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ESTUDO COMPARATIVO DA EXPRESSÃO DAS
PROTEÍNAS REGULADORAS DA APOPTOSE E DA
PROLIFERAÇÃO CELULAR ENTRE AS FORMAS
ESTACIONÁRIAS E RAPIDAMENTE EVOLUTIVAS
DA MICOSE FUNGÓIDE
ADRIANA PESSOA MENDES ERIS
Dissertação apresentada à Fundação Antônio
Prudente para obtenção do título de Mestre em
Ciências
Área de concentração: Oncologia
Orientador: Prof. Dr. Fernando A. Soares
Co-Orientador: Dr. José Antonio Sanches Jr
São Paulo
2007
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca da Fundação Prudente
Eris, Adriana Pessoa Mendes
Estudo comparativo da expressão das proteínas reguladoras da apoptose
e da proliferação celular entre as formas estacionárias e rapidamente
evolutivas da micose fungóide / Adriana Pessoa Mendes Eris -- São Paulo,
2007.
89p.
Dissertação (Mestrado)-Fundação Antônio Prudente.
Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de concentração: Oncologia.
Orientador: Fernando Augusto Soares
Descritores: 1. MICOSE FUNGOIDE. 2. PROTEINAS REGULADORAS DE
APOPTOSE. 3. PROLIFERAÇÃO CELULAR. 4. ANTÍGENO KI-67. 5.
PROTEINAS BCL-2 DE PROTO-ONCOGENE. 6. ANTÍGENO FAS. 7.
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DEDICATÓRIA
À minha avó Rosa (in memorian), minha tia Fá (in memorian)
e aos meus queridos pais. Sem eles, nada disso seria possível.
Ao Téo, pelo amor, apoio e paciência.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr Fernando A. Soares, pela ajuda, orientação e por
me acalmar nos momentos mais difíceis.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr José Antonio Sanches Jr, que me acolheu no
Ambulatório de Oncologia Cutânea da Divisão de Dermatologia do Hospital das
Clínicas de São Paulo e a quem devo meu conhecimento e interesse pelos linfomas
cutâneos.
Ao Prof. Dr. Evandro A Rivitti, chefe da Divisão de Dermatologia do
Hospital das Clínicas de São Paulo, por permitir minha presença em seu serviço e
fornecer o material necessário para a confecção do meu estudo.
Ao Prof. Dr. Cyro Festa Neto, pela amizade, carinho e por me receber no
Ambulatório de Oncologia Cutânea da Divisão de Dermatologia do Hospital das
Clínicas de São Paulo.
Aos meus pais, pelo amor, apoio e pelo exemplo de ética, dignidade e
honestidade que me ajudam a ser uma pessoa melhor.
Ao meu marido Teo, pelo amor, paciência, ajuda e presença constante,
fundamentais na minha vida.
Ao corpo docente da Pós-Graduação da Fundação Antonio Prudente pelo
excelente trabalho realizado.
Ao Dr Luiz Fernando Lima Reis, Diretor da Pós-Graduação da Fundação
Antonio Prudente, pela ética e conhecimento.
À amiga Bianca, pela ajuda e conselhos.
Aos amigos do Departamento de Oncologia Cutânea do Hospital A.C.
Camargo, pela ajuda e incentivo.
Aos amigos do Hospital das Clínicas, Helena e Walmar, pela amizade e
apoio.
Aos funcionários do Departamento de Oncologia Cutânea do Hospital A.C.
Camargo por todo o apoio, carinho e compreensão.
À todos do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital A.C. Camargo
pela ajuda e por me acolherem com carinho.
Aos funcionários do Departamento de Anatomia Patológica da Divisão de
Dermatologia do Hospital das Clinicas de São Paulo pela ajuda em encontrar e
fornecer o material necessário para o meu trabalho.
À Dra. Mirian Nacagami Sotto, por permitir a realização do estudo com o
material de seu laboratório.
Aos funcionários do arquivo de blocos e laboratórios do Departamento de
Anatomia Patológica do Hospital A. C. Camargo.
À amiga Inês Nobuko Nishimoto, pelo auxilio na análise estatística dos
dados.
À Sueli Nonogaki, funcionária do Centro de Pesquisas do Instituto Ludwig,
pela realização das reações imunoistoquimicas com qualidade e precisão.
Aos funcionários do Serviço de Arquivo Médico e Estatístico (SAME) do
Hospital A.C. Camargo pela ajuda em encontrar e selecionar os prontuários.
Aos funcionários do Serviço de Arquivo Médico e Estatístico (SAME) do
Hospital das Clinicas de São Paulo pela presteza em encontrar e selecionar os
prontuários.
Aos funcionários da Biblioteca da Fundação Antonio Prudente, pelo
excelente trabalho que realizam auxiliando a todos na busca das informações
necessárias.
À Suely Francisco, bibliotecária Chefe, pela ajuda, conhecimento e pela
formatação deste trabalho.
À Ana Maria Rodrigues Alves Kuninari, coordenadora da Pós-Graduação da
Fundação Antonio Prudente, e Luciana Pitombeira, funcionária da pós-graduação,
pela ajuda, paciência e todas as informações que me auxiliaram a finalizar este
trabalho.
Aos pacientes, pela confiança e colaboração.
À Professora Emma Eberlein O. F. Lima, pela ajuda final e orientações sobre
a língua portuguesa.
RESUMO
Eris APM. Estudo comparativo da expressão das proteínas reguladoras da
apoptose e da proliferação celular entre as formas “estacionárias” e
“rapidamente evolutivas” da micose fungóide. São Paulo; 2007. [Dissertação de
Mestrado-Fundação Antonio Prudente]
Introdução. Os linfomas cutâneos de célula T compreendem dois terços dos
linfomas cutâneos. São linfomas não Hodgkin extra-nodais com comportamento
clínico classificado como indolente, intermediário e agressivo. A micose fungóide
representa a forma mais comum dos linfomas cutâneos de célula T e consiste em
neoplasia clonal de linfócitos T CD4+ de memória. Sua forma clássica é
caracterizada por lesões tipo patches, placas e tumores que se localizam
principalmente nas áreas não expostas à luz solar. A maior parte dos portadores de
micose fungóide apresenta forma de doença extremamente indolente,
permanecendo com lesões não infiltradas e localizadas por longos períodos.
Entretanto, observam-se casos rapidamente evolutivos com prognóstico menos
favorável. A fim de descobrirmos se estes pacientes apresentam, além da forma de
apresentação clínica, diferenças no comportamento biológico do tumor, avaliamos
o índice de proliferação celular e apoptose entre os dois grupos, visto que, a
proliferação de células neoplásicas na epiderme em associação com as células de
Langerhans sugere que o crescimento desse tumor depende da apresentação
antigênica crônica e da inibição da apoptose das células tumorais. Objetivo.
Comparar a expressão das proteínas reguladoras da apoptose e da proliferação
celular entre dois grupos de doentes classificados de acordo com a apresentação
clínica: “estacionária” ou “rapidamente evolutiva”. Pacientes e métodos. Estudo
retrospectivo incluindo 32 pacientes acompanhados nos Ambulatórios de
Oncologia Cutânea da Divisão de Dermatologia do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e do Hospital A.C.
Camargo. Os doentes foram divididos em dois grupos, conforme a apresentação
cutânea, e denominados portadores de “forma estacionária” e de “forma
rapidamente evolutiva”. Estudou-se, por imunoistoquímica, a expressão das
proteínas Ki-67 para avaliação da proliferação celular e as proteínas Bcl-2, Bax,
Fas, Fas-L e caspase 3 para avaliação da apoptose. Resultados. Os resultados do
estudo imunoistoquímico demonstraram que não houve diferença de expressão
entre os dois grupos estudados com os anticorpos marcadores de apoptose FAS,
FASL, Bcl 2, Bax e caspase 3. A pesquisa da proteína Ki67 demonstrou diferença
de expressão estatisticamente significativa entre os grupos estudados. A
porcentagem de células com expressão do marcador de proliferação celular foi
maior nos pacientes da “forma evolutiva” com média de 35,1% e mediana de
45%, com p-valor de 0,0001. Os pacientes da forma estacionária apresentaram
média de 10,0% e mediana de 8,4%. Conclusões. A ausência de expressão da
caspase 3 em todas as amostras analisadas sugere que a inibição da apoptose é um
fenômeno presente em ambas as formas de apresentação da doença. A expressão
positiva das proteínas reguladoras da apoptose, FAS, FASL, Bcl-2 e Bax, em
ambos os grupos, poderia indicar que o bloqueio da apoptose ocorra através de
Bcl-2, caso a proteína Bax, apesar de expressa, encontre-se inativa ou através de
outras proteínas relacionadas às vias da apoptose, visto que a via de FAS-FASL
apresentou-se intacta em nosso estudo. O aumento da expressão da proteína Ki-67
nas formas evolutivas da doença poderia ser conseqüência do desequilíbrio
precoce do sistema imune anti-tumoral nesses pacientes.
SUMMARY
Eris APM. [Comparative study of the expression of apoptosis-regulating
proteins and cell proliferation between the "stationary" and the "rapidly
progressing" forms of mycosis fungoides]. São Paulo; 2007. [Dissertação de
Mestrado-Fundação Antonio Prudente].
Introduction. T-cell cutaneous lymphomas account for two thirds of the cutaneous
lymphomas. These are non-Hodgkin extra-nodal lymphomas with clinical behavior
classified as intermediate quiescent and aggressive. Mycosis Fungoides represents
the most common form of T-cell cutaneous lymphomas and consists of clonal
neoplasia of T CD+4 memory lymphocytes. Its classic form is characterized by
patches, plaques and tumor type lesions normally located in areas not exposed to
sunlight. Most persons suffering from mycosis fungoides present an extremely
quiescent form of the disease with non-infiltrated lesions during long periods of time.
Nevertheless, rapidly progressing cases can be observed with less favorable
prognosis. Proliferation of neoplasic cells on the epidermis in association with
Langerhans cells suggests that growth of this tumor is stimulated by the antigen
presentation mediated by these cells and reinforces the idea that the major
etiopathogenic mechanisms involved in this disease are the chronic antigen
stimulation and inhibition of apoptosis of the tumor cells. Objective. Compare the
expression of apoptosis-regulating proteins and cell proliferation between two groups
of patients classified according to the clinical presentation: "stationary" or "rapidly
progressing". Patients and methods. This is a retrospective study including 32
patients attended by the Ambulatory of Cutaneous Oncology of the Dermatology
Division of General Hospital of the São Paulo University Medical School, and the
Hospital A.C. Camargo. Patients were subdivided into two groups based on their
cutaneous presentation and classified as bearers of a "stationary form" or a "rapidly
progressing form" of the disease. Expression of the Ki67 proteins were studied by
means of immunohistochemistry in order to evaluate cell proliferation and proteins
Bcl-2, Bax, Fas, Fas-L and caspase 3 to evaluate apoptosis. Results. The results of
the immunohistochemical study demonstrated no difference in the expressions
between the two groups with the antibodies marked for apoptosis FAS, FASL, Bcl 2,
Bax and caspase 3. Study of the expression of the Ki67 protein demonstrated a
statistically significant difference in the expression between the groups studied. The
percentage of the expression was greater in patients with the "progressing form" of
the disease. Conclusions. The negative expression for caspase 3 in all samples
analyzed suggests that the inhibition of apoptosis is a phenomenon present in both
the stationary and the rapidly progressing form of the disease. The positive
expression of the apoptosis-regulating proteins FAS, FASL, Bcl-2 and Bax, in both
groups can indicate that blocking of apoptosis occurs through the Bcl-2, if the Bax
protein, despite being expressed, is found inactive or through other proteins related to
the apoptosis pathway, since the FAS-FASL pathway appeared intact in our study.
The increase in the expression of the Ki67 protein in the progressing forms of the
disease may result from the precocious deficiency of the tumoral immune system in
these patients.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Estágios de maturação dos linfócitos T e a expressão dos
marcadores de superfície.
5
Figura 2
Os mecanismos de iniciação, expressão e inibição da
resposta imune cutânea.
11
Figura 3
Micose fungóide, neoplasia de células T cutâneas.
17
Figura 4
Conseqüências da produção de citocinas pela célula T
maligna.
19
Figura 5
Esquema de progressão da micose fungóide.
23
Figura 6
Vias de apoptose dos linfócitos T ativados.
31
Figura 7
Demonstração de lesões tipo patches e placas em
pacientes com micose fungóide.
42
Figura 8
Demonstração de lesões tumorais em paciente com
micose fungóide.
43
Figura 9
Fotomicrografia de corte histológico de micose fungóide
com marcação positiva para Ki-67.
51
Figura 10
Fotomicrografia de corte histológico de micose fungóide
com marcação das células positivas pelo Ki-67 em
vermelho.
51
Figura 11
Expressão citoplasmática de FAS.
56
Figura 12
Expressão citoplasmática de FASL.
56
Figura13
Expressão citoplasmática de Bcl-2.
57
Figura 14
Expressão citoplasmática de Bax.
57
Figura15
Expressão nuclear e citoplasmática da caspase 3.
58
Figura 16
Expressão nuclear de Ki67.
60
Figura 17
Inibição da via de morte celular por ativação através de c-
FLIP.
65
Figura 18
Células de Langerhans na tolerância e no câncer.
72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Relação entre alguns antígenos CD, células e funções.
7
Tabela 2
Relação entre determinantes celulares-CD e sub-
populações de células identificadas.
8
Tabela 3
Distribuição da casuística de acordo com as variáveis
demográficas e clínicas.
44
Tabela 4
Tabela de anticorpos utilizados.
46
Tabela 5
Distribuição das variáveis clínicas e lesões de acordo com
evolução.
53
Tabela 6
Distribuição da marcação de expressão das proteínas
reguladoras da apoptose, Fas, FasL, Bcl-2, Bax e caspase
3, de acordo com a forma de evolução dos pacientes.
55
Tabela 7
Medidas relativas ao Ki67 de acordo com evolução.
59
LISTA DE QUADROS
Quadro 1
Classificação dos linfomas cutâneos primários da WHO-
EORTC.
14
Quadro 2
Estadiamento TNM para os LCCT.
25
Quadro 3
Estadiamento TNM dos L.C.C.T.
25
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AICD Activation induced cell death (Morte celular por ativação)
AIF Apoptosis-inducing factor (Fator indutor de apoptose)
APC Célula apresentadora de antígeno
APAF-1 Apoptotic protease activating factor
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
CASPASE Cystein aspartate specific protease
CCL17 Ligante de citocina 17
CCL22 Ligante de citocina 22
CCR4 Receptor de citocina 4
CD Cluster of Diferentiation/ Diferenciação Celular
CLA Antígeno linfocitário cutâneo
CTLA-4 Antígeno linfocitário citotóxico citoplasmático 4
c-FLIP cellular FLICE like inhibitory protein
DAB 3,3’ Diaminobenzidine Tetrahydrochloride
DHL Desidrogenase lática
DISC Death inducing signaling complex (complexo de sinalização de
indução de morte)
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
EORTC European Organization for Research and Treatment of Cancer
FADD Domínio de morte associado a FAS
FASL Ligante de FAS
FASR Receptor de FAS
FLICE FAS-associated death-domain-like IL-1beta-converting enzyme
FLIP FLICE like inhibitory protein
G1 Gap 1= interfase
G2M Gap 2/mitose
GM-CSF fator estimulador de colônias
H2O2 Água oxigenada
HTLV1 Human T Cell Lymphotrophic Virus Type I
IL1 interleucina 1
INFγ Interferon gama
ISCL International Society for Cutaneous Lymphoma
LCCT Linfoma cutâneo de células T
LNH Linfoma não Hodgkin
MHC Major histocompatibility complex (Complexo maior de
histocompatibilidade)
Linfócito Naive linfócito T ou B maduro sem encontro anterior com um antígeno
PBS Phosphate buffered saline
PCR Reação de polimerase em cadeia
ROS Reactive oxygen species
S Síntese
TCR Receptor de células T
TGF Fator de crescimento tumoral
TH1 T helper/auxiliar 1
TH2 T helper/auxiliar 2
TNF Tumor necrosis factor (Fator de necrose tumoral)
TNM Tumor, Lymph nodes and Metatastasis
TRAIL Ligante de indução da apoptose relacionado ao TNF
TREG Linfócitos T regulatórios
TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end
labeling
USG ultra-sonografia
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Linfomas 1
1.1.1 Aspectos gerais 1
1.1.2 Maturação dos linfócitos 2
1.1.3 Linfócitos e marcadores de superfície 5
1.1.4 O Sistema Imune Cutâneo 9
1.2 Linfomas não-Hodgkin cutâneos 12
1.2.1 Linfomas cutâneos de célula T 13
1.2.2 Micose fungóide 14
1.3 Apoptose 26
1.3.1 Definição 26
1.3.2 Vias de apoptose 27
1.3.3 Apoptose nos linfomas cutâneos de células T 32
1.4 O índice de proliferação nos linfomas cutâneos de células T 36
2 OBJETIVOS 39
3 CASUÍSTICA E MÉTODOS 40
3.1 Casuística 40
3.2 Métodos 45
3.2.1 Estudo imunoistoquímico 45
3.2.2 Protocolo de Reações 46
3.2.3 Padronização da leitura 48
3.3 Análise estatística 52
4 RESULTADOS 53
4.1 Variáveis Clínicas e as Formas de Evolução 53
4.2
Estudo Imunoistoquímico 54
4.2.1 Proteínas Reguladoras da Apoptose 54
4.2.2 Proteína Marcadora da Proliferação Celular: Ki-67 59
5 DISCUSSÃO 61
6 CONCLUSÕES 76
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 77
ANEXOS
Anexo 1 Ficha de registro de dados
Anexo 2 Distribuição das variáveis clínicas comparando-se as formas de
evolução.
