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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA
PÓS-GRADUÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS
METABOLÔMICA E BIOPROSPECÇÃO DE
VARIEDADES CRIOULAS E LOCAIS DE MILHO
(Zea mays L.)
SHIRLEY KUHNEN
Tese apresentada à Universidade
Federal de Santa Catarina para
obtenção do título de Doutor em
Recursos Genéticos Vegetais
Florianópolis
2007
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA
PÓS-GRADUÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS
METABOLÔMICA E BIOPROSPECÇÃO DE
VARIEDADES CRIOULAS E LOCAIS DE MILHO
(Zea mays L.)
SHIRLEY KUHNEN
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Maraschin
Co-orientadores: Prof
a
. Dr
a
. Juliana Bernardi
Ogliari e Prof. Dr. Paulo Fernando Dias
Tese apresentada à Universidade
Federal de Santa Catarina para
obtenção do título de Doutor em
Recursos Genéticos Vegetais
Florianópolis
2007
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iii
Ao meu filho Mateus,
com amor
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Margarete e Carlos, por terem me proporcionado as oportunidades necessárias para
a conclusão desse trabalho e pelo apoio.
Aos meus irmãos, Gabriela, Carolina e Vladimir, e minha sobrinha Ana Victoria pelo carinho e o
apoio constante.
Ao meu filho Mateus, nascido durante esse período, por ter me proporcionado momentos de muita
alegria e felicidade e por me ajudar a ser uma pessoa cada vez melhor.
Ao restante da família, em especial ao meu tio Nivaldo Cabral Kuhnen, pelos sensatos conselhos e
apoio.
Ao Caco, pelo bem que me fez, pelo amor e apoio.
Ao meu orientador, Professor Marcelo Maraschin, pela orientação, confiança e amizade.
Ao Professor Paulo F. Dias pela orientação nos ensaios biológicos e amizade.
À Professora Juliana B. Ogliari pelo apoio, confiança e participação no projeto.
Ao Professor Antonio Gilberto Ferreira, do Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear
(Universidade Federal de São Carlos) pela obtenção dos espectros e pela hospitalidade durante a
minha permanência no seu laboratório.
À Gláucia, Elisângela e Maiara, do LRMN da UFScar, pelo auxílio na aquisição dos espectros.
À Professora Dra. Ivonne Delgadillo, à Doutora Alexandra Nunes e à doutoranda Ana Isabel
Loureiro Correia (Grupo de Bioquímica Alimentar, Departamento de Química, Universidade de
Aveiro – Aveiro, Portugal) pelo auxílio na aquisição dos espectros de FT-IR e análises
quimiométricas.
Aos funcionários Luis Pacheco, do LMBV e Maria Luisa Peixoto, do LFDV, pelo auxílio técnico.
À Bernadete, secretária do Programa, pelo auxílio e grande amizade.
Ao Luciano Henrique Campestrini, meu grande amigo, pelo apoio e convivência.
Aos colegas de laboratório, Priscilla, Gustavo, Bianca, Aline e Volmir pelo auxílio e convivência
durante esses anos.
Aos amigos Elizeane, Maria Cristina, Vivian, Alexandra, Raquel, Elisa, Wagner e Vanessa pelos
bons momentos de descontração.
À CAPES, pela concessão da bolsa para realização desse trabalho.
Aos agricultores de Anchieta pelas sementes das variedades de milho.
Ao povo Brasileiro que me proporcionou, desde a infância, um ensino público e de qualidade.
v
SUMÁRIO
1 RESUMO.......................................................................................................... x
2 ABSTRACT...................................................................................................... xii
LISTA DE TABELA......................................................................................... xiv
LISTA DE FIGURAS......................................................................................... xvi
3 INTRODUÇÃO………………….................................................................... 01
4 REVISÃO DE LITERATURA……………………………………………... 04
4.1 Milho………………………………………………………………………... 04
4.1.1 Importância econômica e alimentar............................................................. 04
4.1.2 Origem e domesticação……….................................................................... 06
4.2 Identificação do local de estudo...................................................................... 10
4.3 Caracterização dos compostos de interesse..................................................... 13
4.3.1 Metabólitos primários: amido e proteínas.................................................... 13
4.3.2 Metabólitos secundários............................................................................... 16
4.3.2.1 Compostos fenólicos................................................................................. 18
4.3.2.2 Antocianinas.............................................................................................. 19
4.3.2.3 Carotenóides.............................................................................................. 20
4.4 Compostos bioativos – ênfase nos processos de vasculogênese e
angiogênese...........................................................................................................
21
5 OBJETIVOS…….……………….................................................................... 25
5.1 OBJETIVO GERAL……….….................................................................... 25
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS…............................................................... 25
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………… 26
CAPÍTULO 1....................................................................................................... 37
Análises espectroscópica (FT-IR) e quimiométrica da farinha e de sua fração
amídica (amilose/amilopectina) de variedades locais e de cultivares comerciais
de milho (Zea mays).............................................................................................
38
1 Resumo............................................................................................................... 38
2 Introdução ......................................................................................................... 39
3 Material e Métodos….………………………………………………………... 41
3.1 Seleção do material vegetal............................................................................. 41
3.1.1 Variedades crioulas e locais de milho (VCLM)........................................... 41
3.1.2 Cultivares comerciais................................................................................... 41
3.2 Coleta e preparo das amostras......................................................................... 42
3.3 Determinação do conteúdo de glucose e açúcar redutor nas amostras de
farinha...................................................................................................................
42
3.4 Extração e fracionamento dos componentes amídicos amilose e
amilopectina..........................................................................................................
42
3.5 Caracterização estrutural química das amostras de farinhas e das frações
amilose e amilopectina por espectroscopia vibracional de infravermelho médio
com transformada de Fourier (FT-IR)..................................................................
43
4 Resultados e Discussão ..................................................................................... 43
4.1 Caracterização estrutural da farinha de grãos inteiros e degerminados por
vi
espectroscopia vibracional de infravermelho (FT-IR) e análise
quimiométrica.......................................................................................................
43
4.2 Rendimento da extração das FAMs e FAPs de farinhas das VCLM e dos
cultivares comerciais............................................................................................
57
4.3 Caracterização estrutural das FAMs e FAPs por espectroscopia vibracional
de infravermelho (FT-IR) e análise quimiométrica..............................................
61
5 Conclusões........................................................................................................ 72
6 Referências Bibliográficas……………………………………………………. 73
CAPÍTULO 2....................................................................................................... 77
Análise da fração amídica (amilose e amilopectina) por espectroscopia de
ressonância magnética de 13C (13C-RMN) e de 1H (1H-RMN) e
quimiometria.........................................................................................................
78
1 Resumo............................................................................................................... 78
2 Introdução ......................................................................................................... 79
3 Material e Métodos….………………………………………………………... 80
3.1 Seleção do material vegetal............................................................................. 80
3.1.1 Variedades crioulas e locais de milho (VCLM)........................................... 80
3.1.2 Cultivares Comerciais.................................................................................. 80
3.2 Coleta e preparo das amostras......................................................................... 81
3.3 Extração e fracionamento do componente amídico em amilose e
amilopectina..........................................................................................................
81
3.4 Determinação do conteúdo de proteínas associadas às frações
amilose..................................................................................................................
81
3.5 Caracterização das frações amilose e amilopectina por ressonância
magnética nuclear de 13C e 1H e análise quimiométrica.....................................
81
4 Resultados e Discussão ..................................................................................... 82
4.1 13C-RMN........................................................................................................ 82
4.2 1H-RMN......................................................................................................... 90
4.3 Análise quimiométrica – PCA........................................................................ 92
4.3.1 13C-RMN.................................................................................................... 92
4.3.2 1H-RMN...................................................................................................... 97
5 Conclusões........................................................................................................ 102
6 Referências Bibliográficas……………………………………………………. 103
CAPÍTULO 3....................................................................................................... 106
Análise quantitativa, espectroscópica (FT-IR) e quimiométrica da fração
protéica de grãos de variedades locais e comerciais de milho (Zea
mays).....................................................................................................................
107
1 Resumo............................................................................................................... 107
2 Introdução ......................................................................................................... 108
3 Material e Métodos…….……………………………………………………... 109
3.1 Seleção do material vegetal............................................................................. 109
3.1.1 Variedades crioulas e locais de milho (VCLM)........................................... 109
3.1.2 Cultivares Comerciais.................................................................................. 110
3.2 Coleta e preparo das amostras......................................................................... 110
3.3 Caracterização da composição química das farinhas por espectroscopia
vibracional na região do infravermelho médio com transformada de Fourier
(FT-IR)..................................................................................................................
110
vii
3.4 Determinação do conteúdo de proteínas nas amostras de farinha (grãos
inteiros).................................................................................................................
111
4 Resultados e Discussão ..................................................................................... 112
5 Conclusões........................................................................................................ 124
6 Referências Bibliográficas……………………………………………………. 125
CAPÍTULO 4....................................................................................................... 129
Caracterização dos compostos carotenoídicos, antociânicos e (poli)fenólicos
nas farinhas de variedades locais de milho originárias do extremo oeste de
Santa Catarina e de cultivares comerciais.............................................................
130
1 Resumo............................................................................................................... 130
2 Introdução ......................................................................................................... 131
3 Material e Métodos.…………………………………………………………... 133
3.1 Seleção do material vegetal............................................................................. 133
3.1.1 Variedades crioulas e locais de milho (VCLM)........................................... 133
3.1.2 Cultivares híbridos....................................................................................... 133
3.2 Coleta e preparo das amostras......................................................................... 133
3.3 Caracterização do pericarpo dos grãos das VCLM por espectroscopia
vibracional na região do infravermelho médio com transformada de Fourier
(FT-IR) e análise quimiométrica...........................................................................
134
3.4 Estabelecimento do protocolo de extração para a determinação do conteúdo
antociânico de sementes de milho.........................................................................
135
3.5 Caracterização e classificação dos extratos butanol-HCl (70:30, v/v) de
amostras de farinhas das VCLM e cultivares comerciais por espectrofotometria
UV-visível associada à quimiometria...................................................................
136
3.6 Determinação do conteúdo de (poli)fenóis totais............................................ 136
3.7 Identificação de compostos (poli)fenólicos por cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE)..........................................................................................
136
3.8 Extração e dosagem de carotenóides……………………………………....... 137
3.9 Análise de compostos carotenoídicos por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE).................................................................................................
137
3.10 Purificação e caracterização estrutural dos carotenóides extraídos de
sementes de milho por técnicas cromatográficas………………………………..
138
4 Resultados e Discussão ..................................................................................... 138
4.1 Análise do pericarpo por FT-IR e quimiometria............................................. 139
4.2 Extração e caracterização das antocianinas..................................................... 143
4.3 Extração e Caracterização dos (poli)fenóis..................................................... 151
4.4 Carotenóides…………………………………………………………..…….. 160
4.4.1 Identificação e quantificação……………………………………………… 160
4.4.2 Purificação………………………………………………………………... 169
5 Conclusões......................................................................................................... 173
6 Referências Bibliográficas……………………………………………………. 173
CAPÍTULO 5....................................................................................................... 179
Caracterização do perfil metabólico (ênfase em carotenóides, polifenóis e
antocianinas) de flores femininas de variedades crioulas e locais de milho (Zea
mays l.)..................................................................................................................
180
1 Resumo............................................................................................................... 180
2 Introdução ......................................................................................................... 181
viii
3 Material e Métodos…….……………………………………………………... 182
3.1 Material Vegetal.............................................................................................. 182
3.2 Caracterização da composição química do tecido floral por espectroscopia
vibracional no infravermelho médio com transformada de Fourier (FT-IR) e
análise quimiométrica...........................................................................................
183
3.3 Obtenção dos extratos florais.......................................................................... 184
3.4 Caracterização espectroscópica do extrato MeOH-HCl (1%, v/v) e análise
quimiométrica.......................................................................................................
184
3.4.1 Espectrofotometria UV-visível.................................................................... 184
3.4.2 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (1H-RMN)....................... 184
3.4.3 Determinação do conteúdo de fenóis totais................................................. 185
3.4.4 Identificação dos ácidos (poli)fenólicos por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE).................................................................................................
185
3.4.5 Análise do conteúdo de antocianinas totais................................................. 186
3.4.6 Caracterização estrutural das antocianinas usando MALDI-TOFF............. 186
3.5 Caracterização espectroscópica (UV-vis) e cromatográfica (CLAE) do
extrato MeOH-Tolueno (1:1 v/v)..........................................................................
186
3.5.1 Espectrofotometria UV-visível.................................................................... 186
3.5.2 Identificação de carotenóides usando cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE).................................................................................................
186
4 Resultados e Discussão ..................................................................................... 187
4.1 Análise do tecido floral liofilizado por FT-IR e quimiometria....................... 187
4.2 Caracterização dos extratos florais - MeOH-HCl (1%, v/v)........................... 197
4.2.1 Espectroscopia UV-visível........................................................................... 197
3.2.2 MALDI-TOF................................................................................................ 203
4.2.3 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (
1
H-
RMN) e análise quimiométrica.............................................................................
204
4.2.4 Quantificação e identificação de (poli)fenóis.............................................. 210
4.3 Caracterização dos extratos florais - MeOH-tolueno (v/v)............................. 214
4.3.1 Espectroscopia UV-visível........................................................................... 215
4.3.2 Identificação de carotenóides usando CLAE............................................... 215
5 Conclusões......................................................................................................... 218
6 Referências Bibliográficas……………………………………………………. 219
CAPÍTULO 6....................................................................................................... 223
Avaliação do efeito de carotenóides de grãos de milho sobre processos de
formação de vasos sanguíneos..............................................................................
224
1 Resumo............................................................................................................... 224
2 Introdução ......................................................................................................... 225
3 Material e Métodos….………………………………………………………... 227
3.1 Seleção do material vegetal............................................................................. 227
3.2 Extração e Dosagem de Carotenóides............................................................. 227
3.3 Análise de compostos carotenoídicos por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE)…………………………………………........................…….
228
3.4 Ensaios da vesícula vitelínica (VV) e da membrana corioalantóica (MC) de
embriões de galinha..............................................................................................
228
3.5 Análise de dados e estatística.......................................................................... 230
4 Resultados e Discussão ..................................................................................... 230
4.1 Caracterização química do extrato carotenoídico........................................... 230
ix
4.2 Ensaios da vesícula vitelínica (VV) e da membrana corioalantóica (MC) de
embriões de galinha..............................................................................................
232
5 Conclusões........................................................................................................ 235
6 Referências Bibliográficas……………………………………………………. 237
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS…………….....……………………………..... 241
x
1. RESUMO
O declínio do cultivo de variedades crioulas e locais de milho (VCLM), após a
revolução verde, está associado à destruição da agricultura familiar em diversas regiões do
mundo. O estudo do metaboloma de VCLM está entre as estratégias que visam agregar
valor à matéria-prima e produtos derivados daqueles genótipos, estimulando a permanência
de pequenos agricultores no campo. Neste contexto, o presente trabalho determinou o
perfil metabólico de grãos e flores femininas (estigmas/estiletes) de VCLM, cultivadas e
desenvolvidas por pequenos agricultores do município de Anchieta (SC). Adicionalmente,
foram avaliados os efeitos do extrato carotenoídico dos grãos sobre os processos in vivo de
formação de vasos sanguíneos de embriões de Gallus domesticus, como um parâmetro do
potencial de atividade biológica. A partir de um protocolo simplificado de extração e
fracionamento dos componentes amilose e amilopectina, diferenças de composição
química, de interesse industrial, foram detectadas por FT-IR,
13
C-RMN e
1
H-RMN.
Diferenças significativas (P<0,01) no conteúdo protéico total dos grãos das VCLM foram
observadas, sendo as prolaminas, seguido das glutelinas, as proteínas majoritárias no
endosperma. A análise dos componentes principais (PCA) dos dados espectrais de FT-IR
(1650-1500 ondas.cm
-1
) permitiu a rápida distinção das amostras em função da sua
constituição protéica. No que concerne à caracterização dos pigmentos presentes nos grãos,
foram obtidos resultados satisfatórios com o extrator butanol-HCl (70:30, v/v), indicando a
predominância de flobafenos em algumas das VCLM. No extrato organossolvente butanol-
HCl a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) permitiu a identificação e a
quantificação dos ácidos protocatecuico, gálico, cinâmico, clorogênico, caféico e ferúlico,
em quantidades variáveis consoante à VCLM. As xantofilas zeaxantina e luteína foram
identificadas como os carotenóides majoritários nas amostras de grãos, além de pequenas
quantidades de β-criptoxantina, β-caroteno e α-caroteno. O protocolo de purificação destes
metabólitos secundários, via técnicas cromatográficas, resultou em frações com grau de
pureza satisfatório, 88% e 93%, respectivamente para zeaxantina e luteína. Os ensaios de
atividade biológica com o extrato carotenoídico dos grãos da variedade MPA1 revelaram
potente atividade anti-vasculogênica e anti-angiogênica, utilizando a vesícula vitelínica e a
membrana corioalantóica de embriões de galinha (G.domesticus) como modelo de estudo.
Dentre os genótipos em análise, 7 variedades com teores superiores de antocianinas totais
(460 ηm e 525 ηm) foram selecionadas para a obtenção de amostras de flores femininas
xi
(estigmas/estiletes). Cianidina e pelargonidina foram identificadas como as antocianidinas
majoritárias por MALDI-TOF/MS, e o perfil cromatográfico (CLAE) de composição de
ácidos (poli)fenólicos mostrou serem os ácidos protocatecuico, gálico e cinâmico os
compostos majoritários naqueles tecidos. Luteína foi o principal pigmento carotenoídico
detectado nos estigmas/estiletes, seguida de β-caroteno, α-caroteno e zeaxantina. A
diversidade química encontrada nas VCLM revelou o potencial de exploração daqueles
genótipos como fontes de compostos de elevado valor econômico e de interesse à saúde
humana e à indústria alimentícia. Esses resultados demonstram a eficácia da metabolômica
na análise do potencial de uso e de agregação de valor de matérias-primas originadas de
VCLM. Tal abordagem, constitui-se em estratégia que visa contribuir, em alguma
extensão, à manutenção dos agricultores no campo, os quais são os principais responsáveis
pela conservação on farm desta espécie.
xii
2. ABSTRACT
The decline of the maize landraces (ML) cultures following the green revolution is
associated to destruction of familiar agriculture in several regions of the world. The
metabolomic analysis of such genotypes is among the strategies that aim at to add value to
maize raw materials and derived products, contributing to the standing of small farmers in
the field. In this study the metabolic profile of grains and silks of ML was performed. The
maize genotypes analyzed have been cultivated and developed by small farmers at
southern Brazil (Anchieta county, Santa Catarina State) over decades. The effect of the
grain carotenoid extract on the in vivo process of blood vessels formation in Gallus
domesticus embryos was studied, as a parameter for the potential of biological activity. By
using a simplified extraction and fractionation protocol, differences in the chemical
composition (of industrial interest) for the amylose and amylopectin fractions of ML were
detected by FT-IR, 13C-NMR, and 1H-NMR. Significant differences (P<0.01) of the total
protein content of ML grains were observed, being prolamins, followed by glutelins, the
main protein types found in the endosperm. The principal component analysis (PCA) of
FT-IR data (1650-1500 waves.cm
-1
) allowed a fast distinction of the samples as a function
of their protein constitution. Concerning the characterization of the grain’s pigments,
satisfactory results were obtained with the extractor butanol-HCl (70:30, v/v), indicating a
predominance of phlobaphenes in the organosolvent fraction of ML. High performance
liquid chromatography (HPLC) analysis of the butanol-HCl organosolvent extract showed
as the main polyphenols the protocatechuic acid, gallic acid, cinnamic acid, chlorogenic
acid, cafeic acid, and ferulic acid. The xanthophylls zeaxanthin and lutein were identified
as the major carotenoids in the grain samples, with smaller amounts of β-cryptoxanthin, β-
carotene, and α-carotene. The proposed purification protocol of these secondary
metabolites using chromatographic techniques resulted in fractions with satisfactory purity
degree, 88% and 93%, respectively for zeaxanthin and lutein. The biological assay using
the carotenoid extract of the grains of the MPA1variety revealed a potent anti-vasculogenic
and anti-angiogenic activity on the vitelline vesicle and the chorioallantoic membrane of
chicken embryo (G. domesticus). Among the germoplams in study, seven varieties with
superior total anthocyanin content (460ηm and 525ηm) were selected for obtaining corn
silk samples. Cyanidin and pelargonidin were identified as the main anthocyanidins in that
tissue by MALDI-TOF/MS. The chromatographic (HPLC) polyphenolic acid profile
xiii
showed protocatechuic acid, gallic acid, and cinnamic acid as the major compounds in
female flowers samples. Lutein was the main carotenoid pigment found, followed by β-
carotene and small amounts of α-carotene and zeaxanthin. The chemical diversity found in
ML´s tissue samples shows the potential of exploitation of those genotypes as source of
compounds with high commercial value and of interest to human health and food industry.
These results point to the suitability of metabolomics in studies of the potential of usage
and for adding value to ML raw materials. Such an approach might contribute, in any
extension, to avoid rural exodus, maintaining the active agents of the ML on farm
conservation, i.e., small farmers in their production unit.
xiv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Formas de uso alimentar de grãos, estigma/estilete, pólen e colmo do
milho........................................................................................................
05
CAPÍTULO 1
TABELA 1 Sinais espectrais de FT-IR (onda.cm
-1
) das amostras de farinhas de
grãos inteiros de VCLM e comerciais e seus respectivos
grupamentos............................................................................................
45
TABELA 2 Conteúdo médio
*
(g/100g, peso seco) das frações ricas em amilose
(FAM), amilopectina (FAP), glucose e de açúcares redutores em
amostras farinhas de variedades crioulas e locais de milho e de
cultivares comerciais...............................................................................
58
TABELA 3 Sinais espectrais de FT-IR (3000 – 600 ondas.cm
1
) das amostras de
FAM e FAP
*
de 26 VCLM e dos cultivares comerciais........................
62
CAPÍTULO 2
TABELA 1 Deslocamentos químicos (ppm) de 13C das frações rica em amilose
(FAM) extraídas de amostras de grãos de variedades crioulas e locais
de milho, dos cultivares comerciais e de padrões daqueles
polissacarídeos........................................................................................
83
TABELA 2 Conteúdo médio
*
de proteínas (mg/g) nas frações rica em amilose
(FAM) de amostras de grãos das variedades crioulas e locais e dos
cultivares comerciais de milho................................................................
89
CAPÍTULO 3
TABELA 1 Conteúdo médio
*
(média
±
desvio padrão, mg/g) das quatro frações
protéicas (globulina, albumina, prolamina e glutelina) encontradas nos
grãos inteiros de variedades crioulas e locais de milho e nos cultivares
comerciais................................................................................................
113
TABELA 2 Resumo da análise de variância das variáveis globulina, albumina,
zeína I, zeína II e glutelina determinadas na farinha dos grãos das
variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais
estudados.................................................................................................
118
TABELA 3 Componentes principais (PC) calculados a partir dos dados
quantitativos das frações protéicas (globulina, albumina, zeína I, zeína
II e glutelinas) de amostras de farinha dos grãos das variedades
crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais............................
120
CAPÍTULO 4
TABELA 1
Concentração média* (
µ
g/g, média
±
desvio padrão) de (poli)fenóis
totais
**
, ácido protocatecuico, ácido gálico, ácido clorogênico, ácido
caféico, ácido t-cinâmico e ácido ferúlico
***
em amostras de grãos de
variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares
xv
comerciais................................................................................................ 153
TABELA 2 Resumo da análise de variância das variáveis ácido protocatecuico,
ácido gálico, ácido clorogênico, ácido caféico, ácido t-cinâmico e
ácido ferúlico determinados na farinha dos grãos das variedades
crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais
estudados.................................................................................................
157
TABELA 3 Componentes principais (PC) da análise de PCA dos dados
quantitativos de (poli)fenóis (ácido protocatecuico, ácido gálico, ácido
clorogênico, ácido caféico, ácido t-cinâmico e ácido ferúlico)
determinados na farinha dos grãos das variedades crioulas e locais de
milho e dos cultivares comerciais...........................................................
159
TABELA 4
Concentração média* (µg/g, média
±
desvio padrão) de carotenóides
totais
**
, zeaxantina, luteína, β-criptoxantina, β-caroteno e α-
caroteno
***
em amostras de sementes de variedades crioulas e locais
de milho e dos cultivares comerciais.......................................................
162
TABELA 5
Resumo da análise de variância das variáveis zeaxantina, luteína, β-
criptoxantina, β-caroteno e α-caroteno determinados na farinha dos
grãos das variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares
comerciais estudados...............................................................................
166
CAPÍTULO 5
TABELA 1 Bandas (ondas.cm
-1
) espectrais de FT-IR das amostras de tecido floral
das VCLM em estudo com os seus respectivos grupos
funcionais................................................................................................
188
TABELA 2
Conteúdo médio de fenóis totais
*
(µg/mg, peso seco) determinado por
espectroscopia de UV-visível e de compostos (poli)fenólicos
identificados por CLAE
**
(µg/mg, peso seco) em amostras de flores
femininas das VCLM estudadas..............................................................
211
TABELA 3
Conteúdo
*
de carotenóides (µg/g, peso seco) do tecido floral de
VCLM determinados por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE)....................................................................................................
217
CAPÍTULO 6
TABELA 1
Conteúdo de carotenóides
*
(µg/100g, peso seco – média ± desvio
padrão) nos grãos de variedades crioulas e locais de milho
determinados por CLAE (450 ηm).........................................................
231
xvi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Mapa geopolítico de Santa Catarina mostrando a localização do
município de Anchieta (Retirado de
http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:SantaCatarina_Municip_Anchieta.svg)...........
11
FIGURA 2 Vias de síntese dos principais metabólitos secundários de vegetais
superiores (adaptado de TAIZ & ZEIGER, 2004)..................................
17
FIGURA 3 Compostos do metabolismo secundário comumente encontrados em
milho: ácido siríngico (A), quercetina (B), ácido p-cumárico (C),
pelargonidina (D), β-caroteno (E) e luteína (F)......................................
18
FIGURA 4 Fotografia do sistema de incubação dos ovos de galinha (G.
domesticus); (B) Esquema mostrando a abertura na casca e em detalhe
(C) fotografia de um embrião de 2 dias (E2) com a vesícula vitelínica,
onde se visualizam ilhotas sanguíneas (círculo), onde são implantados
os discos de metilcelulose; (D) Aspecto dos vasos primordiais durante
a vasculogênese (embrião de 4 dias; E4) e o local da implantação do
disco (seta); (E) Vista geral de um embrião de 6 dias de idade e o
início da formação da membrana corioalantóica (MC); (F) Aspecto da
angiogênese na MC (8 dias de incubação; E8) e o local da implantação
do disco (seta); (G) Quadro comparativo dos padrões morfológicos
dos embriões nas idades de 2 – 4 dias (com os segmentos de
comprimento cefálico-cervical – CCV e cervical-caudal – CVC) e 8
dias.....…….............................................................................................
24
CAPÍTULO 1
FIGURA 1 Espectros de FT-IR (3000 – 600 ondas.cm-1) de amostras de farinha
de grãos inteiros da variedade comercial AS-3430 e da variedade local
Cateto Vermelho.....................................................................................
44
FIGURA 2 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados espectrais de FT-IR
(3000-600 ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de grãos inteiros de 26
VCLM e dos cultivares comerciais em estudo........................................
47
FIGURA 3 Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos inteiros
para os dados de FT-IR (3000-600 ondas.cm
-1
)......................................
48
FIGURA 4 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (1200-950
ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de grãos inteiros de 26 VCLM e
dos cultivares comerciais em estudo.......................................................
49
FIGURA 5 Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos inteiros
para os dados de FT-IR na região espectral de 1200 a 950 ondas.cm
-1
..
50
FIGURA 6 Espectros de FT-IR (3000 – 600 ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de
grãos inteiros e de grãos degerminados da variedade local Mato
Grosso......................................................................................................
50
FIGURA 7 Espectros de FT-IR (1100-940 cm
-1
) de amostras de farinha de grãos
inteiros e de grãos degerminados da variedade local Mato
Grosso......................................................................................................
51
FIGURA 8 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR na janela
espectral de 3000 a 600 ondas.cm
-1
de amostras de farinha de grãos
xvii
inteiros e de grãos degerminados de 26 VCLM e dos cultivares
comerciais................................................................................................
52
FIGURA 9 Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos inteiros
e degerminados para os dados espectrais de FT-IR (3000-600
ondas.cm
-1
)..............................................................................................
52
FIGURA 10 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR nas janelas
espectrais de 1200-950 ondas.cm
-1
de amostras de farinha de grãos
inteiros e de grãos degerminados de 26 VCLM e dos cultivares
comerciais em estudo..............................................................................
53
FIGURA 11 Contribuição fatorial de PC2 das amostras de farinha de grãos inteiros
e degerminados para os dados espectrais de FT-IR (1200-950
ondas.cm
-1
)..............................................................................................
54
FIGURA 12 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados espectrais de FT-IR
(3000-600 ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de grãos degerminados
de 26 VCLM e dos cultivares comerciais em estudo..............................
55
FIGURA 13 Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos
degerminados para os dados espectrais de FT-IR (3000-600 ondas.cm
-
1
)..............................................................................................................
55
FIGURA 14 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (1250-900
ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de grãos degerminados de 26
VCLM e dos cultivares comerciais em estudo........................................
56
FIGURA 15 Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos
degerminados para os dados de FT-IR na região espectral
compreendida entre 1200-950 ondas.cm
-1
..............................................
57
FIGURA 16 Espectros de FT-IR (3000 – 600 ondas.cm
-1
) das FAM e FAP da
variedade local Mato Grosso...................................................................
61
FIGURA 17 Espectros de FT-IR parciais (1230 – 860 ondas.cm
-1
) de amostras
comerciais de amilose (Sigma, MO – USA) (A) e amilopectina
(Fluka).....................................................................................................
64
FIGURA 18 Espectros de FT-IR na região entre 1230 – 800 ondas.cm
-1
de fração
amilose e amilopectínica da variedade local Asteca...............................
65
FIGURA 19 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados espectrais de FT-IR
(1800-600 ondas.cm
-1
) da FAM e da FAP de 26 VCLM e dos
cultivares comerciais em estudo..............................................................
66
FIGURA 20 Contribuição fatorial de PC2 das FAMs e FAPs para os dados
espectrais de FT-IR (1800-600 ondas.cm
-1
)............................................
67
FIGURA 21 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR nas janelas
espectrais de 1200-950 ondas.cm
-1
da FAM e da FAP dialisada das 26
variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais em
estudo......................................................................................................
68
FIGURA 22 Contribuição fatorial de PC2 das FAMs e FAPs dialisada para os
dados espectrais de FT-IR (1200-950 ondas.cm
-1
)..................................
70
FIGURA 23 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados espectrais de FT-IR
(1200-950 ondas.cm
-1
) da FAM e FAP dialisada de 26 VCLM, dos
cultivares comerciais em estudo e dos padrões comerciais de amilose
(Sigma) e amilopectina (Fluka)...............................................................
71
FIGURA 24 Contribuição fatorial de PC1 das FAMs e FAPs dialisada das VCLM
em estudos e dos padrões comerciais para os dados espectrais de FT-
IR (1200-950 ondas.cm
-1
).......................................................................
72
xviii
CAPÍTULO 2
FIGURA 1 Espectros de ressonância magnética nuclear de 13C da fração rica em
amilose (FAM) das VCLM Cateto e Língua de Papagaio e dos
padrões comerciais de amilose (Sigma) e amilopectina (Fluka)
mostrando os sinais de maior intensidade. Os deslocamentos químicos
associados aos carbonos da α-D-glucose estão indicados como C-1, C-
2, C-3, C-4, C-5 e C-6. S = solvente (DMSO-δ
6
39,5
ppm).................................................................
85
FIGURA 2 Espectros de ressonância magnética nuclear de 1H da fração rica em
amilose (FAM), e rica em amilopectina (FAP) (0 ppm a 5,7 ppm) da
variedade Cateto e dos padrões comerciais de amilose (Sigma) e
amilopectina (Fluka). S= solvente (DMSO-δ
6
2,5
ppm)...................................................................
91
FIGURA 3 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de 13C-RMN (2
ppm a 200 ppm), da fração rica em amilose (FAM) das 26 variedades
crioulas e locais de milho, dos cultivares comerciais e do padrão
comercial de amilose (Sigma).................................................................
93
FIGURA 4 Contribuição fatorial de PC1 das amostras da fração rica em amilose
(FAM) e do padrão comercial de amilose (Sigma), calculada a partir
dos dados de 13C-RMN para a região espectral compreendida entre 2
ppm e 200 ppm........................................................................................
94
FIGURA 5 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de 13C-RMN obtida
a partir dos dados espectrais da janela entre 2 ppm a 200 ppm,
subtraída das ressonâncias em 18 ppm e 56 ppm, da fraçãorica em
amilose (FAM) das 26 variedades crioulas e locais de milho, dos
cultivares comerciais e do padrão comercial de amilo (Sigma)..............
95
FIGURA 6 Contribuição fatorial de PC1 para as amostras da fração rica em
amilose (FAM) e do padrão comercial de amilose (Sigma), calculada a
partir dos dados de 13C-RMN (janela espectral 2 ppm a 200 ppm)
após a retirada das ressonâncias em 18 ppm e 56 ppm...........................
96
FIGURA 7 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de 1H-RMN, para a
janela espectral compreendida entre 0,5 ppm a 8,5 ppm da fração rica
em amilose (FAM) das 26 variedades crioulas e locais de milho, dos
cultivares comerciais e do padrão comercial (Sigma).............................
98
FIGURA 8 Contribuição fatorial de PC1 calculada a partir dos dados espectrais de
1H-RMN (janela espectral: 0,3 ppm a 8,5 ppm) de amostras da fração
rica em amilose (FAM) de VCLM e do padrão comercial de amilose
(Sigma)....................................................................................................
99
FIGURA 9 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de 1H-RMN (janela
espectral entre 0,1 ppm a 7,5 ppm) da fração rica em amilopectina de
24 variedades crioulas e locais de milho, dos cultivares comerciais e
do padrão comercial de amilopectina (Fluka).........................................
100
FIGURA 10 Contribuição fatorial de PC1 calculada a partir dos dados de 1H-RMN
(janela espectral: 0,1 ppm a 7,5 ppm) de amostras da fração rica em
amilopectina (FAP) e do padrão comercial de amilopectina
(Fluka).....................................................................................................
102
xix
CAPÍTULO 3
FIGURA 1 Distribuição percentual das classes de proteínas salino-solúveis
(globulina e albumina), prolamina (zeína I e zeína II) e glutelina em
amostras de farinhas das variedades crioulas e locais de milho e dos
cultivares comerciais estudados..............................................................
117
FIGURA 2 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de conteúdo médio
de glutelina e zeína I encontrados nas amostras de farinha (grãos
inteiros) das 26 variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares
comerciais em estudo..............................................................................
119
FIGURA 3 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (janela
espectral de 1650-1500 ondas.cm
-1
) de amostras de farinha (grãos
inteiros) das 26 VCLM e dos cultivares comerciais em
estudo......................................................................................................
122
FIGURA 4 Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos inteiros
para os dados de FT-IR na região espectral compreendida entre 1650-
1500 ondas.cm
-1
......................................................................................
123
CAPÍTULO 4
FIGURA 1 Detalhe da coloração dos grãos das variedades crioulas e locais de
milho em estudo. A - Rosado, B – Roxo do Valdecir, C – MPA01, D -
Branco do Aldanir...................................................................................
134
FIGURA 2 Detalhe da coloração das amostras de pericarpos isolados e tamisados
dos grãos das variedades Roxo do Valdecir (A), Composto São Luis
(B), Mato Grosso Palha Roxa (C), Branco (D), Roxo do Emílio (E),
Rajado 8 Carreiras (F) e Língua de Papagaio (G)...................................
139
FIGURA 3 Espectros de FT-IR (3000 – 650 ondas.cm
-1
) de amostras de
pericarpos isolados e tamisados das variedades Roxo do Emílio e
Rajado 8 Carreiras...................................................................................
140
FIGURA 4 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (3000-650
ondas.cm
-1
) de amostras de pericarpos isolados de grãos de 7
variedades crioulas e locais de milho......................................................
141
FIGURA 5 Contribuição fatorial de PC1 para os dados de FT-IR (3000-600
ondas.cm
-1
) das amostras de pericarpos isolados de grãos das
VCLM.....................................................................................................
142
FIGURA 6 Perfis de absorbância UV-visível dos extratos MeOH-HCl (1%, v/v) e
butanol-HCl (70:30, v/v) das amostras de grãos da variedade Roxo do
Valdecir, para a janela espectral de 240 a 750 ηm..................................
145
FIGURA 7
Perfil de absorbância UV-visível (400 a 650 ηm) de extratos butanol-
HCl (70, 30%, v/v) de amostras de pericarpo da variedade Roxo do
Emílio, segundo o tempo de incubação...................................................
146
FIGURA 8 Perfil de absorbância UV-visível dos extratos butanol-HCl (70, 30%,
v/v) de amostras de grãos das variedades crioulas e locais de milho e
dos cultivares comerciais, para uma janela espectral entre 400 a 600
ηm...........................................................................................................
147
FIGURA 9 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os valores de absorbância
(289-750 ηm) dos extratos butanol-HCL (70:30, v/v) de grãos das 26
variedades crioulas e locais de milho e cultivares comerciais em
xx
estudo..................................................................................................... 148
FIGURA 10
Contribuição fatorial de PC1 das absorbâncias (400 - 600 ηm) dos
extratos butanol-HCl (70:30, v/v) de grãos de 26 variedades crioulas e
locais de milho e cultivares comerciais..................................................
149
FIGURA 11 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os valores de absorbância na
janela espectral de 400 a 600ηm dos extratos butanol-HCL (70:30,
v/v) de grãos das 26 variedades crioulas e locais de milho e cultivares
comerciais................................................................................................
150
FIGURA 12
Contribuição fatorial de PC1 das absorbâncias (400 - 600 ηm) dos
extratos butanol-HCl (70:30, v/v) de grãos de 26 variedades crioulas e
locais de milho e cultivares comerciais...................................................
151
FIGURA 13 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de conteúdo médio
de ácido protocatecuico e ácido t-cinâmico encontrados nas amostras
de farinha das 26 variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares
comerciais em estudo. R8C = Rajado 8 carreiras, CV = Cateto
Vermelho, RV = Roxo do Valdecir, Palha RE = Palha roxo do emílio;
Ros. = Rosado, LP = Língua de Papagaio, RE = Roxo do Emílio, Cat.
= Cateto. ………………………………………………………..…….
158
FIGURA 14
Perfil cromatográfico de carotenóides (CLAE, 450 ηm) presentes na
fração organosolvente extraída de amostras de sementes da variedade
Roxo do Valdecir. S = solvente; 1 e 2 = compostos não
identificados………………………………..………………………......
165
FIGURA 15 Percentagem de luteína e zeaxantina sobre o conteúdo total de
carotenóides determinado por CLAE (450ηm) em grãos das
variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais em
estudo......................................................................................................
168
FIGURA 16
Perfil espectral de varredura (350-750 ηm) das frações
organosolventes purificadas de carotenóides de grãos de milho
(VCLM MPA1), segundo a fase móvel utilizada na CLC. A – éter de
petróleo; B – éter de petróleo: éter etílico (1:1, v/v); C - éter etílico; D
- éter etílico: álcool etílico (1:1, v/v). As setas indicam o comprimento
de onda de absorção máxima para as respectivas frações.......................
170
FIGURA 17
Perfil cromatográfico (CLAE, 450 ηm) da fração eluída com éter de
petróleo + éter etílico (50%, v/v) na CLC do extrato carotenoídico da
variedade MPA1. S = solvente.……………........................................
171
FIGURA 18
Cromatograma (CLAE, 450 ηm) da fração carotenoídica eluida com
éter etílico: álcool etílico (1:1, v/v) de amostras de sementes do
cultivar comercial BRS1030 (A) e da variedade local MPA01
(B)............................................................................................................
172
CAPÍTULO 5
FIGURA 1 Detalhe das flores femininas das variedades Rosado (A) e Palha Roxa
1 do Emílio (B)........................................................................................
183
FIGURA 2 Espectros de FT-IR na região entre 3000 – 600 ondas.cm
-1
de
amostras de tecido floral liofilizados das variedades crioulas e locais
de milho Rosado, Cateto Vermelho e Mato Grosso Palha
Roxa........................................................................................................
189
FIGURA 3 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (3000 -
xxi
600 ondas.cm
-1
) de amostras de tecido floral liofilizado das 8 VCLM
estudadas.................................................................................................
190
FIGURA 4 Contribuição fatorial de PC1 das amostras de tecido floral liofilizado
para os dados espectrais de FT-IR (3000 - 600 ondas.cm
-1
)...................
191
FIGURA 5 Contribuição fatorial de PC2 das amostras de tecido floral liofilizado
para os dados espectrais de FT-IR (3000 - 600 ondas.cm
-1
)...................
192
FIGURA 6 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR na janela
espectral de 1650-1500 ondas.cm
-1
de amostras de tecido floral
liofilizado das 8 VCLM em estudo.........................................................
193
FIGURA 7 Contribuição fatorial de PC1 das amostras de tecido floral liofilizado
das 8 VCLM, para os dados de FT-IR na região espectral de 1650-
1500 ondas.cm
-1
......................................................................................
194
FIGURA 8 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (1200 -
950 ondas.cm
-1
) de amostras de tecido floral liofilizado das 8 VCLM
em estudo.................................................................................................
195
FIGURA 9 Contribuição fatorial de PC1 das amostras de tecido floral liofilizado
para os dados de FT-IR na região espectral de 1200 - 950 ondas.cm
-1
...
196
FIGURA 10 Contribuição fatorial de PC2 das amostras de tecido floral liofilizado
para os dados de FT-IR (1200 - 950 ondas.cm
-1
)....................................
196
FIGURA 11
Perfil espectral UV-visível (370 a 700ηm) do extrato MeOH-HCl
(1%, v/v) de amostras de flores femininas das 8 VCLM em
estudo......................................................................................................
199
FIGURA 12
Perfil espectral UV-visível (370 a 700ηm) do extrato MeOH-HCl
(1%, v/v) de amostras de flores femininas das 8 VCLM em
estudo......................................................................................................
199
FIGURA 13 Contribuição fatorial de PC1 dos extratos MeOH-HCl (1%, v/v) de
flores calculada a partir dos dados espectrais UV-visível (370-700
ηm).…………………………………………………..........................
200
FIGURA 14 Conteúdo médio de antocianinas (mg/g, peso seco) de tecido floral de
VCLM determinado por espectrofotometria UV-visível - 525 ηm (A)
e 460 ηm (B). RE = Roxo do Emílio; Ros = Rosado; R8C = Rajado 8
carreiras; CV = Cateto Vermelho; PR1E = Palha Roxa 1 do Emílio;
RV = Roxo do Valdecir; LP = Língua de Papagaio; MGPR = Mato
Grosso Palha Roxa; (n= 7). Colunas e barras verticais representam a
média
±
desvio padrão da média, respectivamente.................................
202
FIGURA 15 Antocianidinas detectadas por MALDI-TOF e eletrospray no extrato
MeOH-HCl (1%, v/v) bruto das flores das variedades Roxo do
Valdecir e Rosado...................................................................................
204
FIGURA 16 Espectros de ressonância magnética nuclear de 1H (400 MHz) (0 a 8
ppm) do extrato metanólico acidificado das variedades Roxo do
Valdecir, Rosado e Língua de Papagaio, mostrando as regiões de
detecção de carboidratos, ácidos orgânicos, carboidratos e compostos
aromáticos. TMS (tetrametilsilano – padrão interno); Solvente
(MeOH-δ
6
)..............................................................................................
205
FIGURA 17 Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de 1H-RMN (janela
espectrais de 0,1 a 8,0 ppm) do extrato MeOH-HCl (1%, v/v) de flores
femininas das 8 VCLM em estudo..........................................................
206
FIGURA 18 Contribuição fatorial de PC1 calculada a partir dos dados espectrais de
xxii
1H-RMN (0,2 a 8,0 ppm) do extrato metanólico acidificado de flores
de VCLM.................................................................................................
207
FIGURA 19 Contribuição fatorial de PC2 determinada a partir dos dados espectrais
de 1H-RMN (0,2 a 8,0 ppm) do extrato metanólico acidificado de
flores das VCLM.....................…………………………………………
207
FIGURA 20
D
istribuição fatorial de PC1 e PC3 para os dados de 1H-RMN (0,2 a 8,0
ppm) do extrato MeOH-HCl (1%, v/v) de flores femininas das 8
VCLM estudadas………………………………………………………
208
FIGURA 21 Contribuição fatorial de PC3 calculada a partir dos dados espectrais de
1H-RMN (0,2 a 8,07 ppm) do extrato MeOH-HCl (1%, v/v) de flores
das VCLM em estudo..............................................................................
209
FIGURA 22
Perfil cromatográfico de (poli)fenóis (CLAE, 280 ηm) presentes no
extrato MeOH-HCL (1%, v/v) do tecido floral da variedade Rosado.
1- ácido protocateuico, 2- ácido gálico, 3- ácido t-cinâmico, 4- ácido
caféico, a - composto não identificado…………………………………
212
FIGURA 23 Percentagem dos ácidos (poli)fenólicos identificados por CLAE no
tecido floral das 8 VCLM em estudo......................................................
213
FIGURA 24 Perfil espectral UV-visível de amostras do extrato MeOH-tolueno
(1:1, v/v) de flores femininas das 8 VCLM para as janelas espectrais
entre 400 a 750ηm.………………………….......................................
215
FIGURA 25
Perfil cromatográfico de carotenóides (CLAE, 450 ηm) presentes no
extrato MeOH-tolueno (v/v) do tecido floral saponificado da
variedade Rosado. 1- luteína, 2- β-caroteno, 3- α-caroteno, S –
solvente....................................................................................................
216
CAPÍTULO 6
FIGURA 1 Estruturas químicas dos carotenóides encontrados em grãos de milho e
do ácido retinóico, um derivado do β-caroteno.......................................
225
FIGURA 2 Efeito do extrato carotenoídico de grãos de milho da variedade MPA1
(0,1 – 10 µM de equivalente de zeaxantina/disco) administrados em
membranas de vesículas vitelínicas de embriões de galinha de 4 dias
de idade, cultivados in ovo. O inset mostra a percentagem do número
de vasos nos grupos controle. Discos de metilcelulose contendo
apenas água ultrafiltrada (C-MC) ou água ultrafiltrada e DMSO 2%
(C-DMSO) foram utilizados como controles negativos. Discos de
metilcelulose contendo ácido retinóico (AR; 10 µM) ou luteína (10
µM) foram utilizados como controles positivos. Os resultados são
expressos como a percentagem do número de vasos sanguíneos no
limite dos discos de metilcelulose quando comparados ao grupo
controle (C-DMSO). Colunas e barras verticais representam a média
erro padrão da média (n=8) e os asteriscos denotam uma inibição
estatisticamente significativa da vasculogênese em relação ao controle
(C-DMSO), usando ANOVA seguido do teste post-hoc Tukey
(p<0,05)...................................................................................................
±
233
FIGURA 3 Micrografias ópticas dos vasos vitelínicos do anexo embrionário da
vesícula vitelínica de embriões de galinha de 4 dias de idade, tratados
com (A) metilcelulose (grupo controle) e (B) 10 µM de equivalente de
xxiii
zeaxantina/disco de carotenóides de grãos de milho da variedade
MPA1. Bar = 2 mm.................................................................................
234
FIGURA 4 Efeito do extrato carotenoídico de grãos de milho da variedade MPA1
(0,1 – 10 µM de equivalente de zeaxantina/disco) administrados em
membranas corioalantóicas de embriões de galinha de 8 dias de idade,
cultivados in ovo. O inset mostra a percentagem de vasos nos grupos
controles. Discos de metilcelulose contendo apenas água ultrafiltrada
(C-MC); água ultrafiltrada e DMSO 2% (C-DMSO) – controles
negativos. Discos de metilcelulose contendo luteína e ácido retinóico
(10 µM) foram utilizados como controles positivos. Os resultados são
expressos como a percentagem de vasos sanguíneos no limite dos
discos de metilcelulose quando comparados ao grupo controle (C-
DMSO). Colunas e barras verticais representam, respectivamente, a
média
±
erro padrão da média (n= 8), e os asteriscos denotam uma
inibição estatisticamente significativa da angiogênese em relação ao
controle (C-DMSO), usando ANOVA seguido do teste post-hoc
Tukey (p < 0,05). ....................................................................................
236
1
3. INTRODUÇÃO
Atualmente, existe uma preocupação crescente por parte da comunidade científica
brasileira em fomentar atitudes políticas e técnicas que visem a conservação dos recursos
fitogenéticos, de modo a garantir o equilíbrio ambiental e o desenvolvimento agrícola do País.
Nesse contexto, a importância do milho não está apenas na produção de biomassas com
aplicação na alimentação humana e animal, mas em todo o relacionamento que o mesmo tem
na produção agropecuária brasileira, tanto no que diz respeito a fatores econômicos quanto a
fatores sociais. Além da sua grande importância no agronegócio nacional, esta cultura é base
para a sustentação da pequena propriedade, constituindo um dos principais insumos no
complexo agro-industrial brasileiro, e apresenta diversos benefícios quando de sua utilização
em sistemas de cultivo que utilizam a rotação de culturas e o plantio direto (ICEPA, 2004).
Pela sua versatilidade de uso, sua importância nutricional e social, o milho é um dos
mais importantes produtos do setor agrícola do País. Grande parte dos sistemas produtivos
caracteriza-se pelo baixo nível de tecnificação/mecanização e, como os agricultores não
possuem grandes extensões de terras, dependem da produção advinda de sua propriedade para
sua subsistência. O modelo de agricultura familiar encontrado em algumas regiões do País,
como por exemplo, no extremo oeste de Santa Catarina, representa, em um número
significativo de casos, a ruptura com a rede agro-industrial globalmente organizada, por
cultivarem sementes próprias (variedades crioulas e locais - VCLM), num regime de
subsistência ou semi-subsistência (OGLIARI & ALVES, 2006). Contudo, dado ao pequeno
valor agregado das matérias-primas do milho, os retornos econômicos recebidos pelos
agricultores usualmente são não significativos, gerando um desestímulo à sua permanência
naquela atividade e também no meio rural, potencializando o risco de extinção dos genótipos
locais e crioulos (erosão genética). Tal cenário não é, obviamente, de interesse, considerando-
se o significativo valor social e econômico daquele cereal. Assim, iniciativas que visem a
conservação de variedades ainda preservadas por comunidades locais, como a do município de
Anchieta-SC, tornam-se vitais para o desenvolvimento racional e sustentado das VCLM. Para
tal, é necessária a adoção de estratégias racionais e com suporte científico que estimulem os
pequenos agricultores à manutenção e ampliação das áreas de cultivo de genótipos locais e
crioulos de milho. A determinação de perfis metabólicos (metaboloma) constitui-se em uma
2
alternativa adequada e inovadora, uma vez que compreende a análise quantitativa e qualitativa
dos metabólitos presentes em um organismo ou em um dado tecido. O acesso as
peculiaridades químicas de diferentes genótipos com propósitos nutricionais, medicinais e de
agregação de valor gera possibilidades adicionais de uso da biomassa em questão, com
conseqüências positivas sobre a qualidade de vida das populações rurais, permitindo a
manutenção das mesmas nessa atividade e a conservação daqueles genótipos. O detalhamento
das características de composição química de VCLM estabelecerá subsídios técnico-
científicos que permitirão agregar valor às matérias primas oriundas daquele germoplasma, via
detecção de perfis metabólicos típicos e de interesse ao melhoramento genético, à saúde
humana e animal e/ou à alimentação (por exemplo, alimentos funcionais). Nesse contexto,
observa-se que a ingestão de alimentos que exerçam, como medida profilática, uma ação
modulatória na formação de vasos sanguíneos é uma tendência mundial. Tendo em vista que
as VCLM apresentam maior diversidade genética e, conseqüentemente, maior diversidade
química comparativamente às variedades melhoradas, espera-se um maior espectro de
possibilidades de atividades biológicas de interesse à saúde humana, como na vasculogênese e
angiogênese. De fato, trabalhos que correlacionam a ingestão de compostos (poli)fenólicos,
polissacarídeos, e estilbenos, entre outros, com uma menor incidência de desordens
fisiopatológicas, como as desordens cardiovasculares, têm sido relatados com freqüência na
literatura (IGURA et al., 2001; DEWANTO et al., 2002; DIAS et al., 2005).
Portanto, a médio prazo, é possível vislumbrar que os resultados obtidos no presente
estudo subsidiem a geração de novas tecnologias e produtos, em processos interativos com a
indústria alimentar, cosmética e/ou farmacêutica. Desse modo, permitir-se-á aos pequenos
agricultores maiores retornos econômicos, com a consequente manutenção e/ou aumento da
área de cultivo daquele germoplasma, corroborando para conservação desta importante reserva
gênica de Z. mays (conservação on farm).
