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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
Crescimento muscular e expressão de fatores reguladores
miogênicos e da miostatina no músculo esquelético do
pirarucu (Arapaima gigas Cuvier 1817: Osteoglossidae,
Osteoglossoidei, Teleostei)
FERNANDA REGINA CARANI
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BOTUCATU - SP
2008
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
Crescimento muscular e expressão de fatores reguladores
miogênicos e da miostatina no músculo esquelético do
pirarucu (Arapaima gigas Cuvier 1817: Osteoglossidae,
Osteoglossoidei, Teleostei)
FERNANDA REGINA CARANI
Orientadora: Profa. Dra. Maeli Dal Pai Silva
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BOTUCATU - SP
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Carani, Fernanda Regina.
Crescimento muscular e expressão de fatores reguladores miogênicos e da
miostatina no músculo esquelético do pirarucu (Arapaima gigas Cuvier 1817:
Osteoglossidae, Osteoglossoidei, Teleostei) / Fernanda Regina Carani. –
Botucatu: [s.n.], 2008
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências, Botucatu, 2008.
Orientadora: Maeli Dal Pai Silva
Assunto CAPES: 20402007
CDD 597
Palavras-chave: Crescimento muscular; Fatores de regulação miogênica;
Miostatina; Músculo estriado esquelético; Peixe
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Cora Coralina
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AGRADECIMENTOS
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A realização deste trabalho só foi possível graças aos esforços de muitas
pessoas que, direta ou indiretamente, dele fizeram parte.
À minha querida orientadora, Profa. Dra. Maeli Dal Pai Silva, obrigada por
acreditar em mim e por me mostrar o verdadeiro caminho que nos leva ao
desenvolvimento profissional e pessoal. Obrigada pelas oportunidades que tive e tenho,
pelos sábios ensinamentos e, principalmente, obrigada por permitir que mais uma
etapa se cumpra em minha vida... Isso só foi possível pois você fez parte dela!
Aos professores Dr. José Roberto Sartori, Dra. Adriane Pinto Wasko, Dr. César
Martins e Dra. Margarida Maria Barros pela contribuição na participação na Banca
de Dissertação.
Aos docentes do Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências –
UNESP – Botucatu, pela contribuição para meu desenvolvimento profissional, pelo
apoio e pela amizade.
À Luciana Cristina Montes, secretária do Departamento de Morfologia,
Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu, pela disposição em sempre ajudar da
melhor forma possível, pela competência e pela amizade desenvolvida.
Ao Grupo de Pesquisa “Muscle Club”, pelas conquistas, pela constante troca de
conhecimentos e pela amizade desenvolvida.
À Piscicultura Águas Claras, Mococa-SP, pela gentil colaboração fornecendo
os exemplares de pirarucu.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, pela
bolsa de Mestrado concedida (Proc. N° 05/57368-3).
6
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Primeiramente, à DEUS, por me acompanhar a cada etapa cumprida, por me
guiar em cada obstáculo superado, mas, principalmente, obrigada DEUS, por fazer
valer a pena pelo simples fato de me conceder a VIDA!
À minha Mãe, Cleide, por nos permitir, a mim e às minhas irmãs, a vida, por
nos emprestar sua boca para que pudéssemos falar, seus pés para que pudéssemos
andar, seu amor para que pudéssemos existir e, como se isso fosse pouco, obrigada
Mãe, por nos dar parte de sua própria vida para que a nossa existência tivesse algum
sentido! Apesar de pensar saber bastante, ainda não aprendi algo que seja suficiente e
possa substituir o simples MUITO OBRIGADA!
Às minhas irmãs queridas, Lílian e Carolina, em quem me inspiro como
exemplos de garra, união e esperança, obrigada pelo carinho, compreensão, incentivo,
torcida e, acima de tudo, obrigada por fazerem parte da minha vida! Vocês são muito
especiais para mim! Que DEUS as abençõe!
Ao meu “paizão” de coração, Edison, pelo carinho, apoio, dedicação, torcida,
e, principalmente, por me mostrar que o verdadeiro encanto da vida está na
simplicidade com que a vemos e na humildade com que a vivemos, dia após dia, sem se
preocupar com o amanhã. Obrigada, acima de tudo, por fazer parte da minha família!
À minha família tão querida e que sempre esteve ao meu lado em mais esta
etapa da minha vida. Obrigada aos meus avós Brasílio, Arlete, Edi e Ruth, pelo
exemplo de vida que vocês nos são! Obrigada às minhas tias Christina e Fernanda, tios
Claudinei (in memorian) e José Nelson, primas Paula, Mariáh e Malvina, primos
Paulo, Caio, Igor, Fernando e Bernardo, e a todos que torceram por mim!
7
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
“Existem pessoas em nossas vidas que nos deixam felizes pelo simples fato de
terem cruzado o nosso caminho. Algumas percorrem ao nosso lado, vendo muitas luas
passarem, mas outras apenas vemos entre um passo e outro. A todas elas chamamos de
amigo. Há muitos tipos de amigos. Talvez cada folha de uma árvore caracterize um
deles. Os primeiros que nascem do broto são o amigo pai e a amiga mãe. Mostram o
que é ter vida. Depois vem o amigo irmão, com quem dividimos o nosso espaço para
que ele floresça como nós. Passamos a conhecer toda a família de folhas, às quais
respeitamos e desejamos o bem. O destino ainda nos apresenta outros amigos, os quais
não sabíamos que iam cruzar o nosso caminho. Muitos deles são designados amigos do
peito, do coração. São sinceros, são verdadeiros. Sabem quando não estamos bem,
sabem o que nos faz feliz... Mas também há aqueles amigos por um tempo, talvez umas
férias ou mesmo um dia ou uma hora. Esses costumam colocar muitos sorrisos na face,
durante o tempo que estamos por perto. Falando em perto, não podemos nos esquecer
dos amigos distantes, que ficam nas pontas dos galhos, mas que quando o vento sopra,
aparecem novamente entre uma folha e outra.
O tempo passa, o verão se vai, o outono se aproxima, e perdemos algumas de
nossas folhas. Algumas nascem num outro verão e outras permanecem por muitas
estações. O que nos deixa mais feliz é quando as folhas que caíram continuam por
perto, continuam alimentando as nossas raízes com alegria e com lembranças dos
momentos maravilhosos enquanto cruzavam o nosso caminho.”
Agradeço a vocês, folhas da minha árvore, simplesmente porque um dia fizeram
parte, de alguma forma, deste trabalho e da minha vida...
...Aline Michelin, Andreo Aguiar, Clarianna Martins, Danilo Aguiar, Denis Pioli,
Eduardo Castan, Felipe Gustavo, Fernanda Losi, Flávia Delella, Francis Pacagnelli,
Henrique Gonçalves, Joyce Reissler, Juliana Bardi, Lívia, Ludmila Canuto, Luis
Justulin, Marcos Dias, Nabila Pessotti, Olga, Rachel Milanezi, Robson Carvalho,
Rodrigo Souza, Sueli Michelin, Vivian Vizotto, William Gonçalves.
8
SUMÁRIO
1. Resumo.........................................................................................................................9
2. Abstract.......................................................................................................................10
3. Introdução...................................................................................................................11
4. Objetivos......................................................................................................................27
5. Capítulos.....................................................................................................................28
5.1. Capítulo 1: Morfologia e crescimento do músculo estriado esquelético no pirarucu
(Arapaima gigas Cuvier 1817)........................................................................................28
Acta Scientiarum Biological Sciences (submetido)
5.2. Capítulo 2: Expression of MyoD and Myostatin genes in skeletal muscle of
pirarucu (Arapaima gigas Cuvier 1817)..........................................................................45
6. Conclusões Gerais......................................................................................................62
7. Referências Bibliográficas Gerais.............................................................................62
9
1. RESUMO
O crescimento do músculo estriado esquelético nos peixes pode ocorrer por dois
mecanismos: hipertrofia e/ou hiperplasia das fibras, a partir de células miossatélites ou
mioblastos. Esse processo é controlado por Fatores de Regulação Miogênica (MRFs) e
pelo fator de crescimento Miostatina. Durante as fases de desenvolvimento dos peixes
que atingem um tamanho grande, a expressão temporal dos MRFs e da Miostatina pode
controlar os mecanismos de crescimento e a celularidade muscular, fatores que podem
interferir na qualidade da carne. Os objetivos deste trabalho foram avaliar as
características morfológicas e de crescimento do músculo estriado esquelético no
pirarucu (Arapaima gigas), bem como a expressão do MRF MyoD e da Miostatina
durante as fases de crescimento alevino e juvenil. Foram utilizados alevinos, com 50
dias de idade, e juvenis, com um ano de idade. Após o sacrifício, fragmentos musculares
das regiões dorsal, lateral anterior e lateral posterior foram coletados e congelados em
nitrogênio líquido. Cortes histológicos (10 µm) foram submetidos às colorações HE e
Tricrômico de Gomory para a análise morfológica, e NADH-TR para a análise do
metabolismo oxidativo das fibras musculares. Foi calculado o menor diâmetro das fibras
brancas das regiões dorsal e lateral anterior. A musculatura branca dorsal mostrou-se
mais desenvolvida e na musculatura lateral observou-se compartimentos distintos:
superficial vermelho e branco profundo. A distribuição das fibras musculares em classes
de diâmetros permitiu avaliar o grau de crescimento hiperplásico e hipertrófico do
músculo esquelético do pirarucu nas fases de crescimento estudadas. Fragmentos da
musculatura branca da região dorsal foram utilizados para a avaliação da expressão da
MyoD e da Miostatina por Reação em Cadeia da Polimerase após Transcrição Reversa
(RT-PCR). A análise semi-quantitativa foi realizada por densitometria, e os valores
obtidos normalizados pelos valores do gene constitutivo rRNA 18S. A expressão da
MyoD nos alevinos foi significativamente maior em relação aos juvenis. Por outro lado,
a expressão da Miostatina foi similar nas duas fases de crescimento. Esses resultados
refletem o padrão de crescimento muscular característico dessa espécie, onde a
hiperplasia das fibras predomina nos alevinos e a hipertrofia predomina nos juvenis.
Palavras-chave: músculo estriado esquelético; morfologia; crescimento muscular;
fatores de regulação miogênica; miostatina; peixe.
