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Teresinha Cristina Cândido
COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS DE ELISA - ANTÍGENO
TOTAL E ELISA - LIGANTE DE FUCOSE E MANOSE EM CÃES
SINTOMÁTICOS E OLIGOSSINTOMÁTICOS PARA LEISHMANIOSE
VISCERAL
A
RAÇATUBA – SP
2007
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1
Teresinha Cristina Cândido
Comparação entre os métodos de ELISA - Antígeno total e ELISA -
Ligante de Fucose e Manose em cães sintomáticos e
oligossintomáticos para leishmaniose visceral
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual Paulista (UNESP), da cidade de
Araçatuba – SP, para obtenção de título
de mestre em medicina veterinária.
Área de concentração: Fisiopatologia
médica e cirúrgica.
Orientadora: Profª. Drª. Maria Cecília Rui
Luvizotto;
Co-orientadora: Profª. Drª. Valéria Marçal
Felix de Lima.
Araçatuba – SP
2007
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2
Catalogação-na-Publicação (CIP)
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP
Cândido, Teresinha Cristina
C217c Comparação entre os métodos de ELISA-antígeno total e
ELISA-Ligante de fucose e manose em cães sintomáticos e
oligossintomáticos para leishmaniose visceral / Teresinha Cristina
Cândido. - Araçatuba : [s.n.], 2007
63 f. : il. ; tab. + 1 Cd-Rom
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Odontologia e Curso de Medicina Veterinária, 2007
Orientador: Profa. Dra. Maria Cecília Rui Luvizotto
Co-orientadora: Profa. Dra. Valéria Marçal Felix de Lima
1. Cão 2. Leishmaniose visceral 3. ELISA 4. Ligante de fucose
5. Ligante de manose
CDD 636.0896
3
Dedicatória
Aos meus pais pela dedicação, carinho,
esforço, e por sempre estarem presentes
na minha jornada profissional.
Ao meu namorado pelo companheirismo,
carinho e paciência.
Ao meu irmão pelos sonhos
compartilhados e por acreditar em minha
capacidade profissional.
A Deus por sempre estar presente em
minha vida.
4
Agradecimentos Especiais
À minha querida orientadora, Profª. Drª. Maria Cecília Rui
Luvizotto, pelos ensinamentos, paciência e carinho; que diante da sua
vasta sabedoria, transparência e simplicidade, me faz ser mais uma de
seus discípulos.
À amiga e co-orientadora, Profª. Drª. Valéria Marçal Felix de Lima,
pelo carinho, amizade, ensinamentos, dedicação, disposição e por ter me
acolhido em seu laboratório, permitindo a realização de grande parte
desta pesquisa;
5
Agradecimentos
Ao Laboratório de imunologia Veterinária da UNESP – Araçatuba-
SP, por disponibilizar o laboratório para realização de ELISA;
Ao Centro de Controle de Zoonoses de Araçatuba-SP, e seus
funcionários pela ajuda na coleta de materiais;
À amiga e colega de profissão Tatiana de Oliveira Gerzoschkwitz,
pelo auxílio em minha clínica e na coleta de materiais;
Aos colegas médicos veterinários Cláudio Rossi e Maurício por
terem fornecido gentilmente alíquotas de soro de animais de áreas não
endêmicas;
À minha funcionária Silvana, pela paciência e ajuda no período da
concretização deste trabalho;
Ao amigo Almir, técnico do laboratório de imunologia pela ajuda
técnica na realização do teste de ELISA;
À amiga e colega de profissão Fabiana Ikeda, pela colaboração e
discussões que contribuíram para este trabalho;
À amiga Maria Emília (Mila) por compartilhar anseios e pela força
e incentivo no decorrer desta jornada;
Aos professores da UNESP – Araçatuba, que contribuíram em
disciplinas, aumentando o meu conhecimento em várias áreas;
6
À amiga e professora doutora Gisele Fabrino pelo incentivo deste
trabalho;
À professora e doutora Silvia Helena Venturoli Perri, por realizar
testes estatísticos deste trabalho;
A todos os funcionários da UNESP – Araçatuba, que fizeram parte
de toda esta jornada;
À Fort Dodge Saúde Animal, na pessoa da Drª Ingrid Menz, por
fornecer gentilmente o FML, para realização de ELISA-FML;
E a todos que de forma direta ou indireta, fizeram parte da
concretização deste trabalho, muito obrigado.
7
“As grandes coisas são feitas por pessoas que tem
grandes idéias e saem pelo mundo para fazer com que seus
sonhos se tornem realidades”.
Ernest Holmes
8
Sumário
Lista de Figuras 09
Lista de tabelas 10
Lista de abreviações 11
Resumo 12
Abstract 14
Introdução 15
Revisão de Literatura 19
Material e Métodos 25
Animais 26
Material Biológico 27
• Punção Aspirativa de Linfonodo 27
• Sangue 27
• Exame Parasitológico 27
• Método de ELISA 28
• ELISA para detecção de IgG para Leishmnia L.chagasi 28
• ELISA para detecção de proteína antigênica do FML 30
• Interpretação dos Resultados de ELISA 31
• Análise Estatística 31
Resultados 32
Discussão 45
Conclusões 50
Referências Bibliográficas 52
9
Lista de Figuras
Figura 1. Mostra a freqüência de sinais clínicos observados em
animais sintomáticos para Leishmaniose visceral canina
(LVC) ................................................................... 33
Figura 2. Fotografia de animais com sintomas da LVC .................. 34
Figura 3. Fotografia de cães com LVC, pertencentes ao grupo de
animais oligossintomáticos .............................................. 35
Figura 4. Exame citológico de aspirado de linfonodo poplíteo de
cão, demonstrando o grau de parasitismo ...................... 37
Figura 5. Mostra em percentual, o grau parasitário observado nos
grupos sintomático e oligossintomático .................... 38
Figura 6. Reação sorológica pelo método de ELISA-AgT, em cães
sintomáticos, oligossintomáticos e controle .................... 40
Figura 7. Reação sorológica pelo método de ELISA-FML, em cães
sintomáticos, oligossintomáticos e controle .................... 41
10
Lista de Tabelas
Tabela 1. Valores de sensibilidade, especificidade e valor preditivo
positivo nos ensaios de ELISA-AgT e ELISA-FML em
cães do grupo sintomático e oligossintomático ............. 42
Tabela 2. Análise comparativa dos testes pareados de ELISA-AgT
e ELISA-FML ................................................................... 43
Tabela 3. Análise comparativa entre o grau de parasitismo e os
métodos de ELISA-AgT e ELISA-FML no grupo
sintomático e oligossintomático ...................................... 44
11
Lista de abreviações
LV Leishmaniose Visceral
LVC Leishmaniose Visceral Canina
ELISA Ensaio imunoenzimático em fase sólida
ELISA-AgT ELISA antígeno total de Leishmania L. chagasi
ELISA-FML ELISA antígeno Ligante de Fucose e Manose
RIFI Reação de Imunofluorescência indireta
Dot-ELISA Dot-enzyme-linked immunosorbent assay (teste rápido)
BSM-ELISA bovine submaxillary mucin-ELISA
IFD Imunofluorescência direta
PCR Reação em cadeia da polimerase
D. O. Densidade óptica
rK-39 Antígeno recombinante - K39
rK-26 Antígeno recombinante - K26
RFC Fixação de complemento
AgT Antígeno total
FML Ligante de Fucose e Manose
I.V. Intravenosa
Kg quilograma
ml miligrama
°C graus Celsius
µl microlitros
12
Resumo
A Leishmaniose visceral canina (LVC), conhecida como calazar, é
uma antropozoonose endêmica no Brasil, causada pela Leishmania L.
