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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E MOLECULAR DE AMOSTRAS
BRASILEIRAS DO VÍRUS DA LARINGOTRAQUEÍTE INFECCIOSA
Cristiana Portz
PORTO ALEGRE, 2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E MOLECULAR DE AMOSTRAS
BRASILEIRAS DO VÍRUS DA LARINGOTRAQUEÍTE INFECCIOSA
Autora: Cristiana Portz
Tese apresentada como requisito parcial
para obtenção do grau de Doutor em
Ciências Veterinárias na área de
Microbiologia Veterinária, especialidade
Virologia.
Orientador: Cláudio Wageck Canal
Co-orientadora: Ana Cláudia Franco
PORTO ALEGRE
2008
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Cristiana Portz
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E MOLECULAR DE AMOSTRAS
BRASILEIRAS DO VÍRUS DA LARINGOTRAQUEÍTE INFECCIOSA
Aprovada em 13 FEV 2008.
APROVADO POR:
____________________________________________________________
Prof. Dr. Cláudio Wageck Canal
Orientador e Presidente da Comissão
____________________________________________________________
Prof. Dra. Clarice Weiss Arns
Membro da Comissão
____________________________________________________________
Prof. Dr. Nilo Ikuta
Membro da Comissão
____________________________________________________________
Prof. Dra. Luciane Terezinha Lovato
Membro da Comissão
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me conceder saúde, paciência e persistência .
À minha família, pelo apoio mesmo estando mais distantes.
Ao Prof. Cláudio Wageck Canal pela oportunidade de trabalho, ampliação de
conhecimento, orientação e amizade.
À minha co-orientadora Ana Cláudia Franco e ao seu marido Frans, pela incansável
ajuda, amizade e empenho destinado à realização do trabalho.
À Profa. Ana Paula Ravazzolo pela atenção, dicas e companheirismo durante as etapas do
trabalho e disponibilidade do Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular.
Ao professor Paulo Roehe pelo companheirismo e disponibilização dos Laboratórios de
Virologia do Instituto de Pesquisas Desidério Finamor (IPVDF) e do Instituto de Ciências
Biológicas (ICBS-UFRGS).
Ao CNPq, pelo apoio financeiro em forma de bolsa e a taxa de bancada, sempre bem
vinda, para custeio de parte dos experimentos.
Aos colegas do Laboratório de Virologia da Faculdade de Veterinária da UFRGS, pelo
apoio, amizade e profissionalismo. À Nilzane, Simone, Clarissa, Herbert, Josi, Laura,
Eliana, Márcia, Laurício, Marisa, Fernanda, Flávio, Fabrício, Carla, André, Carine, Kaká,
Lú, Bruna, pessoas muitíssimo importantes e queridas! Ficam lembranças muito boas de
horas felizes que passamos juntos e pela ajuda mútua no trabalho.
À “mãe” Orema, que adota todos de uma maneira especial, e ainda nos auxilia nas tarefas
de esterilização dos materiais. Com certeza ficará uma lembrança carinhosa do convívio
no laboratório!
Aos colegas do grupo de Virologia do IPVDF, Paulinho, Ale, Diógenes, Samuel, Dadá,
Thaís, Fabrício, Eduardo, Marcos, pessoas profissionais, que encontramos no momento
certo e nos animam a seguir em frente! Agradeço a amizade e o convívio com vocês!
À Edna do Laboratório de Micologia/FAVET/UFRGS, pelas “caronas” e “desabafos”,
amizade e carinho!
Ao Marcos, meu grande amor, que nos momentos difíceis me atura e me ilumina!
RESUMO
Atualmente, o Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial de frango.
Doenças respiratórias compreendem o principal problema sanitário e levam à condenação
de um grande número de carcaças, além de perdas na produtividade. Dentre estes
problemas, o vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) tem adquirido grande
importância nos últimos anos, devido a surtos da doença clínica, como em Bastos (SP)
em 2002. Mais recentemente, VLTI vem sendo isolado de galinhas e perus das regiões
Sudeste-Sul do Brasil. Dando continuidade aos trabalhos desenvolvidos no laboratório,
um isolado de peru foi inoculado experimentalmente em galinhas e perus susceptíveis
reproduzindo a doença de forma branda em ambas as espécies. Também foram testados
diferentes cultivos celulares de linhagem CER, CEC-32, HD11, Vero e um primário de
embrião de galinha para a efetiva replicação do ILTV, com o propósito de aumentar o
título viral e a qualidade do DNA viral extraído. O cultivo primário de fibroblasto de
embrião de galinha foi o cultivo mais eficiente na replicação do ILTV dentre todos os
estudados. Isolados de perus e galinhas foram seqüenciados a partir das regiões
genômicas da timidina kinase e glicoproteína C, e alinhados com uma cepa vacinal e
amostras de referência, obtidas no GenBank, demonstrando alta similaridade entre as
amostras, sugerindo uma origem comum recente. Com o propósito de desenvolvimento
de um recombinante com deleção da glicoproteína E, com o objetivo de atenuar a
virulência do ILTV, foi concluído um cassete de clonagem contendo as regiões
flanqueadoras da glicoproteína E e um gene marcador EGFP.
Descritores: Vírus da laringotraqueíte infecciosa, cultivo celular, filogenia, clonagem.
ABSTRACT
Actually, Brazil is the second major poultry producer and exporting country. Respiratory
diseases comprising the most important sanitary problems that leads to condemnation of
many poultry carcass and productivity losses. Between these problems, the
laryngotracheitis virus (ILTV) is displaying great importance following by outbreaks of
the disease, such as that occured in Bastos (SP), 2002, Brazil. Epidemiological studies
showed the presence of antibodies from avian flocks and the existence of carrier birds
without clear clinical signs. More recently, the ILTV has been isolated from chicken and
turkeys of the southest-south of Brazil. Continuing the works at laboratory, a turkey
isolate was inoculated experimentally in susceptible chicken and turkeys and the
reproducible of a mild disease was displayed in both species. Also, different line cell
cultures CER, CEC-32, HD11, Vero and a primary fibroblast cell culture were tested for
the effective propagation of ILTV with the propose to get greatest titers and the quality of
viral DNA extracted. The primary fibroblast cell culture was the most efficient to
replicate ILTV. Turkey and chicken isolates was sequenced from de regions of thymidine
kinase and glycoprotein C and were alignment with a vaccine strain and reference strains
(GenBank) displaying high homology between them, suggesting a common origin. A
cloning cassette containing the regions flanking glycoprotein E and a marker gene EGFP
was constructed with the purpose to develop a recombinant with deletion of the
glycoprotein E.
Key words: Infectious laryngotracheitis virus, cell culture, phylogeny, cloning.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Artigo 1
FIGURE 1- Electron micrograph taken from a pock of a CAM inoculated with
LVV06BR turkey sample displaying one characteristic herpesvirus
particle................................................................................................................................41
FIGURE 2- Micrography of a tracheal chicken sample at day 8 pi (40x magnification).
The arrow indicates one intranuclear inclusion body. …………………………………..41
Artigo 2
FIGURE 1- Phylogenetic three based on neighbor-joining method for the nucleotide
sequences of the TK gene of ILTV isolates (EF552574, EF552578, EF552579,
EF552575, EF552581, EF552580, EF552582, EF552577, EF552576, EF552583,
EF552586, EF552584, EF552585) and the reference strain S83714…………………….57
FIGURE 2- Phylogenetic three based on neighbor-joining method for the nucleotide
sequences of the gC gene of ILTV isolates (EU281341, EU281342, EU281337,
EU281338, EU281340), reference strain U06635 and the vaccine strain……………….57
ANEXO 1
FIGURE 1 - Plasmídeos contendo as regiões flanqueadoras 5`gE e
3`gE..................................................................................................................................106
FIGURE 2 - Esquema do plasmídeo pCR 2.1 com a localização dos sítios de
clonagem..........................................................................................................................106
FIGURE 3 - Esquema da construção do cassete de clonagem para posterior co-
transfecção.......................................................................................................................107
LISTA DE TABELAS
Artigo 1
TABLE 1- Samples identified by protocol number from Laboratório de Virologia
Veterinária (LVV), year of isolation, species from which the samples were collected, and
GenBank accession numbers of nucleotide sequences from amplification
products.…………………………………………………………………………….……39
TABLE 2- Time course of the experimental infection of turkeys (T) and chickens (C)
showing the number of the five birds collected at each time that displayed respiratory
symptoms, or the number of positive birds to ILTV by nested-PCR, virus detection in
chicken and turkey embryo fibroblasts and CAMs of embryonated eggs from both
species. The last line displays the percentage of positive samples throughout the
experiment………………………………………………………………………………..40
Artigo 2
TABLE 1- Identification of the field isolates from chicken and turkey with protocol
number from Laboratório de Virologia Veterinária (LVV), gene analysed, species from
witch the samples were collected, GenBank accession numbers of the nucleotide
sequences and the differences in the nucleotide and amino acid sequences of the TK and
gC genes from field and reference strains. ………………………………………………56
Artigo 3
TABLE 1- Titers of virus strains recovered after three passages of ILTV in different cell
cultures. Titers were expressed in log
10
TCID
50
/50µL. There was no detectable viral yield
in HD11 and CEC-32 cell lines………….………………………………………………73
ANEXO 1
TABLE 1 - Primers utilizados na amplificação das regiões 5’e 3’ flanqueadoras da
gE.....................................................................................................................................105
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
0
C grau Celsius
µL microlitros
pb pares de base
RFLP restriction fragment length polymorphism
ATCC Americam Type Culture Collection
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
MgCl
2
cloreto de magnésio
PCR polymerase chain reaction
pH potencial de hidrogênio
UI unidade internacional
Kb kilobase
pmol picomolar
LTI laringotraqueíte infecciosa
ILTV Infectious laryngotracheitis virus
nm nanômetro
pi pós-infecção
Tris tris (hidroximetil) aminometano
CEO chicken embryo origin
TCO tissue embryo origin
gC glicoproteína C
TK thymidine kinase
CER chicken embryo related cells
HD11 chicken macrophage cell line
Vero African green monkey kidney cells
CEF primary chicken embryo fibroblast cells
CEC-32 avian fibroblast cell line
GaHV-1 Gallid herpesvirus 1
PsHV-1 Psittacid herpesvirus 1
EGFP Enhanced green fish protein
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 10
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................ 13
2.1. Histórico e distribuição geográfica....................................................................... 13
2.2. Importância econômica......................................................................................... 14
2.3. Etiologia................................................................................................................ 14
2.4. Replicação viral.................................................................................................... 15
2.5. Transmissão e latência do VLTI........................................................................... 15
2.6. Patogenia............................................................................................................... 17
2.7. Diagnóstico........................................................................................................... 18
2.8 Vacinas diferenciais e deleção da glicoproteína E de herpesvírus........................ 20
3. ARTIGOS CIENTÍFICOS……………………………………………………….. 22
3.1 Natural infection of turkeys with infectious laryngotracheitis virus……………. 23
3.2 Genetic analysis of glycoprotein C and thymidine kinase genes from Brazilian
strains of infectious laryngotracheitis virus………………………………………….
42
3.3 Comparison of different cell cultures for replication of infectious
laryngotracheitis virus from chickens………………………………………………..
58
4. DISCUSSÃO……………………………………………………………………... 74
5. CONCLUSÕES…………………………………………………………………... 79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………… 80
ANEXOS……………………………………………………………………………. 89
Anexo 1. Deleção da glicoproteína E (gE) do vírus da laringotraqueíte infecciosa
aviária (ILTV)
89
10
1. INTRODUÇÃO
A avicultura brasileira recebe destaque internacional fechando o ano de 2007 com uma
produção superior a 10 milhões de toneladas de carne, e exportações acima de três milhões de
toneladas. Esses resultados de produção elevam o Brasil à posição de segundo maior produtor
mundial. Isso ocorreu devido a uma série de fatores como a implementação de programas de
manejo e qualidade para atender a exigência de diferentes mercados importadores, como a
União Européia e o Japão. Como as exigências são altas para atender o mercado externo e
interno, a avicultura brasileira se beneficia com as políticas adotadas e mão de obra
qualificada. Todavia, a avicultura da carne ficou susceptível às crises internacionais, como a
atual influenza aviária que vem afetando de forma dramática o consumo na Europa Ocidental
e tem causado reflexos severos nas importações do Oriente Médio, contudo demonstrou início
de recuperação em 2006.
As enfermidades respiratórias compreendem o principal problema sanitário e levam à
condenação de um grande número de carcaças, além de perdas na produtividade. O sistema de
criação moderno, baseado em alta densidade, contribui para a deterioração da qualidade do ar
aumentando os riscos da ocorrência de enfermidades tornando seu controle um novo desafio.
A Laringotraqueíte Infecciosa (LTI) é uma infecção aguda do trato respiratório das aves que
causa prejuízos econômicos como a diminuição dos parâmetros produtivos. Esta enfermidade
tem uma importância maior ou menor dentro do cenário de sanidade avícola dependendo de
cada país.
Embora a LTI seja considerada doença exótica no Brasil, já vem sendo descrita desde
1974, em aves com intensa traqueíte hemorrágica. Os sintomas clínicos variam desde uma
forma com apresentação silenciosa até dispnéia e traquéias com intensa hemorragia que
facilitam uma infecção secundária por outros agentes. No Brasil, os últimos relatos oficiais da
presença deste vírus estão restritos à região de Bastos-SP e às aves de postura comercial.
Estudos epidemiológicos demonstram a ocorrência de anticorpos em plantéis avícolas nos
Estados do Rio Grande do Sul, São Paulo, Minas Gerais e a existência de aves portadoras sem
sinais clínicos aparentes incluindo algumas aves criadas em fundo de quintal.
Uma particularidade desta enfermidade é que o controle realizado através de um
programa de vacinação com uma cepa viva atenuada pode servir como fonte de infecção. Por
se tratar de um herpes vírus, o estado de latência no nervo trigêmio ocorre e há reversão de
11
virulência, através de passagens do vírus vivo atenuado, em aves susceptíveis. Por esse
motivo, a vacinação no Brasil é permitida, com autorização do Ministério da Agricultura,
apenas em regiões endêmicas, como a de Bastos-SP.
Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem desenvolvendo estudos sobre isolados
de ILTV provenientes de vários Estados brasileiros. Em um primeiro estudo, um isolado de
ILTV de perus, proveniente de granjas comerciais, foi caracterizado por técnicas de virologia
clássicas. Para um melhor entendimento dos isolados brasileiros, um segundo estudo foi
realizado a partir do seqüenciamento de parte do gene da timidina quinase (TK) e da
glicoproteína C (gC) do genoma do ILTV. O objetivo deste estudo foi encontrar alguma
diferença a nível de nucleotídeos e ou aminoácidos, dentre os isolados de ILTV provenientes
de perus e galinhas. Em um terceiro estudo, analisou-se a susceptibilidade de quatro cultivos
celulares de linhagem, incluindo um cultivo celular primário à infecção pelo ILTV, com o
objetivo de se obter um cultivo celular capaz de replicar o ILTV em altos títulos e para
posterior utilização nos demais experimentos.