10
2. ABSTRACT
In most fish skeletal muscle growth occurs by two mechanisms: hypertrophy
and/or hyperplasia of muscle fibers, through satellite cells or myoblasts. These
processes are controlled by the Myogenic Regulatory Factors (MRFs) and the growth
factor Myostatin. During giant fish growth stages, MRFs and Myostatin expression may
control muscle celullarity and growth mechanisms which directly influence fillet
quality. The aim of this work was to evaluate the morphological and growth
characteristics of skeletal muscle in pirarucu (Arapaima gigas), and MyoD and
Myostatin genes expression during alevin and juvenile growth phases. Alevin (50 day-
old) and juvenile (1 year-old) fish were weighed and then sacrificed. Muscle samples
were collected from dorsal, lateral anterior, and lateral posterior regions, and then
frozen in liquid nitrogen. Histological cuts (10µm) were stained with HE and Gomori
Trichrome in morphological analysis, and NADH-TR for muscle fiber metabolism
analysis. The smallest white fiber diameter was measured in dorsal and lateral anterior
muscle regions. White dorsal muscle was more developed than the others, and there
were distinct muscle layers on the lateral muscle: superficial red and deeper white
muscle. Muscle fiber distribution by diameter class allowed us to evaluate hyperplastic
and hypertrophic growth rate in pirarucu white skeletal muscle. White dorsal muscle
samples were used to determine MyoD and Myostatin genes expression by Polymerase
Chain Reaction after Reverse Transcription (RT-PCR). Semi-quantitative analysis was
performed by densitometry, and values normalized by constitutive gene 18S rRNA.
MyoD expression in alevin was significantly higher than in juvenile whereas Myostatin
expression was similar in both stages. These results reflect the muscle growth
characteristics in this specie, where hyperplasia predominates in alevin and hypertrophy
in juvenile.
Key-words: skeletal muscle; morphology; muscle growth; myogenic regulatory factors;
myostatin; fish.
11
3. INTRODUÇÃO
3.1. Morfologia do Músculo Estriado Esquelético
O tecido muscular estriado esquelético é um tecido complexo, dinâmico e possui
características peculiares de adaptação morfológica, metabólica e funcional frente aos
mais variados estímulos (Pette & Staron, 2000). Esse tecido é formado por células
modificadas e altamente especializadas, as fibras musculares, que são alongadas e
multinucleadas, com núcleos periféricos, localizados abaixo da membrana plasmática
(Figura 1). O diâmetro das fibras musculares pode variar de 10 a 100 µm e o
comprimento pode atingir 10 cm, dependendo da arquitetura do músculo (Dal Pai-Silva
et al., 2005). O sarcoplasma das fibras é constituído em sua totalidade por miofibrilas,
que apresentam estriações transversais, decorrentes da organização das proteínas e
filamentos contráteis em unidades de contração, denominadas sarcômeros (Huxley,
1969).
F
50 µm
FF
50 µm50 µm
Figura 1: Corte transversal das fibras do músculo Semitendinosus de bovino. Fibras musculares (F) e
mionúcleos periféricos (setas). HE. (adaptado de Carani et al., 2006)
Nos peixes, o músculo estriado esquelético pode ocupar de 40 a 75% da massa
corporal total. Essa abundante massa muscular não representa somente um mecanismo
específico para a adaptação desses animais ao meio aquático, mas serve como
importante fonte de proteínas utilizada na alimentação humana (Weatherley & Gill,
1985).
12
Na maioria das espécies de peixes, o músculo estriado é constituído por unidades
morfofuncionais, os miômeros, que se repetem ao longo do corpo e estão inseridos por
curtos tendões em bainhas de tecido conjuntivo, os miosseptos (Alexander, 1969)
(Figura 2). Essa disposição em unidades verticais repetidas confere a esses animais uma
maior mobilidade e destreza durante a realização dos movimentos ondulatórios da
natação (Van Leeuwen, 1999). Na região onde se encontra o nervo da linha lateral, um
septo de tecido conjuntivo, o septo transverso, separa a massa muscular em regiões
epiaxial e hipoaxial (Alexander, 1969; Greer Walker & Pull, 1975).
Figura 2: Esquema da organização anatômica da musculatura estriada esquelética nos peixes. A:
Localização dos miômeros e miosseptos. B: Detalhe do miômero na região anterior. C: Detalhe do
miômero na região posterior. (adaptado de Van Leeuwen, 1999)
Nos mamíferos, as fibras musculares estão envoltas por uma matriz extracelular
rica em carboidratos e proteínas, constituindo o tecido conjuntivo do músculo, que está
organizado em três bainhas: epimísio, que circunda todo o músculo, perimísio, que
divide o músculo em fascículos de fibras, e endomísio, que circunda cada fibra
muscular individualmente (Sanes, 2003; Kjaer, 2004) (Figura 3).
cone anterior
cone anterior
cone dorsal posterior
13
Figura 3: Estrutura da matriz extracelular do músculo esquelético de mamíferos. Músculo
Semitendinosus de bovino após remoção das proteínas das fibras musculares. A: Epimísio (EP); B:
Perimísio (P) e Endomísio (E); C: Detalhe do endomísio circundando uma fibra muscular esquelética.
Microscopia eletrônica de varredura. (adaptado de Kjaer, 2004)
Por outro lado, nos peixes, a distribuição do tecido conjuntivo no músculo
esquelético é específica para cada espécie e a concentração de colágeno também varia
na dependência do comportamento do animal, da atividade realizada durante os
movimentos natatórios e da fase de crescimento estudada (Sato et al., 1986; Ando et al.,
1992; Ofstad et al., 1996; Michelin, 2007). Em algumas espécies de peixes, o tecido
conjuntivo ao redor de cada fibra muscular recebe o nome de endomísio, e o tecido
conjuntivo mais espesso que separa as fibras musculares em grupos é classificado como
perimísio, semelhante aos mamíferos (Michelin, 2007; Almeida, 2007; Carani et al.,
2007) (Figura 4).
14
Figura 4: Corte transversal das fibras musculares do compartimento vermelho de juvenil de pacu
(Piaractus mesopotamicus). Endomísio (seta). Perimísio (cabeça de seta). Reticulina. (adaptado de
Michelin , 2007)
Os primeiros estudos envolvendo o tecido muscular classificavam os músculos
em “vermelhos” ou “brancos” (Ranvier, 1873). A cor vermelha está relacionada com a
presença da mioglobina e com o grau de vascularização do músculo. Com a utilização
de técnicas histoquímicas, observou-se que a maioria dos músculos estriados dos
mamíferos é constituída por uma população heterogênea de fibras, distribuídas em
mosaico, que apresentam características morfológicas, bioquímicas e fisiológicas
distintas (Dubowitz & Pearse, 1960). Inicialmente, as fibras musculares foram
classificadas em vermelhas, intermediárias e brancas (Ogata, 1958). Posteriormente, três
tipos principais de fibras musculares foram descritas, sendo denominadas de fibras dos
tipos I, IIA e IIB, de acordo com o padrão de reação para a atividade da ATPase da
porção globular da cadeia pesada da miosina (ATPase miofibrilar ou m-ATPase)
(Brooke & Kaiser, 1970).
Ashmore & Doerr (1971), utilizando a combinação das reações histoquímicas
para detecção da atividade das enzimas m-ATPase e succinato desidrogenase (SDH),
classificaram as fibras musculares como Red, Red e White. Posteriormente, Peter et
al. (1972), classificaram as fibras musculares em SO (slow oxidative), FOG (Fast
oxidative glycolytic) e FG (Fast glycolytic), baseando-se na combinação das reações
histoquímicas e na detecção da atividade das enzimas m-ATPase e Nicotinamida
Adenina Dinucleotídeo Tetrazólio Redutase (NADH-TR).
15
Estudos mais recentes, envolvendo a microdissecção de fibras e, associando a
reação histoquímica para m-ATPase com a técnica da eletroforese, possibilitaram a
separação de quatro isoformas de cadeia pesada da miosina (MHC), presentes nas fibras
musculares: MHC I, presente nas fibras do tipo I, MHC IIa, presente nas fibras do tipo
IIA, MHC IIb, presente nas fibras do tipo IIB, e MHC IId, presente nas fibras do tipo
IId (Termin et al., 1989). A MHC IId está presente nos músculos de pequenos
mamíferos e possui velocidade de contração intermediária entre as MHC IIa e MHC IIb
(Hilber et al., 1999).
As fibras do tipo I, IIa, IId e IIb são classificadas como fibras puras (Pette &
Staron, 1997; Staron et al., 1999). Porém, além das fibras puras, que expressam apenas
um tipo de RNA mensageiro para a MHC, há fibras que co-expressam diferentes genes
para a MHC (Biral et al., 1988; Aigner et al., 1993; Schiaffino & Reggiani, 1994;
Caiozzo et al., 2003). Essas fibras são denominadas de fibras híbridas ou polimórficas e
são classificadas de acordo com o tipo de MHC predominante: fibras IC (MHC I >
MHC IIa), fibras IIC (MHC IIa > MHC I), fibras IIAD (MHC IIa > MHC IId), fibras
IIBD (MHC IIb > MHC IId) (Staron & Pette, 1993; Di Maso et al., 2000).
A velocidade de contração de uma fibra muscular está diretamente relacionada
com o tipo de MHC (para revisão ver Talmadge et al., 1993). A MHC capaz de rápida
hidrólise do ATP é característica das fibras do tipo II, que são fibras de contração
rápida. Já a MHC de baixa atividade ATPásica é encontrada nas fibras do tipo I, de
contração lenta (Kelly & Rubinstein, 1994).
Nos peixes, as fibras musculares estão distribuídas em áreas ou compartimentos,
diferentemente do padrão de fibras em mosaico observado no músculo esquelético dos
mamíferos. Na maioria das espécies de peixes, as fibras distribuem-se entre os
compartimentos vermelho, intermediário e branco, e essa organização varia de acordo
com a espécie e a fase de crescimento estudada (Alexander, 1969; Weatherley & Gill,
1987).
As fibras musculares vermelhas normalmente são menores (25 a 45 µm de
diâmetro), apresentam velocidade lenta de contração e metabolismo oxidativo, alta
concentração de mioglobina, muitas mitocôndrias, lipídios e excelente suprimento
sangüíneo, sendo utilizadas pelo peixe na realização de movimentos lentos e de
sustentação, como durante a migração (Johnston, 1999). O músculo vermelho
(compartimento vermelho) pode aparecer na região subdermal como uma camada fina e
uniforme ao longo de todo o corpo do animal (Dal Pai-Silva et al., 1995) ou pode
16
apresentar distribuição mais localizada, concentrando-se somente na região do nervo da
linha lateral, onde assume aspecto triangular (Hoyle et al., 1986; Sänger & Stoiber,
2001) (Figura 5).
A maior parte da massa muscular dos peixes é formada pelo compartimento
branco (musculatura branca), localizado em uma região mais profunda do músculo e
formado por fibras musculares maiores (50 a 100 µm de diâmetro), que apresentam
velocidade de contração rápida e metabolismo glicolítico, baixa concentração de
mioglobina, poucas mitocôndrias e lipídios. As fibras musculares brancas dos peixes
são utilizadas durante os movimentos bruscos de natação, como na captura de alimento
e fuga de predadores (Driedzic & Hochachka, 1976; Johnston, 1980). Entre os
compartimentos branco e vermelho encontra-se o compartimento intermediário
(musculatura intermediária), reduzido a uma ou duas camadas de células, formado por
fibras de contração rápida e de metabolismo oxidativo/glicolítico (Johnston, 1981;
Weatherley & Gill, 1987; Zhang et al., 1996) (Figura 5).
