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LORRAYNE BERNEGOSSI POLONIO
Biomassa de Rubrivivax gelatinosus como Suplemento
de Rações para Galinhas Poedeiras
Araçatuba – SP
2007
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2
LORRAYNE BERNEGOSSI POLONIO
Biomassa de Rubrivivax gelatinosus como Suplemento
de Rações para Galinhas Poedeiras
Dissertação de mestrado apresentada à
Faculdade de Odontologia e Curso de Medicina
Veterinária da Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Campus de
Araçatuba, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
Orientadora: Profª. Ass. Drª. Elisa Helena Giglio Ponsano
Araçatuba – SP
2007
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3
Dedicatória
Dedico...
A Deus,
que me conduz pela vida de acordo com o Seu projeto de amor.
Ao meu querido esposo Fernando,
pela imensa compreensão, por sempre acreditar em mim e por seu amor,
que é um presente de Deus na minha vida.
4
Agradecimentos
À Faculdade de Odontologia e Curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Campus de Araçatuba, pela acolhida.
À Profª. Ass. Drª. Elisa Helena Giglio Ponsano pela orientação e pela dedicação demonstrada
durante todo o trabalho. Sua presença foi constante e fundamental para a execução da pesquisa.
Ao Prof. Adj. Manuel Garcia Neto pelas instruções sobre manejo das aves, pelo processamento e
análise estatística de parte dos dados.
Ao Prof. Ass. Dr. Marcelo Vasconcelos Meireles pelo auxílio na análise do material
histopatológico.
Ao Prof. Ass. Dr.
Marcos Franke Pinto pela colaboração na execução do experimento, pela
atenção e presteza.
Ao Prof. Ass. Dr. Paulo César Ciarlini e à residente Tatiana de Souza Barbosa pelo
processamento e execução dos exames sorológicos.
À Profª. Ass. Drª. Silvia Helena Venturoli Perri pelo processamento e análise estatística de parte
dos dados.
À Profª. Rosemeri de Oliveira Vasconcelos pelas instruções sobre métodos de colheita e
conservação de peças anatômicas para análises histopatológicas.
À Profª. Cristina Maria Rodrigues Monteiro, ao Prof. Titular Wilson Machado de Souza e à
Profª. Maria Cecília Rui Luvizoto por permitirem a confecção do material histopatológico nos
laboratórios sob suas responsabilidades e às funcionárias Marta Paccanaro Peres e Magna
Adriana da Silva Galvão pelo grande auxílio e instrução na confecção das mesmas.
5
Às médicas veterinárias Michele Honaga e Ana Paula da Silva Almeida pela maravilhosa
convivência e pelo auxílio na execução de todas as etapas do trabalho, às vezes até tarde da
noite.
Aos alunos de graduação do Curso de Medicina Veterinária – UNESP - Campus de Araçatuba
Tiago Augusto Ferrari, Luis da Silveira Neto, Saulo Vinícius Avanço, Débora Testoni Dias,
Renata Zanutto Paulino, Juliana Pampana Nicolau, e ao mestrando Luis Carlos Garibaldi Simon
Barbosa pelo auxílio e colaboração no trabalho.
Às funcionárias da biblioteca do Curso de Medicina Veterinária – UNESP - Campus de
Araçatuba, Isabel Pereira de Matos, Fátima Maria Metello Bertolucci e Alexandra Bento pelo
carinho e pelas instruções.
Ao funcionário do laboratório de alimentos do Curso de Medicina Veterinária – UNESP -
Campus de Araçatuba, Alexandre José Teixeira pela amizade e pela colaboração na execução do
trabalho.
Aos funcionários Adão Ângelo Custódio e Nerci Ramos Abreu pela colaboração, pelo apoio e
pela prontidão demonstrados na realização do abate das aves.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, pelo suporte financeiro
para a execução do experimento.
Aos professores do curso pelos ensinamentos transmitidos.
Às aves que doaram suas vidas para que este trabalho pudesse ser realizado.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
6
Epígrafe
“Antes do compromisso, há hesitação, a oportunidade de recuar, uma
ineficácia permanente. Em todo ato de iniciativa (e de criação), há
uma verdade elementar cujo desconhecimento destrói muitas idéias e
planos esplêndidos.
No momento em que nos comprometemos de fato, a Providência
também age. Ocorre toda espécie de coisas para nos ajudar, coisas que
de outro modo nunca ocorreriam. Toda uma cadeia de eventos emana
da decisão, fazendo vir em nosso favor todo tipo de encontros, de
incidentes e de apoio material imprevistos, que ninguém poderia sonhar
que surgiriam em seu caminho.
Começa tudo o que possas fazer.
A ousadia traz em si o gênio, o poder e a magia.”
Goethe
7
Sumário
SumárioSumário
Sumário
Capítulo 1
Capítulo 1Capítulo 1
Capítulo 1
9
Resumo 10
Palavras-chaves 10
Abstract 11
Key words 11
Introdução 12
Revisão da literatura 15
1 Carotenóides na natureza 15
2 Carotenóides e os animais 16
3 Carotenóides e pigmentação 17
4 Pigmentação da gema de ovos 18
5 Carotenóides como suplementos de rações animais 20
6 Produção de carotenóides bacterianos em efluentes industriais 22
Referências 25
Capítulo 2
Capítulo 2Capítulo 2
Capítulo 2
30
Artigo científico 31
Anexos 53
Tabela 6 54
Tabela 7 54
Parecer técnico das análises histopatológicas 55
Fotografias referentes ao experimento 57
Normas do Periódico Journal of Applied Poultry Research 62
8
Lista de tabelas
Lista de tabelasLista de tabelas
Lista de tabelas
Tabela 1 47
Tabela 2 49
Tabela 3 50
Tabela 4 51
Tabela 5 52
Tabela 6 54
Tabela 7 54
9
Capítulo 1
Capítulo 1Capítulo 1
Capítulo 1
10
POLONIO, L.B. Biomassa de Rubrivivax gelatinosus como suplemento de rações para
galinhas poedeiras. 2007. 62f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Faculdade de
Odontologia e Curso de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba,
2007.
Resumo
Os efeitos da adição de biomassa de Rubrivivax gelatinosus em dietas de galinhas poedeiras
foram investigados. Sorgo e milho foram utilizados para formulação de rações basais que
receberam níveis crescentes de biomassa. A biomassa bacteriana aumentou a tonalidade de
vermelho e diminuiu a luminosidade das gemas quando adicionada a ambas as rações basais. Na
ração à base de milho, 1.500ppm de biomassa foram suficientes para alcançar a preferência do
consumidor, enquanto que, com ração à base de sorgo, 7.500ppm foram necessários para atingir
o mesmo objetivo. Galinhas alimentadas com ração à base de milho tiveram consumo de ração
superior e melhor conversão alimentar que aquelas alimentadas com ração à base de sorgo, mas
os níveis de inclusão da biomassa em ambas as rações basais não influenciaram estes parâmetros.
Durante o período experimental não ocorreu mortalidade nem mudança no peso das galinhas. As
galinhas alimentadas com ração à base de milho mostraram taxas superiores de produção de
ovos, peso e massa de ovos que aquelas alimentadas com ração à base de sorgo. Estes
parâmetros não foram influenciados pela inclusão de níveis de biomassa em ambos os tipos de
ração. Níveis normais para enzimas séricas e ausência de lesões degenerativas e inflamatórias
nos fígados e nos rins das galinhas permitem a indicação da biomassa para suplementação de
rações.
Palavras-chaves: Cor da gemas de ovos, Preferência do consumidor, Desempenho
11
POLONIO, L. B.; PONSANO, E. H. G.; GARCIA NETO, M.; PINTO, M. F. Utilization of
Rubrivivax gelatinosus biomass to supplement laying hens rations. 2007. 62f. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal) – Faculdade de Odontologia e Curso de Medicina Veterinária,
Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2007.
Abstract
The effects of the dietary inclusion of Rvi. gelatinosus biomass in layers rations were
investigated. Sorghum and corn were used for the formulation of basal rations that received
increasing levels of biomass. The bacterial biomass increased red hues and decreased lightness
of yolks when added to both basal rations. Biomass at 1,500ppm in the corn-based ration was
enough to reach consumers` preference, while with the sorghum-based ration, 7,500ppm were
necessary to reach the same. Hens fed corn-based rations had superior feed consumption and
better feed conversion than those fed sorghum-based rations but the inclusion levels of the
biomass on both basal rations did not influence these parameters. No mortality and no change on
layers weight occurred during the experimental period. Hens fed corn-based rations showed
superior egg production, egg weight and egg mass rates than those fed sorghum-based rations.
These parameters were not influenced by the inclusion levels of the biomass on both kinds of
rations. Normal levels for seric enzymes and the absence of degenerative and inflammatory
lesions in livers and kidneys of hens allow the indication of the biomass for ration
supplementation.
