( PDF ) Avaliação do dano oxidativo e função cardiovascular em diferentes modelos de hiperhomocisteinemia: papel protetor do folato e do estrogênio

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA

LABORATÓRIO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR

TESE DE DOUTORADO

AVALIAÇÃO DO DANO OXIDATIVO E FUNÇÃO CARDIOVASCULAR

DIFERENTES MODELOS DE HIPERHOMOCISTEINEMIA: PAPEL

PROTETOR DO FOLATO E DO ESTROGÊNIO

JAQUELINE BARP

ORIENTADORA: DRA. ADRIANE BELLÓ-KLEIN

PORTO ALEGRE, 2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA

LABORATÓRIO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR

AVALIAÇÃO DO DANO OXIDATIVO E FUNÇÃO CARDIOVASCULAR

DIFERENTES MODELOS DE HIPERHOMOCISTEINEMIA: PAPEL

PROTETOR DO FOLATO E DO ESTROGÊNIO

JAQUELINE BARP

ORIENTADORA: DRA. ADRIANE BELLÓ-KLEIN

TESE APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA, DO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICA DA SAÚDE DA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL, COMO REQUISITO PARCIAL

PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE

DOUTOR.

PORTO ALEGRE, 2007

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“A VIDA É UMA PEÇA DE TEATRO QUE NÃO PERMITE

ENSAIOS

...

POR ISSO, CANTE, RIA, DANCE, CHORE, AME E VIVA

INTENSAMENTE CADA MOMENTO DA SUA VIDA

...

...ANTES QUE A CORTINA SE FECHE E A PEÇA TERMINE

SEM APLAUSOS

.”

CHARLES CHAPLIN

DEDICO ESTE TRABALHO A MINHA FILHA,

BIANCA, A MAIOR E MELHOR REALIZAÇÃO DA

MINHA VIDA

, POR TORNAR TODOS OS DIAS

MUITO MAIS COLORIDOS

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Profª Adriane Belló Klein, pela orientação,

pelo carinho, pela paciência, pela atenção e por toda sua confiança em

mim e no meu trabalho;

À Profª Ângela Wyse, pela colaboração nos protocolos utilizados

neste trabalho;

À Tânia, por estar sempre disposta e pronta para ajudar, e que

muito me ajudou na realização dos experimentos;

Aos colegas Paulo e Rafael pela grande ajuda, e companhia, nos

finais de tarde no laboratório fazendo o registro dos animais;

Às colegas da bioquímica Siomara e Cristiane pela colaboração no

tratamento dos animais;

Às colegas e amigas Helena, Roberta e a Júlia pela grande

colaboração na realização dos experimentos.

À minha colega e amiga Patrícia Bianchi, pelos finais de semana

no laboratório, pelas jantas no Bourbon, pela companhia e ajuda nos

experimentos.

A todos os amigos e colegas (e ex-colegas) do laboratório pelos

momentos de descontração, conversas, cafezinhos, enfim por tornarem

os dias mais agradáveis e menos cansativos;

Às minhas grandes amigas Lucila e Maristela por todos os bons

momentos e o apoio sempre que necessário;

À minha família, em especial a minha mãe, por todo o apoio e

amor que sempre me dedicou;

À minha sogra, por emprestar a casa e cuidar da Bianca para que

eu pudesse terminar o doutorado;

Ao meu marido, Eduardo, pelo apoio, paciência e ajuda, o meu

amor e o mais sincero agradecimento por tudo que já passamos juntos;

Por fim, gostaria de agradecer ao PPG - Fisiologia, à UFRGS e ao

CNPq por todo apoio e infra-estrutura para o desenvolvimento desta

tese.

SUMÁRIO

INDÍCE DE REAÇÕES........................................................................... 9

INDÍCE DE FIGURAS ......................................................................... 10

INDÍCE DE TABELAS ......................................................................... 12

LISTA DE ABREVIATURAS................................................................. 13

ABSTRACT......................................................................................... 14

RESUMO............................................................................................ 16

1. INTRODUÇÃO................................................................................ 18

1.1 ESPÉCIES ATIVAS DE OXIGÊNIO ........................................................... 18

1.1.1 ESTRESSE OXIDATIVO E NITROSATIVO ............................................. 20

1.1.2 S

ISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE............................................... 22

1.2 ESTROGÊNIOS ................................................................................ 25

1.2.1 ESTROGÊNIOS COMO ANTIOXIDANTES .............................................. 26

1.2.2 E

FEITOS DOS ESTROGÊNIOS SOBRE DOENÇAS CARDÍACAS...................... 27

1.2.3 Ó

XIDO NÍTRICO E ESTROGÊNIO...................................................... 30

1.3 HOMOCISTEÍNA ............................................................................... 31

2. HIPÓTESE ..................................................................................... 38

3. OBJETIVO GERAL.......................................................................... 38

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................... 38

4. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................ 40

4.1 ANIMAIS ....................................................................................... 40

4.2 P

ROTOCOLOS EXPERIMENTAIS ............................................................. 40

4.3 C

OLETA DE SANGUE ......................................................................... 43

4.4 S

ACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E PREPARAÇÃO DOS HOMOGENEIZADOS.................. 43

4.5 C

ASTRAÇÃO (OVARIECTOMIA) ............................................................. 44

4.6 R

EGISTRO DA PRESSÃO ARTERIAL......................................................... 44

4.6.1 CANULAÇÃO ARTERIAL................................................................. 44

4.6.2 R

EGISTRO E PROCESSAMENTO DE SINAL ............................................ 45

4.6.3 R

EGISTRO DAS PRESSÕES VENTRICULARES ESQUERDAS......................... 46

4.7 DOSAGEM HORMONAL ....................................................................... 47

4.8 Q

UANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ........................................................... 48

4.9 A

NÁLISE DE NITRITOS+NITRATOS (NOX)............................................... 48

4.10 Q

UIMILUMINESCÊNCIA (QL).............................................................. 48

4.11 S

UBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS) ................... 49

4.12 A

NÁLISE DE CARBONILAS ................................................................. 50

4.13 C

APACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL (TRAP) .......................................... 50

4.14 G

LUTATIONA S-TRANSFERASE (GST)................................................... 51

4.15 G

LUTATIONA PEROXIDASE (GPX)........................................................ 52

4.16 S

UPERÓXIDO DISMUTASE (SOD)........................................................ 53

4.17 C

ATALASE (CAT)........................................................................... 53

4.18 A

NÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................... 54

5. RESULTADOS ................................................................................ 55

5.1 EXPERIMENTO 1:............................................................................. 55

5.2 E

XPERIMENTO 2:............................................................................. 58

5.3 E

XPERIMENTO 3:............................................................................. 62

5.3.1 CORAÇÃO:............................................................................... 65

5.3.2 A

ORTA: .................................................................................. 73

5.3.3 E

RITRÓCITOS: .......................................................................... 74

5.4 EXPERIMENTO 4:............................................................................. 78

5.4.1 CORAÇÃO:............................................................................... 80

5.4.2 F

ÍGADO: ................................................................................. 89

6. DISCUSSÃO................................................................................... 97

6.1 EXPERIMENTO 1:............................................................................. 97

6.2 E

XPERIMENTO 2 .............................................................................. 99

6.3 E

XPERIMENTO 3 .............................................................................101

6.4 E

XPERIMENTO 4 .............................................................................108

7. CONCLUSÃO................................................................................ 114

8. REFERÊNCIAS ............................................................................. 115

ANEXO 1 - ARTIGO.......................................................................... 131

INDÍCE DE REAÇÕES

Reação 1: Formação das EAO, a partir da redução do O

................................... 19

Reação 2: Reação de Fenton............................................................................... 20

Reação 3: Reação de Haber – Weiss .................................................................. 20

Reação 4: Dismutação do radical superóxido pela SOD...................................... 22

Reação 5: Decomposição do peróxido de hidrogênio pela catalase.................... 23

Reação 6: Redução de hidroperóxidos (ROOH) pela glutatina peroxidase (GPx),

formando glutationa oxidada (GSSG) e regeneração da glutationa reduzida

(GSH) pela glutationa redutase (GR). .............................................................. 23

Reação 7: Exemplo de reação de detoxificação do cloro dinitrobenzeno (CDNB)

através da glutationa S-transferase (GST)....................................................... 24

Reação 8: Reação de redução de dissulfetos de glutationa e peróxido de

hidrogênio através do sistema tiorredoxina...................................................... 25

Reação 9: Exemplo de reação global de oxidação .............................................. 35

INDÍCE DE FIGURAS

Figura 1: A -Estrutura do 17 -estradiol. B -Ciclo antioxidante do 17 -estradiol . 27

Figura 2: A -Formação da Hcy. B -Mecanismo de geração de EAO pela Hcy ..... 33

Figura 3: Lipoperoxidação avaliada por quimiluminescência em homogeneizado

cardíaco. .......................................................................................................... 56

Figura 4: Atividade da Catalase em homogeneizado cardíaco. ........................... 56

Figura 5: Atividade da SOD em homogeneizado cardíaco.................................. 57

Figura 6: Atividade da GST em homogeneizado cardíaco....................................57

Figura 7: Lipoperoxidação avaliada por TBARS em homogeneizado cardíaco. .. 59

Figura 8: Análise de carbonilas em homogeneizado cardíaco ............................. 59

Figura 9: Atividade da catalase em homogeneizado cardíaco ............................. 60

Figura 10: Correlação entre TBARS e atividade da catalase homogeneizado

cardíaco ........................................................................................................... 61

Figura 11: Atividade da SOD em homogeneizado cardíaco................................. 61

Figura 12: Atividade da GST em homogeneizado cardíaco ................................. 62

Figura 13: Dosagem de 17 -estradiol em plasma............................................... 64

Figura 14: Nitratos+Nitritos em homogeneizado cardíaco.................................... 65

Figura 15: Correlação entre os níveis de NOx e pressão arterial média em

homogeneizado cardíaco................................................................................. 66

Figura 16: Lipoperoxidação avaliada por quimiluminescência em homogeneizado

cardíaco ........................................................................................................... 67

Figura 17: Correlação entre quimiluminescência e pressão arterial média em

homogeneizado cardíaco................................................................................. 68

Figura 18: Análise de carbonilas em homogeneizado cardíaco ........................... 69

Figura 19: Análise do TRAP em homogeneizado cardíaco................................. 70

Figura 20: Atividade da GST em homogeneizado cardíaco ................................ 70

Figura 21: Correlação entre quimiluminescência e a atividade da GST em

homogeneizado cardíaco................................................................................. 71

Figura 22: Atividade da GPx em homogeneizado cardíaco ................................. 72

Figura 23: Atividade da GST em homogeneizado de aorta...................................73

Figura 24: Atividade da GPx em homogeneizado de aorta...................................74

Figura 25: Nitratos+Nitritos em plasma ................................................................ 75

Figura 26: Lipoperoxidação avaliada por quimiluminescência em eritrócito......... 76

Figura 27: Atividade da GST em eritrócito ........................................................... 77

Figura 28: pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) ................... 79

Figura 29: Nitratos+Nitritos em homogeneizado cardíaco.................................... 80

Figura 30: Correlação entre PDFVE e a NOx em homogeneizado cardíaco.........81

Figura 31: Lipoperoxidação avaliada por TBARS em homogeneizado cardíaco . 82

Figura 32: Correlação entre TBARS e PDFVE em homogeneizado cardíaco...... 83

Figura 33: Análise de carbonilas em homogeneizado cardíaco ........................... 84

Figura 34: Atividade da GST em homogeneizado cardíaco ................................. 85

Figura 35: Atividade da GPx em homogeneizado cardíaco ................................ 86

Figura 36: Correlação entre TBARS e a atividade da GPx em homogeneizado

cardíaco ........................................................................................................... 87

Figura 37: Atividade da SOD em homogeneizado cardíaco................................. 88

Figura 38: Atividade da catalase em homogeneizado cardíaco ......................... 889

Figura 39: Nitratos+Nitritos em homogeneizado hepático.....................................90

Figura 40: Lipoperoxidação avaliada por TBARS em homogeneizado hepático. 91

Figura 41: Análise de carbonilas em homogeneizado hepático ........................... 92

Figura 42: Atividade da GST em homogeneizado hepático ................................ 93

Figura 43: Atividade da GPx em homogeneizado hepático................................. 94

Figura 44: Atividade da SOD em homogeneizado hepático................................. 95

Figura 45: Atividade da catalase em homogeneizado hepático ........................... 96

INDÍCE DE TABELAS

Tabela 1: Pressão arterial média (mmHg) e freqüência cardíaca (bpm).............. 64

Tabela 2: Enzimas SOD e Catalase em homogeneizado cardíaco...................... 72

Tabela 3: Enzimas SOD e Catalase em sangue ................................................. 77

Tabela 4: PDFVE (mmHg), PSVE (mmHg), +dP/dt (mmHg/s), -dP/dt (mmHg/s),

FC (bpm) e HC (mg/g) ..................................................................................... 79

LISTA DE ABREVIATURAS

ATP – adenosina trifosfato

CAT - catalase

DNA – ácido desoxirribonucléico

+dP/dt - derivada positiva

-dP/dt - derivada negativa

EAN – espécies ativas de nitrogênio

EAO - espécies ativas de oxigênio

EO – estresse oxidativo

FC - freqüência cardíaca

GABA – ácido -aminobutírico

GPx - glutationa peroxidase

GR - glutationa redutase

GSH - glutationa reduzida

GSSG - glutationa oxidada

GST - glutationa S-transferase

Hcy – homocisteína

HHcy –hiperhomocisteinemia

LDL - lipoproteínas de baixa densidade

LPO - lipoperoxidação

NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NO - óxido nítrico

NOS – óxido nítrico sintase

NOx – metabólitos do NO

PAM - pressão arterial média

PDFVE - pressão diastólica final no ventrículo esquerdo

PSVE - pressão sistólica ventrículo esquerdo

QL - quimiluminescência

RL – radicais livres

SOD - superóxido dismutase

TBARS - substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TRAP - capacidade antioxidante total

TrxR - tioredoxina redutase

ABSTRACT

It is known that high concentrations of homocysteine (Hcy) are associated

with the increase of risk of cardiovascular disease and of cellular damage caused

by the formation of reactive oxygen species (ROS). It is also known that the

estrogen acts as a non enzymatic antioxidant involved in cardiovascular

protection. In this work we evaluated the effect of homocystinuria on myocardial

oxidative stress parameters, and the effect of hyperhomocysteinemia (HHcy) on

the same parameters and also on hemodynamics in rats with and without

estrogen.

Four experiments were performed. In experiment number one, sixteen

animals were divided in 2 groups (n=8/group): control and Hcy. These animals

received chronic treatment from the 6

to the 28

day of life with increasing doses

of Hcy and were killed one hour after the last dose. In the second experiment,

thirty rats were divided into four groups: Saline (n=8); Folate (n=6); Hcy (n=9) and

Folate+Hcy (n=7). These animals had received folic acid and/or Hcy from the 6

the 28

day of life and had been killed with 80 days of life. In the third experiment,

fourty eight animals were divided in 6 groups (n=8/group): NAIVE; NAIVE+Hcy;

Sham; Sham+Hcy; castrated and castrated+Hcy. These animals were castrated in

the 50

day of life and, after one week, they received an acute treatment with Hcy

for 72 hours at each eight hours and were killed one hour after the last dose. In the

fourth experiment, thirty two animals were divided into four groups (n=8/group):

control, castrated, methionine and castrated+methionine. These animals had been

castrated in the 70

day of life, and received methionine in drinking water for 30

days and were killed at the end of treatment.

In the homocystinuria model (experiment number one), there were no signs

of alterations in lipid peroxidation (LPO) in 28 day rats. However, antioxidant

enzyme activities of SOD and GST were increased in Hcy group. As this is a

chronic treatment, probably these enzymes are increased to minimize the

oxidative damage caused by Hcy. In the second experiment, the effect of the

homocystinuria was evaluated in animals with 80 days. It was observed an

increase in LPO in the animals that had received Hcy, but it returned to control

values with folate administration. The reduction of LPO in the presence of folate

confirms its capacity of minimize the damage caused by Hcy. We also observed

reduction in the enzyme activities of GST and catalase in the animals receiving

Hcy, which also returned to the control values with the administration of folate. It is

possible that Hcy increases the hydrogen peroxide concnetration in the

myocardium of these animals. From the results obtained, we can suggest that the

levels of Hcy can be reduced with folate, since high doses of folate had

significantly reduced the levels of oxidative stress caused by Hcy. In the acute

model of HHcy (experiment number three), myocardial oxidative stress increased

due to the administration of Hcy in the group without estrogen. This result has a

positive correlation with mean arterial pressure (MAP), that is, the higher LPO, the

higher MAP. This effect was not observed in groups with physiological estrogens

levels. It is possible that these findings are related to the antioxidant protection

offered by estrogen. Moreover, we observed a reduction in the activity of GST in

the group castrated+Hcy, which can be contributing for the oxidative damage

observed. In the HHcy model caused by the consumption of methionine

(experiment number four), we observed an increase in LVEDP in group

castrated+methionine. This result has a negative correlation with the nitric oxide

metabolites (Nox) showing that the animals that had an increased ventricular

diastolic pressure had presented lesser NO bioavailability. In this model we also

observed an increase in the myocardial oxidative stress due to the administration

of methionine in the group without estrogen. This result has a positive correlation

with LVEDP, that is, the animals with enhanced LPO also presented high

ventricular diastolic pressure, indicating a possible participation of oxidative stress

in ventricular dysfunction. These animals also presented an increase in the

activities of GST and GPx in group castrated+methionine, suggesting that chronic

treatment with methionine leads to an adaptation of the enzymatic antioxidant

system in the absence of the estrogen.