Figura 5: Corte transversal da musculatura estriada esquelética da tilápia do Nilo (Oreochromis
niloticus). V: Compartimento vermelho superficial. I: Compartimento intermediário. B: Compartimento
branco profundo. NADH-TR. (adaptado de Aguiar et al., 2005)
17
3.2. Formação das Fibras Musculares: O Processo da Miogênese
Nos peixes, a formação das fibras musculares ocorre nas fases iniciais da
embriogênese. O mesoderma paraxial, localizado adjacente à notocorda e ao tubo neural
em formação, segmenta-se na direção rostro-caudal do embrião formando os somitos
(Kimmel et al., 1990). Cada somito é formado por uma porção ventral (esclerótomo),
que dará origem ao esqueleto e à cartilagem do embrião, e uma dorsal (dermomiótomo),
que formará a derme e as musculaturas do tronco e da cauda (Currie & Ingham, 2001).
Nos somitos, uma população de células cubóides mesodérmicas dispõe-se em
uma única camada ao redor da notocorda (Figura 6). Essas células são conhecidas como
células adaxiais, células musculares não-pioneiras ou mioblastos “slow” (Thisse et al.,
1993; Currie & Ingham, 2001; Johnston & Hall, 2004; Ochi & Westerfield, 2007). Sob
o estímulo de glicoproteínas secretadas pela notocorda e pelo tubo neural (Blagden et
al., 1997; Chargé & Rudnicki, 2004), essas células migram em direção à superfície do
miótomo e formam uma única camada abaixo da epiderme. Elas se fundem umas às
outras, dando origem aos miotubos multinucleados, que se diferenciam em fibras
musculares vermelhas para formar a musculatura vermelha do embrião (Blagden et al.,
1997; Currie & Ingham, 2001; Johnston & Hall, 2004; Ochi & Westerfield, 2007)
(Figura 6).
Um subgrupo das células adaxiais não migra para a região superficial; ao invés
disso, elas se alongam, atravessando toda a extensão do miótomo, e formam as fibras
mononucleadas, conhecidas como fibras musculares pioneiras. Essas fibras permanecem
conectadas à notocorda através de processos citoplasmáticos, o que possibilita orientar a
migração das demais células adaxiais em direção à superfície do miótomo. As fibras
pioneiras concentram-se na região de formação do septo horizontal e são as primeiras a
apresentarem atividade contrátil. No final da fase embrionária e depois da eclosão, as
demais células do miótomo (mioblastos “fast” ou células pré-somíticas) fundem-se para
formar os miotubos, que se diferenciam em fibras musculares brancas, dando origem à
musculatura branca do embrião (Devoto et al., 1996; Currie & Ingham, 2001; Johnston
& Hall, 2004; Ochi & Westerfield, 2007) (Figura 6).
18
Células
Pré-somíticas
Laterais
Células
Adaxiais
Fibras Pioneiras
Células Musculares
“fast”
Células Musculares
“slow”
TN
ME
A
B
Células
Pré-somíticas
Laterais
Células
Adaxiais
Fibras Pioneiras
Células Musculares
“fast”
Células Musculares
“slow”
TN
ME
Células
Pré-somíticas
Laterais
Células
Adaxiais
Fibras Pioneiras
Células Musculares
“fast”
Células Musculares
“slow”
TN
ME
A
B
Figura 6: Esquema da formação dos tipos de fibras musculares em zebrafish (Danio rerio). A: Corte
transversal do embrião na fase final de gastrulação, mostrando as Células Adaxiais (vermelho) adjacentes
à notocorda (N). As setas vermelhas indicam que as Células Adaxiais migram em direção à superfície do
miótomo, onde formarão as fibras musculares “slow”. As Células Pré-somíticas Laterais (branco)
ocupam toda a extensão do miótomo e formarão as fibras musculares “fast”. B: Corte transversal do
embrião no estágio de 24 horas pós-fertilização. As Células “slow” formam uma camada abaixo da
epiderme, constituindo a musculatura vermelha superficial do embrião. As Células “fast” organizam-se
por todo o restante do miótomo, formando a musculatura branca profunda. TN: Tubo Neural; N:
Notocorda; ME: Medula Espinhal. (adaptado de Du et al., 1997)
3.3. Crescimento do Músculo Estriado Esquelético
O desenvolvimento e o crescimento do tecido muscular estriado esquelético nos
peixes envolve uma população de células precursoras miogênicas ou mioblastos
indiferenciados (Alfei et al., 1994; Koumans et al., 1994; Johnston et al., 1998;
Rowlerson & Veggetti, 2001), análogos às células miossatélites descritas em mamíferos
(Mauro, 1961). Essas células são ativadas durante o crescimento pós-natal e na
regeneração da musculatura esquelética (Seale et al., 2004) e estão localizadas entre a
lâmina basal e a membrana plasmática das fibras musculares, estando distribuídas
uniformemente ao longo da fibra muscular (Johnston et al., 1998) (Figura 7).
19
Figura 7: Cortes transversais do músculo esquelético de rato. A: Fotomicrografia mostrando a
localização da célula miossatélite (seta) na periferia da fibra muscular. B: Eletromicrografia mostrando
detalhe do núcleo da célula satélite (seta clara) e do núcleo da fibra muscular (seta escura). HE e
Microscopia eletrônica de transmissão.
Nos peixes, o crescimento muscular ocorre mediante a proliferação e a
diferenciação dos mioblastos (Alfei et al., 1994; Johnston et al., 2000). Quando ativados
por sinais celulares, os mioblastos proliferam, diferenciam-se e os núcleos são
internalizados às fibras musculares pré-existentes, aumentando o número de núcleos
para maior síntese de miofibrilas, ocasionando, dessa forma, o aumento no diâmetro ou
área das fibras. Esse processo é conhecido como hipertrofia (Koumans & Akster, 1995;
Johnston, 1999; Rowlerson & Veggetti, 2001) (Figura 8). Por outro lado, os mioblastos
em proliferação podem agregar-se à superfície de fibras musculares pré-existentes e
formar novos miotubos multinucleados. Os miotubos se separam das fibras, originando
novas fibras musculares, processo conhecido como hiperplasia (Veggetti et al., 1990;
Koumans et al., 1994; Johnston, 1999; Johnston et al., 2000; Dal Pai Silva et al., 2003a,
b) (Figura 8).
A
B
20
Figura 8: Esquema demonstrativo dos principais mecanismos de crescimento muscular pós-natal nos
peixes: hipertrofia e hiperplasia. A população de mioblastos indiferenciados contribui para o crescimento
hipertrófico e hiperplásico do músculo esquelético, sob influência dos Fatores de Regulação Miogênica
(MRFs) e dos Fatores de Crescimento. (adaptado de Johnston, 1999)
A hiperplasia das fibras musculares nos peixes pode ocorrer de duas formas: 1)
hiperplasia estratificada, a partir de zonas germinais de proliferação celular, localizadas
nas regiões dorsal e ventral dos miômeros, sendo responsável pelo espessamento das
camadas musculares nas fases iniciais do desenvolvimento; e 2) hiperplasia em
mosaico, que resulta em grande aumento no número de fibras musculares, sendo
observada principalmente na musculatura branca de juvenis das espécies de peixe que
atingem tamanho grande (Rowlerson & Veggetti, 2001). Quando a hiperplasia em
mosaico está ocorrendo, observam-se fibras pequenas (diâmetro menor que 25 µm)
entre fibras maiores, formando um mosaico de fibras de diferentes tamanhos e estágios
de diferenciação (Johnston, 1999; Rowlerson & Veggetti, 2001; Xu et al., 2003) (Figura
9).
21
Figura 9: Esquema representativo dos tipos de crescimento muscular hiperplásico em peixes. Hiperplasia
estratificada (A) e hiperplasia em mosaico (B). TN = tubo neural, N = notocorda, BE = fibras musculares
brancas embrionárias, ZPM = Zona de Proliferação de Mioblastos, V = fibras musculares vermelhas, LL =
linha lateral, CV = coluna vertebral, B = fibras musculares brancas, I = fibras musculares intermediárias.
(adaptado de Rowlerson & Veggetti, 2001)
Nos mamíferos a hiperplasia cessa em um curto período após o desenvolvimento
embrionário (Goldspink et al., 1972; Johnston et al., 2000). Nos peixes, a relativa
contribuição da hiperplasia e da hipertrofia no crescimento muscular tem sido estudada
em muitas espécies e foi verificado que nas espécies de crescimento rápido e que
atingem um tamanho grande, a hiperplasia das fibras persiste por um período de tempo
maior (Kiessling et al., 1991; Valente et al., 1999; Rowlerson & Veggetti, 2001; Carani
et al., 2007). Por outro lado, nas espécies de menor tamanho, a hiperplasia das fibras
cessa nos estágios iniciais de desenvolvimento e a hipertrofia torna-se o mecanismo de
crescimento muscular predominante nessa fase de desenvolvimento (Veggetti et al.,
1993; Koumans & Akster, 1995).
22
3.4. Controle Molecular da Miogênese e do Crescimento Muscular
3.4.1) Fatores de Regulação Miogênica (MRFs)
Nos peixes, assim como nos mamíferos, tanto a miogênese como o crescimento
muscular pós-natal envolvem a proliferação e a diferenciação das células miossatélites
ou mioblastos. Esses processos são regulados por diversos fatores, entre eles os fatores
transcricionais músculo-específicos, coletivamente chamados de Fatores de Regulação
Miogênica (MRFs), dos quais fazem parte a MyoD, Miogenina, Myf5 e MRF4 (Watabe,
2001; Rescan, 2001; Johansen & Overturf, 2005).
Esses fatores são fosfoproteínas nucleares que contêm um domínio altamente
conservado, evolutivamente, de aproximadamente 60 aminoácidos, conhecido como
“basic Helix-Loop-Helix” (bHLH) (Figura 10). Esses fatores ligam-se a seqüências de
DNA (5´-CANNTG-3´), conhecidas como Ebox, presentes na região promotora de
muitos genes músculo–específicos, levando à expressão dos mesmos. Além disso,
podem iniciar a transcrição de seus próprios genes durante o crescimento (Murre et al.,
1989; Sassoon, 1993). A região “Helix-Loop-Helix” do MRF constitui o domínio de
ligação dessa molécula com outra idêntica a ela, formando um homodímero, e também
constitui a região de ligação do MRF com as proteínas E, que atuam como cofatores dos
MRFs, formando um heterodímero. A ligação do homodímero MRF-MRF ou do
heterodímero MRF-Proteína E à seqüência Ebox é que promove a ativação da
transcrição dos genes músculo-específicos (Rudnick & Jaenisch, 1995; Watabe, 1999;
Sabourin & Rudnicki, 2000; Rescan, 2001).
23
Figura 10: Estrutura cristalográfica do complexo formado pelo homodímero do MRF MyoD e o DNA.