chagasi. O teste sorológico de ELISA tem sido empregado na rotina de
inquéritos epidemiológicos e no auxílio diagnóstico clínico de cães
suspeitos. O método de ensaio imunoenzimático em fase sólida (ELISA)
usando o antígeno total de Leishmania L. chagasi (ELISA-AgT), assim
como, o ELISA - Ligante de Fucose e Manose (ELISA-FML), tem
demonstrado boa sensibilidade e especificidade para detectar a doença
em cães assintomáticos e oligossintomáticos. O presente trabalho teve
como objetivo comparar dois antígenos pelo método de ELISA no
sorodiagnóstico de cães naturalmente infectados pela LVC, positivos no
exame parasitológico, e agrupados em: grupo sintomático e, grupo
oligossintomáticos, tendo como grupo controle cães de área não
endêmica. Nos animais oligossintomáticos, a sensibilidade observada
para ELISA-AgT foi de 86,7%, já para o método ELISA-FML apresentou
valor de 90%. A especificidade foi de 100% no método de ELISA-AgT e
96,7 % para o ELISA-FML. Nos animais sintomáticos, a sensibilidade e
especificidade para o ELISA-AgT foram de 90% e 93,3%,
respectivamente; já o método de ELISA-FML apresentou sensibilidade e
especificidade de 86,7% e 96,7%. No teste ELISA-AgT o valor preditivo
positivo foi de 93,1% nos sintomáticos e 100% nos oligossintomáticos,
enquanto que nos animais submetidos ao teste ELISA-FML, foi observado
96,3% para os sintomáticos e 96,4% para os oligossintomáticos. O
índice Kappa foi utilizado para medir o grau de concordância real entre os
dois métodos imunoenzimáticos empregados e o exame parasitológico
direto, mostrando boa concordância entre os métodos realizados. Nossos
resultados, mostraram que em animais oligossintomaticos o ELISA-FML
13
apresentou maior sensibilidade, enquanto que, nos animais sintomáticos,
o ELISA-AgT revelou-se mais sensível na detecção de positividade.
Palavras-chave: cão, leishmaniose visceral, ELISA, ligante de Fucose-
manose.
14
Abstract
Visceral canine leishmaniasis or calazar is Brazilian an endemic
antropozoonosis caused by Leishmania L. chagasi. ELISA sorologycal test
has been used in routine of epidemiological studies and in diagnosis of
clinical suspect dogs. The immunoenzymatic assay in solid phase (ELISA)
using Leishmania L. chagasi total antigens AgT-ELISA and Fucose
Manose ligant-ELISA (FML-ELISA) has been showed good sensibility and
specificity for detection disease in asymptomatic and oligosymptomatic
dogs. The present paper has the goal of compare the efficiency of two
antigens by ELISA methods in dogs naturally affect by leishmaniasis with
positive parasitological exam and grouped by symptoms. Group composed
by symptomatic dogs, and Group by oligosymptomatic dogs. Control group
was constituted of dogs from Leishmania free areas. Dogs of Group
oligosymptomatics presented 86,7% of sensibility in AgT-ELISA and 90%
at FML-ELISA. The specificity was 100% at AgT-ELISA and 96.7% for
FML-ELISA. At Group symptomatics the sensibility and specificity for AgT-
ELISA and FML-ELISA were respectively 90% and 93.3% and, the FML-
ELISA showed 86.7% and 96.7% corresponding to sensibility and
specificity. On ELISA-AgT the positive predictive valor was 93.1% at
symptomatic and 100% at oligosymptomatic, moreover in the dogs tested
by FML-ELISA the valor was 96.3% for the symptomatic and 96.4% for
oligosymptomatics. The Kappa was used and showed a good
concordance between both methods tested. Our results had shown that in
oligosymptomatics animals the FML-ELISA presented greater sensitivity,
while that, in the symptomatic animals, the AgT-ELISA showed more
sensible in the detention of positive.
Key Words: dog, leishmaniasis visceral, ELISA, Fucose Manose ligant.
15
Introdução
16
Introdução
A leishmaniose visceral (LV) também conhecida como calazar, é
uma doença causada por protozoário do gênero Leishmania; no Brasil o
agente etiológico é a Leishmania L. chagasi, na Europa e África a
Leishmania L. donovani ou a Leishmania L. infantum. Sua transmissão,
ocorre através da picada de flebótomo fêmea do gênero Lutzomyia
longipalpis infectada. O vetor está adaptado ao ambiente urbano, sendo
encontrado no interior das residências, nos abrigos de animais
domésticos e no peridomicílio, sua atividade é crepuscular e noturna
(BEVILACQUA et al., 2001, IVERSON et al., 1979, LUZ et al, 2001).
