( PDF ) Estudo comparativo dos modelos animais de hipóxia intermitente e privação de sono em ratos

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JULIANA CINI PERRY

ESTUDO COMPARATIVO DOS MODELOS

ANIMAIS DE HIPÓXIA INTERMITENTE E

PRIVAÇÃO DE SONO EM RATOS

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para

obtenção do Título de Doutor em Ciências.

São Paulo

2007

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JULIANA CINI PERRY

ESTUDO COMPARATIVO DOS MODELOS

ANIMAIS DE HIPÓXIA INTERMITENTE E

PRIVAÇÃO DE SONO EM RATOS

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para

obtenção do Título de Doutor em Ciências.

Orientador:

Prof. Dr. Sergio Tufik

Co-orientador:

Profa. Dra. Vânia D’Almeida

São Paulo

2007

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Perry, Juliana Cini

Estudo comparativo dos modelos animais de hipóxia

intermitente e privação de sono em ratos / Juliana Cini Perry. --

São Paulo, 2007.

xix, 179 p.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola

Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em

Psicobiologia.

Título em inglês: Comparative study between intermittent

hypoxia and sleep deprivation in rats.

1. Hipóxia; 2. Privação de sono; 3. Memória;

4.Cardiovascular; 5. Rato.

iii

Esta tese foi realizada no Departamento de Psicobiologia

da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista

de Medicina, com o apoio financeiro da Associação

Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP), CAPES,

FAPESP (#04/04008-7) e CEPID (#98/14303-3).

Eu amo a vida,

eis a minha verdadeira fraqueza.

Amo-a tanto,

que não tenho

nenhuma imaginação

para o que não

for vida.”

Albert Camus

Dedico essa tese aos meus pais, Regina Maria Cini Perry e

Luiz Eduardo Perry, que com extrema confiança,

indiretamente, acreditaram e contribuíram para o

desenvolvimento da ciência no Brasil.

Aos meus pais científicos, Sergio Tufik e Maria Vital,

pela orientação,

pela amizade,

pela dedicação,

pelos exemplos de ética e profissionalismo,

pelo incentivo neste início de carreira científica.

Sempre serei grata por permitirem o meu amadurecimento pessoal e científico

com muito respeito e paciência.

À minha irmã científica, Monica Levy Andersen,

pelo exemplo de dedicação à Ciência,

por me apresentar novos rumos e novas maneiras de trabalhar,

pela sua irrestrita capacidade de ajudar, sempre!

e por todas as boas risadas...

Apesar das dificuldades que os cientistas brasileiros

enfrentam durante a vida acadêmica, não podemos

deixar de ter EXPECTATIVA:

na pesquisa de qualidade,

de maiores investimentos,

em reunir pesquisadores que amem a Ciência,

para transmitir o conhecimento às várias gerações.

vii

AGRADECIMENTOS

Ao meu marido Sergio que, ao longo desse período, escutou, vivenciou e

participou de todos os momentos.

À minha família, que sempre compreenderam as minhas ausências.

Aos meus irmãos André, Rafael e Carolina, pelo amor e pelo carinho que muitas

vezes foram transmitidos pelo método tradicional: pensamento positivo.

Aos meus queridos sobrinhos, Ana Beatriz e Eduardo, pelo amor incondicional de

que apenas as crianças são capazes.

Às minhas eternas amigas Carolina Pacheco, Flavia Guarinello, Isabela

Antunes, Letícia Sales, Ligia Papale, Luciane Bonetto, Tathiana Alvarenga,

Teresa Schutz e Vanessa Beijamini, pela presença, pelo apoio e pela dedicação

simplesmente incomparável.

A Vânia D’Almeida, pela co-orientação neste trabalho e auxílio na minha formação,

e por compreender as minhas dificuldades nas alterações bioquímicas que ocorrem

dentro de uma célula.

Aos alunos e funcionários do laboratório LEIM, em especial a Maria Perpeto

Socorro Bernardes, pelo exemplo de vida de alguém que não parou no tempo.

A todos os professores do curso de pós-graduação em Psicobiologia, pelas

importantes contribuições para minha formação, em especial a Maria Gabriela M.

Oliveira, pelo incentivo, e às professoras Ana Amélia Benedito Silva e Maria

Laura Pires, pelos inestimáveis conselhos estatísticos.

A todos os meus amigos de curso, Adriano Zager, Andressa da Silva, Angela

Reksidler, Francielli Ruiz, Neuli Tenório, Raquel Martins e Ricardo Lazzarini,

especialmente a Danielle Pereira, Francisco Godoi, Francisco Dubiela, Marcelo

Lima, Renata Koyama e Sergio Rolim, por todas as boas discussões e pela

imensa ajuda nos relatórios, nos artigos e na tese.

viii

À engenharia de Gases Medicinais da Escola Paulista de Medicina, em especial ao

engenheiro Virgilio Gustavo da Silva, pela amizade que se iniciou devido à

redução da concentração de oxigênio na sala da hipóxia.

Aos professores Cássia Bergamaschi e Ruy Campos e aos alunos Bruno Carillo

e Rafael Carvalho, pelo carinho e demonstração da verdadeira colaboração

científica.

A Marilde Costa e Tomé Pimentel, pela amizade e pelo apoio sempre presentes.

Aos amigos Alice Lima, Ricardo Marques, Waldermaks Leite, Solange da Silva,

Cristiano Resende, Manoel Novais, José da Costa, em especial Alberto

Nogueira, Diva Maria Lima, Ivan Xavier, pela amizade e auxílio direto em todos

os momentos durante a execução dos experimentos.

Aos professores Michael Decker e Andrew Escayg e aos amigos Gillian Hue, Ian

Beckford, Glenda Keating e Dan Miller, pelo carinho dispensado em uma terra

distante.

À Maria Cristina Jorge, pela paciência que só é possível para quem vive entre o

conhecimento.

A Magda Bignotto, pela amizade e todos os ensinamentos bioquímicos durante

todas as dosagens dos parâmetros bioquímicos associados ao risco cardiovascular.

Ao professor de inglês Geraldo Curi, pela capacidade de tornar a língua inglesa

mais acessível.

Aos servidores técnico-administrativos do Departamento, especialmente Nereide

Garcia, Júlio Nascimento e Valéria Acquilino.

A José Gilberto de Carvalho, pela ajuda prestada durante a execução deste

trabalho.

A Nelson da Silva, João Bosco e Sebastião da Silva, pelo “Bom-dia”, “Boa-

tarde”, “Boa-noite” e...”Bom-dia”, mais uma vez, tão simpáticos que faziam dos

momentos mais inusitados de trabalho momentos comuns.

A Gui Mi Ko que, ao me apresentar o Wistar Hannover, proporcionou o sucesso

deste trabalho.

À Prof

. Dr

. Dulce Casarini, pela oportunidade de realizar as avaliações

neuroquímicas em seu laboratório, e à técnica responsável pelo HPLC, Luciana

Teixeira, pelo auxílio nas análises.

À Prof

. Dra. Marcia Nagaoka e ao Prof. Dr. Guus Schoorlemmer, por ter

disponibilizado seu tempo e laboratório para a realização dos experimentos de

gasometria.

À AFIP e FAPESP, pelo suporte financeiro, sem o qual não seria possível a

realização deste trabalho.

Aos animais que, com suas vidas, proporcionaram o desenvolvimento desta

pesquisa e contribuíram para a Ciência.

Meus sinceros agradecimentos.

Juliana

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HIAA 5-hidroxindolacético

5-HT serotonina

AASM American Academic Sleep Medicine

ABD abdômen

ATP adenosina tri-fosfato

BRdU 5-bromo-2-deoxiuridina

dióxido de carbono

CTRL controle

DA dopamina

DAT transportador de dopamina

DHBA diidroxibenzilamina

DOPAC ácido 3,4-diidroxifenilacetrico

DTT ditiotreitol

ECoG eletrocorticograma

EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético

EEG eletroencefalográfico

EMG eletromiograma

EOG eletro-oculograma

EUA Estados Unidos da América

FA fluxo aéreo

FC freqüência cardíaca

GSHT glutationa total

HCO

- bicarbonato

HDL do inglês high density lipoprotein

HI hipóxia intermitente

HIF-1 fator de indução a hipóxia

HPLC do inglês high performance liquid chromatography

HRP do inglês horseradish peroxidase

HVA ácido homovanílico

IgG Imunoglobulinas G

LDL do inglês low density lipoprotein

L-DOPA L-3,4 diidroxifenilalanina

MDA malondialdeído

MPTP 1 metil - 4 fenil -1,2,3,6-tetrahidropiridina

nitrogênio

NA noradrenalina

NREM do inglês non rapid eye movement

O2 oxigênio

concentração de oxigênio arterial

pCO

concentração de dióxido de carbono arterial

PaO

pressão parcial de oxigênio arterial

PaCO

pressão parcial de dióxido de carbono arterial

PMSF fluoreto de fenilmetilsulfonila

PSP privação do sono paradoxal

PVDF fluoreto de polivinilidina

REM do inglês rapid eye movement

RS restrição do sono

SaO

saturação da oxihemoglobina

SAOS síndrome da apnéia obstrutiva do sono

SCD-1 estearoil-Coa desaturase

SDS dodecil sulfato de sódio

SREBP-1 proteína de ligação ao elemento de resposta a esterol

SSI fase I do sono de ondas lentas

SSII fase II do sono de ondas lentas

SSIII fase III do sono de ondas lentas

TH tirosina hidroxilase

TOR tórax

UV ultravioleta

VLDL do inglês very low density lipoprotein

VMAT

transportador de monoaminas vesicular

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1:

Curva de dissociação do oxigênio dos membros da expedição

conforme descrita no trabalho de Barcroft e colaboradores em 1923 . . 003

Figura 2:

Polissografia de um voluntário normal e de um paciente apnéico . . . . 009

Figura 3:

Desenho esquemático dos protocolos de hipóxia sustentada e hipóxia

intermitente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 014

Figura 4:

Traçado representativo do ciclo vigília-sono do rato durante 30

segundos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 019

Figura 5:

Aparelho de Hipóxia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 029

Figura 6:

Gráfico representativo das concentrações de O

. . . . . . . . . . . . . . . . . 030

Figura 7:

Tanque de privação de sono pelo método de plataforma única . . . . . . 031

Figura 8:

Delineamento experimental dos experimentos de HI e/ou PSP por 3

ou 4 dias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 032

Figura 9:

Delineamento experimental dos experimentos de HI e/ou RS por 21

dias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 033

Figura 10:

Delineamento experimental do experimento de HI e/ou PSP por 3 dias 034

Figura 11:

Delineamento experimental do experimento de HI e/ou RS por 21 dias 035

Figura 12:

Delineamento experimental dos experimentos de HI e/ou PSP por 4

dias e HI e/ou RS por 21 dias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 037

Figura 13:

Delineamento experimental dos experimentos de HI e/ou PSP por 3

dias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 038

Figura 14:

Caixa de atividade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 043

Figura 15:

Labirinto em cruz elevado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 044

Figura 16:

Aparelho de esquiva inibitória . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 045

Figura 17:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP no número de entradas nos

braços abertos e fechados (%) em ratos submetidos ao labirinto em

cruz elevado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 051

Figura 18:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP no número de entradas nos

braços abertos e fechados (%) em ratos submetidos ao labirinto em

cruz elevado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 052

Figura 19:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP no número de entradas nos

braços fechados em ratos submetidos ao labirinto em cruz elevado . . 053

Figura 20:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP na concentração sérica de

corticosterona (ng/mL) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 054

xiii

Figura 21:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) na

distância (cm) de ratos submetidos à caixa de atividade . . . . . . . . . . . 066

Figura 22:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) na

velocidade (cm/s) de ratos submetidos à caixa de atividade . . . . . . . . 067

Figura 23:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) no

número de levantar de ratos submetidos à caixa de atividade . . . . . . . 068

Figura 24:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) no

tempo de imobilidade de ratos submetidos à caixa de atividade . . . . . 069

Figura 25:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) no

tempo de limpeza (s) de ratos submetidos à caixa de atividade . . . . . . 070

Figura 26:

Efeitos da exposição à PSP (4 dias), HI e/ou RS (4 e 20 dias) no

tempo de latência em ratos submetidos à sessão de treino da tarefa

de esquiva inibitória . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 071

Figura 27:

Efeitos da exposição à PSP (rebote), HI e/ou RS (5 e 21 dias) no

tempo de latência em ratos submetidos à sessão de teste da tarefa de

esquiva inibitória. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

072

Figura 28:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na expressão da enzima

tirosina hidroxilase na substância negra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 075

Figura 29:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na expressão da enzima

tirosina hidroxilase no estriado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 076

Figura 30:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS na concentração sérica de

corticosterona (ng/mL) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 077

Figura 31:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP no peso corporal em ratos . . . . . . 108

Figura 32:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS no peso corporal em ratos . . . . . . . 109

Figura 33:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração

plasmática de homocisteína total (µM) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

Figura 34:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração

plasmática de cisteína (µM) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

Figura 35:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica

de triglicérides (mg/dL) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

Figura 36:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica

de colesterol total (mg/dL) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

113

Figura 37:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica

da fração de HDL-colesterol (mg/dL) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

Figura 38:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica

da fração de LDL-colesterol (mg/dL) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

xiv

Figura 39:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica

da fração de VLDL-colesterol (mg/dL) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

Figura 40:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração

plasmática de homocisteína total (µM) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

Figura 41:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração

plasmática de cisteína (µM) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

Figura 42:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração sérica

de triglicérides (mg/dL) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

Figura 43:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração sérica

de colesterol total (mg/dL) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

Figura 44:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração sérica

da fração de HDL-colesterol em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

Figura 45:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração sérica

da fração de VLDL-colesterol em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

LISTA DE TABELAS E QUADRO

Tabela 1:

A relação dos valores dos gases no sangue arterial durante a

exposição aguda e crônica à hipóxia em humanos . . . . . . . . . . . . . . . . 004

Tabela 2:

Quantificação do valor de pH e da concentração dos gases pO2 e

pCO2 arteriais após 1, 5, 10 e 20 ciclos de hipóxia intermitente . . . . . . 050

Tabela 3:

Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal na concentração de monoaminas no córtex frontal, estriado

e hipocampo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 056

Tabela 4:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração de

monoaminas no córtex frontal e estriado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 074

Tabela 5:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração das

vitaminas folato, B6 e B12 (nmol/L) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

Tabela 6:

Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração das

vitaminas folato, B6 e B12 (nmol/L) em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

Tabela 7:

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (3 dias) no peso corporal e nos

fatores bioquímicos de risco cardiovascular em ratos . . . . . . . . . . . . . . 135

Quadro 1:

Definição dos mecanismos descritos que podem levar ao quadro de

hipóxia e seus exemplos clínicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 005

xvi

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x

LISTA DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xii

LISTA DE TABELAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xv

LISTA DE QUADRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi

RESUMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xix

1 INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 001

1.1 Hipóxia: aspectos históricos e gerais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 001

1.2 Alterações respiratórias e cardiovasculares durante o ciclo vigília-sono . . . 005

1.3 Doenças respiratórias durante o sono . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 007

1.4 Modelos experimentais de hipóxia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 011

1.5 Hipóxia intermitente: alterações comportamentais e neuroquímicas . . . . . . 014

1.6 Hipóxia intermitente: alterações cardiovasculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 016

1.7 Modelo experimental de privação de sono . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 017

1.8 Privação de sono: alterações comportamentais e neuroquímicas . . . . . . . . 020

1.9 Privação de sono: alterações cardiovasculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 024

2 JUSTIFICATIVA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 026

3 OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 027

4 MATERIAL E MÉTODO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 028

4.1 Animais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 028

4.2 Hipóxia intermitente (HI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 028

4.3 Privação de sono paradoxal (PSP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 030

4.4 Restrição de sono (RS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 031

4.5 Delineamento experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 032

4.5.1 Grupos experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 032

4.6 Análise do valor de pH e gases arteriais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 039

4.6.1 Quantificação do valor de pH e da concentração dos gases O

arterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

039

4.7 Análise dos fatores bioquímicos associados ao risco cardiovascular . . . . . . 039

4.7.1 Coleta das amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 039

4.7.2 Quantificação da concentração de homocisteína e cisteína . . . . . . . 040

4.7.3 Quantificação da concentração de triglicérides, colesterol total e

frações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

040

4.7.4 Quantificação da vitamina B

e folato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 041

4.7.5 Quantificação da vitamina B

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 042

xvii

4.8 Análise da concentração sérica de corticosterona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 042

4.8.1 Coleta de sangue para obtenção de soro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 042

4.8.2 Quantificação de corticosterona sérica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 042

4.9 Avaliação comportamental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 042

4.9.1 Caixa de atividade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 042

4.9.2 Labirinto em cruz elevado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 044

4.9.3 Tarefa da esquiva inibitória . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 045

4.10 Avaliação neuroquímica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 046

4.10.1 Determinação do conteúdo de monoaminas no encéfalo de ratos . . 046

4.11 Avaliação da expressão da tirosina hidroxilase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 047

4.11.1 Extração de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 047

4.11.2 Dosagem de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 047

4.11.3 Western blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 047

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 049

6 RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 050

6.1 Avaliação do pH, da concentração dos gases pO

e pCO

arteriais após

exposição à hipóxia intermitente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

050

6.2 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal na ansiedade em ratos submetidos ao labirinto em cruz elevado

051

6.3 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal na concentração sérica de corticosterona em ratos . . . . . . . . . . .

054

6.4 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal na concentração de monoaminas no córtex frontal, estriado e

hipocampo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

055

ARTIGO I: Distinct behavioral and neurochemical alterations induced by

intermittent hypoxia or paradoxical sleep deprivation in rats . . . . . . . . . . . . . . . .

057

6.5 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou restrição de sono (basal,

4, 7, 14 e 21 dias) na atividade geral em ratos submetidos à caixa de

atividade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

065

6.6 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou restrição de sono (5 e 21

dias) e PSP (4 dias consecutivos) no aprendizado e retenção da memória

em ratos submetidos à esquiva inibitória . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

071

6.7 Efeitos da exposição crônica à hipóxia intermitente e/ou restrição de sono

(21 dias) na concentração de monoaminas no córtex frontal, estriado e

hipocampo em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

073

6.8 Efeitos da exposição crônica à hipóxia intermitente e/ou restrição de sono

na expressão da enzima tirosina hidroxilase na substância negra e

estriado em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 075

xviii

ARTIGO EM REVISÃO: Intermittent hypoxia and sleep restriction: motor,

cognitive and neurochemical alterations in rats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

078

6.9 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação/restrição de

sono paradoxal no peso corporal em ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

108

6.10 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação/restrição de sono

paradoxal nos fatores bioquímicos associado ao risco cardiovascular . . . . .

110

ARTIGO II: Consequences of subchronic and chronic exposure to intermittent

hypoxia and sleep deprivation on cardiovascular risk factors in rats . . . . . . . . . .

125

6.11 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e privação de sono paradoxal

durante 3 dias nos fatores bioquímicos associados ao risco cardiovascular

134

7 DISCUSSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

7.1 Vantagens e limitações do modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

7.2 Efeitos da exposição à hipóxia e/ou privação de sono paradoxal nas

avaliações comportamentais e neuroquímicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

138

7.3 Efeitos da exposição à hipóxia e/ou restrição de sono nas avaliações

comportamentais e neuroquímicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

143

7.4 Efeitos da exposição à hipóxia e/ou privação de sono nos fatores

bioquímicos sangüíneos associados ao risco cardiovascular . . . . . . . . . . . .

150

8 CONCLUSÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159

10 ANEXO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

ABSTRACT

xix

RESUMO

A síndrome da apnéia e hipoapnéia obstrutiva do sono (SAOS) caracteriza-se por

episódios recorrentes de obstrução das vias aéreas superiores e está associada às

comorbidades cardiovasculares e cognitivas. Nos pacientes apnéicos não é possível

determinar se essas conseqüências estão relacionadas aos efeitos da hipóxia per se ou se

ocorrem devido à fragmentação do sono. Assim, propõe-se neste estudo a avaliação das

alterações comportamentais, cognitivas e cardiovasculares em um modelo animal que

associa hipóxia à privação de sono. Ratos Wistar machos adultos foram expostos a hipóxia

intermitente (HI-ciclos de 2 min de 21% a 10% de O

) das 7 às 19h e/ou privação de sono

paradoxal (PSP) pelo método da plataforma única durante três ou quatro dias. Para

observar os efeitos crônicos da exposição à HI e/ou restrição de sono (RS), os animais

foram expostos à hipóxia das 10 às 16h e/ou submetidos à RS das 16 às 10h do dia

seguinte durante 21 dias. Os resultados obtidos nesse estudo indicam que a PSP induziu

alterações comportamentais associadas à modificação da neurotransmissão adrenérgica. A

exposição crônica à HI reduziu a concentração de noradrenalina no estriado, modulando

seletivamente os sistemas de neurotransmissão sem modificar o comportamento e a

função cognitiva dos ratos. No entanto, o aumento da atividade motora nos ratos do grupo

RS não foi associado a alterações nas concentrações de catecolaminas e na expressão da

enzima tirosina hidroxilase no sistema nervoso central. A exposição à RS não modificou a

aquisição e a retenção da memória dos animais na tarefa de esquiva inibitória; entretanto,

durante a habituação foi observado prejuízo cognitivo. A PSP e a RS modificaram os

fatores bioquímicos associados ao risco cardiovascular. Embora as alterações induzidas

pela HI nos parâmetros bioquímicos sangüíneos sejam tempo-dependentes, a exposição à

HI associada à PSP reverteu as modificações induzidas pela PSP. Os resultados sugerem

que a hipóxia e a privação de sono modificam os sistemas nervoso central e cardiovascular

por vias distintas.

Palavras-chave: hipóxia; privação de sono; memória; sistema cardiovascular; rato.

Introdução

1. INTRODUÇÃO

1.1 Hipóxia: aspectos históricos e gerais

O diagnóstico e o tratamento da maioria das doenças respiratórias

passaram a depender da compreensão dos princípios fisiológicos da respiração e

das trocas gasosas. Algumas doenças respiratórias resultam da ventilação

inadequada, ao passo que outras ocorrem devido a anormalidades da difusão

através da membrana pulmonar e do transporte de gases dos pulmões para os

tecidos. A oxigenação inadequada dos pulmões ocasiona redução da concentração

de oxigênio sangüíneo e conseqüente deficiência de oxigênio tecidual. Essa

redução do teor de oxigênio denomina-se hipóxia.

O oxigênio é um elemento químico de símbolo O, número atômico 8 com

massa atómica 16 u. Na sua forma molecular, O

é um gás à temperatura

ambiente, incolor, insípido, inodoro, comburente, mas não combustível e pouco

solúvel em água. Representa aproximadamente 21% da composição da atmosfera

terrestre e é um dos elementos mais importantes da química orgânica, participando

de maneira relevante no ciclo energético dos seres vivos, sendo essencial na

respiração celular dos organismos aeróbios.

Em 1878, o fisiologista francês Paul Bert forneceu a primeira evidência

científica de que a falta do O

acarreta saturação incompleta do sangue, levando o

indivíduo a apresentar sintomas como “hiperventilação durante a realização do

exercício, náuseas, dores de cabeça e depressão” (Kellogg, 1978; Marotte, 2006).

Diante disso, iniciaram-se as pesquisas e as observações clínicas que

demonstraram que a hipóxia, aguda ou crônica, resulta em respostas fisiológicas

preditivas. A pesquisa dos mecanismos que induzem a hipóxia se destacou a partir

de 1900. Assim, entre 1921 e 1922, Joseph Barcroft conduziu uma expedição aos

Andes para coletar e analisar sistematicamente as respostas agudas e crônicas

que ocorrem durante o curso às altas altitudes. Durante essa expedição, em

altitudes diferentes, o grupo de pesquisadores monitorou as alterações na

ventilação, os valores do dióxido de carbono arterial e a oxigenação arterial. Além

dos parâmetros respiratórios, Barcroft e seus colaboradores foram submetidos à

Introdução

análise de alguns parâmetros sangüíneos antes da partida, ao nível do mar,

repetidamente durante a exposição às diferentes altitudes e, finalmente, durante a

descida das montanhas.

Dentre as análises realizadas, o resultado de maior relevância foi

encontrado no precursor das células sangüíneas, denominado célula reticular.

Barcroft observou o contraste nas concentrações dessas células entre os nativos

adaptados às altas altitudes em relação aos membros da expedição. Na primeira

semana, a 4.267 metros, foi observado um pico na concentração das células

reticulares e, após alguns dias, a concentração dessas células retornou aos níveis

basais. Entretanto, quando os membros da expedição retornaram ao nível do mar,

as células reticulares apresentaram valores reduzidos em relação à referência

basal. Após esse estudo, Barcroft demonstrou que essas moléculas modificavam

durante a respiração em diferentes altitudes e caracterizou como uma “função

respiratória do sangue” (Barcroft et al., 1923).

Posteriormente, esses resultados revelaram que as moléculas de

hemoglobina eram as principais responsáveis pelo transporte de O

. A Figura 1

ilustra a curva de dissociação da O

dos membros da expedição aos Andes

conforme descrita no trabalho de Barcroft e colaboradores em 1923. A curva de

saturação da hemoglobina com o O

, também denominada curva de dissociação da

oxihemoglobina, representa a relação entre a pressão parcial de oxigênio (PaO

) no

sangue e o percentual de saturação da hemoglobina. A afinidade da hemoglobina

pelo O

é um fenômeno dinâmico que pode ser afetado por diversos mecanismos;

portanto, a análise da curva de dissociação da oxihemoglobina e a influência de

diversos fatores na sua configuração propiciam o cálculo preciso do conteúdo,

transporte e consumo de O

do organismo, permitindo quantificar a função

respiratória e a cardíaca.

Introdução

Figura 1. Curva de dissociação do oxigênio dos membros da expedição conforme

descrita no trabalho de Barcroft e colaboradores em 1923.

Nas décadas que se seguiram após a expedição de Barcroft aos Andes,

muitos pesquisadores mostraram o interesse em descrever as respostas

respiratórias e hematológicas dos indivíduos e das populações expostas a uma

condição de hipóxia em altas altitudes. Diversos estudos demonstraram que a

exposição aguda à hipóxia em altas altitudes acarreta dessaturação da

oxihemoglobina, hiperventilação e redução da concentração do dióxido de carbono

(CO

). A Tabela 1 denota as alterações gerais nos valores dos gases no sangue

arterial induzidas pela exposição à hipóxia aguda e crônica nas altas altitudes.

Introdução

Tabela 1. A relação dos valores dos gases no sangue arterial durante a exposição

aguda e crônica à hipóxia em humanos.

Basal Hipóxia aguda Hipóxia crônica

pH ~ 7,4 > 7,5 ~ 7,5

PaO

> 85 mmHg < 70 mmHg ~ 80 mmHg

PaCO

~ 40-45 mmHg < 35 mmHg ~ 32 mmHg

SaO

> 93% < 80% 90%

HCO

22-24 mEq/L > 22-24 mEq/L 16 mEq/L

Definição das abreviaturas: PaO

: pressão parcial de oxigênio; PaCO

: pressão

parcial de dióxido de carbono; SaO

: saturação da oxihemoglobina; HCO

bicarbonato (Fonte: Perry e Decker, 2007).

O diagnóstico e o tratamento dos efeitos da hipóxia são baseados na

identificação da natureza e da freqüência da troca dos gases (crônico versus

intermitente; ambiental versus patológico). Ao contrário da hipóxia ambiental

induzida, as doenças respiratórias apresentam perfil ligeiramente diferente na

concentração dos gases no sangue arterial. Algumas doenças levam à ventilação

inadequada, enquanto outras apresentam alteração na difusão dos gases através

dos alvéolos, o que resulta no transporte reduzido dos gases dos pulmões aos

tecidos. Alguns dos mecanismos, como descrito no Quadro 1, podem desencadear

um quadro de hipóxia, como concentrações baixas de O

em decorrência de fatores

extrínsecos, observados em indivíduos normais expostos às altas altitudes, ou

naqueles indivíduos acometidos por uma alteração dos gases em conseqüência de

uma doença ou por intoxicação.

Introdução

Quadro 1. Definição dos mecanismos descritos que podem levar ao quadro de

hipóxia e seus exemplos clínicos.

