos o nosso estudo de DNAploidia em
portadores de ATL, associada à determinação de expressão da securina nos
subtipos linfocitários TCD4+ e TCD8+ destes pacientes, para
correlacionarmos expressão de securina e alteração do conteúdo de DNA.
Verificamos também a necessidade de mensurar o índice de DNA e a carga
proviral de portadores do vírus HTLV-I, individualmente em linfócitos TCD4+
e TCD8+. Por outro lado, ainda não se conhece o mecanismo de ação
específico da Tax, nem a característica molecular individual, que favorece a
transformação leucêmica, nos casos de ATL CD8+.
Além do risco de ATL e/ou HAM/TSP, o portador assintomático tem
maior chance de adquirir infecção oportunista. Geralmente tem redução
Discussão
126
sérica de IgE e, maior risco de infecção por S. stercoralis (Gabet et al.,
2000). Chieffi et al., encontraram prevalência de 12,1% de estrongiloidíase
entre 91 portadores de HTLV-I e de 1,6% em 60 indivíduos do grupo
controle, em Hospital Municipal de grande porte da cidade de São Paulo
(Chieffi et al., 2000). Em nosso serviço verificamos que 12,5% de portadores
assintomáticos do vírus HTLV-I apresentam co-infecção com S. stercoralis
(Nukui et al., 2007). Entretanto, na casuística envolvida em nosso estudo, a
incidência de S. stercoralis foi baixa.
A infecção por S. stercoralis ou outros agentes infecciosos em
portadores do vírus HTLV-I, pode induzir aumento da proliferação de
linfócitos T infectados e a carga proviral. Esta expansão linfocitária pode
predispor ao aparecimento de mutações somáticas e, conseqüente
transformação maligna, e menor tempo de latência necessário ao
desenvolvimento de doença nesta população (Gabet et al., 2000). Em 2002,
Satoh et al. demonstraram que a infecção por S. Stercoralis, aumenta a
síntese de IL-2, via ativação do promotor do gene que codifica esta citocina.
Desta forma, a proliferação de células HTLV-I infectadas, que por ação de
proteínas virais, hiperexpressam o receptor de IL-2 (IL-2Rα/CD25), podem
ser estimuladas pelo S. stercoralis por mecanismo autócrino e/ou parácrino
(Satoh et al., 2002).
Desta forma, interrogamos se a infecção por S. Stercoralis pode ser um
modelo de estimulação antigênica crônica, que contribuiria para o
desenvolvimento de ATL mais precocemente em países em
desenvolvimento, como Jamaica e Brasil, que têm maior suscetibilidade de
Discussão
127
exposição a agentes infecciosos, em comparação aos países desenvolvidos,
como Japão. Em nosso estudo a mediana de idade dos casos de ATL é de
39 anos e, no Japão de 60 anos (Gabet et al., 2000).
Vários métodos são disponíveis para o mensuramento do comprimento
dos telômeros, incluindo desde a análise do comprimento dos TRF por
Southern blot, até métodos recentes utilizando PCR, cada um contendo
vantagens e desvantagens. A técnica de Flow FISH é relativamente nova,
sendo implantada há menos de 10 anos (Baerlocher et al., 2006), por meio
dos grupos independentes, representados por Hultdin e Rufer. Assim, como
a maioria das novas técnicas, várias modificações já foram efetuadas.
Mesmo tendo obtido resultados semelhantes com os três diferentes
protocolos utilizados, defendemos o uso do protocolo nº 3, por contemplar as
vantagens dos protocolos nº 1 e nº 2, anteriormente descritos. O protocolo
de Hultdin et al. não reporta resultados em MESF, dificultando comparações
interlaboratoriais e a normalização das variações do citômetro de fluxo, entre
os experimentos. O protocolo de Rufer et al não corrige o valor do
comprimento do telômero pelo índice de DNA. Desta forma, em amostras
com aneuploidia, a exemplo dos casos de ATL, os valores do comprimento
de telômero podem não ser fidedignos (Ross & Hultdin, 2001).
Os dois protocolos monitoram os erros provenientes da realização dos
procedimentos. O protocolo de Rufer, inicialmente utilizando amostra de
células de linfoma, analisada em cada experimento (Rufer et al., 1999) e,
posteriormente, com as modificações efetuadas neste protocolo, por meio da
inclusão de timócitos bovinos, como controle interno em cada ensaio
Discussão
128
(Baerlocher et al., 2006). Similarmente, ao controle realizado por Hultdin, em
nosso protocolo as análises das aquisições em duplicata e as aquisições
entre os períodos nas células de linhagem 1301, asseguraram-nos que os
procedimentos foram realizados de forma homogênea, não sendo fonte de
erros intra e interexperimental.
Não temos estabelecido na literatura, qual o protocolo correto de
análise de comprimento de telômero por Flow-FISH e, consequentemente, a
forma correta de expressar nossos resultados. Adicionalmente, como ainda
não foram realizados estudos de comprimento de telômero, em portadores
do vírus HTLV-I e portadores de ATL, por nenhuma das técnicas de Flow-
FISH e, os protocolos possuirem valores incomparáveis, pudemos avaliar
cada protocolo, frente aos resultados obtidos, levando-se em conta os
atributos que conferem segurança, utilizado por cada protocolo e, a
representatividade de cada protocolo. Porém, é impossível avaliar qual dos
valores é o correto.