A apresentação dos resultados obtidos no presente estudo foi organizada em 6
capítulos. A primeira parte consistiu na caracterização química da farinha das VCLM e de
cultivares comerciais, com ênfase em 3 classes de compostos químicos: amido, proteínas e
pigmentos e a segunda parte consistiu na caracterização química das flores femininas de 7
VCLM e nos resultados dos ensaios biológicos de vasculogênese e angiogênese. Um dos
capítulos foi destinado à caracterização da farinha e da fração amídica (amilose/amilopectina)
3
(Capítulo 1) usando espectroscopia vibracional de infravermelho com transformada de Fourier
(FT-IR) associada à quimiometria. No capítulo subseqüente (Capítulo 2) foram apresentados
os resultados da caracterização das mesmas frações amídicas investigadas por FT-IR, por
ressonância magnética nuclear de
13
C e de
1
H, seguido da análise dos dados por técnicas de
análise multivariada. Os dados quantitativos da composição protéica das amostras de farinha
das variedades em estudo foram mostrados no Capítulo 3, bem como a comparação do perfil
espectral de FT-IR daquela biomassa, para a região de fingerprint para proteínas, via análise
de componentes principais (PCAs). No Capítulo 4 foram apresentados os dados referentes à
quantificação e identificação dos compostos carotenoídicos, antociânicos e (poli)fenólicos das
farinhas das diversas variedades, realizada através de técnicas espectroscópicas (UV-visível) e
cromatográficas (CLAE). O Capítulo 5 destinou-se à caracterização química das flores
femininas das VCLM, com ênfase à identificação e determinação do conteúdo de
carotenóides, (poli)fenóis e antocianinas. Por último, os resultados relativos aos ensaios
biológicos foram apresentados no Capítulo 6, onde o efeito sobre os processos de formação de
vasos sanguíneos (vasculogênese e angiogênese) do extrato carotenoídico de grãos de milho
daquele cereal foi investigado.
4
4. REVISÃO DE LITERATURA
4.1 Milho
4.1.1 Importância econômica e alimentar
A cultura do milho tem grande importância na economia mundial, sendo responsável
por 7% da energia consumida no mundo (FAO, 2007). Da mesma forma, este cereal apresenta
significativa relevância econômica e social para o Brasil. Há duas décadas, o País mantém a
posição de terceiro produtor mundial, após os Estados Unidos e a China, com uma produção
na safra agrícola 2003/2004 de aproximadamente 42,5 milhões de toneladas e uma estimativa
para a safra 2005/2006 de 41 milhões de toneladas, em uma área de 12,5 milhões de hectares
(www.conab.gov.br). Seus produtos como grãos, matéria verde fresca, amido, amilose,
xaropes de glucose e maltodextrinas são utilizados na alimentação humana, diretamente ou
após a industrialização, e, principalmente, na alimentação de aves, suínos e bovinos, que são
as principais fontes de proteínas de origem animal em todo o mundo. Portanto, não é de
surpreender o fato de que o crescimento da demanda de milho em aplicações industriais no
Brasil tenha acompanhado o crescimento da produção de aves e suínos (ICEPA, 2004).
Nos países industrializados, o milho pode ser encontrado em quase todos os produtos:
cosméticos, roupas, papel, pasta dental, tintas, loções, entre outros. Além disso, recentemente,
o milho vem sendo utilizado na confecção de polímeros biodegradáveis que são matérias-
primas para as indústrias de embalagens e automobilística (MIRANDA PEIXOTO, 2002). Na
Tabela 1 estão listados os usos de alguns órgãos e do pólen do milho na alimentação humana
(BULL & CANTARELLA, 1993; DUKE et al.,, 2002; MIRANDA PEIXOTO, 2002).
Além da importância econômica, o milho também tem relações com aspectos sociais e
culturais, servindo como parte da subsistência de muitas famílias rurais (KIRINO, 2003). No
Brasil, 30,8% do total de agricultores que cultivam este cereal o fazem em áreas inferiores a 1
hectare, o que representa apenas 1,89% da produção nacional (DUARTE, 2004). Além disso,
cerca de 60% dos estabelecimentos rurais que produzem milho consomem-no na propriedade,
porém, apesar deste elevado percentual, aqueles estabelecimentos representam apenas 25% da
produção nacional de milho (IBGE, 2005).
5
TABELA 1 – Formas de uso alimentar de grãos, estigma/estilete, pólen e colmo do
milho.
Grãos
podem ser consumidos ainda verdes, crus ou cozidos,
principalmente nas variedades doces.
quando completamente amadurecidos, podem ser
utilizados para a obtenção de fubás, farinhas e amido
de milho. Representam uma importante matéria-
prima à elaboração de pães, doces, biscoitos, cremes,
sorvetes, balas e na indústria alimentícia de modo
geral.
a fração amídica pode ser transformada em dextrina
ou dextrose, as quais são utilizadas na elaboração de
adesivos, xaropes e enlatados. O produto da hidrólise
total do amido pode ser transformado em frutose, um
insumo utilizado como adoçante na indústria de
doces e bebidas.
pipoca (algumas variedades).
tostados e moídos podem ser utilizados como
substituto do café.
o óleo é utilizado diretamente no preparo dos
alimentos, ou então como insumo à produção de
margarinas ou maioneses, por exemplo.
utilizados para obtenção de álcool etílico no preparo
de bebidas alcoólicas.
Estigma/Estilete
consumidos in natura antes da polinização, tendo
sabor levemente adocicado.
Pólen
utilizado como ingrediente na elaboração de
alimentos como sopas, por exemplo, sendo rico em
proteínas.
Colmo
a parte interna é suculenta e pode ser consumida de
maneira similar ao colmo da cana de açúcar. O
extrato aquoso é utilizado no preparo de xaropes.
Fonte: (BULL & CANTARELLA, 1993; DUKE et al., 2002; MIRANDA PEIXOTO, 2002)
Além da utilização como alimento, existem relatos do aproveitamento dos grãos de
algumas variedades de milho na elaboração de preparados com finalidade terapêutica
(BRACK-EGG, 1999) e registros científicos da utilização medicinal dos extratos de suas
6
flores femininas (VELÁZQUEZ et al., 2005). De fato, vários estudos etnobotânicos relatam o
emprego do milho como planta medicinal por etnias com forte tradição cultural. O uso
terapêutico mais citado para Z. mays está relacionado ao sistema urinário, seguido de sua
utilização no tratamento da hipertensão e constipação. O uso medicinal de estigmas de Z. mays
como diurético é citado em 93 livros de fitoterapia, em 13 países (VELÁZQUEZ et al., 2005).
O produto fitoterápico Herbal Maydis Stigma® (estigmas de flores de Z. mays desidratados e
fragmentados), por exemplo, é uma das formas atuais de utilização terapêutica desta planta,
sendo reconhecido pela medicina popular e pela alopatia tradicional como um diurético
moderado, auxiliando na eliminação de cálculos renais. Adicionalmente, os estigmas de milho
são utilizados contra a hiperplasia de próstata, cistite, gota, nefrite crônica e distúrbios
similares (BRITISH HERBAL PHARMACOPOEIA, 1996; MAKSIMOSIĆ et al. 2005). A
despeito das diversas formas de uso referidas, os trabalhos relativos à atividade farmacológica
dos tecidos/órgãos de milho são escassos, sugerindo a necessidade de um detalhamento maior,
como subsídio à exploração racional daquela espécie como fonte de compostos bioativos de
elevado valor de mercado.
4.1.2 Origem e domesticação
Diversas evidências e estudos indicam que a origem e a domesticação do milho
ocorreram no sudeste do México, a partir da sua utilização por povos indígenas. O processo de
domesticação provavelmente ocorreu há 9.000 anos atrás, a partir da gramínea selvagem
mexicana denominada Teosinte (Zea mays ssp. parviglumis ou spp. Mexicana - WANG et al.,
1999; MATSUOKA et al., 2002; KANE & RIESEBERG, 2005). Os agricultores ancestrais,
por meio de um processo contínuo de melhoramento e também em decorrência de pressões de
seleção impostas pelo manejo agrícola, obtiveram uma planta ereta, com um único colmo e
com espigas maiores, contendo maior quantidade e qualidade de grãos. Essas características
fenotípicas são bastante distintas do seu ancestral selvagem que tem vários colmos, espigas
pequenas e com poucos grãos (FREITAS, 2001; MIRANDA PEIXOTO, 2002). Recentes
estudos de microsatélites reforçaram a hipótese de que o milho atual não é o produto de
múltiplos eventos independentes de domesticação, mas de um evento simples. No entanto, a
teoria da introgressão de genes a partir de outros tipos de teosintes, após o evento inicial de
7
domesticação, tem sido usada para explicar a enorme diversidade fenotípica e genética do
milho (WANG et al., 1999; MATSUOKA et al., 2002).
Durante o processo de domesticação das plantas, a diversidade cultural dos povos,
associada à enorme diversidade ambiental, proveram e ainda provêm a humanidade de uma
infinidade de sistemas de produção, baseados em um grande número de espécies e formas de
manejo. Esse processo de seleção e melhoramento de variedades permitiu que as espécies
domesticadas se adaptassem a uma ampla gama de ambientes, segundo o seu potencial
genético e de diversidade. Dessa forma, ao longo de milhares de anos, comunidades locais
com diferentes tradições culturais, em distintas condições ambientais, cultivaram e
selecionaram raças primitivas de Z. mays, legando às gerações posteriores o milho atual,
altamente domesticado e produtivo (MACHADO & PARTENIANI, 1998).
O homem é considerado o principal agente difusor desta espécie que se reproduz
somente via disseminação de suas sementes, seja através de processos migratórios, seja através
da troca de mercadorias, ou mesmo durante os eventos de conquista. Quando Colombo
retornou à Europa, em 1493, após o descobrimento da América, levou consigo alguns grãos
deste cereal até então desconhecido, introduzindo-o nos países mediterrânicos. Cerca de 100
anos depois, comerciantes e navegadores distribuíram o cereal pelos cinco continentes,
principalmente através dos movimentos de colonização realizados pelos povos europeus
naquele período (MACHADO & PARTENIANI, 1998; FREITAS, 2001; MIRANDA
PEIXOTO, 2002; MATSUOKA et al., 2002). Atualmente, são conhecidos cinco principais
tipos de Z. mays, referindo-se às características apresentadas pelos grãos, que já existiam na
América antes de 1492, sendo eles: Pipoca, Duro, Dentado, Farináceo e Doce (DUKE et al.,
2002; MIRANDA PEIXOTO, 2002). Atualmente, mais de 250 cultivares deste cereal são
conhecidos, sendo que todos tiveram sua origem direta ou indiretamente ligada aos trabalhos
de seleção/melhoramento efetuados pelas civilizações pré-colombianas. Muitas dessas
variedades primitivas se perderam, juntamente com a cultura das populações indígenas
extintas durante o processo de colonização das Américas. No entanto, a grande diversidade
genética adquirida nestes milhares de anos possibilitou ao milho adaptar-se a uma ampla gama
de condições edafoclimáticas, fazendo com que seja um dos cereais mais extensivamente
cultivado no mundo, ao lado do trigo e arroz. É uma planta que distribuiu-se desde o nível do
mar até 4.000 metros de altitude, de regiões áridas, com índice pluviométrico de 400 mm/ano,
8
até regiões tropicais com mais de 1.500 mm/ano. Dentro desta diversidade de ambientes, já
foram identificados cultivares tolerantes a extremos de pH, vírus, bactérias e fungos, ao ataque
de herbívoros, a solos de baixa fertilidade e a exposição à radiação UV, por exemplo (DUKE
et al., 2002; MACHADO & PARTENIANI, 1998; FREITAS, 2001; MIRANDA PEIXOTO,
2002).
Um aspecto importante a ser considerado na análise histórica da domesticação e cultivo
deste cereal refere-se ao processo de melhoramento vegetal vigente, em âmbito mundial, até a
década de 50, o qual se baseava na seleção dos genótipos mais adaptados a um determinado
ambiente e era realizado por sucessivas gerações de agricultores, tendo como resultado o que
denominamos hoje variedades crioulas e locais de milho - VCLM (WEID & SOARES,1998).
Embora existam diferentes definições para o termo variedades crioulas e locais, é importante
salientar que para ZEVEN (1998), variedade crioula/local é aquela que tem elevada
capacidade de tolerar estresses (a)bióticos, mantendo um nível de produtividade alto ou
intermediário sob um sistema de produção agrícola com baixo input de energia. No presente
estudo, as VCLM serão entendidas como sendo produto da seleção e manejo desenvolvidos
por agricultores, ao longo dos anos de cultivo, e pelas pressões de seleções impostas pelo
ambiente.
No entanto, como fruto da revolução industrial, um novo paradigma passou a dominar
o pensamento científico agronômico, onde se buscou a máxima artificialização do ambiente de
produção, visando controlar todos os fatores naturais que podem interferir na produção. As
características de produção (Kg de biomassa) e de produtividade (Kg biomassa/unidade de
área) passaram a ser privilegiadas em detrimento de outras características fenotípicas,
resultando em uma redução da variabilidade genética desses novos cultivares, os quais se
tornaram mais vulneráveis a pragas e doenças e também exigentes em termos de balanço
hídrico e nutricional. Para compensar essa fragilidade, criou-se um sistema de controle e
manipulação ambiental baseado na utilização intensa de agrotóxicos, irrigação, adubação
química e de mecanização das práticas agrícolas, com claros efeitos negativos sobre a micro e
a mesofauna nas áreas cultivadas. Como exemplo disto, menciona-se os efeitos dos pesticidas
como agentes de desequilíbrio das cadeias tróficas, produzindo fortes impactos negativos
sobre os insetos. Neste contexto, é possível prever danos ao fluxo gênico entre populações de
interesse, como Zea mays, e a conseqüente redução de sua variabilidade genética. Além disso,
9
esse modelo produtivo vem reduzindo aceleradamente o uso de determinados tipos de
variedades, concentrando-se apenas naquelas de alta resposta ao uso de fertilizantes (WEID &
SOARES,1998). De fato, a redução da base genética tende a se agravar ainda mais, uma vez
que em diversos programas de melhoramento genético daquela espécie as próprias variedades
comerciais são utilizadas como base para o desenvolvimento de novos genótipos (RAIJ,
1998).
A perda da diversidade genética dessa espécie coincide com a destruição da agricultura
familiar tradicional em todo o mundo. Por múltiplas formas e causas, os agricultores
familiares foram sendo expulsos de suas terras e substituídos por empresas que aplicam o
pacote tecnológico moderno das monoculturas mecanizadas e dependentes de agrotóxicos.
Com os pequenos produtores, perdem-se também as variedades locais e o conhecimento dos
recursos genéticos. Até a introdução das variedades melhoradas e dos híbridos de milho,
ocorrida de forma maciça a partir dos anos 70, a absoluta maioria dos agricultores plantava
sementes próprias. Atualmente, apenas agricultores familiares de baixa renda ainda mantêm
essa tradição (WEID & SOARES, 1998). Em função disto, as iniciativas voltadas ao resgate
de variedades ainda preservadas por grupos humanos regionais tornam-se vitais para o
desenvolvimento da cultura do milho (SOARES et al., 1998), notadamente no que se refere à
conservação de genótipos locais sem aparente utilidade comercial, minimizando o
estreitamento da base genética dessa espécie vegetal decorrente do modelo globalizado do
sistema de produção intensiva. Segundo OGLIARI & ALVES (2006), VCLM cultivadas em
regiões de agricultura familiar, por exemplo, são valiosas fontes alternativas de características
genéticas relevantes para cultivos, sendo por isso consideradas como um reservatório de
genes, além de possuírem outras características desejáveis, tais como teores apreciáveis de
metabólitos secundários de interesse à alimentação e saúde humana (como por exemplo,
polifenóis, antocianinas e carotenóides) diversos tipos de amidos e ainda alto rendimento de
grãos, sob condições de cultivo com baixa demanda energética.
A garantia de manutenção da variabilidade genética das espécies cultivadas é essencial
ao presente e futuro da humanidade, pois relaciona-se diretamente com a evolução da
agricultura atual, a qual deve se adequar para garantir a segurança alimentar humana, seja
solucionando o problema de fornecimento de alimentos, seja respondendo à crescente procura
por alimentos com maior valor nutricional (BRUSH, 2001). Tal abordagem é uma
10
preocupação crescente e que tem levado à criação de programas de conservação da
diversidade genética dos recursos vegetais, garantindo o acesso e uso destes às futuras
gerações (BRUSH, 2001; ALVES et al., 2004). Esse debate intensificou-se a partir da
Convenção sobre Diversidade Biológica, realizada no Rio de Janeiro em 1992, a qual
estabeleceu alguns fundamentos estratégicos para o manejo, o uso e a conservação dos
recursos genéticos vegetais, definindo em seus objetivos básicos “a conservação, a utilização
sustentável e a repartição justa e eqüitativa dos benefícios advindos do uso dos recursos
genéticos” (GOEDERT et al., 2001).
A importância do uso, manejo e conservação das variedades locais é foco de discussão
em diversos fóruns internacionais e nacionais, os quais têm apontado como razões principais
para a conservação e manejo das variedades locais: 1) a resistência e adaptação, além da boa
produtividade daquele germoplasma, mesmo em condições edafoclimáticas adversas; 2) as
razões tradicionais ou peculiaridades, como características organolépticas que agregam valor à
comercialização e, 3) a preferência e apreciação pelas famílias de pequenos produtores rurais
(NEGRI, 2003).
4.2 Identificação do local de estudo
No Estado de Santa Catarina, a cultura do milho é uma atividade agrícola importante,
merecendo destaque por sua produção o município de Anchieta, localizado no extremo oeste
catarinense, principalmente devido à sua importância como base da alimentação animal. Na
safra 2005/2006, foram colhidos 3.100 mil toneladas de grãos em SC, cultivados em uma área
aproximada de 784.810 ha, registrando-se ainda um déficit de 1.770 mil toneladas
(EPAGRI/CEPA, 2007). É importante também relatar que cerca de 58% dos cultivos de milho
ocorrem em áreas de até 10 hectares, sendo 62% da produção consumida dentro das
propriedades. Esses dados demonstram a estreita relação entre a cultura do milho e a
subsistência dos pequenos agricultores (CENSO AGROPECUÁRIO/SC, 1996).
O município de Anchieta está situado a 26º 30
’
de latitude sul e 50º 30
’
de longitude
oeste do meridiano de Greenwich, na microrregião do extremo oeste catarinense (Figura 1). A
área do município abrange 229,53 km
2
, sendo o espaço rural organizado em 31 comunidades,
existindo diversas associações de pequenos agricultores para os mais diversos fins (VOGT,
11
2005). No entanto, é importante considerar que a população do município registrou um
decréscimo nos últimos anos. No início da década de 80, de um total de 11.383 habitantes,
8.131 (71,4%) residiam em áreas rurais, enquanto em 2000 a população do município foi
reduziada para 7.134 habitantes, com 65,75% destes ocupando o espaço rural (CANCI et al.,
2002). Os estabelecimentos agrícolas apresentam uma área média de 18 ha, conferindo uma
característica de predominância de pequenas propriedades à estrutura fundiária local. Apenas
1% das propriedades agrícolas possui áreas entre 100 e 500 ha e 4% entre 50 e 100 ha
(SANTA CATARINA, 2003).
FIGURA 1 - Mapa geopolítico de Santa Catarina mostrando a localização do município de
Anchieta (Retirado de
http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:SantaCatarina_Municip_Anchieta.svg).
No município de Anchieta, a agrobiodiversidade está presente entre as famílias rurais,
sendo que no caso do milho crioulo seu plantio é observado em 40,61% das propriedades de
pequenos agricultores, com área média de cultivo de 3,20 ha, um fato que demonstra sua
grande importância como espécie agrícola (CANCI et al., 2002). Este cenário faz com que
12
aquele município seja conhecido como a capital catarinense do milho crioulo, conforme o
projeto lei de n° 466/99, aprovado pela Assembléia Legislativa do estado de Santa Catarina.
Além do milho, as culturas do fumo e da soja também se destacam na região, sendo o
fumo de grande importância econômica. A cana-de-açúcar, feijão, trigo, mandioca e arroz
também são representativas fontes de renda agrícola. Na pecuária, o município se destaca na
produção de suínos, aves e na bovinocultura de leite e de corte (CANCI, 2004). Porém, o
milho crioulo atualmente é a cultura de maior representatividade em termos de área, sendo que
uma diversidade expressiva de genótipos é encontrada, com características e particularidades
de interesse agronômico e nutricional. De fato, em levantamento recente (VOGT, 2005) foi
observado que em um universo de 223 estabelecimentos agrícolas amostrados, 96 destes
(43%) cultivam VCLM, estando distribuídos em 28 comunidades daquele município. Além
disso, 76% dos agricultores cultivam variedades locais específicas há menos de 5 anos, com
cerca de 4% cultivando a mesma variedade há mais de 20 anos, enquanto apenas 2% o fazem
há mais de 30 anos. As variedades locais Pixurum 05, Amarelão, Mato Grosso, Palha Roxa e
Branco estiveram presentes em 71% dos estabelecimentos em 2005 (VOGT, 2005). Dentre as
variedades locais, a Pixurum 05 foi a que teve maior representatividade, sendo cultivada em
32% dos estabelecimentos consultados. Destacaram-se também as variedades Rosado, Asteca,
Roxo, Palha Roxa e Gurvena, por serem cultivadas por um tempo médio superior a 10 anos.
As variedades comumente cultivadas como Pixurum 05, Amarelão, Mato Grosso, Palha Roxa
e Branco apresentaram-se bem distribuídas geograficamente em todo o município (VOGT,
2005; CANCI, 2006).
Dados adicionais permitiram observar que 90% da produção de VCLM no município
de Anchieta destinam-se ao consumo na propriedade e apenas 10% são comercializados. Os
usos das VCLM na propriedade destinam-se principalmente a alimentação animal, na forma
de grãos (41%), forragem (24%) e silagem (8%) e o restante à alimentação humana, como
farinha de milho (18%) e canjica (10%) (VOGT, 2005).
O papel que os pequenos agricultores do extremo oeste catarinense desempenham na
manutenção da variabilidade genética do milho crioulo, alcançada por meio da conservação
nas pequenas propriedades, deve ser enfatizado. Além disto, é importante destacar que seu
cultivo constitui-se em uma alternativa viável economicamente para a agricultura familiar,
sendo uma realidade no município de Anchieta e comunidades vizinhas. Tomados em
13
conjunto, estes aspectos demonstram a necessidade de realização de estudos científicos mais
aprofundados em relação ao cenário atual da pequena agricultura do extremo oeste de SC,
como estratégia para avaliar, conservar e melhorar o sistema produtivo local, bem como para
agregar valor à produção e comercialização das VCLM.
Considerando que a caracterização da variabilidade genética e fitoquímica constituem
estratégia de interesse por permitir a manipulação das reservas gênicas disponíveis em prol do
melhoramento de plantas, a caracterização química das VCLM, no que se refere aos compostos
do metabolismo primário e secundário gera, por sua vez, possibilidades adicionais de uso
daquela biomassa.
4.3 Caracterização dos compostos de interesse
A caracterização química das VCLM é de grande interesse por gerar possibilidades
adicionais de uso da biomassa em questão. Tal caracterização pode ser obtida adotando-se
como estratégia de estudo uma abordagem adequada e dedicada à determinação do perfil
metabólico (metaboloma) daquele germoplasma, apoiada em técnicas analíticas consolidadas,
como por exemplo, a ressonância magnética nuclear (RMN) e a espectroscopia vibracional de
infravermelho médio com transformada de Fourier (FT-IR). O metaboloma é a manifestação
real do genoma e do proteoma de uma determinada amostra no momento da análise, sendo o
levantamento quantitativo e qualitativo de todos os metabólitos presentes em um organismo ou
em um dado tecido. Até o presente momento, contudo, nenhum método analítico possibilita,
isoladamente, a obtenção de um quadro completo do metaboloma de um organismo. Em
função disto, a combinação de diversas técnicas de análise instrumental associdas à
quimiometria torna-se necessária, assim como a inclusão de compostos do metabolismo
primário e secundário, tais como carboidratos, aminoácidos, lipídeos, vitaminas, (poli)fenóis,
terpenos e alcalóides (SUMNER et al., 2003; FUKUSAKI & KOBAYASHI, 2005; VILLAS-
BÔAS & GOMBERT, 2006).
14
4.3.1 Metabólitos primários: amido e proteínas
Em decorrência de seu potencial nutritivo e da composição química, o milho constitui-se
em um dos cereais mais cultivados e consumidos no mundo. Embora, a maior parte da produção
seja destinada à alimentação de animais, estima-se a existência de 600 produtos provenientes
desta matéria-prima. Como exemplo disto, nas indústrias alimentícias é empregado como
matéria-prima para a produção de amido, óleo, farinha e glucose e é usado para conferir
propriedades texturais desejáveis aos alimentos. Além disto, diversos produtos químicos, tais
como adesivos, termoplásticos e rações animais apresentam em sua formulação um ou mais
constituintes oriundos da biomassa desta espécie (BULL & CANTARELLA, 1993; WHITE,
2001).
De acordo com ZUBBER & DARRAH (1987), o grão de milho é constituído por tecidos do
endosperma (85%, p/p), sendo que 70% desta biomassa é amido, embrião (10%, p/p) e
pericarpo (5%, p/p). O pericarpo e a camada de aleurona são responsáveis pela variação da cor
dos grãos dessa gramínea. As cores dos grãos e da palha da espiga podem variar entre vermelha,
marrom, laranja, vermelho púrpura, azul e amarelo (GOODMAN & SMITH, 1987), sendo
controladas por diversos genes (NEUFFER et al., 1987).
O grão de milho é uma importante fonte de proteína e energia para a nutrição humana e
animal, apresentando níveis elevados de amido (amilose e amilopectina), fibras, ácidos graxos
poliinsaturados e açúcares. Dentre esses compostos, o amido se caracteriza por constituir o
polissacarídeo de armazenamento mais abundante em alimentos de origem vegetal (KARIM et
al., 2000). Apesar da ampla distribuição do amido no reino vegetal, poucas plantas são usadas
como matéria-prima para obtenção comercial do mesmo, destacando-se o milho que é a maior
fonte desse polissacarídeo produzido no mundo (WHITE, 2001).
Nas células, o amido está organizado em pequenos grânulos, podendo diferir em
tamanho, forma e teor de α-glucanas, lipídeos, umidade, proteínas e minerais (TESTER &
KARKALAS, 1996; BULÉON et al., 1998). Os grânulos de amido são constituídos por dois
tipos de α-glucanas, sintetizadas a partir da sacarose produzida através do processo de
fotossíntese. Esses dois tipos de polímeros são representados pela amilose e amilopectina
(BULÉON et al., 1998). A amilose é uma molécula linear, constituída por unidades de D-
15
glucose, unidas por ligações glicosídicas do tipo α-D-(1→4), representando cerca de 25 a 30%
do amido, podendo apresentar variações desse valor entre germoplasma. O seu peso molecular é
geralmente de 50.000 a 200.000 Da. A amilopectina, por sua vez, é uma molécula com peso
molecular variando entre 1.000.000 a 3.000.000 Da, sendo também constituída por unidades de
D-glucose, unidas por ligações glicosídicas do tipo α-D-(1→4). No entanto, apresenta
ramificações periódicas no carbono 6 e constitui cerca de 70-75% do grânulo de amido. Existem
ainda evidências de polissacarídeos de tamanho intermediário no milho, representando de 5-7%
do amido (WHITE, 2001; RIDOUT et al., 2002; TESTER et al., 2004). Segundo FERGASON
(2001), o amido do milho não pode ser precisamente dividido nas frações amilopectina e
amilose por existir associado a essas frações uma mistura de várias moléculas de tamanho e
peso intermediários, o que pode resultar em elevada diversidade estrutural. Portanto, a
constituição desses polissacarídeos pode servir futuramente como um marcador bioquímico para
avaliação da diversidade de frações amídicas entre variedades. Tal aspecto é de interesse, haja
vista que algumas variedades podem ter aplicações diretas na indústria de alimentos, uma vez
que grande parte do amido nativo tem uso limitado na indústria por não possuir as propriedades
funcionais necessárias.
As proteínas constituem o segundo componente químico majoritário em importância nos
grãos de milho. O conteúdo protéico dos grãos pode variar entre 6 a 12%, com predomínio de
ocorrência no endosperma (SHUKLA & CHERYAN, 2001). As proteínas do milho podem ser
classificadas em quatro grupos de acordo com a sua solubilidade: albuminas (solúveis em água),
globulinas (solúveis em solução salina), prolaminas (solúveis em solução alcoólica forte) e
gluteninas (solúveis em alcális) (LANDRY & MOUREAUX, 1970; VASAL, 2001). Cabe
ressaltar que a qualidade nutricional das proteínas do milho é considerada baixa, devido à
deficiência dos aminoácidos essenciais lisina e triptofano (CHEFTEL et. al., 1989). Porém, este
cereal representa a base da alimentação nos países pobres, o que tem justificado as pesquisas
que buscam solucionar este problema por meio do desenvolvimento de milhos mutantes com
altos níveis de lisina nos grãos (MERTZ et al., 1992).
16
4.3.2 Metabólitos secundários
Além dos compostos predominantes na composição dos grãos de milho, outros
denominados metabólitos secundários, também estão presentes. A partir do ano de 2000 a
“United States Dietary Guidelines for Americans” passou a recomendar a ingestão diária de
uma diversidade de grãos, preferencialmente em sua forma inteira. Isto porque, os grãos
fornecem muito mais do que carboidratos à nossa dieta, sendo fontes ricas de nutrientes como
fibras, vitaminas B e E, selênio, zinco, cobre, magnésio e metabólitos secundários. Contudo, o
processo de beneficiamento dos grãos elimina grande parte desses constituintes tão
importantes à prevenção de diversas doenças, como as cardiovasculares e o câncer (SLAVIN
et al., 2001).
Os compostos advindos do metabolismo secundário da planta, ao contrário dos
compostos do metabolismo primário (polissacarídeos, proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos),
são encontrados, na maioria das vezes, em grupos vegetais restritos, como por exemplo, em
apenas um gênero. Os metabólitos secundários não são essenciais ao crescimento e
desenvolvimento do indivíduo, mas podem ser imprescindíveis à sobrevivência e continuidade
da espécie dentro do ecossistema, possuindo características químicas variadas (TAIZ &
ZEIGER, 2004). De acordo com a sua origem, podem ser classificados em compostos
fenólicos, terpenos e alcalóides (HARBORNE, 1999).
A via de síntese dos metabólitos secundários está intimamente relacionada à via
principal do metabolismo de carboidratos, como mostra a Figura 2. Resumidamente, dois
compostos intermediários, o fosfoenolpiruvato (proveniente da via glicolítica) e a eritrose-4-
fosfato (oriunda da via das pentoses-fosfato), originam o ácido chiquímico - um importante
precursor de diversos compostos que possuem núcleos aromáticos, como por exemplo os
alcalóides indólicos, quinolínicos, isoquinolínicos, ligninas, lignanas, cumarinas e taninos
hidrossolúveis. Alternativas à via principal de carboidratos com a finalidade de síntese de
compostos secundários são a via do mevalonato e a via de condensação do acetato. A via do
mevalonato origina os terpenóides e os esteróides, enquanto a condensação do acetato resulta
na formação das acetogeninas (WALTON & BROWN, 1999).
17
FIGURA 2 - Vias de síntese dos principais metabólitos secundários de vegetais superiores
(adaptado de TAIZ & ZEIGER, 2004).
Dentre os diversos grupos de metabólitos secundários, as antocianinas, os (poli)fenóis
e os carotenóides (Figura 3) destacam-se por exercerem funções variadas no ciclo de vida da
planta, como mediadores da interação planta-ambiente, planta-insetos, planta-
microorganismos e interações planta-planta, por exemplo (OKSMAN-CALDENTY, 1996;
BOURGAUD et al., 2001; VERPORTE & MEMELINK, 2002). Além disso, são compostos
que possuem atividades biológicas já documentadas na literatura ligadas à saúde humana. São
conhecidos mais de 100.000 metabólitos secundários produzidos por plantas, sendo que a cada
ano são descobertos aproximadamente mais 4.000 compostos (ZHANG et al., 2002).
18
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH O
OH
OH
OH
CO
2
H
COOH
OCH
3
OH
3
HCO
OH
OH
A
B
C
D
E
F
FIGURA 3 - Compostos do metabolismo secundário comumente encontrados
em milho: ácido siríngico (A), quercetina (B), ácido p-cumárico (C),
pelargonidina (D), β-caroteno (E) e luteína (F).
4.3.2.1 Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são moléculas formadas por um ou mais anéis benzênicos,
ligados a grupos hidroxilas, podendo ainda apresentar como substituintes grupamentos metil,
metoxil, amino e monossacarídeos (HARBORNE, 1999). Esse grupo de compostos pode ser
dividido em fenóis simples e polifenóis, baseando-se no número de unidades de hidroxilas na
19
molécula. Derivados de ácidos fenólicos simples, como os ácidos benzóico e cinâmico,
apresentam atividade antioxidante, a qual esta relacionada ao número de hidroxilas presentes na
molécula (CURVELIER et al., 1992). Em grãos de milho amarelo, foi observada a presença dos
ácidos p-hidroxibenzóico, vanílico, siríngico, p-cumárico, caféico e sinápico; enquanto nos
grãos de milho roxo foram detectadas quantidades inferiores dos ácido p-cumárico, vanílico,
ferúlico e protocatéico, além de derivados de quercetina e hesperidina (PEDRESCHI &
CISNEROS-ZEVALLOS, 2007).
Além do papel dos (poli)fenóis como agentes antioxidantes, outras atividades biológicas
têm sido relatadas, tais como anti-tumoral (RAO et. al., 1993), anti-inflamatória (MAGGI-
CAPEYRON et al., 2001) e anti-viral (KING et al., 1999). Polifenóis como os flavonóides e os
precursores de ligninas são potentes antioxidantes, com efeitos anti-mutagênicos e anti-
carcinogênicos reconhecidos (MIDDLETON & KANDASWAMI, 1994; RICE-EVANS et al.,
1997; SUGIHARA et al., 1999).
4.3.2.2 Antocianinas
Dentre os pigmentos flavonoídicos vegetais, as antocianinas têm despertado grande
interesse. Esses compostos são resultantes das vias do ácido chiquímico e do malonato (Figura
2), os quais têm como precursores a fenilalanina e três unidades de acetato, pertencendo,
portanto à classe dos fenilpropanóides (WALTON & BROWN, 1999). Na natureza, esses
pigmentos são responsáveis pela coloração vermelha, rosa, púrpura e azul de tecidos de flores e
frutos, atuando na atração de polinizadores, ou ainda na proteção da planta contra danos
causados por agentes abióticos como os raios ultra-violeta (TAIZ & ZEIGER, 2004). As
antocianinas existem na natureza na forma de heterosídeos, liberando, quando submetidas à
hidrólise ácida, uma molécula de açúcar e uma aglicona denominada antocianidina
(HARBORNE, 1999). As principais antocianidinas encontradas nos grãos de milho roxo
provenientes do Peru são: pelargonidina, peonidina e cianidina (AOKI et al., 2002). No Japão, o
milho roxo tem sido usado como fonte de pigmentos adicionados a bebidas e geléias, entre
outros alimentos. Recentemente, diversos estudos têm sugerido que as antocianinas possuem
atividades biológicas diversas, tais como antioxidante (TSUDA et. al., 1996; GABRIELSKA et
20
al., 1999), anti-mutagênica (YOSHIMOTO et al., 1999) e anti-tumoral (KOIDE et al., 1997).
Com exemplo disto, os pigmentos dos grãos do milho roxo foram associados a um decréscimo
na carcinogênese de cólon de ratos, induzida por Ph1P (2-amino-1-metil-6-fenil-imidazo [4,5-b]
piridina) (HAGIWARA et al., 2001). Neste sentido, as antocianinas têm sido indicadas não só
como corantes de alimentos, mas também como constituintes de alimentos que previnem
doenças, i.e., alimentos funcionais.
4.3.2.3 Carotenóides
Nas plantas, os carotenóides participam do processo fotossintético absorvendo energia
luminosa e transferindo-a para os centros de reação da clorofila (WALTON & BROWN, 1999),
além de protegerem o aparato celular fotossintético contra danos foto-oxidativos (BARTLEY &
SCOINIK, 1995). Estes pigmentos naturais, amplamente distribuídos no reino vegetal, são
responsáveis pela coloração amarela, alaranjada e avermelhada de muitos alimentos. A estrutura
básica de um carotenóide é um esqueleto tetraterpênico (40 átomos de carbono) formado por
oito unidades de isopreno (C
5
H
8
). De maneira geral, os carotenóides podem ser separados em
dois grupos: os carotenos, que são hidrocarbonetos carotenóides, e os oxicarotenóides,
conhecidos genericamente como xantofilas (BRITTON, 1992). A função biológica mais
conhecida dos carotenóides é sua atividade pró-vitamina A, porém, outras funções têm sido
atribuídas a essa classe de compostos, tais como antioxidante (HANDELMAN, 2001) e
preventiva de doenças degenerativas (SCHÜNEMANN et al., 2002; MICHAUD et al., 2000;
SLATTERY et al., 2000).
Nos grãos de milho, os carotenóides mais comuns são a luteína e a zeaxantina (AMAN
et al., 2005). Esses oxicarotenóides, em particular, são pigmentos que possuem atividade
protetora contra a radiação solar. Nos seres humanos, os carotenóides têm participação efetiva
na proteção da retina contra a radiação ultravioleta. Tais compostos podem ser encontrados na
região central da retina (mácula), sendo que sua presença tem sido relacionada a uma menor
incidência de doenças como a degeneração macular e o aparecimento de cataratas, além de
combater alguns tipos de câncer (SNODDERLY, 1995).
21
4.4 Compostos bioativos - ênfase nos processos de vasculogênese e angiogênese
Atualmente, diversas evidências sugerem uma relação entre processos fisiopatológicos
de natureza inflamatória e/ou imunológica e a formação de vasos sanguíneos (JANAVEL et al.,
2001; CARMELIET, 2003). Neste sentido, as atividades anti-inflamatória, antioxidante e anti-
mutagênica exercidas por algumas classes de compostos químicos podem estar relacionadas, em
alguma extensão, ao seu envolvimento na ativação de processos de formação de vasos. Por
outro lado, a vitamina A e seu derivado, o ácido retinóico, são bem conhecidos por sua atividade
anti-angiogênica e anti-tumoral (PAL et al., 2000; BLEBEA et al., 2002; SATAKE et al.,
2003).
Os vasos sanguíneos que integram juntamente com os vasos linfáticos e o coração, o
sistema cardiovascular, são formados a partir dos processos de vasculogênese e angiogênese
(CARMELIET, 2003). A vasculogênese se refere à formação dos primeiros vasos sanguíneos, a
partir de células progenitoras endoteliais, durante o desenvolvimento embrionário. Porém,
existem algumas evidências de que esse processo de vascularização, a partir de células
endoteliais, também ocorra no adulto (MANNIOTIS et al., 1999). Neste caso, pelo menos em
algumas condições patológicas, como doenças tumorais e isquêmicas, as células endoteliais
podem ser mobilizadas, a partir da medula óssea, para a circulação, via ativação desencadeada
por sinalizadores químicos tais como as citocinas, os fatores de crescimento angiogênicos e
hormônios, promovendo a formação de vasos de novo (conceito de vasculogênese em adulto -
ZAMMARETTI & ZISCH, 2005).
A angiogênese, por sua vez, consiste na formação de vasos sanguíneos a partir de vasos
pré-existentes, ocorrendo tanto no período embrionário onde é responsável pela remodelagem
da vascularização primária, como também durante o crescimento no adulto. Nesta fase, participa
nos ciclos de reprodução (proliferação do endométrio), desenvolvimento placentário e em outros
processos, a exemplo de crescimento dos cabelos, inflamação e cicatrização (CARMELIET,
2003).
A angiogênese pode ocorrer em duas condições: fisiológica e patológica, sendo a
primeira de extrema importância para o reparo tecidual. Por outro lado, o segundo tipo de
angiogênese está associado com distúrbios nos mecanismos de controle ou regulação da
formação dos vasos sanguíneos e com o desenvolvimento de desordens como isquemias,
22
distúrbios infamatórios e imunológicos. O limiar entre a angiogênese fisiológica e a patológica
está no equilíbrio entre fatores pró e anti-angiogênicos (CARMELIET, 2003). Em alguns casos,
a inibição da angiogênese constitui uma estratégia terapêutica, ou profilática, da enfermidade
(FOLKMAN, 1971). Porém, a terapia pró-angiogênica pode ser uma solução viável, por
exemplo, em quadros de isquemia (JANAVEL et al., 2001).
Além do desenvolvimento de medicamentos que exerçam uma ação anti- ou pró-
angiogênica, são crescentes os esforços para a recomendação de alimentos que possam exercer
efeitos semelhantes (LOSSO, 2003). Produtos naturais como a cartilagem de tubarão, a
cartilagem bovina, os polissacarídeos de algas marinhas, as isoflavonas da soja, as catequinas, o
estilbeno trans-resveratrol e algumas pró-antocianidinas foram investigados quanto à sua ação
anti-angiogênica (HOLT, 1995; LOSSO, 2003; DIAS et al., 2005).
Estudos epidemiológicos têm demonstrado a associação entre uma dieta rica em frutas e
vegetais com uma menor incidência de doenças degenerativas, tais como o câncer e doenças
cardiovasculares. Porém, os mecanismos que resultam nesses benefícios ainda não estão bem
estabelecidos (LOSSO, 2003).
Entre as diferentes metodologias usadas para avaliar os processos de
vasculo/angiogenêse destacam-se os ensaios da vesícula vitelínica e o da membrana
corioalantóica de Gallus domesticus, espécie cuja fisiologia, genética e embriologia está
extensamente documentada e possui inúmeras similaridades em relação à fisiologia humana.
Além disso, o embrião de galinha desenvolve-se em um ambiente próprio, livre de influência
materna ou placentária, sendo o acesso aos vasos sangüíneos e ao embrião facilitado
(MOURY & SCHOENWOLF, 1995).
Nessa espécie, os primórdios da topografia e os diversos sistemas estabelecem-se
rapidamente (em menos de 96 horas de incubação), consistindo em uma base razoável para
estimativas de toxicidade e teratogenicidade (BUPP BECKER & SHIBLEY, 1998). Até o
final do quarto dia de incubação, estão presentes esboços das principais estruturas do embrião,
tais como as flexuras (flexões), a rotação do tubo neural (GOODRUM & JACOBSON, 1981;
MÄNNER et al., 1993; MÄNNER, 1995), o desenvolvimento de somitos (CHRIST &
ORDAHL, 1995), de arcos branquiais, do botão caudal (SCHOENWOLF, 1994; CATALA et
al., 1995), da vesícula óptica, dos membros, da vesícula vitelínica e do alantóide, bem como a
vascularização intra e extra-embrionárias (MEIER & JACOBSON, 1982).
23
É importante ressaltar que o primeiro indício da presença de vasos sangüíneos nos
ovos de G. domesticus é observado na área vasculosa localizada nas bordas do blastodermo,
após 24 horas de incubação, caracterizando-se pelo aparecimento das ilhotas sangüíneas
(EYAL-GILADI, 1991 - Figura 4). Essas ilhotas que consistem em agregados de células
endoteliais, anastomosam-se e adquirem uma luz vascular, formando os primeiros vasos
sangüíneos (HAMBURGER & HAMILTON, 1951; AREY, 1974).
Uma rede vascular limitada pelo vaso sino terminal se estabelece após 33 horas de
incubação e associa-se ao endoderma subjacente, envolvendo parcialmente o vitelo do ovo,
organizando a vesícula vitelínica, em anexo ao embrião. Nesse anexo embrionário, as artérias
e veias onfalomesentéricas, estabelecem muito cedo, juntamente com o coração, uma
circulação vitelínica (PATTEN, 1951; HOUILLON, 1972).
Os processos de formação de novos vasos a partir das ilhotas sangüíneas e os
movimentos de dobramento do coração ocorrem ao longo das primeiras 40 horas de incubação
após a fertilização (AREY, 1974; SWEENEY, 1998). Além disso, verifica-se o surgimento
dos vasos alantóicos no decorrer do terceiro dia de incubação. O alantóide – um divertículo da
parede ventral do intestino posterior – aumenta de volume, devido à deposição de produtos da
excreção e interpõe-se entre dois anexos pré-existentes; o âmnio e o cório.
A associação do mesoderma somático dos dois anexos com o mesoderma angiogênico do
alantóide resulta no surgimento de um novo anexo: a membrana córioalantóica. No 8º dia de
incubação, a membrana córioalantóica consiste em uma vesícula achatada, vascularizada, que
recobre totalmente o embrião e o saco vitelínico (HUETTNER, 1949; PATTEN, 1951).
24
E
G
B
D
FIGURA 4 – (A) Fotografia do sistema de incubação dos ovos de galinha (G. domesticus);
(B) Esquema mostrando a abertura na casca e em detalhe (C) fotografia de um embrião de 2
dias (E2) com a vesícula vitelínica, onde se visualizam ilhotas sanguíneas (círculo), onde são
implantados os discos de metilcelulose; (D) Aspecto dos vasos primordiais durante a
vasculogênese (embrião de 4 dias; E4) e o local da implantação do disco (seta); (E) Vista geral
de um embrião de 6 dias de idade e o início da formação da membrana corioalantóica (MC);
(F) Aspecto da angiogênese na MC (8 dias de incubação; E8) e o local da implantação do
disco (seta); (G) Quadro comparativo dos padrões morfológicos dos embriões nas idades de 2
– 4 dias (com os segmentos de comprimento cefálico-cervical – CCV e cervical-caudal –
CVC) e 8 dias.
25
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo geral
Caracterizar o perfil metabólico de grãos e estigmas/estiletes de VCLM cultivadas e
desenvolvidas por pequenos agricultores do município de Anchieta, localizado no extremo
oeste de Santa Catarina, com ênfase às frações amídica, protéica, antociânica, fenólica e
carotenoídica e investigar a atividade do extrato carotenoídico sobre os processos de
vascularização de embriões de Gallus domesticus.
5.2 Objetivos específicos
- Determinar os perfis espectrais de infravermelho (FT-IR) de amostras de farinha, produzidas
a partir de grãos inteiros e degerminados, das variedades em estudo e comparar a similaridade
entre as mesmas usando a análise dos componentes principais (PCAs);
- Extrair, fracionar e quantificar os constituintes amiláceos (amilose e amilopectina) das VCLM
e dos cultivares comerciais em estudo;
- Caracterizar a estrutura química das frações amídicas dos grãos em estudo por técnicas
espectroscópicas (FT-IR,
13
C-RMN e
1
H-RMN);
- Determinar o conteúdo das proteínas albumina, globulina, prolamina e glutelina, nos grãos em
estudo;
- Extrair e determinar o conteúdo de compostos carotenoídicos e (poli)fenólicos dos grãos via
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);
- Extrair e caracterizar por espectroscopia UV-vis os pigmentos antociânicos dos grãos das
VCLM de interesse
- Extrair, identificar e quantificar os compostos (poli)fenólicos e carotenoídicos presentes nas
flores femininas (estigmas/estiletes) das VCLM de interesse via e CLAE.
- Determinar o conteúdo e identificar as antocianinas das flores femininas das VCLM através da
espectroscopia UV-vis e a espectrometria de massa (MALDI-TOF);
- Avaliar a atividade da fração carotenoídica extraída dos grãos de milho na vasculogênese e
angiogênese da vesícula vitelínica e da membrana corioalantóica dos embriões de Gallus
domesticus.
26
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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37
Capítulo 1
38
ANÁLISES ESPECTROSCÓPICA (FT-IR) E QUIMIOMÉTRICA DA FARINHA E DE
SUA FRAÇÃO AMÍDICA (AMILOSE/AMILOPECTINA) DE VARIEDADES LOCAIS
E DE CULTIVARES COMERCIAIS DE MILHO (Zea mays)
1 RESUMO
O milho é a principal fonte de amido no mundo, embora o uso industrial do mesmo em
sua forma nativa seja limitado. O amido é constituído pelas cadeias amilose e amilopectina,
que por possuírem um grau de ramificação diferente, apresentam propriedades funcionais
também distintas. O presente estudo teve como objetivo determinar os perfis espectrais de
infravermelho (FT-IR) de amostras de farinha de grãos inteiros e degerminados, bem como de
frações ricas em amilose (FAM) e ricas em amilopectina (FAP), de 26 variedades crioulas e
locais de milho (VCLM) e de cinco cultivares comerciais, obtidas a partir de um protocolo
simples e rápido de extração e fracionamento do amido. Uma constituição química
diferenciada entre amostras de farinha de grãos inteiros e degerminados foi detectada através
da comparação dos perfis espectrais de FT-IR (3000-600 ondas.cm
-1
e 1250-900 ondas.cm
-1
),
associada à análise de componentes principais (PCA). Além disso, observou-se maior
similaridade entre as amostras de grãos degerminados, comparativamente aos grãos inteiros.
O fracionamento do amido nos seus constituintes (FAM e FAP) resultou em conteúdos
distintos destes entre as amostras de farinha, com teores superiores nas VCLM em relação às
variedades comerciais. Subsequentemente, a análise por FT-IR de padrões comerciais de
amilose (Sigma) e amilopectina (Fluka) revelou serem as bandas em 1018 e 997 ondas.cm
-1
,
respectivamente, características dos mesmos, tendo sido estas detectadas nas amostras
analisadas (FAM e FAP). A distinção entre os espectros de FT-IR (1800-600 ondas.cm
-1
e
1250-900 ondas.cm
-1
) da FAM e da FAP (dialisadas) foi possível através de PCA, havendo
uma menor similaridade estrutural entre as amostras da FAM. Os resultados encontrados
sugerem o emprego dessa técnica espectroscópica associada à PCA pela indústria de
alimentos visando a distinção de matéria-prima e/ou produtos contendo amilose e
amilopectina, bem como o potencial de algumas frações das VCLM no setor industrial.
39
2 INTRODUÇÃO
Devido ao seu valor nutricional, o milho é um dos cereais mais cultivados e
consumidos no mundo. Embora majoritariamente a produção seja destinada à alimentação
animal (62%), principalmente de aves, bovinos e suínos, este cereal é matéria-prima na
indústria alimentícia para a produção de amido, óleo, farinha e glucose, além de conferir
propriedades texturais desejáveis aos alimentos (BULL & CANTARELLA, 1993).
O milho é a principal fonte de amido em âmbito mundial. Nos Estados Unidos, por
exemplo, cerca de 95% do amido manufaturado é proveniente dos grãos de milho. O elevado
conteúdo de amido nos grãos de milho, em média 66g% - peso seco -, é o que torna este
processo economicamente viável e rentável. Além do amido, estão presentes também nos
grãos compostos como proteínas (7-13 g/100g), ácidos graxos, fibras e pigmentos
(WATSON, 1984; BOYER & HANNAH, 2001; WHITE, 2001; CUEVAS-RODRÍGUEZ et
al., 2006; POZO-INSFRAN et al., 2006; LOZANO-ALEJO et al., 2007).
O amido é estocado no interior dos grãos na forma de grânulos constituídos pelos
polímeros amilose e amilopectina. A amilose é uma molécula linear, constituída por unidades
de D-glucose unidas por ligações do tipo α-D-(1→4), representando aproximadamente 25 a
30% do amido, ainda que variações dessa amplitude sejam observadas entre germoplasma. A
amilopectina, por sua vez, é uma molécula de peso superior à amilose, sendo também formada
por unidades de D-glucose unidas por ligações α-D-(1→4), porém, apresentando ramificações
periódicas no carbono 6 e constituindo cerca de 70-75% do grânulo de amido. Existem ainda
evidências de polissacarídeos de tamanho intermediário nos grãos de milho, representando de
5 a 7% do amido (WHISTLER & DANIEL, 1984; WHITE, 2001; RIDOUT et al., 2002;
TESTER et al., 2004). Na indústria alimentícia, a amilose é um importante aditivo por
conferir uma textura determinada (espessante de pudins, massa de tomate e outros alimentos
processados), formato e integridade aos alimentos. Da mesma forma, a amilopectina possui
diversas aplicações na indústria, sendo empregada principalmente para conferir características
de textura adequada aos alimentos enlatados e de laticínios, como por exemplo, maciez e
cremosidade, ou melhorar a estabilidade de alimentos congelados e a aparência de alimentos
secos (YOUNG, 1984; WHITE, 2001).
40
Na indústria alimentícia, a espectroscopia vibracional de infravermelho com
transformada de Fourier (FT-IR) tem se destacado como ferramenta de análise adequada por
ser considerada um método analítico sensível e altamente reprodutível. Nesta técnica, os
grupos funcionais das biomoléculas são caracterizados por sua capacidade de absorção da
radiação eletromagnética de comprimento de onda na faixa do infravermelho. Dessa forma,
cada biomolécula possui seu fingerprint estrutural (DOWMEY, 1998; DÉLÉRIS &
PETIBOIS, 2003).
A técnica de FT-IR torna-se ainda mais promissora quando associada a técnicas de
análise estatística multivariada, particularmente através da determinação dos componentes
principais (PCA), uma vez que a mesma permite a rápida extração de informações relevantes
de um conjunto de dados complexos, como em um espectro de FT-IR. Essa abordagem tem
sido comumente utilizada para verificar a autenticidade de alimentos, permitindo a
identificação dos sinais espectrais mais significativos e que corroboram para explicar de
forma mais ampla a variabilidade amostral de um conjunto de dados (DOWMEY, 1998;
VAIDYANATHAN & GOODACRE, 2000; FUKUSAKI & KOBAYASHI, 2005).
Estudos que visam a caracterização estrutural de polissacarídeos (fração amídica)
podem servir futuramente para a rápida identificação de variedades de milho que possam ter
aplicações na indústria de alimentos, ou como um marcador bioquímico para avaliação da
diversidade química entre variedades de milho. Tal aspecto é de interesse, haja vista que
grande parte do amido nativo tem uso limitado na indústria por não possuir as propriedades
funcionais necessárias. Assim, é de grande interesse a investigação das características
estruturais da fração amídica oriunda de germoplasma de Z. mays, visando sua aplicação na
indústria alimentícia. Particularmente, no Município de Anchieta – região extremo-oeste do
Estado de Santa Catarina, são cultivadas variedades de milho com características agronômicas
e nutricionais diferenciadas, em função do modelo de agricultura familiar adotado. Nesta
região, já foram identificadas cerca de 30 variedades crioulas e locais de milho (VCLM),
cultivadas em um regime de subsistência ou semi-subsistência (OGLIARI & ALVES, 2006).
