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Campus de São José do Rio Preto
Programa de Pós-Graduação em Genética
São José do Rio Preto – SP
2008
MATEUS RODRIGUES BEGUELINI
ESTUDO DA ESPERMATOGÊNESE E
NUCLEOLOGÊNESE DE MORCEGOS
Dissertação apresentada para
obtenção do Título de Mestre
em Genética.
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São José do Rio Preto – SP
2008
MATEUS RODRIGUES BEGUELINI
ESTUDO DA ESPERMATOGÊNESE E
NUCLEOLOGÊNESE DE MORCEGOS
Orientadora: Prof
a
Dr
a
. Eliana Morielle Versute
Dissertação apresentada para
obtenção do Título de Mestre
em Genética.
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Beguelini, Mateus Rodrigues.
Estudo da espermatogênese e nucleologênese de morcegos / Mateus
Rodrigues Beguelini. - São José do Rio Preto : [s.n.], 2008.
141 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Eliana Morielle-Versute
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Morcego -
Reprodução. 2. Espermatogênese. 3. Nucleologênese.
4. FISH - Técnica. 6. Chiroptera. I. Morielle-Versute, Eliana. II.
Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas. IV. Título.
CDU - 599.4
Campus de São José do Rio Preto
Programa de Pós-Graduação em Genética
São José do Rio Preto – SP
2008
MATEUS RODRIGUES BEGUELINI
ESTUDO DA ESPERMATOGÊNESE E
NUCLEOLOGÊNESE DE MORCEGOS
COMISSÃO JULGADORA
DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE
Presidente e Orientadora: Prof
a
Dr
a
Eliana Morielle Versute
2
o
Examinador: Prof
a
Dr
a
Luciana Bolsoni Lourenço Morandini
3
o
Examinador: Prof
a
Dr
a
Mary Massumi Itoyama
São José do Rio Preto, 26/ 02 / 2008.
Campus de São José do Rio Preto
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2008
Dedicatória
DedicatóriaDedicatória
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Aos meus pais, Augusto Beguelini e Ercília Rodrigues Beguelini, por
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todo o sacrifício, renúncia, amor e compreensão que me dispuseram ao
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longo dessa longa jornada.
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Meu caráter e tudo que conquistei devo a vocês!
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Agrad
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Agradecimento Especial
ecimento Especialecimento Especial
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À Professora Doutora Eliana Morielle Versute pela paciência,
À Professora Doutora Eliana Morielle Versute pela paciência, À Professora Doutora Eliana Morielle Versute pela paciência,
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compreensão e confiança em mim depositada, além de todo o
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conhecimento a mim transmitido e, acima de tudo, pelo convívio e
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amizade.
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Sincera Gratidão, Admiração e Respeito!
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“Na vida ,nem sempre
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encontramos o caminho
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certo, no entanto, sempre
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existem pessoas iluminadas
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que nos auxiliam a trilha
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da melhor forma possível”
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“Só sei, que nada sei
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E que nunca saberei
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Agradecim
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Agradecimentos
entosentos
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Agradeço a todas as pessoas que me auxiliaram, direta ou indiretamente, na
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realização deste trabalho, em especial:
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A todos os meus familiares pela força e incentivo que sempre me deram, em
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especial meus tios Mário e Joana, meu primo Caíque, meu afi
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meus sobrinhos Vitória e Mikael, amo muito vocês;
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Aos meus amigos e companheiros que tanto me auxiliaram nessa jornada;
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A meus companheiros de laboratório, Bruno, Fábio, Karina, Paula, Maurício,
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Mário e Sandra, que muito me ajudaram duran
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Mário e Sandra, que muito me ajudaram durante esse trabalho;
te esse trabalho;te esse trabalho;
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-orientada Lidiani, a quem admiro pela determinação e força de
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vontade;
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Aos funcionários dos Departamentos de Biologia e Zoologia e Botânica, em
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especial aos técnicos Jorge, Rosana e Luiz;
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Aos funcionários da Seção de Pós
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-gra
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graduação, em especial a Rosemar;
duação, em especial a Rosemar;duação, em especial a Rosemar;
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A CAPES e a FAPESP, pelo auxílio financeiro concedido;
A CAPES e a FAPESP, pelo auxílio financeiro concedido;A CAPES e a FAPESP, pelo auxílio financeiro concedido;
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Ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga e as Profa Dra Sonia Maria Oliani e
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Profa Dra Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira pela disponibilização de
Profa Dra Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira pela disponibilização de Profa Dra Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira pela disponibilização de
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seus laboratórios
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A todos, Muito obrigado!
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Campus de São José do Rio Preto
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"Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes, mas
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não esqueço de que minha vida é a maior empresa do mundo. E que
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posso evitar que ela vá à falência.
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Ser feliz é reconhecer que vale
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Ser feliz é reconhecer que vale a pena viver, apesar de todos os
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desafios.
desafios. desafios.
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Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas e se tornar um autor da
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própria história.
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PEDRAS NO CAMINHO? GUARDO TODAS, UM DIA VOU
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CONSTRUIR UM CASTELO..."
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(Fernando Pessoa)
(Fernando Pessoa)(Fernando Pessoa)
(Fernando Pessoa)
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO
...........................................................................................
9
1. A Ordem Chiroptera................................................................................... 9
2. Espermatogênese: Aspectos Gerais............................................................
14
3. Nucleologênese............................................................................................. 18
II.
OBJETIVOS
.......................................…………..........................................
23
III.
ARTIGO 1
: Testicular morphology and the seminiferous epithelium
cycle in six species of Brazilian bats.........................................................…..
25
Resumo………………………………………………….....………………….
26
Abstract............................................................................................................ 27
Introduction.............................................….....................................................
28
Materials and Methods…………….………………….……………………..
30
Results...................…........................................................................................
31
Discussion......…................................................................................................
40
Acknowledgements...................…....................................................................
47
References..............................................….......................................................
47
Figure Legends.....…........................................................................................
55
Figures…….…………………………………………………………………..
59
Tables…………..……………………………………………………………..
67
IV. ARTIGO 2:
Variação na morfologia, arranjo das estruturas e
expressão nucleolar das células de Sertoli em espécies de morcegos..........
69
Resumo..............................................................................................................
70
Introdução.........................................................................................................
70
Material e Métodos…...…....………………………….……………………..
73
Resultados.........................................................................................................
74
Discussão...........................................................................................................
77
Referências Bibliográficas...............................................................................
82
Legenda das Figuras........................................................................................
86
Figuras...............................................................................................................
87
Tabela................................................................................................................
91
V. ARTIGO 3:
Comportamento do nucléolo e das regiões organizadoras
nucleolares (RONs) durante a divisão meiótica em espécies de morcegos.
92
Resumo..............................................................................................................
93
Introdução.........................................................................................................
93
Material e Métodos…...…………………………….……………………......
96
Resultados.........................................................................................................
97
Discussão...........................................................................................................
102
Referências Bibliográficas...............................................................................
108
Legenda das Figuras........................................................................................
112
Figuras...............................................................................................................
115
VI. DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÕES
..........................................
124
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
................................................
130
VIII.
RESUMO
.......................................................................................................
135
IX. ABSTRACT
.................................................................................................
139
Introdução 9
III. INTRODUÇÃO
1. A Ordem Chiroptera
A ordem Chiroptera constitui a segunda maior ordem de mamíferos,
apresentando cerca de 199 gêneros e 1113 espécies amplamente distribuídas, ocorrendo em
regiões tropicais e temperadas, com exceção de algumas ilhas oceânicas remotas e a
Antártica (Reis et al., 2006). Está classicamente dividida em duas subordens:
Megachiroptera e Microchiroptera. A primeira é encontrada exclusivamente no Velho
Mundo e compreende uma única família (Pteropodidae) com 42 gêneros e 185 espécies,
enquanto que a segunda está amplamente distribuída por todo o globo, envolvendo 17
famílias, 157 gêneros e 928 espécies (Simmons, 2005).
A subordem Megachiroptera apresenta as maiores formas de morcegos,
conhecidas como “raposas voadoras”, com algumas espécies dos gêneros Pteropus e
Acerodon apresentando envergadura de 1,7 metros. De forma geral, apresentam o segundo
dedo provido de unha, olhos grandes e bem desenvolvidos, não possuem sistema de
ecolocalização e são, na sua grande maioria, frugívoros (Nowak, 1999).
Os morcegos da subordem Microchiroptera são cosmopolitas, apresentam a
extraordinária capacidade de ecolocalização, ampla variação de hábitos alimentares, sendo
utilizados como alimentos insetos, outros artrópodes, frutos, sementes, folhas, flores,
néctar, pequenos vertebrados e sangue e possuem o segundo dedo desprovido de unha (Reis
et al., 2006).
No Brasil são encontrados cerca de 64 gêneros e 165 espécies de morcegos,
pertencentes a nove famílias: Emballonuridae (7 gêneros e 15 espécies), Furipteridae (1
gênero e 1 espécie), Molossidae (7 gêneros e 24 espécies), Mormoopidae (1 gênero e 4
Introdução 10
espécies), Natalidae (1 gênero e 1 espécie), Noctilionidae (1 gênero e 2 espécies),
Phyllostomidae (40 gêneros e 92 espécies), Thyropteridae (1 gênero e 4 espécies) e
Vespertilionidae (5 gêneros e 22 espécies). Dessas, Furipteridae, Mormoopidae, Natalidae,
Noctilionidae, Phyllostomidae e Thyropteridae ocorrem exclusivamente nas Américas
(Reis et al., 2006).
Os morcegos são os únicos mamíferos que apresentam vôo ativo, devido à
transformação dos seus membros superiores em asas e, em decorrência dessa capacidade e
da grande variedade de hábitos alimentares, são importantes no controle populacional de
insetos e na polinização e dispersão de sementes, sendo um dos principais agentes na
regeneração de habitats fragmentados.
Embora os morcegos sejam extraordinariamente bem sucedidos, eles
permanecem como um dos grupos menos conhecidos em relação a alguns aspectos, como
os evolutivos e reprodutivos.
A ordem Chiroptera tem sido extensivamente questionada sobre sua origem e
evolução. A hipótese monofilética pressupõe que Megachiroptera e Microchiroptera são
subordens proximamente relacionadas (isto é, formam um clado), e que suas características
compartilhadas, incluindo a habilidade de voar, estariam presentes em seu ancestral comum
mais recente (Simmons, 1994, 1995). Dessa forma, haveria somente uma origem do vôo
ativo em mamíferos. Em contraste, a hipótese difilética indica que os megaquirópteros e os
microquirópteros não formam um grupo monofilético, tendo evoluído independentemente
de dois diferentes grupos de mamíferos não voadores. Sugeriu-se que Megachiroptera está
mais proximamente relacionado a Dermoptera e a Primata do que a Microchiroptera (Smith
& Madkour, 1980; Pettigrew & Jamieson, 1987; Pettigrew et al., 1989; Pettigrew, 1995).
Neste caso, as características comuns a ambos os grupos teriam evoluído em conseqüência
Introdução 11
de evolução convergente ou são simplesmente o resultado da retenção de características
primitivas. Se os morcegos são difiléticos, a habilidade de voar deve ter evoluído
independentemente em Megachiroptera e em Microchiroptera.
Devido a grande maioria dos dados disponíveis suportarem um relacionamento
de grupos-irmãos entre Megachiroptera e Microchiroptera, a hipótese monofilética de
Chiroptera é agora considerada como a hipótese mais fortemente suportada (Simmons &
Conway, 2003).
Dentro de Microchiroptera encontramos um consenso na hipótese de que a
maioria deles tenham se originado no Velho Mundo, a partir de onde radiaram-se
adaptativamente para outras regiões do mundo, inclusive a América. Esta hipótese é
suportada pela presença de representantes das famílias Emballonuridae, Rhinolophidae,
Megadermatidae, Vespertilionidae e Molossidae em sítios arqueológicos da Europa datados
do Terciário Médio (Smith, 1976).
Smith (1976) sugere que a maioria das famílias de Microchiroptera originou-se,
aparentemente, da radiação adaptativa dos embalonurídeos, rinolofídeos e
vespertilionídeos.
Sugere-se que os embalonurídeos teriam chegado primeiro aos trópicos do Novo
Mundo, sendo um possível ancestral dos noctilionídeos, mormoopídeos e filostomídeos do
Novo Mundo, sendo seguidos pelos vespertilionídeos, que seriam, aparentemente, o
estoque de onde derivaram as famílias Natalidae, Thyropteridae e Furipteridae (Smith,
1976). No entanto, esse mesmo autor não descarta a hipótese de que os Chiroptera
ancestrais, datados do Eoceno, foram à fonte a partir da qual várias linhagens de
Microchiroptera radiaram-se adaptativamente.
Introdução 12
Vespertilionidae é a maior família de Chiroptera, representando um terço das
espécies atuais de morcegos (Koopman, 1993), é verdadeiramente cosmopolita, ocorrendo
em todos os continentes, com algumas espécies atingindo regiões temperadas frias e ilhas
oceânicas, tais como Bermudas, Galápagos e Hawai (Koopman, 1970).
Os vespertilionídeos possuem olhos pequenos, nenhum apêndice nasal
(rudimentar em Nyctophilus e em Pharotis), suas caudas são relativamente longas e estão
contidas em toda a extensão da membrana interfemural. Esta grande família inclui uma
larga escala de tamanhos. Alguns morcegos pesam somente 4 gramas, visto que outros
pesam até 50 gramas.
Cinco subfamílias são geralmente propostas para Vespertilionidae:
Vespertilioninae, Myotinae, Miniopterinae, Murininae e Kerivoulinae (Volleth & Heller,
1994; Simmons, 1998; Simmons & Geisler, 1998). Dessas, as três últimas são claramente
monofiléticas (Simmmons, 1998).
A família Phyllostomidae é a mais diversificada da região neotropical, contando
atualmente com cerca de 160 espécies divididas em 57 gêneros. Trata-se de um clado
endêmico do Novo Mundo, com registros que estendem-se do sudoeste dos Estados Unidos
da América até o norte da Argentina (Reis et al., 2006). É, dentre todas as famílias de
mamíferos, a mais diversificada em termos de estratégias alimentares (insetívoros,
onívoros, frugívoros, carnívoros, nectarívoros e hematófagos). A principal característica
morfológica do grupo é o apêndice nasal em forma de folha, presente na maioria das
espécies, mas modificado em forma de ferradura nas espécies hematófagas.
A origem monofilética dessa família é suportada pela congruência de dados
morfológicos, citogenéticos, bioquímicos e moleculares (Baker et al., 1989; Simmons &
Geisleir, 1998; Jones et al., 2002). No entanto, as relações filogenéticas dentro do grupo
Introdução 13
têm sido alvo de intenso debate, principalmente em relação ao reconhecimento de
subfamílias e tribos. Jones e Carter (1976) reconheceram seis subfamílias: Desmodontinae,
Phyllostominae, Glossophaginae, Carollinae, Sternodermatinae e Phyllonycterinae. Já
Wetterer e colaboradores (2000) analisando tanto dados morfológicos quanto sítios de
restrição e cromossomos sexuais, subdividiram a família em sete subfamílias, reconhecendo
mais uma subfamília, a Brachyphyllinae. Cabe destacar ainda que Baker e colaboradores
(2003), com base em dados moleculares propuseram uma nova classificação com 11
subfamílias reconhecidas (Macrotinae, Micronycterinae, Desmodontinae, Lonchorhininae,
Phyllostominae, Glossophaginae, Lonchophyllinae, Carollinae, Glyphonycterinae,
Rhinophyllinae e Sternodermatinae).
