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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
MESTRADO MULDIDISCIPLINAR
EM PATOLOGIA TROPICAL
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ASSOCIADA A
MANIFESTAÇÕES NEUROLÓGICAS E
COMPORTAMENTAIS DO SONO EM PACIENTES COM
HEPATITE C
CARLOS MAURÍCIO OLIVEIRA DE ALMEIDA
MANAUS
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
MESTRADO MULDIDISCIPLINAR
EM PATOLOGIA TROPICAL
CARLOS MAURICIO OLIVEIRA DE ALMEIDA
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ASSOCIADA A
MANIFESTAÇÕES NEUROLÓGICAS E
COMPORTAMENTAIS DO SONO EM PACIENTES COM
HEPATITE C
Dissertação apresentado ao Programa de Pós-
Graduação da Universidade Federal do Amazonas
como parte do requisito para a obtenção do título de
Mestre em Patologia Tropical, na área de
concentração Diagnóstico e Controle.
Orientadora: Profª. Drª. Adriana Malheiro
Co-orientador: Prof. Dr. Wornei Silva Braga
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MANAUS
2007
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Ficha Catalográfica
(Catalogação na fonte realizada pela Biblioteca Central - UFAM)
A447a
Almeida, Carlos Maurício Oliveira de
Avaliação da resposta imune associada a manifestações
neurológicas e comportamentais do sono em pacientes com
hepatite C / Carlos Maurício Oliveira de Almeida. -
Manaus:
UFAM, 2007.
155 f.; il.
Dissertação (Mestrado em Patologia Tropical) ––
Universidade Federal do Amazonas, 2007.
Orientadora: Prof .Dra. Adriana Malheiro
Co-orientador: Prof .Dr. Wornei Silva Braga
1. Hepatite C 2. Saúde pública 3. HCV I.Título
CDU 616.36(043.3)
CARLOS MAURICIO OLIVEIRA DE ALMEIDA
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ASSOCIADA A
MANIFESTAÇÕES NEUROLÓGICAS E
COMPORTAMENTAIS DO SONO EM PACIENTES COM
HEPATITE C
Dissertação apresentado ao Programa de Pós-
Graduação da Universidade Federal do Amazonas
como parte do requisito para a obtenção do título de
Mestre em Patologia Tropical, na área de
concentração Diagnóstico e Controle.
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30 de outubro de 2007
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dra. Adriana Malheiro
Fundação HEMOAM
Prof. Dra. Maria Cristina dos Santos
Universidade Federal do Amazonas
Prof. Dr. Felipe Naveca
Fundação Medicina Tropical do Amazonas
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DEDICATÖRIA
Aos meus pais Fernando e Célia.
À minha esposa Priscila e minha filha Gabriela.
À memória de minhas avós.
À Deus pela saúde conferida.
AGRADECIMENTOS
À minha orietadora Prof ª. Dra. Adriana Malheiro pela presteza e orientação durante esta
jornada;
À Fundação HEMOAM;
À Dra. Kátia Torres pela imensa ajuda nas análises moleculares;
À Tatiana e Daniel pela amizade e importante participação, genotipagem e análises das
citocinas;
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À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM);
À Universidade Federal do Amazonas (UFAM) com o respectivo coordenador, do
mestrado em patologia Tropical, Dr. Nelson Fraijii.
Aos pacientes que colaboraram para o sucesso deste trabalho;
À todos os colegas do mestrado que conseguiram concluir mais uma etapa de longo e árduo
trabalho.
RESUMO
A hepatite C é um grande problema de saúde pública atual com aproximadamente 180
milhões de pessoas infectadas no mundo todo. O HCV é um vírus RNA de fita simples,
pertencente à família flaviviridae O HCV é um agente infeccioso altamente imunogênico
levando ao desenvolvimento de uma intensa resposta imune humoral e celular. No entanto
cerca de 80% dos pacientes evoluem para uma doença crônica, podendo desenvolver cirrose
hepática ou câncer. Apenas 15-20% dos pacientes infectados apresentam ¨clearance¨ viral e
evoluem para a cura. Os mecanismos pelo qual o HCV evade-se do sistema imunológico
ainda não são totalmente conhecidos, mas a polarização da imunidade através da produção de
citocinas parece ser uma das principais causas. Pacientes infectados pelo HCV podem
apresentar várias manifestações extra-hepáticas como fadiga, depressão e distúrbios do sono.
As manifestações neurológicas podem envolver o sistema nervoso periférico na forma de
polineuropatias ou o sistema nervoso central como encefalopatia agudo-subaguda, acidente
vascular cerebral e um comprometimento subcortical. O acometimento neurológico pode
ocorrer pela própria replicação do vírus no tecido nervoso, ou indiretamente pela resposta
imunológica do paciente. Estas alterações podem levar ao comprometimento da qualidade de
vida, talvez secundárias as queixas de sono. O sono é um estado fisiológico-comportamental
que se associa com o sistema imune e com várias citocinas como IL1, IL2, IL-6, TNF-α e
IFN-γ. Pouco se sabe sobre as manifestações neurológicas, incluindo o sono, a resposta imune
e o perfil de citocinas entre estes pacientes. Desta forma o objetivo do presente estudo é
avaliar as manifestações neurológicas como os distúrbios do sono, a resposta imune celular e
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o perfil de citocinas, o genótipo viral entre esses pacientes HCV + da Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas. Para a avaliação da resposta imune celular foi utilizado a fenotipagem
dos leucócitos do sangue periférico e para a avaliação das citocinas Th1 e Th2 e inflamatórias
o ELISA. As alterações neurológicas foram avaliadas por um questionário clínico criado para
o estudo. A qualidade do sono foi avaliada pelo Questionário de Pittsburg (PSQI) e de fadiga
pela escala FSS. Nossos resultados mostraram que as manifestações extra-hepáticas são muito
freqüentes entre eles a fadiga, artralgias e mialgias. As queixas de sono foram tão freqüentes
quanto às demais com 72,4% entre os pacientes. Os pacientes tiveram uma média de PSQI de
6,21 e de FSS de 3,16. Pacientes HCV positivos apresentam uma maior ativação de linfócitos
T CD8
+
e marcação para CD69
+
, alem de níveis elevados de citocinas IL-6, IL-12 e IL-8 do
que controles saudáveis. Os pacientes com Hepatite C com queixas de sono apresentam mais
fadiga e níveis aumentados de IL-4 e IL-6 podendo corresponder como um marcador de sono
ruim nestes pacientes. O genótipo 1 foi o mais freqüente, seguido do genótipo 3 e do genótipo
2 na nossa região. O genótipo 1 tendeu a uma maior secreção de citocinas supressoras Th2,
além de maiores níveis de ALT/AST, do que os outros genótipos, embora não atingisse
valores estatisticamente significantes. O HCV foi isolado do líquor de apenas um paciente do
estudo. Uma das possíveis explicações para tais manifestações neuro-psquiátricas seria uma
ação conjunta do vírus sobre o SNC e a resposta imune, com a secreção de algumas citocinas
como IL-4, IL-6. No entanto é necessário mais estudos sobre a ação do HCV sobre o SNC e o
papel destas citocinas na produção desses sintomas.
Palavras-chaves: Hepatite C; Resposta Imune; Sono
ABSTRACT
Hepatitis C is a major public health problem today with about 180 million people infected
worldwide. The HCV is a single-stranded RNA virus, belonging to the family flaviviridae.
The HCV is a highly immunogenic agent infectious leading to the development of a strong
humoral and cellular immune response. But about 80% of patients develop into a chronic
disease, and may develop liver cirrhosis or cancer. Only 15-20% of patients infected exhibit
viral clearance and evolve to cure. The mechanisms by which HCV escape of the immune
system are not yet fully known, but the polarization of immunity through the production of
cytokines seems to be a major cause. Patients infected by HCV may have several extra-
hepatic manifestations such as fatigue, depression and sleep disorders. The neurological
manifestations may involve the peripheral nervous system in the form of polyneuropathy or
the central nervous system such as sub-acute encephalopathy, stroke and a subcortical
involvement. The neurological involvement can occur by the replication of the virus in nerve
tissue, or indirectly by the patient's immune response. These changes may lead to compromise
the quality of life, perhaps secondary complaints of sleep. The sleep is a physiological state-
behavioral which combines with the immune system and with various cytokines such as IL1,
IL2, IL-6, TNF-α and IFN-γ. Little is known about the neurological manifestations, including
sleep, the immune response and the profile of cytokines among these patients. Thus the
objective of this study was to evaluate the neurological manifestations such as sleep disorders,
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the cellular immune response and the profile of cytokines, the viral genotype among those
HCV + patients of the Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. For the evaluation of
the cellular immune response was used to flow cytometry and for the evaluation of Th1 and
Th2 cytokines and inflammatory an ELISA test. The neurological manifestations were
assessed by a questionnaire designed for the clinical study. The quality of sleep was assessed
by questionnaire from Pittsburg (PSQI) and the fatigue scale (FSS). Our results showed that
the extra-hepatic manifestations are very frequent among them fatigue, arthralgia and
myalgia. Complaints of sleep were so frequent as to the other with 72.4% among patients. The
patients had a mean PSQI of 6.21 and 3.16 for FSS. HCV positive patients have a higher
activation of CD8
+
T lymphocytes and CD69
+
, high levels of cytokines IL-6, IL-12 and IL-8
than healthy controls. Patients with Hepatitis C with complaints of sleep have more fatigue
and increased levels of IL-4 and IL-6 and could be a marker of poor sleep in these patients.