KEY WORDS: homocysteine, estrogen, antioxidant enzymes, oxidative damage,

methionine.

RESUMO

Sabe-se que concentrações elevadas de homocisteína (Hcy) estão

associadas com o aumento do risco de doenças cardiovasculares e com o dano

celular causado pela formação das espécies ativas de oxigênio (EAO). Sabe-se

também que o estrogênio atua como antioxidante não enzimático envolvido na

proteção cardiovascular. Foram objetivos deste trabalho avaliar o efeito da

homocistinúria sobre parâmetros de estresse oxidativo em tecido cardíaco; e

avaliar o efeito da hiperhomocisteinemia (HHcy) sobre parâmetros de estresse

oxidativo e hemodinâmicos em ratas com e sem estrogênio.

Este trabalho foi divido em 4 experimentos. No experimento 1 foram

utilizados 16 animais divididos em 2 grupos (n= 8/grupo): controle e Hcy. Estes

animais receberam tratamento crônico do 6° dia ao 28° dia de vida com doses

crescentes de Hcy e foram mortos 1 hora após a última dose. No experimento 2

foram utilizados 30 ratos, divididos em 4 grupos: Salina (n=8); Folato (n=6); Hcy

(n=9) e Folato+Hcy (n=7). Estes animais receberam ácido fólico e/ou Hcy do 6° ao

28º dias de vida e foram mortos aos 80 dias de vida. No experimento 3, foram

utilizados 64 animais divididos em 6 grupos (n= 8/grupo): NAIVE; NAIVE+Hcy;

Sham; Sham+Hcy; castrada e castrada+Hcy. Estes animais foram castrados no

50° dia de vida e, após uma semana, receberam tratamento agudo com Hcy de 8

em 8 horas por 72 horas e foram mortos 1 hora após a última dose. No

experimento 4, foram utilizados 32 animais divididos em 4 grupos (n= 8/grupo):

controle, castrado, metionina e castrado+metionina. Estes animais foram

castrados no 70° dia de vida, receberam metionina na água de beber por 30 dias

e foram mortos logo após o final do tratamento.

No modelo de homocistinúria (experimento 1), não foram observadas

alterações na lipoperoxidação (LPO) cardíaca nos ratos com 28 dias. No entanto,

as atividades das enzimas antioxidantes SOD e GST estavam aumentadas no

grupo Hcy. Como este é um tratamento crônico, provavelmente estas enzimas

estão aumentadas de forma a minimizar o dano oxidativo causado pela Hcy. Já

no experimento 2, avaliou-se o efeito da Hhcy a longo prazo, em animais com 80

dias. Houve aumento na LPO dos animais tratados com Hcy que foi previnida com

a administração de folato. A redução da LPO na presença do folato confirma sua

capacidade de minimizar o dano causado pela Hcy. Observamos ainda a

diminuição na atividade das enzimas GST e catalase nos animais tratados com

Hcy o que resultaria em aumento da concentração de peróxido de hidrogênio no

tecido cardíaco. O tratamento com folato previniu a atividade das enzimas

antioxidantes. A partir dos resultados encontrados, podemos sugerir que os níveis

de Hcy podem ser reduzidos com folato, uma vez que altas doses de folato

reduziram consideravelmente os níveis de estresse oxidativo gerado pela Hcy. No

modelo de HHcy aguda (experimento 3), o estresse oxidativo cardíaco aumentou

em função da administração de Hcy no grupo sem estrogênio. Este resultado se

correlaciona positivamente com a pressão arterial (PA), ou seja, os animais com

maior LPO também apresentaram uma maior PA. Este efeito não foi observado

nos grupos com níveis estrogênicos fisiológicos. Acredita-se que estes resultados

sejam devidos à proteção antioxidante oferecida pelo estrogênio. Além disso,

observamos uma diminuição na atividade da GST nos animais castrados+Hcy, o

que pode estar contribuindo para o dano oxidativo observado. Já no modelo de

HHcy causado pelo consumo de metionina (experimento 4), observamos um

aumento na PDFVE no grupo castrado+metionina que se correlaciona

negativamente com os metabólitos do NO. Este resultado mostra que os animais

que tiveram disfunção ventricular apresentaram uma menor biodisponibilidade do

NO. Neste modelo observamos também um aumento no dano oxidativo cardíaco

em função da administração de metionina no grupo sem estrogênio. Este

resultado se correlaciona positivamente com a PDFVE, ou seja, os animais com

maior LPO também apresentam uma maior pressão ventricular diastólica,

indicando uma possível participação do estresse oxidativo na disfunção

ventricular. Estes animais ainda apresentaram um aumento na atividade das

enzimas antioxidantes GST e GPx no grupo castrado+metionina, sugerindo que o

tratamento crônico levou a uma adaptação do sistema antioxidante enzimático na

ausência do estrogênio.

PALAVRAS-CHAVE: homocisteína, estrogênio, enzimas antioxidantes, dano

oxidativo, metionina.

1. INTRODUÇÃO

O estrogênio endógeno está associado a um menor risco cardiovascular.

Um dos mecanismos cardioprotetores envolvidos têm como base o seu papel

como neutralizador de radicais livres e, por conseqüência, sua ação antioxidante.

Sabendo da importância de estudar os efeitos deletérios das espécies ativas de

oxigênio (EAO) iniciaremos abordando alguns conceitos básicos de estresse

oxidativo (EO).

1.1 ESPÉCIES ATIVAS DE OXIGÊNIO

Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de

existência independente que contenha um ou mais elétrons desemparelhados,

sendo assim altamente reativos e capazes de atacar qualquer biomolécula

(Halliwell & Gutteridge, 1999).

A geração das EAO ocorre durante os processos de oxidação biológica.

Dentre os quais, podemos destacar a respiração celular acoplada à fosforilação

oxidativa, para formação de ATP na mitocôndria. Em várias reações enzimáticas

e não enzimáticas podem ser gerados compostos intermediários da redução

parcial do oxigênio (O

), sendo que podemos destacar: o ânion radical superóxido

-

), o peróxido de hidrogênio (H

) e o radical hidroxil (OH



). A formação

destas moléculas ocorre em aproximadamente 5% de todo processo de redução

do oxigênio até água.

OHOHOHOO

222

   



 HeHeHee

Superóxido peróxido de hidrogênio radical hidroxil

Reação 1: Formação das EAO, a partir da redução do O

Cada EAO tem suas próprias características, mostrando diferentes

reatividades e tempos de meia-vida (Droge, 2002; Valko et al., 2007).

O ânion radical superóxido (O

-

) é o primeiro intermediário da redução

monovalente do oxigênio à água; a partir do mesmo serão formadas as demais

EAO. A sua dismutação é catalisada pela enzima superóxido dismutase (Valko et

al., 2007). O peróxido de hidrogênio é o segundo intermediário do processo

oxidativo, podendo ser produzido indiretamente, pela redução univalente do

oxigênio, seguida da dismutação do ânion radical superóxido e/ou diretamente,

pela redução divalente do oxigênio molecular. Apesar de não ser um radical livre,

esta espécie ativa pode originar o radical hidroxil, o que seria bastante prejudicial

à célula, além de ter a propriedade de ser muito permeável através das

membranas biológicas (Halliwell & Gutteridge, 1999; Droge, 2002). O radical

hidroxil (OH



), por sua vez, é um dos mais potentes oxidantes dos sistemas

biológicos. Este radical livre possui a capacidade de atravessar as membranas e

pode reagir com biomoléculas, como lipídios insaturados e DNA, apesar de seu

curto tempo de meia vida, da ordem de 10

-9

segundos (Halliwell & Gutteridge,

1999).

A mais reativa destas espécies, o radical hidroxil, é formada através de

reações que necessitam a presença de íons metais de transição como o ferro e o

cobre. A reação do peróxido de hidrogênio com íons ferroso ou cúprico é

chamada de reação de Fenton (1894) que leva à produção do radical hidroxil,

altamente reativo (Reação 2).

H O Fe Cu Fe Cu OH OH

2 2

2 3 2

    

     

/ /

Reação 2: Reação de Fenton

O radical hidroxil também pode ser formado a partir da reação do ânion

superóxido com o peróxido de hidrogênio em presença de íons divalentes de

metais de transição, reação descrita por Haber-Weiss em 1934 (Reação 3).

H O O OH OH

2 2 2

   

  

 

Fe Cu/

Reação 3: Reação de Haber – Weiss

1.1.1 ESTRESSE OXIDATIVO E NITROSATIVO

O estresse oxidativo pode ser definido como “um distúrbio do equilíbrio pró-

oxidante/antioxidante em favor dos pró-oxidantes, levando ao dano potencial”

(Halliwell & Gutteridge, 1999). Além do estresse oxidativo (EO), há também o

estresse nitrosativo, este gerado pelas espécies ativas do nitrogênio (EAN). O

óxido nítrico (NO



) é, fisicamente, um radical livre (RL), considerando o elétron

não pareado. Apesar de sua baixa reatividade, a difusão do NO é facilitada devida

a sua carga neutra em soluções aquosas e sua alta lipossolubilidade (Bredt,

2003). Estas propriedades químicas do NO determinam importantes interações

com vários tipos de enzimas e tornam este radical uma molécula potencialmente

tóxica. O NO reage facilmente com o radical superóxido produzindo o peroxinitrito

(ONOO

). A reação do peroxinitrito com biomoléculas diminui suas funções,

causando toxicidade e alterando vias de sinalização (Boveris, 1998; Tsikas,

2005).

Em princípio, o estresse oxidativo pode resultar de: diminuição da atividade

enzimática antioxidante, deficiência nutricional de antioxidantes ou outros

constituintes dietéticos essenciais pela inadequada ingestão ou absorção dos

nutrientes; ou produção aumentada de EAO e/ou EAN, pela exposição elevada ao

, a presença de toxinas, ou excessiva ativação de sistemas como as células

fagocíticas nas doenças crônicas inflamatórias (Halliwell & Gutteridge, 1999).

O estresse oxidativo pode causar dano a todos os tipos de biomoléculas,

incluindo DNA, proteínas e lipídios. O principal alvo celular do estresse oxidativo

pode variar dependendo da célula, do tipo de estresse imposto e da intensidade

do estresse. O estresse oxidativo intenso pode produzir danos irreversíveis

levando à morte celular (Halliwell & Gutteridge, 1999).

Além de seu efeito citotóxico, as EAO também atuam como mensageiros

em diferentes vias de sinalização intracelular. Um exemplo é a ativação do fator

nuclear

kappa B (NFB) induzida pelo peróxido de hidrogênio e bloqueada por

vários antioxidantes, incluindo a vitamina E (Murphy & Newsholme, 1999;

Dourado et al., 2006).

Um excesso de formação de radicais de nitrogênio é denominado estresse

nitrosativo. Os radicais de nitrogênio (RNs) produzidos por um aumento da

atividade da Óxido Nítrico Sintase (NOS), também podem contribuir para o

desencadeamento de reações radicalares envolvidas na quebra da homeostase

intracelular (Bredt, 2003).

1.1.2 SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE

Os organismos aeróbios possuem sistemas de defesa para se protegerem

contra os efeitos causados pelas EAO. Substâncias que neutralizam a ação dos

RLs na fase de iniciação ou propagação da lipoperoxidação, levando à formação

de produtos menos tóxicos, são chamadas de varredores (scavengers) como as

enzimas antioxidantes e tocoferóis. Aquelas que atuam absorvendo a energia de

excitação dos RLs, neutralizando-os, são chamadas de

quenchers como os

carotenóides e o ácido ascórbico. O sistema de defesa antioxidante é composto

de elementos enzimáticos e não enzimáticos.

Dentre as defesas enzimáticas responsáveis pela detoxificação das EAO,

salientam-se três enzimas: a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a

glutationa peroxidase (GPx)(Sies, 1997).

A superóxido dismutase (SOD) é a enzima que catalisa a dismutação de

dois íons superóxido para formar peróxido de oxigênio (que é menos reativo e

pode ser degradado por outras enzimas) e oxigênio (Reação 4). Esta reação pode

ocorrer espontaneamente em pH fisiológico, porém, com presença da SOD, a

velocidade desta reação é 10

vezes maior (Fridovich, 1975; Yu, 1994; Halliwell &

Gutteridge, 1999).

222

SOD

OHOO2H2  





Reação 4: Dismutação do radical superóxido pela SOD

A geração de peróxido de hidrogênio foi demonstrada como um evento

fisiológico diretamente relacionado ao consumo de oxigênio, sendo a catalase e

as peroxidases as enzimas que metabolizam este peróxido de hidrogênio à água

e oxigênio, impedindo assim a formação de radical hidroxil e conseqüente dano

celular. A catalase (CAT) está presente em todos os tipos de células de

mamíferos, porém ela é uma enzima altamente específica pois possui atividade

apenas para peróxidos de hidrogênio, de etila e de metila (Reação 5) (Chance,

1979).

2 2 2 2

H O O H O

Catalase

  

Reação 5: Decomposição do peróxido de hidrogênio pela catalase

Entre as peroxidases, a mais importante é a glutationa peroxidase. A

glutationa peroxidase (GPx) catalisa a redução de vários peróxidos,

principalmente do peróxido de hidrogênio e de hidroperóxidos orgânicos (Yu,

1994). Para a redução dos peróxidos, esta enzima utiliza o grupamento sulfidril da

glutationa reduzida, que pode ser reciclada pela interação da forma oxidada com

NADPH através da enzima glutationa redutase (Reação 6). Os grupamentos

sulfidril doam dois hidrogênios, formando uma ligação dissulfeto, que pode

transformar a molécula de peróxido em um álcool (R-OH), ou, no caso do

peróxido de hidrogênio (H

), em água (Halliwell & Gutteridge, 1999).

R OOH +2GSH R OH +GSSG +H O

GPx

   



 2NADP2GSH2NADPHGSSG

Reação 6: Redução de hidroperóxidos (ROOH) pela glutatina peroxidase (GPx),

formando glutationa oxidada (GSSG) e regeneração da glutationa reduzida

(GSH) pela glutationa redutase (GR).

Outra classe de enzimas que também têm um importante papel fisiológico

na detoxificação são as glutationa S-transferases (GSTs). Estas enzimas agem na

detoxificação de potentes agentes alquilantes, incluindo compostos

farmacologicamente ativos como herbicidas, pesticidas e xenobióticos. Como

pode ser visto na reação 7, as GSTs catalisam a reação destes compostos com o

grupamento -SH da glutationa, neutralizando assim seus sítios eletrofílicos e

transformando-os em produtos hidrossolúveis, que são mais facilmente

metabolizáveis (Habig, 1974).

CDNB

Reação 7: Exemplo de reação de detoxificação do cloro dinitrobenzeno (CDNB)

através da glutationa S-transferase (GST).

Mais recentemente, foi descrito outro sistema enzimático importante na

defesa antioxidante, o sistema tiorredoxina. Estas enzimas catalisam reduções,

utilizando vários substratos. As tiorredoxinas doam equivalentes redutores para

proteínas, dissulfetos de glutationa, peróxido de hidrogênio, entre outros. Tornam-

se oxidadas e são reduzidas pela tiorredoxina redutase (TrxR). Esta, por sua vez,

utiliza NADPH para reduzir pontes de dissulfeto da tioredoxina (Nordberg & Arner,

2001).

+ GSH

GST

NADPH + TrxS

NADP + Trx (SH

)

Reação 8: Exemplo de reação de redução de dissulfetos de glutationa e peróxido

de hidrogênio através do sistema tiorredoxina.TrxS

– tiorredoxina oxidada,

Trx (SH

) – tiorredoxina reduzida, TrxR – tiorredoxina redutase (adaptado de

Kuntz et al., 2007).

Dentre os compostos não enzimáticos, destacam-se a vitamina E (

-

tocoferol), a vitamina C (ácido ascórbico), o -caroteno (precursor da vitamina A)

e o tripeptídio glutationa. Cabe ainda salientar o poder antioxidante dos

estrogênios, devido à presença do grupamento hidrofenólico (Yu, 1994; Ferreira,

1997; Singal et al., 2000).

1.2 ESTROGÊNIOS

Os estrogênios de ocorrência natural são o 17 -estradiol, a estrona e o

estriol, sendo o estradiol o hormônio mais potente e o produzido em maior

quantidade e o estriol, o menos potente. A estrutura destes hormônios é formada,

basicamente, de um núcleo esteroidal de dezoito carbonos (Figura 1) (Williams,

1996).

TrxR

GSSG

2GSH

O+O

Os estrogênios, bem como os demais hormônios esteroidais, têm como

mecanismo de ação clássico a regulação da transcrição gênica. Através da sua

capacidade de atravessar as membranas celulares, ligam-se aos receptores

nucleares formando um complexo que se liga ao DNA, estimulando a transcrição

de alguns genes (Williams, 1996; Ganong, 1995). Mais recentemente, tem-se

estudado mecanismos de ação não clássicos, ou de efeito rápido, onde os

hormônios esteróides atuam na membrana plasmática. A ação na membrana

pode se dar através de efeitos não específicos na sua fluidez ou de ligações em

receptores de membrana específicos para hormônios esteróides (Wierman, 2007).

Estudos já identificaram sítios de ligação para hormônios esteróides, com

moderada atividade e alta especificidade. Outra ação na membrana pode ser por

ligações com receptores de membrana de neurotransmissores, como o do GABA

(Brann, 1995; Wierman, 2007).

