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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
MESTRADO MULTIDISCIPLINAR EM
PATOLOGIA TROPICAL
ESTUDO DA ATIVIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS E
EXTRATOS DE Piper aduncum L. (Piperaceae) SOBRE O
Mycobacterium tuberculosis
ALITA MOURA DE LIMA
MANAUS
Junho/2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
MESTRADO MULTIDISCIPLINAR EM
PATOLOGIA TROPICAL
ALITA MOURA DE LIMA
ESTUDO DA ATIVIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS E
EXTRATOS DE Piper aduncum L. (Piperaceae) SOBRE O
Mycobacterium tuberculosis
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação da Universidade Federal do Amazonas
como parte do requisito para obtenção do título
de Mestre em Patologia Tropical na área de
concentração “Etnomedicina e Biodiversidade” e
na linha de pesquisa “Princípios Bioativos em
Recursos Naturais Amazônicos”.
Orientadora: Profª Dra. Julia Ignez Salem
Co-orientador: Prof
o
Dr. Valdir Florêncio da Veiga Junior
MANAUS
Junho/2007
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L732e Lima, Alita Moura de.
Estudo da atividade de fungos endofíticos e extratos de
Piper aduncum L. (Piperaceeae) sobre o Mycobacterium
tuberculosis / Alita Moura de Lima. Manaus: [s.n.], 2007.
61 f. : il.; 28 cm
Bibliografia
Dissertação de Mestrado em Patologia Tropical –
Universidade Federal do Amazonas
1. Tuberculose. 2. Fungos endofíticos. I. Título.
iii
ALITA MOURA DE LIMA
ESTUDO DA ATIVIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS E
EXTRATOS DE Piper aduncum L. (Piperaceae) SOBRE O
Mycobacterium tuberculosis
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação da Universidade Federal do Amazonas
como parte do requisito para obtenção do título de
Mestre em Patologia Tropical na área de
concentração “Etnomedicina e Biodiversidade” e na
linha de pesquisa “Princípios Bioativos em Recursos
Naturais Amazônicos”.
Apresentada em 22 de Junho de 2007
BANCA EXAMINADORA
Prof
a
. Dra. Julia Ignez Salem (Presidente)
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/ Universidade Federal do Amazonas
Prof. Dr. Emerson Silva Lima (Membro Interno)
Universidade Federal do Amazonas
Prof
a
. Dra. Maria da Paz Lima (Membro Externo)
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
iv
Dedicatória
A minha amada
A minha amada A minha amada
A minha amada
Super Mãe
Super MãeSuper Mãe
Super Mãe
que nessa fase
que nessa fase que nessa fase
que nessa fase
importante da
importante da importante da
importante da
minha vida foi a
minha vida foi a minha vida foi a
minha vida foi a
pessoa mais
pessoa mais pessoa mais
pessoa mais
presente mesmo
presente mesmo presente mesmo
presente mesmo
estando tão longe.
estando tão longe.estando tão longe.
estando tão longe.
Ao meu bom pai
Ao meu bom paiAo meu bom pai
Ao meu bom pai
que mesmo em silêncio
que mesmo em silêncioque mesmo em silêncio
que mesmo em silêncio
sonhou com este dia
sonhou com este diasonhou com este dia
sonhou com este dia
tão especial em minha vida.
tão especial em minha vida.tão especial em minha vida.
tão especial em minha vida.
v
Agradecimentos
Em primeiro lugar agradeço a Deus
DeusDeus
Deus, por me abençoar com sabedoria e ter colocado ao
meu lado pessoas que foram imprescindíveis para a conclusão desse mestrado.
Meus agradecimentos e admiração a Minha Orientadora Dra. Júlia Ignez Salem
Dra. Júlia Ignez SalemDra. Júlia Ignez Salem
Dra. Júlia Ignez Salem por
ser o exemplo do verdadeiro cientista, transbordando sabedoria e competência. Ao Conselho
Conselho Conselho
Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoNacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Fundação de Amparo a
Fundação de Amparo a Fundação de Amparo a
Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado do Amazonas
Pesquisa do Estado do AmazonasPesquisa do Estado do Amazonas
Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pelo financiamento do projeto.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
de Nível Superiorde Nível Superior
de Nível Superior (CAPES) pela bolsa
de mestrado que foi fundamental para minha dedicação exclusiva no desenvolvimento desta
pesquisa.
A Clarice Maia Carvalho
Clarice Maia CarvalhoClarice Maia Carvalho
Clarice Maia Carvalho por toda ajuda prestada não somente com seu
conhecimento teórico, mas também pelo apoio na prática para realização dos experimentos
deste trabalho.
A Dra. Cecília Verônica
Dra. Cecília VerônicaDra. Cecília Verônica
Dra. Cecília Verônica, da Coordenação de Pesquisa em Produtos Naturais do
INPA, por disponibilizar o Laboratório de Fitoquímica para a preparação dos extratos
fitoquímicos.
A Ana Cláudia Cortez
Ana Cláudia CortezAna Cláudia Cortez
Ana Cláudia Cortez por ter sido mais do que uma colega de trabalho uma amiga
que muito me ajudou para obtenção dos meus resultados.
Aos Técnicos do laboratório Francisco
FranciscoFrancisco
Francisco e Raimundo
RaimundoRaimundo
Raimundo pelo apoio logístico ao longo da
realização experimental.
Ao Pesquisador Dr. Francisco Célio,
Dr. Francisco Célio,Dr. Francisco Célio,
Dr. Francisco Célio, aos técnicos Sr. César
Sr. CésarSr. César
Sr. César e Sr. Luiz
Sr. LuizSr. Luiz
Sr. Luiz da Embrapa
que me ajudaram para obtenção da planta em estudo deste trabalho.
Ao Dr. Nelson
Dr. NelsonDr. Nelson
Dr. Nelson pela dedicação ao coordenador do Curso de Pós Graduação.
A todos os Professores
Professores Professores
Professores do mestrado por todo conhecimento passado.
A Ra
RaRa
Rafaela
faelafaela
faela querida secretária do curso por ser sempre tão prestativa.
A Mari Otsuka
Mari OtsukaMari Otsuka
Mari Otsuka de Lima quem muito me incentivou para entrar no mestrado
apoiando e acreditando em minha capacidade.
Aos meus pais, Vladimir Rosa de Lima
Vladimir Rosa de LimaVladimir Rosa de Lima
Vladimir Rosa de Lima e Persida Moura de Lima
Persida Moura de LimaPersida Moura de Lima
Persida Moura de Lima, que mesmo com o
sofrimento da distancia me apoiaram com muito amor.
A minha amável e linda vozinha Walquíria Moura
Walquíria Moura Walquíria Moura
Walquíria Moura por todo amor e preocupação.
Ao meu Amor Alexandre Realini Dostal
Alexandre Realini DostalAlexandre Realini Dostal
Alexandre Realini Dostal por todo apoio, sendo mais que namorado
um maravilhoso companheiro.
As minhas lindas irmãs Ágata Moura de Lima
Ágata Moura de LimaÁgata Moura de Lima
Ágata Moura de Lima e Agnes Moura de Lima
Agnes Moura de Lima Agnes Moura de Lima
Agnes Moura de Lima pelo carinho
e preocupação por desenvolver esse trabalho em outro Estado.
A Juliana Oliveira
Juliana OliveiraJuliana Oliveira
Juliana Oliveira quem muito admiro, por toda sua ajuda e carinho.
Aos colegas do Mestrado pela amizade que me animava em momentos de cansaço:
Cláudio
CláudioCláudio
Cláudio, Adriana Daumas
Adriana Daumas Adriana Daumas
Adriana Daumas, Gisele
Gisele Gisele
Gisele e a meiga Júnia
Júnia Júnia
Júnia.
Aos colegas de trabalho Adriana
AdrianaAdriana
Adriana, Samira
SamiraSamira
Samira, Hidenori
HidenoriHidenori
Hidenori, Dona Raimunda
Dona RaimundaDona Raimunda
Dona Raimunda, Dona Eliana
Dona ElianaDona Eliana
Dona Eliana e
Sonia
SoniaSonia
Sonia fazendo dos meus dias uma doce rotina de trabalho.
E todos que me ajudaram direta ou indiretamente meus mais sinceros agradecimentos.
vi
RESUMO
A tuberculose, doença infecciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis, está intimamente
ligada às condições de vida da população. Acometendo 1/3 da população mundial ainda se
mantém como um grave problema de saúde pública. Visto que o ciclo de transmissão da
tuberculose envolve quase que exclusivamente o ser humano, o diagnóstico e o tratamento
foram e são eleitos como alvos de controle da endemia. Para ambos os alvos novos
conhecimentos precisam ser gerados, pois a demora no diagnóstico de pacientes com
quantitativo reduzido de bacilos nas secreções faz com que desistam de seus diagnósticos e o
tratamento atual, apesar de ser considerado eficaz, tem nos dados nacionais uma indicação de
cura de apenas 72% dos novos casos da doença. Consequentemente se faz necessário à
descoberta de substâncias que possam ser introduzidas nas técnicas bacteriológicas para
acelerar o crescimento do M. tuberculosis e reduzir o tempo de diagnóstico, assim como
pesquisar novos antagônicos ao M. tuberculosis que possam ser utilizados na terapêutica da
tuberculose. Nesse sentido, o objetivo do presente trabalho foi de estudar a atividade de
extratos fitoquímicos e de caldos metabólitos de fungos endofíticos obtidos de Piper aduncum
L. (Piperaceae) sobre o Mycobacterium tuberculosis, visto indicativos na literatura da
existência de compostos antagônicos em outras espécies do gênero Piper. Utilizando-se
solventes de polaridade crescente obteve-se os extratos diclorometânicos (DCM), metanólicos
(MeOH) e aquosos (H
2
0) de caule e folhas. Para o isolamento dos fungos endofíticos de
folhas e caule, utilizou-se dois tipos de inóculos, diferentes meios de cultivo acrescidos ou
não de sumos vegetais e duas temperaturas de isolamento. Para a realização dos bioensaios de
atividade antagônica foram utilizadas as técnicas de Microplate Alamar Blue Assay (MABA)
e de espectrofotometria pelo GenQuant. Para o bioensaio de atividade acelerado de
crescimento do M. tuberculosis realizou-se apenas a técnica de espectrofotometria.
Obtiveram-se seis extratos fitoquímicos e 315 cepas de fungos endofíticos os quais, após
obtenção de colônias puras e verificação de similaridades de características macroscópicas do
micélio e da produção de pigmento, foram agrupadas e selecionadas 83 cepas para serem
analisadas. Pela técnica do MABA, nenhum dos extratos fitoquímicos proporcionou atividade
antagônica ao M. tuberculosis, enquanto que, dos 83 caldos metabólitos das cepas
selecionadas constatou-se a atividade em 15. Esses resultados foram confirmados pelos
bioensaios de espectrofotometria que também indicou a atividade estimuladora de
crescimento em caldo metabólito de apenas uma das cepas analisadas. Apesar de nos extratos
de Piper aduncum não se ter obtido indicativos de atividade antagônica ao M. tuberculosis, os
componentes microbiológicos desse recurso vegetal demonstraram serem promissores em
estudos para obtenção de bioativos farmacológicos ou de uso nas técnicas bacteriológicas de
diagnóstico da tuberculose.
Palavras Chave: Tuberculose, Piper aduncum, antagonismo, fungos endofíticos.
vii
ABSTRACT
The tuberculosis, infectious disease caused by the Mycobacterium tuberculosis, is intimately
linked to the population conditions of life. Affecting 1/3 of the worldwide population it still is
a serious problem of public health. Since the cycle of transmission of the tuberculosis
involves almost exclusively the human being, the diagnosis and the treatment were and are
elected as targets of control of the endemic disease. For both of the targets new knowledge
need to be generated, because the delay in the diagnosis of patients with reduced quantitative
of bacilli in secretions makes them give up their diagnostics and the current treatment,
although it is considered efficient, has in the national data an indication of cure of only 72%
of the new cases of the illness. Consequently, it is necessary the discovery of substances that
can be introduced in the bacteriological techniques to accelerate the growth of the M.
tuberculosis and to reduce the diagnosis time, as well as to search new antagonists to the M.
tuberculosis that can be used in the tuberculosis therapeutics. Thus, the objective of the
present work was to study the activity of phytochemical extracts and metabolites broth of
endophytic fungi obtained from Piper aduncum L. (Piperaceae) on the Mycobacterium
tuberculosis, according to indicative in the literature of the existence of antagonistic
compounds in other species of the Piper gender. By using solvent of increasing polarity
dichloromethanic extracts (CH
2
Cl
2
), methanolic (MeOH) and watery (H
2
0) of stem and leaves
were obtained, accordingly. For the isolation of the endophytic fungi of leaves and stem, two
types of inoculum were used, as well as different ways of cultivation added or not to
vegetable juice and two temperatures of isolation. For the bioassays of antagonistic activity
the techniques of Microplate Alamar Blue Assay (MABA) and of spectrophotometry for the
GenQuant were used. For the bioassays of growth accelerated activity of the M. tuberculosis
only the spectrophotometric technique was used. Six phytochemical extracts and 315 strains
of endophytic fungi were obtained, which, after the attainment of pure colonies and
verification of similarities of macroscopic characteristics of the mycelium and the pigment
production, 83 strains were grouped and selected to be analyzed. Through the MABA
technique, none of the phytochemical extracts presented antagonistic activity to the M.
tuberculosis, while, out of 83 metabolites broth of the selected strains 15 were evidenced with
activity. These results were confirmed by the bioassays of spectrophotometry that also
indicated stimulating growth activity in metabolites broth of only one of the analyzed strains.
