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Expressão de GFP em
Bacillus thuringiensis S76 uma estirpe
selvagem ativa para Lepidoptera
Ana Flávia Alves Parente
Brasília – DF
2007
Universidade de Brasília
Departamento de Biologia Celular
Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular
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Expressão de GFP em
Bacillus thuringiensis S76 uma estirpe
selvagem ativa para Lepidoptera
Ana Flávia Alves Parente
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Biologia Molecular da Universidade de Brasília
como requisito parcial à obtenção do título de Mestre
em Biologia Molecular.
Orientador: Profª. Drª. Ildinete Silva Pereira
Co-orientador: Profª. Drª. Marlene Teixeira De-Souza
Brasília – DF
2007
Universidade de Brasília
Departamento de Biologia Celular
Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular
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Dedico esse trabalho ao meu pai, José
da Guia Parente, meu grande exemplo
de vida que sempre me ensinou a
importância de buscar o conhecimento.
4
Agradeço...
Em primeiro lugar agradeço à Drª. Marlene Teixeira De-Souza, que representa
muito mais que orientadora deste trabalho científico, uma grande amiga que me
ensinou a ter perseverança mesmo nos momentos mais difíceis. Obrigada por estar
ao meu lado nesses momentos, não apenas no laboratório mas também na minha
vida pessoal.
Agradeço a Drª. Ildinete Silva Pereira pela valiosa orientação e total apoio a esse
trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
concessão de bolsa de estudos.
Aos meus amigos do Laboratório de Microbiologia da UnB, professores, alunos e
equipe técnica, obrigada pelos momentos de descontração e pelos valiosos
conselhos.
Aos professores do Laboratório de Biologia Molecular por estarem sempre
prontos a colaborar com empréstimo de equipamentos, cedendo materiais e
compartilhando experiência.
À Drª. Sônia Nair Báo e Vítor pela valiosa colaboração na parte de
fotodocumentação, por ceder equipamentos e conhecimentos técnicos durante a
realização desse trabalho.
Agradeço a todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Biologia
Molecular pelo empenho, pelas disciplinas oferecidas e por sempre estarem de
portas abertas para os alunos.
Aos amigos de bancada Bruna, Graziela, Breno e Thiago pela amizade e carinho.
Agradeço aos meus pais e exemplo de vida, Ana Izeila Alves e José da Guia
Parente meus eternos incentivadores, pelo apoio incondicional, pelo carinho e
amor que foram tão importantes para realização desse trabalho. Obrigada por
terem acreditado em mim e me apoiado sempre que precisei.
5
Às minhas irmãs Juliana e Tatiana pelo carinho e preocupação, vocês são para
mim o maior exemplo de fraternidade.
Agradeço a minha segunda família, Beth, Jorge e Fernando, que me adotaram em
Brasília e me mostraram que não são somente os laços de sangue que fazem uma
família.
Ao meu companheiro Jorge, por estar ao meu lado em todos os momentos.
Obrigada por dividir comigo as dificuldades e alegrias durante esse período. Sua
alegria, amor e compreensão foram imprescindíveis. Te amo.
À todos que participaram desse trabalho direta ou indiretamente.
Mui
to Obrigada!!!
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ii
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Índice
Resumo
.............................................................................................................
Abstract
............................................................................................................
Lista de figuras
...............................................................................................
Lista de abreviaturas
......................................................................................
1.Introdução
....................................................................................................
1.1. B. thuringiensis ..........................................................................................
1.1.1. Toxinas Cry: estrutura, modo de ação e potencial entomopatogênico ...
1.1.2. Localização e organização estrutural dos genes cry ...............................
1.1.3. Esporulação e Síntese de proteínas Cry ..................................................
1.2. Bactérias endofíticas
......................................................................................
1.3. Green fluorescent protein (GFP) .....................................................................
2. Objetivos
.......................................................................................................
2.1. Objetivos gerais .........................................................................................
2.2. Objetivos específicos .................................................................................
3. Material e métodos
.......................................................................................
3.1. Estirpes e crescimento ..............................................................................
3.2. Plasmídeos .................................................................................................
3.3. Eletrotransformação de B. thuringiensis .....................................................
3.4. Seleção de clones recombinantes ................................................................
3.5. Análise de emissão de fluorescência .........................................................
3.6. Perfil protéico ............................................................................................
3.7. Perfil plasmidial e de restrição ...................................................................
3.8. Curva de crescimento .................................................................................
3.9. Análise morfológica das colônias ............................................................
3.10. Análise morfológica das células ..............................................................
3.11 Meio de cultura e soluções ........................................................................
i
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35
41
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59
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60
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62
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Resumo
B. thuringiensis é um importante entomopatógeno amplamente estudado e
empregado como agente de controle biológico, ainda assim, a ecologia desse
microrganismo é pouco explorada. Apesar da crescente utilização na agricultura desse
agente, as interações com plantas são pouco conhecidas. Com o intuito de construir
uma ferramenta eficaz para o rastreamento dessa bactéria, foi desenvolvida a estirpe
S76GFP
+
a partir de uma estirpe brasileira selvagem de B. thuringiensis. O vetor de
expressão pAD43-25 contendo o gene gfpmut3a funcional, além do vetor parental,
pAD123, contendo o mesmo gene, porém sem promotor foram transferidos para a
estirpe S76, permitindo no primeiro caso a expressão constitutiva do gene durante o
crescimento vegetativo. Adicionalmente, como controle, ambos vetores foram
transferidos para uma estirpe acristalífera (Cry
-
). Células verdes brilhantes foram
detectadas por microscopia de fluorescência, em ambas hospedeiras transformadas
com o vetor pAD43-25, a partir de duas horas após a inoculação em meio líquido e
que puderam ser observadas pelo restante do tempo de cultivo até o fim da
esporulação. A estirpe S76GFP
+
apresentou um discreto acréscimo no tempo de
geração, embora não tenham sido observadas alterações morfológicas das colônias e
células. Análises dos perfis protéico e plasmidial indicaram, respectivamente, a
manutenção da expressão das proteínas Cry e do elenco dos plasmídeos residentes. Do
nosso conhecimento, não apenas é o primeiro relato de visualização da emissão de
fluorescência pela expressão de GFP em B. thuringiensis. Igualmente, é o primeiro
relato de expressão de GFP em uma estirpe de B. thuringiensis selvagem.
Palavras-chave: Bacillus thuringiensis, GFP, proteínas Cry, controle biológico
ii
Abstract
Although extensively studied by its recognized potential as bioinseticide, B.
thuringiensis ecology is poorly understood, and despite its increasing use, little is
known regarding interactions between this microorganism and plants. Thus, a tractable
marker for detection of this bacterium under specific environment and physiological
conditions is a valuable tool. A plasmid (pAD43-25) bearing a functional gfp gene and
the parental vector, bearing the promotorless gfp gene, were introduced in the
Brazilian wild-type strain B. thuringiensis kurstaki S76, allowing, in the first case, the
constitutive synthesis of GFP during vegetative growth. Additionally, both vectors
were transferred to a Cry- B. thuringiensis host. Green bright cells could be detected,
by fluorescence microscopy and in both hosts, since 2h after inoculation in liquid
medium and could be seen throughout remaining cultivation time, until complete
sporulation was accomplished. Strain S76GFP+ seems to grow slower than the
remaining recombinants and parental cells, whereas no perceptible change in cell or
colony morphologies was observed. Protein profile and plasmidial DNA analyses
indicate, respectively, that this recombinant maintained Cry proteins expression and
resident plasmid outline. To our knowledge, it is the first time fluorescence is detected
in a B. thuringiensis strain, as well as, that GFP is expressed in a wild-type B.
thuringiensis.
Key words: Bacillus thuringiensis, GFP, Cry protein, biological control.
ii
i
Lista de figuras.
Figura 1.
B. thuringiensis ..................................................................................
Figura 2.
Modo de ação das proteínas Cry ......................................................
Figura 3.
Estrutura tridimensional da porção N-terminal da proteína Cry3A .
Figura 4.
Ciclo celular de Bacillus subtilis ......................................................
Figura 5.
Aequoria victoria ..............................................................................
Figura 6.
Representação da interação entre GFP, aquarina e emissão de
fluorescência em A. victoria ..........................................................
Figura 7.
Estrutura tridimensional da GFP ......................................................
Figura 8.
Esquema do processo de formação do cromóforo da GFP ..............
Figura 9.
Padrão de cores das diferentes proteínas fluorescentes conhecidas
Figura 10.
Mapa físico dos plasmídeos portadores do gene gfpmut3a ............
Figura 11.
Varredura da emissão de fluorescência ..........................................
Figura 12.
Análise da expressão de GFPmut3a pelas estirpes recombinantes
S76GFP
+
e.Cry
-
GFP
+
.......................................................................
Figura 13.
Emissão de fluorescência pelas células de B. thuringiensis
S76GFP
+
e Cry
-
GFP
+
....................................................................
Figura 14.
Emissão de fluorescência pelas células de B. thuringiensis
S76GFP
+
e Cry
-
GFP
+
....................................................................
Figura 15.
Emissão de fluorescência pelas células de B. thuringiensis
S76GFP
+
e Cry
-
GFP
+
....................................................................
Figura 16.
Análise da expressão de proteínas Cry ...........................................
Figura 17.
Curvas de crescimento de S76 (A), Cry
-
(B) e derivadas ................
Figura 18.
Morfologia das colônias de S76 e Cry
-
parentais e recombinantes .
Figura 19.
Morfologia das células de S76 e Cry
-
parentais e recombinantes ..
Figura 20.
Morfologia das células de S76 e Cry
-
parentais e recombinantes ..
Figura 21.
Morfologia das células de S76 e Cry
-
parentais e recombinantes ..
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Lista de abreviaturas
A
600
- absorbância em 600 nanometros
ACB- agente de controle biológico
APS- persulfato de amônia
α
- alfa
BFP- blue fluorescent protein (proteína de fluorescência azul)
β
- beta
CADR- caderina
CFP cyan fluorescent protein (proteína de fluorescência azul)
cm- centímetros
Cyt- endotoxinas citolíticas
λ
- comprimento de onda
λ
max
- comprimento de onda máximo
Da- dálton
DO- densidade ótica
δ
- delta
DsRed- proteína de fluorescência vermelha
ECFs- fatores sigma extra-citoplasmáticos
EDTA- ácido etilediamino tetracético
EGFP- Enhanced green fluorescent protein (proteína de fluorescência verde
mutante)
GFP- green fluorescent protein (proteína de fluorescência verde)
GPI- glicosilfosfatidil-inositol
h- horas
HCT- meio de cultura próprio para esporulação de B. thuringiensis
ºC- graus Celsius ou centígrados
k- kilo
kb- kilobase
kDa- kilodáltons
LB- meio de crescimento "Luria – Bertani"
LC
50
- concentração letal para 50% da população
M- molar ou molaridade (mol/L)
mA- miliamperes
Mb- mega base
MDa- mega dáltons
MEV- microscopia eletrônica de varredura
Mg- miligrama
mL- mililitro
mm- milímetro
mM- milimolar
min- minutos
µg- micrograma
µL- microlitro
v
nm- namômetro
OGM- organismo geneticamente modificado
PCR- reação em cadeia da polimerase
PG- peptideoglicano
pH- potencial hidrogeniônico
rpm- rotações por minuto
SASPs- proteínas ácido-solúveis
SDS- dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE- gel de poliacrilamida em condições desnaturantes
σ− sigma
Tris- tris (hidroximetil) aminometano
VIP- vegetative insecticidal protein (proteína inseticida de fase vegetativa)
YFP- yellow fluorescent protein (proteína de fluorescência amarela)
1
1. Introdução
Desde o surgimento da agricultura o homem enfrenta problemas com os
insetos-praga que causam danos, diretos e indiretos, às plantações. Por esse motivo,
tornou-se indispensável o controle das populações de insetos, promovendo o aumento
da produção agrícola e proteção de culturas e florestas. Com essa finalidade, a
aplicação de inseticidas químicos é uma estratégia amplamente difundida. No entanto,
apresenta desvantagens principalmente quanto ao aspecto ambiental, provocando
contaminação da água e alimentos, intoxicação de organismos não-alvos, concentração
ao longo da cadeia alimentar e indução de resistência dos insetos-praga ao inseticida
químico. O potencial de efeitos adversos ao meio ambiente associado à utilização
indiscriminada de inseticidas químicos torna importante a busca de métodos
alternativos para o controle de pragas, uma dessas alternativas é o controle biológico.
O controle biológico consiste no emprego de um organismo atuando como
predador, parasita, patógeno, ou ainda um produto desses organismos, no controle de
populações insetos. Essa é uma estratégia muito utilizada tanto em sistemas
agroecológicos como na agricultura convencional. Dentre as estratégias de controle
biológico adotadas atualmente, a aplicação de inseticidas microbianos se destaca. A
ampla utilização de agentes microbianos no controle de insetos ocorre, principalmente,
pelo menor custo desses em relação aos demais bioinseticidas.
Diversas espécies de microrganismos, incluindo fungos e bactérias, são
conhecidos agentes causadores de doenças em insetos, dentre esses, as bactérias
pertencentes ao gênero Bacillus são as mais difundidas, sendo o B. thuringiensis o
mais utilizado (Szewczyk, et al., 2006). Com a otimização das formulações, a
2
comercialização se intensificou surgindo diversos produtos, utilizando diferentes
subespécies de B. thuringiensis. Desde então esse microrganismo tem sido o mais
importante agente de controle biológico (ACB) comercializado, com cerca de 200
produtos registrados nos EUA, sendo responsável por 2% do mercado mundial de
inseticida, e mais de 90% do faturamento com bioinseticidas (Szewczyk, et al., 2006;
Glare e O´Callagham, 2000; Beegle e Yamamoto, 1992).
3
1.1. B. thuringiensis
B. thuringinsis (figura 1) é uma bactéria Gram positiva, esporulante, pertencente ao
grupo filogenético do B. cereus e foi isolada, pela primeira vez, em 1901 por S.
Ishiwata. O microrganismo estava associado a uma doença do bicho-da-seda (Bombix
mori), onde a lagarta adquire um aspecto flácido, e por esse motivo, foi denominado B.
sotto (sotto significa flácido em japonês). Em 1911, um Bacillus similar foi re-isolado
por E. Berliner, a partir de lagartas de Anagasta kiihniella mortas e foi denominado B.
thuringiensis (Glazer e Nikaido, 1995; Berliner, 1915)
Figura 1. B. thuringiensis. Microscopia de contraste
de fase, aumento 1000x.
Fonte:http://textbookofbacteriology.net/Anthrax.html
Baseado em análise filogenética de seqüência de rDNA 16S, a bactéria Gram
positiva B. cereus está situada no Phylum Firmicutes, onde é subseqüentemente
agrupado com outras formadoras de endósporos, contendo baixo teor de G+C. Por sua
vez, o grupo filogenético de B. cereus inclui além dessa, as espécies
weihenstephanensis, mycoides, pseudomycoides, anthracis e thuringiensis
(Onyenwoke et al., 2004). Tradicionalmente, essas bactérias têm sido diferenciadas
por características fenotípicas e potencial patogênico. Os membros mais estudados são
4
o B. cereus, conhecido pela habilidade de causar intoxicação alimentar provocando
gastrenterite em humanos, além de outras doenças, incluindo oftalmites e
periodontites. O B. anthracis constitui um notório e potente patógeno de animais,
agente etiológico do antraz, potencial arma biológica e o B. thuringiensis sintetiza
inclusões cristalinas letais para larvas de insetos utilizadas com muito êxito como
ACB.
Alinhamento de seqüências de rDNA 16S ou de seqüências espaçadoras entre
seqüências de rDNA 16S e 23S, além da caracterização de outras biomoléculas não
tem se mostrado suficiente para distinguir entre esses membros. Assim, não há
consenso se essas bactérias deveriam ser separadas como espécies ou se o B.
thuringiensis e B. anthracis deveriam ser consideradas um subgrupo de B. cereus.
Recentes análises de genômica e de proteômica comparativas apontaram que os
cromossomos do B. cereus, B. thuringiensis e B. anthracis exibem altos níveis de
sintenia, com uma limitada diferença em conteúdo gênico (Rasko, et al.
2005).Também foi observada similaridade de perfil protéico de três estirpes, uma
representante de cada espécie e curadas de seus plasmídeos (Gohar, et al. 2005). Esses
últimos dados complementam e corroboram os anteriores, contribuindo para avançar
na discussão sobre a especiação desse grupo. Por outro lado, apesar dessas
similaridades, essas três espécies ocupam diferentes nichos ecológicos apresentando
especificidade por hospedeiros e um diferente potencial patogênico, papel que pode ser
mediado por informação plasmidial. O complexo perfil plasmidial dessas três espécies
varia grandemente, em número e tamanho.
5
Segundo de Maagd et al. (2003) a ecologia de B. thuringiensis ainda é muito
pouco conhecida, sendo um organismo ubíquo, podendo ser isolado do solo, larvas
mortas, grãos estocados, superfícies de plantas, água, dentre outros. B. thuringiensis é
descrito como um patógeno oportunista de insetos e é encontrado na natureza
predominantemente na forma de esporos, que podem disseminar amplamente pelo
ambiente, uma vez que esses esporos podem permanecer viáveis por longos períodos
de tempo. A epizootia causada por B. thuringiensis ocorre raramente (Aronson et al.,
1986) e apenas em algumas situações específicas no campo, ou em casos especiais,
como aglomerados de insetos, comuns em espécies sociais, criatórios ou em locais de
armazenamento de grãos.
De acordo com Rajanmohan et al. (1998) o B. thuringiensis apresenta atividade
tóxica contra pragas importantes da agricultura, além de insetos vetores de doenças em
humanos, como por exemplo os mosquitos dos gêneros Aedes e Culex. Formulações à
base dessa bactéria são aplicadas no ambiente desde 1933, se destacando no mercado
mundial desde o lançamento do primeiro produto a partir desse microrganismo, na
França em 1938. Entretanto, o sucesso comercial desse agente entomopatogênico deu-
se após 1950, quando foi desenvolvido um método de fermentação aeróbia em
tanques. Com a otimização das formulações, a comercialização se intensificou
surgindo diversos produtos baseados em diferentes subespécies de B. thuringiensis.