1.2.1 ESTROGÊNIOS COMO ANTIOXIDANTES

Sabe-se que a estrutura das moléculas estrogênicas influencia bastante na

sua atividade antioxidante, devido à presença de um grupamento hidrofenólico

(Figura 1-A). O 17 -estradiol, por exemplo, tem um potencial antioxidante

bastante relevante, uma vez que esse hormônio esteróide pode interferir no

processo de iniciação da LPO (Figura 1-B). Esta interferência se dá pela

modificação na rota reacional da peroxidação, evitando assim a sua propagação e

subseqüente geração das EAO (Ayres et al., 1998; Wierman, 2007). O dano ao

DNA também pode ser evitado por ação estrogênica, principalmente, pela inibição

da produção do O

-

(Ayres et al., 1998; Strehlow et al., 2003).

Figura 1: A - Estrutura do 17 -estradiol. B - esquema do ciclo antioxidante do

17 -estradiol quando exposto ao radical hidroxil OH



(adaptado de Prokai et

al., 2003).

Outra propriedade antioxidante dos estrogênios, além da atividade de

“scavenger” de radicais livres, é a ação sobre a regulação da atividade das

enzimas antioxidantes como a glutationa peroxidase (GPx). Investigou-se a

atividade da GPx eritrocitária ao longo do ciclo menstrual e foi verificado um

aumento de sua ação enzimática quando houve picos de estrogênios ao longo do

ciclo (Massafra et al., 1998). Também foi observado que concentrações

progressivas de estradiol foram efetivas em bloquear a produção do ânion

superóxido (Arnal et al., 1996). Além disso, foi verificado que o estradiol de origem

exógena aumenta os níveis de SOD (Oberley et al., 1994) e diminui a expressão

de enzimas pró-oxidantes como a NADPH oxidase (Hua & Harrison, 2000).

1.2.2 EFEITOS DOS ESTROGÊNIOS SOBRE DOENÇAS CARDÍACAS

Os estrogênios têm significativa ação redutora do colesterol plasmático,

inibindo a aterogênese, por isso eles podem contribuir para reduzir a incidência de

hidroxila

fenólica

Enzima

infarto do miocárdio e outras complicações da doença vascular aterosclerótica em

mulheres na pré-menopausa (Hayashi et al., 2000). No entanto, altas doses de

estrogênios ativos por via oral parecem promover tromboses, por chegarem ao

fígado pelo sangue, em altas concentrações e alterarem a produção hepática dos

fatores de coagulação (Genuth, 1996).

As doenças cardiovasculares na pós-menopausa são devidas, em parte, ao

desenvolvimento de aterosclerose causada por deficiência de estrogênios. A

principal causa destas doenças é o aumento do LDL-colesterol e de triglicerídeos

como resultado de uma menor eliminação do LDL e outros lipídios pelo fígado e o

aumento da oxidação do LDL na membrana arterial (Kuhl, 1994).

Os hormônios esteróides sexuais, sobretudo, os estrogênios, possuem

uma grande relevância no funcionamento vascular. O 17ß-estradiol pode

aumentar a liberação de NO, quando administrado cronicamente. Pode ainda

fazer uma “up-regulation” da NO sintase endotelial (eNOS). Ao passo que o

mesmo tem ação sobre a musculatura lisa, como vasodilatador, se aplicado

agudamente (Barret-Connor & Bush, 1991; Di et al., 1999).

Os estrogênios têm se mostrado eficazes em reduzir a proliferação celular

na camada íntima e adventícia da parede vascular em vários modelos

experimentais. Esse efeito tem sido associado à ação do estrogênio na

modulação de fatores envolvidos nesse processo, como inibição da atividade da

proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e/ou aumento da produção de NO

(Orshal et al., 2004). O estrogênio também pode prevenir a formação da placa

ateromatosa ao exercer ação inibitória na expressão de importantes fatores pró-

inflamatórios, como citocinas e moléculas de adesão, envolvidos no processo de

adesão e migração transendotelial (Pfeilschifter et al., 2002; Turgeon, 2006).

Muitos trabalhos têm apontado o NO como o principal mediador dos efeitos

induzidos pelo estrogênio sobre a função endotelial. O estrogênio é capaz de

estimular a síntese de NO em diferentes leitos vasculares, como artéria uterina,

micro-vasos da circulação mesentérica e muscular esquelética e na aorta

(Strehlow et al., 2003; Turgeon, 2006). Aumento da produção de NO, determinado

pela concentração urinária de seus metabólitos nitritos e nitratos, também tem

sido observado em mulheres na menopausa que recebem terapia de reposição

hormonal. O mecanismo mais provável para explicar o aumento da produção de

NO seria a maior atividade da eNOS decorrente da indução da expressão gênica

dessa enzima pelo estrogênio (Wassmann et al., 2001). É fato que o estrogênio,

ao se ligar em seu receptor nuclear, se transforma em fator de transcrição gênica,

que é reconhecido por regiões promotoras no DNA e modula a transcrição de

uma série de proteínas. Seqüências de reconhecimento do complexo

estrogênio/receptor têm sido detectadas na região promotora do gene que

codifica a eNOS, sugerindo que o estrogênio aumenta a expressão gênica dessa

enzima (Tostes et al., 2003; Orshal et al., 2004). Foi demonstrado ainda que a

ovariectomia promove redução significativa da expressão e atividade da eNOS

em diferentes leitos vasculares, e que o tratamento das fêmeas ovariectomizadas

com estradiol restaura a expressão e atividade dessa enzima para os níveis

observados em fêmeas não-castradas (Dantas et al., 2001). Outros estudos têm

demonstrado que o estrogênio pode aumentar a atividade da eNOS por

mecanismos não-genômicos. Por meio do tratamento de células endoteliais em

cultura com um composto impermeável à membrana celular (ligado à albumina),

Kim

et al. observaram que o estrogênio promove indução rápida da liberação de

NO. Isso sugere a existência de um sítio de ação para o estradiol na membrana

plasmática cuja ativação desencadeia a cascata de segundos mensageiros que

levam à ativação rápida da eNOS (Kim et al., 1999; Tostes et al., 2003).

1.2.3 ÓXIDO NÍTRICO E ESTROGÊNIO

O NO é sintetizado nos organismos vivos, principalmente, por um grupo de

enzimas denominadas óxido nítrico sintases (NOS) que convertem o aminoácido

L-arginina em L-citrulina e NO. A atividade da NOS é controlada por citocinas,

efetores e fatores de sinalização do NO para conexão do sistema imunológico

com os sistemas cardiovascular, nervoso e endócrino (Bergendi et al., 1999).

O NO é um gás hidrofóbico e uma vez gerado será capaz de difundir-se

através da membrana plasmática das células endoteliais. É responsável por

controlar o tônus vascular, conhecido como Fator de Relaxamento Derivado do

Endotélio (EDRF), responsável então pela vasodilatação e por inibir alguns

processos como: agregação plaquetária, adesão de leucócitos ao endotélio,

produção de endotelinas (peptídios com potente ação vasoconstritora) e causa

também variação na força de contração e na freqüência cardíaca (Nohl, 1993). O

NO é liberado quando ocorre: aumento do fluxo sangüíneo, aumento do estresse

de cisalhamento (

shear stress), aumento da pressão sangüínea arterial,

provocando então o relaxamento do vaso. Assim, podemos ver que o tônus

vasodilatador depende do NO que é regulado localmente, sendo este um

mecanismo de adaptação local que contribuirá para manter a pressão arterial

dentro de valores normais.

O estrogênio pode interferir positivamente nos mecanismos reguladores do

tônus vascular, promovendo cárdio-proteção. A cárdio-proteção estrogênio-

dependente é mediada em parte pela inibição da oxidação de lipoproteínas de

baixa densidade (LDL), pelo aumento da atividade das enzimas antioxidantes e

pela síntese aumentada de NO. Várias observações dão suporte a esta última

suposição:

1) O NO está relacionado com várias ações cardioprotetoras como, por exemplo,

vasodilatação, inibição da agregação plaquetária e crescimento de células do

músculo liso vascular (Dubey, 1994; Dubey et al., 1995; Aslan et al., 2001);

2) O tratamento de células endoteliais em cultura com 17

 - estradiol estimula a

atividade da NOS constitutiva (Hishikawa et al., 1995);

3) Anéis de aorta retirados de fêmeas liberam mais NO do que o dos machos e

esta maior liberação está correlacionada com os níveis circulantes de estradiol

(Hayashi et al., 1992);

4) O bloqueio farmacológico da eNOS atenua a vasodilatação da circulação

uterina induzida por estradiol (Van-Buren et al., 1992). Em humanos, os níveis

circulantes de NO aumentam com o desenvolvimento folicular e se correlacionam

com os níveis de 17 - estradiol (Rosseli et al., 1994).

Embora existam indicações claras de que a função endotelial está alterada

pelo estrogênio, os efeitos sobre o tônus vascular e conseqüentemente sobre a

pressão arterial e a freqüência cardíaca, dependem da concentração do

estrogênio, tempo e via de administração.

1.3 HOMOCISTEÍNA

Estudos têm demonstrado que a proteção antioxidante dada pelo

estrogênio pode diminuir a oxidação da homocisteína.

A homocisteína é um metabólito importante gerado no metabolismo do

aminoácido (aa) metionina, sendo que as maiores vias do metabolismo da

homocisteína ocorrem nos rins e no fígado (Figura 2A). Possui duas rotas

essenciais: a transmetilação catalisada pela metionina sintase e a transulfuração

catalisada pela cistationina

 sintase que formará cistationina e posterior

conversão à cisteína, um precursor da glutationa (GSH). A importância desta

segunda via é manter o “pool” intracelular de GSH e a sua regulação sob

condições de estresse oxidativo. Alterações no processo de transulfuração, que

usa a vitamina B

como co-fator, podem comprometer a capacidade tampão redox

celular relacionada com a patofisiologia de diferentes distúrbios relacionados com

a homocisteína (Andersson et al., 2000; Dimitrova et al., 2002a).

No ciclo da remetilação, a homocisteína regenera a metionina. Essa

transformação depende da aquisição de um grupo metil numa reação catalisada

pela metionina sintase (Figura 2A). A vitamina B

(cobalamina) é um co-fator

essencial para o funcionamento dessa enzima. O ácido fólico é outro elemento

essencial na via de remetilação, pois ele é o elemento essencial do ciclo do folato,

responsável pela conversão da homocisteína em metionina através da enzima

metionina sintase. A deficiência do folato está correlacionada com o

desenvolvimento de aterosclerose e com doença vascular cerebral e cardíaca

(Title et al., 2000; Dimitrova et al., 2002a). O tratamento com folatos e vitaminas

do complexo B (B

e B

) pode interromper o crescimento da área da placa

aterosclerótica em pacientes com concentrações elevadas de homocisteína

(Tavares et al., 2000). Deficiências de folato, vitamina B

ou B

podem levar à

descompensação do metabolismo da homocisteína e à hiperhomocisteinemia.

Autooxidação Estresse oxidativo indireto

eNOS desacoplada

Xantina oxidase

diminuição da atividade das enzimas antioxidantes

depleção de glutationa

NAD(P)H oxidase

Oxidação do óxido

nítrico induz disfunção

endotelial

Figura 2: A - Hcy é gerada em um ciclo através da S-adenosilmetionina (SAM) e S-

adenosilhomocisteína (SAH). A remetilação da Hcy revertida a metionina é realizada pela vit

, dependente de metionina sintase. Hcy é também convertida à cisteína através da via de

transulfuração, iniciada pela vit B

dependente de cistationina -sintase. O ciclo do folato gera

5-metiltetrahidrofolato (CH

THF) para a remetilação da Hcy. THF- tetrahidrofolato, CH

THF- 5-

10-metilenotetrahidrofolato, SO

-2

-ânion sulfato (adaptado de Jacobsen, 1998). B - Mecanismo

de geração de EAO pela Hcy. A auto-oxidação produz H

, efeitos oxidativos indiretos geram

superóxido. Estes na presença de metais de transição geram o radical hidroxil. O radical

hidroxil promove a lipoperoxidação e diminuindo a biodisponibilidade do NO produzindo o

peroxinitrito. (adaptado de Dayal, 2002)

Homocisteína

Metionina

Cistationina

Cisteína

Vit B

Cistationina



sintase

+ H

urina

Transulfuração

Vit B

Remetilação

THF

Ciclo do

folato

Metionina

sintase

Hiperhomocisteinemia

Dano oxidativo

Lesão vascular

SAM

SAH

Glutationa

Concentrações elevadas de homocisteína estão associadas com o

aumento do risco de aterosclerose e trombose, por isso a hiperhomocisteinemia é

considerada um fator de risco independente no desenvolvimento de trombose

arterial e venosa (Signorello et al., 2002).

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos

sulfurados causado por uma severa deficiência na atividade da cistationina

-

sintase, caracterizada por um acúmulo de homocisteína e metionina, resultando

em alterações principalmente no sistema nervoso central e sistema vascular. Tem

sido demonstrado que este distúrbio leva a um aumento no dano celular pela

formação do ânion radical superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxil

que podem ser gerados diretamente pelo processo de auto-oxidação da

homocisteína (Figura 2B). As EAO geradas durante a oxidação da homocisteína

podem ser iniciadoras de lipoperoxidação, podendo levar a uma lesão oxidativa

do endotélio (Figura 2B) (Signorello et al., 2002).

Em 1969, McCully fez uma observação clínica ligando concentrações

plasmáticas elevadas de homocisteína com doença vascular. Relatou trombose

arterial extensa e aterosclerose grave em duas autópsias de crianças com

concentrações elevadas de homocisteína plasmática e homocistinúria. Com base

nessas observações, propôs que níveis elevados de homocisteína poderiam

causar doença vascular aterosclerótica (McCully, 1969). A teoria de McCully da

aterosclerose foi pela primeira vez comprovada na prática clínica por Wilcken e

Wilcken em 1976, que compararam níveis de homocisteína em pacientes com

doença vascular aterosclerótica com controles (Wilcken & Wilcken, 1976).

Estudos sugerem um papel realmente importante para a homocisteína no

desenvolvimento de doença vascular, pois ela pode promover oxidação do LDL-

colesterol, proliferação de células musculares lisas, ativação de plaquetas e

fatores de coagulação, e disfunção endotelial. Portanto, alterações no

metabolismo da homocisteína têm papel potencial na patogênese da

aterosclerose (Kuller & Evans, 1998; Kanani et al., 1999; Cole, 2001).

Boushey e colaboradores, sumarizaram num artigo de revisão um grande

número de evidências convincentes, associando níveis elevados de homocisteína

e doença vascular. Baseados nos dados da literatura, concluíram que o aumento

de 5

moL/L nos níveis de homocisteína total conferia o mesmo aumento de risco

para doença vascular que um aumento de 20mg/dL nos níveis de colesterol total

(Boushey et al., 1995).

A disfunção endotelial pode ser a causa básica para a ação pró-aterogênica

associada à hiperhomocisteinemia, e é manifestada pelo prejuízo na regulação do

tônus vascular, do fluxo sangüíneo e perda da função antitrombótica das células

endoteliais (Weiss et al., 2000; Sydow & Boger, 2001).

A homocisteína possui um grupo sulfidril reativo (-SH), que pode sofrer

oxidação a dissulfeto (RSSR), como demonstrado na reação 9, em pH fisiológico

na presença de oxigênio (Jacobsen, 2000).

2 RSH + O

 RSSR + [O

-

]  H

Reação 9: Exemplo de reação global de oxidação.

A produção de radicais livres durante a oxidação da homocisteína favorece

a disfunção endotelial. Quando adicionada ao plasma, a homocisteína é

rapidamente auto-oxidada, originando homocistina e homocisteína tiolactona, bem

como espécies ativas de oxigênio consideradas citotóxicas, tais como o

superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxil. Foi demonstrado ainda que

a homocisteína diminui a expressão e inibe a atividade da glutationa peroxidase

pelas células endoteliais, favorecendo a peroxidação lipídica (Domagala et al.,

1998; Welch & Loscalzo, 1998; Lawrence de Koning et al., 2003).

A hiperhomocisteinemia estimula a proliferação de células musculares lisas

pela inativação do óxido nítrico a partir dos peróxidos lipídicos produzidos pela

oxidação da homocisteína, gerando peroxinitrito, que deixa o endotélio mais

vulnerável aos danos promovidos pela homocisteína (Welch et al., 1997;

Domagala et al., 1998; Lawrence de Koning et al., 2003).

Romerio e colaboradores sugerem que o peroxinitrito, um potente oxidante,

gerado pela oxidação do NO pelo ânion superóxido, este produzido pela auto-

oxidação da homocisteína, é o principal mediador da lipoperoxidação na

hiperhomocisteinemia (Romerio et al., 2004). Outro estudo mostra que a

lipoperoxidação causada pela homocisteína é dependente do superóxido, mas

não do peróxido de hidrogênio (Heydrick et al., 2003).

Um outro possível mecanismo pelo qual a hiperhomocisteinemia pode

promover a aterogênese é por meio da redução da biodisponibilidade do óxido

nítrico, um potente agente antiagregante que exerce um importante papel na

regulação da função plaquetária. Ou ainda porque a hiperhomocisteinemia leva a

uma diminuição do transporte de arginina, importante para a biossíntese do óxido

nítrico (Domagala et al., 1998; Leoncini et al., 2003; Becker et al., 2005).

Outros estudos sugerem que o endotélio vascular, em pacientes com

deficiência de cistationina

-sintase, tem maior susceptibilidade para o dano

induzido pela homocisteína, e que esta induz a proliferação celular além de

impedir a regeneração do dano da célula endotelial (Dimitrova et al., 2002b). O

potencial da homocisteína produzir doença vascular está ligado quer à ação direta

desta sobre o endotélio e o sistema de agregação-coagulação, quer à ação

indireta sobre outros mediadores de aterosclerose, como oxidação do colesterol

LDL e efeito mitogênico no músculo liso da parede vascular (Tsai et al., 1996).

