( PDF ) Adaptabilidade diferencial das variantes moleculares "slow" e "fast" da esterase-5 de Drosophila mulleri

Download PDF

ads:

VÍTOR BARALDI THOMAZINE

Adaptabilidade diferencial das variantes moleculares “slow” e

“fast” da esterase-5 de Drosophila mulleri

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Thomazine, Vítor Baraldi.

Adaptabilidade diferencial das variantes moleculares “slow” e “fast”

da esterase-5 de Drosophila mulleri. / Vítor Baraldi Thomazine. - São

José do Rio Preto : [s.n.], 2007.

51 f. : il. ; 30 cm.

Orientador: Carlos Roberto Ceron

Co-orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodríguez

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas

1. Drosofila. 2. Esterases. 3. Aloenzimas - Purificação. 4.

Drosophila mulleri. I. Ceron, Carlos Roberto. II. Bonilla-Rodríguez,

Gustavo Orlando. III. Universidade Estadual Paulista, Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título.

CDU - 575

ads:

iii

VÍTOR BARALDI THOMAZINE

Adaptabilidade diferencial das variantes moleculares “slow” e “fast” da esterase-5 de

Drosophila mulleri

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre

em Genética, área de Genética junto ao Programa de Pós-

Graduação em Genética do Instituto de Biociências, Letras

e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio

de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Carlos Roberto Ceron

Professor Assistente Doutor

UNESP - São José do Ro Preto

Orientador

Prof. Dr. Hamilton Cabral

Professor Doutor

Universidade de São Paulo

Prof

. Dr

. Fátima Pereira de Souza

Professor Assistente Doutor

UNESP - São José do Rio Preto

São José do Rio Preto, 29 de fevereiro de 2008

O presente trabalho foi realizado nos laboratórios de Genética Bioquímica, Bioquímica de

Proteínas e Genética de Populações do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas

(IBILCE) de São José do Rio Preto, da Universidade Estadual Paulista (UNESP), sob a

orientação do Prof. Dr. Carlos Roberto Ceron e co-orientação do Prof. Dr.Gustavo Orlando

Bonnila-Rodríguez, com o auxílio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal

de Nível Superior (CAPES).

Dedico

Aos meus pais, Anibal e Maria Helena,

ao meu irmão, Renan,

à minha namorada, Andresa,

e a todos os meus amigos.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Ceron, pela orientação, amizade e respeito

desde o estágio básico.

Ao Prof. Dr. Gustavo Orlando Bonnila-Rodríguez, pela co-orientação.

À Eliani, técnica do laboratório, por toda a ajuda e paciência no

laboratório.

Ao Prof. Dr. Eduardo Alves de Almeida pela ajuda com os ensaios

enzimáticos.

Aos meus amigos de laboratório, pela ajuda e companhia nesta jornada.

Aos meus amigos de república e de pós-graduação.

À Capes, pelo auxílio financeiro.

À minha namorada Andresa, pelo incentivo, carinho e compreensão.

À minha família, que é tudo em minha vida, sem a qual não estaria aqui.

À Deus,

Obrigado

vii

“Nada é tão contagioso como o entusiasmo.

Ele comove pedras. Encanta brutos.

A verdade é que nada se realiza sem ele;”

Grantland Rice

viii

RESUMO

Vários trabalhos na literatura têm discutido a importância dos polimorfismos

enzimáticos em relação ao estado de ser adaptado dos organismos. Nesse trabalho foram

estudadas algumas propriedades bioquímicas das aloenzimas EST-5

e EST-5

de Drosophila

mulleri, que poderiam estar relacionadas às diferenças em valores adaptativos em indivíduos

que apresentam essas variantes enzimáticas. Os resultados sugerem que a aloenzima EST-5

apresenta maior resistência à desnaturação térmica e a agentes caotrópicos, bem como maior

atividade em altas concentrações salinas. Os resultados do experimento de produtividade a 29º

C mostram que os indivíduos homozigotos para o alelo Est-5

deixam mais descendentes que

os indivíduos homozigotos para o alelo Est-5

. Quanto as caractetísticas cinéticas, essas

aloenzimas não diferem de forma significante. Os valores de V

max

e K

obtidos para as

enzimas não purificadas foram, respectivamente, para a EST-5

: 32,54 µM/min e 1,43 mM, e

para a EST-5

: 33,34 µM/min e 1,54 mM. A purificação das aloenzimas foi obtida pela

separação em SDS-PAGE seguida da remoção dos géis, eluição em agitador magnético para a

difusão das enzimas e posterior concentração desse material em membrana filtrante de 50 kDa

(Millipore). O concentrado foi então analisado quanto à atividade esterásica e quanto à pureza

(SDS-PAGE). Ambas as aleloenzimas apresentaram uma massa molecular entre 66 e 68 kDa

para a subunidade, em SDS-PAGE. Os resultados do presente estudo não são concordantes

com a hipótese de neutralidade para a manutenção dos polimorfismos, tanto em populações

naturais como de laboratório, indicando a atuação da seleção natural sobre as aleloenzimas

estudadas.

ABSTRACT

Several works in literature have discussed the importance of the enzymatic

polymorphisms in respect to the state of being adapted of the organisms. In this work, some

biochemical properties of Drosophila mulleri of the allozymes EST-5

and EST-5

, which

could be related to the differences in fitness values in individuals that present those enzymatic

variants, were studied. The results suggest that the EST-5

allozyme presents larger resistance

on the thermic denaturation and the chaotropics agents, as well as higher activity in elevated

salt concentrations. The results of the productivity experiment at 29°C show that the

homozygous individuals to the Est-5

allele let more offspring than the homozygous

individuals to the Est -5

allele. Regarding the kinetic characteristics, those allozymes do not

differ in a significant way. The K

and V

max

values obtained for crude extracts allozymes

were, respectively, to the EST-5

: 32,54 µM/min and 1,43 mM, and to the EST-5

: 33,34

µM/min and 1,54 mM. The purification of the allozymes was obtained by the separation on

SDS-PAGE followed by their removal from gels, elution in magnetic shaker for the diffusion

of the enzymes and concentration of this material in filtrant membranes of 50 kDa

(Millipore). The concentrated materials were then analyzed regarding to their enzymatic

activity and to the purity (SDS PAGE). Both allozymes presented subunit molecular weights

around 66 and 68 kDa on SDS PAGE. The results of the present study do not agree to

neutrality hypothesis for polymorphisms maintenance, in natural and laboratory populations,

indicating a natural selection action of the on the studied allozymes.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES E TABELA

Figura 1 Gel não-desnaturante, corado especificamente para esterases, 18

ilustrando o padrão de bandas de indivíduos homozigotos e

heterozigotos para os alelos S e F do gene Est-5.

Figura 2 Gel não-desnaturante, corado especificamente para esterases, 19

com amostras pré-incubadas a temperatura de 50°C.

Figura 3 Gel não-desnaturante, corado especificamente para esterases, 20

com amostras pré-incubadas a temperatura de 55°C.

Figura 4 Gel não-desnaturante, corado especificamente para esterases, 21

com amostras pré-incubadas em uréia.

Figura 5 Gel não-desnaturante, corado especificamente para esterases, 22

com amostras pré-incubadas em NaCl.

Figura 6 Gel SDS-PAGE, corado com Nitrato de Prata, mostrando as 24

aleloenzimas EST-5

e EST-5

purificadas.

Figura 7 Gel SDS-PAGE, corado especificamente para esterases, 25

mostrando a atividade catalítica das aleloenzimas EST-5

e EST-5

purificadas sobre o substrato β-naftil-acetato.

Figura 8 Gel não-desnaturante, corado especificamente para esterases, 28

mostrando a ação do PMSF sobre a esterase-2 de D. mulleri.

Figura 9 Gráfico ilustrando a perda da atividade enzimática das amostras 29

pré-incubadas a temperatura de 50ºC.

Figura 10 Gráfico ilustrando a perda da atividade enzimática das amostras 29

pré-incubadas a temperatura de 55ºC.

Figura 11 Gráfico ilustrando a perda da atividade enzimática das amostras 30

pré-incubadas a temperatura de 60ºC.

Figura 12 Gráfico ilustrando a perda da atividade enzimática das amostras 30

pré-incubadas com uréia.

Figura 13 Gráfico ilustrando a perda da atividade enzimática das amostras 31

pré-incubadas com NaCl.

Figura 14 Gráfico ilustrando a perda da atividade enzimática das amostras 31

em diferentes concentrações do triton X-100.

Figura 15 Gráfico ilustrando o perfil de pH das aleloenzimas da esterase-5. 32

Tabela 1 Produtividade média de descendentes por casal a 20 e 29 ºC para 32

as linhagens Est-5

e Est-5

Figura 16 Produtividade média de descendentes por casal a 20 (A) e 29ºC 33

(B) para as linhagens Est-5

e Est-5

xii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

pCMB Para-cloromercuriobenzoato.

bp Pares de bases nucleotídicas.

kDa Quilo dalton, medida de massa molecular.

PAGE Gel de poliacrilamida

SDS Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE Gel de poliacrilamida com SDS

ASN Asparagina, aminoácido.

ASP Ácido Aspártico, aminoácido.

THR Treonina, aminoácido.

ALA Alanina, aminoácido.

xg Força centrífuga.

C Porcentagem de ligações cruzadas no gel, entre a bis-acrilamida e a acrilamida.

TRIS Tri(hidroximetil)aminometano.

HCl Ácido clorídrico.

PMSF Fluoreto de fenil metilssulfonila

DTNB Ácido 5,5’-dithiobis-2-dinitrobenzóico

xiii

SUMÁRIO

I. Introdução 1

I.1 O grupo repleta 1

I.2 Esterases como isoenzimas 2

I.3 O cluster das β-esterases 3

I.4 Polimorfismo no “cluster” das β-esterases do complexo mulleri 5

II. Objetivos 9

III. Material e Métodos 10

III.1 Obtenção e manutenção das moscas 10

III.2 Preparo das amostras 10

III.3 Quantificação da proteína total dos extratos brutos 10

III.4 Teste de resistência à temperatura 10

III.5 Teste de resistência a agentes desnaturantes 10

III.6 Efeito da concentração salina 11

III.7 Teste do efeito do triton X-100 12

III.8 Teste do pH 12

III.9 Mensuração da atividade catalítica 12

III.10 Padronização da Eletroforese 12

III.11 Detecção das esterases nos géis 13

III.12 Ação do fluoreto de fenil metilssulfonila (PMSF) sobre as

esterases de D. mulleri sulfonila (PMSF) 13

III.13 Ensaios enzimáticos 13

III.14 Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE) 14

III.15 Metodologia de purificação das variantes da EST-5 14

III.16 Estudo da produtividade 15

IV. Resultados 16

IV.1 Análise comparativa da atividade enzimática das aloenzimas sobre

diferentes condições físico-químicas 16

IV.2 Purificação das aloenzimas EST-5

e EST-5

xiv

IV.3 Ensaios enzimáticos após diferentes condições físico-químicas 26

IV.4 Caracterização Cinética 27

IV.5 Estudo da produtividade 27

V. Discussão 34

VI. Conclusão 41

Referências 42

Introdução

I - INTRODUÇÃO

I.1 - O grupo repleta

O grupo repleta do gênero Drosophila (Díptera; Drosophilidae) constitui um bom

modelo biológico para estudos evolutivos. Atualmente, este grupo compreende cerca de 100

espécies distribuídas nos subgrupos: fascíola, hydei, mercatorum, mulleri e repleta, dentre os

quais o subgrupo mulleri é o mais numeroso, contando atualmente com 44 espécies. Cada

subgrupo, por sua vez, tem sido subdividido em complexos e clusters. O conhecimento atual

sobre a filogenia do grupo repleta está baseado em dados morfológicos (Throckmorton,

1982a; Vilela, 1983), citológicos (Wasserman, 1982, 1992; Powell, 1997), aloenzimáticos

(Zouros, 1973; Richardson et al. 1975; Richardson e Smouse, 1976; Richardson et al. 1977;

Heed et al. 1990; Mateus e Sene, 2003) e moleculares (Sullivan et al.1990; Russo et al. 1995,

Spicer, 1995, 1996; Rodríguez et al. 2000; Durando et al. 2000; Tartarenkov e Ayala, 2001).

Como já mencionado, dentro do grupo repleta o subgrupo mulleri é o mais numeroso

com 44 espécies. Este grupo apresenta cinco complexos de espécies, a saber: anceps,

eremophila, meridiana, mulleri e buzzatii. Por sua vez, o complexo mulleri reúne as espécies:

Drosophila arizonae, Drosophila mojavensis, Drosophila navajoa, Drosophila aldrich,

Drosophila whelleri e a espécie utilizada neste projeto, a Drosophila mulleri. Análises

filogenéticas moleculares confirmaram a solidez monofilética do complexo mulleri que

consiste de membros estritamente relacionados (Durando et al. 2000), o que faz com que esse

complexo seja muito utilizado para diversos estudos genéticos e evolutivos.

