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MAURÍCIO FRANCO ZANETTE
Comparação entre os métodos de ELISA, imunofluorescência
indireta e imunocromatografia para o diagnóstico da
leishmaniose visceral canina
ARAÇATUBA
2006
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2
MAURÍCIO FRANCO ZANETTE
Comparação entre os métodos de ELISA, imunofluorescência
indireta e imunocromatografia para o diagnóstico da
leishmaniose visceral canina
Dissertação de mestrado apresentada à
Faculdade de Odontologia de Araçatuba,
Curso de Medicina Veterinária, da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho” – UNESP, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
em Ciência Animal.
Orientadora: Profa. Ass. Dra. Mary Marcondes Feitosa
ARAÇATUBA
2006
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“Sempre haverá tempo para aprender
Sempre nos serão dadas novas oportunidades
Para tudo existe solução
O que hoje parece impossível,
amanhã poderá ser realizado
Tudo se transforma, tudo se modifica
É a lei da vida
Não desesperar jamais!
Não atrair pensamentos negativos,
mas acreditar que sempre nos serão dadas oportunidades
de recomeçar e reconstruir.”
(Mensagem psicografada)
4
DEDICATÓRIA
Aos meu pais Nivaldo e Leda,
por terem proporcionado a mim a possibilidade de chegar tão
longe. O carinho de vocês foi fundamental para eu concluir
este projeto, principalmente nesta fase final.
Amo vocês!
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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À minha orientadora,
Profa. Ass. Dra. Mary Marcondes Feitosa,
pela oportunidade oferecida na orientação deste projeto de
dissertação, por acompanhar passo a passo cada etapa deste
trabalho, sempre otimista e confiante, contagiando a todos ao seu
redor e, principalmente, pela compreensão e apoio oferecidos
durante meus momentos de dificuldades, demonstrando ser, além
de uma excelente orientadora, uma amiga.
À você, minha eterna admiração.
Muito obrigado!
6
AGRADECIMENTOS
Ao Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, Campus de Araçatuba, pela oportunidade oferecida para a realização do curso de
mestrado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo suporte
financeiro para a realização deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa de mestrado.
À Profa. Sílvia Helena Perri Venturolli, pela paciência e dedicação na realização da análise
estatística.
Aos funcionários da biblioteca do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual
Paulista (UNESP – Araçatuba), em especial à bibliotecária Izabel Pereira Matos pelo
auxílio na elaboração das referências bibliográficas.
Aos graduandos e bolsistas de iniciação científica Fernando, Juliana, Daniel, Ludmila e
Denis, pelo bom-humor e eficiência no auxílio da colheita e processamento de materiais.
À funcionária Thaise, do Laboratório de Investigações Médicas (LIM-50), pelo auxílio
técnico na realização da reação de imunofluorescência indireta para leishmaniose visceral.
Aos pós-graduandos Cláudio Nazaretian Rossi e Fabiana Augusta Ikeda Garcia pela
cumplicidade e apoio recebido nestes dois anos de convivência intensa.
Ao Cláudio, novamente, pela ajuda na colheita e transporte das minhas amostras.
7
Ao Centro de Controle de Zoonoses de Araçatuba, pela permissão da colheita de materiais.
À Profa. Dra. Caris Maroni Nunes e à Profa. Dra. Luzia Helena Queiroz, membros da
banca do meu exame geral de qualificação, pelas sugestões para a redação deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Aparecido Antonio Camacho pelo fornecimento das amostras de soros de cães
portadores de doença de Chagas.
À Profa. Dra. Mitika Kuribayashi Hagiwara, pelo fornecimento das amostra de soros de
cães infectados por Ehrlichia sp. e Babesia canis.
À Profa. Dra. Solange Maria Gennari, pelo fornecimento de amostras de soros de cães
infectados por T. gondii e N. caninum e pela realização da reação de imunofluorescência
indireta para o diagnóstico de toxoplasmose e neosporose.
À Profa. Dra. Márcia Dallastra Laurenti, pela orientação na realização da reação de
imunofluorescência indireta para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina e por ter
cedido o Laboratório de Investigações Médicas (LIM-50) para a realização deste método.
À Profa. Dra. Rosângela Machado Zacarias, pela realização da reação de
imunofluorescência indireta para diagnóstico de babesiose canina.
À Profa. Dra. Eufrosina Umezawa, pela realização da técnica de ELISA para o diagnóstico
de doença de Chagas
À Profa. Dra. Valéria Marçal Félix Lima, pela orientação na realização do método de
ELISA para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina e por ter cedido o Laboratório de
Imunologia do Curso de Medicina Veterinária –UNESP-Araçatuba, para realização deste
método.
8
À Maria Ângela Valente Sanches que, pacientemente, indicou-me os caminhos para superar
as dificuldades encontradas durante este período da minha vida.
Às minhas queridas amigas de república Lilian e Juliana pelos anos de agradável
convivência e pelas palavras de estímulo quando o desânimo teimava em aparecer.
Aos parentes, amigos, residentes, mestrandos e docentes que me ajudaram, direta ou
indiretamente, a concluir este meu projeto.
9
ZANETTE, M. F. Comparação entre os métodos de ELISA, imunofluorescência
indireta e imunocromatografia para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina.
2006. 92f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Faculdade de Odontologia, Curso
de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2006.
RESUMO
A importância do diagnóstico da leishmaniose visceral canina no Brasil reside no fato de
que, dentre as estratégias de controle da doença indicadas pela Fundação Nacional de
Saúde, encontra-se a eliminação do cão doméstico sorologicamente positivo. Desta forma,
torna-se necessário o conhecimento da sensibilidade e da especificidade das provas
sorológicas utilizadas para a correta identificação destes animais. Para avaliar o
desempenho dos métodos sorológicos no diagnóstico da leishmaniose visceral canina,
foram determinadas e comparadas as características dos métodos de ELISA, reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia, adotando-se como padrão o
método parasitológico. Para tanto, foram utilizados 50 cães naturalmente acometidos por
leishmaniose visceral e 45 cães sadios provenientes de área não endêmica para a doença. A
RIFI revelou sensibilidade de 98% e especificidade de 91,1%, além de ótima concordância
com o método parasitológico (Kappa = 0,893). Os métodos de ELISA e de
imunocromatografia apresentaram boa concordância com o método parasitológico
(coeficientes Kappa de 0,788 e 0,769, respectivamente) e valores de sensibilidade de 94% e
86% e especificidade de 84,4% e 91,1%, respectivamente. Com relação à ocorrência de
reações cruzadas com leishmaniose visceral, das 14 amostras de soro positivas para doença
de Chagas, nove (64,3%) foram consideradas positivas pela técnica de ELISA e seis
(42,9%) pela RIFI, não se observando resultados positivos por imunocromatografia. Das 13
amostras de soros de animais portadores de erliquiose, uma (7,7%) apresentou resultado
positivo por meio dos métodos de ELISA e de imunocromatografia. Das seis amostras de
soro de cães apresentando co-infecção por erliquiose e babesiose, cinco (83,3%) foram
classificadas como positivas pela técnica de ELISA e três (50%) por imunocromatografia,
não se observando resultados positivos pela RIFI. Das 10 amostras de soro de cães com
10
toxoplasmose, cinco (50%) foram positivas pela RIFI e uma (10%) por
imunocromatografia, não ocorrendo reação cruzada pela técnica de ELISA. Somente uma
(12,5%) das oito amostras de soro de cães com neosporose obteve resultado positivo pela
técnica de imunocromatografia, e das 13 amostras de soro de cães com co-infecção por
toxoplasmose e neosporose, três (23%) foram positivas por meio da técnica de
imunocromatografia. Das 12 amostras de soros de cães com babesiose nenhuma apresentou
reação positiva pelos três testes empregados. Em função dos resultados obtidos, a escolha
do melhor método sorológico para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina depende
não somente de sua sensibilidade e especificidade, mas também do conhecimento de
ocorrência de reações cruzadas com outros agentes etiológicos e da situação
epidemiológica da doença na região.
Palavras-chaves ou unitermos: leishmaniose visceral, cão, ELISA, reação de
imunofluorescência indireta, imunocromatografia.
11
ZANETTE, M. F. Comparison among enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),
indirect immunofluorescence assay and immunochromatography for the diagnosis of
canine leishmaniasis. 2006. 92f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Faculdade
de Odontologia, Curso de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista,
Araçatuba, 2006.
ABSTRACT
The importance of canine visceral leishmaniasis diagnosis in Brazil is based on the fact
that, according to the Ministry of Health, a seropositive dog must be culled. Thus, it´s
important to know the sensitivity and specificity values of the methods employed for the
diagnosis of the disease. To evaluate the performance of the available sorological tests for
the diagnosis of canine leishmaniasis it was determined and compared the sensitivity and
specificity of ELISA, indirect immunofluorescent antibody test (IFAT) and
immunochromatographic test using the parasitological test as the gold standard. For this
purposal, the study was carried out with a group of 50 naturally infected dogs from an
endemic area and 45 healthy dogs from a non endemic area for visceral leishmaniasis. The
IFAT was 98% sensitive and 91,1% specific, and showed a very good concordance with the
parasitiological test (k = 0,893). The ELISA showed a sensitivity of 94% and specificity of
84,4% and when kappa index was analysed, a good concordance was obseved (k = 0,788).
The immunochromatographic test was 86% sensisitive and 91,1% specific and showed a
good concordance with the parasitiological test (k = 0,769). About the occurrence of cross
reaction with visceral leishmaniasis, nine (64,3%) out of 14 positive samples for Chagas’
disease were positive by ELISA and six (42,9%) out of 14 were positive by IFAT, while
the immunocromatographic test didn’t yield any positive result. One (7,7%), out of 13
positive samples for ehrlichiosis, was positive by ELISA and immunocromatografic test.
Five (83,3%) out of six positive samples for ehrlichiosis and babesiosis were positive by
ELISA and three (50%) by immunocromatography, while IFAT didn´t yield any positive
result. Five (50%) out of 10 positive samples for toxoplasmosis were positive by IFAT and
one (10%) by immunocromatography. Only one (12,5%) out of eight positive samples for
12
neosporosis was positive by immunocromatography. Three (23%) out of 13 positive
samples for toxoplasmosis and neosporosis were positive by immunocromatography. None
of the 12 positive samples for babesiosis yielded a positive result by any method. Based on
the results of this survey, the best option for a serological method for visceral leishmaniais
diagnosis depends not only on the sensitivity or specificity values, but also on the
knowledge of occurrence of cross reaction among pathogens and the epidemiological
situation of the area.
Keywords: Visceral leishmaniasis, dog, ELISA, indirect immunofluorescent antibody test,
immunochromatographic test.
13
LISTA DE TABELAS E QUADROS
pag.
Tabela 1 - Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pelo método de ELISA, em
número absoluto e percentagem, de cães naturalmente infectados por Leishmania sp.
provenientes do município de Araçatuba. (Araçatuba-SP, 2006).........................................29
Tabela 2- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pela reação de
imunofluorescência indireta (RIFI), em número absoluto e percentagem, de cães
naturalmente infectados por Leishmania sp. provenientes do município de Araçatuba.
(Araçatuba-SP, 2006)............................................................................................................30
Tabela 3– Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pela reação de
imunocromatografia, em número absoluto e percentagem, de cães naturalmente infectados
por Leishmania sp. provenientes do município de Araçatuba. (Araçatuba-SP, 2006).........30
Tabela 4- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pelo método de ELISA, em
número absoluto e percentagem, de cães clinicamente sadios provenientes de área não
endêmica para leishmaniose visceral (Araçatuba-SP, 2006)................................................31
Tabela 5- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pela reação de
imunofluorescência indireta (RIFI), em número absoluto e percentagem, de cães
clinicamente sadios provenientes de área não endêmica para leishmaniose visceral.
(Araçatuba-SP, 2006)............................................................................................................31
Tabela 6- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pela reação de
imunocromatografia, em número absoluto e percentagem, de cães clinicamente sadios
provenientes de área não endêmica para leishmaniose visceral. (Araçatuba-SP,
2006).....................................................................................................................................31
14
Tabela 7- Valores de sensibilidade e especificidade relativas para as técnicas de ELISA,
reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia empregadas no
diagnóstico da leishmaniose visceral canina. (Araçatuba-SP, 2006)....................................32
Tabela 8- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da técnica de
ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia em amostras
de soro de 14 cães portadores de doença de Chagas. (Araçatuba-SP, 2006)........................32
Tabela 9- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da técnica de
ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia em amostras
de soro de 13 cães portadores de erliquiose. (Araçatuba-SP, 2006)....................................33
Tabela 10- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da técnica de
ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia em amostras
de soro de 12 cães portadores de babesiose. (Araçatuba-SP, 2006)....................................34
Tabela 11- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da técnica de
ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia em amostras
de soro de seis cães com co-infecção por erliquiose e babesiose. (Araçatuba-SP, 2006)....35
Tabela 12- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da técnica de
ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia em amostras
de soro de 10 cães portadores de toxoplasmose. (Araçatuba-SP, 2006)...............................35
Tabela 13- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da técnica de
ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia em amostras
de soro de oito cães portadores de neosporose. (Araçatuba-SP, 2006)................................36
Tabela 14- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da técnica de
ELISA, RIFI e imunocromatografia em amostras de soro de 13 cães com co-infecção por
toxoplasmose e neosporose. (Araçatuba-SP, 2006)............................................................37
15
Tabela 15- Resultados da sorologia para doença de Chagas, erliquiose, babesiose,
toxoplasmose e neosporose em amostras de soro de 50 cães naturalmente infectados por
leishmaniose visceral, provenientes do município de Araçatuba. (Araçatuba-SP,
2006).....................................................................................................................................39
Tabela 16- Resultados da sorologia para doença de Chagas, erliquiose, babesiose,
toxoplasmose e neosporose em amostras de soro de 45 cães sadios provenientes de área
não endêmica para leishmaniose visceral. (Araçatuba-SP, 2006)........................................41
Quadro 1– Densidades ópticas médias (DO), por meio da técnica de ELISA para
leishmaniose visceral canina, de 50 cães naturalmente acometidos por leishmaniose
visceral provenientes do município de Araçatuba- SP. (Araçatuba-SP,
2006).....................................................................................................................................61
Quadro 2- Títulos de anticorpos anti-Leishmania sp. obtidos por meio de reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) para leishmaniose visceral, do soro de 49 cães
naturalmente acometidos por leishmaniose visceral provenientes do município de
Araçatuba- SP. (Araçatuba-SP, 2006)..................................................................................62
Quadro 3- Resultados da técnica de imunocromatografia para leishmaniose visceral,
classificadas em escores, variando de fraco positivo (1/2+) à forte positivo (3+), do soro de
50 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral provenientes do município de
Araçatuba. (Araçatuba-SP, 2006) ........................................................................................63
Quadro 4- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de ELISA para
leishmaniose visceral canina, do soro de 45 cães provenientes de área não endêmica para a
doença. (Araçatuba-SP, 2006)..............................................................................................64
Quadro 5- Títulos de anticorpos anti-Leishmania chagasi obtidos por meio de reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) para leishmaniose visceral, do soro de 45 cães
provenientes de área não endêmica para a doença. (Araçatuba-SP, 2006)...........................65
16
Quadro 6- Resultados da técnica de imunocromatografia para leishmaniose visceral,
classificadas em escores, variando de fraco positivo (1/2+) à forte positivo (3+), do soro de
45 cães provenientes de área não endêmica para a doença. (Araçatuba-SP, 2006)..............66
Quadro 7- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de ELISA, títulos
de anticorpos por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas
de imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro de 14 cães portadores de
doença de Chagas. (Araçatuba-SP, 2006).............................................................................67
Quadro 8- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de ELISA, títulos
de anticorpos por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas
de imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro de 13 cães portadores de
erliquiose. (Araçatuba-SP, 2006)..........................................................................................68
Quadro 9- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de ELISA, títulos
de anticorpos por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas
de imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro de 12 cães portadores de
babesiose. (Araçatuba-SP, 2006)..........................................................................................68
Quadro 10- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de ELISA, títulos
de anticorpos por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas
de imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro de seis cães com co-
infecção por erliquiose e babesiose. (Araçatuba-SP, 2006)..................................................69
Quadro 11- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de ELISA, títulos
de anticorpos por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas
de imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro de 10 cães portadores de
toxoplasmose. (Araçatuba-SP, 2006)....................................................................................69
17
Quadro 12- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de ELISA, títulos
de anticorpos por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas
de imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro de oito cães portadores
de neosporose. (Araçatuba-SP, 2006)...................................................................................70
Quadro 13- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de ELISA, títulos
de anticorpos por meio da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas
de imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro de 13 cães com co-
infecção por toxoplasmose e neosporose. (Araçatuba-SP, 2006).........................................70
18
LISTA DE FIGURAS
pag
FIGURA 1 - Percentual da ocorrência de reação cruzada entre amostras de soro de cães
portadores de doença de Chagas (C), toxoplasmose (T), neosporose (N), co-infecção por
toxoplasmose e neosporose (T/N), erliquiose (E), babesiose (B) e co-infecção por
erliquiose e babesiose (E/B), submetidas à técnica ELISA para o diagnóstico de
leishmaniose visceral canina. (Araçatuba –SP, 2006) .........................................................38
FIGURA 2 - Percentual da ocorrência de reação cruzada entre amostras de soro de cães
portadores de doença de Chagas (C), toxoplasmose (T), neosporose (N), co-infecção por
toxoplasmose e neosporose (T/N), erliquiose (E), babesiose (B) e co-infecção por
erliquiose e babesiose (E/B), submetidas à reação de imunofluorescência indireta (RIFI)
para o diagnóstico de leishmaniose visceral canina. (Araçatuba-SP, 2006).........................38
FIGURA 3 - Percentual da ocorrência de reação cruzada entre amostras de soro de cães
portadores de doença de Chagas (C), toxoplasmose (T), neosporose (N), co-infecção por
toxoplasmose e neosporose (T/N), erliquiose (E), babesiose (B) e co-infecção por
erliquiose e babesiose (E/B), submetidas à técnica de imunocromatografia para o
diagnóstico de leishmaniose visceral canina. (Araçatuba-SP, 2006)....................................39
19
SUMÁRIO
pag.
