( PDF ) Estudo funcional de proteínas prion celular mutantes no domínio de ligação à STI1 e a vitronectina

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ESTUDO FUNCIONAL DE PROTEÍNAS PRION

CELULAR MUTANTES NO DOMÍNIO DE

LIGAÇÃO À STI1 E A VITRONECTINA

PAMELA ANDRADE LOURENÇO PEREDA

Dissertação apresentada à Fundação Antônio

Prudente para obtenção do título de Mestre em

Ciências

Área de Concentração: Oncologia

Orientador: Dra. Vilma Regima Martins

São Paulo

2007

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FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente

Pereda, Pamela Andrade Lourenço

Estudo funcional de proteínas prion celular mutantes no domínio

de ligação à STI1 e a vitronectina / Pamela Andrade Lourenço Pereda

– São Paulo, 2007.

80p.

Dissertação (Mestrado)-Fundação Antônio Prudente.

Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de concentração:

Oncologia.

Orientadora: Vilma Regina Martins

Descritores: 1. DOENÇAS DE PRION. 2. PROTEINAS MUTANTES. 3.

SÍNDROME DE GERSTMANN-STRAUSSLER-SCHEINKER. 4.

PROTEINAS PRPC. 5. VITRONECTINA.

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Ao meu marido Camilo Pereda e ao meu filho Caíque

Pereda por serem a razão da minha felicidade.

Eu amo vocês!

AGRADECIMENTOS

À Dra. Vilma R. Martins, pela orientação, por seu compromisso com o

ensino e pela oportunidade de integrar um dos mais respeitados grupos de

pesquisa do Brasil;

Às Dras Marilene Lopes e Gláucia Hajj, pela excencial contribuição no

desenvolvimento deste trabalho.

Ao Dr. Luiz Fernando L. Reis, pela excelência na condução desta pós-

graduação e pelo 7 na Capes;

Aos amigos do laboratório de Biologia Celular e Molecular: Camila,

Cinthia, Cleiton, Eliane, Gabriel, Michele, Zanith, Flávio e Tiago por todos os

momentos compartilhados, amizade, carinho, lições e ajuda;

À Regina Nomizo, pela valiosa ajuda nos experimentos de citometria de

fluxo;

A todos os funcionários e colegas do Instituto Ludwig, que direta ou

indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, e em especial para

Sra. Conceição, Isabel, Leia, Sr. Eudes, Sampaio;

A Capes, FAPESP e ao Howard Hughes Medical Institute pelo apoio

financeiro;

À minha família, por toda a ajuda, por todo o amor;

Especialmente, ao meu marido por sempre estar ao meu lado para tudo;

E a Deus, o meu imenso obrigada!!!

RESUMO

Pereda PAL. Estudo funcional de proteínas prion celular mutantes no

domínio de ligação à STI1 e a vitronectina. São Paulo; 2007. [Dissertação

de Mestrado-Fundação Antônio Prudente].

A proteína prion celular (PrP

) é a isoforma normal da proteína infecciosa

denominada prion ou PrP

. A forma infecciosa está envolvida em doenças

neurodegenerativas transmissíveis, tanto em homens (doença de

Creutzfeldt-Jakob, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker ou GSS e

Insônia Familial Fatal), quanto em animais (scrapie, encefalopatia

espongiforme bovina, etc). Nosso grupo recentemente caracterizou dois

ligantes que interagem com PrP

através do domínio 105-128. A proteína

STI1 (“Stress inducible protein 1”), uma co-chaperonina que associa-se aos

resíduos 113-128 de PrP

levando a neuritogênese e neuroproteção por vias

de sinalização distintas. Além disso, está envolvida com a proliferação

celular em gliomas. A segunda, vitronectina (Vn), uma proteína de matriz

extracelular, interage com os aminoácidos 105-119 de PrP

modulando o

crescimento axonal. Mutações em PrP

nos códons Pro102leu, Pro105Leu e

Ala117Val (correspondentes aos aminoácidos 101, 104 e 116 na seqüência

de camundongos) estão contidas no sítio de interação com STI1 e

vitronectina e estão associadas à síndrome de Gerstmann-Straussler-

Scheinker (GSS), uma doença priônica hereditária. É interessante notar que

camundongos transgênicos com alta expressão do gene de PrP

contendo a

mutação Pro101Leu apresentam neurodegeneração espontânea, enquanto

que sua expressão em níveis normais causa maior susceptibilidade à

infecção por PrP

. Já a mutação Ala117Val produz uma forma

transmembrânica de PrP

que, no entanto, não causa deposição de PrP

nem infecção. Diante destes dados, pode-se propor que mutações nestes

domínios de PrP

estejam associadas à perda de função de PrP

. A

modulação da interação de PrP

com STI1 e vitronectina pode ainda ter um

papel relevante em outras doenças humanas relacionadas a proliferação e

morte celular, como o câncer. Desta forma, é bastante relevante conhecer o

papel das alterações no domínio de PrP

contido entre os aminoácidos 102

a 128 sobre os eventos biológicos desencadeados pela sua interação com

STI1 e vitronectina. Vetores de expressão contendo construções de PrP

tipo selvagem ou com mutações nos codons 102, 105 e 117 associadas com

os polimorfismos 129Met ou 129Val fusionadas a GFP foram geradas e

expressas em células eucarióticas. Através de microscopia confocal

mostramos que as construções GFP-PrP

129Met, GFP-PrP

129Val, GFP-

PrP

102Leu/129Met; GFP-PrP

102Leu/129Val; GFP-PrP

105Leu/129Met;

GFP-PrP

105Leu/129Val; GFP-PrP

117Val/129M são corretamente

endereçadas à membrana plasmática e região perinuclear. E que a

construção GFP-PrP

117Val/129Val fica retida no citoplasma celular e a

forma detectada em ensaios de western blotting tem uma massa molecular

de cerca de 45KDa que contrasta com aquelas de 60KDa presente nas

outras contruções. As contruções transfectadas em células N2a foram

selecionadas e clones com expressão semelhante das proteínas foram

isolados. Ensaios de migração à vitronectina mostraram que não havia

diferença etre os clones expressando a proteína tipo selvagem ou os

mutantes. Ensaios de migração à STI1 não foram realizados uma vez que

esta proteína não induziu migração em ensaios de haptotaxia. No entanto,

este ensaio não é suficiente para afirmar que as mutações não afetam a

função normal da proteína. Assim, outras abordagens devem ser realizadas

a fim de melhor avaliar o impacto destas mutações na função normal de

PrP

SUMMARY

Pereda PAL. [Functional study of mutant prion proteins in ligation

domain STI1 and vitronectin]. São Paulo; 2007. [Dissertação de Mestrado-

Fundação Antônio Prudente].

The cellular prion protein (PrP

) is a normal isoform of the infectious protein

denominated prion or PrP

(scrapie prion protein). The infectious form is

envolved in fatal neurodegenerative disorders, such as Creutzfeldt- Jakob

disease (CJD), Gerstman-Straussler-Scheinker syndrome (GSS) and Fatal-

Familial- Insomnia (FFI) in humans, or scrapie and bovine spongiform

encephalopathy (BSE) in animals. Recently, our group characterized two

ligands that interact with PrP

through 105-128 aminoacids domain. The first

ligand, STI1 protein (Stress-Inducible-Protein 1), a co-chaperone, binds PrP

at the residues 113-128 promoting neuritogenesis and neuroprotection

through distintic signaling pathway. Moreover, PrP

-STI1 interaction is

involved in the Glioma cellular proliferation. The second ligand, Vitronectin

(Vn), an extracellular matrix protein, interacts with PrP

at the aminoacids

105-119 modulating the axonal growth. PrP

mutations at codons Pro102Leu

and Ala117Val (corresponding to aminoacids 101, 104 and 116 in mice

sequence) represents the STI1 and VN binding sites in the PrP

molecule

and are associated to Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome (GSS), an

hereditary prion disease. Interestingly, transgenic mice expressing high

levels of PrP

mutant (Pro101Leu) showed spontaneous neurodegeneration,

while its expression in basal level causes more susceptibility the PrP

. On

the other hand, PrP

mutation Ala117Val produces a PrP

transmembrane

form that does not cause neither deposition of PrP

nor infection. Taken

together, these data suggest that PrP

mutation might be associated to PrP

loss-of-function. The modulation of PrP

interaction with STI1 and Vitronectin

can still play a relevant role in other human disease related to proliferation

and cellular death, like cancer. Indeed, it is relevant to know the role of the

altered PrP

molecule within aminoacids 102-128 and to investigate the

biological events triggered by STI1 and Vitronectin interaction. xpression

vectors presenting wild-type or mutated PrP

at codons 102, 105 and 117

combined with the polymorphism 129Met or 129Val and fused do GFP were

generated and expressed in eucariotic cells. Using confocal microscopy, we

showed that GFP-PrP

129Met, GFP-PrP

129Val, GFP-PrP

102Leu/129Met; GFP-PrP

102Leu/129Val; GFP-PrP

105Leu/129Met;

GFP-PrP

105Leu/129Val; GFP-PrP

117Val/129M were correctly localized

on the plasma membrane and perinuclear region while GFP-PrP

117Val/129Val remained stuck in the cytoplasm. Using western blot assays

we observed that the GFP-PrP

117Val/129Val presented a main form or

45KDa while all of the other constructions had 60KDa. N2a cells were stably

transfected with these constructions and selected clones with similar

expression of PrP

or its mutated forms were isolated. In migration assays

promoted by vitronectin the cells expressing the mutated PrP

protein

presented the same migratory activity of those expressing the mutated

proteins. Migration assays induced by STI1 were not preformed since this

protein was unable to induce migration. Nonetheless, these preliminary

observations do not preclude that PrP

mutations do not affect the normal

function of the protein. Further work, with different approaches, should be

addressed for a better evaluation of the impact of these mutations on the

normal functions of the cellular prion protein.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Gel agarose, purificação de vetor 32

Figura 2 Vetor pEGFP-C1 33

Figura 3 Sequenciamento do clone de PrP

P102L 34

Figura 4 Sequenciamento do clone de PrP

P102L com polimorfismo

no códon 129. 34

Figura 5 PCR recombinante. 36

Figura 6 Digestão diagnóstica. 37

Figura 7 Sequenciamento dos clones de PrP

P102L, P105L. 38

Figura 8 Sequenciamento do clone de PrP

A117V, M129V. 39

Figura 9 Linhagem F14 expressa PrP

. 40

Figura 10 Linhagem F14 expressa PrP

endógeno. 41

Figura 11 Curva de seleção celular com blasticidina. 42

Figura 12 CF10 não expressa PrP

endógeno. 43

Figura 13 Imagem em microscopia confocal da sublocalização das

proteínas quimeras. 47

Figura 14 Western Blotting do pool de células HEK 293T transfectadas

com os mutantes. 48

Figura 15 As células N2a expressam as construções transfectadas. 50

Figura 16 Histograma representativo de ensaios de citometria de fluxo. 51

Figura 17 Histograma representativo de ensaios de citometria de fluxo. 52

Figura 18 Clones de células N2a transfectadas (polimorfismos no códon

129). 53

Figura 19 Clones das células transfectadas (mutações). 54

Figura 20 Citometria de fluxo N2a. 55

Figura 21 Citometria de fluxo dos clones de N2a com o anticorpo 3F4. 56

Figura 22 Anticorpo M235 reconhece PrP

humano em células

HEK293. 57

Figura 23 Gráfico dos ensaios de migração contra Vn com os

clones #1. 61

Figura 24 Gráfico dos ensaios de migração contra Vn com os

clones # 2. 62

Figura 25 Gráfico comparativo das médias independentes entre os

clones 1 e 2. 63

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1 Média de intensidade de fluorescência dos Clones 1. 58

Tabela 2 Média geométrica para distribuição de eventos dos clones 2. 59

Quadro 1 Resumo das principais mutações descritas no gene do PrP

. 10

Quadro 2 Linhagens celulares testadas. 45

LISTA DE ABREVIATURAS

Ala Alanina

Asn Asparagina

Asp Aspartato

BSA Albumina Sérica Bovina

CJD Creutzfeldt-Jakob Disease

DNA Ácido Desoxirribonucléico

FFI Insônia Familial Fatal

GFP Proteína fluorescente verde

GPI Glicosilfosfatidilinositol

GSS Gerstmann-Sträussler-Scheinker

IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

Kd Constante de dissociação

KDa kilodaltons

LB Meio Luria-Bertani

Leu Leucina

LN Laminina

MAPK Proteína Quinase Ativada por Mitógenos

Met Metionina

PBS Tampão Salina Fosfato

PCR Reação em cadeia da polimerase

PI3K Fosfatidil-inositol 3 quinase

PKA Proteína Quinase dependente de cAMP

Prnp Gene da Proteína Prion Celular

Pro Prolina

PrP

Proteína Prion Celular

PrP

Proteína Prion Celular Scrapie

RNA Ácido Ribonucléico

SDS Duodecil Sulfato de Sódio

SFB Soro Bovino Fetal

STI1 Stress inducible protein 1

TBS/TBST Tris Buffered Saline/ Tris Buffered Saline Tween

TE Tris-EDTA

TSE Encefalopatia espongiforme transmissível

UV Ultravioleta

Val Valina

Vn Vitronectina

Xgal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis 1

1.2 Descoberta do agente infeccioso 3

1.3 Proteína Prion Celular (PrP

) 5

1.4 Associação de mutações no gene de PrP

e TSEs 9

2 OBJETIVOS 14

2.1 Objetivo geral 14

2.2 Objetivos específicos 14

3 MATERIAL E MÉTODOS 15

3.1 Clonagem dos mutantes de PrP

102L/129M e do alelo normal com

129V em vetor pGEM

3.1.1 Extração de DNA plasmidial 17

3.2 Construção dos mutantes 102Leu/129Val, 105Leu/129Val,

105Leu/129Met 117Val/129Met, 117Val/129Val em vetor que

expressa proteína fluorescente verde

3.2.1 Preparo do Vetor pGFP para clonagem do peptídeo sinal humano 19

3.2.2 Preparo do vetor peptídeo sinal-pEGFP para clonagem dos

mutantes

3.2.3 Desenho dos iniciadores com mutação na seqüência de interesse 20

3.2.4 Extração de DNA em larga escala 22

3.3 Padronização da transfecção das construções dos mutantes de

PrP

em pGFP

3.3.1 Transfecção com CaCl2 24

3.3.2 Transfecção com Lipofectamina 25

3.3.3 Eletroporação 25

3.3.4 Transfecção com Effectene 26

3.3.5 Linearização dos Vetores 26

3.4 Imunodetecção 27

3.5 Seleção com antibiótico 28

3.6 Citometria de fluxo 29

3.7 Análise de distribuição sub-celular de PrP

3.8 Ensaio de Migração

3.9 Microscopia Confocal

4 RESULTADOS 31

4.1 Construção dos mutantes de PrP

em vetor que expressa a

proteína fluorescente verde (GFP)

