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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
ASSOCIAÇÃO DE Trichoderma sp. E FUNGICIDAS NO CONTROLE DE Fusarium
oxysporum f. sp. phaseoli
Juliana Dalmagro Pandolfo
Bióloga – ULBRA
Dissertação apresentada como um dos
requisitos à obtenção do Grau de
Mestre em Fitotecnia
Área de Concentração Fitossanidade
Porto Alegre (RS) Brasil
Abril de 2007
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ii
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AGRADECIMENTOS
À professora Aida Teresinha Santos Matsumura, pela orientação, sobretudo,
pelo incentivo e amizade fundamentais durante todo o curso, além das sugestões que
contribuíram na concretização dessa dissertação.
Ao professor Miguel Dalmo de Menezes Porto, por toda ajuda e pela
disponibilidade.
Aos professores do Departamento de Fitossanidade da UFRGS, pela
disponibilidade e ensinamentos que auxiliaram durante a realização desta pesquisa.
Aos amigos do de laboratório Isabel Padula Paz, Márcia Eloísa da Silva,
Marcus Almança e Rita Madail Santin pela amizade e assistência na condução deste
trabalho.
À secretária do Programa de Pós-Graduação, Marisa Carvalho Bello, pela
atenção dispensada em todo o período
Aos meus pais, Julio César Pandolfo e Maria Elizabete Pandolfo, pelo apoio e
incentivo indispensáveis e por sempre acreditarem em mim.
Ao meu tio Sérgio Dalmagro por toda ajuda indispensável para a realização
deste trabalho.
Ao meu namorado Felipe Koch Machado, por todo amor, apoio e compreensão.
Às minhas amigas Alice Fogaça Monteiro e Andréa Fogaça Monteiro, pelo
apoio, pelas conversas e risadas.
iii
À Universidade Federal do Rio Grande do Sul pela oportunidade de realização
do Curso de Mestrado.
iv
ASSOCIAÇÃO DE Trichoderma sp. E FUNGICIDAS NO CONTROLE DE Fusarium
oxysporum f.sp. phaseoli.
1
Autor: Juliana Dalmagro Pandolfo
Orientador: Dr
a
. Aida Teresinha Santos Matsumura
Co-Orientador: Dr. Miguel Dalmo de Menezes Porto
RESUMO
Avaliou-se, por testes in vitro, a fungitoxicidade dos produtos Cabrio Top,
Captan SC, Comet, Derosal 500, Derosal Plus, Frowncide 200 SC, Nativo, Opera, Stratego
e Vitavax-Thiram 200 SC em isolados de Trichoderma sp. (T1R, T2R, T4R, T6R, T7R,
TSV e PCT). Os fungicidas foram adicionados em meio de cultura BDA e em discos de
papel filtro na dosagem recomendada pelo fabricante, metade e dobro desta dose. Os
tratamentos foram mantidos a 23 ± 1ºC e fotoperíodo de 14 horas. Após sete dias de
incubação foi medido o diâmetro da colônia dos fungos na presença dos fungicidas e o halo
de inibição formado em torno do disco de papel filtro. Os fungicidas Cabrio Top, Captan
SC, Comet, Stratego e Vitavax-Thiram 200 SC não se mostraram tóxicos aos isolados. O
isolado T4R foi o menos sensível aos fungicidas e os isolado T6R e PCT foram os mais
sensíveis. Avaliou-se também, a fungitoxicidade in vitro destes mesmos defensivos
agrícolas a Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, agente causal da murcha do feijoeiro e o
potencial antagônico dos isolados de Trichoderma sp. ao fitopatógeno. Os fungicidas,
Derosal 500, Derosal Plus, Nativo, Opera e Vitavax-Thiram 200 SC foram efetivos no
controle de F. oxysporum f.sp. phaseoli in vitro. Experimentos in vitro, testando o potencial
antagônico dos isolados T4R, TSV e PCT de Trichoderma sp. ao fitopatógeno mostraram
que os isolados são efetivos no controle de F. oxysporum f.sp. phaseoli quando inoculados
48 horas antes e simultaneamente com o fitopatógeno. Em experimento de casa de
vegetação, sementes de feijão foram tratadas com os fungicidas Vitavax-Thiram 200 SC e
Derosal Plus, com os isolados T4R, TSV e PCT e com o fitopatógeno F. oxysporum f. sp.
phaseoli. Somente o isolado TSV foi efetivo no controle do fitopatógeno. Todos os
isolados de Trichoderma sp. foram recuperados de raízes de plantas cujas sementes foram
tratadas com fungicidas.
____________
1
Dissertação de Mestrado em Fitotecnia, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do
Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil (67 p). Fevereiro, 2007
v
ASSOCIATION OF Trichoderma sp. AND FUNGICIDES IN THE CONTROL OF
Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli
Author : Juliana Dalmagro Pandolfo
Advisor : Dra. Aida Teresinha Santos Matsumura
Co-Advisor : Dr. Miguel Dalmo de Menezes Porto
ABSTRACT
The fungitoxicity of the products Cabrio Top, Captan SC, Comet, Derosal 500,
Derosal Plus, Frowncide 200 SC, Nativo, Opera, Stratego and Vitavax-Thiram200 SC was
evaluated through in vitro tests in strains of Trichoderma sp. (T1R, T2R, T4R, T6R, T7R,
TSV and PCT). The fungicides were added in a PDA culture medium and on discs of filter
paper following manufactures recommended dosages, half and the double of this dose. The
treatments were maintained at 23±1ºC and at a photophase of 14 hours. After 7 days of
incubation the diameter of the fungus colony in the presence of fungicides and the halo of
inhibition formed around the disc of paper filter were measured. The fungicides Cabrio
Top, Captan SC, Comet, Stratego and Vitavax-Thiram 200 SC were not toxic towards the
isolates. The isolate T4R was less sensitive towards the fungicide while the isolates T6R
and PCT were the most sensitive ones. The fungitoxicity in vitro of these same agricultural
defensives towards Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli (the casual agent of Fusarium Wilt
and the antagonistic potential of the isolates of Trichoderma sp. towards the pathogen) was
evaluated. The fungicides Derosal 500, Derosal Plus, Nativo, Opera and Vitavax-Thiram
200 SC were effective in the control of F. oxysporum f.sp. phaseoli in vitro. Experiments in
vitro, testing the antagonistic potential of the isolates T4R, TSV and PCT of Trichoderma
sp. towards the pathogen have shown that the isolates are effective in the control of F.
oxysporum f.sp. phaseoli when inoculated before 48 hour period and simultaneanously with
the pathogen. In experiment in greenhouse bean seeds were treated with the fungicides
Derosal Plus and Vitavax-Thiram200 SC with the isolates T4R, TSV and PCT and with
the pathogen Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli. Only the isolated TSV was effective in
the control of the pathogen. All isolated of Trichoderma sp. Tested they had been recouped
of roots of plants whose seeds had been with fungicides.
___________
1
Master of Science in Agronomy, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil (67p.). February, 2007.
vi
SUMÁRIO
Páginas
INTRODUÇÃO............................................................................................... 1
CAPÍTULO 1
1 Revisão Bibliográfica................................................................................... 4
1.1 A cultura: Feijão (Phaseolus vulgaris L.)............................................ 4
1.2 Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli.................................................... 5
1.3 O fungo Trichoderma sp…………………………………………….. 6
1.4 Controle químico……………………………………………………. 12
1.5 Controle biológico…………………………………………………... 15
1.6 Manejo integrado……………………………………………………. 16
CAPÍTULO II
2 Compatibilidade de isolados de Trichoderma sp. com diferentes
fungicidas.........................................................................................................
19
2.1 Introdução............................................................................................. 19
2.2 Materiais e Métodos.............................................................................. 20
2.2.1 Experimentos em laboratório....................................................... 20
2.2.1.1 Obtenção dos isolados de Trichoderma sp...................... 23
2.2.1.2 Interferência in vitro de fungicidas no crescimento dos
isolados de Trichoderma sp........................................................
24
2.3 Resultados e Discussão.......................................................................... 26
2.3.1 Interferência in vitro de fungicidas no crescimento de isolados
de Trichoderma sp........................................................................................
26
CAPÍTULO III
3 Efeito de fungicidas sobre o desenvolvimento de Fusarium oxysporum
f.sp. phaseoli e interação destes com Trichoderma sp....................................
37
3.1 Introdução.............................................................................................. 37
3.2 Materiais e Métodos.............................................................................. 38
3.2.1 Testes em laboratório................................................................... 41
3.2.1.1 Obtenção de isolados de Trichoderma sp....................... 41
3.2.1.2 Obtenção e multiplicação do inóculo de F. oxysporum
f.sp. phaseoli...............................................................................
42
3.2.1.3 Avaliação do potencial antagônico de Trichoderma sp.
a F. oxysporum f. sp. phaseoli em meio BDA............................
42
3.2.1.4 Interferência in vitro de fungicidas no crescimento de
F. oxysporum f.sp. phaseoli........................................................
43
vii
Páginas
3.2.2 Testes em casa de vegetação.................................................. 44
3.2.2.1 Produção do inóculo de Trichoderma sp................. 45
3.2.2.2 Produção do inóculo de F. oxysporum f.sp.
phaseoli.................................................................................
45
3.2.2.3 Esterilização do substrato........................................ 46
3.2.2.4 Montagem do experimento..................................... 46
3.3 Resultados e Discussão.................................................................... 49
3.3.1 Avaliação do potencial antagônico de Trichoderma sp. a F.
oxysporum f. sp. phaseoli em meio BDA.........................................
49
3.3.2 Interferência in vitro de fungicidas no crescimento de F.
oxysporum f. sp. phaseoli.................................................................
50
3.3.3 Experimentos em casa de vegetação..................................... 55
4 CONCLUSÕES.....................................................................................
5 SUGESTÕES.........................................................................................
59
61
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................
62
viii
RELAÇÃO DE TABELAS
CAPÍTULO II
Páginas
1. Doses recomendadas dos fungicidas utilizados.........................................
24
2 Diâmetro (cm) de colônias dos isolados de Trichoderma sp. em meio de
cultura contendo fungicidas............................................................................
27
3. Halo de inibição (cm) de colônias de Trichoderma sp. em meio de
cultura contendo discos de papel filtro impregnados com fungicida .............
33
CAPÍTULO III
1. Doses recomendadas dos fungicidas utilizados..........................................
44
2. Médias originais do crescimento de isolados de Fusarium oxysporum
f.sp phaseoli inoculados 48h antes, simultaneamente e 48h após a
inoculação de isolados de Trichoderma sp. em meio de
cultura.............................................................................................................
50
3. Diâmetro (cm) do crescimento de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli em
meio de cultura contendo diferentes fungicidas.............................................
52
4. Halos de inibição do crescimento de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli
em meio de cultura contendo discos de papel filtro impregnados com
diferentes fungicidas.......................................................................................
53
5. Influência dos tratamentos realizados no experimento em casa de
vegetação sobre as plantas de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.).......
55
ix
RELAÇÃO DE FIGURAS
CAPÍTULO II
Páginas
1. Experimento in vitro. Placa de Petri contendo meio de cultura BDA; de
um lado da placa se encontra um disco de papel filtro de 0,6 cm de
diâmetro, embebido com solução fungicida (A). Do lado oposto está um
disco de 0,6 cm de diâmetro contendo colônia do fungo Trichoderma
sp.(B)...............................................................................................................
25
2. Desenvolvimento in vitro do isolado TSV na presença da dose
recomenda, meia dose e dobro da dose do fungicida Vitavax-Thiram 200
SC em maio de cultura BDA..........................................................................
29
3. Desenvolvimento in vitro do isolado PCT na presença da dose
recomenda, meia dose e dobro da dose do fungicida Derosal 500 em meio
de cultura BDA...............................................................................................
30
4. Micélio dos isolados de Trichoderma sp. na presença da dose
recomendada do fungicida Frowncide 500 SC em BDA (1). Isolados PCT,
T1R e T2R em: Testemunha (A), dose recomendada de Frowncide 500 SC
(B), meia dose de Frowncide 500 SC (C), dobro da dose de Frowncide 500
SC (D)............................................................................................................
31
5. Isolados T4R, T6R, T7R e TSV em: Testemunha (A), dose
recomendada de Frowncide 500 SC (B), meia dose de Frowncide 500 SC
(C), dobro da dose de Frowncide 500 SC (D)...............................................
32
CAPÍTULO III
Páginas
1. Inóculo de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli em arroz após 14 dias de
incubação........................................................................................................
46
2. Experimento montado em casa de vegetação. Copos plásticos contendo
mistura de areia e vermiculita. Cada tratamento teve quatro repetições........
48
3. Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli na presença de três doses do
fungicida Derosal Plus, depois de sete dias de incubação..............................
51
x
4. Plantas cujas sementes foram tratadas com Fusarium oxysporum f.sp.
phaseoli e com o isolado PCT........................................................................
56
5. Isolado de Trichoderma sp. T4R em Trichoderma seletive médium,
recuperados de raízes de plantas que tiveram suas sementes tratadas com
Derosal Plus (300 mL / 100 kg de sementes) e com o presente isolado........
57
xi
INTRODUÇÃO
A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) desempenha um importante papel
na alimentação humana, constituindo a principal fonte de proteína vegetal. O Brasil situa-se
entre os principais produtores mundiais de feijão, sendo superado apenas pela Índia, que
devido à sua maior área cultivada, ocupa o primeiro lugar.
O feijoeiro comum é cultivado durante todo o ano, o que faz com que inúmeros
fatores tornem-se limitantes para a sua produção. Dentre os mais importantes fatores da
queda de produtividade no feijoeiro encontram-se as doenças, que podem provocar perdas
de até 100%, diminuindo as qualidades fisiológicas, nutricionais e sanitárias do produto
colhido, afetando o preço de sua comercialização.
A murcha ou amarelecimento de fusarium, causada por Fusarium oxysporum f.
sp. phaseoli Kendrick & Snyder tem sido relatada em vários países e, no Brasil o primeiro
relato foi realizado por Cardoso et al. (1966) na região de Laranjal Paulista, SP. Atualmente,
a murcha de fusarium encontra-se disseminada em todas as regiões produtoras de feijão do
país. Este fungo é um habitante do solo, vive saprofiticamente na matéria orgânica e em
restos culturais infectados, podendo sobreviver ainda, por vários anos, na forma de
clamidósporos. Sua disseminação se dá através de implementos agrícolas, água de irrigação,
animais, sementes contaminadas, etc...