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................1
1.1.Leishmaniose Visceral Canina.............................................................................1
1.2 Doença de Chagas..............................................................................................10
1.3 Erliquiose Canina...............................................................................................12
1.4 Babesiose Canina...............................................................................................14
1.5 Toxoplasmose....................................................................................................16
1.6 Neosporose.........................................................................................................17
2 OBJETIVOS.....................................................................................................................20
3 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................21
4 RESULTADOS................................................................................................................29
5 DISCUSSÃO....................................................................................................................43
6 CONCLUSÕES................................................................................................................50
7 REFERÊNCIAS ..............................................................................................................51
ANEXOS ......................................................................................................................... 61
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Leishmaniose Visceral Canina
Etiologia e epidemiologia
A leishmaniose visceral, também conhecida como Calazar, é uma antropozoonose
causada por protozoários da ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e do gênero
Leishmania que infectam o cão e uma ampla variedade de vertebrados, incluindo o homem,
com larga distribuição nas regiões tropicais e subtropicais do planeta (ALENCAR et al.,
1991; KONTOS; KOUTINAS, 1993). A leishmaniose pode ser tegumentar ou visceral. A
espécie envolvida com a infecção na leishmaniose visceral depende da região geográfica,
sendo a Leishmania donovani o agente etiológico na Ásia e África; a Leishmania infantum
na Ásia, Europa e África, e a Leishmania chagasi nas Américas (SÃO PAULO, 2003).
Apesar da discordância entre pesquisadores, semelhanças estruturais verificadas por meio
de estudos moleculares sugerem que a L. chagasi e a L. infantum sejam a mesma espécie,
permitindo que alguns autores denominem de L. infantum o agente etiológico desta
enfermidade também nas Américas (MAURÍCIO et al., 1999).
A doença é endêmica em 87 países, incluindo 21 no Novo Mundo e 66 no Velho
Mundo e, de acordo com dados da Organização Mundial da Saúde, cerca de 90% dos casos
notificados ocorrem na Índia, Sudão, Bangladesh e Brasil (BORJA-CABRERA et al.,
2002).
No Brasil, a leishmaniose visceral humana já foi identificada em 19 dos 27 estados
da Federação e casos autóctones foram descritos em aproximadamente 1600 municípios
(MELO, 2004; SÃO PAULO, 2003)
. No estado de São Paulo, a doença canina foi
identificada pela primeira vez no município de Araçatuba no ano de 1998 e, desde então, já
foi descrita em 41 municípios, difundindo-se para outras regiões do estado, inclusive com
casos autóctones identificados na região metropolitana da cidade de São Paulo a partir do
ano de 2005 (REICHMAN, 2006; SÃO PAULO, 2003).
No município de Araçatuba, de
uma população canina estimada em 47.000 cães quando
do início da epidemia, cerca de 34.000 cães acometidos pela doença foram submetidos à
2
eutanásia no período compreendido entre 2002 a 2005
1
.
No passado a leishmaniose visceral era descrita como uma doença de ambientes
silvestres ou rurais, entretanto, as transformações ambientais provocadas pelo intenso
processo migratório e o processo de urbanização crescente levaram a uma expansão das
áreas endêmicas, com o aparecimento de novos focos, apontando a enfermidade como uma
doença reemergente (ALVES; BEVILACQUA, 2004; CASTRO, 1996; MELO, 2004).
A doença já foi identificada no cão, gato, canídeos silvestres, marsupiais e roedores
(BANETH, 2006; CASTRO, 1996; GENARO, 1993; SANTA ROSA; OLIVEIRA, 1997).
Os cães, considerados os principais reservatórios domésticos, são de grande importância na
manutenção do ciclo da doença, constituindo-se no principal elo na cadeia de transmissão
da leishmaniose visceral (MELO, 2004). Essa importância baseia-se no fato da
leishmaniose visceral ser mais prevalente na população canina que na humana, pela
constatação de que os casos humanos normalmente são precedidos por casos caninos e,
pelo fato dos cães apresentarem uma maior quantidade de parasitas na pele do que o
homem, o que favorece a infecção dos vetores (BANETH, 2006; CASTRO, 1996; SANTA
ROSA; OLIVEIRA, 1997; SCOTT et al.; 2001).
As leishmanias são protozoários pleomórficos que completam seus ciclos de vida
em dois hospedeiros, sendo um vertebrado (canídeos, roedores ou humanos) e um
invertebrado (KONTOS; KOUTINAS, 1993). Elas apresentam duas formas; uma
aflagelada ou amastigota, intracelular obrigatória, encontrada nas células do sistema
fagocítico mononuclear dos hospedeiros vertebrados e, outra, flagelada ou promastigota,
encontrada no tubo digestório dos insetos vetores (SÃO PAULO, 2003; SLAPPENDEL,
1988). Estes últimos são flebotomíneos pertencentes a várias espécies do gênero
Lutzomyia, conhecidos popularmente no Brasil como mosquito palha, birigui ou tatuquiras
(FEITOSA et al., 2000).
1
MORGADO, A.A. Chefe do Serviço de Controlo de Zoonoses do município de Araçatuba- SP. Dados
obtidos oralmente, 2006
3
Patogênese
Durante o repasto sanguíneo em um hospedeiro vertebrado infectado o
flebotomíneo ingere macrófagos parasitados por formas amastigotas de Leishmania sp., as
quais sofrem divisão binária, multiplicação e diferenciação em formas paramastigotas.
Estas colonizam o tubo digestório do vetor e diferenciam-se em formas promastigotas
metacíclicas, que são as formas infectantes. O ciclo biológico completa-se com a picada do
flebótomo infectado e subseqüente inoculação de formas promastigotas do parasita na
corrente sanguínea de um novo hospedeiro vertebrado, as quais diferenciam-se em formas
amastigotas no interior de macrófagos. Ocorre então a disseminação linfática para outros
tecidos ricos em células do sistema mononuclear fagocitário. A infecção dissemina-se para
linfonodos, baço e medula óssea dentro das primeiras horas (BANETH, 2006; KONTOS;
KOUTINAS, 1993).
Em camundongos demonstrou-se que os macrófagos, as células dendríticas e as
células de Langerhans, infectadas por parasitas, atuam como células apresentadoras de
antígenos ativando linfócitos (CD4+) Ta1 ou Ta2. Se forem ativadas preferencialmente as
células Ta1 ocorre a produção de citocinas pró-inflamatórias, as quais aumentam a
eficiência das células fagocíticas e de linfócitos citotóxicos, podendo haver controle do
parasitismo com a eliminação da infecção. Em contraste, quando a infecção está associada
com a indução de linfócitos Ta2, ocorre a produção de citocinas anti-inflamatórias,
proliferação de células B com subseqüente produção de imunoglobulinas e
desenvolvimento da infecção (CIARAMELLA; CORONA, 2003; FEITOSA et al., 2000;
FERRER, 2002a;
PINELLI et al., 1994). Um perigo potencial da regulação de linfócitos T
prejudicada e da atividade exuberante de linfócitos B é a geração de uma grande quantidade
de imunecomplexos circulantes, causando danos em vários órgãos (BANETH, 2006;
CIARAMELLA; CORONA, 2003; FEITOSA et al., 2000; FERRER et al., 1995;
KONTOS; KOUTINAS, 1993; NOLI, 1999). Na enfermidade natural, estão ativados tanto
os subtipos Ta1 quanto Ta2, sendo que a variedade dos sintomas e a gravidade da doença
dependem do equilíbrio entre esses dois sistemas (FEITOSA et al., 2000; PINELLI et al.,
1994).
4
Achados clínicos
Os sintomas da leishmaniose visceral canina variam em decorrência dos
mecanismos imunológicos ativados pelo hospedeiro bem como dos órgãos acometidos. As
manifestações clínicas da doença no cão e no homem são semelhantes e, freqüentemente,
incluem alterações inespecíficas tais como apatia, emagrecimento progressivo, hiporexia ou
anorexia, linfoadenomegalia,, hepatoesplenomegalia e hipertermia (FEITOSA et al., 2000).
Linfoadenomegalia generalizada e esplenomegalia são alterações bastante comuns
causadas por uma proliferação intensa de linfócitos B, histiócitos e macrófagos em resposta
à presença do parasita (CIARAMELLA; CORONA, 2003; KONTOS; KOUTINAS, 1993).
A perda de peso está freqüentemente relacionada ao envolvimento visceral, podendo
ocorrer mesmo em cães com normorexia (FEITOSA et al., 2000). Os cães podem ainda
apresentar uma atrofia muscular proeminente, particularmente em musculatura facial e
temporal (KONTOS; KOUTINAS, 1993). É comum a ocorrência de hipertermia
intermitente, com valores de temperatura variando entre 40,5
o
C e 41
o
C (FEITOSA et al.,
2000).
As alterações dermatológicas são bastante freqüentes em animais com leishmaniose
visceral. O cão pode apresentar tanto um pelame seco como uma seborréia oleosa,
acompanhada ou não de prurido e, muitas vezes, com contaminação bacteriana secundária.
Muitos animais apresentam uma excessiva descamação cutânea que pode, eventualmente,
tornar-se disseminada por todo o corpo. É comum a observação de áreas de rarefação pilosa
e alopecia, associadas ou não à ocorrência de exulcerações ou úlceras cutâneas (FEITOSA
et al., 2000; SCOTT et al., 2001; SLAPPENDEL, 1988). Em locais correspondentes a
saliências ósseas pode-se observar tanto áreas de hiperqueratose e lignificação como áreas
ulceradas, as quais estão, freqüentemente, relacionadas a uma ação direta do parasita ou a
uma vasculite necrotizante causada pela deposição de imunecomplexos (CIARAMELLA et
al., 1997). Alguns cães apresentam despigmentação cutânea, principalmente no plano nasal.
A onicogrifose é um achado relativamente comum e é causada pela presença do parasita
estimulando a matriz ungueal (FEITOSA et al., 2000; SCOTT et al., 2001; SLAPPENDEL,
1988).
5
As alterações oftálmicas acometem preferencialmente o segmento anterior do globo
ocular, sendo mais comum a blefarite associada à dermatite facial, embora não seja raro
observar ceratoconjuntivite seca (CIARAMELLA et al., 1997; NOLI, 1999). A uveíte,
geralmente bilateral, pode ser observada em associação com edema de córnea e formação
de sinéquias devido à presença de Leishmania sp. ou como conseqüência da deposição de
imunecomplexos na íris e corpo ciliar (FEITOSA, 2006).
Muitos cães com leishmaniose visceral apresentam epistaxe, normalmente
unilateral, moderada e intermitente. A provável causa é uma combinação de lesões
ulcerativas e inflamatórias na mucosa nasal (CIARAMELLA; CORONA, 2003; KONTOS;
KOUTINAS, 1993). É possível observar animais com quadro de diarréia crônica devido à
presença de ulcerações de mucosa gástrica e intestinal, resultando em fezes aquosas
acompanhadas de hematoquezia ou melena (CIARAMELLA; CORONA, 2003). A
deposição de imunecomplexos nos rins eventualmete resulta em glomerulonefrite
membranoproliferativa e nefrite tubulointersticial, podendo evoluir para uma insuficiência
renal crônica (FERRER, 2002b; KONTOS; KOUTINAS, 1993).
Dentre os sintomas neurológicos já observados em cães naturalmente acometidos
por leishmaniose visceral destacam-se as convulsões, as alterações em pares de nervos
cranianos (estrabismo, ptose facial e disfagia), alterações de locomoção tais como andar
compulsivo e em círculos, lesões vestibulares evidenciadas por ataxia e nistagmo e,
alterações cerebelares com ocorrência de tremor de intenção. Tais sintomas podem ser
decorrentes da deposição de imunecomplexos ou por infecções oportunistas no sistema
nervoso central (CIARAMELLA et al., 1997; FEITOSA et al., 2005).
Diagnóstico
O diagnóstico clínico da leishmaniose visceral canina é difícil de ser realizado
devido à variedade de sintomas da doença. Os achados clínicos não são patognomônicos da
doença e podem sugerir outras enfermidades, tornando o diagnóstico imunológico ou
parasitológico necessários para a confirmação da suspeita (FEITOSA et al., 2000;
FEITOSA, 2006; SINGH et al., 2003). Por outro lado, enquanto a prevalência da infecção
em cães em áreas endêmicas pode chegar a mais de 50%, a prevalência da doença varia
6
entre três e 10%, demonstrando que a maioria dos cães infectados não desenvolve sintomas,
dificultando mais ainda o diagnóstico (FERRER, 2002a). Esses animais podem permanecer
assintomáticos por toda a vida ou desenvolver sintomas após períodos que variam de três
meses a alguns anos (FERRER et al., 1995).
Os achados do hemograma, da urinálise ou de determinações bioquímicas são
inespecíficos (GRADONI, 2002). A alteração hematológica mais freqüente na leishmaniose
visceral canina é a anemia, que pode variar de leve a grave e apresentar caráter regenerativo
ou arregenerativo. Uma leucocitose por neutrofilia, quando presentes, estão normalmente
associados a um quadro de infecção bacteriana secundária. As alterações em linfócitos são
pouco freqüentes, porém a presença de monocitose é comum, muitas vezes acompanhada
de grandes monócitos ativados. A presença de formas amastigotas nos esfregaços
sangüíneos é um achado raro (IKEDA et al., 2003). Nas fases finais da doença observa-se
também trombocitopenia, no entanto a contagem plaquetária pode ser normal
(CIARAMELLA; CORONA, 2003; FEITOSA et al., 2000). As alterações da urinálise ou
de avaliações bioquímicas refletem, normalmente, um comprometimento renal ou hepático
em decorrência da doença. Muitos animais portadores de leishmaniose visceral apresentam
hiperglobulinemia, conseqüência do aumento das frações beta e gama, associada à
hipoalbuminemia (BANETH, 2006; CIARAMELLA et al., 1997; FEITOSA et al., 2000).