Anexo 3 Relação dos principais estudos FAS, Bcl-2, Ki67
Anexo 4 Banco de dados
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 LINFOMAS
1.1.1 Aspectos Gerais
Os linfomas são divididos em dois grandes grupos: os linfomas de Hodgkin
e os linfomas não-Hodgkin. O linfoma de Hodgkin é um distúrbio maligno único,
geralmente originado nos linfonodos. Caracteriza-se morfologicamente pela
presença de células gigantes neoplásicas, chamadas células de Reed-Sternberg.
Evidências obtidas através da reação em cadeia de polimerase permitiram
caracterizar essa neoplasia como uma expansão monoclonal de linfócitos B
derivados dos centros germinativos (KUPPERS e al. 1994; MARAFIOTI et al.
1997). Os linfomas não Hodgkin são um grupo heterogêneo de doenças
linfoproliferativas que compartilham algumas características clínicas e várias
diferenças biológicas (ASTER 2005). Podem ser divididos em dois grupos: os
linfomas nodais e os linfomas extra-nodais. Os linfomas não-Hodgkin nodais
acometem primariamente os linfonodos e os extra-nodais se manifestam
inicialmente em outros sítios. A incidência dos linfomas não Hodgkin (LNH) varia
de 10 a 20 casos/100.000 habitantes na maioria dos países do ocidente.
Aproximadamente 5% dos LNH apresentam manifestação cutânea. Os linfomas
nodais são predominantemente de linfócitos B. Na pele, os linfomas de células T
são três vezes mais freqüentes que os linfomas B (GROVES et al. 2000; MULLER
et al. 2005; WILLEMZE et al. 2005).
2
Os linfomas cutâneos de célula T (LCCT) são um grupo de LNH com
comportamento clínico e biológico distinto. São definidos pela proliferação clonal
de linfócitos T cutâneos malignos sem evidência de doença extra-cutânea no
momento do diagnóstico. Apresentam incidência anual, avaliada durante o período
de 1973 a 2002, de 6,4 casos por 1.000.000 habitantes. O quadro clínico e o
prognóstico desses linfomas são completamente diferentes dos linfomas sistêmicos
com acometimento cutâneo secundário. A forma mais comum de LCCT é a micose
fungóide, correspondendo a 60% de todos os casos. É uma neoplasia clonal de
linfócitos T CD4+ de memória, os quais tendem a se acumular na epiderme ao redor
das células de Langerhans (CL), formando os patognomônicos microabscessos de
Pautrier (CRISCIONE e WEINSTOCK 2007).
1.1.2 Maturação dos Linfócitos
Os linfócitos são as únicas células humanas que expressam receptores
altamente diversificados para o antígeno, permitindo o reconhecimento de uma
enorme variedade de substâncias estranhas. Essa diversidade é gerada durante o
processo de maturação dos linfócitos T e B a partir de células precursoras. As
células precursoras não expressam receptores de antígenos sendo, portanto,
incapazes de reconhecer ou responder aos mesmos. A partir do processo de
maturação dos linfócitos, os precursores derivados da medula óssea são convertidos
em linfócitos maduros. Durante a maturação, um programa altamente regulado de
expressão seqüencial de genes leva à proliferação de células em desenvolvimento,
promovendo mudança nos fenótipos, aquisição de competência funcional e as várias
etapas de seleção que garantirão ao linfócito que migrar para o tecido linfóide
3
periférico plena competência para responder aos antígenos estranhos, mas não a
antígenos próprios. As células-tronco da medula óssea aumentam a produção de
todas as células sangüíneas, incluindo as da linhagem linfocítica. A maturação das
células B ocorre na medula óssea enquanto que os progenitores das células T
migram e completam sua maturação no timo. A maturação inicial das células T e B
é caracterizada por uma alta atividade mitótica, estimulada principalmente por
interleucina 7, resultando em aumento do número de linfócitos imaturos. Esse
processo de maturação envolve a recombinação somática de genes dos receptores de
antígenos e a expressão de moléculas de imunoglobulina nos precursores da célula
B e de moléculas do receptor de células T (TCR) nos precursores das células T. Os
receptores de antígenos das células B e T são codificados por genes formados por
recombinação somática e por um número limitado de segmentos gênicos que são
segregados. Existem loci separados codificando a cadeia pesada da imunoglobulina,
a cadeia leve κ da imunoglobulina, a cadeia leve λ, a cadeia β do TCR, as cadeias α
e γ e a cadeia δ do TCR (ABBAS e LICHTMAN 2005c).
A maturação das células T no timo evolui em estágios distinguíveis pela
expressão dos genes do receptor de antígenos, pelas moléculas de co-receptores
CD4 e CD8 e por sua localização no timo. As linhagens de células T iniciais
migram para o timo e não expressam TCR nem as moléculas CD4 ou CD8. As
células T em desenvolvimento dentro do timo são chamadas de timócitos. Essas
células colonizam inicialmente a região mais externa do córtex, onde entram em
proliferação, rearranjam os genes do TCR e expressam as moléculas de CD3, TCR,
CD8 e CD4 na superfície celular. À medida que os timócitos sofrem o processo de
maturação, migram do córtex para a medula do timo. No estágio chamado pró-T, as
4
células T são CD4- e CD8- (duplo-negativas) e os genes de TCR estão na
configuração da linhagem germinativa. No estágio pré-T, os timócitos permanecem
duplo-negativos, mas ocorre a recombinação dos genes do TCR, formando-se o pré-
TCR. Os pré-TCR são responsáveis pela transdução de sinais que promovem a
expressão de CD4 e CD8 e a proliferação de timócitos imaturos. No estágio CD4+ e
CD8+ (duplo-positivo) das células T em desenvolvimento, baixos níveis de TCR
são expressos na superfície celular. Os processos de seleção orientam a maturação
dos timócitos duplo-positivos, expressando TCR e modelando o repertório de
células T pela restrição de MHC próprio e auto-tolerância. Os timócitos TCR αβ
maduros que sobrevivem aos processos de seleção migram para a medula do timo,
tornando-se linfócitos CD4+ CD8 - ou CD8+ CD4-. Os timócitos da medula
adquirem a capacidade de se diferenciar em células efetoras auxiliares ou
citotóxicas e, finalmente, deixam o timo e povoam os tecidos linfóides periféricos
(ABBAS e LICHTMAN 2005c) (Figura 1).
5
Legenda: O processo de maturação dos linfócitos T e B consiste numa seqüência de estágios: a
maturação inicial envolve a proliferação das linhagens precursoras, a expressão dos genes para o
receptor do antígeno e a seleção do repertório de linfócitos maduros.
Fonte: NAOUM (2001)
Figura 1 - Estágios de maturação dos linfócitos T e a expressão dos marcadores de
superfície.
1.1.3 Linfócitos e Marcadores de Superfície
Os linfócitos humanos expressam tipos diferentes de proteínas em sua
superfície, as quais são detectadas por anticorpos monoclonais. As moléculas na
superfície da célula que são reconhecidas por anticorpos monoclonais são chamadas
de antígenos ou marcadores, pois identificam e discriminam as diferentes
populações celulares. Esses marcadores podem ser agrupados em várias categorias;
alguns são específicos para células de uma linhagem em particular ou de uma via de
maturação, enquanto a expressão de outros varia de acordo com o estado de
ativação ou diferenciação das mesmas células. Adota-se um sistema de
6
nomenclatura em que um marcador de superfície que identifica uma linhagem em
particular ou um estágio de diferenciação é considerado um membro de um grupo
(cluster) de diferenciação. Todos os antígenos de superfície dos leucócitos cuja
estrutura seja conhecida recebem a designação CD cluster of differentiation
(ABBAS e LICHTMAN 2005 a e b).
Todas as células possuem, em suas composições estruturais de membranas,
proteínas capazes de serem reconhecidas por anticorpos sintetizados em
laboratórios: os anticorpos monoclonais e policlonais. Para os anticorpos produzidos
em laboratório, as proteínas de membrana de células blásticas, linfócitos,
monócitos, entre outras, são identificadas como "antígenos celulares". Observou-se,
porém, que grupos de diferentes anticorpos monoclonais reconheciam o mesmo
antígeno celular presente em mais de uma célula, quer fossem normais, malignas ou
células de linhagens evolutivas. Esses antígenos de diferenciação celular
reconhecidos por grupos de anticorpos monoclonais foram denominados por grupo
de diferenciação celular ou CD. Foram reconhecidos em experimentação
laboratorial perto de 170 diferentes tipos de CD nomeados em algarismos arábicos,
que se diferenciam de acordo com a sua descrição e são conhecidos por CD1, CD2,
CD3, CD4 e outros (NAOUM 2001). A Tabela 1 mostra a relação entre alguns
antígenos CD selecionados com distribuição celular e funções específicas. A tabela
2 mostra a relação entre determinantes celulares CD e sub-populações de células
identificadas.
7
Tabela 1 - Relação entre alguns antígenos CD, células e funções.
Fonte: NAOUM (2001).
8
Tabela 2 - Relação entre determinantes celulares-CD e subpopulações de células
identificadas.
Fonte: NAOUM (2001).
9
1.1.4 O Sistema Imune Cutâneo
A pele contém sistema imunológico especializado constituído de linfócitos e
células apresentadoras de antígenos (APC). É o maior órgão do corpo humano e
uma importante barreira física entre um organismo e seu ambiente externo. A pele
compõe-se de três grandes camadas de tecidos: uma camada superior – a epiderme;
uma camada intermediária – a derme; e uma camada profunda – a hipoderme ou
tecido celular subcutâneo. Os principais tipos de células na epiderme são os
ceratinócitos, responsáveis pela produção da proteína ceratina e de citocinas; os
melanócitos, produtores do pigmento melanina; as células de Langerhans e células
T intra-epteliais. As células de Langerhans, localizadas na porção suprabasal da
epiderme, são células dendríticas imaturas do sistema imunológico cutâneo. Essas
células formam uma rede que lhes permite capturar os antígenos que entram pela
pele. Quando estimuladas por citocinas inflamatórias, perdem adesividade pelas
células epidérmicas, migram para a derme e posteriormente para os linfonodos
através dos vasos linfáticos. Os linfócitos intra-epidérmicos constituem apenas 2%
dos linfócitos associados à pele e a maioria é constituída por linfócitos T CD8+. A
derme contém linfócitos T CD4+, CD8+ e macrófagos. Os linfócitos dérmicos
compreendem mais de 90% dos linfócitos cutâneos e estão distribuídos em grupos
ao redor de vênulas pós-capilares (ABBAS e LICHTMAN 2005a).
As interações moleculares que facilitam a migração das células malignas nos
linfomas T cutâneos e sua localização na pele são fundamentais para a fisiologia
normal da vigilância imunológica. O reconhecimento de antígenos patógenos
através do sistema imune promove a liberação de substâncias como GM-CSF (fator
estimulador de colônias), TNFα (fator de necrose tumoral) e IL1(interleucina1)
10
pelos ceratinócitos e outras células cutâneas. As células dendríticas imaturas na pele
(células de Langerhans) capturam o antígeno, processam-no em peptídeos capazes
de ligar-se a moléculas do MHC (complexo principal de histocompatibilidade) e o
transportam a linfonodos regionais onde o exibirão à linfócitos T ainda não expostos
ou células T naive. Durante essa migração, as células dendríticas amadurecem e se
tornam células apresentadoras de antígenos eficientes. As células dendríticas
maduras expressam altos níveis de moléculas de MHC da classe II com peptídeos
ligados, bem como co-estimuladores para a ativação de linfócitos T. No linfonodo,
os linfócitos T específicos para os complexos peptídeos-MHC exibidos são ativados
e inicia-se a resposta imune promovendo a expansão do clone específico. Este
linfócito T ativado passa a expressar receptores cutâneos como o antígeno
linfocitário cutâneo (CLA) e quimioatractantes como CCR4 (receptor de citocina 4)
que facilitam a migração destas células T para a pele, definindo, portanto, a célula T
cutânea (STINL et al. 2003; GIRARDI et al. 2004) (Figura 2).
11
Legenda: a presença de antígeno na pele, por exemplo, um patógeno, gera sinal de perigo que induz
à produção de imunidade específica a esse antígeno. Na presença desse sinal, há a secreção de GM-
CSF, TNFα e IL1 pelos ceratinócitos. As células apresentadoras de antígeno, CL/CD, capturam o
antígeno e o reapresentam como um peptídeo ao complexo MHC. As CD maduras migram para a
área para-cortical dos linfonodos e células T naive presentes nos linfonodos e são estimuladas
passando a expandir-se. Essas células possuem, em sua superfície, o antígeno linfocitário cutâneo
bem como receptores de vários quimioatractantes que se ligam às células do endotélio vascular na
derme e penetram na pele para proceder a resposta inflamatória. Na ausência de sinal de perigo, as
CL/CD migram para o linfonodo e induzem a sensibilização de células T regulatórias (Treg) que
limitam a expansão clonal dos linfócitos T, sensibilizados durante a resposta imune primária. Esse
evento leva à supressão da resposta imune desejada anti- tumoral e anti- bacteriana e não desejada, a
resposta auto-imune Ag, antígeno; DCC célula dendrítica cutânea; KC ceratinócito; CL célula de
Langerhans; T linfócito T naive; T’ célula T sensibilizada, T* linfócito T anérgico; TCR receptor de
célula T; Treg célula T regulatória.
Fonte: STINL et al. (2003).
Figura 2 - Os mecanismos de iniciação, expressão e inibição da resposta imune
cutânea.
Perturbação
Fase aferente
Homeostasia
Fase eferente
derme
Citocinas e
quimiocinas
Célula
dendrítica
imatura
Expansão
clonal
Células
endoteliais
Células T estimuladas
Célula
dendrítica
madura
Vaso
linfático
aferente
Linfócito T
Linfonodo
epiderme
12
Na resposta imune cutânea primária, a injúria ou estresse celular estimula os
ceratinócitos a liberarem citocinas inflamatórias, as quais recrutam leucócitos para o
local da inflamação. Os leucócitos são responsáveis pela iniciação e manutenção da
resposta inflamatória. A citocina primária regula as moléculas de adesão nas células
endoteliais dérmicas e estimula ceratinócitos basais a liberarem citocinas que
penetram na derme, ligam-se à matriz extracelular e recobrem o endotélio luminar.
As células T, passando com seus ligantes complementares, irão reconhecer as
moléculas de adesão e se ligarão ao longo do endotélio vascular, guiadas,
principalmente, pela ligação do antígeno linfocitário cutâneo (CLA) à E-selectina
presente no endotélio cutâneo. Esta ligação é fortalecida pelas citocinas ligantes
CCL17 (ligante de citocina 17) e CCL22 (ligante de citocina 22) as quais se ligam
ao CCR4 (receptor de citocina 4) presente nas células cutâneas (GIRARDI et al.