Nos últimos dez anos, áreas endêmicas vêm se alastrando devido
ao impacto ambiental do desflorestamento e urbanização acelerada. A
leishmaniose acomete cerca de dois milhões de novos casos humanos
por ano, dos quais 500 mil são de LV. Na América do Sul, o Brasil é o
país mais afetado concentrando 90% dos casos da doença (Brasil, 2003).
Ocorre de forma endêmica na região noroeste do Estado de São Paulo
desde 1998, e a primeira descrição foi na cidade de Araçatuba-SP
(LUVIZOTTO et al., 1999).
O cão é considerado o principal reservatório e apresenta grande
importância epidemiológica por ter alta prevalência em regiões endêmicas
(MARZOCHI et al., 1985), apresentando-se como sintomáticos ou
oligossintomáticos.
A LV é caracterizada pelo comprometimento do sistema monocítico
macrofágico, onde os parasitos se multiplicam e disseminam. Os
principais sintomas observados em cães são: linfoadenomegalia,
esplenomegalia, úlceras cutâneas, alopecia, descamação cutânea,
onicogrifose e hipertermia (IKEDA-GARCIA et al., 2007, MATTOS
JÚNIOR et al., 2004).
17
Os exames sorológicos, visando a pesquisa de anticorpos
circulantes, são empregados como ferramenta no diagnóstico de casos
clínicos e em inquéritos epidemiológicos, existindo uma grande variedade
de técnicas e antígenos empregados (BARBOSA-DE-DEUS et al., 2002;
BORJA-CABRERA et al., 1999; BRAGA et al., 1998; DA-SILVA et al.,
2005; LIMA et al., 2005; PALATNIK-DE-SOUZA et al., 2004; ROSARIO et
al., 2005).
A Imunofluorescência indireta (RIFI) em eluato de papel filtro, do
sangue coletado de pina de orelha dos cães, é utilizado como o método
oficial adotado pelo Centro de Controle e Zoonose de Araçatuba-SP para
a detecção da LV nos cães.
Cinqüenta cães sintomáticos para LV provenientes da cidade de
Araçatuba-SP com diagnóstico positivo no exame citológico de aspirado
de linfonodo, foram sumetidos ao teste de ELISA utilizando antígeno de
lisado total de promastigotas de Leishmania L. chagasi. Os grupos foram
comparados utilizando-se conjugados de peroxidase com proteína A e
Anti-IgG de cão, demonstrando que com o uso da proteína A os valores
de absorbância foram maiores em relação ao anti- IgG de cão, concluindo
que o teste de ELISA com antígeno total de parasitos de Leishmania L.
chagasi associado ao conjugado de peroxidade com proteína A apresenta
grande potencial no diagnóstico e controle da leishmaniose visceral
canina (LVC). Foi também testado possiblidades de reação cruzada com
Erlichia canis, Toxoplasma gondii, Babesia canis e Dirofilaria immitis,
mostrando negatividade a estes patógenos (LIMA et al., 2005).
18
Tendo em vista a importância epidemiológica no diagnóstico
sorológico precoce na leishmaniose visceral canina, o presente trabalho
teve por objetivos:
1. Comparar a sensibilidade e especificidade entre os métodos
sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-FML;
2. Comparar a sensibilidade de ambos os métodos sorológicos
em animais sintomáticos e oligossintomáticos,
correlacionando-os com o grau de parasitismo.
3. Comparar a sintomatologia com o grau de parasitismo.
19
R
EVISÃO DE LITERATURA
20
Revisão de Literatura
A LV é uma antropozoonose causada pela Leishmania L. chagasi;
no Brasil, os cães e roedores são considerados reservatórios principais da
doença. Sua transmissão ocorre através da forma promastigota que se
desenvolve no interior do tubo digestivo do flebótomo Lutzomyia
longipalpis, também conhecido como mosquito-pólvora, e são inoculadas
no hospedeiro quando o vetor fêmea se alimenta (ETTINGER; FELDMAN,
2004). O ciclo enzoótico envolve raposas, chacais, lobos e também
flebótomos; as raposas que circulam no peridomicílio, podem servir de
reservatório aos flebótomos que infestarão os cães tornando-os
reservatórios domésticos (TESH, 1995).
A presença de formas amastigotas de Leishmania sp. em cães
domésticos foi relatado pela primeira vez na Tunísia em 1908 (NICOLLE,
1908).
No Brasil, inicialmente a LV foi descrita como esporádica,
acomentendo animais e humanos nas áreas rurais e silvestres;
posteriormente a doença foi observada em áreas periurbanas nas cidades
São Luis-MA, Teresina-PI e Natal-RN (LUZ et al., 2001; DEANE, 1956). A
primeira suspeita de caso humano de LV no estado de São Paulo foi na
grande São Paulo em 1978 (IVERSSON et al, 1979). Nos últimos anos
tem sido observado casos autóctones de LV na cidade de Araçatuba-SP e
outros municípios da região Noroeste Paulista, onde existia uma
população canina estimada em 33.015 (GALIMBERTTI et al., 1999,
NEVES et al., 2001). Devido a grande expansão geográfica e processo
de urbanização, tem havido um aumento da incidência em regiões que já
vivenciaram epidemias (OLIVEIRA et al., 1998). Em Belo Horizonte-MG,
os casos da doença em cães precederam a epidemia humana
(BEVILACQUA et al.,2001), observação esta detectada também em
estudos no Nordeste brasileiro. Nos focos rurais, mantendo a relação
21
população humana-canina-vetor de forma adequada, a endemia local
permanecerá tendo o cão como o principal reservatório (DEANE, 1956).
Dantas-Torres (2006), propõe a necessidade de investigação da
real prevalência da infecção por Leishmania em cães domésticos, além
das espécies de Leishmania em outros possíveis reservatórios, sugerindo
estudos mais profundos da participação do gato doméstico. A
possibilidade dos animais domésticos participarem como fonte de
infecção sanguíneo de flebótomos pode favorecer a manutenção dos
mesmos no peridomicílio, pois foi observada a dificuldade de captura de
flebótomos, onde não existem animais domésticos (DIAS et al., 2003).