Desde então, esse microrganismo tornou-se o mais importante ACB comercializado,
sendo responsável por mais de 90% do faturamento mundial com bioinseticidas (Glare
e O´Callagham, 2000; Beegle e Yamamoto, 1992)
6
A eficácia das formulações à base de B. thuringiensis e as vantagens da
utilização em relação aos agentes químicos sintéticos, minimizando a contaminação da
água e alimentos, a intoxicação de organismos não-alvos, a concentração ao longo da
cadeia alimentar e a seleção de insetos-praga resistentes, fazem com que este se torne
uma alternativa promissora para o controle de insetos (Jung e Côté, 2000). Embora
após aplicações de formulações comerciais, esporos de B. thuringiensis sejam
encontrados no solo por vários anos, observa-se declínio na população e na toxicidade.
Outra importante utilização do B. thuringiensis consiste na expressão heteróloga
da atividade entomopatogênica, essa estratégia se tornou importante na agricultura
mundial. James (2004) relatou que a utilização de milho e algodão recombinantes
abrange 22,4 milhões de hectares por todo o mundo em 2004, um aumento de 25% em
relação ao ano anterior. Segundo Shelton et al. (2002), a grande vantagem da
utilização de plantas transgênicas inseto-resistentes é a redução do uso de inseticidas
convencionais. Nos Estados Unidos, o número de aplicações de inseticidas contra o
complexo de pragas do algodão diminuiu de 4,6 aplicações anuais entre os anos de
1992 e 1995 para 0,8 aplicações anuais entre 1999 e 2001 com a introdução do
algodão transgênico. Na China, o uso dessa tecnologia proporcionou um decréscimo
no uso de inseticidas foliares entre 60 e 80% (Romeis, et al., 2006).
7
1.1.1. Toxinas Cry: estrutura, modo de ação e potencial entomopatogênico
A atividade entomopatogênica de B. thuringiensis ocorre, principalmente, pela
ação das δ-endotoxinas, ou proteínas Cry, depositadas em forma de inclusões
cristalinas, no citoplasma da célula-mãe durante a fase estacionária. São conhecidos
isolados de B. thuringiensis ativos para larvas de insetos das ordens Lepidoptera,
Coleoptera, Diptera, Mallophaga, Hymenoptera, Orthoptera e Homoptera, além de
algumas espécies de Nematoda, Protozooa e Acarinae. É importante ressaltar a alta
especificidade das toxinas que, em muitos casos, é eficaz apenas para determinada
espécie, não sendo ativa para outros invertebrados, para animais e para plantas
(Schnepf et al., 1998).
Höfte e Whiteley (1989) propuseram uma nomenclatura para as proteínas Cry
baseada na estrutura primária, relacionado à ordem do inseto-alvo, bem como a
morfologia do cristal protéico. No entanto, segundo Crickmore et al. (1998), essa
nomenclatura apresentava-se inadequada, principalmente nos casos de toxinas com
atividade para mais de uma ordem de insetos. A nomenclatura atual é baseada apenas
em relações moleculares entre as cadeias primárias das proteínas. O sistema, adiciona
à raiz monomérica Cry, números e letras ordenados em hierarquias indicando o grau
de divergência filogenética. As superfamílias, indicadas por números, como em Cry1
apresentam até 45% de identidade. Os holótipos, designados por letras maiúsculas
(Cry1A), denotam até 78%. A terceira categoria indicada por letra minúscula
(Cry1Aa), denota identidade de até 95%. A quarta categoria indicada por números,
representa identidade superior a 95% (Cry1Aa1). Até a última atualização do banco de
dados (26/04/2006) foram depositadas 463 seqüências de genes cry, que codificam
8
essas toxinas, cujas seqüências de aminoácidos deduzidas permitiu um agrupamento
em 51 superfamílias e 156 holótipos
(http:/www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/).
As proteínas Cry são sintetizadas sob a forma de protoxinas e, quando ingeridas
por larvas susceptíveis, é solubilizada no ambiente alcalino do intestino médio (típico
de larvas pertencentes às ordens Lepidoptera e Diptera) e processadas pela ação de
proteases locais. A toxina atravessa a membrana peritrófica e liga-se a receptores de
células epiteliais do intestino, insere-se na membrana apical das células colunares,
formando canais iônicos inespecíficos, o que resulta na perda do potencial
transmembrânico ocasionando um aumento na absorção de água e provocando a lise
osmótica da célula (Aronson e Shai, 2001; figura 2). A larva também pode sofrer de
inanição, uma vez que a ingestão da toxina provoca paralisia da peça bucal até o
intestino médio, poucos minutos após a ingestão (de Maagd et al., 2003, Copping e
Menn, 2000).
Figura 2.
Modo de ação das proteínas Cry. 1. ingestão e
solubilização da protoxina.
2. ativação por proteólise das
extremidades.
3. interação com os receptores da superfície do epitélio
intestinal.
4 e 5. inserção na membrana e formação de poros.
(Crickmore)
9
Em larvas de Lepidoptera são conhecidas, no mínimo, quatro proteínas
receptoras diferentes, situadas na superfície das células intestinais e que interagem
com proteínas Cry. Foram descritas: uma N-aminopeptidase ancorada à
glicosilfosfatidil-inositol (GPI) (Knight et al., 1994), uma proteína semelhante a
caderina (CADR), (Nagamatsu et al., 1999), uma proteína de 270 kDa glicoconjugada
(Valaitis et al., 2001), e uma fosfatase alcalina ancorada à GPI (Jurat-Fuentes e Adang,
2004).
Além das proteínas Cry, vários isolados de B. thuringiensis produzem
endotoxinas menores (25-28 kDa) denominadas endotoxinas citolíticas (Cyt), pois
possuem ação citolítica in vitro (de Maagd et al., 2003). Estudos com B. thuringiensis
subsp. israelensis, com conhecida atividade entomopatogênica para insetos da ordem
Diptera, detectaram as proteínas Cry11, Cry4B, Cry4A e Cyt1A atuando
sinergisticamente. Foram analisadas as concentrações letais médias (LC
50
) das toxinas
expressas isoladamente e em diversas combinações. A toxicidade de complexo nativo
é consideravelmente maior que as toxinas individuais, porque existe um sinergismo
entre os componentes, particularmente entre Cyt1A e as proteínas Cry, em B.
thuringiensis subsp. israelensis. Foi proposto também que a combinação nativa
provavelmente facilita a ingestão e solubilização do cristal (Poncet, et al., 1997;
Crickmore et al., 1998).
De acordo com Knowles (1994), o intestino das larvas de Lepidoptera
suscetíveis, geralmente, possui pH alcalino, evitando assim a germinação dos esporos
ingeridos. No entanto, esse modo de ação, ao causar paralisia do intestino, retém os
10
esporos e disponibiliza nutrientes para iniciar a germinação, causando morte por
septicemia. O tecido da larva, então, é utilizado como fonte de nutrientes para o
crescimento vegetativo da bactéria. Assim, o potencial entomopatogênico desse
microrganismo é também ampliado pela presença de outros fatores, não formadores de
inclusões cristalinas, tais como a β-exotoxina, toxinas VIPs (vegetative insecticidal
protein), fosfolipases, quitinases, toxinas termolábeis e antibióticos (Glare e
O’Callagham, 2000). Dessa forma, esses produtos de crescimento vegetativo atuam
sinergisticamente nesse processo infectivo como a importância das fosfolipases no
processo de infecção em larvas Trichoplusia ni por B. thuringiensis (Zhang et al.,
1993), demonstrando a importância dessas enzimas na virulência da bactéria.
Lertcanawanichakul et al. (2004), descreveram aumento da toxicidade de mutantes de
B. thuringiensis expressando quitinases em larvas de Lymantria dispar.
De acordo com de Maagd et al., (2003), as δ-endotoxinas são depositadas em
forma de inclusões cristalinas insolúveis. A morfologia variada, depende da
composição da porção C-terminal das protoxinas, região provavelmente relacionada
com a promoção de cristalização. Por outro lado, a região N-terminal está relacionada
com a toxicidade (Li et al., 1991). A deposição de inclusões insolúveis é importante
para diminuir a digestão proteolítica, impedindo a degradação prematura da protoxina,
além de proteger a própria célula da ação tóxica da porção N-terminal. Vazquez-
Padron et al. (2004) observaram que além de atuar como entomotoxina, essa região da
cadeia primária também provoca efeitos letais no crescimento de B. thuringiensis
quando expressa destituída da porção C-terminal.
11
Baseado na comparação da seqüência primária de aminoácidos, essas
protoxinas podem ser reunidas em dois grupos, sendo que o primeiro compreende
estruturas com 130-135 kDa e o segundo compreende proteínas, naturalmente
truncadas, com 70-73 kDa. Independente do tamanho, a digestão proteolítica é
indispensável para a toxicidade.
Figura 3. Estrutura tridimensional da porção N-terminal da proteína
Cry3A.
Ilustração da estrutura ressaltando a divisão em três domínios. Em azul domínio
I, em verde domínio II e em vermelho domínio III.
Fonte:http://www.nal.usda.gov/bic/BTTOX/cry3a_side.gif
A porção N-terminal da proteína Cry3A (Li et al, 1991), Cry1Aa (Grochulski et
al., 1995) e Cry2A (Morse et al, 2001) tiveram sua estrutura tridimensional resolvidas
por cristalografia de difração de raios X. As estruturas tridimensionais descritas são
similares e são formadas por três domínios conservados (figura 3). Cada um desses
domínios é constituído por cerca de 200 resíduos de aminoácidos. O domínio I está
envolvido no processo de inserção da toxina na membrana, os domínios II e III,
aparentemente, promovem a ligação da toxina ao receptor da membrana epitelial. O
domínio III também protege a toxina de proteólises adicionais mantendo a estrutura
12
tóxica intacta. Em adição, o processo da formação dos canais iônicos envolve
interações entre funções dos três domínios (de Maagd et al., 2003; Yamamoto e Dean,
2000).
13
1.1.2. Localização e organização estrutural dos genes cry.
B. thuringiensis possui um genoma de 2,0 a 5,7 Mb e contém cerca de 34% de
G+C (Schnepf et al., 1998). Até 20% desse material genético pode se apresentar em
forma de elementos extracromossomais. Grande parte desses elementos são
plasmídeos que variam, consideravelmente, em número de cópias e massa molecular
de uma subespécie para outra, podendo apresentar cerca de 4-6 MDa até mais de 300
MDa (Aronson et al., 1986) isto é, cerca de 2 a 600 kb. Assim como em outras
bactérias Gram positivas, os plasmídeos podem ser classificados em duas categorias:
os de massa molecular inferior a 15 MDa, que replicam com um baixo número de
cópias pelo mecanismo do circulo rolante, e aqueles com massa molecular superior a
15 MDa, que replicam com alto número de cópias, via mecanismo teta (Schnepf et al.,
1998; Lereclus et al., 1982). A relação molecular entre os dois grupos é baixa, embora
exista conservação parcial da seqüência de DNA no interior de cada um dos grupos.
Os genes cry estão localizados em plasmídeos grandes, muitos desses
conjugativos. Com raras exceções, esses genes podem estar localizados no
cromossomo (Rajamohan et al., 1998). A maioria dos plasmídeos de B. thuringiensis é
considerada críptica, pois além de portarem os genes cry, pouco se conhece sobre a
biologia desses.
As diferentes subespécies de B. thuringiensis apresentam de um a vários genes
cry que podem estar localizados em um mesmo ou em diferentes replicons (Schnepf et
al, 1998). É comum a ocorrência de dois ou mais genes cry adjacentes em plasmídeos
com massa molecular superior a 100 MDa e um gene cry em um plasmídeo com 40-50
MDa (Aronson, 1994). Dentre as estirpes que possuem esse padrão estão as
14
pertencentes à subespécie kurstaki, sendo que a maioria contém cinco genes, três do
tipo cry1 e dois do tipo cry2. Dois dos genes do tipo cry1 (cry1Aa e cry1Ac) e os dois
genes do tipo cry2 estão localizados no mesmo replicon, enquanto que o gene cry1Ab
está localizado em um plasmídeo de cerca de 44 MDa.
De acordo com Mahillon et al. (1994), várias estirpes de B. thuringiensis
possuem seqüências de genes cry flanqueadas por elementos móveis, incluindo
seqüências de inserção das famílias IS231, IS232 e IS240, em adição a classe II de
transposons, Tn4430. Sugere-se que estes elementos em associação com a conjugação
podem colaborar na disseminação horizontal entre as subespécies mediando a alta
diversidade desses genes. Segundo Schnepf et al. (1998), essas características são
convenientes para o desenvolvimento de novas estirpes, permitindo a ampliação do
espectro de atividade, ou sinergismo, pela coexpressão de múltiplas toxinas, assim
como mutações nos genes cry. Estudos indicam a capacidade de transferência de
plasmídeos entre diferentes estirpes de B. thuringiensis, durante a colonização de
larvas de Spodoptera frugiperda e Galleria mellonella (Jarrett e Stephenson, 1990).
Essa transferência ocorre em níveis semelhantes aos obtidos em culturas laboratoriais.
Transferência de plasmídeos também foi observada em bactérias do solo (Thomas et
al., 2000; Vilas-Bôas et al., 1998).
15
1.1.3. Esporulação e síntese de proteínas Cry
A síntese do cristal tóxico está relacionada com a expressão das proteínas Cry
durante a fase estacionaria (Agaisse e Lereclus, 1995). A expressão, em elevadíssimos
níveis, pode representar de 25 a 30% das proteínas totais das células em esporulação
(Du et al., 1994). Ainda que a formação do esporo possa ser ativada, principalmente,
por carência nutricional esse é um processo dispendioso do ponto de vista energético,
no entanto a produção de δ-endotoxinas prossegue em paralelo.
Esporos são tipos celulares metabolicamente dormentes, altamente
especializados e estabelecidos para sobreviver em condições adversas, incluindo
carência nutricional, altas temperaturas, radiações ionizantes, agentes químicos
variados tais como solventes e detergentes, enzimas hidrolíticas, dessecação, pHs
extremos, presença de antibióticos etc. O esporo maduro e a célula vegetativa de
microrganismos são estrutural, fisiológica e bioquimicamente diferentes (figura 4).
Graças à dormência, os esporos bacterianos não requerem fontes de nutrientes ou
energia para persistirem. A dormência combinada com a resistência permite uma
sobrevida extrema. Certamente, os esporos bacterianos estão entre os de maior
prevalência no ambiente, podendo permanecer dormentes por até milhões de anos.
Uma estirpe de B. sphaericus, isolada em 1995 (Cano e Borucki) a partir de um fóssil
de abelha e uma estirpe halotolerante de Salibacillus sp., isolada, em 2000, de uma
salina por Vreeland e colaboradores, foram datadas de 25-40 milhões de anos e de 250
milhões de anos, respectivamente. Ambos isolados foram capazes de germinar quando
inoculados em meio apropriado. Entretanto, esses e outros resultados semelhantes são
16
Figura 4. Ciclo celular de
B. subtilis. A) Crescimento vegetativo. Após a replicação
do DNA as duas cópias do genoma são separadas e arrastadas em direção aos polos opostos da célula.
Os demais componentes celulares são também duplicados. Um septo simétrico é formado dando
origem a duas células-filhas idênticas entre si e `a célula paretal (fissão binária).
B) Esporulação.
Estágio 0: célula em fim de crescimento vegetativo. Estágio I: no início do processo de diferenciação,
ao invés de serem segregadas, as duas cópias do genoma formam um longo filamento axial de DNA,
que extende-se por todo o esporângio, aumentando o comprimento da célula pré-divisional. Estágio
II: Em contraste com a fissão binária, a septação é deslocada para um dos polos do esporângio, dando
origem a dois tipos de células, o pré-esporo e outra maior, a célula-mãe. O septo separa as duas cópias
do genoma e a porção restante, cerca de 70%, é arrastada para o interior do compartimento do pré-
esporo. Estágio III: engolfamento. Estágio VI: deposição do córtex. Estágio V: formação das capas.
Estágio VI: maturação do esporo. Estágio VII: a lise da parede celular da célula-mãe permite a
liberação do esporo maduro para o meio. Com a formação do septo a esporulação torna-se irreversível
e apenas após a germinação e a extrusão, a célula vegetativa formada pode iniciar novo ciclo de
fissão binária ou reiniciar a formação de um esporo. As letras A, H, E, K, F e G indicam os
respectivos fatores sigma em atividade durante os estágios e compartimentos mostrados.
17
temas de um amplo debate e estão aguardando validação.
O processo de esporulação é melhor conhecido em formadoras de endósporos (a
partir desse ponto, referidos apenas como esporos) dos gêneros Clostridium, que
compreende bactérias anaeróbias e Bacillus, que compreende bactérias facultativas.
Esse complexo processo foi amplamente revisado em recentes artigos (Errington,
2003; Aronson, 2002; Stephenson e Lewis, 2005; Moir et al., 2002; Phillips e Strauch,
2002; Stephens, 1998 e Grossman, 1995) está esquematizado na figura 4 e resumido
abaixo.
A formação do esporo (figura 4) ocorre no esporângio, uma estrutura em
diferenciação, que consiste de dois compartimentos celulares diferentes: o
compartimento da célula-mãe, de maior tamanho, e o compartimento do pré-esporo. O
processo de diferenciação termina com a lise da célula vegetativa, que deu origem a
uma única estrutura de resistência - o esporo maduro que é liberado para o meio
externo. Logo, a esporulação promove mudanças morfológicas e fisiológicas radicais
ao fazer uma remodelagem de duas células, a inibição da atividade metabólica na
célula-filha (o esporo) e a destruição da célula-mãe.
Esses esporos são estruturas altamente refratáveis, vista com um destacado brilho
ao microscópio ótico de contraste de fase. Essas estruturas consistem de um núcleo
central envolvido por cinco camadas: membrana plasmática (interna e externa), parede
celular da célula germinativa, córtex, capas (interna e externa) e o exosporo. O núcleo,
a membrana plasmática, a parede celular da célula germinativa formam uma estrutura
18
condensada envolvida e protegida pela capas. A complexidade das capas, assim como
a ocorrência ou não do exosporo variam entre as diferentes espécies. Cada um desses
componentes tem um papel bem definido na dormência, resistência e germinação.