2004).
1.2 LINFOMAS CUTÂNEOS
Os linfomas cutâneos são um grupo de doenças caracterizado pela presença
de linfócitos malignos na pele. São linfomas extra-nodais não-Hodgkin de células T,
B e natural killer que se apresentam na pele sem evidência de doença extra-cutânea
ao diagnóstico (WILLEMZE et al. 2005). Após o trato gastro-intestinal, a pele é o
segundo sítio de linfoma não-Hodgkin extra-nodal com incidência anual estimada
de um caso para cada 100.000 habitantes (WEINSTOCK 1994; QUERFELD et al.
2003a). Os linfomas cutâneos primários apresentam comportamento clínico e
prognóstico diferentes dos linfomas nodais histologicamente semelhantes e que
13
acometem a pele secundariamente. Dessa forma é fundamental a diferenciação entre
linfoma cutâneo primário e secundário à doença sistêmica para o correto
estadiamento, tratamento e seguimento desses doentes (DUMMER et al. 2006).
1.2.1 Linfoma Cutâneo de Células T (LCCT)
Os linfomas cutâneos de célula T compreendem dois terços dos linfomas
cutâneos. São linfomas não Hodgkin extra-nodais com comportamentos clínicos
classificados como indolente, intermediário e agressivo. Esses linfomas representam
um grupo heterogêneo de neoplasias originadas de linfócitos T cutâneos que
apresentam variações importantes na apresentação clínica, nas características
histológicas e imunofenotípicas e no prognóstico. Por muitos anos, a micose
fungóide e a Síndrome de Sezary eram os únicos tipos de linfomas cutâneos de
célula T conhecidos. Na última década, através da combinação de características
clínicas e histológicas com critérios imunofenotípicos, novos tipos de LCCT foram
definidos e novas classificações elaboradas (WILLEMZE e MEIJER 2006). A nova
classificação utilizada para os linfomas cutâneos foi publicada em 2005 e elaborada
a partir de um consenso entre as duas classificações já existentes; a classificação da
World Health Organization (WHO) e a classificação da European Organization for
Research and Treatment of Cancer (EORTC). Essa nova classificação divide os
linfomas cutâneos em três grupos: os linfomas cutâneos de células T e natural
killer, os linfomas cutâneos de células B e as neoplasias hematológicas precursoras
(WILLEMZE et al. 2005) (Quadro 1).
14
Quadro 1 - Classificação dos linfomas cutâneos primários da WHO-EORTC.
Fonte: Adaptado de WILLEMZE et al. (2005)
1.2.2 Micose Fungóide
A Aspectos Gerais
A primeira descrição de um paciente com micose fungóide foi feita em 1806
pelo médico francês Jean Louis Alibert. O nome micose fungóide foi decorrente da
aparência tipo cogumelo das lesões tumorais da doença. Posteriormente em 1876,
Bazin, descreveu pela primeira vez a evolução natural da doença com os estágios de
patches, placas e tumor.
A micose fungóide é considerada forma indolente e constitui a variante
clínica mais comum dos linfomas cutâneos de células T. Sua incidência anual nos
Estados Unidos, no período de 1973 a 1992, foi de 0.36 casos por 100.000
Classsificação dos linfomas primários cutâneos da WHO-EORTC
Linfomas Cutâneos de Células T e NK
Micose fungóide
Micose fungóide – variantes e subtipos:
- Micose fungóide foliculotrópica
- Reticulose Pagetoide
- Cutis Laxa Granulomatosa
Síndrome de Sezary
Linfoma Leucemia de Células T do Adulto
Doenças Linfoproliferativas Primárias Cutâneas CD30+:
- Linfoma Primario Cutâneo Anaplásico de Grandes Células
- Papulose Linfomatoide
Linfoma Subcutâneo de CélulasT- Paniculite Símile
Linfoma Extranodal de células T/NK, tipo nasal
Linfoma Cutâneo Primário Periférico de células T, inespecífico
Linfoma Cutâneo Primário Agressivo Epidermotropico de células T CD8+ (provisório)
Linfoma Cutâneo de células T gama/delta (provisório)
Linfoma Cutâneo Primário de pequena e média célula T CD4+ pleomórfico (provisório)
Linfomas Cutâneos de Células B
Linfoma Cutâneo Primário de Células B da Zona Marginal
Linfoma Cutâneo Primario Centro Folicular
Linfoma Cutâneo Primário Difuso de Grandes Células B, tipo perna
Linfoma Cutâneo Primário Difuso de Grandes Células B, outros
Linfoma de Grandes Células B Intravascular
Neoplasias Hematológicas Precursoras
Neoplasia Hematodérmica CD4+/CD56+ (Linfoma Blástico de células NK)
15
habitantes (WEINSTOCK e GARDSTEIN 1999). Estudo prévio demonstrou
aumento na incidência da doença durante o período de 1973 a 1984; não houve,
porém, aumentos até 1992 (WEINSTOCK e HORM 1988). A taxa de mortalidade
avaliada durante o período de 1979-1991 foi de 0,064/100.000 habitantes/ano
(WEINSTOCK e GARDSTEIN 1999) e estudo realizado na Suécia encontrou
declínio nas taxas de mortalidade entre 1961 e 1990 (SWANBECK et al. 1994).
Entretanto, há várias possibilidades de erros nas taxas de mortalidade da micose
fungóide, entre elas a não hospitalização para o diagnóstico e tratamento destes
doentes prejudicando o registro dos mesmos, a morte desses por outras causas não
associadas ao linfoma antes mesmo da progressão da doença e diagnósticos feitos
por médicos clínicos fora da área de registro (WEINSTOCK e GARDSTEIN 1999).
A doença acomete, principalmente, indivíduos adultos do sexo masculino,
porém casos esporádicos são descritos em adultos jovens e crianças (AGNARSSON
e KADIN 1995; CROWLEY et al. 1998; ALSALEH et al. 2004; FINK-PUCHES et
al. 2004). Segundo estatísticas americanas, a incidência é substancialmente maior
nos negros em relação aos brancos (WEINSTOCK e GARDSTEIN 1999;
CRISCIONE e WEINSTOCK 2007).
A classificação atual WHO-EORTC descreve a micose fungóide como
micose fungóide clássica ou de Alibert-Bazin e suas três variantes: forma
foliculotrópica, reticulose pagetóide e cútis laxa granulomatosa. Essas variantes
possuem características clínico-patológicas distintas e, dessa forma, são
classificadas separadamente da micose fungóide clássica. No entanto, esse linfoma
apresenta outras variantes clínico-patológicas como as formas siringotrópica,
granulomatosa, vesicobolhosa, pustulosa, poiquilodérmica localizada,
16
liquenóide/poiquilodérmica generalizada, hiperpigmentada, hipopigmentada,
unilesional, palmo plantar, hiperqueratótica, papilomatosa, ictiosiforme e
eritrodérmica, que apresentam comportamento clínico similar à forma clássica da
micose fungóide e, portanto, não são classificadas separadamente (LATKOWSKI e
HEALD 2003; WILLEMZE et al. 2005).
B Etiopatogenia
O clone celular maligno, nas lesões cutâneas tipo patches ou placas da
micose fungóide, apresenta em sua superfície o antígeno linfocitário cutâneo CLA e
CCR4+ (PICKER et al. 1990; FUHLBRIGGE et al. 1997; FERENCZI et al. 2002).
Dessa forma, as células malignas saem do linfonodo regional e migram em direção
à pele guiadas pelo CLA (antígeno linfocitário cutâneo) e CCR4. As células
endoteliais expressam E-selectina que se liga ao CLA do linfócito maligno e CCR4
a qual se liga a CCL17 do endotélio vascular, fortalecendo essa ligação e permitindo
o extravasamento dos linfócitos malignos para a derme (Figura 3).
17
Legenda
: ao saírem do linfonodo regional, as células tumorais da micose fungóide expressam CLA
e migram em direção à pele atingindo os capilares dérmicos. As células endoteliais expressam E-
selectina que se liga ao CLA. Receptores de quimiocinas das células tumorais (CCR4) reconhecem o
ligante (CCL17) das células endoteliais e se ligam ao mesmo. Essas ligações permitem que a célula
maligna atravesse o endotélio vascular e atinja a derme. As células tumorais apresentam afinidade
com as células epidérmicas e, por isso, agrupam-se ao redor das células de Langerhans, formando o
microabscesso de Pautrier.
Fonte: Adaptado de GIRARDI et al. (2004).
Figura 3 - Micose fungóide, neoplasia de células T cutâneas.
Microabscesso de
Pautrier
Capila
r
Epidermotropismo
Extravasamento
Derme
Epiderme
Célula de
Langerhans
Célula
endotelial
Célula T
C
é
lula
T
18
A micose fungóide representa modelo tumoral único, pois tanto as células
tumorais como as células reativas são linfócitos. Sua etiologia ainda não está
estabelecida e uma das teorias estudadas baseia-se na estimulação crônica dos
linfócitos T por um antígeno persistente e a transformação de linfócitos benignos
em neoplásicos (DUMMER et al. 1995; BURG et al. 2001). Entretanto, esse
antígeno tumoral específico ainda é desconhecido. Alguns estudos tentam
demonstrar que as células tumorais apoptóticas processadas e apresentadas pelas
células dendríticas poderiam comportar-se como antígenos tumorais (LUFTL et al.
2002). Vários estudos tentaram associar agentes infecciosos virais com o herpes
vírus tipo 6 e o Human T Cell Lymphotrophic Virus Type I (HTLV I)
(DIAMANDIDOU et al. 1996), porém estudos recentes não confirmam essa
hipótese e consideram-na especulativa (QUERFELD et al. 2003b). Cerca de 30%
dos pacientes podem apresentar uma exacerbação do quadro clínico associada à
infecção pelo Staphylococcus aureus e melhora clínica com uso de antibióticos
específicos. No entanto, é questionável se a colonização bacteriana é primária ou
secundária à doença (DIAMANDIDOU et al. 1996; QUERFELD et al. 2003b).
Estudos demonstram muitas controvérsias da biologia do sistema imune nos
linfomas cutâneos de células T em relação aos sistemas TH1 e TH2 (SAED et al.
1994; VOWELS et al. 1994). As células T malignas observadas na maioria dos
casos de micose fungóide e Síndrome de Sezary apresentam o fenótipo TH2. Dessa
forma, apesar da atividade vigorosa do sistema imunológico do hospedeiro nas fases
iniciais da doença com a secreção de interferon-γ pelas células T CD8+; a produção
crônica de citocinas TH2, como IL4, IL5 e IL10, pela população de células
malignas pode ser um dos mecanismos de escape tumoral. Além do aumento da
19
produção de citocinas TH2, estudos demonstram que a progressão da doença pode
desencadear defeito na produção de citocinas TH1. Observou-se declínio na
produção de IL12 e INF-α e de células dendríticas. A diminuição dessas células
associada ao defeito na produção de IL12 prejudica a produção de outras citocinas
como IL15 e IL18, importantes agentes estimuladores do interferon-γ e da resposta
TH1 (Figura 4).
Legenda: na micose fungóide e na Síndrome de Sezary, as células T malignas produzem citocinas,
IL4, IL5 e IL10 que resultam no predomínio do padrão de resposta TH2 promovendo múltiplas
anormalidades na imunidade celular.
Fonte: Adaptado de KIM et al. (2005).
Figura 4 - conseqüências da produção de citocinas pela célula T maligna.
C Micose fungóide forma clássica – características clínicas
A forma clássica da micose fungóide é caracterizada por lesões tipo patches,
ou seja, máculas eritematosas, hipercrômicas ou hipocrômicas descamativas ou não
e não infiltradas, e lesões em placas eritematosas, descamativas e infiltradas,
localizadas, principalmente, nas áreas não expostas à luz solar, como dobras
Citocinas TH2
Aumento de IgE
Diminuição do efeito TH1
Eosinofilia
Diminuição do efeito TH1
Diminuição da imunidade celular
Diminuição das células dendríticas
Célula T
maligna
20
flexurais, axilas e nádegas. Além de lesões tipo patches e placas, nas formas mais
agressivas ou evolutivas da doença, pode-se constatar a presença de lesões tumorais
principalmente na face, dobras flexurais e região inframamária. Os tumores
constituem a fase de crescimento vertical da doença e representam pior prognóstico,
principalmente, quando se manifestam nos primeiros dois anos após o diagnóstico
(DIAMANDIDOU et al. 1998). Classicamente os pacientes apresentam progressão
gradual do estágio clínico inicial de patches para placas e para tumores, porém um
número significativo de doentes não evolui da forma de patches e placas para a
forma tumoral e permanece nas formas iniciais da doença durante anos
(ACKERMAN 1996). Apenas pequena porcentagem de doentes evolui com lesões
nodulares e tumorais e porcentagem ainda menor morre em decorrência dos efeitos
sistêmicos do linfoma (ACKERMAN 1996).
De fato, a micose fungóide pode iniciar-se em qualquer estágio e variantes
clínicas e histopatológicas não habituais coexistem com lesões típicas de placas e
patches (FUNG et al. 2002). Estudos retrospectivos e multicêntricos realizados
demonstram que o risco de progressão da doença correlaciona-se com a severidade
das lesões cutâneas iniciais, com a idade do paciente, sendo pior nos idosos, e com a
presença de doença extra-cutânea (KIM et al. 2003). Após dez anos do diagnóstico,
esse risco no estágio Ia é ao redor de 5 a 10% e nos pacientes com estágio Ib é de 17
a 39%. Nos pacientes com estágios mais avançados da doença, o risco é maior e o
intervalo de tempo até a progressão é menor (VAN DOORN et al. 2000).
O mecanismo que desencadeia a mudança de comportamento indolente da
doença para a forma mais agressiva ainda é obscuro. Estudos tentam explicar esse
fato através do sistema imunológico, ou seja, nas formas clínicas iniciais, o sistema
21
imune anti-tumoral impediria a progressão da doença (LUFTL et al. 2002). O
aumento do clone de células malignas estimula a expressão de citocinas TH2,
promove o desequilíbrio do sistema imune e permite o crescimento tumoral (KIM et
al. 2005). Com a progressão da doença, os pacientes podem evoluir para a variante
leucêmica da doença, a Síndrome de Sezary, ou podem transformar-se no linfoma
de grandes células.
D Micose fungóide clássica – características histopatológicas
As características histopatológicas da micose fungóide variam de acordo
com o estágio evolutivo das lesões. Nas lesões cutâneas iniciais do tipo patches, o
diagnóstico histológico é difícil de ser estabelecido. A lesão patognomônica é o
microabscesso de Pautrier, mas que é vista em apenas 10% das lesões iniciais. Há
presença de infiltrado linfocitário moderado nas porções papilar e subpapilar da
derme. O infiltrado é composto principalmente de linfócitos, mas também contém
números variáveis de histiócitos. Mesmo na fase inicial da doença, observa-se
freqüentemente epidermotropismo, aspecto altamente sugestivo de micose fungóide
e que representa a presença na epiderme de células mononucleares geralmente
isoladas e rodeadas por um
espaço claro ou halo. No estágio de placas, o infiltrado
linfocitário é denso, disposto em faixa na derme papilar; o fenômeno do
epidermotropismo torna-se mais evidente com a presença de linfócitos agrupados na
epiderme ao redor das células de Langerhans, chamados microabscessos de
Pautrier. A presença de células de mycosis que representam linfócitos T com
núcleos hipercromáticos, irregularmente configurados, é diagnóstica nessa fase,
desde que essas células representem uma porcentagem razoavelmente alta das
22
células do infiltrado dérmico (LEVER e LEVER 1991). Na fase tumoral, o
epidermotropismo torna-se menos intenso, podendo até desaparecer em certos casos
e há a infiltração maciça de células mononucleares atípicas na derme reticular com
diminuição das células T CD8+ citotóxicas. Na fase eritrodérmica da doença, as
células neoplásicas começam a atingir a circulação sanguínea e na síndrome de
Sezary há grande quantidade de células neoplásicas circulantes, caracterizando,
portanto, a forma leucêmica da doença (SANTUCCI et al. 1994) (Figura 5).
23
Legenda: A) pele normal, CL na epiderme e linfócitos T cutâneos na derme e no sangue circulante.