(adaptado de Ma et al., 1994)
Na diferenciação do músculo esquelético, o comprometimento das células
somíticas do mesoderma com a linhagem miogênica é marcado pela expressão dos
MRFs MyoD e Myf5. Esses fatores são conhecidos como fatores primários, sendo
expressos pelos mioblastos na fase de proliferação, que antecede a fase de diferenciação
(Goulding et al., 1994; Williams & Ordahl, 1994).
Embora a MyoD e o Myf5 definam a identidade dos mioblastos, as células
precursoras somíticas devem ser “pré-comprometidas” com a linhagem miogênica antes
da expressão dos MRFs. No embrião, esse “pré-comprometimento” é realizado pelo
fator transcricional Pax3, da família Pax (do inglês, Paired-box), o qual é expresso em
células do mesoderma pré-somítico e dos primeiros somitos epiteliais (Goulding et al.,
1994; Williams & Ordahl, 1994) (Figura 11).
Os mioblastos que saem do ciclo celular, positivos para Myf5 e MyoD, tornam-
se miócitos mononucleados diferenciados e iniciam a expressão dos MRFs Miogenina e
MRF4, os quais regulam a fusão dessas células entre si, formando os miotubos
multinucleados, e a diferenciação dos miotubos em fibras musculares (Megeney &
Rudnicki, 1995; Grobet et al., 1997) (Figura 11). Finalmente, terminado o processo da
miogênese, o músculo esquelético torna-se um tecido estável, caracterizado por fibras
musculares adultas multinucleadas (Decary et al., 1997; Schmalbruch & Lewis, 2000).
24
Figura 11: Células somíticas mesodermais tornam-se células comprometidas com a linhagem miogênica
(células precursoras) e passam a expressar Pax3, que contribui para a expansão das células miogênicas.
Sob controle dos MRFs MyoD e Myf5, as células precursoras tornam-se células da linhagem miogênica,
os mioblastos, que iniciam a proliferação. A expressão de Miogenina e MRF4 controla a diferenciação
dos mioblastos em miotubos, que posteriormente se diferenciam para formar as miofibras maduras.
(adaptado de Zammit et al., 2006)
Os MRFs Miogenina e MyoD também podem estar envolvidos com a
manutenção do fenótipo da fibra muscular adulta, rápida ou lenta. A Miogenina é
expressa em níveis superiores aos da MyoD em músculos lentos, enquanto que o oposto
é verdadeiro para músculos rápidos (Hughes et al., 1993; Voytik et al., 1993).
3.4.2) Fatores de Crescimento
O crescimento do músculo esquelético nos peixes é um processo altamente
organizado, que envolve a ativação da proliferação e diferenciação das células
miossatélites (Johnston, 1999). A ativação das células miossatélites requer um aumento
controlado da expressão dos genes músculo-específicos, relacionados ao crescimento.
Esse processo pode ser regulado por fatores extracelulares, como os FGFs (Fibroblast
Growth Factors), TGFs (Transforming Growth Factors), IGFs (Insulin-like Growth
Factors), HGFs (Hepatocyte Growth Factors), TNFs (Tumor Necrosis Factors) e IL-6
(Interleukin-6), que estão envolvidos no controle da proliferação e diferenciação das
células miossatélites (para revisão ver Hawke & Garry, 2001; Stamler & Meissner,
2001).
O IGF-I (Insulin-like Growth Factor I) é essencial para o crescimento e
desenvolvimento normais do indivíduo. É o mediador das funções de crescimento pós-
Célula
somítica
mesodermal
Célula
precursora
Mioblastos
Miócitos
Miotubo
Miofibra adulta
Pax3
MyoD/Myf5
Miogenina/MRF4
Célula
somítica
mesodermal
Célula
precursora
Mioblastos
Miócitos
Miotubo
Miofibra adulta
Célula
somítica
mesodermal
Célula
precursora
Mioblastos
Miócitos
Célula
somítica
mesodermal
Célula
precursora
Célula
somítica
mesodermal
Célula
precursora
Mioblastos
Miócitos
MiotuboMiotubo
Miofibra adulta
Pax3
MyoD/Myf5
Miogenina/MRF4
25
natal exercidas pelo GH (hormônio do crescimento) e a principal fonte de IGF-I é o
fígado, o qual supre aproximadamente 75% do IGF-I total circulante no corpo
(Schwander et al., 1983).
Vários estudos demonstraram que o IGF-I é mediador da hipertrofia do músculo
esquelético (Adams & McCue, 1998; Musaro et al., 2001). Segundo Florini et al.
(1993), o IGF-I aumenta a massa e a força musculares através de dois mecanismos
principais: 1) atua diretamente sobre as fibras musculares, aumentando a síntese de
proteínas e a massa muscular, 2) estimula a fusão das células miossatélites às fibras
musculares pré-existentes, auxiliando no reparo de regiões danificadas das fibras e
promovendo o crescimento muscular. Este processo é similar ao que acontece durante a
formação do tecido muscular esquelético, onde tanto a fusão como a diferenciação dos
mioblastos é regulada pelo IGF-I, mediante a ativação da via de sinalização PI3K/Akt
(Phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase) (Noguchi, 2005).
Os fatores de crescimento da superfamília dos TGF- (Transforming Growth
Factors ) são importantes citocinas que regulam o crescimento muscular, inibindo
tanto a proliferação como a diferenciação dos mioblastos (Allen & Boxhorn, 1989;
Greene & Allen, 1991; Lefaucheur et al., 1996). Mais recentemente, a Miostatina ou
GDF-8 (Growth and Differentiation Factor 8) foi identificada como um novo membro
da família TGF- (McPherron et al., 1997). A Miostatina é um fator de crescimento
considerado essencial, pois promove a regulação do desenvolvimento e do crescimento
do músculo estriado esquelético nos vertebrados (McPherron et al., 1997). Durante a
formação das fibras musculares, a expressão da Miostatina é restrita aos miótomos em
desenvolvimento, porém, continua associada às células da linhagem miogênica durante
o crescimento pós-natal e na fase adulta (McPherron et al., 1997).
A principal função da Miostatina é regular negativamente o crescimento
muscular, conforme demonstrado em numerosos estudos usando linhagens de células
musculares esqueléticas, camundongos knockout para Miostatina, bovinos e humanos
(Grobet et al., 1997; Kambadur et al., 1997; McPherron et al., 1997; McPherron & Lee,
1997; Lee & McPherron, 1999; Schuelke et al., 2004).
Nos animais knockout para Miostatina ocorre um aumento significativo da
massa muscular, decorrente de maior hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares
durante as fases embrionária e fetal (McPherron et al., 1997; Oldham et al., 2001). A
Miostatina pode controlar o número de fibras musculares a serem formadas, regulando a
26
proliferação e a diferenciação dos mioblastos (Thomas et al., 2000; Langley et al.,
2002).
Alguns trabalhos sugerem que a Miostatina inibe a proliferação e diferenciação
dos mioblastos, através da diminuição da expressão dos MRFs (Langley et al., 2002;
Rios et al., 2002; Joulia et al., 2003). A super-expressão da Miostatina inibe a expressão
dos MRFs MyoD, Myf-5 e Miogenina. Por outro lado, a inativação da Miostatina em
camundongos e bovinos pode aumentar a expressão da MyoD e da Miogenina, levando
a um aumento na proliferação dos mioblastos e a um intenso crescimento muscular
devido à hiperplasia das fibras (Langley et al., 2002; Joulia et al., 2003). O mecanismo
de ação da Miostatina sobre o músculo esquelético dos peixes ainda não é bem
compreendido; entretanto, a expressão de MyoD e Miogenina mostrou-se aumentada
após inativação da Miostatina, indicando, assim, a sua possível influência sobre as vias
da miogênese controladas pelos MRFs (Amali et al., 2004).
Nos animais adultos, a Miostatina parece atuar sobre as células miossatélites,
mantendo-as em um estado quiescente, suprimindo a proliferação e/ou a diferenciação.
Quando necessário, a atividade da Miostatina é inibida e as células miossatélites são
ativadas (Lee, 2004).
O gene da Miostatina foi identificado em muitas espécies, incluindo alguns
peixes (Maccatrozzo et al., 2001a,b; Rescan et al., 2001; Roberts et al., 2001; Rodgers
et al., 2001; Radaelli et al., 2003; Amali et al., 2004), onde o mRNA da Miostatina foi
encontrado no músculo, olhos, brânquias, intestino, gônadas, cérebro e rim. Nos
mamíferos, ao contrário dos peixes, a expressão da Miostatina ocorre principalmente no
músculo esquelético, embora o mRNA tenha sido identificado em menor quantidade nas
fibras de Purkinje e cardiomiócitos (Sharma et al., 1999; Shyu et al., 2005; Morissette
et al., 2006), e também nas glândulas mamárias (Ji et al., 1998). Apesar de estudos
recentes indicarem que a Miostatina pode influenciar o crescimento do músculo
cardíaco (Shyu et al., 2005; Morissette et al., 2006) e, possivelmente, a diferenciação
dos adipócitos (Kim et al., 2001; Zimmers et al., 2002; Rebbapragada et al., 2003), sua
função primordial é regular negativamente o crescimento do músculo estriado
esquelético (Helterline et al., 2007).
No músculo estriado de zebrafish (Danio rerio), peixe que atinge um tamanho
final de poucos centímetros, a expressão da Miostatina é baixa na fase larval, onde o
crescimento muscular por hiperplasia é mais acentuado. Já nas fases juvenil e adulta,
onde o crescimento muscular hiperplásico é baixo, a expressão da Miostatina apresenta-
27
se aumentada, demonstrando que a mesma exerce uma função inibitória sobre o
crescimento muscular hiperplásico nesta espécie (Xu et al., 2003). Além disso, o
bloqueio da atividade da Miostatina em zebrafish, por meio da técnica do iRNA
(interference RNA), produziu animais com um aumento expressivo no peso corporal
devido à hipertrofia e hiperplasia das fibras musculares (Acosta et al., 2005).
A compreensão dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos no controle
do desenvolvimento e do crescimento muscular dos peixes é importante para a
aqüicultura, uma vez que o padrão de crescimento e a celularidade muscular podem ser
determinantes da qualidade da carne.
4. OBJETIVOS
Avaliar no músculo estriado esquelético de alevinos e juvenis de pirarucu
(Arapaima gigas):
1. As características morfológicas e de crescimento;
2. A expressão gênica da MyoD e da Miostatina.
28
5. CAPÍTULOS:
5.1. Capítulo 1
MORFOLOGIA E CRESCIMENTO DO MÚSCULO ESTRIADO
ESQUELÉTICO NO PIRARUCU (ARAPAIMA GIGAS CUVIER
1817)
Morphology and skeletal muscle growth in pirarucu (Arapaima gigas Cuvier 1817)
FERNANDA REGINA CARANI
1
, DANILO HENRIQUE AGUIAR
1
,
FERNANDA
LOSI ALVES DE ALMEIDA
1
, HENRIQUE SANTOS GONÇALVES
1
, CARLOS
ROBERTO PADOVANI
2
, MAELI DAL PAI SILVA
1*
1
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências (IB), Universidade Estadual Paulista (UNESP),
campus de Botucatu, Distrito de Rubião Jr, s/n, SP, Brasil;
2
Departamento de Bioestatística, Instituto de
Biociências (IB), Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus de Botucatu, Distrito de Rubião Jr,
s/n, SP, Brasil;
*
Autor para correspondência. E-mail: [email protected]esp.br.
