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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
Abordagens Múltiplas Sobre a Modulação Fenotípica em Pupas de
Heliconius erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)
Adriano Andrejew Ferreira
Tese submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Genética e Biologia Molecular
da UFRGS como requisito parcial para a
obtenção do grau Doutor em Ciências.
Orientador: Aldo Mellender de Araújo
Co-orientador: Luiz Carlos Kucharski
Porto Alegre, Novembro de 2007
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2
Este projeto de doutorado foi realizado nos Laboratórios de Genética Ecológica,
Drosophila e Biodiversidade e Evolução do Departamento de Genética do Instituto de
Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Este projeto teve o suporte financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) para o fomento da pesquisa, para a bolsa do doutorando e
para bolsa de iniciação científica para o aluno André Klein. A Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) contribuiu com uma bolsa de
iniciação científica para Pedro R. Vieira e posteriormente para Julie G. Zanin.
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3
Aos meus pais, pelo
incentivo e pela
força desde o
princípio.
4
Agradecimentos
Ao meu orientador e amigo, Aldo M. de Araújo, pela oportunidade de desenvolver
este trabalho; incentivo em continuar o caminho; compreensão, especialmente nas questões
familiares; exigências e desafios; e outras tantas coisas que aprendi nesta convivência.
À Renata pela força, auxílio e amor desde o nosso começo.
À Geórgia e Giovana, pela compreensão quando deveria estar presente e não
estava.
À minha família pelo apoio, sempre disponível; pelas suas características amáveis e
solidárias proporcionando uma base ideal.
Em especial aos meus pais: obrigado por sempre “permitir” e exigir, mesmo nas
situações mais adversas, que eu continuasse estudando.
Ao Professor Luis Carlos Kucharski pela participação na questão referente à
quantificação da melanização e também orientação sobre os aspectos fisiológicos que
fariam parte deste projeto. Estendo o agradecimento aos integrantes do laboratório ao qual
o Professor Luiz faz parte.
À Professora Elena Diehl pela identificação das formigas que foi feita pelo
Laboratório de Insetos Sociais da Universidade do Vale do Rio dos Sinos - UNISINOS.
Ao Elmo Cardoso, além do apoio sempre necessário, pela disponibilidade e pela
amizade (dá-lhe Inter), e à Ellen Mezzeck, sempre atenciosa e disponível para solucionar
problemas burocráticos.
Aos alunos de graduação que estiveram no Laboratório de Genética Ecológica e
que de alguma forma contribuíram com este projeto: Teo, Ana Luiza, Marina, Pítia,
Viviane, Gustavo, José, Ana, Vanise (ajudou muito, mesmo quando já estagiava em outro
laboratório), espero que não tenha esquecido ninguém. Caso sim, peço desculpa.
Aos alunos de iniciação que desempenharam um projeto paralelo ou vinculado ao
meu projeto, além de auxiliarem no cuidado com as borboletas e estágios imaturos: Ana
Kristina Silva, André Klein, Gabriela Pasqualim, Pedro Vieira e Julie Zanin.
5
A Daniela (Dani), minha amigona, pelos cafés, trocas de idéias, bate-papo,
apoio...mais uma que compreende a dupla jornada, às vezes até “tripla”.
Aos colegas Lucas Caetano, Luis Ernesto, Maurício Almerão e Nicolas Mega, pelas
trocas de idéias, ajudas e dicas.
Ao pessoal que fez parte do grupo de trabalho com lepidópteros: Léo, Gustavo,
Rejane, Mel, Paim, Luís Fernando, Daisy (in memoriam); com os quais certamente aprendi
alguma coisa, não somente sobre borboletas.
À Professora Vera Lúcia S. V. Gaiesky por acompanhar este projeto, além de ceder
espaço em seu laboratório.
A todo o pessoal do Laboratório de Drosophila (sem esquecer os mais “antigos”
que já seguiram outros caminhos) que sempre me auxiliaram quando necessitei.
À Rosane Nunes Garcia que me orientou, ensinou, ajudou... em fim, fez decolar o
projeto sobre metilação.
À Professora Helga Winge pelo empréstimo da casa de vegetação no início desta
pesquisa.
Ao Professor Josué Sant’Ana pelo auxílio com o projeto sobre vírus.
Ao Professor José Arthur pela câmara de Neubauer.
À Professora Sídia C. Jaques pelo auxílio e dicas na análise estatística.
À Silvia Richter pelas fotos dos géis e pupas.
Aos Professores que contribuíram para minha formação.
A minha chefia do Banrisul que compreendeu a importância do meu afastamento e
permitiu que este procedesse.
Ao Sport Club Internacional pelas conquistas de 2006 e 2007: Libertadores e
Mundial Interclubes e Recopa.
Ao CNPq, Capes e FAPERGS pelo financiamento deste projeto de pesquisa.
Às Heliconius erato phyllis.
6
SUMÁRIO
Resumo............................................................................................................................. 7
Abstract............................................................................................................................ 10
Capítulo 1 ........................................................................................................................ 13
Introdução Geral ......................................................................................................... 13
Objetivos .................................................................................................................... 18
Capítulo 2 ........................................................................................................................ 19
On the reliability of a simple method for scoring phenotypes to estimate
heritability: a case study with pupal colour in Heliconius erato phyllis,
Fabricius 1775 (Lepidoptera; Nymphalidae).
Capítulo 3 ........................................................................................................................ 35
Avaliação da Influência do Fotoperíodo Sobre a Cor da Pupa em Heliconius erato
phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)
Capítulo 4 ........................................................................................................................ 51
Estimativas sobre o risco de predação em pupas de Heliconius erato phyllis
(Lepidoptera; Nymphalidae).
Capítulo 5 ........................................................................................................................ 80
Descrição do Primeiro Caso de Metilação de DNA em Uma Borboleta: Heliconius
erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae).
Capítulo 6 ........................................................................................................................ 101
Discussão Geral .......................................................................................................... 101
Referências Bibliográficas ......................................................................................... 107
Anexo 1............................................................................................................................ 110
Seleção Para Fenótipos Extremos na Coloração da Pupa em Heliconius erato
phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae).
Anexo 2............................................................................................................................ 114
Análise da Influência do Vírus de Poliedrose Nuclear (VPN) na Melanização de
Pupas e Sobrevivência de Heliconius erato phyllis (Lepidoptera;
Nymphalidae).
Anexo 3............................................................................................................................ 118
Fenótipo Incomum em Heliconius erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae).
Anexo 4............................................................................................................................ 124
Pupal Melanization in Heliconius erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae):
Genetic and Environmetal Effects.
7
Resumo
A presente tese, através de quatro manuscritos, aborda aspectos variados sobre a
modulação fenotípica na cor da pupa em Heliconius erato phyllis.
O primeiro manuscrito compara e avalia dois métodos de categorização para a cor
da pupa através da estimativa da herdabilidade (h
2
). O primeiro deles, o método
qualitativo, considera quatro escores, variando de 2 até 5, em uma ordem crescente de
melanização. O segundo método, quantitativo, utiliza a densidade óptica. Após a captura,
as imagens foram analisadas por um software de onde foram obtidos os valores para o grau
de melanização de cada exúvia. A partir dos valores obtidos por cada metodologia
estimou-se a h
2
pelos métodos da regressão linear e da análise da variância, com o n
variando entre 7 e 18 proles. As estimativas da h
2
resultaram em valores semelhantes para
ambas às metodologias de categorização das pupas. Desta forma conclui-se que a
metodologia qualitativa, por sua praticidade, torna-se a mais indicada para a tarefa. A partir
dos baixos valores de h
2
, discute-se o por quê destes resultados. A primeira hipótese
considera o tamanho amostral e a segunda a prioridade na alocação de recurso.
O segundo manuscrito avalia a influência do fotoperíodo na cor da pupa em H.
erato phyllis. Três proles tiveram seus ovos distribuídos entre cinco fotoperíodos:
11L:13E, 12L:12E, 14L:10E, 9L:15E e 24L:00E. Os três primeiros representam fotofases
para Porto Alegre (RS - Brasil). A última fotofase indicada é utilizada pelo nosso grupo
como tratamento padrão e foi considerado um controle. Os resultados encontrados, através
da ANOVA bifatorial indicam uma diferença entre as proles (p = 0,069) e não indicam
diferença entre os tratamentos. Uma segunda análise foi feita através da ANOVA
unifatorial considerando apenas a cor da pupa como dependente dos fotoperíodos. O
8
resultado indicou uma dependência entre os fatores (p = 0,047). Uma terceira análise foi
feita a fim de verificar se a diferença observada devia-se aos tratamentos ou fatores
genéticos. Para isto comparou-se o tratamento 24L:00E das três proles com um conjunto de
22 proles criadas sob este mesmo fotoperíodo. O resultado aponta para uma diferença
genética, concluindo que a cor da pupa em H. erato phyllis não é afetada pelo fotoperíodo.
A adaptação de pupas em campo é o tema do terceiro manuscrito. Duas localidades
foram utilizadas como área de estudo: Estação de Fitotecnia de Águas Belas (ABE) e
Instituto de Pesquisas Hidráulicas (IPH). Cem pupas foram colocadas em cada localidade;
50 próximas ao solo e 50 acima de um metro. Dentro de cada nível de altura foram
formados 25 pares, sendo 25 camufladas e 25 não-camufladas. Entre as 50 pupas de cada
nível havia 25 pupas claras e 25 pupas escuras. Os resultados encontrados indicam uma
relação direta da sobrevivência com o nível de altura em que as pupas foram inseridas. A
camuflagem e a cor não se mostraram significantes para a sobrevivência da pupa em
campo. Pupas implantadas próximo ao solo têm uma chance entre 8 e 13 vezes maior de
serem predadas do que pupas acima de 1,0 metro de altura. Estes resultados foram
vinculados ao tipo de predador observado em campo: formigas. Duas espécies e um gênero
de formigas foram observados predando pupas. Conclui-se que, para pupas próximas ao
solo, a camuflagem conferida pela cor não é adaptativa, visto que os principais predadores
não dependem da visão.
O último artigo trata da descrição do primeiro caso de metilação em uma borboleta:
H. erato phyllis. Estudos prévios mostraram que as estimativas da herdabilidade para a cor
da pupa nesta espécie, determinadas pelo método da regressão linear, apresentavam valores
muito diferentes conforme fossem considerados machos e suas proles ou fêmeas e suas
proles. Uma causa possível para esta discrepância poderia ser devido à ocorrência de
9
metilação do DNA e possível silenciamento dos genes. Através das técnicas MSRE e PCR
bissulfito com primers aleatórios investigamos a presença de metilação em H. erato
phyllis. A análise, utilizando DNA de diferentes fases do desenvolvimento, mostrou que a
técnica de PCR bissulfito foi particularmente eficiente para indicar a presença de metilação
no DNA desta espécie. Isto abre a possibilidade de investigações futuras direcionadas para
avaliar se este fenômeno tem relação com a determinação dos padrões diferenciais de
coloração das pupas em H. erato phyllis.
Por fim esta tese apresenta três anexos. O primeiro trata de um processo de seleção
para fenótipos extremos para a cor da pupa em H. erato phyllis. Resultados preliminares
apontam que o processo é exitoso, porém lento, visto que a variância para a característica
permaneciam relativamente alta quando o processo foi interrompido. O segundo anexo
aborda o efeito do vírus de poliedrose nuclear na coloração das pupas desta espécie. A
hipótese surgiu após o aparecimento de pupas escuras no processo de seleção para pupas
claras quando este fenótipo já não era mais esperado. Assim investigou-se o efeito do vírus
sobre a cor da pupa bem como sobre a sobrevivência de lagartas de 4º e 5º instar. Os
resultados apontam que o vírus não influência a cor da pupa. Por outro lado, há uma
relação direta entre sobrevivência e indivíduos não infectados. O terceiro anexo descreve
um fenótipo incomum para H. erato phyllis, onde os adultos não apresentavam pigmentos
vermelho e amarelo, deixando o imago com um padrão preto e branco ao invés de preto e
vermelho.
10
Abstract
This thesis, through four manuscripts, covers various aspects on the phenotypic
modulation in the pupal color of the in Heliconius erato phyllis.
The first manuscript evaluate by heritability (h
2
) estimative two methods to
measure the degree of melanization of pupal exuviae. The first of them, the qualitative
method, considers four scores, ranging from 2 to 5, in an ascending order of melanization.
The second method, quantitative, uses the optical density. After the capture, the images
were analyzed by software from which were obtained values for the degree of melanization
of each exuviae. From the values obtained for each methodology the h
2
were estimated by
the methods of linear regression and analysis of variance, with n ranging between 7 and 18
broods. Estimates of the h
2
resulted in similar values for both methods of pupal
categorization. Thus it is concluded that the qualitative methodology, for its usefulness, it
is the most suitable for the task. From the low values of h
2
, we have two hypotheses. The
first considers the sample size and the second the allocation priority resource.
The second manuscript evaluates the influence of photoperiod on the pupal colour
of H. erato Phyllis. Three broods had their eggs distributed between five photoperiods:
11L:13E, 12L:12E, 14L:10E, 9L:15E and 24L:00E. The first three represent photoperiod
to Porto Alegre (RS-Brazil). The last indicated photoperiod is used as standard treatment
by our group and was considered a control. The results found through the ANOVA two-
factors to indicate a difference between the broods (p = 0,069) and do not indicate the
difference between treatments. A second analysis was done by ANOVA one-factor
considering only the pupal colour as a dependent on photoperiod. The results show a
dependency among the factors (p = 0,047). A third analysis was performed to determine if
11
the difference observed was due to the treatments or because of the genetic factors. To do
this, a comparison at the treatment 24L:00E between the three broods with a set of 22
broods, reared under the same photoperiod, was performed. The result points to a genetic
difference, concluding that the pupal colour of the in H. erato phyllis is not affected by
photoperiod.
The adaptation of pupas in field is the subject of the third manuscript. Two
locations were used as the study area: Estação de Fitotecnia de Águas Belas (ABE) and
Instituto de Pesquisas Hidráulicas (IPH). One hundred pupas were placed in each locality;
50 next to the ground and 50 above one meter. Each level of height were made by 25 pairs
(25 cryptic and 25 non-cryptic). Among the 50 pupas of each level 25 pupae were light and
25 were dark. The results indicate dependence between survival and the level of when the
pupas were placed. The camouflage and the colour not shown to be significant to the
survival of the pupa in the field. Pupae placed near the ground have a chance between 8
and 13 times larger to be preyed than pupae over 1.0 meter tall. These results were linked
to the type of predator observed in the field: ants. Two species and one genus of ants were
observed preying pupae. Thus it is concluded that for pupae close to the ground, the
camouflage provided by the colour is not adaptive, as the main predators not depend on the
vision.
The last article deals with the description of the first case of methylation in a
butterfly: H. erato phyllis. Previous studies have shown that the estimates of heritability for
the pupal colour in this species, determined by the method of linear regression, had
different values when were considered male and their broods and female and their broods.
One possible cause for this discrepancy could be due to the occurrence of DNA
methylation and the possible silencing of genes. Through technical of MSRE and random
12
primers PCR bisulfite we investigate the presence of methylation in H. erato phyllis. The
analysis, using DNA from different stages of development, showed that the technique of
PCR bisulfite was particularly efficient to indicate the presence of DNA methylation in this
species. This opens the possibility of future research directed to assess whether this
phenomenon has connection with the determination of differential colour patterns of the H.
erato phyllis pupae.
Finally this thesis has three appendices. The first is a process of selection for
extreme phenotypes for the colour of the pupa in H. erato phyllis. Preliminary results
indicate that the procedure is successful, however slow, as the variance for the feature
remained relatively high when the process was interrupted. The second appendix
addresses the effect of nuclear polyhedrosis virus on the pupal colour of this species. The
event came after the emergence of dark pupae in the selection process for light pupae,
when this phenotype was not more expected. So were investigated the effect of the virus on
the pupal colour and on the survival of caterpillars, 4 th and 5 th instars. The results
indicate that the virus does not influence the pupal colour. Moreover, there is a direct
relationship between survival and individuals not infected. The third appendices describes
an unusual phenotype to H. erato phyllis, where the adults had not red and yellow
pigments, leaving the imago with a pattern black and white instead of black and red.
13
CAPÍTULO 1
Introdução Geral
Os insetos holometábolos apresentam em seu ciclo vital o estágio de pupa. Este
estágio, onde ocorre à metamorfose da larva para adulto, é associado à imobilidade, a qual
pode representar ao indivíduo um risco para sua sobrevivência. Portanto, são esperadas,
para as pupas, características que confiram ao indivíduo uma maior chance de
sobreviverem a este estágio. Na ordem Lepidoptera, em muitas espécies, a cor da pupa é
considerada um fenótipo plástico que se ajusta ao fundo no qual esta está inserida (ver
revisão de Hazel - 1995 - para Papilionidae; Angersbach & Kayser, 1971 e Smith, 1980
como exemplo em Pieridae; Starnecker, 1996; Van Dick et al., 1998 e Ferreira et al., 2006
para exemplos em Nymphalidae).
