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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
LUCI AVEIRO CRIVELLARO
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL
DE CITOCROMO c MODIFICADO COM
UMA 4-AMINO-1,8-NAFTALIMIDA
Mogi das Cruzes, SP
200
7
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
LUCI AVEIRO CRIVELLARO
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL
DE CITOCROMO c MODIFICADO COM
UMA 4-AMINO-1,8-NAFTALIMIDA
Dissertação apresentada ao mestrado em Biotecnologia da
Universidade de Mogi das Cruzes, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Área de Concentração: Ciências Biológicas
Orientador: Prof. Dr. Sergio Brochsztain
Co-Orientadora: Profª Drª. Iseli Lourenço Nantes
Mogi das Cruzes, SP
200
7
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FINANCIAMENTO:
FAEP – UMC - Fundação de Amparo ao Ensino e Pesquisa da Universidade
de Mogi das Cruzes.
Secretaria da Educação do Governo do Estado de São Paulo
FICHA CATALOGRÁFICA
Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central
Crivellaro, Luci Aveiro
Síntese e caracterização estrutural de citocromo c
com uma 4-AMINO-1,8-NAFTALIMIDA / Luci Aveiro
Crivellaro. -- 2007.
79 f.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) -
Universidade de Mogi das Cruzes, 2007
Área de concentração: Ciências Biológicas
Orientador: Prof. Dr. Sergio Brochsztain
1. Citocromo c 2. Imidazol 3. Fluorescência I. Título
II. Brochsztain, Sergio
CDD 572.6
LUCI AVEIRO CRIVELLARO
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE CITOCROMO c
MODIFICADO COM UMA 4-AMINO-1,8-NAFTALIMIDA
2007
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, os responsáveis diretos pelo meu sucesso, devido ao
amor incondicional e aos valores morais incutidos desde sempre e ao meu filho, Renato, a
verdadeira razão de minha vida.
AGRADECIMENTOS
Agradecer é uma tarefa difícil quando se trata de citar todos aqueles que colaboraram para que eu
pudesse realizar este trabalho. Inicialmente agradeço a compreensão, dedicação e
companheirismo do meu eterno amigo Rinaldo por todas as horas difíceis que juntos passamos,
sempre me apoiando de maneira tão generosa. As minhas irmãs e amigas Virgínia e Valéria por
tudo que fizeram por mim e pelo meu filho durante esta fase de mil necessidades diferentes e de
momentos difíceis. Aos meus amigos do CIIB que das mais variadas formas colaboraram para o
sucesso do meu trabalho. A Kátia, a Daniela, Cíntia e Tatiana que dispuseram muitas vezes do
seu tempo para me ajudar, agradeço de coração por tudo que aprendi com vocês. O Rodrigo,
Vanessa, Rafael, Fabiane, Barbara, Felipe, Fabrício, Carolina, Juliana Conrado, Priscila, Juliana
Mafra, Juliana Casares, Gabriel e Débora pelo carinho e atenção. Aos meus orientadores Prof
Sergio e Profª Iseli que me deram a oportunidade de desenvolver minhas habilidades, pela
atenção e estímulo necessários em um trabalho como este. Ao Profº Ivarne Tersariol pela
oportunidade de aprimorar meu trabalho e de ter acreditado no meu potencial. Aos demais
pesquisadores, Profº Caíres, Profº Thiago, Profº Flávio e Profª Claudia pela atenção e por tudo
que aprendi durante este período. Agradeço também as supervisoras Izabel e Denise da Diretoria
de Ensino de Mauá pela atenção, carinho e paciência em todos os momentos. Aos colegas do E.E.
Dom José Gaspar, especialmente a Gisele, Daniela, Silvana, Suzemar, Leonor , Tereza e a equipe
gestora: Fátima, Ivete e Vilma pelo carinho e atenção, ouvindo minhas histórias, colaborando de
todas as maneiras, me apoiando e incentivando. Ao apoio financeiro da FAEP - UMC e da
Secretaria da Educação do Estado de São Paulo.
RESUMO
Citocromo c é uma hemoproteina envolvida em eventos importantes da célula: a cadeia
respiratória e a apoptose. No processo de apoptose o citocromo c liberta-se do interior da
membrana mitocondrial e alcança o citosol, mas, devido à proteína não ser fluorescente, há
dificuldade em seguir seu tráfego interno na célula através de técnicas microscópicas de
fluorescência. O objetivo do presente trabalho é o de acoplar o composto fluorescente 4-amino-
1,8-naftalimida (4-ANI) covalentemente ao citocromo c de maneira que se possa monitorar o
fluxo da proteína durante o processo de apoptose. Realizou-se dois métodos para a inserção do
fluoróforo: (i) incubação da proteína com carbodiimida (EDAC) como agente acoplador (ii)
usando o anidrido, precursor da 4-ANI, em imidazol fundido. O sucesso das reações de inserção
foram monitoradas por espectrometria UV/vis, dicroísmo circular, cromatografia de camada
delgada (TLC) e espectrometria de massas (MALDI-ToFF). O método com imidazol fundido foi
o mais eficiente para modificar o citocromo c. O citocromo c modificado não exibiu alterações
significativas estruturais em seu grupo heme e, portanto deve manter algumas propriedades
biológicas. Entretanto, foi observado que o grupo heme promove uma significativa supressão de
fluorescência da imida. Estes resultados sugerem o uso desta proteína fluorescente modificada
para os estudos de ligação em membrana e talvez para monitorar o trânsito do citocromo c na
célula.
Palavras-chave: citocromo c, imidazol, fluorescência.
ABSTRACT
Horse heart cytochrome c (cyt c) is a hemoprotein involved in two important cell events: the
respiratory chain and the apoptosis. In the apoptosis process cyt c detaches from the inner
mitochondrial membrane and attains the cytosol, but, because the protein is not fluorescent, it is
difficult to follow its traffic inside the cells by fluorescence microscopy techniques. Therefore,
the aim of the present work is to attach fluorescent 4-amino-1,8-naphthalimides (ANI) to the cyt
c structure in a manner that preserves its native conformation. Coupling of the precursor 4-amino-
1,8-naphthalic anhydride with cyt c was attempted by using three techniques: (i) incubation of the
protein with the anhydride in molten imidazole; (ii) sonication of the mixture in water; (iii) using
a carbodiimide (EDAC) as coupling agent. According to fluorescence spectrophotometric,
chromatographic and mass spectrometric analysis, the use of molten imidazole was the most
efficient method to modify cyt c. ANI-modified cyt c did not exhibit significant structural
alterations and potentially should maintain some biological properties. However, significant
quenching of the attached imide fluorescence by the heme group was observed. The quenching
intensity was attenuated by the association of the protein with membranes. These results point to
the use of this modified fluorescent protein as a probe for membrane binding studies and perhaps
for monitoring cell traffic.
Key-words: cytochrome c, imidazole, fluorescent.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Representação esquemática de uma mitocôndria. . . . . . . . . . . .
16
Figura 2
– Estrutura do citocromo c de coração de cavalo destacando os
resíduos de lisina e o grupo heme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
grupo heme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
Figura 3
– Representação dos diferentes estados de spin dos íons Fe
2+
e
Fe
3+
do citocromo c resultantes da interação com lipossomos modelos. . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
Figura 4 – Espectros de absorção do citocromo c em suas formas alto spin
e baixo spin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
Figura 5 – Respiração aeróbia a partir da glicose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
Figura 6
– Reações envolvidas no transporte de elétrons na cadeia
respiratória . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
23
Figura 7
– Cadeia respiratória. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
24
Figura 8 – Seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico. . . . .
27
Figura 9 – Mecanismo proposto para a reação entre citocromo c e DPAA.
29
Figura 10
– Estruturas de imidas aromáticas relevantes. . . . . . . . . . . . . . .
.
31
Figura 11 – Reação geral de obtenção de imidas aromáticas . . . . . . . . . . .
32
Figura 12 – Mecanismo geral de formação de imidas. . . . . . . . . . . . . . . . .
33
Figura 13 – Estrutura das 1,8 – naftalimidas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
Figura 14
– Espectros de absorção e de emissão de 4-bromo-N-(2-
fosfonoetil)- 1,8-naftalimida (BNIP) e da 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-
naftalimida (ANIP) em acetonitrila e suas respectivas estruturas. . . . . . . . .
34
Figura 15 – Transição do tipo CT intramolecular nas 4-ANI . . . . . . . . . . . 35
Figura 16 – Preparação do derivado Ru(bpy)2(dcbpy)-citocromo c . . . . . .
36
Figura 17 – Estrutura da f
luoresceína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
Figura 18 – Estrutura do corante Lúcifer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
Figura 19 – Preparação da 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-
ANI-GLI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
Figura 20A – Espectro de 1H-RMN da 4-ANI-GLI em DMSO-d
6 . . . . . . . . . .
48
Figura 20B – Ampliação da região dos prótons aromáticos do espectro da
Fig. 20A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
Figura 20C – Espectro de 1H-RMN do imidazol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50
Figura 21 – Espectros de absorção UV/vis da 4-ANI-GLI . . . . . . . . . . . . .
51
Figura 22 – Espectros de absorção da 4-ANI-GLI em diferentes pH . . . . .
52
Figura 23 – Espectros de emissão da 4-ANI-GLI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
Figura 24 – Espectros de emissão da 4-ANI-
GLI em diferentes pH . . . . . .
54
Figura 25 – Estados de protonação da 4-ANI-GLI em água . . . . . . . . . . . .
55
Figura 26
– Mecanismo de reação entre o citocromo c e a 4-ANI-GLI por
acoplamento com EDAC . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
Figura 27 – Espectro de absorção UV/vis do CIT-ANI-
GLI . . . . . . . . . . .
57
Figura 28
–
Reação entre citocromo c nativo e anidrido 4-amino-1,8-
naftálico em presença de imidazol fundido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
Figura 29
– Resultados
de cromatografia em camada delgada em sílica
gel
de citocromo
c
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . .
61
Figura 30
– Espectros UV/vis registrados para determinação da
concentração do CIT
-
ANI em solução aquosa, após diálise . . . . . . . . . . . .
62
Figura 31
– Espectros UV/vis, normalizados, do citocromo c nativo e do
citocromo
c
tratado com imidazol fundido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
Figura 32 – Espectros de emissão do CIT-ANI-7 e da 4-ANI-GLI . . . . . . 65
Figura 33A
– Efeito do citocromo c no espectro de emissão da 4-ANI-
GLI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
Figura 33B – Gráfico de Stern-Volmer para a supressão de emissão da 4-
ANI-GLI pelo citocromo c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
Figura 34
– Espectros de IR (infravermelho) em ATR . . . . . . . . . . . . . . .
66
Figura 35 – Espectros no visível por CD de citocromo c em imidazol . . . .
67
Figura 36 – Espectros por CD em alfa-hélice de citocromo c nativo . . . . .
68
Figura 37 – Espectro de massa – MALDI ToF– CIT-ANI . . . . . . . . . . . . .
69
Figura 38 – Perfil eletroforético do citocromo c modificado (CIT-ANI). .
70
Figura 39 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e
modificado) em tampão fosfato de sódio 25mM pH7 com adição de
DPAA 0,2 mM em etanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
Figura 40 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e
modificado) em tampão hidróxido de amônio pH10 com adição de DPAA
0,2 mM em etanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
72
Figura 41 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e
modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mM pH7,4 com adição de t-
BuOOH 2 mM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
Figura 42 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e
modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mM pH10 com adição de t-
BuOOH 2 mM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
74
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Rendimento quântico de fluorescência de 1,8-naftalimidas com diferentes
substituintes. ......................................................................................................... 35
Tabela 2 - Dados espectrais para a 4-ANI-GLI em solventes de diferentes polaridades........52
Tabela 3 – Rendimento quântico de fluorescência,
λ
max
abs
,
λ
max
em
e absortividade molar da 4-
ANI-GLI em diferentes pHs................................................................................. 53
Tabela 4 - Descrição sumarizada das condições empregadas na síntese pelo método por
acoplamento com EDAC.................................................................................. 56
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
1H-RMN ressonância magnético nuclear de hidrogênio
4-ANI 4-amino-1,8-naftalimidas
4-ANI-GLI 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida
AAN anidrido 4-amino-1,8-naftálico
ADP adenosina difosfato
ANIP 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida
ATP Adenosina trifosfato
BNIP 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida
Cit c Citocromo c
CIT-ANI citocromo c modificado equimolar
CIT-ANI-7 citocromo c modificado com excesso de AAN
CN
-
Cianeto
Co-Q redutase coenzima Q redutase
DMF dimetilformamida
DMSO dimetilsulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
DPAA difenilacetaldeído
EDAC N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida
FADH
2
flavina adenina dinucleotídeo
Fe
2+
cátion ferro II
Fe
3+
cátion ferro II
I
HRP hidroperoxidase
Lys Lisina
MAA 3-metilacetoacetona
MB azul de metileno
N
3
-
Nitreto
NAD
+
cátion nicotinamida adenina
NADH nicotinamida adenina dinucleotídeo
Pi fosfato inorgânico
t-BuOOH t-butilhidroperóxido
UV/vis espectroscopia ultravioleta e vísivel
LISTA DE SÍMBOLOS
kDa quilo Dalton
∆Eº’ variação de potencial padrão de redução
∆Gº’ variação de energia livre padrão
λ
max
abs
comprimento de onda máximo de absorção
λ
max
em
comprimento de onda máximo de emissão
Φ
F
rendimento quântico de fluorescência
ε
máx
coeficiente de absortividade molar máximo
Et(30) parâmetro empírico de polaridade
R
f
fator de referência
µ
M micromolar
K
sv
constante de
Stern-Volmer
SUMÁRIO
1. Apresentação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
2.1 Citocromos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
2.2 Citocromos c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.3 Imidas Aromáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.4 Modificadores fluorescentes de proteínas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4. Método . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.1 Materiais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2 Equipamentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
4.3 Preparação do citocromo c modificado com imida aromática . . . . . 42
5. Resultados e discussão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.1 Síntese da 4-ANI-GLI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.2 Acoplamento do citocromo c com a 4-ANI-GLI . . . . . . . . . . . . . . . .