The genotype 1 was the most common, followed by 3 and 2 in our region. The genotype 1
tended to increased secretion of Th2 cytokines suppressor, and higher levels of ALT/AST,
than the other genotypes, although not statistically significant. The HCV was isolated from
the liquor of only one of the study patients. One of the possible explanations for such
neurological and psychiatric events would be a joint action of the virus on the CNS and the
immune response, with the secretion of some cytokines such as IL-4, IL-6. But we need more
studies on its share of HCV on the CNS and the role of these cytokines in the production of
these symptoms.
Keywords: Hepatitis C; Immune response; Sleep.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Freqüência e distribuição dos pacientes 44
Tabela 2 Sintomas apresentados pelos pacientes do estudo 46
Tabela 3 Freqüência dos pacientes, Escalas de Epworth, Pittsburg e Krupp, TGO e
TGP
48
Tabela 4 Distribuição segundo a média das citocinas em pacientes HCV e controles
saudáveis
51
Tabela 5 Correlação das citocinas com o questionário de Pittsburg e escala de
Epworth
52
Tabela 6 Correlação das citocinas com TGO-AST 55
Tabela 7 Correlação das citocinas com TGP -ALT 55
Tabela 8 Comparação entre os dois grupos Sono1 e Sono-2 56
Tabela 9 Análise dos resultados da citometria de fluxo entre pacientes e controles 57
Tabela 10 Caracterização e distribuição dos genótipos do vírus da Hepatite C 59
Tabela 11
Análise das citocinas entre os genótipos
64
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Tabela 12
Transaminases e genótipos virais
65
Tabela 13
Análise do líquor dos pacientes com HCV e PCR
65
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LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Ciclos no termociclador 37
Quadro 2 Programa dos iniciadores 38
Quadro 3 Iniciador utilizado 38
Quadro 4 Ciclos no termociclador 40
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LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS
Figura 1 Genoma do vírus HCV 16
Figura 2 Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de
populações celulares por citometria de fluxo
32
Figura 3 Agarose com produtos de PCR 39
Figura 4 Gel de agarose corado com brometo de etídeo contendo amostras de líquor
(21 e 22). A amostra 21 mostra a formação da banda após a corrida por
eletroforese
66
Figura 5
A-Paciente FFL com RM cerebral corte axial demonstrando lesão com
hipersinal em substância branca na seqüência Flair.
B-Paciente VSC com RM cerebral corte axial demonstrando lesão com
hipersinal em substância branca na seqüência Flair.
C-Paciente VSC com RM cerebral corte sagital demonstrando lesão com
hipersinal em substância branca na seqüência Flair.
D- Angioressonância cerebral normal de um paciente.
67
Figura 6
Modelo neuro-imune no surgimento das manifestações neuropsiquiátricas na
infecção pelo HCV.
76
Gráfico 1 Avaliação da escala de sono de Pittsburg entre os 33 pacientes com Hepatite
C
47
Gráfico 2
A-Correlação da Escala de fadiga com a de Pittsburg nos 33 pacientes
estudados
B-Correlação da Escala de fadiga com a de Epworth nos 33 pacientes
estudados
49
Gráfico 3 A-Correlação da Escala de fadiga nos 33 pacientes com a TGO
B-Correlação da Escala de fadiga nos 33 pacientes com a TGP
50
Gráfico 4
A-Correlação da IL-4 com a escala de fadiga nos 33 pacientes
B-Correlação da IL-6 com a escala de fadiga nos 33 pacientes
C-Correlação da IL-8 com a escala de fadiga nos 33 pacientes
D-Correlação da IL-10 com a escala de fadiga nos 33 pacientes
53
Gráfico 5
A-Correlação da IL-12 com a escala de fadiga nos 33 pacientes
B-Correlação do TNF-α com a escala de fadiga nos 33 pacientes
C-Correlação do IFN-γ com a escala de fadiga nos 33 pacientes
54
Gráfico 6 Genótipos do vírus da Hepatite C encontrados na população de estudo 58
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LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS
Gráfico 7 A-Relação da carga viral com L TCD4
+
B-Relação da carga viral com L TCD8
+
60
Gráfico 8 Associação da carga viral e fadiga nos pacientes HCV positivos 60
Gráfico 9
A-Relação da carga viral com M69
+
nos pacientes infectados
B-Relação da carga viral com N69
+
nos pacientes infectados
C-Relação da carga viral com L69
+
nos pacientes infectados
D-Relação da carga viral com E69
+
nos pacientes infectados
61
Gráfico 10
A-Relação da carga viral com IL-6 nos pacientes infectados.
B-Relação da carga viral com TNF-α nos pacientes infectados.
C-Relação da carga viral com IL-8 nos pacientes infectados
62
Gráfico 11
A-Relação da carga viral com IL-4 nos pacientes infectados.
B-Relação da carga viral com IL-10 nos pacientes infectados.
62
Gráfico 12
A-Relação da carga viral com IL-12 nos pacientes infectados
B-Relação da carga viral com IFN-γ nos pacientes infectados
63
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LISTA DE ABREVIATURAS
ACTH
Ângio-RM
EEG
EMG
EOG
FSS
HCV
IL-1
IL-2
IL-4
IL-6
IL-8
IL-10
IL-12
IFN
IFN-γ
IFN-b
IRF-3
5-HT
LTCD4
+
LTCD8
+
NAA
NK
nm
NREM
Pg/ml
REM
RM
Sd
SNC
SOCS
TNF-α
Hormônio adrenocorticotrófico
Ângio-Ressonância
Eletrencefalograma.
Eletroneuromiografia
Eletro-oculograma.
Fatigue Severity Scale
Vírus da Hepatite C
Interleucina-1
Interleucina-2
Interleucina-4
Interleucina-6
Interleucina-8
Interleucina-10
Interleucina-12
Interferon.
Interferon-gama
Interferon -beta
Fator liberador de Interferon-3.
5-Hidroxitriptamina.
Linfócito TCD4
+
Linfócito TCD8
+
N-Acetil Aspartato
Natural Killers
Nanômetro
Sono não-REM
Pico-grama/ml
Sono REM.
Ressonância Magnética.
Desvio Padrão
Sistema Nervoso Central
Citocinas inibitórias.
Fator de Necrose Tumor-alfa
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................
14
1.1 Hepatite C no mundo...................................................................................................
14
1.2 O vírus C......................................................................................................................
15
1.3 Os Genótipos virais
......................................................................................................
16
1.4 Transmissão.................................
................................................................................
17
1.5 Resposta imune ao HCV
..............................................................................................
18
1.6 A hepatite C e as manifestações neurológicas
...........................................................
20
1.7 Sono e o sistema imune...............................................................................................
23
2.OBJETIVOS.........................................................................................................................
26
2.1 Geral..............................................................................................................................
26
2.2 Específicos.....................................................................................................................
26
3. METODOLOGIA...............................................................................................................
27
3.1 Modelo de estudo......................................................................................................... 27
3.2 População de estudo.................................................................................................... 27
3.3 Amostragem................................................................................................................. 27
3.4 Critérios de inclusão e exclusão..................................................................................
28
3.5 Avaliação neurológica e avaliação do sono................................................................
29
3.6 Coletas de amostras.....................................................................................................