A cor da pupa em Heliconius erato phyllis (Figura 1) apresenta uma variação
cromática, desde um padrão bem claro, designado como 2 ("branco"), até um padrão bem
escuro, categorizado como 5 ("preto"), com diferentes intermediários de coloração, até
agora divididos em duas categorias, 3 e 4 (Figura 2). Em relação a este fato surgiram três
questões: 1) Em que medida esta variação reflete diferenças genéticas? 2) Qual a influência
do ambiente na coloração destas pupas? 3) Existiria uma associação entre os diferentes
padrões de coloração e componentes do valor adaptativo? Respostas para as duas primeiras
questões foram propostas em meu projeto de Mestrado e publicadas em Ferreira et al.
(2006). A cor da pupa em H. erato phyllis pode ser considerada um caso de modulação
14
fenotípica (Smith-Gill, 1983) visto que o fenótipo varia continuamente de um padrão claro
até um escuro devido à interação entre o genótipo e o ambiente.
Figura 1: Adulto de Heliconius erato phyllis.
A modulação fenotípica proposta por Ferreira et al. (2006) para a cor da pupa em
H. erato phyllis esclareceu pontos importantes para este fenótipo. Porém, abriu novas
questões referentes a fatores genéticos e ambientais na determinação da cor da pupa desta
espécie. Desta forma, este trabalho propõe-se a esclarecer estas questões e mais aquela
referente a uma possível adaptação conferida pela modulação fenotípica da coloração da
pupa, quando em campo.
Figura 2: Exúvias e pupas de H. erato phyllis: a) exúvias de pupas em escores crescente de melanização; b)
exemplar de uma pupa clara (escore 2); c) exemplar de uma pupa escura (escore 5).
c
a b
15
A estimativa da herdabilidade (h
2
) para a cor da pupa em H. erato phyllis calculada
em Ferreira et al. (2006) utiliza escores qualitativos para determinar este fenótipo. Os
valores encontrados para h
2
não foram significantes em nenhuma das estimativas
apresentadas. Fora a discrepância encontrada, quando as estimativas da h
2
desta
característica, determinadas pelo método da regressão linear, apresentavam valores muito
diferentes conforme fossem considerados machos e suas proles ou fêmeas e suas proles,
levantamos a hipótese de que um método quantitativo para categorizar as pupas pudesse
fornecer informações detalhadas sobre a variação contínua deste fenótipo e assim melhorar
a estimativa da h
2
. Este tema é abordado no segundo capítulo desta tese através do artigo
“On the reliability of a simple method for scoring phenotypes to estimate heritability: a
case study with pupal colour in Heliconius erato phyllis, Fabricius 1775 (Lepidoptera;
Nymphalidae)”, que compara através dos resultados da estimativa da h
2
, dois métodos de
categorização para pupas, um qualitativo e outro quantitativo, concluindo que o igual
resultado fornecido pelos dois métodos estimula o uso do método quantitativo por ser mais
simples e de fácil aplicação.
Os fatores ambientais que atuam sobre a coloração das pupas em lepidópteros
podem ser os mais diversos, como por exemplo, os que foram examinados pelos trabalhos
de Smith em Papilionidae (1978) e Pieridae (1980), e Smith et al. (1988) em Danaus
chrysippus. A mudança na quantidade de horas de luz por dia é um importante fator que
indica mudança nas estações climáticas. A influência deste fator ambiental sobre a
coloração das pupas em H. erato phyllis foi investigada e os resultados estão apresentados
no 3º capítulo da tese. Com base nos resultados conclui-se que o fotoperíodo não afeta a
cor das pupas nesta espécie e atribui-se a causas genéticas as pequenas diferenças
encontradas.
16
A vantagem fornecida por um fenótipo plástico para a cor das pupas em
lepidópteros está diretamente ligada à camuflagem com o meio, a qual fornece, pelo ponto
de vista humano, uma chance maior de sobreviver, visto que a pupa não seria detectada por
possíveis predadores visuais. Esta situação foi investigada por diversos pesquisadores e os
resultados encontrados dependem do contexto em que a pupa foi considerada (Baker,
1970; Wiklund, 1975; Sims & Shapiro, 1983; Hazel et al., 1987 e Hazel et al., 1998). O
capítulo 4 apresenta o artigo “Estimativas sobre o risco de predação em pupas de
Heliconius erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)”. Os resultados indicam que pupas
próximas ao solo possuem um risco maior de serem predadas do que pupas acima de 1m de
altura. Estes dados estão relacionados com o principal predador observado: formigas, as
quais tornam a camuflagem da cor da pupa com o meio, ineficiente, principalmente
próximo ao solo.
Outra questão levantada pelo trabalho de Ferreira et al. (2006) refere-se à
estimativa da herdabilidade calculada para a cor da pupa. Esta característica, estimada pelo
método da regressão linear, diferiu quando eram levados em conta os escores paternos em
relação às médias das proles (valores positivos) daqueles quando se considerou os escores
maternos em relação às médias das proles (valores negativos). Afastando a possibilidade
de herança ligada ao sexo ou influenciada pelo sexo, surgiu a hipótese de que esta situação
estaria sendo afetada por fatores epigenéticos. Assim, como um primeiro passo na busca de
eventos epigenéticos no genoma de H. erato phyllis se iniciou a busca por citosinas
metiladas nesta espécie. O capítulo 5 desta tese, “Descrição do Primeiro Caso de Metilação
de DNA em Uma Borboleta: Heliconius erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)”,
investiga a presença de citosinas metiladas nesta borboleta, bem como compara o padrão
de metilação entre os diferentes estágios de desenvolvimento.
17
Além dos quatro artigos citados que fazem parte desta tese, são apresentados nos
anexos os resultados parciais de um objetivo inicialmente proposto e não concluído e a
breve descrição de dois trabalhos, que surgiram no decorrer deste projeto em virtude de
anomalias encontradas nos experimentos. O primeiro anexo trata de um processo de
seleção para fenótipos extremos para a cor da pupa em H. erato phyllis. O segundo anexo
relata um experimento desenvolvido para verificar uma anomalia surgida no processo de
seleção para fenótipos claros em um período de contaminação viral. O terceiro anexo
descreve um fenótipo anormal encontrado em alguns indivíduos adultos de H. erato phyllis
pertencentes a uma única irmandade; indivíduos com este fenótipo não possuíam os
pigmentos vermelho e amarelo, comum em indivíduos normais.
18
Objetivos
Esta tese tem como objetivo geral esclarecer aspectos relativos à modulação
fenotípica da cor da pupa em Heliconius erato phyllis.
Objetivos específicos
1. Quantificar o grau de melanização nas exúvias das pupas pelo método de
densitometria e repetição dos procedimentos estatísticos para estimar a
herdabilidade para a coloração da pupa em proles obtidas por Ferreira et al 2006.
2. Testar a influência do fotoperíodo sobre a coloração das pupas de Heliconius erato
phyllis.
3. Testar se a coloração da pupa de Heliconius erato phyllis é adaptativa em seu meio
natural.
4. Investigar a presença de metilação no genoma de Heliconius erato phyllis.
19
CAPÍTULO 2
On the reliability of a simple method for scoring phenotypes to estimate heritability:
a case study with pupal colour in Heliconius erato phyllis, Fabricius 1775
(Lepidoptera; Nymphalidae)
Submetido ao periódico Genetics and Molecular Biology
20
On the reliability of a simple method for scoring phenotypes to estimate heritability:
a case study with pupal colour in Heliconius erato phyllis, Fabricius 1775
(Lepidoptera; Nymphalidae)
Adriano Andrejew Ferreira
1
, Luiz Carlos Kucharski
2
and Aldo Mellender de Araújo
1
1. Departamento de Genética e Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brazil.
2. Departamento de Fisiologia e Programa de Pós-Graduação em Fisiologia, UFRGS,
Porto Alegre, RS, Brazil.
Corresponding author: A.M. Araújo, Departamento de Genética, Instituto de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. Phone: + 55-51-
33086717; Fax: +55-51-33087311. E-mail: aldom[email protected]
Key words: Adaptation against predation; Allocation-priority hypothesis; Butterfly;
Optical density; Pupal melanization; Qualitative and quantitative methods.
21
Abstract
In this paper two methods to measure the degree of melanization of pupal exuviae of the
butterfly Heliconius erato phyllis, Fabricius 1775 (Lepidoptera; Nymphalidae; Heliconiini)
are compared. In the first one, qualitative, the exuviae were categorised by scoring for
increasing melanization. In the second, quantitative, the exuviae were categorised by
optical density and posterior analysis by appropriate software. In order to evaluate both
methods we estimated the heritability (h
2
) of the degree of melanization by means of two
conventional methods: analysis of variance and regression. Results for h
2
were consistent
in both methodologies, showing no discrepancies. Since both methodology yield virtually
the same results, the qualitative method seems to be more useful, being reliable even for
field work. We also discuss another feature of heritabilities, which generally present low
values: one possibility is sample size (n ranging from 7 to 18 broods with their parents);
another, and much more interesting, hypothesis is related to the so-called allocation-
priority hypothesis, considering that pupal colour could have lower priority trait as
compared to morphology and appropriate development.
22
Introduction
Butterflies have been traditionally used to solve problems in ecological genetics
and evolution (Kapan, 2001; Ruszczyk et al., 2004; Kronforst et al., 2006; Mavárez et al.,
2006; Cardoso & Gilbert, 2007 – as a few examples of recent papers). In his well-known
and influential book, Ford (1975, p. 9) emphasized that “among many other forms, the
Lepidoptera have up to now been extensively used in ecological genetics. This is partly,
but by no means wholly, accidental. […] their wing-patterns do provide exceptional
opportunities for detecting phenotypic variation; and it will be noticed that, in general, they
possess a large number of the desirable qualities listed above.” Other qualities can be
added, such as the complex life-cycle, during which selection pressures may differentially
influence immature and adult forms (Benson, 1971; Mega & Araújo, in press). Another
well-explored aspect of development is the variation in pupal colour; butterflies can show
polymorphic variation with strong environmental influence (Smith, Shoesmith & Smith,
1988; Hazel, Ante & Stringfellow, 1998) or phenotypes with continuous variation
(Starnecker & Hazel, 1999).
We recently published a paper on pupal melanization in Heliconius erato phyllis,
Fabricius 1775 (Nymphalidae; Heliconiinae), and on the role played by genetic and
environmental factors in the expression of that phenotype (Ferreira, Garcia & Araújo,
2006). In that study, we analysed the results of 28 different broods, inbred and non-inbred,
which were submitted to treatments aimed at separating genetic and environmental
influences. Pupal phenotypes were scored, for convenience, in discrete units, with 2 as the
lightest colour and 5 as the darkest.
23
The present paper deals with that sample plus additional broods, which were scored
as described above. They were also measured according to a continuous scale based on
optical density. It is the purpose of this paper to compare both methodological procedures
to estimate the heritability of pupal colour in H. e. phyllis. We show that, despite the
simplicity of the method, which uses few scores based on visual inspection, heritability
estimates are as good as those obtained using a more sophisticated methodology.
Material and Methods
Heliconius erato is a Neotropical butterfly which shows a remarkable variety of
forms, local breeds, with different wing colours. Local breeds of H. erato, together with
those of Heliconius melpomene, are responsible for one of the most spectacular examples
of mimicry (Sheppard, Turner & Brown, 1985). The so-called “East Brazilian Breed”,
Heliconius erato phyllis has been the subject of many research studies in Brazil for more
than twenty years (Saalfeld & Araújo, 1981; Pansera & Araújo, 1983; Périco & Araújo,
1991; Silva & Araújo, 1994; Ramos & Freitas, 1999; Rodrigues & Moreira, 1999, just to
mention a few). Adults are easily adapted to living in insectaries, where all stages of the
life cycle can be observed and studied.
Rearing immature and adult forms of H. e. phyllis
All pre-adult development of Heliconius erato phyllis was carried out under
continuous light and at a temperature of 25ºC + 1ºC, in a translucent plastic pot (8.5 cm
height and 7.5 cm diameter) with white lid and bottom covered with white soft paper. Each
pot housed only one caterpillar, which was daily fed with Passiflora suberosa or P. misera.
24
Exuviae colour analysis
After adult emergence, each resultant pupal exuviae were compressed between a
translucent slide, and the extremities were fixed with a label that carried information on
rearing conditions, pupal degree of melanization, sex of the adult, and other particular
phenotypes. All slides with pupal exuviae were submitted to two methods of melanization
analysis: visual inspection (qualitative, hereafter), or measurement of optical density
(quantitative, hereafter).
In the second procedure, pupal exuviae were measured by optical density using
Imagemaster VDS, GE Healthcare equipment. This equipment was set to operate by
transmittance, with a yellow filter, aperture f/8, focus 2, and zoom 12. In order to correct
any deviations that could be produced by each measure taken, we created a grey scale,
which consisted of eight small rectangles coloured from 30 to 100% black, printed on a
slide. A total number of four slides with pupal exuviae, plus the slide with a grey scale,
were measured at each time. The area chosen in the exuvia corresponded to the butterfly
wing. The same slide with the grey scale was used for the measurement of all slides with
pupal exuviae. Images were stored and analysed using the software Image J 1.34 m
(Wayne Rasband - National Institutes of Health, USA) at a scale of 43.2 pixels/cm. The
tool polygon was used to draw the figure to be measured in the butterfly wing area; for
each exuvia, the software calculated the mean of all pixels of the polygon (pixel scale
ranged from 0, for black, to 255, for white). The mean value obtained was designated as
raw exuvia score (RES).
In order to correct for eventual deviations in image capture by VDS Imagemaster,
we chose the rectangle in the grey scale corresponding to 60% black. On this rectangle, the
tool polygon was again used to draw a figure equivalent to that in the exuviae to be
25
analysed by the software Image J 1.34m. The obtained value was designated control by
capture (CC). After all slides were measured (n = 648), the mean was estimated, which we
called mean of the controls (MC); by dividing CC by MC, correction ratio (CR) was
obtained. The RES/CR ratio for each measured exuvia was then calculated, and this new
ratio was used to estimate heritability.
Heritability of pupal colour
Heritability estimates (h
2
) were calculated by conventional regression and analysis
of variance methods for both, the qualitative and quantitative methods. Details followed in
the qualitative method, which were repeated in the quantitative one, can be found in
(Ferreira, Garcia, and Araújo, 2006). Sample sizes utilized in this work are a little different
from our previous paper, since we tried to balance the number of exuviae examined in the
two methods.
Results
Table 1 shows heritability estimates as calculated by the methods of regression and
analysis of variance for qualitative scoring of pupal colour. Heritability values were
virtually the same as those published by Ferreira, Garcia & Araújo (2006). Two comments
can be made about these results: firstly, irrespective the method used to estimate
heritability (regression or analysis of variance), h
2
value was low, statistically not different
from zero (there are two values near significance – see the footnote in Table 1). Secondly,
when female parent score value was taken as the independent variable in regression,
heritability estimates were lower than all other values (in Table 1, h
2
negative values). It
26
can be noted that the number of broods, when only mother score was considered, was
higher than that of male parent. This is due to the fact that, in some crosses, we were not
able to identify which male copulated with the female. However, as H. e. phyllis females
are monogamic, this did not influence heritability estimates. Heritabilities estimated by the
optical density method are shown in Table 2. Despite employing a continuous scale for
exuviae phenotypes, h
2
values were of the same order of magnitude as those obtained by
the qualitative method. Again, no values were statistically different from zero, although the
results for the male parent (second column, Table 2) were somewhat higher than the
corresponding values in the qualitative method. The results using the midparental value as
the independent variable in regression analysis were similar to those obtained by analysis
of variance, and h
2
values, when the female value is used as independent variable,
remained low and negative. Scatter diagrams showing midparental value relative to mean
sibship or male or female sibship values are presented in Figure 1.
Discussion
Following the traditional approach of ecological genetics, we observed that pupae
of the butterfly Heliconius erato phyllis indeed show variation in colour (from light to
dark), both in the field and in the insectary. Variation is the first condition for natural
selection; however, in order to evolve, phenotypes, such as like pupal colour, must be
inherited. This is why we estimated the heritability of this trait (the possible role of natural
selection is now being studied by our group). The results here reported, which compared
two methods for scoring pupal colour, showed that this trait has low heritability value. The
meaning of this finding in an evolutionary context is, in our opinion, as important as the
27
evaluation of the two methods employed for scoring pupal colour. The first method,
qualitative, based on a scale of increasing melanization from 2 to 5, was established after
visual inspection of the exuviae by two of the authors, simultaneously (AAF and AMA).