A confirmação do diagnóstico da leishmaniose visceral pode se basear em métodos
parasitológicos, sorológicos e moleculares. Apesar de discordâncias entre alguns autores, o
exame parasitológico é considerado, ainda, o teste ouro para o diagnóstico da doença (DYE
et al., 1993; LEONTIDES et al., 2002; SINGH et al., 2003). Podem ser observadas formas
amastigotas do parasita em esfregaços de linfonodos, medula óssea, aspirado esplênico,
biópsia hepática e esfregaços sangüíneos corados com corantes de rotina, tais como
Giemsa, Wright e Panótico. As formas amastigotas são reconhecidas pela sua forma
esférica a ovóide, medindo 2-5 µm e contendo um núcleo arredondado e um cinetoplasto
alongado (SWENSON et al., 1988; WOLSCHRIJN et al., 1996). Na dependência do
tempo dispendido procurando o
parasita, a sensibilidade passa a ser de, no máximo, 80% em cães sintomáticos e menor em
cães assintomáticos. A sensibilidade depende do grau de parasitemia, do tipo de material
biológico coletado e do tempo de leitura da lâmina (WOLSCHRIJN et al., 1996). Em
7
alguns pacientes a visualização de parasitas é muito laboriosa e os resultados negativos não
são incomuns, especialmente nos casos crônicos (IKEDA-GARCIA; FEITOSA, 2006;
SLAPPENDEL, 1988).
A detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. circulantes utilizando técnicas
sorodiagnósticas constitui-se no instrumento mais utilizado para o diagnóstico da
leishmaniose visceral canina. Animais doentes desenvolvem principalmente uma resposta
imune humoral e produzem altos títulos de IgG anti-Leishmania sp. A soroconversão
ocorre aproximadamente três meses após a infecção e os títulos permanecem elevados por,
pelo menos, dois anos. Entretanto, os testes sorológicos devem ser interpretados com
cautela, uma vez que não são 100% sensíveis e falham em detectar cães infectados no
período pré-patente e antes da soroconversão, cães que nunca farão soroconversão e cães
soropositivos que se convertem em soronegativos mas ainda permanecem infectados
(FERRER, 2002a; FERRER et al., 1995; IKEDA-GARCIA; FEITOSA, 2006;
LEONTIDES et al., 2002). Animais com menos de três meses de idade não devem ser
avaliados através de métodos sorológicos pois podem apresentar resultados positivos pela
presença de anticorpos maternos (BRAGA et al., 1998).
Muitos testes sorológicos podem ser utilizados tais como fixação de complemento,
hemaglutinação indireta, imunofluorescência indireta, ELISA, imunoprecipitacão em gel e
western blot (ALVES; BEVILACQUA, 2004; CIARAMELLA; CORONA, 2003;
FERRER et al., 1995; SCALONE et al., 2002; VERCAMMEN et al., 1997). As técnicas
sorológicas recomendadas atualmente pelo Ministério da Saúde para o inquérito
epidemiológico canino são a imunofluorescência indireta e o ELISA. Na reação de
imunofluorescência indireta, o ponto de corte situa-se no título igual a 1:40 e, no ELISA, o
ponto de corte é determinado a partir da densidade óptica média acrescida de três desvio-
padrões de um grupo controle negativo (BRASIL, 2003; SANTA ROSA; OLIVEIRA,
1997). Para a determinação do ponto de corte da reação de ELISA, a média das densidades
ópticas de animais sadios podem ser acrescidas de dois e cinco desvios (EVANS et al.,
1990; MANCIANTI et al., 1995; RAJASEKARIAH et al., 2001). As alterações dos valores
do ponto de corte podem, conseqüentemente, alterar a sensibilidade e especificidade do
método de ELISA (FERRER, 1995).
A RIFI tem sido a técnica sorológica mais utilizada no diagnóstico da leishmaniose
8
visceral canina, particularmente em inquéritos epidemiológicos (BRASIL, 2003),
entretanto, possui a desvantagem de que, quando da análise de um grande número de
amostras, o tempo dispendido pelo profissional para a leitura das lâminas é muito grande
(RACHAMIN et al., 1991). A reação de imunofluorescência indireta (RIFI) demonstra
sensibilidade que varia entre 90 e 100% e especificidade entre 80 e 100% (ALVES;
BEVILACQUA, 2004; METTLER et al., 2005). De acordo com Mancianti et al. (1995),
esta reação pode determinar valores de sensibilidade e especificidade de 98,4% e 100%,
respectivamente. A especificidade desta prova é prejudicada devido à ocorrência de reações
cruzadas com doenças causadas por outros tripanosomatídeos, tais como o agente causador
da doença de Chagas. Portanto, seus resultados não devem ser utilizados como indicadores
de infecção leishmaniótica específica, particularmente em áreas onde a doença de Chagas é
endêmica (ALVES; BEVILACQUA, 2004; COSTA et al., 1991). Existem, na literatura,
inúmeros relatos da ocorrência de reação sorológica cruzada entre os membros da família
Trypanosomatidae, envolvendo, principalmente, os protozoários L. chagasi, L. braziliensis
e Trypanosoma. cruzi, os quais possuem uma relação filogenética muito estreita. No
entanto, a ocorrência de reação cruzada entre leishmaniose visceral canina e outros agentes
etiológicos por meio dos métodos sorológicos ainda é motivo de discordâncias na medicina
veterinária. Antígenos de superfície e antígenos dos microtúbulos do citoesqueleto do
protozoário são comuns a todos os tripanosomatídeos o que justifica a ocorrência de reação
cruzada entre eles (BADARÓ et al., 1986). Já, com relação à ocorrência de reação cruzada
com outras enfermidades, Vercammen et al. (1997), utilizando amostras de soro de três
cães infectados por Babesia sp. e de um cão infectado por Ehrlichia sp., não observaram
resultados positivos quando da realização da RIFI para leishmaniose visceral.
O teste de ELISA para pesquisa de anticorpos anti-Leishmania sp. apresenta,
dependendo do antígeno empregado, uma sensibilidade que varia entre 95% e 99,5% e uma
especificidade entre 97,1% a 100% (LAURENTI et al., 2005; MANCIANTI et al., 1995).
Há, contudo, discordâncias entre alguns autores, os quais descreveram valores de
sensibilidade e especificidade de 80 e 81%, respectivamente (ASHFORD et al., 1995) e
outros que observaram valores de 100% para ambos os índices (VERCAMMEN et al.,
1997). A sensibilidade e especificidade deste método dependem do tipo de antígeno
empregado (espécie ou forma evolutiva do parasita) e de mudanças no protocolo
9
experimental padrão (tempo de incubação ou tipo de microplacas utilizadas)
(REINTHINGER et al., 2002). As técnicas que utilizam antígenos totais são limitadas em
termos de especificidade, apresentando reações cruzadas não somente com outras espécies
da família Trypanosomatidae, mas também com organismos filogeneticamente distantes
(MELO, 2004; RACHAMIN et al., 1991). Enquanto alguns trabalhos apontam para a
ocorrência de reação cruzada entre leishmaniose visceral e babesiose canina ou doença de
Chagas por meio da técnica de ELISA (ROSÁRIO et al., 2005), outros afirmam não existir
reação cruzada com erliquiose e babesiose (LIMA et al., 2005; VERCAMMEN et al.,
1997), toxoplasmose (LIMA et al., 2005) e doença de Chagas (VERCAMMEN et al.,
1997).
Com o objetivo de tentar elevar a sensibilidade e a especificidade das provas
sorológicas, têm sido utilizados antígenos purificados como as glicoproteínas de membrana
gp63, gp72, gp70 específicas do gênero Leishmania, entretanto, ainda assim podem ocorrer
reações cruzadas com outros tripanosomatídeos (ALVES; BEVILACQUA, 2004;
BADARÓ et al., 1986; SCALONE et al., 2002; VEXENAT et al., 1996). Alguns antígenos
recombinantes, como o rK39, o rK9 e o rK26, foram geneticamente desenvolvidos e
parecem conferir grande sensibilidade quando da realização da sorologia (BHATIA et al.,
1999; ROSATI et al., 2003).
Além das provas sorológicas de rotina existem testes comerciais de
imunocromatografia utilizados tanto em humanos quanto em animais (BERN et al., 2000;
CARVALHO et al., 2003; GRADONI, 2002; REITHINGER et al., 2002; SUNDAR et al.,
2002). A maioria destes consiste de métodos que empregam anticorpos monoclonais anti-
IgG de cão e antígenos de Leishmania de diferentes fontes. Eles são atrativos devido à
simplicidade de uso e à rápida resposta (cerca de 10 minutos)
(GRADONI, 2002). A
sensibilidade e a especificidade destes testes, utilizando o antígeno recombinante rK39 para
o diagnóstico da leishamniose visceral humana variam, de acordo com a literatura, de 90 a
100% e de 93 a 100%, respectivamente (BERN et al., 2000; CARVALHO et al., 2003;
SUNDAR et al., 2002). Já na avaliação do teste de imunocromatografia para detecção de
leishmaniose visceral canina, enquanto alguns autores descreveram valores de sensibilidade
entre 84 e 92,1% e de especificidade entre 99 e 100% (LAURENTI et al., 2005; MELO,
2004), outros observaram uma sensibilidade de 100% e especificidade de 75%
10
(REITHINGER et al., 2002). Apesar dos relatos de que os testes de imunocromatografia
podem levar a uma grande proporção de diagnósticos falso positivos, existem discordâncias
quanto à ocorrência de reação cruzada do antígeno rK39 com Leishmania braziliensis ou T.
cruzi (REITHINGER et al., 2002).
O método do PCR (reação em cadeia da polimerase) através do qual é possível
identificar e amplificar seletivamente o DNA do parasita
(BANETH, 2006; NOLI, 1999),
constitui-se em uma nova perspectiva para o diagnóstico da leishmaniose visceral pois
apresenta sensibilidade e especificidade muito elevadas, próximas a 100% (ASHFORD et
al., 1995; ROURA et al., 1999). A principal desvantagem das técnicas moleculares é que
elas requerem laboratórios bem equipados (BRASIL, 2003).
A importância do diagnóstico da leishmaniose visceral canina no Brasil reside no
fato de que dentre as estratégias de controle da doença indicadas pela Fundação Nacional
de Saúde encontra-se a eliminação do cão doméstico infectado (CASTRO, 1996; SANTA
ROSA; OLIVEIRA,1997;
SÃO PAULO, 2003). As limitações associadas ao exame
parasitológico, tais como a dificuldade de punção de medula óssea em animais obesos,
dificuldade de obtenção de material quando da punção de linfonodos de tamanhos
reduzidos e, muitas vezes, a falta de experiência do profissional na identificação do
parasita, fazem, do método sorológico uma ferramenta útil no diagnóstico da leishmaniose
visceral por se tratar de uma técnica pouco invasiva, acessível para a a maioria dos clínicos
veterinários e que demonstra uma sensibilidade superior aos métodos parasitológicos. Em
se tratando de um programa de controle de doença baseado na eliminação do reservatório, é
de extrema importância o conhecimento da sensibilidade e da especificidade das provas
sorológicas utilizadas para a correta identificação de fontes de infecção, evitando-se as
taxas de positividade equivocadas.
Nesse contexto, um ponto a ser considerado é a possibilidade de reações cruzadas
entre leishmaniose visceral, doença de Chagas, erliquiose, babesiose, toxoplasmose e
neosporose; enfermidades comumente observadas numa mesma região geográfica e, cujo
diagnóstico diferencial torna-se muitas vezes dificultado pela semelhança entre alguns
sintomas e entre alterações laboratoriais .
Em áreas endêmicas para leishmaniose visceral os métodos sorológicos são
rotineiramente utilizados como exame de triagem para descartar a possibilidade de infecção
11
por L. chagasi em cães com alterações clínicas compatíveis com a doença, antes mesmo de
se investigar outros possíveis diagnósticos diferenciais. Quando a sorologia é utilizada
como único método de diagnóstico da leishmaniose visceral canina a ocorrência de reação
cruzada pode implicar na eutanásia de um animal acometido por outro agente passível de
tratamento. Como não existem métodos sorológicos perfeitos, o profissional deve optar
pelo método que reúna as qualidades desejadas para cada tipo de situação. No entanto, a
literatura diverge sobre qual o teste mais preciso para o diagnóstico de doença, assim como
diverge quanto à sensibilidade e especificidade das técnicas sorológicas, havendo a
necessidade de mais estudos acerca destes indicadores para a escolha de um método
apropriado, simples, sensível e específico.
1.2 Doença de Chagas
A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana é uma
importante zoonose causada pelo Trypanosoma cruzi, protozoário pertencente à ordem
Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e ao gênero Trypanosoma, com distribuição
exclusivamente no continente americano, onde estima-se que 16 a 18 milhões de pessoas
estejam infectadas (APT et al., 1998; DEDET; PRATLONG, 2000; PASSOS et al., 1997).
Mais da metade destes casos encontram-se nos países do cone sul, como Argentina,
Bolívia, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai. Os cães, além de serem importantes
reservatórios domésticos do T. cruzi na maioria destes países, são também vítimas da
doença, desenvolvendo alterações clínicas que se assemelham àquelas observadas em
humanos (MONTENEGRO et al., 2002).
A transmissão do T. cruzi se dá pelas fezes que o triatomíneo infectado deposita
sobre a pele enquanto suga o sangue do hospedeiro vertebrado. Geralmente a picada
provoca prurido e o ato de coçar facilita a penetração do tripanossomo pelo local da picada.
O T.cruzi, contido nas fezes do barbeiro, pode também penetrar por membranas mucosas
dos olhos, narinas e cavidade oral ou através de feridas ou cortes recentes existentes na pele
(BARR, 2006; MAYWALD et al., 1996).
Após a infecção as tripomastigotas penetram nas células do hospedeiro,
12
multiplicam-se e são transportadas através do organismo principalmente no interior de
macrófagos. A parasitemia desenvolve-se dentro de poucos dias , com pico entre duas e
quatro semanas pós inoculação, coincidindo com a fase aguda da doença. (ALVES, 2003;
BARR, 2006). Esta ocorre principalmente em cães com menos de um ano de idade
(BARR, 2006; LANA et al., 1992; MEURS et al., 1998). A patogênese desta fase resulta de
dano celular à medida que as tripomastigotas rompem células do hospedeiro,
especialmente miócitos cardíacos e, em alguns casos, células do tecido nervoso (BARR,
2006; BERGER et al., 1988). Durante a fase aguda pode-se observar uma
linfoadenomegalia generalizada e hipertermia (ALVES, 2003). Sintomas decorrentes de
uma miocardite aguda, tais como colapso ou morte súbita em cães jovens, têm sido
freqüentemente descritos. É comum a observação de membranas mucosas pálidas, pulso
fraco, taquiarritmias e dispnéia. Cães infectados que sobrevivem a esta fase podem
desenvolver ascite, hepato e esplenomegalia decorrentes de insuficiência cardíaca
congestiva direita. Anorexia e diarréia também podem ser observados na fase aguda.
Alterações neurológicas incluem paresia e ataxia de membros pélvicos (ANDRADE et al.,
1997; BARR, 2006). Animais que sobrevivem à miocardite aguda desenvolvem uma
miocardiopatia crônica, com aumento cardíaco global, principalmente de câmara
ventricular direita (ALVES, 2003).
O diagnóstico da doença de Chagas pode ser realizado por meio de exames
parasitológicos ou sorológicos, na dependência da fase da doença. Na fase aguda as formas
tripomastigotas do T. cruzi são facilmente detectáveis por meio do exame microscópico
direto de sangue do animal infectado (BRENIERE et al., 1985). Após o intenso
parasitismo sanguíneo inicia-se a fase crônica assintomática ou latente, em que o grau de
parasitemia sofre uma queda considerável em virtude da mobilização da defesa específica
do hospedeiro, o que torna difícil o encontro das formas tripomastigotas (ALVES, 2003).
Nesse estágio da doença, quando as formas do parasita são pobremente identificadas na
circulação sanguínea, o diagnóstico deve ser baseado na identificação de anticorpos anti-T.
cruzi circulantes (BRENIERE et al., 1985, ALVES, 2003).