Uma exceção é o exosporo. Essa delgada camada que envolve os esporos é
quimicamente complexa e não estabelece contato físico com as proteínas da capa. Há
um grande espaço vazio entre as duas estruturas. Até o momento, não há função
essencial descrita para o exósporo. Em algumas espécies há sugestões que, por ser uma
estrutura hidrofóbica, poderia auxiliar na dispersão do esporo. Entretanto, em espécies
de Bacillus onde a estrutura não está ausente, como por exemplo em B. subtilis, não
pode ser constada diferenças importantes entre dormência e resistência.
A formação do esporo requer uma intrincada rede de regulação temporal e
espacial e, em B. subtilis, certamente a formadora de esporo mais estudada, requer
mais de 150 produtos gênicos exclusivamente devotados ao processo, dos quais 75
devem agir seqüencialmente, sob pena de interrupção prematura da formação do
esporo. Embora em Bacillus a esporulação seja induza por depleção de nutrientes, esse
programa de diferenciação celular não é iniciado imediatamente após o retardo no
crescimento induzido por essa limitação. As células cessam o crescimento exponencial
típico e entram na fase estacionária. Durante a transição para a fase estacionária, as
células iniciam um vasto repertório de eventos em resposta a crescente adversidade
ambiental. Essa diversidade de respostas alternativas inclui a ativação da motilidade
flagelar, que permite, por quimiotaxia, buscar novas fontes de nutrientes; a produção
de antibióticos para inviabilizar ou inibir o crescimento de microrganismos
competidores no solo; a secreção de enzimas hidrolíticas, que permitem processar
19
proteínas e polissacarídeos extracelulares viabilizando a importação e utilização como
nutrientes alternativos. A indução do estado de competência permite a importação de
DNA exógeno que pode ser incorporado de novo ou, eventualmente, é integrado de
maneira estável, mediado por recombinação homóloga, e adicionando informação ao
genoma. As estratégias utilizadas por B. subtilis para a tomada de decisão entre
permanecer em crescimento vegetativo ou entrar em dormência é hoje um modelo que
tem ajudado na elucidação dos princípios envolvidos na tomada de decisão de
processos de diferenciação celular em eucariotos.
Com essa diversidade de possibilidades, o energeticamente dispendioso e
extremamente complexo processo de esporulação é o último recurso utilizado em
resposta a escassez de nutrientes e é inibido até que as demais alternativas de
crescimento e sobrevivência tenham sido exauridas. Ainda assim, nesse momento,
algumas condições devem ser atingidas para a instalação do processo como, por
exemplo, a alta densidade celular. Antes de iniciar a esporulação, os Bacillus também
monitoram várias condições internas, tais como integridade e estado da replicação do
cromossomo e a integridade do ciclo de Krebs. Este controle estringente
provavelmente assegura que, uma vez iniciada, a formação do esporo seja bem
sucedida, pois a esporulação, além de complexa, é irreversível. Se houver falha na
produção do esporo, essa célula perde, para sempre, a possibilidade de propagar sua
informação genética. Apenas a germinação do esporo maduro leva a restauração da
célula vegetativa, estrutura capaz de se duplicar por fissão binária.
Após a dormência, em condições fisíco-químicas apropriadas, a germinação é
rapidamente disparada em resposta a sinais ambientais, levando a uma rápida
20
degradação da estrutura do esporo, ativação do metabolismo e perda de resistência. O
evento seguinte, denominado extrusão, envolve crescimento e é seguida pela divisão
celular. Esses eventos provocam mudanças na permeabilidade da membrana, no fluxo
de íons e ativam enzimas degradativas. A eficiência na germinação, conhecida como
ativação, pode ser aumentada, em laboratório, por diversos tratamentos incluindo
calor, tempo e agentes químicos e é mediada por mecanismos ainda desconhecidos.
Um grande número de componentes é necessário para iniciar o processo com destaque
para os germinantes, pequenas moléculas, notadamente aminoácidos, açúcares ou
purinas. Os agentes germinantes atuam individualmente ou como mistura, por
exemplo, asparagina, glicose, frutose e íons potássio atravessam as camadas mais
externas se ligam a receptores localizados na membrana do esporo, disparando uma
via de transdução de sinal que ativa o processo. Assim, a viabilidade de espécies
endoesporulantes pode ser mantida, quase que permanente, pela transição entre células
vegetativas e esporuladas (figura 4).
As espécies B. subtilis e B. anthracis foram as primeiras bactérias formadoras
de esporos descritas em dois artigos independentes, publicados em 1876 no mesmo
volume da revista Beitr. Biol. Pflan por Ferdinand Cohn e Robert Koch,
respectivamente. A importância dessas publicações pode ser observada ainda nos dias
de hoje, pelo volume de artigos disponíveis e, conseqüentemente, o conhecimento
gerado em diversas áreas da microbiologia e disciplinas afins, com um grande
destaque para o B. subtilis. Nesse contexto, essa espécie constitui o paradigma de
diferenciação celular em procariotos. Grande parte do que se conhece sobre a
esporulação de B. thuringiensis e espécies relacionadas vem de dados obtidos nesse
21
modelo. Seguramente, esse processo e extremamente semelhante entre as espécies
desse gênero.
Em B. subtilis, assim como em outras bactérias formadoras de endósporos, a
diferenciação celular é dividida, até certo nível de maneira arbitrária, em seis a sete
estágios (I-VII) como descritos na figura 4. É importante ressaltar que, o tempo
necessário para que cada um desses estágios ocorra, e conseqüentemente, o tempo de
produção e de liberação do esporo maduro é característico de cada espécie. O tempo é
referido como t
n
, onde
n
é o número de horas necessário para inicio de um evento
particular. Desse modo, t
0
indica o início do processo que, em condições de laboratório
ocorre em 8-9 e 48 horas, para B. subtilis e B. thuringiensis, respectivamente.
Alternativamente, tempos negativos, t
-n
, indica eventos anteriores à entrada na fase
estacionária.
A série de mudanças bioquímicas e morfológicas complexas e bem definidas
que caracteriza a esporulação ilustra um verdadeiro processo de diferenciação dentro
do ciclo celular de procariotos e é delineada por eventos que culminam com a
formação do esporo maduro (figura 4). Assim, esse processo de diferenciação envolve
três tipos de células: a pré-divisional; a célula-mãe e o pré-esporo. No estágio zero,
que antecede a esporulação, as células ainda estão em fase vegetativa e replicando
DNA. O processo tem início na fase estacionária com os eventos típicos do estágio I, a
formação do filamento axial, isto é, a formação de um longo filamento de DNA que
extende por toda a célula pré-divisional, onde os dois genomas estão organizados do
centro para os pólos do esporângio, sendo a origem de replicação cromossomal voltada
para os pólos. Ainda se observa a excreção de exoenzimas, incluindo proteases. No
22
estágio II, ocorre a formação do septo assimétrico, isto é, em um dos pólos do
esporângio, levando a delimitação de dois compartimentos de tamanhos distintos. Essa
é a primeira mudança morfológica dramática e é acompanhada da segregação do
material genético. Esse material é resultado do último ciclo de replicação da célula
vegetativa, e até o final do processo permanecerá ativo nos dois compartimentos
formados: o do pré-esporo, a célula germinativa e o da célula-mãe, onde ocorre a
montagem do esporo. Uma vez que o septo é formado, a esporulação é irreversível. O
marco do estágio III é a formação do protoplasto (futuro núcleo do esporo) via
engolfamento do pré-esporo pela membrana citoplasmático da célula-mãe e mediado
por um mecanismo semelhante à fagocitose. Esse evento é acompanhado do aumento
na expressão das enzimas dos ciclos de ácido tricarboxílico e do glioxilato. O aspecto
brilhante visto ao microscópio de contraste de fase se inicia no estágio IV com a
formação do córtex, onde também é iniciada a desidratação do núcleo. O estágio V
marca a formação do revestimento protéico do esporo, as capas interna, que é mais
delgada, e externa, com maior espessura. O estágio VI inaugura a maturação do
esporo, onde há modificação cortical da peptídeoglicana (PG), absorção de ácido
dipicolínico (específico de endósporo) e cálcio, além da expressão de pequenas
proteínas ácido-solúveis (SASPs – com 75 resíduos de aminoácidos). Observa-se
também um aumento na desidratação, pelo menos em parte, pela substituição de água
por dipicolinato de cálcio. Esses eventos levam ao desenvolvimento de resistência aos
agentes físicos e químicos. Finalmente, no estágio VII, quando a nova estrutura, de
morfologia arredonda a ovalada, bem definida e com elevada refratabilidade, pode ser
observada dentro do esporângio, é o fim da maturação. A localização do esporo no
23
citoplasma da célula-mãe pode ser central como em B. subtilis, subterminal como em
B. thuringiensis ou terminal como em Clostridium ssp. A liberação do esporo ocorre
em algumas espécies produtoras de autolisinas, enzimas capazes de hidrolisar ligações
beta (1-4), essas últimas típicas da estrutura da parede celular bacteriana, provocando a
lise e liberação do esporo maduro para o meio.
O citoplasma do núcleo do esporo apresenta pH entre 5,5-6; cerca de uma
unidade abaixo do pH citoplasmático da célula vegetativa, conseqüência da alta
concentração das SASPs (cerca de 5%) complexada com o material genético. Essa
associação previne diversas lesões no DNA durante a dormência. De fato, o maior
fator de proteção conferido ao DNA durante a dormência é a saturação do material
genético com essas proteínas. Essa ligação altera de maneira dramática a química do
DNA e a atividade enzimática relacionada. A ligação dessas proteínas também é
fundamental para a resistência a radiação UV, dessecação, calor, agente oxidantes etc.
Essas proteínas são imediatamente degradadas, por proteases específicas também
contidas no núcleo do esporo, no início da germinação, visando disponibilizar os
primeiros aminoácidos utilizados pela nova célula em formação, durante a extrusão. O
núcleo ainda contém 10-15% de cálcio, quelado por ácido dipicolínico (dipicolinato de
cálcio, 1:1), assegurando que esse cátion divalente não vaze para o meio externo. Esses
componentes, em adição a ribossomos, estão incluídos dentro uma membrana
citoplasmática modifica (membrana interna), que delimita o núcleo do esporo. Uma
fina camada de PG, remanescente da célula vegetativa durante a formação do septo
cerca a membrana interna. Durante a germinação, essa camada fornece os primeiros
monômeros para o início da formação de novas camadas de PG. A camada de PG
24
remanescente é circundada por uma espessa camada denominada córtex, composta por
um tipo incomum de PG. No córtex, ao contrário do que acontece em paredes celulares
típicas de células vegetativas, resíduos de aminoácidos são projetados por camadas
adjacentes e estão frouxamente ligados. O córtex é rapidamente degradado no início da
germinação. Finalmente, o revestimento do esporo é composto por cerca de trinta
proteínas, sintetizadas e depositadas em uma precisa hierarquia, dando origem as capas
interna e externa. Eventualmente, a capa pode estar contida numa estrutura
extremamente delgada (exosporo). Durante a formação do esporo, o núcleo é
desidratado, restando entre 20-30% do volume de água contido na célula vegetativa. O
esporo se torna refringente e resistente aos agentes físicos e químicos descritos, sendo
estas propriedades também correlacionadas com à PG cortical e a presença de grande
quantidade de dipicolinato de cálcio.
A nomenclatura de genes de esporulação, em geral, utiliza o monômero spo e
adiciona algarismos romanos, correspondentes ao estágio da formação do esporo onde
mutações nas seqüências desses genes provocam a interrupção prematura do processo.
Por exemplo, mutação em genes do tipo spoII, interrompe a formação do septo e não
permite a passagem para o estágio III, enquanto que os genes que codificam produtos
necessários ao inicio da esporulação são do tipo spo0. Os diferentes operons são
distinguidos pela adição de uma letra maiúscula, como por exemplo, spoIIA, spoIIB
etc. Os diferentes cístrons, dentro de um dado operón, são representados por novas
letras maiúscula (spoIIAA, spoIIAB etc). Por sua vez, e seguindo a nomenclatura
padrão adotada para produtos gênicos de procariotos, as respectivas proteínas são
designadas pela mesma nomenclatura, no entanto sendo a primeira letra maiúscula e
25
sem o itálico (SpoIIAA, SpoIIAB etc.). Entretanto, nem todos os genes e produtos
envolvidos na endoesporulação são designados segundo essas regras. Muitos genes
foram nomeados segundo a função bioquímica dos produtos, a exemplo do gene
spoOH, que codifica um fator sigma e foi renomeado sigH (σ
H
), além de outros
exemplos descritos abaixo.
A iniciação da transcrição é o evento mais importante na regulação da
expressão gênica em procariotos. A RNA polimerase de bactérias consiste de cinco
subunidades (α
2;
β;β’;ω), mas essa estrutura, denominada núcleo da enzima (RNAP),
não é capaz de iniciar a transcrição a partir de seqüências promotoras. Por essa razão, a
RNAP necessita associar-se a pequenas proteínas, conhecidas como fatores sigma (σ),
formando a RNA polimerase holoenzima (RNAPσ). Esse complexo de seis
subunidades pode reconhecer seqüências promotoras. Além de promover
especificidade a RNAP, os fatores sigma contribuem para a separação das fitas de
DNA e, depois do início da transcrição, se dissociam do núcleo (escape do promotor),
podendo ser novamente recrutado para iniciar novo ciclo de iniciação. A maioria das
bactérias sintetiza diferentes fatores sigma que, por sua vez, reconhecem diferentes
seqüências consenso. Essa variedade de fatores sigma permite a bactéria manter a
expressão gênica basal e, ao mesmo tempo, regular a expressão em resposta a um
estímulo ambiental específico. Células de B. subtilis induzidas à fase estacionária por
carência nutricional possuem uma diversidade de opções. Circuitos de regulação,
altamente complexos e interconectados, dirigem a expressão gênica diferencial e
permitem que a população opte por uma estratégia de sobrevivência. A decisão
depende do resultado de uma elaborada rede de transdução de sinal designada, pelos
26
autores que descreveram o modelo, de phosphorelay. Essa via , composta por diversas
quinases e fosfatases, afeta, em última instância, a atividade dos fatores chaves da
transcrição, Spo0A e AbrB. Se a decisão for entrar em esporulação, uma cascata
temporal e espacial de regulação controlada por fatores sigmas, ligados ao núcleo da
RNA polimerase, promove a formação do esporo.
O genoma de B. subtilis codifica pelo menos dezessete fatores sigma, incluindo
sete fatores sigma extra-citoplasmáticos (ECFs). Os ECFs ativam a expressão gênica
em resposta uma diversidade de sinais de estresse, sendo a maioria co-transcrita com
um ou mais reguladores negativos. Em geral, esses reguladores incluem uma proteína
transmembrânica com um domínio extra-citoplasmático, o sensor do sinal e um
domínio inibitório intracelular, que funciona como um fator anti-sigma ao se ligar e
inibir o respectivo ECF até o momento de entrar em atividade. Dentre os dezessete
fatores sigma dessa Gram positiva, nove são fatores sigma primários, e reconhecem
seqüências promotoras de genes cujos produtos estão envolvidos no metabolismo basal
(σ
A
); de genes de
resposta ao choque térmico (σ
B
); de genes cujos produtos estão
relacionados com flagelo e quimiotaxia (σ
D
), além de sete ECF (SigV, SigW, SigX,
SigY, SigZ, SigM e YlaC), que são co-transcritos com seus respectivos operons.
Outros cinco fatores sigma primários são relacionados com a esporulação (σ
H
, σ
F
,
σ
E
,
σ
K
e σ
G
).
O σ
H
, que é observado em baixas concentrações durante o crescimento
vegetativo, funciona primariamente na transição para a fase estacionária até a
formação do septo. Em conjunto com Spo0A fosforilado, é o elemento chave na
27
regulação do início da formação do esporo. Os outros quatro (σ
F
,
σ
E
, σ
K
e σ
G
) são
exclusivos desse processo. Em adição aos dezesseis fatores sigma primários
pertencentes à família σ
70
, o σ
L
participa na síntese dos produtos do operón levanase e
pertence à família σ
54
.
Desse modo, a profunda mudança morfológica que ocorre durante a esporulação
é acoplada a uma mudança global na expressão gênica que, por sua vez, é mediada por
sucessivas ativações de fatores sigmas alternativos. A elevação no nível de σ
H
, em
conjunto com a ativação do regulador de resposta Spo0A, na célula pré-divisional
permite disponibilizar produtos importantes para a formação do filamento axial,
divisão assimétrica e compartimentalização da expressão gênica. Imediatamente após a
divisão assimétrica, σ
F
se torna ativo exclusivamente no compartimento do pré-esporo
e σ
E
é ativado exclusivamente no compartimento da célula-mãe. As duas linhas
separadas de expressão gênica dirigem o engolfamento do pré-esporo, pela célula-mãe,
e resultam na ativação dos fatores sigmas tardios, específicos de cada um dos
compartimentos. Após o engolfamento, o fator σ
G
é ativado no compartimento do pré-
esporo e o fator σ
K
é ativado no compartimento da célula-mãe. As sínteses do córtex e
das capas, a maturação do esporo e a lise da célula-mãe são mediadas pelas atividades
dos fatores sigmas especificamente ativados nos dois compartimentos em estágios
tardios. Cada passo é dependente da conclusão do anterior.
Provavelmente, a esporulação é idêntica em B. thuringiensis e B. subtilis, com a
adicional produção de δ-endotoxinas, no citoplasma da célula-mãe de B. thuringiensis.
A diferenciação é disparada por depleção de nutrientes e ainda assim a intensidade na
28
produção e o processo de esporulação, associado a todas as mudanças fisiológicas e
morfológicas, prosseguem em paralelo. Dessa maneira, o empacotamento das toxinas,
em cristais insolúveis, está relacionado com a expressão dessas proteínas durante a
fase estacionaria (Agaisse e Lereclus, 1995). Em condições laboratoriais, as células de
B. thuringiensis em esporulação sintetizam cerca de 0,5 mg de proteínas Cry por mL
de meio (cerca de 10
8
células/mL), acumuladas em estruturas com tamanho compatível
com a presença de 10
6
moléculas de proteínas de 130 kDa por cristal. Essa relação
corresponde, tipicamente, de 25 a 30% das proteínas totais das células em esporulação
(Du et al., 1994). Essa premente expressão, a partir de genes presentes em baixo
número de cópias, só pode ser explicada pela intervenção de elementos genéticos que
atuam na síntese e cristalização dessas toxinas e envolvem mecanismos extremamente
eficazes. Dessa maneira, além do interesse em estudar essa bactéria com objetivos de
otimização como ACB, o B. thuringiensis é um atraente modelo de estudo do ponto de
vista da interação entre a síntese de δ-endotoxinas, codificadas por plasmídeos, e a
esporulação.