The other method, with a more demanding routine, was based on optical density, which
resulted in a continuous melanization scale. As we showed here, both methods yielded
almost equal heritability estimates. As it is easier to score pupal phenotypes by visual
inspection, which can be performed during field work, we propose that it is accepted as a
reliable method.
Due to the fact that pupal melanization in H. erato phyllis presented almost equal
heritability values using both methods, one question prevails: why a phenotype, which is
presumably related to survival, should have low heritability values? To make things more
difficult, our previous results (Ferreira et al., 2006) showed that pupal colour in that
species is strongly influenced by the environment. There are at least two reasons for such
findings: firstly, as Falconer (1989) has pointed out, in order to obtain significant
heritability estimates, a large number of parents and offspring (more than 100) is necessary
to achieve a small standard error when heritability estimates are calculated by offspring-
parent regression. Secondly, the failure to obtain a high heritability value depends on the
trait being measured. Glazier (2002) discussed a very interesting possibility, which he
called the allocation-priority hypothesis. Under this hypothesis, low priority traits in the
resource-allocation system are more affected by environmental variation, reducing their
heritabilities. A priority rule in the case of pupation is its appropriate development and
morphology, and secondarily, its colour. Colour, or in the case here studied, melanization
of the pupa, should be viewed as an improvement in the chances of survival in the presence
of visual predators. As a matter of fact, we tested the effects of different degrees of
28
melanization on the survival of pupae in nature. Our results strongly support the hypothesis
that colour is not an important variable in pupal mortality, as their main predators in the
studied area were ants (Ferreira and Araújo, in preparation). Glazier’s suggestion,
however, despite being extremely interesting, needs to be carefully tested under field and
laboratory conditions.
Acknowledgements – The authors are grateful to Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) for financial support, and thank the colleagues of the
Ecological Genetics group (Department of Genetics, UFRGS), for their assistance in
rearing the butterflies.
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31
Figure 1: Scatter diagrams of midparental value (abscissa) and mean sibship value, male
sibship value, female sibship value (ordinate). Left: results of qualitative method (a, b, and
c); right: results of the quantitative method (d, e, and f). Units of scale: qualitative method,
scores of melanization; quantitative method, corrected exuviae score by optical density.
See Material and Methods for details.
32
Qualitative
a)
Midparental Value
5,04,03,02,01,00,0
Sibship Mean
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
b)
Midparental Value
5,04,03,02,01,00,0
Male Sibship Mean
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
c)
Midparental Value
5,04,03,02,01,00,0
Female Sibship Mean
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
Quantitative
d)
Midparental Value
190170150130110907050
Sibship Mean
190
170
150
130
110
90
70
50
e)
Midparental Value
190170150130110907050
Male Sibship Mean
190
170
150
130
110
90
70
50
f)
Midparental Value
190170150130110907050
Female Sibship Mean
190
170
150
130
110
90
70
50
33
Table 1: Heritability estimates (h
2
+ s.e.) calculated by regression and analysis of variance
(ANOVA, inbred broods are not included) based on a qualitative melanization score . Total
number of broods used between parenthesis.
Regression (Parent x offspring)
Sibship
Midparental
value
Male parent Female parent
ANOVA
Mean
0.40 ± 0.21 (7) 0.44 ± 0.28 (7)
-0.11 ± 0.23 (12) 0.31 ± 0.11 (18)
Males
0.36 ± 0.15 (7)
1
0.43 ± 0.20 (7)
2
-0.20 ± 0.24 (12) 0.34 ± 0.13 (18)
Females
0.47 ± 0.32 (7) 0.49 ± 0.41 (7) -0.01 ± 0.26 (12) 0.32 ± 0.12 (18)
1
p = 0,064
2
p = 0,083
34
Table 2: Heritability estimates (h
2
+ s.e.) calculated by regression and analysis of variance
(inbred broods are not included) based on a continuous (quantitative) melanization scale .
Total number of broods used between parenthesis.
Regression (Parent x offspring).
Sibship
Midparental
value
Male parent Female parent
ANOVA
Mean
0.31 ± 0.25 (7) 0.61 ± 0.30 (7) -0.04 ± 0.20 (12) 0.30 ± 0.10 (18)
Males
0.30 ± 0.18 (7) 0.42 ± 0.27 (7) -0.03 ± 0.19 (12) 0.29 ± 0.12 (18)
Females
0.34 ± 0.36 (7) 0.84 ± 0.42 (7) -0.06 ± 0.27 (12) 0.32 ± 0.12 (18)
35
CAPÍTULO 3
Avaliação da Influência do Fotoperíodo Sobre a Cor da Pupa em Heliconius erato
phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)
Este manuscrito será submetido ao periódico Journal of the Lepidopterists’ Society
36
Avaliação da Influência do Fotoperíodo Sobre a Cor da Pupa em Heliconius erato
phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)
Adriano Andrejew Ferreira
e Aldo Mellender de Araújo
Departamento de Genética e Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
Palavras-chave: Borboleta, Cor da Pupa, Fotofase, Influência Ambiental
37
Resumo
Fatores ambientais afetando a cor da pupa em Lepidoptera é um tema bastante
investigado. A influência de ambientes claros e escuros no condicionamento da cor da
pupa na borboleta Heliconius erato phyllis foi investigada e confirmada em um outro
trabalho, executado pelos mesmos autores deste. O fotoperíodo, não investigado no
referido trabalho, é uma fonte de variação ambiental importante e comprovada para
algumas espécies de lepidópteros. Assim, o presente trabalho aborda a influência de
diferentes fotofases no condicionamento da cor da pupa em H. erato phyllis. A fim de
verificar este fator ambiental, três proles foram comparadas em relação aos efeitos de cinco
tratamentos. A análise do fotoperíodo por proles não indica influência deste sobre a cor da
pupa. Uma segunda análise considerando apenas a cor da pupa como dependente do
fotoperíodo, mostra uma diferença no limiar da significância. Este fato motivou uma
terceira análise a fim de verificar se as diferenças encontradas referiam-se as fotofases ou
se eram diferenças genéticas.
38
Introdução
Uma investigação anterior, sobre a influência de fatores ambientais no
condicionamento da cor das pupas em Heliconius erato phyllis, mostrou que lagartas de 5º
estádio, submetidas a ambientes claros ou escuros induziam a formação de pupas
respectivamente claras ou escuras (Ferreira et al., 2006). Todavia, uma outra possível
variável influente sobre a cor das pupas, não investigada no trabalho referido, poderia ser o
fotoperíodo. Autores como Smith (1978; 1980), Hazel & West, (1983) já trataram deste
tema. Smith encontrou para duas espécies de Pieridae (Pieris rapae e P. brassicae) e
Papilio polytes uma forte associação entre o fotoperíodo e a cor da pupa, sendo que P.
rapae forma pupas escuras em fotofases de inverno. Hazel & West (1983) avaliaram
quatro espécies de Papilionidae: P. polyxenes e P. troilus foram fortemente influenciados
pelo fotoperíodo de inverno formando pupas marrons. As outras duas espécies investigadas
não foram afetadas pelo fotoperíodo (Battus philenor e Eurytides marcellus).
Tendo em vista os resultados encontrados nos trabalhos referidos acima, decidiu-se
investigar esta questão no presente trabalho, partindo do princípio que a correta
interpretação de informações fornecidas pelo ambiente pode se constituir em uma
vantagem para a sobrevivência do organismo e que em outras espécies de Lepidoptera a
coloração da pupa é um fenótipo que pode responder as mudanças na quantidade de horas
de luz.
39
Material e Métodos
Fêmeas de Heliconius erato phyllis foram isoladas em insetário (2m x 2m x 3,5m)
para oviposição. Um primeiro procedimento foi adotado para análises dentro de uma prole,
no qual apenas uma fêmea ovipositava em um insetário. Um processo alternativo foi
utilizado com o intuito de tornar aleatória as diferenças genéticas em nossos resultados.
Para isto, várias fêmeas de H. erato phyllis, com um mínimo de 7 e no máximo de 15
indivíduos, permaneciam juntas em um mesmo insetário para oviposição. Este grupo de
fêmeas não permaneceu constante durante o tempo de experimento, sendo que novas
fêmeas fecundadas eram acrescidas ao grupo, enquanto que outras eram retiradas do local.
Os insetários foram supridos com as plantas hospedeiras preferências de H. erato
phyllis: Passiflora suberosa, P. misera e P. capsularis (Périco & Araújo, 1991). Os adultos
foram alimentados diariamente com uma mistura de água, mel e pólen. Os ovos foram
coletados diariamente e acondicionados individualmente em potes plásticos, translúcidos,
com a tampa branca (8,5 cm de altura por 7,5 cm de diâmetro). O fundo do pote foi coberto
por um papel absorvente branco, para retenção de umidade. As lagartas foram alimentadas
diariamente com P. suberosa e mantidas a 25°C.
As pupas da borboleta H. erato phyllis foram categorizadas de acordo com o
método descrito em Ferreira et al. (2006).
Para analisar a influência do fotoperíodo nesta espécie, os ovos, logo após serem
acondicionados em seus potes plásticos, foram submetidos a diferentes tratamentos de
quantidades de horas de luz, permanecendo nesta situação até o adulto emergir. Cada prole
teve seus ovos distribuídos por todos os tratamentos. Os seguintes tratamentos de
fotoperíodos foram utilizados: 14L:10E, 12L:12E, 11L:13E, 9L:15E e 24L:00E. Os três
40
primeiros foram escolhidos por simularem durações de horas de luz em Porto Alegre
(Estado do Rio Grande do Sul – Brasil), sendo que 12hs de luz representa o equinócio de
primavera e o equinócio de outono, e 14hs de luz representa o solstício de verão (Silveira,
2000). A utilização do fotoperíodo 9L:15E teve o objetivo de fornecer uma situação atípica
de luz para a espécie no Estado do Rio Grande do Sul. O tratamento 24L:00E é utilizado
por nosso grupo de pesquisa como padrão de horas de luz e foi utilizado como controle em
nossas análises.
A análise estatística dos dados foi feita através da análise da variância uni e
bifatorial, utilizando o teste de Tukey como teste post hoc.
Resultados
A influência do fotoperíodo sobre a coloração da pupa em H. erato phyllis foi
testada a partir da análise de duas irmandades (prole 1 e 2) e uma prole que se constituiu a
partir da oviposição de várias fêmeas (prole 3), sendo as três proles submetidas aos cinco
tratamentos de fotoperíodo. A distribuição dos escores por tratamento e por prole está na
tabela 1. A análise da variância bifatorial (Tabela 2) não indica uma diferença significante
para as proles, embora esteja no limiar da significância (p = 0,069). Os tratamentos
também não mostram diferença entre si sobre o efeito na cor da pupa (p = 0,280), assim
como também não foi significante a interação entre prole e tratamento (p = 0,233).
A fim de analisar apenas a dependência da cor da pupa unicamente em relação aos
fotoperíodos, efetuou-se uma análise da variância unifatorial (Tabela 3). O resultado obtido
(n = 346 exúvias) entre os tratamentos, mostra uma diferença significante (p = 0,047) entre
os fotoperíodos. O teste de Tukey aponta uma única diferença, no limiar da significância,
41
entre os fotoperíodos 12L:12E e 14L:10E (p = 0,059). A distribuição dos escores por
tratamentos e por proles é mostrada na figura 1.
A fim de verificar se o valor, no limiar da significância, obtido pela análise da
variância unifatorial realmente reflete uma diferença entre os fotoperíodos, ou se este se
deve a diferenças genéticas comparamos as três proles, porém, destas somente as pupas
que se formaram sob o tratamento 24L:00E, com um conjunto de 22 proles (a partir de
agora denominado de conjunto) que haviam sido criadas sob o mesmo fotoperíodo e que
tal como a prole 3, também representa a oviposição de várias fêmeas. A comparação entre
as três proles, mais o conjunto foi feita através da análise da variância unifatorial (Tabela
4). O resultado obtido mostra uma diferença significante (p = 0,001). O teste de Tukey
indica que o conjunto difere das proles 1 e 2 e não difere da prole 3 (p = 0,013; 0,020 e
0,503; respectivamente). A figura 2 mostra a distribuição dos escores para esta
comparação.
Discussão
Os tratamentos de fotoperíodos analisados neste trabalho indicam que estes não
afetam a coloração da pupa em H. erato phyllis. Os resultados obtidos pela análise da
variância bifatorial (Tabela 2), que compara a cor da pupa dentro das proles e dentro de
cada fotoperíodo, mostraram que os efeitos dos tratamentos não influenciaram na
determinação da cor da pupa.
A diferença entre os tratamentos apontados pela análise da variância unifatorial,
quando examinado pelo teste de Tukey mostra uma diferença, próxima a significância,
entre os fotoperíodos 12L:12E e 14L:10E. Visto que esta foi à única diferença entre os
42
tratamentos, uma segunda análise da variância unifatorial foi feita, porém considerando
apenas o tratamento controle (24L:00E) das três proles e incluindo um conjunto de outras
22 proles, também criadas sob este último tratamento. Os resultados mostrados na figura 2
evidenciam dois agrupamentos (um deles formados pelas proles 1 e 2 e o outro, pelas
proles 3 e “conjunto”) que diferem nas médias dos escores. Caso fosse o fotoperíodo um
determinante ambiental da cor da pupa, como o que ocorre em algumas espécies das
famílias Pieridae, Papilionidae e Lycaenidae (Smith, 1978; Smith, 1980; Hazel & West,
1983; Usui et al., 2004), seria esperado que esta diferença não se manifestasse ou fosse
reduzida. O conjunto de 22 proles, baseado nas diversas origens de suas fêmeas
fundadoras, pode ser comparado a prole 3 no que se refere a variabilidade genética, pois
ambos representam as características genotípicas de diversas irmandades. Diferentemente,
as proles 1 e 2, representam, cada uma, as características genotípicas de um casal. Desta
forma, é plausível concluir, que as diferenças observadas, podem ser consideradas como
genéticas e não devido à influência do fotoperíodo.
A mudança na quantidade de horas de luz está associada a mudanças de estações
climáticas, as quais, além da quantidade de luz, também trazem mudanças de temperatura.
A interação entre fotoperíodo e temperatura não foi testada por nós devido aos resultados
fornecidos por um teste piloto, onde metade de uma irmandade foi submetida ao
tratamento controle enquanto que a outra metade foi submetida a um fotoperíodo de
inverno (em torno de 11hs de luz) e temperatura de inverno (média de 16°C). As médias
para a cor da pupa foram 3,90 ± 0,55 (controle) e 3,88 ± 0,49 (condições de inverno). Esta
situação contrasta com os efeitos observados em Lycaena phlaeas daimio que aumenta a
freqüência de pupas escuras conforme diminui a temperatura e sob efeito do fotoperíodo
10L:14E (Usui et al., 2004). Hazel (2002) considerou como polifenismo, o efeito das
43
condições de luz e temperatura de outono, modificando o fenótipo de claro para escuro em
lagartas de Papilio polyxenes. Porém, a falta de influência do fotoperíodo na cor das pupas
em H. erato phyllis, é compartilhada por outras espécies, como por exemplo, Battus
philenor e Eurytides marcellus (Hazel & West, 1979; Hazel & West, 1983) que, assim
como H. erato phyllis, tem a cor de sua pupa influenciada principalmente pela cor de fundo
do local escolhido para fazer a muda para pupa (Hazel & West, 1979; Hazel & West, 1982;
West & Hazel, 1985; Ferreira et al., 2006). Possivelmente o fotoperíodo não é um fator
ambiental importante na determinação da cor da pupa nesta latitude devido às pequenas
diferenças entre as estações do ano.
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45
Tabela 1: Número de exúvias em cada escore para a cor da pupa divididos por prole em
cada tratamento de fotoperíodo.
Fotoperíodo Prole Escore para cor da pupa
2 3 4 5
9L:15E
1 0 15 4 0
2 3 17 2 0
3 1 20 6 0
Total
4 52 12 0
11L:13E
1 1 15 2 1
2 3 16 3 0
3 0 23 7 0
Total
4 54 12 1
12L:12E
1 0 19 1 0
2 0 21 0 1
3 0 29 0 0
Total
0 69 1 1
14L:10E
1 0 16 5 0
2 1 19 4 0
3 0 18 8 1
Total
1 53 17 1
24L:00E
1 0 17 1 0
2 0 19 3 0
3 1 16 9 2
Total
1 52 12 2
46
Tabela 2: Resultado da análise da variância bifatorial, para as proles 1, 2 e 3 considerando a cor da
pupa como variável dependente da prole e do fotoperíodo.
