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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
IVANA FROEDE NEIVA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BIOSOROTIPOS SELVAGENS
DE Streptococcus mutans ISOLADOS DE CRIANÇAS COM
DIFERENTES HISTÓRICOS DA DOENÇA CÁRIE
CURITIBA
2007
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IVANA FROEDE NEIVA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BIOSOROTIPOS SELVAGENS
DE Streptococcus mutans ISOLADOS DE CRIANÇAS COM
DIFERENTES HISTÓRICOS DA DOENÇA CÁRIE
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Processos Biotecnológicos, área de concentração: Saúde
humana, Setor de Tecnologia, Universidade Federal do
Paraná, como requisito parcial à obtenção de título de
Doutor em Processos Biotecnológicos.
Orientadora: Profª. Dra. Vânia Aparecida Vicente.
CURITIBA
2007
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TERMO DE APROVAÇÃO
IVANA FROEDE NEIVA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BIOSOROTIPOS SELVAGENS DE
Streptococcus mutans ISOLADOS DE CRIANÇAS COM DIFERENTES
HISTÓRICOS DA DOENÇA CÁRIE
Tese aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor no Curso de
Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos, área de concentração: Saúde
humana, Setor de Tecnologia, Universidade Federal do Paraná, pela seguinte banca
examinadora:
Orientadora: Profª. Drª. Vânia Aparecida Vicente
Departamento de Patologia Básica - UFPR
Profª. Drª. Lygia Vitória G. Terasawa
Departamento de Genética - UFPR
Profª. Drª. Patrícia R. Dalzoto
Departamento de Patologia Básica - UFPR
Prof. Dr. Ricardo L. R. Souza
Departamento de Genética - UFPR
Profª. Drª. Marina Ribas
Pontifícia Universidade Católica do Paraná – PUC-PR
Curitiba, 20 de dezembro de 2007
DEDICATÓRIA
Dedico,
A quem tudo pertence: ‘’Deus’’ que sempre esteve do meu lado ... e
aos meus familiares; em especial meus pais: Ciro e Vera;
meu esposo, Ricardo e
meu filho, João Gabriel.
AGRADECIMENTOS
A todos aqueles que fazem da docência e da pesquisa um caminho sem volta
de dedicação, trabalho, esforço e perseverança, muitas vezes com sacrifícios de
suas vidas pessoais, passando por dificuldades e adversidades em muitos aspectos,
mas sempre dando o melhor de si aos seus aprendizes, com dignidade,
competência, amor e respeito. O meu muito obrigado!!
A todos aqueles que um dia foram meus alunos e aos que ainda são, por
darem sentido a todo tempo que vivi dedicando-me ao ensino e docência. Foi graças
a vocês, pela confiança, carinho e apoio que me deram, que obtive motivação
durante todo o período de elaboração deste trabalho.
À minha orientadora, Profª Drª Vânia Aparecida Vicente, por dar-me a
oportunidade de tamanho aprendizado em seu laboratório, pela paciência,
disponibilidade e carinho dedicado a este trabalho, pela amizade, pelo
companheirismo, pelos conselhos..., por tudo!!! Obrigado.
À Profª Débora do Rocio Klisiowicz pela disponibilidade, paciência e apoio nas
análises das seqüências, apesar do nosso pouco tempo de convivência já deu para
perceber que é uma pessoa determinada, dedicada, disciplinada e muito especial, o
meu muito obrigado!
Ao Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol, Coordenador, pela dedicação ao
programa de pós-graduação.
À minha colega de disciplina Vânia Suely Maria, exemplo de compromisso
com a docência, pela amizade e convivência científica compartilhada.
Aos queridos amigos que fiz nos laboratórios por onde passei, sem os quais
não teria conseguido: Dicezar, Dicler, Mônica, Yanê, Julianas, Izadora, Rafael,
Paulo, alunos do projeto de extensão, minha eterna gratidão pelo carinho,
disposição, colaboração, apoio científico, técnico e emocional que me dedicaram.
Vocês permanecerão para sempre na minha lembrança e em meu coração!
A todos os funcionários da UFPR, da diretoria à biblioteca, passando por
todos os departamentos, meus agradecimentos pelo apoio, colaboração, paciência e
amizade nestes dez anos de convívio carinhoso!
Às minhas grandes amigas Débora, Maristela, Ruth, Espéria, Márcia e ao meu
grupo de oração (célula), por tornarem minha vida mais doce nos momentos mais
amargos. Sou feliz por tê-los sempre por perto.
A todos os colegas do Curso de Pós-Graduação em Processos
Biotecnológicos, pela amizade e companheirismo.
Ao Prof. Dr. Walter Boerguer e equipe, pela disponibilidade e acolhimento no
laboratório de Ecologia Molecular, além, é claro, dos inúmeros empréstimos de
material e equipamentos, o meu eterno obrigado!
Ao Laboratório Mutidisciplinar de Biologia Molecular do Departamento de
Botânica, sob a responsabilidade da Profª Elide Pereira dos Santos, o meu muito
obrigado pela disponibilidade e empréstimos dos equipamentos.
Aos voluntários que, com todo desprendimento e disponibilidade, se
dispuseram a participar com seriedade e dedicação deste estudo. Sem vocês este
trabalho não seria possível.
Ao meu Departamento Odontologia Restauradora pela ajuda de custo na
aquisição de material para desenvolvimento deste trabalho, bem como a CAPES e
ao Curso de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos: Obrigado pelo apoio.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................ 10
LISTA DE TABELAS....................................................................................... 11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.......................................................... 12
RESUMO.......................................................................................................... 13
ABSTRACT ..................................................................................................... 14
1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 15
2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................... 18
2.1 BIOFILME ................................................................................................ 18
2.2 SALIVA E PAPEL IMUNOLÓGICO DO HOSPEDEIRO............................ 19
2.3 DIETA........................................................................................................ 21
2.4 CÁRIE ....................................................................................................... 22
2.5 Streptococcus mutans............................................................................... 22
2.5.1 Caracterização Biológica de S. mutans................................................. 23
2.5.2 Fatores de Virulência............................................................................. 25
2.5.3 Colonização da Boca por Streptococcus mutans .................................. 27
2.5.3.1 Produção de polissacarídeos extracelulares por S. mutans ................ 30
2.6. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE S. mutans................................... 35
2.6.1 Diversidade das Espécies de Estreptococcus do Grupo Mutans ......... 36
2.6.1.1 Avaliação da variabilidade genética do Grupo Mutans por meio de
marcadores moleculares...................................................................... 37
2.6.2 Análise de Distância ............................................................................. 43
2.7 RELAÇÃO ENTRE AS VARIÁVEIS DIETÉTICAS, CLÍNICAS E
MICROBIOLÓGICAS E O DESENVOLVIMENTO DA CÁRIE
DENTAL.................................................................................................... 48
2.8 DIVERGÊNCIAS QUANTO AOS FATORES DE VIRULÊNCIA DE
S. mutans.................................................................................................. 49
3 OBJETIVOS ............................................................................................... 52
0B4 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 53
1B4.1 MATERIAL BIOLÓGICO ........................................................................... 53
2B4.2 CASUÍSTICA............................................................................................. 53
3B4.3 EXAME CLÍNICO ...................................................................................... 54
4B4.4 ESTERILIZAÇÃO ...................................................................................... 54
5B4.5 MEIOS DE CULTURA............................................................................... 54
6B4.51 Ágar Mitis Salivarius Sacarosado com Bacitracina e Telurito de
Potássio (AMSB) ................................................................................... 54
7B4.5.2 Ágar Sangue (Merck)............................................................................. 55
8B4.5.3 Caldo BHI (Infusão de Cérebro e Coração) (Newprov) ......................... 55
9B4.5.4 Meio Todd – Hewit (Merck).................................................................... 55
10B4.6 SOLUÇÕES E REAGENTES.................................................................... 55
4.6.1 Solução Salina....................................................................................... 55
4.6.2 Água Peptonada.................................................................................... 56
4.6.3 DNA Polimerase (Invitrogen) ................................................................. 56
4.6.4 dNTP (Invitrogen) .................................................................................. 56
4.6.5 EDTA 0,5M ............................................................................................ 56
4.6.6 Gel de Agarose (0,8%) .......................................................................... 57
4.6.7 Gel de Agarose (1,6%) .......................................................................... 57
4.6.8 Oligonucleotídeos iniciadores (Primers) ................................................ 57
4.6.9 Tampão da Amostra .............................................................................. 57
4.6.10 Tampão CTAB....................................................................................... 57
4.6.11 Tampão de Corrida para Gel de Agarose (TEB 10X – pH 8,0).............. 58
4.6.12 Tampão Tris-EDTA (TE)........................................................................ 58
4.6.13 Solução de Brometo de Etídio ............................................................... 58
11B4.7 COLETAS SALIVARES............................................................................. 58
12B4.8 ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E ESTIMATIVA DE S. mutans e S.
sobrinus NA SALIVA ................................................................................. 58
13B4.8.1 Provas Bioquímicas para Identificação de S. mutans............................ 59
14B4.8.1.1 Prova da catalase ................................................................................ 60
15B4.8.1.2 Prova da fermentação do Sorbitol e Manitol ........................................ 60
16B4.8.1.3 Prova da Hidrólise da Esculina ............................................................ 60
17B4.8.1.4 Prova da Hidrólise da Arginina ............................................................ 60
4.9 ESTOQUE............................................................................................... 60
18B4.10 EXTRAÇÃO DE DNA .............................................................................. 61
19B4.11 VARIABILIDADE GENÉTICA POR MEIO DE MARCADORES
MOLECULARES ..................................................................................... 62
20B4.11.1 Amplificação do DNA por RAPD.......................................................... 62
21B4.11.2 Eletroforese ......................................................................................... 62
22B4.11.3 Análise da Variabilidade Genética ....................................................... 63
23B4.12 REAÇÕES DE SEQUENCIAMENTO...................................................... 63
24B4.12.1 Reação de Sequenciamento da Região Intergênica (16S-23S) .......... 64
25B4.12.2 Reação de Sequenciamento do Gene da gtf-B ................................... 65
26B4.12.3 Análise das Seqüências da Região Intergênica (16S-23S) e gtf-B...... 65
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 66
5.1 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE S. mutans........ 66
5.2 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DOS ISOLADOS.................. 70
5.2.1 Caracterização Molecular dos Isolados de S. mutans por Meio de
Marcadores Moleculares RAPD ........................................................... 71
5.2.2 Sequenciamento da Região Intergênica 16S-23S................................. 75
5.2.3 Sequenciamento Parcial do Gene que Codifica a Enzima
Glicosiltransferase (GTF)....................................................................... 78
27B6 CONCLUSÕES........................................................................................... 88
28BREFERÊNCIAS................................................................................................ 89
62BAPÊNDICES .................................................................................................... 103
63BAPÊNDICE 1 - AVALIAÇÃO DA DIETA E COLONIZAÇÃO SALIVAR
DE S. mutans EM CRIANÇAS COM DIFERENTES
HISTÓRICOS DA DOENÇA CÁRIE................................. 104
64BAPÊNDICE 2 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E
ESCLARECIDO ............................................................... 105
65BAPÊNDICE 3 - FICHA DE ANAMNESE E EXAME CLÍNICO.................... 106
66BAPÊNDICE 4 - APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA ............................ 107
67BAPÊNDICE 5 - ACEITE DE TRABALHOS ................................................ 108
68BAPÊNDICE 6 - TRABALHO PARA FUTURA PUBLICAÇÃO .................... 109
69BANEXOS.......................................................................................................... 110
ANEXO 1 - SEQÜÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS DO GENE gtf-B DOS
ISOLADOS ANALISADOS .................................................... 111
70BANEXO 2 - PORCENTAGEM DE AMINOÁCIDOS PARA O GENE
gtf-B DO S. mutans ANALISADO E DAS LINHAGENS
DE REFERÊNCIAS PUBLICADAS NO "GENBANK" ............ 113
71BANEXO 3 - SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS DA REGIÃO
INTERGÊNICA DOS ISOLADOS ANALISADOS .................. 114
72BANEXO 4 - ESQUEMA ILUSTRATIVO DA REGIÃO INTERGÊNICA
AMPLIFICADA PELO PAR DE OLIGONUCLEOTÍDEOS ..... 120
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - BIOFILME DENTAL EM SUPERFÍCIE LISA DO ESMALTE DENTÁRIO............ 19
FIGURA 2 - MACRO E MICRO MORFOLOGIA DE COLÔNIAS DE Streptococcus
mutans.................................................................................................................. 23
FIGURA 3 - ESTRUTURA PRIMÁRIA DAS ENZIMAS GTFs EXPRESSAS POR S.
mutans.................................................................................................................. 32
FIGURA 4 - VARIAÇÃO MACROMORFOLÓGICA DE S. mutans EM AMSB ........................ 67
FIGURA 5 - MARCADORES RAPD DAS AMOSTRAS DE DNA DE S. mutans
ISOLADOS DAS CRIANÇAS, UTILIZANDO OLIGONUCLEOTÍDEO
INICIADOR OPA 5 (Operon Technologies) ......................................................... 71
FIGURA 6 - DENDROGRAMA GERADO A PARTIR DE SIMILARIDADE GENÉTICA
OBTIDA POR MARCADORES RAPD DOS ISOLADOS, UTILIZANDO-SE
O COEFICIENTE DE JACCARD E MÉTODO DE AGRUPAMENTO
UPGMA................................................................................................................. 72
FIGURA 7 - ANÁLISE TRIDIMENSIONAL DOS ISOLADOS DE S. mutans ......................... 75
FIGURA 8 - PADRÃO DE AMPLIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE DNA DE S. mutans
ISOLADOS DAS CRIANÇAS, UTILIZANDO OLIGONUCLEOTÍDEO
INICIADOR DA REGIÃO INTERGÊNICA (CHEN et al., 2004)............................ 76
FIGURA 9 - DENDROGRAMA DE SIMILARIDADE GENÉTICA DE ISOLADOS DE S.
mutans PROCEDENTES DE AMOSTRAS SALIVARES DE CRIANÇAS
COM DIFERENTES HISTÓRICOS DE CÁRIE.................................................... 78
FIGURA 10 - PADRÃO DE AMPLIFICAÇÃO DO DNA DOS ISOLADOS DE S. mutans
PROVENIENTES DAS CRIANÇAS, UTILIZANDO OS
OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES QUE FLANQUEIAM A REGIÃO
ESPECÍFICA DA GTF-B DA ENZIMA GLIGOSILTRANSFERASE (OHO et
al., 2000)............................................................................................................... 79
FIGURA 11 - DISTÂNCIAS NUCLEOTÍDICAS BASEADAS NA ANÁLISE DAS
SEQUÊNCIAS PARCIAIS DA REGIÃO GTF-B DOS ISOLADOS E
LINHAGEM REFERÊNCIA DE Streptococcus mutans ....................................... 82
FIGURA 12 - DENDROGRAMA DE SIMILARIDADE GENÉTICA ENTRE ISOLADOS DE
S. mutans PROCEDENTES DE CRIANÇAS COM DIFERENTES
HISTÓRICOS DE CÁRIE ..................................................................................... 83
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - CARACTERISTICAS DIFERENCIAIS DAS ESPÉCIES DE
ESTREPTOCOCOS DO “GRUPO MUTANS”, OS SOROTIPOS E A
PRINCIPAL FONTE DE ISOLAMENTO............................................................. 24
TABELA 2 - ENZIMAS GLICOSILTRANSGERASES (GTF) EXPRESSAS POR
Streptococcus mutans........................................................................................ 31
TABELA 3 - CARACTERÍSTICAS DIFERENCIAIS DAS ESPÉCIES DE
ESTREPTOCOCOS DO GRUPO MUTANS, BASEADO EM PROVAS
BIOQUÍMICAS E DE SENSIBILIDADE À BACITRACINA................................. 59
TABELA 4 - SEQÜÊNCIA DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES............................ 62
TABELA 5 - AVALIAÇÃO DA DIETA E COLONIZAÇÃO SALIVAR DE S. mutans EM
CRIANÇAS COM DIFERENTES HISTÓRICOS DA DOENÇA CÁRIE ............. 68
ABELA 6 - PORCENTAGEM DE BASES NUCLEOTÍDICAS E LONGITUDE PARA O
FRAGMENTO IINTERGÊNICO (16S-23S) DAS AMOSTRAS DE S.
mutans ESTUDADAS......................................................................................... 77
TABELA 7 - PORCENTAGEM DE BASES NUCLEOTÍDICAS E LONGITUDE PARA O
FRAGMENTO GTF-B DOS ISOLADOS E LINHAGENS REFERÊNCIAS
DE S. mutans E DAS SEQÜÊNCIAS PUBLICADAS NO "GENBANK" ............. 80
TABELA 8 - DIFERENÇAS NUCLEOTÍDICAS PARA O GENE gtf-B ENTRE OS
ISOLADOS DE S. mutans E AS LINHAGENS REFERÊNCIAS
UTILIZADAS (FUJIWARA et al., 1998) ................................................................ 81
TABELA 9 - DIFERENÇAS AMINOACÍDICAS PARA O GENE gtf-B ENTRE OS
ISOLADOS DE S. mutans E AS LINHAGENS REFERÊNCIAS
UTILIZADAS (FUJIWARA et al., 1998) ................................................................ 85
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
aa - aminoácido
ATCC - American Type Culture Collection.
BLAST - programa do GenBank para análise de seqüências.
BOOTSTRAP - teste de confiabilidade.
pb - pares de base.
C - citosina.
CIA - clorofórmio-álcool isoamílico
FORWARD - sentido 3’ do DNA.
G - Guanina.
G(+) - Gram-positivo.
G(-) - Gram-negativo.
GC - relação entre Guanina e Citosina.
GTF - Glicosiltransferase
ITS - sequenciamento de regiões intergênicas 16S-23S
J - coeficiente de Jaccard.
dNTP - dinucleotídeo fosfato.
OPA - Operon A.
PCR - reação de polimerização em cadeia (Polimerase Chain Reaction).
PRIMER - Oligonucleotídeo iniciador.
RAPD - amplificação de DNA polimórfico ao acaso (Radom Amplified
Polymorphic DNA).
REA - análise por enzima de restrição.
REVERSE - sentido 5’ do DNA.
T - Timina.
Taq - enzim DNA Polimerase do Termophylus aqu nucleotídeos.
TE - Tris-EDTA.
Tm - melting temperature – temperatura em que 50% do DNA está
hibridizado.
UPGMA - algoritmo usado para análise de DNA.
+, ++, +++ - número de cruzes que estima a intensidade do biofilme.
RESUMO
Amostras de Streptococcus do grupo Mutans provenientes da saliva de crianças de
baixa renda, com diferentes históricos da doença cárie foram isoladas em Agar Mitis
Salivarius e purificadas, obtendo 44 isolados de S. mutans, caracterizados por meio
de marcadores morfológicos e bioquímicos. O DNA genômico dos isolados foi
extraído utilizando CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio) associado a sonicação. A
variabilidade genética dos isolados foi estudada por meio de marcadores RAPD
utilizando os oligonucleotideos iniciadores OPA2, OPA3, OPA5, OPA8, OPA9 E
OPA13. O software “NTSYS” foi utilizado para análise do polimorfismo usando o
coeficiente de Jaccard e o método “UPGMA” para construção de dendrogramas. A
consistência dos agrupamentos foi avaliada por boodstrap usando o “winboot”
software. Os dados revelaram grande variabilidade entre os isolados de S. mutans,
considerando-se sua procedência e dados clínicos em diferentes grupos de crianças.
O sequenciamento da região intergênica 16S-23S e do gene que codifica
Glicosiltransferase B (gtf-B) foi realizado com o objetivo de estabelecer um padrão
molecular de diferenciação dos isolados com diferentes padrões de virulência. A
análise molecular da região intergênica revelou similaridades entre os isolados
seqüenciados, o que demonstra que todos devam pertencer a mesma espécie. Já a
análise do gtf-B revelou cinco genótipos diferentes, quando comparados com
seqüências publicadas do mesmo gene no “Genbank” indicando a existência de
variedades dentro da espécie.
Palavras-chave: Streptococcus mutans; Criança; Cárie; Extração de DNA;
Polimorfismo Genético.
ABSTRACT
Samples from the Streptococcus group obtained from saliva of low income
background children with different history of tooth decay, were isolated and purified
in Agar Mitis Salivarius, in order to obtain 44 samples of S. mutans, which were
characterized by using morphological and biochemical identification. The genomic
DNA from the extracted by the method of CTAB (Cetil-methiltetra amonium),
associated to the sonication, was analysed by the RAPD method using the primers
OPA2, OPA3, OPA5, OPA8, OPA9 and OPA13. The software “NTSYS” was applied
for polymorphism analysis, using the Jaccard coefficient and the “UPGMA” method
for construction of dendograms. The consistency of different groups was evaluated
by boodstrap using the “winboot” software. The data revealed a wide variability
among the isolated of the Streptococcus mutans, considering their origin and the
clinical data in various children’s group. The sequency of the intergenic region and
the Glicosiltransferase B (gtf-B) was performed in order to establish a molecular
pattern of the strain with different virulences. The molecular analysis of the intergenic
region, revealed similarities among the isolated, which showed that they were from
the same species. However the gtf-B analysis demonstrated five different genotypes
when compared with sequencies from the “Genbank”, pointing to the existence of
variations into the same species.
Key words: Streptococcus mutans; Children; Cárie; DNA Extraction; Genetic
Polymorphism.
15
29B1 INTRODUÇÃO
A cárie é uma doença infecciosa e transmissível, de origem microbiana,
associada à presença bacteriana na colonização de superfícies dentais. Devido à
sua natureza multifatorial e origem microbiana, pode variar de intensidade e
prevalência de acordo com as condições endógenas de cada hospedeiro
(LOESCHE, 1986; BABIERI, 2005; MOREIRA, 2006).
Muitos estudos têm demonstrado que o Streptococcus mutans está associado
com a cárie em seres humanos e que há uma correlação entre o número de S.
mutans presente na saliva, a manifestação clínica da doença e o risco ao
desenvolvimento da doença (BRATTHALL, 1992; MATTOS-GRANER, 1999; SMITH
et al., 1998; BEIGHTON, 2005; WAN et al., 2003). S. mutans é amplamente
distribuído, não apenas em populações de moderada ou alta incidência de cárie
(ZICKERT et al., 1982; BEIGTON et al., 1987), como também em populações que
não apresentam ou têm baixo índice da doença (CARLSSON et al., 1985; MATEE et
al., 1993), mostrando que a simples colonização por estes microrganismos não
implica no desenvolvimento de cárie (BRATTHALL, 1992; BEIGHTON, 2005).
Fatores endógenos do hospedeiro, como o fluxo e a capacidade tampão da saliva,
presença de imunoglobulinas salivares, bem como os fatores exógenos, como dieta
e higiene bucal, estariam interagindo para o estabelecimento da doença,
evidenciando a natureza multifatorial desta.
Durante seu processo evolutivo, S. mutans desenvolveu fatores que
determinam sua cariogenicidade ou virulência, como o sistema enzimático para o
metabolismo da sacarose, substância mais cariogênica consumida pelos seres
humanos (KOGA et al., 1995). S. mutans é considerado um microrganismo
cariogênico para todas as espécies de animais dentados até hoje testadas.
Atualmente, foi demonstrado que induz cárie quando implantado em modelos
animais experimentais. Observa-se, entretanto, que cáries obtidas com a
participação de S. mutans e da microbiota normal da boca são mais extensas e
freqüentes do que só com S. mutans, demonstrando assim, a participação efetiva da
microbiota bucal na etiologia da doença (BRATTHALL e CARLSON, 1988; KOGA et
al., 1995).
16
O S. mutans apresenta características fisiológicas e morfológicas que o
tornam o microrganismo de maior cariogenicidade da microbiota bucal. Além de
possuir várias estruturas que facilitam a aderência, como glicocálice e fímbrias,
apresentam também enzimas, como a glicosiltransferase e a frutosiltransferase,
capazes de converter moléculas de açúcares, como a sacarose, em polímeros
extracelulares. Estes são responsáveis pela aderência desse microrganismo às
superfícies dentárias e propicia a agregação deste com outros microrganismos na
boca. Além disso, este agente realiza a síntese de polímeros intracelulares pelos
sistemas enzimáticos permease e revertase, que garantem o armazenamento de
energia para ser utilizada em condições de inanição no ambiente bucal e em
situações metabólicas específicas próprias, como aquelas de oxidoredução extrema
do biofilme dental. A partir do conhecimento dessas características próprias de S.
mutans, é importante ressaltar o reconhecimento da existência de biosorotipos
variáveis de bactérias com tais características biológicas na saliva humana (OHO et
al., 2000; GRONROOS e ALALUUSUA, 2000).