As espécies do grupo repleta ocupam diferentes habitats, mas sem dúvida, a

característica mais notável é a capacidade de utilizarem os cladódios em decomposição de

vários tipos de cactos neotropicais para realizar a ovoposição e se alimentar de leveduras

presentes nesses vegetais. Essa adaptação tem permitido às espécies do grupo ocuparem

desertos e as zonas áridas do Novo Mundo e facilitado a exploração de nichos desocupados,

permitindo uma rápida evolução e formação de novas espécies (Ruiz e Fontdevila, 1981;

Heed, 1982; Etges et al. 2001; Tidon-Sklorz e Sene, 2001). O grau de utilização dos tecidos

cactáceos é variado entre as espécies. Por exemplo, a maioria das espécies do subgrupo

mulleri utiliza as cactáceas como local de criação, chegando a ser indispensável à vida de

certas espécies como Drosophila mojavensis que é cactofílica restrita. Já as espécies do grupo

fascíola, hydei, mercatorum e repleta são generalistas, alimentando-se de outros frutos

vegetais (Pereira et al. 1983).

Introdução

I.2 – Esterases como isoenzimas

Isoenzimas podem ser definidas segundo a comissão de Nomenclatura Bioquímica da

IUPAC-IUB (International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of

Biochemistry), de 1977, “como múltiplas formas moleculares de uma enzima que ocorrem

dentro de uma única espécie, como resultado da presença de mais de um gene estrutural”. A

importância das isoenzimas do ponto de vista evolutivo, bioquímico e fisiológico, torna-se

evidente quando são analisadas algumas de suas características. Formas moleculares múltiplas

das enzimas são observadas em todos os organismos, podendo assim desempenhar uma

função específica no metabolismo em harmonia com outras enzimas no contexto celular. As

isoenzimas freqüentemente apresentam distribuições diferentes, tanto celular como tecidual, o

que confere versatilidade, flexibilidade e precisão em termos das várias funções metabólicas

desempenhadas pelos tecidos. A origem destas formas moleculares múltiplas pode ser

atribuída à presença de mais de um loco gênico, ou a mais de um alelo em um mesmo loco.

Assim, em ambos os casos, os produtos gênicos são diferentes, e no último caso, em

particular, as formas enzimáticas podem ser chamadas de aleloenzimas (ou aloenzimas). Esta

classe de isoenzimas é a responsável pelos polimorfismos enzimáticos observados em

populações naturais.

As aloenzimas apresentam diferentes padrões de mobilidade eletroforética resultantes

de diferenças alélicas e têm se constituído um excelente material para o estudo da questão da

adaptabilidade ou neutralidade dos polimorfismos, pois suas propriedades diferem entre os

indivíduos de uma mesma espécie ou entre populações que habitam diferentes ambientes.

As esterases encontram-se entre os sistemas enzimáticos que apresentam a maior

diversidade de função e formas isoenzimáticas. Presentes em todos os organismos, elas

compreendem um grupo multifuncional e heterogêneo de enzimas que participam da hidrólise

de ésteres e outros compostos. Nos insetos, estas enzimas estão envolvidas em vários

processos metabólicos, incluindo degradação de feromônios e do hormônio juvenil (Kort e

Granger, 1981; Jones et al. 1994; Rauschenbach et al. 1994), processos digestórios

(Sreerama

e Veerahadrappa, 1991; Kerlin e Hugues, 1992; Argentine e James, 1995) e reprodutivos

(Richmond e Senior, 1991; Mikhailov e Torrado, 2000). Uma função importante das

carboxilesterases nos insetos está relacionada à capacidade de metabolizar vários compostos

agroquímicos, incluindo piretróides, organofosforados e carbamatos (Spackman et al. 1994;

Gupta et al. 2005; Wheelock et al. 2005). Várias das esterases encontradas nos insetos são

Introdução

altamente polimórficas, o que justifica suas múltiplas atividades no metabolismo desses

organismos.

A classificação mais amplamente aceita para as esterases é baseada na sua

sensibilidade a três grupos de inibidores da atividade enzimática (Holmes e Máster, 1967

apud Oakeshott et al. 1993), incluindo os reagentes que se ligam a grupos sulfidrílicos (como

exemplo o para-cloromercuriobenzoato – pCMB ou iodoacetamida), os organofosforados

(exemplo: malathion) e carbamatos (como exemplo o sulfato de eserina). Com base neste

critério, quatro classes de esterases são diferenciadas:

. acetilesterases - não são afetadas pelos inibidores acima citados e geralmente têm maior

afinidade por substratos alifáticos, envolvendo derivados do ácido acético.

. arilesterase - são inibidas somente por reagentes que se ligam a grupos sulfidrílicos e atuam

principalmente sobre substratos aromáticos.

. carboxilesterases - são inibidas somente por organofosforados e sua maior afinidade é por

ésteres alifáticos, geralmente ácidos de cadeias longas.

. colinesterases - são inibidas por organofosforados e carbamatos, e atuam preferencialmente

sobre substratos como ésteres de colina a outros ésteres alifáticos e aromáticos. Podem ser

separadas em acetilcolinesterases e pseudocolinesterases.

I.3 – O cluster das β-esterases

Como já observado, os organismos multicelulares utilizam um amplo conjunto de

enzimas para desempenhar as mais diversas funções bioquímicas, e essas enzimas são, em

geral, resultantes da evolução das famílias de multigenes. É suposto que a evolução dessas

famílias tenha ocorrido por meio da duplicação gênica e posterior divergência do gene

duplicado, que adquire novas funções. As esterases compreendem um sistema isoenzimático

que exemplifica esse processo. Há uma significativa similaridade entre as carboxilesterases e

colinesterases de eucariotos já seqüenciadas, que podem ser agrupadas em uma família

multigênica denominada carboxil/colinesterase. Essa família engloba todas as esterases de

Drosophila seqüenciadas até o momento. A família das carboxil/colinesterases pode ser

incluída dentro de uma superfamília chamada α/β hidrolases. Esta inclui também as lipases e

algumas arilesterases de bactérias, que apresentam algumas semelhanças na estrutura terciária

e na seqüência de aminoácidos (revisão em Oakeshott et al. 1993) e parecem apresentar um

ancestral comum.

Introdução

Em Drosophila, e outros organismos, dois grupos de esterases podem ser distinguidos

com base no substrato hidrolisado in vitro, o grupo das α-esterases e o grupo das β-esterases,

que hidrolisam preferencialmente os substratos sintéticos α-naftil e β-naftil acetatos,

respectivamente. Alternativamente, essas enzimas atuam sobre o α e o β-naftil propionato ou

α e o β-naftil butirato. Em Drosophila, o grupo das α-esterases inclui carboxilesterases,

colinesterases e acetilesterases. O grupo das β-esterases é constituído somente por

carboxilesterases, entretanto, Mateus (1997) detectou a presença de acetilesterases,

características da fase larval, em espécies do complexo mulleri.

O grupo das β-esterases tem sido intensivamente estudado no gênero Drosophila,

desde a estrutura e função das enzimas até a estrutura, organização e regulação de seus genes.

Vários estudos correlacionam a EST-6 de D.melanogaster com diferentes ß-esterases em

outras espécies de Drosophila, sugerindo uma provável homologia entre a EST-6 e estas

esterases. Homologia de seqüências nucleotídicas também foi observada para a Est-6

de D.

melanogaster

e a Est-5 de Zaprionus indianus, uma ß-carboxilesterase detectada

principalmente nos machos desses drosofilídeos (Paulino, 2008). Brady et al.

(1992)

observaram uma similaridade de 73% nas seqüências codificadoras para os genes Est-6 de D.

melanogaster e Est-5b de D. pseudoobscura. A comparação destas seqüências indicou a

distribuição de 2 exons intercalados por um intron, de 55bp no caso de D. pseudoobscura,

localizado na mesma posição do intron de 51bp observado em D. melanogaster. Entretanto, as

enzimas correspondentes (EST-6 e EST-5) mostram claras diferenças quanto à estrutura

quaternária e ao padrão de expressão tecidual. A EST-5 de D. pseudoobscura é um dímero de

100kDa, expressa-se em altas concentrações durante o desenvolvimento e é encontrada nos

olhos e na hemolinfa de adultos de ambos os sexos. A EST-6 é um monômero de 62kDa, se

expressa primariamente em machos adultos de D. melanogaster e sua atividade é encontrada

apenas em ductos ejaculatórios. Já na maioria das espécies do grupo repleta avaliadas até o

momento, observa-se pelo menos duas β-esterases que tem estrutura dimérica, sendo uma

presente em todas as etapas do desenvolvimento e a outra restrita à fase larval, como a EST-1

(todo o ciclo) e EST-J (larval) de D. buzzatii (East, 1982), ou EST-5 (todo o ciclo) e EST-4

(fase larval) de D. mojavensis (Zouros et al. 1982; Pen et al. 1986) e em D. arizonae e D.

mojavensis (Mateus et al. 2008).

A genética clássica e o avanço das técnicas moleculares permitiram a localização

cromossômica dos genes responsáveis pela codificação das β-carboxilesterases. Esses genes

estão organizados em “clusters”, assim como os genes de outras esterases em Drosophila e

mesmo em outros organismos. Em espécies de Drosophila, o grupo das

β-carboxilesterases

Introdução

inclui dois ou três genes ligados, organizados em “clusters” (Oakeshott et al. 1993). Na maior

parte das vezes, estes genes estão estreitamente ligados e orientados na mesma direção. Assim

admite-se que tenham surgido por duplicação. Um modelo de duplicação foi proposto por

Brady et al. (1990) e Brady e Richmond (1992) em D. pseudoobscura e D. melanogaster.

Nesse modelo, uma primeira duplicação, no loco, teria ocorrido antes da divergência entre D.

pseudoobscura e D. melanogaster, provavelmente entre 20 e 40 milhões de anos atrás. Essa

duplicação teria originado os genes Est-5A e Est-5B em D. pseudoobscura e Est-P e Est-6 em

D. melanogaster, que codificam a esterase larval e aquela presente em todo o ciclo,

respectivamente em cada espécie. Já a Est-5C teria se originado por meio de uma duplicação

mais recente de Est-5B em D. pseudoobscura. Segundo Brady e Richmond (1992), a

duplicação que originou Est-5A e Est-5B em D. pseudoobscura, e Est-P e Est-6 em D.

melanogaster, deve ser a mesma que originou os genes para a esterase larval e de todo o ciclo

nos outros grupos de espécies de Drosophila. Seria improvável que essas duplicações

tivessem ocorrido independentemente uma da outra e, portanto, esses dois genes deveriam

estar presentes em uma espécie de Drosophila ancestral, comum à maioria, senão a todas as

espécies que atualmente apresentam esses genes duplicados.

Estudos que visam detectar uma grande parcela de atividade esterásica em insetos

podem certamente contribuir para um entendimento mais completo destas enzimas do ponto

de vista genético. Entre esses trabalhos devem ser citados os de Ritz (1997), com Megaselia

scalaris, de Castiglioni-Ruiz et al. (1997), com Hematobia irritans, de Lapenta et al. (1995,

1998), que utilizaram o padrão de esterases para estabelecer relações de proximidade entre as

linhagens de Drosophila serido e posteriormente utilizaram o padrão de esterases para

caracterizar as espécies do “cluster” buzzati, de Nascimento e Bicudo (2002) com espécies de

Drosophila do subgrupo saltans (grupo saltans) e de Lima-Catellani et al. (2004) com Aedes

aegypti.

I.4 – Polimorfismo no “cluster” das β-esterases do complexo mulleri

Nas espécies de Drosophila do complexo mulleri, uma esterase com especifidade para

o β-naftil acetato se destaca do conjunto de outras esterases encontradas nesses organismos.

Esta enzima foi previamente estudada em espécies do complexo mulleri, principalmente em

Drosophila mojavensis e em Drosophila arizonae, e em espécies relacionadas, sendo

designada esterase-5 por Zouros et al. (1982). A expressão do loco Est-5 foi detectada em

todo o ciclo de vida desses insetos, sendo a atividade da enzima correspondente (EST-5)

Introdução

detectada principalmente na hemolinfa e no corpo gorduroso. Uma segunda β-esterase,

denominada esterase-4 também foi encontrada em Drosophila mojavensis e outras espécies do

complexo mulleri (Zouros et al. 1982; Pen et al. 1984; Ceron, 1988; Mateus et al. 2008). A

esterase-4 é uma enzima exclusivamente larval detectada em larvas de 3º instar e em pupas,

com menor atividade. Ambas, esterase-4 e esterase-5 são enzimas diméricas. Assim, os

indivíduos homozigotos, para os locos Est-4 e Est-5, apresentam enzimas com subunidades

idênticas, detectadas nos géis como uma única banda para cada enzima, enquanto os

indivíduos heterozigotos possuem enzimas formadas por subunidades idênticas e diferentes,

que em géis de poliacrilamida não-desnaturante são visualizados como três bandas, duas

bandas iguais a dos parentais homozigotos e uma banda híbrida intermediária a essas duas,

resultado da habilidade de formação de heterodímeros intralocus (Zouros et al. 1982).