Causa da Variação SQ gl QM F p
Prole 2,097 2 1,048 3,808 0,069
Fotoperíodo 1,684 4 0,421 1,533 0,280
Interação (PxS) 2,203 8 0,275 1,318 0,233
47
Tabela 3: Resultado da análise da variância unifatorial, para as proles 1, 2 e 3 considerando
a cor da pupa como variável dependente do fotoperíodo.
SQ gl QM F p
Entre Tratamentos 2,098 4 0,525 2,437 0,047
Dentro dos Tratamentos 74,259 345 0,215
Total 76,357 349
48
Tabela 4: Resultado da análise da variância unifatorial, para o tratamento 24L:00E entre as proles
1, 2 , 3 e Conjunto considerando a cor da pupa como variável dependente das proles.
SQ gl QM F p
Entre Proles 12,509 3 4,170 6,262 0,001
Dentro das Proles 599,296 900 0,666
Total 611,804 903
49
Figura 1: Distribuição dos escores, em porcentagem, para a cor da pupa entre os
tratamentos de fotoperíodos dentro de cada prole.
a)
b)
c)
Prole 1
0%
20%
40%
60%
80%
100%
9 11121424
Fotoperíodo (Horas de Luz)
5
4
3
2
Prole 2
0%
20%
40%
60%
80%
100%
9 11121424
Fotoperíodo (Horas de Luz)
5
4
3
2
Prole 3
0%
20%
40%
60%
80%
100%
9 11121424
Fotoperíodo (Horas de Luz)
5
4
3
2
50
Figura 2: Distribuição dos escores, em porcentagem, para a cor da pupa para as proles 1, 2,
3 e conjunto submetidas ao tratamento fotoperíodo de 24L:00E.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Prol
e
1
P
role
2
P
r
ol
e
3
Conj
u
nt
o
5
4
3
2
51
CAPÍTULO 4
Estimativas sobre o risco de predação em pupas de Heliconius erato phyllis
(Lepidoptera; Nymphalidae)
Este manuscrito será submetido ao periódico Biotropica
52
Estimativas sobre o risco de predação em pupas de Heliconius erato phyllis
(Lepidoptera; Nymphalidae)
Adriano Andrejew Ferreira
e Aldo Mellender de Araújo
Departamento de Genética e Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
Palavras-chave: Adaptação, Cor da Pupa, Formigas, Modulação Fenotípica, Sobrevivência
53
Resumo
A sobrevivência dos estágios imaturos em Lepidoptera certamente está associada a
adaptações específicas para cada estágio. Assim a coloração da pupa resultando de uma
interação entre o genótipo e o ambiente representaria uma maior chance de sobrevivência.
A adaptação em campo, conferida pela camuflagem entre a cor da pupa e o fundo na qual
está inserida, até o presente momento, foi estudada principalmente nas famílias
Papilionidae e Pieridae. Neste trabalho avaliamos a sobrevivência de pupas em campo em
Heliconius erato phyllis (Nymphalidae) uma espécie Neotropical. As pupas que nesta
espécie apresentam uma variação de um padrão claro até um padrão escuro (preto), foram
implantadas em dois locais. Em cada local foram divididas em dois níveis diferentes de
altura. Em cada nível as pupas foram colocadas aos pares, sendo uma considerada críptica
e a outra não-críptica. Os fenótipos claro e escuro também foram avaliados em relação à
sobrevivência. Os resultados encontrados indicam uma relação direta da sobrevivência
com o nível de altura em que as pupas foram inseridas. A camuflagem e a cor não se
mostraram significantes para a sobrevivência da pupa em campo. Pupas implantadas
próximo ao solo têm uma chance entre 8 e 13 vezes maior de serem predadas do que pupas
acima de 1,0 metro de altura. Estes resultados foram vinculados ao tipo de predador
observado em campo: formigas. Três espécies foram observadas trabalhando na remoção
de pupas. Em um primeiro momento conclui-se que, para esta espécie de borboleta, a
vantagem para sobrevivência das pupas estaria relacionada à escolha de um local afastado
do solo, bem como o tempo de desenvolvimento e a densidade populacional.
54
Introdução
A sobrevivência dos estágios imaturos em Lepidoptera certamente está associada a
adaptações específicas para cada estágio. No estágio pupal onde a vulnerabilidade acentua-
se pela imobilidade, a camuflagem com o meio, através da cor, é considerada um
importante mecanismo de defesa (Hazel, 1995). A modificação da coloração conforme o
local em que se situa, apresentada por pupas de várias espécies de borboletas, resulta da
plasticidade fenotípica. A plasticidade fenotípica na coloração das pupas em Lepidoptera,
principalmente nas famílias Papilionidae, Pieridae e Nymphalidae vêm sendo estudada há
algumas décadas (Hidaka et al., 1959; Baker, 1970; Clarke & Sheppard, 1972; Hazel &
West, 1983; Starnecker, 1996; Ferreira et al., 2006; Jones et al., 2007), bem como sua
função adaptativa (Baker, 1970; Wiklund, 1975; Sims & Shapiro, 1983; Hazel et al., 1987
e Hazel et al., 1998). Estes últimos trabalhos citados, que avaliam a adaptação da pupa
através da sua coloração, em geral concluem que a plasticidade fornece proteção à crisálida
e por conseqüência aumenta as chances de sobrevivência do indivíduo para chegar ao
estágio de imago.
Heliconius erato phyllis, Cramer (Nymphalidae) é uma subespécie amplamente
estudada que habita principalmente o sul, sudeste e o leste do Brasil. A coloração da pupa,
nesta borboleta, apresenta uma variação contínua desde um padrão bem claro até um
padrão bem escuro (preto). Ferreira et al., 2006, mostraram que a herdabilidade do
fenótipo da cor da pupa, quando os pais e a prole são considerados, está em torno de 50 %
(este valor pode ser menor quando apenas a fêmea e sua prole são considerados); por outro
lado, estes autores mostraram que o grau de melanização das pupas é um caráter
fortemente influenciado pelo ambiente. Desta forma concluem que esta variação é o
55
resultado da interação entre o genótipo e o ambiente, conferindo, também, ao indivíduo um
caráter plástico para a coloração da pupa.
O presente trabalho avalia o impacto da predação sobre as pupas de H. erato
phyllis, em dois locais onde habitualmente ocorrem populações naturais desta borboleta. O
objetivo do trabalho foi investigar o papel de algumas variáveis, tais como o grau de
melanização das pupas, seu grau de camuflagem em relação ao ambiente circundante e da
distância de posicionamento da pupa em relação ao solo, quanto ao risco de predação.
Material e Métodos
As pupas utilizadas neste estudo eram provenientes de ovos coletados em insetário
(2m x 2m x 3,5m), utilizados para criação de H. erato phyllis. Em algumas ocasiões,
quando foi necessário incrementar a quantidade de pupas para os experimentos, fêmeas
foram coletadas na natureza, em locais próximos a Porto Alegre, capital do Estado do Rio
Grande do Sul, Brasil. Os experimentos foram realizados em dois verões consecutivos,
2005/2006 e 2006/2007.
Criação dos Animais
Os ovos foram coletados diariamente e acondicionados individualmente em potes
plásticos, translúcidos, com a tampa branca (8,5 cm de altura por 7,5 cm de diâmetro). O
fundo do pote foi coberto por um papel absorvente branco, para retenção de umidade. As
lagartas foram alimentadas diariamente com Passiflora suberosa e mantidas a 25°C com
luz permanente (24hs). Um tratamento alternativo foi utilizado com a intenção de
incrementar a quantidade de pupas escuras. No início do 5° ínstar as lagartas eram
56
transferidas para potes recobertos externamente por papel preto e cuja tampa era recoberta
em sua parte interna. Em ambos os tratamentos as lagartas empuparam dentro do pote.
Local de Estudo
Foram utilizadas duas áreas neste estudo, ambas localizadas na periferia de Porto
Alegre: a) Estação de Fitotecnia de Águas Belas - FEPAGRO - Viamão, RS -
30°02’17.18’’ S - 51°01’10.48’’ W (aqui designada como ABE). Neste local situa-se uma
mata de eucaliptos na qual há uma grande quantidade de P. suberosa e, também, uma mata
secundária, separada da primeira por uma pequena estrada, na qual também há P.
suberosa, porém em menor quantidade. b) Instituto de Pesquisas Hidráulicas (IPH) -
campus universitário da UFRGS - Porto Alegre, RS - 30°04’29.89’’ S - 51°07’00.70’’ W.
Neste local, um caminho, que contorna o instituto indicado acima, separa um resquício de
mata secundária e a cerca deste instituto, a qual possui vários arbustos na sua extensão. As
pupas foram implantadas neste caminho. A vegetação é secundária e contém pelo menos
cinco espécies de passifloráceas: P. suberosa, P. misera, P. caerulea, P. elegans e P. alata;
as duas primeiras espécies são hospedeiras preferenciais de H. erato phyllis (Périco e
Araújo, 1991). P. suberosa, por outro lado, está presente em abundância nas duas
localidades. A distância linear entre os dois locais de estudo é de cerca de 10 km.
Implantação das Pupas
A preparação para a implantação das pupas na natureza ocorreu em laboratório.
Após serem retiradas dos potes (com o cuidado de preservar a seda de fixação, presente
junto ao cremaster) foram sexadas e categorizadas em relação à cor (a partir de uma escala
crescente de melanização, descrita em Ferreira et al., 2006, separou-se dois grupos, pupas
57
claras e pupas escuras). Uma linha foi amarrada na seda para a posterior fixação no
substrato.
Um total de 200 pupas foi implantado na natureza, 100 em Águas Belas (ABE) e
100 no Instituto de Pesquisas Hidráulicas (IPH). Dentro de cada local as 100 pupas foram
divididas em dois níveis de altura: Altura 1 (A1) - pupas próximas ao solo, até 30 cm e,
Altura 2 (A2) - pupas posicionadas entre 1 e 1,70m. Para cada nível de altura, foram
posicionadas 50 pupas. Em cada nível as 50 pupas foram implantadas aos pares, sendo uma
camuflada (críptica) e outra não-camuflada (conspícua) em relação ao local de implantação
(Figura 1). A distância entre os pares foi aleatória (no mínimo 1m), porém sempre maior
que a distância dentro de um par, a qual variou entre 10 e 50 cm. Em cada conjunto de 50
pupas em cada nível, 25 eram de fenótipo escuro e 25 de fenótipo claro. A distribuição dos
fenótipos deu-se de forma independente da distribuição camufladas/não-camufladas, isto é,
o número de pupas escuras camufladas não foi necessáriamente igual ao número de pupas
claras camufladas. Desta forma, com o desenho experimental acima descrito, foi testada a
intensidade da predação por nível de altura e, em cada nível, o efeito de estar ou não
camuflada e finalmente, o efeito dos fenótipos claro e escuro.
Após a fixação de cada pupa, o local era marcado. Uma hora após o término da
implantação das pupas seguia-se a primeira vistoria. A partir deste momento, nos dias
subseqüentes, duas inspeções eram feitas, uma no início da manhã (8 h) e outra ao final da
tarde (18 h). As ocorrências entre 8 e 18 horas foram consideradas como “predação
diurna”, enquanto que aquelas entre as 18 e às 8 horas da manhã seguinte como “predação
noturna”. As inspeções foram diárias e seguiram até que a última pupa fosse predada ou
dela emergisse um adulto.
58
Uma vez implantadas na natureza, as pupas tiveram seu destino categorizado entre
“predadas” e “não-predadas”. Dentro destas categorias foram feitas subdivisões, as quais
estão listadas na Tabela 1. Todos os resíduos das pupas predadas foram coletados e
conservados em álcool 70% para exame posterior.
Testes Estatísticos
A análise dos dados obtidos em campo foi feita através da hipótese de
independência mútua entre as variáveis através de uma tabela de contingência
tridimensional, onde a freqüência esperada calculada é comparada com a freqüência
observada por meio do teste estatístico χ
2
conforme Everitt (1977). Testou-se a relação da
predação com a camuflagem e a altura, a relação da predação com o fenótipo e a altura e, a
relação da predação com o fenótipo e a camuflagem.
Resultados
A tabela 1 apresenta um resumo da situação final dos testes ocorridos em campo.
Para as pupas não predadas considerou-se dois desfechos: a) a emergência do adulto ou b)
morte não relacionada a predadores. Esta última possibilidade refere-se às pupas que
morreram por causas desconhecidas e permaneceram no local de implantação. Para as
pupas predadas foram considerados três desfechos a partir da constatação da ausência, ou
dano na pupa.
A tabela 1 mostra que das 50 pupas implantadas na altura 1 em ABE 26% não
foram predadas (13/50), enquanto que para o IPH, nesta mesma altura, o valor foi de 41%
(21/50). Para a altura 2 os valores correspondentes foram significantemente menores,
59
sendo em ABE 82% das pupas (41/50) não predadas com um valor semelhante sendo
encontrado para o IPH, 86% (43/50). Por outro lado, de um modo geral, Águas Belas
apresentou valores maiores de predação para os dois níveis de altura: 74% das pupas
colocadas na natureza para altura 1 e 18% para altura 2, contra 58% (A1) e 14% (A2) para
as pupas distribuídas no IPH (Figura 2).
Entre os indivíduos predados o fato mais freqüente foi a remoção total ou quase
total da pupa (item 2a, Tabela 1): 91% (42/46) das ocorrências em ABE e 89% (32/36) no
IPH, sendo em ambos locais a maioria ocorrida próximo ao solo (A1). Dentre estas, em
apenas dois casos houve a remoção parcial da pupa (item 2b, Tabela 1), sendo o restante
removido em sua totalidade. A ocorrência de predação em torno de 1 metro de altura (A2)
foram menos freqüentes, porém apresentam uma nova categoria de predação: pupas com
furo ou buraco (Figura 3). Entre as pupas que foram removidas parcialmente (Tabela 1, 2b;
Figura 4) três delas não estavam camufladas enquanto as outras duas foram consideradas
camufladas.
Os resultados encontrados para as duas localidades, ABE e IPH, indicam que a
predação independe da camuflagem, mas está diretamente relacionada com o nível de
altura em que a pupa foi colocada (Tabelas 2 e 3). Sempre que a comparação Predação x
Camuflagem foi feita, os resultados quanto ao teste do qui-quadrado mostraram-se não
significativos. Resultado semelhante foi obtido quando a análise da predação envolveu os
fenótipos claro/escuro e o nível de altura (Tabelas 4 e 5). A predação da pupa não está
relacionada com a sua cor, mas sim com o nível de altura no qual ela foi inserida. Uma
análise complementar foi feita, comparando-se fenótipo e camuflagem com relação à
predação, mantendo-se a altura constante, isto é, analisando-se os resultados para cada
altura em particular onde as pupas foram posicionadas. Para ABE, altura 1: χ
2
= 1,14; 0,80
60
< p < 0,90; e altura 2: χ
2
= 4,23; 0,30 < p < 0,50. Para o IPH, altura 1: χ
2
= 6,44; 0,10 < p <
,20; e altura 2: χ
2
= 5,82; 0,20 < p < 0,30 (Para todos valores gl = 4). Nenhuma das
comparações resultou significante, confirmando os resultados anteriores e indicando que a
predação independe do fenótipo e da camuflagem.
Uma vez que a altura de posicionamento das pupas mostrou-se altamente relevante
para a sobrevivência das mesmas, estimou-se o risco de predação, sob a forma de odds
ratio (OR) para cada um dos níveis de altura de implantação das pupas, nos dois locais. Em
ABE o risco de pupas próximas ao solo serem predadas foi 13 vezes maior que as pupas
implantadas entre 1 e 1,7m de altura (OR = 12,97; Intervalo de Confiança 95% : 4,53 –
38,46). No IPH este valor é menor, mas ainda expressivo: pupas próximas ao solo têm 8,5
vezes mais de chance de serem predadas do que pupas entre 1 e 1,7m de altura (OR = 8,48;
IC 95%: 2,92 – 25,56).
Com base nas observações diárias para cada local, curvas de sobrevivência foram
estabelecidas (Figura 2): tanto em um local como no outro, a atividade de predação mostra-
se mais intensa nas primeiras 24hs, especialmente no caso do nível A1 de altura (Figura 2
a); o nível de altura A2 não apresentou esta tendência (Figura 2 b). Uma comparação entre
as curvas, para cada altura de implantação das pupas, mostrou que elas são
significativamente diferentes (teste de Kolmogorov-Smirnov: D = 0,70 ; p < 0,01, para A1
e D = 0,40 ; p = 0,05, para A2.