4.2 Padronização das transfecções de mutantes fusionados a pEGFP

em diferentes linhagens celulares

4.3 Avaliação da localização sub-celular de PrP

4.4 Geração de clones celulares de células N2a transfectadas com

pEGFP associatdo aos mutantes de PrP

4.4 Análise quantitativa da expressão de PrP

nos clones de células

N2a transfectadas com os mutantes de PrP

4.5 Ensaios de migração célular induzida por vitronectina nos clones de

N2a expressando PrP

mutantes

4.6 Ensaios de migração celular à STI1 dos clones de N2a

expressando PrP

mutantes

5 DISCUSSÃO 64

6 CONCLUSÕES 70

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 71

Pamela Andrade Lourenço Pereda

1 INTRODUÇÃO

1.1 ENCEFALOPATIAS ESPONGIFORMES TRANSMISSÍVEIS

Encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs) são doenças

neurodegenerativas caracterizadas pela morte neuronal e vacuolização

cerebral. Essas enfermidades acometem homens e animais e apresentam

caráter hereditário, infeccioso ou esporádico.

A doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) assim chamada por ter sido

descrita primeiramente por Creutzfeldt em 1920 e por Jakob em 1921, é a

mais comum das TSEs, pode apresentar caráter autossômico dominante, e

neste caso acomete uma em um milhão de pessoas. CJD também pode

manifestar-se através de contágio iatrogênico ou apresentar caráter

esporádico. Os sintomas apresentados resumem-se em desordens visuais,

perda da memória e movimentos mioclônicos, sendo que estes sintomas

evoluem até a morte num período de 12 meses (RICHARDSON e

MASTERS 1995).

Há relatos de transmissão iatrogênica de CJD por transplante de

dura-máter e córnea de indivíduos com TSE (LANG et al. 1998), foi

constatada também a contaminação por material cirúrgico mal esterilizado

(FLECHSIG et al. 2001). Segundo trabalhos recentemente publicados, há

possibilidade também da transmissão de CJD por transfusão de

hemocomponentes (LLEWELYN et al. 2004).

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Os casos esporádicos da doença foram assim denominados pela

impossibilidade de associá-la a mutações gênicas, exposição a agentes

infecciosos ou qualquer indício que justifique sua causa (WILL 2003).

A síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) é uma outra

TSE, também hereditária e autossômica dominante. Possui como

sintomatologia: ataxia, tremores, dificuldades de locomoção, distúrbios da

fala, irritabilidade, comportamento descontrolado e redução da capacidade

intelectual.

A última TSE descrita é a Insônia Familial Fatal, que se manifesta em

idade menos avançada que a CJD, por volta dos 48 anos de idade e

costuma causar distúrbios do sono, do sistema endócrino e motor causando

por último a demência (MEDORI et al. 1992).

Em animais, a TSE mais conhecida é a encefalopatia espongiforme

bovina (BSE), também chamada de “doença da vaca louca”, que é causada

pela contaminação do gado através de ração suplementada com proteína de

carne e ossos de ovelhas contaminadas por scrapie (PRUSINER et al.

1991). O scrapie é outra TSE que se manifesta em ovelhas e cabras,

causando perda de coordenação e intenso prurido (PRUSINER 1982;

BASLER et al. 1986).

Por sua vez, a doença mais preocupante, particularmente na América

do Norte é a “Chronic Wasting disease” e a “Transmissible Mink

Encephalopathy” que afetam animais de vida livre como o visão, cervos,

antílopes e martas respectivamente.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

1.2 DESCOBERTA DO AGENTE INFECCIOSO

Diferentes modelos experimentais foram realizados na tentativa de

melhor compreender o mecanismo de transmissão das TSEs e de purificar o

seu agente etiológico.

Estes modelos tornaram possível a obtenção de grandes quantidades

de extratos protéicos provenientes de cérebro de animais portadores da

doença. Assim através de diversas técnicas como a centrifugação

diferencial, extrações com detergentes, proteólise limitada, precipitação com

sulfato de amônio e eletroforese, pôde-se constatar que este agente tratava-

se de uma partícula infecciosa exclusivamente protéica. Uma característica

muito interessante do agente infeccioso é a sua resistência parcial à

digestão proteolítica.

A descoberta de que as TSEs eram causadas por um agente protéico

provocou uma quebra de paradigma, ao se contrastar com a afirmação da

biologia de que doenças infecciosas são causadas por microorganismos que

contêm ácidos nucléicos (DNA e RNA) (PRUSINER 1982).

Através de anticorpos produzidos a partir do agente infeccioso

purificado, pode-se reconhecer uma proteína de 27-30kDa em extratos

protéicos de cérebro de animais infectados. Entretanto, em extratos

protéicos de cérebro de animais não infectados, os anticorpos também

reconheciam uma proteína com cerca de 30-35kDa, ou seja, foi observado

que havia uma isoforma normal do agente infeccioso (OESCH et al. 1985).

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Desta forma, os estudos possibilitaram o sequenciamento da proteína

reconhecida por este anticorpo, tornando possível assim a clonagem do

gene homólogo ao agente infeccioso (OESCH et al. 1985; CHESEBRO et al.

1985). Esta isoforma normal foi denominada proteína prion celular ou PrP

a forma infecciosa proteína prion scrapie ou PrP

(BASLER et al. 1986).

Supõe-se que PrP

seja capaz de converter moléculas de PrP

moléculas resistentes à digestão proteolítica. A maior evidência para esta

hipótese é dada pelo fato de animais deficientes para o gene de PrP

não

apresentarem a doença (BUELER et al. 1992).

Devido a grande insolubilidade de PrP

, é provável que seu acúmulo

seja um dos motivos que levem à morte neuronal e deposição de material

amilóide, degenerando assim as células do sistema nervoso.

Vários modelos tem sido propostos para explicar a formação de

aglomerados de PrP

, porém a proposta geral é que a proteína se

desestabilize em consequência da infecção com PrP

e se converta de

PrPc em PrPsc. O acúmulo de PrP

leva a

progressão rápida dessas

doenças

(HUANG et al. 1994; COHEN et al. 1994).

Entretanto, há ainda muitas questões em aberto, pois já foram

descritos casos de doenças causadas por prion onde não são encontrados

tais aglomerados.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

1.3 PROTEÍNA PRION CELULAR (PrP

)

PrP

é uma proteína de superfície celular, codificada pelo gene (Prnp)

presente no cromossomo 20 em humanos e 2 em camundongos (OESCH et

al. 1985; CHESEBRO et al. 1985). PrP

possui aproximadamente 250

aminoácidos, dos quais os primeiros 22 na extremidade amino-terminal

sinalizam o endereçamento ao retículo endoplasmático rugoso, onde o

peptídeo sinal N-terminal (resíduo 1-22) e o segmento hidrofóbico C terminal

(resíduos 231-253) são clivados, seguindo-se a adição da âncora de

glicosilfosfatidilinositol (GPI). Esta é então encaminhada para o complexo de

Golgi e transportada até a superfície celular (PRUSINER et al. 1991;

HARRIS 1999).

A estrutura tridimensional da proteína prion foi determinada por

ressonância magnética em pH ácido (RIEK et al. 1996, 1997).

A expressão de PrP

é mais abundante em neurônios, mas também

ocorre em outros tipos celulares como os gânglios simpáticos e células

componentes do sistema imune (FORD et al. 2002). A distribuição sub-

celular se dá em membranas celulares pré-sinápticas (HERMS et al. 1999),

em axônios em crescimento (SALES et al. 2002) e no citoplasma de alguns

tipos neuronais (MIRONOV et al. 2003).

PrP

é constitutivamente expresso em diferentes tecidos de animais

adultos (BASLER et al. 1986) e suas concentrações são altamente

reguladas durante o desenvolvimento. Em camundongos, PrP

pode ser

encontrado a partir do nono dia de vida intra-uterina e, após o nascimento a

Pamela Andrade Lourenço Pereda

expressão da proteína aumenta atingindo um pico de expressão no dia 14º

pós-natal. Dependendo da região do cérebro, estas concentrações de PrP

se mantêm ou diminuem no animal adulto (SALES et al. 2002).

A função de PrP

ainda não foi completamente desvendada, porém

sua conservação evolutiva sugere um importante papel fisiológico. PrP

pode desempenhar funções tanto isoladamente quanto associado a outras

proteínas e está relacionado a muitos fenômenos biológicos desde estresse

oxidativo até ativação de linfócitos, apresentando também várias funções em

células neuronais (MARTINS e BRENTANI 2002).

A principal hipótese sobre a função de PrP

é que a proteína prion

seja uma plataforma de superfície celular dinâmica para reunir a modulação

de sinais baseados na seletividade de interações moleculares e sinalizações

transmembrana, traduzindo desta forma uma vasta gama de consequências

fisiológicas e comportamentais (revisado por LINDEM et al. 2007).

PrP

possui dois sítios altamente conservados de glicosilação, sendo

que pode ser encontrado na forma não glicosilada, monoglicosilada ou

diglicosilada. O papel da glicosilação foi atribuido a suscetibilidade de

conversão conformacional, bem como a diversidade das TSEs (LAW SON et

al. 2005). Algumas simulações de dinâmica molecular sugerem que os

glicanos N-ligados podem modular a estabilidade de PrP

(ZUEGG e

GREADY 2000; ERMONVAL et al. 2003; DEMARCO e DAGGERT 2005).

Recentemente, CHEN et al. (2003), mostraram que PrP

participa no

estímulo de vias de sinalização envolvidas em sobrevivência e diferenciação

neuronal como: Fyn quinase, fosfatidil-inositol 3 quinase (PI3K), proteína

Pamela Andrade Lourenço Pereda

quinase dependente de cAMP (PKA) e proteína quinase ativada por

mitógenos (MAPK).

Nosso grupo caracterizou a interação entre PrP

e a proteína de

matriz extracelular laminina (LN). Esta interação possui alta afinidade (Kd

2x10

-8

M) e especificidade e se dá entre o decapeptídeo da região carboxi-

terminal da cadeia γ1 de LN (GRANER et al. 2000) e o domínio entre os

aminoácidos 173 ao 182 de PrP

(COITINHO et al. 2006).

Sugere-se que a interação PrP

-LN possa ter um importante papel

fisiológico em uma variedade de tecidos onde ambas são expressas. Nosso

grupo identificou que esta interação induz neuritogênese ex vivo, em culturas

primárias de neurônios hipocampais. Entretanto neurônios derivados de

animais deficientes para PrP

(Prnp

0/0

) apresentaram neuritogênese

reduzida em resposta a LN. Além disso, quando estes neurônios foram

plaqueados sobre o peptídeo carboxi-terminal da cadeia γ1 de LN, apenas

aqueles do tipo selvagem apresentavam neuritogênese (GRANER et al.

2000). Isto indica que a ligação de PrP

à LN é um processo importante na

diferenciação neuronal.

Outros dados demonstram ainda que o bloqueio da interação PrP

-LN

usando anticorpos específicos impede a consolidação da memória de longa

duração (COITINHO et al. 2006).

Nosso grupo também demonstrou através de ensaios de ligação in

vitro a interação de alta afinidade (Kd de 10

-7

M) entre PrP

e uma co-

chaperonina denominada STI1 (“Stress inducible protein 1”) (ZANATA et al.

2002). Os domínios de interação foram mapeados entre os aminoácidos

Pamela Andrade Lourenço Pereda

113-128 de PrP

e entre os resíduos 230-245 de STI1 (ZANATA et al. 2002).

Além de observarmos a expressão de STI1 na superfície celular, também

demonstramos que STI1 depende de PrP

para induzir um efeito protetor

contra apoptose em um modelo já estabelecido de neurônios da retina. STI1

estimula tanto a via de MAPK quanto a de PKA, no entanto somente esta

última é relevante para o fenômeno de neuroproteção (CHIARINI et al. 2002;

ZANATA et al. 2002).

Dados recentes do grupo mostraram que a interação entre PrP

STI1 apresenta efeito neuroprotetor não apenas em neurônios retinianos

mas também em neurônios hipocampais ao ativar a via de PKA; além disso,

promove crescimento neurítico através da via de MAPK nestas células

(LOPES et al. 2005).