Marcadores moleculares têm esclarecido a variabilidade genética existente
entre isolados de S. mutans provenientes da saliva e de outras fontes. A técnica de
PCR (reação de polimerização em cadeia) têm sido utilizada na identificação dos
diferentes biosorotipos do grupo mutans, permitindo, assim, a estimativa da
freqüência destes agentes na microbiota bucal (OHO et al., 2000; GRONROOS e
ALALUUSUA, 2000; MARCHANT et al., 2001; LI et al., 2001; HUANG et al., 2001;
IGARASHI et al., 2001; OKADA et al., 2002). Marcadores RAPD (Amplificação de
DNA polimórfico ao acaso) têm sido utilizados no estudo do polimorfismo e
distribuição de populações de S. mutans da boca e biofilme dental (CAULFIELD e
WALKER, 1989; SAARELA et al., 1993; SAARELA et al. 1996; LI e CAUFIELD,
1998; TRUONG et al., 2000; EMANUELSSON, 2001; GONÇALVES et al., 2002;
KAMIYA, 2003; KLEIN et al., 2004; NAPIMOGA et al., 2004). Seqűências ITS
(Sequenciamento de regiões intergênicas 16S - 23S) do DNAr têm sido utilizadas
para identificar Streptococcus como membros de uma espécie ou grupo ou
classificá-los em novas espécies. O sequenciamento parcial do gene da enzima GTF
(Glicosiltransferase) tem sido utilizado para avaliar a sua atividade enzimática,
verificando, assim, a sua virulência. (FUJIWARA et al., 1998).
17
Sendo assim durante este trabalho foi avaliado o polimorfismo dos biótipos
selvagens de S. mutans, isolados de crianças com diferentes históricos de cárie, por
meio de marcadores RAPD. Os isolados separados em grupos através do RAPD,
foram identificados por meio de seqüências de regiões intergênicas (16S-23S) e
diferenciados através das seqüências de regiões específicas do gene da enzima
gliclosiltransferase (gtf-B).
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
A associação microbiota, dieta, e hospedeiro associada ao tempo
desempenha um papel importante no desenvolvimento da doença cárie, sendo que
o hospedeiro é naturalmente mais suscetível de acordo com a idade, higiene e dieta.
2.1 BIOFILME
Segundo Leite et al. (2001), o termo biofilme é empregado para designar
comunidades de microrganismos aderidas sobre uma superfície e sob a ação
contínua de um fluxo salivar.
A formação do biofilme dental é a etapa inicial no desenvolvimento da doença
cárie, assim como de infecções periodontais, e ocorre em duas fases distintas.
Durante a primeira fase, bactérias que possuem carga negativa podem alcançar, por
energia cinética, uma superfície natural que também possui carga negativa. Além
disso, a própria morfologia de S. mutans associada à presença de Actinomyces
naslundii e Candida albicans potencialisam a virulência desta bactéria (BARBIERI,
2005). Na segunda fase, o biofilme acumula bactérias por coagregação com a
mesma espécie ou com outras espécies, utilizando mecanismos e estruturas como
glicocálice, adesinas, fímbria, além da produção de matriz polissacarídica
extracelular (JORGE, 1998; KOLENBRANDER, 2000).
O ciclo de desenvolvimento do biofilme pode ser resumido em quatro fases:
iniciação, maturação, manutenção e dissolução. A plasticidade fenotípica permite
que bactérias se adaptem às alterações impostas pelo meio ambiente ao qual estão
submetidas. A transição entre um estado e outro é feita de maneira controlada e é
altamente complexa sob o ponto de vista fisiológico, bioquímico e molecular (O’
TOOLE, KAPLAN, KOLTER, 2000).
Os biofilmes podem ser formados por uma única ou por diferentes espécies de
microrganismos. No seu processo de formação, uma comunidade microbiana
multiespécies, com um patógeno predominante, interage com o hospedeiro, dividindo
espaço e recursos disponíveis com outros organismos oportunistas (LEITE et al., 2001)
O biofilme garante a vida da colônia em ambientes não estáveis, com fluxo
19
constante de líquidos. Pode-se atribuir ao biofilme uma série de vantagens para a
colônia, como melhor comunicação entre células, em função da solução de
continuidade entre elas, facilitando as atividades bioquímicas, melhor proliferação,
acesso a nichos e recursos que não poderiam ser utilizados por células isoladas e a
defesa coletiva contra fatores antagônicos (LEITE et al., 2001).
A formação do biofilme na superfície dental é um fenômeno complexo, e
possivelmente a chave para o esclarecimento das patologias bucais de origem
bacteriana. O entendimento preciso da formação e virulência desse biofilme em
função do tempo, dos fatores imunológicos, dos fatores microbianos, entre outros,
tem sido investigado por muitos autores, e vem sendo gradativamente esclarecido
(MONTANARO et al., 2004).
FIGURA 1 - BIOFILME DENTAL EM SUPERFÍCIE LISA DO ESMALTE DENTÁRIO
FONTE: O autor
Legenda: Coloração com fuscina básica em dentes decíduos (A) em dentes permanentes (B)
2.2 SALIVA E PAPEL IMUNOLÓGICO DO HOSPEDEIRO
A saliva é uma mistura complexa de vários componentes, formada
principalmente por secreções das glândulas salivares, mas também contém fluído
gengival, células epiteliais descamadas, microrganismos, leucócitos, resíduos
alimentares, sangue, entre outros componentes, sendo essencial para manutenção
da saúde bucal. A saliva reveste a mucosa bucal e a protege contra irritação, forma
reservatório de íons para a remineralização dentária, apresenta função de
tamponamento de pH, ação antimicrobiana, participa da formação da película
B A
20
adquirida e na digestão enzimática da amilase e, participa, ainda, das sensações
gustativas, por sua ação solvente. Os componentes antimicrobianos da saliva
incluem imunoglobulinas, lisozimas, lactoferrinas, peroxidases, amilases e proteínas
aniônicas. Além disso, seus componentes orgânicos, especialmente as
glicoproteínas, funcionam como nutrientes para os microrganismos bucais. As
proteínas salivares podem ser degradadas por proteases produzidas, por exemplo,
por S. mutans e S. sanguis. O conteúdo bacteriano da saliva é estimado em 10
9
bactérias por mL. A saliva ajuda a controlar a invasão da boca por microrganismos,
sendo que, um fluxo salivar aumentado pode diminuir a concentração microbiana e a
falta da mesma resulta em aumento do número de bactérias na microbiota bucal
(TENOVUO, 1998).
Entre os fatores relacionados ao hospedeiro, são importantes os vários
mecanismos antimicrobianos inespecíficos, os anticorpos imunoglobulinos
inespecíficos e os anticorpos imunoglobulinas A (IgA) presentes na saliva, que
funcionam como primeira linha de defesa contra diferentes agentes infecciosos
(MARCOTTE e LAVOIE, 1998).
A imunoglobulina A (IgA) constitui anticorpo predominante nas secreções,
incluindo a saliva. A IgA é considerada a primeira linha de defesa do hospedeiro
frente aos patógenos que colonizam ou invadem superfícies banhadas pelas
secreções. A principal função da IgA parece ser limitar a aderência, tal como a
penetração de antígenos estranhos no interior da mucosa (AALTONEN et al., 1990).
Além disso, bactérias indígenas têm sido encontradas revestidas pela IgA
(MARCOTTE e LAVOIE, 1998; KOLENBRANDER, 2000).
Nos últimos anos, acumularam-se evidências de que anticorpos,
passivamente transferidos da mãe para a criança, via placenta ou pela
amamentação, possam estimular primariamente os linfócitos, contribuindo para o
desenvolvimento da imunidade ativa no neonato. Este fenômeno deve, portanto,
influenciar a resposta de anticorpos para S. mutans nos primeiros anos de vida
(HANNULA, 2000; MARCOTTE e LAVOIE, 1998).
21
2.3 DIETA
A dieta exerce um papel fundamental no desenvolvimento da doença cárie, mas,
apesar disso, não pode ser considerada como principal fator causal, já que é bastante
conhecida a natureza multifatorial da cárie dentária (CORRÊA, 1998; THEILADE e
BIRKHED, 1988). Neste contexto, vale ressaltar que o efeito cariogênico causado pelo
consumo de carboidratos da dieta pode ser modificado por outros fatores, como a
capacidade tampão da saliva, ou seja, uma determinada dieta cariogênica pode implicar
numa incidência de cárie que varia de indivíduo para indivíduo.
Os efeitos ou implicações locais de uma dieta cariogênica no metabolismo do
biofilme, e especificamente na produção de ácidos, são importantes no processo
carioso. Entretanto, os efeitos sistêmicos no desenvolvimento de estruturas, tais como
os dentes, podem influenciar na progressão da doença cárie (THEILADE e BIRKHED,
1988). Pode-se dizer que dieta é o efeito local dos alimentos, ou seja, seu papel e sua
relação com os tecidos dentais. Já o efeito sistêmico que os diferentes nutrientes
provenientes da alimentação ocasionam na saúde de maneira geral e no crescimento e
desenvolvimento pode ser chamado de nutrição (KATZ, 1981).
De acordo com Corrêa, (1998) o aconselhamento dietético é fundamental,
primeiramente pelo prisma da prevenção de cáries e também pelo fato de maus hábitos
alimentares poderem levar à obesidade, uma pré-condição para outras doenças
sistêmicas graves. Além disso, os hábitos alimentares incorretos aprendidos na infância
são difíceis de serem modificados posteriormente.
Em torno dos trinta meses, a maioria das crianças já está com a dentadura
decídua completa, e, ao mesmo tempo, os dentes permanentes estão em processo de
formação e desenvolvimento. Por isso, nesta fase a dieta assume papel fundamental,
tanto local como sistemicamente (SCHULMAN, 1981). Sistemicamente, a dieta deve
oferecer a quantidade necessária de nutrientes para o desenvolvimento do organismo
em geral, e em particular dos dentes que estão em formação. Como efeitos locais, tem-
se os alimentos da dieta atuando diretamente nos elementos dentários, que por sua
vez, já estão colonizados pelas bactérias cariogênicas, o que pode dar início ao
processo carioso.
22
2.4 CÁRIE
A cárie dental é uma das doenças infecciosas e transmissíveis mais prevalentes
em humanos e uma das mais dispendiosas com relação ao tratamento sintomático
restaurador (LOECHE, 1986). Além disso, o tratamento sintomático das lesões de cárie
é ineficaz para o controle e eliminação desta doença e apresenta um custo
extremamente elevado, sendo inviável sua aplicação em termos de saúde pública.
Assim, é marcante a necessidade de instituição de medidas preventivas com o objetivo
de controlar os fatores etiológicos da cárie dental (DEMERS et al., 1990).
Os estreptococos do grupo mutans têm sido encontrados em praticamente todos
os indivíduos com alta, baixa ou muito baixa prevalência de cárie (CARLSSON,
OLSSON e BRATTHALL, 1985). Porém, a simples detecção destes microrganismos na
saliva ou biofilme não justifica o desenvolvimento de cárie, devendo-se levar em
consideração a concepção da natureza multifatorial da doença, a qual apresenta
variações de acordo com as condições sócio-econômicas, culturais e ambientais de
uma população (MATTOS-GRANER et al., 2001; BRATTHALL, 1992). Entre esses
fatores destaca-se a dieta com alto teor de sacarose e a qualidade e freqüência de
higiene bucal como fundamentais para a ocorrência da cárie.
Sendo assim, a lesão cariosa é considerada a manifestação de um processo
patológico que ocorre em conseqüência de uma interação entre bactérias presentes na
boca, superfícies dentais e constituintes da dieta, especialmente a sacarose.
O consumo excessivo de carboidratos propicia meio adequado à formação de
ácido pelo metabolismo microbiano, que pode levar a desmineralização do esmalte.
Assim, a progressão da doença cárie depende de hospedeiro suscetível, microbiota
patogênica e dieta rica em carboidratos, interagindo em condições críticas num
determinado período de tempo (YAZAKI et al., 1999; PETTI e HAUSEN, 2000).
2.5 Streptococcus mutans
Os estreptococos do grupo mutans foram isolados por Clarke, no início do
século XX, em crianças inglesas, e descritos como estreptococos “mutantes”, visto
que apresentavam morfologia celular mais achatada que outros estreptococos
(MATTOS-GRANER, 1999).
23
Na década de 1960, o desenvolvimento de pesquisas com animais estimulou
estudos a respeito da microbiologia da cárie dental, em que a bactéria S. mutans foi
convincentemente conectada à etiologia da doença (HAMADA, 1986).
2.5.1 Caracterização Biológica de S. mutans
A bactéria S. mutans caracteriza-se por cocos Gram-positivos, com morfologia
ovalada, medindo aproximadamente, 0,5 a 0,75 µm de diâmetro. Estes agrupam-se
aos pares ou em cadeias, requerem meios nutricionalmente ricos para seu
crescimento e temperatura média de 37ºC. Em meio de cultura ágar Mitis salivarius
acrescido de bacitracina (AMSB), formam colônias pequenas, com bordas irregulares,
fortemente aderidas ao meio. Com adição de sacarose ao ágar, muitas linhagens de
S. mutans produzem colônias com cerca de 1 mm de diâmetro (Figura 2).
FIGURA 2 - MACRO E MICROMORFOLOGIA DE COLÔNIAS DE Streptococcus mutans
FONTE: O autor
Legenda: Características macro (A) das colônias em ágar mitis salivarius, com adição de
sacarose e bacitracina. Micromorfologia (B) característica de S. mutans, coloração
de Gram
O meio de cultura mais freqüente utilizado para o isolamento primário de S.
mutans é o ágar mitis salivarius (AMS) com adição de sacarose, bacitracina e telurito
de potássio (GOLD et al., 1973). A identificação de S. mutans é baseada na
macromorfologia em AMS, na micromorfologia, além de características de
crescimento específicas quanto ao padrão enzimático e assimilação de açúcares
(GRONROOS, ALALUSUA, 2000; KONEMAN et al., 2001).
A
B
24
A partir das características bioquímicas e fisiológicas do S. mutans foi
possível ressaltar e reconhecer a existência de biossorotipos variáveis, os quais
foram reunidos em um grupo denominado “mutans”. Sendo assim, os estreptococos
do grupo mutans foram originalmente descritos como uma única espécie S. mutans,
dividida em oito subgrupos designados de a a h, em função da especificidade
sorológica dos antígenos de carboidratos da parede celular. Mais tarde, esses vários
sorotipos foram classificados em categorias de espécies independentes: S. mutans
(que inclui os sorotipos: c, e, f) e S. sobrinus (sorotipos d e g), ambos
predominantemente colonizadores da boca e tecido dentário de humanos
(BENTLEY et al., 1991) (Tabela 1).
TABELA 1 - CARACTERÍSTICAS DIFERENCIAIS DAS ESPÉCIES DE ESTREPTOCOCOS DO
“GRUPO MUTANS”, OS SOROTIPOS E A PRINCIPAL FONTE DE ISOLAMENTO
Espécie de Streptococcus
Características
mutans cricetus sobrinus rattus macacae
Fermentação de:
- manitol
- sorbitol
- melibiose
- rafinose
+
+
+
+
+
+
d
+
+
d
d
d
+
+
+
+
+
-
+
-
Hidrólise de:
- arginina
- esculina
-
+
-
d
-
d
+
+
-
-
Produção de H
2
O
2
- - + - -
Resistência à bacitracina -2Ul/mL
+ - + + -
Sorotipo
c, e, f a d, g b H
Fonte homem hamster homem ratos Macaco
Homem
Ratos
% de isolamento no homem 90% Raro 7-35% Raro 0%
Legenda: (+) 90% das cepas ou mais positivas, (-) 90% das cepas ou mais negativas, (d) proporção
substancial difere em Mayer (1989), com modificações
FONTE: (MOREIRA, 2006)
Assim, além do grupo mutans, que compreende os isolados de origem
humana S. mutans e S. sobrinus, mais algumas espécies de origem animal como S.
cricetus, S. rattus e S. macacae, os estreptococos viridans incluem outros grupos
como: salivarius (S. salivarius e S. vestibularis), mitis (S. mitis e S. oralis) e sanguis
25
(S. sanguis, S. godonni, S. parasanguis e S. crista) (FRANDESEN, PEDRAZZOLI,
KILIAN, 1991; KONEMAN, 2001).
Os S. mutans, S. sobrinus e outros membros de estreptococos bucais do grupo
mutans são capazes de produzir enzimas denominadas glicosiltransferases, que
hidrolisam a sacarose da dieta em glicose e frutose, e unem os resíduos de glicose
entre si por meio de ligações glicosídicas α-1,6 e α- 1,4, para formar glicanos
insolúveis. Esses glicanos conferem aos microrganismos a capacidade de aderir às
superfícies lisas dos dentes e formar a matriz do biofilme dental. A aderência
específica de S. mutans e de outros microrganismos aos glicanos aderentes e
insolúveis e a subseqüente formação de ácidos, promovem a desmineralização do
esmalte dentário e o início das lesões de cárie (LOECHE, 1986; GRÖNRROS,
ALALUSUA, 2000).
Além disso, o S. mutans também parece produzir maior quantidade de ácidos
a partir de carboidratos do que outras bactérias bucais, porque são capazes de
fermentar grande variedade de açúcares e são mais resistentes aos ácidos que
outros estreptococos bucais. Esses microrganismos também sintetizam
polissacarídeos intracelulares que podem ser metabolizados para produzir ácidos na
ausência de carboidratos fermentáveis exógenos (GRÖNRROS, ALALUSUA, 2000).
2.5.2 Fatores de Virulência
Gibbons (1984) relatou que o potencial de virulência de S. mutans é
principalmente dependente das suas altas propriedades acidogênicas e da
habilidade de se acumular nos dentes, especialmente devido à síntese de glicanos
extracelulares a partir da sacarose.
A produção de ácidos e a capacidade de metabolização de substratos em
meio ácido foram os primeiros fatores de virulência atribuídos a microrganismos
específicos relacionados à etiologia da cárie (LOECHE, 1986; KÖHLER, BIRKHED,
OLSSON, 1995).
Alguns estudos demonstraram que existem diferenças na capacidade de
produção de ácidos entre as diferentes espécies de estreptococos do grupo mutans.
De Soet et al. (1991), observaram que os S. sobrinus eram mais acidogênicos do
que os S. mutans em animais gnobióticos. Köhler, Birkhed e Olsson(1995),
26
detectaram diferenças na produção de ácidos entre linhagens de S. mutans isoladas
de humanos. Embora tenham observado grandes variações entre linhagens de S.
mutans isolados de diferentes indivíduos, os autores não foram capazes de associar
o potencial acidogênico com o número de lesões de cárie presentes nos indivíduos
colonizados por estes microrganismos.
Entretanto, Köhler e Krasse (1990) observaram que linhagens de S. mutans
isoladas de crianças livres de cárie, portadoras de altos níveis de estreptococos do
grupo mutans, demonstraram baixa cariogenicidade em modelos animais, quando
comparadas com outras linhagens da mesma espécie, isoladas de crianças
altamente infectadas e com altos índices de cárie dental. Outros estudos
demonstraram grande variabilidade na cariogenicidade de linhagens isoladas de
humanos em modelos animais (DE SOET et al., 1991), mas pouco se sabe sobre os
fatores bacterianos relacionados a estas diferenças (BOWDEN, 1997).
A influência de fatores de virulência de S. mutans e de S. sobrinus na
capacidade de colonização e indução da cárie dental poderia ser mais facilmente
observada em populações mais homogêneas quanto às características sócio-
econômicas, hábitos dietéticos, de higiene bucal e exposição ao flúor (MATTOS-
GRANER, 1998).
Van Houte, Lopman e Kent (1996), avaliaram o pH final do meio de cultura
rico em sacarose, após cultivo de amostra de biofilme dental em superfícies
dentárias, com diferentes condições clínicas (lesões de cárie, lesões de manchas
brancas em esmalte, lesões de cárie ativa e superfícies hígidas). Os autores
observaram que, quando S. mutans estava presente em maior concentração no
biofilme, foram detectados os menores valores de pH, em torno de 4,2, coincidindo
com as amostras de biofilme nas superfícies dentárias com lesões, sugerindo que a
cariogenicidade do biofilme dental é dependente do aumento na proporção de
organismos acidogênicos e acidúricos.
Além da tolerância aos ácidos e produção de ácido, os S. mutans ainda
possuem, como mecanismo de virulência, a capacidade de sobrevivência no biofilme
dental devido à alta capacidade de adaptação ao ambiente, presença de adesinas
na superfície celular, produção de glicosiltransferases, mutacina e polissacarídeos
extracelulares (MATTOS-GRANER, 1999).
27
Em adição a esses fatores, outras propriedades podem influenciar a virulência
de S. mutans, entre elas a atividade proteolítica capaz de degradar colágeno dos
substratos (HOMER, WHILEY, BEIGHTON, 1990; JACKSON, LIM , DAO, 1997).
Enzimas associadas à célula do microrganismo utilizam sacarose como
substrato, gerando glicose e frutose, e, por fermentação clássica produzem energia e
grande quantidade de ácido lático. Algumas moléculas de glicose provenientes da
sacarose são convertidas em polissacarídeo intracelular de alto peso molecular
(amilopectina ou glicogênio). Este processo proporciona armazenamento de material
para o metabolismo energético quando nenhum substrato exógeno for encontrado.
Além disso, os S. mutans podem produzir hidrolases glicosídicas que extraem hidratos
de carbono da saliva para utilização como fonte de energia (GRÖNROOS,
ALALUSUA, 2000).
Mattos-Graner et al. (2000), avaliaram algumas características fenotípicas de
virulência de S. mutans, isolados de crianças com e sem atividade de cárie e
observaram uma relação positiva entre a produção de glicanos insolúveis e a
capacidade de adesão ao vidro. Isto sugere que as linhagens de crianças com alta
atividade de cárie podem colonizar mais eficientemente, induzindo mais facilmente a
cárie dental.
Avaliando a diversidade dos isolados de S. mutans em indivíduos livres de
cárie e com presença de cárie ativa, Napimoga (2004) concluiu em seu estudo que
indivíduos cárie ativos apresentavam um maior número de genótipos de S. mutans
com alta capacidade de sintetizar glicanos insolúveis, quando comparados com
genótipos isolados de indivíduos livres de cárie.
2.5.3 Colonização da Boca por Streptococcus mutans
Em geral, a aquisição de microrganismos pelo corpo humano ocorre por
contato direto entre hospedeiro e outro, ou através de objetos inanimados, como
chupetas e brinquedos. A saliva é a principal via de transmissão de S. mutans
(KOHLER e BRATTHALL, 1979), e a mãe é considerada a mais importante fonte de
infecção para as crianças (LI e CAUFIELD, 1995; KLEIN et al., 2004), embora outros
estudos tenham sugerido haver outras formas de aquisição (MATTOS-GRANER et
al., 2001; MOREIRA et al., 2006).
28
Após a colonização por esta bactéria, os níveis salivares de S. mutans
tendem a se manter estáveis nos indivíduos analisados. Maltz e Zickert (1982)
observaram que o uso de 1 a 3,2 g/dia de penicilina V oral por dez dias, diminui o
número de S. mutans de 2,4 x10
6
para 6,8 x 10
3
/mL de saliva. Entretanto, dois dias
após a última administração do antibiótico, a contagem de S. mutans era quase a
mesma que antes do tratamento, demonstrando que a colonização de S. mutans em
humanos está diretamente relacionada aos fatores endógenos do hospedeiro.
Uma correlação significativa alta tem sido demonstrada entre o número de
estreptococos do grupo mutans na saliva e sua prevalência na dentição, em termos
de número de superfícies dentais colonizadas e nível de infecção das superfícies
dentais (DUCHIN e VAN HOUTE, 1978; LINDQUIST, 1991).