A vacinação utilizando cepas vivas atenuadas por múltiplas passagens em ovos
embrionados ou cultivo celular tem sido a principal forma utilizada para controlar a
disseminação do ILTV. Entretanto, o vírus latente pode ser reativado por fatores de estresse e
pode ser transmitido de uma ave portadora para aves susceptíveis, representando um sério
problema e comprometendo esforços para o controle desta enfermidade. Tanto cepas de
campo quanto as vacinais produzem infecções latentes. Nesse sentido, um quarto estudo
almejou o desenvolvimento de um recombinante com deleção da glicoproteína E, com o
propósito de se reduzir a virulência e latência do ILTV, utilizando a técnica de recombinação
sítio dirigida.
Portanto, o presente trabalho é composto por quatro artigos, sendo que o primeiro
descreve o diagnóstico de infecções naturais por ILTV em perus. Para isto, um isolado de
ILTV de perus foi inoculado em galinhas e perus susceptíveis que foram avaliados por
isolamento viral, PCR, seqüenciamento, imunofluorescência e microscopia eletrônica. No
segundo artigo, foi avaliada a diversidade genética entre os isolados brasileiros do ILTV
provenientes de frangos e perus comerciais e de galinha de fundo de quintal. O terceiro artigo
descreve a susceptibilidade de diferentes cultivos celulares para a replicação do ILTV. No
Anexo 1, está descrito um trabalho em que foi concluído um cassete de clonagem contendo as
regiões flanqueadoras da gE e um gene marcador que expressa a proteína verde fluorescente
12
de peixe (GFP), com o objetivo de deleção da glicoproteína E do ILTV de um isolado de
campo, para a produção de uma vírus recombinante.
13
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Histórico e distribuição geográfica
A Laringotraqueite Infecciosa Aviária (LTI) é de uma doença respiratória causada por
um herpes vírus que acomete principalmente as galinhas de postura comercial, de distribuição
geográfica cosmopolita. Pertence à Lista B da OIE e não é uma zoonose. A doença foi
primeiramente descrita em 1920, nos EUA, e assim como a maioria das doenças emergentes
da época, vários nomes foram utilizados para descrever a doença, como bronquite infecciosa,
traqueolaringite, traqueíte infecciosa e difteria aviária. O termo laringotraqueíte foi utilizado
no começo da década de 30 e o nome laringotraqueíte infecciosa aviária foi adotado em 1931
pelo Special Committee on Poultry Diseases of the American Veterinary Medical Association
(COVER, 1996). Nas áreas onde a produção avícola desenvolve-se em larga escala, existe a
expectativa de uma maior prevalência e persistência do herpes vírus responsável pela
laringotraqueíte infecciosa (JORDAN, 1993). A forma suave da doença já foi descrita por
vários pesquisadores na Grã Bretanha, Austrália, EUA e Nova Zelândia (BAGUST & GUY,
1997). A partir de 2001, foi identificada a forma de laringotraqueíte infecciosa (LTI)
Silenciosa no Estado da Geórgia/EUA, cuja freqüência vem aumentando continuamente
(SELLERS, 2004). A LTI tem sido diagnosticada em todos os continentes, inclusive em
países vizinhos ao Brasil, como Argentina, Colômbia e Uruguai. No Brasil, a doença foi
descrita por Hipólito et al. (1974), em aves com sinais clínicos respiratórios e intensa traqueíte
hemorrágica. Vargas (2000) analisou 1271 soros procedentes de plantéis avícolas do Estado
do Rio Grande do Sul e, através do teste de ELISA, constatou que há maior incidência em
aves de postura comercial com possibilidade da presença da forma silenciosa da LTI. Em
2003, Beltrão et al. (2003) isolou o vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV) e confirmou
sua presença em plantéis avícolas do sul do Brasil coletando suabes e amostras de tecido de
traquéia de lotes de galinhas com sinais respiratórios. No ano de 2003, confirmou-se ILTV em
quatro lotes de poedeiras comerciais do Estado de SP através de análises histopatológica,
virológica e sorológica (ITO et al., 2003). Surtos de LTI no Estado de São Paulo foram
confirmados pela técnica de PCR e posterior seqüenciamento do gene P32 do genoma do
ILTV (VILLAREAL et al., 2004). Recentemente, foram detectados anticorpos contra LTI
procedentes de plantéis avícolas de postura comercial, matrizes de corte e aves caipiras, pela
técnica de ELISA indireto, no Estado de Minas Gerais (SILVA & RISTOW, 2007). No
14
Estado de São Paulo, foram analisadas granjas de postura comercial, após dois anos de surto
clínico, onde detectou-se ILTV em isolados de traquéia e conjuntiva através da técnica de
PCR da região do gene da glicoproteína E (CHACÓN et al., 2007).
2.2 Importância econômica
A importância econômica e social da avicultura brasileira coloca o setor em evidência
no âmbito internacional devido a mão de obra cada vez mais qualificada e altos índices de
produção interna e exportação. A indústria avícola brasileira é a segunda maior produtora e
exportadora de carne de frango do mundo (ABEF, 2006). Os desafios respiratórios mais
presentes no campo estão relacionados a causas multifatoriais, envolvendo microrganismos,
agentes imunossupressores e condições ambientais desfavoráveis que levam à condenação de
um grande número de carcaças, além de perdas na produtividade. As enfermidades que
acometem o sistema respiratório são os distúrbios mais freqüentes observados na avicultura.
O sistema de criação baseado em alta densidade de aves por galpão contribui para a
diminuição da qualidade do ar, aumentando os riscos de ocorrência de várias enfermidades,
como o ILTV, tornando seu controle um desafio na atualidade (INOUE, 2005). A LTI tem
adquirido grande importância nos últimos anos devido a surtos da doença clínica, como em
Bastos (SP), em 2002. A LTI pode ser responsável por severas perdas econômicas devido à
alta morbidade e mortalidade, queda na produção de ovos e piora no desempenho dos frangos.
Os prejuízos com as galinhas poedeiras ocorrem nos lotes de início de produção, onde se
observa alta refugagem, ausência de pico de produção e mortalidade (GAMA, 2004).
2.3 Etiologia
O VTLI ou Gallid herpesvirus tipo 1 (GaHV-1) (ROIZMAN, 1982) pertence a família
Herpesviridae, subfamília Alfaherpesvirinae, gênero Iltovirus, sendo capaz de provocar uma
importante doença respiratória nas galinhas que ocorre em todo o mundo. O genoma é
constituído por fita dupla de DNA, com aproximadamente 155 Kb, icosaédrico medindo de 80
a 100 nm de diâmetro, envelopado e possuindo em torno de 48% de resíduos de guanina (G) e
citosina (C) (GUY & BAGUST, 2003). Análises de restrição revelaram que o genoma DNA
de fita dupla é composto por duas regiões, longa (UL) e curta (US), sendo a região US
flanqueada por repetições invertidas (IR e TR) (WILD et al., 1996). O ILTV é sensível aos
agentes lipolíticos e desinfetantes comuns (HANSON, 1991). Onze ORF`s conservadas do
15
ILTV possuem homologia com as glicoproteínas do genoma do herpes vírus simplex tipo 1
(HSV-1) que são gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL e gM (FUCHS et al., 2007).
Recentemente, encontrou-se uma inversão dentro da UL do genoma do ILTV que
também havia sido identificada no genoma do Psittacid herpesvirus 1 (PsHV-1), causador da
doença de Pacheco. A presença de genes específicos para o Gallid herpesvirus 1 (GaHV-1) e
PsHV-1 podem indicar um ramo separado dentro da árvore filogenética dos herpes vírus.
Atualmente, apenas o ILTV está classificado como membro do gênero Iltovirus (DAVISON
et al., 2005). A partir destes estudos recentes, o genoma do PsHV-1 poderá ser agrupado
dentro deste mesmo gênero.
2.4 Replicação viral
A replicação do ILTV tem sido pouco investigada até o momento, entretanto parece
ser similar aos demais alfaherpesvírus assim como o herpes simplex vírus (HSV-1)
(ROIZMAN & KNIPE, 2001). O vírus inicia sua infecção através da adsorção a receptores
celulares específicos, seguido de fusão do envelope viral com a membrana plasmática da
célula hospedeira. O nucleocapsídeo viral penetra no citoplasma celular onde é transportado
ao núcleo por microtúbulos celulares (WILD et al., 1996). O DNA viral chega ao núcleo da
célula hospedeira através de poros nucleares onde ocorre a replicação do genoma e montagem
dos nucleocapsídeos. Os novos nucleocapsídeos formados, migram através da membrana
nuclear e se acumulam em vacúolos no retículo endoplasmático do citoplasma, onde adquirem
o envelope. As partículas envelopadas, por sua vez, saem da célula hospedeira por lise, ou por
fusão da membrana e exocitose (GUO et al., 1993). No entanto, dentre os poucos virions
completos, várias partículas sem nucleocapsídeos são formadas. Provavelmente, estes erros
estruturais são em parte responsáveis pelos baixos títulos do ILTV encontrados nas culturas
de células (FUCHS et al., 2007).
2.5 Transmissão e latência do ILTV
A principal forma de transmissão ocorre através do contato direto de aves com aves
susceptíveis (BAGUST & GUY, 1997). As portas naturais de entrada do vírus são as vias
nasal e ocular, mas também a infecção pode ocorrer por via oral. Após a entrada, segue-se a
fase de replicação viral nos seios nasais, traquéia e pulmões. O vírus pode permanecer latente
no nervo trigêmio ou persistir no trato respiratório como infecção inaparente nas aves
16
portadoras (GAMA, 2004). O vírus é eliminado das aves doentes e/ou portadoras pelas
secreções oronasais, podendo alcançar outras aves susceptíveis pelo ar, fômites, esterco, cama
e trânsito de funcionários pela granja. O período de incubação varia de 6 a 12 dias após
infecção natural, via rota ocular e respiratória, e de 2 a 4 dias após inoculação experimental
via intratraqueal (FUCHS et al., 2007). As aves portadoras podem, freqüentemente, eliminar o
ILTV e esta disseminação pode variar e aumentar de intensidade por estresses como o início
de postura, alta lotação, excesso de calor ou frio, mudança na alimentação, ruídos, alta
concentração de amônia e transporte dentre outros (HUGHES et al., 1989). No surto da região
de Bastos-SP, a disseminação ocorreu de forma rápida entre galinhas de um mesmo galpão e
galpões com aves do mesmo lote (GAMA, 2004).
Assim como outros alfaherpesvírus, o ILTV também causa infecção latente no nervo
trigêmio. Bagust et al. (1986) reportou pela primeira vez a infecção do gânglio trigêmio de
galinhas desafiadas com uma cepa australiana bastante virulenta, após quatro a sete dias de
inoculação. A reativação do vírus latente no nervo trigêmio, reportada por Kaleta et al.
(1986), foi detectada em até 15 meses após a vacinação de um lote na Alemanha. Williams et
al. (1992), com o auxílio da PCR, confirmou que o gânglio trigêmio é o principal sítio de
latência do ILTV. Em 1989, Hughes e colaboradores reportaram a re-excreção do vírus em
galinhas com infecção latente após algum estresse.
A virulência da cepa vacinal, viva atenuada, pode ser aumentada em combinação com
fatores adversos como co-infecção com outros patógenos respiratórios, pouca ventilação, alta
densidade de aves por galpão e por várias passagens do vírus em aves susceptíveis (HAN et
al., 2002). A vacinação com vacinas vivas atenuadas por múltiplas passagens em ovo
embrionado (CEO) ou em cultivo celular (TCO) tem sido a principal forma utilizada para
controlar a disseminação da LTI (GUY & BAGUST, 2003), com exceção do Brasil, pois o
Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) apenas permite a vacinação em
áreas endêmicas, como ocorreu em Bastos-SP. Nos EUA tem se observado o aumento do
número de epidemias de LTI nos últimos anos e se acredita que a causa da maioria dessas
epidemias sejam os vírus derivados das vacinas CEO, que persistem em matrizes de corte e
postura e servem como fonte de infecção para os frangos de corte (DAVISON et al., 2005).
Evidências experimentais demonstram que as cepas vacinais atenuadas, especialmente das
vacinas CEO, podem reverter sua virulência com facilidade após passagens consecutivas em
aves (GUY et al., 1991), ou após recrudecência viral da forma latente (HUGHES et al., 1991
17
WILLIAMS et al., 1992; HAN et al., 2002). Estudos utilizando a técnica de polimorfismo de
tamanho de fragmento de restrição (RFLP), no genoma viral de isolados americanos
indicaram que os mesmos são semelhantes às cepas vacinais provenientes de CEO (OLDONI
& GARCIA, 2007).
Existem, aproximadamente, 2% de aves portadoras de infecção latente nas granjas
com reativação viral por fatores de estresse e outros patógenos imunossupressores. Ambos
isolados de campo e o vacinal têm demonstrado estabelecer infecção latente em galinhas
(BAGUST et al., 1986). Portanto, a imunização com vacina viva atenuada protege as aves
contra a doença clínica em locais endêmicos, entretanto não impede uma nova infecção por
uma cepa de campo virulenta, e a infecção latente indesejada podendo haver uma reativação
viral isolada ou associada a outros patógenos. Alguns países evidenciaram que após a
vacinação contra o ILTV, ocorreram surtos da doença (SCHOLTZ et al., 1994).
2.6 Patogenia
O ILTV pode infectar galinhas, perus experimentalmente infectados (WINTERFIELD
& SO, 1968) e faisões (CRAWSHAW & BOYCOTT, 1982) susceptíveis. A doença afeta
aves de todas as idades, embora na maioria das ocorrências os sinais característicos sejam
observados em aves adultas. A susceptibilidade da infecção decresce com a maturidade, sendo
a idade de 10 semanas e a época de início da produção, os períodos de maior ocorrência da
LTI nas aves (SCHMIDT, 1988). O vírus possui afinidade por epitélio respiratório, replicando
no epitélio da laringe, traquéia e outras membranas mucosas como a conjuntiva, os sinos
respiratórios, sacos aéreos e pulmões.
Através de uma técnica de nested-PCR, referente a região do gene da glicoproteína E
do genoma do ILTV, foram diagnosticadas como positivas para a presença de DNA viral,
isolados de traquéia e conjuntiva detectando infecções clínicas e latentes (CHACÓN et al.,
2007). Rodriguez-Avila et al. (2007) demonstraram que as vacinas atenuadas em CEO e TCO
comparadas possuem um tropismo similar apresentando replicação localizada em conjuntiva
ocular e traquéia. As duas vacinas foram capazes de transmitir o ILTV de aves vacinadas para
aves não vacinadas por contato direto. Rápido e frequentemente foram detectados altos títulos
de vírus em aves vacinadas ou não, sendo que as vacinas de CEO se replicaram mais
rapidamente do que a vacina de TCO.
