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ANDRÉ LUIS FACHINI DE SOUZA
CURITIBA
2007
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Ciências – Bioquímica, Setor de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Paraná,
como requisito parcial à obtenção do título de
Doutor em Ciências - Bioquímica.
Orientador: Prof
a
Dra Liu Un Rigo
Co-orientador: Prof
a
Dra Leda Satie Chubatsu
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES fdxA,
modB2, modE1 E modE2 DE Herbaspirillum seropedicae
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ANDRÉ LUIS FACHINI DE SOUZA
CURITIBA
2007
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES fdxA,
modB2, modE1 E modE2 DE Herbaspirillum seropedicae
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Ciências – Bioquímica, Setor de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Paraná,
como requisito parcial à obtenção do título de
Doutor em Ciências - Bioquímica.
Orientador: Prof
a
Dra Liu Un Rigo
Co-orientador: Prof
a
Dra Leda Satie Chubatsu
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AGRADECIMENTOS
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização e
divulgação deste trabalho,
Agradeço as professoras Dr.
a
Liu Un Rigo e Dr.
a
Leda Satie Chubatsu pela
orientação e amizade;
Ao professor Dr. Fábio de Oliveira Pedrosa pela oportunidade de trabalhar
no Laboratório de Fixação Biológica de Nitrogênio;
Ao professor Dr. Emanuel Maltempi de Souza pelo apoio e sugestões
durante o desenvolvimento deste trabalho;
Aos professores Dr.
a
Rose Adele Monteiro, Dr. Leonardo Magalhães Cruz,
Dr.
a
Maria Berenice Reynaud Steffens e Dr
a
Elaine Machado Benelli e aos demais
que de alguma forma contribuíram para o trabalho;
À Roseli Prado, Dona Ju e Valter pelo suporte técnico;
Agradeço também à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em
Bioquímica;
Agradeço a professora Dr.
a
Carmen Lúcia de Oleiveira Petkowicz por
incentivar meu ingresso no mestrado e por seus conselhos;
Gostaria de destacar meu agradecimento às agências financiadoras deste
trabalho, CNPq/MCT, Fundação Araucária, Fundo Paraná de Ciência e Tecnologia e
Instituto do Milênio/CNPq/PADCT;
A todos os amigos conquistados neste período e aos colegas de laboratório;
Meus sinceros agradecimentos aos meus familiares, em especial minha
mãe Lila e meu irmão Charles pelo incentivo;
À Deus.....
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS................................................................................................. v
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................. vi
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................... viii
RESUMO...................................................................................................................... ix
ABSTRACT................................................................................................................. x
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 1
1.1 FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO........................................................ 1
1.2 ORGANIZAÇÃO DOS GENES nif E mod EM DIAZOTROFOS 3
1.3 METABOLISMO DE MOLIBDATO.................................................................... 6
1.3.1 Transporte de Molibdato em Bactéria.................................................................. 8
1.3.1.1 Sistema de transporte de molibdênio e regulação em E. coli............................ 9
1.3.1.2 Proteína ModE................................................................................................... 15
1.4 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MOLIBDOENZIMAS EM E. coli............ 20
1.5 Herbaspirillum seropedicae.................................................................................... 23
2 OBJETIVOS............................................................................................................. 25
2.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................ 25
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................. 25
3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 26
3.1 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS............................................................................. 26
3.2 MEIOS DE CULTURA.......................................................................................... 28
3.3 ANTIBIÓTICOS..................................................................................................... 29
3.4 ESTOCAGEM......................................................................................................... 29
3.5 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA............................................................ 30
3.5.1 Mini-preparação de Plasmídeos........................................................................... 30
3.5.2 Extração de DNA Cromossomal.......................................................................... 31
3.5.3 Purificação de DNA em gel de Agarose de Baixo Ponto de Fusão...................... 31
3.6 ELETROFORESE EM GEL DE ÁGAR................................................................ 32
3.7 ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM........................................................................ 33
3.7.1 Digestão com Endonucleases de Restrição.......................................................... 33
3.7.2 Ligação de DNA................................................................................................... 33
3.8 TRANSFORMAÇÃO POR ELETROPORAÇÃO................................................. 34
3.8.1 Preparo de Células Eletrocompetentes................................................................. 34
3.8.2 Eletroporação........................................................................................................ 35
3.9 SEQUENCIAMENTO DE DNA............................................................................ 36
3.9.1 Reação de Sequenciamento.................................................................................. 36
3.9.2 Edição e Análise das Sequências.......................................................................... 36
3.10 MUTAGÊNESE.................................................................................................... 37
3.10.1 Mutagênese Sítio Dirigida.................................................................................. 37
3.10.2 Mutagênese de H. seropedicae........................................................................... 41
3.10.3 Hibridização de DNA (Southern Blot)............................................................... 41
3.10.3.1 Digestão do DNA cromossomal e separação em gel de agarose..................... 41
3.10.3.2 Transformação e fixação do DNA à membrana de
nylon..............................................................................................................................
42
3.10.3.3 Preparo da sonda de DNA marcada com [
32
P]dCTP....................................... 42
3.10.3.4 Pré-hibridização e hibridização....................................................................... 43
3.11 EXPERIMENTOS DE FISIOLOGIA................................................................... 44
3.11.1 Ensaio de Atividade da Nitrogenase em Meio Semi-sólido............................... 44
3.11.2 Ensaio de Desrepressão e Inativação Reversível da Nitrogenase por Amônio
(Switch off/on)............................................................................................................... 45
3.11.3 Ensaio de Atividade de β-galactosidase.............................................................
45
3.12 AMPLIFICAÇÃO E CLONAGEM DE modE1 E modE2................................... 46
3.13 INDUÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ModE1 E ModE2 EM
PEQUENA ESCALA.................................................................................................... 49
3.14 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ModE1 e ModE2........................ 50
3.14.1 Eletroforese de Proteína em Condições Desnaturantes (SDS-PAGE)............... 50
3.14.2 Purificação da Proteína His-ModE1................................................................... 52
3.14.3 Rompimento das Células e preparação dos Corpos de Inclusão........................ 53
3.14.4 Solubilização, Redobramento e Cromatografia de Afinidade de His-ModE1... 53
3.14.5 Purificação da Proteína His-ModE2................................................................... 54
3.14.6 Dosagem de Proteína.......................................................................................... 55
3.15 ENSAIO DE LIGAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 E His-ModE2 A
DNA.............................................................................................................................. 55
3.15.1 Marcação Radioisotópica da Região Promotora do Gene modA2..................... 55
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 57
4.1 ORGANIZAÇÃO DOS GENES nif DE H. seropedicae........................................ 57
4.2 ANÁLISE DO GENE fdxA DE H. seropedicae...................................................... 59
4.2.1 Mutagênese do gene fdxA..................................................................................... 63
4.2.2 Ensaios Fisiológicos............................................................................................. 66
4.2.2.1 Análise transcricional do gene fdxA de H. seropedicae.................................... 66
4.2.2.2 Atividade da nitrogenase................................................................................... 68
4.3 ANÁLISE DOS GRUPOS DE GENES mod DE H. seropedicae........................... 74
4.3.1 Análise Transcricional do Gene modB2 de H. seropedicae................................. 84
4.3.2 Atividade da Nitrogenase no Mutante modB2...................................................... 86
4.4 AMPLIFICAÇÃO E CLONAGEM EM VETOR DE EXPRESSÃO DOS
GENES modE1 E modE2..............................................................................................
88
4.5 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE1....................................................... 90
4.6 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE2....................................................... 94
4.7 ENSAIOS DE LIGAÇÃO DAS PROTEÍNA His-ModE1 E His-ModE2 NA
REGIÃO PROMOTORA DO GENE modA2...............................................................
97
4.7.1 Análise ds Região Promotora de modA2.............................................................. 97
4.8 ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 E His-ModE2 À
DNA..............................................................................................................................
100
5 CONCLUSÕES......................................................................................................... 107
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 109
LISTA DE TABELAS
TABELA
1 -
BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS UTILIZADOS................................................. 26
TABELA
2 -
COMPOSIÇÃO DOS MEOS DE CULTURA DE E. coli.................................. 28
TABELA
3 -
COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA NFbHP.......................................... 28
TABELA
4 -
ANTIBIÓTICOS UTILIZADOS PARA SELEÇÃO DE E. coli E H.
seropedicae........................................................................................................... 29
TABELA
5 -
SISTEMA DE MARCAÇÃO RADIOATIVA DE DNA UTILIZADO COMO
SONDA PARA HIBRIDIZAÇÃO DE DNA...................................................... 43
TABELA
6 -
ATIVIDADE DE β-GALACTOSIDASE EM H. seropedicae SMR1 CONTENDO
DIFERENTES CONSTRUÇÕES.................................................
67
TABELA
7 -
COMPARAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DOS
PRODUTOS DOS GENES modA1B1C1 E modA2B2C2 DE H.
seropedicae...........................................................................................................
76
TABELA
8 -
RESUMO DA PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 e His-ModE2 DE H.
seropedicae............................................................................................... 96
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 -
ESTRUTURA DOS COFATORES CONTENDO DE MOLIBDÊNIO. 7
FIGURA 2 -
SEQUÊNCIA DE DNA DA REGIÃO INTERGÊNICA ENTRE
modABC E modEF DE E. coli................................................................. 10
FIGURA 3 -
ARRANJO DOS DOMÍNIOS DAS PROTEÍNAS DO TIPO ModE
DESCRITAS............................................................................................ 17
FIGURA 4 -
ESTRUTURA DA PROTEÍNA ModE DE E. coli................................. 19
FIGURA 5 -
SEQUÊNCIA DE ALGUNS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE ModE........... 22
FIGURA 6 -
ESQUEMA DE MUTAGÊNESE DOS GENES fdxA E modB2 DE H.
seropedicae.............................................................................................. 39
FIGURA 7 -
ESQUEMA DE CLONAGEM DOS GENES modE1 E modE2............. 48
FIGURA 8 -
ESQUEMA DEPURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE1 DE H.
seropedicae.............................................................................................. 52
FIGURA 9 -
ORGANIZAÇÃO ESTRUTURAL DOS GENES mod E fdxA EM H.
seropedicae.............................................................................................. 58
FIGURA 10 -
ALINHAMENTO DA SEQUENCIA DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA FdxA DE H. seropedicae COM SEQUENCIAS DE
OUTRAS PROTEÍNAS SIMILARES....................................................
61
FIGURA 11 -
ALINHAMENTO DA SEQUENCIA DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS Fdx1 e Fdx2 DE H. seropedicae....................................... 62
FIGURA 12 -
HIBRIDIZAÇÃO DE DNA DO GENOMA DAS ESTIRPES DE H.
seropedicae SELVAGEM (SMR1) E MUTANTE fdxA (KC6 E KO3)
COM A SONDA HS05-MF-037-A04..................................................... 64
FIGURA 13 -
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA REGIÃO GENÔMICA
DAS ESTIRPES SELVAGEM SMR1 E MUTANTE KC6 APÓS
INTEGRAÇÃO DO CASSETE lacZ-Km............................................... 65
FIGURA 14 -
ATIVIDADE DA NITROGENASE DAS ESTIRPES SELVAGEM
SMR1 E MUTANTE KC6...................................................................... 69
FIGURA 15 -
EFEITO DA ADIÇÃO DE AMÔNIO NA ATIVIDADE DA
NITROGENASE..................................................................................... 71
FIGURA 16 -
ALINHAMENTO DAS SEQUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS ModA1 E ModA2 DE H. seropedicae COM OUTRAS
PROTEÍNAS ModA................................................................................ 77
FIGURA 17 -
ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS ModB1 e ModB2 DE H. seropedicae............................... 79
FIGURA 18 -
ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS ModC1 E ModC2 DE H. seropedicae.............................. 81
FIGURA 19 -
ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS ModE1 e ModE2 DE H. seropedicae............................... 83
FIGURA 20 -
ATIVIDADE DE β-GALACTOSIDASE EM H. seropedicae
ESTIRPES SELVAGEM (SMR1) E MUTANTE modB2 (13-30).........
85
FIGURA 21 -
ATIVIDADE DA NITROGENASE DAS ESTIRPES
SELVAGEM (SMR1) E MUTANTE NO GENE modB2 (13-30)
DE H. seropedicae..........................................................................
87
FIGURA 22 -
AMPLIFICAÇÃO DOS GENES modE1 E modE2 de H.
seropedicae.............................................................................................. 89
FIGURA 23 -
PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE1 SUPER-EXPRESSA
EM E. coli................................................................................................ 93
FIGURA 24 -
PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE2 SUPER-EXPRESSA
EM E. coli................................................................................................ 95
FIGURA 25 -
SEQUÊNCIA DE DNA DA REGIÃO INTERGÊNICA ENTRE
modA2B2C2 E modE2 DE H. seropedicae.............................................. 99
FIGURA 26 -
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 E
His-ModE2 NA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO À REGIÃO
PROMOTORA DE modA2 DE H. seropedicae NA AUSÊNCIA DE
MOLIBDATO......................................................................................... 102
FIGURA 27 -
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 E
His-ModE2 NA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO À REGIÃO
PROMOTORA DE modA2 DE H. seropedicae NA AUSÊNCIA DE
MOLIBDATO......................................................................................... 103
FIGURA 28 -
ENSAIO DE COMPETIÇÃO ENTRE OS FRAGMENTOS DE DNA
DA REGIÃO PROMOTORA DE modA2 MARCADO E NÃO
MARCADO PELA LIGAÇÃO A His-ModE1....................................... 104
FIGURA 29 -
ENSAIO DE COMPETIÇÃO ENTRE OS FRAGMENTOS DE DNA
DA REGIÃO PROMOTORA DE modA2 MARCADO E NÃO
MARCADO PELA LIGAÇÃO A His-ModE2....................................... 105
LISTA DE ABREVIATURAS
ADP adenosina difosfato
ATP adenosina trifosfato
Azul-de-
bromofenol
3’,3’’,5’,5’’-tetrabromofenol-sulfonaftaleína
pb pares de base
dNTP desoxinucleotídeo trifosfato
dCTP desoxicitosina trifosfato
DMSO dimetil sulfóxido
D.O. Densidade óptica
DTT ditiotreitol
EDTA ácido etileno diamono tetracético
IPTG
Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo
kb quilopares de bases nucleotídicas
kDa quilodalton
ONP orto-nitrofenil
ONPG
orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo
orf
seqüência potencialmente codificadora de proteína (open reading
frame)
PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida
PCR Reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)
PMSF Fenilmetil sulfonil fluorídio
RNAse ribonuclease
rpm rotações por minuto
SDS dodecil sulfato de sódio
TEMED N’,N’,N’,N’, tetrametil-etilenodiamina
Tris tris-(hidroximetil)-aminometano
UV radiação ultravioleta
RESUMO
Na região a jusante dos genes estruturais da nitrogenase de Herbaspirillum
seropedicae (nifHDKENXorf1orf2) estão localizados os genes fdxA (codifica uma
ferredoxina do tipo 2[4Fe-4S]) e os genes nifQmodA1B1C1, relacionados com o
transporte e incorporação de molibdênio em cofatores de molibdoenzimas. O gene
fdxA foi mutagenizado pela inserção sítio-dirigida de um cassete lacZ-Km. Uma
estirpe de H. seropedicae fdxA
-
foi construída e apresentou redução de 75% na
atividade da nitrogenase comparada com a estirpe selvagem. O fenótipo
apresentado, a localização do gene fdxA e sua cotranscrição com os genes nifHDK
revelada por ensaios usando o gene repórter lacZ, sugerem o envolvimento de FdxA
no transporte de elétrons para a nitrogenase ou biossíntese dos cofatores metálicos
da nitrogenase. Entretanto, o produto do gene fdxA mostrou não estar envolvido no
desligamento da nitrogenase em resposta à adição de íons amônio. Este resultado
que contrasta com o obtido em Azoarcus onde a mutação do gene fdxN, que codifica
uma ferredoxina 2[4Fe-4S], a jusante de nifENX levou a diminuição da inibição
reversível da nitrogenase dependente de NH
4
+
. Além dos genes modA1B1C1
localizados a jusante de fdxA, a análise da sequência genômica de H. seropedicae
revelou um segundo grupo homólogo aos genes envolvidos com a captação de
molibdato pela célula (modA2B2C2) e dois genes do tipo modE (modE1 e modE2),
possíveis reguladores transcricionais deste sistema. Mutantes no gene modB2
apresentaram atividade da nitrogenase semelhante a da estirpe selvagem e análises
de expressão modB2::lacZ indicaram que este gene é transcrito em condições de
limitação de molibdato no meio de cultura. As proteínas ModE1 e ModE2 foram
expressas e purificadas. A proteína recombinante (His)
6
-ModE1 foi super-expressa
como corpo de inclusão, solubilizada com uréia e renaturada em coluna durante a
purificação por cromatografia de afinidade. A proteína (His)
6
-ModE2 foi expressa
na fração solúvel e também foi purificada por cromatografia de afinidade. Essas
proteínas foram analisadas quanto a capacidade de ligar na região promotora de
modA2 através de ensaios de retardamento de banda em gel. As proteínas foram
capazes de retardar a migração de DNA no ensaio, sugerindo a participação na
regulação da expressão dos genes modABC.
ABSTRACT
In the region downstream from the H. seropedicae nitrogenase structural genes
(nifHDKENXorf1orf2) are present the genes fdxA (codes for a 2[4Fe-4S] ferredoxin)
and the nifQmodA1B1C1 genes, related to the molybdate incorporation and
transport. The fdxA gene was mutagenized by lacZ-Km insertion and the H.
seropedicae fdxA mutant strain showed 75% reduction in nitrogen fixation activity
compared to the wild type strain. The fdxA is also co-transcribed with nifHDK, as
shown by lacZ reporter gene fusion, suggesting the involvement of FdxA in electron
transport to nitrogenase or in the biosynthesis of the nitrogenase metal cofactors.
Thereafter, the product of the fdxA gene is not involved in the nitrogenase switch
off/on process in response to ammonium. The genomic sequencing has revealed a
second similar set genes of molybdate uptake, modA2B2C2 and two potential
molybdate-dependent transcriptional regulators genes (modE1 and modE2). A
modB2 mutant strain showed nitrogenase activity similar to the wild strain and the
analysis of the expression of modB2::lacZ indicated that modB2 is expressed under
molybdate.The proteins (ModE1 and ModE2) were expressed and purified. The
recombinant His-ModE1 protein was expressed as inclusion bodies, solubilized with
urea, and on-column refolded during affinity chromatography. His-ModE2 was
purified by affinity chromatography from the soluble fraction. Both proteins were
assayed for DNA-binding activity. The results indicated that His-ModE1 and His-
ModE2 bound to modA2 promoter region, suggesting they may be involved in the
regulation of the molybdate transport in H. seropedicae.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO
A fixação biológica de nitrogênio é a conversão de nitrogênio atmosférico
(N
2
) em amônia (NH
3
) realizada por alguns organismos procariotos que podem ser
simbióticos, associativos ou de vida livre (POSTGATE, 1985; CAPONE, 2001).
O nitrogênio atmosférico não pode ser usado diretamente pelos sistemas
biológicos para sintetizar componentes químicos essenciais como proteínas e ácidos
nucléicos. Este composto é um dos principais nutrientes limitantes do crescimento
de plantas. O uso de fertilizantes químicos é muito importante para a produção de
alimentos, sendo indispensável para a agricultura moderna (BOHLOOL et al., 1992;
CAPONE, 2001).
O nitrogênio fixado presente no ambiente é perdido por processos de
denitrificação microbiana, erosão, volatilização, além da remoção de resíduos de
plantações contendo nitrogênio. A reserva de nitrogênio nos solos destinados à
agricultura deve ser mantida em níveis adequados visando maximizar a
produtividade agrícola. Portanto, o nitrogênio dos solos removido pelas culturas
agrícolas é reposto pela adição de nitrogênio quimicamente fixado na forma de
fertilizantes comerciais ou pela fixação biológica de nitrogênio (CAPONE, 2001).
A redução biológica do dinitrogênio atmosférico à amônia é catalisada pelo
complexo enzimático nitrogenase. Este complexo é formado pela Fe-proteína e pela
MoFe-proteína (DEAN, BOLIN e ZHENG, 1993).
A Fe-proteína ou dinitrogenase redutase é uma proteína dimérica (γ
2
),
contendo um núcleo metálico 4Fe-4S capaz de transportar elétrons para a proteína
MoFe (GIORGIADIS et al., 1992).
A MoFe-proteína ou dinitrogenase, maior componente do complexo, é um
tetrâmero (α
2
β
2
) que contém dois tipos de centros redox, o grupo P ([8Fe-7S]) e o
cofator FeMo (7Fe-9S-Mo-Y-homocitrato), onde Y é provavelmente um átomo de N
2
(KIM e REES, 1992; EINSLE et al., 2002; HINNEMANN e NORSKOV, 2003). O
grupo P media a transferência intramolecular de elétrons para o cofator FeMo
(FeMoco), o qual é o sítio de ligação e redução do substrato (REES e HOWARD,
2000).
Todos os diazotrofos codificam uma nitrogenase contendo um cofator
FeMo, porém em condições limitantes de molibdênio, alguns organismos sintetizam
nitrogenases alternativas contendo cofatores V-Fe (Azotobacter vinelandii,
Rhodobacter capsulatus) ou Fe-Fe (Azotobacter vinelandii, Rhodobacter capsulatus,
Rhodospirillum rubrum) (PAU, MITCHENALL e ROBSON, 1989; SCHNEIDER et
al., 1991; DAVIS et al., 1996; EADY, 1996).
A estequiometria da reação catalisada pela nitrogenase é descrita pela
equação (1) (SIMPSON e BURRIS, 1984):
N
2
+ 8H
+
+ 8e
-
+ 16MgATP → 2NH
3
+ H
2
+ 16MgADP + 16Pi (1)
O fluxo de elétrons através da nitrogenase nesse processo envolve
primeiramente a redução da Fe-proteína por proteínas doadoras de elétrons
(ferredoxinas e/ou flavodoxinas), seguido pela transferência de elétrons da Fe-
proteína para a MoFe-proteína, de uma maneira dependente da hidrólise de MgATP,
e a transferência intramolecular de elétrons, do grupo P para o FeMoco, sítio de
ligação e redução do substrato (HAAKER e KLUGKIST, 1987).
As vias pelas quais os elétrons são transportados para a nitrogenase são
parcialmente conhecidas. Tem sido proposto que flavodoxinas ou ferredoxinas
atuam como doadoras diretas de elétrons para a nitrogenase. Em Azotobacter
chroococcum, foi demonstrado que uma flavodoxina transfere elétrons para a
nitrogenase in vitro (YATES, 1972; DEISTUNG e THORNELEY, 1986). Em
Klebsiella pneumoniae, esse processo envolve uma flavodoxina (nifF) e uma
piruvato:flavodoxina oxidoredutase (nifJ). Extratos de células da estirpe selvagem
de K. pneumoniae reduziram acetileno na presença de piruvato como redutor. Já
3
extratos de mutantes nifF foram inativos, porém a atividade foi estimulada com a
adição da flavodoxina de A. chroococcum (HILL e KAVANAGH, 1980). O
acoplamento da oxidação do substrato de carbono e o transporte de elétrons para a
atividade da nitrogenase em K. pneumoniae envolve a transferência de elétrons para
a piruvato flavodoxina oxidoredutase NifJ, seguido pela transferência de elétrons
para a flavodoxina NifF que transfere elétrons para a proteína Fe da nitrogenase
(HILL e KAVANAGH, 1980; DEISTUNG et al., 1985).
Em outros diazotrofos há evidências que sugerem que ferredoxinas atuam em
uma cadeia de transporte de elétrons para a nitrogenase como em Bradyrhizobium
japonicum, Rhodospirillum rubrum, Azoarcus sp. e Rhodobacter capsulatus
(HAUSER et al., 2007; EDGREN e NORDLUND, 2005; EDGREN e
NORDLUND, 2006; EGENER et al., 2001; JOUANNEAU et al., 1995).
Em R. rubrum, o transporte de elétrons para a nitrogenase se dá por duas
vias: uma utilizando o produto dos genes fix, em condições heterotróficas e outra
através de uma piruvato:ferredoxina oxidoredutase (nifJ), em condições anaeróbicas.
Em ambos os sistemas, a ferredoxina FdxN parece ser o doador direto de elétrons
para a Fe-proteína (EDGREN e NORDLUND, 2005; EDGREN e NORDLUND,
2006).