Causas da hipóxia Definição Exemplo clínico

Hipóxia hipóxica

Baixas concentrações de O

atmosfera (redução do PaO

)

Altas altitudes

Hipóxia anêmica

Inadequação do transporte sangüíneo

de O

para os tecidos devido à

redução efetiva da concentração de

hemoglobina

Perda de sangue, anemia

Shunt

Redução da ventilação-perfusão e

difusão dos gases no alvéolo

Malformação

arteriovenosa

Hipóxia cardiogênica

Transporte inadequado do O

o pelo

sangue para os tecidos devido à

diminuição do débito cardíaco

Insuficiência cardíaca

congestive

Hipóxia histotóxica

Incapacidade dos tecidos de utilizar o

(inibição da atividade de enzimas

celulares)

Intoxicação por arsênico

ou deficiência de

vitaminas

Hipóxia

hipermetabólica

Aumento na demanda de ATP ou

metabolismo energético (hipertermia)

Febre alta

Definição das abreviações: PaO

: pressão parcial de oxigênio; ATP: adenosina

tri-fosfato (Fonte: Perry e Decker, 2007).

1.2 Alterações respiratórias e cardiovasculares durante o ciclo vigília-sono

Com o advento do registro eletroencefalográfico (EEG) por Hans Berger em

1929 e com a descrição de distintos padrões EEG presentes durante o sono por

Loomis, Harvey e Holvart em 1937, tornou-se evidente a relação entre a

fenomenologia do sono e os potenciais elétricos do sistema nervoso. Em 1953,

Aserinsky e Kleitman descreveram a ocorrência cíclica de movimentos oculares

rápidos durante o sono associada ao aumento da atividade cortical. No entanto, em

1957, Dement e Kleitman demonstraram que a atividade ocular ocorria

simultaneamente à fase dessincronizada do sono e estava relacionada com o

conteúdo dos sonhos, no ser humano, e, por isso, utilizaram a denominação de

“sono de movimentos oculares rápidos” (REM, do inglês rapid eye movement). O

Introdução

sono REM, por seu padrão do EEG análogo ao da vigília, porém associado à

acentuada diminuição do tônus muscular, foi denominado de sono paradoxal

por

Jouvet e Michel em 1959 (para revisão, ver Datta e MacLean, 2007).

Em mamíferos, a vigília e o sono representam dois estados fisiológicos

normalmente definidos por meio de registros EEG. As interações dos processos

circadiano e homeostático são conhecidas por regular o ciclo entre esses dois

estados (Borbély e Achermann, 1999). As alterações respiratórias e

cardiovasculares foram estudadas durante a vigília; entretanto, as verificações

durante o sono são escassas. Uma vez que cada sistema orgânico possui um papel

distinto na adaptação de mudanças de estado, torna-se fundamental a condução de

estudos visando investigar como esses sistemas são afetados pelo sono. Assim,

pode-se sugerir que existam dois tipos de fisiologia: a fisiologia da vigília e a

fisiologia do sono.

A respiração pode ser definida, de modo simplificado, como troca de gases

entre as células do organismo e a atmosfera. Durante a vigília, a respiração é

controlada pelos comandos ventilatórios voluntário ou comportamental e

involuntário ou metabólico, que respondem aos estados de hipoxemia, hipercapnia

e acidose, além de exercerem influência mecânica sobre a caixa torácica e o

parênquima pulmonar (Andersen e Bittencourt, 2008). Durante o sono, ocorre perda

do controle voluntário e diminuição da resposta ventilatória do controle metabólico,

além da hipotonia dos músculos respiratórios, que levam ao estado fisiológico de

hipoventilação (Douglas, 2005; Andersen e Bittencourt, 2008).

A atividade cardiovascular basal é maior durante a vigília e diminui ao longo

do período de sono. No sono non-rapid eye movement (NREM), ocorre um estado

de relaxamento cardiovascular, principalmente nos estágios 3 e 4 (Bittencourt et al.,

2003). Apesar de reduzida durante a maior parte do sono, essa atividade pode

aumentar e atingir níveis superiores aos observados durante a vigília. É comum a

pressão arterial sistêmica, a freqüência cardíaca e o débito cardíaco atingirem

valores inferiores ao basal durante os estágios 3 e 4 do sono NREM e níveis

Adotamos a denominação de sono de ondas lentas e sono paradoxal para referir aos estágios de sono em

ratos, e sono NREM e REM como referências em seres humanos.

Introdução

significativamente superiores aos da vigília na fase fásica

do sono REM

(Bonsignore et al., 1994; Bittencourt et al., 1998).

1.3 Doenças respiratórias durante o sono

Dentre as doenças respiratórias que ocorrem durante o sono destaca-se a

síndrome da apnéia obstrutiva do sono (SAOS). A SAOS é caracterizada por

episódios recorrentes de obstrução parcial ou total das vias aérea superiores, que

levam a interrupções intermitentes da ventilação, alteração dos gases arteriais e do

padrão normal de sono (American Academic Sleep Medicine – AASM, 1999). Na

maioria dos pacientes, esses eventos causam dessaturação da oxihemoglobina e,

em casos de eventos prolongados, hipercapnia, que freqüentemente são revertidos

por despertares, tornando o sono fragmentado (AASM, 1999).

A prevalência da SAOS na população americana (EUA) é de

aproximadamente 4% nos homens e de 2% nas mulheres, em indivíduos entre 30 e

60 anos de idade, que apresentam queixa de sonolência excessiva diurna e índice

de apnéia-hipopnéia maior que cinco por hora

(Young et al., 1993). Esses autores

também descreveram que, ao considerar somente o índice de apnéia-hipopnéia,

aproximadamente 24% dos homens e 9% das mulheres apresentam SAOS.

Como podem ser observadas na Figura 2, a apnéia e a hipopnéia levam a

pausas periódicas da respiração e hipoventilação alveolar. Em resposta à apnéia

ou hipopnéia, ocorre aumento do esforço respiratório que geralmente está

associado a despertares (<15 segundos), levando à fragmentação do sono (AASM,

1999). Além disso, a obstrução das vias aéreas superiores durante o sono acarreta

episódios de hipóxia (AASM, 1999).

O sono REM não tem estágios, mas apresenta eventos fásicos (intermitentes) e eventos tônicos (constantes durante todo o

episódio de REM). Exemplos dos eventos fásicos são os movimentos oculares rápidos e flutuações cardiorrespiratórias,

enquanto os eventos tônicos são a atonia muscular, a dessincronização do EEG, a perda do controle autonômico da

temperatura e a ocorrência do ritmo theta hipocampal.

O índice de apnéia-hipopnéia tem sido utilizado na maioria dos estudos como indicadores de gravidade da síndrome da

apnéia obstrutiva do sono (SAOS). O índice de apnéia-hipopnéia é determinado pelo número de episódios de apnéias e

hipopnéias por hora de sono, sendo classificado como leve (5 a 15 eventos), moderado (15 a 30 eventos) e grave (acima

de 30 eventos) (Young et al., 2002).

Introdução

Os critérios de diagnósticos da SAOS, segundo a força tarefa empreendida

pela American Academic Sleep Medicine (AASM, 2005), são baseados na

combinação das características clínicas do paciente associadas ao registro

polissonográfico. Dentre os sintomas clínicos relatados pelos pacientes destacam-

se: 1. sonolência diurna excessiva não relacionada a outros fatores e/ou; 2. dois ou

mais dos seguintes sintomas e sinais, não explicados por outras condições: asfixia

ou respiração difícil durante o sono, despertares noturnos recorrentes, sensação de

sono não-restaurador, fadiga diurna e dificuldade de concentração.

A monitoração durante a noite inteira, conduzida por um profissional

especialista em sono, é o padrão-ouro para o diagnóstico da SAOS. O registro

polissonográfico permite a avaliação simultânea de variáveis neurofisiológicas e

cardiorrespiratórias que refletem a quantidade e a qualidade do sono do paciente. A

SAOS acarreta redução do sono delta e do REM, aumentando a vigília e os

estágios 1 e 2 do sono NREM (Bittencourt et al., 2001). Segundo a AASM (2005),

um paciente pode ser diagnosticado com apnéia do sono se apresentar cinco ou

mais apnéias e/ou hipopnéias e/ou despertares relacionados a esforços

respiratórios por hora de sono.

Introdução

Figura 2. Polissonografia de um voluntário normal (A) e de um paciente apnéico (B).

Notar: episódio de apnéia e hipopnéia obstrutiva do sono durante um período de 120 segundos,

aumento do esforço respiratório indicando a natureza obstrutiva do evento e, em função desse

evento, o paciente apresenta despertar e dessaturação. Abreviaturas: canais de registro do EEG

(C3-A2; C4-A1; O1-A2; O2-A1); eletro-oculograma (EOG); freqüência cardíaca (FC); fluxo nasal

(FA); tórax (TOR); abdômen (ABD); saturação da oxihemoglobina (SaO

ECG

TOR

ABD

SaO

C3-A2

C4-A1

O1-A2

O2-A1

EOG

C3-A2C3-A2

C4-A1C4-A1

O1-A2O1-A2

O2-A1O2-A1

EOG-EEOG-E

SaO

Despertar

Apnéia

Hipopnéia

TORTOR

ABDABD

ECGECG

EOG-DEOG-D

Desaturação

Despertar

Introdução

Diversas evidências mostram que os pacientes com SAOS apresentam

sonolência excessiva diurna em decorrência dos repetidos números de despertares

durante o sono (Bittencourt et al., 2005), alterações cardiovasculares (Lavie et al.,

2000; Nieto et al., 2000; Peppard et al., 2000; Young et al., 2002; Bittencourt et al.,

2003; Lavie, 2004; Drager et al., 2007) e conseqüências metabólicas (Ip et al.,

2002; Punjabi e Polotsky, 2005; Vgontzas et al., 2005; Wolk e Somers, 2007). Além

disso, alterações neuropsicológicas podem estar presentes na SAOS como

prejuízos na memória, flutuações de humor, depressão, irritabilidade e ansiedade

(Bedard et al., 1991; Bedard et al., 1993; Engleman et al., 1994; Borak et al., 1996;

Engleman e Joffe, 1999; Beebe e Gozal, 2002; Naismith et al., 2004; El-Ad e Lavie,

2005; Kjelsberg et al., 2005; Naegele et al., 2006; Verstraeten, 2007).

Em relação às alterações da função cognitiva, os pacientes com SAOS

apresentam prejuízo na atenção, nas funções executivas

e na memória de longo

prazo (Adams et al., 2001; Sateia, 2003, Naegele et al., 2006; Quan et al., 2006).

Recentemente Verstraeten (2007), em extensa revisão da literatura, sugere que os

testes cognitivos associados a estudos de ressonância magnética funcional indicam

que a perda de sono tem importância maior como causa primária dos déficits

cognitivos que a hipoxemia.

As conseqüências das alterações neuropsicológicas são implicações nas

relações familiares e sociais e prejuízos cognitivos que afetam o desempenho

acadêmico e profissional. Essas alterações também podem contribuir não só para a

piora da qualidade de vida dos pacientes, como também para o aumento da

freqüência dos acidentes de trânsito. Estudos têm enfatizado a relação entre a

SAOS e acidentes de trânsito (George et al., 1987; Findley et al., 1992; Leger,

1994; Santos et al., 2004). Sassani e colaboradores (2004) relataram os custos e a

mortalidade relacionados a SAOS em acidentes de trânsito nos Estados Unidos e

apontaram uma análise do custo-benefício no tratamento desses motoristas. Esses

autores observaram que 800.000 motoristas apnéicos se envolveram em acidentes

automobilísticos que levaram a 1.400 óbitos e prejuízo de 15,9 bilhões de dólares.

Essa situação agrava-se quando os estudos populacionais indicam a alta

prevalência dessa doença nos adultos (Young et al., 2002).

Habilidade no planejamento de estratégias de resolução de problemas para a execução de metas mediada pelo córtex

frontal.

Introdução

Dentre as alterações cardiovasculares presentes nos pacientes com SAOS,

destaca-se a hipertensão arterial. Estudos mostram que a SAOS é um fator de risco

independente na hipertensão arterial, sendo que 40-60% dos apnéicos apresentam

essa alteração (Lavie et al., 2000; Roux et al., 2000; Young et al., 2002). A

variabilidade da prevalência de hipertensão nos pacientes apnéicos pode ocorrer

devido a características fenotípicas, como aumento da idade e do índice de massa

corpórea, história familiar e o gênero feminino (Drager et al., 2006).

Após um evento obstrutivo, as flutuações da pressão intratorácica induzidas

pelo esforço respiratório, a hipóxia e o despertar afetam o sistema nervoso

autônomo resultando em alterações na pressão arterial (Fletcher, 1995). Assim,

tem sido proposto que a hipóxia e a fragmentação do sono são fatores relacionados

às doenças cardiovasculares associadas à SAOS, pois ativam o sistema simpático

e alteram as respostas aos barorreceptores e quimiorreceptores (Leuenberger et

al., 1995; Narkiewicz et al., 1999; Leung e Bradley, 2001; Imadojemu et al., 2002).

Os dados da literatura sugerem que a hipóxia e a fragmentação do sono

são fatores relevantes relacionados com alterações presentes nos pacientes com

SAOS. Entretanto, apenas um estudo clínico conseguiu investigar isoladamente os

efeitos da fragmentação do sono e hipóxia (Ringler et al., 1990). Tal dificuldade se

dá devido à simultaneidade desses eventos, situação essa que não permite

determinar em estudos clínicos se as alterações observadas estão relacionadas

aos efeitos da hipóxia per se ou aos despertares constantes durante o sono.

1.4 Modelos experimentais de hipóxia

Dentre os mamíferos mais utilizados para o estudo da hipóxia, destacam-se

os roedores. Esses animais apresentam respostas similares àquelas observadas

em humanos, além de serem de fácil manutenção, especificamente os

camundongos, pela possibilidade do uso de ferramentas moleculares que

contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas

respostas à hipóxia. Outros animais como o cão e o carneiro também são utilizados

para determinar os efeitos da hipóxia; no entanto, esses animais apresentam um

custo elevado de manutenção por longos períodos e limitações éticas.

Introdução

a) Hipóxia Sustentada

Os efeitos da hipóxia no organismo têm sido estudados com protocolos

experimentais que mimetizam alterações ambientais ou fisiopatológicas. Para

aprofundar a avaliação das alterações respiratórias que ocorrem em condições de

exposição a altas altitudes e em doenças pulmonares crônicas, criou-se o protocolo

de hipóxia sustentada, no qual a redução de concentração de O

é constante

(Figura 3A).

Em roedores, a hipóxia sustentada induziu aumento da vigília, redução do

sono paradoxal e fragmentação do sono de ondas lentas (Pappenheimer, 1984;

Laszy e Sarkadi, 1990). Após uma a duas semanas de exposição à hipóxia

sustentada, ocorreu uma recuperação parcial do sono de ondas lentas e do sono

paradoxal, embora o padrão de sono não tenha retornado aos valores obtidos

durante a avaliação basal (Pappenheimer, 1984).

b) Hipóxia Intermitente

Para reproduzir os distúrbios respiratórios que ocorrem durante o sono,

como a SAOS, é empregado o protocolo de hipóxia intermitente (HI). Nesse

modelo, os insultos da hipóxia geralmente têm duração de 10 a 30 segundos que

são alternados com períodos de concentração normal de O

(21%), denominados

normóxia (Figura 3B).

No modelo de hipóxia proposto por Gozal e colaboradores (2001a), os ratos

submetidos à HI apresentaram redução da concentração de oxigênio arterial (pO

)

arterial de 89,4 ± 3,2 mmHg para 44,2 ± 2,2 mmHg após o primeiro ciclo de hipóxia

e após 10 ciclos consecutivos foi de 36,7 ± 2,1 mmHg. A concentração de dióxido

de carbono arterial (pCO

) avaliada nos ratos do grupo controle foi de 35,7 ± 2,4

mmHg, enquanto nos animais do grupo HI ocorreu diminuição para 30,5 ± 1,7 e

26,7 ± 1,4 mmHg após o primeiro e décimo ciclo, respectivamente. Os autores não

verificaram alteração após o décimo ciclo de HI.

Ao contrário da hipóxia sustentada, Gozal e colaboradores (2001a)

observaram que os ratos expostos à HI na concentração de 10% de O

(12 horas

Introdução

da fase clara do ciclo) apresentaram redução da duração do sono de ondas lentas

e paradoxal após o primeiro dia de exposição à hipóxia. No segundo dia de

exposição, observou-se aumento de sono de ondas lentas e paradoxal nos ratos,

indicativo de rebote do sono, e entre os dias 3 a 14 de exposição à HI as

características do sono foram similares aos padrões basais. Entretanto, Hamrahi e

colaboradores (2001) desenvolveram um modelo de HI no qual os ratos eram

expostos a uma redução do O

somente durante o período de sono, para mimetizar

os efeitos dessa manipulação à SAOS. Em relação à arquitetura do sono, esses

autores demonstraram que os animais apresentaram aumento da vigília, redução

do sono paradoxal e múltiplos episódios de sono de ondas lentas de curta duração

semelhantes aos resultados da hipóxia sustentada. No período de rebote, os ratos

apresentaram redução da vigília e aumento do sono de ondas lentas e paradoxal.

Recentemente, após avaliação dos efeitos da hipóxia no padrão de sono,

Polotsky e colaboradores (2006) observaram que os camundongos expostos a um

insulto mais intenso de HI (5% de O

) apresentam redução da duração do sono de

ondas lentas e diminuição pronunciada de sono paradoxal durante a exposição à

hipóxia (fase clara do ciclo) acompanhada do rebote de sono paradoxal quando os

animais foram retirados da câmara de hipóxia (fase escura do ciclo). Portanto,

quando a HI é mais tênue (10% de O

), há menor modificação na arquitetura do

sono nos roedores (Gozal et al., 2001a; Veasey et al., 2004).

Introdução

Figura 3. Desenho esquemático dos protocolos de hipóxia sustentada (A) e hipóxia

intermitente (B).

Na hipóxia sustentada, a concentração de O

é mantida constante durante

horas, enquanto na hipóxia intermitente ocorrem variações da concentração de O

por segundo ou

minutos.

1.5 Hipóxia intermitente: alterações comportamentais e neuroquímicas

Apesar de a redução das concentrações de O

no sangue arterial exercer

estresse em todos os órgãos, o cérebro é particularmente vulnerável aos efeitos da

hipóxia (Choi, 1990). O dano neuronal induzido pela hipóxia em regiões específicas

do cérebro é acompanhado por alterações comportamentais e neuroquímicas

(Gozal et al., 2001a,b). Row e colaboradores (2002) verificaram que ratos expostos

à HI (14 dias) apresentaram aumento da atividade motora quando submetidos ao

campo aberto. Em relação às alterações cognitivas, alguns autores demonstraram

que a HI resulta em prejuízo na memória espacial tanto em ratos jovens (Gozal et

al., 2001a; Row et al., 2002) como em ratos idosos submetidos ao labirinto aquático

de Morris (Gozal et al., 2003a). Sabe-se que esse prejuízo da memória espacial

está associado ao tempo de exposição dos animais à HI, como demonstrado por

Gozal e colaboradores (2003b). No entanto, após a exposição crônica à HI (14 e 30

dias) essa alteração na memória não foi observada nos animais. Segundo os

10% O

21% O

2%-10% O

horas

segundos

segundos ou

minutos

Hipóxia sustentada

Hipóxia intermitente

10% O

21% O

2%-10% O

horas

segundos

segundos ou

minutos

Hipóxia sustentada

Hipóxia intermitente

horas

segundos

segundos ou

minutos

Hipóxia sustentada

Hipóxia intermitente

Introdução

autores, esse resultado pode estar associado ao efeito bifásico da HI observado

pelo ensaio de incorporação de 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) no hipocampo.

Nessa análise que avaliou a proliferação neuronal observou-se que ratos expostos

à HI durante 1 e 3 dias apresentaram redução das células BrdU marcadas e, após

sete dias, não foi observada alteração desse parâmetro. A exposição à HI durante

14 e 30 dias produziu aumento da proliferação neuronal no hipocampo.

Estudos mostram que as alterações comportamentais em animais após a

HI podem estar associadas à participação do estresse oxidativo. Row e

colaboradores (2003) relataram que a exposição de ratos à HI durante 7 dias

acarretou aumento da peroxidação lipídica no córtex. Além disso, esses autores

demonstraram que a administração do antioxidante PNU-101033E (3 mg/kg; 2

vezes ao dia durante 7 dias) reverteu os efeitos cognitivos e neuroquímicos

produzidos pela HI. Veasey e colaboradores (2004) observaram que camundongos,

após a HI, apresentaram alteração de vários parâmetros associados ao estresse

oxidativo, como aumento da peroxidação lipídica, da oxidação de proteínas e

nitração em regiões associadas à vigília. Além disso, estudos mostram que a HI

induz a morte neuronal no córtex e na região CA

do hipocampo, sem alterar a

região CA

em ratos. Esses resultados dependem do tempo de exposição dos

animais à HI, uma vez que os autores observaram nos ratos um pico na morte

neuronal após 48 horas de exposição à HI, achado que não se manteve após 14

dias (Gozal et al., 2001b).

Outro fator importante a ser considerado é a idade dos animais. Ratos

(entre 10 e 25 dias de vida) expostos à HI apresentam maior vulnerabilidade à

morte neuronal nas regiões CA

e córtex quando comparados com os animais de 2,

5, 30, 60 ou 90 dias (Gozal et al., 2001b). Nesse sentido, Gozal e colaboradores

(2003a) demonstraram que ratos idosos (22-24 meses de idade) submetidos à HI

apresentaram morte neuronal no córtex e hipocampo mais pronunciada que

animais com três meses de idade.

Durante o período crítico do desenvolvimento cerebral, a hipóxia promove a

perda da integridade funcional do sistema dopaminérgico implicando relevantes

alterações comportamentais e cognitivas (Decker et al., 2003; 2005). Segundo

Decker e colaboradores (2003), filhotes de ratos Sprague-Dawley, com sete dias de

Introdução

vida, expostos à HI (6 horas por dia, durante 4 dias) apresentaram aumento do

transportador de monoaminas para a vesícula 2 (VMAT

) e do receptor D

, sem

alterar a expressão da tirosina hidroxilase e do transportador de dopamina (DAT)

no estriado, em comparação aos animais controle. Por outro lado, não foi

observada alteração dos valores da enzima tirosina hidroxilase, VMAT

, D

, DAT no

córtex pré-frontal e sensório-motor nos animais pós-hipóxia. Em ratos adultos, a

exposição aguda à HI foi associada à redução na síntese de noradrenalina (NA)

(Miwa et al., 1986; Roubein et al., 1981) e de dopamina (DA) no cérebro (Miwa et

al.,1986). No entanto, as concentrações de monoaminas retornam aos níveis

basais após 36 horas do insulto de hipóxia (Roubein et al., 1981). Além disso,

outros estudos (Broderick e Gibson, 1989; Henley e Bellush, 1989; Olson, 1988;

Akiyama et al., 1991; Li et al., 1996; Ohkuwa et al., 2003) relataram que a resposta

do metabolismo de monoaminas está associada ao protocolo de hipóxia

empregado. Diversos fatores como concentração de O

, duração da hipóxia, idade

e sexo dos animais podem contribuir para a disparidade dos resultados.

1.6 Hipóxia intermitente: alterações cardiovasculares

Durante a apnéia, variações na pressão intratorácica induzida pelo esforço

respiratório, eventos como hipoxemia e despertar do paciente afetam o sistema

nervoso autônomo e cardiovascular, acarretando aumento da pressão arterial.

Estudos experimentais com modelos animais têm demonstrado a relação entre a HI

e a hipertensão. Em cães, a obstrução das vias aéreas superiores durante o sono,

simulando variações na pressão intratorácica, hipoxemia e despertares induziram o

aumento da pressão arterial diurna após quatro semanas (Brooks et al., 1997).

Esses autores demonstraram que os efeitos se deram em decorrência da hipóxia

per se uma vez que, ao avaliarem somente o número de despertares, não

encontraram aumento de pressão arterial. Além disso, roedores também

apresentaram aumento da pressão arterial após a exposição crônica à HI (Fletcher

et al., 1992a; Hui et al., 2003; Zoccal et al., 2007).

Durante a hipóxia, o mecanismo envolvido na gênese da hipertensão

parece estar relacionado a diversos componentes que incluem aumento da

Introdução

atividade simpática (Fletcher et al., 1992a; Bao et al., 1997a; Narkiewicz et al.,

1997; Fletcher, 2003), alterações nas funções dos quimiorreceptores (Fletcher et

al., 1992b; Lesske et al., 1997; Garcia-Rio et al., 2000; Fletcher, 2003), aumento da

concentração de NA (Fletcher et al., 1987; Marrone et al., 1993; Dimsdale et al.,

1995; Hui et al., 2003) e DA (Hui et al., 2003), assim como redução da resposta

vascular ao óxido nítrico (Duchna et al., 2000) e aumento das concentrações

plasmáticas de endotelinas (Saarelainen et al., 1997; Kanagy et al., 2001).

A HI (5% de O

) também pode modificar o perfil lipídico em roedores

aumentando o colesterol total, os níveis de fosfolipídeos e o índice de triglicérides

em camundongos (Li et al., 2005a; 2006). Esses dados sugerem que a

hiperlipidemia induzida pela HI pode estar relacionada a mudanças nas vias de

síntese dos lipídeos ou na recaptação de colesterol no fígado (Li et al., 2005a).

Segundo Li e colaboradores (2007), ao contrário das respostas obtidas no

metabolismo de lipídeos após a exposição da HI a 5% de O

(Li et al., 2005a), a

exposição dos camundongos à HI com concentração maior de O

(10%) não

interferiu no metabolismo dos lipídeos.

1.7 Modelo experimental de privação de sono

O sono é fundamental para uma boa saúde mental e emocional, além de

apresentar importância essencial na manutenção saudável do organismo. Em

geral, o ser humano dorme 8 horas de sono alternadas com um período de

aproximadamente 16 horas de vigília. Atualmente, esse tempo tem-se reduzido em

função das atividades contemporâneas. Em conseqüência do cenário econômico, a

população brasileira é induzida a prolongar a jornada de trabalho para manter uma

condição digna de sobrevivência que, associada à deficiência da infra-estrutura de

transporte coletivo nas grandes cidades, culmina com a diminuição do período

disponível para descanso. Além isso, a exposição à luz artificial ampliou o período

das atividades de lazer, prolongando a vigília. Essas questões socioeconômicas e

culturais conduzem a uma redução dramática no tempo de sono. A restrição de

sono (RS) é uma preocupação social relevante devido às importantes implicações

no desempenho individual e na saúde, como por exemplo, o aumento da

Introdução

prevalência da hipertensão intrinsecamente associada a menos de 5 horas de sono

(Gottlieb et al., 2006, Gangwisch et al., 2006).

Dentre os modelos propostos para o estudo da privação do sono, destaca-

se a utilização de roedores que permitem o emprego de uma metodologia crônica e

pelo amplo conhecimento do seu ciclo vigília-sono descrito por Timo-Iaria e

colaboradores em 1970. Posteriormente, a descrição minuciosa da implantação de

eletrodos e do registro eletrofisiológico do ciclo vigília-sono do rato foi o tema

abordado no livro de Andersen e colaboradores em 2001. Segundo esses autores,

o padrão de sono do rato pode ser classificado em vigília, sono de ondas lentas

(SS

, SS

III

), sono pré-paradoxal e sono paradoxal. A Figura 2 ilustra um

traçado representativo do ciclo vigília-sono do rato no Laboratório de Sono de

Ratos da Universidade Federal de São Paulo.

Introdução

Figura 4. Traçado representativo do ciclo vigília-sono do rato durante 30 segundos.

Vigília (A): episódio de vigília caracterizado por dessincronização cortical (canal 1-ECoG) e tônus

muscular acentuado (canal 3-EMG). Sono de ondas lentas (B): padrões eletrocorticográficos de

sono de ondas lentas. Notam-se ondas sincronizadas, com alta amplitude e baixa freqüência (canal 1-

ECoG) e hipotonia muscular (canal 3-EMG). Sono paradoxal (C): episódio de sono paradoxal.

Destacam-se o ritmo teta (canal 1- ECoG) e atonia muscular (canal 3-EMG). Calibração: 1 segundo e

50μV, velocidade: 10 mm/s e tempo: 30 segundos. Sistema: EMBLA / Somnologica Sleep Diagnostic

System. Ilustração: Laboratório de Sono de Ratos da Universidade Federal de São Paulo. Citado em

Antunes, 2006.