Although in extracts of Piper aduncum no indicative of antagonistic activity to the M.
tuberculosis has been obtained, the microbiological compounds of this vegetable resource
demonstrated to be promising in studies for attainment of pharmacological bioactive or use in
the bacteriological techniques of diagnosis of the tuberculosis.
Keywords: tuberculosis, Piper aduncum, antagonism, endophytic fungi.
viii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.
Folhas e inflorescência de Piper aduncum L..................................................... 18
Figura 2.
Substâncias existentes em partes de P. aduncum............................................... 20
Figura 3.
Fármacos utilizados na terapêutica da Tuberculose e nas Micobacterioses...... 20
Figura 4.
Fluxograma de procedimentos para obtenção de Extratos e Endofíticos de P.
aduncum.............................................................................................................
24
Figura 5.
Exemplo dos Procedimentos de descontaminação superficial de folhas........... 26
Figura 6.
Isolamento de fungos endofíticos de folhas pelas técnicas de Maceração e
fragmentação......................................................................................................
27
Figura 7.
Separação e obtenção de colônias puras de fungos endofíticos......................... 28
Figura 8.
Metodologia utilizada para produção de caldo metabólito estéril de fungos
endofíticos..........................................................................................................
29
Figura 9.
Preparação de inóculo micobacteriano...............................................................
30
Figura 10.
Técnica do MABA na análise antagônica ao M. tuberculosis por extratos de
Piper aduncum L................................................................................................
31
Figura 11.
Técnica do MABA, na análise antagônica ao M. tuberculosis por caldos
metabólitos de fungos endofíticos......................................................................
33
Figura 12.
Fluxo de procedimentos para verificação de crescimento micobacteriano por
leitura espectrofotométrica.................................................................................
35
Figura 13.
Substâncias isoladas de P. sarmentosum com atividade antagônica ao M.
tuberculosis............................................................................................................
40
Figura 14.
Substância isolada de P. aff. pedicellatum com atividade antagônica ao M.
tuberculosis............................................................................................................
40
Figura 15.
Estrutura química de amida isolada de P. sarmentosum com antagonismo ao
M. tuberculosis e piperina isolada de P. aduncum.............................................
41
Figura 16.
Estrutura química de substâncias isoladas de P. sanctum com antagonismo ao
M. tuberculosis...................................................................................................
41
ix
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1.
Planta, extrato, concentração inibitória mínima (CIM) e autores da
pesquisa de ativos inibidores de M. tuberculoisis ........................................
17
Quadro 2.
Fungos endofíticos com alguns de seus produtos e usos de atividade
biológica para a saúde humana......................................................................
18
Tabela 1.
Distribuição do quantitativo de cepas de fungos endofíticos isolados de P.
aduncum L.....................................................................................................
42
Quadro 3.
Grupo de fungo endofítico de Piper aduncum, parte de origem do
isolamento e resultado da análise de antagonismo ao M. tuberculosis pela
técnica do Alamar Blue.................................................................................
44
Tabela 2.
Resultados de estimulação de crescimento ou de antagonismo do M.
tuberculosis por técnica espectrofotométrica (GeneQuant) conforme o
grupo de fungo endofítico de Piper aduncum isolado em meio de cultivo
sem sumo vegetal..........................................................................................
46
Tabela 3.
Resultados de estimulação de crescimento ou de antagonismo do M.
tuberculosis por técnica espectrofotométrica (GeneQuant) conforme o
grupo de fungo endofítico de Piper aduncum isolado em meio de cultivo
com sumo vegetal..........................................................................................
47
Quadro 4.
Resumo dos resultados de antagonismo ou estimulação de crescimento do
M. tuberculosis H37Rv
48
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AM
Amazonas
ATCC
American Type Culture Collection
BDA
Ágar Batata Dextrose
C
Concentração
CIM
Concentração Inibitória Mínima
cm
Centímetro
DL
50
Dose letal para 50% dos indivíduos testados
DO
Densidade óptica
DMSO
Dimetilsufóxido
g
Grama
H
37
Ra
Cepa avirulenta do Mycobacterium tuberculosis
H
37
Rv
Cepa virulenta do Mycobacterium tuberculosis
INPA
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Kg
Kilograma
L-J
Meio de Lowenstein Jensen
MABA
Microplate Alamar Blue Assay
mg
Miligrama
min.
Minuto
mL
Mililitro
mm
Milímetro
NCCLS
National Committee for Clinical Laboratory Standards
OMS
Organização Mundial de Saúde
pH
Potencial Hidrogênionico
PMf
Produtos testados e Meio de cultivo após incubação por 6 dias
PMi
Produtos testados e Meio de cultivo no tempo do ensaio
PMIf
Produtos testados e Meio de cultivo acrescido do inoculo
micobacteriano, após incubação por 6 dias
PMIi
Produtos testados e Meio de cultivo acrescido do inoculo
micobacteriano no tempo inicial do ensaio
SFB
Soro fetal bovino
TA
Temperatura ambiente
TB
Tuberculose
UFAM
Universidade Federal do Amazonas
UFC
Unidade Formadora de Colônia
EUA
Estados Unidos da América
v/v
Volume a volume
V
Volume
µg
Micrograma
µL
Microlitro
µm
Micrometro
o
C
Graus Celsius
xi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................
12
1.1 O diagnóstico da tuberculose ..........................................................................
13
1.2 A terapêutica da tuberculose............................................................................
14
1.3 A tuberculose e os recursos Vegetais...............................................................
16
1.4 O vegetal Piper aduncum L...............................................................................
19
2. OBJETIVOS................................................................................................................
23
2.1 Geral...................................................................................................................
23
2.2 Específicos..........................................................................................................
23
3. METODOLOGIA.......................................................................................................
3.1 Modelo de Estudo..............................................................................................
24
3.2 Obtenção de extratos e caldos metabólitos de fungos endofíticos de P.
aduncum.............................................................................................................
24
3.2.1
Detalhes dos procedimentos de obtenção de extratos............................. 25
3.2.2
Detalhes dos procedimentos de isolamento e obtenção dos caldos
metabólitos de fungos endofíticos...........................................................
26
3.3 Bioensaios para verificação de atividade antagônica ao M.
tuberculosis.........................................................................................................
30
3.3.1
Bioensaios do MABA com extratos fitoquímicos...................................
31
3.3.2
Bioensaios do MABA com caldos metabólitos.......................................
33
3.4 Bioensaio espectrofotométrico de Atividade estimulatória de crescimento do M.
tuberculosis...........................................................................................................................
34
3.5 Análise dos resultados.......................................................................................
38
4. RESULTADOS E DISCUSÕES................................................................................
39
5. CONCLUSÕES...........................................................................................................
50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................
51
APÊNDICES.......................................................................................................................
57
12
1. INTRODUÇÃO
A Tuberculose é uma doença infecto-contagiosa, presente desde a Antiguidade,
causada por um bacilo denominado de Mycobacterium tuberculosis (SOARES, 1994).
Segundo Briglia (1999)
A transmissão do bacilo da tuberculose ocorre, principalmente, através
do ar devido à contaminação do mesmo por gotículas de saliva
expelidas pela tosse, fala ou espirro de doentes ainda não
diagnosticados e tratados. O bacilo, ao penetrar por via respiratória no
organismo humano não infectado anteriormente, tende a se localizar e
multiplicar-se nos alvéolos da periferia pulmonar. Posteriormente
dissemina-se para os demais órgãos do corpo por via
linfohematogênica, canalicular ou por contigüidade O bacilo pode
alojar-se em qualquer parte do corpo humano apesar de ser encontrado
com maior freqüência no pulmão, permanecendo viável, porém,
contido por células de defesa do organismo. Nesses casos temos os
indivíduos infectados que, segundo estimativas do Plano Nacional de
Controle da Tuberculose (Brasil, 1998) estão presentes em 35% da
população brasileira, dos quais 10% desenvolverão a doença,
representando novos focos na cadeia de transmissão. Assim, pode-se
afirmar que não há como eliminar o bacilo de todos os indivíduos
infectados seja pelo desconhecimento de quem está infectado seja pela
impossibilidade econômica e técnica de diagnóstico e tratamento de
todos os infectados. Este fato faz com que o próprio homem proteja a
viabilidade do M. tuberculosis podendo perpetuar a existência da
tuberculose humana, caso não se apliquem medidas urgentes e
inovadoras nas várias frentes de trabalho envolvidas com a doença.
Além do exposto por Briglia (1999) tem-se atualmente a premissa de perpetuação e
cronicidade da tuberculose devido o surgimento de pacientes portadores de tuberculose
multirresistente (TBMR), que no dizer de Kalafer (1995) representaria a “terceira epidemia”.
Devido aos fatos relatados é que as bases do controle da Tuberculose estão
relacionadas exclusivamente com o ser humano fazendo com que o diagnóstico e o tratamento
sejam eleitos como alvos para o controle da endemia.
13
1.1 O Diagnóstico da Tuberculose
O diagnóstico da tuberculose é vital para a quebra da cadeia de transmissão da doença.
Para realização se faz necessário o encontro de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) nas
secreções suspeitas e/ou do desenvolvimento do agente etiológico em meios de cultivo. Esses
dependem da qualidade dos procedimentos dos exames, quantidade de bacilos presente na
amostra e de componentes nos meios de cultivos que possam estimular a taxa de
desenvolvimento do Mycobacterium tuberculosis.
Em relação à Tuberculose pulmonar, forma mais incidente da doença, quando as
secreções dos pacientes são multibacilares (acima de 10.000 bacilos/mL de escarro), o
diagnóstico é rápido e feito por exame baciloscópico. Trata-se de um exame de baixo custo
(em torno de R$2,50) e de fácil realização. Por esses motivos a baciloscopia é o exame
preferencial e mais utilizado na rede básica de saúde visto que consegue diagnosticar em
torno de 60% dos pacientes portadores de Tuberculose (SES, 2002).
Para os pacientes considerados paucibacilares (número de bacilos inferior a 10.000
bacilos/mL de escarro) deve-se realizar o isolamento do Mycobacterium tuberculosis para a
confirmação diagnóstica, o qual necessita de 30 a 60 dias em métodos de cultivos tradicionais
e de 20 a 30 dias nos semi-automatizados. Entretanto, a maior parte dos laboratórios
brasileiros atuantes nas ações de controle da Tuberculose não realiza o método de cultivo, e os
poucos que o executam ainda fazem uso dos métodos de isolamento tradicionais. A demora
ou ausência de realização do método de cultivo faz com que os pacientes desistam de seus
diagnósticos e por isso são denominados por Briglia (1999) de “pacientes evasivos suspeitos”.
Assim, tem-se um intervalo bastante longo até o resultado do cultivo, o que leva ao
agravamento do quadro clínico, à descrença no atendimento de saúde, à perpetuação e
14
transmissão da tuberculose e à manutenção da prevalência “oculta” estimada em torno de 30%
no Brasil (RUFFINO-NETTO, 1998). Buscar procedimentos que possam diminuir o tempo
necessário para o diagnóstico da Tuberculose paucibacilar é sem dúvida uma das prioridades
na linha de pesquisa diagnóstica da doença.
Segundo Carvalho (2005), os métodos clássicos merecem estudos que permitam sua
utilização de forma otimizada e passível de implantação em unidades com poucos recursos.