18
Algumas cepas são altamente citolíticas nesses tecidos, principalmente traquéia,
resultando em severo dano epitelial e hemorragia. A manifestação da doença apresenta-se de
forma aguda caracterizada por dispnéia severa, tosse, expectoração de exsudato muco-
sanguinolento e, em casos severos, morte em 2 ou 3 dias (GAMA, 2004). A taxa de
mortalidade varia de 30 a 70%. A presença do vírus pode ser detectada em tecido traqueal de
6 a 8 dias pós-infecção (ROBERTSON & EGERTON, 1981). Aves com infecção latente não
apresentam sinais clínicos aparentes e podem se comportar como portadoras e disseminar o
vírus para outras aves susceptíveis até 16 meses após a infecção (TURNER, 1972). Achados
microscópicos variam de acordo com o estágio da doença. Ocorre infiltração de células
inflamatórias na mucosa, perda dos cílios do epitélio respiratório com posterior destruição
total do epitélio e vasos sanguíneos da lâmina própria. Corpúsculos de inclusão intranuclear
podem ser encontrados no epitélio apenas nos primeiros dias após infecção (PURCELL,
1971).
2.7 Diagnóstico
Desde o final do ano de 2002, um dos agentes respiratórios mais discutidos em
congressos e simpósios brasileiros é o Gallid herpesvirus 1, responsável pela laringotraqueite
infecciosa. Entretanto, o diagnóstico do ILTV requer uma assistência laboratorial para ser
diferenciado de outras doenças respiratórias e ou infecções secundárias como Pasteurella
multocida, Escherichia coli, Haemophilus paragallinarum, Mycoplasma sp.,
Ornithobacterium sp., pneumovírus aviário, vírus da bronquite infecciosa e vírus da doença
de Newcastle dentre outros agentes, que podem se manifestar sozinhos ou coexistir na mesma
doença respiratória em um determinado momento da vida do lote (GAMA, 2004). O
diagnóstico baseia-se na detecção de corpúsculos de inclusão intranucleares no epitélio do
trato respiratório, isolamento viral, detecção do antígeno viral ou DNA viral em tecidos ou a
detecção de anticorpos através de sorologia. O isolamento viral pode ser feito através da
inoculação de suspensões virais de exudatos respiratório e conjuntival, raspados de traquéia
ou tecidos, na membrana córioalantóide (MCA) de ovos embrionados SPF de 9 a 10 dias de
incubação. Após dois a cinco dias de inoculação, há produção de placas opacas na MCA ou
morte embrionária. Os cultivos celulares primários atualmente utilizados para a propagação
do VLTI incluem o chicken embryo liver (CEL), chicken embryo kidney (CK), chicken
embryo fibroblast (CEF), chicken embryo lung (CEL) e células de linhagem como a African
19
green monkey kidney cells (Vero) (HUGHES & JONES, 1988). Embora o ILTV venha sendo
replicado preferencialmente, em cultivos primários CK e CEL, as cepas de VLTI pouco
patogênicas ou LTI silenciosa não foram capazes de causar efeito citopático nestes
respectivos cultivos nem mesmo em várias células de linhagem, após passagens consecutivas
(SELLERS et al., 2004). Anticorpos específicos para o ILTV podem ser utilizados em
diagnóstico sorológico através das técnicas de vírus neutralização, ágar-gel imunodifusão,
imunofluorescência indireta e enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) (HITCHNER et
al., 1977; JORDAN & CHUBB, 1962; MEULEMANS & HALEN, 1982). A técnica de
ELISA também tem sido utilizada para a detecção de proteínas virais em exudatos de traquéia
(YORK et al., 1988). Entretanto, mais recentemente, a detecção de proteína por teste de
imunoperoxidase e detecção de DNA viral pela PCR convencional ou PCR em tempo real têm
demonstrado ser ótimas ferramentas para a detecção viral (ABBAS & ANDREASEN, 1996;
CREELAN et al., 2006; KIRKPATRICK et al., 2006; SCHOLZ et al., 1994; WILLIAMS et
al., 1992). Em combinação com a técnica de polimorfismo de tamanho de fragmento de
restrição (PCR-RFLP) e o seqüenciamento de DNA viral a partir de uma PCR também
contribuíram para a diferenciação de isolados virais em estudos epidemiológicos e
filogenéticos (CREELAN et al., 2006; KIRKPATRICK et al., 2006). No entanto, o uso
rotineiro de análise por RFLP de genomas virais com objetivos epidemiológicos é limitado
devido à dificuldade de purificação de DNA viral puro em grande quantidade (OLDONI &
GARCIA, 2007). Análises moleculares mais profundas sobre o genoma completo do ILTV
também são prejudicadas pela inexistência de um sistema de cultivo celular ótimo para a
propagação do ILTV (FUCHS et al., 2007).
Mais recentemente, um protocolo de nested-PCR sensível e específico para a região da
timidina kinase foi desenvolvido detectando positividade em isolados brasileiras de galinhas
(BELTRÃO, 2003) e para a região da glicoproteína E (CHACÓN et al., 2007). Em países
onde a vacinação é aconselhada, como nos Estados Unidos, foram utilizados protocolos de
PCR-RFLP com o objetivo de indicar evidências moleculares de que os surtos de LTI
estavam relacionados com isolados vacinais que reverteram virulência após passagens em
aves susceptíveis. (OLDONI & GARCIA, 2007).
20
2.8 Vacinas diferenciais e deleção da glicoproteína E de herpes vírus
Para a prevenção do ILTV, vacinas com vírus vivo têm sido utilizadas por muitas
décadas. Na época da descoberta da LTI, as galinhas eram imunizadas através da inoculação
cloacal de uma cepa virulenta (BRANDLY & BUSHNELL, 1934). Posteriormente, isolados
de ILTV de campo foram atenuados através de passagens em ovos embrionados e cultivos
celulares (SAMBERG & ARONOVICE, 1969). As cepas vacinais obtidas poderiam ser
administradas individualmente via ocular, assim como para aplicação em massa via aerossol
ou pela água de beber (GUY & BAGUST, 2003). A maioria destas vacinas funciona
eficazmente, entretanto, muitas ainda possuem uma virulência residual que pode aumentar
significantemente após passagens em aves susceptíveis e resultar em surtos de LTI
(ANDREASEN et al., 1990; GUY et al., 1990).
Para resolver o problema de reversão da virulência de algumas cepas vacinais, foram
produzidas e testadas, eficazmente, as vacinas inativadas e vacinas de subunidades contendo
glicoproteínas imunogênicas purificadas (BARBOOM et al., 1986; YORK & FAHEY, 1991).
Entretanto, o alto custo de produção não compensaria a imunização em larga escala. Portanto,
o desenvolvimento de vacinas contra LTI contendo o vírus vivo geneticamente modificado
parecia ser mais promissor. Proteínas de envelope viral imunogênicas foram expressadas em
vetores de vírus aviários, como no herpesvírus da doença de Marek e no vírus da varíola
aviária (Bouba aviária), atenuado resultando em uma boa imunização após desafio pelo ILTV
selvagem (SAIF et al., 1994; TONG et al., 2001; DAVISON et al., 2006). Mais uma vez, seria
necessária uma imunização individual que dificultaria a vacinação em massa. Mais
recentemente, estuda-se a geração de mutantes de ILTV atenuados por deleção de genes que
determinam virulência. A infectividade do DNA genômico do ILTV permite a geração de
vírus mutantes através de uma recombinação homóloga com co-transfecção plasmidial, que
carrega a deleção ou inserção desejada. O sucesso desta construção se baseia no
conhecimento dos mecanismos da replicação viral, entretanto este método ainda é prejudicado
pela falta de células de linhagem eficientes para a propagação e manipulação do ILTV
(FUCHS et al., 2007).
Atualmente, quatorze genes do genoma do ILTV foram deletados com sucesso (UL0,
ORF A, ORF B, ORF C, ORF D, ORF E, UL10, UL21, UL23, UL47, UL49.5, UL50, US4,
US5), sendo todos indispensáveis para a replicação viral in vitro, desde que se tenha um
cultivo celular capaz de propagar o ILTV recombinante e produzir placas virais. Portanto,
21
estes genes, aparentemente, não representam ser cruciais para a adaptação nas células
hospedeiras, embora outras funções importantes de infecção em galinhas susceptíveis não
possam ser excluídas (FUCHS et al., 2007).
Um recombinante do ILTV com deleção do gene da timidina kinase diminuiu a
virulência e induziu proteção em galinhas SPF desafiadas com vírus virulento (HAN et al.,
2002). Recentemente, o desenvolvimento de um ILTV mutante gE e gI negativo mostrou uma
redução na capacidade de dispersão viral célula-célula com conseqüente falha na produção de
placas virais (DEVLIN et al., 2006).
A glicoproteína E (gE) dos alfaherpes vírus parece estar associada à virulência e
latência viral. A gE e gI do herpes vírus simplex (HSV) estão associados a eficiente
transmissão neurônio-neurônio do vírus nas sinapses nervosas (DINGWELL et al., 1995).
Mutantes de BoHV gE negativos são avirulentos in vivo e têm sido utilizados como vacinas
protegendo contra o desafio por cepas de campo (REBORDOSA et al., 1996). A deleção da
gE, localizada na região US do herpes vírus bovino tipo 1 (BoHV-1), sugere uma diminuição
da dispersão célula-célula e virulência do vírus. Recombinantes de herpes vírus eqüino tipo 4
(EVH-4) gE e gI negativos, conferiram diminuição da virulência em potros desafiados por
uma cepa de campo (DAMIANI et al., 2000).
As vacinas diferenciais possuem a vantagem de permitir a distinção da resposta imune
induzida por animais vacinados e por animais infectados com vírus selvagem ou de campo
(VAN OIRSCHOT et al., 1999). Além de possibilitar a diferenciação de respostas imunes de
animais enfermos e vacinados, o uso de vacinas diferenciais tem ainda a vantagem de reduzir
a circulação do vírus de campo facilitando o controle das infecções virais.
22
3. ARTIGOS CIENTÍFICOS
3.1 Natural infection of turkeys with infectious laryngotracheitis virus*
* Manuscrito aceito para publicação na forma de artigo original no periódico científico
Veterinary Microbiology.
23
Natural infection of turkeys by infectious laryngotracheitis virus
Cristiana Portz
a,
, Nilzane Beltrão
a
, Thales Quedi Furian
a
, Alfredo Bianco Junior
a
, Marisa Macagnan
a
, Josiane Griebeler
a
, Carlos André Veiga Lima Rosa
b
, Edson Moleta Colodel
c
, David Driemeier
c
,
Alberto Back
d
, Monika Barth
e
, Cláudio Wageck Canal
a*
a
Laboratório de Virologia, Faculdade de Veterinária da UFRGS, Av. Bento Gonçalves, 9090,
Bairro Agronomia, Porto Alegre, Brazil.
b
Laboratório de Análises Genéticas-DNA, Centro de Ciências Agroveterinárias da UDESC,
Lages, Santa Catarina, Brasil.
c
Laboratório de Patologia Veterinária, Faculdade de Veterinária da UFRGS, Av. Bento
Gonçalves, 9090, Bairro Agronomia, Porto Alegre, Brasil.
d
Centro de Diagnóstico Veterinário Brasil Sul Ltda, Mercolab, Cascavel, Paraná, Brasil
e
Laboratório de Ultra-estrutura viral do Instituto Oswaldo Cruz IOC/FIOCRUZ, Rio de
Janeiro, Brasil.
* Corresponding author. Tel.: +55 51 3308 6926; fax: +55 51 3308 7305; E-mail address:
claudio.canal@ufrgs.br
Abstract
The infectious laryngotracheitis virus (ILTV) is an important respiratory pathogen of chickens
that also infects pheasants and peafowl. Epidemiologically non-related commercial turkey
flocks with clinical signs such as tracheitis, swollen sinuses, conjunctivitis and expectoration
of bloody mucus were examined for the presence of the virus. Laboratory ILTV detection was
performed by virus isolation in embryonated eggs and cell cultures, PCR and sequencing of
amplification products, histopathology, indirect immunofluorescence and electron
microscopy. One ILTV turkey isolate was also experimentally inoculated into susceptible
24
chickens and turkeys, reproducing a mild respiratory disease. This is the first description of
natural infections with ILTV in turkeys.
Keywords: Infectious laryngotracheitis virus, turkey, avian pathology, diagnosis
1. Introduction
The infectious laryngotracheitis virus (ILTV, Gallid herpesvirus 1) is found in intensive
broiler production areas and causes respiratory disease in chickens worldwide (Guy and
Bagust, 2003). Classified as a member of the subfamily Alphaherpesvirinae of the family
Herspesviridae, it is the only current member of the genus Iltovirus (Johnson and Tyack,
1995). ILTV infections of chickens in Brazil were reported based on serological, virological
and histopathological tests (Beltrão et al., 2003; Silva and Ristow, 2007). The isolation of
ILTV from field material has been described using embryonated chicken eggs inoculated onto
the chorioallantoic membrane (CAM) (Hughes and Jones, 1988) and in primary kidney and
liver cell cultures of chickens or chicken embryos (Chang et al., 1960; Guy and Bagust,
2003). More recently, DNA detection by conventional polymerase chain reaction (PCR) or
real-time PCR have become the methods of choice for virus diagnosis (Scholtz et al., 1994;
Beltrão et al., 2004; Villarreal et al., 2004; Creelan et al., 2006; Chacón et al., 2007; Fuchs et
al., 2007). ILTV has a very narrow host range in vivo, and only domestic chickens, pheasants
and peafowl have been described as natural hosts (Guy and Bagust, 2003; Crawshaw and
Boycott, 1982). Although experimental infection of the upper respiratory tract of young
turkeys was described by Winterfield and So (1968), no cases of natural infection were found
in this species so far. In our study, natural turkey infections were diagnosed by clinical signs,
25
PCR, virus isolation in CAM, electron microscopy and histopathology, and the disease was
reproduced into susceptible chickens and turkeys.
2. Materials and Methods
2.1. Samples
From 2002 to 2005, pools of samples from four turkey commercial broiler flocks were
collected by veterinarians and sent to our laboratory to be analyzed (Table 1). Turkey samples
were obtained from flocks that were about 100 days old and had respiratory signs that
included nasal discharge, depression, marked dyspnea and tracheitis. Some of the samples
showed hyperemic and hemorrhagic tracheas. A vaccine sample (Laryngo-vac, Solvay
Animal Health Inc., IA, USA) was used as a positive control. The vaccine was imported in
1994 for research purposes with permission of the Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (Brazilian Department of Agriculture). A vaccine for turkey herpesvirus
(HVT) of serotype 3 Marek’s disease virus (Biovet, Brazil) was used as a negative control.
Also, the samples were tested for Marek`s disease viruses by real-time PCR (Islam et al.,
2004), avian leukosis virus by PCR (Garcia et al., 2003), avipoxvirus (Fallavena et al., 2002)
and reovirus was commercially performed by Simbios Biotecnologia (Canoas, RS, Brazil).
Each pool of tracheas was slit longitudinally, and the epithelium was scrapped off together
with associated mucus using a scalpel blade. Scrapings were placed in 1.5 mL PBS with
antibiotics. The mixture was vortexed vigorously and centrifuged to clarify the supernatant.
These samples were aliquoted and stored at -70
0
C until use.