Introdução

A privação de sono tem sido amplamente utilizada como instrumento para

estudar as funções do sono, bem como os mecanismos envolvidos nesse

comportamento. O primeiro modelo animal desenvolvido para o estudo dos efeitos da

privação sono foi proposto em cães por Marie de Manacéine em 1894 (para revisão,

ver Suchecki e D’ Almeida, 2008), e posteriormente adaptado para gatos (Jouvet et

al., 1964) e ratos (Cohen e Dement, 1965). Nesse procedimento, os animais eram

colocados sobre uma plataforma circular única de 6,5 cm de diâmetro e circundados

por água. Com a atonia muscular, característica da fase paradoxal de sono, os ratos

apresentavam perda do equilíbrio postural, caindo na água e conseqüentemente

acordando. Em 1981, Van Hulzen e Coenen introduziram a técnica da plataforma

múltipla na qual um animal é colocado em um tanque contendo sete plataformas,

evitando assim sua imobilização. Machado e colaboradores (2004) observaram que

tanto a técnica da plataforma única como da plataforma múltipla suprimem o sono

paradoxal durante 4 dias consecutivos, advindo daí a denominação “privação de sono

paradoxal” (PSP), embora também haja uma redução do sono de ondas lentas (-39%

e -31%, respectivamente). Posteriormente, ao se comparar as diferenças entre os dois

métodos de PSP, demonstrou-se que não existem diferenças estatisticamente

significativas nos parâmetros de sono dos animais nas duas técnicas empregadas

(Machado et al., 2006).

Diante da RS imposta à sociedade moderna, propôs-se um modelo animal

que mimetizasse essas condições. Assim, o protocolo experimental proposto por

Machado e colaboradores (2005) caracterizou-se por alojar diariamente os ratos sobre

uma plataforma circular em um tanque durante 18 horas (das16h às 10h do dia

seguinte), seguido de uma janela de sono de 6 horas (das10h às 16h). Nesse

procedimento experimental foram observadas redução de sono de ondas lentas e

supressão do sono paradoxal durante o período de 18 horas de RS. Entretanto, nas 6

horas em que era permitido que os animais dormissem, observou-se um rebote de

sono, preferencialmente de sono paradoxal.

1.8 Privação de sono: alterações comportamentais e neuroquímicas

Diversos paradigmas experimentais têm sido utilizados no estudo das

alterações comportamentais e dos substratos neuronais envolvidos na PSP. Dentre

Introdução

as alterações comportamentais induzidas pela PSP, destaca-se o aumento da

agressividade (Tufik et al., 1978), facilitando os ataques de pânico e convulsões (de

Paula e Hoshino, 2002), também o aumento expressivo dos reflexos genitais

(Andersen e Tufik, 2002; Andersen et al., 2003) e da atividade motora (Tufik e

Silveira Filho, 1983), que pode ser potencializado por drogas como anfetamina

(Frussa-Filho et al., 2004), cocaína (Andersen e Tufik, 2002; Andersen et al.,

2005a) e ecstasy (Andersen et al., 2006).

Em relação à função cognitiva, alguns autores constataram aumento do

sono paradoxal após a aprendizagem, correlação da porcentagem desse estágio de

sono com a aprendizagem processual em humanos e prejuízo da aquisição da

memória após privação de sono (Peigneux et al., 2001). Bonnet e Arand (2003)

sugeriram que a privação total, parcial e a fragmentação de sono apresentam um

impacto significativo no grau de sonolência e, conseqüentemente, no desempenho

psicomotor em humanos. Os efeitos da RS, no que se refere a dados qualitativos,

são similares àqueles observados após a privação total de sono. Entretanto, os

efeitos da privação de sono na cognição são mais complexos ou variáveis, com

base na freqüência e no grau de perda de sono (Bonnet e Arand, 2003).

Nos roedores, memórias hipocampo-dependentes são particularmente

sensíveis à privação de sono. Nesse sentido, alguns estudos têm demonstrado que

a privação de sono altera a memória espacial em ratos expostos ao labirinto

aquático de Morris (Beaulieu e Godbout, 2000) e também a aquisição e retenção da

tarefa de esquiva inibitória (Bueno et al., 1994; Dametto et al., 2002; Moreira et al.,

2003; Dubiela et al., 2005). A privação total de sono nas primeiras 5 horas após a

sessão de treino da tarefa de medo condicionado ao contexto induziu prejuízo da

consolidação da memória, enquanto a privação total de sono iniciada 5-10 horas

após o treino não teve nenhum efeito (Graves et al., 2003). Nesse estudo,

avaliando outra tarefa, o medo condicionado ao som, independente do tempo de

exposição à privação total de sono, não foi capaz de modificar a consolidação

dessa tarefa hipocampo-independente. Além disso, Godoi e colaboradores (2005)

também encontraram prejuízo na atenção visual de ratos privados de sono, abrindo

caminho para a utilização desses animais no estudo dos mecanismos subjacentes

aos efeitos da privação de sono sobre a atenção.

Introdução

Em particular, em relação à participação do estresse oxidativo nas

alterações observadas após a PSP, alguns autores têm demonstrado que ratos

privados de sono por meio do modelo da plataforma única apresentaram redução

dos níveis de glutationa total (GSH

) tanto no tálamo como no hipotálamo;

entretanto, não foi observada alteração no córtex, hipocampo, medula e cerebelo

(D’Almeida et al., 1998). Além disso, a PSP não altera os índices de necrose e

apoptose neuronal, independente do protocolo de PSP utilizado (Cirelli et al., 1999;

Hipolide et al., 2002). Portanto, a ausência de estresse oxidativo e da morte

neuronal nas áreas do cérebro correlacionadas à função cognitiva sugere que os

mecanismos que acarretam alteração de memória parecem não depender da

participação desses dois fatores.

Em virtude de o sono ser gerado por mecanismos ativos do tronco cerebral

(para revisão, ver Datta e MacLean, 2007), pode-se prever que as alterações

comportamentais observadas após a PSP sejam resultantes das alterações na ação

dos neurotransmissores que ocorrem pela privação de sono. Atualmente muitos

estudos estão sendo realizados para esclarecer a função dos diversos sistemas de

neurotransmissão envolvidos no ciclo vigília-sono, porém os mecanismos

moleculares e as interações entre esses dois processos ainda não foram

completamente elucidados. As evidências sugerem que neurotransmissores,

incluindo DA, NA, serotonina (5-HT), histamina, além de pequenas moléculas,

como a adenosina, podem influenciar a regulação do ciclo vigília-sono (Porkka-

Heiskanen et al., 2002; Boutrel e Koob, 2004; Siegel, 2004; Lima et al., 2007).

Lena e colaboradores (2005), empregando a metodologia de microdiálise,

demonstrou que as concentrações de DA estão elevadas no córtex pré-frontal

medial e no núcleo accumbens durante a vigília e o sono paradoxal em relação às

concentrações durante o sono de ondas lentas. Esses resultados sugerem que a

liberação de DA nas áreas de projeção neuronal ocorre durante o ciclo vigíla-sono.

Recentemente, Lima e colaboradores (2007) demonstraram redução do sono

paradoxal em ratos após infusão bilateral de 1 metil - 4 fenil -1,2,3,6-

tetrahidropiridina (MPTP) na substância negra pars compacta durante 3 dias

consecutivos.

Introdução

Desde a década de 70, experimentos conduzidos pelo nosso grupo

sugerem uma importante participação da DA nos efeitos da PSP. Em 1978, Tufik e

colaboradores relataram que ratos com PSP apresentavam resposta aumentada na

agressão e estereotipia induzida pela apomorfina. Nos anos seguintes, os

resultados mostraram que, além da apomorfina, a PSP intensifica os efeitos de dois

outros agonistas dopaminérgicos (bromocriptina e piribedil) (Tufik, 1981). Em outro

estudo, verificou-se que a injeção de haloperidol, um antagonista dopaminérgico,

em ratos privados de sono paradoxal 24 horas antes da administração da

apomorfina potencializava o comportamento agressivo (Tufik et al., 1987). Nesse

estudo, a administração do haloperidol antes da administração da apomorfina

bloqueava o comportamento agressivo nos ratos submetidos à PSP,

proporcionando maior suporte à teoria da supersensibilidade dos receptores

dopaminérgicos pós-sinápticos (Tufik et al., 1987).

Contudo, em virtude de a apomorfina ser um agonista misto de receptores

, não foi possível determinar a partir daqueles experimentos quais os subtipos

de receptores dopaminérgicos estariam alterados após a PSP. Assim, Nunes e

colaboradores (1994), utilizando a análise autorradiográfica, demonstraram que a

PSP aumentou a ligação em receptor D

e não em D

, sugerindo que os receptores

sejam responsáveis pelas alterações previamente relatadas nos comportamentos

induzidos pela apomorfina após a PSP, conferindo maior evidência aos estudos

preliminares sobre os efeitos comportamentais dos estimulantes dopaminérgicos em

animais privados de sono paradoxal (Tufik et al., 1978; 1981; 1987). Posteriormente,

outros estudos corroboraram a hipótese de que a PSP induz supersensibilidade dos

receptores dopaminérgicos (Andersen e Tufik, 2002; 2005; Andersen et al., 2003;

2005a,b,c). Embora diversos estudos tenham abordado essa temática, ainda não

há consenso sobre os efeitos da PSP nas concentrações das monoaminas no

cérebro (Farooqui et al., 1996). Entretanto, Farooqui e colaboradores observaram

aumento na concentração de DA após a PSP.

Até o momento, mesmo após 50 anos de estudos sobre o sono REM, a

falta do conhecimento a respeito da geração, da manutenção e do significado

fisiológico do sono REM continua a ser um desafio para os pesquisadores (Mallick

et al., 2002).

Introdução

1.9 Privação de sono: alterações cardiovasculares

Estudos mostram que a PSP altera alguns parâmetros sangüíneos

associados ao risco cardiovascular. Em relação ao estresse oxidativo, apesar de a

PSP não modificar os níveis do produto de peroxidação lipídica (malondialdeído –

MDA) e de GSH

no plasma, ratos expostos à PSP por 4 dias pelo método da

plataforma única apresentaram aumento do status pró-oxidativo analisado por meio

do índice de MDA/GSH

(de Oliveira et al., 2002). Além disso, ratos expostos à

PSP por 4 dias apresentaram aumento na concentração de endotelinas, sugerindo

que a PSP pode contribuir para o desenvolvimento da hipertensão arterial e

aterosclerose por alterar os parâmetros sangüíneos relacionados às doenças

cardiovasculares (Palma et al., 2002). De fato, a PSP resulta em alterações

fisiológicas (Rechtschaffen e Bergmann, 2002) e cardiovasculares em ratos adultos

e idosos (Andersen et al., 2004a).

Nesses últimos anos, vários estudos têm atribuído a elevada concentração

de homocisteína plasmática ao risco de desenvolvimento e progressão de doenças

cardiovasculares. Entretanto, em ratos, a PSP reduziu os níveis plasmáticos de

homocisteína (de Oliveira et al., 2002; Andersen et al., 2004a). Nesse sentido,

Andersen e colaboradores (2004a) observaram em ratos jovens (3 meses de idade)

que a PSP reduziu as concentrações de triglicérides e de very low-density

lipoprotein (VLD-colesterol), aumentou os níveis de high-density lipoprotein (HDL-

colesterol) e de low-density lipoprotein (LDL-colesterol), sem alterar a viscosidade

sangüínea, o colesterol total, o folato e a vitamina B

. Por outro lado, em ratos

idosos (22-24 meses de idade), esse estudo mostrou que a PSP aumentou as

concentrações das frações de HDL e LDL-colesterol e da vitamina B

, reduziu a

viscosidade sangüínea, os triglicérides e o VLDL e não alterou os níveis de

homocisteína, folato e colesterol total.

Modelos experimentais são fundamentais na investigação científica e

apresentam duas funções básicas: a analítica (representar e explicar a natureza) e

a heurística (estimular a investigação e a criatividade) (para revisão, ver

Guimarães, 1993). A primeira pode ser testada observando-se a veracidade do

modelo, e a segunda, pela observação de sua utilidade (Lehmann, 1972). O uso

dos modelos animais é valioso porque oferece a oportunidade de distinguir os

Introdução

diferentes componentes associados a uma determinada condição patológica cuja

abordagem clínica é difícil ou inacessível (Guimarães, 1993). Entretanto, apesar da

possibilidade de experimentação animal, nem sempre os mesmos parâmetros

fisiológicos determinantes para a doença em humanos estão presentes ou

disponíveis para investigação em modelos animais. Um exemplo dessa condição é

a fragmentação de sono presente em humanos afetados por SAOS. Essa condição

está mais associada a prejuízos qualitativos que quantitativos do sono. Apesar

disso, os modelos atualmente disponíveis utilizam a privação do sono como a

condição mais semelhante ao observado em humanos (fragmentação do sono),

considerando a similaridade de vários eventos fisiológicos presentes e/ou influentes

para ambas as situações. Desta forma, os estudos envolvendo PSP podem auxiliar

o entendimento sobre sua contribuição nos efeitos deletérios observados nos

quadros de distúrbios respiratórios do sono.

Justificativa

2. JUSTIFICATIVA

A síndrome da apnéia obstrutiva do sono (SAOS) é caracterizada por

episódios recorrentes de obstrução das vias aéreas superiores e afeta

aproximadamente 5% da população, estando associada a comorbidades

cardiovasculares e cognitivas. Considerando que em estudos clínicos é difícil

dissociar os efeitos da fragmentação de sono e da hipóxia e, ainda, que em estudos

com modelos animais são determinados somente os efeitos isolados desses

fatores, foi proposta, neste estudo, a avaliação das alterações comportamentais,

cognitivas e cardiovasculares por meio de um novo modelo animal que associa a

hipóxia à privação de sono.

Objetivo

3. OBJETIVOS

Os objetivos deste estudo foram avaliar as alterações comportamentais,

cognitivas, neuroquímicas e os fatores bioquímicos sangüíneos envolvidos no risco

cardiovascular induzidos pela hipóxia intermitente e privação de sono paradoxal em

ratos.

3.1 Objetivos específicos

Os objetivos específicos estabelecidos foram os seguintes:

(1) Validar o protocolo de hipóxia intermitente em nosso laboratório;

(2) Verificar os efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de

sono paradoxal, durante 3 dias, na ansiedade e na concentração de

monoaminas no sistema nervoso central em ratos;

(3) Investigar os efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou restrição

de sono, durante 21 dias, na atividade motora, na aquisição e retenção

da memória, na concentração de monoaminas e na expressão da

enzima tirosina hidroxilase no sistema nervoso central em ratos;

(4) Avaliar os efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou

privação/restrição de sono paradoxal, durante 4 e 21 dias, nos fatores

bioquímicos associados ao risco cardiovascular em ratos;

(5) Investigar se as alterações bioquímicas associadas ao risco

cardiovascular induzidas pela privação de sono paradoxal poderiam ser

antecipadas pela exposição à hipóxia intermitente em ratos.

Material e Método

4. MATERIAL E MÉTODO

4.1 Animais

Foram utilizados 163 ratos Wistar Hannover (HanTac:WH; Taconic, EUA)

machos, de 3 meses de idade, provenientes do Centro de Desenvolvimento de

Modelos Experimentais para a Medicina e Biologia – CEDEME – e 45 ratos Wistar

machos, de 3 meses de idade, provenientes do Biotério do Departamento de

Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo (Experimento 3 somente na

exposição à HI e/ou PSP durante 4 dias). Os animais foram mantidos com

temperatura de (22 ± 1ºC) e com ciclo de claro-escuro de 12 horas (das 7 às 19h)

controlados. Água e comida foram fornecidas à vontade aos animais durante todo o

experimento. Os ratos utilizados neste estudo foram mantidos e tratados de acordo

com as normas de experimentação animal, citadas no livro Princípios Éticos e

Práticos do Uso de Animais de Experimentação (Andersen et al., 2004b). Todos os

procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da

Universidade Federal de São Paulo (processo nº 0490/04).

4.2 Hipóxia intermitente (HI)

Para a realização da HI, que consiste na variação da concentração de O

de 21% a 10% a cada 2 minutos, os animais foram alojados dentro de uma câmara

de acrílico (80 x 54 x 58 cm). O fluxo dos gases nitrogênio (N

)

e O

dentro da

câmara foi alterado por um sistema automático de análise de oxigênio (Oxycycler

modelo A44XOV, Biospherix, Redfield, NY, EUA). A abertura da válvula para a

saída dos gases foi controlada por um sistema acoplado ao computador (Software

Oxycycler, Biospherix, Redfield, NY, EUA) programado para ajustar

automaticamente qualquer desvio da concentração de O

. As concentrações de gás

carbônico (CO

) (<0,01%), de umidade (40 a 50%) e de temperatura (22 a 24ºC)

foram controladas durante todo o experimento.

Material e Método

Figura 5. Aparelho de Hipóxia (Oxycycler modelo A44XOV, Biospherix, Redfield,

NY, EUA). Foram controladas e mantidas as concentrações de CO

(<0,01%), umidade

(40 a 50%) e temperatura (22 a 24ºC).

Material e Método

Figura 6. Gráfico representativo das concentrações de O

. Controle da variação da

concentração de O

de 21% a 10% a cada 2 minutos, dentro da câmara de hipóxia.

4.3 Privação de sono paradoxal (PSP)

Os animais foram submetidos à PSP pelo método da plataforma única

que consiste em colocá-los sobre uma plataforma circular de 6,5 cm de diâmetro

e 8 cm de altura em um tanque (23 x 23 x 12 cm) com água. Na tentativa de

minimizar o estresse proveniente do isolamento social, foi elaborada uma gaiola

de alumínio com orifícios (16 x 16 x 16 mm) e, com ela, recobertas todas as

superfícies externas, permitindo a mútua observação dos animais, o que reduzia

o estresse gerado pelo isolamento.

A atonia muscular presente no sono paradoxal faz com que o animal

acorde ao encostar as narinas ou, ainda, o corpo inteiro na água. Durante todo o

período de PSP, a sala foi mantida em condições de temperatura constante (22 ±

1ºC) e sob um ciclo claro-escuro de 12 horas, iniciando-se a fase clara às 7h da

manhã. A água dos tanques foi trocada diariamente.

Material e Método

Figura 7. Tanque de privação de sono pelo método de plataforma única. O

tanque foi adaptado para melhor circulação dos gases dentro do aparelho de hipóxia

e maior interação entre os animais.

4.4 Restrição de sono (RS)

Os animais foram submetidos à RS pelo método da plataforma única

(descrito no item 4.3). Diariamente, os ratos foram alojados sobre uma

plataforma circular em tanque com água, durante 18 horas (das 16 às 10h do dia

seguinte). Às 10h os animais foram alojados (n=6) em gaiolas de polipropileno

(41 x 34 x 17,5 cm), onde permaneceram até as 16h, permitindo-se assim 6

horas de sono (das 10 às 16h) (Machado et al., 2005). Quando os animais foram

agrupados, manteve-se o cuidado de alojar dois grupos distintos em uma mesma

gaiola. Esse procedimento foi adotado para minimizar as diferenças entre os

grupos.

Material e Método

4.5 Delineamento experimental

4.5.1 Grupos experimentais

Nos experimentos de HI e/ou PSP por 3 ou 4 dias, os ratos foram

distribuídos em quatro grupos:

(1) Controle (CTRL)

(2) Hipóxia intermitente (HI)

(3) Privação de sono paradoxal (PSP)

(4) Hipóxia intermitente associada à privação de sono paradoxal (HI-PSP)

Figura 8. Delineamento experimental dos experimentos de HI e/ou PSP por 3 ou 4

dias. Os animais foram expostos à hipóxia durante a fase clara do ciclo (das 7 às 19h) e

durante a fase escura (das 19 às 7h), sendo mantidos com a concentração de O

igual a

21%. Os animais do grupo PSP foram submetidos à PSP pelo método da plataforma única

durante 3 ou 4 dias consecutivos. Os ratos do grupo HI-PSP foram alojados na câmara de

hipóxia e submetidos à HI concomitante à PSP. Os ratos do grupo CTRL e HI foram

mantidos isolados na sala de experimentação em um tanque com serragem, para

assemelharem-se às condições ambientais dos grupos PSP.

7-19h PSP

19-7h PSP

Período escuro

19-7h PSP

7-19h HI-PSP

7-19h HI 19-7h CTRL

19-7h CTRL

7-19h CTRL

3 ou 4 dias

Período claro

7-19h PSP

19-7h PSP

Período escuro

19-7h PSP

7-19h HI-PSP

7-19h HI 19-7h CTRL

19-7h CTRL

7-19h CTRL

3 ou 4 dias

Período claro

7-19h PSP

19-7h PSP

Período escuro

19-7h PSP

7-19h HI-PSP

7-19h HI 19-7h CTRL

19-7h CTRL

7-19h CTRL

3 ou 4 dias

Período claro

Material e Método

Nos experimentos de HI e/ou RS por 21 dias, os ratos foram distribuídos

em quatro grupos:

(1) Controle (CTRL)

(2) Hipóxia intermitente (HI)

(3) Restrição de sono (RS)

(4) Hipóxia intermitente associada à restrição de sono (HI-RS)

Figura 9. Delineamento experimental dos experimentos de HI e/ou RS por 21 dias.

Para a realização da hipóxia, os animais dos grupos HI e HI-RS foram alojados em gaiolas

com serragem e alocados na câmara de hipóxia das 10 às 16h, durante 21 dias

consecutivos. Diariamente, os animais dos grupos CTRL e HI foram alojados em gaiolas

individuais, e os ratos dos grupos RS e HI-RS foram transferidos para o tanque de PSP das

16 às 10h do dia seguinte. Os animais dos grupos CTRL e HI também foram alojados em

gaiolas individuais por 18 horas, com o objetivo de mimetizar as condições experimentais.

Período escuro

10-16h HI

21 dias

Período claro

7-10h

10-16h CTRL

19-7h CTRL

16-19h

19-7h CTRL

7-10h

16-19h

10-16h HI

7-10h

19-7h RS

16-19h

10-16h HI

7-10h

19-7h RS

10-16h CTRL

16-19h

Período escuro

10-16h HI

21 dias

Período claro

7-10h

10-16h CTRL

19-7h CTRL

16-19h

19-7h CTRL

7-10h

16-19h

7-10h

10-16h CTRL

19-7h CTRL

16-19h

19-7h CTRL

7-10h

16-19h

10-16h HI

7-10h

19-7h RS

16-19h

10-16h HI

7-10h

19-7h RS

16-19h

7-10h

19-7h RS

16-19h

10-16h HI

7-10h

19-7h RS

10-16h CTRL

16-19h

7-10h

19-7h RS

10-16h CTRL

16-19h

Material e Método

EXPERIMENTO 1:

EFEITOS COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICOS APÓS A EXPOSIÇÃO À

HIPÓXIA INTERMITENTE E PRIVAÇÃO DE SONO PARADOXAL EM RATOS

DURANTE 3 DIAS

Para a realização da HI, os animais foram alojados dentro da câmara de

hipóxia durante as 12 horas da fase clara do ciclo claro-escuro. Os animais do

grupo PSP foram mantidos na mesma sala de experimentação nos tanques de PSP

durante 3 dias consecutivos. Os ratos do grupo HI-PSP foram alojados na câmara

de hipóxia e submetidos à HI durante as 12 horas da fase clara do ciclo claro-

escuro, associada à PSP durante 24 horas consecutivas. Ao final dos 3 dias, os

animais foram sacrificados por decapitação, o sangue foi coletado para a dosagem

sérica de corticosterona, e o cérebro, removido para a dissecação do córtex,

estriado e hipocampo.

Figura 10. Delineamento experimental do experimento de HI e/ou PSP por 3

dias. Após 3 dias, os animais foram avaliados no labirinto em cruz elevado e

sacrificados para a coleta de tecido e sangue.

Habituação

PSP

Avaliação

comportamental/

coleta dos

tecidos e de

san

HI e/ou PSP

3 dias

Material e Método

EXPERIMENTO 2:

ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS, COGNITIVAS E NEUROQUÍMICAS

INDUZIDAS PELA HIPÓXIA INTERMITENTE E RESTRIÇÃO DE SONO EM

RATOS DURANTE 21 DIAS

A atividade geral dos animais foi avaliada por meio da caixa de atividade

três dias antes do início do experimento (basal) e 4, 7, 14 e 21 dias após a

exposição à HI e/ou RS. Depois da avaliação comportamental, os animais

(n=9/grupo) foram decapitados, o sangue foi coletado para dosagem sérica de

corticosterona, e seus cérebros foram removidos para a dissecação do córtex pré-

frontal e estriado para a quantificação de monoaminas. Os experimentos foram

conduzidos, utilizando-se 9 ratos por grupo.

Para a avaliação cognitiva, diferentes grupos de ratos (n=12/grupo) foram

submetidos à sessão de treino da tarefa de esquiva inibitória após 4 e 20 dias de

exposição à HI e/ou RS e, depois de 24 horas, realizou-se a sessão de teste.

Somente nessa tarefa um grupo de ratos foi submetido à PSP durante 4 dias

consecutivos. Após 21 dias, os ratos (n=3/grupo) submetidos à tarefa de esquiva

inibitória foram decapitados, e seus cérebros removidos para a dissecação da

substância negra e do estriado para quantificação da expressão da enzima tirosina

hidroxilase.

Figura 11. Delineamento experimental do experimento de HI e/ou RS por 21

dias. Avaliação temporal da atividade motora e da função cognitiva. Após 21 dias,

os animais foram sacrificados para a coleta de tecido e sangue.

Motor/

Treino

esquiva

inibitória

Motor/

Teste

esquiva

inibitória /

coleta de

tecido e de

sangue

Motor

HI e/ou RS

Motor

basal

Treino

esquiva

inibitória

Teste

esquiva

inibitória

Material e Método

EXPERIMENTO 3:

AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS SANGÜÍNEOS ASSOCIADOS

AO RISCO CARDIOVASCULAR EM RATOS SUBMETIDOS À HIPÓXIA

INTERMITENTE E PRIVAÇÃO DE SONO PARADOXAL DURANTE 4 E 21 DIAS

Para realizar a avaliação do valor de pH e da concentração dos gases O

arterial, foram coletadas amostras basais após 1, 5, 10 e 20 ciclos de HI (10%

a 21% de O

a cada 2 minutos). Os experimentos foram conduzidos, utilizando-se 5

ratos.

Para a realização da HI, os animais foram alojados dentro da câmara de

hipóxia durante as 12 horas da fase clara do ciclo claro-escuro. Os animais do

grupo PSP foram mantidos na mesma sala de experimentação, nos tanques de

PSP, durante quatro dias consecutivos. Os ratos do grupo HI-PSP foram alojados

na câmara de hipóxia e submetidos à HI durante as 12 horas da fase clara do ciclo

claro-escuro, associada à PSP durante 24 horas consecutivas. Ao final dos 4 dias

de HI e/ou PSP, os animais foram sacrificados por decapitação e o sangue foi

coletado. Os experimentos foram conduzidos, utilizando-se 10 ratos por grupo.

Para observar os efeitos da exposição crônica, os animais foram

submetidos à HI das 10 às 16h, durante 21 dias consecutivos. Diariamente, os

animais dos grupos HI e CTRL foram alojados em gaiolas individuais, e os ratos

dos grupos RS e HI-RS foram transferidos para o tanque de privação de sono das

16 às 10h do dia seguinte. Ao final dos 21 dias de HI e/ou RS, os animais foram

sacrificados por decapitação e o sangue foi coletado. Os experimentos foram

conduzidos, utilizando-se 9 ratos por grupo.

Material e Método

Figura 12. Delineamento experimental dos experimentos de HI e/ou PSP por 4

dias e de HI e/ou RS por 21 dias. Após 4 e 21 dias, os animais foram sacrificados

para a coleta de sangue.

Habituação

PSP

Coleta de

sangue

HI e/ou PSP

Coleta de

sangue

HI e/ou RS

3 dias

Habituação

3 dias

Material e Método

EXPERIMENTO 4:

AVALIAÇÃO DOS PARAMÊTROS BIOQUÍMICOS SANGÜÍNEOS ASSOCIADOS

AO RISCO CARDIOVASCULAR EM RATOS SUBMETIDOS À HIPÓXIA

INTERMITENTE E PRIVAÇÃO DE SONO DURANTE 3 DIAS

No experimento agudo, os animais foram expostos à HI durante a fase

clara do ciclo (das 7 às 19h) e durante a fase escura (das 19 às 7h), sendo

mantidos na câmara de hipóxia com a concentração de O

igual a 21% durante 3

dias. Os animais do grupo PSP foram submetidos à privação de sono pelo método

da plataforma única, durante 3 dias consecutivos. Os ratos do grupo HI-PSP foram

alojados na câmara de hipóxia e submetidos à HI concomitante à PSP.

Figura 13. Delineamento experimental dos experimentos de HI e/ou PSP por 3

dias. Após 3 dias, os animais foram sacrificados para a coleta de sangue.