A homocisteína também causa dano diretamente na matriz vascular, por

afetar a função bioquímica e biossintética das células vasculares, além de

aumentar a lipoperoxidação e a formação de oxicolesterol altamente aterogênico

(Kanani et al., 1999).

Pacientes com hiperhomocisteinemia têm uma piora na vasodilatação

dependente do endotélio, enquanto a vasodilatação independente do endotélio

não é afetada significativamente. Podendo este resultado ser relacionado com o

dano oxidativo causado pela homocisteína na parede do vaso, uma vez que foi

demonstrado em estudos “in vitro” que a homocisteína aumenta o estresse

oxidativo (Virdis et al., 2001).

As propriedades vasodilatadoras das células endoteliais normais ficam

afetadas pelo excesso de homocisteína, devido principalmente à diminuição do

óxido nítrico, pelo aumento do ânion superóxido (Virdis et al., 2001).

Estudos demonstraram que altas concentrações de estrogênio, utilizado

em terapia de reposição hormonal, estão associadas com um decréscimo na

concentração sérica de homocisteína (Dimitrova et al., 2002a). Considerando que

o estrogênio já está descrito amplamente como um antioxidante não enzimático,

envolvido na proteção cardiovascular e visto que este possui influência no

metabolismo da homocisteína, o presente estudo visa elucidar alterações

bioquímicas e fisiológicas desta interação.

2. HIPÓTESE

Sendo que a hiperhomocisteinemia está associada com o aumento do

estresse oxidativo e que os estrogênios apresentam propriedades antioxidantes, o

presente estudo busca testar a hipótese de que a retirada dos estrogênios poderia

alterar o perfil oxidativo e, assim, piorar a disfunção endotelial e miocárdica

promovida pela homocisteína em ratas.

3. OBJETIVO GERAL

Avaliar primeiramente o efeito de substâncias acumuladas na

homocistinúria sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em coração de

ratos jovens e adultos. Em adição, avaliar o efeito da hiperhomocisteinemia,

aguda e crônica, sobre parâmetros de estresse oxidativo e também parâmetros

hemodinâmicos em ratas adultas na presença ou ausência de estrogênio.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Homocistinúria – ratos jovens e adultos

1) Verificar o estresse oxidativo através das medidas de LPO, dosagem de

carbonilas, atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GST, em

coração de ratos submetidas ao modelo experimental de homocistinúria.

2) Verificar o efeito do folato sobre parâmetros oxidativos em coração de ratos

submetidas ao modelo experimental de homocistinúria.

 Hiperhomocisteinemia aguda – ratas adultas castradas

1) Verificar o efeito da hiperhomocisteinemia sobre o estresse oxidativo através

das medidas de LPO, carbonilas, capacidade antioxidante total, atividade das

enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GST, em coração e aorta de ratas

submetidas ou não a castração.

2) Verificar o efeito sistêmico da hiperhomocisteinemia sobre o estresse oxidativo

através das medidas de LPO, capacidade antioxidante total, atividade das

enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GST, em sangue de ratas

submetidas ou não a castração.

3) Avaliar o metabolismo do NO através de seus metabólitos nitritos e nitratos,

em coração e plasma de ratas submetidas ou não a castração.

4) Avaliar os seguintes parâmetros hemodinâmicos: pressão arterial média e

freqüência cardíaca

 Hiperhomocisteinemia crônica – ratas adultas castradas

1) Verificar o efeito da hiperhomocisteinemia sobre o estresse oxidativo através

das medidas de LPO, carbonilas, atividade das enzimas antioxidantes SOD,

CAT, GPx e GST, em coração de ratas submetidas ou não a castração.

2) Avaliar o metabolismo do NO através de seus metabólitos nitritos e nitratos,

em coração de ratas submetidas ou não a castração.

3) Avaliar os seguintes parâmetros relativos à mecânica cardíaca: freqüência

cardíaca, pressão ventricular esquerda sistólica, pressão ventricular esquerda

diastólica, primeira derivada temporal positiva da pressão (+dP/dt), a primeira

derivada temporal negativa da pressão (-dP/dt) e hipertrofia cardíaca.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS

Para este estudo foram utilizadas ratos Wistar machos e fêmeas

provenientes do Biotério do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Os animais foram mantidos em caixas plásticas com medidas de 270 x 260

x 310 mm, sendo quatro animais por caixa. Todos os animais foram mantidos em

ambiente com temperatura controlada (21°C) e ciclo “claro-escuro” de 12 horas.

Água e ração comercial foram oferecidas “ad libitum”.

4.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS

Experimento 1:

Os animais foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais, n=8 por grupo:

Grupo1 - Controle

Grupo 2 - Homocisteína

Estes grupos com ratos imaturos (machos e fêmeas) receberam tratamento

crônico com homocisteína que iniciou no 6° dia de vida e terminou no 28° dia com

doses crescentes de homocisteína (i.p.): do 6° ao 13° dia, 0,3 mol/g de peso

corporal, do 14° ao 20° dia, 0,4 mol/g de peso corporal e do 21° ao 28° dia, 0,6

mol/g de peso corporal (Streck et al., 2002). Uma hora após a última dose os

animais foram mortos por decapitação.

Experimento 2:

Foram utilizados 30 ratos, divididos em 4 grupos:

Grupo I - Salina (n=8)

Grupo II - Folato (n=6)

Grupo III - Homocisteína (Hcy) (n=9)

Grupo IV - Folato + Hcy (n=7)

Protocolo de administração de Hcy e Folato em ratos Wistar:

Os animais receberam uma administração intraperitonial diária de ácido

fólico (5 mg/kg) (Lalonde et al., 1993) e/ou duas injeções diárias de Hcy (0,3-0,6

μmol/g p.c.) (Streck et al., 2002) do 6° ao 28º dia de vida. Os animais controles

receberam semelhantes volumes de salina. Aos 80 dias, os animais foram mortos

por decapitação.

Experimento 3:

Os animais foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais, n=8 por grupo:

Grupo I – NAIVE controle: (NAIVE: animais que não foram submetidos a

nenhum tipo de estresse cirúrgico) fêmeas intactas, nas quais foi administrada

solução salina nas mesmas condições da homocisteína.

Grupo II – NAIVE homocisteína: fêmeas intactas, submetidas ao tratamento com

homocisteína, conforme protocolo descrito posteriormente.

Grupo III – Sham controle: fêmeas submetidas à cirurgia fictícia de castração,

nas quais foi administrada solução salina.

Grupo IV – Sham homocisteína: fêmeas submetidas à cirurgia fictícia de

castração, submetidas ao tratamento com homocisteína.

Grupo V – Castrada controle: fêmeas castradas, nas quais foi administrada

solução salina.

Grupo VI – Castrada homocisteína: fêmeas castradas, submetidas ao

tratamento com homocisteína.

Estes grupos de ratas adultas foram castradas no 50° dia de vida e, após

uma semana de castração, receberam tratamento agudo com homocisteína

intraperitonial (0,6

mol/g peso) de 8 em 8 horas por 72 horas. Uma hora após a

última dose foram mortos por decapitação.

Experimento 4:

Foram utilizados 32 animais, sendo n=8 em cada grupo, distribuídos nos

seguintes grupos experimentais:

Grupo I – Sham controle: são fêmeas submetidas à cirurgia fictícia de castração,

e que receberam água “ad libitum”.

Grupo II – Castrada controle: são fêmeas castradas, e que receberam água “ad

libitum”.

Grupo III – Sham metionina: são fêmeas submetidas à cirurgia fictícia de

castração, submetidas ao tratamento com metionina.

Grupo IV – Castrada metionina: são fêmeas castradas, submetidas ao

tratamento com metionina.

Estes grupos de ratas foram castradas no 70° dia de vida e receberam

metionina na água de beber por 30 dias na dose de 1 g/kg/dia (Ungvari et al.,

1999; Hagar, 2002). Com controle diário da ingesta de água. Logo após o final do

tratamento os animais foram anestesiados e mortos por deslocamento cervical.

4.3 COLETA DE SANGUE

No experimento 2 e 3 o sangue foi coletado ao final do tratamento para

posteriores dosagens. O sangue dos animais foi coletado através de punção do

plexo venoso retro – orbital com um tubo de microhematócrito com uma das

extremidades quebrada em bisel (Halpern, 1951). Para isso, os animais foram

previamente anestesiados com éter etílico. Após a coleta, o sangue foi

centrifugado por 10 minutos a 3000 rpm em centrífuga refrigerada (Sorvall RC 5B

– Rotor SM 24), os eritrócitos e o plasma retirados. O plasma foi congelado em

freezer a -80ºC para posteriores dosagens de estresse oxidativo e hormônios. Os

eritrócitos foram lavados com soro fisiológico (NaCl 0,9%), novamente

centrifugados e aliquotados. Uma parte foi ressuspensa em soro para medida de

lipoperoxidação, ao restante foi adicionado uma solução de ácido acético 1mM e

sulfato de magnésio 4mM, e as amostras foram congeladas em frezeer a –80°C

para posteriores dosagens das enzimas antioxidantes.

4.4 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E PREPARAÇÃO DOS HOMOGENEIZADOS

Os animais foram mortos por decapitação nos experimentos 1, 2 e 3 e por

deslocamento cervical no experimento 4. Os corações, fígados e aortas foram

retirados. A aorta foi retirada, congelada em nitrogênio líquido e macerada, após

diluída em cloreto de potássio (KCl) 1,15% (5mL por g de aorta) e procedido da

mesma forma que para o tecido. Os corações e fígados foram pesados e

homogeneizados em ultra-Turrax em KCl 1,15% (5mL por g de tecido para

coração e 9mL por mg de tecido para fígado), fluoreto de fenil metil sulfonila

(PMSF) na concentração de 100 mmol/L em isopropanol (10L por mL de KCl

adicionado). A suspensão foi centrifugada a 3000 rpm por 10min em centrífuga

refrigerada (Sorvall RC %B – SM 24). O sobrenadante foi aspirado, separado em

alíquotas e congelado em freezer (–70°C), sendo utilizado posteriormente para as

análises bioquímicas (Llesuy et al., 1985).

4.5 CASTRAÇÃO (OVARIECTOMIA)

A castração foi realizada em ratas fêmeas com técnicas apropriadas e de

uso corrente em nosso laboratório. As fêmeas foram anestesiadas com quetamina

(90 mg/kg de peso do animal) e xilazina (10mg/kg de peso do animal), por via

intraperitoneal. Foi feita uma incisão na pele e tecido subcutâneo entre a última

costela e a coxa, a cerca de 1 cm da linha mediana. Após, uma segunda incisão

atingiu a camada muscular, abrindo a cavidade peritoneal. O ovário foi exposto,

efetuada uma ligadura abaixo da trompa uterina, retirado o ovário e suturada a

incisão da pele em planos separados, repetindo o procedimento no outro ovário

(Waynforth & Flecknell, 1992).

4.6 REGISTRO DA PRESSÃO ARTERIAL

4.6.1 CANULAÇÃO ARTERIAL

O procedimento cirúrgico bem como o cuidado pós-operatório, foram

baseados na descrição feita por Waynforth e Flecknell (1992). Um dia antes do

sacrifício dos animais, estes foram anestesiados novamente com quetamina (90

mg/Kg de peso corporal) e xilazina (10mg/Kg de peso corporal) e receberam

cateteres na artéria carótida, exteriorizados na região dorsal do pescoço. Os

cateteres foram confeccionados com tubos de Tygon PE-90, conectados a tubos

de polietileno PE-50 (Clay Adams, USA). A desobstrução das cânulas se deu

através da lavagem com heparina sódica (0,01 mL de Liquemine - Roche, 5000U)

em 0,1 ml de solução fisiológica de NaCl 0,9%, antes de cada registro de pressão.

A implantação das cânulas foi feita 24 horas antes da realização do registro de

pressão arterial.

4.6.2 REGISTRO E PROCESSAMENTO DE SINAL

Após as 72 horas de tratamento (experimento 3) foram feitos os registros

de pressão batimento-a-batimento nos animais acordados. Teve-se o cuidado de

mantê-los em local silencioso, evitando qualquer fator externo que interferisse na

medida da pressão. Era feita também uma adaptação, colocando-se os ratos na

sala onde eram feitos os registros uns 15 minutos antes. O tempo de registro da

pressão arterial (PA) e da freqüência cardíaca (FC) foi de 15 minutos.

Os registros foram adquiridos a partir da conexão da cânula, introduzida na

carótida, a um transdutor de pressão (P23Db, Gould-Statham, Oxford, CA, USA)

acoplado a um codificador de sinais Hewlett Packard (HP 8805) que se

encontrava ligado à placa analógico-digital CODAS (AT/MCA CODAS-DATAQ

Instruments, Inc., Akron, Ohion, USA) por um seletor de canais, em um

computador 486 (66 MHz e 8Mb RAM). A freqüência de amostragem para realizar

os registros de PA e FC foi de 2000 Hz. O programa utilizado (CODAS) permite

trabalhar diretamente com a onda de pulso, que é vista na tela do computador, e

os dados podem ser gravados em disco rígido. Neste mesmo programa, podem-

se executar cálculos a partir dos valores obtidos, assim é possível trabalhar com

valores de pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC) para cada

batimento. A FC é obtida a partir do inverso do período, entre um pico e outro,

multiplicado por 60 (segundos). Após gravados os sinais em disco rígido, gera-se

uma planilha que pode ser analisada em programa Excel for Windows, a partir da

qual se obtém valores de PAM e FC e seus respectivos gráficos, para cada

animal experimental registrado.

4.6.3 REGISTRO DAS PRESSÕES VENTRICULARES ESQUERDAS

Na quarta semana após o início do tratamento (experimento 4) os animais

foram pesados e anestesiados com uma mistura de cloridrato de quetamina (90

mg/Kg de peso corporal) e cloridrato de xilazina (10mg/Kg de peso corporal) por

via intraperitoneal. Foi utilizado, para a canulação do ventrículo esquerdo via

artéria carótida direita, um cateter de polietileno (PE50) conectado a um

transdutor de pressão (Strain-Gauge-Narco Biosystem Transducer RP-155,

Houston, Texas, USA) e acoplado a um amplificador de sinais (Pressure Amplifier

HP 8805C). O catéter foi inserido até o ventrículo e sua posição foi determinada

pela observação da onda característica de pressão ventricular. Após 5 minutos de

estabilização, foram registradas a pressão diastólica final do ventrículo esquerdo

(PDFVE), pressão sistólica ventricular esquerda (PSVE), freqüência cardíaca (FC)

e as derivadas positiva (+dP/dt  índice de contratilidade) e negativa (-dP/dt 

índice de relaxamento), expressas em mmHg/s. Os sinais analógicos foram

digitalizados (Windaq – Data Acquisition System) com taxa de amostragem de

2000 Hz (Li et al., 2000). A PSVE foi determinada utilizando-se o programa

comercial Windaq associado ao sistema de aquisição. Este programa permite a

detecção dos valores máximos e mínimos da curva de pressão, batimento a

batimento, fornecendo os valores de pressão ventricular. A PDFVE foi

determinada pela detecção manual do ponto de inflexão no traçado da onda de

pressão diastólica do ventrículo esquerdo. Foram realizadas 20 detecções por

registro.

4.7 DOSAGEM HORMONAL

O método utilizado para dosar os estrogênios foi de quimiluminescência

por imunoensaio competitivo. O aparelho utilizado para esta medida foi o

IMMUNOLITE 2000, com os seguintes reagentes: substrato quimiluminescente

dioxietano (L2SUBM), reagente estradiol Wedge (L2E2A2), que é constituído pela

combinação de estradiol com fosfatase alcalina e esferas recobertas com um

anticorpo altamente específico para o estradiol (L2E212). O método se baseia na

competição, pelo anticorpo específico para estradiol, das moléculas de hormônio

da amostra analisada com as moléculas do estradiol ligadas à fosfatase alcalina.

A quantidade absoluta de hormônio na amostra foi calculada através de

uma curva padrão. Esta curva é obtida pela incubação de quantidades variadas

de hormônio autêntico com quantidades idênticas de anticorpos e de hormônio

marcado. A dosagem hormonal foi realizada no Laboratório Weinmann.

4.8 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

As proteínas foram quantificadas pelo método descrito por Lowry e

colaboradores, em 1951, que utiliza como padrão uma solução de albumina

bovina na concentração de 1 mg/mL. A medida foi efetuada em espectrofotômetro

a 625 nm e os resultados expressos em mg/ml.

4.9 ANÁLISE DE NITRITOS+NITRATOS (NOX)

Os nitratos foram determinados como nitritos totais (nitrito inicial mais nitrito

reduzido a partir de nitratos) após sua redução usando nitrato redutase de

Aspergillus sp. na presença de NADPH. A concentração de nitritos foi

determinada usando o reagente de Griess, onde um agente cromóforo com forte

absorbância em 540 nm é formado pela reação do nitrito com uma mistura de

naftil-etilenodiamina (0,1%) e sulfonilamida (1%). A absorbância foi medida em

espectrofotômetro para dar a concentração de nitrito. Uma curva padrão foi

estabelecida com concentrações seriais de nitrito de sódio (10

-8

a 10

-3

mol/L). Os

resultados são expressos em M de NOx (Granger et al., 1999).