Pen et al. (1986) purificaram a esterase-5 de Drosophila mojavensis, espécie

pertencente ao complexo mulleri, e a compararam com a esterase-4, previamente purificada

(Pen et al. 1984). A subunidade da esterase-4 apresentou um peso molecular entre 62 e 64

kDa sob SDS-PAGE, enquanto a subunidade da esterase-5 apresentou um peso molecular

entre 64 e 66 kDa. Zouros et al. (1982), por meio de várias evidências, já haviam concluído

que essas enzimas são produtos de um evento de duplicação. Essas evidências foram

reforçadas pela análise da composição de aminoácidos da esterase-4 e 5, e determinação das

seqüências dos primeiros 40 aminoácidos da extremidade N-terminal dessas enzimas, as quais

se mostraram largamente idênticas (Pen et al. 1986).

Ceron (1988) isolou duas linhagens homozigotas para a esterase-5 de Drosophila

mulleri que mostraram diferentes velocidades de migração sob géis não-desnaturantes, cujos

alelos foram designados Est-5

(do inglês “slow“: migração lenta) e Est-5

(de “fast”:

migração rápida). Observou-se que nas populações de laboratório a freqüência do alelo Est-5

era de aproximadamente 70%, contra 30% do alelo Est-5

Em estudos populacionais posteriores, Lourenço et al. (2001) mostraram uma

adaptabilidade diferencial para os alelos Est-5

e Est-5

em Drosophila mulleri. Foram

estimados vários componentes do valor adaptativo para os genótipos Est-5

/Est-5

, Est-5

/Est-

(com o alelo F de origem materna), Est-5

/Est-5

(com o alelo S de origem materna) e Est-

/Est-5

. Doze componentes foram analisados, incluindo longevidade, produtividade e

viabilidade. Estes parâmetros foram usados para estimar o valor adaptativo total para cada

genótipo. O melhor valor adaptativo foi alcançado para os indivíduos portadores do genótipo

Est-5

/Est-5

(valor adaptativo de 1.000), seguido pelo valor adaptativo de 0.892 apresentado

pelo genótipo Est-5

/Est-5

, 0.863 para o Est-5

/Est-5

, e 0.842 para Est-5

/Est-5

. Estes

Introdução

resultados sugeriram uma maior adaptabilidade relativa do genótipo Est-5

/Est-5

, seguido

pelo heterozigoto Est-5

/Est-5

que possuía o alelo Est-5

de origem materna, o que é

incompatível com a predição de um polimorfismo neutro neste loco.

Dados da literatura reforçam a hipótese de adaptabilidade diferencial para as variantes

alélicas. Por exemplo, em Drosophila melanogaster a variante “slow” para a EST-6 é a mais

comum em localidades mais distantes do equador (Oakeshott et al. 1981; Bubliy et al. 1999).

Já em populações experimentais de Drosophila melanogaster, mantidas a 29°C,

iniciando-se com uma relação 1:1 dos alelos Est-6

e Est6

, houve um aumento da freqüência

do alelo S (Totskii et al. 1994). A seqüência completa de aminoácidos para as variantes S e F

da EST-6 de Drosophila melanogaster já foi determinada, diferindo em 2 aminoácidos:

ASN/ASP na posição 237 e THR/ALA na posição 247, respectivamente para as aloenzimas F

e S. Essas duas trocas foram consideradas os sítios mais prováveis de seleção atuando sobre a

distribuição diferencial desses alelos em função da latitude (Cooke e Oakeshott, 1989). Estes

estudos também revelaram uma única variante aloenzimática de termoestabilidade, EST6

-8

dentro do grupo EST6

, que é muito mais comum que outras variantes, e pode ser produto de

um processo seletivo contemporâneo. Outros estudos correlacionam a alta variabilidade

genética de locos esterásicos em populações naturais de pássaros das espécies Parus major, P.

caeruleus e P. ater com um aumento do valor adaptativo desses indivíduos, permitindo o

aparecimento de resistência múltipla a vários componentes tóxicos, além da possibilidade de

utilização de novos recursos alimentares (Driesel et al. 2004).

Outros estudos relacionados à evolução molecular da EST-6 em D.melanogaster

mostraram que a distribuição diferencial desses alelos em função da latitude poderia ser

explicada pela interação de processos seletivos atuando nas suas regiões promotoras e

codificadoras (Balakirev et al. 2002). Estes estudos suportam a hipótese que a variação em

loco estrutural altamente polimórficos em populações naturais devem ser material para a

seleção natural, e esta variação deve ser mantida em populações pela força da seleção

balanceada. Ayala et al. (2002) em seus estudos, da mesma forma, obtiveram evidências

indicando que a seleção direcional e a balanceadora estariam impactando separadamente a

região promotora e codificante do loco Est-6. Estes estudos também revelaram um pico de

polimorfismo silencioso próximo das duas substituições codificantes do polimorfismo,

ASN/ASP na posição 237 e THR/ALA na posição 247, o qual não é consistente com a

predição da teoria neutra da evolução molecular.

A comparação das seqüências nucleotídicas e de aminoácidos entre proteínas

homólogas de espécies diferentes, e de variantes protéicas dentro de uma mesma espécie

Introdução

fornece elementos para entendermos suas relações evolucionárias interespecíficas bem como

as diferenças em valores adaptativos entre os indivíduos de uma espécie. Além disso,

caracterizações bioquímicas e comparações entre as linhagens homozigotas para essas

variantes são importantes no fornecimento de informações sobre a questão da adaptabilidade

diferencial das isoenzimas. Esse foi o objetivo do presente trabalho, com base na

caracterização bioquímica e em estudos de produtividade, envolvendo as linhagens

homozigotas da Est-5

e Est-5

de D. mulleri para o reforço, ou não, da questão da

adaptabilidade diferencial dessas variantes enzimáticas.

Objetivos

II - OBJETIVOS

a) Verificar e comparar a atividade das aloenzimas EST-5

e EST-5

de extratos brutos

de linhagens homozigotas de Drosophila mulleri frente a vários parâmetros:

temperatura, agentes desnaturantes, efeito da concentração salina e variação do pH;

b) Purificar, identificar e seqüênciar os fragmentos N-terminais das aleloenzimas EST-5

e EST-5

para a construção de oligonucleotídeos iniciadores, visando o

sequênciamento do gene e, desta forma, estabelecer as diferenças em suas seqüências

nucleotídicas e de aminoácidos;

c) Caracterizar cineticamente as aloenzimas para tentar ajudar na diferenciação dessas

variantes alelonzimáticas em Drosophila mulleri.

d) Mensurar e comparar a produtividade das linhagens homozigotas da esterase-5 de

D.mulleri em diferentes temperaturas

e) Correlacionar os dados obtidos nos itens acima para o reforço, ou não, da questão da

adaptabilidade diferencial dessas variantes enzimáticas em D. mulleri.

Material e Métodos

III - MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Genética Bioquímica e no Laboratório de

Bioquímica de Proteínas do Departamento de Química e Ciências Ambientais. Também foi

utilizado o Laboratório de Populações do Departamento de Biologia da UNESP, campus de

São José do Rio Preto.

III.1 - Obtenção e manutenção das amostras

Duas linhagens de Drosophila mulleri foram utilizadas: a linhagem Est-5

que

homozigota para o alelo que codifica a isoenzima EST-5

, de migração mais lenta, e a

linhagem Est-5

, homozigota para o alelo que codifica a isoenzima EST-5

, de migração mais

rápida em relação ao ânodo. As duas linhagens foram mantidas no Departamento de Biologia

da UNESP, campus de São José do Rio Preto, em garrafas de vidro de 250 mL, contendo

meio de banana-ágar, em câmaras de temperatura constante a 25°C, com fotoperíodo de

aproximadamente 12 horas. As culturas-estoques das moscas foram mantidas por meio de

repiques a cada 25 dias.

III.2- Preparo das Amostras

Para verificação das possíveis diferenças entre as aleloenzimas da esterase-5, estas

foram submetidas a tratamentos físicos e químicos (temperaturas, agentes desnaturantes, entre

outros) que serão descritos nos itens.III.4 a III.9. Para cada experimento foi feito um extrato

bruto recém-preparado, que consistiu em um total de 15 moscas macerado em tampão TRIS-

HCl 0,5M pH 8,8 contendo glicerol a 12% e azul de bromofenol a 0,01%. O macerado foi

centrifugado a 10.000xg a 4°C por 5 minutos e, em seguida, o sobrenadante de cada uma das

amostras foi submetido aos tratamentos específicos.

III.3 - Quantificação da proteína total dos extratos brutos e amostras purificadas

Com o intuito de garantir que os extratos e proteínas purificadas das linhagens Est-5

da Est-5

de Drosophila mulleri, aplicados nos géis e utilizados nos ensaios enzimáticos,

apresentassem a mesma concentração de proteínas totais, determinamos a concentração das

mesmas, utilizando-se o método de Bradford (1976).

Material e Métodos

III.4 - Teste de resistência à temperatura

Nestes experimentos foram realizadas pré-incubações dos sobrenadantes dos

extratos brutos em diferentes temperaturas. Os sobrenadantes foram mantidos às temperaturas

de 50° e 55° C, em banho-maria, por 5, 10 e 15 minutos. Após esses procedimentos, os

sobrenadantes foram submetidos à eletroforese e à coloração usual. Neste experimento, as

amostras controles permaneceram incubadas em gelo durante o tratamento das amostras. O

teste de temperatura foi repetido com 50 e 55° C, pré-incubando-se também os extratos brutos

à temperatura de 60°C. Além disso, foi adicionado o tempo de pré-incubação de 20 minutos,

após esses tratamentos, as amostras foram analisadas quanto à atividade esterásica por meio

do ensaio enzimático específico para carboxilesterase.

III.5 - Teste de resistência a agentes desnaturantes

A observação do efeito de agentes desnaturantes sobre a atividade das aleloenzimas foi

realizada pré-incubando-se os extratos brutos das aleloenzimas EST-5

e EST-5

a uma

concentração de uréia 2 M, nos tempos de 10, 20, 30, 45 e 60 minutos a 37° C. As amostras

controle foram pré-incubadas em tampão sem uréia por 60 minutos a 37° C. Após esses

procedimentos, as amostras foram submetidas à eletroforese não desnaturante, seguida da

coloração específica das esterases, para a visualização da atividade enzimática das

aloenzimas. O teste de resistência a uréia foi repetido pré-incubando-se os extratos brutos a

uma concentração de 2 M de uréia por 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos a 37° C, e, após esses

tratamentos, as amostras foram analisadas quanto a atividade esterásica por meio do ensaio

enzimático específico para carboxilesterase.

III.6 - Efeito da concentração salina

O experimento com o cloreto de sódio foi realizado pré-incubando-se os extratos

brutos das aloenzimas com NaCl na concentração de 2,5 M por 15 minutos à 37°C, sendo

que, neste experimento, ambas aloenzimas foram misturadas. Após este tratamento, o extrato

bruto das aloenzimas misturadas foi utilizado para a eletroforese. Neste experimento, as

amostras controles foram pré-incubadas sem o NaCl por 15 minutos à 37°C. A análise do

efeito da concentração salina foi repetida pré-incubando-se os extratos brutos a uma

Material e Métodos

concentração de 2,5 M de cloreto de sódio por 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos a 37° C, e, após

esse tratamento, as amostras foram analisadas quanto a atividade esterásica por meio de

ensaio enzimático específico para carboxilesterases.

III.7 – Teste do efeito do triton X-100

Neste experimento não houve pré-incubação do extrato bruto. O triton X-100 foi

diluído no tampão de homogeinização do ensaio enzimático nas concentrações de 0,01; 0,1; 1;

2 e 5 %. Portanto, no experimento com triton X-100, a atividade enzimática das aleloenzimas

foi mensurada apenas por meio dos ensaios enzimáticos.

III.8 - Teste do pH

Neste experimento, como no item III.8, não houve pré-incubação do extrato bruto. A

mudança do pH foi realizada através da mudança do tampão de homogeinização para tampões

com os seguintes pHs: 5,4; 5,7; 6,2; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,5. Para cada pH foi preparado um branco

da reação Portanto, nos experimentos com variação de pH, a atividade enzimática das

aleloenzimas foi mensurada apenas por meio dos ensaios enzimáticos.

III.9 – Mensuração da atividade catalítica

Após os tratamentos, descritos acima, a atividade enzimática foi mensurada de duas

formas: através da visualização da atividade catalítica das aleloenzimas sobre géis não

desnaturantes, após a coloração específica das esterases, como será descrito no item III.10 e

III.11, e por meio de ensaio enzimático específico para carboxilesterases, que será descrito no

item III.13.

III.10 - Padronização da Eletroforese

Após os tratamentos, os sobrenadantes foram utilizados para a eletroforese em géis de

poliacrilamida a 10% (C = 5%), confeccionados com tampão TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8. A

corrida eletroforética foi de 3 horas e meia a uma voltagem constante de 180V, com tampão

da cuba TRIS-glicina 0,1M pH 8,3, seguida da coloração específica para as esterases como

será descrito no item III.11.