31
3.6.1 Análise dos fenótipos celulares através da citometria de fluxo ...........................
31
3.6.2 Quantificação de citocinas....................................................................................
33
3.6.3 Exame de líquor................................................................................................... 34
3.7 Análise Molecular do HCV........................................................................................ 36
3.7.1 Extração de RNA..................................................................................................
36
3.7.2 Síntese de DNA complementar (cDNA).............................................................. 37
3.7.3 Reação em cadeia da Polimerase (PCR)...............................................................
37
3.7.4 Purificação dos produtos amplificados.................................................................
38
3.7.5 Quantificação dos produtos de PCR.....................................................................
39
3.7.6 Seqüenciamento dos produtos de PCR.................................................................
39
3.7.7 Reação de Precipitação.........................................................................................
40
3.7.8 Análise de Seqüências.......................................................................................... 41
3.7.9 PCR Quantitativo..................................................................................................
41
3.8 Exames de imagem..................................................................................................
41
3.9 Análise dos resultados............................................................................................. 42
4. RESULTADOS ..................................................................................................................
43
4.1 Anamnese e exame neurológico.................................................................................
43
4.2 Questionário clínico e o sono......................................................................................
45
4.3 Escala de sonolência de Epworth e de fadiga (FSS)................................................ 47
4.4 Análise do perfil de citocinas em pacientes com Hepatite C...................................
50
4.5 Análise da citometria de fluxo nos pacientes HCV positivos..................................
57
4.6 Distribuição genotípica do HCV na população de pacientes infectados................
58
4.7 Análise líquor e Ressonância Magnética cerebral dos pacientes HCV..................
65
5. DISCUSSÕES..................................................................................................................... 68
6.CONCLUSÕES....................................................................................................................
77
BIBLIOGRAFIA................................................................................................................... 79
APÊNDICES...........................................................................................................................
93
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1.INTRODUÇÃO
1.1 A Hepatite C no mundo
A Hepatite C é considerada, na atualidade, um problema de saúde pública e econômica
mundial. Segundo dados da OMS, é a principal causa de hepatite pós-transfusional,
correspondendo a 80-90% dos casos e com alto grau de cronificação (KOZIOL et al., 1986;
KUO et al., 1989; ALTER et al., 1992; OMS, 2007). Estima-se que 180 milhões de pessoas
estão infectadas cronicamente pelo vírus C e que 3 a 4 milhões sejam contaminadas
anualmente (OMS, 2007). O continente americano é responsável por 13,1 milhões de casos.
O Brasil é um dos países que mantém uma endemicidade intermediária com taxas de
prevalência de 2,6 casos por 100.000 habitantes, ficando atrás apenas da Bolívia (11,2
casos/100.000), países africanos como a Nigéria, Mongólia, Ruanda, República do Congo,
Egito e alguns países orientais como a Tailândia e o Vietnam (OMS, 1999).
Na Região Amazônica os estudos até hoje realizados mostram uma soroprevalência
que varia de 0,37% a 2,4% na população geral (FERRARI et al., 1999; SOUTO et al., 1999;
PAULA et al., 2001; SOUTO et al., 2001; KHOURI et al., 2005).
Souto et al. (1999), em um estudo de prevalência dos marcadores do vírus C na região
de Terra Nova, observaram a presença de anticorpos para o HCV no soro em 2,4% da
população. Os pesquisadores associaram a infecção ao uso de drogas ilícitas e cirurgias
prévias. Eles concluíram que a Amazônia tem uma endemicidade viral intermediária.
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Corroborando os dados anteriores, Paula et al (2001) em um trabalho de campo na
região do rio Purus e Acre, verificaram a prevalência do vírus C em 1,7% dos pacientes
daquela região.
1.2 O Vírus C
O vírus da Hepatite C foi detectado em 1989 por Choo e colaboradores, através do
sangue de chimpanzés infectados experimentalmente com sangue de pacientes com Hepatite
não-A, não-B. Ele é um vírus RNA de fita simples, formado por aproximadamente 10.000
nucleotídeos e menos de 80 nm de diâmetro (CHOO et al., 1989).
O HCV pertence à família flaviviridae, gênero hepacivírus e apresenta muitas
semelhanças genômicas com outros da mesma família, por exemplo, com o vírus da Dengue,
da Febre Amarela, da Encefalite Japonesa e com os pestivírus (KATO et al. 1990; CHOO et
al., 1991; BUKH et al., 1992). O genoma viral tem uma longa área codificadora (¨Open
Reading Frame¨) formada pelas regiões gênicas C, E1 e E2 que codificam as proteínas
estruturais do capsídeo e do envelope viral, enquanto as regiões gênicas NS2, NS3, NS4a,
NS4b, NS5a e NS5b dão origem a várias enzimas como RNA helicase, RNA polimerase e
proteases importantes na replicação viral (FINE, 1995; SUZUKI et al., 2007) (Fig.1).
O genoma viral tem duas regiões terminais: a região terminal 5`, com 341 bases
nitrogenadas, também denominada região não-variável por manter mais de 90% de homologia
entre os vários genótipos existentes, permitindo, assim, o estudo do RNA viral por PCR.
Acredita-se que a mesma tenha esta propriedade por ser um local de importância para a
expressão e replicação viral (HAN et al. 1991; BUKH et al. 1992; FINE 1995). A região
terminal 3` tem consideráveis variações no seu comprimento e seqüência de bases, sendo
também conhecida como região hiper-variável e responsável pela presença de diferentes
genótipos do HCV (BUKH et al., 1992).
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Figura1- Genoma do vírus HCV
Fonte: SUZUKI et al. 2007
1.3 Os genótipos virais
Atualmente, pela análise de seqüência de bases do genoma do vírus C, conhecem-se 6
genótipos distintos (1 ao 6) com 76 subtipos descritos (SIMMONDS, et al. 1994;
SIMMONDS et al. 2005). A distribuição dos genótipos é variável no mundo. Os genótipos 1,
2 e 3 estão presentes na maioria dos continentes, enquanto o genótipo 4 ocorre no norte da
África, especialmente no Egito e no Oriente Médio, e os tipos 5 e 6 são prevalentes na África
do Sul e Ásia, especialmente em Hong-Kong e no Vietnam (TAKADA et al., 1991; CHA, et
al., 1992; TAKADA et al., 1992; BUKH, et al, 1993; KINOSHITA et al., 1993; SIMMONDS
et al., 1993; ALONSO et al., 1994; KLETER et al., 1994; MACOMISH, et al., 1994;
PISTELLO et al., 1994; RAVAGGI et al., 1994; ZHANG et al. 1995).
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No Brasil existem poucos estudos de genotipagem, mas os dados não diferem muito
em relação aos encontrados nos países ocidentais, sendo o genótipo 1 responsável pela
maioria das infecções (61 a 77%), seguido do genótipo 3 (25 a 39%) e do 2 (1,6 a 4,6%). Os
genótipos 4, 5 e 6 correspondem de 0,1 a 0,2% dos casos (GINABREDA et al., 1997;
OLIVEIRA et al., 1999; AMORIM et al., 2004; VOGLER et al., 2004; CAMPIOTTO et al.,
2005).
Recentemente, Campiotto et al. (2005), em um estudo envolvendo pacientes com
Hepatite C crônica de vários centros nacionais de referências, demonstraram que os genótipos
variavam entre as diferentes regiões do País. O tipo 1 foi o mais prevalente em todas as
regiões. No Norte, representou 74,1% das amostras, seguido pelos genótipos 3 (22-33%) e 2
(7,1%). O genótipo 2 foi mais freqüente na Região Centro-Oeste (11,4%), o tipo 3 no Sul
(43,2%). Os tipos 4 e 5 foram raros em todos os estados (0,3-0,2%). Eles concluíram que tal
distribuição possa representar uma infecção endêmica de longa data nestas áreas, após a
chegada de imigrantes europeus, quando a prática de transfusão de sangue tornou-se comum e
nenhum teste para o vírus era ainda disponível.
O conhecimento dos genótipos virais existentes é importante, pois são fortes
preditores para a resposta sustentada à terapia com interferon-α. Dados da literatura apontam
para uma maior resistência do genótipo 1 à terapia com interferon-α do que os genótipos 2 e 3
(TONG et al. 1997; EASL, 1999).
1.4 Transmissão
O HCV já foi isolado de várias secreções orgânicas como sangue, medula, bile,
mucosa intestinal, oral e líquor (CHOO et al., 1989; CAUDAI et al. 1997; MORSICA et al.
1997; MAGGI et al. 1999; CARROZZO et al. 2002; LASKUS et al. 2002), nervos periféricos
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(HECKMANN et al. 1999), substância branca, córtex e gânglio da base (BOLAY et al. 1996;
VARGAS et al. 2002; FORTON et al. 2004).
Em mais de 50% dos casos, a transmissão se dá pela transfusão de sangue e derivados
contaminados, acidentes com materiais pérfuro-cortantes e pelo uso de drogas injetáveis
(ALTER et al. 1982; ALTER et al., 1989; ALTER et al., 1990; ROMERO-PEREZ et al.,
1990; ALTER et al., 1992).
