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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Biociências
Departamento de Genética
Programa Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular
Caracterização do polimorfismo de Echinococcus granulosus em dois
genes nucleares e um mitocondrial: evidências de introgressão
Jeferson L. Badaraco
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-graduação em Genética e Biologia
Molecular da UFRGS como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre.
Orientadora: Dra. Karen L. Haag
Porto Alegre, Abril de 2007.
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Índice
Resumo ............................................................................................................................ 4
Abstract........................................................................................................................... 6
Capítulo 1. Introdução............................................................................................... 8
1.1. Seleção natural:................................................................................................ 8
1.2. Gênero Echinococcus....................................................................................... 9
1.3. O Echinococcus granulosus ........................................................................... 11
1.4. Variação intraespecífica................................................................................. 14
1.5. O antígeno B................................................................................................... 17
1.6. Variação antigênica ....................................................................................... 19
1.7. Populações de parasitas................................................................................. 23
1.8. Marcadores moleculares em Echinococcus................................................... 24
1.9. Objetivos......................................................................................................... 25
Capítulo 2. Manuscrito: Utilizando marcadores mitocondrial e nuclear para
testar o isolamento reprodutivo entre linhagens de Echinococcus granulosus....... 28
Resumo ....................................................................................................................... 29
2.1. Introdução ...................................................................................................... 30
2.2. Materiais e métodos ....................................................................................... 31
2.3. Resultados....................................................................................................... 34
2.4. Discussão........................................................................................................ 36
2.5. Agradecimentos.............................................................................................. 42
2
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2.6. Referências..................................................................................................... 43
2.7. Tabelas e Figuras........................................................................................... 47
Capítulo 3. Resultados parciais sobre a diversidade do AgB4............................. 53
3.1. Metodologia.................................................................................................... 53
3.2. Resultados....................................................................................................... 56
3.3. Perspectivas.................................................................................................... 62
Capítulo 4. Considerações Finais............................................................................ 64
Referência Bibliográficas............................................................................................. 66
3
4
Resumo
Nos parasitos do gênero Echinococcus observam-se grandes diferenças genéticas entre
as espécies. Mais ainda, a espécie E. granulosus apresenta uma grande variação
intraespecífica. Diversas variantes com características biológicas e epidemiológicas
particulares, e adaptadas a hospedeiros intermediários diferentes, foram classificadas
como linhagens. De fato, estas linhagens são muitas vezes tão divergentes
geneticamente quanto as demais espécies do gênero. Isto tem gerado diversas discussões
quanto seu status taxonômico. Os genes do antígeno B (AgB) de Echinococcus
compõem uma família multigênica. A proteína secretada, um oligômero formado a
partir de subunidades de 8 kDa, tem um papel importante no estabelecimento da
infecção, modulando a resposta imune do hospedeiro. Estudos demonstraram que alguns
genes desta família devem estar sob seleção positiva ou diversificadora. Inclusive, a
quantidade de variantes encontradas é alta em um único parasito. Este trabalho analisa
amostras de E. granulosus coletadas no Rio Grande do Sul e as compara a amostras de
outra populações geográficas (Argentina, Argélia e Romênia) usando um marcador
mitocondrial (cox1-391 pb) e duas seqüências nucleares. Uma delas corresponde a um
fragmento que inclui majoritariamente o segundo íntron do gene de cópia única
codificador da malato desidrogenase citosólica (mdh - 214 pb) e a outra trata-se da
seqüência parcial do gene que codifica a subunidade 4 do AgB (AgB4 - 329-355 pb),
incluindo aproximadamente 80 pb da região promotora do gene até em torno de 60 pb à
montante do códon de parada da tradução. A análise do fragmento de mdh utilizou a
técnica de PCR-SSCP, seguida de seqüenciamento, para discriminar os alelos das
amostras de cada população, totalizando 259 indivíduos (isolados). Os achados
confirmam a homogeneidade das populações geográficas de E. granulosus e a
divergência dos parasitos das linhagens ovina e bovina (freqüentemente denominada E.
ortleppi). Apesar da divergência entre as linhagens, são encontrados em baixa
freqüência alelos característicos da linhagem bovina (haplótipo G5) em parasitos com
haplótipo mitocondrial ovino (G1) e vice-versa. Tal situação poderia ser conseqüência
do cruzamento entre parasitos destas linhagens quando em simpatria. A abordagem
adotada na análise do gene AgB4 foi a amplificação por PCR seguida do
seqüenciamento direto de 151 isolados. Os dados indicam a presença de mais de duas
cópias do AgB4 no genoma, e que, dada a conservação na região codificante, seria
provável que estes genes estejam evoluindo em concerto. Também encontramos alta
divergência entre as seqüências dos isolados com haplótipos mitocondriais G1 (AgB4
tipo 1) e G5 (AgB4 tipo 2). A divergência é tão grande que acreditamos que na
linhagem bovina o gene AgB4 tenha recombinado com AgB2. Uma seqüência idêntica
a nossa depositada no GeneBank foi previamente sugerida como sendo uma variante
não-funcional do AgB2. Assim como no caso do mdh alguns parasitos com haplótipos
mitocondriais G5 (linhagem bovina) apresentaram em baixa freqüência seqüências de
AgB4 do tipo 1 características da linhagem ovina. Este achado reforça a hipótese de
fluxo gênico entre as linhagens de E. granulosus.
5
Abstract
In the parasites belonging to the genus Echinococcus large differences between species
are observed. Furthermore, the E. granulosus species shows a high intraspecific
variability. Different variants with particular biologic and epidemiologic features,
adapted to distinct intermediate hosts, were classified as strains. Indeed, the strains are
frequently as genetically divergent as the other species within the genus. This has
generated several discussions about their taxonomic status. The Echinococcus antigen B
(AgB) genes belong to a multigene family. The secreted protein, an oligomer built by
subunits of 8kDa, has an important role in the infection establishment, modulating the
host immune response. Studies have demonstrated that some genes in this family might
be under positive or diversifying selection. Moreover, the quantity of variants found is
high, even in a single parasite. This study analyzes samples of E. granulosus collected
in Rio Grande do Sul, and compares them to samples from other geographic regions
(Argentina, Algeria and Romania) using a mitochondrial marker (cox1 – 391bp) and
two nuclear sequences. One corresponds to a fragment including mostly the second
intron of the cytosolic malate dehydrogenase single copy gene (mdh – 214bp) and the
other is a partial gene sequence encoding the fourth subunit of AgB (AgB4 – 329-
355bp), which includes approximately 80bp of the promoter region until around 60bp
upstream to the stop codon. The analysis of the mdh fragment was based on the PCR-
SSCP technique, followed by sequencing, to discriminate among alleles within samples
of each population, totalizing 259 individuals (isolates). Our findings confirm the
homogeneity within E. granulosus geographic populations and a high divergence
between parasites from the ovine and bovine (frequently named E. ortleppi) strains.
Despite the divergence between strains, bovine strain (haplotype G5) characteristic
alleles are found in low frequency in parasites with the ovine mitochondrial haplotype
6
(G1) and vice-versa. This situation could be a consequence of interbreeding between
parasites from the different strains, when in simpatry. The approach used for the AgB4
gene analysis was the PCR amplification followed by direct sequencing of 151 isolates.
The data indicate the presence of more than two AgB4 gene copies inside the genome;
and that, considering the conservation of the coding region, it would be probable that
these genes are evolving in concert. We also found a high divergence in AgB4
sequences between isolates with haplotypes G1 (AgB4 type 1) and G5 (AgB4 type 2).
The divergence is so large, that we believe that in the bovine strain the AgB4 gene
might have recombined with AgB2. As well as for the mdh gene, some parasites with
the G5 mitochondrial haplotype (bovine strain) showed in low frequencies AgB4 type 1
sequences, characteristic of the ovine strain. This finding reinforces the hypothesis of
gene flow between strains of E. granulosus.
7
Capítulo 1. Introdução
1.1. Seleção natural:
A teoria selecionista considera que as mutações são constantemente removidas
pela força purificadora da seleção direcional, e certa parte, pela deriva genética. A teoria
balanceadora sugere que a própria seleção natural pode manter ou aumentar a
variabilidade nas populações (seleção diversificadora ou positiva). Baseado nas
primeiras seqüências de aminoácidos, e para explicar a diversidade dos padrões
eletroforéticos de isoenzimas nas populações naturais, surgiu a teoria neutralista de
evolução. Esta considera que a evolução se daria basicamente pela deriva genética.
Porém, a teoria não deixa de reconhecer a existência de seleção purificadora e raros
casos de seleção diversificadora (Lewontin, 1974).
Com as informações das seqüências de DNA, o neutralismo se fortaleceu.
Verificou-se que o número de substituições sinônimas é muito maior que as não-
sinônimas para a maioria dos genes. Ainda, permitiu a identificação de um “relógio
molecular” onde as seqüências possuem taxas de substituição constantes ao longo do
tempo (Kimura, 1991). Com o acúmulo de dados provenientes do seqüenciamento de
DNA, foi proposta a teoria quase neutra. Neste caso, as mutações selecionadas
fracamente se “comportariam” diferentemente, sendo influenciadas em populações
pequenas pela deriva genética, e em populações grandes pela seleção natural, o que se
confunde muito com a visão selecionista. Ainda, de acordo com a teoria quase neutra, a
seleção “darwiniana” positiva seria necessária para que os genes adquirissem novas
funções (Ohta, 1996).
8
1.2. O Gênero Echinococcus
O gênero Echinococcus, descrito por Rudolphi em 1801, pertence ao Filo
Platyhelminthes, Classe Cestoda, subclasse Eucestoda, Família Taeniidae. Como os
demais membros do Filo, são animais triploblásticos, acelomados, achatados
dorsoventralmente, com simetria bilateral e sem sistema digestivo desenvolvido. A
família reúne endoparasitos obrigatórios, com ciclo de vida indireto. Na fase adulta
infectam o intestino de vertebrados (Thompson, 1995).
Existem, no mínimo, cinco espécies descritas para o gênero Echinococcus: E.
oligarthrus, E. vogeli, E. multilocularis, E. granulosus e o recentemente encontrado E.
shiquicus (Xiao et al., 2006). As espécies E. oligarthrus e E. vogeli são encontradas
exclusivamente na América do Sul; a primeira utiliza um grande número de felinos
como hospedeiros definitivos e a segunda é restrita a um canídeo selvagem,
popularmente conhecido como cachorro do mato. O ancestral destas espécies teria
chegado ao continente sul-americano junto com a migração dos hospedeiros após a
formação do estreito do Panamá no Pleistoceno recente. Duas hipóteses filogeográficas
são propostas para a especiação no gênero Echinococcus. Atualmente, a maioria das
espécies de Echinococcus usa canídeos como hospedeiros definitivos. Se esta é a
característica ancestral, a provável origem da espécie deve ser a América do Norte, onde
surgiu o hospedeiro. Por outro lado, se o hospedeiro ancestral foi um felino, o qual
surgiu na Ásia, o ancestral do Echinococcus deve ter migrado para a América, Europa e
África junto com seus hospedeiros (Nakao et al., 2006).
A taxonomia de Echinococcus ainda é muito controversa. Quando seu ciclo
biológico foi evidenciado em 1852 por von Siebold, acreditava-se existir duas formas da
espécie E. veterinorum, uma de humanos (altricipariens) e outra de animais
9
(scolicipariens) (Gemmell, 1990). Novos ciclos, envolvendo outros hospedeiros,
começaram a ser descritos e, conseqüentemente, o número de novas espécies aumentou.
Na segunda metade do século passado uma revisão taxonômica agrupou as espécies do
gênero em apenas quatro, E. oligarthrus, E. vogeli, E. multilocularis e E. granulosus.
As características principais de cada espécies, segundo Schantz et al. (1995) são:
• E. oligarthrus: na fase adulta parasita um felídeo selvagem e na fase larval,
roedores selvagens. Está distribuída na América Central e América do Sul.
• E. vogeli: na fase adulta parasita um canídeo selvagem e na fase larval, roedores
selvagens. Está distribuída na América Central e América do Sul.