Neste contexto, o presente estudo objetivou determinar os perfis espectrais de infravermelho
(FT-IR) de amostras de farinha, produzidas a partir de grãos inteiros e degerminados, e de
frações ricas em amilose (FAM) e em amilopectina (FAP) de 26 VCLM e de 5 cultivares
41
comerciais. A análise da similaridade estrutural química das frações amídicas foi realizada via
análise estatística multivariada (PCAs) dos dados espectrais de FT-IR.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção do material vegetal
3.1.1 Variedades crioulas e locais de milho (VCLM)
As 26 VCLM utilizadas nesse estudo foram obtidas junto aos pequenos agricultores do
município de Anchieta, localizado no extremo oeste catarinense, pelo Sindicato dos
Trabalhadores na Agricultura Familiar (SINTRAF). Amostras de grãos do seguinte
germoplasma foram repassadas ao grupo do Núcleo de Estudos em Agrobiodiversidade
(NeaBio) da UFSC: Roxo do Valdecir, Rajado 8 carreiras, Palha Roxa 02, Rosado, Cateto
Vermelho, Cateto, Pires, Palha Roxa 1 do Emílio, Mato Grosso Palha Roxa, Pixurum 07, MPA
13, Branco do Aldanir, Pixurum 04, Mato Grosso, Pixurum 06, Composto São Luis, Asteca,
MPA 02, Pixurum 01, Cunha 01, MPA 01, Pixurum 05, Roxo do Emílio, Amarelão 03, Moroti
e Língua de Papagaio.
3.1.2 Cultivares comerciais
Amostras de grãos de cultivares comerciais recomendados para a região Sul do Brasil
foram utilizadas no presente estudo para efeitos de análise comparativa, são eles: BRS-1030;
BR106; AG-9090; Pioneer 3069 e AS-3430.
O cultivar BRS-1030 (Embrapa), um híbrido simples, é de ciclo precoce, com
florescimento em 61 dias, de porte baixo, com grãos semi-duros de cor alaranjada. O cultivar
AG-9090 (Agroceres) é de ciclo precoce, com florescimento em 72-80 dias e grãos são
semidentados, de cor alaranjada e com alto teor de óleo. Pioneer 3069 é um híbrido simples
de ciclo super-precoce, enquanto o cultivar AS-3430 (Agroeste) é um híbrido triplo, de ciclo
precoce, porte médio/alto, apresentando grãos duros de cor avermelhada.
42
3.2 Coleta e preparo das amostras
Para cada variedade, amostras de grãos (50g, peso seco) foram trituradas em moinho de
laboratório (Cyclone Sample Mill - modelo 3010/019), utilizando-se peneira de 0,1mm. Além
das amostras de grãos inteiros (endosperma e gérmen), grãos das mesmas variedades foram
degerminados manualmente com o auxílio de um alicate de corte e em seguida triturados. Após
a moagem, as amostras de grãos degerminados foram lavadas com hexano (3x, 15 minutos) para
remoção de lipídeos. As amostras de grãos inteiros e grãos degerminados foram imediatamente
submetidas aos procedimentos experimentais de interesse, ou embaladas em sacos plásticos, sob
vácuo, e mantidas a –18
º
C para posterior análise.
3.3 Determinação do conteúdo de glucose e açúcar redutor nas amostras de farinha
A extração de glucose e açúcar redutor nas amostras de farinha (500 mg) se deu pela
adição de água destilada-deionizada (10 mL) e aquecimento (35
0
C), por um período de 20
minutos. Posteriormente, as amostras foram filtradas e o volume ajustado para 10 mL. O
conteúdo de glucose foi determinado no filtrado pelo método enzimático usando um kit
comercial (Labtest
®
/Lote 6001/2006 – Lagoa Santa-MG). O protocolo de análise baseou-se
nas orientações do fabricante do kit e, para efeitos de cálculo do conteúdo de glucose,
utilizou-se uma curva padrão daquele monossacarídeo (Sigma/St Louis – MO, USA - 0,025;
0,05; 0,1; 0,2; 0,4 mg/mL – r
2
= 0,999 e y = 2,4126x). As leituras dos valores de absorbância
(505 ηm) das amostras foram realizadas em triplicatas, em espectrofotômetro Shimadzu (UV-
1203).
O conteúdo de açúcares redutores foi determinado através do método descrito por
MILLER (1959), com a utilização do ácido 3,5-dinitrossalicílico. Para tal, coletou-se uma
alíquota (5 mL) do filtrado utilizado para a determinação do conteúdo de glucose, sendo o
valor do conteúdo de açúcares totais calculado através da leitura da absorbância das amostras
(540 ηm - Shimadzu UV-1203), com o auxílio de uma curva padrão de glucose (Sigma/St
Louis – MO, USA - 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 e 1,4 mg/mL; r
2
= 0,997; y = 0,5646x)
3.4 Extração e fracionamento dos componentes amídicos amilose e amilopectina
A uma alíquota de farinha (3g/variedade) adicionaram-se 200mL de água
destilada/deionizada, seguido de agitação (20 min) e refluxo (80
0
C, 1h). As amostras foram
43
centrifugadas (30 min, 2500 rpm) e o sobrenadante precipitado com álcool etílico para a
remoção da FAM (96ºGL, 5V - 12h, 4
0
C). O etanol foi removido por aspiração e a FAM
mantida em estufa (55
0
C) até peso constante. O material precipitado após a centrifugação,
contendo a FAP, foi seco em estufa (55
0
C) até peso constante e posteriormente tamisado (80
mesh). A 200 mg da FAP bruta foram adicionados 6 mL de água destilada/deionizada,
seguido de diálise da solução contra água destilada-deionizada (membrana de acetato de
celulose, cut-off 10.000-12.000 MW, Sigma/St Louis – MO, USA) por um período de 24
horas. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
3.5 Caracterização estrutural química das amostras de farinhas e das frações ricas em
amilose e em amilopectina por espectroscopia vibracional de infravermelho médio com
transformada de Fourier (FT-IR)
As análises das amostras de farinha (grãos inteiros e degerminados), das FAMs e
FAPs das VCLM e dos cultivares comerciais e de padrões comerciais de amilose (Sigma A-
7043) e amilopectina (Fluka 10120), ambos extraídos de milho, por espectroscopia
vibracional de FT-IR utilizaram equipamento Bruker IFS 55, equipado com sistema de ATR
de reflexão única (Golden Gate), coletando-se 128 varreduras/amostra, em janela espectral de
500 a 4000 ondas.cm
-1
e com resolução de 4 ondas.cm
-1
. O processamento dos espectros
obtidos foi realizado manualmente com o auxílio do programa OPUS (Bruker Biospin, versão
5.0) e considerou a delimitação da janela espectral de interesse (3000-600 ondas.cm
-1
), a
correção da linha de base, a normalização e a diminuição da relação sinal/ruído (smoothing).
Subsequentemente, o conjunto de dados totais dos espectros processados foi submetido à
análise estatística multivariada, através da aplicação dos métodos de componentes principais
(PCAs), com auxílio do pacote estatístico Unscrambler 9.1.
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização estrutural da farinha de grãos inteiros e degerminados por
espectroscopia vibracional de infravermelho (FT-IR) e análise quimiométrica
44
Nos espectros adquiridos para as amostras de farinha de grãos inteiros foram
observados 19 picos majoritários na região entre 3000 – 600 ondas.cm
-1
, embora sinais de
fraca intensidade tenham sido encontrados na região entre 2770 – 1790 ondas.cm
-1
,
conforme demonstrado na Figura 1.
A análise dos espectros de FT-IR das amostras revelou a existência de semelhança
estrutural dos componentes das farinhas estudadas. Tal afirmação leva em conta o fato de que
nos espectros de FT-IR um aumento nos valores de absorbância reflete a posição e a
intensidade das bandas relativas aos grupamentos funcionais de uma determinada classe de
compostos, permitindo a sua identificação e a análise comparativa de amostras (CERNÁ et
al., 2003).
FIGURA 1 - Espectros de FT-IR (3000 – 600 ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de
grãos inteiros da variedade comercial AS-3430 e da variedade local Cateto Vermelho.
Na Tabela 1 estão apresentados os principais sinais espectrais (onda.cm
-1
) detectados
nas amostras de farinha e os grupos funcionais dos constituintes respectivos.
De maneira geral, os carboidratos mostram um aumento nos valores de absorbância na
faixa espectral de infravermelho entre 1200 – 950 ondas.cm
-1
, sendo esta região considerada
uma região de fingerprint daquela classe de metabólitos primários (CERNÁ et al., 2003).
45
TABELA 1- Sinais espectrais de FT-IR (onda.cm
-1
) das amostras de farinhas de grãos
inteiros de VCLM e comerciais e seus respectivos grupamentos.
Sinal Grupo Funcional
2924
deformação axial e angular do grupo metil (-CH
3
) e/ou metileno (CH
2
)
2854
deformação axial e angular do grupo metil (-CH
3
) e/ou metileno (CH
2
)
1743
deformação axial do grupo C=O de ácidos ou acetil
1645
deformação axial do grupo C=O de aminas
1542
deformação angular do grupo NH
2
de aminas
1456
deformação axial de grupos CH
3
1419
deformação angular do grupo OH de ácidos carboxílicos ou de C-H
1366
deformação angular do grupo C-H
1340
deformação simétrica da ligação C-CH
3
1243
deformação da ligação C-OH
1149
deformação axial da ligação C-O, C-C, C-O-C (ligação glicosídica)
1076
deformação axial da ligação C-O, C-C, C-O-C (ligação glicosídica)
1012
deformação axial do grupo C-O e deformação angular do grupo OH
997
deformação axial do grupo C-O e deformação angular do grupo OH
930
deformação da ligação C-H (carbono anomérico α da D-glucose)
856
deformação da ligação C-H (carbono anomérico α da D-glucose)
762
vibração simétrica do anel dos açúcares
706
deformação da ligação =CH de compostos aromáticos
Fonte: LAMBERT et al. (2001)
Já os constituintes protéicos são identificados por esta técnica através dos sinais em
1650 e 1550 ondas.cm
-1
, relativos às aminas I e II, respectivamente (LAMBERT, 2001). A
presença de grupos carboxílicos, associada à deformação axial do grupo funcional C=O,
tipicamente encontrados em ácidos graxos, por exemplo, pode ser detectada pelo sinal em
1740 ondas.cm
-1
(SILVERSTEIN, 1994). A presença de ácidos graxos também pode ser
constatada pelos sinais entre 3000-2800 ondas.cm
-1
como mostrado na Tabela 1
(LAMBERT, 2001; YANG et al., 2005). Além disso, a existência simultânea de bandas entre
690-900 ondas.cm
-1
e 1700-2000 ondas.cm
-1
sugere a presença de compostos com anéis
46
aromáticos em sua estrutura, tais como os de origem (poli)fenólica (LAMBERT, 2001; XU et
al., 2005).
A despeito das semelhanças estruturais claramente observadas através da análise
visual dos perfis espectrais de FT-IR das amostras de farinha de grãos inteiros em estudo,
notadamente aquelas indicadoras da presença de carboidratos, proteínas, ácidos graxos e
(poli)fenóis naquelas matrizes, sinais de menor intensidade (ou a ausência destes) podem não
ser facilmente identificados, reduzindo a confiabiliadade dos resultados obtidos no que se
refere à similaridade de características estruturais químicas.
Em processos de análise comparativa de amostras de matrizes complexas,
discrepâncias mínimas nos perfis espectrais poderão ser significativas na discriminação dos
materiais de interesse. Portanto, a análise do conjunto de perfis espectrais requer estratégias
que permitam maximizar a extração de informações a partir dos dados coletados (espectros de
FT-IR), não implicando, obviamente, no uso de técnicas de grande demanda de tempo e/ou
custos. Neste contexto, ferramentas estatísticas de análise multivariada de dados, através da
determinação dos componentes principais (PCA) do conjunto de dados espectrais, por
exemplo, têm sido frequentemente utilizadas com sucesso.
No presente estudo, os efeitos de regiões do espectro (bucket analysis) foram
testados de modo a otimizar a classificação e o agrupamento das amostras, sendo que a
primeira região testada compreendeu a janela espectral situada entre 3000-600 ondas.cm
-1
.
Para tal, a matriz de dados espectrais foi normalizada em seus componentes lineares, enquanto
as colunas foram centralizadas. A Figura 2 apresenta a dispersão das variáveis em estudo
(farinha de grãos inteiros), segundo a determinação de PCA da matriz de dados obtida a partir
dos espectros de FT-IR. Os componentes principais PC1 e PC2 contribuiram para explicar em
81% a variância presente nos dados.
A análise da Figura 2 não revela uma clara separação das amostras em grupos, mas
sim uma dispersão das amostras estudadas por todos os quadrantes do gráfico de distribuição
fatorial, embora 3 das variedades estudadas tenham se destacado das demais, a saber: os
cultivares comerciais AG-9090 e AS-3430 (PC1 +) e a variedade local Amarelão (PC2 -).
47
FIGURA 2 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados espectrais de FT-IR (3000-
600 ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de grãos inteiros de 26 VCLM e dos cultivares
comerciais em estudo.
A análise do perfil espectral de FT-IR dos dados agrupados em PC1 mostra que os
sinais que mais contribuíram para a dispersão das amostras ao longo desse eixo foram 2920,
2850, 1739, 1635, 1138, 1060 e 991 ondas.cm
-1
, o que indica que as farinhas das variedades
estudadas possuem constituição química diferenciada, comparativamente as demais do
universo amostral em estudo. As classes de compostos que corroboram para esta classificação
são os ácidos graxos (2920, 2850, 1739 ondas.cm
-1
), as proteínas (1635 ondas.cm
-1
) e os
carboidratos (1138, 1060, 991 ondas.cm
-1
- Figura 3). Um segundo procedimento
experimental para a determinação dos componentes principais foi realizado, no qual
considerou-se a região entre 1200-950 ondas.cm
1
do espectro, a qual tipicamente caracteriza
os carboidratos.
48
FIGURA 3 - Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos inteiros para os
dados de FT-IR (3000-600 ondas.cm
-1
).
A Figura 4 demonstra que os componentes principais PC1 x PC2 dessa região
espectral explicaram em 95% a variância existente, porém, novamente, não foi possível
constatar uma clara separação das amostras analisadas. As amostras de farinha com maior
discrepância de composição química foram as das variedades comercias AG-9090 e AS-3430 e
as VCLM Amarelão, MPA2 e Moroti. Os sinais que contribuíram para a classificação das
amostras em PC1 foram 1149, 1076, 1014, 995 e 933 ondas.cm
-1
como mostrado na Figura 5.
Os resultados quimiométricos dos dois procedimentos experimentais, usando duas
regiões distintas dos espectros de FT-IR (3000-600 e 1200-950 ondas.cm
-1
), mostraram o
mesmo padrão de dispersão das amostras (farinha de grãos de milho), o que sugere que as
mesmas têm constituições químicas diferenciadas no que diz respeito às classes de compostos
detectados nas janelas espectrais acima referidas. Dessa forma, o não agrupamento das
amostras possivelmente resultou de diferenças estruturais conferidas pela presença de
compostos químicos específicos às variedades.
49
IGURA 4 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (1200-950
Espectros de FT-IR de amostras de grãos das mesmas variedades, porém
germ
F
ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de grãos inteiros de 26 VCLM e dos cultivares
comerciais em estudo.
de inados foram adquiridos para melhor caracterização das frações protéica e
polissacarídica presentes exclusivamente no endosperma. Para tal, os compostos apolares
majoritários foram previamente removidos das amostras de farinha com a utilização de
hexano. Os perfis espectrais da farinha de grãos inteiros e degerminados da variedade Mato
Grosso estão mostrados na Figura 6. Pequenas diferenças no perfil espectral de grãos inteiros
e degerminados foram visualmente observadas em algumas regiões do espectro, como na
região de fingerprint para carboidratos (Figura 7).
50
IGURA 5 - Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos inteiros para
F
os dados de FT-IR na região espectral de 1200 a 950 ondas.cm
-1
.
FIGURA 6- Espectros de FT-IR (3000 – 600 ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de
grãos inteiros e de grãos degerminados da variedade local Mato Grosso.
51
FIGURA 7- Espectros de FT-IR (1100-940 cm
-1
) de amostras de farinha de grãos
inteiros e de grãos degerminados da variedade local Mato Grosso.
A determinação dos componentes principais dos dados espectrais de FT-IR para
comparação do grau de similaridade das amostras de grãos inteiros e degerminados está
mostrada na Figura 8. Os componentes principais PC1 e PC2 contribuiram para explicar em
93% a variância presente nos dados, sendo possível observar uma clara separação das
amostras em dois grupos, correspondendo às amostras de grãos degerminados (PC1 +) e às
amostras de grãos inteiros (PC -).
Pode-se observar que os grupos apresentaram-se distintos quando analisados
separadamente, principalmente para as amostras de grãos inteiros, possivelmente em função
de diferenças na composição química conferidas pela presença do gérmen. A análise do perfil
espectral de FT-IR dos dados de PC1 (Figura 9) confirma que os principais sinais
responsáveis pela separação de grãos inteiros e degerminados são 2924, 2850 e 1743
ondas.cm
-1
.
52
FIGURA 8 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR na janela
espectral de 3000 a 600 ondas.cm
-1
de amostras de farinha de grãos inteiros e de grãos
degerminados de 26 VCLM e dos cultivares comerciais.
FIGURA 9- Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos inteiros e
degerminados para os dados espectrais de FT-IR (3000-600 ondas.cm
-1
).
53
FIGURA 10 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR nas janelas
espectrais de 1200-950 ondas.cm
-1
de amostras de farinha de grãos inteiros e de grãos
degerminados de 26 VCLM e dos cultivares comerciais em estudo.
Entretanto, a clara separação de grãos inteiros e degerminados foi também
observada, como mostrado na Figura 10, quando se utilizou a faixa espectral entre 1200-950
ondas.cm
-1
, sendo 95% da variância dos dados explicados pelos componentes principais 1 e 2.
As amostras foram separadas em função do componente principal PC2, onde o grupo
que reúne os grãos inteiros ficou agrupado na região positiva, enquanto as amostras de grãos
degerminados agruparam-se em PC negativo. Novamente, é possível observar claramente que
a presença do gérmen nas farinhas contribui para a maior dispersão das amostras, indicando
uma constituição de carboidratos diferenciada para as mesmas, conforme demonstrado na
Figura 10.
54
FIGURA 11 - Contribuição fatorial de PC2 das amostras de farinha de grãos inteiros e
degerminados para os dados espectrais de FT-IR (1200-950 ondas.cm
-1
).
A análise do perfil espectral de PC2 revelou que o sinal que agrupou as amostras
(grãos degerminados) na porção positiva foi 999 ondas.cm
-1
, enquanto para as amostras de
grãos inteiros (PC -) as bandas em 1176, 1068 e 948 ondas.cm
-1
apresentaram as maiores
contribuições fatoriais (Figura 11).
As amostras de farinha de grãos degerminados também foram analisadas isoladamente
por PCA para a região entre 3000-600 ondas.cm
-1
, a fim de confirmar os resultados mostrados
nas Figuras 8 e 10, que indicam constituição química similar entre as mesmas.
A Figura 12 mostra a classificação desse conjunto de dados, onde PC1 e PC2
contribuíram para explicar em 79% a variância dos mesmos. A análise do gráfico de
distribuição fatorial das amostras em estudo revela novamente que as variedades comerciais
AG-9090 e AS-3430 se diferenciam em alguma extensão das demais, assim como a VCLM
MPA 1 (Figura 13).
55
FIGURA 12 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados espectrais de FT-IR
(3000-600 ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de grãos degerminados de 26 VCLM e dos
cultivares comerciais em estudo.
FIGURA 13 - Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos
degerminados para os dados espectrais de FT-IR (3000-600 ondas.cm
-1
).
56
Vários sinais espectrais de FT-IR (2927, 2164, 1651, 1535, 1415, 1369, 1149, 1080,
1014 e 999 ondas.cm
-1
) contribuíram para a classificação das amostras (grãos degerminados)
ao longo do eixo PC1, como pode ser observado na Figura 13.
Uma classificação similar das amostras (farinha de grãos degerminados) foi observada
quando se analisou a região do espectro compreendida entre 1200-950 ondas.cm
-1
(Figura 14).
As bandas que mais contribuíram para a dispersão das amostras ao longo do eixo componente
principal 1 (PC1) (Figura 14) foram 1145, 1076, 1014 e 999 ondas.cm
-1
como mostra a Figura
15.
FIGURA 14- Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (1250-900
ondas.cm
-1
) de amostras de farinha de grãos degerminados de 26 VCLM e dos cultivares
comerciais em estudo.
As variedades apresentaram uma dispersão ampla, ocupando os quadrantes do gráfico
de distribuição fatorial, sendo que as amostras mais discrepantes do grupo principal foram as
VCLM MPA1, Mato Grosso Palha Roxa e Branco e as variedades comerciais AG-9090 e BRS-
1030. Esses resultados apontam para uma constituição de carboidratos localizados no
endosperma parcialmente distinta entre variedades, sejam crioulas ou comerciais. A
57
classificação das variedades via análise dos componentes principais e usando a região de
fingerprint para carboidratos sugere diferenças associadas às proporções amilose: amilopectina
naquelas biomassas.
Dessa forma, visando maior detalhamento da constituição química da fração amídica e
compostos associados, testou-se um protocolo rápido e simples de extração e fracionamento
da amilose e amilopectina das VCLM e dos cultivares comerciais. As frações obtidas foram
analisadas por FT-IR e os perfis espectrais comparados através de PCA.
FIGURA 15- Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos degerminados
para os dados de FT-IR na região espectral compreendida entre 1200-950 ondas.cm
-1
.
4.2 Rendimento da extração das FAMs e FAPs de farinhas das VCLM e dos cultivares
comerciais
Os resultados de rendimento do processo de extração e fracionamento do amido em
amilose e amilopectina das 26 VCLM e dos cultivares comerciais em estudo estão
apresentados na Tabela 2.
58
TABELA 2 – Conteúdo médio
*
(g/100g, peso seco) das frações ricas em amilose (FAM),
amilopectina (FAP), glucose e de açúcares redutores em amostras farinhas de variedades
crioulas e locais de milho e de cultivares comerciais.
Variedades
FAM
FAP
Total Glucose
Açúcares
redutores
Pires
11,3±2,4 41,0±5,2 52,3 0,21±0,04 1,48±0,17
Roxo Emílio
12,4±1,0 33,7±3,5 46,1 0,27±0,02 1,22±0,07
MPA 13
14,3±1,5 34,7±19,8 49,0 0,27±0,01 1,52±0,15
Pixurum 6
14,8±1,9 28,2±9 52,1 0,16±0,02 0,84±0,09
Pixurum 5
16,4±0,8 24,7±6,9 43,6 0,23±0,01 0,94±0,01
Mato G. P. Roxa
17,1±0,9 26,6±5,6 58,1 0,13±0,01 0,78±0,09
Cunha
17,8±2,6 34,3±2,5 43,7 0,43±0,02 0,90±0,07
Roxo Valdecir
17,8±2,3 33,2±4,7 51,0 0,29±0,03 0,91±0,05
Cateto Vermelho
17,9±1,3 29,3±4,4 66,1 0,26±0,01 0,71±0,05
Rajado 8 C.
18,0±4,0 33,4±2,1 47,2 0,22±0,04 1,22±0,06
MPA 1
18,2±1,8 36,2±9,3 41,1 0,15±0,0 0,86±0,07
L. Papagaio
18,3±2,3 29,8±3,8 51,0 0,32±0,03 1,88±0,04
Amarelão 3
18,4±3,4 30,3±0,9 49,7 0,24±0,09 1,52±0,14
Palha R. Emílio
18,5±1,9 31,2±5,1 48,1 0,25±0,02 1,72±0,1
Branco
19,6±1,8 46,5±11,5 43,0 0,15±0,0 0,82±0,04
C. S. Luis
19,6±1,7 31,4±1,0 53,3 0,31±0,03 1,77±0,14
Pixurum 7
19,7±2,8 34,5±3,0 54,4 0,14±0,03 0,63±0,06
Moroti
20,0±2,3 33,3±2,3 48,7 0,12±0,01 0,29±0,05
Pixurum 4
20,6±1 37,5±1,6 51,4 0,17±0,01 0,86±0,03
MPA 2
21,1±1,8 22,5±5,4 50,5 0,14±0,03 1,14±0,17
Pixurum 1
21,2±0,8 27,3±4,1 47,8 0,25±0,02 0,81±0,02
Palha Roxa 2
21,3±6,4 26,5±3,4 57,0 0,13±0,01 0,81±0,10
Rosado
21,7±2,9 35,3±2,7 54,2 0,26±0,04 1,62±0,20
Asteca
21,9±4,6 28,6±9,4 48,5 0,27±0,03 1,18±0,12
Cateto
22,3±8,6 19,7±0,3 42,0 0,21±0,01 1,31±0,12
Variedades Locais
Mato Grosso
25,4±0,1 19,9±1,2 45,3 0,16±0,02 1,20±0,15
BRS 1030
15,2±2,5 16,2±5,3 31,4 0,11±0,02 0,43±0,06
AS-3430
19,9±0,2 12,9±1,6 32,8 0,18±0,01 0,36±0,02
Pioneer 3069
20,8±1,1 13,5±4,2 34,3 0,16±0,02 0,29±0,03
BR106
21,7±1,4 12,2±1,5 33,9 0,11±0,05 0,32±0,1
Variedades
Comerciais
AG-9090
22,8±1,3 13,8±135 36,6 0,15±0,02 0,35±0,05
*
dados médios de 3 extrações independentes
59
Os conteúdos das frações amídicas para as variedades em análise foram bastante
distintos, com uma amplitude de valores de 11,3g amilose/100g e 25,4g amilose/100g para as
variedades Pires e Mato Grosso, respectivamente.
Para a FAP, o conteúdo variou entre 19,9 g/100g e 46,5 g/100g para as variedades
Mato Grosso e Branco. De forma comparativa, os cultivares comerciais apresentaram uma
menor amplitude de valores de concentração de FAM, isto é, 15,2 g/100g (BRS-1030) a 22,8
g/100g (AG-9090) e FAP 12,2 g/100g (BR-106) a 16,2 g/100g (BRS-1030). O somatório do
conteúdo de ambas as frações obtido para cada variedade apresentou uma ampla faixa de
variação. Para as VCLM o conteúdo total das duas frações variou entre 66,1 g% e 41,1 g%
para Branco e Pixurum 5, respectivamente, enquanto que para os cultivares comerciais em
estudo, os valores variaram entre 31,4 g% e 36,6 g% (Tabela 2).
Esses resultados sugerem uma possível qualidade energética distinta para as amostras
de farinha, em função da quantidade dos polissacarídeos presentes naquela biomassa. De
acordo com WHITE (2001), os valores de rendimento para as VCLM encontrados no presente
estudo estão de acordo com a literatura que aponta uma média de 66 g% para o conteúdo
daqueles polissacarídeos em grãos de Z. mays. No entanto, ressalta-se o fato de que os
menores valores encontrados foram detectados para os cultivares comerciais, corroborando a
discussão de que os programas de melhoramento vegetal estão ocasionando na erosão
genética nessa espécie, na medida em que privilegiam o aspecto produtividade em detrimento
das demais características fenotípicas como, por exemplo, aquelas de caráter nutricional.
Além da determinação do conteúdo de amido presente nas farinhas, foram detectadas
naquelas biomassas variações nos conteúdos de glucose e açúcar redutor (Tabela 2).
Novamente as VCLM mostraram conteúdos superiores de glucose e açúcar redutor quando
comparados aos dos cultivares comerciais. O conteúdo de glucose para as VCLM variou entre
0,12-0,43 g% para as variedades Moroti e Cunha, respectivamente e para os cultivares
comerciais BRS-1030 e AS-3430 entre 0,11-0,18 g%. Já o conteúdo de açúcar redutor
encontrado nas farinhas das VCLM variou entre 0,29-1,88 g% para as variedades Moroti e
Língua de Papagaio.
Os cultivares comerciais apresentaram conteúdos de açúcar redutor entre 0,29-0,43
g%, para as variedades Pionner 3069 e BRS-1030. Segundo TRACY (2001), o conteúdo
médio de açúcares redutores é aproximadamente 3,9 g/100g, no milho normal, 22 dias após a
60
polinização. No presente estudo, valores inferiores e variáveis entre as variedades podem ter
sido encontrados, uma vez que as espigas podem ter sido retiradas da planta em épocas
diferentes.
Diversos fatores condicionam o uso de amidos na indústria alimentícia como, por
exemplo, a relação entre os conteúdos de amilose e amilopectina. De fato, esta relação é
determinante das propriedades reológicas dos amidos, sendo esta característica específica à
variedade de milho. Como exemplo disto, DOMBRINK-KURTZMAN & KNUTSON (1997)
verificaram que o conteúdo de amilose em grânulos de amido pode influenciar a dureza do
endosperma, estando esta característica relacionada ao maior conteúdo desse constituinte
amiláceo. No presente estudo, verificou-se que a proporção entre as frações FAP/FAM das
amostras de farinhas também apresentou grande amplitude de valores, com destaque para as
variedades Pires (21,6% de amilose) e Mato Grosso (56,1% de amilose - Tabela 2). Os
resultados apontam para a existência de constituições amídicas significativamente distintas,
principalmente em relação à proporção dos polissacarídeos presentes em farinhas de VCLM,
um aspecto com implicação direta nas suas propriedades funcionais. Grânulos de amido,
quando aquecidos na presença de água, sofrem um processo denominado gelatinização, que é
responsável pelo aumento da viscosidade do mesmo. Este processo caracteriza-se pelo
desarranjo molecular do grânulo causado pela penetração da água e hidratação das cadeias de
amilopectina. No entanto, após a gelatinização, sob condições de temperatura ambiente, inicia-
se o fenômeno da retrogradação, onde verifica-se o rearranjo das moléculas através do
restabelecimento de ligações do tipo pontes de hidrogênio, sendo este um fenômeno
indesejável. Assim, tanto a gelatinização como a retrogradação são influenciadas pela razão
amilopectina/amilose (MOORE et al., 1984; FERGASON, 2001).
De fato, a análise dos dados de rendimento do fracionamento do amido para as
diferentes variedades (Tabela 2) está de acordo com o que foi sugerido através da análise dos
componentes principais, usando a região de fingerprint para carboidratos, uma vez que a
análise quimiométrica revelou certo grau de distinção entre as amostras de farinhas, um fato
possivelmente associado às diferenças nas proporções amilose: amilopectina naquelas
biomassas.
61
Subseqüente à determinação dos valores de rendimento dos constituintes amiláceos
das amostras de farinhas das VCLM, foram realizadas análises espectroscópicas (FT-IR) e
quimiométrica das FAMs e FAPs.
4.3 Caracterização estrutural das FAMs e FAPs por espectroscopia vibracional de
infravermelho (FT-IR) e análise quimiométrica
As frações amídicas (FAM e FAP) das 26 VCLM e dos cultivares comerciais foram
analisadas por espectroscopia de FT-IR, visando a caracterização estrutural das mesmas.
Na Figura 16 são mostrados os espectros adquiridos para as duas frações extraídas da
variedade local Mato Grosso, onde pode-se observar os picos majoritários na região entre
3000 – 600 ondas.cm
-1
.
FIGURA 16 - Espectros de FT-IR (3000 – 600 ondas.cm
-1
) das FAM e FAP da variedade
local Mato Grosso.
A análise dos espectros das duas frações revela sinais de elevada intensidade
associados à presença de lipídeos (2924, 2855, 1743 ondas.cm
-1
), proteínas (1650-1500
ondas.cm
-1
), carboidratos (1200-950 ondas.cm
-1
) e de compostos de origem aromática (sinais
62
entre 1700-2000 e 600-800 ondas.cm
-1
). Na região compreendida entre 2800-1750 ondas.cm
-1
foram detectados sinais de fraca ou média intensidade consoante à variedade.
Os sinais espectrais de FT-IR das amostras de FAM e FAP estão apresentados na
Tabela 3.
TABELA 3 - Sinais espectrais de FT-IR (3000 – 600 ondas.cm
1
)
das amostras de FAM e FAP
*
de 26 VCLM e dos cultivares
comerciais.
FAM
FAP
Amilose
commercial
Amilopectina
comercial
2924 2924 2927 2927
n.d. n.d. 2897 2888
2855 2854 n.d. n.d.
1743 1743 n.d. n.d.
n.d. n.d. n.d. 1682
n.d. n.d. n.d. 1669
1650 1645 1643 1649
n.d. n.d. n.d. 1637
n.d. n.d. n.d. 1574
1555 n.d. n.d. 1558
n.d. n.d. n.d. 1540
n.d. n.d. n.d. 1520
n.d. n.d. n.d. 1507
1450 1450 1453 1455
n.d. n.d. 1410 1419
1370 1370 1368 1361
n.d. n.d. 1336 1338
n.d. n.d. 1297 n.d.
1240 1240 1241 1244
1205 1205 1207 1207
1149 1149 1149 1148
1104 1105 1101 1105
1070 1076 1076 1077
1058 n.d. 1050 1043
1018 1014 1018 n.d.
999 995 999 996
933 933 933 930
860 853 860 860
n.d. n.d. 793 793
760 760 760 760
n.d. 706 709 709
*
cinco espectros adquiridos/amostra; n.d.= não detectado
63
A análise comparativa da FAM entre as variedades revelou diferenças quanto à
presença ou ausência dos sinais em todas as regiões do espectro. Foram encontradas no
espectro da FAM da variedade local Cateto Vermelho, por exemplo, 66 bandas, enquanto
apenas 23 sinais foram detectados para a variedade Amarelão. Por outro lado, a comparação
dos perfis espectrais da FAP das variedades em estudo mostrou menor grau de distinção,
tendo sido detectados 33 sinais no espectro da variedade local Pixurum 5, enquanto o cultivar
comercial Pioneer 3069 apresentou 23 bandas na mesma fração.
Um segundo aspecto importante decorrente da análise dos perfis espectrais de FT-IR
das FAMs e FAPs refere-se à possibilidade de distinção destas duas frações amídicas. Para
tal, espectros de FT-IR de um padrão de amilose (Sigma – MO – USA) e amilopectina (Fluka)
foram obtidos e comparados aqueles das amostras. Os sinais encontrados nos padrões
comerciais estão mostrados na Tabela 3, onde é possível verificar que as bandas 2927, 1650,
1450, 1370, 1240, 1205, 1149, 1105, 1076, 1050, 1018, 999, 933 e 860 ondas.cm
-1
estão
presentes nas amostras de amilose e no padrão comercial. Para as amostras de amilopectina e
o padrão comercial detectamos que, em comum, foram detectados os sinais 2927, 1650, 1450,
1370, 1240, 1205, 1149, 1105, 1076, 995, 930, 860, 760 e 709 ondas.cm
-1
.
Em um estudo similar, XIE et al. (2006), encontraram em perfis espectrais de FT-IR de
amido as bandas 2931, 1350, 1150, 1080, 1022, 930, e 860 ondas.cm
-1
como sendo típicas
daquele polissacarídeo, enquanto IRUDAYARAJ & YANG (2002) detectaram bandas em
2931, 1652, 1420, 1054, 930 e 857 ondas.cm
-1
.
Analisando a região de fingerprint para carboidratos (Figura 17), verifica-se que a
banda em 1018 ondas.cm
-1
é característica do polissacarídeo amilose, enquanto aquela em 997
ondas.cm
-1
caracteriza a amilopectina.
64
FIGURA 17- Espectros de FT-IR parciais (1230 – 860 ondas.cm
-1
) de amostras
comerciais de amilose (Sigma, MO – USA) (A) e amilopectina (Fluka).
Na FAM de todas as VCLM, exceto Cateto, Composto São Luis, Pixurum 1, Pixurum
6, Pires, Rosado e Roxo Valdecir, o perfil espectral do padrão de amilose comercial (Sigma,
MO – USA) entre 1200-950 ondas.cm
-1
foi observado, com destaque à presença do sinal mais
intenso em 1018 ondas.cm
-1
. Nas variedades citadas e nas amostras dos cultivares comerciais
AS-3430, AG-9090 e Pioneer 3069 o perfil espectral da FAM foi similar ao observado para o
padrão de amilopectina (Fluka). Esse resultado sugere o maior conteúdo do polímero
amilopectina em relação à amilose na fração precipitada com etanol naquelas variedades.
A análise visual dos espectros das FAPs e o da amilopectina comercial (Fluka) revelou
pequena semelhança entre os mesmos, onde o sinal em 997 ondas.cm
-1
, típico daquele
polissacarídeo, foi detectado como a banda majoritária apenas para as variedades comerciais
AS-3430, Pioneer 3069, AG-9090 e para as VCLM Branco, Cateto, Mato Grosso, Moroti,
Pixurum 6, Pixurum 7, Palha Roxa 2 e Rosado. Entretanto, cabe ressaltar que o sinal em 1018
ondas.cm
-1
esteve presente em todas as amostras em menor intensidade, ou na mesma
65
intensidade que a banda indicadora de amilose (997 ondas.cm
-1
). A presença de ambos os
sinais nesses espectros permite sugerir que essa fração não se encontra pura no seu constituinte
amiláceo, mas que a detecção simultânea dos mesmos é possível pela fácil distinção das
bandas no espectro (Figura 17).
Os espectros da FAP das demais variedades (Amarelão, Asteca, Composto São Luis,
Cunha, Cateto Vermelho, Língua de Papagaio, Mato Grosso Palha Roxa, MPA1, MPA2,
MPA13, Pixurum 1, Pixurum 4, Pixurum 5, Pires, Palha Roxa do Emílio, Rajado 8 carreiras,
Roxo do Emílio, Roxo do Valdecir e dos cultivares comerciais BR106 e BRS-1030)
assemelharam-se ao perfil espectral da amilose comercial (Sigma, MO – USA), apresentando
um sinal típico daquele polissacarídeo em 1018 ondas.cm
-1
um pouco mais intensa do que a
banda em 997 ondas.cm
-1
(Figura 18). Esses resultados sugerem que nessas variedades o
amido é constituído por um baixo conteúdo de amilopectina e que o protocolo de extração
utilizado não foi suficientemente adequado à extração de toda a amilose.
FIGURA 18- Espectros de FT-IR na região entre 1230 – 800 ondas.cm
-1
de fração
amilose e amilopectínica da variedade local Asteca.
De forma subseqüente à interpretação dos espectros de FT-IR procedeu-se a
determinação dos componentes principais (PCA) do conjunto de dados, visando maximizar a
obtenção de informações. Esta técnica estatística é simples, rápida e de interesse à distinção
66
dos polímeros em estudo (amilose e amilopectina) em amostras de produtos derivados de
milho. Portanto, com o objetivo de determinar o grau de similaridade das duas frações
(amilose e amilopectina), foram calculados os componentes principais a partir do conjunto de
dados da janela espectral entre 1800-600 ondas.cm
-1
. A Figura 19 mostra a dispersão das
variáveis em estudo (amilopectina/amilose) ao longo dos eixos dos componentes principais 1 e
2, os quais contribuiram para explicar em 81% a variância presente nos dados. A análise da
Figura 19 revela a separação das amostras em dois grupos, com as amostras da FAM
ocorrendo predominantemente em PC2 negativo, enquanto na região positiva do mesmo foram
agrupadas as amostras da FAP. As amostras da FAM em PC2 + correspondem àquelas onde a
distinção das bandas em 1018 e 997 ondas.cm
1
não se assemelhou ao perfil do padrão
comercial de amilose, quais sejam Mato Grosso, Rosado, Pixurum 5, Cateto Vermelho e
BRS1030.
FIGURA 19 - Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados espectrais de FT-IR
(1800-600 ondas.cm
-1
) da FAM e da FAP de 26 VCLM e dos cultivares comerciais em
estudo.
No estudo realizado por DUPUY et al. (1997), a mesma estratégia analítica, isto é,
espectroscopia de FT-IR associada à quimiometria, foi usada para classificar amostras de
67
amido modificados e não modificados. Os autores verificaram que a banda com maior
contribuição à separação das amostras foi a 1014 ondas.cm
-1
.
No presente estudo, a análise do perfil espectral de FT-IR dos dados agrupados em
PC2 negativo (Figura 20) sugere que o primeiro grupo (FAP) foi agrupado pelos sinais
característicos de carboidratos (1149, 1076, 1026, 987, 864 e 763 ondas.cm
-1
), enquanto o
segundo grupo (FAM) principalmente pelos sinais característicos de compostos associados,
como lipídeos e proteínas (1743, 1641, 1535, 1450, 1234 e 1164 ondas.cm
-1
). Portanto, um
outro experimento foi realizado, onde as FAMs e FAPs foram comparadas via cálculo dos
componentes principais para os dados espectrais da janela entre 1200-950 ondas.cm
-1
. Neste
caso, não se detectou uma clara separação das duas frações (dados não mostrados), sugerindo
que os compostos associados (contaminantes) foram determinantes à separação observada na
Figura 19. Dessa forma, as amostras de amilopectina passaram por um processo de “clean
up” para a retirada de compostos de baixo peso molecular fracamente associados aos
polissacarídeos.
FIGURA 20 - Contribuição fatorial de PC2 das FAMs e FAPs para os dados espectrais de
FT-IR (1800-600 ondas.cm
-1
).
68
A comparação visual dos espectros de FT-IR para as amostras de amilopectina antes e
após a diálise não revelou diferenças significativas quanto à presença ou ausência de sinais,
embora as amostras tenham sido parcialmente separadas na análise por PCA para região
espectral entre 1200-950 ondas.cm
-1
(dados não mostrados). Diante disso, procedeu-se
subsequentemente a análise dos componentes principais dos dados espectrais da FAM e da
FAP dialisada para a região de fingerprint de carboidratos.
A Figura 21 mostra a classificação dos componentes principais para esses dados, onde
PC1 e PC2 contribuem em 88% para explicar a variância dos mesmos. A análise do gráfico de
distribuição fatorial revela a existência de uma separação ainda mais acentuada das amostras
(amilose/amilopectina) em dois grupos, comparativamente aos resultados mostrados na
Figura 19.
FIGURA 21 - Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR nas janelas
espectrais de 1200-950 ondas.cm
-1
da FAM e da FAP dialisada das 26 variedades crioulas
e locais de milho e dos cultivares comerciais em estudo.
69
As amostras foram agrupadas ao longo do eixo de PC2, com a FAM situada em PC2
+, enquanto a FAP dialisada ocorreu em PC2 -. Observa-se ainda na Figura 21 que os grupos
(frações amídicas) distinguem-se em alguma extensão quando analisados separadamente, isto
é, consoante às variedades em estudo, notadamente para as amostras de amilose,
possivelmente em função de diferenças estruturais conferidas àquela macromolécula por
constituintes associados (contaminantes). A análise da contribuição dos autovetores (Figura
22) indicou que o sinal em 1014 ondas.cm
-1
caracterizou a amostra de FAP dialisada,
enquanto a FAM foi melhor caracterizada pelas bandas em 1145, 1072, 972 e 941 ondas.cm
-1
.
Esse resultado não está de acordo com a interpretação dos espectros, onde foi possível
observar uma banda majoritária em 1018 ondas.cm
-1
e outra em 997 ondas.cm
-1
para os
padrões comerciais de amilose e amilopectina, respectivamente. Dessa forma, pode-se
concluir que a presença de outros sinais na região de fingerprint para carboidratos detectados
nas amostras obtidas a partir do fracionamento do amido modificaram o perfil espectral das
mesmas. Sendo assim, o padrão de dispersão das amostras observado na Figura 21 resultou
em grande parte da presença desses outros compostos associados às frações amídicas.
Posteriormente, a análise dos componentes principais foi aplicada aos dados
espectrais de FT-IR (janela espectral entre 1200-950 ondas.cm
-1
) com o intuito de se comparar
as amostras de FAM e FAP dialisada extraídas das VCLM e dos cultivares comerciais com os
padrões comerciais de amilose (Sigma) e amilopectina (Fluka - Figura 23). Neste caso, a
distribuição das amostras ocorreu principalmente pelo eixo PC1 que contribuiu para explicar
em 85% a variância dos dados, enquanto PC2 contribuiu com 8%. As amostras de FAP
dialisada, agrupadas em PC1 positivo e claramente separadas das amostras de FAM,
revelaram elevado grau de similaridade entre si. Porém, tal estratégia analítica não logrou
êxisto no que se refere as amostras da FAP dialisada, a qual não se assemelhou a nenhum dos
dois padrões comercais de interesse.
70
FIGURA 22- Contribuição fatorial de PC2 das FAMs e FAPs dialisada para os dados
espectrais de FT-IR (1200-950 ondas.cm
-1
).
A distinção das amostras quando comparadas aos padrões comerciais pode ter
ocorrido pela presença de outros carboidratros nessa fração, tais como celulose e pectinas,
uma vez que os mesmos não foram retirados das amostras. Nesse contexto, o estudo realizado
por COIMBRA et al. (1999), usando FT-IR e quimiometria para caracterização de
polissacarídeos de parede celular de extratos de oliveira, revelou ser a banda em 1014
onda.cm
-1
predominantemente encontrada em polímeros de origem péctica.
71
FIGURA 23 - Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados espectrais de FT-IR
(1200-950 ondas.cm
-1
) da FAM e FAP dialisada de 26 VCLM, dos cultivares comerciais
em estudo e dos padrões comerciais de amilose (Sigma) e amilopectina (Fluka).
Isso pode nos sugerir a presença de quantidades variáveis de polímeros de parede
celular associados à FAP, uma vez que a remoção dos mesmos pela diálise, neste caso, não é
efetiva. Além disso, a análise da Figura 23 revela novamente a maior dispersão das amostras
da FAM, com uma predominância das mesmas em PC1 negativo. Já o padrão comercial de
amilose (Sigma), usando essa abordagem de análise, localizou-se em PC2 negativo e não
agrupado às amostras da FAM extraídas das VCLM e dos cultivares comerciais. A separação
do padrão comercial (Sigma) pode ser resultado da associação de compostos químicos ao
mesmo, fato este indicado pela
1
H-RMN (Capítulo 2). Dessa forma, o padrão comercial
(amilose) utilizado no presente estudo não apresenta elevado grau de pureza, ao contrário do
que foi observado para o padrão de amilopectina comercial (Fluka) que agrupou-se à algumas
amostras de FAM das variedades em estudo em PC1 negativo. A semelhança entre as
amostras da FAM e o padrão comercial de amilopectina (Fluka) pode indicar a presença desse
polímero nesta fração para algumas variedades, possivelmente devido ao elevado conteúdo do
mesmo componente amiláceo daquela variedade. As bandas que contribuíram de forma
72
significativa para a classificação das amostras ao longo de PC1 foram 1149, 1076 e 1014
ondas.cm
-1
como mostrado na Figura 24.
FIGURA 24- Contribuição fatorial de PC1 das FAMs e FAPs dialisada das VCLM em
estudos e dos padrões comerciais para os dados espectrais de FT-IR (1200-950 ondas.cm
-1
).
5 CONCLUSÕES
Os resultados encontrados no presente estudo usando a espectroscopia vibracional de
infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), associada à análise de PCA, apontaram
para a possibilidade do uso das mesmas na classificação de amostras de farinha de grãos
inteiros ou degerminados e provenientes de diferentes variedades de milho. Por ser uma
técnica rápida e simples, sugere-se a sua utilização no screeening de farinhas com constituição
química diferenciada, bem como em estudos que visam a investigação da diversidade
química.
Da mesma forma, a associação de FT-IR com o PCA também demonstrou ser uma
ferramenta de alto potencial e aplicabilidade em análises da estrutura química das frações
73
amídicas de VCLM. A análise dos espectros de FT-IR das mesmas mostrou que com o
protocolo utilizado para extrair e fracionar o amido foram obtidas frações com constituição
química diferenciada, sugerindo um aprofundamento na investigação das mesmas.
Tal abordagem analítica permitiu detectar perfis de maior similaridade estrutural para
as FAPs em estudo, comparativamente às FAMs. De fato, a FAM das VCLM parece
apresentar um perfil de variação estrutural superior ao observado para a FAP daquele
germoplasma, sendo decorrente da associação daqueles polímeros com contaminantes e
também pela proporção dos dois polissacarídeos que constituem a fração amídica no
germoplasma em questão, ou ainda pela presença de polímeros de tamanho intermediário.
Além disso, a possibilidade de distinção dos polissacaríedos amiláceos via FT-IR,
como demonstrado no presente estudo, é de interesse porque abre a perspectiva de
quantificação desses constituintes em produtos derivados do milho, através da construção de
uma curva padrão usando tal metodologia. Dessa forma, tornar-se-á possível a realização de
estudos qualitativos e quantitativos de produtos derivados daquele cereal, tais como a
identificação de amostras de farinha com características químicas para usos específicos de
forma simples, rápida e com um custo não muito elevado.
Quando tomados em conjunto, os resultados do presente estudo apontaram para o
potencial de aplicação do amido das VCLM no ramo industrial, ainda que estudos mais
aprofundados sobre as características reológicas da farinha sejam necessários, como estratégia
de detalhamento do potencial de uso daquela biomassa nesse setor.
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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corns. 2
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Piracicaba, SP, 1993.
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food additives. Carbohydrate Polymers, v. 51, p. 383–389, 2003.
74
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77
Capítulo 2
78
ANÁLISE DA FRAÇÃO AMÍDICA (AMILOSE E AMILOPECTINA) POR
ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA DE 13C (13C-RMN) E DE 1H
(1H-RMN) E QUIMIOMETRIA
1 RESUMO
Os polissacarídeos amilose e amilopectina, principais constituintes dos grânulos de
amido, possuem diversas aplicações no setor industrial, principalmente na área de alimentos,
de papel e têxtil, embora suas propriedades funcionais possam variar com a fonte botânica.
Devido à importância dessas macromoléculas para aquele setor, tem-se observado o crescente
interesse na busca de novas tecnologias, bem como, de amidos diferenciados. No presente
estudo, as características estruturais de amidos fracionados em amilose e amilopectina, através
de uma metodologia rápida e simples, obtidos de 26 variedades crioulas e locais de milho
(VCLM), de 5 cultivares comerciais e de 2 padrões comerciais (amilose-Sigma- e
amilopectina – Fluka) foram investigadas utilizando a 1H-RMN e a 13C-RMN, associadas à
análise dos componentes principais (PCA). Nos espectros de 13C-RMN da fração
sobrenadante rica em amilose (FAM) e do padrão comercial (Sigma) foram identificados os
carbonos C1 a C6 dos resíduos de α-D-glucose. Observou-se também, nos espectros das
frações, deslocamentos químicos de intensidade variável (18 e 56 ppm) atribuídos a presença
de lipídeos. A análise de PCA dos dados espectrais de 13C-RMN revelou que as amostras se
diferenciaram em função dos teores de lipídeos. Por outro lado, as ressonâncias em 100,9;
79,5 e 61,0 ppm mostraram-se características da amilopectina comercial (Fluka), não tendo
sido as mesmas detectadas na fração do pellet rica em amilopectina (FAP), em função da
baixa resolução espectral obtida. Os prótons dos resíduos de α-D-glucose foram detectados
nas FAM e no padrão comercial, assim como, a ressonância associada à ligação α-(1→6) que
diferiu em intensidade. Através da análise de PCA ficou demonstrado que a FAM possui
constituição química distinta, no que diz respeito à presença de contaminantes. A comparação
dos perfis espectrais de 1H-RMN da FAP com o padrão comercial (Fluka) revelou várias
diferenças, principalmente na região de compostos alifáticos e aromáticos. No entanto, a
análise de PCA desta fração revelou maior similaridade de composição química entre as
mesmas quando comparadas à FAM. De modo geral, a 13C-RMN mostrou-se eficiente na
elucidação estrutural das frações amídicas e a 1H-RMN constituiu-se em uma ferramenta
analítica adequada à análise de amostras que possuem maior potencial de uso no setor
industrial.
79
2 INTRODUÇÃO
O endosperma das sementes de milho é constituído majoritariamente por amido, um
polissacarídeo de reserva fonte de energia para o desenvolvimento do embrião durante a
germinação. Apesar da ampla distribuição desse polissacarídeo no Reino Vegetal, poucas
plantas são usadas para a obtenção comercial do mesmo (WHITE, 2001). Nesse sentido, o
milho destaca-se pela sua importância, sendo responsável por cerca de 80% da produção
mundial (JOBLING, 2004).
O amido compreende dois homopolímeros de α-D-glucose, a amilose e a amilopectina.
A amilose é uma molécula linear, onde ligações α-(1→4) são responsáveis pela união de seus
monômeros. A amilopectina, por sua vez, é um polímero que possui várias ramificações,
unidas à cadeia principal por ligações α-(1→6) (JAMES et al., 2003). A proporção dos
polissacarídeos amilose e amilopectina na constituição do grânulo de amido varia com a
origem botânica da espécie, com efeito determinante na reologia do mesmo (TESTER et al.,
2004).