Após a observação que PrP

interage com a proteína de matriz

extracelular LN (GRANER et al. 2000) o grupo avaliou se PrP

poderia agir

como um receptor pleiotrópico, ligando-se a outras proteínas de matriz. De

fato, observou-se a interação da PrP

com a proteína denominada

vitronectina. Por outro lado a interação não ocorre com outras proteínas da

matriz extracelular como fibronectina e colágeno IV (HAJJ et al. 2007).

A vitronectina (Vn) é uma glicoproteína multifuncional de 459

aminoácidos e massa molecular de 75kDa, que está relacionada a

processos metabólicos como adesão celular, mecanismos de defesa

humoral, invasão e migração celulares (SEGER e SHALTIEL 2000). É

possível observar a presença de Vn em vários tecidos como músculo

esquelético, rins, tecido conjuntivo e nervoso (HAYMAN et al. 1983).

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Vn possui a capacidade de interagir com integrinas e provocar a

formação de “clusters” na membrana celular, o que leva à interação com

proteínas de citoesqueleto acionando cascatas de sinalização intracelulares

(HYNES 2002).

Através de ensaios de ligação semelhantes aos já feitos

anteriormente pelo nosso grupo com PrP

, LN e STI1 foi possível

demonstrar a ligação de PrP

com Vn como específica e de alta afinidade

(kd 10

-8

M). O sítio de interação entre ambas as proteínas foi mapeado e

reside entre os aminoácidos 105-119 em PrP

e 309-322 em Vn. Além disso,

foi possível evidenciar que essa interação é importante no mecanismo de

crescimento axonal de gânglios da raiz dorsal (HAJJ 2004).

Deste modo, alterações na molécula de PrP

podem privar o tecido

nervoso de sinais neuroprotetores e de diferenciação neuronal, o que estaria

relacionado ao aparecimento de patologias associadas à perda de função

desta proteína.

1.4 ASSOCIAÇÃO DE MUTAÇÕES NO GENE DE PrP

E TSES

Existe uma série de mutações no gene de PrP

que levam ao

aparecimento das TSEs. O Quadro 1 fornece-nos uma visão panorâmica a

respeito de todas as mutações já descritas, onde se pode observar que

estas ocorrem em toda a extensão da proteína. Além disso, a razão para

uma mutação causar uma sintomatologia específica associada à uma

doença e não a outra, ainda, não foi estabelecida. Neste aspecto é

Pamela Andrade Lourenço Pereda

interessante notar que a mutação que ocorre no resíduo Asp178Asn pode

levar ao aparecimeto de FFI ou CJD, o que determina o desenvolvimento de

uma das doenças é um polimorfismo no aminoácido 129, que varia entre

valina ou metionina. A mutação no códon 178 acompanhada do genótipo

Val129 no mesmo alelo determina o desenvolvimento de CJD, enquanto que

a mutação acompanhada de Met129 causa FFI (MEDORI et al. 1992).

Quadro 1 - Resumo das principais mutações descritas no gene do PrP

Códon Mutação Patologia associada Referências

51-91 Inserção 48 a 216 pb CJD /GSS GOLDFARB et al. (1993)

102 Pro→Leu GSS HSIAO et al. (1989)

105 Pro→Leu GSS YAMADA et al. (1993)

117 Ala→Val GSS DOH-URA et al. (1989)

145 Tyr→STOP GSS GHETTI et al. (1996)

171 Asn→Ser Esquizofrenia SAMAIA et al. (1997)

178 Asp→Asn IFF/CJD GOLDFARB (1991); MEDORI

et al. (1992)

180 Val→ Ile CJD KITAMOTO et al. (1993)

183 Thr→Ala CJD NITRINI et al. (1997)

187 His→Arg GSS CERVENAKOVA et al. (1999)

188 Trh→Lys Demência FINCKH et al. (2000)

196 Glu→Lys CJD PEOC’H et al. (2000)

198 Phe→Ser GSS HSIAO et al. (1992 )

200 Glu→Lys CJD GOLDFARB et al. (1991)

202 Asp→Asn GSS PICCARDO et al. (1998)

208 Arg→His CJD MASTRIANNI et al. (1996)

210 Val→ Ile CJD POCCHIARI et al. (1993)

211 Glu →Gln CJD PEOC’H et al. (2000)

212 Gln→ Pro GSS PICCARDO et al. (1998)

217 Gln→ Arg GSS HSIAO et al. (1989)

232 Met→ Arg CJD KITAMOTO et al. (1994)

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Diferentes mutações associadas a GSS entre elas Pro102Leu,

Pro105Leu e Ala117Val foram notificadas no domínio 102-125, que

representa o sítio de interação de PrP

à Vn e STI1. Uma vez que a

interação de PrP

com estas moléculas está envolvida com distintos

fenômenos biológicos como a diferenciação neuronal e a neuroproteção

(ZANATA et al. 2002; CHIARINI et al. 2002; LOPES et al. 2005; HAJJ et al.

2007), torna-se indispensável investigar se essas mutações estão

associadas a perda de função de PrP

102 (Pro102Leu): Mutação típica de pacientes portadores de GSS, a

doença costuma se apresentar por volta da quarta a sexta década de vida,

os sintomas são síndrome cerebelar progressiva e lenta, com perda da

capacidade mental e distúrbios comportamentais no estágio mais avançado

da doença. Pode-se observar através da análise microscópica depósitos de

material amilóide no cerebelo e no córtex cerebral, associados à alterações

espongiformes (HSIAO et al. 1989).

105 (Pro105Leu): Esta mutação costuma tornar-se evidente em pacientes

com idade média entre 40 e 50 anos de idade, pôde ser observado

clinicamente através de sintomas como a hiperreflexia nos membros

inferiores e sinal de Babinski. Uma análise histológica do córtex cerebral

mostra deposição de PrP

principalmente no córtex motor, corpo estriado,

tálamo e no cerebelo (YAMADA et al. 1993).

117(Ala117Val): Descrita em pacientes de uma família francesa e de duas

famílias inglesas. A faixa etária de manifestação da doença se apresentou

ampla entre 19 e 64 anos de idade, com uma evolução da doença de 2 a 6

Pamela Andrade Lourenço Pereda

anos. Os sintomas apresentados foram a demência pré-senil associada a

sinais extra-piramidais, parkisonismo e ataxia. Histologicamente foi

observada no córtex, gânglio basal, tálamo a deposição de material amilóide,

associados à degeneração espongiforme (DOH-URA et al. 1989).

129(Met129Val): Sabe-se que o polimorfismo (Met129Val) no códon 129 de

PRNP está relacionado à susceptibilidade ao desenvolvimento da doença

esporádica ou adquirida de Creutzfeldt-Jakob (CJD) (WADSWORTH et al.

2004). Este polimorfismo foi identificado pela primeira vez através de um

estudo da doença Gerstmann-Straussler em uma família francesa (DOH-

URA et al. 1989). Posteriormente o mesmo polimorfismo foi determinado em

um estudo no Reino Unido com 22 casos de pacientes com Creutzfeldt-

Jakob. Neste estudo foi encontrado uma maior freqüência de homozigotos

para metionina na posição 129, sendo que 90% dos casos esporádicos de

CJD apresentavam este polimorfismo comparados a 51% de homozigotos

na população normal. Este resultado ressalta a importância do estudo dos

diferentes alelos polimórficos do códon 129 em combinação com as

diferentes mutações patológicas.

DEL BO et al. (2004) mostraram uma associação entre polimorfismo

no códon 129 do gene PRNP e prejuízos cognitivos em indivíduos com

síndrome de Down. Foi encontrada uma diferença significativa na taxa de

declínio da habilidade intelectual em um subgrupo de pacientes que

carregava pelo menos um alelo valina comparado com aqueles com

metionina/metionina. Portanto levando a conclusão que a variabilidade no

Pamela Andrade Lourenço Pereda

gene PRNP pode contribuir para acelerar a taxa de declínio cognitivo nestes

indivíduos.

O genótipo Met/Met ou Met/Val no códon 129 do gene PRNP foi ainda

associado a uma melhora na performance na memória de longa duração em

indivíduos jovens normais quando comparados com um grupo semelhante

apresentando Val em homozigose (PAPASSOTIROPOULOS et al. 2005).

Desta forma, sugerindo a importância do códon 129 nas funções celulares

de PrP

Portanto, o presente trabalho avaliará as mutações em PRNP

associadas a GSS presentes nos códons 102, 105, 117 em combinação com

os polimorfismos valina ou metionina no códon 129.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Expressar proteínas PrP

contendo mutações Pro102Leu, Pro105Leu

e Ala117Val associadas com o polimorfismo 129Met or 129Val e avaliar sua

interação com Vn e STI1, sua distribuição, compartimentalização e

sinalização celular.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Construção dos mutantes de PrP

Pro102Leu, Pro105Leu e

Ala117Val associados com polimorfismo no códon 129 metionina ou

valina fusionados a proteína fluorescente verde (GFP),

2. Avaliação da distribuição celular destes mutantes de PrP

;

3. Avaliação da interação destes mutantes de PrP

com as proteína

STI1 e vitronectina por ensaios de migração por haptotaxia.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

3 MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi submetido a Comissão de ética em pesquisa (CEP)

do Hospital do Câncer na reunião do dia 31/05/2005, os membros da

comissão aprovaram a realização do estudo. Projeto de pesquisa nº: 699/05.

3.1 CLONAGEM DOS MUTANTES DE PrP

102L/129M E DO

ALELO NORMAL COM 129V EM VETOR PGEM

Para a clonagem do mutante de PrP

102L/129M e do alelo normal

129V em vetor pGEM foram utilizados os seguintes iniciadores sintetizados

pela empresa IDT (“Integrated DNA Technologies”) baseados na seqüência

de PrP

humano depositada no -GenBank sob o número AY=008282 (www.

ncbi.nlm.nih.gov):

1 Forward: F1seq 5’ATG CTG GTT CTC TTT GTG 3

2 Reverse:F2seq 5´CTC CCT CAA GCT GGA AAA AGA 3’

Foi utilizado como molde o DNA genômico de pacientes portadores de

doenças hereditárias por prion ou DNA de indivíduos adultos normais

possuem os códons respectivamente 102L/129M ou 102P/129V e de PrPc

mutados. Esses pacientes fazem parte de um estudo conduzido por outra

aluna de nosso grupo (LANDEMBERGER 2006). O gene de PrP

com as

Pamela Andrade Lourenço Pereda

devidas mutações foi amplificado via PCR (reação em cadeia da polimerase)

utilizando Taq polimerase Platinum (Invitrogem). A identificação dos

produtos de PCR foi feita através de gel de agarose 0,8% em tampão

contendo brometo de etídio (10ng/mL). Os fragmentos de DNA foram

visualizados sob luz UV.

Posteriormente foi feita uma purificação dos fragmentos de DNA

amplificados segundo o protocolo fornecido pelo Kit Wizard® SV Gel and

PCR clean-up system (Promega). O produto da purificação foi visualizado

novamente através do gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídio

(10ng/ml). Este produto de PCR purificado foi utilizado em uma reação de

ligação com 400 unidades T4 ligase no vetor pGEM T Easy vector-system

(Promega), por 16 horas. O produto desta reação (3µl) foi empregado na

transformação de 100µl de bactérias competentes DH5α, e incubado por 30

minutos no gelo, juntamente com o tubo controle apenas com bactérias.

Após este período transferimos os tubos para um banho seco a 42ºC por

dois minutos para que ocorra a transformação. Em seguida os tubos foram

colocados no gelo por 3 minutos, e logo após foi acrescentado 1ml de LB

(para 100ml: 1g Triptona, 0,5g extrato de levedura,1g NaCl) (Meio Luria-

Bertani) (Sambrook, 2001) e foi deixado no banho à 37ºC por 1 hora para

recuperação da parede celular da bactéria.

Neste intervalo foram feitas placas de Petri com 14mL de LB ágar

acrescido de XGal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside),

IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) e 50µg/mL de Ampicilina para

que se pudesse fazer a seleção das colônias através da triagem azul/branca,

Pamela Andrade Lourenço Pereda

uma vez que o vetor utilizado codifica a β-galactosidase na região do sítio de

clonagem.

Após o período de 1 hora em que as bactérias foram deixadas no

banho, os tubos foram centrifugados por 1 minuto a 1700 xg. O

sobrenadante foi descartado e o pellet da bactéria foi ressuspendido em

100µl de LB semeado sobre o LB ágar. As placas foram incubadas a 37ºC

durante 16 horas.

Para selecionar os clones que receberam a construção inserto + vetor

corretamente, as colônias foram removidas da placa com auxílio de uma

alça plástica estéril (Fisherbrand®Bac-Loops®) e inoculadas em 50µl de LB

acrescido de 50µg/ml de ampicilina para serem amplificadas via PCR. Os

iniciadores usados foram os mesmos utilizados na amplificação anterior. O

resultado deste PCR foi analisado através de gel de agarose como já citado

anteriormente, um fragmento de 800pb foi identificado e as colônias

positivas foram selecionadas para gerar um pré-inóculo para purificação de

DNA.

3.1.1 EXTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL

Através deste inóculo foi feita uma extração de DNA com o sistema

“Minipreps DNA Purification System” (Promega) seguindo o protocolo do

fabricante. Brevemente, centrifugou-se este inóculo a 9700 xg por 10

minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em

300ul de “cell ressuspension solution”. Em seguida adicionou-se 300µl de

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Cell Lysis solution e o tubo foi invertido algumas vezes para homogenização.

A solução de lise foi inativada com 300µl de “neutralization solution”.