Porém, os processos iniciais de colonização da boca incluem a introdução de
diversas populações microbianas. Bactérias do gênero Streptococcus do grupo
viridans (S. mitis, S. oralis, S. salivarius) podem ser consideradas como pioneiras
nesse processo, porém alguns organismos variam de acordo com as condições
endógenas do hospedeiro (LI e CAUFIELD, 1995).
A colonização inicial por S. mutans na superfície bucal envolve interações
entre a superfície da célula bacteriana e receptores da película adquirida, sendo este
um mecanismo sacarose-dependente. Em seguida, com a entrada da sacarose, a
célula bacteriana ativa as enzimas glicosiltransferases que sintetizam glicanos
extracelulares, intensificando as ligações e o acúmulo de bactérias, resultando numa
massa microbiana tenaz, o biofilme dental (CHIA et al., 1998; BEIGTON, 2005).
Segundo Antony e Munshi (1997), S. mutans é acidúrico e tem requerimento
nutricional simples, mas isto não pode ser o determinante primário para sua
colonização. A produção de polissacarídeos a partir da sacarose pode facilitar a
colonização de superfícies lisas dos dentes pelo S. mutans, porém a colonização
parece ser uma conseqüência tardia da colonização inicial de fóssulas e fissuras. O
S. mutans requer uma superfície não escovada ou limpa para sua colonização.
Ainda com relação aos fatores dietéticos, não há dúvidas que o principal
componente da dieta, envolvido na etiologia da cárie dental, é a sacarose (LOECHE,
1986; TANZER, 1992). Estudos in vitro demonstram que a presença freqüente de
sacarose propicia quedas constantes do pH, favorecendo microrganismos acidúricos
29
como estreptococos do grupo mutans e lactobacilos (BRADSHAW e MARSH, 1998).
Mais relevante é o fato de que a sacarose é o único substrato a partir do qual são
produzidos polissacarídeos extra-celulares (PEC) por estreptococos do grupo
mutans, sendo que os PEC insolúveis em água (glicanos) são importantes para a
colonização e acúmulos destas bactérias nas superfícies dentárias (TANZER, 1992;
HAJISHENGALLIS e MICHALEK, 1999).
Os mecanismos precisos pelos quais os S. mutans são capazes de colonizar e
se acumular nas superfícies dentárias ainda vêm sendo esclarecidos. Duas fases
distintas, aparentemente independentes, parecem caracterizar a colonização dos
dentes. A fase primária ou inicial de colonização é dependente da interação específica
de proteínas da película adquirida do esmalte com moléculas de superfície da célula
bacteriana, denominadas adesinas. A segunda fase de colonização é denominada
fase de acúmulo e propicia o aumento do número de células bacterianas no biofilme
dental, sendo importante para a produção de ácidos, o que favorece os processos de
desmineralização dental. O acúmulo de S. mutans nas superfícies dentárias envolve
diferentes processos de interação, coaderência e coagregação com outros
microrganismos bucais (KOLENBRANDER e LONDON, 1993).
Caulfied, Cutter e Dasanayake (1993), em estudo longitudinal de 46 crianças,
desde o nascimento até cinco anos de idade, detectaram S. mutans em 21% das
crianças aos 19 meses de idade e em 62% das crianças aos 31 meses de idade.
Aquelas não infectadas até os 31 meses de idade, mantiveram-se livres de
S. mutans até os cinco anos de idade. Estes autores sugerem que o período crítico
para implantação de S. mutans na boca corresponderia ao intervalo entre 19 e 31
meses de idade, o qual foi denominado de “janela de infectividade”, que coincide
com a erupção dos molares decíduos.
Segundo Alaluusua et al. (1996), a maior diversidade genética de
estreptococos do grupo mutans observada em crianças com cárie de mamadeira,
deve-se às condições propícias do ambiente para o estabelecimento de múltiplos
genótipos. Entretanto, contrário a esta posição, Kreulen et al. (1997), verificaram que
crianças com lesões de “cárie rampante” apresentavam apenas uma linhagem de S.
mutans, enquanto os respectivos irmãos, sem lesões de cárie, apresentavam de
duas a cinco linhagens, sugerindo que clones específicos de S. mutans são
selecionados em cavidades orais com atividade de cárie.
30
A infecção por S. mutans demonstra-se capaz de predizer cárie dental em
idade precoce, independente da presença inicial de lesões de cárie (O’SULLIVAN e
THIBODEAU, 1996). Alaluusua e Renkonen (1983) verificaram que crianças
finlandesas com níveis detectáveis de S. mutans aos dois anos de idade,
apresentaram uma incidência de cárie dental cerca de 11 vezes maior do que
crianças não colonizadas por estes microrganismos, após dois anos de
acompanhamento. Embora um grande número de trabalhos demonstre uma
associação significativa entre a infecção precoce de S. mutans e a incidência de
cárie dental (ALALUUSUA e RENKONEM, 1983; FUJIWARA et al., 1991;
GRINDEFJORD et al.,1996), a simples detecção destes microrganismos na saliva ou
biofilme dental não justifica o desenvolvimento de cárie dental (BEIGTON, 2005).
2.5.3.1 Produção de polissacarídeos extracelulares por S. mutans
Estreptococos do grupo mutans são capazes de sintetizar PECs de alto peso
molecular formados por cadeias altamente ramificadas, que compõem uma matriz
extracelular com propriedades físico-químicas particulares (TANZER, 1992). Estes
polissacarídeos são sintetizados apenas a partir da sacarose, um dissacarídeo formado
pela ligação de uma molécula de glicose com frutose, através de uma ponte glicosídica
(GARRET e GRISHAM, 1995). S. mutans são capazes de sintetizar polissacarídeos de
glicose, denominados glucanos, e polissacarídeos de frutose, denominados frutanos. S.
sobrinus, por outro lado, sintetizam apenas os glucanos (TANZER, 1992; FUJIWARA,
2002). Os glucanos solúveis em água apresentam uma predominância de ligações do
tipo α-1-6 entre as moléculas de glicose, são importantes fontes de substrato disponível
em condições de limitação de nutrientes e atuam como iniciadores da produção de
glucanos insolúveis em água (GI). Os glucanos insolúveis em água são ricos em
ligações do tipo α-1-3, sendo também referidos como glucanos álcali-solúveis, uma vez
que são solubilizados em soluções alcalinas de NaOH (SMITH e TAUBMAN, 1987).
Os glucanos são sintetizados por enzimas extracelulares denominadas
glicosiltransferases (GTF), as quais hidrolisam as moléculas de sacarose e
polimerizam as moléculas de glicose liberadas. Estas enzimas podem estar ligadas à
superfície das células de S. mutans ou livres no meio extracelular
(HAJISHENGALLIS e MICHALEK, 1999).
31
Fujiwara (2002) menciona três tipos diferentes de GTFs secretadas por
S. mutans: GTF-B, GTF-C e GTF-D. A GTF-B é codificada pelo gene gtfB e está
envolvida na síntese de glucanos insolúveis em água (GI) (SHIROZA et al., 1987),
enquanto a GTF-C (expressa a partir do gene gtfC) catalisa a reação de produção de
glucanos solúveis e insolúveis em água (HANADA e KURAMITSU, 1988). A GTF-D
sintetiza apenas glucanos solúveis em água, sendo codificada pelo gene gtfD (HONDA
et al., 1990). S. sobrinus expressam quatro enzimas GTF distintas, sendo que apenas
uma delas sintetiza exclusivamente glucanos insolúveis (GTF-I) (ABO et al., 1991;
HANADA et al., 1991).
A Tabela 2 mostra as GTFs expressas pela linhagem GS-5 de S. mutans.
TABELA 2 - ENZIMAS GLICOSILTRANSGERASES (GTF) EXPRESSAS POR Streptococcus
mutans
Espécie Linhagem Enzima
Massa
Molecular
(kDa)
Gene Glucano Referência
GTF-B 165,8 gtfB
ligações α-1-3
Shiroza et al., 1987
GTF-C 153,0 gtfC
ligações α-1-3
e α-1-6
Hanada e Kuramitsu,
1988
GTF-D 159,0 gtfD
ligações α-1-6
Honda et al., 1990
S. mutans
GS-5
ND = não descrito
As GTFs são proteínas de alto peso molecular (140-160 kDa) formadas por
uma seqüência de aproximadamente 1.500 aminoácidos. Em geral, as GTFs
apresentam como características comuns um peptídeo sinal de cerca de trinta
resíduos de aminoácidos na sua porção amino-terminal (NH
2
), característico de
diferentes proteínas secretadas, seguido de uma cadeia de aproximadamente 1.000
resíduos de aminoácidos, formada por partes muito conservadas intercaladas com
áreas mais variáveis, a qual contém o domínio catalítico (SMITH e TAUBMAN, 1987;
HAJISHENGALLIS e MICHALEK, 1999). Através de mutagênese sítio-dirigida,
identificou-se um resíduo de ácido aspártico (Asp
413
) essencial para a atividade
enzimática da GTF-B (TSUMORI e KURAMITSU, 1997). As seqüências de
aminoácidos próximas deste resíduo de aspartato demonstram-se bem conservadas
em todas as GTFs das espécies de S. mutans (SMITH et al., 1997). No extremo
carboxi-terminal, as GTFs apresentam repetições de aminoácidos, que parecem ser
32
fundamentais para a ligação das GTFs aos glucanos (KATO e KURAMITSU, 1990;
ABO et al., 1991). A habilidade das GTFs em se ligar aos glucanos produzidos é,
também, pré-requisito para sua atividade enzimática (SHIROZA UEDA,
KURAMITSU, 1987).
A Figura 3 mostra a estrutura primária das GTFs expressadas por S. mutans.
FIGURA 3 - ESTRUTURA PRIMÁRIA DAS ENZIMAS GTFs EXPRESSAS POR S. mutans
Legenda: Extremidade amido (NH2) terminal, observa-se um peptídeo sinal em azul, seguido pelo
domínio catalítico (em amarelo). Repetições peptídicas (em laranja), na porção carboxi-
terminal estão associadas com a capacidade de ligação das GTFs aos glucanos (KATO e
KURAMITSU, 1990; ABO et al., 1991), sendo também necessárias à atividade enzimática
(SHIROZA et al., 1987)
FONTE: MATTOS- GRANER, 1999
Os glucanos insolúveis e as enzimas GTF participam da ligação e acúmulo de
células de S. mutans, em conjunto com outras proteínas secretadas por estes
microrganismos, as proteínas ligantes de glucano (PLGs) (SMITH et al., 1994).
Assim como as GTFs, as PLGs encontram-se associadas à superfície celular ou no
meio extracelular e promovem a interação da superfície da célula com os glucanos
insolúveis em água (RUSSELL, 1979; SMITH et al., 1994). Há indícios de que as
proteínas ligantes de glucanos modificam a estrutura do biofilme dental tornando-a
mais cariogênica (HAZLETT, MICHALEK, BANAS, 1998; HAZLETT,
MAZURKIEWICZ, 1999).
Estudos in vitro demonstram que as linhagens de S. mutans mutantes, que
NH
2
Peptídeo COOH
sinal
Asp
413
Trp
491
Hist
561
1500aa
domínio catalítico domínio ligante de glucano
33
não expressam GTF-B e GTF-C, apresentam uma aderência sacarose-dependente
in vitro de apenas 0,5%, enquanto que linhagens selvagens demonstram uma
aderência de 77,9% (TSUMORI e KURAMITSU, 1997). Linhagens de S. mutans
transformadas geneticamente para não expressarem GTF-B e GTF-C, induzem
lesões de cárie em superfícies lisas e oclusais em número significativamente inferior
do que linhagens selvagens (MUNRO, MICHALEK, MACRINA, 1991).
Yamashita et al. (1993) avaliaram a cariogenicidade de linhagens de S.
mutans que não expressavam cada um dos genes gtf, em ratos alimentados com
dieta contendo 56% de sacarose. As linhagens que não expressaram GTF-B,
produziram apenas 69% da quantidade de GI e induziram um número de dois a
cinco vezes menor de lesões de cárie em superfícies dentárias lisas, quando
comparadas com as linhagens selvagens. As linhagens mutantes que não
expressaram GTF-C, produziram 84% do GI e uma incidência de lesões de cárie em
superfícies lisas de cerca de um e meio a quatro vezes menor do que os isolados
selvagens. Linhagens defectivas em ambas as enzimas, GTF-B e GTF-C,
praticamente não sintetizaram GI e demonstraram uma incidência de cárie de duas a
cinco vezes menor. Tsumori e Kuramitsu (1997), demonstraram que linhagens in
vitro defectivas de um ou mais genes gtf, têm sua capacidade de aderência
reduzida.
Em 1995, Vickerman e Jones purificaram as enzimas GTFB, GTFC e GTFD e
caracterizaram a atividade dessas enzimas em solução e aderidas à superfície,
explorando o papel de seus produtos, os glucanos, na aderência bacteriana em uma
película experimental. Os autores demonstraram que as enzimas GTFB, GTFC e GTFD
são ativas na película experimental e que o comportamento dessas enzimas em
solução pode diferir daquele da enzima aderida à superfície aderida de hidroxiapatita.
Em acréscimo, os glucanos produzidos pela GTFB ou GTFC, mas não pele GTFD,
aumentaram a aderência de S. mutans GS5 e S. sobrinus 6715 à película.
Mattos-Graner et al. (2000), avaliaram algumas características fenotípicas de
virulência de S. mutans isolados de crianças com e sem cárie, e observaram uma
relação positiva entre a produção de glucanos insolúveis e a capacidade de adesão
ao vidro, sugerindo que isolados de crianças com alta atividade de cárie podem
colonizar melhor, induzindo à cárie dental.
34
Anticorpos salivares contra GTFs reduzem significativamente a capacidade de
colonização dos dentes por S. mutans em animais (SMITH, TAUBMAN e
EBERSOLE, 1992). A indução do sistema imune de mucosas contra peptídeos
correspondentes ao sítio catalítico da GTF (altamente homólogos entre diferentes
tipo de GTF) é capaz de reduzir significativamente o desenvolvimento da cárie dental
em ratos alimentados com dieta contendo 56% de sacarose (SMITH, TAUBMAN,
EBERSOLE, 1992; SMITH et al., 1994; TAUBMAN, HOLMBERG, SMITH, 1995;
SMITH et al., 1997). Em humanos com 18 a 36 anos de idade, a imunização via oral
contra GTF e S. sobrinus foi capaz de induzir a produção de IgA salivar e IgG no
soro (SMITH e TAUBMAN, 1987). Após 42 dias decorrentes da primeira imunização,
observou-se uma redução nos níveis salivares de S. mutans em comparação aos
níveis destes microrganismos detectados no início do estudo, embora os resultados
tenham variado entre indivíduos (SMITH e TAUBMAN, 1987).
Embora o papel da expressão e atividade das GTFs tenham sido muito bem
estudados através de experimentos in vitro e em modelos animais, não há
evidências da influência da intensidade de expressão e atividade destas enzimas na
virulência de linhagens isoladas de humanos. A maior parte dos estudos realizados
nesta área utilizam clones geneticamente conhecidos de S. mutans e S. sobrinus
(SMITH et al., 1993, TAUBMAN, HOLMBERG, SMITH, 1995; TSUMORI e
KURAMITSU, 1997) e pouco se sabe sobre as características específicas das GTFs
expressas por isolados de humanos (FUJIWARA et al., 1998). Alaluusua et al.
(1997) avaliaram a expressão de GTF em isolados de 12 crianças finlandesas de um
ano e meio a três anos de idade, sendo que, destas, seis tinham cárie de mamadeira
e seis eram livres de cárie. Estes autores não detectaram diferenças na expressão
das enzimas GTF-B, GTF-C e GTF-D entre os grupos. Chia et al. (1991)
demonstraram polimorfismo dos genes gtfB em 33 isolados de S. mutans em
humanos na Tailândia, sugerindo que este polimorfismo pode estar associado a
variações na atividade enzimática. Através da análise de restrição dos genes gtf
expressos pela linhagem S. mutans UA101, também isolada de humanos,
Yamashita, Bowen e Kuramitsu (1992) sugeriram que as mesmas apresentavam um
único gene codificador de enzimas GTFs capazes de sintetizar GI, resultante da
combinação homóloga entre os genes gtfB e gtfC. Esta linhagem, S. mutans UA101,
demonstrou uma baixa produção de GI por GTFs purificadas de sobrenadantes das
35
culturas celulares e uma baixa aderência dependente de sacarose in vitro, quando
comparadas com a linhagem S. mutans GS-5 (YAMASHITA, BOWEN e
KURAMITSU, 1992). Fujiwara et al. (1998) clonaram e sequenciaram os genes gtfB,
gtfC e gtfD de cinco linhagens de S. mutans isoladas de humanos no Japão e
verificaram que, exceto para os genes gtfC, as seqüências nucleotídicas dos genes
gtf foram praticamente idênticas entre as linhagens estudadas e aos genes gtfs
expressos pela linhagem GS-5. Mais estudos são necessários para avaliar a relação
entre variações nos genes gtf e a capacidade de síntese de GI e habilidade de
colonização e acúmulo nas superfícies dentárias, bem como sua influência na
cariogenicidade de clones específicos.
2.6 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE S. mutans
O conhecimento da seqüência completa do genoma do S. mutans, possibilitou
um melhor entendimento da complexidade e especificidade genética deste
organismo. Este agente difere de outros patógenos humanos do gênero como S.
pyogenes e S. pneumoniae, que, embora façam parte da flora bucal humana, são
apenas inicidentalmente patógenos bucais (ADJIC et al., 1999).
De acordo com a análise do seu genoma o S. mutans é capaz de metabolizar
a mais vasta variedade de carboidratos do que qualquer outro organismo Gram-
positivo seqüenciado até hoje, podendo sintetizar todos os seus aminoácidos
necessários. O número de proteases, peptidadses e outras exoenzimas produzidas
por S. mutans claramente sugerem que este obtém recursos dos tecidos de seu
hospedeiro. A análise da seqüência genômica mostrou que aproximadamente 16%
de suas ORFs (Open Reading Frames) correspondem a genes únicos e revelou a
prevalência de muitos genes, não caracterizados previamente, como envolvidos na
virulência, transporte e regulação gênica. Estas descobertas provêm base para o
desenvolvimento futuro de drogas e novas abordagens na prevenção e tratamento
da cárie dental (ADJIC et al., 1999).
Outros métodos de identificação molecular do S. mutans também podem ser
utilizados como anticorpos monoclonais, análise de DNA através de detecção de
genes específicos, como o gene B-glicosiltransferase (gtf-B), gene frutosiltransferase
(ftf) e gene dextranase (dexA) (CHIA et al., 1991).
36
2.6.1 Diversidade das Espécies de Estreptococos do Grupo Mutans
A diversidade das espécies bacterianas é evidente, considerando-se as
próprias variações fenotípicas observadas através de estudos de sorotipagem,
tipagem de bacteriocinas e biotipagem (BOWDEN, 1997). Uma vez que as bactérias
se propagam através da divisão binária, cada geração é geneticamente igual à
próxima célula que será gerada. No entanto, podem ocorrer mutações casuais
gerando um clone específico. Além disso, por meio de recombinação genética pode
ocorrer alterações mais extensas, como a incorporação de um plasmídio (DNA
circular) ou transposon no genoma de uma célula hospedeira (CAUFIELD, 1997).
A comparação entre clones de S. mutans isolados de diferentes indivíduos
permitiu a identificação das mães como a fonte principal de infecção de seus filhos
(MOREIRA, 2006). A análise dos padrões de restrição de DNA de isolados de S.
mutans, em indivíduos adultos e crianças, não demonstrou o mesmo padrão entre
duas pessoas, a não ser entre aquelas relacionadas de alguma forma, como entre
mãe e filho e entre irmãos (LI e CAUFIELD, 1995). Existem evidências de que clones
de S. mutans, assim como de microrganismos periodontopatogênicos, como
Porphyromonas gingivalis e Actinobacillus actinomycetemcomitans, possam ser
transmitidos entre cônjuges em convivência prolongada, visto que estes indivíduos
compartilham de pelo menos um ribotipo destas bactérias (SAARELA et al., 1993).
Clones bacterianos selecionados podem estar associados com a maior
virulência, como demonstrado, por exemplo, em Haemophilus influenzae (MUSSER et
al., 1988) e Actinobacillus actinomycetemcomitans (MAYER et al., 1999). Pouca
informação existe ainda sobre o impacto da diversidade de clones de S. mutans e S.
sobrinus na transmissão e severidade da cárie dental (BOWDEN, 1997), sendo este
um campo promissor para o melhor entendimento dos processos de colonização e
indução de cárie dental por estes microrganismos. Grandes variações na
cariogenicidade de linhagens de S. mutans e S. sobrinus isolados de humanos foram
observadas em modelos animais (KÖHLER e KRASSE, 1990; DE SOET et al., 1991).
Alaluusua et al. (1996) avaliaram a diversidade genética de S. mutans em seis
crianças livres de cárie e seis crianças com cárie de mamadeira na faixa etária de
três a cinco anos, através da análise do padrão de restrição do DNA ribossômico
(ribotipagem). Estes autores estudaram de três a treze isolados de S. mutans e
37
identificaram mais de um ribotipo de S. mutans entre as quatro crianças que
apresentavam cárie rampante. Apenas uma das crianças livres de cárie apresentou
mais de um ribotipo, sugerindo que indivíduos com maior atividade de cárie
apresentam maior diversidade de clones de S. mutans. Por outro lado, Kreulen et al.
(1997) sugerem que clones específicos de S. mutans são selecionados em crianças
com alta atividade de cárie. Estes autores avaliaram a diversidade de clones de S.
mutans isolados em amostras de biofilme dental associadas ou não a lesões de
cárie e em amostras de saliva, coletadas de sete pares de irmãos e respectivas
mães, sendo que, em um dos irmãos avaliaram trinta ou mais isolados por indivíduo,
cujo padrão genético foi por RAPD. As sete crianças com cárie rampante
apresentavam apenas um clone de S. mutans, enquanto os irmãos com baixa
atividade de cárie apresentavam de dois a cinco clones distintos.
2.6.1.1 Avaliação da variabilidade genética do Grupo Mutans por meio de
marcadores moleculares
O uso de técnicas moleculares é uma abordagem nova e eficaz para a
identificação das espécies bacterianas que compõem as comunidades microbianas
residentes nos diversos órgãos do corpo e de bactérias associadas a processos
patológicos.
Com a diversidade de bactérias associadas à doença cárie, é possível que
diferentes genótipos de S. mutans possam exercer efeito seletivo na manifestação
clínica da doença. O conceito de diversidade, aqui abordado, compreende a
diversidade apresentada abaixo do nível de espécie, também chamada de
diversidade intra-específica (SCHLOTER et al., 2000), pela qual são avaliadas
estirpes pertencentes a mesma espécie. Para o estudo da diversidade intra-
específica, geralmente são utilizadas técnicas de impressão digital com alta
resolução. Isso se deve, em parte, à impossibilidade do uso de métodos tradicionais
da Microbiologia e à dificuldade de se construir oligonucleotídeo iniciadors e sondas
estirpe-específicas, em razão da pequena variabilidade entre as seqüências de
nucleotídeos (LUDWING e SCHLEIFER, 1994). Vários fatores podem influenciar a
diversidade intraespecífica, entre eles, a separação espacial, diferenças ambientais
e interações bactéria-hospedeiro (SCHLOTER et al., 2000).
38
A variabilidade genética de microrganismos pode ser detectada por análise do
fenótipo ou por marcadores moleculares. A primeira, considerada clássica, baseia-se
na caracterização morfológica ou bioquímica, restringindo os estudos em
populações. As técnicas moleculares, por sua vez, fornecem ferramentas para
evidenciar, e entender melhor, diversos aspectos relacionados diretamente ou
indiretamente ao DNA. Desta forma, a análise dos ácidos nucléicos vem sendo
amplamente utilizada na diferenciação de indivíduos e no esclarecimento
filogenético dos organismos estudados (FERREIRA, 2000).
Diversas técnicas de biologia molecular estão disponíveis para a detecção da
variabilidade genética, ou seja, de polimorfismo genético, como, por exemplo,
análise de plasmídeos, análise com enzimas de restrição, RAPD e ribotipagem. Em
Microbiologia Bucal, a análise de DNA baseada em traços do genótipo oferece uma
rápida e realista identificação das bactérias, comparada com métodos baseados em
caracterização do fenótipo.