Key words: Egg yolk color, Consumer preference, Performance
12
Introdução
A aparência dos alimentos, principalmente em relação à coloração, é uma característica
determinante na aceitação dos mesmos pelo consumidor. Geralmente, os consumidores preferem
produtos que apresentam, no momento da compra, cores intensas e uniformes, pois julgam que
são saudáveis, frescos, nutritivos e foram produzidos dentro de padrões de qualidade, enquanto
que alimentos de cores pálidas são comumente rejeitados pelos consumidores, pois seu aspecto
pode gerar desconfiança, suspeita de deterioração, ou mesmo, repugnância (FONTANA, 2003;
LIUFA et al., 1997; NYS, 2000; PONSANO et al.; 2002b).
Em tempos remotos, não havia problemas com a coloração de produtos de origem animal,
pois os métodos de produção eram extensivos, com o objetivo de abastecer a própria família do
criador ou, no máximo, diminutos mercados. Isto é particularmente verdadeiro no tocante à
criação de galinhas poedeiras, as quais podiam se alimentar por si próprias, e seus hábitos
alimentares geravam ovos com gemas de tonalidade agradável aos consumidores habituais
(BOSMA et al., 2003; KLAUI; BAUERNFEIND, 1981; LATSCHA, 1990).
No momento em que as pessoas passaram a se concentrar em cidades, os métodos de
produção tiveram de ser adaptados para atender à grande demanda por produtos de origem
animal, como os ovos, produto enfocado neste trabalho. As aves, então confinadas em granjas,
dependiam da dieta fornecida pelos criadores para proporcionar ovos com gemas de coloração
compatível com a preferência do consumidor. Desta forma, a responsabilidade por esta tarefa
recaiu sobre os ingredientes da ração, principalmente, o milho amarelo, que constitui o cereal
mais utilizado na alimentação de aves (LATSCHA, 1990; MARUSICH; BAUERNFEIND,
1981; PONSANO et al., 2004).
O milho, assim como os vegetais, as algas, alguns fungos e algumas bactérias, apresentam
pigmentos chamados carotenóides. Estes são responsáveis pela diversidade de cores observadas
na natureza, com tonalidades que vão do amarelo ao vermelho. As cores das pétalas de flores,
como margaridas e girassóis; de frutas, como morango e pêssego; de alguns insetos, como
besouros e borboletas; de aves como flamingo e arara vermelha; de peixes, como salmão e peixe
palhaço; de crustáceos, como lagosta e camarão, etc., são proporcionadas pelos pigmentos
carotenóides. A natureza sem os carotenóides seria bem menos colorida e menos bela
(GOUVEIA et al., 1996; HUDON, 1994; WILLIAMS, 1992).
13
No entanto, os animais são incapazes de produzir tais pigmentos, e precisam ingerí-los na
sua dieta para que produtos de origem animal tenham uma coloração adequada. A cor das gemas,
portanto, depende da presença de carotenóides na dieta das galinhas e, quanto mais as aves
consumirem alimentos que contenham pigmentos carotenóides em sua constituição, tanto maior
será a deposição destes pigmentos nas gemas dos ovos e a intensidade da sua coloração
(AWANG et al., 1992; BAUERNFEIND, 1972; HENCKEN, 1992; KLAUI; BAUERNFEIND,
1981, LATSCHA, 1990; MARUSICH; BAUERNFEIND, 1981).
O milho sozinho, porém, nem sempre pode gerar nas gemas a coloração desejada pelos
consumidores, pois seus pigmentos carotenóides podem variar devido à sua instabilidade. Os
carotenóides podem sofrer oxidação degradativa dependendo do tempo de estocagem do milho,
da temperatura ambiente e da incidência de iluminação. Até mesmo os processos de colheita e de
moagem do milho para a produção de ração podem comprometer a quantidade destes pigmentos
e prejudicar a absorção e deposição de carotenóides pelas aves nos tecidos corporais, em
particular na gema do ovo (EL BOUSHY; RATERINK, 1992; NYS, 2000).
Com a intenção de solucionar este problema, várias pesquisas têm sido conduzidas com o
objetivo de buscar fontes alternativas de pigmentos carotenóides a serem adicionadas à ração de
galinhas poedeiras para melhorar a coloração das gemas. Devido à tendência atual para o uso de
produtos naturais, muitas algas, leveduras, vegetais e microrganismos estão sendo estudados e
recomendados para utilização como suplemento pigmentante (AKIBA et al., 2000; BOSMA, et
al., 2003; EL BOUSHY; RATERINK, 1992; FARRAN, 2001; GOUVEIA et al., 1996; LIUFA et
al, 1997; PATERSON et al., 2000; PEREZ-VENDRELL, et al., 2001; PINCHASOV et al., 1992;
PONSANO et al., 2002b; PONSANO et al., 2004; PRABAKARAN et al., 2001).
Dentre estas fontes alternativas de pigmentos carotenóides, está a biomassa de coloração
vermelho-púrpura produzida pela bactéria fotossintetizante Rubrivivax gelatinosus. Esta bactéria
não patogênica é encontrada em ambientes aquáticos, solos úmidos e efluentes industriais, onde
desempenha uma função primordial na despoluição das águas residuárias. A biomassa oriunda
do cultivo desta bactéria em efluente de abatedouro avícola é rica em nutrientes e pigmentos
carotenóides, sugerindo sua utilização como suplemento para ração de galinhas poedeiras com a
intenção de aumentar a pigmentação da cor da gema (PONSANO et al., 2002a; 2003; 2004).
O fato de Rubrivivax gelatinosus ser um microrganismo com capacidade depuradora de
efluentes e de sua biomassa ser constituída por nutrientes e pigmentos carotenóides significa um
magnífico recurso para a avicultura industrial, pois o substrato para o crescimento da bactéria é
um subproduto poluidor da indústria alimentícia, que precisa ser tratado ou eliminado por todas
as indústrias de produtos avícolas (PONSANO et al., 2002a).
14
A presente pesquisa teve o objetivo de avaliar os efeitos da aplicação de diferentes níveis
de biomassa da referida bactéria em ração para galinhas poedeiras quanto à tonalidade das
gemas, à fisiologia das aves, aos parâmetros de desempenho e à preferência do consumidor.
Estes estudos estão abordados no artigo científico apresentado no capítulo 2 da presente
dissertação de mestrado.
15
Revisão da Literatura
1 Carotenóides na natureza
Os carotenóides são uma classe de pigmentos de ocorrência natural, de cores amarela,
alaranjada e vermelha. O nome do grupo é devido ao fato dos carotenóides constituírem o
principal pigmento da cenoura (Daucus carota), um dos primeiros alimentos em que se observou
esta classe de pigmentos. Os carotenóides constituem o grupo de pigmentos de ocorrência
natural mais difundida. Cerca de 600 pigmentos carotenóides foram isolados e identificados nos
reinos animal e vegetal e a cada ano este número aumenta com a descoberta de novos pigmentos
(BAUERNFEIND, 1972; GOODWIN, 1986; KLAUI; BAUERNFEIND, 1981; LATSCHA,
1990; NYS, 2000).
Universalmente presentes em tecidos vegetais fotossintéticos, os carotenóides também
podem ser encontrados em tecidos não fotossintéticos de plantas superiores, como frutas, pétalas
de flores, pólen, raízes, etc., bem como em tecidos animais. Neste caso, eles aparecem como
conseqüência da deposição em tecidos-alvos, uma vez que os animais são incapazes de sintetizar
seus próprios carotenóides, dependendo totalmente da ingestão na dieta para seu suprimento de
pigmentos carotenóides (AWANG et al., 1992; BAUERNFEIND, 1972; BOSMA et al., 2003;
GOUVEIA et al., 1996; HENCKEN, 1992; HUDON, 1994; KLAUI; BAUERNFEIND, 1981;
LATSCHA, 1990; LIUFA et al., 1997; MARUSICH; BAUERNFEIND, 1981; NYS, 2000;
PONSANO et al., 2002b; PONSANO et al., 2004; WILLIAMS, 1992).
Além de sua variedade e beleza, os pigmentos carotenóides executam funções muito
variadas na vida de vários organismos. No reino vegetal, por exemplo, os carotenóides têm
importância na fotossíntese ao partilhar com a clorofila uma função chave no metabolismo de
energia dos vegetais superiores. Esses pigmentos são considerados condutores de energia, pois
absorvem a luz como um tipo de antena, tornam-se excitados e transferem esta energia capturada
para centros de reação, onde a energia da luz é convertida em energia elétrica e, então, em
energia química, na forma de trifosfato de adenosina (ATP), substância necessária para a síntese
de uma variedade de compostos (LATSCHA, 1990).