O controle da murcha de fusarium pode ser feito, através de práticas culturais,
resistência genética das plantas e uso de fungicidas. O controle químico deve ser utilizado
2
preferencialmente no tratamento de sementes a fim de proteger a plântula no seu estágio
inicial. Porém, o controle de doenças, atualmente, está sendo direcionado para medidas que
causem o menor impacto possível, tanto do ponto de vista do meio ambiente, quanto à
contaminação do ser humano. As medidas devem analisar o agroecossistema como sendo
dinâmico e, portanto, todas as interferências levam para alguma conseqüência. Então o
manejo integrado de doenças, e não a utilização de medidas isoladas mostra-se como a
forma mais pertinente.
Em programas de manejo integrado deve-se considerar o controle microbiano
como um importante fator de redução da densidade populacional de agentes patogênicos. A
utilização de produtos químicos quando associados fungos antagonistas pode aumentar a
eficiência no controle e também reduzir a quantidade de defensivos agrícolas.
Atualmente, diversas substâncias são empregadas no controle de doenças, sendo
os fungicidas um grupo numeroso e destacado. Entretanto, as conseqüências de sua
utilização não são unicamente positivas, pois, muitos desses compostos químicos são
nocivos ao meio ambiente.
O controle integrado, com a utilização de produtos fitossanitários seletivos em
conjunto com fungos que agem como agentes de controle biológico, pode ser uma estratégia
mais segura e eficiente. Porém, alguns produtos fitossanitários podem afetar o crescimento
vegetativo, a viabilidade e a conidiogênese dos fungos antagonistas, ou até alterar sua
composição genética.
A maioria dos relatos sobre o uso de antagonistas para o controle de doenças
induzidas por fungos fitopatogênicos apresenta o Trichoderma sp. como um dos mais
promissores entre os agentes de biocontrole. No entanto, poucos trabalhos têm sido
realizados a propósito da seleção de biótipos compatíveis com fungicidas, em agentes de
biocontrole, para seu uso no manejo integrado de doenças.
3
A seleção de biótipos de Trichoderma sp. compatíveis com fungicidas para
serem utilizados em combinação é uma opção para se obter uma estratégia de controle
efetivo que envolve pesquisas biológicas e químicas no controle integrado de um ou mais
fitopatógenos. Esporos e micélios de isolados resistentes podem ser usados em conjunto
com fungicidas para tratamento de sementes, pulverizações foliares ou aplicações no solo.
A hipótese desta pesquisa é a de que existem diferentes graus de tolerância
fungicidas em isolados de Trichoderma sp. e que este apresenta potencial de controle a
Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli.
Atualmente no Brasil, ainda são escassos os trabalhos visando a seleção de
isolados de Trichoderma sp. compatíveis com defensivos agrícolas e seu uso no manejo
integrado de doenças. Com isto, a presente pesquisa teve por objetivos: (i) a avaliação in
vitro do desenvolvimento de isolados de Trichoderma sp. na presença de fungicidas; (ii)
verificação do antagonismo dos isolados de Trichoderma sp contra Fusarium oxysporum f.
sp. phaseoli in vitro; (iii) avaliação in vivo, do potencial antagônico dos isolados de
Trichoderma sp. a Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, na presença e na ausência dos
fungicidas.
CAPÍTULO I
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 A cultura: Feijão (Phaseolus vulgaris L.)
O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) é a espécie mais cultivada no gênero
Phaseolus que pertence a ordem Fabales e família Fabaceae. O Brasil é um dos maiores
produtores mundiais do gênero Phaseolus. Entretanto, a produção brasileira de feijão tem
sido insuficiente para abastecer o mercado interno, devido à redução da área plantada, da
ordem de 35%, nos últimos 17 anos. Cerca de 60% da produção brasileira é proveniente de
agricultura de mão de obra familiar (Magalhães, 2005).
O feijão exerce um importante papel na alimentação da população brasileira. As
sementes dessa leguminosa constituem-se na principal fonte de proteína de origem vegetal,
principalmente para população de baixa renda, fornecendo ainda ferro, carboidratos e fibras
(Lima et al., 2003).
O feijoeiro comum é uma planta exigente em nutrientes, muito sensível a fatores
climáticos extremos como alta ou baixa umidade do solo, alta ou baixa temperatura do ar,
além de ser conhecido como planta muito suscetível à doenças e pragas. A própria
arquitetura da planta é deficiente e tem, por exemplo, um sistema radicular limitado.
Pesquisas realizadas nos últimos anos, em especial sobre manejo da cultura e melhoramento,
projetaram o feijão como uma cultura economicamente viável, cultivada em extensas áreas
na época seca, em especial quando se aplica alta tecnologia como cultivares melhoradas,
5
preparo adequado do solo, controle efetivo de ervas daninhas, doenças e pragas e técnicas
avançadas de irrigação (Portes, 1996).
A ocorrência de determinados patógenos nas sementes, mesmo em taxas
relativamente baixas, pode gerar grandes perdas na produção, como é o caso de Fusarium
oxysporum f. sp phaseoli, agente etiológico da murcha ou amarelecimento de fusarium em
feijoeiro (Costa et al., 2003).
1.2 Fusarium oxysporum f. sp phaseoli
Fusarium oxysporum f. sp phaseoli é um fungo que pertence ao Filo Ascomycota e
a ordem Hypocreales. O micélio é incolor no início, mas com idade torna-se colorido,
amarelo pálido, cor-de-rosa pálido, ou um tanto púrpura. O fungo produz três tipos de
esporos assexuados. Os microconídios, os quais têm uma ou duas células, são os esporos
mais freqüentes e abundantes produzidos sob todas as circunstâncias, mesmo dentro de
plantas infectadas. Os macroconídios são os esporos típicos de Fusarium sp., têm de três a
cinco células e possuem extremidades gradualmente curvadas. Os clamidósporos possuem
uma ou duas células, são esporos redondos produzidos no meio ou na ponta de um micélio
mais velho ou em um macroconídio. Os três tipos de esporos são produzidos nas culturas do
fungo e provavelmente no solo, embora somente os clamidósporos possam sobreviver no
solo por um longo tempo (Agrios, 2004). O fungo Fusarium oxysporum f.sp phaseoli é um
habitante do solo e vive saprofiticamente sobre a matéria orgânica e restos culturais (Tuset-
Barrachina, 1973; Kimati, 1980).
O patógeno é favorecido por temperaturas amenas (em torno de 20°C) in vivo, porém
apresenta seu ótimo crescimento in vitro em torno de 28°C (Kimati, 1980).
A murcha de fusarium do feijoeiro foi relatada pela primeira vez na Califórnia
em 1928. No Brasil, os primeiros a relatarem a doença foram Cardoso et al. (1966) no
6
município de Laranjal Paulista - SP. Constatada primeiramente em feijão e, posteriormente,
em feijão vagem, a doença tem se mostrado bastante importante, principalmente neste
último tipo, sendo possivelmente uma das causas determinantes das mudanças periódicas
das áreas de cultivo (Kimati, 1980).
A penetração Fusarium oxysporum f.sp phaseoli ocorre geralmente próxima aos
ápices radiculares, além de ferimentos e aberturas naturais radiculares do feijoeiro
(Bianchini et al., 1983). A infecção pode ocorrer em qualquer época do ciclo da planta,
principalmente quando jovem (Tesut-Barrachina, 1973). Sua incidência ocorre em reboleiras
(Mohan et al., 1983), podendo levar a planta à morte (Costa et al.,1982).
O patógeno coloniza o sistema vascular da planta, causando amarelecimento e
murcha das folhas. Com o avanço da doença, as folhas secam e caem. Os sintomas iniciam-
se pelas folhas inferiores progredindo para as superiores (Bianchini et al., 1997). Plantas
severamente afetadas e cultivadas em locais úmidos apresentam uma massa cotonosa branca
ou rosada externamente ao caule, composta de micélios e conídios do fungo. Devido a
colonização pelo fungo nota-se na região do xilema, coloração marrom-escuro, estendendo-
se no caule principal, ramos laterais e pecíolos das folhas (Cardoso et al., 1966; Costa et al.,
1982)
O fungo é disseminado de um campo para outro principalmente através dos
esporos aderidos a superfície das sementes. A disseminação pode ser feita também por vento
e água de irrigação, que transportam partículas de solo infestado e conídios produzidos sobre
a planta morta (Bianchini et al., 1997).
1.3 O fungo Trichoderma sp.
O fungo Trichoderma sp. corresponde a fase anamórfica do gênero Hypocrea sp.
que pertence ao filo Ascomycota (Agrios, 1997). As espécies de Trichoderma geralmente
7
são encontradas como componentes da microbiota em quase todos os tipos de solos,
especialmente os orgânicos, incluindo a camada de húmus das florestas, solos agrícolas e
pomares, podem viver saprofiticamente ou parasitando outros fungos (Roiger et al., 1991).
Este fungo tem como características morfológicas o micélio, inicialmente de
coloração branca e de crescimento rápido. Com o desenvolvimento, torna-se cotonoso e
compacto com tufos verdes escuro. A coloração da colônia é devida, geralmente, à coloração
e a quantidade de conídios. Os conídios são unicelulares, de forma subglobosa, ovóide,
elipsóide ou elíptico-cilíndrica, com textura lisa ou rugosa e coloração hialina para verde-
amarelado até verde-escuro, sendo a última mais comum. Sua posição é uma forma de
esfera, no ápice das fiálides. As fiálides têm forma de cantil com o centro dilatado e o ápice
afilado, solitários ou em grupos, hialinos, formando um ângulo com os conidióforos. Os
conidióforos são muito ramificados, solitários ou em tufos compactos, geralmente em
formato cônico ou piramidal. Normalmente mostram-se eretos, formando um ângulo reto
com a hifa vegetativa. As áreas conidiais apresentam-se em forma de faixas concêntricas de
coloração verde (Melo, 1991).
Trichoderma sp. é um micoparasita necrotrófico eficaz no controle de inúmeros
fungos fitopatogênicos, principalmente aqueles com estruturas de resistência consideradas
difíceis de serem atacadas por microrganismos. Sucesso maior com o uso de Trichoderma
tem sido documentado para patógenos de solo, como: Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii,
Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium sp. e Pythium sp. No entanto, diversos trabalhos têm
documentado o parasitismo de Trichoderma sp. a uma vasta gama de fungos fitopatogênicos
(Armillaria sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp., Venturia sp., Endothia sp.,
Phytophthora sp., Rhizopus sp., Diaporthe sp., Fusicladium sp., Botrytis sp., Poria
monticola, Stereum purpureum) (Melo, 1998).
8
Estudos indicam que a forma de ação do fungo como agente de controle
biológico está baseada na competição por nutrientes, produção de metabólitos antifúngicos,
enzimas hidrolíticas da parede celular, quitinases, proteases e glucanases, bem como
micoparasitismo (Papavizas, 1985; Melo, 1991).
As várias espécies de Trichoderma têm capacidade de produção de uma
quantidade de enzimas líticas, como por exemplo, celulases, hemicelulases, glucanases, tanto
extra quanto intracelularmente, conferindo-lhes uma excelente capacidade de degradação de
celulose e, conseqüentemente, a degradação de paredes celulares de fungos, tornando-o um
potencial competidor. Em solos com grande presença de compostos à base de celulose há um
favorecimento ao aumento da densidade populacional de Trichoderma sp. (Melo, 1991;
Melo, 1996; Melo, 1998).
No micoparasitismo, o hospedeiro, no caso o patógeno, pode ser mantido vivo,
micoparasita biotrófico, ou ser morto, micoparasita necrotrófico. Esta interação pode ser
dividida em quatro fases: localização, reconhecimento, contato e penetração. A localização
provavelmente deve-se aos estímulos químicos liberados pelo patógeno, que são detectados
pelo antagonista. A partir disso, há um reconhecimento do patógeno pelo antagonista,
seguido pelo contato através de enrolamento da hifa do antagonista em torno da hifa do
patógeno. Posteriormente ocorre a penetração, pela formação de apressórios e pela ação de
enzimas que degradam a parede celular (Melo, 1996).
Outro mecanismo de ação de Trichoderma sp. é a capacidade de certos isolados
promoverem o crescimento de plantas e aumentarem a germinação e emergência de
sementes (Melo, 1998). A promoção de crescimento pode ser induzida de diversas formas
por fungos e bactérias: por produção de hormônios vegetais, por produção de vitaminas ou
conversão de materiais a uma forma útil para a planta, por absorção e translocação de
minerais e por controle de patógenos. A aplicação de Trichoderma sp. tem levado a
9
aumentos significativos na porcentagem e na precocidade de germinação, no peso seco e na
altura de plantas (Melo, 1996).
Sivan e Chet (1993) usaram Trichoderma harzianum em combinação com solo
esterilizado e reduziram as taxas de fumigação com brometo de metila além de obter um
controle significativo em murcha de tomate em plântulas colonizadas com o antagonista em
casa de vegetação e transplantadas para o campo.
O trabalho realizado por Reis et al. (1995) teve objetivo de selecionar isolados de
Trichoderma sp. para o controle de F. oxysporum f.sp. phaseoli. Os pesquisadores avaliaram
o potencial de 41 isolados de Trichoderma sp., aplicados na forma de pó biológico em solo
natural, para o controle da murcha do feijoeiro. Como resultado três isolados de Trichoderma
sp. (TN-31, TN63, TN-10) apresentaram redução de até 55% da severidade da doença,
mostrando-se mais eficientes do que o benomyl no tratamento de sementes. Os isolados TN-
28, TN-59 E TN-15 apresentaram maior nível de antagonismo pelo teste de pareamento.
Após a realização dos experimentos, procedeu-se a identificação dos isolados mais
promissores para o biocontrole, sendo TN-63 identificado como T. viride e TN-31 como T.
aureoviride.
Nemec et al. (1996) avaliaram alguns agentes de biocontrole, entre eles,
Trichoderma harzianum, para o controle de Fusarium oxysporum em vegetais. No final da
pesquisa eles concluíram que todos os agentes de biocontrole reduziram a murcha causada
por F. oxysporum em tomateiro e que T. harzianum foi o agente de biocontrole mais
efetivos, reduzindo 12% da severidade da doença.
Carver et al. (1996) isolaram T. aureoviride como endofítico em cravos sadios e
testaram seu potencial antagonista contra Fusarium oxysporum f. sp. dianthi em estufas de
crescimento para o cultivo de cravos (Dianthus caryophillus) no sudoeste da Inglaterra.
Geralmente elevadas temperaturas, como as do interior de estufas de crescimento, reduzem a
10
capacidade antagonista dos microrganismos tanto in vitro quanto in vivo. Porém, o fungo
Trichoderma aureoviride tem seu máximo potencial de antagonismo alcançado a 28°C, o
que o torna um excelente microrganismo para ser utilizado no controle biológico em plantas
cultivadas em estufas e casas de vegetação. T. aureoviride também demonstrou tolerância
aos pesticidas utilizados na produção comercial de cravos. Indicando, assim, que é um
microrganismo que pode ser usado em programas de manejo integrado.