Material e Métodos

III.11 - Detecção das esterases nos géis

Após a eletroforese, os géis foram pré-incubados numa solução de tampão fosfato

0,1M, pH 6,2 por 40 minutos. Ao término da pré-incubação, os géis foram submetidos à

coloração em 50 mL de tampão fosfato 0,1M pH 6,2 contendo 20 mg de alfa-naftil-acetato e

20 mg de beta-naftil-acetato como substratos das enzimas, 60 mg de Fast Blue RR, e 5 mL de

n-propanol. O Fast Blue acopla-se com o produto da reação das esterases (alfa ou beta naftol)

formando um precipitado que é visualizado nos géis com bandas pretas, no caso das α-

esterases, ou vermelhas, no caso das esterases específicas para o beta-naftil-acetato (β-

esterases). O propanol foi adicionado para melhorar a visualização das bandas no gel. O

tempo de coloração foi o menor possível para ressaltar as diferenças entre as aloenzimas

submetidas aos diferentes tratamentos. Após a coloração o gel foi transferido para a solução

descorante contendo: água, ácido acético, e etanol comercial, na proporção de 3: 1: 3, mais

12% de glicerina comercial, e submetido à secagem de acordo com Ceron et al. (1992).

III.12 - Ação do fluoreto de fenil metilssulfonila (PMSF) sobre as esterases de D. mulleri

Extratos brutos das linhagens homozigotas da esterase-5 de Drosophila mulleri foram

pré-incubados por 5 min à temperatura ambiente com o fluoreto de fenil metilssulfonila

(PMSF), numa concentração final de 1 mM. Em seguida, os extratos foram submetidos à

eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante e a coloração usual para as esterases,

como descritos no item III.3, tendo como controle extratos brutos de ambas as linhagens sem

a pré-incubação com o PMSF.

III.13 – Ensaios enzimáticos

A atividade esterásica foi medida de acordo com Ellman et al. (1961). O feniltiocetato

foi usado como substrato para a carboxilesterase e monitorado pela liberação de tiol-derivados

em 412 nm. Os ensaios foram realizados em triplicata em tampão de homogeinização TRIS-

HCl 100 mM pH 8,0 com 1mM de DTNB, mais PMSF 1mM. A reação catalítica foi

mensurada por 1 min. Brancos sem substrato ou amostras foram incubadas em 25˚C por 5 min

para calcular a reação-cruzada endógena com o DTNB. Os ensaios começaram pela adição do

substrato. As atividades específicas foram expressadas em U mg proteína

-1

; 1 U é a quantia

de enzima que hidrolisa 1 µmol de substrato por min. A concentração de proteínas dos

Material e Métodos

extratos brutos foi determinada de acordo com o Método de Bradford (1976). Nestes

experimentos foi utilizado um espectrofotômetro GBC Cintra 10

Os gráficos foram construídos através da utilização do programa computacional

Origin 6.0. A atividade catalítica foi determinada como porcentagem do controle sem o

tratamento físico ou químico. Nos gráficos, os valores foram representados pelas médias ±

desvio padrão(

S.D

) das leituras, em porcentagens.

Os experimento cinéticos dos extratos brutos das aleloenzimas EST-5

e EST-5

foram

realizados fixando-se a concentração da enzima e aumentando a concentração do substrato.

Os valores cinéticos foram obtidos pelo mesmo programa computacional citado acima,

plotando-se os recíprocos dos valores das velocidades iniciais em função dos recíprocos da

concentração do substrato. Através deste gráfico, o gráfico de Lineweaver-Burk, foi possível

determinar os valores de V

max

e K

de ambas aloenzimas.

III.14 - Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE)

A eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) foi realizada em gel de

corrida a 11 % e o de empilhamento a 4% de concentração (Laemmli, 1970). Para a corrida

eletroforética foi preparado um tampão de corrida TRIS-HCl pH 8,3 com SDS a 1%. A

corrida foi realizada aplicando uma voltagem de 110V, por aproximadamente 2 horas e 30

minutos. As amostras foram preparadas com tampão TRIS-HCl 0,5M pH 6,8 contendo

glicerol a 10%, mais azul de bromofenol a 0,05%, mercaptoetanol a 0,715M e SDS a 2,5%

(Dodecil Sulfato de Sódio) e, além disso, as amostras foram fervidas por 5 minutos.

III.15 - Metodologia de purificação das variantes moleculares da EST-5

O método de purificação consistiu na separação em gel de poliacrilamida - SDS, como

descrito acima, de uma amostra contendo extrato bruto de aproximadamente 200 moscas, que

foram aplicadas em cinco géis. Neste caso, as amostras foram preparadas conforme o item

III.2. Os géis foram confeccionados com pentes que formaram um único e grande poço. Após

a corrida eletroforética, que nesse caso durou cinco horas, os cinco géis foram pré-incubados

por 40 minutos em 100 ml de tampão fosfato 0,1 M pH 6,2 mais 2,5 mL de triton X-100, para

a remoção do SDS, e renaturação das proteínas. Em seguida, os géis foram lavados em água

destilada até a retirada total do triton X-100, submetidos à coloração para identificação das

esterases e posterior remoção da enzima. Uma fina tira de gel na qual se visualizava a

Material e Métodos

atividade da esterase-5 (S ou F em cada caso) foi cortada e macerada em tampão TRIS-HCl

50 mM pH 8,0, colocado em um agitador a 4°C em geladeira por 12 horas para a difusão da

enzima do gel. Após esse procedimento, a solução foi filtrada e concentrada em membrana

filtrante de 50 kDa (Millipore). O concentrado foi então analisado quanto a proteínas totais

(SDS-PAGE) para a verificação da pureza das amostras. Neste caso, as amostras das enzimas

purificadas foram diluídas em tampão de amostra conforme descrito no item III.14. Também

foram utilizados marcadores de peso molecular com proteínas coloridas Rainbow

na faixa

de 14.3 - 220 kDa (Amersham Pharmacia Biotech). A coloração usada para a detecção das

proteínas nos géis foi o Nitrato de Prata segundo o método de See (1989). Para verificação da

atividade, foi utilizado o mesmo procedimento da extração da enzima do gel, procedimento

este que preserva a atividade da enzima.

III.16 – Estudo da produtividade

Foram realizados cruzamentos por casal em tubos, contendo meio de cacto,

para ambas as linhagens, nas temperaturas de 20 e 29°C. Cinqüenta casais, formados por

indivíduos virgens com 7 dias foram mantidos em câmara de germinação tipo B.O. D. a 20 e a

29º C. Após seis dias, os casais foram descartados e os tubos que continham a progênie foram

mantidos na mesma temperatura até a eclosão dos descendentes. Contagens diárias do número

de machos e fêmeas recém-eclodidos nos cruzamentos em tubos foram realizadas durante 8

dias para ambas as linhagens nas duas temperaturas.

Resultados

IV – RESULTADOS

A EST-5 é uma carboxilesterase presente em todos os estágios do ciclo de vida de

Drosophila mulleri, indicando que desempenha funções importantes. Em eletroforese em géis

não desnaturantes, essa esterase é a enzima mais fortemente corada que apresenta atividade

preferencial pelo substrato sintético beta-naftil acetato, corando-se em vermelho. Além disso,

as aloenzimas EST-5

e EST-5

apresentam estrutura quaternária dimérica e em cruzamentos

entre indivíduos homozigotos, obtém-se, nos descendentes, um padrão eletroforético de três

bandas, característico da formação de uma enzima híbrida, resultante da agregação de uma

cadeia EST-5

com uma EST-5

(figura 1).

IV.1 – Análise comparativa da atividade enzimática das aloenzimas sobre diferentes

condições físico-químicas.

Foram realizados vários experimentos com os extratos brutos contendo as

aleloenzimas EST-5

e EST-5

em diferentes temperaturas, concentrações de uréia e NaCl. De

modo geral, observou-se que a aloenzima EST-5

sofre um menor efeito da temperatura, das

concentrações de uréia e NaCl sobre sua atividade, indicando uma maior estabilidade desta

isoenzima em relação a EST-5

. Nestes experimentos, comparou-se a atividade enzimática

das aloenzimas pela intensidade de coloração das bandas no gel. Também foi mantida a

mesma concentração de proteínas por amostra, em torno de 65 µg/uL.

Os resultados obtidos com os experimentos de temperatura foram os seguintes: a 50°C

(figura 2) notou-se uma atividade enzimática levemente maior para EST-5

, pois as bandas

desta aleloenzima estão levemente mais intensas. Na temperatura de 55°C (figura 3)

observou-se para as duas aloenzimas uma redução da atividade em função do tempo de pré-

incubação. Além disso, esta temperatura demonstrou que a EST-5

apresenta maior

resistência à desnaturação térmica que a EST-5

, pois como visualizado, no tempo de 5

minutos houve uma intensa atividade catalítica da EST-5

(colunas 2 e 3), enquanto nesse

mesmo tempo foi detectado uma menor atividade da EST-5

. Já no tempo de 10 minutos

(colunas 4 e 5) não foi detectada nenhuma atividade enzimática para a EST-5

, enquanto a

EST-5

mostrou-se ainda com alguma atividade, detectada pela coloração no gel.

O experimento de pré-incubação com uréia está exibido na figura 4. Da mesma forma,

notou-se uma maior resistência da aloenzima EST-5

à desnaturação pela uréia que a EST-5

pois esta teve a atividade reduzida no tempo de 10 minutos (coluna 2), perdendo totalmente a

Resultados

atividade catalítica no tempo de 20 minutos (coluna 3), enquanto a aleloenzima EST-5

só

apresentou sinal de desnaturação no tempo de 20 minutos, tornando-se inativa aos 30 minutos

(coluna 4).

Na figura 5, observa-se o resultado da pré-incubação das isoenzimas misturadas e

tratadas com cloreto de sódio à concentração de 2,5 M. Percebe-se, neste caso, que as

aleloenzimas têm a migração alterada pelo efeito do NaCl, por isso, migram menos que seus

respectivos controles. Um dos objetivos deste experimento era de verificar a dissociação das

subunidades e a consecutiva formação da aloenzima EST-5

/EST-5

, que seria a

representação de uma enzima híbrida, contudo, isso não foi observado. O resultado mais

relevante nesse experimento foi a comprovação da maior resistência da EST-5

sobre a sua

correlata EST-5

, perante o efeito salino, como pode ser observado pela intensidade de

coloração da banda nos géis.

Resultados

Figura 1: Imagem digitalizada de gel não-desnaturante, corado especificamente para

esterases, ilustrando o padrão de bandas apresentado por uma mosca da linhagem homozigota

Est-5

(coluna 1), da linhagem Est-5

(coluna 8), e por moscas heterozigotas resultantes de

cruzamentos entre moscas das linhagens acima citadas (colunas 2-7). Observa-se que a

amostra 8 é de um indivíduo homozigoto Est-5

e “alelo nulo” para o loco Est-2.

1 2 3 4 5 6 7 8

EST-5

/EST-5

EST

Resultados

A - B -

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

Figura 2: Imagem digitalizada de gel não-desnaturante contendo amostras da linhagem Est-5

(A) e Est-5

(B), corado especificamente para esterases. As amostras foram pré-incubadas à

temperatura de 50°C nos tempos de 5 (colunas 2 e 3), 10 (colunas 4 e 5) e 15 minutos

(colunas 6 e 7). Amostras não tratadas (colunas 1-A e 1-B).

EST

EST-5

EST-2

Resultados

A - B -

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

Figura 3: Imagem digitalizada de gel não-desnaturante contendo amostras da linhagem Est-5

(A) e Est-5

(B), corado especificamente para esterases. As amostras foram pré-incubadas à

temperatura de 55°C nos tempos de 5 (colunas 2 e 3), 10 (colunas 4 e 5) e 15 minutos

(colunas 6 e 7). Amostras não tratadas (colunas 1-A e 1-B).

EST-5

EST-2

Resultados

A - B -

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Figura 4: Imagem digitalizada de gel não-desnaturante contendo amostras da linhagem Est-5

(A) e Est-5

(B), corado especificamente para esterases. As amostras foram pré-incubadas em

uréia na concentração de 2 M nos tempos de 10 (colunas 2-A e 2-B), 20 (colunas 3-A e 3-B),

30 (colunas 4-A e 4-B), 45 (colunas 5-A e 5-B) e 60 minutos (colunas 6-A e 6-B). Amostras

não tratadas (colunas 1-A e 1-B).

EST-5

EST-2

Resultados

1 2 3 4 5 6

Figura 5: Imagem digitalizada de gel não-desnaturante contendo amostras da

linhagem Est-5

e Est-5

submetida a uma pré-incubação com NaCl 2,5 M e corado

especificamente para esterases. Colunas 3, 4, 5, e 6 amostras EST-5

e EST-5

combinadas e pré-incubadas com NaCl por 15 minutos a 37° C. Coluna 1 e 2: amostra

EST-5

e EST-5

não tratadas.

EST-5

EST-2

Resultados

IV.2 – Purificação das aloenzimas EST-5

e EST-5

Inicialmente, foram realizados testes de purificação das aleloenzimas utilizando-se

métodos clássicos. Ao redor de 8 gramas de moscas suspensas em 15 mL de tampão TRIS-

HCL 10 mM com 0,22 M de NaCl pH 7,5 foram trituradas com auxílio de um homogenizador

manual Power Gen 35 (Fischer Scientific), filtradas através de 4 camadas de gaze e

centrifugadas a 10.000 xg durante 45 minutos a 4°C em centrífuga refrigerada Jouan CR3i.