No reino animal, várias interações intra e inter-específicas e modelos de comportamento
são fortemente influenciadas pela cor, que atua como sinal, por exemplo, como um atrativo, uma
advertência ou como uma camuflagem, em comunicações entre uma ampla variedade de
16
organismos. À parte destas funções sinalizadoras óbvias, contudo, os carotenóides também
realizam uma ampla extensão de tarefas puramente fisiológicas, atuando como precursores da
vitamina A e participando do desenvolvimento e maturação gonadal, da fertilização, da gestação,
da viabilidade e crescimento, particularmente de peixes e crustáceos e no processo reprodutivo
de uma grande variedade de classes e espécies animais, como por exemplo, aves, bovinos,
eqüinos e suínos (AMAYA, 1985; BHOSALE; BERNSTEIN, 2005; BOSMA, et al., 2003;
GOODWIN, 1986; HENCKEN, 1992; KLAUI; BAUERNFEIND, 1981; LATSCHA, 1990;
MARUSICH; BAUERNFEIND, 1981; PEREZ-VENDRELL, et al., 2001).
Os carotenóides são divididos, quimicamente, em dois grupos: os carotenos e as xantofilas.
Os carotenos são hidrocarbonetos puros, ou seja, compostos consistindo apenas de átomos de
carbono e hidrogênio, sem oxigênio, geralmente de cor alaranjada. As xantofilas, por sua vez,
são derivadas dos carotenos correspondentes pela adição de várias funções de oxigênio, de
coloração amarela e vermelha, também chamadas oxicarotenóides. Os carotenóides mais
adequados para a pigmentação são aqueles contendo funções oxigenadas por apresentarem a
capacidade de se depositar nos tecidos animais (BHOSALE; BERNSTEIN, 2005; EL BOUSHY;
RATERINK, 1992; LATSCHA, 1990; LIAAEN-JENSEN, 1978; WILLIAMS, 1992;
PONSANO et al., 2004).
2 Carotenóides e os animais
Os carotenóides ingeridos pelos animais em sua alimentação são absorvidos pelo intestino
delgado, principalmente na área do jejuno-íleo e uma pequena porção no duodeno, junto com
outros lipídeos (EL BOUSHY; RATERINK, 1992; LATSCHA, 1990; NYS, 2000; PEREZ-
VENDRELL et al., 2001).
Os mamíferos, de modo geral, não acumulam carotenos nem xantofilas. Até o que se sabe
hoje, o homem é o único entre os mamíferos que acumula pigmentos carotenóides em
quantidades significantes. Em contraste, invertebrados marinhos e terrestres são ricos em
carotenóides (esponjas, celenterados, equinodermos, caracóis, crustáceos, insetos), como são,
também, um grande número de peixes e aves. As aves, em geral, absorvem principalmente
oxicarotenóides que se acumulam em locais como a pele, a plumagem, as pernas, o tecido
adiposo corporal, o fígado e, acima de tudo, a gema do ovo. Portanto, a coloração amarelo-
alaranjada da gema de ovo não é sintetizada pela galinha, mas é proveniente da transferência
dietária e depósito de pigmentos oxicarotenóides (xantofilas) presentes na ração (AWANG et al.,
17
1992; BAUERNFEIND, 1972; BOSMA et al., 2003; GOUVEIA et al., 1996; HENCKEN, 1992;
HUDON, 1994; KLAUI; BAUERNFEIND, 1981; LATSCHA, 1990, MARUSICH;
BAUERNFEIND, 1981; PRABAKARAN et al., 2001; WILLIAMS, 1992).
Em animais, os carotenóides também exercem várias funções protetoras. Eles podem,
efetivamente, destruir espécies reativas de oxigênio (radicais livres) e inibir sua formação,
atuando, desta forma, como um antioxidante. Recentemente, foi evidenciada uma importante
função no campo da imunologia veterinária e humana. Em frangos, os carotenóides podem
fornecer proteção contra encefalomalácea. Os carotenóides parecem aumentar a atividade
citotóxica de Natural Killers, diminuir a velocidade de crescimento de tumores e promover a
cura de feridas (BHOSALE; BERNSTEIN, 2005; KLAUI; BAUERNFEIND, 1981; LATSCHA,
1990; NYS, 2000).
Evidências epidemiológicas sugerem que as xantofilas dietárias podem inibir o começo de
muitas doenças, tais como aterosclerose, catarata, degeneração macular relacionada à idade,
escleroses múltiplas e cânceres. Devido às notáveis propriedades antioxidantes e funções
relacionadas à saúde, as xantofilas constituem um mercado mundial multimilionário
(BHOSALE; BERNSTEIN, 2005).
3 Carotenóides e pigmentação
As cores são parte integral da experiência diária do homem. Não é de admirar, portanto,
que as cores também possuam uma importante função na culinária pois, para que um produto
comestível em particular seja considerado apetitoso, ele deve apresentar uma determinada cor.
Foi demonstrado, repetidamente, que uma mudança radical na coloração do alimento, ainda que
sem mudança no sabor e aroma, pode torná-lo completamente inaceitável (WILLIAMS, 1992).
Cores fortes e vivas aguçam o apetite, aumentam a satisfação e a apreciação do alimento, e
atuam também como um tipo de tempero. Em contraste, cores parecendo artificiais dão origem a
desconfiança e rejeição. Dos diferentes critérios de qualidade, a cor é, portanto, um dos mais
importantes, embora freqüentemente subestimada. Então, não é coincidência que extratos de
grãos e plantas tais como páprica, açafrão, cenoura, pimenta e outros tenham sido usados por
séculos para refinar alimentos em todo o mundo (LASTCHA, 1990).
Para a maioria dos consumidores, poucas propriedades dos alimentos são mais importantes
do que a cor. Quando determinado produto se apresenta com a coloração esperada, a resposta do
consumidor é agradável, porém, quando o alimento tem uma coloração inesperada, o consumidor
18
torna-se cauteloso e interpreta-a como um possível sinal de imaturidade, de deterioração, de
processamento inapropriado ou adulterado. A coloração do alimento influencia na decisão de
compra do produto. Em adição, há uma conexão entre cor e saúde onde, normalmente, há um
instinto de rejeição por alimentos de origem animal que se apresentam pálidos. Cores naturais e
brilhantes dão impressão de um alimento de alta qualidade, sadio e nutritivo (FONTANA, 2003;
GOUVEIA et al., 1996; KLAUI; BAUERNFEIND, 1981, LATSCHA, 1990; LIUFA et al.,
1997; NYS, 2000; PONSANO et al., 2002b; PONSANO et al., 2004; SUNDE, 1992;
WILLIAMS, 1992).
No intuito de atender às exigências dos consumidores e das indústrias produtoras de
alimentos, os produtores de aves adicionam corantes, geralmente sintéticos, às dietas de galinhas
poedeiras para melhorar a atratividade de ovos e seus produtos (AWANG et al., 1992;
BAUERNFEIND, 1972; BOSMA et al., 2003; HENCKEN, 1992).
Pigmentos ou corantes são termos que designam compostos que, quando presentes na
matéria-prima ou adicionados às rações, têm um efeito corante nos tecidos dos animais como
pele, gordura e músculo, ou seus produtos tais como ovos, manteiga e queijo (BAUERNFEIND,
1972; LATSCHA, 1990; MARUSICH; BAUERNFEIND, 1981).
O grupo de corantes alimentares mais difundido pertence à família dos carotenóides, os
quais estão naturalmente presentes em vegetais, como frutas, grãos de cereais, alimentos
marinhos e laticínios. Em animais, a presença de carotenóides é responsável, por exemplo, pela
cor do peixe dourado, do camarão, dos canários e dos flamingos (WILLIAMS, 1992).
Por isso, além da ampla extensão de funções fisiológicas, os carotenóides também
influenciam a aparência, isto é, a coloração de muitos produtos usados pelo homem como
alimento. Ultimamente, a principal significância dos carotenóides é sua utilidade como
pigmentante natural adicionado à ração de animais para elevar a qualidade da aparência de
muitos alimentos de origem animal, tais como ovos (AMAYA, 1985; BAUERNFEIND, 1972;
HENCKEN, 1992; LATSCHA, 1990).