No trabalho realizado por Larkin & Fravel (1998) isolados de Trichoderma sp.
foram coletados de raízes e da rizosfera de plantas de tomate. O objetivo da pesquisa foi
testar a eficácia do antagonista no controle de murcha de Fusarium. Plântulas de tomate
foram tratadas com o agente de biocontrole em casa de vegetação e transferidas para o
campo onde o solo estava infestado com o fitopatógeno. Um produto comercial à base de
Trichoderma sp. (RootShield) também foi testado. O isolado de T. hamatum foi o mais
efetivo no controle da doença, com redução de 30 a 65%. O produto comercial foi efetivo
somente quando incorporado com taxa de 0,2% ou mais.
Thavengalu et al. (2004) isolaram Trichoderma sp. da rizosfera de bananeira de
diferentes áreas de Tamil Nadu, Índia, e avaliaram in vitro seu potencial antagonista contra
Fusarium oxysporum, patógeno da banana. O isolado Th-10 de T. harzianum foi o mais
eficiente na inibição do crescimento micelial de Fusarium in vitro. Dois experimentos de
campo foram realizados. A aplicação de Th-10 formulado como pó seco controlou
efetivamente o fitopatógeno Fusarium oxysporum com uma eficácia comparada a do
fungicida carbendazim.
No trabalho realizado por Wang et al. (2005), isolados de Trichoderma sp. e
fungicidas foram testados no controle de Fusarium spp. em plântulas de equináceas
(Echinacea spp.). Vinte isolados de Trichoderma sp. demonstraram atividade antagonista
para Fusarium sp. em meio de cultura, com taxas de inibição de 44 a 65%. Alguns isolados
11
reduziram significativamente a incidência e a severidade da doença em plântulas em
experimentos de casa de vegetação. Dois isolados de Trichoderma sp. T1 e T13 foram
aplicados sozinhos e em combinação com uma baixa concentração do princípio ativo
fludioxonil em avaliações em casa de vegetação. Os resultados sugeriram que fludioxonil e
Trichoderma sp. podem ser utilizados em combinação para um controle de manejo integrado
da doença em equináceas.
Outros trabalhos também foram realizados como, por exemplo, o de Kredics et
al. (2001) que investigou os efeitos de dez metais pesados, em experimentos in vitro, na
atividade da enzimas β-glucosidase, celobihidrolase, β-xilosidade e endoxilanase produzidas
por seis isolados de Trichoderma sp., além de selecionar e caracterizar isolados mutantes
resistentes aos metais. Em uma concentração de 1mmol, somente o mercúrio mostrou
efeitos inibitórios na atividade enzimática dos isolados, in vitro. Os outros metais não
afetaram a atividade enzimática. Um total de 177 mutantes resistentes a metais foram
isolados e testados por resistência cruzada a outros metais pesados. Alguns desses mutantes
apresentaram atividade antagonista a Fusarium sp. em meio de cultura contendo os
respectivos metais. Trichoderma sp. é um agente de biocontrole efetivo contra fitopatógenos
mesmo na presença de metais pesados. Os mutantes resistentes a metais podem ser ideais
para o uso em conjunto com pesticidas que contém metais pesados em sua formulação, como
parte de um sistema de proteção integrada.
Alguns fatores ambientais podem afetar a ação antagonística de Trichoderma sp.
sobre os patógenos, dentre eles a disponibilidade de água (umidade) e nutrientes, o pH, a
temperatura e textura do solo. A importância da umidade do solo na atividade antagônica do
Trichoderma sp. é variável, conforme a espécie em questão. De modo geral, em condições
de solo bastante seco e extremamente úmido esta atividade é reduzida, tendo como
12
condições mais adequadas solos ligeiramente úmidos a úmidos (Liu & Baker, 1980; Melo
1996).
Os níveis de pH também influenciam o parasitismo de Trichoderma sp. Em geral
este fungo é favorecido por valores mais baixos, ou seja, pH ácido (Chet & Baker, 1980;
Papavizas, 1985). Chet & Baker (1981) verificaram incremento da supressividade às doenças
do solo com pH de 5,1, quando comparado com pH em torno de 8,0, isso conseqüência de
um favorecimento do desenvolvimento de Trichoderma sp., além de outros fungos.
Outro fator que pode influenciar na atividade antagonista de Trichoderma sp. é a
temperatura, no entanto, há diferenças entre as espécies. Harman et al. (1980) verificaram
que Trichoderma sp. foi eficiente contra Rhizoctonia solani entre temperaturas de 17 a 30°C.
A rizosfera ou zona próxima das raízes das plantas no solo é uma área com
atividades biológicas bastante ativas, com efeitos diretos importantes sobre as plantas como,
por exemplo, sobre a nutrição das mesmas (Salgado et al., 1999). Na rizosfera encontram-se
microrganismos que podem promover o crescimento vegetal, e proteger o sistema radicular
da infecção por patógenos, estando incluído nesse grupo o fungo Trichoderma sp. Assim, o
fungo Trichoderma sp., além de apresentar potencial como biocontrolador de patógenos,
pode ter a capacidade de promover o crescimento vegetal e mostrar competência rizosférica
(Melo, 1996).
1.4 Controle Químico
O controle químico de doenças de plantas é, em muitos casos, a única medida
eficiente e economicamente viável de garantir as altas produtividade e qualidade de
produção, visadas pela agricultura moderna (Kimati, 1995). Os defensivos agrícolas fazem
parte do conjunto de tecnologias associadas ao processo de modernização da agricultura, que
ocorreu a partir da década de 60. Com o uso generalizado dos defensivos agrícolas nas mais
13
diferentes condições ambientais, muitos problemas começaram a ser percebidos e
diagnosticados, tais como a ocorrência de resíduos em alimentos, a contaminação de solos e
águas, o efeito em organismos não visados e a intoxicação de trabalhadores rurais. Com a
crescente conscientização sobre o risco do uso desses produtos, houve significativos avanços
nas legislações de registro e uso desses químicos em muitos países. Com isso, há uma
tendência de se substituir os defensivos agrícolas mais problemáticos em termos ambientais
e de saúde humana por produtos químicos mais específicos e que sejam mais seguros
(Campagnola & Bettiol, 2003).
O controle químico de doenças de plantas é feito através de vários tipos de
produtos, comumente denominados agroquímicos, incluindo fertilizantes e pesticidas. O
grupo mais importante de pesticidas utilizados para o controle de doenças de plantas é o dos
fungicidas (Kimati, 1995). O uso de fungicidas representa um dos principais métodos de
controle de doenças de plantas. A facilidade de aplicação e os resultados imediatos obtidos
os tornaram amplamente difundidos em diversas culturas. Porém, o uso contínuo pode
promover a seleção de fungos fitopatogênicos resistentes, não controlados pelo fungicida
anteriormente eficaz, colocando em risco a eficiência do método (Ghini & Kimati, 2002). Os
fungicidas constituem um grupo com propriedades químicas e biológicas muito variáveis,
podendo envolver vários princípios de controle em função da natureza do produto, da época
e metodologia de aplicação e do estádio de desenvolvimento epidemiológico da doença
(Kimati, 1995).
O controle químico de doenças fúngicas visa tanto a erradicação ou diminuição
do inóculo associado às sementes, mediante o tratamento das mesmas, como a proteção das
plantas através de pulverizações foliares (Rava & Sartorato, 1996).
O tratamento de sementes, com o objetivo de controlar seus patógenos e dar
proteção contra os do solo, é considerado como um dos métodos de baixo custo. É de fácil
14
aplicação, além de ser pouco poluente; causa menor impacto no ambiente, se comparado
com pulverizações de parte aérea.
O tratamento de sementes traz como benefícios a manutenção ou melhoria da
qualidade sanitária da semente, evita a disseminação ou introdução de patógenos como fonte
de inóculo primário e pode proporcionar bom estande inicial na cultura do feijoeiro (Ito et
al.,2003).
Batista et al. (2002) executaram testes de fungitoxicidade in vitro contra dois
isolados de Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae, com o objetivo de selecionar fungicidas
para o controle desta doença. Os fungicidas e as doses utilizadas foram: benomil (0,5 g i.a. L
-
1
); tiofanato metílico (1,4 g i.a. L
-1
); procloraz (0,675 g i.a. L
-1
) e carbendazim (0,5 g i.a. L
-1
).
Os fungicidas procloraz, benomil e carbendazim apresentaram níveis elevados de redução do
crescimento micelial e esporulação dos isolados do fitopatógeno, enquanto tiofanato metílico
não apresentou efeito satisfatório.
Reid et al. (2002) testaram o fungicidas benomil e fludioxonil em experimentos
em casa de vegetação contra F. oxysporum f.sp. asparagi. Os resultados mostraram que o
fungicida fludioxonil limitou a morte das plantas mesmo em níveis elevados de inóculo.
No trabalho realizado por Nel et al. (2007), fungicidas foram avaliados in vitro e
in vivo quanto a sua eficácia contra o patógeno F. oxysporum f.sp. cubense. Os fungicidas
procloraz e propiconazole, em concentrações de 1 e 5µg ml
-1
,
inibiram significativamente o
crescimento micelial do patógeno. Já benomil mostrou redução de 80,6% na severidade da
doença causada por F. oxysporum f.sp. cubense.
A partir do ano de 1950 passou-se a explorar a idéia de integração do controle
químico com o biológico, com o objetivo de resolver-se o conflito entre o uso de inseticidas
e a ação dos inimigos naturais (Conceição, 2000).
15
1.5 Controle Biológico
O controle biológico visa o controle de pragas e doenças com menor impacto
ambiental e com menor risco para o homem, bem como a redução de custos em relação ao
emprego de métodos químicos tradicionais (Moraes, 1992).
O controle biológico de fitopatógenos pode ser alcançado através de práticas de
manejo para favorecer antagonistas nativos e também através da introdução de
microrganismos selecionados. O sucesso do biocontrole, no entanto, depende da natureza
das propriedades antagonistas e mecanismos de ação do hiperparasita (Melo, 1998).
No trabalho realizado por Moino & Alves (1999) foram feitos confrontos in
vitro, entre o fungo Trichoderma sp. e os fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e
Metarhizium anisopliae. Os isolados de B. bassiana (isolado 634) e M. anisopliae (isolado
E-9) foram inoculados em meio BDA, com intervalos de 0, 48, 120 e 168 horas entre a
inoculação de Trichoderma sp. e dos entomopatógenos. Foi avaliado o crescimento radial
das colônias nos períodos de 48 e 120 horas após a inoculação de Trichoderma sp., sendo
que este afetou o desenvolvimento dos entomopatógenos quando inoculado simultaneamente
ou após 48 horas.
Lobo Jr. & Abreu (2000) avaliaram a inibição do crescimento micelial do
isolado “S1” de Sclerotinia sclerotiorum, obtido de plantas de feijoeiro, por meio da
produção de metabólitos voláteis produzidos por isolados de Trichoderma viride, T.
aureoviride, T. koningii e T. pseudokoningii. Os resultados mostraram que todos os
isolados produziram metabólitos voláteis que inibiram o desenvolvimento do patógeno.
No trabalho de Rojo et al. (2007) foram avaliadas espécies de Trichoderma
como potenciais agentes de biocontrole para reduzir a podridão causada por Fusarium
solani em plantações de amendoim na Argentina. Foram selecionados dois isolados, um
de T. harzianum e outro de T. longibrachiatum para experimentos de campo. Cada
16
tratamento consistiu de sementes tratadas com cada um dos isolados. Os resultados
mostraram que T. harzianum foi mais efetivo que T. longibrachiatum em diminuir a
severidade da doença e aumentar a freqüência de plantas saudáveis.
Os mecanismos das interações entre microrganismos patogênicos e antagônicos
podem ser divididos em antibiose, competição, parasitismo, hipovirulência, predação e
indução de defesa do hospedeiro. Uma característica adequada para um antagonista é
apresentar mais de um mecanismo, pois as chances de sucesso do controle biológico serão
aumentadas (Bettiol & Ghini, 1995).
Um agente de biocontrole ideal seria aquele que colonizasse e fosse
competitivo no microambiente; rizosfera, filosfera, rizoplano e espermosfera (Melo, 1998).
Dentre os muitos agentes potenciais de biocontrole, o fungo Trichoderma sp. tem sido um
dos mais estudados, dado as suas características peculiares de antagonismo em condições
naturais, principalmente no solo (Melo, 1991).
1.6 Manejo integrado
Na agricultura moderna, qualquer medida de controle a ser adotada nunca
deverá ser recomendada isoladamente, e sempre terão que ser levados em consideração os
aspectos econômicos, ecológicos e sociológicos. O Manejo Integrado é, portanto um
sistema de apoio à tomada de decisões para seleção e uso de táticas de controle de doenças,
pragas e plantas daninhas, harmonicamente coordenadas em estratégias de manejo,
baseados em análises de custo e benefício, que levam em consideração os interesses dos
produtores, da sociedade e do meio ambiente (Zambolim, 2000).
O manejo integrado consiste na implementação de métodos de controle que
utilizem, harmonicamente, os processos químicos, físicos, biológicos e os métodos
17
culturais, de forma planejada. Resulta em benefício da produtividade, proteção ambiental,
segurança do consumidor e das pessoas envolvidas (Conceição, 2000).
Na prática, o manejo integrado envolve três ações principais (Geier, 1966): (i)
determinar como o ciclo vital de um patógeno precisa ser modificado de modo a mantê-lo
em níveis toleráveis, ou seja, abaixo do limiar de dano econômico; (ii) combinar o
conhecimento biológico com a tecnologia disponível para alcançar a modificação
necessária, ou seja, exercer a ecologia aplicada; (iii) desenvolver métodos de controle
adaptados às tecnologias disponíveis e compatíveis com aspectos econômicos e ecológico-
ambientais, ou seja, conseguir aceitação econômica e social (Bergamin Filho & Amorim,
1996).
A classe agronômica tem apoiado o Método Integrado de Cultivo, em que são
levados em conta todos os fatores que podem proporcionar à planta a capacidade máxima
de produção, permitindo que esta aproveite eficazmente o seu potencial produtivo. O
controle químico é, então, apenas uma das medidas da Agricultura Integrada. A prática do
Manejo Integrado, em defesa fitossanitária, permite que sejam aplicados produtos e
métodos de acordo com as necessidades sentidas por produtores e consumidores de
alimentos (Conceição, 2000).