4.10 LIPOPEROXIDAÇÃO POR QUIMILUMINESCÊNCIA (QL)

O método consiste em adicionar um hidroperóxido orgânico de origem

sintética ao homogeneizado de tecido, avaliando-se a capacidade de resposta

produzida pela amostra. A realização deste tipo de teste consiste no fato de que

os hidroperóxidos são espécies químicas bastante instáveis, reagindo com lipídios

por um mecanismo radicalar que gera produtos que emitem luz pela amostra em

estudo. A quimiluminescência (QL) foi medida em contador beta (LKB Rack Beta

Liquid Scintilation Spectrometer. O meio de reação no qual foi realizado o ensaio

consistiu em 3,5 mL de uma solução reguladora de KCl 140mmol/L, fosfatos 20

mmol/L, (pH 7,4), na qual foi adicionado 0,5 mL de homogeneizado ou 10

L de

eritrócito diluído em soro fisiológico. Os resultados são expressos em contagens

por segundo (cps), por miligrama de proteína, segundo Gonzalez Flecha et al.,

1991.

4.11 SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS)

A técnica consiste em aquecer o material biológico a ser testado na

presença de ácido tiobarbitúrico, para medir espectrofotometricamente a

formação de um produto de coloração rósea. Para tanto, foi utilizada uma alíquota

de 0,25 mL de homogeneizado, à qual foram adicionados 0,75 mL de ácido

tricloroacético a 10%, que tem a função de desnaturar as proteínas presentes e

acidificar o meio de reação. Esta mistura foi, então, agitada e centrifugada durante

3 minutos a 1000g. Foram retirados 0,5 mL do sobrenadante e a este foram

adicionados 0,5 mL de ácido tiobarbitúrico 0,67%, que reagiu com os produtos da

lipoperoxidação formando um composto de coloração rosada. A mistura foi

incubada por 15 minutos a 100

C e resfriada. Em seguida, foi realizada a leitura

da absorbância a 535nm em espectrofotômetro. Utilizou-se padrão de

tetrametoxipropano. Os resultados são expressos em mol de malondialdeído

(MDA) por mg de proteína (Buege & Aust, 1978).

4.12 ANÁLISE DE CARBONILAS

A avaliação das carbonilas foi realizada de acordo com o método descrito

por Reznick & Packer (1994). Este método consiste na reação da

dinitrofenilhidrazina (DNPH) com as carbonilas das proteínas formando

hidrazonas que podem ser medidas espectrofotometricamente. É uma técnica

com alta reprodutibilidade podendo detectar níveis de carbonilas em vários

sistemas. Utilizada para medir dano à proteína, uma vez que carbonilas são

formadas a partir de quebras da ligação C-N dos aa que sofreram dano oxidativo.

O método consiste em incubar amostra de tecido ou plasma com 2,4

dinitrofenilhidrazina (DNPH 10 mmol/L) e 2.5mol/L HCl por 1h em temperatura

ambiente, no escuro. As amostras foram agitadas a cada 15 min e após foi

adicionado TCA 20% (p/v). A seguir ficaram no gelo por 10 min e em seguida

foram centrifugadas por 5 min a 1000 g, foi coletada a proteína precipitada. Essas

proteínas foram lavadas uma vez com TCA 10% e mais 3 vezes com

etanol:acetato de etila (1:1) (v/v). O precipitado final foi dissolvido em guanidina

6mol/L, em banho de 37ºC por 10 min, e lido a 360nm. Os resultados são

expressos em

mol de carbonilas por mg de proteína (Reznick and Parker, 1994).

4.13 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL (TRAP)

Este método é importante para avaliar a capacidade antioxidante total dos

fluidos biológicos e pode determinar a capacidade do sistema em resistir às

condições de estresse oxidativo. Ainda, valores diminuídos podem ser associados

a patologias promovidas por aumentadas concentrações de radicais livres.

O método consiste em incubar uma mistura de 2,2'-azo-bis(2-

amidinopropano) (ABAP - 10 mM), usado como uma fonte de radicais livres, com

luminol (10 µM) em tampão glicina (0,1 mM - pH 8,6). Esta mistura foi levada ao

contador e a luminescência surgiu da oxidação do luminol pelos radicais livres. A

adição de Trolox (vitamina E hidrossolúvel) reduziu quase que completamente a

emissão de luz, demonstrando um tempo de indução que está linearmente

relacionado com a concentração de Trolox. Foi elaborada uma curva de

calibração com Trolox nas concentrações de 0,2 à 1 µM. O homogeneizado de

tecido foi adicionado ao invés do Trolox e se observou um tempo de indução que

também está relacionado com a quantidade de homogeneizado adicionado. A

quantidade total de antioxidantes presente no tecido pode ser avaliada (em

unidades de Trolox) por interpolação da medida do tempo de indução na curva de

calibração obtida com o Trolox (Evelson et al., 2001).

4.14 GLUTATIONA S-TRANSFERASE (GST)

As glutationas transferases são um grupo de enzimas que catalisam

reações de conjugação de glutationa com vários xenobióticos, tendo um

importante papel na detoxificação de agentes alquilantes. Todas as transferases

são ativas com o composto 1 cloro-2,4 dinitro benzeno (CDNB), sendo a

conjugação deste com GSH utilizada para quantificar-se sua atividade. A

formação do composto corado dinitro-fenil-glutationa (DNP-SG), foi medida

espectrofotometricamente a 340nm. Para realização deste ensaio foram utilizados

850L de solução tampão fosfato de sódio 0,2mol/L (pH = 6,5), 50L de GSH,

50L de homogeneizado de tecido ou eritrócitos e 150L de CDNB (20mmol/L). A

atividade da GST foi expressa em mol/min/mg de proteína (Mannervik &

Gluthenberg, 1981).

4.15 GLUTATIONA PEROXIDASE (GPX)

A enzima GPx catalisa a reação de hidroperóxidos com a glutationa

reduzida (GSH) para formar glutationa oxidada (GSSG) e o produto da redução

do hidroperóxido. Logo, sua atividade pode ser determinada medindo-se o

consumo de NADPH na reação de redução acoplada à reação da GPx.

A amostra foi previamente preparada adicionando-se uma mistura de

cianetos para inibir a atividade pseudo-peroxidase da hemoglobina,

transformando-a em cianometaemoglobina. Mede-se então, a atividade da

glutationa peroxidase em espectrofotômetro a 340nm, em um meio de reação que

contém: solução tampão fosfato 140 mmol/L e EDTA 1mmol/L, (pH 7,5;), NADPH

0,24 mmol/L; azida sódica 1mmol/L, utilizada para inibir a atividade da catalase;

GSH 5 mmol/L; glutationa redutase (GR) 0,25 U/mL e, por fim, hidroperóxido de

tert- butil 0,5 mmol/L.

Na cubeta, foram adicionados 330L de tampão, 50L de homogeneizado

de tecido, 500L de NADPH, 10L de azida sódica, 50L de GSH e 10L de GR.

A absorbância foi registrada por aproximadamente 3 minutos. Foram adicionados

50L de hidroperóxido de tert-butil e a diminuição da absorbância, devido ao

consumo de NADPH, foi monitorada por um tempo médio de 5 minutos. Os

resultados são expressos em mol por minuto por mg de proteína, segundo Flohé

& Gunzler (1984).

4.16 SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD)

A técnica utilizada para determinação da SOD está baseada na inibição da

reação do radical superóxido com o pirogalol. O superóxido é gerado pela auto-

oxidação do pirogalol quando em meio básico. A SOD presente na amostra em

estudo compete pelo radical superóxido com o sistema de detecção. Dado que

não se pode determinar a concentração, nem a atividade da enzima em termos de

substrato consumido por unidade de tempo, utilizou-se a quantificação em

unidade relativa. A oxidação do pirogalol foi detectada espectrofotometricamente

a 420 nm. A atividade da SOD foi determinada medindo-se a velocidade de

formação do pirogalol oxidado. No meio de reação, foram utilizados 973

L de

tampão Tris 50mmol/L (pH 8,2), 8L de pirogalol 24mmol/L, 4L de catalase

30mol/L. O aumento na absorbância foi acompanhado a 420nm durante 2

minutos. Esta curva obtida foi utilizada como branco. Foi também feita uma curva

padrão utilizando três concentrações distintas de SOD (Sigma, 0,25U, 0,5U e 1U),

através da qual foi obtida a equação da reta para realização dos cálculos. Os

resultados são expressos em U SOD/mg proteína, segundo Marklund, 1985.

4.17 CATALASE (CAT)

A atividade da catalase é diretamente proporcional à taxa de decomposição

do peróxido de hidrogênio e obedece a uma cinética de pseudo-primeira ordem.

Sendo assim, sua atividade pode ser medida através da avaliação do consumo do

Este teste consiste em avaliar a diminuição da absorbância no

comprimento de onda de 240nm, que é onde ocorre maior absorção pelo peróxido

de hidrogênio. Para a realização deste ensaio foram utilizados uma solução

tampão fosfato a 50mmol/L (pH=7,4) e peróxido de hidrogênio 0,3mol/L.

Em cubeta de quartzo, foram adicionados 955

L do tampão fosfato e 10L

de amostra do tecido. A cubeta foi colocada em espectrofotômetro e descontada

contra um branco de tampão fosfato. Após, foram adicionados 35L do H

e foi

feito o monitoramento da diminuição da absorbância a 240nm. Os resultados são

expressos em mol por miligramas de proteína (Aebi, 1984).

4.18 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Com base nos resultados das análises, foram calculadas as médias e os

desvios padrões da média para cada uma das medidas realizadas e para cada

um dos grupos estudados. Para a comparação entre os grupos foi aplicada

análise de variância (ANOVA) de uma via, complementado com o teste de

Student-Newmann-Keuls. Para comparação entre 2 grupos foi utilizado teste t

Student para dados não pareados. Para as análises de correlações foi utilizado o

teste de Pearson.

As diferenças foram consideradas significativas quando a análise

estatística apresentou p  0,05. O software GraphPad Instat, versão 3.00 para

Windows, foi utilizado como ferramenta computacional para análise estatística dos

dados.

5. RESULTADOS

5.1 EXPERIMENTO 1:

Dois grupos de ratos jovens (28 dias). 1) grupo controle: ratos intactos com

salina e 2) grupo homocisteína: ratos intactos com homocisteína, que tiveram o

tratamento com homocisteína iniciado no 6° dia de vida e receberam tratamento

crônico com homocisteína nas seguintes doses:

6 - 13° dia: 0,3

mol/g de peso corporal.

14 - 20° dia: 0,4

mol/g

21 - 28° dia: 0,6 mol/g.

No 28° dia os animais foram mortos por decapitação. As medidas de

estresse oxidativo foram realizadas em homogeneizado de tecido cardíaco.

A LPO através da medida de quimiluminescência não apresentou diferença

significativa entre os grupos controle e homocisteína, como mostrado na figura 3.

Da mesma forma, a atividade da enzima antioxidante catalase (figura 4) também

é semelhante entre os grupos. Já as atividades das enzimas SOD e GST

apresentaram-se aumentadas no grupo homocisteína em relação ao controle; a

SOD apresentou um aumento de 24% (figura 5) e a GST de 38% (figura 6).

Controle Homocisteína

QL (cps/mg prot)*1000

Figura 3: Lipoperoxidação avaliada por quimiluminescência (em cps/mg prot) em

homogeneizado cardíaco (n=8/grupo).

Controle Homocisteína

Catalase (pmol/mg prot)

Figura 4: Atividade da catalase (em mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo).

Controle Homocisteína

SOD (U SOD/mg prot)

Figura 5: Atividade da SOD (em U/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). (*) P<0.05 quando comparado ao grupo controle. Utilizando

médiadpm e teste t-student.

Controle Homocisteína

GST (pmol/mg prot)

Figura 6: Atividade da GST (em mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). (*) P<0.05 quando comparado ao grupo controle. Utilizando

médiadpm e teste t-student.

5.2 EXPERIMENTO 2:

Os animais foram divididos em 4 grupos: (n=30)

I - Salina (n=8)

II - Folato (n=6)

III - Homocisteína (Hcy) (n=9)

IV - Folato + Hcy (n=7)

Protocolo de administração de Hcy e Folato em ratos Wistar:

Os animais receberam 1 administração intraperitonial diária de ácido fólico

(5 mg/Kg) (Lalonde et al., 1993) e/ou 2 injeções diárias de Hcy intraperitonial (0,3-

0,6

μmol/g p.c.) (Streck et al., 2002) do 6° ao 28º dias de vida. Os animais

controles receberam semelhantes volumes de salina. Aos 80 dias, os animais

foram mortos.

A LPO avaliada através do método de TBARS apresentou um aumento de

200% no grupo III em relação ao grupo I (

P<0.001). No grupo IV, os valores da

LPO foram restabelecidos a níveis semelhantes ao grupo I (figura 7).

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

I II III IV

TBARS (umol/mg prot)

Figura 7: Lipoperoxidação avaliada por TBARS (mol/mg prot) em

homogeneizado cardíaco. (*) P<0,001 quando comparado aos demais grupos.

Utilizando médiadpm e ANOVA. I = salina (n=8), II = folato (n=6), III =

homocisteína (n=9), IV = folato + homocisteína (n=7).

O dano à proteína foi avaliado pela técnica de dosagem de carbonilas.

Observamos na figura 8 um dano 50% maior no grupo III quando comparado ao

grupo I (

P=0,002). E, novamente, o grupo que recebeu folato (IV) restabeleceu os

valores a níveis semelhantes ao grupo I.

I II III IV

carbonilas (nmol/mg prot)

Figura 8: Análise de carbonilas (proteínas oxidadas) (mol/mg prot) em

homogeneizado cardíaco. (*) P<0,002 quando comparado aos demais grupos.

Utilizando médiadpm e ANOVA. I = salina (n=8), II = folato (n=6), III =

homocisteína (n=9), IV = folato + homocisteína (n=7).

As atividades enzimáticas antioxidantes avaliadas foram a catalase, SOD e

GST. Na figura 9, observa-se que a catalase teve sua atividade aumentada em

300% no grupo III quando comparada aos demais grupos (

P<0,001).

I II III IV

CAT (pmol/mg prot)

Figura 9: Atividade da catalase (mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco.

(*)

P<0,001 quando comparado aos demais grupos. Utilizando médiadpm e

ANOVA. I = salina (n=8), II = folato (n=6), III = homocisteína (n=9), IV = folato +

homocisteína (n=7).

Quando correlacionamos a lipoperoxidação, avaliada pelo método TBARS,

com a atividade da enzima catalase observamos uma importante correlação

positiva (r=0,7678; p0,0001). Mostrando que os animais que tiveram aumento de

lipoperoxidação apresentaram a atividade da catalase aumentada (figura 10).

0 20 40 60 80

0.0

0.5

1.0

1.5

tbars (umol/mg prot)

catalase (pmol/mg prot)

Figura 10: Correlação entre o TBARS (mol/mg prot) e a atividade da Catalase

(mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco. (r=0,7678; p



0,0001)

A SOD teve sua atividade diminuída em 22% no grupo III e 20% no grupo

IV quando comparada ao grupo I (P<0,05). Mostrando que a Hcy reduz a

atividade da SOD e o tratamento com folato não restabelece a atividade desta

enzima (figura 11).

I II III IV

SOD (U/mg prot)

Figura 11: Atividade da SOD (U/mg prot) em homogeneizado cardíaco.

(*) P<0,05 quando comparado ao grupo I. Utilizando médiadpm e ANOVA.

I = salina (n=8), II = folato (n=6), III = homocisteína (n=9), IV = folato + hcy (n=7).

Já a atividade da enzima antioxidante GST apresentou um aumento de

80% no grupo III quando comparada aos demais grupos (P<0,002). Ou seja, o

tratamento com folato (grupo IV) reverteu o aumento da atividade da GST

causado pela Hcy (figura 12).

I II III IV

GST (pmol/mg prot)

Figura 12: Atividade da GST (mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco.

(*) P<0,002 quando comparado aos demais grupos. Utilizando médiadpm e

ANOVA. I = salina (n=8), II = folato (n=6), III = homocisteína (n=9), IV = folato +

hcy (n=7).

5.3 EXPERIMENTO 3:

Os animais (ratas 50 dias) foram distribuídos nos seguintes grupos

experimentais (n=8/grupo):

Grupo I - NAIVE controle: intactas, recebendo solução salina.

Grupo II - NAIVE Hcy: intactas, tratadas com homocisteína.

Grupo III - Sham controle: submetidas à cirurgia fictícia de castração, recebendo

solução salina.

Grupo IV - Sham Hcy: submetidas à cirurgia fictícia de castração, tratadas com

homocisteína.

Grupo V – Castrada controle: castradas, recebendo solução salina.

Grupo VI - Castrada Hcy: castradas, tratadas com homocisteína.

Estes grupos de ratas adultas foram castradas no 50° dia de vida e

receberam tratamento agudo com homocisteína (0,6

mol/g peso) de 8 em 8

horas por 72 horas e foram mortos 1 hora após a última injeção.

Dosagem Hormonal:

Os hormônios foram medidos para que houvesse uma avaliação da

variação hormonal após a castração. Para isso, foram medidos os níveis de 17-

estradiol.

Os níveis hormonais foram avaliados (em pg / mL) no plasma. Observou-se

significativa redução dos níveis de 17-estradiol no grupo castrado em relação ao

controle (Figura 13). Os níveis de 17-estradiol foram 53% menores no grupo III

(14,31,1) em relação ao grupo V (30,7  2,8).

III V

17B-estradiol (pg/mL)

Figura 13: Dosagem de 17 -estradiol (em pg/mL) em plasma. III - Sham Controle

(n=6) e V - castrada controle (n=6).