A transmissão via sexual e a transmissão materna ou vertical são meios raros e
incomuns de infecção, sendo responsáveis por menos de 10% de todos os casos (ALTER et
al. 1982; ALTER et al., 1989; ALTER et al., 1990; ALTER et al., 1992; ROMERO-PEREZ et
al., 1990; OHTO et al., 1994).
1.5 Resposta imune ao HCV
A Hepatite C é uma doença com curso clínico variável. Em geral, ela é lentamente
progressiva (FOCCACIA; SOUZA, 2000). Cerca de 15 a 20 % dos pacientes recuperam-se
espontaneamente, 25% tem doença assintomática com transaminases persistentemente
normais e lesões histológicas hepáticas benignas e o restante, desenvolvem uma hepatite de
leve a moderada intensidade com fibrose (EASL, 1999).
Vinte por cento dos pacientes com hepatite crônica desenvolvem cirrose em 10 a 20
anos de doença. Entre estes, há um risco anual de 1 a 4% para o desenvolvimento de
carcinoma hepatocelular (EASL, 1999).
O quadro clínico se torna mais evidente no início da fase crônica, com o surgimento
de disfunção hepática, cirrose, hipertensão portal, coagulopatias e hemorragias (FOCCACIA;
SOUZA, 2000). As manifestações extra-hepáticas são comuns e envolvem o tecido cutâneo
com o surgimento de vasculites, fenômeno de Raynaud, púrpuras, porfiria cutânea tardia,
manifestações neurológicas, desordens auto-imunes como doenças do colágeno, Síndrome
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Sjogren-like, tireodites, glomerulonefrites membrano-proliferativas, poliarterite nodosa,
crioglobulinemia mista e também a associação com vários auto-anticorpos teciduais
(GUMBER et al. 1995; PAWLOTSKY et al. 1995; CACAOUB et al. 1994, CACOUB et al.
2000; RAMOS-CASALS et al. 2005).
Dados da literatura demonstram que parte das manifestações clínicas observadas em
pacientes com Hepatite C acontece devido à resposta imune desenvolvida pelos indivíduos
(KIETERSAUER et al. 1997; NELSON et al. 1997).
A Hepatite C caracteriza-se por uma importante resposta imune celular e humoral
(COOPER et al. 1999; TAKAKI et al. 2000; THIMME et al. 2001).
A resposta imune humoral é fundamental na neutralização de partículas virais livres e
para impedir a entrada do vírus nas células do hospedeiro. No entanto, a resposta imune
celular (TCD4
+
) é crítica para a geração e manutenção de um estado antiviral, tanto pela
secreção de citocinas estimulatórias de linfócitos B, ativação de células TCD8
+
específicas e
pela geração de uma memória imune celular (GRAKOUI et al. 2003; ABBAS ; LICHTMAN,
2005).
A produção de citocinas é um fator predominante no perfil da resposta imune.
Dependendo do perfil de citocinas produzidas, as células TCD4
+
são divididas em Th1, com
conhecida função citotóxica através da ativação de linfócitos TCD8
+
e produção de citocinas
antivirais como IFN-γ, IL-12 e inflamatórias como TNF-α e IL-1 ou uma resposta Th2, com
função supressora sobre a resposta imune e produção de IL-10 e IL-4 que agem inibindo a
secreção de IFN-γ e IL-12 (ABBAS; LICHTMAN, 2005; FUKUDA ; NAKANO, 2003).
Os mecanismos responsáveis pelo dano à célula hepática e infecção crônica não são
bem conhecidos. Porém dados existentes na literatura apontam a resposta imune e não o
próprio vírus como o grande vilão do processo inflamatório crônico (FUKUDA ; NAKANO,
2003). O principal mecanismo de lesão hepática e citotoxicidade parece ser devido à
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imunidade celular, com a ativação de células T helper e subseqüentes células citotóxicas
TCD8
+
com lise das células-alvo infectadas (FUKUDA ; NAKANO, 2003; KIETERSAUER
et al. 1997; NELSON et al. 1997).
Os mecanismos pelos quais apenas 15-20% das pessoas infectadas eliminam o vírus e
mais de 50% tornam-se portadores crônicos do HCV, ainda são incertos (KOZIOL et al.,
1986; ALTER et al., 1992; COX et al., 2005). Sabe-se, por exemplo, que uma rápida e
sustentada resposta policlonal específica Th1 (T CD4
+
/CD8
+
) no início da infecção é
fundamental para o controle da viremia e cura (COOPER et al. 1999; TAKAKI et al. 2000;
THIMME et al. 2001), enquanto que uma fraca resposta celular específica é, talvez, um dos
fatores de persistência do vírus (COX et al. 2005).
Esta habilidade do HCV na evasão da resposta imune se deve, também, a outros
mecanismos possíveis, tais como: infecção e comprometimento das células apresentadoras de
antígenos (BAIN et al., 2001); modulação da resposta imune do hospedeiro, inibição da
sinalização e expressão de IFN-β por meio de fatores reguladores de interferon como o IRF-3,
bloqueio das enzimas sinalizadoras (JAK/STAT) pelas proteases NS3/NS4 virais (SU et al.,
2002; BLINDENBACHER et al. 2003; FOY et al. 2005; LI et al., 2005), ação de citocinas
sinalizadoras supressoras (SOCS) produzidas pelas proteínas do vírus (BODE et al. 2003) e o
bloqueio do fator NF-kB com a conseqüente diminuição na liberação de citocinas
inflamatórias como IL-1 (FOY et al. 2005). Além disso, como muitos vírus RNA, a
inexistência de uma polimerase com atividade corretiva permite a formação de muitas
variantes ou quase-espécies, dificultando mais ainda a resposta imune e favorecendo o escape
viral (WEINER, et al. 1992;FARCI et al 2000).
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1.6 A Hepatite C e as manifestações neurológicas
Há alguns anos, tem-se descrito o surgimento de várias manifestações neurológicas
durante a fase aguda e crônica da Hepatite C. O sistema nervoso periférico é, freqüentemente,
o mais envolvido na forma de polineuropatias, mononeuropatias, mononeurites múltiplas e
poliradiculoneurite aguda (Síndrome de Guillan-Barré), com o comprometimento tanto
desmielinizante quanto axonal (CAUDAI et al. 1997; TEMBL, et al. 1999; FILLIPPINI et al.,
2002; NEMNI et al. 2003; AMMENDOLA et al. 2005; GEMIGNANI et al. 2005; COLLE et
al. 2002).
O envolvimento do sistema nervoso central pela Hepatite C também é descrito
apresentando-se como Acidente Vascular Cerebral (AVC) (HECKMANN et al.,1999),
Encefalomielite aguda ou progressiva (BOLAY et al., 1999; FUJITA et al., 1999; TEMBL et
al., 1999; BUCCOLIERO et al., 2006), Síndrome das Pernas Inquietas (TEMBL et al. 1999)
e outras menos caracterizadas como fadiga, perda da memória, desatenção, depressão,
parestesias e queixas de sono (LANG et al., 2006). Muitos destas manifestações já podem
estar presentes precocemente, porém, é possível ocorrer de não serem associadas à infecção
pelo HCV (GUMBER et al., 1995).
É bem estabelecido que o comprometimento é freqüentemente observável em
pacientes com insuficiência hepática, termo este conhecido como encefalopatia hepática
(FERENCI et al.,. 2002). O conhecimento do envolvimento precoce do sistema nervoso
central (funções corticais) em pacientes não cirróticos e com o vírus C é recente (FORTON et
al. 2001; FORTON et al.,. 2002; HILSABECK et al.,. 2002; MCANDREWS et al.,. 2005).
Hilsabeck et al. (2002), em estudo transversal com portadores de infecção crônica pelo
HCV, demonstraram a ocorrência de comprometimentos cognitivos precoces na área da
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atenção, velocidade psicomotora, flexibilidade mental e aprendizagem, em mais de 50% dos
pacientes não cirróticos e estes foram independentes de doenças psiquiátricas, idade e QI.
Em estudo de ressonância magnética com espectroscopia, Forton et al. (2001)
demonstraram anormalidade no metabolismo cerebral, com aumento da relação de
colina/creatina na substância branca e nos gânglios da base em pacientes com infecção leve
pelo vírus C em relação aos controles saudáveis e pacientes com vírus B. Um ano após,
Forton et al. (2002), em outro estudo, comparando pacientes com infecção leve pelos vírus C,
controles saudáveis e indivíduos com remissão espontânea, observaram um comprometimento
maior na concentração e memória de trabalho nos pacientes infectados do que nos outros
grupos, junto com um aumento de relação de colina/creatina na substância branca e gânglios
da base destes pacientes.