Pereira et al. (1996) avaliaram o efeito de vermicomposto, solarização,
herbicida (EPTC), fungicida (procimidone), Trichoderma harzianum e Bacillus turingensis
no controle de Sclerotinia sclerotiorum. Os resultados obtidos mostraram que a
solarização, isoladamente, constitui-se em excelente estratégia de controle, e que, mesmo
na ausência de solarização, a incorporação de T. harzianum ao vermicomposto, após a
aplicação de herbicida EPTC, propiciou ganhos significativos em nível de controle,
independente da profundidade de incorporação dos escleródios de S. sclerotiorum.
Concluíram que a utilização de T. harzianum, em presença de vermicomposto associado ao
18
herbicida EPTC, apresenta-se como estratégia promissora para o controle de S.
sclerotiorum.
Silva et al. (1999) avaliaram a sensibilidade de isolados de Trichoderma sp.
aos fungicidas benomil e iprodione. Os resultados mostraram que, os dois fungicidas,
presentes em meio de cultura, exerceram efeito negativo sobre o crescimento micelial dos
isolados de T. harzianum e T. viride.
May & Kimati (2000) verificaram que os ingredientes ativos metalaxyl,
carboxin / thiram, chlorothalonil, captan, propamocarb e hymexazol não interferiram no
desenvolvimento in vitro de cinco isolados de Trichoderma sp. sendo, então, produtos com
potencial para serem recomendados em manejo integrado.
No trabalho realizado por Medeiros et al. (2006) foram avaliados os efeitos do
composto sintético Tiazolidina-2,4-diona sobre o desenvolvimento in vitro de um isolado
de Trichoderma sp. Nenhuma das concentrações utilizadas influenciou no
desenvolvimento micelial de Trichoderma sp., demonstrando o potencial de utilização
desta molécula como uma forma complementar de controle de Monosporascus
cannonballus , junto com Trichoderma sp.
Para o desenvolvimento de uma tecnologia que possibilite a combinação de
diferentes métodos de controle, é importante a realização de estudos sobre seus efeitos
associados. No caso do controle biológico, é de fundamental importância a avaliação dos
efeitos sobre o agente de biocontrole, dos diversos produtos químicos que são comumente
utilizados na cultura. Esses estudos têm a finalidade de determinar a compatibilidade entre
esses produtos e o agente de biocontrole e, se possível, estabelecer as concentrações
adequadas para cada caso (Mello et al., 2003).
CAPÍTULO II
2 COMPATIBILIDADE DE ISOLADOS DE Trichoderma sp.
COM DIFERENTES FUNGICIDAS in vitro
2.1 Introdução
Existem, atualmente, no mercado inúmeras substâncias químicas empregadas no
controle de pragas e doenças, sendo os fungicidas um grupo numeroso e destacado. Entretanto,
as conseqüências da sua utilização não são unicamente positivas, muitos destes compostos
químicos são tóxicos ao homem e animais e, também do ponto de vista ambiental, acarretam
diminuição do potencial de controle biológico (Loureiro et al., 2002).
O manejo integrado, com a utilização de produtos fitossanitários seletivos em
conjunto com fungos antagonistas, pode ser uma estratégia mais segura e eficiente. Entretanto
alguns produtos fitossanitários podem afetar o crescimento vegetativo e a conidiogênese dos
fungos antagonistas, ou até alterar sua composição genética (Alves et al., 1998).
A maioria dos relatos sobre o uso de antagonistas para o controle de doenças
induzidas por fungos fitopatogênicos apresenta o Trichoderma sp. como um dos mais
promissores entre os agentes de biocontrole (Cassiolato et al., 1996). No entanto, poucos
trabalhos têm sido realizados a propósito de avaliar compatibilidade entre fungicidas e agentes
20
de biocontrole, visando seu uso conjunto no manejo integrado de doenças (Cassiolato et al.,
1996; Silva, 1997).
A seleção de biótipos estáveis para serem utilizados em combinação com
fungicidas é uma opção para se obter um esquema de controle efetivo no manejo integrado de
um ou mais fitopatógenos (Papavizas, 1985).
Assim, o objetivo deste trabalho foi testar a sensibilidade, in vitro, de isolados de
Trichoderma sp. aos fungicidas.
2.2 Material e Métodos
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Microbiologia Fitopatológica
na Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
2.2.1 Experimentos em laboratório
Para os testes in vitro foram utilizados os seguintes fungicidas aplicados em
plantas de feijão.
Nome comercial: Cabrio Top
Nome químico
: methyl N-(2-{[1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-3-yl]oxymethyl}phenyl)
N-methoxy carbamate + Zinc ammoniate ethylenebis(dithiocarbamate)–
poly(ethylenethiuram disulfide)
Ingrediente ativo: pyraclostrobin + metiram
Classe: fungicida
Formulação: granulado dispersível
Concentração: (50g de pyraclostrobin + 550g de metiram) / kg
Classe toxicológica: III – medianamente tóxico
Dose recomendada: 1,5 kg / 200 a 300 L de água
21
Nome comercial: Captan SC
Nome químico: N-(trichloromethylthio)
Ingrediente ativo: captana
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada
Concentração: 480g de captana / L
Classe toxicológica: I – Extremamente tóxico
Dose recomendada: 400 mL / 100L
Nome comercial: Comet
Nome químico: methyl N-(2-{[1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-3-yl]oxymethyl}phenyl)
N-methoxy carbamate
Ingrediente ativo: pyraclostrobin
Classe: fungicida
Formulação: concentrado emulsionável
Concentração: 250g de pyraclostrobin / L
Classe toxicológica: II – altamente tóxico
Dose recomendada: 0,3 L / 200 a 300 L
Nome químico: Derosal 500
Nome químico: Methyl benzimidazol-2-ylcarbamate
Ingrediente ativo: carbendazim
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada
Concentração: 500g de carbendazim / L
Classe toxicológica: III – medianamente tóxico
Dose recomendada: 0,5L / 300 a 600 L
Nome comercial: Derosal Plus
Nome químico:
methyl benzimidazol-2-ylcarbamato + tetramethylthiuram dissulfide
Ingrediente ativo: carbendazim + thiram
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada para tratamento de sementes
Concentração: (150g de carbendazim + 350g de tiram) / L
Classe toxicológica: III – medianamente tóxico
Dose recomendada: 300 mL / 100 kg de sementes
Nome comercial: Frowncide 500 SC
Nome químico:
3-cloro-N-(-3-cloro-5-trifluorometil-2-piridil)-a,a,a-trifluoro-2,6-dinitro-
p-toluidina
Ingrediente ativo: fluazinam
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada
Concentração: 500g de fluazinam / L
Classe toxicológica: II – altamente tóxico
Dose recomendada: 1,0 a 1,5 L / 1000 a 1500 L
22
Nome comercial: Nativo
Nome químico: methyl (E)-methoxyimino-{(E)-α-[1-(α,α,α-trifluoro-m-
tolyl)ethylideneaminooxy]-=o-tolyl}acetate + (RS)-1-p-chlorophenyl-4,4-dimethyl-3-(1H-
1,2,4-triazol-1-ylmethyl)pentan-3-ol
Ingrediente ativo: trifloxistrobina + tebuconazole
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada
Concentração: (100g de trifloxistrobina + 200g de tebuconazole) / L
Classe toxicológica: III – medianamente tóxico
Dose recomendada: 0,6 L / 300L
Nome comercial: Ópera
Nome químico:
(2RS, 3SR)-1-[3-(2-chlorophenyl)-2,3-epoxy-2-(4-fluorophenyl) propyl]-
1H-1,2,4-triazole + methyl N-(2-{[1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-3-
yl]oxymethyl}phenyl) N-methoxy carbamate
Ingrediente ativo: epoxiconazole + pyraclostrobin
Classe: fungicida
Formulação: emulsão
Concentração: (50g de epoxiconazole + 133g de pyraclostrobin) / L
Classe toxicológica: II – altamente tóxico
Dose recomendada: 0,75L / 300L
Nome comercial: Stratego
Nome químico: Methyl (E)-methoxyimino-{(E)-α-[1-(α,α,α,-trifluoro-m-tolyl)
ethylideneaminooxy]-=o-tolyl}acetate + (RS)-1-[2-(2,4-dichlorophenyl)-4-propyl-1,3-
dioxolan-2-yl]methyl]-1H-1,2,4-triazole
Ingrediente ativo: trifloxistrobina + propiconazol
Classe: fungicida
Formulação: concentrado emulsionável
Concentração: (125g de trifloxistrobina + 125g de propiconazol) / L
Classe toxicológica: II – Altamente tóxico
Dose recomendada: 0,6 L / 200 a 300L
Nome comercial: Vitavax – Thiram 200 SC
Nome químico: 5,6-dihydro-2-methyl-1,4-oxathi-ine-3-carboxanilin+ tetramethylthiuram
disulfide
Ingrediente ativo: carboxina + tiram
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada para tratamento de sementes
Concentração: (200g de carboxina + 200g de thiram) / L
Classe toxicológica: IV – Pouco tóxico
Dose recomendada: 250 a 300 mL / 100 kg de sementes
23
2.2.1.1 Obtenção dos isolados de Trichoderma sp.
Foram utilizados 7 isolados de Trichoderma sp. denominados T1R, T2R, T4R,
T6R, T7R, TSV e PCT.
Os isolados de Trichoderma sp. foram obtidos a partir de amostras de solo
coletadas de lavouras de feijão irrigado, localizadas na cidade de Cristalina, GO. Das
amostras de solo, devidamente identificadas, foram retiradas alíquotas de 10 g e
homogeneizadas com 90 mL de água destilada esterilizada. A partir desta suspensão, foram
realizadas diluições sucessivas até 10
-3
. Da última diluição, foi inoculado 0,1 mL, em placa de
Petri com BDA (batata 200 g, dextrose 20 g, ágar 15 g) acidificado com ácido lático (3 gotas /
100 mL) Foram utilizadas cinco placas por isolado de Trichoderma sp. O inóculo foi
espalhado com alça de Drigalsky. As placas foram incubadas a 23 ± 1ºC e fotoperíodo de 12
horas. Após 5 dias foi feita a repicagem para obtenção de culturas axênicas.
As amostras foram identificadas conforme o pivô e a fazenda em que foram
coletadas e os isolados obtidos foram denominados conforme esta identificação (T:
Trichoderma sp.; 1: pivô central n°1; R: identificação da fazenda). O isolado TSV foi obtido
de uma área não cultivada e sem aplicação de produtos químicos (T: Trichoderma sp.; SV:
selvagem). Foi utilizado também, um produto comercial formulado à base de isolados de
Trichoderma sp. veiculados em arroz. Este foi denominado PCT (produto comercial
Trichoderma sp.).
24
2.2.1.2 Interferência in vitro de fungicidas no crescimento de isolados de
Trichoderma sp.
O efeito de fungicidas sobre os isolados de Trichoderma sp. (T1R; T2R; T4R;
T6R; T7R; TSV e PCT) foi avaliado pelo crescimento dos isolados do antagonista na presença
dos mesmos. Primeiramente, a adição dos produtos foi feita no meio de cultura batata-
dextrose-ágar (BDA) acidificado com ácido lático (3 gotas / 100mL), depois de autoclavado e
ainda líquido (40ºC), de modo que a concentração final do produto foi estabelecida
considerando o volume de meio utilizado. Foram utilizados quatro tratamentos, sendo, três
concentrações para cada fungicida ( a dose recomendada pelo fabricante (Tabela 1), a metade
e o dobro desta dose), mais a Testemunha, constituída apenas de BDA. Em seguida, o meio de
cultura foi vertido em placas de Petri e foram preparadas quatro placas por tratamento.A
inoculação dos isolados de Trichoderma sp. foi feita com discos de colônias de 0,6 cm de
diâmetro, no centro da placa. As placas foram incubadas em câmara de crescimento, com
temperatura de 23 ± 1ºC e fotoperíodo de 14 horas. A avaliação foi feita, após 7 dias,
medindo-se o diâmetro das colônias. Os dados obtidos foram submetidos à análise de
variância e teste de Tukey (P<0,05) para comparação das médias.
TABELA 1. Doses utilizadas para cada fungicida
Fungicida (nome comercial) Dose utilizada no experimento
Cabrio Top 1,5 kg / 300 L de água*
Captan SC 400 mL / 100L
Comet 0,3 L / 300 L
Derosal 500 0,5L / 300 L
Derosal Plus 300 mL / 100 kg de sementes
Frowncide 500 SC 1,0 L / 1000 L
Nativo 0,6 L / 300L
Opera 0,75L / 300L
Stratego 0,6 L / 300L
Vitavax-Thiram 200 SC 300 mL / 100 kg de sementes
* Dose recomendada pelo fabricante
25
O segundo teste foi feito mergulhando-se discos de 0,6 cm de diâmetro de papel
filtro em soluções de fungicida com água destilada estéril. As concentrações utilizadas foram
as mesmas citadas no teste anterior. Os discos de papel filtro foram embebidos na solução e
colocados em um lado das placas de Petri, do lado oposto foi colocado um disco de BDA
contendo colônia dos isolados de Trichoderma sp. (Figura 1). Para cada tratamento foram
feitas quatro repetições. A Testemunha consistiu somente nos isolados de Trichoderma sp. Os
tratamentos foram mantidos em câmara de crescimento, com temperatura de 23 ± 1ºC e
fotoperíodo de 14 horas. No sétimo dia foi medido o halo de inibição formado em torno do
disco de papel filtro. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e teste de
Tukey (P<0,05) para comparação das médias.
A B
FIGURA 1. Experimento in vitro. Placa de Petri contendo meio de cultura BDA; de um lado
da placa se encontra um disco de papel filtro de 0,6 cm de diâmetro, embebido
com solução fungicida (A). Do lado oposto está um disco de 0,6 cm de diâmetro
contendo colônia do fungo Trichoderma sp.(B).
26
2.3 Resultados e Discussão
O interesse em estudar a compatibilidade de isolados de Trichoderma sp. à
fungicidas está na utilização deste antagonista no controle integrado de fitopatógenos. Isolados
compatíveis podem ser usados em conjunto com fungicidas para tratamento de sementes,
pulverizações foliares ou aplicações no solo.
2.3.1 Interferência in vitro de fungicidas no crescimento de Trichoderma sp.
Estudos in vitro têm a vantagem de expor ao máximo o microrganismo à ação do
produto químico, fato que não ocorre em condições de campo, onde vários fatores servem de
obstáculo a essa exposição, assim, constatada a inocuidade de um produto em laboratório,
espera-se que o mesmo seja seletivo no campo. Por outro lado, a alta toxicidade de um produto
in vitro nem sempre indica a sua elevada toxicidade no campo, mas sim a possibilidade da
ocorrência de danos dessa natureza (Moino Jr. & Alves, 1999).