Título resumido: Músculo estriado esquelético em Arapaima gigas.
Submetido para publicação na revista Acta Scientiarum, Biological Sciences, 2007.
29
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar as características morfológicas e de crescimento do
músculo estriado esquelético no pirarucu (Arapaima gigas). Foram utilizados animais
em duas fases de crescimento: alevinos, com 50 dias de idade, e juvenis, com um ano de
idade. Após o sacrifício, fragmentos musculares das regiões dorsal, lateral anterior e
lateral posterior foram coletados e congelados em nitrogênio líquido. Cortes
histológicos (10 µm) foram submetidos às colorações HE e Tricrômico de Gomori para
a análise morfológica, e NADH-TR para a análise do metabolismo oxidativo das fibras
musculares. Foi calculado o menor diâmetro das fibras musculares brancas nas regiões
dorsal e lateral anterior. A musculatura dorsal branca mostrou-se mais desenvolvida e
na musculatura lateral observou-se compartimentos distintos: superficial vermelho e
branco profundo. Nos alevinos, o crescimento muscular ocorreu predominantemente por
hiperplasia das fibras e, nos juvenis, predominou o crescimento muscular por
hipertrofia.
Palavras-chave: morfologia; músculo estriado esquelético; crescimento muscular;
Arapaima gigas.
ABSTRACT
The aim of this work was to evaluate the morphological and growth characteristics of
skeletal muscle tissue in pirarucu (Arapaima gigas) using alevins (50 days old) and
juveniles (1 year old). Muscle samples were collected from dorsal, lateral anterior, and
lateral posterior regions, and then frozen in liquid nitrogen. Hystological frozen sections
(10µm) were stained with HE and Gomori Trichrome for morphological analysis, and
NADH-TR to evaluate muscle fiber oxidative metabolism. Morphometric analysis
samples were obtained from dorsal and lateral anterior regions, and smallest diameter
white fibers were measured. White dorsal muscle was thicker and two muscle fiber
compartments were identified in the lateral anterior region: red (superficial) and white
(deep) muscle. Hyperplasia muscle growth predominated in alevins and hypertrophy in
juveniles.
Key words: morphology; skeletal muscle; muscle growth; Arapaima gigas.
30
INTRODUÇÃO
Nos peixes, a maior parte da massa corporal é constituída pelo músculo estriado
esquelético (40 a 75% do peso total). Este tecido está organizado em unidades
morfofuncionais, os miômeros, que se repetem ao longo do corpo do animal, e são
separados por bainhas de tecido conjuntivo, os miosseptos (Alexander, 1969). Na região
do nervo da linha lateral existe um septo de tecido conjuntivo que separa a massa
muscular em regiões epiaxial e hipoaxial, o septo transverso (Alexander, 1969; Grizzle
& Rogers, 1979).
Na maioria das espécies de peixes as fibras musculares estão distribuídas em
áreas ou compartimentos distintos, diferente do padrão de distribuição em mosaico
observado nos mamíferos (Bahler et al., 1968; Close, 1972). Nos peixes, a maior parte
da massa muscular é formada pelo compartimento branco (musculatura branca), com
fibras musculares maiores (até 100 µm de diâmetro), de contração rápida e metabolismo
glicolítico, que possuem baixa concentração de mioglobina, além de poucas
mitocôndrias e lipídeos (Sänger, 1990; Sänger, 1992). Essas fibras são utilizadas
durante a realização de movimentos bruscos de natação, como na captura de alimento
ou durante a fuga de predadores (Driedzic & Hochachka, 1976; Johnston, 1980). O
compartimento vermelho (musculatura vermelha), localizado na região superficial
adjacente ao tegumento, é formado por fibras menores (até 45 µm de diâmetro), de
contração lenta e metabolismo oxidativo, que apresentam alta concentração de
mioglobina, muitas mitocôndrias, lipídeos e excelente suprimento sanguíneo, sendo
utilizadas pelo peixe na realização de movimentos lentos e de sustentação, como
durante a migração (Driedzic & Hochachka, 1976; Johnston, 1980). Entre essas duas
áreas distintas encontra-se o compartimento intermediário (musculatura intermediária)
com características morfofisiológicas intermediárias entre as fibras vermelhas e brancas
(Johnston, 1981; Weatherley & Gill, 1987; Zhang et al., 1996; Sänger & Stoiber, 2001).
A musculatura branca dos peixes ocupa em torno de 60% do volume da massa
muscular total. Por outro lado, a musculatura vermelha não ultrapassa 30% da
musculatura miotomal e está restrita à região da linha lateral, aumentando em espessura
na direção antero-posterior do animal (Gill et al., 1989).
O crescimento pós-natal do tecido muscular esquelético nos peixes envolve os
mecanismos de hipertrofia e hiperplasia das fibras, a partir da proliferação dos
mioblastos indiferenciados ou células miossatélites (Alfei et al., 1994; Johnston, 1999;
Johnston et al., 2000; Dal Pai-Silva et al., 2003a, b). Na hipertrofia as células
31
miossatélites se fundem a fibras musculares existentes, aumentando o número de
núcleos para maior síntese de miofibrilas, enquanto que, na hiperplasia, ocorre a
formação de novas fibras musculares (Koumans et al., 1993; Johnston et al., 2000).
Quando a hiperplasia está ocorrendo, observa-se um mosaico de fibras com
diferentes diâmetros (fibras grandes e pequenas associadas), e predominam fibras com
diâmetro menor que 25 µm. Esse padrão de organização das fibras é melhor observado
na musculatura branca (Veggetti et al., 1993; Johnston, 1999).
A contribuição da hipertrofia e da hiperplasia no crescimento do tecido muscular
pode variar de acordo com a espécie e a fase de crescimento estudadas (Brooks &
Johnston, 1993; Johnston, 1993). Nos mamíferos, a hiperplasia cessa em um curto
período de tempo após o nascimento (Goldspink et al., 1972; Johnston et al., 2000). Nos
peixes que atingem um tamanho pequeno, o crescimento muscular pós-natal ocorre
principalmente por hipertrofia das fibras e a hiperplasia ocorre somente nas fases
iniciais do desenvolvimento. Por outro lado, nas espécies de peixe de crescimento
indeterminado e que atingem um tamanho maior a hiperplasia das fibras estende-se por
um período de tempo mais prolongado (Weatherley et al., 1988; Alami-Durante et al.,
1997, Rowlerson & Veggetti, 2001).
O pirarucu (Arapaima gigas), peixe nativo do Brasil e exclusivo da Bacia
Amazônica, pertence à família Osteoglossidae (Li & Wilson, 1996) e é uma espécie que
possui rápido crescimento, podendo alcançar até 3 metros de comprimento e pesar 250
Kg, quando atinge a fase adulta (Souza & Val, 1991). Esta espécie possui elevado
interesse econômico para a aqüicultura e sua criação em regime intensivo vem se
apresentando como uma alternativa economicamente viável para a piscicultura,
otimizando o aproveitamento da musculatura na alimentação.
O objetivo deste trabalho foi analisar as características morfológicas e o
crescimento do músculo estriado esquelético em alevinos e juvenis de pirarucu
(Arapaima gigas).
MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia do Músculo Estriado
no Departamento de Morfologia – IB, UNESP, Botucatu-SP. Foram utilizados
exemplares de pirarucu (Arapaima gigas) em duas fases de crescimento: alevinos, com
50 dias de idade (n=5; 47,94±3,64g), e juvenis, com um ano de idade (n=4;
5705,00±1979,30g). Os alevinos foram trazidos da Piscicultura Águas Claras, Mococa,
32
SP, para o laboratório, anestesiados com MS-222 (Tricaine Methanensulfonate –
SIGMA
) e sacrificados para a coleta das amostras musculares. A coleta das amostras
dos exemplares juvenis foi realizada na Piscicultura, após o sacrifício dos mesmos em
um tanque coberto com gelo. Os fragmentos musculares foram retirados das regiões
dorsal (epiaxial), lateral anterior (na região da linha lateral próxima à nadadeira anal), e
lateral posterior (próximo à nadadeira caudal), conforme o esquema da Figura 1.
As amostras musculares foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas
em freezer a -80°C. Cortes histológicos (10 µm), obtidos em criostato, foram
submetidos às colorações HE (Hematoxilina-Eosina) e Tricrômico de Gomori para
avaliação do padrão morfológico das fibras musculares, e NADH-TR (Nicotinamida
Adenina Dinucleotídeo – Tetrazólio Redutase) para avaliação do metabolismo oxidativo
das fibras.
Foi calculado o menor diâmetro das fibras musculares brancas das regiões dorsal
e lateral anterior. Utilizando um sistema de análise de imagens (Leica QWin), foi
mensurado o menor diâmetro de uma população de 200 fibras musculares por animal,
em cada região analisada. Para avaliar o padrão de crescimento hiperplásico e
hipertrófico da musculatura branca do pirarucu, as fibras musculares foram distribuídas
em classes, na dependência do seu diâmetro (<10µm, 10-20µm, 20-30µm, 30-50µm,
50-80µm e >80µm), conforme metodologia adaptada de Veggetti et al. (1990) e Valente
et al. (1999).
Para a análise estatística da freqüência das fibras em classes de diâmetros foi
utilizado o Teste de Goodman para contrastes entre e dentro de proporções multinomiais
(Goodman, 1964; Goodman, 1965).
33
Figura 1: (A) Foto de alevino de pirarucu (Arapaima gigas). (B) Esquema representativo das regiões de
coleta das amostras musculares. (1) região dorsal; (2) região lateral anterior; (3) região lateral posterior.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Análise Anatômica
A musculatura estriada esquelética do pirarucu, tanto nos alevinos como nos
juvenis, está dividida em regiões epiaxial e lateral, separadas por um septo de tecido
conjuntivo, o septo transverso (Figura 2). As fibras musculares estão organizadas em
miômeros, unidades morfofuncionais, que se repetem ao longo do corpo e são separadas
por bainhas de tecido conjuntivo, os miosseptos, onde as fibras estão inseridas. Esse
padrão de organização é semelhante ao observado em outras espécies de peixes
(Alexander, 1969; Grizzle & Rogers, 1979; Dal Pai-Silva et al., 1995).
Nas duas fases de crescimento, a musculatura epiaxial do pirarucu aparece mais
desenvolvida do que a musculatura lateral na região cranial do animal. No sentido
antero-posterior, a musculatura da região epiaxial torna-se gradativamente mais
delgada, chegando a mesclar-se com a musculatura lateral, próximo à região onde tem
início a nadadeira caudal. No entanto, nessa região, a musculatura lateral torna-se mais
espessa e desenvolvida (Figura 2).