Os sinais clínicos mais freqüentemente observados nos cães são a
linfadenomegalia, emagrecimento progressivo, úlceras cutâneas,
descamação cutânea, onicogrifose, alopecia (FEITOSA et al., 2000,
MATTOS JÚNIOR et al., 2004). Uma ampla variação de sintomas pode
ser observada no cão, desde a ausência de alterações clínicas ou até
mesmo sintomas comuns a outras enfermidades, possibilitando classificar
clinicamente animal em sintomático, oligossintomático e assintomático
(BRASIl, 2003; GENARO, 1992; CIARAMELLA et al., 1997; NOLI, 1999;
FEITOSA et al., 2000). Em humanos, os fatores que predispõe o
desenvolvimento clínico da LV incluem a má nutrição e imunossupressão
( GUERIN, et al., 2002).
Os inquéritos diagnósticos caninos e humanos na década de 60,
eram realizados por punção de fígado, baço e raspado de pele, métodos
estes eficazes, mas de difícil utilização em massa (ADLER; THEODOR,
1932). A fixação de complemento (RFC) e a imunofluorescência indireta
(RIFI), mostraram boa sensibilidade porém baixa especificidade devido às
reações cruzadas com tripanossomatídeos e riquetsias (PAPPAS, 1984,
PAPPAS, 1985).
Na década de 70 surgiram exames sorológicos com técnicas que
apresentaram alta sensibilidade e especificidade, como o ELISA, Dot-
ELISA, ELISA-FML, BSM-Elisa; entretanto permaneceram reações
22
cruzadas com outros tripanossomatídeos. A técnica de PCR (reação em
cadeia da polimerase) tem demonstrado maior sensibilidade e
especificidade em animais assintomáticos e com títulos baixos de
anticorpos (ALVES; BEVILACQUA, 2004, ASHORD et al., 1995,
MANCIANTI, 2004).
Dentre os métodos de diagnóstico, o exame parasitológico para
pesquisa direta do parasito, tem sido amplamente difundido, possuindo
alta especificidade; porém, a sensibilidade é baixa falhando na detecção
de casos onde o parasitismo é baixo. No diagnóstico de rotina, a punção
aspirativa de linfonodo e medula óssea são empregadas na identificação
de formas parasitárias amastigotas (BARROUIN-MELLO et al., 2006;
BRASIL, 2003; MOREIRA et al., 2002).
Em 2002, Moreira et al., correlacionaram a técnica de IFD
(imunofluorescência direta) aplicado em esfregaços de linfonodo poplíteo,
como exame direto do parasito, concluindo que o exame direto possui
alta especificidade e metodologia rápida, porém, o método de IFD,
demonstrou maior sensibilidade, com maiores índices de positividade.
Na LV é difícil a correlação de sinais clínicos, quantidade
parasitária e sorologia, pois, os títulos elevados de anticorpos na RIFI
nem sempre estão correlacionados com os sinais clínicos e análise
parasitológica, assim como o grau de parasitismo nem sempre está
associado aos sintomas (MADEIRA et al., 2004, SOUZA et al., 2005).
Braga et al. (1998), observaram em seus experimentos que o ELISA
utilizando soro de cão, mostrou-se 4,6 vezes mais sensível que RIFI do
eluato de papel filtro, pois detectaram maior número de cães
precocemente infectados.
Entre os antígenos purificados utilizados para diagnóstico da LV
está o ligante de fucose-manose (FML), que é composto por uma fração
glicoproteica, que inibe a penetração de promastigota e amastigota em
macrófagos murinos in vitro (PALATINIK et al., 1989; PALATINIK-DE-
SOUZA et al., 1993). O FML está presente na superfície do parasita
23
durante todo o seu ciclo (PALATINIK-DE-SOUZA et al., 1993) sendo um
potente imunógeno para camundongos e coelhos, e um antígeno
específico no sorodiagnóstico humano (PALATINIK-DE-SOUZA et al.,
1995) e canino (BORJA-CABRERA et al., 1999). Esta fração glicoproteica
é composta de 29% de açúcares neutros, 44% de proteínas e traços de
carboidratos e hexoaminas. Entre os açúcares neutros foram
identificados: 10% fucose, 47% manose, 30% glicose, 12% galactose
(PALATINIK et al., 1989).
Testes com ELISA-FML foram realizados em soros humanos como
método diagnóstico da LV; mostrando 100% de sensibilidade e 96% de
especificidade em pacientes sintomáticos; dos pacientes aparentemente
saudáveis e positivos no ELISA-FML, 20% desenvolveram a
sintomatologia no período de 10 meses (PALATINIK-DE-SOUZA et al.,
1996). Em 417 amostras de sangue humano da cidade de Natal-RN,
foram realizadas comparações entre o método de RIFI (eluato) com
ELISA-FML (soro) obtendo-se como resultados de positivivdade para
leishmaniose, médias de 12,9% para o ELISA-FML, e 8,7% para RIFI,
mostrando que o ELISA-FML era mais sensível (PALATINIK-DE-SOUZA
et al., 2004).
Borja-Cabrera et al. (1999), compararam o método de ELISA
utilizando antígenos FML e lisado total de promastigota de Leishmania L.
mexicana, com o método de RIFI utilizando antígenos total de Leishmania
L. mexicana e Leishmania L. chagasi e observaram que em cães
sintomáticos o ELISA-FML mostrou 100% de sensibilidade, o ELISA com
Leishmania L. mexicana 55,6%, e 33,3% para ambos antígenos no RIFI.
Em cães assintomáticos foram observadas sensibilidade de 100% para o
FML, 43% para ELISA com Leishmania L. mexicana e 24% para ambos
antígenos no RIFI. A campo o ELISA-FML mostrou-se mais sensível,
seguido pelo ELISA (soro) com Leishmania L. mexicana; concluindo que
o ELISA-FML foi mais sensível e específico, sugerindo ser útil no controle
da LV em áreas endêmicas.
24
Foi observado por Borja-Cabrera (2000), uma correlação
significante entre os sintomas de animais positivos para LV com a
densidade óptica (D.O.) de ensaio sorológico de ELISA-FML.