Os marcadores moleculares, baseados em PCR, podem ser utilizados no estudo
de evolução molecular, na detecção de infecções microbianas através da amplificação
do DNA do patógeno com oligonucleotídeos iniciadores específicos ao seu genoma e
na medicina forense (WATSON et al., 1992; ALBERTS et al., 2004).
A PCR é hoje uma tecnologia com inúmeras aplicações em Ciências Biológicas,
tanto em pesquisa básica como aplicada, tendo proporcionado o seu autor, Kary B.
Mullis, no início da década de 90, o prêmio Nobel de Medicina. Por meio da PCR, pode-
se, a partir de uma única molécula de DNA, gerar 100 bilhões de moléculas similares em
algumas horas (MULLIS, 1990).
A PCR pode ser definida como um método “in vitro” para produzir grandes
quantidades de um fragmento específico de DNA, de tamanho e seqüência
definidos, a partir de uma pequena quantidade de um molde complexo de ácido
nucléico (MULLIS e FALOONA, 1987; SAIKI et al., 1988). A reação de amplificação
é catalizada pela DNA polimerase, que alonga um pequeno fragmento de DNA de
fita simples, chamado de oligonucleotídeo iniciador ou primer, quando este está
ligado a uma fita molde de DNA. O alongamento é feito pela adição, na extremidade
3’OH do iniciador, do nucleotídeo complementar ao nucleotídeo correspondente na
fita molde. O fragmento amplificado é aquele compreendido entre as duas
39
extremidades 3’ de um segmento “duplex”, complementares aos dois iniciadores
utilizados na reação. Os iniciadores são sintetizados artificialmente, tendo como
base uma seqüência de nucleotídeos complementares as seqüências que delimitam
o fragmento de ácido nucléico a ser amplificado.
A PCR tem a vantagem de necessitar somente de quantidades muito
pequenas do DNA a ser amplificado. É uma técnica tão sensível, que o DNA isolado
de uma única célula, é suficiente para detecção de seqüências específicas de
genes. Além da detecção de genes em um DNA genômico, a PCR pode ser aplicada
para clonagem de DNA; sequenciamento; quantificação de seqüências específicas;
análise de expressão gênica pela amplificação a partir de mRNA; mutagênese direta
e indireta; análise da estrutura de genomas; análise de interações DNA-proteína;
evolução molecular; identificação de mutações, novos membros de famílias
multigênicas e de polimorfismo; diagnóstico de patógenos e de doenças hereditárias;
identificação de anormalidades cromossomais; mutações somáticas específicas e
terapia gênica (BRASILEIRO e CARNEIRO, 1998).
O resultado da amplificação de ácidos nucléicos por PCR pode ser facilmente
visualizado por eletroforese em gel de agarose. O sucesso da amplificação depende
das condições da reação, da pureza dos reagentes utilizados e dos diferentes
parâmetros da reação (BRASILEIRO e CARNEIRO, 1998).
A necessidade do conhecimento prévio da seqüência que flanqueia o
segmento a ser amplificado para que os oligonucleotídeos possam ser construídos,
é uma das limitações da técnica de PCR (WATSON et al., 1992; ALBERTS et al.,
2004). Para solucionar este problema Willians et al. (1990), Welsh e McClelland
(1990) desenvolveram-se uma técnica denominada RAPD (Polimorfismo de DNA
amplificado ao acaso). Esta técnica baseia-se na amplificação de segmentos de
DNA por um único oligonucleotídeo de seqüência arbitrária (WILLIAMS et al., 1990).
As tecnologias de marcadores moleculares estão evoluindo rapidamente e
modificações já existem para algumas das técnicas acima descritas. Contudo, os
tipos de marcadores aqui abordados são ainda os mais utilizados em estudos
genéticos e programas de melhoramento. Atributos como consistência e tempo de
obtenção de resultados, nível de polimorfismo obtido, custo e facilidade de uso são
importantes para a implementação de marcadores moleculares.
40
O RAPD é baseado na amplificação de segmentos de DNA, utilizando o
mesmo princípio da PCR (SAIKI et al., 1985). A principal diferença entre a PCR
usual e o RAPD está na reação de amplificação que utiliza apenas um único
oligonucleotídeo, com uma seqüência arbitrária de 10 a 15 bases. A amplificação
somente ocorre se este oligonucleotídeo iniciador arbitrário for complementar a um
sítio em uma das fitas, e complementar a um mesmo sítio (com orientação invertida)
na outra fita de DNA. Os fragmentos amplificados apresentam de 4 a 10 kb,
dependendo do limite máximo de amplificação da DNA polimerase empregada
(WILLIAMS et al., 1990).
A técnica RAPD permite caracterizar e avaliar o grau de similaridade genética
entre genótipos aos níveis inter e intraespecíficos, sendo altamente sensível a
diferenças de até um único nucleotídeo entre o oligonucleotídeo iniciador e o DNA
molde. Permite ainda a obtenção de fingerprints genômicos de indivíduos,
variedades e populações; analise da estrutura e diversidade genética em
populações naturais, populações de melhoramento e bancos de germoplasma;
construção de mapas genéticos de alta cobertura genômica, localização de genes
de interesse econômico, e ainda, a obtenção de novos marcadores para
diagnósticos via PCR (FUNGARO e VIEIRA, 1998; FUNGARO, 2000).
Marcadores RAPD também oferecem a possibilidade de amostrar regiões do
DNA repetitivo, uma vez que os oligonucleotídeo iniciadors utilizados para detecção
da variação são arbitrários, ao contrário das sondas RFLP que são pré-selecionadas
para regiões de cópia única (WILLIAMS et al., 1993; WANG et al., 1993). O RAPD
reúne, assim, a simplicidade da técnica da visualização direta dos marcadores
isoenzimáticos com o poder de resolução dos marcadores de DNA. O uso desta
técnica não requer experiência profunda em biologia molecular e nem instalações
sofisticadas de laboratório. Neste contexto, a técnica RAPD é um das poucas
ferramentas disponíveis que, efetivamente, permitem a análise genética detalhada
com um grande número de marcadores (MEGNEGNEAU; DEBETS; HOCKSTRA,
1993).
Klein et al. (2004) caracterizaram por RAPD isolados de S. mutans e S. sobrinus,
com o objetivo de monitorar e acompanhar a colonização da boca de 16 crianças e
suas mães, durante 20 meses. Foram analisados o padrão de transmissão vertical de
mãe para filho, a diversidade genotípica e a persistência das linhagens. Observou-se
41
um aumento da diversidade genotípica de S. mutans na boca durante o período de
acompanhamento. Alguns genótipos foram adquiridos, alguns persistiram e outros
foram perdidos, refletindo o desenvolvimento contínuo da microbiota bucal da criança.
Saarela et al. (1996) propuseram o emprego do RAPD na genotipagem de
diferentes espécies e sorotipos de estreptococos bucais. Os autores observaram que
os resultados se repetiam quando os mesmos isolados eram submetidos à
ribotipagem, e que o poder discriminatório dessas duas técnicas era superior à
simples sorotipagem, gerando maior número de biótipos.
A aplicação do RAPD em estudos de clonalidade individual ou familiar
envolvendo estreptococos bucais foi proposta por LI e CAUFIED (1998), que após
uma discriminação com vários oligonucleotídeo iniciadors, mostraram que esse
recurso pode ser de grande valia em levantamentos onde são obtidos mais de um
clone bacteriano por indivíduo.
Gronrroos e Alaluusua (2000), utilizando a técnica de RAPD, identificaram de
um a quatro diferentes clones de S. mutans em crianças de três a sete anos, além
de constatarem que os diferentes clones foram encontrados em diferentes sítios,
sugerindo que os mesmos colonizam sítios específicos.
Redmo-Emanuelsson et al. (2003), investigaram a presença de diferentes
genótipos e a estabilidade de S. mutans em diferentes sítios da boca de um mesmo
indivíduo, utilizando a técnica de RAPD. Foram encontrados até sete diferentes
clones, considerando-se toda a boca. Os autores encontraram até quatro diferentes
clones em um mesmo sítio, e estes mesmos genótipos foram encontrados em uma
segunda avaliação realizada entre quatro a sete meses após a coleta inicial,
indicando genótipos estáveis.
Napimoga et al. (2005), em recente estudo usando a técnica de RAPD,
encontrou o máximo de oito genótipos de S. mutans em indivíduos jovens, que
apresentavam cárie ativa.
Os ácidos ribonucléicos ribossomais (RNAr) são considerados os
biopolímeros mais adequados para estudo da diversidade. Seus genes são
universalmente distribuídos e apresentam elevado grau de conservação. Sua
variabilidade pode apresentar-se em maior ou menor extensão, em diferentes
regiões da molécula (LANE et al., 1985).
42
A combinação das tecnologias de PCR e de seqüenciamento de ácidos
nucléicos permite a identificação de uma ampla gama de bactérias, incluindo
aquelas para as quais os métodos convencionais de isolamento e cultivo em meios
de laboratório ou culturas de células ainda não foram desenvolvidos.
A utilização do sequenciamento de regiões intergênicas 16S-23S baseia-se
na existência de seqüências altamente conservadas nos genes DNAr da subunidade
menor dos ribossomos (RNAr 16S) de todas as bactérias e seqüências intersticiais
variáveis nessas moléculas, que são espécie-específicas. A molécula de RNAr 16S
é encontrada em todas as bactérias e tornou-se padrão universal para a sua
identificação e classificação. A amplificação, por PCR, de seqüências de DNA
complementares às seqüências variáveis do DNAr 16S de um microrganismo
desconhecido e sua comparação com seqüências variáveis do RNAr 16S de
espécies conhecidas, fornece informação suficiente ou para identificá-lo como
membro de uma espécie ou grupo conhecido ou colocá-lo em uma nova espécie
(REIS et al., 2006).
Laguerre et al. (1996) caracterizaram 43 estirpes de Rhizobium leguminsarum
de diferentes biovares, por meio da análise de restrição da região intergênica 16S-
23S DNAr. Os padrões de restrição permitiram a diferenciação das estirpes ao nível
intraespecífico. Os autores afirmam que, por meio dos padrões de bandeamento
facilmente analisáveis e reproduzíveis, gerados pela restrição da região intergênica,
foi possível discriminar as estirpes até o limite determinado pela elevada similaridade
existente.
Azevedo et al. (1998) analisou os perfis de restrição da região intergênica
16S-23S DNAr de 71 estirpes de A. amazonense. Seus resultados mostram, ao nível
intra-específico, a existência de grande diversidade genética entre as estirpes.
A adaptação a um ambiente altamente competitivo por meio de
transformações genéticas não ocorre frequentemente, porém quando esta ocorre,
pode ser altamente vantajosa para o microrganismo, podendo este adquirir um gene
de resistência a antibiótico ou um fator de virulência, promovendo grande vantagem
seletiva (LI, CAUFIELD e EMANUELSSON, 2001). Paddick et al. (2003) avaliaram o
efeito do ambiente na diversidade genotípica de A. naeslindii e S. oralis no biolfilme
dental proveniente de indivíduos livres de cárie e cáries ativos. Os autores
43
encontraram um número de genótipos de A. naeslindi muito próximo em ambos os
grupos, porém, o número de genótipos de S. oralis isolados do biolfilme proveniente
de indivíduos cáries–ativos foi superior e estatisticamente significativo, quando
comparado com o grupo de indivíduos livres de cárie. Os autores sugerem que,
devido ao constante estresse ambiental, como por exemplo, a queda de pH, a
diversidade ecológica do biofilme dental pode ser alterada, em relação a algumas
espécies bacterianas.
A existência de polimorfismo nos genes gtfs expressos por diferentes
linhagens de S. mutans (CHIA et al., 1991; YAMASHITA et al., 1992) poderia estar
associada às variações na atividade enzimática específica (Chia et al., 1991).
Alterações de um único aminoácido dentro do domínio catalítico das GTFS
provocadas por mutagênese sítio-dirigida são capazes de alterar sensivelmente a
atividade enzimática (CHIA et al., 1998)
2.6.2 Análise de Distância
Emile Zuckerkandl e Linus Pauling (1965) introduziram a idéia de que
moléculas podem ser usadas como “cronômetros moleculares”, abrindo a
possibilidade do uso de moléculas de DNA ou proteínas como “documentos da
história evolutiva” de seres vivos. Uma década mais tarde, Carl Woese e
colaboradores identificaram o gene do RNA ribossomal 16S como poderoso
marcador filogenético, utilizando-o para propor um terceiro domínio dos seres vivos,
o domínio das Arqueobactérias (FOX et al., 1980). O conteúdo informativo das
moléculas marcadoras é crítico na análise filogenética e o esforço para reconstruir a
história de um gene ou organismo analisando seqüências moleculares particulares
está em função do número e caráter das mudanças detectáveis na seqüência.
Assim, o conteúdo informativo máximo depende do número de nucleotídeos ou de
aminoácidos da molécula e dos estados potenciais assumidos pelos caracteres
(quatro nucleotídeos e vinte aminoácidos). Portanto, a análise comparativa de
moléculas marcadoras permite somente uma primeira aproximação do curso da
evolução bacteriana (LUDWIG e SCHLEIFER, 1999).
A análise de distância requer várias etapas para obter-se uma árvore
filogenética final que possa representar a história evolutiva do indivíduo analisado
44
(CRUZ, 2001). É necessário construir esta árvore e avaliá-la, verificando similaridade
ou não entre os indivíduos estudados (HERSHKOVITZ e LEIPE, 1998).
Antes do desenvolvimento deste processo é necessário, por se tratar de
filogenia molecular, que se escolha uma molécula que leve em conta as
semelhanças entre os microrganismos. A análise filogenética de DNA ou proteínas é
uma importante ferramenta para estudar a história evolutiva dos microrganismos,
uma vez que a taxa evolutiva das seqüências varia com o gene ou segmento de
DNA (WILSON, CARLSON, WHITE, 1977), por estar sobre pressão de seleção,
variando entre um gene ou outro, entre diferentes partes do mesmo gene, e entre
uma linha e outra de descendentes. Isso significa que seqüências de nucleotídeos
podem mudar rápido o suficiente para mostrar variação significativa ao nível
intraespecífico (pseudogenes, ou sítios silenciosos de códons), considerando que as
seqüências que são cruciais para funções altamente conservadas, permanecerão
reconhecíveis. Esta variação de taxas permite compará-las, caso sejam bem
escolhidas. Também significa que análises cada vez mais sofisticadas devem ser
desenvolvidas para extrair ao máximo a informação filogenética (YONG, 1992).
A análise filogenética é, por outro lado, importante para estudar-se o padrão
de famílias multigenes (ATCHLEY e ZHU, 1997), bem como para entender a
evolução adaptativa ao nível molecular (JERMANN et al., 1995). Esta técnica
permite uma visão aprofundada do mecanismo de manutenção de alelos
polimórficos em populações (TAKAHATA, 1993). Entretanto, existem duas razões
pela qual a filogenia molecular pode falhar: a similaridade entre as seqüências pode
não ocorrer devido à ancestralidade de um gene, que pode não ser representativa
da história evolutiva do genoma como um todo. A evolução convergente é um
problema menor para o genótipo do que para o fenótipo, uma vez que o mapa a
partir do genótipo para o fenótipo é redundante (YONG, 1992).
A reconstrução de árvores filogenéticas usando métodos estatísticos foi
iniciada, independentemente, em taxonomia numérica para caracteres morfológicos
(SNEAT e SOKAL, 1973) e em genética de populações para os dados de freqüência
gênica (CAVALLI-SFORZA e EDWARDS, 1964). Alguns dos métodos estatísticos
desenvolvidos para este propósito são ainda usados na análise filogenética de
dados moleculares, mas recentemente novos métodos têm sido desenvolvidos. As
relações genéticas são tradicionalmente representadas em um diagrama
45
denominado de “árvore”, devido à maneira com que os ramos das diferentes
linhagens analisadas são arranjados, lembrando os ramos de uma árvore. Embora
esta representação não mostre todas as possíveis variações da maneira como os
organismos evoluem (ex: são incapazes de mostrar a transferência horizontal da
informação genética), ela tem persistido, por ser, freqüentemente, uma aproximação
e por ser a maneira mais facilmente tratada computacionalmente (GOLDMAN,
1997).
Diversas ferramentas para alinhar seqüências foram desenvolvidas nos últimos
25 anos, podendo-se dividi-las “grosseiramente” em GLOBAIS e LOCAIS, que por sua
vez são separadas em métodos de alinhamento em PARES, por estudarem duas
seqüências e MÚLTIPLO, mais de duas seqüências (ALTSCHUL, 1997; ALTSCHUL et
al., 1997). A maioria dos métodos de análise filogenética trabalha a partir de um grupo
de seqüências alinhadas pelo método de alinhamento múltiplo, quando se quer
estabelecer relações evolutivas de um grupo de organismos. Neste caso, as seqüências
são dispostas cada uma numa linha, de modo que cada base seja colocada numa
coluna chamada de sítio, que contenha esta mesma base em todas as seqüências, sem
que, para isso, a estrutura primária da molécula seja alterada.
Para isso, aceita-se o pressuposto de que a semelhança entre as seqüências
reflete a hipótese de homologia entre elas. A única alteração permitida é a
introdução de espaços denominados falhas (“gaps”) que representam deleções de
nucleotídeos, durante a evolução. Normalmente como não se tem informações sobre
a ancestralidade em relação aos organismos nas análises filogenéticas, é válido
pensar que as falhas possam representar inserções nas seqüências que não as
possuem. Uma falha é difícil de interpretar em termos evolutivos, não havendo
métodos confiáveis que possam usar a informação contida em seus padrões
(GOLDMAN, 1997). Entre duas seqüências é possível encontrar diversas
possibilidades para o alinhamento e este problema torna-se mais grave no
alinhamento múltiplo. O número de comparações aumenta geometricamente em
relação ao número de seqüências a serem alinhadas, tornando os cálculos
impraticáveis, quando se trabalha com algumas dezenas de seqüências, mesmo em
computadores com grande capacidade de análise. Por isso, a maior parte dos
programas para esta finalidade utiliza um conceito denominado “alinhamento
progressivo” (SANKOFF, 1975).
46
A idéia de alinhamento progressivo depende da existência de um
relacionamento filogenético entre as seqüências, para que o alinhamento comece a
ser feito entre as seqüências mais próximas e seja “progressivamente” conduzido,
até que a seqüência mais distante seja incorporada. Este fato remete a um
paradoxo: a análise filogenética de um grupo de seqüências depende do correto
alinhamento entre elas e, da mesma forma, para se conseguir o alinhamento
confiável é preciso ter um alinhamento prévio das relações filogenéticas entre as
seqüências. Na prática, os programas mais usados, como o Clustal W (HIGGINS et
al., 1994), partem do alinhamento aos pares, montam uma matriz de similaridade
entre todos os pares de seqüências e calculam a “árvore filogenética” grosseira para
guiar o alinhamento múltiplo propriamente dito. Este método não garante que se
tenha sempre o melhor alinhamento possível, mas torna-se tanto mais confiável.
Até o presente momento, dois elementos do modelo de substituição podem
ser acessados para dados de nucleotídeos, mas não para dados de aminoácidos ou
códons. Um deles é o modelo de substituição entre bases, e o outro a taxa relativa
de substituição entre os diferentes sítios da seqüência. Variáveis mais complexas,
como os modelos de substituição sítio-específico ou linhagens-específicas, não
podem ser determinados (HERSHKOVITZ e IEIPE, 1998).
Para estabelecer o modelo de substituição entre bases é preciso
quimicamente semelhante, ou seja, uma purina sendo substituída por outra purina
(ex.: A.G) ou uma pirimidina substituída por outra pirimidina (ex.: C.T). A este tipo de
substituição considerar dois tipos de substituições de bases, quimicamente distintos,
que são observados no DNA. A primeira é aquela onde uma base é substituída por
outra denomina-se TRANSIÇÃO. O segundo tipo é aquele que ocorre a substituição
de bases quimicamente distintas, como uma purina sendo substituída por uma
pirimidina (ex., A.C) ou vice-versa. A esse segundo tipo de substituição dá-se o
nome de TRANSVERSÃO. A transversão normalmente é menos comum de que a
transição (HERSHKOVITZ e IEIPE, 1998).
Na prática, a especificação das taxas relativas de substituições entre resíduos
particulares normalmente tem a forma de uma matriz quadrada, com um número de
linhas e colunas sendo igual a quatro para as bases do DNA. Estas matrizes podem
determinar os “pesos” que serão aplicados às substituições pelos algoritmos de
construção da árvore, como são feito quando se usa o método de Máxima
47
Parcimônia. Neste caso, onde a matriz de “pesos” é aplicada, o método é referido
como “Parcimônia Ponderada”. Para os métodos de construção de árvores de
distância e Máxima Verossimilhança, o “peso” dado às substituições pode ser
derivado dos próprios dados, sendo a matemática envolvida mais complexa
(HERSHKOVITZ e IEIPE, 1998).
O segundo elemento, a taxa relativa de substituição total entre diferentes
sítios, também afeta os resultados da construção da árvore. O exemplo mais óbvio
desta variação é aquela entre as três posições de códon, onde a terceira posição
tende a ser a mais variável que as duas primeiras. Por esta razão, em algumas
análises feitas a partir de seqüências codificadoras de proteínas, a terceira posição é
excluída (HERSHKOVITZ e IEIPE, 1998). Variação entre sítios também é observada
no 16S rRNA, entre as posições mais ou menos conservadas (VAN DE PEER,
CHAPELLE, DE WACHER, 1996). Entretanto, as abordagens a esta questão são
matematicamente mais complexas como no modelo não paramétrico (YANG et
al.,1996) e no modelo invariante e modelo de distribuição gama (SWOFFORD et al.,
1996). Estes modelos ainda não são rotineiramente empregados, mas o modelo de
distribuição gama começa a ganhar força, na medida em que novos algoritmos têm
sido desenvolvidos e disponibilizados nos pacotes de programas para análises
filogenéticas.
Segundo Nei, Takezaki, Sitnikova (1995) e Nei (1996), considera-se
atualmente a reconstrução de uma árvore filogenética como uma inferência
estatística de uma verdadeira árvore filogenética, entendendo-se como “verdadeira”
a real história evolutiva do grupo de organismo em estudo. Há dois processos
envolvidos nesta inferência: “estimativa” da topologia ou do padrão de ramos de uma
árvore e estimativa dos comprimentos dos ramos para uma dada topologia de
árvore. Quando a topologia é conhecida, estimativas estatísticas do comprimento
dos ramos são relativamente simples. O problema maior reside na estimativa ou
reconstrução de uma topologia.
O número de topologias a serem analisadas aumenta rapidamente em
relação ao número de organismos ou seqüências sendo comparados. Desta forma,
analisando-se quatro organismos, existem apenas três possíveis topologias
(considerando-se árvores sem raiz e ramos divididos dicotomicamente); quando este
número aumenta para dez organismos, o número de topologias possíveis torna-se
48
gigantesco, sendo igual a 2.027.025; se o número de organismos é igual a vinte, o
número de topologias possíveis atinge inimagináveis 8 x 10
20
árvores (PENNY,
1991), o que seria impraticável de se calcular até mesmo em computadores de alta
capacidade de processamento. Apesar dos fundamentos matemáticos em filogenia
molecular não estarem bem estabelecidos, simulações por computador e dados
empíricos indicam que os métodos atualmente usados, como Neighbor-Joining,
Evolução Mínima e Parcimônia produzem árvores filogenéticas razoavelmente boas
quando um número suficientemente grande de nucleotídeos é usado. Entretanto,
quando a taxa de evolução varia extensivamente de ramo a ramo, muitos métodos
podem falhar em recuperar a verdadeira topologia (NEI, 1996).
2.7 RELAÇÃO ENTRE AS VARIÁVEIS DIETÉTICAS, CLÍNICAS E
MICROBIOLÓGICAS E O DESENVOLVIMENTO DA CÁRIE DENTAL
A cárie é uma doença infecciosa e transmissível porque é causada por
bactérias que colonizam as superfícies dos dentes. Ao contrário da maioria das
doenças infecciosas que afetam os seres humanos, ela é o resultado de um
desequilíbrio da microbiota bucal nativa e não de um patógeno exógeno não nativo.