4 Pigmentação da gema de ovos
Os ovos são uma rica fonte de nutrientes vitais e, por isso, são comumente usados na
alimentação humana. O grau de pigmentação das gemas de ovos depende basicamente do desejo
do consumidor e varia com a área geográfica, tradição e cultura. Em países como Alemanha,
França (região Sul), Países Baixos, Espanha, Itália, Peru, Colômbia, Israel, Suíça, Ceilão,
19
Austrália, Nova Zelândia, Irlanda do Norte, África do Sul, Estados Unidos (região Nordeste),
México e Bélgica, gemas de coloração mais alaranjada são preferidas (EL BOUSHY;
RATERINK, 1992; GOUVEIA et al., 1996; MARUSICH; BAUERNFEIND, 1981; NYS, 2000;
PRABAKARAN et al., 2001; SUNDE, 1992). No Norte da França, no Sul da Inglaterra e na
Finlândia, os consumidores preferem gemas de coloração intermediária, enquanto que na Irlanda,
no Norte da Inglaterra e na Suécia, a preferência é por gemas de cor pálida (SUNDE, 1992;
NYS, 2000). No Brasil, consumidores de algumas regiões preferem gemas de ovos bem
pigmentadas (PONSANO et al., 2002b; 2004), havendo diferenças de preferência entre regiões
metropolitanas e interioranas. Em muitas áreas de mercado ao redor do mundo, consumidores e
indústrias que produzem alimentos contendo ovos em sua formulação (maionese, misturas para
bolos, produtos de confeitaria, massas, e outros) preferem gemas de ovos fortemente coloridas,
sendo difícil resistir ou ignorar essa tendência cultural e comercial (AKIBA et al., 2001;
BAUERNFEIND, 1972; EL BOUSHY; RATERINK, 1992; MARUSICH; BAUERNFEIND,
1981; PONSANO et al., 2002b; WILLIAMS, 1992).
Com o advento da industrialização e dos grandes avanços nos campos da medicina e da
higiene no início do século XIX, uma mudança fundamental nas estruturas sociais começou a se
desenvolver. O resultado foi a migração da população rural e a concentração de setores
industrializados da sociedade em cidades, um aumento exponencial sustentado da população e,
em conseqüência, uma mudança fundamental na situação de suprimento de alimentos. A
pequena propriedade rural foi substituída pelo empreendimento agrícola racionalizado focado na
maximização da produção, visando suprir as necessidades da população crescente com produtos
essenciais, particularmente, proteína animal (LATSCHA, 1990).
Na época de produção extensiva de aves, a pigmentação dos produtos não apresentava
problemas, pois a alimentação com milho, o livre acesso das galinhas à grama verde e a
oportunidade de se alimentarem por si mesmas garantiam uma adequada pigmentação às gemas
de ovos, embora a taxa produção fosse baixa (BOSMA et al., 2003; KLAUI; BAUERNFEIND,
1981; LATSCHA, 1990; MARUSICH; BAUERNFEIND, 1981).
Atualmente, com os métodos de criação intensivos, o peso da pigmentação recaiu sobre o
milho amarelo, que nem sempre produz resultados adequados sem a ajuda de quantidades
significativas de corantes provenientes de fontes externas. Além disso, a seleção genética de
linhagens animais de alta produção com menor ingestão de ração e o uso de dietas com baixo
teor de fibras resultaram em uma ingestão menor de xantofilas para serem transferidas e
depositadas nas gemas que, consequentemente, se tornaram de coloração mais clara
20
(BAUERNFEIND, 1972; CHANDRA et al., 1978; KLAUI; BAUERNFEIND, 1981;
LATSCHA, 1990; MARUSICH; BAUERNFEIND, 1981; PONSANO et al., 2004).
Em geral, o uso de rações ricas em carotenóides, ou de suplementos carotenóides na ração,
efetivamente mantém ou aumenta a coloração onde carotenóides são limitantes. Estas práticas
têm se tornado o principal meio de conseguir a coloração desejada em vários produtos de origem
animal, incluindo gemas de ovos (HUDON, 1994).
5 Carotenóides como suplementos de rações animais
Nos últimos anos, tem havido uma tendência para uso de produtos naturais e de baixo
custo, em detrimento ao uso de produtos artificiais ou sintéticos para suplementação de dietas
animais, com o objetivo de melhorar a coloração de alimentos. Devido ao fato dos carotenóides
serem pigmentos naturais, eles estão bem adaptados a esta crescente demanda de grandes grupos
de consumidores para o uso de, somente, pigmentos de ocorrência natural em rações e produtos
alimentares. (BAUERNFEIND, 1972; LATSCHA, 1990; PONSANO et al., 2004; TOYOMIZU
et al., 2001).
Os carotenóides mostram pobre estabilidade e são altamente sensíveis a uma ampla
variedade de fatores, tais como luz, oxigênio, ácidos, bases e calor. Sob tais condições, os
carotenóides são suscetíveis a processos de degradação oxidativa rápida (LATSCHA, 1990;
NYS, 2000).
A taxa de diminuição do conteúdo de carotenóides aumenta quando a temperatura ambiente
está elevada. O conteúdo de carotenóides dos ingredientes naturais das rações mostra uma
grande variação. Entre os grãos, somente o milho amarelo e seus subprodutos contêm
quantidades mensuráveis destes pigmentos, com os carotenos representando somente cerca de
10% do total de carotenóides e as xantofilas 90%. Porém, o conteúdo total de carotenóides do
milho amarelo - principal cereal utilizado como ingrediente energético e fonte de xantofilas na
ração para aves - não é constante. As condições de colheita e a moagem podem destruir ou
remover uma porção considerável do conteúdo de carotenóides. A estocagem do milho por um
ano a 25ºC determina perda de 50% do seu conteúdo de oxicarotenóides. Este fato deve ser
considerado por países que dependem da importação de ingredientes para ração
(BAUERNFEIND, 1972; EL BOUSHY; RATERINK, 1992; LATSCHA, 1990; MARUSICH;
BAUERNFEIND, 1981; NYS, 2000).
21
Por conta disto, muitas pesquisas têm sido realizadas, para testar xantofilas de plantas,
algas e leveduras no intuito de obter fontes alternativas de carotenóides suplementares de origem
natural para aumentar o conteúdo destes pigmentos na ração para aves (AKIBA et al., 2000;
AWANG et al., 1992; BOSMA, et al., 2003; EL BOUSHY; RATERINK, 1992; FARRAN,
2001; GOUVEIA et al., 1996; LIUFA et al, 1997; MARUSICH; BAUERNFEIND, 1981;
PATERSON et al., 2000; PEREZ-VENDRELL, et al., 2001; PINCHASOV et al., 1992;
PONSANO et al., 2002b; PONSANO et al., 2004; PRABAKARAN et al., 2001).
Pinchasov et al. (1992) compararam dietas à base de milho e soja adicionadas de diferentes
concentrações cantaxantina sintética (Carophyll red - Roche
®
) e observaram que, aumentando os
níveis de cantaxantina, a pigmentação da gema aumentou de maneira quadrática. Gouveia et al.
(1996) avaliaram o efeito dos carotenóides presentes na biomassa da microalga Chlorella
vulgaris sobre a pigmentação das gemas de ovos, quando incluída na ração, com bons resultados.
Liufa et al. (1997) utilizaram farinha de folha de Alocasia macrorrhiza, rica em xantofilas, na
ração de aves com bons resultados na pigmentação das gemas e boas perspectivas para seu uso
como pigmentante de tecidos e produtos avícolas. Baiao et al. (1999) avaliaram a eficácia
pigmentante de vários oxicarotenóides na gema do ovo, utilizando três fontes dietárias de
oxicarotenóides amarelos e duas fontes de carotenóides vermelhos combinados em rações para
poedeiras e demonstraram a importância das xantofilas vermelhas para a geração de uma
tonalidade mais pigmentada à gema. Akiba et al. (2000) conduziram dois experimentos para
avaliar o potencial pigmentante da gema de ovos com Phaffia rhodozyma, uma levedura
contendo altos teores de oxicarotenóides em comparação com a páprica, uma fonte pigmentante
de ocorrência natural, e os resultados mostraram que a levedura pode ser uma fonte útil para o
propósito almejado. Paterson et al. (2000) testaram a utilização de farinha de folhas de
Calliandra calothyrsus em ração para galinhas poedeiras e comprovaram sua utilidade como
fonte de pigmentação dietária para a produção de ovos. Farran (2001) avaliou os parâmetros de
qualidade de ovos de galinhas poedeiras alimentadas com sementes de Vicia sativa e os
resultados indicaram que a semente não foi prejudicial para as aves. Prabakaran et al. (2001)
adicionaram dois produtos comerciais que contêm xantofilas derivadas de flores de Marigold
(Tagetes erecta. L) e Pimenta do Chile (Capsicum annum. L) na ração de poedeiras, em
diferentes combinações, para tentar melhorar a intensidade da cor das gemas e avaliar seus
efeitos na preferência do consumidor, e observaram que os consumidores preferiram os ovos de
coloração mais intensa. Ponsano et al. (2002a) desenvolveram metodologia para o isolamento e
caracterização da bactéria púrpura não sulfurosa Rubrivivax gelatinosus de efluente de
abatedouro avícola, sugerindo o uso de sua biomassa na suplementação de rações para galinhas
22
poedeiras. Bosma et al. (2003), estudaram a otimização da produção de flores de Marigold
africana (Tagetes erecta L.), pois os pigmentos carotenóides das flores desta planta podem ser
extraídos e utilizados como aditivo alimentar natural para colorir gemas de ovos com a
tonalidade alaranjada.