B) estagio de patches e placas, os linfócitos T malignos na epiderme e ao redor das CL formando os
microabscessos de Pautrier. C) fase tumoral, células malignas na derme e subcutâneo e diminuição
de linfócitos T CD8+.D) fase eritrodérmica e SS, células malignas no sangue circulante. Evolução da
doença, desvio da resposta imune TH1 para TH2 pelo aumento de citocinas IL4, IL5 e IL10,
afetando os linfócitos T CD8+, células NK e número de células dendríticas prejudicando a resposta
imune do hospedeiro.
Fonte: Adaptado de KIM et al. (2005).
Figura 5 - Esquema de progressão da micose fungóide.
Célula
T
Célula
T CD8+
citotóxic
Célula T
CD4+
mali
g
na
Célula
N
K
Célula de
Lan
g
erhan
Célula
dendríti
ca
eosinófilo
monócit
p
laca
menos
derme
Pele normal
eritrodermia
epiderme
Sd. de Sezary
menos
menos
Diminuição da resposta TH1
Diminuição
Ulceração
circulação
24
Na micose fungóide, as células apresentam o padrão de células T de
memória (CD2+; CD3+; βF1+; CD4+; CD8 -; CD5+; CD45RO+) com freqüente
perda do antígeno CD7 e CD26 (ZHANG et al. 2005). Raros casos são descritos
com padrão de células T supressoras CD8+/CD4 – (AGNARSSON et al. 1990;
BERTI et al. 1999). A demonstração de fenótipos aberrantes com a perda de
antígenos pan T, como CD2, CD3 e CD5 pode ser encontrada com freqüência,
sendo importante para o diagnóstico (RALFKIAER 1994). As células neoplásicas
são CD4+, CLA+ e CCR4+ e produzem citocinas de padrão de resposta TH2, ou
seja, interleucinas 4, 5 e 10. Com a evolução da doença, há um desvio da resposta
TH1 para resposta TH2. Esses pacientes apresentam eosinofilia e sintomas atopia
like. A diminuição da resposta TH1 promove maior chance de neoplasias e
infecções. A diminuição de células natural killer e CD8+ está associada ao
comprometimento da resposta imune contra agentes microbianos e tumores
(GOLDGEIER et al. 1981; AXELROD et al. 1992; PIELOP et al. 2003; EVANS et
al. 2004).
E Estadiamento
O estadiamento clínico dos linfomas cutâneos de células T é baseado no
sistema de estadiamento sugerido pelo grupo cooperativo de micose fungóide dos
Estados Unidos. Adotou-se o sistema TNM (Tumor, Lymph nodes and Metastasis)
de BUNN e LAMBERG (1979) modificado, considerando-se o T como lesões
cutâneas, o N como linfonodos e o M como lesões viscerais e acrescentando-se o B
como sangue periférico. O estadiamento TNMB pode ser visto nos Quadros 2 e 3.
25
Quadro 2 - Estadiamento TNM para os LCCT.
Quadro 3 - Estadiamento TNM dos L.C.C.T.
Estádio clinico
T
N
M
IA TI N0 0
IB T2 N0 0
IIA T1-2 N1 0
IIB T3 N0-1 0
III T4 N0-1 0
IVA T1-4 N2-3 0
IVB T1-4 N0-3 1
Estadiamento dos Linfomas Cutâneos de Células T: Classificação TNM
T: pele
T0 lesões clínicas ou histologicamente sugestivas de LCCT.
T1 Placas limitadas, pápulas ou patches < 10% da superfície cutânea.
T2 Placas generalizadas, pápulas ou patches ≥ 10% da superfície cutânea.
T3 Tumor ≥ 1.
T4 Eritrodermia generalizada
N: linfonodos
N0 ausência de linfonodos palpáveis, histologia negativa p/ LCCT.
N1 adenopatia palpável, histologia do linfonodo negativa p/ LCCT.
N2 ausência de linfonodos palpáveis, histologia positiva p/ LCCT.
N3 adenopatia palpável, histologia do linfonodo positiva p/ LCCT.
B: Sangue periférico
B0 células atípicas não presentes < 5%.
B1 células atípicas circulantes > 5%.
M: órgãos viscerais
M0 ausência de envolvimento visceral.
M1 envolvimento visceral com confirmação histológica.
26
O prognóstico dos pacientes com micose fungóide está diretamente
relacionado ao estádio clínico em que o paciente se encontra, sendo que estudos
realizados demonstraram curvas de sobrevida progressivamente piores em função da
extensão do acometimento cutâneo, maior número de territórios linfáticos
clinicamente acometidos, presença de tumores e eritrodermia. Estudo realizado com
489 pacientes com diagnóstico de micose fungóide demonstrou que pacientes T1,
ou seja, com patches e placas em até 10% da superfície corpórea apresentaram
sobrevida semelhante à população geral. No entanto, pacientes T2, T3 e T4
apresentaram sobrevida significantemente menor que a população geral. Os
pacientes T2 com estágio de placa apresentaram sobrevida pior do que os pacientes
T2 com apenas patches. Os autores justificam essa diferença com a profundidade do
infiltrado cutâneo e as atipias celulares mais intensas nas lesões tipo placas, quando
comparadas com as lesões tipo patches (ZACKHEIM et al. 1999). Devido a essa
diferença, os autores destacam a falha no estadiamento do T e sugerem uma revisão
desta classificação.
1.3 APOPTOSE
1.3.1 Definição
A apoptose é a forma fisiológica de morte celular inicialmente descrita por
KERR et al. em 1972. A célula em apoptose sofre uma condensação seguida de
retração, o citoesqueleto é destruído, o envelope nuclear é degradado e o DNA
nuclear fragmentado (NICKOLOFF e GRIFFITHS 1990). A indução da apoptose
envolve a ativação de enzimas citosólicas chamadas caspases. As caspases
27
constituem uma família de proteases que apresenta uma cisteína no sítio ativo e
cliva suas proteínas-alvo em ácido aspártico especifico. As caspases são sintetizadas
na célula com um precursor inativo, ou prócaspases, que são normalmente ativadas
pela clivagem do ácido aspártico por outras caspases. Ao serem ativadas, as
caspases clivam e ativam outras prócaspases, resultando em uma cascata de
amplificação proteolítica. A ativação da via de morte intracelular normalmente é
desencadeada por um mecanismo de “tudo-ou-nada”. A cascata de proteases não é
somente destrutiva e auto-estimulada, mas também irreversível (ALBERTS et al.
2004).
Há três vias distintas iniciadoras das caspases: via de receptor de morte
envolvendo a caspase 8, a via de stress do retículo endoplasmático atribuída à
caspase 12 e a via mitocondrial que ativa a caspase 9. Estudos recentes demonstram
evidências, tanto in vitro como in vivo, que a morte celular programada pode ser
desencadeada em circunstâncias diversas e que uma forma de apoptose pode ser
produzida sem o envolvimento de caspases – a via de execução autofágica de morte
celular. Entretanto, a via de apoptose mediada pelas caspases é ainda a maior ou a
mais freqüente via de morte celular programada (ASSUNÇÃO GUIMARÃES e
LINDEN 2005).
1.3.2 Vias de Apoptose
A Via associada a alterações da permeabilidade mitocondrial (via
intrínseca)
Os linfócitos ativados evoluem para a apoptose passiva quando são privados
dos sinais de sobrevivência mais frequentemente providos por IL2. Os linfócitos
28
privados desses estímulos promovem o rápido aumento da permeabilidade das
membranas mitocondriais e a liberação do citocromo c que ativará a caspase 9,
iniciando a via apoptótica. Essa forma de apoptose é, também, chamada de morte
celular programada ou morte por negligência, indicando que muitas células são
programadas para morrer. Outros fatores como irradiação causando degradação do
DNA, glicocorticóides e certos quimioterápicos podem induzir apoptose nas células
alvo pelo mesmo mecanismo mitocondrial e o próprio reconhecimento de um
antígeno pode causar translocação mitocondrial de fatores pró-apoptóticos da
família Bcl, resultando na morte celular. O controle da apoptose é um complexo
fundamental e necessário, pois a morte celular descontrolada é prejudicial para todo
o organismo. Os principais mediadores da via intrínseca da apoptose são conhecidos
como “família Bcl-2”, a qual é constituída por membros pró-apoptóticos (Bax, Bak,
Bad, Bid) e anti apoptóticos (Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1). A sobrevida da célula depende
do equilíbrio entre as moléculas promotoras e inibidoras da morte celular. Bcl-2 e
Bcl-x promovem a sobrevida da célula enquanto Bax e Bad promovem a morte
celular. Bcl-2 e Bcl-xL inibem a liberação de íons de cálcio, citocromo c da
mitocôndria se ligam a APAF-1, inibindo a ativação da caspase 9, impedindo,
portanto, uma das vias da apoptose, a morte celular programada ou por negligência.
B Via associada a sinais originados dos receptores da membrana
plasmática (via extrínseca)
A segunda forma ativa de indução de apoptose é a morte celular induzida por
ativação AICD. Essa forma de morte celular ocorre quando os linfócitos T CD4 são
ativamente estimulados pelo complexo TCR/CD3. A função primária de AICD é
29
evitar a auto-imunidade através de um mecanismo falho do próprio e a estimulação
crônica de células T ativadas. Essa via de apoptose dos linfócitos é acionada pela
ligação de ligantes aos receptores de membrana que induzem à morte, os quais
pertencem à família do receptor do fator de necrose tumoral TNF, incluindo um
grande número de proteínas como a Fas e o CD40. As regiões citoplasmáticas dos
membros dessa família contêm um domínio de morte. Os dois receptores mais bem
descritos que contêm os domínios de morte são o Fas e TNF tipo 1. Fas é uma
proteína de 36kDa que, na ligação cruzada com anticorpos específicos, aciona a
apoptose das células que a expressam. As células linfóides e muitas outras células
expressam Fas. O receptor de Fas é expresso em baixos níveis nas células T não
estimuladas, mas, com a ligação ao complexo TCR/CD3, esses níveis aumentam
(MEECH et al. 2001; ABBAS e LICHTMAN 2005d).
Fas ligante (FasL) é uma proteína transmembrana que também pertence à
família do fator de necrose tumoral e é expressa principalmente nos linfócitos T
ativados pelo antígeno e pela interleucina 2. Fas e FasL desempenham papel
essencial na homeostasia das células T. Quando os linfócitos T maduros são
repetidamente estimulados por antígenos, eles co-expressam Fas e FasL. Fas liga-se
a FasL na mesma célula ou nas células adjacentes, agregando três moléculas Fas. Os
domínios de morte intracelulares aglomerados ligam-se à proteína adaptadora que
contém o domínio de morte citosólico chamado FAAD. FAAD liga-se à forma
inativa de uma caspase, a caspase 8. A caspase 8 sofre ativação autocatalítica e é
capaz de ativar as caspases efetoras e determinar a apoptose. Esta via de apoptose é
chamada de via de apoptose induzida por ativação (NAGATA e GOLSTEIN 1995;
BOSSI e GRIFFITHS 1999; MEECH et al. 2001; ABBAS e LICHTMAN 2005c).
30
Defeitos em Fas e FasL são associados com desenvolvimento de síndromes
linfoproliferativas-like autoimunes. A expressão de FasL requer a ligação ao
TCR/CD3 e estímulo de IL2. Altos níveis de IL2 são necessários para inibir a
transcrição de c-FLIP, um inibidor da caspase 8. Na ausência de IL2, a via de
sinalização de morte via FasL é bloqueada e AICD não ocorre. A IL2 possui papel
fundamental na resposta imune, servindo tanto como fator de crescimento para a
expansão das células T, como também no restabelecimento da homeostasia pós a
resposta imune (MEECH et al. 2001) (Figura 6).
31
Legenda: A fase terminal da resposta imune requer a ativação tanto da caspase 8 como da caspase 9.
Caso persista o estímulo antigênico através do receptor da célula T (TCR/CD3), níveis elevados de
IL-2 induzem os linfócitos para apoptose mediada por FAS. A sinalização repetida do TCR/CD3
estimula FasR e FasL na mesma célula. A ligação de FasL a FasR recruta FADD que, em resposta,
recruta e ativa a caspase 8. Esta forma de apoptose é chamada de morte celular por ativação (AICD) .
Com a destruição do antígeno e morte dos linfócitos por AICD, os níveis de IL-2 diminuem
bruscamente. A perda do fator de sobrevida IL-2 promove o início da segunda forma de apoptose que
não requer o estimulo da célula T, a forma passiva da apoptose, a qual promove a liberação do
citocromo c da mitocôndria que ativa a caspase 9. A maior parte dos linfócitos ativados é eliminada
nesta forma de morte celular.
Fonte: Adaptado de MEECH et al. (2001).
Figura 6 – Vias de apoptose dos linfócitos T ativados.
Apoptose ativa
AICD
Apoptose passiva
Células T
ativadas
antí
g
eno
antí
g
eno
Citocromo c
32
1.3.3 Apoptose nos linfomas cutâneos de células T
Estudos recentes demonstram que o índice de proliferação de linfócitos nos
linfomas cutâneos de células T é baixo nas fases iniciais da doença. Desta forma o
acúmulo celular seria causado principalmente por defeito da apoptose destas células
(DUMMER et al. 1995; DEREURE et al. 2001; ZHANG et al. 2002).
A indução e o controle da apoptose nos linfócitos podem ser mais complexos
do que em outras células, pois os linfócitos são as únicas células em animais adultos
que podem expandir-se de forma clonal e migrar livremente pelo corpo. Além disso,
os linfócitos podem causar um grande dano caso se tornem ativados contra
antígenos próprios ou permaneçam na circulação após a resposta imune a um
determinado antígeno. Dessa forma, os linfócitos possuem estratégias adicionais
para evitar a auto-imunidade e doenças linfoproliferativas. Estas estratégias se
utilizam da via de morte de Fas. Durante a resposta imune, linfócitos T específicos
ao antígeno são estimulados e expandem em resposta ao antígeno através do
complexo receptor de célula T/CD3 em associação com moléculas co-
estimulatórias. Essa fase de estimulação é potencializada pela produção de IL-2 e
seguida de uma fase de término que resulta na eliminação dos clones expandidos e
restabelecimento do número basal de linfócitos. As formas ativas e passivas de
apoptose ocorrem nessa fase de término (MEECH et al. 2001). Nos linfócitos, a
ativação de uma caspase e a subseqüente apoptose poderão ser induzidas por vias
distintas: via mitocondrial e via associada aos receptores da membrana plasmática.
Moléculas e genes relacionados à regulação da apoptose como Fas, p53, c-myc e
Bcl-2 são demonstrados em vários tecidos. Alterações nesses reguladores são
descritas em algumas neoplasias hematológicas.
33
A FAS e FASL
Mutações no gene Fas são encontradas nos linfomas não Hodgkin, leucemia-
linfoma de células T do adulto, leucemia linfoblástica da infância e mieloma
múltiplo, enquanto mutações no gene Bax são encontradas nos linfomas não
Hodgkin (KANAVAROS et al. 1994). Alguns estudos demonstram que os linfócitos
neoplásicos dos linfomas cutâneos de células T apresentam defeito na ativação da
apoptose mediada pela Fas e FasL. Demonstrou-se nesses trabalhos que as células
tumorais apresentam o fenótipo TH2 e produzem pequenas quantidades de IL2,
citocina fundamental para a ativação da apoptose através da via da caspase 8. No
entanto, o conhecimento dos mecanismos de morte celular nos linfomas cutâneos de
células T ainda é pouco conhecido (MEECH et al. 2001). A diminuição da
expressão de Fas foi encontrada no sangue periférico de pacientes com micose
fungóide e síndrome de Sezary (DEREURE et al. 2000) e ausência da expressão de
Fas foi associada a formas agressivas de LCCT (ZOI-TOLI et al. 2000). NI et al. em
2001, demonstraram que as células neoplásicas de lesões cutâneas dos pacientes
com micose fungóide expressam FasL. Nesse estudo observou-se inversão da
distribuição de células neoplásicas FasL+ e linfócitos T CD8+ dentro do infiltrado
das lesões de micose fungóide. Ou seja, nos locais de alta concentração de células
neoplásicas FasL+ havia pequena quantidade de linfócitos T CD8+. Conclui-se que
um dos mecanismos de escape tumoral das células neoplásicas na micose fungóide é
feito através da indução e eliminação de linfócitos T citotóxicos a partir da indução
da apoptose dessas células através da via de FasL-Fas das células tumorais.