Reações cruzadas entre T. cruzi e Leishmania sp. por meio de métodos sorológicos,
tais como RIFI e ELISA, podem induzir a dados epidemiológicos distorcidos,
particularmente em áreas onde as duas enfermidades co-existem, além de promover
13
dificuldades no diagnóstico e tratamento dos animais (LEMESRE et al., 1986). Pacientes
infectados por T. cruzi na fase crônica assintomática podem ser falsamente diagnosticados
como portadores de leishmaniose visceral quando estes apresentam lesões cutâneas
causadas por outros agentes, que não pelos tripanosomatídeos. Por outro lado, um indivíduo
previamente infectado por Leishmania sp. apresentando problemas cardíacos pode ser
falsamente diagnosticado como portador de doença de Chagas (PASSOS et al., 1997).
1.3 Erliquiose canina
A erliquiose é uma enfermidade causada por bactérias intracitoplasmáticas,
gram negativas, transmitidos por carrapatos, que infectam leucócitos e plaquetas de várias
espécies de animais domésticos (MACHADO, 2004; MORAES et al., 2004). A doença é
transmitida por meio da picada do carrapato, Rhipicephalus sanguineus, e tem distribuição
mundial (BULLA et al., 2004), de ocorrência comum no Brasil. De acordo com uma
avaliação sorológica realizada no estado de São Paulo, aproximadamente 20% dos cães
atendidos em hospitais e clínicas veterinárias apresentaram anticorpos contra E. canis
(MACHADO, 2004; MORAES et al., 2004). Em um estudo soroepidemiológico realizado
na região sul do país, em Londrina – PR, envolvendo 381 cães selecionados aleatoriamente,
foi demonstrada uma soroprevalência de 23% para E. canis, empregando-se a técnica de
ELISA (TRAAP et al., 2006).
Por apresentar curso clínico extremamente variável, a erliquiose torna-se um
importante diagnóstico diferencial para muitas doenças (TROY et al., 1980)
incluindo a
leishmaniose visceral, devido à semelhança das alterações clínicas manifestadas pelas duas
enfermidades (NOLI, 1999).
Durante o período de incubação de oito a 20 dias os organismos multiplicam-se,
por meio de fissão binária, em macrófagos do sistema mononuclear fagocitário,
disseminando-se por todo o organismo. O subsequente curso da doença divide-se em três
fases, quais sejam; aguda, subclínica e crônica. A fase aguda persiste por duas a quatro
semanas, durante as quais observam-se sintomas tais como anorexia, hipertemia,
corrimento nasal, depressão, mucosas hipocoradas, linfoadenomegalia, esplenomegalia,
14
petéquias e equimoses (NEER; HARRUS, 2006). É comum a ocorrência de uveíte anterior
e alterações do segmento posterior do globo ocular tais como corioretinite, papiledema e
hemorragia retiniana, que podem resultar em cegueira aguda. Cães com erlichiose também
podem desenvolver claudicação secundária a uma poliartropatia por deposição de
imunecomplexos (GOULD et al., 2000). Animais não tratados ou submetidos a tratamento
de forma incorreta podem evoluir para uma fase subclínica, durante a qual ocorre ganho de
peso do animal e resolução da hipertermia. Cães imunocompetentes podem eliminar a
Ehrlichia sp. ou tornar-se reservatórios para toda a vida e, eventualmente, desenvolver a
fase crônica da doença. A fase crônica, em sua forma severa, caracteriza-se por produção
prejudicada de elementos sanguíneos pela medula óssea, levando a um quadro de
pancitopenia. Nesta fase os cães geralmente morrem de infecções secundárias e
hemorragias incontroláveis (NEER; HARRUS, 2006) Apesar do sangramento poder
ocorrer em qualquer superfície mucosa a epistaxe é mais freqüentemente observada. Os
sinais neurológicos, apesar de pouco comuns, são resultado de um quadro de meningite
devido a um processo inflamatório ou à hemorragias. Pode-se observar convulsões, estupor,
ataxia, disfunção cerebelar ou vestibular, anisocoria, tremor de intenção e hiperestesia
localizada ou generalizada (MARETZKI et al., 1994).
Os níveis de IgG começam a se elevar 15 dias pós infecção, geralmente com
hipergamaglobulinemia policlonal, apesar de poder ocorrer gamopatia monoclonal em
alguns animais. Os altos títulos de anticorpos não fornecem proteção, pelo contrário, podem
levar a uma piora na progressão da doença devido a seus efeitos imunopatológicos, uma
vez que muitas das manifestações clínicas da doença são imunomediadas (NEER;
HARRUS, 2006).
A alteração hematológica mais comum é a trombocitopenia, presente em qualquer
fase da doença em aproximadamente 84% dos casos. Esta pode ser resultante de destruição
imunemediada, diminuição na produção, aumento no consumo de plaquetas, diminuição da
meia-vida ou seqüestro esplênico de plaquetas. Anemia de caráter arregenerativo e
leucopenia também são observadas na maioria dos casos (BULLA et al., 2004;
MACHADO, 2004). Em áreas endêmicas para as duas enfermidades a erliquiose associada
a um quadro de leishmaniose pode complicar os sintomas da última e, particularmente,
contribuir para suas anormalidades hematológicas (NOLI, 1999).
15
O diagnóstico definitivo da doença pode ser baseado na identificação de mórulas
da Ehrlichia sp. em leucócitos de esfregaços sanguíneos, principalmente na fase aguda da
doença, ou de punções biópsias aspirativas de fígado, pulmão, linfonodos e medula óssea.
O achado de mórulas é difícil e consome muito tempo, mas pode ser otimizado realizando-
se esfregaços sanguíneos de um leito capilar periférico, como por exemplo da margem da
orelha. O diagnóstico de erliquiose também pode-se basear em resultados sorológicos
positivos por meio da reação de imunofluorescência indireta (MYLONAKIS et al., 2003).
Estes testes detectam anticorpos séricos tão precocemente quanto sete dias pós infecção,
apesar de que alguns cães tornam-se soropositivos somente após 28 dias. Devido à
persistência de títulos pós-tratamento ou recuperação clínica, um título positivo não
significa necessariamente que o quadro clínico do animal seja resultante de erliquiose,
especialmente em áreas endêmicas onde cães assintomáticos possuem títulos sorológicos
para E. canis (NEER; HARRUS, 2006).
1.4 Babesiose canina
A babesiose canina é uma doença de distribuição mundial causada por diferentes
espécies de Babesia sp. (FURTANELLO et al., 2005; TABOADA; LOBETTI, 2006;
TABOADA; MERCHANT, 1991), hemoprotozoários que infectam os eritrócitos
promovendo um quadro hemolítico manifestado clinicamente por anemia e icterícia de
intensidades variáveis. O cão, hospedeiro doméstico mais importante, pode ser parasitado
por duas espécies diferentes: Babesia canis, mais freqüente nos países tropicais, incluindo o
Brasil, e Babesia gibsoni, encontrada principalmente no norte e oeste da África, sudeste
asiático e, de forma endêmica, no sudoeste dos Estados Unidos da América (BRANDÃO;
HAGIWARA, 2002).
Os principais vetores envolvidos na transmissão da Babesia canis são carrapatos da
espécie Rhipicephalus sanguineus, o carrapato vermelho do cão. Entretanto, outras
espécies, como Dermacentor ssp., Hyaloma plumbeum e Haemaphisalis leachi também
podem transmitir o agente (BRANDÃO; HAGIWARA, 2002; TABOADA; MERCHANT,
1991).
A babesiose pode, clinicamente, seguir cursos hiperagudos, agudos, crônicos ou
16
subclínicos. A apresentação hiperaguda caracteriza-se pelo desenvolvimento de choque
hipotensivo, hipóxia e dano tecidual extenso, sendo observada geralmente em filhotes com
elevado grau de parasitemia e histórico de ixodidiose acentuada (TABOADA; LOBETTI,
2006; TABOADA; MERCHANT, 1991). Sintomas da forma hiperaguda, algumas vezes
referida como babesiose cerebral, tais como ataxia e convulsões, podem demonstrar um
comprometimento neurológico provavelmente decorrente da estase de eritrócitos
parasitados no interior dos capilares do sistema nervoso central. Grande parte dos cães que
desenvolve esta forma da doença vem a óbito mesmo com o tratamento (ABDULLAHI et
al., 1990; TABOADA; MERCHANT, 1991).
Já a forma aguda, síndrome clínica mais comumente observada, caracteriza-se por
febre, letargia, anemia hemolítica, anorexia, linfoadenomegalia, esplenomegalia e êmese
(ABDULLAHI et al., 1990 e TABOADA; LOBETTI, 2006). Complicações observadas em
casos de intensa parasitemia incluem distúrbios dos sistemas respiratório, gastrointestinal,
vascular e musculoesquelético. Manifestações respiratórias de vias aéreas superiores são
ocasionalmente observadas, sendo geralmente brandas e auto-limitantes, prontamente
responsivas ao tratamento. As manifestações gastrointestinais incluem êmese e
eventualmente diarréia. Raramente ocorrem hemorragias, que variam de petéquias à
equimoses secundariamente à trombocitopenia ou à coagulação intravascular disseminada.
Além desses sintomas, em muitos animais infectados observa-se uma glomerulonefrite
membranoproliferativa de caráter imunemediado que pode culminar em insuficiência renal
aguda. A icterícia em casos de babesiose pode ser causada por hemólise e, principalmente,
por disfunções hepáticas (TABOADA; LOBETTI, 2006; TABOADA; MERCHANT,
1991).
As anormalidades hematológicas mais comumente encontradas na babesiose canina
são anemia e trombocitopenia. A reticulocitose é proporcional à severidade da anemia
(FURTANELLO et al., 2005). As anormalidades leucocitárias incluem leucocitose,
leucopenia, neutrofilia ou neutropenia, linfocitose e eosinofilia (FURTANELLO et al.,
2005). A discordância das informações relativas ao leucograma na babesiose canina pode
estar relacionada ao momento em que a avaliação é feita (HAGIWARA; HOLZCHUH,
1987). A trombocitopenia isolada é observada em muitos casos de babesiose e pode estar
relacionada ao consumo imune ou coagulatório de plaquetas por injúrias hemolíticas ou
17
vasculares (TABOADA; LOBETTI, 2006).
O diagnóstico da babesiose pode ser realizado por meio da visualização do
protozoário em esfregaços de sangue, porém, devido à dificuldade de identificação do
parasita em pacientes crônicos os métodos sorológicos podem ser empregados para
identificação de anticorpos anti-Babesia sp. nos animais infectados, sendo a RIFI o teste
mais comumente utilizado. O método de ELISA também tem sido utilizado para detecção
de anticorpos anti-Babesia sp., com resultados mais sensíveis e menos específicos do que
aqueles da reação de imunofluorescência indireta. Testes sorológicos utilizando antígenos
totais podem levar a resultados falso positivos para Toxoplasma gondii e Neospora
caninum (TABOADA; LOBETTI, 2006).
1.5 Toxoplasmose
A toxoplasmose é uma zoonose com ampla distribuição mundial causada pelo
Toxoplasma gondii, um protozoário intracelular obrigatório que pode acometer qualquer
mamífero e tem como único hospedeiro definitivo os felídeos (HIGA et al., 2000;
AZEVEDO et al., 2004). O ciclo biológico do parasito compreende três estágios
infectantes: (1) os taquizoítos, formas que se multiplicam rapidamente; (2) os bradizoítos,
formas de lenta multiplicação, encontrados nos cistos teciduais e (3) os esporozoítos
encontrados em oocistos. Enquanto os taquizoítos e bradizoítos ocorrem nos tecidos de
todos os animais infectados, os oocistos são excretados somente nas fezes dos gatos
(DUBEY; LAPIN, 2006; IKEDA et al., 2005).
Os principais meios de transmissão são a infecção congênita, ingestão de tecidos
infectados e ingestão de água ou alimentos contaminados com oocistos. A toxoplasmose e a
sororeatividade ao T. gondii são mais prevalentes em animais mais velhos devido ao
aumento de exposição com a idade, e em animais de zonas rurais que possuem o hábito de
caçar pequenos mamíferos (DUBEY; LAPPIN, 2006).
Levantamentos sorológicos utilizando a reação de imunofluorescência indireta,
realizados em diferentes cidades do país, demonstraram valores positivos em 91% dos 657
cães testados na cidade de Campinas; 63,8% em 1256 amostras obtidas no Centro de
Controle de Zoonoses da Cidade de São Paulo e 47,3% em 243 animais de Belo Horizonte
18
(BRITO et al., 2002).
Os sintomas da toxoplasmose em cães são variáveis e dependem da idade, da
presença de infecções concomitantes, da severidade da infecção e dos órgãos afetados
(PAIXÃO; SANTOS, 2004). Os sintomas podem estar associados aos sistemas respiratório,
neuromuscular ou gastrointestinal e são manifestados por anorexia, hipertermia, letargia,
diarréia intermitente, secreção nasal e ocular, tosse e convulsões. A toxoplamose
generalizada é observada principalemete em cães jovens com menos de um ano de idade e
caracteriza-se por febre, tonsilite, dispnéia, diarréia e êmese. Pode-se observar icterícia
decorrente de necrose hepática extensa. Os sintomas mais observados em cães mais velhos
tem sido associados com o sistema nervoso e muscular. Os sinais neurológicos dependem
da localização da lesão no encéfalo ou medula espinhal e incluem convulsões, alterações de
nervos cranianos, tremores, ataxia, paresia e paralisia. Cães com miosite também podem
apresentar alterações locomotoras. Lesões oculares associadas à toxoplasmose em cães
incluem retinite, uveíte anterior e neurite óptica (DUBEY; LAPPIN, 2006; PAIXÃO;
SANTOS, 2004).
Aproximadamente por volta da terceira semana pós-infecção os taquizoítos
começam a desaparecer dos tecidos transformando-se em cistos teciduais contendo
bradizoítos. Esta fase está associada com uma resposta imune sistêmica que inibe a
parasitemia. Estes cistos podem persistir no hospedeiro por toda a vida e podem,
eventualmente, sofrer ruptura liberando bradizoítos que iniciam uma recidiva clínica
durante um período de imunossupressão. Casos de toxoplasmose têm sido descritos em
associação à cinomose e outras doenças imunossupressoras tais como erliquiose e
leishmaniose visceral (DUBEY; LAPPIN, 2006,
IKEDA et al., 2005).
Múltiplos testes sorológicos têm sido utilizados para detecção de anticorpos no
diagnóstico da toxoplasmose, entretanto, a confirmação do diagnóstico deve-se basear na
elevação do título em amostras pareadas (DOMINGUES et al., 1998; DUBEY; LAPPIN,
2006).
1.6 Neosporose canina
Neospora caninum é um protozoário intracelular obrigatório, do filo Apicomplexa,
19
que apresenta estreita semelhança estrutural e biológica com o T. gondii. Devido às
similaridades morfológicas, o N. caninum era erroneamente identificado como T. gondii até
1988, quando foi identificado pela primeira vez. A doença acomete várias espécies de
herbívoros porém, os canídeos são considerados os hospedeiros definitivos do protozoário.
Em cães, as principais vias de infecção são a ingestão de cistos teciduais e a via
transplacentária (DUBEY; LAPPIN, 2006).
O ciclo de vida do N. caninum é semelhante ao do T. gondii. Após a ingestão de
cistos ocorre a liberação de bradizoítos que se diferenciam em taquizoítos e disseminam-se
sistemicamente, podendo multiplicar-se em vários tipos celulares. Com o desenvolvimento
de imunidade contra o protozoário ocorre a formação de cistos teciduais que são
demonstrados apenas no sistema nervoso central e tecido muscular (BARBER et al., 1996;
DUBEY; LAPPIN, 2006; PAIXÃO; SANTOS, 2004).
A neosporose pode ser fatal em cães de qualquer idade, mas tende a ser mais grave
em filhotes infectados congenitamente. Cães com até seis meses de idade normalmente
apresentam paralisia flácida de membros pélvicos, que ascende progressivamente para os
anteriores sem, no entanto, demonstrar alteração de consciência. Estes sintomas podem
estar associados à atrofia e contratura muscular gradativa dos membros acometidos. Alguns
filhotes podem, ainda, apresentar deformações articulares, ventroflexão cervical, disfagia e
megaesôfago (DUBEY; LAPPIN, 2006; PAIXÃO; SANTOS, 2004).