Em nosso estudo, a análise dos valores de comprimento de telômero,
determinados com o protocolo nº 1 (Hultdin et al, 1998) e o protocolo
estabelecido em nosso laboratório, demonstraram similaridade de valores,
indicando elevada representatividade do protocolo que estabelecemos. A
vantagem que o protocolo nº 3, apresenta em relação ao protocolo nº 1, é o
controle das variações diárias do citômetro de fluxo, normalizadas com a
utilização de pérolas de calibração e os dados sendo reportados em MESF.
Entretanto, a partir das análises realizadas, verificamos que nosso
Discussão
129
equipamento demonstrou ótimo desempenho, refletido na similaridade dos
resultados obtidos entre estes dois protocolos.
Foram obtidos valores de comprimento de telômero diferentes, quando
analisamos o comprimento telomérico por meio do protocolo estabelecido
em nosso laboratório e, pelo protocolo nº 2, definido por Rufer et al. em
1999. Estas diferenças foram observadas, quando a análise englobou
portadores de ATL, chegando à análise da influência da carga proviral no
comportamento de telômero, alcançar nível de significância estatística. A
diferença entre esses protocolos resulta da falta de correção do conteúdo de
DNA, o que resultou em valores de comprimento de telômero menores para
o protocolo nº 2, do que o observado pelos outros protocolos e, explica a
diferença estatística observada.
Utilizamos em nosso estudo pérolas de calibração fluorescente, com
quantidades entre 0 e 150.000 MESF, que resultaram em histogramas
contendo seis picos fluorescentes diferentes, o que diferencia-se dos
trabalhos publicados na literatura, que utilizam o protocolo nº 2 em suas
análises de comprimento de telômero. Desta forma, não podemos utilizar a
equação que representa o declínio da curva de calibração destes trabalhos.
Consequentemente, não pudemos avaliar numericamente, nossos valores
de comprimento de telômero, estabelecidos pelo protocolo nº 2, com os
dados já publicados na literatura. Sendo assim, necessitamos estimar os
valores de comprimento de telômero em kilobases (kb) e, correlacionarmos
com os valores encontrados em unidades MESF, por meio do protocolo nº 2,
para estabelecermos a equação de conversão dos nossos valores, com a
Discussão
130
finalidade de avaliação numérica dos nossos resultados e comparação com
os dados literários.
Laboratorialmente, a utilização do protocolo desenvolvido em nosso
laboratório demonstrou vantagem em relação aos demais protocolos, pela
conversão de valores de fluorescência telomérica em MESF, o que permitiu
a comparação dos valores de comprimento telomérico entre as diferentes
instituições e controle das variações diárias do citômetro de fluxo, devido a
utilização de pérolas de calibração. Além disso, obtivemos confiabilidade de
resultados com a utilização de células de linhagem 1301, adicionadas ao
procedimento e, acurácia de resultados por meio da correção do valor de
comprimento de telômero pelo índice de DNA, determinado em todas as
amostras analisadas. Entretanto, a ótima representatividade encontrada
entre nosso protocolo e o protocolo nº 1, permite-nos afirmar que, em
citômetros de fluxo, que possuam ótima reprodutibilidade de valores e,
controle da linearidade, resultados similares serão obtidos com a utilização
do protocolo nº 1.
Até o presente momento, em decorrência do baixo número de
indivíduos analisados, os protocolos de análise utilizados em nosso estudo,
não foram capazes de definir comprimento de telômero com potencial de
diagnóstico. Para uma análise completa faz-se necessário, analisar pontos
de corte de comprimento dos telômeros em cada extrato etário, devido à
ocorrência de redução dos telômeros com a idade. Para tanto, a estratégia
de estudos multicêntricos é a ideal para este tipo de análise, devido a
possibilidade de alcançar amostragem necessária e, que seja representativa
Discussão
131
da população brasileira. Desta forma, evidenciamos a necessidade de
continuação deste estudo, objetivando estabelecer um marcador laboratorial,
que indique indivíduos portadores do vírus HTLV-I propensos à progressão
para ATL, e possivelmente, para separar formas graves e indolentes de
doença.
Com o nosso protocolo pudemos estabelecer os valores de referência
de comprimento telomérico para linfócitos TCD4+ e TCD8+, em indivíduos
brasileiros saudáveis, definidos por faixa etária, com idade entre 26 a 64
anos.
A ATL é uma doença rara, porém extremamente agressiva e letal
causada pelo HTLV-I. O Brasil é o país com maior número absoluto de
portadores deste vírus. Não fosse o bastante, temos altas taxas de doenças
infecto-contagiosas, típicas de regiões subdesenvolvidas. Neste cenário
existem mais dúvidas que certezas e, ao se desvendar um mistério, outros
muitos insurgem. Conhecemos pouco da biologia da doença, e menos ainda
do tratamento. Sabemos como evitar a contaminação, mas não
conseguimos 100% de êxito.