As observações realizadas diariamente nas pupas implantadas, mostraram que as
formigas devem estar entre os principais predadores das mesmas. As figuras 5 e 6
correspondem a registros fotográficos de remoção ou tentativa de remoção das pupas
realizadas pela espécie Pachycondyla striata (Ponerinae), uma formiga de tamanho
61
avantajado, com cerca de 2/3 do tamanho da pupa. Outras espécies de formiga encontradas
removendo as pupas e/ou caminhando sobre as mesmas, estão indicadas na Tabela 6.
Outras observações, porém sem registro fotográfico, revelaram que mais duas
espécies de formigas removeram pupas: Odontomachus chelifer (Ponerinae), onde um
grupo de indivíduos efetuou a remoção completa e o transporte da pupa, provavelmente
para seu ninho. Por outro lado, Crematogaster sp.1 (Myrmicinae) também através de um
grupo de indivíduos, retirava pequenos pedaços da pupa até sua remoção quase completa,
permanecendo apenas o último segmento do abdômen. Os registros de predação para P.
striata e O. chelifer restringem-se a pupas próximas ao solo. Enquanto que para
Crematogaster sp.1, em mais de uma oportunidade foi observada a remoção, também,
entre 1 e 1,7m. Estas três espécies de formigas foram encontradas em ambos locais de
implantação das pupas. A presença de uma quarta espécie, Solenopsis sp., foi registrada em
fotografia (Figura 4), em uma pupa colocada na altura 2 em ABE. Porém, apenas dois
indivíduos foram vistos sobre esta pupa que foi considerada predada, apresentando
remoção parcial. Diferente dos casos citados anteriormente consideramos que esta espécie
de formiga não estava relacionada com a predação da pupa fotografada, devido ao baixo
número de indivíduos encontrados sobre e nas proximidades do local de implantação.
Discussão
Um fenótipo variável, tal como a coloração da pupa em lepidópteros, a qual pode se
tornar críptica em seu local de empupação, em princípio será considerado adaptativo.
Porém West-Eberhard (2003, p. 33) define que “plasticidade é a habilidade de um
organismo reagir a um estímulo ambiental interno ou externo através de uma mudança na
62
forma, estado, movimento ou taxa de atividade. Ela pode ser ou não adaptativa (uma
conseqüência de seleção prévia).” A coloração da pupa em Heliconius erato phyllis,
considerado um fenótipo com variação contínua, que responde a influência ambiental
(Ferreira et al., 2006), permitiu-nos testar a hipótese de adaptação ao meio. Contudo, os
resultados aqui apresentados sugerem que a camuflagem, tanto de pupas claras como das
escuras, não confere vantagem para a sobrevivência das pupas desta espécie. Resultados
semelhantes foram encontrados para alguns papilionídeos. Battus philenor, uma espécie
onde a pupa pode ser verde ou marrom, não mostrou uma diferença significante para
predação quando foram comparadas pupas crípticas com não-crípticas, conforme o tipo de
substrato escolhido para empupar (Sims & Shapiro, 1983). Para Papilio machaon Wiklund
(1975) encontrou que pupas crípticas, na geração de verão, têm maior sobrevivência que
pupas não-crípticas, porém esta diferença não foi significante. A mesma comparação feita
para a geração de inverno mostrou que a coloração críptica não confere vantagem para a
sobrevivência. Em Papilio polyxenes, os resultados indicaram que apenas pupas verdes em
locais com fundo verde, 40 cm acima do solo, têm uma sobrevivência diferencial devido à
sua camuflagem; outras combinações entre a cor da pupa e a cor do fundo não se
mostraram efetivas na proteção contra a predação (Hazel et al., 1998). Mesmo assim, os
autores dos trabalhos citados acima consideram o polimorfismo para a coloração da pupa,
nas respectivas espécies, como adaptativo.
No presente trabalho, constatou-se que o fator altura foi preponderante na
sobrevivência das pupas de H. erato phyllis: nas duas localidades testadas, onde a
ocorrência da espécie é comum, o fator “maior distância do solo” se mostrou vantajoso
uma vez que pupas próximas ao solo apresentaram um risco entre 8 e 13 vezes maior de
serem predadas. Este fato está diretamente relacionado com o principal predador de pupas
63
observado no presente trabalho, as formigas. As três espécies de formigas aqui referidas,
ao finalizarem seu trabalho deixam pouco ou nenhum vestígio da pupa. A falta de vestígios
foi relatada por West e Hazel (1982) com pupas de Battus philenor, porém a causa do
desaparecimento não foi discutida; e por White (1986) ao avaliar a mortalidade em campo
de pupas de Euphydryas editha bayensis. Em um período de estudo White encontrou a taxa
de 42% de desaparecimentos sem vestígios.
Porém, a possibilidade de formigas como predadoras de pupas não foi levantada
nestes dois trabalhos, assim como em outros que abordam a sobrevivência da pupa em
campo. Baker (1970) constata apenas predação por pássaros em pupas de Pieris rapae e P.
brassicae. Wiklund (1975) conclui que para pupas de Papilio machaon os únicos
predadores seriam pássaros e pequenos mamíferos. As pupas de Battus philenor também
foram testadas em campo por Sims & Shapiro (1983) onde os predadores não foram
determinados; os autores supõem a predação por pássaros e pequenos mamíferos baseados
nas pupas que foram encontradas danificadas. Hazel et al. (1987) e Hazel et al. (1998)
avaliam a sobrevivência, porém sem inferir sobre predadores.
A intensidade de predação verificada próxima ao solo nas primeiras 24 horas
(Figura 2 a) se ajusta à forma de forrageio de P. striata e O. chelifer que devido à alta
concentração de pupas no início do experimento teriam uma maior probabilidade de
encontrar suas presas. Crematogaster sp. 1 constrói seu ninho em árvores ou arbustos e,
geralmente, restringe-se a estes locais em busca de alimento; é possível, portanto, que
algumas das pupas tenham sido implantadas coincidentemente em locais onde havia tais
ninhos. Com base nos resultados do presente trabalho pode-se concluir que, na maioria dos
casos, onde não se encontram restos ou apenas o último segmento do abdômen as pupas
foram predadas por formigas. Nos outros casos apontados podemos apenas especular sobre
64
os predadores, visto o que pequeno número de ocorrências não permite uma avaliação mais
criteriosa. Destes, os ocorridos próximos ao solo poderiam ser efetuados por pequenos
mamíferos ou répteis e para os casos de predação ocorridas entre 1 e 1,7m esta poderia ser
feita por aves.
A diferença entre a intensidade de predação verificada nas duas áreas de estudo
(Figura 2) é de difícil explicação. É possível que ela esteja relacionada com a maior ação
antrópica verificada no IPH, um local atualmente não sujeito aos cuidados verificados em
ABE, o qual é um local para pesquisa e mostra-se relativamente mais preservado e
conseqüentemente reservado da ação antrópica. Outro fator de ordem macroecológica que
se mostrou diferente entre os dois locais, foi a maior intensidade de precipitação
pluviométrica no local ABE (informações compiladas a partir das observações de campo);
a relação entre este fato e a maior magnitude da predação neste local ainda é uma
incógnita.
Além da proteção pela altura, indicada pelos resultados deste trabalho, outros
fatores podem ser considerados como vantajosos para a sobrevivência da pupa. Um deles
seria o tempo de permanência no estágio de pupa (aproximadamente 8 dias a 25°C); quanto
menor o tempo de exposição menor será a probabilidade de predação. Ao contrário disso,
quanto maior a duração do período de pupa, maior o risco, tal como o registrado para
pupas da espécie Papilio polyxenes; ao permanecer neste estágio durante todo o inverno,
nenhuma sobreviveu nos experimentos de Hazel et al. (1987); mais ainda, 80% delas
desapareceram nas primeiras sete semanas.
Outro fator que aumentaria as chances de sobrevivência das pupas de H. erato
phyllis, em condições naturais, seria sua baixa densidade; Romanovsky et al (1985)
estimaram em cerca de 80 % o desaparecimento de lagartas de primeiro e segundo instares
65
desta espécie em observações que não envolveram a manipulação dos estágios imaturos.
Desta forma, considerando-se a mortalidade total na fase pré-adulta, a densidade de pupas
não deve ser usualmente alta, mesmo nos períodos de alta densidade de adultos. Os
experimentos aqui relatados proporcionaram uma densidade de pupas em campo
extremamente alta em relação ao esperado pela baixa sobrevivência de imaturos, o que
possivelmente teve reflexos na quantificação da intensidade da predação. Portanto, um
tempo de metamorfose relativamente rápido, associado à baixa densidade e a escolha de
um local relativamente afastado do solo, constituiriam fatores capazes de aumentar a
sobrevivência das pupas em H. erato phyllis.
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68
Tabela 1: Resumo, em números absolutos, quanto ao destino das pupas implantadas em
duas localidades (ABE e IPH), onde foram testadas quanto ao risco de predação em dois
níveis de altura A1 (até 30cm do solo) e A2 (entre 1 e 1,70m).
Situação Desfecho da Situação
ABE
A1 A2
IPH
A1 A2
1) Não Predadas a) emergiu 13 40 17 43
b) morte não relacionada a predadores 0 1 4 0
2) Predadas a) sem restos ou o segmento final do abdômen 37 5 27 5
b) remoção parcial, restando metade da pupa 0 1 2 2
c) pupa com furo ou buraco 0 3 0 0
69
Tabela 2: Teste de independência mútua através de tabela de contingência tridimensional
para a predação de pupas implantadas em Águas Belas (ABE), considerando a camuflagem
em relação ao nível do solo. Os números representam a quantidade de pupas resultante em
cada situação.
Nível em Relação ao Solo
A1 A2
Camuflagem
Sim Não Sim Não Total
Predação
Sim 19 18 4 5 47
Não 6 7 21 20 53
Total 25 25 25 25 100
P x A = Predação x Altura; P x C = Predação x Camuflagem.
χ
2
Total
= 31,72; p = 0,001; gl = 4. P x A: χ
2
= 31,72; p = 0,001; gl = 3. P x C: χ
2
= 0,24; p = 0,971; gl = 3.
70
Tabela 3: Teste de independência mútua através de tabela de contingência tridimensional
para a predação de pupas implantadas no IPH, considerando a camuflagem em relação ao
nível do solo. Os números representam a quantidade de pupas resultante em cada situação.
Nível em Relação ao Solo
A1 A2
Camuflagem
Sim Não Sim Não Total
Predação
Sim 18 11 5 2 36
Não 7 14 20 23 64
Total 25 25 25 25 100
P x A = Predação x Altura; P x C = Predação x Camuflagem.
χ
2
Total
= 26,03; p = 0,001; gl = 4. P x A: χ
2
= 22,04; p = 0,001; gl = 3. P x C: χ
2
= 5,54; p = 0,136;gl = 3
71
Tabela 4: Teste de independência mútua através de tabela de contingência tridimensional
para a predação de pupas implantadas em Águas Belas (ABE), considerando o fenótipo em
relação ao nível do solo. Os números representam a quantidade de pupas resultante em
cada situação.
Nível em Relação ao Solo
A1 A2
Fenótipo
Claro Escuro Claro Escuro Total
Predação
Sim 19 18 5 4 47
Não 6 7 20 21 53
Total 25 25 25 25 100
P x A = Predação x Altura; P x F = Predação x Fenótipo
χ
2
Total
= 31,72; p = 0,001; gl = 4. P x A: χ
2
= 31,61; p = 0,001; gl = 3. P x F: χ
2
= 0,24; p = 0,971; gl = 3.
72
Tabela 5: Teste de independência mútua através de tabela de contingência tridimensional
para a predação de pupas implantadas no IPH, considerando o fenótipo em relação ao nível
do solo. Os números representam a quantidade de pupas resultante em cada situação.
Nível em Relação ao Solo
A1 A2
Fenótipo
Claro Escuro Claro Escuro Total
Predação
Sim 12 17 3 4 36
Não 13 8 22 21 64
Total 25 25 25 25 100
P x A = Predação x Altura; P x F = Predação x Fenótipo
χ
2
Total
= 29,78; p = 0,001; gl = 4. P x A: χ
2
= 21,58; p = 0,001; gl = 3. P x F: χ
2
= 2,22; p = 0,528; gl = 3
73
Tabela 6: Lista das espécies de formigas encontradas sobre as pupas implantadas nos dois
locais de estudo (ABE e IPH).
Formicidae
Subfamília
Atividade em relação à pupa
Myrmicinae Crematogaster sp.1 (*) Remoção
Ponerinae
Odontomachus chelifer
Remoção
Ponerinae
Pachycondyla striata
Remoção
Myrmicinae
Solenopsis sp
Não determinado
(*) Conforme a coleção de referência de Formicidae do Laboratório de Insetos Sociais, UNISINOS, São
Leopoldo, RS.
74
Figura 1: Um par de pupas de Heliconius erato phyllis em campo (ABE). Pupas próximas
ao solo (altura 1), onde a pupa de cor escura foi considerada camuflada enquanto que a
pupa de cor clara foi considerada não-camuflada.
75
Figura 2: Curvas de sobrevivência para pupas posicionadas próximas ao solo (a) e para
pupas implantadas à altura de cerca de 1 metro (b). Linha contínua, ABE; linha tracejada,
IPH.
a)
Quantidade (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Duração do Experimento (Horas Após Implantação)
2
0
4
1
8
0
1
5
6
1
3
2
1
0
8
8
4
6
0
3
6
1
2
0
b)
Quantidade (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Duração do Experimento (Horas Após Implantação)
2
0
4
1
8
0
1
5
6
1
3
2
1
0
8
8
4
6
0
3
6
1
2
0
76
Figura 3: Pupa de Heliconius erato phyllis em campo (ABE). Pupas considerada não-
críptica implantada na altura 2. Observa-se um buraco na região das asas próximo ao início
do abdômen.
77
Figura 4: Pupa de Heliconius erato phyllis em campo (ABE). Pupas considerada não-
críptica implantada na altura 2, onde restou apenas o abdômen de uma pupa escura. A seta
indica uma formiga (Solenopsis sp) que provavelmente chegou após a ação do predador.
78
Figura 5: Um par de pupas de Heliconius erato phyllis em campo (ABE). Pupas próximas
ao solo (altura 1). A pupa de cor escura foi considerada camuflada enquanto que a pupa de
cor clara foi considerada não-camuflada (ver figura 1). a) notar a presença de um indivíduo
de Pachycondyla striata (setas) sobre a pupa escura enquanto outro tenta alcançar a pupa
clara; b) um indivíduo de Pachycondyla striata (seta) está sobre a pupa escura, a qual teve
seus apêndices cefálicos arrancados (seta).
a)
b)
79
Figura 6: Outra situação em ABE onde uma pupa considerada camuflada, implantada
próximo ao solo, está sendo atacada por Pachycondyla striata. O par desta pupa estava a
10 cm de distância e não foi importunado, permanecendo no local da implantação até o
adulto emergir. a) formiga inspecionando a pupa; b) tentativa de remoção a partir da seda
de fixação; c) tentativa de remoção a partir da seda de fixação vista por outro ângulo.
a)
b)
c)
80
CAPÍTULO 5
Descrição do Primeiro Caso de Metilação de DNA em Uma Borboleta: Heliconius
erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)
Este manuscrito será submetido ao períodico Insect Molecular Biology
81
Descrição do Primeiro Caso de Metilação de DNA em Uma Borboleta: Heliconius
erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)
Adriano Andrejew Ferreira
1
, Gabriela Pasqualim
2
, Rosane Nunes Garcia
3
e Aldo
Mellender de Araújo
1
1. Departamento de Genética e Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
2. Instituto de Biociências, Curso de Ciências Biológicas, UFRGS, Porto Alegre, RS,
Brasil.
3. Departamento de Ciências Exatas e da Natureza, Colégio de Aplicação, UFRGS,
Porto Alegre, RS, Brasil.
Palavras-chave: Cor da Pupa, Heliconius erato, Inseto, Metilação, PCR Bissulfito.
82
Resumo
Pupas da borboleta Heliconius erato phyllis apresentam um contínuo quanto ao
grau de melanização. Estudos prévios mostraram que as estimativas da herdabilidade desta
característica, determinadas pelo método da regressão linear, apresentavam valores muito
diferentes conforme fossem considerados machos e suas proles ou fêmeas e suas proles.