Coleta de

sangue

Habituação

PSP

HI e/ou PSP

3 dias

Material e Método

4.6 Análise do valor de pH e gases arteriais

4.6.1 Quantificação do valor de pH e da concentração dos gases O

e CO

arterial

Para a realização dos ensaios de avaliação do valor de pH e da

concentração dos gases O

e CO

arterial no modelo de HI, utilizaram-se cinco

ratos, os quais foram anestesiados com halotano e canulados por meio de um tubo

de polietileno PE-10 na artéria femoral. Essa cânula foi conectada a um tubo de

polietileno PE-50, que foi inserido na camada subcutânea do animal e conectado,

na região dorsal, a uma cânula metálica. A cânula de polietileno foi preenchida com

NaCl a 0,9%, contendo heparina (50 U/mL) e penicilina G procaína (2000 U/mL). A

cirurgia e a cânula não alteraram as funções das patas posteriores dos ratos. Após

12 dias de recuperação da cirurgia, amostras de sangue (150 μL) foram coletadas

em capilares contendo heparina. As amostras basais (21% de O

) e após 1, 5, 10 e

20 ciclos de HI (2 minutos de 10% a 21% de O

) foram coletadas e imediatamente

analisadas por meio de um Blood Gas Analyzer (Instrumentation Laboratory 16/20,

Itália).

4.7 Análise dos fatores bioquímicos associados ao risco cardiovascular

4.7.1 Coleta das amostras

Para a avaliação dos parâmetros sangüíneos relacionados ao risco

cardiovascular, os animais foram decapitados no período das 9 às 11h. As

amostras para a dosagem de homocisteína e cisteína foram coletadas utilizando-se

tubos com anticoagulante (EDTA) e centrifugadas a 1.814 x g a 4ºC por 8 minutos.

Para a determinação da concentração de triglicérides, colesterol total e frações, das

vitaminas folato, B

e B

, as amostras foram coletadas em tubos secos, sem

anticoagulante, e centrifugadas a 2.469 x g a 20ºC por 20 minutos, em temperatura

ambiente. As amostras de plasma e soro foram armazenadas a -80°C para análise

posterior.

Material e Método

4.7.2 Quantificação da concentração de homocisteína e cisteína

A análise dos níveis das concentrações de homocisteína e cisteína totais

plasmáticas foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC – High

performance liquid chromatography), detector fluorimétrico e sistema isocrático,

como descrito por Pfeiffer e colaboradores (1999).

Para realizar a análise quantitativa, construiu-se uma curva de calibração a

partir de cinco soluções de homocisteína em concentrações crescentes de 3,125 μ

M, 6,25 μM, 12,5μM, 25,0μM e 50,0μM, uma curva de calibração a partir de cinco

soluções de cisteína em concentrações crescentes de 50 μM, 100 μM, 200 μM, 400

μM e 800 μM e de um padrão interno de cistamina com concentração constante de

10μM. Por interpolação, o programa de análise de dados do sistema de HPLC dá à

equação correspondente a quantificação dos níveis das concentrações de

homocisteína e cisteína plasmáticas nos ensaios.

Utilizou-se o HPLC (Shimadzu, Japão) composto por um injetor automático

de amostras SIL-10Advp, um detector de fluorescência RF-10AXL, uma coluna

analítica da marca Phenomenex C18 (modelo Prodigy ODS2, 150mm x 3,2mm e

micropartículas de 5,0μm) e uma pré-coluna C18 (modelo Alltech ODS, 30mm x

3,2mm e micropartículas de 5,0μm). Na coluna ocorreram as separações dos

compostos, enquanto a detecção da fluorescência se realizou com detector

ajustado para excitação a 385ηm e emissão a 515ηm. A análise cromatográfica foi

realizada com uma fase móvel composta de tampão ácido acético/acetato 0,1M (pH

5,5) com 30mL/L de metanol grau cromatográfico em um fluxo de 0,7mL/min.

4.7.3 Quantificação da concentração de triglicérides, colesterol total e frações

As concentrações de triglicérides, colesterol total e HDL colesterol foram

analisadas a partir do ensaio enzimático colorimétrico automatizado ADVIA 16/50®

(BAYER Diagnostics Corporation, Alemanha). Para a determinação da

concentração de LDL-colesterol foi empregada a fórmula de Friedewald: [LDL =

colesterol total - (HDL + triglicérides/5)]. Para o cálculo dos níveis de VLDL-

Material e Método

colesterol utilizou-se a fórmula: [VLDL = triglicérides/5]. Os resultados foram

expressos em mg/dL de sangue.

4.7.4 Quantificação da vitamina B

e folato

A dosagem da vitamina B

e a de folato foi baseada no método de Sharma

e Dakshinamurti (1992) para a aplicação em HPLC com detecção ultravioleta (UV)

e eluição isocrática. Para essa metodologia, utilizou-se um padrão de vitamina B

(piridoxal-5-fosfato – Sigma) e um de ácido fólico (Sigma), ambos com

concentração de 1 mg/dL (diluídos em H

O milliQ).

As amostras foram submetidas ao processo de extração com ácido

metafosfórico (Merck) a 10%, em uma proporção de 3:1, agitadas por 30 segundos

e depois centrifugadas em 1.232 x g por 20 minutos. Para a análise no HPLC, o

sobrenadante de cada amostra preparada foi transferido para tubos e colocado

para leitura. Todas as etapas da extração foram realizadas em microtubo escuro

para minimizar a degradação das vitaminas, que são fotossensíveis.

Utilizou-se o HPLC (Shimadzu, Japão) composto por um injetor automático

de amostras SIL-10Advp, um detector de UV SPD-10A vp, uma coluna analítica da

marca Phenomenex (modelo Bondclone C18, 300 x 3,9mm e micropartículas de 10

μm) e uma pré-coluna C18 (modelo Alltech ODS, 30 x 3,2mm e micropartículas de

5,0μm). Na coluna obtiveram-se as separações dos compostos detectadas por UV

ajustada para comprimento de onda de 290ηm. A análise cromatográfica foi

realizada com uma fase móvel composta de 18% de acetonitrila, 2% de ácido

metafosfórico a 5% em água milliQ, em um fluxo de 1mL/min. O tempo de retenção

foi de 2,93 minutos para a vitamina B

e 4,09 minutos para o folato. A concentração

sérica das vitaminas foi calculada em relação aos padrões de vitamina B

e folato.

Material e Método

4.7.5 Quantificação da vitamina B

Para a medida da vitamina B

, utilizou-se o sistema automático de

quimiluminescência ACS:180® (BAYER Diagnostics Corporation, Alemanha). Os

resultados foram expressos em pg/mL de sangue.

4.8 Análise da concentração sérica de corticosterona

4.8.1 Coleta de sangue para a obtenção de soro

Todos os animais dos grupos experimentais e controles foram submetidos à

coleta de sangue por decapitação. O sangue, imediatamente coletado em tubo seco,

sem anticoagulante, foi centrifugado a 2.469 x g a 20ºC por 20 minutos em

temperatura ambiente para a obtenção do soro, o qual foi armazenado em

eppendorfs de polietileno em freezer -80°C até o momento da realização das

dosagens. Todos os animais foram decapitados, de forma intercalada, entre 9 e 11h.

4.8.2 Quantificação de corticosterona sérica

A técnica de radioimunoensaio foi utilizada para determinar os níveis séricos

de corticosterona (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, EUA) específicos para ratos e

camundongos. Os valores obtidos foram expressos em ng/mL.

4.9 Avaliação comportamental

4.9.1 Caixa de atividade

A caixa de atividade (Insight, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil) consiste em

uma câmara de acrílico transparente (41 x 41 x 41 cm) com seis barras de

sensores. Tais sensores detectam o movimento do animal por meio do programa

Monitor de Atividades®, acoplado a um computador. A posição relativa do animal

foi calculada pela média aritmética dos sensores acionados nos eixos x e y.

Material e Método

Os animais foram colocados individualmente no centro da caixa de

atividade, e seu comportamento foi avaliado por 5 minutos. Durante a observação

foram registrados a distância percorrida (cm), a velocidade média (cm/s), a

freqüência de levantar (apoio somente nas patas posteriores, com o tronco

perpendicular ao chão da caixa de atividade), a duração de imobilidade (sem

nenhuma atividade motora, permanecendo estático em relação à cabeça, tronco e

patas), a duração de limpeza da pelagem, genitália e focinho (grooming) e os bolos

fecais. Foram utilizados cronômetros para o controle do tempo de duração de

imobilidade e limpeza. A caixa de atividade foi limpa com solução de etanol a 5%

após a observação de cada animal. Os ratos foram expostos à caixa de atividade

das 8 às 9h30min.

Figura 14. Caixa de atividade (Insight, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil). Avalia a

atividade motora do animal por meio de sensores que detectam o seu movimento pelo

programa acoplado a um computador (Monitor de Atividades®).

Material e Método

4.9.2 Labirinto em cruz elevado

O labirinto em cruz elevado foi proposto por Pellow (1985) para avaliar o

estado de ansiedade do animal. Consiste em dois braços opostos fechados e dois

opostos abertos, apresentando 38 cm de altura do chão. Os animais foram

colocados individualmente no centro do labirinto em cruz elevado, e seu

comportamento foi avaliado durante 5 minutos. Durante a observação, foi anotado o

número de entradas do animal nos braços abertos e fechados, a porcentagem do

tempo de permanência nesses braços, bem como o tempo de permanência no

centro do labirinto. O equipamento foi limpo com solução de etanol a 5% após a

observação de cada animal. Os ratos foram expostos ao labirinto em cruz elevado

em uma única sessão, no período das 8 às 9h30min.

Figura 15. Labirinto em cruz elevado. Aparelho proposto por Pellow, em 1985, para

avaliar o estado de ansiedade do animal.

Material e Método

4.9.3 Tarefa da esquiva inibitória

Após 20 dias de exposição à HI e/ou PSP, os animais foram submetidos à

sessão de treino da esquiva inibitória. A caixa de esquiva é dividida em dois

compartimentos iguais, os quais foram separados por uma porta-guilhotina. Na

sessão de treino, os animais foram alojados individualmente no compartimento

escuro da caixa de condicionamento e, após um período de habituação de 10

segundos, a porta-guilhotina foi aberta automaticamente. Ao atravessar o

compartimento, o animal recebeu um choque nas patas de 0,8 mA com duração de

1 segundo. Na sessão de teste, realizada 24 horas após a sessão de treino, os

animais foram submetidos ao mesmo procedimento; entretanto, não receberam o

choque nas patas. O tempo de latência da passagem para o compartimento escuro

foi registrado automaticamente nas sessões de treino e teste.

Figura 16. Aparelho de esquiva inibitória. Teste utilizado para avaliação da aquisição

e retenção da memória em roedores.

Material e Método

4.10 Avaliação neuroquímica

4.10.1 Determinação do conteúdo de monoaminas no encéfalo de ratos

Para a determinação da concentração de monoaminas, os animais foram

decapitados e seus encéfalos foram removidos para a dissecação do córtex frontal,

estriado e hipocampo. Todos os procedimentos de dissecação foram conduzidos

rapidamente em uma superfície contendo gelo seco. Foram anotadas as massas

dos tecidos a fresco, e esses foram armazenados a -80°C para análise posterior.

Os níveis endógenos de monoaminas foram analisados por cromatografia

de fase reversa com detecção eletroquímica e eluição isocrática, como descrito por

Naffah-Mazzacoratti e colaboradores (1992). Para tanto, utilizou-se o HPLC

(Shimadzu, Japão) composto por uma bomba modelo LC-10Advp (Shimadzu,

Japão), um detector eletroquímico L-ECD-6 A (0,5 V, Shimadzu, Japão) e um

injetor Rheodyne com loop de 100μL. Acoplado ao sistema, foi utilizada uma coluna

de fase reversa C18, 5μM (4,6 mm x 250 mm, Brownlee, Applied Biosystems,

Estados Unidos), com pré-coluna RP18, 7μM (15 x 3,2mm, Brownlee, Applied

Biosystems, Estados Unidos). A análise cromatográfica foi realizada com uma fase

móvel composta por fosfato de sódio dibásico 20mM, ácido cítrico 20mM, metanol a

10%, Na

EDTA 0,12 mM, ácido heptanessulfônico 566 ng/mL e pH 2,64, em um

fluxo de 0,8mL/min. As amostras foram homogeneizadas em 300 µl de ácido

perclórico (0,1 M) e centrifugadas 12.000 x g por 10 minutos. A quantificação das

monoaminas foi realizada pela comparação das áreas sob a curva das amostras,

dos padrões do precursor das catecolaminas L-3,4 - diidroxifenilalanina (L-DOPA),

da adrenalina, da noradrenalina (NA), da dopamina (DA) e dos seus metabólicos –

o ácido 3,4 -diidroxifenilacético (DOPAC) e o ácido homovanílico (HVA), da

serotonina (5-HT) e seu metabólico – o ácido 5 - hidroxindolacético (5-HIAA), além

do padrão interno diidroxibenzilamina (DHBA). Os valores obtidos foram expressos

em ng/g de tecido úmido.

Material e Método

4.11 Avaliação da expressão da tirosina hidroxilase

4.11.1 Extração de proteínas

Após a decapitação, os encéfalos foram dissecados rapidamente para a

retirada bilateral da substância negra e estriado. Essas estruturas foram

imediatamente congeladas em nitrogênio líquido, evitando-se assim a degradação

de seus conteúdos protéicos. Posteriormente, os tecidos isolados foram

homogeneizados por sonicação, em tampão de lise refrigerado (pH 7,4), contendo

50 mM de Tris-HCl, 120 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de dodecil sulfato de

sódio (sodium dodecyl sulfate – SDS), 0,25% de deoxicolato de sódio, 0,25% de

ditiotreitol (dithiothreitol – DTT), 20 μM de fluoreto de fenilmetilsulfonila

(phenylmethylsulfonyl fluoride – PMSF) e tablete completo de inibidor de proteases

(Roche, Alemanha). O extrato foi então centrifugado a 10.000 x g, 4°C por

40 minutos. O sobrenadante correspondeu ao extrato protéico total, o qual foi

congelado a -80°C em alíquotas, para posterior dosagem de proteínas totais.

4.11.2. Dosagem de proteínas

A concentração de proteínas totais no extrato foi determinada pelo método

de Lowry (Lowry et al., 1951). A dosagem de proteínas foi realizada após lise do

tecido. Uma solução de soro albumina bovina (1 mg/mL) foi utilizada como padrão.

4.11.3 Western blotting

Para o experimento de imunodetecção (Western blotting), foi utilizada

metodologia-padrão, conforme descrito por Sambrook e Gething (1989).

Resumidamente, as amostras de 5 μg de proteína foram aplicadas em gel de

poliacrilamida-SDS a 10%. Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para

a membrana de fluoreto de polivinilidina (polyvinylidene fluoride - PVDF), as quais

foram reagidas por 16 horas com anticorpo específico contra tirosina hidroxilase

(1:1000, Sigma, EUA) e β-tubulina III (1:5.000, Amesham, EUA). Em seguida, por

Material e Método

uma hora, com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase (anti-mouse IgG

HRP 1:5.000, Pharmigen, EUA). A visualização foi realizada com o sistema de

quimioluminescência (ECL, Santa Cruz Biotechnology, EUA) e filmes Kodak T-Mat.

As bandas obtidas foram analisadas por densitometria óptica, com o auxílio do

software Image J, domínio público (http://rsb.info.nih.gov.ij/).

Análise Estatística

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os testes de Bartlett e Kolmogorov-Smirnov foram empregados para avaliar

a homocedasticidade das variâncias e distribuição normal dos dados,

respectivamente. Na ausência de homocedasticidade (Bartlett) e distribuição

normal (Kolmogorov-Smirnov), os dados foram transformados utilizando-se raiz

quadrada e representados pela média ± desvio-padrão (DP). O nível de

significância considerado foi p<0,05. O programa STATISTICA 6.0 foi empregado

para efetuar as análises.

As concentrações de O

e CO

arteriais e o valor de pH foram analisados

por meio da análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas, seguida do

teste post hoc de Newman-Keuls quando apropriado.

Todos os parâmetros avaliados na caixa de atividade e o número de

entradas nos braços fechados foram analisados por meio da ANOVA de uma via,

seguida do teste post hoc de Tukey quando apropriado. A porcentagem do tempo

de permanência e a do número de entradas nos braços abertos e nos braços

fechados foi analisada pelo teste não-paramétrico da ANOVA de Kruskall-Wallis,

seguido do teste U de Mann-Whitney quando apropriado. Os dados da esquiva

passiva dos grupos CTRL e PSP, durante 4 dias consecutivos, foram analisados

pelo teste t-Student para amostras independentes. Os dados dos outros grupos

foram analisados por meio da ANOVA de uma via, seguida do teste post hoc de

Tukey quando apropriado.

Os dados da concentração sérica de corticosterona das dosagens

neuroquímicas e de western blotting foram analisados por meio da ANOVA de uma

via, seguida do teste post hoc de Tukey quando apropriado.

Os resultados dos fatores bioquímicos sangüíneos associados ao risco

cardiovascular foram avaliados por meio da análise de co-variância (ANCOVA),

seguida do teste post hoc de Tukey quando apropriado.

Resultados

6. RESULTADOS

6.1 Avaliação do pH, da concentração dos gases pO

e pCO

arteriais após

exposição à hipóxia intermitente

Ao final do primeiro ciclo de hipóxia, foi observado aumento do pH arterial

em comparação à amostra basal [F

(4,16)

= 31,3; p<0,001]. Esse aumento no pH

manteve-se após 5, 10 e 20 ciclos de HI. Em relação à concentração dos gases

e pCO

arteriais, verificou-se redução desses dois parâmetros nos animais

após 1, 5, 10 e 20 ciclos de HI, em comparação à concentração basal [F

(4,16)

123,9; p<0,001 e F

(4,16)

= 11,9; p<0,001, respectivamente].

Tabela 2: Quantificação do valor de pH e da concentração dos gases pO

e pCO

arteriais após 1, 5, 10 e 20 ciclos de hipóxia intermitente.

Basal 1 ciclo 5 ciclos 10 ciclos 20 ciclos

7,46 ± 0,02 7,58 ± 0,02** 7,58 ± 0,01** 7,59 ± 0,02** 7,61 ± 0,01**

92,8 ± 3,96 43,4 ± 4,33** 44,0 ± 3,74** 44,4 ± 4,50** 41,6 ± 5,81**

pCO

36,3 ± 4,78 28,2 ± 3,17* 28,8 ± 3,58* 28,8 ± 3,77* 25,1 ± 1,98**

Os valores estão representados pelas médias ± DP, pO

e pCO

em mmHg, ANOVA para

medidas repetidas, seguida do teste post hoc de Newman-Keuls. *p<0,01 e **p<0,001,

quando comparados aos parâmetros basais.

Resultados

6.2 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal na ansiedade em ratos submetidos ao labirinto em cruz elevado

A Figura 17 ilustra a porcentagem do número de entradas, nos braços

abertos e fechados, dos ratos avaliados durante 5 minutos no labirinto em cruz

elevado. Em relação ao número de entradas nos braços abertos e fechados, não se

observou diferença estatisticamente significativa entre os grupos [H

(3,36)

= 1,53;

p=0,67].

Figura 17. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP no número de entradas nos braços

abertos e fechados (%) em ratos submetidos ao labirinto em cruz elevado.

Os valores

estão representados pelas médias ± DP. ANOVA de Kruskal-Wallis.

100

CTRL

PSP

HI-PSP

Entradas nos braços abertos (%)

100

Entradas nos braços fechados (%)

Resultados

A Figura 18 ilustra a porcentagem do tempo total de permanência, nos

braços abertos, dos ratos avaliados no labirinto em cruz elevado. O teste não-

paramétrico, ANOVA de Kruskal-Wallis, mostrou que não houve diferença

estatística significativa no tempo de permanência nos braços abertos e fechados

(3,36)

= 4,84; p=0,18].

Figura 18. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP no tempo de permanência nos braços

abertos e fechados (%) em ratos submetidos ao labirinto em cruz elevado.

Os valores

estão representados pelas médias ± DP. ANOVA de Kruskal-Wallis.

100

CTRL

PSP

HI-PSP

Tempo nos braços abertos (%)

100

Tempo nos braços fechados (%)

Resultados

Em relação ao número de entradas nos braços fechados, a ANOVA de uma

via mostrou diferença estatisticamente significativa entre os grupos (F

(3,32)

= 5,75;

p<0,003). A análise a posteriori mostrou que os ratos do grupo PSP apresentaram

aumento desse parâmetro em comparação aos animais dos grupos CTRL e HI.

Entretanto, essa diferença não foi observada nos ratos do grupo HI-PSP.

Figura 19. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP no número de entradas nos braços

fechados em ratos submetidos ao labirinto em cruz elevado.

Os valores estão

representados pelas médias ± DP. ANOVA de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. *

p<0,05 quando comparado ao grupo CTRL; # p<0,05 quando comparado ao grupo HI.

CTRL

PSP

HI-PSP

Número de entradas nos braços fechados

Resultados

6.3 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal na concentração sérica de corticosterona em ratos

Os valores de corticosterona estão representados na Figura 20. A ANOVA

de uma via revelou diferença estatisticamente significativa entre os grupos [F

(3,30)

6,24; p<0,01]. Os ratos expostos à PSP apresentaram aumento na concentração

de corticosterona quando comparados aos animais dos grupos CTRL (p<0,05).

Nos ratos do grupo HI-PSP, a concentração de corticosterona foi maior quando

comparada aos ratos dos grupos CTRL (p<0,01) e HI (p<0,02).

Figura 20. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP na concentração sérica de

corticosterona (ng/mL) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANOVA

de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. * p<0,05 quando comparado ao grupo CTRL; #

p<0,05 quando comparado ao grupo HI.

100

200

300

400

CTRL

PSP

HI-PSP

Corticosterona (ng/mL)

Resultados

6.4 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal na concentração de monoaminas no córtex frontal, estriado e

hipocampo

A Tabela 3 ilustra os efeitos da HI e PSP na concentração de monoaminas

no córtex frontal, estriado e hipocampo. A ANOVA de uma via, seguida do teste

post hoc de Tukey mostrou que os ratos do grupo PSP apresentaram aumento

estatisticamente significativo na concentração de adrenalina estriatal em

comparação aos ratos dos grupos CTRL e HI [F

(3,32)

= 6,39; p<0,002]. Essa

alteração não foi observada no grupo HI-PS. Os ratos dos grupos PSP e HI-PSP

apresentaram aumento estatisticamente significativo na concentração do HVA no

hipocampo em comparação aos ratos do grupo CTRL [F

(3,29)

= 4,04; p<0,02]. Não

houve diferença estatisticamente significativa nas demais monoaminas analisadas

das amostras do córtex frontal, estriado e hipocampo.

Resultados

Tabela 3: Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal na concentração de monoaminas no córtex frontal, estriado e

hipocampo.

CTRL HI PSP HI-PSP

Córtex frontal

L-DOPA 108,0 ± 61,1 158,5 ± 93,5 92,3 ± 50,4 108,9 ± 67,8

Adrenalina 22,3 ± 14,1 18,5 ± 3,8 25,3 ± 15,4 20,0 ± 14,3

NA 1500,6 ± 559,3 1682,0 ± 545,9 1449,1 ± 446,4 1454,3 ± 493,4

DA 11,4 ± 14,0 11,2 ± 6,3 7,8 ± 4,2 6,2 ± 4,5

DOPAC 65,3 ± 79,8 76,5 ± 66,1 83,6 ± 45,3 71,4 ± 40,1

HVA 88,5 ± 27,1 75,3 ± 17,0 86,1 ± 27,1 89,0 ± 18,3

5-HT 49,2 ± 28,0 73,2 ± 31,1 68,9 ± 38,8 44,5 ± 44,5

5-HIAA 34,2 ± 38,1 44,9 ± 53,2 22,9 ± 16,0 36,0 ± 57,8

Estriado

L-DOPA 190,0 ± 84,6 237,0 ± 220,9 175,6 ± 84,6 158,7 ± 92,3

Adrenalina 79,3 ± 20,5 66,8 ± 15,3 131,4 ± 49,0*# 102,9 ± 36,3

NA 1192,6 ± 341,1 1160,4 ± 328,0 1238,8 ± 321 1320,7 ± 464,1

DA 12127,2 ± 4468,0 13919,8 ± 4780,0 14687,2 ± 2060,0 15385,0 ± 2327,0

DOPAC 3087,9 ± 762,8 3564,9 ± 681,6 3565,8 ± 877,8 3529,6 ± 1107,0

HVA 635,8 ± 157,4 591,2 ± 295,2 840,0 ± 247,9 827,5 ± 237,2

5-HT 973,7 ± 332,2 862,0 ± 312,8 981,1 ± 316,6 985,1 ± 316,2

5-HIAA 985,5 ± 313,6 1104,2 ± 300,8 1249,5 ± 303,4 1195,1 ± 447,3

Hipocampo

L-DOPA 107,4 ± 71,0 143,4 ± 64,0 159,9 ± 84,2 157,2 ± 72,6

Adrenalina 49,0 ± 32,4 47,6 ± 17,6 70,3 ± 33,6 74,4 ± 51,3

NA 618,5 ± 190,3 670,6 ± 170,8 579,3 ± 234,1 658,4 ± 184,6

DA 68,9 ± 44,9 51,6 ± 34,8 70,2 ± 35,1 88,6 ± 59,0

DOPAC 116,7 ± 50,4 108,8 ± 50,7 135,8 ± 105,8 115,1 ± 35,7

HVA 681,2 ± 129,8 875,7 ± 124,1 1014,8 ± 320,6 * 1030,4 ± 306,2 *

5-HT 273,9 ± 111,8 432,5 ± 312,5 286,0± 180,4 328,1 ± 239,5

5-HIAA 115,0 ± 126,6 165,2 ± 135,3 92,0 ± 48,5 120,3 ± 74,0

Os valores estão representados pelas médias ± DP em ng/g de tecido úmido. ANOVA, seguida do

teste post hoc de Tukey. *p<0,05 quando comparado ao grupo CTRL; # p<0,05 quando comparado

ao grupo HI. Definição das abreviaturas: L-3,4-diidroxifenilalanina= L-DOPA, noradrenalina= NA,

dopamina= DA, ácido 3,4-diidroxifenilacético= DOPAC, ácido homovanílico= HVA, serotonina= 5-HT

e ácido 5-hidroxindolacético= 5-HIAA.

Resultados – Artigo Publicado I

Resultados

6.5 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou restrição de sono (basal,

4, 7, 14 e 21 dias) na atividade geral em ratos submetidos à caixa de atividade

As Figuras 21, 22, 23, 24 e 25 ilustram a atividade geral dos ratos avaliados

na caixa de atividade. A ANOVA de uma via mostrou que não houve diferença

estatística entre os grupos na avaliação basal nos seguintes parâmetros: distância

percorrida [F

(3,32)

=2,61; p=0,07], velocidade [F

(3,32)

=2,53; p=0,07], freqüência de

levantar [F

(3,32)

=0,47; p=0,70], duração de imobilidade (a estatística não pôde ser

concluída porque os valores obtidos nessa análise foram iguais a 0), grooming

(3,32)

=0,88; p=0,46].

Resultados

Em relação à distância percorrida (Fig. 21), a ANOVA de medidas repetidas

mostrou que houve diferença estatística nos grupos [F

(3,32)

=11,05; p<0,001] entre os

dias de avaliação [F

(4,128)

=2,62; p<0,04] e interação entre os fatores grupo e tempo

(12,128)

=2,69; p<0,003). O teste post hoc de Tukey mostrou que os ratos dos

grupos RS e HI-RS apresentaram aumento estatisticamente significativo na

distância percorrida em comparação aos grupos CTRL e HI. No entanto, no 21º dia,

os animais CTRL percorreram menor distância (21 dias) em comparação à medida

basal.

Figura 21. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) na distância

(cm) de ratos submetidos à caixa de atividade.

Os valores estão representados pelas

médias ± DP. ANOVA, seguida do teste post hoc de Tukey. *p<0,05 quando comparado ao grupo

CTRL; #p<0,05 quando comparado ao grupo HI; §p<0,05 quando comparado à avaliação basal;

1000

2000

3000

4000

5000

6000

4 dias 7 dias 14 dias

basal

21 dias

CTRL

HI-RS

Distância (cm)

Resultados

Na avaliação da velocidade (Fig. 22), a ANOVA de medidas repetidas

mostrou que houve diferença estatística entre os grupos [F

(3,32)

=11,21; p<0,001];

entretanto, não ocorreu diferença estatística significativa na variável tempo de

exposição [F

(4,128)

=2,07; p=0,09]. O teste post hoc de Tukey mostrou que os ratos

dos grupos RS e HI-RS apresentaram aumento estatisticamente significativo tanto

na distância percorrida como na velocidade de locomoção em comparação aos

grupos CTRL e HI.

Figura 22. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) na velocidade

(cm/s) de ratos submetidos à caixa de atividade.

Os valores estão representados pelas

médias ± DP. ANOVA, seguida do teste post hoc de Tukey. *p<0,05 quando comparado ao grupo

CTRL; #p<0,05 quando comparado ao grupo HI.