Como resultado de numerosos experimentos com variadas fontes de carotenóides, pode ser
constatado que a cor da gema resulta de deposição, relativamente não específica, de
oxicarotenóides, ou seja, é necessário que o carotenóide possua grupos funcionais contendo
oxigênio. Os carotenos, hidrocarbonetos puros, não possuem grupos funcionais oxigenados e não
são depositados na gema em quantidade significativa. Os oxicarotenóides são depositados nas
gemas dos ovos em proporção direta à sua distribuição na ração, sendo que a taxa de deposição
dos carotenóides da ração nos tecidos alvos é o principal fator que determina a eficiência
pigmentante dos carotenóides (EL BOUSHY; RATERINK, 1992; HENCKEN, 1992;
MARUSICH; BAUERNFEIND, 1981; WILLIAMS, 1992).
6. Produção de carotenóides bacterianos em efluentes industriais
Dentre as mais diversificadas fontes de pigmentos carotenóides destacam-se as biomassas
provenientes do cultivo de bactérias púrpuras fotossintetizantes, pois estes microrganismos
possuem a especial função de depuração de águas residuárias, e seu crescimento nestas águas
origina uma biomassa nutritiva. Experimentos foram conduzidos por Kobayashi e Kurata (1978),
Balloni et al. (1987) e Ponsano et al. (2002a; 2002b; 2003; 2004) com a obtenção de bons
resultados na purificação de efluentes industriais, além da pigmentação de gemas de ovos e
carcaças de frangos de corte, devido às muitas vantagens que estes microrganismos apresentam.
A ocorrência freqüente das espécies de bactérias púrpuras fotossintetizantes, como
Rubrivivax sp, em instalações de tratamento de águas residuárias (despejos) e lagoas aponta para
a possibilidade de aplicação planejada deste microrganismo no tratamento de efluentes, com a
vantagem da produção de biomassa rica em compostos como proteínas com altas quantidades de
aminoácidos essenciais, carotenóides, cofatores biológicos e vitaminas, especialmente a vitamina
B
12
(BALLONI et al., 1987; BALLOWS et al., 1992; KOBAYASHI; KURATA, 1978;
PONSANO et al., 2002a).
Getha et al. (1998) utilizaram a bactéria púrpura fotossintetizante, Rhodopseudomonas
palustris, para tratamento de águas residuárias ricas em carboidratos provenientes de fábrica de
macarrão com a produção de biomassa rica em pigmentos carotenóides e com a redução de 77%
23
na demanda química de oxigênio do efluente. Ponsano et al. (2002a) desenvolveram
metodologias para isolamento de Rhodocyclus gelatinosus (atualmente denominada Rubrivivax
gelatinosus) de efluente de abatedouro avícola e para sua caracterização. A bactéria isolada e
caracterizada foi cultivada em águas residuárias de abatedouro de aves, onde promoveu o
desenvolvimento de coloração vermelho-castanha devido à presença de oxicarotenóides da série
espiriloxantina alternativa que produz, dentre eles esferoidene, hidroxi-esferoidene e
espiriloxantina. O cultivo microbiano, após ser submetido às operações de centrifugação e
liofilização, originou a biomassa bacteriana contendo 7,1% de umidade, 62,8% de proteína bruta
(com todos os aminoácidos essenciais para aves), 25,6% de carboidratos totais, 0,5% de lipídeos
e 4,0% de sais minerais, em base seca, e seu uso foi sugerido como suplemento alimentar na
ração de aves (PONSANO et al., 2002a; 2003; 2004). Azad et al. (2003) avaliaram os efeitos da
utilização da bactéria fotossintetizante Rhodovulum sulfidophilum no tratamento de efluente
industrial de processamento de sardinha, com a produção de biomassa útil para aqüicultura e
com a redução simultânea da Demanda Química de Oxigênio (DQO) da água residuária.
Ponsano et al. (2004) avaliaram a atividade de Rhodocyclus gelatinosus como despoluente de
efluente de abatedouro avícola. Além disso, estudaram a utilização de diferentes níveis da
biomassa da bactéria na promoção da pigmentação de gemas de ovos e a influência da inclusão
dietária do produto sobre parâmetros de desempenho de galinhas poedeiras. Efeitos positivos
foram encontrados na despoluição das águas residuárias e na suplementação da ração com a
biomassa. Zheng et al. (2005) estudaram a utilização de efluente industrial da fabricação de óleo
para a produção de biomassa de leveduras como Rhodotorula rubra, Candida tropicalis e C.
utilis e obtiveram bons resultados na purificação do efluente, além de um produto rico em
proteínas, com destino à alimentação animal.
Conforme visto, os microrganismos fotossintetizantes executam uma importante função de
purificação do resíduo líquido industrial, sua utilização é interessante porque a matéria-prima é
livre de custo, requer menor custo com instalação de equipamento purificador de águas
residuárias, a biomassa é rica em proteínas e tem ótima composição em aminoácidos e vitaminas,
não é patogênica ou tóxica (KOBAYASHI; KURATA, 1978).
De acordo com Chávez et al. (2005) o processamento de um frango para consumo humano
requer 10 a 12 litros de água, dos quais 60% são convertidos em efluente de abatedouro avícola.
Considerando que, segundo Pinheiro e Pinheiro (2006), no ano de 2005 a avicultura brasileira
produziu 9,3 milhões de toneladas de carne de frango, podemos concluir que são produzidos, em
média, 62 milhões de litros de efluente de abatedouro avícola por dia no Brasil.
24
Este imenso volume de efluente oriundo de abatedouros avícolas brasileiros demonstra o
potencial de substrato para o cultivo de Rubrivivax gelatinosus, com duas vantagens primordiais.
A primeira delas tem valor sublime para o meio ambiente e constitui-se na despoluição dos
efluentes de abatedouros avícolas pelo desenvolvimento de Rvi. gelatinosus, promovendo a
degradação da matéria orgânica presente nas águas residuárias. A conseqüência direta deste
desenvolvimento gera a segunda vantagem, que é a produção de uma biomassa rica em
nutrientes protéicos, vitamínicos e pigmentos oxicarotenóides, a qual pode ser utilizada como
ingrediente pigmentante em ração para galinhas poedeiras, com o objetivo de melhorar a
atratividade das gemas de ovos e de produtos que contenham ovos em sua formulação.
Neste trabalho de pesquisa, foram empregados níveis mais altos de biomassa de R.
gelatinosus que em trabalhos anteriores, como os executados por Ponsano et al. (2002b; 2004),
com o objetivo de avaliar os efeitos da utilização destes níveis superiores na fisiologia das aves
quanto a possível toxicidade do emprego da biomassa, no desempenho das galinhas, na
intensidade da coloração das gemas e na aceitação das mesmas pelos consumidores.
O capítulo 2 é referente ao artigo científico intitulado Utilization of Rubrivivax
gelatinosus Biomass to Supplement Laying Hen Rations, que teve como objetivos avaliar os
efeitos da adição de biomassa de Rvi. gelatinosus em ração de galinhas poedeiras sobre a cor das
gemas e a preferência do consumidor.
O artigo foi escrito de acordo com as normas da revista Journal of Applied Poultry
Research.
25
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30
Capítulo 2
Capítulo 2Capítulo 2
Capítulo 2
31
Artigo Científico
UTILIZATION OF RUBRIVIVAX GELATINOSUS BIOMASS TO SUPPLEMENT LAYING
HENS RATIONS
L. B. POLONIO, E. H. G. PONSANO
1
, M. GARCIA NETO and M. F. PINTO
Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, Curso de Medicina Veterinária, Universidade
Estadual Paulista - Unesp.
P. O. box 341, Araçatuba – SP, Brazil. 16050 – 680.
Phone: (18) 3636-1381
Fax: (18) 3636-1352
Primary Audience: Egg Producers, Nutritionists, Researchers, Feed Manufacturers
SUMMARY
The effects of the dietary inclusion of Rvi. gelatinosus biomass in layers rations on
yolk color, consumer preference, productive parameters and hens` metabolism were investigated.
One hundred twenty six Dekalbe hens aging 19 weeks were used in the experiment. Sorghum
and corn were used for the formulation of basal rations that received increasing levels of
biomass. The bacterial biomass increased red hues and decreased lightness of yolks when added
to both basal rations. Biomass at 1,500ppm in the corn-based ration was enough to reach
consumers` preference, while with the sorghum-based ration, 7,500ppm were necessary to reach
1
Corresponding author: elisahgp@fmva.unesp.br
32
the same. Hens fed corn-based rations had superior feed consumption and better feed conversion
than those fed sorghum-based rations but the increasing levels of the biomass on both basal
rations did not influence these parameters. No mortality and no change on layers` weight
occurred during the experimental period. Hens fed corn-based rations had superior egg
production, egg weight and egg mass rates than those fed sorghum-based rations, although these
parameters were not influenced by the increasing levels of the biomass on both kinds of rations.