• E. multilocularis: no ciclo de vida selvagem, o principal hospedeiro carnívoro é
a raposa vermelha, e infecta pequenos roedores na fase larval. Distribui–se por
todo o hemisfério Norte.
• E. granulosus: seu ciclo principal envolve o cão doméstico e ovelhas, porém,
pode parasitar uma série de espécies de animais domésticos (porco, cavalo,
camelo, cabras e bovinos) e selvagens (cervídeos), além de humanos. É
cosmopolita e muito ligado às práticas de produção animal.
A dificuldade maior na taxonomia do gênero está em tentar definir as espécies
segundo o conceito tradicional de espécies biológicas, baseado no potencial de
intercruzamento. Este problema se repete em diversos parasitas capazes de realizar
autofecundação. Um método alternativo para a definição de espécies nestes casos seria a
utilização de um critério cladístico, o da monofilia recíproca, para determinar
populações historicamente coesas, e a diferenciação genética na designação das espécies
(Lymbery, 1992).
10
1.3. O Echinococcus granulosus
As espécies do gênero Echinococcus são morfologicamente semelhantes na fase
adulta, e infectam o intestino de carnívoros. No ciclo do E. granulosus (Figura 1), o cão
doméstico é parasitado pelo verme adulto, uma pequena tênia com cerca de 2-4mm
(Figura 2), que raramente causa morbidade. Os ovos são disseminados no ambiente
pelas fezes, e ingeridos por herbívoros domésticos (ovinos e bovinos) ou selvagens
(diversos macrópodos).
Cisto Hidático
Oncosfera
Hosp. intermediário
Hosp. definitivo
Ovos
Protoescólices
Ingestão de
cistos
Ingestão de ovos
Evaginado
Adulto
Fase infectiva
Doen
ç
a
Figura 1: Ciclo de vida do Echinococcus granulosus: 1) o verme adulto no intestino de
carnívoros; 2) os ovos são liberados no ambiente; 3) os ovos ingeridos liberam as
oncosferas que atingem o fígado; 4) desenvolvimento da metacestoide, formação do
cisto hidático, proliferação clonal do parasito, formação dos protoescólices; 5) ingestão
dos cistos hidático com protoescólices, pelo carnívoro; 6) evaginação no trato digestivo
do carnívoro, inicio da estrobilação e fixação no intestino delgado (modificado de
http://www.dpd.cdc.gov/DPDx/HTML/Echinococcosis.asp)
11
Nestes hospedeiros a larva oncosfera chega a órgãos como o fígado e os pulmões
desenvolvendo o cisto hidático. Os cistos hidáticos são compostos por uma camada
acelular e elástica (camada laminar), que envolve a camada germinativa. Esta é um
sincício celular, com composição semelhante ao tegumento do adulto, e suas células
indiferenciadas são responsáveis pela proliferação assexual do parasito, dando origem
aos protoescólices. Cada protoescólice tem a capacidade de desenvolver um novo
adulto. O líquido hidático preenche o lúmen do cisto, e é uma mistura de proteínas do
parasito além de sais e proteínas do hospedeiro que mantêm os protoescólices. A
camada adventícia envolve mais externamente o cisto, e é composta por fibroblastos e
tecido conjuntivo do hospedeiro (Figura 3).
A manifestação clínica da fase larval de Echinococcus granulosus é chamada de
hidatidose cística, e causa muitos danos aos hospedeiros intermediários, tendo impacto
direto em rebanhos de animais domésticos. Por se tratar de uma zoonose, isto é, o
homem pode ser infectado e desenvolver a doença, é de importância para a saúde
pública (Schantz et al., 1995; Torgerson e Heath, 2003). É interessante notar que no
Escólice
Pro
g
lótide imatura
Pro
g
lótide madura
Estróbilos
Pro
g
lótide
g
rávida
Figura 2: Verme adulto de Echinococcus, evidenciando o escólice e os estróbilos com suas
proglótides em diferentes estágios de desenvolvimento (modificado de http://www.k-
state.edu/parasitology/625tutorials/Tapeworm03.html).
12
meio doméstico o ciclo é mantido pela prática de alimentar os cães com as vísceras
infectadas de animais abatidos nas propriedades rurais.
E. granulosus é cosmopolita, e tem alta prevalência em regiões da África, Ásia,
Europa, e América do Sul (Budke, 2006). No Rio Grande do Sul se tem registro de que
a pecuária iniciou ainda no século XVI e, provavelmente, com ela chegou o parasito.
Kloetzel e Pereira (1992) calcularam a prevalência de hidatidose cística em humanos em
24 municípios da região da campanha do Rio Grande do Sul é de 55 casos por 10.000
habitantes. Dados de 2003 da Secretaria da Agricultura do Estado estimam que a
hidatidose contribua com cerca de 40% das principais zoonoses controladas nos
rebanhos de bovinos (tuberculose, cisticercose, faciolose e hidatidose).
Medidas sanitárias objetivando o controle da hidatidose cística são menos
efetivas em locais onde existe o ciclo selvagem (Gemmell, 1990). O desenvolvimento
2
3
1
5
Fig
Órgão
infectado do
hospedeiro
Figura 3: Corte histológico de um cisto hidático de E. granulosus: 1) camada germinativa; 2) camada
laminar (acelular); 3) camada adventícia (tecido conjuntivo e fibroblastos); 4) cápsulas prolígeras
originando os protoescólices a partir das células indiferenciadas da camada germinativa; 5) protoescólice
(modificado de
http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/03051999/00016/09G0016_lores .jpg).
13
de vacinas para os hospedeiros intermediários tem sido alvo de diversas pesquisas.
Gauci et al. (2005) utilizaram uma proteína recombinante expressa na oncosfera (EG95)
para conseguir níveis de proteção satisfatórios em rebanhos de ovinos e caprinos.
Contudo, os altos custos de produção impedem a aplicação em larga escala deste
recurso. Um controle efetivo só será possível se associado a programas de vacinação
com medidas sanitárias adequadas (Torgerson, 2006).
1.4. Variação intraespecífica
E. granulosus apresenta uma maior variação intra-específica quando comparado
as demais espécies do gênero (McManus e Thompson, 2003). O termo linhagem foi
usado para diferenciar grupos da mesma espécie que diferem em características
biológicas de relevância epidemiológica tais como: tempo de desenvolvimento,
especificidade ao hospedeiro intermediário, endemismo. As técnicas de análise de
polimorfismo de DNA principalmente PCR-RFLP da região do DNA ribossomal ITS1
(Bowles e McManus, 1993b) se mostraram sensíveis na identificação destas variantes.
A utilização do seqüenciamento de regiões do DNA mitocondrial que codificam a
NADH desidrogenase 1 (ND1- 470 pb) e a subunidade 1 da citocromo oxidase (cox1-
391 pb), identificou os haplótipos (G1-G10) relacionados à estas linhagens (Tabela 1;
Bowles et al., 1992; Bowles e McManus, 1993a).
A variante de E. granulosus menos específica ao hospedeiro intermediário ou
quanto ao órgão alvo é a de ovinos (haplótipo G1). A introdução desta linhagem na
Austrália permitiu que o parasito infectasse o dingo, um canídeo selvagem, e o ciclo
passou a ocorrer entre os animais nativos (Gemmell, 1990; Thompson, 1995). Existem
também diversas microvariantes mitocondriais, isto é, haplótipos contendo poucas
mutações em relação aos haplótipos mais comuns. Uma destas microvariantes, que foi
14
caracterizada como uma outra linhagem é o haplótipo G2. Foi identificada em ovinos da
Tasmânia, e está presente na Argentina pela introdução de animais provenientes daquela
ilha (Thompson e McManus, 2002).
Tabela 1: Principais linhagens de Echinococcus granulosus, e os haplótipos
mitocondriais correspondentes. Os hospedeiros utilizados e distribuição geográfica
também estão indicados (modificado de Thompson e McManus, 2002).
Linhagens
(haplótipo)
Hosp. Intermediário Hosp. Definitivo Distribuição geográfica
Ovino (G1)
ovinos, bovinos,
cabras macropodes
diversos e humanos
cão, raposa, chacal,
dingo, hiena
Austrália, Europa, Estados Unidos,
Nova Zelândia, China, África,
Oriente Médio, América do Sul,
Rússia
Ovino da tasmânia
(G2)
ovinos e bovinos e
humanos
cão e raposa Tasmânia e Argentina
Búfalo (G3) búfalos, bovinos? cão Ásia
Eqüino (G4) eqüinos cão
Europa, Oriente Médio, África do
Sul
Bovino (G5) bovinos e humanos cão
Europa, Índia, Sri-Lanka, América
do Sul, Rússia, África do Sul
Camêlo (G6)
camelídeos e cabras e
humanos
cão
África, China, Oriente Médio,
Argentina
Suíno (G7) suínos,humanos? cão Europa, Rússia, América do Sul
Cervídeo (G8) cervídeos e humanos cão e lobos América do Norte, Eurásia e África
O haplótipo G4 de eqüinos tem sido recentemente considerado como outra
espécie, denominada E. equinus, pois só ocorre em cavalos, e as seqüências
nucleotídicas de marcadores mitocondriais e nucleares são muito divergentes (Williams
e Sweatman, 1963; Bowles et al., 1995). A posição taxonômica de outras linhagens
também está sendo revisada, como é o caso do haplótipo de bovinos (G5), e um grupo
filogeneticamente relacionado que reúne as linhagens de cervídeo, suíno e camelo (G8,
G7 e G6). G5 já tem sido chamada de E. ortleppi, e suas características mais marcantes
são: a alta especificidade do metacestóide de se desenvolver nos pulmões de bovinos,
15
um período pré-patente mais curto e grande diferenciação genética (Thompson e
McManus, 2002). Quanto às outras três linhagens, têm se sugerido que devam compor
uma espécie separada (E. canadensis), pois são tão divergentes geneticamente da
linhagem ovina (G1) quanto G5, e compartilham um ancestral comum mais recente com
G5 em filogenias de marcadores mitocondriais (Figura 4; Nakao et al., 2006).
No Rio Grande do Sul, a principal linhagem que parasita o rebanho de bovinos e
ovinos é a G1. Os focos da doença estão concentrados na metade sul do estado onde
ocorre a criação extensiva destes animais. A linhagem G5 ocorre em simpatria, porém
apenas em bovinos. Ambas podem infectar acidentalmente humanos, e não é conhecido
ciclo selvagem da doença.
Figura 4: Filogenia do gênero Echinococcus baseado no genoma mitocondrial completo
obtida por máxima verossimilhança. Eort-E .ortleppi Emul-E. multilocularis; Eshi-
E
.
shiquicus; Eequ-E equinus; Egran-E granulosus; Evog-E .vogeli; Eoli-E .oligarthrus; Tsol-
Taenia solium. G6, G7, G8 são os haplótipos mitocondriais já referidos (ver texto, modificado
de Nakao et al., 2006).
16
1.5. O antígeno B
A proteína de Echinococcus mais abundante no líquido hidático (cerca de 10%
da proteína bruta) é uma lipoproteína termo estável (Oriol et al., 1971; Musiani et al.,
1978). Esta proteína, o antígeno B (AgB), é altamente imunogênica em humanos
(Maddison et al., 1989), sendo amplamente utilizada em imunodiagnóstico (Lightowlers
e Gottstein, 1995).
O AgB é produzido pelo parasito durante o desenvolvimento do metacestóide.
Ele parece ser secretado pela membrana germinativa e pelos protoescólices (Rickard et
al., 1977; Yarzabal et al., 1977; Sanchez et al., 1991). A grande quantidade desta
proteína sugere um papel importante na sobrevivência do parasito, porém sua função
biológica ainda não está bem determinada.