4 dias 7 dias 14 dias

basal

21 dias

CTRL

HI-RS

Velocidade (cm/s)

Resultados

Após quatro dias de exposição à HI e/ou RS, os ratos apresentaram

aumento no número de levantar quando comparados aos animais dos grupos CTRL

e HI. O mesmo comportamento também foi observado após 7, 14 e 21 dias. Após

exposições sucessivas dos animais à caixa de atividade, os ratos CTRL (14 e 21

dias) e HI (21 dias) diminuíram o número de levantar, enquanto ocorreu aumento

desse parâmetro em comparação à média basal no grupo HI-RS (grupo

(3,32)

=17,26; p<0,001], tempo [F

(4,128)

=2,88; p<0,02] e interação [F

(12,128)

=5,25;

p<0,001]).

Figura 23. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) no número de

levantar de ratos submetidos à caixa de atividade.

Os valores estão representados pelas

médias ± DP. ANOVA, seguida do teste post hoc de Tukey. *p<0,05 quando comparado ao grupo

CTRL; #p<0,05 quando comparado ao grupo HI; §p<0,05 quando comparado à avaliação basal.

100

4 dias 7 dias 14 diasbasal

21 dias

CTRL

HI-RS

Número de levantar

Resultados

Os ratos dos grupos RS e HI-RS apresentaram redução estatisticamente

significativa no tempo de imobilidade, após 14 dias de exposição [F

(3,32)

=4,04;

p<0,01]. Não foram observadas alterações estatisticamente significativas nos outros

dias de avaliação.

Figura 24. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) no tempo de

imobilidade (s) de ratos submetidos à caixa de atividade.

Os valores estão representados

pelas médias ± DP. ANOVA, seguida do teste post hoc de Tukey. *p<0,05 quando comparado ao

grupo CTRL.

4 dias 7 dias 14 diasbasal

21 dias

CTRL

HI-RS

Tempo de imobilidade (s)

Resultados

Em relação à duração de limpeza (Fig. 25), observou-se, utilizando a

ANOVA para medidas repetidas, que não houve diferença estatística entre os

grupos após 4, 7, 14, e 21 dias de exposição à HI e/ou RS (grupo [F

(3,32)

=0,23;

p<0,87] e tempo [F

(4,128)

=0,77; p<0,55]).

Figura 25. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (basal, 4, 7, 14 e 21 dias) no tempo de

limpeza (s) de ratos submetidos à caixa de atividade.

Os valores estão representados

pelas médias ± DP. ANOVA para medidas repetidas.

4 dias 7 dias 14 diasbasal

21 dias

CTRL

HI-RS

Tempo de limpeza (s)

Resultados

6.6 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou restrição de sono (5 e 21

dias) e PSP (4 dias consecutivos) no aprendizado e retenção da memória em

ratos submetidos à esquiva inibitória

As Figuras 26 e 27 ilustram as sessões de treino e teste dos ratos

avaliados na tarefa de esquiva passiva. Os animais submetidos à PSP, HI e/ou RS

não apresentaram alteração estatisticamente significativa no tempo de latência

durante a sessão de treino, quando comparados aos animais do grupo CTRL [PSP

t-Student t=0,2; p=0,82; 4 dias F

(3,42)

=0,82; p=0,48; 20 dias F

(3,41)

= 0,91; p=0,44].

Figura 26. Efeitos da exposição à PSP (4 dias), HI e/ou RS (4 e 20 dias) no tempo de

latência (s) em ratos submetidos à sessão de treino da tarefa de esquiva inibitória.

valores estão representados pelas médias ± DP. Teste t-Student (PSP comparada ao CTRL) e

ANOVA de uma via (HI e/ou RS comparado com o CTRL).

100

150

200

250

300

CTRL PSP HI RS HI-RS HI RS HI-RS

Sessão de treino (s)

4 dias

20 dias

Resultados

Em relação à sessão de teste da tarefa de esquiva passiva, foi observada

redução no tempo de latência no grupo PSP em comparação ao grupo CTRL [t-

Student; t=-3,11; p<0,006]. Observou-se, ainda, que não houve diferença estatística

entre os grupos na sessão de teste, após exposição à HI e/ou RS no 5º

(3,42)

=0,74; p=0,53] e 21º dia de exposição [F

(3,41)

=0,18; p=0,91].

Figura 27. Efeitos da exposição à PSP (rebote), HI e/ou RS (5 e 21 dias) no tempo de

latência (s) em ratos submetidos à sessão de teste da tarefa de esquiva inibitória.

valores estão representados pelas médias ± DP. Teste t-Student (PSP comparada ao CTRL) e

ANOVA de uma via (HI e/ou RS comparada com o CTRL). *p<0,05 quando comparado ao grupo

CTRL.

100

200

300

400

CTRL PSP HI RS HI-RS HI RS HI-RS

Sessão de teste (s)

5 dias

Rebote

21 dias

Resultados

6.7 Efeitos da exposição crônica à hipóxia intermitente e/ou restrição de

sono (21 dias) na concentração de monoaminas no córtex frontal, estriado e

hipocampo em ratos

A Tabela 4 ilustra os dados referentes à concentração de monoaminas no

córtex frontal e estriado. Em relação à concentração de monoaminas no córtex

frontal, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos na

concentração de adrenalina [F

(3,29)

=0,6; p=0,61], NA [H

(3,35)

=2,0; p=0,57], DA

(3,28)

=1,6; p=0,19], DOPAC [F

(3,30)

=1,8; p=0,16], HVA [F

(3,30)

=0,1; p=0,95], 5HT

(3,30)

=1,9; p=0,15] e 5HIAA [F

(3,31)

=0,4; p=0,73].

Foi observada redução estatisticamente significativa na concentração de

noradrenalina no estriado dos ratos submetidos à HI e HI-RS, em comparação aos

ratos do grupo CTRL (p<0,001) e RS (p<0,001) [F

(3,32)

=35,8; p<0,001]. Os ratos dos

grupos RS (p<0,04) apresentaram aumento da concentração de 5HIAA em

comparação ao grupo CTRL [F

(3,30)

=8,0; p<0,001], e os ratos do grupo HI-RS, em

comparação aos grupos CTRL (p<0,001) e HI (p<0,03).

Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos na

concentração de L-DOPA [H

(3,30)

=1,1; p=0,77], adrenalina [F

(3,30)

=0,9; p=0,46],

DOPAC [F

(3,31)

=1,7; p=0,17], DA [F

(3,32)

=0,5; p=0,66], HVA [F

(3,31)

=1,4; p=0,24] e 5HT

(3,30)

=2,6; p=0,06] no estriado de ratos.

Resultados

Tabela 4. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração de

monoaminas no córtex frontal e estriado.

CTRL HI RS HI-RS

Córtex frontal

Adrenalina 150,0 ± 83,4 214,5 ± 80,5 185,5 ± 76,4 230,4 ± 204,7

NA 484,3 ± 157,4 569,1 ± 42,7 534,1 ± 83,2 558,1 ± 115,1

DA 124,5 ± 27,6 203,0 ± 103,5 157,0 ± 74,2 137,6 ± 48,0

DOPAC 145,0 ± 61,7 242,1 ± 91,4 200,8 ± 85,1 170,9 ± 116,2

HVA 467,1 ± 158,5 462,9 ± 175,3 498,7 ± 141,0 469,4 ± 133,2

5-HT 795,3 ± 439,8 657,9 ± 465,2 473,8 ± 228,5 413,4 ± 307,7

5-HIAA 242,5 ± 266,2 171,4 ± 116,2 176,3 ± 95,4 122,2 ± 59,3

Estriado

L-DOPA 69,1 ± 22,9 67,9 ± 20,4 62,3 ± 36,8 148,0 ± 135,7

Adrenalina 126,6 ± 73,9 112,5 ± 50,6 93,3 ± 28,9 151,2 ± 95,2

NA 532,5 ± 91,0 214,4±80,5*¥ 545,1 ± 109,7 205,8 ± 96,7*¥

DA 17297,4 ± 2277,7 17068,7±3117,5 18643,6 ± 4130,5 18098,9 ± 1999,4

DOPAC 3418,2 ± 673,3 3600,1±557,3 3969,1 ± 482,5 3807,1 ± 325,7

HVA 1253,0 ± 566,1 877,2±226,2 1038,1 ± 304,0 999,7 ± 311,3

5-HT 1688,1 ± 395,1 1211,9±257,9 1498,5 ± 345,8 1251,5 ± 517,8

5-HIAA 669,6 ± 116,4 798,6±116,3 895,2 ± 145,9* 1068,2 ± 274,1*#

Os valores estão representados pelas médias ± DP em ng/g de tecido úmido. ANOVA,

seguida do teste post hoc de Tukey. *p<0,05 quando comparado ao grupo CTRL; #p<0,05

quando comparado ao grupo HI; ¥p<0,05 quando comparado ao grupo RS. Definição das

abreviaturas: L-3,4-diidroxifenilalanina= L-DOPA, noradrenalina=NA, dopamina=DA, ácido

3,4-diidroxifenilacético=DOPAC, ácido homovanílico=HVA, serotonina=5-HT e ácido 5-

hidroxindolacético=5-HIAA.

Resultados

6.8 Efeitos da exposição crônica à hipóxia intermitente e/ou restrição de

sono na expressão da enzima tirosina hidroxilase na substância negra e

estriado em ratos

As Figuras 28 e 29 ilustram os dados referentes à expressão da enzima

tirosina hidroxilase. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os

grupos na expressão da tirosina hidroxilase tanto no estriado [F(4,45)=1,2; p=0,23]

quanto na substância negra [F(4,45)=0,9; p=0,46].

Substância negra

Figura 28. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na expressão da enzima

tirosina hidroxilase na substância negra.

Os valores estão representados pelas médias ± DP.

ANOVA de uma via. Definição de abreviatura: Tirosina hidroxilase=TH; Notar CTRL/choque: os ratos

utilizados nesse experimento foram os submetidos à tarefa de esquiva inibitória.

100

125

TH 60 KDa

α-Tubulina

55 KDa

CTRL

CTRL/choque

HI-RS

TH proteína (% CTRL)

Resultados

Estriado

Figura 29. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na expressão da enzima

tirosina hidroxilase no estriado.

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANOVA

de uma via. Definição de abreviatura: Tirosina hidroxilase=TH; Notar CTRL/choque: os ratos

utilizados nesse experimento foram os submetidos à tarefa de esquiva inibitória.

A Figura 30 ilustra os valores séricos de corticosterona. A ANOVA de uma

via revelou diferença estatisticamente significativa entre os grupos [F

(3,27)

=5,31;

p<0,01]. Os ratos expostos à RS apresentaram aumento na concentração de

corticosterona quando comparados aos animais dos grupos CTRL (p<0,05) e HI

(p<0,01).

100

125

TH 60 KDa

α-Tubulina

55 KDa

CTRL

CTRL/choque

HI-RS

TH proteína (% CTRL)

Resultados

Figura 30. Efeitos da exposição à HI e/ou RS na concentração sérica de

corticosterona (ng/mL) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANOVA

de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. * p<0,05 quando comparado ao grupo CTRL; #

p<0,05 quando comparado ao grupo HI.

100

200

300

400

CTRL

HI-RS

Corticosterona (ng/mL)

Resultados – Artigo em Revisão

Intermittent Hypoxia and Sleep Restriction:

Motor, Cognitive and Neurochemical Alterations in Rats

Juliana C. Perry

; Vânia D’Almeida

1,2

; Marcelo M.S. Lima

; Francisco R.L. Godoi

;

Maria Aparecida B.F. Vital

; Maria Gabriela M. Oliveira

and Sergio Tufik

;

(1) Department of Psychobiology, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil

(2) Department of Health Sciences, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil

(3) Department of Pharmacology, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brazil

Number of pages: 26

Number of figures: 4

*Corresponding author:

Juliana Cini Perry

Department of Psychobiology - Universidade Federal de São Paulo

Rua Napoleão de Barros, 925

Vila Clementino – SP – São Paulo – Brazil

CEP: 04024-002

Phone # (55-11) 2149-0155

Fax # (55-11) 5572-5092

e-mail address: [email protected]

Resultados – Artigo em Revisão

Abstract

The present study evaluated the effects of intermittent hypoxia (IH) and sleep

restriction (SR) upon motor and cognitive function in rats. Also evaluated were

catecholamine concentrations and tyrosine hydroxylase (TH) protein expression in different

regions of the forebrain. Wistar Hannover rats were submitted to IH for 4 days and 21 days

(2 min room air - 2 min 10% O

for 1000-1600h), followed by SR for 18h (1600-1000h). Rats

were randomly assigned to four experimental groups: 1) control 2) IH 3) SR and 4) IH-SR.

In the inhibitory avoidance task, an additional group of rats was submitted to paradoxical

sleep deprivation (PSD) for 96 consecutive hours. Results showed that SR induced an

increase in motor activity without modifying catecholaminergic turnover in the frontal cortex

and striatum. The increase in exploratory activity in SR rats could be the result of impaired

habituation. Neither SR periods induced cognitive deficits in the inhibitory avoidance task

after 5 and 21 days. However, 96h of PSD impaired acquisition/retention in rats. Exposure

to IH did not affect motor and cognitive function but IH associated to SR increased motor

activity. After 21 days, IH and IH-SR groups norepinephrine concentration in the striatum

was reduced although

neither SR nor IH affected TH protein expression. Results herein

suggest that hypoxia and sleep loss exert distinct deleterious effects upon the central

nervous system.

Keywords:

hypoxia, sleep deprivation, motor, memory, norepinephrine, rat

Resultados – Artigo em Revisão

1. Introduction

Obstructive sleep apnea is characterized by repetitive obstruction of the

upper airways resulting in pauses in breathing and subsequent oxygen desaturation.

These alterations lead to arousals commonly associated with hypoxia and

consequently lead to sleep deprivation. The classic daytime manifestation of apnea

is excessive sleepiness but other symptoms such as cognitive deficits and fatigue

are commonly reported [33]. Several neurobehavioral morbidities with major impact

on public health and the economy may be related to obstructive sleep apnea. More

direct effects are seen in traffic and workplace accidents [13,14,29].

Both hypoxia and sleep deprivation have been suggested as contributors to

cognitive deficits observed in apnea patients [6]. Gozal’s group demonstrated that

exposure to intermittent hypoxia (IH) is associated with impairment of spatial

learning in adult rats, and with increased apoptosis in the cortex and CA

region of

the hippocampus [16]. Moreover, IH exposure during the development of the

nervous system (7-11 days of age) induced deficits in spatial working memory in

juvenile rats [9]. When hypoxia occurs during a critical period of brain development,

shortage of oxygen in the brain disrupts the functional integrity of the dopaminergic

system and induces motor alterations [9,10]. Exposure to IH in adult rats has been

associated with modified biosynthesis of both norepinephrine and dopamine in the

brain [24,31].

Studies in our laboratory have demonstrated that 96h of paradoxical sleep

deprivation (PSD) impairs attention [15] and acquisition/retention of an aversive task

[8,32]. PSD can lead to behavioral alterations, some of which have been attributed

to the catecholaminergic neurotransmission systems in the brain

[2,3,21,27,37,49,50]. Although the mean firing rate of dopaminergic neurons does

not change significantly throughout the sleep-wake cycle [30], paradoxical sleep is

Resultados – Artigo em Revisão

also characterized by an increase in dopamine release [22]. In fact, a recent study

has associated dopamine-mediated disturbances with paradoxical sleep [12].

In humans it is not possible to determine whether such effects are

related to hypoxia per se or whether they occur due to the frequency of arousals

induced by breathing alterations during sleep. Apneic patients showed a reduction in

delta sleep and rapid-eye-movement (REM) sleep, and prolonged sleep stages 1

and 2 [7]. We sought to establish the relevance of investigating the effects of sleep

deprivation when associated to hypoxia in our paradigm. Thus, this study was

designed to determine the effects of IH and sleep restriction (SR) on motor and

cognitive functions. In an attempt to comprehend the motor responses that

occurred subsequent to SR we assessed the effects of SR and SR-HI in areas

known to be linked to motor activity.

2. Material and Methods

2.1. Animals

Experiments were performed on 135 male adult Wistar Hannover rats

provided by the Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para

Medicina e Biologia (CEDEME) - Universidade Federal de São Paulo. The animals

were housed in groups of 5 in standard polypropylene cages in a room maintained

at 22

C with a 12:12h light-dark cycle (lights on at 0700 h) and allowed free access

to food and water. Rats used in this study were maintained and treated in

accordance with the guidelines established by the Ethical and Practical Principles

for the Use of Laboratory Animals. All animal procedures were approved by the

school’s Ethics Committee (CEP nº 0490/04).

Resultados – Artigo em Revisão

2.2. Intermittent Hypoxia (IH)

IH was induced in a purpose-built chamber (30 x 20 x 20 in., Oxycycler model

A44X0, Biospherix, Redfield, NY, USA) connected to a supply of O

and N

gas.

Sensors measured O

concentration, CO

concentration (<0.01%), humidity (40-

50%) and temperature (22-24ºC). Inflow of O

and N

into the chamber was

controlled by a computer programmed to produce cycles of 2 min room air - 2 min

10% O

. Rats were subjected to this schedule during the light period (1000-1600h).

The hypoxia procedure used in the present study reduced oxygen saturation to

about 50% [39]. The experimental protocol adopted in this investigation was similar

to that described by Gozal and colleagues [16].

2. 3. Sleep Restriction (SR)

This protocol is based on the same platform over water technique used in the

paradoxical sleep deprivation (see below), completely depriving the rats of

paradoxical sleep and also of an amount of slow-wave sleep [26]. Rats were

individually placed on a circular platform (6.5 cm in diameter) in a cage (23 x 23 x 29

cm) filled with water up to 1 cm below the platform level. During paradoxical sleep

the rats tend to fall off the platform and awaken due to muscular atonia. However,

different from the continuous 96h PSD, in this protocol the rats were kept on the

platforms for 18h (beginning at 1600h) and allowed to sleep for 6 hours (1000 to

1600h) every day for 21 days. Thus, there is a partial compensation for the sleep

loss [26]. Animals were initially exposed to either room air or IH for 6h prior to SR.

This particular time interval (1000h to 1600h) was chosen because it is when

paradoxical sleep has been found to attain its highest expression [26]. All animals

were exposed to a habituation period on the platforms for 1h a day for 3 days prior

Resultados – Artigo em Revisão

to the commencement of the SR protocol. After 21 days, SR (-4.4%) and IH-SR (-

3.3%) reduced body weight while control (7.2%) and IH (6.9%) rats gained weight

[39].

Throughout the study, the experimental room was maintained under

controlled temperature (22 ± 1

C) and a 12:12h light-dark cycle (lights on at 0700h).

Food and water were provided ad libitum and the water in the tank was changed

daily. The control groups used a similar individual cage containing bedding and

were kept in the same room as the experimental rats during the study.

2.4. Paradoxical Sleep Deprivation (PSD)

The animals were subjected to continuous PSD over a period of 4 days. Rats

were individually placed on a circular platform (6.5 cm in diameter) in a cage (23 x

23 x 29 cm) filled with water up to 1 cm below the platform level. During paradoxical

sleep the rats tend to fall off the platform and awaken due to muscular atonia. All

sleep-deprived animals were exposed to a habituation period for 1h a day for 3 days

prior to the commencement of the PSD protocol. After 4 days of PSD the rats

reduced body weight by 5.7% [39].

2.5. Measures of Motor Activity

The rats were exposed to the activity chamber 72h before the experimental

procedure (baseline) and 4, 7, 14 and 21 days after SR and/or IH. The locomotor-

recording chamber (Insight, Riberão Preto, São Paulo, Brazil) consisted of

transparent Plexiglas boxes (41×41×41 cm). A series of infrared photodiodes

positioned along one side of the cubicle and parallel to the floor projected infrared

beams to photoreceivers positioned on the opposite side of the cage. As the rodent

ambulated across the floor of the cubicle, the number and sequence of photo-beam

Resultados – Artigo em Revisão

interruptions reflected the total distance traveled (cm) and speed (seconds). A

second set of infrared photoreceivers located approximately 6 cm above the floor of

the cubicle detected the number of rearing events. A computer attached to the

photoreceivers kept a second-by-second count of beam interruptions in the X, Y,

and Z axis. Immobility time (seconds of lack of movement during testing) was

recorded by hand-operated chronometers, as was grooming time (seconds rubbing

face or any other part of body with the forepaws). Rats were observed individually

for 5 min. The apparatus was cleaned with a water-alcohol (5%) solution prior to

behavioral testing to eliminate possible bias due to odors left by previous rats.

2.6. Inhibitory Avoidance Task

The inhibitory avoidance test apparatus consisted of an automated shuttle-

box (Insight Instruments, Riberão Preto, São Paulo, Brazil) with a dark front glass

and a floor made of parallel stainless steel bars 5 mm in diameter spaced 15 mm

apart. The box (23 x 50 x 23 cm) is divided into two compartments of the same size

by a wall with a guillotine door. The walls of each compartment were either black or

white. The white compartment was illuminated while the black remained dark. In the

training session, the animals were individually placed in the light chamber facing the

wall. The door was opened and the time to enter the dark compartment was

recorded automatically by the apparatus. When the animal crossed to the other

compartment, the door was noiselessly lowered and a 0.8 mA footshock (aversive

stimulus) was applied through the grid floor for 1 second. The test session

conducted 24 h later was identical to the training except for the absence of the

footshock. After 30 seconds of habituation, the door was opened, and the time in

seconds taken by the rat to enter the dark compartment was recorded up to a

maximum of 300 seconds. Animals were removed from the chamber after crossing

Resultados – Artigo em Revisão

to the dark compartment or by reaching the time limit. In this memory test the

animals were submitted to only one trial of the learning task and the latency time

was evaluated to characterize acquisition. The apparatus was cleaned with a water-

alcohol (5%) solution before behavioral testing to eliminate possible bias due to

odors left by previous rats. Each animal was tested only once.

2.7. Catecholamine Quantification

After the motor behavioral task the animals were killed by decapitation. The

cortex and striatum were rapidly dissected on dry ice, weighed and stored at -80°C.

Frozen tissue was homogenized in 15 mL of 0.1 M perchloric acid containing 0.02%

followed by addition of 10 µL of dihydroxybenzylamine (DHBA - 146.5

ng/mL) used as internal standard. After centrifugation (11,000 × g at 4ºC for 40 min),

the supernatant was filtered and analyzed by high performance liquid

chromatography (HPLC). The endogenous concentrations of the precursor L-DOPA,

epinephrine, norepinephrine, dopamine, and their metabolites 4-hydroxy-3-methoxy-

phenylacetic acid (DOPAC) and homovanillic acid (HVA) were measured by HPLC

using reverse phase chromatography coupled with electrochemical detection L-

ECD-6

A (0.5 V, Shimadzu) as described by Naffah Mazacoratti and colleagues [34].

Isocratic separation was obtained using an RP 18 Brownlee column (4.6 x 250 mm,

5 µM, Shimadzu) and RP 18 Brownlee pre-column (3.2 x 15 mm, 7µM) eluted with

the following mobile phase: 20 mM sodium dibasic phosphate, 20 mM citric acid,

containing 10% methanol, 0.12 nM Na

EDTA and 566 ng/mL heptanesulfonic acid,

pH 2.64, with a flow rate of 0.8 mL/min. The values obtained were expressed as

ng/g tissue wet weight.

Resultados – Artigo em Revisão

2.8. Tyrosine Hydroxylase (TH) Protein Expression

After inhibitory avoidance task the rats were decapitated and their brains

quickly dissected. The substantia nigra and striatum were immediately frozen in dry

ice until the lysis procedure was performed in a 1.5 mL eppendorf tube by sonication

in the presence of an ice-cold buffer containing 50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl,

1% NP-40, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.25% sodium deoxycholate, 2 mM

EDTA, 1 mM dithiothreitol (DTT), 20 μM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and

protease inhibitors (Complete tablet; Roche, Indianapolis, IN, USA). After incubation

on ice for 30 min, extracts were centrifuged at 10,000 x g for 30 minutes at 4° C,

and the supernatants for protein extracts were collected and stored at -80°C for

further Western blotting analysis. The aliquot of supernatant was taken for total

protein analysis. Samples containing equal amounts of total protein (5 μg per lane)

were boiled with SDS sample buffer and electrophoresis on 10% SDS-

polyacrylamide gels in a Mini-Protean II Dual Slab Cell (Bio-Rad). Proteins were

electrophoretically transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes using a

Mini-Transblot electrophoretic transfer cell (Bio-Rad). Each membrane was blocked

for 1 h with 10% nonfat dry milk/0.5% Tween-20 in Tris-buffered saline.

Subsequently, each PVDF was probed overnight at 4°C with monoclonal antibodies

against TH (1:5,000; Sigma, USA) or monoclonal antibodies against α-tubulin

(1:500; Sigma, USA), followed by several washes in TBST and incubation with a

secondary horseradish peroxidase-conjugated antibody (1:5,000; Pharmigen, USA)

for 60 minutes, and visualized by chemoluminescence (Santa Cruz Biotechnology,

USA). The bands were quantified by using ImageJ 1.32j public domain software

(http://rsb.info.nih.gov.ij/).

Resultados – Artigo em Revisão

2.9. Experimental Design

Rats were randomly assigned to the four experimental groups: 1) control, 2)

IH, 3) SR and 4) IH-SR. Seventy-two hours prior to the commencement of IH and/or

SR protocols and also on days 4, 7, 14 and 21 of the experimental period the same

group of rats were assessed for motor activity (n=9 per group, tested between

0800h and 1000h), as depicted in Figure 1.

The different groups of rats were submitted to IH, SR and IH-SR

(n=12/group) for 4 and 20 consecutive days and training in the inhibitory avoidance

task. An additional group of 12 rats was subjected to PSD for 96 consecutive hours

and trained and tested in this task. The training session occurred immediately after

the end of the sleep restriction on the last day (4 or 20) for SR and IH-SR, and

immediately after the end of the PSD period. The test session was performed 24

hours later (i.e, after 24 hours of recovery sleep).

Finally, rats for neurochemical (n= 9/group) and TH protein expression

(n=3/group) analysis were decapitated after 21 days (0900h), immediately at the

end of the last sleep restriction period. In order to evaluate whether the foot shock

the animals received after the inhibitory avoidance task would interfere with TH

expression, 3 naïve rats were used.

2.10. Statistical Analysis

Values shown are expressed as mean ± standard error of mean (SEM).

Homogeneity of variance was assessed by the Bartlett test and normal distribution

of the data by the Kolmogorov-Smirnov test. One-way analysis of variance (ANOVA)

was used to assess the data of inhibitory avoidance, catecholamine concentrations

and TH protein expression. A repeated measure ANOVA was used to analyze

activity chamber data. The Tukey post-hoc test was used to compare values at

Resultados – Artigo em Revisão

different time points. When the Bartlett test showed absence of homoscedasticity,

data were square transformed or analyzed by Kruskal-Wallis ANOVA. Independent-

samples t-test (groups) was used to analyze control and PSD group in inhibitory

avoidance. P< 0.05 was considered statistically significant.

3. Results

3.1. Experiment 1:

Effects of Intermittent Hypoxia and Sleep Restriction on Motor Behavior

There were no statistically significant differences in baseline evaluation

across groups for the following parameters: distance traveled [F

(3,32)

=2.61; p=0.07;

Fig. 1A], rearing [F

(3,32)

=0.47; p=0.70; Fig. 1B], speed [F

(3,32)

=2.53; p=0.07],

immobility time and grooming [F

(3,32)

=0.88; p=0.46]. Distance traveled is shown in

Figure 2A. Repeated ANOVA measures revealed significant differences between

groups [F

(3,32)

=11.04; p<0.001], time-points [F

(4,128)

=2.61; p<0.04] and interaction

between these two factors [F

(12,128)

=2.68; p<0.003]. SR and IH-SR significantly

increased distance traveled in the activity chamber after 4, 7, 14 and 21 days

compared to the control group. After 21 days, the control group showed a reduction

in distance traveled compared to baseline (p<0.01). Similar effects were observed in

speed analyses. As can be seen in Figure 2B, repeated-ANOVA measure of the

rearing data revealed significant differences between groups [F

(3,32)

=17.25;

p<0.001], time-point effects [F

(4,128)

=2.87; p<0.03] and interaction across group vs.

time-points [F

(12,128)

=5.25; p<0.001]. One-way ANOVA followed by Tukey test

showed that SR and IH-SR groups increase rearing after 4, 7, 14 and 21 days

compared to control group. Control and IH groups showed a reduction of rearing

Resultados – Artigo em Revisão

compared to baseline after 21 days (p<0.01). No significant differences across

groups were observed in grooming behavior and immobility time.