Foram realizadas comparações do método de ELISA entre soro e
eluatos utilizando antígenos de Leishmania L. amazonensis, Leishmania
L. chagasi, rK-39 e rK-26; em grupos de animais assintomáticos,
oligossintomáticos e sintomáticos. Os antígenos de Leishmania L.
amazonensis., Leishmania L. chagasi., mostraram maior sensibilidade
independente da fase clínica da doença, tanto no eluato como no soro, já
os antígenos recombinantes mostram-se mais sensíveis para detectar
cães sintomáticos independente de ser usado soro ou eluato, porém sem
mostrar diferença estatística entre os tipos de antígenos. A análise de
reações cruzadas com outros patógenos como Tripanosoma cruzi,
Babesia canis e Dirofilaria immitis, foram nulos no ensaio de ELISA
utilizando antígenos recombinantes (ROSÁRIO et al., 2005).
O antígeno total utilizado nos testes sorológicos, é constituído de
frações antigênicas da forma promastigota do parasito, sendo portanto de
baixo custo, e de fácil realização (LIMA et al., 2003, MARTIN et al., 1998;
MOHAMMED et al., 1985).
A busca de diagnóstico precoce em humanos e cães se faz
necessária por se tratar de uma zoonose que pode ser fatal para
humanos (ALVES; BEVILACQUA, 2004).
25
Material e Métodos
26
Material e Métodos
Animais
Foram utilizados noventa cães, sendo, sessenta animais
provenientes do Centro de Controle de Zoonoses da cidade de
Araçatuba-SP, portadores de infecção natural por Leishmania L. chagasi,
confirmado pelo exame citológico de punção de linfonodo poplíteo, e trinta
animais saudáveis provenientes de região não endêmica cidade de
Santos-SP. Os animais foram agrupados em:
• Grupo sintomático: composto por trinta animais positivos, que
apresentavam mais de dois sinais clínicos. Rarefação pilosa e
alopecia, úlceras cutâneas, caquexia, onicogrifose,
linfadenomegalia, dentre outros.
• Grupo oligossintomáticos: composto por trinta animais positivos,
que apresentavam boa condição corpórea, ausência de lesões
cutâneas, porém apresentavam linfadenomegalia.
• Grupo controle: composto por trinta animais saudáveis,
provenientes da cidade de Santos-SP, região não endêmica para
LV.
Após avaliação clínica e coleta de material, os animais do grupo A
e B foram eutanasiados, seguindo as normas da Secretaria de Saúde e
Higiene Pública do município de Araçatuba-SP. Estes animais foram
previamente submetidos à anestesia com Thiopental sódico ®
(25mg/Kg/IV) e posteriormente eutanasiados com cloreto de potássio a
19,1% (1mg/Kg/IV).
27
Material Biológico
Punção aspirativa de linfonodos
Os cães dos grupos sintomático e oligossintomático, foram
submetidos à punção aspirativa por agulha fina do linfonodo poplíteo,
segundo a técnica preconizada por Cowell et al., 1999. Os esfregaços
corados pelo Panótico rápido (Labor Clin ®) foram examinados em
microscópio de luz com objetiva de 100X à imersão.
Sangue
Os cães dos grupos sintomáticos,oligossintomáticos e controle,
foram submetidos à coleta de sangue por venopunção jugular e, após
formação de coágulo, foi centrifugado a 3000rpm, para obtenção de soro.
As amostras de soro foram aliquotadas em frascos de polipropileno de 1,5
ml e armazenadas em freezer a –20
o
C para posterior realização do teste
enzimático de ELISA.
Análise Parasitológica
Os esfregaços de linfonodo foram examinados por um observador
experiente, com o objetivo de identificar formas amastigotas típicas de
Leishmania sp. Para tanto, utilizou-se um escore a fim de quantificar o
grau de parasitismo em cada esfregaço, analisando-se 50 campos em
cada esfregaço. Dessa forma, o grau de parasitemia foi classificados em:
raro (1 a 10 parasitos/ esfregaço), discreto (11 a 20 parasitos/esfregaço),
moderado (21 a 30 parasitos/esfregaço) e acentuado (> 30
parasitos/esfregaço).
28
Método de Elisa
Método de ELISA para detecção de IgG para Leishmania L. chagasi
segundo (LIMA et al., 2003).
O teste foi realizado no Laboratório de Imunologia Veterinária da
UNESP de Araçatuba. Para a realização do ensaio, microplacas de
poliestireno de 96 poços (Costar, EUA) foram sensibilizadas com 50 µl da
solução, por poço, contendo 20 µg/ml de proteína de lisado total de
promastigotas de Leishmania L. chagasi em tampão carbonato-
bicarbonato (0,05 M, pH 9,6), sendo incubadas a 4 °C por uma noite.
Após a sensibilização as placas foram lavadas por três vezes com
PBS acrescido de 0,05% de Tween 20, pH 7,2 (PBS T 20) e bloqueadas
com 150 µl, por poço, de PBS acrescido de 10% de soro fetal bovino
(SFB), por 1 hora, à temperatura ambiente. Em seguida as foram lavadas
novamente com PBS T 20.
As amostras foram diluídas em PBS T 20 acrescido de 10% de
SFB, na diluição de 1:400, a mesma diluição foi realizada para os
controles positivos e negativos. A seguir foram adicionados 100 µl de
amostras e padrões, por poço, em triplicata. Esta etapa do ensaio foi
incubada por três horas, à temperatura ambiente e em seguida as placas
foram lavadas novamente com PBS T 20.
Posteriormente foram adicionados 100 µl de anticorpo anti-IgG de
cão conjugado a peroxidase (Sigma, EUA), por poço, diluído 1:1000 em
PBS T 20. A incubação foi realizada por uma hora, à temperatura
ambiente e em seguida a placa foi lavada novamente com PBS T 20. A
seguir, as placas foram cobertas com 100 µl da solução reveladora,
composta pelo substrato o-phenylenediamine dihydrocloride (OPD)
(Sigma,EUA) (0,4mg/ml), água oxigenada (H
2
O
2
), ácido cítrico (0,1 M) e
29
fosfato de sódio dibásico (0,2 M), por poço, e permaneceram à
temperatura ambiente até a revelação e o momento de leitura.