1.2 ORGANIZAÇÃO DOS GENES nif E mod EM DIAZOTROFOS
A organização dos genes nif é bastante variada entre os diazotrofos. Os
genes estruturais da nitrogenase (nifHDK) são trancritos como uma única unidade
transcricional em organismos como em Sinorhizobium meliloti, Rhizobium
leguminosarum e Gluconacetobacter diazotrophicus (CORBIN, BARRAN e
DITTA,1983; KROL et al., 1982; LEE et al., 2000). Em alguns casos, os genes
nifHDK são separados em dois operons (nifH e nifDK) como em Bradyrhizobium
japonicum (FISCHER e HENNECKE, 1984). Em outros organismos o operon
nifHDK é transcrito juntamente com outros genes como em Azotobacter vinelandii
4
(nifHDKnifTYorf1orf2) e Azospirillum brasilense (nifHDKorf1nifY) (JACOBSON et
al., 1989; PASSAGLIA et al., 1991).
Em A. brasilense o maior grupo de genes nif está localizado em uma região
de aproximadamente 40 kb formada por três operons: nifHDKorf1nifY,
nifENXorf3orf5fdxAnifQ e nifUSVorf4 (GALIMAND et al., 1989; FRAZZON e
SCHRANK, 1998; POTRICH et al., 2001).
Em K. pneumoniae, os genes nif estão agrupados em oito unidades
transcricionais, entre elas nifHDKTY e nifENX (MERRICK, 1992).
Em alguns organismos tais como R. capsulatus, A. diazotrophicus e H.
seropedicae são encontrados também genes envolvidos na captação de molibdato
pela célula (modABC) na região nif (WANG, ARGERMÜLLER e KLIPP, 1993;
LEE et al., 2000; KLASSEN, 2000)
Em R. capsulatus os genes modABC estão localizados imediatamente a
jusante dos genes nifHDKnifU
II
nifR4 nifA
II
nifB
II
, em direção oposta e organizados
em uma unidade transcricional juntamente com o gene mopA (mopAmodABCD). O
gene mopB está localizado imediatamente a jusante de mopA e transcrito em direção
oposta ao operon mopAmodABCD (WANG, ARGERMÜLLER e KLIPP, 1993).
A expressão dos genes modABCD de R. capsulatus não é somente
controlada negativamente pelos níveis de molibdato, mas também é dependente da
proteína NtrC. Esse ativador transcricional somente é ativo sob condições limitantes
de nitrogênio e, portanto, o sistema de transporte de molibdato é expresso somente
sob condições de desrepressão da nitrogenase (WANG, ANGERMÜLLER e KLIPP,
1993; KUTSCHE, et al., 1996).
A expressão da Fe-nitrogenase (anfHFGK) de R. capsulatus é reprimida por
MoO
4
2-
e amônio. Esta regulação se deve à repressão da transcrição do gene anfA
que codifica um ativador transcricional específico dos genes estruturais desta
nitrogenase alternativa (WIETHAUS et al., 2006).
As proteínas reguladoras dependentes de molibdato de R. capsulatus,
MopA e MopB, possuem dois domínios Mop, similares ao domínio MopI da
5
proteína Mop de Clostridium pasteurianum na porção C-terminal, implicados com a
ligação a molibdato (WANG, ANGERMÜLLER e KLIPP, 1993; WIETHAUS et
al., 2006). Porém estas proteínas não são funcionalmente idênticas, apesar de ambas
serem capazes de reprimir a transcrição dos genes modABCD e anfA. Também
foram identificados em R. capsulatus uma proteína ligante de molibdato (Mop) e um
sistema do tipo ABC de função desconhecida (MorABC) formado por dois operons
transcritos divergentemente, morAB e morC e localizados em uma região distinta do
genoma. Em altas concentrações de molibdato as proteínas MopA e MopB ligam ao
oxiânion e reprimem a transcrição de morAB e morC, porém somente a proteína
MopA foi capaz de ativar dependentemente de molibdato a expressão de um gene do
tipo mop presente em uma região distinta do genoma de R. capsulatus (WIETHAUS
et al., 2006).
Dentre os organismos em que foram identificados genes de transporte de
molibdato, somente os de Anabaena variabilis, A. vinelandii, R. capsultus,
Staphylococcus carnosus e B. japonicum foram clonados, identificados e
caracterizados funcionalmente. Nestes organismos, com excessão de R. capsulatus,
os genes mod não estão localizados em uma região associada aos genes nif (THIEL,
PRATTE e ZAHALAK, 2002; WANG, ARGERMÜLLER e KLIPP, 1993; LUQUE
et al., 1993; NEUBAUER et al., 1999; DELGADO et al., 2006). Nestes organismos
molibdato é transportado por sistemas de alta afinidade e há indícios da presença de
outros sistemas de baixa afinidade capazes de transportar também este oxiânion
(MOUNCEY, MITCHENALL e PAU, 1995; WANG, ANGERMÜLLER e KLIPP,
1993; ZAHALAK et al., 2004; DELGADO et al., 2006; NEUBAUER et al., 1999).
6
1.3 METABOLISMO DE MOLIBDATO
Molibdênio é um metal de transição necessário para a maioria dos
organismos vivos. As poucas espécies que não necessitam de molibdênio requerem
tungstênio, o qual apresenta características químicas semelhantes. Estes metais
podem participar de sistemas de oxi-redução de transferência de um ou dois elétrons.
As enzimas contendo estes metais são fundamentais na catálise de etapas-chave no
metabolismo de carbono, nitrogênio e enxofre (HILLE, 2002).
O molibdênio é encontrado nos cofatores de enzimas sob a forma de centro
multinuclear de ferro e molibdênio, como o cofator FeMo (FeMoco) (KIM e REES,
1992) (Figura 1A), presente na enzima nitrogenase, e principalmente na forma de
centros mononucleares de molibdênio (Moco), presente nas demais molibdoenzimas
(HILLE, 1996) (Figura 1B).
Em todos os casos de molibdoenzimas mononucleares conhecidas, o
cofator, chamado de molibdopterina (MPT), apresenta uma estrutura básica (Figura
1B-1). Estas enzimas são classificadas em duas famílias com base na química de
coordenação do Mo (Figura 1B-2 e 3). Em procariotos esse cofator pode sofrer
modificações através da ligação de outros nucleotídeos ao grupo fosfato terminal do
MPT, dando origem aos cofatores molibdopterina citosina dinucleotídeo (MCD),
molibdopterina guanina dinucleotídeo (MGD), molibdopterina adenina dinucleotídeo
(MAD) ou ainda bis-molibdopterina guanina dinucleotídeo (bis-MGD) (Figura 1B-4)
(SCHWARZ, 2005; SCHWARZ e MENDEL, 2006).
7
FIGURA 1 - ESTRUTURA DOS COFATORES CONTENDO MOLIBDÊNIO
FONTES: KIM e REES, 1992; SCHWARZ, 2005; SCHWARZ e MENDEL, 2006.
(A) Modelo do cofator FeMo (FeMoco) da nitrogenase de A. vinelandii (KIM e REES,
1992). Y provavelmente é um átomo de N (EINSLE et al., 2002).
(B) Estrutura dos cofatores de molibdênio e suas respectivas enzimas descritas nos
quadros. (1) estrutura básica do cofator pterina; (2) átomo de Mo é covalentemente
ligado a um resíduo de cisteína conservado; (3) possui um terceiro enxofre (não
protéico) ligado; (4) Mo bis-ditioleno coordenado; DMSO, dimetil sulfóxido;
TMAO, trimetilamina N-óxido (HILLE, 1996).
(A)
(B)
1
2
3
4
Eucariotos
N
itrato redutase
Sulfito oxidase
Eucariotos e Procariotos
Xantina desidrogenase
Aldeído oxidase
Procariotos
DMSO redutase
Formato desidrogenase
TMAO redutase
Sulfito oxidase
N
itrato redutase
8
1.3.1 Transporte de Molibdato em Bactéria
Transportadores do tipo ABC (ATP-binding cassette) desempenham um
papel central em muitos processos fisiológicos, facilitando a translocação de
substratos através da membrana celular (LOCHER, 2004). Muito destes sistemas
transportam moléculas associadas com proteínas ligantes presentes no periplasma de
bactérias gram-negativas ou ancoradas na membrana citoplasmática de bactérias
gram-positivas (NIKAIDO e HALL, 1998).
Molibdênio, na forma de oxiânion molibdato (MoO
4
2-
), é transportado para
o interior das células bacterianas por um sistema de transporte do tipo ABC
(LINTON e HIGGINS, 1998). O sistema de transporte de molibdato em bactéria é
formado pela proteína ModA, proteína periplasmática capaz de ligar o íon
molibdato; ModB, proteína integrante da membrana que forma um canal de
passagem de MoO
4
2-
e ModC, proteína que liga e hidrolisa ATP, fornecendo energia
para o sistema de transporte (SELF et al., 2001).
Os transportadores ABC requerem proteínas periplasmáticas que se ligam
aos solutos com alta afinidade e o dirigem para a face externa do transportador.
Pequenos substratos chegam até o periplasma por difusão através de poros formados
na membrana externa. Estes transportadores também possuem dois domínios
transmembrana que formam um canal para translocação do soluto, e duas
subunidades citoplasmáticas de ligação a nucleotídeo que hidrolisam ATP e dirigem
o transporte. A ligação e hidrólise de ATP promovem mudanças conformacionais
nos domínios transmembrana que permitem a passagem do soluto para o citoplasma.
(NIKAIDO e HALL, 1998; DAVIDSON e CHEN, 2004).
9
1.3.1.1 Sistema de transporte de molibdato e sua regulação em E. coli
Em E. coli os genes de transporte de molibdato e sua regulação estão
organizados em dois operons (RILEY et al., 2006). Os genes estruturais deste
sistema são codificados pelo operon modABC. A montante do gene modA e
transcrevendo na direção oposta está o operon modEF, onde o produto do gene
modE está envolvido na regulação do transporte de molibdato e modF possui função
desconhecida (Figura 2) (MAUPIN-FURLOW et al., 1995; GRUNDEN et al., 1996;
RILEY et al., 2006).
E. coli em condições de anaerobiose sintetiza um limitado número de
molibdoenzimas. Normalmente não é necessária a suplementação de meios de
cultivo com molibdato, pois o molibdato presente como contaminante de vários sais
é suficiente para permitir a síntese destas enzimas (SELF et al., 2001). Sob
condições limitantes, molibdato é transportado pelo sistema de alta afinidade
ModABC com um K
m
de ~26 nmol/L (CORCUERA, BASTIDAS e
DUBOURDIEU, 1993).
Estudos genéticos e fisiológicos mostraram que o molibdato pode ser
transportado em E. coli também pelo sistema de transporte de sulfato (cysTWA) e
por um transportador de ânions inespecífico (ROSENTEL et al., 1995). A
quantidade de molibdato necessária para a produção de níveis ótimos da
molibdoenzima formato-hidrogênio-liase (FHL) foi dez vezes maior quando o
sistema de transporte de sulfato foi utilizado por mutantes mod, comparada com a
quantidade requerida pela estirpe selvagem. Estirpes mutantes cysA, mod
+
foram
incapazes de utilizar o sistema de transporte de molibdato para transportar sulfato.
Quando cultivada em condições limitantes de molibdato, a qual permite a
desrepressão do operon mod, a estirpe mutante cysA apresentou fenótipo cys
+
. Esses
resultados mostram que molibdato e sulfato podem ser transportados por ambos os
sistemas, mas o uso específico dos sistemas depende da regulação e da
disponibilidade de um ou de outro ânion (ROSENTEL et al., 1995).
10
FIGURA 2 - SEQUÊNCIA DE DNA DA REGIÃO INTERGÊNICA ENTRE
modABC E modEF DE E. coli.
FONTE: Adaptado de RECH, DEPPENMEIER e GUNSALUS, 1995; GRUNDEN e
SHANMUGAM, 1997; GRUNDEN et al., 1999
Localização na região intergênica modE-modABC de seqüências importantes para a transcrição e
regulação dos genes modE e modABC de E. coli. Estas regiões estão indicadas na figura e descritas
como segue:
- Regiões 1, 2 e 3 são regiões protegidas da clivagem por Dnase I no complexo ModE-DNA;
- +1, sítio de início de transcrição;
- -35/-10, prováveis regiões promotoras de modA e modE;
- * assinalam as bases hiper-sensíveis à clivagem por Dnase I na presença de ModE;
- Setas indicam regiões de repetição invertida que podem formar uma estrutura em grampo;
- Os tetrâmeros GTTA estão indicados na figura.
CAT AACAATG TCC TGGCAAAAGTCTTATTGTGACGGAAAACGAACGCCACGCAAAGCTGACCGCACAAAAGGGGAGTG
500 pb
modF modE modA modB modC
g
al
E
795,3 kb 801,3 kb
y
bhA
modE
CTTTTCTGTGCTTAGCGGTT AGAATA GTCTCATGACTATA TCTGGA GTTGACCATGTTAGAGTT – 140 nt – TCCCTG
-35 -10
AATGCCCGCTTAGTCGGGCATT TTCTTTTTCTCAACTTCCTGCTTTTCCTGCCGATATTTTTTC TTATCTACCTCACAAAGGT
TAGCAATAACTGC TGGGAA AATTCCGAGTTAGTC GTTATATTG TCG CCTACAT AAC GTTACAT TAAGGGGTTACCA ATG
-10 -35
Re
g
ião 1 Re
g
ião 2 Re
g
ião 3
**
modA
+1
11
Gene modA – O gene modA de E. coli codifica uma proteína de 257 aminoácidos.
A seqüência de aminoácidos N-terminal de ModA é similar a seqüências sinal
encontradas em proteínas ligantes periplasmáticas (MAUPIN-FURLOW et al.,
1995).
A proteína ModA de E. coli foi super-expressa e isolada do espaço
periplasmático. ModA purificada teve sua extremidade N-terminal seqüenciada,
revelando que os primeiros 24 aminoácidos N-terminais da pró-proteína ModA de
257 aminoácidos foi removido durante o processo de secreção da proteína madura
para o periplasma. A proteína ModA madura (233 aminoácidos) apresentou massa
molecular aparente determinado por SDS-PAGE de 22,5 kDa e a proteína nativa de
31,6 kDa estimada por gel permeação (RECH, WOLIN e GUNSALUS, 1996).
Ensaios de ligação da proteína ModA madura com diferentes oxiânions
revelaram que esta proteína é capaz de ligar na forma monomérica com alta
afinidade o molibdato e tungstato (K
d
= 20 ± 0,8 nmol/L), enquanto sulfato, cromato,
selenato, fosfato e clorato não foram capazes de ligar mesmo em concentrações de
10 mmol/L (RECH, WOLIN e GUNSALUS, 1996; IMPERIAL, HADI e AMY,
1998). Estirpes mutantes de E. coli (modC
-
), deficientes no transporte de molibdato,
porém acumulando grandes quantidades de ModA madura no espaço periplasmático,
foram utilizadas para a determinação da constante de dissociação de ModA in vivo.
Neste ensaio a quantidade de molibdato ligado pela célula reflete a quantidade
ligada pela proteína ModA, sendo determinado um K
d
= 67 nmol/L (IMPERIAL,
HADI e AMY, 1998).
A estrutura cristalina da proteína ModA de E. coli complexada a MoO
4
2-
e
WO
4
2-
foi resolvida (HU et al., 1997). ModA é composta de dois domínios com
conformações semelhantes, separados pela região de ligação ao oxiânion. Esses
domínios são designados N- e C-terminal e o ânion molibdato/tungstato é
posicionado na interface dos dois domínios, ligando à proteína como uma espécie
tetraédrica (HU et al., 1997).
12
A especificidade da ligação da proteína ModA à molibdato e tungstato pode
ser explicada pelo volume da cavidade de ligação ao oxiânion. ModA de E. coli tem
um volume de 80 Å
3
,
enquanto a proteína periplasmática de transporte de sulfato
apresenta um sítio de ligação de 64 Å
3
. As distâncias metal-oxigênio nas estruturas
cristalinas de molibdato e tungstato são de 1,77 Å (GATEHOUSE e LEVERETT,
1969) e 1,78 Å (KOSTER, KOOLS e RIECK, 1969), respectivamente, comparada a
1,47 Å para o ânion sulfato (BAUR, 1964).
Gene modB – o gene modB de E. coli tem 690 pb e codifica uma proteína de 229
aminoácidos com massa molecular de 24,9 kDa predito a partir de sua seqüência de
aminoácidos (MAUPIN-FURLOW et al., 1995).
A proteína ModB de E. coli é altamente hidrofóbica e possui cinco regiões
transmembrana distintas e uma seqüência (EQAA) característica dos componentes
permease dos sistemas ABC, localizada em uma alça citoplasmática entre as regiões
transmembrana 3 e 4 (MAUPIN-FURLOW et al., 1995; SELF et al., 2001).
Análise comparativa das seqüências de aminoácidos de 19 proteínas ModB
homólogas revelaram duas regiões similares adicionais. A primeira região está
localizada entre os aminoácidos 53 e 66 de ModB de E. coli, presente no segundo
domínio transmembrana, cuja seqüência consenso é
LPLVLPP(V/T/S)VhG(F/Y)XL, onde h representa um aminoácido hidrofóbico e X,
qualquer aminoácido. A segunda seqüência consenso, FAR(S/T)LGEFG(A/V)(T/V),
está localizada entre os aminoácidos 157 e 167 em ModB de E. coli (SELF et al.,
2001).
Gene modC – o gene modC codifica uma proteína de 352 aminoácidos com massa
molecular de 37,5 kDa (MAUPIN-FURLOW et al., 1995). A proteína ModC possui
quatro motivos que são conservados na seqüência primária de 94 ATPases do tipo
ABC de E. coli. São eles: motivos Walker A e B, diretamente envolvidos na ligação
e hidrólise de ATP; a assinatura ABC (LSGGQ) e um motivo contendo uma
13
histidina conservada, normalmente precedida por quatro resíduos hidrofóbicos e
seguida por um resíduo carregado (MAUPIN-FURLOW et al., 1995; GRUNDEN e
SHANMUGAM, 1997; LINTON e HIGGINS, 1998; SELF et al., 2001).
Os genes modABC são expressos em baixo nível na estirpe selvagem e
traços de molibdato presente nos meios de cultivo são suficientes para reprimir
completamente a expressão deste operon. A regulação do transporte de molibdato
em E. coli é dependente da concentração de molibdato, uma vez que condições
limitantes deste oxiânion levam a um aumento no nível de expressão do sistema.
Oxigênio e nitrato não exerceram qualquer efeito na expressão destes genes. Estirpes
deficientes no transporte de molibdato (modC
-
) tiveram a expressão dos genes de
transporte aumentada cerca de 40-60 vezes (RECH, DEPPENMEIER e
GUNSALUS, 1995). Este efeito também foi observado em uma estirpe mutante
modA::lacZ sob condições de limitação de molibdato. Esta estirpe apresentou alto
nível de expressão do gene modA e ausência de atividade da molibdoenzima formato
desidrogenase (FHL). Complementando este mutante com os genes modABC, houve
baixa expressão de β-galactosidase independente da presença de molibdato,
mostrando que traços de molibdato no citoplasma são suficientes para a atividade da
molibdoenzima FHL e repressão do operon modABC (GRUNDEN et al., 1996). A
regulação da expressão de genes modABC é exercida pela proteína repressora ModE.
Esta proteína é codificada pelo gene modE localizado a montante de modA e
transcrita na orientação oposta (GRUNDEN et al., 1996; ANDERSON et al., 1997)
(Figura 2). Experimentos usando um mutante modE contendo uma fusão lacZ
indicou que o gene modE é expresso constitutivamente em baixos níveis e que sua
expressão não é afetada pelos reguladores transcricionais Fnr, ArcA e NarL.
Mutações nos genes requeridos para biossíntese de molibdopterina, moa, mob, moe e
mog, também não resultaram em mudanças na expressão de modE (GRUNDEN et
al., 1996).
14
A repressão da transcrição dos genes modABC ocorre através da ligação da
proteína ModE na região promotora destes genes (GRUNDEN et al., 1996). Análise
da seqüência da região a montante do gene modA em ensaios de footprinting com
DNase I e mutações sítio-dirigidas nesta região definiram as posições exatas de
ligação da proteína ModE em E. coli (RECH, DEPPENMEIER e GUNSALUS,
1995; GRUNDEN et al., 1996; ANDERSON et al., 1997; McNICHOLAS, RECH e
GUNSALUS, 1997; GRUNDEN et al., 1999) (Figura 2).
Ensaios de footprinting revelaram três regiões de DNA protegidas por
ModE, GTTATATTG (-15 a –7, região 1), GCCTACAT (-4 a +4, região 2) e
GTTACAT (+8 a +14, região 3). Ensaios de mobilidade em gel mostraram que as
regiões 1 e 2 são essenciais para a ligação do complexo ModE-molibdato ao DNA e
que a região 3 aumenta a afinidade desta ligação. Na região 1 há a presença de uma
repetição invertida, GTTA, separado por uma base T. Esse tetrâmero, ou uma
variação dele, é encontrado 9 vezes na região operadora/promotora do operon
modABC (ANDERSON et al., 1997; GRUNDEN e SHANMUGAM, 1997;
GRUNDEN et al., 1999; SELF et al., 2001).
Ensaios in vitro de ligação da proteína ModE à região promotora de modA
revelaram que a ligação ocorre na presença ou ausência de oxigênio e a adição de
molibdato aumentou significativamente a ligação ao DNA (McNICHOLAS, RECH
e GUNSALUS, 1997).
Análises in silico de genomas seqüenciados revelaram que o gene modE é
encontrado em Archaea e Bacteria e a seqüência de reconhecimento da proteína
ModE é também conservada entre esses dois domínios (STUDHOLME e PAU,
2003).
15
1.3.1.2 Proteína ModE
A proteína ModE é um regulador transcricional capaz de sensoriar os níveis
intracelulares de molibdato e regular a transcrição dos operons envolvidos com o
transporte e utilização deste oxiânion (GRUNDEN et al., 1996; McNICHOLAS
CHIANG e GUNSALUS, 1996; McNICHOLAS, RECH e GUNSALUS, 1997;
TAO et al., 2005).
Análise das seqüências de aminoácidos revelou que estas proteínas possuem
um domínio hélice-volta-hélice (HTH) na região N-terminal e dois sub-domínios
denominados MopI e MopII na região C-terminal (Figura 3A). Na maioria dos casos
os organismos possuem apenas uma proteína homóloga a ModE, porém foram
identificados em alguns genomas seqüenciados mais de uma proteína deste tipo
(STUDOLME e PAU, 2003).
As Archaeas metanogênicas Methanosarcina mazei (Q8PWN4) e
Methanosarcina acetivorans (Q8TTZ2) codificam uma proteína do tipo ModE que
possui somente um sub-domínio Mop C-terminal (Figura 3B). Bactérias como
Ralstonia eutropha (Q9RBF7), Ralstonia solanacearum (Q8XXMI) e Pyrobaculum
aerophilum (Q8ZZY3) codificam proteínas contendo o domínio HTH característico
de ModE na porção N-terminal, possuindo na região C-terminal um domínio SBP
(Figura 3C). Membros desta família ligam a diversos solutos como açúcares,
peptídeos e íons inorgânicos (STUDHOLME e PAU, 2003).
Reguladores transcricionais contendo o domínio HTH exibem uma
correlação entre a posição e a função deste domínio em Bacteria e Archaea. Em
proteínas que atuam como repressoras ou com dupla função repressora/ativadora, o
domínio HTH tende a estar posicionado na região N-terminal, enquanto ativadores
tendem a ter o domínio HTH na região C-terminal (PÉREZ-RUEDA e COLLADO-
VIDES, 2001). Como a proteína ModE pode atuar tanto como repressora quanto
ativadora, o domínio HTH está posicionado na região N-terminal (STUDHOLME e
PAU, 2003). Em contraste, Campylobacter jejuni (Q9PMF6) apresenta uma ORF
16
(1507c) com o domínio HTH no C-terminal, sugerindo uma função de ativadora
transcricional (Figura 4D). Esta orf sobrepõe o gene fdhD, o qual codifica a
molibdoenzima formato desidrogenase, sugerindo uma ligação funcional entre essa
proteína regulatória e o metabolismo de molibdênio (STUDHOLME e PAU, 2003).