Uma das formas de aperfeiçoá-los seria mediante a inclusão, nos meios de cultivo clássicos,
de substâncias aceleradoras do crescimento micobacteriano. Nesse sentido a autora realizou
estudo com caldos metabólitos de fungos endofíticos de Copaifera multijuga Hayne, não
tendo encontrado, em nenhum deles, indicativo de ação estimuladora de crescimento do M.
tuberculosis. Apesar desse resultado, a premissa da autora é de importante validade científica
visto que um resultado positivo poderia proporcionar uma diminuição no tempo de isolamento
do microrganismo. Tal fato possibilitaria um diagnóstico mais rápido, uma provável
diminuição no número de “pacientes evasivos suspeitos” e na prevalência “oculta”.
O fato de Carvalho (2005) não ter obtido o tão almejado bioativo acelerador de
crescimento micobacteriano em endofíticos de Copaifera multijuga não significa que o
mesmo não possa existir em outros componentes dos ecossistemas. Nesse sentido novos
estudos devem e podem ser executados em outras espécies vegetais.
1.2 A Terapêutica da Tuberculose
Segundo Toman (1986), apesar da grande importância do diagnóstico “esse não tem
razão de ser se não for seguido de tratamento adequado, razão pela qual as duas atividades
devem ser consideradas como uma única unidade funcional”. Assim, é preciso que os atuais
15
medicamentos utilizados no combate a Tuberculose sejam capazes de curar todos os casos,
fato esse que não vem acontecendo na última década devido ao encontro cada vez mais
constante de pacientes portadores de tuberculose multirresistente (ZHANG et al., 2007).
O tratamento de pacientes com tuberculose ativa é baseado na utilização de múltiplos
agentes, a fim de se evitar o desenvolvimento de mutantes resistente a drogas e acelerar a
eliminação das bactérias. Além de combater a fármaco-resistência, os esquemas com
múltiplos fármacos conseguem também encurtar a duração necessária ao tratamento, mediante
as contribuições peculiares dos diversos agentes empregados (GOLDMAN; BENNETT,
2000).
O tratamento atual está composto de esquemas multidrogas utilizando-se isoniazida
(INH), Rifampicina (RMP), e Pirazinamida (PZA) por dois meses, e continuação apenas com
a Isoniazida e Rifampicina por mais quatro meses (BRASIL, 2007). Este tratamento é
suplementado com Entambutol (EMB) ou estreptomicina quando necessário (BARRY, 1997).
Apesar de o referido tratamento ser considerado eficaz, os dados nacionais indicam
que a cura é obtida em apenas 72% dos novos casos da doença. Dos 28% restantes, em 12 % a
cura não é obtida devido ao abandono de tratamento (RUFFINO-NETTO; VILLA, 2006).
Portanto, tem-se um universo de 16% de novos casos de Tuberculose que não respondem
adequadamente ao tratamento, seja devido a existência de fatores intrínsecos a cada individuo
que propiciam a falência terapêutica, seja devido a existência de cepas do agente etiológico
com resistência aos medicamentos padronizados.
No Brasil a magnitude de cepas multirresistentes e suas associações não foram ainda
definitivamente estabelecidas. Um estudo realizado por Melo (2003) na cidade de São Paulo
apresentou como condições mais freqüentes os casos de: abandono terapêutico (45%),
etilismo (27%), falência seqüencial aos esquemas de retratamento (23%), contagio com
16
pacientes portadores de cepas multirresistentes (15%), reações adversas às drogas (6%), HIV-
positivo (4%) e diabetes (3%).
Na análise dos dados de Melo (2003), constata-se que a taxa de falência seqüencial aos
esquemas de tratamento e retratamento acrescida das taxas de aquisição da doença devido a
contagio com pacientes portadores de cepas com multirresistência medicamentosa e de
reações adversas as drogas, são responsáveis por 44% da não obtenção da cura. Esses são
fatores que não dependem dos indivíduos que adoecem e, portanto, são os que mais
pressionam a busca de novos medicamentos de combate a doença. Assim, faz-se necessário
que novas terapêuticas sejam descobertas para impedir que a doença tuberculose realmente se
transforme na 3ª epidemia prevista por Kalafer (1995).
Nesse sentido, a busca científica de novos antibióticos tem sido constantemente
reportada, principalmente em extratos vegetais com indicação popular de uso no tratamento
empírico da Tuberculose (GRAHAM et al., 2004).
1.3 A Tuberculose e os recursos vegetais
Estudos com plantas têm pressuposto alternativas potenciais para o tratamento da
Tuberculose (JIMÉNEZ et al., 2005). Apenas no período de 2000 a 2005, e em relação aos
estudos de antagonismo ao Mycobacterium tuberculosis por extratos fitoquímicos, foram
encontrados os trabalhos apresentados na Quadro 1.
17
Quadro 1
Planta, Extrato, Concentração inibitória mínima (CIM) e Autores da pesquisa de ativos inibidores de M.tuberculosis.
Planta origem
Parte
utilizada
Extrato Cepa Técnica
CIM
(µg/mL)
Autor
Buddleja cordata México Casca NI H
37
Rv Radiométrico 64 Acevedo et al. (2000)
Ficus citrifolia
Pisonia borinquena
Porto Rico NI Etanol NI Radiométrico 100 Antoun et al. (2001)
Amorphophallus bequaertii
Myrianthus arboreus
Rubus rigidus
Congo
Tubérculo
Raiz
Casca
Extrato diclorometanólico NI Radiométrico 100 Tshibangu et al. (2002)
Clausena excavata Tailândia Rizoma Clorofórmio H
37
Ra MABA 50-200 Sunthitikawinsakul et al. (2003)
Artemisia ludoviciana
Chamaedore tepejilote
Lantana hispida
Juniperus communis
Malva parviflora
México
NI
Metanol
H
37
Rv
Radiométrico
50-200
Jiménez-Arellanes et al. (2003)
Piper sanctum México folha Hexâno H
37
Rv MABA 4 Mata et al. (2004)
Piper sarmentosun Tailândia frutos Hexâno e Etanol H
37
Ra MABA 25 Rukachaisirikul et al. (2004)a
Senecio chionophilus Chile raiz Hexâno e diclorometano H
37
Rv MABA < 128 Gu et al. (2004)
Salvia aephiopis L.
Stachys sylvatica L.
Chelidonium majus L.
Partes aéreas
Ulmus glabra Hudson folhas
Urtica dioica
Turquia
Partes aéreas
Èter H
37
Rv MABA 50
Tosun et al. (2004)
Valeriana laxiflora USA. Raiz Hexâno e diclorometano NI 15,5 – 127 Gu et al. (2004)b
Senna obliqua Peru Casca e fruto Metanólico clínica Radiométrico 12 Graham et al. (2004)
Micromelum hirsutum Chicago Casca Diclorometano H
37
Rv NI 1,5 Ma et al. (2005)
Engelhardia roxburghiana China Raiz NI H
37
v NI 3,12 Lin et al. (2005)
Chrysanthemum morifolium Japão Flores Metanol H
37
Rv MABA 4 Akihisa et al. (2005)
Chamaedora tepejilote México folhas Hexâno H
37
Rv Radiométrico 100 Jimeénez et al. (2005)
NI= Não informado; MABA= Microplate Alamar Blue assay
18
Assim como existe a presença de novas moléculas tuberculocidas em recursos vegetais
específicos das plantas, não se pode excluir a possibilidade de encontrá-las sendo liberadas
para o interior da planta por microrganismos endofíticos. Segundo Peixoto Neto et al. (2002)
estes microrganismos habitam no interior das plantas e têm gerado grande esperança
biotecnológica. Tal fato vem resultando em um maior conhecimento destes seres e suas
relações não totalmente esclarecidas com a planta hospedeira. Apesar de representados pelas
classes bacterianas e fúngicas, é nos fungos endofíticos que se tem ampla aplicabilidade na
indústria alimentícia, agricultura, controle biológico de pragas, entre outras (ACEVEDO et
al., 2000).
No período de 2000 a 2005, os trabalhos encontrados sobre fungos endofíticos
produtores de bioativos para uso na saúde humana estão apresentados no Quadro 2.
Quadro 2
Fungos endofíticos com alguns de seus produtos e usos de atividade biológica para a saúde
humana.
Endofítico Composto químico Atividade biológica Referências
Colletotrichum sp. NI Antibacteriano Lu Hong et al. (2000)
Cytonama sp. Ácido Citônico A e B
Inibidor da protease em
Citomegalovírus
Guo et al. (2000)
Stegolarium
kukenani
Taxol Antitumoral Strobel et. al. (2001)
Aspergillus
fumigatus
Fumigaclavine C
Ácido helvólico
Fumitremorgin C
Antifúngico Liu et al. (2004)
Menisporopsis
theobromae
Menisporopsina A Antimicobacteriano
Chinworrungsee et al.
(2004)
Phomopsis sp Ácido 3-nitropropiônico Antimicobacteriano
Chomcheon et al.
(2005)
Muscodor albus Compostos voláteis Antifúngico
Atmosukarto et al.
(2005)
NI = Não informado
19
Figura 1 - Folhas e inflorescências
de Piper aduncum L.
Fonte
:
h
ttp://www.hear.org
Dentre os recursos vegetais utilizados na medicina popular, o gênero Piper vem sendo
estudado em função das suas propriedades antimicrobianas (BASTOS; ALBUQUERQUE,
2004). Conforme apresentado no Quadro 1, os extratos fitoquímicos de partes dos vegetais
das espécies Piper sanctum e Piper sarmentosun possuem constituintes com atividade
inibitória ao Mycobacterium tuberculosis. Esses constituintes podem ser produzidos pelas
plantas ou terem suas origens devido à excreção metabólica de seus microrganismos
endofíticos. Assim, é possível que os vegetais ou seus endofíticos possam produzir
substâncias antagônicas como também substâncias aceleradoras de crescimento
micobacteriano. Consequentemente, ampliar os conhecimentos sobre as possíveis ações dos
bioativos de espécies do gênero Piper em favor da saúde do homem é dar continuidade e
gerar novos conhecimentos que possam ser assimilados e utilizados em prol de todas as
sociedades.
1.4 O vegetal Piper aduncum L.
A família Piperaceae compreende 12
gêneros, em torno de 1.400 espécies distribuídas em
várias regiões tropicais. Piper é o maior gênero das
Piperaceae, com mais de 700 espécies das quais 170
crescem no Brasil (MAIA et al., 1998).
No estudo da composição química de
espécies pertencentes à família Piperaceae são
encontradas diversas classes de metabólitos,
principalmente os derivados prenilados de ácido benzóico, fenilpropanóides e derivados de
alcalóides, como as amidas, extremamente comuns em Piper (POHLIT at al., 2006). Assim,
componentes e extratos de espécies vegetais do gênero Piper vêm despertando o interesse dos
cientistas por apresentarem comprovados efeitos biológicos em diferentes microrganismos
20
(RUEGG et al., 2006; SAWANGJAROEN et al., 2005), dentre eles o Mycobacterium
tuberculosis (MATA et al., 2004; RUKACHAISIRIKUL et al., 2004a; RUKACHAISIRIKUL
et al., 2004b; TUNTIWACHWUTTIKUL et al., 2006).
Na Amazônia têm-se diferentes espécies e entre elas a P. aduncum que, segundo
Ribeiro et al. (1999), é comum nas matas da Amazônia e com freqüência é invasora de áreas
alteradas pelo homem, tais como terrenos, beira de estrada, etc... Conforme Silva (2005), o
arbusto tem ampla distribuição, principalmente nos bairros de periferia da cidade de Manaus,
nas encostas de terra firme e ao longo da BR 174.
A espécie Piper aduncum L. é uma pequena árvore de até 7 m de altura, com raiz de
sedimentos curtos e macios, folhagens e gravetos aromáticos. Seus galhos são eretos e ao
longo deles são observados nós. Folhas alternadas, de 12 a 22 cm de comprimentos,
inervadas, com pêlos macios. A inflorescência se encontra na superfície oposta da folha, é
curvada com 12 a 17 cm de penduculo, podendo ser de cor branca a amarelo claro, se
tornando verde quando madura. Suas flores crescem em fileiras transversais regulares. Possui
como fruto uma baga. Sementes de marrom a preto, medindo de 0,7 a 1,25 mm de comprimento
(WATERHOUSE; MITCHELL, 1998). Na medicina popular possui ampla aplicabilidade
contra alguns males como: gonorréia, leucorreia, hemorragias menstruais, estimulante digestivo,
diurético, laxante, anti-ulceroso, antimicrobiano, entre outras (POHLIT et al., 2006).
Conhecido vulgarmente como “pimenta-de-macaco”, o Piper aduncum L. produz um
óleo essencial com grande potencial de exploração devido à sua comprovada ação sobre
fitopatógenos de culturas agronômicas tradicionais. Entre suas ações tem-se o antagonismo a
fungos (GAIA et al., 2004, BASTOS; ALBUQUERQUE, 2004), bactérias e moluscos
(ORJALÁ et al., 1994). Destaque deve ser dado à ação inseticida do óleo sobre adultos de
Cerotoma tingomarianus, inseto considerado praga de maior importância para a cultura do
feijoeiro no Acre (FAZOLIN et al., 2005).