A reação ocorreu em cinco minutos, no escuro e foi interrompida
pela adição de 50 µl, por poço, de ácido clorídrico 1 N. A leitura foi
realizada em espectrofotômetro para microplacas de 96 poços, Spectra
Count
TM
(Packard Bio Science Company, U.S.A.), utilizando filtro para
comprimento de onda de 490 nm.
30
ELISA para detecção de proteína antigênica do FML segundo
(BORJA-CABRERA, 1999) com modificação.
As microplacas de poliestireno de 96 poços (Costar, EUA) foram
sensibilizadas com 50 µl da solução, por poço, contendo 40 µg/ml de
antígeno FML em tampão carbonato-bicarbonato (0,06 M, pH 9,6), sendo
incubadas por uma hora a 37 °C e após a 4 °C por uma noite.
Após a sensibilização as placas foram lavadas por três vezes com
PBS acrescido de 1 % de leite desnatado e Tween 20, pH 7,2 (PBS T 20).
As amostras foram diluídas na concentração de 1:100 no tampão (PBS T
20), a mesma diluição foi realizada para os controles positivos e
negativos. A seguir foram adicionados 100 µl de amostras e padrões, por
poço, em triplicata. Esta etapa do ensaio foi incubada por uma hora , à
temperatura de 37°C e em seguida as placas foram lavadas novamente
com PBS T 20.
Posteriormente foram adicionados 100 µl de anticorpo anti-IgG de
cão conjugado a peroxidase (Sigma, EUA), por poço, diluído 1:1000 em
PBS T 20. A incubação foi realizada por uma hora, à temperatura
ambiente e em seguida a placa foi lavada novamente com PBS T 20. A
seguir, as placas foram cobertas com 100 µl da solução reveladora,
composta pelo substrato o-phenylenediamine dihydrocloride (OPD)
(Sigma,EUA) (0,4mg/ml), água oxigenada (H
2
O
2
), ácido cítrico (0,1 M) e
fosfato de sódio dibásico (0,2 M), por poço, e permaneceram à
temperatura ambiente até a revelação e o momento de leitura.
A reação ocorreu em cinco minutos, no escuro e foi interrompida
pela adição de 50 µl, por poço, de ácido clorídrico 1 N. A leitura foi
realizada em espectrofotômetro para microplacas de 96 poços, Spectra
Count
TM
(Packard Bio Science Company, U.S.A.), utilizando filtro para
comprimento de onda de 490 nm.
31
Interpretação dos resultados do ELISA.
O ponto de corte “cut off” foi determinado através do programa
estatístico “MedCalc” pelo método curva Roc (Gardner; Greiner, 2006)
através da densidade óptica (D.O.) dos soros negativos e a D.O. dos
soros positivos.
Análise Estatística
A análise estatística foi constituída dos seguintes testes não
paramétricos: o teste de Mcnemar, utilizado para comparar proporções de
resultados positivos de dois grupos dependentes; teste de qui-quadrado
que verificou associação entre métodos e grupos; para associação entre
parasitismo e as variáveis estudadas, foi usado teste exato de Fisher (Zar,
1998). As análises estatísticas foram efetuadas empregando-se o
programa SAS (Statistical Analysis System). Os resultados estatísticos
foram considerados significativos, quando P<0,05. Os valores da
sensibilidade e especificidade entre as variáveis, foram determinados pela
curva Roc (Gardner; Greiner, 2006), empregando-se o programa
MedCalc. O índice Kappa (Smith, 1995) foi utilizada para medir o grau de
concordância real entre o teste parasitológico e as técnicas de ELISA.
32
Resultados
33
Resultado
Avaliação Clínica dos Animais
Grupo sintomático
Foram observados neste grupo quinze cães machos e quinze fêmeas,
que apresentaram sintomas (Figura 2) abaixo relatados:
• Linfadenomegalia (30 cães)
• Onicrogrifose (18 cães)
• Rarefação pilosa (15 cães)
• Caquexia (15 cães)
• Pododermatite (12 cães)
• Alopecia em pina (12 cães)
• Alopecia periocular (9 cães)
• Úlceras cutâneas (9 cães)
• Descamação cutânea (8 cães)
30
9
12
15
8
9
15
18
12
Sinais clínicos observados em animais do grupo
sintomático
linfadenomegalia
alopecia periocular
alopecia em pina de orelha
rarefação pilosa
descamação cutânea
úlcera cutânea
caquexia
onicogrifose
pododermatite
Figura 1. Mostra a freqüência de sinais clínicos observados em animais
sintomáticos para LVC (n = 30).
34
Figura 2. Animais com sintomas da LVC. (A) Animal apresentando
caquexia, alopecia em região periocular bilateral e dermatite. (B)
Onicogrifose. (C) Dermatite ulcerativa em região articular. (D) lesão
ulcerativa com rarefação pilosa em pina.
A B
C
D
35
Grupo oligossintomático
Dos animais deste grupo, 15 cães eram machos e 15 fêmeas, que
se apresentavam em boa condição corpórea, e todos com
linfadenomegalia (100%) (Figura 3).
Figura 3. Animal com LVC pertencente ao grupo de animais
oligossintomáticos. (A e C) Demonstra animal em boa condição corpórea,
livre de lesões dermatológicas. (B) Linfonodo poplíteo com aumento de
volume (linfadenomegalia).
A
A
B
C
36
Diagnóstico Parasitológico
A avaliação do grau de parasitismo nos esfregaços de linfonodo
dos animais sintomáticos, mostrou que 36,7% apresentaram raros
parasitos, seguido pelos 33,3% de animais que apresentam moderado
parasitismo, 16,7% mostrou discreto parasitismo, enquanto que 13,3% do
grupo apresentou acentuado grau parasitário. Nos animais
oligossintomáticos, raro grau parasitário foi observado em 50% do grupo,
seguido pelos 20% que apresentaram moderado parasitismo, inúmeros
parasitos foram observados em 16,7% dos animais, e 13,3% dos animais
apresentaram discreto grau parasitário (Figura 4A, B,C, D e Figura 5).
37
Figura 4. Fotomicrografia do esfregaço de aspirado de linfonodo poplíteo
de cão, demonstrando o grau de parasitismo. (A) Representa raros
parasitos, indicado na seta. (B) Demonstra discreto parasitismo. (C)
Demonstra moderado parasitismo. (D) Demonstra inúmeros parasitos no
interior do citoplasma de macrófago. Panótico Rápido.