Também são encontrados organismos que codificam proteínas contendo
apenas o domínio HTH N-terminal sem apresentar qualquer domínio para ligação a
molibdato ou qualquer outro soluto (Figura 3E). São eles Salmonella typhimurium
(
NP_459758), Agrobacterum tumefaciens (NP_533229), Sulfolobus solfataricus
(Q97Z66), Sulfolobus tokodaii (Q97ET9), Pseudomonas aerophilum (Q8ZYE6),
Archaeglobus fulgidus (O29240), Methanopyrus kandleri (Q8TVF9) e Rhizobium
loti (Q98K14) (STUDHOLME e PAU, 2003).
17
FIGURA 3 - ARRANJO DOS DOMÍNIOS DAS PROTEÍNAS DO TIPO ModE
DESCRITAS
FONTE: adaptado de STUDHOLME e PAU, 2003
Arranjo esquemático dos domínios presentes em proteínas do tipo ModE, conforme
descrito no texto. HTH indica domínio hélice-volta-hélice; MOP indica o sub-domínio
responsável pela ligação a molibdato; SBP indica um domínio relacionado com a ligação de
diferentes solutos. Proteínas representadas pelo esquema D apresentam na região N-
terminal um domínio de função desconhecida.
MOP
MOP
MOP
18
A proteína ModE de E. coli foi cristalizada e sua estrutura resolvida nas
formas de apoproteína (não ligada a molibdato) ou complexada a molibdato (número
de acesso PDB: 1H9S, 1H9R, 1O7L, 1B9M) (HALL et al., 1999; GOURLEY et al.,
2001; SCHÜTTELKOPF, BOXER e HUNTER, 2003).
O domínio de ligação a DNA (N-terminal) é composto por 60% de α-
hélices e 20% de folhas β, sendo o motivo HTH formado pelas estruturas
secundárias α2, α3, β3 e β4 (Figura 4A). O domínio C-terminal (DiMop) é
composto principalmente por folhas β (60%). Os sub-domínios Mop possuem
conformações similares do tipo OB (oligonucleotide/oligosaccharide binding fold)
formados por 5 folhas β em forma de β-barril e uma α-hélice na base deste barril
(Figura 4B) (HALL et al., 1999; MURZIN, 1993).
A proteína ModE discrimina os oxiânions baseado nos seus tamanhos e
cargas, sendo capaz de ligar somente a molibdato e a tungstato a uma estequiometria
de dois oxiânions por dímero, porém a afinidade de ModE-tungstato pela região
promotora de modA apresentou K
d
seis vezes maior do que a de ModE-molibdato
(GRUNDEN et al., 1999). A capacidade de discriminar oxiânions com base na carga
e tamanho também foi observado na proteína ModA de E.coli. Nesta proteína o
volume observado do sítio de ligação de oxiânion é de aproximadamente 80 Å
3
,
compatível com o volume do sítio de ligação de oxiânion de ModE (78 Å
3
)
(GRUNDEN et al., 1999; GOURLEY et al., 2001).
Ensaios in vivo indicam que a ligação de ModE à molibdato aumenta a
afinidade ao DNA (ANDERSON et al., 1997), e as comparações das estruturas da
proteína nas formas apo e ligada indicam mudanças estruturais na superfície de
interação com o DNA, alterando a afinidade de ModE pelo DNA. A interação entre
a proteína ModE de E. coli e a região promotora de modA apresentou um K
d
~0,3
nmol/L, aumentando para 8 nmol/L na ausência de molibdato. Na forma ligada a
molibdato, as duas hélices do motivo HTH são posicionadas de maneira a serem
inseridas nos dois sulcos maiores consecutivos do DNA, interagindo com a
19
seqüência palindrômica de reconhecimento de ModE, e as regiões das folhas β3 e β4
interagem com o sulco menor entre os dois sulcos maiores consecutivos
(GRUNDEN et al., 1999; HALL et al., 1999; SCHÜTTELKOPF, BOXER e
HUNTER, 2003).
FIGURA 4 - ESTRUTURA DA PROTEÍNA ModE DE E. coli
FONTE: HALL et al., 1999 (número de acesso PDB: 1B9M).
(A) indica a estrutura do domínio N-terminal, contendo o motivo HTH formado pelas
hélices α2 e α3 e a volta entre elas. (B) indica a estrutura do domínio C-terminal, com os
subdomínios Mop indicados na figura. (C) indica o dímero da proteína ModE. A estrutura
apresentada foi obtida com resolução 2,1Å.
dímero
C
N
-terminal
A
C-terminal
B
volta
MopI
MopII
20
1.4 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MOLIBDOENZIMAS EM E. coli
E. coli pode respirar aerobica e anaerobicamente usando uma variedade de
aceptores finais de elétrons acoplados a fosforilação oxidativa. Esses compostos
incluem, em ordem decrescente de potencial de redução, oxigênio, nitrato, dimetil
sulfóxido (DMSO), trimetilamina-N-óxido (TMAO) e fumarato (INGLEDEW e
POOLE, 1984). Sob condições de crescimento anaeróbico E. coli produz muitas
molibdoenzimas e muitas delas servem como enzimas terminais na respiração
anaeróbica. Assim, além de repressor dos genes de transporte de molibdato, o
complexo ModE-molibdato também é capaz de aumentar a expressão dos genes que
codificam muitas dessas molibdoenzimas, como fdhF (formato desidrogenase-H;
FDH-H), hyc (hidrogenase 3, parte do complexo da formato-hidrogênio-liase em
adição a FDH-H), que são componentes da respiração anaeróbica, e narXL
(reguladores da nitrato redutase respiratória), além das enzimas requeridas para a
síntese do cofator molibdopterina (moaABCDE) (SELF et al., 2001).
Outro aceptor final de elétrons na respiração anaeróbica em E. coli é
dimetilsulfóxido (DMSO). Sua respectiva redutase (DMSO redutase) é codificada
pelo operon dmsABC. A expressão deste operon é aumentada em resposta a
condições de anaerobiose (Fnr) e reprimida na presença de nitrato (NarL). Outros
aceptores finais de elétrons como trimetilamina N-óxido (TMAO) e fumarato não
exercem efeito algum na expressão do operon dms. Foi demonstrado que a completa
repressão do operon dms por nitrato exigiu a presença de molibdato (COTTER e
GUNSALUS, 1989).
Estudos in vitro revelaram que a proteína ModE interage com a região
promotora do gene dmsA, cuja expressão também é dependente das proteínas Fnr,
NarL e RNA polimerase. Ensaios in vitro revelaram que a proteína IHF é capaz de
ligar à região promotora do operon dmsABC e ensaios in vivo mostraram que IHF é
importante para a regulação dependente de molibdato deste operon (McNICHOLAS,
CHIANG e GUNSALUS, 1998).
21
O perfil de expressão gênica global de E. coli estirpes selvagem e duplo
mutante modE, moeA (MoeA é necessário para a ativação dos operons nar, fdhF e
hyc) em condições de anaerobiose revelaram 67 genes diferencialmente expressos,
sendo 33 destes expressos em maior quantidade na estirpe duplo mutante e 34
expressos em maior quantidade na estirpe selvagem. Além dos genes conhecidos por
serem regulados por molibdato, dois operons que codificam proteínas envolvidas na
via de utilização de deoxirribose (deoCABD) e transporte de oligopeptídeo
(oppABCDF) tiveram suas expressões aumentadas na estirpe duplo mutante modE,
moeA (TAO et al., 2005).
O nível de mRNA do gene oppA foi demonstrado ser 19 vezes maior em
uma estirpe de E. coli mutante modE quando comparada com a estirpe selvagem.
Este resultado mostra que o operon opp está sujeito a um controle transcricional
dependente de molibdato (TAO et al., 2005).
Experimentos de RT-PCR quantitativa revelaram que o nível de mRNA de
deoC foi levemente maior nas estirpes mutantes modE ou moeA (~1,7 vezes) quando
comparadas com a estirpe selvagem. Porém, na estirpe duplo mutante modE, moeA,
esse aumento foi de 25 vezes. Estes resultados foram confirmados por análise de
uma fusão deoC-lacZ que mostrou aumento de 4 vezes na atividade de β-
galactosidase. Um aumento de aproximadamene 5 vezes na atividade de β-
galactosidase foi observado na estirpe mutante modE, revelando que a regulação de
deoC deve-se principalmente à proteína ModE e a contribuição da proteína MoeA é
pequena. A diferença na indução de mRNA comparada com a atividade de β-
galactosidase pode ser resultado de um complexo controle da expressão do operon
deo por outras proteínas como DeoR, CytR e CRP-cAMP. Ensaios de mobilidade
eletroforética revelaram que a proteína ModE é capaz de ligar na região a montante
do operon deo (TAO et al., 2005).
Os sítios de ligação da proteína ModE de alguns organismos na região a
montante de genes relacionados com a síntese e regulação de molibdoenzimas,
determinados in vivo e in vitro, estão indicados na figura 5.
22
FIGURA 5 - SEQUÊNCIA DE ALGUNS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE ModE
Seqüências invertidas repetidas localizadas a montante dos genes modA (RECH, DEPPENMEIER e GUNSALUS, 1995),
moaA (ANDERSON et al., 2000), narK, hyc (SELF et al., 1999), napF (McNICHOLAS e GUNSALUS, 2002), dmsA
(McNICHOLAS, CHIANG e GUNSALUS, 1998), torY, oppA, deoC, orf (xapR, sdaA, yiaT, yafN, b2654, yfeU, yifM_1,
b1368, b2107, yijP, yiaT, yicE, yfeT, ybfB, yecG, ybgD, yigF, b1501) (TAO et al., 2005) de E. coli (Ec); mopA, morA,
morC, anfA de R. capsulatus (Rc); modE, modG, anfA, vnfA de A. vinelandii (Av) (KUTSCHE et al., 1996); orf1-2,
formilmetanofurano desidrogenase contendo Mo (subunidade E), proteína G de síntese de cobalamina de Methanosarcina
mazei (Mm) e orf1-4, vnfH (proteína Fe), modA, nifII, formilmetanofurano desidrogenase contendo Mo (subunidade E) de
Methanosarcina acetivorans (Ma) (STUDHOLME e PAU, 2003). N, nucleotídeo (A, T, C ou G). (+) ativação e (-)
repressão da transcrição.
GCGTTATATAGACATATATATATCGATNNNNNNN
Av an
f
A
(
-
)
TCGTTATATGGAATCACTATATATCGATN
Rc an
f
A
(
-
)
ATCGCTATTAGTCGGGTCTATATAACGAT
Rc mo
p
A
(
-
)
CGCTATAAGGTTGGACTACATAGCGNNNN
Rc morA
(
-
)
CGCTATGTAGTCCAACCTTATAGCGNNNN
Rc mor
C
(
-
)
TGCTTTATATAAAACTGGATAAATAGATAAATTG
Av modE
(
?
)
GACAATTTATACTGCNNNNAAATGATATAGCGGT
Av mod
G
(
?
)
AGCGTTATATTACNNNNNNGAATATATAGCGCTN
Av vn
f
A
(
-
)
TGGCGTTATGTTTATTTAAACATAACGAT
Mm or
f
1
(
?
)
ATTAGGTTTATAAGTCAATAAATAATGAA
Mm or
f
2
(
?
)
TATGGTTATGTAATTCTAAACATAACGAA
Ma or
f
1
(
?
)
AATCGTTATGTTTAGGTATACATAACTA
Ma or
f
2
(
?
)
ATTCGTTATGTTTAGAATTACATAACCAT
Ma or
f
3
(
?
)
TGTCGTTATGTTTATTTAAACATAACGGT
Ma or
f
4
(
?
)
NNNNNTGTGTNNNNNNNTGYGT
GTTATATTGTCGCCTACATAACGTTACAT
Ec modA
(
-
)
GACGCTATATACATGATTACATAGCGAA
Ec moaA
(
+
)
TTGCCGTGTGGTTAGTCGCTTTACATCGGT
Ec narK
(
+
)
CAGAGGGTTATTTCGTGCATATCGCCT
Ec h
y
c
(
+
)
ATCGCTATATAAATATATTTATAACCATTT
Ec na
p
F
(
+
)
NTCGATGTATACAAGCCTATATAGCGAAC
Ec dms
(
-
)
NNCGTTATATANNNNNNTATATAACG
Ec tor
Y
(
+
)
NNNNN TATATNNNNNNNTAYAT
Ec or
f
(
?
)
NNNNNTATAGNNNNNNNTACGC
Ec o
pp
(
-
)
NNNNNTGTGCNNNNNNNTACTG
NNNNNTGTGTNNNNNNNTGTGT
Ec deo
(
-
)
123
23
1.5 Herbaspirillum seropedicae
Herbaspirillum seropedicae é uma β-Proteobacteria endofítica, gram-
negativa, encontrada associada a várias gramíneas de interesse econômico como
milho, arroz, cana-de-açúcar e abacaxi (BALDANI et al., 1986; YOUNG, 1992;
CRUZ et al., 2001).
Esta bactéria possui um metabolismo típico respiratório e não fermenta
açúcares. Utiliza ácidos orgânicos como malato, fumarato, succinato, piruvato,
citrato e trans-aconitato como fontes preferenciais de carbono. Manitol, sorbitol,
glicerol e açúcares como glucose, galactose e L-arabinose também são oxidados
(BALDANI et al., 1986).
H. seropedicae é capaz de fixar nitrogênio atmosférico em condições
microaeróbicas, apresentando bom crescimento na presença de N
2
como única fonte
de nitrogênio. A avaliação do efeito de compostos de nitrogênio no crescimento e
atividade da nitrogenase em H. seropedicae revelou que L-glutamato ou L-
glutamina como únicas fontes de nitrogênio sustentaram o crescimento da bactéria,
porém a atividade da nitrogenase foi dependente da depleção destes componentes no
meio de cultura. L-serina, L-arginina ou cloreto de amônio também permitem o
crescimento, mas não foi observada atividade da nitrogenase. Entretando, L-
histidina, L-lisina, cloreto de metilamônio, cloreto de tetrametilamônio ou
etilenodiamina não foram capazes de sustentar o crescimento de H. seropedicae
(KLASSEN et al., 1997).
A inibição da atividade da nitrogenase por íons amônio e outras fontes de
nitrogênio (glutamato, glutamina, alanina e serina) ocorre independentemente de
ADP-ribosilação, provavelmente pela alteração do suprimento de elétrons para a
nitrogenase causado pelo transporte desses compostos (FU e BURRIS, 1989;
KLASSEN et al., 1997).
A regulação da fixação de nitrogênio em H. seropedicae envolve o ativador
transcricional NifA, o qual ativa a transcrição dos genes nif (SOUZA et al., 1991a e
24
b). A expressão do promotor nifA é regulada pelo ativador transcricional NtrC e é
dependente de RpoN (σ
N
) (SOUZA et al., 2000), enquanto que a atividade da
proteína NifA é controlada por oxigênio, íons amônio (SOUZA et al., 1999) e pela
proteína PII (BENELLI et al., 1997).
Os genes nif em H. seropedicae estão distribuídos em vários operons em
uma região de aproximadamente 36 kb do genoma (
www.genopar.org). Os genes
estruturais da nitrogenase (nifHDK) são transcritos a partir de um promotor do tipo
RpoN (σ
N
)-dependente. Esta região promotora possui dois sítios para ligação de
NifA e um sítio para ligação de IHF (MACHADO et al., 1996). A jusante dos genes
nifHDK e fazendo parte do mesmo operon estão os genes nifENXorf1orf2
(KLASSEN et al., 1999). Os produtos dos genes nifX e orf1 são essenciais para a
atividade máxima da nitrogenase em condições de limitação de ferro, indicando a
participação destas proteínas na biossíntese dos grupos metálicos da nitrogenase
(KLASSEN et al., 2003). Na região a jusante de nifHDKENXorf1orf2 são
encontrados os genes fdxA (ferredoxina do tipo 2[4Fe-4S], seguido por
nifQmodA1B1C1 (KLASSEN, 2000, SOUZA, 2003).
Além do grupo de genes envolvidos no transporte de molibdato,
modA1B1C1, localizados na região nif, um gene do tipo modE (modE1) (VOIGT,
2000), regulador transcricional dependente de molibdato dos genes modABC, está
localizado imediatamente a montante do gene nifA, 14,6 kb a montante do gene
nifH. Também foi anotado um segundo grupo de genes de transporte de molibdato
(modA2B2C2). Este grupo está localizado em uma região distinta do genoma
contendo o gene modE2 imediatamente à montante e transcrevendo na direção
oposta ao gene modA2.
25
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar funcionalmente os genes fdxA e modB2 e as proteínas ModE1 e
ModE2 de H. seropedicae
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter mutantes nos genes fdxA e modB2 com a inserção sítio dirigida do
cassete lacZ-Km;
Determinar o fenótipo nif dos mutantes fdxA e modB2 obtidos;
Clonar, superexpressar e purificar as proteínas ModE1 e ModE2;
Analisar a capacidade de ligação das proteínas ModE1 e ModE2 à região
promotora do gene modA2.
26
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS
As estirpes de bactérias e plasmídeos utilizados estão descritas na Tabela 1.
TABELA 1 - BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS UTILIZADOS
BACTÉRIA ESTIRPE CARACTERÍSTICAS REFERÊNCIA
SMR1 Selvagem, Nif
+
, Sm
R
PEDROSA et al.,
1997
Herbaspirillum
seropedicae
KC6 SMR1, fdxA::lacZ-Km
(mesma orientação de
fdxA), Sm
R
, Km
R
Este trabalho
DH10B Estirpe hospedeira para
amplificação de
plasmídeos, Sm
R
GRANT et al., 1990
Escherichia coli
BL21(DE3) Estirpe hospedeira para
expressão das proteínas
His-ModE1 e His-ModE2
Novagen, Darmstadt,
Alemanha
Vetor
pPW452 Tc
R
, lacZ sem promotor;
vetor para fusão
P. WODLEY
pMP220 Tc
R
, lacZ sem promotor;
vetor para fusão
SPAINK et al., 1987
pSUP202 Ap
R
, Cm
R
, Tc
R
, mob SIMON PRIEFER e
PÜHLER, 1983
pKOK6.1 Ap
R
, Cm
R
, Km
R
, lacZ sem
promotor
KOKOTEK E LOTZ,
1989
pET-28a(+) Vetor de expressão
contendo cauda His; Km
R
Novagen, Darmstadt,
Alemanha
pCR
®
2.1
Vetor de clonagem TA,
fragmento lacZα, Km
R
,
Ap
R
Invitrogen, Carlsbad,
EUA
Plasmídeos Vetor Propriedades
HS05-MF-037-A04 pUC18 Fragmento nifX(5’)-
nifQ(5’) de H. seropedicae
Genopar
a
HS25-MF-013-D09 pUC18 Fragmento orf1(5’)-
modA1(5’) de H.
seropedicae
Genopar
a
HS05-EG-048-B06
pUC18 Fragmento de 1,5 kb
contendo os genes modA2
e parte de modB2 de H.
seropedicae
Genopar
a
27
TABELA 1 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS UTILIZADOS - continuação
PLASMÍDEO VETOR CARACTERÍSTICAS REFERÊNCIA
pMPnifX-nifQ pMP220 Fragmento BamHI-EcoRI
contendo
nifXorf1orf2fdxAnifQ de
H. seropedicae
Este trabalho
pPWorf1-modA1 pPW452 Fragmento KpnI-PstI
contendo
orf1orf2fdxAnifQmodA1de
H. seropedicae
Este trabalho
pALFSA pSUP202 Fragmento de 1,2 kb
contendo o gene fdxA
clonado no sítio EcoRI do
plasmídeo pSUP202
Este trabalho
pALFKC pSUP202 Fragmento de 1,2 kb
contendo o gene fdxA com
o casete lacZ-Km inserido
no sítio NsiI de fdxA na
mesma orientação do gene
Este trabalho
pALFAB pSUP202 Fragmento de 1,5 kb
contendo parte do gene
modB2 clonado nos sítios
EcoRI-PstI do plasmídeo
pSUP202
Este trabalho
pABKC pSUP202 Fragmento de 1,5 kb
contendo parte do gene
modB2 com o casete lacZ-
Km inserido no sítio NsiI
de modB2 na mesma
orientação do gene
Este trabalho
pCR2.1modE1
pCR
®
2.1 pCR
®
2.1 contendo o
produto de PCR modE1
Este trabalho
pCR2.1modE2
pCR
®
2.1 pCR
®
2.1 contendo o
produto de PCR modE2
Este trabalho
pET28amodE1 pET-28a(+) pET-28a(+) contendo o
gene modE1 NdeI-BamHI
de H. seropedicae
Este trabalho
pET28amodE2 pET-28a(+) pET-28a(+) contendo o
gene modE2 NdeI-BamHI
de H. seropedicae
Este trabalho
a
Projeto de seqüenciamento genômico de H. seropedicae (www.genopar.org).
28
3.2 MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura utilizados no cultivo de estirpes de E. coli foram LB
(Luria Broth) (MILLER, 1972), SOB (SAMBROOK, FRITSCH E MANIATIS,
1989) e SOC (HANAHAN, 1983). A composição destes meios está descrita na
Tabela 2.
TABELA 2 - COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA DE E. coli
CONSTITUINTES(g/L)
LB
*
SOB
*
SOC
*
Triptona 10 20 20
Extrato de levedura 5 5 5
NaCl 10 0,5 0,5
KCl - 0,186 0,186
MgCl
2
- - 0,94
MgSO
4
- - 1,2
Glucose - - 3,6
* O pH foi ajustado para 7,0 com a adição de gotas de NaOH 0,1 mol/L e os meios foram esterilizados em
autoclave durante 20 minutos, a 121
o
C e 1 atm.
O meio sólido LA foi preparado pela adição de 15 g/L de agar ao meio LB.
As estirpes de H. seropedicae foram cultivadas em meio NFbHP (KLASSEN et. al.,
1997) (Tabela 3)
TABELA 3 - COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA NFbHP*
COMPOSIÇÃO CONSTITUINTE CONCENTRAÇÃO (g/L)
Macronutriente MgSO
4
.7H
2
O 0,2
NaCl 0,1
CaCl
2
0,02
FeSO
4
.7H
2
O 0,02
Titriplex I** 0,056
KH
2
PO
4
7,975
K
2
HPO
4
0,89
Micronutriente Na
2
MoO
4
.2H
2
O
2,0×10
-3
MnSO
4
.H
2
O
2,35×10
-3
H
3
BO
3
2,8×10
-3
CuSO
4
.5H
2
O
8,0×10
-5
ZnSO
4
.7H
2
O
2,4×10
-4
Vitamina Biotina
1,0×10
-4
Suplemento orgânico Malato 5,0
*
O pH foi ajustado para 6,5 com solução de KOH 70% (p/v) e o meio foi esterilizado em autoclave durante 20
minutos, a 121
o
C e 1 atm. KH
2
PO
4
e K
2
HPO
4
foram adicionados no momento do uso.
** ácido nitrilo triacético
29
Como fonte de nitrogênio foi utilizado NH
4
Cl 20 mmol/L. Para a preparação
do meio NFbH semi-sólido foi adicionado 0,175% de agar ao meio líquido. O meio
NFbHP isento de molibdato foi preparado utilizando-se os sais diluídos em água
ultra pura tratada com carvão ativo como descrito (SCHNEIDER et al., 1991).
3.3 ANTIBIÓTICOS
Os antibióticos utilizados para seleção de estirpes de E. coli e H.
seropedicae estão listados na Tabela 4. Os antibióticos ampicilina (em forma de sal
de sódio), estreptomicina e canamicina (em forma de sulfato) foram dissolvidos em
água e esterilizados por filtração (0,22 μm) e conservados a –20
o
C (SAMBROOK,
FRITSCH e MANIATIS, 1989).
TABELA 4 - ANTIBIÓTICOS UTILIZADOS PARA SELEÇÃO DE E. coli E H. seropedicae.
ANTIBIÓTICO E. coli
(μg/mL)
H. seropedicae
(μg/mL)
SOLUÇÃO-ESTOQUE
(mg/mL)
Ampicilina(Ap) 250 - 250
Canamicina(Km) 50 500/1000 100
Estreptomicina(Sm) 20 80 80
3.4 ESTOCAGEM
Estoques de E. coli foram mantidos em glicerol 50% (v/v) a –20
o
C e de H.
seropedicae foram mantidos sob a mesma condição e em meio NFbHP semi-sólido
contendo 20 mmol/L NH
4
Cl e antibióticos apropriados, à temperatura ambiente.
30
3.5 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA
3.5.1 Mini-preparação de Plasmídeos
A preparação de plasmídeos em pequena escala foi feita por lise alcalina,
baseada no método descrito por SAMBROOK, FRITSCH e MANIATIS (1989).