O lisado foi centrifugado por 10 minutos a 20800 xg para separar

debris celulares e DNA genômico. O sobrenadante foi recuperado, foi

adicionado 1ml de resina e a mistura foi incubada por 20 minutos à

temperatura ambiente. A resina foi empacotada em colunas fornecidas pelo

Kit e lavadas com “wash solution” (2mL). Logo após este procedimento a

coluna foi transferida para um tubo e centrifugada a 9700 xg por 2 minutos

para eliminar o tampão de lavagem restante. O DNA foi eluído da resina com

50µl de água quente livre de nucleases com centrifugação por 2 minutos a

9700xg.

O DNA extraído foi analisado através de gel de agarose 0,8%, corado

com Brometo de etídio (10ng/mL). Com esta preparação fez-se o

sequenciamento utilizando o Kit Big Dye e os iniciadores utilizados

anteriormente. A reação foi colocada no termociclador e as ciclagens

utilizadas foram 95ºC por 20 segundos, 60ºC por 1 minuto e 15 segundos e

isto se repetiu por 24 vezes. Após o término das ciclagens, foi feita a

precipitação do DNA com 1µl de acetado de sódio 1,5mM e 40ul de Etanol

95%, incubando-se 15 minutos no gelo. Após a centrifugação de 10 minutos

a 4ºC, aspirou-se todo o sobrenadante, adicionou-se 250ul de Etanol 75% e

centrifugou-se por mais 10 minutos à 9700 xg. Descartou-se novamente o

sobrenadante e o tubo foi colocado na estufa a 56ºC para secar. Após estes

procedimentos foi feito o sequenciamento e para isso foi utilizado o “kit”

“Dynamic

ET terminator cycle sequencing” (Amersham Pharmacia),

Pamela Andrade Lourenço Pereda

conforme instruções do fabricante, e o processamento das mesmas foi

realizado no sequenciador automático ABI Prism 377 DNA Sequencer

(Perkin Elmer).

Finalizando assim a construção da mutação 102P/129V no vetor

pGEM que foi usada como molde para as subclonagens em vetor pEGFP.

3.2 CONSTRUÇÃO DOS MUTANTES 102LEU/129VAL,

105LEU/129VAL, 105LEU/129MET 117VAL/129MET,

117VAL/129VAL EM VETOR QUE EXPRESSA PROTEÍNA

FLUORESCENTE VERDE

3.2.1 PREPARAÇÃO DO VETOR PGFP PARA CLONAGEM DO

PEPTÍDEO SINAL HUMANO

Para que PrP

seja endereçado corretamente para a superfície celular

fusionado a GFP é necessário inserir o fragmento de DNA que codifica para

essa sequência na região à montante (5´) da sequência que codifica GFP.

Para esse fim, usamos como molde DNA genômico humano para

amplificarmos o fragmento de PrP

que codifica a sequência do peptídeo

sinal. Os iniciadores usados foram:

Foward (FHpepsinal)(5’-3’)CCACCGGTAGCAGTCATTATGCGAA

CCT

Reverse (RHpepsinal)(5’-3’)AAACCGGTAAGCAGAGGCCCAGG

TCACT

Pamela Andrade Lourenço Pereda

A ciclagem usada na PCR, com ciclos de 95ºC (desnaturação) 1

minuto, 60ºC (hibridação) 1 minuto, 68ºC (extensão) 1 minuto, repetidos 34

vezes e 68ºC para extensão final por 5 minutos .

O fragmento de DNA correspondente ao peptídeo sinal humano, foi

digerido com enzima Age-I, e purificado para a sua ligação ao vetor pEGFP

previamente digerido com Age-I e desfosforilado.

As etapas de ligação, transformação e sequenciamento foram

realizadas como citado anteriormente (item 3.1).

3.2.2 PREPARAÇÃO DO VETOR PEPTÍDEO SINAL-PEGFP PARA

CLONAGEM DOS MUTANTES

O vetor pGFP-C1 (Clontech) com o peptídeo sinal humano já clonado,

foi purificado com o Kit Clean-Up (Promega) após digestão enzimática com

EcoRI e BamHI, foi desfosforilado durante 30 minutos a 37°C com 10

unidades (U) da enzima Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (Invitrogen). A

reação foi então inativada por 10 minutos a 72°C e novamente purificada. O

vetor digerido, desfosforilado e purificado foi utilizado nas clonagens dos

mutantes.

3.2.3 DESENHO DOS INICIADORES COM MUTAÇÃO NA SEQÜÊNCIA

DE INTERESSE

Foram desenhados iniciadores a serem utilizados nas construções

das mutações sítio dirigidas nos códons Pro105Leu, Ala117Val e Met129Val

Pamela Andrade Lourenço Pereda

de PrP

. Foi utilizado o software Oligo tech para analisar se os iniciadores

formavam dímeros e para verificar a temperatura de annealing dos mesmos.

Iniciador Fw105L

5’-CCGAGTAAGCTAAAAACCAACATG-3’

Iniciador Rv 105L

5’-GTTGGTTTTTAGCTTACTCGGCTT-3’

Iniciador Fw117V

5’-GGTGCAGCAGTAGCAGGGGCAGTG-3’

Iniciador Rv117v

5’-AGCCCCAGCTACTGCAGCACCAGC-3’

Iniciadores que flanqueiam as extremidades 5’ e 3’ do gene de PrPc

(FHIIPrPc):5'CAT GAA TTC T AAG AAG CGC CCG AAG CCT GGA3'

(RHIIPrPc):5'ACT GGA TCC TCA ACC TAC TAT CAG AAA GAT3'

A técnica de PCR recombinante (AUSUBEL et al. 1994) foi utilizada

para construir as mutações sítio dirigidas.

Foram feitas duas reações de PCR uma utilizando o iniciador

FHIIPrPc juntamente com o reverse de cada mutação para amplificarmos a

1ª. Metade da ORF de Prnp e a outra utilizando o iniciador Foward de cada

mutação juntamente com o RHIIPrPc para amplificação da 2ª. Metade da

ORF de Prnp.

Os iniciadores internos se sobrepõem em 7 códons, fazendo com que

as fitas sintetizadas por eles sejam coesivas. O próximo passo foi fazer uma

reação de ligação e extensão destas duas metades sem o uso de

iniciadores, pois cada metade é o próprio iniciador da outra metade. Para

Pamela Andrade Lourenço Pereda

isso usa-se ciclagem apenas de desnaturação, uma hibridação e uma

extensão. Logo depois os iniciadores externos são inseridos no sistema

(FHIIPrP

e RHIIPrP

) para amplificação da nova fita contendo a mutação

desejada.

O produto de PCR foi purificado e em seguida foi feita uma digestão

com as enzimas de restrição EcoRI e BamH, para a ligação ao vetor pEGFP-

C1 (Clontech) digerido previamente com as mesmas enzimas, como já

descrito anteriormente. Após a purificação do produto de digestão o vetor e o

inserto foram ligados utilizando 400 unidades da enzima T4 Ligase, tampão

apropriado da enzima, 25ng vetor, 125ng do inserto e a quantidade

suficiente de água para completar 20ul de reação. Após a adição de cada

um destes componentes a reação foi incubada a 4ºC 16 horas. Foi feita a

transformação como já descrito anteriormente e 16 horas depois foram

selecionadas algumas colônias da placa de transformação. Em seguida, foi

feita uma PCR a fim de verificar quais colônias possuíam o inserto de PrP

As colônias que mostraram-se positivas apresentando uma banda do

tamanho de PrP

, aproximadamente 800 pares de bases, foram inoculadas

em 5ml de LB acrescidos de Kanamicina 50µg/ul, para extração de DNA,

como já descrita anteriormente. A partir desta preparação fez-se a reação de

sequenciamento para verificar se as mutações estavam corretas.

Após a verificação do sequenciamento os clones selecionados foram

submetidos a uma extração de DNA em larga escala.

3.2.4 EXTRAÇÃO DE DNA EM LARGA ESCALA

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Para a realização desta preparação de DNA foi utilizado o Kit

Qiagen® Plasmid Maxi seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, a

cultura foi centrifugada por 10 minutos a 4ºC e 2700 xg e o sobrenadante foi

descartado. O precipitado foi ressuspendido com 10 ml de tampão P1, e

adicionado 10ml de tampão P2, a solução foi invertida gentilmente e em

seguida deixada à temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida foi

acrescentado 10ml de tampão P3 gelado e o tubo foi invertido novamente. A

solução foi deixada no gelo por 15 minutos, enquanto isso a coluna para

filtrar a solução foi equilibrada com tampão QBT, separadamente foi

montado um outro filtro com uma membrana de 0,2µm e acoplado a uma

mangueira de sucção a vácuo com um tubo falcon de 50ml embaixo.

A solução foi filtrada por meio de sucção, e este filtrado foi passado

pela coluna já equilibrada com QBT, o eluato foi desprezado, e a coluna foi

lavada duas vezes com 30ml de tampão QC, o lavado e o DNA foi eluído

com 15ml de tampão QF que desta vez foi armazenado foi desprezado em

um tubo falcon de 50ml. O DNA foi precipitado com 10,5 ml de isopropanol,

e centrifugado por 30 minutos a 4ºC a 8600 xg. O sobrenadante foi

descartado, foi acrescentado etanol 70%, e então foi centrifugado

novamente por 40 minutos a 8600 xg a 4ºC. O sobrenadante foi descartado

e o tubo foi colocado para secar na estufa a 56ºC.

O DNA foi ressuspendido com 500µl de TE (Tris-EDTA) e quantificado

através de absorbância em 260nm e sua qualidade analisada em gel de

agarose 0,8%. Todos os clones selecionados foram armazenados no freezer

-70ºC, com LB 10% glicerol.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

3.3 PADRONIZAÇÃO DA TRANSFECÇÃO DAS CONSTRUÇÕES

DOS MUTANTES DE PRP

EM PEGFP

As linhagens celulares utilizadas foram HEK293 (ATCC

Number:

CRL-1573™): linhagem embrionária proveniente de rim humano, cultivada

em meio MEM

(Gibco™) ,F14 (cedida pelo Dr. David Brown) linhagem

proveniente de fusão de células da linhagem N18TG2 de neuroblastoma

murino e neurônios cerebelares de camundongos deficientes para o gene de

PrP

. Cultivada em meio DMEM

-High Glucose (Gibco™), (BROWN 2001),

MEF

0/0 ‘’

Mice embrionic Fibroblast’’ (linhagem proveniente de fibroblastos

embrionários de camundongos deficientes para o gene de PrP

. Cultivadas

em meio DMEM

(Gibco™). CF10 (cedida pela Dra. Sue Priola) células

derivadas de cérebro de embriões de camundongos deficientes para o gene

de PrP

. Cultivadas em meio Opti-MEM

(Gibco) e 1% de antibióticos

Penicilin/streptavidine (Gibco™), SN56 (fusão de neurônio septal e

neuroblastoma

de camundongo) e N2a (ATCC

Number: CCL-131™) clone

estabelecido a partir de neuroblastoma murino. Cultivadas em meio MEM

(Gibco™) contendo piruvato monossódico 1mM.

3.3.1 TRANSFECÇÃO COM CACL2

As células (4x10

) para transfecção foram semeadas em uma placa

de 35mm e mantidas em cultura por 16 horas. Foram adicionados os

reagentes na seguinte ordem: 3µg de DNA, 187ul H

O, 62,5ul CaCl

1M e

Pamela Andrade Lourenço Pereda

250ul de BBS após 5 minutos de incubação o meio foi aspirado das placas

em cultivo e foi acrescentada a mistura. As células foram incubadas na

estufa úmida a 37ºC com 3% CO

por 5 horas.

Após este período todo o meio das placas foi aspirado e as mesmas

foram lavadas duas vezes com PBS. Em seguida foi colocado meio

apropriado (2ml) nas placas e foram incubadas por mais 24 horas a 37ºC em

estufa úmida com 5% CO

As imagens das células transfectadas foram adquiridas através de um

microscópio de fluorescência utilizado para excitar a molécula fluorescente

(GFP) sob luz ultravioleta (488nm).

3.3.2 TRANSFECÇÃO COM LIPOFECTAMINA

Foram plaqueadas 4x10

células em uma placa de 6 poços usando

Optimem completo acrescido com 10% Soro Fetal Bovino (Invitrogen) e 1%

penicilina e estreptomicina 5000µ/ml (Gibco). Em seguida as células foram

incubadas em estufa úmida 37ºC com 3% CO

por 16 horas.

Para transfectar, foi usado um tubo para diluir 1 e 2 µg de vetor em

150µl de meio Optimem sem soro e sem antibiótico. Em outro tubo foram

diluídas concentrações de 2,5µg, 5 e 10µg de lipofectamina em 150µl de

meio sem soro e sem antibiótico.

As duas soluções foram incubadas separadamente por 5 minutos e

então foram misturadas e incubadas por 20 minutos à temperatura ambiente.

Neste intervalo as placas foram lavadas com meio sem soro e foi

adicionado 1,5 ml de meio Optimem sem soro e sem antibiótico.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Foram adicionados os 300ul da solução (lipofectamina e vetor) sobre

a placa de cultivo contendo 1,5 ml de meio de maneira que a solução ficasse

homogeneizada. Após o período de incubação de 4 horas a 37ºC em estufa

úmida com 5% CO

, o meio foi trocado por Optimem completo e a placa foi

incubada novamente na mesma condição anterior por 24 a 48 horas.

O pico máximo de expressão da quimera GFP-PrP

mutantes se dá

de 24 a 48 horas após a transfecção.