O material foi concentrado por centrifugação em concentradores Amicon Centricon 50

e submetido a cromatografias de exclusão de massa molecular em Sephacryl S-100 HR e em

Sephacryl S-300 HR e uma troca iônica em resina Q–Sepharose. Contudo, os resultados não

mostraram um grau de purificação satisfatório, em virtude do qual decidimos isolar a enzima

pelo método eletroforético descrito no item III. 16 de Material e Métodos.

A purificação das aloenzimas EST-5

e EST-5

foi obtida através da remoção de

ambas de géis de poliacrilamida, contendo SDS. A visualização das enzimas purificadas foi

feita em gel de poliacrilamida – SDS com a posterior coloração de prata. A figura 6 mostra

esses resultados, onde as aloenzimas EST-5

e EST-5

estão totalmente purificadas e

apresentam subunidades de mesma massa molecular, em torno de 66 e 68 kDa.

Para demonstrar que o material obtido continha de fato as aloenzimas EST-5

e EST-

purificadas, amostras do mesmo material foram submetidas à eletroforese em gel de

poliacrilamida – SDS, porém, neste caso, as amostras foram diluídas em tampão de amostra

sem SDS e mercaptoetanol, e não foram fervidas (item III.2). Além disso, após a corrida

eletroforética, o gel foi pré-incubado em tampão fosfato com triton X-100 2,5 % para a

retirada do SDS e renaturação da enzima e, posteriormente, foi corado especificamente para

esterases. O resultado é visto na figura 7, onde pode ser observado as atividades das

aloenzimas purificadas EST-5

e EST-5

, utilizando-se o substrato β-naftil-acetato (colunas 2

e 3 da figura 7, respectivamente). Observa-se ainda, que as aloenzimas apresentaram

migrações distintas e que a EST-5

apresenta-se menos intensamente corada, provavelmente

devido à ação do triton.

Amostras das aloenzimas purificadas EST-5

e EST-5

foram encaminhadas para o

Laboratório Nacional de Luz Síncronton - LNLS, no Laboratório de Espectrometria de

Massas, em Campinas, SP, para a identificação de alguns fragmentos de seqüências primárias.

Ainda não temos esses resultados disponíveis.

Resultados

Figura 6: Imagem digitalizada de gel de poliacrilamida-SDS, corado com Nitrato de Prata.

Coluna 1: marcador de peso molecular colorido Rainbow

; coluna 2: amostra EST-5

purificada; coluna 3: amostra EST-5

purificada.

EST-5

1 2 3

14.3 kDa

20.1 kDa

30 kDa

45 kDa

66 kDa

97 kDa

220 kDa

Resultados

1 2 3

Figura 7: Imagem digitalizada de gel de poliacrilamida-SDS, contendo amostras não

desnaturadas das aloenzimas EST-5

e EST-5

purificadas, e, em seguida, corado

especificamente para as esterases. Coluna 1: marcador de peso molecular Rainbow

; coluna

2: amostra EST-5

; coluna 3: amostra EST-5

EST-5

220 kDa

97 kDa

66 kDa

45 kDa

30 kDa

14,3 kDa

20,1 kDa

Resultados

IV.3 – Ensaios enzimáticos após diferentes condições físico-químicas.

O processo de purificação não teve um bom rendimento em termos quantitativos, desta

forma, a atividade enzimática das aleloenzimas foi medida com os extratos brutos das

linhagens homozigotas da esterase-5 de Drosophila mulleri, acrescido de fluoreto de fenil

metilssulfonila (PMSF). O PMSF é um inibidor de serino-proteases e não tem ação sobre a

esterase-5. Como o ensaio enzimático usado neste trabalho é específico para

carboxilesterases, o uso deste composto foi necessário para inibir a esterase-2, uma α-esterase

que também apresenta atividade como carboxilesterase. A figura 8 evidencia a ação deste

inibidor.

Os resultados dos ensaios enzimáticos corroboram os resultados obtidos no item IV.1.

Nos dois experimentos foi avaliada a resistência das formas aloenzimáticas EST-5

e EST-5

à desnaturação térmica, a desnaturação por agentes caotrópicos e o efeito salino, a diferença

baseou-se na metodologia empregada para mensurar a atividade catalítica. Também foi

mantida a mesma concentração de proteínas por amostra, em torno de 65 µg/uL.

Os ensaios enzimáticos precedidos pela pré-incubação à temperatura de 50, 55 e 60ºC

estão mostrados respectivamente nas figuras 9, 10 e 11. Observa-se que nas três figuras as

aleloenzimas apresentam curvas semelhantes, demonstrando um padrão na perda da atividade

enzimática em função do tempo de pré-incubação. Contudo, a característica a ser ressaltada é

a predominância da curva da EST-5

sobre a EST-5

. Em todas as figuras, a atividade

catalítica é mostrada como porcentagem do controle sem o tratamento físico ou químico.

O efeito da uréia sobre atividade enzimática está demonstrado na figura 12.

Semelhantemente às curvas com o efeito da temperatura, as aleloenzimas tratadas com uréia

exibiram um padrão semelhante e gradativo de redução da atividade catalítica, porém, com

uma maior evidência da diferença de resistência das isoenzimas à desnaturação. Os resultados

do cloreto de sódio e do triton X-100 (figura 13 e 14, respectivamente) também mostraram

maior divergência entre as curvas das aleloenzimas. A queda abrupta da atividade catalítica da

EST-5

no tempo de 20 minutos e nas concentrações de 0,01 a 1% são conseqüências da

maior sensibilidade da EST-5

a estes compostos. Em ambos os casos, a diferença entre as

aloenzimas diminuiu no final com o aumento do tempo de pré-incubação e a concentração do

detergente.

O experimento realizado em diferentes pHs não mostrou diferenças no perfil de

atividades de ambas as aloenzimas. Na figura 15, observa-se que ambas as enzimas

Resultados

apresentam curvas de pH semelhantes, com atividade máxima na região alcalina e menor

atividade em pHs ácidos.

IV.4 - Caracterização Cinética.

Para a caracterização cinética foram realizados ensaios enzimáticos, conforme descrito

no item III.13. Com os valores das velocidades iniciais e concentração do substrato construiu-

se o gráfico de Lineweaver-Burk, obtendo-se para a EST-5

os valores de 32,54 µM/min de

max

e 1,43 mM de K

, e para a EST-5

os valores de 33,34 µM/min de V

max

e 1,54 mM de

IV.5 – Estudo da produtividade.

O resultado do estudo da produtividade para as linhagens homozigotas da esterase-5

nas temperaturas de 20 e 29°C está mostrado na tabela 1 e na figura 16 (A e B). A tabela 1

mostra a média do número total de descendentes por casal de ambas as linhagens nas duas

temperaturas, enquanto a figura 16 mostra a média de descendentes por casal por dia, a figura

16-A a 20°C e a figura 16-B a 29°C.

Observa-se na tabela, que as proporções de machos e fêmeas estão próximas do

esperado. Na temperatura de 20°C, a linhagem Est-5

produziu um total de 49,25% de machos

e 50,75% de fêmeas, enquanto a linhagem Est-5

produziu um total de 46,15% de machos e

53,85% de fêmeas. Na temperatura de 29°C, a linhagem Est-5

produziu um total de 47,3% de

machos e 52,7% de fêmeas, enquanto a linhagem Est-5

produziu um total de 51,35% de

machos e 48,68% de fêmeas.

Ainda na tabela 1, pode-se observar que na temperatura de 20°C houve uma

produtividade maior, de 30% em favor da linhagem Est-5

, em contrapartida, na temperatura

de 29°C a linhagem Est-5

deixou em torno de 50% a mais de descendentes que a linhagem

Est-5

. A figura 16 ilustra melhor essa diferença, mostrando a diferença por dia. Nesta figura

também pode-se perceber que a temperatura alta (figura 16-B) acelera o tempo de

desenvolvimento das moscas, já que nos tubos mantidos a 29°C as moscas eclodiram nove

dias antes que aquelas mantidas a 20°C (figura 16-A).

Resultados

Figura 8: Imagem digitalizada de gel não-desnaturante, corado especificamente para

esterases, mostrando ação do PMSF sobre as esterases das linhagens Est

e Est

de D. mulleri.

Colunas 1-3 e 4-6: extratos brutos das linhagens Est

e Est

não tratadas com o PMSF

(controle). Colunas 7-9 e 10-12: extratos brutos das mesmas linhagens pré-incubados por 5

min a temperatura ambiente com PMSF 1 mM.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

EST-5

EST-2

Resultados

0 5 10 15 20

100

110

Atividade enzimática (%)

Tempo de pré-incubação (min)

AmostraS

AmostraF

Figura 9: Efeito do tempo de pré-incubação à temperatura de 50°C sobre a atividade das

aloenzimas EST-5

e EST-5

. As barras verticais indicam o desvio padrão. Os ensaios foram

realizados em triplicata.

0 5 10 15 20

100

110

Atividade enzimática (%)

Tempo de pré-incubação (min)

AmostraS

AmostraF

Figura 10: Efeito do tempo de pré-incubação à temperatura de 55°C sobre a atividade das

aloenzimas EST-5

e EST-5

. As barras verticais indicam o desvio padrão. Os ensaios foram

realizados em triplicata.

Resultados

0 5 10 15 20

100

110

Atividade enzimática (%)

Tempo de pré-incubação (min)

AmostraS

AmostraF

Figura 11: Efeito do tempo de pré-incubação à temperatura de 60°C sobre a atividade das

aloenzimas EST-5

e EST-5

. As barras verticais indicam o desvio padrão. Os ensaios foram

realizados em triplicata.

0 5 10 15 20 25 30

100

110

Atividade enzimática (%)

Tempo de pré-incubação (min)

AmostraS

AmostraF

Figura 12: Efeito do tempo de pré-incubação em uréia na concentração 2M sobre a atividade

das aloenzimas EST-5

e EST-5

. As barras verticais indicam o desvio padrão. Os ensaios

foram realizados em triplicata.

Resultados

0 10 20 30 40 50 60

100

105

Atividade enzimática (%)

Tempo de pré-incubação (min)

AmostraS

AmostraF

Figura 13: Efeito do tempo de pré-incubação com cloreto de sódio na concentração 2,5 M

sobre a atividade das aloenzimas EST-5

e EST-5

. As barras verticais indicam o desvio

padrão. Os ensaios foram realizados em triplicata.

0 1 2 3 4 5

100

Atividade enzimática (%)

% do Triton X-100

AmostraS

AmostraF

Figura 14: Efeito da concentração do triton X-100 sobre a atividade das aloenzimas EST-5

EST-5

. As barras verticais indicam o desvio padrão. Os ensaios foram realizados em

triplicata.

Resultados

5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5

100

110

120

130

Atividade enzimática (%)

pHs

AmostraS

AmostraF

Figura 15: Efeito da variação do pH sobre a atividade das aloenzimas EST-5

e EST-5

. As

barras verticais indicam o desvio padrão. Os ensaios foram realizados em triplicata.

Tabela 1: Produtividade média de descendentes por casal a 20 e 29ºC para as linhagens Est-

e Est-5

Média do Número de Descendentes por Casal

20ºC

29ºC

Linhagens

Macho

Fêmea

Macho

Fêmea

Est-5

6.5

6.7

19.5

Est-5

10.5

11.2

10.7

Resultados

A –

1 2 3 4 5 6 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Média de descendentes por casal

Dias após início dos cruzamentos

B –

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Média de descendentes por casal

Dias após início dos cruzamentos

Figura 16 (A e B): Produtividade média de descendentes por casal para as linhagens Est-5

(barras pretas) e Est-5

(barras vermelhas), a 20 (A) e 29°C (B).

Discussão

V - DISCUSSÃO

Neste trabalho estudou-se o polimorfismo da esterase-5 em D. mulleri, no intuito de se

compreender quais os mecanismos que atuam na manutenção destas variantes genéticas.

Segundo Árnason (1991), que estudou o polimorfismo do loco da esterase-5 (alelos 100 e

106), loco este ligado ao cromossomo X em Drosophila pseudoobscura, assume que a

hipótese de seleção balanceada é rejeitada em favor da hipótese nula (Kimura, 1983). Árnason

trabalhou com um total de 22 populações réplicas, com onze começando com alta freqüência

de 76% (população N) do alelo 106 e outras onze com uma baixa freqüência de 21%

(população U) do mesmo alelo. Depois de 200-300 dias, as freqüências alélicas mudaram

direcionalmente e diminuíram em ambas as populações U e N como grupo, e alcançaram o

equilíbrio de 60 e 14 %, respectivamente. A princípio, esta mudança sugere seleção natural.

Contudo, com uma posterior reperturbação das freqüências alélicas em cada população,

criando-se assim 22 adicionais populações reperturbadas EN e EU, e tendo como controle a

população original, foi obtido um resultado diferente, pois as freqüências alélicas não

mudaram direcionalmente entre as populações reperturbadas como um grupo, concluindo

desta maneira, que os alelos 100 e 106 do loco Est-5 não diferem no valor adaptativo dentro

das condições ambientais do laboratório de populações.