Normal levels for seric enzymes and the absence of degenerative and inflammatory lesions in
livers and kidneys of hens allow the indication of the biomass for ration supplementation.
Key words: yolk color, consumer preference, performance, egg production
Running Title: BIOMASS IN LAYERS RATIONS
DESCRIPTION OF PROBLEM
For most consumers around the world, few attributes of food can influence at a
deeper degree the decision for the purchase of foodstuffs rather than color. Natural and bright
colors remind high quality, healthful and nutritious food, what is especially true for egg yolks [1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]. In some regions like Germany, south of France, The Netherlands, Spain,
Italy, Peru, Colombia, Israel, Swiss, Grain-Britain, Ceiland, Australia, New Zealand, North
Ireland, South Africa, northeast of United States of America, Mexico and Belgium, people prefer
orange yolks [2, 4, 6, 10, 11]. In the north region of France, in the south of England and in
Finland, consumers prefer an intermediate color for yolks, while in Ireland, in the north of
33
England and in Sweden, most consumer prefer pale yolks [2, 6]. In Brazil, there are differences
in the preference for the color of the egg yolk that vary in accordance with the region [8, 9], i.e.
either in country or metropolitan sites but, in a general sense, most consumers prefer well-
pigmented egg yolks. The color of the egg yolk depends on the amount and kind of xanthophylls
present in the animal feed [12, 13] since birds, as the other animals, are unable to synthesize their
own carotenoids, conversely of plants, fungi, algae and photosynthetic bacteria [1, 3, 4, 5, 6, 8, 9,
10, 14, 15, 16, 17]. The yellow-orange color of the egg yolk, thus, is not synthesized by the
laying hen, but derives from the dietary transference and deposition of pigments from the feed
that occur in yolk and other tissues [1, 3, 4, 10, 14, 15, 16, 17, 18]. In order to attain the optimal
coloration for yolks, hens` feed must contain yellow and red xanthophylls, commonly supplied
by the feed ingredients, such as corn and alfalfa [12]. Moreover, also to reach the market
requests and increase attractiveness of egg products, poultry breeders generally add synthetic
pigments to hens` diets [14, 15, 16, 17]. Recent researches have been accomplished in an attempt
to experience xanthophylls from plants, algae, bacteria and yeasts as alternative sources of
natural carotenoids for birds` feeds [4, 5, 8, 9, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25].
Photosynthetic bacteria like Rubrivivax gelatinosus widely inhabit aquatic
environments, moist soil and industrial effluents, in which they play an important role in the
degradation of pollutant compounds [26]. Biomass derived from the cultivation of Rvi.
gelatinosus in poultry slaughterhouse wastewater contains xanthophylls from alternative
spirilloxanthin series that impairs its purple-red color and suggest its use as a pigment for poultry
products [9, 26]. Rvi. gelatinosus biomass has been previously tested in broilers and layers
rations aiming at color enhance of carcass and yolks [8, 9]. Nevertheless, its effects on hens`
physiology have not been investigated yet and, according to Litchfield [27] the toxicity of
ingredients might be investigated before they can be safely used for feed supplementation.
Moreover, investigations on the inclusion levels of the product to reach consumers` preference
34
on the color of products and about hens` productive parameters also needed to be performed
before the recommendation of the biomass for feeding supplementation.
So, the purpose of this research was to evaluate the influence of the dietary inclusion
of Rvi. gelatinosus biomass on yolk color, consumer preference, performance, hepatic and renal
metabolism of laying hens.
MATERIAL AND METHODS
Ration Formulation and Layers Management
Corn and sorghum isocaloric and isoproteic diets (Table 1) were formulated
according to NRC recommendations [28]. One hundred twenty-six Dekalbe layers at 19 wks age
were individually housed in wire cages (25 cm wide × 40 cm deep × 45 cm high) equipped with
feeders and drinkers. During an adaptation period of four wks, layers were fed sorghum ration
with no biomass addition at 100g/hen per day and water ad libitum. The time of light exposition
gradually increased during the adaptation period until it reached 16h per day, and so remained
for the whole experiment time. The inclusion levels of Rvi. gelatinosus biomass prepared in
poultry slaughterhouse wastewater [30] were 0 (control), 1,500, 3,000, 4,500, 6,000 and
7,500ppm, into both corn and sorghum basal rations, making a total of 12 treatments [31]. Diets
were mixed weekly and stored in closed cans at room temperature. Hens received ration and
water ad libitum for 24 days.
35
Analytical Procedures
For productive parameters determination [32], layers and feeds were weighted at the
beginning and at the end of experimental period; number and weight of eggs were determined
daily. Egg yolk colors were measured daily for L* (lightness), a* (redness) and b* (yellowness)
[33]. For the consumer preference tests, 50 untrained panelists visually evaluated the egg yolks
according to a hedonic scale of five points [34, 35]. At the end of the experiment, one hen of
each replication was randomly selected for blood collection and killing [36]. Serum was
analyzed for total protein, albumin, alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase (AST),
alanine aminotransferase (ALT), uric acid, creatinine, gamma-glutamyltransferase (GTT) and
creatine kinase (CK) in automated analyzer [37]. Liver and kidney fragments were withdrawn
for the histological preparation [38] and investigation on degenerative and inflammatory lesions.
Data were analyzed by the general linear model procedure of SAS software [39, 40].
RESULTS AND DISCUSSION
Yolk Colors
Yolks from treatments that contained Rvi. gelatinosus biomass were significantly
darker (P<0.05) than those from respective control sorghum and corn-based feeds, due to the
effective deposition of the product (Table 2). The pigmenting ability of the biomass was
demonstrated by the significant increases (P<0.05) on redness of yolks from treatments that
received the product, both on sorghum and corn-based feeds, compared to their respective
control groups (Table 2). Yolks from all corn-based treatments had significantly higher b* values
36
than yolks from sorghum-based treatments because the latter is free of oxycarotenoids, while the
former contains around 17ppm of xanthophylls, mainly lutein and zeaxantin, that play a role on
the yellowness of yolks, despite of their instability at environmental conditions [24]. For
sorghum-based treatments (Table 2), all inclusion levels of the product led to significant
increases in redness of yolks (P<0.05), as compared to a* values of that control group yolks,
although treatments with 3,000 and 4,500ppm of biomass were equivalent in redness, like
treatments with 6,000 and 7,500ppm (P>0.05). Also for those feeds, only 6,000 and 7,500ppm of
biomass provided significantly higher yellowness (P<0.05) for yolks than control feed did, what
indicates the main ability of the product in providing red color, its original color, due to the red
color of its component carotenoids [9]. Redness of yolks from all corn-based treatments that
received the biomass (Table 2) was significantly higher than redness of that control group
(P<0.05). With that feed, yolks from treatments with 1,500 and 3,000ppm of biomass had
equivalent red colors, as it happened to yolks from treatments with 4,500, 6,000 and 7,500ppm
of the product (P>0.05). For corn-based treatments, none of the inclusion levels was able to
provide higher yellowness than for the control group, showing that the b* values were provided
by the corn own xanthophylls and confirming the ability of the product on enhancing the red
color of yolks. Conversely, Baiao et al. [12] tested the pigmenting properties of different sources
and concentrations of yellow and red xanthophylls (natural and synthetic) when added to diets of
layer hens and found that yellowness of yolks was modified by the red xanthophylls used.
Oxycarotenoids from Rvi. gelatinosus biomass in addition to corn xanthophylls were responsible
for the raising of a new orange color in yolks from corn-based feeds. The use of reflectance
colorimetry was justified in this research, since traditional visual method by Roche Color Fan -
RCF [41] cannot reach the hues raised by the biomass inclusion on sorghum-based rations due to
the main increase on redness. Chandra et al. [20] fed layers with a sorghum diet supplemented
37
with paprika meal and also could not score the color of yolks with the RCF because of the
reddish tinges obtained.
Consumers` Preference
Results from the first preference test (Table 3) shows that yolks from hens fed
4,500ppm of the biomass in corn-based ration had the highest preference rank (P<0.05),
followed by equivalent ranks presented by 3,000 and 1,500ppm in the same ration. None of the
sorghum-based rations was able to reach the highest rank of preference attained with corn-based
treatments (P>0.05). In the second preference test (Table 3), yolks from hens fed 6,000 and
7,500ppm of biomass in corn-based ration and 7,500ppm of biomass in sorghum-based ration
were preferred by consumers showing that a blend of yellowness and redness in yolk is desirable
to reach consumers` preference. This is in agreement to Baiao et al. [12], who states that red
xanthophylls can be used to extend the dominant wavelength of yolk pigmentation from a pure
yellow to a more desirable golden color. These results confirm the regional preference for well-
pigmented egg yolks and the influence of red xanthophylls on yolk color. Thus, the inclusion of
1,500ppm of Rvi. gelatinosus biomass into corn-based rations is enough to reach the maximum
preference of the consumer while, when the ration is formulated with sorghum, 7,500ppm of the
product will be necessary to reach the same purpose. The high preference scores reached by
yolks from hens fed corn-based diets supplemented with the bacterial biomass demonstrate the
importance of both xanthophylls sources (yellow and red) to satisfy the regional consumer, since
yolk colors depend not only on the levels of pigmenting substances, but also on the type and
ratio of these compounds [13].