Na área da saúde humana tem-se comprovada ação analgésica e antiinflamatória
(MONTEIRO et al., 2001). Segundo Braga et al. (2007), o extrato metanólico de P. aduncum
apresentou atividade antagônica aos microrganismos Leishmania amazonensis, L. chagasi,
21
Candida albicans e Cryptococcus neoformans.
Além dos efeitos relatados tem-se antagonismo ao M. intracellulare pelas substâncias
1 a 5 apresentadas na Figura 2.
Figura 2 – Substâncias existentes em partes de P. aduncum
Fonte: Pohlit et al. (2006)
Vale ressaltar que as substâncias apresentadas na Figura 2 não possuem qualquer
semelhança química com os fármacos de 6 a 11(Figura 3) utilizados na terapêutica da
Tuberculose ou de outras doenças causadas por espécies do gênero Mycobacterium.
Figura 3 – Fármacos utilizados na terapêutica da Tuberculose e nas Micobacterioses
E
E
t
t
i
i
o
o
n
n
a
a
m
m
i
i
d
d
a
a
22
A ausência de informações sobre atividade antagônica ao M. tuberculosis em extratos
ou compostos de P. aduncum e o relato desse achado em compostos de Piper sanctum, P. aff.
Pedicellatum e P. sarmentosum (MATA et al., 2004; RUKACHAISIRIKUL et al., 2004a;
RUKACHAISIRIKUL et al., 2004b; TUNTIWACHWUTTIKUL et al., 2006), induzem
predizer que a atividade biológica contra M. tuberculosis pode ter também uma afinidade com
substâncias encontradas em extratos de P. aduncum. Entretanto, e segundo Gobbo-Neto;
Lopes (2007), tal premissa deve ter em conta que existem variações na composição química
entre espécies do mesmo gênero, ou mesmo dentro de uma espécie específica, devido a
fatores bióticos e abióticos acrescidos da variação provocada pela presença de
microrganismos simbiontes, os chamados fungos endofíticos. A referida premissa acrescida
da busca de novas moléculas, até mesmo sem semelhança com os atuais fármacos, para o
tratamento da tuberculose induziram o presente trabalho.
É importante ressaltar que todas as pesquisas relatadas foram realizadas em extratos
fitoquímicos das plantas. Assim, por mais promissoras que sejam, a aplicabilidade no uso
comercial predispõe a destruição do vegetal, seja a partir de cultivos pré-determinados ou
atividades extrativistas. Por esse motivo tem-se intensificado a procura dos mesmos
compostos em metabólitos de microrganismos endofíticos. A obtenção por esse processo
torna-se menos agressiva ao meio ambiente e mais econômica nos possíveis usos pelas
indústrias farmacêuticas.
Mediante o exposto e visto a biodiversidade amazônica nos dois componentes
ambientais - vegetal e microrganismos - e o relato da presença de compostos antagônicos ao
M. tuberculosis em espécies vegetais de Piper, a presente proposta pretende pesquisar
bioativos que possam inibir ou estimular o crescimento M. tuberculosis em elementos
oriundos da espécie Piper aduncum L..
23
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Estudar a atividade de fungos endofíticos e extratos de Piper aduncum L. (Piperaceae)
sobre o Mycobacterium tuberculosis.
2.2 Específicos
2.2.1 Pesquisar nos extratos vegetais de caule e folhas de Piper aduncum L., efeito antagônico
ao Mycobacterium tuberculosis;
2.2.2 Investigar efeito antagônico ao Mycobacterium tuberculosis em caldos metabólitos
produzidos por fungos endofíticos de caule e folhas de Piper aduncum L.;
2.2.3 Averiguar atividade estimulatória de crescimento do M. tuberculosis em caldos
metabólitos de fungos endofíticos de caule e folhas de Piper aduncum L., sem indicativo
de ação antagônica.
24
3. METODOLOGIA
3.1 Modelo de Estudo
Trata-se de estudo experimental para avaliação de atividade antagônica ao M.
tuberculosis por extratos de Piper aduncum L. e de antagônica ou estimuladora de
crescimento do M. tuberculosis por caldos metabólitos produzidos por fungos endofíticos
isolados de Piper aduncum L.
3.2 Obtenção de extratos e caldos metabólitos de fungos endofíticos de P. aduncum
As principais etapas de obtenção de extratos e caldos metabólitos de fungos
endofíticos de P. aduncum estão apresentadas na Figura 4.
Figura 4 – Fluxograma de procedimentos para obtenção de extratos e endofíticos de P. aduncum
Coleta de folhas e caule de P. aduncum em monocultivo
da EMBRAPA
Lavagem e
Secagem
Trituração
Preparação e
obtenção dos
Extratos
Descontaminação para
isolamento de endofíticos
Descontaminação e
trituração em água
para preparação dos
sumos de folhas e
caules
Técnica de Fragmentação
Técnica de Maceração
Semeadura em
meios Saboraud,
Malte e BDA
Semeadura em meios
Saboraud, Malte e BDA
acrescidos de sumo
vegetal
Isolamento de cepas fúngicas
Maceração
em
solventes
Preparação e obtenção dos caldos metabólitos
Bioensaio
a
ntagônico
Adição aos
meios de cultivo
Bioensaios antagônico e estimulador de
crescimento
25
Um galho contendo folhas e inflorescência coletado no monocultivo de Piper
aduncum L. da Empresa Brasileira de Agro-pecuária (EMBRAPA) da Amazônia Ocidental,
situada em Manaus/AM, foi entregue ao herbário do INPA para confirmação da identificação
botânica, tendo recebido como registro o nº. 216608.
3.2.1 Detalhes dos Procedimentos de obtenção de Extratos
Do mesmo monocultivo de Piper aduncum, foram coletados em torno de 2 kg de caule
e folhas, em agosto de 2005 e transportados para o Laboratório de Micobacteriologia do
INPA. As amostras aparentemente sem indicação de afecções por pragas foram lavadas em água
corrente, secas à temperatura ambiente e submetidas à trituração em moinho elétrico para
pulverização das mesmas.
Utilizando-se solventes de polaridade crescente obteve-se os extratos diclorometânicos
(DCM), metanólicos (MeOH) e aquosos (H
2
0) de caule e folhas, a partir de 100 g de seus
respectivos pulverizados. Empregou-se a técnica descrita por Celeghini et al. (2001) onde, por
3 vezes, os pulverizados foram misturados com diclorometano na proporção de 1:10 (100 g de
amostra: 1000 mL de diclorometano), e macerados com auxílio de ultra-som, em banho-maria,
à temperatura ambiente por 20 minutos. Antes de cada nova mistura com diclorometano
realizou-se filtragem para obtenção dos extratos diclorometânicos.
Os macerados foram deixados à temperatura ambiente para evaporação do
diclorometano restante. Foram então submetidos a 3 novos processos de maceração com
auxílio de ultra-som, porém, utilizando-se o metanol e água como solventes, obtendo-se assim
o extrato metanólico e aquoso (CELEGHINI et al., 2001).
Tanto os extratos diclorometânico como metanólicos foram expostos à concentração
em evaporador rotatório sob pressão reduzida e o aquoso em liofilizador. As massas obtidas
foram pesadas e diluídas em 1 mL de solvente dimetilsulfóxido (DMSO), tornado-se as
“soluções mãe”. Dessas soluções foram retiradas alíquotas para obtenção de “extratos teste”
26
em concentração inicial de 4,8 mg/mL, para todos os extratos.
Para obter a referida concentração foi aplicada a formula C
1
x V
1
= C
2
x V
2
, onde C
1
e
V
1
foram, a concentração e o volume inicial da “solução mãe” e C
2
e V
2
a concentração e o
volume final da solução a ser utilizada no bioensaio (extrato teste). Assim sendo, nesta
metodologia:
C
1
concentração da “solução mãe”;
V
1
incógnita da fórmula;
C
2
concentração do extrato desejada ao Bioensaio;
V
2
volume de 2.000 µL (volume fixo necessário para a realização dos Bioensaios).
3.2.2 Detalhes dos Procedimentos de Isolamento e obtenção dos Caldos Metabólitos de
Fungos Endofíticos
Para o isolamento dos fungos endofíticos utilizou-se a metodologia de Carvalho
(2005), onde as amostras foram submetidas a um processo de descontaminação superficial
visando à eliminação dos microrganismos epifíticos (PEREIRA, 1993). Esse processo foi
realizado em Cabine de Segurança Biológica abrangendo as etapas demonstradas na Figura 5.
Figura 5
-
Exemplo dos Procedimentos de descontaminação superficial de folhas.
Fonte
: Adaptada de Carvalho
(
2005
)
LAVAGEM
Detergente Neutro e
Água CORRENTE
ETANOL
70%
Por 1min
NaHCL
3%
Por 4min
ETANOL
70%
Por 30seg
LAVAGEM
Água Destilada
Estéril Por 30seg
LAVAGEM
Água
27
Vale ressaltar que para se efetuar o processo de descontaminação em caule,
preliminarmente os mesmos foram cortados com o auxílio de uma faca doméstica (estéril) em
fragmentos de aproximadamente 1cm x 0,5cm e então, submetidos a descontaminação.
Para verificação da eficiência da descontaminação superficial, toda a água destilada da
última etapa (Figura 5) foi centrifugada a 3.000 x g por 15 minutos e 0,2 mL do sedimento foi
semeado nos mesmos meios de cultivo utilizados para o isolamento dos fungos endofíticos. Os
reagentes, meios de cultivo e equipamentos utilizados estão apresentados no Apêndice 1.
Após descontaminação superficial, as amostras vegetais foram processadas para o
isolamento de endofíticos por dois métodos de obtenção dos inóculos: o primeiro denominado
de fragmentação visando o isolamento a partir de superfícies expostas de pequenos
fragmentos e o outro relacionado com a maceração das amostras em graal.
Também foram utilizados diferentes meios de cultivo (BDA -Batata-Dextrose-Ágar,
Sabouraud e Extrato de malte 2%), acrescidos ou não de sumos obtidos das mesmas partes
vegetais correspondentes as dos isolamentos, na proporção de 10% e obtidos por trituração
em liquidificador. Todos os meios foram acrescidos de terramicina (100 µg/mL), para inibir o
crescimento bacteriano e foram utilizadas 2 placas de cada meio para cada amostra vegetal
trabalhada. O fluxo dos procedimentos está demonstrado na Figura 6, tendo como exemplo os
procedimentos com folhas.
Figura 6 - Isolamento de fungos endofíticos de folhas pelas técnicas de Maceração e fragmentação.
F
onte:
Adaptado de Carvalho
(
2005
)
Fragmentação
Material Vegetal
Descontaminado
Incubação:
18ºC
33ºC
Meio Sem Sumo
Meio Com Sumo
Maceração
0,2 ml
Meio Com Sumo
Meio Sem Sumo
28
Para a obtenção dos fragmentos de folhas, foi utilizado um perfurador metálico (estéril) que
proporciona círculos de 7 mm de diâmetro. Em cada placa foram dispostos nove fragmentos sendo
alguns retirados da região da nervura central e outros livres desta estrutura foliar. Das amostras de
caule previamente cortadas, semeou-se quatro fragmentos em cada placa de Petri contendo os
diferentes meios de cultivo.
Na realização do método de maceração foi utilizada a mesma quantidade de amostra
vegetal do método de fragmentação. O material vegetal adicionado de 3 mL de água destilada
esterilizada foi macerado em um graal com o auxílio de um pistilo. Alíquotas de 0,2 mL desse
macerado foram semeadas nas placas de Petri contendo os meios de cultivo e incubadas a 18 e
a 33ºC com avaliação diária, pelo período máximo de 30 dias. Colônias visíveis foram
retiradas logo no início de seus crescimentos, codificadas, repicadas em meio de cultivo BDA
com ou sem sumo vegetal, e processadas conforme ilustrado na Figura 7.
A codificação das cepas isoladas possibilitou a identificação de cada indivíduo, a parte
vegetal de onde foi isolado, a temperatura e o meio de cultivo onde ocorreu o isolamento
Figura 7 - Separação e obtenção de colônias puras de fungos endofíticos.
Fonte:
Adaptado de Carvalho
(
2005
)
CF
–
BDA
1
Frag. 18
o
C
C2 L2
-
N
CF
–
BDA 1
Mac. 33oC
F1
17.06.03
CEPAS
C1 C2 C3
L1
L2
L3
29
primário. Visando suas guardas, todas as cepas isoladas foram repicadas conforme método
descrito no Apêndice 2 e depositadas no acervo de microbiologia médica no INPA.