Aparentemente, a grande irradiação adaptativa dos filostomídeos foi uma
resposta a exploração de diferentes tipos de alimentos e hábitats presentes no Novo Mundo
(Smith, 1976).
Por sua ampla distribuição geográfica, os morcegos sofrem considerável
influência dos fatores abióticos sobre suas estratégias reprodutivas, incluindo processos de
degeneração do epitélio seminífero e alterações anuais no ciclo do epitélio seminífero.
Espécies que ocorrem em altas latitudes tendem a possuir um padrão monoéstrico de
reprodução intimamente associado à temperatura, entretanto, em espécies tropicais, os
ciclos reprodutivos estão fortemente associados com a estação chuvosa. Estes fatores
climáticos (temperatura e pluviosidade) combinados com a viabilidade do suplemento
alimentar influenciam diretamente nos ciclos reprodutivos dos quirópteros tropicais,
proporcionando diferentes possibilidades de ciclos reprodutivos, desde padrões
monoéstricos e poliéstricos bimodais, até espécies que se reproduzem ao longo de todo o
ano (Fleming et al., 1972; Taddei, 1976). Isso demonstra que as estratégias reprodutivas,
Introdução 14
em Chiroptera, são amplamente complexas e diversas, variando dependendo da latitude e
do hábitat que os morcegos habitam, variando dentro da mesma família, gênero ou mesmo
dentro de uma mesma espécie (Bradbury & Vehrencamp, 1977; Taddei, 1980).
A complexidade na taxonomia e em aspectos biológicos variados como
alimentação, comportamento, fisiologia e reprodução fazem de Chiroptera um grupo alvo
de muitas especulações. Os relacionamentos evolutivos de muitos táxons ainda não foram
investigados em detalhe e com alta representatividade, assim como são poucos os estudos
relacionados à reprodução. Isso demonstra que a análise em conjunto de diferentes aspectos
(morfológicos, citogenéticos, ecológicos, moleculares e bioquímicos) possibilitaria a
obtenção de respostas mais robustas para essas incongruências filogenéticas.
2. Espermatogênese: Aspectos Gerais
A espermatogênese é um processo ordenado e complexo de divisão celular e
diferenciação pelo qual células-tronco se transformam em espermatozóides. Ocorre nos
túbulos seminíferos dos testículos (Fig. 1) que em humanos produzem aproximadamente
120 milhões de espermatozóides diariamente. A manutenção dessa impressionante
produção diária requer uma coordenação das divisões celulares mitóticas das
espermatogônias, para repor as reservas de células-tronco e para sofrerem a diferenciação
em espermatócitos, divisões meióticas dos espermatócitos para produzir espermátides, que
contém um número haplóide de cromossomos, e diferenciação das espermátides em
espermatozóides maduros (Matsumoto, 1996).
A regularidade do processo espermatogênico está ligada aos processos
genéticos, transcricionais, traducionais e reguladores, onde o ciclo é mantido por uma
grande rede de reações que vai desde a ativação e desativação gênica, até a produção de
Introdução 15
proteínas que coordenam as divisões celulares. Nos adultos esse processo contínuo pode ser
dividido em três fases distintas: a mitótica, a meiótica e a espermiogênese, cada uma
caracterizada por mudanças morfológicas e bioquímicas do citoplasma e núcleo celular.
Fig. 1 Arranjo geral do epitélio testicular de morcegos (Platyrrhinus lineatus), coloração
por Hematoxilina-Eosina. Túbulo seminífero (TS), espaço intersticial (EI), célula de Sertoli
(S), espermatogônia (Sg), espermatócito primário (I), espermátides (Sd) e células de Leydig
(L
y
). Barra = 50
µ
m.
A fase mitótica, também chamada de proliferativa ou espermatogonial, é
caracterizada pelas divisões mitóticas das células-tronco (espermatogônias), que vão
originar novas células, parte da qual irá servir para a renovação da população de células-
tronco e outras que entrarão no processo de divisão e diferenciação. As espermatogônias
Introdução 16
predestinadas a entrarem em meiose ainda sofrerão algumas divisões mitóticas formando
outros tipos de espermatogônias que, ao final das mitoses, serão deslocadas para o
compartimento adluminal e entrarão em uma prolongada fase de meiose como
espermatócitos em pré-leptóteno. Todos os tipos celulares subseqüentes ficarão no
compartimento adluminal, passando entre junções celulares de células de Sertoli adjacentes
e serão dependentes dessas células para terem acesso a nutrientes e hormônios necessários a
sua diferenciação (Costa & Paula, 2003).
Na fase meiótica são observadas todas as reações preparatórias para a divisão
celular, como a inibição da transcrição e a condensação do DNA, assim como a ocorrência
das duas divisões meióticas para a formação das espermátides haplóides (Parvinen et al.,
1991).
A espermiogênese é caracterizada por mudanças morfológicas progressivas das
espermátides até espermatozóides. Estas modificações incluem: o desenvolvimento do
acrossomo que, apesar de possuir características semelhantes entre os mamíferos, uma
espécie difere das outras nos detalhes de sua formação e na sua forma final na região
anterior do espermatozóide; a condensação e o alongamento do núcleo, onde as histonas
associadas à cromatina nuclear são substituídas por protaminas, assim há uma remodelagem
das fibras de cromatina que passam a ser mais compactas; e quase ao mesmo tempo, a
formação do flagelo e acúmulo de mitocôndrias. Associado a esses eventos, ocorre uma
redução progressiva do volume citoplasmático pela liberação de corpos residuais de
citoplasma (Ward & Coffey, 1991; Costa & Paula, 2003). Após esses processos as
espermátides são liberadas para o lúmen do túbulo seminífero, passando a serem chamadas
de espermatozóides, fechando o ciclo da espermatogênese.
Introdução 17
A espermatogênese é um processo que ocorre em contato contínuo com uma
célula somática, a célula de Sertoli (Enders & Millette, 1988), essas localizam-se junto à
lâmina basal dos túbulos seminíferos, e seu citoplasma envolve as células germinativas,
estendendo-se até o lume tubular. Dentre as funções que desempenha, podem-se destacar:
formação da barreira hematotesticular; suporte estrutural e nutricional das células
germinativas; responsabilidade pela progressão das células germinativas, em diferenciação,
em direção ao lume; liberação dos espermatozóides para o lume tubular, processo
conhecido como espermiação; fagocitose de células germinativas degeneradas e corpos
residuais de citoplasma de espermátides maduras; secreção de fluidos e proteínas para
banhar as células germinativas em desenvolvimento e conduzir os espermatozóides através
dos túbulos em direção à rete testis (Russell & Griswold, 1993).
Essa célula tem um papel crucial no desenvolvimento das células germinativas e
na regulação da espermatogênese, recebendo sinais endócrinos circulantes e fatores
parácrinos das células de Leydig, peritubular e células germinativas, integrando esses
sinais, e secretando produtos que controlam o desenvolvimento das células germinativas e
modulam a função de outras células testiculares, incluindo sua própria função (Matsumoto,
1996).
Embora o processo de espermatogênese tenha sido objeto de estudo em muitos
mamíferos, como Camelus dromedarius (Osman & Plöen, 1986), Macaca mulatta (de
Rooij et al., 1986), Cynomys ludovicianus (Foreman, 1997), Felis catus (França &
Godinho, 2003), Puma concolor (Leite et al., 2006) e Chrysocyon brachyurus (Bitencourt
et al., 2007), pouca atenção tem sido dada a esse estudo em morcegos, apesar dessa ser uma
grande e diversa classe de organismos, que apresentam diferentes estratégias reprodutivas
Introdução 18
para ajustar esses animais às várias condições ecológicas e comportamentais as quais estão
submetidos.
3. Nucleologênese
O nucléolo é a estrutura mais facilmente visível, mesmo sem coloração e in vivo,
em microscopia de luz, o que é possível graças ao seu índice de refração mais elevado do
que o dos outros elementos do núcleo e do citoplasma. Seu tamanho e forma depende do
estado funcional celular, variando conforme a espécie e, dentro de uma espécie, de tecido
para tecido e mesmo de célula para célula. Quanto mais forte a sobrecarga funcional
celular, maior será o nucléolo (Mello, 2001).
A função principal do nucléolo é a biogênese dos ribossomos, fenômeno que
envolve uma série de eventos como a transcrição de genes RNAr, o processamento dos pré-
RNAs ribossômicos e a reunião de partículas pré-ribossomais (Scheer & Hock, 1999).
Presentemente o nucléolo é um dos mais surpreendentes e bem estudado sub-
compartimento do núcleo. Quando observado em microscopia eletrônica, o nucléolo dos
eucariotos superiores contém três componentes principais: o centro fibrilar (FC), o
componente fibrilar denso (DFC) e o componente granular (GC). O centro fibrilar contém
centenas de cópias de genes DNAr arranjados em um ou mais arranjos em tandem, em
vários locos cromossômicos denominados regiões organizadoras nucleolares (RONs).
Apesar dos vários genes, somente um subconjunto deles está normalmente ativo e este
parece ter uma localização mais periférica, estendendo-se para o componente fibrilar denso,
onde são observados os RNAs ribossômicos recém transcritos. No componente granular, o
mais periférico, vão ocorrer os eventos finais do processamento dos transcritos de RNAr,
Introdução 19
com a formação das partículas pré-ribossomais que serão translocadas para o citoplasma
através dos poros nucleares (Carmo-Fonseca et al., 2000).
Durante o ciclo celular, podem ocorrer alterações na forma e tamanho dos
nucléolos, em conseqüência do papel funcional dos vários domínios nucleolares, que
desorganizam-se e reorganizam-se durante o ciclo, caracterizando o fenômeno denominado
nucleologênese.
Quando a célula entra em mitose, ocorre no nucléolo a desorganização do CG e
depois do CFD. As várias classes de compartimentos nucleolares distribuem-se então para
diferentes regiões da célula. O aparelho ou maquinário transcricional permanece
organizado durante a mitose, sendo que a RNA polimerase I e seus fatores de transcrição
permanecem localizados nas regiões organizadoras dos nucléolos (Jordan et al., 1996;
Roussel et al., 1996; Savino et al., 2001).
Contrariamente a esse, os componentes do processamento dos pré-RNAs
ribossômicos são encontrados, no mínimo, em dois diferentes sítios: na região
pericromossomal (PR) e no citoplasma. Eles se dispõem em volta dos cromossomos no
início da prometáfase e permanecem até o início da telófase (Dundr et al., 1997) e, no
citoplasma, aparecem constituindo numerosas partículas esféricas relativamente grandes.
Elas aparecem na anáfase, diminuem em número na telófase e eventualmente desaparecem
na fase G1 (Dundr et al., 1997; Dundr & Olson, 1998).
Os diferentes trabalhos voltados ao estudo da nucleologênese têm mostrado que
a reorganização nucleolar inicia-se no final da anáfase ou início da telófase, quando a
transcrição pela RNA pol I é reiniciada (Scheer et al., 1993; Fomproix et al., 1998). Ao
mesmo tempo, componentes nucleolares específicos presentes nas regiões
Introdução 20
pericromossômicas são liberados dos cromossomos descondensados e começam a
associarem-se com os corpúsculos nucleolares no recém formado núcleo da célula filha.
Estudos envolvendo análises in vivo das células têm fornecido informações
importantes para o entendimento da nucleologênese, mas ainda não conseguiram esclarecer
todo o processo. Os resultados desses estudos têm mostrado que o material que migra para
o citoplasma desaparece durante a telófase e que seus componentes dissociados aparentam
entrar no núcleo. Ao mesmo tempo, certas seqüências de pré-RNAr são encontradas no
núcleo telofásico, onde elas estão associadas inicialmente com os cromossomos em
descondensação, e posteriormente com os corpúsculos nucleolares. Esses corpúsculos
constituem-se na maior fonte de componentes relacionados à organização do nucléolo nos
estágios tardios da mitose. Portanto, têm sido postulado que os nucléolos pós-mitóticos são
construídos parcialmente de componentes derivados da célula materna (Dundr et al., 2000).
Se assumirmos o modelo de Dundr e colaboradores (2000) para a
nucleologênese em células de mamíferos, estaremos aceitando que quando a transcrição é
interrompida no início da fase M (mitose), os transcritos de pré-RNAr são liberados do
componente fibrilar denso, associados com os componentes do processamento. Estes
complexos então associam-se com as regiões periféricas de todos os cromossomos. Na
anáfase, alguns desses componentes permanecem nos cromossomos enquanto outros
empacotam-se formando partículas grandes que se deslocam para o citoplasma. Durante a
telófase estes complexos de processamento ou seus subcomponentes entram nos núcleos
por dois caminhos: o primeiro através de sua associação passiva com as regiões
pericromossômicas, as quais automaticamente tornam-se parte do núcleo quando o
envoltório nuclear é formado e, no segundo, eles podem ser transportados para o interior do
núcleo como pequenas partículas dissociadas. Uma vez no núcleo, os componentes desses
Introdução 21
complexos de processamento são eventualmente incorporados aos que estão na
proximidade do núcleo, fornecendo material para o novo nucléolo pós-mitótico. A
incorporação dos componentes de processamento no nucléolo recém formado é dependente
da reativação da transcrição no nucléolo.
Evidentemente que muitos desses estudos envolveram análises sofisticadas
como a de imunocitoquímica de ultraestrutura por microscopia eletrônica, análise das
células por imunofluorescência em material fixado e células in vivo (real time), e de
hibridações com sondas de pré-RNAr. Contudo, esses estudos ainda não foram suficientes
para esclarecer como vimos, vários aspectos da nucleologênese, mesmo porque, apesar do
fenômeno ser comum a todas as células eucariotas, alguns aspectos devem ser particulares a
cada organismo ou espécie.
Apesar das diferentes abordagens sobre a nucleologênese, há ainda muito a ser
entendido, principalmente na divisão meiótica. Deve ser considerado aqui, que nas células
somáticas a transcrição é suspensa no início do ciclo de condensação cromossômica, mas
nas células gaméticas os genes ribossomais são ativos durante a prófase I - leptóteno,
zigóteno e início do paquíteno, nos espermatócitos, e até o diplóteno, nos oócitos (Wachtler
& Sthal, 1993) o que propicia a análise mais prolongada dos eventos.
Como citado anteriormente, as RONs fazem parte do centro fibrilar, e portanto
são indispensáveis à formação do nucléolo. Não só em mamíferos, mas em vários outros
grupos de organismos, o número e a posição das RONs varia amplamente entre as espécies.
Na maioria dos mamíferos as RONs são encontradas nos autossomos, mas em algumas
espécies, elas ocorrem também nos cromossomos sexuais.
O número de RONs ativas corresponde ao número máximo de nucléolos que
podem ser encontrados em células interfásicas, todavia, o número de RONs que são ativas
Introdução 22
em cada célula pode variar. A ativação diferencial de RONs conduz a uma variação no
número e tamanho dos nucléolos, porém não é a única responsável, uma vez que existem
modificações cíclicas na morfologia dos nucléolos durante o ciclo celular, assim como
fusão nucleolar, resultante de movimento, crescimento e aproximação dos nucléolos.
O número de RONs em espécies de morcegos é variável, assim como é variável
o número de RONs ativas e de nucléolos. Também é característico em morcegos uma taxa
elevada de fusão nucleolar (Volleth, 1987; Morielle & Varella-Garcia, 1988).