A introdução de açúcar refinado na dieta das sociedades modernas abalou o
equilíbrio entre saúde e doença. Novas compreensões sobre a história natural das
principais bactérias cariogênicas, os S. mutans, podem contribuir com maneiras para
controlar ou prevenir esta doença infecciosa (BARBIERE, 2005)
A análise comparativa de diferentes estudos quanto ao papel de diversos
fatores dietéticos, clínicos e microbiológicos envolvidos no desenvolvimento da cárie
dental é muito difícil e, certamente, sujeita a graves equívocos (BEIGHTON, 2005).
Isto porque há grandes variações sócio-econômicas, ambientais, culturais e
comportamentais entre as populações estudadas, diferenças estas que podem
interferir na intensidade e forma com que cada fator influencia o desenvolvimento da
doença cárie. Somando a isto, diferentes critérios são adotados aos fatores de risco,
sejam eles comportamentais, clínicos ou microbiológicos (GRINDEFJORD et al.,
1991; HAUSEN, 1997; MATTOS GRANNER, 1999).
Segundo Hausen (1997), os estudos de predição de cárie visam identificar
indivíduos que necessitariam tratamento individualizado para evitar o desenvolvimento
49
de um número inaceitável de lesões de cárie. Mesmo em populações que recebem
atenção odontológica precoce, como é o caso das crianças engajadas no programa de
prevenção de cárie da Bebê-Clínica da Universidade de Londrina - PR, há um grupo
de indivíduos de alto risco que desenvolve lesões de cárie dental, a despeito de todos
os cuidados preventivos (FRAIZ, 1998).
Variações nos fatores sócio-econômicos e culturais poderiam influenciar no risco
de infecção por S. mutans (GRINDEFJORD et al., 1991). Estes fatores podem se
relacionar, por exemplo, com hábitos de consumo de sacarose. Assim, o consumo
freqüente de sacarose pode favorecer a infecção por S. mutans como sugerem alguns
estudos epidemiológicos realizados em crianças de um ano de idade (GRINDEFJORD
et al., 1991). O uso prolongado da mamadeira contendo sacarose, principalmente
durante a noite, está associado à infecção precoce por S. mutans, ao acúmulo destes
microorganismos no biofilme dental (VAN HOUTE, LOPMAN, KENT, 1996) e ao
desenvolvimento severo de lesões de cárie dental em superfícies normalmente menos
susceptíveis à carie dental, como as vestibulares e linguais dos incisivos superiores
(RIPA,1988). Restrições no consumo de sacarose podem, do mesmo modo, promover
quedas significativas dos níveis de S. mutans, mesmo em microbiotas estabelecidas em
indivíduos adultos (WENNERHOLM, BIRKED, EMILSON, 1995). No entanto, estudos
realizados em populações caracterizadas pelo consumo de sacarose, como nas regiões
de Turiani e Singida da Tanzânia, demonstram uma freqüência de S. mutans de 66%
em crianças entre 1 e 3,5 anos de idade (MATEE et al., 1993), superior à observada em
países desenvolvidos, onde o consumo de sacarose é maior, como E.U.A e alguns
países europeus. No presente trabalho, detectamos relação entre o consumo de
sacarose e a manifestação clínica da doença (Apêndice 1). Assim, são necessários
novos estudos que explorem diferentes fatores relacionados à infecção precoce por S.
mutans. Por exemplo, pouca informação existe na literatura sobre as condições
imunológicas de crianças altamente infectadas por S. mutans em idade precoce
(RUSSELL et al., 1999).
2.8 DIVERGÊNCIAS QUANTO AOS FATORES DE VIRULÊNCIA DE S. mutans
É importante considerar que a cárie dental é uma doença infecciosa que sofre
influência de inúmeros fatores relacionados à suscetibilidade individual, resposta
50
imunológica, dieta, hábitos de higiene, uso do flúor, entre outros (BEIGHTON, 2005;
BRATTHALL, 1992). Além disso, observa-se uma grande diversidade genética e
fenotípica nas espécies do grupo mutans, a qual pode estar relacionada a variações
na habilidade de colonização e indução de cárie dental por clones específicos dentro
de uma mesma espécie (BOWDEN 1997; CAUFIELD, 1997). Kohler e Krasse (1990)
observaram que isolados de S. mutans em crianças livres de cárie portadoras de
altos níveis deste microrganismo, demonstraram baixa cariogenicidade em modelos
animais, quando comparados com outros isolados de mesma espécie em crianças
altamente infectadas e com altos índices de cárie dental. Outros estudos
demonstram grande variabilidade na cariogenicidade de S. mutans isoladas de
humanos em modelos animais (DE SOET et al., 1991), mas pouco se sabe sobre os
fatores bacterianos relacionados a estas diferenças (BOWDEN, 1997).
Estudos realizados na Finlândia sugerem que crianças com alta atividade de
cárie apresentam uma grande diversidade de ribotipos de S. mutans, quando
comparados com crianças livres de cárie (ALALUUSUA et al., 1996). Não há um
consenso sobre a relação de atividade de cárie e níveis de S. mutans com a
diversidade genética de S. mutans. A freqüência de múltiplos ribotipos não parece
estar associada aos níveis bucais de S. mutans no biofilme dental de crianças da
faixa etária de 1,5 a 3 anos de idade (ALALUUSUA et al., 1996). Estudos sobre a
diversidade genética de S. mutans são extremamente trabalhosos e caros, pois
requerem a análise de grande número de isolados por indivíduo. Além disso, a
proporção em que clones distintos colonizam a boca pode ser variável. A análise de
clones através de PCR em um grande número isolados (trinta ou mais por indivíduo)
demonstrou uma relação negativa entre a atividade de cárie e a diversidade de
genótipos de S. mutans, sugerindo uma possível seleção de isolados mais virulentos
em crianças com alta atividade de cárie dental (KREULEN et al., 1997).
Emilson et al. (1987), demonstraram que linhagem isoladas de indivíduos
pertencentes a uma população com baixíssima incidência de cárie eram capazes de
induzir lesões de cárie avançadas em modelo animal. Os autores sugerem que a
baixa atividade de cárie apresentada por esta população não se deve a ausência de
virulência dos S. mutans que colonizam estas pessoas, mas por outros fatores,
como a dieta. Kohler e Krasse (1990) observaram que linhagem de S. mutans
isoladas de crianças livres de cárie portadoras de altos níveis de S. mutans
51
demonstraram baixa cariogenicidade em modelos animais, quando comparadas com
outras linhagens de mesma espécie, isoladas de crianças altamente infectadas.
Estas divergências encontradas na literatura demonstram a complexidade envolvida
na expressão de virulência por microorganismos cariogênicos.
A detecção de um maior número de genótipos em isolados de indivíduos
cárie-ativos e a maior capacidade destes isolados em sintetizar glucanos insolúveis
a partir de sacarose, sugere esta ser uma importante característica de virulência
associada à cárie dental. No entanto, são necessários estudos para uma maior
análise dos genes gtf e das proteínas ligantes de glucanos (GBPs), na tentativa de
compreender o papel de genes e proteínas ligantes com relação à cárie dental
(NAPIMOGA, 2004).
52
3 OBJETIVOS
A partir de isolados de Streptococcus mutans, obtidos de amostra salivares de
crianças das escolas municipais de Campo Largo assistidas pelo projeto de
extensão em saúde bucal do Departamento de Patologia Básica, bem como da
Clínica de Odontopediatria da UFPR, objetivou-se:
• caracterizar os isolados de Streptococcus do grupo Mutans por meio de
marcadores morfológicos e bioquímicos;
• verificar o polimorfismo genético entre isolados de S. mutans por meio de
marcadores RAPD;
• realizar ribotipagem por meio de sequenciamento da região intergênica
(16S-23S) visando a identificação dos isolados de S. mutans separados
geneticamente por meio de marcadores RAPD;
• diferenciar os isolados de S. mutans por meio do seqüênciamento de um
segmento específico da enzima glicosiltransferase (gtf-B).
53
30B4 MATERIAIS E MÉTODOS
31B4.1 MATERIAL BIOLÓGICO
Foram utilizadas isolados de Streptococcus do grupo mutans, obtidos da saliva
de crianças procedentes das escolas rurais assistidas pelo projeto de extensão
intitulado “Promoção de saúde em crianças das escolas rurais da rede municipal de
ensino de Campo Largo e região metropolitana de Curitiba” do Departamento de
Patologia Básica do Setor de Ciências Biológicas, bem como da Clínica de
Odontopediatria do Departamento de Estomatologia do Setor de Ciências da Saúde
da Universidade Federal do Paraná (UFPR). A linhagem ATCC de S. mutans 25175
foi gentilmente cedida pela Profª Maria Luiza Drechsei Fávero, do Departamento de
Farmácia da UFPR; sendo que a linhagem 25175 da American Type Culture
Collection, foi identificada como S. mutans Clarke, a partir do seu isolamento de
dentina cariada. Como controle foi utilizado linhagens de S. mutans ATCC 25175 e
UA159, linhagem de S. sobrinus ATCC 33478 e de S. pyogenes ATCC 13540.
32B4.2 CASUÍSTICA
Foram selecionadas para o estudo 30 crianças na faixa etária de três a doze
anos, não levando em cosideração raça e sexo. Estas crianças foram divididas em
três grupos, com situação homogênea de risco social (condição social e econômica
semelhante), sendo que destas, o grupo I era composto de crianças com dieta com
muito açúcar, alta concentração de colônias de S. mutans/mL de saliva baseado nas
unidades formadoras de colônias (UFC/mL) e alta experiência de cárie; o grupo II
era composto de crianças com dieta com muito açúcar, baixa concentração de S.
mutans na saliva(UFC/mL) e alta experiência de cárie e o grupo III com crianças com
dieta com pouco açúcar, baixa concentração de S. mutans na saliva(UFC/mL)e
baixa experiência de cárie. (Apêndice 1). As crianças apresentavam dentição
decídua ou mista, possuíam ou não experiência e atividade á cárie, que foi
investigado pelo histórico da doença, através do índice CPOD (Índice de Dentes
54
Permanentes Cariados, Perdidos e Obturados) e ceod (dentes decíduos). (Apêndice
3). Todas as crianças possuíam permissão dos responsáveis através do termo de
consentimento informado (Apêndice 2).
33B4.3 EXAME CLÍNICO
As crianças passaram por avaliação clínica, executada por um único
examinador, que avaliou a presença de biofilme dental nas superfícies vestibulares
dos incisivos, presença de cálculo dentário na superfície lingual dos incisivos
inferiores, presença de lesões de cárie ativas, contagem de dentes perdidos por
cárie ou obturados, segundo índices CPOD (para dentes permanentes) e ceo-d
(para dentes decíduos) conforme casuística (Tabela 3). A presença de biofilme
dental na superfície vestibular dos incisivos foi notada por exame visual, sem uso de
evidenciadores de biofilme dental, sendo que quando existia biofilme visível, em dois
ou mais incisivos, a criança era classificada positivamente para este fator; pouca (+)
ou muito biofilme (++ ) e a presença cálculo dentário (+++).
34B4.4 ESTERILIZAÇÃO
Os meios de cultura e soluções foram esterilizados em autoclave, com
pressão atmosférica de 1 atm por 20 min. Vidrarias foram autoclavadas por 40 min,
frascos, ponteiras e tubos tipo Eppendorf foram autoclavados à pressão de 1 atm,
por 15 min. Todo material contaminado foi esterilizado antes do descarte.
35B4.5 MEIOS DE CULTURA
36B4.5.1 Ágar Mitis Salivarius Sacarosado com Bacitracina e Telurito de Potássio (AMSB)
Ágar Mitis Salivarius 45g
Sacarose 15g
Água Destilada 500mL
Bacitracina (sol. Estoque 50.000 µg/mL) 0,30 mL
Telurito do Potássio(1%) 0,50 mL
55
O pH foi ajustado para 7,3 -7,4. Após a autoclavagem o meio foi resfriado até
45ºC, acrescentou-se bacitracina, distribuiu-se em placas de Petri e armazenou-se
sob refrigeração a 4 ºC (GOLD et al., 1973).
37B4.5.2 Ágar Sangue (Merck)
Ágar de infusão de cérebro e coração 52g
Água Destilada 1000mL
O pH foi ajustado para 7,4 com NaOH 1N.
Após o resfriamento do meio a 50ºC, acrescentou-se sangue desfibrinado de
carneiro para uma concentração final de 5%.
38B4.5.3 Caldo BHI (Infusão de Cérebro e Coração) (Newprov)
BHI pó 37 g
Água Destilada 1000mL
39B4.5.4 Meio Todd – Hewit (Merck)
Infusão de coração 500g
Neopeptona (difco) 20g
Bacto-dextrose 2g
Cloreto de sódio 2g
Fosfato dissódio o,4g
Carbono de sódio 2,5g
Foi dissolvido 30g em 1000 mL de água destilada.
40B4.6 SOLUÇÕES E REAGENTES
4.6.1 Solução Salina
NaCl 8,5 g
Água destilada 1000ML
56
4.6.2 Água Peptonada
Triptona 2,5g
Peptona 2,5g
NaCl 5,0 g
Água destilada 1000ML
4.6.3 DNA Polimerase (Invitrogen)
A Taq DNA polimerase foi utilizada nas reações de amplificação foi a da
marca Invitrogen, na concentração de 5 U/ µL
4.6.4 dNTP (Invitrogen)
Os quatro desoxirribonucleotídeos (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) em soluções
estoques (100 mM), foram diluídos em água ultrapura para a concentração 2,5mM (
solução de uso). Nas reações de amplificação, a concentração final utilizada foi de
0,2 mM de cada dNTP.
4.6.5 EDTA 0,5M
EDTA 37,22g
Água destilada p/100ML
pH 8,0
O EDTA foi pesado e acrescentou-se uma parte de água ultrapura
autoclavada (aproximadamente 80% - 800mL) e o pH corrigido inicialmente com
NaOH em pellet (aproximadamente 20 g) e o ajuste final com NaOH (4N). Para
obtenção de EDTA 50mM, diluiu-se esta solução dez vezes. A solução foi
autoclavada e mantida a 4ºC.
57
4.6.6 Gel de Agarose (0,8%)
Agarose 0,8 g
Tampão TEB 1X 100mL
4.6.7 Gel de Agarose (1,6%)
Agarose 1,6 g
Tampão TEB 1X 100mL
4.6.8 Oligonucleotídeos iniciadores (Primers)
Os oligonucleotídeo iniciadors foram diluídos em tampão TE, obtendo-se a
concentração final de 4 mM, usando o peso molecular do oligonucleotídeo iniciador
individual dado pelo fornecedor. Os oligonucleotídeo iniciadors diluídos foram
mantidos a -20ºC.
4.6.9 Tampão da Amostra
Sacarose 40,0g
Azul de bromofenol 0,25g
Água destilada 100mL
Os ingredientes foram solubilizados e mantidos a 4ºC.
4.6.10 Tampão CTAB
Tris-base 2,42 g
Cloreto de sódio 8,2g
Na-EDTA 0,74g
CTAB 2,0g
Água ultrapura 80mL
pH 7,5
A solução foi aquecida para que o Na-EDTA e o CTAB fossem dissolvidos e o
volume completado para 100mL com água Ultrapura autoclavada.
58
4.6.11 Tampão de Corrida para Gel de Agarose (TEB 10X – pH 8,0)
Tris-base 54g
Ácido bórico 27,5g
EDTA 0,5M 20mL
Água ultrapura p/500mL
4.6.12 Tampão Tris-EDTA (TE)
Tris-HCL (pH: 8,0) 20mM
EDTA 20mM
4.6.13 Solução de Brometo de Etídio
Foram dissolvidos 1,0% (p/v) de brometo de etídio em água destilada,
agitando-se por várias horas (SAMBROOK; FRITCH; MANIATIS, 2002). A solução
foi estocada à temperatura ambiente. Para revelação, foram diluídos 3 µL de
brometo em 1000mL de água destilada.
41B4.7 COLETAS DE SALIVA
Foram realizadas coletas salivares não estimuladas, em recipientes plásticos,
esterilizados, com tampa, instruindo a criança para que excretasse sua saliva dentro
de recipientes até que o volume coletado fosse de aproximadamente 3 mL. Após
homogenização no local de coleta, 100 µL da saliva foi diluída em 900 µL de água
peptonada, transportada em recipiente térmico com gelo, e mesma processada em
até duas horas após coleta.
42B4.8 ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E ESTIMATIVA DE S. mutans NA SALIVA
Para o isolamento de S. mutans, foi realizada diluição (10
-1
) das amostras
salivares em água peptonada, homogeneizadas em agitador magnético e 0,1mL da
solução diluída foi semeada em ágar Mitis Salivarius adicionado de bacitracina (30
µg/mL de meio) e telurito de potássio (0,001%), e incubada a 37ºC por 48 h, em
microaerofilia, utilizando-se jarra de Gaspack.
Após incubação, foi realizada a estimativa das colônias de estreptococos do
59
grupo mutans multiplicando-se o número de colônias em uma área padronizada de 1
cm
2
pelo respectivo fator de diluição e pela área total da placa.
Duas a três colônias com morfologia característica de S. mutans foram
repicadas em meios próprios para a realização de provas bioquímicas, e coradas
pelo método Gram para análise de sua micromorfologia. A Figura 2 mostra as
características macro e micromorfológicas dos estreptococos do grupo mutans. Em
seguida, os isolados de S. mutans foram suspensos em glicerol 20% e congelados
em freezer – 80ºC.
43B4.8.1 Provas Bioquímicas para Identificação de S. mutans
A caracterização bioquímica de S. mutans seguiu os resultados das provas
recomendadas para esta espécie apresentadas na Tabela 3.
TABELA 3 - CARACTERÍSTICAS DIFERENCIAIS DAS ESPÉCIES DE ESTREPTOCOCOS DO
GRUPO MUTANS, BASEADO EM PROVAS BIOQUÍMICAS E DE SENSIBILIDADE À
BACITRACINA
Sorotipos
S. mutans S. rattus S. cricetus S. sobrinus S. ferus S. macacae S. downei
Provas c/e/f b A d/g E E h
Fermentação de
Manitol + + + + + + +
Sorbitol + + + +* + + +
Melibiose +* + + +** - - -
Rafinose + + + +** - + -
Produção de
H
2
O
2
- - - + - - -
Hidrólise de
Arginina
- + - - - - -
Esculina + + d d + + -
Resistência à
Bacitracina
+ + - + - - -
FONTE: Adaptado de Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology
(*) Algumas linhagens podem dar resultados negativos; (**) algumas linhagens podem dar resultado
positivo; d 11-89% das linhagens são positivas
60
44B4.8.1.1 Prova da catalase
A prova foi realizada colocando-se água oxigenada 3% sobre colônias
características no AMSB, observando-se a formação de bolhas de gás (prova
positiva).
45B4.8.1.2 Prova da fermentação do Sorbitol e Manitol
Foi adicionado 0,1mL de cultura pura, cultivada em meio base caldo BHI
(Newprov), em um meio contendo manitol ou sorbitol e indicador de pH (púrpura de
bromocresol). Os meios foram incubados a 37ºC por 48 horas. A prova foi
considerada positiva quando ocorreu a mudança da cor do indicado de pH do meio,
de roxo para amarelo.
46B4.8.1.3 Prova da Hidrólise da Esculina
Foi semeado 0,1mL de cultura pura em Àgar Esculina Inclinado. Após
incubação a 37ºC por 48 h o desenvolvimento de coloração negra determinou a
positividade da prova.
47B4.8.1.4 Prova da Hidrólise da Arginina
Foi adicionado 0,1 mL de cultura pura do microrganismo em meio base caldo
BHI. contendo arginina e indicador de pH (púrpura de bromocresol). O tubo
inoculado foi vedado com óleo mineral e incubado a 37ºC por 48 horas. Inicialmente,
a cor do meio altera para amarelo devido à acidificação pela fermentação da glicose
presente no meio. Se a arginina é descarboxilada, pela presença da enzima
dihidrolase, um produto final alcalino reverte o indicador para coloração púrpura,
indicando a reação positiva.
48B4.9 ESTOQUE
Após isolamento e caracterização bioquímica, as amostras de S. mutans
isoladas da saliva dos indivíduos pertencentes aos diferentes grupos de crianças,
foram inoculadas em caldo BHI e incubadas por 24 horas, a 36ºC. Após adição de
61
glicerol a 40% (para cada mL de material, acrescentou-se 1 mL de glicerol a 40%,
resultando em uma concentração final de 20% de glicerol), as amostras foram
congeladas a -80ºC.
49B4.10 EXTRAÇÃO DE DNA
A extração de DNA foi realizada de acordo com Vicente (2000), com
modificações. As amostras foram previamente inoculadas em caldo BHI (Brain Heart
Infusion) e incubadas por 45h a 37ºC. Após este período as culturas foram
centrifugadas a 49000 X g por 2 min e o sedimento transferido a um tubo contendo
uma mistura de sílica em pó (sílica gel Merck) e celite 2:1, em 600µL de CTAB. Em
seguida foram aplicados três pulsos (de 30 seg) de ultra-som (potência 70), com
intervalos de 30 seg entre cada pulso, sob banho de gelo, utilizando desruptor de
célula ultrassônico (Unique).
Foram, então, adicionados 400µL de CTAB e as amostras incubadas em
banho-maria a 65ºC por 10 minutos. Após atingir temperatura ambiente, foram
adicionados 1000 µL de clorofórmio-álcool isoamílico (CIA) e os tubos centrifugados
a 49000 x g por 7 minutos. O sobrenadante foi transferido a outro tubo, ao qual
foram adicionados mais 1000 µL de CIA e a centrifugação repetida. Cerca de 2000
µL de álcool 96% gelado foram adicionados ao sobrenadante e os tubos incubados a
-20ºC por 30 minutos para precipitação dos ácidos nucléicos, e após este período
foram centrifugados a 49000 x g por 7 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o
precipitado lavado com álcool 70% gelado e repetida a centrifugação. O álcool foi
retirado e os tubos vertidos em fluxo laminar até a secagem completa do precipitado.
Posteriormente, foram adicionados 50 µL de água ultrapura para ressuspender o
DNA. Os tubos foram deixados à temperatura ambiente por 24 horas e armazenados
à -4ºC. A integridade foi verificada mediante eletroforese em gel de agarose 0,8%, e
visualizada com brometo de etídio em transluminador UV.
62
50B4.11 VARIABILIDADE GENÉTICA POR MEIO DE MARCADORES MOLECULARES
51B4.11.1 Amplificação do DNA por RAPD
Para a amplificação do DNA, foram utilizadas as condições descritas por
PEREIRA et al. (2002), com modificações, utilizando uma mistura contendo os
seguintes elementos: 1,5 unidades de Taq DNA polimerase; 0,4 mM de cada dNTP;
4,0 mM de cloreto de magnésio (MgCl2); 0,4 mM de oligonucleotideos iniciadores ;
10 mM de tampão da enzima 1 x e 12 ng de DNA por 15 µL de reação.
As condições de amplificação foram realizadas de acordo com SPOLIDORO
et al. (2003), com modificações. Foram utilizados 40 ciclos com as seguintes
condições: 30s a 94ºC; 30s a 36ºC; e 1min a 72ºC. Foram utilizados 5min a 94ºC
para desnaturação inicial e 3min a 72ºC de extensão final.
Os oligonucleotídeos utilizados foram da linha Operon Technologies e suas
respectivas seqüências podem ser visualizadas na Tabela 4.
TABELA 4 - SEQÜÊNCIA DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES
Oligonucleotídeo iniciador Seqüência
OPA – 2 5’ TGCCGAGCTG 3’
OPA – 3 5’ AGTCAGCCAC 3’
OPA – 5 5’ AGGGGTCTTG 3’
OPA – 8 5’ GTGACGTAGG 3’
OPA – 9 5’ GGGTAACGCC 3’
OPA – 13 5’ CAGCACCCAC 3’
FONTE: Operon Technologies®
52B4.11.2 Eletroforese
Os produtos resultantes da amplificação por RAPD foram analisados por
eletroforese em gel de agarose 1,6%, sob voltagem constante de 3V/cm. O padrão
de peso molecular utilizado foi o de 100 pb (DNA Ladder 100 pb, Invitrogen). O gel
foi corado com brometo de etídio 0,5 µg/mL (10 min) e as bandas observadas com
auxílio de um transluminador de luz ultravioleta. A fotodocumentação foi feita pelo
sistema de imagem digital (Multidoc-It).