Cada cepa isolada foi repicada em placas de Petri contendo meio sólido de BDA ou de
BDA acrescidas de sumo vegetal e incubadas por 14 dias. Para a obtenção dos caldos
metabólitos e conforme recomendado por Carvalho; Sato (2001) e por Carvalho (2005), um
oitavo (1/8) da massa fúngica com o respectivo meio de cultivo sobre seu crescimento (2,5
mL), foi semeada em 10 mL de meio BDA líquido. No caso de cepas originalmente obtidas
em meios acrescidos de sumo vegetal, o BDA líquido também foi acrescido do sumo vegetal
na proporção de 10%. As etapas realizadas até a obtenção do caldo metabólico estéril estão
demonstradas na Figura 8.
O ajuste do pH foi realizado com solução de hidróxido de sódio a 4 % e a filtragem, para
obtenção de caldo metabólito estéril, com membrana de éster celulose de 0,22 µm (Millipore).
Visando a não repetição de ensaios em cepas com probabilidade de serem da mesma
Figura 8- Metodologia utilizada para produção de caldo metabólito estéril de fungos endofíticos.
Fonte
: Adaptado de Carvalho
(
2005
)
REPIQUE
EM PLACA 20mL BDA SÓLIDO
SEPARAÇÃO DE 1/8
SEMEADURA EM BDA LÍQUIDO
INCUBAÇÃO
7 DIAS – T.A.
AGITAÇÃO
DIÁRIA
FILTRAR
CALDO
METABÓLITO
AJUSTE DE PH
6.8 A 7.2
FILTRAGEM
CALDO METABÓLITO
ESTÉRIL
REPIQUE
EM PLACA 20mL BDA SÓLIDO
REPIQUE
EM PLACA 20mL BDA SÓLIDO
SEPARAÇÃO DE 1/8
SEMEADURA EM BDA LÍQUIDO
SEPARAÇÃO DE 1/8
SEMEADURA EM BDA LÍQUIDO
INCUBAÇÃO
7 DIAS – T.A.
AGITAÇÃO
DIÁRIA
INCUBAÇÃO
7 DIAS – T.A.
AGITAÇÃO
DIÁRIA
FILTRAR
CALDO
METABÓLITO
FILTRAR
CALDO
METABÓLITO
AJUSTE DE PH
6.8 A 7.2
FILTRAGEM
AJUSTE DE PH
6.8 A 7.2
AJUSTE DE PH
6.8 A 7.2
FILTRAGEM
CALDO METABÓLITO
ESTÉRIL
CALDO METABÓLITO
ESTÉRIL
30
espécie, realizou-se a análise das características macroscópicas do micélio (cor, textura e
crescimento) e da produção de pigmento (cor e difusão) dos fungos endofíticos, e agrupou-se
as cepas com as mesmas características. De cada grupo foi então selecionada uma cepa para a
realização dos bioensaios.
3.3 Bioensaios para verificação de Atividade antagônica ao M. tuberculosis
O bioensaio é conhecido como Microplate Alamar Blue Assay (MABA), e foi
realizado em todos os extratos e caldos metabólitos obtidos, conforme adaptação da técnica de
Franzblau et al. (1998). É efetivada em microplaca de 96 poços que permite a análise de
produtos em várias concentrações frente a um determinado agente e em uma única placa. Tem
como base a utilização de Alamar Blue, corante com baixa toxicidade, sem efeito carcinogênico
e indicador de uma oxido-redução ambiental pela mudança de cor de fácil interpretação.
Conforme estabelecido por Carvalho (2005), na realização da técnica utilizam-se como
reagentes o inóculo micobacteriano, os produtos a serem testados (extratos ou caldos metabólitos),
água deionizada estéril e meio de cultivo Middlebrook 7H9CG e solução reveladora Alamar Blue.
O agente submetido à análise de ação inibitória foi a cepa padrão de Mycobacterium
tuberculosis H
37
Rv (ATCC 27294), por se tratar de cepa sensível a todas as drogas tuberculocidas.
A preparação do inóculo micobacteriano foi realizada após o subcultivo da cepa de M. tuberculosis
H
37
Rv, em meio de Lowenstein-Jensen, por 21 dias, conforme demonstrado na Figura 9.
Figura 9 - Preparação de inóculo micobacteriano.
Fonte: Adaptado de Carvalho (2005)
ADICIONAR 1,5mL
DE TWEEN 0,04% -
ALBUMINA 0,2% v/v
AGITAR EM
VORTEX
TUBO DE
CULTIVO
TUBO COM
PÉROLAS DE
VIDRO
AGITAR EM
VORTEX
TRANSFERIR
± 5mg DE
BACILOS
TRANSFERIR 100µL
TUBO COM 5mL DE
TWEEN-ALBUMINA
AGITAR EM
VORTEX
AJUSTAR
TURBIDEZ PARA
TUBO Nº 1 DA
ESCALA DE
MACFARLAND
TRANSFERIR
280µL
TUBO COM
6,72 mL DE
MEIO 7H9GC
DILUIÇÃO
1:25
ADICIONAR 1,5mL
DE TWEEN 0,04% -
ALBUMINA 0,2% v/v
AGITAR EM
VORTEX
ADICIONAR 1,5mL
DE TWEEN 0,04% -
ALBUMINA 0,2% v/v
AGITAR EM
VORTEX
ADICIONAR 1,5mL
DE TWEEN 0,04% -
ALBUMINA 0,2% v/v
AGITAR EM
VORTEX
AGITAR EM
VORTEX
TUBO DE
CULTIVO
TUBO DE
CULTIVO
TUBO COM
PÉROLAS DE
VIDRO
AGITAR EM
VORTEX
TUBO COM
PÉROLAS DE
VIDRO
AGITAR EM
VORTEX
AGITAR EM
VORTEX
TRANSFERIR
± 5mg DE
BACILOS
TRANSFERIR 100µL
TUBO COM 5mL DE
TWEEN-ALBUMINA
AGITAR EM
VORTEX
AGITAR EM
VORTEX
AJUSTAR
TURBIDEZ PARA
TUBO Nº 1 DA
ESCALA DE
MACFARLAND
TRANSFERIR
280µL
TUBO COM
6,72 mL DE
MEIO 7H9GC
DILUIÇÃO
1:25
31
3.3.1 Bioensaios do MABA com Extratos Fitoquímicos
Para a realização dos bioensaios foram adicionados os reagentes aos poços das
microplacas, com micropipetas multicanal, na seguinte ordem de adição e procedimentos:
1ª. Água deionizada estéril 200 µL nos poços das colunas 1 e 12, nas fileiras A a H;
2ª. Água deionizada estéril 100 µL nos poços da coluna 2, nas fileiras de B a G;
3ª. Meio de cultivo 100 µL nos poços das colunas de 3 a 11, nas fileiras de B a G;
4ª. Extratos na concentração de 4,8 mg/mL 100 µL nos poços das colunas 2 e 3, nas
fileiras de B a G.
5ª. Diluições sucessivas dos extratos Após homogeneização do conteúdo dos poços da
coluna 3, fileiras de B a G, foram transferidos 100 µL para os poços laterais da direita e
sucessivamente repetidas até os poços da coluna 10, fileiras de B a G. Os 100 µL
retirados dos poços da coluna 10, fileiras de B a G foram desprezados.
6ª. Inóculo micobacteriano 100 µL nos poços das colunas 3 a 11, nas fileiras de B a G.
Esses procedimentos e seus significados estão ilustrados na Figura 10.
TRANSFERE-SE 100
µ
µµ
µ
L
DESPREZA-SE 100 µL
D
F
G
E
C
B
A
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
12
EXTRATO
TESTE
+
ÁGUA
=
CONTROLE
NEGATIVO
EXTRATO TESTE
+
MEIO DE CULTIVO
+
INÓCULO MICROBIANO
MEIO DE
CULTIVO
+
INÓCULO
MICROBIANO
=
CONTROLE DE
POSITIVIDADE
ÁGUA
EXTRATO DILUÍDO
+
MEIO DE CULTIVO
+
INÓCULO MICROBIANO
=
CONTROLE DE CONTAMINAÇÃO
EXTRATO DILUÍDO
+
MEIO DE CULTIVO
+
INÓCULO
MICROBIANO
Figura 10
-
Técnica do MABA na análise antagônica ao M. tuberculosis por extratos de Piper aduncum L.
Fonte: Adaptado de Carvalho (2005)
32
As microplacas preparadas conforme demonstrado na Figura 10 foram incubadas a
37ºC pelo período de 5 dias. Após esse período foram adicionados 50 µL da solução
reveladora Alamar Blue/Tween 80 ao poço da coluna 11, fileira B (poço B11), e a microplaca
re-incubada por mais 24 horas, visando confirmação de multiplicação microbiana.
Na ocorrência de cor rósea no poço B11, todo o conteúdo dos poços da coluna 10, das
fileiras de B a G, foi retirado e semeado em tubo contendo meio de cultivo Lowenstein-
Jensen. A atividade permitiu verificar contaminação por outros microrganismos que não o M.
tuberculosis, e assim estabelecer que o resultado obtido era fidedigno de atividade sobre o
referido microrganismo.
Aos demais poços das colunas de 2 a 9 das fileiras de B a G e aos poços da coluna 11
das fileiras de C a G foram adicionados 50 µL da solução Alamar Blue/Tween 80 e a
microplaca re-incubada por mais 24 horas. A composição do meio de cultivo e os reagentes
utilizados estão descritos no Apêndice 1.
O resultado de atividade inibitória pela técnica do MABA foi constatado quando os
conteúdos dos poços apresentavam cor azul devido ao não desenvolvimento micobacteriano.
A não inibição do crescimento foi interpretada pela visualização de cor rósea.
Vale salientar que para se ter a certeza de que as possíveis atividades inibitórias foram
proporcionadas pelos extratos fitoquímicos sem a interferência do solvente utilizado, foi
realizada a verificação da toxidade do DMSO sobre o M. tuberculosis. Para tanto, preparou-se
uma solução de DMSO a 30% em água Milli-Q estéril e executou-se a mesma técnica descrita
para o ensaio dos extratos, sendo que, os extratos testes foram substituídos pela solução de
DMSO. Constatou-se que o mesmo era viável de se utilizado em concentração máxima de
7,5%, sendo essa inferior à utilizada nas diluições dos extratos (de 0,96% a 4,8%).
A característica da técnica de se realizar diluições sucessivas permitiu que os extratos
fossem testados em sete diferentes concentrações, sendo a concentração inicial de 2,4 mg/mL
33
e a final de 0,0375 mg/mL. Alem disso, como cada extrato foi analisado duplamente, em cada
placa foi possível a realização de bioensaios de apenas três extratos.
3.3.2 Bioensaios do MABA com Caldos Metabólitos
Efetuados com os caldos metabólitos produzidos pelos fungos endofíticos, isto é, sem
a realização de fracionamento e sem diluições dos mesmos, teve a seguinte seqüência de
adição dos reagentes:
1ª. Água deionizada estéril 200 µL nos poços das colunas 1 e 12, nas fileiras A e H;
2ª. Água deionizada estéril 100 µL nos poços das colunas 2, 6, nas fileiras de B a G;
3ª. Caldos metabólitos 100 µL nos poços das colunas 2, 3, 5, 8 e 9, nas fileiras de B a G e
nas colunas 4, 7 e 10. Após 6 dias de incubação, as alíquotas de 200µL das fileiras foram
semeadas em tubo de Lowenstein-Jensen.
4ª. Inóculo micobacteriano 100 µL nos poços das colunas 3 a 11, nas fileiras de B a G.
Mediante o exposto, um maior número de caldos pode ser analisado em cada placa
utilizada. Os procedimentos descritos e seus significados estão ilustrados na Figura 11.
Figura 11 - Técnica do MABA, na análise antagônica ao M. tuberculosis por ca
ldos metabólitos de
fungos endofíticos.
Fonte: Adaptado de Carvalho (2005)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Á
GUA
A
B
C
D
E
F
G
H
ÁGUA
+
CALDO METABÓLITO
=
CONTROLE NEGATIVO
MEIO DE CULTIVO
+
CALDO METABÓLITO
CALDO METABÓLITO
+
INÓCULO MICROBIANO
=
CONTROLE DE CONTAMINAÇÃO
MEIO DE CULTIVO
+
INÓCULO MICROBIANO
=
CONTROLE DE POSITIVIDADE
34
Após incubação por 5 dias a 37ºC, foram adicionados 50
µ
L da solução reveladora
Alamar Blue/Tween 80 ao poço da coluna 11, fileira B, e a microplaca re-incubada por mais
24 horas. Na ocorrência de cor rósea no poço B11, todo o conteúdo dos poços da coluna 4, 7 e
10, das fileiras de B a G, foi retirado e semeado em tubo contendo meio de cultivo
Lowenstein-Jensen. As demais etapas, assim como a interpretação dos resultados, foram as
mesmas descritas para a verificação de atividade pelos extratos vegetais.