(*) P<0,001 quando comparado ao grupo controle (III). Utilizando médiadpm e

test t student.

Pressão Arterial Média e Freqüência Cardíaca:

Observamos uma diferença significativa na pressão arterial média (mmHg)

quando comparamos o grupo VI com o grupo V, mostrando que a Hcy, na

ausência de estrogênio, aumenta a PAM. Já a freqüência cardíaca (bpm) não

apresentou diferenças significativas entre os grupos estudados (Tabela 1).

Tabela 1: Pressão arterial média (mmHg) e freqüência cardíaca (bpm) I - NAIVE

controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham Hcy, V - Castrada controle

e VI – Castrada Hcy. (n=4/grupo)

I II III IV V VI

PAM

84,32,8 85,53,8 84,33,5 91,23,3 85,03,0 96,22,2*

33720 36624 35724 36134 35225 38720

(*) P<0.05 quando comparamos o grupo VI ao grupo V (teste t student).

5.3.1 CORAÇÃO:

A análise dos metabólitos do NO em tecido cardíaco apresentou-se

aumentada no grupo VI em relação ao grupo I (67%), IV (21%) V (45%),

observado na figura 14, os demais grupos não apresentaram diferenças

significativas.

I II III IV V VI

NOx (uM)

Figura 14: Nitratos+Nitritos (M) em homogeneizado cardíaco (n=8/grupo).

I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham Hcy, V -

Castrada controle e VI – Castrada Hcy.

(*) P<0,05 quando comparado aos grupos I, IV e V. Utilizando médiadpm e

ANOVA.

Quando comparamos os níveis de nitratos com a pressão arterial

observamos uma correlação positiva (r=0,7565; p0,0001). Mostrando que os

animais que tiveram níveis aumentados de nitratos também apresentaram

aumento na pressão arterial (figura 15).

0 5 10 15

100

110

PAM (mmHg)

nitrato (uM)

Figura 15: Correlação entre os níveis de nitratos (M) e pressão arterial média

(mmHg) em homogeneizado cardíaco. (r=0,7565; p



0,0001), foram utilizados os

24 animais que tinham registro de pressão.

A LPO apresentou-se aumentada no grupo VI em relação aos grupos

II (40%), IV (48%) e V (70%), como mostra a figura 16, os demais grupos

estudados não apresentaram diferenças significativas entre si.

I II III IV V VI

QL (cps/mg prot) *1000

Figura 16: Lipoperoxidação avaliada por quimiluminescência (cps/mg prot) em

homogeneizado cardíaco (n=8/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III -

Sham Controle, IV - Sham Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy.

(*) P<0,05 quando comparado aos grupos II, IV e V. Utilizando médiadpm e

ANOVA.

Observamos uma correlação positiva (r=0,8498; p0,0001) entre a

quimiluminescência e a PAM , demostrando que os animais que tiveram aumento

da lipoperoxidação foram os mesmos que apresentaram a pressão arterial

elevada. Sugerindo que o aumento da pressão pode estar sendo provocado pelas

EAO (figura 17).

60 70 80 90 100 110

QL*1000 (cps/mgprot)

PAM (mmHg)

Figura 17: Correlação entre quimiluminescência (cps/mg prot) e pressão arterial

média (mmHg) em homogeneizado cardíaco.

(r=0,8498; p



0,0001), foram

utilizados os 24 animais que tinham registro de pressão.

Na figura 18, observamos que a oxidação de proteínas, avaliada pelo

método das carbonilas, não houve diferenças significativas na oxidação de

proteínas entre os grupos estudados.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

I II III IV V VI

carbonilas (mmol/mg prot)

Figura 18: Análise de carbonilas (mmol/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham

Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy.

A capacidade antioxidante total, avaliada pela técnica do TRAP (figura 19),

apresentou-se diminuída no grupo VI em relação aos grupos II (74%), IV (52%) e

V (50%).

I II III IV V VI

TRAP (uM Trolox/mg prot)

Figura 19: Análise do TRAP (M trolox/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham

Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy. (*) P<0,05 quando comparado

aos grupos II, IV e V. Utilizando médiadpm e ANOVA.

A atividade da enzima GST diminuiu no grupo VI em relação aos grupos

II (60%), IV (74%) e V (74%), figura 20.

I II III IV V VI

GST (pmol/mg prot)

Figura 20: Atividade da GST (mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham

Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy. (*) P<0.05 quando comparado

aos grupos II, IV e V. Utilizando médiadpm e ANOVA.

Aqui também observamos uma correlação negativa (r=0,6520; p0,0006)

entre a atividade da enzima GST e a lipoperoxidação. Mostrando que os animais

que tiveram aumento de lipoperoxidação apresentaram a GST diminuída (figura

21).

0 10 20 30 40

QL*1000 (cps/mgprot)

GST(pmol/mg prot)

Figura 21: Correlação entre quimiluminescência (cps/mg prot) e a atividade da

GST (mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco. (r=0,6520; p



0,0006)

A atividade de enzima antioxidante GPx diminuiu no grupo VI em relação

ao grupo V (40%). Em relação aos demais grupos, não houve diferenças

significativas (figura 22).

I II III IV V VI

GPx (nmol/min/mgprot)

Figura 22: Atividade da GPx (mol/min/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham

Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy.

(*) P<0,05 quando comparado ao grupo V. Utilizando médiadpm e ANOVA.

As enzimas SOD e CAT não apresentaram diferenças significativas nas

suas atividades entre os grupos estudados (tabela 2).

Tabela 2: Atividade das enzimas SOD (U/mg prot) e catalase (mol/mg prot) em

homogeneizado cardíaco (n=8/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III -

Sham Controle, IV - Sham Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy.

SOD CAT

9,901,72 26,503,16

12,041,25 28,922,16

III

17,193,84 27,593,97

12,291,33 29,292,60

15,213,51 23,742,90

10,320,91 34,064,32

5.3.2 AORTA:

A atividade da enzima GST em aorta diminuiu no grupo VI em relação aos

grupos II (54%) e IV (59%). Já os grupos II e IV apresentaram-se aumentados em

relação aos seus respectivos controles I (93%) e III (137%). O grupo VI não diferiu

do seu grupo controle V (figura 23).

I II III IV V VI

GST (pmol/mg prot)

Figura 23: Atividade da GST (mol/mg prot) em homogeneizado de aorta

(n=6/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham

Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy. Utilizando médiadpm e ANOVA.

(*) P<0,05 quando comparado aos grupos II e IV.

(#) P<0,05 quando comparado ao grupo III.

(¥) P<0,05 quando comparado ao grupo I.

A atividade da enzima antioxidante GPx aumentou no grupo VI em relação

ao grupo II (100%); o grupo IV também apresentou-se aumentado em relação ao

grupo II (70%). O grupo V apresentou-se aumentado em relação ao grupo I (82%)

(figura 24).

I II III IV V VI

GPx (nmol/min/mg prot)

Figura 24: Atividade da GPx (mol/min/mg prot) em homogeneizado de aorta

(n=6/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham

Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy. Utilizando média

dpm e ANOVA.

(*)

P<0,05 quando comparado ao grupo II.

(¥) P<0,05 quando comparado ao grupo I.

5.3.3 SANGUE:

A análise dos metabólitos de NO em plasma, figura 25, apresentou-se

diminuída no grupo VI em relação ao grupo V (40%), os demais grupos não

apresentaram diferenças significativas.

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

I II III IV V VI

NOx (uM)

Figura 25: A – Nitratos+Nitritos (M) em plasma (n=8/grupo). I - NAIVE controle, II

- NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham Hcy, V - Castrada controle e VI –

Castrada Hcy.

(*) P<0,05 quando comparado ao grupo V. Utilizando médiadpm e ANOVA.

A LPO apresentou-se diminuída no grupo VI em relação aos grupos IV

(43%) e V (42%). O grupo II também se apresentou diminuído em relação ao

grupo I (33%). Os demais grupos estudados não apresentaram diferenças

significativas entre si (figura 26).

100

150

200

250

300

350

400

450

I II III IV V VI

QL (cps/mg prot)

Figura 26: Lipoperoxidação avaliada por quimiluminescência (cps/mg prot) em

eritrócitos (n=8/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV -

Sham Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy. Utilizando média

dpm e

ANOVA.

(*) P<0,05 quando comparado aos grupos IV e V.

(#) P<0,05 quando comparado ao grupo I.

A atividade da enzima GST diminuiu no grupo VI em relação ao grupo II

(58%) (figura 27), no entanto não apresentou diferença significativa com os

demais grupos. As enzimas antioxidantes SOD e CAT não apresentaram

diferenças significativas nas suas atividades entre os grupos estudados (tabela 3).

I II III IV V VI

GST (pmol/mg prot)

Figura 27: Atividade da GST (mol/mg prot) em eritrócitos (n=8/grupo). I - NAIVE

controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV - Sham Hcy, V - Castrada controle

e VI – Castrada Hcy.

(*) P<0,05 quando comparado ao grupo II. Utilizando médiadpm e ANOVA.

Tabela 3: Atividade das enzimas SOD (U/mg prot) e catalase (mol/mg prot) em

eritrócitos (n=8/grupo). I - NAIVE controle, II - NAIVE Hcy, III - Sham Controle, IV -

Sham Hcy, V - Castrada controle e VI – Castrada Hcy.

SOD CAT

12,883,01 11,180,67

11,151,60 15,252,48

III

11,531,64 15,732,30

16,352,33 12,862,73

10,732,02 19,222,73

17,822,48 19,541,84

5.4 EXPERIMENTO 4:

Os animais (ratas de 70 dias) foram distribuídos nos seguintes grupos

experimentais (n=8/grupo):

Grupo I – Sham controle: fêmeas submetidas à cirurgia fictícia de castração e

que receberam água “ad libitum”.

Grupo II – Castrada controle: fêmeas castradas e que receberam água “ad

libitum”.

Grupo III – Sham metionina: fêmeas submetidas à cirurgia fictícia de castração,

submetidas ao tratamento com metionina.

Grupo IV – Castrada metionina: fêmeas castradas, submetidas ao tratamento

com metionina.

Estes grupos de ratas adultas foram castradas no 70° dia de vida e

receberam metionina na água de beber por 30 dias na dose de 1 g/kg/dia

(Ungvari et al., 1999; Hagar, 2002). Ao final do tratamento foram anestesiadas,

canuladas, para análise da hemodinâmica cardíaca, e mortas por deslocamento

cervical.

Hemodinâmica Cardíaca:

Nestes animais, foi avaliada a pressão intraventricular esquerda e, na

tabela 4, observamos os seguintes parâmetros: pressão diastólica final no

ventrículo esquerdo (PDFVE), pressão sistólica ventrículo esquerdo (PSVE),

derivada positiva (+dP/dt), derivada negativa (-dP/dt), freqüência cardíaca (FC) e

hipertrofia cardíaca (HC). Observamos, na figura 28, que a PDFVE apresentou-se

aumentada no grupo IV em relação aos grupos I (108%), II (116%) e III (51%). Os

demais grupos não apresentaram diferenças significativas entre si.

Tabela 4: pressão diastólica final no ventrículo esquerdo (PDFVE em mmHg),

pressão sistólica ventrículo esquerdo (PSVE em mmHg), derivada positiva (+dP/dt

em mmHg/s), derivada negativa (-dP/dt em mmHg/s), freqüência cardíaca (FC em

bpm) e hipertrofia cardíaca (HC em mg/g). I - Sham controle, II - Castrada

controle, III - Sham metionina, IV - Castrada metionina. (n=8/grupo)

PDFVE PSVE -dP/dt +dP/dt FC HC

8,49±1,56 136±9 -6014±332 7290±388 228±6 2,59±0,12

8,20±1,43 129±6 -6763±132 6967±267 229±15 2,68±0,11

III

12,29±1,17 121±4 -5425±328 6484±494 216±12 2,88±0,14

18,55±1,46*

132±8 -5472±406 6725±223 233±9 2,68±0,13

(*) P<0,05 quando comparado aos grupos I, II e III. Utilizando médiadpm e

ANOVA.

I II III IV

PDFVE (mmHg)

Figura 28: Pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) em mmHg

(n=8/grupo) I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina.

(*) P<0,05 quando comparado aos grupos I, II e III. Utilizando médiadpm e

ANOVA.

5.4.1 CORAÇÃO:

A análise dos nitritos + nitratos em tecido cardíaco apresentou-se diminuída

no grupo IV em relação ao grupo I (40%), II (36%), III (33%), observado na figura

29.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

I II III IV

NOx (uM)

Figura 29: Nitratos+Nitritos (M) em homogeneizado cardíaco (n=8/grupo). I -

Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV - Castrada

metionina.

(*) P<0,05 quando comparado aos grupos I, II e III. Utilizando médiadpm e

ANOVA.

Observamos também que houve uma correlação negativa (r=0,8708;

p0,0001) entre a PDFVE e os metabólitos de NO, mostrando que os animais que

tiveram aumento de pressão ventricular apresentaram uma menor

biodisponibilidade do NO (figura 30).

0.0 0.5 1.0 1.5

PDFVE (mmHg)

NOx (uM)

Figura 30: Correlação entre PDFVE (mmHg) e a NOx (M) em homogeneizado

cardíaco.

(r=0,8708; p



0,0001)

A LPO avaliada pelo método das substâncias reativas ao ácido tio-

barbitúrico (TBARS) apresentou-se aumentada no grupo IV em relação aos

grupos I (200%), II (92%) e III (103%), como mostra a figura 31. Observamos

ainda um aumento na LPO no grupo II em relação ao grupo I (50%).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

I II III IV

TBARS (umol/mg prot)

Figura 31: Lipoperoxidação avaliada por TBARS (mol/mg prot) em

homogeneizado cardíaco (n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III

- Sham metionina, IV - Castrada metionina. Utilizando médiadpm e ANOVA.

(*) P<0,05 quando comparado aos grupos I, II e III.

(#) P<0,05 quando comparado ao grupo I.

Observamos também que houve uma correlação positiva (r=0,7956;

p0,0001) entre a PDFVE e o TBARS, mostrando que os animais que tiveram

aumento de pressão ventricular também apresentaram a lipoperoxidação

aumentada (figura 32).

0 1 2 3 4

PDFVE (mmHg)

TBARS(umol/prot)

Figura 32: Correlação entre TBARS (mol/mg prot) e PDFVE (mmHg) em

homogeneizado cardíaco. (r=0,7956; p



0,0001)

Na figura 33, observamos que a oxidação de proteínas avaliada pelo

método das carbonilas apresentou-se aumentada no grupo IV em relação aos

grupos I (96%), II (110%) e III (66%); os demais grupos não apresentaram

diferenças significativas entre si.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

I II III IV

carbonilas (mmol/mg prot)

Figura 33: Análise de carbonilas (mmol/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina. (*) P<0,05 quando comparado aos grupos I, II e III. Utilizando

médiadpm e ANOVA.

A atividade da enzima GST aumentou no grupo IV em relação aos grupos I

(31%) e II (50%); os demais grupos não mostraram diferenças significativas entre

si (figura 34).

I II III IV

GST (pmol/mg prot)

Figura 34: Atividade da GST (mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina.

(*)

P<0,05 quando comparado aos grupos I e II. Utilizando médiadpm e ANOVA.

A atividade da enzima antioxidante GPx aumentou no grupo IV em relação

aos grupos I (37%) , II (34%) e III (25%); os demais grupos não apresentaram

diferenças significativas entre si (figura 35).

I II III IV

GPx (nmol/min/mg prot)

Figura 35: Atividade da GPx (mol/min/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina. (*)

P<0,05 quando comparado aos grupos I, II e III. Utilizando

médiadpm e ANOVA.

Também observamos uma correlação positiva (r=0,7936; p

0,0001) entre a

atividade da enzima GPx e a lipoperoxidação. Mostrando que os animais que

tiveram aumento de lipoperoxidação apresentaram a GPx aumentada (figura 36).

0 10 20 30 40

TBARS(umol/prot)

GPx (nmol/prot)

Figura 36: Correlação entre TBARS (mol/mg prot) e a atividade da GPx

(mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco. (r=0,7936; p



0,0001)

A atividade de enzima antioxidante SOD aumentou no grupo IV em relação

ao grupo III (36%); em relação aos demais grupos, não houve diferenças

significativas (figura 37).

I II III IV

SOD (U/mg prot)

Figura 37: Atividade da SOD (U/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina.

(*) P<0,05 quando comparado ao grupo III. Utilizando médiadpm e ANOVA.

A atividade de enzima antioxidante catalase aumentou no grupo IV em

relação ao grupo III (26%); em relação aos demais grupos, não houve diferenças

significativas (figura 38).

I II III IV

catalase (pmol/mg prot)

Figura 38: Atividade da catalase (mol/mg prot) em homogeneizado cardíaco

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina,

IV - Castrada metionina.

(*) P<0,05 quando comparado ao grupo III. Utilizando médiadpm e ANOVA.

5.4.2 FÍGADO:

A análise dos metabólitos do NO em tecido hepático, figura 39, não

apresentou diferenças significativas entre os grupos estudados.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

I II III IV

NOx (uM)

Figura 39: A – Nitratos+Nitritos (M) em homogeneizado hepático (n=8/grupo). I -

Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV - Castrada

metionina.

A LPO avaliada pelo método das substâncias reativas ao ácido tio-

barbitúrico (TBARS) apresentou-se aumentada no grupo IV em relação aos

grupos I (180%), II (77%) e III (180%), como mostra a figura 40. Observamos

ainda um aumento na LPO no grupo II em relação ao grupo I (60%).