O AgB é rico em α-hélices (Monteiro et al., 2007), e é considerado homólogo às
proteínas de helmintos que se ligam à lipídeos (HLBPs; Gonzalez-Sapienza e Cachau,
2003). Porém, sua função não parece estar relacionada com a captação e o metabolismo
de lipídeos, mas a processos de detoxificação de xenobiontes (Chemale et al., 2001;
Chemale et al., 2005). O envolvimento do AgB na evasão da resposta imune do
hospedeiro intermediário foi sugerido em experimentos in vitro que registraram a
inibição do recrutamento de células polimorfonucleares e de proteases (Shepherd et al.,
1991). Rigano et al. (2007) testaram a ação do AgB sobre os monócitos e células
dendríticas (CD). Verificaram que ele não só inibe a diferenciação dos monócitos em
CD, como modula as CD sentinelas polarizando a resposta para o tipo Th2, considerada
não protetora para a infecção. Para determinar o envolvimento da resposta imune celular
do hospedeiro com a variação encontrada nos genes do AgB de Echinococcus
multilocularis , Graichen et al. (2007) infectaram camundongos da linhagem Balb/c e
17
nude (desprovidos de células T). Os camundongos nude, incapazes de ativar a resposta
do tipo T celular, apresentaram uma quantidade de transcritos de AgB menor em
comparação aos camundongos Balb/c no primeiro mês de infecção. Os resultados
podem estar sugerindo que a expressão do AgB de Echinococcus é mediada por fatores
envolvidos com a resposta imune celular do hospedeiro.
Quando descrito por Oriol et al. (1971), o AgB foi caracterizado como uma
lipoproteína de 120-160kDa. O padrão de migração do AgB nativo em gel de SDS-
PAGE é composto por bandas de 8, 16, 24 e 32kDa. A quantidade relativa de proteína
aumenta à medida que o peso molecular diminui, sugerindo que a estrutura quaternária
desta proteína se forma pela ligação de peptídeos de 8kDa (Lightowlers et al., 1989).
O isolamento de genes que codificam peptídeos do antígeno B começou com
Shepherd et al. (1991), que obteve uma seqüência parcial do cDNA. A seqüência
completa foi obtida por Frosch et al. (1994b). Uma outra seqüência relacionada com a
primeira seqüência descrita foi identificada em um banco de cDNA por Fernandez et al.
(1996). Esta nova seqüência apresentava uma similaridade nucleotídica de 40% com a
primeira. Por isso, a primeira isoforma passou a ser chamada de EgAgB8/1 e a segunda
EgAgB8/2. Para simplificar, os genes do antígeno B serão referidos aqui apenas por
AgB seguido do número correspondente à isoforma identificada (AgB1, AgB2, AgB3 e
AgB4).
Outras seqüências foram descritas com similaridades nucleotídicas diferentes: o
AgB3 (Chemale et al., 2001) é 63% similar ao AgB1 e 42,5% ao AgB2; o AgB4(Arend
et al., 2004) é 71% similar ao AgB2 e 38% e 43,8% similar ao AgB1 e AgB3,
respectivamente (Mamuti et al., 2006). Estruturalmente, os genes do antígeno B já
caracterizados possuem uma região codificadora de aproximadamente 300 pb
18
interrompidas por um íntron rico em repetições CCT. O primeiro éxon codifica um
peptídeo sinal, enquanto o segundo éxon codifica a proteína secretada. Acredita-se que a
região do íntron rica em CCT facilite eventos de recombinação entre os genes da
família.
Experimentos de “Southern blot” genômico demonstram que esta proteína deve
ser codificada por uma família gênica com no mínimo sete genes. Uma quinta seqüência
genômica similar ao AgB3 foi descrita recentemente como outro gene o AgB5 (Haag et
al., 2004). A evolução dos genes provavelmente ocorreu por eventos de duplicação
anterior a especiação, pois estes genes estão presentes em todas as espécies do gênero.
Os genes formam dois clados: um composto por AgB1, AgB3 e AgB5 e outro por
AgB2 e AgB4 (Figura 5; Haag et al., 2006b).
1.6. Variação antigênica
A variabilidade de antígenos dos parasitos pode lhes garantir a sobrevivência
frente à resposta imunológica do hospedeiro. O fenômeno denominado variação
antigênica pode ser mantido em nível populacional, de modo que diferentes linhagens
de parasitos têm vantagens em diferentes hospedeiros. Isto é observado freqüentemente
em antígenos codificados por um único loco no genoma. Outra forma de variação
antigênica ocorre em nível individual, onde os antígenos seriam expressos por diferentes
locos em momentos diferentes do desenvolvimento (Machado et al., 2006).
No caso da variação ser mantida em nível populacional, poderíamos citar dois
exemplos. Em bactérias como Streptococcus pneumoniae, existem mais de 90 linhagens
que diferem nos antígenos de superfície da cápsula polissacarídea. Cada uma é capaz de
produzir uma resposta imune específica. Deste modo, outras linhagens têm a chance de
infectar os hospedeiros (Henrichsen, 1995). No vírus influenza verifica-se altas taxas
19
mutacionais em genes que codificam antígenos específicos. A resposta imune contra
estes antígenos é capaz de eliminar o vírus, porém a cada ciclo as mutações acumuladas
nesta proteína impedem o reconhecimento pela memória imunológica da população
hospedeira gerada na primeira epidemia do vírus, o que garante que os sorotipos mais
recentes possam infectar hospedeiros que já tiveram contato com a linhagem anterior
(Fitch et al., 1997).
Já num sistema de parasitos eucariotos, podemos citar a expressão diferencial de
antígenos de superfície do protozoário Trypanosoma brucei (VSG – Variant-Surface
Glycoprotein). Freqüentemente o alelo da VSG expresso é substituído por translocação
ou recombinação, dirigidas por seqüências homólogas nas regiões flanqueadoras de
1000 cópias do gene vsg distribuídas pelos cromossomos. Desta forma, os
tripanossomos expressam diferencialmente suas proteínas de superfície, dificultando a
eliminação do parasito (Cross et al., 1998).
Estudos preliminares com o gene AgB1 indicaram que existe heterogeneidade de
seqüências entre linhagens de E. granulosus (Frosch et al., 1994a). Esta
heterogeneidade de seqüência foi observada também em protoescólices de um mesmo
cisto (ver abaixo). Um excesso de substituições não-sinônimas em relação às sinônimas
entre parasitos de diferentes linhagens foi encontrado neste mesmo gene, principalmente
na região do segundo éxon, indicando a ocorrência de seleção positiva ou balanceadora
(Haag et al., 1998). Além disto, variações no nível nucleotídico são encontradas mesmo
para um único protoescólice (Haag et al., 2004). Neste caso, a variação alélica
encontrada poderia estar ligada a eventos de hipermutação somática ou recombinação
durante a fase larval.
20
Figura 5: Filogenia inferida por máxima verossimilhança dos genes da família do antígeno B de
Echinococcus. A separação entre os clados AgB1-AgB3-AgB5 e AgB2-AgB4 está indicada pelo ramo
interno mais longo. Eg-E. granulosus, Eo-E. oligarthrus, Em- E. multilocularis, Ev- E. vogeli). Extraído
de Haag et al. (2006b).
21
Outra explicação para a existencia desta variação nucleotídica seria que os genes
do AgB seriam redundantes no genoma, e estariam dispostos em tandem, o que tem sido
suportado por experimentos de PCR em tempo real (Haag et al., 2006a). Um exemplo
disto é observado em genes que codificam RNA ribossomal. Pequenas mutações que
ocorrem nas diferentes cópias seriam responsáveis pela variação encontrada nas
seqüências amplificadas.
Haag et al. (2006b) encontraram evidências de seleção positiva em códons
específicos de genes para três isoformas (AgB1-códon 18, AgB3-códon 3 e AgB4-
códon 71). A evolução dos genes AgB parece não desviar da neutralidade. É
interessante notar que o códon selecionado positivamente em AgB1 está situado em
uma região imunorreativa mapeada por Gonzalez-Sapienza e Cachau (2003).
O antígeno B, portanto, é codificado por uma família gênica que poderia estar
sendo expressa de modo diferencial durante o desenvolvimento do parasito, e evoluindo
de maneira contingente (Haag et al., 2004). Evidências indicam que ele tem um papel
fundamental na permanência da infecção frente ao sistema imunológico do hospedeiro.
A pressão de seleção causada sobre certas regiões desta proteína (aquelas expostas às
moléculas do sistema imune do hospedeiro) explicaria em parte a variação apresentada
em termos de alelos. Porém, outro mecanismo gerador de variabilidade é necessário
para explicar as variações encontradas durante a propagação clonal, podendo ser
elevadas taxas de mutação ou recombinação entre os genes da família, facilitadas por
uma possível localização próxima dos telômeros, e motivos repetitivos constantes nas
regiões não codificadoras dos genes, a exemplo das proteínas VSG de Trypanosoma
(Borst, 2002).
22
1.7. Populações de parasitas
Uma população pode ser definida como um grupo de organismos da mesma
espécie ocupando um dado espaço e tempo, compartilhando um mesmo “pool”
genético. Este conceito não pode ser aplicado na íntegra para parasitas. Por exemplo,
todos os indivíduos de uma única espécie em um único hospedeiro constituiriam uma
população? Ou todos os indivíduos de todos os hospedeiros de um ecossistema
representariam esta população? Outro problema é o fato de que muitos helmintos
parasitas na fase adulta aumentam em número somente por migrações em seus
hospedeiros definitivos (Esch e Fernandez, 1993).
Assim, os conceitos de infrapopulação, metapopulação e suprapopulação foram
introduzidos por Esch et al. (1975) para hierarquizar a estrutura populacional de
parasitos. A infrapopulação consistiria nos parasitos de uma única espécie em um
hospedeiro individual. A metapopulação seria a composição de infrapopulações em uma
determinada espécie hospedeira de um ecossistema. Já a suprapopulação, o nível
hierárquico mais alto, reúne todos os parasitos de uma determinada espécie em todas as
fases de seu desenvolvimento em todas as espécies hospedeiras em um determinado
ecossistema. Esch e Fernandez (1993) consideram que fatores como a amplitude de
distribuição do parasito, seu ciclo de vida, e sua especificidade quanto aos hospedeiros
são fatores que contribuem para o grau de diferenciação entre as metapopulações.
A identificação da espécie com a qual se trabalha é o ponto de partida para
estudos populacionais. Os marcadores moleculares são muito utilizados na
caracterização de espécies já descritas, e também são ferramentas na prospecção de
espécies crípticas (Criscione et al., 2005). A estruturação populacional de parasitos
depende do fluxo gênico e da diversidade genética contida na população. O tipo de
23
ciclo, de reprodução e o sistema de cruzamento influenciam diretamente o fluxo gênico
e a diversidade genética. Price (1980) considera que populações de parasitas devam ser
homozigotas e ter baixa diversidade genética. Embora esta idéia não se aplique a todas
as espécies de parasitas, é o que parece ocorrer em organismos onde a transmissão entre
hospedeiros ocorre pela infecção por grupos de parasitos irmãos, e o principal sistema
de acasalamento é a autofecundação (Criscione et al., 2005).
1.8. Marcadores moleculares em Echinococcus
A variação genética em Echinococcus já foi acessada por marcadores nucleares e
mitocondriais. O DNA mitocondrial é amplamente empregado na discriminação de
organismos relacionados, principalmente por possuir uma taxa evolutiva mais rápida,
ser haplóide, de herança materna e não recombinar.
Os primeiros estudos moleculares em Echinococcus utilizaram a técnica de
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) genômico ou PCR-RFLP da região
ITS1 do rDNA nuclear (McManus e Simpson, 1985; Bowles e McManus, 1993b). Os
resultados identificaram diversas linhagens em E. granulosus, e os padrões observados
são constantes dentro de cada linhagem. A análise direta das seqüências de DNA se
mostrou muito mais sensível na detecção de variações. Regiões codificantes dos genes
mitocondriais da subunidade 1 da citocromo oxidase (cox1) e NADH desidrogenase 1
(ND1) foram usadas na determinação de haplótipos relacionados com as características
de cada linhagem (Bowles et al., 1992; Bowles e McManus, 1993a).