3.2. Experiment 2:

Effects of Subchronic and Chronic Intermittent Hypoxia and Sleep

Restriction on Acquisition/Retention in the Inhibitory Avoidance

No significant differences were observed in the latency time between control,

PSD [t-value= 0.2; p=0.82], 4 days [F

(3,42)

=0.82; p=0.48] and 20 days [F

(3,41)

=0.91;

p=0.44] in the experimental groups during the training sessions (Fig. 3A). The rats

submitted to PSD for 96h consecutively showed reduced latency to cross to the dark

compartment compared to the control group in the test session [t-value= -3.11;

p<0.01; Fig. 3B]. No significant change was observed in the latency time during test

session after 5 days [F

(3,42)

=0.74; p=0.53] and 21 days [F

(3,41)

=0.18; p=0.91]

exposure to IH and/or SR (Fig. 3B).

3.3. Experiment 3:

Effects of Chronic Intermittent Hypoxia and Sleep Restriction on

Catecholamine Concentrations and TH Protein Expression

The striatal norepinephrine concentration was reduced after chronic IH and

IH-SR compared to controls and SR groups [F

(3,32)

=35.8; p<0.001]. Differences

across groups for the other catecholamine concentrations analyzed in the frontal

cortex and striatum were not significant.

No significant statistical difference across groups was observed in TH protein

expression in the striatum [F

(4,45)

=1.2; p=0.23; Fig. 4A] and substantia nigra

(4,45)

=0.9; p=0.46; Fig. 4B].

Resultados – Artigo em Revisão

4. Discussion

The purpose of the present study was to compare IH and SR in terms of their

effects on motor behavior, cognitive function and the catecholaminergic

neurotransmission system. SR induced an increase in motor activity without

modifying neurotransmission and TH expression in the frontal cortex and striatum.

Neither IH nor SR induced cognitive deficits on the inhibitory avoidance task.

However, 96h of PSD impaired acquisition/retention in rats. After 21 days, IH and

IH-SR reduced striatal norepinephrine concentration but did not affect TH protein

expression.

Under baseline conditions the experimental groups did not show statistical

differences in any of the motor activity parameters evaluated. After the treatments,

no statistically significant difference was observed in immobility time and grooming

behavior between groups. However, from day 4 on the rats in the control group

showed reduced locomotion and rearing frequency compared to their own baseline

and to SR and IH-SR groups, an effect that persisted until day 21 of exposure. The

SR and IH-SR groups showed no change in locomotion (distance travelled) at any

point compared to their respective baseline level. These results suggest that control

animals showed habituation to the apparatus, and this was impaired in SR or IH-SR

animals.

Several behavioral alterations induced by sleep deprivation are associated

with the dopaminergic system [2,3,4,49,50]. In 1978, Tufik and colleagues [49]

demonstrated that 96h of PSD in rats produced a significant increase in stereotypic

behaviors after apomorphine administration. In fact, PSD increased D

binding in

the striatum and nucleus accumbens in rats [35]. Approximately thirty years later,

Dzirasa and colleagues [12] demonstrated that dopamine plays a central role in

regulating sleep-wake states and that the action is mediated by the D

dopamine

Resultados – Artigo em Revisão

receptor pathway. However, according to our findings SR was not able to produce

alterations neither in catecholamine concentrations nor TH protein expression,

suggesting that the motor-exploratory alterations observed in SR an IH-SR rats are

not relate to alterations in catecholamine synthesis or release. There are other

neurotransmitters implicated in the regulation of sleep-wake cycle and motor

behavior. For instance, serotonergic neurons of the dorsal raphe nucleus decrease

their activity during non-rapid eye movement (NREM) sleep and are silent during

REM sleep [43] and localization of serotonin receptors in central motor-related

centers suggest that they are involved in locomotor activity, probably by modulating

the release of neurotransmitters such as gamma-aminobutyric acid (GABA) from

striatal neuron terminals [28]. Gabaergic system can participate in the behavioral

alterations induced by sleep deprivation since drugs acting through the GABA

and

GABA

receptors produced inhibition of exploratory activity [41,42].

Notwithstanding, one may consider an alternative explanation for the

increased locomotor activity in SR rats when compared to control group. Rats

actively explore an environment when first exposed to it and tend to decrease this

response (habituate) in subsequent exposures to the same context. Habituation to

an environment recognized as familiar can be taken as a memory index, since it is

one form of non-associative contextual learning [23]. This contextual learning is

dependent on the hippocampal formation, a structure that is known to be critically

involved in memory processes, being impaired by pharmacological [52] or surgical

[53] manipulation of this brain structure. Sleep deprivation is known to affect

hippocampus-dependent learning in tasks such as the spatial version of the Morris

water maze [5,20], contextual fear conditioning [19] or inhibitory avoidance [8,32].

Thus, it is conceivable that the observed increase in exploratory activity in SR rats

could be due to impaired habituation to the test apparatus.

Resultados – Artigo em Revisão

Consistent with the literature, our findings demonstrated that rats submitted

to 96h of PSD prior to training showed impaired acquisition/retention on inhibitory

avoidance tasks. On the other hand, the SR protocol did not impaired performance

in this aversive task, suggesting that the amount of sleep obtained in this protocol

was sufficient to protect against major cognitive dysfunction. Nevertheless, if

regarded as an index of learning, the absence of habituation in the locomotor

activity may indicate a certain degree of impairment induced by SR. Concerning the

absence of effect on avoidance learning, one should consider an alternative

explanation, as it is know that the intensity US can alter the response to amnesic

agents. For example, rats that received post-training intrahippocampal infusion of

tetrodotoxin show impaired avoidance learning when trained under a 0.8 mA

footshock intensity, but not if the shock was raised to 1.0 mA [44]. Thus, the lack of

effect on the inhibitory avoidance task could be not due to the absence of cognitive

impairment, but because of the intensity of the shock US used.

Despite the growing number of studies describing structural changes in the

post-hypoxic brain, events mediating TH regulation and catecholaminergic

neurotransmission have been relegated to only a few studies. In accordance to

Gozal and colleagues [18] our data showed that TH protein expression was not

altered after IH. Although chronic IH and IH-SR groups did not modify the TH

expression in the substantia nigra and striatum, both groups showed a reduction in

striatal norepinephrine concentration. In various regions of the rat brain, it has been

shown that norepinephrine concentrations decrease after exposure to acute hypoxia

[31,46]. Roubein and colleagues [46] found that levels of monoamines in brain

regions returned to initial concentrations after 36h in a hypoxic environment; these

findings suggest that the brain may conceivably be adapted to hypoxia [46]. The

present findings are consistent with previous studies [1,24,31,36,40,46] that

Resultados – Artigo em Revisão

characterized the pattern of the monoamine metabolism response and found that it

was consistent with the hypoxia protocol. Several factors such as oxygen

concentration, duration of hypoxia exposure, or age and sex of rats, may account for

discrepancies in the monoamine metabolism response.

A cumulative reduction in the amount of normal night sleep results in

decrements in daytime function and quality of life [11]. Rats submitted to a schedule

of 18 h of sleep deprivation a day showed a suppression of paradoxical sleep and

loss of deep slow wave sleep, which were partially compensated during the 6 h

sleep window [26]. Throughout the SR procedure, rats slept an average of 30-40%

of the time, corresponding to 8-9 h per day. PSD for 96 consecutive hours was

effective in producing a total suppression of paradoxical sleep and a significant loss

of slow wave sleep (39%) [25]. After 96h of PSD, the animals were submitted to a

training session for the inhibitory avoidance task and immediately placed in the

home cages for a 24h recovery period. It was found that that the average level of

paradoxical sleep was 104% compared to baseline conditions [25]. The effects of

sleep on memory may seem more complex or variable based upon the frequency

and degree of sleep loss. Results herein suggest that post-training modifications of

sleep architecture could impair the memory acquisition/retention processes. Some

studies demonstrated increases in paradoxical sleep after learning, learning

decrements after PSD, and specific correlations of sleep-stage percentage with

procedural learning in humans [38]. Others argue that the effects of PSD on learning

might be epiphenomena of stress [51]. However, adrenalectomy/corticosterone

replacement surgery did not modify the effect of PSD on acquisition rate,

demonstrating that the deficits in spatial task acquisition due to pre-training sleep

deprivation are not secondary to the adrenal stress response [48].

Resultados – Artigo em Revisão

Severe hypoxia/ischemia might obviously cause an extensive lesion to

susceptible brain neurons, which does not always result in neuronal death, but

rather is followed by a marked impairment of brain functioning, e.g., various

behaviors, stress response, learning and memory [16,45]. Exposure to IH is

associated with impairment of spatial learning in adult rats [16,47]. In this study the

rats submitted to IH did not show impaired habituation in the activity chamber (4, 7,

14 and 21 days) or impaired acquisition/retention in the inhibitory avoidance task (4

and 21 days). Some authors suggest that the alteration of spatial memory after IH

corresponds to a time-dependent effect, since the rats exposed to 7 days of IH

showed spatial memory impairment that disappeared after chronic IH protocol (14

and 30 days) [17], and these data could be interpreted as a biphasic effect of IH

during the hippocampal neurogenesis process. Therefore our results showed that

the absence of cognitive alteration in the IH group may be due to its time of

exposure to IH. Other difference between the present work and the others that

found impairments after IH exposure is the task, since we used inhibitory avoidance

and the effects were observed on the Morris Water Maze.

Studies using milder hypoxic insults have proven to be less disruptive to

sleep architecture [16]. Within this context, exposure to IH-RS increased motor

activity when compared to control group. Interestingly, this alteration was probably

due to the influence of SR on habituation and comes to prove that a certain amount

of adequate sleep may protect against the cognitive effects expected after hypoxia.

The present results suggest that hypoxia decreases striatal norepinephrine

concentrations without modifying behavior, and selectively modulates noradrenergic

neurotransmission system in the central nervous system. However, SR induces

behavioral alterations that are not related to the catecholaminergic turnover in the

frontal cortex and striatum. SR altered locomotor activity trough 21 days, an effect

Resultados – Artigo em Revisão

that was not intensified by the co-exposure to IH. On the whole, our results suggest

that IH and SR modify the central nervous system in different ways.

Resultados – Artigo em Revisão

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Acknowledgements

The catecholamine quantification was performed at the Kidney and Hormones

Laboratory of Nephrology of the Medicine Department of UNIFESP under the

supervision of Prof. Dulce Elena Casarini, PhD, with execution by Luciana Cristina

Teixeira. We are grateful to Angela Braga Reksidler for her excellent assistance in

the Western blot analyses. The authors would like to express their thanks to Ivan

Oliar, Diva Lima, Tomé Pimentel, and Marilde Costa for skilful technical assistance.

This work was supported by grants from Associação Fundo de Incentivo à

Psicofarmacologia (AFIP) and FAPESP (#04/04008-7 to JCP.; 97/0187-4 to VD’A

and CEPID #98/14303-3 to ST). VD’A, MGMO, MABFV and ST are recipients of

CNPq fellowships.

Resultados – Artigo em Revisão

103

Legends

Figure 1. Schematic representation of experimental design. Seventy two hours prior to

the commencement of intermittent hypoxia and/or sleep restriction, and on days 4, 7, 14

and 21 of the experimental period (from 0800 h to 1000 h), the rats were assessed for

motor activity. The rats were exposed to the inhibitory avoidance test 5 or 21 days after SR

and/or IH. After 21 days the rats were decapitated for neurochemical and TH protein

expression analysis.

Figure 2. Effects of intermittent hypoxia and sleep restriction on motor behavior. The

rats were exposed to the activity chamber 72h before commencement of the experimental

procedure (baseline) and 4, 7, 14 and 21 days after SR and/or IH.

(A) Distance traveled

(cm) and (B) rearing (number of times the animals stood on their hind legs) during 5

minutes. ¥p<0.05 compared to baseline; *p<0.05 compared to control group; #p<0.05

compared to IH group. Repeated ANOVA measures followed by Tukey test. Data are

expressed as mean ± SEM (n=9/group).

Figure 3. Effects of intermittent hypoxia and sleep restriction on the inhibitory

avoidance task.

The rats were exposed to the inhibitory avoidance task 4 and 20 days

after SR and/or IH. (A) Training session and (B) test session. *p<0.05 compared to control

group. T-test (control vs. SD) and one-way ANOVA (control vs. subchronic and chronic

groups). Data are expressed as mean ± SEM (n=11-12/group).

Figure 4. Western blot analysis of TH protein expression after intermittent hypoxia

and/or sleep restriction (21 days).

(A) substantia nigra and (B) striatum. A representative

immunoblot for each tissue is shown. One-way ANOVA was applied. Data are expressed

as mean ± SEM (n=3/group).

Resultados – Artigo em Revisão

104

Motor/

Memory

training

Motor/

Memory

test/

Tissue

collection

Motor

IH or SR

(21 days)

Baseline

Moto

3 days

Memory

training

Memory

test

Resultados – Artigo em Revisão

105

1000

2000

3000

4000

5000

6000

4 days 7days 14days

baseline

21days

control

IH-SR

Distance (cm)

100

4days 7days 14daysbaseline

21days

Rearing

Resultados – Artigo em Revisão

106

100

200

300

control SD IH SR IH-SR IH SR IH-SR

Test session (s)

100

200

300

control SD IH SR IH-SR IH SR IH-SR

Training session (s)

5 days 21 days

Rebound

4 days 20 days

Resultados – Artigo em Revisão

107

A) substantia nigra

100

125

TH 60 KDa

α-Tubulin

55 KDa

control

shock control

IH-SR

TH protein (% of control)

B) striatum

100

125

TH 60 KDa

α-Tubulin

55 KDa

TH protein (% of control)

Resultados

108

6.9 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação/restrição de

sono paradoxal no peso corporal em ratos

Os resultados do peso corporal avaliado em diferentes tempos nos animais

submetidos à hipóxia e privação de sono estão descritos na Figura 31. A ANOVA

para medidas repetidas mostrou diferença significativa entre os grupos [F

(3,36)

=2,9;

p<0,05], tempo [F

(1,36)

=66,6; p<0,001] e a interação entre esses dois fatores

(3,36)

=36,1; p<0,001]. Os animais do grupo CTRL apresentaram aumento

estatisticamente significativo comparado à avaliação basal (p<0.03). Os animais

submetidos à PSP durante 4 dias consecutivos apresentaram perda no peso

corporal quando comparados aos ratos do grupo CTRL. Todos os animais

experimentais tiveram o delta do peso corporal reduzido em comparação ao grupo

CTRL [F

(3,36)

=39,1; p=0,001; CTRL ∆=1,8; HI ∆= -0,2; PSP ∆= -5,7; HI-PSP ∆=-7,7].

Figura 31. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP no peso corporal em ratos. Os valores

estão representados pelas médias ± erro padrão da média. ANOVA de medidas repetidas, seguida

do teste

post hoc de Newman-Keuls. *p<0,001 comparado com o basal; #p<0,001 comparado com o

grupo CTRL.

350

380

410

440

470

Basal 4 dias

Peso corporal (g)

CTRL

PSP

HI-PSP

Resultados

109

No experimento crônico, verificou-se diferença estatística significativa entre

os grupos [F

(3,32)

=3,7; p<0,02], tempo [F

(4,128)

=46,3; p<0,001] e interação entre

esses fatores [F

(12,128)

=29,7; p<0,001]. Os ratos dos grupos HI (7, 14 e 21 dias) e

CTRL (14 e 21 dias) apresentaram ganho no peso corporal quando comparados à

avaliação do peso basal (p<0,001). A ANOVA, seguida do teste a posteriori de

Newman-Keuls, revelou que os ratos dos grupos RS (7, 14 e 21 dias) e HI-RS (4, 7

14 e 21 dias) apresentaram redução significativa no peso corporal em relação ao

peso basal (p<0,001). O delta do peso foi negativo após 21 dias nos grupos RS

(∆=-4,4) e HI-RS (∆=-3,3) comparados com os ratos dos grupos CTRL (∆=7,2) e HI

(∆=6,9) [F

(3,32)

=51,9; p<0,001].

Figura 32. Efeitos da exposição à HI e/ou RS no peso corporal em ratos. Os valores

estão representados pelas médias ± DP. ANOVA de medidas repetidas, seguida do teste

post hoc

de Newman-Keuls. *p<0,001 comparado com o basal; #p<0,001 comparado com o grupo CTRL.

300

330

360

390

420

450

480

Basal 4 dias 7 dias 14 dias 21 dias

Peso corporal (g)

CTRL

HI-RS

Resultados

110

6.10 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação/restrição de

sono paradoxal nos fatores bioquímicos associados ao risco cardiovascular

A Figura 33 ilustra os dados referentes à concentração plasmática de

homocisteína total. Não houve diferença estatisticamente significativa na

concentração plasmática de homocisteína [ANCOVA; F

(3,35)

=1,26; p=0,3] após

quatro dias de HI e/ou PSP.

Figura 33. Efeitos da exposição HI e/ou PSP (4 dias) na concentração plasmática de

homocisteína total (µM) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP.

ANCOVA.

CTRL

PSP

HI-PSP

Homocisteína (µM)

Resultados

111

Não houve diferença estatisticamente significativa na concentração

plasmática de cisteína [ANCOVA; F

(3,35)

=0,8; p=0,48; Fig. 34] após quatro dias de

HI e/ou PSP.

Figura 34. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração plasmática de

cisteína (µM) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANCOVA.

100

200

300

400

500

CTRL

PSP

HI-PSP

Cisteína (µM)

Resultados

112

A concentração de triglicérides foi reduzida após 4 dias de PSP [ANCOVA;

(3,35)

=5.5, p<0.01], quando combinada ou não com a HI (Fig. 35).

Figura 35. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica de

triglicérides (mg/dL) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANCOVA,

seguida do teste

post hoc de Newman-Keuls. *p<0,05 quando comparado ao grupo CTRL; #p<0,05

quando comparado ao grupo HI.

100

125

150

CTRL

PSP

HI-PSP

Triglicérides (mg/dL)

Resultados

113

Os ratos submetidos à PSP apresentaram aumento estatisticamente

significativo na concentração de colesterol total (ANOVA de Kruskal-Wallis/U-Mann-

Whitney [H

(3,40)

=9,9; p<0,02; Fig. 36], quando comparados aos ratos dos grupos HI

e HI-PSP [U=11; p<0,004 e U=23.5; p<0,05, respectivamente]. Não houve diferença

estatisticamente significativa entre os ratos dos grupos CTRL e HI-PSP.

Figura 36. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica de

colesterol total (mg/dL) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP.

ANCOVA, seguida do teste

post hoc de Newman-Keuls. #p<0,05 quando comparado ao grupo HI;

¥p<0,001 quando comparado ao grupo HI-PSP.

100

CTRL

HI-PSP

PSP

Colesterol total (mg/dL)

Resultados

114

A Figura 37 ilustra os efeitos da HI e/ou PSP na concentração da fração de

HDL-colesterol. As concentrações séricas de HDL-colesterol [ANCOVA; F

(3,35)

=3,6;

p<0,02] foram maiores nos animais PSP em comparação aos grupos HI e HI-PSP

(p<0,05).

Figura 37. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica da

fração de HDL-colesterol (mg/dL) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ±

DP. ANCOVA seguido do teste

post hoc de Newman-Keuls. #p<0,05 quando comparado ao grupo

HI; ¥p<0,001 quando comparado ao grupo HI-PSP.

CTRL

PSP

HI-PSP

HDL-colesterol (mg/dL)

Resultados

115

Não houve diferenças estatisticamente significativas na concentração de

LDL-colesterol entre os grupos [ANCOVA; F

(3,26)

=1,1; p<0,37], como ilustra a Figura

38.

Figura 38. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica da

fração de LDL-colesterol (mg/dL) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ±

DP. ANCOVA.

CTRL

PSP

HI-PSP

LDL-colesterol (mg/dL)

Resultados

116

A ANCOVA, seguida da análise a posteriori, utilizando o teste de Newman-

Keuls, evidenciou que os ratos dos grupos RS e HI-RS apresentaram redução dos

níveis de VLDL-colesterol [ANCOVA; F

(3,35)

=6,2; p<0,01] em comparação aos

grupos CTRL e HI (p<0,001), como ilustra a Figura 39.

Figura 39. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração sérica da

fração de VLDL-colesterol (mg/dL) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ±

DP. ANCOVA, seguido do teste

post hoc de Newman-Keuls. *p<0,001 quando comparado ao grupo

CTRL; #p<0,001 quando comparado ao grupo HI.

CTRL

HI-PSP

PSP

VLDL-colesterol (mg/dL)

Resultados

117

Após a exposição à HI e/ou PSP, durante 4 dias, não houve diferença

estatística em relação à concentração de folato, vitamina B

e vitamina B

[ANCOVA;

(3,35)

=0,1; p=0,9, F

(3,35)

=1,2; p=0,3; F

(3,35)

=2,6; p=0,06, respectivamente].

Tabela 5.

Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (4 dias) na concentração das

vitaminas folato, B

e B

(nmol/L) em ratos.

CTRL HI PSP HI-PSP

Folato (nmol/L)

16,2±3,5 16,9±4,2 15,6±3,1 15,5±3,3

Vitamina B

(nmol/L)

10,1±0,9 9,6±1,3 10,1±2,0 9,2±1,6

Vitamina B

(nmol/L)

833,1±125,7 916,1±251,2 940,5±172,2 866,3±187,7

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANCOVA.

Resultados

118

Após 21 dias, os ratos submetidos à RS [ANCOVA; F

(3,31)

=5,5; p<0,01]

apresentaram redução estatisticamente significativa na concentração de

homocisteína em comparação aos animais dos grupos CTRL (p<0,01), HI (p<0,001)

e HI-RS (p<0,01), como ilustra a Figura 40.

Figura 40. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração plasmática de

homocisteína total (µM) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP.

ANCOVA, seguida do teste

post hoc de Newman-Keuls. *p<0,01 quando comparado ao grupo

CTRL; #p<0,001 quando comparado ao grupo HI; ¥p<0,001 quando comparado ao grupo HI-RS.

¥#

CTRL

HI-RS

Homocisteína (µM)

Resultados

119

Em relação à concentração de cisteína (Fig. 41), foi observado aumento

estatisticamente significativo nos animais submetidos à HI-RS em comparação aos

grupos CTRL, HI e RS [ANCOVA; F

(3,31)

=7,2; p<0,001].

Figura 41. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração plasmática de

cisteína (µM) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANCOVA, seguida

do teste

post hoc de Newman-Keuls. *p<0,01 quando comparado ao grupo CTRL; #p<0,001 quando

comparado ao grupo HI; ‡p<0,01 quando comparado ao grupo RS.

100

200

300

400

500

CTRL

HI-RS

‡

Cisteína (µM)

Resultados

120

Os ratos dos grupos RS e HI-RS apresentaram redução estatisticamente

significativa na concentração de triglicérides em comparação aos ratos do grupo

CTRL [ANCOVA; F

(3,30)

=5.2; p<0.01; Fig. 42]. Entretanto, os animais do grupo HI

apresentaram aumento estatisticamente significativo desse parâmetro em

comparação aos grupos CTRL (p<0,005), RS (p<0.001) e HI-RS (p<0.001).

Figura 42. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração sérica de

triglicérides (mg/dL) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANCOVA,

seguida do teste

post hoc de Newman-Keuls. *p<0,01 quando comparado ao grupo CTRL; #p<0,001

quando comparado ao grupo HI; ‡p<0,01 quando comparado ao grupo RS; ¥p<0,001 quando

comparado ao grupo HI-RS.

100

150

200

250

‡

CTRL

HI-RS

Triglicérides (mg/dL)

Resultados

121

A Figura 43 ilustra a concentração do colesterol total dos ratos. Após a

exposição crônica à HI e/ou RS, não houve diferença estatisticamente significativa

entre os grupos [ANCOVA; F

(3,31)

=0,2; p=0,9].

Figura 43. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração sérica de

colesterol total (mg/dL) em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP.

ANCOVA.

100

CTRL

HI-RS

Colesterol total (mg/dL)

Resultados

122

Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos nos

níveis de HDL-colesterol [ANCOVA F

(3,31)

=0,46; p=0,7], como mostra a Figura 44.

Figura 44. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração sérica da

fração de HDL-colesterol em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP.

ANCOVA.

CTRL

HI-RS

HDL-colesterol (mg/dL)

Resultados

123

Em relação aos níveis de VLDL-colesterol (Fig. 45), houve diferença

estatisticamente significativa após exposição crônica [ANCOVA; F

(3,30)

=5,4; p<0,01].

Os ratos dos grupos RS e HI-RS apresentaram diminuição da concentração de

VLDL-colesterol em comparação ao grupo CTRL (p<0,001). Já nos ratos do grupo

HI observou-se aumento desse parâmetro em comparação aos grupos CTRL

(p<0,005), RS (p<0,001) e HI-RS (p<0,001).

Figura 45. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração sérica da

fração de VLDL-colesterol em ratos.

Os valores estão representados pelas médias ± DP.

ANCOVA, seguido do teste

post hoc de Newman-Keuls. *p<0,005 quando comparado ao grupo

CTRL; #p<0,001 quando comparado ao grupo HI; ‡p<0,001 quando comparado ao grupo RS;

¥p<0,001 quando comparado ao grupo HI-RS.

‡

CTRL

HI-RS

VLDL-colesterol (mg/dL)

Resultados

124

As concentrações de folato e vitamina B

permaneceram inalteradas após

a exposição crônica à HI e/ou RS [ANCOVA; F

(3,31)

=2,3; p=0,09; F

(3,32)

=0,5; p=0,6,

respectivamente]. Os ratos do grupo HI apresentaram redução da concentração de

vitamina B

[ANCOVA; F

(3,31)

=4,4; p<0,01] em comparação aos animais dos grupos

CTRL (p<0,05) e RS (p<0,05), como ilustra a Tabela 6.

Tabela 6. Efeitos da exposição à HI e/ou RS (21 dias) na concentração das

vitaminas folato, B

e B

(nmol/L) em ratos.

CTRL HI RS HI-RS

Folato (nmol/L)

27,4 ± 2,1 24,9 ±3,4 28,0 ± 2,7 27,5 ± 2,5

Vitamina B

(nmol/L)

13,7 ± 2,2 11,2 ± 1,3 *

‡

14,0 ± 2,0 12,1 ± 1,8

Vitamina B

(nmol/L)

1066,7 ± 106,7 1267,8 ± 178,8 1354,2 ± 142,4 1419,7 ± 222,5

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANCOVA seguido do teste post hoc de

Newman-Keuls. *p<0,01 quando comparado ao grupo CTRL; ‡p<0,01 quando comparado

ao grupo RS.

Resultados – Artigo Publicado II

125

Resultados – Artigo Publicado II

126

Resultados – Artigo Publicado II

127

Resultados – Artigo Publicado II

128

Resultados – Artigo Publicado II

129

Resultados – Artigo Publicado II

130

Resultados – Artigo Publicado II

131

Resultados – Artigo Publicado II

132

Resultados – Artigo Publicado II

133

Resultados – Artigo Publicado II

134

6.11 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal durante 3 dias nos fatores bioquímicos associados ao risco

cardiovascular

A Tabela 7 mostra as alterações nos fatores bioquímicos de risco

cardiovascular nos ratos submetidos à HI e/ou PSP durante 3 dias. Não houve

diferença estatisticamente significativa no peso corporal dos ratos dos grupos CTRL

e HI em comparação ao peso basal [ANOVA para medidas repetidas; F

(3,32)

=26,82;

p=0,001]. Após 3 dias, os ratos dos grupos PSP e HI-PSP apresentaram redução

estatisticamente significativa nos valores de peso corporal em comparação à

avaliação de peso basal (p<0,001). Os animais submetidos à PSP, durante 3 dias

consecutivos, apresentaram perda no peso corporal quando comparados aos ratos

do grupo CTRL. Os animais dos grupos PSP e HI-PSP apresentaram variação do

delta do peso corporal em comparação ao grupo CTRL [ANOVA; F

(3,32)

=37,47;

p=0,001; CTRL∆=1,8; HI∆=0,9; PSP∆=-5,1; HI-PSP∆=-5,6].

A ANCOVA, seguida do teste post hoc de Newman-Keuls [ANCOVA;

(3,31)

=3,03; p<0,05], mostrou que houve diminuição estatisticamente significativa na

concentração de homocisteína dos ratos submetidos à PSP e à HI-PSP em

comparação aos ratos do grupo CTRL (p<0,01) e HI (p<0,03). As concentrações de

cisteína permaneceram inalteradas após a exposição à HI e/ou PSP [ANCOVA;

(3,31)

=0,93; p=0,43].