56
5.3 Síntese do CIT-ANI pelo método de imidazol fundido . . . . . . . . . . . 58
6. Conclusões e Sugestões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Referências . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
absorbância
comprimento de onda (nm)
1 APRESENTAÇÃO
A presente pesquisa destina-se a examinar diferentes métodos de preparação de
citocromo c fluorescente bem como caracteriza-lo. Através deste estudo são descritos vários
experimentos realizados para atingir tal objetivo, com a perspectiva de acoplar o composto
fluorescente 4-amino-1,8-naftalimida covalentemente ao citocromo c, uma vez que se acredita
na possibilidade do uso da referida proteína fluorescente para acompanhar o processo de
apoptose celular.
15
2 INTRODUÇÃO
Os citocromos, moléculas cuja função foi elucidada em 1924 por David Keilin
(KEILIN, 1966; SCOTT,1996) , são proteínas com atividade redox presentes em todos os
organismos, exceto em poucos tipos de anaeróbios obrigatórios. Essas proteínas contêm
grupos heme que alternam entre seus estados de oxidação Fe
2+
e Fe
3+
durante o transporte
de elétrons. Dentre eles destacamos o citocromo c, o qual desde a sua descoberta muito tem
sido estudado a respeito de sua estrutura e função, principalmente por se tratar de uma
biomolécula importante na cadeia respiratória. Por ser também uma proteína estável,
hidrossolúvel, fácil de manipular e um componente importante do sistema de transporte
mitocondrial de elétrons, utilizamos neste projeto o citocromo c de coração de cavalo
(SCOTT,1996).
2.1 Citocromos
Os citocromos são proteínas que se localizam na membrana interna da mitocôndria e
apresentam como característica uma intensa absorção da luz visível devido a seus grupos
prostéticos heme que contêm ferro. As mitocôndrias contêm três classes de citocromos
designados por a, b e c, que podem ser distinguidos pelas diferentes estruturas dos grupos heme,
com conseqüentes alterações nos espectros de absorção de luz. Os grupos heme dos citocromos a
e b estão ligados às suas proteínas associadas de forma não-covalente. Os grupos heme dos
citocromos do tipo c, por outro lado, estão ligados covalentemente por meio de resíduos de
cisteína (SCOTT,1996).
2.2 Citocromos c
A partir dos dados obtidos com o sequenciamento de aminoácidos do citocromo c foram
definidas quatro classes dessa molécula:
classe I, citocromo c mitocondrial, possui geralmente baixo-spin em sua forma
oxidada, tem resíduos de histidina e metionina coordenados com o grupo heme, o
16
qual é único e está ligado próximo ao grupo N-terminal. A metionina é o sexto
ligante e encontra-se próxima ao C-terminal. Atualmente, são conhecidos dezesseis
subtipos dessa molécula;
classe II, citocromo c bacteriano, são alto-spin, havendo somente a histidina
coordenada ao heme, ou baixo-spin, onde aparece também a metionina coordenada
ao heme próxima ao N-terminal;
classe III, citocromos c que apresentam múltiplos grupos heme (três grupos em
média) em sua estrutura, relacionados cada um com 30 a 40 aminoácidos e
coordenação com múltiplas histidinas;
classe IV, podem ter de um a quatro grupos heme, são grandes, ligados a cadeias
polipeptídicas que podem variar de 20 a 35 kDa (SCOTT,1996).
2.2.1 Estrutura do citocromo c mitocondrial
A mitocôndria é responsável por processar e converter oxigênio e glicose em energia, sob a
forma de ATP (adenosina trifosfato). As mitocôndrias são constituídas de uma membrana externa
lisa e de uma membrana interna extensamente invaginada conforme pode ser observado na Figura
1.
Figura 1 - Representação esquemática de uma mitocôndria .
Cristas
Matriz
Membrana Interna
Membrana
Externa
17
O citocromo c de coração de cavalo é uma proteína hidrossolúvel fortemente catiônica, com
ponto isoelétrico 10. Está localizado na parte externa da membrana interna da mitocôndria, é uma
hemoproteína composta de 104 aminoácidos que apresenta o grupo heme ligado covalentemente
à proteína por meio de ligações tioéter de dois resíduos de cisteína (Figura 2)
(BRAUTIGAN,
1978).
Os resíduos positivamente carregados do citocromo c são predominantemente lisinas
(Lys), compreendendo 18% do total de resíduos, além de duas argininas e três histidinas. Vários
resíduos de Lys invariáveis no citocromo c localizam-se na forma de anel ao redor da
extremidade exposta do grupo heme (Figura 2A). Esses resíduos constituem um sítio de ligação
identificado por meio de um tratamento do citocromo c com anidrido acético (que acetila os
resíduos de Lys do citocromo c) (SCOTT,1996).
A estrutura secundária do citocromo c, determinada por análise de difração de raio-X,
apresenta três
α
-hélices maiores e duas menores que correspondem a cerca de 40% do
polipeptídeo. Suas
α
-hélices estão interligadas pela porção de cadeias polipeptídicas. Estas
contem curvaturas, voltas, segmentos estendidos ou enrolados irregularmente, que envolvem o
grupo heme em um arranjo esférico (SCOTT, 1996). Estudos demonstram que o número e a
natureza dos ligantes coordenados ao átomo de ferro central, o tipo de ligação entre o heme e a
proteína, a geometria do complexo e a natureza dos aminoácidos presentes nas cadeias
circunvizinhas ao sítio ativo são aspectos de grande relevância para a compreensão da estrutura e
das funções de uma hemoproteína e de suas propriedades redox. O ferro hemínico oxidado no
citocromo c está octaedricamente coordenado com quatro átomos de nitrogênio do anel
tetrapirrólico da porfirina, estando a 5ª e a 6ª posições ocupadas pelo resíduo de metionina 80 e
de histidina 18, respectivamente, na cadeia da proteína (Figura 2B) (SCHEJTER, 1988
OSHEROFF,1980).
18
Figura 2 – Estrutura do citocromo c de coração de cavalo destacando os resíduos de lisina e o grupo HEME.
A: Estrutura secundária destacando sítio A (Lys 72 e Lys 73) e sítio L (Lys 22, Lys 25 e Lys 27); B: HEME – anel
pirrólico com os 5º e 6º ligantes coordenados com o átomo de ferro; C: HEME – evidenciando as ligações tioéter nos
resíduos de Cisteína 14 e 16.
Fe
N
N
N
S
N
N
His
18
N
+
+
Met
80
A
B
C
19
O enxofre da metionina 80 e o nitrogênio da histidina 18 formam ligações do tipo ligantes
fortes e mantêm o heme em um estado de baixo spin quando na forma oxidada (Fe
3+
). Entretanto,
a sexta coordenação, em razão de não ser muito estável, pode ser quebrada facilmente pelo
aumento de pH ou da temperatura, ou pode ter seu enxofre substituído por ligantes aniônicos
como CN
-
, N
3
-
ou ainda pelo imidazol. A ruptura desta ligação promove a transição do estado de
spin do átomo de ferro hemínico do citocromo c, de baixo spin para alto spin. O estado de alto
spin favorece a atividade peroxidásica do citocromo c em reações que geram radicais do tipo
peroxil, alcoxil e alquil, os quais possuem potencial para propagar danos biológicos, exercendo
papel importante no estresse oxidativo, além de expor o grupo heme, fato este que também
facilita o processo de transporte de elétrons (LIU, 1996; BANCI, 2001; MILLER, 1978;
MOORE, 1980).
2.2.2 Citocromo c mitocondrial e seus diferentes estados de spin
A mecânica quântica considera que o elétron apresenta tanto características de partícula
como de onda. De acordo com o princípio de Pauling, cada orbital pode conter um ou dois
elétrons, que possuem spins (rotações de partículas) opostos. O comportamento magnético da
matéria é conseqüência do conjunto de seus spins eletrônicos. Se elétrons estiverem submetidos a
um campo magnético, seus spins tornam-se alinhados. O citocromo c no seu estado férrico (Fe
3+
)
ou ferroso (Fe
2+
) apresenta orbitais com a configuração 3d
5
e 3d
6
, respectivamente, estando seus
elétrons distribuídos conforme representado na Figura 3.
A interação do ferro hemínico do citocromo c com seus ligantes promove a redistribuição
eletrônica e o desdobramento de seus orbitais d, possibilitando a existência da forma baixo e alto
spin, 1/2 e 5/2, respectivamente, para o ferricitocromo c (Fe
3+
). Conforme pode ser visto na
Figura 3, tanto a forma baixo spin como a forma alto spin apresentam número ímpar de elétrons
com spins desemparelhados. Porém, no ferrocitocromo c (Fe
2+
), como existem seis elétrons para
serem distribuídos nos orbitais d, tanto na forma alto como baixo spin, não há número ímpar de
elétrons com spins desemparelhados (ZUCCHI,2001).
20
Spin alto Spin Intermediário Spin Baixo
5 elétrons
3d-Fe
3+
S=5/2
S=3/2
S=1/2
6 elétrons
3d-Fe
2+
S=2
S=1
S=0
Figura 3 – Representação dos diferentes estados de spin dos íons Fe
2+
e Fe
3+
do citocromo c resultantes da
interação com lipossomos modelos (ZUCCHI, 2001).
A Figura 4 mostra os espectros de absorção do citocromo c em suas formas alto e baixo
spin, oxidado e reduzido, com bandas características. Uma metaloproteína, como o citocromo c,
por exemplo, apresenta duas transições eletrônicas em seu espectro de absorção: a banda Q, na
região entre 550 e 600 nm (baixa intensidade) e a banda Soret, entre 380 e 450 nm (alta
intensidade). Alterações neste espectro podem revelar mudanças na estrutura da proteína devido a
sua interação com o ambiente (SCOTT, 1996).
21
Figura 4
–
Espectros de absorção UV/vis do citocromo c em suas formas alto spin (a) e baixo spin (b). O
espectro de absorção do citocromo c oxidado e reduzido na forma alto spin (a) mostrando banda evidente de
absorbância em torno de 550 nm enquanto que a baixo spin (b) mostra duas bandas ao redor de 525 nm e 556 nm
(ZUCCHI, 2001).
2.2.3 Funções fisiológicas do citocromo c
O citocromo c faz parte do transporte de elétrons da cadeia respiratória, na superfície
externa da membrana mitocondrial interna. Outras funções do citocromo c referem-se à sua
participação na apoptose celular e atividade oxidase/peroxidase sobre vários substratos, incluindo
t-butilhidroperóxido (t-BuOOH), difenilacetaldeído (DPAA) e 3-metilacetoacetona (MAA)
(NANTES,2001) .
2.2.3.1 Citocromo c e a cadeia respiratória
A respiração celular compreende três etapas básicas: glicólise, ciclo de Krebs e cadeia
respiratória (também chamada de cadeia de transporte de elétrons). A Figura 5 mostra a
seqüência dos processos envolvidos na respiração celular, tanto na fase anaeróbia, que ocorre no
Oxidado
Reduzido
Reduzido
Oxidado
22
citosol,quanto na fase aeróbia, na mitocôndria, organela que contem o citocromo c
(LEHNINGER,2006; MARZOCCO, 1999; VOET, 1995).
A cadeia respiratória consiste num sistema de transferência de elétrons provenientes dos
transportadores NADH
(nicotinamida adenina dinucleotídeo) e FADH
2
(flavina adenina
dinucleotídeo) até a molécula de oxigênio. Também designada cadeia de transporte de elétrons, é
formada por um conjunto de proteínas denominadas citocromos. Esse conjunto de carregadores
de elétrons, está disposto linearmente na membrana interna da mitocôndria.
O processo de transporte de elétrons tem início quando os elétrons do NADH
são
transferidos para a primeira molécula da cadeia, a coenzima CoQ-redutase. Nessa etapa, o íon
H
+
(próton hidrogênio)
é liberado para a matriz mitocondrial e o NAD
+
torna-se apto para receber
mais elétrons e íons H
+
do ciclo de Krebs.
Figura 5 -
Respiração aeróbia a partir da glicose (UFMT, 2006).