Os resultados dos testes são apresentados nas Tabelas 2 e 3.
27
TABELA 2: Diâmetro (cm) de colônias dos isolados de Trichoderma sp. em meio de cultura contendo fungicidas
*Médias seguidas pela m a letra, minúscula na coluna e maiúsc não diferem estatisticam entre si (TU EY 5%)esm ula na linha, ente K
Fungicidas/Doses T1R T2R T4R T6R T7R TSV PCT Testemunha
Cabrio Top
5g / L
2,5 g / L
10 g / L
4,19 dC*
5,99 bcC
3,12 eC
5,49 cB
7,44 bB
4,44 dB
8,50 aA
8,50 aA
7,60 aA
0,60 jD
0,60 jF
0,60 jE
4,54 bBC
5,49 bD
3,14 cC
7,39 aA
8,50 aA
8,50 aA
1,82 dD
1,69 eE
0,98 dD
8,50 A
8,50 A
8,50 A
Captan SC
4 mL / L
2 mL / L
8 mL / L
1,12 ghDE
1,42 gE
0,92 ghDE
1,42 ghC
1,84 fgC
1,14 dC
1,14 gD
1,32 gE
0,94 ghDE
0,90 iEF
1,24 hEF
0,79 ijEF
1,29 efCD
1,59 deD
0,99 efCD
0,84 ghF
1,14 gF
0,72 gF
2,39 fgB
3,62 deB
1,79 gB
8,50 A
8,50 A
8,50 A
Comet
1 mL / L
0,5 mL / L
2 mL / L
5,12 cB
5,38 cCD
2,09 fD
4,04 dB
6,54 bBC
3,23 eC
8,14 aA
8,50 aA
4,24 cB
2,94 efC
4,22 cD
2,41 gD
4,79 bB
5,11 bCD
2,30 cdD
2,51 eC
7,47 bAB
2,24 efD
0,60 hD
0,60 hE
0,60 hE
8,50 A
8,50 A
8,50 A
Derosal 500
0,83 mL / L
0,415 mL / L
1,66 mL /L
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 i
0,60 i
0,60 i
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 j
0,60 j
0,60 j
0,60 f
0,60 f
0,60 f
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
8,50 A
8,50 A
8,50 A
Derosal Plus
3 mL / L
1,5 mL / L
6 mL / L
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 i
0,60 i
0,60 i
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 j
0,60 j
0,60 j
0,60 f
0,60 f
0,60 f
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
8,50 A
8,50 A
8,50 A
Frowncide 500 SC
1,5 mL / L
0,75 mL / L
3 mL / L
3,34 eCD
3,69 deD
3,81 deC
2,41 fEF
2,14 fE
2,12 fD
5,59 bB
5,94 bB
5,29 bB
2,78 fgDE
3,24 deD
3,39 dC
5,12 bB
5,29 bB
4,79 bB
2, 02 fF
2,27 efE
2,17 efD
4,88 cB
4,49 cdC
3,84 deC
8,50 A
8,50 A
8,50 A
Nativo
2 mL / L
1 mL / L
4 mL / L
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 i
0,60 i
0,60 i
1,34 g
2,09 f
0,99 gh
0,60 j
0,60 j
0,60 j
0,60 f
0,60 f
0,60 f
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
8,50 A
8,50 A
8,50 A
Opera
2,5 mL / L
1, 25 mL / L
5 mL / L
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 i
0,60 i
0,60 i
3,34 de
4,11 cd
2,89 e
0,60 j
0,60 j
0,60 j
0,60 f
0,60 f
0,60 f
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
0,60 h
8,50 A
8,50 A
8,50 A
Stratego
2 mL / L
1 mL / L
4 mL / L
8,50 aA
8,50 aA
8,50 aA
8,50 aA
8,50 aA
8,50 aA
8,50 aA
8,50 aA
8,50 aA
2,44 gB
4,54 cB
2,42 gD
8,50 aA
8,50 aA
8,50 aA
2,24 efB
4,24 dC
2,54 eC
8,50 aA
8,50 aA
5,29 bcB
8,50 A
8,50 A
8,50 A
6,64 bBC
8,50 aA
0,92 ghC
6,69 bBC
8,50 aA
1,08 hC
8,50 aA
8,50 aA
1,08 ghC
5,64 bC
8,50 aA
1,49 hBC
7,24 aAB
8,50 aA
2,64 cB
6,01 cBC
8,50 aA
2,12 efB
6,36 bBC
8,50 aA
2,97 efB
Vitavax-Thiram 200SC
3 mL / L
1,5 mL / L
6 mL / L
8,50 A
8,50 A
8,50 A
Testemunha 8,50 a 8,50 a 8,50 a 8,50 a 8,50 a 8,50 a 8,50 a
28
Observa-se, na Tabela 2 que os isolados T1R, T2R e T7R não apresentaram
nenhuma alteração em seu desenvolvimento quando inoculados em meio de cultura
adicionados com as diferentes doses do fungicida Stratego e na presença da meia dose do
fungicida Vitavax-Thiram 200 SC. Os fungicidas Derosal 500, Derosal Plus, Nativo e Opera
inibiram completamente o desenvolvimento destes isolados em quaisquer umas das doses
testadas. Na presença dos fungicidas Cabrio Top, Captan SC, Comet e Frowncide 500 SC os
isolados T1R, T2R e T7R apresentaram desenvolvimento, porém, diferiram estatisticamente da
Testemunha.
O desenvolvimento do isolado T4R não diferiu estatisticamente da Testemunha
quando inoculado em meio de cultura contendo quaisquer doses dos fungicidas Cabrio Top e
Stratego e na dose recomendada e meia dose dos fungicidas Comet e Vitavax-Thiram 200 SC.
Na presença dos fungicidas Captan SC, Frowncide 500 SC, Nativo e Opera o isolado se
desenvolveu, porém, diferiu estatisticamente da Testemunha. Os fungicidas Derosal 500 e
Derosal Plus inibiram completamente o desenvolvimento do isolado T4R.
O isolado T6R não diferiu estatisticamente da Testemunha somente na presença da
meia dose do fungicida Vitavax-Thiram 200 SC. Na presença dos fungicidas Cabrio Top,
Derosal 500, Derosal Plus, Nativo e Opera o isolado não apresentou qualquer
desenvolvimento. O isolado apresentou desenvolvimento na presença dos fungicidas Captan
SC, Comet, Frowncide 500 SC e Stratego, porém diferindo estatisticamente da Testemunha.
Na presença do fungicida Cabrio Top e na presença da metade da dose do
fungicida Vitavax-Thiram 200 SC (Figura 2) o desenvolvimento do isolado TSV não diferiu
estatisticamente da Testemunha. Não houve crescimento do isolado quando inoculado na
presença dos fungicidas Derosal 500, Derosal Plus, Nativo e Opera. Com os fungicidas Captan
29
SC, Comet, Frowncide 500 SC e Stratego, TSV apresentou desenvolvimento, porém, diferiu
estatisticamente da Testemunha.
Testemunha Meia dose
TSV
–
VITAVA
X
-THIRAM 200 SC
Dose recomendada
Dobro da dose
FIGURA 2. Desenvolvimento in vitro do isolado TSV na presença da dose recomenda, meia
dose e dobro da dose do fungicida Vitavax-Thiram 200 SC em maio de cultura
BDA.
O produto comercial PCT não diferiu estatisticamente da Testemunha na presença
da dose recomendada e meia dose do fungicida Stratego e na presença da meia dose Vitavax-
Thiram 200 SC. O isolado não se desenvolveu na presença dos fungicidas Comet, Derosal 500
(Figura 3), Derosal Plus, Nativo e Opera. Na presença dos fungicidas Cabrio Top, Captan SC e
Frowncide 500 SC o isolado PCT apresentou crescimento, porém diferiu estatisticamente da
Testemunha.
30
Dose recomendada Dobro da dose
PCT – DEROSAL 500
Meia dose Testemunha
FIGURA 3. Desenvolvimento in vitro do isolado PCT na presença da dose recomenda, meia
dose e dobro da dose do fungicida Derosal 500 em meio de cultura BDA.
Os fungicidas que Derosal 500, Derosal Plus, se mostraram tóxicos para todos os
isolados testados, inibindo completamente seus desenvolvimentos. Ambos os produtos
apresentam a substância carbendazim em suas formulações. Os fungicidas Nativo e Opera
também foram tóxicos aos isolados com exceção do isolado T4R que apresentou
desenvolvimento significativamente menor do que a Testemunha.
O grupo das estrobilurinas é desenvolvido a partir de compostos naturais
produzidos por cogumelos, e atua na inibição da respiração mitocondrial de fungos, impedindo
a transferência de elétrons entre o citocromo b e o citocromo c (Barlett et al, 2002). Nota-se
que os produtos Cabrio Top, Comet, Nativo, opera e Stratego, apesar de pertencerem ao grupo
das estrobilurinas, revelaram diferenças significativas entre eles.
31
O fungicida Frowncide 500 SC, que tem como princípio ativo a substância
fluazinam, não inibiu completamente o desenvolvimento dos isolados de Trichoderma sp.,
porém inibiu a esporulação do antagonista (Figuras 4 e 5). O trabalho realizado por May &
Kimati (2000) mostra que o princípio ativo fluazinam, quando misturado ao meio de cultura
BDA, interferiu no desenvolvimento de cinco isolados de Trichoderma sp., porém não
menciona se esta substância teve alguma ação antiesporulante sobre os isolados.
A B C D
T1R
A B C D
T2R
PCT
A B C D
1
FIGURA 4. Micélio dos isolados de Trichoderma sp. na presença da dose recomendada do
fungicida Frowncide 500 SC em BDA (1). Isolados PCT, T1R e T2R em:
Testemunha (A), dose recomendada de Frowncide 500 SC (B), meia dose de
Frowncide 500 SC (C), dobro da dose de Frowncide 500 SC (D).
32
FIGURA 5. Isolados T4R, T6R, T7R e TSV em: Testemunha (A), dose recomendada de
Frowncide 500 SC (B), meia dose de Frowncide 500 SC (C), dobro da dose de
Frowncide 500 SC (D).
T7R
A B C D
A B C D
T4R
A B C D
T6R
A B C D
TSV
33
TABELA 3: Halo de inibição (cm) de colônias de Trichoderma sp. em meio de cultura contendo discos de papel filtro impregnados com fungicida
*Médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem estatisticamente entre si (TUKEY 5%).
Funcicidas / Doses T1R T2R T4R T6R T7R TSV PCT Testemunha
Cabrio Top
5g / L
2,5 g / L
10 g / L
0,25 fB*
0,00 fB
0,17 fAB
0,02 fB
0,00 fB
0,62 abcdefAB
0,00 dB
0,00 dB
0,00 dB
0,01 f
*
B
0,30 fB
1,80 abcdefA
0,00 fB
0,00 fB
0,35 defAB
0,00 eB
0,00 eB
0,82 bAB
0,93 defghA
0,92 defghA
0,95 defghAB
0,00 B
0,00 B
0,00 B
Captan SC
4 mL / L
2 mL / L
8 mL / L
0,00 fB
0,00 fA
0,61 cdefAB
0,00 fB
0,00 fA
0,02 fB
0,00 dB
0,00 dA
0,48 bcdAB
1,44 abcdefA
0,83 bcdefA
2,02 abcdeA
0,09 efB
0,04 fA
0,20 efB
0,00 eB
0,00 eA
0,00 eB
0,00 hB
0,00 hA
0,00 hB
0,00 B
0,00 A
0,00 B
Comet
1 mL / L
0,5 mL / L
2 mL / L
0,72 cdefAB
0,29 efBC
1,59 abcdA
0,14 defB
0,00 fC
0,32 cdefBC
0,00 dB
0,00 dC
0,00 dC
0,59 cdefB
0,41 defB
1,32 abcdefA
0,09 efB
0,12 efC
0,39 defBC
0,09 deB
0,09 deBC
0,14 cdeC
1,26 abcdefA
0,20 fghBC
1,21 abcdefA
0,00 B
0,00 C
0,00 C
Derosal 500
0,83 mL / L
0,415 mL / L
1,66 mL /L
1,62 abcdAB
0,97 bcdefABC
2,02 abA
1,72 aAB
0,48 bcdefBC
1,68 aBC
1,64 aAB
0,00 dC
1,54 aBC
1,26 abcdefB
1,74 abcdefAB
2,84 abA
1,32 abcdAB
0,51 cdefBC
2,22 aAB
2,10 aA
2,12 aA
2,32 aAB
2,33 abA
2,31 abcA
2,58 aA
0,00 C
0,00 C
0,00 D
Derosal Plus
3 mL / L
1,5 mL / L
6 mL / L
0,00 fC
0,00 fB
0,95 bcdefAB
0,78 abcdefB
0,00 fB
1,43 abcA
0,00 dC
0,00 dB
0,00 dB
0,54 cdefBC
0,14 fB
0,97 abcdefAB
0,38 defBC
0,00 fB
1,91 abA
0,18 cdeC
0,04 deB
0,72 bcAB
1,94 abcdeA
1,89 abcdeA
2,01 abcdA
0,00 C
0,00 B
0,00 B
Frowncide 500 SC
1,5 mL / L
0,75 mL / L
3 mL / L
0,48 defAB
0,33 efA
1,99 abA
,30 cdefAB
0,00 fA
1,49 abAB
0,31 cdAB
0,00 dA
1,09 abAB
1,07 abcdefA
0,70 bcdefA
2,15 abcdeA
0,38 defAB
0,02 fA
0,57 cdefAB
0,39 bcdeAB
0,29 bcdeA
0,59 bcdAB
0,24 fghAB
0,21 fghA
1,14 bcdeA
0,00 B
0,00 A
0,00 B
Nativo
2 mL / L
1 mL / L
4 mL / L
2,11 abABC
0,09 fC
2,42 aAB
0,91 abcdefCD
0,09 efC
1,49 abBC
0,20 cdD
0,00 dC
0,71 bcC
2,39 abcdAB
2,54 abcA
3,12 aA
0,99 bcdeBCD
0,00 fC
1,52 abcBC
3,01 aA
0,88 bB
2,89 aA
0,99 cdefgBCD
0,76 efghB
2,17 abcdAB
0,00 D
0,00 C
0,00 D
Opera
2,5 mL / L
1, 25 mL / L
5 mL / L
1,34 abcdeBC
0,72 cdefBCD
1,79 abcB
1,16 abcdBC
0,79 abcdefBCD
1,34 abcB
0,13 cdE
0,04 dE
0,23 cdC
2,44 abcA
2,54 abcA
2,59 abcA
0,47 defDE
0,29 efDE
1,00 bcdeB
0,00 eE
0,02 eE
0,39 bcdeC
1,88 abcdeAB
1,44 abcdeB
2,29 abcA
0,00 E
0,00 E
0,00 C
Stratego
2 mL / L
1 mL / L
4 mL / L
0,00 f
0,00 f
0,00 f
0,00 f
0,00 f
0,00 f
0,00 d
0,00 d
0,00 d
0,00 f
0,00 f
0,00 f
0,00 f
0,00 f
0,00 f
0,00 e
0,00 e
0,00 e
0,07 gh
0,00 h
0,00 h
Vitavax-Thiram 200SC
3 mL / L
1,5 mL / L
6 mL / L
0,00 fB
0,00 fB
0,94 bcdefBC
0,38 bcdefAB
0,00 fB
0,52 abcdefBC
0,00 dB
0,00 dB
0,00 dC
1,14 abcdefA
0,80 bcdefB
2,75 abA
0,36 defAB
0,39 defB
0,36 defBC
0,00 eB
0,00 eB
0,68 bcBC
1,47 abcdeA
1,19 bcdefA
2,04 abcdA
0,00 B
0,00 B
0,00 C
Testemunha 0,00 f 0,00 f 0,00 h 0,00 e 0,00f 0,00 f 0,00 d
34
Na Tabela 3 os resultados mostram que o isolado T1R não diferiu
estatisticamente da Testemunha quando inoculado na presença de quaisquer doses dos
fungicidas Cabrio Top, Captan SC, Derosal Plus, Stratego e Vitavax-Thiram 200 SC, nas
doses recomendadas dos fungicidas Comet e Frowncide 500 SC e nas meias doses dos
fungicidas Derosal 500, Nativo e Opera.