Os cães adultos e idosos normalmente desenvolvem a doença devido a uma
agudização de uma doença crônica assintomática. Quando acometidos, os cães apresentam
envolvimento multifocal do sistema nervoso central, associado ou não à polimiosite. As
alterações clínicas incluem paraparesia que pode evoluir para tetraparesia, distúrbios
vestibulares, convulsões, alterações comportamentais, hiperestesia difusa e hipotonia
muscular. Outras complicações menos freqüentes incluem a ocorrência de uma miocardite e
pneumonia (BARBER; TREES, 1996). Uma forma cutânea da enfermidade tem sido
observada em cães apresentando doença imunossupressora concomitante (ORDEIX et al.,
2002). Em casos de envolvimento neurológico pode ocorrer morte de animais de qualquer
idade (DUBEY; LAPPIN, 2006).
O diagnóstico de neosporose é realizado por meio da demonstração de taquizoítos
de N. caninum ou de cistos teciduais nos tecidos nervosos infectados, ou pela identificação
20
de anticorpos específicos por meio das técnicas de RIFI, ELISA e imunoprecipitação.
Títulos da RIFI superiores a 1:50 são considerados positivos, porém, animais infectados
normalmente apresentam valores acima de 1:800. Animais cronicamente infectados,
assintomáticos, podem apresentar altos títulos de anticorpos durante anos (DUBEY;
LAPPIN, 2006).
O relato do primeiro caso de neosporose no Brasil ocorreu em 2001 e, a partir de
então, vários estudos soroepidemiológicos vem sendo realizados, revelando uma elevada
prevalência no país (CAÑON-FRANCO et al., 2003; GENNARI et al., 2002; SOUSA et
al., 2002).
Estudos conduzidos por Tarantino et al. (2001), Cringoli et al. (2002) e Gennari et
al. (no prelo), demonstraram uma alta freqüência de co-infecção entre neosporose e
leishmaniose visceral em cães. A causa mais provável para a alta prevalência de N.
caninum em cães soropositivos para Leishmania é a imunossupressão decorrente desta.
21
GENNARI, S. M.; CANÓN-FRANCO, W. A.; FEITOSA, M. M. F.; IKEDA, F. A.LIMA, V. M. F.;
AMAKU, M. Presence of anti-Neospora caninum and Toxoplasma gondii antibodies in dogs infected with
visceral leishmaniasis from the region of Araçatuba , São Paulo, Brazil. Brazilian Journal of Veterinary
Research and Animal Science..(no Prelo)
2 OBJETIVOS
Em vista do que foi exposto anteriormente, o presente projeto de pesquisa
teve por objetivos:
• Determinar e comparar a sensibilidade e a especificidade dos
métodos de ELISA, imunofluorescência indireta e
imunocromatografia utilizados no diagnóstico da leishmaniose
visceral canina,
• Determinar a ocorrência de possíveis reações cruzadas entre
antígenos de Trypanosoma cruzi, Erlichia canis, Babesia canis,
Toxoplasma gondii e Neospora caninum com Leishmania chagasi,
por meio dos métodos de ELISA, imunofluorecência indireta e
imunocromatografia.
22
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais Utilizados
Foram utilizados nove grupos de animais. O primeiro grupo foi constituído por
amostras de soro de 50 cães parasitologicamente positivos para leishmaniose visceral,
sintomáticos, de ambos os sexos e com idade variando entre um e oito anos, encaminhados
ao Hospital Veterinário do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual
Paulista, Campus de Araçatuba e ao Centro de Controle de Zoonoses do município de
Araçatuba - SP. O segundo grupo foi constituído por amostras de soro de 45 cães
clinicamente sadios, de ambos os sexos e com idade variando entre um e oito anos,
provenientes das cidades de Santos – SP, área considerada não endêmica para leishmaniose
visceral ou tegumentar. O terceiro grupo, constituído por amostras de soro de 14 cães
portadores de doença de Chagas fornecidas pelo Prof. Dr. Aparecido Antonio Camacho do
Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal. O quarto, quinto e
sexto grupos constituídos por amostras de soro de 15 cães portadores de erliquiose canina,
14 cães portadores de babesiose canina e seis cães com co-infecção por erliquiose e
babesiose, todos experimentalmente infectados e sorologicamente positivos, fornecidos
pela Profa. Dra. Mitika Kuribayashi Hagiwara, do Departamento de Clínica Médica de
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. O sétimo,
oitavo e nono grupos constituídos por amostras de soro de 11 cães portadores de
toxoplasmose, oito cães portadores de neosporose e 13 cães com co-infecção por
23
toxoplasmose e neosporose, todos experimentalmente infectados e sorologicamente
positivos, fornecidos pela Profa. Dra. Solange Maria Gennari, do Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo.
Para a formação do grupo de cães naturalmente acometidos por leishmaniose
visceral foram realizados esfregaços de medula óssea e linfonodo de 130 animais, dos
quais selecionaram-se apenas os que demonstraram formas amastigotas de Leishmania sp.
Foram, também, realizados esfregaços sanguíneos de ponta de orelha destes cães e, aqueles
que demonstraram presença de hemoparasitas à microscopia, foram excluídos do grupo,
utilizando-se um total de 50 cães com diagnóstico parasitológico de leishmaniose visceral.
3.2 Delineamento Experimental
Os soros dos animais dos grupos 1 e 2 (cães naturalmente infectados por
Leishmania sp e cães sadios provenientes de área não endêmica para leishmaniose visceral)
foram submetidos aos métodos de ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e
imunocromatografia para o diagnóstico de leishmaniose visceral, com o objetivo de se
determinar a especificidade e sensibilidade de cada um dos testes mencionados. Essas
amostras também foram avaliadas para presença de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi,
anti-Erlichia canis, anti-Babesia canis, anti-Toxoplasma gondii e anti-Neospora caninum
com o objetivo de verificar a ocorrência de co-infecções ou possíveis reações cruzadas
entre os antígenos.
As amostras de soro dos animais com doença de Chagas, erliquiose, babesiose, co-
infecção por erliquiose e babesiose, toxoplasmose, neosporose e co-infecção por
toxoplasmose e neosporose foram submetidas aos três métodos sorológicos para o
diagnóstico de leishmaniose visceral, com o objetivo de avaliar a ocorrência de possíveis
reações cruzadas entre os antígenos.
3.3 Punção Biópsia Aspirativa de Medula Óssea
24
A colheita de medula óssea foi realizada com agulha hipodérmica 40x16mm,
acoplada à seringa de 10 ml, mediante punção na crista ilíaca, com os animais contidos em
decúbito lateral. Após a anti-sepsia local, a agulha foi posicionada sobre a crista ilíaca e,
por meio de movimentos rotatórios, exerceu-se uma pressão até que a mesma atingisse a
cavidade medular. A agulha foi, então, conectada a uma seringa descartável de polietileno
de 10 ml, onde foi exercido vácuo para a aspiração do material medular. Os esfregaços do
material colhido foram realizados imediatamente após a colheita, secos ao ar e corados com
corante hematológico
1
, para posterior observação ao microscópio óptico em objetiva de
100x, para a pesquisa de formas amastigotas de Leishmania sp. e hemoparasitas.
1
Panótico Rápido
®
- Laborclin
De um total de 130 amostras pesquisadas, foram selecionados 50 animais nos
quais foi possível a visualização de formas amastigotas típicas de Leishmania sp.
3.4 Punção Biópsia Aspirativa de Linfonodos
A punção biópsia aspirativa foi realizada nos linfonodos poplíteos e pré-
escapulares, na dependência de aumento de volume dos mesmos e da facilidade de punção
de acordo com o animal, com uma agulha hipodérmica 25x7mm acoplada a uma seringa de
10ml. Com o material colhido foram realizados esfregaços que, posteriormente, foram
corados com corante hematológico
1
e observados ao microscópio óptico em objetiva de
100x, para a pesquisa de formas amastigotas de Leishmania sp.
3.5 Pesquisa de hemoparasitas
Nos cães dos grupos 1 e 2 realizou-se a colheita de sangue periférico em região de
pavilhão auricular para a confecção de esfregaços que, posteriormente, foram corados com
corante hematológico
1
e observados ao microscópio óptico em objetiva de 100x, para a
25
pesquisa de hemoparasitas. Os animais que apresentavam mórulas de Erlichia sp. ou
Babesia sp. no esfregaço foram descartados.
3.6 Colheita de Sangue Total
A colheita de sangue foi realizada, após anti-sepsia local, por punção da veia
jugular. O sangue, num volume total de 20 ml, foi mantido à temperatura ambiente até a
coagulação e retração visível do coágulo. Em seguida, sofreu centrifugação a 3.000 r.p.m.,
durante cinco minutos, para melhor separação do soro. Este, por sua vez, foi transferido
para ependorfes com o auxílio de pipeta automática e congelado imediatamente a -20
o
C,
até o momento do seu processamento.
1
Panótico Rápido
®
- Laborclin
3.7 ELISA para Leishmaniose Visceral
A presença de IgG anti-Leishmania sp. no soro, foi determinada por meio da
técnica de ELISA, como descrita por Lima et al (2003). As microplacas foram cobertas
com antígeno total de Leishmania chagasi, cepa MHOM/BR/74/PP75, numa concentração
de 20µg/ml em tampão carbonato 0,05 M, pH 9,6, e incubadas por 18 horas a 4ºC. Após a
lavagem com PBS-tween por três vezes, as placas foram bloqueadas com 200 µl de BSF
10% em PBS e incubadas à temperatura ambiente, durante duas horas. Após nova lavagem
com PBS-tween por três vezes, 100 µl do soro controle positivo, do soro controle negativo
e das amostras de soros dos animais dos nove grupos experimentais, diluídas 1:400 em PBS
contendo 0,05% de Tween® 20 e 10% de BSF, foram adicionadas a cada poço e incubadas
por três horas à temperatura ambiente. Após quatro lavagens com PBS-tween 20,
adicionou-se à placa 100 µl de anticorpo anti-IgG de cão, marcado com peroxidase
1
,
previamente titulado. Após a incubação por uma hora em temperatura ambiente, a placa foi
novamente lavada quatro vezes com PBS-Tween® 20 e foram adicionados 100 µl de uma
solução contendo substrato OPD (0,4 mg/ml) em diluente apropriado. A reação foi
interrompida adicionando-se a cada poço 50 µl de H
2
SO
4
1M e, a densidade óptica (D.O.)
26
foi avaliada a 492nm, utilizando-se um leitor de ELISA
2
. Os resultados foram expressos
pela média da densidade óptica obtida dos soros em triplicata. Para a determinação do
ponto de corte foi realizado o teste de ELISA no soro de 20 cães sadios de área não
endêmica para leishmaniose visceral. O ponto foi estipulado a partir da média acrescida de
três desvios-padrões da leitura da densidade óptica (DO), o qual foi considerado 0,270.
3.8 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para leishmaniose visceral
A reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para leishmaniose visceral foi
realizada de acordo com Camargo (1974). As lâminas foram sensibilizadas adicionando-se
15 µl da suspensão de parasitas, promastigotas de Leishmania chagasi, cepa
MHOM/BR/72/cepa 46, em PBS em cada círculo. Após a secagem em estufa, as
1
Sigma –Aldrich Brasil LTDA
2
Labsystems Multiskan EX
lâminas foram embaladas em papel extra-fino e papel alumínio e armazenadas em freezer
à –20
o
C . No momento do uso, as lâminas foram descongeladas em estufa durante cinco
minutos. Em cada círculo foram adicionados 20 µl das amostras de soro a serem testados,
diluídas na concentração de 1:40 em PBS. As lâminas foram então
incubadas durante 30 minutos em câmara úmida à 37
o
C e, em seguida, lavadas por
imersão em PBS por três vezes. O anticorpo anti-IgG de cão conjugado ao isotiocianato de
fluoresceína
1
foi diluído na concentração de 1:100 em azul de Evans e, 20 µl desta solução
foram adicionados em cada círculo das lâminas, as quais foram novamente incubadas
durante 30 minutos à 37
o
C. Optou-se por utilizar a diluição 1:100 do conjugado, por ter
sido esta a que melhor discriminou os soros positivos das amostras negativas para
leishmaniose visceral canina. Após nova lavagem em tampão PBS, foi adicionada glicerina
tamponada com carbonato-bicarbonato (pH 9,5) e as lâminas foram recobertas por lamínula
para leitura em microscópio de fluorescência. Soros sabidamente positivos e negativos
foram utilizados em cada lâmina como controles positivo e negativo da reação. Foram
consideradas positivas as reações fluorescentes em soros com diluições iguais a 1:40. As
amostras de soros positivas nesta diluição foram novamente testadas para a determinação
27
do título. Em cada círculo da lâmina foram adicionados 20 µl de diluições sucessivas dos
soros testes positivos a partir de 1:80, duplicando-se a diluição até 1:1280.
3.9 Imunocromatografia para leishmaniose visceral
Para a realização da técnica de imunocromatografia utilizou-se um Kit comercial
2
que detecta a presença de anticorpos anti-Leishmania sp. no soro de animais. Em uma fita
impregnada com o antígeno foram aplicados 20 µl do soro a ser testado. Em seguida, foram
adicionadas três gotas de tampão à fita, cuja leitura foi realizada após 10 minutos. A fita
apresenta uma membrana pré-coberta com o antígeno recombinante (rK39) na região da
banda teste e anti-proteína A na região da banda controle. Durante o teste, a amostra de
soro reage com o conjugado colorimétrico (conjugado proteína A coloidal de ouro) e a
mistura então ascende através da membrana
1
Sigma –Aldrich Brasil LTDA
2
Kalazar Detect Animal Rapid Test – Inbios International
por capilaridade, reagindo com o antígeno e produzindo uma banda vermelha. A despeito
da presença de anticorpos anti-Leishmania sp. no soro, a mistura continua a migrar através
da membrana até a região da anti-proteína A, dando origem a uma nova banda vermelha
nesta região. A presença desta linha indica um volume adequado da amostra de soro
utilizada, um fluxo adequado através da fita e a viabilidade dos reagentes. Desta forma, o
teste foi considerado positivo quando se formaram duas faixas vermelhas e, negativo,
quando aparecia somente a faixa controle. Os resultados foram determinados
individualmente, de forma qualitativa (positivo ou negativo) e as variações da intensidade
de cor da banda formada foram classificadas em escores variando de fraco positivo (1/2+),
quando de uma banda tênue, à forte positivo (3+), quando de uma banda de cor intensa.
3.10 ELISA para doença de Chagas
A presença de IgG anti-Trypanosoma cruzi nas amostras de soros dos animais
naturalmente acometidos por leishmaniose visceral e de animais sadios foi determinada por
28
meio do método de TESA-ELISA, utilizando exoantígenos de formas tripomastigotas do T.
cruzi, realizado de acordo com a técnica descrita por Umezawa et al. (2001).
3.11 Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para babesiose, toxoplasmose e
neosporose.
A RIFI para detecção de anticorpos anti-Babesia canis foi realizada segundo
Machado (1994). As reações de imunofluorescência indireta utilizadas para a detecção de
anticorpos anti-Neospora caninum e anti-Toxoplasma gondii foram realizadas de acordo
com Dubey et al. (1988) e Camargo (1974), respectivamente, estabelecendo-se como ponto
de corte 1:50 para neosporose e 1:16 para toxoplasmose.
3.12 Teste de imunoensaio enzimático para a detecção de anticorpos anti-Erlichia
canis
Para a realização do teste de imunoensaio enzimático utilizou-se o Kit comercial
SNAP*3Dx*
1
. Foram pipetadas três gotas do soro de cada amostra e armazenadas em
ependorfes fornecidos juntamente com o Kit.
Em seguida, foram adicionadas quatro gotas
do conjugado anti-Erlichia canis HRPO fornecido pelo o teste, em cada ependorfe. Os
tubos foram homogeneizados e o conteúdo de cada tubo colocado em um dispositivo
para a realização do teste. Oito minutos após acionar o ativador do dispositivo realizava-se
a leitura do teste. De acordo com o fabricante, um resultado positivo, indicado pela
presença de um círculo azul, corresponde a um elevado título de anticorpos anti-E. canis.