A variação no número de RONs é grande, podendo ser destacado a presença de
um par em espécies de diferentes famílias como Platyrrhinus lineatus, Molossus rufus e
Lasiurus ega, 3 e 5 pares nas espécies Artibeus lituratus e Myotis nigricans (Morielle-
Versute et al, 1996; Marchesin, 2002). No entanto, essa variação não ocorre somente no
número, mas também em seu posicionamento onde, devido a rearranjos, elas podem estar
localizadas em diferentes loci cromossômicos, com o extremo de Carollia perspicillata,
que apresenta as RONs no cromossomo X.
Em geral todas as observações sobre RONs e nucléolos em morcegos foram
feitas a partir da análise de células somáticas. Em decorrência da escassez de informações e
do interessante aspecto envolvendo a nucleologênese, uma análise de células meióticas,
envolvendo a caracterização das RONs e nucléolos, é interessante.
Objetivos 23
IV. OBJETIVOS
Devido à escassez de informações referentes à espermatogênese e à nucleologênese
em Chiroptera, e ao interessante e vasto campo de conhecimento que esses aspectos
representam, o intuito do presente estudo foi:
* Estudar a morfologia testicular: espaço intersticial e túbulos seminíferos,
analisando o posicionamento e comportamento das células espermatogênicas ao longo do
epitélio seminífero.
* Caracterizar e comparar a espermatogênese de seis espécies de morcegos:
Artibeus lituratus, Artibeus planirostris, Carollia perspicillata, Platyrrhinus lineatus,
Sturnira lilium (Phyllostomidae) e Myotis nigricans (Vespertilionidae).
* Analisar o comportamento da cromatina e do DNA ao longo da divisão meiótica.
* Estudar a variação na morfologia e comportamento do nucléolo das células de
Sertoli das espécies de morcegos: Artibeus lituratus, Artibeus planirostris, Carollia
perspicillata, Platyrrhinus lineatus, Phyllostomus discolor (Phyllostomidae), Cynomops
planirostris, Molossus molossus, Molossus rufus (Molossidae), Histiotus velatus e Myotis
nigricans (Vespertilionidae).
* Estudar o comportamento do nucléolo e das estruturas nucleolares durante a
divisão meiótica e a espermiogênese, identificando possíveis diferenças na nucleologênese
Objetivos 24
de cinco espécies de morcegos que apresentam diferentes números de Regiões
Organizadoras Nucleolares (RONs): Artibeus lituratus e Artibeus planirostris (três pares),
Carollia perspicillata (RON no cromossomo X: uma RON no macho e duas na fêmea),
Myotis nigricans (cinco pares) e Platyrrhinus lineatus (um par).
* Determinar a localização dos sítios de DNAr nas cinco espécies acima por meio
de hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr.
Artigo 1 25
III. ARTIGO 1
Testicular morphology and the seminiferous epithelium cycle
in six species of Brazilian bats
Mateus Rodrigues Beguelini
a
, Karina de Cassia Faria
b
, Paula Renata Lopes Moreira
a
,
Sandra Regina de Carvalho Marchesin
a
, Eliana Morielle-Versute
a,*
a
Laboratory of Chiroptera, Department of Zoology and Botany,
UNESP - São Paulo
State University, São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil 15054-000;
b
Mato Grosso State University – UNEMAT, Nova Xavantina, Mato Grosso, Brazil
78690-000
*Corresponding author. Tel.: +55 17 32212369. FAX: + 55 17 32212374
E-mail address: [email protected] (Eliana Morielle-Versute)
Artigo 1 26
Resumo
Ao contrário de outros mamíferos, existe muito pouca informação relacionada ao
processo de espermatogênese em morcegos, uma grande e diversificada classe de
organismos que apresenta diferentes estratégias reprodutivas. No presente estudo, a
espermatogênese em seis espécies de morcegos tropicais foi investigada por
microscopia de luz. As espécies estudadas foram Artibeus lituratus, Artibeus
planirostris, Carollia perspicillata, Myotis nigricans, Platyrrhinus lineatus e Sturnira
lilium. Baseado na condensação da cromatina, morfologia nuclear, posição em relação à
membrana basal e formação do flagelo, três tipos de espermatogônias foram
reconhecidos: o tipo A escuro (A
d
), o tipo A claro (A
P
) e tipo B; e a diferenciação das
espermátides foi dividida em sete etapas. Com a exceção de M. nigricans, o ciclo do
epitélio seminífero das outras cinco espécies estudadas foi semelhante ao de outros
mamíferos, mostrando fases graduais pelo método da morfologia tubular. Uma
assincronia foi observada no ciclo do epitélio seminífero de M. nigricans, evidenciada
pela sobreposição de fases e ciclo indefinido. As freqüências encontradas nas três fases
do ciclo foram variáveis, com a maior freqüência ocorrendo na fase pós-meiótica (mais
de 50%) e a menor na fase meiótica (menos de 10%). Pouca correlação foi encontrada
entre regiões heterocromáticas e concentração de DNA. As semelhanças observadas nas
cinco espécies de Phyllostomidae podem estar relacionadas a sua proximidade
filogenética e menor tempo de divergência, ao passo que as diferenças de M. nigricans
podem ser devidas a sua maior distância filogenética, uma vez que a família
Vespertilionidae divergiu anteriormente.
Artigo 1 27
Testicular morphology and the seminiferous epithelium cycle in six species of
Brazilian bats
Mateus Rodrigues Beguelini
a
, Karina de Cassia Faria
b
, Paula Renata Lopes Moreira
a
,
Sandra Regina de Carvalho Marchesin
a
, Eliana Morielle-Versute
a,*
a
Laboratory of Chiroptera, Department of Zoology and Botany,
São Paulo State
University – UNESP/IBILCE, São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil 15054-000
b
Mato Grosso State University – UNEMAT, Nova Xavantina, Mato Grosso, Brazil
78690-000
*Corresponding author. Tel.: +55 17 32212369. FAX: + 55 17 32212374
E-mail address: [email protected] (Eliana Morielle-Versute)
Abstract
Unlike other mammals, there is very little information regarding the process of
spermatogenesis in bats, a great and diverse class of organisms that presents different
reproductive strategies. In the present study, spermatogenesis in six species of tropical
bats was investigated by light microscopy. The species studied were Artibeus lituratus,
Artibeus planirostris, Carollia perspicillata, Myotis nigricans, Platyrrhinus lineatus and
Sturnira lilium. Based on chromatin condensation, nuclear morphology, position in
relation to the basal membrane and formation of the flagellum, three types of
spermatogonia were recognized: the dark type A (A
d
), the pale type A (A
p
) and type B;
and developing spermatids were divided into seven steps. With the exception of M.
nigricans, the seminiferous epithelium cycle of the other five species studied was
similar to that of other mammals, showing gradual stages by the tubular morphology
method. An asynchrony was observed in the seminiferous epithelium cycle of M.
Artigo 1 28
nigricans, evidenced by overlapping of stages and undefined cycles. The frequencies
found in the three phases of the cycle were variable, with the largest frequency
occurring in the post-meiotic phase (more than 50%) and the least in the meiotic phase
(less than 10%). Little correlation was found between heterochromatic regions and
DNA concentration. The similarities observed in the five species of Phyllostomidae can
be related to their phylogenetic proximity and shorter time of divergence, while the
differences in M. nigricans can be related to its greater phylogenetic distance, since the
Vespertilionidae family diverged earliest.
Keywords: Spermatogenesis, Spermiogenesis, Seminiferous Epithelium Cycle,
Chiroptera.
Introduction
Spermatogenesis is a complex, highly ordered process of cell division and
differentiation by which spermatogonial stem cells give rise to mature spermatozoa.
Maintenance of this process requires coordination of the mitotic cellular divisions of
spermatogonia, both to replenish stem cell reserves and to undergo further
differentiation into spermatocytes, meiotic divisions of spermatocytes to produce
spermatids containing a haploid number of chromosomes, and differentiation of
spermatids into mature spermatozoa (Matsumoto, 1996).
The spermatogenic cells are arranged in the seminiferous tubules in an organized
and fixed form, constituting cellular associations that characterize the seminiferous
epithelium cycle (Leblond and Clermont, 1952).
The stages are artificial demarcations established by researchers based upon
histological features of the seminiferous epithelium. The criteria used for stage
Artigo 1 29
identification correspond from the overall seminiferous epithelium composition to the
morphological characteristics of spermatids (Russell et al., 1990). With the use of
different forms of analysis, the number of stages and the features used for the
classification scheme vary between species, and there are even divergences between
researchers concerning the same species. However, the tubular morphology method
yields eight stages of the cycle for all species, being a less arbitrary and simpler
methodology to characterize the stages of the cycle (Berndtson, 1977; Paula et al.,
1999).
Although the process of spermatogenesis has been the subject of investigation in
several species of mammals, such as Camelus dromedarius (Osman and Plöen, 1986),
Macaca mulatta (de Rooij et al., 1986), Cynomys ludovicianus (Foreman, 1997), Felis
catus (França and Godinho, 2003), Puma concolor (Leite et al., 2006) and Chrysocyon
brachyurus (Bitencourt et al., 2007), less attention has been given to its study in bats, a
great and diverse class of organisms that presents different reproductive strategies to
enable these animals to adjust to the multiple ecological and behavior conditions to
which they are submitted.
Due to their wide geographic distribution, the reproductive strategies of bats
suffer considerable influence from abiotic factors. Species that occur in high latitudes
tend to present a conspicuous monoestrous pattern, with their reproductive cycles
closely associated with temperature. However, in tropical species, reproductive cycles
are strongly associated with the rainy season. These climatic factors (temperature and
rainfall) combined with the viability of the alimentary supplement, have a direct
influence on the reproductive cycles of tropical bats, resulting in cycles ranging from a
seasonal monoestric pattern and bimodal seasonal polyestry, to species that reproduce
throughout the year (Fleming et al., 1972; Taddei, 1976). This shows that reproductive
Artigo 1 30
strategies in Chiroptera are quite complex and diverse, and, depending on the latitude
and type of habitat that bats inhabit, vary within the same family, genus, and even
within a species (Bradbury and Vehrencamp, 1977; Taddei, 1980).
The literature relating to the reproductive parameters for species of Chiroptera is
scarce. Except for reports concerning seasonal breeding cycles (Miller, 1939; Krutzsch,
1975; Krutzsch et al., 1976; Krutzsch and Crichton, 1987; Van der Merwe and
Rautenbach, 1987, 1990; Happold and Happold, 1989; Heideman et al., 1992) and a few
studies concerning to spermatogenesis in Megachiroptera (Saidapur and Patil, 1992;
Morigaki et al., 2001), there is little data about the process of spermatogenesis in bats,
especially related to Microchiroptera.
Due to the scarcity of information and to the vast and fascinating field of
knowledge that these aspects represent, the objective of the present study was to analyze
different aspects of spermatogenesis and to determine the arrangement and kinetics of
the seminiferous epithelium cycle in six species of tropical bats, Artibeus lituratus,
Artibeus planirostris, Carollia perspicillata, Platyrrhinus lineatus and Sturnira lilium of
Phyllostomidae and Myotis nigricans of Vespertilionidae.
Materials and Methods
Animals
For the sake of wild life conservation only two sexually mature specimens of
each species (Artibeus lituratus, Artibeus planirostris, Carollia perspicillata,
Platyrrhinus lineatus, Sturnira lilium and Myotis nigricans) were used in the present
study. These animals were collected with mist nets in the urban region of São José do
Rio Preto (São Paulo, Brazil). After removing both testes, the specimens were
Artigo 1 31
catalogued and deposited in the Scientific Collection of the Laboratory of Chiroptera,
IBILCE-UNESP.
Histology
Testes were fixed in Karnovisky fixative solution or in Bouin fixative solution
(for at least 24 hours), dehydrated in ethanol at increasing concentrations, embedded in
glycol methacrylate (Historesin, Leica Instruments), and sectioned (1 µm) using a Leica
RM 2155 microtome. Tissue sections were submitted to conventional cytological and
cytochemical procedures such as Hematoxylin–Eosin (Ribeiro and Lima, 2000),
Toluidine Blue (Mello and Vidal, 1980) and Feulgen reaction (Mello and Vidal, 1980).
Stages of the Seminiferous Epithelium Cycle
Stages of the cycle in bats were characterized based on the shape and location of
spermatid nuclei, presence of meiotic divisions, and overall seminiferous epithelium
composition (Berndtson, 1977; França and Godinho, 2003). This method provides eight
stages of the seminiferous epithelium cycle. The relative stage frequencies were
determined from the analysis of approximately 200 seminiferous tubule cross sections
per animal at 400x magnification. Both testes were analyzed for each animal.
The sections were evaluated in a Zeiss photomicroscope and documented by an
Axiovision 3.1 for Windows computer software for image analysis.
Results
Testicular Morphology
Hematoxylin-Eosin stain was used for the general analysis of the seminiferous
tubules and for the characterization of the stages of the seminiferous epithelium cycle.
Artigo 1 32
Like other mammals, the testicular tissue of the bats is composed of two
histologically distinct compartments: the seminiferous tubules, in which
spermatogenesis occurs, and the interstitium, which is nestled between the seminiferous
tubules. The seminiferous epithelium varied in thickness in the different species,
however, all the analyzed species presented an active reproductive pattern, no situations
of reproductive latency being observed.
Apart from a few minor differences the pattern of the characteristics of the
seminiferous tubules was similar in each of the six species. P. lineatus was therefore
chosen to illustrate the general characteristics of all six.
Sertoli cells were observed in the seminiferous tubules, extending from the basal
portions to the lumen of the tubule. These involve the germ cells in development,
providing them with a structural framework. Spermatogonia are present within the basal
compartment, and both spermatocytes in meiotic division and maturing spermatids
reside in the adluminal compartment, more closely related to the lumen. After
spermatogenesis, mature spermatozoa are released into the lumen of the seminiferous
tubule. The interstitium contains Leydig cells, a large quantity of extracellular matrix
and peritubular myoid cells, surrounding the seminiferous tubules (Fig. 1).
Leydig cells are characterized by round nuclei and numerous lipid droplets,
typical of steroid secreting cells (Fig. 1A). Sertoli cells are characterized by oval or
elongated nuclei, containing a large nucleolus (Fig. 1B).
Three types of spermatogonia were recognized, based on their chromatin
distribution, nuclear morphology and position within the seminiferous epithelium: the
dark type A (A
d
), the pale type A (A
P
) and type B. The A
d
spermatogonia is the rarest
type, observed closely apposed to the basal lamina and is characterized by possessing an
oval and highly stained nucleus, with partially condensed chromatin, and one few
Artigo 1 33
perceptive nucleolus (Fig. 1C). Type A
P
has a large round-to-oval nucleus, containing
dispersed chromatin and from 0 (Fig. 1D) to 2 nucleoli. Type B spermatogonia have a
round-to-oval nucleus, somewhat darker than A
p
spermatogonia but lighter and larger
than A
d
spermatogonia, possessing one or two nucleoli (Fig. 1D). Unlike type A
d
spermatogonia, types A
p
and B were not exclusively associated with the basal lamina.
The spermatogonia were observed in self-renewal mitosis (Fig. 1E) and in
differentiation meiosis.
The meiotic steps were characterized based on chromatin condensation and
position within the seminiferous epithelium. Primary spermatocytes in the leptotene and
zygotene stages occupy the base of the seminiferous epithelium and the first layer (Fig.