Uma colônia da bactéria contendo o plasmídeo de interesse foi inoculada
em 3 mL de meio LB contendo o antibiótico apropriado e incubado a 37
o
C sob
agitação (120 rpm) por aproximadamente 16 horas. Um volume de cultura de 1,5
mL foi transferido para um tudo de microcentrífuga e as células foram coletadas por
centrifugação a 15.000×g, durante 1 minuto, à temperatura ambiente. O meio foi
descartado e as células ressuspensas em 100 μL de GET (glucose 50 mmol/L,
EDTA 10 mmol/L pH 8,0, Tris-HCl 25 mmol/L pH 8,0). Foram adicionados a esta
suspensão bacteriana 200 μL de solução de lise (SDS 1%, NaOH 0,2 mol/L),
homogeneizado por inversão e mantido em gelo por 5 minutos. Após este período de
tempo foram adicionados 200 μL de Kacf (acetato de potássio 0,88 mol/L e ácido
fórmico 0,15 mol/L, pH 5,0). O lisado bacteriano foi homogeneizado por inversão
várias vezes e mantido em gelo por 10 minutos, seguido pela adição de 50 μL de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). As fases orgânica e aquosa foram
misturadas por agitação vigorosa e a emulsão foi centrifugada a 15.000×g por 10
minutos. A fase aquosa foi transferida para outro tubo e o ácido nucléico precipitado
pela adição de 1,5 volume de etanol 96% (v/v) à temperatura ambiente. O
precipitado foi coletado por centrifugação a 15.000×g por 10 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com 500 μL de etanol 80%
(v/v) e centrifugado nas mesmas condições descritas. O sobrenadante foi novamente
descartado e o DNA seco a temperatura ambiente e dissolvido em 20-30 μL de água
ultrapura.
Os plasmídeos destinados à reação de sequenciamento foram incubados
com RNAse a uma concentração final de 10 μg/mL por 3 horas a 37
o
C. Este DNA
31
foi desproteinizado com 20 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1),
centrifugado, precipitado com etanol 96% (v/v), lavado com etanol 80% (v/v), seco
em temperatura ambiente e dissolvido em 15-20 μL de água.
3.5.2 Extração de DNA Cromossomal
O DNA de H. seropedicae foi purificado a partir de células crescidas em
meio NFbHP suplementado com NH
4
Cl 20 mmol/L até D.O.
550
= 1,0. Uma alíquota
de 1,5 mL da suspensão bacteriana foi centrifugada por 1 minuto, ressuspensa em
400 μL de GET (glucose 50 mmol/L, EDTA 10 mmol/L pH 8,0 e Tris-HCl 25
mmol/L pH 8,0) e incubada por 10 minutos à temperatura ambiente com 50 μg/mL
de lisozima. Após este período, foi acrescentado SDS a uma concentração final de
1% e 500 μg/mL de pronase E e incubado a 37
o
C durante aproximadamente 12
horas. O material foi extraído com 200 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico
(25:24:1) e centrifugado por 10 minutos. O DNA presente na fase aquosa foi
precipitado com 0,6 volume de isopropanol, lavado com etanol 80% (v/v) e seco à
temperatura ambiente.
3.5.3 Purificação de DNA em Gel de Agarose de Baixo Ponto de Fusão
Fragmentos de DNA liberados na digestão de plasmídeos com
endonucleases de restrição foram separados por eletroforese em gel de agarose de
baixo ponto de fusão 0,8% (p/v). Após a corrida eletroforética o gel foi corado com
uma solução de azul de metileno 0,25% (p/v) por 1 minuto e descorado com
sucessivas lavagens com água ou corado com brometo de etídeo 0,5 μg/mL. A
banda de interesse foi cortada do gel e removida para tubo de microcentrífuga, sendo
fundida a 65
o
C por 15 minutos. Foram adicionados 100 mmol/L de Tris-HCl, 250
mmol/L de NaCl e 1 mmol/L de EDTA pH 8,0, incubado a 65
o
C por 5 minutos,
32
seguido pela adição de 1 volume de fenol tamponado (pH 8,0). Esta mistura foi
vigorosamente homogeneizada e centrifugada a 15.000×g por 15 minutos. A fase
aquosa foi transferida para novo tubo e o DNA precipitado com 1 volume de
isopropanol. A mistura foi mantida em gelo por 30 minutos e o tubo centrifugado a
15.000×g por 15 minutos. O DNA sedimentado foi lavado com 500 μL de etanol
80% (v/v), novamente centrifugado, seco à temperatura ambiente e dissolvido em 10
μL de água ultrapura.
3.6 ELETROFORESE EM GEL DE ÁGAR
A separação e a estimativa do tamanho de fragmentos de DNA ou
plasmídeos íntegros foi feita por eletroforese em gel de ágar 1% (p/v) em tampão
TBE (Tris base 90 mmol/L; ácido bórico 90 mmol/L; EDTA 20 mmol/L pH 8,0). A
corrida eletroforética foi realizada no mesmo tampão e na mesma concentração
descrita acima. Para aplicação em gel as amostras de DNA foram misturadas a 0,2
volume de solução corante FSUDS (azul de bromofenol 0,08% (p/v); Ficoll 400
10% (p/v); SDS 1% (p/v); EDTA 1,8 mmol/L pH 8,0; Tris-HCl 65 mmol/L pH 8,0;
xileno cyanol 0,4% (p/v)) e a corrida realizada a 5 V.cm
-1
de gel por 3 a 4 horas
(SAMBROOK, FRITSCH e MANIATIS, 1989).
O gel foi corado em solução de brometo de etídeo 0,5 μg/mL por 20
minutos e as bandas visualizadas sob luz ultravioleta (312 nm) em transiluminador
(UVP, Inc. Upland, CA USA).
A massa molecular dos fragmentos de DNA foi estimada por comparação
com o padrão eletroforético de fragmentos de DNA de tamanhos moleculares
conhecidos (MBI Fermentas).
33
3.7 ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM
3.7.1 Digestão com Endonucleases de Restrição
As condições de digestão de DNA com endonucleases de restrição foram
àquelas recomendadas pelo fabricante.
Em geral foram utilizados 0,1 – 1 μg de DNA, 1 – 2U de endonuclease de
restrição em um sistema de volume 20-50 μL, mantido a 37
o
C por aproximadamente
3 horas.
O padrão de restrição foi determinado por eletroforese em gel de ágar 1%
(p/v). Para aplicação em gel foi adicionado ao sistema de reação 3 – 5 μL de
FSUDS. Para amostras destinadas a clonagem, 1/10 do volume do sistema de reação
foi retirado e misturado com 3 μL de F.S.U.D.S para aplicação em gel.
Após a digestão, as enzimas foram termicamente inativadas de acordo com
as recomendações do fabricante. O DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol
96% (v/v), sedimentado por centrifugação a 15.000×g por 15 minutos, lavado com
etanol 80% (v/v), seco à temperatura ambiente e dissolvido em água.
3.7.2 Ligação de DNA
Fragmentos de DNA com extremidades coesivas foram ligados a vetores
linearizados com pontas coesivas compatíveis. Os sistemas de ligação foram feitos
mantendo-se uma relação DNA inserto:vetor de 5:1 (concentração molar). As
concentrações de inserto e vetor foram estimadas por eletroforese em gel de agar 1%
(p/v) de uma alíquota destes DNAs.
Os sistemas de ligação possuíam volume final de 20 μL, contendo 50 – 500
ng de vetor, T4 DNA Ligase 1 – 2U e tampão de ligação 1× concentrado (Tris-HCl,
34
MgCl
2
, DTT e ATP). As concentrações dos componentes e o pH do tampão de
ligação variaram de acordo com o fabricante.
O sistema de reação foi mantido a 15
o
C por aproximadamente 16 horas
(SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS, 1989). Uma alíquota de 1 – 2 μL deste
sistema foi utilizado para transformação por eletroporação.
3.8 TRANSFORMAÇÃO POR ELETROPORAÇÃO
3.8.1 Preparo de Células Competentes
Um pré-inóculo foi preparado inoculando-se uma colônia de E. coli
(linhagem DH10B ou BL21(DE3)) em meio LB contendo o antibiótico apropriado e
incubado a 37
o
C, sob agitação de 120 rpm por aproximadamente 16 horas. Um
volume de 1 mL desta suspensão bacteriana foi transferido para 250 mL de meio
SOB, cultivado nas mesmas condições descritas acima até a cultura atingir uma
D.O.
600
entre 0,5 e 0,8. Neste ponto a cultura foi deixada em gelo durante 15 a 30
minutos. Esta cultura foi então centrifugada a 2.500×g durante 5 minutos, a 4
o
C e o
sobrenadante descartado.
As células sedimentadas foram delicadamente ressuspensas em 40 mL de
água estéril a 4
o
C em banho de gelo e centrifugadas (2.500×g, 5 min., 4
o
C). O
sobrenadante foi novamente descartado e as células novamente ressuspensas em 40
mL de glicerol 15% a 4
o
C e centrifugadas nas mesmas condições descritas acima.
Após o descarte do sobrenadante as células foram ressuspensas e distribuídas em
alíquotas de 20 μL e armazenadas a –70
o
C até serem usadas na transformação por
eletroporação.
Para o preparo de células competentes de H. seropedicae foram transferidos
30 μL de cultura estocada em meio semi-sólido para 10 mL de meio NFbHP
contendo NH
4
Cl 20 mmol/L e antibióticos necessários, incubando-se durante 16
horas, a 30
o
C, sob agitação. Um volume de 2 mL da suspensão bacteriana foi
35
transferido para 40 mL de meio NFbPH contendo NH
4
Cl 20 mmol/L, sem
antibióticos, a 30
o
C até a cultura atingir D.O.
600
entre 0,8 e 1,0. Esta suspensão,
manuseada em gelo durante todo o experimento, foi centrifugada a 4.300xg, 4
o
C por
5 minutos, sendo o sobrenadante descartado. As células foram lavadas com 15 mL
de água ultrapura estéril a 4
o
C, seguida por lavagem com solução de glicerol 15%
(v/v) e ressuspensa em 100 μL de solução de glicerol 15% (v/v) estéril, distribuídas
em alíquotas de 20 μL e armazenadas a –70
o
C.
3.8.2 Eletroporação
Para eletroporação foram adicionados 20 – 30 ng de DNA a 20 μL de
estoque de células competentes de E. coli, mantidas em gelo. A mistura foi colocada
em cubeta de eletroporação resfriada em gelo e as células eletroporadas de acordo
com as instruções do aparelho (Eletroporador Cell-Porator
®
Electroporation System
– Life Technologies, Gaithersburg, EUA), ajustado nas seguintes condições:
resistência de 200 Ω; capacitância de 300 μF e voltagem 4 kV. Nestas condições um
pulso foi aplicado. Imediatamente após a eletroporação, as células foram
ressuspensas em 1 mL de meio SOC e incubadas a 37
o
C, durante 1 hora. Foram
plaqueadas 100 μL da suspensão em meio LA seletivo e incubadas a 37
o
C durante
12 a 16 horas.
A eletroporação de H. seropedicae foi realizada ajustando-se o aparelho
para capacitância de 300 μF e voltagem 4 kV. Após o pulso as células foram
ressuspensas em 1 mL de meio NFbHP contendo NH
4
Cl 20 mmol/L e incubadas a
30
o
C durante 3 horas. Após este tempo foram plaqueadas 300 μL das células em
meio NFbHP sólido contendo NH
4
Cl 20 mmol/L com antibióticos apropriados e
incubado a 30
o
C durante 24 horas.
36
3.9 SEQUENCIAMENTO DE DNA
3.9.1 Reação de Sequenciamento
A reação de sequenciamento de DNA foi baseada no processo de
incorporação de dideoxinucleotídeos fluorescentes. Para esta reação foi utilizado
cerca de 100 a 400 ng de DNA purificado, 10 pmols do iniciador apropriado e 4,0
μL de mistura para sequenciamento DYEnamic ET (Amersham Biosciences),
completando um sistema de volume final de 10 μL. A reação de amplificação foi
realizada em termociclador (Applied Biosystens), com os seguintes ciclos de
temperatura: 95
o
C/20 s (1 ciclo); 96
o
C/20s, 60
o
C/1,30 min (30 ciclos).
Foram adicionados 10 μL de água ultrapura ao produto da reação de
sequenciamento, que foi precipitado com 20 μL de isopropanol, centrifugado a
15.000×g por 20 minutos, lavado com etanol 80% (v/v), seco à temperatura
ambiente e dissolvido em 4 μL de tampão de aplicação (formamida:EDTA 25 mM
pH 8,0 + blue dextran 50 mg/mL (5:1)) (Applied Biosystems), mantido a 90
o
C por 2
minutos e colocado em gelo. Após este tratamento a amostra foi submetida à
eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 5% em Sequenciador Automático
de DNA ABI-PRISM 377 (Perkin-Elmer).
3.9.2 Edição e Análise de Sequências
As sequências de nucleotídeos obtidas foram comparadas com as seqüências
depositadas no banco de dados Genbank (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando o
programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL et. al., 1997).
O alinhamento de seqüências de nucleotídeos e aminoácidos foi feito pelo
programa ClustalW (THOMPSON et al., 1994). Este alinhamento foi usado para
gerar uma representação gráfica da conservação dos aminoácidos pelo programa
37
WebLogo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi ) (CROOKS et al., 2004). Esta
representação é calculada com base na freqüência de cada aminoácido em cada
posição.
As seqüências de aminoácidos das proteínas ModE1 e ModE2 de H.
seropedicae foram analisadas pelo programa SMART (Simple Modular Architecture
Research Tool) (http://smart.embl-heidelberg.de) (SCHULTZ et al., 1998; LETUNIC
et al., 2006) para identificação de domínios. Este programa também foi utilizado para
a identificação de seqüência sinal nas proteínas ModA1 e ModA2. Para a
determinação de hélices transmembrana nas proteínas ModB1 e ModB2 foi utilizado
o programa SOSUI (HIROKAWA, BOON-CHIENG e MITAKU, 1998).
3.10 MUTAGENESE
3.10.1 Mutagênese
A inativação dos genes fdxA e modB2 foram obtidas inserindo-se no mesmo
sentido de transcrição, o cassete lacZ-Km do plasmídeo pKOK6.1 no sítio de
restrição NsiI de fdxA e de modB2 (KOKOTEK e LOTZ, 1989).
Para obtenção do cassete, o plasmídeo pKOK6.1 foi digerido com a
endonuclease de restrição PstI. O cassete lacZ-Km foi separado e purificado por
eletroforese em gel de agarose 0,8% (p/v) de baixo ponto de fusão (item 3.5.3).
O plasmídeo HS25-MF-013-D09 (orf1(5’)-modA1(5’)) contendo o gene
fdxA inteiro foi selecionado do banco de genes do H. seropedicae. Este plasmídeo foi
submetido à restrição com a enzima EcoRI. O fragmento liberado de
aproximadamente 1280 pb foi purificado em gel de agarose de baixo ponto de fusão
(item 3.5.3) e clonado no sítio EcoRI do plasmídeo pSUP202 dando origem ao
plasmídeo pALFSA (Figura 6A).
38
O plasmídeo pALFSA foi utilizado para inserir um cassete lacZ::Km
(liberado do plasmídeo pKOK6.1 digerido com PstI) no sítio NsiI presente no gene
fdxA na mesma orientação do gene, originando o plasmídeo pALFKC (Figura 6A).
O plasmídeo HS05-EG-048-B06 (modA2-modB2(5’)) contendo parte do
gene modB2 foi digerido com EcoRI e PstI e o fragmento liberado clonado em
pSUP202 dando origem ao plasmídeo pALFAB (Figura 6B). Este plasmídio foi
utilizado para inserir o cassete lacZ-Km no sítio NsiI presente no gene modB2, na
mesma orientação do gene, dando origem ao plasmídeo pABKC (Figura 6B)
39
FIGURA 6 ESQUEMA DE MUTAGÊNESE DOS GENES fdxA E modB2 DE H.
seropedicae
Os sítios de restrição estão indicados na figura. E, EcoRI; N, NsiI; P, PstI. As setas indicam
os sentidos de transcrição dos genes.
HS25-MF-013-D09
200pb
orf1
orf2
fdxA
nifQ modA1
E E
N
Fragmento EcoRI-EcoRI clonado em pSUP202
orf1
orf2
fdxA
nifQ
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
E
coR
I
200pb
orf1
orf2
fdxA
nifQ
N
1,0Kb
KmlacZ
P P
pALFKC
p
ALFSA
1 Clonagem de fdxA em pSUP202
2 Inserção do cassete lacZ-Km no gene fdxA
E
coR
I
A
40
FIGURA 6 ESQUEMA DE MUTAGÊNESE DOS GENES fdxA E modB2 DE H.
seropedicae - Continuação
Os sítios de restrição estão indicados na figura. N, NsiI; P, PstI. As setas indicam os
sentidos de transcrição dos genes.
1 Clonagem de modB2 em pSUP202 e inserção do cassete lacZ-Km
B
200pb
p
romoto
r
modA2
modB2
GAATTC
CTTAAG
CTGCAG
GACGTC
N
E
coRI
P
s
t
I
Km lacZ
P
P
Fragmento EcoRI-PstI clonado
em pSUP202 (pALFAB)
pABKC
41
3.10.2 Mutagênese de H. seropedicae
Estirpes mutantes de H. seropedicae foram obtidas introduzindo-se os
plasmídeos construídos in vitro com inserção sítio dirigida de cassete lacZ-Km nos
genes estudados (pALFKC e pABKC) na estirpe selvagem de H. seropedicae
(SMR1).
As construções foram introduzidas por eletroporação como descrito (item
3.8). As colônias de H. seropedicae crescidas foram testadas quanto à resistência ao
antibiótico do cassete inserido e sensibilidade ao antibiótico de resistência do vetor
no qual o gene estava clonado.
As possíveis estirpes mutantes selecionadas foram inoculadas em 3 mL de
meio NFbHP contendo NH
4
Cl 20 mmol/L com os antibióticos apropriados. Desta
cultura, 1,5 mL foi transferido para tubo de microcentrífuga e o DNA cromossomal
foi extraído como descrito no item 3.5.2.
3.10.3 Hibridização de DNA (Southern Blot)
A técnica de hibridização de DNA permite detectar fragmentos específicos
de DNA em amostras de composição complexa como DNAs genômicos
(SOUTHERN, 1975). Esta técnica foi utilizada para verificar a inserção do cassete
lacZ-Km nos genes alvo de estudo no genoma da bactéria H. seropedicae.
3.10.3.1 Digestão do DNA cromossomal e separação em gel de agarose
O DNA cromosomal das estirpes de H. seropedicae estirpe selvagem
(SMR1) e estirpes mutantes foram digeridos com as endonucleases de restrição
EcoRI. e PstI. Os fragmentos de DNA gerados pela digestão foram separados em gel
de agarose 0,8% (p/v). O gel foi corado em solução de brometo de etídeo 0,5 μg/mL
por 20 minutos e visualizado em transiluminador com descrito (item 3.6).
42
3.10.3.2 Transferência e fixação do DNA à membrana de náilon
Após a eletroforese o gel foi transferido para o sistema de transferência por
pressão negativa usando o sistema Vaccum Blot (Pharmacia Biotech), sendo
posicionado sobre uma membrana de náilon Hybond
TM
N de mesma dimensão do
gel. Este sistema foi acoplado a uma bomba a vácuo e após a aplicação de uma
pressão de 50 mbar, o gel foi regado constantemente com uma solução de
depurinação (HCl 250 mmol/L) por 5 minutos. O gel foi então rapidamente lavado
com água destilada seguido pela aplicação de uma solução de desnaturação (NaCl
1,5 mol/L; NaOH 0,5 mol/L) por 10 minutos. O gel foi novamente lavado com água
destilada e aplicada uma solução de neutralização (Tris-HCl 0,5 mol/L pH 7,5; NaCl
1,5 mol/L) por 10 minutos e solução de transferência (NaCl 3,0 mol/L; citrato
trissódico dihidratado 0,3 mol/L, pH 7,0) por aproximadamente 1 hora.
A membrana foi seca a temperatura ambiente e o DNA foi fixado à
membrana através da exposição à luz ultravioleta (312 nm) durante 4 minutos. Esta
membrana foi armazenada em garrafa de hibridização até a sua utilização.
3.10.3.3 Preparo da sonda de DNA marcada com [α
32
P] dCTP
A marcação do DNA utilizado como sonda foi realizada como descrita
(SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS, 1989). O plasmídeo HS05-MF-037-A04
digerido com a enzima EcoRI foi marcado com [α
32
P]dCTP com auxílio do
fragmento Klenow da DNA polimerase I. O sistema utilizado para marcação da
sonda está descrito na Tabela 5.
43
TABELA 5 SISTEMA DE MARCAÇÃO RADIOATIVA DE DNA UTILIZADO
COMO SONDA PARA HIBRIDIZAÇÃO DE DNA
COMPONENTE QUANTIDADE CONCENTRAÇÃO FINAL
DNA desnaturado 40 ng 800 ng/mL
OLB*
12 μL
-
BSA 10 mg/mL
2,5 μL 500 μg/mL
[α
32
P]dCTP (10 μCi/μL) 2,0 μL (20 μCi)
133,2 nmol/L
Klenow 2,5 U 50 U/mL
H
2
O
q.s.p 50 μL
* OLB = mistura A:B:C (1:2,5:1,5)
solução A: Tris-HCl (pH 8,0) 1,25 mmol/L, MgCl
2
0,125 mmol/L, β-mercaptoetanol 5 mmol/L, 2 mmol/L de
dATP, dGTP e dTTP
solução B: Mops 2 mol/L
solução C: hexadesoxinucleotídeos 1 mg/mL
Este sistema foi incubado a temperatura ambiente por aproximadamente 16
horas. Para a hibridização a sonda marcada foi aquecida a 100
o
C por 5 minutos,
resfriada em gelo e adicionada a solução de pré-hibridização.
3.10.3.4 Pré-hibridização e hibridização
Na garrafa de hibridização contendo a membrana com o DNA fixado, a pré-
hibridização foi realizada em 20 mL de tampão Tris-HCl 100 mmol/L pH 8,0; SDS
7% (p/v) e EDTA 1 mmol/L, a 65
o
C por 30 minutos. Para bloquear ligações
inespecíficas da sonda à superfície da membrana, foi adicionado à solução de pré-
hibridização 4 μL de DNA de esperma de salmão (2 mg/mL) previamente fervido
por 5 minutos, incubando-se a 65
o
C por 4 horas..
Para a hibridização a sonda marcada com [
32
P] foi adicionada à solução de
pré-hibridização e incubada a 65
o
C durante aproximadamente 24 horas sob
constante agitação rotatória em forno de hibridização (Hybaid).
Após a hibridização, a membrana foi lavada duas vezes com 20 mL de
solução de alta estringência (SSC 0,1×, SDS 0,1% (p/v)) a 65
o
C por 30 minutos,
seca e visualizada com PhosphorImager Storm (GE Healthcare).
44
3.11 EXPERIMENTOS DE FISIOLOGIA
Para determinação da função dos genes estudados e identificação de
prováveis regiões promotoras, foram realizados ensaios de atividade da nitrogenase,
inativação reversível da nitrogenase por amônio e ensaios de β-galactosidase.
3.11.1 Ensaio de Atividade da Nitrogenase em Meio Semi-Sólido
A atividade da nitrogenase foi determinada em culturas mantidas em 4 mL
de meio NFbHP semi-sólido contendo 0,5 mmol/L de glutamato de sódio, após 24
horas de incubação a 30
o
C ou após formação de película na superfície do meio. Os
frascos foram fechados com rolha de borracha, acetileno injetado (10% de fase
gasosa) e incubados a 30
o
C por 1 hora. Para determinar as quantidades de etileno
produzidas foram tomadas alíquotas de 0,5 mL da fase gasosa e analisadas em
cromatografia gasosa (Cromatógrafo Varian, modelo 3400, equipado com coluna
Porapak N e detector de ionização de chama) (DILWORTH, 1966; SCHOLLHORN
e BURRIS, 1967). Foi usado nitrogênio como gás de arraste a um fluxo de 20
mL/min, temperatura da coluna de 120
o
C, do detector de 200
o
C e como padrão
etileno.
O cálculo do etileno formado foi realizado utilizando etileno padrão, no
qual 0,5 mL contém 2,23 nmoles de etileno a 1 atm e a 25
o
C e a atividade específica
da nitrogenase foi expressa como nmol de etileno formado por minuto e por mg de
proteína total da cultura.