Segundo Aronson (2002), aparentemente os genes cry evoluíram, ou estão
evoluindo, para assegurar a coordenação com a esporulação, a partir da transferência
de seqüências plasmideais, flanqueadas por elementos móveis. Após essa
transferência, um ancestral, muito provavelmente o B. cereus, incorporou essas
informações ao repertório genético estável, algum tempo depois da aparição dos
insetos.
De fato, a expressão dos genes cry em sua maioria é dirigida pelos dois fatores
sigmas específicos do compartimento da célula-mãe. Essa estratégia permite a ativação
29
da síntese ainda nos estágios iniciais, permanecendo eficiente até estágios tardios da
esporulação. Dois pontos de iniciação da transcrição sobrepostos foram mapeados
definindo dois promotores, BtI e BtII, com estruturas sobrepostas e que podem ser
ativados de maneira seqüencial (Wong et al., 1983). O promotor BtI entra em atividade
a partir do estágio II (t
2
) com a transcrição dirigida por um homologo funcional de σ
E
,
prosseguindo até t
5
, então no estágio III. A partir desse momento, a continuidade da
expressão é garantida pelo reconhecimento de BtII por um homologo de σ
K
. Essa
arquitetura rara de seqüências promotoras, que controla a transcrição em níveis
semelhantes durante todo período de expressão, é reconhecida pelas RNAPσ
35
(Brown
e Whiteley, 1988) e RNAPσ
28
(Brown e Whiteley, 1990), respectivamente. A
seqüência de aminoácidos deduzida revelou 88 e 85% de identidade desses fatores
sigma como os homólogos funcionais σ
E
e σ
K
de B. subtilis, respectivamente (Adams
et al., 1991). Do mesmo modo, o controle temporal da transcrição no compartimento
da célula-mãe, pela ativação sucessiva de σ
35
e σ
28
, ao mesmo tempo assegura a
formação do esporo e produção do cristal. A transcrição de genes que ocorre no
compartimento do pré-esporo é dependente dos homólogos funcionais de σ
F
e σ
G
,
respectivamente, ainda não caracterizados em B. thuringiensis.
Outra variação no sistema dual de expressão das toxinas Cry, foi relatada para os
genes cry4A, cry4B e cry11A de B. thuringiensis israelensis (Poncet et al., 1997),
transcritos em baixos níveis durante o final da fase exponencial, a partir de uma
seqüência promotora reconhecida por σ
H
. Essa seqüência promotora sobrepõe uma
seqüência de DNA reconhecida por σ
E
. Dessa forma, os respectivos transcritos estão
30
presentes no final da fase do crescimento exponencial, produto de σ
H
, mas não podem
ser observados no início da fase estacionária, graças a repressão mediada pela
interação de Spo0A com a seqüência alvo (Spo0A box), também presentes na região 5´
UTR desse gene. Entretanto, um novo ciclo de transcrição pode ser observado entre t
4-
6
, a partir de seqüências promotoras reconhecidas por σ
E
.
Aparentemente, a sobreposição de promotores é uma importante modificação da
utilização de fatores de transcrição da esporulação empregada para a expressão de
genes cry e para a montagem das protoxinas em inclusões (ver abaixo). Apesar disso,
uma surpreendente exceção nesse padrão de expressão foi observada em 1993 por De-
Souza e colaboradores. Nesses estudos sobre regulação, foi observada a presença de
mensageiros do gene cry3A a partir de t
-2,
ou seja, duas horas antes do início da fase
estacionária. O ponto de iniciação da transcrição foi mapeado 558 pb acima do ATG
iniciador (De-Souza et al., 1996; Agaisse e Lereclus, 1994a), mas o mensageiro é
imediatamente processado dando origem a uma forma mais estável (ver abaixo).
Análise da seqüência promotora revelou alta homologia com a seqüência canônica
reconhecida por σ
A
de B. subtilis (De-Souza et al., 1996; Agaisse e Lereclus, 1994b).
Dessa maneira, é apropriado dividir os genes cry em dependentes da esporulação,
como é o caso da maioria e, com poucas exceções, independentes desse processo.
Parece óbvio que proteínas expressas em altos níveis, como as δ-endotoxinas,
sejam codificadas por mensageiros estáveis. Entretanto, os mRNAs são moléculas com
meias-vidas curta quando comparadas com outras biomacromoléculas, como proteínas
ou DNA. Apesar disso, os transcritos de bactérias tem uma ampla variação na
31
estabilidade, podendo permanecer funcional desde 0,5 até 50 minutos, com meia-vida
média de três minutos (Takayama e Kjelleberg, 2000). Em 1972, Glatron e Rapoport
demonstraram que os mensageiros de gene cry permanecem ativos por cerca de dez
minutos. Resultados posteriores apontaram que, a maioria dos genes cry1 está
organizada em unidades monocistrônicas, com ponto de iniciação da transcrição
situado tipicamente acima do ATG iniciador, cerca de 100-150 pb, e seqüência de
terminação da transcrição situada próxima do códon de terminação da tradução
(Schnepf et al., 1998; Agaisse e Lereclus, 1995; Baum e Malvar, 1995). A terminação
da transcrição de cry1A é independente de Rho e a estrutura terminadora é
caracterizada por grandes seqüências invertidas e repetidas (IRs), potenciais
formadoras de estruturas em alça e que, possivelmente funcionam como
retroreguladores positivos, protegendo esses mensageiros contra o ataque de
exonucleases com atividade 3’→5’ (Wong e Chang, 1986).
A análise estrutural da região 5’ UTR do gene cry3A (De-Souza et al., 1993 e
1996; Agaisse e Lereclus, 1994a) sugere que o mensageiro, com ponto de iniciação da
transcrição mapeado no nucleotídeo -558, é processado postranscionalmente, dando
origem a um mRNA mais estável e com extremidade 5’ mapeada em -129. O elemento
estabilizador foi atribuído a uma seqüência similar à seqüência consenso Shine-
Dalgarno (SD) consenso, localizada na extremidade 5’ UTR do gene. Mutações nessa
região mostram que essa SD adicional não é funcional, do ponto de vista traducional,
mas media a ligação da extremidade 3’ do rRNA 16S a região. Por sua vez, a ligação
da subunidade ribossomal 30S estabiliza o transcrito correspondente. Outros genes
cry3 apresentam mecanismo semelhante (Schnepf et al., 1998).
32
Os genes cry são transcritos em diferentes níveis, resultando em quantidades
desiguais de protoxinas dentro de uma mesma inclusão (Aronson, 2002). Diversos
fatores podem explicar esse aparente paradoxo: o número de cópias dos diferentes
plasmídeos portadores dessas informações numa dada estirpe, as diferenças em
estabilidade inerentes a cada produto e diferenças no nível de transcrição, ainda que
esse evento seja mediado por regiões promotoras idênticas. Essas diferenças, até o
momento pouco dissecadas, podem ser mediadas por informações contidas em
seqüências que flanqueam a extremidade 5’ UTR do gene, situadas anteriormente à
região promotora. O seqüenciamento de genes cry, de uma maneira geral, se limita a
pequenos fragmentos que flanqueiam a região codante, fornecendo pouca ou quase
nenhuma informação adicional a respeito da regulação da expressão.
As inclusões compostas por protoxinas variam em tamanho e forma (Aronson,
2002). A estrutura e solubilidade do cristal dependem da energia necessária para o
rompimento das inúmeras pontes dissulfeto e de componentes adicionais. Essas
morfologias refletem a porção C-terminal das respectivas cadeias primárias. A
extremidade C-terminal das proteínas de 130-140 kDa é rica em resíduos de cisteína
(entre 16 e 19) interligados por pontes S-S intracadeia. As proteínas naturalmente
truncadas, como as do tipo Cry3, não possuem esse alto número de resíduos de
cisteína, aparentemente envolvidos na formação do cristal bipiramidal. A estrutura
dessa protoxina provavelmente é empacotada por interações iônicas intermoleculares
(Li et al., 1991), num citoplasma com características redutoras, próprias da fase de
crescimento vegetativo. Por outro lado, o ambiente oxidante do compartimento da
célula-mãe é mais apropriado para a formação de pontes S-S.
33
Diversos elementos que aumentam a síntese e empacotamento de proteínas
naturalmente truncadas como Cry2A e Cry11A, foram identificados. Esses elementos
incluem duas proteínas que otimizam a tradução e/ou a cristalização dessas protoxinas.
Uma proteína de 20 kDa, codificada pelo gene orf3 do operon de cry11A e uma de 29
kDa, codificada pelo gene orf2 do operon de cry2A, aparentemente atuam de modo
semelhante à chaperonas e facilitam a cristalização. Diversos estudos mostraram que
esses elementos isolados, em combinação ou em associação com outros elementos
genéticos, podem ser manipulados para aumentar a produção de proteínas Cry.
A limitação do conhecimento da ecologia de B. thuringiensis, assim como o
benefício de acumular uma grande diversidade de toxinas em altos níveis dificulta
ainda mais especular sobre a regulação dos genes de δ-endotoxinas. Em adição ao que
foi resumido acima, provavelmente existem outros eventos menos óbvios relacionados
com a regulação da expressão dessas toxinas, muitos desses mediados por informações
contidas em plasmídeos de B. thuringiensis, a exemplo das exotoxinas e VIPs. Assim,
para o melhor conhecimento da biologia molecular dessa bactéria, o potencial de
atividades codificado por plasmídeos, que representa até 20% do genoma, deve ser
analisado em conjunto com aqueles contidos no cromossomo.
Apesar da alta eficiência dessas toxinas, o B. thuringiensis apresenta algumas
limitações como ACB. Nos casos onde a cultura é atingida por um complexo de
pragas, a alta especificidade desse microrganismo compromete a utilização desse
agente. Por outro lado, existem casos onde a própria ecologia da praga dificulta esse
tipo de controle, quando as larvas se alimentam de tecidos internos ou de raízes,
conseqüentemente impossibilita o acesso do B. thuringiensis. Além disso, os cristais
34
de B. thuringiensis apresentam baixa persistência no campo, pois podem ser
degradados pela ação de raios ultravioleta ou lavados por fatores ambientais, como
água da chuva ou orvalho. Entretanto, essas restrições tem sido superadas com o
desenvolvimento de estratégias mais eficientes, por meio de processos
biotecnológicos. Técnicas como a do DNA recombinante e outras manipulações
gênicas têm proporcionado alternativas, tanto pela otimização dos formulados a base
de B. thuringiensis, quanto pela expressão transgênica (Valadares-Inglis et al., 1998).
Nesse sentido, a compreensão da ecologia de B. thuringiensis, bem como a
interação dessa bactéria com outros organismos, pode proporcionar uma melhor
exploração do potencial como ACB, inclusive, permitindo a exploração de recentes
relatos que apontam para a interação de B. thuringiensis com plantas, por um tipo de
colonização característico de endofíticas (Bai et al., 2002; Gray et al., 2006). Por esse
motivo, o esclarecimento dessas interações são importantes para, eventualmente,
promover maior versatilidade no controle microbiano de insetos.
35
1.2. Bactérias endofíticas
Os microrganismos são encontrados colonizando os mais diversos habitats,
como o sistema digestório de animais superiores, a superfície e o interior de plantas, a
matéria orgânica morta, a água doce e salgada etc. Sua capacidade de adaptação
permite que estejam presentes mesmo em ambientes considerados inóspitos para
outros seres vivos, tais como fontes termais submarinas e interior de rochas e geleiras
(Newman & Banfield, 2002).
Tecidos de plantas constituem um verdadeiro ecossistema microbiano. No
interior das plantas hospedeiras, os microrganismos podem ocupar diferentes nichos e,
por esse motivo, podem ser relacionados em classes distintas. Aqueles classificados
como epífitos são encontrados na superfície de plantas, os fitopatógenos são agentes
causadores de doenças e os endofíticos colonizam os tecidos internos da hospedeira,
estabelecendo associações duradouras e naturais, sem que essa relação cause danos
substanciais à hospedeira, podendo, em muitos casos, estabelecer uma relação benéfica
(Azevedo et al., 2000; Hallmann et al. 1997).
A distinção entre os microrganismos colonizadores de tecidos de plantas foi
proposta em 1866 por Bary. Em alguns casos, o tipo de relação, benéfica ou
patogênica, depende de fatores como condições ambientais ou equilíbrio com as
comunidades microbianas. Sendo assim, uma bactéria endofítica pode, dependendo
das condições, comportar-se como patógeno. Ou ainda, uma epífita pode colonizar
tecidos internos da planta, atuando como endofítica ou patogênica (Sabaratnam e
Beattie, 2003; Andrews e Harris, 2000). Entretanto, microrganismos que estabelecem
infecções dormentes, ou latentes, não são considerados endofíticos, uma vez que essa
36
relação não é duradoura (Bacon e Hinton 1997). Assim, a distinção entre endofíticos,
epifíticos e fitopatógenos tem proposição apenas didática, pois a interação entre
microrganismos e plantas pode variar, tornando-se difícil estabelecer um limite para
discriminar cada uma dessas classes (Baldani et al., 1997). Dentro dessa dinâmica,
Azevedo et al. (2000) acrescentam que, mais recentemente, Baldani e colaboradores
sugeriram o termo “endofítico associativo ou facultativo" para denominar as estirpes
capazes de colonizar a superfície e interior da raiz e sobreviver bem no solo. Por outro
lado, “endofítico obrigatório" denominaria as estirpes que são incapazes de sobreviver
bem no solo, mas são capazes de colonizar o interior da raiz e as partes aéreas da
planta.
Dessa maneira, são considerados endofíticos os microrganismos encontrados
colonizando tecidos vegetais por, ao menos, uma parte de seu ciclo de vida. Esses
podem ser isolados a partir de tecidos de plantas com superfície descontaminada ou
diretamente dos tecidos internos (Hallmann et al., 1997). O interesse no emprego de
endofíticas no controle biológico de pragas agrícolas e patógenos de plantas surgiu
somente após 1980, com a descoberta desse potencial de utilização (Azevedo et al.,
2000; Jacobs, et al. 1985). Esses microrganismos também podem induzir alterações
fisiológicas em plantas tornando as hospedeiras mais resistentes ao estresse hídrico
(Azevedo et al., 2000).
Desde então, o crescente entendimento da interação planta-endófito e o relato
de funções importantes desses microrganismos com as hospedeiras viabilizaram a
utilização de bactérias endofíticas no controle biológico de patógenos (Hallmann et al.,
1997), na indução de crescimento vegetal (Bent e Chanway, 1998; Hallmann et al.,
37
1997; Hoflich et al., 1994), na biorremediação de áreas poluídas (Newman e Reynolds,
2005), na fixação do nitrogênio atmosférico e na síntese de fitormônios e enzimas
(Lambert e Joos, 1989).
Diversos microrganismos endófitos possuem a capacidade de produzir
fitormônios, como as auxinas, as citocininas, as giberelinas, o ácido abscísico e o
etileno, que proporcionam a estimulação do crescimento vegetal. Essa característica
foi relatada em espécies de bactérias dos gêneros Azospirillum, Herbaspirillum,
Erwinia, Pantoea e Pseudomonas (Kuklinsky-Sobral et al., 2004; Lee et al. 2002).
Os microrganismos endofíticos podem atuar, em certos casos, no controle
biológico de pragas e patógenos antagonizando os agentes causadores de doenças. Os
endófitos ainda podem competir por nutrientes ou ainda liberar compostos capazes de
inibir o crescimento de patógenos (Azevedo et al., 2000), como é o caso de uma
estirpe endofítica de B. subtilis, que atua no controle do fungo Fusarium moniliforme,
patógeno de milho (Bacon et al. 2001).
Um dos primeiros relatos do controle biológico de pragas por endófitos
descreve um metabólito secundário sintetizado pelo fungo Phomopsis oblonga ativo
para larvas do besouro Physocnemum brevilineum, conhecido vetor do patógeno
Ceratocystis ulmi, impedindo assim a propagação da doença em olmo (Claydon et al.,
1985).
Estudos demonstraram que algumas endofíticas são diazotróficas, ou seja, são
capazes de fixar nitogênio (Engelhard et al., 2000; Olivares et al., 1996; Ureta et al.,
1995). A fixação do nitrogênio é o processo de conversão de N
2
, um gás inerte que
38
representa 70% da composição da atmosfera, à formas mais reduzidas e mediado
exclusivamente por bactérias. A obtenção do nitrogênio em formas reduzidas é
indispensável pois fornece compostos nitrogenados diretamente para as plantas por
meio de associações. A outra forma de obtenção do nitrogênio ocorre apenas pela
decomposição de organismos mortos e liberação dos mesmos no ambiente,
disponibilizando o nitrogênio necessário para o desenvolvimento vegetal. Gramíneas
de importância econômica, tais como cana-de-açúcar, arroz, trigo, sorgo, milho e
algumas forrageiras foram identificadas como hospedeiros de diversas espécies de
bactérias endofíticas diazotróficas, sendo as principais G. diazotrophicus,
Herbaspirillum spp. e Azospirillum spp (Boddey et al. 2003; James 2000; Baldani et
al., 1997; James et al., 1997).
A principal via de penetração de endófitos na planta é a raiz da hospedeira. No
entanto, essa penetração também pode ocorrer, em regiões aéreas como flores, caules,
folhas, por meio de aberturas naturais como lenticelas, hidatódios ou por ferimentos
nos tecidos (Hallmann et al., 1997; Roos e Hattingh, 1983). Outra estratégia de entrada
é pela degradação da parede celular da planta por atividades celulolíticas e pecnolíticas
microbianas, permitindo o acesso para os tecidos internos (Azevedo, 2000).
Após a penetração os microrganismos endofíticos podem se fixar no ponto de
entrada ou se difundir pela planta, colonizando células, espaços intercelulares, ou o
sistema vascular (Bell et al., 1985; Jacobs et al., 1985; Patriquin et al., 1978).