1E), and have a highly stained and largely uncondensed nucleus. In the pachytene stage,
they present more condensed chromatin and are contained in the second and third
layers. Diplotene nuclei possess condensed chromatin and are contained in the top
layers (Fig. 1E). Secondary spermatocytes are rarely observed.
Based on chromatin distribution, nuclear morphology and position within the
seminiferous epithelium, spermiogenesis was divided into seven steps. In step 1 (Sd
1
)
spermatids, the nuclei are round with largely uncondensed chromatin and only one
nucleolus. They are usually located in the top layers of the seminiferous epithelium
adjacent to the lumen (Fig. 1F). In step 2 (Sd
2
), there is a decrease in the size of the
nucleus, which began the compacting of the chromatin, the stain became stronger and
the nucleolus could no longer be distinguished (Fig. 1G). In step 3 (Sd
3
), the tail
filament is visible, as a small invagination in the distal region, and the nuclei are
beginning their proximal nuclear elongation (Fig. 1H). In step 4 (Sd
4
) there is a larger
proximal nuclear elongation, a flagellum elongation and a position orientation, whereby
all the spermatids are arranged with the proximal region turned towards the base of the
Artigo 1 34
seminiferous epithelium and the flagellum towards the lumen (Fig. 1I). In step 5 (Sd
5
)
there is a central and distal condensation of the nucleus, which becomes longer and
cylindrical (Fig. 1J). In step 6 (Sd
6
) the spermatids become longer and form laterally
placed groups that ascend towards the lumen of the seminiferous tubule, only the
proximal region being embedded in Sertoli cell cytoplasm (Fig. 1K). In the region
subsequent to the nucleus there is a greater portion of the flagellum, possibly the
beginning of the formation of the intermediate piece. In step 7 (Sd
7
) the nuclei are very
slim and highly condensed. The spermatids are distributed next to the lumen, ready to
be released. Residual bodies are present (Fig. 1L).
Unlike P. lineatus, in the A. lituratus and A. planirostris species the
spermatogonia and Leydig cells had from one to six nucleoli and the spermatids one to
three (Fig. 2A). In C. perspicillata all the cellular types, Leydig cells, spermatogonia
and spermatids had only one nucleolus (Fig. 2B). In S. lilium, the spermatid elongation
in step 2-3 is not easily distinguished and the spermatids are asymmetrical (Fig. 2C). In
M. nigricans the Sertoli cells had a more elongated nucleus than the other species (Fig.
2D), the Leydig cells and spermatogonia had several stained points, step 1 spermatids
with one to five nucleoli and step 2 spermatids were differently shaped, with an
elongated distal region and a large and distinct nucleolus (Fig. 2E). Step 7 spermatids
were more elongated than the other species (Fig. 2F).
Seminiferous Epithelium Cycle
The characteristics of the seminiferous epithelium cycle of the A. lituratus, A.
planirostris, P. lineatus and S. lilium species were very similar. The seminiferous
epithelium cycle was distinctly grouped into eight stages in accordance with the tubular
Artigo 1 35
morphology method (Figs. 3 and 4), and, for all species, in one seminiferous tubule
section only one single stage was observed.
Stage 1 is characterized by the presence of pre-leptotene spermatocytes, near the
basal lamina; one or two layers of pachytene spermatocytes; and several layers of step 1
spermatids (Fig. 3, Stage 1). Stage 2 is composed of leptotene and pachytene
spermatocytes and step 2 or 3 spermatids (Fig. 3, Stage 2). Stage 3 has zygotene and
diplotene spermatocytes and step 4 spermatids (Fig. 3, Stage 3). Stage 4 is characterized
by the occurrence of the two meiotic divisions, where the primary spermatocytes
undergo the first meiotic division, producing the secondary spermatocytes that are
quickly divided, producing step 1 spermatids. Zygotene spermatocytes, step 1 and step 5
spermatids are also observed (Fig. 3, Stage 4).
Stage 5 is characterized by spermatocytes undergoing transition from zygotene
to pachytene, step 1 spermatids, and spermatids undergoing transition from step 5 to
step 6 (Fig. 3, Stage 5). Stage 6 has B spermatogonia, pachytene spermatocytes, step 1
spermatids and step 6 spermatids (Fig. 3, Stage 6). Stage 7 is characterized by the
presence of B spermatogonia, pachytene spermatocytes, step 1 spermatids and
spermatids undergoing transition from step 6 to step 7 (Fig. 3, Stage 7). Stage 8 is
composed of B spermatogonia, a few pre-leptotene spermatocytes, pachytene
spermatocytes, step 1 spermatids, step 7 spermatids, ready to be released, and residual
bodies (Fig. 3, Stage 8).
Type A
d
and A
p
spermatogonia are observed in all stages of the cycle, however,
type B was found only from stages 6 to 8. Spermatogonia undergoing mitotic divisions
were observed from stages 5 to 1.
A total of approximately 4.5 cycles of the seminiferous epithelium is necessary
for the complementation of the spermatogenic process in phyllostomid bats, that is,
Artigo 1 36
spermatogonia must pass through 4.5 cycles to differentiate spermatozoon, and to be
released from the seminiferous tubule (Fig. 4).
The C. perspicillata species also presented the same pattern as that observed in
the other species, however an advance was observed in the cycle, whereby step 7
spermatids are released from the seminiferous tubule in stage 7, and stage 8 is formed
only by type A and B spermatogonia, pachytene spermatocytes and step 1 spermatids.
Unlike the phyllostomid species, an asynchrony was observed in the
seminiferous epithelium cycle of M. nigricans, whereby the fixed cell association
observed in the other species was not observed. This species presented more than one
stage with the production of pre-leptotene spermatocytes, which occurred not only in
stage 1 (Fig. 5A), but also in stages 6, 7 and 8 (Figs. 5B and 5C). This over-production
caused an overlapping of stages and a combination of random cells, ranging from two
spermatocyte generations associated with two or three spermatid generations (Figs. 5D
and 5E) to stages with only pre-leptotene spermatocytes and two spermatid generations
(Figs. 5F and Fig. 6).
The relative frequencies of each stage of the seminiferous epithelium cycle in the
analyzed species are represented in Table 1. In Table 2, the frequencies were grouped
into pre-meiotic (stages 1-3), meiotic (stage 4) and post-meiotic (stages 5-8) phases.
There was a similar pattern for all species, with stage 4 presenting the lowest frequency
and stage 5 the highest. In all species, the post-meiotic phase corresponded to more than
50% of the frequency and the meiotic phase to less than 10%. The relative frequencies
of M. nigricans could not be exactly determined due to the overlapping of stages.
Artigo 1 37
Arrangement of Chromatin and DNA Condensation
Toluidine Blue stain enabled us to analyze chromatin condensation through the
spermatogenic cycle. Despite some small variations, the general characteristics
observed were similar in all six species.
In P. lineatus Leydig cells were observed with one or two large heterochromatic
regions accompanied by small points (Fig. 7A). The Sertoli cells had a euchromatic
nucleus with only one large heterochromatic region, generally centrally located (Fig.
7B). Type A
d
spermatogonia had a highly stained nucleus, indicative of condensed
chromatin (Fig. 7C).
Two types of A
P
spermatogonia were observed: one with an euchromatic
nucleus and another presenting one or two large heterochromatic regions (Fig. 7D).
Type B spermatogonia presented nuclei darker than type A
P
, but clearer and larger than
type A
d
(Fig. 7E). Mitotic spermatogonia and meiotic cells were highly stained due to
chromatin condensation for the cellular divisions.
In the other species the only differences observed were in the amount of
heterochromatin in some cellular types. The Leydig cells of S. lilium and M. nigricans
presented the smallest amount of heterochromatin, with only one small heterochromatic
region in S. lilium and two to five small points arranged next to the nuclear membrane
in M. nigricans. C. perspicillata presented only one heterochromatic region, larger than
that in S. lilium, and A. lituratus and A. planirostris presented two or three
heterochromatic regions accompanied by small points throughout the nucleus.
Type A
P
spermatogonia presented similar characteristics to P. lineatus, with a
predominance of euchromatic over heterocromatic regions. A single large
heterocromatic region, or an absence of large regions is observed in P. lineatus and C.
Artigo 1 38
perspicillata, absence or one to three regions in S. lilium, one to three in A. lituratus and
A. planirostris and multiple regions in M. nigricans.
As in the case of HE stain, seven steps were found in spermiogenesis of all
analyzed species. In step 1 spermatids there was a prevalence of euchromatin, with a
single distinctive heterochromatic region and some small points observed in P. lineatus,
S. lilium and C. perspicillata (Fig. 7F), one to three heterocromatic regions in A.
lituratus and A. planirostris, while in M. nigricans step 1 spermatids with one or two
large regions and several minor regions were observed which, in step 2 spermatids
became a single and large heterocromatic region. In step 2 due to the beginning of
chromatin condensation, the nuclei became darker and it was no longer possible to
distinguish any stained region (Fig. 7G). In step 3 there was the onset of proximal
nuclear elongation, and the spermatids were highly stained (Fig. 7H). In step 4 the
proximal nuclear elongation became more accentuated and paler than the distal region
(Fig. 7I). In step 5 a central and distal condensation of the nuclei was observed, leaving
the posterior region more stained (Fig. 7J). In step 6, the nuclei became longer and more
darkly stained (Fig. 7K). In step 7, the spermatids were intensely metachromatic and
positioned next to the lumen of the epithelium ready to be released, where it was
possible to observe the presence of residual bodies (Fig. 7L).
No significant difference was observed in the heterochromatic amount of the
spermatogonia and Sertoli cells, throughout the eight stages of the seminiferous
epithelium cycle. However, in stages 7 and 8 an increase in spermatids metachromasy
was observed.
The Feulgen reaction in preparations of P. lineatus showed Leydig and Sertoli
cells with uniformly pale nuclei, or with no more than a few small darker points in the
Leydig cells (Fig. 8A-B). A more intense staining was observed in type A
d
Artigo 1 39
spermatogonia than in A
P
type (Fig. 8C). Two shapes of type A
P
spermatogonia were
found, one with an uniformly pale nucleus (Fig. 8D) and another with partially
compacted DNA, with darker points (Fig. 8E). Type B spermatogonia possess darker
nuclei than type A
P
, although they are clearer and greater than those of type A
d
(Fig.
8F).
Mitotic spermatogonia and meiotic cells presented intense staining due to
chromatin condensation for the cellular divisions. Due to the chromosomal
condensation, primary spermatocytes in transition from pre-leptotene/leptotene
presented a highly stained nucleus, paler than in zygotene spermatocytes. Pachytene
spermatocytes presented areas without coloration and more highly stained points on
chromosomic filaments and, in diplotene cells, the chromosomic filaments were more
distinct. The two meiotic divisions presented intense coloration, due to the assembly and
movement of the chromosomes to the polar regions of the cell.
In step 1 of spermiogenesis a pale nucleus of the spermatids was observed, with
only one darker point (Fig. 8G). In step 2 spermatids, with the beginning of the
chromatin condensation, the coloration became higher and the distinction of darker
regions could no longer be made (Fig. 8H). The other steps of spermiogenesis (Figs. 8I
to 9M) occurred as described for HE stain.
The characteristics described above for P. lineatus were also observed in the
other species. The only significant difference found was related to step 1 spermatids,
which, in C. perspicillata, presented only one highly stained region, larger than in the
case of P. lineatus. In S. lilium a middle stained region accompanied by some small
points was observed. In A. lituratus and A. planirostris from one to three highly stained
regions were found and, in M. nigricans, the step 1 spermatids contained from one to
Artigo 1 40
three middle regions accompanied by some small points, which, in step 2 spermatids
merged to form a single, large region.
Discussion
Different methods have been proposed for the identification and classification of
the cellular types present in the seminiferous epithelium. In several of them different
types of spermatogonia have been recognized in accordance with the topographical
arrangement in relation to the basal membrane (Van Haaster and de Rooij, 1993; de
Rooij, 2001; Chiarini-Garcia et al., 2001, 2003; Chiarini-Garcia and Russell, 2002). The
most complex classification recognizes a series of chains with from 4 to 32
spermatogonia, which, after 9 to 11 mitotic divisions, produce the spermatocytes (de
Rooij, 2001). Spermatogonial stem cells are represented by isolated cells denominated
A-single (A
s
), which, by mitotic divisions, can replenish the stem cell populations and
produce two new spermatogonia, which remain connected by intercellular bridges, the
A-paried (A
pr
) spermatogonia, which divide into chains of 4 to 32 A-aligned (A
al
)
spermatogonia, which form the spermatocytes.
Other studies in species of primates and birds based on the chromatin
distribution and nuclear morphology, have resulted in different classifications
recognizing from three to seven types of spermatogonia, where three types are generally
present: the dark spermatogonia, type A
d
, the probable spermatogonial stem cell; the
pale spermatogonia, type A
p
, which represent intermediate stages, and type B
spermatogonia, which precede the formation of primary spermatocytes. The other four
types represent different generations of the principal types, A
p
and B (B
1
, B
2
, B
3
and B
4
)
(Cavicchia and Dym, 1978; Lin and Jones, 1992; Smithwick et al., 1996; Ehmke et al.,
2005; Bakst et al., 2007).
Artigo 1 41
The few studies related to spermatogenesis in species of Chiroptera have been
based on PAS-hematoxylin reaction or hematoxylin-eosin stain. In a non-scrotal
microchiropteran, Rhinopoma kinneari, three types of spermatogonia were observed: a
single type A, the intermediate type (In) and type B (Singwi and Lall, 1983). McGuckin
and Blackshaw (1987) also observed these three types of spermatogonia in the
megachiropteran bat Pteropus poliocephalus, and Saidapur and Patil (1992) described
five types of spermatogonia in Rousettus leschenaulti, also a megachiropteran bat. In
this study, three types of A spermatogonia were recognized (A
1
, A
2
, and A
3
), in addition
to In and B types. The analyses of ultrastructural characteristics in Myotis
macrodactylus enabled Lee (2003) to recognize two distinct types of A spermatogonia,
the dark and the pale types, as well as type B spermatogonia.
In the present study, three main types of spermatogonia were recognized for the
six species, types A
d
, A
P
and B, which, despite differences in numbers, correspond to
the types described by several of the authors above.
Although the two types of A
P
spermatogonia distinguished in our study were
identified based primarily on chromatin condensation, the characteristics observed in
two specific reactions, Toluidine Blue stain and the Feulgen reaction, were sufficient to
differentiate them. Type A
p1
spermatogonia are characterized by having fully
euchromatic nuclei with small, isolated heterochromatic regions, without the
compactation of DNA; while A
p2
spermatogonia, have DNA compacted in some regions
and one or two large heterocromatic regions. It is reasonable to argue that these two
types represent two differentiated physiological states of the same cell, or that they are
two different cellular types, possibly the A
p1
and A
p2
types identified by Lin and Jones
(1992) in birds cells, or possibly two of the three types of A spermatogonia observed by
Artigo 1 42
Saidapur and Patil (1992) in the megachiropteran bat, or even two of the seven types of
intermediate spermatogonia identified by de Rooij (2001) in rodent species.
Based on the data obtained, we agree with the above authors, who agued that the
maturation of germinative cells began when the spermatogonial stem cells (A
d
)
underwent mitotic division, producing not only more A
d
spermatogonia, but also A
p
spermatogonia. In their turn, these divided and differentiated into B spermatogonia,
which are the cells destined to suffer meiosis and differentiate into spermatozoa.