3.3.3 ELETROPORAÇÃO

As cubetas de eletroporação devem ficar expostas a luz ultravioleta

por 15 minutos para esterilização. As células em cultura foram tripsinizadas

e centrifugadas por 5 minutos a 3800 xg e ressuspendidas em 1ml de meio

DMEM 10% soro. Foi colocado em cada cubeta: 2,5ul de tampão BES 0,5M

pH 7,2 na parede no fundo da cubeta, adicionamos também 10µg/ul de DNA

de esperma de salmão, 15µg de DNA e 1X10

de células. As cubetas foram

colocadas no eletroporador (170V, capacitância 950, constante entre 40 e

50). Após estes procedimentos as células foram plaqueadas e mantidas em

estufa úmida a 37ºC por 24 horas com 5% CO

, para posteriormente serem

analisadas através de um microscópio de fluorescência.

3.3.4 TRANSFECÇÃO COM EFFECTENE

A transfecção com Effectene Transfection Reagent 2002 Qiagen, foi

realizada conforme instrução dos fabricantes (ARNOLD et al. 2006).

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3.3.5 LINEARIZAÇÃO DOS VETORES

Os vetores foram linearizados com enzimas cuidadosamente

escolhidas de modo que cortassem apenas um único sítio e que não

prejudicasse nenhuma função importante do vetor. As enzimas de restrição

selecionadas foram a ClaI e ScaI para os vetores pEGFP e pEF6 (vetor de

blasticidina) respectivamente. Os vetores foram digeridos 16 horas à 37ºC, e

purificados com Kit clean Up e dosados no espectrofotômetro (NanoDrop-

1000 Spectrophotometer).

3.4 IMUNODETECÇÃO

As linhagens F14 e HEK293T foram lisadas com PBS NP40 1% (para

100ml- 1% NP-40 1 mL;10% Glicerol 10mL;135Mm NaCl 2,7mL; 20Mm Tris

Ph 8,0 2mL) acrescido de inibidor de proteases. O extrato celular foi

centrifugado por 10 minutos a 15300 xg e 4ºC, o sobrenadante foi passado

para um novo tubo e o precipitado desprezado. A concentração de proteína

foi dosada através de reação colorimétrica pelo reagente de Bradford.

O reagente de Bradford foi diluído 5 vezes em H

O e 200ul da solução

foi adicionada em poços de placas de 96 poços. Foi feita uma curva padrão

com uma proteína de massa conhecida, BSA (Albumina Sérica Bovina) que

foi utilizada como referência para dosagem do extrato protéico celular. Em

seguida a placa foi levada a um leitor de Elisa.

Um total de 50µg de proteína por poço foi aplicada juntamente com

tampão redutor 4x (240mM TRIS HCl, 0,8% SDS, 200mM 2 Mercaptoetanol,

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traços de bromo fenol blue, 40% Glicerol, H

O quantidade suficiente para

12mL). Como controle positivo foi usado um extrato de encefalo fração 30%

(ZANATA et al. 2002)e como marcador foi usado o High Mass Ladder

(Invitrogen). Todos os tubos foram fervidos por 10 minutos antes da

aplicação em gel acrilamida 10% que em seguida foi submetido a uma

eletroforese com SDS Page.

Após a eletroforese o gel foi submetido a transferência para

membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences) em uma amperagem

de 0,04A por 60 minutos.

Após a transferência, a membrana foi corada com Ponceau (0,1%

Ponceau,10% ácido acético) e lavada com H

O para verificar a eficiência da

transferência protéica.

Na etapa de imunodetecção a membrana foi bloqueada com leite

Molico 5% diluído em TBST por 1 hora. Posteriormente foram feitas 3

lavagens com TBST, e incubada com 1mL de leite molico e 1:1000 de

anticorpo primário de mouse anti-PrPc produzido no laboratório (ZANATA et

al. 2002).

A membrana foi incubada na câmara fria a 4ºC por 16 horas e após

este período foi lavada por 3 vezes com TBST (10Mm Tris

pH7,4NaCl150Mm, 0,05% Tween), e incubada com anticorpo secundário

anti-mouse HRP (Amersham) diluído 1:5000 em leite molico por 1 hora à

temperatura ambiente.

A membrana foi revelada com uma solução 1:1 de ECL Western

Blotting Detection Reagents (Amershan Biosciences). O filme “High

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performance autoradiography Amershan Biosciences” foi colocado sobre a

membrana e exposto por 5 minutos. Em seguida o filme foi colocado na

solução reveladora (Kodak), na água e na solução fixadora (Kodak) e

colocado para secar.

3.5 SELEÇÃO COM ANTIBIÓTICO

As células foram selecionadas com 600µg/mL de Geneticina

(Gibco™), ao qual o vetor pEGFP-C1 confere resistência. E foram

acompanhadas durante o período de tempo necessário para que todas

morressem, aproximadamente 15 dias.

3.6 CITOMETRIA DE FLUXO

As células foram retiradas da placa de cultura através de tripsina, a

tripsina foi inativada com meio MEM, 10% soro fetal bovino e 1% piruvato de

sódio (20ml de soro fetal bovino, 2ml de Piruvato (concentração), para 200ml

de meio MEM), e as células foram incubadas a 37ºC por 1 hora para o

restabelecimento da membrana.

As células foram centrifugadas novamente, o sobrenanadante

descartado e as mesmas ressuspensas em PBS 0,5% BSA contendo o

anticorpo anti-PrP

e (1µg/µl) diluído 1:100 e incubada a 4ºC por 1 hora.

Após este período as células foram lavadas 3 vezes com PBS. O

anticorpo secundário anti-mouse FITC (Pharmingen) 1/200 foi diluído em

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100ul de PBS 0,5% BSA e incubado por 1 hora a 4ºC. Em seguida as

células foram lavadas 3 vezes com com PBS e a fluorescência 2

(ficoeretrina-PE) foi medida no citômetro (Fac Scan- Becton Dickinson).

3.7 ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO SUBCELULAR DE PRP

Para analisar a distribuição celular dos mutantes de PrP

, foram

realizadas transfecções em células SN56, uma linhagem celular originária da

fusão de neurônios septais e neuroblastoma de cérebro de camundongo

neonatal. Estas células foram utilizadas devido ao seu amplo uso em

estudos de tráfego de proteínas. As células foram transfectadas com

lipofectamina numa concentração de 2,5µg/µl e 2µg de DNA conforme o

protocolo descrito no item 3.3.2. As células foram plaqueadas em lamínulas

de vidro para microscopia de 22mm, transfectadas e em seguida

diferenciada com Adenosina monofosfato cíclico (AMPc) 2mM em meio

DMEM sem soro com 1% L-glutamina por 48 horas. As lamínulas foram

montadas em aparato próprio e as imagens das células vivas foram

adquiridas em microscópio (Nikon) confocal (Biorad). Os núcleos celulares

foram corados com DAPI 0,14',6-Diamidina-2-fenilindole (0,1µg/ml).

3.8 ENSAIO DE MIGRAÇÃO

Os ensaios foram realizados em câmaras de Boyden (Transwell® –

Corning) com membranas de 6,5mm de diâmetro contendo poros de 8,0µm.

As membranas foram sensibilizadas com 10µg/ml de VN ou 0,5% de BSA

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por 1 hora a 37°C. Para evitar ligações inespecíficas, em seguida as

membranas foram bloqueadas com BSA 0,5% por 30 minutos a 37°C. Em

cada poço foram plaqueadas 2x10

células, que permaneceram incubadas

por 6 horas em estufa com atmosfera constante de 5% de CO

a 37ºC.

Encerrado o período de migração, os poços foram lavados com PBS e as

células fixadas com paraformaldeído (4%) e coradas com intercalante de

DNA DAPI (0,1µg/ml). As células que não migraram, ficando na face

superior da membrana, foram removidas para possibilitar a quantificação.

Imagens de 10 campos aleatórios de cada membrana foram capturadas em

microscópio Olympus IX70 sob flitro UV (SWB). A contagem do número de

células por campo foi realizada com o auxílio de um programa de

processamento de imagem (Image J

Para comparação entre as amostras, os valores de média de número

de células por campo foram normalizados em relação à média obtida das

células N2a transfectadas com o vetor vazio. As análises estatísticas da

média de 3 experimentos independentes foram feitas através da análise de

variância (ANOVA) e teste de comparação múltiplas Tukey-HSD.

3.9 MICROSCOPIA CONFOCAL

As análises feitas sob microscopia confocal (BioRad Radiance) foram

realizadas em microscópio Nikon TE 2000 utilizando laser de argônio

488nm.

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4 RESULTADOS

4.1 CONSTRUÇÃO DOS MUTANTES DE PRPC EM VETOR QUE

EXPRESSA A PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (GFP)

Os mutantes de PrP

foram clonados no vetor pGFP para que fosse

possível analisar a distribuição celular das quimeras GFP-PrP

posteriormente estudar o comportamento desses mutantes em distintos

ensaios biológicos.

A clonagem da mutação no códon Pro102Leu de PrP

no vetor pGEM

se deu a partir da amplificação de DNA genômico de um paciente portador

de GSS que apresentava a mutação de interesse.

Para que fosse possível selecionar os dois alelos do gene de PrP

que apresentasse a mutação P102L associada ou não ao polimorfismo

129M, clonamos o fragmento mutado primeiramente em vetor pGEM

utilizando o sistema de clonagem pGEM T-Easy Vector System (Promega).

Esse sistema foi utilizado na clonagem de fragmentos de DNA

diretamente do produto de PCR que pode ser visualizado na Figura 1.

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Legenda: Produto amplificado e purificado do fragmento de PRNP contendo a mutação

Pro102Leu M- marcador de peso molecular 100 pares de bases, 1 e 2 duplicatas da

construção P102L.

Figura 1 - Gel agarose fragmento amplificado de PrP

Após analisados e conferidos os clones contendo 102Leu/129Met e

102Pro/129Val foram selecionados e utilizados como molde para

subclonagem em vetor pEGFP.

Primeiramente, para que PrP

seja endereçado corretamente para a

membrana plasmática faz-se necessário clonar o peptídeo sinal humano que

sinaliza para sua compartimentalização na superfície celular. Como todos os

nossos mutantes contêm a sequência de PrP

humano, desenhamos

iniciadores para clonar o peptídeo sinal humano a partir de cDNA humano

através de PCR com iniciadores específicos.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

A sequência que representa o peptídeo sinal humano foi inserido no

sítio de AgeI do vetor pEGFP a 5’ da sequência do vetor que codifica EGFP

(veja Figura 2).

Legenda: Figura ilustrativa do vetor pEGFP-C1, em destaque o sítio de AgeI.

Figura 2 - Vetor pEGFP-C1.

A construção pEGFP peptídeo sinal humano foi conferida através de

reação de sequenciamento para confirmarmos a ausência de erros na

adição nucleotídica.

Os clones pEGFP-PrPc Pro102 foram então analisados e o sítio

mutado associado ou não ao polimorfismo 129 pode ser verificado nas

Figuras 3 e 4.

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Legenda: Eletroferograma representativo do sequenciamento do clone não mutado

(Leu102) com o polimorfismo Met129.

Figura 3 - Sequenciamento do clone Leu102/Met129.

Legenda: Eletroferograma representativo do sequenciamento do clone que apresenta a

mutação/polimorfismo nos códons Pro102 e Val129.

Figura 4 - Sequenciamento do clone Pro102/Val129.

102 L

129 M

102 P

129 V

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Já para as construções das mutações 102L/129M, 105L/129M,

105L/129V, 117V/129M, 117V/129V, WT/129V, WT/129M utilizamos a

técnica de PCR recombinante para alterar a sequência nucleotídica e

consecutivamente o aminoácido de interesse, já que não tínhamos DNA

genômico de pacientes que apresentavam essas mutações.

A técnica de PCR recombinante foi utilizada para que as duas

metades da ORF de PRNP sejam amplificadas separadamente.

Primeiramente é feita uma PCR para amplificar a primeira metade da ORF

com iniciador FHIIPrPc (primer F5’) juntamente com o iniciador reverse

(Primer R3’) que possui a mutação de interesse. A seguir uma segunda

reação foi realizada para amplificar a segunda metade da ORF de PRNP

com o primer RHIIPrPc juntamente com o foward de cada mutação de

interesse. Os iniciadores internos sobrepõem-se em sete códons, fazendo

com que as fitas sintetizadas sejam coesivas, o próximo passo foi fazer uma

reação de ligação e extensão destas duas metades.Um esquema da técnica

pode ser observado na Figura 5.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Legenda: Esquema ilustrativo de PCR recombinante

Figura 5 - PCR recombinante.

Desta maneira, todos os mutantes Pro102/129M e Pro105, Ala117

associados com polimorfismo 129M ou V foram clonados no vetor pEGFP.

As construções pEGFP- PrP

mutantes foram digeridas com EcoRI e

BamHIII para confirmação do tamanho dos insertos (Figura 6) e além disso a

os produtos clonados foram re-sequenciados para descartarmos a

possibilidade de alteração de bases nucleotídicas. Desta forma, todas as

mutações em PrP

associadas ao polimorfismo no 129 (Met ou Val) foram

construídas no vetor pEGFP e sequênciadas.

PCR das metades

Reação de

extensão

PCR das metades

unidas

PCR recombinante

Ponto para inserção

Primer F ext.

Primer R ext.

Primer R int.

Primer F int.

Primer R int.

Primer F ext.

Primer R ext.

Primer F int.

Primer F ext.

Primer R ext.