3.13 Análise Estatística
29
Foram determinadas a sensibilidade e a especificidade dos métodos de ELISA,
imunofluorescência indireta e imunocromatografia considerando-se como referência os
resultados obtidos no exame parasitológico para leishmaniose visceral canina. O cálculo
de sensibilidade e especificidade seguiu as fórmulas apresentadas abaixo.
Sensibilidade = _______verdadeiros positivos________ x 100
(verdadeiros positivos + falsos negativos)
Especificidade = ______verdadeiros negativos________
x 100
(verdadeiros negativos + falsos positivos)
1
IDDEX Laboratories
O coeficiente Kappa foi utilizado para avaliar a concordância dos métodos de
ELISA, RIFI e imunocromatografia com o exame parasitológico. A interpretação da
concordância entre os métodos a partir dos valores de Kappa, de acordo com Pereira
(2001), encontra-se apresentada na tabela abaixo.
Kappa Concordância
<0,00 Ruim
0,00-0,20 Fraca
0,21-0,40 Sofrível
0,41-0,60 Regular
0,61-0,80 Boa
0,81-0,99 Ótima
1,00 Perfeita
30
As análises foram realizadas utilizando-se o programa “Statistical Analysis System”
(SAS).
4 RESULTADOS
4.1 Detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas amostras de soros de cães
naturalmente infectados por leishmaniose visceral.
Todas as amostras de soro dos cães naturalmente infectados por
leishmaniose visceral foram submetidas à técnica de ELISA, e o número de cães e
sua respectiva percentagem, de acordo com o resultado da sorologia, encontram-se
31
apresentados na tabela 1. Os valores individuais das médias das absorbâncias
(densidades ópticas) encontram-se apresentados no quadro 1 (anexos).
Somente 49 amostras de soro foram testadas pela reação de
imunofluorescência indireta (RIFI), pois ocorreu um problema no frasco em que se
encontrava armazenada uma das amostras, que precisou ser descartada do
experimento. Como esta avaliação foi a última a ser realizada durante o
experimento, não havia outra alíquota de soro do mesmo cão que pudesse substituí-
la. O número de cães e sua respectiva percentagem, de acordo com o resultado da
sorologia, encontram-se apresentados na tabela 2. Os valores individuais dos títulos
de anticorpos encontram-se apresentados no quadro 2 (anexos).
As amostras dos 50 soros submetidos à técnica de imunocromatografia
foram qualitativamente classificadas na dependência da intensidade de cor da banda
formada. O número de cães e sua respectiva percentagem, de acordo com o
resultado da sorologia, encontram-se apresentados na tabela 3. Os resultados
individuais das leituras das fitas encontram-se apresentados no quadro 3 (anexos).
Tabela 1– Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pelo método de
ELISA, em número absoluto e percentagem, de cães naturalmente
infectados por Leishmania sp., provenientes do município de
Araçatuba. (Araçatuba-SP, 2006)
ELISA Número de animais Percentagem
Positivo
47 94%
Negativo
3 6%
Total
50 100%
Tabela 2– Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pela reação de
imunofluorescência indireta (RIFI), em número absoluto e
percentagem, de cães naturalmente infectados por Leishmania sp.,
provenientes do município de Araçatuba. (Araçatuba-SP, 2006)
RIFI Número de animais Percentagem
Positivo
48 98%
Negativo
1 2%
Total
49 100%
32
Tabela 3– Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pela reação de
imunocromatografia, em número absoluto e percentagem, de cães
naturalmente infectados por Leishmania sp., provenientes do
município de Araçatuba. (Araçatuba-SP, 2006)
Imunocromatografia
Número de animais Percentagem
Positivo
43 86%
Negativo
7 14%
Total
50 100%
4.2 Detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas amostras dos soros de
animais sadios, provenientes de área não endêmica para leishmaniose
visceral canina.
As 45 amostras de soro dos cães de área não endêmica foram submetidas às
técnicas de ELISA, RIFI e imunocromatografia, e o número de cães e sua
respectiva percentagem, de acordo com o resultado da sorologia, encontram-se
apresentados nas tabelas 4, 5 e 6, respectivamente. Os valores individuais das
médias das absorbâncias (densidades ópticas), dos títulos de anticorpos e das
leituras das fitas de imunocromatografia encontram-se apresentados nos quadros 4,
5 e 6, respectivamente (anexos).
Tabela 4- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pelo método de
ELISA, em número absoluto e percentagem, de cães clinicamente
sadios provenientes de área não endêmica para leishmaniose visceral.
(Araçatuba-SP, 2006)
ELISA Número de animais Percentagem
Positivo
7 15,6 %
Negativo
38 84,4%
33
Total
45 100%
Tabela 5- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pela reação de
imunofluorescência indireta (RIFI), em número absoluto e
percentagem, de cães clinicamente sadios provenientes de área não
endêmica para leishmaniose visceral. (Araçatuba-SP, 2006)
RIFI Número de animais Percentagem
Positivo
4 8,9%
Negativo
41 91,1%
Total
45 100%
Tabela 6- Resultados da sorologia para leishmaniose visceral pela reação de
imunocromatografia, em número absoluto e percentagem, de cães
clinicamente sadios provenientes de área não endêmica para
leishmaniose visceral. (Araçatuba-SP, 2006)
Imunocromatografia
Número de animais Percentagem
Positivo
4 8,9%
Negativo
41 91,1%
Total
45 100%
4.3 Determinação dos valores de sensibilidade e especificidade relativas dos
métodos empregados no diagnóstico da leishmaniose visceral canina.
A sensibilidade e especificidade relativas dos métodos de ELISA, reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia foram determinadas
considerando-se como referência os resultados obtidos no exame parasitológico
para leishmaniose visceral canina. Os valores de sensibilidade e especificidade, bem
como o coeficiente Kappa, encontram-se apresentados na tabela 7.
Tabela 7- Valores de sensibilidade e especificidade relativas para as técnicas de
ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e
imunocromatografia empregadas no diagnóstico da leishmaniose
visceral canina. (Araçatuba-SP, 2006)
Sensibilidade Especificidade Kappa
RIFI
98,0% 91,1% 0,893
34
ELISA
94,0% 84,4% 0,788
Imunocromatografia
86,0% 91,1% 0,769
4.4 Detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas amostras de soros de
animais portadores de doença de Chagas.
Das 14 amostras de soro de cães com doença de Chagas submetidas à
sorologia para leishmaniose visceral, nove (64,3%) apresentaram resultado positivo
por meio da técnica de ELISA, seis (42,9%) pela RIFI e todas foram consideradas
negativas pelo teste de imunocromatografia. Os resultados das sorologias
encontram-se apresentados na tabela 8 e os valores individuais das médias das
absorbâncias (densidades ópticas), dos títulos de anticorpos e das leituras das fitas
de imunocromatografia encontram-se apresentados no quadro 7 (anexos).
Tabela 8-Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da
técnica de ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e
imunocromatografia em amostras de soro de 14 cães portadores de
doença de Chagas. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA RIFI Imunocromatografia
C1
Positivo Negativo Negativo
C2
Positivo Positivo Negativo
C3
Negativo Negativo Negativo
C4
Positivo Positivo Negativo
C5
Positivo Negativo Negativo
C6
Positivo Positivo Negativo
C7
Positivo Negativo Negativo
C8
Negativo Negativo Negativo
C9
Positivo Positivo Negativo
C10
Positivo Negativo Negativo
C11
Positivo Positivo Negativo
C12
Negativo Negativo Negativo
C13
Negativo Positivo Negativo
C14
Negativo Negativo Negativo
4.5 Detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas amostras de soros de
animais portadores de erliquiose, provenientes de área não endêmica para
leishmaniose visceral canina.
35
Das 13 amostras de soro de animais portadores de erliquiose submetidas à
sorologia para leishmaniose visceral, uma (7,7%) apresentou valor acima do ponto
de corte pelo método de ELISA, nenhuma foi considerada positiva pela reação de
imunofluorescência indireta e uma (7,7%) apresentou reatividade ao teste de
imunocromatografia. Os resultados das sorologias encontram-se apresentados na
tabela 9 e os valores individuais das médias das absorbâncias (densidades ópticas),
dos títulos de anticorpos e das leituras das fitas de imunocromatografia encontram-
se apresentados no quadro 8 (anexos).
Tabela 9-Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da
técnica de ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e
imunocromatografia em amostras de soro de 13 cães portadores de
erliquiose. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
168
Negativo Negativo Negativo
169
Negativo Negativo Negativo
171
Negativo Negativo Negativo
172
Negativo Negativo Negativo
174
Positivo Negativo Negativo
175
Negativo Negativo Negativo
177
Negativo Negativo Negativo
178
Negativo Negativo Negativo
179
Negativo Negativo Negativo
180
Negativo Negativo Negativo
181
Negativo Negativo Positivo
182
Negativo Negativo Negativo
183
Negativo Negativo Negativo
4.6 Detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas amostras de soros de
animais portadores de babesiose, provenientes de área não endêmica para
leishmaniose visceral canina.
Das 12 amostras de soro de cães com babesiose submetidas à sorologia para
leishmaniose visceral, nenhuma apresentou reação positiva por meio dos métodos
36
de ELISA, RIFI e imunocromatografia. Os resultados das sorologias encontram-se
apresentados na tabela 10 e os valores individuais das médias das absorbâncias
(densidades ópticas), dos títulos de anticorpos e das leituras das fitas de
imunocromatografia encontram-se apresentados no quadro 9 (anexos).
Tabela 10-Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da
técnica de ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e
imunocromatografia em amostras de soro de 12 cães portadores de
babesiose. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
149
Negativo Negativo Negativo
150
Negativo Negativo Negativo
151
Negativo Negativo Negativo
152
Negativo Negativo Negativo
153
Negativo Negativo Negativo
154
Negativo Negativo Negativo
155
Negativo Negativo Negativo
156
Negativo Negativo Negativo
157
Negativo Negativo Negativo
158
Negativo Negativo Negativo
159
Negativo Negativo Negativo
160
Negativo Negativo Negativo
4.7 Detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas amostras de soro de
animais apresentando co-infecção por erliquiose e babesiose, provenientes
de área não endêmica para leishmaniose visceral canina.
Das seis amostras de soro de cães apresentando co-infecção por erliquiose e
babesiose, submetidas à sorologia para leishmaniose visceral, cinco (83,3%)
apresentaram resultado positivo por meio da técnica de ELISA, nenhum pela reação
de imunofluorescência indireta (RIFI) e, três (50%) apresentaram reatividade ao
teste de imunocromatografia. Os resultados das sorologias encontram-se
apresentados na tabela 11 e os valores individuais das médias das absorbâncias
37
(densidades ópticas), dos títulos de anticorpos e das leituras das fitas de
imunocromatografia encontram-se apresentados no quadro 10 (anexos).
Tabela 11-Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da
técnica de ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e
imunocromatografia em amostras de soro de seis cães com co-
infecção por erliquiose e babesiose. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
161
Positivo Negativo Positivo
162
Positivo Negativo Negativo
163
Positivo Negativo Positivo
164
Positivo Negativo Negativo
165
Positivo Negativo Positivo
166
Negativo Negativo Negativo
4.8 Detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas amostras de soros de
animais portadores de toxoplasmose, provenientes de área não endêmica
para leishmaniose visceral canina.
Das 10 amostras de soro de cães infectados com toxoplasmose, submetidas
à sorologia para leishmaniose visceral, todas apresentaram resultados negativos por
meio da técnica de ELISA, cinco (50%) apresentaram resultado positivo pela reação
de imunofluorescência indireta e uma (10%) foi classificada como positiva pela
técnica de imunocromatografia. Os resultados das sorologias encontram-se
apresentados na tabela 12 e os valores individuais das médias das absorbâncias
(densidades ópticas), dos títulos de anticorpos e das leituras das fitas de
imunocromatografia encontram-se apresentados no quadro 11 (anexos).
Tabela 12-Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da
técnica de ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e
imunocromatografia em amostras de soro de 10 cães portadores de
toxoplasmose. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
118
Negativo Positivo Negativo
119
Negativo Negativo Negativo
122
Negativo Positivo Negativo
38
123
Negativo Negativo Negativo
124
Negativo Positivo Negativo
128
Negativo Negativo Negativo
131
Negativo Positivo Negativo
133
Negativo Negativo Negativo
138
Negativo Positivo Negativo
148
Negativo Negativo Positivo
4.9 Detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas amostras de soros de
animais portadores de neosporose, provenientes de área não endêmica para
leishmaniose visceral canina.
Das oito amostras de soro de cães com neosporose, submetidas à sorologia
para leishmaniose visceral, todas apresentaram resultados negativos por meio da
técnicas de ELISA e imunofluorescência indireta (RIFI) e uma (12,5%) foi
classificada como positiva pela técnica de imunocromatografia. Os resultados das
sorologias encontram-se apresentados na tabela 13 e os valores individuais das
médias das absorbâncias (densidades ópticas), dos títulos de anticorpos e das
leituras das fitas de imunocromatografia encontram-se apresentados no quadro 12
(anexos).
Tabela 13-Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da
técnica de ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e
imunocromatografia em amostras de soro de oito cães portadores
de neosporose. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
121
Negativo Negativo Negativo
126
Negativo Negativo Negativo
129
Negativo Negativo Negativo
134
Negativo Negativo Negativo
137
Negativo Negativo Negativo
140
Negativo Negativo Positivo
144
Negativo Negativo Negativo
147
Negativo Negativo Negativo
39
4.10 Detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas amostras de soros de
animais apresentando co-infecção por toxoplasmose e neosporose,
provenientes de área não endêmica para leishmaniose visceral canina.
Das 13 amostras de soro de cães com co-infecção por toxoplasmose e
neosporose, submetidas à sorologia para leishmaniose visceral, todas apresentaram
resultados negativos por meio da técnicas de ELISA e imunofluorescência indireta
(RIFI) e três (23%) foram classificadas como positivas pela técnica de
imunocromatografia. Os resultados das sorologias encontram-se apresentados na
tabela 14 e os valores individuais das médias das absorbâncias (densidades ópticas),
dos títulos de anticorpos e das leituras das fitas de imunocromatografia encontram-
se apresentados no quadro 13 (anexos).
Tabela 14-Resultados da sorologia para leishmaniose visceral por meio da
técnica de ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e
imunocromatografia em amostras de soro de 13 cães com co-
infecção por toxoplasmose e neosporose. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
120
Negativo Negativo Negativo
125
Negativo Negativo Negativo
127
Negativo Negativo Positivo
130
Negativo Negativo Negativo
132
Negativo Negativo Negativo
135
Negativo Negativo Negativo
136
Negativo Negativo Negativo
139
Negativo Negativo Positivo
141
Negativo Negativo Positivo
142
Negativo Negativo Negativo
143
Negativo Negativo Negativo
145
Negativo Negativo Negativo
146
Negativo Negativo Negativo
4.11 Percentagem de ocorrência de reações cruzadas entre amostras de soro de
cães portadores de doença de Chagas, erliquiose, babesiose, co-infecção
por erliquiose e babesiose, toxoplasmose, neosporose e co-infecção por
40
toxoplasmose e neosporose, submetidas à sorologia para leishmaniose
visceral.