Atualmente, o amido é o principal carboidrato encontrado na dieta dos seres humanos
e de outros animais, sendo matéria-prima com diversas aplicações industriais, tanto no setor
alimentício como no de adesivos (WHITE, 2001). A amilose, por exemplo, é um importante
aditivo usado como espessante de pudins, massa de tomate e de outros alimentos processados,
proporcionando formato e integridade aos mesmos. Da mesma forma, o emprego da
amilopectina tem como finalidade conferir características de textura adequada como, por
exemplo, a maciez e cremosidade aos alimentos enlatados e laticínios, ou melhorar a
estabilidade de alimentos congelados e a aparência de alimentos secos (JOBLING, 2004;
WHITE, 2001). No entanto, tendo em vista que o emprego do amido nativo pela indústria é
limitado por este não apresentar as propriedades funcionais necessárias, é de grande interesse
a descoberta de amidos que não necessitem de modificação. Dessa forma, germoplasmas que
não tenham sido submetidos aos programas de melhoramento convencional e que vêm sendo
cultivados por pequenos agricultores constituem um campo adequado de investigação, como
observado no Município de Anchieta – região extremo-oeste do Estado de Santa Catarina.
Neste município variedades de milho com características agronômicas e nutricionais
diferenciadas vem sendo desenvolvidas, em função do modelo de agricultura familiar adotado,
já tendo sido identificadas cerca de 30 variedades crioulas e locais de milho (VCLM -
OGLIARI & ALVES, 2006). Além disso, o uso de um protocolo de extração de grânulos de
80
amido e/ou de seus constituintes (amilose e amilopectina) que não necessite de solventes
orgânicos, tal como o butanol, é de interesse pelo menor impacto ambiental causado
(YOUNG, 1984).
Dessa forma, o presente estudo objetivou a proposição de uma metodologia rápida,
simples e limpa de fracionamento dos grânulos de amido em amilose e amilopectina, obtidos
de germoplasmas crioulos e locais de milho, cultivados no Município de Anchieta, e de
variedades híbridas comerciais. Para a comparação das características estruturais das frações
polissacarídicas utilizou-se a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H e de
13C, associada à análise dos componentes principais (PCA) dos dados espectrais.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção do material vegetal
3.1.1 Variedades crioulas e locais de milho (VCLM)
Amostras de grãos de 26 VCLM foram resgatadas junto aos pequenos agricultores do
município de Anchieta (região extremo oeste de SC) pelo Sindicato dos Trabalhadores na
Agricultura Familiar (SINTRAF) e repassadas ao grupo do Núcleo de Estudos em
Agrobiodiversidade (NeaBio-UFSC). As variedades Roxo do Valdecir, Rajado 8 carreiras,
Palha Roxa 02, Rosado, Cateto Vermelho, Cateto, Pires, Palha Roxa 1 do Emílio, Mato
Grosso Palha Roxa, Pixurum 07, MPA 13, Branco do Aldanir, Pixurum 04, Mato Grosso,
Pixurum 06, Composto São Luis, Asteca, MPA 02, Pixurum 01, Cunha 01, MPA 01, Pixurum
05, Roxo do Emílio, Amarelão 03, Moroti e Língua de Papagaio foram utilizados no presente
estudo.
3.1.2 Cultivares Comerciais
Amostras de grãos de cultivares comerciais recomendadas para a região Sul do Brasil
foram utilizadas para efeitos de análise comparativa, a saber: BRS1030; BR-106; AG-9090;
Pioneer 3069 e AS-3430.
O cultivar BRS1030 (Embrapa), um híbrido simples, é de ciclo precoce, com
florescimento em 61 dias, de porte baixo, com grãos semi-duros de cor alaranjada. O cultivar
AG-9090 (Agroceres) é de ciclo precoce, com florescimento em 72-80 dias, com grãos
semidentados, de cor alaranjada e com alto teor de óleo. Pioneer 3069 é um híbrido simples,
81
de ciclo super-precoce. AS-3430 (Agroeste) é um híbrido triplo, de ciclo precoce, porte
médio/alto que apresenta grãos duros de cor avermelhada.
3.2 Coleta e preparo das amostras
Para cada variedade, amostras de grãos (50 g, peso seco) foram trituradas em moinho
de laboratório (Cyclone Sample Mill - modelo 3010/019), utilizando-se peneira de 0,1mm.
Após a moagem, as amostras de grãos foram imediatamente submetidas aos procedimentos
experimentais de interesse, ou embaladas em sacos plásticos, sob vácuo, e mantidas a –18
º
C
para posterior análise.
3.3 Extração e fracionamento do componente amídico em amilose e amilopectina
A uma alíquota de farinha (3 g/variedade) foram adicionados 200 mL de água
destilada/deionizada, seguido de agitação (20 min) e refluxo (80
0
C, 1 h). As amostras foram
centrifugadas (2500 rpm, 30 min) e o sobrenadante precipitado com álcool etílico (96ºGL, 5V
– 12 h, 4
0
C) para a remoção da fração rica em amilose (FAM). O etanol foi removido por
aspiração e a FAM mantida em estufa (55
0
C) até peso constante. O material precipitado após a
centrifugação, contendo a fração rica em amilopectina (FAP), foi seco em estufa (55
0
C) até
peso constante e, posteriormente, tamisado (80 mesh). A 200 mg da FAP bruta foram
adicionados 6 mL de água destilada/deionizada, seguido de diálise da solução contra água
destilada-deionizada (membrana de acetato de celulose, cut-off 10.000-12.000 MW, Sigma)
por um período de 24 horas. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
3.4 Determinação do conteúdo de proteínas associadas às FAMs
A 40 mg de amostra foi adicionado 1 mL de água destilada/deionizada, seguido de
incubação em banho-maria (45
0
C, 4h). Subsequentemente, as amostras foram centrifugadas
(12.000 rpm, 15 min) e uma alíquota (300 µL) do sobrenadante foi utilizada para a
determinação do conteúdo de proteínas, usando o método de BRADFORD (1976). Para
efeitos de cálculo, utilizou-se uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA – 1 mg/mL
– 0,025 mg/mL, r
2
= 0,93; y = 2,1041x).
3.5 Caracterização das FAMs e FAPs por ressonância magnética nuclear de 13C e 1H e
análise quimiométrica
As análises de ressonância magnética nuclear (RMN) foram realizadas no Laboratório
de RMN, no Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos (SP). Foram
82
obtidas medidas de RMN de 1H e de 13C das amostras da FAM e de 1H das amostras da FAP
das VCLM e dos cultivares comerciais, bem como dos padrões comerciais de amilose (Sigma
A-7043) e de amilopectina (Fluka 10120), ambos extraídos e purificados de milho. Para tal, as
amostras (50 mg) foram solubilizadas em DMSO-δ
6
(0,6 mL), e transferidas para tubos de
RMN (5mm ∅ interno). Os espectros de ressonância magnética nuclear foram obtidos em
equipamento Bruker DRX-400, operando em freqüência de ressonância de 400,13/100,03
MHz (9,4 Tesla) de 1H/13C, com um tempo de relaxação de 6,57s (1H) e 693ms (13C),
8/2000 varreduras (1H/13C, respectivamente), coletando-se 64.000 (1H) e 32.000 (13C)
pontos para efeitos de processamento, a 28
O
C. Tetrametil-silano (TMS) foi usado como
padrão interno. Uma função de multiplicação exponencial, com um fator de alargamento de
linha (lb) de 0,3Hz (1H) e 3Hz (13C) foi aplicada ao FID, previamente à transformação de
Fourier (MARASCHIN et al., 2003). Os espectros foram processados utilizando-se o software
XWin-NMR (versão 3.1, Bruker-Biospin – Rheinsteten, Germany) e analisados com o auxílio
do software Topspin (versão 1.3). A análise dos componentes principais das amostras foi
aplicada ao conjunto total de ressonâncias dos espectros (1H, 0 - 12,471ppm e 0 - 234,391ppm
– 13C), utilizando-se o software The Unscramble (versão 9.1).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 13C-RMN
Os espectros de 13C-RMN das amostras da FAM das VCLM e dos cultivares
comerciais, assim como, dos padrões comerciais, mostraram sinais bem resolvidos e com
deslocamentos químicos que estão de acordo com as informações descritas na literatura e
disponíveis em bancos de dados para aquela macromolécula (DEBET & GIDLEY, 2006;
www.aist.go.jp/RIODB/SDBS). Como mostrado na Tabela 1, para todas as amostras, foram
detectadas 6 ressonâncias relacionadas aos carbonos dos polissacarídeos que constituem o
amido. O carbono anomérico da α-D-glucose (C-1), por exemplo, foi detectado em 100,1
ppm, enquanto um sinal típico de C-6 foi observado em campo mais alto, 60,1 ppm. Os
demais sinais encontrados, entre 71 ppm e 79 ppm, correspondem aos carbonos C-4 (79,2
ppm), C-3 (73,7 ppm), C-2 (72,4 ppm) e C-5 (72,1 ppm), constituintes do anel piranosídico da
α-D-glucose (GORIN, 1981; QIT et al., 2003 - Tabela 1).
A Figura 1 mostra as ressonâncias de 13C detectadas nas amostras analisadas,
consoante à posição estrutural daquele núcleo nos resíduos de α-D-glucose.
TABELA 1 - Deslocamentos químicos (ppm) de 13C das frações rica em amilose (FAM) extraídas de amostras de grãos
de variedades crioulas e locais de milho, dos cultivares comerciais e de padrões daqueles polissacarídeos.
VARIEDADES CH
3
C CH
3
O / CH(NH) C-1 C-4 C-3 C-2 C-5 C-6
Pixurum 06
19,06 56,55 100,54 79,22 73,71 72,42 72,06 60,95
Pixurum 04
19,05
56,56 100,52 79,20 73,71 71,62 72,04 60,95
Amarelão 03
18,60 56,13 100,08 78,70 73,27 71,97 71,62 60,51
Composto São Luis
18,60 56,10 100,10 78,79 73,26 71,98 71,62 60,51
Asteca
18,60 56,11 100,09 78,78 73,27 71,97 71,61 60,52
MPA02
18,61 56,10 100,09 78,78 73,25 71,99 71,61 60,51
Pixurum 01
18,50 — 99,97 78,66 73,14 71,86 71,50 60,39
MPA01
18,49 56,00 99,97 78,67 73,14 71,86 71,50 60,39
Cunha
19,05 56,55 100,53 79,21 73,71 72,42 72,05 60,94
Pixurum 05
18,60 56,10 100,09 78,78 73,26 71,97 71,61 60,50
Mato Grosso
18,60 56,10 100,08 78,78 73,26 71,98 71,62 60,56
Cateto
19,05 56,55 100,50 79,23 72,43 72,07 70,37 60,95
MPA13
18,61 56,09 100,09 78,79 73,27 71,98 71,61 60,52
Moroti
18,50 56,07 100,04 78,75 73,22 71,93 71,56 60,46
Pixurum 07
18,61 56,10 100,09 78,79 73,27 71,99 71,62 60,51
Branco
18,59 56,10 100,09 78,79 73,27 71,98 71,61 60,50
Cateto Vermelho
18,59 56,11 100,08 78,77 73,25 71,97 71,6 60,49
Variedades Locais
Rosado
— — 100,08 78,77 73,26 71,97 71,61 60,5
Pires
18,48 56 99,97 78,65 73,14 71,85 71,49 60,39
Palha Roxa do Emílio
19,06 56,54 100,5 79,22 73,7 72,42 72,05 60,94
Língua de Papagaio
— — 100,06 78,76 73,21 71,94 71,57 60,47
Mato Grosso P. Roxa
19,05 56,55 100,5 79,23 73,7 72,43 72,06 60,95
Palha Roxa 02
19,05 56,55 100,55 79,22 73,71 72,41 72,06 60,95
Rajado 8 carreiras
19,06 56,54 100,52 79,21 73,69 72,42 72,05 60,92
Roxo do Valdecir
— — 100,08 78,78 73,25 71,96 71,59 60,48
Variedades Locais
Roxo do Emílio
— — 100,09 78,77 73,26 71,97 71,6 60,5
BRS1030
18,6 56,09 100,09 78,79 73,26 71,97 71,61 60,51
BR106
18,53
56,04 100,04 78,73 73,21 71,94 71,56 60,43
Pioneer 3069
18,62 56,25 100,22 78,91 73,38 72,06 71,71 60,64
AG-9090
18,55 56,06 100,05 78,76 73,23 71,95 71,58 60,47
Variedades
comerciais
AS-3430
18,54 56,04 100,05 78,74 73,22 71,92 71,57 60,43
Amilose (Sigma)
— — 100,06 78,78 73,24 71,97 71,60 60,49
Amilopetina (Fluka)
—
— 100,24 78,83 73,34 72,06 71,69 60,57
Padrões
85
FIGURA 1 – Espectros de ressonância magnética nuclear de 13C da fração rica em
amilose (FAM) das VCLM Cateto e Língua de Papagaio e dos padrões comerciais de
amilose (Sigma) e amilopectina (Fluka) mostrando os sinais de maior intensidade. Os
deslocamentos químicos associados aos carbonos da α-D-glucose estão indicados como
C-1, C-2, C-3, C-4, C-5 e C-6. S = solvente (DMSO-δ
6
39,5 ppm).
86
As amostras padrões (amilose e amilopectina comerciais) evidenciaram pequenas
diferenças de perfis espectrais determinadas pelo efeito de ramificação do polissacarídeo
amilopectina. Ressalta-se que as diferenças de resolução dos espectros dos padrões comerciais
decorreram da dificuldade de solubilização da amilopectina, ainda que diversos solventes
[D
2
O – temperatura ambiente e 45
0
C, D
2
O e DMSO-δ
6
(70:30, v/v) e DMSO-δ
6
] tenham sido
testados. A melhor solubilização daquele polímero ocorreu em DMSO-δ
6
, permitindo a
detecção dos sinais característicos de α-D-glucose (100,1 ppm; 79,2 ppm; 73,7 ppm; 72,4
ppm; 72,1 ppm e 60,1 ppm). No entanto, para aquele polissacarídeo foram observadas outras
ressonâncias além daquelas relacionadas a α-D-glucose. Um sinal em 100,9 ppm, próximo ao
sinal do C-1 (100,1 ppm) foi detectado, provavelmente originário do C-1 do resíduo de α-D-
glucose envolvido na ligação α(1→6) nos pontos de ramificação. Um perfil de 13C RMN
similar a este foi observado em amostras de glicogênio hepático de coelho, o qual apresentou
um grau de ramificação superior ao da amilopectina de cereais (GORIN, 1981). Foram
detectados ainda, no padrão comercial de amilopectina, sinais em 61,00 ppm e 79,5 ppm,
provavelmente relacionados ao C-6 de α-D-glucose no ponto da ramificação do polímero
relacionado e ao C-4 nas extremidades não redutoras (final das ramificações),
respectivamente.
Analisando os espectros da FAM das VCLM e dos cultivares comerciais, verificou-se
que os deslocamentos químicos que caracterizaram o padrão comercial de amilopectina (100,1
ppm; 79,5 ppm e 61,0 ppm) não foram detectados nas mesmas, o que nos permite sugerir que
nenhuma das variedades analisadas possui teores deste polissacarídeo (amilopectina)
detectáveis por 13C-RMN, considerando o protocolo de extração utilizado. Nessas amostras,
além das ressonâncias características do resíduo de α-D-glucose foram detectados
deslocamentos químicos de intensidade variável entre 18 ppm e 31 ppm, 56 ppm e 62-63 ppm.
Estas ressonâncias relacionam-se à presença de outros compostos associados à fração amídica
como, por exemplo, a presença de compostos contendo grupamentos metila (-CH
3,
18 ppm),
sugerindo a contaminação das FAM das VCLM com ácidos graxos e lipídeos (PERLIN &
CASU, 1982). Além disto, as diferenças de intensidade detectadas para a ressonância em 18
ppm estão associadas, possivelmente, a ocorrência de lipídios em conteúdos distintos nos
grãos do germoplasma em análise, os quais foram facilmente detectados visualmente durante o
processo de extração. A presença de compostos de origem lipídica nessas amostras foi
87
também detectada nos espectros de FT-IR (Capítulo 1) e nos de 1H-RMN, como será descrito
mais adiante (Figura 2). Tal fato é de interesse, por revelar uma característica importante das
amostras das VCLM e por ter implicações diretas no uso do polímero pela indústria
alimentícia. Isto porque, sabe-se que a associação de ácidos graxos ao grânulo de amido
modifica seu comportamento reológico, retardando a gelatinização do grânulo (DEBET &
GIDLEY, 2006; RAPHAELIDES & GEORGIADIS, 2006). É importante ressaltar que a
gelatinização do grânulo de amido é um dos fatores de maior influência sobre as suas
propriedades funcionais, incluindo melhorias na palatabilidade e aspectos sensoriais
(D´APPOLONIA & MORAD, 1981). Estudos que visam à remoção dos componentes não
glicídicos de amostras de amido vêm sendo desenvolvidos, recomendando o uso de
tratamentos químicos a base de surfactantes como o dodecil sulfato de sódio (SDS - DEBET
& GIDLEY, 2006). Porém, cabe destacar que nas amostras das variedades Rosado, Língua de
Papagaio, Roxo do Valdecir e Roxo do Emílio as ressonâncias em 18 ppm e 56 ppm não
foram detectadas, sugerindo um maior grau de pureza para as mesmas.
Os outros deslocamentos químicos detectados nessa mesma região do espectro
apresentaram fraca intensidade (24-32 ppm), tendo sido observados em todas as amostras
analisadas e estando provavelmente associados à presença de ácidos orgânicos, tais como o
ácido acético (β-CH3: 24,1 ppm - FAN, 1996) e o ácido propiônico (α-CH2: 31,5 ppm - FAN,
1996). Esses resultados foram subsequentemente confirmados por 1H-RMN, porém, as
ressonâncias que indicam a presença do grupo ácido carboxílico (COOH: 182,2 ppm e COOH:
185,7 ppm – FAN, 1996) nos espectros de 13C-RMN não foram detectadas nos mesmos,
indicando um baixo conteúdo de tais compostos nas amostras da FAM.
Os dados espectrais de 13C-RMN ainda sugerem a presença de contaminantes de
origem protéica ou lipídica nas amostras da FAM, considerando a ressonância em 56 ppm
observada em todas as amostras, a exceção das variedades Pixurum 01, Rosado, Língua de
Papagaio, Roxo do Valdecir e Roxo do Emílio (Tabela 1 e Figura 1). Essa ressonância está
associada à presença de compostos contendo grupamentos CH-NH ou -OCH
3
, comumente
encontrados em proteínas e lipídeos, respectivamente (PERLIN & CASU, 1982). Buscando
elucidar tal aspecto, procedeu-se a extração e a quantificação de proteínas eventualmente
associadas à FAM. A extração aquosa, a 40
0
C, revelou que as frações possuem conteúdos
88
distintos de proteínas associados ao polissacarídeo (Tabela 2), com uma amplitude de valores
de 2,50 mg/g (Roxo do Valdecir) a 8,25 mg/g (Pixurum 1).
Os resultados da quantificação protéica na FAM não corroboraram a hipótese de que a
ressonância em 56 ppm resulta da presença de proteínas ligadas à amilose, uma vez que nas
variedades Roxo do Emílio, Língua de Papagaio, Rosado e Pixurum 1 o conteúdo de tais
compostos não pode ser associado à ausência da ressonância nos espectros de 13C-RMN.
Portanto, assume-se que os deslocamentos químicos em 18 ppm e 56 ppm devem estar
relacionados a compostos lipídicos associados à FAM.
De fato, a correlação dos resultados de 13C-RMN com a espectroscopia de FT-IR
(Capítulo 1) indica a existência de compostos lipídicos nas amostras em análise, além de
ácidos orgânicos, devido à presença de bandas de intensidade moderada na região de 1700
ondas.cm
-1
(deformação axial do grupo C=O). Além disso, a ausência de ressonâncias com
intensidades elevadas em 175 ppm a 185 ppm nos espectros de 13C-RMN reforça a hipótese
de que a contaminação da FAM é principalmente de origem lipídica e não de ácidos
orgânicos, uma vez que aquele deslocamento está associado ao carbono do grupo carboxila
dos ácidos.
Espectros de 13C-RMN da FAP das VCLM e dos cultivares comerciais também foram
adquiridos, porém de difícil interpretação dada à baixa resolução observada, isto é, baixa
relação sinal:ruído (dados não mostrados).
Esse resultado decorreu em função da dificuldade de solubilização dessa fração em
solvente adequado à aquisição dos espectros, da mesma forma que para a amilopectina
comercial (Fluka). Para aquelas amostras, apenas os carbonos referentes ao resíduo da α-D-
glucose foram detectados, resultado este que não exclui a presença da amilopectina nas
mesmas (reação positiva ao teste de lugol, dados não mostrados), porém indica o baixo
conteúdo do mesmo em relação aos demais compostos químicos.
89
TABELA 2 - Conteúdo médio
*
de proteínas (mg/g) nas frações rica em amilose (FAM)
de amostras de grãos das variedades crioulas e locais e dos cultivares comerciais de
milho.
VARIEDADES FAM
Roxo Valdecir
2,50±0,44
MPA 2
3,22±0,29
Cateto
3,64±0,14
MPA 13
4,06±0,21
Asteca
4,11±0,46
Mato Grosso
4,32±0,52
L. Papagaio
4,51±0,59
Palha Roxa
4,64±0,75
Branco
4,72±0,89
Pixurum 4
4,81±0,24
Cateto Vermelho
4,87±0,61
Rosado
4,88±0,26
Palha R. Emílio
4,94±0,15
MPA 1
5,01±1,12
Pixurum 6
5,05±0,25
C. S. Luis
5,09±0,38
Moroti
5,96±3,29
Pixurum 7
5,97±0,25
Pixurum 5
6,03±0,19
Mato Grosso P. Roxa
6,58±0,04
Rajado 8 C.
6,80±0,65
Pires
6,84±0,30
Roxo Emílio
7,22±0,97
Cunha
7,44±0,26
Amarelão 3
7,50±0,04
Variedades Locais
Pixurum 1
8,25±0,17
Pioneer 3069
4,35±0,17
AG-9090
4,37±0,22
AS-3430
5,16±0,25
BR106
6,46±0,47
Variedades
Comercias
BRS 1030
6,57±0,01
*
Resultado médio de 2 extrações independentes
90
4.2 1H-RMN
Similaridades de perfis espectrais de 1H-RMN foram observadas entre as amostras das
frações amídicas em estudo, tanto para a amilose como para a amilopectina. No padrão
comercial de amilose (Sigma) foram detectadas 15 ressonâncias bem resolvidas, de modo
similar ao observado nas amostras da FAM das VCLM e dos cultivares comerciais (Figura 2).
Entre as amostras da FAM, as principais diferenças nos perfis espectrais ocorreram na
região alifática (0,5 ppm a 3,0 ppm), principalmente no que se refere à presença ou à
intensidade dos sinais detectados em 0,77 ppm, 1,06 ppm (tripleto), 1,16 ppm e 2,08 (singleto)
ppm. Neste caso, o tripleto e o singleto dos deslocamentos químicos em 1,06 ppm e 2,08 ppm,
respectivamente, indicaram a provável ocorrência dos ácidos propiônico e acético nas
amostras (FAN, 1996), um fato decorrente, em alguma extensão, da contaminação microbiana
dos polissacarídeos durante o período de armazenamento que antecedeu as análises.
Por outro lado, foram detectadas diferenças entre os perfis espectrais dos padrões
comerciais de amilose (Sigma) e amilopectina (Fluka) (Figura 2). Para a janela espectral de
ocorrência de compostos alifáticos (0 - 3 ppm) um único sinal (s, 1,21 ppm) foi encontrado no
padrão de amilopectina, enquanto o padrão de amilose apresentou 6 ressonâncias (0,85 ppm;
1,23 ppm; 1,47 ppm; 1,91 ppm; 2,01 ppm e 2,17 ppm), sugerindo a presença de compostos
não amídicos associados aquele polímero. Os prótons dos resíduos de α-D-glucose foram
detectados, nos dois padrões comerciais, entre 3 e 5 ppm, através das ressonâncias em 5,1 ppm
(H
1
), 3,54 ppm (H
2
), 3,68 (H
3
) e 3,41 ppm (H
4
) (KAJIWARA & MIYAMOTO, 1998).
Os 1H envolvidos na ligação glicosídica α-1,4 foram associados aos deslocamentos
químicos em 5,41 ppm e 5,51 ppm, detectadas em ambos os padrões comerciais. Uma típica
ressonância em 4,91 ppm, associada aos núcleos de 1H envolvidos na ligação α-1→6
(JODELET et al., 1998), foi detectada na amostra do padrão comercial de amilopectina
(Fluka) e também, com menor intensidade, na amostra comercial de amilose (Sigma),
indicando que a amostra padrão deste último polissacarídeo não se encontra pura.
91
FIGURA 2- Espectros de ressonância magnética nuclear de 1H da fração rica em
amilose (FAM), e rica em amilopectina (FAP) (0 ppm a 5,7 ppm) da variedade Cateto e
dos padrões comerciais de amilose (Sigma) e amilopectina (Fluka). S= solvente
(DMSO-δ
6
2,5 ppm).
92
Cabe destacar que nas amostras da FAM das VCLM e dos cultivares comerciais, a
ressonância associada às ligações α-(1→6) (4,91 ppm) também foi detectada, porém
apresentando intensidade variável consoante à amostra.
Em estudo similar, JODELET et al. (1998), constataram mudanças de perfis de 1H-
RMN na janela espectral entre 5,31 e 5,41 ppm de α-dextrinas, as quais estavam associadas ao
grau distinto de ramificação de amostras de amilopectina de milho.
No presente estudo, um perfil espectral distinto para essa mesma região também foi
observado, comparativamente aos dois padrões comerciais, tendo sido detectadas 7
ressonâncias no espectro do padrão comercial de amilopectina e apenas 2 no padrão da
amilose comercial.
A FAP extraída das VCLM e dos cultivares comerciais mostrou um perfil espectral de
1H-RMN parcialmente distinto do encontrado para o padrão comercial (Fluka),
principalmente na região entre 5,41 e 5,51 ppm (Figura 2). De qualquer forma, esse resultado
não exclui a presença da amilopectina na fração analisada, mas sugere um conteúdo elevado
de outros constituintes químicos. Cabe ressaltar que outros polímeros de natureza protéica,
hemicelulósica e compostos de baixo peso molecular (isto é, pigmentos) podem estar
associados a esta fração, uma vez que tratamentos para a remoção dos mesmos não foram
realizados. Ressonâncias em 6,63 ppm, 6,79 ppm, 7,02 ppm e 7,23 ppm (dados não
mostrados) foram detectadas em todas as amostras da FAP, sugerindo a presença de
compostos aromáticos que podem ser encontrados em proteínas e alguns pigmentos. Além
disso, a ressonância em 2,08 ppm (CH
3
– FAN, 1996), associada ao ácido acético, também foi
detectada nessas amostras, sugerindo sua eventual contaminação microbiana.
4.3 Análise quimiométrica – PCA
4.3.1 13C-RMN
Subseqüente à análise dos perfis espectrais de 13C-RMN e de forma similar ao
tratamento estatístico aplicado aos dados obtidos com a utilização da espectroscopia de FT-IR
(Capítulo 1), a semelhança estrutural química das FAMs das VCLM, dos cultivares
comerciais e do padrão comercial de amilose (Sigma) foi avaliada, utilizando-se a análise de
componentes principais (PCA). Para essa análise procedeu-se a retirada, na matriz de dados,
93
dos sinais associados ao solvente utilizado para a solubilização das amostras e daqueles
relativos aos ácidos orgânicos (24 ppm a 32 ppm). A Figura 3 mostra a dispersão das
variáveis em estudo segundo a determinação dos componentes principais (PCA) da matriz de
dados obtida a partir dos espectros de 13C-RMN.
FIGURA 3 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de 13C-RMN (2 ppm a
200 ppm), da fração rica em amilose (FAM) das 26 variedades crioulas e locais de milho,
dos cultivares comerciais e do padrão comercial de amilose (Sigma).
A análise do gráfico de distribuição fatorial (Figura 3) mostra que os componentes
principais PC1 e PC2 contribuiram para explicar em 43% a variabilidade encontrada nos
espectros de 13C-RMN, assim como revela a separação das amostras em dois grupos
principais, em função de PC1 e de PC2. Um dos grupos localizou-se na região positiva dos
eixos PC1 e PC2, enquanto o outro situou-se na região negativa de ambos.
Pode-se observar ainda na Figura 3 que o padrão comercial de amilose (Sigma) ficou
nitidamente separado de qualquer um dos grupos, possivelmente em função da ausência dos
deslocamentos químicos presente nas demais amostras, principalmente em 18 e 56 ppm. Cabe
destacar que a FAM das VCLM Língua de Papagaio e Rajado 8 carreiras e do cultivar
comercial BR-106 não agruparam-se junto às demais amostras, sendo que a primeira
94
localizou-se em PC1 negativo e PC2 positivo, a segunda em PC1 e PC2 positivo e a terceira
em PC1 positivo e PC2 negativo. A análise dos autovetores calculados a partir dos dados de
13C-RMN revelou que a separação das amostras da FAM e do padrão comercial (Sigma)
ocorreu em função de vários deslocamentos químicos (Figura 4). Dessa forma, as
ressonâncias em 19,8; 46,8; 50,0; 58,0; 63,2 e 78,5 ppm agruparam parte das amostras em PC1
positivo, enquanto as ressonâncias em 13,0; 50,4; 53,3; 56,4; 58,6; 59,5; 63,5; 64,7; 65,6;
67,8; 70,0; 73,0; 78,9; 84,9 e 88,4 ppm contribuíram para o agrupamento das amostras em
PC1 negativo, assim como o padrão comercial de amilose (Sigma).
FIGURA 4- Contribuição fatorial de PC1 das amostras da fração rica em amilose (FAM) e do
padrão comercial de amilose (Sigma), calculada a partir dos dados de 13C-RMN para a região
espectral compreendida entre 2 ppm e 200 ppm.
Apesar da contribuição fatorial destacar a participação de várias ressonâncias na
separação das amostras, sugere-se que o padrão de distribuição observado na Figura 3 está,
provavelmente, correlacionado principalmente à presença e a intensidade dos deslocamentos
químicos em 18 ppm e 56 ppm, originários de compostos lipídicos. Esta hipótese baseou-se no
fato de ter-se observado durante o processo de extração diferenças proeminentes no conteúdo
95
de lipídeos entre as amostras (análise visual), o que de certa forma reflete os distintos teores de
óleos nos grãos das VCLM e dos cultivares comerciais.
Com o objetivo de confirmar a importância da presença e da intensidade das
ressonâncias em 18 e 56 ppm na separação das amostras (Figura 3), realizou-se um segundo
procedimento experimental de PCA retirando-se aquelas ressonâncias da planilha de dados, o
que resultou em um novo padrão de classificação das amostras (Figura 5).
FIGURA 5 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de 13C-RMN obtida a
Nesse caso, os eixos PC1 e PC2 contribuíram para explicar apenas 38% a variância
total d
partir dos dados espectrais da janela entre 2 ppm a 200 ppm, subtraída das ressonâncias
em 18 ppm e 56 ppm, da fraçãorica em amilose (FAM) das 26 variedades crioulas e
locais de milho, dos cultivares comerciais e do padrão comercial de amilo (Sigma).
os dados. Apesar disso, o padrão de classificação das amostras utilizando as
contribuições dos componentes 3 (PC3 -13%), 4 (PC4 -11%) e 5 (PC5 - 7%) foi idêntico ao
observado na Figura 5. Analisando a Figura 5 verificamos que o padrão comercial de amilose
(Sigma) distanciou-se das amostras da FAM extraídas das VCLM e dos cultivares comercias,
assim como observado na Figura 4, segundo o eixo PC1, localizando-se na região negativa do
mesmo. A separação do padrão comercial de amilose (Sigma) ocorreu possivelmente pela
ausência de sinais de baixa intensidade, principalmente na região entre 60 e 65 ppm,
96
detectados nas demais amostras. Todas as amostras das VCLM e dos cultivares comerciais
agruparam-se em PC1 positivo e negativo, com exceção das amostras das variedades Língua
de Papagaio que localizou-se em PC2 negativo e BR-106 que distanciou-se do grupo formado
pelas amostras em PC1 negativo.
Os resultados de autovetores (Figura 6) mostraram que a localização do padrão
comerc
IGURA 6- Contribuição fatorial de PC1 para as amostras da fração rica em amilose
os obtidos a partir da abordagem quimiométrica dos espectros de 13C-
RMN reforçam a hipótese de que a fração amídica correspondente à amilose das variedades
ial de amilose (Sigma) e das variedades Palha Roxa, Mato Grosso, Moroti, Pixurum 4,
Pires, Roxo do Valdecir, MPA1, BR-106, AG-9090 e AS-3430 em PC1 negativo ocorreu pela
presença das ressonâncias em 12,98; 53,27; 64,70; 65,62; 69,62 e 84,94 ppm. Já as demais
amostras reuníram-se em PC1 positivo por causa dos sinais em 19,84; 46,85; 50,01; 63,17 e
78,53 ppm. Como discutido anteriormente, possivelmente esses são deslocamentos químicos
associados à presença de contaminantes em baixa concentração nas amostras da FAM.
F
(FAM) e do padrão comercial de amilose (Sigma), calculada a partir dos dados de 13C-
RMN (janela espectral 2 ppm a 200 ppm) após a retirada das ressonâncias em 18 ppm e 56
ppm.
Os resultad
97
analisa
do Valdecir, Roxo do Emílio, Mato Grosso, Rosado, Pixurum
1, Pixu
N
Os resultados da análise quimiométrica (PCA) dos espectros de 1H-RMN da FAM
tese de constituição química distinta para as mesmas observada inicialmente
encontrada nos dados espectrais de 1H-RMN, havendo uma clara
separaç
das possuem constituição química distinta no que diz respeito aos compostos lipídicos
associados, uma vez que após a remoção dos mesmos nos espectros observou-se elevada
similaridade entre as mesmas.
Nesse sentido, a FAM das VCLM Cateto Vermelho, Asteca, Branco, Amarelão, Pires,
MPA1, MPA2, MPA13, Roxo
rum 5, Pixurum 7, Composto São Luis e o cultivar comercial BRS1030 possuem maior
semelhança na composição química em relação as demais (Figura 3). Assim, a partir do
protocolo de extração e fracionamento do amido proposto neste estudo, foram obtidos
polissacarídeos que distinguem-se em alguma extensão em suas características estruturais, um
fato que sugere a necessidade de estudos mais detalhados quanto ao potencial diferenciado de
uso destas macromoléculas na indústria alimentícia, por exemplo. Para tal, recomenda-se
estudos posteriores destas biomassas relativos à investigação de seus comportamentos
reológicos.
4.3.2 1H-RM
reforçaram a hipó
a partir dos dados de 13C-RMN. Previamente à análise quimiométrica dos espectros de 1H-
RMN (Figura 7), foram retirados da matriz de dados os sinais associados ao solvente
(DMSO-δ
6
, 2,05 ppm) e aqueles relativos aos ácidos orgânicos (propiônico - 1,06 ppm e
acético - 2,08 ppm).
Na Figura 7 pode-se notar que os componentes principais PC1 e PC2 explicam em
66% a variabilidade
ão das amostras ricas em amilose (FAM) em três grupos. O grupo com maior
semelhança química segundo essa abordagem incluíu as amostras das variedades Pixurum 1,
Pixurum 4, Pixurum 5, Pires, Mato Grosso, Cateto Vermelho, Rosado, Roxo do Valdecir,
Roxo do Emílio, MPA2 e Palha Roxa do Emílio, localizadas em PC1 negativo e PC2 positivo.
98
FIGURA 7 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de 1H-RMN, para a
janela espectral compreendida entre 0,5 ppm a 8,5 ppm da fração rica em amilose
(FAM) das 26 variedades crioulas e locais de milho, dos cultivares comerciais e do
padrão comercial (Sigma).
Por sua vez, um segundo grupo situado na região positiva de PC1 mostrou maior
heterogeneidade, o que pode ser evidenciado pela dispersão das amostras (Branco, Amarelão,
Pixurum 7, Rajado 8 carreiras, Cateto, Moroti, Língua de Papagaio, Mato Grosso Palha Roxa,
Composto São Luis, BRS1030 e BR-106). Além disso, a FAM da variedade MPA1
comportou-se como um outlier, separando-se de todas as demais, enquanto as amostras das
VCLM MPA13, Asteca, Pixurum 6, Palha Roxa, Cunha e dos cultivares comerciais Pioneer
3069, AG-9090, AS-3430 e do padrão comercial (Sigma) ficaram nitidamente separadas,
agrupando-se em PC1 e PC2 negativo.
99
Os autovetores que resultaram na dispersão das variáveis segundo o eixo PC1 (Figura
7) estão mostrados na Figura 8, onde pode-se verificar que as ressonâncias em 2,17; 2,81;
2,99; 3,12; 3,78; 4,09; 4,81; 4,96; 5,68; 6,07; 6,30 e 6,38 ppm foram as responsáveis pela
localização das amostras na região positiva do eixo, enquanto 2,03; 2,95; 3,74 e 4,06
contribuiram em maior extensão à região negativa.
FIGURA 8- Contribuição fatorial de PC1 calculada a partir dos dados espectrais de 1H-
RMN (janela espectral: 0,3 ppm a 8,5 ppm) de amostras da fração rica em amilose
(FAM) de VCLM e do padrão comercial de amilose (Sigma).
Esses deslocamentos químicos são atribuídos principalmente a compostos químicos
contaminantes do material amostral, o que evidencia a importância dos mesmos na
classificação das amostras. Portanto, a similaridade entre algumas amostras (Cunha, Palha
Roxa, Asteca, MPA13, Pixurum 6, Pionner3069, AS-3430 e AG-9090) e o padrão comercial
(Sigma) ocorreu pelo menor contéudo de compostos químicos, isto é contaminantes,
associados às mesmas. O menor conteúdo de contaminantes nessas amostras, provenientes de
VCLM e de cultivares comerciais, pode indicar a utilização das mesmas pela indústria
alimentícia, o que poderá ser confirmado a partir de estudos de reologia em andamento.
100
De maneira geral, o resultado da análise quimiométrica usando os dados espectrais de
1H-RMN da FAM diferiu daquele obtido para 13C-RMN (Figura 3 e Figura 7), em função
do maior número de ressonâncias detectadas nos primeiros, fato este resultante do maior
número de 1H em relação a 13C nas amostras. A maior sensibilidade da primeira técnica
justifica o seu uso, associada à quimiometria, em estudos que visem o screening de frações
amídicas com constituição química diferenciada, voltada para um uso específico. A 1H-RMN
tem ainda como vantagem o menor tempo de aquisição dos espectros, o que acarreta em um
custo muito menor em relação à 13C-RMN.
A análise quimiométrica dos espectros de 1H-RMN da FAP resultou em um padrão de
classificação distinto (Figura 9) ao observado para a FAM (Figura 7), evidenciando uma
menor dispersão das amostras. Esse resultado sugere elevada similaridade entre as FAPs
extraídas das diferentes variedades de milho no que diz respeito à sua composição química,
exceto para as variedades Cateto e Palha Roxa que separaram-se das demais, localizando-se
em PC1 positivo e PC2 negativo e para Roxo do Valdecir, MPA13 e Cateto Vermelho que
FIGURA 9 – Distribuição fatorial de PC1 e PC
localizaram-se no quadrante positivo destes eixos.
2 para os dados de 1H-RMN (janela
espectral entre 0,1 ppm a 7,5 ppm) da fração rica em amilopectina de 24 variedades
crioulas e locais de milho, dos cultivares comerciais e do padrão comercial de
amilopectina (Fluka).
101
Cabe destacar que as amostras Pixurum 7 e Pioneer 3069 não entraram nessa anál
pela im
ise
ixurum 1, Pixurum 5, Pixurum 6, Roxo do Emílio,
Mato G
ior conteúdo deste polissacarídeo constituindo o
amido
s ao longo de PC1 resultou da presença e intensidade de
vários
possibilidade de solubilização de suas fração ricas em amilopectina em DMSO-δ
6
. A
espectroscopia de FT-IR (Capítulo 1) também revelou maior similaridade entre as FAPs do
que entre as FAM, principalmente quando se utilizou para a análise quimiométrica apenas a
região de fingerprint para polissacarídeos.
Além disso, a FAP das variedades P
rosso Palha Roxa e Composto São Luis mostraram um perfil espectral semelhante ao
do padrão comercial de amilopectina (Fluka), o que foi evidenciado pelo agrupamento das
mesmas em PC1 e PC2 negativo (Figura 9).
Esses resultados podem sugerir um ma
nessas variedades, um aspecto a ser confirmado em estudos subseqüentes. A proporção
amilose/amilopectina dos grânulos de amido tem influência direta sobre propriedades
reológicas de elevada importância para a indústria alimentícia, tais como a gelatinização e a
retrogradação. A gelatinização caracteriza-se pelo desarranjo molecular sofrido pelo amido
quando este é aquecido na presença de água, permitindo a penetração daquele solvente e a
hidratação dos segmentos lineares da amilopectina. (TESTER & MORISSON, 1990). Após a
gelatinização do amido, normalmente sob condições de temperatura ambiente, inicia-se o
fenômeno da retrogradação, que se caracteriza pelo rearranjo das moléculas através do
restabelecimento de ligações do tipo pontes de hidrogênio (MUNHOZ et al., 2004). Deve-se
levar em consideração que a retrogradação das cadeias de amilose (JANE & ROBYT, 1984),
assim como a re-agregação das cadeias de amilopectina, fenômeno denominado re-
cristalização (CHANG et al., 2004), conferem aos géis de amido mudanças estruturais que a
longo prazo são indesejáveis, gerando características texturais indesejáveis aos alimentos que
contêm aqueles polissacarídeos.
A separação das amostra
deslocamentos químicos como mostrado no gráfico de contribuição fatorial (Figura
10), não sendo possível atribuir a somente uma classe de compostos, ou a uma única região do
espectro, o padrão de agrupamento observado. Isto se deve, provavelmente, ao fato da FAP ter
uma estrutura química de maior complexidade, bem como estar associada a uma diversidade
de compostos ainda maior, comparativamente à FAM. A maior diversidade de contaminantes
na FAP era esperada, uma vez que esta fração consistiu do pellet obtido a partir da
102
centrifugação, após a etapa de extração aquosa do amido da farinha, muito provavelmente
contendo além de proteínas, outros polissacarídeos de natureza estrutural, isto é, parede
celular.
Além disso, é importante destacar que as frações amídicas dos cultivares comerciais
não se
CONCLUSÕES
eral, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear, especialmente a
1H-RM
diferenciaram das VCLM na análise de PCA a partir dos dados de 1H-RMN ou de 13C-
RMN, revelando a aplicabilidade destas técnicas, independente da origem botânica do amido
em análise.
FIGURA 10- Contribuição fatorial de PC1 calculada a partir dos dados de 1H-RMN
(janela espectral: 0,1 ppm a 7,5 ppm) de amostras da fração rica em amilopectina (FAP) e
do padrão comercial de amilopectina (Fluka).
5
De maneira g
N, mostrou-se eficiente na detecção das diferenças de composição química de frações
contendo amilose e/ou amilopectina extraídas de VCLM e de cultivares comerciais. O
emprego de tais técnicas, associadas à análise de PCA, demonstrou que a fração rica em
amilose (FAM) das variedades Cunha, Palha Roxa, Asteca, MPA13, Pixurum 6, AG-9090 e
103
AS-3430 é similar ao padrão comercial de amilose (Sigma). Tal resultado é de grande
interesse, pois revela o potencial de uso das mesmas pela indústria alimentícia. De maneira
similar, as amostras da fração rica em amilopectina (FAP) das variedades Composto São Luis,
Pixurum 6, Mato Grosso Palha Roxa, Pixurum 1, Pixurum 5 e Roxo Emílio se assemelharam
ao padrão comercial de amilopectina (Fluka). Dessa forma, sugere-se o potencial de aplicação
dessas variedades na indústria alimentícia, ainda que estudos mais aprofundados sobre as
características reológicas sejam necessários, como estratégia de detalhamento do potencial de
uso daquela biomassa nesse setor. Esses são resultados de grande interesse porque valorizam a
diversidade genética do milho mantida pelos pequenos agricultores do extremo oeste de Santa
Catarina e porque sugerem a possibilidade do uso dessa ferramenta analítica (RMN) no
screening de polissacarídeos pela indústria.
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106
Capítulo 3
107
ANÁLISE QUANTITATIVA, ESPECTROSCÓPICA (FT-IR) E QUIMIOMÉTRICA
DA FRAÇÃO PROTÉICA DE GRÃOS DE VARIEDADES LOCAIS E
COMERCIAIS DE MILHO (Zea mays)
1 RESUMO
As proteínas, classificadas segundo sua solubilidade em albuminas, globulinas,
prolaminas e glutelinas, são o segundo componente químico majoritário encontrado no
endosperma dos grãos de milho. A investigação da composição protéica de germoplasma
crioulo de milho é de grande interesse, tendo em vista o elevado consumo desse cereal no
mundo. Dessa forma, o presente estudo se propôs a quantificar as proteínas dos grãos de
variedades crioulas e locais de milho (VCLM) e caracterizá-las usando a espectroscopia de
FT-IR, associada à quimiometria, nas amostras de farinha. O conteúdo de proteínas totais
variou de 43,92 a 69,90 mg/g, sendo as prolaminas as proteínas majoritárias, seguido das
glutelinas, globulinas e albuminas para a maioria das amostras analisadas. No que diz
respeito às frações protéicas foram encontrados conteúdos significativamente distintos
(P<0,01). A proporção de cada uma das frações também variou de acordo com o
germoplasma (prolaminas: 29 a 63%; glutelinas: 12 a 52%; globulina+albumina: 15 a 32%).
A variável glutelina (PC1) contribuiu em 69,5% para a explicação da variância total dos
dados, seguido da variável zeína I (PC2) (29,4%) na análise dos componentes principais
(PCA) dos dados relativos ao conteúdo das 5 frações protéicas. O padrão de distribuição das
amostras, segundo os eixos PC1 e PC2, permitiu a rápida distinção do germoplasma com
elevado conteúdo de glutelina e zeína I das demais. Da mesma forma, na análise de PCA dos
dados espectrais de FT-IR (1650-1500 ondas.cm
-1
) observou-se a dispersão das amostras de
farinhas, indicando constituição protéica distinta para as mesmas. Esses resultados permitem
concluir que a variabilidade genética das VCLM resultou na diversidade protéica detectada
nos grãos, sugerindo um potencial a ser explorado em programas de melhoramento genético
dedicados à obtenção de variedades com valor nutricional superior.
108
2 INTRODUÇÃO
A cultura do milho, em função do seu potencial nutritivo e da composição química,
tem grande importância na economia mundial, sendo responsável por 7% da energia
consumida no mundo (FAO, 2007). No que diz respeito ao aspecto nutricional, o grão de
milho é uma importante fonte de proteína e energia na dieta humana e de animais,
apresentando níveis elevados de amido, fibras, ácidos graxos poli-insaturados e açúcares
(BOYER & HANNAH, 2001, CUEVAS-RODRIGUEZ et al., 2006).
As proteínas constituem o segundo componente químico majoritário nos grãos de
milho, sendo encontradas principalmente no endosperma (INGLETT, 1997; SHUKLA &
CHERYAN, 2001). Tais macromoléculas podem ser classificadas em quatro grupos, de
acordo com a sua solubilidade: albuminas (solúveis em água), globulinas (solúveis em
solução salina), prolaminas (solúveis em solução alcoólica forte) e glutelinas (solúveis em
álcalis) (INGLETT, 1977; LANDRY & MOUREAUX, 1970; VASAL, 2001).
As prolaminas constituem as proteínas de reserva do grão e são encontradas
majoritariamente no endosperma, enquanto as demais, denominadas metabolicamente
ativas, ocorrem no gérmen e endosperma. As primeiras estão relacionadas à dureza do grão,
uma importante característica relacionada à qualidade dos mesmos, uma vez que os grãos
duros são menos suscetíveis aos danos durante o plantio, cultivo e colheita (DOMBRINK-
KURTZMAN & KNUTSONM 1997). Por outro lado, as proteínas que estão no gérmen são
superiores em quantidade e qualidade, comparativamente àquelas do endosperma. Embora
este cereal represente a base da alimentação nos países pobres, a qualidade nutricional das
proteínas do milho é considerada baixa, devido à deficiência dos aminoácidos essenciais L-
lisina e L-triptofano (CHEFTEL et. al., 1989).
Além das técnicas convencionais de quantificação, a análise espectroscópica
vibracional de infravermelho (FT-IR), associada a técnicas estatísticas multivariadas, vem
sendo empregada em estudos como, por exemplo, na avaliação da composição de
polissacarídeos de plantas (COIMBRA et al., 1998; COIMBRA et al., 1999), devido à sua
elevada sensibilidade, rapidez e reprodutibilidade. Os sinais detectados em um espectro de
FT-IR estão correlacionados com os diversos grupos funcionais de uma determinada classe
de compostos químicos (DÉLÉRIS & PETIBOIS, 2003). Em função disto, a análise por FT-
109
IR de uma matriz complexa (amostras de farinha de milho, por exemplo) permite inferir
sobre sua constituição química e detectar eventuais alterações de perfil químico entre
amostras de interesse, considerando o perfil espectral total, ou apenas uma região específica
(fingerprint) como a de proteínas.
O estudo da composição protéica de variedades de milho é de grande interesse para
programas de melhoramento, bem como para a determinação de potenciais de uso
domésticos ou industriais. Nesse sentido, em algumas regiões do País, como no Município
de Anchieta (Santa Catarina) são cultivadas variedades de milho com características
agronômicas e nutricionais diferenciadas, em função do modelo de agricultura familiar
adotado. Naquela localidade, observou-se a retomada do cultivo de sementes próprias
(variedades crioulas e locais de milho - VCLM), num regime de subsistência ou semi-
subsistência, tendo sido já identificadas mais de 30 VCLM (OGLIARI & ALVES, 2006).
Em função disto, este trabalho analisou o conteúdo das frações protéicas globulina,
albumina, prolamina e glutelina de amostras de farinhas de grãos inteiros (gérmen +
endosperma) de 26 VCLM e de cinco variedades comerciais e comparou o perfil espectral
de FT-IR do material amostral para a região de fingerprint para proteínas, via análise de
componentes principais (PCAs).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção do material vegetal
3.1.1 Variedades crioulas e locais de milho (VCLM)
As 26 VCLM utilizadas nesse estudo foram obtidas junto aos pequenos agricultores
do município de Anchieta, localizado no extremo oeste catarinense, pelo Sindicato dos
Trabalhadores na Agricultura Familiar (SINTRAF). Amostras de grãos deste germoplasma
foi repassado ao grupo do Núcleo de Estudos em Agrobiodiversidade (NeaBio) da UFSC, a
saber: Roxo do Valdecir, Rajado 8 Carreiras, Palha Roxa 02, Rosado, Cateto Vermelho,
Cateto, Pires, Palha Roxa 1 do Emílio, Mato Grosso Palha Roxa, Pixurum 07, MPA 13,
Branco do Aldanir, Pixurum 04, Mato Grosso, Pixurum 06, Composto São Luis, Asteca,
110
MPA 02, Pixurum 01, Cunha 01, MPA 01, Pixurum 05, Roxo do Emílio, Amarelão 03,
Moroti e Língua de Papagaio.
3.1.2 Cultivares comerciais
Amostras de grãos de cultivares comerciais recomendados para a região Sul do
Brasil foram utilizadas no presente estudo para efeitos de análise comparativa, são eles:
BRS-1030; BR-106; AG-9090; Pioneer 3069 e AS-3430.
O cultivar BRS1030 (Embrapa), um híbrido simples, é de ciclo precoce, com
florescimento em 61 dias, de porte baixo, com grãos semi-duros de cor alaranjada. O
cultivar AG-9090 (Agroceres) é de ciclo precoce, com florescimento em 72-80 dias, com
grãos semidentados, de cor alaranjada e com alto teor de óleo. Pioneer 3069 é um híbrido
simples de ciclo super-precoce de cor alaranjada, enquanto AS-3430 (Agroeste) é um híbrido
triplo, de ciclo precoce, porte médio/alto, com grãos duros de cor avermelhada.
3.2 Coleta e preparo das amostras
Para cada variedade, amostras de grãos (50g, peso seco) foram trituradas em moinho
de laboratório (Cyclone Sample Mill - modelo 3010/019), utilizando-se peneira de 0,1mm.
Após a moagem, os compostos lipossolúveis foram removidos por tratamento das amostras
em hexano (1:10, p/v - 15min), seguido de centrifugação (1.500g, 15min, 3x). As amostras
foram então embaladas em sacos plásticos, sob vácuo, e mantidas a –18
º
C para posterior
análise.
3.3 Caracterização da composição química das farinhas por espectroscopia vibracional
na região do infravermelho médio com transformada de Fourier (FT-IR)
As análises das amostras de farinha das VCLM e dos cultivares comerciais por
espectroscopia vibracional de FT-IR utilizaram equipamento Bruker IFS 55, equipado com
sistema de ATR de reflexão única (Golden Gate), coletando-se 128 varreduras/amostra, em
janela espectral de 500 a 4000 ondas.cm
-1
, e com resolução de 4 ondas.cm
-1
. Os espectros
foram processados com auxílio do programa OPUS versão 5.0 (Bruker GmbH), sendo que o
conjunto de dados espectrais para a região de fingerprint para proteínas (1650-1500
ondas.cm
-1
) foi submetido à análise estatística multivariada, através da aplicação dos
111
métodos de componentes principais (PCAs), com auxílio do pacote estatístico Unscrambler
9.1.