O isolado T2R não diferiu estatisticamente da Testemunha na presença dos
fungicidas Cabrio Top, Captan SC, Comet, Stratego e Vitavax-Thiram 200 SC, nas doses
recomendadas e meia dose dos fungicidas Derosal plus, Frowncide 500 SC e Nativo e nas
meias doses dos fungicidas Derosal 500 e Opera.
Nas doses dos fungicidas Cabrio Top, Captan SC, Comet, Derosal Plus, Opera,
Stratego e Vitavax-Thiram 200 SC o desenvolvimento do isolado T4R não diferiu
estatisticamente da Testemunha. Também não houve diferença estatística do isolado com a
Testemunha na presença das doses recomendadas e meias doses dos fungicidas Frowncide
500 SC e Nativo e na metade da dose do fungicida Derosal 500.
O desenvolvimento do isolado T6R foi inibido pelas três doses dos fungicidas
Nativo e Opera e pelo dobro das doses dos fungicidas Captan SC, Derosal 500, Frowncide
200 SC e Vitavax-Thiram 200 SC, apresentando um halo de inibição mais de 2 cm. Nas
doses recomendadas e meias doses dos fungicidas Captan SC, Derosal 500, Frowncide 500
SC e Vitavax-Thiram 200 SC o desenvolvimento do isolado T6R não diferiu
estatisticamente da Testemunha.
O isolado T7R não diferiu estatisticamente da Testemunha quando inoculado
nas presenças de quaisquer das doses dos fungicidas Cabrio Top, Comet, Frowncide 500
SC, Stratego e Vitavax-Thiram 200 SC, na dose recomendada e meia dose dos fungicidas
Captan SC, Derosal Plus e Opera e nas meias doses dos fungicidas Derosal 500 e Nativo.
35
As três doses dos fungicidas Derosal 500 e Nativo inibiram o desenvolvimento
do isolado T7R. Na presença dos fungicidas Captan SC, Comet, Opera e Stratego o
desenvolvimento do isolado T7R não diferiu estatisticamente da Testemunha. Também não
houve diferença estatística da Testemunha quando o isolado foi inoculado na presença da
dose recomendada e meia dose dos fungicidas Cabrio Top, derosal Plus, Frowncide 500
SC e Vitavax-Thiram 200 SC.
O isolado PCT não diferiu estatisticamente da Testemunha quando inoculado
com quaisquer das doses dos fungicidas Cabrio Top, captan SC e Stratego, na dose
recomendada e meia dose do fungicida Frowncide 500 SC e meia dose dos fungicidas
Comet e Nativo. Os fungicidas Derosal 500, Opera e Vitavax-Thiram 200 SC inibiram o
desenvolvimento do isolado que apresentou halos de inibição de 1,19 a 2,58 cm.
Comparando-se os dois testes in vitro realizados pode-se concluir que, para
análise de compatibilidade de isolados de Trichoderma sp. com fungicidas, o teste em que
os defensivos agrícolas foram adicionados ao meio BDA apresenta resultados mais
confiáveis, pois o fungo entra em contato direto com o produto químico. No experimento
em que os fungicidas foram aplicados nos discos de papel filtro e confrontados com os
isolados de Trichoderma sp. os resultados não confirmaram o teste anterior. No primeiro
teste, todos os isolados tiveram seu desenvolvimento inibido quando inoculados em meio
de cultura contendo os fungicidas Derosal Plus e Derosal 500, o mesmo não aconteceu no
segundo teste quando os isolados foram confrontados com discos de papel filtro embebidos
em soluções desses fungicidas.
Pode-se concluir então, pelos resultados apresentados que o isolado T4R se
mostrou o menos sensível aos fungicidas utilizados em testes in vitro. Os isolados T6R e
PCT apresentaram maior sensibilidade aos fungicidas testados nos testes in vitro. Os
fungicidas Stratego e Vitavax-Thiram 200 SC apresentaram menor toxicidade, in vitro, aos
36
isolados de Trichoderma sp. testados. Os fungicidas que apresentaram maior toxicidade
aos isolados de Trichoderma sp. testados in vitro foram o Derosal 500, Derosal Plus,
Nativo e Opera. O fungicida Frowncide 500 SC apresentou características antiesporulantes
aos isolados de Trichoderma sp.
CAPÍTULO III
3 EFEITO DE FUNGICIDAS SOBRE DESENVOLVIMENTO DE
Fusarium oxysporum f .sp. phaseoli E INTERAÇÃO DESTES COM
Trichoderma sp.
3.1 Introdução
Entre as doenças que ocorrem no feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), a murcha
ou amarelecimento, causada por Fusarium oxysporum Schelecht f.sp. phaseoli kendrich &
Snyder, destaca-se como uma das principais, causando reduções na produtividade em até
80% (Echandi, 1967).
Em geral, os princípios de controle recomendados são baseados em medida de
exclusão, visando a não introdução do patógeno na área de cultivo e a evasão para locais
ou áreas sem o histórico da doença. No entanto, trabalhos com agentes biológicos contra
algumas “formae speciales” de Fusarium oxysporum têm sido extensivamente pesquisados.
Diversas espécies de Trichoderma têm se destacado como biocontroladores de
fitopatógenos habitantes do solo. Êxitos também têm sido obtidos com o emprego de
fungicidas em aplicações preventivas em diferentes patossistemas envolvendo “formae
speciales” de Fusarium oxysporum (Batista et al., 2002).
38
Assim, o objetivo deste trabalho foi (i) avaliar o potencial antagonista de
isolados de Trichoderma sp. contra o agente causal da murcha em feijoeiro Fusarium
oxisporum f.sp. phaseoli (ii) testar diferentes fungicidas para o controle de Fusarium
oxysporum f.sp. phaseoli e (iii) avaliar, in vivo, a ação de dois fungicidas indicados para o
tratamento de sementes de feijão contra F. oxysporum f.sp phaseoli juntamente com
isolados de Trichoderma sp.
3.2 Material e Métodos
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Microbiologia
Fitopatológica e em casa de vegetação, localizados no Departamento de Fitossanidade da
Faculdade de Agronomia da UFRGS.
Os seguintes fungicidas foram escolhidos por serem produtos aplicados no
cultivo do feijoeiro comum.
Nome comercial: Cabrio Top
Nome químico: methyl N-(2-{[1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-3-
yl]oxymethyl}phenyl) N-methoxy carbamate + Zinc ammoniate
ethylenebis(dithiocarbamate)–poly(ethylenethiuram disulfide)
Ingrediente ativo: pyraclostrobin + metiram
Classe: fungicida
Formulação: granulado dispersível
Concentração: (50g de pyraclostrobin + 550g de metiram)/ kg
Classe toxicológica: III – medianamente tóxico
Dose recomendada: 1,5 kg / 200 a 300 L de água
Nome comercial: Captan SC
Nome químico: N-(trichloromethylthio)
Ingrediente ativo: captana
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada
Concentração: 480g de captana / L
Classe toxicológica: I – Extremamente tóxico
Dose recomendada: 400 mL / 100L
39
Nome comercial: Comet
Nome químico: methyl N-(2-{[1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-3-
yl]oxymethyl}phenyl) N-methoxy carbamate
Ingrediente ativo: pyraclostrobin
Classe: fungicida
Formulação: concentrado emulsionável
Concentração: 250g de pyraclostrobin / L
Classe toxicológica: II – altamente tóxico
Dose recomendada: 0,3 L / 200 a 300 L
Nome químico: Derosal 500
Nome químico: Methyl benzimidazol-2-ylcarbamate
Ingrediente ativo: carbendazim
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada
Concentração: 500g de carbendazim / L
Classe toxicológica: III – medianamente tóxico
Dose recomendada: 0,5L / 300 a 600 L
Nome comercial: Derosal Plus
Nome químico: methyl benzimidazol-2-ylcarbamato + tetramethylthiuram dissulfide
Ingrediente ativo: carbendazim + thiram
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada para tratamento de sementes
Concentração: (150g de carbendazim + 350g de tiram) / L
Classe toxicológica: III – medianamente tóxico
Dose recomendada: 300 mL / 100kg de sementes
Nome comercial: Frowncide 500 SC
Nome químico: 3-cloro-N-(-3-cloro-5-trifluorometil-2-piridil)-a,a,a-trifluoro-2,6-
dinitro-p-toluidina
Ingrediente ativo: fluazinam
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada
Concentração: 500g de fluazinam / L
Classe toxicológica: II – altamente tóxico
Dose recomendada: 1,0 a 1,5 L / 1000 a 1500 L
Nome comercial: Nativo
Nome químico: methyl (E)-methoxyimino-{(E)-α-[1-(α,α,α-trifluoro-m-
tolyl)ethylideneaminooxy]-=o-tolyl}acetate + (RS)-1-p-chlorophenyl-4,4-dimethyl-3-
(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)pentan-3-ol
Ingrediente ativo: trifloxistrobina + tebuconazole
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada
Concentração: (100g de trifloxistrobina + 200g de tebuconazole) / L
Classe toxicológica: III – medianamente tóxico
Dose recomendada: 0,6 L / 300
40
Nome comercial: Ópera
Nome químico: (2RS, 3SR)-1-[3-(2-chlorophenyl)-2,3-epoxy-2-(4-fluorophenyl)
propyl]-1H-1,2,4-triazole + methyl N-(2-{[1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-3-
yl]oxymethyl}phenyl) N-methoxy carbamate
Ingrediente ativo: epoxiconazole + pyraclostrobin
Classe: fungicida
Formulação: emulsão
Concentração: (50g de epoxiconazole + 133g de pyraclostrobin) / L
Classe toxicológica: II – altamente tóxico
Dose recomendada: 0,75L / 30
Nome comercial: Stratego
Nome químico:
Methyl (E)-methoxyimino-{(E)-α-[1-(α,α,α,-trifluoro-m-tolyl)
ethylideneaminooxy]-=o-tolyl}acetate + (RS)-1-[2-(2,4-dichlorophenyl)-4-propyl-1,3-
dioxolan-2-yl]methyl]-1H-1,2,4-triazole
Ingrediente ativo: trifloxistrobina + propiconazol
Classe: fungicida
Formulação: concentrado emulsionável
Concentração: (125g de trifloxistrobina + 125g de propiconazol) / L
Classe toxicológica: II – Altamente tóxico
Dose recomendada: 0,6 L / 200 a 300L
Nome comercial: Vitavax – Thiram 200 SC
Nome químico: 5,6-dihydro-2-methyl-1,4-oxathi-ine-3-carboxanilin +
tetramethylthiuram disulfide
Ingrediente ativo: carboxina + thiram
Classe: fungicida
Formulação: suspensão concentrada para tratamento de sementes
Concentração: (200g de carboxina + 200g de tiram) / L
Classe toxicológica: IV – Pouco tóxico
Dose recomendada: 250 a 300 mL / 100kg de sementes
41
3.2.1 Testes em laboratório
3.2.1.1 Obtenção dos isolados de Trichoderma sp.
Foram utilizados três isolados de Trichoderma sp. denominados T4R, TSV e
PCT.
Os isolados de Trichoderma sp. foram obtidos a partir de amostras de solo
coletadas de lavouras de feijão irrigado, localizadas na cidade de Cristalina, GO. Das
amostras de solo, devidamente identificadas, foram retiradas alíquotas de 10 g e
homogeneizadas com 90 mL de água destilada esterilizada; a partir desta suspensão, foram
realizadas diluições sucessivas até 10
-3
. Da última diluição, foi inoculado 0,1 mL, em
placa, (cinco placas por amostra, contendo meio de cultura sólido de batata-dextrose-ágar,
BDA (Batata 200 g, dextrose 20 g, ágar 15 g) acidificado com ácido lático (3 gotas / 100
mL). O inóculo foi espalhado com alça de Drigalsky. As placas foram incubadas a 23 ±
1ºC e fotoperíodo de 12 horas. Após 5 dias, foi feita a repicagem para obtenção de culturas
axênicas.
Os isolados foram identificados conforme o local da coleta das amostras de
solo. O isolado T4R (T: Trichoderma sp.; 4: número do pivô central; R: identificação da
fazenda produtora de feijão), foi retirado de uma área (pivô) de cultivo, portanto, com
intensa aplicação de defensivos agrícolas. O isolado TSV foi obtido de uma área não
cultivada e sem aplicação de produtos químicos (T: Trichoderma sp.; SV: selvagem). Foi
utilizado também, um produto comercial formulado à base de isolados de Trichoderma sp.
veiculados em arroz. Este foi denominado PCT (produto comercial Trichoderma sp.).