3.4 Bioensaio espectrofotométrico de Atividade Estimulatória de crescimento do M. tuberculosis
Realizada apenas nos caldos metabólitos dos fungos endofíticos, foi executada
conforme realizado por Carvalho (2005), utilizando-se o equipamento GeneQuant pro
RNA/DNA Calculador (Amersham Pharmacia Biotech) com base na possibilidade de
estabelecimento exato de variação no valor numérico correspondente a massa micobacteriana
na presença do produto a ser testado. Assim, a técnica foi utilizada no presente trabalho
visando principalmente à determinação do percentual de crescimento do
M. tuberculosis
quando exposto aos produtos testados. Entretanto, permite também verificar a ação antagônica
dos produtos testados visto que a ausência ou diminuição de crescimento é indicativa da mesma.
A técnica foi realizada nos mesmos dias em que se processou a técnica do MABA,
visando à utilização dos mesmos preparados de caldos metabólitos, meio de cultivo e inóculo
micobacteriano. A execução foi realizada em Cabine de Segurança Biológica (CSB)
utilizando-se 4 frascos de tampa rosqueável contendo os reagentes descritos a seguir:
Frasco 1 -
2.000 µL de meio de cultivo;
Frasco 2 -
1.000 µL de meio de cultivo + 1.000 µL de meio de cultivo contendo o inóculo
micobacteriano
Frasco 3 -
1.000
µ
L de caldo metabólito + 1.000 µL de meio de cultivo.
Frasco 4 -
1.000
µ
L caldo metabólito + 1.000 µL de meio de cultivo contendo o inóculo
micobacteriano.
35
Após preparação, alíquotas de 500
µ
L de cada frasco foram transferidas para cubetas e
submetidas a leituras de densidade ótica (DO), em 600 nm, no equipamento GeneQuant. Após
leitura as alíquotas foram desprezadas em frasco contendo solução de fenol a 5% que
posteriormente foi submetido à autoclavação. De cada frasco também foram retirados 200
µ
L
e semeados em meio de Lowenstein-Jensen para verificação de contaminação e viabilidade de
crescimento micobacteriano. Esses procedimentos foram repetidos após a incubação dos
frascos a 37ºC por 6 dias. O fluxo dessas atividades está ilustrado na Figura 12.
Figura 12 - Fluxo de procedimentos para verificação de crescimento micobacteriano
por leitura
espectrofotométrica.
Fonte
:
Adaptado de
Carvalho
(
2005
)
500 µL
200 µL
Incubação
por 6 dias
a 37
o
C
Leitura no
GeneQuant
Semeadura
em L-J
Semeadura
em L-J
Leitura no
GeneQuant
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Meio de
cultivo
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Meio de
cultivo
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
500 µL
200 µL
Mi Mf
MIi MIf
CMi CMf
CMIi
CMIf
500 µL
200 µL
Incubação
por 6 dias
a 37
o
C
Leitura no
GeneQuant
Semeadura
em L-J
Semeadura
em L-J
Leitura no
GeneQuant
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Meio de
cultivo
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Meio de
cultivo
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
500 µL
200 µL
500 µL
200 µL
Incubação
por 6 dias
a 37
o
C
Incubação
por 6 dias
a 37
o
C
Leitura no
GeneQuant
Semeadura
em L-J
Semeadura
em L-J
Leitura no
GeneQuant
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Meio de
cultivo
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Meio de
cultivo
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
500 µL
200 µL
Leitura no
GeneQuant
Leitura no
GeneQuant
Semeadura
em L-J
Semeadura
em L-J
Semeadura
em L-J
Semeadura
em L-J
Leitura no
GeneQuant
Leitura no
GeneQuant
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Meio de
cultivo
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Meio de
cultivo
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
1
2
3
4
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Meio de
cultivo
Meio de
cultivo
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Meio de
cultivo
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
1
2
3
4
1
2
3
4
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Meio de cultivo
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Meio de
cultivo
Meio de
cultivo
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Caldo Metabólito
+
Meio de cultivo
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
Caldo metabólito
+
Meio com inóculo
micobacteriano
500 µL
200 µL
500 µL
200 µL
Mi Mf
MIi MIf
CMi CMf
CMIi
CMIf
36
Para a calibração do equipamento GeneQuant, antes da leitura de cada frasco, utilizou-
se água Milli-Q e os tubos de cultivo semeados no início do ensaio foram analisados após 2
dias visando verificar se havia ocorrido contaminação por outros microrganismo. Na presença
de contaminação os tubos e frascos foram desprezados e o ensaio repetido. Na ausência de
contaminação os frascos e os tubos de cultivo permaneceram incubados a 37ºC pelo período
de 6 dias.
Conforme Carvalho (2005), os resultados das leituras de densidade ótica foram
analisados mediante o estabelecimento de que:
1.
A diferença dos resultados entre as leituras de densidade ótica (DO) dos frascos de
ensaios contendo meio de cultivo acrescido do inóculo micobacteriano e os com
apenas meio de cultivo, nos Tempos iniciais (Ti) e finais (Tf) do ensaio, estabeleceu o
valor numérico correspondente à massa micobacteriana desenvolvida na ausência do
produto testado, excluída a interferência de DO proporcionada pelo meio de cultivo.
Consequentemente, os valores indicativos de crescimento micobacteriano normal
foram estabelecidos conforme o calculo a seguir demonstrado:
Onde:
MI
Tf
= Valores das DO nos ensaios contendo Meio de cultivo acrescido do inóculo
micobacteriano (MI), após incubação por 6 dias (Tf).
MI
Ti
= Valores das DO nos ensaios contendo Meio de cultivo acrescido do inóculo
micobacteriano, nos tempos iniciais do ensaio (Ti).
M
Tf
= Valores das DO nos ensaios contendo apenas Meio de cultivo, após incubação por
6 dias (Tf).
M
Ti
= Valores das DO nos ensaios contendo apenas Meio de cultivo, nos tempos iniciais
do ensaio (Ti).
A
B
T
i
Tf
A
= (
MI
Tf
–
MI
Ti
) – (
M
Tf
–
M
T
I
)
B
= (
MI
Ti
–
M
Ti
)
37
2. A diferença dos resultados entre as leituras de densidade ótica dos ensaios contendo os
caldos metabólitos acrescidos do meio de cultivo contendo o inóculo micobacteriano e
os com Caldos metabólitos acrescidos apenas de meio de cultivo, nos tempos iniciais
(Ti) e finais (Tf) do ensaio, estabeleceu os valores de massa micobacteriana inicial e
final na presença do produto testado, excluídas as interferências de DO proporcionadas
pelo Meio de cultivo e o Caldo metabólito testado. Para obtenção dos resultados
numéricos foi aplicada a seguinte equação:
Onde:
CMI
Tf
= Valores das DO nos ensaios contendo Caldos metabólitos (C) e Meio de cultivo
acrescido do inóculo micobacteriano (MI), após incubação por 6 dias (Tf).
CMI
Ti
= Valores das DO nos ensaios contendo Caldos metabólitos (C) e Meio de cultivo
acrescido do inóculo micobacteriano (MI), nos tempos iniciais do ensaio (Ti).
CM
Tf
= Valores das DO nos ensaios contendo Caldos metabólitos (C) na presença
apenas de Meio de cultivo (M), após incubação por 6 dias (Tf).
CM
Ti
= Valores das DO nos ensaios contendo Caldos metabólitos (C) na presença
apenas de Meio de cultivo (M), nos tempos iniciais do ensaio (Ti).
Os valores obtidos nas equações demonstradas foram utilizados para o
estabelecimento das proporções de crescimento micobacteriano na presença dos Caldos
metabólitos testados, mediante aplicação na equação:
C
D
T
i
Tf
C
= (
C
MI
Tf
–
C
MI
Ti
) – (
C
M
Tf
–
C
M
Ti
)
D
= (
CMI
Ti
–
CM
Ti
)
(C – D) x 100
(A – B)
X=
(A – B) 100%
(C
–
D) x%
X= % de crescimento
38
Para interpretação de possibilidade de princípio bioativo com ação inibitória de crescimento
do
Mycobacterium tuberculosis
, foi considerado um resultado com crescimento máximo de
10%, enquanto que para indicação de ação estimulatória foi estabelecido um crescimento
igual ou superior a 110%.
Todos os tubos de meios de Lowenstein-Jensen, semeados com as alíquotas dos
frascos do ensaio, permaneceram incubados pelo período de 30 dias antes de serem analisados
e desprezados. A ausência ou presença quantitativa de crescimento micobacteriano (número
de colônias) foi registrada para posterior análise conjunta com os resultados das técnicas de
bioensaios realizadas, visando obter as informações sobre o crescimento micobacteriano e a
pureza dos mesmos.
3.5 Análise dos resultados
Os resultados obtidos foram tabulados em planilhas eletrônicas visando analise isolada
e conjunta das diferentes técnicas de bioensaio utilizadas.
39
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
De amostras de
Piper aduncum
foram obtidos 6 extratos fitoquímicos (3 de folhas e 3
de caule) e 315 cepas de fungos endofíticos.
Dos extratos obtidos e analisados pela técnica do MABA (Alamar Blue), nenhum
forneceu resultados de antagonismo ao
M. tuberculosis
(cepa H37Rv).
Tendo-se como premissa de que em extratos de
Piper sanctum
,
P.
aff.
Pedicellatum
e
P. sarmentosum
foram encontrados compostos com atividade antagônica ao
Mycobacterium
tuberculosis
(MATA et al., 2004; RUKACHAISIRIKUL et al., 2004a; RUKACHAISIRIKUL
et al., 2004b; TUNTIWACHWUTTIKUL et al., 2006), nossos resultados pressupõem que a
espécie
P. aduncum
não possui os mesmos compostos encontrados nas demais espécies referidas.
Sabe-se que em espécies do mesmo gênero ou mesmo dentro de uma espécie específica,
variações na composição química podem ser observadas, sendo originadas de diversos fatores,
bióticos e abióticos. Efeitos como a composição do solo, temperatura, grau de insolação,
umidade, altitude, assim como o estágio de desenvolvimento e idade da planta, seus ritmos
circadiano e sazonal, e mesmo a presença de agressores, como fungos, bactérias e herbívoros,
propiciam variação na composição fitoquímica das plantas (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Mediante o exposto pode-se dizer que apesar das plantas de determinada família
apresentarem sua composição fitoquímica homogênea, a presença de um ou mais dos fatores
relatados faz com que ocorra uma grande variação química entre as espécies e mesmo em uma
única espécie. Assim, essas variações poderiam explicar os resultados negativos na pesquisa
de extratos antagônicos ao
M. tuberculosis
em
P. aduncum
coletado em Manaus, região
ecologicamente bastante diferente da Tailândia e México, de onde foram estudados os
exemplares de
Piper sanctum
,
P.
aff.
Pedicellatum
e
P. sarmentosun
que proporcionaram
bioativos antagônicos ao
M. tuberculosis
(MATA et al., 2004; RUKACHAISIRIKUL et al.,
2004a; RUKACHAISIRIKUL et al., 2004b; TUNTIWACHWUTTIKUL et al., 2006).
40
Além do exposto tem-se na revisão recente dos constituintes fitoquímicos de
P.
aduncum
(POHLIT et al., 2006), o relato de diversas estruturas químicas das quais cinco têm
indicação de atividade antagônica ao
Mycobacterium intracellulare
. Por outro lado, várias das
substâncias já relatadas no gênero
Piper
com atividade sobre o
Mycobacterium tuberculosis
são semelhantes as já isoladas em
P. aduncum
.
Tem-se, por exemplo, nos estudos realizados com o extrato hexânico dos frutos de
P.
sarmentosum
Roxb., obtido na Tailândia, o isolamento de 14 substâncias, mas apenas a amida
pelitorina e o 1-(3,4-metilenodióxifenil)-1
E
-tetradeceno (Figura 13) apresentaram CMI de 25
µg/ml contra
M. tuberculosis
(RUKACHAISIRIKUL et al., 2004b). Essas substâncias não são
relatadas em
P. aduncum.
Figura 13 – Substâncias isoladas de P. sarmentosum com atividade antagônica ao M. tuberculosis
Fonte: Rukachaisirikul et al., 2004b
Nos estudos realizados com os extratos das raízes profundas de
P.
aff.
pedicellatum
obtidos em hexano foi encontrado o 2-
endo
-bornil piperato (RUKACHAISIRIKUL et al.,
2004a), que apresentou atividade antagônica a cepa de
M. tuberculosis
H37Ra, com CMI de
25 µg/ml (Figura 14). Essa substância também não foi relatada como existente em
P.
aduncum
(POHLIT et al., 2006).