38
Productive Parameters
Table 4 shows that feed consumption was superior for hens fed corn-based rations
than for those fed the sorghum-based ones (P<0.05). According to Trevino et al. [42], this
finding may be due to the adstringent taste of some sorghum varieties that might have a negative
effect on birds’ ingestion. Increasing inclusion levels of Rvi. gelatinosus biomass did not
influence feed consumption at none of the rations used, what allows to demonstrate that the
product did not cause any change in palatability. Also, as no significant difference on feed
consumption (P>0.05) was detected among the inclusion levels of the product, it is feasible to
conclude that the yolks pigmentation are really due to the presence of the biomass in the rations.
The best feed conversion rates were detected with treatments that used corn (Table 4), with no
significant rates among the increasing inclusion levels of the product (P>0.05). Also, the
sorghum-based treatments, that had the worst feed conversion, were not influenced (P>0.05) by
the included levels of the biomass. During the experimental period, body condition of hens was
not affected, as they kept average weight of 3.70kg, which was influenced neither by the
energetic source utilized nor by the increasing inclusion levels of the biomass.
Hens fed corn-based rations showed superior egg production, egg weight and egg
mass output (P<0.05) than those fed sorghum-based rations (Table 5), what might reflect the
relationship between feed intake and feed conversion and these parameters. Nevertheless, these
parameters were not influenced by the increasing addition levels of the biomass (P>0.05) on both
kinds of rations. Conversely to results found in this study, Ponsano et al. [9] observed reduced
layers` weight and increased egg weight when inferior levels of Rvi. gelatinosus biomass (500,
1,000 and 2,000ppm) were added to sorghum-based rations. Productive parameters were
considered normal for the experimental conditions used in this study and no deleterious effects
due to the application of Rvi. gelatinosus biomass were detected, results that were reforced
by
39
the absence of mortality during the whole experimental period. These data are in agreement with
data from other authors [12, 13, 43] who found no influence of synthetic and/or natural
pigmentants on laying hens` productive parameters.
Biochemical and Histological Analysis
The absence of deleterious effects on hens` performance was also reforced by the
normal values found for seric enzymes, as compared to values reported by Saukas [44] who
studied hematological and biochemical characteristics of birds under normal and pathological
conditions. Moreover, no degenerative or inflammatory lesions in liver and kidney as a
consequence of the biomass inclusion were observed in the histological investigations. These
results allow the indication of Rvi. gelatinosus biomass for layer hens` feed supplementation.
The effective deposition of Rvi. gelatinosus oxycarotenoids in the yolk may represent
an additional benefit to consumer, besides that of the pigmentation improvement, since
epidemiological evidences suggest that dietary xanthophylls may inhibit the onset of many
diseases such as arteriosclerosis, cataracts, age-related macular degeneration, multiple sclerosis
and cancers due to the antioxidant properties of these compounds [45]. Also, besides
oxycarotenoids, additional proteins, lipids, minerals and vitamins are present in the yolk as part
of the bacterial biomass deposition.
CONCLUSIONS AND APPLICATIONS
1. Rvi. gelatinosus biomass caused an increase in yolks red hues, contributing to improve color
of yolks mainly when hens` feed was formulated with corn.
40
2. When ration was formulated with corn, 1,500ppm of Rvi. gelatinosus biomass were enough
to reach the consumers` preference for yolk color; when sorghum was the basis of the ration,
7,500ppm of the biomass were necessary to reach the preference.
3. Inclusion of increasing levels of Rvi. gelatinosus biomass into laying hens` diets did not
affect performance.
REFERENCES AND NOTES
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30. R. gelatinosus biomass contained 62.8% protein, 25.6% carbohydrate, 0.5% lipids, and 4.0%
ash, and all essential amino acids for birds.
31. Laying hens were distributed in a completely randomized experimental design with a 2
(energetic source) x 6 (biomass level) factorial arrangement and 3 replications of 3 individually
housed birds per experimental unit.
32. Productive parameters included feed consumption (g/hen/d), feed conversion (kg feed/kg
egg), body weight variation (g) egg production (%/hen/d), egg weight (g) and egg mass
(g/hen/d).
33. Measurements on yolk color attributes were obtained from the average of three consecutive
pulses from the optical chamber of the MiniScan XE Plus (Hunter Lab) calibrated with black and
white standards.
34. Preference tests were performed at the 16
th
day of the experiment (when the color
measurement indicated stabilization of the color parameters) in two stages, in order to allow a
better evaluation of colors by the panelists.
35. IFT. Sensory evaluation guide for testing food and beverage products. Food Technology, v.
35, n. 11, p. 50-59, 1981.
45
36. Hens were killed by cervical dislocation, bled for 3min by severing the jugular veins, scalded
in hot water for 2min, defeathered in an automated picker and handly eviscerated.
37. Automated analyzer BTS-370 Plus ByoSistems was calibrated with normal and pathologic
controls.
38. Liver and kidney fragments were fixed in 10% formaldeid for 24-48h, dehydrated in alcohol,
cleared in xylol and embedded in paraplastic with the purpose of proceeding the microtomy.
Cuts were made at approximately 5µm of thickness, routinely stained with hematoxylin-eosin
and examined to the light microscope.
39. Data on yolk colors and productive parameters were analyzed by ANOVA and the
differences among treatments were tested by Duncan’s Multiple Range Test. Data on consumers`
preference were analyzed by Friedman`s Analysis of Variance and differences were tested by
Dunn`s Multiple Comparison Test. Significance level adopted was 5%.
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Acknowledgements
Authors thank Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – Fapesp – for
financial support, Frango Sertanejo Industry for the effluent supply, Dr Silvia H. V. Perri for the
statistical analysis, Dr Marcelo V. Meireles for the histological analysis, Dr Paulo César Ciarlini
for the biochemical analysis, Marta P. Peres and Magna A. S. Galvão for the aid in histological
preparations.
47
Table 1. Composition of basal rations
Ingredient Sorghum ration (%) Corn ration (%)
Ground corn - 63.60
Ground sorghum 67.73 -
Soybean meal (48% CP) 19.02 21.45
Limestone 8.50 8.54
Soybean oil 3.20 2.80
Dicalcium phosphate 0.78 0,70
Salt (NaCl) 0.37 0,35
Vitamin mineral premix
1
0.40 0.40
Inert filler (sand) - 2.16
Calculated composition
ME, kcal/kg 2,900 2,900
CP, % 16.00 16.00
EE, % 5.42 5.42
Calcium, % 3.46 3.46
Available phosphorus, % 0.26 0.26
Sodium, % 0.16 0.16
Arginine, % 0.96 1.03
Lysine, % 0.75 0.84
48
Methionine + cysteine, % 0.58 0.58
Threonine, % 0.58 0.59
Tryptophan, % 0.18 0.18
1
Provided per kg of diet: vitamin A, 8,800 IU; vitamin D
3
, 3,300 IU; vitamin E,
40 IU; vitamin K
3
, 3.3 mg; thiamine, 4.0 mg; riboflavin, 8.0 mg; pantothenic
acid, 15 mg; niacin, 50 mg; pyridoxine, 3.3 mg; choline, 600 mg; folic acid, 1
mg; biotin, 220 µg; vitamin B
12
, 12 µg; antioxidant, 120 mg; manganese, 70 mg;
zinc, 70 mg; iron, 60 mg; copper, 10 mg; iodine, 1.0 mg; selenium, 0.3 mg.
49
Table 2. Mean color attributes of yolks – lightness (L*), redness (a*), yellowness (b*)
Overall treatments
BL
1
(ppm) ES
2
L*
a*
b*
0 sorghum 71.05
a
-0.75
g
26.04
e
0 corn 65.90
cd
10.64
e
53.98
ab
1,500 sorghum 67.47
bc
5.53
f
27.23
e
1,500 corn 63.25
ef
14.12
d
55.51
a
3,000 sorghum 68.69
b
9.00
e
29.84
cde
3,000 corn 62.85
f
15.56
cd
51.06
ab
4,500 sorghum 66.87
bcd
8.94
e
29.18
de
4,500 corn 62.19
f
18.82
ab
50.97
ab
6,000 sorghum 65.06
de
14.07
d
33.22
cd
6,000 corn 62.52
f
17.36
abc
51.06
ab
7,500 sorghum 62.60
f
16.52
bcd
34.01
c
7,500 corn 61.75
f
19.44
a
50.63
b
P value
BL x ES
< 0.0001 <0.0001 <0.0001
CV
3
(%) 1.74 10.41 5.32
1
Biomass level;
2
Energetic source;
3
Coefficient of variation
a,b,c,d,e,f
Means in a column with different superscripts differ significantly (P < 0.05).