Resultados opostos à teoria da neutralidade foram obtidos por Ochando, et al. (1999)

que estudaram o valor adaptativo de fêmeas selvagens de Drosophila melanogaster com

relação às variantes aloenzimáticas das seguintes enzimas: GPDH, ADH, PGM e EST-C. Os

componentes do valor adaptativo foram estimados sobre diferentes condições ambientais:

duas temperaturas (22 e 28° C) e duas densidades (escasso e lotado). Os parâmetros medidos

do valor adaptativo foram fecundidade, taxa de ovoposição e produtividade. O parâmetro

densidade teve um significante efeito sobre produtividade; a temperatura teve um significante

efeito sobre fecundidade, taxa de oviposição e taxa de desenvolvimento. Diferenças no valor

adaptativo entre os genótipos aloenzimáticos ocorreram para todos os componentes do valor

adaptativo, exceto taxa de oviposição. Mas qual genótipo é superior depende das condições

ambientais: heterozigotos exibiram um maior valor adaptativo que os homozigotos em alguns

casos, mas inferior em outros. No todo, os experimentos mostraram que os polimorfismos

aloenzimáticos são associados com os efeitos de seleção.

No presente trabalho, as duas formas aloenzimáticas mais comuns em D. mulleri, as

aloenzimas EST-5

e EST-5

, foram submetidas a tratamentos físicos e químicos na tentativa

de se verificar diferenças entre essas variantes enzimáticas. Além disso, as duas linhagens

Discussão

homozigotas da esterase-5 foram comparadas em termos de produtividade, em condições de

laboratório, nas temperaturas de 20 e 29°C.

Trabalhos realizados submetendo aloenzimas a diferentes condições ambientais vêm

sendo realizados há algum tempo. Dentre esses, os mais comuns são aqueles realizados com a

temperatura. Khaustova et al. (1992) com alelos da enzima álcool desidrogenase e Totskii et

al. (1994) com alelos da esterase-6 de Drosophila melanogaster também utilizaram os efeitos

das altas temperaturas para identificar os mecanismos atuantes na manutenção destes

polimorfismos.

No presente estudo, os experimentos de variação de temperatura revelaram um fator

seletivo a favor do alelo Est-5

, pois, como já relatado, a aloenzima EST-5

resistiu muito

mais aos efeitos da temperatura que sua correlata EST-5

. Além disso, o experimento de

produtividade em alta temperatura (29ºC) mostrou que indivíduos com o genótipo

homozigoto para o alelo Est-5

deixam mais descendentes que indivíduos com o genótipo

homozigoto Est-5

/Est-5

. Esses resultados corroboram os resultados obtidos por Lourenço et

al. (2001), que detectaram uma maior adaptabilidade relativa do genótipo Est-5

/Est-5

seguido pelo heterozigoto Est-5

/Est-5

que possuía o alelo Est-5

de origem materna, o que é

incompatível com a predição de polimorfismo neutro. Neste trabalho, a longevidade foi

considerada diretamente como um dos principais componentes associados com o valor

adaptativo total. A observação que moscas com o genótipo Est-5

/Est-5

são

significantemente mais longevas sugeriram que esses indivíduos têm a chance de persistir na

população por mais tempo e então teriam a possibilidade de produzir mais descendentes. Por

outro lado, os machos Est-5

/Est-5

apresentaram um período de longevidade menor. Os

resultados obtidos para produtividade revelaram uma outra possível associação para a

freqüência aumentada do alelo Est-5

na população. A maior produtividade para os

cruzamentos cujas fêmeas parentais tinham o genótipo Est-5

/Est-5

, principalmente em

comparação com o genótipo Est-5

/Est-5

, certamente contribuiu para a maior performance

exibida pelo alelo Est-5

. Em adição, a produtividade média de machos e fêmeas em todas as

combinações indicou uma vantagem para as fêmeas portadoras do alelo Est-5

. Este fato,

adicionado a maior longevidade dos indivíduos Est-5

/Est-5

capacitou a classificação deste

genótipo como aquele que apresenta maior adaptabilidade.

O resultado de maior resistência da aloenzima EST-5

à temperatura, obtido no

presente trabalho, poderia realmente conferir maior valor adaptativo aos seus portadores em

ambientes de elevada temperatura, pois, como visto nas figuras 3, 9, 10 e 11, a atividade

enzimática da aloenzima EST-5

decresce mais rapidamente com o aumento do tempo de pré-

Discussão

incubação que a sua correlata, portanto, os portadores do alelo EST-5

sobreviveriam melhor

nesses ambientes, sendo mais longevos, produzindo maior descendência. Essa hipótese foi

reforçada pelos experimentos de produtividade, no qual os genótipos homozigotos Est-5

/Est-

deixaram mais descendentes a 29°C.

Os dados obtidos do presente trabalho corroboram os resultados de Totskii et al.

(1994), que estudaram os efeitos do sistema gene-enzima da esterase-6 sobre a expressão dos

traços de viabilidade em Drosophila melanogaster em diferentes temperaturas. Os resultados

desses trabalhos indicaram que a aloenzima S, que tem menor mobilidade eletroforética, é

mais resistente a altas temperaturas (57°C) que a aloenzima F. Comparando as linhagens, as

moscas homozigotas S foram mais resistentes a altas temperaturas e foram duas vezes mais

férteis que as moscas homozigotas F. Esta vantagem seletiva da linhagem S foi monitorada

por 40 gerações em altas temperaturas (29°C). Além disso, nas populações experimentais que

começaram com uma razão 1:1 da Est-6

e Est-6

, e que foram mantidas em 29°C, foi

demonstrado um aumento na freqüência do alelo S. Khaustova et al. (1992) também

concluíram que influências constantes (período de vida de 25 gerações) de elevada

temperatura mudaram a estrutura genética das populações, devido às vantagens seletivas do

alelo S da enzima álcool desidrogenase, sobre estas condições. Lourenço (2000) também

examinou o conjunto de populações de Drosophila mulleri iniciadas com diferentes

freqüências iniciais do alelo Est-5

na temperatura de 25°C. Foi demonstrado que depois de

12 gerações o genótipo Est-5

/Est-5

foi o mais freqüente em todas as populações,

independentemente das freqüências iniciais deste alelo quando as populações foram

estabelecidas.

Nos experimentos de produtividade do presente trabalho, também foi observado que

na temperatura de 20°C houve uma vantagem da linhagem Est-5

/Est-5

, que deixou mais

descendentes, em torno de 30% a mais que a linhagem Est-5

/Est-5

. Entretanto, há um efeito

claro da temperatura de 29°C em relação ao genótipo Est-5

. Esses resultados poderiam

explicar a manutenção do alelo F nas populações, pois a vantagem seletiva depende das

condições ambientais, que ora favorece um alelo, ora o outro.

De maneira semelhante, Bubliy et al. (1994) concluíram que a seleção natural é quem

mantêm o polimorfismo nas populações naturais. Esses autores estudaram as freqüências

alélicas de três locos aloenzimático, o ADH, o alfa-GPDH e o EST-6, em populações naturais

de Drosophila melanogaster do leste europeu, do Caucáso e da Ásia Central. Os dados

obtidos por eles foram combinados com dados de outros autores sobre o polimorfismo do

Discussão

ADH, do alfa-GPDH e do EST-6 em outras regiões da Eurásia. Esses dados foram analisados

na tentativa de se encontrar um padrão de diferenciação geográfica em escala continental. A

freqüência do alelo ADH-S apresentou-se negativamente correlacionada com a latitude e a

média de chuva do mês mais seco, e positivamente correlacionadas com a temperatura média

do mês mais frio e a média de chuvas do mês mais chuvoso. A freqüência do alfa-GPDH-S

aumentou na parte oeste da Eurásia e não foi associada com variabilidade climática. A

freqüência do alelo Est-6

aumentou em direção ao centro do continente e foi positivamente

correlacionada com a temperatura do mês mais frio e com a média de chuvas do mês mais

seco. Esses resultados reforçam que a variação genética deve ser mantida em populações pela

força da seleção balanceada.

Os resultados obtidos com a uréia (figuras 4 e 12) também condizem com os

resultados obtidos com os experimentos de temperatura. Em ambas as figuras, os resultados

indicam que a aloenzima EST-5

resiste a um maior tempo que a EST-5

sobre a concentração

de uréia 2M. Na figura 12, a atividade catalítica da EST-5

permanece maior em todos os

pontos, até que, aos 30 minutos, ambas atingem uma atividade enzimática perto dos 30 %.

Esses resultados sugerem que devam existir diferenças, mesmo que sutis, na estrutura das

aloenzimas que permita que a aloenzima EST-5

resista mais, tanto às altas temperaturas

como a agentes desnaturantes.

Da mesma maneira que a temperatura e a uréia, elevadas concentrações de cloreto de

sódio mostraram um efeito maior sobre a aloenzima EST-5

. Na figura 5, observa-se-se que

os controles de ambas as aloenzimas apresentam níveis idênticos de atividade enzimática, isso

é notado pela coloração, enquanto nas alíquotas tratadas nota-se uma diferença nos níveis de

atividade, isto é a EST-5

apresenta menor atividade catalítica do que a sua correlata, mesmo

que com uma pequena diferença metodológica, pois as aloenzimas foram pré-incubadas juntas

no NaCl. Todavia, a figura 14 ilustra melhor essa diferença entre as aleloenzimas, apesar

destas não apresentarem tanto prejuízo na suas atividades enzimáticas perante o cloreto de

sódio, 82,5 % para a EST-5

e 75% para EST-5

O triton X-100 é um detergente não-iônico comumente usado em tampão de extração

de enzima destinado a ensaios enzimáticos. Contudo, trabalhos mais recentes concluíram que

o triton X-100 altera e modula atividade de acetilcolinesterases e butirilcolinesterases

(Jaganathan e Boopaty, 1998; Marcel et al.,2000; Rosenfeld et al., 2001). E, também, reduz a

atividade de carboxilesterases com o aumento de sua concentração (Vioque-Fernández et

al.2007), experimento este, realizado com camarões-d’água-doce da espécie Procambarus

clarkii, cuja atividade esterásica foi reduzida a menos da metade em concentrações acima de 2

Discussão

%. De maneira similar, o resultado do experimento com o triton X-100 (figura 14) do presente

trabalho também demonstrou a diminuição da atividade das carbolxilesterases frente a este

detergente e, possibilitou ainda, a diferenciação das aloenzimas.

Em relação ao pH, os dados da figura 15 mostram que ambas as aloenzimas

apresentam curvas de pH semelhantes. Assim, o pH não deve influir na distinção entre elas.

Portanto, os resultados em conjunto sugerem que a aloenzima EST-5

apresenta um

comportamento de maior resistência à desnaturação térmica ou por agentes caotrópicos, bem

como maior atividade em altas concentrações salina, além da maior produtividade nos

experimentos a 29ºC, o que poderia conferir uma maior vantagem adaptativa aos seus

portadores.

Tem sido dada tanta importância as esterases, que em diversas espécies, essas têm sido

purificadas e caracterizadas quanto às suas propriedades, proporcionando um maior

entendimento das funções delas. A maioria dos trabalhos com purificação e caracterização é

relativa à área de resistência a inseticidas, que tentam esclarecer as funções das esterases em

linhagens resistentes a produtos agroquímicos.

Entre esses trabalhos, foi encontrado o de Prabhakaran e Kamble (1995), que

purificaram e caracterizaram as formas mais ativas das esterases E5, E6, e E7, em Blattella

germanica (barata da Alemanha), tanto das linhagens resistentes como das linhagens

susceptíveis a inseticidas desta espécie. Os resultados desses autores sugerem que a

resistência aos inseticidas nesta espécie de barata seja devido ao aumento da produção da

isoenzima E6, cuja atividade principal deve ser a de seqüestrar as moléculas dos inseticidas,

seguida de uma hidrólise mais lenta.

Em outro estudo, Lee et al. (2000) purificaram e caracterizaram uma esterase que

conferia resistência ao coleóptero da espécie Oryzaephilus surinamensis frente a vários

inseticidas organofosforados. A esterase da linhagem resistente, designada como A, não

encontrada na linhagem susceptível, foi purificada e caracterizada pelas técnicas de

cromatografia e eletroforese, com uma massa molecular de 130 kDa, consistindo de duas

subunidades de 65 kDA, estimada por SDS-PAGE.

Haubruge et al. (2002) utilizaram muitas técnicas para conseguir a purificação de uma

carboxilisterase que confere resistência específica a linhagens de Tribolium castaneum ao

malathion. A enzima purificada apresentou um peso molecular de 62 kDa.

Srinivas et al. (2006) purificaram e caracterizaram uma isoenzima esterásica envolvida

na hidrólise de compostos organofosforados de uma peste resistente a inseticida, a

Helicorvepa armigera, coletada de safra de campos. A massa molecular determinada por

Discussão

SDS-PAGE foi de 66 kDa. A enzima foi parcialmente seqüenciada e identificada como

alcalino fosfatase.

Neste trabalho realizamos a purificação das aloenzimas EST-5

e EST-5

em D.

mulleri a partir de linhagens homozigotas para essas enzimas. Com a intenção de se obter as

diferenças nas seqüências de aminoácidos entre as aleloenzimas, estas foram encaminhadas

para a identificação no Laboratório Nacional de Luz Síncronton - LNLS, no Laboratório de

Espectrometria de Massas, em Campinas, SP, cujos resultados ainda não foram obtidos. O

sequênciamento de fragmentos das aloenzimas purificadas serão oportunamente utilizados

para o desenho de oligonucleotídeos iniciadores, visando o sequênciamento do gene da

esterase-5.