34
B Bcl-2
Em doenças linfo-proliferativas como a micose fungóide e linfoma nodal
folicular, a superexpressão da proteína Bcl-2 é descrita como supressora da
apoptose, podendo ser um mecanismo importante na patogênese destas doenças
(DIAMANDIDOU et al. 1996). Bcl-2 é uma proteína de 25kD que prolonga a vida
celular inibindo a apoptose. A expressão desta proteína é estudada em uma
variedade de tecidos normais e linfomas, mas há pouca informação sobre a
expressão de Bcl-2 em células cutâneas T benignas e malignas (KIKUCHI et al.
1997). Na pele e no epitélio gastrointestinal, as células da camada basal expressam
Bcl-2. A expressão de Bcl-2 é encontrada em linfomas malignos de células B,
linfomas leucemias de células B, linfoma de Hodgkin e linfomas de células T.
KANAVAROS et al. em 1994, realizou estudo com 14 pacientes com forma inicial
de micose fungóide, 21 pacientes com micose fungóide na sua forma avançada e 3
pacientes com Síndrome de Sezary e encontrou expressão de Bcl-2 em 70% dos
casos. Nos linfomas cutâneos de células T, a expressão de Bcl-2 é encontrada nas
células neoplásicas, causando-lhes aumento da sobrevida e promovendo resistência
à radioterapia e fotoquimioterapia extra-corpórea (ZHANG et al. 2002). A
expressão de Bcl-2 nos linfomas de células T parece refletir o estágio de
desenvolvimento correspondente (DUMMER et al. 1995).
C Bax
Bad e Bax são proteínas pró-apoptóticas que bloqueiam o efeito protetor de
Bcl-2 e Bcl-xL através da formação de heterodímeros e promovem a apoptose
(YANG et al. 1995). A superexpressão de Bcl-2 e Bcl-x, bem como a diminuição de
35
membros pró-apoptóticos da família Bcl como Bax, Bak, Bik e Bid estão associadas
à progressão tumoral (DUMMER et al. 1995). Estudo, realizado em 2003 por
ZHANG et al. utilizando linhagem de células de LCCT e biópsias de pele de
pacientes com micose fungóide e Síndrome de Sezary, avaliou a expressão de
reguladores de apoptose Bcl-x, Mcl-1, Bax e Bad. Nesse estudo, observou-se forte
expressão de Bcl-x, Mcl-1, Bad e Bax na linhagem de células do LCCT e nas lesões
tipo patches e placas das biópsias de pele de pacientes com micose fungóide. Esses
mesmos autores observaram que, com a progressão da doença e com o aumento de
linfócitos neoplásicos houve aumento proporcional da expressão de Bax, sugerindo
que essa proteína atuaria como um marcador de linfócitos T malignos nos LCCT.
No entanto, apesar de fortemente expressos, Bax e Bad apresentavam-se inativos. O
trabalho conclui que o aumento da expressão dos inibidores de apoptose (Bcl-x e
Mcl-1) e a inativação dos promotores (Bad e Bax) permitem o aumento das células
neoplásicas através do aumento da sobrevida.
D Caspase 3
As caspases são mediadores fundamentais da apoptose. Foram reconhecidas
em humanos, até o momento, 14 caspases. A caspase 3 apresenta-se como um
componente-chave do mecanismo de apoptose. Essa protease cliva inúmeras
proteínas celulares, incluindo PARP (poly ADP-Ribose polymerase). A clivagem de
PARP é um alvo importante da apoptose de vários agentes anti-tumorais. Estudo
realizado por ZHANG et al. em 2005, utilizando inibidor da histona deacetilase
(SAHA suberoylanilide hydroxamic acid) no tratamento de LCCT, demonstrou
ativação da apoptose nas células tumorais através do aumento da concentração de
36
Bax, da ativação da caspase 3 e da clivagem de PARP. Em 2001, GAD et al.
observaram indução da apoptose através do aumento da atividade da caspase 3, após
o tratamento de cultura de células de LCCT com terapia fotodinâmica.
1.4 O ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO NOS LINFOMAS CUTÂNEOS
DE CÉLULAS T
O comportamento clínico das doenças linfoproliferativas na pele parece ser
refletido pelo índice de proliferação e apoptose celular. O índice de proliferação
celular pode ser avaliado pela expressão do Ki67. O antígeno Ki67 é um antígeno
nuclear humano presente no núcleo de células em ciclo celular (DEREURE et al.
2002). A função do ciclo celular é duplicar exatamente todo o conteúdo do DNA
nos cromossomos e, com precisão, segregar as cópias dentro das duas células-filha
geneticamente idênticas. A duplicação do DNA ocorre durante a fase S (S de
síntese), a qual necessita de 10-12 horas e ocupa em torno da metade do ciclo
celular de uma típica célula de mamífero. Após a fase S, a segregação do
cromossomo e a divisão celular ocorrem na fase M (M de mitose), que dura em
torno de uma hora e envolve uma série de eventos que inicia a divisão celular, ou
mitose. Com a continuação da mitose, as células fazem uma breve pausa em um
estado denominado metáfase, no qual os cromossomos estão alinhados na região
equatorial do fuso mitótico, posicionados para a segregação. A súbita separação das
cromátides-irmãs marca o inicio da anáfase, durante a qual os cromossomos se
movem para os pólos opostos do fuso, onde se descondensam e reorganizam
núcleos intactos. A célula é então dividida em duas pela divisão citoplasmática, ou
37
citocinese, e a divisão celular está completa. A maioria das células necessita de
muito mais tempo para crescer e duplicar sua massa de proteínas e organelas do que
o seu tempo necessário para replicar o seu DNA e dividir-se. Para tal, as fases de
intervalos extras são introduzidas em muitos ciclos celulares - uma fase G1, entre a
fase M e a fase S, e uma fase G2, entre a fase S e a mitose. Dessa forma, o ciclo
celular eucariótico é dividido em quatro fases seqüenciais: G1, S, G2 e M. As fases
G1, S e G2 consideradas em conjunto são chamadas interfase (ALBERTS et al.
2004).
Ki-67 foi descrito por GERDES et al. (1984) como um anticorpo
monoclonal ativo contra antígenos nucleares de células em proliferação do centro
germinativo, sendo inicialmente descrito em casos de células de linfoma de
Hodgkin e de Reed Sternberg. Trata-se de um complexo protéico biomolecular, não
isotônico com 345 e 395kDa, com quase 30.000 pares de bases dentro do genoma
humano (SCHLUTER et al. 1993; BROWN e GATTER 2002) presente em todas as
fases de proliferação, exceto nas células em repouso (fase G0) (GERDES et al.
1984).
A detecção imunoistoquímica por Ki-67 é um método bem caracterizado no
reconhecimento do antígeno nuclear expresso nas fases G1, S e G2M do ciclo
celular (TURBITT e MACKIE 1986). Estudo demonstrou uma forte correlação
entre o grau histológico dos linfomas não Hodgkin e o índice proliferativo avaliado
através do anticorpo Ki-67 e concluiu que esse índice pode ser útil na determinação
do diagnóstico e prognóstico de pacientes com doenças linfoproliferativas (HALL et
al. 1988).
38
Em relação aos linfomas cutâneos de células T, estudo comparando o índice
proliferativo nas fases iniciais e tumorais da micose fungóide demonstrou pequeno
número de células positivas para Ki-67 em todas as fases (TURBITT e MACKIE
1986). DUMMER et al. no entanto, em 1995, estudaram 72 pacientes com micose
fungóide, utilizando Bcl- 2 para avaliar o índice de apoptose e Ki-67 para avaliar o
índice de proliferação celular. Os resultados do estudo demonstraram expressão
significante de Bcl-2 em todos os estágios da micose fungóide e expressão
abundante de Ki-67 nas formas avançadas da doença. A expressão do antígeno Ki-
67 igual ou superior a 10% ocorreu em 5% pacientes com lesões tipo patches, em
38% dos pacientes com placas moderadas, em 64% dos pacientes com placas
infiltradas e em 100% dos pacientes com lesões tumorais. O autor concluiu que, nas
lesões iniciais da micose fungóide em que o índice proliferativo é baixo, o acúmulo
de células tumorais se dá através do aumento da sobrevida destas células com a
inibição da apoptose por Bcl-2.
39
2 OBJETIVOS
Pacientes portadores de micose fungóide podem apresentar forma de
doença extremamente indolente, com permanência de lesões não infiltradas e
localizadas por longos períodos de tempo, ou forma de doença agressiva,
rapidamente evolutiva, com prognóstico menos favorável. Esta observação suscita
questionamentos relacionados a possíveis diferenças no comportamento biológico
da doença. Considerando-se que os linfomas podem resultar de defeitos no
mecanismo de apoptose, bem como alteração nas taxas de proliferação celular,
elaborou-se esse estudo com o objetivo de avaliar, comparativamente, a expressão
de proteínas reguladoras da apoptose e da proliferação celular em dois grupos de
pacientes classificados de acordo com a apresentação clínica: estacionária ou
rapidamente evolutiva.
40
3 CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1 CASUÍSTICA
Avaliaram-se fragmentos de lesões cutâneas diagnosticadas como linfoma
cutâneo epidermotrópico de célula T, micose fungóide, de 32 pacientes
acompanhados nos Ambulatórios de Oncologia Cutânea da Divisão de
Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo e do Hospital do Câncer A.C. Camargo.
Os doentes foram divididos em dois grupos, conforme a apresentação
cutânea, e denominados portadores de forma estacionária e de forma rapidamente
evolutiva. Nenhum dos casos apresentava evidência de acometimento linfonodal
e/ou visceral na ocasião da inclusão. Todos se encontravam fora de tratamento para
a doença por no mínimo trinta dias e apresentavam sorologia negativa para
HTLV1/2.
Os critérios utilizados para inclusão dos casos em um dos grupos foram:
• Forma estacionária (Figura 7).
a. Pacientes com lesões cutâneas não infiltradas, descamativas ou não,
hipocrômicas, hipercrômicas ou eritematosas denominadas patches.
b. Pacientes cuja forma de apresentação cutânea descrita acima permaneceu
inalterada por cinco anos.
• Forma rapidamente evolutiva (Figura 8).
41
a. Pacientes com presença de placas infiltradas e/ou tumores desde o inicio do
quadro clínico.
b. Pacientes com desenvolvimento de placas e/ou tumores até cinco anos após
o diagnóstico de micose fungóide.
Todos os pacientes haviam sido submetidos a exames clínicos,
hematológicos, bioquímicos e de imagens, com especial atenção para descrição do
tipo de lesão cutânea (patches, placas ou tumores), mensuração da superfície
corpórea acometida (através da “regra dos nove” utilizada em grandes queimados,
(WALLACE 1951) e detecção da presença ou não de linfadenomegalias e/ou
visceromegalias (Tabela 3).
42
Legenda: A) lesões tipo patches acometendo mais de 10% da superfície corpórea; B) lesão tipo placa
em abdômen.
Figura 7 - Demonstração de lesões tipo patches e placas em pacientes com micose
fungóide.
A
B
43
Legenda: Lesões tumorais na região axilar (A) e mentoniana (B).
Figura 8 - Demonstração de lesões tumorais em paciente com micose fungóide.
A
B
44
Tabela 3 - Distribuição da casuística de acordo com as variáveis demográficas e
clínicas.
Variável Categoria/medidas Freq (%) ou medidas
Sexo
Masculino
Feminino
11 (34,4)
21 (65,6)
Cor
Branca
Não branca
21 (65,6)
11 (34,4)
Evolução
Forma estacionária
Forma evolutiva
19 (59,4)
13 (40,6)
Idade ao diagnóstico
N
Minima-máxima
Mediana
Média (desvio padrão)
32
19 – 74
46
48,7 (16,0)
Início das lesões
(anos)
N
Min-Máx
Mediana
Média (desvio padrão)
32
3m-34
3
7,4 (9,1)
Lesão inicial
Patches
Placa
Placa &Tumor
19 (59,4)
7 (21,9)
6 (18,7)
Localização das lesões
Face
Tronco
Membros
Nádegas
11 (34,4)
29 (90,6)
28 (87,5)
20 (65,5)
Linfonodos palpáveis
Ausente
Presente
17 (53,13)
15 (46,88)
Superfície corpórea
<10%
>10%
9 (28,1)
23 (71,9)
Grupo de apresentação
Patches <10%
Patches>10%
Patches e placas<10%
Patches e placas>10%
Tumores
7 (21,9)
12 (37,5)
1 (3,2)
6 (18,7)
6 (18,7)
Estadiamento
IA
IB
IIA
IIB
7 (21,9)
8 (25)
11 (34,4)
6 (18,7)
45
3.2 MÉTODOS
Os fragmentos de pele dos 32 pacientes encontravam-se emblocados em
parafina e disponíveis nos Departamentos de Anatomia Patológica dos serviços em
questão. Todos os exames histopatológicos haviam sido revisados por dois
patologistas distintos que confirmaram o diagnóstico de micose fungóide.
Inicialmente, foram analisadas 82 lâminas provenientes de biópsias de lesões
cutâneas tipo patches, placas e tumores. Dentre essas, foram selecionadas 58
lâminas consideradas adequadas para a realização do estudo imunoistoquímico.
3.2.1 Estudo imunoistoquímico
O estudo imunoistoquímico foi realizado nos blocos de parafina das
respectivas lâminas selecionadas. Utilizamos o anticorpo Ki67 para avaliar o índice
de proliferação celular e os anticorpos Bcl2, Bax, Fas, Fas-L e caspase 3 para
avaliar o índice de apoptose (Tabela 4). A metodologia utilizada está descrita a
seguir
46
Tabela 4 - Tabela de anticorpos utilizados.
ANTICORPOS CLONES MARCAÇÃO TÍTULOS FABRICANTES
BCL2
124 citoplasmática 1:50
Dako, Glostrup, Dinamarca,
cod # M0887
BAX
B9 citoplasmática 1:100
Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, EUA, cód #
sc7480
CASPASE 3
Policlonal
de coelho
nuclear e
citoplasmática
1:600
Cell Signaling, Technology,
Danvers, MA, EUA, cód #
9661
Ki67
MIB-1 Nuclear 1:100
Dako, Glostrup, Dinamarca,
cód # M7240
FAS (C20)
Policlonal
de coelho
citoplasmática 1:300
Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA, EUA cód #
sc715
FAS-L (N20)
Policlonal
de coelho
citoplasmática 1:300
Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA, EUA cód #
sc834
3.2.2 Protocolo de Reações
O material incluído em parafina foi processado de acordo com técnica
imunoistoquímica padronizada.
Realizada a desparafinação dos cortes de 3μm de espessura, do material
incluído em parafina, em lâminas previamente tratadas com 3-
Aminopropyltriethoxy-silano (Sigma, A-3648, EUA), e deixadas por 24horas em
estufa a 60°C. Após a desparafinação, as lâminas foram deixadas nas seguintes
soluções nesta ordem:
1. Xilol a 60° por vinte minutos
2. Xilol à temperatura ambiente por vinte minutos
3. Etanol 100% por 30 segundos
47
4. Etanol 95% por 30 segundos
5. Etanol 70% por 30 segundos
Posteriormente, as lâminas foram lavadas em água corrente e em água
destilada. A solução tampão citrato 10mM pH 6.0 foi fervida em panela de pressão
(Eterna®, Nigro) destampada e as lâminas foram mergulhadas nela. A panela foi
lacrada com a válvula de segurança aberta. Após a saída do vapor saturado, a
válvula de segurança foi abaixada e aguardada a pressurização total. Contaram-se
quatro minutos após esse sinal. A panela foi deixada fechada sob água corrente por
dez minutos, posteriormente foi destampada com as lâminas e deixada por mais dez
minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas em água corrente e
destilada. Procedeu-se ao bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 3% (água
oxigenada 10 volumes) com quatro trocas de cinco minutos cada e as lâminas foram
lavadas em água corrente e destilada. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em
solução salina tamponada com fosfato (PBS-phosphate buffered saline) 10mM pH
7,4 por cinco minutos e incubadas com o anticorpo primário diluído em título pré-
estabelecido conforme Tabela 4 em tampão PBS contendo albumina bovina (BSA)
1% (Sigma, A9647, EUA) e azida sódica (NaN3) 0,1% por dezoito horas a 4°C em
câmara úmida.