Another interesting feature of the seminiferous epithelium refers to
spermiogenesis, which has been the subject of special attention, due to the fact that it
represents an excellent model of cellular differentiation (Clermont and Leblond, 1955;
Gardner, 1966; Foreman, 1997; Lin et al., 1997; Lin and Jones, 2000).
Due to differences in the information resulting from the application of different
techniques, several classifications of spermiogenesis have been proposed, which
recognize from 6 to 16 steps (Cavazos and Melampy, 1954; Gunawardana, 1977;
Singwi and Lall, 1983; Lin and Jones, 1993; Góes and Dolder, 2002).
In the present study, the classification established, based on nuclear morphology,
chromatin condensation and cell position within the seminiferous epithelium, enabled us
to distinguish only seven steps in the spermiogenesis of the analyzed species. However,
it was observed that the distinctive characteristics used in the delimitation of each step
were also used by other authors who analyzed bat and other vertebrate species (Singwi
and Lall, 1983; Saidapur and Patil, 1992; Lin and Jones, 1993, 2000). It is important to
emphasize that the pronounced curvature of the nuclei of spermatids observed in two
steps recognized by Gunawardana (1977) (steps 9 and 10) and the formation of the
nuclear helix in the final steps observed by Lin and Jones (2000) (steps 13 to 16) have
not been observed in bats.
Artigo 1 43
The pattern of arrangement of the cells in seminiferous tubules exhibit
differentiated cellular associations, classified as stages of the seminiferous epithelium
cycle (Leblond and Clermont, 1952; Costa and Paula, 2003). As spermatogenesis is a
synchronous and continuous process, the separation into stages is artificial, and the
number of stages varies depending on the criteria used by each author and on species
analyzed.
The most frequently used criteria are those of the tubular morphology method,
based on overall seminiferous epithelium composition, alterations in the nuclei of the
spermatogenic cells, occurrence of meiotic divisions and morphological characteristics
of spermatids. Although this method generally provides eight stages of the cycle for
most species (Berndtson, 1977; Garcia-Gil et al., 2002; França and Godinho, 2003; Leal
and França, 2006), variations between different species have been detected, when other
methods are utilized. Thus, six stages are referred to in Pan troglodytes (Smithwick et
al., 1996), nine stages in Lagostomus maximus maximus (Muñoz et al., 1998), ten stages
in Cynomys ludovicianus (Foreman, 1997), eleven stages in Otolemur garnetti (Ojoo et
al., 2005), and twelve stages in Phodopus sungorus sungorus (Van Haaster and de
Rooij, 1993) and Macaca mullata (Ehmcke et al., 2005), among others. The more
extensive is the criteria used, the more specific and detailed are the stages that can be
identified (Paula et al., 1999).
In the species of bats analyzed eight stages were identified and only one stage
was found in a section of the seminiferous tubule, as observed in the majority of the
mammals, with the exception of hominids (Russel et al., 1990). In primate-hominids,
two or more stages are present in the same section of the seminiferous tubule, in a
helical spiral arrangement (Wistuba et al., 2003; Leal and França, 2006).
Artigo 1 44
The seminiferous epithelium cycle is very similar in A. lituratus, A. planirostris,
C. perspicillata, P. lineatus and S. lilium. It is also very similar to the cycle of other
mammals, such as the puma (Leite et al., 2006), wolf (Bitencourt et al., 2007), mules
and donkeys (Neves et al., 2002) and other bats (Saidapur and Patil, 1992; Morigaki et
al., 2001). In all these species, disregarding the number of stages which each species
presents, it was found that spermiation is followed by the initiation of the elongation of
the spermatids and the entry of type B spermatogonia into the meiotic prophase. These
features demonstrate that these are possibly common and basal characteristics
(plesiomorphic), which have been conserved in the different mammalian groups. The
helical spiral arrangement observed in primate-hominids is therefore probably an
apomorphic character.
The occurrence of variations in the composition and function of the seminiferous
epithelium with regard to the annual breeding cycle in bats has been described
specifically for hibernating bats. A process of degeneration of spermatogenic cells in the
seminiferous tubules occurs prior to hibernation, after which, the spermatogenic process
is re-started by elevated levels of testicular and plasma testosterone that induces an
over-production of new spermatogenic cells (Racey, 1974; Lee, 2003; Lee and Mori,
2004; Sharifi et al., 2004). In tropical bats, the reproductive cycles are closely
associated with the rainy season and, although the greatest stimulus (peak of
testosterone hormone) is generally linked to the breeding phase, slight variations in
testicular size have been observed throughout the year (Zortéa, 2003).
All the species analyzed in the present study are polyestrous (Goodwin and
Greenhall, 1961; Tamsitt and Valdivieso, 1965; Carter, 1970) and some of them
copulated twice in the year, but no significant differences were observed in the
composition of the seminiferous epithelium.
Artigo 1 45
Myotis nigricans, unlike the other Myotis species, such as M. macrodactylus,
which hibernates and suffers a degeneration of the spermatogenic cells (Lee, 2003),
presents active testes through the year (Wilson and Findley, 1971), and exhibits
asynchrony in spermatogenesis. This asynchrony observed in the seminiferous
epithelium cycle of M. nigricans can be interpreted as being due to over-hormonal
stimulation, in which the seminiferous tubules are stimulated to developed more than
one generation of spermatogenic cells at the same time. The stimuli may be a
consequence of the short period of phylogenetic divergence between the species of
Myotis and the development of new sites for the beginning of the meiotic prophase is an
adaptation to tropical habitats, since there is no hibernation phase.
The frequencies of the stages and phases of the cycle presented a similar pattern
for all the species analyzed. Stage 5 had the highest frequency and stage 4 the lowest;
the most extensive was the post-meiotic phase (more than 50%) and the least was the
meiotic phase (less than 10%).
The frequency of the stages is directly correlated with the time of differentiation
of the predominant germ cell, and is a characteristic which, in mammals, must be
phylogenetically determined within the members of a single family (França and
Cardoso, 1998; França and Russell, 1998; França et al., 1999; Paula et al., 1999; Neves
et al., 2002; França and Godinho, 2003; Leal and França, 2006). In the megachiropteran
bats, Pteropus poliocephalus and Rousettus leschenaulti, an equilibrium between the
pre-meiotic and post-meiotic phases has been observed (McGuckin and Blackshaw,
1987; Saidapur and Patil, 1992). On the other hand, in the Rhinopoma kinneari species
(Singwi and Lall, 1983) and in the species analyzed in the present study, both
microchiropterans, a higher frequency was observed in the post-meiotic phase, with
Artigo 1 46
more than 50% of the frequency, and a lower meiotic frequency, below 10%. These
results are in accordance with the literature.
Little correlation was found between heterochromatic regions and DNA
concentration. Only in step 1 spermatids (Sd
1
) the heterochromatic regions also
correspond to regions of DNA concentration. In type A
P
and B spermatogonia and
Sertoli cells, heterochromatic regions were not related to DNA concentration, possibly
being able to be formed solely by the large protein concentration that inactivates the
genes present.
The comparisons of the characteristics observed in the six species of bats
analyzed revealed the great similarity between A. lituratus and A. planirostris and
between these and P. lineatus, C. perspicillata and S. lilium. The great similarity
between the species of Artibeus may possibly be due to their phylogenetic proximity
and shorter period of divergence, when compared with other species of the family, such
as P. lineatus, C. perspicillata and S. lilium, which share a common ancestral with the
Artibeus species (Wetterer et al., 2000).
M. nigricans was the most differentiated species, presenting a unique
characteristic in relation to its morphology and also to its seminiferous epithelium cycle.
The differences found in M. nigricans may be due to its larger phylogenetic distance. It
belongs to another family (Vespertilionidae), and has diverged for a longer period than
the phyllostomid species.
With this study, we may observe that the reproductive characteristics of the bats
are quite complex and diverse, differing among species that have longer period of
phylogenetic divergence. Thus, due to the multi-factors that affect the biology of bats,
the reproductive analysis is interesting, both to obtain data for phylogenetic analysis and
Artigo 1 47
to discover new reproductive patterns, how the M. nigricans observed in the present
study.
Acknowledgements
We are grateful to Dr Sonia Maria Oliani and Dr Sebastião Roberto Taboga for
the use of their laboratories and equipment, and to Luiz Roberto Falleiros Junior for the
technical assistance. The scholarship awarded to Mateus Rodrigues Beguelini by the
Brazilian Research Foundation (CAPES) is also gratefully acknowledged. Financial
support from the São Paulo State Research Foundation (FAPESP) and the Brazilian
Research Foundation (CAPES) is gratefully acknowledged.
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Artigo 1 55
Fig. 1 General arrangement of the testicular epithelium of Platyrrhinus lineatus,
Hematoxylin-Eosin stained. A. Interstitium compartment with Leydig cells (L
y
) with
numerous lipid droplets. B. Sertoli cells (S) with asymmetrical nucleus and a single
nucleolus. C. Type A
d
spermatogonia closely apposed to the basal lamina with deeply
stained nucleus and chromatin partially condensed. D. Type A
p
spermatogonia with pale
and oval nucleus, B spermatogonia with round and dark nucleus and Sertoli cell (S). E.
Mitosis cell (M), spermatocytes undergoing transition from leptotene/zygotene (L/Z)
and diplotene (D). F. Step 1 spermatids (Sd
1
) with round nuclei and only one nucleolus.
G. Step 2 spermatids (Sd
2
) beginning the chromatin condensation. H. Step 3 spermatids
(Sd
3
) beginning the nuclear elongation and the flagellum formation (arrow). I. Step 4
spermatids (Sd
4
) with larger proximal nuclear elongation. J. Step 5 spermatids (Sd
5
)
with a central and distal condensation of the nucleus. K. Step 6 (Sd
6
) spermatids with
elongated nuclei and a greater portion of the flagellum (arrow). L. Step 7 spermatids
ready to be released and residual bodies (arrows). Bars = 10 µm.
Fig. 2 General arrangement of the testicular epithelium of Artibeus lituratus (A),
Carollia perspicillata (B), Sturnira lilium (C) and Myotis nigricans (D-F),
Hematoxylin-Eosin stained. A. Type A
p
spermatogonia with a single great nucleolus,
type B spermatogonia, step 1 spermatids (Sd
1
) with one to three nucleoli and step 7
spermatids (Sd
7
). B. A
p
spermatogonia and step 1 spermatids (Sd
1
) with a single
nucleolus. C. Step 3 spermatids (Sd
3
) with asymmetrical shapes D. More elongated
Sertoli cells (S). E. Step 2 spermatids (Sd
2
) with distal nuclear elongation and step 1
spermatids (Sd
1
). F. Step 7 spermatids (Sd
7
) more elongated than the other species. Bars
= 10 µm.
Artigo 1 56
Fig. 3 Photographic mounting showing the eight stages of the seminiferous epithelium
cycle in Platyrrhinus lineatus, Hematoxylin-Eosin stained. Type A
d
spermatogonia
(A
d
); Type A
P
spermatogonia (A
P
); Type B spermatogonia (B); Pre-leptotene
spermatocyte (Pl); Spermatocyte undergoing transition from leptotene/zygotene (L/Z);
Zygotene spermatocyte (Z); Pachytene spermatocyte (P); Diplotene spermatocyte (D);
Metaphasic figure (M); Step 1 spermatids (Sd
1
); Step 3 spermatids (Sd
3
); Step 4
spermatids (Sd
4
); Step 5 spermatids (Sd
5
); Spermatids undergoing transition from step 5
to step 6 (Sd
5-6
); Step 6 spermatids (Sd
6
); Spermatids undergoing transition from step 6
to step 7 (Sd
6-7
); Step 7 spermatids (Sd
7
). Bars = 10 µm.
Fig. 4 Diagram showing the composition of the seminiferous epithelium and the
frequency (%) of each stage of the seminiferous epithelium cycle of Platyrrhinus
lineatus. The Roman numbers indicated the spermatogenic cycle. The space given to
each stage is proportional to its frequency. Type A spermatogonia; type B
spermatogonia; pre-leptotene spermatocyte (Pl); leptotene spermatocyte (L); zygotene
spermatocyte (Z); pachytene spermatocyte (P); diplotene spermatocyte (D); secondary
spermatocyte (II); step 1 spermatid (Sd
1
); step 2 or 3 spermatid (Sd
2-3
); step 4 spermatid
(Sd
4
); step 5 spermatid (Sd
5
); step 5 or 6 spermatid (Sd
5-6
); step 6 spermatid (Sd
6
); step
6 or 7 spermatid (Sd
6-7
); step 7 spermatid (Sd
7
).
Fig. 5 Seminiferous epithelium cycle in Myotis nigricans, Hematoxylin-Eosin stained.
A. Stage 1 containing pre-leptotene spermatocytes (Pl), pachytene spermatocytes (P)
and step 1 spermatids (Sd
1
). B. Stage 6 with pachytene spermatocytes (P), step 1
spermatids (Sd
1
), step 6 spermatids and presenting the production of pre-leptotene
spermatocytes (Pl). C. Stage 7 with pachytene spermatocytes (P), step 1 spermatids
Artigo 1 57
(Sd
1
), spermatids undergoing transition from 6-7 steps and presenting the production of
pre-leptotene spermatocytes (Pl). D. Overlapping of stages with two spermatocyte
generations (pre-leptotene (Pl) and pachytene (P) spermatocytes) associated with two
spermatid generations (step 1 (Sd
1
) and step 6-7 spermatids (Sd
6-7
). E. Overlapping of
stages with two spermatocyte generations (pre-leptotene (Pl) and pachytene (P)
spermatocytes) associated with three spermatid generations (step 1 (Sd
1
), step 2 (Sd
2
)
and step 6-7 spermatids (Sd
6-7
). F. Stage with only pre-leptotene spermatocytes (Pl) and
two spermatid generations (step 1 (Sd
1
) and step 6 spermatids (Sd
6
)). Bars = 20 µm.
Fig. 6 Diagram showing the composition of the seminiferous epithelium of Myotis
nigricans. The Roman numbers indicated the spermatogenic cycle. Type A
spermatogonia; type B spermatogonia; pre-leptotene spermatocyte (Pl); leptotene
spermatocyte (L); zygotene spermatocyte (Z); pachytene spermatocyte (P); diplotene
spermatocyte (D); secondary spermatocyte (II); step 1 spermatid (Sd
1
); step 2 or 3
spermatid (Sd
2-3
); step 4 spermatid (Sd
4
); step 5 spermatid (Sd
5
); step 5 or 6 spermatid
(Sd
5-6
); step 6 spermatid (Sd
6
); step 6 or 7 spermatid (Sd
6-7
); step 7 spermatid (Sd
7
).
Fig. 7 General arrangement of the testicular epithelium of Platyrrhinus lineatus
submitted to Toluidine Blue stain. A. Leydig cells (L
y
) with one or two large
heterochromatic regions and some small points. B. Sertoli cells (S) presenting
euchromatic nuclei with only one large heterochromatic region. C. Type A
d
spermatogonia with highly stained nucleus. D. Two shapes of type A
P
spermatogonia,
one with euchromatic nucleus and another presenting one or two large heterochromatic
regions. E. Type B spermatogonia with a highly stained nucleus. F. Step 1 spermatid
(Sd
1
) with prevalence of euchromatin, with a single distinctive heterochromatic region.
Artigo 1 58
G. Step 2 spermatid (Sd
2
) highly stained. H. Step 3 spermatid (Sd
3
). I. Step 4 spermatid
(Sd
4
) with a proximal region paler than the distal region. J. Step 5 spermatid (Sd
5
). K.