A técnica de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), permitiu a
análise de muitos isolados e a identificação de heterozigotos de alelos que se
diferenciam por poucos nucleotídeos. A técnica foi utilizada na caracterização dos
haplótipos mitocondriais já descritos (Gasser et al., 1998), e aplicada na identificação da
24
variabilidade do DNA mitocondrial em populações da China e Argentina (Zhang et al.,
1999). Porém, o mais interessante para estudos populacionais é a capacidade de
discriminar alelos em heterozigose e homozigose. Haag et al. (1999), se valeram disso
para determinar a variabilidade genética em locos nucleares (codificantes e não-
codificantes), e inferir que a autofecundação é o sistema de cruzamento prevalente em
populações de E. granulosus.
A análise de variabilidade de microssatélites é uma das ferramentas mais
utilizadas em teste de paternidade e estudos forenses pela capacidade de identificar
virtualmente os indivíduos. Esta característica faz dos microssatélites a principal
escolha para estudos das relações evolutivas entre espécies e populações (Barker, 2002).
Em Echinococcus foi identificado um microssatélite multi-locus com motivos de
repetição CA e GA denominado EmsB. O polimorfismo de tamanho destes
microssatélites mostrou-se sensível para discriminar isolados de E. multilocularis de
uma mesma localidade (Bart et al., 2006).
1.9. Objetivos
Haag et al. (2006a), estudaram a região flanqueadora dos genes que codificam as
subunidade do AgB, e buscaram estimar o número de cópias de cada subunidade no
genoma das espécies E. granulosus, E. ortleppi e E. multilocularis. Os resultados da
PCR em tempo real sugeriram que o gene do AgB2 apresenta um menor número de
cópias nas três espécies. O AgB4 apresentou poucas cópias em E. granulosus da
linhagem G1.
Dos quatro genes principais, AgB1 e AgB4 apresentam um maior número de
sítios sofrendo seleção positiva (Haag et al., 2006b). O AgB1 parece estar sob seleção
positiva ou diversificadora entre as linhagens de E. granulosus (Haag et al., 1998). O
25
AgB4 ainda não foi utilizado em estudos populacionais. Além disso, a maioria dos
trabalhos que buscaram caracterizar os genes do AgB analisaram apenas o segundo
éxon (Chemale et al., 2001; Arend et al., 2004; Haag et al., 2006b), ou os primers
utilizados não foram específicos na amplificação dos genes, e ignoravam a região
promotora (Haag et al., 2004; Kamenetzky et al., 2005).
Tendo em vista o acima exposto, este trabalho buscou analisar o polimorfismo
da região promotora, o primeiro éxon, o íntron e a seqüência parcial do segundo éxon
do gene do AgB4 em amostras de Echinococcus de quatro países: Argentina, Argélia,
Brasil e Romênia. Os parasitos foram separados, primeiramente, pelo haplótipo
mitocondrial, utilizando a seqüência parcial do gene mitocondrial cox1. Além disso, foi
usada a seqüência parcial de um segundo gene nuclear, que codifica a malato
desidrogenase citosólica (mdh) com o objetivo de refinar as análises populacionais.
Os objetivos específicos foram:
¾ Determinar o haplótipo mitocondrial usando o marcador cox1 segundo Bowles
et al. (1992) dos isolados que não possuíamos esta informação;
¾ Amplificar o fragmento do gene mdh e caracterizar os alelos que ocorrem nas
linhagens, identificando heterozigotos e homozigotos nas amostras pelo
polimorfismo da conformação da fita simples de DNA:
Calcular a diversidade nucleotídicas das amostras.
Estimar a freqüência alélica nas amostras das diferentes populações e
verificar se estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Analisar a estruturação populacional das linhagens.
26
¾ Amplificar e seqüenciar o gene do AgB4 das amostras para as diferentes
linhagens, caracterizar os alelos e definir os polimorfismos nas amostras de cada
população objetivando:
Identificar se os amplificados correspondem a ortólogos.
Utilizá-lo para caracterizar a estrutura genética das populações.
Identificar sítios de seleção entre as diferentes populações ou linhagens.
27
Capítulo 2. Manuscrito: Utilizando marcadores mitocondrial e nuclear
para testar o isolamento reprodutivo entre linhagens de
Echinococcus granulosus.
Autores
Badaraco, J.
1
, Ayala, F.J.
2
e Haag, K. L.
1
Afiliação
1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
RS, Brazil.
2
Department of Ecology and Evolutionary biology, University of Califórnia at Irvine,
CA, USA.
Autor para correspondência
Departamento de Genética, Universidade federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento
Gonçalves, 9500, Prédio 43323, Caixa Postal 15053, Porto Alegre, RS, CEP 91501-970,
Brasil.
Tel.: +55-51-3316-9826; Fax: +55-51-33167311
e-mail: [email protected]
Palavras-chave: hidatidose, Echinococcus granulosus, epidemiologia, genética
populacional.
28
Resumo
Diversos trabalhos utilizando marcadores morfológicos e moleculares
concordam que algumas linhagens de Echinococcus granulosus, usualmente definidas
por haplótipos mitocondriais, deveriam ser considerados espécies distintas. Porém,
utilizar apenas marcadores mitocondriais não nos permite testar o efeito de trocas de
genes entre as populações parcialmente isoladas. A partir do DNA total de 259 parasitos
de amostras do Brasil, Argentina, Argélia e Romênia, determinou-se os haplótipos
mitocondriais e amplificou-se um fragmento de 214pb do gene nuclear que codifica a
malato desidrogenase citosólica (mdh). Dos dez haplótipos mitocondriais já descritos
para Echinococcus, cinco estão incluídos no presente estudo ( G1, G2, G5, G6 e G7).
Um fato interessante é a presença de um parasito do haplótipo G7, linhagem suína,
infectando um bovino na amostra do Brasil. Pelo padrão de migração da fita simples
(SSCP) do gene mdh foram identificados 3 alelos distintos (Md1-Md3), formando
homozigotos e heterozigotos, confirmados por seqüenciamento. Não foram encontrados
alelos exclusivos nas linhagens. Mesmo assim, nas linhagens do agrupamento G1-G2 os
alelos Md1 e Md2 estão em alta freqüência independentemente da amostra, enquanto
Md3 é o alelo mais freqüente para o agrupamento G5-G6-G7. Estes achados podem ser
conseqüências de: a) um polimorfismo ancestral ou b) introgressão de genes. Os valores
de Fst indicam uma alta diferenciação entre as linhagens dos agrupamentos G1-G2 e
G5-G6-G7. Este achado confirma-se pela AMOVA, que mostra que 79% da variância
está entre as linhagens. Dados de outros marcadores nucleares estão sendo acessados
para estes isolados, que serão esclarecedores para esta questão. Em nossa opinião,
parece mais provável que um processo de introgressão esteja ocorrendo. Mesmo sendo
lento, este processo pode trazer conseqüências biológicas e epidemiológicas
importantes.
29
2.1. Introdução
O gênero Echinococcus Rudolphi, 1801 (Cestoda; Taeniidae) inclui no mínimo
quatro espécies: E. vogeli, E. oligarthrus, E. multilocularis e E granulosus, as quais
necessitam de dois hospedeiros: um carnívoro na fase adulta, e um herbívoro, onde se
desenvolve a larva ou metacestóide (Thompson, 1995). Nesta última fase ocorre
reprodução assexuada, a proliferação clonal dos protoescólices, cada um deles com o
potencial de gerar um verme adulto. Conseqüentemente, ao serem ingeridos pelo
hospedeiro definitivo, os protoescólices originarão uma população geneticamente
idêntica de vermes no trato digestivo de um hospedeiro individual.
Os parasitos adultos são hermafroditas, e se reproduzem principalmente por
autofertilização, muito embora existam algumas evidências de fertilização cruzada
(Thompson e Lymbery, 1996; Lymbery et al., 1997; Haag et al., 1999). Entretanto, dada
a população de origem clonal no hospedeiro definitivo, espera-se que a fecundação
cruzada ocorra entre genótipos idênticos mais freqüentemente (geitonogamia), o que em
termos populacionais, equivale a autofecundação (Criscione e Blouin, 2006).
Uma característica marcante dos parasitas da espécie E. granulosus é a grande
variação intra-específica (McManus e Thompson, 2003). Variantes genéticas que
diferem em caracteres de relevância epidemiológica são classificadas como linhagens
distintas (Bowles et al., 1992; Wachira et al., 1993; Bowles et al., 1995; Thompson e
McManus, 2002). Tais linhagens são comumente identificadas pelo seqüenciamento
parcial de genes mitocondriais, e seus haplótipos foram designados G1 - G10. Dentre os
haplótipos (linhagens) mais comuns destacam-se: G1 (linhagem ovina), a qual apresenta
uma grande plasticidade fenotípica; e G5 (linhagem bovina), ambas encontradas no sul
do Brasil e capazes de infectar bovinos. Algumas linhagens são particularmente
30
diferenciadas, razão pela qual tem-se proposto que sejam categorizadas como espécies.
Por exemplo, a linhagem G5, por ser altamente adaptada a bovinos, ter o
desenvolvimento preferencial nos pulmões, uma morfologia característica dos estróbilos
e rápido período pré-patente, foi proposta como uma nova espécie, denominada E.
orteppi (Thompson e McManus, 2002).
Este trabalho identificou as linhagens mitocondriais circulantes em amostras de
bovinos do estado do Rio Grande do Sul (Brasil). Foi avaliada a diversidade genética
dentro de cada linhagem usando um fragmento de 214 pb do gene nuclear codificador
da malato desidrogenase citosólica (mdh). A diversidade nestas amostras foi comparada
com amostras de outras populações (Argentina, Argélia e Romênia). Buscou-se avaliar
se as diferenças quanto a biologia das distintas linhagens são suficientes para restringir
o fluxo gênico.
2.2. Materiais e métodos
2.2.1. Características das amostras
Os metacestóides (isolados) foram coletados de bovinos em um frigorífico da
região metropolitana de Porto Alegre, o qual recebe animais principalmente da região
sul do estado. Lamentavelmente não é possível precisar a origem exata dos animais
devido a grande mobilidade de reses antes do abate. Cada isolado foi considerado como
um indivíduo diferente, mas a forma de coleta impediu a determinação de parasitas de
um mesmo hospedeiro.
O DNA total de 171 metacestóides foi obtido através de extração convencional
com fenol-clorofórmio. Foram também analisadas amostras de outros hospedeiros e
regiões geográficas (Tabela 1), as quais foram gentilmente cedidas pela Dra. Mara C.
Rozsenzvit (material da Argentina) e pelo Dr. Jean-Mathieu Bart (material da Argélia e
31
Romênia). Os haplótipos mitocondriais destas amostras foram previamente
estabelecidos.
2.2.2. Determinação do haplótipo mitocondrial
Para a determinação dos haplótipos mitocondriais que caracterizam as diferentes
linhagens, utilizou-se a seqüência parcial da subunidade 1 da citocromo oxidase (cox1).
Os fragmentos foram obtidos com os primes desenvolvidos por Bowles et al., 1992.
Cada reação continha aproximadamente30ng de DNA total, 1 unidade de Taq DNA
polimerase (INVITROGEN®), 1,5mM de MgCl
2
, 10mM de dNTPs e 20pmois de cada
primer em um volume total de 50μl. A amplificação foi feita por “touchdown” com a
temperatura de anelamento inicial de 55°C reduzindo um grau a cada dois ciclos nos 20
primeiros ciclos e mais 20 ciclos a 45°C. Com exceção do primeiro passo de
desnaturação de 4 minutos e o último passo de extensão 7 minutos, os demais tinham a
duração de 1 minuto. Estes amplicons foram seqüenciados automaticamente (ABI
3730XL) usando apenas o primer direto, o que foi suficiente para diferenciar os
haplótipos já descritos.