23
Os elétrons provenientes do NADH são transferidos de um complexo proteico para outro da
cadeia respiratória. Durante esse fluxo de elétrons, ocorre transferência de íons H
+
dispersos na
matriz, para o espaço inter membranas, gerando um gradiente de concentração. Esse mecanismo
de bombeamento de H
+
,
acoplado a um sistema de transferência de elétrons, é denominado
quimiosmose, fenômeno também presente na fotossíntese.
Esse gradiente de concentração que se estabelece, no espaço intermembranas, é uma forma
de armazenar energia, pois os íons H
+
tendem a voltar para a matriz, onde sua concentração é
menor. O processo denominado fosforilação oxidativa refere-se a passagem dos íons H
+
através
do complexo da enzima ATP sintase, determinando a formação de ATP a partir de adenosina
difosfato (ADP) e fosfato inorgânico (Pi).
O oxigênio só participa na etapa final da cadeia respiratória, em que desempenha a função
de aceptor final de elétrons e dos íons H
+
presentes na matriz mitocondrial, formando moléculas
de água. No caso de não haver oxigênio disponível, não há retirada dos elétrons da cadeia e,
portanto, os citocromos permanecem com os elétrons, o bombeamento de elétrons cessa e o
processo é interrompido.
A Figura 6 mostra, com mais detalhes, a série de complexos protéicos contendo centros
redox com afinidade progressiva por elétrons, ou seja, com aumento do potencial de redução
padrão, promovendo a oxidação do NADH e FADH
2
. Os elétrons são passados através dessa
cadeia, do menor ao maior potencial de redução padrão. Os elétrons são carregados do Complexo
I e do Complexo II para o Complexo III pela coenzima Q (CoQ ou ubiquinona) e do Complexo
III para o Complexo IV pelo citocromo c.
Figura 6 –Reações envolvidas no transporte de elétrons na cadeia respiratória, os respectivos potenciais padrão de
redução de cada espécie ( ∆Eº’) e os valores de energia livre de Gibbs ( ∆Gº’) (VOET,1995).
Complexo I: NADH + CoQ(oxidada)
→
NAD
+
+ CoQ(reduzida)
∆Eº’ = 0,360 v ∆Gº’ = -69,5 kJ.mol
-1
Complexo II: FADH
2
+ CoQ (oxidada) → FAD + CoQ (reduzida)
∆Eº’ = 0,085 v ∆Gº’ = - 16,4 kJ.mol
-1
Complexo III: CoQ(reduzida) + cit c(oxidado) → CoQ(oxidada) + cit c(reduzido)
∆Eº’ = 0,190 v ∆Gº’ = -367,5 kJ.mol
-1
Complexo IV: cit c(reduzido) + ½ O
2
→ cit c(oxidado) + H
2
O
∆
Eº’ = 0,580 v
∆
Gº’ =
-
112 kJ.mol
-1
24
O Complexo I catalisa a oxidação de NADH pela CoQ, enquanto que o Complexo II
catalisa a oxidação de FADH
2
pela CoQ. O Complexo III catalisa a oxidação da CoQ(reduzida)
pelo citocromo c (cit c), que transfere elétrons para o Complexo IV que catalisa a oxidação do
citocromo c reduzido pelo O
2
, o aceptor terminal de elétrons do processo de transporte de
elétrons. Conforme um par de elétrons atravessa, sucessivamente, os Complexos I, III e IV, é
liberada energia livre suficiente em cada uma das etapas para gerar a síntese de uma molécula de
ATP (Figura 7). A reação redox do Complexo II, não libera energia livre suficiente para sintetizar
o ATP; ela serve somente para injetar os elétrons a partir do FADH
2
na cadeia de transporte de
elétrons (LEHNINGER, 2006; VOET, 1995).
Figura 7 - Cadeia respiratória : CoQ – coenzima Q(círculo lilás) e citocromo c(círculo vermelho) (VOET,1995).
A síntese endergônica de ATP a partir de ADP e Pi na mitocôndria, é catalisada por uma
ATP-sintase (também conhecida como Complexo V), dirigida pelo processo de transporte de
elétrons. A energia livre do transporte de elétrons, através dos Complexos I ao IV (Figura 7),
deve ser conservada em uma forma que a ATP-sintase possa utilizá-la, chamada de energia de
acoplamento (VOET,1995).
25
2.2.3.2 Citocromo c e apoptose
A apoptose
é definida como morte celular programada ocorrida sem reação inflamatória. A
apoptose é uma forma de morte celular ativa, necessária tanto para processos que envolvem
desenvolvimento de órgãos, como por exemplo, no controle de diferenciação de tecidos (na
formação das fendas interdigitais nos membros superiores e regressão do timo no ser humano)
quanto para destruir células que representem uma ameaça à integridade do organismo (RIBEIRO,
2004).
A apoptose é um processo fisiológico no desenvolvimento de animais e plantas, sendo tão
importante quanto o processo de mitose, pois garante indivíduos com quantidade e qualidade celular
para a manutenção da vida.
Por ser um processo ativo, a apoptose é caracterizada por uma
seqüência bem definida e repetitiva de alterações morfológicas, que envolvem núcleo, citoplasma
e membrana plasmática, assim produzem como resultados contração da célula, drástica
reorganização nuclear e fragmentação celular. As células apoptóticas aglomeram-se perdendo
contato com as células vizinhas.
A morfologia do processo apoptótico inclui diminuição do tamanho celular e condensação
da cromatina no núcleo, permanecendo preservadas as membranas e as endomembranas. Nesta
fase do processo, não é possível corá-las com Azul de Tripan em um procedimento de contagem
de células, porque este só cora células mortas, ou seja, aquelas cujas membranas tenham sido
alteradas.
A apoptose é iniciada através da depleção de um fator de crescimento, pela interação de
citocinas ou outros ligantes com receptores de superfície da célula. Entretanto, células
danificadas por substâncias químicas, radiação, calor ou outras tensões também podem ativar
apoptose (OLEINICK,2001).
Estudos apontam o citocromo c como uma proteína envolvida na iniciação da apoptose por
ativar caspases, sendo sua liberação para o citosol um passo importante nesta ativação. No citosol
o citocromo c liga-se a proteína Apaf-1 (proteína adaptadora), a qual se liga a procaspase 9,
ativando-a . O complexo chamado apoptossomo [citocromo c, Apaf-1, caspase 9 e ATP] depende
de energia para ser formado, e irá se agregar no citosol. Desta maneira, a caspase cliva e ativa
outras caspases. Essa ativação seqüencial de uma caspase por outra, cria uma cascata de atividade
26
proteolítica, que leva à digestão de proteínas estruturais no citoplasma com degradação do DNA
cromossomal e morte da célula (SKULACHEV, 1998).
A Figura 8 mostra a seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico. Há vários
fatores que levam à liberação do citocromo c para o citosol: sobrecarga intramitocondrial de Ca
2+
(induzindo a abertura de um poro na parte interna, contribuindo para a dissipação do potencial
elétrico da membrana e do inchamento mitocondrial); radiação ultravioleta e substâncias
oxidantes (CAI, 1998).
A iniciação do processo apoptótico sugere ser dependente de passos de ativação e inibição
gênica, com efeito, em cascata, que resulta no balanço intracelular entre fatores letais e de
sobrevivência. A existência de mecanismos, tanto inibidores como ativadores da apoptose, levam
a crer que todas as células possuam uma capacidade intrínseca para sofrer tal processo. Os
primeiros reguladores de apoptose descritos, foram revelados por análises genéticas e pertencem
a uma família de proteínas chamadas Bcl-2. Assim, em células não apoptóticas, as membranas
externas das mitocôndrias expressam em sua superfície as proteínas Bcl-2 e Bcl-X (anti-
apoptóticas). Estas proteínas são importantes para manutenção da fisiologia mitocondrial, porque
estão envolvidas no controle da impermeabilidade da membrana. A regulação da apoptose está
diretamente relacionada à atividade dessas proteínas que são codificadas pelo gene bcl-2.
A inibição da atividade da Bcl-2 (proteína anti-apoptótica) ou aumento na expressão de Bax
(proteína da família Bcl-2, pró-apoptótica) leva a um aumento da permeabilidade da membrana
mitocondrial, com o conseqüente aumento no volume da matriz da mesma, expansão e
fragmentação de sua membrana interna. Esse evento favorece a liberação do citocromo c para o
espaço intermembranas e para o citosol. Uma característica importante da apoptose é a
fragmentação do DNA. Nos estágios iniciais, são produzidos fragmentos de 50 a 300 kb,
apresentando a cromatina separada da matriz nuclear, isto é geralmente seguido por uma rápida
fragmentação da dupla fita de DNA em sítios internucleossomais. As enzimas que catalisam esta
fragmentação são, geralmente, endonucleases nucleares não-lisossomais. Em certas células elas
são ativadas por Ca
2+
e Mg
2+
e inibidas por Zn
2+
. O DNA ativo é hidrolisado preferencialmente
por estas enzimas, rompendo-se em longos fragmentos de oligonucleotídeos. Esses, quando
submetidos à eletroforese, apresentam um padrão típico de 200 pares de base, correspondentes ao
DNA com fragmentos internucleossomais.
27
A fragmentação do DNA pelas endonucleases foi inicialmente utilizada como diagnóstico
de apoptose. No entanto, atualmente, já se sabe que nem todos os tipos de células mostram esta
característica, ou seja, as mudanças nucleares pela apoptose podem ocorrer sem ativação de
endonucleases ou produção de oligonucleotídeos (OLEINICK, 2001).
Figura 8 – Seqüência de eventos envolvidos no processo apoptótico (WEIZMANN, 2007).
p53
Bax
PUMA
Bcl
-
2
Estímulos apoptóticos
Smac
Cyt c
/ATP
Apaf-1
p53
Caspase-9
Caspase-3
Células Alvo
IAPs
Mitocôndria
Apoptose
28
2.2.4 Reações do citocromo c
Desde 1973, muitos pesquisadores têm realizado testes de reatividade do citocromo c a fim
de avaliar seu potencial de redução. O seu comportamento encontra-se descrito em relação a sua
atividade peroxidase/oxidase sobre aldeídos, como difenilacetaldeído (DPAA),
β
-cetonas e
hidroperóxidos, como o t-butilhidroperóxido (t-BuOOH), assim como em presença de azul de
metileno (MB) irradiado ou de β-mercaptoetanol (NANTES, 2001; ESTEVAM, 2004;
MUGNOL, 2004; PRIETO, 2004; KAWAI, 2005).
2.2.4.1 Reação com DPAA
O difenilacetaldeído (DPAA) é um aldeído hidrofóbico que se difunde livremente através
de membranas biológicas e pode ser oxidado por várias hemoproteínas como citocromo c, além
de outras como: peroxidase de raiz forte (HRP), mioglobina e hemoglobina. O mecanismo
proposto para esta reação é mostrado a seguir (Figura 9).
A etapa (a) mostra as estruturas de ressonância do DPAA, sendo a forma enólica a que tem
maior capacidade doadora de elétrons para o citocromo c, produzindo o radical alcoxil e o
citcocromo c reduzido (cyt c Fe
2+
) conforme descrito na etapa (b). O radical alcoxil em meio
aerado reage com oxigênio molecular e forma o radical peroxil que pode ciclizar para um
intermediário dioxetano como mostrado na etapa (c). O dioxetano é instável e sofre termólise a
37ºC produzindo benzofenona triplete e ácido fórmico, conforme etapa (d).
A benzofenona triplete produzida nesta reação é uma espécie excitada de vida longa (100
µ
s), fonte potencial de oxigênio singlete em meio aerado por um processo de transferência
colisional. A geração de oxigênio singlete para este sistema foi detectada durante a reação e
suprimida por histidina, com a mesma constante de supressão determinada indicada para o
oxigênio singlete.
Os dados da literatura de redução de citocromo c por DPAA sugerem a relação com a
ionização das cadeias laterais de dois resíduos de tirosina, presentes na estrutura de citocromo c.
A reação de oxidação do DPAA pelo ferro hemínico é favorecida quando um resíduo de tirosina
está ionizado e o outro não. A cadeia lateral do resíduo não ionizado faz stacking com os anéis
29
aromáticos do DPAA e a cadeia lateral de tirosina ionizada favorece a doação de elétrons do
DPAA pois deve diminuir seu potencial de redução (RINALDI, 2004).
O
2
HO
H
OH
H
OH
Fe
3+
H
O
Fe
2+
H
O
OH
.OO
O
H
OH
O
O
H
OH
O
O
HCOOH
e-
+
cyt c
+
cyt c
meio aerado
+
(a)
(b)
(d)
(c)
37ºC
3
*
Figura 9 – Mecanismo proposto para a reação entre citocromo c e DPAA (NANTES,2001).
2.2.4.2 Reação com t-BuOOH
Dados da literatura demonstram que o citocromo c reage com hidroperóxidos orgânicos
formando radicais livres, fato importante no processo de peroxidação lipídica e danos a proteínas.
A reação do citocromo c com t-butil hidroperóxido (t-BuOOH) resulta em progressiva queda de
absorção da banda Soret, em 409 nm, juntamente com a conversão do estado de spin do ferro
hemínico, de baixo spin para alto spin com simetria rômbica. (NANTES, 2001).