Neste cenário, encontra-se o Brasil, país no qual a mortalidade por
neoplasia cresceu nas últimas décadas, passando a representar 13,7% de
todos os óbitos em 2004. Entre as mortes por câncer de 1995 a 1999, as
leucemias representaram 3,35% do total dos óbitos em homens e 7,26% dos
óbitos em mulheres (INCA 2007a). Acreditamos que não há outra forma de
resolver problemas, se não seu enfrentamento. É preciso atuar em todas as
frentes, na prevenção, no diagnóstico precoce e oferecendo o melhor
Discussão
132
tratamento. Para evitar a ATL é preciso investir mais e mais na prevenção da
transmissão do HTLV-I. Como isso não é 100% eficaz, precisamos persistir
em estudos que possam determinar fatores indicativos de transformação
leucêmica, para que se possa atuar precocemente e impedir o aparecimento
da ATL, pois o tratamento atual é extremamente insatisfatório.
7. Conclusões
Conclusões
134
• A perda do comprimento do telômero de portadores do HTLV-I foi
maior do que a observada no grupo de indivíduos saudáveis, porém,
sem diferença estatística significante.
• Devido à baixa amostragem e à ampla faixa etária analisada, não foi
possível demonstrar estatisticamente menor comprimento de telômero
em ATL, em relação a indivíduos saudáveis.
• As células malignas de portadores de ATL apresentam acentuada
perda telomérica.
• O subtipo linfocitário TCD8+ não transformado de ATL jovens
apresentou comprimento de telômero próximo ao limite superior de
referência, esperado para a idade, porém, os casos de ATL de maior
faixa etária apresentaram redução considerável do comprimento dos
telômeros.
• Apesar da diferença de idade ter favorecido portadores de ATL, a
análise comparativa entre comprimento de telômero de portadores de
HTLV-I e de ATL, demonstrou maior redução de comprimento de
telômero nos casos de ATL, mas sem atingir o nível de significância
estatística estabelecido.
• A pequena quantidade de casos de ATL, com carga proviral acima do
limite de referência, prejudicou a análise da relação entre
comprimento de telômero e carga proviral.
8. Anexos
Anexos
136
ANEXO A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLÍNICAS
DA
FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
(Instruções para preenchimento no verso)
_______________________________________________________________
I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL
1
. NOME DO PACIENTE.................................................................................................................
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ........................................ SEXO : .M F
DATA NASCIMENTO: ......../......../......
ENDEREÇO ......................................................................... Nº .................. APTO: ...................
BAIRRO:.................................................. CIDADE ..............................................................
CEP:.................................. TELEFONE: DDD (............) ............................................................
2.RESPONSÁVEL LEGAL .............................................................................................................
NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) ................................................................
DOCUMENTO DE IDENTIDADE :...............................................SEXO: M F
DATA NASCIMENTO.: ....../......./......
ENDEREÇO: ....................................................................... Nº ................. APTO: .....................
BAIRRO: ............................................... CIDADE: ......................................................................
CEP: ............................... TELEFONE: DDD (............)...............................................................
____________________________________________________________________________
II - DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA
1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA:
Avaliação do comprimento dos
telômeros em células infectadas pelo vírus HTLV-I utilizando a técnica
Hibridação in situ e citometria de fluxo (Flow-FISH).
2. PESQUISADOR:
Juliana Pereira
CARGO/FUNÇÃO:
Médica
INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº
73746
UNIDADE DO HCFMUSP:
Hematologia
Anexos
137
3.
AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:
SEM RISCO RISCO MÍNIMO RISCO MÉDIO X
RISCO BAIXO RISCO MAIOR
(probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano como conseqüência imediata ou tardia do estudo)
4.DURAÇÃO DA PESQUISA : 02 anos
.
____________________________________________________________________________________
III - REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU
REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA CONSIGNANDO
:
1.
justificativa e os objetivos da pesquisa:
O (a) Senhor (a) está sendo convidado
(a) a participar voluntariamente desta pesquisa que tem como objetivo
estudar o tamanho do final do cromossomo (conjunto de pequeninas
estruturas que determinam as características de cada indivíduo como, cor
de cabelo, cor da pele, etc) das suas células. Esta pesquisa poderá
contribuir para o melhor conhecimento da infecção pelo vírus HTLV-I.
2.
procedimentos que serão utilizados e propósitos, incluindo a identificação dos
procedimentos que são experimentais:
Serão coletados cerca de 10 ml de
sangue da veia do antebraço. A coleta é semelhante à utilizada na obtenção
de sangue para exames de rotina.
3. desconfortos e riscos esperados:
O (a) Senhor (a) poderá sentir dor semelhante
àquela provocada por picada de agulha durante a coleta de sangue para a
realização de exames laboratoriais de rotina.
4
.
benefícios que poderão ser obtidos:
Esta pesquisa pode permitir a implantação
de uma nova técnica para estudo da infecção pelo vírus HTLV-I.
Anexos
138
5.