A
B
C
D
38
Grau parasitário
Sintomático
36,7% 16,7% 33,3% 13,3%
Oligossintomático
50,0% 13,3% 20,0% 16,7%
Raro Discreto Moderado Acentuado
Figura 5. Mostra em percentual, o grau de parasitismo
observado nos grupos sintomáticos e oligossintomáticos.
39
Diagnóstico Sorológico
Ensaio Imunoenzimático de ELISA
No ELISA-AgT, o ponto de corte determinado pela curva Roc foi ,
D.O. de 0,170 no grupo sintomático, e D.O. de 0,232 para o grupo
oligossintomático (Figura 6A e 6B). No ELISA-FML o mesmo
procedimento foi adotado, e o ponto de corte foi estabelecido em D.O. de
0,170 para ambos os grupos (Figura 7A e 7B).
40
ELISA-AgT
Figura 6. Reação sorológica pelo método de ELISA-AgT, em cães
sintomáticos (A), oligossintomáticos (6) e controle (A e B) (n = 30 para
cada grupo representado). O ponto de corte está indicado.
controle sintomático
A
controle oli
g
ossintomático
B
41
ELISA-FML
Figura 7. Reação sorológica pelo método de ELISA-FML, em cães
sintomáticos (A), oligossintomáticos (B) e controle (A e B) (n = 30 para
cada grupo representado). O ponto de corte está indicado.
controle sintomático
A
controle oligossintomático
B
42
O teste de ELISA-AgT, mostrou sensibilidade de 90% nos
animais sintomáticos, e 86,7% para o grupo oligossintomático, a
especificidade obtida foi de 93,3% para o grupo sintomático e 100% nos
animais oligossintomáticos; o valor preditivo positivo foi maior no grupo
oligossintomático (100%), enquanto que no grupo sintomático foi de
93,1% (Tabela 1).
No ensaio de ELISA-FML, a sensibilidade foi de 86,7% nos
animais oligossintomáticos, e 90% nos sintomáticos; a especificidade foi
de 96,7% em ambos os grupos, o valor preditivo positivo foi de 96,3%
para o grupo sintomático e 96,4% para os oligossintomáticos (Tabela 1).
Tabela 1. Valores de sensibilidade, especificidade e valor preditivo
positivo nos ensaios de ELISA-AgT e ELISA-FML em cães do grupos
sintomático e oligossintomático
Método Grupo
Sensibilidade Especificidade
Valor
Preditivo
Positivo
ELISA-AgT
Sintomático 90,0% 93,3% 93,1%
Oligossintomático 86,7% 100% 100%
ELISA-FML
Sintomático 86,7 % 96,7% 96,3%
Oligossintomático 90,0% 96,7% 96,4%
43
A comparação da positividade dada pelo teste ELISA-AgT e ELISA-
FML, mostrou discreta diferença na positividade entre ambos diagnósticos
(3,3%), porém, não mostrou diferença estatística significativa pelo teste de
McNemar p > 0,05 (Tabela 2).
Tabela 2. Análise comparativa dos testes pareados de ELISA-AgT e
ELISA-FML.
(1)
teste de McNemar
Grupo ELISA-AgT
ELISA-FML
P
(1)
Positivo Negativo Total
% % %
Sintomático
(n = 30)
Positivo 80,0 6,7 86,7
1,000
Negativo 10,0 3,3 13,3
Total 90,0 10,0 100,0
Oligossintomático
(n = 30)
Positivo 80,0 6,7 86,7
0,6547
Negativo 10,0 3,3 13,3
Total 90,0 10,0 100,0
Controle
(n = 30)
Positivo 0,0 3,3 3,3
0,5637
Negativo 6,7 90,0 96,7
Total 6,7 93,3 100,0
44
A análise comparativa entre o grau de parasitismo e a presença
de sintomatologia nos animais, não mostrou valor significativo pelo teste
exato de Fisher em ambos os grupos estudados (P=0,6327). Porém, foi
observada uma correlação significativa (P<0,0145) entre o grau de
parasitismo com a positividade obtida no ensaio de ELISA-AgT; o, mesmo
nãofoi observado no ensaio de ELISA-FML (Tabela 3).
Tabela 3. Análise comparativa entre o grau de parasitismo com a
positividade sorológica de ELISA-AgT e ELISA-FML de ambos os grupos
estudados.
(1)
teste exato de Fisher.
Variável Categoria
Parasitismo
P
(1)
raro discreto moderado acentuado Total
N % N % N % N % N %
Grupo
Sintomático
(n = 30)
11 36,7 5 16,7 10 33,3 4 13,3 30 100
0,6327
Oligossintomático
(n = 30)
15 50 4 13,3 6 20 5 16,7 30 100
Total
(n = 60)
26 43,3 9 15,0 16 26,7 9 15 60 100
ELISA-
AgT
Positivo 22 84,6 9 100 16 100 5 55,6 52 86,7
0,0145
Negativo 4 15,4 0 0,0 0 0,0 4 44,4 8 13,3
Total 26 100 9 100 16 100 9 100 60 100
ELISA-
FML
Positivo 22 84,6 8 88,9 15 93,7 8 88,9 53 88,3
0,9346
Negativo 4 15,4 1 11,1 1 6,3 1 11,1 7 11,7
Total 26 100 9 100 16 100 9 100 60 100
45
Discussão
46
Discussão
Os principais sintomas observados na avaliação clínica dos
animais, foram linfoadenomegalia, lesões dermatológicas e onicogrifose,
corroborando com os achados de Feitosa, et al., 2000, Mattos Junior, et
al., 2004 e Ikeda-Garcia et al., 2007.
No Brasil, as medidas adotadas para a contenção da LVC,
encontram-se no controle do vetor, identificação da doença, e posterior
eutanásia do cão infectado. Neste contexto, o diagnóstico de animais
positivos pelas técnicas sorológicas e parasitológicas, tem importante
papel, visto que os achados clínicos e hematológicos são compatíveis
com outras doenças infecciosas.