Ambas as aloenzimas foram purificadas, como mostrado nas figuras 6 e 7. Na figura 6,

as massas moleculares encontradas para as subunidades das EST-5

e EST-5

são idênticas e

estimadas em torno de 66 e 68 kDa por SDS-PAGE. Esses resultados reforçam a idéia de que

a migração diferente em géis não desnaturantes seja devido ao efeito de carga elétrica,

provavelmente envolvendo mutações que tenham substituídos aminoácidos de cargas opostas

ou aminoácidos neutros por aminoácidos eletricamente carregados.

Os resultados da purificação foram confirmados utilizando-se um sistema que preserva

a atividade enzimática. A figura 7 mostra a separação das esterases em gel de poliacrilamida -

SDS, onde as amostras não foram fervidas. Após a corrida eletroforética, o gel foi pré-

incubado em tampão fosfato com triton X-100 2,5 %, para remoção do SDS, e,

posteriormente, foi corado especificamente para esterases. Portanto, as bandas que são

visualizadas neste gel são o resultado da atividade catalítica das aloenzimas purificadas sobre

o substrato β-naftil-acetato, dessa forma, assegurando que as proteínas purificadas na figura 6

são realmente as EST-5

e EST-5

. Contudo, nesta figura 7, as aleloenzimas apresentaram

migrações diferentes, explicado pela metodologia empregada. Nesse caso, o SDS deve ter

contribuído para a dissociação das subunidades que ainda apresentaram atividade catalítica.

Como as isoenzimas não foram totalmente desnaturadas, mas apenas dissociadas em suas

subunidades observou-se, nesse caso, que a migração também teve a influência da carga total

das subunidades das proteínas, e não devido ao peso molecular, como é o caso da figura 6.

Além disso, a figura 7 também pode ser explorada para ilustrar a diferença de resistência das

aleloenzimas frente ao triton, pois como visualizado, a atividade esterásica da EST-5

foi mais

expressiva que a EST-5

, que apresentou atividade catalítica mais reduzida.

Pen et al. (1986) também purificaram as duas principais variantes da esterase-5 de D.

mojavensis, espécie pertencente ao mesmo complexo mulleri. Da mesma forma, as EST-5

Discussão

EST-5

100

foram purificadas de linhagens homozigotas para os alelos codificantes destas

isoenzimas. E, semelhantemente aos nossos resultados, as aleloenzimas apresentaram massas

moleculares iguais em SDS-PAGE. As subunidades das EST-5

e EST-5

100

de Drosophila

mojavensis apresentaram uma massa molecular entre 64 e 66 kDa,

um pouco menor que a

esterase-5 de Drosophila mulleri.

Lee et al. (2000) também realizaram ensaios enzimáticos com a enzima em extrato

bruto e só depois purificaram uma das esterases (designada como A). Esses autores

purificaram e caracterizaram a esterase A (enzima não encontrada nas linhagens susceptíveis

ao inseticida) que conferia resistência ao coleóptero da espécie Oryzaephilus surinamensis

frente a vários inseticidas organofosforados. As atividades esterásicas dos extratos brutos das

linhagens resistentes (linhagem VOSF) e susceptíveis (linhagem VOS48) foram realizadas

com três substratos: ρ-nitrofenil acetato, α-naftil acetato e β-naftil acetato. A linhagem VOSF

mostrou elevada atividade esterásica em comparação a linhagem VOS48, demonstrando assim

o nível de esterases em insetos adultos para as duas linhagens.

Haubruge et al. (2002) caracterizaram cineticamente a carboxilisterase que confere

resistência ao malathion (MCE) em Tribolium castaneum. A MCE de linhagens resistentes

apresentou um K

17 vezes menor e uma V

max

4,6 vezes maior do que a MCE de linhagens

susceptíveis. No entanto, a MCE das linhagens susceptíveis hidrolisou o α-naftil acetato mais

rápido do que a MCE de linhagens resistentes. A constante de especificidade para as duas

esterases estudadas mostrou que a MCE de linhagens susceptíveis preferem o α-naftil acetato

ao malathion, por outro lado, a MCE de linhagens resistentes apresentou uma melhor

especificidade ao malathion comparado ao α-naftil acetato.Desta forma os autores concluem

que a resistência específica ao malathion é devido à presença de uma esterase

qualitativamente diferente.

Como observado, há trabalhos comparando os valores cinéticos de variantes

isoenzimáticas, principalmente aquelas variantes que proporcionam resistência a inseticidas. E

essas, na maioria dos casos, apresentam características cinéticas distintas. Em contrapartida,

nos resultados do presente trabalho, os valores de V

max

e K

foram semelhantes para ambas as

aloenzimas, o que sugere que a diferença entre elas não esteja relacionada à atividade do sítio

catalítico, mas talvez as diferenças sutis em suas estruturas, causadas por trocas de

aminoácidos, que originaram a resistência diferencial entre elas.

Conclusão

VI – CONCLUSÃO

Os resultados dos extratos brutos contendo as aloenzimas EST-5

e EST-5

submetidos a tratamentos físicos e químicos, juntamente com os resultados dos experimentos

de produtividade e dados da literatura, são incompatíveis com a hipótese da neutralidade para

a manutenção do polimorfismo no loco da esterase-5 de Drosophila mulleri, devido ao fator

seletivo a favor do alelo Est-5

nas condições estudadas.

Os experimentos de purificação reforçaram importantes dados sobre as aloenzimas,

pois estas apresentaram subunidades de mesma massa molecular, o que deixa claro que a

migração diferente em géis não desnaturantes seja devido ao efeito de carga elétrica,

provavelmente envolvendo mutações que tenham substituídos aminoácidos de cargas opostas

ou aminoácidos neutros por aminoácidos eletricamente carregados.

A caracterização cinética forneceu os valores de V

max

, que embora semelhantes,

sugeriram que a diferença entre elas não esteja relacionada à atividade do sítio catalítico, mas

talvez as diferenças sutis em suas estruturas, causadas por trocas de aminoácidos, que

provavelmente originaram a resistência diferencial entre elas.

Referências

REFERÊNCIAS

ANDERSON, P. R.; OAKESHOTT, J. G. Parallel geographic patterns of allozymic variation

in two slibing Drosophila Species. Nature, v.308, p.729-731, 1984.

ÁRNASON, E. Perturbation-reperturbation test of selectuion vs. hitchhing of the two major

alleles of esterase-5 in Drosophila pseudoobscura. Genetics, v.129, p.145-168, 1991.

ARGENTINE, J. A.; JAMES, A. A. Characterization of a salivary gland-specific esterase in

the vector mosquito, Aedes aegypti. Insect. Biochem. Mol. Biol., v. 25(5), p.621–630, 1995.

AYALA, F. J.; BALAKIREV, E. S.; SÁEZ, A. G. Genetic polymorphism at two linked loci,

Sod and Est-6, in Drosophila melanogaster. Gene, v. 300, p.19–29, 2002.

BALAKIREV, E. S.; BALAKIREV, E. I.; AYALA, F. J. Molecular evolution of the Est-6

gene in Drosophila melanogaster: contrasting patterns of DNA variability in adjacent

functional regions. Gene, v. 288, p.167-177, 2002.

BALAKIREV, E. S.; BALAKIREV, E. I.; RODRIGUEZ-TRELLES, F.; AYALA, F. J.

Molecular evolution of two linked genes, Est-6 and Sod, in Drosophila melanogaster.

Genetics, v.153, p.1357-1369, 1999.

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-due binding. Analitical Biochimestry,

v.72, p.248-254, 1976.

BRADY, J. P.; RICHMOND, R. C. "Molecular analysis of evolutionary changes in the

expression of Drosophila esterases" Proc. Nat. Acad. Sci., v. 87, p. 8217-8221, 1992

BRADY, J. P.; RICHMOND, R. C.; OAKESHOTT, J. G. Cloning of the esterase-5 locus

from Drosophila pseudoobscura and comparison with its homologue in D. melanogaster.

Molecular Biology and Evolution, v.7, 1990.

Referências

BUBLIY, O. A.; KALABUSHKIN, B. A.; IMASHEVA, A. G. Geographic variation of six

allozyme loci in Drosophila melanogaster: An analysis of data from different continents.

Hereditas, v.130, p. 25, 1999.

BUBLIY, O. A.; IMASHEVA, A. G; LAZEBNYI, O. E. Geographic variability of Adh,

alpha-Gpdh, and Est-6 loci in natural Eurasia Drosophila melanogaster populations.

Genetika, v.4, p.467- 477, 1994.

CASTIGLIONI-RUIZ, L.; BICUDO, H. E. M. C.; CERON, C. R. Esterase patterns in four

brazilian populations of Haematobia irritans. Cytobios, v.90, p.81-94, 1997.

CERON, C. R. Padrão de esterases no desenvolvimento de Drosophila mulleri, D.

arizonensis e seus híbridos. 1988. 142f. Tese (Doutorado em Genética) - Instituto de

Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, 1988.

CERON, C. R.; SANTOS, J. R.; BICUDO, H. E. M. C. The use of gelatin to dry cellophane

wound slab gels in an embroidering hoop. Rev. Brasil. Genet., v.15, p.201-3, 1992.

COOKE, P. H.; OAKESHOTT, J. G. Amino-acid polymorphisms for esterase-6 in

Drosophila melanogaster. Proc. Nat. Acad. Sci., v.86(4), p.1426-1430, 1989.

DRIESEL, S.; BACHMANN, L.; STAUSS, M.; SEGELBACHER, G.; FLACH, D.;

TOMIUK, J.; KOMPF, J. High genetic variability of esterase loci in natural populations of

Parus major, P. caeruleus, and P. ater. Biochemical Genetics, v,42, p.109-119, 2004.

DURANDO, C. M.; BAKER, R. H.; ETGES, W. J.; HEED, W. B.; WASSERMAN, M.;

DESALLE, R. Phylogenetic analysis of the repleta species group of the genus Drosophila

using multiple sources of characters. Mol. Phylogenet. Evol., v.16, p. 296–307, 2000.

EAST, P. D. Non-specific esterases of Drosophila buzzatii. In: BARKER, I. S. F.; STAMER,

W. T. (Ed.). Ecological genetics and evolution: the cactus-yeast Drosophila model system.

Sidney: Academic Press, 1982. p. 323-338.

Referências

ELLMAN, G. L.; COURTNEY, K. D.; ANDRESS, V.; FEATHERSTONE, M. A new and

rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol., v.4,

p.88–95, 1961.

ETGES, W. J.; JACKSON, L. L. Premating isolation is determined by larval rearing

substrates in cactophilic Drosophila mojavensis. VI. Epicuticular hydrocarbon variation in

Drosophila mojavensis cluster species. J. Chem. Ecology., v.27, p. 2125–2149, 2001.

GUPTA, S. C.; SIDDIQUE, H. R.; SAXENA, D. K.; CHOWDHURI, D. K. Hazardous effect

of organophosphate compound, dichlorvos in trangenic D. melanogaster (hsp70-lacZ):

induction of hsp70n anti-oxidant enzymes and inhibition of acetylcholinesterase. Biochem. Et

Biophys. Acta., v.1725, p.81-92, 2005.

HAUBRUGE, E.; AMICHOT, M.; CUANY, A.; BERGE, J. B.; ARNAUD, L. Purification

and characterization of carboxylesterase involved in malathion-specific resistance from

Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae). Insect Biochem. And Mol. Biology, v 32,

p. 1181-1190, 2002.

HEED, W. B. The origin of Drosophila in the Sonoran Desert, In: BARKER, J. S. F.;

STARMER, W. T. (Ed.). Ecological genetics and evolution: the cactus-yeast-Drosophila

model system. Sydney: Academic Press, 1982. p. 65-80.

HEED, W. B.; SANCHEZ, A.; ARMENGOL, R.; FONTDEVILA, A. Genetic differentiation

among island populations and species of cactophilic Drosophila in the West Indies. In:

BARKER, J. S. F.; STARMER, W. T.; MACINTYRE, R. J. (Ed.). Ecological and

Evolutionary Genetics of Drosophila. New York: Plenum Press, 1990. p. 447-490.

HOLMES, R. S.; MASTERS, C. J. The developmental multiplicity and isoenzyme status of

cavian esterases. Biochem. Biophy. Acta., v.132; p. 379-399, 1967.

IUPAC-IUB COMISSION on Biochemical Nomenclature. Nomenclature of multiples forms

of enzymes. Recommendations (1976). J. Biol. Chem., v.252, p.5939-41, 1977.

Referências

JAGANATHAN, L.; BOOPATY, R. Interaction of Triton X-100 with acyl pocket of

butyrylcholinesterase: effect on esterase activity and inhibitor sensitivity of the enzyme.

Indian. J. Biochem., v.35, p.142–147, 1998.

JONES, G.; VENKATARE, B. R.; RIDLEY, B.; O’MANOY, P.; TURNER, H. Structure,

expression and gene sequence of a juvenile hormone esterase-related protein from

metamorphosing larvae of Trichoplusia ni. Biochem. J., v.302, p. 827-35, 1994.