26
2.2. Virus isolation in CAM
Specific pathogen-free embryonated eggs of chickens and commercial turkeys after nine days
of incubation were inoculated with 0.2 mL of the samples, which was dropped onto the
chorioallantoic membrane (CAM). Each sample was grown at least three times in CAM from
both species to increase the titer of the virus. CAMs were examined for pock formation
(opaque plaques on the CAM) at five to seven days post inoculation. The embryos that died
within the first 24 hours were classified as nonspecific deaths.
2.3. DNA amplification and sequencing
Virus DNA was extracted by phenol-chloroform method and was performed directly from
field samples or from the experimentally infected birds. The PCR using the external primers
was performed as described previously (Abbas et al., 1996). The internal primers were
selected to amplify a 647 bp fragment with the following primer sequences:
5`ACGATGACTCCGACTTTC 3` (positions 4501-4519 from the sequence determined by
Griffin and Boursnell, 1990) and 5` CGTTGGAGGTAGGTGGTA 3` (positions 5112-5130).
The PCR reaction mixture contained 10 mM Tris-HCl pH 8.5, 50mM KCl, 2.5 mM MgCl
2
,
200 µM of each dNTP, 20 pmol of each primer, 1 unit of Taq DNA polymerase (Cbiot, Porto
Alegre, Brazil) and 50ng of DNA template in a final volume of 25 µL. The nested-PCR
cycling program included 30 cycles of denaturing at 95
o
C for 1 minute, annealing at 50
o
C for
1 minute, extension at 72
o
C for 1.5 minutes and a final extension cycle at 72
o
C for 10
minutes.
The vaccine sample and two samples of each field sample from positive turkey flocks were
sequenced. The 647 bp amplification products from the region of the thymidine kinase gene
were purified with GFX DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences,
27
Sweden). Both strands were sequenced with a reaction containing 80 ng of target DNA and
five pmol of forward and reverse primers. Product sequences were resolved on an automatic
sequencer (ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, CA, USA). The
resulting sequences were assembled and analyzed using the BioEdit software package (Hall,
1999) and the NCBI’s (http://www.ncbi.nlm.nih.gov
) analysis tools. They were compared
with the related sequence from strain 632 (Keeler et al., 1991), GenBank accession number
S83714.
2.4. Experimental infection
One ILTV isolate from turkeys (LVV06BR) was chosen to infect susceptible chickens and
turkeys to test whether the disease was reproducible and whether both species were
susceptible. The virus was subsequently grown five times in CAMs of nine-day-old turkey
embryos to increase the titer for the experimental infection. Eighty 9- to 10-week-old female
commercial turkeys and eighty 7- to 8-week-old commercial chickens were kept in isolation
rooms and received a standard grower diet throughout the experiment. One group of 30
chickens and 30 turkeys were used as negative controls and received 0.2 mL of PBS
intratracheally. Egg infective dose (EID
50
) based on pock formation was 0.2 x 10
4
(Reed and
Muench, 1938). A 0.2 mL viral inoculum was inoculated in each group of turkeys and
chickens intratracheally. On post-inoculation (pi) days 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20,
five randomly selected infected birds (chickens and turkeys) and three control birds were
killed in accordance with accepted veterinary practices, and their tracheas were individually
collected and analyzed. Birds were examined daily for the presence of clinical signs. Samples
were prepared from the tracheas as described above and were inoculated into the CAM of the
respective species eggs for virus recovery. Some of the pocks were further analyzed under
28
electron microscopy. The tracheal samples were also tested for the presence of virus DNA by
nested-PCR and virus isolation in fibroblast cell cultures, and sections of the medial portion of
the tracheas were examined by histopathology.
2.5. Isolation in fibroblast cell culture
Primary fibroblast cell cultures were prepared from nine-day-old chicken and turkey embryos.
The cells were grown into 96 well plates at 37
0
C, using an initial concentration of 7 x 10
4
cells/well in Eagle’s minimal essential medium (E-MEM) with 200 IU/mL of penicillin, 20
mg/mL of Streptomycin and supplemented with 5% fetal calf serum. Monolayers were grown
to 90% of cell confluence and were inoculated with scraped tracheal supernatants from
experimentally infected turkeys and chickens for virus isolation with four repetitions.
Adsorption was allowed to occur for 40 minutes at 37
0
C, and medium with 2% of fetal calf
serum was completed to 200 µL. The plates were incubated at 37
0
C in a CO
2
incubator. The
cells were monitored daily during 96 hours for the development of viral cytopathic effect
(CPE) using an inverted microscope (Carl Zeiss, Germany).
2.6. Indirect immunofluorescence
Monolayers of chicken and turkey embryo fibroblast cells were inoculated with the scraped
tracheal supernatants of experimentally infected chickens and turkeys. After incubation for 24
h at 37
o
C, the cell monolayers were fixed with methanol and acetone (1:1) for 10 minutes at
4
o
C. A monoclonal antibody for ILTV gC (Veits et al., 2003) (BFAV Insel Riems, Germany)
was diluted (1:100) in PBS, pH 8.5, and subsequently incubated with the cells for 1 hour.
Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated rabbit anti-mouse IgG antibodies (DAKO,
Germany) was diluted (1:80) in PBS, pH 8.5, and incubated with the cells for one hour. After
each step, the cell monolayers were washed three times for five minutes with PBS, pH 8.5.
29
The stained cells were examined with a fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany,
200X).
2.7. Histopathology
A transverse medial section of each trachea from experimentally infected chickens and
turkeys was fixed in 10% formalin and embedded in paraffin. The cross-sections were stained
with hematoxylin and eosin for light microscopic analysis to detect intranuclear inclusion
bodies and histological changes.
2.8. Electron micrographs
The pocks produced by inoculation of the LVV06BR turkey isolate and the vaccine sample in
CAMs were cut off, centrifuged and fixed with PBS-1% glutaraldehyde. One drop of each
sample was applied to collodium-carbon coated grids and stained with 2% phosphotungstic
acid (PTA), pH 7.2, and was examined under transmission electron microscopy (Zeiss-900,
Carl Zeiss, Germany) for virus morphology characterization.
3. Results
3.1. Field samples
The presence of viral DNA was confirmed in at least one pool of field tracheal turkey samples
from each flock producing a fragment of 647 bp. GenBank accession numbers EF552574;
EF552576; EF552577; and EF552579 were assigned to the sequenced fragments (Table 1).
All sequenced amplification products and the vaccine (GenBank accession number
EF552581) showed 100% nucleotide similarity with the 632 strain (Keeler et al., 1991). The
30
real-time PCR for detection of Marek`s disease viruses and the PCR for detection of avian
leukosis virus, reovirus and avipoxvirus were negative.
The electron micrographs of the vaccine and LVV06BR samples (Figure 1) under
transmission electron microscopy revealed characteristic herpesvirus particles.
3.2. Experimental infection
Turkeys and chickens experimentally infected with ILTV obtained from turkeys showed mild
respiratory signs that began 48 hours pi. Turkeys showed depression and dyspnea beginning
on day eight pi, and the infected chickens showed less pronounced respiratory signs from day
six to day 16 pi. One of the inoculated chickens died on day 12 pi, and examination showed a
hyperemic trachea and exudate. Gross findings were mild hyperemia and mucus secretion that
were observed in tracheas from day six to ten pi. After this acute phase, no respiratory signs
were observed after 16 days pi. On day six and eight pi, virus isolation on CAM and nested-
PCR were positive for ILTV in both species. Nested-PCR and virus isolation detected the
virus from day 2 until day 20 pi in both species.
Virus isolation in fibroblast cell cultures of turkey embryos was positive in 84% of the
samples from turkeys and in 75% of the samples from chickens. Virus isolation in fibroblast
cell of chicken embryos was positive in 70% of the chicken samples and 84% of the turkey
samples. CPE was observed earlier in fibroblast cell cultures of chicken embryos (18-24 h)
than in turkey fibroblast cell cultures (24-36 h). No control birds had abnormal respiratory
signs or lesions, and the virus was not detected in any samples. The indirect
immunofluorescence technique was able to detect virus in the vaccine and field samples
(Table 2).
31
Histopathological examination detected inclusion bodies in some of the experimentally
infected tracheal samples. Microscopically, lesions in turkey tracheas were less severe than in
chickens. Traqueas from experimentally infected turkeys displayed only mononuclear
infiltration and necrosis. Gross findings in the tracheas included hyperemia and desquamation
of the lumen. Mixed inflammatory cell infiltration, syncytial cells and eosinophilic
intranuclear inclusion bodies were also found. Intranuclear inclusion bodies were only found
in two chicken epithelial tracheal cells on days eight and ten pi (Figure 2). On day twelve pi,
the histological lesions were not characteristic, and only necrosis was seen.
4. Discussion
Only chickens and pheasants have been described as natural hosts for ILTV so far (Guy and
Bagust, 2003). Although turkeys do not seem to be infected unless experimentally challenged
(Winterfield and So, 1968), some respiratory signs compatible with ILT have been observed
in commercial turkey operations in Brazil. In this study, the natural ILTV infections in
different commercial turkey flocks was confirmed by nested-PCR, electron microscopy, virus
isolation in CAMs, fibroblast cell cultures, and indirect immunofluorescence.
The purpose of sequencing was to confirm the specificity of the amplification products
because the ILTV TK gene is conserved within the species (Griffin and Boursnell, 1990),
which makes it more appropriate for diagnosis than for phylogenetic studies. The sequenced
amplification products from turkeys showed 100% similarity with strain 632 (Keller et al.,
1991), which indicates that they might have a common origin. Also, this high homology with
the sequence retrieved from GenBank precluded the classification of the turkey isolate as a
distinct virus species.
32
The evaluation of the molecular diversity of turkey and chicken strains using less conserved
regions of the genome may identify whether turkey strains are in fact chicken strains that may
cross infect turkeys or whether they are circulating in the turkey population for a longer
period. The experimentally inoculated turkey sample showed characteristic herpesvirus
particles under electron microscopy. Since herpesvirus from turkey (HVT) has the same
appearance in electron micrograph, this hypothesis was discarded using a specific real-time
PCR protocol to detect HVT.
The experimental infection of turkeys and chickens with one strain isolated from turkeys
determined that this virus is pathogenic for both species, and may indicate that this virus has a
chicken origin. The infected turkeys had mild respiratory signs, such as swelling of the infra-
orbital sinuses, nasal discharge and mild tracheitis. The infected chickens had less pronounced
and earlier respiratory signs. The turkey isolate appears to be of low pathogenicity and to
cause mild respiratory signs in experimentally infected turkeys and chickens. Clinical signs
were also not observed after seven days pi in chickens experimentally infected with a low
pathogenic ILTV strain (Sellers et al., 2004).
Nested-PCR and virus isolation in fibroblast cultures from experimentally inoculated chickens
and turkeys were more sensitive than isolation in embryonated eggs to detect ILTV. Abbas
and Andreasen (1996) reported that PCR was less sensitive than virus isolation, but more
sensitive than histopathology. Virus isolation requires infectious viral particles, whereas PCR
requires ILTV DNA. Therefore, PCR would be expected to have at least the same sensitivity
as virus isolation. Nested-PCR showed to be a rapid and sensitive technique for ILTV
diagnosis.
The findings of indirect immunofluorescence in fibroblast monolayers with CPE confirm its
association with the presence of ILTV. Although fibroblast cell cultures of chicken embryos
33
were a sensitive method to detect ILTV when compared with embryonated eggs in our study,
they were previously described as poor substrates for ILTV propagation (Schnitzlein et al.,
1994). Other pathogens can induce the pock lesions in the CAM used for detection of ILTV
after the primary isolation and experimental infection. Avian leukosis virus, reovirus and
avipoxvirus were not detected by the PCR protocols used in these samples, what turns them
unlikely to be the cause of the pocks.
Histopathological findings and indirect immunofluorescence confirmed the presence of ILTV
in the experimentally infected turkey samples. Variable degrees of necrotizing tracheitis and
infiltration of the mucosa with mixed inflammatory cells were seen in both species, but were
more severe in chickens than in turkeys. Eosinophilic intranuclear inclusion bodies were
found in two chickens and in none of the turkey tracheal sections. These findings were similar
to those reported for the mild form of the disease (Russell and Turner, 1983; Timurkaan et al.,
2003). Sellers et al. (2004) also reported the absence of characteristic histopathological
lesions, as syncytia or inclusions, in the mild form of the disease. Some authors reported that
inclusion bodies are present only in the early stages of infection, that is, one to five days pi
(Purcell, 1971; Guy et al., 1991; Vanderkop, 1993) and that histopathologic detection of
inclusion bodies was a specific method for the diagnosis of ILTV infection when compared
with virus isolation although its sensitivity was lower (Guy et al., 1992). The signs caused by
ILTV infection are similar to those caused by other respiratory pathogens of chickens, such as
Newcastle disease virus, infectious bronchitis virus, Mycoplasma sp., Haemophilus sp., and
Ornithobacterium rhinotracheale (Scholz et al., 1994). Pasteurella multocida was also
recovered from one of the naturally infected turkey flocks. As Pasteurella multocida is a
respiratory pathogen of turkeys, the severity of the clinical signs of the naturally infected
turkey flocks might be explained by co-infections with other respiratory pathogens. Low
34
virulent strains can also cause ILT outbreaks under field conditions when combined with
predisposing factors, such as stress, co-infection with other respiratory pathogens, and poor
ventilation (Han and Kim, 2001).
This study reported on the first detection of ILTV in naturally infected turkey flocks. Further
studies should identify the origin of the turkey virus detected in this study and determine the
prevalence and economic impact of the disease in the turkey industry. These data will be
essential to determine the need to control the disease in commercial turkey flocks.
Acknowledgements
Financial support was provided by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) and Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Sul
(FAPERGS).
35
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39
Table 1
Samples identified by protocol number from Laboratório de Virologia Veterinária (LVV),
year of isolation, species from which the samples were collected, and GenBank accession
numbers of nucleotide sequences from amplification products.
Protocol
number
Year of
isolation
Species Genbank
accession No.
LVV03BR 2005 Turkey EF552574
LVV06BR 2002 Turkey EF552576
LVV07BR 2005 Turkey EF552577
LVV09BR 2002 Turkey EF552579
vaccine ----- Chicken EF552581
40
Table 2
Time course of the experimental infection of turkeys (T) and chickens (C) showing the
number of the five birds collected at each time that displayed respiratory symptoms, or the
number of positive birds to ILTV by nested-PCR, virus detection in chicken and turkey
embryo fibroblasts and CAMs of embryonated eggs from both species. The last line displays
the percentage of positive samples throughout the experiment.