Pouco se sabe como tais manifestações neurológicas ocorrem e se são oriundas de um
processo viral direto dentro do sistema nervoso central ou de um processo inflamatório
vascular intenso. No entanto, é sabido que o vírus C replica-se em vários sítios extra-
hepáticos como nos monócitos, linfócitos, macrófagos (LERAT et al., 1998; LASKUS et al.,
2000; LAPORT et al., 2003; RADKOWSKI et al., 2000). Trabalhos recentes mostraram o
isolamento de seqüências de RNA viral replicativo em tecido cerebral de necropsia de
pacientes infectados cronicamente pelo vírus (LASKUS et al., 2002; VARGAS et al., 2002;
RADKOWSKI, et al., 2002; FORTON et al., 2004). A forma pelo qual o HCV penetra no
SNC permanece ainda incerta. É possível que o tráfego de células sanguíneas infectadas,
especialmente os monócitos/macrófagos, precursores da micróglia, ocasione, lentamente, a
troca por células sadias, um mecanismo conhecido pelo nome de Cavalo-de-Tróia (¨Trojan
Horse¨), similar ao que ocorre na infecção pelo HIV (PRICE et al. 1988; LASKUS, et al.,
2005)
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1.7 Sono e o sistema imune
Apesar de um considerável progresso no entendimento do mecanismo neurobiológico
do sono NREM-REM, não conhecemos, ainda, a sua exata função e tampouco a sua relação
com o sistema imune (ZEPELIN et al. 2005).
O sono é considerado um estado fisiológico-comportamental caracterizado por
atividade motora reduzida, diminuição da resposta a estímulos, postura estereotípica e estado
de consciência reversível (KANDEL et al., 2000).
No seres humanos, o sono é definido por fases cíclicas e alternadas de sono NREM e
REM ao longo da noite, com duração média de 60-90 minutos (KANDEL, 2000).
Há quase cem anos, descobriu-se, através de estudos anátomo-patológicos de casos de
Encefalite Letárgica (VAN ECONOMO, 1930) e análise do líquor de animais privados de
sono (PAPPENHEIMER, 1975), que havia uma rede neural e fatores humorais liberados pelo
sistema nervoso central e responsável pela regulação do ciclo sono-vigília (OPP, 2004).
Dentre esses fatores, tem-se descrito que algumas citocinas envolvidas na resposta
imune também modulam o comportamento, como o ciclo sono-vigília (MOLDOFSKY et al.,
1986). Dentre elas, a IL-1, o TNF-α, o IFN e, recentemente, a IL-6 são as mais importantes.
Sabe-se, por exemplo, que a IL-1 age em alguns neurônios da área pré-óptica hipotalâmica-
Ca
2+
dependentes, estimulando a neurotransmissão gabaérgica (DE et al., 2003; ALAM et al.,
2004). Alguns autores relatam que ocorre um pico na liberação de IL-1 e IL-2,
especificamente na fase NREM do sono humano (MOLDOFSKY et al., 1986), sendo isso
independente da temperatura corporal (TOBLER et al., 1984). A infusão de IL-1 no
ventrículo, no hipotálamo anterior e mesencéfalo basal e de TNF-α no córtex, aumenta o sono
de ondas lentas (fase 3 e 4 NREM) (TOBLER et al., 1984; MANFRIDI et al., 2003;
YOSHIDA et al., 2004). Trabalhos existentes na literatura sugerem que o TNF-α participe da
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oscilação do sono de ondas lentas através dos receptores AMPA excitando os interneurônios
inibitórios tálamo-corticais (DE et al., 2003). Estudos recentes demonstram que a IL-1
interage com o sistema serotoninérgico em vários níveis e que a microinfusão da mesma no
núcleo dorsal da Rafe aumenta o NREM em ratos (IMERI et al., 1999; MANFRIDI et al.,
2003).
Trabalhos recentes também sugerem que a IL-6 pode estar envolvida em muitos
distúrbios associados a hipersonolência e privação do sono (REDWINE et al., 2000;
SHEARER et al., 2001; OKUN et al., 2004).
O sono altera a função imune, com uma diminuição da resposta imune celular com o
seu início (MOLDOFSKY et al. 1986), mas também a função imune pode influenciar o sono,
como ocorre na vigência de algum processos infecciosos e de algumas doenças
imunodeficientes como a AIDS, onde se observam profundas alterações na arquitetura do
sono, com o predomínio do sono delta na segunda metade da noite, despertares freqüentes e
queixas de fadiga, insônia e sonolência excessiva com a progressiva queda dos linfócitos T
CD4
+
, observada no sangue periférico (NORMAN et al., 1990; DARKO et al., 1992;
NORMAN et al., 1992; DARKO et al., 1995).
Estudos com privação total e parcial do sono em ratos levam à progressiva debilitação,
lesões ulcerosas, aumento da ingestão de alimentos, perda de peso, aumento do gasto de
energia, culminando com hipotermia e morte (11-32 dias em privação total e 16-54 em
privação parcial) (RECHTSCHAFFEN et al., 1989). Estudos em humanos com privação de 6
até 64 horas levam a uma alteração transitória da resposta celular, com uma diminuição
seguida de um aumento do número e da atividade das células ¨Natural Killers¨ (NK), uma
redução da atividade das linfocinas associada às células NK (LAK), da proliferação mitótica
dos linfócitos e diminuição na produção de IL-2 pelos mesmos (MOLDOFSKY et al. 1989;
DINGES, et al., 1994; IRWIN et al. 1996).
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Apesar dos vários trabalhos relatando a existência de alterações neurológicas entre os
pacientes com Hepatite C, pouco se sabe da relação entre a infecção pelo vírus C, a resposta
imune e o surgimento de tais manifestações.
Como a função imune está intimamente vinculada ao sono e as alterações deste
ocorrem nas mais variadas doenças crônicas (The International Classification of Sleep
Disorders, 1997), é provável que o vírus C colabore direta ou indiretamente nas manifestações
neurológicas e talvez no sono, podendo, então, ter impacto na qualidade de vida e na adesão
do paciente ao tratamento da doença (LEE et al. 1997; BERNSTEIN et al. 2002).
Assim, o estudo da resposta imune celular e humoral e de algumas citocinas na
infecção pelo HCV, bem como a sua correlação neurológica com queixas de sono nesses
pacientes, é importante para o entendimento da doença, colaborando para uma maior eficácia
na preconização do tratamento.
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2.OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliação da resposta imune em pacientes com hepatite C associado à alterações
neurológicas e do sono.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Avaliar o perfil da resposta imune celular em pacientes HCV positivos.
2.2.2 Avaliar o perfil de produção de citocinas dos pacientes com infecção pelo HCV.
2.2.3. Associar a resposta imune com as alterações neurológicas e do sono.
2.2.4 Descrever os genótipos virais e a carga viral nos pacientes HCV positivos.
2.2.5 Relacionar resposta imune, genótipo viral a alterações do sono nos pacientes HCV
positivos.
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3.METODOLOGIA
3.1 Modelo de estudo
O estudo foi observacional, com base em uma série de casos do tipo descritivo.
3.2 População de estudo
Foi composta de pacientes de demanda espontânea, com o diagnóstico de Hepatite C,
atendidos na Fundação de Medicina Tropical do Estado do Amazonas (FMT-AM) e que ainda
não haviam iniciado tratamento clínico no período de junho de 2006 a maio de 2007. O
projeto fez parte de um estudo mais abrangente sobre Hepatite C, recebendo apoio financeiro
do CNPq, Convênio n
o
. : 403602-2004-1.
3.3 Amostragem
A população de estudo foi composta por 33 pacientes encaminhados ao ambulatório de
hepatites do Hospital Tropical do Amazonas (FMT-AM), com o diagnóstico sorológico
positivo para o vírus C. Os pacientes foram convidados a participar do estudo e a assinar o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice-F).
Para a análise da citometria de fluxo e citocinas foi criado um grupo controle,
composto por 40 doadores saudáveis de sangue, selecionados aleatoriamente.
Após essa primeira fase, os pacientes foram submetidos a um exame
clínico/neurológico e responderam um questionário validado internacionalmente sobre
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distúrbios do sono. Os pacientes foram divididos em dois grupos: Grupo 1-pacientes com
HCV e queixas de sono (Sono 1-“maus dormidores”) e Grupo 2- pacientes HCV e sem
queixas de sono (Sono 2 “bons dormidores), de acordo com a pontuação obtida no
questionário de Pittsburgh ser maior > ou = 5 ou <5, respectivamente. Os dois grupos foram
comparados quanto à resposta imune, perfil de citocinas e genotipagem (Apêndice–G).