2.2.3. Genotipagem do lócus mdh
Foi amplificado um fragmento de 214pb do gene codificador da malato
desidrogenase citosólica, que compreende parte do segundo éxon, o segundo íntron e
parte do terceiro éxon. As reações foram feitas nas mesmas condições descritas para
cox1, mas os primers utilizados foram: 5’CGC TCC TTC CAT TTC CGA AAG3’
direto e 5’TTG GTG ACA ACG GCG TGA GAC3’ reverso. O programa de
amplificação incluiu 40 ciclos com temperatura de anelamento de 50°C. Os fragmentos
foram desnaturados e migrados em gel de poliacrilamida (12%) para a separação pela
conformação da fita simples (SSCP – single strand conformation polymorphism)
32
utilizando o sistema GenePhor (GE Healthcare). A migração foi feita em “buffer A”
(pH 9.0 GE Healthcare) à temperatura de 12°C e à voltagem constante de 200V por 1h
e 30 min. Posteriormente os géis foram corados com nitrato de prata 1% utilizando
protocolos convencionais. Os alelos identificados por SSCP foram confirmados por
seqüenciamento automático. Foram seqüenciadas no mínimo 6 amostras independentes
representativas de cada padrão encontrado na análise de SSCP.
2.2.4. Análise dos dados de seqüência
Para todas as análises, as amostras de cada país foram separadas por linhagem,
de acordo com os haplótipos mitocondriais (G1, G2, G5, G6 e G7). A diversidade no
locus mdh para cada linhagem de E. granulosus foi estimada através dos parâmetros:
número de sítios segregantes (S), diversidade nucleotídica (π) e Theta (θ) (Nei e Li,
1979; Nei, 1987), usando o programa DNAsp 4.0 (Rozas et al., 2003).
A deficiência ou não de heterozigotos (equilíbrio de Hardy-Weinberg) e a
estruturação genética das populações baseado no índice Fst (Reynolds et al., 1983), e na
AMOVA (Excoffier et al., 1992) foram testados utilizando o programa Arlequin 3.1
(Excoffier et al., 2005). A análise da estrutura populacional foi feita seguindo um
padrão hierárquico. Primeiramente, foram agrupadas as amostras de acordo com sua
localização geográfica, e dentro de cada grupo os isolados foram separados em
populações de acordo com a linhagem identificada pelo haplótipo mitocondrial.
33
2.3. Resultados
2.3.1. Identificação de linhagens
Apenas os haplótipos mitocondriais G1 e G5 foram encontrados nas amostras de
bovinos do Brasil, com exceção de um único parasito com o haplótipo G7, característico
da linhagem de porco, isolado do fígado de um bovino. Do total de 171 isolados
provenientes do Brasil, 115 pertenciam à linhagem G1 e 55 à G5 (Tabela 1).
2.3.2. Alelos do gene mdh
Três alelos, Md1, Md2 e Md3, foram identificados pelos padrões de SSCP
(Figura 1) e confirmados por seqüenciamento. Na Tabela 2 estão dispostas as
freqüências genotípicas e alélicas por linhagem para cada amostra.
Não existem alelos restritos a linhagens específicas, porém o alelo Md3 aparece
em maior freqüência (no mínimo 0,88) nas linhagens bovina, de camelo e suína (G5, G6
e G7). Os alelos Md1 e Md2, por outro lado, estão presentes em baixa freqüência nestas
linhagens. Na Romênia foi encontrado um isolado heterozigoto Md2/Md3 pertencente à
linhagem G7.
Md1 e Md2 são mais freqüentes nos isolados das linhagens G1 e G2, sendo Md2
o alelo mais representado em todas as amostras deste grupo. Ainda assim, Md3 aparece,
em baixa freqüência, nos isolados de G1 das amostras da Argentina, Brasil e Argélia.
Apenas um parasito com o haplótipo mitocondrial G1 do Brasil é heterozigoto entre
Md2 e Md3 e outros dois apresentaram o alelo Md3 em homozigose.
As freqüências genotípicas foram testadas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg
(Tabela 3). Foram encontradas deficiências no número de heterozigotos para a linhagem
G1 nas amostras da Argentina, Brasil e Argélia e nos isolados da linhagem G5 do Brasil
34
(p<0,001). Na Tabela 3 também estão os índices de diversidade de seqüências entre as
linhagens de cada amostra: número de sítios segregantes (S) e diversidade nucleotídica
(π). Os valores de π mostram que as amostras de G1 são mais diversas com exceção da
amostra da Argentina. Contudo, a diversidade nucleotídica é baixa de um modo geral.
Nas amostras G2 da Argentina, e G1 e G7 da Romênia, os valores de S foram 3, 3 e 8
respectivamente, as demais apresentaram10 sítios segregantes, exceto G6 da Argélia,
por ser monomórfico para Md3. Três sítios segregantes estão localizados no final do
éxon 2 do gene, outros três no segundo íntron e mais quatro no terceiro éxon.
2.3.3. Diferenciação e estruturação populacional
A Tabela 4 mostra o grau de diferenciação entre as populações geográficas de
cada linhagem, calculado pelo índice Fst (diagonal inferior). Dos valores com suporte
estatístico destacam-se as grandes diferenças entre as linhagens G1 e G5 na amostra do
Brasil (0,82). Esta diferença se repete entre as demais populações de G1 e a de G5. As
linhagens, G6 e G7, não apresentam diferenças significativas em relação a G5. Os
valores de Fst entre populações da linhagem G1 da Argentina e Argélia, Argentina e
Brasil, e Argélia e Brasil são de 0,1 e 0,13 (p<0,001) e -0,01.
Na diagonal superior da Tabela 4 está a estimativa do número de migrantes por
geração calculada com base no Fst para cada par de populações (Slatkin 1991). Em
negrito aparecem apenas os valores com Fst estatisticamente significativos (p<0,05), e
que fazem sentido em termos populacionais. Apesar do grande grau de diferenciação
entre as amostras das linhagens G1 e G5 no Brasil e G1 e G6 na Argélia e G1 e G7 na
Romênia existe um certo fluxo gênico de 0,11, 0,13 e 0,08 migrantes por geração
respectivamente.
35
O teste AMOVA foi estruturado nos seguintes níveis hierárquicos: 1)
populações amostras de cada localidade separadas pela linhagem 2) grupos compostos
pelas populações da mesma linhagem. Os resultados mostram que a maior parte da
variação encontra-se entre as linhagens (haplótipos mitocondriais) de E. granulosus
(79%); já as populações geográficas da mesma linhagem apresentam pouca variação
(1%), mas existe uma certa variação dentro das populações (20%).
2.4. Discussão
Nesta amostra de cistos hidáticos de hospedeiros bovinos do Rio Grande do Sul
encontrou-se uma maior prevalência da linhagem G1 (67%), sendo que G5 ocorre em
menor freqüência (32%). A linhagem de porco (haplótipo G7) já foi encontrada em
bovinos da república Eslováquia (Turcekova et al., 2003), e neste trabalho descrevemos
pela primeira vez em bovinos do sul do Brasil. Do ponto de vista biológico este dado é
importante, pois, demonstra a plasticidade destes parasitas. Do ponto de vista
epidemiológico este também tem relevância, já que uma terceira linhagem infectiva aos
humanos ocorre nos bovinos criados extensivamente nesta região do país.
O gene mdh de Echinococcus possui um íntron após o primeiro códon. Haag et
al. (1999) estudaram o padrão de SSCP da região promotora somada ao primeiro íntron
de 110 isolados de E. granulosus de várias haplótipos mitocondriais e de diferentes
hospedeiros. Foram identificados 6 alelos diferentes, e alguns alelos privados em alguns
haplótipos. Numa outra região do mesmo gene estudada no presente trabalho,
identificamos apenas 3 alelos, e nenhum que ocorresse exclusivamente em um
haplótipo.
Nakao et al. (2006), publicaram uma hipótese filogeográfica para a divergência
das espécies de Echinococcus. A divergência das espécies neotropicais E. oligarthrus e
36
E. vogelli, provavelmente ocorreu após a formação do istmo do Panamá durante o
Pleistoceno. O local-berço das espécies não é claro, mas se o hospedeiro definitivo
inicial fosse um felino, a origem mais provável seria a Ásia. Se fosse um canídio, o
berço das espécies de Echinococcus seria a América do Norte. Os autores também
sugeriram que a resposta para esta pergunta deveria vir das espécies do gênero menos
ligadas aos processos migratórios humanos, que teve papel fundamental principalmente
na dispersão da espécie E.granulosus e suas linhagens.
Possivelmente a criação de diferentes espécies de hospedeiros intermediários em
um mesmo local (bovinos e ovinos, por exemplo) permitiu o contato entre parasitos que
realizavam ciclos até então isolados. A simpatria pode ter acarretado na troca de genes
entre as diferentes populações, previamente isoladas. Isto traz a tona alguns problemas.
1) Qual sistema de cruzamento predominante? 2) A taxa de fluxo gênico é suficiente
para a homogeneização destas populações? 3) Qual o conceito de espécie mais
adequado para estes parasitos?
2.4.1. Sistema de cruzamento
A capacidade do adulto hermafrodita de realizar autofecundação pode ser
vantajosa em infecções com baixa densidade de vermes, porém a freqüência com que
isto ocorre na natureza é pouco conhecida (Thompson, 1995). Duas considerações
quanto ao estabelecimento da infecção no hospedeiro definitivo devem ser observadas:
os cistos, que possuem milhares de protoescólices, são ingeridos inteiros pelos cães; no
intestino muitos protoescólices (clones) se agregam, possivelmente por atração entre os
vermes, o que poderia estar relacionado com diferenças no microambiente nutricional,
mas que em contrapartida aumentaria as chances de fecundação cruzada (Lymbery et
al., 1989). Por estas características, poderíamos supor que o cruzamento entre clones
37
seria tão provável quanto a autofecundação. De qualquer forma, a conseqüência do
cruzamento entre clones é equivalente a autofecundação (Criscione e Blouin, 2006).
Em Echinococcus o tipo de fecundação foi estudado a partir de marcadores
moleculares. Lymbery e Thompson (1988) usaram eletroforese de isoenzimas e
verificaram que a variação observada nos parasitos entre as regiões da Austrália e a
ausência de desequilíbrio de ligação sugeria a fecundação cruzada. Por outro lado, a
deficiência de heterozigotos era um indício de autofecundação. Lymbery et al. (1997)
concluíram, que estes dados refletiriam a ocorrência de fecundação cruzada entre clones
(geitonogamia). A análise do polimorfismo de seqüência por SSCP de 6 locus do
genoma feita por Haag et al. (1999), concluiu que os dois tipos de fecundação correm
em Echinococcus, e encontraram evidências de cruzamento entre linhagens
mitocondriais diferentes, apesar destas linhagens serem bastante homogêneas em termos
genéticos.
Os dados aqui apresentados confirmam a deficiência de heterozigotos nas
populações de todas as linhagens mitocondriais estudadas. Isto nos permite apenas
concluir que a autofecundação ou um sistema equivalente deve estar atuando nas
populações. Além disso, as freqüências haplotípicas sugerem que: ou está ocorrendo
cruzamento entre as linhagens, ou as linhagens apresentam um polimorfismo ancestral.
Os possíveis híbridos são encontrados entre as os haplótipos G1 e G5 na amostras do
Brasil, G1 e G6 na Argentina, e G1 e G7 na Romênia. Pelo menos para as amostras do
Brasil podemos afirmar que os ciclos das linhagens ovina e bovina compartilham o
mesmo hospedeiro definitivo. O mesmo é sugerido para outras amostras da Argentina
(Haag et al., 2004), no Sul da Argélia entre as linhagens ovina e camelina (Bardonnet et
38
al., 2003; Bart et al., 2004) e na Romênia entre os haplótipos mitocondriais G1, G2 e G7
(Bart et al., 2006).
39
2.4.2. Populações em simpatria
Apesar das evidências que sugerem o cruzamento entre indivíduos de linhagens
diferentes (Thompson e Lymbery, 1996; Lymbery et al., 1997; Haag et al., 1999), as
populações mesmo em simpatria permanecem bem diferenciadas. Tanto os valores de
Fst e a AMOVA suportam que as populações da linhagem ovina (haplótipos G1 e G2)
estão bastante diferenciadas das linhagens de bovinos de porco e de camelo (haplótipos
G5, G6, G7). As estimativas de números de migrantes, baseados nos valores de Fst,
sugerem que o fluxo gênico não é suficiente para que ocorra a homogeneização destas
populações em simpatria (Futuyma, 1986).