As lâminas foram lavadas em tampão PBS com três trocas de três minutos
cada. Incubou-se o anticorpo secundário biotinilado-reagente C (Biotinylated goat
anti-mouse/rabbit Ig) do kit StreptABComplex/HRP Duet (mouse/rabbit) (Dako
A/S, K492, Dinamarca) no título pré-estabelecido de 1:200, diluído em PBS, por
trinta minutos a 37°C. Posteriormente, foram lavadas em tampão PBS, com três
trocas de três minutos cada e incubadas com o complexo – reagente A (Streptavidin)
48
e reagente B (Biotinylated perixydase) nos títulos pré-estabelecidos de 1:200 diluído
em PBS por trinta minutos a 37°C e depois lavadas em tampão PBS com três trocas
de três minutos cada. As laminas foram incubadas em solução substrato: 3,3’
Diaminobenzidine Tetrahydrochloride (DAB) 60mg% (Sigma, D-5637, EUA); 1ml
de Dimetilsulfóxido (DMSO); 1mL de H202 6% (água oxigenada 20 volumes);
100mL de PBS por cinco minutos a 37°C, ao abrigo da luz.
Observou-se ao microscópio, nas lâminas controles, o desenvolvimento de
precipitado castanho dourado como produto final da reação. As lâminas foram
lavadas em água corrente e água destilada por três minutos e contracoradas com
Hematoxilina de Harris por um minuto. As lâminas foram bem lavadas em água
corrente e destilada, imersas duas vezes em água amoniacal (solução de hidróxido
de amônio 0,5%) e lavadas em seguida em água corrente e destilada.
As lâminas foram desidratadas nas seguintes soluções:
1. Etanol 80% em 30 segundos
2. Etanol 95% em 30 segundos
3. Etanol 100% duas vezes trinta segundos cada
4. Xilol quatro vezes 30 segundos cada
O procedimento foi finalizado com a montagem das lâminas em Entellan neu
(Merck, 1.07961, Alemanha).
3.2.3 Padronização da leitura
A Marcação citoplasmática de Fas e FasL
Os resultados da imunoistoquímica para Fas e FasL foram avaliados por
dois métodos semi-quantitativos. A intensidade da marcação foi graduada como
49
negativa (0), fracamente positiva (1), moderadamente positiva (2) ou fortemente
positiva (3). Posteriormente, o número de células marcadas foi graduado em (0)
para ausência de células positivas, (1) para presença de 1 a 25% de células
marcadas, (2) para 26 a 50% de células marcadas, (3) de 50% a 75% de células
marcadas e (4) para mais de 75% de células marcadas.
A soma da intensidade e da proporção de células marcadas resultou em dois
grupos:
Fraco com score de 0 a 2
Forte com score de 3 a 7
Foram considerados positivos os pacientes com score final igual ou superior a 3.
Aqueles com score final menor que 3 foram considerados negativos.
B Marcação citoplasmática de Bcl2 e Bax
A marcação citoplasmática Bcl2 e Bax foi avaliada qualitativamente e
quantitativamente da mesma maneira que Fas e FasL (TORMANEN-
NAPANKANGAS et al. 2001).
C Marcação nuclear e citoplasmática da caspase 3
A marcação nuclear e citoplasmática da caspase 3 foi avaliada
qualitativamente e quantitativamente como os anticorpos FAS, FASL, Bcl-2 e Bax.
D Marcação nuclear de Ki-67
A quantificação imunoistoquímica de Ki-67 foi obtida com a razão
paramétrica absoluta entre os núcleos de células positivas e o número total de
50
células tumorais contadas por seção. O índice de proliferação avaliado pela
expressão nuclear da proteína Ki-67 foi definido como a porcentagem de células
tumorais com coloração nuclear positiva por, pelo menos, 500 células tumorais
contadas por campo de microscopia em aumento de 400x. Foram avaliados cinco
campos e consideradas positivas as células que apresentavam núcleos acastanhados.
A contagem foi realizada com o auxílio do programa de computador “Axion
Vision” 3.1 (Carl Zeiss Vision, Germany) com o processo de captura de imagens
digitais e marcação com cores diferentes as células positivas e as negativas sendo
automaticamente processado pelo programa de computador a somatória e a
porcentagem de células marcadas para cada categoria, conforme figuras a seguir:
(Figuras 9 e 10).
51
Figura 9 - Fotomicrografia de corte histológico de micose fungóide com marcação
positiva para Ki-67.
Figura 10 - Fotomicrografia de corte histológico de micose fungóide com marcação
das células positivas pelo Ki-67 em vermelho.
52
3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Estatísticas descritivas de distribuição de freqüências foram utilizadas para
descrever as variáveis categóricas e as medidas de tendência central e de
variabilidade para as numéricas.
O teste exato de Fisher foi utilizado para verificar as associações entre as
variáveis categóricas e a evolução e o teste não paramétrico U de Mann-Whitney
para as numéricas em relação à evolução. O nível de significância de 5% foi
adotado para todos os testes estatísticos. O pacote estatístico STATA versão 7.0 foi
utilizado para a realização das análises estatísticas.
53
4 RESULTADOS
4.1 VARIÁVEIS CLÍNICAS E AS FORMAS DE EVOLUÇÃO
A análise estatística das variáveis clínicas de acordo com a forma de
apresentação clínica demonstrou diferença estatisticamente significante apenas em
relação ao tempo de aparecimento das lesões cutâneas até a confirmação histológica
da doença. No grupo de pacientes com a forma estacionária, esse tempo de
aparecimento das lesões variou de 6 meses até 34 anos com uma mediana de 5 anos.
No entanto, no grupo de pacientes com a forma rapidamente evolutiva, o período
variou de 3 meses a 17 anos com mediana de 1 ano e p-valor estatisticamente
significativo de 0,0082 (Tabela 5).
Tabela 5 - Distribuição das variáveis clínicas e lesões de acordo com evolução.
Variável
Medidas /
Categoria
Total
Grupos
Estacionária Evolutivo
N (%) /medida N (%)
/medida
p-valor
Inicio lesões
(anos)
N
Min-Max
Mediana
Média (desvio
padrão)
32
3 meses-34
3
7,4 (9,1)
19
6m-34
5
10,4 (10,3)
13
3m-17
1
3,1 (4,7)
0,0082 *
p-valor obtido pelo teste exato de Fisher
* p-valor obtido pelo teste U de Mann-Whitney
dp = desvio padrão
NA = não avaliável
54
As demais variáveis clínicas analisadas não apresentaram diferenças
estatisticamente significantes quando relacionamos a forma de evolução da doença:
estacionária ou rapidamente evolutiva (vide Tabelas em Anexo 2).
4.2 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
4.2.1 Proteínas Reguladoras da Apoptose
Os resultados do estudo imunoistoquímico demonstraram que não houve
diferença de marcação entre os dois grupos estudados com o anticorpos marcadores
de apoptose FAS, FASL, Bcl 2, Bax e caspase 3. Todos os pacientes apresentaram
marcação forte para FAS. Apenas dois pacientes da forma evolutiva apresentaram
marcação negativa para FASL. Em um paciente da forma estacionária, a marcação
para Bcl2 não foi avaliável. Um paciente da forma estacionária apresentou
marcação negativa para Bax. Em relação à caspase 3, todos os pacientes
apresentaram marcação negativa com score final menor que 3 (Tabela 6 e Figuras
11 a 15).
55
Tabela 6 - Distribuição da marcação de expressão das proteínas reguladoras da
apoptose, Fas, FasL, Bcl-2, Bax e caspase 3, de acordo com a forma de evolução
dos pacientes.
Variável Categoria Total
Grupos
Estacionária Evolutiva
N (%) N (%)
FAS Positivo 32 (100,0) 19 (100,0) 13 (100,0)
Negativo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
FASL
Positivo
Negativo
30 (93,8%)
2 (6,2%)
19 (100,0)
0 (0,0)
11 (84.6,0)
2 (15,4)
Bcl-2
Positivo
Negativo
Não avaliável
31 (96,9%)
0 (0,0%)
1 (3,1%)
18(94,7)
0 (0,0)
1(5,3)
13 (100,0)
0 (0,0)
0 (0,0)
Bax
Positivo
Negativo
31(96,8%)
1 (3,1%)
18(94,7)
1 (5,3)
12 (92,3)
1 (7,7)
Caspase 3
Positivo
Negativo
0 (0,0)
32 (100%)
0 (0,0)
19 (100,0)
0 (0,0)
13 (100,0)
56
Figura 11 - expressão citoplasmática de FAS.
Figura 12 - expressão citoplasmática de FASL.
57
Figura 13 - expressão citoplasmática de Bcl-2.
Figura 14 - expressão citoplasmática de Bax.
58
Figura 15 - Expressão nuclear e citoplasmática da caspase 3.
59
4.2.2 Proteína Marcadora da Proliferação Celular: Ki-67
A pesquisa da expressão da proteína Ki-67, marcador de proliferação celular,
demonstrou diferença de expressão estatisticamente significativa entre os grupos
estudados (Figura 16). A porcentagem de expressão foi maior nos pacientes da
“forma evolutiva” com media de 35,1% e mediana de 45%, com p-valor
estatisticamente significativo de 0,0001 (Tabela 7).
Tabela 7 - Medidas relativas ao Ki67 de acordo com evolução.
Variável Medidas
Total
(n=32)
Grupos
Estacionária Evolutiva
(n=19) (n=13)
medidas medidas
p-valor
KI67
Min-Max
Mediana
Media (desvio padrão)
3,7 - 59,8
12,9
20,2 (17,4)
3,7- 19,8
8,4
10,0 (4,7)
8,4 - 59,8
45,0
35,1 (18,6)
0,0001
p-valor obtidos pelo teste U de Mann-Whitney
60
Legenda: A) marcação fraca do anticorpo Ki-67 - paciente com forma estacionária. B) marcação
forte do anticorpo Ki-67 - paciente com forma evolutiva da doença.
Figura 16 – Expressão nuclear de Ki-67.
A
B
61
5 DISCUSSÃO
A micose fungóide é considerada classicamente como forma indolente de
LCCT. A despeito desse fato constatou-se, no Ambulatório de Oncologia Cutânea
da Divisão de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo, que determinados pacientes apresentam forma
mais agressiva de doença desde o seu inicio, enquanto outros apresentam doença
extremamente indolente e permanecem com lesões cutâneas inalteradas por
longos períodos. No intuito de elucidar se esses pacientes apresentam diferenças
no comportamento biológico do tumor, avaliaram-se pacientes com diagnóstico
clínico e histológico de micose fungóide divididos em dois grupos distintos de
acordo com a apresentação das lesões cutâneas iniciais e evolução clínica da
doença. Formaram-se dois grupos denominados: forma estacionária e forma
rapidamente evolutiva.
A proliferação de células neoplásicas na epiderme em associação com as
células de Langerhans sugere que a progressão da micose fungóide seja estimulada
pela apresentação antigênica mediada por essas células e reforça a idéia que essa
neoplasia consista em uma doença de estimulação antigênica crônica, cujo
crescimento é promovido pela apresentação de vírus, bactérias ou peptídeos
químicos modificados. Provavelmente, a estimulação antigênica crônica e a inibição
da apoptose das células tumorais sejam os principais mecanismos etiopatogênicos
62
envolvidos nessa doença. Entretanto, o mecanismo molecular responsável pela
patogênese dos LCCTs ainda não está elucidado.
A apoptose ou morte celular programada é um mecanismo fundamental para
o controle da homeostasia celular, que atua como importante ferramenta na defesa
contra o câncer. Através da apoptose, células mutadas ou infectadas por vírus, com
potencial capacidade de transformação maligna, são eliminadas. Existem duas
principais vias de apoptose: a via extrínseca, iniciada através de ligantes de morte e
ativação das caspases e a via intrínseca, que depende da liberação de fatores pró-
apoptóticos, como o citocromo c, e posterior ativação da caspase 9. Na via
intrínseca, a liberação dos fatores pró-apoptóticos é regulada pela família de
proteínas de Bcl-2, ou seja, Bcl-2, Bax, Bak e Bid. A família de ligantes da via
extrínseca inclui o fator de necrose tumoral (TNF-α), CD95-FAS ligante e ligante
de indução da apoptose relacionado ao TNF (TRAIL), que podem ligar-se aos seus
respectivos receptores de morte TNF-R1, CD95, TRAIL-R1/DR4 e TRAIL-R2/DR5
ou a receptores decodificados como TRAIL-R3/DcR-1 ou TRAIL-R4/DcR-2.
Posteriormente, ocorre a formação do complexo de sinalização de indução de morte
(DISC) através da ligação de FADD, ativação da caspase 8, ativação das caspases
efetoras, clivagem dos substratos de morte e finalmente a fragmentação do DNA.
Paralelamente, os ligantes de morte podem ainda estimular vias de expressão gênica
para produção de mediadores inflamatórios e proteínas anti-apoptóticas (RIEDL e
SHI 2004; DI PIETRO e ZAULI 2004; ABBAS e LICHTMAN 2005d; LAVRIK et
al. 2005).
O controle da apoptose via ligantes e receptores de morte é importante para
homeostasia dos linfócitos. Muitos linfócitos precursores são produzidos em
63
excesso e devem ser eliminados. Da mesma forma, na resposta imune após a
eliminação do antígeno, o número de linfócitos deve voltar ao normal. Em ambos os
casos, o mecanismo de apoptose utilizado envolve a via de sinalização extrínseca
mediada pelo sistema de FAS. A interrupção da via extrínseca da apoptose pode,
portanto, corresponder a um importante mecanismo para o desenvolvimento dos
linfomas (BRAUN et al. 2007). Em nosso estudo, avaliamos as proteínas
reguladoras da apoptose entre os dois grupos estudados e observamos, a partir da
não expressão da caspase 3, que o mecanismo da apoptose está supresso em ambas
as formas de apresentação clínica. Não obtivemos diferenças de expressão desta
protease, componente-chave do mecanismo da apoptose, entre os pacientes da
forma estacionária e da forma rapidamente evolutiva. Frente a este resultado,
inferimos que a supressão da apoptose é um defeito presente até mesmo nas fases
iniciais da doença e que o acúmulo celular seria causado, inicialmente, pela inibição
da morte das células neoplásicas e não pela proliferação das mesmas, que, nas fases
inicias, apresenta-se baixo conforme constatado por outros autores (DUMMER et
al. 1995; DEREURE et al. 2001; ZHANG et al. 2002).
Sabe-se que as células do LCCT são células T maduras ativadas que
apresentam a sobrevida média prolongada e, portanto, defeito na morte celular. Um
defeito específico na via de FAS-FASL pode resultar no acúmulo dessas células. Na
tentativa de descobrirmos se esta via da apoptose estaria inibida e se haveria
diferença entre os grupos, estudamos a expressão das proteínas FAS e FASL,
mediadoras da via extrínseca, e obtivemos expressão positiva em praticamente todos
os casos. Apenas em dois pacientes (15,4%) da forma rapidamente evolutiva houve
expressão negativa de FASL.
64
Nossos resultados foram contraditórios aos resultados de estudos que
demonstraram a diminuição da expressão de FAS em linfócito T CD4 do sangue
periférico de pacientes com micose fungóide e síndrome de Sezary e a ausência de
expressão de FAS em casos mais agressivos de LCCT. Entretanto, mutações do
gene FAS foram encontradas em apenas 14% das células tumorais dos pacientes
com LCCT, o que nos leva a concluir que outras anormalidades associadas à
sinalização de FAS-FASL devam existir na patogênese da micose fungóide (ZOI-
TOLI et al. 2000; MEECH et al. 2001; DEREURE et al. 2002; NI et al. 2005).
Nossos resultados nos levam a pensar na possibilidade de defeito em outra
proteína medidora da via extrínseca, visto que a expressão de FAS-FASL
apresentou-se presente ou, então, na inatividade destas proteínas, fato que não foi
avaliado em nosso estudo.