Uma causa possível para esta discrepância poderia ser devido à ocorrência de metilação do
DNA e possível silenciamento dos genes responsáveis pelo fenótipo da pupa. No presente
trabalho, utilizamos as técnicas de MSRE e PCR bissulfito com primers aleatórios, a fim
de verificar se estas são eficientes para a detecção de seqüências metiladas no genoma
daquela borboleta. A análise, utilizando DNA de diferentes fases do desenvolvimento,
mostrou que a técnica de PCR bissulfito foi particularmente eficiente para indicar a
presença de metilação no DNA desta espécie. Isto abre, portanto, a possibilidade de
investigações futuras direcionadas para avaliar se este fenômeno tem relação com a
determinação dos padrões diferenciais de coloração das pupas em H. erato phyllis. O
fenômeno aqui relatado corresponde ao primeiro caso de metilação no genoma de uma
borboleta.
83
Introdução
O estudo da metilação no DNA tem poucas décadas de existência e inicialmente
este processo epigenético foi descrito em mamíferos, apontando para o fato de que os
insetos, tais como Drosophila, por exemplo, teriam o seu genoma livre de metilação
(Urieli-Shoval et al., 1982). Porém, pesquisas mais recentes confirmaram que a metilação
do DNA ocorre em representantes de diferentes filos, e que alguns motivos das DNA
metiltransferases (DNMT) são evolutivamente conservados, ocorrendo desde bactérias,
alguns insetos, plantas e mamíferos (Kumar et al., 1994; Colot & Rossignol, 1999;
Hendrich & Tweedie, 2003). O processo de modificação epigenética através da metilação
do DNA pode, portanto, estar amplamente conservado entre os seres vivos, mas com
funções diferentes das descritas inicialmente para os mamíferos (Field et al., 2004; Garcia
et al., 2007).
Em insetos, a metilação do DNA já foi descrita por Deobagkar e colaboradores
(1982) em Planococcus citri (Hemiptera). Além de outros trabalhos, dentro desta mesma
ordem (Achwal et al., 1983; Field, 1989; Manicardi et al., 1994), a ocorrência da metilação
do DNA também já foi descrita em Orthoptera (Sarkar et al., 1992), Diptera (Nayak et al.,
1991; Gowher et al., 2000; Lyko et al., 2000; Garcia et al., 2007), Lepidoptera (Patel &
Gopinathan, 1987; Mandrioli, 2002) e Hymenoptera (Wang et al., 2006). As funções da
metilação em insetos estão relacionadas, por exemplo, com a regulação gênica, como no
afídio Myzus persicae e com o imprinting genômico em Planococcus citri (Field et al.,
2004).
Analisando a coloração da pupa na borboleta Heliconius erato phyllis,
(Nymphalidae) Ferreira et al. (2006) encontraram que esta característica possui um
84
controle genético poligênico, com forte influência ambiental. A coloração clara ou escura
das pupas é determinada pela atuação conjunta de fatores genéticos e ambientais. No
entanto, a herdabilidade para esta característica, estimada pelo método da regressão linear,
diferiu quando eram levados em conta os escores paternos em relação às médias das proles
(valores positivos) daqueles quando se considerou os escores maternos em relação às
médias das proles (valores negativos). Fatores epigenéticos que poderiam estar atuando no
genoma de H. erato phyllis, parecem ser uma explicação atrativa para o fenômeno
observado por Ferreira et al. (2006).
A fim de se iniciar um processo de investigação neste sentido, utilizou-se, então, as
técnicas de MSRE (Methylation-Sensitive Restriction Endonuclease) e PCR bissulfito com
primers aleatórios, com o objetivo de verificar se estas técnicas seriam eficientes para a
detecção de seqüências metiladas no genoma de H. erato phyllis. Os resultados
demonstraram que a técnica de PCR bissulfito foi particularmente eficiente, mas, com os
dados obtidos aqui, não se pode ainda determinar o quanto a metilação é responsável pela
herança diferencial no padrão de coloração das pupas. Entretanto, abre-se uma importante
perspectiva para investigações futuras do papel deste fenômeno epigenético no genoma
desta espécie.
Resultados
A figura 1 mostra os padrões gerados pelas quatro enzimas de restrição testadas
(HpaII, HhaI, MboI e MspI) em uma pupa macho de H. erato phyllis. A análise dos
padrões de restrição de HpaII e MspI mostra que estas duas enzimas deixam vários
fragmentos de alto peso molecular não digeridos. Estas duas enzimas são isoesquizômeros
85
que reconhecem a mesma seqüência 5’CCGG3’, mas enquanto HpaII cliva seu sítio
independente do fato da citosina externa (C 5’) estar metilada, MspI não cliva esta
seqüência nesta situação. Inversamente, MspI cliva seu sítio independente do fato da
citosina interna estar metilada (C 3’) enquanto HpaII não cliva a seqüência nesta condição.
Os padrões de clivagem das enzimas HhaI (5’GCG↓C3’, onde a citosina em negrito é
sensível a metilação) e MboI (5’↓GATC3’, não sensível à metilação) mostram um padrão
de clivagem de baixo peso molecular. Resultados similares foram encontrados para larva,
pupa fêmea e adultos de ambos os sexos (dados não mostrados).
Em decorrência dos resultados acima, uma alíquota do DNA genômico de
diferentes fases do desenvolvimento de H. erato phyllis foi tratada com bissulfito de sódio
e submetida à amplificação para confirmar, ou não, a presença de metilação no genoma
desta espécie.
Entre sete primers aleatórios testados neste trabalho, apenas os primers de número
4 e 5 foram eficientes na amplificação, tanto no DNA tratado com bissulfito de sódio como
no DNA controle (Figura 2 e 3). Os demais primers não produziram amplificação no
genoma de H. erato phyllis.
O DNA tratado com bissulfito de sódio exibe em comum com o DNA controle,
bandas mais intensas em fragmentos de ≅500 pb; estas bandas são comuns também para
todos os estágios de desenvolvimento e para ambos os sexos. Nesta mesma situação
ocorrem bandas em torno de 850 pb. No DNA controle, principalmente no padrão da pupa
macho, ocorre bandas mais intensas com tamanho de 1650 pb. No resultado da
amplificação do DNA tratado com bissulfito é importante destacar a presença de bandas
(≅1000 pb) que são comuns para ambos os sexos no estágio adulto, mas que não estão
presentes nos outros estágios de desenvolvimento (Figura 2).
86
Para testar a eficiência da conversão com bissulfito de sódio as mesmas amostras de
DNA foram submetidas à PCR com primers do gene de β-actina. Exclusivamente nas
amostras de DNA tratadas com bissulfito de sódio não houve amplificação do gene,
indicando a eficiência da conversão das citosinas não metiladas (Figura 4).
Discussão
O papel central da metilação do DNA na manutenção de funções celulares e o
reconhecimento de que as mudanças nos padrões de metilação podem ter ampla implicação
na saúde humana criaram uma grande necessidade por técnicas confiáveis para detectar e
quantificar a metilação no DNA (Dahl & Guldberg, 2003). Esta busca por novas técnicas,
acabou também, por favorecer o desenvolvimento para detecção e quantificação da
metilação em outros organismos, inclusive em insetos. O seqüenciamento bissulfito, o
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) e a imunohistoquímica revelaram que
em D. melanogaster, por exemplo, as citosinas metiladas estão preferencialmente
relacionadas a dinucleotídeos CpT e CpA, ao contrário do que acontece nos demais
organismos estudados, onde a preferência é pela metilação dos dinucleotídeos CpG.
Também se sabe que apenas 0,4% do DNA total de D. melanogaster é metilado, sendo que
estes níveis são detectados apenas em embriões no estágio inicial de desenvolvimento
(Hung et al., 1999; Tweedie et al., 1999; Lyko et al., 2000; Lyko, 2001; Kunert et al.,
2003).
O tratamento com bissulfito converte as citosinas que não estão metiladas em
uracila. A presença de amplificação no DNA tratado com bissulfito de sódio mostra que os
sítios de anelamento do primer em algumas regiões do DNA genômico foram preservados
(Figura 2 e 3). As diferenças que ocorrem entre o DNA controle e o DNA tratado com
87
bissulfito (ausência de algumas bandas, Figura2) podem ser explicadas pelo fato de que as
regiões onde as citosinas não estavam protegidas pela metilação foram modificadas, o que
impediu o anelamento do primer. Os resultados fornecidos pelos primers da β actina
corroboram a eficiência da técnica com o bissulfito de sódio, tendo em vista que as
amostras tratadas não amplificaram (Figura 4).
Os resultados obtidos em H. erato phyllis utilizando a técnica de MSRE, indicam
que pode estar ocorrendo metilação das duas citosinas em sítios CCGG, tendo em vista que
os padrões de clivagem em MspI e HpaII ficaram semelhantes, com a presença de vários
fragmentos não digeridos de alto peso molecular para ambas as enzimas. Esta hipótese
poderia ser sustentada pelo fato de que a enzima HhaI, que também é sensível à metilação
e reconhece sítios GCGC, tem um padrão de clivagem similar a MboI, com um padrão de
clivagem de baixo peso molecular, o que indica digestão intensa no DNA.
Por outro lado, se o genoma de H. erato phyllis for pobre em seqüências de
reconhecimento das enzimas MspI e HpaII, o padrão de digestão com alto peso molecular
pode ser decorrente deste fenômeno e não da presença de citosinas metiladas. Porém, o
resultado obtido pela técnica de PCR bissulfito e apoiado pelos resultados obtidos por
Mandrioli & Volpi (2003), os quais apontam para um conteúdo de citosinas metiladas na
mariposa Mamestra brassicae em torno de 9% e que os sítios de ocorrência são 5’ CCGG
3’, corroboram a primeira hipótese fornecida pela análise dos resultados da técnica MSRE.
Os resultados das duas técnicas (MSRE e PCR bissulfito) analisados em conjunto,
portanto, indicam a presença de citosinas metiladas em H. erato phyllis, apontando para
mais uma espécie da ordem Lepidoptera, com metilação em seu DNA. Um aspecto
importante a ser destacado é que se trata do primeiro caso descrito para borboletas
(subordem Rhopalocera). Outro destaque refere-se ao fato de se tratar de um gênero
88
amplamente estudado quanto a outros aspectos de biologia evolutiva (seleção natural e
mimetismo, filogenias). As duas espécies de lepidóptera anteriormente descritas como
possuindo DNA metilado, Bombyx mori (Patel & Gopinathan, 1987) e Mamestra brassicae
(Mandrioli, 2002), pertencem à subordem Heterocera (mariposas). As duas técnicas
utilizadas para a detecção em H. erato phyllis, MSRE e o método de PCR bissulfito, são
confiáveis e amplamente utilizadas na detecção da metilação no DNA (Dahl & Guldberg,
2003).
Os resultados apresentados não permitem maiores conclusões em relação à função
da metilação em H. erato phyllis, visto que as metodologias empregadas restringiram-se à
detecção do fenômeno, como foi o objetivo proposto inicialmente. Inferências sobre a
função da metilação nesta espécie, como efeitos epigenéticos atuando sobre a herança da
cor da pupa (Ferreira et al., 2006), não podem efetivamente ser propostas neste momento,
ainda que seja possível observar pela técnica de PCR bissulfito o aparecimento de bandas
que diferem entre o estágio adulto, quando comparado aos estágios imaturos (Figura 2). A
metilação em insetos, diferentemente de alguns casos já documentados para mamíferos,
pode apresentar funções diversas entre as espécies (ver revisão de Field et al., 2004).
Mandrioli & Borsatti (2006) reúnem dados indicando que a metilação em insetos e
outros invertebrados ocorre dentro de regiões codificantes de alguns genes, diferentemente
do que ocorre com mamíferos onde a região promotora do gene é que está metilada. Um
exemplo recente disto é o que ocorre em Apis mellifera. A metilação neste inseto está
predominantemente limitada a regiões codificantes de genes (Wang et al., 2006). Os dados
obtidos para A. mellifera corroboram trabalhos anteriores como o de Salzberg et al. (2004),
por exemplo, que já haviam identificado porções codificantes de genes metilados em
89
Drosophila. Estes dados indicariam que a metilação em insetos está atuando na regulação e
não no silenciamento de genes (Mandrioli & Borsatti, 2006).
Finalmente, o presente trabalho demonstrou dois pontos importantes. O primeiro
deles seria de que a descoberta da existência de metilação no DNA genômico de H. erato
phyllis pode ser importante para a compreensão de como esses processos epigenéticos
estariam ou não conservados em espécies relacionadas e qual a importância disto para
evolução destes grupos de organismos. O segundo ponto é que a técnica de PCR bissulfito,
amplamente empregada em mamíferos (Jones & Takai, 2001; Kang et al., 2001; Laird et
al., 2004, como exemplo), é eficiente para ser utilizada em Lepidoptera.
Procedimentos Experimentais
Animais utilizados
O material biológico utilizado neste trabalho provém de borboletas criadas em
insetário. Os ovos foram coletados diariamente e acondicionados em potes plásticos
translúcidos com tampa branca (8,5 cm de altura por 7,5 cm de diâmetro), sendo o fundo
coberto com papel absorvente branco; a uma temperatura de 25°C com luz constante. No
estágio larval as lagartas foram alimentadas com Passiflora suberosa e os imagos foram
alimentados com uma mistura de mel, água e pólen.
Os adultos utilizados foram acondicionados individualmente em envelopes
entomológicos, onde foram anotadas as informações gerais sobre a borboleta e colocados
em freezer a -20°C. As pupas, larvas e ovos foram congelados em tubos para
microcentrífuga. As lagartas utilizadas foram anestesiadas com gelo, no 5° ínstar de
desenvolvimento (último ínstar antes do estágio de pupa), e dissecadas para remoção do
90
trato digestivo, sendo imediatamente congeladas. Os ovos tiveram seu desenvolvimento
interrompido com 72hs à -20ºC. Com a intenção de diminuir a presença de bandas oriundas
de polimorfismos que poderiam ser detectados com os primers aleatórios, um casal de
irmãos de Heliconius erato phyllis, virgens, foi isolado em um insetário para cópula,
garantindo que os ovos coletados da fêmea fossem de um único macho.
Isolamento de DNA genômico
Para o processo de extração de DNA foram testados diferentes protocolos. Os
melhores resultados foram obtidos com os protocolos de Lodhi et al. (1994) e Lefort &
Douglas (1999). Ambos foram descritos e compilados para extração de DNA de vegetais e
posteriormente testados, com sucesso, na extração de DNA da borboleta Dryas julia (Mega
& Revers, não publicado).
A extração do DNA genômico para ser utilizado na técnica MSRE (Methylation-
Sensitive Restriction Endonuclease) foi feita de uma larva, uma pupa macho e uma pupa
fêmea, um adulto macho e um adulto fêmea não endocruzados. A extração de DNA para o
tratamento com bissulfito de sódio foi feita de 28 ovos com 72 horas de desenvolvimento,
uma larva, uma pupa macho e uma pupa fêmea, um adulto macho e um adulto fêmea,
todos pertencentes à mesma prole endocruzada. A extração de DNA genômico dos adultos
utilizou somente a cabeça e o tórax dos indivíduos. Para os outros estágios de
desenvolvimento utilizou-se a estrutura completa, que foram preparadas como previamente
descrito.
Análises com a técnica MSRE (Methylation-Sensitive Restriction Endonuclease)
91
Clivou-se de 3 a 4 µg do DNA genômico de uma larva de 5° instar, assim como de
uma pupa macho e uma fêmea, e um adulto macho e um adulto fêmea (indivíduos não
aparentados) com as enzimas de restrição HpaII, HhaI, MboI – Invitrogen – e MspI –
Promega, fracionados em gel de agarose 1%, e corado com brometo de etídio. HpaII não
cliva o DNA quando 5’C↓CGG3’ C 3’ está metilado na seqüência; similarmente, HhaI não
cliva quando 5’GCG↓C3’ C 5’ está metilado na seqüência e MspI quando 5’C↓CGG3’ C
5’ está metilado na seqüência. MboI que cliva a seqüência 5’↓GATC3’ é insensível a
metilação. DNA ladder (1kb) – Promega foi utilizado como marcador de peso molecular
para este experimento.
PCR Bissulfito
Duas µg de DNA de cada estágio de desenvolvimento foram tratadas com bissulfito
de sódio (NaHSO
3
) conforme o protocolo adaptado de Hayatsu et al. 1970; Tremblay
1998; Clark et al. 1994; Frommer et al. 1992; Oakeley 1999; Fraga & Esteller, 2002; Li &
Dahiya, 2002, disponível na URL http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/Bisulfite-
Modification--Conversion--of-DNA-3160.html.
Sete primers aleatórios foram testados na amplificação da alíquota de DNA
genômico tratado com bissulfito de sódio. As seqüências dos primers aleatórios testados
estão na Tabela 1. As condições de reação para uma alíquota de 4µl de DNA e 0,12µl de
Taq DNA polimerase foram 3 min a 95°C; 40s a 95°C, 2 min a 40°C e 2 min a 72ºC para
um total de 39 ciclos; 5 min a 72°C. Os mesmos sete primers, também foram utilizados na
amplificação de 2 µg de DNA genômico não tratado, utilizado como controle.