Indivíduos controle:
As amostras dos indivíduos controle serão obtidas
coletando-se um tubo de hemograma junto com a amostra de sangue para
realizar os exames de triagem obrigatórios em doadores, no momento da
doação voluntária de sangue. Não será necessária nova punção específica
apenas para a pesquisa.
IV - ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO
SUJEITO DA PESQUISA CONSIGNANDO:
1. liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e de deixar de participar
do estudo, sem que isto traga prejuízo à continuidade da assistência.
O (a) Senhor (a) tem o direito de não participar ou de se retirar do estudo a
qualquer momento, sem que isto represente qualquer tipo de prejuízo para o
seu atendimento dentro da instituição onde o projeto está sendo realizado.
2. salvaguarda da confidencialidade, sigilo e privacidade.
Todas as informações obtidas para o desenvolvimento da pesquisa serão
confidenciais, respeitando a sua privacidade.
_______________________________________________________________
V. INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS PELO
ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE
INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS.
Caso o (a) Senhor (a) tenha dúvidas ou queira maiores informações sobre a
pesquisa, estaremos à disposição através do telefone 3061-5544 ramal 339.
Favor falar com Dra. Juliana Pereira, Dra. Beatriz Beitler de Maurino, Dra.
Gracia Martinez ou Graciela Aparecida Brocardo.
____________________________________________________________________________________
Anexos
139
VI. OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES:
____________________________________________________________________________________
VII - CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO
Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o
que me foi explicado, consinto em participar do presente Protocolo de Pesquisa
São Paulo, de de 20 .
____________________________________________ _______________________________
assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal assinatura do pesquisador
(carimbo ou nome Legível)
Anexos
140
ANEXO B
RESULTADOS OBTIDOS NO PROCEDIMENTO DE FLOW-FISH
PARA AS CÉLULAS DE LINHAGEM 1301
Procedimento com
sonda telomérica
em IMF nº 1
Procedimento com
sonda telomérica
em IMF nº 2
Valor médio de
fluorescência
telomérica em
IMF
Tempo
1591,36 1537,72 1509,37 1
1858,29 1629,06 1683,595 1
1408,92 1365,01 1333,465 1
1820,9 1777,31 1736,615 1
1728,04 1780,27 1697,425 1
1544,78 1616,32 1531,565 1
1409,38 1436,74 1363,23 1
1558,66 1564,38 1527,09 1
1556,23 1712 1582,465 1
1475,86 1463,3 1417,42 1
1418,03 1449,8 1381,31 1
1305,53 1287,99 1251,095 1
1434,19 1432,27 1376,725 2
1364,33 1357,04 1307,425 2
1729,3 1653,21 1618,23 2
1916,71 2267,54 2032,725 2
1669,67 1681,64 1607,02 2
Continua
Anexos
141
Continuação
Procedimento com
sonda telomérica
em IMF nº 1
Procedimento com
sonda telomérica
em IMF nº 2
Valor médio de
fluorescência
telomérica em
IMF
Tempo
1582,17 1656,41 1542,215 2
2179,08 2203,37 2105,32 2
2093,63 2117,74 2045,15 2
1902,8 1920,91 1831,27 2
1887,47 1878,27 1799,76 2
956,44 1078,93 944,575 2
1327,3 1408,33 1296,905 2
1147,83 1215,83 1109,705 2
1497,63 1515,55 1456,46 2
1502,34 1318,13 1346,22 2
1291,59 1352,24 1266,765 2
1245,5 1261,26 1203,17 2
1339,59 1433,63 1344,585 2
1503,86 1473,04 1434,77 2
1404,73 1434,1 1372,35 2
1639,73 1528,8 1517,49 2
1625,21 1570,71 1536,15 2
1633,33 1640,13 1580,28 2