3.4 Determinação do conteúdo de proteínas nas amostras de farinha (grãos inteiros)
A extração das frações protéicas foi realizada através de centrifugações sequenciais,
em tubos Eppendorf, utilizando o precipitado da extração anterior (12000g, 5min) como
matéria para a extração seguinte. As frações albumínica e globulínica foram extraídas com
água destilada-deionizada (4
0
C, 2x, 15 min) e NaCl 0,5M (4
0
C, 2x, 30min),
respectivamente. A extração da fração prolamínica utilizou uma solução de 2-propanol 55%
(v/v), contendo 0,6% de 2-mercaptoetanol (2-ME, v/v – 2x, 30min e 1x, 15min, 25
0
C), para
a obtenção das proteínas do tipo Zeína I. Uma solução de NaCl 0,5M (pH 10), contendo
0,6% de 2-ME (v/v), foi utilizada para a extração das prolaminas do tipo Zeína II (2x,
30min, temperatura ambiente). As glutelinas foram extraídas com uma solução de dodecil
sulfato de sódio 0,5% (p/v, pH 10), contendo 0,6% de 2-ME (v/v, 2x, 30min e 1x, 15min,
temperatura ambiente). Os experimentos foram realizados em triplicata. O conteúdo de
proteína total para cada fração foi determinado conforme descrito previamente
(BRADFORD, 1976), utilizando-se albumina de soro bovino (BSA) para a construção da
curva-padrão, de acordo com a solução de extração (globulinas: 0,7 a 0,01mg/mL – r
2
0,96;
albuminas: 0,1 a 0,01mg/mL - r
2
0,99; prolaminas: 1 a 0,01mg/mL - r
2
0,94; glutelinas: 1 a
0,1mg/mL - r
2
0,97).
Os conteúdos médios das frações protéicas foram inicialmente comparados através
da análise de variância (ANOVA), com o auxílio do programa Statistica
®
6.0.
Subseqüentemente, esses mesmos resultados foram submetidos à análise de componentes
principais (PCA), visando determinar o grau de similaridade entre as mesmas, com o auxílio
do programa Fitopac
®
1.6.4. Todas as análises foram realizadas sem a padronização dos
dados, uma vez que o efeito de unidade (escala) foi suprimido com a medição das variáveis
em mesma escala.
112
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O conteúdo protéico total nas amostras de farinhas das VCLM apresentou uma
variação entre 4,39% (43,92 mg/g) (variedade Rosado) e 6,99% (69,90 mg/g) (Língua de
Papagaio) e de 3,93% (39,35 mg/g) (BR106) a 5,47% (54,72 mg/g) (AS-3430) para os
cultivares comerciais (Tabela 1). Tais valores são inferiores aos descritos na literatura para
milho que relatam uma variação entre 8 e 13% de proteínas, o que vem a reforçar a elevada
diversidade existente nos genótipos em estudo. Variações no conteúdo protéico dos grãos
têm sido relatadas e estão principalmente relacionadas ao tipo de milho (ZUBBER &
DARRAH, 1987). Como exemplo, BAJAJ (1990) verificou em sementes de variedades com
alto teor de óleo (“high oil”) um conteúdo médio de proteína de cerca de 8,8%, enquanto
variedades de milho dentado apresentaram teores algo superiores (~ 10%). Além disso,
fatores tais como o tipo de solo, o uso de fertilizantes e as condições climáticas podem
alterar a composição química do milho (SCHONHAUS, 1980), o que pode explicar em
alguma extensão o menor conteúdo de proteínas encontrado nos grãos das variedades
analisadas no presente estudo. Cabe destacar que o modelo de agricultura adotado pelos
agricultores de Anchieta é de subsistência, pouco tecnificado e nem sempre recorrem ao uso
de insumos. Além disto, diversas propriedades adotam práticas de cultivo orgânico daquele
cereal (KIST, 2006).
O protocolo de extração e fracionamento das proteínas do milho, descrito
inicialmente por OSBORNE & MENDEL (1914), e posteriormente modificado por
LANDRY & MOUREAUX (1970), permitiu verificar que as proteínas da fração prolamina
são predominantes nas farinhas de todas as variedades estudadas (Tabela 1). Estes
resultados estão de acordo com a classificação descrita por LOOKHART (1991), que aponta
a classe das prolaminas como a mais abundante para o endosperma de milho.
A segunda classe de proteínas em predominância foi a das glutelinas, exceto para as
VCLM Rosado, Rajado 8 Carreiras, Amarelão 3, MPA2 e Roxo do Emílio, onde as
globulinas ocorrem em maior concentração.
No que diz respeito à fração prolamina (Zeína I + Zeína II), verificou-se uma
amplitude de valores entre 28,43 mg/g (variedade Amarelão 3) a 13,47 mg/g (variedade
Pixurum 6).
113
TABELA 1 - Conteúdo médio
*
(média
±
desvio padrão, mg/g) das quatro frações
protéicas (globulina, albumina, prolamina e glutelina) encontradas nos grãos inteiros de
variedades crioulas e locais de milho e nos cultivares comerciais.
Prolamina
Variedade Globulina Albumina Zeína I Zeína II Glutelina Total
Rosado
11,87
0,96± 1,10
±
0,29 14,60
±
1,17 5,75
±
0,20 10,60 1,18± 43,92
Cateto
10,10
0,39
± 0,56
±
0,04 13,96
±
1,81 5,03
±
0,39 14,31 5,13± 43,97
Rajado 8 C.
10,83
0,32± 0,91
±
0,04 21,12
±
0,59 3,64
±
0,61 8,02 2,50 ±
44,52
Pixurum 4
8,94
0,77 ± 1,08
±
0,18 18,90
±
0,50 4,67
±
0,15 10,96 0,31± 44,55
Amarelão 3
10,14
0,05± 1,15
±
0,30 26,26
±
1,52 2,17
±
0,56 5,57 2,88 ± 45,30
Pixurum 6
10,20 0,74± 1,06
±
0,32 8,85
±
1,57 4,62
±
0,10 22,01 2,88± 46,74
Mato Grosso
9,74
0,39 ± 1,05
±
0,13 17,15
±
1,97 5,24
±
0,85 13,77 6,29± 46,94
MPA02
12,10
0,34± 1,03
±
0,03 22,89
±
2,06 2,65
±
0,14 10,14 0,78± 48,81
Moroti
12,35
1,13± 1,67
±
0,39 18,71
±
1,22 3,27
±
0,23 13,04 3,46± 49,04
Mato G. P.R.
11,08
0,14± 0,88
±
0,10 19,90
±
4,16 3,32
±
0,23 14,04 5,06± 49,21
Pixurum 7
9,85
0,56 ± 0,91
±
0,04 20,73
±
2,61 4,04
±
0,27 14,95 4,11± 50,47
Palha Roxa 2
10,51
0,43± 1,23
±
0,20 18,96
±
0,93 4,16
±
0,17 16,03 3,31± 50,90
C. S. Luis
10,76
0,75± 1,18
±
0,13 23,29
±
0,48 3,47
±
0,92 13,32 2,86± 52,02
Pixurum 1
10,67
0,50± 1,22
±
0,11 20,97
±
0,53 3,81
±
0,20 15,94 2,47± 52,61
Cunha
10,82
0,75± 1,21
±
0,16 22,93
±
2,33 4,73
±
1,21 13,04 6,53± 52,72
Roxo Valdecir
11,56
0,28± 0,91
±
0,17 14,83
±
0,41 3,24
±
0,12 22,55 8,81± 53,09
Pixurum 5
12,77
0,57± 1,42
±
0,37 11,69
±
1,41 4,23
±
0,17 24,18 2,84± 54,29
Palha R. Em.
10,93
0,29± 0,73
±
0,17 23,88
±
0,86 3,48
±
0,34 15,31 4,18± 54,33
Roxo Emílio
12,56
0,79± 1,36
±
0,15 24,16
±
0,98 4,33
±
0,81 12,14 3,32± 54,55
MPA 1
9,50
0,28 ± 0,75
±
0,05 13,17
±
0,56 2,80
±
0,20 28,71 7,67± 54,94
Asteca
12,10
1,56± 1,06
±
0,05 23,71
±
1,34 5,00
±
1,79 13,59 4,23± 55,46
MPA 13
13,06
2,00± 1,27
±
0,13 15,08
±
0,75 3,02
±
0,10 23,37 6,12± 55,80
Variedades Locais
C. Vermelho
11,54
0,12± 0,95
±
0,11 22,49
±
1,69 4,78
±
0,11 16,85 0,38± 56,61
114
Branco
10,74
0,38± 1,03
±
0,03 22,45
±
2,19 4,38
±
0,39 20,74 2,34± 59,36
Pires
12,69
0,36± 0,87
±
0,06 19,74
±
1,20 3,91
±
0,32 23,82 2,93± 61,04
L. Papagaio
10,53
0,18± 0,94
±
0,16 23,43
±
0,45 4,01
±
0,25 30,98 3,34± 69,90
BR106
11,10
0,36± 1,52
±
0,15 8,39
±
0,64 5,03
±
0,14 13,32 2,62± 39,35
BRS1030
10,15
1,10± 0,96
±
0,31 14,41
±
0,84 5,34
±
0,15 10,24 3,26± 41,09
Pioneer 3069
8,55
0,53 ± 0,78
±
0,09 20,37
±
2,87 3,69
±
0,16 12,50 0,98± 45,90
AG-9090
6,35
0,14 ± 0,54
±
0,21 12,83
±
0,55 3,49
±
0,27 22,92 2,72± 46,12
Variedades
Comerciais
AS-3430
8,09
0,08 ± 0,60
±
0,13 14,16
±
0,20 3,52
±
0,32 28,35 1,23± 54,72
* Resultado médio de 3 extrações independentes.
As VCLM Cunha, Língua de Papagaio e Cateto Vermelho também apresentaram
elevado conteúdo de prolaminas (∼27 mg/g), o que indica um menor valor nutricional para
as três variedades. Isto porque, embora as prolaminas sejam quantitativamente as proteínas
de maior importância do milho, o valor nutricional destas é baixo, em função de sua
composição em aminoácidos. Nessa fração protéica, os aminoácidos L-glutamina, L-leucina
e L-prolina são os majoritários, enquanto L-lisina e L-triptofano estão praticamente
ausentes. No milho, o conteúdo total de L-lisina não ultrapassa 1,8% e de L-triptofano
0,35% (PAIVA et al., 1991).
Nesse sentido, estudos prévios constataram que a diminuição do conteúdo de
prolaminas no grão é uma das formas mais eficientes para otimizar o valor nutritivo da
proteína do milho. Isto porque, as demais frações protéicas possuem um conteúdo maior
dos aminoácidos essenciais lisina e triptofano. Nos programas de melhoramento em que se
elevou o conteúdo de proteína total, não foi observado um aumento na qualidade nutricional
dos grãos, uma vez que este é acompanhado por um aumento proporcional de prolaminas e
pela diminuição do conteúdo das demais frações protéicas (LANDRY, 2002; GIBBON &
LARKINS, 2005). Dessa forma, as VCLM com maior valor nutricional para proteínas nesse
estudo são Pixurum 6, Pixurum 5 e MPA1 e os cultivares comerciais BR106 e AG-9090,
considerando seus menores conteúdos de prolamina (13,47; 15,92; 15,97, 13,42 e 16,32
mg/g, respectivamente), comparativamente aos demais.
115
Por outro lado, um conteúdo elevado de prolaminas está correlacionado com a maior
dureza dos grãos, uma vez que essas são proteínas de reserva utilizadas durante o
desenvolvimento do embrião, sendo armazenadas no endosperma em corpúsculos protéicos
que auxiliam na manutenção da integridade do mesmo (DOMBRINK-KURTZMAN &
KNUTSONM, 1997; CHANDRASHEKAR & MAZHAR, 1999). Sendo assim, as VCLM
Amarelão 3, Cunha, Língua de Papagaio e Cateto Vermelho e o cultivar comercial Pioneer
3069 são os que possuem os grãos de maior dureza e, portanto, os menos suscetíveis a danos
durante o plantio, cultivo e colheita.
De forma similar, uma amplitude significativa de valores de concentração foi
observada para a fração glutelina para as variedades estudadas (5,57 mg/g a 30,98 mg/g -
VCLM e 10,24 mg/g a 28,35 mg/g - cultivares comerciais). As glutelinas constituem a
fração protéica do milho de menor solubilidade, em função de sua conformação espacial
conferida, em grande extensão, pelo elevado número de resíduos de cistina (WALL, 1964;
PAULIS & WALL, 1985). No âmbito nutricional, essas macromoléculas têm como
principal característica favorável um maior conteúdo de L-lisina e L-triptofano, quando
comparadas às prolaminas (LANDRY & MOUREAUX, 1970). Assim, para o universo
amostral em estudo, as variedade Língua de Papagaio (30,98 mg/g), MPA1 (28,71 mg/g) e o
cultivar comercial AS-3430 (28,35 mg/g) destacam-se dos demais em função de seu maior
conteúdo de glutelinas, sugerindo um maior valor nutricional.
De forma contrária ao observado para as demais frações proteicas, uma amplitude
inferior de valores de concentração foi observada para as frações protéicas salino-solúveis
(globulina + albumina) para as VCLM (10,02 mg/g a 14,33 mg/g) e os cultivares comerciais
(6,88 mg/g a 12,62 mg/g). Essas frações protéicas exercem funções enzimáticas, estruturais
e como hidrocolóides durante a germinação da semente (WALL, 1964). A característica
mais importante ligada a essas duas frações protéicas é o seu perfil de aminoácidos,
caracterizado por conteúdos elevados de resíduos básicos, sulfurados e L-triptofano, bem
como o baixo teor de ácido glutâmico, L-prolina e L-leucina (MISRA et al., 1976). Os
resultados de composição das frações salino-solúveis indicam que as VCLM MPA13,
Pixurum 5 e Moroti e o cultivar comercial BR106 possuem um valor nutricional superior às
demais pelo seu maior conteúdo em globulina e albumina (14,33; 14,19; 14,02 e 12,62
mg/g, respectivamente).
116
No que diz respeito à proporção entre as frações protéicas, BOYER & HANNAH
(2001) comentam que em média os grãos de milho são constituídos por 7% de albumina, 5%
de globulina, 52% de prolamina e 25% de glutelina. No entanto, a proporção das frações
protéicas pode apresentar variações entre as amostras consoantes ao genótipo do milho. No
presente estudo, por exemplo, a proporção de prolamina (Zeína I + Zeína II) variou entre
aproximadamente 63% (Amarelão 3) a 29% (MPA1 - Figura 1). Além disto, destaca-se que
além da variedade MPA1, outros 20 germoplasma apresentaram uma proporção inferior a
50% dessa fração protéica, a saber: Rosado, Cateto, Pixurum 6, Mato Grosso, Moroti, Mato
Grosso Palha Roxa, Pixurum 7, Palha Roxa, Pixurum 1, Roxo do Valdecir, Pixurum 5,
MPA13, Cateto Vermelho, Branco, Pires, Língua de Papagaio, Pixurum 1, Cunha, Roxo do
Emílio, MPA1, Branco, Língua de Papagaio e os cultivares comerciais BR106, BRS1030,
AG-9090 e AS-3430. Esses resultados reforçam a importância de se conservar as VCLM
pela diversidade química encontrada nas mesmas e apontam para o potencial de uso de
algumas delas em programas de melhoramento genético que visem, por exemplo, produzir
grãos de maior dureza e, portanto, menos suscetíveis aos danos pós-colheita.
A análise da Figura 1 permite verificar que as variedades onde a diminuição da
proporção de prolaminas foi bastante acentuada, MPA1, Pixurum 5, Pixurum 6 e Roxo do
Valdecir, um concomitante aumento da fração de glutelinas foi observado, sugerindo um
maior valor nutricional para este germoplasma.
No que diz respeito à fração glutelina, a proporção variou de 12,30% (Amarelão) a
52,27% (MPA1) considerando todas as VCLM em estudo. Naquelas variedades onde
detectou-se uma menor proporção de prolaminas e um aumento de glutelinas (MPA1,
Pixurum 5, Pixurum 6 e Roxo do Valdecir) e nas variedades MPA13 e Língua de Papagaio,
a percentagem dessa fração esteve acima de 40%, sendo este valor bem superior aos 25%
sugerido por BOYER & HANNAH (2001). Nos grãos dos cultivares comerciais AG-9090 e
AS-3430 também detectou-se uma proporção de glutelinas acima de 40%.
A proporção para a fração protéica salino-solúvel (globulina + albumina) entre as
variedades analisadas não apresentou grande amplitude de valores como para as outras
frações (∼16% a 29% para as VCLM e 15% a 32% para os cultivares comerciais).
117
Figura 1- Distribuição percentual das classes de proteínas salino-solúveis (globulina e albumina), prolamina (zeína I e zeína II) e
glutelina em amostras de farinhas das variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais estudados.
118
No entanto, a proporção detectada nos grãos das variedades Rosado, Rajado 8
Carreiras, MPA2, Moroti, Pixurum 5, Roxo do Emílio e MPA13 e para os cultivares
comerciais BR106 e BRS1030 foi acima de 25%, sendo essa proporção o dobro da sugerida
por BOYER e HANNAH (2001). Assim, esses resultados sugerem um valor nutricional
superior para estas variedades em função de seus conteúdos de globulina e albumina.
Diferenças altamente significativas (P<0,01) entre as médias dos 31 tratamentos
foram observadas para as cinco variáveis analisadas (globulina, albumina, zeína I, zeína II e
glutelina). O resumo da análise estatística univariada está mostrado na Tabela 2
TABELA 2 - Resumo da análise de variância das variáveis globulina, albumina, zeína I,
zeína II e glutelina determinadas na farinha dos grãos das variedades crioulas e locais de
milho e dos cultivares comerciais estudados.
Fonte de variação Globulina Albumina Zeína I Zeína II Glutelina
Anova (QM Tratamentos)
6,50** 0,21** 69,21** 2,22** 123,31**
Média
10,72 1,03 18,52 4,03 16,62
Desvio padrão 1,57 0,30 4,92 0,96 7,07
CV (%) 6,57 17,78 8,46 13,25 22,95
** P < 0,01 - teste Tukey.
Os valores de conteúdos médios para os 5 tratamentos foram utilizados para cálculo
dos componentes principais (PCAs), visando o agrupamento das variedades em função da
similaridade de constituição protéica. A dispersão das variáveis (variedades) projetada na
forma bidimensional nos eixos cartesianos de PC1 e PC2 é mostrada na Figura 2. O
componente principal 1 (PC1) apresenta a amplitude de valores para a fração glutelina,
sendo o componente de maior contribuição à explicação da variância total dos dados
(69,50%). O eixo componente principal PC2, que corresponde à fração zeína I, explicou em
29,4% a variância dos resultados. Dessa forma, as variedades com os maiores conteúdos de
glutelina (Língua de Papagaio, Pires, Branco, AS3430, MPA1, MPA13, Roxo do Valdecir,
AG9090, Pixurum 5 e Pixurum 6) agruparam-se em PC1 negativo, sendo que as três
primeiras variedades se diferenciaram das demais, com agrupamento em PC2 positivo, por
apresentarem em decorrência de seu elevado conteúdo de zeína I.
De forma contrária, as VCLM Cateto Vermelho, Palha Roxa do Emílio, Asteca,
Pixurum 1, Pixurum 7, Roxo do Emílio, Composto São Luis, Cunha, MPA2 e Amarelão,
bem como, o cultivar comercial Pioneer 3069, devido ao baixo conteúdo de glutelina e
elevado conteúdo de zeína I, formaram um grupo em PC1 e PC2 positivos. Adicionalmente,
ressalta-se que a variedade Amarelão diferiu das demais em decorrência de seu menor
conteúdo de glutelina. Por último, as VCLM Palha Roxa, Moroti, Mato Grosso Palha Roxa,
Rajado 8 Carreiras, Pixurum 4, Mato Grosso, Rosado e o cultivar comercial BRS1030
agruparam-se em PC1 positivo e PC2 negativo em função de seus menores teores de
glutelina e zeína I. As amostras das variedades Cateto e BR106 localizaram-se, no gráfico
das contribuições fatoriais, próximas à região negativa de PC2, indicando que o seu
conteúdo de zeína I é relativamente baixo quando comparado aos demais genótipos.
Os resultados de autovalores, as porcentagens de variância e os autovetores
(coeficientes de ponderação das variáveis) estão mostrados na Tabela 3.
FIGURA 2 - Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de conteúdo médio de glutelina
e zeína I encontrados nas amostras de farinha (grãos inteiros) das 26 variedades crioulas e
locais de milho e dos cultivares comerciais em estudo.
119
120
TABELA 3 – Componentes principais (PC) calculados a partir dos dados quantitativos das frações protéicas (globulina,
albumina, zeína I, zeína II e glutelinas) de amostras de farinha dos grãos das variedades crioulas e locais de milho e dos
cultivares comerciais.
Coeficientes de ponderação das variáveis (Auvetor) Componente
Principal
Variância
(Autovalor)
Explicação da
variância total (%)
Variância
acumulada (%)
Globulina Albumina Zeina I Zeina II Glutelina
PC1 45,14 69,50 69,50 0,0344 0,0098 0,4362 0,0077 -0,8991
PC2
17,13 26,37 95,87 0,0492 -0,0088 0,8953 -0,0799 0,4355
PC3 2,04 3,14 99,01 0,9897 0,1111 -0,0536 0,0713 0,0136
PC4 0,60 0,93 99,94 -0,0663 -0,0173 0,0724 0,9942 0,0408
PC5 0,04 0,06 100,00 -0,1117 0,9936 0,0109 0,0086 0,0119
121
Observa-se que as variáveis glutelina e zeína I apresentaram os maiores autovetores
em valor absoluto nos componentes de maior autovalor (maior proporção de variação
explicada) sendo, portanto, consideradas de maior importância para explicar a variabilidade
das frações protéicas das amostras em estudo. Além disto, pode-se verificar que a variância
acumulada nos dois primeiros autovetores foi bastante elevada, aproximadamente 96%,
sendo esse um resultado considerado bastante satisfatório.
A perspectiva de uso da análise dos componentes principais (PCA) para discriminar
amostras de grãos em função do seu conteúdo protéico parece ser uma ferramenta bastante
útil à seleção fácil e rápida de germoplasma de interesse nutricional. Considerando que os
resultados quantitativos associados à quimiometria mostraram-se promissores, propôs-se a
investigação da seleção de amostras de farinha de milho com constituição protéica
diferenciada, via aplicação da espectroscopia vibracional de infravermelho com
transformada de Fourier (FT-IR) e análise multivariada (PCA) dos dados espectrais.
A vantagem de tal metodologia baseia-se no fato de que as amostras de farinhas são
analisadas in natura, dispensando eventuais protocolos de extração e fracionamento de
compostos, contribuindo para a redução do erro experimental e do custo das análises.
A análise de FT-IR das farinhas das VCLM e dos cultivares comerciais revelou uma
típica absorção de deformação axial do grupo funcional C=O e a deformação angular do
grupo NH
2
da amina (1650 e 1550 onda.cm
-1
), relativos às aminas I e II das proteínas
(LAMBERT, 2001). A partir destes resultados adotou-se, para efeitos de classificação das
variedades de milho através do cálculo dos PCAs segundo sua composição protéica, apenas
a região espectral acima mencionada. Além disto, a matriz de dados espectrais foi
normalizada em seus componentes lineares e as colunas centralizadas.
A Figura 3 mostra a dispersão das variáveis em estudo (variedades), segundo a
determinação dos componentes principais (PCAs) da matriz de dados obtida a partir dos
espectros de FT-IR.
Os componentes principais PC1 e PC2 contribuiram para explicar em 98% a
variância presente nos dados espectrais de FT-IR. A análise da Figura 3 revela a dispersão
das amostras em estudo, sem uma clara separação das mesmas, com exceção às variedades
Pixurum 6, Roxo do Emílio, Amarelão e os cultivares comerciais AG-9090 e AS-3430.
122
A dispersão das variáveis (amostras de farinha – Figura 3) indica que as mesmas
possuem certo grau de distinção espectral (FT-IR) na região compreendida entre 1650-1500
ondas.cm
-1
, sendo essas diferenças provavelmente relacionadas à constituição protéica. De
fato, FABIAN & MANTELE (2002) destacam que é possível observar uma forte correlação
entre algumas bandas no espectro de FT-IR de um polipeptídeo e sua estrutura secundária
(α-helice e β-pregueada, por exemplo).
Portanto, esses resultados sugerem que as proteínas presentes nas farinhas das
VCLM possuem conformação distinta, o que em alguma extensão pode ser resultado das
diferentes proporções de globulina, albumina, prolaminas e glutelinas encontradas nas
mesmas.
FIGURA 3 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (janela espectral
de 1650-1500 ondas.cm
-1
) de amostras de farinha (grãos inteiros) das 26 VCLM e dos
cultivares comerciais em estudo.
Além disso, os resultados obtidos no presente estudo sugerem a aplicação da técnica
de FT-IR associada à quimiometria no screening de farinhas com constituição protéica
diferenciada ou para um uso específico.
123
Os resultados de distribuição fatorial (Figura 3) demonstram, adicionalmente, que as
amostras dos cultivares comerciais AG-9090 e AS-3430 localizaram-se em PC1 negativo e
PC2 positivo, separando-se das demais amostras em análise, o que sugere maior
similaridade quanto à constituição protéica para estas variedades. Essa hipótese é reforçada
pelos resultados mostrados na Figura 1, onde é possível verificar que as farinhas destes
cultivares comerciais têm a mesma proporção de globulina, albumina, prolamina e glutelina,
com predominância desta última fração, um aspecto não observado para os demais
cultivares comerciais. Um padrão de distribuição similar foi também observado para a
distribuição fatorial dos dados quantitativos (Figura 2), com o agrupamento destas
variedades híbridas no quadrante correlacionado ao maior conteúdo de glutelinas.
FIGURA 4 - Contribuição fatorial de PC1 das amostras de farinha de grãos inteiros para os
dados de FT-IR na região espectral compreendida entre 1650-1500 ondas.cm
-1
.
Por outro lado, as amostras de farinha das VCLM que mais se destacaram das
demais (Pixurum 6, Amarelão e Roxo do Emílio – Figura 3) não formaram um grupo a
parte, ocorrendo de forma dispersa entre os quadrantes formados pelos os eixos dos
124
componentes principais. Este resultado sugere uma constituição protéica diferenciada para
as mesmas. A variedade Amarelão também se destacou das demais no gráfico de
distribuição fatorial (PCA) dos dados quantitativos mostrado na Figura 2, o que de certa
forma indica que as diferenças na proporção das classes protéicas estão sendo detectadas nos
espectros das amostras de farinha.
Os autovetores que determinaram a distribuição fatorial mostrada na Figura 3 foram
1643, 1570, 1550, 1535 e 1516 ondas.cm
-1
(Figura 4). A detecção das bandas em 1570 e
1550 ondas.cm
-1
relaciona-se ao grupamento de amidas II encontrado nas proteínas,
enquanto a banda em 1516 ondas.cm
-1
indica, segundo BEEKES et al. (2007) a presença do
aminoácido “tirosina” e 1643 ondas.cm
-1
a conformação das proteínas em α-hélice
(LOKSZTEJN et al., 2007).
Os resultados encontrados no presente estudo podem ser futuramente utilizados na
identificação de farinhas que possuam um perfil desejado para esta classe de compostos,
através da comparação de amostras-teste com amostras de referência, isto é, que tenham
uma constituição protéica conhecida. Assim, os resultados obtidos são considerados de
reconhecido interesse à indústria alimentar, porque a abordagem analítica utiliza técnicas
rápidas, sensíveis e reprodutíveis, podendo ser empregada em estudos de seleção de farinhas
com constituição química diferenciada, principalmente por dispensar as etapas de extração
protéica, um processo demorado, trabalhoso e propenso a erro.
5 CONCLUSÕES
Tomados em conjunto, os resultados encontrados sugerem que a variabilidade
genética existente nas populações de milho analisadas contribui, em alguma extensão, para a
variabilidade de composição química daquele germoplasma, aqui representada pelo
componente protéico. Além disso, verificou-se que as variedades Língua de Papagaio,
MPA1, Pires, Branco e AS-3430 apresentaram um potencial a ser explorado em programas
de melhoramento genético dedicados à obtenção de variedades com valor nutricional
superior, bem como de otimização da alimentação de populações humanas, principalmente
em regiões economicamente menos favorecidas. Porém, é importante considerar que em
diversos programas de melhoramento de Z. mays a dificuldade observada não foi a de
125
incremento do conteúdo das frações protéicas não-prolaminas, mas do conteúdo de
aminoácidos essenciais em termos absolutos (VASAL, 2001). Assim, buscando um maior
detalhamento da caracterização protéica das VCLM, estudos deverão ser conduzidos no
sentido de quantificar os aminoácidos lisina e triptofano no germoplasma local e crioulo.
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129
Capítulo 4
130
CARACTERIZAÇÃO DOS COMPOSTOS CAROTENOÍDICOS,
ANTOCIÂNICOS E (POLI)FENÓLICOS NAS FARINHAS DE VARIEDADES
CRIOULAS E LOCAIS DE MILHO ORIGINÁRIAS DO EXTREMO OESTE DE
SANTA CATARINA E DE CULTIVARES COMERCIAIS
1 RESUMO
Atualmente, tem-se sugerido os grãos de milho como alimento funcional, uma vez
que estes contêm diversas substâncias benéficas à saúde, podendo existir, entre as
variedades, diferenças qualitativas e quantitativas, no que diz respeito as principais
classes de compostos. Em função disto, o presente estudo propôs-se a determinar o perfil
fitoquímico dos grãos de 26 variedades crioulas e locais de milho (VCLM) e de 5
variedades híbridas comerciais, com ênfase aos compostos carotenoídicos, (poli)fenólicos
e antociânicos. Os tecidos constituintes do pericarpo de grãos de coloração branca a roxa
de 7 VCLM mostraram ter constituição química diferenciada quando analisados por
espectroscopia vibracional de FT-IR associada à análise de PCA (3000–650 ondas.cm
-1
).
Subsequentemente, a extração de pigmentos da farinha de todas as variedades, usando
butanol-HCl (70:30, v/v), com tempo de incubação de 1 h, revelou serem os flobafenos
ou as antocianinas os flavonóides majoritários, consoante à VCLM em análise. No
mesmo extrato organosolvente verificou-se ainda elevada amplitude de valores de
(poli)fenóis totais (variação de 321 a 1.132µg/g) entre os genótipos. Os principais ácidos
(poli)fenólicos detectados por CLAE foram os ácidos protocatecuico, gálico e t-cinâmico
e quantidade menores dos ácidos clorogênico, caféico, cumárico e ferúlico também foram
observadas. O conteúdo de todos os ácido (poli)fenólicos diferiu significativamente
(P<0,01) entre as variedades, sugerindo o maior valor nutricional de algumas VCLM,
comparativamente aos cultivares comerciais. No que concerne à quantificação de
carotenóides, uma amplitude de valores também foi observada (∼ 2 a 26 µg/g), tendo sido
os maiores conteúdos detectados nos cultivares comerciais. As xantofilas zeaxantina e
luteína foram identificadas como os pigmentos majoritários nas amostras em estudo
através da CLAE, além de pequenas quantidades de β-caroteno, β-criptoxantina e α-
caroteno. Devido à importância crescente destes pigmentos no setor industrial e/ou
farmacêutico, estabeleceu-se um protocolo de purificação destes metabólitos secundários
131
via técnicas cromatográficas e espectroscópicas, obtendo-se frações com grau de pureza
satisfatório (88% - 93%) para zeaxantina e luteína. Estes resultados sugerem algumas
VCLM, assim como alguns cultivares comerciais, como fontes potenciais à extração de
diversos tipos de compostos de interesse à saúde humana, caracterizando o milho como
alimento funcional.
2 INTRODUÇÃO
Diversas evidências sugerem uma relação inversa entre o consumo de produtos de
origem vegetal e a incidência de doenças degenerativas em humanos. Isto se deve à
presença de compostos bioativos nesses alimentos, tais como as vitaminas A, C e E, os
(poli)fenóis e os pigmentos denominados carotenóides e antocianinas que exercem efeitos
importantes na prevenção de algumas doenças (KRIS-ETHERTON et al., 2002).
Dentre os pigmentos naturais, os carotenóides são os mais importantes em função
de sua ampla distribuição e sua diversidade estrutural. Estes pigmentos são relacionados
à prevenção de doenças cardiovasculares, câncer, degeneração macular e catarata
(FAULKS & SOUTHON, 2001; CHEW et al., 2003; AHMED et al., 2005). As
antocianinas, por sua vez, compreendem um grupo de pigmentos pertencentes à classe
dos flavonóides, sendo responsáveis pela coloração de tecidos de frutas, flores e folhas
(ESCRIBANO-BAILÓN et al., 2004). Diversas funções biológicas também têm sido
atribuídas a esses compostos, tais como anti-mutagênica, anti-carcinogênica,
antioxidante e anti-inflamatória (YOSHIMOTO et al., 2001, HAGIWARA et al., 2001;
CEVALLOS-CASALS & CISNEROS-ZEVALLOS, 2003; ROSSI et al., 2003). Da
mesma forma, os compostos (poli)fenólicos são amplamente distribuídos no Reino
Vegetal, desempenhando atividades biológicas importantes no metabolismo humano
como antioxidante, anti-inflamatória e anti-carcinogênica (OWEN et al., 2000; ADOM
& LIU, 2002).
Neste contexto, diversos estudos vêm sendo realizados visando à investigação de
alimentos que contenham compostos químicos de naturezas distintas, geralmente
resultantes do metabolismo secundário das plantas, que possam ser usados como
alimentos funcionais, ou na produção de suplementos alimentares. Atualmente, a
132
preocupação com a ingestão de alimentos que possam trazer algum benefício à saúde é
um tema em crescente expansão. Cerca de 50% dos casos de doenças cardiovasculares e
um terço dos casos de câncer podem ser atribuídos aos hábitos alimentares inadequados
(FRANCO, 2006). Dentre os alimentos funcionais que vêm sendo estudados, podemos
destacar os grãos de milho porque, a despeito de sua constituição majoritária em amido e
proteínas, contém diversas substâncias benéficas a saúde, provenientes do metabolismo
secundário, tais como (poli)fenóis, carotenóides e antocianinas (WHITE, 2001). O
consumo desse alimento é um hábito bastante antigo na América Latina, principalmente
na elaboração de alimentos locais, como tortilhas (México), arepas (Venezuela e
Colômbia), cuscuz (Brasil) e polenta (América do Sul) (SERNA-SALDIVAR et al.,
2001). O uso do milho como alimento em uma determinada localidade está relacionado
às características nutricionais da variedade empregada e também ligado a fatores
culturais. No Peru, por exemplo, o milho roxo é amplamente utilizado na fabricação de
“Chicha Morada”, uma bebida local bastante popular e com reconhecidos benefícios à
saúde humana (BRACK-EGG, 1999). De forma similar, no sul do Brasil, e mais
especificamente na região extremo oeste do Estado de Santa Catarina, alguns municípios
– Anchieta, Guaraciaba, Novo Horizonte, por exemplo – têm no milho uma cultura de
grande importância econômica e sócio-cultural. Naquela região, foram identificadas
cerca de 30 variedades crioulas e locais de milho (VCLM) com características
diferenciadas, como variações na coloração dos grãos (brancos, amarelos, vermelhos e
roxos), por exemplo (OGLIARI & ALVES, 2006). Tal diversidade genética pode estar
correlacionada a grande diversidade química presente nos tecidos e órgãos daquele
cereal, um aspecto de reconhecida importância em estudos da análise do potencial de
biomassas como fonte de compostos de interesse à saúde humana, como por exemplo,
alimentação, profilaxia, terapêutica e cosmética. Desse modo, a caracterização química
das VCLM pode aprofundar o conhecimento sobre suas singularidades metabólicas,
contribuindo desta maneira para uma melhor caracterização e avaliação do germoplasma
atualmente disponível. Os dados gerados nesta linha de investigação possibilitarão, em
alguma extensão, a otimização do uso corrente, a proposição de novos usos e de novos
produtos derivados das biomassas do milho. Neste contexto, o objetivo desse estudo foi
determinar o perfil fitoquímico de grãos de 26 VCLM cultivadas no município de
133
Anchieta e de 5 variedades híbridas comerciais, com ênfase aos compostos
carotenoídicos, (poli)fenólicos e antociânicos.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção do material vegetal
3.1.1 Variedades crioulas e locais de milho (VCLM)
As 26 VCLM utilizadas nesse estudo foram obtidas junto aos pequenos agricultores
do município de Anchieta (SC), pelo Sindicato dos Trabalhadores na Agricultura Familiar
(SINTRAF). As amostras de grãos foram repassadas ao Núcleo de Estudos em
Agrobiodiversidade (NeaBio) da UFSC e consideraram as variedades Roxo do Valdecir,
Rajado 8 Carreiras, Palha Roxa 02, Rosado, Cateto Vermelho, Cateto, Pires, Palha Roxa 1
do Emílio, Mato Grosso Palha Roxa, Pixurum 07, MPA 13, Branco do Aldanir, Pixurum
04, Mato Grosso, Pixurum 06, Composto São Luis, Asteca, MPA 02, Pixurum 01, Cunha
01, MPA 01, Pixurum 05, Roxo do Emílio, Amarelão 03, Moroti e Língua de Papagaio
(Figura 1).
3.1.2 Cultivares híbridos
Amostras de grãos de cultivares comerciais recomendadas para a região Sul do
Brasil foram utilizadas no presente estudo para efeitos de análise comparativa, a saber:
BRS1030; BR106; AG-9090; Pioneer 3069 e AS-3430.
O cultivar BRS1030 (Embrapa) é um híbrido simples, de ciclo precoce, com
florescimento em 61 dias, de porte baixo, com grãos semi-duros de cor alaranjada. O
cultivar AG-9090 (Agroceres) é de ciclo precoce, com florescimento em 72-80 dias, com
grãos semidentados, de cor alaranjada e com alto teor de óleo. Pioneer 3069 é um híbrido
simples de ciclo super-precoce de cor alaranjada, enquanto AS-3430 (Agroeste) é um
híbrido triplo, de ciclo precoce, porte médio/alto, com grãos duros de cor avermelhada.
3.2 Coleta e preparo das amostras
134
Para cada variedade, amostras de grãos (50 g, peso seco) foram trituradas em
moinho de laboratório (Cyclone Sample Mill - modelo 3010/019), utilizando-se peneira de
0,1 mm. Após a moagem, as amostras foram imediatamente submetidas aos procedimentos
experimentais de interesse, ou embaladas em sacos plásticos, sob vácuo, e conservadas em
freezer (–18
º
C) para posterior análise.
A
B
C
D
A
B
C
D
FIGURA 1 - Detalhe da coloração dos grãos das variedades crioulas e
locais de milho em estudo. A - Rosado, B – Roxo do Valdecir, C –
MPA01, D - Branco do Aldanir.
3.3 Caracterização do pericarpo dos grãos das VCLM por espectroscopia
vibracional na região do infravermelho médio com transformada de Fourier (FT-
IR) e análise quimiométrica
Devido à maior concentração de pigmentos no pericarpo dos grãos de algumas
das VCLM, procedeu-se à retirada do pericarpo dos grãos de amostras das variedades:
Roxo do Valdecir, Composto São Luis, Mato Grosso Palha Roxa, Branco, Roxo do
Emílio, Rajado 8 Carreiras, MPA01, Cateto Vermelho e Língua de Papagaio.
135
Posteriormente, as amostras de pericarpo foram trituradas, tamisadas (80 mesh) e
analisadas (~10 mg, peso seco) por espectroscopia vibracional de FT-IR, em
equipamento Bruker IFS 55, equipado com sistema de ATR de reflexão única (Golden
Gate), programado para coletar 128 varreduras/amostra, em janela espectral de 500 a
4000 ondas.cm
-1
e com resolução de 4 ondas.cm
-1
. Os espectros foram processados com
auxílio do programa OPUS versão 5.0 (Bruker GmbH). O processamento dos espectros
considerou a delimitação da janela espectral a ser analisada (3000-600 ondas.cm
-1
), a
correção da linha de base, a normalização e a diminuição da razão sinal/ruído.
Posteriormente, o conjunto de dados totais dos espectros foi submetido à análise
estatística multivariada, através da aplicação dos métodos de componentes principais
(PCA), com auxílio do pacote estatístico Unscrambler 9.1.
3.4 Estabelecimento do protocolo de extração para a determinação do conteúdo
antociânico de sementes de milho
Amostras de grãos previamente triturados (1 g, peso fresco) da variedade Roxo
do Valdecir (grãos com elevado grau de pigmentação), foram extraídas com soluções (20
mL) de metanol-HCl 1% (v/v, 0
0
C, 30 min), ou butanol-HCl (70:30, v/v, temperatura
ambiente, 1 h), conforme descrito por BODDU et al. (2004). Os extratos
organosolventes foram recuperados por filtração sob vácuo e caracterizados através de
espectrofotometria de varredura UV-visível, considerando-se as absorbâncias lidas em
janela espectral de 240 ηm a 750 ηm (Shimadzu 2301).
Posteriormente, foram realizados dois ensaios para determinação do intervalo de
tempo para extração otimizada de compostos antociânicos de amostras de farinha
(pericarpo) das VCLM, utilizando butanol-HCL (70:30, v/v – 20 mL) como solução
extratora, devido à sua maior eficiência. No primeiro procedimento, os compostos alvo
foram exaustivamente extraídos de uma mesma amostra (n = 3), durante 6 horas (t
zero
,
t
0,5h
; t
1h
; t
2h
; t
3h
; t
4h
; t
5h
e t
6h
. O segundo procedimento compreendeu a extração dos
compostos antociânicos do pericarpo da variedade Roxo do Emílio, usando diferentes
intervalos de tempo de incubação: 30 min, 1 h, 4 h, 6 h e 15 h. A eficiência de extração
das antocianinas nestes ensaios foi monitorada através da determinação dos valores de
absorbância na janela espectral entre 240 ηm a 750 ηm (Shimadzu 2301).
136
3.5 Caracterização e classificação dos extratos butanol-HCl (70:30, v/v) de
amostras de farinhas das VCLM e cultivares comerciais por espectrofotometria
UV-visível associada à quimiometria
A obtenção do extrato butanol-HCl (70:30, v/v) das farinhas em estudo
considerou a incubação de 1 g farinha/amostra (peso seco) na presença de 20 mL daquela
solução extratora (temperatura ambiente, 1 h). Após esse período, as amostras foram
centrifugadas (2.500 rpm, 15 min) e o sobrenadante monitorado por espectroscopia UV-
visível (240 ηm a 750 ηm). Os extratos organosolventes das amostras foram agrupados,
via análise dos componentes principais (PCA), utilizando-se a matriz de covariância dos
valores de absorbância, com o auxílio do software Unscrambler 9.1.
3.6 Determinação do conteúdo de (poli)fenóis totais
Uma alíquota (2 mL) do extrato butanol-HCl (70:30, v/v) obtido conforme
descrito no item 3.5 foi evaporada usando N
2
gasoso e ressuspensa em 1,5 mL água:
EtOH (70:30, v/v). Uma alíquota de 1 mL dessa solução foi usada para a determinação do
conteúdo de (poli)fenóis totais, na presença do reativo de Folin-Ciocalteau, conforme
descrito previamente (SINGLETON & ROSSI, 1965). A quantificação dos compostos
fenólicos utilizou uma curva-padrão (ácido gálico - 50 µg/mL - 800 µg/mL - r
2
= 0,99; y
= 1,358x) e os resultados foram expressos em equivalentes de ácido gálico.
3.7 Identificação de compostos (poli)fenólicos por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE)
Para a identificação dos (poli)fenóis no extrato butanol-HCl (70:30, v/v), uma
alíquota de 10 µL da amostra (vide item 3.6) foi analisada em cromatógrafo líquido
(Shimzadu LC-10A), equipado com coluna C
18
(Shim-Pack CLC-ODS, 25 cm x 4,6 mm
∅) e detector espectrofotométrico UV-visível operando em 280 ηm. A eluição utilizada
consistiu de H
2
O:AcOH:η-BuOH (350:1:10, v/v/v), com fluxo de 0,8 mL/min e a
identificação dos compostos de interesse foi feita com base nos tempos de retenção
obtidos a partir da análise de amostras padrões [ácido protocatecuico (Sigma P-5630),
ácido gálico (Sigma G-7384), ácido t-cinâmico (Fluka 96340), ácido siríngico (Fluka
86230), ácido caféico (Sigma C-0625) – 100 µg/mL), sob as mesmas condições
137
experimentais. A quantificação dos ácidos fenólicos foi feita utilizando-se uma curva
padrão externa de ácido gálico (100 µg/mL – 2,5 µg/mL; r
2
= 0,91; y = 1589,9x) e ácido
caféico (100 µg/mL - 1µg/mL; r
2
= 0,99; y = 532,83x) tomando como base a intensidade
dos sinais. Os valores apresentados correspondem à média de 3 injeções/amostra, a partir
de análises realizadas em triplicata.
Os conteúdos médios de (poli)fenóis foram inicialmente comparados através da
análise de variância (ANOVA), com o auxílio do software SAS
®
9.1. Subseqüentemente,
esses mesmos resultados foram submetidos à análise de componentes principais (PCA),
visando determinar o grau de similaridade entre as mesmas, com o auxílio do programa
Fitopac
®
1.6.4.
3.8 Extração e dosagem de carotenóides
Amostras (1 g, peso seco) de grãos das 26 VCLM e dos cultivares híbridos foram
maceradas na presença de 2 volumes de solução de hexano:acetona (v/v), contendo 100
mg/L de hidroxitolueno butilado (BHT). As amostras foram filtradas sob vácuo,
centrifugadas por 10 minutos (5.000 rpm) e o solvente evaporado em fluxo de nitrogênio.
O extrato concentrado foi ressuspenso em 3 mL de hexano, lavado com 9 mL de água
destilada-dionizada (3x) e, posteriormente, submetido à espectrofotometria UV-visível
(Shimadzu 2301) para a determinação do teor de carotenóides, através da leitura da
absorbância a 450 ηm (AMAN et al., 2001). A concentração de carotenóides totais foi
calculada usando a fórmula de Lamber-Beer, utilizando-se o coeficiente de extinção
molar (
= 2300, hexano) conforme previamente descrito por BRITTON (1982). As
análises foram realizadas em triplicata.
%1
1cm
A
3.9 Análise de compostos carotenoídicos por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE)
As amostras de carotenóides obtidas conforme descrito no item 3.8 foram
analisadas por CLAE. Para tal, o solvente foi evaporado em fluxo de N
2
e o extrato
ressuspenso em 300 µL de hexano. Alíquotas (10 µL) de cada amostra foram analisadas
em cromatógrafo líquido (Shimzadu LC-10A), equipado com coluna C
18
de fase reversa
(Vydac 218TP54, 25 cm x 4,6 mm ∅ interno) e pré-coluna (Vydac 218GK54, 5 µm) e
138
detector espectrofotométrico UV-visível, operando em 450 ηm. A eluição utilizou
MeOH:Acetonitrila (90:10, v/v) como fase móvel, em fluxo de 1 mL/min. A
identificação dos compostos de interesse (
β
-caroteno, luteína e zeaxantina) foi feita com
base nos tempos de retenção determinados a partir da análise de amostras padrões
[luteína (Sigma X-6250), zeaxantina, β-caroteno (Sigma C-0126) – 100 µg/mL] sob as
mesmas condições experimentais. A quantificação dos carotenóides utilizou curva-padrão
externa de luteína (0,05 µg/mL a 55 µg/mL, r
2
= 0,99; y = 12575x) e considerou a
intensidade dos picos de interesse para efeitos de cálculo, sendo que os valores
apresentados correspondem à média de 3 injeções/amostra, a partir de análises realizadas
em triplicata.
Os conteúdos médios de carotenóides foram comparados através da análise de
variância (ANOVA, SAS
®
9.1). Os mesmos resultados também foram submetidos à
análise de componentes principais (PCA, Fitopac
®
1.6.4).
3.10 Purificação e caracterização estrutural dos carotenóides extraídos de sementes
de milho por técnicas cromatográficas
Extratos organosolventes dos pigmentos carotenoídicos da variedade MPA01 e da
cultivar híbrida BRS1030 foram obtidos e purificados por cromatografia líquida em
coluna (CLC), seguido de análise das frações de interesse por espectofotometria UV-
visível e CLAE.
Os compostos carotenoídicos de amostras de sementes de milho (5 g) foram
extraídos, conforme descrito anteriormente no item 3.8, aplicados em coluna de alumina
(18,3 mL) e eluídos sequencialmente com éter de petróleo, éter de petróleo:éter etílico
(1:1, v/v), éter etílico e éter etílico:álcool etílico (1:1, v/v). As frações coletadas para cada
um dos solventes orgânicos foram reunidas e monitoradas utilizando-se
espectrofotometria UV-visível (Shimadzu 2301), através da leitura da absorbância em
janela espectral de 350 ηm a 750 ηm. Posteriormente, as frações organosolventes da
CLC foram analisadas via CLAE, utilizando-se a metodologia descrita no item 3.9.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
139
4.1 Análise do pericarpo por FT-IR e quimiometria
O isolamento do pericarpo dos grãos de algumas VCLM (Roxo do Valdecir,
Roxo do Emílio, Composto São Luis, Mato Grosso Palha Roxa, Rajado 8 Carreiras,
Língua de Papagaio e Branco - Figura 2) foi efetuado visando à investigação de
possíveis diferenças de composição química entre aquele germoplasma, usando a
espectroscopia de FT-IR associada à análise de PCA.
.
FIGURA 2 – Detalhe da coloração das amostras de pericarpos isolados e tamisados
dos grãos das variedades Roxo do Valdecir (A), Composto São Luis (B), Mato
Grosso Palha Roxa (C), Branco (D), Roxo do Emílio (E), Rajado 8 Carreiras (F) e
Língua de Papagaio (G).
Os espectros de FT-IR do pericarpo das VCLM Roxo do Emílio e Rajado 8
Carreiras estão mostrados na Figura 3, onde se pode observar os picos majoritários
encontrados para a janela espectral compreendida entre 3000-650 ondas.cm
-1
.
A análise dos espectros revelou que para a região de fingerprint de carboidratos
(1200-950 ondas.cm
-1
) as amostras são bastante semelhantes, destacando-se duas bandas
em 1150 e outra em 1033 ondas.cm
-1
. Estes sinais possivelmente relacionam-se à
presença de polissacarídeos estruturais nas amostras, tais como hemicelulose, pectina e
celulose. Além disso, dois sinais típicos de hidrocarbonetos alifáticos (2920 e 2851
ondas.cm
-1
) com elevada intensidade foram detectados em todas as amostras. Esses estão
também possivelmente relacionados à presença de ácidos graxos ou lipídeos, uma vez
que indicam a deformação axial e angular do grupo metil (-CH
3
) e/ou metileno (CH
2
)
(LAMBERT, 2001).
140
FIGURA 3 - Espectros de FT-IR (3000 – 650 ondas.cm
-1
) de amostras de pericarpos
isolados e tamisados das variedades Roxo do Emílio e Rajado 8 Carreiras.
Entretanto, na região espectral compreendida entre 2200 e 1400 ondas.cm
-1
,
foram detectadas diferenças para as amostras de pericarpo das VCLM devido à presença
de diversos sinais de baixa, média e elevada intensidade. A presença de sinais de fraca
intensidade na região entre 2000-1700 ondas.cm
-1
caracteriza a presença de compostos
aromáticos, de acordo com SILVERSTEIN (1994) e LAMBERT (2001). As diferenças
detectadas para essa região do espectro para as amostras reforçam a hipótese de que a
composição de flavonóides presentes no pericarpo dos grãos das VCLM estudadas possui
algum grau de distinção.
Tendo em vista as diferenças observadas nos espectros de FT-IR das VCLM,
foram calculados os componentes principais (PCA) como estratégia de análise para a
detecção de similaridades de composição química do material amostral. A região
analisada por PCA compreendeu os sinais detectados entre 3000-650 ondas.cm
-1
, sendo
que a matriz de covariância de dados espectrais foi normalizada em seus componentes
lineares, enquanto as colunas foram centralizadas.
141
A Figura 4 mostra a dispersão das variedades em estudo, segundo a
determinação dos componentes principais (PCA) da matriz de dados obtida a partir dos
espectros de FT-IR para a região compreendida entre 3000-650 ondas.cm
-1
. Os
componentes principais PC1 e PC2 contribuiram para explicar em 95% a variância
presente nos dados.
FIGURA 4 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (3000-650
ondas.cm
-1
) de amostras de pericarpos isolados de grãos de 7 variedades crioulas e
locais de milho.
A análise do gráfico de distribuição fatorial dos dados de FT-IR revelou que as
amostras de pericarpo das 7 VCLM diferiram entre si, principalmente em função do eixo
componente PC1. As amostras das variedades Roxo do Emílio e Branco localizaram-se
em PC1 negativo, formando dois grupos distintos. Nesta estratégia de análise, as
variedades de grãos roxos (Roxo do Emílio e Roxo do Valdecir) evidenciaram uma
constituição química distinta, no que diz repeito aos tecidos mais externos de seus grãos
(pericarpo). A variedade Roxo do Valdecir agrupou-se às variedades Rajado 8 Carreiras e
Mato Grosso Palha Roxa, separado das demais, em PC1 e PC2 ( + ), apesar das
diferenças de coloração de seus grãos. A VCLM Rajado 8 Carreiras possui grãos
142
variegados e Mato Grosso Palha Roxa alaranjado a avermelhado. As amostras de
pericarpo da variedade Língua de Papagaio, que possui grãos roxos e amarelos na mesma
espiga, formaram um grupo a parte em PC1 ( + ) e PC2 ( - ), enquanto as amostras da
variedade de grãos amarelos Composto São Luis destacaram-se das demais, localizando-
se em PC2 negativo. Diversas bandas do espectro de FT-IR contribuíram para a
separação das amostras ao longo de PC1, conforme demonstrado pelos valores de
contribuição fatorial (Figura 5).
FIGURA 5 - Contribuição fatorial de PC1 para os dados de FT-IR (3000-600
ondas.cm
-1
) das amostras de pericarpos isolados de grãos das VCLM.