3.4 Critérios de inclusão e exclusão.
Foram incluídos no estudo todos os pacientes adultos, com mais de 18 anos, com
diagnóstico confirmatório, composto de um ELISA e Inmunoblot positivos para o HCV,
atendidos no ambulatório de hepatite da Fundação de Medicinal Tropical do Amazonas
(FMT-AM).
Foram excluídos pacientes com história de uso de drogas ilícitas nos últimos sete anos
ou consumo diário de álcool, doenças psiquiátricas diagnosticadas na entrevista ou em
tratamento em outros serviços, doenças degenerativas neurológicas ou processos expansivos
no sistema nervoso central, diagnosticado pelo exame clínico e pela ressonância magnética de
crânio, sintomas sugestivos de apnéia obstrutiva do sono, como ronco, apnéias noturnas e
sonolência diurna. Foram, também, excluídos pacientes sob o uso drogas antidepressivas,
anti-histamínicos, corticóides, tratamento com interferon ou ribavirina que podiam interferir
na secreção de algumas citocinas, segundo Vannier et al. (1993), diagnóstico de outras
hepatites virais, diagnóstico de HIV, diabetes mellitus (glicemia de jejum >110mg/dl),
pacientes com insuficiência renal crônica, pacientes com doença hepática avançada ou cirrose
evidenciada pelo exame clínico e pela ultrassonografia abdominal, além de portadores de
distúrbio tireoidiano (hipotireoidismo ou hipertireodismo) diagnosticada através de exames de
TSH e T4 livre.
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Os pacientes com sorologia positiva para o vírus da imunodeficiência humana (HIV)
descobertos durante a pesquisa, foram encaminhados ao ambulatório especializado do próprio
hospital para tratamento.
3.5 Avaliação neurológica e avaliação do sono
Os pacientes foram submetidos à rigorosa anamnese clínica e neurológica, com o
objetivo de observar sinais e sintomas de insuficiência hepática, cirrose, sinais de vasculites
como púrpuras cutâneas, artralgias e todas as outras manifestações extra-hepáticas. Para a
avaliação neurológica foi feito teste de força motora, reflexos, avaliação da sensibilidade,
avaliação da coordenação e marcha e de nervos cranianos. Para o exame da sensibilidade
superficial foram usados um pincel e agulha própria ao exame semiológico. O exame da
sensibilidade profunda foi pesquisado com diapasão e avaliação cinética-postural.
Também foi aplicado um questionário (Apêndice–B) composto por informações
pessoais, aspectos sociais, econômicos e familiares, dados sobre doenças anteriores e atuais,
tratamentos anteriores e em curso, medicamentos em uso, utilização de drogas ilícitas e
álcool, percepção sobre a doença e satisfação pessoal, sintomas subjetivos como fadiga,
artralgia, mialgia, perda da memória, fraqueza em extremidades, dormência nos membros,
cefaléia e insônia.
Para a avaliação da fadiga foi utilizada a definição utilizada em outros trabalhos
(GERSHON et al. 2000; FORTON et al. 2001) como uma incapacidade de manter uma força
específica sustentada ou incapacidade de manter uma tarefa mental contínua. Os pacientes
foram também submetidos a um questionário sobre a severidade da fadiga (Escala de
Severidade de Fadiga - FSS) (KRUPP et. al, 1989 ). Esta é uma escala validada
internacionalmente com uma sensibilidade e especificidade maior que 90%, diferenciando
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indivíduos com e sem fadiga. Ela é composta de nove itens cada uma com pontuação que
varia de 1 a 7 pontos. Ela avalia o impacto da fadiga na vida pessoal, profissional e social. A
pontuação é somada e dividida por 9. Quanto maior a pontuação maior a severidade da
mesma (Apêndice –C).
Todos os pacientes do estudo submeteram-se a um questionário validado
internacionalmente: Questionário de Pittsburgh-PSQI (BUYSSE et. al., 1988) (Apêndice-A).
Pittsburgh é um questionário usado mundialmente nas pesquisas sobre qualidade do sono, é
composto de 19 itens reunidos em 7 grandes grupos que avaliam a duração, a latência, a
eficiência do sono e queixas diurnas. Cada grupo recebe uma nota de 0-3 que é somada para
compor um escore final ou PSQI -Pittsburgh Scale Questionaire Index, que varia de 0-21
pontos. Os escores mais altos indicam pior qualidade do sono. A escolha de tal questionário
foi feita pelo fato do mesmo ser largamente utilizado, fácil de ser aplicado. Com nível de
corte de 5 pontos, ele atinge uma sensibilidade de 89,6% e especificidade de 86,5 %
diferenciando indivíduos saudáveis de pacientes com queixas de sono (“bom dormidor/mau
dormidor”). Com o mesmo corte atinge-se uma sensibilidade para identificar insones de
84,4%, pacientes com hipersonia de 88% e depressivos por volta de 97%.
A análise da sonolência excessiva foi realizada pela escala de sonolência de Epworth,
já validada para o português e que consistia em 8 ítens que mediam a propensão para o sono
em várias situações cotidianas. Em cada item o paciente recebia uma nota que variava de 0 até
3 pontos, dependendo da gravidade do seu sintoma. A pontuação máxima é de 24 pontos e a
mínima de 0. Para efeito de análise, uma pontuação de 11 ou mais foi considerada indicativo
de sonolência excessiva (JOHNS,1991) (Apêndice-D).
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3.6 Coleta de amostras
Após aprovação no Comitê de Ética da FMT-AM e da assinatura do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido, foram coletadas amostras de sangue com e sem
anticoagulante para a realização de hemograma, transaminases, TAP, bilirrubinas, glicemia de
jejum, uréia, creatinina, sorologias para hepatite A, B e D, HIV, Na, K, TSH e T4 livre na
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM). Amostras de sangue foram
enviadas ao HEMOAM para o estudo da resposta imune celular e de citocinas.
As Amostras foram armazenadas para pesquisas futuras, conforme Portaria n
o
.
0092/2005 da Fundação HEMOAM (Apêndice-H).
3.6.1 Análise dos fenótipos celulares através da citometria de fluxo
Amostras de 50 µL de sangue venoso coletada com EDTA foram incubadas com
anticorpos monoclonais por 20 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Os
marcadores de superfície celulares avaliados: anti-CD8
+
(code MHCD0801, lote 08090506,
marca CALTAG) e anti-CD69+ (code MHCD6901, lote 04120906, marca CALTAG)
marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), este último representa uma marcação
para leucócitos ativados, anti-CD4
+
(code MHCD0404, lote 23031206, marca CALTAG)
marcados com ficoeritrina (PE) e anti-CD3
+
(code MHCD0306, lote 60010708, marca
CALTAG) marcados com terceira cor, foram colocados no fundo dos tubos. Após a marcação
dos glóbulos brancos, as hemácias presentes foram lisadas com 2 mL de solução de lise. Em
seguida, lavadas com 2mL de PBS (solução fisiológica tamponada com fosfato) e
centrifugadas por 7 minutos, a 1300 rotações por minuto. Posteriormente, desprezou-se o
sobrenadante por inversão e adicionou-se 300 µL de PBS a 1% de formaldeído. A leitura foi
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realizada no laboratório de Citometria de Fluxo do HEMOAM, no citômetro de fluxo
FACScalibur, com sistema de detecção de quatro cores (Becton Dickinson).
A identificação das populações celulares de interesse foi realizada utilizando-se o
programa Cell-Quest. Primeiramente identificou-se a população de linfócitos, neutrófilos,
monócitos e eosinófilos, utilizando gráficos “dot plot” onde a população de interesse ocupa
uma região característica após ajustes de ganhos do seu tamanho (FSC) e granulosidade
(SSC), (FIG. 1A). Posteriormente a seleção da região de interesse, analisou-se a intensidade
de fluorescência apresentada pelas células marcadas nessa região, através de histograma de
fluorescência 1 (FL1) versus fluorescência 2 (FL2) (FIG. 1B). Após a definição das regiões, o
percentual de células positivas foi determinado utilizando-se um histograma simples de
análise da região. Os resultados obtidos foram anexados na ficha de acompanhamento do
paciente, padronizada para o estudo em causa.
A B
Figura 2- Seqüência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de
populações celulares por citometria de fluxo. (A) Gráficos Dot plot FSC x SSC são
utilizados para seleção da população linfocitária – R2. (B) Histograma; FL1 x FL2 são
utilizados para avaliar parâmetros de interesse em populações celulares específicas.