A morte celular induzida pela ativação mediada por FAS pode ser evitada
por uma proteína chamada FLIP (para proteína inibidora FLICE), que possui um
domínio de morte, mas não possui um domínio caspase. A FLIP pode ligar-se à
proteína adaptadora FADD (domínio de morte associado ao FAS) ou à pró-caspase
8 no citoplasma, sendo porém incapaz de ativá-la. Dessa forma, inibe
competitivamente a ligação da caspase 8 ao domínio de morte associado ao FAS
(FADD), bloqueando o sinal apoptótico (ABBAS e LICHTMAN 2005d) (Figura
17).
65
Legenda: A) a ligação de Fas-Fasl ativa a caspase 8 e promove a apoptose. B) c-FLIP se liga à
FADD e à pró-caspase 8 e bloqueia o sinal apoptótico.
Fonte: Adaptado de SCAFFIDI et al. (1999).
Figura 17 - Inibição da via de morte celular por ativação através de c-FLIP.
Estudo realizado em linhagem de células derivadas de linfoma de Hodgkin
demonstrou que células malignas desse linfoma, as células de Reed-Sternberg,
expressam c-FLIP e FASL. A expressão de c-FLIP é responsável pela inibição da
apoptose via FAS e a expressão de FASL é capaz de induzir a apoptose quando há
inibição de c-FLIP. A superexpressão de FAS e c-FLIP foi observada também em
linhagem de células de linfoma anaplásico de grandes células. Nesse estudo, a
inibição de c-FLIP promoveu a morte celular mediada por FAS. Dessa forma,
terapias que bloqueiem c-FLIP podem ser promissoras no tratamento dessas
neoplasias (DUTTON et al. 2004; OYARZO et al. 2006).
Pró-domínio da
caspase
8
Substrato
de morte
Domínio de morte
Domínioefetordemorte
66
As células neoplásicas da micose fungóide são CD4+, CLA+ e CCR4+ e
produzem citocinas de padrão de resposta TH2, ou seja, interleucinas 4, 5 e 10. Com
a evolução da doença, observamos aumento da proliferação celular e,
conseqüentemente maior concentração de células malignas e desvio da resposta
TH1 para resposta TH2. A produção excessiva de citocinas do tipo TH2 pelas
células malignas pode antagonizar a produção de citocinas do tipo TH1, como IL2 e
INF-γ. Baixos níveis de IL2 são insuficientes para inibirem FLIP, permitindo que
essa proteína bloqueie a via de FAS-FASL e impeça que as células malignas sofram
apoptose (MEECH et al. 2001). Esses estudos favorecem a hipótese de que a via de
FAS-FAS-L esteja prejudicada nesses pacientes, nas lesões mais agressivas da
doença, onde encontramos maior concentração de linfócitos neoplásicos e, portanto
aumento das citocinas de padrão de resposta TH2, como as interleucinas 4, 5 e 10 e
diminuição das citocinas TH1, como IL2 e IFNγ. Como dito anteriormente, baixas
concentrações de IL2 não inibem a atividade de FLIP e permitem a inibição da via
extrínseca através da ligação dessa proteína à FADD e inibição da pró-caspase 8.
Nossos resultados não demonstraram diminuição de FAS ou FAS-L, mas
demonstraram defeito na apoptose em todos os pacientes. Dessa forma, a via
extrínseca da apoptose pode estar prejudicada pela inatividade dessas proteínas,
apesar da sua presença ou através da inibição dessa via após a ligação de FAS e
FAS-L a partir da ligação de FLIP à FADD.
Avaliamos a expressão das proteínas Bcl-2 e Bax, membros da família Bcl,
para obtermos informações sobre a via intrínseca de morte celular. A família de
proteínas Bcl é constituída por proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas. O
equilíbrio entre essas proteínas é fundamental para a manutenção da homeostasia
67
celular através do controle da via intrínseca de morte celular. A superexpressão de
proteínas anti-apoptóticas e a diminuição de proteínas pró-apoptóticas estão
associadas com a progressão tumoral (DUMMER et al. 1995; KORSMEYER
1995).
A primeira proteína dessa família a ser identificada foi Bcl-2, o segundo
oncogene encontrado em um linfoma de células B no homem. Bcl-2 e seu homólogo
Bcl-x inibem a apoptose impedindo a liberação mitocondrial do citocromo c e
ligando-se a Apaf-1. Estudos avaliando a expressão de Bcl-2 nos LCCT
demonstram positividade nas lesões iniciais e avançadas da doença e também na
síndrome de Sezary, forma leucêmica e agressiva dos LCCT (DUMMER et al.
1995). Em 1994, KANAVAROS et al. avaliaram a expressão de c-Myc, Bcl-2, p53
e PCNA em pacientes com micose fungóide nas lesões iniciais tipo patches e nas
lesões em placas e tumores e observaram aumento da expressão desses genes nas
formas avançadas da doença, evidenciando o aumento da proliferação celular
através da expressão de PCNA e inibição da apoptose através de Bcl-2, c-Myc e
p53. A baixa positividade para Ki67 e a expressão abundante de Bcl-2 nas formas
iniciais da micose fungóide sugerem que o acúmulo de células tumorais durante a
fase inicial da doença poderia ser facilitado pelo aumento da sobrevida da célula
neoplásica (DUMMER et al. 1995). Em 2003, RASSIDAKIS et al. avaliaram a taxa
de apoptose utilizando a técnica de TUNEL em 112 linfomas de células T, incluindo
10 casos de micose fungóide e correlacionaram os resultados com a expressão de
Bcl-2. A taxa média de apoptose foi de 1,47% com variações de acordo com o tipo
histológico do tumor, sendo que as menores taxas foram encontradas nos casos de
micose fungóide (média de 0,74%), tendo havido correlação entre apoptose e
68
positividade para Bcl-2, ou seja, nos casos BcL-2+ as taxas de apoptose estavam
diminuídas. Dois fatores de transcrição foram associados ao aumento de expressão
do gene Bcl-2: c-Myb e STAT 5 (FRAMPTON et al. 1996; TAYLOR et al. 1996,
WEBER-NORDT et al. 1996; SALOMONI et al. 1997). Estudo utilizando linhagem
de células de LCCT sugere que o aumento da proteína Bcl-2 nas células malignas
do LCCT pode ser conseqüência da ação direta de c-Myb e STAT5 ativados pelas
interleucinas 7 e 15. Os autores concluem que, nas fases iniciais da doença, c-Myb
pode aumentar a expressão de Bcl-2 (QIN et al. 2001).
Em nosso estudo, Bcl-2 apresentou-se fortemente expresso em ambos os
grupos estudados. Não obtivemos diferenças de expressão dessa proteína entre as
formas estacionárias e rapidamente evolutivas.
Da mesma forma, a expressão da proteína Bax apresentou-se forte em todos
os pacientes estudados. Bax, membro da família de genes Bcl-2, é uma proteína de
21 kDa que acelera a apoptose através de ligações e antagonismo com o Bcl-2, o
qual possui efeito inibidor na atividade de morte celular in vivo. Bax, geralmente, se
encontra no citoplasma, mas através de estímulo apoptótico, Bax inicia uma
mudança conformacional e desloca-se para a membrana mitocondrial, onde
proporciona e media a liberação do citocromo-c do espaço da inter-membrana para
o citosol, ativando a caspase 3 e perpetuando a cascata apoptótica. ZHANG et al.
em 2003, avaliaram a expressão de Bcl-x, Mcl-1, proteínas inibidoras da apoptose e
de Bax e Bad, proteínas promotoras da apoptose, em cultura de células e biópsias
cutâneas de pacientes com micose fungóide. Os autores encontraram expressão
dessas proteínas in vitro e in vivo sem diferenças de intensidade quando comparadas
as lesões nos diferentes estágios da doença. No entanto, as proteínas Bax e Bad,
69
apesar de fortemente expressas, encontravam-se inativas, permitindo a conclusão de
que nos LCCT, o equilíbrio entre promotores e inibidores de apoptose pende para as
proteínas inibidoras, favorecendo a imortalidade das células neoplásicas.
Nossos resultados não apresentaram diferenças de expressão de Bcl-2 e nem
de Bax nos grupos estudados. A expressão de marcação de Bax foi forte em todos
os pacientes, sendo que em apenas um paciente da forma indolente não foi possível
avaliarmos essa proteína. Entretanto, como evidenciamos a diminuição da apoptose
em todos os casos, através da expressão diminuída da caspase 3, podemos afirmar
que a inibição da apoptose foi um fenômeno presente em ambos os grupos e,
portanto, a via intrínseca mediada pela caspase 9 pode estar bloqueada por Bcl-2
caso Bax, apesar de presente, apresentar-se sob a forma inativa, como foi verificado
no trabalho de ZHANG et al. em 2003.
A avaliação do índice proliferativo entre os dois grupos demonstrou
proliferação celular mais intensa nas formas evolutivas da doença com diferença
estatisticamente significativa. Estudos realizados em pacientes com LCCT e
linfomas não Hodgkin demonstraram índices proliferativos crescentes de acordo
com a evolução clínica da doença (DUMMER et al. 1995; KORKOLOPOULOU et
al. 1998). Entretanto, TURBITT e MACKIE em 1986 realizaram estudo
comparativo entre 40 pacientes com micose fungóide e 23 pacientes com outros
infiltrados linfocitários cutâneos não neoplásicos e obtiveram baixa positividade de
Ki67 em um pequeno número de pacientes com micose fungóide e ausência de
positividade nos infiltrados não neoplásicos. Para os autores, esses resultados
poderiam sustentar a idéia de que, na micose fungóide, o acúmulo de células
tumorais seria resultante de células que se dividiram em sítio extra-cutâneo e não da
70
proliferação de linfócitos T na pele. A melhor compreensão da etiopatogenia da
micose fungóide contradiz essa idéia, pois se sabe que a resposta imune cutânea
baseia-se na sensibilização das células de Langerhans por antígeno específico, na
transformação das CL, que são células dendríticas imaturas, em células dendríticas
maduras e sua migração para o linfonodo regional, onde sensibilizarão linfócitos T
naive que proliferarão e retornarão à pele guiados pelo CLA (antígeno linfocitário
cutâneo). Na pele, esses linfócitos continuarão a dividir-se por mecanismo ainda não
elucidado, promovendo a proliferação dessas células.
A resposta imune anti-tumoral também segue o mesmo princípio. Os
antígenos tumorais específicos da micose fungóide ainda não foram bem definidos.
Uma das possibilidades seria a célula tumoral apoptótica, processada e apresentada
pelas células dendríticas, atuar como antígeno. Essa apresentação cruzada do
antígeno tumoral pode induzir a resposta imune anti-tumoral e promover a lise do
tumor (BERARD et al. 2000; NOURI-SHIRAZI et al. 2000). No entanto, para
tornar-se imunogênica, além da ingestão de corpos apoptóticos, as células
dendríticas imaturas devem tornar-se maduras em resposta ao sinal de perigo. É
descrito que tumores pequenos podem não liberar sinais de perigo ou podem
suprimir a função apresentadora da célula dendrítica pela liberação de interleucina
10 e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), induzindo à tolerância
tumoral (ENK et al. 1993; STEINBRINK et al. 1999; OHM e CARBONE 2001). A
interleucina 10 é uma citocina do tipo TH2 produzida pelas células tumorais,
especialmente nas fases avançadas da doença. LUFTL et al (2002) encontraram
número progressivo de células IL10+ durante a progressão da doença, favorecendo
a hipótese da participação dessa interleucina nas fases avançadas da doença e sua
71
contribuição para tolerância tumoral e, conseqüentemente, para a proliferação
celular descontrolada. Estudos em modelo in vitro de LCCT demonstram que
células dendríticas imaturas, ocupadas por células apoptóticas do LCCT, ligam-se
ao TCR (receptor de células T) da célula T maligna e essas células passam a
adquirir o fenótipo da célula Treg (T regulatória), expressando antígeno linfocitário
citotóxico citoplasmático 4 (CTLA-4), Fox-P3 e CD25 e secretando citocinas
imunossupressoras IL-10 e TGF-β (fator de crescimento tumoral) (Figura 18).
72
Legenda: a célula de Langerhans é uma célula dendrítica imatura posicionada na epiderme e que
atua como a primeira célula apresentadora de antígeno. Possui papel importante na imunidade, na
regulação de doenças auto-imunes e nos cânceres cutâneos. Elementos tissulares apoptóticos são
ingeridos por células dendríticas imaturas e seus antígenos são processados e apresentados para o
TCR das células T CD4+. Células de Langerhans imaturas podem migrar para o linfonodo regional,
onde estimulam a resposta T regulatória e previnem o desenvolvimento de doenças auto-imunes. As
células T malignas do LCCT assumem fenótipo de células T regulatórias, após a estímulo da
apresentação de peptídeos próprios e suprimindo a resposta imune normal das células T. As células
de Langerhans desempenham papel central no crescimento e expansão nessa forma de neoplasia
cutânea.
Fonte: Adaptado de BERGER et al. (2006).
Figura 18 - Células de Langerhans na tolerância e no câncer.
epiderme
Célula T CD4
Célula T regulatória
Célula apoptótica
derme
Célula do LCCT
apoptótica
Célula dendrítica imatura
Célula dendrítica imatura
Tolerância a auto antígenos
Inibição de doenças auto-
imunes
Doença
Imunossupressão
Células T regulatórias
Câncer
Célula do LCCT CD4
Microabscesso de Pautrier
73
Através da secreção IL-10 pela célula Treg tumoral, mantém-se a
imaturidade da célula dendrítica e permite-se a fagocitose continuada e a
apresentação de antígenos derivados das células apoptóticas, perpetuando a
proliferação de células tumorais (BERGER et al. 2002, 2005 e 2006). Além do
aumento da proliferação celular maligna, estudo demonstrou a expressão de FASL
em todos os estágios da micose fungóide. Observou-se, entretanto, relação inversa
entre FASL e linfócitos T CD8+ nas lesões cutâneas. Ou seja, nas áreas com alta
concentração de FASL, encontraram-se baixas concentrações de células T CD8+ e
em áreas com baixas concentrações de FASL, havia maior concentração das células
T CD8+. Além disso, os autores observaram, através da técnica de TUNEL, que os
linfócitos T CD8+, presentes nas áreas de alta concentração de FASL,
apresentavam-se em apoptose. Esses autores concluíram que FASL, presente nas
células neoplásicas de lesões de micose fungóide, pode ser capaz de induzir a
apoptose dos linfócitos T CD8+ citotóxicos através da via de FAS-FASL (NI et al.
2001). A ativação da apoptose nos linfócitos T citotóxicos atuaria como mecanismo
de escape tumoral, prejudicando a imunidade celular e, conseqüentemente,
facilitando a proliferação do tumor.
A presença de índice proliferativo superior nos pacientes com a forma
evolutiva pode ser conseqüente da alteração precoce do sistema imune através da
diminuição dos linfócitos T citotóxicos (CD8+), facilitando a progressão das células
tumorais. Nesses pacientes, a maior concentração de linfócitos neoplásicos
intensifica a resposta imune TH2 e promove aumento de IL4, IL5 e IL10, que
impede a maturação das células dendríticas e perpetua a resposta antigênica.
Somado a isso, as células neoplásicas podem adquirir o fenótipo de linfócitos Treg e
74
produzir IL10 e TGFβ, intensificando ainda mais a progressão do tumor. Nosso
estudo não avaliou a concentração de células dendríticas, de linfócitos T CD8+, de
IL10 nem mesmo a presença das células Treg, porém a diferença estatisticamente
significativa do número de linfócitos neoplásicos entre os dois grupos leva-nos a
pensar que esses fenômenos podem estar presentes mais precocemente nas formas
evolutivas da doença.