45
3.11.2 Ensaios de Desrepressão e Inativação Reversível da Nitrogenase por Amônio
(Switch off/on)
Para ensaios de desrepressão e inativação reversível da nitrogenase H.
seropedicae estirpes selvagem SMR1 e mutante KC6 foram cultivadas em frascos
de 60 mL contendo 10 mL de meio NFbHP suplementado com glutamato de sódio 4
mmol/L durante 16 horas, sob agitação de 120 rpm à 30
o
C em agitador rotatório de
água. Os frascos foram vedados com rolhas de borracha e acetileno foi injetado
(10% da fase gasosa), mantendo-os à 30
o
C sob agitação e a formação de etileno foi
analisada em intervalos de tempo de 10 minutos, com a adição de NH
4
Cl 350
μmol/L ou 1 mmol/L aos 30 minutos. As quantidades de etileno formadas foram
determinadas de acordo com o ítem 3.11.1.
3.11.3 Ensaio de Atividade de β-galactosidase
A atividade de β-galactosidase em culturas de H. seropedicae foi
determinada como descrito por MILLER (1992) com modificações. Alíquotas de
100 μL de cultura foram misturadas a 900 μL de tampão Z (Na
2
HPO
4
.7H
2
O 60
mmol/L, NaH
2
PO
4
.H
2
O 40 mmol/L, KCl 10 mmol/L, MgSO
4
.7H
2
O 1 mmol/L, β-
mercaptoetanol 50 mmol/L, SDS 0,0027%; pH 7,0), seguido pela adição de 2 gotas
de clorofórmio. O sistema foi agitado vigorosamente e incubado em banho de água a
30
o
C por 5 minutos. A reação foi inicidada pela adição de 200 μL de orto-nitrofenil-
β-D-galactopiranosídeo (ONPG) (4 mg/mL em tampão Z) e interrompida pela
adição de 500 μL de Na
2
CO
3
1mol/L após mudança da coloração do sistema. A
absorbância do produto colorido foi determinada em 420 nm e 550 nm. A reação
controle foi feita seguindo o mesmo procedimento, porém com água como amostra.
A atividade de β-galactosidase foi determinada como quantidade (nmol) de
orto-nitrofenol (ONP) formado por mg de proteína por unidade de tempo (min).
46
3.12 AMPLIFICAÇÃO E CLONAGEM DOS GENES modE1 E modE2
Os genes modE1 e modE2 de H. seropedicae foram amplificados por PCR
(reação em cadeia da polimerase) utilizando como molde o DNA genômico de H.
seropedicae SMR1. Nesta reação foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores
específicos NdeI-modE1R (5’CATCGGCAAGCATATG
AGTACC3’), BamHI-
modE1F (5’GGTGTCAGGATCC
CAGAATG3’) e NdeI-modE2R
(5’GTACAATCACGCATATG
AATG3’), BamHI-modE2F
(5’GCAGGCGGATCC
GGTATTTG3’), respectivamente. Os iniciadores utilizados
contêm os sítios de restrição NdeI e BamHI (sublinhados) para clonagem em vetor
de expressão.
A mistura de reação para amplificação continha aproximadamente 20 ng do
DNA molde, 10 pmol de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores, 0,2 mmol/L de
dNTP (mistura equimolar de desoxirribonucleotídeos), 1,5 mmol/L de MgCl
2
e Taq
DNA polimerase (1U), tampão Tris-HCl 20 mmol/L pH 8,6, KCl 100 mmol/L, e
volume final de 25 μL. Para esta reação foi utilizado um termociclador (Perkin-
Elmer) com os seguintes ciclos de temperatura: 94
o
C/5 min. (1 ciclo); 94
o
C/30 s,
52,5
o
C/30 s, 72
o
C/1,5 min. (35 ciclos) e 72
o
C/5 min.
Os produtos de PCR modE1 (874 pb) e modE2 (415 pb) foram clonados em
vetor pCR
®
2.1 do kit TA Cloning
®
(Invitrogen
TM
) dando origem aos plasmídeos
pCR2.1modE1 e pCR2.1modE2, respectivamente (Figura 7).
O sistema de clonagem TA liga o produto de PCR no plasmídeo pCR
®
2.1
de 3,9 kb. O vetor foi construído para ser um vetor linear contendo uma
deoxitimidina (T) na extremidade 3’ que é ligada a uma deoxiadenina (A) na
extremidade 3’ do produto de PCR (Invitrogen
TM
). Os plasmídeos pCR2.1modE1 e
pCR2.1modE2 foram digeridos com NdeI e BamHI. Os fragmentos liberados pela
digestão, correspondendo aos genes modE1 e modE2 foram purificados em gel de
agarose 1% (p/v) usando o kit QIAquick gel extraction (Qiagen). Estes fragmentos
purificados foram inseridos no vetor de expressão pET-28a(+) previamente digerido
47
com NdeI e BamHI, resultando nos plasmídeos pET28amodE1 e pET28amodE2.
Em todas as etapas de clonagem os plasmídeos foram analisados por
sequenciamento em seqüenciador ABI PRISM
TM
377.
48
FIGURA 7 - ESQUEMA DE CLONAGEM DOS GENES modE1 E modE2
1 Digestão dos plasmídeos pCR2.1modE1 e pCR2.1modE2 com NdeI e BamHI liberando os
insertos modE1 (807 pb) e modE2 (366 pb);
2 Clonagem dos insertos liberados no vetor de expressão pET28a(+) nos sítios NdeI e BamHI
A
CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA
GTC CTT TGT CGA TAC TGG TAC TAA TGC GGT TCG AAC CAT GGC TCG AGC CTA GGT GAT
GTA ACG GCC GCC AGT GTG CTG GAA TTC GCC CTT P C R P r o d AG GGC GAA TTC TGC
CAT TGC CGG CGG TCA CAC GAC CTT AAG CGG GAA TTC CCG CTT AAG ACG
AGA TAT CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT TCG CCC TAT
TCT ATA GGT AGT GTG ACC GCC GGC GAG CTC GTA CGT AGA TCT CCC GGG TTA AGC GGG ATA
AGT GAG TCG TAT TAC AAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG GAA AAC
TCA CTC AGC ATA ATG TTA AGT GAC CGG CAG CAA AAT GTT GCA GCA CTG ACC CTT TTG
Primer reverso M13
lacZα ATG
Promotor T7
Primer universal M13
HindIII
KpnI
SacI BamHI SpeI
BstXI
EcoRI
EcoRI
EcoRV
BstXI
NotI
XhoI
NsiI
XbaI
ApaI
A
A
PRODUTO DE PCR
Plac
5’-CATCGGCAAGCA TATGAGTACC
3’-GTAGCCGTTCGTAT ATTCATGG
modE1
G
GTGTCAG GATCCCAGAATG-5’
C
CACAGTCCTAG GGTCTTAC-3’
modE2
N
deI
B
amHI
5’-GTACAATCACGCA TATGAATG
3’-CATGTTAGTGCGTAT ACTTAC
G
CAGGCG GATCCGGTATTTG-5’
C
GTCCGCCTAG GCCATAAAC-3’
A
GATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA
TATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAA
A
TGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC
GAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG
BglII
Promotor T7
Operador lac
XbaI
rbs
Cauda His
Terminador T7
NdeI
B
amHI
H
H
H
H
H
H
M
G
S
S
S
S
G
L
V
P
R
G
S
H
M
Gene modE1 ou modE2
1
2
49
3.13 INDUÇÃO DA EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ModE1 E ModE2 EM
PEQUENA ESCALA
Os plasmídeos pET28amodE1 e pET28amodE2 que contêm os genes
modE1 e modE2 de H. seropedicae inseridos no vetor de expressão pET-28a(+),
respectivamente, foram introduzidos por eletroporação em E. coli estirpe
BL21(DE3) para induzir a expressão das proteínas ModE1 e ModE2 contendo uma
cauda de histidinas N-terminal. Algumas colônias transformantes foram inoculadas
em 10 mL de meio LB contendo 50 μg/mL de canamicina e incubadas sob agitação
de 200 rpm a 20
o
C, 30
o
C ou 37
o
C até a cultura atingir uma absorbância de
aproximadamente 0,3 em comprimento de onda de 600 nm. Nesta etapa a expressão
das proteínas His-ModE1 e His-ModE2 foi induzida pela adição de IPTG 0,5
mmol/L ou lactose 15 mmol/L (0,5% (p/v)), mantendo-se as culturas em agitação
constante na temperatura testada por mais 3 horas. Nesta etapa as células foram
sedimentadas por centrifugação a 15.000×g em tubos de microcentrífuga, a massa
celular foi ressuspensa em diferentes tampões de lise e as células rompidas por
sonicação (3x30 segundos, com intervalos de 1 minuto) em Ultrasonic processor XL
(Heat Systems). Para otimizar as condições de expressão da maior quantidade de
proteína solúvel, foram testados diferentes indutores, cultivo em diferentes
temperaturas e tampões de lise com diferentes pHs, contendo diferentes sais (NaCl,
KCl e MgCl
2
) nas concentrações de 10-500 mmol/L. Com base nos experimentos
realizados, a indução da expressão das proteínas ModE1 e ModE2 em grande escala
foi feita em 250mL de cultura crescida a 37
o
C sob agitação de 200 rpm. Assim que
a cultura atingiu A
600
em torno de 0,3 foi adicionado IPTG 0,5 mmol/L mantendo a
cultura nas mesmas condições por mais 3 horas.
50
3.14 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ModE1 E ModE2
3.14.1 Eletroforese de Proteína sob Condições Desnaturantes (SDS-PAGE)
As análises eletroforéticas de proteínas em gel de poliacrilamida em
condição desnaturante foram feitas como descrito por LAEMMLI (1970). Esta
técnica é utilizada para separar proteínas de acordo com sua massa. A solução de
proteína a ser analisada é misturada com SDS, um detergente aniônico que desnatura
as proteínas ligando-se ao esqueleto polipeptídico, conferindo uma carga negativa ao
polipeptídeo proporcional ao seu tamanho. Além da adição de SDS, a solução de
proteína é fervida na presença de agente redutor como β-mercaptoetanol.
O sistema de eletroforese em gel de poliacrilamida é composto pelos géis
de empilhamento e separador. O gel de empilhamento possui pH 6,8 e concentração
de poliacrilamida de 4% e o gel separador possui pH 8,8 e concentração de
poliacrilamida de 15%.
Antes de serem analisadas por SDS-PAGE as amostras foram misturadas
com 5,0 μL de tampão de amostra (Tris-HCl 62,5 mmol/L pH 6,8, glicerol 8,7%
(v/v), SDS 2% (p/v), β-mercaptoetanol 5% (v;v) e azul de bromofenol 0,00125%
(p/v)) e aquecidas a 100
o
C por 3 minutos. As eletroforeses foram realizadas a 150-
200 V em tampão Laemmli (Tris base 25 mmol/L, glicina 192 mmol/L; pH 8,3 e
SDS 0,1% (p/v)) durante aproximadamente 60 minutos. Os géis foram corados com
solução de azul de Coomassie G-250 0,1% (p/v) e descorados com solução
descorante para gel de proteína (metanol 25% (v/v) e ácido acético 10% (v/v)).
51
3.14.2 Purificação da Proteína His-ModE1
E. coli estirpe BL21(DE3) contendo a construção pET28amodE1 teve a
expressão da proteína His-ModE1 induzida como descrito no item 3.13. Esta
proteína formou agregados insolúveis conhecidos como corpos de inclusão. O
procedimento adotado para rompimento das células por sonicação, separação dos
corpos de inclusão do extrato solúvel, solubilização e redobramento de His-ModE1
sem a formação de agregados de proteína estão resumidos na Figura 8.
52
FIGURA 8 - ESQUEMA DE PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE1 DE H.
seropedicae
20 mL tampão de lavagem/4
o
C – 1 h
Sonicação - 3×30 segundos
Centrifugação 12.000×g – 20 minutos
Solubilização
20 mL tampão de solubilização/4
o
C – 1 h
Sonicação - 3×30 segundos
Centrifugação 12.000×g – 20 minutos
S/N4 -sobrenadante (His-ModE1 solubilizada)
Precipitado – proteína insolúvel (descartado)
Renaturação na Coluna e Cromatografia de Afinidade
Lavagem
Eluição
Diálise das frações reunidas
Gradiente 100 – 0% de uréia
His-ModE1 purificada
2×
Rompimento das Células e Preparação dos Corpos de Inclusão
E. coli BL21(DE3)+pET28amodE1 (250 mL)
Células ressuspensas em 20 mL de tampão de lise/30 min em gelo
Sonicação - 3×30 segundos
Lisado
Centrifugação/12.000xg – 20 minutos
Precipitado
(1)
= corpos de inclusão (His-ModE1)
Sobrenadante = S/N1
Isolamento e Lavagem dos Corpos de Inclusão
Precipitado
(1)
Precipitado
(2)
= corpos de inclusão (His-ModE1)
Sobrenadantes = S/N2 e S/N3
53
3.14.3 Rompimento das Células e Preparação dos Corpos de Inclusão
Uma cultura de 250 mL de E. coli BL21(DE3) contendo a construção
pET28amodE1 super-expressou a proteína His-ModE1 induzida por IPTG 0,5
mmol/L (item 3.13). Esta cultura foi centrifugada a 12.000×g por 20 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspenso em 20 mL de tampão de
lise (Tris-HCl 50 mmol/L pH 8,0, NaCl 500 mmol/L, PMSF 1 mmol/L, glicerol
10% (v/v) e lisozima 200 μg/mL) e incubado em gelo por 30 minutos. A suspensão
celular foi sonicada em gelo (3×30 segundos com intervalos de 1 minuto) e
centrifugada a 12.000×g por 20 minutos. A fração sobrenadante (S/N1) foi guardada
em gelo e o precipitado
(1)
(Figura 8) foi ressuspenso em 20 mL de tampão de
lavagem (Tris-HCl 50 mmol/L pH 8,0, NaCl 500 mmol/L, uréia 2 mol/L, Triton X-
100 0,5% (p/v), DTT 1 mmol/L) e mantido a 4
o
C por 1 hora. Esta suspensão foi
novamente sonicada (3×30 segundos com intervalos de 1 minuto), centrifugada a
12.000×g por 20 minutos, sendo o sobrenadante (S/N2) guardado em gelo e o
precipitado tratado novamente com o mesmo procedimento. Este novo sobrenadante
(S/N3) foi guardado em gelo e o precipitado
(2)
(Figura 8) submetido ao tratamento
para solubilização e redobramento das proteínas agregadas.
3.14.4 Solubilização, Redobramento e Cromatografia de Afinidade de His-ModE1
Para solubilizar as proteínas dos corpos de inclusão, o precipitado
(2)
(Figura
8) foi ressuspenso em 20 mL de tampão de solubilização (Tris-HCl 50 mmol/L pH
8,0, NaCl 500 mmol/L, uréia 8 mol/L, DTT 1,0 mmol/L) e mantido a 4
o
C por 1
hora. Esta suspensão foi novamente sonicada e centrifugada a 12.000×g por 15
minutos a 4
o
C.
A fração sobrenadante (S/N4) contendo a proteína His-ModE solubilizada
foi aplicada a coluna HiTrap Chelating HP (5 mL) carregada com Ni
2+
. A cauda de
54
histidinas de His-ModE1 é capaz de quelar os íons Ni
2+
da coluna, imobilizando a
proteína. O redobramento de His-ModE1 foi realizado com a proteína ligada na
matriz da coluna em tampão de renaturação (Tris-HCl 50 mmol/L pH 8,0, NaCl 500
mmol/L) através de um gradiente linear decrescente de uréia (8 mol/L-0). Após esta
etapa a proteína foi eluída da coluna com um gradiente linear crescente de imidazol
(0-1,0 mol/L). Foram coletadas 25 frações de 2 mL e analisadas em SDS-PAGE.
As frações que possuíam concentrações maiores de His-ModE1 foram
reunidas e dialisadas contra o tampão de armazenamento (Tris-HCl 50 mmol/L,
glicerol 50% (v/v) e NaCl 500 mmol/L) a 4
o
C por 16 horas e a proteína purificada
foi armazenada a –80
o
C.
3.14.5 Purificação da Proteína His-ModE2
Uma cultura de 250 mL de E. coli BL21(DE3) contendo a construção
pET28amodE2 super-expressou a proteína ModE2 induzida por IPTG 0,5 mmol/L
(item 3.13). Esta cultura foi centrifugada a 12.000×g por 20 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspenso em 20 mL de tampão de
sonicação (Tris-HCl 50 mmol/L pH 8,0, glicerol 10% (p/v), NaCl 500 mmol/L).
Esta suspensão foi sonicada em gelo (3×30 segundos com intervalos de 1 minuto) e
centrifugada a 12.000×g por 20 minutos. A fração sobrenadante foi aplicada à
coluna HiTrap Chelating HP (5 mL) carregada com Ni
2+
. Os tampões utilizados para
eluição da proteína His-ModE2 foram os mesmos utilizados para a purificação de
His-ModE1, como descritos acima. Foram coletadas 25 frações de 2 mL e analisadas
por SDS-PAGE. Aquelas que possuíam concentrações maiores de proteína foram
reunidas e adicionado glicerol a uma concentração final de 50% (v/v). A proteína
purificada foi quantificada e armazenada a –80
o
C.
55
3.14.6 Dosagem de Proteína
Proteínas totais foram determinadas pelo método descrito por BRADFORD
(1976), utilizando albumina de soro bovino como padrão.
3.15 ENSAIO DE LIGAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 E His-ModE2 A
DNA
Os ensaios de ligação das proteínas His-ModE1 e His-ModE2 a DNA
utilizaram um fragmento BamHI-NheI de aproximadamente 350 pb contendo a
região promotora do gene modA2. Nesta região foi encontrada uma seqüência
consenso para ligação da proteína ModE, regulador transcricional dos genes
modABC, responsáveis pelo transporte de molibdênio em E. coli (ANDERSON et
al., 1997). As reações de ligação foram realizadas em um sistema de volume final de
10 μL contendo 5 nmol/L de DNA marcado com [α
32
]dCTP, tampão (Tris-HCl 10
mmol/L pH 8,0, KCl 50 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, MgCl
2
7 mmol/L e glicerol 10%
(p/v)), diferentes concentrações das proteínas His-ModE1 ou His-ModE2 (0-800
nmol/L) e NaMoO
4
.2H
2
O 10 mmol/L quando requerido. Este sistema foi incubado a
30
o
C por 10 minutos e aplicado em gel de poliacrilamida 4% (v/v) (acrilamida:bis-
acrilamida (19:1)) em TBE 1×. A eletroforese foi conduzida em tampão TBE 1× a
60V, durante aproximadamente 1,5 hora a 4
o
C. Os géis foram secos em secador de
gel Heto dry GD-1 (Heto Lab Equipament, Allerod, Denmark) e visualizados em
PhosphorImager Storm
TM
(GE Healthcare).
3.15.1 Marcação Radioisotópica da Região Promotora do Gene modA2
O fragmento de DNA de aproximadamente 350 pb contendo a região
promotora de modA2 de H. seropedicae foi obtido através da digestão do plasmídeo
HS05-EG-048-B06 com as endonucleases de restrição BamHI e NheI. O fragmento
56
purificado foi marcado com [
32
P]. O sistema de marcação continha cerca de 100
nmol/L de DNA, tampão de reação (Tris-HCl 50 mmol/L pH 8,0, MgCl
2
5 mmol/L
e DTT 1 mmol/L), 0,2 mmol/L de dTTP, dATP, dGTP e 1,0 μL de α[32P] dCTP
(10 μCi/mL) e 5,0 U de enzima Klenow em um volume final de reação de 100 μL.
A reação foi incubada a 30
o
C por 30 minutos e purificada utilizando kit PCR clean-
up (Qiagen) para remoção de nucleotídeos não incorporados.
57
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ORGANIZAÇÃO DOS GENES nif DE H. seropedicae
Os genes estruturais da nitrogenase de H. seropedicae estão localizados em
uma região do genoma de aproximadamente 36 kb contendo genes nif responsáveis
pela regulação da fixação de nitrogênio, biossíntese do cofator FeMo e maturação
dos componentes estruturais em formas ativas. Nesta região também estão presentes
alguns genes nif-associados como genes de ferredoxinas, de regulação e transporte
de molibdato e orfs conservadas entre alguns diazotrofos e orfs de função
desconhecida. Na região a jusante dos genes nifHDKENXorf1orf2 estão localizados
os genes fdxAnifQ e os genes modA1B1C1 (Figura 9), organização incomum entre
os diazotrofos estudados (MACHADO et al., 1996; KLASSEN et al., 1999;
SOUZA, 2003). A montante do gene nifA está presente o gene modE1 (VOIGT,
2000) que codifica um regulador transcricional dos genes mod. Em uma região
distinta do genoma de H. seropedicae está localizado um segundo grupo de genes
mod (modA2B2C2) entre os genes eriC (canal de cloreto) e aceA (isocitrato liase)
(www.genopar.org) (Figura 9).
58
FIGURA 9 - ORGANIZAÇÃO ESTRUTURAL DOS GENES mod E fdxA EM H.
seropedicae
FONTE: SOUZA et al., 1991a; MACHADO et al., 1996; KLASSEN, et al., 1999; VOIGT, 2000;
SOUZA, 2003 e www.genopar.org
A figura não está mostrando toda a região nif de H. seropedicae. Estão representados somente os
genes estudados neste trabalho e o contexto genômico no qual estão inseridos. Os genes estão
indicados na figura e as setas indicam o sentido de transcrição.
hesB
f
dx
N
nifB nifA orf orf
modE1
nifH
D
K
E
X
1 2
N
f
dxA nifQ modA1 modB1 modC1
eriC
modE2modA2modB2 modC2
aceA
1 Kb
59
4.2 ANÁLISE DO GENE fdxA DE H. seropedicae
Na região dos genes nif de H. seropedicae foram encontrados quatro genes
que codificam ferredoxinas, duas do tipo 2Fe-2S (fdx1 e fdx2) e duas do tipo 2[4Fe-
4S] (fdxA e fdxN). O gene fdxA (EF666057)
está localizado a jusante dos genes
nifHDKENXorf1orf2 e imediatamente a montante dos genes nifQmodA1B1C1
(SOUZA, 2003) e o gene fdxN (M60319) está localizado a jusante do gene nifB e a
montante de hesB (REGO et al., 2006) (Figura 9).
O gene fdxA codifica uma proteína de 101 aminoácidos e possui dois
grupos de cisteínas conservados, formando dois motivos (Cys-X
2
-Cys-X
2
-Cys-X
3
-
Cys) separados por 41 aminoácidos, que provavelmente coordenam dois grupos
[4Fe-4S] (
BRUSCHI e GUERLESQUIN, 1988) (Figura 10).
Análise da seqüência de aminoácidos de fdxA indicou 64% de identidade (81%
de similaridade) a uma ferredoxina 4Fe-4S de Burkholderia vietnamiensis G4
(ABO58950) (MENARD et al., 2007), 56% de identidade (72% de similaridade) a
proteína FdxA from Azospirillum brasilense (AAK51501) (POTRICH et al., 2001),
55% de identidade (73% de similaridade) a proteína Fer3 de Bradyrhizobium
japonicum (AAG60736) (GOTTFERT et al., 2001) e 50% de identidade (75% de
similaridade) a ferredoxina FdIII de Rhodobacter capsulatus (M26323) (MORENO-
VIVIAN et al., 1989). Nestes organismos, os genes que codificam estas ferredoxinas
estão localizados no grupo de genes nifENX (KLASSEN et al., 1999; MENARD et
al., 2007; POTRICH et al., 2001; GOTTFERT et al., 2001; MORENO-VIVIAN et
al., 1989).
O gene fdxN codifica uma ferredoxina de 72 aminoácidos contendo dois
grupos de cisteínas conservadas, o primeiro apresentando um padrão típico Cys-X
2
-
Cys-X
2
-Cys-X
3
-Cys e o segundo apresentando um padrão incomum Cys-X
2
-Cys-X
8
-
Cys-X
3
-Cys. A comparação entre as ferredoxinas FdxA e FdxN de H. seropedicae
não mostrou similaridade significante em suas seqüências de aminoácidos, com
exceção dos grupos de cisteínas conservadas.
60
A localização dos genes fdxA e fdxN em operons de genes essenciais para a
síntese da nitrogenase sugere o envolvimento do produto destes genes na
transferência de elétrons no processo de fixação de nitrogênio em H. seropedicae.