Com o intuito de monitorar a colonização de plantas hospedeiras e,
conseqüentemente, compreender melhor a relação entre microrganismos e plantas,
estudos utilizando a expressão heteróloga de GFP tem sido realizados, permitindo,
39
avaliar o tipo de colonização das hospedeiras tanto por endofíticos quanto por
patógenos (Hallmann, 1997).
A elucidação das interações entre bactérias e plantas é essencial, não apenas
para o entendimento ecológico incluído as relações entre os microrganismos e suas
hospedeiras, mas também pelas aplicações biotecnológicas tanto na medicina, quanto
na agricultura e na industria, pela prevenção da invasão por patógenos, pela produção
de hormônios, pela expressão heteróloga por endofíticas, dentre as diversas outras
aplicações até então descritas. Apesar dessa importância os microrganismos
endofíticos são relativamente pouco estudados (Strobel e Daisy, 2003; Bloemberg e
Lugtemberg, 2001; Azevedo et al., 2000).
Baseado em relatos anteriores, as espécies dos gêneros Bacillus, estão entre
as endofíticas predominantes isoladas nas diferentes hospedeiras estudadas (Araújo,
2002; Hallmann et al., 1997). Dentre as bactérias do gênero Bacillus encontradas em
tecidos vegetais, a espécie B. thuringiensis, conhecida pelo seu potencial
entomopatogênico, foi descrita colonizando raízes de soja o que levou estimulação do
crescimento de tecido, além de produzirem biocinas, atuando então como
microrganismos endofíticos (Gray et al., 2006). De acordo com Bai et al. (2002),
dentre quatorze isolados de bactérias, possivelmente endofíticas e isoladas de raízes de
soja, três pertencem ao gênero Bacillus. Duas dessas foram identificadas, por análise
filogenética da subunidade ribossomal 16S, como B. subtillis e uma de B.
thuringiensis.
O B. thuringiensis é uma bactéria amplamente estudada. No entanto, sua
ecologia ainda é pouco conhecida, uma vez que a maioria dos trabalhos descritos está
40
relacionada ao seu potencial entomopatogênico (de Maagd et al., 1997). O uso da GFP
como ferramenta de monitoramento pode facilitar o estudo da ecologia dessa bactéria,
bem como sua interação com a hospedeira. A elucidação de genes envolvidos nesses
processos permitirá também a construção de recombinantes otimizados para a
utilização como ACB, além de possibilitar a rastreabilidade desses OGMs.
41
1.3. Green fluorescent protein (GFP)
A proteína de fluorescência verde, green fluorescent protein (GFP), foi relatada
pela primeira vez em 1962 por Shimomura e colaboradores, durante experimentos que
visavam identificar a molécula capaz de promover a emissão de bioluminescência em
espécies de água-viva do gênero Aequoria (figura 5). O alvo do estudo era a proteína
quimioluminescente aquarina, entretanto, uma outra proteína capaz de emitir forte
fluorescência verde foi identificada como um subproduto do processo de purificação
da aquarina. Essa proteína foi denominada green protein pois seu precipitado
apresenta coloração verde mesmo em luz ambiente (Hastings e Morin, 1969). No
entanto, essa nomenclatura foi considerada inadequada, e referindo-se à capacidade de
emitir fluorescência verde, foi modificado para green fluorescent protein (Morin e
Hastings, 1971).
Figura 5.
A. victoria. Fotografia demonstrando a
emissão de fluorescência por A. victoria.
Fonte: www.immunok.com/newsimages
42
Em 1974, Morise e colaboradores elucidaram a relação entre as proteínas
aquarina e GFP na bioluminescência de Aequorea sp. A aquarina é responsável pelo
fornecimento da energia necessária para a emissão de luz, que promove a excitação
das moléculas de GFP, por um mecanismo do tipo Föster. A GFP absorve luz com
uma excitação máxima em comprimento de onda (λ) de 395 nm, e no estado excitado
dissipa a energia na forma de luz verde λ
máx
de 509 nm (figura 6). Na ausência de
GFP, a aquarina emite luz azul com λ
máx
470 nm.
Figura 6. Representação da interação entre GFP, aquarina e emissão
de fluorescência em A. victoria.
Aquarina emite luz azul promovendo a excitação
da GFP, resultando na emissão de luz verde.
Fonte:http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-
ww/GFP2.htm
Inicialmente, ambas, aquarina e GFP, despertavam atenção pela sua forte
capacidade de absorbância em luz visível, porém, não apresentavam nenhuma
luz verde
Luz
a
z
u
l
43
importância particular que despertasse interesse em sua aplicação prática (Shimomura,
2005). Os subseqüentes estudos de caracterização da GFP possibilitaram a
cristalização, em 1974, por Morise e colaboradores, e a resolução de seu padrão de
difração por raio X, em 1988, por Perozzo e colaboradores.
A seqüência de aminoácidos da cadeia primária da GFP foi elucidada em 1992
po Prasher e colaboradores, por meio da clonagem e seqüenciamento do DNA
genômico e complementar (cDNA) do gene correspondente, denominado gfp. Foi
determinado que a proteína possui 238 resíduos de aminoácidos e massa molecular
calculada de 26.888 Da.
A estrutura do cristal foi resolvida somente em 1996, por dois grupos
independentes (Örmo et al., Yang et al.), sendo uma estrutura composta por onze
folhas β em formação do tipo barril, alinhadas por uma α-hélice no eixo do cilindro
(figura 7A). O cromóforo, ou fluoróforo, encontra-se no interior do cilindro (figura
7B) sustentado pelas α-hélices. As estruturas estão depositadas no “Protein Data
Bank” com o número de acesso 1EMA (Örmo et al, 1996) e 1GFL (Yang et al, 1996).
A fluorescência da GFP é explicada pela presença de um cromóforo
denominado p-hidroxibenzilideneimidazolidinona formado pela ciclização e oxidação
autocatalítica dos resíduos de aminoácidos Ser-Tyr-Gly (figura 8), nas posições 65-67
(Cody et al., 1993). A formação do cromóforo ocorre independente da adição de co-
fatores e com a proteína solubilizada, uma vez que em estado insolúvel a cadeia
polipeptídica é incapaz de adquirir a conformação ativa (Reidi e Flynn, 1997). Durante
a formação do cromóforo, a molécula de GFP assume uma conformação próxima à
nativa, possibilitando a formação de uma imidazolinona por ataque nucleofílico do
44
carbonil Ser
65
à amida Gly
67
, seguido pela desidratação. Finalmente, o oxigênio
molecular desidrogeniza a ligação α-β do resíduo 66, conjugando o grupo aromático
com a imidazolinona, tornando assim, a molécula capaz de emitir fluorescência (Reid
e Flynn, 1997; Heim et al., 1994).
Figura 7.
Estrutura tridimensional da GFP. Representação da estrutura
tridimensional em forma de barril formada por onze folhas β (em verde), mostrando o
cromóforo no interior do cilindro, ancorado pelas α hélices, ressaltando, em amarelo, a estrutura
do cromóforo.
A) vista pela parte frontal. Fonte: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Images.htm. B) vista
pela parte superior.
Fonte:http://thalamus.wustl.edu/nonetlab/ResearchF/GFPtags.html
Para a correta formação do cromóforo apenas o resíduo de aminoácido Gly
67
é
indispensável, pois substituições dos outros dois resíduos de aminoácidos presentes
parecem não impedir a formação do cromóforo. Sendo assim, o grupo aromático do
resíduo de aminoácido Tyr
66
pode ser substituído e a proteína se manter fluorescente
(Remington, 2006). Essa característica permitiu o desenvolvimento das conhecidas
A
B
45
primeiras variantes de GFP, blue fluorescent protein (BFP) e cyan fluorescent protein
(CFP, Tsien, 1998).
Dessa maneira, são conhecidas diversas outras proteínas que emitem
fluorescência em diferentes cores e que também apresentam largo emprego em
processos biotecnológicos (figura 9). Baseadas na maturação do cromóforo, as
proteínas fluorescentes podem ser divididas em duas classes, (Remington, 2006). As
proteínas capazes de emitir fluorescência entre as cores azul e verde, possuem
mecanismo de maturação do cromóforo similar ao mecanismo da GFP, enquanto que
aquelas emissoras de fluorescência entre as cores amarela e vermelha, a exemplo da
proteína fluorescente DsRed, que emite de luz vermelha, apresentam uma reação de
oxidação adicional no processo de maturação formando uma acilimina (Henderson e
Remington, 2005; Gross et al., 2000).
Com a expressão heteróloga de GFP ativa (Chalfie, 1994), as perspectivas de
utilização dessa proteína como ferramenta para pesquisas in vivo se tornaram
ilimitadas. As primeiras clonagens foram realizadas em células de E. coli e
Caenohabidtis elegans, (Chalfie, 1994) e em Drosophila melanogaster (Wang e
Hazelrigg, 1994), demonstrarando a capacidade de expressão de GFP tanto em
organismos procariotos como em eucariotos. Também foi possível confirmar que a
formação do cromóforo não necessita de substrato ou de enzima específica de A.
victoria, assim como nenhum cofator induz a fluorescência.
46
Figura 8. Esquema do processo de formação do cromóforo de GFP. Ciclização e
oxidação dos residuos de aminoácidos Thy
65
-Tyr
66
-Gly
67
de uma proteína mutante de GFP
(Enhanced green fluorescent protein), resultando na conformação do cromóforo maduro capaz de
emitir fluorescência verde.
Fonte:http://www.olympusconfocal.com/java/fpfluorophores/gfpfluorophore/index.html
Fluoróforo
imaturo
Rearranjo
torsional
Ciclização
Desidratação
Desidratação
Oxidação
Fluoróforo
maduro
47
Figura 9. Padrão de cores das diferentes proteínas
fluorescentes conhecidas.
Fonte:http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm
Rizzuto et al. (1995) relataram a expressão de GFP fusionada à extremidade
amino terminal da subunidade VIII da citocromo c oxidase em células de mamíferos.
Apesar da extensa manipulação da extremidade amino-terminal, e do ambiente redutor
da matriz mitocondrial, foi verificada a emissão de forte fluorescência, sem nenhuma
alteração nas propriedades de emissão de luz ou nas características do espectro da
proteína fluorescente. A possibilidade da GFP ser direcionada, in vivo, para qualquer
compartimento subcelular, tornou a utilização dessa molécula ainda mais promissora.
O direcionamento pode ser obervado por fusões transcricionais da GFP com proteínas
específicas, possibilitando a visualização de diferentes estruturas celulares pela
excitação do cromóforo em comprimento de onda adequado.
O emprego de GFP tornou-se mais atraente graças ao sucesso na rastreabilidade
genética de muitos organismos, além da maneira fácil e rápida que pode ser expressa
nos diversos sistemas e condições biológicos. A utilização de GFP como molécula
repórter teve um impacto comparável a aplicação de LacZ para o estudo de localização
de macromoléculas in vivo, incluindo bactérias. Entretanto, é importante destacar que,
a GFP tem a vantagem de ser mais sensível, além de não necessitar da adição de
indutor ou substrato. Estudos de macromoléculas, até então por imunomarcação
48
utilizando ouro e por microscopia de imunofluorescência, eram limitados pois
necessitavam de anticorpos diretos contra a proteína alvo e a fixação da amostra,
impossibilitando a investigação em células vivas. A obtenção de anticorpos é um
processo trabalhoso e com rendimento baixo, por esse motivo, o uso de uma proteína
repórter de fácil visualização como a GFP proporcionou o rápido desenvolvimento no
estudo dessas moléculas (Phillips, 2001).
Com o desenvolvimento das metodologias de monitoramento da expressão de
GFP, diversos estudos sobre a localização, tanto de proteínas como DNA foram
facilitados. Esses estudos proporcionaram o entendimento de uma variedade de
processos como divisão celular, replicação e divisão de cromossomo, esporulação,
transdução de sinais etc. Essa metodologia possibilitou, também, um grande avanço no
esclarecimento da organização celular bacteriana (Phillips, 2001), o monitoramento da
expressão gênica, do transporte de proteínas, perturbando minimamente as células,
tecidos ou organismos (Heim et al., 1994).
Estudos da expressão de genes específicos e localização sub-celular de
proteínas ligadas a diferentes estágios de esporulação de B. subtilis tem empregado
amplamente a GFP como repórter (Lewis e Errington, 1996). Além disso, o processo
de divisão celular e septação foi melhor entendido com a utilização de GFP fusionada
a proteínas envolvidas na divisão celular como DivIVA (Edwards et al, 2000), FtsH
(Wehrl et al, 2000) e FtsL (Edwads et al, 2000). Assim como em B. subtilis, a GFP foi
extensamente utilizada em estudos de proteínas relacionadas com a divisão celular em
E. coli, como é o caso das proteínas FtsA (Ma et al, 1996), FtsI (Weiss et al, 1999),
FtsK (Yu et al, 1998), FtsL (Ghigo et al, 1999), FtsQ (Chen et al, 1999), FtsZ (Ma et
49
al, 1996), MinC (Hu e Lutkenhaus, 2000), MinD (Raskin e Bôer, 1997), MinE (Raskin
e Bôer, 1999; Fu et al, 2001) e ZipA (Hale e Bôer, 1999).
De acordo com Chalfie (1994), a utilização de microrganismos marcados com
GFP é uma estratégia muito promissora em estudos sobre a interação de
microrganismos e plantas. O padrão de colonização de Pseudomonas chlororaphis,
bactéria utilizada no controle biológico do fungo Drechslera teres causador da doença
das sementes em grãos de cevada, foi estudado utilizando estirpes recombinantes
expressando GFP (Tombolini et al., 1999). Em adição, a colonização de sementes de
arroz pelas endofíticas Pantoea sp. e Ochrobactrum sp. (Verma et al., 2004), a
colonização epifítica e endofítica de videira por Burkholderia sp (Compant et al.,
2005) e a interação do microrganismo patógeno Xulophilus ampelinus, agente
causador da necrose bacteriana em videiras (Grall e Manceau, 2003) são exemplos do
emprego de GFP.
As proteínas fluorescentes representam uma poderosa ferramenta em estudos
envolvendo biotecnologia de plantas. A conhecida facilidade de detecção da GFP
aliada a aparente ausência de efeitos citotóxicos (Harper et al., 1999) possibilitou a
utilização dessa proteína na seleção de plantas recombinantes (Miki e Mchugh, 2003).
A vantagem dessa técnica de seleção inclui a identificação de possíveis transformantes
em menor tempo após a transformação, ou seja, antes da exposição à pressão de
seleção por exposição a antibióticos ou herbicidas (Jordan, 2000; Harper et al., 1999).
Essa estratégia aumenta a eficiência de transformação, que é especialmente limitante
no caso de cerais (Jordan, 2000). A utilização dessa técnica foi possível pelo
desenvolvimento de mutantes de GFP que garantem a correta formação do cromóforo
50
quando essa proteína é expressa em plantas, além da seleção de moléculas com maior
emissão de fluorescência, como é o caso das mutantes mGFP4, mGFP5 e sGFPS65T
(Haseloff et al., 1997; Chiu et al., 1996). Outra importante utilização da GFP em
plantas está relacionada ao monitoramento de OGMs, a expressão dessa proteína em
tecidos vegetais possibilita o rastreamento desses organismos, sendo possível detectar
fluorescência mesmo em tecidos jovens (Stewart, 2001).
A GFP, assim como outros sistemas de monitoramento, podem ser utilizados
em estudos de colonização de tecidos de plantas por bactérias, incluindo aquelas
utilizadas em controle biológico, sendo as hospedeiras geneticamente modificadas ou
não (Amarger, 2002). Segundo Bloemberg e Lugtenberg (2001), estudos sobre
comunidades microbiológicas e suas interações com plantas são facilitados pela
utilização da GFP e suas variantes como, yellow fluorescent protein (YFP), CFP e
DsRed. Atualmente, estão sendo construídos vetores estáveis no ambiente da rizosfera
expressando essas proteínas (Heeb et al., 2002). A utilização desses vetores, capazes
de expressar proteínas de cores variadas (figura 9), possibilitam o estudo de diferentes
populações bacterianas interagindo com a rizosfera (Stuurman et al., 2000). Essa
técnica foi utilizada em experimentos de colonização de bactérias do gênero
Pseudomonas, empregando variantes de proteínas fluorescentes, enriquecendo o
entendimento sobre as interações dessas bactérias durante o crescimento em raízes
(Dekkers et al., 2000).
A estratégia geral para construção de fusões do gene repórter gfp utiliza a
reação em cadeia da polimerase (PCR), ou outras técnicas de clonagem, modificando
sítios de restrição tanto na seqüência do gene gfp, quanto na seqüência do alvo. O gene
51
gfp repórter pode ser fusionado em ambas as extremidades da seqüência do gene alvo,
gerando fusões traducionais amino ou carboxi-terminais. Essas fusões devem
considerar a estrutura da proteína alvo, respeitando as condições para que esta
permaneça funcional (Phillips, 2001).
Apesar das inúmeras vantagens da GFP nativa, sua utilização pode ser limitada
pela formação lenta do cromóforo, que requer, em média, duas horas após a síntese
para ser formado. Essa característica limita estudos que requerem monitoramento
dentro desse intervalo de tempo, como é o caso da detecção de proteínas com meia-
vida curta. A GFP selvagem tende a formar corpos de inclusão, principalmente quando
em altas temperaturas (superiores à 37 °C), além da intensidade da fluorescência ser
relativamente baixa, o que pode induzir a interpretação incorreta de resultados. Em
algumas situações o monitoramento pode se tornar inviável caso a proteína híbrida seja
expressa em níveis abaixo da sensibilidade da técnica (Heim et al, 1994; Phillips
2001).
Com objetivo de contornar as limitações da GFP selvagem, a otimização no
tempo de formação do fluoróforo, o aumento da emissão de fluorescência (Cormack et
al. 1996) e alteração das propriedades espectrais gerou proteínas variantes mais
eficientes que a GFP nativa (Heim e Tsien, 1996). Cormack e colaboradores (1996)
construíram três proteínas GFP mutantes que emitem fluorescência entre vinte e trinta
e cinco vezes mais intensa por excitação em λ
488
nm. Em bactérias durante o
crescimento em fase logarítimica, cultivadas a 37
o
C, a proteína selvagem dificilmente
é detectada antes de uma a duas horas. Sob condições idênticas, a fluorescência das
proteínas mutantes é detectável dentro de oito minutos. Estes estudos, juntamente com
52
a busca de novas proteínas fluorescentes em outras espécies de celenterados, ampliam
as possibilidades de utilização dessa proteína complementando a atividade da GFP e
suas variantes.