30
2.3 Imidas Aromáticas
Neste trabalho, fez-se a modificação do citocromo c com uma 4-amino-1,8-naftalimida
principalmente por se tratar de uma substância que exibe fluorescência. Imidas aromáticas
constituem uma classe de compostos de grande interesse em razão de suas diversas aplicações na
área biológica e no campo de novos materiais (RODRIGUES, 1999) . A importância biológica
das 1,8-naftalimidas e das 1,4,5,8-naftalenodiimidas se referem principalmente a suas atividades
anticarcinogênicas e antivirais que resultam das suas capacidades de intercalação no DNA.
Além do mais, a ativação fotoquímica encontrada favorece a atividade biológica das imidas
naftalênicas, resultando em clivagem específica na seqüência de DNA (SAITO, 1992). As 1,8-
naftalimidas e seus derivados substituídos com grupos doadores de eletrons no carbono na
posição 4 são coloridas, amarelo brilhantes, exibindo intensa fluorescência e ótima
fotoestabilidade, sendo por esse fato importantes na modificação do citocromo c apresentada
neste trabalho.
2.3.1 Estrutura das Imidas
As imidas contêm o grupo -CO-N(R)-CO- em sua estrutura, sendo que R pode ser um
átomo de hidrogênio, um grupo alquila ou um grupo arila. Elas podem ser classificadas como
monoimidas e diimidas considerando o número de grupos imida, ou também como benzênicas,
naftalênicas e perilênicas se considerarmos o número de anéis aromáticos. A Figura 10 mostra as
estruturas de imidas aromáticas importantes em vários estudos envolvendo fluorescência
(BROCHSZTAIN, 1999; CAMPOS, 2004; BARROS, 1996; COSNARD, 1998; FURTADO,
2005; GRABCHEV, 2003; POTEAU, 2000; ).
As imidas aromáticas têm sido recentemente muito estudadas no desenvolvimento de
novos materiais. Isto se deve à versatilidade de sua síntese, permitindo variar amplamente a
estrutura do grupo R. A modificação do grupo R permite a modelação de propriedades destas
moléculas, tais como: solubilidade e capacidade de se incorporar em sistemas supramoleculares
(SAHA, 2002; GUNNLAUGSSON, 2003).
31
Figura 10 – Estruturas de imidas aromáticas relevantes. A numeração das imidas naftalênicas segue a ordem
indicada na estrutura do naftaleno que consta no alto da página (BROCHSZTAIN, 1999).
NH
2
N
O
O
CH
2
COOH
N
N
OO
OO
R
R
N OO
NH
2
R
8
1
2
3
45
6
7
N-R
O
O
N-R
O
O
N OO
R
1,8
-
naftalimidas
ftali
midas
2,3
-
naftalimidas
4-amino-1,8-naftalimidas
1,4,5,8-naftalenodiimidas
4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida
(4-ANI-GLI)
32
2.3.2 Síntese de imidas aromáticas
As imidas aromáticas podem ser facilmente sintetizadas, permitindo a incorporação de
vários N-substituintes. Para este procedimento usa-se um anidrido aromático e uma amina
primária. É uma reação muito versátil sendo que qualquer imida aromática pode
ser sintetizada
desde que exista uma amina primária (R-NH
2
) com o substituinte “R” desejado
(GRABCHEV,2003).
A Figura 11 mostra a reação geral de obtenção de imidas aromáticas a
partir de um anidrido 1,8-naftálico e uma amina primária.
Figura 11
– Reação geral de obtenção de imidas aromáticas (BROCHSZTAIN, 1999)
.
O mecanismo proposto para explicar a formação das imidas, descrito na Figura 12, sugere
a presença de um intermediário, neste caso o ácido âmico, que ao sofrer rearranjo intramolecular
passa a exibir o anel imídico. A reação é uma abertura do anel seguida de fechamento com perda
de uma molécula de água (CECHINEL, 2003).
O
O
O
N O
O
NH
2
+
R
2
R
1
R
2
R
1
33
Figura 12 – Mecanismo geral de formação de imidas (CECHINEL, 2003).
2.3.3 Espectroscopia das imidas
Em geral, as transições eletrônicas de mais baixa energia (S
0
→S
1
) das naftalimidas
apresentam um caráter
π
→
π
*. Entretanto, a presença de um substituinte doador de elétrons na
posição 4, como no caso das 4-amino-1,8-naftalimidas (4-ANI, Figura 10), altera totalmente as
propriedades fotofísicas da molécula (Figura 13) (PESCE,1971). Neste caso, a transição S
0
→S
1
possui um caráter de transferência de carga (CT) intramolecular, de acordo com a literatura
(ALEXIOU, 1990; SAHA, 2002). A influência do substituinte na posição 4 fica evidente ao
compararmos os espectros característicos da 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (BNIP)
com o da 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (ANIP), mostrados na Figura 14. Nota-se
que o espectro da BNIP apresenta resolução vibracional típica de transições π→π*. A
substituição de um átomo de bromo por um grupo amino, entretanto, leva a alterações dramáticas
no espectro de absorção, resultando em um deslocamento para o vermelho do
λ
max
abs
de cerca de
100 nm e da perda da resolução vibracional, características típicas de uma transição do tipo CT.
A natureza do substituinte na posição 4 também influi na fluorescência dos compostos
(Figuras 13, 14 e Tabela 1). Alexiou (1990) e colaboradores prepararam uma série de 1,8-
naftalimidas substituídas e determinaram suas propriedades fotofísicas. Os resultados desses
estudos (Tabela 1) mostraram que a presença do bromo como substituinte na posição 4 diminui
significativamente o rendimento quântico de fluorescência da 1,8-naftalimida (Φ
F
= 0,003).
Entretanto, se o substituinte for o grupo amino este valor aumenta para 0,64, confirmando a
influência da natureza do substituinte na fluorescência do composto (ALEXIOU, 1990;
O
O
O
H
2
N - R
NH - R
OH
O
O
N - R
O
O
+
34
WOODS,2003; YIN,1998). No caso da BNIP a presença de um átomo de bromo suprime
totalmente a fluorescência. Outras características das ANI típicas de transições por transferência
de carga (CT) são o acentuado deslocamento de Stokes, da ordem de 100 nm (Figura 14) e a
elevada sensibilidade dos λ
max
de absorção e emissão à polaridade do meio (vide seção 4.1.1).
Figura 13 – Estrutura das 1,8 – naftalimidas (BROCHSZTAIN, 1999)
.
Figura 14 – Espectros de absorção (ABS) e de emissão (EM) de 4-bromo-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (BNIP)
e da 4-amino-N-(2-fosfonoetil)-1,8-naftalimida (ANIP) em acetonitrila e suas respectivas estruturas
(BROCHSZTAIN, 1999)
.
300 350 400 450 500 550 600
0,0
0,2
0,4
0,6
ANIPANIP
BNIP
Absorbância
Comprimento de onda nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
ABS
ABS
EM
Intensidade u.a.
N
PO
3
H
2
Br
O
O
N
PO
3
H
2
NH
2
O
O
BNIP
ANIP
R
1
= praticamente não influi nas propriedades fotofísicas.
R
2
= aceptor de elétrons (compostos incolores, não fluorescentes).
-NO
2
; -Cl; -Br.
R
2
= doador de elétrons (compostos amarelos altamente fluorescentes).
-NH
2
; -NHR; -NR
2
; -OCH
3
N O
O
R
1
R
2
35
Tabela 1 – Rendimento quântico de fluorescência de 1,8-naftalimidas com diferentes substituintes (ALEXIOU,
1990).
A transição do tipo CT intramolecular nas 4-ANI pode ser melhor visualizada através das
estruturas de ressonância mostradas na Figura 15.
Figura 15 – Transição do tipo CT intramolecular nas 4-ANI.
R
1
R
2
Φ
F
Propil - Br 0,003
Butil - H 0,040
Butil - NH
2
0,640
NH
2
N OO
NH
2
NO O
:
+
R
1
R
1
h
ν
36
2.4 Modificadores fluorescentes de proteínas
Uma vez que o objetivo é sintetizar um citocromo c fluorescente procurou-se na literatura
trabalhos referentes a modificadores fluorescentes de proteína. As modificações químicas de
proteínas têm sido amplamente utilizadas para obter informações sobre o papel de diferentes
grupos funcionais em seu mecanismo de ação. Além disso, quando ambas, a seqüência de
aminoácidos e a estrutura tridimensional da proteína são conhecidas, como no caso do citocromo
c, os resultados das modificações de resíduos funcionais importantes podem ser interpretados. Os
modificadores mais utilizados encontrados na literatura são: complexos de rutênio, fluoresceína e
os corantes Lúcifer (CATÁLOGO SIGMA, 2006).
1.4.1. Complexos de rutênio
Os ésteres ativados de complexo de rutênio são modificadores fluorescentes por acilação de
aminas em aminoácidos de cadeias laterais de proteínas (Figura 16). Comercialmente, estão
disponíveis em uma série de corantes baseados em complexos de rutênio com diversas
aplicações. Estes corantes podem ser usados para marcar biomoléculas sob condições brandas.
Figura 16 – Preparação do derivado Ru(bpy)2(dcbpy)-citocromo c
N-O-C
O
O
O
N
N
O
C
O
O
N
N
C
O
C
O
N
H
Proteína -
Proteína - NH
2
Ru(bpy)
2
CO
3
O
N
N
C
O
C
O
N
H
Proteína -
Ru(bpy)
2
+2
+
37
As vantagens destes corantes como marcadores de proteínas incluem: alta fotoestabilidade,
boa solubilidade em água, ausência de interações corante – corante e amplos deslocamentos
Stokes, ou seja, com significativo efeito batocrômico (para o vermelho) ou hipsocrômico (para o
azul ). Além disso, os sinais de fluoróforos de longa vida podem ser utilizados para eliminar a
emissão dos de vida curta e a autofluorescência de células e biomoléculas para melhorar ainda
mais a sua sensibilidade (SCOTT , 1996).
2.4.2 Fluoresceína
John A. Thomas e colaboradores relataram um método adequado para monitorar o
transporte de cátions hidrogênio em partículas mitocondriais, evento importante no processo de
fosforilação oxidativa. Os pesquisadores prepararam citocromo c modificado por isotiocianato de
fluoresceína (Figura 17) na proporção 1:5, reagindo por 4 horas em pH 7,8 (THOMAS, 1975).
Figura 17 – Estrutura da fluoresceína
Sabe-se que o citocromo c de coração de cavalo apresenta 19 resíduos de lisina com amino
grupos primários e que estes reagiram com isotiocianato fluoresceína, fato esse que possibilitou a
preparação de 19 derivados modificados. Entretanto, duas lisinas se mostraram muito mais
reativas do que outras.
O
O
OH
COOH
38
2.4.3 Corantes Lúcifer
A estrutura dos corantes Lúcifer (Figura 18) se assemelha ao modificador do citocromo c
utilizado neste trabalho por se tratar de um derivado de 4-ANI. Desde sua apresentação, em 1978,
amarelo Lúcifer CH e amarelo Lúcifer VS têm sido usados com sucesso como marcadores
intracelulares em uma ampla variedade de sistemas biológicos. Ambos contêm o mesmo grupo 4-
amino-1,8-naftalimida, mas eles diferem no substituinte do nitrogênio da imida. As suas sínteses
estão baseadas no pigmento comercial sulfoflavina. Os pigmentos têm propriedades espectrais
semelhantes: absorção máxima entre 280 nm e 430 nm com emissão máxima perto de 540 nm.
Figura 18 –Estrutura do corante Lúcifer
.
Stewart (1980) e colaboradores relatam ter desenvolvido um método de obtenção do
conjugado covalente a proteína, em filamentos de actina, de cultura de fibroblastos, sinalizados
por conjugados desse gênero, e que o mesmo seria publicado posteriormente, porém, após
extensa pesquisa, buscando a possível publicação dos referidos autores não a encontramos.
O Lúcifer amarelo VS é similar ao isotiocianato de fluoresceína em sua facilidade de uso e
intensidade de fluorescência e tem a vantagem de que seu pico de emissão de 540 nm é
consideravelmente para o vermelho da fluoresceína em 515nm, e aí que seu contraste
fluorescente mais fortemente com tecido autofluorescente. Mas desde que o Lúcifer não tem
outra vantagem clara e já que é menos conhecido a cerca de sua química e estabilidade de ligação
que é formada, é provável que isotiocianato de fluoresceína permanecerá o pigmento escolhido
para mais aplicações imunofluorescentes. Quando a fluorescência é necessária em pHs abaixo de
6, Lúcifer amarelo VS é mais útil. A intensidade fluorescente do Lúcifer VS continua sendo a
mesma de pH 2 a pH 10, assim como a atípica propriedade de solubilidade em água do pigmento.
NH
2
SO
3
-Li+
Li+-O
3
S
N OO
R
39
Esta independência do pH faz com que o pigmento seja apropriado para monitoramento de
mudanças conformacionais induzidas por alterações de pH em macromoléculas
(STEWART,1981).