42
3.2.1.2 Obtenção e multiplicação do inóculo de Fusarium oxysporum f.sp.
phaseoli
Para isolar Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli plantas de feijão apresentando
sintomas de escurecimento da raiz e amarelecimento das folhas foram lavadas em água
corrente, cortadas em pequenos pedaços e desinfestadas com álcool 70% durante 1 minuto,
hipoclorito de sódio 1% durante 1 minuto e três lavagens com água destilada esterilizada.
Os pedaços da planta desinfestados foram, então, plaqueados em meio de cultura BDA
acidificado com ácido lático, e mantidos a temperatura de 23 ± 1ºC e fotoperíodo de 12
horas, por 14 dias. Posteriormente, um esporo de cada cultura foi isolado e plaqueado sob
as mesmas condições anteriormente descritas para obtenção de culturas puras. A
confirmação da identificação do patógeno como sendo Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli
foi feita no Laboratório de Microbiologia Fitopatológica do Departamento de
Fitossanidade da UFRGS.
3.2.1.3 Avaliação do potencial antagônico de Trichoderma sp. a Fusarium
oxysporum f.sp. phaseoli em meio BDA.
Discos de micélio, de 0,6 cm de diâmetro, dos isolados T4R, TSV e PCT de
Trichoderma sp. e do isolado Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli foram inoculados em
lados opostos da placas contendo somente meio de cultura BDA acidificado com ácido
lático. Foram feitos confrontos inoculando-se o antagonista 48 horas antes do patógeno, 48
horas depois e junto com o patógeno. A Testemunha consistiu de Fusarium oxysporum
f.sp. phaseoli inoculado sem o Trichoderma sp. O delineamento experimental foi
inteiramente casualizado com 5 repetições para cada tratamento. As placas foram
incubadas a temperatura de 23 ± 1ºC e fotoperíodo de 12 horas, até os isolados do
antagonista e do patógeno se encontrarem. Foi feita medição do crescimento do patógeno
43
no dia do encontro das colônias. Os dados obtidos foram submetidos à analise de variância
e teste de Tukey (P<0,05) para comparação das médias.
3.1.2.4 Interferência in vitro de fungicidas no crescimento de Fusarium
oxysporum f.sp. phaseoli
O efeito de fungicidas sobre o Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli foi estudado
avaliando-se o crescimento do isolado do patógeno na presença dos mesmos.
Primeiramente, a adição dos produtos foi feita no meio de cultura batata-dextrose-ágar
(BDA) acidificado com ácido lático, 3 gotas / 100mL , depois de autoclavado e ainda
líquido (40ºC), de modo que a concentração final do produto foi estabelecida considerando
o volume de meio utilizado. Foram utilizadas 4 tratamentos, sendo três concentrações para
cada fungicida (a dose recomendada pelo fabricante (Tabela 1), a metade e o dobro desta
dose) mais a Testemunha, constituída apenas de BDA. Em seguida, o meio de cultura foi
vertido em placas de Petri e foram preparadas quatro placas por tratamento. A inoculação
do isolado de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli foi feita com discos de micélio, no centro
da placa. As placas foram incubadas em câmara de crescimento, com temperatura de 23 ±
1ºC e fotoperíodo de 14 horas, por 14 dias. A avaliação foi feita medindo-se o diâmetro das
colônias no décimo quarto dia. Os dados obtidos foram submetidos a analise de variância e
teste de Tukey (P<0,05) para comparação das médias.
44
TABELA 1. Doses utilizadas para cada fungicida
Fungicida (nome comercial) Dose utilizada no experimento
Cabrio Top 1,5 kg / 300 L de água*
Captan SC 400 mL / 100L
Comet 0,3 L / 300 L
Derosal 500 0,5L / 300 L
Derosal Plus 300 mL / 100 kg de sementes
Frowncide 500 SC 1,0 L / 1000 L
Nativo 0,6 L / 300L
Opera 0,75L / 300L
Stratego 0,6 L / 300L
Vitavax-Thiram 200 SC 300 mL / 100 kg de sementes
* Dose recomendada pelo fabricante
O segundo teste foi feito mergulhando-se discos de 0,6 cm de diâmetro de papel
filtro em soluções de fungicida com água destilada esterilizada. As concentrações
utilizadas foram as mesmas citadas no teste anterior. Os discos de papel filtro foram
encharcados na solução e colocados em um lado das placas de Petri, do lado oposto foi
colocado um disco de BDA contendo micélio e esporos do patógeno. Cada tratamento
contou com quatro repetições e a Testemunha que consistiu somente do isolado de
Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli na placa. Os tratamentos foram mantidos em câmara de
crescimento, com temperatura de 23 ± 1ºC e fotoperíodo de 14 horas. No décimo quarto
dia foi medido do halo de inibição formado em torno do disco de papel filtro. Os dados
obtidos foram submetidos a análise de variância e teste de Tukey (P<0,05) para
comparação das médias.
3.2.2 Testes em casa de vegetação
Para o experimento na casa de vegetação foram utilizados dois fungicidas:
Derosal Plus e Vitavax-Thiram 200 SC. Estes produtos são recomendados pelos
fabricantes para o controle de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli e são utilizados pelos
produtores de feijão da cidade de Cristalina, GO. Foram utilizados também, três isolados
45
de Trichoderma sp.: T4R, TSV e PCT. Estes isolados foram utilizados, pois foi coletado
em diferentes locais, além do isolado T4R ter se mostrado o menos sensível a fungicidas
em testes realizados anteriormente.
3.2.2.1 Produção do inóculo de Trichoderma sp.
Para produção de inóculo foram utilizados sacos plásticos transparentes de 2 L
com 250 g de grãos de arroz sem casca e esterilizados em autoclave por 30 min a 120°C,
estes foram inoculados com 50 mL de uma suspensão com 10
7
esporos de Trichoderma sp.
dos isolados T4R e TSV, cada isolado foi inoculado separadamente. Após a incubação, por
14 dias, a 23 ± 1 °C, o substrato colonizado foi seco a 36°C, por aproximadamente quatro
dias. Em seguida, o inóculo de cada um dos isolados foi triturado e passado em peneira de
40 mesh. O produto comercial PCT já é veiculado em grãos de arroz triturados.
3.2.2.2 Produção do inóculo de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli
Para produção de inóculo do patógeno foram utilizado sacos plásticos
transparentes de 2 L com 250 g de grãos de arroz sem casca e esterilizados em autoclave
por 30 min a 120°C, estes foram inoculados com 50 mL de uma suspensão com 10
7
esporos de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, de água destilada esterilizada. Após a
incubação, por 14 dias, a 23 ± 1 °C (Figura 1), o substrato colonizado foi seco a 36°C, por
aproximadamente quatro dias. Em seguida, o inóculo foi triturado e peneirado.
46
FIGURA 1. Inóculo de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli em arroz após 14 dias de
incubação.
3.2.2.3 Esterilização do substrato
Para o cultivo do feijão foram utilizadas duas partes de vermiculita e uma parte
de areia. A areia foi lavada em água corrente e posta para secar em estufa a 40 °C. Após
dois dias de secagem a areia, ainda úmida, foi autoclavada por 30 min a 120°C ou 1 atm. A
vermiculita foi esterilizada também por 30 min a 120°C ou 1 atm.
3.2.2.4 Montagem do experimento.
O experimento foi feito na casa de vegetação do Departamento de
Fitossanidade da UFRGS.
A cultivar de feijão utilizado foi a carioca por ser suscetível a Fusarium
oxysporum f.sp. phaseoli.
Foram feitos os seguintes tratamentos:
1. F. oxysporum f.sp. phaseoli
47
2. F. oxysporum f.sp. phaseoli + Vitavax-Thiram 200 SC
3. F. oxysporum f.sp. phaseoli + Derosal Plus
4. F. oxysporum f.sp. phaseoli + T4R
5. F. oxysporum f.sp. phaseoli + TSV
6. F. oxysporum f.sp. phaseoli + PCT
7. F. oxysporum f.sp. phaseoli + T4R + Vitavax-Thiram 200 SC
8. F. oxysporum f.sp. phaseoli + TSV + Vitavax-Thiram 200 SC
9. F. oxysporum f.sp. phaseoli + PCT + Vitavax-Thiram 200 SC
10. F. oxysporum f.sp. phaseoli + T4R + Derosal Plus
11. F. oxysporum f.sp. phaseoli + TSV + Derosal Plus
12. F. oxysporum f.sp. phaseoli + PCT + Derosal Plus
13. T4R
14. TSV
15. PCT
16. Testemunha
Para a execução do experimento, copos plásticos com capacidade para 300 mL
foram cheios com uma mistura composta por duas partes de vermiculita e uma parte de
areia (Figura 2). As sementes para cada tratamento foram pesadas e inoculadas com os
fungicidas e os isolados do antagonista e do fitopatógeno conforme os tratamentos
propostos. Os fungicidas, utilizados como tratamento de sementes, foram aplicados
conforme a dosagem recomendada pelo fabricante (300 mL do produto para cada 100 kg
de sementes). Os isolados de Trichoderma sp. e o isolado de F. oxysporum f.sp. phaseoli
foram inoculados na forma de tratamento de sementes conforme a dosagem utilizada para
a aplicação do produto comercial formulado à base de Trichoderma sp., ou seja, 5 g do
48
produto para cada 60 kg de sementes. Cada tratamento teve quatro repetições com duas
sementes cada uma. A Testemunha consistiu de sementes não tratadas.
FIGURA 2. Experimento montado em casa de vegetação. Copos plásticos contendo
mistura de areia e vermiculita. Cada tratamento teve quatro repetições.
Após três semanas foram retirados, de uma das repetições, segmentos de raízes
ao acaso que foram plaqueadas em meio batata-dextrose-agar (BDA) acidificado com
ácido lático, e em Trichoderma seletive médium (Dhingra & Sinclair, 1995) composto por:
glicose 3,0 g; KCl 0,15 g; MgSO
4
7H
2
O 0,2 g; NH
4
NO
3
1,0 g; K
2
HPO
4
0,9 g; Agar 15 g e
água 1L. Após a esterilização do meio, acrescentou-se 250 mg de clorofenicol, 200 mg de
quintozene e 150 mg de rosa de bengala. As amostras tiveram 3 repetições para cada meio
de cultura com 4 segmentos de raízes. Após sete dias de incubação a 23 ± 1°C e
fotoperíodo de 12 horas, foi feita a contagem de raízes com presença de Trichoderma sp. e
Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli.
49
3.3 Resultados e Discussão
3.3.1 Avaliação do potencial antagônico de Trichoderma sp. a Fusarium
oxysporum f.sp. phaseoli em meio BDA.
A seleção in vivo é essencial para um bom resultado do biocontrole em campo,
mas a seleção de antagonistas in vitro, apesar das restrições quanto à sua eficácia, é uma
técnica bastante utilizada na detecção de potenciais biocontroladores, como testes
preliminares, por consumir pouco tempo, espaço e material (Faria et al., 2002). O método
de cultura pareada em disco de agar é o mais utilizado em estudos de antagonismo in vitro,
existindo inúmeros relatos de sucesso na seleção de microrganismos, visando ao controle
biológico de fitopatógenos (Mariano, 1993).
No teste de confrontos entre os isolados do antagonista contra o patógeno,
todos os isolados mostraram potencial antagônico a Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli
principalmente quando o patógeno foi inoculado simultaneamente ou 48 horas depois que
os isolados de Trichoderma sp. (Tabela 2).
O antagonismo de Trichoderma sp. é explicado pela produção de antibióticos,
de amplo espectro de ação, tais como glitoxina, viridina, trichodermina, suzuczcilina,
alameticina e dermadina, que têm a capacidade de inibir o desenvolvimento de outros
fungos (Dennis & Webster, 1971). Além de antibióticos, Trichoderma sp. produzem
enzimas, como celulase e hemicelulase, capazes de degradar materiais lignocelulolíticos e
causar a lise na parede de células de fungos fitopatogênicos (Melo, 1996).
50
TABELA 2. Médias originais do crescimento de isolados de Fusarium oxysporum f.sp
phaseoli inoculados 48h antes, simultaneamente e 48h após a inoculação de
isolados de Trichoderma sp. em meio de cultura.
Desenvolvimento de F. oxysporum f.sp, phaseoli
na presença dos isolados de Trichoderma sp.
Tratamentos 48h antes do
antagonista
Junto com o
antagonista
48h depois do
antagonista
F. oxysporum f.sp. phaseoli x T4R
Testemunha
2,40 c*
6,50 a
1,09 b
2,00 a
0,62 d
1,25 b
F. oxysporum f.sp. phaseoli x TSV
Testemunha
2,84 bc
6,50 a
1,02 b
2,40 a
0,60 d
1,10 bc
F. oxysporum f.sp. phaseoli x PCT
Testemunha
1,07 d 0,90 b 0,17 e
6,50 a 2,40 a 1,70 a
*- Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não são estatisticamente diferentes
(Tukey, 5%)
3.3.2 Interferência in vitro de fungicidas no crescimento de Fusarium
oxysporum f.sp. phaseoli
A Tabela 3 mostra os resultados referentes ao experimento em que fungicidas,
em três dosagens, foram incorporados ao BDA. O crescimento de Fusarium oxysporum
f.sp. phaseoli diferiu estatisticamente da Testemunha na presença de todos os fungicidas e
nas três doses testadas. O patógeno apresentou algum desenvolvimento na presença dos
fungicidas Cabrio Top, Captan SC, Comet, Frowncide 500 SC Stratego e na metade da
dose recomendada do fungicida Vitavax-Thiram 200 SC. Com os fungicidas Derosal 500,
Derosal Plus (Figura 3), Nativo, Opera e nas doses recomendada e dobro da dose do
fungicida Vitavax-Thiram o isolado de Fusarium oxysporum f.sp.phaseoli não se
desenvolveu.
No trabalho realizado por Batista et al. (2002) o fungo Fusarium oxysporum f. sp.
passiflorae teve seu desenvolvimento reduzido quando inoculado em meio de cultura
BDA adicionado com o fungicida carbendazim (Derosal 500 e Derosal Plus) em uma dose
de 0,5 g.i.a.L
-1
.
51
F
. Oxysporum f.sp.
p
haseoli com Derosal Plus
Testemunh Dose recomendada Meia dose Dobro da dose
FIGURA 3. Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli na presença de três doses do fungicida
Derosal Plus, depois de sete dias de incubação.
No trabalho realizado por Fischer et al. (2006) foram avaliados a eficiência
in vitro de oito fungicidas na inibição do crescimento micelial de três isolados de F.
subglutinans. Os produtos tebuconazole (fungicida Nativo) e carbendazim (Derosal 500 e
Derosal Plus) foram os mais eficientes na inibição dos isolados enquanto o fungicida
Captan se mostrou pouco eficiente.