A expressão de GFP em B. thuringiensis fusionada a δ-endotoxinas tem sido
utilizada, principalmente, para verificar a correta expressão dos genes e a capacidade
da emissão de fluorescência nesse organismo, até onde conhecemos, apenas em
estirpes acristalíferas (Cry
-
). A fusão da seqüência codante de gfp, tanto selvagem
como mutante, na extremidade 5’ do gene cry1Ac de B. thuringiensis subsp. kurstaki, e
expressão da proteína recombinante em B. thuringiensis Cry
-
foi
relatada. No entanto,
apesar de confirmada a expressão por gel de poliacrilamida, em condições
desnaturantes (SDS-PAGE) e imunoblot, a detecção de fluorescência não foi
evidenciada, provavelmente pela instabilidade da molécula híbrida em B. thuringiensis
(Roh et al., 2004a e b). A expressão dessa fusão em baculovírus foi relatada em 2003
por Chang e colaboradores. Nesse experimento foi evidenciada a combinação da
toxicidade da proteína Cry1Ac e do baculovírus, aliados a facilidade de
monitoramento da GFP, proporcionando a rápida detecção da atividade
entomopatogênica, além de viabilizar estudos sobre a disseminação do vírus no
campo. A proteína Cry1Ac fusionada à GFP, pode ser um eficiente repórter para
monitoramento de plantas recombinantes tanto na detecção da expressão da proteína,
quanto na análise da transferência gênica em situações de campo (Shen et al., 2006).
Com a finalidade de desenvolver uma ferramenta que permita o rastreamento
de estirpes de B. thuringiensis, e assim facilitar os estudos ecológicos dessa bactéria, o
presente trabalho propõe a expressão de GFP em uma estirpe brasileira selvagem de B.
53
thuringiensis. A estirpe selecionada para o presente trabalho está depositada no Banco
de Bacillus entomopatogênicos Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, e foi
denominada B. thuringiensis subsp. kurstaki S76. Essa estirpe é cerca de onze vezes
mais ativa que a estirpe HD-1, padrão para Lepidoptera, como estimado pela LC
50
(Gitahy, et al., 2007). Por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e ótica, foi
observada a presença de inclusões bipiramidais e cubóides, o que é consistente com o
perfil morfológico de estirpes dessa variedade de B. thuringiensis, sendo também
confirmada a presença das proteínas Cry por análise em SDS-PAGE. Em adição, foi
observada a presença de um pequeno cristal esférico. O perfil plasmidial da S76
também é similar ao obtido para a estirpe HD-1. Amplificações utilizando o DNA total
ou plasmidial da S76 e seqüências iniciadoras específicas indicaram a presença dos
genes cry1Aa, cry1Ab e cry1Ac, que codificam proteínas com atividade para
Lepidoptera e cry2Aa1 e cry2Ab2, que codificam proteínas com atividade para
Diptera. Não foram detectados a presença dos genes cry1Ad, cry2Ac e cry9,
conhecidos por codificarem as respectivas proteínas Cry ativas para Lepidoptera.
A seleção da estirpe para o presente trabalho foi baseada no potencial
entomopatogênico do B. thuringiensis S76 para o controle de Diatraea sacharallis, a
principal praga da cana-de-açúcar, Sacharum sp. Atualmente, a cana-de-açúcar é uma
das principais culturas agrícolas do país fornecendo matéria-prima para a produção de
açúcar, álcool e alimentação animal. No Brasil, a área cultivada com cana-de-açúcar,
em 2003, foi de 6,2 milhões de hectares, com produtividade 428 milhões toneladas
(IBGE, 2006). A agroindústria do açúcar e do álcool aporta para o nosso país, em
54
produto final, dez bilhões de dólares por ano, gerando um milhão de empregos diretos
e indiretos (Rodrigues, 2004).
O controle de D. saccharalis é limitado pela localização da lagarta, dentro do
colmo, tornando essa inacessível para qualquer tipo de formulação de dispersão. Como
parte de um projeto maior, que tem como objetivo o desenvolvimento de um veículo
alternativo e eficiente para a utilização de proteínas Cry visando o controle dessa
lagarta, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma metodologia de
monitoramento, visando facilitar o estudo das interações entre B. thuringiensis S76 e
plantas hospedeiras, especialmente em cana-de-açúcar. Facilitando a determinação das
possíveis vias de entrada do microrganismo nos tecidos internos da planta, a possível
forma de colonização, além de facilitar a identificação dos tecidos preferencialmente
colonizados, e permitir a rastreabilidade da persistência de B. thuringiensis no
ambiente.
55
2. Objetivos
2.1. Objetivos gerais
O presente trabalho tem como objetivo desenvolver uma estirpe de B.
thuringiensis recombinante que permita ser monitorada pela detecção de fluorescência,
mantendo as características selvagens. Com esse intuito, foi selecionada a estirpe
selvagem de B. thuringiensis subsp. kurstaki S76 como hospedeira para a expressão
heteróloga da proteína mutante de GFP.
2.1. Objetivos específicos
! Transferência dos plasmídeos portadores do gene gfpmut3a para as estirpes de
B. thuringiensis S76 e a mutante acristalífera 4Q2-81 utilizada como controle.
! Análises morfológicas de células e colônias recombinantes.
observar se houve mudança nas características de células e colônias, o que pode ser
conseqüência de alguma mudança em nível de genoma;
! Análises dos perfis plasmidial e protéico das recombinantes.
por comparação com a estirpe S76, observar se houve mudanças na expressão de
proteínas Cry e no perfil de plasmídeos residentes, já que a manutenção dessas
características é desejável para o modelo de estudo proposto.
56
3. Material e métodos
3.1. Estirpes e crescimento
. Para obtenção do recombinante S76Cry
+
foi utilizada
estirpe S76 de B. thuringiensis subsp. kurstaki depositada no Banco de Bacillus
Entomopatogênicos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília - DF), e
como controle o mutante acristalífero 4Q2-81 (Cry
-
) de B. thuringiensis israelensis,
totalmente curada de plasmídeos, depositadas no Bacillus Genetic Stock Center (Ohio,
EUA). Culturas de B. thuringiensis em fase vegetativa foram obtidas por crescimento
em meio de cultura LB líquido a 28 ºC, sob agitação de 200 rpm, até o tempo
apropriado e o crescimento celular acompanhando por turbidimetria (A
600
) e/ou
microscopia ótica de contraste de fase. Quando necessário, foi adicionado ao meio de
cultura o antibiótico apropriado. As estirpes de B. thuringiensis foram induzidas à
esporulação utilizando meio HCT (Lecadet et al., 1980), a 28 ºC, sob agitação de 200
rpm por 48-72 h. A cultura esporulada foi submetida a um choque térmico a 80
o
C, por
10 min e os esporos, depois de secos em estufa a 37 ºC, foram estocados em papel de
filtro estéril. E. coli DH5α, utilizada para amplificação dos vetores pAD123 e pAD43-
25, foi cultivada em meio de cultura LB adicionado de ampicilina 100 µg/mL e
cloranfenicol 10 µg/mL, a 37 ºC e 200 rpm de agitação por 16 h. O crescimento em
meio sólido foi obtido acrescentando 1,5% de ágar ao meio LB líquido para cultura de
E. coli e 1,8% de ágar ao meios LB líquido para cultura de B. thuringiensis.
3.2. Plasmídeos. Os vetores pAD123 e pAD43-25 (figura 11; Dunn e Handelsman,
1999) são bifuncionais com seqüências de 5925 e 7262 pb, respectivamente, contendo
57
Figura 10.
Mapa físico dos plasmídeos portadores do gene gfpmut3a. As setas
indicam a direção de expressão dos genes, os sítios únicos de restrição, e mostra a localização dos
genes bla que confere resistência à ampicilina, cat que confere resistência à cloranfenicol e gfpmut3a
que codifica a seqüência da proteína variante de GFP. A seta em verde indica a seqüência promotora.
A) pAD123; B) pAD43-25
Mapas obtidos de http://www.bgsc.org.
A
B
58
origens de replicação para E. coli (pBR322), que replica com cerca de 25 cópias por
cromossomo e para Bacillus (pTA1060), que replica com cinco a seis cópias por
cromossomo. Contém ainda a seqüência codificante do gene bla, que confere
resistência à ampicilina, utilizada na concentração final de 100 µg/mL e a seqüência
codificante do gene cat, que confere resistência ao cloranfenicol, 10 µg/mL,
antibióticos utilizados para seleção em E. coli. O cloranfenicol 10 µg/mL foi utilizado
para seleção em B. thuringiensis. Em adição, os plasmídeos contém a seqüência
codificadora do gene gfp de A. victoria otimizada (gfpmut3a) por Cormack et al.
(1996), que resultou em uma proteína GFP (GFPmut3A) com maior eficiência na
emissão de fluorescência e formação do cromóforo que a proteína homóloga nativa. O
plasmídeo pAD123 não apresenta seqüência regulatória antecedendo a extremidade 5’
do gene gfpmut3a, portanto, esse não é expresso, enquanto que o vetor pAD43-25
possui uma seqüência adicional, proveniente de um fragmento cromossomal B. cereus
UW15, que dirige a síntese de GFPmut3A de maneira constitutiva.
3.3. Eletrotransformação de B. thuringiensis. Os plasmídeos descritos no item
anterior foram amplificados em E. coli DH5α, e foram obtidos por lise alcalina e
purificados por cromotografia de afinidade utilizando um kit Qiagen Tip100 (Qiagen,
Alemanha), conforme instruções do fabricante. O DNA foi precipitado com etanol
absoluto, lavado com etanol 70%, ressuspenso em 100 µL de TE e estocados a -20
o
C.
Quantidade apropriada de pAD123 ou de pAD43-25 foram transferidas para as
estirpes de interesse por eletroporação: 200 mL de células hospedeiras foram crescidas
em meio LB líquido, a 28 °C, até a fase logarítmica média (A
600
≅ 1,5), coletadas por
centrifugação 6000 x g, a 4 ºC, por 15 min; lavadas com 100 mL H
2
O destilada estéril
59
a 4 ºC e ressuspensas em 2 mL de PEG 8.000 40% (p/v). Duzentos e cinqüenta
microlitros de células competentes foram misturadas a 1 µg de plasmídeo, em cubetas
para eletroporação de 0,4 cm (Bio-Rad, USA). As conteúdo das cubetas foi submetido
à eletroporação em sistema Bio Rad Gene Pulser modelo II: 1 pulso de 2,5 V;
capacitância de 25 µF e resistência de 1.000 Ω. As células foram recuperadas em 1 mL
de meio LB líquido, incubadas à 28 ºC, sob agitação lenta por uma hora, plaqueadas
em meio LB sólido contendo, quando necessário, marca de seleção apropriada,
incubadas à 28 ºC por 16-18 h.
3.4. Seleção de clones recombinantes. Os dois clones S76ΩpAD43-25, o único
clone S76ΩpAD123 obtidos pela transformação de S76 com os respectivos vetores,
dez clones Cry
-
ΩpAD43-25 e dez clones Cry
-
ΩpAD123, obtidos pela transformação
do mutante Cry- com os respectivos vetores, aleatoriamente escolhidos, além das
estirpes parentais, foram repicadas em meio LB sólido contendo antibiótico quando
apropriado. As placas foram incubadas a 28
o
C por 24 h e, as respectivas colônias,
analisadas pela inspeção visual de emissão de fluorescência em sistema Typhoon 9210
(Amershan Biosciences – Molecular Dynamics, Reino Unido), com os filtros ajustados
para excitação em λ
532
, para a detecção de emissão de fluorescência em λ
526
e
sensibilidade de 200 mícrons.
3.5. Análise de emissão de fluorescência. As estirpes recombinantes, assim como
as parentais, foram crescidas em meio LB líquido acrescido de cloranfenicol 10
µg/mL, quando necessário, a 28 ºC e agitação de 200 rpm. Amostras foram coletadas
com 2; 4; 6; 8; 12; 24 e 48 h de crescimento e submetidas à análise visual de emissão
de fluorescência pelo sistema Typhoon 9210 e por microscopia de fluorescência. As
60
imagens geradas no sistema Thyphoon 9210 foram obtidas a partir leituras diretas de 1
mL da cultura, realizada em frasco Erlenmeyer e transferida para placas de cultura de
células de 24 poços com diâmetros de 16 mm, com os filtros ajustados como descrito
no item anterior. As amostras também foram analisadas, a fresco, por microscopia
óptica de fluorescência em fotomicroscópio Zeiss Axiophot (Alemanha) em objetiva
100x e as imagens registradas utilizando filme colorido Fuji Superia 135 mm com
sensibilidade de 400 ASA. Para documentação da fluorescência o tempo de exposição
foi entre 15 e 30 s. Os mesmos campos selecionados também foram fotografados em
contraste de fase utilizando o ajuste automático de tempo de exposição do aparelho.
3.6. Perfil protéico. As estirpes analisadas foram cultivadas em meio LB líquido,
conforme descrito anteriormente, por 72 h. As células foram observadas por
microscopia de contraste de fase em objetiva de aumento 100x para certificar a
esporulação de no mínimo 80% da população. Oitenta microlitros de cada cultura
foram submetidos à desnaturação na presença de tampão redutor a 100 ºC por 5 min.
As amostras foram aplicadas em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes
12% e submetidas à eletroforese (1 V/cm) em tampão de corrida 1x. O gel foi
submetido à coloração por solução de Comassie Blue R-250, transferido para a
solução descorante e fotografado com o auxílio de câmera fotográfica digital e
transiluminador de luz branca.
3.7. Perfil plasmidial e de restrição. O DNA plasmidial da estirpe selvagem e dos
clones recombinantes foram obtidos por lise alcalina, precedida por tratamento com
lisozima 4 mg/mL, em 4 mL de tampão TEG e purificados em coluna de troca iônica
utilizando o kit Qiagen Tip100 (Qiagen, Alemanha), de acordo com as instruções do
61
fabricante. O DNA foi precipitado com etanol absoluto, lavado com etanol 70%,
ressuspenso em 100 µL de TE e estocado a -20
o
C. Quantidades apropriadas de DNA
foram digeridas pelas enzimas Hind III e Ssp I (New England Biolabs, EUA), de acordo
com as orientações do fabricante.
Os DNAs plasmidiais intactos ou digeridos foram analisados em gel de agarose 0,6% em
tampão TAE 1x, 4 °C. As amostras e o padrão de massa molecular (1 kb Plus DNA ladder
- Invitrogen, USA) foram misturados com tampão de amostra e aplicados no gel. O padrão
de migração das moléculas de DNA foi visualizado em luz ultravioleta após coloração do
gel com brometo de etídeo (0,5 µg/mL), por 1 h, posterior descoloração em H
2
O destilada,
por 2 h e fotografado utilizando câmera fotográfica digital e transiluminador de luz
ultravioleta.
3.8. Curva de crescimento. O ciclo de crescimento das estirpes S76, S76GFP
-
,
S76GFP
+
, Cry
-
, Cry
-
GFP
-
e Cry
-
GFP
+
foi acompanhado em meio LB líquido, contendo
cloranfenicol 10 µg/mL, quando apropriado, com densidade celular inicial baixa (A
600
de 0,01), a 28 ºC e agitação de 200 rpm. Leituras de absorbância, em
espectrofotômetro Ultrospec 1000 (Amersham Pharmacia Biothec) A
600
foram
realizadas com intervalos de 30 min. a partir da segunda hora de crescimento, até a
entrada na fase estacionária. As curvas de crescimento obtidas são resultados da média
aritmética de três leituras, independentes, da mesma cultura. A partir da média das
amostras, foi calculado o número logarítmico de células por mL de cultura, para
facilitar a plotagem dos dados no gráfico. Para esse cálculo foi considerado que, uma
cultura de B. thuringiensis com A
600
1,5 possui, aproximadamente, 10
8
céls/mL
(Lereclus et al., 1989). Também foi calculado o desvio padrão das amostras.
62
3.9. Análise morfológica das colônias. Esporos das estirpes recombinantes e
parentais, ressuspensos em água bidestilada estéril, foram inoculados em meio sólido
LB com antibiótico adequado, quando necessário. As placas foram incubadas a 28 ºC e
fotografadas após 16 e 40 h de incubação, com câmera digital Canon Power Shot A95.
As imagens capturadas foram impressas em papel fotográfico.
3.10. Análise morfológica das células. Culturas de S76, Cry
-
e os recombinantes
derivados de ambas estirpes foram inoculadas em meio LB líquido acrescido de
antibiótico adequado, no caso das estirpes recombinantes. As amostras foram coletadas
com 2; 4; 6; 12; 24 e 48h de crescimento, analisadas por microscopia óptica de
contraste de fase em objetiva com aumento de 100x e fotografadas com o auxílio de
uma câmera fotográfica digital DCM35 (Hangzhoul Huzxin IC Technology Co.)
acoplada ao microscópio (Zeiss Axiolab, Alemanha). As imagens capturas foram
transformadas em formato JPEG e impressas em papel fotográfico.
63
3.11 - Meios de cultura e soluções
! Meio Luria-Bertani (LB): extrato de levedura 0,5%; peptona de caseína 1%;
NaCl 1%; ajustar pH 7,2 com NaOH.
! Meio HCT: Triptona 0,5%; Hidrolisado de caseína 0,2%; 50 mL de solução I;
10 mL de solução II; 10 mL de solução III, 10 mL de solução IV, o volume foi
completado até 1 L com água destilada. O pH do meio foi ajustado para 7,25
com a adição de KOH e autoclavado a 115 °C, por 30 min. No momento do
uso, foi adicionada glicose 0,3%.
Solução I: KH
2
PO
4
0,5 M
Solução II: MgSO
4
.7H
2
O, 50 mM; MnSO
4
.H
2
O, 1 mM; ZnSO
4
.7H
2
O 4
mM.
Solução III: Fe
2
(SO
4
)
3
7 mM; H
2
SO
4
0,1 M.
Solução IV: CaCl
2
.2 H
2
O 0,1 M; glicose 0,3%; ajustar pH 7,25 com KOH.
! PEG 8.000: polietilenoglicol 40%.