A
1
2
3
B
34
Figura 2: (A) Esquema representativo do corte transversal de pirarucu (Arapaima gigas). Observar a
musculatura epiaxial (E) desenvolvida e a musculatura lateral (L). Observar o septo de tecido conjuntivo
que separa essas duas regiões (septo). (B) Detalhe do alevino de pirarucu, mostrando a musculatura
epiaxial deslocada para cima (seta escura). (C) Corte transversal da região anterior do alevino de
pirarucu. Notar a musculatura epiaxial bem desenvolvida (seta clara).
Análise Morfológica
Considerando-se as duas fases de crescimento e as regiões analisadas, as fibras
da musculatura estriada do pirarucu exibiram padrão morfológico normal, sendo
poligonais ou arredondadas, multinucleadas e com núcleos periféricos. As fibras
E
L
septo
A
B
C
35
apresentaram diferentes tamanhos, separadas por tecido conjuntivo frouxo, o endomísio,
e organizadas em fascículos por um septo mais espesso de tecido conjuntivo,
constituindo uma estrutura semelhante ao perimísio (Figura 3). Esse padrão de
organização das fibras, observado tanto na musculatura da região dorsal como na
musculatura da região lateral dos animais, é similar ao padrão observado na maioria das
espécies de peixes estudadas (Alexander, 1969; Hoyle et al., 1986; Dal Pai-Silva et al.,
1995; Dal Pai et al., 2000; Fernandez et al., 2000; Aguiar et al., 2005).
Figura 3: Cortes transversais do músculo branco de alevinos (A e B) e juvenis (C e D) de pirarucu
(Arapaima gigas). A e C: região dorsal; B e D: região lateral anterior. Observar as fibras musculares
poligonais (F), separadas pelo endomísio (*). Notar uma camada espessa de tecido conjuntivo, o
perimísio (seta). HE.
Nas duas fases de crescimento estudadas, o perimísio mostrou uma organização
diferenciada, formando camadas circulares concêntricas de tecido conjuntivo mais
espesso, envolvendo os grupos de fibras musculares. Esse arranjo circular foi observado
na musculatura dorsal e na musculatura lateral posterior (Figura 4).
B
F
F
*
A
F
F
*
C
F
*
D
F
*
36
A associação entre as fibras musculares e o tecido conjuntivo é importante para a
manutenção da integridade e função do músculo (Cohn & Campbell, 2000; Takala &
Virtanen, 2000). Nos peixes, a distribuição do tecido conjuntivo no músculo esquelético
é específica para cada espécie e a concentração de colágeno também varia na
dependência do comportamento e da atividade realizada durante os movimentos
natatórios (Sato et al., 1986; Ando et al., 1992; Ofstad et al., 1996). No pirarucu, o
tecido conjuntivo espesso fornece uma estrutura de suporte e sustentação do corpo, no
momento em que a força de contração das fibras musculares é transmitida, através do
perimísio, ao esqueleto axial e nadadeira caudal, gerando a ondulação do corpo e o
movimento de propulsão, importante nas espécies de grande tamanho (Chiquet et al.,
1996; Sänger & Stoiber, 2001).
Figura 4: Corte transversal da musculatura dorsal (A) e lateral posterior (B) de alevinos de pirarucu
(Arapaima gigas). Perimísio organizado em camadas concêntricas espessas (*), envolvendo os grupos de
fibras (F). Tricrômico de Gomori.
Após a realização da reação histoquímica para NADH-TR, a musculatura dorsal
do pirarucu mostrou-se constituída predominantemente por fibras musculares com fraca
intensidade de reação para a enzima. Por outro lado, a musculatura lateral mostrou-se
constituída por dois compartimentos distintos de fibras: o compartimento superficial,
presente na região da linha lateral, formado por fibras musculares pequenas, com forte
reação para a enzima NADH-TR, e o compartimento profundo, mais espesso, formado
por fibras musculares maiores, de fraca intensidade de reação para a enzima NADH-TR.
Na região lateral anterior, o compartimento profundo aparece muito
F
*
B
*
F
A
37
desenvolvido; porém, na direção antero-posterior do animal, esse compartimento torna-
se mais delgado e o compartimento superficial aparece mais espesso e desenvolvido
(Figura 5).
Figura 5: Cortes transversais da musculatura dorsal (A e C), lateral anterior (B e D) e lateral posterior (E)
de alevinos (A e B) e juvenis (C, D e E) de pirarucu (Arapaima gigas). Observar na região dorsal a
predominância de fibras musculares com fraca reação enzimática (F), agrupadas pelo perimísio (*).
Observar nas regiões lateral anterior e posterior as fibras musculares do compartimento superficial (S),
com forte reação enzimática, e as fibras do compartimento profundo (P), com fraca intensidade de reação.
NADH-TR.
S
P
F
*
A
B
C
F
*
S
P
D
E
S
P
38
O padrão de organização das fibras musculares em compartimentos encontrado
no pirarucu foi descrito em outras espécies de peixes (Johnston, 1981; Weatherley &
Gill, 1987) e está relacionado com o tipo de atividade desenvolvida durante os
movimentos de locomoção (Johnston, 1999; Veggetti et al., 1990). Na região dorsal e
no compartimento lateral profundo, as fibras musculares com fraca reação para NADH-
TR constituem a musculatura branca. Essas fibras possuem metabolismo glicolítico e
velocidade de contração rápida, sendo utilizadas durante a realização de movimentos
bruscos de natação (Driedzic & Hochachka, 1976; Johnston, 1980). A presença de um
compartimento branco profundo e da musculatura dorsal bem desenvolvidos no pirarucu
pode estar relacionada com o movimento natatório brusco desta espécie durante a
captura de alimento.
Por outro lado, no compartimento superficial, as fibras musculares com forte
intensidade de reação para NADH-TR constituem a musculatura vermelha. Essas fibras
possuem metabolismo oxidativo e velocidade de contração lenta, sendo freqüentemente
utilizadas durante a realização de movimentos de sustentação e velocidade lenta de
natação (Driedzic & Hochachka, 1976; Johnston, 1980). O aumento gradual do
compartimento vermelho, observado no sentido antero-posterior do pirarucu, pode estar
relacionado com a atividade sustentada da nadadeira caudal durante os movimentos
normais de natação e também durante o processo de respiração aérea típico desta
espécie. Neste processo, o animal sobe com freqüência até a superfície da água para
captar oxigênio do ar e, ao longo desse tempo, ele mantém seu corpo em sustentação
através dos movimentos lentos e contínuos da nadadeira caudal.
Análise Morfométrica
Analisando as fibras musculares brancas das regiões dorsal e lateral anterior do
pirarucu, as fibras musculares dos peixes alevinos exibiram tamanho menor em
comparação com as fibras dos peixes juvenis. No entanto, nas duas fases de crescimento
foram observadas muitas fibras pequenas entre fibras maiores, caracterizando um
mosaico de fibras quanto ao tamanho. Esse padrão de distribuição das fibras é
característico da maioria das espécies de peixes, sendo indicativo da ocorrência do
crescimento muscular por hipertrofia e hiperplasia (Veggetti et al., 1993; Johnston,
1999; Rowlerson & Veggetti, 2001).
Considerando-se as duas regiões analisadas, tanto nos peixes alevinos como nos
juvenis, foi observado o mesmo padrão de distribuição das fibras em classes de
39
diâmetros. Os alevinos apresentaram a maioria das fibras com diâmetro inferior a 30
µm. Nos juvenis, a maior parte das fibras exibiu diâmetros acima de 30 µm (Figura 6).
Figura 6: Distribuição das freqüências das fibras musculares brancas do pirarucu (Arapaima gigas) em
classes de diâmetros, nas regiões dorsal e lateral anterior. (*) Valores estatisticamente significativos
(p<0,01) comparando-se as fases de crescimento, fixado a classe de diâmetro.
O crescimento do tecido muscular nos peixes, no período pós-natal, ocorre pela
associação dos processos de hipertrofia e hiperplasia das fibras musculares, a partir dos
mioblastos indiferenciados ou células miossatélites (Alfei et al., 1994; Johnston et al.,
2000; Dal Pai-Silva et al., 2003a, b). A contribuição desses processos no crescimento
muscular tem sido estudada em muitas espécies de peixes, principalmente aquelas com
potencial para a aqüicultura intensiva e que atingem um tamanho grande. Nesses
animais, o crescimento hiperplásico predomina nas fases iniciais de desenvolvimento,
porém, persiste por um período mais prolongado (Weatherley et al., 1988; Kiessling et
al., 1991; Valente et al., 1999; Dal Pai et al., 2000; Rowlerson & Veggetti, 2001).
Região Dorsal
0
10
20
30
40
50
60
70
<10 10-20 20-30 30-50 50-80 >80
Diâmetros (µm)
Freqüência das Fibras (%)
alevinos
juvenis
Região Lateral
0
10
20
30
40
50
60
70
<10 10-20 20-30 30-50 50-80 >80
Diâmetros (µm)
Freqüência das Fibrs (%)
alevinos
juvenis
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
40
No pirarucu alevino, a grande proporção de fibras musculares de pequenos
diâmetros (<30µm) indica a ocorrência de crescimento muscular hiperplásico
predominante, processo que pode contribuir para o significativo aumento da massa
muscular nesta espécie. Por outro lado, nos juvenis, o aumento no diâmetro das fibras
musculares (>30µm) está relacionado à fusão dos mioblastos a fibras pré-existentes e à
intensa atividade de síntese protéica, processo conhecido como hipertrofia (Valente et
al., 1999; Rowlerson & Veggetti, 2001). Nos mamíferos, esse mecanismo predomina no
estágio pós-natal (Goldspink et al., 1972) e, nos peixes menores, a hipertrofia é o
principal mecanismo de crescimento muscular das fases juvenil e adulta (Rowlerson et
al., 1995; Zimmerman & Lowery, 1999). No pirarucu juvenil, a abundância de fibras
musculares com diâmetros maiores que 30 µm caracteriza o crescimento muscular
hipertrófico predominante nesta fase; entretanto, a presença de fibras musculares
pequenas entre fibras maiores é indicativa de que a hiperplasia das fibras ainda está
ocorrendo.
Considerando-se as fases de crescimento analisadas no pirarucu, a hiperplasia e a
hipertrofia ocorreram de forma similar na musculatura branca das duas regiões
analisadas. Em média, o diâmetro das fibras dorsais variou de 19,3 µm nos alevinos
para 51,7 µm nos juvenis, um aumento de 2,7 vezes. Na musculatura lateral anterior, o
diâmetro variou de 18,2 µm nos alevinos para 50,1 µm nos juvenis, em média, um
aumento de 2,8 vezes. No pirarucu, assim como em outras espécies de peixes estudadas
(Kiessling et al., 1991; Valente et al., 1999; Rowlerson & Veggetti, 2001), o expressivo
ganho de peso (119 vezes) observado durante as fases de crescimento analisadas é
resultado do balanço entre os mecanismos hipertrófico e hiperplásico de crescimento
muscular.