KHAUSTOVA, N. D.; TOTSKII, V. M.; STREL'TSOVA, N. A. Gene-enzyme system of

alcohol dehydrogenase and adaptation of Drosophila to increased temperature. Genetika, v.5,

p.73-80, 1992.

KERLIN, R. L.; HUGHES, S. Enzymes in saliva from four parasitic arthropods. Med. Ved.

Entom., v.6, p.121-126, 1992.

KIMURA, M. The neutral theory. Cambridge: University Press, 1983.

KORT, C. A.; GRANGER, N. A. Regulation of the juvenile hormone titer. Ann. Rev.

Entomol., v.26, p.1-20, 1981.

LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T

. Nature, v.227, p. 680-685, 1970.

LAPENTA, A. S.; BICUDO, H. E. M. C.; CERON, C. R. Esterase patterns of species in the

Drosophila buzzatii cluster. Cytobios, v.84, p.13–29, 1995.

LAPENTA, A. S.; BICUDO, H. E. M. C.; CERON, C. R.; CORDEIRO, J. A. Esterase

patterns and phylogenetic relationships of species and strains included in the Drosophila

buzzatti cluster. Cytobios, v.96, p. 95-107, 1998.

LEE, S.; LEES, E. M.; CAMPBELL, B. C. Purification and characterization of an esterase

conferring resistance to fenitrothion in Oryzaephilus surinamensis (L.) (Insecta, Coleoptera,

Silvanidae). J. Agric. Food Chem., v.48, p.4991-4996, 2000.

Referências

LIMA-CATELANI, A. R. A.; CERON, C. R.; BICUDO, H. E. M. C. Variation of genetic

expression during the develoment, revealed by esterase pattern in Aedes aegypti (Diptera,

Culicidae). Biochem. Genet., v.42, n.3/4, p.69-84, 2004.

LOURENÇO, M. F. Efeito de variantes moleculares da esterase-8 sobre o valor adaptativo

de Drosophila mulleri. 2000. 162f. Tese (Doutorado em Genética) – Instituto de Biociências,

Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto, SP, 2000.

LOURENÇO, M. F.; CERON, C. R.; CARARETO, C. M. A. Evaluation of fitness

components in strains of Drosophila mulleri carrying different genotypes for an esterase.

Cytobios, v.106, p.125-138, 2001.

MARCEL, V.; ESTRADA-MONDACA, S.; MAGNÉ, F.; STOJAN, J.; KLAÉBÉ, A.;

FOURNIER, D. Exploration of the Drosophila acetylcholinesterase substrate activation site

using a reversible inhibitor (Triton X-100) and mutated enzymes. J. Biol. Chem., v.275,

p.11603–11609, 2000.

MATEUS, R. P. Caracterização da esterase larval em espécies de Drosophila do complexo

mulleri (grupo repleta). 1997. 76f. (Mestrado em Genética). Instituto de Biociências, Letras e

Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto, 1997.

MATEUS, R. P.; SENE, F. M. Temporal and spatial allozyme variation in the South

American cactophilic Drosophila antonietae (Diptera; Drosophilidae). Biochemical Genetics,

v. 41, 2003.

MATEUS, R. P.; CABRAL, H.; BONILLA-RODRIGUEZ, G. O; CERON, C. R. Molecular

weight estimation of esterase isoenzymes in closely related Drosophila species (Díptera:

Drosophilidae) in non-denaturing polyacylamide gel electrophoresis. Brazilian Archives of

Biology and Technology, 2008. No prelo.

MIKHAILOV, A. T.; TORRADO, M. Carboxylesterases moonlight in the male reproductive

tract: a functional shift pivotal for male fertility. Reprod. Fert. and Develop., v.5, p.53-62,

2000.

Referências

NASCIMENTO, A. P.; BICUDO, H. E. M. C. Esterase patterns and phylogenetic

relationships of Drosophila species in the saltans subgroup (saltans group). Genetica, v.114,

p.41-51, 2002.

OCHANDO, M. D.; AYALA, F. J. Fitness of wild-caught Drosophila melanogaster females:

allozyme variants of GPDH, ADH, PGM, and EST. Genetica, v.105, p.7-18, 1999.

OAKESHOTT, J. G.; CHAMBERS, G. K.; GIBSON, J. B.; WILLCOCKS, D.A. Latitudinal

relationships of esterase-6 and phosphoglucomutase gene frequencies in Drosophila

melanogaster. Heredity, v.47, p.385-396,1981.

OAKESHOTT, J. G.; PAPENRECHT, E. A.; BOYCE, T. M.; HEALY, M. J.; RUSSELL, R.

J. Evolutionary genetics of Drosophila esterases. Genetica, v.90, p.239-268, 1993.

PAULINO, R. M. Sequenciamento de uma esterase macho-específica em Zaprionus indianus.

2008. 79f. (Mestrado em Genética) - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,

Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto, 2008.

PEN, J.; RONGEN, H. A. H.; BEINTEMA, J. J. Purification and properties of esterase-4 from

Drosophila mojavensis. Biochem. Biophys. Acta., v.789, p.203-209, 1984.

PEN. J.; BEEUMEN, J. V.; BEINTEMA, J. J. Estructural comparision of two esterases from

Drosophila mojavensis isolated by immunoaffinity chromatography. Biochem. J., v.238,

p.691-699, 1986.

PEREIRA, M. A.; VILELA, C. R.; SENE, F. M. Notes on breeding and feeding sites in some

species of repleta group of genus Drosophila (Diptera, Drosophilidae). Cien. e Cult., v.35, p.

1313-1319, 1983.

POWELL, J. R. Progress and prospects in evolutionary biology: the Drosophila model. New

York: Oxford University Press, 1997.

Referências

PRABHAKARAN, S. K.; KAMBLE, S. T. Purification and characterization of an esterase

isozyme from insecticide resistant and susceptible strains of german cockroach, Blattella

germanica (L.).Insect. Biochem. Molec. Biol., v.25, p.519-524, 1995.

RAUSCHENBACH, I. Y.; LUKASHINA, N. S.; KOROCKKIN, L. I. Role of pupal esterase

in regulation of hormonal status in two D. virilis stocks differing in response to high

temperature. Develop. Genet., v22, p.65-80, 1994.

RICHARDSON, R. H.; RICHARDSON, M. E.; SMOUSE, P. E. Evolution of

electrophoredtic mobility in the Drosophila mulleri complex. In: MARKERT, C. L (Ed.).

Isozymes IV: Genetics and Evolution. New York: Academic Press, 1975. p. 533–545.

RICHARDSON, R. H.; SMOUSE, P. E. Patterns of molecular variation. I. Interspecific

comparison of electromorphs in the Drosophila mulleri complex. Biochem. Genet., v.14, p.

447–465, 1976.

RICHARDSON, R. H.; SMOUSE, P. E.; RICHARDSON, M. E. Patterns of molecular

variation. II. Associations of electrophoretic mobility and larval substrate within species of

the Drosophila mulleri complex. Genetics, v.85, p.141–154, 1977.

RICHMOND, R. C.; SENIOR, A. Esterase 6 of Drosophila melanogaster: kinetics of transfer

to females, decay in females and males recovery. J. Insect. Physiol., v.27 p. 849-853, 1991.

RITZ, F. R. C. Padrão de esterases em Megaselia scalaris. 1997. 128f. Tese (Doutorado em

Genética) - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista,

São José do Rio Preto, 1997.

RODRIGUEZ, C.; PICCINALI, R.; LEVY, E.; HASSON, E. Contrasting population genetic

structures using allozymes and the inversion polymorphism inversion in Drosophila buzzatii.

J. Evol. Biol., v.13, p.976, 2000.

RUIZ, A.; FONTDEVILA, A. Ecologia y evolución del grupo mulleri de Drosophila en

Venezuela y Colombia. Acta. Cient. Venezolana., v.32, p. 338-345, 1981

Referências

ROSENFELD, C.; KOUSBA, A.; SULTATOS, L. G. Interactions of rat brain

acetylcholinesterase with the detergent Triton X-100 and the organophosphate paraoxon.

Toxicol. Sci., v.63, p.208–213, 2001.

RUSSO, C. A. M.; TAKEZAKI, N.; NEI, M. Molecular phylogeny and divergence times of

Drosophilid species. Mol. Biol. Evol., v.12, p.391–404, 1995.

SAAD, M.; GAME, A. Y.; HEALY, M. J.; OAKESHOTT, J.G. Associations of esterase-6

allozyme and activity variation with reproductive fitness in Drosophila melanogaster.

Genetica, v.94, p.43-56, 1994.

SEE, Y. S.; JACKOWSKI, G. Estimating molecular weights of polypeptides by SDS gel

electrophoresis. In: CREIGHTON, T.E. Protein structure: a practical approach. New York:

IRL, 1989. p. 1-19.

SRINIVAS, R.; JAYALAKSHMI, S. K.; SREERAMULU, K.; SHERMAN, N. E.; RAO, J.

Purification and characterization of an esterase isozyme involved in hydrolysis of

organophosphorus compounds from an insecticide resistant pest, Helicoverpa armigera

(Lepidoptera: Noctüidae). Biochimica et Biophysica Acta, v.1760, p.310–317, 2006.

SPACKMAN, M. E.; OAKESHOTT, J. G.; SMITH, K.; MEDVECZKY, K. M.; RUSSEL, R.

J. A cluster of esterase genes on chromosome 3R of D. melanogaster includes homologues of

esterase genes confering insetcticide resistance in Lucilia cuprina. Biochem. Genet., v.32,

p.39-62, 1994.

SPICER, G. S. Phylogenetic utility of the mitochondrial cytochrome oxidase gene: Molecular

evolution of the Drosophila buzzatii species complex. J. Mol. Evol., v.41, p.749 –759, 1995.

SPICER, G. S.; PITNICK, S. Molecular systematics of the Drosophila hydei subgroup as

inferred from mitochondrial DNA sequences. J. Mol. Evol., v. 43, p.281–286, 1996.

SREERAMA, L.; VEERABHADRAPPA, P. S. Purification and properties of

carboxylesterases from the mid-gut of the termite Odontotermis worni. Insect Biochem.,

v.21(8), p.833–844, 1991.

Referências

SULLIVAN, D. T.; ATKINSON, P. W.; BAYER, C. A.; MENOTTI-RAYMOND, M. The

evolution of Adh expression in the repleta group of Drosophila. In: BARKER, J. S. F.;

STARMER, W. T.; MACINTYRE, R. J. (Ed.). Ecological and evolutionary Genetics of

Drosophila. New York: Plenum Press, 1990. p. 407–418.

TARTARENKOV, A.; AYALA, F. Phylogenetic relationships among species groups of the

virilis-repleta radiation of Drosophila. Mol. Phylogen. Evol., v.21, p. 327-331, 2001.

TIDON-SKLORZ, R.; SENE, F. M. Two newspecies of the Drosophila serido sibling set

(Diptera, Drosophilidae). Iheringia. Ser. Zool., v.90, p.141, 2001.

THROCKMORTON, L. H. Pathways of evolution in the genus Drosophila and the founding

of the repleta group. In: BARKER, J. S. F.; STARMER, W. T. (Ed.). Ecological genetics and

evolution: the cactus–yeast–Drosophila model system. New York: Academic Press, 1982. p.

33-48.

TOTSKII, V. N.; ESERKEPOVA, E. V.; DZHAN, Z. U. Esterase-6 gene-enzyme system and

resistance of Drosophila to increased temperature. Genetika, v.3, p.342-348, 1994.

VILELA, C. R. A revision of the D. repleta species group (Diptera, Drosophilidae). Rev.

Brás. Ent., v.27, p.1-114, 1983.

VIOQUE-FERNÁNDEZ, A.; ALMEIDA, E. A.; LÓPEZ-BAREA, J. Esterases as pesticide

biomarkers in crayfish (Procambarus clarkii, Crustácea): tissue distribution, sensitivity to

model compounds and recovery from inactivation. ScienceDirect, v.145, p.404-412, 2007.

WASSERMAN, M. Cytological evolution in the Drosophila repleta species group. In

BARKER, J. S. F.; STARMER, W. T. (Ed.). Ecological genetics and evolution: the cactus–

yeast–Drosophila model system. New York: Academic Press, 1982. p. 49–64.

WASSERMAN, M. Cytological evolution of the Drosophila replete species group. In:

KRIMBAS, C. B.; POWELL, J. R (Ed.). Drosophila inversion polimorphism. Boca Raton:

Boca Raton, 1922. p.455-552.

Referências

WHEELOCK, C. E.; SHAN, G.; OTTEA, J. Overview of carboxylesterases and their role in

the metabolism of insecticides, J. Pestic. Sci., v.30(2), p.75-83, 2005.

ZOUROS, E. Genic differentiation associated with the early stages of speciation in the mulleri

subgroup of Drosophila. Evolution, v.27, p.601, 1973.

ZOUROS, E.; DELDEN, W.; ODENSE, R.; DIJK, H. "An esterase duplication in Drosophila:

differences in expression of duplicate loci within and among related species". Biochem.

Genet., v.20, p.929-942, 1982.

Autorizo a reprodução xerográfica para fins de pesquisa.

São José do Rio Preto,13/02/2008

Assinatura

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 