De fato, a posição taxonômica destas linhagens está em discussão. A linhagem
de bovino (haplótipo G5) já é tratada como a espécie E. ortleppi (Thompson and
McManus, 2002). Os haplótipos G1, G2 e G3 formariam a espécie E. granulosus, e os
haplótipos G6, G7 e G8 comporiam a espécie E. canadensis (Nakao et al., 2006).
2.4.3. Espécies de Echinococcus
Como definir espécies de parasitos? O conceito biológico de espécies não é
aplicável para a maioria dos parasitos, principalmente aqueles que realizam
autofecundação. Lymbery (1992) buscou tratar deste problema de modo objetivo, pois
não seria adequado refutar o conceito de espécies biológicas naqueles organismos em
que o sistema de cruzamento predominante é a autofecundação. O autor sugere utilizar a
cladística para identificar grupos monofiléticos e discriminar as espécies por um método
de distância genética. Concordamos com a classificação da linhagem bovina como uma
nova espécie, e apesar de não conseguirmos distinguir, com o gene nuclear, as linhagens
de porco e camelo da linhagem de bovino, os dados mitocondriais suportam esta
separação (Thompson e McManus, 2002; Nakao et al., 2006)
40
Não podemos ignorar o fato que estas populações quando em simpatria são
capazes de intercruzar. A conseqüência deste fluxo gênico é a evolução. Novos
conjuntos de genes estão sendo “testados” em cada ambiente. Thompson e Lymbery
(1988) consideram a linhagem de camelo (haplótipo G6) pouco infectiva à humanos. Na
Argentina esta linhagem foi encontrada em 4 de 9 pacientes com hidatidose (Rosenzvit
et al., 1999). McManus e Thompson (2003) especularam que alguma mutação pode ter
surgido nos parasitos da linhagem G6 deste país, o que teria permitido a infecção de
humanos. Da mesma forma, porém com a possibilidade do cruzamento das linhagens de
ovino e de camelo, sugerimos que a introgressão gênica possa ser a responsável por
ampliar o número de espécies hospedeiras em parasitos com o haplótipo G6.
No sul do Brasil, o contato entre as linhagens de bovinos e ovinos possivelmente
aumentou nas últimas décadas. A especificidade ao hospedeiro da linhagem de bovino
deve ter colaborado para a restrição do contato com a linhagem ovina. Porém, o acesso
à energia elétrica para o congelamento da carne, permitiu que o abate de bovinos ficasse
freqüente nas fazendas, unido à retração da ovinocultura, os cães passaram a ser
alimentados mais freqüentemente com cistos da linhagem bovina do que no passado.
No sul do Brasil, não é conhecido um ciclo selvagem do parasito. Na Austrália,
o parasito da linhagem ovina se adaptou ao ambiente silvestre usando o dingo como
hospedeiro definitivo, e macrópodos, como cangurus, para desenvolver suas larvas.
(Thompson, 1995). Na Terra do Fogo dados de campo indicaram o potencial de
infecção da raposa cinza (Pseudalpex griséus) por Echinococcus granulosus (Zanini et
al., 2006). O a introgressão gênica poderia favorecer o surgimento de parasitos com
capacidade de infectar com sucesso animais selvagens. A infecção por Echonococcus
nos canídeos leva a uma imunidade populacional, isto é, os animais mais novos são
41
intensamente infectados enquanto os animais mais velhos a infecção é controlada,
liberando poucos ovos (Torgerson, 2006). Sendo assim, novos hospedeiros definitivos
poderiam aumentar rapidamente a quantidade de ovos no ambiente. Isto traria
conseqüências importantes no controle da doença e um possível aumento de casos em
humanos. Considerar apenas a informação do DNA mitocondrial fornece uma visão
limitada da história natural dos organismos (Anderson, 2001). Por isso, novos
marcadores nucleares analisados em conjuntamente aos mitocondriais serão cruciais na
elucidação da dinâmica evolutiva das populações de Echinococcus.
2.5. Agradecimentos
Agradecemos à Dra. Mara C. Rozsenzvit pelas amostras genotipadas dos parasitos
coletados na Argentina. e ao Dr Jean-Mathieu Bart pelas amostras da Argélia e da
Romênia. Os órgãos financiadores deste projeto foram CAPES e CNPq.
42
2.6. Referências
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46
47
2.7. Tabelas e Figuras
Tabela 1: Número de isolados de cada linhagem*
por amostra.
Amostra Hospedeiro Linhagem n total
Ovino G1 7
G1 14
G2 4
Argentina
Humano
G6 8
33
G1 115
G5 55
Brasil
Bovino
G7 1
171
Ovino G1 10
Humano G1 5
Bovino G1 7
G1 3
Argélia
Dromedário
G6 3
28
Ovino G1 6
Humano G1 1
Bovino G1 12
Romênia
Suíno G7 8
27
Total
259
* linhagem definida pelos haplótipos de cox1
Tabela 2: Freqüências genotípicas absolutas (% entre parênteses) e haplotípicas dos alelos de mdh para cada
linhagem distribuídas por amostra.
Freqüência genotípica Freqüência haplotípica
Amostras Linhagens
Md1/Md1 Md1/Md2 Md2/Md2 Md2/Md3 Md3/Md3
Total
Md1 Md2 Md3
1 2 17 - 1 21 0,1 0,86 0,04
G1
(4,76) (9,52) (80,95) (4,76)
- 1 3 - - 4 0,12 0,88 -
G2
(25) (75)
- 1 - - 7 8 0,06 0,06 0,88
G6
(12,5) (87,5)
1 4 20 - 8 33 0,09 0,67 0,24
Argentina
total
(3,03) (12,12) (60,61) (24,24)
5 9 10 - 1 25 0,38 0,58 0,04
G1
(20) (36) (40)
(4)
- - - - 3 3 - - 1
G6
(100)
5 9 10 - 4 28 0,52 0,34 0,14
Argélia
total
(17,86) (32,14) (35,71) (14,29)
25 46 41 1 2 115 0,42 0,56 0,02
G1
(21,74) (40) (35,65) (0,87) (1,74)
- 3 - - 52 55 0,03 0,03 0,94
G5
(5,5) (94,5)
- - - - 1 1 -
- 1
G7
(100)
25 49 41 1 54 171 0,29 0,39 0,32
Brasil
total
(14,62) (28,65) (23,98) (0,58) (31,58)
2 6 11 - - 19 0,26 0,74 -
G1
(10,53) (31,58) (57,89)
- - - 1 7 8 - 0,06 0,94
G7
(12,5) (87,5)
2 6 11 1 7 27 0,19 0,53 0,28
Romênia
total
(7,41) (22,22) (40,74) (3,7) (25,93)
48
Tabela 3: Desvio da heterozigosidade esperada e índices de diversidade de seqüência
nos alelos de mdh para os isolados de cada linhagem nas diferentes amostras.
Amostras Heterozigose
Índices de Diversidade de
Seqüência
Origem Linhagem
n
Observada Esperada
Sítios
Polimórficos (S)
Diversidade
nucleotídica (π)
G1 21 0,09** 0,26 10 0,006
G2 4 0,25 0,25 3 0,003
Argentina
G6 8 0,13 0,24 10 0,01
G1 115 0,41** 0,51 10 0,01
Brasil
G5 55 0,05** 0,1 10 0,004
G1 25 0,36* 0,53 10 0,01
Argélia
G6 3 0 - 0 0
G1 19 0,32 0,4 3 0,01
Romênia
G7 8 0,13 0,13 8 0,005
* = p<0,05
** = p<0,001
49
Tabela 4: Valores de Fst na diagonal inferior e número de migrantes por geração na diagonal superior.
Amostras Diferenciação Populacional Fst e Número de migrantes por geração
Argentina Brasil Argélia Romênia
Origem Linhagem
n
G1 G2 G6 G1 G5 G1 G6 G1 G7
G1 21 ∞
0,13
3,30 0,07 4,32 0,08 15,32 0,09
G2 4 -0,06
0,12
5,04 0,06 8,10 0,02 ∞ 0,06
Argentina
G6 8 0,8** 0,80** 0,16 285,70 0,18 ∞ 0,11 ∞
G1 115 0,13** 0,09 0,76*
0,11
∞ 0,12 13,46 0,13
Brasil
G5 55 0,87** 0,9** 0,00 0,82** 0,09 ∞ 0,07 ∞
G1 25 0,10** 0,06 0,73* -0,01 0,84**
0,13
23,34 0,14
Argélia
G6 3 0,87** 0,95* -0,03 0,81** -0,06 0,79** 0,06 ∞
G1 19 0,03 -0,02 0,81* 0,03* 0,88** 0,02 0,89**
0,08
Romênia
G7 8 0,85** 0,89** -0,04 0,79**
-0,03 0,78** -0,08 0,86**
* = p<0,05
** = p<0,001
em negrito valores de Nm relevantes onde o Fst possui p<0,05.
50
Tabela 5: AMOVA entre grupos (G1, G2, G5, G6, G7) e entre populações
geográficas (Argentina, Argélia, Brasil, Romênia).
Fonte de Variação G.L. Soma dos Quadrados
Componente da
variância
Percentagem
de Variação
Entre grupos 4 739,3 3,00261 Va 78,97
Entre populações do
grupo
5 12,79 0,04299 Vb 1,13
Dentro das populações 508 384,29 0,73144 Vc 19,9
Total 517 1.136,93 3,80
51
52
Figura 1: Padrões de migração das fitas simples (SSCP) dos fragmentos do gene mdh. 1)
homozigoto para o alelo Md1; 2) Heterozigoto Md1/Md2; 3) Homozigoto para o
alelo Md2; 4) Heterozigoto Md2/Md3; 5) Homozigoto para o alelo Md3. Δ fita
dupla dos amplicons de mdh, notar a presença de heteroduplex nos heterozigotos
( 2 e 4). Padrão de peso molecular ΦΧ174/HeaIII.
Capítulo 3. Resultados parciais sobre a diversidade do AgB4
3.1. Metodologia
3.1.1. Amostras
Na Tabela 2 estão dispostos os 151 isolados de cada amostra que tiveram o
AgB4 seqüenciado, com seus respectivos haplótipos. Um isolado é definido como um
indivíduo, e representa uma fração dos protoescólices geneticamente idênticos de um
único cisto hidático.
Tabela 2: número de isolados
seqüenciados de cada amostra
separados por linhagem.
Amostra haplótipo isolados
G1 10
G2 2
Argentina
G6 1
G1 72
Brasil
G5 21
G1 24
Argélia
G6 2
G1 18
Romênia
G7 1
Total 151
3.1.2. PCR e seqüenciamento
Um
primer foi desenhado a partir do clone DQ148522.1 do GeneBank, anelando
na região promotora 5’ (PB4F_ol1 5’ GGA TGG AGT ATA AGG AGC AG 3’). A
região 5’de anelamento dos primers existe certa homologia entre as seqüências de AgB2
e AgB4. Para evitar a amplificação do AgB2 utilizou-se um
primer reverso específico
53
para AgB4 utilizado por Haag et al. (2006a). Este primer anela dentro do segundo éxon
(AgBRev2 5’ GAC ATA TTT CTT CAA CAC TTC GTG AAC 3’). O tamanho
esperado dos amplicons é de 355 pb (Figura 6).
Com o objetivo de reduzir ainda mais chance de amplificação do AgB2, as PCRs
foram realizadas com um programa do tipo touchdown. A temperatura de anelamento
variava de 60°C a 50°C nos 20 primeiros ciclos e permanecia a 50°C por mais 20 ciclos.
Cada ciclo iniciava com uma temperatura de 94°C para desnaturação por 1 min, mais 1
min à 50°C para anelamento dos primers, e um último passo de extensão de 1 min à
72°C. As condições das reações foram as seguintes: aproximadamente 30ng de DNA
total; 1,5 unidades de enzima (Taq DNA polimerase INVITROGEN®); 1,5mM de
MgCl
2
; 10mM de dnTPs; 20pmois de cada primer, em um volume total de 50μl.