As percentagens de ocorrência de reações cruzadas entre amostras de soro
de cães portadores de doença de Chagas, erliquiose, babesiose, co-infecção por
erliquiose e babesiose, toxoplasmose, neosporose e co-infecção por toxoplasmose e
neosporose, submetidas à sorologia para leishmaniose visceral por meio da técnica
ELISA , da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e por imunocromatografia
encontram-se apresentadas nas figuras 1, 2 e 3.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C E B E/B T N T/N
ELISA positivo (%)
FIGURA 1- Percentagem da ocorrência de reação cruzada entre amostras de soro de
cães portadores de doença de Chagas (C), erliquiose (E), babesiose (B) e
co-infecção por erliquiose e babesiose (E/B), toxoplasmose (T),
neosporose (N) e co-infecção por toxoplasmose e neosporose (T/N)
submetidas à técnica ELISA para o diagnóstico de leishmaniose visceral
canina. (Araçatuba –SP, 2006)
41
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C E B E/B T N T/N
RIFI positivo (%)
FIGURA 2- Percentagem da ocorrência de reação cruzada entre amostras de soro de
cães portadores de doença de Chagas (C), erliquiose (E), babesiose (B),
co-infecção por erliquiose e babesiose (E/B), toxoplasmose (T),
neosporose (N) e co-infecção por toxoplasmose e neosporose (T/N)
submetidas à reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para o
diagnóstico de leishmaniose visceral canina. (Araçatuba-SP, 2006)
FIGURA 3- Percentagem da ocorrência de reação cruzada entre amostras de soro de
cães portadores de doença de Chagas (C), erliquiose (E), babesiose (B),
co-infecção por erliquiose e babesiose (E/B), toxoplasmose (T),
neosporose (N) e co-infecção por toxoplasmose e neosporose (T/N),
submetidas à técnica de imunocromatografia para o diagnóstico de
leishmaniose visceral canina. (Araçatuba-SP, 2006)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C E B E/B T N T/N
Imunocromatografia positiva (%)
42
4.12 Sorologia para doença de Chagas, erliquiose, babesiose, toxoplasmose e
neosporose nas amostras de soro de animais parasitologicamente positivos
para leishmaniose visceral.
Todas as amostras de soro de cães naturalmente infectados por leishmaniose
visceral foram submetidas à sorologia para doença de Chagas, erliquiose, babesiose,
toxoplasmose e neosporose. Das 50 amostras testadas, nenhuma apresentou
sorologia positiva para doença de Chagas, 28 (56%) apresentaram sorologia positiva
para erliquiose, 42 (85,7%) para babesiose, 17 (34%) para toxoplasmose e oito
(16%) para neosporose. Os resultados encontram-se apresentados individualmente
no tabela 15.
Tabela 15- Resultados da sorologia para doença de Chagas, erliquiose, babesiose,
toxoplasmose e neosporose em amostras de soro de 50 cães
naturalmente infectados por leishmaniose visceral, provenientes do
município de Araçatuba. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal Doença de
Chagas
Erliquiose Babesiose Toxoplasmose Neosporose
2
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
5
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
11
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
12
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
13
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
21
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
22
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
25
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
26
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
29
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
30
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
34
Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo
37
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
39
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
40
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
42
Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
45
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
46
Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo
47
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
50
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
51
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
52
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
54
Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
56
Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo
43
59
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
60
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
62
Negativo Negativo . . .
63
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
64
Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo
73
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
74
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
75
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
76
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
77
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
80
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
82
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
83
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
85
Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
86
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
87
Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo
88
Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo
89
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
91
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
92
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
94
Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
98
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
99
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
100
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
113
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
117
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
4.13 Sorologia para doença de Chagas, erliquiose, babesiose, toxoplasmose e
neosporose nas amostras de soro de animais sadios, provenientes de áreas
não endêmicas para leishmaniose visceral canina.
Todas as amostras de soro de cães clinicamente sadios provenientes de área
não endêmica para leishmaniose visceral foram submetidas à sorologia para doença
de Chagas, erliquiose, babesiose, toxoplasmose e neosporose. Das 45 amostras
testadas, nenhuma apresentou sorologia positiva para doença de Chagas, sete
(15,6%) apresentaram sorologia positiva para erliquiose, 38 (84,4%) para babesiose,
17 (37,8%) para toxoplasmose e nenhuma para neosporose. Os resultados
encontram-se apresentados individualmente no tabela 16.
Tabela 16- Resultados da sorologia para doença de Chagas, erliquiose, babesiose,
toxoplasmose e neosporose em amostras de soro de 45 cães sadios
44
provenientes de área não endêmica para leishmaniose visceral.
(Araçatuba-SP, 2006)
Animal Doença de
Chagas
Erliquiose Babesiose Toxoplasmose
Neosporose
184
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
185
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
186
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
187
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
188
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
189
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
190
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
191
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
192
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
193
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
194
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
195
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
196
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
197
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
198
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
199
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
200
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
201
Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo
202
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
203
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
204
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
205
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
206
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
207
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
208
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
209
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
210
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
211
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
212
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
213
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
214
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
215
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
216
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
217
Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
218
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
219
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
220
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
221
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
222
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
223
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
224
Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo
225
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
226
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
227
Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo
228
Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo
45
5 DISCUSSÃO
A escolha dos métodos sorológicos avaliados neste estudo baseou-se no fato da
reação de imunofluorescência indireta e do ELISA serem os métodos recomendados pelo
Ministério da Saúde para a o diagnóstico da leishmaniose visceral canina, e do teste
46
comercial de imunocromatografia ser um método recém desenvolvido que tem como
atrativo, além de sua praticidade e rápido resultado, o antígeno recombinante K39, o qual
determina elevada especificidade. No presento estudo, a reação de imunofluorescência
indireta apresentou elevados valores de sensibilidade (98%) e especificidade (91,1%)
(tabela 7), demonstrando o melhor desempenho quando comparada aos outros dois
métodos, corroborando os relatos de Alves e Bevilacqua, (2004) e Mettler et al. (2005), no
entanto, com especificidade abaixo da descrita por Mancianti et al. (1995). Apesar do bom
desempenho, a reação de imunofluorescência indireta é uma técnica laboriosa,
principalmente quando se deseja avaliar uma grande número de amostras, e requer
habilidade do observador para interpretação dos resultados, pois o limiar entre reações
positivas e negativas é muito sutil e, algumas vezes, subjetivo.
O método de ELISA apresentou sensibilidade de 94%, que se aproxima dos valores
observados por Laurenti et al. (2005) e Mancianti et al. (1995). A especificidade observada
nesta reação foi de 84,4% (tabela 7), valor próximo ao observado por Ashford et al. (1995)
e inferior ao verificado por Vercammen et al. (1997). O método de ELISA apresentou como
atrativo a capacidade de processar várias amostras de soro simultaneamente em um curto
intervalo de tempo, qualidade almejada para inquéritos epidemiológicos.
O teste de imunocromatografia demonstrou 86% de sensibilidade e 91,1% de
especificidade (tabela 7), dados que se aproximam dos apresentados por Laurenti et al.
(2005) e Melo (2004), os quais avaliaram pacientes caninos. Os valores obtidos encontram-
se um pouco abaixo dos verificados por Bern et al. (2000), Carvalho et al. (2003) e Sundar
et al. (2002), os quais submeteram ao teste amostras de soro de pacientes humanos. Ao
contrário dos resultados obtidos por Reinthinger et al. (2002), a especificidade deste teste
demonstrou ser elevada. O teste de imunocromatografia destacou-se por ser de fácil
execução e pela rapidez de seus resultados. Devido a essas qualidades este método torna-se
uma opção viável de diagnóstico em regiões onde o acesso a laboratórios é restrito, com
custo unitário da fita de imunocromatografia em torno de R$12,00.
A concordância de cada teste individualmente com o método parasitológico, que foi
adotado como padrão ouro neste trabalho, foi avaliada por meio da determinação do
coeficiente Kappa. O coeficiente Kappa demonstrou discreta diferença entre os métodos
avaliados com o teste ouro. Dentre os métodos avaliados, a RIFI apresentou uma ótima
47
concordância (Kappa = 0,893) com o exame parasitológico, seguida dos métodos de ELISA
(Kappa = 0,788) e de imunocromatografia (Kappa = 0,769), ambos com uma concordância
considerada boa, de acordo com os critérios sugeridos por Pereira (2001).
No presente experimento, a detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. nas
amostras de soro de animais portadores de doença de Chagas, erliquiose, babesiose,
toxoplasmose e neosporose produziu reações cruzadas com todos os agentes etiológicos,
exceto Babesia canis, em pelo menos uma das três técnicas avaliadas, corroborando os
achados de Alves e Bevilacqua (2004), Costa et al. (1991) e discordando das observações
de Lima et al. (2005) e Vercammen et al. (1997).
Das 14 amostras de soro de cães portadores de doença de Chagas nove (64,3%)
foram positivas por meio do método de ELISA, seis (42,9%) positivas na reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e nenhuma amostra foi considerada positiva pelo teste
de imunocromatografia para leishmaniose visceral (quadro 7). O emprego de antígenos
totais nos métodos de ELISA e RIFI, aparentemente, prejudicou a especificidade e
predispôs à ocorrência de reação cruzada com o T. cruzi, concordando com os relatos de
Melo (2004) e Rachamin et al. (1991). Uma desvantagem do uso de antígeno total é que ele
pode compartilhar epítopos comuns com outros antígenos microbianos e pode reagir com
soro de pacientes positivos para outras doenças infecciosas. Por outro lado, torna-se
evidente o auxílio da técnica de imunocromatografia no diagnóstico de cães portadores de
leishmaniose visceral em áreas endêmicas para a doença de Chagas.
Das 13 amostras de soro de cães portadores de erliquiose, uma (animal 174) foi
positiva por meio do método de ELISA e outra (animal 181) por imunocromatografia
(quadro 8). Apesar de Vercammen et al. (1997) afirmarem não existir reação cruzada entre
leishmaniose visceral e erliquiose por meio da técnica de ELISA, os autores avaliaram o
soro de um único cão portador de erliquiose, o que certamente prejudica a confiabilidade
dos resultados. Por outro lado, Lima et al (2005) testaram amostras de soro de 15 cães com
erliquiose, um número um pouco maior que o testado no presente experimento, e não
obtiveram reações cruzadas. A reação de imunofluorescência indireta foi a única que não
apresentou reações cruzadas entre erliquiose e leishmaniose visceral canina.
A ausência de reação cruzada com soros de animais infectados por Babesia sp. foi
observada em todos os três métodos (quadro 9), concordando com Lima et al. (2005) e
48
Vercammen et al.(1997), e discordando de Rosário et al (2005). Por outro lado, os soros de
cães concomitantemente infectados por Ehrlichia sp. e Babesia sp. apresentaram resultados
positivos pelas técnicas de ELISA e imunocromatografia em cinco (83,3%) e três (50%)
das seis amostras testadas, respectivamente (quadro 10). Não foi possível correlacionar os
valores de absorbância média observada pela técnica de ELISA e os resultados da
imunocromatografia. Enquanto o cão 161 apresentou absorbância de 0,313 pelo ELISA e
foi considerado como positivo (+) por imunocromatografia, o animal 162 possuía
absorbância de 0,310 e foi classificado como negativo pela técnica de imunocromatografia.
Apesar da ausência de relatos na literatura, a co-infecção entre erliquiose e babesiose
aumentou a ocorrência de reações cruzadas com leishmaniose visceral quando comparado
aos agentes isoladamente.
Nenhuma das amostras de soro dos 10 cães portadores de toxoplasmose apresentou
reação cruzada por meio da técnica de ELISA, confirmando os relatos de Lima et al.
(2005). No entanto, cinco (50%) foram positivas pela RIFI e uma (10%) pelo teste de
imunocromatografia (quadro 11), demonstrando ser a técnica de ELISA a mais confiável
em regiões com alta prevalência de toxoplasmose.
Apesar da ausência de relatos na literatura sobre estudos pesquisando possíveis
reações cruzadas entre neosporose e leishmaniose visceral por meio de técnicas sorológicas,
no presente experimento foi possível verificar que as amostras soropositivas para neoporose
(quadro 12) e de animais com co-infecção por toxoplasmose e neosporose (quadro 13)
apresentaram resultados positivos somente pela técnica de imunocromatografia, revelando
um (12,5%) e três (23%) resultados positivos, respectivamente. Diferente do que se
observou com co-infecção por erliquiose e babesiose, os soros de cães apresentando co-
infecção por T. gondii e N. caninum não apresentaram uma maior ocorrência de reação
cruzada com leishmaniose visceral quando comparado com os dois agentes isoladamente.
Embora existam descrições na literatura da ocorrência de reações cruzadas entre
leishmaniose visceral e as demais enfermidades testadas no presente experimento, como as
descritas por Alves e Bevilacqua (2004) e Costa et al. (1991), tais estudos não mencionam
o título obtido por meio da reação de imunofluorescência indireta e nem a densidade óptica
observada na técnica de ELISA. É importante ressaltar, no entanto, que a maioria dos
animais erroneamente classificados como positivos no presente experimento, apresentaram
49
reações fracamente positivas, com títulos de RIFI, densidades ópticas de ELISA e escores
de imunocromatografia próximos ao ponto de corte estabelecido pelo método, valores
muito inferiores aos demonstrados pelas médias das amostras do grupo controle positivo.
À exceção do que ocorreu aos demais patógenos, algumas amostras de soro
positivas para doença de Chagas atingiram valores elevados de densidade óptica pelo
método de ELISA, fato este justificado pela relação filogenética entre L. chagasi e T. cruzi,
confirmando os relatos de Badaró et al. (1986). Deste modo, os resultados sorológicos
positivos para leishmaniose visceral devem ser interpretados com muita cautela devido à
possibilidade de reação cruzada com doença de Chagas, especialmente em áreas onde há
sobreposição das duas enfermidades, situação muito comum em diversas regiões do Brasil.
Diante desta situação, dos métodos avaliados, o teste comercial de imunocromatografia
empregando como antígeno o rk39 é a melhor opção devido à sua capacidade de distinguir,
com sucesso, os pacientes chagásicos daqueles infectados pela L. (L.) chagasi, em função
de sua elevada especificidade.
Embora o número de amostras testadas seja pequeno, a percentagem de reação
cruzada entre cães positivos para leishmaniose visceral e animais apresentando co-infecção
entre erliquiose e babesiose foi bastante elevada, alcançando valores de 83,3% no ELISA e
50% na imunocromatografia. Tais observações não podem ser confrontadas com a
literatura, uma vez que os trabalhos realizados testaram soros de animais infectados por um
único agente, como os descritos por Lima et al. (2005), Rosário et al. (2005) e Vercammen
et al. (1997). A reação cruzada entre Leishmania sp. e Ehrlichia sp. por meio das mesmas
técnicas também ocorreu, porém, com menor freqüência (7,7% para ambos os testes). Este
fato gera preocupação, pois estas duas enfermidades apresentam sintomas que,
freqüentemente, assemelham-se aos observados na leishmaniose visceral canina, além de
coexistirem em grande parte do país. Por este motivo, devemos atentar aos resultados
positivos para o calazar canino quando houver suspeita de co-infecção, principalmente
quando o ELISA ou o teste de imunocromatografia forem empregados. Nesta situação, a
possibilidade de co-infecção deve ser descartada por meio da pesquisa de mórulas de
Ehrlichia sp. ou Babesia sp. em esfregaços de sangue periférico antes de se firmar o
diagnóstico sorológico e, sempre que possível, o método de escolha deve ser a reação de
imunofluorescência indireta.
50
A literatura descreve apenas um trabalho avaliando reação cruzada entre
toxoplasmose e leishmaniose visceral (Lima et al., 2005), a qual não foi observada pelos
autores, que utilizaram a técnica de ELISA, fato este também verificado no presente
experimento. Entretanto, as reações cruzadas envolvendo toxoplasmose ocorreram por
meio das técnicas de imunocromatografia (10%) e, mais pronunciadamente, pela RIFI
(50%), sugerindo a utilização do método de ELISA para a avaliação de cães com alterações
neuromusculares compatíveis com o envolvimento destas duas enfermidades. Apesar da
elevada ocorrência de reação cruzada entre L. chagasi e T. gondii, por meio da RIFI, os
títulos máximos destas reações não ultrapassaram 1:80.
A soroprevalência de erliquiose nas amostras dos 50 cães naturalmente infectados
por Leishmania sp. (tabela 15) e dos 45 cães clinicamente sadios (tabela 16) foi de 56% e
15,6%, respectivamente, sugerindo que a elevação do número de casos soropositivos pode
estar relacionada à imunossupressão causada pela leishmaniose visceral. Além disto, é
importante ressaltar que a soroprevalência da erliquiose nos animais provenientes de
Araçatuba – SP ultrapassou o dobro da observada em um estudo realizado em clínicas e
hospitais do estado de São Paulo, a qual aproximou-se de 20% (MACHADO, 2004;
MORAES et al., 2004).