Dentre os fungicidas sistêmicos, os benzimidazóis são os mais conhecidos
devido as suas excelentes propriedades sistêmicas e eficácia no controle de importantes
agentes fitopatogênicos (Ghini & Kimati, 2002).
O grupo das estrobilurinas é desenvolvido a partir de compostos naturais
produzidos por cogumelos, e atua na inibição da respiração mitocondrial de fungos,
impedindo a transferência de elétrons entre o citocromo b e o citocromo c (Barlett et al.,
2002). Nota-se que os produtos Cabrio Top, Comet, Nativo, Opera e Stratego, apesar de
pertencerem ao grupo das estrobilurinas revelaram diferenças significativas entre eles.
Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli apresentou crescimento na presença dos fungicidas
Cabrio Top, Comet e Stratego e não se desenvolveu na presença de nenhuma das doses dos
52
fungicidas Nativo e Opera. Portanto, dentro do grupo das estrobilurinas, os fungicidas
Nativo e Opera se mostraram eficientes no controle deste agente fitopatogênico.
TABELA 3. Diâmetro (cm) do crescimento de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli em meio de cultura
contendo discos de papel filtro impregnados com diferentes fungicidas.
Fungicidas Medida do diâmetro (cm)
da colônia
Cabrio Top
5g / L
2,5 g / L
10 g / L
3,45 de*
4,50 c
3,00 ef
Captan SC
4 mL / L
2 mL / L
8 mL / L
0,92 ij
1,10 hij
0,82 j
Comet
1 mL / L
0,5 mL / L
2 mL / L
3,32 de
4,15 cd
2,12 fg
Derosal 500
0,83 mL / L
0,415 mL / L
1,66 mL /L
0,60 j
0,60 j
0,60 j
Derosal Plus
3 mL / L
1,5 mL / L
6 mL / L
0,60 j
0,60 j
0,60 j
Frowncide 500 SC
1,5 mL / L
0,75 mL / L
3 mL / L
2,10 fg
2,05 fgh
2,00 gh
Nativo
2 mL / L
1 mL / L
4 mL / L
0,60 j
0,60 j
0,60 j
Opera
2,5 mL / L
1, 25 mL / L
5 mL / L
0,60 j
0,60 j
0,60 j
Stratego
2 mL / L
1 mL / L
4 mL / L
2,00 gh
2,52 efg
1,92 gh
Vitavax-Thiram 200 SC
3 mL / L
1,5 mL / L
6 mL / L
0,60 j
1,90 ghi
0,60 j
Testemunha 8,50 a
*Médias seguidas pela mesma letra não são estatisticamente diferentes (Tukey 5%)
A Tabela 4 mostra os resultados referentes ao experimento com os discos de
papel filtro embebidos em soluções com três dosagens de cada fungicida. Fusarium
oxysporum f.sp. phaseoli não diferiu estatisticamente da Testemunha quando esteve na
presença dos discos de papel filtro contendo as diferentes doses dos fungicidas Cabrio
53
Top, Derosal 500, Nativo e Stratego. Nos tratamentos com discos contendo a dose
recomendada e a meia dose dos fungicidas Captan SC, Comet e Opera o desenvolvimento
do patógeno não diferiu estatisticamente da Testemunha. Na presença dos discos de papel
filtro contendo as três doses dos fungicidas Derosal Plus, Frowncide 500 SC e Vitavax-
Thiram 200 SC o desenvolvimento do patógeno diferiu estatisticamente da Testemunha.
TABELA 4. Halos de inibição do crescimento de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli em meio de cultura
contendo discos de papel filtro impregnados com diferentes fungicidas.
Fungicidas Medida do halo de
inibição (cm)
Cabrio Top
5g / L
2,5 g / L
10 g / L
0,00 f*
0,00 f
0,00 f
Captan SC
4 mL / L
2 mL / L
8 mL / L
0,48 ef
0,33 ef
0,79 abcde
Comet
1 mL / L
0,5 mL / L
2 mL / L
0,40 ef
0,34 ef
0,52 de
Derosal 500
0,83 mL / L
0,415 mL / L
1,66 mL /L
0,00 f
0,00 f
0,00 f
Derosal Plus
3 mL / L
1,5 mL / L
6 mL / L
1,29 a
1,12 abc
1,39 a
Frowncide 500 SC
1,5 mL / L
0,75 mL / L
3 mL / L
1,44 a
1,04 abcd
1,44 a
Nativo
2 mL / L
1 mL / L
4 mL / L
0,00 f
0,00 f
0,44 f
Opera
2,5 mL / L
1, 25 mL / L
5 mL / L
0,49 def
0,40 ef
0,62 bcde
Stratego
2 mL / L
1 mL / L
4 mL / L
0,00 f
0,00 f
0,00 f
Vitavax-Thiram 200 SC
3 mL / L
1,5 mL / L
6 mL / L
1,16 ab
1,12 abc
1,44 a
Testemunha 0,00 f
*Médias seguidas pela mesma letra não são estatisticamente diferentes (Tukey 5%)
54
O teste em que os fungicidas foram adicionados ao meio de cultura BDA
parece ser mais eficiente quando se quer avaliar o desenvolvimento de algum
microrganismo. Isso porque o microrganismo, nesse caso o fungo fitopatogênico
Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, entra em contato direto com o fungicida. No teste em
que discos de papel filtro foram embebidos em soluções dos fungicidas e confrontados
com o fitopatógeno, os resultados não concordaram com o primeiro teste. Os fungicidas
Derosal 500 e Nativo inibiram totalmente o desenvolvimento de F. oxysporum f. sp.
phaseoli no primeiro experimento in vitro, já no segundo experimento in vitro, os
tratamentos não diferiram estatisticamente da Testemunha.
55
3.3.3 Experimentos em casa de vegetação
Os resultados quanto à influência dos tratamentos nas plantas de feijão
(Phaseolus vulgaris L.) estão relacionados na Tabela 5.
TABELA 5. Influência dos tratamentos realizados no experimento em casa de vegetação
sobre as plantas de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.)
Tratamento Estado das plantas (6 plantas por tratamento)
1.Testemunha 6 plantas sadias
2. F. oxysporum f.sp. phaseoli 6 plantas apresentando sintomas de escurecimento
de raiz
3. F. oxysporum f.sp. phaseoli + T4R 6 plantas apresentando sintomas de escurecimento
de raiz
4. F. oxysporum f.sp. phaseoli + TSV 6 plantas sadias
5. F. oxysporum f.sp. phaseoli + PCT 3 plantas sadias e 3 plantas apresentando
escurecimento das raízes
6. F. oxysporum f.sp. phaseoli + T4R + Derosal
Plus
4 plantas sadias e 2 plantas apresentando
escurecimento nas raízes
7. F. oxysporum f.sp. phaseoli + TSV + Derosal
Plus
4 plantas sadias e 2 plantas apresentando
escurecimento nas raízes
8. F. oxysporum f.sp. phaseoli + PCT + Derosal
Plus
5 plantas sadias e 1 plantas apresentando
escurecimento nas raízes.
9. F. oxysporum f.sp. phaseoli + T4R + Vitavax-
Thiram 200 SC
4 plantas sadias e 2 plantas apresentando
escurecimento nas raízes
10. F. oxysporum f.sp. phaseoli + TSV + Vitavax-
Thiram 200 SC
4 plantas sadias e 2 plantas apresentando
escurecimento nas raízes
11. F. oxysporum f.sp. phaseoli + PCT + Vitavax-
Thiram 200 SC
4 plantas sadias e 2 plantas apresentando
escurecimento nas raízes.
12. F. oxysporum f.sp. phaseoli + Derosal Plus 6 plantas sadias
13. F. oxysporum f.sp. phaseoli + Vitavax-Thiram
200 SC
6 plantas sadias
14. T4R 6 plantas sadias
15. TSV 6 plantas sadias
16. PCT 6 plantas sadias
56
No tratamento onde foi inoculado somente o Fusarium oxysporum f.sp.
phaseoli, todas as plantas apresentaram sintomas de escurecimento na raiz. Nos
tratamentos com o agente fitopatogênico e os isolados de Trichoderma sp. houve controle
efetivo da doença somente pelo isolado TSV. Todas as plantas apresentaram sintomas de
escurecimento na raiz quando inoculadas com o isolado T4R e com o fitopatógeno e 50 %
das plantas apresentaram os mesmos sintomas com o isolado PCT e o fitopatógeno (Figura
4).
FIGURA 4. Plantas cujas sementes foram tratadas com Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli
e com o isolado PCT.
Nos tratamentos em que as sementes foram tratadas com o fitopatógeno, os
isolados de Trichoderma sp. e o fungicida Derosal plus, 33% das plantas apresentaram
sintomas de escurecimento de raiz quando tratadas com o isolado T4R, a mesma
porcentagem de plantas doentes ocorreu no tratamento com o isolado TSV e 16, 6 % das
plantas apresentaram sintoma da doença quando tratadas com o isolado PCT.
Quando as sementes foram tratadas com F. oxysporum f.sp. phaseoli, isolados
de Trichoderma sp e o fungicida Vitavax-Thiram 200 SC, 33 % das plantas, em cada
tratamento, apresentaram sintomas de escurecimento nas raízes.
57
Nos tratamentos onde as sementes foram tratadas pelos fungicidas e inoculadas
com F. oxysporum f. sp. phaseoli, as plantas não apresentaram sintomas da doença.
Os resultados mostraram que os dois fungicidas testados, Derosal Plus e
Vitavax-Thiram 200 SC, foram efetivos no controle do agente fitopatogênico,
principalmente quando as sementes foram tratadas somente com esses produtos. Os
isolados de Trichoderma sp. T4R e PCT não foram efetivos no controle de Fusarium
oxysporum f.sp phaseoli in vivo. Apenas o isolado TSV apresentou controle sobre o
fitopatógeno nos experimentos in vivo.
Em todos as plantas que apresentaram sintomas do agente patogênico
Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli houve a recuperação do mesmo quando os fragmentos
de raízes foram colocados em meio de cultura BDA. Nos tratamentos em que houve
inoculação dos isolados de Trichoderma sp. na presença ou não dos fungicidas, estes
também foram recuperados quando os fragmentos de raízes foram colocados em
Trichoderma seletive médium (Figura 5).
FIGURA 5. Isolado de Trichoderma sp. T4R em Trichoderma seletive médium,
recuperados de raízes de plantas que tiveram suas sementes tratadas com
Derosal Plus (300 mL / 100 kg de sementes) e com o presente isolado.
Os isolados T4R, TSV e PCT já haviam sido testados in vitro quanto ao seu
desenvolvimento na presença de fungicidas. Todos os isolados se desenvolveram in vitro
58
na presença do fungicida Vitavax-Thiram 200 SC em três doses testadas (1,5 mL/ L, 3 mL
/ L e 6 mL / L). Já o fungicida Derosal Plus inibiu completamente o desenvolvimento in
vitro desses isolados em todas as doses testadas (1,5 mL/ L, 3 mL / L e 6 mL / L). Isso
comprova que os resultados de testes in vitro não descartam a possibilidade de isolados de
Trichoderma sp. se desenvolverem in vivo. Estudos in vitro têm a vantagem de expor ao
máximo o microrganismo à ação do produto químico, fato que não ocorre em condições de
campo, onde vários fatores servem de obstáculo a essa exposição, assim, constatada a
inocuidade de um produto em laboratório, espera-se que o mesmo seja seletivo no campo.
Por outro lado, a alta toxicidade de um produto in vitro nem sempre indica a sua elevada
toxicidade no campo, mas sim a possibilidade da ocorrência de danos dessa natureza
(Moino Jr. & Alves, 1998).
Os três isolados de Trichoderma sp. T4R, TSV e PCT foram efetivos no
controle de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, agente causal da murcha do feijoeiro, em
testes in vitro, principalmente quando inoculados 48 horas antes do fitopatógeno e
simultaneamente com o fitopatógeno.
Os fungicidas Derosal 500, Derosal Plus, Nativo, Opera e Vitavax-Thiram 200
SC foram efetivos no controle de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli em experimento in
vitro, quando adicionados ao meio de cultura BDA.
Os isolados T4R e PCT não foram efetivos no controle de F. oxysporum f. sp.
phaseoli em experimento in vivo, somente as plantas cujas sementes foram tratadas com o
isolado TSV e com o fitopatógeno não apresentaram sintomas de escurecimento da raiz.
No experimento em casa de vegetação, os fungicidas Derosal Plus e Vitavax-
Thiram 200 SC não inibiram o desenvolvimento dos isolados de Trichoderma sp. T4R,
TSV e PCT.
59
4 CONCLUSÕES
O isolado T4R de Trichoderma sp. se mostrou o menos sensível aos fungicidas
nos testes in vitro.
O isolado T6R de Trichoderma sp. e o produto PCT foram os mais sensíveis
aos fungicidas em testes in vitro.
Os produtos que apresentaram menos toxicidade aos isolados de Trichoderma
sp. in vitro foram o Stratego e o Vitavax-Thiram 200 SC.
Os fungicidas que apresentaram mais toxicidade aos isolados de Trichoderma
sp. in vitro foram Derosal 500, Derosal Plus, Nativo e Opera.
O fungicida Frowncide 500 SC apresentou características antiesporulantes em
todos os isolados de Trichoderma sp. nos experimentos in vitro.
Os fungicidas Derosal 500, Derosal Plus, Nativo, Opera e Vitavax-Thiram 200
SC foram efetivos na inibição do desenvolvimento de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli
in vitro.
Os isolados de Trichoderma sp. T4R, TSV e o produto PCT foram efetivos no
controle de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, in vitro, quando inoculados 48 horas
antes e simultaneamente com o patógeno.
Em experimentos in vivo, somente o isolado TSV foi efetivo no controle do
fitopatógeno Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli.
60
Os isolados de Trichoderma sp. T4R, TSV e o produto PCT foram recuperados
de raízes de plantas cujas sementes foram tratadas com Derosal 500 e Vitavax-Thiram 200
SC.
61
5 SUGESTÕES
Realizar novas avaliações com o fungicida Frowncide 500 SC em isolados de
Trichoderma sp., testando diferentes doses do produto, diferentes meios de cultura,
valores de pH’s e temperaturas de incubação.
Experimentos em casa de vegetação testando os isolados de Trichoderma sp.
com diferentes doses dos fungicidas .
Realizar novos experimentos em casa de vegetação testando novos métodos de
inoculação e diferentes concentrações do inóculo dos isolados de Trichoderma sp. e de
Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli.
Testar os fungicidas Vitavax-Thiram 200 SC e Derosal Plus na metade da dose
recomendada com os isolados de Trichoderma sp. para avaliar suas eficiências no
controle de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli.
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