Os ratos dos grupos PSP e HI-PSP apresentaram redução estatisticamente

significativa na concentração de triglicérides [ANCOVA; F

(3,31)

=3,39; p<0,04] e

VLDL-colesterol [ANCOVA; F

(3,31)

=3,69; p<0,03] em comparação aos grupos CTRL

(p<0,001) e HI (p<0,001). Não houve diferença estatisticamente significativa entre

os grupos na concentração de colesterol total e as frações HDL-colesterol e LDL-

colesterol [ANCOVA; F

(3,31)

=0,12; p=0,94; F

(3,30)

=0,52; p=0,67; F

(3,23)

=0,33; p=0,79,

respectivamente] e nos níveis séricos das vitaminas folato, B

e B

[ANCOVA;

(3,31)

=0,94; p=0,43; F

(3,31)

=0,45; p=0,71 e F

(3,31)

=1,02; p=0,39, respectivamente].

Resultados – Artigo Publicado II

135

Tabela 7. Efeitos da exposição à HI e/ou PSP (3 dias) no peso corporal e nos

fatores bioquímicos de risco cardiovascular em ratos.

CTRL HI PSP HI-PSP

Peso corporal inicial (g)

335,5 ± 18,0 340,5 ± 24,5 366,6 ± 62,0 348,6 ± 35,3

Peso corporal final (g)

340,2 ± 14,9 343,6 ± 24,3 347,2 ± 52,3 328,8 ± 30,6

Homocisteína (µM)

6,6 ± 0,7 6,1 ± 1,1 5,1 ± 0,6*# 4,9 ± 1,0*#

Cisteína (µM)

313,5 ± 27,7 306,2 ± 45,2 312,4 ± 16,9 326,1 ± 26,1

Triglicérides (mg/dL)

92,5 ± 26,0 104,0 ± 26,7 45,2 ± 18,6*# 43,4 ± 9,3*#

Colesterol total (mg/dL)

63,8 ± 9,8 60,5 ± 9,6 59,2 ± 18,8 60,2 ± 8,9

HDL (mg/dL)

42,5 ± 6,1 40,1 ± 6,7 42,1 ± 7,95 40,2 ± 4,8

LDL (mg/dL)

6,5 ± 1,9 5,6 ± 3,5 13,5 ± 8,19 11,3 ± 6,4

VLDL (mg/dL)

18,4 ± 5,3 21,0 ± 5,2 9,0 ± 3,7*# 8,6 ± 9,3*#

Folato (nmol/L)

27,6 ± 8,2 27,9 ± 7,6 28,5 ± 8,0 29,3 ± 6,9

Vitamina B

(nmol/L)

12,0 ± 1,5 11,1 ± 1,7 10,1 ± 1,5 10,4 ± 2,0

Vitamina B

(nmol/L)

1473,3 ± 255,2 1504,3 ± 248,5 1545,1 ± 238,9 1343,1 ± 212,8

Os valores estão representados pelas médias ± DP. ANCOVA, seguida do teste post hoc de

Newman-Keuls. *p<0,001 comparado com o grupo CTRL; #p<0,001 comparado com o grupo HI.

Discussão

136

7. DISCUSSÃO

7.1 Vantagens e limitações do modelo

No protocolo de hipóxia utilizado neste estudo, os animais foram alojados

dentro de uma câmara de acrílico e expostos à HI, que consiste na variação de O

de 10% a 21% a cada dois minutos por meio do fluxo dos gases N

e O

Durante o evento obstrutivo em indivíduos apnéicos, geralmente ocorre

dessaturação da oxihemoglobina de aproximadamente 80-85% e, em alguns

pacientes, esses níveis podem alcançar 60% (AASM, 1999). Nas primeiras horas

de exposição dos ratos a um ambiente com baixa concentração de O

, induzido

pela injeção de N

sem a adição de CO

, os ratos apresentaram aumento dos

valores de pH e redução do pO

pCO

arteriais (Tabela 2). Nossos dados

mostraram que a exposição dos ratos a ciclos de dois minutos de HI induziu, nos

animais, dessaturação da oxihemoglobina de aproximadamente 50%. A queda na

saturação do O

arterial observada neste estudo foi similar aos resultados relatados

por Gozal e colaboradores (2001a). Além da redução de pO

, os ratos também

apresentaram declínio de CO

no sangue (hipocapnia).

Nas primeiras horas da exposição a um ambiente com baixa concentração

de O

, ocorre aumento na freqüência respiratória, tendo-se como resultado a

redução de pCO

arterial (Pappenheimer, 1984). A hiperventilação em resposta à

hipóxia foi acompanhada por alcalose respiratória em decorrência da redução de

pCO

arterial, enquanto o pH do sangue está elevado e a concentração de

bicarbonato no sangue diminuída. Entretanto, Pappenheimer (1977) demonstrou

que o efeito da hipóxia no padrão de sono está mais relacionado à redução do O

do ambiente que aos efeitos secundários inerentes a alguns protocolos de hipóxia,

tal como a alcalose respiratória. Assim, em relação aos efeitos sobre o sistema

cardiovascular, foi verificado que o aumento da pressão arterial observado em ratos

após a exposição crônica à HI ocorre devido à hipóxia e não em resposta à adição

do CO

(Bao et al., 1997b).

Discussão

137

Para evitar a influência da hipocapnia ou hipercapnia (aumento de CO

sangue), alguns autores propuseram um protocolo experimental que utiliza uma

mistura composta pelos gases O

(10%) e CO

(2 a 5%) com balanço do gás N

(Decker et al., 2003; 2005). Os animais, quando expostos a essa composição de

gases, apresentam um estado de hipoxemia, sem desenvolver um quadro de

hipercapnia ou hipocapnia, e conseqüente acidose ou alcalose respiratória. Assim,

a adição de CO

na composição dos gases sustenta a concentração de CO

arterial

em uma escala normativa, o que mimetiza o quadro de hipóxia-isocapnia sem

corresponder à hipocapnia ou hipercapnia.

Durante o evento obstrutivo em humanos, a interrupção da ventilação

resulta em redução da ventilação alveolar. Em resposta a essa redução, ocorrem

hipercapnia e acidose respiratória. Embora a hipóxia-isocapnia minimize os

confundidores fisiológicos em potencial induzidos pela alteração da pCO

arterial

em ratos, essa metodologia não foi capaz de induzir o mesmo desarranjo ácido-

básico que acompanha o evento de apnéia. No entanto, é importante ressaltar que,

algumas semanas após a exposição à hipóxia sem a adição de CO

, similar ao

modelo de hipóxia utilizado neste estudo, os níveis de saturação da oxihemoglobina

são restaurados parcialmente, a hiperventilação diminui gradualmente e os níveis

do CO

estabilizam-se (West, 1982). Logo, podemos afirmar que a HI é um modelo

de SAOS incompleto, uma vez que os ratos não apresentam obstrução das vias

aéreas superiores e hipercapnia. Entretanto, ocorreu saturação da oxihemoglobina

de 50 a 60%, semelhante à observada nos pacientes com SAOS. Portanto, nessa

condição experimental, os ratos foram avaliados sobre o efeito da hipóxia per se.

Em relação ao padrão de sono, estudos que utilizaram protocolos de

hipóxia com concentrações de O

moderadas (10%) apresentaram efeitos sutis na

arquitetura do sono em roedores, em relação àqueles com concentrações mais

baixas de O

(5%) (Gozal et al., 2001a; Veasey et al., 2004; Polotsky et al., 2006).

Gozal e colaboradores (2001a) observaram redução na duração do sono de ondas

lentas e paradoxal nos ratos expostos à HI a 10% (ciclos de 90 segundos, 12 horas

por dia), sendo que essas alterações ocorreram somente após o primeiro dia de

exposição à hipóxia. No segundo dia, os autores observaram aumento de sono de

ondas lentas e paradoxal nos ratos, indicativo de rebote do sono. Já entre os dias 3

Discussão

138

a 14 de exposição à HI, as características do sono foram similares aos padrões

basais. No entanto, os pacientes apnéicos apresentam fragmentação do sono e

conseqüente redução do sono delta e do sono REM e aumento da vigília e dos

estágios 1 e 2 do sono NREM (Bittencourt et al., 2001). Assim, devido à ausência

de modelos animais adequados para fragmentação do sono, verificou-se a

relevância de investigar os efeitos da privação de sono associada à hipóxia.

7.2 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

paradoxal nas avaliações comportamentais e neuroquímicas

Os resultados mostraram que os ratos expostos à HI e/ou PSP

durante 3 dias consecutivos e avaliados no labirinto em cruz elevado não

apresentaram diferença nas porcentagens do tempo de permanência e no número

de entradas nos braços abertos e fechados. Porém, nos ratos submetidos à PSP,

foi observado aumento no número de entradas nos braços fechados em

comparação aos ratos dos grupos CTRL e HI. Nos parâmetros neuroquímicos,

observou-se aumento na concentração de adrenalina no estriado e de HVA no

hipocampo nos ratos submetidos à PSP. A alteração comportamental e o aumento

da concentração de adrenalina no estriado não foram observados quando a HI foi

associada à PSP. No entanto, foi observado aumento na concentração sérica de

corticosterona tanto nos ratos do grupo PSP quanto do grupo HI-PSP.

O labirinto em cruz elevado é o instrumento mais utilizado em modelos

animais para avaliação da ansiedade (Pellow et al., 1985; File, 1992). Esse modelo

foi baseado no conflito entre dois comportamentos inatos dos roedores: a esquiva

de ambientes abertos e a tendência a explorar novos ambientes (Pellow et al.,

1985). Os parâmetros analisados neste estudo foram as porcentagens do tempo

gasto e do número de entradas nos braços abertos e fechados. De fato, animais

tratados com drogas ansiolíticas entram mais vezes, bem como permanecem mais

tempo nos braços abertos. Por outro lado, animais tratados com drogas

ansiogênicas apresentam aumento do número de entradas e do tempo de

permanência nos braços fechados. Os resultados mostraram que a exposição à HI

Discussão

139

e/ou PSP por 3 dias não alteraram as porcentagens de permanência e o número de

entradas tanto nos braços abertos quanto nos braços fechados. Nesse sentido,

nosso grupo já demonstrou que ratos submetidos à PSP durante 4 dias

consecutivos não apresentaram alteração na ansiedade quando comparados aos

animais CTRL, utilizando os métodos plataforma única (Suchecki et al., 2002) e

plataforma múltipla (Andersen et al., 2005a).

Alguns estudos da literatura têm demonstrado que, além do comportamento

de ansiedade, o número de entradas nos braços fechados está associado à

atividade exploratória dos animais (Pellow et al., 1985; Pellow e File, 1986; File,

1992; Padovan e Guimarães, 2000). Nossos resultados mostraram que a PSP

aumentou o número de entradas nos braços fechados sem alterar a porcentagem e

que esse parâmetro pode estar associado ao aumento da atividade exploratória dos

animais submetidos ao labirinto em cruz elevado. No entanto, essa alteração não

foi observada nos ratos dos grupos HI e HI-PSP. Esses dados sugerem que a HI

reverteu o aumento do comportamento exploratório induzido pela PSP.

Os resultados obtidos na atividade exploratória corroboram dados

anteriores do nosso grupo, que demonstraram que a PSP aumentou a locomoção

dos ratos (Tufik e Silveira Filho, 1983). Porém, Andersen e colaboradores (2005a)

ao investigarem os efeitos da PSP durante 4 dias consecutivos, não observaram

alteração da atividade motora dos ratos avaliados no campo aberto. Essa

diversidade de resultados encontrados no modelo de PSP provavelmente está

associada à metodologia empregada. No estudo de Tufik e Silveira Filho (1983) e

neste estudo, os ratos foram submetidos à PSP pelo método da plataforma única,

enquanto Andersen e colaboradores (2005a) utilizaram o método da plataforma

múltipla, em que se mantêm grupos de 10 animais no tanque de PSP. O método

da plataforma única contém variáveis adicionais que podem mascarar a

interpretação dos resultados. Nesse método, o animal é submetido a, pelo menos,

dois tipos de estresse: isolamento social e imobilização (Kovalzon e Tsibulsky,

1984). Para minimizar o estresse proveniente do isolamento social, foi elaborada

uma gaiola de alumínio com orifícios, que permitia a mútua observação dos

animais. Uma vez que a imobilidade é um fator inerente ao método da plataforma

Discussão

140

única, especulamos que essa imobilização possa influenciar a atividade

exploratória dos animais quando submetidos a um novo ambiente.

Diversos autores demonstraram que as monoaminas como DA, NA e 5-HT

estão envolvidas na regulação do ciclo vigília-sono em mamíferos (Boutrel e Koob,

2004; Siegel, 2004). Além disso, os efeitos da privação de sono sobre o organismo

estão associados à alteração da neurotransmissão central. Considerando que as

variações nos sistemas de neurotransmissão, como dopaminérgico, noradrenérgico

e serotoninérgico influenciam o comportamento de ansiedade nos ratos (Handley e

McBlane, 1993; Maisonnette et al., 1993; Martijena et al., 1997) e que as regiões do

sistema límbico, tais como o núcleo accumbens, a amígdala, o hipocampo e o

córtex frontal, participam da manutenção do comportamento emocional (Goldstein

et al., 1996), avaliamos os efeitos da exposição à HI e/ou PSP na concentração de

monoaminas em regiões do cérebro dos ratos relacionadas à ansiedade. Nossos

resultados demonstraram que a HI, além de não modificar os parâmetros

comportamentais avaliados, também não alterou as concentrações de monoaminas

analisadas. Entretanto, a PSP aumentou significativamente a atividade exploratória

dos animais, bem como as concentrações de adrenalina no estriado. Um dado

relevante foi que essas alterações não foram encontradas nos ratos do grupo HI-

PSP.

Dados da literatura mostram que as projeções adrenérgicas no sistema

nervoso central estão amplamente envolvidas na regulação do ciclo vigília-sono

(Pace-Schott e Hobson, 2002; Berridge e Waterhouse, 2003). Os neurônios do

locus coeruleus estão em intensa atividade durante a vigília ativa, em menor

atividade durante a vigília relaxada, reduzem, ainda mais, sua atividade durante o

sono NREM e silenciam-se completamente durante o sono REM (Foote et al., 1980;

Aston-Jones e Bloom, 1981). De fato, a ativação de diversos fatores de transcrição

associados à vigília foi regulada positivamente pelo sistema adrenérgico (Cirelli et

al., 1996; Cirelli e Tononi, 2000). Além disso, ratos submetidos à PSP por 4 dias

consecutivos apresentam down-regulation dos receptores β-adrenérgicos em várias

áreas do cérebro (Hipolide et al., 1998) e alterações comportamentais induzidas por

agonistas e antagonistas noradrenérgicos (Andersen et al., 2005d).

Discussão

141

As alterações comportamentais observadas em resposta à ação de drogas

dopaminérgicas após PSP podem ser explicadas pela supersensibilidade de

receptores dopaminérgicos pós-sinápticos (Tufik et al., 1978; Tufik, 1981) ou

subsensibilidade dos receptores dopaminérgicos pré-sinápticos (Tufik et al., 1987).

Porém, contrariamente ao esperado, a concentração de DA, um neurotransmissor

amplamente associado ao ciclo vigília-sono, não se alterou após a exposição à

PSP por 3 dias em nenhuma das regiões estudadas.

Neste estudo, foi observado aumento na concentração de corticosterona

sérica nos ratos submetidos à PSP e à HI-PSP. Resultados similares, relativos à

PSP, foram previamente descritos por Suchecki e colaboradores (2002) e por

Andersen e colaboradores (2005b). O aumento de corticosterona poderia

influenciar as análises comportamentais e bioquímicas; entretanto, Andreatini e

Leite (1994) mostraram que a administração aguda de corticosterona induziu um

efeito ansiolítico nos ratos submetidos ao labirinto em cruz elevado. Além disso,

esses autores observaram que a administração repetida de corticosterona não

modificou o comportamento dos animais (Andreatini e Leite, 1994). Os ratos

expostos à HI associada à PSP durante 3 dias consecutivos apresentaram aumento

da concentração de corticosterona, sem modificar o comportamento e a

concentração de monoaminas no sistema nervoso central dos ratos. Logo, as

alterações induzidas pela PSP parecem não estar relacionadas a uma resposta ao

estresse propriamente dito.

O estresse é um fator inerente ao método de privação de sono. Na tentativa

de encontrar um grupo controle adequado para mimetizar o estresse induzido pela

privação de sono, pesquisadores do nosso grupo propuseram algumas alternativas.

Suchecki e Tufik (2000) testaram um grupo controle no qual os ratos foram alojados

em um tanque idêntico ao utilizado na privação de sono, mas mantidos sobre uma

grade. No entanto, esse grupo apresentou rebote de sono após o período de

privação, sugerindo que houve perda de sono. Posteriormente, outros estudos do

nosso grupo demonstraram que diferentes modalidades de estresse (natação

forçada, imobilização, choque nas patas e frio) também produziram alterações no

padrão de sono dos ratos (Palma et al., 2000; Papale et al., 2005). Esse fato

Discussão

142

dificulta a utilização de um grupo controle que minimize o estresse da privação de

sono sem modificar o padrão de sono.

Embora a exposição à HI (10% de O

) não ocasione modificações

relevantes no padrão de sono em ratos (Gozal et al., 2001a), a hipóxia induziu

prejuízo da memória espacial, bem como morte neuronal no córtex e na região CA

do hipocampo (Gozal et al., 2001a,b). Esses resultados variam conforme o tempo

de exposição dos animais à HI, uma vez que houve um pico na morte neuronal

após 48 horas de exposição à HI (Gozal et al., 2001a). Nossos resultados

mostraram que a HI, por um período similar (3 dias), não foi capaz de modificar

nenhum dos parâmetros comportamentais e neuroquímicos estudados. Entretanto,

os ratos do grupo HI-PSP não apresentaram alteração da atividade exploratória no

labirinto em cruz elevado, provavelmente pela influência da hipóxia no sistema

adrenérgico.

A hipóxia induz à redução da oxigenação no cérebro e apresenta

“vulnerabilidade seletiva” em locais específicos como nos neurônios do córtex, do

estriado e do hipocampo (Gozal et al., 2001a,b; Payne et al., 2004; Decker et al.,

2005). Ratos expostos a uma baixa concentração de O

apresentaram redução da

taxa de síntese e do turnover de NA e DA (Miwa et al., 1986). De fato, os neurônios

dopaminérgicos são sensíveis à hipóxia (Miwa et al., 1986; Decker et al., 2003,

2005). O cérebro possui reserva limitada de O

e pouca habilidade de manter-se

em ambientes anaeróbios; portanto, os neurônios reduzem a demanda metabólica

ao diminuírem sua atividade (Neubauer e Sunderram, 2004). Apesar do aumento

das concentrações de HVA no hipocampo, não foram observadas no presente

estudo alterações nas concentrações de adrenalina estriatal quando a PSP foi

associada à HI. De fato, a maioria dos neurônios responde ao insulto de hipóxia,

reduzindo a demanda metabólica.

Alguns estudos sugerem que a hipóxia, a perda ou a fragmentação de sono

interferem nos processos de homeostase e restaurativos que ocorrem durante o

sono (Bonnet, 1986; Beebe e Gozal, 2002). Os dados da literatura indicam que os

neurônios são considerados as células mais sensíveis ao ambiente de anoxia

(Bickler e Donohoe, 2002). Entretanto, eles têm a capacidade de adaptar-se a um

Discussão

143

ambiente limitado de O

e desencadear mecanismos para manter a integridade e

as funções do cérebro em circunstâncias fisiológicas desfavoráveis. Certamente, os

resultados obtidos quando a PSP foi associada à HI são mais difíceis de interpretar.

Provavelmente as respostas da hipóxia refletem as mudanças neurofisiológicas

devido às alterações no sistema de neurotransmissão. Durante o estado de vigília,

as concentrações do lactato cortical aumentam (Shram et al., 2002). Além disso,

ratos privados de sono apresentam redução nas concentrações extracelulares de

glicogênio do cérebro (Kong et al., 2002), sugerindo um aumento do metabolismo

neuronal. O lactato contribui ativamente para o fornecimento da demanda

energética neuronal que está diretamente relacionada à transmissão sináptica.

Entretanto, a disponibilidade reduzida do O

induz depleção de ATP no neurônio

devido à inibição da atividade glicolítica e mitocondrial (Kahlert e Reiser, 2004).

Portanto, a diminuição do metabolismo celular e conseqüente redução da atividade

neuronal implicam redução da transmissão sináptica.

Os resultados obtidos neste estudo indicam que a PSP induziu alterações

comportamentais associadas à modificação da neurotransmissão central. Os

animais expostos somente à HI não apresentaram alterações nos parâmetros

avaliados; entretanto, a associação da HI à PSP foi capaz de reverter o aumento

da atividade exploratória e da adrenalina no estriado induzido pela PSP. Ao

associar a PSP à depleção de oxigênio, os parâmetros comportamentais e

neuroquímicos foram similares aos valores encontrados nos ratos do grupo CTRL.

Assim, a investigação dos efeitos produzidos pela PSP e/ou HI em ratos

pode contribuir para o melhor entendimento dos efeitos da baixa oxigenação no

sistema nervoso central em condição de privação de sono.

7.3 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou restrição de sono

nas avaliações comportamentais e neuroquímicas

Após a exposição crônica, nossos dados mostraram que a RS aumentou a

atividade motora dos ratos, sem modificar a concentração das catecolaminas e a

Discussão

144

expressão da enzima tirosina hidroxilase. A exposição crônica à HI não foi capaz de

modificar nenhum dos parâmetros motores observados nos ratos; entretanto,

reduziu a concentração de NA no estriado dos animais. Essa alteração também foi

observada no grupo HI-RS. Na avaliação cognitiva, observou-se que a RS não

modificou a aquisição e a retenção da memória dos animais na tarefa de esquiva

inibitória; porém, foi observado prejuízo da habituação. Ao se considerar apenas a

distância percorrida, os ratos do grupo HI também apresentaram prejuízo da

habituação. Somente os ratos submetidos à PSP durante 4 dias consecutivos

apresentaram prejuízo na aquisição e retenção na tarefa de esquiva inibitória em

comparação ao grupo CTRL.

Em relação à avaliação motora realizada em diferentes tempos de

exposição à HI e/ou RS, nossos resultados demonstraram que, independente da

condição experimental, os ratos não apresentaram diferenças estatísticas em

nenhum dos parâmetros durante a avaliação basal. Por outro lado, a exposição à

RS e à HI-RS durante 4 dias aumentou a locomoção (distância percorrida), a

velocidade e freqüência de levantar. Esse aumento na atividade motora também

ocorreu após 7, 14 e 21 dias. As exposições sucessivas à caixa de atividade

reduziram a locomoção e a freqüência de levantar somente dos animais CTRL em

comparação à análise basal. Além disso, foi observada diminuição da freqüência de

levantar nos ratos do grupo HI em comparação ao basal. Em relação à duração de

imobilidade, após 14 dias foi verificada redução desse parâmetro nos ratos dos

grupos RS e HI-RS em comparação aos grupos CTRL e HI. Não foram observadas

diferenças estatísticas entre os grupos na duração de limpeza.

A HI não modificou nenhum dos parâmetros motores avaliados. No entanto,

Row e colaboradores (2002) verificaram que ratos neonatais (décimo dia pós-natal -

PN10) expostos à HI durante 14 dias apresentaram aumento da atividade motora

quando submetidos ao campo aberto, com 30 dias de idade. Esses dados são

corroborados pelo estudo de Decker e colaboradores (2003) que observaram

aumento da atividade motora em ratos jovens submetidos à HI durante a fase de

desenvolvimento neuronal (PN7-P11). Esses autores relataram que o aumento da

atividade motora está associado ao aumento de VMAT

e D

no estriado.

Entretanto, ratos expostos à hipóxia (2% de O

) durante a vida adulta apresentaram

Discussão

145

redução da atividade motora após uma única sessão de 20 minutos. Portanto, a

ausência de alteração motora nos animais do grupo HI neste estudo pode estar

relacionada a diferentes fatores como idade dos animais (neonatal versus adulto),

tempo de exposição à hipóxia (minutos versus dias) ou gravidade da hipóxia (2%

versus 10%).

A hipóxia moderada (10% de O

) está associada a alterações

comportamentais mediadas pelo aumento de perda neuronal (Goldbart et al., 2003;

Gozal et al., 2001a,b). Estudos mostram que a HI induz à morte neuronal no córtex

e na região CA

do hipocampo, sem alterar a região CA

de ratos (Gozal et al.,

2001a,b). Os autores observaram que essa alteração foi tempo-dependente, sendo

que o pico na morte neuronal ocorreu após 48 horas de exposição à HI (Gozal et

al., 2001a). Além disso, foi observada ausência dessa diferença após 14 dias de

exposição à HI (Gozal et al., 2001a).

A exposição à HI leva ao prejuízo na memória espacial, o que foi observado

tanto em ratos jovens (Gozal et al., 2001a; Row et al., 2002) como em ratos idosos

submetidos ao labirinto aquático de Morris (Gozal et al., 2003a). Neste estudo, ao

se observar o parâmetro distância percorrida, os ratos submetidos à HI

apresentaram prejuízo na habituação após serem submetidos a sucessivas

avaliações na caixa de atividade (4, 7, 14 e 21 dias). Porém, não foi verificado

prejuízo na aquisição e retenção da memória na tarefa de esquiva inibitória (5 e 21

dias). Nesse sentido, alguns autores sugerem que o prejuízo da memória espacial

está associado ao tempo de exposição dos animais à HI (Gozal et al., 2003b; Row

et al., 2007).

Gozal e colaboradores (2003b) demonstraram que ratos submetidos à HI

durante 7 dias apresentaram prejuízo na memória espacial quando avaliados no

labirinto aquático de Morris e, após a exposição crônica à HI (14 e 30 dias), essa

alteração na memória não foi observada. Segundo os autores, tal resultado pode

estar associado ao efeito bifásico da HI observado em função do aumento de

neurogênese no hipocampo. Nessa análise, que avalia a proliferação neuronal, foi

verificado que ratos expostos à HI durante 1e 3 dias apresentaram redução das

células marcadas para BrdU e, após 7 dias, não foi observada alteração desse

Discussão

146

parâmetro. Na análise realizada após 14 e 30 dias de exposição à HI, os ratos

apresentaram aumento da proliferação neuronal no hipocampo. Assim, podemos

sugerir que a ausência da alteração cognitiva no grupo de HI na esquiva inibitória

pode estar relacionada ao tempo de exposição à HI ou em função das diferenças

entre as tarefas da memória empregada nos dois estudos (esquiva inibitória versus

labirinto aquático de Morris).

Uma hipótese alternativa para explicar o aumento da atividade motora nos

ratos submetidos à RS poderia ser o prejuízo na habituação. Os ratos, quando

expostos a um novo ambiente, aumentam o comportamento exploratório (Thiel et

al., 1999). Após exposições subseqüentes ao mesmo contexto, sem a presença de

estímulos positivos ou aversivos, os animais apresentam tendência a diminuir essa

resposta. Portanto, considera-se a habituação uma tarefa de aprendizagem de

contexto não-associativa (Thiel et al., 1999; Leussis e Bolivar, 2006) e hipocampo-

dependente, caracterizada a partir de estudos que avaliaram os efeitos de lesões

(Wright et al., 2004) ou pela manipulação farmacológica (Vianna et al., 2001) nessa

região do encéfalo. Nesse sentido, alguns autores já demonstraram que a privação

de sono implica prejuízo de tarefas hipocampo-dependentes, tais como a versão

espacial do labirinto aquático de Morris (Beaulieu e Godbout, 2000; Guan et al.,

2004), o medo condicionado ao contexto (Graves et al., 2003) e a esquiva inibitória

(Bueno et al., 1994; Moreira et al., 2003; Dubiela et al., 2005). Assim, o aumento

observado na atividade exploratória nos ratos do grupo RS e HI-RS pode estar

relacionado ao prejuízo na tarefa de habituação. Consistente com a literatura,

nossos resultados demonstraram que ratos submetidos à PSP durante 4 dias

consecutivos apresentaram prejuízo na aquisição e na retenção da tarefa de

esquiva inibitória. O protocolo de RS não induziu nenhuma alteração nessa tarefa

aversiva. No entanto, alguns estudos verificaram que a intensidade do choque

(estímulo incondicionado) alterou a resposta aos fármacos que causam prejuízo

cognitivo (Quiroz et al., 2003). Assim, a administração intra-hipocampal de

tetrodoxina induziu prejuízo na aquisição e retenção da tarefa de esquiva inibitória

somente nos ratos que receberam um choque de 1,0 mA nas patas durante a

sessão de treino. Essa alteração não foi observada nos ratos treinados em uma

condição experimental com choque de 0,8 mA (Quiroz et al., 2003). Apesar da

análise de diversas intensidades de choque realizada previamente neste estudo, na

Discussão

147

condição experimental de RS a intensidade do estímulo incondicionado empregado

deveria ser reduzida. Por outro lado, a alteração discreta da arquitetura de sono

dos ratos, como ocorre no protocolo de RS, pode explicar a ausência dos efeitos da

RS na tarefa de esquiva inibitória.