40
3 OBJETIVOS
Os principais objetivos deste trabalho são:
•
Modificar o citocromo c, uma importante proteína, com um cromóforo pertencente
a um grupo de substâncias bastante explorado pelos pesquisadores nos últimos
anos, uma 4-amino-1,8-naftalimida, a fim de obter uma biomolécula fluorescente
que possa ser utilizada para seguir o curso da apoptose.
•
Desenvolver diferentes métodos de inserção da imida no citocromo c: (i) através de
síntese por acoplamento com EDAC; (ii) síntese com imidazol fundido; (iii) síntese
utilizando tratamento por microondas e ultra-som.
•
Purificar e caracterizar o citocromo c modificado de acordo com os métodos
citados no item anterior.
41
4 MÉTODO
4.1 Materiais
- Citocromo c de coração de cavalo (Cytochrome c horse heart) – (cit c)12384
g/mol (Sigma).
- Anidrido 4-amino-1,8-naftálico – MM 213 g/mol – (AAN) (Aldrich).
- Imidazol, MM 68,08 g/mol ,(Merck).
- Dimetilformamida (DMF) – (J.T. Baker).
- EDAC – (N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida)-MM 191,7 g/mol -
- Fosfato de sódio mono e dibásico – (Sigma).
- Fosfato de potássio – (Sigma)
- Glicina MM 75 g/mol – (Carlo Erba).
- Cromatofolhas de plástico – Silicagel 60 – F
254
– marcador – (Merck)
- Membrana de nitrocelulose – 6,000-8,000 – 23 mm de largura – (Spectrum
Laboratório Inc.).
- Carboximetil-celulose 32 – (Whatman).
- (4-ANI-GLI) - (4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida), preparada no Centro
Interdisciplinar de Investigação Bioquímica da Universidade de Mogi das
Cruzes, UMC.
- Dimetilsulfóxido – (DMSO) – (Sigma).
Todos os demais reagentes utilizados são de grau analítico e as soluções foram
preparadas com água deionizada em sistema Mili-Q
TM
Water System da Millipore Corp.
(Bedford, MA,USA).
4.2 Equipamentos
- Agitadores: Vortex – Genie 2, modelo G250, Scientific Industries (Boemia,
NY,EUA).
- Banhos de temperatura constante PRECISION.
- Centrifuga refrigerada, Hitachi modelo CF 15R (Tóquio, Japão).
- Espectrofotômetro Shimadzu Modelo 1501 MultiSpec (Tóquio, Japão).
- Espectrofluorímetro Hitachi F2500 (Tóquio, Japão).
- Espectropolarímetro JASCO J-810 (CD).
42
- Infravermelho FTIR/ATR – Perkin Elmer modelo Spectrum One.
- pHmetro modelo Orion 900 - A.
- Purificador de água Mili-Q
TM
Water System da Millipore Corp. (Bedford,
MA,USA).
- Shaker Tecnal TE-053.
- Espectrômetro de massas – MALDI-TOFF.
- Liofilizador STS Systems modelo EZ550R.
- Lâmpada compacta 4W modelo UVGL-25 (UVP).
- Forno microondas
- Sonicador
- Ressonância Magnética Nuclear – RMN – Equipamento Bruker AC 200 (200
MHz) - Central Analítica do Instituto de Química da USP.
4.3 Preparação do citocromo c modificado com imida aromática
(CIT-ANI)
4.3.1 Síntese de 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-ANI-GLI)
por acoplamento com citocromo c
A preparação de 4-ANI-GLI foi realizada em presença de imidazol fundido. Misturou-
se 100 mg (470 µmoles) de anidrido 4-amino-1,8-naftálico e 40 mg (533 µmoles) de glicina
com 0,5 g de imidazol fundido. A mistura permaneceu sob agitação e aquecimento (120ºC)
por 30 minutos. Após esfriar, adicionou-se cerca de 10 mL de clorofórmio à mistura reacional
para dissolver o excesso de glicina e imidazol. O sólido resultante foi recolhido por filtração
em funil de Büchner e lavado com um pouco de clorofórmio e finalmente seco a vácuo.
Obteve-se 150 mg do produto (117,62 % de rendimento), fato este que pode ser explicado
pela formação do produto na forma do sal de imidazol. A reação foi monitorada por
cromatografia de camada delgada (TLC) utilizando etanol para eluição. O espectro RMN da
4-ANI-GLI em DMSO-d
6
apresenta
δ
(ppm): 4,67(s), H
a
, 2H; 6,87(d), H
c
, 1H; 7,04(s), H
b
’,
2H; 7,55(s), H
g
(NH
2
), 2H; 7,68(t), H
e
, 1H; 7,72(d), H
a
’, 1H; 8,20(d), H
b
, 1H; 8,44(d), H
d
, 1H;
8,65(d), H
f
, 1H.
43
4.3.2 Acoplamento entre citocromo c e 4-ANI-GLI com EDAC
- Método A
Misturou-se em um béquer: 1mL de ácido clorídrico 10
-5
M, 3
µ
L de EDAC 50 mM
(0,14 µmol) e 10,5
µ
L de uma solução aquosa de 4-ANI-GLI 13,8 mM (0,14 µmol). Em
seguida adicionou-se 50
µ
L de uma solução aquosa de citocromo c 2,9 mM (0,14 µmol). A
mistura permaneceu por 30 minutos sob agitação e a reação foi interrompida com a adição de
100
µ
L de tampão acetato de sódio 0,2 M pH 5,0. O produto obtido foi dialisado em água por
quatro horas, duas vezes.
- Método B
Em um balão misturou-se 5 mg (0,4 µmol) de citocromo c nativo, 22 mg (80 µmoles) de
4-ANI-GLI e 12,5 mg (65 µmoles) de EDAC em 1,25 mL de tampão fosfato de potássio 50
mM pH 6,0. O tampão fosfato foi previamente deaerado em argônio, por 30 minutos. A
mistura permaneceu sob agitação em sistema fechado e em banho de gelo (~ 4ºC) por 12
horas. A mistura reacional foi dialisada em 2 L de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0
até que a solução externa não apresentasse mais imida (seis vezes).
- Método C
5 mg (0,4 µmol) de citocromo c nativo, 22 mg (80 µmoles) de 4-ANI-GLI e 12,5 mg
(65 µmoles) de EDAC foram misturados em 1,25 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM
pH 6,0. O tampão fosfato foi previamente deaerado em argônio, por 30 minutos. A mistura
permaneceu sob agitação em sistema fechado e em banho de gelo (~ 4ºC) por 24 horas.
Adicionou-se 14 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0 ao produto obtido que foi
centrifugado por 30 minutos, 18000 rpm à temperatura de 20ºC. O líquido sobrenadante foi
dialisado com membrana de nitrocelulose, 6,000 – 8,000, em 2 L de tampão fosfato de
potássio 50 mM pH 6,0 com troca do tampão a cada duas horas, por seis vezes.
44
- Método D
Em um frasco foram colocados 0,8 mg (4 µmoles) de EDAC, 2,2 mg (8 µmoles) de 4-
ANI-GLI e 1 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0 que foram misturados
vigorosamente por 15 minutos, à temperatura ambiente. Uma solução de citocromo c nativo:
0,4 µmol em 500 µL tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0 foi preparada e
posteriormente adicionada lentamente (~20minutos) à mistura imida + EDAC. O sistema
reacional permaneceu sob agitação por mais dez minutos. A mistura reacional foi dialisada
em 2 L de tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0, com troca a cada 2 horas por seis vezes.
4.3.3 Acoplamento de citocromo c com anidrido 4-amino-1,8-naftálico
(AAN) usando imidazol fundido
- Método A
Em um balão misturou-se 3 mg (2,34 µmoles) de citocromo c, 7,4 mg (34,7 µmoles) de
anidrido 4-amino-1,8-naftálico e 750 mg de imidazol. A mistura foi mantida a 90ºC por 10
minutos sob agitação. A dissolução da mistura reacional foi feita com adição de 25 mL de
água deionizada. A seguir a mistura foi centrifugada a 20ºC por 5 minutos e 1000 rpm. O
líquido sobrenadante foi retirado e dialisado em água deionizada por 12 horas.
- Método B
Em um balão misturou-se 517 mg de imidazol e 161,5 µL de solução 0,01M (1,6
µmoles) de anidrido 4-amino-naftálico em DMF (dimetilformamida) a 90ºC. A seguir
adicionou-se 1,6 µmoles de citocromo c deixando-se a mistura sob agitação por 2 minutos.
Após o resfriamento da mistura foram adicionados 20 mL de água deionizada e procurou-se
dissolver a mistura que na seqüência foi centrifugada a 20ºC, 5 minutos e 1000 rpm. O
líquido sobrenadante foi retirado e dialisado em membrana de nitrocelulose (6,000-8,000) e
água deionizada por duas horas.
45
4.3.4 Síntese por ultra-som e microondas
Em um tubo de ensaio misturou-se 2 µmoles de citocromo c nativo, 81
µ
L de solução de
anidrido 4-amino-1,8-naftálico 0,01M (0,8 µmol) em DMF (dimetilformamida) e 500
µ
L de
água deionizada. O tubo foi coberto com parafilme e sonicado por 10 minutos e em seguida
registrou-se seu espectro UV/vis. Repetiu-se essa operação em intervalos de 10 minutos por
mais duas vezes. Em seguida sonicou-se por mais 24 horas e um novo espectro UV/vis foi
registrado. Utilizou-se uma solução controle como referência para avaliação do processo. Essa
solução continha: 0,4 µmol de citocromo c nativo, 40,5
µ
L de DMF e 250
µ
L de água
deionizada. Após o tratamento por sonicação submeteu-se essas mesmas amostras à
microondas por 20 segundos monitoradas . Repetiu-se o procedimento por mais três vezes.
4.3.5 Monitoração das preparações
4.3.5.1 Teste de estabilidade térmica do citocromo c
Testamos a estabilidade térmica do citocromo c dissolvido em água, submetido a 90ºC
durante 1min, 2 min e 15 min e avaliamos através de espectroscopia UV-VIS.
4.3.5.2 Cromatografia por camada delgada (TLC)
Após a diálise do liquido sobrenadante do CIT-ANI aplicamos em cromatofolhas e
eluimos com etanol junto a citocromo c nativo e o anidrido 4-amino-1,8-naftálico (AAN)
conforme figura 16 mostrada em resultados.
4.3.5.3 Espectroscopia Ultra-Violeta/Vísivel
Em um espectrofotômetro de rede de fotodiodo Multispec 1501 da Shimadzu
Corporation realizou-se medidas em cubetas de quartzo de caminho ótico de 10 mm para
soluções de menor concentração e de 1mm para soluções de maior concentração. O software
Shimadzu Hyper-UV foi utilizado para obtenção do espectros, cujas medidas foram feitas a
temperatura ambiente. O equipamento contém uma lâmpada de halogênio para medidas na
faixa de luz visível e uma lâmpada de deutério para medidas na faixa de luz ultra-violeta.
46
4.3.5.4 Dicroísmo Circular
As medidas de CD, na região de ultravioleta distante (190-260 nm), foram realizadas
em um espectropolarímetro Power Suply JASCO, à 25ºC, em uma velocidade de varredura de
50 nm/min. Foram utilizadas cubetas de 0,5mm de caminho óptico. Os experimentos foram
realizados com 20µM do citocromo c modificado em água à 25ºC.
Os espectros por
dicroísmo circular foram registrados em colaboração com a Profª Adelaide Faljoni Alário, do
Instituto de Bioquímica da USP.
4.3.5.5 Espectroscopia por Infravermelho (IR)
Dispersou-se 100 µL da solução aquosa do CIT-ANI em uma placa de Zn/Se e secou-
se com ar quente, por 15 minutos, a fim de eliminar a interferência provocada pela presença
de água e registrou-se os espectros por infravermelho a partir da média de 32 leituras. Os
espectros foram corrigidos com acerto de linha base e retirada de ruídos.
47
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Geralmente, o método mais utilizado para acoplar biomoléculas com modificadores
orgânicos emprega carbodiimidas como agentes acoplantes (FRAGOSO, 2002), uma vez que a
reação é feita em meio aquoso e à temperatura ambiente, ao contrário dos métodos de síntese
convencional, os quais empregam condições drásticas, como solventes orgânicos e altas
temperaturas que sabidamente causam danos às biomoléculas. Assim sendo, procurou-se
primeiramente fazer a modificação do citocromo c por acoplamento com EDAC (FRAGOSO,
2002), porém os resultados iniciais dos experimentos por TLC e espectroscopia UV/vis indicam
não ter ocorrido a reação. Decidiu-se, portanto, tentar um método alternativo que consiste em
utilizar imidazol fundido como solvente para a reação de acoplamento. Apesar do método
empregar condições drásticas julgou-se ser viável testá-lo devido a grande estabilidade do
citocromo c e ao sucesso de nosso grupo na síntese de imidas com o mesmo método. Além desses
métodos, procuramos também sintetizar o CIT-ANI por ultra-som e microondas.