Conclui-se, em função disto, que a técnica de FT-IR associada à análise
quimiométrica dos dados constitui uma estratégia eficiente para a detecção de
similaridades de composição das amostras de grãos, em função da presença de pigmentos
determinantes de seus padrões de cor observados visualmente (brancos, amarelos,
alaranjados, vermelhos, variegados e roxos). De forma interessante, estas duas
143
ferramentas analíticas (FT-IR e PCA) revelaram que as similaridades de coloração dos
grãos, detectadas visualmente, não estão necessariamente correlacionadas a uma
composição química semelhante.
Estes resultados sugerem que o tecido do pericarpo dos grãos das VCLM possui
constituição química distinta no que se refere às diversas classes de compostos detectados
por FT-IR. Dessa forma, procedeu-se à investigação dessas diferenças realizando a
extração dos pigmentos e caracterizando-os através do perfil espectral UV-visível.
4.2 Extração e caracterização das antocianinas
As antocianinas, pigmentos responsáveis pela coloração azul, vermelha, violeta e
púrpura de vários tecidos vegetais pertencem à família dos flavonóides, têm despertado o
interesse da indústria de alimentos pela sua comprovada atividade antioxidante, por
exemplo, e como potenciais substitutos de corantes sintéticos (CEVALLOS-CASALS &
CISNEROS-ZEVALLOS, 2003; KONG et al., 2003; EINBOND et al., 2004). Em
algumas variedades de milho roxo, como as cultivadas nos Andes peruanos, tais
compostos vêm sendo estudados como corantes naturais, havendo inclusive diversos
registros de seu uso pelas civilizações Incas (ESCRIBANO-BAILÓN et al., 2004;
CEVALLOS-CASALS & CISNEROS-ZEVALLOS, 2004; CORTÉS et al., 2006). No
entanto, para o germoplasma brasileiro, trabalhos dessa natureza são escassos ou
inexistentes, apesar do potencial que algumas variedades possuem, dada à intensa
pigmentação de seus grãos. Dessa forma, o presente estudo propôs-se a realizar uma
investigação preliminar daqueles compostos presentes nos grãos de algumas das VCLM,
cultivadas no município de Anchieta (SC), com ênfase à seleção de um método de
extração e caracterização usando a espectroscopia de UV-visível.
Para caracterizar os pigmentos antociânicos de qualquer tecido vegetal, o primeiro
passo, é a seleção de um método de extração adequado. Usualmente, são empregados
água, acetona, clorofórmio, metanol ou etanol com a adição de pequenas quantidades de
ácido clorídrico ou ácido fórmico, como solventes (GIUSTI & WROLSTAD, 2001). Para
o milho roxo dos Andes, o metanol, a água e o ácido trifluoracético (TFA) foram
empregados com êxito no processo de extração das antocianinas da farinha
144
(CEVALLOS-CASALS & CISNEROS-ZEVALLOS, 2004; CORTÉS et al., 2006, AOKI
et al., 2001). No entanto, cabe ressaltar que em cereais como o milho e o sorgo, além da
síntese das 3-hidroxi-antocianinas (cianidina e pelargonidina, por exemplo) uma segunda
via, regulada de forma independente, produz as 3-desoxi-antocianinas (apigenidina e
luteolinidina), de ocorrência bem mais restrita (GROTEWOLD et al., 1998). Esses
compostos têm sido denominados de fitoalexinas (NICHOLSON &
HAMMERSCHMIDT, 1992), e estão relacionados à via de síntese dos flobafenos que
são pigmentos insolúveis de coloração vermelha, resultantes da condensação de
luteoferol e apiferol (4-flavanóis) (STAFFORD, 1998). Tendo em vista que a
caracterização dos pigmentos responsáveis pela coloração dos grãos das VCLM do
município de Anchieta é um trabalho inédito, fez-se necessário o emprego de um
protocolo de extração eficiente para a remoção dos mais diversos pigmentos. Dessa
forma, utilizou-se o protocolo descrito por GROTEWOLD et al. (1998), usando butanol-
HCl (70:30, v/v) que tem-se mostrado adequado para remoção dos 4-flavanóis.
A Figura 6 mostra o perfil espectral de extratos de grãos da variedade Roxo do
Valdecir (coloração de grãos roxa – Figura 1) obtido com a utilização de MeOH-HCl
(1%, v/v) e butanol-HCl (70:30, v/v). Analisando a Figura 6, verificou-se que o solvente
MeOH-HCl (1%, v/v) não se mostrou adequado à extração dos pigmentos flavonoídicos
de grãos da varieadade Roxo do Valdecir, em função dos baixos valores de absorbância
na faixa espectral característica daqueles compostos, isto é, 400 e 560 ηm.
De outra forma, o protocolo descrito para a extração de 4-flavanóis utilizando
solução de butanol-HCl (70:30, v/v - GROTEWOLD et al., 1998), revelou na região
espectral característica dos pigmentos flavonoídicos (400-560 ηm), um aumento
significativo nos valores de absorbância. Além disto, um valor máximo de absorbância
para aquela janela espectral foi detectado em 550 ηm, sugerindo a presença de 4-
flavanóis e flobafenos nesse extrato, em concordância do descrito por STAFFORD
(1998) e GROTEWOLD et al. (1998). É importante considerar que a completa
elucidação da estrutura dos flobafenos ainda não foi concluída, mas que os mesmos são
produto da polimerização não enzimática dos 4-flavanóis (STYLES & CESKA, 1989).
145
Tendo em vista os resultados superiores obtidos com a utilização da solução
extratora de butanol-HCl (70:30, v/v), um novo experimento foi realizado para otimizar o
tempo de incubação das amostras para a obtenção daqueles pigmentos.
IGURA 6 - Perfis de absorbância UV-visível dos extratos MeOH-HCl (1%, v/v) e
Para tanto, amostras de pericarpo (10 mg) da variedade Roxo do Emílio foram
extraíd
erem que possivelmente os pigmentos extraídos começaram a
sofrer oxidação em função da exposição do extrato ao ambiente atmosférico, o que pode
F
butanol-HCl (70:30, v/v) das amostras de grãos da variedade Roxo do Valdecir, para a
janela espectral de 240 a 750 ηm.
as, à temperatura ambiente, e monitoradas usando espectrofotometria UV-visível
(400 a 650 ηm) por períodos de 30 minutos a 15 horas - Figura 7. Com períodos de
incubação das amostras de 30 minutos e 1 h detectou-se nos extratos um valor máximo de
absorbância para os pigmentos em 566 ηm. Entretanto, a partir de 4 h percebeu-se uma
mudança no perfil espectral, embora os valores de absorbância tenham sido superiores
aos tempos de 30 min e 1h, indicando a oxidação dos compostos durante período de
extração. O valor máximo de absorbância ocorreu em 507 ηm com 15 h de extração,
enquanto picos de máximas foram detectados em 566 ηm e 507 ηm com 4h e 6h de
extração, respectivamente.
Esses resultados sug
146
ser evi
erfil de absorbância UV-visível (400 a 650 ηm) de extratos butanol-HCl
e amostras de pericarpo da variedade Roxo do Emílio, segundo o tempo
e incubação.
Cl (70: 30, v/v) dos grãos das 26 VCLM e dos 5 cultivares comerciais, adotou-se o
tempo
denciado pela mudança no valor máximo de absorbância para 507 ηm (efeito
hipocrômico).
FIGURA 7 – P
(70, 30%, v/v) d
d
Portanto, com o objetivo de comparar os perfis espectrais dos extratos butanol-
H
de extração 1 h. A Figura 8 mostra o perfil espectral desses extratos para uma
janela entre 400 e 750 ηm. O gráfico mostra que o perfil espectral entre as variedades são
bastante semelhantes, exceto para as variedades Roxo do Emílio, Roxo do Valdecir,
Rajado 8 Carreiras e Língua de Papagaio, com valores de absorbância superiores às
demais entre 440 e 580 ηm. O perfil espectral na região entre 400 e 600 ηm dos extratos
butanol-HCl (70:30, v/v) dos grãos das duas variedades intensamente pigmentadas, Roxo
do Emílio e Roxo do Valdecir, foi bastante semelhante. A variedade Roxo do Valdecir
apresentou os maiores valores de absorbância em 547-550 ηm, enquanto para Roxo do
Emílio este comportamento foi detectado na faixa de 553-562 ηm. Esses resultados
sugerem a presença dos pigmentos flobafenos como os responsáveis pela coloração dos
grãos nas duas variedades roxas, com destaque para a variedade Roxo do Valdecir,
conforme mostrado na Figura 8. O extrato da variedade Rajado 8 Carreiras, por sua vez,
mostrou valores de absorbância superiores entre 510 e 551 ηm, o que possivelmente
147
indica a presença de outros pigmentos de origem antociânica além dos flobafenos, em
maiores concentrações em relação a estes últimos metabólitos secundários. O extrato da
variedade Língua de Papagaio revelou um perfil espectral distinto em relação aos demais,
uma vez que os maiores valores de absorbância foram detectados entre 516 e 533 ηm,
sugerindo um menor teor de flobafenos e a predominância das antocianinas. O perfil
espectral dos cultivares comerciais visualmente se assemelhou ao das VCLM com
coloração de grãos semelhante (amarelo-alaranjado).
FIGURA 8 – Perfil de absorbância UV-visível dos extratos butanol-HCl (70, 30%, v/v)
de am
c
ostras de grãos das variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares
omerciais, para uma janela espectral entre 400 a 600 ηm.
ugerem uma constituição de flavonóides distinta para as VCLM. Ressalta-se que os
pigmen
cipais (PCA), com o objetivo de classificar os
extratos butanólico dos grãos das VCLM e dos cultivares comerciais.
É importante considerar que esses resultados são de caráter preliminar, porém
s
tos dos grãos de algumas VCLM, tais como Rosado, Cateto Vermelho, Palha
Roxa do Emílio e Mato Grosso Palha Roxa, não foram extraídos com a solução de
butanol-HCL (70:30, v/v), corroborando a hipótese de que a pigmentação observada não
é decorrente dos mesmos pigmentos.
Posteriormente, os dados espectrais de UV-visível foram submetidos à
determinação dos componentes prin
148
A Figura 9 apresenta a separação das amostras, para a janela espectral entre 289-
750 ηm, segundo os eixos componentes PC1 e PC2, que explicaram em 80% a
variabilidade total dos dados.
FIGURA 9 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os valores de absorbância (289-750
ηm) dos extratos butanol-HCL (70:30, v/v) de grãos das 26 variedades crioulas e locais
de milho e cultivares comerciais em estudo.
C1 e PC2 ( - ). O extrato butanólico da variedade Branco, um germoplasma de reduzida
pigmen
As duas variedades roxas (Roxo do Valdecir e Roxo do Emílio) agruparam-se em
PC1 ( - ) e PC2 ( + ), enquanto o cultivar comercial AG-9090 destacou-se das demais em
P
tação de grãos, (Figura 1) também localizou-se distante das demais, em PC1 e
PC2 ( + ). O agrupamento observado na Figura 9 pode ser atribuído aos comprimentos
de onda em 289 ηm e 295 ηm (PC1+0 e 374 ηm (PC1 negativo), consoante aos valores
das contribuições fatoriais (Figura 10).
Um segundo procedimento experimental de PCA foi realizado para o mesmo
conjunto de dados, porém considerando apenas a região espectral compreendida entre
149
400-600ηm, que é característica para os pigmentos antociânicos e flobafenos (Figura
11).
FIGURA 10 - Contribuição fatorial de PC1 das absorbâncias (400 - 600 ηm) dos
extratos butanol-HCl (70:30, v/v) de grãos de 26 variedades crioulas e locais de milho e
ultivares comerciais.
astante semelhante ao observado na Figura 9, com 98% da variabilidade total dos dados
c
O padrão de agrupamento observado para a região espectral considerada foi
b
sendo explicada por PC1 e PC2. Os extratos das variedades roxas apresentaram
ocorrência distinta (PC1 + e PC2 - ) em relação aos demais. As variedades Língua de
Papagaio e Rajado 8 Carreiras não agruparam-se próximas das roxas (PC1 + e PC2 - ).
Esses resultados corroboram a hipótese de que os grãos das VCLM em estudo possuem
constituição química distinta quanto aos compostos pertencentes à classe dos flavonóides.
Além disso, analisando a Figura 11 verifica-se que através dessa técnica foi possível
agrupar, em PC1 e PC2 negativos, as variedades com grãos brancos (Branco, Pixurum 7 e
MPA13), as quais revelaram um perfil de composição química distinto em relação às
demais.
150
A contribuição fatorial (Figura 12) calculada para os dados espectrais em análise
(400-600 ηm) revelou, novamente, que a presença de flobafenos nos grãos das variedades
roxas f
nela espectral de 400 a 600ηm dos extratos butanol-HCL (70:30, v/v) de grãos das 26
ariedades crioulas e locais de milho e cultivares comerciais.
Cabe destacar que os cultivares comerciais agruparam-se às demais VCLM,
indicando composição química similar no que diz respeito aos compostos extraídos com
butano
oi responsável pela separação das mesmas, uma vez que o comprimento de onda
próximo a 550 ηm é característico para essa classe de compostos (STAFFORD, 1998 e
GROTEWOLD et al., 1998).
FIGURA 11 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os valores de absorbância na
ja
v
l-HCl (70:30, v/v). Dessa forma, os resultados encontrados até o presente
momento sugerem fortemente a presença de pigmentos flobafenos nos grãos de algumas
das VCLM como os responsáveis pela pigmentação do pericarpo. Sugere-se um
aprofundamento da análise empregando ferramentas analíticas que possam identificá-los
151
de forma inequívoca, tais como a espectrometria de massa e a espectroscopia de
ressonância magnética nuclear.
IGURA 12 - Contribuição fatorial de PC1 das absorbâncias (400 - 600 ηm) dos extratos
.3 Extração e Caracterização dos (poli)fenóis
teiros e a redução do risco de doenças
crônica
F
butanol-HCl (70:30, v/v) de grãos de 26 variedades crioulas e locais de milho e cultivares
comerciais.
4
A correlação entre o consumo de grãos in
s em seres humanos, tais como o câncer e doenças cardiovasculares (JACOBS et
al., 1995; JACOBS et al., 1998), justifica a necessidade de estudos de caracterização dos
constituintes fitoquímicos nesses alimentos. No entanto, são escassos na literatura os
trabalhos realizados com grãos, comparativamente ao grande número de estudos
realizados com frutas e vegetais, apesar da predominância daqueles na alimentação
humana. Dentre as moléculas candidatas a exercerem benefícios à saúde humana,
destacam-se os (poli)fenóis pela sua comprovada ação antioxidante (ADOM & LIU,
2002), entre outras atividades biológicas.
152
No presente estudo, a extração dos compostos (poli)fenólicos não antociânicos
das farinhas de milho, foi realizada utilizando-se a solução extratora de butanol-HCl
(70:30, v/v). No entanto, a detecção daqueles metabólitos secundários no extrato bruto
não foi possível sem a realização de um “clean-up” das amostras, devido à presença de
múltiplos compostos interferentes. Portanto, após a evaporação do solvente de extração,
as amostras foram solubilizadas (2 mL) em mistura de EtOH: H
2
O (30:70, v/v) como
estratégia para remoção dos contaminantes.
O conteúdo médio de (poli)fenóis totais nos extratos EtOH: H
2
O (30:70, v/v) das
amostras de farinhas de milho foi determinado através do método de Folin-Ciocalteu
(SINGLETON & ROSSI, 1965) e os resultados estão apresentados na Tabela 1. Pode-se
observar que os valores de conteúdo médio para essa classe de compostos apresentaram
grande amplitude para as amostras em estudo, isto é, 516,29 µg (poli)fenóis totais/g
farinha a 1.132,04 µg (poli)fenóis totais/g farinha para as variedades Mato Grosso e
Rosado, respectivamente. Dentre as VCLM analisadas, teores apreciáveis desses
metabólitos secundários foram ainda identificados nas amostras Roxo do Emílio (988
µg/g), Roxo do Valdecir (988 µg/g) e Rajado 8 Carreiras (908 µg/g). Por outro lado, os
menores conteúdos de (poli)fenóis foram detectados em farinhas dos grãos das variedade
MPA1 e Cateto Vermelho, cerca de 545 µg/g e 585 µg/g, respectivamente. Entre os
cultivares comerciais, conteúdos inferiores de (poli)fenóis foram observados em relação
às VCLM, porém com uma significativa amplitude - 321,63 µg/g (AG-9090) a 789,96
µg/g (BR106). Os resultados quantitativos para algumas das VCLM foram similares aos
encontrados em amostras de grãos roxos de variedades de milho cultivados no Andes
peruanos (1.328 µg/g a 1.903 µg/g) (CEVALLOS-CASALS & CISNEROS-
ZEVALLOS, 2003; PEDRESCHI & CISNEROS-ZEVALLOS, 2007) e superiores aos
determinados para o milho doce comercializado nos EUA (250 µg/g a 470 µg/g)
(DEWANTO et al., 2002).
153
TABELA 1 - Concentração média* (µg/g, média
±
desvio padrão) de (poli)fenóis totais
**
, ácido protocatecuico, ácido gálico, ácido
clorogênico, ácido caféico, ácido t-cinâmico e ácido ferúlico
***
em amostras de grãos de variedades crioulas e locais de milho e dos
cultivares comerciais.
Variedade
Total
**
Ácido
Protocatecuico
Ácido
Gálico
Ácido
Clorogênico
Ácido
Caféico
Ácido t-
Cinâmico
Ácido
Ferúlico
Rosado
516,29
±
124,68 142,93
±
18,65 156,35
±
9,77 32,94 9,81±
n.d.
172,33
±
4,98
n.d.
MPA 1
545,92
±
47,69 120,31
±
5,64 122,74
±
5,60 36,77 9,50±
n.d.
188,00
±
10,26
n.d.
Cateto Vermelho
585,41
±
31,76 196,26
±
4,29 148,91
±
2,88
n.d.
6,85
±
5,24 299,29
±
5,74. 6,24
Moroti
593,88
±
176,65 202,25
±
2,14 198,73
±
17,28
n.d. n.d.
175,30
±
14,09
n.d.
Cateto
598,11
±
50,49 146,73
±
14,63 151,26
±
24,15 24,15 0,88±
n.d.
228,93
±
14,66 3,09
±
2,92
Pires
617,86
±
40,37 193,88
±
11,19 180,19
±
11,38
n.d.
5,52
±
6,27 191,28
±
13,04
n.d.
Composto São Luis
663,00
±
96,53 205,33
±
27,92 154,63
±
18,60 33,30 3,68±
n.d.
228,36
±
28,58 4,61
±
0,38
Pixurum 4
664,41
±
27,75 97,24
±
4,75 113,89
±
3,61
n.d. n.d.
117,97
±
9,65
n.d.
Branco
683,45
±
62,84 171,79
±
64,16 224,48
±
58,16
n.d. n.d.
111,14
±
38,60
n.d.
MPA 2
691,21
±
95,23 156,87
±
25,38 138,69
±
23,37
n.d.
13,03
±
1,60 222,46
±
39,23
n.d.
MPA 13
691,21
±
38,17 224,62
±
23,25 182,76
±
21,89
n.d. n.d.
198,61
±
17,55 8,42
±
0,27
Pixurum 6
692,62
±
20,00 190,70
±
9,04 200,47
±
32,69
n.d.
12,30
±
2,82 218,23
±
13,90
n.d.
Asteca
710,96
±
58,18 141,65
±
8,77 126,26
±
7,39
n.d. n.d.
257,87
±
16,48 5,18
±
0,29
Mato Grosso P. Roxa
733,53
±
21,30 134,68
±
18,63 146,49
±
12,93
n.d. n.d.
224,27
±
29,75 8,33
±
2,20
Palha R. do Emílio
736,35
±
77,23 174,54
±
11,62 265,14
±
16,20 4,38 2,48 ±
n.d.
163,28
±
16,02
n.d.
Língua de Papagaio
737,76
±
216,50 150,48
±
16,64 161,39
±
22,58
n.d. n.d.
184,31
±
15,73 4,48
±
0,98
Variedades Locais
Cunha
747,64
±
56,20 177,72
±
47,80 245,78
±
47,99
n.d. n.d.
103,48
±
28,86
n.d.
154
Pixurum 1
761,74
±
21,99 226,80
±
12,00 178,68
±
9,85
n.d.
13,85
±
0,05 231,92
±
12,34 9,72
±
1,57
Palha Roxa
780,08
±
72,97 127,27
±
21,07 126,37
±
15,17
n.d.
5,63
±
1,24 208,44
±
30,16
n.d.
Pixurum 7
788,55
±
97,64 190,24
±
7,90 152,70
±
5,19
n.d. n.d.
179,00
±
6,88
n.d.
Pixurum 5
835,10
±
175,98 163,36
±
33,35 161,17
±
30,85 5,43 0,99 ±
n.d.
141,44
±
25,49
n.d.
Amarelão 3
839,33
±
64,64 188,12
±
10,29 201,47
±
9,67 37,41 6,60± 14,47
±
0,61 283,75
±
14,70
n.d.
Rajado 8 Carreiras
908,45
±
79,88 190,19
±
25,25 176,92
±
27,31
n.d.
14,66
±
3,45 227,11
±
4,48 13,33
±
8,65
Roxo do Valdecir
998,73
±
62,34 177,71
±
6,93 204,27
±
14,62
n.d.
33,70
±
6,56 234,34
±
9,68
n.d.
Roxo do Emílio
988,73
±
7,33 134,24
±
7,89 204,35
±
6,04 38,35 7,44± 14,94
±
2,60 192,36
±
10,36 4,96
±
1,13
Mato Grosso
1132,04
±
397,99 168,42
±
10,07 158,09
±
7,68
n.d.
43,47
±
1,33 280,16
±
30,97
n.d.
AG-9090
321,63
±
11,97 422,89
±
40,64 187,67
±
4,77 25,44 8,09±
n.d.
310,00
±
7,85 10,24
±
3,46
BRS 1030
462,69
±
27,21 129,63
±
0,98 156,60
±
4,65
n.d.
9,16
±
0,00 158,84
±
3,74 5,63
±
0,11
AS-3430
675,69
±
25,86 116,15
±
7,97 137,82
±
8,09 2,25 0,11 ±
n.d.
121,62
±
10,36
n.d.
Pioneer 3069
774,44
±
36,89 185,54
±
16,80 174,39
±
14,40 30,66 4,92± 16,07
±
1,67 282,63
±
24,03 17,88
±
0,88
Variedades
Comerciais
BR106
789,96
±
118,22 338,05
±
65,93 189,41
±
29,52 9,12 4,56 ±
n.d.
214,04
±
36,98 13,61
±
8,65
* Média de 3 extrações
SD (desvio padrão da média); ±
** Determinado por espectrofotometria UV-visível (SINGLETON & ROSSI, 1965)
*** Determinado por CLAE (280ηm ) e conteúdo de (poli)fenóis calculados através da intensidade do pico de interesse – média de 3 injeções.
155
Para as variedades onde se encontrou um maior conteúdo de (poli)fenóis (Mato Grosso,
Roxo do Emílio, Roxo do Valdecir e Rajado 8 Carreiras) sugere-se, além do valor nutricional
superior para a farinha, um pericarpo com maior resistência, uma vez que polissacarídeos de
parede celular estão unidos por ácidos (poli)fenólicos (KROON & WILLIAMSON, 1999).
Dessa forma, os grãos dessas variedades, eventualmente, são menos susceptíveis ao
ataque de patógenos, além de apresentarem uma textura diferenciada, uma característica que
pode interferir no tempo de cozimento dos grãos. Nesse sentido, POZO-INSFRAN et al. (2006)
sugeriram que o maior tempo de cozimento para o milho branco, comparativamente ao milho
roxo dos Andes, está associado ao maior conteúdo de (poli)fenóis deste último.
Subsequentemente à quantificação dos compostos (poli)fenólicos totais, procedeu-se a
identificação dos mesmos por CLAE. Os perfis de eluição cromatográfica revelaram a existência
de 3 picos majoritários em todas as amostras analisadas, os quais foram identificados pela
comparação dos tempos e retenção (Rt) com compostos padrões, como sendo ácido
protocatecuico (Rt = 4,53 min), ácido gálico (Rt = 5,95 min) e ácido t-cinâmico (Rt = 18,82
min). Foram detectados ainda quantidades menores de ácido clorogênico (Rt = 11,79 min), ácido
caféico (Rt = 16,50 min), ácido m-cumárico (Rt = 28,74 min) e ácido ferúlico (Rt = 32,01 min)
em algumas amostras, sendo esses possivelmente os compostos (poli)fenólicos livres. Isto
porque, aproximadamente 85% dos (poli)fenóis dos grãos de milho encontram-se ligados aos
polissacarídeos de parede celular (ADOM & LIU 2002). No presente estudo, o uso de butanol-
HCl (70:30, v/v) como solução de extração foi um procedimento suficientemente severo para
liberar os (poli)fenóis ligados à parede celular do pericarpo dos grãos, como mostrado na Figura
6. Sugerimos que esses estão representados pelo pico com tempo de retenção em 18,82 min e
que, portanto, este não se refere a um composto isolado, mas aos ácidos hidroxicinâmicos, tais
como p-cumárico, caféico e ferúlico e seus derivados que estão presos aos polissacarídeos da
parede celular (PEDRESCHI & CISNEROS-ZEVALLOS, 2007). A identificação desses ácidos
hidroxicinâmicos liberados durante a extração dos polissacarídeos de parede celular não foi
possível usando as condições cromatográficas descritas anteriormente. Para isso, seria necessário
realizar a hidrólise alcalina das amostras como foi realizado no estudo de PEDRESCHI &
CISNEROS-ZEVALLOS (2007).
Os resultados referentes à análise dos compostos (poli)fenólicos por CLAE nas
amostras de farinhas das VCLM e cultivares comerciais são apresentados na Tabela 2. As
156
principais diferenças foram observadas quanto à presença de (poli)fenóis livres. Nesse sentido, o
ácido clorogênico foi detectado apenas nas VCLM Rosado, Cateto, Composto São Luis, Palha
Roxa do Emílio, Pixurum 5, Amarelão 3 e Roxo do Emílio, com teores variando entre 5,43 µg/g
a 38,35 µg/g. Na farinha dos cultivares comerciais, detectou-se ácido clorogênico em todas as
amostras (2,25 µg/g a 30,66 µg/g), exceto para a BRS1030. O conteúdo de ácido caféico variou
entre 5,52 µg/g a 43,47 µg/g nas variedades Cateto Vermelho, Pires, MPA2, Pixurum 6, Pixurum
1, Palha Roxa, Amarelão, Rajado 8 Carreiras, Roxo do Valdecir, Roxo do Emílio e Mato Grosso.
Nos cultivares comerciais apenas BRS1030 (9,16 µg/g) e Pioneer 3069 (16,07 µg/g)
apresentaram esse metabólito secundário. O ácido ferúlico livre foi detectado nas VCLM Cateto
Vermelho, Cateto, Composto São Luis, MPA13, Asteca, Mato Grosso Palha Roxa, Língua de
Papagaio, Pixurum 1, Rajado 8 Carreiras e Roxo do Emílio (3,09 µg/g a 13,33 µg/g) e em todos
os cultivares comerciais (5,63 µg/g a 17,88 µg/g), exceto AS-3430. Esses são resultados de
interesse, uma vez que alguns desses compostos (por exemplo os ácidos ferúlico e caféico) são
encontrados em quantidades significativas apenas em grãos, como o milho, o trigo e o arroz. O
ácido ferúlico é reconhecido por apresentar atividade antioxidante, protegendo as membranas
celulares (SRINIVASAN et al., 2006), anti-mutagênica (MURAKAMI et al., 2002) e por
preventiva de doenças como o câncer (SRINIVASAN et al., 2006) e aterogênese
(RUKKUMANI et al., 2004).
O ácido gálico, um (poli)fenol simples (variação de 113,89 µg/g - 265,14 µg/g para as
VCLM e 137,82 µg/g - 189,41 µg/g para os comerciais), e o ácido protocatecuico (variação de
97,27 µg/g - 224,62 µg/g para as VCLM e 116,15 µg/g - 422,89 µg/g para comerciais),
importantes constituintes do chá verde, foram, juntamente com o ácido hidroxicinâmico
(variação de 103,48 µg/g a 299,29 µg/g –VCLM- e 121,62 µg/g a 310,00 µ
g/g – comerciais), os
compostos mais abundantes na maioria das amostras. Tal resultado apresenta significância dada
à comprovada atividade anti-carcinogênica (KATIYAR & MUKHTAR, 1996; LANDRAULT et
al., 2001) daqueles metabólitos.
No milho amarelo, diversos estudos mostraram serem os ácidos p-hidroxibenzóico,
vanílico, protocateíco, siríngico, p-cumárico, ferúlico, caféico e sinápico os (poli)fenóis livres
mais importantes (ADOM & LIU, 2002; GUELDNER et al., 1992; HEDIN & CALLAHAN,
1990; SNOOK et al., 1995; SOSULSKI et al., 1982). No entanto, diferenças de composição
157
(poli)fenólica entre variedades também se devem ao local de cultivo, uma vez que a síntese
desses compostos está fortemente correlacionada às condições ambientais.
Diferenças altamente significativas (P<0,01) entre as médias dos 31 tratamentos foram
observadas para as seis variáveis analisadas (ácido protocatecuico, ácido gálico, ácido
clorogênico, ácido caféico, ácido t-cinâmico e ácido ferúlico). O resumo da análise estatística
univariada (ANOVA) está mostrado na Tabela 2, porém as diferenças detectadas entre as
variedades não foram indicadas pela dificuldade de apresentação do grande número de resultados
obtidos (diferenças). Sendo assim, adotou-se a estratégia de comparação dos resultados
quantitativos também através de PCA, visando o agrupamento das variedades em função dos
conteúdos de compostos (poli)fenólicos.
O cálculo dos componentes principais (PCA) foi realizado a partir da matriz de
covariância dos dados cromatográficos dos 6 tratamentos. A dispersão das variáveis (variedades)
segundo os eixos cartesianos PC1 e PC2 está apresentada na Figura 13.
TABELA 2 - Resumo da análise de variância das variáveis ácido protocatecuico, ácido gálico,
ácido clorogênico, ácido caféico, ácido t-cinâmico e ácido ferúlico determinados na farinha dos
grãos das variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais estudados.
Fonte de
variação
Ácido
protocatecuico
Ácido
gálico
Ácido
clorogênico
Ácido
caféico
Ácido t-
cinâmico
Ácido
ferúlico
Quadrado
Médio (ANOVA
)
12000,04**
3760,91**
406,57**
213,87**
8153,21**
75,34**
Média 180,21 171,87 7,27 5,27 202,60 3,90
Desvio padrão 65,79 39,00 13,35 9,72 54,55 5,89
CV (%) 13,77 12,17 113,11 114,80 10,70 99,22
** P < 0,01 - teste Tukey.
O eixo PC1 apresenta a amplitude de valores para a variável ácido protocatecuico, sendo
o componente de maior contribuição à explicação da variância total dos dados (61,0%). O eixo
PC2, que corresponde ao ácido t-cinâmico, explicou em 25,97% a variância dos resultados,
sendo que a variância acumulada nos dois primeiros autovetores correspondeu cerca de 87%. Os
resultados de autovalores, as percentagens de variância e os autovetores (coeficientes de
ponderação das variáveis) estão mostrados na Tabela 3.
158
FIGURA 13 - Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de conteúdo médio de ácido protocatecuico e ácido t-cinâmico
encontrados nas amostras de farinha das 26 variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais em estudo. R8C =
Rajado 8 carreiras, CV = Cateto Vermelho, RV = Roxo do Valdecir, Palha RE = Palha roxo do emílio; Ros. = Rosado, LP =
Língua de Papagaio, RE = Roxo do Emílio, Cat. = Cateto.
Coeficientes de ponderação das variáveis (Auvetor)
Componente
Principal
Variância
(Autovalor)
Explicação da
variância total (%)
Variância
acumulada
(%) Protocatecuico Gálico Clorogênico Caféico t-Cinâmico Feúlico
PC1 4913,44 61,00 61,00 0,837 0,143 0,041 0,022 0,524 0,046
PC2
2091,41 25,97 86,97 -0,389 -0,516 0,076 0,092 0,752 0,032
PC3 791,65 9,83 96,80 -0,372 0,835 0,077 0,185 0,349 0,032
PC4 188,94 2,34 99,14 0,002 0,001 -0,951 0,284 0,067 -0,091
159
TABELA 3 – Componentes principais (PC) da análise de PCA dos dados quantitativos de (poli)fenóis (ácido protocatecuico,
ácido gálico, ácido clorogênico, ácido caféico, ácido t-cinâmico e ácido ferúlico) determinados na farinha dos grãos das variedades
crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais.
160
As variáveis ácido protocatecuico e ácido t-cinâmico apresentaram os maiores
autovetores em valor absoluto nos componentes de maior autovalor (maior proporção de
variação explicada) sendo, portanto, consideradas de maior importância para explicar a
variabilidade na composição de (poli)fenóis.
Dessa forma, as variedades com os maiores conteúdos de ácido protocatecuico
agruparam-se em PC1 ( + ) e com os maiores conteúdos de ácido t-cinâmico em PC2 (+).
A análise do resultado de PCA indicou que as variedades com maior conteúdo de
(poli)fenóis e portanto, de maior valor nutricional são as localizadas na região positiva de
ambos os eixos, a saber Mato Grosso, Amarelão, Cateto Vermelho, Roxo do Valdecir,
Rajado 8 carreiras, Composto São Luis e o cultivar comercial Pionner 3069. O cultivar
AG-9090 não se agrupou às demais variedades em função do elevado conteúdo de ácido
protocatecuico detectado na mesma. Por outro lado, as variedades com menor conteúdo
de ácido protocatecuico e ácido t-cinâmico foram Cunha, Branco e Palha Roxa do
Emílio, localizando-se em PC 1 e PC2 ( - ).
O emprego dessa ferramenta estatística aos dados quantitativos mostrou-se
bastante eficiente na visualização das diferenças entre variedades, permitindo a rápida
detecção de farinhas com maior conteúdo de (poli)fenóis e portanto, maior valor
nutricional.
Serão necessários estudos posteriores que forneçam um maior detalhamento da
constituição (poli)fenólica nas amostras das VCLM, tendo em vista o crescente interesse
nessa classe de compostos. É importante considerar que apesar do maior conteúdo
(poli)fenólico, do milho, estar associado aos polissacarídeos de parede celular, estudos
prévios mostraram que a microflora intestinal humana pode liberá-los, acarretando em
um aumento da concentração dos mesmos no plasma sanguíneo (ANDREASEN et al.,
2001).
4.4 Carotenóides
4.4.1 Identificação e quantificação
Os valores de conteúdo médio de carotenóides totais, determinados por
espectrofotometria UV-visível e a fórmula de Lamber-Beer, para os grãos das VCLM e
161
para os cultivares comerciais, conforme protocolo descrito por AMAN et al. (2005), estão
apresentados na Tabela 4. Este método mostrou-se bastante adequado, dada à
simplicidade, rapidez e elevada repetibilidade do protocolo, o que pode ser evidenciado
pelos baixos valores de desvio padrão (Tabela 4). Tomando-se como referencial o
conteúdo médio de 15 µg/g, detectado na maioria das variedades comerciais em estudo, as
VCLM revelaram menor potencial como fonte daqueles compostos.
Apenas as variedades Pixurum 06, MPA 2, Pixurum 04, Asteca, Pires, MPA 1 e
Roxo do Emílio apresentaram valores superiores a 15 µg/g. Esses resultados estão de
acordo com os registros da literatura para carotenóides em grãos de milho, sendo que uma
grande amplitude de conteúdos (0,5 – 23 µg/g) tem sido relatada, o que parece estar
relacionado com o potencial de cada genótipo (MANGELS et al., 1993). As VCLM MPA
01 e Roxo do Emílio, com as maiores concentrações de carotenóides totais (∼19 µg/g),
apresentam, portanto, um maior potencial de uso em programas de melhoramento
genético local visando, por exemplo, incrementos de valor nutricional de grãos, conforme
estudo em andamento (OGLIARI & KIST, 2007 - informação pessoal). De forma similar,
estas variedades são de maior relevância às indústrias alimentar e farmacêutica,
comparativamente às demais VCLM em estudo. É ainda interessante especular que estas
seriam as variedades menos suscetíveis ao ataque de patógenos, uma vez que os
carotenóides agem como um importante reservatório de moléculas sinalizadoras, muitas
delas voláteis. A clivagem enzimática de carotenóides produz apocarotenóides que atuam
nas interações de alelopatia e no sistema de defesa das plantas (BOUVIER et al., 2005).
Com relação à pigmentação dos grãos, é importante destacar que algumas
variedades com grãos vermelhos e roxos (Roxo do Emílio, Roxo do Valdecir, Mato
Grosso Palha Roxa e Palha Roxa do Emílio) apresentaram conteúdos elevados de
carotenóides (~ 15 µg/g), sendo considerados genótipos com elevado potencial de uso
pelo reservatório de metabólitos secundários de interesse presentes.
162
TABELA 4 - Concentração média* (µg/g, média
±
desvio padrão) de carotenóides totais
**
, zeaxantina, luteína, β-criptoxantina, β-
caroteno e α-caroteno
***
em amostras de sementes de variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais.
Variedade
Total Zeaxantina Luteína
β
-criptoxantina
β
-caroteno
α
-caroteno
MPA 13
2,01
±
0,03 0,16
±
0,13 0,06
±
0,09
n.d. n.d. n.d.
Branco
4,47
±
0,62 0,07
±
0,09 0,03
±
0,05
n.d. n.d. n.d.
Rajado 8 carreira
5,67
±
1,03 0,30
±
0,05 0,10
±
0,02 0,05
±
0,01 0,01
±
0,00 0,02
±
0,00
Rosado (Rajado)
6,73
±
0,89 0,64
±
0,13 0,35
±
0,08 0,01
±
0,01 0,01
±
0,00
n.d.
Palha Roxa 2
7,30
±
0,30 1,49
±
0,28 0,63
±
0,10 0,01
±
0,01 0,02
±
0,01 0,01
±
0,00
Pixurum 07
7,46
±
0,46 0,08
±
0,03 0,04
±
0,04
n.d. n.d. n.d.
Moroti
7,46
±
0,35 0,07
±
0,12 1,42
±
0,33
n.d. n.d. n.d.
Cateto
8,26
±
1,38 1,88
±
0,35 1,10
±
0,19 0,02
±
0,00 0,01
±
0,00 0,02
±
0,00
Amarelão 3
9,31
±
1,95 1,18
±
0,08 0,59
±
0,05 0,01
±
0,00 0,01
±
0,00 0,01
±
0,00
Pixurum 05
9,33
±
2,68 1,39
±
0,22 0,65
±
0,15 0,02
±
0,01 0,02
±
0,00 0,02
±
0,00
Cateto Vermelho
9,68
±
1,27 2,52
±
0,05 1,25
±
0,05 0,03
±
0,00 0,03
±
0,00 0,01
±
0,00
Mato Grosso
10,75
±
0,30 2,37
±
0,26 2,57
±
0,08 0,05
±
0,01 0,02
±
0,00 0,01
±
0,00
Composto São Luis
11,14
±
2,36 2,03
±
0,32 1,44
±
0,21 0,04
±
0,00 0,02
±
0,00 0,01
±
0,00
Cunha 1
11,79
±
0,03 3,50
±
0,89 0,48
±
0,45 0,02
±
0,01 0,03
±
0,01 0,02
±
0,01
Língua de Papagaio
11,79
±
3,06 4,43
±
0,35 0,61
±
0,09 0,04
±
0,01 0,03
±
0,00 0,01
±
0,00
Pixurum 01
12,80
±
0,70 3,00
±
0,18 1,35
±
0,08 0,04
±
0,00 0,03
±
0,00 0,01
±
0,00
Mato Grosso Palha Roxa
13,20
±
0,19 3,97
±
0,27 2,52
±
0,11 0,03
±
0,00 0,03
±
0,01 0,02
±
0,00
Roxo do Valdecir
13,45
±
1,84 4,82
±
0,15 1,86
±
0,08 0,02
±
0,01 0,03
±
0,00 0,02
±
0,00
Variedades Locais
Palha Roxa 1 do Emílio
14,41
±
2,28 2,40
±
0,67 0,84
±
0,25 0,03
±
0,01 0,02
±
0,00 0,01
±
0,00
163
Pixurum 06
14,99
±
2,44 4,26
±
0,63 1,30
±
0,23 0,02
±
0,02 0,03
±
0,01 0,01
±
0,01
MPA 02
16,19
±
2,14 5,97
±
1,29 2,76
±
0,60 0,05
±
0,01 0,04
±
0,00 0,02
±
0,00
Pixurum 04
16,79
±
0,70 4,49
±
0,43 2,48
±
0,17 0,05
±
0,01 0,04
±
0,00 0,02
±
0,00
Asteca
16,79
±
1,79 3,90
±
0,48 2,44
±
0,26 0,04
±
0,01 0,04
±
0,01 0,02
±
0,01
Pires
17,15
±
0,89 4,18
±
0,09 2,36
±
0,06 0,04
±
0,01 0,03
±
0,00 0,02
±
0,00
MPA 01
18,88
±
1,38 7,05
±
1,17 3,69
±
0,88 0,06
±
0,01 0,04
±
0,01 0,02
±
0,01
Roxo do Emílio
19,63
±
2,22 10,70
±
2,54 0,85
±
0,08 0,10
±
0,02 0,04
±
0,00 0,03
±
0,00
BR106
7,19
±
0,03 1,30
±
0,41 0,60
±
0,17 0,01
±
0,00 0,02
±
0,00
n.d.
AG-9090
14,01
±
1,22 3,54
±
0,60
n.d.
0,05
±
0,01 0,04
±
0,00 0,02
±
0,00
Pioneer 3069
18,68
±
3,90 7,22
±
1,61
n.d.
0,05
±
0,01 0,04
±
0,00 0,01
±
0,00
BRS 1030
23,13
±
0,89 12,55
±
0,23 1,34
±
0,13 0,05
±
0,01 0,04
±
0,00 0,02
±
0,00
Variedades
Comerciais
AS-3430
25,59
±
0,79 9,09
±
1,14
n.d.
0,05
±
0,01 0,04
±
0,00 0,01
±
0,00
* Média de 3 extrações SD (desvio padrão da média); ±
** Determinado por espectrofotometria UV-visível (450ηm) e
(ε) de 2348 M
-1
.cm
-1
);
*** Determinado por CLAE (450ηm ) e conteúdo de carotenóides calculados através da intensidade do pico de interesse;
164
No entanto, os cultivares comerciais analisados apresentaram os valores médios de
carotenóides totais mais elevados, destacando-se o cultivar AS-3430, com cerca de 25
µg/g. Tal informação é de interesse, porque indica que os programas de melhoramento
genético convencionais para milho utilizados no Brasil vêm selecionando genótipos com
quantidades apreciáveis desses metabólitos secundários, um aspecto associado à maior
aceitação desta característica pelo mercado nacional. De fato, segundo SERNA-
SALDIVAR et al. (2001), no Brasil, os grãos de milho de cor amarela intensa são
preferidos aos demais.
Após a quantificação dos carotenóides totais dos grãos de milho, procedeu-se à
análise cromatográfica das amostras em estudo, visando à identificação e quantificação
dos compostos de interesse. A CLAE revelou serem as xantofilas zeaxantina e luteína os
carotenóides predominantes (Figura 14), sendo possível também a detecção de pequenas
quantidades de β-criptoxantina, β-caroteno e α-caroteno em algumas amostras em estudo
(Tabela 4).
A identificação de zeaxantina, luteína e β-caroteno foi realizada através da
comparação dos tempos de retenção detectados nos cromatogramas das amostras com os
tempos de retenção de compostos padrões, enquanto β-criptoxantina e α-caroteno foram
identificados com base na comparação de perfis de eluição obtidos em trabalhos de
estudos de identificação de carotenóides em sementes de milho em condições analíticas
similares (SCOTT & ELDRIDGE, 2005; HULSHOF et al., 2007).
Os perfis de eluição cromatográfica revelaram ainda a existência de outros 2
sinais (Figura 14), cuja identificação dos compostos ainda não foi possível. Pode-se
observar na Figura 14, que os tempos de retenção para as xantofilas luteína e zeaxantina
foram 4,41 min e 4,61 min, respectivamente, demonstrando a existência de um efeito de
co-eluição, resultando em sobreposição parcial das áreas dos dois picos de interesse.
165
FIGURA 14 - Perfil cromatográfico de carotenóides (CLAE, 450 ηm) presentes na
fração organosolvente extraída de amostras de sementes da variedade Roxo do Valdecir.
S = solvente; 1 e 2 = compostos não identificados.
Tal fato pode ser explicado levando-se em conta que estes compostos são
isômeros de posição. A utilização de coluna de fase quiral para a separação destes
compostos é indicada à otimização do perfil cromatográfico (MOROS et al., 2002;
HUSHOLF et al., 2007), ainda que o perfil de eluição obtido tenha sido considerado
satisfatório. Em função disto, para efeitos de quantificação destes compostos optou-se
pela utilização da intensidade dos sinais de interesse, ao invés da integral da área dos
mesmos.
Diferenças significativas (P<0,01) entre o conteúdo médio dos 31 tratamentos
foram observadas para todos os carotenóides identificados por CLAE, como mostrado de
forma resumida na Tabela 5.
As análises quantitativas de zeaxantina e luteína (Tabela 4) detectaram
amplitudes de concentração entre 10,7 µg/g e 0,07 µg/g para a xantofila zeaxantina, nos
grãos das VCLM Roxo do Emílio e Branco, respectivamente, e 3,69 µg/g e 0,03 µg/g
para a luteína nas variedades MPA01 e Branco. Para os cultivares comerciais o conteúdo
de zeaxantina variou entre 12,55 µg/g e 1,30 µg/g para AS-3430 e BR106,
respectivamente e de luteína entre 0,0 µg/g (não detectado) para AG-9090, Pioneer 3069
e AS-3430 e 1,30 µg/g para o cultivar BRS1030. Esses resultados estão em conformidade
166
ao descrito na literatura que relata conteúdos de luteína e zeaxantina nos grãos de milho
variando entre 0,5 µg/g a 23 µg/g (MANGELS et al., 1993).
TABELA 5 - Resumo da análise de variância das variáveis zeaxantina, luteína, β-
criptoxantina, β-caroteno e α-caroteno determinados na farinha dos grãos das variedades
crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais estudados.
Fonte de
variação
Zeaxantina
Luteína
β-criptoxantina
β-caroteno
α-caroteno
Quadrado
Médio (ANOVA
)
29,43**
3,01**
0,002**
0,001**
0,0001**
Média 3,57 1,15 0,03 0,02 0,01
Desvio padrão 3,15 1,01 0,02 0,01 0,01
CV (%) 20,61 21,45 29,54 15,85 26,37
** P < 0,01 - teste Tukey.
Os resultados quantitativos encontrados no presente estudo foram bastante
satisfatórios quando comparados aos da literatura, considerando que o protocolo usado
para a extração desses metabólitos não compreendeu etapas de saponificação e/ou de re-
extração. Embora, tenha sido observado ao final da extração um resíduo (farinha) ainda
com coloração amarela, possivelmente em decorrência da presença de pigmentos
carotenoídicos, optamos por um protocolo rápido e simples, uma vez que MOROS et al.
(2002), após 5 etapas de re-extração conseguiram aumentar o conteúdo desses pigmentos
de 20,09 µg/g para apenas 22,81 µg/g. A baixa recuperação obtida após vários passos de
re-extração pode ser pelo fato desses compostos estarem fortemente associados às
proteínas zeínas do endosperma conforme sugerido por TSUI & CHERYAN (2007).
Por outro lado, baixos conteúdos de β-criptoxantina, β-caroteno e α-caroteno,
foram observados nos grãos das VCLM e dos cultivares comerciais, comparativamente às
xantofilas zeaxantina e luteína. Para as variedades locais de milho, Roxo do Emílio
apresentou os maiores teores destes três carotenóides (0,10 µg/g; 0,04 µg/g e 0,03 µg/g
para β-criptoxantina, β-caroteno e α-caroteno, respectivamente), enquanto os cultivares
comerciais apresentaram conteúdos similares dos mesmos (0,05 µg/g; 0,04 µg/g e 0,02
167
µg/g para β-criptoxantina, β-caroteno e α-caroteno, respectivamente). Dessa forma,
considerando os teores dos dois carotenos identificados (β- e α-caroteno) e do
monohidroxi-carotenóide (β-criptoxantina), assume-se que o germoplasma analisado não
possuei potencial de uso como alimento funcional ou como matéria prima para a extração
dos mesmos. Conteúdos superiores destes compostos em cultivares de milhos comerciais,
como por exemplo, 9,8 µg/g de β-criptoxantina, 2,8 µg/g de β-caroteno e 3,90 µg/g de α-
caroteno foram registrados recentemente (BERARDO et al., 2004; HULSHOF et al.,
2007).
Devemos ainda considerar, como observado na Tabela 4, que as diferenças
detectadas na constituição carotenoídica dos grãos das VCLM de milho são
principalmente de natureza quantitativa. Sendo assim, o perfil carotenoídico para os grãos
das VCLM e dos cultivares comerciais, para as duas xantofilas majoritárias, está
mostrado na Figura 15. Pode-se notar que para as VCLM, Roxo do Emílio, Língua de
Papagaio e Cunha, o carotenóide zeaxantina foi o composto majoritário, representado
aproximadamente 91,20%; 86,35% e 86,30% do conteúdo total de carotenóides,
determinado por CLAE, respectivamente. A luteína, por sua vez, foi encontrada em maior
proporção que os demais carotenóides nos grãos das variedades Moroti (94,91%), Mato
Grosso (51,28%) e Composto São Luis (40,92%). Os demais carotenóides não
representaram mais do que 3% do conteúdo total para todas as variedades estudadas.
Além disso, nos grãos de todos os cultivares comerciais observou-se um conteúdo
bem superior da xantofila zeaxantina, representando 99,41; 99,31; 98,47; 89,61 e 67,04%
do conteúdo total de carotenóides para AS-3430, Pioneer 3069, AG-9090, BRS1030 e
BR106, respectivamente. De fato, os dados da literatura permitem constatar que os
carotenóides zeaxantina e luteína estão presentes em todas as variedades de milho
estudadas até o momento, e em alguns casos β-criptoxantina, β-caroteno e α-caroteno. As
diferenças no perfil quantitativo desses compostos, consoante ao processo de
melhoramento genético utilizado para a obtenção do genótipo de interesse já vêm sendo
observadas em estudos anteriores (MANGELS et al., 1993; BERARDO et al., 2004;
SCOTT & ELDRIDGE, 2005; HULSHOF et al., 2007).
168
FIGURA 15 – Percentagem de luteína e zeaxantina sobre o conteúdo total de carotenóides determinado por CLAE (450ηm) em
grãos das variedades crioulas e locais de milho e dos cultivares comerciais em estudo.
169
4.4.2 Purificação
Os resultados obtidos por espectrofotometria UV-visível e CLAE revelaram que
quantidades de interesse de carotenóides estão presentes nas farinhas de milho de algumas
VCLM, assim como nos cultivares comerciais, caracterizando essas biomassas como uma
importante matéria-prima para a elaboração de alimentos funcionais. Nesse contexto,
diversos estudos têm sugerido que luteína e zeaxantina possuem efeito inibitório sobre o
crescimento tumoral (PARK et al., 1998) e estimulatório sobre a função imunológica em
ensaios utilizando modelos de culturas celulares in vitro e em camundongos (CHEW &
PARK, 2004). Dessa forma, tendo em vista o crescente interesse na obtenção de luteína ou
zeaxantina para a produção de suplementos alimentares e alimentos funcionais
(RODRIGUES & SHAO, 2004), variedades de milho que tenham conteúdos elevados
destas xantofilas são de grande interesse para a indústria alimentícia, nutricêutica e
farmacêutica. De fato, o alto teor de carotenóides mostra-se como uma característica
particularmente importante para aumentar o valor comercial de grãos de milho de
variedades específicas, bem como o uso destes genótipos em programas de melhoramento
genético deste cereal. Portanto, são necessários estudos aprofundados de caracterização
bem como de purificação dos mesmos a partir da biomassa de interesse, isto é, grãos de
milho. Diante disso, extratos organosolventes destes pigmentos foram obtidos e purificados
por cromatografia líquida em coluna (CLC), seguido de análise das frações de interesse por
espectrofotometria UV-visível e CLAE.
Diversas fases estacionárias, tais como DEAE-Sepharose, celulose e
MgO/Hiflosupercel são adequadas à purificação de compostos carotenoídicos (SCHOEFS,
2004). MÍNGUEZ-MOSQUERA et al. (2002) relatam o uso de celulose, sacarose, amido,
carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, carbonato de zinco, óxido de alumínio, hidróxido de
cálcio, óxido de cálcio e sílica gel como fases estacionárias adequadas à separação de
carotenóides em sistemas de CLC. A escolha de uma fase estacionária depende da
polaridade dos carotenóides constituintes da amostra. Segundo MÍNGUEZ-MOSQUERA
et al. (2002), os carotenos são separados mais eficientemente usando hidróxido de cálcio
ou óxido de alumínio, enquanto para as xantofilas o emprego de uma fase estacionária de
fraca adsorção, como a celulose, seria uma melhor opção. De forma similar, a seleção da
fase móvel também está diretamente ligada à polaridade dos carotenóides a separar. Éter de
170
petróleo, hexano, ciclohexano, benzeno, tolueno, éter etílico, acetona, acetato de etila,
diclorometano, álcool tert-butil, n-propanol, etanol, metanol e piridina são alguns dos
solventes empregados como fase móvel descritos na literatura. Normalmente, misturas de
éter etílico, benzeno ou acetona em éter de petróleo, ou etanol em éter etílico ou acetato de
etila em benzeno são empregadas (MÍNGUEZ-MOSQUERA et al., 2002).