O controle utilizado para verificar a eficiência da conversão pelo bissulfito de sódio
foi feito com a utilização do primer da β actina, pois a seqüência do gene que codifica esta
92
proteína está descrita como não metilada em diferentes organismos tais como
Psammechinus miliaris e Branchiostoma lanceolatum (Tweedie et al., 1997). As
seqüências dos primers da β actina estão na Tabela 1. As condições de reação para uma
alíquota de 1µl de DNA e 0,12µl de Taq DNA polimerase foram 5 min a 94°C; 40s a 94ºC,
30s a 58°C e 40s a 72ºC para um total de 39 ciclos; 7 min a 72ºC; 5 min a 10°C. Os
produtos de PCR foram aplicados em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. O
marcador de peso molecular utilizado foi 1 kb Plus DNA ladder (Invitrogen).
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96
Tabela 1: Seqüência dos sete primers aleatórios e primers da β actina testados na
amplificação do DNA genômico de Heliconius erato phyllis tratado, ou não, com
Bissulfito de Sódio.
Primer
Seqüência
H-AP1 5’ AAG CTT GAT TGC C 3’
H-AP2 5’ AGG CTT CGA CTG T 3’
H-AP3 5’ AAG CTT TGG TCA G 3’
H-AP4 5’ AAG CTT CTC AAC G 3’
H-AP5 5’ AAG CTT AGT AGG C 3’
H-AP6 5’ AAG CTT GCA CCA T 3’
H-AP7 5’ AAG CTT AAC GAG G 3’
β actina senso
5’ AAT CAC CAT CGG CAA CGA G 3’
β actina reverso
5’ GAA GCA CTT GCG GTG GAC GAT 3’
97
Figura 1: Padrão de fragmentos obtidos após a digestão total do DNA genômico de uma
pupa macho de H. erato phylis com HpaII (CCGG), HhaI (GCGC), MspI (CCGG) e MboI
(GATC). O tamanho dos fragmentos está indicado no lado esquerdo da figura em pares de
kilobase (kb).
H
p
a
I
I
H
h
a
I
M
s
p
I
M
b
o
I
kb
10
3
1
98
Figura 2: Resultado da detecção de seqüências metiladas no genoma de Heliconius erato
phyllis, através de PCR bissulfito, com a utilização do primer aleatório H-AP5. a) resultado
para tratamento bissulfito e controle. b) resultado com a amplificação do tratamento
bissulfito (controle não amplificou). É importante notar nesta foto o padrão diferencial de
bandas entre o estágio adulto e os estágios imaturos. Amostras correspondentes ao DNA
controle não tratado estão antecedidas da letra “C” e as correspondentes ao DNA tratado
com bissulfito de sódio, antecedidas de “B”. M - Marcador de peso molecular 1 kb plus
DNA Ladder (Invitrogen); L - larva; PM - pupa macho; PF - pupa fêmea; AM - adulto
macho; AF - adulto fêmea.
a)
b)
M
BL
CL
BPM
CPM
BPF
CPF
CAM
BAF
CAF
BAM
M
BL
CL
BPM
CPM
BPF
CPF
CAM
BAF
CAF
BAM
2kb
1kb
0,65kb
M
BL
CL
BPM
CPM
BPF
CPF
CAM
BAF
CAF
BAM
M
BL
CL
BPM
CPM
BPF
CPF
CAM
BAF
CAF
BAM
1kb
0,65kb
2kb
99
Figura 3: Resultado da detecção de seqüências metiladas no genoma de Heliconius erato
phyllis, através de PCR bissulfito, com a utilização do primer aleatório H-AP4. Estes
resultados referem-se apenas ao tratamento bissulfito. O – Ovo; L - larva; PM - pupa
macho; PF - pupa fêmea; AM - adulto macho; AF - adulto fêmea; CN – controle negativo.
O L PM PF AM AF CN
2kb
1kb
0,65kb
100
Figura 4: Resultado do PCR bissulfito realizado com primer para β-actina em DNA tratado
e não tratado com bissulfito de sódio (indicado na figura). 0 - Marcador de peso molecular
1 kb plus DNA Ladder (Invitrogen); O - ovo; L - larva; PM - pupa macho; PF - pupa
fêmea; CN – controle negativo.
0 CN O L PM PF O L PM PF CN
Bissulfito Controle
2 kb
1 kb
0,65 kb
0 CN O L PM PF O L PM PF CN
Bissulfito Controle
0 CN O L PM PF O L PM PF CN
Bissulfito Controle
2 kb2 kb
1 kb1 kb
0,65 kb0,65 kb
101
CAPÍTULO 6
Discussão Geral
A modulação fenotípica para a cor da pupa em Heliconius erato phyllis proposta
por Ferreira et al. (2006) abriu questões que foram abordadas nos artigos inclusos nesta
tese. O desenvolvimento de uma técnica que avaliasse quantitativamente a coloração das
pupas, apresentada no artigo “On the reliability of a simple method for scoring phenotypes
to estimate heritability: a case study with pupal colour in Heliconius erato phyllis,
Fabricius 1775 (Lepidoptera; Nymphalidae)”, não proporcionou os resultados esperados no
que se refere a um método prático e direto, como os utilizados por Maisch & Bückmann
(1987). Estes autores categorizam as pupas de Inachis io, baseando-se na quantidade de
manchas escuras que a pupa apresenta, traçando um limite entre cada uma das cinco
categorias propostas. É importante ressaltar que o padrão de melanização entre as duas
espécies difere, e isto torna impossível a aplicação do método utilizado em I. io para H.
erato phyllis. A substituição do método qualitativo pelo método que aplica a densidade
óptica, seria oportuna caso o último apresentasse uma melhora na estimativa da
herdabilidade devido a uma melhor descriminação do fenótipo.
As estimativas da herdabilidade calculadas para este artigo não diferem daquelas
calculadas por Ferreira et al. (2006). Desta forma, a falta de significância observada, talvez
seja apenas superada quando utilizarmos um grande número de pares (genitores:proles) no
cálculo da estimativa pelo método da regressão linear, como proposto por Falconer (1989).
102
Uma hipótese alternativa proposta, e que necessita ser testada, é aquela da prioridade na
alocação de recursos (allocation-priority) proposta por Glazier (2002). Esta hipótese
propõe que fenótipos com baixa prioridade no sistema de alocação de recursos estariam
sujeitos a maior influência ambiental e por conseqüência teriam uma menor herdabilidade.
Esta hipótese será testada por nosso laboratório envolvendo diversas situações de estresse
em H. erato phyllis com posterior estimativa da herdabilidade para vários fenótipos.
A duração de horas de luz em um dia é um fator ambiental que não mostrou efeito
sobre a cor da pupa em H. erato phyllis. Este fato é compartilhado por Battus philenor e
Eurytides marcellus; espécies que entram em diapausa no início do inverno e permanecem
no estágio de pupa até as condições climáticas voltarem a ser favoráveis (Hazel & West,
1979; Hazel & West, 1983). O efeito do fotoperíodo, como indicativo de mudança
climática brusca, talvez não faça sentido para H. erato phyllis, uma subespécie que habita
principalmente regiões tropicais, onde a menor quantidade de horas de luz em um dia não
está associado com a queda brusca na temperatura, como ocorre no hemisfério Norte. Uma
hipótese especulativa, para populações de H. erato phyllis que habitam regiões de clima
temperado, seria a formação de pupas escuras para auxiliar na termorregulação, como o
que ocorre com Lycaena phlaeas daimio (Usui et al., 2004), Papilio polyxenes e P. troilus
(Hazel & West, 1983). Porém, o fato observado para H. erato phyllis nas regiões
temperadas é a extinção de populações locais como mostrado por Saalfeld & Araújo
(1981), ocorrendo posterior recolonização a partir de regiões mais quentes (Ribeiro et al.,
não publicado). Assim, uma possível seleção para pupas escuras, influenciadas pelo
fotoperíodo de inverno, que em geral, está associada com espécies oriundas do hemisfério
Norte, como por exemplo P. polytes e P. demoleus (Smith, 1978), necessitaria de um
isolamento populacional, onde indivíduos que fossem provenientes de pupas escuras, as
103
quais poderiam ter sido estimuladas pela mudança de fotoperíodo, obtivessem vantagem
sobre indivíduos não sensíveis a esta situação. Este episódio hipotético forneceria
“material” para a seleção natural atuar e levaria ao conseqüente aumento na freqüência
destes indivíduos. Porém, para esta hipótese merecer crédito, além da necessidade de
pesquisar a freqüência dos fenótipos das pupas em campo, esta teria de ser maior para
pupas escuras.
A modulação fenotípica é um termo utilizado por Smith-Gill (1983) para designar a
plasticidade de um fenótipo com variação contínua. Assim, a cor da pupa em H. erato
phyllis, um caso de modulação fenotípica, pode ser ou não adaptativa, como todo fenótipo
plástico (West-Eberhard, 2003). Os testes em campo com as pupas de H. erato phyllis
permitem especular sobre a função adaptativa deste fenótipo. Os dados referentes a pupas
implantadas até 30 cm de distância do solo indicam fortemente que estas pupas não são
protegidas pelo seu fenótipo plástico, visto que os principais predadores são formigas. Esta
constatação está de acordo com a proposição de Wiklund (1975) onde a vantagem seletiva
para o polimorfismo na coloração da pupa estaria relacionada com a composição de
predadores, bem como com a densidade populacional destes. Ou seja, a camuflagem pela
coloração não se efetiva em H. erato phyllis, pelo menos em pupas próximas ao solo, pelo
fato da predação não ser visual.
É possível que tal situação seja diferente para pupas implantadas acima de 1m de
altura. Considerando-se apenas pupas predadas, que não apresentavam vestígios de que
foram atacadas por formigas, as pupas conspícuas tiveram uma maior incidência de
predação (3 / 5) do que as camufladas (2 / 5), porém esta diferença não foi significante.
Um aumento no número amostral seria indicado para a obtenção de respostas mais
confiáveis. Hazel et al. (1998) avaliando a sobrevivência de Papilio polyxenes, aponta para
104
uma maior sobrevivência de pupas implantadas afastadas do solo e que camuflam-se com
fundo verde. Concluem, estes autores, que a seleção poderia estar atuando sobre a
preferência de empupar em locais afastados do solo e para pupas influenciáveis pelo
ambiente. É plausível que tal situação não seja um caso isolado, ocorrendo apenas em P.
polyxenes. H. erato phyllis, bem como outras espécies, também poderiam estar se
beneficiando desta interação entre os dois mecanismos de proteção. Porém, são necessários
experimentos que validem esta hipótese.
Pachycondyla striata, fotografada durante a remoção de algumas pupas, é uma
espécie que, presumo baseado nas observações, avalia a sua presa quando não obtém
sucesso na remoção. Esta avaliação lhe permite identificar pontos frágeis que podem
facilitar a remoção quando se investe contra eles. O mesmo procedimento foi observado
para Odontomachus chelifer. O gênero Crematogaster, devido ao seu tamanho em relação
a presa, se utiliza da estratégia de remover pequenos pedaços das pupas, um trabalho lento
e contínuo, mas com êxito. A situação de formigas como predadoras de pupas, ainda não
foi descrita na literatura. Porém, isto não implica que o fato não ocorra, ou tenha ocorrido
em experimentos desenvolvidos por outros pesquisadores. A ausência completa da pupa é
comum e frequentemente atribuída a pássaros ou mamíferos (West & Hazel, 1982; White,
1986). O fato da predação por formigas não ter sido detectada ainda, talvez resida na
maneira como os experimentos são delineados; em geral as inspeções não são diárias, o
que diminui a chance de obsevação de formigas agindo sobre as pupas. Desta forma, seria
importante que este trabalho estimulasse novas pesquisas sobre o tema, inclusive no
hemisfério Norte, onde pupas em diapausa estão expostas a riscos por um longo período.
A descrição do primeiro caso de metilação em uma borboleta torna-se mais
significativa por tratar-se de um organismo que pode ser considerado como modelo para
105
estudo; se não entre os insetos, posto ocupado por Drosophila melanogaster, certamente
entre as borboletas. Isto devido às facilidades com que este organismo é mantido em
laboratórios e insetários. A constatação de metilação em H. erato phyllis abre portas no que
se refere à função deste evento. A análise das figuras 2 e 3 ( capítulo 5) permite especular
que a metilação presente nos estágios imaturos é semelhante e que difere em algumas
seqüências para o estágio adulto. Estaria esta modificação no padrão de metilação entre
imaturos e adultos associada à coloração da pupa? Os resultados mostrados não permitem
concluir sobre isto, mas estimulam a busca por resultados que indiquem o motivo deste
padrão desigual. O trabalho de Wang et al. (2006) mostra a presença de metilação em
regiões codificadoras de Apis mellifera. Tal situação aponta para uma função regulatória
por parte da metilação.
Outra situação que deve ser destacada é a completa associação entre os resultados
observados para machos e fêmeas. A falta de um padrão de metilação sexo-específica,
como a detectada por Garcia et al. (2007) em Drosophila willistoni, não corrobora com a
hipótese da metilação estar ligada a um possível caso de imprinting genômico; que
acabaria por silenciar genes responsáveis pela coloração da pupa na fêmea. Isto explicaria
a estimativa da herdabilidade desigual encontrada para machos e fêmeas em relação a sua
prole (Ferreira et al., 2006). Contudo, não existem, ainda, informações suficientes, tanto
para confirmar como para refutar a hipótese de silenciamento de genes para a coloração da
pupa. Desta forma a única informação concreta é presença de metilação no genoma de H.
erato phyllis.
Este projeto de doutorado envolvendo aspectos da modulação fenotípica na cor da
pupa em H. erato phyllis teve desdobramentos envolvendo anomalias surgidas em nossas
criações de imaturos e adultos. O surgimento de um fenótipo atípico em adultos desta
106
espécie, falta de pigmentos vermelho e amarelo, estimulou a busca por uma explicação, a
partir da análise dos indivíduos anômalos e através da literatura. Outra anomalia refere-se
ao possível efeito viral, pelo VPN, na coloração das pupas, o qual estaria “estimulando” a
produção de pupas escuras. Estes dois desdobramentos estão nos anexos 3 e 2,
respectivamente. O anexo 1 mostra resultados preliminares de um processo de seleção para
fenótipos extremos na cor da pupa de H. erato phyllis.
107
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110
Anexo 1
Seleção Para Fenótipos Extremos na Coloração da Pupa em Heliconius erato phyllis
(Lepidoptera; Nymphalidae)
Um dos objetivos propostos para este projeto de doutorado foi determinar a
quantidade de locos que segregam para a cor da pupa através do cruzamento de linhagens
claras e escuras para a coloração da pupa. Com o transcorrer do experimento constatou-se,
o que já havíamos previsto, que o tempo necessário para a conclusão deste objetivo,
excedia o tempo de duração das estações favoráveis ao desenvolvimento de Heliconius
erato phyllis, ou seja, oito meses. Porém, a prévia solução encontrada (manutenção de
genitores, para ambas as linhagens formadas, em insetários montados dentro de
laboratório) não obteve sucesso, devido à baixa atividade das borboletas e subseqüente
morte. Desta forma, apresento aqui apenas os resultados relativos à primeira parte do
experimento: a seleção para pupas de cor clara e seleção para pupas de cor escura.
O experimento consistiu na manutenção de adultos, previamente escolhidos devido
a fenótipos extremos para a cor da pupa, em insetários. Um deles foi escolhido para abrigar
apenas indivíduos provenientes de pupa clara e o outro para abrigar indivíduos
provenientes de pupa escura. Os adultos foram alimentados com uma mistura de mel, água
e pólen. Os ovos foram coletados diariamente e acondicionados em potes plásticos
translúcidos com tampa branca (8,5 cm de altura por 7,5 cm de diâmetro), sendo o fundo
coberto com papel absorvente branco; a uma temperatura de 25°C com luz constante. As
lagartas foram alimentadas com Passiflora suberosa. Após a formação das pupas
escolhiam-se os fenótipos extremos, para quando da emergência do adulto, estes fossem
111
para o respectivo insetário. O procedimento descrito foi válido para as duas linhagens.
Devido ao fato de que as fêmeas iniciais, para cada linhagem, não eram endocruzadas ou
irmãs, considerou-se que cada linhagem formada nem sempre era constituída de indivíduos
endocruzados. A opção por este processo aleatório teve a intenção de diluir o valor de F,
visto que, em outros experimentos, o cruzamento entre irmãos proporciona uma alta
mortalidade na prole. Durante este processo de seleção, as exúvias dos indivíduos gerados
foram armazenadas e categorizadas conforme Ferreira et. al. (2006).