Na região dos genes nif de H. seropedicae, dois outros genes que codificam
ferredoxinas do tipo [2Fe-2S] (fdx1 e fdx2) foram anotados no sequenciamento
genômico. O gene fdx1 está localizado a 3,5 kb a jusante do gene nifH, enquanto
fdx2 está a 17,5 kb a montante de nifH (www.genopar.org). Estes genes codificam
ferredoxinas de 100 e 111 aminoácidos, respectivamente. Ambas proteínas
apresentam resíduos de cisteínas conservados, formando um motivo (Cys-X
5
-Cys-
X
2
-Cys-X
35
-Cys) típico para coordenação do grupo [2Fe-2S] (Figura 11).
O gene fdx1 foi mutagenizado e não apresentou fenótipo de deficiência na
redução de acetileno em condições de presença e ausência de fonte de nitrogênio,
indicando o não envolvimento do produto deste gene no processo de fixação
biológica de nitrogênio (SOUZA, 2003).
61
FIGURA 10 ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA FdxA DE H. seropedicae COM SEQUÊNCIAS DE OUTRAS
PROTEÍNAS SIMILARES
10 20 30 40 50
| | | | |
Fer3_Bj MS----FATRDGRDWMPQYLASIDAKKCIGCGRCFKVCGQDVMTLKGINEEGELV
FdIII_Rc MPT--VAYTRGGAEYTPVYLMKIDEQKCIGCGRCFKVCGRDVMSLHGLTEDGQVV
FdxA_Ab MAEFVTGTTRGGAAWTPKFVESIDQKMCIGCGRCFKVCGRDVLELIGITEDGDIV
4Fe_4S_Bv MSETFNVKLPSGETWTPTFVSTLDEAKCIGCGRCFKVCPRGVLELVGVDEDGEHV
FdxA_Hs -MTTFTVKLPGGADWTPQFVGQINEDKCIGCGRCFKVCGRDVLALVGINDEGQRI
* * *********** * * * *
65 75 85 95 105
| | | | |
Fer3_Bj NLDN----DADDEVEKKIMVLNDQGACIGCGACDRVCPASCQTHVPAAAA
FdIII_Rc APGTDEWDEVEDEIVKKVMALTGAENCIGCGACARVCPSECQTHAALS--
FdxA_Ab DAFD-------DEAEKKVMSVKNAGNCIGCESCGKVCSKNCITHLPQAA-
4Fe_4S_Bv ALDSD--SDDDDEYEKKVMTIAHRQLCIGCTACAKICPKKCYTHAAAQV-
FdxA_Hs AVDPD--DDEDEEYERKIMTIANRDNCIGCEACSRICPKKCYTHGSAQV-
* * * **** * * * **
O alinhamento foi feito utilizando o programa ClustalW (THOMPSON et al., 1994). Os resíduos
de cisteínas conservados estão indicados na figura nas caixas pretas. (*) Aminoácidos idênticos.
Fer3_Bj – proteína Fer3 de Bradyrhizobium japonicum
FdIII_Rc – proteína FdIII de Rhodobacter capsulatus
FdxA_Ab – proteína FdxA de Azospirillum brasilense
4Fe-4S_Bv – ferredoxina 4Fe-4S de Burkholderia vietnamiensis G4
FdxA_Hs – proteíns FdxA de Herbaspirillum seropedicae
62
FIGURA 11 ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS Fdx1 E Fdx2 DE H. seropedicae
10 20 30 40 50
| | | | |
Fdx2 MPHITVRPHPVLCAEGSSFDARSGQFLCDALLKNGIALEHACEKSCACSTCHVIVHEG
Fdx1 MPVVTIQPS------GKTIEVSIGTTLLAAVMKAGEAIANKCQGKAECGACHIFVLEG
** * * * * * * * * * * * ** * **
68 78 88 98 108
| | | | |
Fdx2 YDSLAPAGDDEEDQLGRAWGLSAQSRLACQVVLRQQDLVIELPLYTVNLARERD
Fdx1 RKSVSRTTPSENAKLDSIVGVGSKSRLACQVIVGEEDVTLEL----LNFASGR-
* * * * ******* * ** * * *
O alinhamento foi feito utilizando o programa ClustalW (THOMPSON et al., 1994). Os
resíduos de cisteínas conservados estão indicados na figura nas caixas pretas. (*)
Aminoácidos idênticos.
63
4.2.1 Mutagênese do Gene fdxA
O plasmídeo pALFKC (cassete lacZ::Km inserido na mesma orientação de
transcrição do gene fdxA) foi transformado na estirpe SMR1 de H. seropedicae.
Baseado na resistência a canamicina e na sensibilidade a tetraciclina (marcador do
plasmídeo), foi selecionada uma estirpe mutante, KC6 (cassete na mesma orientação
de fdxA). A integração do cassete lacZ::Km no DNA genômico do H. seropedicae
foi verificada por hibridização, utilizando como sonda o plasmídeo HS05-MF-037-
A04 (nifX(5’)-nifQ(5’)), conforme descrito em Material e Métodos (item 3.10.3). O
resultado da hibridização é mostrado na Figura 12.
Os perfis de hibridização mostraram que a estirpe mutante KC6 é resultado da
inserção do cassete lacZ-Km no genoma de H. seropedicae por recombinação dupla
homóloga. A representação esquemática da região mutagenizada na estirpe KC6 está
mostrada na Figura 13.
64
FIGURA 12 HIBRIDIZAÇÃO DE DNA DO GENOMA DAS ESTIRPES DE H.
seropedicae SELVAGEM (SMR1) E MUTANTE fdxA (KC6) COM A SONDA
HS05-MF-037-A04
Painel A: eletroforese em gel de agarose 0.7% (p/v) do DNA genômico das estirpes
selvagem (linhas 2 e 3) e mutante KC6 (linhas 4 e 5). As amostras foram digeridas com
EcoRI (linhas 2 e 4) ou com PstI (linhas 3 e 5). Os marcadores de tamanho molecular são
apresentados na linha 1. O gel foi corado com brometo de etídeo (item 3.6). Painel B:
Hibridização das amostras apresentadas em A. Painel C: esquema indicando o plasmídeo
HS05-MF-037-A04 utilizado como sonda digerido com EcoRI (E), com destaque para o
gene fdxA. (P) PstI.
1
2
3
4
5
A
1,6
2,0
3,0
4,0
5,0
Marcador de Tamanho Molecular (Kb)
1
2
3
4
5
B
1,6
3,9
2,4
0,8
7,0
3,4
2,0
Kb
C
nifX orf1
orf2
f
dxA nifQ(5’)
E
vetor pUC18R
500pb
P
65
FIGURA 13 REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA REGIÃO GENÔMICA DAS ESTIRPES SELVAGEM
(SMR1) E MUTANTE (KC6) APÓS A INTEGRAÇÃO DO CASSETE lacZ-Km
ESTIRPE SELVAGEM SMR1
N
siI
nifN nifX orf1
2
f
dxA
nifQ modA1
500 pb
nifE
E
coRI
E
coRI
P
stI
P
stI
3900 pb
2400 pb
P
stI
800 pb
ESTIRPE MUTANTE KC6
nifN nifX orf1
2
nifE
E
coRI
P
stI
nifQ modA1
E
coRI
P
stI
E
coRI
E
coRI
3000 pb 3400 pb 2000 pb
7000 pb
P
stI
800 pb
lacZ::Km
f
dxA(5’)
f
dxA(3’)
O gene fdxA está representado em preto. A caixa listrada no mapa da estirpe selvagem representa o inserto do plasmídeo
HS05-MF-037-A04, usado como sonda. As setas indicam o sentido de transcrição.
65
66
4.2.2 Ensaios Fisiológicos
A estirpe de H. seropedicae contendo o cassete lacZ-Km inserido no gene
fdxA (KC6) foi utilizada para avaliar a expressão do gene em ensaios de atividade de
β-galactosidase e a função do gene no contexto da fixação de nitrogênio foi
analisada em experimentos de atividade da nitrogenase em meio semi-sólido e
experimentos inativação reversível da nitrogenase.
4.2.2.1 Análise transcricional do gene fdxA de H. seropedicae
Os genes nifHDKENXorf1orf2 de H. seropedicae são transcritos a partir de
um promotor do tipo –24/-12 localizado a montante do gene nifH (MACHADO et
al., 1996; KLASSEN et al., 1999). Análises in silico não mostraram a presença de
potenciais seqüências consenso de promotores conhecidos e sítios de ligação da
proteína NifA na região compreendida entre os genes nifH e fdxA. Para verificar
experimentalmente a presença de promotor na região a montante de fdxA, as regiões
dos genes nifX-nifQ e orf1-modA1 foram clonadas em vetor contendo o gene lacZ
sem promotor, pPW452 e pMP220, respectivamente (Tabela 6). Os resultados
mostraram níveis basais de atividade de β-galactosidase em todas as condições
testadas. Os experimentos também foram efetuados em condições limitantes de
molibdênio, devido a presença do grupo de genes modA1B1C1 a jusante de fdxA.
Estes resultados confirmam que os genes nifHDKENXorf1orf2fdxAnifQmodA1B1C1
formam um único operon, transcritos a partir do promotor do gene nifH, uma vez
que a região intergênica nifQ-modA1 foi analisada e os resultados obtidos também
indicam a ausência de promotor neste fragmento (KLASSEN, 2000).
A atividade de β-galactosidase na estirpe de H. seropedicae KC6, contendo
o gene lacZ inserido na mesma orientação de fdxA, foi determinada na presença ou
ausência de oxigênio e amônio (Tabela 6). Os resultados mostraram que o gene fdxA
é expresso apenas em condições de fixação de nitrogênio (microaerofilia e baixas
67
concentrações de amônio) e independente da presença de molibdato no meio de
cultura, confirmando a sua provável co-expressão com os genes nifHDK.
TABELA 6 ATIVIDADE DE β-GALACTOSIDASE EM H. seropedicae SMR1
CONTENDO DIFERENTES CONSTRUÇÕES
a
β-galactosidase
(nmol ONP.mg proteína
-1
.min
-1
)
Estirpes/Plasmídeos Condições
+Mo -Mo
+N/+O 3,6 ± 1,2 nd
+N/-O 7,9 ± 5,6 nd
-N/+O 6,6 ± 1,3 nd
SMR1/pEMS140
(nifB::lacZ)
-N/-O 815,6 ± 54,3 nd
+N/+O 6,4 ± 0,6 0,4 ± 0,3
+N/-O 7,1 ± 5,0 6,7 ± 3,7
-N/+O 0,3 ± 0,1 7,9 ± 4,5
SMR1/pMPnifX-nifQ
(nifX-nifQ::lacZ)
-N/-O 12,1 ± 1,2 8,5 ± 4,2
+N/+O 14,3 ± 5,3 10,6 ± 2,4
+N/-O 7,3 ± 2,5 5,2 ± 1,0
-N/+O 5,3 ± 4,6 9,3 ± 0,5
SMR1/pPWorf1-modA1
(orf1-modA1::lacZ)
-N/-O 10,9 ± 1,9 2,6 ± 2,4
KC6 (fdxA::lacZ-Km) +N/+O 4,6 ± 3,7 7,9 ± 3,2
+N/-O 13,2 ± 6,8 28,2 ± 14,1
-N/+O 12,3 ± 9,4 12,6 ± 7,6
-N/-O 520,3 ± 7,6 525,8 ± 19,5
a
A atividade de β-galactosidase foi determinada como descrito em Material e Métodos (3.12.3). +N
ou –N indicam a presença ou ausência de NH
4
Cl 20 mmol/L; +O indica que o experimento efetuado
em condições de aerobiose; -O indica O
2
~1,5%; -Mo indica condições limitantes de MoO
4
-2
; +Mo
indica meio contendo MoO
4
-2
adicionado. (nd) indica condição não ensaiada. Os resultados são a
média de três experimentos independentes feitos em triplicata.
A ferredoxina codificada pelo gene fdxN, presente no grupo de genes nif em
H. seropedicae, provavelmente é co-expressa com o gene nifB em condições de
fixação de nitrogênio (NifA/RpoN-dependente), uma vez que a análise in silico
indica ausência de uma seqüência consenso de promotor na região nifB-fdxN (REGO
et al., 2006).
68
4.2.2.2 Atividade da nitrogenase da estirpe mutante KC6
A atividade da nitrogenase da estirpe de H. seropedicae mutante no gene
fdxA (KC6) foi determinada em condições de fixação de nitrogênio em meio NFbHP
semi-sólido suplementado com 0,5 mmol/L de glutamato de sódio (item 3.11.1).
Nesta condição a estirpe mutante KC6 apresentou diminuição de aproximadamente
75% na atividade da nitrogenase em relação à estirpe selvagem (Figura 14). Este
fenótipo sugere o envolvimento do produto do gene fdxA em alguma etapa do
processo redução de nitrogênio ou maturação das proteínas Fe ou MoFe. A
localização deste gene a jusante dos genes nifENXorf1orf2 sugere o envolvimento
desta ferredoxina na síntese do cofator FeMo ou do grupo P da nitrogenase. A
proteína FdxA poderia também atuar como doador de elétrons para a Fe-proteína
durante a redução do nitrogênio.
Os genes nifX e orf1 de H. seropedicae são essenciais para a atividade da
nitrogenase em condições limitantes de ferro e molibdênio, sugerindo o envolvimento
do produto destes genes na utilização de ferro ou molibdênio para a atividade da
nitrogenase (KLASSEN et al., 2003). Como o gene fdxA provavelmente faz parte do
operon nifHDKENXorf1orf2, o efeito da mutação deste gene na atividade da
nitrogenase sob condições de limitação de ferro ou molibdênio foi determinada. A
atividade da nitrogenase na estirpe mutante KC6 nestas condições apresentou uma
diminuição de 75% na atividade quando comparada com a estirpe selvagem,
semelhante à atividade observada na presença de ferro e molibdênio (resultados não
apresentados). Estes resultados indicam que o produto de fdxA não está envolvido na
mobilização de ferro ou molibdênio necessária para a síntese dos cofatores metálicos
para a atividade da nitrogenase em H. seropedicae.
69
FIGURA 14 ATIVIDADE DA NITROGENASE DAS ESTIRPES SELVAGEM
(SMR1) E MUTANTE (KC6)
O ensaio foi realizado em meio NFbHP semi-sólido contendo glutamato de sódio 0,5
mmol/L (item 3.11.1). A atividade da nitrogenase máxima (100%) foi de aproximadamente
8,0 nmol de etileno.mg proteín
-1
.min
-1
. Os resultados são a média de três experimentos
independentes feitos em triplicata.
0
20
40
60
80
100
120
SMR1 KC6
Atividade da Nitrogenase (%)
70
Em Azoarcus sp. o gene fdxN que codifica uma ferredoxina 2[4Fe-4S], é
co-transcrito com os genes nifHDK. Deleção deste gene resultou em uma redução de
81% na atividade da nitrogenase e também afetou a inativação reversível da
nitrogenase pela adição de amônio (EGENER et al., 2001).
Em H. seropedicae, o gene fdxA que codifica uma ferredoxina 2[4Fe-4S]
diferente de fdxN, também é co-transcrito com os genes nifHDK e a estirpe mutante
fdxA
-
apresentou atividade da nitrogenase reduzida. Esta similaridade levanta a
hipótese da participação do produto deste gene na inibição reversível da nitrogenase.
Este mutante (KC6) foi ensaiado em experimentos de desligamento da nitrogenase
por íons amônio (Figura 15). Os resultados sugerem que o produto do gene fdxA não
está envolvido neste processo em H. seropedicae. A adição de 350 μmol/L de NH
4
Cl
às culturas selvagem e mutante produziu o desligamento da nitrogenase em ambas as
estirpes e religamento da atividade da nitrogenase em torno de 20 minutos após o
início do desligamento. Quando se adicionou 1 mmol/L de NH
4
Cl às culturas das
estirpes selvagem e mutante houve desligamento da nitrogenase, porém não foi
observado o religamento durante o tempo do experimento (resultados não
apresentados).
71
FIGURA 15 EFEITO DA ADIÇÃO DE AMÔNIO NA ATIVIDADE DA
NITROGENASE
O ensaio foi realizado como descrito em Material e Métodos (3.11.2). A seta indica a adição
de NH
4
Cl 350 μmol/L. A atividade da nitrogenase máxima (100%) foi de aproximadamente
8,0 nmol de etileno. mg proteín
-1
.min
-1
para estirpe selvagem SMR1 e 75% menor para a
estirpe mutante KC6. Os resultados são a média de três experimentos independentes feitos
em triplicata.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo de incubação (min)
Atividade da Nitrogenase (%)
SMR1
KC6
N
H
4
Cl 350
μ
mol/L
72
Muitas bactérias fixadoras de nitrogênio reagem à adição de amônio
inativando reversivelmente a nitrogenase e este processo envolve diferentes
mecanismos. Em alguns diazotrofos como R. rubrum (POPE, MURELL e
LUDDEN, 1985), R. capsulatus (JOUANNEAU et al., 1989) e A. brasilense (FU et
al., 1989), a Fe-proteína do complexo da nitrogenase é modificada pós-
traducionalmente através da ADP-ribosilação reversível de um resíduo específico de
arginina. Entretanto, em outras bactérias, o desligamento da nitrogenase envolve
algum mecanismo diferente e pouco conhecido (PIERRARD, LUDDEN e
ROBERTS, 1993).
Em H. seropedicae, hibridização DNA-DNA não revelou a presença dos
genes responsáveis pelo processo de ADP-ribosilação (draT-draG) (FU e BURRIS,
1989) e o sequenciamento do genoma de H. seropedicae confirmou a ausência
destes genes (www.genopar.org).
O mecanismo de desligamento da nitrogenase com a adição de amônio em
H. seropedicae, mostrou envolver o canal de NH
3
AmtB (NOINDORF et al., 2006),
como visto em A. brasilense (HUERGO et al., 2006) e R. capsulatus (YAKUNIN e
HALLENBECK, 2002). Entretanto, nestes organismos o desligamento da
nitrogenase em resposta a íons amônio ocorre via ADP-ribosilação (YAKUNIN e
HALLENBECK, 2002; HUERGO et al., 2006).
A associação de genes codificando ferredoxinas com genes essenciais para
a fixação de nitrogênio sugere que estas proteínas estejam envolvidas neste
processo. A presença de um gene de uma ferredoxina (Fd) na região do gene
estrutural da nitrogenase redutase (vnfH) da nitrogenase alternativa (V-nitrogenase)
de A. vinelandii sugere o envolvimento desta ferredoxina na transferência direta de
elétrons para esta nitrogenase (JOERGER et al., 1990).
Entretanto, alguns genes de ferredoxinas são encontrados posicionados
entre os genes nifENX e nifQ como em R. capsulatus, A. brasilense e H. seropedicae
(fdxA). (MORENO-VIVIAN et al., 1989; POTRICH et al., 2001; SOUZA, 2003).
Em R. capsulatus, este gene (fdxM) codifica uma ferredoxina 2[4Fe-4S] não
73
essencial para a fixação de nitrogênio (MORENO-VIVIAN et el., 1989; SAEKI et
al., 1991). Outras ferredoxinas foram identificadas em R. capsulatus como FdxN
(2[4Fe-4S]), FdxA (([3Fe-4S][4Fe-4S]) e FdxC ([2Fe-2S]). Mutações nos genes
fdxN e fdxC indicaram que são necessários para a fixação de nitrogênio (SAEKI et
al., 1991).
Alguns genes de ferredoxinas são encontrados associados ao gene nifB em
A. vinelandii, B. japonicum, Anabaena sp., Rhizobium meliloti, R. rubrum e H.
seropedicae (fdxN) (JOERGER e BISHOP, 1988; EBELING, NOTI e HENNECKE,
1988; MULLIGAN, BUIKEMA e HASELKORN, 1988; EDGREN e
NORLUND,2005).
O produto do gene fdxN é essencial para a atividade da nitrogenase em H.
seropedicae, uma vez que uma estirpe mutante neste gene foi incapaz de reduzir
acetileno em condições de fixação de nitrogênio. Este fenótipo foi revertido através
da complementação desta estirpe mutante com uma construção contendo apenas o
gene fdxN sob controle do promotor lacZ (A. Invitti, resultados não publicados).
A localização conservada de genes de ferredoxinas entre genes necessários
para a bissíntese do cofator pode indicar o seu papel no processo de fixação de
nitrogênio. Em H. seropedicae, a localização do gene fdxA, entre os genes
nifHDKorf1orf2 e nifQ e o gene fdxN, associado ao gene nifB pode sugerir,
juntamente com os dados fisiológicos, um provável envolvimento em alguma etapa
da biossíntese do cofator FeMo da nitrogenase.
74
4.3 ANÁLISE DOS GRUPOS DE GENES mod DE H. seropedicae
No genoma de H. seropedicae foram anotados dois grupos de genes que
codificam sistemas de transporte de molibdato do tipo ABC (modA1B1C1 e
modA2B2C2). O grupo modA1B1C1 está localizado na região à jusante dos genes
nifHDKENXorf1orf2fdxAnifQ, provavelmente formando um único operon sob
controle do promotor do gene nifH (Tabela 6). (MACHADO et al., 1996;
KLASSEN et al., 1999; KLASSEN, 2000; SOUZA, 2003). Um gene do tipo modE
(modE1) similar ao regulador transcricional dependente de molibdato dos genes
modABC de E. coli, está localizado à montante do gene nifA, 14,6 kb a montante do
gene nifH. O segundo grupo modA2B2C2 está localizado em uma região distinta do
genoma contendo o gene modE2 imediatamente à montante e transcrevendo na
direção oposta ao gene modA2 (Figura 9).
Análise da seqüência do gene modA1 revelou que codifica uma proteína de
24.645 Da e pI de 9,18 homóloga à proteína ModA de Herminiimonas
arsenicoxydans, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 e Pseudomonas entomophila
L48 (Tabela 7). O produto do gene modA2 é uma provável proteína de 24.093 Da e
pI calculado de 9,16. Esta proteína é homóloga à proteína ModA de Ralstonia
entropha H16, Ralstonia entropha JMP134 e Ralstonia metallidurans CH34 (Tabela
7). Como proteínas do tipo ModA são periplasmáticas em bactérias gram-negativas,
foram identificadas nas proteínas ModA1 e ModA2 de H. seropedicae seqüências
sinal envolvidas na translocação destas proteínas para o espaço periplasmático. Na
proteína ModA1 foi determinada como seqüência sinal os resíduos N-terminais 1-21
(MLRTLMLACTWLWLLMPVVHA) e na proteína ModA2 os resíduos 1-28
(MSTRSRLNTALGAACAATLMLAAGAAQA) (Figura 16), similares aos
descritos na literatura (SCHULTZ et al., 1998; LETUNIC et al., 2006).
Comparação das seqüências de aminoácidos das proteínas ModA1 e ModA2
de H. seropedicae indica identidade de 25%. As proteínas ModA de E. coli e
ModA2 de A. vinelandii tiveram suas estruturas tridimensionais resolvidas. Na
75
forma de monômero estas proteínas são compostas de dois domínios estruturalmente
semelhantes, designados N- e C-terminais, e separados pela região de ligação ao
molibdato (HU et al., 1997 e LAWSON et al., 1998). Também foram definidos os
aminoácidos que interagem com MoO
4
2-
. Em ambas as proteínas o oxiânion interage
com grupos amida da cadeia principal e hidroxilas de cadeias laterais de alguns
aminoácidos. Na proteína ModA de E. coli sete pontes de hidrogênio são formadas
entre molibdato e a proteína. São quatro pontes de hidrogênio doadas por grupos NH
da cadeia principal (resíduos Ser38, Ser66, Ala152 e Val181) e três de grupos OH da
cadeia lateral (resíduos Ser38, Ser66 e Tyr199) (HU et al., 1997). Em ModA2 de A.
vinelandii, também foram observadas interações em aminoácidos equivalentes
(LAWSON et al., 1998).
Com base no alinhamento das proteínas ModA1 e ModA2 de H.
seropedicae com as proteínas ModA de E. coli e A. vinelandii, os aminoácidos que
potencialmente interagem com o oxiânion podem ser apontados (Figura 16).