Desta forma, os resultados obtidos neste trabalho podem contribuir para um
melhor entendimento dos mecanismos celulares envolvidos no crescimento do músculo
esquelético do pirarucu, espécie promissora na área de aqüicultura intensiva.
CONCLUSÕES
O padrão de organização e distribuição da musculatura estriada no pirarucu é
reflexo das características fisiológicas e de comportamento desta espécie. Nos alevinos,
o crescimento muscular ocorre predominantemente por hiperplasia das fibras e, nos
juvenis, predomina o crescimento muscular por hipertrofia.
41
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à Piscicultura Águas Claras, Mococa, SP, pelo fornecimento dos
exemplares de pirarucu, e à FAPESP (Proc. 05/57368-3) pela bolsa de Mestrado
concedida.
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45
5.2. Capítulo 2
Manuscrito a ser submetido para a publicação.
EXPRESSION OF MYOD AND MYOSTATIN GENES IN
SKELETAL MUSCLE OF PIRARUCU (ARAPAIMA GIGAS
CUVIER 1817)
FERNANDA REGINA CARANI
1
, FERNANDA LOSI ALVES DE ALMEIDA
1
,
ROBSON FRANCISCO CARVALHO
1
, CÉSAR MARTINS
1
, CARLOS ROBERTO
PADOVANI
2
, MAELI DAL PAI SILVA
1*
1
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências (IB), Universidade Estadual Paulista (UNESP),
campus de Botucatu, Distrito de Rubião Jr, s/n, SP, Brasil;
2
Departamento de Bioestatística, Instituto de
Biociências (IB), Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus de Botucatu, Distrito de Rubião Jr,
s/n, SP, Brasil;
*
Autor para correspondência. E-mail: [email protected]esp.br.
ABSTRACT
In most fish skeletal muscle growth occurs by hypertrophy and/or hyperplasia of
muscle fibers. These processes are controlled by the Myogenic Regulatory Factors
(MRFs) and the growth factor Myostatin. In this study, we investigated skeletal muscle
Myostatin and MyoD genes expression, and their possible role in regulating muscle
growth in pirarucu (Arapaima gigas), during alevin and juvenile growth phases. Alevin
(n=5; 50 day-old) and juvenile (n=3; 1 year-old) fish were weighed and then sacrificed.
White dorsal muscle samples were used to determine MyoD and Myostatin genes
expression by Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Semi-
quantitative analysis was performed by densitometry, and values normalized by
constitutive gene 18S rRNA. MyoD expression in alevin was significantly higher than
juvenile, whereas Myostatin expression was similar in both stages. These results reflect
the muscle growth characteristics in this specie, where hyperplasia predominates in
alevin and hypertrophy in juvenile.
Key-words: muscle growth; myogenic regulatory factors; MyoD; Myostatin; Arapaima
gigas.
46
INTRODUCTION
In most fish, slow and fast muscle fibers occupy distinct axial muscle regions. A
superficial layer of slow oxidative fibers (red muscle) covers a deeper, larger mass of
fast glycolytic fibers (white muscle). Intermediate muscle fibers (pink muscle) are
frequently located between slow and fast muscle fibers (Hoyle et al., 1986; Weatherley
& Gill, 1987; Sänger & Stoiber, 2001; Rescan, 2005).
Muscle progenitor cell specification in the somite depends on inductive signals
emanating from adjacent tissues, such as the neural tube and the notochord. In response
to these numerous signals, muscle precursor cells, called myoblasts, begin expressing
several transcriptional activators which control muscle structural genes expression. Four
related proteins have been identified in vertebrates: MyoD, Myogenin, Myf5, and
MRF4 (Rescan, 2001; Watabe, 2001; Johansen & Overturf, 2005). Termed Myogenic
Regulatory Factors (MRFs), they belong to a larger group of proteins containing a basic
DNA-binding motif and a helix-loop-helix domain, which regulates dimerization with
universal proteins E12 or E47. The heterodimer thus formed has a high affinity for the
E-box domain, a DNA motif containing the 5’-CANNTG-3’ sequence, found in many
skeletal muscle-specific gene promoters. The association between MRF and E-box
DNA domain is involved in transcriptional activation of muscle-specific genes (Rudnick
& Jaenisch, 1995; Molkentin & Olson, 1996; Sabourin & Rudnicki, 2000; Rescan,
2001).
MyoD and Myf5 are the first MRFs to be expressed in activated myoblasts,
whereas Myogenin and MRF4 transcript accumulation is only seen when cells begin
differentiating (Goulding et al., 1994; Williams & Ordahl, 1994).
Postnatal muscle growth involves the proliferation of a population of myogenic
precursor cells, termed satellite cells. These are either absorbed by fibers as they expand
(hypertrophy) or they fuse to form multinucleated myotubes and new fibers
(hyperplasia) (Rowlerson & Veggetti, 2001). In mammals the majority of postnatal
muscle growth is mainly by hypertrophy of existing myotubes, with very little new
myoblast proliferation. However fish muscle growth continues by both hyperplastic and
hypertrophic mechanisms through life (Rowlerson & Veggetti, 2001). These cellular
events are regulated by muscle-specific transcriptional factors (MRFs) and growth
factors produced locally by muscle cells or neighbouring tissues (Hawke & Garry,
2001; Stamler & Meissner, 2001; Watabe, 2001).
47
Myostatin is a member of the transforming growth factor β (TGF-β) super-
family of secreted growth and differentiation factors; it is a potent regulator of skeletal
muscle growth in mammals, inhibiting both myoblast proliferation and differentiation
(McPherron et al., 1997; Lee & McPherron, 1999; Thomas et al., 2000; Langley et al.,
2002). Mice and cattle carrying Myostatin mutations have shown a significant increase
in skeletal muscle mass (Grobet et al., 1997; McPherron et al., 1997).
Although Myostatin has been sequenced in several fish species (Maccatrozzo et
al., 2001a,b; Ostbye et al., 2001; Rescan et al., 2001; Roberts et al., 2001; Roberts &
Goetz, 2003; Rodgers et al., 2001; Langley et al., 2002; Radaelli et al., 2003), its role in
fish muscle growth is unclear. The Myostatin action mechanism in fish is not well
understood; however, expression of some MRFs, such as MyoD and Miogenin, was
upregulated when Myostatin function was removed, suggesting that it may influence the
MRF controlled myogenesis pathway (Amali et al., 2004).
In this study, we investigated skeletal muscle Myostatin and MyoD genes
expression, and their possible role in regulating muscle growth in pirarucu (Arapaima
gigas), an economically important large (giant) Amazonian fish.
MATERIAL AND METHODS
Animals
This experiment was approved by Ethics Committee of Instituto de Biociências,
UNESP, Botucatu, SP, Brazil (Protocol N° 72/07-CEEA). The specimens of pirarucu
(Arapaima gigas) were obtained from Piscicultura Águas Claras, Mococa, SP, Brazil,
where they were mantained under the same conditions. The alevin (n=5) and juvenile
(n=3) fish had been weighed and sacrificed with MS-222 (Tricaine Methanensulfonate-
SIGMA
®
). White muscle was isolated from the dorsal region of alevin and juvenile
fishes aged 2 and 12 months, respectively, and then frozen in liquid nitrogen and stored
at -80 °C until used for RT-PCR analysis.
Total RNA extraction
Frozen samples were mechanically homogenized and total RNA used for PCR
amplification was isolated from skeletal muscle with ice-cold TRIzol Reagent
(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), which is based on the guanidine
thiocyanate-phenol-chloroform extraction method (Chomczynski & Sacchi, 1987).
48
Total RNA was solubilized in RNase-free water and quantified by measuring the optical
density (OD) at 260 nm. RNA purity was ensured by obtaining a 260/280 nm OD ratio
> 1.8. The integrity of RNA was confirmed by inspecting the electrophoretic pattern of
28S and 18S ribosomal RNA in a 1.5% agarose gel stained with SYBR Safe DNA Gel
Stain (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) and visualized under
ultraviolet light.
Semi-quantitative RT-PCR analysis
Four micrograms of RNA were reverse transcribed with random hexamer
primers and First Strand cDNA Synthesis Kit (GE Healthcare – Amersham Biosciences)
in a total volume of 33 µL, according to standard methods. Control samples were also
analyzed for testing genomic DNA contamination, in which all reagents were added to
RNA samples except the RT enzyme. These reactions were then PCR amplified to
ensure that genomic DNA did not contaminate the RNA samples. One microliter of
cDNA was then amplified using 0.5 µL of each primer (10 µM) (Table 1), 0.5 µL of
ultrapure water, and 22.5 µL of Platinum
®
PCR Supermix (22 U/mL of Platinum
®
Taq
DNA Polymerase, 22 mM Tris-HCl pH 8.4, 55 mM KCl, 1.65 mM MgCl
2
, 220 µM
dNTPs - Invitrogen Life Technologies, São Paulo, SP, Brazil) in a final volume of 25
µL.
Primer pairs for MyoD and Myostatin mRNA were designed from cDNA
nucleotide sequences from Ictalurus furcatus (Ostariophysi, Siluriformes, Teleostei)
(Table 1), published in GenBank. A set of primers designed from the 18S ribosomal
RNA (rRNA) consensus fish sequences was used to amplify a segment of the 18S
rRNA gene (Tom et al., 2004) (Table 1), used as the housekeeping gene in semi-
quantitative RT-PCR analysis. PCR amplification for MyoD gene was carried out for 2
minutes at 94ºC, followed by 35 cycles of denaturation for 1 minute at 94°C, 30 seconds
of annealing at 60°C, 1.5 minute of extension at 72°C, and an additional 5 minutes
extension step. PCR amplification for Myostatin gene was carried out for 3 minutes at
94ºC, followed by 35 cycles of denaturation for 1 minute at 94°C, 1.5 minute of
annealing at 58,3°C, 1.5 minute of extension at 72°C, and an additional 5 minutes
extension step. PCR amplification for 18S rRNA gene was carried out for 2 minutes at
94ºC, followed by 32 cycles of denaturation for 1 minute at 94°C, 1 minute of annealing
at 60°C, 1 minute of extension at 72°C, and an additional 5 minutes extension step.
49
All PCR products were verified using the DYEnamic ET Terminator Cycle
Sequencing kit (GE Healthcare - Amersham Biosciences) procedures. The nucleic acid
sequences obtained were analyzed in BLASTN search at the National Center for
Biotechnology Information (NCBI) web site (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) to
compare the amplified genes with those of other teleost fish (Altschul et al., 1997).
After PCR amplification, 8 µL of each reaction underwent electrophoresis on 1.5%
agarose gels and stained with SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen Life
Technologies, Carlsbad, CA, USA). Images were captured under ultraviolet light and
the PCR products size (number of base pairs) of each band corresponded to the size of
processed mRNA. The bands were quantified by densitometry as Integrated Optical
Density (IOD) and the PCR signs normalized to the housekeeping 18S rRNA gene
signs.