R2
(A)
(B
)
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3.6.2 Quantificação de citocinas
Para as dosagens das citocinas humanas foi utilizado o Ensaio Imunoenzimático
(ELISA) usando-se Kits Opteia
Tm
Set Human (BD). De acordo com as especificações do
fabricante foram analisadas as citocinas IL-4 (Lote Número 61570), IL-6 (Lote Número
55702), IL-8 (Lote Número 555244), IL-10 (Lote Número 555157), IL-12 (Lote Número:
61371) TNF-α (Lote Número 56627), IFN-γ (Lote Número 57328). A técnica foi
desenvolvida na Fundação HEMOAM.
Inicialmente, a microplaca de 96 poços foi sensibilizada com 100 µL por poço com
Anticorpos de Captura (Anticorpo primário AC-1°) diluído em tampão de ligação (Carbonato
de Sódio 0,1 M). A placa foi envolvida em papel laminado e incubada durante a noite, a 4°C.
Após esse período, os poços foram aspirados e lavados 3 vezes com 300 µL de tampão de
lavagem (PBS + 0,05% de Tween-20). Concluída a última lavagem, as placas foram aspiradas
e invertidas em papel absorvente para remover qualquer tampão residual. Adicionou-se
200µL de diluente de ensaio (Solução Salina Tamponada de Fosfato - PBS + 10% de Soro
Bovino Fetal - SBF) em cada poço, evolvido em papel laminado e incubado a temperatura
ambiente, por 1 hora.
Durante essa incubação foram preparadas diluições seriadas de cada citocina, cujas
concentrações seguiram as especificações do fabricante. As diluições foram realizadas em
tubos tipo eppendorf utilizando-se um volume inicial de 600µL no primeiro tubo e, em outros
7 tubos, foram adicionados 300ul da solução diluente. Após acrescido o volume exigido de
citocina no primeiro tubo, foram transferidos 300µL para o próximo tubo, agitando entre cada
transferência, até obtermos uma curva de diluição seriada.
Após o término do período de incubação, as placas foram aspiradas e lavadas
novamente por 3 vezes, com 300 µL de tampão de lavagem e, em seguida, invertidas em
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papel absorvente para remover qualquer tampão residual. Foram adicionados 100 µL da curva
padrão, amostra e controle (PBS + 10% SBF) dentro dos poços apropriados, envolvidas em
papel alumínio e incubados a temperatura ambiente, por 2 horas. Após as 2 horas, as placas
foram aspiradas e lavadas em 5 ciclos de lavagens no total. Logo em seguida, foram
adicionados 100 µL do anticorpo de detecção associado à enzima (Anticorpo secundário +
reagente SAv-HRP) para cada poço. Novamente, a placa foi envolvida em papel alumínio e
incubada à temperatura ambiente, por 1 hora. As placas foram aspiradas e lavadas em 7 ciclos
no total, deixando de molho por 30s em cada ciclo. Foram adicionados 100 µL de solução de
substrato em cada poço, a placa foi envolvida em papel laminado e incubada à temperatura
ambiente por 30 min. Para o bloqueio da reação foram acrescidos 50µL de H
2
SO
4
(2N) em
cada poço e realizada a leitura da absorbância a 450 nm em aparelho da marca ASYS
(Microplate reader v.1.14) dentro de 30 min após a parada da reação.
Para a análise do perfil de citocinas, foi criado um grupo controle composto por 40
doadores da Fundação HEMOAM. Os valores de citocinas foram medidos em pg/mL.
3.6.3 Exame de líquor
Foram coletadas amostras de líquor através de punção lombar, de acordo com as
recomendações da Academia Brasileira de Neurologia (PUCCIONI-SOHLER et al., 2002) e
após o consentimento dos pacientes. Aqueles que apresentavam plaquetopenia (plaquetas
abaixo de 30.000), anticoagulados, com sinais de hipertensão intracraniana ou sinais
neurológicos focais evidenciados ao exame físico eram contra-indicados para a realização do
exame.
A avaliação do líquor consistiu da análise física com a observação da cor e do seu
aspecto, da citologia e bioquímica, além da bacterioscopia. Para análise da citologia foram
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utilizados 0,2 mL de líquor, colocados em uma câmara (câmara de Fucs-Rosenthal). As
células e hemáceas foram contadas e o resultado dividiu-se por 3 para o resultado final. Para
o exame cito-morfológico foram utilizados 3 a 5 mL do líquor. Este material foi centrifugado
por 5-10 minutos à 2000 RPM. Em seguida, foi separado o sedimento do sobrenadante e
colocado em lâminas para serem corados pelos métodos da Hematoxilina-Eosina (HE),
GRAM e Zieh-Nielsen e Nanquim. Após a coloração, as lâminas foram lidas em um
microscópio óptico em aumento de 100 X em lente de imersão, possibilitando a
diferenciação das células linfomonocitárias dos neutrófilos, bactérias, criptococos e
micobactérias.
Para a análise da glicose foi utilizado o método enzimático calorimétrico. Após a
centrifugação do líquor, foi separado o sobrenadante. Para a realização da glicose foram
separados 40µL do líquor e levados ao banho maria (37ºC) por cerca de 10 minutos com
reagente. Realizou-se a leitura em espectrofotômetro a 505nm. O resultado total foi obtido
multiplicando-se o Fator X Absorbância e dividindo-se por 2 com resultado em mg/dl. Os
valores de referência corresponderam a 2/3 da glicemia sanguínea.
A análise das proteínas foi realizada pelo Método Turbidimétrico com uso de Acido
Sulfossalicílico (SSA) a 3%. Para esta análise foram utilizados 0,4 mL de líquor obtido do
sobrenadante centrifugado. Foram adicionados 4,6 mL da solução de SSA a 3% em um tubo
com líquor e 4,6 mL em outro tubo com água destilada (branco). Em seguida, foi colocado em
repouso por cerca de 10 minutos e realizada a leitura em espectrofotômetro em 420 nm contra
o branco. O resultado foi obtido multiplicando-se o Fator X absobância do teste em mg %. Os
valores de referência em adultos são: região lombar 10-40mg/dl; occipital 10-30 mg/dl;
ventricular 10-25 mg/dl.
Estas análises foram realizadas no laboratório de Bacteriologia da Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas.
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3.7 Análise molecular do HCV
Amostras de sangue e soro foram coletadas e armazenadas a – 70
o
C e analisadas na
Fundação de Medicina Tropical - USP de São Paulo, com a colaboração do Professor Dr.
José Eduardo Levi.
3.7.1 Extração de RNA
Para a extração de RNA-HCV, foram seguidas as instruções do fabricante de
QIAmp
®
Viral RNA Kit (Quiagen): pipetou-se 560 µL de solução buffer AVL já preparada,
contendo “RNA carreador” dentro de microtubos (eppendorfs) de 1,5 mL. Adicionou-se 140
µL de soro no tubo de microcentrífuga com AVL/RNA carreador e os mesmos foram agitados
por 15 s em agitador magnético. O material foi incubado a 37º C por 15s e centrifugado
novamente para remover gotas da tampa. Adicionou-se 560 µL de etanol (96-100%) no tubo e
agitados por 15 segundos. Colocou-se a coluna fornecida pelo Kit em um microtubo de 2 mL
e em seguida, aplicou-se 630 µL da solução de etanol. A amostra foi centrifugada a 8000
RPM por 1 s e posta em outro tubo de 2 mL limpo. Foram repetidas novamente, as etapas
anteriores. Então a coluna foi aberta e adicionou-se 500 µL do buffer AW1 e centrifugada a
8000 RPM por 60 s. A coluna foi posta em outro tubo de 2 mL limpo, descartando-se o tubo
contendo o filtrado. Após esta etapa, a coluna foi aberta e adicionou-se 500 µL do buffer
AWZ e centrifugado a 14000 RPM por 4 s. A coluna foi colocada em novo tubo de 1,5 mL e
adicionou-se 60 µL do buffer AVE a 37ºC. A coluna foi fechada e deixada em descanso por
60 s. Após esse tempo foi outra vez centrifugada a 8000 RPM por 60s e, finalmente,
transferida para um tubo de 1,5 mL, limpo para a realização da síntese do DNA
complementar (cDNA).
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3.7.2 Síntese de DNA complementar (cDNA)
A síntese de cDNA foi realizada através da reação de Transcrição Reversa (RT),
utilizando-se reagentes da Invitrogen
TM
Life Technologies, Carlsbad, CA, USA. O volume
final da reação foi de 40,1µL nas seguintes condições: Tampão PCR 1X sem µg, 0,2mM de
dNTP (2,5mM), 5mM de MgCl2 (50mM), 0,4 µL de DTT (0,1M), 2,5µM de primers
randômico, 1 unidade de enzima inibidora de RNAse, e 2,5 unidades de enzima Transcriptase
Reversa do vírus da Leucemia Murina de Moloney (M-MLV).