Figura 14 – Substância isolada de P. aff. pedicellatum com atividade antagônica ao M. tuberculosis
Fonte: Rukachaisirikul et al., 2004a
pelitorina
1-(3,4-metilenodióxifenil)-1E-tetradeceno
2-
endo
-bornil piperato
41
Em outro estudo, realizado por Tuntiwachwuttikul et al. (2006) também com exemplar
obtido na Tailândia, 16 substâncias foram isoladas dos extratos etanólicos das raízes de
P.
sarmentosum
Roxb., mas novamente somente duas apresentaram CMI de 25 µg/ml contra
M.
tuberculosis
, entre elas o 1-(3,4-metilenodióxifenil)-1
E
-tetradeceno (relatado anteriormente),
e a amida pirrolidínica apresentada a seguir. Essa amida tem estrutura semelhante à piperina
encontrada em
P. aduncum
, diferenciando-se apenas no tamanho da cadeia carbônica entre a
amida e o grupamento fenilmetileno dióxi (Figura 15).
Figura 15 – Estrutura química de amida isolada de P. sarmentosum com antagonismo ao M. tuberculosis
e piperina isolada de P. aduncum
Fonte: Tuntiwachwuttikul et al. (2006); Pohlit et al. (2006)
É possível que a diferenciação na cadeia carbônica entre a amida e a piperina, seja um
dos fatores responsável pela ausência de resultado antagônico ao
M. tuberculosis
em extratos
de
P. aduncum
. Essa premissa de como pequenas variações na estrutura química pode alterar
a atividade frente ao
M. tuberculosis
tem um bom exemplo no trabalho de Mata et al. (2004),
em extratos dos galhos de
Piper sanctum
. Neste estudo, a separação cromatográfica guiada
por bioensaios de atividade antimicobacteriana permitiu o isolamento, entre outras, de 4
substâncias com diferenciação apenas no tamanho da cadeia carbônica. Duas dessas foram
antagônicas ao
M. tuberculosis
com CMI entre 4 e 6,25 µg/ml (Figura 16). Outras substâncias
também isoladas, apresentando 10 ou 16 carbonos na cadeia central, não apresentaram bioatividade.
Figura 16 – Estrutura química de substâncias isoladas de P. sanctum com antagonismo ao M. tuberculosis.
Fonte: Mata et al. (2004)
amida pirrolidínica
piperina
Atividade
antagônica
12
14
42
As substâncias relatadas nos vários trabalhos apresentados poderiam nos indicar que a
atividade antagônica ao
M. tuberculosis
está relacionada à presença de um grupo 3,4-
metilenodióxi-esteril ou à porção amida da molécula. Entretanto, várias outras moléculas
similares foram isoladas nos mesmos estudos sem, no entanto, apresentarem atividade biológica.
Assim como os promotores de crescimento, usualmente encontrados em alguns
extratos vegetais em grandes quantidades, mas somente em quantidades traço em outros, é
possível que algumas das substâncias bioativas presentes nos extratos de
P. aduncum
estejam
em quantidades muito pequenas para serem detectadas nos ensaios de atividade antimicobacteriana.
Entretanto, também é possível que fungos endofíticos sejam os elicitores das substâncias
encontradas nas outras espécies, e não em
P. aduncum
. Consequentemente, o estudo paralelo
de extratos vegetais e de caldos metabólicos dos fungos endofíticos passa a ter papel
fundamental na análise da bioatividade dos constituintes fitoquímicos das espécies vegetais.
Pelo motivo exposto, das mesmas coletas vegetais de onde se obteve os extratos
fitoquímicos, foram isoladas 315 cepas de fungos endofíticos de folhas e caule de
P.
aduncum
. Seus isolamentos, conforme as técnicas de obtenção dos inóculos, meios de cultivo
e temperaturas utilizadas, encontram-se apresentados na Tabela 1.
Tabela 1
Distribuição do quantitativo de cepas de fungos endofíticos isolados de
P. aduncum
L.
NÚMERO DE CEPAS ENDOFÍTICAS ISOLADAS
Conforme técnicas de obtenção do inóculo e ºC de
isolamento
Fragmentação Macerado
ºC de isolamento ºC de isolamento
18 33 18 33
Totais
Parte
Vegetal
Meios
de
Cultivo
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
Sem SV* 65 20,6 26 8,2 17 5,4 4 1,3 112 35,5
Com SV* 48 15,2 28 8,9 10 3,2 5 1,6 91 28,9
Folha
Sub-Totais
113 35,8 54 17,1 27 8,6 9 2,9 203 64,4
Sem SV* 18 5,7 09 2,9 16 5,1 06 1,9 49 15,6
Com SV* 27 8,6 11 3,5 17 5,4 08 2,5 63 20,0
Caule
Sub-Totais
45 14,3 20 6,4 33 10,5 14 4,4 112 35,6
TOTAIS
232 (73,6%) 83 (26,4%)
315 100
* SV = Sumo Vegetal
43
Observa-se na Tabela 1 que as folhas propiciaram maior quantitativo de cepas
fúngicas (203) do que o caule (112). Alem disso, o acréscimo de sumo vegetal aos meios de
cultivo e a utilização de incubação dos mesmos na temperatura de 33ºC propiciou 16,5% de
todos os isolados. Os meios com sumo e independente da temperatura de isolamento utilizada,
permitiram 48,9% dos isolamentos. Constatou-se assim a importância das inserções de
diferentes processos e componentes nos modelos clássicos de isolamento de fungos
endofíticos de
Copaifera multijuga
introduzidas por Carvalho (2005), e confirmou-se o
disposto por Canhos; Manfio (2001) de que “é necessário que os estudos de isolamento de
endofíticos em meio de cultivo sejam mais fidedignos da microbiota existente na espécie
vegetal, pois os métodos e meios de cultivo tradicionais não possuem as condições
encontradas nos ambientes naturais”.
Após agrupamento das cepas com as mesmas características macroscópicas do micélio
(cor, textura e crescimento) e da produção de pigmento (cor e difusão), obteve-se 85 grupos,
sendo 44 isolados de folhas e 41 de caule. Entretanto, três grupos foram considerados como
perdidos (72, 80 e 85) devido à impossibilidade de obtenção de cepas puras, mesmo após
diversas tentativas de descontaminação na cepa isolada ou nas demais cepas representantes do
grupo.
Mediante o exposto, os bioensaios pela técnica do Alamar Blue para verificação de
ação antagônica ao
M. tuberculosis
foram executados com os caldos metabólitos de 83 grupos
de fungos endofíticos. Os resultados obtidos conforme parte vegetal de onde a cepa foi
isolada, presença ou ausência de sumo vegetal no meio de cultivo de isolamento, tipo de
inóculo utilizado e resultados da atividade antagônica estão apresentados no Quadro 3.
44
Quadro 3
Grupo de fungo endofítico de
Piper aduncum
, parte de origem do isolamento e resultado da
análise de antagonismo ao
M. tuberculosis
pela técnica do Alamar Blue
Nº
do
Grupo
Parte
vegetal
isolada
Sumo
vegetal
no meio
de cultivo
Tipo
de
inóculo
Resultado
da atividade
inibitória
Nº
do
Grupo
Parte
vegetal
isolada
Sumo
vegetal
no meio
de cultivo
Tipo
de
inóculo
Resultado da
atividade
inibitória
1 Folha não Frag. Negativo 43 Folha não Mac. Negativo
3 Folha sim Frag. Negativo 44 Folha sim Frag.
Positivo
4 Folha não Frag. Negativo 45 Caule sim Frag. Negativo
5 Caule sim Frag. Negativo 46 Folha não Frag. Negativo
6 Folha sim Frag. Negativo 47 Caule sim Frag.
Positivo
7 Caule não Frag. Negativo 48 Caule sim Frag.
Positivo
8 Caule sim Frag. Negativo 49 Caule sim Frag.
Positivo
9 Folha sim Frag.
Positivo
50 Caule sim Frag. Negativo
10 Folha sim Frag. Negativo 51 Caule sim Frag. Negativo
11 Caule não Frag. Negativo 52 Caule sim Frag.
Positivo
12 Folha não Mac. Negativo 53 Folha não Frag. Negativo
13 Folha sim Mac.
Positivo
54 Folha não Mac. Negativo
14 Folha sim Frag. Negativo 55 Caule não Frag. Negativo
15 Folha não Frag. Negativo 56 Caule sim Frag. Negativo
16 Folha não Frag.
Positivo
57 Folha não Frag. Negativo
17 Folha não Frag. Negativo 58 Folha não Frag. Negativo
18 Folha não Mac. Negativo 59 Folha não Frag. Negativo
19 Folha não Mac. Negativo 60 Caule não Frag. Negativo
20 Folha não Frag. Negativo 61 Caule sim Frag.
Positivo
21 Folha sim Frag. Negativo 62 Folha sim Frag. Negativo
22 Folha sim Frag. Negativo 63 Caule não Frag. Negativo
23 Caule sim Frag. Negativo 64 Folha sim Frag. Negativo
24 Caule sim Frag. Negativo 65 Caule não Frag. Negativo
25 Caule sim Frag. Negativo 66 Folha sim Mac. Negativo
26 Folha sim Mac. Negativo 67 Folha não Mac. Negativo
27 Folha não Frag. Negativo 68 Caule não Frag. Negativo
28 Caule sim Frag. Negativo 69 Caule sim Frag. Negativo
29 Caule sim Frag.
Positivo
70 Caule sim Frag. Negativo
30 Caule não Frag. Negativo 71 Folha não Frag.
Positivo
31 Folha não Mac.
Positivo
73 Folha sim Frag.
Positivo
32 Folha não Frag. Negativo 74 Caule não Mac. Negativo
33 Folha não Frag. Negativo 75 Caule não Mac. Negativo
34 Folha sim Frag. Negativo 76 Caule não Mac. Negativo
35 Caule sim Frag. Negativo 77 Caule sim Mac. Negativo
36 Caule não Frag. Negativo 78 Caule não Mac. Negativo
37 Folha não Frag. Negativo 79 Caule sim Mac. Negativo
38 Folha não Frag. Negativo 81 Caule sim Mac. Negativo
39 Folha não Frag.
Positivo
82 Caule não Mac. Negativo
40 Folha não Frag. Negativo 83 Caule não Mac. Negativo
41 Caule não Frag. Negativo 84 Caule não Mac. Negativo
42 Folha sim Frag.
Positivo
45
Os resultados de positividade antagônica ao
M. tuberculosis
apresentados no Quadro 3
foram re-confirmados na repetição dos bioensaios. Assim, confirma-se que dos 15 fungos
endofíticos cujos caldos metabólitos inibiram o crescimento de
M. tuberculosis
, quatro foram
isolados em meio de cultivo sem sumo vegetal. Conseqüentemente, 73,3 % dos fungos que
produziram substâncias com atividade antagônica ao
M. tuberculosis,
foram obtidos em meio
de cultivo acrescido de sumo vegetal. Nesse sentido podemos pressupor que, apesar dos
constituintes químicos dos extratos de
P. aduncum
não possuírem antagônicos ao
M
tuberculosis
, podem fornecer nutrientes aos fungos endofíticos que os utilizam na síntese dos
metabólitos com capacidade antagônica.
Vale ressaltar que não se tem como inferir a massa ou o tipo de metabólito que
propiciou a ação antagônica ao
M. tuberculosis
e que os resultados, considerados preliminares
são apenas indicativos de que as cepas testadas produzem substâncias com atividade
bacteriostática ou bactericida sobre o
M. tuberculosis
.
Além do exposto contata-se que 60% dos fungos produtores de metabólitos
antagônicos foram isolados de folhas e que 86,7% foram isolados de inóculos de fragmentos.
Portanto, no contexto da pesquisa em
Piper aduncum
L., a técnica de obtenção do inóculo por
maceração não apresentou a mesma importância constatada por Carvalho (2005) na obtenção
de fungos endofíticos de
Copaifera multijuga
.
Quando os caldos metabólitos dos 83 grupos de endofíticos foram analisados por
espectrofotometria para verificação de metabólitos com atividade estimulatória de
crescimento do
M. tuberculosis
, obteve-se, além da ação prevista, a confirmação dos
resultados de antagonismo encontrados pela técnica do MABA. Os resultados obtidos
conforme o acréscimo ou não de sumo vegetal nos de meio de cultivo utilizados, estão
apresentados nas Tabelas 2 e 3.