5.1 Síntese da 4-ANI-GLI
O acoplamento de uma proteína com EDAC acontece a partir da reação entre um grupo
carboxila e um grupo amino formando uma amida. Portanto, existem duas possibilidades de
acoplamento: (a) uma 4-ANI carboxilada (4-ANI-COOH) reagindo com um grupo amino da
proteína (proteína-NH
2
) ou (b) uma 4-ANI substituída com grupo amino (4-ANI-NH
2
) reagindo
com um grupo carboxila da proteína (proteína-COOH). Uma vez que o citocromo c é uma
proteína que apresenta considerável quantidade de resíduos do aminoácido lisina (18% dos
resíduos), parece mais lógico utilizar a opção (a). Portanto, decidiu-se sintetizar o composto 4-
ANI-GLI por condensação do AAN com o aminoácido glicina (Figura 19).
Preparou-se a 4-ANI-GLI utilizando-se imidazol fundido como solvente. Após a reação,
foram feitos testes de solubilidade com a mistura obtida (4-ANI-GLI + imidazol + glicina) nos
solventes etanol, água e clorofórmio com o objetivo de purificar a imida. Descobriu-se que o
clorofórmio dissolve apenas o imidazol e a glicina e por isso foi escolhido para a purificação da
4-ANI-GLI. Obteve-se para a reação um rendimento superior a 100% (vide seção 3.3.1),
sugerindo que o produto foi obtido na forma do sal imidazólico (Figura 19). Ao refazer os
48
cálculos para a fórmula molecular 4-ANI-GLI
.
imidazol, obteve-se um rendimento de 94 % , o
que é coerente com a formação do sal. O espectro de 1H-RMN do produto (Figuras 20A e B)
confirmou este resultado uma vez que os picos atribuíveis ao imidazol (Figura 20C) estavam
presentes em proporções estequiométricas.
Figura 19 – Preparação da 4-amino-N-carboetoxi-1,8-naftalimida (4-ANI-GLI)
Figura 20A – Espectro de 1H-RMN da 4-ANI-GLI em DMSO-d
6
: 4,67(s), H
a
, 2H; 6,87(d), H
c
, 1H; 7,04(s), H
b
’,
2H; 7,55(s), H
g
(NH
2
), 2H; 7,68(t), H
e
, 1H; 7,72(d), H
a
’, 1H; 8,20(d), H
b
, 1H; 8,44(d), H
d
, 1H; 8,65(d), H
f
, 1H.
O
O
O
NH
2
NH
2
-CH
2
-COOH
N
O
O
NH
2
CH
2
COOH
H
2
O
+
+
imidazol
90ºC
0.4867
0.5097
0.5150
1.0636
0.1422
0.9853
1.3009
0.5463
1.0916
0.0717
Integral
8.6753
8.6336
8.4602
8.4251
8.2233
8.1816
7.7165
7.6967
7.6792
7.6397
7.5519
7.0429
6.8893
6.8476
4.6711
3.8681
2.5122
2.0887
-0.0000
(ppm)
-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.5
13968 SERGIO-UMC LUCI01
H
g
H
a
H
2
O
H
f
H
d
H
b
H
e
+
H
a
’
H
b
’
DMSO
X
X
H
c
DMSO-d
6
0.4867
0.5097
0.5150
1.0636
0.1422
0.9853
1.3009
0.5463
1.0916
0.0717
Integral
8.6753
8.6336
8.4602
8.4251
8.2233
8.1816
7.7165
7.6967
7.6792
7.6397
7.5519
7.0429
6.8893
6.8476
4.6711
3.8681
2.5122
2.0887
-0.0000
(ppm)
-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.5
13968 SERGIO-UMC LUCI01
H
g
H
a
H
2
O
H
f
H
d
H
b
H
e
+
H
a
’
H
b
’
DMSO
X
X
H
c
DMSO-d
6
N
O
O
Hb
Hc
NH
2
Hd
He
Hf
Hg
CH
2
Ha
COO
N NH
2
+
Hb' Hb'
Ha'
}
}
-
.
49
0.4867
0.5097
0.5150
1.0636
0.1422
0.9853
1.3009
0.5463
Integral
8.6753
8.6336
8.4602
8.4251
8.2233
8.1816
7.7165
7.6967
7.6792
7.6397
7.5519
7.0429
6.8893
6.8476
(ppm)
6.46.56.66.76.86.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.08.18.28.38.48.58.68.78.88.99.09.19.2
13968 SERGIO-UMC LUCI01
H
c
H
b
’
H
g
(NH
2
)
H
a
’
H
b
H
d
H
f
H
e
DMSO-d
6
0.4867
0.5097
0.5150
1.0636
0.1422
0.9853
1.3009
0.5463
Integral
8.6753
8.6336
8.4602
8.4251
8.2233
8.1816
7.7165
7.6967
7.6792
7.6397
7.5519
7.0429
6.8893
6.8476
(ppm)
6.46.56.66.76.86.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.08.18.28.38.48.58.68.78.88.99.09.19.2
13968 SERGIO-UMC LUCI01
H
c
H
b
’
H
g
(NH
2
)
H
a
’
H
b
H
d
H
f
H
e
DMSO-d
6
Figura 20B – Ampliação da região dos prótons aromáticos do espectro da Figura 20A.
50
Figura 20C – Espectro de 1H-RMN do imidazol (SBDS – AIST, 2007).
H
a
(7,73 ppm)
H
b
(7,13 ppm)
X
H
2
O
CDCl
3
H
a
(7,73 ppm)
H
b
(7,13 ppm)
X
H
2
O
CDCl
3
N NH
2
+
Hb' Hb'
Ha'
51
5.1.1 Caracterização fotofísica da 4-ANI-GLI
5.1.1.1 Caracterização por UV/vis
As 4-ANI apresentam propriedades fotofísicas interessantes, como emissão de
fluorescência, exibindo comportamento diferente em diversos solventes. Como é típico em
transições de transferência de carga (CT), um aumento na polaridade do meio provoca
deslocamento batocrômico (SAHA,2002). A Figura 21 mostra os espectros de absorção UV/vis
da 4-ANI-GLI em diferentes solventes. Pode-se observar uma banda de absorção (ε
máx
= 9544 a
10272 M
-1
cm
-1
) que não apresenta estrutura vibracional, com comprimento de onda de máxima
absorção (λ
max
abs
) variando de 408 nm a 430 nm e deslocamento batocrômico conforme a
polaridade do meio aumenta, indicando transição eletrônica do tipo CT. Os dados espectrais
estão resumidos na Tabela 2.
Figura 21 - Espectros de absorção UV/vis da 4-ANI-GLI 4x10
-5
M em solventes de diferentes
polaridades.
350 400 450 500 550
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Absortividade Molar M
-1
. cm
-1
Comprimento de onda nm
(___)clorofórmio
(___)acetonitrila
(___)água
(___)etanol
52
Tabela 2. Dados espectrais para a 4-ANI-GLI em solventes de diferentes polaridades. Os
respectivos parâmetros empíricos de polaridade de solvente E
T
(30) (REICHARDT,1994) são
também apresentados. (a) solvente aprótico; (b) solvente prótico.
A Figura 22 mostra o efeito de pH sobre os espectros de absorção da 4-ANI-GLI em água.
Em pH 6,0 obtivemos o maior valor de ε , fato este que corresponde também ao melhor
rendimento quântico de fluorescência (vide seção 4.1.1.2). Os dados estão resumidos na Tabela 3.
Figura 22 - Espectros de absorção da 4-ANI-GLI em água em diferentes pH, em tampão triplo (5mM de acetato de
sódio + 5mM tris(hidroxi-metil-aminometano) + 5mM de hidróxido de amônio) na concentração de 4 x 10
-5
M;(....)
pH 4,5; (__) pH 8,5; (----) pH 6,0.
Solvente
Et(30)
λ
max
abs
nm
ε
M
-1
cm
-1
λ
max
em
nm
Φ
F
Clorofórmio
(a)
39,1 408 9545 501 0,40
Acetonitrila
(a)
45,6 418 9544 508 0,25
Etanol
(b)
51,9 430 10272 517 0,24
Água
(b)
63,1 428 9909 540 0,06
350 400 450 500
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Absortividade Molar M
-1
.cm
-1
Comprimento de onda nm
53
Tabela 3
– Rendimento quântico de fluorescência,
λ
max
abs
,
λ
max
em
e absortividade molar da 4-ANI-GLI em
diferentes pHs.
5.1.1.2 Caracterização por espectroscopia de emissão
A Figura 23 mostra
os espectros de fluorescência da 4-ANI-GLI que foram obtidos em
solventes de diferentes polaridades. Os
λ
max
em
aumentam (deslocamento batocrômico) a medida
que a polaridade do solvente aumenta, variando de 500 a 538 nm. Os dados espectrais estão
resumidos na Tabela 2.
Figura 23- Espectros de emissão da 4-ANI-GLI 4x10
-5
M em solventes de diferentes polaridades. Espectros
normalizados de emissão, registrados após excitação de solução em 375 nm.
pH
λ
max
abs
nm
ε
M
-1
cm
-1
λ
max
em
nm
Φ
F
4,5 430 10188 538 0,0625
6,0 428 10334 538 0,0778
8,5 429 9889 538 0,0671
450 500 550 600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Intensidade a.u.
Comprimento de onda nm
Clorofórmio
Acetonitrila
Etanol
Água
54
Pode-se observar que o efeito de solvente sobre os espectros de emissão é muito mais
pronunciado do que o observado com os espectros de absorção seguindo a ordem de polaridade
de acordo com o parâmetro empírico Et(30) (Tabela 2) introduzido por Reichardt (1994).
A Figura 24 mostra o efeito de pH sobre os espectros de emissão da 4-ANI-GLI. Observa-
se que mudanças de pH não alteram significativamente o comprimento de onda máximo de
emissão da 4-ANI-GLI. A intensidade de emissão, por outro lado, é sensível ao pH do meio,
aumentando de pH 4,5 para 6,0 e diminuindo novamente ao aumentar-se o pH para 8,5. Este
fenômeno pode ser explicado através dos estados de protonação da 4-ANI-GLI, de acordo com o
Figura 25. Os resultados obtidos sugerem que a forma “zwitteriônica” é mais emissiva que as
outras possivelmente devido à supressão pelo contra-íon nas formas aniônica e catiônica. Outros
autores observaram efeitos semelhantes com naftalimidas utilizadas como quimiosensores
(GUNNLAUGSSON,2003).
Figura 24 - Espectros de emissão da 4-ANI-GLI em água em diferentes pH, em tampão triplo (5mM de acetato de
sódio + 5mM tris(hidroxi-metil-aminometano) + 5mM de hidróxido de amônio).
450 500 550 600 650
0
10
20
30
40
50
60
70
Intensidade
Comprimento de onda nm
pH 4,5
pH 6,0
pH 8,5
55
Figura 25 – Estados de protonação da 4-ANI-GLI em água.
CH
2
COOH
NH
3
N
O
O
Cl
H
H
H
H
Na
CH
2
COO
NH
3
N
O
O
CH
2
COO
NH
2
N
O
O
-
-
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
-
56
5.2 Acoplamento do citocromo c com a 4-ANI-GLI utilizando-se EDAC
Procurou-se fazer o acoplamento em duas etapas, como mostrado nA Figura 26. Na
primeira etapa, reagiu-se a 4-ANI-GLI com EDAC, gerando um éster de isoaciluréia. Na segunda
etapa, adicionou-se a solução de citocromo c à mistura do éster de isoaciluréia. Tentou-se fazer o
acoplamento utilizando-se diferentes condições como resumido na Tabela 4 (vide seção 3.3.2
para maiores detalhes) . Deve-se considerar que no método A os três reagentes foram adicionados
juntos, já em B variou-se apenas o tampão. Todas as condições de B foram repetidas em C e
apenas o tempo de reação foi o dobro. No método D colocou-se EDAC e a 4-ANI-GLI para
reagir e após quinze minutos adicionou-se o citocromo c.
Figura 26 – Mecanismo de reação entre o citocromo c e a 4-ANI-GLI por acoplamento com EDAC.
Tabela 4 - Descrição sumarizada das condições empregadas na síntese pelo método por acoplamento com
EDAC (MARGALIT,1973
a b
)
Método Cit c : 4-ANI-GLI: EDAC pH Tampão
A 1:1:1 5 Ácido clorídrico
B 1:200:165 (12 horas) 6 Fosfato de potássio 50 mM
C 1:200:165 (24 horas) 6 Fosfato de potássio 50 mM
D 1:20:10 6 Fosfato de potássio 50 mM
N
N
C
N
NH
2
N
O
O
CH
2
COOH
H
+
NH
2
cyt c
NH
cyt c
N
N
C
N
O
H
H
NH
2
N
O
O
CH
2
C
O
N
N
C
N
H
H
+
NH
2
N
O
O
CH
2
C
O
O
+
+
57
Os resultados por TLC (não mostrados) indicam que a imida não se ligou ao
citocromo c nativo. A Figura 27 mostra o espectro de absorção UV/vis com a banda Soret
inalterada, diferente dos espectros do citocromo c modificado preparado pelo método com
imidazol (vide seção 4.3.3) que apresenta um ombro característico da imida na região da banda
Soret. Se houvesse ocorrido o acoplamento seria esperado um espectro semelhante ao da solução
contendo uma mistura do citocromo c com a 4-ANI-GLI (linha verde na Figura 27)
Figura 27
– Espectro de absorção UV/vis do cit c nativo (linha preta), 4-ANI-GLI (linha vermelha), solução
contendo cit c + 4-ANI-GLI (linha verde) e do produto isolado da reação de acoplamento de acordo com o método D
(linha azul).