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Legenda: Figura ilustrativa da digestão diagnóstica das construções pEGFP- PrP

mutantes

digeridas com Eco RI e Bam HIII para liberação do inserto. Da esquerda para a direita:

Marcador de peso molecular 100 pares de bases, (uncut) não digerido, 1- 102Leu/129Met,

2-102Leu/129Val, 3-105Leu/129Met, 4-105Leu/129Val, 5-117Val/129Met, 6- 117Val/129Val,

7-WT/129Val, 8-WT/129Met e + controle positivo.

Figura 6 - Digestão diagnóstica.

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Legenda: Eletroferograma representativo do sequenciamento dos clones Pro102, Leu102,

Pro105 e Leu105.

Figura 7 - Sequenciamento dos clones P102L, P105L.

Os eletroferogramas mostrando os códons Pro102, Leu102,

Pro105 e Leu105 nos produtos de PRNP amplificados por PCR e clonados

no vetor de expressão estão ilustrados na figura 7. As variantes dos códons

117 e 129 são mostradas na Figura 8.

Após a conferência de todas as seqüências das construções

GFP-PrP

mutados foram feitas as preparações de DNA plasmidial que

foram usadas em ensaios de transfecção celular.

102 P 102 L

105 P 105 L

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Legenda: Eletroferograma representativo do sequenciamento dos clones que apresentam

as mutações Ala117, Val117 e os polimorfismos Met129 e Val129.

Figura 8 - Sequenciamento dos clones Ala117, Val117, Met129 e Val129.

4.2 PADRONIZAÇÃO DAS TRANSFECÇÕES DE MUTANTES

FUSIONADOS A PEGFP EM DIFERENTES LINHAGENS

CELULARES.

Primeiramente, a nossa célula de escolha foi a linhagem F14

originada a partir da fusão de neurônios cerebelares com neuroblastomas de

camundongo deficiente para Prnp (BROWN et al, 2001). Essa célula foi

escolhida pois não expressa PrP

, e portanto a proteína endógena não

interfereria em experimentos biológios nos quais as quimeras GFP-PrP

exógenas estariam sendo expressas.

117 V

117 A

129 M

129 V

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Estas células foram transfectadas com o vetor de expressão para a

proteína tipo selvagem com Val no códon 129. Após seleção com G418 foi

realisado um ensaio de imunodeteção para a proteína PrP

Na Figura 9 podemos observar a expressão da proteína recombinante

(GFP-PrPc129V) na altura de 66KDA. Para nossa surpresa pudemos

observar que as células F14 expressam a proteína PrP

endógena.

Portanto, ao contrário do que se esperava essa linhagem não é desprovida

de PrP

Legenda: Imunodetecção de PrP

em extrato de célula da linhagem F14 fusionada a GFP

(F14pEGFP), extrato de célula transfectada polimorfismo Val129 fusionado a GFP

(GFPPrPc129V),) e extrato de célula F14 revelado com anticorpo anti-PrP

(esquerda) e

com anti-GFP (direita).

Figura 9 - Linhagem F14 expressa PrP

Para confirmar que esta linhagem realmente expressava PrP

, um

ensaio de citometria de fluxo foi realizado. Como pode ser visto, através do

gráfico da Figura 10, um aumento importante da fluorescência na superfície

Pamela Andrade Lourenço Pereda

celular foi observado quando as células foram avaliadas com um anticorpo

policlonal contra PrP

(M228). Portanto, este resultado confirma a presença

de PrP

na linhagem F14. O soro pré-imune de camundongo não reconhece

nenhum antígeno (SN) (Figura 10).

Legenda: Célula F14 foi reagida com soro pré-imune (SN) e com anticorpo anti-PrP

(M228).

Figura 10 - Linhagem F14 expressa PrP

endógeno na superfície.

Desta forma, após a constatação de que a célula F14 expressa PrP

e que não poderia ser utilizada para os próximos experimentos, foi

necessário fazer uma nova pesquisa afim de se encontrar uma outra célula

deficiente para PrP

Nosso grupo imortalizou uma linhagem celular originária de cultura

primária de fibroblasto embrionário de camundongo deficiente para PrP

Essa foi imortalizada por passagem serial na cultura e denominada de

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MEF

0/0

(“Mice Embrionic Fibroblast”) (MURAS 2005). Foram feitas

padronizações para a co-transfecção destas células com DNA, através do

método de lipofectamina, das construções GFP ou GFP-PrP

tipo-selvagem

mais o vetor que confere resistência a blasticidina. A eficiência de

transfecção foi de aproximadamente 10%. Além disso, iniciamos a

padronização de seleção celular pelo antibiótico realizando uma curva dose-

resposta como mostra a Figura 11.

Legenda: a- Painéis A, B e C células MEF

0/0

tratadas respectivamente com 5, 10, 15 µg/ml

de blasticidina, D controle sem tratamento.

Figura 11 - Curva dose-resposta da sensibilidade a blasticidina de células

MEF

0/0

Depois de várias tentativas verificamos que a transfecção das

construções GFP-PrP

em MEF

0/0

apresentaram uma eficiência muito baixa

e decidimos prosseguir com outra linhagem. A doutora Suzette A. Priola nos

cedeu células CF10 derivadas de cérebro de embrião de camundongos

Prnp

0/0

, imortalizadas com pSV3-neo e selecionadas com G418. Sendo

assim, iniciamos novas padronizações de transfecção com estas células,

Pamela Andrade Lourenço Pereda

porém antes dos experimentos fizemos uma imunodetecção para confirmar

a ausência de PrP

nestas células, como mostra a Figura 12.

Extrato de CF10, F14 (controle positivo, pois expressa PrP

), e

extrato de cérebro precipitado com 30% de sulfato de amônio foram

submetidos a SDS-PAGE 10% seguido por imunodetecção com anticorpo

contra PrP

. Como mostrado na Figura 12, apenas os controles positivos

F14 e extrato de encefalo 30% (sulfato de amônio) reagiram contra o

anticorpo anti-PrPc, indicando que a linhagem CF10 é desprovida de PrP

Legenda- Linhagem F14 (controle positivo), extrato de encefalo fração 30% em sulfato de

amônio (controle positivo) e linhagem celular CF10.

Figura 12 - Células CF-10 não expressam PrP

endógeno.

30% F14 CF10

kDa

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Portanto, seguimos com os ensaios de transfecção na linhagem

CF10, uma vez que a mesma é desprovida de PrP

endógeno, como

confirmado através de imunodetecção (Figura 12) e citometria de fluxo (dado

não mostrado).

A transfecção pelo método de cálcio como já padronizado para as

outras linhagens, mostrou-se bastante tóxica para CF10 (dado não

mostrado) A melhor condição de transfecção encontrada foi com

lipofectamina 2,5µg e 2µg de DNA em placa de 35mm com 4x10

células. As

células foram, co-transfectadas com uma concentração 10 vezes menor do

vetor que confere resistência a blasticidina. A eficiência de transfecção de

CF10 com lipofectamina foi de aproximadamente 10%. Porém, em busca de

uma maior eficiência na transfecção de CF10, foram testadas outras

abordagens como: eletroporação e effectene (reagente comercial utilizado

em transfecções que promete uma maior eficiência, usado juntamente com

um tampão Enhancer, o Effectene atua formando micelas, englobando o

DNA facilitando sua entrada na célula). A eletroporação, cuja metodologia

está detalhadamente descrita em material e métodos, não repercutiu numa

boa eficiência de transfecção. Desta forma, seria necessário re-padronizar

todo o protocolo preexistente para esse tipo celular, o que exigiria muito

tempo. Partimos então para uma segunda alternativa que pensava-se ser

menos tóxica para a célula: transfectá-la com effectene (Qiagen). Células

CF10 foram transfectadas com effectene, conforme material e métodos. Os

dados não serão apresentados, pois os resultados não foram satisfatórios.

Desta forma, optamos por utilizar uma linhagem celular provinda de

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neuroblastoma murino (ATCC CAT Nº CCL-131) a Neuro-2a ou N2a, já que

esta apresentou melhor eficiência de transfecção com lipofectamina na

concentração de 2,5 µg/µl mas que apresenta expressão de PrP

endógena.

Além disso, observamos que células SN-56 (neurônios septais

imortalizados) apresentam uma eficiência de transfecção semelhante às

N2a, mas com a vantagem de apresentarem uma relação nucleo/citoplasma

menor que células N2a. Isto permite analisar com mais precisão a

distribuição celular das moléculas quimeras GFP/PrP

Portanto, as células SN-56 foram transfectadas transitoriamente e

usadas para avaliação da distribuição celular das proteínas mutantes de

PrP

. Já as células N2a foram transfectadas e clones expressando as

proteínas de interesse foram isolados e avaliados em ensaios de migração.

Quadro 2 - Linhagens celulares testadas.

Linhagem

Celular

Método de

Transfecção

Eficiência de

Transfecção

Aplicação

Hek 293

Cálcio

40% Imunodetecção

F14

Lipofectamina

40% Não utilizada

MEF%

Lipofectamina

10% Não utilizada

CF10

Todos

5% Não utilizada

N2a

Lipofectamina

40% Migração Celular

SN56

Lipofectamina

40% SublocalizaçãoCelular

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4.3 AVALIAÇÃO DA LOCALIZAÇÃO SUB-CELULAR DE PRP

Células da linhagem SN56 foram transfectadas com as construções

de PrP

e após 2 dias de diferenciação a compartimentalização subcelular

das quimeras foi avaliada utilizando um microscópio (Nikon) confocal

(Biorad) (Figura 13).

Como podemos observar PrP

fusionado a GFP é corretamente

endereçado a membrana, e cicla entre esta estrutura e uma região

perinuclear previamente mostrada como sendo o complexo de Golgi (Lee et

al. 2001) (seta, imagem G, Figura 14).

As mutações nos códons 102 e 105 parecem não exercer nenhum

efeito na localização subcelular de PrP

, que continua sendo corretamente

enviado a membrana e acumulando no complexo de Golgi. A mutação no

códon 117, quando associada ao códon 129Met, tampouco apresenta

alteração na distribuição subcelular. No entanto quando esta última está

associada ao códon 129Val, apresenta distribuição completamente alterada,

encontrando-se dispersa pelo citoplasma da célula Figura 13 (P e Q). Esta

alteração da distribuição já sugere, per se uma alteração na função da

proteína. Além disso, o não endereçamento correto desta proteína ao

retículo endoplasmático e Complexo de Golgi deve necessariamente implicar

no comprometimento de sua glicosilação.

Avaliamos ainda a expressão de PrP

nas células transfectadas com

os mutantes através de imunodetecção, a fim de confirmarmos sua massa

Pamela Andrade Lourenço Pereda

molecular. Para essa análise utilizamos a linhagem HEK293, devido a sua

alta eficiência de transfecção.

Legenda: Proteínas quimeras GFP-PrP

transfectadas em SN56. A-B WT/129Met, C-D

WT/129Val, E-F 102Leu/129Met, G-H 102Leu/129Val, I-J 105Leu/129Met, L-M

105Lleu/129Val, N-O 117Val/129Met, P-Q 117Val/129Val (PrP

encontra-se disperso no

citoplasma). A Seta branca na figura G indica a região perinuclear.

Figura 13 - Imagem em microscopia confocal da sub-localização das

proteínas quimeras.

Na Figura 14 pode-se observar que todos os mutantes exceto o

117Val/129Val apresentam-se com a massa molecular semelhante

PQPQ

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(aproximadamente 66 kDa) devido a fusão com GFP. Já a proteína com

mutação no códon 117Val/129Val parece estar sendo degradada, sua

localização no gel está em torno de 45 kDa. Essa alteração na massa

molecular pode ser causada por uma degradação da proteína. Que poderia

ocorrer devido a localização citoplasmática desta proteína PrP

mutante e

sua possível exposição a maior degradação por processamento proteolítico.

Legenda: Western blot obtido a partir de extratos de células HEK 293 transfectadas com os

mutantes de PrP

e revelado com anticorpo anti-PrP

policlonal (M235). 1-HEK sem

transfectar, 2- HEK GFP, 3- WT/129Met, 4- WT/129Val, 5-102Pro/129Met, 6-

102Leu/129Val, 7-105Leu/129Met, 8-105Leu/129Val, 9-117Val/129Met e 10-117Val/129Val.

Figura 14 - Western blotting do pool de células HEK 293 transfectadas com

os mutantes.

4.4 GERAÇÃO DE CLONES CELULARES DE CÉLULAS N2A

TRANSFECTADAS COM pEGFP ASSOCIADO AOS MUTANTES DE

PRP

kDa

123

567

Pamela Andrade Lourenço Pereda

As células N2a transfectadas com as quimeras pEGFP-PrP

tipo

selvagem e mutantes e selecionadas com antibiótico (G418), foram

analisadas inicialmente através do ensaio de citometria de fluxo apenas pela

fluorescência emitida por GFP. Como observado na Figura 15, todas as

células que receberam as construções emitem fluorescência quando

comparadas ao controle (célula não transfectada). Conseqüentemente, isso

indica que as células expressam tanto PrP

tipo selvagem como mutantes,

uma vez que GFP está sob o mesmo promotor de PrP

Após verificar que as células N2a transfectadas com as quimeras

estavam expressando as construções GFP-PrP

, confirmamos a expressão

de PrP

através de ensaios de citometria de fluxo utilizando o anticorpo

monoclonal anti-PrP

humano (3F4). Este anticorpo reconhece somente o

PrP

humano, possibilitando o reconhecimento apenas da proteína exógena

na superfície celular (PrP

humano fusionado a GFP) mas não de PrP

endógeno murino.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Legenda: Histogramas representativos de ensaios de citometria de fluxo mostrando o

deslocamento do pico de fluorescência de GFP em relação a célula N2a não transfectada

(curva cinza), células transfectadas com A-102Leu/129Met, B-102Leu/129Val, C-

105Leu/129Met, D-105Leu/129Val e a direita E-117Val/129Met, F-117Val/129Val e G-GFP.