Apenas uma análise preliminar foi feita, com a intenção de mostrar o efeito da
seleção durante o transcorrer do experimento. Assim, as linhagens constituídas, cada uma,
de 138 exúvias foram divididas em 6 grupos, onde cada grupo foi formado por 23 exúvias.
A formação dos conjuntos baseou-se na ordem de oviposição. Desta forma, o conjunto 1
foi formado pelos 23 primeiros ovos que se desenvolveram até o estágio adulto. O
conjunto 2 pelos 23 ovos seguintes e assim sucessivamente até o conjunto 6. A tabela 1
mostra as médias e seus desvios para a linhagem clara. A tabela 2 mostra estes parâmetros
para a linhagem escura.
A decrescente média mostrada para a seleção clara e a crescente mostrada para a
seleção escura indica que obtivemos sucesso neste processo de seleção para as duas
linhagens. Porém, através dos valores dos desvios padrão, constata-se que a variância, em
ambas as linhagens, ainda está alta. Isto pode ser um indicativo que seja necessário
continuar o processo de seleção por um tempo maior a fim de se obter um valor menor
para a variância.
Ambos os processos de seleção mostram um valor não esperado para os conjuntos
6. A única anomalia verificada durante o processo de seleção foi uma contaminação pelo
vírus de poliedrose nuclear. Uma investigação preliminar não indica associação entre os
112
indivíduos infectados e a coloração da pupa (Anexo 2). Porém outros experimentos são
necessários para resultados mais conclusivos.
Referência Bibliográfica
Ferreira AF, Garcia RN & Araújo AM (2006) Pupal melanization in Heliconius erato
phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae): genetic and environmental effects. Genetica
126: 133-140.
113
Tabela 1: Médias dos escores referentes a seis conjuntos, de 23 indivíduos cada, formados
pela ordem de oviposição na linhagem clara. Observa-se a ordem decrescente das médias
com o transcorrer do tempo, exceção para o conjunto 6.
Conjunto Média Desvio Padrão
1 3,35 0,775
2 3,26 0,689
3 3,22 0,422
4 2,87 0,694
5 2,57 0,728
6 3,22 1,043
Total 3,08 0,784
Tabela 2: Médias dos escores referentes a seis conjuntos, de 23 indivíduos cada, formados
pela ordem de oviposição na linhagem escura. Observa-se a ordem crescente das médias
(no tempo) entre os conjuntos 2 e 5.
Conjunto Média Desvio Padrão
1 4,00 0,905
2 3,87 0,920
3 4,09 0,949
4 4,48 0,790
5 4,91 0,417
6 4,83 0,491
Total 4,36 0,862
114
Anexo 2
Análise da influência do vírus de poliedrose nuclear (VPN) na melanização de pupas e
sobrevivência de Heliconius erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)
1
Durante um processo de seleção para pupa de cor clara (linhagem clara) e para pupa
de cor escura (linhagem escura), em Heliconius erato phyllis formaram-se pupas com
fenótipo escuro no final do processo de seleção para a linhagem clara, as quais não eram
mais esperadas. As médias indicadas na tabela 1, do anexo 1 (página 113) referem-se a seis
conjuntos, de 23 indivíduos cada, formados pela ordem de oviposição da linhagem clara. A
ordem decrescente das médias com o transcorrer do experimento é interrompida com o
valor do conjunto 6. Uma investigação preliminar deste fato apontou que o aumento na
freqüência de pupas escuras na linhagem clara, coincidiu com um período de
contaminação, nos estágios imaturos, pelo vírus de poliedrose nuclear (VPN).
A fim de verificar uma eventual ação viral, pelo VPN, na modificação da coloração
das pupas em H. erato phyllis foram realizados experimentos em uma irmandade. Os
adultos mantidos em insetário (2m x 2m x 3,5), foram alimentados com uma mistura de
mel, água e pólen. Os ovos foram coletados diariamente e acondicionados em potes
plásticos translúcidos com tampa branca (8,5 cm de altura por 7,5 cm de diâmetro), sendo
o fundo coberto com papel absorvente branco; a uma temperatura de 25°C com um
fotoperíodo de 12L:12E. As lagartas foram alimentadas com Passiflora suberosa. A partir
dos imaturos desta prole, dois grupos de lagartas, chamados controle e infectado foram
formados. O grupo infectado, no início do 4º ou 5º ínstar, foi colocado em um pote
1
Este trabalho foi feito em colaboração com o Prof. Dr. Josué Sant’Ana e Julie Graziela Zanin.
115
totalmente branco (3 cm de altura por 2 cm de diâmetro) que continha um disco de P.
suberosa de aproximadamente 2 cm de diâmetro. Sobre a superfície deste disco foi
colocado 100 µl de solução viral (concentração de 10
7
poliedros/ml). As lagartas
permaneciam neste pote até consumirem todo o disco, sendo após novamente colocadas no
pote padrão de criação. Os indivíduos do grupo controle, também foram transferidos para o
mesmo tipo de pote, com um disco de P. suberosa, porém sobre este foi colocado 100 µl
de água e ali permaneciam até consumirem todo o disco foliar.
Foram amostrados 80 indivíduos, sendo 40 para cada grupo. Destes 80, 46 estavam
no 5° ínstar de desenvolvimento, e 34 no 4° ínstar. O escore de melanização das pupas
(descrito por Ferreira et al., 2006) foi feito 24h após a formação desta. Os fenótipos de cor
das pupas foram agrupados em duas categorias: claro (escores 2 e 3) e escuro (escores 4 e
5). Foi utilizado o teste qui-quadrado para avaliar a associação entre a coloração da pupa e
os indivíduos infectados. Os valores obtidos não foram significantes (χ²=1,966; 1g.l.; p =
0,161 – com correção de Yates). Testamos também, os efeitos do vírus em relação aos
fatores mortalidade e tempo de desenvolvimento. Em relação à mortalidade as lagartas
infectadas no 4° ínstar tiveram uma maior mortalidade do que as infectadas no 5° ínstar
(χ²=6,547; 1g.l.; p= 0,011 – com correção de Yates; Ф=-0,46). A mesma comparação entre
os controles não se revelou significante (χ²=0,886; 1g.l.; p= 0,347 – com correção de
Yates). Uma comparação entre a mortalidade total dos infectados com os respectivos
controles mostrou-se altamente significante (χ²=15,622; 1g.l.; p= 0,0001 – com correção de
Yates). A média do tempo de desenvolvimento ovo-pupa entre os controles foi de 16,29 ±
4,33 dias, enquanto que a dos infectados foi de 16,61 ± 3,38; essa diferença não foi
estatisticamente significante (t= -0,62; 63 g.l.; p> 0,4).
116
Os resultados mostrados não indicam associação entre a coloração da pupa e
contaminação por VPN. Porém, estes valores referem-se apenas a uma irmandade e são
necessários novos testes. Esta perspectiva é estimulada pelo fato de que ocorrem entre as
pupas do grupo infectado, uma freqüência maior de fenótipos escuros que chegaram ao
estágio adulto. Esta situação, caso recorrente e significante, pode indicar que o
desenvolvimento de pupas melânicas estaria ligado a mecanismos de defesa contra o VPN.
Situação semelhante à proposta foi encontrada por Gershenzon (1994) onde as formas
melânicas da mariposa Antheraea pernyi mostraram maior resistência ao VPN.
O estágio de infecção mostrou-se altamente associado com a chance de
sobrevivência do indivíduo. Isto pode ter ocorrido por dois motivos que podem estar
atuando em conjunto ou de forma isolada. O primeiro propõe que a infecção em um estádio
menor permite um tempo maior para o VPN atuar sobre o organismo e conseqüentemente
não permitindo que este alcance o estágio adulto. A segunda hipótese relaciona-se ao
sistema imune, o qual poderia ser menos eficiente quanto menor o estádio de
desenvolvimento.
Desta forma o presente estudo deixa aberta perspectivas de estudo para uma melhor
avaliação desta situação e seus possíveis desdobramentos.
117
Referência Bibliográfica
Ferreira AF, Garcia RN & Araújo AM (2006) Pupal melanization in Heliconius erato
phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae): genetic and environmental effects. Genetica
126: 133-140.
Gershenzon SM (1994) A melanistic form of the oak silkworm Antheraea pernyi
(Lepidoptera, Attacidae). Vestnik Zoologii 6: 46-51.
118
Anexo 3
Fenótipo Incomum em Heliconius erato phyllis (Lepidoptera; Nymphalidae)
2
Neste artigo reportamos o primeiro caso de Heliconius erato phyllis com ausência
completa das cores vermelha e amarela nos imagos. Esta borboleta é conhecida por possuir
uma coloração aposemática que se caracteriza por uma mancha vermelha e uma listra
amarela nas asas anteriores e, nas asas posteriores, uma barra amarela. No lado ventral,
abaixo desta barra, a existência de pequenos pontos vermelhos denominados red raylets e
na extremidade pequenas manchas amareladas constituem o chamado “retângulo creme”.
Todas as características citadas estão dispostas sobre um fundo preto (Figura 1a).
Os indivíduos com o padrão de coloração alterado surgiram em uma prole
reservada para testes fisiológicos. A fêmea estava ovipositando em insetário (2m x 2m x
3,5m) e seus ovos sendo recolhidos diariamente e acondicionados em potes plásticos
translúcidos e com tampa branca (8,5 cm de altura por 7,5 cm de diâmetro), sendo o fundo
coberto com papel absorvente branco, submetidos a uma temperatura de 25°C com luz
constante e alimentados com Passiflora suberosa. Desta prole emergiram nove imagos que
apresentaram o fenótipo descrito logo a baixo.
A região das asas, da cabeça, do tórax e do abdômen que deveriam conter escamas
amarela ou vermelha apresentavam estas em tons de branco (Figura 1b). Os olhos,
normalmente pretos, mostraram-se menos pigmentados, apresentando-se na cor marrom
claro. A ausência de pigmentos vermelho e amarelo no padrão de coloração externo
sugeriu que estes fossem ausentes também em estruturas internas. Sabendo que os
2
Este trabalho foi feito em colaboração com André Klein.
119
testículos de Lepidoptera são pigmentados, dissecaram-se dois machos com estas
alterações fenotípicas no padrão de coloração e mais um terceiro, da mesma prole, que
apresentava fenótipo normal. Neste último, os testículos eram avermelhados, enquanto que
nos primeiros eram completamente brancos (Figura 1c). Além da ausência de coloração,
seis, entre os nove indivíduos, não foram capazes de distender corretamente as asas, sendo
incapazes de voar. Por fim, em apenas um dos imagos com o fenótipo de cores alterado,
constatou-se uma alteração morfológica nas antenas. Enquanto que o formato normal é o
filiforme, neste, as extremidades eram “falciformes” na extremidade apical (Figura 1d).
A eclosão do primeiro imago com este fenótipo foi casualmente registrada em
vídeo enquanto se realizavam observações em viveiro referentes a um estudo sobre o
comportamento sexual desta espécie. Este indivíduo, uma fêmea, não conseguiu estender
as asas. Fato registrado em vídeo que posteriormente analisado, permitiu a constatação de
que as asas ficaram presas no interior da exúvia por um determinado tempo,
impossibilitando que as asas fossem corretamente estendidas.
Durante a mesma observação relatada acima, cerca de 20 minutos após o início da
eclosão, quando a fêmea aberrante já havia se separado completamente da exúvia, mas
ainda permanecia pendurada a alguns centímetros dela, um dos machos que estavam no
viveiro se aproximou, inspecionou a fêmea brevemente, pousou e iniciou a cópula, tendo
sido este evento também filmado. Este tipo de acasalamento caracteriza o que se denomina
“cruzamento-pupal”, típico de algumas borboletas do gênero Heliconius (Deinert, 1994;
Brower, 1997). A separação do casal se deu entre 125 e 160 minutos após o início da
cópula. A fêmea foi recolhida e constatou-se que ela estava com o cheiro característico das
fêmeas férteis desta espécie, resultante de um composto antiafrodisíaco transferido pelo
macho durante a inseminação (Gilbert, 1976). A fêmea foi mantida em laboratório dentro
120
de uma gaiola de 60x30x30 cm durante 5 dias, junto a um ramo da planta hospedeira, P.
suberosa, e um alimentador com mistura de água, mel e pólen. Devido à deformação nas
asas, esta borboleta era incapaz de voar e, pela redução de pigmentos nos olhos,
aparentemente tinha a visão prejudicada. Conseqüentemente este indivíduo não se
alimentava sozinho, sendo necessário fazê-lo artificialmente. Após a morte a fêmea foi
dissecada para verificar a existência de ovos em seu abdômen. Porém, nenhum foi
encontrado.
Dois imagos com o fenótipo incomum, que estenderam normalmente as asas, foram
colocados em um viveiro, sendo possível observar seu comportamento. Na maior parte do
tempo, eles permaneciam em pouso, caminhando para se deslocar. Quando levantavam
vôo, este era rápido, geralmente em uma única direção e freqüentemente resultava no
choque contra os limites do viveiro. Além disso, estas borboletas não se aproximaram dos
alimentadores, nas cores vermelho e amarelo que deveria atraí-los. Estes dois indivíduos
apenas se alimentavam quando eram colocados sobre os alimentadores. Estas observações,
juntamente com a da fêmea que mantivemos em laboratório, citada acima, sugerem uma
deficiência grave na visão destes indivíduos.
Uma fêmea com este fenótipo incomum, mas com as asas normalmente distendidas,
foi introduzida em um viveiro contendo apenas machos da mesma espécie e com fenótipo
normal. Durante o tempo de observação, não houve interação com esta fêmea. A fim de
comparação, foi introduzida uma outra fêmea, virgem, com fenótipo normal, no mesmo
viveiro, porém sem retirar a fêmea atípica. Durante o período de observação, os machos
interagiram apenas com a fêmea normal, mesmo estando a fêmea atípica próxima (<40
cm). Apesar de ter sido única, esta observação sugere que a ocorrência da cópula, logo
após a eclosão, com uma fêmea igualmente anormal e, ainda, sem a distensão correta das
121
asas foi desencadeada essencialmente por uma sinalização química da fêmea, já que a
forma visual dificilmente seria reconhecida como co-específica pelo macho.
A prole na qual apareceram estas borboletas com fenótipo incomum muito
provavelmente se originou de um endocruzamento. Um total de 49 ovos foram
ovipositados. Destes, dois não resultaram em larvas, três morreram em primeiro instar, dois
em segundo e sete em estágio de pupa. Além disso, seis larvas foram usadas em testes de
fisiologia, das quais apenas uma sobreviveu, tendo eclodido um imago com o fenótipo aqui
relatado. Trinta indivíduos atingiram a fase de imago e, destes, nove apresentavam o
fenótipo alterado. Esta proporção se aproxima de ¼, o que seria esperado se tal fenótipo
fosse causado por uma mutação recessiva em um sistema simples de 1 loco e 2 alelos.
No gênero Heliconius, os omocromos são uma importante classe de pigmentos que
derivam do triptofano. Um dos intermediários desta via, a 3-OH-quinurenina, é
responsável pelo amarelo das asas. A partir deste pigmento é sintetizada a xantomatina
que, quando oxidada, gera di-hidroxantomatina, responsável pelo vermelho nas asas
(Nijhout, 1991). É provável que a mutação que resultou no fenótipo aqui apresentado tenha
afetado alguma enzima que catalise uma reação intermediária entre o triptofano e a 3-OH-
quinurenina, interrompendo a síntese de ambos os pigmentos, amarelo e vermelho.
122
Referências Bibliográficas
Brower, A.V.Z. (1997) The evolution of ecologically important characters in Heliconius
butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae): a cladistic review. Zoological Journal of
the Linnean Society. 119: 457-472.
Deinert, E.I., Longino, J.T. & Gilbert, L.E. (1994) Mate competition in butterflies. Nature
370: 23-24.
Gilbert, L. (1976) Postmating female odor in Heliconius butterflies: a male contributed
antiaphrodisiac? Science 193: 419-420.
Nijhout, H.F. (1991) The Development and Evolution of butterfly Wing Patterns.
Washington: Smithsonian Institution Press, USA
123
Figura 1: a) Vista dorsal e ventral de H. e. phyllis normal. b) Vista dorsal e ventral de H. e.
phyllis com padrão de cores alterado. c) Testículo norma (esquerda) e sem pigmentação
(direita). d) Antena normal (esquerda) e falciforme (direita).
a
b
c
d
124
Anexo 4
125
126
127
128
129
130
131
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