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

I II III IV

TBARS (umol/mg prot)

Figura 40: Lipoperoxidação avaliada por TBARS (mol/mg prot) em

homogeneizado hepático (n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle,

III - Sham metionina, IV - Castrada metionina. Utilizando médiadpm e ANOVA.

(*) P<0,05 quando comparado aos grupos I, II e III.

(#) P<0,05 quando comparado ao grupo I.

Na figura 41, observamos que a oxidação de proteínas avaliada pelo

método das carbonilas apresentou-se aumentada no grupo IV em relação aos

grupos I (196%), II (127%) e III (89%); os demais grupos não apresentaram

diferenças significativas entre si.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

I II III IV

carbonilas (mmol/mg prot)

Figura 41: Análise de carbonilas (mmol/mg prot) em homogeneizado hepático

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina. (*)

P<0,05 quando comparado aos grupos I, II e III. Utilizando

médiadpm e ANOVA.

A atividade da enzima GST diminuiu no grupo IV em relação ao grupo I

(30%); em relação aos demais grupos, não houve diferenças significativas

(figura 42).

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

I II III IV

GST (nmol/mg prot)

Figura 42: Atividade da GST (mol/mg prot) em homogeneizado hepático

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina.

(*) P<0,05 quando comparado ao grupo I. Utilizando médiadpm e ANOVA.

A atividade de enzima antioxidante GPx não apresentou diferenças

significativas entre os grupos estudados, figura 43.

100

120

140

I II III IV

GPx (nmol/min/mg prot)

Figura 43: Atividade da GPx (mol/min/mg prot) em homogeneizado hepático

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina.

A atividade de enzima antioxidante SOD diminuiu no grupo IV em relação

aos grupos I (30%), II (20%) e III (26%); os demais grupos não apresentaram

diferenças significativas entre si (figura 44).

I II III IV

SOD (U/mg prot)

Figura 44: Atividade da SOD (U/mg prot) em homogeneizado hepático

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina. (*)

P<0,05 quando comparado aos grupos I, II e III. Utilizando

médiadpm e ANOVA.

A atividade de enzima antioxidante catalase não apresentou diferenças

significativas entre os grupos estudados (figura 45).

I II III IV

catalase (pmol/mg prot)

Figura 45: Atividade da catalase (mol/mg prot) em homogeneizado hepático

(n=8/grupo). I - Sham controle, II - Castrada controle, III - Sham metionina, IV -

Castrada metionina.

6. DISCUSSÃO

6.1 EXPERIMENTO 1:

Sabe-se que a homocisteína aumenta o estresse oxidativo, por ser

facilmente oxidada e gerar radicais livres. Uma vez na circulação a homocisteína

é rapidamente auto-oxidada formando homocistina, dissulfetos mistos e também

as espécies ativas de oxigênio (Baydas et al., 2006). É sabido também que ela

atua nos vasos promovendo a disfunção endotelial, especialmente por oxidar o

LDL colesterol (Romerio et al., 2004). Também já está amplamente estudado o

efeito do acúmulo de homocisteína sobre a função endotelial. Por este motivo,

procuramos elucidar, neste trabalho, como funciona o dano oxidativo gerado pela

homocisteína sobre o tecido cardíaco, uma vez que o aumento dos níveis de Hcy

é considerado um fator de risco para doença cardiovascular (Perry, 1999).

Inicialmente, testamos o efeito crônico da Hcy no coração, num modelo de

homocistinúria. A homocistinúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos

sulfurados, causado pela deficiência da enzima cistationina -sintase. O bloqueio

desta rota metabólica provoca acúmulo de homocisteína e metionina. A metionina

é formada em condições de excesso de homocisteína, que sofre metilação e é

convertida em metionina por ação da metionina sintase. As concentrações

normais de homocisteína variam de 5 a 15 mol/L, enquanto que as de metionina

são de aproximadamente 35 mol/L. Pacientes com deficiência da enzima

cistationina -sintase apresentam concentrações plasmáticas de homocisteína

acima de 200 mol/L, e de metionina até 2000 mol/L (Mudd et al., 2001).

Pacientes com homocistinúria desenvolvem, prematuramente, doença vascular

oclusiva, levando à trombose arterial e venosa (Davi et al., 2001; Robert et al.,

2005). A patogenia da lesão vascular determinada pela HHcy inclui lesão da

célula endotelial, crescimento da musculatura lisa vascular, maior adesividade

plaquetária, aumento da oxidação do LDL-colesterol com deposição na parede

vascular e ativação direta da cascata da coagulação (Durand et al., 2001). O

modelo de homocistinúria utilizado neste estudo está descrito na literatura, e

induz uma elevação nos níveis de homocisteína sanguínea para

aproximadamente 500

mol/L, promovendo uma hiperhomocisteinemia severa,

semelhante à encontrada na homocistinúria (Streck et al., 2002). Neste

experimento, foram utilizados ratos jovens (machos e fêmeas), sexualmente

imaturos, portanto sem a influência do estrogênio, que foram mortos logo após o

término do tratamento de três semanas. No nosso estudo observou-se aumento

da atividade das enzimas antioxidantes SOD e GST no grupo tratado com Hcy em

relação ao controle. Uma vez que a homocisteína aumenta a geração de EAO

durante a sua oxidação (Baydas et al., 2006), acredita-se que estas enzimas têm

suas atividades aumentadas por aumento nos substratos, ânion superóxido e

peróxido de hidrogênio. A GST também tem um importante papel na detoxificação

de xenobióticos, por isso ela está aumentada devido à intoxicação causada pela

homocisteína. Resultados semelhantes foram encontrados por Vilaseca-Busca e

colaboradores onde a atividade da SOD apresentou-se aumentada na

homocistinúria provavelmente devido a um aumento na produção de EAO

(Vilaseca-Busca et al., 2002). Já a catalase não apresentou alterações no

experimento 1 o que pode ser devido a uma inibição por NO. No entanto, não

houve aumento do dano oxidativo, avaliado através da LPO. Sugere-se que,

neste período de tratamento, as atividades enzimáticas aumentadas foram

suficientes para reverter o dano causado pela Hcy, ou ainda pode ter

compensado pela presença de antioxidantes não enzimáticos. Campolo e

colaboradores demonstraram que o aumento da Hcy aumenta a glutationa

reduzida (GSH), mas não altera LPO no plasma de humanos tratados com

metionina (Campolo et al., 2006). Estudos em humanos mostram que há um

aumento da LPO na homocistinúria em pacientes adolescentes e adultos (14 a 51

anos) e que isto está associado a um maior risco cardiovascular e trombótico

(Davi et al., 2001). Outro estudo também mostrou um aumento da LPO em fígado

de camundongos, com hiperhomocisteinemia severa causada por deficiência da

cistationina

-sintase (Robert et al., 2005). Não foi encontrado na literatura um

modelo de homocistinúria que avalie o estresse oxidativo cardíaco.

O dano oxidativo ao miocárdio pode contribuir para agravar o quadro da

HHcy já que além da disfunção endotelial isso poderia contribuir para a disfunção

miocárdica.

6.2 EXPERIMENTO 2

Neste experimento, foi utilizado o mesmo modelo descrito no experimento

1 que induz uma elevação nos níveis de homocisteína sanguínea para

aproximadamente 500

mol/L, promovendo uma hiperhomocisteinemia severa,

semelhante à encontrada na homocistinúria (Streck et al., 2002). No entanto, 12

horas após o término do tratamento a concentração plasmática de homocisteína

retorna aos valores normais (Streck et al., 2004). Utilizando as mesmas doses de

homocisteína do experimento anterior e o mesmo tempo de tratamento, porém

analisando os animais já adultos com 80 dias de vida, foi observado o estresse

100

oxidativo 52 dias após o término do tratamento. O objetivo foi verificar o efeito da

hiperhomocisteinemia (HHcy) severa, a longo prazo, sob parâmetros oxidativos

no tecido cardíaco. Este tratamento simula a homocistinúria, como foi citado

anteriormente. Para isso foram utilizados ratos machos, ou seja, sem influência do

estrogênio, uma vez que já foi demonstrado que os androgênios não influenciam

no estresse oxidativo (Barp et al., 2002). Foi observado, neste modelo, um

aumento do dano oxidativo aos lipídios e às proteínas. Sabe-se que a HHcy

estimula a formação de ânion superóxido e de peróxido de hidrogênio,

promovendo um aumento no estresse oxidativo (Welch et al., 1997; Hogg, 1999;

Streck et al., 2004). Resultados semelhantes foram encontrados na literatura,

onde modelos de homocistinúria apresentam um aumento de LPO e aumento de

dano às proteínas em fígado e plasma (Davi, 2001; Robert, 2005). No entanto,

nos animais que receberam Hcy e folato foi observado que a LPO e o dano a

proteínas volta para valores semelhantes aos dos controles, ou seja o folato

impede o dano oxidativo no coração destes animais. O folato é um co-substrato

do ciclo de remetilação da metionina, que impede a formação de Hcy; por isso, o

tratamento com ácido fólico reduz a concentração plasmática de homocisteína

(Thambyrajah et al., 2000). Hagar demonstrou que o tratamento com folato, em

ratos infartados, reduz significativamente o dano oxidativo do miocárdio (Hagar,

2002). Já Malinow e colaboradores observaram uma redução da Hcy plasmática

em pacientes, com doença cardíaca isquêmica, que consumiram cereais

fortificados com ácido fólico (Malinow et al., 1999). Observamos também um

aumento nas atividades das enzimas antioxidantes CAT e GST, bem como uma

diminuição na atividade da SOD. É sabido que altas concentrações de peróxido

de hidrogênio ativam a catalase, no entanto, esse grande aumento nas espécies

101

ativas de oxigênio pode inibir a atividade enzimática da SOD, o que se chama de

inativação oxidativa (Li et al., 1999). Já o aumento observado na GST reflete a

detoxificação da Hcy, sendo que esta enzima é a principal responsável pelos

processos de detoxificação de xenobióticos. Heydrick e colaboradores sugerem o

aumento nos níveis de Hcy está associada a um aumento da LPO dose

dependente, e que esta não é inibida pelo aumento da catalase, mas é inibida

pelo aumento da SOD. E que altas doses de Hcy não alteram a atividade da GPx,

em cultura de células endoteliais (Heydrick et al., 2004). Já Baydas e

colaboradores e Huang e colaboradores demonstraram que o aumento na

concentração plasmática de Hcy inibe a atividade de enzimas antioxidantes como

a SOD e a GPx (Huang et al., 2001; Baydas et al., 2005). Quando protegemos

estes animais com folato, as atividades da catalase e da GST retornam a valores

controles, o que comprova ou reforça que o aumento da atividade enzimática foi

devido ao aumento na geração de EAO pela Hcy. Isso também é demonstrado na

correlação positiva encontrada entre a LPO e a atividade da catalase. Como

discutido anteriormente, o folato reduz os níveis de homocisteína e assim reduz o

dano oxidativo, retornando a atividade das enzimas aos seus valores basais.

6.3 EXPERIMENTO 3

Neste experimento foram utilizadas ratas sexualmente maduras castradas

ou não. A castração foi realizada para que tivéssemos grupos com e sem

estrogênio, sendo que a retirada dos estrogênios foi feita para simular a

menopausa. Já está estabelecido que na menopausa ocorre um aumento dos

níveis de Hcy e também um aumento no risco cardiovascular (Hak et al., 2000;

102

Chagas et al., 2003; Mosca et al., 2006). Por outro lado também já está bem

estabelecido na literatura que a Hcy causa disfunção endotelial (Kuller & Evans,

1998; Kanani et al., 1999; Cole, 2001) e que o estrogênio tem ação antioxidante

(Ayres et al., 1998; Strehlow et al., 2003; Wierman, 2007). Então nosso próximo

passo foi estudar a influência do estrogênio no efeito oxidativo causado pela

homocisteína em coração, aorta e efeito sistêmico em termos de estresse

oxidativo, observando algumas alterações hemodinâmicas. A escolha dos tecidos

foi feita com base nos nossos objetivos. Primeiramente queríamos avaliar o efeito

no miocárdio, sendo que a Hcy é um fator de risco cardiovascular (Perry, 1999).

Na aorta queríamos comprovar o efeito sobre o endotélio e a avaliação sistêmica

foi realizada para observarmos o balanço entre os tecidos através dano oxidativo

sistêmico. Neste modelo foi avaliado agudamente o efeito da Hcy em animais

castradas ou não. O modelo de HHcy utilizado foi o descrito por Scherer e

colaboradores, que causa hiperhomocisteinemia severa (Scherer et al., 2007).

Primeiramente, foi feita análise hormonal para confirmar a diminuição dos níveis

de 17

-estradiol, após uma semana de castração. O grupo castrado apresentou

níveis significativamente menores de 17 -estradiol, como já havia sido

demonstrado em trabalhos prévios realizados em nosso laboratório (Barp et al.,

2002).

Inicialmente, os animais foram cateterizados sob anestesia e após foram

realizadas as medidas hemodinâmicas em animal acordado. A avaliação

hemodinâmica apresentou diferenças significativas na pressão arterial média

apenas quando comparamos os animais castrados que receberam ou não a Hcy.

Observou-se que a Hcy aumenta a pressão arterial somente na ausência de

estrogênio. Já a freqüência cardíaca não apresentou alterações significativas

103

entre os grupos estudados, como demonstrado na literatura. Herrmann e

colaboradores demonstram não haver variação na pressão arterial, porém

observaram uma elevação da pressão diastólica ventricular esquerda (Herrmann

et al., 2006). Já Ungvari e colaboradores não observaram diferenças na pressão

arterial medida em artéria femural (Ungvari et al., 1999). Ambos os trabalhos

utilizaram tratamento crônico para indução de HHcy moderada, enquanto no

nosso trabalho utilizamos tratamento agudo para HHcy severa. Em contrapartida

a estes resultados, Mariotti e colaboradores demonstraram que a HHcy diminui a

pressão sangüínea avaliada pelo método de pletismografia caudal e não altera

produção de óxido nítrico (NO) plasmático (Mariotti et al., 2006).

O NO é amplamente conhecido como vasodilatador, porém sabe-se que

ele tem um importante papel na atividade cardíaca. Estudos recentes mostram

que inibindo a vasodilatação NO – dependente, aumenta-se o índice de eventos

cardiovasculares, uma vez que o NO tem um importante papel na regulação do

metabolismo cardíaco, modulando a respiração mitocondrial. O NO atenua a

respiração mitocondrial por inibir os complexos I e II da cadeia de transporte de

elétrons e por interação coma citocromo oxidase (Suematsu et al., 2007). O NO

também atua na modulação da resposta cardíaca à isquemia/reperfusão. Além de

atuar como molécula cardioprotetora, e ser essencial para o funcionamento

normal do coração (Xu et al., 2004). Becker e colaboradores demontraram que a

HHcy inibe a regulação do consumo de oxigênio cardíaco pelo NO, e este efeito é

proporcional a concentração plasmática de Hcy. Sugerem também que a redução

da biodisponibilidade do NO pelo ânion superóxido é o maior impacto ao

metabolismo cardíaco causado pela Hcy, causando uma piora na vasodilatação

(Becker et al., 2005).

104

Visto esta importante função do NO no coração, achamos interessante

verificar os níveis de nitritos + nitratos (NOx) neste tecido. Os níveis de NOx

estão aumentados nas ratas castradas com Hcy. Estudos demonstram que a

HHcy reduz a biodisponibilidade do NO (Suematsu et al., 2007). Enquanto o

estrogênio aumenta a atividade da NOS e aumenta a produção de NO no coração

(Xu et al., 2004). Neste trabalho sugere-se que os níveis de NOx estão

aumentados no coração, pois a HHcy reduz a biodisponibilidade de NO

aumentando seus metabólitos. Como este tratamento é agudo é possível que

estes metabólitos ainda não tenham sido secretados. Quando correlacionamos a

pressão arterial com os níveis de NOx, observamos uma correlação positiva,

mostrando que os animais com maiores níveis destes metabólitos, supostamente

com menores concentrações de NO, apresentam uma maior pressão arterial.

Dantas e colaboradores mostram que a inativação do NO pelo ânion superóxido

pode colaborar para a disfunção endotelial e para a hipertensão, e que o

estrogênio por sua propriedade antioxidante tem efeito protetor contra o dano

endotelial (Dantas et al., 1999).

Quando analisamos o estresse oxidativo, observamos um aumento na

lipoperoxidação cardíaca, analisada pela técnica de quimiluminescência, no grupo

que recebeu Hcy e tinha baixa concentração de estrogênio. Isso demonstra um

aumento do dano oxidativo nestes animais, uma vez que não têm o efeito

antioxidante oferecido pelo estrogênio. Já o grupo com estrogênio que recebeu

Hcy não apresentou aumento da LPO. Quando correlacionamos a pressão arterial

com a LPO, observamos uma correlação positiva, mostrando que os animais que

apresentaram maior dano oxidativo também tiveram a pressão arterial mais

elevada. Estes animais são os que receberam Hcy e tinham baixa concentração

105

de estrogênio. Estes dados são corroborados por dados encontrados na literatura

que demonstram que a HHcy aumenta estresse oxidativo (EO) e a LPO no

sistema nervoso (Streck et al., 2003; Matté et al., 2004), e que o EO promove

dano cardíaco (Ungvari et al., 1999). Outro estudo mostra que o 17 -estradiol

diminui a expressão de pró-oxidantes em células endoteliais e recupera a função

cardíaca pós isquemia em coração de ratas (Xu et al., 2004). Neste experimento

não foi observado dano oxidativo a proteínas, provavelmente pelo tempo do

tratamento, uma vez que o dano a proteínas ocorre mais lentamente que o dano a

lípidios. Quando analisamos a capacidade antioxidante total nestes animais,

observamos uma diminuição nos antioxidantes não enzimáticos, avaliados em

conjunto pela técnica do TRAP, no grupo que recebeu Hcy e tinha baixa

concentração de estrogênio. Isso demonstra um maior dano oxidativo neste grupo

que teve aumento na LPO e diminuição da capacidade antioxidante total. Estudos

mostram que a Hcy in vitro induz a LPO e diminui as defesas antioxidantes não

enzimáticas, gerando um quadro de estresse oxidativo (Streck et al., 2003; Matté

et al., 2004). Observamos também que apenas a cirurgia já é um fator de estresse

oxidativo uma vez que os grupos em que foi feita a cirurgia fictícia apresentaram

uma menor capacidade antioxidante total quando comparado com os animais

intactos.