46
Tabela 2
Resultados de estimulação de crescimento ou de antagonismo do M. tuberculosis por técnica espectrofotométrica (GeneQuant) conforme o grupo de fungo
endofítico de Piper aduncum isolado em meio de cultivo sem sumo vegetal
47
Tabela 3
Resultados de estimulação de crescimento ou de antagonismo do M. tuberculosis por técnica espectrofotométrica (GeneQuant) conforme o grupo de fungo
endofítico de Piper aduncum isolado em meio de cultivo com sumo vegetal
48
Os resultados apresentados nas Tabelas 2 e 3 estão resumidamente apresentados no
Quadro 4.
Quadro 4
Resumo dos resultados de antagonismo ou estimulação de crescimento do
M. tuberculosis
H37Rv
Número de
Identificação
Parte
vegetal de
isolamento
Tipo de
inóculo
Sumo
vegetal no
cultivo
Resultado
pelo MABA
Resultado de
% de
crescimento
PACFS29 Caule Fragmento Sim Positivo -1,73
PACFS47 Caule Fragmento Sim Positivo -4,16
PACFS48 Caule Fragmento Sim Positivo 5,88
PACFS49 Caule Fragmento Sim Positivo -2,89
PACFS52 Caule Fragmento Sim Positivo -4,18
PACFS61 Caule Fragmento Sim Positivo 6,62
PAFFS9 Folha Fragmento Sim Positivo 4,72
PAFFS42 Folha Fragmento Sim Positivo 1,2
PAFFS44 Folha Fragmento Sim Positivo 2,67
PAFFS73 Folha Fragmento Sim Positivo -6,54
PAFFN16 Folha Fragmento Não Positivo -3,36
PAFFN39 Folha Fragmento Não Positivo 4,04
PAFFN71 Folha Fragmento Não Positivo 4,8
PAFMS13 Folha Macerado Sim Positivo 1,8
PAFMN31 Folha Macerado Não Positivo -3,93
PAFFN59 Folha Fragmento Não Negativo 140,98
O caldo metabólito referente ao grupo 59 foi o único que apresentou atividade
estimulatória de crescimento do
M. tuberculosis
, com taxa de 141%. Conforme o previsto
para a determinação de taxa de crescimento (
≥
110%), o fato significa que ocorreu uma
ampliação de crescimento em 31% do que era esperado sem a ação do caldo metabólito.
Obteve-se assim, apenas uma cepa com premissa de ser produtora de metabólitos com
capacidade de estimular o crescimento do
M. tuberculosis
.
Apesar da enorme importância do referido resultado, não se realizou os testes
complementares para verificar se a ampliação de crescimento deu-se apenas na indução de
multiplicação das Unidades Formadoras de Colônia (UFC) ou se também diminuiu o tempo
49
de multiplicação bacilar, previsto entre 12 e 24 horas (KONEMAN et al., 1992). Se as
substâncias existentes no caldo metabólito tiverem significativa ação de diminuição no tempo
de multiplicação bacilar, os resultados encontrados são passiveis de imediata aplicabilidade
na rede básica de saúde, pois na prática, permitiria que o diagnóstico bacteriológico da
tuberculose fosse mais rapidamente ofertado aos pacientes. Atualmente pelos métodos
clássicos o diagnóstico requer de três a oito semanas, tempo esse necessário para se visualizar
colônias em meio de cultivo Löwenstein-Jensen ou Middlebrook agar.
O ensaio espectrofotométrico idealizado por Carvalho (2005), confirmou os resultados
de antagonismo obtidos pela técnica do MABA, pois todos os 15 caldos metabólitos tiverem
valores inferiores a 10% de crescimento na técnica espectrofotométrica.
Como 11 dos caldos metabólitos com atividade antagônica eram oriundo de cepas
fúngicas que se desenvolveram em meios de cultivo com sumo vegetal (grupos 9, 13, 29, 42,
44, 47, 48, 49, 52, 61 e 73) novos bioensaios pela técnica do MABA e por
espectrofotométrica foram realizados com caldos obtidos do crescimento das cepas sem o
acréscimo dos sumos vegetais. A intenção foi a de se verificar o pressuposto anteriormente de
que os constituintes químicos dos extratos de
P. aduncum
seriam fontes nutricionais usadas
pelos fungos endofíticos na síntese dos metabólitos com capacidade antagônica. Dos 11
caldos analisados, 5 não mais apresentaram atividade antagônica.
O resultado é fortemente indicativo de que as substâncias antagônicas produzidas por
algumas cepas fúngicas são dependentes dos constituintes fitoquímicos de
Piper aduncum
,
enquanto outros não necessitam desses compostos para a síntese das mesmas. O fato induz
indicar que na continuidade da pesquisa realizada, deve-se dar preferência ao estudo dos
endofíticos que independem da planta para produzirem moléculas com atividade antagônica
ao
M. tuberculosis
. A obtenção de bioativos antagônicos que independem do vegetal torna-se
menos agressiva ao meio ambiente e mais econômica em seus possíveis usos pelas indústrias
farmacêuticas.
50
5. CONCLUSÕES
5.1 Dos extratos fitoquímicos de
Piper aduncum
L. analisados pela técnica do MABA
(Alamar Blue) nenhum forneceu resultados de antagonismo ao
Mycobacterium
tuberculosis
, indicando inexistência de substâncias com essa atividade ou presença em
quantidades inferiores as necessárias na detecção da ação;
5.2 De 83 grupos de fungos endofíticos isolados de
P. aduncum
, 15 têm indicação de serem
sintetizadores de metabólitos com atividade antagônica ao
M. tuberculosis
, sendo que 5
necessitam dos constituintes químicos da planta para a síntese dos bioativos;
5.3 A cepa de fungo endofítico de
Piper aduncum
L com indicação de atividade acelerado de
crescimento do
M. tuberculosis
representa um promissor produto biotecnológico nas
atividades bacteriológicas de diagnóstico da Tuberculose, podendo proporcionar uma
maior rapidez no diagnóstico da doença;
5.4 O ensaio espectrofotométrico, idealizado por Carvalho (2005), foi eficiente na detecção de
atividade antagônica ou aceleradora de crescimento micobacteriano, tornando-se
imprescindível em análises de triagem de substâncias com efeitos de estimulação de
crescimento micobacteriano.
51
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APÊNDICE 1 - Reagentes, Meios de cultivo e Equipamentos utilizados
Fonte: Carvalho (2005)
1. Reagentes Utilizados
1.1. Solução de Hipoclorito de Sódio 3%
Concentração da solução estoque: 12%
Colocar 25 mL da solução estoque (12%) em uma proveta e completar o volume para
100 mL com água destilada esterilizada.
1.2. Solução de Etanol 70%
Concentração de etanol utilizado: 92,8%.
Colocar 75,4 mL de etanol (92,8%) em uma proveta e completar o volume para 100
mL com destilada esterilizada.
1.3. Solução de Terramicina - 100µ
µµ
µg/mL
Preparar uma solução estoque na concentração de 50 mg/mL.
Dissolver, em câmara de fluxo laminar, uma cápsula de terramicina (500 mg) em 5 mL de
etanol 70% e acrescentar mais 5 mL de água destilada esterilizada. Armazenar em frasco
esterilizado coberto com papel laminado (para proteger da luz) sob refrigeração a 4
o
C .
Concentração utilizada: 100
µ
g/mL.
Utilizar 200
µ
L da solução estoque do antibiótico para cada 100 mL de meio de
cultivo. Acrescentar o antibiótico, de forma asséptica, em câmara de fluxo laminar, ao meio
quando este estiver ainda líquido a temperatura de aproximadamente 45
o
C.
1.4. Solução de Tween 80 a 0,04%
Em um tubo de ensaio estéril adicionar 2 µL de Tween 80 e 5 mL de água destilada
estéril (solução Tween 80 a 0,04%). Homogeneizar.
58
1.5. Solução de Albumina Bovina 0,2%
Adicionar 10 mg de albumina bovina a 5 mL de soro fisiológico 0,85% (solução de
Albumina bovina a 0,2%). Homogeneizar e ajustar o pH para 6.8 com hidróxido de sódio a
4%.
2. Composição e preparação dos Meios de cultivo utilizados
2.1. Meio de cultivo BDA (Batata-Dextrose-Ágar)
Cozinhar 200 g de batatas descascadas em 500 mL de água destilada e cozinhar
durante 1h. Filtrar o infuso através de gaze e completar o volume a 500 mL com água
destilada. Adicionar a dextrose, dissolver completamente e então adicionar o ágar. Completar
o volume a 1000 mL com água destilada. Autoclavar a 121
o
C durante 15 minutos.
2.2. Meio de cultivo Agar-Sabouraud
Dissolver o agar em 500 mL de água destilada. Adicionar dextrose e a peptona,
misturando-as bem. Adicionar 500 mL de água destilada. Autoclavar a 121
o
C durante 15
minutos.
Compentes
Infusão de batata 500 mL
Dextrose (D-glicose) 15 g
Ágar 15 g
Água destilada 500 mL
Componentes
Peptona 10 g
Dextrose (D-glicose) 40 g
Ágar 15 g
Água destilada 1000 mL
59
2.3. Meio de cultivo Extrato de Malte 2%
Dissolver o ágar e o extrato de malte em 1000 mL de água destilada. Autoclavar a 121
o
C durante 15 minutos.
2.4. Meio de cultivo Lowenstein-Jensen
Componentes
Fosfato Monopotássico 2,4 g
Sulfato de Magnésio 0,24 g
Citrato de Magnésio 0,6 g
Asparagina 3,6 g
Glicerol 12 mL
Água destilada 600 mL
Homogeneizado de ovos 1000 mL
Verde de Malaquita 2% 20 mL
Dissolver todos os componentes em 600 mL de água destilada e autoclavar á 121
o
C
durante 15 minutos. Adicionar a esta solução 30g de fécula de batata esterilizada e ferver à
100
o
C durante 30 minutos e depois manter a 56
o
C. Misturar a esta solução 1 litro de
homogeneizado de ovos e 20 mL de verde de malaquita à 2%. Distribuir o meio em tubos e
coagular a temperatura de 85
o
C por 40 minutos (David et al., 1989).
Componentes
Extrato de malte 10 g
Ágar 15 g
Água destilada 1000 mL
60
2.5. Caldo de cultivo Middlebrook 7H9GC (Difco)
Fórmula aproximada por 900 mL
Componentes
Sulfato de amônio 0,5 g
Ácido L-glutâmico 0,5 g
Citrato de sódio 0,1 g
Piridoxina 0,001 g
Biotina 0,0005 g
Fosfato dissódico 2,5 g
Fosfato monopotássico 1,0 g
Citrato de amônia férrico 0,04 g
Sulfato de magnésio 0,05 g
Cloreto de cálcio 0,0005 g
Sulfato de zinco 0,001 g
Sulfato de cobre 0,001 g
Dissolver 4,7 g do meio em 900 mL de água destilada contendo 2 mL de glicerol.
Autoclavar a 121
o
C por 15 minutos. Adicionar assepticamente 100 mL de solução de
enriquecimento OADC quando este estiver esfriado a temperatura de 45
o
C.
3. Equipamentos utilizados
Especificação Fabricante
GeneQuant
pro
RNA/DNA Calculator Amersham Pharmacia Biotech
UltraSonic Cleaner – USC 500 Unique
Evaporador Rotatório sob Pressão Reduzida Fisatom
Estufas BOD Mohetson Scientific
Espectrofotômetro Perkin – Elmer 5-52A
Microscópio Zeiss
Câmara de fluxo lâminar Veco
61
APÊNDICE 2 – Técnicas de conservação de fungos
Fonte: Carvalho (2005)
1. Conservação de Fungos Endofíticos Isolados
As técnicas de conservação foram executadas como sugere Smith e Onions, 1983 e
encontram-se descritas a seguir.
1.1. Armazenagem sob óleo mineral
A armazenagem em óleo mineral consistiu em cobrir por 1 cm de óleo mineral
esterilizado (parafina líquida) colônias fúngicas maduras e estocar estas em salas a
temperatura de 20
o
C.
1.2. Armazenagem em água destilada
A técnica em água, descrita por Castellani, consistiu em cortar blocos de
aproximadamente 6 mm de colônias fúngicas jovens e armazenar em frascos “tipo penicilina”
com água destilada esterilizada e fechados com tampa de borracha e selo de alumínio. Estes
frascos foram armazenados a temperatura de 20
o
C.
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