Days post
inoculation
Respiratory
Symptoms
(dyspnea,
depression)
Detection of
virus DNA by
nested-PCR
Detection of
virus in chicken
embryo
fibroblast
Detection of
virus in turkey
embryo
fibroblast
Detection of
virus in CAMs
Species T C T C T C T C T C
2
0 0 1 1 1 1 1 1 0 0
4
0 0 3 2 2 3 3 3 0 0
6
0 1 3 4 5 4 5 4 1 0
8
1 2 5 5 5 4 5 4 3 2
10
3 2 5 5 5 5 5 5 3 4
12
4 3 5 5 5 5 5 5 2 3
14
5 3 5 5 5 5 5 5 1 2
16
5 1 4 5 5 3 5 3 1 2
18
2 0 4 5 5 3 4 3 0 0
20
0 0 3 2 4 2 4 3 0 0
General
percentage
40 24 76 78 84 70 84 75 26 25
41
Figure captions
Figure 1: Electron micrograph taken from a pock of a CAM inoculated with LVV06BR
turkey sample displaying one characteristic herpesvirus particle.
Figure 2: Micrography of a tracheal chicken sample at day 8 pi (40x magnification). The
arrow indicates one intranuclear inclusion body.
42
3.2 Genetic analysis of glycoprotein C and Thymidine kinase genes from Brazilian
isolates of infectious laryngotracheitis virus*
* Manuscrito a ser submetido na forma de artigo original no periódico científico Vírus
Genes.
43
GENETIC ANALISYS OF GLYCOPROTEIN C AND
THIMIDINE KINASE GENES FROM BRAZILIAN ISOLATES
OF INFECTIOUS LARYNGOTRACHEITIS VIRUS
Cristiana Portz
a 1
, Herbert Rech
a 1
, Nilzane Beltrão
b
, Carlos André Lima Rosa
c
, Giancarlo
Pasquali
d
, Cláudio Wageck Canal
a
a
Laboratório de Virologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do
Sul (UFRGS), Av. Bento Gonçalves, 9090 - Agronomia CEP: 91540-000, Porto Alegre, Rio
Grande do Sul, Brasil. Telephone: +55 51 3308 6926, Fax: +55 51 3308 7305.
b
Centro de Diagnóstico Veterinário Brasil Sul Ltda, Mercolab, Cascavel, Paraná, Brazil
c
Laboratório de Análises Genéticas-DNA, Centro de Ciências Agroveterinárias, UDESC,
Lages, Santa Catarina, Brazil
d
Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia do Instituto de Biociências, UFRGS,
Porto Alegre, RS, Brazil
1
Both authors contributed equally to this work.
Running title: laryngotracheitis virus genetic analysis
Key words: Gallid herpesvirus 1, avian laryngotracheitis virus, turkey, chicken, genotyping
To whom proof should be sent: Cláudio Wageck Canal; e-mail: claudio.ca[email protected]
Members of the editorial board as suggested: I. Davidson (Israel) and Y. Shtram (Israel)
44
Abstract
Infectious laryngotracheitis viruses (ILTV) were isolated from Brazilian chicken and turkey
flocks with clinical signs of respiratory disease. Fragments of the thymidine kinase (TK)
and glycoprotein C (gC) genes of the ILTV genome were amplified by PCR and sequenced.
The sequences from field isolates, a vaccine strain and previously published sequences
were compared. The TK and gC genes from Brazilian isolates displayed over than 99%
similarity and the nucleotide changes did not interfere in the amino acids characteristics.
From these results, is possible to conclude that ILTV Brazilian isolates are closely related
between them and with strains from other countries.
45
Introduction
Infectious laryngotracheitis (ILT) is an acute viral respiratory disease of worldwide
distribution that affects growth and egg production, leading to economic losses in the
poultry industry [1]. The causative agent is the Gallid herpesvirus 1 or infectious
laryngotracheitis virus (ILTV) that is classified in the subfamily Alphaherpesvirinae of the
family Herpesviridae [2]. Susceptible hosts to ILTV infection were restricted to chicken,
pheasants and peafowl [4]. Among avian hosts, the herpesviruses also tend to be species
specific with respect to susceptibility, pathogenicity and virulence. Turkey infection was
described only by experimental infection [5]. ILTV infections of chickens in Brazil were
reported based on serological, virological and histophatological tests [3].
The thymidine kinase gene (TK) is located in the unique long genome region (UL23) of the
virus and is not essential for virus replication in tissue culture and was described as being
associated with virulence and reactivation from the latent state [6]. It has been described as
a conserved gene, what turns it more appropriate for diagnosis than for genotyping
purposes [13].
The glycoprotein C gene (UL44) is located in the unique long genome region [6], and is
either nonessential for replication in vitro [7]. Glycoprotein C, detected in the envelope of
purified virions [8], usually plays an important role during initial virus attachment by
binding to heparin sulfate chains of proteoglycans at the host cell membrane [9, 10]. The
gC gene of BoHV-1 has high degree of variability along its N-terminal region and has often
been envisaged as a target for the development of type-differential tests [11].
46
Comparison of genes between field isolates and the vaccine strain of ILTV can be applied
to characterize the strains and to verify the involvement of ILTV vaccine strains in the
outbreak of disease.
The present study aimed to sequence and analyze the TK and gC genes from field Brazilian
isolates in order to investigate the genetic diversity within these regions and to compare
them with a vaccine strain and ILTV field strains, previously published as [13].
47
Materials and Methods
Samples
Between the years 2002 and 2006 pools of tracheas from fourteen commercial breeders
were collected by veterinaries and submitted to our laboratory to be analyzed (Table 1).
One of the isolates (LVV08BR) was collected from free-range chickens. Turkey isolates
were obtained from flocks with approximately 100 days old exhibiting respiratory sings
including nasal discharge, depression, dyspnea and tracheitis. The isolates were collected
from chickens displaying a mild to severe respiratory disease with hyperemic and
hemorrhagic tracheas. A vaccine strain (Solvay Animal Health, Inc., IA, USA) was used as
a positive control and was either sequenced. The vaccine was imported in 1994 for research
purposes with permission of the Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.
Sequences comprising the same genome regions found in GenBank, from TK genome
region, with the accession numbers S83714, D00565, DQ522949, DQ785400, DQ786401
,
and from gC genome region, U06635, were compared with Brazilian isolates.
Laboratory procedures, viral DNA amplification and sequencing
Each pool of tracheas was slit longitudinally and, using a scalpel blade, the epithelium was
scrapped off together with associated mucus. The scrapings were placed in a total of 1.5
mL of phosphate buffered saline (PBS) with antibiotics. The mixture was vigorously
vortexed and centrifuged to clarify the supernatant. Virus DNA extraction was performed
directly from the clinical samples by phenol-chloroform procedure as described previously
[3]. The external primers were previously described [14]. The internal primers
48
(5`ACGATGACTCCGACTTTC 3` and 5` CGTTGGAGGTAGGTGGTA 3`) were selected
to amplify a 647bp fragment.
The PCR reaction mixture contained 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM
MgCl
2
, 200 µM dNTP of each nucleotide, 0.5 µM of each primer, 1 unit of Taq DNA
polymerase (Cbiot, Porto Alegre, Brazil) and 1 µl of DNA sample in 25 µl of reaction final
volume. The nested-PCR cycling program included 30 cycles of denaturing at 95
o
C for 1
minute, annealing at 50
o
C for 1 minute, extension at 72
o
C for 1.5 minutes and a final
extension cycle at 72
o
C for 10 minutes.
In order, two set of primers were selected based on a published DNA sequence of the gC
gene (GenBank accession number U06635). The selected primers were an external primer
pair 5’-GAAACTGCCTTCGCCGAGC-3’ (bases 300 to 318, sense) and 5'-
GCCAAGCGCTTCAACACTTAAGT-3’ (bases 1262 to 1284, antisense) and an internal
primer pair 5’-GATCTACATTCCACCGAGCAACCG-3’ (bases 351 to 374, sense) and
5’-ATGGTGGGTTAATTCCATCTTCACC-3’ (bases 1036 to 1060, antisense). The PCR
reaction mixture contained 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl
2
, 200
µM dNTP of each nucleotide, 0.5 µM of each primer, 1 unit of Taq DNA polymerase
(Cbiot, Porto Alegre, Brazil) and 1 µl of DNA sample in 25 µl of reaction volume. The
condition for PCR reaction was: 1 cycle of 95
o
C for 5 min, followed by 35 cycles of 95
o
C
for 1 minutes, 58
o
C for 1 minutes and 72
o
C for 1.5 minutes and a final extension of 72
o
C
for 10 minutes. The internal amplification product was 709 bp. All amplifications
were
performed with a Perkin Elmer GenAmp PCR System 2400 thermocycler. The 647 bp
amplification products from TK gene and the 709 bp amplification products from the gC
49
gene were purified with GFX DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences,
Sweden).
Both strands were sequenced in a reaction containing 80 ng of target DNA and 5 pmol of
forward and reverse primers. Product sequences were resolved on a MegaBACE automatic
sequencer (GE Healthcare, Canadian). The obtained nucleotides sequences were assembled
and analyzed using the BioEdit software package [15] and the NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nith.gov
) analysis tools. The phylogenetic relationship between these
sequences was performed by Mega3 [16].
50
Results
Analysis of the nucleotide and amino acid sequences of the TK gene
The resulting sequences were assembled with GenBank accession numbers assigned on
Table 1. Two groups of field isolates from TK gene were performed considering three
nucleotides changes. The four turkey isolates (LVV03BR, LVV06BR, LVV07BR,
LVV09BR) were included in the group 1 with other chicken isolates (LVV04BR,
LVV08BR, LVV11BR, LVV13BR) and the vaccine strain. The group 2 comprises only
chicken isolates LVV01BR, LVV02BR, LVV05BR, LVV10BR. The nucleotide sequences
of TK gene of ILTV from group 1 were highly similar to the reference strains (S83714,
DQ522949 and D00565), the vaccine strain, all the turkey field isolates (LVV03, LVV06,
LVV07, LVV09), free-range chicken field isolates (LVV08) and three chicken field
isolates (LVV04, LVV11, LVV13). The reference strains from TK gene were assembled
with the sequences from group 1 and showed three different nucleotides from the TK
region analyzed comparing with group 2 (T
283
→ C, G
301
→ A and A
754
→ C). These
nucleotide differences did not change the characteristic of the deduced amino acids. The
reference sequences DQ786400 and DQ786401 assembled in group 2 have only one change
of nucleotide at position 754 and none of the sequences displayed three additional
nucleotides at positions (C
462
; G
463
; C
469
) as showed by the reference strain D00565.
51
Analysis of the nucleotide and amino acid sequences of the gC gene
A turkey field isolate (LVV06BR), four chicken field isolates (LVV11BR, LVV13BR,
LVV14BR, LVV15BR), and the vaccine strain amplified a fragment of 709 bp from the
glycoprotein C region by nested-PCR. The nucleotide sequences were analyzed and aligned
with the homologous sequence from the strain 632 (GenBank accession number U06635).
The nucleotide and deduced amino acid sequences differences are summarized in Table 1.
All the sequences displayed 100% homology with the sequence U06635, with exception of
the sample (LVV13BR). The 632 strain (U06635) sequence displayed three different
nucleotides from the gC region analyzed (C
612
→ T, G
652
→ A e A
900
→ G). Furthermore,
the other nucleotide mutations were localized before the start codon and did not cause
alteration in translation.
52
Discussion
In the present study, the genetic diversity of ILTV isolates that circulate in Brazilian
commercial chicken and turkey flocks was analyzed by amplification and sequencing of the
thymidine kinase (TK) and glycoprotein C (gC) genome regions. All the tracheal isolates
analyzed came from regions with high density of commercial breeder flocks in Brazil
suggesting that the disease is present between the regions. Free-range chicken infected with
ILTV also determine an important factor to the spreading of the disease trough the poultry
industry. Antibodies to ILTV were also detected in free-range chickens with or without
clinical signs at Minas Gerais State, Brazil [17]. The field turkey sequences from the two
regions displayed high similarity with chicken isolates and vaccine strain. It is difficult to
assess weather the ILTV is being reintroduced on the farm after clean out and a sporadic
outbreaks occur. Also exist the suspect that low pathogenic strains of ILTV, witch caused
weak clinical signs, could cause the disease in the field conditions by a combination of
specific factors such as co-infection of respiratory diseases [12].
Through the results, the nucleotide sequence analysis from the TK and gC regions
displayed high similarity with the related published sequences. The sequences of the TK
gene from the vaccine strain, field isolates from group 1 and the reference strains displayed
100% of similarity what does not rule out that the field isolates could be originated from a
vaccine strain through the reversion of virulence already described by other authors [18,
19]. Other genes than the two described in the present work can be involved with virulence,
such as ribonucleotide reductase, glycoprotein E and glycoprotein I [20].
The nucleotides changes analyzed from TK and gC regions did not interfere in amino acids
characteristics. In addition, the TK genome region evaluated was described as highly
conserved among the avian herpesvirus [13]. Despite the high degree of similarity between
53
the sequences from TK gene, the gC gene was chosen because it has been described as less
conserved between BoHV-1 strains. However, gC gene from ILTV is not too much studied,
the alignment of the turkey and chicken field isolates displayed high similarity with
reference strains. A comparison of the TK gene sequence determined from strain 632 [13]
with that subsequently published for the Thorne strain of ILTV reveals only one area of
divergence. This difference corresponds to a change in the primary amino acid sequence
from Arginine-Arginine to Proline- Valine at amino acid position 101 that can induce
changes in virus virulence [13].
From these results, the evaluation of molecular diversity of the Brazilian field isolates could
also involves the study of other regions of the ILTV genome. In order, other techniques as
RFLP-PCR are largely used to compare field with vaccine strains, but in Brazil the vaccine
practice is only allowed in outbreaks [12, 22-24] and turn difficult to relate the involvement
of the vaccine strains with the field strains diagnosed by research groups in different States
of Brazil [3, 17, 25]. Also, it was difficult to purify quality viral DNA [22]. This
diagnostics tools are important to improve sanitary programs and establish a continuous
program to determine the incidence, prevalence, the economic impact of this disease in the
poultry industry.
Acknowledgements
The financial support of this study was provided by Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação de Amparo a Pesquisa
do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS).
54
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Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2000, p. 104.
56
Table 1 - Identification of the field isolates from chicken and turkey with protocol number
from Laboratório de Virologia Veterinária (LVV), gene analysed, species from
witch the samples were collected, GenBank accession numbers of the nucleotide
sequences and the differences in the nucleotide and amino acid sequences of the TK
and gC genes from field and reference strains.
Protocol
numbers
Genes
analyzed
Species Genbank
accession
numbers
ILTV
strains
differences
Position of
nucleotide
Nucleotide
mutation
Amino
acid
mutation
LVV03BR Turkey EF552574
LVV04BR Chicken EF552575
LVV06BR Turkey EF552576
LVV07BR Turkey EF552577
LVV08BR Free-
range
chicken
EF552578
LVV09BR Turkey EF552579
LVV11BR Chicken EF552580
LVV13BR Chicken EF552582
Vaccine Chicken EF552581
Keeler et al. Chicken S83714
Chen et al. Chicken DQ522949
Griffin &
Boursnell
TK gene
Chicken D00565
Group 1
283
301
754
C → T
A → G
C → A
G***
K***
A***
LVV01BR Chicken EF552583
LVV02BR Chicken EF552584
LVV05BR Chicken EF552585
LVV10BR Chicken EF552586
Chacon et al. Chicken DQ786400
Chacon et al.