Figura 15 - Expressão das construções GFP-PrP

nas células N2a.

Na Figura 16 estão representados os histogramas das células

transfectadas com o PrP

tipo selvagem com metionina ou valina no códon

polimórfico 129. Podemos notar um deslocamento das curvas que

representam a expressão de PrP

humano (quimeras GFP) nas células

transfectadas.

Intensidade de Fluorescência

Número de Células

Intensidade de Fluorescência

Número de Células

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Legenda: As células N2a foram incubadas com IgG Pré Imune (curva azul) ou anticorpo

monoclonal anti-PrPc humano 3F4 (curva cinza) . Painel A- a quimera pEGFP WT/129Met

e painel B- WT/129Val.

Figura 16 - Histograma representativo do ensaio de citometria de fluxo.

Já na Figura 17 estão representados os histogramas do ensaio de

citometria de fluxo das células transfectadas com as construções pEGFP-

PrP

contendo as mutações selecionadas, em combinação com as duas

variantes do alelo polimórfico 129. Como podemos notar as células

expressando os mutantes tiveram o pico de fluorescência deslocado,

indicando sua expressão na superfície celular.

Durante a análise das células transfectadas, observamos que a

população de células era bastante heterogênea quanto a expressão de

PrP

Intensidade de Fluorescência

Número de células

3F4 3F4

WT/V

IgG IgG

3F4 3F4

WT/V

IgG IgG

Quantidade de Células

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Legenda: As células foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-PrP

humano 3F4

(curva azul), mostrando o deslocamento do pico de fluorescência em relação ao controle

negativo IgG (curva cinza). Em A-102Leu/129Met, B-102Leu/129Val, C-105Leu/129Met, D-

105Leu/129Val, E-117Val/129Met e F-117Val/129Val.

Figura 17 - Histograma representativo dos ensaios de citometria de fluxo

Há um deslocamento indicando que há células expressando a

proteína mutante, mas também há células com níveis muito baixos de

expressão. Com o intuito de selecionar somente as células com maior

quantidade das proteínas mutantes, optamos por isolar clones celulares

através de diluição seriada. Sendo assim, partindo de células transfectadas

e selecionadas com G418, foram feitas diluições seriadas para a obtenção

de aproximadamente 150 células que foram depositadas em placas de 96

poços, sempre sob seleção positiva com o antibiótico G418. Após o

plaqueamento, os poços foram analisados ao microscópio e aqueles que

102L/M 102L/V

105L/M

105L/V

117V/M

117V/V

102L/129M 102L/129V

105L/129M

105L/129V

117V/129M

117V/129V

102L/M 102L/V

105L/M

105L/V

117V/M

117V/V

102L/129M 102L/129V

105L/129M

105L/129V

117V/129M

117V/129V

Pamela Andrade Lourenço Pereda

apresentavam apenas uma célula foram marcados e tiveram a multiplicação

celular acompanhada. Quando as células atingiram a confluência foram

transferidas para poços de 15mm e posteriormente para garrafas de cultura

celular de 25cm

. Estas células foram então analisadas por citometria de

fluxo para a fluorescência de GFP.

Legenda: Histograma representativo de ensaios de citometria de fluxo com a leitura apenas

da fluorescência de GFP. Mostrando o deslocamento do pico de fluorescência (curva azul)

com relação a N2a não transfectada. Painel A clone pEGFP PrP

WT/129Met e painel B

pEGFP- PrP

WT/129Val.

Figura 18 - Clones de células N2a transfectadas com PrP

(polimorfismos

no codon 129).

A Figura 18 apresenta os histogramas obtidos pela citometria de fluxo

de dois clones de células transfectadas com PrP

tipo selvagem contendo

metionina ou valina no códon 129., derivados de clones isolados por diluição

limitante.

N2a

WT HUMANO 3F4

N2a

WT/V HUMANO 3F4

N2a

WT HUMANO 3F4

N2a

WT/V HUMANO 3F4

A B

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Legenda:Histograma representativo de ensaios de citometria de fluxo com leitura apenas

da fluorescência de GFP. Deslocamento do pico de fluorescência das células que

expressam os mutantes (curva azul) em relação a N2a não transfectada (curva cinza).

Figura 19 - Clones das células transfectadas com PrP

(GFP ou mutações

nos codons 102, 105 e 117).

A Figura 19 apresenta os histogramas obtidos por citometria de fluxo

de seis clones de células transfectadas com PrP

apresentando as

mutações nos códons 102, 105 e 117 em associação ao polimorfismo no

117V/129M 117V/129V

105L/129V

105L/129M

102L/129M

102L/129V

117V/129M 117V/129V

105L/129V

105L/129M

102L/129M

102L/129V

Pamela Andrade Lourenço Pereda

códon 129. Cabe ressaltar que após a seleção clonal a expressão das

quimeras se manteve homogênea.

Foram selecionados e analisados, um total de 110 clones. Destes,

alguns dos que apresentavam fluorescência de GFP semelhante foram

selecionados para a realização do experimento de migração. Dos clones

analisados, obtivemos 26 com expressão adequada das quimeras.

Para nos certificarmos quanto a expressão dos mutantes na superfície

celular dos clones foi realizada um segundo ensaio de citometria de fluxo

com o anticorpo 3F4que reconhece a proteína PrP

humana, (Figuras 20 e

21).

Legenda: PrP

endógeno (camundongo) não é reconhecimento de pelo anticorpo 3F4.

Figura 20 - Expressão de PrP

em células N2a.

Para avaliar a expressão de PrP

(endógeno mais ectópico) entre os

clones testamos um anticorpo que reconhecesse tanto a proteína endógena

(PrP

murino) quanto a proteína exógena (PrP

humano). Desta forma

N2a

Pamela Andrade Lourenço Pereda

poderíamos estimar quanto de PrP

total há na superfície celular e o quanto

de PrP

foi acrescentado a célula.

O anticorpo escolhido foi o policlonal (M235) que produzimos em

nosso laboratório inoculando PrP

recombinante em camundongos

deficientes para o gene de PrP

(ZANATA et al. 2002). Como controle do

reconhecimento do anticorpo utilizamos o anticorpo 3F4.

Legenda: Histograma representativo do ensaio de citometria de fluxo com o anticorpo 3F4

para avaliar a expressão de PrP

exógeno. N2a- célula controle, WT/129Met, WT/129Val,

102Leu/129Met, 102Leu/129Val, 105Leu/129Met, 105Leu/129Val, 117Val/129Met e

117Val/129Val.

Figura 21 - Citometria de fluxo dos clones de N2a com o anticorpo 3F4.

Pode-se observar na Figura 22 onde foram testadas células HEK 293,

derivadas de rim de embrião humano), que o anticorpo policlonal (M235)

apresentou um deslocamento maior do que o anticorpo monoclonal 3F4.

Indicando que o anticorpo M235 reconhece tanto a proteína PrP

camundongo como a proteína ectópica humana.Cabe ressaltar que foi

N2a N2a

N2a

N2aN2a

N2a

WT/129M WT/129V 102/129M

102/129V

105/129M

105/129V 117/129M

117/129V

N2a N2a

N2a

N2aN2a

N2a

WT/129M WT/129V 102/129M

102/129V

105/129M

105/129V 117/129M

117/129V

Pamela Andrade Lourenço Pereda

realizada uma curva de titulação para ambos anticorpos e o melhor título foi

representado nas Figuras 20, 21 e 22.

Legenda:Teste em células humanas HEK 293 para avaliar se o anticorpo policlonal M235

reconhece PrP

humano à semelhança do anticorpo monoclonal 3F4. O gráfico demonstra

que o M235 apresenta um deslocamento de fluorescência maior que o anticorpo 3F4 e que

portanto deve reconhecer tanto a PrP endógena, como a ectópica.

Figura 22 - Anticorpo policlonal M235 reconhece PrP

humano.

Com esse resultado, prosseguimos os experimentos quantitativos da

expressão de PrP

nos clones isolados usando o anticorpo M235. A

vantagem do seu uso neste estudo se dá devido a capacidade deste

anticorpo em reconhecer tanto a proteína endógena quanto ectópica,

permitindo realizar análises comparativas e determinar valores de expressão

relativa da proteína PrP

humana.

Controle

3F4

M235

Controle

3F4

M235

Pamela Andrade Lourenço Pereda

4.5 ANÁLISE QUANTITATIVA DA EXPRESSÃO DE PRPC NOS

CLONES DE CÉLULAS N2A TRANSFECTADAS COM OS

MUTANTES DE PRPC

Inicialmente foi avaliado um clone de células N2a por mutação de

interesse (denominados clones #1). Os valores de fluorescência média para

cada clone obtidos a partir de dois ensaios independentes estão colocados

na Tabela 1. O valor de fluorescência para o clone de células N2a que

recebeu o vetor vazio (apenas o vetor de expressão de GFP) foi considerado

igual a 1 e os outros valores são relativos a este. Podemos observar que os

clones expressam no máximo 3 vezes mais proteína ectópica do que

endógena. Este é um ponto positivo uma vez que uma superexpressão da

proteína ectópica pode causar alterações na funcionabilidade celular. Por

outro lado, há clones como o Leu105/129Met e o Val117/129Val cuja

expressão da proteína PrP

é semelhante ao da célula que recebeu apenas

o vetor vazio, portanto que não expressa PrP

ectópico.

Tabela 1 - Média de intensidade de fluorescência dos Clones #1 através de

citometria de fluxo.

Média de intensidade de Fluorescência

GFP WT WT/V 102 102V 105 105V 117 117V

Ensaio 1

60,43 97,34 119,7 187,69 128,64 61,4 129,8 82,49 57,25

Valor Relativo 1

GFP

1 1,61 1,97 3,11 2,13 1,02 2,15 1,37 0,95

Ensaio 2

14,2 31,62 50,03 32,2 57,23 22,47 38,2 31,06 11,86

Valor relativo 2

GFP

1 2,23 3,52 2,27 4,03 1,58 2,69 2,19 0,84

Valores (média de intensidade de fluorescência) de dois ensaios independentes.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Um segundo grupo de clones (clones #2) foi também avaliado por

citometria de fluxo para quantificação da expressão de PrP

onde foram

quantificadas as intensidades de fluorescência (valor médio de intensidade

de fluorescência dos eventos lidos) fornecida pelo programa BD CellQuest

Pro. A Tabela 2 mostra estas quantificações bem como os valores relativos

de expressão de PrP

em comparação com as células N2a que receberam o

vetor vazio. Este último clone (N2a-GFP) é differente daquele usado como

controle na Tabela 1. Para este segundo grupo de clones pode-se verificar a

expressão ectópica de PrP

quando comparados ao clone apenas com GFP,

com excessão dada aos clones WT e ao 117Val/129Val.

Tabela 2 - Média de intensidade de fluorescência dos Clones #2 através de

citometria de fluxo.

Média de intensidade de

Fluorescência

N2a GFP WT WT/V 102 102V 105 105V 117

117V

Ensaio 1

51,63

42,64 29,47 146,66 111,66 190,19 74,44 90,9 39,83

39,16

Valor

Relativo 1

1,21 1 0,69 3,43 2,61 4,46 1,74 2,13 0,93 0.92

Ensaio 2 83,27 68,18 69,02 188,12 217,91 191,34 103,11 159,75 95,72

72,32

Valor

relativo 2

1,22 1 1,01 2,75 3,19 2,80 1,51 2,34 1,40 1,06

Valores (média de intensidade de fluorescência) de dois ensaios independentes.

A expressão de PrP

não foi alterada quando as células N2a

receberam o vetor vazio e expressaram apenas a proteína GFP (células

transfectadas apenas com o vetor vazio), indicando que esta proteína não

Pamela Andrade Lourenço Pereda

interfere nas concentrações endógenas de PrP

. Por outro lado, o mutante

117Val 129Val tanto do grupo de clones #1 (tabela 1) como do grupo #2

(Tabela 2) não apresentam aumento de PrP

na superfície célular. Este fato

pode ser explicado por este mutante ficar retido no citoplasma (Figura 13,

figura 19F) e apresentar uma alta degradação (Figura 14).

4.6 ENSAIOS DE MIGRAÇÃO CÉLULAR À VITRONECTINA DOS

CLONES DE N2A EXPRESSANDO PRP

MUTANTES

A Figura 23 mostra resultados de ensaios independentes de migração

celular à vitronectina do primeiro grupo de clones isolado contendo cada

uma das mutações WT/129Met, WT/129Val, 102LeuL/129Met,

102Leu/129Val, 105Leu/129Met, 105Leu/129Val, 117Val/129Met,

117Val/129Val e clones com vetor vazio (GFP).

Os resultados de todos os ensaios foram normalizados em relação

aos clones GFP. Este parece ser o melhor controle uma vez que leva em

conta a possibilidade da expressão de GFP interferir na migração celular.

Não houve diferença de migração das células à vitronectina quando

os clones com os mutantes de PrP

foram comparados com aquele

expressando a proteína normal (Figura 23).

O mesmo experimento de migração à vitronectina foi realizado para o

grupo de clones #2 e novamente não houve diferença entre eles (figura 24).