! SDS-PAGE:
Gel de poliacrilamida: Tris-HCL, pH 8,8, 12%
Tampão redutor 2X: Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM; SDS 4%; β-
mercaptoetanol 4%; glicerol 20%; azul de bromofenol 0,1%.
Tampão de corrida 1X: Tris base 24 mM, glicina 19 mM, dodecil sulfato
de sódio 3,5 mM.
Solução de coloração: Comassie Blue R-250 0,01%; etanol 52%; ácido
acético 10%.
Solução descorante: etanol comercial 9,3%; ácido acético 6,3%.
! Solução estoque de Ampicilina 50 mg/mL
64
! Solução estoque de Cloranfenicol 10 mg/mL em etanol
! Solução de lisozima 4 mg/mL preparada TEG no momento do uso.
! TAE 1X: Tris base 40 mM; Ácido acético 18,8 mM; EDTA 1 mM; pH 8.
! Tampão de amostra para DNA: Ficoll 400 25%; Azul de bromofenol 0,25%,
TAE 1X.
! TE: Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM, pH 8,0.
! TEG: Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; Glicose 50 mM; EDTA 10 mM, pH 8,0.
65
4. Resultados e Discussão
B. thuringiensis, apesar de extensamente estudado por seu reconhecido
potencial bioinseticida, é uma bactéria com ecologia muito pouco conhecida. Mesmo
com a crescente utilização desse ACB na agricultura, pouco se sabe sobre possíveis
interações desse microrganismo com as plantas. A maioria dos estudos limita-se à
identificação desses microrganismos em superfície ou tecidos internos de vegetais e no
solo. Um melhor entendimento das interações entre o B. thuringiensis e as plantas é de
grande importância para a melhor exploração do potencial dessa bactéria,
proporcionando alternativas, não apenas para o controle de pragas, mas também para a
exploração de novas estratégias de utilização. Estudos anteriores demonstraram uma
possível interação de B. thuringiensis como endofítico. Essa possibilidade aponta para
um potencial ainda inexplorado: o aproveitamento desse sistema para a expressão
heteróloga de genes de resistência a insetos-praga, reguladores químicos vegetais e
antibióticos, dentre outros, estratégia empregada para diversas outras endofíticas.
A utilização de marcadores que permitam o rastreamento de microrganismos
no ambiente e em diversas condições fisiológicas, é uma ferramenta desejável nos
estudos de interação entre esses e as plantas. Uma alternativa eficiente, principalmente
pela facilidade de detecção, é a expressão de proteínas fluorescentes. Com esse intuito,
no presente trabalho, a estirpe selvagem brasileira S76 de B. thuringiensis kurstaki,
ativa para Lepidoptera, foi transformada com um plasmídeo contendo o gene gfp.
Assim, a estirpe S76GFP
+
foi obtida e analisada segundo diferentes critérios.
Com base em resultados anteriormente obtidos por nosso grupo, pudemos
verificar a baixa eficiência de transformação da estirpe S76 (dados não mostrados).
66
Essa baixa eficiência, somada às possibilidades de cura parcial ou total dos plasmídeos
residentes, imposta pela metodologia utilizada para a transformação, e dos possíveis
eventos de recombinação entre os vetores inseridos e o genoma da hospedeira, foi
utilizada, como controle, a estirpe de B. thuringiensis israelensis Cry
-
4Q2-81, com
reconhecida estabilidade e amplamente utilizada como hospedeira para expressão
heteróloga. É importante ressaltar que, além de não conter genes cry funcionais, esse
mutante sofreu cura total dos plasmídeos residentes. As duas hospedeiras, S76 e Cry
-
,
ainda foram transformadas com o vetor parental que deu origem ao vetor de expressão
da variante de gfp, onde o gene não está precedido de seqüência regulatória.
67
4.1. Obtenção da estirpe recombinante de B.thuringiensis S76 contendo o
gene
gfp (S76GFP
+
)
A estirpe B. thuringiensis S76GFP
+
, objeto de estudo do presente trabalho,
assim como as estirpes controles, S76GFP
-
, Cry
-
GFP
-
, Cry
-
GFP
+
, foram construídas
pela transferência, para as hospedeiras de interesse, dos vetores pAD123 (5.932 pb) ou
pAD43-25 (7.262 pb) conforme mostrado na figura 10A e B (Dunn e Handelsman,
1999). Esses vetores bifuncionais contêm origens de replicação tanto para E. coli
(pBR322), como para Bacillus (pTA1060), marcas de resistência a ampicilina (gene
bla) e cloranfenicol (gene cat), além de uma seqüência de um gene mutante de
gfpmut3a (figura 10A e B). Em pAD123 o gene gfpmut3a (Cormack et al., 1996) não é
funcional podendo ser expresso após a inserção, no sítio múltiplo de clonagem, de um
fragmento contendo uma seqüência promotora em orientação correta. O vetor pAD43-
25 é um derivado do pAD123, contendo uma seqüência adicional, proveniente do
cromossomo de B. cereus UW85, precedendo o ATG iniciador da seqüência
codificadora para gfp. Essa seqüência regulatória dirige a síntese da variante de GFP
de modo constitutivo e em altos níveis.
Os recombinantes obtidos por eletrotransformação foram recuperados em
meio de cultura LB sólido, contendo o antibiótico apropriado. Enquanto que, a
eficiência de transformação da estirpe Cry
-
com os vetores pAD123 (Cry
-
ΩpAD123) e
pAD43-25 (Cry
-
ΩpAD43-25) foi de 5,9 x 10
3
transformantes/µg de DNA e 6,2 x 10
3
transformantes/µg de DNA, respectivamente, a eficiência obtida para estirpe S76 com
ambos plasmídeos (S76ΩpAD123 e S76ΩpAD43-25) foi de 0,6 transformantes/µg de
DNA e 1,2 transformantes/µg de DNA, respectivamente. Essa baixa eficiência de
68
transformação obtida para a estirpe de B. thuringiensis S76 resultou em apenas um
recombinante S76ΩpAD123 e dois S76ΩpAD43-25.
O clone S76ΩpAD123, os dois clones S76ΩpAD43-25, além de dez clones
Cry
-
ΩpAD123, dez clones Cry
-
ΩpAD43-25 e dez clones de cada uma das hospedeiras
não transformadas, escolhidos aleatoriamente, foram submetidos à avaliação de
expressão de GFP por leitura direta de emissão de fluorescência pelas colônias no
sistema Thyphoon 9210. Conforme esperado, ambos os clones S76ΩpAD43-25 e os
dez clones Cry
-
ΩpAD43-25 apresentaram emissão de fluorescência, conforme
estimado visualmente pela comparação com os demais clones utilizados como controle
negativo (figura 11).
Adicionalmente, o DNA plasmidial dos clones recombinantes anteriormente
submetidos a análise de emissão de fluorescência foi extraído, por lise alcalina. As
estirpes recombinantes obtidas a partir de S76 apresentaram conteúdo plasmidial
semelhante ao da estirpe selvagem, exceto pela presença dos respectivos vetores
inseridos (dados não mostrados). Conforme esperado, para os clones provenientes da
transformação de B. thuringiensis Cry- com os plasmídeos de interesse, foi observada
apenas a presença dos respectivos vetores (dados não mostrados).
Dessa forma, como não foi possível discriminar, pelas metodologias
utilizadas, quaisquer diferenças entre os clones analisados, foram selecionadas,
aleatoriamente, um dos dois clones de S76ΩpAD43-25, referido a partir desse ponto,
como B. thuringiensis S76GFP
+
.
69
Figura 11. Varredura da emissão de fluorescência. Recombinantes crescidos em
meio LB sólido durante uma noite foram submetidos a leitura direta de emissão de
fluorescência utilizando o sistema Typhoon 9210 com excitação no comprimento de 532 nm e
detecção de emissão de fluorescência em 526 nm
: A) Cry
-
ΩpAD123; B) Cry
-
ΩpAD43-25;
C) Cry
-
; D) S76ΩpAD123; E) S76ΩpAD43-25 e F) S76.
Da mesma maneira, foi selecionado um dentre os dez clones analisados
anteriormente para cada caso, Cry
-
ΩpAD43-25 e Cry
-
ΩpAD123, que serão referidos, a
partir de então, como B. thuringiensis Cry
-
GFP
-
e B. thuringiensis Cry
-
GFP
+
,
C
70
respectivamente. Os três clones aleatoriamente escolhidos, em conjunto com o clone
S76ΩpAD123, referido como B. thuringiensis S76GFP
-
, foram comparados entre si e
em relação as respectivas hospedeiras, quanto a expressão de proteínas Cry e GFP, a
morfologia de células e colônias, o ciclo celular, os perfis plasmidiais e de restrição.
71
4.2. Análise da expressão da proteína GFP recombinante (GFPmut3a)
Uma vez que o sistema Typhoon 9210 demonstrou-se adequado para observar
a emissão direta de fluorescência das colônias, esse foi utilizado para o
acompanhamento da expressão de GFP durante o crescimento em meio LB líquido,
incubadas a 28 ºC, 200 rpm, com coletas nos intervalos de tempos de 2; 4; 6; 12; 24 e
48 h. Como pode ser observado visualmente na figura 12, foi verificada discreta
emissão de fluorescência pela estirpe recombinante S76GFP
+
a partir de seis horas de
crescimento, com incremento na intensidade até 24 h após a inoculação, essa, seguida
de um decréscimo visual nas leituras de fluorescência. Esse resultado é surpreendente,
uma vez que, a expressão de gfpmut3a é dirigida por fator de transcrição típico de fase
vegetativa (Dunn e Handelsman, 1999). Sendo assim, no momento em que esse fator
encontrar-se inativo, após a septação durante a fase estacionária, a expressão de GFP
cessa. No entanto, possivelmente, a estabilidade da molécula de GFP (Ormö, et al.,
1996; Yang et al., 1996), mesmo quando expressa na fase vegetativa de crescimento
de B. thuringiensis, proporciona estabilidade atividade por períodos mais longos. A
estabilidade da GFP selvagem é notada em diversos sistemas, sendo essa característica
marcante, desde os primeiros experimentos de expressão de gfp onde foi demonstrada
a estabilidade dessa molécula quando expressa em células de procariotos e eucariotos
(Chalfie, 1994). Conforme previsto, a estirpe recombinante S76GFP
-
não apresentou
emissão de fluorescência durante todo o experimento, bem como a selvagem (figura
12).
Também foi observada emissão de fluorescência na estirpe controle Cry
-
GFP
+
(figura 12). Essa, assim como em S76GFP
+
, foi detectada a partir de seis horas de
72
crescimento. No entanto, a emissão manteve-se aparentemente estável até o final do
experimento (48 h). É importante ressaltar que, apesar de ambas recombinantes
apresentarem emissão a partir de 6 h de cultivo, a estirpe Cry
-
GFP
+
apresenta uma
intensidade de emissão discretamente maior que aquela observada para S76GFP
+
com
o mesmo tempo de crescimento. Como esperado, a estirpe parental e a Cry
-
GFP
-
não
apresentaram emissão nesse sistema de leitura (figura 12).
Figura 12.
Análise da expressão de GFPmut3a pelas estirpes recombinantes
S76GFP
+
e Cry
-
GFP
+
Recombinantes crescidos em meio LB líquido foram submetidos à leitura
direta de emissão de fluorescência utilizando o sistema Typhoon 9210 com excitação no
comprimento de 532 nm e detecção de emissão de fluorescência em 526 nm
: 1) meio LB; 2) S76;
3) S76GFP
-
; 4)
S76GFP
+
; 5) meio LB; 6) Cry
-
; 7) Cry
-
GFP
-
; 8) Cry
-
GFP
+
.
6 h
4 h
2 h
48 h
36 h
24 h
12 h
8 h
48 h
36 h
24 h
12 h
8 h
6 h
4 h
2 h
1 2 3 4 5 6 7 8
73
A expressão da variante de GFP também foi detectada por microscopia de
fluorescência, em amostras de culturas líquidas crescidas e coletadas nas mesmas
condições daquelas submetidas à leitura no sistema Typhoon 9210. Foi observada
emissão de fluorescência pela estirpe S76GFP
+
com apenas duas horas de crescimento
(figura 13A). Essa característica mostrou-se constante durante todo o experimento (2;
4; 6; 12 e 24 h de crescimento; figuras 13A e E; 14A e E; 15A e E ). A visualização de
células fluorescentes por essa técnica, mesmo em estágios iniciais de crescimento, foi
possível pela maior sensibilidade dessa metodologia quando comparada com a leitura
no sistema Typhoon 9210. De fato, a GFP selvagem necessita de, aproximadamente,
duas horas para a completa ciclização do cromóforo e somente após esse período, é
possível captar emissão de fluorescência. Em contrapartida, a proteína GFPmut3a
promove a formação do cromóforo vinte e uma vezes mais rápida que a selvagem.
Sendo assim, a utilização dessa proteína como ferramenta de monitoramento em B.
thuringiensis, mesmo em estágios iniciais de crescimento, é uma estratégia eficiente,
como pode ser observado no presente estudo. Conforme citado anteriormente, a
expressão da variante de GFP foi detectada também em estágios tardios de
crescimento (12; 24 e 48 h), ou seja, mesmo quando a cultura encontrava-se em fase
estacionária, sendo possível a observação de esporângios e esporos maduros emitindo
fluorescência (figura 15E). Esse dado sugere novamente a alta estabilidade dessa
molécula no sistema de expressão utilizado, uma vez que, em princípio, essa proteína
apenas é expressa durante o crescimento vegetativo de B. thuringiensis.
74
Figura 13.
Emissão de fluorescência nas células de B. thuringiensis S76GFP
+
e
Cry
-
GFP
+
. As células foram crescidas em cultura líquida e o mesmo campo de cada uma das
amostras coletadas, foi avaliado tanto por microscopia de contraste de fase (MCF), quanto por
microscopia de fluorescência (MOF) em aumento de 1.000x. Amostras coletadas em 2h de
crescimento:
A e B) S76GFP
+
; C e D) Cry
-
GFP
+
; Amostras coletadas com 4h de
crescimento:
E e F) S76GFP
+
; G e H) Cry
-
GFP
+
.
A
C
E
G
B
D
F
H
M
M
75
Figura 14.
Emissão de fluorescência nas células de B. thuringiensis S76GFP
+
e
Cry
-
GFP
+
. As células foram crescidas em cultura líquida e o mesmo campo de cada uma das
amostras coletadas, foi avaliado tanto por microscopia de contraste de fase (MCF), quanto por
microscopia de fluorescência (MOF) em aumento de 1.000x. Amostras coletadas em 6h de
crescimento:
A e B) S76GFP
+
; C e D) Cry
-
GFP
+
; Amostras coletadas com 12h de
crescimento:
E e F) S76GFP
+
; G e H) Cry
-
GFP
+
.
A
C
E
G
B
D
F
H
M
M
76
Figura 15.
Emissão de fluorescência pelas células de B. thuringiensis S76GFP
+
e Cry
-
GFP
+
. As células foram crescidas em cultura líquida e o mesmo campo de cada uma das
amostras coletadas, foi avaliado tanto por microscopia de contraste de fase (MCF), quanto por
microscopia de fluorescência (MOF) em aumento de 1.000x. Amostras coletadas em 24h de
crescimento:
A e B) S76GFP
+
; C e D) Cry
-
GFP
+
; Amostras coletadas com 48h de
crescimento:
E e F) S76GFP
+
; G e H) Cry
-
GFP
+
.
A
C
E
G
B
D
F
H
M
M
77
Algumas células da estirpe S76GFP
+
apresentam emissão de fluorescência
visualmente maior que outras (figura 13A e E; 14A e E; 15A e E). Essa diferença na
intensidade pode ser explicada pela localização das células em diferentes planos do
campo de observação, ou pela diferença nos níveis de expressão de GFP. Esses
resultados estão de acordo com os obtidos por Dunn e Handelsman (1999) durante a
expressão de GFP em B. cereus. A localização em diferentes planos também pode
explicar as diferenças na intensidade da coloração verde observada quando as células
permaneciam associadas em uma mesma cadeia, durante a fase vegetativa, em arranjo
do tipo estreptobacilos.
Em paralelo à análise por microscopia de fluorescência, os mesmos campos e
planos, foram observados por microscopia de contraste de fase. Como demonstrado
nas figuras 13; 14 e 15, parte da população apresenta intensidade de fluorescência
menor ou em níveis abaixo da sensibilidade da técnica. Por esse motivo, visando o
melhor aproveitamento dessa ferramenta de monitoramento em estudos futuros, é
desejável a seleção das células com maior intensidade de emissão de fluorescência.
Uma alternativa apropriada para essa finalidade é a utilização da metodologia do
sistema de FACS (fluorescence activated cell sorter), que permite a seleção de células
de acordo com a intensidade de emissão de fluorescência.
A estirpe controle Cry
-
GFP
+
, assim como a S76GFP
+
, apresentou emissão de
fluorescência em todos os tempos de crescimento analisados (2; 4; 6; 12; 24 e 48
horas). De maneira similar aos resultados obtidos para a estirpe S76, a expressão da
proteína também ocorreu de forma heterogênea na população (figura 13C e G; 14C e
G; 15C eG). Como esperado, as estirpes controle Cry
-
GFP
-
, S76GFP
-
e as estirpes
78
parentais não apresentaram emissão de luz verde quando submetidas às mesmas
condições (dados não mostrados).
É importante ressaltar que, do nosso conhecimento, não apenas é o primeiro
relato de visualização da emissão de fluorescência pela expressão de GFP em células
vegetativas de B. thuringiensis, mas, igualmente, é o primeiro relato de expressão de
GFP em uma estirpe de B. thuringiensis selvagem. Os demais relatos descritos
utilizaram um mutante Cry
-
e promotores ativos durante a fase estacionária.a
expressão. Fusões traducionais da proteína Cry1Ac, tanto com GFP quanto EGFP, não
se mostraram eficientes para essa finalidade. Apesar de confirmada a expressão por
SDS-PAGE e imunoblot (Roh et al., 2004 a e b) e da visível emissão de fluorescência
pela expressão dessa fusão em plantas (Halfhill et al., 2005; Shen et al., 2006) e em
vírus (Chang et al., 2003).