TK gene
Chicken DQ786401
Group 2
283
301
754
T → C
G → A
A → C
G***
K***
A***
LVV06BR Turkey EU281337
LVV11BR Chicken EU281338 612 C → T **
Vaccine Chicken EU281339 652 G → A **
LVV13BR Chicken EU281340 900 A → G R***
LVV14BR Chicken EU281341
LVV15BR Chicken EU281342
Keeler et al.
gC
Chicken U06632
LVV13BR
DQ786400 and DQ786401 sequences from group 2 have only one change of nucleotide at
position 754.
** This region of the gene is not translated.
*** No amino acid changes.
57
Figure 1: Phylogenetic three based on neighbor-joining method for the nucleotide
sequences of the TK gene of ILTV isolates (EF552574, EF552578, EF552579, EF552575,
EF552581, EF552580, EF552582, EF552577, EF552576, EF552583, EF552586,
EF552584, EF552585) and the reference strain S83714.
Figure 2: Phylogenetic three based on neighbor-joining method for the nucleotide
sequences of the gC gene of ILTV isolates (EU281341, EU281342, EU281337, EU281338,
EU281340), reference strain U06635 and the vaccine strain.
58
3.3 Comparison of different cell cultures for replication of infectious laryngotracheitis
virus from chickens*
* Manuscrito submetido na forma de artigo original ao periódico científico Acta
Scientiae Veterinariae.
59
COMPARISON OF DIFFERENT CELL CULTURES FOR REPLICATION OF
INFECTIOUS LARYNGOTRACHEITIS VIRUS FROM CHICKENS
Comparação de diferentes cultivos celulares para a replicação do vírus da laringotraqueíte
infecciosa das galinhas
Cristiana Portz
1
; Laura Lopes de Almeida
1
; Alfredo Bianco Júnior
1
; Herbet Reck
1
;
Ana Cláudia Franco
2
& Cláudio Wageck Canal
1
1
Laboratório de Virologia, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul (UFRGS), Brazil
2
Laboratório de Virologia, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS),
Brazil
Corresponding author: claudio.canal@ufrgs.br
60
ABSTRACT
The propagation of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) has been described using
primary cell cultures derived from chicken embryo liver and kidney or embryonated eggs,
but these cultures use Specific Pathogen Free (SPF) eggs that are expensive and spend time.
Since cell line cultures are easier to maintain in laboratory conditions the growth of ILTV
was evaluated in five different cell cultures: chicken embryo related cells (CER), a cell
hybrid derived from chicken embryo fibroblasts cells and BHK-21; Vero, from African
green monkey kidney cells; HD11, a chicken macrophage cell line; CEC-32, an avian
fibroblast cell line and a primary cell culture of chicken embryo fibroblasts (CEF).
Cytophatic effect was observed until 96 hours following inoculation and the presence of the
viral DNA was performed by PCR. The HD11 and CEC-32 cell lines did not support the
virus growth but CEF and Vero, as already described were permissive cultures for
propagation of ILTV. The results also showed that the CER cell line can be used for
primary isolation and replication of ILTV.
Keywords: Infectious laryngotracheitis virus, virus isolation, cell culture, Gallid
herpesvirus 1, diagnosis.
61
RESUMO
A propagação do vírus da laringotraqueíte infecciosa tem sido descrita usando culturas de
células primárias derivadas de fígado e rim de embrião de galinha ou ovos embrionados,
entretanto, essas culturas necessitam de ovos livres de patógenos específicos (SPF) que
tomam tempo e custam caro. Desta maneira, culturas de células de linhagem são mais
fáceis de manter em laboratório e conduzir os experimentos. A propagação do ILTV foi
avaliada em cinco diferentes cultivos celulares: chicken embryo related cells (CER), que é
uma linhagem híbrida derivada de fibroblasto de embrião de galinha e BHK-21; a linhagem
Vero, derivada de células de rim de macaco verde africano; HD11, uma linhagem de
células de macrófagos de galinha; CEC-32, uma linhagem de fibroblasto de ave e um
cultivo primário de fibroblasto de embrião de galinha (CEF). O efeito citopático foi
observado até 96 horas pós-inoculação e a presença do DNA viral foi confirmada por PCR.
Os cultivos de linhagem HD11 e CEC-32 não suportaram a propagação viral e os cultivos
celulares de CEF e Vero, como previamente descrito, mostraram ser permissíveis à
replicação do ILTV. Os resultados também demonstram que a linhagem celular CER
também pode ser utilizada para o isolamento e replicação do ILTV.
Descritores: Vírus da laringotraqueíte infecciosa, isolamento viral, cultivos celulares, Gallid
herpesvirus 1, diagnóstico.
62
INTRODUCTION
Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) is classified as a member of the family
Herpesviridae in the subfamily Alphaherpesvirinae. The virus is taxonomically identified
as Gallid herpesvirus 1 (GaHV-1), genus Iltovirus, witch genome is a linear double-
stranded DNA with 155 kb [10, 13]. ILTV infection is characterized by signs of respiratory
distress in chickens that may result in significant mortality and loss of productivity. The
first report of ILTV in Brazil dates from 1974 and since then some cases were reported
based on serological, virological and histophatological tests [2, 9, 19, 21]. The isolation of
ILTV from field material has been described using embryonated chicken eggs inoculated in
the chorioallantoic membrane (CAM) [12], and primary cell cultures derived from chicken
embryo liver (CEL), chicken embryo kidney (CEK), chicken embryo fibroblast (CEF) and
a cell line derived from an African green monkey kidney cells (Vero) [10]. However, due to
the short span, cost and the time spent to produce primary cell cultures, an option to
enhance the number of viable viral particles achieved after virus passage in cell culture and
to increase the sensitivity of virus isolation, may be the use of a continuous cell line. Such
cell lines are especially relevant to many laboratory procedures that require high virus
titers, such as antigen production for diagnostic tests, animal inoculation experiments and
vaccine production. The purpose of the present study was to compare the susceptibility of
different cell lines for ILTV propagation.
63
MATERIALS AND METHODS
Two ILTV strains were tested: LVV13BR was isolated from chickens of São Paulo
State (Brazil) and LVV06BR that was isolated from turkeys of the South Region of Brazil.
The cells tested were a primary cell culture of chicken embryo fibroblasts (CEF) [12], that
was compared with four cell lines: chicken embryo related cells (CER), a cell hybrid
derived from chicken embryo fibroblasts cells and BHK-21 (Baby hamster kidney cells,
clone 21, ATCC CCL-10) [20], an avian fibroblast cell line (HD11) [3], an avian fibroblast
cell culture, CEC-32 [23] and a mammalian cell line derived from African green monkey
kidney cells (Vero) [12]. The cells were grown into 96 well plates at 37
0
C, using an initial
concentration of 5.0 x 10
5
cells/mL in Eagle`s minimal essential medium (E-MEM) with
200 IU/mL of Penicillin, Streptomycin and supplemented with 5% fetal calf serum. Both
chicken and turkey virus strains were isolated directly from tracheal clinical samples and
were grown at least three times in the chorioallantoic membrane (CAM) of embryonated
eggs from both species, to increase the titer of the viruses. CAMs were examined for pock
formation (opaque plaques on the CAM) at five to seven days post inoculation. Egg
infective dose (EID
50
/mL) based on pock formation was 0.2 x 10
4
[16].
Monolayers were grown to 90% of cell confluence and were inoculated with 50 µL
of each viral isolate, with eight repetitions. Adsorption was allowed for 40 minutes at 37
0
C
and medium with 2% of fetal calf serum was completed to 200 µL. The plates were
incubated at 37
0
C with 5% CO
2
. The cells were observed daily during 96 hours for the
development of viral cytopathic effect (CPE) using an inverted microscope (Carl-Zeiss,
West Germany). The plates were frozen at -70
0
C until the next passage of the virus.
Harvested cultures were centrifuged at 1000 g for 10 minutes and stored at -70
0
C in small
64
aliquots until required. After three passages in each cell line, supernatants were titrated in
96 well plates by the Reed & Muench method expressed as the log
10
tissue culture infective
dose per 50 µL (TCID
50
/50 µL).
After each of the three passages, virus DNA was extracted by the phenol-cloroform
method [1]. Two pair of primers were used in a nested-PCR that targets the TK gene of
ILTV and amplified a fragment of 647 bp [2].
Statistical analysis were performed using Tukey`s test with 1% of significance and
analysis of variance (ANOVA). The analysis were performed using the software package
SAS
®
(Version 5 Ed. SAS Inst. Inc., Cary, N.C.).
65
RESULTS
CER and Vero cell lines were able to replicate ILTV producing viral titers that were
not statistical different (Table 1). Primary cell culture of chicken embryo fibroblasts (CEF)
was the more susceptible to infection with ILTV producing the highest viral titer (10
5
/50
µL). In contrast, HD11 and CEC-32 cell lines did not produce detectable virus DNA after
three passages. The cell lines Vero, CER and CEF were able to replicate both strains of
ILTV. The predominant cytophatic effect observed was an initial rounding followed by
death of the cells. The CPE in CER and CEF cells was observed 24 hours after infection. In
addition, the Vero cell line displayed CPE only after 48 or 72 hours of infection.
66
DISCUSSION
ILTV has been propagated in a variety of primary cell cultures from chicken
embryo liver and chicken embryo kidney cells being the preferred substrates [12]. In the
present study, one primary and four cell lines were tested to analyze the replication of
ILTV. The cell lines HD11 and CEC-32 were not able to replicate ILTV. CEF and Vero
cells were efficient to replicate ILTV, although they produced low viral titers as previously
described [10, 11]. The CER cell line was never tested before for the susceptibility to
ILTV, however, it was characterized before as susceptible for infectious bursal diseases
virus, rabies virus and other viruses from mammals [5, 6, 7, 20]. It showed to be a
permissive cell line to replicate ILTV generating low viral titers and was able to produce
CPE 24 hours after virus inoculation. Therefore, CEF, Vero and CER cell cultures
displayed to be poor substrates for ILTV propagation, but all of them were able to replicate
both turkey and chicken strains of ILTV, although CEF and Vero were considered to be
poor substrates for ILTV propagation [12, 18]. The macrophage cell line (HD11) was not
able to replicate ILTV, although a previous study showed that macrophage cultures were
susceptible to ILTV infection, but replication of most ILTV strains examined was restricted
[4]. The cell line CEC-32 is closely related to CEF cell culture, but it seems to be derived
from quail [23], a species that is not described as susceptible to ILTV infection.
The use of two different strains is based on the knowledge that some strains are
difficult to replicate in cells that the majority of the strains growth readily. For example, a
low pathogenic strain of ILTV isolated from poultry companies at southeast of United
States was not able to replicate in primary chicken embryo liver or kidney cells as well as
several continuous cell lines [18]. Presumably, erroneous structures as formation of viral
67
particles without nucleocapsids, are in part responsible for the low titers of ILTV in tissue
culture, witch rarely exceeds one infection unit per cell [8]. In these cases, the PCR
technique is a very important means of detection, since it can be used to test samples from
suspected birds prior to the inoculation in embryonated eggs or cell cultures and it allows
the detection of infection in a very early phase when compared with serological reactions
[15].
Although primary cell cultures are still used as hosts for ILTV, they cannot be
maintained in vitro for a long time and Specific Pathogen Free (SPF) eggs are very
expensive [12]. However, the experiments at our laboratory showed that replication of
ILTV in chorioallantoic membranes (CAM) produce higher viral titers. The replication
cycle of ILTV has only been poorly investigated up to now and the knowledge of
fundamental mechanisms of virus replication are still hampered by the lack of suitable cell
lines for efficient in vitro propagation and manipulation [8].
This is the first report that compares the viral replication of ILTV in HD11, CER
and CEC-32 cell lines. Specially, CER cell line may be easily maintained in the laboratory
and is susceptible to a wide spectrum of different viruses. Nevertheless, further experiments
with other strains of ILTV and optimal cell cultures might also contribute to the
establishment of a suitable cell line for ILTV propagation and diagnosis.
68
CONCLUSIONS
The cell lines CEC-32 and HD11 were not able to replicate ILTV. The cell cultures
CEF and Vero, as already shown, supported ILTV propagation. The results indicate that the
CER cell line can be used for primary isolation and replication of ILTV.
Acknowledgements
Financial support was provided by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) and Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Sul
(FAPERGS).
69
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73
Table 1. Titers of virus strains recovered after three passages of ILTV in different cell
cultures. Titers were expressed in log
10
TCID
50
/50 µL. There was no detectable viral yield
in HD11 and CEC-32 cell lines.
Cell line
Field samples Virus titer
CER
LVV13BR 3.0
b
LVV06BR 3.0
b
Vero
LVV13BR 4.0
b
LVV06BR 3.0
b
CEF
LVV13BR 5.0
a
LVV06BR 4.0
b
HD11
LVV13BR --
LVV06BR --
CEC-32
LVV13BR --
LVV06BR --
74
4. DISCUSSÃO
No Brasil, o ILTV foi descrito pela primeira vez em 1974 por Hipólito e
colaboradores, e os últimos relatos oficiais da presença deste vírus estão restritos à região
de Bastos-SP, em aves de postura comercial. Estudos epidemiológicos demonstram a
ocorrência de anticorpos em plantéis avícolas nos Estados do Rio Grande do Sul, São
Paulo, Minas Gerais e a existência de aves portadoras sem sinais clínicos aparentes
incluindo aves criadas em fundo de quintal. Uma particularidade desta enfermidade é que o
controle realizado através de um programa de vacinação com vírus vivo atenuado pode
servir como fonte de infecção. Por se tratar de um herpes vírus, o estado de latência no
nervo trigêmio ocorre e pode ocasionar reversão de virulência através de passagens do vírus
vivo atenuado em aves. Por esse motivo, a vacinação no Brasil é permitida somente com
autorização do Ministério da Agricultura, em regiões endêmicas, como no surto que
ocorreu em Bastos-SP.
O presente trabalho é composto por quatro artigos, sendo que o primeiro descreve o
diagnóstico de infecções naturais por ILTV em perus. Para isto, um isolado de ILTV de
perus foi inoculado em galinhas e perus susceptíveis que foram avaliados por isolamento
viral, PCR, seqüenciamento, imunofluorescência e microscopia eletrônica. No segundo
artigo, foi avaliada a diversidade genética entre os isolados brasileiros do ILTV
provenientes de frangos e perus comerciais e de galinha de fundo de quintal. O terceiro
artigo descreve a replicação do ILTV em diferentes cultivos celulares. No quarto artigo,
está descrito o inicio de um trabalho que visa à deleção da glicoproteína E do ILTV de um
isolado de campo, com o objetivo de se produzir, futuramente, uma vacina diferencial.
No primeiro artigo, descreveu-se a detecção de ILTV a partir de traquéia de perus
provenientes de granjas comerciais com infecção respiratória. Um destes isolados foi
escolhido para a realização de uma infecção experimental em galinhas e perus susceptíveis.