1606,9 1529,42 1501,655 3
1657,65 1612,34 1574,43 3
Continua
Anexos
142
Continuação
Procedimento com
sonda telomérica
em IMF nº 1
Procedimento com
sonda telomérica
em IMF nº 2
Valor médio de
fluorescência
telomérica em
IMF
Tempo
1597,19 1564,18 1528,395 3
1851,46 1876,02 1802,015 3
1736,23 1833,5 1714,175 3
1613,28 1832,65 1648,605 3
1781,3 1831,93 1732,09 3
1990,61 1918,1 1892,27 3
1846,89 1982,14 1845,695 3
2114,16 2091,91 2024,255 3
2077,21 2097,97 2004,97 3
1605,43 1607,08 1536,77 3
1692,89 1640,62 1576,74 3
1442,96 1395,63 1348,62 3
1718,05 1735,93 1677,06 3
1669,43 1666,32 1611,71 3
1763,46 1659,98 1637,16 3
1512,85 1496,62 1460,84 3
1495,23 1245,78 1306,225 3
1484,29 1486,73 1397,87 3
1697,28 1703,78 1617,24 3
Anexos
143
ANEXO C
COMPRIMENTO TELOMÉRICO DOS SUBTIPOS LINFOCITÁRIOS
TCD4+ E TCD8+ EM PORTADORES DO VÍRUS HTLV-I PELOS
PROTOCOLOS Nº 1 E Nº 2 (EM MESF) E Nº 3
TCD4 TCD8
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
0,10612 4.699,33 11,028 0,09578 4.150,62 9,967
0,10183 3.583,94 10,588 0,10173 3.519,45 10,578
0,13697 6.853,25 14,025 0,10134 4.906,17 10,403
0,12175 5.961,31 12,479 0,11212 5.012,64 11,500
0,08275 3.670,99 8,509 0,06890 3.046,31 7,096
0,11333 4.467,59 11,623 0,11757 4.665,06 12,054
0,08739 3.863,78 8,982 0,09211 4.161,25 9,463
0,13962 6.538,22 14,694 0,09853 4.274,30 10,437
0,09476 4.011,83 10,046 0,11592 4.933,32 12,243
0,07744 3.208,57 8,240 0,06985 2.933,36 7,446
0,09327 3.292,47 9,860 0,09386 3.043,33 9,922
0,13059 4.842,17 13,783 0,12247 4.439,87 12,942
0,10150 4,114,76 10,851 0,10001 4,147,88 10,695
0,12522 6,316,00 13,326 0,09311 4,281,37 9,973
0,11251 4,519,81 12,001 0,10426 4,106,48 11,140
0,10541 4,073,35 11,260 0,10738 4,107,02 11,465
Continua
Anexos
144
Continuação
TCD4 TCD8
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
0,09309 4.675,04 9,908 0,09634 4.673,51 10,247
0,11885 5.773,12 12,588 0,10830 4.910,42 11,491
0,08832 3.872,79 9,410 0,09007 3.966,66 9,592
0,09142 3.938,27 9,733 0,08623 3.664,84 9,191
0,11707 2.684,86 12,452 0,08453 1.763,12 9,053
0,11206 3.508,28 11,930 0,11493 3.118,86 12,229
0,12338 3.257,72 13,109 0,13209 3.309,31 14,014
0,09507 3.345,92 10,156 0,09547 3.376,35 10,198
0,09789 3.187,79 10,451 0,10007 2.708,43 10,679
0,09983 5.446,32 10,647 0,09456 4.661,74 10,097
0,10044 4.588,86 10,711 0,08790 3.995,11 9,400
0,09048 4.006,59 9,633 0,08855 3.972,62 9,431
0,11568 4.880,05 12,256 0,13866 5.796,21 14,638
0,08881 4.156,26 9,458 0,07975 3.736,97 8,511
0,10576 4.992,04 11,225 0,08662 3.636,54 9,229
0,09303 4.526,01 9,898 0,08271 3.911,92 8,821
0,09326 4.116,21 9,911 0,09938 4.171,50 10,548
0,12602 5.626,68 13,315 0,12890 5.343,00 13,613
0,09836 4.687,93 10,321 0,11209 5.035,41 11,738
0,10495 4.757,18 11,002 0,10757 4.547,98 11,272
0,09263 4.048,35 9,729 0,09897 4.131,40 10,384
Continua
Anexos
145
Continuação
TCD4+ TCD8+
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
0,10342 4.737,03 10,844 0,09356 4.058,59 9,825
0,08078 3.845,32 8,545 0,07064 3.193,96 7,490
0,11096 5.125,96 11,674 0,07944 3.822,68 8,405
0,05791 2.962,08 6,160 0,06383 3.044,64 6,779
0,10934 5.481,09 11,507 0,09567 4.779,00 10,091
0,09223 3.769,48 9,657 0,07172 2.801,07 7,536
0,09001 3.774,33 9,428 0,10977 4.335,35 11,464
0,08669 3.117,86 9,085 0,09514 3.431,88 9,956
0,08366 3.741,74 8,736 0,08514 3.787,34 8,888
0,09373 4.024,70 9,772 0,07223 2.901,66 7,557
0,11886 5.167,20 12,354 0,13894 5.635,30 14,411
0,10138 3.946,75 10,559 0,10976 4.018,11 11,419