As amostras foram submetidas aos seguintes ciclos no termociclador confome o
quadro abaixo:
Quadro 1
Ciclos no termociclador
Temperatura Minutos
65º C 5 minutos
22º C 10 minutos
37º C 30 minutos
95º C 5 minutos
3.7.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Após a etapa de síntese, o DNA complementar foi amplificado através da técnica de
PCR, utilizando-se reagentes da Invitrogen
TM
Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, nas
seguintes condições: PCR buffer 1X, 0,2mM de dNTP, 4mM de MgCl2, 0,2 µM de cada
Primer HC11 e HC18 (Tabela 1), 1,25 unidades de Taq DNA polimerase, 5mM de cDNA,
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para uma reação com volume final de 50µL. O programa utilizado para a amplificação por
PCR está abaixo, no quadro 2:
Quadro 2
Programa dos iniciadores
Etapa 1
Desnaturação inicial por 5 minutos a 95º C
Etapa 2 Desnaturação por 30 segundos a 94º C
Etapa 3 Hibridização por 30 segundos a 55º C
Etapa 4 Extensão por 1 minuto a 72º C
Etapa 5 Repetição das etapas 2 a 4 por 40 ciclos
Etapa 6 72º C por 7 minutos
O produto amplificado pelos primers HC11 e HC18 gerou um fragmento de 338pb da
região 5'UTR do genoma do HCV.
Quadro 3.
Iniciador utilizado
PRIMER SEQUÊNCIA 5’
GGTGCACGGTCTACGAGACCT
3.7.4 Purificação dos produtos amplificados
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3.7.5 Quantificação dos produtos de PCR
3.7.6 Seqüenciamento dos produtos de PCR
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Big Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction
3.7.7 Reação de Precipitação
Big
Dye
Cycle Sequencing Ready Reaction
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3.7.8 Análise de Seqüências
3.7.9 PCR Quantitativo
3.8 Exames de imagem
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3.9 Análise dos resultados.
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4. RESULTADOS
mellitus
4.1 Anamnese e Exame Neurológico
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Pacientes
Idade Sexo
Altura
(cm)
P (kg) Origem
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4.2 Questionário clínico e o sono
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Sintomas (n = 33) N %
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0
2
4
6
8
10
12
14
16
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Pacientes
Escala de Pittsburgh
4.3 Escala de sonolência de Epworth e de fadiga (FSS).
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Pacientes Idade Sexo Epworth
Pittsburgh
Krupp
TGO TGP
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y = 0,1716x + 2,1006
R
2
= 0,1039
p = 0,067
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Pittsburgh
Krupp
y = 0,1716x + 2,1006
R
2
= 0,1039
p = 0,43
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Epworth
Krupp
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y = 0,01x + 2,5079
R
2
= 0,0735
p= 0,12
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 50 100 150 200 250
TGO
Krupp
y = 0,0055x + 2,5269
R
2
= 0,1122
p=0.057
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 100 200 300 400 500 600
TGP
Krupp
4.4 Análise do perfil de citocinas em pacientes com Hepatite C
γ
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α γ
Pacientes (n=33) Controle (n=40)
<0,001
0,049
<0,001
γ
γ
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Citocinas Variáveis F-test* p *
r
2
γ
α γ
γ α
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y = 21,21x + 268
R
2
= 0,0349
p=0,813
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Krupp
IL-4
y = -2,9992x + 43,08
R
2
= 0,0114
p=0,741
0
50
100
150
200
250
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Krupp
IL-6
y = -18,54x + 132,85
R
2
= 0,1332
p=0,067
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Krupp
IL-8
y = 0,3776x + 2,7257
R
2
= 0,1752
p=0,483
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Krupp
IL-10
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y = -36,567x + 629,02
R
2
= 0,0252
p=0,402
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Krupp
IL-12
y = -0,8976x + 10,8
R
2
= 0,3975
p=0,370
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Krupp
TNF-a
y = 0,5751x + 22,269
R
2
= 0,0394
p=0,582
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Krupp
IFN
α
γ
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Citocinas Variáveis F-test* p* r
2
0,042
γ
Citocinas Variáveis F-test* p* r
2
0,009
0,039
γ
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Sono 1 (n=18) Sono 2 (n=15)
0,048
γ
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4.5 Análise da citometria de fluxo nos pacientes HCV positivos
Pacientes (n=33) Controle (n=40)
0,011
0,0015
0,023
0,0007
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4.6 Distribuição genotípica do HCV na população de pacientes infectados
41%
23%
36%
Genótipo 1 Genótipo 2 Genótipo 3
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Pacientes
Genótipo
ELISA
RIBA
Cópias/ml
PCR
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y = -202973x + 1E+07
R
2
= 0,0337
p=0,307
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 10 20 30 40 50 60
CD4+
Carga viral
y = -212227x + 1E+07
R
2
= 0,0452
p=0,235
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 10 20 30 40 50 60
CD8+
Carga viral
y = -130005x + 5E+06
R
2
= 0,0008
p=0,873
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 2 4 6 8
Krupp
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y = 1E+06x - 2E+06
R
2
= 0,2599
p=0,002
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 5 10 15 20 25
M69
Carga viral
y = 2E+06x + 648222
R
2
= 0,1968
p= 0,010
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
N69
Carga viral
y = 2E+06x - 4E+06
R
2
= 0,2886
p=0,001
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
L69
Carga viral
y = 478728x + 1E+06
R
2
= 0,0395
p=0,267
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 5 10 15 20 25
E69
Carga viral
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γ
y = 16997x + 4E+06
R
2
= 0,006
p=0,668
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 50 100 150 200 250
IL-6
Carga viral
y = -484312x + 5E+06
R
2
= 0,0251
p=0,378
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 2 4 6 8 10 12 14
TNF-a
Carga viral
y = 29927x + 3E+06
R
2
= 0,1066
p=0,064
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 50 100 150 200 250 300 350 400
IL-8
Carga viral
α
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y = -8586,2x + 5E+06
R
2
= 0,0207
p= 0,425
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 100 200 300 400 500 600 700 800
IL-4
Carga viral
y = 702115x + 4E+06
R
2
= 0,02
p=0,433
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
IL-10
Carga viral
y = -4588,5x + 7E+06
R
2
= 0,0581
p=0,177
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 500 1000 1500 2000
IL-12
Carga viral
y = 2994,5x + 5E+06
R
2
= 2E-05
p=0,981
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 5 10 15 20 25 30 35 40
IFN
Carga viral
γ
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α
γ
α
γ
+
+
* Teste de Kruskal-Wallis
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* Teste de Kruskal-Wallis
4.7 Análise do líquor e da ressonânciamagnética cerebral dos pacientes HCV
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5. DISCUSSÃO
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α
Flaviviridae
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γ α
γ α
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γ
γ
α
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6. CONCLUSÕES
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
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6.9
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Hepatology
Mem Inst Oswaldo
Cruz
. Mem Inst Oswaldo Cruz
Proc Natl Acad Sci
J Gastroenterol
J Hepatol
Nat Med.
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Diagnostic and Coding Manual
J Exp
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Eur J
Pharmacol
Hepatology
J Nerv Ment Dis
Liver Transpl
J Biol Chem
Rev Inst Med
Trop S Paulo
Proc Natl Acad Sci
Brain Research
Priciples and Practice of Sleep Medicine
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J Clin Microbiol
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2. Obras Consultadas
Practice of Sleep Medicine
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– Escala de Qualidade do Sono de Pittsburgh
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– Questionário Clínico
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– Escala de Fadiga de Krupp
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– Exames realizados
Western-blot
Citometria de Fluxo
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-
USG abdominal:
_____________________________________________________________
___________________________________________________________________________.
RM de
crânio:________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
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– Termo de consentimento livre e esclarecido
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– Fluxograma do estudo
Ambulatório
Pacientes com HCV+
ELISA+ e Blot+
Coleta de amostras para
o estudo ,
genotipagem
HCV+ com alterações do sono
Consentimento -
TCLE
Critérios de Inclusão
e Exc
lusão
HCV+ sem alterações do sono
Avaliação Clínica
Avaliação Neurológica
Avaliação do
Sono
Avaliação da resposta imune
Genotipagem, citocinas
Avaliação da resposta imune
Genotipagem, cotocinas
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– Formulário de guarda de material biológico humano para pesquisa
.
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