A ritmicidade circadiana é definida como um padrão temporal com duração

de aproximadamente 24 horas, como por exemplo, o ritmo vigília-sono. Nesse

sentido, nosso grupo demonstrou que os ratos dormem aproximadamente 12-13

horas por dia, sendo aproximadamente 8-9 horas na fase clara e 4-5 horas na fase

escura (Machado et al., 2004). Os ratos submetidos ao protocolo experimental de

RS proposto por Machado e colaboradores (2005) concentram a fase de sono no

horário das 10h às 16h. Nesse período compensam a perda do sono paradoxal e

sono de ondas lentas. Durante todo o procedimento, os ratos dormem em média de

30-40% do tempo, o que corresponde a 8-9 horas por dia (Machado et al., 2005).

No entanto, durante o período de PSP por 4 dias consecutivos, os animais

submetidos ao método da plataforma única apresentaram supressão do sono

paradoxal e diminuição de 39% do tempo total de sono de ondas lentas (Machado

et al., 2004).

Após a sessão de treino da tarefa de esquiva inibitória, os ratos do

grupo PSP foram alojados em gaiolas contendo serragem, sendo permitido que os

animais dormissem. No período de rebote, observou-se aumento significativo na

porcentagem de sono paradoxal (104%) em comparação com o registro basal

(Machado et al., 2004). Nossos dados sugerem que diferentes intensidades de

perturbações na arquitetura do sono podem influenciar na aquisição e retenção da

memória. Além disso, uma mesma intensidade de PSP (4 dias consecutivos) em

diferentes horários (início: 8h, 14h, 20h e 2h) também induz prejuízo na memória

em ratos (Rolim, 2007).

Outro fator que pode interferir nos efeitos da PSP na memória é o estresse

inerente ao método empregado (Vertes e Eastman, 2000). Ratos adrelectomizados

e privados de sono apresentaram prejuízo na memória espacial no labirinto

aquático de Morris, demonstrando que o déficit na aquisição da tarefa está

associado à exposição pré-treino dos ratos à PSP e não aos efeitos secundários à

Discussão

148

resposta da adrenal ao estresse (Ruskin et al., 2006). Nesse sentido, nossos

resultados mostram que os ratos expostos à RS apresentaram aumento da

concentração de corticosterona previamente demonstrado nos ratos submetidos à

PSP durante 4 dias (Suchecki et al., 2002; Andersen et al., 2005b), e os ratos

submetidos à HI-RS não alteraram os níveis de corticosterona; no entanto,

apresentaram o mesmo prejuízo cognitivo que os animais restritos de sono.

Embora existam várias evidências dos efeitos deletérios da hipóxia e da

privação de sono no cérebro, pouco se conhece a respeito da regulação da

expressão da tirosina hidroxilase e da síntese das catecolaminas após a exposição

crônica a esses dois fatores. Nossos resultados mostram que as manipulações

experimentais não modificaram a expressão da enzima tirosina hidroxilase na

substância negra e no estriado. Além disso, apenas os ratos dos grupos HI e HI-RS

reduziram a NA no estriado. Entretanto, Li e colaboradores (1996) observaram em

ratos submetidos à HI (35 dias) aumento da concentração de NA e diminuição do

turnover de DA no hipotálamo e, conseqüentemente, aumento da atividade motora.

De acordo com Gozal e colaboradores (2005), nossos dados mostraram

que a expressão da proteína tirosina hidroxilase não foi alterada pela HI. Embora a

exposição crônica à HI e à HI-SR não tenha alterado a expressão da tirosina

hidroxilase na substância negra e no estriado, ambos os grupos apresentaram

redução na concentração de NA estriatal. De fato, as concentrações de NA

diminuem após a exposição à HI em diversas regiões do encéfalo (Roubein et al.,

1981; Miwa et al., 1986). Roubein e colaboradores (1981) verificaram que os níveis

de monoaminas retornaram às concentrações basais após 36 horas de exposição à

HI. Esses achados sugerem que o cérebro pode adaptar-se a uma condição de

baixa oxigenação (Roubein et al., 1981).

Evidências descritas na literatura sugerem que o sistema dopaminégico

desempenha um papel importante na regulação do sono (Tufik et al., 1978; Tufik,

1981; Andersen et al., 2005a,b,c; Andersen e Tufik, 2005; Dzirasa et al., 2006; Lima

et al., 2007). Nesse sentido, demonstrou-se que a lesão seletiva da via

nigroestriatal, que por sua vez provoca redução da neurotransmissão

dopaminérgica nessa via (Da Cunha et al., 2001; Perry et al., 2004) foi capaz de

Discussão

149

gerar importantes prejuízos no padrão de sono em ratos, em particular de sono

paradoxal (Lima et al., 2007). Contrariamente ao esperado, a concentração de DA

não apresentou alteração após a exposição à RS em nenhuma das regiões

estudadas. Estudos realizados por nosso grupo demonstraram que a PSP induziu

intensificação da resposta dopaminérgica (Tufik et al., 1978; Tufik, 1981),

evidenciada pelo aumento da agressividade e do comportamento estereotipado

induzidos por apomorfina, um agonista direto de receptores dopaminérgicos (Tufik

et al., 1978; Tufik, 1981). Tais achados levaram os autores a sugerir a hipótese de

que a PSP induzia supersensibilidade dos receptores dopaminérgicos pós-

sinápticos (Tufik et al., 1978; Tufik, 1981) e subsensibilidade dos receptores

dopaminérgicos pré-sinápticos (Tufik et al., 1987). Posteriormente, esse dado,

corroborado ao estudo autorradiográfico do encéfalo de ratos submetidos a 4 dias

consecutivos de PSP, mostrou aumento da densidade dos receptores D

no núcleo

accumbens e no caudado-putâmen (Nunes et al., 1994). Aproximadamente 30 anos

mais tarde, Dzirasa e colaboradores (2006) relataram que a DA participa

ativamente na regulação do ciclo vigília-sono e que sua ação foi mediada pelos

receptores D

dopaminérgicos. Porém, nossos dados mostraram que a RS não

modificou a expressão da enzima tirosina hidroxilase e a concentração de

catecolaminas em nenhuma das regiões observadas. A avaliação da expressão da

tirosina hidroxilase, enzima passo limitante na síntese de catecolaminas, é uma

ferramenta útil para avaliar a atividade funcional do sistema de neurotransmissão

catecolaminérgico no cérebro. Uma hipótese para explicar o aumento da atividade

motora observada nos ratos do grupo RS seria a supersensibilidade dos receptores

dopaminérgicos. Embora essa suposição possa ser razoável dentro do contexto da

PSP, ainda permanece desconhecido se os efeitos observados na atividade motora

dos ratos restritos de sono podem ser explicados por esse mecanismo.

Assim, nossos resultados demonstraram que as modificações no

comportamento e nos sistemas de neurotransmissão induzidas pela HI e pela PSP

são distintas. Além disso, diversos fatores, tais como: a concentração de oxigênio,

a duração da exposição à hipóxia, a idade dos ratos, podem influenciar a resposta

da hipóxia.

Discussão

150

7.4 Efeitos da exposição à hipóxia intermitente e/ou privação de sono

nos fatores bioquímicos sangüíneos associados ao risco cardiovascular

Os resultados observados mostraram que a exposição à HI durante 3 ou 4

dias não modificou os parâmetros bioquímicos avaliados. Os ratos submetidos à

PSP durante 4 dias apresentaram redução das concentrações de triglicérides e do

VLDL-colesterol em comparação ao grupo CTRL, e aumento das concentrações de

colesterol total e do HDL-colesterol nos ratos PSP em comparação ao grupo HI. As

concentrações de triglicérides e do VLDL-colesterol permaneceram reduzidas

quando a PSP foi associada à HI. Entretanto, os animais expostos à HI-PSP não

apresentaram nenhuma alteração dos níveis de colesterol total e do HDL-colesterol

como observado no grupo submetido à PSP. Todavia, não foram verificadas

diferenças estatísticas entre esses grupos nas concentrações de homocisteína,

cisteína, do LDL-colesterol e das vitaminas B

, B

e folato.

Após a exposição crônica à HI, foi observada redução dos níveis da

vitamina B

e aumento de triglicérides e do VLDL-colesterol. Os ratos dos grupos

RS e HI-RS apresentaram redução dos níveis de triglicérides e do VLDL-colesterol.

Nos ratos submetidos à RS por 21 dias, observou-se redução da concentração de

homocisteína; entretanto, os animais do grupo HI-RS não apresentaram alteração

desse parâmetro. Nesse grupo verificou-se aumento da concentração de cisteína

em comparação aos grupos CTRL, HI e RS. Não foram observadas alterações dos

níveis de colesterol total, HDL-colesterol e das vitaminas folato e B

entre os

grupos após a exposição crônica à HI e/ou RS.

A redução na concentração de oxigênio arterial induz alterações em todos

os sistemas, sendo o sistema cardiovascular, em particular, vulnerável aos efeitos

da hipóxia (Fletcher et al., 1992a,b; Fletcher, 1995; Bao et al., 1997a; Hui et al.,

2003). No entanto, após a exposição à HI durante 3 ou 4 dias não foi observada

nenhuma alteração dos parâmetros bioquímicos sangüíneos avaliados. Nossos

resultados diferem daqueles relatados por Li e colaboradores (2005a), que

demonstraram que a exposição à HI durante 5 dias (5% de O

– 12 horas na fase

clara do ciclo) aumentou as concentrações séricas dos triglicérides, de colesterol

total, de HDL-colesterol e dos fosfolipídeos em camundongos. Essa aparente

Discussão

151

contradição entre os dois estudos pode estar relacionada a dois fatores: 1)

Diferenças na gravidade da hipóxia: Li e colaboradores (2007) observaram que

concentrações de oxigênio, 5% versus 10%, foram capazes de produzir diferentes

alterações metabólicas; 2) Diferenças nas respostas metabólicas existentes entre

as espécies: camundongos versus ratos.

Durante a apnéia de sono em humanos, ocorrem variações na pressão

intratorácica induzida pelo esforço respiratório, hipoxemia e fragmentação de sono,

que afetam o sistema nervoso autônomo e o sistema cardiovascular. Nesse

sentido, estudos experimentais utilizando modelos animais também têm mostrado a

relação entre a hipóxia e a hipertensão. Em cães, a obstrução das vias aéreas

superiores durante o sono, simulando variações na pressão intratorácica,

hipoxemia e despertares, induziu aumento da pressão arterial diurna após quatro

semanas (Brooks et al., 1997). Neste estudo, entre os fatores avaliados, a hipóxia,

como sugerido pelos autores, tem um papel importante no aumento da pressão

arterial. Fletcher e colaboradores (1992a) demonstraram que a HI (5% de O

)

produziu aumento da pressão arterial em roedores. Essa alteração da pressão

arterial, após a HI prolongada, foi atribuída à modificação da sensibilidade dos

barorreceptores carótidos (Fletcher et al., 1992b; Lesske et al., 1997) e ao aumento

da atividade tanto do sistema nervoso simpático (Bao et al., 1997a; Fletcher, 2000)

como do sistema renina-angiotensina (Fletcher et al., 1999). Além disso, Hui e

colaboradores (2003), utilizando um protocolo de HI similar ao do presente estudo

(10% de O

), observaram aumento na pressão arterial dos ratos somente após 30

dias de HI. Assim, esses estudos sugerem que o aumento de pressão em ratos

submetidos à HI, independente da gravidade do insulto de hipóxia (5% ou 10%),

está relacionado ao tempo de exposição dos animais a essa condição

experimental.

Para elucidar essa questão, foram investigados os efeitos da exposição

crônica à HI e/ou RS nos parâmetros sangüíneos associados aos fatores de risco

cardiovascular em ratos. No modelo utilizado neste estudo, os ratos foram

submetidos ao protocolo de HI (5% de O

) no período das 10h às 16h durante 21

dias. Após a exposição crônica à HI, foram observados a redução da concentração

Discussão

152

da vitamina B

e o aumento dos níveis de triglicérides e do VLDL-colesterol nos

animais.

A vitamina B

é um dos componentes que participa da remoção da

homocisteína. Alguns estudos têm identificado a elevada concentração de

homocisteína plasmática como fator de risco ao desenvolvimento e progressão de

doenças cardiovasculares (Selhub, 1999). A homocisteína é um aminoácido

sulfurado que apresenta um grupo sulfidrila em sua estrutura. Esse aminoácido não

é um constituinte da dieta nem formador de proteínas, mas é produzido

exclusivamente como um produto intermediário do metabolismo intracelular da

metionina (Finkelstein e Martin, 2000). O metabolismo da homocisteína está situado

entre duas vias metabólicas: a da remetilação e a da transulfuração. Na

remetilação, para formar a metionina, a reação é dependente de folato e da

vitamina B

. Na via de transulfuração, que ocorre principalmente no fígado e nos

rins, a enzima cistationina β-sintase condensa a homocisteína com serina para

formar a cistationina por meio de uma reação irreversível dependente de vitamina

, formando, ao final, a cisteína. Assim, a vitamina B

pode alterar o metabolismo

da homocisteína reduzindo a atividade da enzima serina hidroximetiltransferase e

suprimindo o catabolismo da homocisteína (Selhub, 1999). No entanto, a redução

da vitamina B

induzida pela exposição crônica à HI não foi acompanhada pelo

aumento da concentração plasmática de homocisteína nem pela redução da

cisteína. Dados da literatura demonstraram que a deficiência da vitamina B

está

associada à elevação da concentração de homocisteína do plasma (Miller et al.,

1992), embora esse efeito seja menos pronunciado que a deficiência de folato

(Miller et al., 1994).

Em relação ao aumento sérico de triglicérides e do VLDL-colesterol após a

exposição crônica à HI, os dados observados evidenciaram um efeito tempo-

resposta da hipóxia. Li e colaboradores (2005b, 2006) verificaram que a HI durante

5 dias aumenta a síntese dos triglicérides no fígado por meio da up-regulation da

proteína de ligação ao elemento de resposta a esterol (SREBP)-1, e do aumento da

atividade da estearoil-CoA desaturase (SCD)-1, enzima de síntese de triglicérides

que acelera a síntese de ácidos graxos mono-insaturados, conseqüentemente

aumentando a síntese de triglicérides, elevando seus níveis tanto no fígado como

Discussão

153

no soro. Além disso, a HI aumenta a atividade de transcrição do fator de indução à

hipóxia (HIF)-1 (Cai et al., 2003, Yuan et al., 2005), sugerindo que a HIF-1 possa

regular a via do SREBP-1, aumentando assim a síntese dos lipídeos. Embora os

resultados obtidos na concentração de triglicérides no presente estudo não

corroboram os achados de Li e colaboradores (2005a) depois da exposição à HI (4

dias), foi observado aumento desse parâmetro bioquímico após a exposição

crônica (21 dias). Provavelmente, as diferenças do metabolismo entre as espécies

(rato versus camundongo) podem contribuir para uma resposta rápida da hipóxia no

perfil lipídico de camundongos devido ao metabolismo acelerado desses animais.

Além disso, não podemos refutar a hipótese de que a gravidade dos efeitos da

hipóxia associada ao tempo de sua exposição desempenha um papel importante

nas alterações do metabolismo dos lipídeos em ratos.

Dados da literatura mostram que a PSP por 4 dias pode alterar os

parâmetros sangüíneos associados ao risco cardiovascular (de Oliveira et al., 2002;

Andersen et al., 2004a). Em concordância, nossos resultados mostraram que a

PSP durante esse período aumentou o colesterol total e o HDL-colesterol em

comparação aos grupos HI e HI-PSP; entretanto, reduziu a concentração sérica de

triglicérides e do VLDL-colesterol em comparação ao grupo CTRL. Anteriormente,

nosso grupo demonstrou aumento da concentração de LDL-colesterol (Andersen et

al., 2004a) e redução da homocisteína plasmática em ratos submetidos a 4 dias de

PSP (de Oliveira et al., 2002; Andersen et al., 2004a). Todavia, os resultados

observados no presente estudo demonstraram por meio da análise de ANCOVA

que esses dois parâmetros bioquímicos sangüíneos estão relacionados à perda de

peso corporal observada nos ratos. Nossos resultados mostraram que, após 4 dias

de PSP, os ratos reduziram o peso em 5,7%, sendo essa redução mais

pronunciada nos animais do grupo HI-PSP (7,7%) em comparação à avaliação

basal. A perda de peso corporal induzida pela PSP já foi verificada em diversos

estudos (Kushida et al., 1989; Martins et al., 2006). Recentemente, Martins e

colaboradores (2007) demonstraram que alguns componentes do metabolismo de

lipídios podem ser influenciados pela perda de peso corporal dos ratos submetidos

à PSP. Esses autores avaliaram os efeitos da PSP em ratos que receberam uma

dieta líquida rica em lipídeos comparados com a dieta convencional. Ao contrário

do grupo PSP, os ratos do grupo HI não apresentaram diferença no peso em

Discussão

154

comparação à avaliação basal. Portanto, a perda de peso observada nos ratos do

grupo HI-PSP ocorreu em função da PSP e não em decorrência da exposição à HI.

Em particular, a PSP durante 3 dias consecutivos foi capaz de reduzir a

concentração de homocisteína sem a interferência da perda de peso dos animais

como verificado após a análise da ANCOVA. Provavelmente esse resultado está

associado à pequena variação na perda de peso corporal no terceiro dia de PSP (-

5,1%) em relação ao quarto dia (-5,7%).

No modelo de RS, proposto por Machado e colaboradores (2005), também

foi verificada a redução no peso corporal. Nossos resultados mostraram que a

perda de peso nos animais restritos de sono no quarto dia foi similar ao que ocorre

após PSP por 4 dias consecutivos. Também foi observado nos animais HI-RS que,

após 7, 14 e 21 dias de PSP, o peso dos animais não apresentou alteração

significativa em comparação à avaliação realizada no quarto dia de experimento.

Os animais do grupo CTRL e HI apresentaram aumento no peso corporal após 14 e

21 dias, quando comparado ao peso basal. A exposição crônica à RS induz

alterações similares àquelas observadas após exposição à PSP, durante 4 dias,

nas concentrações de triglicérides e do VLDL-colesterol. Entretanto, a RS não

modificou a concentração de colesterol total e do HDL-colesterol como observado

após a exposição de 4 dias à PSP. Além disso, foi verificado redução da

concentração de homocisteína nos ratos restritos de sono. Nessa avaliação, a

perda de peso corporal induzida pela RS não influenciou nos parâmetros

bioquímicos analisados. A redução da concentração de homocisteína, observada

nos ratos RS, poderia ser explicada pela alteração de algum componente presente

no metabolismo da homocisteína. Contudo, neste estudo não foi observada

modificação da concentração de cisteína e das vitaminas folato, B

e B

. Futuros

estudos serão necessários para verificar a influência da RS na redução da

concentração de homocisteína plasmática.

Os resultados obtidos na análise da homocisteína plasmática não podem

ser relacionados ao estresse embora o método da plataforma única, utilizada neste

experimento para induzir a PSP, seja considerado como procedimento estressante

para o animal (Rechtschaffen e Bergmann, 2002; Suchecki et al., 2002; Andersen

et al., 2005b). Nesse sentido, de Oliveira e colaboradores (2004) demonstraram

Discussão

155

que o estresse agudo de imobilização (1 hora) aumentou a concentração

plasmática de homocisteína; outros estresses, como o frio e a natação forçada, não

afetaram esse parâmetro, conforme o autor. Além disso, durante a exposição à

hipóxia, o ruído produzido pela entrada de gases na câmara pode ser considerado

um fator estressante para os animais. No entanto, estresse acústico não induziu

alterações cardiovasculares em ratos (Bao et al., 1999).

No presente estudo, os animais do grupo HI-PSP apresentaram redução da

concentração de triglicérides e VLDL-colesterol, o que pode ser atribuído à resposta

da PSP sobre essas variáveis, já que os animais expostos à HI durante 4 dias não

modificaram nenhum dos parâmetros bioquímicos avaliados. Entretanto, os animais

expostos à HI-PSP não apresentaram nenhuma alteração dos níveis de colesterol

total e HDL-colesterol como observado no grupo submetido à PSP. A redução da

demanda de oxigênio, componente essencial na cascata respiratória e na produção

de ATP, pode acarretar diminuição da atividade celular. Diversos estudos da

literatura têm demonstrado as interações da HI com o sistema cardiovascular;

porém, poucos trabalhos avaliam o efeito do pré-condicionamento induzido pela

exposição repetida à hipóxia (Maulik e Das, 2002). Provavelmente, a diminuição do

metabolismo celular em resposta à redução de oxigênio sangüíneo levaria a hipóxia

a reverter o aumento induzido pela PSP tanto no colesterol total como na fração de

LDL-colesterol.

Após uma exposição prolongada à HI-RS, foi observada a redução das

concentrações de triglicérides e do VLDL-colesterol nos ratos. Esses resultados

foram similares àqueles obtidos após a exposição de 4 dias. Dado relevante foi

ausência da alteração da concentração de homocisteína nos animais do grupo HI-

RS, os quais apresentaram aumento da concentração de cisteína. Esse resultado

corrobora o estudo de Cintra e colaboradores (2007), que demonstraram aumento

da concentração de cisteína plasmática nos pacientes apnéicos. Portanto, destaca-

se o modelo de HI-RS como uma ferramenta útil para a compreensão dos

mecanismos envolvidos no aumento da cisteína plasmática nos pacientes com

SAOS.

Discussão

156

Em relação às avaliações do sistema cardiovascular, um fator limitante do

presente estudo foi a análise pontual dos parâmetros. Dados da literatura têm

demonstrado que os efeitos da HI no sistema cardiovascular em ratos ocorrem

após uma longa exposição dos animais a esse protocolo (Fletcher et al., 1992a,b;

Fletcher, 1995; Bao et al., 1997; Hui et al., 2003). No entanto, Lai e colaboradores

(2006) observaram aumento da pressão arterial em ratos expostos à hipóxia

durante 5 dias. Essa aparente contradição entre os dois estudos pode estar

associada à metodologia empregada. No presente trabalho, realizou-se a avaliação

em um único momento dos parâmetros sangüíneos bioquímicos, enquanto no

estudo de Lai e colaboradores empregou-se uma avaliação refinada da pressão

arterial com a utilização da telemetria, permitindo a investigação de parâmetros

fisiológicos no ciclo de 24 horas. Futuros estudos, utilizando-se uma metodologia

mais refinada (telemetria), poderão contribuir para uma melhor avaliação da

influência da privação de sono e da hipóxia na ritmicidade do sistema

cardiovascular.

Tomados em conjunto, os resultados obtidos neste estudo indicam que a

PSP induziu alterações comportamentais associadas à modificação da

neurotransmissão adrenérgica central. Os animais expostos somente à HI não

apresentaram alterações nos parâmetros avaliados; entretanto, ao associar a

privação de sono à depleção de oxigênio, os parâmetros comportamentais e

neuroquímicos avaliados foram similares aos valores encontrados nos ratos do

grupo CTRL. A exposição crônica à HI reduziu a concentração de NA no estriado,

modulando seletivamente os sistemas de neurotransmissão central, sem modificar

o comportamento e a função cognitiva dos ratos. Todavia, o aumento da atividade

motora nos ratos restritos de sono não foi associado a alterações nas

concentrações de catecolaminas e na expressão da enzima tirosina hidroxilase no

sistema nervoso central. A exposição à RS não modificou aquisição e retenção da

memória dos animais na tarefa de esquiva inibitória; porém, foi observado prejuízo

cognitivo detectado somente na tarefa não-associativa. A PSP (4 dias) e a RS (21

dias) modificaram os fatores bioquímicos associados ao risco cardiovascular.

Embora as alterações induzidas pela HI nos parâmetros bioquímicos sangüíneos

sejam tempo-dependentes, a exposição à HI associada à PSP reverteu as

modificações induzidas pela PSP. Além disso, a HI não foi capaz de antecipar

Discussão

157

nenhuma alteração nos parâmetros bioquímicos sangüíneos, induzida pela PSP.

Nossos resultados sugerem que a HI e a RS modificam o sistema nervoso central e

o cardiovascular por mecanismos distintos.

Finalmente, os dados acima apresentados mostram que as respostas

obtidas neste estudo podem ser influenciadas em parte em função da privação de

sono paradoxal e não pela hipóxia per se. Nesse aspecto, estudos futuros que

avaliem os efeitos causados pela hipóxia deverão utilizar especificamente um

estímulo que leve à fragmentação de sono sem hipóxia para determinar se as

perturbações no sono podem, de forma independente, prejudicar as variáveis

analisadas. Assim, investigar se a associação da hipóxia e privação de sono

exercem alguma influência no sistema cardiovascular e sistema nervoso central

pode ser útil no desenvolvimento de um melhor modelo animal para avaliar

alterações presentes nas doenças respiratórias durante o sono.

Conclusões

158

8. CONCLUSÕES

O modelo animal testado, que associa hipóxia à privação de sono, através

da avaliação das alterações comportamentais, cognitivas e cardiovasculares,

demonstrou que:

(1) A PSP induziu aumento da atividade exploratória, que foi acompanhada

pelo aumento na concentração de adrenalina no estriado. Os animais

expostos à HI não apresentaram alterações nos parâmetros

comportamentais e neuroquímicos; no entanto, a associação com a

PSP reverteu as modificações induzidas pela PSP.

(2) Cronicamente, a HI reduziu a concentração de noradrenalina no

estriado sem modificar o comportamento motor e a função cognitiva

dos ratos. O aumento da atividade motora observado nos ratos

submetidos à RS não está associado às alterações nas concentrações

catecolaminérgicas e na expressão da enzima tirosina hidroxilase. A

exposição à RS não modificou a memória dos animais na tarefa de

esquiva inibitória; entretanto, foi observado prejuízo da habituação.

(3) A PSP, a RS e a exposição crônica à HI influenciaram os fatores

bioquímicos associados ao risco cardiovascular. A HI associada à PSP

reverteu as modificações induzidas pela PSP.

(4) A HI não foi capaz de antecipar nenhuma alteração nos parâmetros

bioquímicos sangüíneos induzidos pela PSP.

Com base nos resultados obtidos e nas condições experimentais do

presente trabalho, conclui-se que a hipóxia e a privação de sono modificam os

sistemas nervoso central e cardiovascular por vias distintas. Além disso, diversos

fatores, tais como: a concentração de oxigênio, a duração da exposição à hipóxia e

a idade dos ratos, podem influenciar a resposta da hipóxia nos parâmetros

avaliados.

Referências Bibliográficas

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Anexo

178

10. ANEXOS

Anexo 1: Carta de Aprovação do Comitê de Ética da UNIFESP

Anexo

179

Anexo 2: Ata de aprovação da tese.

Abstract

180

ABSTRACT

Obstructive sleep apnea (OSA) is characterized by repetitive obstruction of the

upper airways resulting in pauses in breathing and subsequent oxygen desaturation

and is associated with cardiovascular and cognitive comorbidities. However, it is not

possible to determine whether such effects in apneic patients are related to hypoxia

per se or whether they occur due to the frequency of arousals induced by breathing

alterations during sleep. Thus, this study was designed to determine the isolated

and combined effects of hypoxia and sleep loss in behavior, cognitive and blood

parameters related to cardiovascular risk in rats. Wistar male rats were exposed to

intermittent hypoxia (IH) during the light period (2 min room air - 2 min 10% O

for

12h/day) and/or paradoxical sleep deprivation (PSD - 24h/day) using the single

platform method. Consequences of chronic IH and/or sleep restriction (SR)

exposure were examined after 21 consecutive days of the hypoxia protocol from

1000-1600h followed by an SR period of 18h (1600 -1000h). Results showed that

PSD induced behavioral alterations associated to modification of adrenergic

neurotransmission. Chronic exposure to IH reduced the concentration of

norepinephine in the striatum, without modifying behavior and cognitive function in

rats. Indeed, the increase of motor activity observed in rats of the SR group was not

associated with the alterations in the concentration of catecholamine and tyrosine

hydroxylase protein expression in the central nervous system. Exposure to SR did

not affect acquisition/retention on the inhibitory avoidance task. PSD (4 days) and

SR (21 days) modified the biochemical factors associated with cardiovascular risk.

Although the alterations that were induced by IH in biochemical parameters of blood

are time dependant, exposure to IH associated with PSD reversed the alterations

induced by PSD. Our results suggest that hypoxia and sleep loss modify

cardiovascular and central nervous systems in distinct ways.

Keywords: hypoxia; sleep deprivation; memory; cardiovascular system; rat.

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