0,10482 3.583,62 10,946 0,10074 3.403,85 10,526
0,07370 2.707,60 7,735 0,07695 3.104,49 8,071
0,04717 2.013,53 4,983 0,06305 2.363,91 6,632
Anexos
146
ANEXO D
COMPRIMENTO TELOMÉRICO DOS SUBTIPOS LINFOCITÁRIOS
TCD4+ E TCD8+ EM INDIVÍDUOS SAUDÁVEIS PELOS PROTOCOLOS
Nº1 E Nº 2 (EM MESF) E Nº 3
TCD4+ TCD8+
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
0,10133 3.956,08 10,536 0,10852 4.296,03 11,274
0,10455 4.682,03 11,006 0,11496 5.188,05 12,083
0,09775 4.532,75 10,379 0,14032 6.085,36 14,795
0,09919 3.713,07 10,456 0,07525 3.050,42 7,969
0,09783 3.510,79 10,333 0,09697 2.935,28 10,244
0,10277 4.544,77 10,822 0,10712 4.785,78 11,272
0,09855 4.870,35 10,371 0,10454 4.766,30 10,991
0,09332 3.107,31 9,762 0,09297 3.547,34 9,725
0,11577 3.970,20 12,193 0,13977 4.924,06 14,671
0,09076 3.924,51 9,564 0,09939 3.834,49 10,458
0,14304 5.757,77 14,951 0,12993 4.962,26 13,602
0,08590 3.590,49 9,073 0,09146 3.571,09 9,651
0,09518 3.823,21 9,981 0,09715 3.504,77 10,185
0,09799 4.366,17 10,404 0,09679 3.940,19 10,279
0,17253 3.321,43 18,201 0,16656 3.986,70 17,584
0,11373 4.774,58 11,937 0,10651 4.224,26 11,191
0,09855 4.870,35 10,371 0,10454 4.766,30 10,991
0,09920 4.575,63 10,419 0,08906 3.798,88 9,371
Continua
Anexos
147
Continuação
TCD4+ TCD8+
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
0,09332 3.107,31 9,762 0,09297 3.547,34 9,725
0,09043 3.531,66 9,547 0,12689 4.652,62 13,319
0,09043 3.531,66 9,547 0,12689 4.652,62 13,319
0,11168 4.167,76 11,748 0,10042 3.536,77 10,583
0,08617 3.770,05 9,031 0,07800 3.092,08 8,187
0,09495 4.165,57 10,016 0,11740 4.375,85 12,339
0,11307 3.575,68 11,897 0,10709 3.469,03 11,279
0,09518 3.823,21 9,981 0,09715 3.504,77 10,185
0,09783 3.510,79 10,333 0,09697 2.935,28 10,244
0,12164 4.318,97 12,748 0,13419 4.533,01 14,040
0,11288 4.289,68 11,852 0,11121 4.086,51 11,680
0,09436 4,047,44 10,104 0,08882 3.269,76 9,267
0,09943 4.436,37 10,432 0,08803 3.647,77 9,253
0,10490 3.775,63 11,008 0,10324 3.261,19 10,837
0,09799 4.366,17 10,404 0,09679 3.940,19 10,279
0,08710 3.940,35 9,155 0,07669 3.577,81 8,078
0,11676 6.107,03 12,273 0,12864 6.622.67 13,500
0,09518 3.823,21 9,981 0,09715 3.504,77 10,185
0,08546 3.808,32 8,998 0,06892 3.068,62 7,281
0,10501 4.329,05 11,064 0,12548 5.047,76 13,180
0,09436 4,047,44 10,104 0,08882 3.269,76 9,267
0,09251 3.612,02 9,678 0,09635 3.473,35 10,074
Continua
Anexos
148
Continuação
TCD4+ TCD8+
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
0,09829 3.109,22 10,336 0,09402 2.932,75 9,895
0,09495 4.165,57 10,016 0,11740 4.375,85 12,339
0,09619 3.869,10 10,124 0,08469 3.277,02 8,932
0,09943 4.436,37 10,432 0,08803 3.647,77 9,253
0,08546 3.808,32 8,998 0,06892 3.068,62 7,281
0,09574 3.441,18 10,072 0,10755 4.141,34 11,294
0,08589 3.472,92 9,057 0,08800 3.498,90 9,276
0,07784 2.951,26 8,222 0,08309 2.990,75 8,766
0,08139 1.993,48 8,556 0,09454 2.913,95 9,915
0,09518 3.823,21 9,981 0,09715 3.504,77 10,185
0,09964 4.709,45 10,590 0,08078 3.751,23 8,621
0,09919 3.713,07 10,456 0,07525 3.050,42 7,969
Anexos
149
ANEXO E
COMPRIMENTO TELOMÉRICO DOS SUBTIPOS LINFOCITÁRIOS
TCD4+ E TCD8+ EM PORTADORES DE ATL PELOS PROTOCOLOS Nº 1
E Nº 2 (EM MESF) E Nº 3
TCD4+ TCD8+
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
Protocolo
nº 1
Protocolo
nº 2
Protocolo
nº 3
0,05969 2.212,07 6,248 0,09349 3.078,43 9,731
0,07805 2.644,67 8,279 0,12607 3.521,05 13,298
0,11588 3.094,12 12,202 0,05274 2.375,54 5,576