63
53B4.11.3 Análise da Variabilidade Genética
Para análise do polimorfismo gerado pelos marcadores RAPD, foi utilizado o
software NTSYS (Numerical Taxonomy System of Multivariate Programs), de acordo
com os princípios adotados em taxonomia numérica (ROHLF, 1988).
As bandas resultantes da amplificação foram analisadas com base em
variáveis binárias, onde 0 indica ausência de banda e 1 presença. Utilizando o
software NTSYS, a partir da matriz binária obtida, foi construída uma matriz de
similaridade, utilizando o coeficiente de Jaccard (J). Este coeficiente permite calcular
similaridades com base em variáveis binárias. As bandas foram consideradas como
variáveis, enquanto as linhagens como unidades. O coeficiente foi calculado segundo
a fórmula J=M/P, onde M é o número de concordâncias positivas, e o P o número total
de variáveis, menos as concordâncias negativas (SNEATH e SOKAL, 1973).
A partir da matriz de similaridade, as unidades foram agrupadas através do
método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Average), para a
construção dos dendrogramas. A confiabilidade dos grupamentos foi verificada pela
análise bootstrap com 10000 reamostragens, segundo descrito por FELSENSTEIN
(1985), utilizando o software Bood 3.03 (COELHO, 2005). Foram considerados
consistentes os agrupamentos que apresentaram P maior ou igual a 75%, sendo P a
freqüência de determinado agrupamento no conjunto dos dendrogramas resultantes
das repetições bootstrap. Para o estudo foram utilizadas 44 isolados de
Streptococcus mutans e, como controle foram utilizados linhagens ATCC de S.
mutans (25175) e UA cedida pelo do Departamento de Farmácia da UFPR, com seu
isolamento feito à partir de dentina cariada, linhagem ATCC de S. sobrinus ( 33478)
e ATCC de S. pyogene; totalizando assim 48 amostras. A análise de variância dos
marcadores RAPD foi realizada utilizando o programa Arlequin (SCHNEIDER;
ROESSLI; EXCOFFIER, 2000).
54B4.12 REAÇÕES DE SEQUENCIAMENTO
Os DNAs das amostras de S. mutans foram submetidos à amplificação por
PCR para sequenciamento. Dentre as 44 amostras estudadas, foram selecionadas
por amostragem, 8 isolados de S. mutans correspondentes aos grupos genéticos
64
correlacionados à sua procedência, os dados clínicos, cárie dental, consumo de
sacarose e uma linhagem ATCC de S. mutans. A reação de PCR foi realizada em
um volume total de 50 µL, contendo 33,2 µL de água ultra pura; 5 µL tampão; 3 µL
de cloreto de magnégio(MgCl); 4 µL de dinucleotídeo fosfato (DNTP) ; 0,8 µL de
cada de cada oligonucleotideo iniciador (sentido 3’-5’ e reverso 5’-3’ ); 0,2 µL de
Taq e 3 µL de DNA.. O programa de amplificação utilizado foi de 1 ciclo inicial de
desnaturação a 94ºC por 2 minutos, seguindo 30 ciclos de 95ºC por 30 segundos,
59ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto, com uma etapa de extensão final a 72ºC
por 5 minutos (OHO et al.,2000). Os produtos de amplificação por PCR foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 1,6 % . Após a amplificação o DNA foi
corado com brometo de etídio e verificado em um transluminador UV. A purificação
da PCR foi realizada utilizando PEG (polietilenoglicol) e precipitado com etanol em
sucessivas centrifugações (MURPHY, BERG, EHLEMAN, 2005).
4.12.1 Reação de Sequenciamento da Região Intergênica (16S-23S)
Os produtos da PCR com o oligonucleotideo iniciador universal para bactérias
13BF (5’-GTGAATACGTTCCCGGGCCT-3’) e 6R (5’-GGGTTYCCCCRTTCRGAAAT-
3’) (Chen et al. 2005), o quais amplificam fragmentos da porção do gene 16S RNAr, a
região ITS, e pequena porção da região do gene 23S RNAr (Anexo 4) foi submetida à
reação de sequenciamento, usando-se “Big-Dye Thermocycle sequencing”, sistema
que utiliza a estratégia de marcação de cada nucleotídeo terminal com fluorocromo de
cor diferente. Para sequenciamento da região intergênica 16S-23S, foram utilizados os
mesmos oligonucleotídeo iniciadors sintetizados e purificados por Invitrogen Life
Technologies em conformidade com Chen et al. (2005). As reações de
sequenciamento consistiram de 1 a 3 µL dos produtos de PCR purificado, 0,5 µL de
tampão; 0,5 µL de cada oligonucleotídeo iniciador; 0,5 µL do Big-Dye.; a completar um
volume final de 10 µL a reação com água ultra pura. As reações de amplificação
consistiam de 1 min a 96ºC seguido de 35 ciclos a 96ºC por 10 s em 50ºC por 5 s e por
60ºC por 4min para extensão final. Após liofilização em SpeedVac a 60ºC por 40 min,
as amostras foram seqüenciadas por eletroforese em ABI 377(Applied Biosystems).A
edição nos dois sentidos (HALL, 2001) por meio do Standen Package (STADEN,
JUDGE, BONFIELD,1998).
65
4.12.2 Reação de Sequenciamento do Gene gtf-B
Para sequenciamento do gene gtf-B, foram utilizados os iniciadores
sintetizados e purificados por Invitrogen Life Technologies, em conformidade com
OHO et al.(2000); GTFB – F (5’ ACTTACACACTTTTCGGGTGGCTTGG 3’) e GTFB
– R (5’ CAGTATAAGCGCCAGTTTCATC 3’). As reações consistiram de 1 a 3 µL do
produto de PCR purificado, 0,5 µL do tampão ; 0,5 µL de cada oligonucleotideo
iniciador e 0,5 µL do Big-Dye.; completando a reação para 10 µL de volume final
com água ultra pura. As reações de amplificação consistiam de 1 min a 96ºC seguido
de 35 ciclos a 96ºC por 10 s em 50ºC por 5 s e por 60ºC por 4min para extensão final.
Após liofilização em SpeedVac a 60ºC por 40 min, as amostras foram seqüenciadas
em seqüenciador ABI 377(Applied Biosystems).A edição nos dois sentidos ,3’-5’ e
reverso 5’-3’ , (HALL, 2001) foi feita por meio do Standen Package (STADEN et al.,
1998).
55B4.12.3 Análise das Seqüências da Região Intergênica (16S-23S) e gtf-B
As seqüências foram analisadas e corrigidas com o programa STADEN
Pakage (STADEN, JUDGE e BONFIELD, 2001) e alinhadas com a versão do
CLUSTAL-W (THOMPSON, HIGGINS, GIBSON, 1994) e MEGA 3 (KUMAR,
TAMURA, e NEI, 2004). Para a obtenção da composição nucleotídica e aminoácida,
cálculo das distâncias e posições nucleotídicas variáveis foi utilizado o programa
MEGA 3 (KUMAR, TAMURA e NEI, 2004).
66
56B5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE S. mutans
A partir do isolamento em AMSB, as colônias características de S. mutans,
com macromorfologia de aspecto puntiformes, pequenas, médias e grandes foram
selecionadas. Seguindo estes critérios foram isoladas 90 colônias a partir de
amostras salivares das 30 crianças estudadas, obtendo uma média de três colônias
por indivíduo, de diferentes morfologias. Entre as 90 colônias isoladas, um
percentual de 49%, totalizando 44 isolados foi positivo para S. mutans.
Resultados semelhantes foram observados por Yoo et al. (2005), utilizando o
meio ágar Mitis Salivarius acrescido de bacitracina, em que os autores verificaram, em
21 colônias típicas, que 12 não pertenciam ao grupo “mutans”, sendo identificadas por
provas bioquímicas e moleculares como S. anginosus, S. sanguis e Pantoea
agglomerans. Desta forma, os resultados sugerem a necessidade de padronização de
outros critérios além da macromorfologia em meio seletivo para isolamento dos
estreptococos do grupo “mutans”.
Emilson, Carlsson e Bratthall (1987) identificaram duas morfologias distintas de
isolados de S. mutans em ágar Mitis Salivarius com bacitracina, sendo a primeira
associada aos sorotipos c/e/f, tendo aparência de vidro estilhaçado; e a segunda de
consistência mais cremosa e superfície granular, associada aos sorotipos d/g. De
acordo com observações referentes ao isolamento de S. mutans, Barbiere (2005)
relatou que a morfologia colonial entre os isolados foi bastante diferenciada, indicando
assim a necessidade de selecionar para as provas bioquímicas não somente as
colônias com a mesma característica morfológica, mas sim com várias morfologias
encontradas.
A partir da caracterização bioquímica dos isolados, verificou-se, para cada
criança analisada, o isolamento de uma a três colônias positivas bioquimicamente
para S. mutans.
Com o critério de leitura analisado, observou-se que poucas placas
apresentavam exclusivamente colônias com morfologia puntiforme (34%), porém esta
morfologia juntamente com as médias (29,6%) foram as mais freqüentes entre as
67
amostras observadas, seguida por colônias pequenas (25%) e colônias grandes
prevalentes (11,3%) (Figura 4).
FIGURA 4 - VARIAÇÃO MACROMORFOLÓGICA DE S. mutans EM AMSB
FONTE: o autor (2007)
A existência de variação morfológica pode sugerir a ocorrência de mais de um
biossorotipo na boca (MOREIRA, 2006). Segundo Antony e Munshi (1997), os
resultados obtidos pela estimativa de colônias presentes em amostras salivares
podem ser graduados conforme: alta contagem (superior a 10
5
UFC/mL),
intermediário (entre 10
3
e 10
5
), e baixa contagem (inferior a 10
2
UFC/mL).
Entre as 30 crianças analisadas, 13 apresentavam uma alta concentração de
S. mutans na saliva, em torno de 10
7
UFC/mL de saliva cultivada, enquanto que 17
crianças apresentavam em torno de 10
2
UFC/mL de saliva analisada.
Entre as crianças com alta contagem, todas apresentavam um alto histórico
de ocorrência da doença. Tais resultados indicam que existe uma relação positiva
entre concentração de S. mutans na saliva e a manifestação clínica da doença. No
entanto, entre as crianças com baixa colonização, observou-se um grupo que,
embora apresentasse baixa concentração de S. mutans na saliva, desenvolveu um
histórico da doença (Tabela 5).
1
34,0%
25,0%
29,6%
11,3%
0,0%
5,0%
10,0%
15,0%
20,0%
25,0%
30,0%
35,0%
puntiforme
pequena
média
grande
Porcentagem das colônias
Morfologia colonial
68
TABELA 5 - AVALIAÇÃO DA DIETA E COLONIZAÇÃO SALIVAR DE S. mutans EM CRIANÇAS
COM DIFERENTES HISTÓRICOS DA DOENÇA CÁRIE
Fatores Nº Criança Idade
Morfologia
S. mutans
60BDiluição
CPOD ceo Biofilme
57BCárie
ativa
01 A 3 Pe+q 0,00 0 4 ++ Sim
02 B 3 punti 1/100 0 5 ++ Sim
03 C 8 peq 1/30 0 6 ++ Sim
04 D 4 punti 1/30 0 6 ++ Sim
05 E 12 méd 1/20 4 -- ++ Sim
06 F 8 peq 1/5 0 2 ++ Não
07 G 4 méd 1/30 0 5 ++ sim
08 H1 11 punti 1/50 12 -- ++ Sim
09 H2 11 méd 1/50 12 -- ++ Sim
10 I 4 méd 1/10 0 4 ++ Sim
11 J1 7 gr 1/50 0 5 ++ Sim
12 J2 7 méd 1/50 0 5 ++ sim
13 J3 7 peq 1/10 0 5 ++ Sim
14 K1 6 punti 1/50 4 5 ++ Sim
15 K2 6 méd 1/50 4 5 ++ Sim
16 L1 10 méd 1/50 1 7 ++ Sim
17 L2 10 punti 1/50 1 7 ++ Sim
>aç
>UFC
>CA
Grupo I
18 M 7 punti 1/150 1 4 ++ Sim
19 N 6 punti 0,00 2 4 +++ Não
20 O1 11 peq 1/50 4 -- +++ Sim
21 O2 11 punti 1/30 4 -- +++ Sim
22 P 8 punti 1/100 0 2 +++ Não
23 Q 4 punti 0,00 0 4 +++ Sim
24 R 4 méd 1/20 0 5 +++ Sim
25 S1 4 punti 1/100 0 6 ++ Sim
26 S2 4 méd 1/100 0 6 ++ Sim
27 T 4 gr 1/5 0 2 ++ Sim
>aç
<UFC
>CA
Grupo II
28 U 7 punti 1/5 2 3 +++ Sim
29 V1 10 punti 1/30 0 -- + Não
30 V2 10 méd 1/50 0 -- + Não
31 W1 3 méd 1/50 -- 0 ++ Não
32 W2 3 peq 1/30 -- 0 ++ Não
33 X1 5 méd 1/10 -- 0 + Não
34 X2 5 peq 0,00 -- 0 + Não
35 X3 5 gr 0,00 -- 0 + Não
36 Y1 4 méd 1/30 -- 0 + Não
37 Y2 4 gr 1/100 -- 0 + Não
38 Z 11 punti 1/30 0 -- + Não
39 Α 12 peq 1/50 0 -- + Não
40 & 9 peq 1/100 0 1 + Não
41 & 9 gr 1/200 0 1 + Não
42 € 7 punti 1/100 0 1 + Não
43 € 7 peq 1/70 0 1 + Não
<aç
<UFC
<CA
Grupo III
44 ¥ 11 peq 1/30 2 -- ++ Não
Legenda: + pouco biofilme dental, ++ muito biofilme dental, +++ presença de cálculo dentário; -- não
se aplica; 0 á 1000 UFC (<UFC) e acima de 10000 UFC (>UFC); A a
¥ corresponde a
diferentes crianças analisadas, > ou < aç = maior ou menor quantidade de açúcar na dieta;
> ou < CA = maior ou menor histórico da doença cárie
69
De fato, sugere-se que os níveis de S. mutans consistem no fator mais eficaz
na identificação de crianças de alto risco de cárie em idade precoce
(GRINDEFFORD et al., 1996) e são considerados úteis na identificação de crianças
de risco à cárie, independente da presença ou ausência prévia de lesões de cárie
(O’SULLIVAN e THIBODEAU, 1996).
Neste trabalho, os grupos I e III confirmam esta relação, por outro lado no
grupo II isto não é observado, uma vez que crianças com baixo níveis de S. mutans
desenvolvem a doença. Estes dados sugerem que o baixo nível de S. mutans na
saliva não justifica o não desenvolvimento da cárie dental (alta especificidade) e a
simples presença destes microrganismos, mesmo que em altos níveis, em
desenvolverem a doença. Dados obtidos a partir de crianças livres de cárie e
altamente infectadas por S. mutans, descritas em diferentes países (CARLSSON,
OLSSON, BRATTHALL, 1985; MATEE et al., 1993), corroboram com esta idéia.
Além disso, pouco se conhece ainda sobre as variações nos fatores de virulência
entre clones de S. mutans e sua relação com a atividade de cárie dental. Maiores
estudos sobre este aspecto serão importantes para compreensão dos mecanismos
pelos quais S. mutans colonizam os dentes e induzem a cárie dental, possibilitando,
assim o desenvolvimento de novas estratégias preventivas e de identificação de
indivíduos de risco (BOWDEN, 1997; CAUFIELD, 1997; BEIGHTON, 2005).
Diversos autores relataram tal relação (BARBIERE, 2005; BEIGHTON , 2005;
BRATTHALL, 1992; MOREIRA, 2006). No entanto nos últimos anos vem se
estabelecendo uma extensa discussão a respeito da existência de biossorotipos
variantes em relação à virulência, os quais podem explicar a ocorrência de
indivíduos pobremente colonizados com manifestação clínica da doença.
Alguns estudos demonstraram que existem diferenças na capacidade de
produção de ácidos entre as diferentes espécies de estreptococos do grupo mutans.
De Soet et al. (1991), observaram que os S. sobrinus eram mais acidogênicos do
que os S. mutans em animais gnobióticos. Köhler et al. (1995), detectaram
diferenças na produção de ácidos entre linhagem de S. mutans isoladas de
humanos. Embora tenham observado grandes variações entre linhagens de S.
mutans isolados de diferentes indivíduos, os autores não foram capazes de associar
o potencial acidogênico com o número de lesões de cárie presentes nos indivíduos
colonizados por estes microrganismos.
70
Baixa cariogenicidade foi observada por Köhler e Krasse (1990) em linhagens
de S. mutans isoladas de crianças livres de cárie portadoras de altos níveis de
estreptococos do grupo mutans em modelos animais, quando comparadas com
outras linhagens da mesma espécie, isoladas de crianças altamente infectadas e
com altos índices de cárie dental. Outros estudos demonstraram grande
variabilidade na cariogenicidade de linhagens isoladas de humanos em modelos
animais (DE SOET et al., 1991), mas pouco se sabe sobre os fatores bacterianos
relacionados a estas diferenças (BOWDEN, 1997).
A influência de fatores de virulência de S. mutans e de S. sobrinus na capacidade
de colonização de indução da cárie dental poderia ser mais facilmente observada em
populações mais homogêneas quanto às características sócio-econômicas, hábitos
dietéticos, de higiene bucal e exposição ao flúor (MATTOS-GRANER, 1999).
Tais resultados vêm de encontro com o observado para os indivíduos
estudados neste trabalho, que apresentaram uma baixa contagem e uma alta
incidência da doença. Porém, faz-se necessário ressaltar que a maioria das crianças
analisadas possuía uma dieta hipersacarosada. Além disso, também foi observado
que crianças com baixa concentração de S. mutans, baixo consumo de açúcar,
apresentaram um histórico reduzido da doença.
Barbiere (2005) observou que crianças com alta concentração de S. mutans,
alto consumo de sacarose e baixa manifestação clínica da doença associado à
aderência in vitro, apresentaram S. mutans com um potencial de aderência inferior
aos isolados provenientes de pacientes com alto histórico da doença.
5.2 ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DOS ISOLADOS
Diante da diversidade morfológica e numérica observada, os diferentes isolados
foram estudados por meio de marcadores moleculares para comparar geneticamente os
isolados de S. mutans provenientes da saliva de crianças com diferentes históricos da
doença cárie. Foi realizado um estudo do polimorfismo por meio de marcadores RAPD,
bem como a ribotipagem por meio de sequenciamento da região intergênica (16S-23S)
do gene que codifica o DNAr, visando a identificação dos isolados separados
geneticamente por meio de RAPD. Estes isolados foram também caracterizados por meio
de sequenciamento parcial do gene que codifica a enzima GTF.
71
5.2.1 Caracterização Molecular dos Isolados de S. mutans por meio de marcadores
RAPD
Os diferentes isolados foram inicialmente estudados por meio de marcadores
RAPD onde foram utilizados seis oligonucleotídeos iniciadores, obtendo-se 102
marcadores, e o perfil de amplificação pode ser observado na Figura 5. De acordo
com o perfil de amplificação obtido verificou-se polimorfismo entre os isolados
provenientes de crianças com diferentes experiências à cárie, consumo de açúcar,
bem como referente a colonização por S. mutans (alta e baixa UFC/mL de saliva).
FIGURA 5 - MARCADORES RAPD DAS AMOSTRAS DE DNA DE S. mutans ISOLADOS DAS
CRIANÇAS, UTILIZANDO OLIGONUCLEOTÍDEO INICIADOR OPA 5 (Operon
Technologies)
Legenda: Eletroforese em gel de agarose a 1,4%. Amostras de número 1 a 44 isolados de S.
mutans isoladas das 30 crianças estudadas, onde de 1 a 18 são do grupo I, de 19 a 28
são do grupo II e do 29 a 44 do grupo III; amostra 45 (UA 159) e46( 25175) linhagens
de referência do S. mutans ; 47 linhagem de referência do S. sobrinus, 48 linhagem de
referência do S. pyogenes, contole positivo (49,50,51,52) e M marcador de peso
molecular (Ladder de 100pb)
A análise dos dados, utilizando o coeficiente de Jaccard e o método UPGMA
(programa NTSYSpc 2.1), gerou um dendrograma que demonstrou a separação dos
isolados em sete grupos com maior consistência e valores de bootstrap acima de
75% (Figura 6).
72
r = 0.80169
FIGURA 6 - DENDROGRAMA GERADO A PARTIR DE SIMILARIDADE GENÉTICA OBTIDA POR
MARCADORES RAPD DOS ISOLADOS, UTILIZANDO-SE O COEFICIENTE DE
JACCARD E MÉTODO DE AGRUPAMENTO UPGMA
Legenda: Isolados de S. mutans de 1 a 44 provenientes da saliva das crianças pesquisadas;
ATCC-SM e ATCC-UA linhagem referência de S. mutans, ATCC-SS linhagem de
referência de S. sobrinus e ATCC-SP linhagem referência de S. pyogenes, como grupo
externo , a % corresponde ao Bootstrap e o Coefficient é de similaridade genética
73
De acordo com a Figura 6, os isolados foram agrupados em pelo menos 7
grupos. Os isolados SM-1 e SM-3 agrupados no grupo I eram provenientes de
indivíduos distintos e apresentam similaridade genética aproximada de 40%
(bootstrap 80%). Porém, no grupo II, reuniram-se linhagens SM-8 e SM-9
provenientes de um mesmo indivíduo, com similaridade de 75% (bootstrap 99%),
assim como o grupo III reuniu as linhagens SM-11, SM-12 e SM-13 provenientes de
um mesmo indivíduo, com similaridade genética de aproximadamente 50% e valor
de bootstrap 83%. Os grupos I, II e III reuniram as linhagens provenientes de
isolados de saliva de crianças com alto consumo de sacarose, alta contagem de
UFC/mL de saliva e alta atividade de cárie. Dentre os isolados das amostras
salivares das crianças com alto consumo de sacarose, alta atividade de cárie e baixa
estimativa de UFC/mL de saliva, houve a formação de apenas um agrupamento,
com valor significativo de bootstrap 88%, o grupo IV, que reuniu os isolados de um
mesmo indivíduo SM-20 e SM-21 com similaridade de 57% . Este indivíduo deve ser
multicolonizado, devido à baixa similaridade genética de seus isolados.
Os outros agrupamentos (grupos V, VI e VII) foram de isolados de crianças
que apresentavam baixo consumo de sacarose, baixa estimativa de UFC/mL de
saliva e baixa atividade de cárie. O grupo V (SM-32 e SM-33) reuniu isolados de
amostras salivares de duas crianças com similaridade genética de aproximadamente
55% e bootstrap de 80%. O grupo VI (SM-35 e SM-37) reuniu isolados de amostras
salivares de dois irmãos com similaridade genética de aproximadamente 65% e valor
consistente de bootstrap de 88%. O grupo VII constituiu-se de isolados de amostras
salivares de 3 irmãos (SM-39, SM-41 e SM-42), com similaridade de 47% e valor de
bootstrap 75%.
No entanto, os agrupamentos que apresentaram um baixo valor de bootstrap
sugeriram a existência de isolados feneticamente intermediários aos grupos.
As linhagens referência ATCC-SP e ATCC-SS, utilizadas como grupo externo,
não apresentaram proximidade genética com os isolados estudados.
Existe pouca informação disponível sobre a relação entre a diversidade clonal
e as características de virulência de S. mutans, assim como seu comportamento
quando comparados indivíduos com diferentes experiências de cárie. No presente
estudo não houve relação entre os isolados (genótipo), criança e manifestação
74
clínica da doença cárie, porém foi encontrado um maior número de genótipos em
crianças com história de cárie.
Estudos e relatos têm demonstrado a existência de uma diversidade genética
intraindividual de S. mutans (SAARELA et al., 1996; ALALUUSUA et al., 1996;
GRONROOS e ALALUUSUA, 2000; REDMO-EMANUELSSON et al., 2003), porém,
não existe um consenso sobre a relação de atividade de cárie com a diversidade
genética de S. mutans. Por ribotipagem, foi identificado mais de um clone de S.
mutans entre as crianças que apresentavam cárie, enquanto apenas uma criança
livre de cárie apresentou mais de um ribotipo, sugerindo que indivíduos com maior
atividade de cárie apresentam maior diversidade de S. mutans (ALALUUSUA et al.,
1996).