O isolado de peru, inoculado experimentalmente, demonstrou ser de baixa patogenicidade
uma vez que ambas as espécies adoeceram com sinais respiratórios leves entre os dias seis
e 16 pós-inoculação (pi). Existe a suspeita de que cepas de ILTV pouco patogênicas, com
sinais clínicos leves, podem causar a doença em condições de campo, por combinação de
fatores como estresse e co-infecção de doenças respiratórias. Os achados histopatológicos
revelaram corpúsculos de inclusão intranucleares em duas galinhas, nos dias oito e 10 pi,
75
que também apresentaram estágios de hemorragia, descamação do epitélio e necrose
conforme a evolução da doença, sendo observada de forma mais severa nas galinhas. As
lesões mais severas incluíram secreção de muco hemorrágico na traquéia em uma galinha
aos 12 dias pi. Esses achados são similares aos encontrados na forma branda da doença
(RUSSELL & TURNER, 1983; TIMURKAAN et al., 2003). Alguns autores reportam que
corpúsculos de inclusão intranuclear estão presentes apenas no começo da infecção,
aproximadamente, de um a cinco dias pi (PURCELL, 1971; GUY et al., 1991;
VANDERKOP, 1993). Sellers et al. (2004) constataram que a ausência de sinais
histopatológicos, como sincício e corpúsculo de inclusão intranuclear, podem ocorrer na
forma branda da doença. A PCR direcionada ao gene da timidina kinase do genoma do
ILTV também confirmou a presença de DNA viral e seu seqüenciamento foi comparado
com a cepa 632 (KEELER et al., 1991) para verificar a especificidade dos produtos de
amplificação. A seqüência de DNA do isolado de perus apresentou alta similaridade,
sugerindo uma origem comum a dos isolados de galinha e vacinal. O isolado de peru
também foi replicado em monocamada de fibroblasto de embrião de galinha de nove dias
de incubação e foi confirmada a presença do ILTV por imunofluorescência indireta.
Membranas de ovos embrionados de galinha inoculados com o isolado de peru, após quatro
passagens, demonstraram lesão do tipo pock. Estes últimos foram recortados das
membranas e fixados para a microscopia eletrônica, onde partículas características de
herpes vírus foram encontradas. Como a morfologia de partículas dos herpes vírus são
muito similares, PCRs para regiões distintas do HVT foram realizadas com resultados
negativos, deixando clara a infecção por ILTV. A infecção de perus pelo ILTV apenas
havia sido descrita a partir de infecção experimental (WINTERFIELD & SO, 1968).
Portanto, esses resultados chamam a atenção para o primeiro caso de infecção natural de
perus.
No segundo artigo, os isolados provenientes de traquéias de frangos e de perus,
além de uma cepa vacinal, foram avaliados por sequenciamento nucleotídico, a partir de
duas PCRs que visavam à amplificação de regiões distintas do genoma. Os produtos de
amplificação da PCR direcionada ao gene da timidina kinase foram sequenciados e a
comparação com as cepas disponíveis no GenBank foi realizada. Os isolados de peru foram
reunidos em um grupo, juntamente com isolados provenientes de galinhas e a cepa vacinal.
76
A análise revelou alta similaridade sugerindo que os isolados que estão circulando no Brasil
possuem uma origem comum recente. O grupo composto apenas por isolados de galinha
apresentou três nucleotídeos diferentes do grupo formado pelos isolados de perus, galinhas
e cepa vacinal, embora estas diferenças não tenham resultado em diferença de aminoácidos.
Confirmou-se que a timidina kinase trata-se de um gene conservado como descrito
previamente por (GRIFFIN & BOURSNELL, 1990) e mais apropriado para diagnóstico do
que estudos voltados para filogenia.
Sendo assim, a glicoproteína C (gC) do ILTV foi escolhida como alvo para a
caracterização genética destes isolados, após a sua amplificação por PCR e
seqüenciamento. A gC do ILTV ainda é pouco estudada, embora em outros alfaherpesvírus,
como o BoHV, este gene tenha se mostrado adequado para a caracterização de diferentes
isolados devido ao alto grau de variabilidade observado na região N-terminal (CLAUS et
al., 2005). Os resultados demonstraram poucas diferenças de nucleotídeos que, entretanto,
não acarretaram em mudança de aminoácidos. Desta forma, pode-se concluir, uma vez
mais, que, ou os isolados são geneticamente muito homogêneos ou as regiões do genoma
escolhidas para esta caracterização não são adequadas para esta finalidade. O
seqüenciamento de regiões distintas do genoma do ILTV foi escolhido em substituição à
técnica de PCR-RFLP, amplamente utilizada para a caracterização de isolados de campo e
vacinais (OLDONI & GARCIA, 2007) por apresentar maior poder de discriminação. O
controle por vacinação é permitido apenas em áreas endêmicas tornando-se difícil saber se
os isolados de campo realmente tiveram uma origem vacinal ou de uma cepa de campo
após passagens entre aves.
O terceiro artigo teve o objetivo de se determinar um cultivo celular capaz de
replicar eficazmente o ILTV para ser utilizado no diagnóstico e na produção de grande
concentração de DNA viral com vistas à produção de cepas recombinantes, o que é objeto
do quarto artigo. Vários cultivos celulares de linhagens (chicken embryo related cells
(CER), African green monkey kidney cells (Vero), chicken macrophage cell line (HD11),
avian fibroblast cell culture (CEC-32) e um cultivo primário de fibroblasto de embrião de
galinha (FEG) foram testados. Um isolado de ILTV de galinha e um de peru foram
inoculados nestes cultivos para esta determinação. Os cultivos de CEC-32 e HD11 nunca
haviam sido testados anteriormente e não foram capazes de replicar o ILTV. Calnek et al.
77
(1986), descreveu que a replicação do ILTV em macrófagos é viável, porém a replicação é
restrita. A linhagem HD11 tem origem de fibroblasto de codorna e, por isso, o ILTV pode
não ter sido replicado. Os cultivos de FEG e Vero foram capazes de replicar ambos os
isolados virais em títulos mais baixos, como descrito previamente por Hughes & Jones,
(1988). Embora o cultivo de fibroblasto seja considerado um substrato pobre para a
replicação do ILTV (SCHNITZLEIN et al., 1994), dependa de ovos embrionados SPF e
não se mantenha por muito tempo em cultura, os isolados virais replicaram atingindo títulos
maiores do que os obtidos com as linhagens celulares neste experimento. Este experimento
também descreveu a primeira utilização da linhagem CER para a replicação do ILTV. Esta
linhagem foi capaz de replicar o ILTV em títulos mais baixos do que o FEG, embora tenha
as vantagens de ser de fácil manuseio em laboratório e permitir a replicação de vários
outros vírus, como descrito por (SPILKI et al., 2006). A inoculação em membrana cório-
alantóide de ovos embrionados de nove dias de incubação, ainda foi o sistema que gerou os
maiores títulos, produzindo lesões do tipo pock. Sellers et al. (2004) descreveram que
algumas cepas de baixa patogenicidade, dos Estados Unidos, não foram capazes de replicar
em cultivos primários de fígado e rim de embrião de galinha, assim como em células de
linhagens, sendo sua propagação limitada in vitro, e elas causarem poucas alterações
patológicas in vivo. O ciclo de replicação do ILTV tem sido pouco investigado e ainda há
falta de linhagens celulares eficientes para a sua propagação e manipulação in vitro
(FUCHS et al., 2007), já que o cultivo primário torna-se laborioso.
No Anexo 1, o projeto de deleção da glicoproteína E (gE) de um isolado de campo
do vírus da laringotraqueíte (ILTV) foi incentivada por trabalhos prévios utilizando outros
alfaherpesvírus, como o que realizou a deleção da gE do herpes vírus bovino tipo 1 (BoHV-
1) (FRANCO, 2001) e recombinantes de herpes vírus eqüino tipo 4 (EHV-4) (DAMIANI et
al., 2000). Para resolver o problema de reversão da virulência de algumas cepas vacinais, o
desenvolvimento de vacinas contra o ILTV contendo o vírus vivo geneticamente
modificado parece ser promissor (FUCHS et al., 2007).
Tomando por base a deleção por recombinação homóloga sítio dirigido, um cassete de
clonagem foi construído utilizando-se um vetor plasmidial contendo duas regiões
flanqueadoras da gE, a partir de uma cepa vacinal conhecida, e um gene marcador EGFP. A
co-transfecção para uma recombinação sítio dirigida seria executada utilizando-se um
78
isolado de campo, porém esta etapa do trabalho não foi alcançada devido à dificuldade de
purificação do DNA viral em quantidade suficiente. As dificuldades de se recuperar DNA
viral purificado já haviam sido relatadas por outros autores (OLDONI & GARCIA, 2007;
FUCHS et al., 2007), inclusive para a utilização de técnicas rotineiras como a de PCR-
RFLP com objetivos epidemiológicos. Recombinantes do ILTV, geneticamente atenuados
com deleção do gene da timidina kinase reduziram a virulência e induziram proteção em
galinhas SPF desafiadas com isolado viral patogênico (SCHNITZLEIN et al., 1995; HAN
et al., 2002). Assim como a deleção das glicoproteínas J e possivelmente a gG do ILTV
(FUCHS et al., 2007). No entanto, o recombinante com deleção das glicoproteínas gI e gE
do ILTV resultou em incapacidade de dispersão do vírus em células hospedeiras, indicando
que as glicoproteínas deletadas podem ser essenciais para a replicação do ILTV (DEVLIN
et al., 2006). Todavia, este tipo de construção pode ter afetado algum gene essencial para a
replicação do vírus, como a US9, localizada posteriormente a gE com função pouco
conhecida. Previamente, apenas os vírus da doença de Marek (MDV) e o da Varicela Zoster
(VZV) gE/gI deletados mostraram ser essenciais para a replicação. As glicoproteínas gI e
gE formam um heterodímero responsável pela dispersão viral célula a célula, comum entre
os herpes vírus. No entanto, a deleção da gE pode gerar melhores resultados, como o
BoHV-1 gE negativo descrito por (FRANCO, 2001), já que os alfaherpesvírus costumam
ser conservados. Por outro lado, a deleção da gE do genoma do ILTV também será útil para
um estudo de sua função e comportamento em cultivos celulares.
Para que o Brasil, segundo maior produtor e maior exportador mundial de carne de
frangos e perus, consiga manter seu status de produção, devem ser reforçados os programas
de prevenção contra as doenças avícolas listadas pelo Escritório Internacional de Epizootias
(OIE). Para que isto se torne realidade para o ILTV, ainda se faz necessário um estudo
epidemiológico básico para que se tomem decisões de controle desta doença, que ainda é
considerada exótica no País.
79
5. CONCLUSÕES
1) Através de técnicas de caracterização viral utilizadas, verificou-se a presença do
ILTV em plantéis de frangos e perus das regiões sudeste-sul do país. Esta é a primeira
descrição de infecção natural do ILTV em perus.
2) Um isolado de peru, inoculado experimentalmente, demonstrou ser de baixa
patogenicidade, sendo capaz de causar uma doença respiratória leve em galinhas e perus
susceptíveis.
3) A análise da diversidade genética, a partir do sequenciamento das regiões da
timidina quinase (TK) e glicoproteína C (gC) do genoma do ILTV, de isolados de campo
de galinhas e perus, de uma cepa vacinal e das cepas disponíveis no GenBank
demonstraram alta similaridade, com poucas alterações de nucleotídeos sem mudança de
aminoácidos, sugerindo que os isolados são muito homogêneos ou que estas regiões do
genoma não são adequadas para este tipo de estudo.
4) O cultivo primário de fibroblasto de embrião de galinha (FEG) e as linhagens CER
e Vero foram capazes de replicar o ILTV. Esta foi a primeira descrição da utilização da
linhagem CER como cultivo celular para o isolamento e replicação do ILTV.
5) As linhagens CEC-32 e HD11 não foram capazes de replicar o ILTV.
6) Um cassete de clonagem contendo as regiões flanqueadoras da glicoproteína E e o
gene marcador EGFP foi construído para, posteriormente, ser utilizado na geração de vírus
recombinante por recombinação homóloga para ser testado como vacina marcadora.
80
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89
ANEXO 1
Deleção da glicoproteína E (gE) do vírus da laringotraqueíte infecciosa aviária
(ILTV)*
* Dados preliminares. Manuscrito em fase de conclusão e redação, a ser submetido a
periódico científico.
90
DELEÇÃO DA GLICOPROTEÍNA E (gE) DO VÍRUS DA LARINGOTRAQUEÍTE
INFECCIOSA AVIÁRIA (ILTV)
Cristiana Portz, Ana Cláudia Franco, Herbert Reck, Nilzane Beltrão, Cláudio Wageck
Canal
Resumo
A glicoproteína E dos alfaherpesvírus vem sendo associada à virulência e latência.
O presente trabalho teve como objetivo a deleção da glicoproteína E (gE) do vírus da
laringotraqueíte (ILTV) para o desenvolvimento de recombinantes. Um cassete de
clonagem foi construído utilizando-se o plasmídeo pCR2.1 contendo duas regiões
flanqueadoras da gE, a partir de uma cepa vacinal, e um gene marcador EGFP. As etapas de
montagem do cassete foram todas concluídas, entretanto a etapa final de co-transfecção
para uma recombinação sítio dirigida não foi alcançada devido à dificuldade de purificação
do DNA viral. O presente trabalho ainda encontra-se em andamento.
91
1. Introdução
A Laringotraqueite Infecciosa Aviária (LTI) é de uma doença respiratória causada
por um herpes vírus que acomete principalmente as galinhas de postura comercial, de
distribuição geográfica cosmopolita. O ILTV trata-se de um Gallid herpesvírus 1
classificado na família Herpesviridae da subfamília Alfaherpesvirinae composto por DNA
de fita dupla e genoma de aproximadamente 155 kb (ROIZMAN, 1982). Para a prevenção
do ILTV, vacinas com vírus vivo têm sido utilizadas por muitas décadas. A maioria destas
vacinas tem uma boa eficácia, entretanto, muitas delas ainda possuem uma virulência
residual que pode aumentar significantemente após passagens em aves susceptíveis e
resultar em surtos de LTI (ANDREASEN et al., 1990; GUY et al., 1991). Para resolver o
problema de reversão da virulência de algumas cepas vacinais, foram produzidas e testadas,
eficazmente, as vacinas com vírus inativado e vacinas de subunidades contendo
glicoproteínas imunogênicas purificadas (BARBOOM et al., 1986; YORK & FAHEY,
1991). Entretanto, o alto custo de produção não compensaria a imunização em larga escala.
Mais recentemente, estuda-se a geração de mutantes de ILTV atenuados por deleção de
genes que determinam virulência. A infectividade do DNA genômico do ILTV permite a
geração de vírus mutantes através de uma recombinação homóloga com co-transfeção
plasmidial, que carrega a deleção ou inserção desejada (FUCHS et al., 2007). Atualmente,
quatorze genes do genoma do ILTV já foram deletados com sucesso (UL0, ORF A, ORF B,
ORF C, ORF D, ORF E, UL10, UL21, UL23, UL47, UL49.5, UL50, US4, US5), sendo
todos indispensáveis para a replicação viral in vitro, desde que se tenha um cultivo celular
capaz de propagar o ILTV recombinante e produzir placas virais (FUCHS et al., 2007).