O método selecionado para purificar os carotenóides dos grãos de milho no
presente estudo considerou o uso de coluna cromatográfica, tendo o óxido de alumínio
como fase estacionária e a eluição das amostras com solventes orgânicos de polaridade
crescente. Uma vez isoladas e purificadas, as frações carotenoídicas obtidas foram
identificadas através de suas propriedades físico-químicas e espectroscópicas. Os perfis
espectrais do UV-visível das frações obtidas através da CLC confirmaram serem os
carotenóides os pigmentos predominantes nestas, revelando valores máximos de absorção
entre 410 e 480 ηm (Figura 16).
Éter de petróleo
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
3
5
0
38
0
41
0
440
47
0
500
5
3
0
560
590
620
65
0
68
0
71
0
740
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter de petróleo + Éter etílico
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
3
5
0
380
4
10
4
4
0
4
70
5
0
0
5
30
5
6
0
5
90
6
2
0
650
6
80
710
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
350
3
8
0
41
0
4
4
0
47
0
500
53
0
56
0
59
0
620
6
5
0
68
0
7
1
0
74
0
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico + Álcool etílico
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
3
5
0
3
80
410
4
4
0
4
70
500
5
3
0
5
60
59
0
620
6
50
68
0
71
0
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
AB
C
D
Éter de petróleo
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
3
5
0
38
0
41
0
440
47
0
500
5
3
0
560
590
620
65
0
68
0
71
0
740
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter de petróleo + Éter etílico
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
3
5
0
380
4
10
4
4
0
4
70
5
0
0
5
30
5
6
0
5
90
6
2
0
650
6
80
710
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
350
3
8
0
41
0
4
4
0
47
0
500
53
0
56
0
59
0
620
6
5
0
68
0
7
1
0
74
0
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico + Álcool etílico
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
3
5
0
3
80
410
4
4
0
4
70
500
5
3
0
5
60
59
0
620
6
50
68
0
71
0
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
AB
C
D
Éter de petróleo
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
3
5
0
38
0
41
0
440
47
0
500
5
3
0
560
590
620
65
0
68
0
71
0
740
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter de petróleo + Éter etílico
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
3
5
0
380
4
10
4
4
0
4
70
5
0
0
5
30
5
6
0
5
90
6
2
0
650
6
80
710
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
350
3
8
0
41
0
4
4
0
47
0
500
53
0
56
0
59
0
620
6
5
0
68
0
7
1
0
74
0
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico + Álcool etílico
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
3
5
0
3
80
410
4
4
0
4
70
500
5
3
0
5
60
59
0
620
6
50
68
0
71
0
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
AB
C
D
450ηm
450ηm
450ηm
440ηm
Éter de petróleo
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
3
5
0
38
0
41
0
440
47
0
500
5
3
0
560
590
620
65
0
68
0
71
0
740
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter de petróleo + Éter etílico
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
3
5
0
380
4
10
4
4
0
4
70
5
0
0
5
30
5
6
0
5
90
6
2
0
650
6
80
710
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
350
3
8
0
41
0
4
4
0
47
0
500
53
0
56
0
59
0
620
6
5
0
68
0
7
1
0
74
0
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico + Álcool etílico
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
3
5
0
3
80
410
4
4
0
4
70
500
5
3
0
5
60
59
0
620
6
50
68
0
71
0
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
AB
C
D
Éter de petróleo
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
3
5
0
38
0
41
0
440
47
0
500
5
3
0
560
590
620
65
0
68
0
71
0
740
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter de petróleo + Éter etílico
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
3
5
0
380
4
10
4
4
0
4
70
5
0
0
5
30
5
6
0
5
90
6
2
0
650
6
80
710
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
350
3
8
0
41
0
4
4
0
47
0
500
53
0
56
0
59
0
620
6
5
0
68
0
7
1
0
74
0
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico + Álcool etílico
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
3
5
0
3
80
410
4
4
0
4
70
500
5
3
0
5
60
59
0
620
6
50
68
0
71
0
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
AB
C
D
Éter de petróleo
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
3
5
0
38
0
41
0
440
47
0
500
5
3
0
560
590
620
65
0
68
0
71
0
740
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter de petróleo + Éter etílico
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
3
5
0
380
4
10
4
4
0
4
70
5
0
0
5
30
5
6
0
5
90
6
2
0
650
6
80
710
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
350
3
8
0
41
0
4
4
0
47
0
500
53
0
56
0
59
0
620
6
5
0
68
0
7
1
0
74
0
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
Éter etílico + Álcool etílico
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
3
5
0
3
80
410
4
4
0
4
70
500
5
3
0
5
60
59
0
620
6
50
68
0
71
0
7
40
Comprimento de onda (nm)
Absorbância
AB
C
D
450ηm
450ηm
450ηm
440ηm
FIGURA 16 - Perfil espectral de varredura (350-750 ηm) das frações organosolventes
purificadas de carotenóides de grãos de milho (VCLM MPA1), segundo a fase móvel
utilizada na CLC. A – éter de petróleo; B – éter de petróleo: éter etílico (1:1, v/v); C - éter
etílico; D - éter etílico: álcool etílico (1:1, v/v). As setas indicam o comprimento de onda de
absorção máxima para as respectivas frações.
171
Segundo MÍNGUEZ-MOSQUERA et al. (2002), os comprimentos de onda onde as
máximas absorbâncias para o β-caroteno são observadas em 429, 452 e 478 ηm
(acetona)
.
Para as xantofilas luteína e zeaxantina, as absorbâncias máximas são detectadas em 422,
445, 474 ηm
(etanol)
e 430, 452, 479 ηm
(acetona)
, respectivamente. Portanto, os resultados
apresentados na Figura 16 estão de acordo com a literatura, uma vez que o comprimento
de onda aonde se detectou máxima absorção para as frações éter de petróleo, éter etílico e
éter etílico: álcool etílico (1:1, v/v) foi 450 ηm e para a fração éter de petróleo: éter etílico
(1:1, v/v) foi 440 ηm.
As frações obtidas foram também caracterizadas usando CLAE, onde se observou
que o β-caroteno e outros carotenóides de mesma polaridade foram eluídos
preferencialmente com a utilização da mistura de solventes éter de petróleo: éter etílico
(1:1, v/v) na CLC. Na Figura 17 é apresentado o cromatograma dessa fração rica em β-
caroteno. De fato, a CLAE revelou ser aquele pigmento o metabólito majoritário naquela
fração para as amostras em estudo, representando cerca de 50% do conteúdo carotenoídico
total.
Adicionalmente, a análise dos perfis cromatográficos revelou que os compostos β-
criptoxantina e α-caroteno co-eluíram na fração éter de petróleo + éter etílico (50%, v/v),
assim como uma pequena quantidade da xantofila luteína.
FIGURA 17 - Perfil cromatográfico (CLAE, 450 ηm) da fração eluída com éter de
petróleo + éter etílico (50%, v/v) na CLC do extrato carotenoídico da variedade MPA1. S
= solvente.
172
As xantofilas (zeaxantina e luteína), por sua vez, eluiram com a mistura de éter
etílico: álcool etílico (1:1, v/v), sendo o grau de pureza obtido para estes compostos
dependente de suas quantidades na amostra. Isto porque, em processos de separação
cromatográfica utilizando colunas de fase reversa, como no presente caso, a separação de
zeaxantina e luteína é menos eficiente, comparativamente à utilização de coluna
cromatográfica de fase quiral, porque os compostos são isômeros de posição. A despeito do
uso de coluna de fase reversa nos experimentos, a purificação das xantofilas do cultivar
BRS1030 permitiu a obtenção de amostras de zeaxantina com um grau de pureza de 93%,
por ser aquele pigmento sua xantofila majoritária, enquanto a variedade local MPA01
apresentou um grau de pureza da mistura isomérica zeaxantina/luteína de 88% (Figura
18).
Os resultados obtidos sugerem que a estratégia de extração e de purificação dos
carotenóides de milho usando CLC foi bastante eficiente para as xantofilas predominantes
nos grãos do cereal estudado. Cabe ressaltar que esses pigmentos têm hoje, elevado valor
de mercado, 1 mg de luteína (grau de pureza 98%) custa R$ 264,00 (Sigma) e a
disponibilidade de zeaxantina pura é bastante limitada. Dessa forma, algumas das VCLM e
cultivares comerciais por apresentarem mais de 90% de seus carotenóides representados
por zeaxantina são fonte em potencial para serem usadas como matéria-prima para
extração dos mesmos.
FIGURA 18 - Cromatograma (CLAE, 450 ηm) da fração carotenoídica eluida com éter
etílico: álcool etílico (1:1, v/v) de amostras de sementes do cultivar comercial BRS1030
(A) e da variedade local MPA01 (B).
173
5 CONCLUSÕES
Os resultados encontrados no presente estudo revelaram, nas amostras de algumas
variedades, quantidades apreciáveis de metabólitos secundários com propriedades
biológicas de crescente interesse na atualidade. A determinação dos perfis metabólicos
realizada poderá ser utilizada futuramente para agregar valor às matérias-primas oriundas
das variedades de forma diferenciada. Nesse sentido, a detecção de flobafenos nos grãos de
duas variedades roxas está correlacionada com o maior potencial de defesa das mesmas
contra herbívoros e/ou microorganismos patogênicos. Além disso, esses são compostos de
alto valor agregado, uma vez que apresentam aplicação farmacológica e/ou industrial,
podendo ser usados como antioxidantes, anti-sépticos e no desenvolvimento de sabor
adstringente de bebidas. Da mesma forma, o elevado conteúdo de (poli)fenóis, detectado
usando CLAE, nas farinhas das variedades Mato Grosso, Amarelão, Cateto Vermelho,
Roxo do Valdecir, Rajado 8 carreiras, Compostos São Luis e Pionner 3069 sugere um
maior valor nutricional para as mesmas pelo reconhecido papel antioxidante exercido por
essa classe de compostos. Por outro lado, as farinhas das variedades comerciais possuem
maior valor nutricional quando comparadas às VCLM, exceto para Pixurum 6, MPA2,
Pixurum 4, Asteca, Pires, MPA1 e Roxo do Emílio, no que diz respeito ao conteúdo de
carotenóides. Os resultados encontrados nos permitiram concluir que aquelas variedades
podem ser usadas como matéria-prima para extração e obtenção dessa importante classe de
compostos, como demonstrado a partir de um protocolo de purificação usando
cromatografia em coluna aberta. Todos esses resultados reforçam o uso do milho como
alimento funcional podendo ser na forma de alimentos funcionais ou na produção de
suplementos alimentares.
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179
Capítulo 5
180
CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO (ÊNFASE EM CAROTENÓIDES,
POLIFENÓIS E ANTOCIANINAS) DE FLORES FEMININAS DE VARIEDADES
CRIOULAS E LOCAIS DE MILHO (Zea mays L.).
1 RESUMO
Na medicina tradicional os estigmas/estiletes (flores femininas) de milho são usados,
principalmente, no tratamento de desordens ligadas ao sistema urinário (diurético), hipertensão
e constipação, podendo apresentar um potencial farmacológico distinto em função de sua
composição química. No presente estudo foram determinados os perfis metabólicos com
ênfase às frações antociânica, polifenólica e carotenoídica de 8 variedades crioulas e locais de
milho (VCLM), originárias do extremo oeste de Santa Catarina, através de técnicas
espectroscópicas como FT-IR, 1H-RMN, UV-visível associadas à estatística multivariada
(análise dos componentes principais -PCA) e cromatográficas (CLAE). A análise dos tecidos
florais liofilizados por FT-IR (3000-600; 1650-1500 e 1250-900 ondas.cm
-1
) e PCA revelou
constituição química diferenciada para os mesmos. As antocianidinas pelargonidina e
cianidina foram identificadas por MALDI-TOF, no extrato metanólico bruto (MeOH-HCl,
1%,v/v), de duas VCLM. As diferenças quantitativas e qualitativas nos perfis espectrais UV-
visível (370 e 525 ηm) dos extratos metanólicos das VCLM foram facilmente identificadas
através de PCA. A 1H-RMN dos extratos brutos, associada à análise de PCA, resultou em um
padrão de distribuição das amostras semelhante ao obtido por UV-visível, refletindo as
diferenças na composição química. A determinação do conteúdo de antocianinas (460 e 525
ηm) e (poli)fenóis totais no extrato MeOH-HCl (1%,v/v) revelou diferenças entre as VCLM e
a variabilidade entre os indivíduos de uma mesma variedade. A partir da CLAE foram
identificados os ácidos protocatecuico, gálico e t-cinâmico como sendo os compostos
(poli)fenólicos majoritários do extrato metanólico, além de pequenas quantidades de ácido
siríngico e caféico. O principal pigmento carotenoídico identificado por CLAE (extrato
metanol-tolueno) das flores foi a luteína, seguido do β-caroteno, α-caroteno e zeaxantina.
Esses resultados demonstram a elevada diversidade química existente entre as variedades
cultivadas no extremo oeste de Santa Catarina e sugerem que as mesmas possuem um
potencial fitoquímico a ser explorado.
181
2 INTRODUÇÃO
Vários estudos etnobotânicos relatam o emprego do milho como planta medicinal por
povos com forte tradição cultural. O uso terapêutico mais citado para esta planta relaciona-se
ao sistema urinário, seguido do tratamento da hipertensão e constipação (VELÁZQUEZ et al.,
2005). O produto fitoterápico Herbal Maydis Stigma (estigmas de flores de Z. mays
desidratados e fragmentados), por exemplo, é uma das formas atuais de utilização terapêutica
desta planta, sendo reconhecida pela medicina popular e pela alopatia tradicional como um
diurético moderado, auxiliando na eliminação de cálculos renais. Adicionalmente, os estigmas
de milho são utilizados contra a hiperplasia de próstata, cistite, gota, nefrite crônica e
distúrbios similares (BRITISH HERBAL PHARMACOPOEIA, 1996; MAKSIMOSIĆ et al.,
2005). A despeito das diversas formas de uso referidas, os trabalhos relativos à caracterização
química desse tecido são escassos, sugerindo a necessidade de um detalhamento maior, como
subsídio à exploração racional daquela espécie como fonte de compostos bioativos de elevado
valor de mercado.
Tal caracterização pode ser mais facilmente obtida adotando-se como estratégia de
estudo uma abordagem adequada e dedicada à determinação do perfil metabólico
(metaboloma) daquele germoplasma, apoiada em estratégias analíticas consolidadas, como,
por exemplo, as espectroscopias UV-visível, vibracional no infravermelho com transformada
de Fourier (FT-IR) e de ressonância magnética nuclear associadas à quimiometria (SUMNER
et al., 2003).
A caracterização do perfil metabólico das flores femininas de milho deve ainda levar
em consideração as possíveis diferenças decorrentes da constituição genética das variedades.
Isto porque as variedades são o resultado de centenas de anos de domesticação, realizada por
diferentes povos e em localidades distintas. A adaptação de um dado germoplasma às
condições ambientais distintas e a pressão de seleção a ele imposta contribuem para a
heterogeneidade observada, por exemplo, na coloração dos mais diversos órgãos da planta,
tais como folhas, flores, caule e raízes, o que reflete diferenças qualitativas e quantitativas no
conteúdo de pigmentos, tais como os carotenóides, os polifenóis e as antocianinas. Nesse
contexto, a região extremo oeste de Santa Catarina caracteriza-se por ser um campo
estratégico para estudos dessa natureza, devido à ocorrência de mais de 30 variedades crioulas
182
e locais de milho (VCLM), como observado no município de Anchieta (OGLIARI & ALVES,
2006).
Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo analisar o perfil metabólico de
flores femininas de 8 VCLM cultivadas e desenvolvidas por pequenos agricultores do
extremo- oeste do estado de Santa Catarina (município de Anchieta, Brasil). Tal abordagem
enfatizou as frações carotenoídica, polifenólica e antociânica, como estratégia de exploração
do potencial fitoquímico, visando gerar subsídios à agregação de valor daquelas biomassas.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material Vegetal
Sementes das VCLM Língua de Papagaio, Roxo do Valdecir, Roxo do Emílio, Mato
Grosso Palha Roxa, Palha Roxa 1 do Emílio, Rosado, Rajado 8 carreiras e Cateto Vermelho
foram obtidas junto aos pequenos agricultores do município de Anchieta, localizado no
extremo-oeste catarinense, pelo Sindicato dos Trabalhadores na Agricultura Familiar
(SINTRAF) e repassadas ao grupo do Núcleo de Estudos em Agrobiodiversidade (NeaBio) da
UFSC.
As variedades foram plantadas em duas áreas experimentais em Florianópolis (Santa
Catarina) para obtenção das flores femininas. As plantas (n = 8) foram dispostas em
espaçamento de 0,5 m x 0,5 m, procedendo-se a coleta das flores entre o 4° e o 7° dias após a
emissão da inflorescência (Figura 1). As amostras de tecidos de estigmas/estiletes (biomassa
variando entre 0,5 g a 5,0 g – peso fresco) foram coletadas e imediatamente congeladas (N
2
líquido), sendo posteriormente divididas em duas sub-amostras. Uma sub-amostra foi
imediatamente analisada quanto ao conteúdo dos compostos de interesse (polifenóis e
antocianinas), enquanto a outra foi armazenada (-80
0
C) e posteriormente liofilizada.
183
FIGURA 1 - Detalhe das flores femininas das variedades Rosado (A) e Palha Roxa 1 do
Emílio (B).
3.2 Caracterização da composição química do tecido floral por espectroscopia
vibracional no infravermelho médio com transformada de Fourier (FT-IR) e análise
quimiométrica
Análises de amostras de flores liofilizadas (30 mg/indivíduo; n = 6/variedade) das 8
VCLM por espectroscopia vibracional de FT-IR foram realizadas após a maceração dos
tecidos florais em graal e subseqüente tamização (80 mesh). A aquisição dos dados espectrais
utilizou equipamento Bruker IFS 55, equipado com sistema de ATR de reflexão única
(Golden Gate), programado para coletar 128 varreduras/amostra, em janela espectral de 500 a
4000 ondas.cm
-1
e com resolução de 4 ondas.cm
-1
. Cinco espectros/amostra foram coletados,
sendo processados com auxílio do programa OPUS versão 5.0 (Bruker GmbH). O
processamento dos espectros considerou a delimitação da janela espectral de interesse (3000-
600 ondas.cm
-1
), a correção da linha de base, a normalização dos dados e a otimização da
razão sinal/ruído. Posteriormente, o conjunto de dados totais dos espectros foi submetido à
184
análise estatística multivariada, através do cálculo dos componentes principais (PCAs),
utilizando-se o pacote estatístico Unscrambler 9.1.
3.3 Obtenção dos extratos florais
a)
MeOH-HCl (1%, v/v): amostras de tecidos florais (1,0 g - peso fresco) foram
macera
-Tolueno
das na presença de metanol acidificado (HCl 1%, v/v – 10 mL), por 30 minutos, a 0
0
C,
e os respectivos extratos filtrados em suporte de celulose (0,45 µm) e ajustados para o volume
final de 10 mL.
b)
MeOH (1:1, v/v): amostras de tecidos florais (1,0 g – peso fresco) foram
acera
4 Caracterização espectroscópica do extrato MeOH-HCl (1%, v/v) e análise
3.4.1 Espectrofotometria UV-visível: O perfil espectral UV-visível (370ηm a
700ηm
3.4.2 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (1H-RMN): Para a obtenção
dos esp
m das com metanol: tolueno (1:1, v/v – 12 mL), durante 30 minutos, a temperatura
ambiente e subsequentemente filtradas em suporte de celulose (0,45 µm). O volume final foi
corrigido para 10 mL.
3.
quimiométrica
) do extrato metanólico acidificado (3 mL) das flores femininas foi obtido em
espectrofotômetro Shimadzu 2301. Uma leitura para cada amostra foi efetuada, com resolução
de 1 ηm, sendo o conjunto total de dados espectrais submetido à análise estatística
multivariada, para efeito de cálculo dos componentes principais (PCA).
ectros de 1H-RMN dos extratos metanólicos acidificados das flores, inicialmente
procedeu-se à remoção do solvente orgânico em fluxo de N
2
gasoso. O extrato seco das
amostras foi ressuspenso em 600 µL de MeOH-δ
6
e transferido para um tubo de RMN de 5
mm de diâmetro interno. Os espectros de ressonância magnética nuclear foram obtidos em
triplicata, em equipamento Bruker DRX-400, operando em freqüência de ressonância de
400,13 MHz (9,4 Tesla) de 1H, com um tempo de relaxação de 6,57s, 16 varreduras,
coletando-se 64.000 pontos para efeito de processamento a 28
0
C. Uma função de
multiplicação exponencial, com um fator de alargamento de linha (lb) de 0,3Hz, foi aplicada
185
ao FID, previamente à transformação de Fourier. Os espectros foram processados utilizando-
se o software XWin-NMR (versão 3.1, Bruker-Biospin – Rheinsteten, Germany) e analisados
com o auxílio do software Amix-Aurelia (versão 3.0, Bruker-Biospin – Rheinsteten,
Germany). A análise dos componentes principais das amostras foi aplicada ao conjunto total
de ressonâncias de interesse dos espectros (1H – 0,1 - 8,0 ppm), utilizando-se o software
Unscramble (versão 9.1).
3.4.3 Determinação do conteúdo de fenóis totais
H-HCl (1%, v/v) foram usadas para a
determ
3.4.4 Identificação dos ácidos (poli)fenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência
álises prévias dos compostos (poli)fenólicos dos extratos metanólicos acidificados
em est
Alíquotas (1 mL/amostra) do extrato MeO
inação do conteúdo de fenóis totais utilizando-se a espectrofotometria UV-visível
(Shimadzu 2301) e o reativo de Folin-Ciocalteu, conforme descrito previamente
(SINGLETON & ROSSI, 1965). A quantificação dos compostos de interesse foi feita através
de curva padrão (acido gálico – 50 µg/mL a 800 µg/mL, r
2
= 0,99; y = 1,358x) e os resultados
expressos em equivalentes de ácido gálico.
(CLAE)
An
udo revelaram a necessidade de um pré-tratamento das amostras, em função do
comprometimento da resolução cromatográfica (dados não mostrados). Para tal, uma alíquota
(500 µL) da fração organossolvente foi concentrada na presença de N
2
gasoso e ressuspensa
em 100 µL de álcool etílico. Subsequentemente, 400 µL de acetato de etila foram adicionados
às amostras, seguido de centrifugação a 5.000 rpm (10 min). Uma alíquota (10 µL) da fração
acetato de etila foi injetada em cromatógrafo líquido (Shimzadu LC-10A), equipado com
coluna C
18
(Shim-Pack CLC-ODS, 25 cm x 4,6 mm ∅) e pré-coluna (Shim-Pack CLC-ODS, 5
µm, 4,6 mm ∅), termostatizador (40ºC) e detector espectrofotométrico UV-visível (280 ηm).
A eluição utilizou H
2
O:AcOH:η-BuOH (350:1:10, v/v/v) como fase móvel, em fluxo de 0,8
mL/min e a identificação dos compostos baseou-se nos tempos de retenção, obtidos a partir da
análise de amostras padrões [ácido protocatecuico (Sigma P-5630), ácido gálico (Sigma G-
7384), ácido t-cinâmico (Fluka 96340), ácido siríngico (Fluka 86230), ácido caféico (Sigma
186
C-0625) – 100 µg/mL) sob as mesmas condições experimentais. A quantificação dos ácidos
fenólicos foi feita através do uso de curva-padrão externa de ácido gálico (2,5 µg/mL a 100
µg/mL, r
2
= 0,91; y = 1589,9x) e ácido caféico (1 µg/mL a 100 µg/mL, r
2
= 0,99; y =
532,83x), considerando-se a intensidade dos sinais de interesse.
3.4.5 Análise do conteúdo de antocianinas totais
através da leitura da absorbância (460 ηm e
525 ηm
.4.6 Caracterização estrutural das antocianinas usando MALDI-TOFF
rômetro de massa
de tem
.5 Caracterização espectroscópica (UV-vis) e cromatográfica (CLAE) do extrato
3.5.1 Espectrofotometria UV-visível
rofotometria UV-visível (Shimadzu 2301),
través
.5.2 Identificação de carotenóides usando cromatografia líquida de alta
eficiên
ão de carotenóides nas amostras em estudo considerou a saponificação
destes,
O conteúdo de antocianinas foi determinado
- Shimadzu 2301) das soluções amostrais (ε = 34300 M
-
.cm
-
e peso molecular de 449,2
g.mol
-
(GIUSTI & WROLSTAD, 2001).
3
A caracterização estrutural das antocianinas foi feita usando um espect
po de vôo equipado com uma interface de desorção/ionização assistida por laser
(MALDI-TOF – PerSeptive Biosystems Voyager), conforme descrito previamente (Maraschin
et al., 2001).
3
MeOH-Tolueno (1:1 v/v)
O extrato foi analisado utilizando-se espect
a da leitura da absorbância em janela espectral de 270 ηm a 750 ηm, com resolução de
10 ηm.
3
cia (CLAE)
A identificaç
como previamente descrito por WANG et al. (2006). Para tal, uma alíquota do extrato
(1,25 mL) foi seca a exaustão usando N
2
gasoso, seguido da adição de solução de isopropanol
(1:1,5 p/v) e KOH 15% (5:3, v/v – 1 mL), com incubação por 12h, a 40
0
C. Posteriormente, o
extrato foi diluído com água destilada (1:3, v/v) e particionado (3x) com acetato de etila (1:1).
187
A fração organossolvente foi coletada e filtrada com sulfato de sódio anidro. A amostra foi
concentrada sob vácuo (40
0
C) e ressuspensa em acetona. Uma alíquota (10 µL/amostra) foi
analisada em cromatógrafo líquido (Shimzadu LC-10A), equipado com coluna C
18
de fase
reversa (Vydac 218TP54, 25cm x 4,6mm ∅ interno) e pré-coluna (Vydac 218GK54, 5 µm),
termostatizador (40ºC) e detector espectrofotométrico UV-visível, operando em 450ηm. A
eluição utilizou MeOH:Acetonitrila (80:20, v/v) como fase móvel, em fluxo de 1 ml/min. A
identificação dos compostos de interesse foi feita com base nos tempos de retenção
determinados a partir da análise de amostras padrões [luteína (Sigma X-6250), zeaxantina, β-
caroteno (Sigma, Saint Louis – MO, USA – 100 µg/mL], sob as mesmas condições
experimentais. A quantificação dos carotenóides foi feita através de curva-padrão externa de
luteína (0,05 µg/mL a 55 µg/mL, r
2
= 0,99; y = 12575x) tomando como base a intensidade dos
sinais dos compostos de interesse.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
.1 Análise do tecido floral liofilizado por FT-IR e quimiometria
000-600 ondas.cm
-1
das
mostra
a ausência de sinais foram detectadas entre as
4
Foram identificados 21 bandas nos espectros de FT-IR, entre 3
a s de todas as variedades (Tabela 1). Os espectros dos tecidos florais femininos das
VCLM Cateto Vermelho e Mato Grosso Palha Roxa, para a região compreendida entre 1800-
600 ondas.cm
-1
, estão apresentados na Figura 2.
Algum s diferenças quanto à presença ou
variedades, por exemplo, para a variedade Cateto Vermelho, foram encontradas 24 bandas,
enquanto que para a variedade Roxo do Valdecir foram detectadas 31. Além das bandas
indicadas na Tabela 1 foram identificados outros sinais de menor intensidade, na região entre
2246-1939 ondas.cm
-1
, em todas as amostras analisadas.
188
TABELA 1 - Bandas (ondas.cm
-1
) espectrais de FT-IR das amostras de tecido floral das
CLM em estudo com os seus respectivos grupos funcionais.
m
-1
)
Grupo Funcional
V
Bandas
(ondas.c
2919
Deformação axial e angular do grupo metil (-CH
3
) e/ou metileno (CH
2
)
2850
Deformação axial e angular do grupo metil (-CH
3
) e/ou metileno (CH
2
)
1732
Deformação axial do grupo C=O de ácidos, ou acetil
1640
Deformação axial do grupo C=O de aminas
1574
Deformação angular do grupo NH
2
de aminas
+
e éteres cíclicos
O, C-C, C-O-C
ranosídico dos açúcares
o O-H
1519
Deformação do grupo –NH
3
1440
Deformação do grupo CH
2
1370
Deformação do grupo CH
3
1315
Deformação da ligação C-N
1254
Deformação da ligação C-OH
1202
Deformação da ligação C-O-C d
1150
Deformação axial da ligação C-O, C-C, C-O-C
1102
Deformação da ligação C-O-C
1072
Deformação axial da ligação C-
1030
Deformação da ligação R-C-O
868
Deformação da ligação C-H
816
Deformação da ligação C-H
775
Vibração simétrica do anel pi
701
Deformação da ligação =CH de compostos aromáticos
665
Deformação da ligação C-H
633
Deformação angular da ligaçã
Fonte: LAMBERT
et al. (2001)
189
F
te
IGURA 2 - Espectros de FT-IR na região entre 3000 – 600 ondas.cm
-1
de amostras de
cido floral liofilizados das variedades crioulas e locais de milho Rosado, Cateto
to Grosso Palha Roxa.
-1
)
l ou metileno que são sinais típicos de hidrocarbonetos
lifáticos (Tabela 1 e Figura 2). A banda em 1732 ondas.cm
-1
, resultante da deformação axial
ada
Vermelho e Ma
Os espectros mostraram bandas de elevada intensidade (2919 e 2850 ondas.cm
associadas a deformação do grupo meti
a
de grupos C=O, indica a presença de ésteres de ácidos graxos ou polissacarídeos, por exemplo.
A presença de compostos de origem protéica nas amostras pode ser sugerida pelos sinais entre
1650-1500 ondas.cm
-1
e de aminoácidos pela região entre 1550-1480 ondas.cm
-1
. Na região de
fingerprint para carboidratos (1200-950 ondas.cm
-1
) diversas bandas foram encontrados para
todas as amostras analisadas. Compostos aromáticos foram detectados pelos sinais entre 2000-
1700 ondas.cm
-1
e a banda em 633 ondas.cm
-1
(SILVERSTEIN, 1994; LAMBERT, 2001).
Subsequentemente à interpretação dos espectros procedeu-se à determinação dos
componentes principais (PCA) do conjunto total de dados. Para efeitos de classificação das
variedades de acordo com sua constituição química, a primeira região do espectro utiliz
para efeitos de cálculo dos componentes principais (PCAs) compreendeu as bandas entre
3000-600 ondas.cm
-1
. Para todas as regiões testadas a matriz de dados espectrais foi
normalizada em seus componentes lineares, enquanto as colunas foram centralizadas.
190
A Figura 3 mostra a dispersão das variedades em estudo, segundo a determinação dos
componentes principais (PCA) da matriz de dados obtida a partir dos espectros de FT-IR. Os
componentes principais PC1 e PC2 contribuiram para explicar em 93% a variância presente
nos dados. Analisando o gráfico de distribuição fatorial verifica-se que as amostras de tecido
floral diferem entre si pela formação de 3 grupos principais.
FIGURA 3 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (3000 - 600
ondas.cm
-1
) de amostras de tecido floral liofilizado das 8 VCLM estudadas.
O primeiro deles se localizou em PC1 negativo e PC2 positivo, sendo constituído pelas
rupo formado pelas variedades Palha Roxa do Emílio e Roxo do Valdecir localizou-se em
variedades Mato Grosso Palha Roxa, Cateto Vermelho e Língua de Papagaio. O segundo
g
PC1 e PC2 negativo, enquanto as variedades Rosado, Roxo do Emílio e Rajado 8 Carreiras
ficaram localizadas em PC1 positivo e PC2 negativo. As bandas que mais contribuíram para a
separação das amostras ao longo de PC1 foram 1612, 1539, 1527, 1434, 1361, 1276, 1199,
1157, 1087 e 1064 ondas.cm
-1
, como mostra a Figura 4, que são característicos
principalmente de proteínas e carboidratos. Considerando apenas o eixo do componente
191
principal 1 (PC1) as variedades Rosado, Roxo do Emílio e Rajado 8 Carreiras apresentaram
maior semelhança química em relação às demais. Por outro lado, a classificação das
variedades em função do eixo componente principal PC2 separou principalmente Mato Grosso
Palha Roxa, Cateto Vermelho e Língua de Papagaio das demais. Neste caso, as bandas que
contribuíram para a dispersão das amostras ao longo de PC2 foram principalmente 2919,
2854, 1743, 1727, 1658, 1643, 1103, 1029, 921 ondas.cm
1
na região positiva que são basndas
relacionados a compostos lipídicos, protéicos e carboidratos e 1600, 1558, 1523, 1430, 1353,
1284 e 1199 ondas.cm
-1
na região negativa associados a proteinas e carboidratos, como
mostrado na Figura 5.
FIGURA 4 - Contribuição fatorial de PC1 das amostras de tecido floral liofilizado para os
dados espectrais de FT-IR (3000 - 600 ondas.cm
-1
).
Considerando que os sinais característicos para compostos protéicos foram importantes
tilizando somente a região espectral associada à ocorrência de sinais típicos daquela classe de
macromoléculas, isto é, 1650-1500 ondas.cm
-1
(Figura 6). Nesse caso, os eixos PC1 e PC2
para a separação das amostras, um segundo procedimento experimental foi realizado,
u
192
explicaram em 98% a variação total dos dados espectrais, resultando em 4 grupos distintos.
Um primeiro agrupamento, constituído pelas amostras de flores das variedades Cateto
Vermelho, Mato Grosso Palha Roxa e Língua de Papagaio, localizou-se em PC1 negativo e
PC2 positivo. As variedades Rajado 8 Carreiras e Rosado agruparam-se em PC1 e PC2
positivos, enquanto um terceiro grupo (variedades Palha Roxa do Emílio e Roxo do Valdecir,
foi observado em PC1 e PC2 negativos. As amostras de flores da variedade Roxo do Emílio se
diferenciaram das demais, com valores de PC1 positivo e PC2 negativo.
FIGURA 5 - Contribuição fatorial de PC2 das amostras de tecido floral liofilizado para os
dados espectrais de FT-IR (3000 - 600 ondas.cm
-1
).
Em função do exposto, constata-se que a análise quimiométrica das amostras para a
gião de fingerprint de proteínas (650-1500 ondas.cm
-1
)
revelou um padrão similar de
ados espectrais em sua totalidade (3000-600 ondas.cm
-1
- Figura 3), exceção feita à
rieda
re
classificação ao observado quando do cálculo dos valores dos componentes principais para os
d
va de Roxo do Emílio, cuja constituição protéica é, provalvemente, distinta das demais
VCLM em estudo, haja vista seu não agrupamento.
193
FIGURA 6 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR na janela espectral de
1650-1500 ondas.cm
-1
de amostras de tecido floral liofilizado das 8 VCLM em estudo.
Os autovetores que determinaram o padrão de distribuição mostrado na Figura 7
-1
II das
roteínas. Além disso, algumas bandas dessa região do espectro podem estar correlacionadas
stante similar ao observado na Figura 3,
foram 1608, 1573, 1558, 1538 e 1523 ondas.cm
. Conforme descrito na literatura (BEEKES
et al., 2007), as bandas em 1570 e 1550 ondas.cm
-1
relacionam-se ao grupo de amidas
p
com a estrutura secundária das cadeias polipeptídicas (FABIAN & MANTELE, 2002), o que
sugere uma constituição protéica distinta para os tecidos analisados e reforça a hipótese de que
as diferenças genotípicas entre as VCLM podem ser investigadas através da diversidade
química, aqui representada pelas proteínas.
Uma terceira janela espectral de FT-IR, referente à região de fingerprint para
carboidratos (1200-950 ondas.cm
-1
) foi analisada, onde os valores de PC1 e PC2 explicaram
em 94% a variação total dos dados (Figura 8). Para essa região do espectro, as amostras
apresentaram um padrão de dispersão ba
194
possibilitando a identificação de 3 grupos. As amostras das variedades Palha Roxa do Emílio e
Roxo do Valdecir dispersaram-se ao longo do eixo de PC1 -, mostrando certo grau de
distinção entre as repetições. As amostras das variedades Rosado, Rajado 8 Carreiras e Roxo
do Emílio localizaram-se em PC1 e PC2 +, enquanto as variedades Mato Grosso Palha Roxa,
Cateto Vermelho e Língua de Papagaio agruparam-se em PC2 -.
FIGURA 7 - Contribuição fatorial de PC1 das amostras de tecido floral liofilizado das 8
VCLM, para os dados de FT-IR na região espectral de 1650-1500 ondas.cm
-1
.
Para a região de carboidratos, sugere-se a presença de polissacarídeos estruturais, tais
o eixo PC1, os
utovetores que contribuíram para a distinção das amostras foram 1153, 1099, 1064 e 1037
-1 -1
como celulose, pectina e hemicelulose, além de açúcares simples constituindo as amostras de
flores e determinando o padrão de distribuição observado na Figura 8. Para
a
ondas.cm
(Figura 9) e para PC2 foram 1160, 1118, 1091, 1068, 1025, 1010 e 991 ondas.cm
(Figura 10). Em um estudo prévio de caracterização de polissacarídeos estruturais de flores
(Cirsium horridulum), por FT-IR, foram determinadas as bandas características à identificação
195
de celulose (2850 e 1060 ondas.cm
-1
) e de pectina (1745, 1015 e 1105 ondas.cm
-1
) (MARGA
et al., 2003).
FIGURA 8 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados de FT-IR (1200 - 950
ondas.cm
-1
) de amostras de tecido floral liofilizado das 8 VCLM em estudo.
De forma similar, COIMBRA et al. (1999) associando FT-IR e quimiometria,
m
-1
. No presente
studo, a distinção dos tecidos florais por PCA provavelmente, refletiu as diferentes
verificaram que amostras padrões de hemicelulose são caracterizadas por bandas em 1173 e
1041 ondas.cm
-1
, enquanto as pectinas em 1145, 1104, 1014 e 952 ondas.c
e
proporções dos polissacarídeos de parede celular constituindo as amostras, uma vez que essas
são matrizes complexas, devendo apresentar conteúdos distintos dos mesmos.
196
FIGURA 9 - Contribuição fatorial de PC1 das amostras de tecido floral liofilizado para
os dados de FT-IR na região espectral de 1200 - 950 ondas.cm
-1
.
FIGURA 10 - Contribuição fatorial de PC2 das amostras de tecido floral liofilizado para os
dados de FT-IR (1200 - 950 ondas.cm
-1
).
197
Comparando os resultados do presente estudo com os encontrados por COIMBRA et
al. (1999) pode-se sugerir que a separação das amostras ao longo de PC2 (Figura 8) ocorreu
devido ao conteúdo distinto de pectina, pela presença da banda em 1010 ondas.cm
-1
(Figura
10), devendo ter os tecidos das VCLM Palha Roxa do Emílio, Língua de Papagaio, Cateto
Vermelho e Mato Grosso Palha Roxa conteúdos superiores desse composto. Esses resultados
indicaram propriedades mecânicas distintas para os tecidos florais, uma vez que a composição
da parede celular tem relação direta com características como rigidez e elasticidade. A
celulose, por exemplo, confere força e rigidez à célula enquanto a pectina elasticidade,
permitindo a adaptação do tecido após um estresse mecânico (WHITNEY et al., 1999;
WILSON et al., 2000).
Os resultados obtidos por FT-IR, tomados em conjunto, permitem distinguir as
amostras de flores femininas das variedades estudadas, independente da região do espectro
analisada. Dessa forma, podemos sugerir que as variedades Cateto Vermelho, Mato Grosso
íngua de Papagaio se distinguem das variedades Palha Roxa do Emílio e Roxo
assim como as variedades Roxo do Emílio, Rosado
-visível
Palha Roxa e L
do Valdecir que formam um grupo a parte,
e Rajado 8 Carreiras. Sendo assim, a diversidade química detectada nas flores das VCLM,
provavelmente, reflete às diferenças genotípicas resultantes do processo de seleção empregado
pelos agricultores de Anchieta. Estudos posteriores sobre a diversidade genética desse
germoplasma são de interesse para confirmar os resultados do presente estudo e consolidar o
uso de FT-IR e quimiometria em estudos de diversidade química.
4.2 Caracterização dos extratos florais - MeOH-HCl (1%, v/v)
4.2.1 Espectroscopia UV
A espectroscopia UV-visível é uma técnica rápida e simples, usada principalmente
para a identificação de grupos cromóforos, especialmente cromóforos conjugados, como
aqueles encontrados em compostos aromáticos (LAMBERT et al., 2001). Dessa forma,
compostos antociânicos, por exemplo, são facilmente identificados usando tal metodologia,
inclusive permitindo a distinção de suas agliconas delfinidina, cianidina, pelargonidina,
petunidina, peonidina e malvidina. Isto porque, grupos funcionais ligados ao anel B das
198
antocianidinas podem provocar um deslocamento no comprimento de onda de absorção
máxima daqueles compostos. Cianidina e peonidina, por exemplo, têm máximos de
absorbância em 510,5 ηm e 511 ηm, enquanto delfinidina, petunidina e malvidina apresentam
valores de máxima absorbância em 522,5 ηm, 549 ηm e 520 ηm, res
pectivamente. Da mesma
rma, a glicosilação desses compostos provoca um deslocamento no comprimento de onda de
de decrescer o coeficiente
olar. Peonidina-3-glucosídeo, por exemplo, tem um comprimento de onda
máximo em 536 ηm enquanto sua aglicona tem em 511 ηm (FULEKI & FRANCIS, 1968;
04). Assim, considerando a capacidade de detecção dos
mpos
e proteínas (LAMBERT et al., 2001). De forma similar, as regiões entre 400-430 ηm e 480-
560 ηm, com valores de absorbância elevados, indicaram a presença de compostos
η
VCLM, onde PC1 e PC2 explicaram em 96% a variabilidade total dos dados.
fo
absorção máxima na região do visível em relação às agliconas, além
de absorção m
ESCRIBANO-BAILÓN et al., 20
co tos antociânicos por espectrofotometria UV-visível e o potencial discriminante
daqueles metabólitos, extratos metanólicos das flores femininas das VCLM, ricos em
compostos antociânicos, foram analisados através da determinação de seu perfil espectral (370
– 700 ηm).
Os perfis espectrais dos extratos para a região entre 370-700 ηm são mostrados na
Figura 11. A análise do gráfico permite observar um elevado grau de similaridade entre os
extratos, sendo que valores máximos de absorbância entre 280 e 370 ηm foram detectados
(dados não mostrados), sugerindo a presença de compostos aromáticos, tais como (poli)fenóis
antociânicos (GIUSTI & WROLSTAD, 2001). Para esta região, e apesar da similaridade
espectral observada, é possível detectar a diferença de conteúdo de tais compostos para as
variedades analisadas, assim como para a região de absorção das clorofilas (630-660 m).
Com a finalidade de distinguir as amostras não somente por seus conteúdos de
compostos antociânicos, os dados espectrais de UV-visível foram submetidos à determinação
dos componentes principais (PCA), conforme demonstrado na Figura 12. A abordagem
quimiométrica utilizada mostrou-se bastante eficiente para classificar os extratos metanólicos
das flores das
199
FIGURA 11 - Perfil espectral UV-visível (370 a 700ηm) do extrato MeOH-HCl (1%,
v/v) de amostras de flores femininas das 8 VCLM em estudo.
FIGURA 12 – Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para os dados espectrais UV-visível (370-
700 ηm) do extrato metanol acidificado do tecido floral das 8 VCLM estudadas.
0
370 420 470 520 570 620 670
Comprimento de onda (nm)
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Absorbância
Roxo Emílio Mato G.P. Roxa Língua Papagaio Roxo Valdecir
Rosado Palha Roxa Emílio Rajado 8 Carreiras Cateto Vermelho
200
As variedades Rajado 8 carreiras, Palha Roxa do Emílio, Cateto Vermelho e Ro
Emílio agruparam-se em PC1 ( - ) e PC2 ( + ), enquanto as v
xo do
ariedades Língua de Papagaio,
Rosado e Roxo do Valdecir localizaram-se em PC1 +. A variedade Mato Grosso Palha Roxa
localizou-se em PC1 e PC2 ( - ), destacando-se das demais.
O padrão de classificação observado na Figura 12 pode ser atribuído aos
comprimentos de onda 393, 418, 516 e 653 ηm, conforme indicado pelos respectivos valores
de contribuições fatorais mostrados na Figura 13.
FIGURA 13- Contribuição fatorial de PC1 dos extratos MeOH-HCl (1%, v/v) de flores
estão associados às antocianinas (GIUSTI
& WROLSTAD, 2001), enquanto o sinal em 653 ηm a presença de clorofila.
Para o comprimento de onda em 393 ηm o menor valor de absorbância foi detectado
na variedade Mato Grosso Palha Roxa, e os maiores valores nas variedades Roxo do Valdecir,
Língua de Papagaio e Rosado que foram agrupadas utilizando-se a análise de PCA. Para os
calculada a partir dos dados espectrais UV-visível (370-700 ηm).
Os comprimentos de onda 393, 418, 516 ηm
201
comprimentos de onda em 418 e 516 ηm os maiores valores de absorbância foram detectados
novamente para as variedades Roxo do Valdecir, Língua de Papagaio e Rosado, indicando que
estes três extratos possuem um conteúdo maior das distintas antocianinas. Portanto, a análise
dos dados UV-visível por PCA confirmou que os extratos metanólicos das VCLM possuem
quantidades diferenciadas de antocianinas distintas, confirmando que a técnica e a ferramenta
estatística utilizadas são adequadas na discriminação das amostras em função da sua
diversidade genética detectada através da diversidade química (antocianinas).
Posteriormente, procedeu-se à quantificação dos compostos antociânicos no tecido
floral das variedades estudadas. Porém, para esta análise procedeu-se a extração e
quantificação individual das flores para avaliar a variabilidade entre os indivíduos de uma
mesma variedade.
Os resultados de conteúdo de antocianinas das 8 VCLM em estudo são mostrados na
Figura 14, onde se observou uma amplitude de conteúdo médio de antocianinas de 1,36 mg/g
e equivalentes de cianidina-3-glucosídeo (Palha Roxa do Emílio) a 2,86 mg/g de equivalentes
78 mg/g de equivalentes de
ianidina-3-glucosídeo) apresentaram teores elevados desses compostos em seus tecidos
de cianidina-3-
glucosídeo, seguido da variedade Rajado 8 carreiras (0,90 a 3,75 mg/g de equivalentes de
d
de cianidina-3-glucosídeo (Roxo Emílio) [λ 525 ηm]. As variedades Rosado (2,84 mg/g de
equivalentes de cianidina-3-glucosídeo) e Língua de Papagaio (2,
c
florais. Para a variedade Língua de Papagaio foi observada a maior variabilidade entre
indivíduos, com uma amplitude de valores entre 0,5 a 5,6 mg/g de equivalentes
cianidina-3-glucosídeo) e da variedade Mato Grosso Palha Roxa (1,34 a 3,91 mg/g de
equivalentes de cianidina-3-glucosídeo). A variabilidade encontrada entre os indivíduos de
uma mesma variedade demonstra que o processo de seleção realizado pelos agricultores tem
resultado em diversidade química, o que em parte é também ocasionado pelas trocas gênicas
entre variedades/populações cultivadas em áreas próximas, uma vez que esta é uma espécie de
polinização aberta. A manutenção de populações com conteúdos variáveis de compostos de
interesse (antocianinas, por exemplo) é de grande importância por permitir a seleção de
plantas que possam ser usadas em programas de melhoramento.
202
=
FIGURA 14 - Conteúdo médio de antocianinas (mg/g, peso seco) de tecido floral
de VCLM determinado por espectrofotometria UV-visível - 525 ηm (A) e 460
ηm (B). RE = Roxo do Emílio; Ros = Rosado; R8C = Rajado 8 carreiras; CV
Cateto Vermelho; PR1E = Palha Roxa 1 do Emílio; RV = Roxo do Valdecir; LP
= Língua de Papagaio; MGPR = Mato Grosso Palha Roxa; (n= 7). Colunas e
barras verticais representam a média
±
desvio padrão da média, respectivamente.
RE
Ros
R8C
CV
PR1E
RV
LP
MGPR
0
1
2
do de antocianinas (mg/g)
(460 nm)
Conteú
RE
Ros
R8C
CV
PR1E
RV
LP
MGPR
0
1
2
3
4
5
A
Conteúdo de antocianinas (
(525 nm)
B
mg/g)
VARIEDADES
RE
Ros
R8C
CV
PR1E
RV
LP
MGPR
0
1
2
do de antocianinas (mg/g)
(460 nm)
Conteú
RE
Ros
R8C
CV
PR1E
RV
LP
MGPR
0
1
2
3
4
5
A
Conteúdo de antocianinas (
(525 nm)
B
mg/g)
VARIEDADES
203
Por outro lado, quando a determinação do conteúdo médio de antocianinas totais nos
cidos florais foi realizada a 460 ηm, os maiores valores foram encontrados para as
ariedades Rajado 8 carreiras (1,31 mg/g de equivalente de cianidina-3-glucosídeo) e Rosado
,32 mg/g de equivalente de cianidina-3-glucosídeo), seguido das variedades Roxo do Emílio
,17 mg/g de equivalente de cianidina-3-glucosídeo) e Roxo do Valdecir (1,09 mg/g de
quivalente de cianidina-3-glucosídeo).
Para essa classe de antocianinas, a maior variabilidade foi detectada para a variedade
ajado 8 carreiras, com uma amplitude de 0,57 a 2,09 mg/g de equivalente de cianidina-3-
lucosídeo.
Tomando em conjunto os resultados encontrados para as antocianinas determinadas a
60 ηm e 525 ηm, percebe-se que o tecido floral da variedade Palha Roxa do Emílio é o que
presenta menor pigmentação, seguido da variedade Cateto Vermelho e Roxo do Valdecir. Já
s variedades Roxo do Emílio, Rosado e Rajado 8 carreiras mostram-se mais pigmentadas que
s demais para os dois grupos de antocianinas analisadas. Esses resultados estão de acordo
com a classificação obtida através da análise dos dados espectrais de FT-IR (Figura 3), onde
as variedades Palha Roxa do Emílio e Roxo do Valdecir formaram um grupo distinto de
Rosado, Rajado 8 carreiras e Roxo do Emílio.
3
spectivos
g cado bruto
das variedades Roxo do Valdecir e Rosado (Figura 15), usando eletrospray e MALDI-TOF.
Entreta
te
v
(1
(1
e
R
g
4
a
a
a
.2.2 MALDI-TOF
As antocianidinas pelargonidina (m/z 271) e cianidina (m/z 287) e os seus re
licosídeos (m/z 433 e m/z 449) foram identificadas no extrato metanólico acidifi
nto, em estudos subseqüentes faz-se necessária a remoção de impurezas para a
identificação de outros pigmentos de origem antociânica nas flores das VCLM.
204
FIGURA 15 – Antocianidinas detectadas por MALDI-TOF e
o extrato MeOH-HCl (1%, v/v) bruto das flores das
variedades Roxo do Valdecir e Rosado.
analisado por
H-RMN, sendo os dados espectrais utilizados para o cálculo dos componentes principais
(PCs). Os espectros se mostraram bastantes similares, tendo sido observadas algumas
iferenças, principalmente na região de fingerprint para carboidratos (3,0 – 5,5 ppm) e
minoácidos e ácido orgânicos (0 – 3,0 ppm) (Figura 16). Na região espectral que indica a
resença de compostos aromáticos (5,5 – 11 ppm), tais como as antocianinas, as diferenças
observadas foram principalmente quanto à intensidade dos sinais entre as variedades.
Subsequentemente os dados espectrais de 1H-RMN para a janela entre 0,2 e 8,0 ppm
(PC1), 2 (PC2) e 3 (PC3)
ontribuíram para explicar em 67% a variância total dos dados. Essa abordagem analítica
ermitiu a distinção dos extratos metanólicos dos tecidos florais das variedades Língua de
relação às demais, que se localizaram em PC1 negativo/PC2 positivo e
PC1 positivo, respectivamente. Os extratos das demais variedades mostraram elevada
milaridade, ocorrendo em PC1/PC2 negativo (Figura 17).
eletrospray n
4.2.3 – Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (1H-RMN) e
análise quimiométrica
O extrato metanólico bruto das flores femininas das VCLM foi também
1
d
a
p
foram submetidos à análise de PCA. Os componentes principais 1
c
p
Papagaio e Rosado em
si
205
FIGURA 16 – Espectros de ressonância magnética nuclear de 1H (400 MHz) (0
a 8 ppm) do extrato metanólico acidificado das variedades Roxo do Valdecir,
Rosado e Língua de Papagaio, mostrando as regiões de detecção de
carboidratos, ácidos orgânicos, carboidratos e compostos aromáticos. TMS
(tetrametilsilano – padrão interno); Solvente (MeOH-δ
6
).
206
As ressonâncias que contribuíram para a separação da variedade Rosado em PC1 e
Figura 19,
às
mbém
eira
últim pagaio
ppm
F s dados de 1H-RMN (janela
spectrais de 0,1 a 8,0 ppm) do extrato MeOH-HCl (1%, v/v) de flores femininas das 8
VCLM em estudo.
para a variedade Língua de Papagaio em PC2 estão mostrados na Figura 18 e
respectivamente. Para a variedade Rosado, os deslocamentos químicos mais importantes para
a separação foram principalmente aqueles característicos para carboidratos (4,27; 4,31; 4,66 e
4,75 ppm), o que pode estar correlacionado com a predominância de um tipo de antocianina
no extrato, uma vez que as antocianidinas se ligam aos açúcares, dando origem
antocianinas. Outros três deslocamentos químicos (1,46; 5,92 e 7,32 ppm) ta
contribuíram para a classificação das variedades ao longo de PC1, estando a prim
ressonância relacionada a presença de aminoácidos ou ácidos orgânicos, enquanto as duas
as a compostos aromáticos. Por outro lado, o extrato da variedade Língua de Pa
diferiu das demais, principalmente pelo componente PC2. A contribuição fatorial de PC2 é
mostrada na Figura 19, onde é possível verificar que as ressonâncias em 1,40; 4,25 e 5,92
foram as responsáveis pelo não agrupamento daquela variedade.