Statistical analysis
Weight data were analyzed by the non-parametric Mann-Whitney test (Norman
& Streiner, 1993). Semi-quantitative RT-PCR data were analyzed using the Student’s
unpaired t-test (Norman & Streiner, 1993). The level of significance was p<0.05.
Table 1: Oligonucleotide primers used for PCR amplification of reverse transcribed
RNA.
Gene
Accession
N°
Primer Sequence Species
T
A
°C
Cycles
PCR
Length,
bp
MyoD AY562555
5’- ATGGARYTGTCGGATATYCC
3’- TGACAGACAGGTCGTAGCAC
I. furcatus 60 35 633
Myostatin
AY540992
5’- GGCTGGGACTGGATTATTGC
3’- TAGTAGATGCCGTTCTAGGG
I. furcatus 58,3
35 673
18S
rRNA
-
5’-TACCACATCCAAAGAAGGCAG
3’- CATCAACCTAGAGCCCTAGCT
Tom et al. (2004)
60 32 245
* Accession N°: GenBank accession number. T
A
: annealing temperature. R: A/G. Y: C/T.
50
RESULTS
Anatomical Data
Mean ± SD body weight of alevins and juveniles were 47,94±3,64g and
5863,33±2392,91g, respectively (p<0.05).
Total RNA integrity analysis
The integrity of total RNA extracted from pirarucu white muscle was analyzed
by investigating the electrophoretic pattern of 28S and 18S ribossomal RNA bands
(Figure 1). All samples had a typical rRNA band distribution pattern, indicating no
RNA degradation during total RNA extraction procedures, which allowed us to continue
the following reactions.
Figure 1: Electrophoretic pattern of 28S and 18S rRNAs present in total RNA samples extracted from
alevin (1-5) and juvenile (6-8) pirarucu (Arapaima gigas).
Semi-quantitative analysis of MyoD and Myostatin genes expression
MyoD and Myostatin amplified cDNA segment electrophoresis showed one
band of approximately 630 and 670 base pairs (bp), respectively, and the primer set for
18S rRNA gene generated one band of approximately 250 bp (Figure 2). This confirms
the specificity and efficiency of the primers set used in this study.
1 2 3 4 5 6 7 8
28S
18S
51
Figure 2: MyoD (A), Myostatin (B) and 18S rRNA (C) representative PCR results in alevin (1-5) and
juvenile (6-8) fish. (N) Negative Control.
Densitometry showed estimated MyoD and Myostatin mRNA levels in alevin
and juvenile pirarucu (Figure 3).
Estimated MyoD mRNA levels in alevins were significantly higher than in
juveniles, whereas estimated Myostatin mRNA levels were similar in both phases,
although juvenile Myostatin was higher than alevin.
B
1 2 3 4 5 6 7 8 N
A
1 2 3 4 5 6 7 8 N
C
1 2 3 4 5 6 7 8 N
52
Figure 3: MyoD (A) and Myostatin (B) mRNA content estimated by semi-quantitative RT-PCR analysis
in alevin and juvenile fish. Gene expression were normalized to the 18S rRNA gene signals. Normalized
data are expressed as Means ± SD. * p < 0.05 statistical significance.
DISCUSSION
This study investigated MyoD and Myostatin expression, factors that control
muscle growth, in two developmental stages of pirarucu (Arapaima gigas, Cuvier
1817).
The pirarucu is a fish from the Amazon Basin belonging to the Osteoglossidae
family (Nelson, 1994; Li & Wilson, 1996) and it has been intensively farmed with
satisfactory results, achieving 10 Kg weight gains in just one year (Alcântara & Guerra,
1992; Moura Carvalho & Nascimento, 1992; Cavero et al., 2002).
Fish skeletal muscle growth is dependent on proliferation and differentiation of
myogenic precursor cells (satellite cells or myoblasts) (Johnston et al., 2000; Rowlerson
& Veggetti, 2001). When activated, they proliferate, differentiate, and their nuclei are
internalized by existing fibers, which characterize hypertrophic muscle growth
Myostatin
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
1
mRNA (relative IOD)
Alevin
Juvenile
B
MyoD
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
1
mRNA (relative IOD)
Alevin
Juvenile
*
A
53
(Johnston, 1999; Rowlerson & Veggetti, 2001). Also proliferative myoblasts aggregate
to the fiber surface, generate new myotubes, which then separate giving rise to new
muscle fibers, a process called hyperplasia (Veggetti et al., 1990; Johnston et al., 2000;
Dal Pai Silva et al., 2003a, b).
In fish, fiber hyperplasia occurs in two ways: 1) stratified hyperplasia, which
promotes an increase of muscle layers during the early development stages, and 2)
mosaic hyperplasia, which results in a large number of muscle fibers, specifically in the
juvenile stage of large economically important fish (Rowlerson & Veggetti, 2001).
According to Steinbacher et al. (2006), the intensity and temporal activation of
muscle growth mechanisms in teleosts are directly related to growth rate and final fish
size. In slow growing fish, which reach small sizes, muscle fiber hyperplasia stops early
and fiber hypertrophy becomes the predominant mechanism of growth (Veggetti et al.,
1993; Koumans & Akster, 1995). In fast growing fish that reach large sizes, fiber
hyperplasia and hypertrophy both remain active for a long time (Rowlerson & Veggetti,
2001; Steinbacher et al., 2006), as seen in pirarucu (Carani et al., 2007).
Hypertrophy and hyperplasia are both regulated by sequential expression of
Myogenic Regulatory Factors (MRFs), MyoD, Myf-5, Miogenin, and MRF4. They are
transcriptional factors that bind to a specific DNA sequence, termed E-box (5’-
CANNTG-3’), found in the promoter region of many muscle-specific genes (Sabourin
& Rudnicki, 2000; Rescan, 2001; Watabe, 2001; Johansen & Overturf, 2005). MyoD
and Myf-5 control the determination of myogenic lineage and regulate myoblast
activation and proliferation (Goulding et al., 1994; Williams & Ordahl, 1994).
Miogenin and MRF4 act in the myoblast differentiation stage, where myotubes fuse to
form new myofibers (Megeney & Rudnicki 1995; Grobet et al., 1997). According to
Johansen & Overturf (2005), MyoD and Myf-5 expression are directly related to
myoblast proliferation and muscle fiber hyperplasia, and Miogenin expression levels
can be correlated with the degree of muscle fiber hypertrophy.
MyoD gene expression analysis in pirarucu showed that estimated levels of
mRNA for this gene are significantly higher in alevins than juveniles. These results are
similar to MyoD gene expression studies in other fish species, including rainbow trout,
Oncorhynchus mykiss (Johansen & Overturf, 2005), flounder, Paralichthys olivaceus
(Zhang et al., 2006), and pacu, Piaractus mesopotamicus (Almeida, 2007), and they are
consistent with the hypothesis that the high MyoD gene expression observed in pirarucu
alevin is related to the intense myoblast proliferation and hyperplasia rates found in this
54
growth phase (Johansen & Overturf, 2005), a fact also demonstrated by morphological
analysis (Carani et al., 2007).
Furthermore, the low MyoD mRNA levels observed in juvenile pirarucu indicate
that at this growth phase there are low myoblast proliferation and muscle fiber
hyperplasia rates, as morphological analysis showed a predominance of skeletal muscle
hypertrophy (Carani et al., 2007).
The TGF- growth factors, including Myostatin, also control skeletal muscle
growth in fish (Rescan et al., 2001; Rodgers et al., 2001; Radaelli et al., 2003).
Although the effects of Myostatin on muscle growth are not well understood in teleosts,
it can negatively control skeletal muscle growth, regulating myoblast proliferation and
differentiation (Thomas et al., 2000; Langley et al., 2002; Joulia et al., 2003).
Several studies have analysed Myostatin gene expression in fish species during
embryo development. These include zebrafish, Danio rerio (Vianello et al., 2003;
Helterline et al., 2007), tilapia, Oreochromis mossambicus (Rodgers et al., 2001), brook
trout, Salvelinus fontinalis (Roberts & Goetz, 2003), and rainbow trout, Oncorhynchus
mykiss (Garikipati et al., 2006). These studies detected extremely low levels of
Myostatin mRNA in early embryonic development. Few authors have examined the
differential expression of skeletal muscle Myostatin in fish during post-natal growth
(Xu et al., 2003). According to the authors, Myostatin expression is low in larval
zebrafish, where fiber hyperplasia is more pronounced. And Myostatin expression is
high in juvenile and adult stages when hyperplastic growth rate is low.
In this study, estimated Myostatin mRNA levels in pirarucu alevin were lower
then those in juveniles, although this was not statistically significant. These results
suggest that in the early development stages of pirarucu where there is intensive
hyperplastic growth (Carani et al., 2007), the inhibitory action of Myostatin on
myoblast proliferation is low, a fact also observed in other teleost species (Rodgers et
al., 2001; Roberts & Goetz, 2003; Garikipati et al., 2006; Helterline et al., 2007). As the
pirarucu reaches a large size and muscle fiber hyperplasia persists for a long time
(Carani et al., 2007), it is possible that the Myostatin expression values seen in juveniles
only become statistically higher in a later growth phase.
Although some studies have indicate that Myostatin can influence MyoD and
Miogenin transcriptional activities in fish (Langley et al., 2002; Joulia et al., 2003), our
study did not observe any correlation between the estimated MyoD and Myostatin genes
expression levels.
55
CONCLUSION
The differential expression of MyoD observed in pirarucu alevins and juveniles
may be due to their muscle growth pattern, where fiber hyperplasia predominates in the
alevin and hypertrophy predominates in the juvenile stage. However, muscle growth
control in pirarucu, specie with rapid growth in a short time, follows a non similar
pattern to other teleosts. This may be a reflection of the physiological characteristics of
the specie and indicates the need for further studies analysing the mechanisms that
control rapid and fast growing skeletal muscle.
ACKNOWLEDGMENTS
This study was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP, Process n° 05/57368-3). The authors thank Piscicultura Águas Claras,
Mococa, SP, Brazil, for fish supply.
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62
6. CONCLUSÕES GERAIS
No pirarucu (Arapaima gigas), a distribuição da musculatura estriada esquelética
formando os compartimentos vermelho e branco, e a musculatura branca dorsal, está
relacionada com as características fisiológicas e o comportamento dessa espécie.
Nos alevinos, o crescimento muscular ocorre predominantemente por hiperplasia
das fibras e, nos juvenis, predomina o crescimento muscular por hipertrofia.
O mRNA do fator regulador miogênico MyoD é expresso de forma diferencial
na musculatura branca do pirarucu nos períodos de crescimento alevino e juvenil.
O mRNA da Miostatina é expresso de forma semelhante na musculatura branca
do pirarucu nos períodos de crescimento alevino e juvenil.
A expressão da MyoD e da Miostatina no pirarucu pode estar relacionada com as
características de crescimento muscular desta espécie.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS
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