Os amplicons foram seqüenciados automaticamente (ABI 3730XL). O
seqüenciamento de toda a região amplificada só foi possível com a utilização de um
segundo primer direto (AgB8/2F 5’ TTG CTC TCG TGG CTT TCG TG 3’) que anela
após a região repetitiva do promotor (Figura 6), uma vez que o uso do primer direto da
PCR resultava em muitos picos sobrepostos.
3.1.3. Análise dos dados
3.1.3.1.Obtenção das sequencias
Cada reação de amplificação foi seqüenciada com os primers AgBRev2 e
AgB8/2F. Os cromatogramas de cada isolado foram alinhados e obtidos os contigs no
programa SeqMan
TM
II do pacote Lasergene DNAStar® 6.0. Este programa calcula
diretamente a qualidade das seqüências pelos dados do seqüenciador. Foram utilizados
picos com escore de qualidade superior a 12 segundo as predeterminações do programa
no nível de rigorosidade médio.
54
55
Figura 6: Comparação das regiões amplificadas do gene AgB4 (DQ148522.1 e AY614001.1)
e a homologia em AgB2 (DQ148518.1 e AY569356.1). Em verde Localização dos primers
utilizados (PB4F_ol1, AgB8/2F e AgB4Rev2), as setas indicam a direção do primer na
seqüência. Em vermelho a posição do primeiro códon. Em azul localização do íntron. Em
laranja microssatélite com motivo GT.
A
gB4 :
A
gB2 :
* 20 * 40 * 60
TGTTTACGTGAAGGCATGTCTAACAGTAAGTGGATGGAGTATAAGGAGCAGAGCGGAGTG
.......A..G..ATG..C.......G..................AG..G....A..C.A
: 6
0
: 6
0
A
gB4 :
A
gB2 :
* 80 * 100 * 120
ACCTCTACCCC-TGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATCTGCGTGTGACATTTGTGG
...........G...........----------------.....................
: 11
9
: 10
4
A
gB4 :
A
gB2 :
* 140 * 160 * 180
AGACAATCGCATAATGAGGACTTACATCCTTCTCTCTCTTGCTCTCGTGGCTTTCGTGGC
............................................................
: 17
9
: 16
4
A
gB4 :
A
gB2 :
* 200 * 220 * 240
CGTCGTTCAAGCGTGAGTCTCACAACGTCTCCTTCTCTTCTCTCCATACCTCACTTTGAC
.......................................S......Y......T...C..
: 23
9
: 22
4
A
gB4 :
A
gB2 :
* 260 * 280 * 300
ACTGTTCTCCTCCCTTCCAGGAAAGCTGAACCCGAGAGATGCAAGTGCC---TCATAATG
.T.TG..A........TT..T....A...G..AA.AGC.CA..T.G.G.AAG.GG...AA
: 29
6
: 28
4
A
gB4 :
A
gB2 :
* 320 * 340 * 360
AGAAAATTGGGCGAAATTCGGGACTTCTTTAGAAGTGATCCACTGGGTCAAAAACTTGTT
.A..G..G...T...C....A.............A.................G......C
: 35
6
: 34
4
A
gB4 :
A
gB2 :
* 380 * 400 * 420
GCTCTTGGCAGGGACCTGACTGCCATCTGCCAGAAGCTGCAATTGAAGGTTCACGAAGTG
..........AT.....A........T.....................A...GT..G...
: 41
6
: 40
4
A
gB4 :
A
gB2 :
* 440 *
TTGAAGAAATATGTCAAGGATTTGCTGGAAGAAGAAGAT
C.......G.....T...A.....G........A.....
: 455
: 443
AgB4Rev2
AgB8/2F
PB4ol1
Com exceção da região após o microssatélite do promotor, algumas seqüências
tiveram ambigüidades no segundo éxon apenas. As ambigüidades foram consideradas
como polimorfismos reais quando apareciam nas duas fitas seqüenciadas. Após o
microssatélite, em direção ao início do amplicon, a maioria das seqüências apresentou
picos múltiplos, esta região foi excluída das análises de diversidade.
3.1.3.2.Alinhamento e diversidade
As seqüências foram alinhadas e separadas em dois grupos (ver abaixo). Os
alinhamentos foram feitos no programa ClustalX 1.81 (Thompson et al., 1997) e
conferidos no programa GeneDoc 2.7 (Nicholas, 1997). As estimativas de diversidade
nucleotídicas foram feitas no programa DNASP 4.0 (Rozas et al., 2003), separadamente
para as seqüências de cada tipo, e em conjunto.
3.2. Resultados
Pelos padrões dos cromatogramas, é verificado que os amplicons de AgB4 são
compostos por uma população heterogênea de seqüências, que variam em número de
repetições GT na região promotora 5’ (Figura 7). Temos a certeza de estar amplificando
especificamente genes que codificam o AgB4, pela homogeneidade das seqüências na
região codificadora. Porém, fica claro que se trata de genes parálogos, ou os
protoescólices não são geneticamente idênticos, pois o número de amplicons distintos é
nitidamente superior a 2. Acreditamos estar amplificando parálogos de AgB4, porque
Haag et al. (2006a) já mostraram evidências da redundância deste gene. Devido às
dificuldades de leitura na região 5’ compreendendo os motivos repetitivos, foram
excluídos das análises subseqüentes aproximadamente 60 pb.
Foram identificados dois conjuntos de seqüências claramente distintas. Mais
freqüentemente nos isolados com haplótipo mitocondrial G1 foram encontradas as
56
seqüências que nós chamamos de “tipo 1”. Em G5, as seqüências do “tipo 2” foram
mais freqüentes (Tabela 3).
Figura 7: Cromatogramas das seqüências obtidas com o primer AgB4Rev2 (as setas
vermelhas indicam o sentido do seqüenciamento). “A” seqüência obtida de um isolado
com haplótipo G1 (tipo 1) que não sai de fase após o microssatélite. “B” e “C”
seqüências de outros isolados G1 com múltiplos picos nas posições após o
microssatélite, “D”, seqüência padrão de um isolado do haplótipo G5 (tipo 2). As
seqüências não estão alinhadas para facilitar a visualização da qualidade dos picos. As
3 seqüências apresentam a base subseqüente ao primer PB4F_ol1.
57
Tabela 3: Freqüências das seqüências do tipo 1 e do
tipo 2 para os diferentes haplótipos mitocondriais.
Seqüências AgB4
Tipo1 Tipo2
Haplótipos
Absoluto % Absoluto %
total
G1 122 0,99 1 0,01 123
G2 2 1,00 0 0 2
G5 4 0,18 18 0,82 22
G6 2 0,67 1 0,33 3
G7 1 1,00 0 0 1
Total 131 0,87 20 0,13 151
3.2.1. Seqüências do tipo 1
Neste grupo foram encontradas seqüências em que o motivo GT está repetido 4,
11, 13 e 14 vezes. O motivo está distante 33 nucleotídeos à montante do primeiro
códon. Do início do amplicon até o primeiro códon são aproximadamente 83
nucleotídeos. Este comprimento varia para algumas seqüências devido a indels na
região repetitiva (Figura 8). Após a região repetitiva as seqüências do tipo 1 são pouco
divergentes, apresentando apenas 4 sítios polimórficos. Três deles no éxon 2 e um no
éxon 1. Os íntrons de todas estas seqüências são idênticos, e possuem o sinal de
remoção conservado. As seis diferentes seqüências encontradas possuem poucos sítios
segregantes e uma baixa diversidade nucleotídica (Tabela 4).
Tabela 4: Diversidade das seqüências obtidas do gene
AgB4 calculada para cada tipo de seqüência.
Sítios
segregantes
Número de
haplótipos
Diversidade
haplotípica
Diversidade
nucleotídica
Tipo1 7 6 0,52 0,0023
Tipo2 6 2 0,1 0,0018
Tipo1 e 2 42 6 0,63 0,034
58
59
Figura 8: Alinhamento das seqüências de AgB4 obtidas em cada haplótipo mitocondrial.
O número que precede o haplótipo representa o isolado do qual a seqüência foi obtida.
Em vermelho está indicado o primeiro códon do gene. Em azul estão indicados os sítios
de splicing, e em laranja a mutação das seqüências do tipo 2 no sítio 3’. Em amarelo está
indicado uma inserção de 2 nucleotídeos nas seqüências do tipo 2. Em verde o possível
sítio de splicing da variante do tipo 2. “?” representa ausência de informação, “-“
representa indels.
493_G1 :
395_G1 :
482_G1 :
628_G1 :
112_G5 :
625_G6 :
626_G6 :
097_G6 :
640_G7 :
* 20 * 40 * 60 * 80
AGCGGAGTGACCTCTACCCCGTGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT----ATCTGCGTGTGACATTTGTGGAGACAATCGCATAA
....................-.........................GTGT...................................
----------------------........................GTGT...................................
--------------------............------------------..S..Y.............................
-----...............A......C.........------------------------........................
-----...............A......C.........------------------------........................
....................-.........................GTGT...................................
------------------------......................GTGT...................................
----------------------........................GTGT...................................
: 81
: 84
: 63
: 47
: 56
: 56
: 84
: 61
: 63
493_G1 :
395_G1 :
482_G1 :
628_G1 :
112_G5 :
625_G6 :
626_G6 :
097_G6 :
640_G7 :
* 100 * 120 * 140 * 160 *
TGAGGACTTACATCCTTCTCTCTCTTGCTCTCGTGGCTTTCGTGGCCGTCGTTCAAGCGTGAGTCTCACAACGTCTCCTTCTCTT
.....................................................................................
.....................................................................................
.....................................................................................
.....................................................................................
.......C................................................................A............
.....................................................................................
.....................................................................................
.....................................................................................
: 166
: 169
: 148
: 132
: 141
: 141
: 169
: 146
: 148
493_G1 :
395_G1 :
482_G1 :
628_G1 :
112_G5 :
625_G6 :
626_G6 :
097_G6 :
640_G7 :
180 * 200 * 220 * 240 *
CTCTCCATACCTCACTTTGACACTGTTCTCCTCCCTTCCAGGAAAGCTGAACCCGAGAGATGCAAGTGCCTCATAATGAGAAAA-
....................................................................................-
....................................................................................-
....................................................................................-
G......C......T...C...T.TG...........T.T.T....A...G..AA.AGCGCA..T.G.G.AAG.G..A.A....G
..............T...C...T.TG...........T.T.T....A...G..AA.AGCGCA.GT.G.G.AAG.G..A.A....G
....................................................................................-
....................................................................................-
....................................................................................-
: 250
: 253
: 232
: 216
: 226
: 226
: 253
: 230
: 232
493_G1 :
395_G1 :
482_G1 :
628_G1 :
112_G5 :
625_G6 :
626_G6 :
097_G6 :
640_G7 :
260 * 280 * 300 * 320 * 340
-TTGGGCGAAATTCGGGACTTCTTTAGAAGTGATCCACTGGGTCAAAAACTTGTTGCTCTTGGCAGGGACCTGACTGCCATCTGC
-....................................................C.........G.....................
-....................................................Y...............................
-...R................................................................................
A.G...T...C...AA...............................G.....................................
A.G...T...C....A...............................G.....................................
-....................................................Y...............................
-....................................................C...............................
-....................................................................................
: 334
: 337
: 316
: 300
: 311
: 311
: 337
: 314
: 316
493_G1 :
395_G1 :
482_G1 :
628_G1 :
112_G5 :
625_G6 :
626_G6 :
097_G6 :
640_G7 :
*
CAGAAGCTGCAATTGAAG
..................
..................
..................
...........T......
...........T......
..................
..................
..................