Alguns fatores devem ser considerados com relação ao insucesso da reação de
acoplamento com EDAC: a) o fato de a imida 4-ANI-GLI estar na forma de sal imidazólico pode
ter dificultado a reação uma vez que a EDAC reage com nucleófilos diversos; b) fosfatos reagem
também com EDAC, por isso o uso do referido tampão descrito na Tabela 4 implica em consumo
da carbodiimida. Diante do exposto verifica-se a possibilidade de sucesso a partir da eliminação
de tais problemas no desenvolvimento de trabalhos futuros.
300 350 400 450 500 550 600
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Absorbância
Comprimento de onda nm
58
5.3 Síntese do CIT-ANI pelo método de imidazol fundido
Devido a todas as tentativas de acoplar a imida ao citocromo c pelo método da
carbodiimida não apresentarem resultados satisfatórios decidiu-se pelo método com imidazol. As
reações de acoplamento em imidazol fundido foram realizadas utilizando duas condições
diferentes (Figura 28): excesso de anidrido 4-amino-1,8-naftálico (Método A) e na proporção
equimolar citocromo c : anidrido (Método B). Os produtos isolados nestas reações foram
designados como CIT-ANI-7 e CIT-ANI, respectivamente. Como controle aqueceu-se o
citocromo c em imidazol fundido nas mesmas condições utilizadas nas reações de acoplamento
com o objetivo de avaliar as alterações provocadas pelo tratamento.
Para evitar a degradação da proteína misturou-se primeiro o anidrido com o imidazol
sólido, aqueceu-se a mistura até a fusão do imidazol (PF = 90ºC) e só então adicionou-se o
citocromo c e o tempo de tratamento foi minimizado (no máximo 10 minutos). Após a reação
deixou-se esfriar a mistura e adicionou-se água para dissolver o produto, uma vez que esperava-
se que este fosse hidrossolúvel, já que tanto o citocromo c quanto as ANI são bastante solúveis
em água. Entretanto, observou-se que parte do sólido residual não se dissolveu, por isso
centrifugou-se a mistura e retirou-se o liquido sobrenadante para dar prosseguimento à
caracterização. O liquido sobrenadante foi então dialisado para remover o excesso de anidrido e o
imidazol. A diálise foi conduzida até que na solução externa não houvesse mais anidrido e
imidazol, monitorada por UV-VIS. O dialisado apresentou uma coloração vermelho-alaranjada
diferente das soluções originais de citocromo c e do anidrido e mostrou uma fluorescência
alaranjada quando examinada com uma lâmpada de UV (λ = 365 nm) em uma placa de TLC
(vide infra) sugerindo que a modificação deva ter ocorrido. O conteúdo do tubo de diálise foi
armazenado sem nenhum outro processamento e utilizado desta forma para a caracterização.
A presença de precipitado após a adição de água nos produtos da reação, tanto na
presença quanto na ausência do anidrido (controle), sugere a formação de oligômeros de
citocromo c induzida pelo imidazol fundido. Tentou-se dissolver este precipitado em vários
solventes (água em pH ácido e alcalino, DMF a quente, DMSO, SDS, etanol) sem sucesso.
Diante deste resultado decidiu-se desprezar o precipitado, seguindo a caracterização apenas com
o produto dialisado.
59
Figura 28 – Reação entre citocromo c nativo e anidrido 4-amino-1,8-naftálico em presença de imidazol fundido.
Método A: cit c: anidrido (1:14) . Método B: cit c : anidrido (1:1). (a)Lys 22; (b)Lys 25; (c)Lys 27; (d)Lys 73; (e)
Lys 72; (f) Lys 87; (g) Lys 88.
As estruturas apresentadas para os produtos são apenas uma sugestão uma vez que
não é possível determinar a estrutura exata com a nossa metodologia.
N
O
O
NH
2
N
O
O
NH
2
N O
O
NH
2
N
O
O
NH
2
N
O
O
NH
2
N
O
O
NH
2
N
O
O
NH
2
CIT-ANI-7
NH
2
NH
2
NH
2
N
O
O
NH
2
2
HN
2
HN
2
HN
CIT-ANI
NH
2
NH
2
NH
2
2
HN
2
HN
2
HN
NH
2
imidazol
90ºC
Cit
c
: anidrido
(excesso)
1:14
Cit
c
: anidrido
1:1
Método A
Método B
O
O
O
N
H
2
+
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
60
5.3.1 Caracterização do CIT-ANI pelo método do imidazol fundido
O CIT-ANI-7 (Figura 28), ou seja, o produto obtido a partir da reação de citocromo c com
excesso de anidrido 4-amino-1,8-naftálico (AAN), apresentou alterações que permitiram a sua
caracterização por diversas técnicas, exceto por espectrometria de massa (MALDI-Toff), já que
não foi possível a ionização do mesmo após inúmeras tentativas. Por outro lado, o produto obtido
em proporções equimolares (CIT-ANI) (Figura 28), foi detectado por espectrometria de massa,
mas não pôde ser caracterizado pela maioria das outras técnicas. Por isso a maior parte dos
resultados apresentados a seguir referem-se ao CIT-ANI-7.
5.3.1.1 Caracterização por TLC
As reações foram monitoradas inicialmente por TLC (Figura 29) comparando-se o
comportamento do CIT-ANI-7 com o dos reagentes puros, utilizando etanol como eluente.
Nessas condições o citocromo c não sai da origem (R
f
= 0), enquanto que o AAN se desloca com
R
f
= 0,9, portanto há uma diferença significativa entre ambos, o que pode ser confirmado quando
se aplica os dois reagentes no mesmo ponto. A mancha do CIT-ANI-7 permaneceu na origem
(R
f
=0) de forma semelhante ao observado com o cit c nativo, sugerindo se tratar de uma
macromolécula, mas diferentemente do citocromo c apresentou fluorescência sob irradiação UV
e uma coloração alaranjada (a cor da mancha do citocromo c é avermelhada). Nota-se a total
ausência do AAN na análise do dialisado. Todas essas observações constituem forte evidência do
sucesso da modificação.
61
Figura 29 - Resultados
de cromatografia em camada delgada em sílica gel de citocromo c modificado pelo método de
imidazol: (1) citocromo c nativo; (2) AAN; (3) AAN + citocromo c nativo; (4) CIT-ANI-7. Eluente: etanol.
62
5.3.1.2 Caracterização por UV/vis
O sucesso da modificação foi confirmado por espectroscopia de UV/vis no caso do CIT-
ANI-7 (Figura 30). O espectro UV/vis do citocromo c nativo é dominado pela banda Soret com
máxima intensidade em 409 nm. Já as 4-ANI apresentam uma banda larga centrada em cerca de
430 nm. O espectro do CIT-ANI-7 mostra claramente a presença da banda Soret e de um ombro
na região onde a imida absorve sugerindo que a imida ligou-se à proteína.
Figura 30 – Espectros UV/vis registrados para determinação da concentração do CIT-ANI em solução aquosa, após
diálise, por comparação com mistura física. Imida-4-amino-1,8-naftálica – [ANIP] - 4,2 x 10
-5
M (linha cheia);
citocromo c nativo 3,8 x 10
-6
M (linha tracejada); mistura física – [cit c nativo 3,8x10
-6
M + ANIP 3,8 x 10
-5
M]
(linha pontilhada) e CIT-ANI-7 3,8 x 10
-6
M (linha traço-ponto); inserto destacando a banda de transferência de
carga em 695 nm.
O espectro do CIT-ANI-7 é bastante semelhante ao espectro de uma solução contendo o
cit c nativo e uma 4-ANI pura na proporção molar 1:7 (cit c : 4-ANI) sugerindo que o citocromo
foi modificado com cerca de 7 moléculas de imida, daí a denominação CIT-ANI-7. Em geral,
reações que envolvem modificações de proteínas resultam em uma distribuição de produtos com
populações de números diferentes de modificador (THEODORAKIS, 1995; THOMAS, 1975).
350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
550 600 650 700
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
660 670 680 690 700
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
63
Presume-se a partir do exposto na Figura 30 que o produto com sete modificações seja o mais
populoso. Como foi visto na introdução, o cit c nativo apresenta 19 resíduos de lisina, com sete
deles mais expostos, sendo possível modifica-los por acetilação, o que esta de acordo com a
sugestão da estrutura mostrada na Figura 28 (SCOTT, 1996). O espectro do CIT-ANI, por outro
lado, não mostrou diferença significativa em relação ao espectro do cit c nativo devido ao baixo
grau de modificação.
A Figura 31 mostra as alterações do citocromo c nativo fundido em imidazol (controle
negativo). Estas diferenças são: desvio de 2 nm para o azul do pico da banda Soret (Figura 31
A)
e o desaparecimento da banda de transferência de carga (CT) em 695 nm (Figura 31 C), o que
indica a perda de coordenação da metionina-80 na sexta posição.
Figura 31
–
Espectros UV/vis, normalizados, do citocromo c nativo (linha tracejada) e do citocromo c
tratado com imidazol fundido (linha cheia). Figura 31
A: banda Soret; Figura 31 B: banda β e Figura 31 C:
inserto destacando a banda de transferência de carga (695 nm).
350 400 450
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
500 550 600
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Absorbância u.a
Comprimento de onda nm
650 675 700 725 750
0,04
0,06
0,08
A
B
C
64
5.3.1.3 Caracterização por fluorescência
A Figura 32 mostra o espectro de emissão do CIT-ANI-7 em comparação com o da imida
4-ANI-GLI, utilizada como referência. Em ambos os espectros a concentração da imida foi
ajustada para 1
µ
M. Como o citocromo c nativo não apresenta fluorescência, o simples fato de o
CIT-ANI-7 apresentar um espectro de emissão semelhante ao da 4-ANI-GLI é mais uma prova
do sucesso da modificação. Nota-se um deslocamento para o vermelho do
λ
max
em
no caso do CIT-
ANI-7, o que sugere que as moléculas de imida em média estão em um ambiente mais polar do
que a água quando incorporadas à proteína. O CIT-ANI, por outro lado, não apresentou
fluorescência detectável, devido ao baixo grau de modificação.
Pode-se observar na Figura 32 que a intensidade de fluorescência da imida é reduzida no
CIT-ANI-7 em comparação com a imida livre (os espectros foram registrados nas mesmas
condições), o que pode ser explicado pelo efeito supressor do ferro hemínico da proteína ligada
covalentemente à imida. Para avaliar o efeito supressor do grupo heme, realizaram-se
experimentos de supressão de fluorescência adicionando-se citocromo c nativo como supressor
externo à uma solução aquosa contendo 1 µM de 4-ANI-GLI (Figura 33A). Como visto na Figura
32, é necessário adicionar 12 µM de citocromo c nativo para que a solução 1 µM de 4-ANI-GLI
tenha a mesma fluorescência do que a solução de CIT-ANI-7 0,14
µ
M (contendo, portanto, 1
µ
M
de imida). Pode-se concluir que o citocromo c, quando ligado covalentemente à imida, agindo
como um supressor interno, apresenta uma eficiência de supressão cerca de duas ordens de
grandeza maior do que quando adicionado externamente à uma solução da imida livre. A
supressão neste caso é provavelmente devida à “quenching” estático.
A Figura 33A mostra o efeito da adição de alíquotas sucessivas de citocromo c nativo á
solução 1
µ
M de 4-ANI-GLI. Pode-se observar que a fluorescência da imida é totalmente
suprimida quando a [cit c] é cerca de 1 x 10
-4
M. O gráfico de Stern-Volmer correspondente é
mostrado na Figura 33B. Uma alta constante de supressão (K
sv
≈ 1 x 10
6
M
-1
) pode ser observada.
65
Figura 32 - Espectros de emissão do CIT-ANI-7 e da 4-ANI-GLI 1x 10
-6
M em tampão fosfato de potássio 50 mM
pH 6,0. O comprimento de onda de excitação foi 430 nm para os três espectros: (
_____
)[CIT-ANI-7] = 0,14
micromolar; (----) citocromo c nativo 12 x 10
-6
M + 4-ANI-GLI 1 x 10
-6
M ; (
_
.
_
) 4-ANI-GLI 1
x 10
-6
M.
Figura 33 - A - Efeito do citocromo c no espectro de emissão da 4-ANI-GLI: citocromo c nativo em adições
sucessivas e a imida controle (4-ANI-GLI) 1µM em tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0. B – Gráfico de Stern-
Volmer para a supressão de emissão de fluorescência da 4-ANI-GLI pelo citocromo c em tampão fosfato de potássio
pH 6,0. [4-ANI-GLI] = 10
-6
M; excitação = 430 nm; emissão = 435 nm. Regressão linear: y = 1,02 x + 0,065;
coeficiente de correlação (r) = 0,999.