0,12821 6.240,12 13,398 0,14032 6.288,71 14,643
0,07559 3.283,52 7,971 0,07747 3.060,36 8,169
0,03837 1.272,45 4,084 - - -
Anexos
150
ANEXO F
COMPRIMENTO TELOMÉRICO DOS SUBTIPOS LINFOCITÁRIOS
TCD4+ E TCD8+ DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO VÍRUS HTLV-I
SEPARADOS POR CARGA PROVIRAL
TCD4+ TCD8+
Comprimento
telomérico do grupo
com carga proviral
baixa
Comprimento
telomérico do
grupo com carga
proviral alta
Comprimento
telomérico do
grupo com carga
proviral baixa
Comprimento
telomérico do
grupo com carga
proviral alta
0,10612 4.699,33
11,028 0,12522 6.316,00
13,326 0,09578
4.150,62 9,967 0,09311
4.281,37
9,973
0,10183 3.583,94
10,588 0,11251 4.519,81
12,001 0,10173
3.519,45 10,578 0,10426
4.106,48
11,140
0,13697 6.853,25
14,025 0,10576 4.992,04
11,225 0,10134
4.906,17 10,403 0,08662
3.636,54
9,229
0,12175 5.961,31
12,479 0,09263 4.048,35
9,729 0,11212
5.012,64 11,500 0,09897
4.131,40
10,384
0,08275 3.670,99
8,509 0,08669 3.117,86
9,085 0,06890
3.046,31 7,096 0,09514 3.431,88 9,956
0,11333 4.467,59
11,623 0,04717 2.013,53
4,983 0,11757
4.665,06 12,054 0,06305 2.363,91 6,632
0,08739 3.863,78
8,982 0,07805 2.644,67 8,279 0,09211
4.161,25 9,463 0,12607
3.521,05
13,298
0,13962 6.538,22
14,694 0,12821 6.240,12 13,398 0,09853
4.274,30 10,437 0,14032
6.288,71
14,643
0,09476 4.011,83
10,046 0,07559 3.283,52 7,971 0,11592
4.933,32 12,243 0,07747
3.060,36
8,169
0,07744 3.208,57
8,240 - - - 0,06985
2.933,36 7,446 - - -
0,09327 3.292,47
9,860 - - - 0,09386
3.043,33 9,922 - - -
0,13059 4.842,17
13,783 - - - 0,12247
4.439,87 12,942 - - -
Continua
Anexos
151
Continuação
TCD4+ TCD8+
Comprimento
telomérico do grupo
com carga proviral
baixa
Comprimento
telomérico do
grupo com carga
proviral alta
Comprimento
telomérico do
grupo com carga
proviral baixa
Comprimento
telomérico do
grupo com carga
proviral alta
0,10150 4.114,76 10,851 - - - 0,10001
4.147,88 10,695 - - -
0,10541
4.073,35 11,260 - - - 0,10738
4.107,02 11,465 - - -
0,09309
4.675,04 9,908 - - - 0,09634
4.673,51 10,247 - - -
0,11885
5.773,12 12,588 - - - 0,10830
4.910,42 11,491 - - -
0,08832
3.872,79 9,410 - - - 0,09007
3.966,66 9,592 - - -
0,09142
3.938,27 9,733 - - - 0,08623
3.664,84 9,191 - - -
0,11707
2.684,86 12,452 - - - 0,08453
1.763,12 9,053 - - -
0,11206
3.508,28 11,930 - - - 0,11493
3.118,86 12,229 - - -
0,12338
3.257,72 13,109 - - - 0,13209
3.309,31 14,014 - - -
0,09507
3.345,92 10,156 - - - 0,09547
3.376,35 10,198 - - -
0,09789
3.187,79 10,451 - - - 0,10007
2.708,43 10,679 - - -
0,09983
5.446,32 10,647 - - - 0,09456
4.661,74 10,097 - - -
0,10044
4.588,86 10,711 - - - 0,08790
3.995,11 9,400 - - -
0,09048
4.006,59 9,633 - - - 0,08855
3.972,62 9,431 - - -
0,11568
4.880,05 12,256 - - - 0,13866
5.796,21 14,638 - - -
0,08881
4.156,26 9,458 - - - 0,07975
3.736,97 8,511 - - -
0,09303
4.526,01 9,898 - - - 0,08271
3.911,92 8,821 - - -
0,09326
4.116,21 9,911 - - - 0,09938
4.171,50 10,548 - - -
Continua
Anexos
152
Continuação
TCD4+ TCD8+
Comprimento
telomérico do grupo
com carga proviral
baixa
Comprimento
telomérico do
grupo com carga
proviral alta
Comprimento
telomérico do
grupo com carga
proviral baixa
Comprimento
telomérico do
grupo com carga
proviral alta
0,12602
5.626,68 13,315 - - - 0,12890
5.343,00
13,613
- - -
0,09836
4.687,93 10,321 - - - 0,11209
5.035,41
11,738
- - -
0,10495
4.757,18 11,002 - - - 0,10757
4.547,98
11,272
- - -
0,10342
4.737,03 10,844 - - - 0,09356
4.058,59
9,825
- - -
0,08078
3.845,32 8,545 - - - 0,07064
3.193,96