: 352
: 355
: 334
: 318
: 329
: 329
: 355
: 332
: 334
3.2.2. Seqüências do tipo 2
As seqüências do tipo 2 são mais curtas do que o esperado (329 pb),
apresentando uma deleção na região promotora de aproximadamente 24 pb, quando
comparadas com as seqüências do tipo 1 (Figura 8). Diferentemente das seqüências do
tipo 1, os cromatogramas não apresentaram picos sobrepostos na região 5’ (Figura 7).
Mas as diferenças não se restringem a região 5’. Frente à grande divergência das
seqüências do tipo 1 e do tipo 2 (Tabela 4) realizamos uma busca no GeneBank usando
a ferramenta BLASTn. As seqüências do tipo 1 foram todas identificadas como AgB4.
Entretanto, as do tipo 2 apresentaram similaridade com uma seqüência (AY569358.1),
considerada uma cópia não funcional do gene do AgB2 (Kamenetzky et al., 2005), que
chamamos de AgB2-like.
Apesar das diferenças, o primeiro éxon é bastante conservado. Nas 151
seqüências, foram encontradas apenas duas diferenças em duas seqüências nesta região.
Uma apresentou uma transição (C-T) silenciosa na posição 3 do terceiro códon, outra
uma transversão (T-A) que muda o aminoácido a de uma serina para uma tirosina na
segunda posição do códon 8. A diversidade nucleotídica das seqüências nesta região foi
0,0005.
As grandes diferenças na região codificadora das seqüências do tipo 1 e do tipo
2 iniciam no sinal de splicing na extremidade 3’do íntron. Nas seqüências do tipo 2 este
sinal está alterado, e não pode ser utilizado para a edição do mRNA (Figura 8). A partir
deste ponto, a seqüência torna-se semelhante à de AgB2. A maioria das diferenças entre
as seqüências tipo 1 e tipo 2 encontra-se em uma região que se estende por 60 bases
após o sítio splicing “original”. Nesta região existe uma inserção de dois nucleotídeos
que certamente mudaria a fase de leitura (Figura 9). Após esta região o próximo sinal de
60
remoção de íntron, se utilizado, produziria uma seqüência relacionada com o AgB,
porém truncada (Figura 10).
Figura 9: Alinhamento dos fragmentos amplificados de AgB4 tipo 1 e tipo 2 com
AgB2 e AgB2 like (GeneBank). Em vermelho, o primeiro códon. Em azul, sinais de
splicing e em laranja mutação no sinal 3’de splicing nas seqüências do tipo 2 e
AgB2-Like. Em amarelo, indels que mudariam a fase de leitura nas seqüências do
tipo 2 e, AgB2-Like. Em verde possível local de splicing das seqüências do tipo 2.
A
gB4_DQ152008.1 :
Tipo1 :
Tipo2 :
B2like_AY569358 :
A
gB2_DQ148518.1 :
* 20 * 40 * 60 *
AGCGGAGTGACCTCTACCCC-TGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATCTGCGTGT----GACATTTGT
...............C....-C......................................----.........
-----...............A.....----------------------------......GTGT.........
???????????????????????????????????????????????????????????????????......
...A..C.A...........G...........------------------..........----.........
: 68
: 68
: 40
: 6
: 51
A
gB4_DQ152008.1 :
Tipo1 :
Tipo2 :
B2like_AY569358 :
A
gB2_DQ148518.1 :
80 * 100 * 120 * 140
GGAGACAATCGCATAATGAGGACTTACATCCTTCTCTCTCTTGCTCTCGTGGCTTTCGTGGCCGTCGTTCAAG
.........................................................................
.........................................................................
.........................................................................
.........................................................................
: 141
: 141
: 113
: 79
: 124
A
gB4_DQ152008.1 :
Tipo1 :
Tipo2 :
B2like_AY569358 :
A
gB2_DQ148518.1 :
* 160 * 180 * 200 * 22
CGTGAGTCTCACAACGTCTCCTTCTCTTCTCTCCATACCTCACTTTGACACTGTTCTCCTCCCTTCCAGGAAA
.........................................................................
............................G......C......T...C...T.TG...........T.T.T...
............................G......C......T...C...T.TG...........T.T.T.G.
............................G......C......T...C...T.TG..A........TT..T...
: 214
: 214
: 186
: 152
: 197
A
gB4_DQ152008.1 :
Tipo1 :
Tipo2 :
B2like_AY569358 :
A
gB2_DQ148518.1 :
0 * 240 * 260 * 280 *
GCTGAACCCGAGAGATGCAAGTGCCTCATAATGAGAAAA---TTGGGCCAAATTCGGGACTTCTTTAGAAGTG
.......................................---......G........................
.A...G..AA.AGCGCA..T.G.G.AAG.G..A.A....-GA.G...TG..C...AA................
.A...G..AA.AGCGCA..T.G.G.AAG.G..A.A....-GA.G...TG..C...AA................
.A...G..AA.AGC.CA..T.G.G.AAG.GG.A.A....AGA.G...TG..C....A.............A..
: 284
: 284
: 258
: 224
: 270
A
gB4_DQ152008.1 :
Tipo1 :
Tipo2 :
B2like_AY569358 :
A
gB2_DQ148518.1 :
300 * 320 * 340 * 360
ATCCACTGGGTCAAAAACTTGTTGCTCTTGGCAGGGACCTGACTGCCATCTGCCAGAAGCTGCAATTGAAG
.......................................................................
...............G................................................T......
...............G................................................T......
...............G......C..........AT.....A........T.....................
: 355
: 355
: 329
: 295
: 341
A
gB4_DQ152008.1 :
Tipo1 :
A
gB2_DQ148518.1 :
Tipo2 :
* 20 * 40 * 60
MRTYILLSLALVAFVAVVQAKAEPERCKCLIMRK-LGQIRDFFRSDPLGQKLVALGRDLTAICQKLQLK
MRTYILLSLALVAFVAVVQAKAEPERCKCLIMRK-LGEIRDFFRSDPLGQKLVALGRDLTAICQKLQLK
MRTYILLSLALVAFVAVVQAKDEPKAHMGQVVKKRWGELRDFFRNDPLGQRLVALGNDLTAICQKLQLK
MRTYILLSLALVAFVAVVQA------------------------SDPLGQRLVALGRDLTAICQKLHLK
: 68
: 68
: 69
: 45
Figura 10: Alinhamento da seqüência parcial de aminoácidos do AgB4, AgB2 e da
seqüência do tipo 2 apartir do possível sítio de excisão do íntron.
61
3.3. Perspectivas
A possibilidade dos genes do AgB estarem redundantes no genoma de
Echinococcus foi proposta por Haag et al. (2006a) utilizando PCR em tempo real. O
presente trabalho reúne dados de 151 isolados, e os padrões dos cromatogramas de
quase todos eles sugerem a amplificação de mais de um loco relacionado com o AgB4.
Para buscar identificar a diversidade existente, alguns amplicons estão sendo clonados.
Pelo menos 40 plasmídeos contendo insertos relacionados a AgB4 serão seqüenciados,
para avaliar a diversidade alélica e a variação no número de repetições GT entre as
variantes.
A grande homologia na região codificadora e no íntron entre as seqüências de
um mesmo grupo poderia sugerir a evolução em concerto, a exemplo do que ocorre nas
regiões de rDNA. As variantes podem estar distribuídas no genoma em freqüências
desiguais, o que poderia ser sugerido pelas diferentes alturas nos picos sobrepostos dos
cromatogramas, e pela variação da estimativa do número de cópias encontradas em
experimentos de PCR em tempo real (Haag et al., 2006a).
Kamenetzky et al. (2005) utilizaram uma reação de PCR não específica para a
amplificação de seqüências dos genes AgB2 e AgB4 em amostras pequenas de parasitos
de diferentes haplótipos mitocondriais. Após as clonagens dos amplicons, encontraram
uma seqüência no cluster dos haplótipos G5 e G6/G7 que eles consideraram como
sendo uma cópia não-funcional de AgB2. Dada a especificidade de nossas reações,
sugerimos que as seqüências presentes em G5 são conseqüência de uma variante de
AgB4 que aparentemente recombinou com o gene AgB2. O sítio de remoção do íntron
está alterado. Contudo, a conservação do íntron, do éxon 1 e final do éxon 2 pode estar
sugerindo que este gene ainda é funcional, e poderia estar sendo editado pela remoção
62
do íntron em um sítio alternativo. Estudos envolvendo a transcrição reversa e
seqüenciamento dos cDNAs de AgB4 do tipo 2 serão esclarecedores. Uma vez que as
seqüências do tipo 2 ocorrem preferencialmente nos isolados do haplótipo G5, duas
explicações são possíveis: a) o tipo 2 é a seqüência típica da linhagem bovina; ou b) o
gene AgB4 não truncado desta linhagem está em um local diferente no genoma. De
qualquer modo, a presença da seqüência do tipo 1 em isolados com haplótipo G5 seria
melhor explicado pela introgressão gênica (ver capítulo 4).
63
Capítulo 4. Considerações Finais
Tabela 5: Total de isolados caracterizados para os 3 marcadores (cox1, mdh e AgB4).
mdh AgB4
Haplótipo
Md1/Md1 Md1/Md2 Md2/Md2 Md2/Md3 Md3/Md3 Tipo1 Tipo2
Total
G1 23 39 55 1 2 119 1 120
G2 - 1 1 - - 2 - 2
G5 - 2 - - 20 4 18 22
G6 - 1 - - 2 2 1 3
G7 - - - - 1 1 - 1
Total 23 43 56 1 25 128 20 148
Embora estudos prévios tenham demonstrado uma alta diferenciação genética
entre as linhagens de E. granulosus (Bowles et al., 1992; Bowles e McManus, 1993a;
Bowles e McManus, 1993b; Bowles et al., 1995; Thompson e McManus, 2002; Nakao
et al., 2006), nosso estudo com dois marcadores nucleares aponta para um considerável
grau de fluxo gênico entre elas. Para os dois genes nucleares pudemos identificar alelos
(no caso de mdh) e seqüências características (no caso de AgB4) para as linhagens ovina
e bovina. Enquanto nos parasitos da linhagem ovina (haplótipos G1 e G2) predominam
dos alelos Md1 e Md2 para mdh e seqüências do tipo 1 para Agb4, nos isolados da
linhagem bovina predominam o alelo Md3 e seqüências do tipo 2 (Tabela 5).
No futuro será interessante adicionar um número maior de marcadores à análise.
Combinados aos dados do gene AgB4, nossos resultados indicam que o
compartilhamento de alelos de mdh (capítulo 4) não se trata de um polimorfismo
ancestral, mas é resultado de introgressão gênica. As implicações evolutivas e
epidemiológicas desse achado são relevantes para o controle da doença.
64
Finalmente, nossos resultados sobre o polimorfismo do AgB4 confirmam o alto
grau de redundância dos genes do AgB, conforme proposto previamente por estudos do
nosso grupo. Comparando a diversidade das seqüências do tipo 1 e do tipo 2 (apenas da
região do éxon 1, íntron e éxon 2) observamos que a do tipo 2 é menos variável nos
níveis de diversidade nucleotídica e alélica (Tabela 4). Considerando que o número de
cópias estimado nos parasitos da linhagem bovina é maior que nos da linhagem ovina
(Haag et al., 2006a), nosso dados estariam de acordo com a evolução em conserto dos
genes. Os eventos de conversão gênica, que geram a evolução em concerto, são
favorecidos quanto maior for o número de cópias e se os genes se encontram agregados
em clusters (Graur e Li, 2000).
Porém, são necessários estudos mais aprimorados sobre os processos de
divergência dos genes parálogos nessa família, que teriam gerado a grande
diferenciação entre os genes AgB4 das linhagens ovina (seqüências tipo 1) e bovina
(seqüências tipo 2). Uma vez que o AgB tem um importante papel na interação parasito-
hospedeiro, conforme constatado por diversos estudos (Shepherd et al., 1991; Rigano et
al., 2001; Gonzalez-Sapienza e Cachau, 2003; Rigano et al., 2007 Graichen et al.,
2007), este tipo de investigação poderá identificar mais precisamente os mecanismos
genéticos responsáveis pela adaptação do Echinococcus aos seus hospedeiros
intermediários.
65
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