Step 6 spermatid (Sd
6
) with longer and darker stained nuclei. L. Step 7 spermatid (Sd
7
)
with strong metachromasy, and the presence of residual bodies (arrows). Bars = 10 µm.
Fig. 8 General arrangement of the testicular epithelium of Platyrrhinus lineatus
submitted to Feulgen reaction. A. Leydig cells (L
y
) with uniformly pale nuclei, only
with some small darker points. B. Sertoli cells (S) with uniformly pale nuclei. C. Type
A
d
spermatogonia with highly stained nucleus. D. Type A
P
spermatogonia with
uniformly stained nuclei. E. Type A
P
spermatogonia presenting DNA partially
compacted, with darker points. F. Type B spermatogonia. G. Step 1 spermatids (Sd
1
)
presented pale nuclei, with only one darker point. H. Step 2 spermatids (Sd
2
) with
stronger coloration. I. Step 3 spermatids (Sd
3
). J. Step 4 spermatids (Sd
4
) with a
proximal nuclear coloration clearer than the distal region. K. Step 5 spermatids (Sd
5
)
with the distal nuclear region highly stained. L. Step 6 spermatids (Sd
6
) with elongated
nuclei. M. Step 7 spermatids (Sd
7
) highly stained and ready to be released. Bars = 10
µm.
Artigo 1 – Figura 1 59
Artigo 1 – Figura 2 60
Artigo 1 – Figura 3 61
Artigo 1 – Figura 4 62
Artigo 1 – Figura 5 63
Artigo 1 – Figura 6 64
Artigo 1 – Figura 7 65
Artigo 1 – Figura 8 66
Artigo 1 – Table 1 67
Table 1 Relative frequencies (%) of the eight stages of the seminiferous epithelium cycle in
the five species of phyllostomid bats: Artibeus lituratus, Artibeus planirostris, Carollia
perspicillata, Platyrrhinus lineatus and Sturnira lilium.
Stages
A. lituratus A. planirostris
C. perspicillata P. lineatus S. lilium
1
8.1 8.5 16.5 13.5 14
2
15.6 19 8.5 12.4 13.5
3
12.6 9.5 8.5 11.9 9.1
4
9.5 4.5 5.5 7.6 6.4
5
24.2 26 25.5 22.2 21.8
6
9.5 17.5 12 10.3 20.5
7
9.5 6.5 17.5 8.6 7
8
11 8.5 6 13.5 7.7
Artigo 1 – Table 2 68
Table 2 Relative frequencies (%) of the pre-meiotic, meiotic and post-meiotic phases of the
seminiferous epithelium cycle in the five species of Phyllostomidae: Artibeus lituratus,
Artibeus planirostris, Carollia perspicillata, Platyrrhinus lineatus and Sturnira lilium.
Stages
A. lituratus A. planirostris
C. perspicillata
P. lineatus S. lilium
PM
36.3 37 33.5 37.8 36.6
M
9.5 4.5 5.5 7.6 6.4
PtM
54.2 58.5 61 54.6 57
PM - Pre-meiotic phase; M -
Meiotic phase; PtM - Post-meiotic phase.
Artigo 2 69
IV. ARTIGO 2
Variação na morfologia, arranjo das estruturas e expressão
nucleolar das células de Sertoli em espécies de morcegos
Mateus Rodrigues Beguelini
a
, Karina de Cássia Faria
b
, Paula Renata Lopes Moreira
a
,
Sandra Regina de Carvalho Marchesin
a
, Eliana Morielle Versute
a
a
Laboratório de Chiroptera, Departamento de Zoologia e Botânica, UNESP -
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, São José do Rio Preto, São
Paulo, Brasil 15054-000
b
Universidade do Estado do Mato Grosso – UNEMAT, Nova Xavantina, Mato Grosso,
Brasil 78690-000l.
Corresponding author. Tel.: +55 17 32212369. FAX: + 55 17 32212374
E-mail address: [email protected] (Eliana Morielle-Versute)
Artigo 2 70
Resumo
A célula de Sertoli desempenha uma função auxiliar crucial na espermatogênese. Devido à
sua importância funcional e aos vários mecanismos que regula, é esperado que diferenças
morfo-fisiológicas sejam pequenas ou inexistentes e que espécies proximamente
relacionadas apresentem células de Sertoli com características similares. Baseado nisso, o
objetivo do presente estudo foi avaliar a forma e o comportamento dos nucléolos das
células de Sertoli de 10 espécies de morcegos de três famílias, por meio das técnicas de
impregnação por nitrato de prata (Ag-NOR) e alaranjado de acridina. O nucléolo das
células de Sertoli das espécies de Phyllostomidae apresentaram um único e bem distinto
nucléolo formado pela interação das RONs em um único ponto. O padrão de expressão é
periférico e a relação de área nucleolar/área nuclear varia de acordo com o número de
RONs que cada espécie apresenta. As espécies de Molossidae, Cynomops planirostris e
Molossus rufus, tem padrão semelhante ao de Phyllostomidae, mas Molossus molossus se
diferencia dos demais, tanto qualitativa quanto quantitativamente. Essa diferenciação,
possivelmente, se deve a uma regulação fisiológica exclusiva de M. molossus. Os
vespertilionídeos apresentam características morfológicas únicas e também uma maior
relação de área nucleolar/área nuclear. O padrão nucleolar das células de Sertoli variou
entre as diferentes famílias de morcegos e, dentro de uma mesma família. O padrão de
variação é influenciado pelo número de RONs que as espécies apresentam, assim como
pelo momento fisiológico da célula e do ciclo espermatogênico.
Palavras-chave: célula de Sertoli, Nucléolo, RON, FISH, Chiroptera.
Introdução
O relacionamento evolutivo dos diferentes táxons de Chiroptera tem sido avaliado
utilizando-se diferentes conjuntos de caracteres que envolvem especialmente a análise de
Artigo 2 71
aspectos morfológicos, moleculares, citogenéticos, entre outros (Pettigrew 1986; Simmons
1994, 1995; Nikkaido et al. 2000; Van Den Bussche et al. 2004).
Apesar de que uma avaliação conjunta das informações possa melhorar as
interpretações, nem sempre é isso que se verifica, pois alguns caracteres são tão variados e
diferentes a ponto de complicar as análises quando utilizados juntos ou, por outro lado,
podem variar muito pouco, não fornecendo qualquer informação que auxilie nas
interpretações evolutivas e na determinação do relacionamento existente entre os diferentes
táxons.
Um interessante exemplo desta última situação é observado no gênero Myotis de
Chiroptera, gênero com a maior representação em Chiroptera, onde nas análises
morfológicas e citogenéticas das cerca de 90 espécies do gênero, evidenciou-se que, além
de apresentarem grande semelhança morfológica, apresentam também intenso
conservacionismo cariotípico, evidenciado não só no número e morfologia dos
cromossomos (2n = 44 e NF = 50 ou 52), mas também no padrão de bandas G, número e
posição das regiões organizadoras nucleolares (RON) e localização da heterocromatina
constitutiva (Bickham et al. 1986; Andrade et al. 1995; Marchesin 2002).
Em situações como essa é interessante e necessário a caracterização de outros
aspectos que poderiam ser associados aos já descritos (morfológico, genético, citogenético,
molecular e ecológico) podendo assim, auxiliar na identificação e diferenciação das
espécies e substanciar hipóteses de relacionamento evolutivo mais robustas.
Do ponto de vista citogenético, uma característica pouco estudada em Chiroptera é
a relativa à espermatogênese, que é um processo cíclico e altamente coordenado no qual
espermatogônias diplóides se diferenciam em espermatozóides haplóides (França et al.
1999). Esse processo de proliferação e diferenciação das células germinativas masculinas
ocorre em contato contínuo com uma célula somática, a célula de Sertoli (Enders e Millette
1988).
Artigo 2 72
A célula de Sertoli apresenta um papel central no desenvolvimento de um testículo
funcional e também na expressão do fenótipo masculino. Elas são as primeiras células a se
diferenciarem na gônada fetal indiferenciada, um evento que promove a formação do
cordão seminífero, previne a entrada das células germinativas em meiose e diferenciação e
também estimula a regressão dos ductos Mullerianos via secreção de hormônio anti-
Mulleriano (Mackay 2000; Josso et al. 2001). Durante a puberdade, suas funções mudam e
essas células passam a ser a principal fonte reguladora da espermatogênese, recebendo
sinais endócrinos circulantes e fatores parácrinos das células de Leydig, peritubular e
germinativas, integrando esses sinais, e secretando produtos que controlam o
desenvolvimento das células germinativas e modulam a função de outras células
testiculares, incluindo sua própria função (Matsumoto 1996).
Devido à importância funcional que as células de Sertoli apresentam e aos vários
mecanismos que regula, é esperado que diferenças morfo-fisiológicas sejam pequenas ou
inexistentes e que espécies proximamente relacionadas apresentem células de Sertoli com
características similares. A análise de estruturas com características como as das células de
Sertoli, ou seja conservacionismo, é interessante pois, quando forem observadas
diferenças, essas poderão ser utilizadas como mais uma ferramenta de análise,
caracterização e diferenciação de táxons.
Baseado nisso, o objetivo do presente estudo foi caracterizar as células de Sertoli de
10 espécies de morcegos pertencentes a três grandes famílias, Phyllostomidae, Molossidae
e Vespertilionidae, quanto a aspectos morfológicos e de expressão do nucléolo e avaliar,
através da impregnação por nitrato de prata (Ag-NOR) e a coloração com o alaranjado de
acridina, o comportamento nucleolar durante a espermatogênese.
Artigo 2 73
Materiais e Métodos
Animais
Foram avaliados dois espécimes, sexualmente maturos, das espécies Artibeus
lituratus, Artibeus planirostris, Carollia perspicillata, Phyllostomus discolor e
Platyrrhinus lineatus (Phyllostomidae), Molossus molossus e Molossus rufus (Molossidae)
e Myotis nigricans (Vespertilionidae), e um espécime das espécies Cynomops planirostris
(Molossidae) e Histiotus velatus (Vespertilionidae). Os animais foram capturados com o
uso de redes de espera na região urbana de São José do Rio Preto (São Paulo, Brasil). A
fim de preservar os espécimes testemunhos, esses foram fixados, catalogados e depositados
na coleção científica do laboratório de Chiroptera, IBILCE-UNESP.
Suspensão Meiótica
Após a morte do animal, que seguiu o método proposto por Oliveira-Filho (1999),
os testículos foram removidos e macerados em placas de Petri contendo solução hipotônica
de KCl (0,075 M) e colquicina (0,1%), onde permaneceram por 40 minutos a temperatura
ambiente. A suspensão celular foi então centrifugada a 1000 rpm por 6 minutos, o
sobrenadante descartado e de 7 a 9 ml de solução fixadora, metanol: ácido acético (3:1) foi
adicionada por 15 minutos. A suspensão foi centrifugada e a solução fixadora trocada mais
duas vezes. A suspensão final foi pingada sobre lâminas de vidro limpas e as células
submetidas aos procedimentos de impregnação por nitrato de prata (Kavalco e Pazza 2004)
ou coloração pelo alaranjado de acridina (Abrams et al. 1993).
Análise Qualitativa
Para a obtenção das características morfológicas (formato e composição) e de
expressão nucleolares foram avaliadas para cada espécime 50 células de Sertoli. Nas
espécies com um único espécime, 100 células foram analisadas. As células foram
Artigo 2 74
analisadas em microscópio Zeiss com analisador de imagens Axiovision 3.1 para Windows
acoplado.
Análise Quantitativa
As análises quantitativas foram realizadas com o intuito de investigar a capacidade
nucleolar transcricional nas diferentes espécies analisadas, através da avaliação da relação
de área nucleolar/área nuclear e da obtenção do índice densitométrico. Essas análises
foram realizadas em fotomicroscópio Zeiss com analisador de imagens Axiovision 3.1 para
Windows acoplado. Esse software foi utilizado na medição das áreas nuclear e nucleolar e
também na análise densitométrica do nucléolo.
As medidas foram obtidas a partir das mesmas 50 células de Sertoli utilizadas na
avaliação qualitativa, as quais foram submetidas à impregnação por nitrato de prata. Em
espécies com um único espécime, 100 células de Sertoli foram analisadas.
A análise densitométrica corresponde a uma escala arbitrária (0 a 255) na qual 0
corresponde a pouco denso (branco) e 255 corresponde a muito denso (preto).
Resultados
As células de Sertoli de morcegos, assim como da maioria dos mamíferos, são
células facilmente distinguíveis, sendo células grandes e disformes que apresentam núcleos
bem maiores que os das células germinativas, com formato oval ou alongado e, na maioria
das espécies, com um típico e grande nucléolo (Fig. 1).
Impregnação por íons prata
Em 100% das células de Sertoli das espécies A. lituratus, A. planirostris, C.
perspicillata, C. planirostris, M. rufus, P. discolor e P. lineatus foi observado apenas um
nucléolo, geralmente disforme e ocupando a área central (Fig. 2A - 2G). Nas células de A.
Artigo 2 75
lituratus e A. planirostris de 4 a 6 subcomponentes menores e facilmente observáveis
formam esse nucléolo único (Fig. 2A e B). A freqüência no número de subcomponentes foi
variável nas células, sendo em A. lituratus de 30% para 4 subcomponentes, 35% para 5 e
35% para 6 e de 25% para 4, 35% para 5 e 40% para 6 em A. planirostris. Nas células das
espécies C. perspicillata, C. planirostris e M. rufus o nucléolo apresentou um formato mais
bem definido, com aspecto circular e bem delimitado (Figs. 2C – 2E). Nas células de P.
discolor e P. lineatus o nucléolo apresentou formato irregular e constituído de dois
subcomponentes em 79% das células de P. lineatus (Fig. 2F) e em 56% das células de P.
discolor (Fig. 2G).
Nas preparações de M. molossus foram observadas três situações para as células de
Sertoli, onde 62% delas apresentaram duas marcações distintas e individualizadas na forma
de dois nucléolos (Fig. 2H), em 32% das células um único nucléolo disforme e ocupando a
área central e em 6% uma marcação difusa (Fig. 2I).
Em H. velatus o nucléolo das células de Sertoli apresentou formato irregular, com
uma textura filamentar e ocupando boa área do núcleo (Fig. 2J).
Em M. nigricans quatro situações foram observadas, onde em 40% das células o
nucléolo apresentou um formato irregular, espalhado e com uma textura filamentar (Fig.
2K), assim como o observado em H. velatus; em 36% das células foi observado um único
nucléolo disforme ocupando boa parte da área central do núcleo; em 18% das células dois
nucléolos (Fig. 2L) e em 6% das células uma marcação difusa.
Alaranjado de Acridina
As células de Sertoli coradas pelo alaranjado de acridina foram facilmente
observadas apresentando-se claramente diferenciadas dos outros tipos celulares do epitélio
seminífero, por possuírem núcleos grandes e disformes, coradas na sua maior parte em
Artigo 2 76
vermelho (indicativo de concentração de DNA) e com marcações menores em amarelo,
indicativas de regiões de acúmulo de RNAs (Fig. 3).
Nas espécies A. lituratus, A. planirostris, C. perspicillata, C. planirostris, M. rufus
e P. lineatus 100% das células apresentaram uma única marcação fluorescente central
localizada, possivelmente, sobre a área nucleolar (Figs. 4A - 4F). Na espécie P. discolor as
células apresentaram em 71% delas, além da marcação central observada em todas as
células, outras 1 a 4 pequenas marcações espalhadas (Fig. 4G).