7,490
- - -
0,11096
5.125,96 11,674 - - - 0,07944
3.822,68
8,405
- - -
0,05791
2.962,08 6,160 - - - 0,06383
3.044,64
6,779
- - -
0,10934
5.481,09 11,507 - - - 0,09567
4.779,00
10,091
- - -
0,09223
3.769,48 9,657 - - - 0,07172
2.801,07
7,536
- - -
0,09001
3.774,33 9,428 - - - 0,10977
4.335,35
11,464
- - -
0,08366
3.741,74 8,736 - - - 0,08514
3.787,34
8,888
- - -
0,09373
4.024,70 9,772 - - - 0,07223
2.901,66
7,557
- - -
0,11886
5.167,20 12,354 - - - 0,13894
5.635,30
14,411
- - -
0,10138
3.946,75 10,559 - - - 0,10976
4.018,11
11,419
- - -
0,10482
3.583,62 10,946 - - - 0,10074
3.403,85
10,526
- - -
0,07370
2.707,60 7,735 - - - 0,07695
3.104,49
8,071
- - -
Anexos
153
ANEXO G
CARACTERIZAÇÃO DOS INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO VÍRUS
HTLV-I
HTLV
Idade
Sexo
Leucócitos
(mm
3
)
Linfócitos
(%)
Linfócitos
(mm
3
)
Eosinófilos
(%)
Eosinófilos
(mm
3
)
IgE
S.stercoralis
I 47 F 9.400 22 2.100 4,5 400 96 Não
I 40 F 3.900 45,3 1.800 3,3 100 18 Sim (tipo 1)
I 46 F 6.200 46,2 2.900 1,3 100 98 Não
I 53 M 6.700 48,2 3.200 1,9 100 42 Não
I 63 F 5.600 35,2 2.000 6 300 27 Não
I 30 F 6.400 33,5 2.200 5,6 400 25 Não
I 44 F 9.100 29,7 2.700 2,5 200 138 Não
I 50 F 5.600 32,3 1.800 2,1 100 62 Não
I 40 M 4.700 33 1.600 2,1 100 30 Não
I 47 M 7.400 27,4 2.000 2,7 200 98 Não
I 61 F 6.600 32,7 2.200 0,6 0 6 Não
I 30 F 9.100 22,3 2.000 4,4 400 198 Não
I 42 F 8.600 27,1 2.300 3,9 300 56 NR
I 36 M 4.700 50,6 2.400 11,5 500 3950
Não
I 52 F 4.000 60 2.400 2 100 0 Não
I 41 M 8.300 36,1 3.000 4,6 400 431 Não
I 46 F 7.500 28 2.100 1,0 100 129 Não
I 34 F 5.600 42,6 2.400 11,9 700 437 Não
I 50 F 4.800 34 1.600 6,7 300 31 Não
I 60 M 8.800 22,1 2.000 0,5 0 6 Não
I 59 F 6.300 22,9 1.500 2,1 100 7 Não
I 49 F 4.900 27,6 1.400 1,6 100 183 Não
I 51 F 8.100 56,1 4.600 6,7 500 304 Não
I 51 F 5.800 32,9 1.900 1,2 100 21 Não
I 31 F 7.200 30 2.200 3,5 300 1290
Não
I 40 F 5.200 27,8 1.500 1,9 100 12 Não
I 64 F 4.700 36,5 1.700 3,2 200 36 Não
I 57 F 5.600 45,8 2.600 0 0 82 Não
Continua
Anexos
154
Continuação
HTLV
Idade
Sexo
Leucócitos
(mm
3
)
Linfócitos
(%)
Linfócitos
(mm
3
)
Eosinófilos
(%)
Eosinófilos
(mm
3
)
IgE
S.stercoralis
I 29 F 7.900 30,6 2.400 1,4 100 84 Não
I 46 M 5.900 49,4 2.900 4,5 300 243 Não
I 56 M 8.200 43,7 3.600 1,3 100 50 Não
I 55 F 7.200 42,2 3.000 1,9 100 31 NR
I 39 M 8.200 44,2 3.700 1,6 100 9 Não
I 54 F 8.800 22,4 2.000 0 0 4 Não
I 30 M 4.000 40,6 1.600 2,2 100 143 Não
I 40 F 4.300 53,6 2.300 1,1 100 10 Não
I 57 M 6.200 39,1 2.400 1,8 100 43 Não
I 56 F 5.600 47,3 2.700 1,6 100 40 Não
I 46 M 5.100 43,1 2.200 4,1 200 131 Não
I 51 F 6.800 40,4 2.800 2,2 200 21 Não
I 64 F 6.800 43,6 3.000 4,7 300 1040
Não
I 51 F 7.200 28,7 2.100 2,2 200 74 Não
I 47 M 5.500 20,6 1.200 0,9 100 25 Não
I 56 M 6.500 31 2.000 1,2 100 -4 Não
I 57 M 6.200 21,9 1.400 0,5 0 150 Não
I 57 F 4.500 39,1 1.800 3,3 200 47 Não
I 57 F 6.600 41,7 2.800 2,6 200 56 Não
I 55 M 6.700 30,1 2.000 5,4 400 292 Sim
I 30 F 8.200 32,6 2.700 2,7 200 50 Não
I 39 F 3.400 30,9 1.100 0,9 0 18 Não
I 58 F 4.400 40,2 1.800 1,6 100 11 Não
I 54 M 5.800 53,7 3.200 1,2 100 13 Não
I
47 M * * * * * * Não
I
18 F 11.200 56,5 6.300 0,8 100 NR Não
I
24 M 28.800 6 1.700 1 300 NR NR
I
31 F 4.200 62,6 2.600 0,5 0 15 Não
I
59 F 5.800 44 2.600 0,9 100 92 Não
I
57 M 8.900 44,9 4.000 7,9 700 NR NR
NR: Exame não realizado
* Impossibilidade de coleta dos dados devido ao paciente pertencer a outro hospital
7. Referências
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