Por outro lado, foi sugerido que clones específicos de S. mutans são
selecionados em crianças com alta atividade de cárie (KREULEN et al., 1997);
porém não houve correlação com um maior número de genótipos. Já alguns
trabalhos (HIROSE et al., 1993; ALALUUSUA et al., 1996; NAPIMOGA et al., 2004)
identificaram vários genótipos em indivíduos que tinham experiência de cárie.
Acredita-se que a existência de múltiplos genótipos bacterianos na biofilme dental
dental pode ser conseqüência de circunstâncias favoráveis à colonização de
Streptococus do grupo “Mutans”. Um ambiente mais propício poderia suportar este
crescimento de múltiplos genótipos mais adaptados ao ambiente cariogênico, muito
embora seja possível que a ação silmultânea de algumas bactérias com potenciais
cariogênicos distintos possa elevar o risco de cárie. O biofilme dental é composto por
uma comunidade bacteriana complexa, que alberga diversos microorganismos,
inclusive S. mutans, a qual esta exposta a diversas situações de estresse fisiológico,
como excesso ou limitação de nutrientes, baixo pH, alta osmolaridade, oxidação e
freqüente exposição a antimicrobianos, como considerado por Alaluusua et al.
(1996).
A alta colonização e o aumento do número de genótipos são provavelmente,
conseqüências da freqüência de consumo de carboidratos fermentáveis, e é
possível que ações silmultâneas de diferentes genótipos com potencial cariogênico
distintos possam aumentar o risco para o desenvolvimento da cárie dentária
(ALALUUSUA et al., 1996).
75
Observou-se que, na população estudada, circula uma grande diversidade de
biossorotipos de S. mutans, em que alguns estão relacionados com maior ou menor
manifestação clínica da doença. (Figura 7).
FIGURA 7 - ANÁLISE TRIDIMENSIONAL DOS ISOLADOS DE S. mutans
Legenda: Polimorfismo genético dos isolados de S. mutans.
FONTE: o autor (2007)
De acordo com a distribuição dos isolados visualizados no gráfico
tridimensional (Figura 7), observa-se a alta variabilidade genética nas amostras
estudadas.
5.2.2 Sequenciamento da Região Intergênica 16S-23S
A identificação dos isolados de S. mutans provenientes de diferentes grupos
genéticos caracterizados por meio dos marcadores RAPD foi realizada por meio do
sequenciamento da região intergênica (16S-23S).
5.1581
5.6941
6.6440
76
Inicialmente, foram utilizados os oligonucleotídeo iniciadors específicos 13BF
e 6R (CHEN et al., 2005) para a realização da PCR da região de interesse. Os
produtos da amplificação apresentaram bandas extranumerárias, indicando, assim, a
baixa especificidade das condições de reação de PCR (Figura 8A). Sendo assim, foi
realizada uma segunda PCR, a partir dos produtos de amplificação visualizados na
Figura 8A e o perfil de amplificação obtido pode ser observado na Figura 8B.
FIGURA 8 - PADRÃO DE AMPLIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE DNA DE S. mutans ISOLADOS
DAS CRIANÇAS, UTILIZANDO OLIGONUCLEOTIDEOS INICIADOR PARA
AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO INTERGÊNICA (CHEN et al., 2004)
Legenda: M: marcador de peso molecular 1kb; 1: ATCC - S. sobrinus; 2 a 7 e 9: isolados de S.
mutans pertencentes a diferentes grupos de acordo com marcador RAPD; 8: ATCC -
S. mutans (25175); 10: branco
A partir do sequenciamento dos fragmentos apresentados na Figura 8B
obteve-se seqüências com cerca de 660 pb, correspondente ao fragmento de
interesse. As seqüências foram analisadas e corrigidas com o Programa STADEN
Pakage (STADEN; JUDGE e BONFOELD, 2001) e alinhadas com a versão do
CLUSTAL-W (THOMPSON; HIGGINS e GIBSON, 1994) e MEGA 3 (KUMAR;
TAMURA e NEI, 2004). O resultado do alinhamento pode ser visualizado no Anexo 3.
A
B
100pb
600pb
800pb
1000pb
77
Os amplicons foram seqüenciados de acordo com as condições estabelecidas
por OHO, YAMSHITA, SHIMAZAKI (2000), obtendo fragmentos com longitude média
de 656,6 pb (Tabela 6). De acordo com as porcentagens de bases nucleotídicas
observadas entre os isolados analisados, verificou-se que as amostras
apresentaram similaridade genética. Ao compar-se os isolados com outra espécie, o
S. sobrinus, percebe-se uma diferença no total de pares de bases nucleotídicas
(Tabela 6).
De acordo com as seqüências intergênicas 16S-23S verificou-se similaridade
entre as amostras seqüenciadas, tanto no padrão de amplificação demonstrado no
gel de agarose, quanto na seqüência de nucleotídeos analisada, o que leva à
confirmação de que estes isolados pertencem a espécie S. mutans.
TABELA 6 - PORCENTAGEM DE BASES NUCLEOTÍDICAS E LONGITUDE PARA O FRAGMENTO
INTERGÊNICO (16S-23S) DAS AMOSTRAS DE S. mutans ESTUDADAS
Isolados T(U) C A G Total
Isolados de S. mutans analisados
1
2
6
12
18
20
37
Média
23.0 20,1 29,4 27,5 657
23,1 20,1 29,2 27.5 657
23.1 20,2 29,1 27,5 657
23.0 20,1 29,4 27,5 657
23.1 19,9 29,4 27,5 657
23.2 20,0 29,2 27,5 654
23.1 20,1 29,2 27,5 657
23.1 20,1 29,3 27,5 656,6
S sobrinus
ATCC-33478
24.5 20,3 28,3 27,0 715
FONTE: o autor (2007)
Os isolados 1, 2, 6, 12 e 37 são indivíduos com maior similaridade genética,
sendo que os isolados 1 e 12 (Grupo I) são idênticos quanto às seqüências
analisadas, apesar de serem isolados de indivíduos distintos, o que vem demonstrar
que a mesma espécie pode manifestar-se de forma clinicamente semelhante quanto
à doença cárie. Já os isolados 20 e 18 são geneticamente semelhantes para as
sequências analisadas e agruparam-se próximas dos isolados 1, 2, 6, 12 e 37.
78
Apesar de serem de grupos distintos, os isolados 18 e 20 são também semelhantes
quanto à manifestação clínica da doença cárie. A linhagem ATCC S. sobrinus
agrupou-se distante das amostras em estudo, o que demonstra não ser da mesma
espécie dos isolados analisados (Figura 9).
1
12
2
37
6
18
20
sob
0.05
FIGURA 9 - DENDROGRAMA DE SIMILARIDADE GENÉTICA DE ISOLADOS DE S. mutans
PROCEDENTES DE AMOSTRAS SALIVARES DE CRIANÇAS COM DIFERENTES
HISTÓRICOS DE CÁRIE
FONTE: o autor (2007)
Legenda: Árvore filogenética pelo método Neighbor-Joinig (Kimura 2-parametros) para a região
intergênca de Streptococcus mutans e linhagem de referência ATCC 33478 de S.
sobrinus
5.2.3 Sequenciamento Parcial do Gene que Codifica a Enzima Glicosiltransferase
(GTF)
Com o objetivo de comparar geneticamente os isolados em relação à
manifestação clínica da doença, foi estudada a seqüência parcial do gene (região
gtf-B) que codifica a proteína GTF, nos oito isolados de S. mutans pertecentes a
diferentes grupos, de acordo com o histórico da doença e marcadores RAPD. Para o
isolamento do fragmento de interesse foram utilizados os oligonucleotídeo iniciadors
descritos por OHO, YAMSHITA, SHIMAZAKI (2000), em que obteve-se amplicons de
aproximada-mente 500 pb (Figura 10).
79
FIGURA 10 - PADRÃO DE AMPLIFICAÇÃO DO DNA DOS ISOLADOS DE S. mutans
PROVENIENTES DAS CRIANÇAS, UTILIZANDO OS OLIGONUCLEOTÍDEOS
INICIADORES QUE FLANQUEIAM A REGIÃO ESPECÍFICA DO GENE GTF-B DA
ENZIMA GLIGOSILTRANSFERASE (OHO et al., 2000)
Legenda: M: marcador de peso molecular ladder 1kb; 1: ATCC - S. mutans (25175); 2 a 8:
isolados de S. mutans pertencentes a diferentes grupos de acordo com marcador
RAPD; 9: ATCC - S. sobrinus (33478); B: branco
Os amplicons obtidos foram seqüenciados de acordo com as condições
estabelecidas por OHO et al. (2000), obtendo fragmentos com longitude de 493,3 pb
(Figura 1 do Anexo I). De acordo com as variações nucleotídicas observadas entre
os isolados analisados, verificou-se que a amostra 6 apresentou três inserções
(TAT) nas posições 421, 422 e 423, respectivamente , resultando um alinhamento de
496 pares de bases (Tabela 7). Inserções envolvendo mais de um par de base não
foram observadas entre as linhagens estudadas por Fujiwara et al.(1998).
De acordo com a Tabela 7, a porcentagem média de bases AT entre os
isolados e a linhagem referência foi de 66,4% , sendo que as linhagens sequen-
ciadas por Fujiwara et al. (1998) apresentavam uma porcentagem em torno de
66,1% (Tabela 7). Tais resultados demonstram que existem variações nucleotídicas
entre isolados de S. mutans procedentes de diferentes regiões e/ou histórico clínico
da doença.
500pb
100pb
80
TABELA 7 - PORCENTAGEM DE BASES NUCLEOTÍDICAS E COMPRIMENTO PARA O
FRAGMENTO GTF-B DOS ISOLADOS E LINHAGEM REFERÊNCIA DE S. mutans E
DAS SEQUÊNCIAS PUBLICADAS NO "GENBANK
"
Isolados T C A G Total
Isolados de S. mutans analisados
1
2
6
12
18
19
20
37
ATCC
Média
28.6 16.0 37.7 17.6 493
28.6 16.2 37.3 17.8 493
28.8 16.1 37.5 17.5 496
28.6 16.0 37.7 17.6 493
28.8 16.0 37.7 17.4 493
28.8 16.0 37.9 17.2 493
28.8 16.0 37.7 17.4 493
28.8 16.0 37.9 17.2 493
28.4 16.4 37.5 17.6 493
28.7 16.1 37.7 17.5 493.3
Fujiwara et al., 1998
D89977
D88660
D88657
D88654
D886511
Média
28.4 16.4 37.5 17.6 493
28.8 16.4 37.3 17.4 493
28.6 16.2 37.9 17.2 493
28.4 16.4 37.5 17.6 493
28.4 16.4 37.5 17.6 493
28.5 16.4 37.6 17.5 493
Média Geral 28.6 16.2 37.6 17.5 493.2
FONTE: o autor (2007)
Legenda: Em preto estão os valores médios de cada base
nucleotídea
De acordo com o observado na literatura, até o momento, não foram
realizados estudos comparando a longitude e composição nucleotídica para o
fragmento em estudo. Por este motivo, os resultados obtidos neste trabalho foram
comparados com as seqüências publicadas no Genbank por Fujiwara et al. (1998).
As amostras utilizadas para tais comparações foram: D89977, D88660, D88657,
D88654, D886511, nas quais o fragmento para a comparação foi retirado do gene
completo.
81
Dentre as sete mutações descritas neste trabalho, cinco apresentaram
informações de parcimônia, enquanto que nas seqüências publicadas por Fujiwara
et al.(1998) tal informação não foi observada (Tabela 8).
TABELA 8 - DIFERENÇAS NUCLEOTÍDICAS PARA O GENE gtf-B ENTRE OS ISOLADOS DE S.
mutans E LINHAGENS REFERÊNCIAS UTILIZADAS (FUJIWARA et al., 1998)
Posição nucleo-
tídica
Isolados
1111123334444
680367702560222
387710738918123
Genotipo
Isolados de S. mutans
1
2
6
12
18
19
20
37
ATCC
* *** *
TTCAGCGGAAAG---
.........GC.---
..........C.TAT
............---
..T...AAG.C.---
..T...AA..C.---
..T...AAG.C.---
..T...AA..C.---
C.........C.---
A
B
C
A
D
E
D
E
F
Fujiwara et al, 1998
D89977
D88660
D88657
D88654
D886511

C........C.---
C..C.T...CT---
CAT.T.A..C.---
C........C.---
C........C.---
F
G
H
F
F
FONTE: o autor (2007)
Legenda: . nucleotídeos semelhantes
- inserção/deleção
* posição com informação de parcimônia
posição variável para as amostras pubicadas no genbank
Para os isolados e linhagem referência de S. mutans 25175 sequenciadas, no
presente estudo, seis diferentes genótipos foram detectados e denominados de A a
F (Tabela 8). Fujiwara et al. (1998), ao sequenciarem cinco amostras de S. mutans,
para este mesmo fragmento, encontraram três genótipos, sendo que em três
82
linhagens a seqüência é idêntica à da linhagem referência utilizada no presente
estudo. Para os seis diferentes genótipos verificou-se presença de sete mutações
decorrentes, principalmente, de inserções e ou deleções de um único nucleotídeo
para a amioria dos isolados, com exceção do isolado 6 que apresentou uma
alteração em 3 nucleotídeos seqüenciais na posição 421, provavelmente fruto de
uma inserção de 3 pares de bases. Dentre as amostras estudadas por Fujiwara et al.
(1998), foram encontradas mutações, porém decorrentes de inserções e deleções
envolvendo apenas um único nucleotídeo.
Analisando as seqüências obtidas pelo método estabelecido por Kimura 2-
parâmetros (STADEN; JUDGE e BONFIELD, 2001) foi possível estabelecer as
distâncias nucleotídeas entre as linhagens analisadas considerando as mutações
encontradas neste fragmento (Figura 11).
1 2 6 12 18 19 20 37 ATCC
1
1
1
0
1
0
0
4
1
3
1
4
1
3
1
1
1
2
0.0041
1
0
1
1
5
0
4
0
5
0
4
0
2
0
6
0.0020 0.0020
0
1
4
0
3
0
4
0
3
0
1
0
12
0.0000
0.0041 0.0020
4
1
3
1
4
1
3
1
1
1
18
0.0102
0.0102 0.0082 0.0102
1
0
0
0
1
0
5
0
19
0.0082 0.0082 0.0061 0.0082 0.0020
1
0
0
0
4
0
20
0.0102
0.0102 0.0082 0.0102 0.0000 0.0020
1
0
5
0
37
0.0082 0.0082 0.0061 0.0082 0.0020 0.0000 0.0020
4
0
ATCC
0.0041 0.0041 0.0020 0.0041 0.0102 0.0082 0.0102 0.0082
FIGURA 11 - DISTÂNCIAS NUCLEOTÍDICAS BASEADAS NA ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS
PARCIAIS DA REGIÃO gtf-B DOS ISOLADOS E LINHAGEM REFERÊNCIA DE
Streptococcus mutans
FONTE: o autor (2007)
Legenda: Na parte inferior distâncias calculadas por Kimura 2-parâmetros e na parte superior distâncias
por números de mutações. Em azul estão as transições e em vermelho as transversões.
Sublinhado com duas linhas, as maiores distâncias nucleotídicas e em uma linha as menores
83
Ainda de acordo com a Figura 11, os isolados 18 e 20 demonstraram as
menores distâncias nucleotídicas quando comparados par a par com os demais
analisados neste estudo, apresentando também o maior número de transições. Com
relação às mutações, as transições foram mais freqüentes que as transvesões,
quando comparadas par a par, o número de transições entre os isolados foi de um
até cinco, enquanto as transversões ocorriam como um único evento.
Sendo assim, entre os isolados houve diferenças nucleotídicas para a região
seqüenciada e essas diferenças permitiram agrupar os isolados (Figura 12).
ATCC
D88660
D89977
D88654
D886511
6
2
1
12 PRIMER
D88657
19
37
18
20
0.001
FIGURA 12 - DENDROGRAMA DE SIMILARIDADE GENÉTICA ENTRE ISOLADOS DE S. mutans
PROCEDENTES DE CRIANÇAS COM DIFERENTES HISTÓRICOS DE CÁRIE
Legenda: Árvore filogenética pelo método Neighbor-Joinig (Kimura 2-parâmetros) para
sequenciamento parcial nucleotídico da GTF-B de Streptococcus mutans. ATCC 25.175
linhagem referências utilizada; 1, 2, 6, 12, 18, 20, 19, 18 – isolados; D88 a D89
seqüências nucleotídicas da região gtf-B de S. mutans depositadas no “Genbank”
De acordo com o alinhamento realizado para as seqüências da região gtf-B
(Figura 12) verificou-se que a linhagem referência utilizada, ATCC, agrupou-se com
as linhagens referências depositadas no “Genbank.” Os isolados 1, 2, 6 e 12
provenientes de indivíduos com o mesmo histórico da doença (Grupo I) foram
reunidos em um mesmo grupo, onde verificou-se que os isolados 1 e 12 eram
84
idênticos quanto às seqüências analisadas, apesar de serem isolados de indivíduos
distintos, porém com o mesmo padrão de manifestação clínica da doença. Enquanto
a linhagem D88657 (FUJIWARA et al., 1998) agrupou-se isoladamente e próxima
dos isolados 18, 19, 20 e 37.
A partir do dendrograma (Figura 12) verificou-se que os isolados 20 e 18 são
geneticamente semelhantes, apesar de pertencerem a grupos de indivíduos com
diferentes padrões de colonização e estarem associados à manifestação clínica da
doença. Isso sugere que a virulência dos isolados pode ser semelhante. Entretanto,
os isolados 37 e 19, considerados geneticamente semelhantes para as sequências
analisadas, diferiram quanto aos grupos epidemiológicos e manifestação clínica da
doença, indicando que fatores endógenos e exógenos do hospedeiro também
podem influenciar no desenvolvimento da doença.
Para o fragmento analisado foram descritos 165 aminoácidos, sendo que a
análise das porcentagens dos aminoácidos para o gene gtf-B não detectou a
presença de Cisteina, Metionina e de Triptofano (Tabela 2 do Anexo 2). A ausência
destes aminoácidos também foi observada nas sequências publicadas por Fujiwara
et al. (1998).
Os isolados analisados apresentaram variações na seqüência de
aminoácidos e os resultados estão apresentados na Tabela 9.
85
TABELA 9 - DIFERENÇAS AMINOACÍDICAS PARA O GENE gtf-B ENTRE OS ISOLADOS DE S.
mutans E AS LINHAGENS REFERENCIAS UTILIZADAS (FUJIWARA et al., 1998)
Posição amino-
cidica
Amostras
11111
33455612234
06647800161
Isolados/linagem referencia ATCC
1
2
6
12
18
19
20
37
ATCC
* ** *
SAQSSSTNIK-
.......SL.-
........L.Y
..........-
.V...NA.L.-
.V...NA.L.-
.V...N..L.-
.V...N..L.-
........L.-
Fujiwara et al, 1998
D89977
D88660
D88657
D88654
D886511

........L.-
..P.F...LN-
TV.I....L.-
........L.-
........L.-
FONTE: o autor (2007)
Legenda: . nucleotídeos semelhante
- inserção/deleção
* posição com informação de parcimônia
posição variável para as amostras pubicadas no genbank
Observando-se a Tabela 9, apenas o isolado 6 apresenta a adição de um
aminoácido (Tirosina), devido a três inserções (TAT) nas posições 421, 422 e 423
(Tabela 8). Na posição aminoacídica 30 (Tabela 9), apenas a amostra D88657
apresentou um aminoácido diferente, Treonina, enquanto os demais apresentaram
Serina.
86
Os isolados 1, 2, 6 e 12 ; a linhagem ATCC25175 de S. mutans e as seqüências
das diferentes linhagens extraídas do “genbank” como fonte de comparação,
apresentavam Alanina na poisição 36, enquanto os outros isolados e a linhagem
D88657 apresentaram Valina (Tabela 9).
Da mesma forma, os isolados e as linhagens referencias apresentam
Glutamina na posição aminoacídica 46, com exceção da linhagem D88660 que
apresentou Prolina. Nas posições aminoacídicas 54 e 57 os isolados e linhagens
referências apresentavam o mesmo aminoácido, Serina, exceto a linhagem D88657
que apresentava alteração para a Isoleucina e a D88660 para Fenilanina (Tabela 9).
Para os isolados 18, 19, 20 e 37 foram observadas diferenças na posição
aminoacídica 68 com alteração do aminoácido para Asparagina enquanto as demais
amostras analisadas apresentavam Serina (Tabela 9).
Os isolados 18 e 20 apresentam Alanina na posição aminoacídica 110 e o
restante das amostras apresentaram a Treonina (Tabela 9). E o isolado 2 apresentou
Serina na posição aminoacídica 120, sendo que os demais apresentaram
Asparagina (Tabela 9).
Os isolados 1 e 12 apresentam alteração do aminoácido Isoleucina na
posição aminoacídica 121 (Tabela 9), enquanto que as demais amostras
apresentam Leucina. E na posição aminoacídica 136 (Tabela 9) apenas a amostra
D88660 apresentou um aminoácido diferente, Asparagina, sendo que as demais
apresentaram Lisina.
A partir desses resultados sugere-se que as posições aminoacídicas de 30 a
136 são regiões passíveis de variações do gene gtf-B de Streptococcus mutans.
De acordo com a literatura, a existência de polimorfismo nos genes gtfs
expressos por diferentes linhagens de S. mutans (CHIA et al., 1991; YAMASHITA et
al., 1992) poderia estar associada às variações na atividade enzimática específica
(CHIA et al., 1991). Alterações de um único aminoácido dentro do domínio catalítico
das GTFS provocadas por mutagênese sítio-dirigida são capazes de alterar
sensivelmente a atividade enzimática, promovendo diferenças no padrão de
aderência em superfície lisa entre as linhagens de S. mutans estudadas (CHIA et al.,
1998).
87
Sendo assim, é importante ressaltar que o isolado 6 apresentou na posição
aminoacídica 141a inserção do aminoacido Tirosina, diferindo dos demais(Tabela 9).
Tal modificação gerou uma variação aminoacídica, podendo influenciar na atividade
da enzima, uma vez que existem relatos indicando que esta posição é considerada a
mais conservada da GTF-B justamente por se encontrar dentro do domínio catalítico
(CHIA et al., 1998; FUJIWARA et al., 2002). Tal resultado pode ser associado ao
padrão de virulência do isolado, o qual foi obtido de um indivíduo com um histórico
alto de manifestação clínica da doença. A análise intraespecífica, utilizando o
alinhamento das seqüências de fragmentos da GTF-B dos isolados e linhagens
referências demonstrou diferenças nas bases nucleotídeas, sugerindo que tais
alterações podem influenciar o padrão de virulência dos isolados justificando, assim,
as variações observadas nos níveis de colonização dos indivíduos e manifestação
clínica da doença.
Assim, estudos posteriores se fazem necessários, como testes de aderências
in vitro, visando complementar os resultados obtidos e, consequentemente, fornecer
dados a respeito dos diferentes fatores relacionados à doença cárie. A extensão da
análise dos genes gtf representa um caminho para a elucidação do papel deste fator
na virulência e manifestação clínica da doença cárie.
Novas compreensões sobre a história natural da principal bactéria
cariogênica, o Streptococcus mutans, bem como uma maior análise dos genes gtf na
tentativa de compreender o papel dele com relação à cárie dental, podem contribuir
com métodos de controle ou prevenção desta doença infecciosa.
88
58B6 CONCLUSÕES
• A caracterização morfológica e bioquímica utilizada permitiu a identificação
de S. mutans entre isolados do grupo Mutans a partir de amostras
salivares;
• A variabilidade genética encontrada entre os isolados de S. mutans,
sugeriu uma associação entre genótipo, criança e manifestação clínica da
doença cárie;
• A existência de grupos associando crianças com alta manifestação clínica
da doença e baixo índice de S. mutans na saliva, demonstra que se deve
considerar, além dos fatores exógenos, a existência de variação quanto à
virulência entre os biossorotipos selvagens de S. mutans;
• O sequenciamento da região intergênica do DNAr dos isolados analisados,
permitiu confirmar a espécie S. mutans por meio da similaridade genética
dos isolados;
• O sequenciamento parcial do gene que codifica a enzima GTF, permitiu a
detectação de cinco diferentes genótipos, em que isolados com diferenças
nas seqüências nucleotídicas apresentaram variações aminoacídicas, as
quais podem justificar as diferenças no padrão de virulência dos isolados.