IGURA 17 - Distribuição fatorial de PC1 e PC2 para o
e
207
F
1H-RMN (0,2 a 8,0 ppm) do extrato metanólico acidificado de flores das VCLM.
FIGURA 18 - Contribuição fatorial de PC1 calculada a partir dos dados espectrais de 1H-
RMN (0,2 a 8,0 ppm) do extrato metanólico acidificado de flores de VCLM.
IGURA 19 - Contribuição fatorial de PC2 determinada a partir dos dados espectrais de
208
Essas são ressonâncias características das três classes de compostos detectados pela
os
RMN no extrato metanólico: aminoácidos/ácidos orgânicos, açúcares e compostos aromáticos,
sugerindo uma composição química diferenciada em alguma extensão, com base na ocorrência
de compostos destas classes de metabólitos, para o extrato da flor feminina da variedade
Língua de Papagaio.
O componente principal 3 (PC3) contribuiu em 11% para explicar a variabilidade d
dados espectrais, sendo a classificação das amostras em estudo a partir dos componentes PC1
e PC3 (54%) mostrada na Figura 20.
FIGURA 20 - Distribuição fatorial de PC1 e PC3 para os dados de 1H-RMN (0,2 a 8,0 ppm)
do extrato MeOH-HCl (1%, v/v) de flores femininas das 8 VCLM estudadas.
Neste caso, as variedades Palha Roxa do Emílio, Cateto Vermelho, Rajado 8 carreiras,
Roxo do Emílio, Mato Grosso Palha Roxa e Língua de Papagaio localizaram-se em PC1/PC3
negativo, sugerindo uma composição química similar entre as mesmas. As variedades Rosado
e Roxo do Valdecir mostraram-se quimicamente distintas das demais, localizando-se em PC1
p e
contribuíram para a separação da variedade Roxo do Valdecir em PC3 positivo estão
ositivo e PC1 negativo/PC3 positivo, respectivamente. Os deslocamentos químicos qu
209
mostrados na Figura 21, a saber: 1,78; 4,59 e 5,92 ppm. Por outro lado, as ressonâncias em
1,71 e 4,33 ppm foram responsáveis pelo agrupamento das demais variedades, à exceção de
Rosado em PC3 negativo.
FIGURA 21 - Contribuição fatorial de PC3 calculada a partir dos dados espectrais de 1H-
RMN (0,2 a 8,07 ppm) do extrato MeOH-HCl (1%, v/v) de flores das VCLM em estudo.
As ferramentas analíticas usadas (FT-IR, 1H-RMN e UV-visível) associadas à
quimiometria mostraram-se adequadas à identificação de variedades com maior similaridade
de com
1 , v/v) obtidos
as flores das VCLM Língua de Papagaio e Rosado. O extrato bruto da variedade Roxo do
posição química. Nesse contexto, o emprego da espectrofotometria UV-visível e da
H-RMN revelou constituição diferenciada dos extratos brutos MeOH-HCl (1%
d
Valdecir também se diferenciou dos demais usando UV-visível e 1H-RMN (dados não
mostrados – PC2 x PC3). Por outro lado, a análise do tecido floral liofilizado por FT-IR
mostrou diferenças de composição entre as 3 variedades citadas, indicando que compostos
químicos que não são extraídos com o solvente orgânico são de elevada importância para a
diferenciação das mesmas. Portanto, a escolha da técnica analítica a ser utilizada para avaliar a
similaridade de composição química entre variedades dependerá do objetivo da investigação.
210
No presente estudo, por exemplo, foi possível discriminar extratos com potencial
farmacológico distinto em função da constituição e conteúdo de pigmentos via
espectrofotometria UV-visív
el e 1H-RMN.
4.2.4 Quantificação e identificação de (poli)fenóis
A espectrofotometria UV-visível, utilizando o reativo de Folin-Ciocalteu
(SINGLETON & ROSSI, 1965), foi empregada na determinação do conteúdo total de
(poli)fenóis das amostras em estudo, juntamente com a cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE). Os dados de conteúdo médio de fenóis totais e dos compostos
(poli)fenólicos identificados por CLAE no tecido floral das 8 VCLM estudadas são mostrados
na Tabela 2. Os ácidos t-cinâmico, gálico e protocateuico foram os principais compostos
detectados nas amostras de flores.
Além desses, o ácido caféico foi detectado em pequenas quantidades nas amostras de
todas as variedades, assim como o ácido siríngico nas variedades Roxo do Emílio, Roxo do
Valdecir, Rosado e Palha Roxa do Emílio (Figura 22 e Tabela 2).
Entre o germoplasma analisado, o maior teor de fenóis totais (UV-visível) foi
detectado na variedade Roxo do Emílio (45,29 µg de equivalente de ácido gálico/mg), seguido
µg de equivalente de ácido gálico/mg – Tabela 2).
da variedade Roxo do Valdecir (32,98 µg de equivalente de ácido gálico/mg). As variedades
ajado 8 carreiras e Palha Roxo do Emílio apresentaram os menores conteúdos (10,12 e 12,87
R
211
TABELA 2 - Conteúdo médio de fenóis totais
*
(µg/mg, peso seco) determinado por espectroscopia de UV-visível e
de compostos (poli)fenólic
**
( peso lores s
VCLM estudadas.
Variedades Total Ácid
caféi
os identificados por CLAE
µg/mg,
Ácido
gálico
seco) em amostras de f
Ácido
t-cinâmico
Ácido
siríngico
feminina das
o
co
*
Ácido
protocatecuico
Roxo Emílio
,07±0
45,29±3,11 2,56±0,19 0,97±0,01 1,37±0,09 0,04±0,01 0 ,01
Roxo Valdecir
,16±0
Rajado 8 Carreiras
10,12± ,07±0
Língua de Papagaio
,12±0
Rosado
,22±0
Mato Grosso Palha Roxa
21,55± 9 ,13±0
Cateto Vermelho
22,16± 0 ,01±0
Palha Roxa do Emílio
7 ,05±0
32,98±3,94 2,03±0,09
4,51 1,85±0,06
24,34±6,02 1,84±0,00
28,35±5,83 1,04±0,02
8,80 1,00±0,33
8,35 0,21±0,01
12,87±5,33 1,69±0,05
0,69±0,1
2,75±1,0
4,11±0,0
0,43±0,0
0,19±0,0
0,05±0,0
0,74±0,0
0 1,26±0,42 0,01±0,00
0 1,39±0,20
n.d.
2 0,71±0,12 0,02±0,00
1 0,56±0,03 0,01±0,00
1,36±0,08
n.d.
0,31±0,03
n.d.
2,06±0,80 0,02±0,00
0
0
0
0
0
0
0
,04
,04
,00
,00
,07
,00
,00
*
n= 7 indivíduos;
**
n= 6 indivíduos; 3 inj e tado
eçõ s/amostra; n.d.= não detec .
212
URA óis (CLAE, 280 ηm) presentes no extrato
H-HCL
co, 3- ácido t-cinâmico, 4- ácido caféico, a - com to não identificado.
E m s de flores de 15 variedades de milho
enientes da iáveis destes metabólitos secundários
a 29,37 de equivalentes de catequina/mg rroborando os dados encontrados no
ente ram teores superiores em duas ordens
agn s por MAKSIMOSIĆ et al. (2005),
rindo o ncial superior das variedades cultiv e desenvolvidas pelos agricultores do
icípio de Anc tos de interesse à saúde humana.
A nális nas quantidades de (poli)fenóis em
ção a bserv es destes metabólitos secundários por
ctrofotometria UV-visível (Tabela 2). Isto ocorreu pelo fato da determinação do conteúdo
poli)fenóis totais ter sido realizada no extrato bruto MeOH-HCl (1%, v/v), contendo
os pigmentos antociânicos, que também m com o reativo de Folin-Ciocalteu.
E tanto, p ficaç fez-se necessário a separação dos
st ntoc li)fe a melhor identificação dos mesmos.
imentos s ando pretende-se utilizar técnicas
ráficas, etanólico bruto das flores das VCLM
é uma matriz complexa, o que dificulta a eluição dos compostos de interesse. Apesar disso,
fica evidente que a CLAE permitiu identificar diferenças qualitativas de importância para o
FIG
MeO
gáli
prov
(8,8
pres
de m
suge
mun
rela
espe
de (
também
compo
Proced
croma
22 – P
(1%
erfi
, v/v
l cro
) do
mat
tec
ográ
ido f
fico
lora
de
l da
(poli
vari
)fen
edade Rosado. 1- ácido protocateuico, 2- ácido
pos
gma
prec
), co
vela
crito
adas
pos
eque
teor
ge
mos
do
qu
studo si ila
Sérv
r mo
ia ap
stro
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e ex
am q
trato
uan
s de
tidad
esti
es a
µg
trabalho
itude, c
pote
. No
omp
ent
arati
anto,
vam
alg
ente
uns
aos
das V
val
CL
ores
M re
des
hiet
es
ado
a de
crom
qua
SC
atog
ndo
com
ráfi
da d
o fo
cas
eter
nte d
reve
min
este
laram
ação
s com
p
dos
s a
o o
rea
mes
isan
ário
extrato m
ntre
os a
ara
cos
a n
o a C
a id
dos
atur
LA
enti
(po
eza
E, u
ão
nólic
ne
ez q
dos
os v
cess
ue o
iâni
dess
com
são
ma v
tog
213
germoplasma em estudo, como demonstrado na Figura 23.
todas as
tecido floral das 8 VCLM em estudo.
Os ácidos t-cinâmico, gálico, caféico e protocatecuico foram encontrados em
variedades, enquanto o ácido siríngico não foi detectado nas variedades Rajado 8 carreiras,
Mato Grosso Palha Roxa e Cateto Vermelho. Para as variedades Língua de Papagaio e Rajado
8 carreiras o composto (poli)fenólico majoritário encontrado foi o ácido gálico, enquanto para
as variedades Roxo do Emílio, Roxo do Valdecir e Rosado foi o ácido protocatecuico. O ácido
t-cinâmico foi o composto majoritário no extrato das variedades Mato Grosso Palha Roxa,
Cateto Vermelho e Palha Roxa do Emílio.
FIGURA 23 – Percentagem dos ácidos (poli)fenólicos identificados por CLAE no
Esses resultados sugerem potencial farmacológico distinto para as variedades em
função das diferenças quantitativas e qualitativas detectadas através da CLAE, conforme
evidenciado pelos perfis cromatográficos peculiares segundo a variedade em estudo. Estudos
prévios mostraram que o ácido protocatecuico, epicatequinas e outros compostos
214
(poli)fenólicos comumente encontrados em chás e frutos possuem atividades anti-mutagênica,
et
r a
milaridade espectral entre os extratos em estudo, exceto para a variedade Roxo do Valdecir.
anti-carcinogênica, anti-oxidante, além de inibirem a agregação plaquetária (WEISBURGER,
1999; FUJIKI et al., 1998; DEWANTO et al., 2002; REIN et al., 2000).
Os resultados encontrados são de interesse, uma vez que até o presente momento não
há registros na literatura concernentes à identificação de tais metabólitos secundários
[compostos (poli)fenólicos] no tecido floral dessa espécie, apesar do seu largo emprego como
fitoterápico (MAKSIMOSIĆ et al., 2005).
4.3 Caracterização dos extratos florais - MeOH-tolueno (v/v)
4.3.1 Espectroscopia UV-visível
Compostos de diferentes polaridades foram extraídos do tecido floral das VCLM
utilizando como solvente a mistura metanol/tolueno (v/v). O perfil espectral de UV-visível foi
determinado para a janela espectral de 280 a 750 ηm (Figura 24). Similar ao realizado para o
extrato MeOH-HCl (1%, v/v), observou-se um elevado grau de similaridade entre os extratos,
com um valor de absorbância máximo entre 280 e 380, sugerindo a presença de grupos
cromóforos, encontrados em compostos de origem (poli)fenólica ou protéica (LAMBERT
al., 2001). Para os pigmentos carotenoídicos, o conjunto de ligações duplas conjugadas de sua
cadeia hidrocarbônica determina um máximo de absorção entre 400 e 500 ηm (BRITTON,
1982; MÍNGUEZ-MOSQUERA et al., 2001). Nessa região característica para carotenóides foi
detectado um aumento no valor de absorbância para todas as amostras, sugerindo a presença
daqueles compostos. A ampliação dessa região do espectro (Figura 24) permitiu verifica
si
215
-visível de amostras do extrato MeOH-tolueno (1:1,
outras variedades, exceto para Roxo do Valdecir e Roxo do Emílio, onde a xantofila
zeaxantina também foi detectada. Os resultados do presente estudo são inéditos, uma vez que
trabalhos preliminares (MAKSIMOVIĆ et al., 2005; VELAZQUEZ et al.,, 2005) de
caracterização química do tecido floral dessa espécie não incluíram tais metabólitos.
Posteriormente, procedeu-se à quantificação desses compostos como mostra a Tabela
3. Os maiores conteúdos de luteína foram encontrados no tecido floral da variedade Língua de
Papagaio (∼176 µg/g), Rosado (∼112 µg/g) e Mato Grosso Palha Roxa (∼95 µg/g), enquanto
FIGURA 24 - Perfil espectral UV
v/v) de flores femininas das 8 VCLM para as janelas espectrais entre 400 a 750ηm.
Considerando a natureza lipofílica das clorofilas, verificou-se a presença de tais
pigmentos nos extratos MeOH-tolueno na região do espectro compreendida entre 630-660 ηm.
4.3.2 Identificação de carotenóides usando CLAE
Os compostos carotenoídicos no extrato MeOH-toleuno das flores foram
caracterizados por CLAE, após a saponificação dos mesmos para a retirada de lipídeos e
clorofilas. A Figura 25 mostra que a xantofila luteína é o carotenóide majoritário no tecido
floral saponificado da variedade Rosado. Nessa amostra foram identificadas também pequenas
quantidades de α-caroteno e β-caroteno. O mesmo padrão cromatográfico foi obtido para as
216
menores teores foram detectados nas amostras das variedades Palha Roxa do Emílio 39
-
corrência foi observada somente nas variedades Roxo do Emílio e Roxo do Valdecir, variou
min
(∼
µg/g) e Roxo do Valdecir (∼51 µg/g).
FIGURA 25 – Perfil cromatográfico de carotenóides (CLAE, 450 ηm) presentes no
extrato MeOH-tolueno (v/v) do tecido floral saponificado da variedade Rosado. 1
β α-caroteno, S - solvente. luteína, 2- -caroteno, 3-
Quando comparados ao conteúdo de luteína, os demais carotenóides são considerados
minoritários no tecido analisado. O conteúdo da xantofila zeaxantina, por exemplo, cuja
o
entre 0,92 e 5,45 µg/g, respectivamente. Por sua vez, o conteúdo dos carotenóides pró-
vita a A, α-caroteno e β-caroteno, variou entre 0,40 a 6,0 µg/g e 2 a 20 µg/g nas variedades
Roxo do Valdecir e Língua de Papagaio, respectivamente.
Os resultados de identificação e quantificação de carotenóides observados no presente
estudo são bastante promissores por serem estes metabólitos secundários de alto valor
agregado.
217
TABELA 3 - Conteúdo
*
de carotenóides (µg/g, peso seco) do tecido floral de VCLM determinados por
cromatografia lí a
Var d
teína antina
β
-caroteno
α
-caroteno
quid
ieda
de alta eficiên
es
cia (CLAE).
Total
Lu
Zeax
Roxo Emílio
,6 ±0,01 5,33±0,75 1,97±0,2459,74 51,52±5 4 0,92
Roxo Valdecir
,96 ±0,33 2,00±0,09 0,40±0,35
Rajado 8 Carreiras
,66
.d.
5,97±0,55 1,57±0,15
Língua de Papagaio
,55
.d.
19,93±1,39 5,84±0,92
Rosado
,73
.d.
13,16±1,48 3,93±0,54
Mato Grosso Palha Roxa
,34
.d.
8,07±0,74 1,86±0,05
Cateto Vermelho
,83
.d.
7,84±0,70 1,94±0,23
,64
.d.
2,09±0,30 0,26±0,22
51,89 44,04±1
85,10 77,56±6
201,89 176,12±7
129,16 112,07±3
104,99 95,06±8
88,30 78,52±6
41,45 39,11±3
5,45
n
n
n
n
n
n
Palha Roxa do Emílio
* n= 6 indivíduos; 3 injeções
/amostra; n.d.= não detectado.
218
A xantofila luteína, por exemplo, é um produto bastante valorizado no mercado
adamente 1 mg (70% pureza) custa em torno de R$ 274,00
UA) sendo extraído e purificado a partir de flores
e ca ula es apreciáveis e por ser esta uma
02).
ilizan r ação de luteína de flores de calêndula
WAN et as flores femininas de milho possuem
prox e ário em relação ao conteúdo total daquela
que o isômero zeaxantina está ausente em algumas
ificação a partir dessa biomassa pode ter um custo menos
leva or nã a separação dos isômeros. Futuramente, faz-
e nec rio u o de viabilidade econômica do processo de extração e purificação desse
etabólito a partir das flores femininas do milho.
Tomados em conjunto, os resultad ente estudo nos permitiram
a fonte de comp icos de interesse à saúde humana,
o o n ação dessa biomassa como fonte de
postos bioativos poderá representar, em um ro próximo, uma alternativa de renda aos
uenos agricultores do município de Anchieta. As diferenças quali/quantitativas detectadas
os metabólitos secundários analisados nas amostras das VCLM podem resultar em usos e
cações distintos daqueles materiais. Dentre as variedades analisadas, Roxo Emílio, Roxo
de Rosado destacam-se pelo ior conteúdo de antocianinas e (poli)fenóis, sugerindo
acológico superio mes a vez que diversas atividades biológicas,
o ti-oxidan agên nogênica, têm sido atribuídas a esses
abólitos se a a v de Papagaio, por exemplo, a despeito do
ueno conté odo
sua explo ias de alimento e/ou farmacêutica poderá
enfatizar esta última característica. Assim, as diferenças de composição química descritas
neste trabalho sugerem que as VCLM podem ter usos distin nutenção do cultivo
internacional, onde aproxim
(Sigm
d
espécie de rápido florescim
(
a
espécie. No entanto, considerando
variedades, o processo de pur
e
s
m
5 CONCL
concluir que as VCLM são um
com
com
peq
para
apli
Val
um potencial farm
com
met
peq
que
a, E
lênd
. At
pelo
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fato
ente
das
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me
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sma
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etabó
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vem
rem quantidad
l., 20
Ut
G
imadam
do
al.,
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20
1/3
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des
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descrito para a extr
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USÕES
os encontrados no pres
ostos quím
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ssalta-se seu elevado teor de luteína, de m
ústr
ant cia inas, (poli)fenóis e carotenóides. A utiliz
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mut
par
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ão n
e a
dade
vad
das
cund
udo
raçã
nas o
o âm
tos e que a ma
219
de variedades distintas é de extrema importância quando se pretende explorar o potencial
fitoquímico de uma espécie, por exemplo.
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223
Capítulo 6
224
AVALIAÇÃO DO EFEITO DE CAROTENÓIDES DE GRÃOS DE MILHO
SOBRE PROCESSOS DE FORMAÇÃO DE VASOS SANGUÍNEOS
1 RESUMO
As xantofilas zeaxantina e luteína são os principais pigmentos de coloração
amarelo-alaranjada, pertencentes à família dos oxicarotenóides, encontrados nos grãos
de milho. A importância desses pigmentos está relacionada à sua utilização como
corante natural e também como suplementos alimentares. Diversas doenças humanas, a
exemplo de alguns tumores e da degeneração macular (DM) estão associadas à
formação descontrolada de vasos sanguíneos (neovascularização), sendo referidas como
doenças angiogênicas. Com o objetivo de investigar a atividade moduladora da
vascularização, um extrato carotenoídico rico em xantofilas, obtido a partir de grãos de
milho, foi avaliado utilizando-se como modelos, membranas vascularizadas de anexos
embrionários de Gallus domesticus. Verificou-se a ocorrência de 38 – 50 % de inibição
(P<0,05) da vasculogênese e da angiogênese na vesícula vitelínica (VV) e de 23 - 52%
de inibição da angiogênese na membrana corioalantóica (MC) de grupos tratados com o
extrato carotenoídico (0,1 - 10 µM de equivalente de zeaxantina/implante,
respectivamente), comparado ao controle (veículo). Um efeito inibitório similar ao
exercido pelas xantofilas foi observado nos grupos dos controles positivos tratados (10
µM/ implante) com ácido retinóico (49% de inibição na VV e 57% na MC) e com
luteína (padrão comercial; 65% de inibição na VV e 55% na MC). Esses resultados
permitem sugerir que o extrato carotenoídico rico em xantofilas, obtido a partir de grãos
de milho, é capaz de inibir processos de formação de vasos sanguíneos (vasculo- e
angiogênese), o que sugere a sua futura aplicação na prevenção e/ou terapêutica de
doenças relacionadas ao descontrole na regulação da angiogênese.
225
2 INTRODUÇÃO
Os carotenóides são os pigmentos mais amplamente distribuídos na natureza.
Entretanto, os seres humanos não são capazes de sintetizar estes compostos, que são
obtidos da dieta, especialmente através da ingestão de frutas e verduras. As xantofilas
(oxicarotenóides), denominadas de luteína e zeaxantina, compostos que não possuem
atividade pró-vitamina A, são os carotenóides majoritários dos grãos de milho (Figura
1) (MANGELS et al., 1993).
FIGURA 1- Estruturas químicas dos carotenóides encontrados em grãos de
milho e do ácido retinóico, um derivado do β-caroteno.
Algumas atividades importantes relacionadas à saúde humana têm sido
atribuídas a essas xantofilas, tais como o aumento da função imune (CHEW & PARK,
2004) o bloqueio do crescimento de tumores (CHEW et al., 2003) e a proteção contra a
226
degeneração macular relacionada à idade (DM), uma doença similar à catarata que
causa cegueira precoce (AHMED et al., 2005).
Um grande número de doenças como, por exemplo, a DM e o crescimento de
alguns tumores são caracterizados pela formação descontrolada de vasos sanguíneos
(neovascularização). De fato, várias evidências sugerem uma relação entre o descontrole
na regulação da formação de vasos sanguíneos e processos tais como isquemia,
inflamação, infecção ou câncer (malignização) (CARMELIET, 2003).
A vasculogênese e a angiogênese são os processos de formação de vasos
sanguíneos mais conhecidos e estudados. Durante o período de embriogênese, a
formação dos primeiros vasos envolve a diferenciação de células precursoras
(angioblastos) e a organização de uma rede vascular primária no embrião e no saco
vitelínico (vasculogênese) (RUITER et al., 1992). Subsequentemente, esta rede de
vasos primários sofre uma remodelagem, que envolve tanto eventos de morte celular e
de regressão vascular como a ramificação de capilares a partir de vasos pré-existentes
(angiogênese) (FOLKMAN, 1971). Este último processo ocorre tanto no período
embrionário como na fase adulta. Contudo um corpo crescente de evidências mostra que
a diferenciação de células progenitoras endoteliais, evento característico da
vasculogênese, está presente também no adulto, em associação com algumas patologias,
como, por exemplo, o câncer (ZAMMARETTI & ZISCH, 2005). A angiogênese é um
processo de extrema importância em inúmeros processos fisiológicos, como por
exemplo, no ciclo reprodutivo feminino e na cicatrização, e está associada a algumas
condições patológicas, conhecidas como doenças angiogênicas (CARMELIET, 2003).
Observa-se atualmente um aumento no interesse sobre estudos que tenham como
objetivo a investigação dos efeitos inibitórios sobre a formação de vasos sanguíneos
apresentados por produtos naturais, a exemplo de derivados de cartilagem de tubarão,
ergosterol, taxol, vitamina A e do resveratrol (IGURA et al., 2001; TAKAHU et al.,
2001; HLATKY & FOLKMAN, 2002; TAN et al., 2003).
A ingestão regular de alimentos, como grãos e produtos derivados, que
contenham compostos pró- ou anti-vasculogênicos/angiogênicos têm se consolidado
como estratégia profilática em doenças relacionadas ao crescimento descontrolado de
vasos sanguíneos (SLAVIN et al., 2001; CARMELIET, 2003). Muitos dos benefícios à
saúde associados à ingestão desses alimentos, como a prevenção da DM, têm sido
atribuídos a presença de pigmentos, como os carotenóides, sendo de grande interesse a
descoberta das atividades biológicas exercidas pelos mesmos no corpo humano. Neste
227
sentido, o ácido retinóico, que é um derivado do β-caroteno, é amplamente reconhecido
pelas suas propriedades anti-angiogênicas (
OIKAWA et al., 1989) (Figura 1).
Dessa forma, este estudo teve como objetivo investigar o efeito de um extrato
carotenoídico, rico em xantofilas, sobre os processos de formação de vasos sanguíneos,
utilizando como modelos, membranas vascularizadas de anexos embrionários de Gallus
domesticus. O presente estudo integrou um projeto que está sendo realizado no extremo
oeste do estado de Santa Catarina, em associação com pequenos agricultores que
desenvolvem e cultivam variedades crioulas e locais de milho (VCLM), e que tem como
objetivo geral obter informações relacionadas aos compostos bioativos presentes
naquelas variedades, voltadas à agregação de valor aos produtos derivados do milho.
Para isso, foi realizada, em uma etapa preliminar, a identificação e a quantificação dos
carotenóides presentes nos grãos de 26 VCLM cultivadas no município de Anchieta
(Capítulo 4). O extrato carotenoídico da VCLM MPA1 foi selecionado para os ensaios
biológicos por ter sido detectado no mesmo o maior conteúdo de luteína e um elevado
conteúdo de zeaxantina.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção do material vegetal
O composto de milho MPA1 foi desenvolvido por um agricultor (Nélcio Alceu
Folgiarini) do município de Anchieta, localizado no extremo oeste de Santa Catarina,
com o apoio técnico do Sindicato de Trabalhadores da Agricultura Familiar (SINTRAF)
e da Associação dos Pequenos Produtores de Milho Crioulo Orgânico e Derivados
(ASSO), a partir da safra 1999/2000. Esse composto foi produzido a partir de
populações distintas de milho, sendo 18 delas populações sintéticas comerciais, 4
variedades de polinização aberta do grupo Pixurum e 3 VCLM (Cateto, Mato Grosso
Palha Roxa e Amarelão), cultivadas no município de Anchieta.
3.2 Extração e Dosagem de Carotenóides
Amostras (1 g, peso seco) de grãos das 26 VCLM foram maceradas na presença
de 2 volumes de solução de hexano:acetona (v/v), contendo 100 mg/L de hidroxitolueno
butilado (BHT). As amostras foram filtradas sob vácuo, centrifugadas por 10 minutos
(5.000 rpm) e o solvente evaporado em fluxo de nitrogênio. O extrato concentrado foi
228
ressuspenso em 3 mL de hexano, lavado com 9 mL de água destilada (3x) e,
posteriormente, submetido à espectrofotometria UV-visível (Shimadzu 2301) para a
determinação do conteúdo de carotenóides, através da leitura da absorbância a 450 ηm
(AMAN et al., 2001). A concentração de carotenóides totais foi calculada usando a
fórmula de Lambert-Beer, utilizando-se o coeficiente de extinção molar (ε) de 2348 M
-
1
.cm
-1
(zeaxantina), como previamente descrito por BRITTON (1982). As análises
foram realizadas a partir de 3 extrações independentes.
3.3 Análise de compostos carotenoídicos por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE)
A identificação dos carotenóides foi realizada após a injeção de amostras
concentradas (10 µL) em cromatógrafo líquido (Shimzadu LC-10A), equipado com
coluna C
18
de fase reversa (Vydac 218TP54, 25 cm x 4,6 mm ∅ interno) e detector
espectrofotométrico UV-visível, operando em 450ηm. A eluição utilizou
MeOH:Acetonitrila (90:10, v/v) como fase móvel, em fluxo de 1 mL/min. A
identificação dos compostos de interesse (isto é,
β
-caroteno, luteína e zeaxantina) foi
feita com base nos tempos de retenção determinados a partir da análise de amostras
padrões sob as mesmas condições experimentais. A quantificação dos carotenóides
utilizou curva-padrão externa [0,5 µg/mL – 45 µg/mL para luteína e zeaxantina (r
2
=
0.99) e 0,01 µg/mL – 12 µg/mL para
β
-caroteno (r
2
= 0,98)] e considerou a intensidade
dos picos de interesse para efeitos de cálculo, sendo que os valores apresentados
correspondem à média de 3 injeções/amostra, obtidas através de extrações
independentes.
3.4 Ensaios da vesícula vitelínica (VV) e da membrana corioalantóica (MC) de
embriões de galinha
A atividade inibitória do extrato carotenoídico obtido das sementes da VCLM
MPA1 sobre a vasculogênese e a angiogênese foi determinada por meio de ensaios da
vesícula vitelínica (VV) e da membrana corioalantóica (MC) de embriões de galinha,
respectivamente. Para tal, ovos de galinha foram preliminarmente mantidos em estufa
incubadora (Gera-Petersime) equipada com ventilação forçada, controle digitalizado de
umidade (33%) e temperatura (37,5ºC), por um período de 48h.
229
Os tratamentos in ovo (n = 8) foram realizados pela adsorção do extrato
carotenoídico (0,1 – 10 µM de equivalente de zeaxantina) em suportes de metilcelulose
(MCE) em forma de disco (0,45% p/v, 3 mm de diâmetro; 1 disco/embrião),
polimerizados em ambiente asséptico (câmara de fluxo laminar), sob uma bandeja
revestida com Teflon
®
. Uma solução de DMSO 2% (v/v) foi utilizada para solubilizar
os carotenóides, tendo em vista a baixa solubilidade dos mesmos em meio aquoso.
Dessa forma, um grupo tratado apenas com DMSO 2% (v/v) foi usado como controle
negativo, e outro grupo tratado apenas com MCE (água ultra-pura; pH 7,2). O ácido
retinóico (AR, 10 µM/disco) e luteína (padrão comercial – Sigma/X-6250) (Lut, 10
µM/disco) foram usados como controles positivos.
O ensaio de vasculogênese foi realizado de acordo com o método descrito por
DIAS et al. (2007). Nesse ensaio, após as primeiras 48 h de incubação (E2; 48 h;
estágio 13–HH; HAMBURGER & HAMILTON, 1951) os ovos foram removidos da
incubadora e uma janela (10 mm de diâmetro) foi aberta na casca, na posição superior
ao embrião (foram utilizados somente ovos contendo embriões viáveis), expondo a VV.
O tratamento in vivo foi realizado, implantando-se os discos de MCE (1 disco/embrião)
sobre a membrana vasculosa da VV, onde ilhotas sangüíneas – primórdios de vasos
sangüíneos iniciais – estão presentes na rede vascular primária, como evidência da
vasculogênese. Após, as janelas na casca foram fechadas com filme de celofane preto e
os ovos retornaram à incubadora por um período adicional de 48 h, alcançando a idade
embrionária de 4 dias (E4; 96h; estágio 23–HH). Concluído o período de incubação, o
número de vasos interceptando o limite do disco de MCE foi avaliado usando um
microscópio estereoscópico (30x). Desta forma, a inibição da vasculogênese foi
determinada em função do decréscimo no número de vasos vitelínicos (aparecimento de
uma zona avascular) e expressa como a percentagem de vasos comparada ao controle
negativo (DMSO 2%, v/v, veículo).
O ensaio da membrana corioalantóica (MC) foi realizado de acordo com os
procedimentos previamente descritos por RIBATTI et al. (1987). Os ovos fertilizados
foram incubados durante 2 dias (E2) a uma temperatura de 37
0
C e umidade constante
(33%) e no 4
0
dia (E4) do experimento foi aberta uma pequena janela na região da
câmara de ar da casca, a fim de evitar a aderência dos mesmos. Em seguida, as janelas
na casca foram fechadas com filme de celofane preto e retornaram à incubadora. No 6
0
dia (E6; estágio 28/29–HH) de incubação a janela na casca dos ovos foi ampliada (10
230
mm de diâmetro) para permitir a implantação dos discos de MCE sobre o terço externo
da membrana corioalantóica, onde vasos capilares ainda estavam crescendo. Os discos
de MCE nos grupos controle negativo foram polimerizados com água ultra-pura estéril
ou DMSO 2% (v/v). Os grupos de controle positivo e os grupos tratados com as
diferentes concentrações do extrato carotenoídico foram os mesmos usados no ensaio da
VV. No 8
0
dia (E8; estágio 34–HH; total de 192 h) de incubação, a inibição da
angiogênese foi avaliada conforme descrito para o ensaio de vasculogênese.
Os experimentos envolvendo os animais foram realizados de acordo com os
procedimentos descritos no protocolo número 069/proc.23080.028290/2006-
11/UFSC/CEUA/UFSC, aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais
(CEUA/UFSC).
3.5 Análise de dados e estatística
Os dados foram apresentados como média
±
erro padrão da média (E.P.M.),
obtidos de pelo menos dois experimentos independentes. A análise estatística foi
realizada através da ANOVA (one-way analysis of variance) seguida do teste de Tukey
(HSD). Os efeitos foram considerados estatisticamente significativos para valores de P
menores que 0,05.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização química do extrato carotenoídico
A cromatografia líquida revelou que o carotenóide majoritário nos grãos das
VCLM analisadas é a xantofila zeaxantina, seguido de luteína, β-criptoxantina, β-
caroteno e α-caroteno. Padrões comerciais foram utilizados na identificação de
zeaxantina, luteína e β-caroteno, enquanto que a identificação dos outros carotenóides
baseou-se na comparação dos perfis de eluição obtidos no presente estudo com os
registrados em estudos prévios, utilizando grãos de milho e realizados em condições
similares (SCOTT & ELDRIDGE, 2005; HULSHOF et al., 2007).
Na Tabela 1 estão apresentados o conteúdo de carotenóides na variedade
selecionada (MPA1) e os conteúdos máximos e mínimos encontrados para as outras
variedades estudadas. O conteúdo total de carotenóides variou de 1.963 a 201 µg/100g
considerando todas as VCLM estudadas, sendo que nos grãos da variedade MPA1
231
foram detectados aproximadamente 1.900 µg/100g de carotenóides totais, usando o
método espectrofotométrico.
Através da Tabela 1 pode-se verificar que as concentrações de luteína e
zeaxantina variaram de 3 µg/100g na variedade Branco (conteúdo mínimo) a 369
µg/100g na variedade MPA1 (conteúdo máximo) e de 7 µg/100g na variedade Branco a
1.070 µg/100g na variedade Roxo do Emílio, respectivamente. Quantidades-traço de β-
criptoxantina, β-caroteno e α-caroteno foram detectadas em algumas variedades,
principalmente naquelas em que os maiores conteúdos de carotenóides totais foram
encontrados, como em MPA1 e Roxo do Emílio.
TABELA 1- Conteúdo de carotenóides
*
(µg/100g, peso seco – média ±
desvio padrão) nos grãos de variedades crioulas e locais de milho
determinados por CLAE (450 ηm).
MPA 01 Variação para as outras VCLM
Zeaxantina 705 ± 101 7 ± 1 – 1.070 ± 254
Luteína 369 ± 28 5 ± 3 – 369 ± 88
β-criptoxantina
5 ± 1 traços – 11 ± 3
β-caroteno
4 ± 1 traços – 4 ± 1
α-caroteno
2 ± 1 traços – 2 ± 1
Total 1.888 ± 118 201 ± 20 – 1.963 ± 222
*
Média de três extrações independentes
Os resultados do presente estudo, no que diz respeito às xantofilas estão de
acordo com trabalhos prévios que mostraram que os conteúdos de luteína e zeaxantina
nos grãos de milho variam entre 50 a 2.300 µg/100g. Contudo na literatura constam
registros de conteúdos superiores de β-caroteno (10 a 70 µg/100g) (MANGELS et al.,
1993). Portanto, as sementes da variedade MPA1 e de outras VCLM destacam-se como
importantes fontes de xantofilas com provável aplicação na indústria farmacêutica e
alimentícia, porém não constituem fonte de β-caroteno em função da pequena
quantidade detectada.
Atualmente existe um crescente interesse em incluir a xantofila luteína na dieta
humana, tanto na forma de suplementos dietéticos como através de alimentos
funcionais. O suplemento Ocuvite
®
(Bausch & Lomb), por exemplo, contém
232
quantidades significativas de luteína (2 a 6 mg/cápsula), sendo sua ingestão
recomendada para manutenção da saúde macular (http:/www.bausch.com/em_us/
consumer/visioncare/product/vitamins/ocuvite_adult.asp.
x). Nos Estados Unidos, por
exemplo, o reconhecimento da luteína cristalina pela FDA (Food and Drugs
Administration) como suplemento permitiu o uso do mesmo em alimentos e bebidas
sem nenhuma restrição (ALVES-RODRIGUES & SHAO, 2003).
4.2 – Ensaios da vesícula vitelínica (VV) e da membrana corioalantóica (MC) de
embriões de galinha
Os carotenóides vêm despertando o interesse na comunidade científica como
prováveis candidatos a agentes anticarcinogênicos a serem usados em alimentos
funcionais, uma vez que estudos epidemiológicos têm mostrado que o consumo de
frutas e vegetais tem uma relação inversa com a incidência de várias doenças,
principalmente o câncer (ZIEGLER et al., 1996; MÍNGUEZ-MOSQUERA et al.,
2002).
No contexto clínico, as xantofilas luteína e zeaxantina têm sido investigadas
mais especificamente com relação à prevenção da degeneração macular relacionada à
idade (DM), pois existem evidências de que o aparecimento da patologia está associado
à diminuição no conteúdo dessa classe de compostos (AHMED et al., 2005). Diversos
estudos têm proposto que as xantofilas ajudam a preservar a saúde macular por
seqüestrarem os radicais livres gerados a partir da incidência de raios ultravioletas (UV)
(SUNDELIN & NILSSON, 2001; SANTOSA & JONES, 2005; WHITEHEAD et al.,
2006), porém pouca atenção tem sido dada a outros possíveis benefícios e mecanismos
de ação desses compostos. Em uma investigação ímpar CHEW et al. (2003),
demonstraram com base em estudos imuno-histoquímicos, que a inibição do
crescimento de tumores mamários em ratos, após a ingestão de luteína, foi decorrente
do aumento da apoptose e combinado à inibição da angiogênese.
O ensaio da VV de embriões de galinha foi utilizado no presente estudo por ser
um teste rápido e adequado para a avaliação dos processos iniciais de vasculogênese e
de angiogênese descrito recentemente por DIAS et al. (2007)..
Os resultados permitem concluir que os carotenóides de milho (0,1 µM – 10 µM
de equivalente de zeaxantina/disco) inibiram de um modo dose-dependente o processo
de vascularização (28% - 50% de inibição, respectivamente) quando comparados ao
grupo controle (DMSO 2%, v/v) (Figura 2).
233
FIGURA 2- Efeito do extrato carotenoídico de grãos de milho da variedade MPA1
(0,1 – 10 µM de equivalente de zeaxantina/disco) administrados em membranas de
vesículas vitelínicas de embriões de galinha de 4 dias de idade, cultivados in ovo. O
inset mostra a percentagem do número de vasos nos grupos controle. Discos de
metilcelulose contendo apenas água ultrafiltrada (C-MC) ou água ultrafiltrada e
DMSO 2% (C-DMSO) foram utilizados como controles negativos. Discos de
metilcelulose contendo ácido retinóico (AR; 10 µM) ou luteína (10 µM) foram
utilizados como controles positivos. Os resultados são expressos como a
percentagem do número de vasos sanguíneos no limite dos discos de metilcelulose
quando comparados ao grupo controle (C-DMSO). Colunas e barras verticais
representam a média
erro padrão da média (n=8) e os asteriscos denotam uma
inibição estatisticamente significativa da vasculogênese em relação ao controle (C-
DMSO), usando ANOVA seguido do teste post-hoc Tukey (p<0,05).
±
234
Na Figura 3 pode-se observar a redução no número de vasos capilares da
vesícula vitelínica de embriões de grupos tratados com 10 µM de equivalente de
zeaxantina/disco quando comparado ao grupo controle.
A utilização do controle com DMSO 2% (v/v) (controle negativo) foi incluído
nos experimentos em função da necessidade de solubilização do extrato carotenoídico
em um solvente não aquoso. No entanto, na concentração de 2% (v/v), o DMSO,
mostrou-se eficiente na solubilização do extrato na MC e não provocou efeito inibitório
na formação de vasos vitelínicos iniciais (98 vasos) quando comparado ao grupo
controle tratado apenas com MC (100 vasos) (inset - Figura 2).
O efeito anti-angiogênico da luteína (padrão comercial) demonstrado por CHEW et al.
(2003), através de ensaios imuno-histoquímicos, em ratos inoculados com tumores de
mama, envolve uma vascularização mais avançada. No presente estudo verificou-se que
o efeito inibitório dessa xantofila sobre a vascularização inicial é mais efetivo (cerca de
65% de inibição) do que o exercido pelo ácido retinóico (cerca de 49% de inibição)
(Figura 2). Além disso, na concentração de 100 µM de equivalente de zeaxantina/disco
(dados não apresentados), os carotenóides inibiram a vascularização em apenas 38% em
relação ao controle, possivelmente em função do limite de solubilidade do extrato na
MC.
FIGURA 3- Micrografias ópticas dos vasos vitelínicos do anexo embrionário da
vesícula vitelínica de embriões de galinha de 4 dias de idade, tratados com (A)
metilcelulose (grupo controle) e (B) 10 µM de equivalente de zeaxantina/disco de
carotenóides de grãos de milho da variedade MPA1. Bar = 2 mm.
De forma similar aos resultados encontrados no ensaio de vasculogênese e
angiogênese iniciais (ensaio da VV), o mesmo extrato carotenoídico de grãos de milho
235
da variedade MPA1 mostrou uma potente atividade anti-angiogênica utilizando o ensaio
na MC.
Nas MC dos grupos controles negativo, em que foram utilizados discos-suporte
contendo apenas água ultra-pura ou água e DMSO 2% (v/v), observou-se, em média,
114 e 112 vasos, respectivamente, no limite dos discos (inset Figura 4). Por outro lado,
nas membranas tratadas com o extrato carotenoídico (0,1 – 10 µM de equivalente de
zeaxantina/disco) foram observados poucos vasos no limite dos discos de MC (23 –
52% de inibição) quando comparado ao grupo controle (P<0,05) (Figura 4).
Além disso, como observado na Figura 4 (inset) os controles positivo, ácido
retinóico (AR) e luteína comercial (Lut), causaram uma potente inibição da angiogênese
(57 e 55%, respectivamente) quando comparada ao grupo controle (DMSO 2%, v/v),
sendo este resultado similar ao observado no grupo tratado com a maior concentração
de carotenóides (10 µM de equivalente de zeaxantina/disco).
A concentração de 10 µM/disco de carotenóides foi a que apresentou efeito
inibitório mais potente (cerca de 50%), tanto no ensaio da VV como no da MC.
Contudo a luteína isolada (Sigma) foi a substância que apresentou maior efeito
inibitório (65%), quando administrada sobre a vesícula vitelínica.
Os mecanismos de ação dos carotenóides sobre os processos de formação de
vasos sanguíneos ainda são pouco conhecidos, não tendo sido investigados no presente
trabalho. Estudos prévios MAJEWSKIA et al. (1995) e PAL et al., (2000) mostraram
que ácido retinóico, astaxantina e outros carotenóides inibem seletivamente a resposta
angiogênica induzida por VEGF (vascular endothelial growth factor) no ensaio da MC
de embriões de galinha. Portanto, um estudo futuro e mais detalhado se faz necessário
para determinar se a combinação de carotenóides presentes nos grãos da variedade
MPA1 pode inibir a formação dos vasos sanguíneos, influenciando as vias de
sinalização moduladas pelo VEGF.
5 CONCLUSÕES
Os resultados encontrados no presente estudo sugerem a utilização dos grãos das
VCLM como fonte de compostos bioativos de interesse às indústrias farmacêuticas e
alimentícias, em função de seus conteúdos apreciáveis em zeaxantina e luteína, potentes
inibidores dos processos de formação de vasos sanguíneos (vasculogênese e
angiogênese).
236
FIGURA 4- Efeito do extrato carotenoídico de grãos de milho da variedade MPA1 (0,1
– 10 µM de equivalente de zeaxantina/disco) administrados em membranas
corioalantóicas de embriões de galinha de 8 dias de idade, cultivados in ovo. O inset
mostra a percentagem de vasos nos grupos controles. Discos de metilcelulose contendo
apenas água ultrafiltrada (C-MC); água ultrafiltrada e DMSO 2% (C-DMSO) –
controles negativos. Discos de metilcelulose contendo luteína e ácido retinóico (10 µM)
foram utilizados como controles positivos. Os resultados são expressos como a
percentagem de vasos sanguíneos no limite dos discos de metilcelulose quando
comparados ao grupo controle (C-DMSO). Colunas e barras verticais representam,
respectivamente, a média
erro padrão da média (n= 8), e os asteriscos denotam uma
inibição estatisticamente significativa da angiogênese em relação ao controle (C-
DMSO), usando ANOVA seguido do teste post-hoc Tukey (p < 0,05).
±
237
Diante disso, é instigante especular sobre a possível participação daquelas
xantofilas nos processos de remodelagem da rede de vasos sanguíneos na região da
mácula do olho, uma vez que este tecido é altamente vascularizado. Muito
possivelmente, a atividade antioxidante das xantofilas na retina não é o único papel
desempenhado pelas mesmas. A associação que existe entre a presença das xantofilas na
região macular e a prevenção de doenças degenerativas oculares sugere que aquelas
substâncias estejam relacionadas à atividade anti-angiogênica. Portanto, o presente
estudo sugere o uso das xantofilas como adjuvantes na prevenção de doenças
degenerativas causadas pelo crescimento descontrolado de vasos sanguíneos, bem como
a inclusão dos grãos de milho entre os alimentos funcionais na dieta humana, em função
de suas quantidades apreciáveis desses metabólitos secundários.
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241
7- CONSIDERAÇÕES FINAIS
A diversidade química encontrada, no presente estudo, entre o germoplasma de milho
crioulo cultivado em Anchieta (SC) indica a urgente necessidade de se propor/criar ações que
promovam a sua conservação. Contudo, para que o processo de conservação on farm tenha
continuidade, é necessário que os agricultores permaneçam nessa atividade, o que será mais
facilmente alcançado quando um maior retorno econômico for obtido por eles. Sendo assim,
propõe-se que os resultados aqui encontrados sejam utilizados para subsidiar ações voltadas à
agregação de valor da biomassa em questão.
Como exemplo, tem-se a possibilidade de produzir farinhas provenientes daquela
localidade com constituição química diferenciada, como foi detectado, no presente estudo,
pela técnica de FT-IR associada à quimiometria (PCA) (Capítulo 1). A investigação do
potencial de uso de algumas delas em setores específicos da indústria de alimentos, como para
produção de pães, massas ou produtos processados está entre as possibilidades de agregar
valor ao milho crioulo de Anchieta. Além disso, observou-se que via espectroscopia de FT-IR
é possível distinguir os polímeros amilose e amilopectina em amostras pela detecção de
bandas em 1018 e 997 ondas.cm
-1
(Capítulo 1). Esse resultado reveste-se de importância, pois
permite a detecção e/ou a quantificação de tais polissacarídeos em amostras de farinha ou de
outros alimentos, usando uma técnica rápida, simples e de baixo custo.
De forma similar, verificou-se que a partir das farinhas de milho crioulo podem ser
obtidas frações ricas em amilose (FAM) ou amilopectina (FAP), a partir de um protocolo
simples e rápido de extração e fracionamento do amido, com constituição química peculiar,
como demonstrado por FT-IR e PCA. A distinção de tais frações foi atribuída à associação dos
polímeros com contaminantes (lipídios, proteínas e compostos de baixo peso molecular não
identificados) e também pela distinta proporção dos dois polissacarídeos constituindo a fração
amídica no germoplasma em questão e/ou ainda pela presença de polímeros de tamanho
intermediário (Capítulo 1). A análise dessas frações por 13C-RMN revelou a similaridade de
perfis espectrais entre as frações ricas em amilose (FAM) extraídas das VCLM e dos
cultivares comerciais com o padrão comercial de amilose (Sigma), exceto pela presença de
compostos de origem lipídica (Capítulo 2). A 1H-RMN, por sua vez, constituiu uma
ferramenta analítica bastante adequada à identificação de frações amídicas de variedades com
242
maior potencial de uso na indústria, em função da similaridade de perfis espectrais
encontradas entre as mesmas e o padrão comercial (Sigma) (Capítulo 2). Sendo assim sugere-
se um potencial ainda a ser explorado de algumas daquelas frações por determinados setores
da indústria de alimentos, principalmente aqueles relacionados à produção de espessantes.
As farinhas do germoplasma analisado podem ser também diferenciadas em função de
seu valor nutricional associado ao conteúdo de proteínas. Os resultados demonstraram que
além da elevada amplitude de valores de proteínas totais detectada entre as amostras, algumas
variedades têm um maior conteúdo das frações globulina e glutelinas, que são justamente
aquelas que apresentam maior proporção dos aminoácidos essenciais lisina e triptofano. A
aplicação da técnica de PCA a esse conjunto de dados quantitativos foi de grande auxílio, pois
permitiu a rápida distinção das variedades de maior valor nutricional. De forma complementar,
a análise dos espectros de FT-IR para a região de fingerprint de proteínas (1650-1500
ondas.cm
-1
), usando PCA, reforçou o resultado de que as farinhas das VCLM e dos cultivares
comerciais possuem constituição protéica distinta, consolidando o emprego dessa técnica em
estudos que envolvam o screening de vários genótipos (Capítulo 3).
Através do presente estudo foi possível também detectar o potencial diferenciado das
farinhas das VCLM em relação à presença e conteúdo de pigmentos, tais como carotenóides e
antocianinas e/ou outros compostos de interesse à saúde humana, como, por exemplo,
(poli)fenóis. Os pigmentos denominados flobafenos, compostos de ocorrência bastante restrita
na natureza, foram encontrados apenas nas amostras de grãos das variedades roxas, sendo esse
um resultado de grande interesse, em função das aplicações dos mesmos no setor industrial e
farmacêutico. Em contrapartida, as demais variedades pigmentadas mostraram-se como fontes
adequadas para extração de compostos antociânicos. A elucidação estrutural de tais compostos
encontra-se em andamento e é etapa essencial para agregar valor às farinhas produzidas na
região ou para utilização das mesmas como fonte de matéria-prima de pigmentos a serem
usados como corantes de bebidas ou de alimentos. As farinhas de milho crioulo podem ainda
ter um valor nutricional diferenciado, em função de seus teores de ácidos (poli)fenólicos,
conforme demonstrado no presente estudo (Capítulo 4).
Os maiores valores de conteúdos de carotenóides, por sua vez, foram encontrados entre
as cultivares comerciais. De qualquer forma, as xantofilas, zeaxantina e luteína, que são os
carotenóides majoritários das farinhas de milho, podem ser facilmente extraídas dessa
243
biomassa (grãos) para produção de suplementos alimentares que possuem, nos dias de hoje,
elevado valor de mercado.
O extrato carotenoídico rico em xantofilas, obtido a partir de grãos de milho, mostrou
um potente efeito inibitório nos processos de formação de vasos sanguíneos (vasculo- e
angiogênese), sugerindo a sua futura aplicação na prevenção e/ou terapêutica de doenças
relacionadas à angiogênese descontrolada (Capítulo 6).
As flores femininas das variedades de milho crioulo, semelhante às farinhas,
apresentam constituição química diferenciada, conforme evidenciado pelo uso de análises
espectroscópicas como, FT-IR (3000-600; 1650-1500 e 1250-900 ondas.cm
-1
), 1H-RMN, UV-
visível e quimiométrica (PCA). As classes de compostos químicos relacionadas a essa
distinção e que podem resultar em um potencial farmacológico diferenciado para esse tecido
foram as antocianinas, os (poli)fenóis e os carotenóides. As antocianidinas pelargonidina e
cianidina foram identificadas como sendo os compostos majoritários por MALDI-TOF/MS,
no extrato metanólico bruto (MeOH-HCl, 1%,v/v) das flores femininas de VCLM. Contudo,
foram detectados conteúdos distintos de antocianinas (460 e 525 ηm), (poli)fenóis (ácidos
gálico, t-cinâmico, protocatecuico, siríngico e caféico) e carotenóides (luteína, β-caroteno, α-
caroteno e zeaxantina) entre as VCLM. Esses resultados apontam na direção, a curto e médio
prazo, da utilização daquela biomassa como fonte de matéria-prima de compostos de interesse
a saúde humana, visando a produção de fitoterápicos ou fitofármacos.
Tomados em conjunto, em um futuro próximo, espera-se que os resultados aqui
encontrados possam ser usados para a criação de uma marca coletiva, no município de
Anchieta, a ser usada pelos produtos derivados dos milhos crioulos (farinhas diferenciadas,
fitoterápicos e/ou fitofármacos), gerando um maior retorno econômico aos pequenos
agricultores e, portanto, estimulando-os a continuarem conservando aquele germoplasma.
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