Com freqüências variadas no número de marcações, as células de Sertoli de M.
molossus apresentaram três diferentes padrões, onde 54,8% das células apresentaram
somente uma grande marcação central; 26,4% apresentaram duas marcações distintas (Fig.
4H) e 19% apresentaram a marcação fluorescente espalhada em torno do núcleo sem
limites definidos e irregulares (Fig. 4I).
Nas células de Sertoli da espécie H. velatus o padrão foi nitidamente distinto, com
100% das células apresentando várias pequenas marcações fluorescentes de tamanhos
variados e irregulares (Fig. 4J). As marcações apareceram em número de dois (37,6%), três
(35,1%) e quatro ou mais (27,3%). Todas marcações estavam localizadas em área
periférica ao nucléolo.
A espécie com maior variação foi M. nigricans, onde as células de Sertoli
apresentaram quatro padrões distintos, com 61,2% das células apresentando somente
pequenas marcações fluorescentes, estas de tamanhos variados (Fig. 4K), condição
também observada em H. velatus; 24,5% apresentando células com somente uma única
marcação central (Fig. 4L); 13% apresentando duas marcações e 1,3% apresentando
marcações fluorescentes irregulares espalhadas em torno do núcleo e sem limites definidos.
Artigo 2 77
Análise Quantitativa
As medidas tomadas relativas à relação de área nucleolar/área nuclear (Nu/N) e do
índice densitométrico dos nucléolos, estão apresentadas na Tabela 1. Podemos observar
que C. perspicillata foi a espécie que apresentou a menor porcentagem de Nu/N (4,5%) e
também o menor índice densitométrico. Platyrrhinus lineatus e P. discolor apresentaram
uma porcentagem de Nu/N bem próxima a dos molossídeos C. planirostris e M. rufus. A.
lituratus e A. planirostris apresentaram uma maior porcentagem que as espécies anteriores,
e essas estão bem próximas a de M. molossus. Já os vespertilionídeos apresentaram as
maiores porcentagens de Nu/N, além de H. velatus possuir o segundo maior índice
densitométrico (186,6), tendo em vista que o maior valor foi observado em M. rufus.
Discussão
Originalmente descrita por Enrico Sertoli em 1865, a célula de Sertoli desempenha
uma função auxiliar crucial na espermatogênese (Petersen e Söder 2006). Essas células
apresentam, geralmente, um único e grande nucléolo na maioria das espécies de mamíferos
estudadas (Hodgson et al. 1979; Pawar e Wrobel 1991; Guttenbach et al. 1996). Nas
espécies de morcegos estudadas a presença de um único nucléolo central foi à
característica comum, no entanto, esse apareceu constituído por um número variável de
subcomponentes. A individualização de subcomponentes na constituição do nucléolo
dessas espécies é devida a características de arranjo das estruturas que compõem o
nucléolo, e em especial das proteínas argirofílicas que nele estiverem presentes, uma vez
que são elas que reagem com a prata.
Uma outra associação que pode ser feita quanto à variação na presença e número
dos subcomponentes é de que eles parecem variar de acordo com o número de RONs que
as espécies apresentam, pois a variação total ficou dentro do número de RONs que cada
espécie apresenta, ou seja, um único componente para C. perspicillata, um ou dois para P.
Artigo 2 78
discolor e P. lineatus e de quatro a seis para A. lituratus e A. planirostris, que apresentam
respectivamente uma, duas e seis RONs. As exceções foram C. planirostris e M. rufus, que
apesar de apresentarem duas RONs, apresentaram apenas um único componente. Apesar
da variação de subcomponentes, a predominância de um único nucléolo na maioria das
células reforça o evento de fusão das RONs durante a formação do nucléolo, que
apresentou morfologia variada, o que possivelmente esta refletindo diferenças no arranjo
das estruturas e na expressão gênica.
Mirre e Knibiehler (1982) observaram em ratos que, apesar de apresentar cinco
pares de cromossomos com RONs, as células de Sertoli possuem um único nucléolo que
também apresenta variação em seus subcomponentes. Eles observaram que o número de
centros fibrilares varia de célula para célula e que quanto maior for o número de centros
fibrilares ativos, maior será o tamanho nucleolar. No presente estudo observamos que o
nucléolo das células de Sertoli variou não só em número de subcomponentes, mas também
em morfologia e expressão.
O nucléolo com formato filamentar e disperso indica que, possivelmente, o
mecanismo fisiológico que coordena a junção das RONs e de seus centros fibrilares na
formação de um único nucléolo, observado nas células de Sertoli da maioria dos
mamíferos, está ausente ou modificado em H. velatus e M. nigricans. Nessas espécies,
possivelmente, as RONs encontram-se desconectadas, com seus centros fibrilares ativos
concentrando proteínas nucleolares em diversos pontos separados, não dando o aspecto
circular comum do nucléolo das células de Sertoli de outros mamíferos.
A presença de mais de um nucléolo nas células de Sertoli de M. nigricans e M.
molossus, também indica que essa fisiologia celular pode estar modificada em certos
momentos do ciclo do epitélio seminífero de algumas espécies. Possivelmente, em estágios
do ciclo de grande requerimento nutricional ou hormonal as células de Sertoli sejam
fortemente estimuladas a produção, e essa super-expressão pode ser sustentada por um
Artigo 2 79
aumento na atividade e, por conseguinte, no tamanho nucleolar na maioria das espécies, no
entanto, a separação das RONs para formação de novos nucléolos pode ter sido,
possivelmente, um mecanismo fisiológico importante estabelecido nessas espécies.
O padrão de expressão evidenciado pelo alaranjado de acridina foi semelhante ao
observado na impregnação pela prata, e de forma geral detectou apenas uma única
marcação central na maioria das espécies, à exceção de P. discolor que apresentou alguns
pontos com expressão aparentemente fora da região nucleolar. Esses pontos,
possivelmente, tratam-se de regiões de expressão de RNAm, uma vez que o alaranjado de
acridina marca diferencialmente DNA e RNA inespecificamente (Kosower et al.1992).
As espécies que apresentaram maior variação de padrões na morfologia nucleolar e
expressão nas células de Sertoli foram M. molossus, H. velatus e M. nigricans, em que a
presença de nucléolos irregulares ou em número de dois foi observada.
Em H. velatus o nucléolo apresentou um padrão atípico de morfologia nucleolar,
com aspecto filamentar e difuso. Essa conformação pode ser devida a uma maior
desespiralização do DNA ribossômico durante a expressão nessa espécie ou uma maior
quantidade de motivos repetitivos de DNAr. A expressão desse nucléolo filamentar,
observada na coloração pelo alaranjado de acridina, indica que ela ocorre apenas nas
extremidades e de forma pontual.
O padrão observado em M. nigricans, com variação na composição e expressão,
pode ser devido ao seu grande número de RONs, ao menos 5 pares (Marchesin 2002), que
possibilitam maiores possibilidades de adequações fisiológicas.
Não se pode também excluir, como condição responsável por parte da variação
observada nas espécies, o artefato de técnica, onde o processo de obtenção das células pode
desestruturar a composição nucleolar, espalhado ou alterando a posição de seus
subcomponentes. Contudo, nos parece mais provável que as diferenças sejam também
Artigo 2 80
conseqüências das variações fisiológicas dos estágios do ciclo espermatogênico das
diferentes espécies.
Mudanças funcionais e morfológicas das células de Sertoli durante o ciclo do
epitélio seminífero já foram observadas por diversos autores, essas alterações podem ser
observadas na ultraestrutura das mitocôndrias (Posalaki et al. 1968), microtúbulos (Fawcett
1975), complexo de Golgi (Chen e Yates 1975), lisossomos (Chemes 1986) e em várias
outras organelas (Assaf 1980; Kerr 1988; Wrobel e Schimmel, 1989). No entanto, a
maioria dessas alterações morfológicas cíclicas é observada, principalmente, na parte basal
do citoplasma.
Wrobel e Schimmel (1989) e Pawar e Wrobel (1991) observaram que o volume e a
área do núcleo das células de Sertoli de touros e búfalos, respectivamente, também
variaram ciclicamente, no entanto, essas variações não eram significativas, apresentando
valores relativamente constantes durante todo o ciclo. Essas observações estão de acordo
com o observado para outros mamíferos (Johnson e Nguyen 1986; Sinha Hikin et al. 1989;
Russel et al. 1990).
No presente estudo também ocorreram variações intra-específicas na área nuclear e
nucleolar, e que, possivelmente, podem ser devidas a variações funcionais dessas células
durante o ciclo, como o observado em outros mamíferos. No entanto, não pode ser, de
novo, descartada a hipótese de um possível efeito de hipotonização diferencial decorrente
da técnica de obtenção dessas células.
A relação área nucleolar/área nuclear nas espécies analisadas variou entre as
espécies de diferentes famílias, assim como dentro de uma mesma família. Não foi
possível correlacionar a área nucleolar e a densitometria com o número de RONs que as
espécies apresentam. Apenas a espécie C. perspicillata, que apresentou a menor
porcentagem de área nucleolar/área nuclear e também o menor índice densitométrico,
correlaciona-se diretamente com o número de RONs, uma vez que a sua única RON,
Artigo 2 81
possivelmente é super expressa para poder desempenhar um papel fisiológico adequado.
Apesar do menor tamanho e de uma menor compactação em seus componentes, o nucléolo
de C. perspicillata assemelhou-se ao dos outros filostomídeos que possuem um par de
RONs, ou seja P. discolor e P.lineatus.
As espécies C. planirostris e M. rufus, que possuem um par de RONs, apresentaram
uma relação área nucleolar/área nuclear semelhante às espécies de filostomídeos que
também tem um par de RONs, indicando que as células estão, possivelmente, sobre o
controle de um mesmo processo fisiológico.
Molossus molossus novamente se diferenciou dos demais molossídeos e, apesar de
também possuir apenas um par de RONs, apresentou uma relação de área nucleolar/área
nuclear próxima a das espécies de filostomídeos que possuem três pares de RONs (A.
lituratus e A. planirostris).
Os vespertilionídeos se diferenciaram das outras espécies, apresentando uma maior
relação de área nucleolar/área nuclear. Apesar de H. velatus possuir apenas um par de
RONs, essa espécie apresentou uma relação de área nucleolar/área nuclear bem maior que
a de espécies com maior número de RONs. Isso pode ser devido a sua conformação em
forma filamentar, que propicia mais sítios de interação das proteínas nucleolares com o
nucléolo. Já M. nigricans apresentou a maior porcentagem de área nucleolar/área nuclear,
acima dos 10%, possivelmente, por essa espécie apresentar o maior número de RONs
dentre todas as espécies analisadas.
Analisando os dados conjuntamente podemos perceber que as células de Sertoli das
espécies de Phyllostomidae apresentam um único e bem distinto nucléolo que é formado
pela interação de todas as RONs em um único ponto, esse nucléolo apresenta um padrão de
expressão periférica e a relação de área nucleolar/área nuclear é proporcional ao número
total de RONs que as espécies apresentam. Observamos que o mesmo é valido para as
espécies de Molossidae, C. planirostris e M. rufus, mas que M. molossus se diferencia dos
Artigo 2 82
demais, tanto qualitativa quanto quantitativamente. Essa diferenciação, possivelmente, se
deve a uma regulação fisiológica exclusiva de M. molossus. Vespertilionidae apresenta
características morfológicas únicas, em relação às outras espécies, e também uma maior
relação de área nucleolar/área nuclear.
Apesar da importância funcional que as células de Sertoli apresentam e aos vários
mecanismos que regulam, o padrão nucleolar foi variável dentro e entre as diferentes
famílias de morcegos sendo que, dentro de uma mesma família, a variação está mais
relacionada ao número total de RONs que as espécies apresentam.
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Artigo 2 86
Fig. 1 Aspecto geral da lâmina com suspensão testicular de Molossus rufus submetida a
impregnação por nitrato de prata. Células de Sertoli (S), célula mióide (M),
espermatogônia (Sg) e espermátide (Sd). Barra = 10 µm.
Fig. 2 Células de Sertoli submetidas a impregnação por nitrato de prata. A. Artibeus
lituratus. B. Artibeus planirostris. C. Carollia perspicillata. D. Cynomops planirostris. E.
Molossus rufus. F. Platyrrhinus lineatus. G. Phyllostomus discolor. H e I. Molossus
molossus. J. Histiotus velatus. K e L. Myotis nigricans. Barras = 10 µm.
Fig. 3 Aspecto geral da lâmina com suspensão testicular de Phyllostomus discolor
submetida a impregnação por nitrato de prata. Células de Sertoli (S), espermatogônia (Sg),
espermatócito primário (I) e espermátide (Sd). Barra = 10 µm.
Fig. 4 Células de Sertoli submetidas ao alaranjado de acridina. A. Artibeus lituratus. B.
Artibeus planirostris. C. Carollia perspicillata. D. Cynomops planirostris. E. Molossus
rufus. F. Platyrrhinus lineatus. G. Phyllostomus discolor. H e I. Molossus molossus. J.
Histiotus velatus. K e L. Myotis nigricans. Barras = 10 µm.
Artigo 2 – Figura 1 87
Artigo 2 – Figura 2 88
Artigo 2 – Figura 3 89
Artigo 2 – Figura 4 90
Artigo 2 – Table 1 91
Tabela 1. Relação de área nucleolar / área nuclear e índice densitométrico dos nucléolos
das espécies: Artibeus lituratus, Artibeus planirostris, Carollia perspicillata, Phyllostomus
discolor, Platyrrhinus lineatus (Phyllostomidae), Cynomops planirostris, Molossus
molossus, Molossus rufus (Molossidae), Histiotus velatus e Myotis nigricans
(Vespertilionidae).
Família Espécies
Relação de área nucleolar/
área nuclear (%)
Índice
Densitométrico
A. lituratus 5,89 148,4
A. planirostris 6,06 179,09
C. perspicillata 4,5 127,92
P. discolor 4,94 161,69
Phyllostomidae
P. lineatus 4,67 172,62
C. planirostris 4,61 130,2
M. molossus 5,72 159,15
Molossidae
M rufus 4,82 186,6
H. velatus 7,12 181,61
Vespertilionidae
M. nigricans 10,75 133,93
Artigo 3 92
V. ARTIGO 3
Comportamento do nucléolo e das regiões organizadoras nucleolares
(RONs) durante a divisão meiótica em espécies de morcegos
Mateus Rodrigues Beguelini
a
, Sandra Regina de Carvalho Marchesin
a
, Maria Tercília
Vilela de Azeredo Oliveira
b
, Eliana Morielle Versute
a
a
Laboratório de Chiroptera, Departamento de Zoologia e Botânica, UNESP -
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, São José do Rio Preto, São
Paulo, Brasil 15054-000
b
Departamento Biologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” –
UNESP/IBILCE, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil 15054-000
Short Title: Comportamento nucleolar na meiose de morcegos.