Em relação ao exame parasitológico, apesar de apresentar baixa
sensibilidade, a especificidade é alta, quando observado a presença do
parasito ao exame direto. Em nossos resultados, observamos oito cães
positivos para LVC no exame parasitológico, dentre estes, quatro
apresentavam acentuado grau de parasitismo, que obtiveram sorologia
negativa no ensaio de ELISA-AgT; o mesmo foi observado no teste de
ELISA-FML, onde, sete animais positivos ao exame parasitológico,
mostraram negatividade sorológica, dados estes que corroboram com os
observados por Barrouin-Mello et al., 2006; Barrouin-Mello et al., 2006;
Brasil, 2003; Moreira et al., 2002. Nosso estudo revelou correlação
significativa (P=0,0145) entre o grau de parasitismo com a positividade
sorológica no ensaio de ELISA-AgT, porém não revelou correlação entre o
grau de parasitismo com a sintomatologia, concordando com dados
observados por Madeira et al., 2004; Souza et al., 2005.
Diferentes métodos sorológicos são utilizados para o diagnóstico
da doença. Desses, a reação de imunofluorescência indireta (IFI) tem
sido amplamente empregada, embora, tal método apresente limitações,
tais como: reatividade cruzada com outras doenças e sensibilidade
47
reduzida para detecção de cães assintomáticos (ALMEIDA et al., 2004,
BRAGA et al., 1998, SUNDAR; RAÍ, 2002).
A técnica de ELISA apresenta vantagens, pois a leitura é
automatizada, não depende do observador, vários testes são
processados ao mesmo tempo e tem sido utilizada em levantamentos
epidemiológicos (SUNDAR; RAÍ, 2002). Métodos de ELISA utilizando o
antígeno total do parasito são descritos para o diagnóstico da doença
canina e humana (LIMA et al., 2003, MARTIN et al., 1998; MOHAMMED
et al., 1985). Tais métodos têm algumas vantagens sobre outros métodos
comumente utilizados. A preparação de antígeno total é simples, grandes
quantidades são produzidas sob condições padronizadas (EVANS et al.,
1990). Visto que o antígeno total apresenta determinados epítopos
antigênicos que não estão presentes no antígeno solúvel.
Nossos resultados mostraram que o ELISA-AgT apresentou
sensibilidade e especificidade altas, sendo mais sensível nos animais
sintomáticos (90,0%) do que nos oligossintomáticos (86,7%) e
especificidade de 93,3% para os sintomáticos e 100% nos
oligossintomáticos. Rosário et al., 2005, realizou ELISA com antígeno
total de Leishmania L. chagasi, em animais positivos para LVC pelo
método de IFI e obteve sensibilidade de 98% e especificidade e 100%;
nossos resultados mostraram a mesma especificidade no grupo de
oligossintomáticos, porém com menor sensibilidade (86,7%). A diferença
observada na sensibilidade pode estar associada ao exame ouro do
diagnóstico, onde no nosso estudo foi realizado exame direto
parasitológico, e o acima descrito foi previamente diagnosticado por teste
sorológico.
Métodos de ELISA baseados em frações purificadas ou
recombinantes têm sido descritos (METTLER et al., 2005, NIETO et al.,
1999, RHALEM et al., 1999) e apresentam alta sensibilidade e
especificidade, tendo como vantagem, menor possibilidade de reações
48
cruzadas com outros patógenos (METTLER et al., 2005, ROSÁRIO et al.,
2005).
Entre os antígenos purificados utilizados para diagnóstico da LV
está o ligante de fucose-manose (FML), que é um antígeno específico no
sorodiagnóstico humano (PALATINIK et al., 1995) e canino (BORJA-
CABRERA et al., 1999).
Em cães sintomáticos, o método ELISA-FML empregando
proteína A conjugada à peroxidase para detecção dos anticorpos, resultou
em sensibilidade e especificidade de 100% (BORJA-CABRERA et al.,
1999). No grupo de animais sintomáticos estudado, o mesmo método
utilizando anti-IgG de cão, conjugado à peroxidase para detecção de
anticorpos, resultou em sensibilidade de 86,7% e especificidade de
96,7%. A diferença observada em nossos estudos, com os obtidos por
Borja-Cabrera et al., 1999, pode ser atribuída ao uso da proteína A. De
fato, a proteína A conjugada à peroxidase apresenta vantagem em
relação ao uso de IgG conjugada à peroxidase pois, a proteína A reage
com todas as classes de IgG e também reage parcialmente com IgA e
IgM (GOUDSWAARD et al., 1978). O uso de proteína A conjugado à
peroxidase aumenta a diferença nos valores de absorbância no soro de
cães infectados e saudáveis, o que auxilia na discriminação dos animais
positivos (LIMA et al., 2003); tal fato se reflete diretamente na
sensibilidade do ensaio. Nos animais assintomáticos, Borja-Cabrera et
al., 1999, obteve sensibilidade de 100%. Em nosso estudo, o grupo
oligossintomático, o qual mais se assemelha ao grupo acima descrito,
apresentou sensibilidade de 86,7% e especificidade de 96,7%, a menor
sensibilidade observada pode estar associada à não utilização de
proteína A.
49
Nossos resultados mostraram que em animais oligossintomáticos
o ELISA-FML apresentou maior sensibilidade, por outro lado, nos animais
sintomáticos, o ELISA-AgT mostrou-se mais sensível na detecção de
positividade na LVC; porém as diferenças observadas na sensibilidade em
ambos os métodos e grupos foram de 3,3% mostrando-se discretas.
50
Conclusão
51
Conclusão
1. O ELISA-FML apresentou maior sensibilidade do que o ELISA-AgT
nos animais oligossintomáticos. O ELISA-AgT, apresentou maior
sensibilidade do que o ELISA-FML nos animais sintomáticos;
2. Ambos os métodos sorológicos ELISA-AgT e ELISA-FML, são
eficazes no diagnóstico da LVC, pois, apresentaram discreta
diferença na sensibilidade de ambos os métodos sorológicos nos
grupos estudados;
3. A avaliação do grau de parasitismo, não está correlacionada com a
progressão da doença;
4. Pode haver uma correlação positiva entre o método sorológico
ELISA-AgT com o exame parasitário.
52
Referências
53
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