92
Um recombinante do ILTV com deleção do gene da timidina kinase diminuiu a
virulência e induziu proteção em galinhas SPF desafiadas com vírus virulento (HAN et al.,
2002). Recentemente, o desenvolvimento de um ILTV mutante gE e gI negativo mostrou
uma redução na capacidade de dispersão viral célula-célula com conseqüente falha na
produção de placas virais (DEVLIN et al., 2006).
A glicoproteína E (gE) dos alfaherpes vírus parece estar associada à virulência e
latência viral. A gE e gI do herpes vírus simplex (HSV) estão associados a eficiente
transmissão neurônio-neurônio do vírus nas sinapses nervosas (DINGWELL et al., 1995).
As vacinas diferenciais possuem a vantagem de permitir a distinção da resposta imune
induzida por animais vacinados e por animais infectados com vírus selvagem ou de campo
(VAN OIRSCHOT et al., 1999). Além de possibilitar a diferenciação de respostas imunes
de animais enfermos e vacinados, o uso de vacinas diferenciais tem ainda a vantagem de
reduzir a circulação do vírus de campo facilitando o controle das infecções virais. O ILTV
no Brasil é considerado exótico e ainda vem sendo estudado por poucos grupos de pesquisa
vinculados a universidades. O presente trabalho almejou a deleção da glicoproteína E de
um isolado de campo e vacinal do ILTV.
93
2. Material e Métodos
2.1. Padronização do cultivo celular
Inicialmente, foi necessário estabelecer um cultivo de células que permitiria a
obtenção do ILTV em altos títulos. Foram testados o cultivo primário de fibroblasto de
embrião de galinha e linhagens celulares como as células VERO e CER (chicken embryo
related). Os cultivos celulares foram mantidos em meio mínimo essencial de Eagle (E
MEM, Gibco
®
) suplementado com 5% de soro fetal bovino, e uma suspensão de
antibióticos.
2.2. Isolados virais utilizadas
Os isolados virais utilizados na realização deste projeto compreendem um isolado
de campo isolado de galinha (LVV13BR) obtido e caracterizado em trabalho prévio, e a
cepa vacinal (Solvay Animal Health, Inc., IA, USA).
2.3. Obtenção do DNA viral
Após a padronização do cultivo celular, foi realizada a extração do DNA viral a
partir de 200 μL de suspensão viral. O DNA viral foi processado pela digestão com
proteinase K, seguida de extração com fenol-clorofórmio (SAMBROOK & RUSSEL,
2001). Após a precipitação com acetato de sódio e isopropanol, o DNA viral foi
ressuspenso em 50 μL de TE (10 mM Tris-HCL pH 8,0, 1 mM EDTA).
94
2.4. Oligonucleotídeos
As reações de PCR foram realizadas para a obtenção dos fragmentos flanqueadores
da região gênica a ser deletada. O primeiro par de oligonucleotídeos corresponde a uma
região anterior a glicoproteína E (região 5’de gE), e o segundo par, a uma região posterior a
glicoproteína E (região 3’da gE).
2.5. Ligação e clonagem
Os produtos da PCR foram imediatamente ligados em um vetor plasmidial TA
Cloning kit Top10 pCR 2.1. (Invitrogen).
2.6. Transformação plasmidial
As transformações em células competentes (TOP 10) foram realizadas de acordo
com a orientação do fabricante.
2.7. Construção e seleção do recombinante
As co-transfecções para a obtenção dos recombinantes serão realizadas em um
próximo trabalho, de acordo com o protocolo de FRANCO, 2001.
95
3. Resultados
3.1. Padronização do cultivo celular
O ILTV foi replicado primeiramente em membrana cório-alantóide de ovos
embrionados de nove dias de incubação para atingir maiores títulos. O cultivo celular
escolhido para a replicação e co-transfecção do ILTV foi o de fibroblasto de embrião de
galinha. Os cultivos celulares foram mantidos em meio mínimo essencial de Eagle (E
MEM, Gibco
®
) suplementado com 5% de soro fetal bovino e uma suspensão de
antibióticos (200 UI/mL de penicilina, 200 mg/mL de estreptomicina).
3.2. Obtenção do DNA viral
O DNA viral foi extraído a partir de membrana córioalantóide (MCA) inoculadas,
respectivamente, com ambos isolados virais. A partir de seis MCA, as lesões do tipo pock
foram recortadas e lisadas por uma suspensão de digestão contendo proteinase K (200
µg/mL), 10% de SDS e TE (10 mM de Tris-Cl, 5 mM de EDTA, pH 8.0), sendo incubado a
37
0
C, sob agitação leve, por uma hora. Em seguida adicionou-se 0,3 M de NaCl e a
suspensão foi tratada com igual volume de fenol saturado (Invitrogen, USA). A
centrifugação foi de 3000 RPM por 30 minutos e o sobrenadante foi colhido e precipitado
com isopropanol e estocado a -20
0
C, por duas horas. Após a precipitação, o DNA
enovelado foi colhido com o auxílio de uma ponteira e ressuspenso em 10 mL de TE.
Posteriormente, o DNA viral ressuspenso foi deixado sob agitação leve, à temperatura
ambiente, por 18 horas.
96
3.3. Oligonucleotídeos utilizados para a Reação Polimerásica em Cadeia (PCR)
As reações de PCR foram realizadas para a obtenção dos fragmentos flanqueadores
da região gênica a ser deletada. O primeiro par de oligonucleotídeos obtido com a ajuda do
programa Vector NTI
TM
Suite 8.0 corresponde a uma região anterior a glicoproteína E (gE),
que foi denominada de região 5’ da gE, e o segundo par de oligonucleotídeos, que
correspondente a uma região posterior a gE, foi denominada de região 3’da gE (Tabela 1).
As reações de PCR foram realizadas de acordo com o protocolo descrito por
(SAMBROOK & RUSSEL, 2001). A PCR para a região 5`gE foi realizada para o volume
final de 25 μl, contendo 1 μl (200 μg/μL) de DNA molde, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 3 mM
MgCl
2
, 2 mM de cada dideoxinucleotídeo (dNTP), 20 pmol de cada oligonucleotídeo e 0,5
unidades de Taq DNA polimerase (5 U/μL ) (CenBiot Enzimas, Porto Alegre, Brasil). O
programa de ciclos da PCR correspondente a região 5` gE incluiu 35 ciclos de desnaturação
a 94
o
C por 1 minuto, anelamento a 52
o
C por 1 minuto, extensão a 72
o
C por 2 minutos e
uma extensão final de 72
o
C por 10 minutos. O programa de ciclos para a região 3’gE
seguiu da mesma forma descrita, com exceção da temperatura de anelamento que foi de
56
o
C por 1 minuto e a concentração de MgCl
2
para a PCR foi de 2.0 mM. As amplificações
de DNA viral foram executadas no termociclador Perkin Elmer GeneAmp PCR System
2400 (Applied Biosystems). A eletroforese do produto amplificado foi realizada em gel de
agarose 1,2% corado com 0,5 µg/mL de brometo de etídio.
A purificação de DNA a partir de géis de agarose foi realizada através do kit de purificação
GFX DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences, Sweden) seguindo as
orientações do fabricante.
97
3.4. Clonagem das regiões flanqueadoras da gE
A ligação e clonagem dos produtos da PCR de cada fragmento flanqueador da gE
(3’e 5’) foram imediatamente ligados no vetor plasmidial pCR 2.1 (TA Cloning kit Top10,
Invitrogen) e transformados em Escherichia coli (células competentes Top10 do kit). As
ligações e transformações foram realizadas segundo recomendação do fabricante comercial.
A extração do DNA plasmidial para a checagem de ambos os fragmentos
flanqueadoras da gE foi realizada pelo método de lise alcalina de células bacterianas
Miniprep (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). Após a obtenção dos plasmídeos, estes foram
avaliados em relação à concentração e integridade através da eletroforese em gel de
agarose.
3.5. Construção do cassete de clonagem
Ambos os fragmentos 5’e 3’ gE foram clonados no sítio para a enzima de restrição
EcoRI (Figura 1) dos respectivos vetores plasmidiais e seqüenciados com o
oligonucleotídeo M13 do plasmídeo para a checagem dos fragmentos. O fragmento 5’gE
permaneceu neste sítio e sua orientação foi também avaliada através da enzima de restrição
AvaI (New England Biolabs, MA, USA). O fragmento 3’gE foi retirado do plasmídeo pCR
2.1 através da clivagem por EcoRI (New England Biolabs, MA, USA), o DNA
correspondente ao fragmento, em seguida, foi recortado do gel de agarose, purificado e
tratado com a enzima Large Fragment of DNA Polymerase I (Invitrogen, USA) com o
objetivo de fazer pontas cegas. Posteriormente, o plasmídeo contendo o fragmento 5’gE foi
aberto no sítio de Not I e também foi submetido ao tratamento da enzima Large Fragment
of DNA Polymerase I (Invitrogen, USA) e fosforilado com o auxílio da enzima Alkaline
98
Phosphatase Calf Intestinal (CIAP, Invitrogen, USA), segundo recomendações do
fabricante. Posteriormente, o fragmento 3’gE, já preparado, foi ligado no plasmídeo
contendo o fragmento 5’gE, com o auxílio da enzima T4 Ligase (Invitrogen, USA), na
proporção 3:1. Novamente foi transformado em E. coli, o DNA plasmidial extraído por
Miniprep e a checagem da orientação do fragmento 3’gE foi realizado através da clivagem
com as enzimas de restrição Sal I e Bgl II (New England Biolabs, MA, USA) (Figura 2).
Após a checagem das orientações dos fragmentos 5’e 3’gE clonados, um gene
marcador EGFP (enhanced green fish protein) para a seleção do recombinante foi clonado
no sítio Eco RV do mesmo plasmídeo. Utilizou-se o pEGFP-N1 (CLONETECH
Laboratories, Inc.), com o número de acesso U55762 no GenBank. O cassete contendo o
EGFP, SV40 poly A e o promotor CMV foi retirado do plasmídeo original com o auxílio
das enzimas de restrição Ase I e Afl II (New England Biolabs, MA, USA) (Figura 3).
Posteriormente, o DNA correspondente a este fragmento foi recortado do gel de agarose,
purificado e tratado com a enzima Large Fragment of DNA Polymerase I (Invitrogen,
USA). A ligação foi realizada com o auxílio da enzima T4 Ligase (Invitrogen, USA), na
proporção 3:1. A checagem da orientação do fragmento EGFP foi realizado através da
clivagem com a enzima de restrição Hind III (New England Biolabs, MA, USA).
3.6. Detecção dos recombinantes
A expressão do gene GFP nas células infectadas com ILTV recombinantes será
confirmada pela visualização da autofluorescência. Posteriormente, as placas virais
fluorescentes serão isoladas com o auxílio de uma ponteira e passadas pelo menos três
vezes consecutivas em cultivo celular, segundo protocolo descrito por (FRANCO, 2001).
99
Para a caracterização do vírus deletado será utilizada a técnica de PCR com
oligonucleotídeos que amplificam a gE do ILTV, previamente descrita por GARCIA &
RIBLET (2001).
100
4. Discussão
O cassete de clonagem contendo as regiões flanqueadoras da gE e o EGFP foi
concluído, entretanto a purificação do DNA viral, em quantidade de 1 µg para a realização
da etapa de co-transfecção não foi alcançada, após a utilização de protocolos distintos de
extração de DNA viral (KEELER et al., 1991, WILD et al., 1996; FRANCO, 2001).
Recombinantes do ILTV, geneticamente atenuados com deleção do gene da
timidina kinase reduziram a virulência e induziram proteção em galinhas SPF desafiadas
com isolado viral patogênico (SCHNITZLEIN et al., 1995; HAN et al., 2002). Assim como
a deleção das glicoproteínas J e possivelmente a gG do ILTV (FUCHS et al., 2007). Em
contraste, o recombinante com deleção das glicoproteínas gI e gE do ILTV resultou em
incapacidade de dispersão do vírus em células hospedeiras, indicando que as glicoproteínas
deletadas podem ser essenciais para a replicação do ILTV. Previamente, apenas os vírus da
doença de Marek (MDV) e o da Varicela Zoster (VZV) gE/gI deletados mostraram ser
essenciais para a replicação. As glicoproteínas gI e gE formam um heterodímero
responsável pela dispersão viral célula a célula, comum entre os herpes vírus (DEVLIN et
al., 2006). A função da US9, proteína codificada pela ORF 9, localizada anteriormente a
gE, ainda não foi totalmente investigada no ILTV. A construção deste recombinante gE/gI
deletado pode ter afetado esta região, que por sua vez, pode ter impedido a replicação do
vírus (DEVLIN et al., 2006).
Vários genes deletados do ILTV já foram testados in vivo para se observar a
eficiência vacinal, entretanto o ILTV dUTPase negativo mostrou reter considerável
virulência após desafio com altas doses de vírus (FUCHS et al., 2000). A virulência
residual de cada uma delas deve ser muito bem estudada em paralelo a experimentos de
101
imunização. O sucesso desta construção se baseia no conhecimento dos mecanismos da
replicação viral, entretanto este método ainda é prejudicado pela falta de células de
linhagem eficientes para a propagação e manipulação do ILTV (OLDONI & GARCIA,
2007; FUCHS et al., 2007). As células LMH de linhagem são atualmente utilizadas para a
co-transfecção do ILTV, entretanto o cultivo é delicado e a replicação do vírus é baixa
(FUCHS et al., 2007).
Novos experimentos, com base nas funções de cada glicoproteína e/ou em conjunto
devem ser realizados para o seu melhor entendimento e para futuros projetos de deleções
com o propósito de atenuação de virulência. Neste sentido, o presente projeto ainda se torna
importante para o melhor entendimento do papel da glicoproteína E do ILTV.
Agradecimentos
Ao apoio financeiro concedido pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) e a Fundação de amparo a pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul
(FAPERGS). Ao apoio técnico e de infra-estrutura do Instituto de Pesquisas Veterinárias
Desidério Finamour (IPVDF) e ao Laboratório de Virologia do ICBS/UFRGS.
102
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105
Tabela 1: Primers utilizados na amplificação das regiões 5’e 3’ flanqueadoras da gE.
Seqüência dos oligonucleotídeos Localização no genoma
Produto da
amplificação (pares
de base (pb)
Região
5’gE
P1: CGCCAGGATTGACGACGA
P2: CCCGGCTGAATTCTCCTCCT
12602-13752 1151
Região
3’gE
P3: TGCGGTCGTGGAGGGAGAAAGG
P4: GCTACCGCCCTTGTTTCTGCAAGG
15183-16081 899
106
Figura 1: Plasmídeos contendo as regiões flanqueadoras 5`gE e 3`gE, marcador de peso
molecular lambda HindIII.
Figura 2: Esquema do plasmídeo pCR 2.1 com a localização dos sítios de clonagem.
5`gE 3`gE
107
Figura 3: Esquema da construção do cassete de clonagem para posterior co-transfecção.
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