76
TABELA 7 – COMPARAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DOS
PRODUTOS DOS GENES modA1B1C1 e modA2B2C2 DE H. seropedicae
GENE
ORGANISMO
IDENTIDADE
a
(%)
SIMILARIDADE
a
(%)
NÚMERO DE
ACESSO
ModA1
Herminiimonas arsenicoxydans
66 81 YP_001101661
Polaromonas naphthalenivorans
CJ2
68 84 YP_982267
Pseudomonas entomophila L48
64 79 YP_607903
ModA2
Raltonia entropha H16
71 81 YP_725193
Raltonia entropha JMP134
71 84 YP_294860
Raltonia mettalidurans CH34
68 78 YP_582726
ModB1
Thiobacillus denitrificans
ATCC 25259
73 86 YP_315042
Azotobacter vinelandii AvOP
70 82 ZP_00419364
Methylococcus capsulatus
str. Bath
74 87 YP_113837
ModB2
Ralstonia metallidurans
CH34
81 91 YP_582725
Ralstonia eutropha JMP134
81 89 YP_294859
Ralstonia eutropha H16
80 89 YP_725192
ModC1
Azotobacter vinelandii AvOP
61 73 ZP_00419365
Pseudomonas stutzeri A1501
63 74 YP_001171882
Azoarcus sp. BH72
60 71 YP_935339
ModC2
Ralstonia eutropha H16
68 82 YP_725191
Ralstonia eutropha JMP134
64 81 YP_294858
Ralstonia pickettii 12J
66 80 ZP_01662211
ModE1
Burkholderia vietnamiensis G4
70 81 YP_001115213
Burkholderia xenovorans LB400
80 90 YP_553832
Pseudomonas stutzeri A1501
41 58 YP_001171885
ModE2
Methylobacillus flagellatus KT
53 70 YP_546401
Novosphingobium
aromaticivorans DSM 12444
60 70 YP_497784
Methylococcus capsulatus
str. Bath
51 64 YP_113805
a
determinado pelo programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1997) (item 3.9.2)
77
FIGURA 16 – ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS ModA1 E ModA2 DE H. seropedicae COM OUTRAS PROTEÍNAS ModA
10 20 30 40 50 60 70
| | | | | | |
ModA1_Av ---MSFSLSRLVVALGAGLLAC--AAQAAEVQVAVAANFTAPMKDIASQFEKDT-GHKVITSFGPTGGFY
ModA1_Hs -----MLRTLMLACTWLWLLMP--VVHAEEVHVAVAANFTQPFKQIAAAFEQAT-GHKVVAAFGSTGQFY
ModA2_Av -------MKRLLACLAIALALPF-TAQANELKVVTATNFLGTLQQLAGEFEKET-GHSITISSGSSGPVY
ModA_Ec -MARKWLNLFAGAALSFAVAGNA-LADEGKITVFAAASLTNAMQDIATQFKKEK-GVDVVSSFASSSTLA
ModA2_Hs MSTRSRLNTALGAACAATLMLAAGAAQAADLVVSAAASLTNAFKELAQSFEQQHPGVKVVSNFGASDILM
.. : .. .: * .*:.: .::::* *:: * .: ..:. .
80 90 100 110 120 130 140
| | | | | | |
ModA1_Av SQIQNGAPFEVFLAADDTTPEKLEKEGGTVAGSRFTYAVGKLVLWSAKPGYVDDQGAVLKKN-----AFK
ModA1_Hs AQINNGAPFEILLAADADTPALLEKQKTAVAGTRFTYARGKLVLWSAKPGVVDAQGEILKKG-----AFE
ModA2_Av AQIVNGAPYDVFFSADQKSPEKLDNEGFALPGSRFTYAIGKLVLWSAKPGLVDDQGKVLAGN-----GWR
ModA_Ec RQIEAGAPADLFISADQKWMDYAVDKKAIDTATRQTLLGNSLVVVAPKASVQKDFTIDSKTNWTSLLNGG
ModA2_Hs RQIVRGAPADVFASADQTAMDKAVAEKAVDPATRKNFAANQIVLIVTQGSRLAPTSLADLT----QPDYK
** *** ::: :** : ..:* . ..:*: .: .
150 160 170 180 190 200 210
| | | | | | |
ModA1_Av HLSIANPKTAPYGAAAVQVLAKLGLTEAT--KSKLVEGASIAQAHQFVATGNAELGFVALSQVYKDGKLT
ModA1_Hs HLSLANPKLAPYGLAGVQTMQKLGLEEAL--RPKIVQAENVNQAYQFIASGNALLGFVALSQVVRNGQIA
ModA2_Av HIAISNPEIAPYGLAGTQVLTHLGLLDKLTAEKRIVKANSVGQAHSQTASGAADLGFVALAQIIQKDGSI
ModA_Ec RLAVGDPEHVPAGIYAKEALQKLGAWDTL--SPKLAPAEDVRGALALVERNEAPLGIVYGSDAVAS--KG
ModA2_Hs RIALGNPASVPFGRYTRTALEQAGLWSQV--QAKGVMAENVRTSLDYVARGEADAGFVFATDAAIMP-EK
::::.:* .* * .: : * . : . . .: : . * *:* ::
220 230 240 250 260
| | | | |
ModA1_Av GGSGWNVPGDLYEPIRQDAVILTKGKDNPAAQALVDYLKGPKATEVIKAYGYGLQ-
ModA1_Hs DGSAWIVPADLYAPILQDAVLLEKGRDHPAALALMTYLKSEPARQVIRGYGYELDR
ModA2_Av PGSHWFPPADYYEPIVQQAVIVKSTREKALAEQFMSWMKGPRAVAIIKAAGYSLPE
ModA_Ec VKVVATFPEDSHKKVEYPVAVVEGHNN-ATVKAFYDYLKGPQAAEIFKRYGFTIK-
ModA2_Hs VKVALRLPSD--QPATYPIAVTAGSRQPALAAQFVAYVLSPTGQAVLARYGFLKP-
* * .: .: . . : :: . . :: *:
As seqüências do peptídeo sinal das proteínas estão indicadas na figura e compreendem os
primeiros 20-28 aminoácidos das proteínas (SCHULTZ et al., 1998 e LETUNIC et al., 2006). Os
resíduos de aminoácidos que potencialmente interagem com o oxiânion estão marcados com
triângulos. Triângulos brancos, aminoácidos que interagem com o oxiânion através da cadeia
principal e triângulos pretos, resíduos que interagem com a cadeia lateral (
HU et al., 1997 e
LAWSON et al., 1998). Os números dos resíduos citados no texto referem-se aos números deste
alinhamento. O alinhamento foi feito com o programa ClustalW (
THOMPSON et al., 1994). A.
vinelandii (Av), H. seropedicae (Hs), E. coli (Ec).
(*) aminoácidos idênticos (9%)
(:) aminoácidos fortemente similares (16%)
(.) aminoácidos fracamente similares (13%)
Peptídeo sinal
T V V
V
T
V
T
78
As porcentagens de similaridade e identidade da seqüência de aminoácidos
das proteínas ModB1 (26.549 Da) e ModB2 (23.872 Da) de H. seropedicae com
proteínas do tipo ModB de outros organismos está descrita na Tabela 7. As proteínas
ModB de H. seropedicae possuem 35% de resíduos de aminoácidos idênticos.
Baseado na sua seqüência primária foram preditas cinco hélices transmembrana de
23 resíduos de aminoácidos, sugerindo que estas proteínas provavelmente formam
um canal transmembrana envolvido na passagem de molibdato e/ou outro oxiânion
para o interior da célula (TUSNÁDY, 1998). Também foram identificadas
seqüências sinal de 33 e 30 aminoácidos em ModB1 e ModB2, respectivamente
(Figura 17).
Baseado na comparação da seqüência de aminoácidos de várias proteínas
ModB descritas foram identificadas algumas seqüências consenso entre elas. A
primeira seqüência (LPLVLPP(V/T/S)VhG(F/Y)XL) está localizada dentro da
segunda hélice transmembrana, onde h representa um aminoácido hidrofóbico e X
qualquer aminoácido (Figura 17). Esta seqüência foi encontrada nos componentes
permease dos sistemas de transporte de sulfato (CysU e CysW) e fosfato (PstA e
PstC), porém não foi localizada nas permeases dos transportadores de histidina e
maltose, sugerindo que esta seqüência desempenhe uma função significativa no
transporte de oxiânions (SELF et al., 2001).
Uma segunda seqüência consenso (FAR(S/T)LGEFG(A/V)(T/V)) foi
encontrada na quarta hélice transmembrana de ModB1 ou na alça periplasmática de
ModB2 entre as hélices 4 e 5; este motivo está presente apenas em componentes
permease de sistemas de transporte de molibdato (SELF et al., 2001) (Figura 17).
Também foi identificada uma seqüência (EQAA) localizada em uma alça
citoplasmática entre as hélices 3 e 4 representando uma assinatura característica de
permeases de sistemas de transporte do tipo ABC. Esta região representa um ponto
de contato com o componente ATPase destes sistemas (SELF et al., 2001) (Figura
17).
79
FIGURA 17 – ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS ModB1 e ModB2 DE H. seropedicae
ModB1 MWLTAEDWSAVRLTLSLASIVTVLLLLLGTPLAWWLARTRSGWRHGVAAVVALPLVLPPA 60
ModB2 ---MHPVWTPLLLSLKVAGLATLLNLVLGVAAAYGLSRWRSALRDFIDSVLTLPLVLPPT 57
*:.: *:*.:*.:.*:* *:**.. *: *:* **. *. : :*::*******:
ModB1 VLGFYLLVLMGPQGPVGQLTQALGLGLLPFSFGGLVLASLLYSMPFVVQPLQNAFEAVGE 120
ModB2 VLGYYLLVLFGRRGALGAWLERMGIELV-FTWQGAVLASTVVAFPLVLKSARAAFESVDH 116
***:*****:* :*.:* : :*: *: *:: * **** : ::*:*::. : ***:*..
ModB1 RPMEVAATLRASPLDAFFTVAVPLAGPGFLTAAVLGFAHTVGEFGVVLMIGGNIPGKTRV 180
ModB2 QMEDAARVLGVSEAGVFFRVSLPLAMRGIMAGVLLAFARALGEFGATLMVAGNLPGRTQT 176
: :.* .* .* ..** *::*** *:::..:*.**:::****..**:.**:**:*:.
ModB1 LSMQIYDHVEAFEYAQAHRLAGAMLVFSFLVLLVMMRLGRAGKTRLKAGKSGRAPQEATA 240
ModB2 LSVAIYEAVQAGDDGSATLLV---VITSITCIVLLMVAG-----RLTP---DRAQQQLR- 224
**: **: *:* : ..* *. :: *: ::::* * **.. .** *:
ModB1 QSGDATRRTT 250
ModB2 ----------
A sequência do peptídeo sinal e as hélices transmembrana das proteínas estão indicadas na figura e
foram determinadas pelos programas SMART (SCHULTZ et al., 1998; LETUNIC et al., 2006) e
SOSUI (HIROKAWA, BOON-CHIENG e MITAKU, 1998). As alças periplasmáticas e
citoplasmáticas, as seqüências consenso 1 e 2 e a assinatura característica dos componentes
permease dos transportadores do tipo ABC estão indicados na figura. O alinhamento foi feito com o
programa ClustalW (
THOMPSON et al., 1994)
(*) aminoácidos idênticos (35%)
(:) aminoácidos fortemente similares (24%)
(.) aminoácidos fracamente similares (12%)
Hélice 1
Hélice 3
Hélice 4
Hélice 5
Assinatura permease ABC
Seqüência consenso 1
Seqüência consenso 2
Peptídeo sinal
Alça periplasmática Alça citoplasmática
Alça periplasmática
Extremidade citoplasmática
Alça citoplasmática Hélice 2 Extremidade periplasmática
80
A terceira proteína componente do sistema de transporte de molibdato é a
ATPase ModC. As proteínas ModC1 (40.188 Da) e ModC2 (24.532 Da) de H.
seropedicae possuem baixa identidade (20%) entre si e tamanhos bastante diferentes
(Figura 18). A comparação da seqüência de aminoácidos destas proteínas com outras
do tipo ModC estão descritas na Tabela 7.
Análise de alinhamento da seqüência de aminoácidos de várias ATPases de
sistemas de transporte ABC identificaram quatro pequenos motivos conservados
(LINTON e HIGGINS, 1998). Entre eles estão os motivos Walker A
(GXXGXGKST) onde X é qualquer aminoácido e Walker B (hhhhDEPT) onde h é
um resíduo hidrofóbico. Estes motivos estão envolvidos diretamente na ligação e
hidrólise de ATP. Também foram identificados uma assinatura ABC (LSGG) e um
motivo formado por um resíduo de histidina conservado, localizado
aproximadamente 30 aminoácidos a jusante do resíduo de ácido aspártico do motivo
Walker B, normalmente precedido por quatro resíduos hidrofóbicos e seguido por
um resíduo carregado (hhhhH+/-), onde +/- é um resíduo carregado (LINTON e
HIGGINS, 1998).
Apesar das proteínas ModC1 e ModC2 apresentarem diferenças na estrutura
primária, foram identificados os quatro motivos característicos dos componentes
ATPases de sistemas de transporte do tipo ABC, sugerindo a funcionalidade de
ambas as proteínas (Figura 18).
81
FIGURA 18 – ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS ModC1 E ModC2 DE H. seropedicae
ModC1 MKQAMVGPSIAQPGIIAKMAYGYGGAGEFQLDLDLTLPGQGVSALSGPSGCGKTTFLRCM 60
ModC2 ---------MSLDLQIQKQLHASD--RRFALDLSLVSASQRI-VLYGPSGAGKSLTLKAI 48
:: * * :. . .* ***.*. ..* : .* ****.**: *:.:
ModC1 AGLLRPSRGYLEVNGEVWQDSQRQYFLPTHRRALGYVFQEASLLPHLSVSRNLDYGARR- 119
ModC2 AGLMRPDSGRIRLNGRTLFNSNEGIDLPVQGRNVAYLFQDYALFPHLSVAQNIAFGLARG 108
***:**. * :.:**.. :*:. **.: * :.*:**: :*:*****::*: :* *
ModC1 ---SGAVSSAASRQKIIDLLGIAALLQSMPSALSGGERQRVAIARALFTAPRLLLMDEPM 176
ModC2 CFNLRRPAQHPAVAKWLRAFELDDIAHSRPAQISGGQRQRVALARALVAEPDILLLDEPF 168
:. .: * : : : : :* *: :***:*****:****.: * :**:***:
ModC1 AALDNDRKRDILPYLERLRDELAIPILYISHHPEEIARLADTLVLMRQGRCLASGPLTTL 236
ModC2 SALDLSLRERMRAELAELQAQLQVPMLLITHDPADVEALGQTVFELRDGRLHQG------ 222
:*** . :. : . * .*: :* :*:* *:*.* :: *.:*:. :*:** .
ModC1 LSRLDLPLAHAEDAGAVIEAKVAAHDETYHLTRLVLAGGEIFVPRRELPVGQSVRLQIHA 296
ModC2 ------------------------------------------------------------
ModC1 RDVSLALSPSHDSSILNRLSATVLKLAPAQHPAHVLAVLDAGGEQLLARITRRSCDQLAL 356
ModC2 ------------------------------------------------------------
ModC1 VAGQPVWAQIKSVALL 372
ModC2 ----------------
Os motivos característicos das proteínas ModC1 e ModC2 (Walker A e B, assinatura ABC e motivo
4) estão indicados na figura. O alinhamento foi feito com o programa ClustalW (
THOMPSON et
al., 1994).
(*) aminoácidos idênticos (20%)
(:) aminoácidos fortemente similares (13%)
(.) ainoácidos fracamente similares (7%)
Walker A
Walker B Assinatura ABC
Motivo 4
82
Foram identificados em H. seropedicae dois genes (modE1 e modE2) que
codificam prováveis proteínas envolvidas na regulação da transcrição dos genes
modABC (Figura 19). A similaridade e identidade das seqüências de aminoácidos
das proteínas ModE1 e ModE2 com proteínas ModE de outros organismos está
mostrada na Tabela 7.
ModE1 é uma proteína de 299 aminoácidos (Q9F4K4) com massa
molecular calculada de 28.283 Da e pI de 9,65, enquanto ModE2 possui 122
aminoácidos (EF666058.1) e massa molecular calculada de 13.045 Da e pI de 9,73.
As seqüências destas proteínas foram alinhadas e os domínios funcionais preditos
(SCHULTZ et al., 1998; LETUNIC et al., 2006) (Figura 19).
A proteína ModE1 possui na porção N-terminal um domínio hélice-volta-
hélice (HTH) compreendido entre os resíduos 24-88. Na região C-terminal está
presente um provável domínio de ligação a molibdato que consiste de dois
subdomínios Mop repetidos em sequência (DiMop) delimitados pelos resíduos 129-
192 e 201-264, respectivamente (SCHULTZ et al., 1998; LETUNIC et al., 2006).
A proteína ModE2 possui um domínio HTH entre os resíduos 21-85
(SCHULTZ et al., 1998; LETUNIC et al., 2006), similar ao domínio N-terminal de
ModE de outros organismos (Tabela 7).
83
FIGURA 19 – ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS
PROTEÍNAS ModE1 e ModE2 DE H. seropedicae
ModE1 MSTLPATDTTLLSSELKLVHRLDQRFFALLDAIAQTGSINRAASTAGYSYKGAWMLLESA 60
ModE2 ---MNDSKTLRVRVMQGETIAFGPGKADLLQAIGRTGSISGAAREMEMSYRRAWLLVEEM 57
: :.* : . :. **:**.:****. ** **: **:*:*.
ModE1 GNLVNGALIETVTGGKGGGGTRLTPAAVELLAVWRELQRRNLEFLHRQETWLNQLPALAG 120
ModE2 NRCFASPLVTTATGGSRGGGAAVTALGQEVLTRYRRQKK--------------AAASIAA 103
.. . ..*: *.***. ***: :*. . *:*: :*. :: .::*.
ModE1 LLRRMSMKTSARNQFAGVISAIDTGPVTTQVTVTIAGAQEIVATMTTTAANRLKLRIGSN 180
ModE2 DLRHLHTLMNAPQPDDGDA----------------------------------------- 122
**:: .* : *
ModE1 AIALIKSSAVVLVTDFAGFSLSARNQFEGTVSRVERGAVSSLVVLTLPGGACMTASLTND 240
ModE2 ------------------------------------------------------------
ModE1 AIDALSLAVGQTATAVFKAYAVMVAVQQD 269
ModE2 -----------------------------
O alinhamento foi feito com o programa ClustalW (THOMPSON et al., 1994). Os domínios hélice-
volta-hélice (HTH), MopI e MopII estão destacados na caixa preta e indicados na figura. Estes
domínios foram determinados utilizando o programa SMART (SCHULTZ et al., 1998 e LETUNIC
et al., 2006).
(*) aminoácidos idênticos (38%)
(:) aminoácidos fortemente similares (12%)
(.) ainoácidos fracamente similares (18%)
Hélice-volta-hélice
(
HTH
)
Mo
p
I
Mo
p
II
84
4.3.1 Atividade da Nitrogenase na Estirpe Mutante modB2
O plasmídeo pABKC (cassete lacZ::Km inserido na mesma orientação de
transcrição do gene modB2) foi transformado na estirpe selvagem de H.
seropedicae. Com base na resistência a canamicina e na sensibilidade a tetraciclina
(marcador do plasmídeo), foi selecionada a estirpe mutante 13-30 (cassete na mesma
orientação de modB2). Esta estirpe mutante foi utilizada em ensaios de atividade da
nitrogenase (item 3.11.1).
Em condições de fixação de nitrogênio na presença ou em condições
limitantes de molibdato a estirpe mutante 13-30 apresentou atividade da nitrogenase
semelhante àquela apresentada pela estirpe selvagem (Figura 20). Este resultado
difere daquele obtido por KLASSEN (2000), que notou que a atividade do mutante
modA1 é significativamente menor do que a estirpe selvagem em condições
limitantes de MoO
4
2-
. A atividade da nitrogenase do mutante modA1 somente foi
semelhante à estirpe selvagem quando a concentração de molibdato adicionado no
meio foi superior a 10 μmol/L. Entretanto, KLASSEN (2000) observou que a estirpe
selvagem apresentou atividade mesmo quando molibdato não foi adicionado ao
meio, enquanto que os resultados apresentados aqui mostram que a atividade da
nitrogenase da estirpe selvagem apresentou queda de aproximadamente 75% na
atividade da nitrogenase em condições limitantes de molibdato. Isso ocorreu
provavelmente devido à diferenças nas condições do ensaio. Para remover traços de
MoO
4
2-
acumulado na célula, o pré-inóculo das estirpes selvagem e mutante modB2
foram repicadas três vezes em meio NFbHPN líquido tratado com carvão ativo para
remover MoO
4
2-
. Esse tratamento possivelmente resultou em depleção severa de
MoO
4
2-
e no decréscimo observado na atividade da nitrogenase na estirpe selvagem.
Estes resultados sugerem que o grupo de genes modA1B1C1 presente na
região dos genes nif e expresso provavelmente sob controle do promotor do gene
nifH, é suficiente para garantir a atividade da nitrogenase nas condições ensaiadas,
enquanto que o segundo grupo de genes de transporte de molibdato (modA2B2C2)
85
provavelmente está envolvido com o transporte deste oxiânion para a síntese das
demais molibdoenzimas.
FIGURA 20 - ATIVIDADE DA NITROGENASE DAS ESTIRPES SELVAGEM
(SMR1) E MUTANTE NO GENE modB2 (13-30) DE H. seropedicae
0
20
40
60
80
100
120
SMR1(+Mo) SMR1(-Mo) 13-30 (+Mo) 13-30 (-Mo)
Atividade da Nitrogenase (%)
As estirpes foram cultivadas em meio NFbHP semi-sólido contendo glutamato de sódio 0,5
mmol/L (item 3.11.1). A atividade da nitrogenase máxima (100%) foi de aproximadamente
12 nmol de etileno.mg proteína
-1
.min
-1
. (+Mo) indica a presença de molibdato de sódio
adicionado ao meio de cultura e (-Mo) indica condições limitantes de molibdato utilizando
meio tratado com carvão ativado (item 3.2). Os resultados são uma média de três
experimentos independentes feitos em triplicata.
86
4.3.2 Análise Transcricional do Gene modB2 de H. seropedicae
A atividade de β-galactosidase na estirpe de H. seropedicae mutante 13-30,
contendo o gene lacZ sem promotor inserido na mesma orientação do gene modB2,
foi determinada em condições limitantes de molibdato (Figura 21). Para isto o meio
foi depletado de MoO
4
2-
como descrito em Material e Métodos (item 3.2). Os
resultados sugerem que nas condições ensaiadas a expressão do gene modB2 é
regulada pela presença de molibdato no meio. Em condições limitantes de molibdato
(Mo-) houve expressão do gene modB2 revelado pela atividade de β-galactosidase,
enquanto que na presença de molibdato adicionado ao meio foram observadas
apenas atividades basais. Estes resultados estão de acordo com a análise in silico da
provável região promotora dos genes modA2B2C2 localizada a montante de modA2
(Figura 5 e 25). Esta região possui uma seqüência consenso para ligação da proteína
ModE, regulador transcricional dependente de molibdato dos genes modABC
(GRUNDEN et al., 1996; McNICHOLAS, CHIANG e GUNSALUS, 1996;
McNICHOLAS, RECH e GUNSALUS, 1997; TAO et al., 2005).
87
FIGURA 21 - ATIVIDADE DE β-GALACTOSIDASE EM H. seropedicae
ESTIRPE MUTANTE modB2 (13-30)
0
50
100
150
200
250
300
350
Mo+ Mo-
Atividade de beta-galactosidase
(nmol ONP. mg proteína
-1
. min
-1
)
As estirpes foram cultivadas em 3 mL de meio NFbHPN com D.O.
600
inicial de ~0,2 e
mantidas em agitador rotatório a 30
o
C por 7 horas. A determinação da atividade de β-
galactosidase foi realizada como descrito em Material e Métodos (3.11). (Mo+) indica a
presença de molibdato de sódio adicionado ao meio de cultura e (Mo-) indica condições
limitantes de molibdato utilizando meio tratado com carvão ativado (item 3.2).
88
4.4 AMPLIFICAÇÃO E CLONAGEM EM VETOR DE EXPRESSÃO DOS
GENES modE1 E modE2
As seqüências que codificam as proteínas ModE1 e ModE2 de H.
seropedicae foram amplificadas utilizando-se DNA genômico como molde (ítem
3.12) (Figura 22). Os produtos de PCR modE1 (874 pb) e modE2 (415 pb) foram
clonados em plasmídeo pCR
®
2.1 (Invitrogen
TM
) dando origem aos plasmídeos
pCR2.1modE1 e pCR2.1modE2, respectivamente. Os fragmentos destes plasmídeos
foram liberados e clonados em pET28a(+) dando origem aos plasmídeos
pET28amodE1 e pET28amodE2, respectivamente (ítem 3.12).