Os resultados obtidos em nosso estudo nos permitem concluir que a
apoptose é um fenômeno constante em todas as formas de apresentação clínica da
micose fungóide. Através da interpretação dos nossos resultados e baseando-se na
literatura existente, podemos inferir que nos estágios iniciais da micose fungóide a
via intrínseca mediada por Bcl-2 pode estar bloqueada pela superexpressão de Bcl-
2. Nessa fase, portanto, a inibição da apoptose promoveria o aumento das células
neoplásicas, visto que, como observado em nossos pacientes, nas fases iniciais, o
índice de proliferação das células neoplásicas, avaliado pela expressão da proteína
Ki67, mostrou-se baixo. A supressão da apoptose levaria ao aumento progressivo
das células tumorais promovendo a supressão da resposta imune através do desvio
da resposta imune TH1 para TH2 por essas células. Haveria, portanto, aumento de
IL4, IL5 e IL10 e diminuição de IL2, prejudicando a resposta imune tumoral pela
diminuição de linfócitos T citotóxicos e permitindo que os linfócitos T neoplásicos
adquiram o fenótipo de células T regulatórias e passem a atuar como antígenos
tumorais. Baixos níveis de IL2, permitiriam a inibição da segunda via da apoptose
através de c-FLIP promovendo aumento ainda maior da população de células
tumorais. Dessa forma, a proliferação celular seria provocada inicialmente por
defeito na via intrínseca da apoptose e, posteriormente, pela deficiência da resposta
75
imune anti-tumoral desencadeada pelas próprias células neoplásicas. O aumento das
células malignas, além de perpetuar a resposta imune pela estimulação antigênica
crônica, permitiria nas fases avançadas da doença, a inibição da via de FAS-FASL
através de c-FLIP. Porém, estudos complementares avaliando a função dessas
proteínas e a expressão de c-FLIP são necessários para confirmarmos essas
suposições.
76
6 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente estudo comparando-se as formas estacionárias e
rapidamente evolutivas da micose fungóide permitem concluir que:
1. A não-expressão da caspase 3 confirma que a supressão da apoptose é um
mecanismo importante na patogênese da micose fungóide, independente da
forma de apresentação e evolução clinica da doença.
2. A desregulação da apoptose não é determinante da evolução clínica da
micose fungóide;
3. A proliferação celular aumentada provavelmente é o mecanismo celular que
difere as formas rapidamente evolutivas das formas estacionárias da micose
fungóide.
77
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ANEXOS
Anexo 1 - Ficha de Registro de Dados
Identificação
Nome __________________________________________________
Instituição _______________________________________________
RGH _________________________
Endereço _________________________________________________
Cidade ___________________ Estado ________________________
Cep ______________________________
Telefone ____________________________
Dados do paciente
Data de nascimento: _____/______/___________
Naturalidade ________________________________
Procedência ____________________________________
Profissão ___________________________
Sexo ( ) masculino ( ) feminino
Cor ( ) B ( ) N ( ) A ( ) pardo/mulato ( ) ignorado
Forma de evolução:
Estacionária - critérios:
1. Forma cutânea inicial ao diagnóstico – patches
2. Ausência de alteração no tamanho e no número de lesões em 5 anos
3. Mais de cinco anos de evolução antes do diagnóstico histológico
Rapidamente evolutiva – critérios:
1. Transição de lesão cutânea em menos de cinco anos
2. Não resposta ao tratamento convencional
3. Forma cutânea inicial ao diagnóstico – placas >10%sup. corpórea ou
tumores.
Estacionária
Rapidamente
evolutiva Evolução
História Clínica
Forma de apresentação inicial: ( ) patch/placa ( ) placas ( ) tumor
Início das lesões: ________ Idade ao diagnóstico: ________________
Data do diagnóstico histológico ____/ ____ /_________
Data da 1ª consulta _____/_____/ ____________
Biópsias anteriores ( ) sim ( ) não
Caso sim, resultado: ( )dermatite inespecífica ( )Linfoma cutâneo
Tratamentos anteriores: ( ) sim ( ) não Qual(s)________________
Quadro Clínico
( ) patches ( ) placas ( ) tumor ( ) outros _________
Localização das lesões:
( ) face, ( ) tórax, ( ) abdômen, ( )MMSS, ( )MMII ( ) nádegas ( )dorso
Superfície corpórea ( ) até 10% ( ) > 10 %
Linfonodos palpáveis ( )cervical ( )axilar ( )inguinal ( ) não palpável
Visceromegalias ( ) sim ( )não Qual(s):
Alteração de M. Óssea ( ) sim ( ) não
Apresentação das lesões cutâneas no momento do diagnóstico histológico
Apresentação Grupo T1 Grupo T2 GrupoT3
Sup.corp<10%
A A
Sup corp≥10%
B B
Grupo T1 Patches:
T1A – patches < 10% superfície corpórea
T1B – patches ≥10% superfície corpórea
Grupo T2 Patches e placas
T2A < 10% superfície corpórea
T2B ≥ 10% superfície corpórea
Grupo T3 Tumores
Evolução:
Apresentação
clínica
5 anos até o
diagnóstico
Diagnóstico
histológico
5 anos após
diagnóstico
T1A
T1B
T2A
T2B
T3
Exames laboratoriais
Hemograma
anemia ( ) sim ( ) não
leucopenia ( ) sim ( ) não
leucocitose ( ) sim ( ) não
linfocitose ( ) sim ( ) não
linfócitos morfologicamente alterados ( ) sim ( ) não
Transaminases hepáticas ( ) normais ( )alteradas ____________
DHL ( ) normal ( ) alterada __________
Fosfatase alcalina ( ) normal ( ) alterada _______________
Pesquisa de células de Sezary ( ) negativo ( ) < 5% ( ) > 5%
HTLV1 e 2 ( ) positivo ( ) negativo- data do exame
Relação CD4/CD8 ( ) < 10 ( ) > 10
Exames de imagem
Raiox de tórax ( ) normal ( ) alterado
USG de abdômen ( ) normal ( ) alterado ( ) não realizado
USG de bases linfonodais ( ) normal ( ) alterado ( ) não realizado
Tomografia de tórax ( ) normal ( ) alterado ( ) não realizado
Tomografia de abdômen ( ) normal ( ) alterado ( ) não realizada
Exame anátomo patológico
Pele
Resultado
Lâmina
Não diagnóstico Diagnóstico sugestivo
Diagnóstico
compatível
Estadiamento clínico
( ) IA ( ) IB ( ) IIA ( ) IIB ( ) III ( ) IVA ( )IVB
Índice de proliferação - expressão
Lesão
Marcador
Patches Placa Tumor
Ki67
Índice de apoptose - expressão
Lesão
Marcador
Patches Placa Tumor
Fas
FasL
Bcl2
Caspase 3
Anexo 2 - Distribuição das variáveis clínicas comparando-se as formas de evolução.
Tabela 1 - Distribuição das variáveis relacionadas ao local das lesões de acordo com
evolução.
Variável Categoria Total
Grupos
Estacionária Evolutiva
N (%) N (%)
p-valor
Face
Não
Sim
21 (65,6)
11 (34,4)
17 (80,9)
2 (18,2)
4 (19,0)
9 (81,8)
0,002
Tronco
Não
Sim
3 (9,4)
29 (90,6)
2 (66,7)
17 (58,6)
1 (33,3)
12 (41,4)
0,999
Membros
Não
Sim
4 (12,5)
28 (87,5)
3 (75,0)
16 (57,1)
1 (25,0)
12 (42,9)
0,629
Nádegas
Não
Sim
11 (35,5)
20 (65,5)
8 (72,7)
11 (55,0)
3 (27,3)
9 (45,0)
0,452
Superfície
corporal
Até 10%
Acima 10%
9 (28,1)
23 (71,9)
7 (77,8)
12(52,2)
2 (22,2)
11 (47,8)
0,249
p-valor obtido pelo teste exato de Fisher
Tabela 2 - Distribuição das variáveis demográficas de acordo com evolução.
Variável
Medidas /
Categoria
Total
Grupos
Estacionária Evolutiva
N (%) /medida N (%) /medida
p-valor
Sexo
Masculino
Feminino
11 (34,4)
21 (65,6)
6 (54,5)
13 (61,9)
5 (45,4)
8 (38,1)
0,721
Cor
Branco
Não Branco
21 (65,63)
11 (34,3)
10 (47,6)
9 (81,8)
11 (52,4)
2 (18,2)
0,128
Idade
Diagnóstico
N
Min-Max
Mediana
Media (dp)
32
19-74
46
48,7 (16,0)
19
26-72
44
46,5 (14,0)
13
19-74
58
51,9 (18,6)
0,2574 *
p-valor obtido pelo teste exato de Fisher
* p-valor obtido pelo teste U de Mann-Whitney
dp = desvio padrão
Tabela 3 - Distribuição das variáveis relacionadas ao linfonodos de acordo com
evolução.
Variável Categoria Total
Grupos
Estacionária Evolutivo
N (%) N (%)
p-valor
Linfonodos
Totais
Não
Sim
17 (53,1)
15 (46,9)
13 (76,5)
6 (40,0)
4 (23,5)
9 (60,0)
0,070
Linfonodo
Inguinal
Não
Sim
22 (68,7)
10 (31,2)
14 (63,6)
5 (50,0)
8 (36,4)
5 (50,0)
0,699
Linfonodo
Cervical
Não
Sim
30 (93,7)
2 (6,2)
18 (60,0)
1 (50,0)
12 (40,0)
1 (50,0)
0,999
Linfonodo
Axila
Não
Sim
25 (78,1)
7 (21,9)
17 (68,0)
2 (28,6)
8 (32,0)
5 (71,4)
0,091
Linfonodo
Outros
Não
Sim
30 (93,7)
2 (6,2)
18 (60,0)
1 (50,0)
12 (40,0)
1 (50,0)
0,999
p-valor obtido pelo teste exato de Fisher
Tabela 4 - Distribuição das variáveis relacionadas ao grupo de apresentação e estadiamento
de acordo com evolução.
Variável Categoria Total
Grupos
Estacionária Evolutivo
N N
Grupo
Apresentação
T1A
T1B
T2A
T2B
T3
7
12
1
6
6
7
12
0
0
0
0
0
1
6
6
Estadiamento
IA
IB
IIA
IIB
7
8
11
6
6
7
6
0
1
1
5
6
Anexo 3 - Relação dos principais estudos FAS, Bcl-2, Ki67
Quadro 1- A expressão de Ki-67 nos linfomas.
Autor Conclusões
TURBITT e MACKIE 1986
As lesões cutâneas da micose fungóide são resultantes da
proliferação de células em outros sítios e não na pele
KORKOLOPOULOU et al. 1998
Aumento da expressão de Ki-67 com o aumento do grau
de malignidade dos linfomas
DUMMER et al. 1995
Nas fases iniciais da micose fungóide, a expressão
abundante de Bcl-2 e baixa de Ki67 sugere que o
acumulo inicial das células neoplásicas seja facilitado
pelo aumento da sobrevida das mesmas.
Estudo em questão
A expressão de Ki67 foi significativamente maior nas
formas evolutivas da micose fungóide p valor 0,0001
Quadro 2 - A expressão de FAS-FASL nos LCCT.
Autor Conclusões
DEREURE et al. 2000
Diminuição da expressão de FAS em linfócitos periféricos CD4+ de
LCCT.
ZOI-TOLI et al. 2000
Ausência da expressão de Fas foi associada a formas agressivas de
LCCT.
MEECH et al. 2001
Linfócitos neoplásicos dos LCCT apresentam defeito na apoptose
mediada por FAS-FASL.
DEREURE et al. 2002
Mutações do gene FAS foram encontradas em apenas 14% das células
tumorais dos pacientes com LCCT.
NI et al. 2001
Inversão da distribuição de células neoplásicas FasL+ e linfócitos T
CD8+ dentro do infiltrado das lesões de micose fungóide.Nos locais de
alta concentração de células neoplásicas FasL+ havia pequena quantidade
de linfócitos T CD8+.
BRAUN et al. 2007
A interrupção da via extrínseca (FAS-FASL) da apoptose pode
corresponder a um importante mecanismo para o desenvolvimento dos
linfomas.
Estudo em questão
A expressão de FAS-FASL foi semelhante nas formas estacionárias e
rapidamente evolutivas da micose fungóide.
Quadro 3 - A expressão de Bcl-2 nos linfomas.
Autor Conclusões
KANAVAROS et al. 1994
Avaliaram a expressão de c-Myc, Bcl-2, p53 e PCNA em
pacientes com micose fungóide nas lesões iniciais tipo patches e
nas lesões em placas e tumores e observaram aumento da
expressão desses genes nas formas avançadas da doença.
Evidenciando o aumento da proliferação celular através da
expressão de PCNA e inibição da apoptose através de Bcl-2, c-
Myc e p53.
DUMMER et al. 1995
A superexpressão de Bcl-2 e Bcl-x bem como a diminuição de
membros pró-apoptóticos da família Bcl como Bax, Bak, Bik e
Bid estão associados com a progressão tumoral. A expressão de
Bcl-2 nos linfomas de células T parece refletir o estágio de
desenvolvimento correspondente.
QIN et al. 2001
O aumento da proteína Bcl-2 nas células malignas do LCCT pode
ser conseqüente da ação direta de c-Myb e STAT5 ativados pelas
interleucinas 7 e 15. Nas fases iniciais da doença c-Myb pode
aumentar a expressão de Bcl-2.
ZHANG et al. 2002
Nos LCCT, a expressão de Bcl-2 é encontrada nas células
neoplásicas causando-lhes aumento da sobrevida e promovendo
resistência à radioterapia e fotoquimioterapia extra-corpórea.
RASSIDAKIS et al. 2003
Avaliaram a taxa de apoptose por TUNEL em 112 linfomas de
células T (10 casos de micose fungóide) e correlacionaram os
resultados com a expressão de Bcl-2. Nos casos BcL-2 + as taxas
de apoptose estavam diminuídas.
ZHANG et al. 2003
Avaliaram a expressão de Bcl-x, Mcl-1, Bax e Bad em cultura de
células e biópsias cutâneas de pacientes com micose fungóide.
Expressão positiva dessas proteínas in vitro e in vivo sem
diferenças de intensidade quando comparadas as lesões nos
diferentes estágios da doença. No entanto, as proteínas Bax e Bad,
apesar de fortemente expressas encontravam-se inativas.
Estudo em questão
Bcl-2 apresentou-se fortemente expresso nas formas estacionárias
e rapidamente evolutivas da micose fungóide.
Anexo 4 – Banco de dados
Quadro 1 - Banco de dados com os resultados da imunoistoquímica.
Paciente Evolução Ki-67 Fas. Fasl Bcl2 Bax Caspase 3
ADDS estacionaria 7,4 positivo positivo positivo positivo negativo
APA estacionaria 8,4 positivo positivo positivo positivo negativo
DMM estacionaria 9,8 positivo positivo positivo positivo negativo
DSD estacionaria 10,4 positivo positivo positivo negativo negativo
ESC estacionaria 15,3 positivo positivo positivo positivo negativo
EAS estacionaria 10,5 positivo positivo positivo positivo negativo
EPM estacionaria 15,35 positivo positivo positivo positivo negativo
JDF estacionaria 7,02 positivo positivo positivo positivo negativo
JTS estacionaria 6,6 positivo positivo positivo positivo negativo
LHAR estacionaria 16,4 positivo positivo positivo positivo negativo
MSM estacionaria 3,75 positivo positivo positivo positivo negativo
VLN estacionaria 7,3 positivo positivo positivo positivo negativo
MOG estacionaria 3,9 positivo positivo não avalia. positivo negativo
NSS estacionaria 10,1 positivo positivo positivo positivo negativo
AHS estacionaria 6,7 positivo positivo positivo positivo negativo
MMS estacionaria 19,8 positivo positivo positivo positivo negativo
TAN estacionaria 5,85 positivo positivo positivo positivo negativo
MS estacionaria 8 positivo positivo positivo positivo negativo
WSS estacionaria 17,2 positivo positivo positivo positivo negativo
DFA evolutiva 16,8 positivo positivo positivo positivo negativo
ENL evolutiva 18,4 positivo positivo positivo positivo negativo
FAF evolutiva 8,4 positivo positivo positivo positivo negativo
LST evolutiva 49 positivo positivo positivo positivo negativo
MFA evolutiva 49,6 positivo positivo positivo positivo negativo
MLT evolutiva 9,4 positivo positivo positivo positivo negativo
MAMF evolutiva 19,1 positivo positivo positivo positivo negativo
CBS evolutiva 55,4 positivo positivo positivo positivo negativo
LAC evolutiva 59,8 positivo positivo positivo positivo negativo
SFP evolutiva 45,05 positivo positivo positivo positivo negativo
ALF evolutiva 29,6 positivo negativo positivo positivo negativo
MJS evolutiva 45,5 positivo negativo positivo positivo negativo
ML evolutiva 50,5 positivo positivo positivo positivo negativo
Quadro 2 - Banco de dados com as variáveis clínicas estudadas.
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