50
TABLE 3. Consumer preference for yolk colors
Overall treatments
Test
BL
1
(ppm) ES
2
Median (sum of the ranks)
0 sorghum 1 (61.50)
e
0 corn 3 (194.50)
c
1,500 sorghum 2 (115.00)
d
1 1,500 corn 4 (282.50)
ab
3,000 sorghum 3 (240.00)
bc
3,000 corn 4 (320.00)
a
4,500 sorghum 3 (234.50)
bc
4,500 corn 5 (352.00)
a
P value
BL x ES <0.0001
0 sorghum 1 (67.00)
c
0 corn 3 (139.50)
b
2 6,000 sorghum 2 (137.50)
b
6,000 corn 4 (254.00)
a
7,500 sorghum 4 (211.50)
a
7,500 corn 4 (240.50)
a
P value
BL x ES <0.0001
1
Biomass level;
2
Energetic source
a,b,c,d,e
Medians in a column with different superscripts differ significantly (P < 0.05).
51
TABLE 4. Performance of hens fed different levels of Rvi. gelatinosus biomass
Biomass level
(ppm)
Feed conversion
(kg ration/kg egg)
Feed consumption
(g/hen/d)
0 3.00 81.05
1,500 2.98 79.78
3,000 2.64 81.60
4,500 2.78 75.00
6,000 2.84 80.38
7,500 3.03 86.11
Energetic Source (ES)
Corn 2.472
b
86.905
a
Sorghum 3.324
a
74.514
b
P value
Biomass level (BL) 0.8098 0.1325
Energetic Source (ES)
0.0001 0.0001
BL x ES 0.8674 0.822
CV
1
(%) 20.39 7.96
1
Coefficient of variation
a,b
Means in a column with different superscripts differ significantly (P < 0.05).
52
TABLE 5. Productive parameters of the experiment
Biomass level (BL)
(ppm)
Egg production
(%/hen/d)
Egg weight
(g)
Egg mass
(g/hen/d)
0 50.06 53.38 26.85
1,500 51.06 53.77 27.76
3,000 57.38 52.62 30.34
4,500 51.16 51.95 26.82
6,000 49.31 54.46 27.08
7,500 52.31 54.28 28.64
Energetic Source (ES)
Corn 60.64
a
54.99
a
33.38
a
Sorghum 42.60
b
51.82
b
22.14
b
P value
BL 0.6275 0.2752 0.7242
ES 0.0001 0.0001 0.0001
BL x ES 0.9687 0.7942 0.9712
CV
1
(%) 16.88 3.86 16.90
1
Coefficient of variation
a,b
Means in a column with different superscripts differ significantly (P < 0.05).
53
Anexos
AnexosAnexos
Anexos
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TABELA 6. Resultados dos testes bioquímicos realizados em galinhas poedeiras que receberam
ração à base de sorgo.
Tratamento Animal
Albumina
(g/L)
PT
(g/L)
FA
(U/L)
AST
(U/L)
ALT
(U/L)
Ác.
Úrico
(mg/dL)
GGT
(U/L)
Creatinina
(mg/dL)
CK
0/S 1 76,62 33,85 86 87 19 4 14,57 0,05 13,89
1500/S 3 86,02 45,18 219 119 22 12 7,87 0,09 10,84
1500/S 19 70,69 35,39 1417 103 11 4 11,91 0,02 24,58
4500/S 7 67,76 36,55 -15 85 17 2 3,64 -0,06 38,78
PT – proteína total, FA – fosfatase alcalina, AST – aspartato aminotransferase, ALT – alanina aminotransferase,
GGT – gama glutamiltransferase, CK – creatina-quinase.
TABELA 7. Resultados dos testes bioquímicos realizados em galinhas poedeiras que receberam
ração à base de milho.
Tratamento
Animal
Albumina
(g/L)
PT
(g/L)
FA
(U/L)
AST
(U/L)
ALT
(U/L)
Ác.
Úrico
(mg/dL)
GGT
(U/L)
Creatinina
(mg/dL)
CK
0/M 2 72,69 33,36 1839 88 14 4 13,61 0,01 8,38
0/M 10 75,47 36,66 584 76 17 3 6,88 0,05 22,35
1500/M 4 76,47 37,76 780 89 18 5 10,99 0,03 13,04
1500/M 12 78,09 42,16 1295 61 0 7 -9,06 0,06 8,92
3000/M 6 81,40 42,82 447 65 13 6 11,93 0,07 38,34
3000/M 14 74,31 37,59 1659 81 15 4 11,78 0,05 6,81
3000/M 22 77,32 34,57 984 81 19 4 9,38 0,03 18,73
4500/M 8 69,38 36,99 728 104 16 5 9,15 0,05 10,9
4500/M 16 83,25 38,64 708 79 21 4 9,42 0,05 13,66
PT – proteína total, FA – fosfatase alcalina, AST – aspartato aminotransferase, ALT – alanina aminotransferase,
GGT – gama glutamiltransferase, CK – creatina-quinase.
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Parecer técnico das análises histopatológicas
Fragmentos de fígado
Os fígados das galinhas poedeiras apresentavam, macroscopicamente, coloração amarelada
e eram friáveis ao toque, sendo estas características consideradas normais em virtude da
categoria destas aves.
Microscopicamente o parênquima hepático não apresentava alterações patológicas. Vale
ressaltar que o fígado das aves não se apresenta dividido em lóbulos, como ocorre nos
mamíferos, os hepatócitos das aves estão dispostos em cordões devido à falta de septo
interlobular. O corte do fígado da ave mostra uma massa de cordões de hepatócitos que
compõem o parênquima hepático, circundados por sinusóides sangüíneos.
O formato dos hepatócitos era poliédrico com vários canalículos biliares ao redor. O
citoplasma dos hepatócitos continha enormes e numerosos vacúolos gordurosos. O núcleo dos
hepatócitos era levemente ovalado na forma, situados basalmente, um ou mais nucléolos estavam
presentes.
Fragmentos de rim
Os rins apresentavam, macroscopicamente, coloração marrom escura e estavam
posicionados dorsalmente na parede abdominal, externos ao peritôneo.
Microscopicamente os túbulos contorcidos proximais eram arredondados ao corte, ou de
perfil alongado quando intimamente localizados com túbulos contorcidos distais e glomérulos. A
parede dos túbulos contorcidos proximais constituía-se de epitélio cúbico simples com borda em
escova. O citoplasma destas células, neste corte corado com HE, apresentava-se acidófilo,
provavelmente pela presença de mitocôndrias. O núcleo das células dos túbulos proximais era de
forma esférica, com um nucléolo proeminente e localizado próximo da base.
As partes delgadas das alças de Henle apresentavam epitélio simples pavimentoso, com
núcleos salientes para a luz, a qual se mostrava mais ampla que a dos túbulos. As partes
espessas, formadas por epitélio cúbico simples, também não apresentavam alterações.
As células dos túbulos contorcidos distais, em comparação com as células dos túbulos
proximais, apresentavam-se menores, sem borda em escova e com citoplasma menos acidofílico.
O núcleo destas células assumia uma posição central ou levemente deslocada para a lâmina
basal.
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A única alteração observada nas lâminas de rim foi a constatação que as células tubulares,
proximais e distais, estavam soltas da lâmina basal, porém, isto foi considerado artefato de
técnica, pois estava presente na totalidade das lâminas coradas.
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Fotografias relativas ao experimento
Galpão experimental de poedeiras da Unesp – Campus de Araçatuba.
Fonte: Lorrayne B. Polonio.
Galinhas poedeiras da raça Dekalbe se alimentando no galpão.
Fonte: Lorrayne B. Polonio
58
Cultivo de Rubrivivax gelatinosus.
Fonte: Elisa H. G. Ponsano.
Biomassa de R. gelatinosus liofilizada.
Fonte: Elisa H. G. Ponsano.
59
Gemas de diversas tonalidades provenientes das galinhas do experimento.
Fonte: Lorrayne B. Polonio.
Teste de preferência das gemas.
Fonte: Lorrayne B. Polonio.
60
Soros obtidos das galinhas.
Fonte: Lorrayne B. Polonio.
Amostras de sangue das poedeiras em centrifugação.
Fonte: Lorrayne B. Polonio.
Analisador bioquímico automático BTS – 370 Plus BioSystems.
Fonte: Lorrayne B. Polonio.
61
Da esquerda para a direita: Ana Paula da Silva Almeida, Michele Honaga e
Lorrayne B. Polonio.
Fonte: Lorrayne B. Polonio.
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