Os genes modE1 e modE2 foram clonados nos sítios NdeI e BamHI do vetor
de expressão pET28a(+) (pET28amodE1 e pET28amodE2). Este vetor contém
elementos importantes como o gene lacI que codifica uma proteína repressora capaz
de ligar na região operadora lac e um promotor T7, específico somente para a T7
RNA polimerase (não reconhecido pela RNA polimerase bacteriana). Neste sistema
as proteínas ModE1 e ModE2 são expressas contendo uma cauda N-terminal de 6
resíduos de histidina (Novagen).
Os plasmídeos de expressão pET28amodE1 e pET28amodE2 foram
transformados em E. coli BL21(DE3) a qual possui em seu genoma o gene da T7
RNA polimerase sob controle do promotor lacUV5, reprimido pelo repressor LacI.
Quando um indutor (lactose ou IPTG) está presente a transcrição da T7 RNA
polimerase é ativada.
A expressão das proteínas His-ModE1 e His-ModE2 foi induzida pela
adição de lactose ou IPTG nas temperaturas 20, 30 e 37
o
C. A proteína His-ModE2
foi expressa em grande quantidade na fração solúvel em todas as condições testadas,
apresentando-se mais solúvel quando induzida com IPTG em ambas as
temperaturas. A proteína His-ModE1 sempre foi encontrada na fração insolúvel,
independente do indutor da expressão (IPTG ou lactose) ou temperatura de
crescimento.
89
FIGURA 22 - AMPLIFICAÇÃO DOS GENES modE1 E modE2 de H. seropedicae
Eletroforese em gel de agar 1% (p/v) dos produtos de PCR da reação de amplificação dos
genes modE1 e modE2. Os produtos amplificados estão indicados na figura. O gel foi
corado com brometo de etídeo (item 3.6).
Linha 1 Marcador de tamanho molecular 1 Kb ladder (Gibco)
Linha 2 Produto de amplificação contendo o gene modE1
Linha 3 Produto de amplificação contendo o gene modE2
modE1
modE2
1000
750
500
250
1
2
3
Marcador de Tamanho Molecular
90
4.5 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE1
Diferentes procedimentos foram utilizados para se obter His-ModE1 na
forma solúvel como diferentes temperaturas de indução (37, 30, 20
o
C), choque
térmico, uso de lactose como indutor e diferentes formulações de tampão de lise
(pH, força iônica e diferentes sais), porém em todas as condições testadas a grande
maioria da proteína expressa permaneceu na fração insolúvel (resultados não
apresentados). A proteína ModE de E. coli foi super-expressa e purificada fundida a
uma cauda de resíduos de histidinas ou na forma nativa (GRUNDEN et al., 1996;
McNICHOLAS, RECH e GUNSALUS, 1997; HALL et al., 1999; GRUNDEN et
al., 1999). Uma forma N-terminal truncada de ModE de E. coli, contendo o domínio
de ligação a molibdato na porção C-terminal foi também purificada na forma solúvel
complexada a molibdato e tungstato (GOURLEY et al., 2001). Diferentes
procedimentos e tampões foram utilizados nestas purificações e em todos os casos a
proteína permanecia na fração solúvel (GRUNDEN et al., 1996; ANDERSON et al.,
1997; McNICHOLAS, RECH e GUNSALUS, 1997; HALL et al., 1999;
GOURLEY et al., 2001). Entretanto algumas formas mutantes da proteína ModE de
E. coli capazes de reprimir o promotor modA independente de molibdato formaram
corpos de inclusão quando foram super-expressas. A purificação destas proteínas na
forma solúvel foi possível diminuindo-se a temperatura de indução para 23
o
C
(GRUNDEN et al., 1999). As proteínas MopA e MopB de R. capsulatus, dois
reguladores transcricionais dependentes de molibdato, homólogos a ModE, foram
super-expressos em E. coli na forma solúvel. Proteínas contendo o domínio Mop
implicadas na homeostase de molibdênio em Sporomusa ovata, Eubacterium
acidaminophilum e Azotobacter vinelandii também foram purificadas como
proteínas solúveis (DELARBRE et al., 2001; WAGNER, STUPPERICH e
KRATKY, 2000; WIETHAUS et al., 2006).
Devido a dificuldade de se obter His-ModE1 de H. seropedicae solúvel um
procedimento para solubilização dos corpos de inclusão e redobramento da proteína
91
desnaturada foi desenvolvido. As proteínas de corpos de inclusão são geralmente
inativas e desnaturadas (SINGH e PANDA, 2005). Contudo, sua alta densidade
permite que sejam isolados por centrifugação. Além disso, são expressas em grande
quantidade e protegidas de degradação proteolítica. A proteína His-ModE1 de H.
seropedicae super-expressa em E. coli BL21(DE3) contendo o plasmídeo
pET28amodE1 representou 40% da quantidade total de proteína celular. Para o
rompimento das células foi utilizada a combinação de lisozima e sonicação. Estes
tratamentos diminuem a quantidade de restos celulares que podem sedimentar
juntamente com os corpos de inclusão e contaminar a preparação da proteína. A
sonicação também auxilia na quebra do DNA total da célula. O lisado celular foi
centrifugado resultando em um sobrenadante (S/N1) e um sedimento (corpos de
inclusão) (Figura 23). Etapas de lavagem dos corpos de inclusão com tampão
contendo baixa concentração de agente caotrópico (uréia 2M) e detergente (Triton
X-100 0,5%) foram incluídos para remover proteínas contaminantes e restos
celulares que poderiam estar adsorvidos no agregado hidrofóbico de His-ModE1. As
frações sobrenadante (S/N2 e S/N3) das duas etapas de lavagem continham baixas
concentrações de His-ModE1 (Figura 23). Apesar das perdas de proteína na lavagem
dos corpos de inclusão estas etapas foram indispensáveis para reduzir a quantidade
de contaminantes na preparação final. Entretanto, as frações S/N2 e S/N3 poderiam
ser aplicadas na coluna Hi-Trap Ni
2+
para recuperar a proteína perdida.
Os corpos de inclusão foram solubilizados em tampão contendo uréia 8M,
um forte agente desnaturante que rapidamente desnatura e solubiliza as proteínas
dos corpos de inclusão (BENNION e DAGGETT, 2003). Numa primeira tentativa
de obter His-ModE1 renaturada e ativa, a fração contendo proteína solubilizada com
uréia 8 mol/L foi submetida à diálise em tampão sem agente desnaturante antes de
ser aplicada à coluna de afinidade. Entretanto, durante a diálise foi observada a
formação de agregados, inviabilizando a aplicação na coluna cromatográfica (dados
não apresentados).
92
Em uma segunda tentativa, His-ModE1 solubilizada em tampão contendo
uréia 8 mol/L foi aplicada na coluna de afinidade e renaturada na matriz da própria
coluna através da lavagem com gradiente decrescente de uréia. As moléculas de
proteína ligadas na matriz da coluna têm mobilidade restrita, reduzindo interações
intermoleculares e, portanto, a formação de agregados em concentrações
intermediárias de agente desnaturante é dificultada. Além disso, o tempo de remoção
de uréia é muito menor neste procedimento.
A proteína His-ModE1 renaturada foi então eluída da coluna em gradiente
de imidazol na forma solúvel e dialisada. Apresentou pureza de 98,1%, determinada
por análise densitométrica de gel de poliacrilamida corado com Coomassie blue R-
250 (Figura 23) e rendimento de aproximadamente 4% (Tabela 8). A concentração
final obtida foi de 10 µM (calculado como monômero), não sendo observada a
formação de agregados.
93
FIGURA 23 - PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE1 SUPER-EXPRESSA EM E.
coli
Eletroforese em gel de poliacrilamida 15% na presença de SDS (SDS-PAGE). O gel foi
corado com Coomassie blue R-250.
Linha 1 - Marcador de massa molecular (kDa) (GE Healthcare)
Linha 2 - Lisado de E.coli Bl21(DE3) (pET28amodE1) antes da indução
Linha 3 - Lisado de E.coli Bl21(DE3) (pET28amodE1) após indução com IPTG 0,5 mmol/L
Linha 4 – Fração S/N1
Linha 5 – Fração S/N2
Linha 6 – Fração S/N3
Linha 7 – Precipitado após solubilização dos corpos de inclusão
Linha 8 – Fração de proteína solubilizada com uréia 8 mol/L (S/N4)
Linha 9 – His-ModE1 purificada
1
2
3
4
5
6
7
8
9
97
66
45
30
20,1
14,4
kDa
94
4.6 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE2
A proteína His-ModE2 superexpressa em E. coli BL21(DE3) contendo o
plasmídeo pET28amodE2 estava predominantemente na forma solúvel (Figura 24),
em contraste com a His-ModE1. A diferença no comportamento destas proteínas
pode ser devido ao menor tamanho e menor quantidade de aminoácidos
hidrofóbicos. A proteína His-ModE2 foi purificada da fração solúvel através de
procedimento padrão de purificação por cromatografia de afinidade. Contudo,
durante diálise da proteína purificada foi observada a formação de precipitado,
diminuindo drasticamente o rendimento da proteína. Para evitar a precipitação
durante este procedimento, as frações de proteína eluídas da coluna, contendo
imidazol, foram diluídas pela adição de glicerol até atingir uma concentração de
50% (v/v) de glicerol e a preparação foi armazenada a -70
o
C. A pureza da proteína
His-ModE2 foi de 98,2% (20 µM, calculada como monômero) (Tabela 8),
determinada por análise densitométrica de gel de poliacrilamida corado com
Coomassie blue R-250.
95
FIGURA 24 - PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA His-ModE2 SUPER-EXPRESSA
EM E. coli
Eletroforese em gel de poliacrilamida 15% na presença de SDS (SDS-PAGE). O gel foi
corado com Coomassie blue R-250.
Linha 1 - Marcador de massa molecular (kDa) (GE Healthcare)
Linha 2 - Lisado de E.coli Bl21(DE3) (pET28amodE2) sem indução
Linha 3 - Lisado de E.coli Bl21(DE3) (pET28amodE2) após indução com IPTG 0,5 mmol/L
Linha 4 - Fração solúvel
Linha 5 - His-ModE2 purificada
1 2 3 4 5
97
66
45
30
20,1
14,4
kDa
96
TABELA 8 – RESUMO DA PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 e
His-ModE2 DE H. seropedicae
ETAPAS PROTEÍNA TOTAL
(mg)
RENDIMENTO DA ETAPA
(%)
RENDIMENTO
GLOBAL (%)
His-ModE1
Extrato bruto
a
38,8 100 100
S/N4 7,08 18,2 18,2
His-ModE1
purificada
1,5 21,2 3,9
His-ModE2
Extrato bruto
a
38,4 100 100
Fração solúvel 29,3 76,2 76,2
His-ModE2
purificada
4,0 13,7 10,4
a
250 mL de culturas de BL21(DE3) contendo os plasmídeos pET28amodE1 ou pET28amodE2 induzidas
com IPTG 0,5 mmol/L à 37
o
C
97
4.7 INTERAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 E His-ModE2 NA REGIÃO
PROMOTORA DO GENE modA2
A proteína ModE de E. coli regula negativamente a transcrição dos genes
modABC em resposta a disponibilidade de molibdato e esta regulação é baseada na
ligação do complexo ModE-molibdato à seqüências de ligação conservadas em
regiões promotoras dos genes alvo (SELF et al., 2001).
A ligação das proteínas His-ModE1 e His-ModE2 a um DNA alvo foi
verificada por ensaios de mobilidade em gel. Este método é baseado na observação
de que complexos de proteína e DNA migram através de um gel de poliacrilamida
não desnaturante mais lentamente que DNA livre.
4.7.1 Análise da Região Promotora do Gene modA2
Os ensaios de ligação das proteínas His-ModE1 e His-ModE2 foram
realizados utilizando um fragmento de aproximadamente 350 pb da região
promotora do gene modA2 de H. seropedicae (Figura 25A). Esta região contém uma
seqüência consenso para ligação do complexo ModE-molibdato. Experimentos de
footprinting com DNAse I da região promotora de modA de E. coli mostraram que
ModE protege três seqüências pentaméricas, TAYAT (Y = pirimidina). A primeira e
a segunda são separadas por 7 nucleotídeos e a terceira é separada da segunda por 5
nucleotídeos; a última não é essencial para ligação de ModE (Figuras 2 e 5)
(McNICHOLAS, RECH e GUNSALUS, 1997; GRUNDEN et al., 1999;
ANDERSON et al., 1997; STUDHOLME e PAU, 2003).
A sequência a montante dos genes modA2B2C2 foi alinhada com a região
promotora dos genes mod de outros organismos usando uma matriz de peso
dependente da posição da base (SCHENEIDER e STEPHENS, 1990; CROOKS et
al., 2004) (Figura 25B). Um alto grau de conservação foi observado na seqüência
palindrômica (TATAT-N
7
-TATAT), indicando que esta região pode ser uma
98
provável seqüência alvo para ligação das proteínas ModE1 e/ou ModE2 em H.
seropedicae. Para a geração da representação gráfica foram alinhadas as seqüências
a montante dos genes modA, moaA e dmsA de E. coli; mopA e anfA de R.
capsulatus; modE, modG, anfA e vnfA de A. vinelandii, além da região a montante
do gene modA2 de H. seropedicae (Figura 25B).
99
FIGURA 25 - SEQUÊNCIA DE DNA DA REGIÃO INTERGÊNICA ENTRE
modA2B2C2 E modE2 DE H. seropedicae
(A) Sequência da região entre os genes modE2 e modA2 de H. seropedicae. Na figura são indicados
as prováveis regiões promotoras (-10/-35), as regiões consenso para ligação de ModE-molibdato
(regiões 1 e 2), e o sítio para ligação de ribossomo (Shine-Dalgarno). Abaixo é mostrada uma
comparação entre o sítio de ligação de ModE na região promotora de modA de E. coli com a mesma
região de H. seropedicae. As bases dentro das caixas pretas são idênticas em ambas as seqüências.
(B) Freqüência de bases no sítio de ligação de ModE-molibdato gerado a partir do alinhamento dos
sítios de ligação a ModE da região promotora de alguns genes gerado pelo programa WebLogo
(CROOKS et al., 2004)
A
B
CATGCGCGTGATTGTACAAGGGCGCCCCGGCAGCGGCCAGGGCGGCG
CCAAGAATTGACGTTCGTTATATCCTTGCGTATATTTCGCCACACACCA
CCACACCACTACACGCCGCCACGCGCTGTTCGTGCTTGGCCTTTCCTGTC
CAGGACGCCTGATG
modA2
modE2
-10-35
Shine-Dalgarno
Região 1 Região 2
GT TATATTGTCGCC TACATAACGTTACAT
GT TATATCCTTGCG TATATTTCGCCACAC
E. coli
H
. seropedicae
1 2 3
100
4.8 ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 E His-ModE2 À
DNA
A similaridade da seqüência de DNA da região promotora de modA2 à
seqüência consenso de ligação de ModE não é suficiente para demonstrar a presença
de um sítio de ligação biologicamente significativo. Assim, experimentos de
mobilidade em gel do complexo His-ModE1- e His-ModE2-DNA foram realizados
para determinar a capacidade destas proteínas ligarem à região promotora de modA2
em H. seropedicae.
Em E. coli, a proteína ModE requer molibdato ou tungstato para ligar com
alta afinidade à região promotora de modABC (ANDERSON et al., 1997). As
proteínas His-ModE1 e His-ModE2 de H. seropedicae ligaram à região promotora
de modA2, revelado pelo decréscimo da taxa de migração do fragmento de DNA de
aproximadamente 350 pb marcado com [
32
P] (Figuras 26 e 27). Todos os ensaios
foram realizados na presença de DNA heterólogo de arenque não marcado (3
ng/uL). A quantidade de complexo formado foi dependente da concentração de
proteína. Assumindo His-ModE1 e His-ModE2 como dímero em solução, 600 nM
das proteínas purificadas foram capazes de ligar a 100% do DNA nos sistemas.
A ligação ao DNA de ambas as proteínas ocorreu independentemente da
adição de molibdato. A insensibilidade à adição de molibdato no sistema pode
sugerir que traços de molibdato presentes nos reagentes utilizados na purificação das
proteínas sejam suficientes para saturar e ativar a ModE1 de H. seropedicae.
A proteína His-ModE2 também foi capaz de ligar à região promotora de
modA2 de maneira independente da adição de molibdato. Estes resultados estão de
acordo com a estrutura predita da proteína ModE2 de H. seropedicae que contém
somente o domínio hélice-volta-hélice (HTH) na região N-terminal, mas não o
domínio DiMop de ligação a molibdato, que foi observado apenas na proteína
ModE1 de H. seropedicae.
101
A especificidade da ligação das proteínas foi testada com um ensaio de
competição com o mesmo fragmento de DNA de 350 pb não marcado (DNA
homólogo frio) (Figuras 28 e 29). A análise densitométrica mostrou a dissociação
dos complexos His-ModE1- e His-ModE2-DNA marcado na presença de 100 nM
(excesso de 20 vezes) e 50 nM (excesso de 10 vezes) de fragmento de DNA não
marcado, respectivamente.
102
FIGURA 26 - EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 E
His-ModE2 NA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO À REGIÃO PROMOTORA DE
modA2 DE H. seropedicae NA AUSÊNCIA DE MOLIBDATO
O ensaio de ligação foi feito usando 5 nM de um fragmento de DNA marcado com [
32
P] de
350 pb contendo a região promotora de modA2 de H. seropedicae. As concentrações das
proteínas His-ModE1 e His-ModE2 utilizadas nos sistemas, o complexo proteína-DNA
[
32
P] formado e DNA livre estão indicados na figura. As reações de ligação foram aplicadas
em gel de poliacrilamida 4% em TBE 1×. Estes géis foram secos e visualizados em
PhosphorImager Storm
TM
(GE Healthcare).
W Proteína (nM)
0 100 200 400 800 100 200 400 800
His-ModE1 His-ModE2
W proteína-DNA [
32
P]
W DNA [
32
P] livre
1 2 3 4 5 6 7 8 9
- MoO
4
2-
103
FIGURA 27 - EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS His-ModE1 E
His-ModE2 NA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO À REGIÃO PROMOTORA DE
modA2 DE H. seropedicae NA PRESENÇA DE MOLIBDATO
O ensaio de ligação foi feito usando 5 nM de um fragmento de DNA de 350 pb contendo a
região promotora de modA2 de H. seropedicae na presença de NaMoO
4
.2H
2
O
1 mM. As
concentrações das proteínas His-ModE1 e His-ModE2 utilizadas nos sistemas, o complexo
proteína-DNA[
32
P] formado e DNA[
32
P] livre estão indicados na figura. As reações de
ligação foram aplicadas em gel de poliacrilamida 4% em TBE 1×. Estes géis foram secos e
visualizados em PhosphorImager Storm
TM
(GE Healthcare).
0 100 200 400 800 100 200 400 800
His-ModE1 His-ModE2
1 2 3 4 5 6 7 8 9
+ MoO
4
2-
W Proteína (nM)
W proteína-DNA[
32
P]
W
DNA [
32
P] livre
104
FIGURA 28 - ENSAIO DE COMPETIÇÃO ENTRE OS FRAGMENTOS DE DNA
DA REGIÃO PROMOTORA DE modA2 MARCADO COM [
32
P] E NÃO-
MARCADO PELA LIGAÇÃO A His-ModE1
O ensaios foram feitos usando 600nM de His-ModE1 e 5 nM de DNA marcado [
32
P]. As
concentrações de DNA não-marcado adicionadas aos sistemas, o complexo His-ModE1-
DNA [
32
P] formado e o DNA [
32
P] livre estão indicados na figura. As reações de ligação
foram aplicadas em gel de poliacrilamida 4% em TBE 1×. Estes géis foram secos e
visualizados em PhosphorImager Storm
TM
(GE Heathcare).
W DNA [
32
P] livre
W His-ModE1-DNA [
32
P]
0
W DNA não marcado (nM)
0
- + + + + + +
5 25 50 75 100
W His-ModE1
1 2 3 4 5 6 7
105
FIGURA 29 - ENSAIO DE COMPETIÇÃO ENTRE OS FRAGMENTOS DE DNA
DA REGIÃO PROMOTORA DE modA2 MARCADO COM [
32
P] E NÃO-
MARCADO PELA LIGAÇÃO A His-ModE2
O ensaios foram feitos usando 600nM de His-ModE2 e 5 nM de DNA marcado [
32
P]. As
concentrações de DNA não-marcado adicionado aos sistemas, o complexo His-ModE2-
DNA [
32
P] e DNA [
32
P] livre estão indicados na figura. As reações de ligação foram
aplicadas em gel de acrilamida 4% em TBE 1×. Estes géis foram secos e visualizados em
PhosphorImager Storm
TM
(GE Healthcare).
0 0 5 25 35 50
- + + + + +
1 2 3 4 5 6
W DNA [
32
P] livre
W His-ModE2-DNA [
32
P]
W DNA não marcado (nM)
W His-ModE2
106
Os resultados apresentados mostraram que as proteínas His-ModE1 e His-
ModE2 de H. seropedicae ligaram à região promotora do gene modA2. Esta região
possui uma seqüência consenso (TATAT-N
7
-TATAT) de ligação de proteínas
ModE. Ambas as proteínas foram capazes de ligar a esta região com a mesma
especificidade, porém a ligação foi independente da presença de molibdato na
reação.
Como demonstrado em E. coli, traços de molibdato são suficientes para
aumentar a afinidade de ModE ao DNA alvo e reprimir a transcrição dos genes
modABC (McNICHOLAS, RECH e GUNSALUS, 1997; GRUNDEN et al., 1999;
HALL et al., 1999; SCHÜTTELKOPF, BOXER e HUNTER, 2003).
Em H. seropedicae, a insensibilidade com relação à presença de molibdato
nos ensaios in vitro pode ter ocorrido devido a traços de molibdato presente nos
reagentes utilizados na purificação e nos sistemas de reação, sendo aparentemente
suficientes para não resultar em diferenças significativas no perfil de ligação. Ou
ainda, o protocolo de purificação da proteína His-ModE1 envolveu etapas de
desnaturação (uréia 8 mol/L) para solubilização dos corpos de inclusão e posterior
renaturação, podendo resultar em alguma variação estrutural do domínio C-terminal
levando à inativação do sítio de ligação a MoO
4
2-
renaturado. Neste caso, esta
eventual mudança conformacional não foi suficiente para comprometer a capacidade
de interação com DNA, observada nos ensaios.
Os resultados apresentados sugerem que estas proteínas podem estar
envolvidas na regulação da transcrição dos genes modA2B2C2 em H. seropedicae,
porém não refletem a condição fisiológica que permite o balanço entre os níveis
intracelulares de molibdato e a síntese do transportador. Estudos adicionais
envolvendo a caracterização de mutantes modE1 e modE2 contribuirão na
determinação de seus papéis fisiológicos na regulação da captação de molibdato em
H. seropedicae.
107
5 CONCLUSÕES
1. O gene fdxA é expresso em condições de fixação de nitrogênio;
2. A região nifX-modA1 de H. seropedicae não possui promotor funcional em
condições de fixação de nitrogênio;
3. O produto do gene fdxA é importante para a fixação de nitrogênio em H.
seropedicae, apresentando uma redução de 75% na redução de acetileno quando
mutagenizado com um cassete lacZ-Km;
5. O produto do gene fdxA não está envolvido no processo de inibição reversível da
nitrogenase em resposta a adição de íons amônio;
7. A expressão do gene modB2 é regulada pela presença de molibdato no meio de
cultura;
8. Mutação no gene modB2 não afeta a atividade da nitrogenase mesmo em
condições limitantes de molibdato;
9. A proteína His-ModE1 de H. seropedicae super-expressa em E. coli é insolúvel.
Esta proteína foi isolada como corpos de inclusão, solubilizada com uréia 8 mol/L,
renaturada e purificada em coluna de afinidade, obtendo-se uma forma solúvel da
proteína com pureza de 98,1%.
10. A proteína His-ModE2 é solúvel quando expressa em E. coli e foi purificada por
cromatografia de afinidade com pureza de 98,2%.
108
11. As proteínas His-ModE1 e His-ModE2 foram capazes de ligar in vitro à região
promotora do operon modA2B2C2 de H. seropedicae, independentemente da
presença de molibdato.
12. Mutantes nos genes modE1 e modE2 contribuirão para a determinação de suas
respectivas funções no processo de regulação do transporte de molibdato em H.
seropedicae.
109
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