A soroprevalência de neosporose nos animais naturalmente infectados por
leishmaniose visceral também foi superior (16%) quando comparada aos cães sadios, que
não apresentaram sororeatividade para a doença, sugerindo que a imunossupressão causada
pela leishmaniose também predispôs à infecção por este protozoário, conforme descrito por
Cringoli et al. (2002), Gennari et al. (no prelo) e Tarantino et al. (2001). Não houve
diferença aparente entre as soroprevalências de doença de Chagas, babesiose e
toxoplasmose nas amostras dos dois grupos acima citados.
Em relação ao grupo de 45 cães sadios, dos nove animais que apresentaram
resultados falso positivos por meio das técnicas sorológicas, os sete que apresentaram
sorologia positiva pela técnica de ELISA (quadro 4) possuíam anticorpos anti-Babesia sp,
sendo que destes, dois apresentavam também anticorpos anti-Toxoplasma gondii. Apesar
de não ter sido observada reação cruzada pela técnica de ELISA para leishmaniose visceral
no soro de cães com babesiose, confirmando os relatos de Lima et al. (2005) e Vercammen
et al. (1997), no grupo de cães provenientes de área não endêmica para leishamniose
51
visceral esta reação parece ter ocorrido, a não ser que seja decorrente de formação de
anticorpos contra outro agente não testado no presente experimento. Dos quatro cães que
apresentaram sorologia positiva pela RIFI (quadro 5), três possuíam anticorpos anti-
Babesia sp. e um anti-Toxoplasma sp discordando dos achados de Vercammen et al (1997).
Finalmente, os quatro cães com sorologia positiva pela imunocromatografia (quadro 6)
também possuíam anticorpos anti-Babesia sp., sendo que um deles se observou também
anticorpos anti-Toxoplasma sp., mais uma vez sugerindo haver reação cruzada entre
babesiose e leishmaniose visceral, apesar dos resultados negativos nos soros de cães
portadores de babesiose.
Com base nos valores de Kappa e na comparação entre os valores de sensibilidade e
especificidade de cada método testado, o presente estudo permitiu concluir que a reação de
imunofluorescência indireta apresentou o melhor desempenho, seguida da técnica de
ELISA e, por último, pela imunocromatografia. Os resultados apresentados diferem
parcialmente dos apresentados por Mancianti et al. (1995), que verificou em seus estudos
uma sensibilidade do método de ELISA superior ao da RIFI concluindo, no entanto, que
ambos os métodos são aptos para o sorodiagnóstico da doença.
Apesar da reação de imunofluorescência indireta ter apresentado o melhor
desempenho, a escolha do método sorológico para o diagnóstico da leishmaniose visceral
canina depende também da praticidade e do custo de sua execução, além do conhecimento
da situação epidemiológica da doença na área onde as amostras de soros serão avaliadas.
Em áreas endêmicas para leishmaniose visceral, onde a prevalência da doença é elevada, é
preferível a utilização de um teste que apresente elevada sensibilidade para identificar
dentre uma população de suspeitos o maior número de animais infectados, evitando que
cães positivos permaneçam como fontes de infecção para o vetor e, conseqüentemente,
minimizando as chances de infecção humana. Neste contexto, as técnica de ELISA e da
RIFI são opções aceitáveis por apresentarem elevada sensibilidade. No entanto,
concordando com Mancianti et al. (1995), o método de ELISA apresenta a vantagem de
realização de inquéritos epidemiológicos em larga escala com rápida divulgação dos
resultados. A RIFI, apesar da elevada sensibilidade, é uma técnica laboriosa que consome
muito tempo para o processamento de um grande número de amostras, fato este que
compromete o sucesso de um programa de controle da doença baseado na eutanásia de cães
52
infectados.
Por outro lado, em áreas com baixa prevalência da doença, o médico veterinário
tende a optar por um teste com elevada especificidade para evitar que cães sejam
erroneamente diagnosticados como portadores de leishmaniose visceral e,
conseqüentemente, submetidos à eutanásia desnecessariamente. Nesta situação, a técnica de
imunocromatografia é adequada devido à sua elevada especificidade, além de não haver a
necessidade de se equipar laboratórios em áreas onde a prevalência da doença seja baixa e
não justifique tal empreendimento.
53
7 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos, nas condições do presente experimento, permitem concluir:
1. A reação de imunoflorescência indireta (RIFI) apresenta o melhor desempenho
dentre os três métodos avaliados, demonstrando 98% de sensibilidade e 91,1% de
especificidade, além de ótima concordância com o método parasitológico (Kappa =
0,893);
2. O método de ELISA apresenta 94% de sensibilidade e 84,4% de especificidade,
além de boa concordância com o método parasitológico (Kappa = 0,788);
3. O teste de imunocromatografia apresenta o pior desempenho dentre os três métodos
avaliados, demonstrando uma sensibilidade de 86% e especificidade de 91,1%,
apesar de boa concordância com o método parasitológico (Kappa = 0769);
4. A pesquisa de anticorpos anti-Leishmania sp apresenta resultados positivos nas
amostras de soros de animais portadores de doença de Chagas, erliquiose,
babesiose, toxoplasmose e neosporose em, pelo menos, uma das três técnicas
avaliadas, confirmando a ocorrência de reação cruzada entre os agentes etiológicos
destas enfermidades.
54
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ANEXOS
Quadro 1– Densidades ópticas médias (DO), por meio da técnica de
65
ELISA para leishmaniose visceral canina, de 50 cães
naturalmente acometidos por leishmaniose visceral
provenientes do município de Araçatuba- SP.
(Araçatuba-SP, 2006)
Animal DO Animal DO
2
1,004
60
0,066 *
5
1,006
62
1,280
11
1,253
63
1,430
12
1,241
64
1,459
13
1,356
73
1,199
21
1,088
74
1,160
22
1,091
75
1,120
25
1,377
76
1,235
26
1,288
77
1,312
29
0,922
80
1,017
30
1,100
82
1,068
34
1,036
83
1,104
37
1,135
85
0,795
39
1,168
86
0,121*
40
1,140
87
1,219
42
1,191
88
1,115
45
1,108
89
1,173
46
1,330
91
1,200
47
1,296
92
0,156*
50
1,052
94
1,000
51
0,924
98
0,938
52
1,236
99
1,366
54
1,370
100
1,184
56
1,140
113
1,189
59
1,059
117
1,270
* animais soronegativos
66
Quadro 2- Títulos de anticorpos anti-Leishmania sp. obtidos por
meio de reação de imunofluorescência indireta (RIFI)
para leishmaniose visceral, do soro de 49 cães
naturalmente acometidos por leishmaniose visceral
provenientes do município de Araçatuba- SP. (Araçatuba-
SP, 2006)
Animal Título Animal Título
2
1 :1280
60
< 1:40 *
5
1:640
62
------
11
1:1280
63
1:1280
12
1:1280
64
1:1280
13
1:1280
73
1:1280
21
1:1280
74
1:1280
22
1:320
75
1:1280
25
1:1280
76
1:1280
26
1:320
77
1:1280
29
1:160
80
1:1280
30
1:1280
82
1:1280
34
1:1280
83
1:1280
37
1:320
85
1:640
39
1:1280
86
1:1280
40
1:1280
87
1:1280
42
1:1280
88
1:640
45
1:640
89
1:640
46
1:1280
91
1:1280
47
1:1280
92
1:40
50
1:1280
94
1:640
51
1:1280
98
1:1280
52
1:1280
99
1:1280
54
1:1280
100
1:1280
56
1:1280
113
1:1280
59
1:1280
117
1:1280
* animal soronegativo
67
Quadro 3- Resultados da técnica de imunocromatografia para
leishmaniose visceral, classificadas em escores,
variando de fraco positivo (1/2+) à forte positivo (3+),
do soro de 50 cães naturalmente acometidos por
leishmaniose visceral provenientes do município de
Araçatuba. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal
Resultado
Animal
Resultado
2
3+
60
Negativo
5
2+
62
2+
11
negativo
63
3+
12
negativo
64
3+
13
2+
73
2+
21
3+
74
3+
22
2+
75
2+
25
1+
76
3+
26
1+
77
3+
29
1+
80
2+
30
1+
82
1/2 +
34
2+
83
1+
37
2+
85
negativo
39
3+
86
negativo
40
1+
87
2+
42
2+
88
1+
45
1/2 +
89
1/2 +
46
1+
91
3+
47
2+
92
negativo
50
2+
94
2+
51
2+
98
negativo
52
2+
99
2+
54
1/2 +
100
3+
56
1+
113
1+
59
3+
117
2+
68
Quadro 4- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da
técnica de ELISA para leishmaniose visceral canina,
do soro de 45 cães provenientes de área não endêmica
para a doença. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal
DO Animal DO
184
0,234
207
0,068
185
0,144
208
0,111
186
0,153
209
0,111
187
0,224
210
0,060
188
0,344 *
211
0,159
189
0,327 *
212
0,048
190
0,226
213
0,037
191
0,437 *
214
0,160
192
0,285 *
215
0,071
193
0,247
216
0,067
194
0,150
217
0,090
195
0,339 *
218
0,065
196
0,299 *
219
0,069
197
0,253
220
0,061
198
0,210
221
0,160
199
0,277 *
222
0,080
200
0,081
223
0,152
201
0,078
224
0,065
202
0,057
225
0,072
203
0,144
226
0,064
204
0,104
227
0,049
205
0,065
228
0,117
206
0,079
*animais soropositivos
69
Quadro 5- Títulos de anticorpos anti-Leishmania sp. obtidos por
meio de reação de imunofluorescência indireta (RIFI)
para leishmaniose visceral, do soro de 45 cães
provenientes de área não endêmica para a doença.
(Araçatuba-SP, 2006)
Animal Título Animal Título
184
< 1:40
207
< 1:40
185
< 1:40
208
< 1:40
186
< 1:40
209
< 1:40
187
< 1:40
210
< 1:40
188
1:160 *
211
< 1:40
189
< 1:40
212
< 1:40
190
< 1:40
213
< 1:40
191
1:160 *
214
< 1:40
192
1:40 *
215
< 1:40
193
< 1:40
216
< 1:40
194
< 1:40
217
< 1:40
195
< 1:40
218
< 1:40
196
1:40 *
219
< 1:40
197
< 1:40
220
< 1:40
198
< 1:40
221
< 1:40
199
< 1:40
222
< 1:40
200
< 1:40
223
< 1:40
201
< 1:40
224
< 1:40
202
< 1:40
225
< 1:40
203
< 1:40
226
< 1:40
204
< 1:40
227
< 1:40
205
< 1:40
228
< 1:40
206
< 1:40
* animais soropositivos
70
Quadro 6- Resultados da técnica de imunocromatografia para
leishmaniose visceral, classificadas em escores,
variando de fraco positivo (1/2+) à forte positivo (3+),
do soro de 45 cães provenientes de área não endêmica
para a doença. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal Resultado Animal Resultado
184
negativo
207
negativo
185
negativo
208
negativo
186
negativo
209
negativo
187
½ +
210
negativo
188
½ +
211
negativo
189
negativo
212
negativo
190
negativo
213
negativo
191
negativo
214
negativo
192
negativo
215
negativo
193
½ +
216
negativo
194
negativo
217
negativo
195
negativo
218
negativo
196
negativo
219
negativo
197
negativo
220
negativo
198
negativo
221
negativo
199
½ +
222
negativo
200
negativo
223
negativo
201
negativo
224
negativo
202
negativo
225
negativo
203
negativo
226
negativo
204
negativo
227
negativo
205
negativo
228
negativo
206
negativo
71
Quadro 7- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica
de ELISA, títulos de anticorpos por meio da reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas de
imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do
soro de 14 cães portadores de doença de Chagas. (Araçatuba-
SP, 2006)
Animais ELISA RIFI Imunocromatografia
C1
0,336* < 1:40 Negativo
C2
0,357* 1:40 * Negativo
C3
0,248 < 1:40 Negativo
C4
0,402* 1:40 * Negativo
C5
0,436* < 1:40 Negativo
C6
0,660* 1:160 * Negativo
C7
0,299* < 1:40 Negativo
C8
0,244 < 1:40 Negativo
C9
0,941* 1:80 * Negativo
C10
0,406* < 1:40 Negativo
C11
0,784* 1:160 * Negativo
C12
0,221 < 1:40 Negativo
C13
0,119 1:40 * Negativo
C14
0,105 < 1:40 Negativo
* animais soropositivos
72
Quadro 8- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica
de ELISA, títulos de anticorpos por meio da reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas de
imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do
soro de 13 cães portadores de erliquiose. (Araçatuba-SP,
2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
168
0,085 < 1:40 Negativo
169
0,051 < 1:40 Negativo
171
0,203 < 1:40 Negativo
172
0,151 < 1:40 Negativo
174
0,385* < 1:40 Negativo
175
0,128 < 1:40 Negativo
177
0,077 < 1:40 Negativo
178
0,156 < 1:40 Negativo
179
0,095 < 1:40 Negativo
180
0,098 < 1:40 Negativo
181
0,037 < 1:40 1/2+
182
0,100 < 1:40 Negativo
183
0,112 < 1:40 Negativo
* animal soropositivo
73
Quadro 9- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica
de ELISA, títulos de anticorpos por meio da reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas de
imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro
de 12 cães portadores de babesiose. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
149
0,028 < 1:40 Negativo
150
0,031 < 1:40 Negativo
151
0,073 < 1:40 Negativo
152
0,081 < 1:40 Negativo
153
0,141 < 1:40 Negativo
154
0,069 < 1:40 Negativo
155
0,132 < 1:40 Negativo
156
0,080 < 1:40 Negativo
157
0,087 < 1:40 Negativo
158
0,046 < 1:40 Negativo
159
0,045 < 1:40 Negativo
160
0,054 < 1:40 Negativo
Quadro 10- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica
de ELISA, títulos de anticorpos por meio da reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas de
imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro
de seis cães com co-infecção por erliquiose e babesiose.
(Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
161
0,313* < 1:40 1 +
162
0,310* < 1:40 Negativo
163
0,299* < 1:40 1/2 +
164
0,450* < 1:40 Negativo
165
0,397* < 1:40 1/2 +
166
0,140 < 1:40 Negativo
* animais soropositivos
74
Quadro 11- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de
ELISA, títulos de anticorpos por meio da reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas de
imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro
de 10 cães portadores de toxoplasmose. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
118
0,039 1:80* Negativo
119
0,023 < 1:40 Negativo
122
0,103 1:40* Negativo
123
0,033 < 1:40 Negativo
124
0,079 1:40* Negativo
128
0,015 < 1:40 Negativo
131
0,009 1:40* Negativo
133
0,081 < 1:40 Negativo
138
0,071 1:80* Negativo
148
0,054 < 1:40 1 +
*animais soropositivos
Quadro 12- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de
ELISA, títulos de anticorpos por meio da reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas de
imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro
de oito cães portadores de neosporose. (Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
121
0,088 < 1:40 Negativo
126
0,025 < 1:40 Negativo
129
0,056 < 1:40 Negativo
134
0,018 < 1:40 Negativo
137
0,056 < 1:40 Negativo
140
0,122 < 1:40 1 +
144
0,018 < 1:40 Negativo
147
0,130 < 1:40 Negativo
75
Quadro 13- Densidades ópticas médias (DO) obtidas por meio da técnica de
ELISA, títulos de anticorpos por meio da reação de
imunofluorescência indireta (RIFI) e leitura das fitas de
imunocromatografia para leishmaniose visceral canina, do soro de
13 cães com co-infecção por toxoplasmose e neosporose.
(Araçatuba-SP, 2006)
Animal ELISA
RIFI Imunocromatografia
120
0,028 < 1:40 Negativo
125
0,026 < 1:40 Negativo
127
0,026 < 1:40 1/2 +
130
0,027 < 1:40 Negativo
132
0,021 < 1:40 Negativo
135
0,002 < 1:40 Negativo
136
0,134 < 1:40 Negativo
139
0,065 < 1:40 1+
141
0,147 < 1:40 1/2 +
142
0,044 < 1:40 Negativo
143
0,066 < 1:40 Negativo
145
0,046 < 1:40 Negativo
146
0,034 < 1:40 Negativo
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