450 500 550 600 650 700
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Intensidade
comprimento de onda (nm)
1 x 10
-
6
100 x 10
-
6
0 1 2 3 4 5 6 7 8
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
I
0
/I
[cit c] 10
-6
M
A
B
450 500 550 600 650 700
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Intensidade
comprimento de onda (nm)
CIT-ANI-7
[cit c 12 x 10
-6
M +ANI1x10
-6
M]
4-ANI-GLI 1 x 10
-6
M
66
5.3.1.4 Caracterização por Infravermelho (IR)
A Figura 34 mostra espectros de IR do citocromo c nativo, da ANIP, uma 4-ANI utilizada
como referência (vide estrutura na Figura 6), e dos citocromos modificados CIT-ANI e CIT-ANI-
7. O espectro do citocromo c nativo é dominado por duas bandas intensas em 1542 e 1653 cm
-1
.
Estas bandas, que são características de proteínas, são denominadas amida II e amida I,
respectivamente. Já o espectro da ANIP apresenta três bandas proeminentes em 1583, 1644 e
1687 cm
-1
, que podem ser atribuídas ao estiramento dos grupos carbonila (-C=O) da imida
aromática. Os espectros dos citocromos modificados CIT-ANI e CIT-ANI-7, por outro lado,
mostram bandas provenientes tanto da proteína como da imida, o que constitui mais uma
evidência de que as modificações ocorreram. Apesar de os espectros de CIT-ANI e CIT-ANI-7
serem dominados pelas bandas amida II e amida I da proteína (linhas pontilhadas em vermelho),
pode-se observar também as bandas de 4-ANI sobrepostas a estas (linhas pontilhadas em azul),
em especial a banda em 1583 cm
-1
, a qual é mais visível por estar situada entre as bandas da
proteína. Além disso, a intensidade relativa das bandas de absorção de 4-ANI em CIT-ANI e
CIT-ANI-7 correspondem ao esperado conforme o grau de modificação dos mesmos, sendo mais
intensas em CIT-ANI-7 do que em CIT-ANI.
Figura 34- Espectros de IR (infravermelho) em ATR – A: (azul) citocromo c nativo; (verde) ANIP (ester dietílico);
(vermelho) CIT-ANI; (preto) CIT-ANI-7. Espectros em escala original. B: (a) citocromo c nativo; (b) ANIP (ester
dietílico); (c)CIT-ANI; (d) CIT-ANI-7. Os espectros foram redimensionados para melhor visualização.
1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450
60
70
80
90
100
110
% Transmitância
cm
-1
1900 1850 1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450 1400
d
1532
1579
1651
1655
Transmitância
Número de onda (cm
-1
)
c
1541
1570
1644
b
1583
1687
1900 1850 1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450 1400
a
1542
1653
A
B
67
5.3.1.5 Caracterização por Dicroísmo Circular
A Figura 35 mostra significativas mudanças espectrais entre o citocromo c nativo, o
citocromo c modificado por imida (CIT-ANI-7 e CIT-ANI) e o citocromo c tratado em imidazol
fundido (controle negativo). A diminuição da banda negativa no CIT-ANI e o desaparecimento
dessa mesma banda no CIT-ANI-7 e no citocromo c em imidazol fundido sugere afastamento do
sexto ligante do ferro hemínico, ou seja, existe a possibilidade do imidazol ter alterado a
coordenação da metionina 80, tornando o citocromo c mais simétrico devido a presença do grupo
imidazol da histidina próxima à cavidade heme (LIU,1997).
Figura 35 - Espectros no visível por CD de citocromo c tratado com imidazol fundido 20 µM (.....), CIT-ANI-7 20
µM (
_____
), CIT-ANI 20 µM (
----
), citocromo c nativo 20mM (-.-.-.).
O citocromo c nativo apresenta em sua estrutura 40% de α-hélice e 9% de folhas-β
indicadas no espectro mostrado na Figura 36 pela banda positiva em 190 nm e a banda negativa
em 222 nm. A diminuição destas bandas mostra perda da estrutura em α-hélice.
360 380 400 420 440
-2
-1
0
1
2
3
4
θ
Molar (grau.dmol
-1
.cm
2
)
Comprimento de onda (nm)
68
190 200 210 220 230 240 250
-60
-40
-20
0
20
40
60
[
θ
] (grau.dmol
-1
.cm
2
)
Comprimento de onda (nm)
Figura 36 - Espectros por CD em alfa-hélice de citocromo c nativo 20 µM (
____
), citocromo c nativo em imidazol
fundido 20 µM (-----) e CIT-ANI-7 20 µM (-..-..-).
69
5.3.1.6 Caracterização por espectrometria de massas
O espectro de massa do citocromo c nativo (MALDI-ToF) apresenta basicamente um pico
referente ao íon molecular com massa de 12384 Da (Figura 37A). A escolha dessa técnica para
caracterização do CIT-ANI-7 e do CIT-ANI deve-se ao fato de ser possível identificar alterações
de massa a partir da formação dos fragmentos ionizados. Trata-se de uma técnica qualitativa,
onde a amostra pode ou não ser ionizada em decorrência de mudanças em sua estrutura
(ALTERMAN, 2004).
As amostras (CIT-ANI-7 e CIT-ANI) foram diluídas, em uma faixa de concentração de 10
a 20 µM, na matriz de ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinâmico em solução saturada de acetonitrila
e ácido trifluoroacético e submetidas a uma voltagem de 20 kV. A amostra de CIT-ANI-7 não
ionizou, fato este que impossibilitou uma análise mais detalhada de suas modificações.
Entretanto, esse fato está de acordo com os resultados encontrados, inicialmente, com a formação
de partículas insolúveis, logo após o tratamento e com o perfil eletroforético (Figura 38).
Figura 37 – A: Espectro de Massa– MALDI ToFF MS– do citocromo c nativo; B: Espectro de massa CIT-ANI.
O espectro de massa do CIT-ANI (Figura 37B) mostra três séries de picos com massa
maior do que o cit c nativo. A diferença de massa entre as séries é de exatamente 195 Da, que é a
massa esperada do modificador, o qual é uma molécula de AAN (PM = 213) que perdeu uma
molécula de água ao se condensar com o grupo –NH
2
de uma lisina para formar a imida.
Presume-se, portanto, que as séries correspondem ao citocromo c modificado com uma (picos a-
12300 12400 12500 12600
0
500
1000
1500
2000
intensidade
m/z
citocromo c nativo
12400 12600 12800 13000
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
B
∆=195 Da
(j)
(i)
(h)
(g)
(f)
(e)
(d)
(c)(b)
(a)
Intensidade
massa/carga
A
70
e), duas (picos f-j) e três moléculas de 4-ANI, sendo a população com uma única modificação a
mais importante. Além do espaçamento de 195 Da entre as séries, observa-se dentro de cada série
um espaçamento de 28 Da, o que pode indicar a incorporação de número variável de um segundo
fragmento à proteína (a massa deste fragmento é compatível com um grupo etila). Até o presente
momento não foi possível estabelecer a origem deste segundo fragmento.
4.3.1.7 Caracterização por eletroforese
O perfil eletroforético do CIT-ANI-7 foi comparado: a) com o padrão (1) na faixa de
14400 Da a 97000 Da de massa e b) com o citocromo c nativo em duas concentrações (2) 5µM e
(3) 10 µM. Nota-se a presença de uma banda intensa no CIT-ANI-7 (4, 5, 6 e 7) coincidindo com
a banda do citocromo c nativo que está abaixo da banda de 14400 Da do padrão. Este fato sugere
a presença de moléculas de CIT-ANI-7 com variadas modificações ou até mesmo de moléculas
de citocromo c em sua forma nativa. Entretanto, outras bandas situadas logo acima da banda
14400 Da indica um acréscimo de massa da ordem de 2016 Da (padrão – citocromo c nativo) que
corresponderiam a 10 ou 11 modificações (massa do modificador = 195 Da). Outra banda de
menor intensidade pode ser vista na Figura 25 indicando haver a possibilidade de ter um outro
grupo de moléculas de CIT-ANI com um número ainda maior de modificações, ou formação de
oligômeros.
Figura 38 – Perfil eletroforético do citocromo c modificado (CIT-ANI): 1 – Padrão Low Range 14400 – 97000 Da;
2 – cit c nativo 10 µM; 3- cit c nativo 5 µM; 4 e 6 – CIT-ANI-7 10 µM; 5 e 7 - CIT-ANI-7 5 µM.
1
2
3
4
5
6
7
Cit c nativo
10
µ
µµ
µ
M
5
µ
µµ
µ
M
10
µ
µµ
µ
M
5
µ
µµ
µ
M
10
µ
µµ
µ
M
5
µ
µµ
µ
M
Padrão
71
5.3.1.8 Reatividade do CIT-ANI-7
O citocromo c apresenta atividade catalítica sobre peróxidos e compostos carbonílicos. As
modificações do citocromo c podem ser acompanhadas por espectroscopia UV/vis em função das
alterações de intensidade e absorbância máxima, principalmente na região da banda Soret e da
banda de transferência de carga em 695 nm, a partir de sua reatividade com substâncias como
DPAA (difenilacetaldeído), t-Bu-OOH (t-butil-hidroperóxido). Portanto, os resultados a seguir
demonstram a atividade oxidante do CIT-ANI-7 em comparação ao citocromo c nativo.
4.3.1.8.1 Estudo da reatividade do CIT-ANI-7 com DPAA
Conforme
descrito
na introdução, a reação do citocromo c com DPAA depende de sua
estrutura protéica que pode ser modulada por associações com bicamadas lipídicas e sofrer
efeitos decorrentes de mudanças do pH do meio em que se encontra. A Figura 39 mostra a
alteração espectral do citocromo c nativo comparada à do CIT-ANI-7.
Figura 39 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25mM
pH7 com adição de DPAA 0,2 mM em etanol. Cit c nat - tempo zero (linha tracejada); cit c nat – tempo 1800s
(linha cheia); CIT-ANI-7 – tempo zero (linha traço ponto) e CIT-ANI-7 – tempo 1800s (linha pontilhada).
300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Absorbância
Comprimento de onda nm
500 550 600 650
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
72
Figura 40 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão hidróxido de amônio pH10
com adição de DPAA 0,2 mM em etanol. Cit c nat - tempo zero (linha tracejada); cit c nat – tempo 1800s (linha
cheia); CIT-ANI-7 – tempo zero (linha traço ponto) e CIT-ANI-7 – tempo 1800s (linha pontilhada)
A reação entre o citocromo c nativo e o DPAA é favorecida em pH alcalino devido a
desprotonação do resíduo de tirosina próximo do heme que facilita a redução. A Figura 40 mostra
o espectro do citocromo c nativo comparado aos do CIT-ANI-7 no inicio da reação e após 1800
s. Observa-se uma alteração significativa do espectro do citocromo c nativo, típica da redução do
ferro hemínico, enquanto que o CIT-ANI-7 permanece praticamente inalterado.
300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Absorbância
Comprimento de onda nm
cit c nat t=1800s
cit c nat t=0s
citim t=1800 s
citim t = 0 s
500 550 600 650
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
73
5.3.1.8.2 Estudo da reatividade do CIT-ANI-7 com t-BuOOH
A Figuras 41 e 42 mostram o citocromo c nativo, utilizado como controle, apresentando
“bleaching”da banda Soret, devido a mudanças em seu potencial de redução, enquanto que o
CIT-ANI-7 não apresenta alterações estruturais significativas, tanto em pH 7,4 quanto em pH 10.
Figura 41 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mM
pH7,4 com adição de t-BuOOH 2 mM. Cit c nat - tempo zero (linha cheia); cit c nat – tempo 1800s (linha tracejada);
CIT-ANI-7 – tempo zero (linha pontilhada) e CIT-ANI-7 – tempo 1800s (linha traço ponto)
300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
absorbância
Comprimento de onda nm
cit c nat t=0s
cit c nat t=1800 s
citim t=0
citim t=1800s
500 550 600 650
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
74
Figura 42 – Decurso da reação entre citocromo c 4µM (nativo e modificado) em tampão fosfato de sódio 25 mM
pH10 com adição de t-BuOOH 2 mM. Cit c nat - tempo zero (linha cheia); cit c nativo – tempo 1800s (linha
pontilhada); CIT-ANI-7 – tempo zero (linha traço ponto) e CIT-ANI-7 – tempo 1800s (linha tracejada)
300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Absorbância
Comprimento de onda nm
citim t=0
citim t=1800s
cit c nat t=0s
cit c nat t=1800 s
500 550 600 650
75
6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES
- A tentativa de sintetizar o CIT-ANI através dos métodos por acoplamento com
EDAC, sonicação e microondas não obteve o sucesso desejado.
- O método por imidazol fundido mostrou ser o mais eficaz, sendo possível caracterizar
o CIT-ANI-7 por diferentes técnicas.
- O CIT-ANI mostrou evidentes alterações por espectrometria de massa e por
infravermelho mostrando a presença da imida no citocromo c.
- As mudanças espectrais observadas por UV/vis e CD mostram possíveis alterações
na estrutura secundária do CIT-ANI-7 e CIT-ANI.
- Experimentos envolvendo a ativação de caspase , a fim de avaliar o potencial do CIT-
ANI-7 (e do CIT-ANI), como fator apoptótico, estão em desenvolvimento.
76
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