Apesar dos inúmeros esforços para verificar a expressão da proteína GFP por
SDS-PAGE, não foi possível identificar a presença de banda correspondente à massa
molecular da variante de GFP (figura 16), que é de aproximadamente 28 kDa. No gel
apresentado e em outras diversas tentativas, em diferentes tempos de crescimento da
cultura (6; 12; 24 e 72 horas de crescimento) e em condições diversas (análise de
células lisadas, sobrenadante e cultura precipitada). Uma vez que a GFP mostrou-se
estável, esse fato ocorreu, possivelmente, pela presença da proteína em quantidades
abaixo do limite de detecção desse sistema ou ainda pela co-migração dessa com uma
ou mais proteínas de massa molecular semelhante. Experimentos utilizando técnicas
com maior sensibilidade, como por exemplo immunoblot, podem ser alternativas
79
apropriadas para a detecção dessa proteína no extrato celular de B. thuringiensis
recombinante.
Entretanto, a análise do perfil protéico da estirpe S76 e das recombinantes
S76GFP
+
e S76GFP
-
demonstrou a presença de proteínas com massas moleculares de
aproximadamente de 130 e 71 kDa, ausentes no perfil apresentado pela estirpe Cry
-
e
derivadas, que, provavelmente, correspondem às proteínas Cry características da
estirpe selvagem (figura 16). Como foi mencionado, o conteúdo de genes cry da
estirpe B. thuringiensis S76 é composto por cry1Aa, cry1Ab e cry1Ac, além de
cry2Aa1 e cry2Ab2 (Gitahy et al., 2007) que codificam proteínas ativas para
Lepidoptera e Diptera, respectivamente. Dessa maneira, os resultados obtidos apontam
para a preservação das respectivas seqüências codantes e da manutenção da
capacidade de expressão das δ-endotoxinas.
No sistema proposto, a manutenção da expressão de proteínas Cry pela estirpe
S76GFP
+
é uma característica importante, uma vez que a conservação da atividade
entomopatogênica, em associação com a expressão de GFP, é característica desejável
para explorar tal ferramenta. Por esse motivo, bioensaios com larvas de D. sacharallis
empregando o elenco de células utilizadas nesse trabalho serão essenciais para
identificar a manutenção dessa atividade.
A detecção da emissão de fluorescência pela expressão de gfp em B.
thuringiensis S76GFP
+
, detectada tanto por microscopia, quanto pelo sistema Typhoon
9210, desde os estágios iniciais de crescimento até o final da esporulação, viabiliza o
rastreamento desses microrganismos no ambiente. Sendo assim, a estirpe desenvolvida
80
possibilita estudos futuros visando o melhor entendimento da ecologia dessa bactéria e
suas interações com outros organismos e em diferentes condições fisiológicas.
Figura 16. Análise da expressão de proteínas Cry. Culturas em
meio líquido LB foram crescidas por 72h e alíquotas da cultura total
analisadas em gel de poliacrilamida 12% em condições desnaturantes (SDS-
PAGE). As setas indicam as bandas que correspondem, provavelmente, às
proteínas Cry.
1) Marcador de massa molecular Bench Marck
(Invitrogen, USA). 2) Cry
-
; 3) Cry
-
GFP
-
; 4) Cry
-
GFP
+
5) S76; 6)
S76GFP
-
; 7)
S76GFP
+
.
Depois de confirmada a visualização da emissão de fluorescência foram
realizadas comparações morfológicas e de padrão de crescimento entre a estirpe de B.
1234567
120 kDa
70 kDa
50 kDa
30 kDa
20 kDa
81
thuringiensis S76GFP
+
, a estirpe controle e a selvagem, com o objetivo de verificar se
houve a manutenção dessas características na estirpe recombinante.
82
4.3. Análises morfólogica e fisiológica da estirpe recombinante de B.
thuringiensis
S76 contendo o gene gfp (S76GFP
+
)
Mudanças fenotípicas podem indicar alterações no conteúdo genético de um
microrganismo. Por esse motivo, a estirpe de S76GFP
+
de
B. thuringiensis foi cultivada
em meio LB líquido, contendo cloranfenicol 10 µg/mL, em paralelo com as demais
estirpes de interesse, com o objetivo de analisar possíveis alterações no ciclo celular e
nas morfologias celular e de colônia. As amostras foram coletadas com intervalos
regulares de 30 minutos a partir de duas horas de cultivo. Os dados apresentados na
figura 17 refletem um crescimento típico de populações unicelulares em sistema
descontínuo, onde pode ser observado o crescimento exponencial até a transição para a
fase estacionária. Foi observado um discreto incremento no tempo de geração para os
recombinantes S76GFP
+
e Cry-GFP
+
quando comparados com as respectivas parentais
e com os recombinantes S76GFP
-
e Cry-GFP
-
(figura 17A e B). Essa alteração poderia
ser explicada pela titulação de fatores de transcrição típicos de fase vegetativa imposta
pela expressão de gfpmut3A, ainda que o vetor pAD43-25 replique com baixo numero
de cópias (5-6 cópias/cromossomo). O fato desse mesmo incremento não ter sido
verificado para os recombinantes obtidos pela transferência do plasmídeo contendo o
gene não funcional, onde a replicação é mediada por informações contidas no mesmo
fragmento, reforça essa idéia.
O crescimento das células de interesse em meio LB sólido incubadas a 28
°C
por 16 e 40 h também foi analisado. Foi observada a formação de colônias após 16 h
de incubação para todas as estirpes analisadas, exceto para o recombinante S76GFP
+
(figura 18). Entretanto, com 40 h de incubação, pode ser observado, para todas os
83
casos analisados, colônias com aspecto arredondado e aveludado, típicos das parentais.
Embora o tempo de crescimento em meio sólido e liquido não se sobreponham, uma
vez que as condições tenham particularidades, como por exemplo a incorporação de
O
2
, esse dados corroboram aqueles obtidos na curva de crescimento (figura 16)
notadamente para o recombinante S76GFP
+
(figura 17).
Figura 17. Curvas de crescimento de S76 (A), Cry
-
(B) e derivadas. Curvas de
crescimento baseadas em leitura de absorbância (A
600
) de cultura líquida em intervalos de 30 min.
Em adição, as células cultivadas, em meio LB líquido e, coletadas com 2; 4; 6;
12; 24 e 48 h foram comparadas por microscopia de contraste de fase. Não foi possível
visualizar alterações na morfologia, no arranjo típico em estreptobacilos, observados
durante o crescimento vegetativo, assim como na formação dos respectivos esporos
(figuras 19; 20 e 21).
7,5
8
8,5
9
9,5
10
Tempo (h)
Cry-GFP+
Cry-GFP-
Cry-
Tempo (h)
tabela s76
S76GFP+
S76GFP-
S76
7,5
8
8,5
9
9,5
10
0 2,5 5 7,5 10 12,5
0 2,5 5 7,5 10 12,5
7,5
8
8,5
9
9,5
10
Tempo (h)
Cry-GFP+
Cry-GFP-
Cry-
Tempo (h)
tabela s76
S76GFP+
S76GFP-
S76
7,5
8
8,5
9
9,5
10
0 2,5 5 7,5 10 12,5
0 2,5 5 7,5 10 12,5
84
Figura 18. Morfologia das colônias de S76 e Cry
-
parentais e recombinantes.
Colônias crescidas em meio de cultura LB sólido. 16h de crescimento A) Cry
-
; B) Cry
-
GFP
-
;
C) Cry
-
GFP
+
; D) S76; E) S76GFP
-
; F) S76GFP
+
; 40h de crescimento G) Cry
-
; H) Cry
-
GFP
-
;
I) Cry
-
GFP
+
; J) S76; K) S76GFP
-
; L) S76GFP
+
.
A
A
B
B
C
C
D
D
E
E
F
F
G
G
H
H
I
I
J
J
K
K
L
L
85
Figura 19.
Morfologia das células de S76 e Cry
-
parentais e recombinantes. As
células foram crescidas em cultura líquida e avaliadas por microscopia de contraste de fase com
aumento de 1.000x.
Amostras coletadas com 2h de crescimento: A) Cry
-
; B) Cry
-
GFP
-
; C) Cry
-
GFP
+
; D) S76; E) S76GFP
-
; F) S76GFP
+
. Amostras coletadas com 4h de crescimento: G) Cry
-
; H)
Cry
-
GFP
-
; I) Cry
-
GFP
+
; J) S76; K) S76GFP
-
; L) S76GFP
+
.
J K L
A B C
D F
G H I
86
Figura 20.
Morfologia das células de S76 e Cry
-
parentais e recombinantes. As
células foram crescidas em cultura líquida e avaliadas por microscopia de contraste de fase com
aumento de 1.000x. Amostras coletadas com 6h de crescimento:
A) Cry
-
; B) Cry
-
GFP
-
; C) Cry
-
GFP
+
; D) S76; E) S76GFP
-
; F) S76GFP
+
. Amostras coletadas com 12h de crescimento: G) Cry
-
;
H) Cry
-
GFP
-
; I) Cry
-
GFP
+
; J) S76; K) S76GFP
-
; L) S76GFP
+
.
J K L
A B C
D E F
G H I
87
Figura 21.
Morfologia das células de S76 e Cry
-
parentais e recombinantes. As
células foram crescidas em cultura líquida e avaliadas por microscopia de contraste de fase com
aumento de 1.000x. Amostras coletadas com 24h de crescimento:
A) Cry
-
; B) Cry
-
GFP
-
; C) Cry
-
GFP
+
; D) S76; E) S76GFP
-
; F) S76GFP
+
. Amostras coletadas com 48h de crescimento: G) Cry
-
;
H) Cry
-
GFP
-
; I) Cry
-
GFP
+
; J) S76; K) S76GFP
-
; L) S76GFP
+
.
J K L
A B C
D E F
G H I
88
Como não foram observadas alterações morfológicas e nem no padrão de
crescimento, a não ser pelo discreto aumento no tempo de geração, entre as estirpes
recombinantes S76GFP
+
e Cry-GFP
+
, as respectivas estirpes controles (GFP
-
) e as
parentais, foi realizada análise comparativa do perfil plasmidial, com o intuito de
verificar se a manutenção das características fenotípicas parentais descritas
estenderam-se ao perfil de plasmídeos residentes.
89
4.4. Estabilidade genética da estirpe recombinante de B.thuringiensis S76
contendo o gene
gfp (S76GFP
+
)
As estirpes de B. thuringiensis HD-1, padrão para Lepidoptera, e S76,
pertencem à subespécie kurstaki e apresentam perfis plasmidiais semelhantes,
contendo cerca de onze elementos extracromossomais (Gitahy et al., 2007). O padrão
de migração de bandas, obtido à partir da análise do DNA plasmidial de S76 em gel de
agarose, foi compatível com o descrito anteriormente (figura 22A, coluna 1).
Conforme esperado, o perfil plasmidial das recombinantes S76GFP
+
, S76GFP
-
apresentaram, além do perfil da estirpe selvagem, evidência dos plasmídeos
transformantes, destacando que, não foi observada a cura de nenhum dos plasmídeos
residentes de S76 durante a manipulação (figura 22A, colunas 4 e 6). A estirpe
controle Cry
-
não contém plasmídeos, sendo assim, conforme esperado, as
recombinantes Cry
-
GFP
-
e Cry
-
GFP
+
apresentaram no perfil plasmidial apenas a
presença dos vetores pAD123 e pAD4325, respectivamente (figura 22B, colunas 3 e
9).
Essa informação foi corroborada pelo perfil de restrição obtido com a digestão
dos DNA plasmidial dos clones de interesse. A enzima de restrição Hind III lineariza,
ambos plasmídeos pAD123 e pAD43-25, gerando fragmentos de DNA de cerca de 5,9
(figura 22A, coluna 7, figura 22B, coluna 4) e 7,2 kb (figura 22A, coluna 12; figura
22B, coluna 11), respectivamente. Por sua vez, a digestão com a enzima Ssp I gera
quatro fragmentos no primeiro caso e cinco no vetor de expressão de gfp. A digestão
do plasmídeo pAD123 com essa enzima gera fragmentos de DNA 2.927 pb; 1.793 pb;
1.171 pb e 61 pb, que podem ser observados pela digestão do DNA plasmidial de
90
Figura 22. Análise do perfil plasmidial das estirpes recombinantes S76GFP
-
,
S76GFP
+
, Cry
-
GFP
-
e Cry
-
GFP
+
. DNA plasmidial intacto. A. 2) S76; 3) pAD123; 4)
S76GFP
-
; 5) pAD43-25; 6) S76GFP
+
. DNA plasmidial digerido com a enzima de restrição Hind
III.
8) S76; 9) pAD123; 10) S76GFP
-
;
11) pAD43-25; 12) S76GFP
+
. DNA plamidial digerido
com a enzima de restrição Ssp I.
13) S76; 14) pAD123; 15) S76GFP
-
; 16) pAD43-25; 17)
S76GFP
+
; 1 e 7) Marcador 1 kb plus DNA ladder (invitrogen-USA); 18) fago λ digerido com Hind
III;
B. DNA plasmidial intacto. 2) pAD123; 3) Cry
-
GFP
-
; 9) pAD43-25; 10) Cry
-
GFP
+
; DNA
plasmidial digerido com a enzima de restrição Hind III
4) pAD123; 5) Cry
-
GFP
-
; 11) pAD43-25;
12) Cry
-
GFP
+
. DNA plasmidial digerido com a enzima de restrição Ssp I. 6) pAD123; 7) Cry
-
GFP
-
; 13) pAD43-25; 14) Cry
-
GFP
+
. 1 e 16) Marcador 1 kb plus DNA ladder (invitrogen); 8) fago
λ digerido com Hind III;
S76GFP
-
(figura 22A, coluna 13), e Cry
-
GFP
-
(figura 22B, coluna 7), excluído o
menor fragmento que pelo seu pequeno tamanho não pode ser visualizado em gel de
agarose na concentração adequada para a análise desta heterogênea e complexa
população de fragmentos de DNA. O vetor pAD43-25 possui cinco sítios de restrição
para Ssp I, gerando cinco fragmentos de DNA com tamanhos de 2.927 pb; 1.793 pb;
1.418 pb, 1.063 pb e 61 pb, que foram observados pela digestão do DNA plasmidial
das estirpes recombinantes S76-GFP
+
e Cry
-
-GFP
+
com essa enzima (figura 22A,
coluna 15; figura 22B, coluna 14). De maneira que, o menor fragmento não pode ser
observado pela razão discutida acima. Em adição aos fragmentos obtidos pela restrição
dos vetores pAD123 e pAD43-25, o perfil plasmidial das recombinantes provenientes
A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
91
de S76 inclui ainda fragmentos adicionais produzidos pela restrição dos plasmídeos
residentes da estirpe parental (figura 21A, colunas 8, 10, 13 e 15).
A análise do perfil plasmidial, por essa metodologia, revelou a manutenção do
elenco de plasmídeos residentes de S76, tanto na estirpe recombinante S76-GFP
-
,
quanto na S76-GFP
+
em adição aos vetores recombinantes introduzidos. Esses dados
estão de acordo com aqueles obtidos pela varredura de emissão de fluorescência pelo
sistema Typhoon 9210.
Os resultados obtidos no presente trabalho, evidenciando a expressão da
variante de GFP em níveis suficientes para detecção por microscopia de fluorescência
e pelo sistema de leitura Typhoon 9210, a manutenção das características morfológicas
e fisiológicas analisadas, assim como a expressão das proteínas Cry, corroboram com a
evidência do potencial de utilização da estirpe S76GFP
+
como ferramenta de
monitoramento tanto em experimentos in vitro quanto no ambiente. O
desenvolvimento dessa estirpe é um dos objetivos do projeto que envolve a
caracterização da estirpe S76, objeto de estudo do grupo de pesquisa formado pela
colaboração entre o Laboratório de Biologia Molecular e Biotecnologia de B.
thuringiensis, UnB, e Embrapa Agrobiologia.
Possibilitar estudos sobre a ecologia de B. thuringiensis S76 e suas interações
com Saccharum sp. são as perspectivas imediatas do presente trabalho. No entanto,
essa ferramenta de rastreamento pode ser utilizada com diversas finalidades, como
estudos de persistência no ambiente e em plantas, interações de B. thuringiensis com
plantas, animais, outros microrganismos, dentre outros.
92
5. Conclusões e Perspectivas
5.1 Conclusões
! No presente trabalho, foram obtidos os recombinantes S76 GFP
+
, S76GFP
-
,
Cry
-
GFP
+
e Cry
-
GFP
-
, a partir da transformação da estirpe brasileira selvagem
S76 e de um mutante acristalífero de B. thuringiensis, respectivamente.
! Foi possível observar emissão de fluorescência pelas estirpes recombinantes,
transformadas com o vetor contendo o gene gfpmut3a funcional, por
microscopia de fluorescência, assim como por leitura direta de emissão de
fluorescência pelo sistema Typhoon 9210. Por microscopia de fluorescência, foi
possível visualizar emissão a partir de 2 h até estágios avançados de
crescimento em cultura líquida, sugerindo a estabilidade da variante de GFP,
em ambas as hospedeiras de B. thuringiensis.
! Não foram observadas alterações na expressão dos genes cry característicos da
estirpe S76, sendo evidenciada a presença, por SDS-PAGE, de proteínas com
massa molecular aproximada de 130 e 71 kDa, correspondentes às proteínas
Cry.
! As estirpes recombinantes não apresentaram alterações na morfologia de
células e de colônias quando comparadas as estirpes hospedeiras.
! Houve um discreto acréscimo no tempo de geração das estirpes GFP
+
,
provavelmente pela expressão adicional de GFP.
! A estirpe de interesse, S76 GFP
+
, não apresentou alterações no elenco de
plasmídeos residentes da estirpe selvagem, exceto pela presença do vetor
pAD43-25.
93
! A eficácia na expressão de GFP em B. thuringiensis, a facilidade de detecção da
fluorescência, a estabilidade da proteína nesse sistema de expressão, somados a
manutenção das características selvagens, indicam que a estirpe recombinante
S76GFP
+
é apropriada para estudos de monitoramento desse microrganismo.
5.2. Perspectivas
! A avaliação da atividade entomopatogênica do recombinante S76GFP
+
, a
inoculação em cana-de-açúcar, além de estimativa de prevalência no ambiente
são perspectivas imediatas, necessárias para validação dessa estratégia.
94
6. Referências Biliográficas
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Brasília, novembro, 2007.
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