89
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103
73BAPÊNDICES
104
74BAPÊNDICE 1 - AVALIAÇÃO DA DIETA E COLONIZAÇÃO SALIVAR DE S. mutans
EM CRIANÇAS COM DIFERENTES HISTÓRICOS DA DOENÇA
CÁRIE
Fatores Nº Criança Idade
Morfologia
S. mutans
61BDiluição
CPOD ceo Biofilme
59BCárie
ativa
01 A 3 Pe+q 0,00 0 4 ++ Sim
02 B 3 punti 1/100 0 5 ++ Sim
03 C 8 peq 1/30 0 6 ++ Sim
04 D 4 punti 1/30 0 6 ++ Sim
05 E 12 méd 1/20 4 -- ++ Sim
06 F 8 peq 1/5 0 2 ++ Não
07 G 4 méd 1/30 0 5 ++ sim
08 H1 11 punti 1/50 12 -- ++ Sim
09 H2 11 méd 1/50 12 -- ++ Sim
10 I 4 méd 1/10 0 4 ++ Sim
11 J1 7 gr 1/50 0 5 ++ Sim
12 J2 7 méd 1/50 0 5 ++ sim
13 J3 7 peq 1/10 0 5 ++ Sim
14 K1 6 punti 1/50 4 5 ++ Sim
15 K2 6 méd 1/50 4 5 ++ Sim
16 L1 10 méd 1/50 1 7 ++ Sim
17 L2 10 punti 1/50 1 7 ++ Sim
>aç
>UFC
>CA
Grupo I
18 M 7 punti 1/150 1 4 ++ Sim
19 N 6 punti 0,00 2 4 +++ Não
20 O1 11 peq 1/50 4 -- +++ Sim
21 O2 11 punti 1/30 4 -- +++ Sim
22 P 8 punti 1/100 0 2 +++ Não
23 Q 4 punti 0,00 0 4 +++ Sim
24 R 4 méd 1/20 0 5 +++ Sim
25 S1 4 punti 1/100 0 6 ++ Sim
26 S2 4 méd 1/100 0 6 ++ Sim
27 T 4 gr 1/5 0 2 ++ Sim
>aç
<UFC
>CA
Grupo II
28 U 7 punti 1/5 2 3 +++ Sim
29 V1 10 punti 1/30 0 -- + Não
30 V2 10 méd 1/50 0 -- + Não
31 W1 3 méd 1/50 -- 0 ++ Não
32 W2 3 peq 1/30 -- 0 ++ Não
33 X1 5 méd 1/10 -- 0 + Não
34 X2 5 peq 0,00 -- 0 + Não
35 X3 5 gr 0,00 -- 0 + Não
36 Y1 4 méd 1/30 -- 0 + Não
37 Y2 4 gr 1/100 -- 0 + Não
38 Z 11 punti 1/30 0 -- + Não
39 α 12 peq 1/50 0 -- + Não
40 & 9 peq 1/100 0 1 + Não
41 & 9 gr 1/200 0 1 + Não
42 € 7 punti 1/100 0 1 + Não
43 € 7 peq 1/70 0 1 + Não
<aç
<UFC
<CA
Grupo III
44 ¥ 11 peq 1/30 2 -- ++ Não
Legenda: + pouco biofilme dental, ++ muito biofilme dental, +++ presença de cálculo dentário; -- não
se aplica; 0 á 1000 UFC (<UFC) e acima de 10000 UFC (>UFC); A a
¥ corresponde a
diferentes crianças analisadas, > ou < aç = maior ou menor quantidade de açúcar na dieta;
> ou < CA = maior ou menor histórico da doença cárie
105
75BAPÊNDICE 2 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
76BEstamos realizando uma pesquisa cujas amostras serão selecionadas em alunos de escolas
municipais de Campo Largo e região metropolitana; vinculadas ao projeto de extensão do
Depatamento de Patologia básica na disciplina de Microbiologia da Universidade Federal do Paraná;
o objetivo desta pesquisa é estudar o isolamento e caracterização molecular de Streptococcus
mutans em crianças com diferentes atividades de cárie para se possível confeccionarmos um
oligonucleotídeo iniciador de diagnóstico.
77BNão existem riscos ao paciente relacionados a esta pesquisa, que consiste apenas em coleta
de saliva. Não será realizado nenhum procedimento clínico em seu filho (a) relacionado a esta
pesquisa.
78BO dentista responsável pela pesquisa, Ivana Froede Neiva poderá ser encontrada nos
telefones 0xx41 3360-4052. Caso seja mais conveniente a professora Vânia Aparecida Vicente está
autorizada, como pesquisadora e orientadora deste trabalho, a prestar os esclarecimentos e pode ser
encontrada no Departamento de Patologia Básica, na Disciplina de Microbiologia da universidade
Federal do Paraná.
79BEstão garantidas todas as informações que você queira, antes e depois do estudo. A sua
participação neste estudo é voluntária. Você tem a liberdade de não autorizar sua participação no
estudo, ou se aceitar, retirar seu consentimento a qualquer momento. O tratamento executado na
UFPR não está condicionado a sua participação.
80BOs resultados serão divulgados em relatório, eventos e/ou publicações científicas, sendo isto
feito sob forma codificada, para que a confidencialidade seja mantida.
81BNenhuma despesa necessária para a realização da pesquisa será de sua responsabilidade.
Para sua participação no estudo você não receberá qualquer valor em dinheiro.
82BEu,______________________________________________li o texto acima e compreendi a natureza
e objetivo do estudo do qual fui convidado (a) a participar. A explicação que recebi menciona os
riscos e benefícios do estudo. Eu entendi que sou livre para interromper a participação no estudo a
qualquer momento sem justificar minha decisão. Eu concordo e autorizo meu (s) filhos
voluntariamente a participar deste estudo.
83B_________________________________________Data__/__/___Assinatura do responsável
84B_________________________________________Data__/__/___Ivana Froede Neiva
106
85BAPÊNDICE 3 - FICHA DE ANAMNESE E EXAME CLÍNICO
107
86BAPÊNDICE 4 - APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
108
87BAPÊNDICE 5 - ACEITE DE TRABALHOS
Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes
DECLARAÇÃO DE ACEITE DE TRABALHO
Declaramos, para todos os fins que se fizerem necessários e de direito, que recebemos os seguintes
trabalhos para publicação na Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, Centro Tecnológico
da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais, intitulados:
1) Isolamento, identificação e extração de DNA Genômico de Staphylococcus aureus de mastites
clínicas e subclínicas bovina, pelo método do CTAB (Brometo de cetiltrimetilamônio).
Autores: Gonçalves, D.; Higuti, I. H.; Vicente, V. A.; Bittencourt, J. V. M, Neiva, I. F, Andersen, E. e
Gonçalves, C. H. M.
2) Análise molecular por meio de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) em populações de
Staphylococcus aureus, causadoras de infecções intramamárias em bovinos.
Autores: Gonçalves, D.; Vicente, V. A.2; Higuti, I. H.; Bittencourt, J.V.M, Neiva, I. F, Pie, M; Andersen,
E. e Gonçalves, C. H. M.
Os referidos trabalhos, encaminhado para análise pela Comissão Editorial da Revistado ILCT foram
aprovados, e serão enviado para fase de editoração, com data de publicação prevista para o número
353 , referente aos meses de novembro/dezembro de 2006 - Volume 61, podendo ainda haver uma
ou outra mudança em relação aos números da Revista do ILCT.
Juiz de Fora, 29 de Agosto de 2006
Luiza Carvalhaes Albuquerque
Editora Responsável - Revista do I.L.C.T.
Coordenadora de Transferência e Difusão de Tecnologia do CT/ILCT
109
88BAPÊNDICE 6 - TRABALHO PARA FUTURA PUBLICAÇÃO
Polimorfismo genético de diferentes biosorotipos de Streptococcus mutans
isolados de crianças de baixa renda
Autores: Neiva, I. F
1
; Moreira, M
2
; Vicente, V. A
3
; Gonçalves, D
4
; Carvalho, Y
5
.
1 . Doutoranda em Processos Biotecnológico e Professora do Departamento de Odontologia
Restauradora – UFPR; 2 Mestre em Microbiologia e Cirurgiã Dentista da Prefeitura de Curitiba; 3.
Professora Drª do Departamento de Patologia Básica da UFPR; 4 . Doutor em Bioprocessos e Médico
Veterinário; 5.
Doutora em Agronomia
ABSTRACT
Samples proceeding from saliva of low income children, with different activities and
experiences of tooth decays and saccharose intake had been isolated and classified from
mutans group. 44 samples were characterized using morphological and biochemical
identification after sowed in a Mitis Salivarius Agar. Additionally, the Gram coloration test was
used to isolation of the positive samples in mean containing 20% of glycerol and frozen to
80ºC. Streptococcus mutans genomic DNA was extracted by method of CTAB, associated
sonication and other different chemical composites in buffer. The RAPD reaction used the
OPA2, OPA3 OPA5, OPA8, OPA9 and OPA13 oligonucleotide primers. The software
“NTSYS” was used for polymorphism analisys using the Jaccard coefficient and the
“UPGMA” method for construction of dendrograms. The consistency of different groupings
was evaluated by boodstrap using the “winboot” software. The data showed great variability
between the different sorotypes, detected by RAPD markers, considering their origin and the
clinical data in different children group, with no association between genotype, tooth decay
and saccharose intake.
Keywords: Streptococcus mutans; Children; Caries; RAPD.
RESUMO
Amostras de Streptococcus mutans provenientes da saliva de crianças de baixa renda, com
diferentes atividades e experiências de cárie foram isoladas e classificadas a partir do grupo
mutans. 44 amostras foram caracterizadas usando identificação morfológica e bioquímica
após serem semeadas em Agar Mitis Salivarius. Adicionalmente, realizou-se o teste da
coloração de Gram, isolando-se as amostras Gram positivas em meio líquido contendo
glicerol a 20% e congelados em freezer - 80ºC. O DNA genômico dos Streptococcus mutans
foi extraído, pelo método do CTAB, associado a sonicação e outros diferentes compostos
químicos no tampão. Para reação de RAPD utilizou-se os oligonucleotídeo iniciadors
iniciadores OPA2, OPA3, OPA5, OPA8, OPA9 E OPA13. O software “NTSYS” foi utilizado
para análise do polimorfismo usando o coeficiente de Jaccard e o método “UPGMA” para
construção de dendrogramas. A consistência dos agrupamentos foi avaliada por boodstrap
usando o “winboot” software. Os dados revelaram grande variabilidade detectada por
marcadores RAPD, considerando-se sua procedência e dados clínicos em diferentes grupos
de crianças, sem associação entre genótipo, cárie dental e consumo de sacarose.
Palavras -Chave: Streptococos mutans; Criança; Cárie; RAPD.
110
ANEXOS
111
ANEXO 1 – SEQÜÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS DO GENE gtf-B DOS ISOLADOS
ANALISADOS
[ 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 GGT GGC TTG GTT AAA GCA GAT TCT AAT GAA TCG AAA TCC CAA ATT TCT AAT GAT TCT AAT
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#19 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#ATCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
[ 111 111 111 111 111 111 111 ]
[ 666 666 666 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 ACT AGT GTT GTT ACT GCT AAT GAA GAA TCT AAT GTA ACA ACC GAA GCG ACA TCT AAG CAA
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ...
#19 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ...
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ...
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ...
#ATCC ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
[ 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 ]
[ 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 555 666 666 666 677 777 777 778 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 GAA GCT GCT AGT AGT CAA ACT AAT CAT ACA GTA ACG ACA AGC AGT AGC TCT ACT TCG GTA
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
#19 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
#ATCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
[ 111 111 111 111 111 111 122 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 ]
[ 888 888 888 999 999 999 900 000 000 001 111 111 111 222 222 222 233 333 333 334 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 GTT AAT CCC AAA GAG GTT GTA AGT AAT CCT TAT ACT GTT GGG GAA ACA GCT TCT AAT GGT
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#19 ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#20 ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#37 ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#ATCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
[ 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 223 ]
[ 444 444 444 555 555 555 566 666 666 667 777 777 777 888 888 888 899 999 999 990 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 GAA AAG CTT CAA AAT CAA ACA ACT ACA GTT GAC AAA ACT TCT GAA GCT GCT GCT AAT AAT
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#19 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#ATCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
112
[ 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 ]
[ 000 000 000 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 ATT AGT AAA CAA ACA ACC GAA GCT GAT ACA GAT GTT ATT GAT GAT AGC AAT GCA GCC AAT
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G.
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#19 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#ATCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
[ 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 444 444 444 444 444 444 444 ]
[ 666 666 666 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 ATA CAA ATA TTG GAA AAA CTT CCC AAT GTA AAA GAA ATT GAT GGT AAG TAT TAT TAT TAT
#2 C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#19 C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#20 C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#37 C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#ATCC C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
[ 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 ]
[ 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 555 666 666 666 677 777 777 778 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 --- GAC AAT AAC GGC AAA GTT CGT ACT AAT TTT ACA TTA ATT GCT GAT GGC AAA ATT TTA
#2 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 TAT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#19 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#20 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#37 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#ATCC --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
[ 444 444 444 444 444 4]
[ 888 888 888 999 999 9]
[ 123 456 789 012 345 6]
#1 CAT TTT GAT GAA ACT G
#2 ... ... ... ... ... .
#6 ... ... ... ... ... .
#12 ... ... ... ... ... .
#18 ... ... ... ... ... .
#19 ... ... ... ... ... .
#20 ... ... ... ... ... .
#37 ... ... ... ... ... .
#ATCC ... ... ..
113
ANEXO 2 - PORCENTAGEM DE AMINOÁCIDOS PARA O GENE gtf-B DO S. mutans ANALISADO E DAS LINHAGENS DE REFERÊNCIAS
PUBLICADAS NO "GENBANK"
Amostras analisadas
Amostra
1
2
6
12
19
37
20
18
ATCC
Média
Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Total
7.93 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.88 7.32 3.66 0.00 10.98 1.83 4.27 0.61 12.20 13.41 8.54 0.00 3.05 164
7.93 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.27 7.32 4.27 0.00 10.37 1.83 4.27 0.61 12.80 13.41 8.54 0.00 3.05 164
7.88 0.00 6.67 7.88 1.21 4.24 1.21 4.24 7.27 4.24 0.00 10.91 1.82 4.24 0.61 12.12 13.33 8.48 0.00 3.64 165
7.93 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.88 7.32 3.66 0.00 10.98 1.83 4.27 0.61 12.20 13.41 8.54 0.00 3.05 164
7.93 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.27 7.32 4.27 0.00 11.59 1.83 4.27 0.61 11.59 12.80 9.15 0.00 3.05 164
7.32 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.27 7.32 4.27 0.00 11.59 1.83 4.27 0.61 11.59 13.41 9.15 0.00 3.05 164
7.93 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.27 7.32 4.27 0.00 11.59 1.83 4.27 0.61 11.59 12.80 9.15 0.00 3.05 164
7.32 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.27 7.32 4.27 0.00 11.59 1.83 4.27 0.61 11.59 13.41 9.15 0.00 3.05 164
7.93 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.27 7.32 4.27 0.00 10.98 1.83 4.27 0.61 12.20 13.41 8.54 0.00 3.05 164
7.79 0.00 6.70 7.92 1.22 4.27 1.22 4.40 7.31 4.13 0.00 11.17 1.83 4.27 0.61 11.98 13.27 8.80 0.00 3.11 164.1
GenBank
D89977
D88660
D88657
D88654
D886511
Média
7.93 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.27 7.32 4.27 0.00 10.98 1.83 4.27 0.61 12.20 13.41 8.54 0.00 3.05 164
7.93 0.00 6.71 7.93 1.83 4.27 1.22 4.27 6.71 4.27 0.00 11.59 2.44 3.66 0.61 11.59 13.41 8.54 0.00 3.05 164
7.32 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.88 7.32 4.27 0.00 10.98 1.83 4.27 0.61 10.98 14.02 9.15 0.00 3.05 164
7.93 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.27 7.32 4.27 0.00 10.98 1.83 4.27 0.61 12.20 13.41 8.54 0.00 3.05 164
7.93 0.00 6.71 7.93 1.22 4.27 1.22 4.27 7.32 4.27 0.00 10.98 1.83 4.27 0.61 12.20 13.41 8.54 0.00 3.05 164
7.83 0.00 6.71 7.93 1.32 4.27 1.22 4.47 7.22 4.17 0.00 11.08 1.93 4.17 0.61 11.89 13.52 8.64 0.00 3.05 164
Média geral 7.79 0.00 6.70 7.92 1.26 4.27 1.22 4.40 7.27 4.18 0.00 11.14 1.87 4.22 0.61 11.93 13.37 8.75 0.00 3.09 164.1
Legenda: Proximidade na porcentagem de aa para as amostras analisadas qundo comparadas entre si e com as do “genbank”
114
ANEXO 3 – SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS DA REGIÃO INTERGÊNICA DOS ISOLADOS ANALISADOS
[ 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 TCC CGG GCC TTG TAC ACA CCG CCC GT- CAC ACC ACG AGA GTT TGT AAC ACC CGA A-G TCG
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ..- ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ...
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ..- ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ...
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ..- ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ...
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ..- ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ...
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ..- ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ...
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ..- ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-. ...
#sob ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .G. ... ... ... ... ... ... ... .A. .A. ...
[ 111 111 111 111 111 111 111 ]
[ 666 666 666 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 GTG AGG TAA CCT TTT A-G GGG CCA GCC GCC TAA GGT GGG ATG GAT GAT TGG GGT GAA GTC
#2 ... ... ... ... ... .-. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 ... ... ... ... ... .-. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 ... ... ... ... ... .-. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 ... ... ... ... ... .-. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#20 ... ... ... ... ... .-. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#37 ... ... ... ... ... .-. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#sob ... ... ... ..A ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
115
[ 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 ]
[ 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 555 666 666 666 677 777 777 778 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 GTA ACA AGG TAG CCG TAT CGG AAG GTG CGG CTG GAT CAC CTC CTT TCT AAG GAA AAA C--
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .--
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .--
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .--
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .--
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .--
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .--
#sob ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... .TA
[ 111 111 111 111 111 111 122 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 ]
[ 888 888 888 999 999 999 900 000 000 001 111 111 111 222 222 222 233 333 333 334 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 -GC AAA GCA CAT TAG GGG AAC TTC TTG TTT AGT TTT GAG AGG GTA AGT GGG GCC TTA GCT
#2 -.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 -.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 -.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 -.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#20 -.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#37 -.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#sob A.T ..C .A. G.C GTT AA. ..A .C. G.A .GA .AA .AG .G. .C. .CC ..- AAA AT. C.G AT.
116
[ 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 222 223 ]
[ 444 444 444 555 555 555 566 666 666 667 777 777 777 888 888 888 899 999 999 990 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 CAG CTG GGA GAG CGC CTG CTT TGC ACG CAG GAG GTC AGC GGT TCG ATC CCG CT- --- ---
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- --- ---
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- --- ---
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- --- ---
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- --- ---
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- --- ---
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- --- ---
#sob TTC TA. .AC .GC .AT ..T T.. CCT .G. A.T TTA ... T.- A.. A.A ..T A.T TAG TAA CGG
[ 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 ]
[ 000 000 000 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 AGG CTC CAT TAA AAC AGG ATA CTA A-- --- CAG ACG GTT CGC TTG CGA ATA CTT CTG -TA
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... .-- --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... -..
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... .-- --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... -..
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... .-- --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... -..
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... .-- --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... -..
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... .-- --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... -..
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... .-- --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... -..
#sob .A. .A. GT. .TG GGG .C. C.. T.T .GT TTT ... .G. T.. T.T GG. GCC T.. GC. .A. C.G
117
[ 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 333 444 444 444 444 444 444 444 ]
[ 666 666 666 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 112 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 GAA GAT TAT CTA TTT TTC TAA GAA GTC AGT CTG GAG TTC AAC TTC AT- -AT CTT GTT TAA
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ...
#6 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ...
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ...
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ...
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ...
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ...
#sob .G. ..G CGC ..G C.. .G. -.C .C. .GA G.. .A. CG. ... G.T CC. GCT AGG ..C CA. ..G
[ 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 444 ]
[ 222 222 222 333 333 333 344 444 444 445 555 555 555 666 666 666 677 777 777 778 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 GAC AAG GAA GTC TAT AAA ATC CA- -CT TAG GAT ATG --- --- --- -AT AAG TAT CCT ---
#2 ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ... --- --- --- -T. ... ... ... ---
#6 ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ... --- --- --- -T. ... ... ... ---
#12 ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ... --- --- --- -.. ... ... ... ---
#18 ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ... --- --- --- -T. ... ... ... ---
#20 ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ... --- --- --- -T. ... ... ... ---
#37 ... ... ... ... ... ... ... ..- -.. ... ... ... --- --- --- -T. ... ... ... ---
#sob ..T .C. ..G .A. G.. TCG C.T TTT T.. ..A ..C G.T AGT CCG GCG TTC ... ... T.. CAA
118
[ 444 444 444 444 444 444 455 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 ]
[ 888 888 888 999 999 999 900 000 000 001 111 111 111 222 222 222 233 333 333 334 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 --A GAG ATG GTT CAT T-- --- --- -GA CAA --- --T TG- -AA TAG CTA GTA AAA GCC CTA
#2 --. ... ... ... ... .-- --- --- -.. ... --- --. ..- -.. ... ... ... ... ... ...
#6 --. ... ... ... ... .-- --- --- -.. ... --- --. ..- -.. ... ... ... ... ... ...
#12 --. ... ... ... ... .-- --- --- -.. ... --- --. ..- -.. ... ... ... ... ... ...
#18 --. ... ... ... ... .-- --- --- -.. ... --- --. ..- -.. ... ... ... ... ... ...
#20 --. ... ... ... ... .-- --- --- -.. ... --- --. ..- -.. ... ... ... ... ... ...
#37 --. ... ... ... ... .-- --- --- -.. ... --- --. ..- -.. ... ... ... ... ... ...
#sob AG. .CA G.. CCC .C. .AT CCT AAG C.G ... CGA CG. ..C C.. .T. T.C A.T G.. AAT TG.
[ 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 555 556 ]
[ 444 444 444 555 555 555 566 666 666 667 777 777 777 888 888 888 899 999 999 990 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 TAG CGC AGC TAT AGG GAA ACA AGA AAG AAA CCG AGA CGC TGA AAA G-- -CC AGA GAA AC-
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-- -.. ... ... ..-
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-- -.. ... ... ..-
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-- -.. ... ... ..-
#18 ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... .-- -.. ... ... ..-
#20 ... ... ... ... ... ... .A. .-- -.. ... ... ... ... ... ... .-- -.. ... ... ..-
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .-- -.. ... ... ..-
#sob ATA TCT .T. A.A TA. T.. CA. GA. ..T ... ... .A. ... ..T ... TAT TTT .A. ..G ..C
119
[ 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 ]
[ 000 000 000 111 111 111 122 222 222 223 333 333 333 444 444 444 455 555 555 556 ]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 ]
#1 --- GAG AAA TAA GGT TAA GTT AAT AAG GGC GCA CGG TGG ATG CCT AGG CAC TAG GAG CCG
#2 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#6 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#12 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#18 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#20 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#37 --- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#sob AAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ...
[ 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 666 777 777 777 777 777 777 7]
[ 666 666 666 777 777 777 788 888 888 889 999 999 999 000 000 000 011 111 111 1]
[ 123 456 789 012 345 678 901 234 567 890 123 456 789 012 345 678 901 234 567 8]
#1 ATG AAG GAC GTG ACG AAC GAC GAC ATG CTT TGG GGA GCT GTA AGT AAG CCT TGA TCC A
#2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#12 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#18 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#20 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#37 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#sob ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... .TG ... ... .
120
ANEXO 4 - ESQUEMA ILUSTRATIVO DA REGIÃO INTERGÊNICA AMPLIFICADA PELO PAR DE
OLIGONUCLEOTÍDEOS 13BF e 6R (CHEN et al., 2005)
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