Também foi realizado o teste Mann-Whitney para a comparação das médias

independentes entre os clones 1 e clones 2, que mostrou não haver

Pamela Andrade Lourenço Pereda

diferença estatística entre estes valores (Figura 25). Isso indica que os

resultados obtidos não foram dados por efeitos clonais entre as células.

Portanto, estes dados apontam que mutações nos aminoácidos 102,

105 e 117, localizados dentro do sítio de interação de PrP

a vitronectina,

combinadas com o polimorfismo 129Met ou 129Val em PrP

não alteram a

capacidade das células de migração à vitronectina.

Legenda: Gráficos representativos de 6 ensaios independentes de migração celular com os

clones N2a (controle de célula sem transfectar), GFP (controle de célula transfectada

apenas com o vetor GFP), WT/129Met, WT/129Val, 102Leu/129Met, 102Leu/129Val,

105Leu/129Met, 105Leu/129Val, 117Val/129Met, 117Val/129Val. A migração do clone

tansfectado apenas com GFP foi considerada igual a um e o valor dos clones é relativo a

este. Análise de variância (ANOVA) e teste de comparação múltipla Tukey-HSD.

Considerou-se uma diferença estatisticamente significativa quando p<0,05 em relação a

migração dos clones que expressam PrP

WT.

Figura 23 - Ensaio de migração à vitronectina com os clones N2a #1.

Clones 1Clones 1

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Legenda: Gráficos representativos de 3 ensaios independentes de migração celular

com os clones N2a (controle de célula sem transfectar), GFP (controle de célula

transfectada apenas com o vetor GFP), WT/129Met, WT/129Val, 102Leu/129Met,

102Leu/129Val, 105Leu/129Met, 105Leu/129Val, 117Val/129Met, 117Val/129Val. A

migração do clone tansfectado apenas com GFP foi considerada igual a um e o valor dos

clones é relativo a este. Análise de variância (ANOVA) e teste de comparação múltipla

Tukey-HSD. Considerou-se uma diferença estatisticamente significativa quando p<0,05 em

relação a migração dos clones que expressam PrP

WT.

Figura 24 - Ensaio de migração à vitronectina com os clones N2a #2.

Clones 2Clones 2

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Legenda: N2a (controle de célula sem transfectar), GFP (controle de célula transfectada

apenas com o vetor GFP), WT/129Met, WT/129Val, 102Leu/129Met, 102Leu/129Val,

105Leu/129Met, 105Leu/129Val, 117Val/129Met, 117Val/129Val. Comparação entre médias

independentes pelo teste Mann-Whitney. Considerou-se uma diferença estatisticamente

significativa quando p<0,05.

Figura 25 - Gráfico comparativo dos valores relativos de migração à

vitronectina dos clones N2a #1 e #2.

4.7 ENSAIOS DE MIGRAÇÃO CELULAR À STI1 DOS CLONES

DE N2A EXPRESSANDO PRP

MUTANTES

O presente trabalho previa a realização de ensaios de migração à

STI1 uma vez que estes mutantes estão inseridos dentro ou muito próximos

ao sítio de PrP

que liga esta proteína. Entretanto, nenhuma capacidade

migratória das células foi observada quando se usava STI1 em ensaios de

haptotaxia. Portanto, esta abordagem ficou impossibilitada no presente

trabalho.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

5 DISCUSSÃO

Inúmeros trabalhos sobre mutações no gene de PrP

já foram

publicados,

porém, a grande maioria destes referem-se ao fenótipo das

doenças de prion, biossíntese e processamento das proteínas mutadas.

Uma das hipóteses, que é largamente aceita é que o acúmulo de PrP

ou de

uma forma tóxica da molécula de prion seja a principal causadora da doença

(HETZ et al. 2003). A natureza da partícula tóxica ainda é alvo de grande

discussão (SILVEIRA et al. 2005).

Entretanto, dois fatos importantes devem ser levados em conta: a

descrição de que em algumas formas das doenças por prions há

degeneração neuronal sem que se detecte depósitos de PrP

(DORANDEU

et al. 1998; GRAY et al. 1999; CHRÉTIEN et al. 1999), e o número crescente

de descrições de funções celulares de PrP

(MARTINS et al. 2002).

Portanto, reforçando a hipótese de que a perda de função de PrP

pode

contribuir para a patogênese desta doença.

Uma vez que existem formas da doença causadas por mutações

específicas no gene PRNP, fica evidente que verificar a perda de função

nestas moléculas é uma abordagem bastante promissora.

Neste estudo foram geradas construções GFP- PrP

apresentando as

mutações Pro102Leu, Pro105Leu e Ala117Val combinadas com os

polimorfismos 129Met ou 129Val, sendo que todas estas formas mutantes

Pamela Andrade Lourenço Pereda

estão relacionadas a GSS. Estas mutações localizam-se no sítio de ligação

a STI1 e a Vitronectina.

Nossos resultados mostraram que as construções GFP- PrP

do tipo

selvagem 129Met/WT e 129Val/WT assim como os mutantes

129Met/102Leu, 129Val/102Leu, 129Met/105Leu, 129Val/105Leu e

129Met/117Val estão localizadas corretamente na membrana plasmática e

na região perinuclear. Já o mutante 129Val/117Val apresentou-se disperso

pelo citoplasma da célula.

A alteração na compartimentalização celular do mutante 117 é um

dado inédito na literatura. É de particular interesse o fato deste mutante só

ter sua compartimentalização alterada quando associado ao polimorfismo

129Val. Este dado é extremamente relevante e a modificação ocorrida deve

alterar a função fisiológica de PrP

, apesar de não termos observado nada

específico com relação à migração em vitronectina.

Há dados na literatura que mostram que mesmo o PrP

tipo selvagem

pode ser ocasionalmente retido no citosol mas não se sabe se esta

compartimentalização tem alguma função fisiológica. Não há um consenso

se a forma citoplasmática de PrP

é ou não tóxica e se isso pode ser

associado com alguma patogênese neuronal (MA e LINDQUIST 2001; MA et

al. 2002; MIRONOV et al. 2003; FIORITI et al. 2005; CAMPANA et al. 2006;

ORSI et al. 2006; WANG et al. 2006). De fato, em cultura de neurônios

humanos PrP

citosólico não é tóxico e pode contrariamente ter funções

anti-apoptóticas (ROUCOU et al. 2003).

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Nossos dados indicam que a presença da proteína no citoplasma não

parece ser tóxica uma vez que as células proliferam normalmente e sua

aderência a placa de cultura não foi alterada.

Por outro lado, é bastante conhecido que o polimorfismo do codon129

no gene PRNP podem afetar a susceptibilidade a doença, porém o

mecanismo preciso pelo qual isto ocorre ainda não foi estabelecido

(ALPEROVITCH et al. 1999). O códon 129 no gene PRNP pode afetar o

fenótipo clínico-patológico de CJD e Insonia Familial Fatal (CORTELLI et al.

1999). O genótipo Met129Met aumenta a suceptibilidade à doenças por

prions (VALLERON et al. 2001) enquanto Val129Val proteje contra a BSE e

vCJD (WADSWORTH et al. 2004).

O endereçamento incorreto de PrP

ao retículo endoplasmático e

Complexo de Golgi deve necessariamente implicar no comprometimento de

sua glicosilação. Na literatura há muitos trabalhos que estudam o possível

papel da glicosilação na localização subcelular de PrP

e diferentes

resultados foram mostrados. Em geral a forma não glicosilada de PrP

não é

detectada na superfície celular, permanecendo presa no citoplasma

(ROGERS et al. 1990; DEARMOND et al. 1997; LEHMANN e HARRIS

1997). Mas a forma não glicosilada já foi detectada na superfície de

diferentes linhagens celulares quando transfectadas com alguns mutantes

no sítio de glicosilação (KORTH et al. 2000; NEUENDORF et al. 2004). Isso

sugere que a mutação no aminoácido e não a falta de glicosilação pode

influenciar o destino intracelular de PrP

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Nossos dados sugerem que não há uma variação importante no

padrão de glicosilação dos mutantes estudados. Mas deve-se salientar, no

entanto, que as nossas observações sobre o padrão de glicosilação são

apenas circuntânciais, uma vez que não foi realizado nenhum ensaio

enzimático de deglicosilação específico a fim de nos certificarmos que as

diferentes bandas vistas próximas a altura esperada para GFP-PrP

são

realmente as distintas formas di-, mono- e não-glicosiladas da proteína.

Para a avaliação funcional das proteínas mutantes, as construções

GFP-PrP

foram transfectadas em células da linhagem N2a, que foram

selecionadas com geneticina gerando populações com expressão

heterogênea das proteínas de interesse. Destas foram selecionados clones

através do método de diluição limitante. Estes clones foram utilizados nos

ensaios de migração celular.

O conceito de migração celular envolve um ciclo de diversos passos

altamente coordenados e regulados. Em resposta a diversos estímulos

migratórios, o movimento direcional é iniciado quando, a polimerização de

actina direciona uma protusão da membrana, que é estabilizada pela ligação

à matriz extracelular (MEC). O conceito de haptotaxia foi estabelecido há

muitos anos e reflete a motilidade direcional ou projeção de células contra

um gradiente de sítios de adesão celular ou quimioatrativos ligados a um

substrato. Estes gradientes estão naturalmente presentes na matriz

extracelular ou podem ser estabelecidos artificialmente pela alteração da

concentração de sítios de adesão em um substrato (CARTER 1967).

Pamela Andrade Lourenço Pereda

Os estimulos migratórios utilizados neste trabalho foram a

Vitronectina e STI1, respectivamente uma glicoproteína multifuncional

relacionada a processos metabólicos como adesão e migração celular entre

outros (SEGER e SHALTIEL 2000) e uma co-chaperonina relacionada a

processos de neuroproteção (CHIARINI et al. 2002; ZANATA et al. 2002). O

sítio de ligação de vitronectina e STI1 à PrP

estão embricados (aas 106 a

128 na molécula de camundongo) e as mutações de PrP

estudadas neste

trabalho estão inseridas ou muito próximas a este domínio. Portanto, nossa

idéia inicial era que estas proteínas mutantes apresentassem uma alteração

na interação com vitronectina ou STI1 afetando a resposta celular

desencadeada por cada um destes complexos.

Uma observação importante com relação aos clones gerados é que

não há superexpressão da proteína selvagem e nem das mutantes de PrP

Consideramos isso vantajoso uma vez que a superexpressão de qualquer

proteína pode levar a um desbalanço celular e a resultados que poderiam

não refletir nos mecanismos fisiológicos de PrP

Não foram detectadas diferenças nos experimentos de migração

realizados com o estímulo de Vitronectina a partir de dois clones diferentes

expressando a proteína tipo selvagem ou as mutantes combinadas aos

polimorfismos em 129. Indicando portanto, que estes resultados não foram

ocasionados por diferenças clonais.

Chamou nossa atenção que a expressão de mais moléculas de PrP

do tipo selvagem (GFP-PrP

), nas células que já expressavam PrP

endógeno (N2A), não foi capaz de alterar as taxas de migração. Isso pode

Pamela Andrade Lourenço Pereda

significar que PrP

tenha uma menor participação nos processos de

migração quando comparado a outros ligantes de vitronectina, como as

integrinas. Além disso, é possível que as vias de sinalização responsáveis

por tal fenômeno estejam saturadas com a presença por exemplo de de

integrinas e do próprio PrP

endógeno.

Os experimentos de migração por haptotaxia usando STI1 mostraram

que esta proteína não tem atividade atraente. Uma possibilidade é que

quando aderida a um substrato STI1 oculte o sítio de ligação a PrP

. Vale

ressaltar que em todos os experimentos abordados pelo grupo STI1 sempre

foi usada na forma solúvel. Estudos futuros abordarão outras atividades do

complexo PrP

-STI1 como sobrevivência e diferenciação celulares nos

mutantes de PrP

Vale ressaltar que nosso grupo mostrou que outros mutantes de PrP

localizados no sítio de interação com laminina (códons 171 e 178)

apresentaram deficiência na migração celular quando esta molécula da

matriz extracelular foi usada em ensaios de haptotaxia (MACHADO 2007).

Portanto, parece que ensaios específicos devem ser usados para abordar

cada um destes mutantes e seu respectivo ligante.

Desta forma, este trabalho contribuiu de forma importante na geração

de ferramentas importantes para continuação destes estudos além de

apontar que ensaois biológicos diferentes deverão ser usados na tentativa

de identificar a perda de função de proteínas mutantes de PrP

Pamela Andrade Lourenço Pereda

6 CONCLUSÕES

 As construções GFP-PrP

129Met, GFP-PrP

129Val, GFP-PrP

102Leu/129Met; GFP-PrP

102Leu/129Val; GFP-PrP

105Leu/129Met; GFP-PrP

105Leu/129Val; GFP-PrP

117Val/129Met

foram corretamente endereçadas à membrana plasmática e

apresentam uma massa molecular de cerca de 60KDa.

 A construção GFP-PrP

117Val/129Val fica retida no citoplasma

celular e a forma predominante detectada em ensaios de western

blotting tem uma massa molecular de cerca de 45KDa.

 Células N2A transfectadas com as quimeras GFP-PrP

129Met, GFP-

PrP

129Val, GFP-PrP

102Leu/129Met; GFP-PrP

102Leu/129Val;

GFP-PrP

105Leu/129Met; GFP-PrP

105Leu/129Val; GFP-PrP

117Val/129Met e GFP-PrP

117Val/129Val não apresentam alteração

na migração celular desencadeada por vitronectina.

 STI1 não foi capaz de induzir migração celular quando usada em

ensaios de haptotaxia.

Pamela Andrade Lourenço Pereda

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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