Spencer e colaboradores demonstraram que a combinação de estrogênio

com Hcy bloqueia significativamente a ação da Hcy (Spencer et al., 2004).

No coração observamos que houve um aumento do estresse oxidativo nos

animais castrados que receberam Hcy, uma vez que a QL apresentou-se

aumentada e houve uma diminuição nas enzimas GST e GPx, que são as

enzimas dependentes de glutationa. Novamente observamos que a diminuição na

106

atividade enzimática da GPx e GST só são observadas no grupo com Hcy e com

baixa concentração de estrogênio, mostrando um efeito pró-oxidante da Hcy no

coração destes animais.

Suematsu e colaboradores demonstraram que o aumento do estresse

oxidativo pela Hcy reduz a atividade da GPx, diminui a biodisponibilidade de NO e

aumenta os níveis de superóxido (Suematsu et al., 2007).

O risco de infarto aumenta em 12% na HHcy moderada e de 20 a 30% dos

pacientes com doença coronariana apresenta HHcy moderada. Estes danos estão

associados ao poder oxidante da Hcy, uma vez que ela aumenta os níveis de

ânion superóxido e de peroxinitrito que são potentes oxidantes, além de diminuir o

NO e a atividade da NO sintase endotelial (eNOS), que tendem a manter a função

cardíaca (Spencer et al., 2004).

Quando correlacionamos a LPO com a atividade da GST observamos uma

correlação negativa, mostrando que os animais que apresentaram maior dano

oxidativo tiveram uma menor atividade antioxidante desta enzima. Isto sugere que

os animais que receberam Hcy, mas tinham a presença do estrogênio como

antioxidante, têm um menor dano oxidativo que os animais castrados e que

receberam Hcy, provavelmente porque o estrogênio impede o dano oxidativo

causado pela Hcy.

Robin e colaboradores demonstraram que em tecido sanguíneo e hepático,

não há variação nos níveis de NOx após suplementação com metionina. E ainda

que a Hcy possa aumentar os níveis plasmáticos de cisteína e de GSH em ratos

espontaneamente hipertensos (SHR) (Robin et al., 2004).

Neste modelo foram avaliados também alguns parâmetros em aorta. No

entanto, devido à dificuldade em fazer a coleta desta artéria, por ela se apresentar

107

muito frágil nos animais que receberam Hcy, e romper facilmente enquanto era

retirada, só foi possível avaliar a atividade de duas enzimas antioxidantes. As

enzimas escolhidas foram a GST e a GPx por participarem do metabolismo da

glutationa e por terem se mostrado alteradas no tecido cardíaco. Na aorta

observamos que a Hcy por si só, independente da ação do estrogênio, aumenta

os níveis de GST tentando reverter o dano causado pela Hcy. No entanto nos

animais que receberam Hcy e estavam castrados não houve um aumento da

GST. Possivelmente a formação de muitas EAO, inibiu a atividade enzimática da

GST (inativação oxidativa). Já a GPx apresentou-se aumentada quando houve a

castração, independente da presença de Hcy, mostrando que só a retirada dos

estrogênios já promove uma resposta adaptativa do sistema antioxidante

enzimático para combater o dano oxidativo em aorta. Este dano também é

observado quando temos Hcy e o estresse cirúrgico no grupo sham. Ou seja,

tanto a castração quanto a Hcy promovem aumento da atividade da GPx para

reverter o dano oxidativo causado por estes procedimentos. Barp e colaboradores

demonstraram que a castração induz um aumento do estresse oxidativo (Barp et

al., 2002). Já Chagas e colaboradores sugerem que a Hcy causa um efeito lesivo

direto ao endotélio e que este processo é dependente da biodisponibilidade de

oxigênio. Os autores sugerem um mecanismo de dano via radicais livres pelo

aumento do peróxido de hidrogênio (Chagas et al., 2003).

Em experimentos em anel de aorta isolados observou-se que a Hcy causa

uma redução da biodisponibilidade do NO e um importante aumento do estresse

oxidativo (Eberhardt et al., 2000). Outro estudo demonstra que a HHcy, causada

por altas doses de metionina, produz um efeito angiotóxico na aorta. Este efeito é

108

acompanhado de extenso dano endotelial, degeneração celular e características

degenerativas no processo mitocondrial (Matthias et al., 1996).

Também foi avaliado com este protocolo experimental, o estresse oxidativo

sistêmico, como marcadores periféricos, uma vez que é uma análise

minimamente invasiva e a mais utilizada na clínica médica. Observamos

sistemicamente que a LPO apresenta-se diminuída, bem como a atividade da

GST e os metabólitos do NO. Acredita-se que o vaso é o primeiro órgão-alvo de

dano causado pela Hcy, até pelo seu aspecto após o tratamento. Então para

proteger o vaso do dano oxidativo, possivelmente, são mobilizados antioxidantes

de outros órgãos. Palace e colaboradores demonstraram que órgãos como o

coração, o fígado e os rins podem depletar suas reservas de antioxidantes para

diminuir o estresse oxidativo sistêmico em resposta ao insulto isquêmico ao

miocárdio (Palace et al., 1999).

6.4 EXPERIMENTO 4

Outro objetivo deste trabalho foi ver o efeito da hiperhomocisteinemia

crônica, em ratas castradas e não-castradas. Porém, devido ao alto custo da Hcy,

fomos buscar na literatura um tratamento alternativo. O que encontramos foi que

o tratamento crônico com metionina na água de beber causa uma

hiperhomocisteinemia moderada, com valores de homocisteína entre 15 –

30mol/L (Welch & Loscalzo, 1998). Uma vez que a única fonte de Hcy no

organismo é o metabolismo da metionina, a administração crônica deste

aminoácido essencial pode levar à HHcy. O modelo de HHcy utilizado foi baseado

no estudo de Ungavari et al., 1999, o qual demonstrou uma elevação da

109

concentração plasmática de Hcy para valores de 23,6 mol/L, indicando HHcy

moderada. Em um estudo realizado por Hanratty et al., 2001, foram considerados

dois grupos de pacientes, tendo o primeiro recebido metionina oral e o outro

recebido homocisteína oral. Foi observado um aumento na homocisteína

plasmática e na concentração de metionina do primeiro grupo, sendo que no

segundo grupo foi observado um aumento na homocisteína plasmática, com

pouco efeito na concentração de metionina. Ambos os tratamentos indicaram

danos endoteliais, sugerindo que a homocisteína é o agente causador.

Após estabelecido o modelo, o objetivo foi o de demonstrar a disfunção no

ventrículo esquerdo em ratos, submetidos à hiperhomocistenemia (HHcy), a qual

foi correlacionada com o estresse oxidativo do miocárdio e redução de

metabólitos do NO.

Como já demonstrado por outros autores, a Hcy contribui para a

mortalidade cardiovascular por ações no miocárdio, em adição aos efeitos

vasculares (Joseph et al., 2002; Joseph et al., 2003). Uma elevada concentração

da Hcy plasmática tem sido associada a danos no endotélio vascular, contribuindo

para doenças das artérias coronarianas, trombose e doenças cerebrovasculares

(Hermann et al., 2006). A HHcy pode também exercer efeitos deletérios no

coração, causando remodelamento cardíaco adverso, que se caracteriza por

fibrose intersticial e perivascular, resultando no aumento de rigidez do miocárdio

(Joseph et al., 2002). No entanto, o mecanismo pelo qual a elevação da Hcy

pode levar à redução da função mecânica do coração ainda está sob

investigação. Estudos destes mecanismos ainda são raros. Recentemente, tem

observou um aumento na concentração da Hcy plasmática em pacientes com

110

insuficiência cardíaca congestiva (ICC), representado um fator de risco adicional

(Vassan et al., 2003).

Neste estudo, objetivamos investigar a função ventricular por meio do

cateterismo cardíaco de ratos com HHcy. Foi verificada uma elevação significativa

da PDFVE nas ratas com ausência de estrogênio. A menopausa foi induzida por

ovariectomia bilateral. Este procedimento foi utilizado baseado na observação de

que os níveis de Hcy aumentam significativamente em mulheres após a

menopausa. Isto pode justificar, em parte, o aumento do risco de doenças

cardiovasculares nessas mulheres (Verhoef et al., 1999; Sundstrom et al., 2004).

Uma vez que Spencer et al., 2004 demonstraram que a combinação de

Hcy e estrogênio inibem significativamente os efeitos adversos da Hcy, foi

observada somente a disfunção ventricular na ausência deste hormônio. Este

resultado reforça a característica cardioprotetora do estrogênio. Também

achamos um decréscimo na quantidade de nitritos+nitratos (NOx) no miocárdio de

ratos submetidos à ovariectomia e que receberam metionina, quando comparados

a outros grupos. Foi demonstrada uma correlação negativa bastante forte entre

NOx e PDFVE, indicando uma possível participação do decréscimo da

biodisponibilidade do NO na disfunção ventricular (Elahi et al., 2007). Esta

redução da biodisponibilidade do NO pode também ser resultante de uma

supressão indireta da atividade da NO sintase endotelial (eNOS) pela Hcy (Zhang

et al., 2000). Outro mecanismo para explicar a redução na biodisponibilidade do

NO é devido à formação de peroxinitrito, resultante da reação entre o NO e o

ânion superóxido (O

-

), o qual é reconhecido como sendo produzido pela reação

de oxidação da Hcy (Ungavari et al., 2002). Assim, a medida dos marcadores de

estresse oxidativo no miocárdio passa a ser de interesse. Neste trabalho foi

111

avaliado o dano oxidativo a lipídios por meio do TBARS. Este marcador está

aumentado em animais castrados, demonstrando que o estrogênio inibe o

estresse oxidativo no miocárdio. Barp et al., 2002, demonstraram este efeito uma

semana após a castração. Quando associados a castração e a

hiperhomocisteinemia, o estresse oxidativo foi potencializado e também se

verificou dano a proteínas avaliados por carbonilas. Estes achados corroboram o

estudo de Bayes et al., 2003, onde foi verificada uma associação entre a HHcy

induzido por metionina e a lipoperoxidação. Devi e colaboradores também

demonstraram que a HHcy aumenta o TBARS em miocárdio de ratos SHR,

sugerindo que a HHcy aumenta o estresse oxidativo e a LPO miocárdica (Devi et

al., 2006).

A terapia de reposição hormonal em ratas castradas ou administração de

SOD mimético foram associadas com uma melhor recuperação cardíaca após

isquemia-reperfusão (Xu et al., 2004). O estrogênio tem sido associado também

como protetor contra o estresse oxidativo induzido por Hcy, prevenindo injúria

endotelial (Dimitrova et al., 2002b).

Um dos resultados obtidos neste trabalho foi a verificação do aumento da

atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GST no grupo com

ausência de estrogênio associado com a administração da metionina. De fato, as

enzimas antioxidantes parecem responder ao desequilíbrio no estresse oxidativo

aumentando suas atividades numa tentativa de minimizar o dano oxidativo.

Resultados similares foram produzidos no nosso laboratório com a utilização de

outras situações de estresse oxidativo. Neste trabalho foi demonstrado que as

enzimas antioxidantes também se encontravam elevadas quando o estresse

oxidativo era induzido pela administração de tiroxina (Araujo et al., 2006).

112

Como a Hcy pode levar à produção do ânion superóxido e de peróxido de

hidrogênio (Chambers et al., 1999; Perna et al., 2003), o aumento da atividade

antioxidante pode ser devido a uma elevação nos substratos dessas enzimas. A

atividade da SOD e os metabólitos do NO apresentaram um padrão de oscilação

oposto. Isto significa que quanto maior a atividade da SOD, menor a quantidade

de metabólitos de NO. Esta alteração foi verificada em ratas castradas

submetidas a tratamento com metionina. A atividade aumentada da SOD pode ser

devida a um aumento da produção do ânion superóxido, o qual por sua vez

inativa o NO, conforme citado anteriormente. No grupo que recebeu metionina

com concentração fisiológica de estrogênio, a atividade da SOD não foi alterada,

sugerindo que a produção do superóxido pode também estar inalterada (Perna et

al., 2003; Suematsu et al., 2006).

De fato, o estrogênio pode preservar a biodisponibilidade do NO não

apenas pelo aumento da produção de NO, mas também por sua ação

scavenger,

reduzindo ou inibindo o estresse oxidativo (Virdis et al., 2000).

Nossos dados demonstram uma associação entre a HHcy e a disfunção

ventricular em ratas menopausadas, o qual foi correlacionado com a diminuição

da biodisponibilidade de NO, bem como com o aumento do dano oxidativo no

miocárdio. Estes achados demonstram a importância da restituição do balanço

NO/redox em mulheres menopáusicas de maneira a melhorar a função cardíaca

na HHcy, influenciando favoravelmente o prognóstico da insuficiência cardíaca.

Outro objetivo deste estudo foi verificar o efeito crônico da metionina como

causadora de HHcy sobre o fígado. O fígado é o principal órgão responsável pela

metabolização da metionina e da homocisteína, principalmente pela rota de

transulfuração da Hcy à cistationina (Robin et al., 2004).

113

No fígado não foram observadas alterações nos metabólitos do NO. Ji e

Kaplowitz sugerem que a HHcy piora quadros de doenças hepáticas e que a

biodisponibilidade do NO é importante no balanço redox nestes casos (Ji &

Kaplowitz, 2004). A lipoperoxidação hepática, avaliada pelo método do TBARS,

apresentou-se aumentada no grupo castrado que recebeu metionina. Observou-

se também um aumento no dano a proteínas avaliado pelo método das

carbonilas. Robert e colaboradores demonstraram que há um aumento nas

carbonilas em fígado de camundongos com deficiência da cistationina

-sintase e

que esta deficiência é uma das causas da hiperhomocisteinemia (Robert et al.,

2005).

Outros estudos também mostram que a LPO é um importante mecanismo

na patogênese do dano hepático. E que o aumento nos níveis de Hcy promove

um aumento da LPO e do estresse oxidativo em fígado de ratos (Huang et al.,

2001; Robin et al., 2004).

Outro resultado obtido neste experimento foi a diminuição da atividade das

enzimas antioxidantes SOD e GST. Alguns estudos sugerem que a homocisteína

atua inibindo a atividade das enzimas antioxidantes no tecido hepático. Huang e

colaboradores demonstraram que o aumento nos níveis de Hcy, por depleção de

folato, resulta em uma diminuição da atividade da GPx e da SOD, sem alterar a

atividade da catalase em tecido hepático (Huang et al., 2001). Já Robin e

colaboradores mostraram uma diminuição significativa na atividade das enzimas

antioxidantes GPx e glutationa redutase em fígado de ratos SHR (Robin et al.,

2004). Estes dados no tecido hepático sugerem um grande dano oxidativo no

fígado, pois durante a metabolização da Hcy, ocorre a sua auto-oxidação e a

geração de espécies ativas de oxigênio.

114

7. Conclusão

1) A administração crônica de homocisteína a animais neonatos não aumenta o

dano oxidativo cardíaco avaliado imediatamente após o término do tratamento,

provavelmente pela aumentada atividade antioxidante no miocárdio.

2) A homocisteína, administrada cronicamente a ratos neonatos, induz aumento

do dano oxidativo ao miocárdio quando estes animais se tornam maduros, sendo

que esses danos foram minimizados pela suplementação com folato. Estes

dados sugerem que o folato atua como protetor cardiovascular na

hiperhomocisteinemia.

3) O dano oxidativo miocárdico foi induzido no miocárdio de fêmeas castradas

tratadas agudamente com homocisteína, efeito esse que não se observa na

presença de níveis estrogênicos fisiológicos. Estes dados apontam para um

efeito cárdio-protetor do estrogênio na hiperhomocisteinemia.

4) O tratamento crônico com metionina induz disfunção diastólica do ventrículo

esquerdo que foi associada à redução da biodisponibilidade do óxido nítrico

(NO), assim como ao aumento do dano oxidativo no miocárdio. Estes achados

sugerem a importância do balanço NO/redox na melhora da função cardíaca na

hiperhomocisteinemia.

115

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131

ANEXO 1

Artigo submetido à Life Science.

Ventricular dysfunction induced by methionine is related to myocardial

oxidative stress in female ovariectomized rats.

Barp, J.

; Schenkel, P.

; Llesuy, S.

, Wyse, A.T.S.

, Belló-Klein, A

Comprovante de submissão:

Dear Dr. Belló-Klein, Your submission entitled "Ventricular dysfunction

induced by methionine is related to myocardial oxidative stress in female

ovariectomized rats" has been received by Life Sciences

You will be able to check on the progress of your paper by logging on to

Elsevier Editorial Systems as an author. The URL is

http://ees.elsevier.com/lfs/.

Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been

assigned.

Thank you for submitting your work to this journal.

Kind regards,

Life Sciences

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