Corresponding author. Tel.: +55 17 32212369. FAX: + 55 17 32212374
E-mail address: [email protected] (Eliana Morielle-Versute)
Artigo 3 93
Resumo
O nucléolo tem sido proposto como o paradigma da compartimentalização nuclear
funcional. Estudos revelam que cada um dos seus subcompartimentos apresenta uma
distribuição diferencial, dispersando-se para diferentes partes da célula durante a divisão
mitótica. Apesar das diferentes abordagens sobre o ciclo nucleolar, há ainda muito a ser
entendido, principalmente na divisão meiótica e, em decorrência disso, o objetivo desse
estudo foi analisar a nucleologênese meiótica em cinco espécies de morcegos que
apresentam variação no número de regiões organizadoras nucleolares (RONs): Artibeus
lituratus e Artibeus planirostris (3 pares), Carollia perspicillata (RON no cromossomo X),
Myotis nigricans (5 pares) e Platyrrhinus lineatus (1 par). As marcações encontradas no
FISH corroboram estudos da literatura confirmando o número de locos de DNAr
observados após coloração pela prata, ou seja apenas um sítio de DNAr em C.
perspicillata, dois em P. lineatus, seis em A. lituratus e A. planirostris e dez em M.
nigricans. A desorganização do nucléolo, de todas as espécies, inicia-se quando as
espermatogônias entram em meiose, onde o material nucleolar passa a comportar-se de até
três maneiras. Parte dele dissolve-se no nucleoplasma, outra parte permanece associada as
RONs durante toda a divisão meiótica e outra junta-se as regiões pericromossomais. A
atividade diferencial de RONs e a fusão nucleolar são eventos que também ocorrem nas
células meióticas de morcegos.
Palavras-chave: Nucleologênese, Nucléolo, Chiroptera.
Introdução
A regularidade do processo espermatogênico está ligada aos processos genéticos,
transcricionais, traducionais e reguladores, onde o ciclo é mantido por uma grande rede de
reações que vai desde a ativação e desativação gênica, até a produção de proteínas que
coordenam as divisões celulares. Dentro deste rico e complexo sistema encontramos um
Artigo 3 94
outro ciclo muito importante, o ciclo nucleolar. Este ciclo caracteriza-se por alterações na
forma e tamanho dos nucléolos, em conseqüência do papel funcional dos vários domínios
nucleolares, que desorganizam-se e reorganizam-se durante o ciclo, caracterizando o
fenômeno denominado nucleologênese (Sirri et al. 2002).
Nas células de eucariotos superiores, no início da mitose quando a transcrição do
DNA ribossômico (DNAr) é reprimida, o nucléolo começa a se desorganizar e não pode
mais ser observado durante toda a mitose. Por outro lado, ao fim da mitose ele se
reorganiza concomitantemente com a restauração da transcrição do DNAr e torna-se
funcionalmente ativo ao longo de toda a intérfase (Sirri et al. 2008).
O nucléolo tem sido proposto como o paradigma da compartimentalização nuclear
funcional (Strouboulis & Wolffe 1996). Ele é o sítio de biogênese dos ribossomos e sua
maquinaria nucleolar apresenta-se distribuída em diferentes compartimentos. Quando
observado em microscopia eletrônica, três principais componentes (compartimentos)
podem ser distinguidos nas células de mamíferos: o centro fibrilar (CF), o componente
fibrilar denso (CFD) e o componente granular (CG). Os CFs são áreas claras, parcial ou
totalmente rodeadas por uma região altamente contrastada, o CFD, e ambos estão
embebidos no CG (Sirri et al. 2008).
O CF contém centenas de cópias de genes DNAr arranjados em um ou mais
arranjos em tandem, em vários locos cromossômicos denominados regiões organizadoras
nucleolares (RONs). Apesar dos vários genes, somente um subconjunto deles está
normalmente ativo e este parece ter uma localização mais periférica, estendendo-se para o
CFD, onde são observados os RNAs ribossômicos recém transcritos. No CG, o mais
periférico, vão ocorrer os eventos finais do processamento dos transcritos de RNAr, com a
formação das partículas pré-ribossomais que serão translocadas para o citoplasma através
dos poros nucleares (Carmo-Fonseca et al. 2000).
Artigo 3 95
A localização dos componentes nucleolares está correlacionada com sua função na
produção das subunidades ribossômicas. Cadeias de RNA ribossômico (RNAr) em
transcrição são localizadas na junção dos CFs com o CFD e se acumulam no CFD (Puvion-
Dutilleul et al. 1997; Cmarko et al. 2000; Guillot et al. 2005). Por outro lado, o
processamento do pré-RNAr é iniciado junto ao sítio de transcrição no CFD (Cmarko et al.
2000) e continua durante a migração intra-nucleolar do RNA até o CG. Do mesmo modo,
as proteínas nucleolares que participam das primeiras etapas do processamento do RNAr,
como a fibrilarina e a nucleolina, localizam-se no CFD (Puvion-Dutilleul et al. 1991;
Ginisty et al. 1998), enquanto que proteínas como a B23/NPM e a PM-Scl 100, que estão
envolvidas nas etapas intermediárias e tardias do processamento, localizam-se no CG
(Biggiogera et al. 1989; Gautier et al. 1994).
Estudos revelam que cada um desses subcompartimentos existente dentro do
nucléolo apresenta uma distribuição diferencial ao longo da divisão celular, dispersando-se
para diferentes partes da célula durante a divisão mitótica (Hernandez-Verdun et al. 1993;
Dundr et al. 1997; Leung et al, 2004; Chen et al. 2005).
Apesar das diferentes abordagens sobre o ciclo nucleolar, há ainda muito a ser
entendido, principalmente na divisão meiótica, merecendo destaque o fato de que nas
células somáticas a transcrição é suspensa no início do ciclo de condensação
cromossômica, mas nas células gaméticas os genes ribossomais são ativos durante a
prófase I – leptóteno, zigóteno e início do paquíteno, nos espermatócitos, e até o diplóteno,
nos oócitos (Wachtler & Sthal 1993), o que propicia a análise mais prolongada dos
eventos. Além disso, a maioria das observações sobre RONs e nucléolos foram feitas em
espécies chave, como humanos e roedores, estabelecendo suas características morfológicas
e fisiológicas básicas, no entanto, a investigação de como a nucleologênese pode ser
afetada pela variação no número de RONs não foi notadamente explorada.
Artigo 3 96
Em decorrência da escassez de informações e do interessante aspecto envolvendo a
nucleologênese em células meióticas, o objetivo do presente estudo foi analisar esse
interessante processo em células meióticas de cinco espécies de morcegos que apresentam
variação no número de RONs: Artibeus lituratus e Artibeus planirostris (3 pares), Carollia
perspicillata (RON no cromossomo X: 1 par na fêmea e uma RON no macho),
Platyrrhinus lineatus (1 par) (Morielle & Varella-Garcia 1988) e Myotis nigricans (5
pares) (Marchesin 2002), por meio de técnicas que possibilitam a identificação de
diferentes estruturas envolvidas no processo (proteínas nucleolares, RNAs e DNAr).
Materiais e Métodos
Animais
Foram avaliados quatro espécimes, sexualmente maturos, das espécies Artibeus
lituratus, Artibeus planirostris, Carollia perspicillata, Myotis nigricans e Platyrrhinus
lineatus. Os animais foram capturados com o uso de redes de espera na região urbana de
São José do Rio Preto (São Paulo, Brasil). A fim de preservar os espécimes testemunhos,
esses foram fixados, catalogados e depositados na coleção científica do laboratório de
Chiroptera, IBILCE-UNESP.
Suspensão Meiótica
Após a morte do animal, que seguiu o proposto por Oliveira-Filho (1999), os
testículos foram removidos e macerados em placas de Petri contendo solução hipotônica de
KCl (0,075 M) e colquicina (0,1%), onde permaneceram por 40 minutos a temperatura
ambiente. A suspensão celular foi então centrifugada a 1000 rpm por 6 minutos, o
sobrenadante descartado e de 7 a 9 ml de solução fixadora, metanol: ácido acético (3:1) foi
adicionada por 15 minutos. A suspensão foi centrifugada e a solução fixadora trocada mais
duas vezes. A suspensão final foi pingada sobre lâminas de vidro limpas e as células
Artigo 3 97
submetidas aos procedimentos de impregnação por nitrato de prata (Kavalco & Pazza,
2004), coloração pelo alaranjado de acridina (Abrams et al. 1993) e a hibridização in situ
fluorescente (FISH) com sonda de DNAr.
Hibridização in situ Fluorescente (FISH)
Nesse procedimento foi utilizada a sonda de DNA ribossômico de Xenopus laevis,
fornecida pela Dra Shirlei Recco Pimentel (UNICAMP). As lâminas foram submetidas a
um pré-tratamento envolvendo a desidratação do material em uma série de álcoois (70, 85
e 100%), e uma digestão enzimática por pepsina (8%) e Rnase (1%). Após o pré-
tratamento, o material foi desnaturado em solução de formamida a 70%, pH 7,0 a 70
º
C
durante 2 minutos, lavado em uma série de álcoois gelados, seco e colocado a hibridizar
com a sonda de seqüência de DNAr marcada com biotina, por um período, em média, de
36 horas a 37
º
C. A detecção da hibridização foi feita pela incubação das lâminas em
solução de fluorosceína-isocianato (FITC-avidina Vector) por 20 minutos e contra
coloração com iodeto de propídio (PI) 0,3 µg/ml e diamidino-fenilindole (DAPI) 0,5
µg/ml.
As lâminas foram analisadas em foto microscópio de fluorescência Zeiss Axiophot
II e as melhores imagens foram capturadas digitalmente com o auxílio de uma câmera
Zeiss Axiocam MR por meio do programa Axiovision 3.1 para Windows.
Resultados
Impregnação por íons prata
As células de A. lituratus e A. planirostris apresentaram as mesmas características,
com as espermatogônias apresentando quatro (Fig. 1A) a seis nucléolos que nos
espermatócitos primários (leptóteno) começam a desorganizar-se e os componentes
nucleolares passam a se comportar de duas ou três maneiras (Figs. 1B – 1I). Parte deles
Artigo 3 98
podem ser visualizados como marcações irregulares que se dissolvem no nucleoplasma
(Fig. 1D), outra parte associa-se às regiões pericromossomais (Fig. 1D – 1G) e a terceira
permanece associada às RONs durante toda a divisão (Fig. 1G – 1K). As células em
metáfase I apresentaram seis cromossomos marcados (Fig. 1J), e em metáfase II um a três
cromossomos marcados (Fig. 1K). Nas espermátides um a cinco nucléolos foram
observados (Fig. 1L).
A análise das células de C. perspicillata submetidas à impregnação por nitrato de
prata revelou nas espermatogônias e nos espermatócitos primários iniciais (leptóteno) a
presença de um único nucléolo (Fig. 2A). À medida que ocorre o avanço na compactação
cromossômica esse nucléolo desorganiza-se e seus componentes podem ser visualizados
como marcações irregulares no nucleoplasma (Fig. 2B), associados às RONs, onde são
observados durante toda a divisão celular (Fig. 2C – 2E) e associados às regiões
pericromossomais (Fig. 2F). Nas células em metáfase II foram observados um ou nenhum
cromossomo marcado (Fig. 2G e 2H). Nas espermátides um único e grande nucléolo foi
notado (Fig. 2I).
Em P. lineatus as espermatogônias apresentaram um (Fig. 3A) ou dois nucléolos,
os espermatócitos primários iniciais (leptóteno) um único nucléolo (Fig. 3B) que, a
semelhança do observado em A. lituratus, com a compactação cromossômica desorganiza-
se, e seus componentes são visualizados no nucleoplasma, associados às RONs e às regiões
pericromossomais (Figs. 3B – 3F). As células em metáfase mitótica apresentaram dois
cromossomos marcados (Fig. 3G), e em metáfase meiótica I uma única marcação
(bivalentes) foi observada (Fig. 3H). Nas espermátides um único e bem definido nucléolo
foi observado (Fig. 3I).
Em M. nigricans foram observadas espermatogônias com cinco a dez marcações
(Fig. 4A) que se desorganizam e passam a ser observadas como pontos escuros sobre os
cromossomos (Figura 4B – 4D). Nas metáfases I até dez cromossomos marcados (5
Artigo 3 99
bivalentes) foram visualizados (Figura 4E) e nas espermátides uma a cinco marcações
foram características (Fig. 4F).
Hibridização in situ fluorescente (FISH)
As células das diferentes espécies quando hibridizadas com a sonda DNAr
apresentaram marcações indicativas dos sítios cromossômicos de DNAr hibridizados com
as seqüências características da sonda. Os sinais fluorescentes indicativos da hibridização
foram melhor evidenciados em espermatócitos primários, por esses encontrarem-se em um
estado de maior condensação, facilitando a visualização e distinção da fluorescência. Já em
células em intérfase, devido ao recrutamento ocasional de mais de um cromossomo com
RON para a formação do nucléolo e do acentuado grau de descondensação cromossômica,
foram observados números variados de sinais, além de intensidades diferentes.
Os três tipos celulares de C. perspicillata, ou seja, as espermatogônias,
espermatócitos primários e espermátides recém formadas e em alongamento apresentaram
uma única marcação fluorescente, com variação no tamanho, evidenciada pela intensidade
de fluorescência (Figs. 5A – 5H).
Nas preparações de P. lineatus células mióides, não detectadas nas preparações das
outras espécies, apresentaram uma ou duas marcações fluorescentes (Fig. 5I), as
espermatogônias apresentaram uma (Fig. 5J) ou duas marcações fluorescentes (Fig. 5K), os
espermatócitos primários uma única e grande marcação fluorescente que ao longo da
divisão meiótica se subdivide em duas marcações (Figs. 5L – 5P), ou espermatócitos com
duas marcações fluorescentes já distintas (Figs. 5Q – 5S) e espermátides com uma única
marcação (Fig. 5T).
Em A. lituratus os espermatócitos primários iniciais (leptóteno) apresentaram duas
a três marcações fluorescentes (Fig. 6A) que ao longo da divisão meiótica se subdividem
em até seis marcações distintas (Figs. 6B – 6E). Nas células em metáfase II foram
Artigo 3 100
observados três cromossomos marcados (Fig. 6F). As espermátides apresentaram uma
única e grande marcação (Fig. 6G) ou duas ou três marcações menores (Fig. 6H).
As suspensões testiculares de A. planirostris apresentaram resultados semelhantes
aos observados em A. lituratus.
As espermatogônias da espécie M. nigricans apresentaram de cinco a dez
marcações fluorescentes (Fig. 7A). Nos espermatócitos primários o número de marcações
fluorescentes foi variável (Figs. 7B – 7D) e nas espermátides uma a cinco marcações foram
notadas (Fig. 7E). Os espermatozóides exibiram uma ou duas marcações fluorescentes
anteriores (Fig. 7F).
Alaranjado de acridina
De maneira geral, todas as espécies submetidas ao alaranjado de acridina
apresentaram um mesmo padrão, sendo observada marcações indicando a presença de
RNA intra-nuclear, tanto em células interfásicas como também nas células em divisão
meiótica.
A análise das células de C. perspicillata revelou espermatogônias com uma
marcação fluorescente central (Fig. 8A), indicativa, possivelmente, da região nucleolar. Os
espermatócitos primários iniciais (leptóteno) apresentaram marcações (áreas vermelhas)
indicativas de concentração de RNA espalhadas pelo núcleo (Fig. 8B) que, no decorrer da
divisão meiótica vão se desorganizando (Fig. 8C – 8F), e apenas marcações pontuais
podem ser observadas, e essas, geralmente, diminuem de tamanho ao longo da
compactação cromossômica, desaparecendo na metáfase (Fig. 8G). Nas espermátides a
marcação fluorescente única é novamente observada (Fig. 8H). Esses resultados
evidenciam que, ao longo da prófase meiótica as regiões ricas em RNA se desorganizam e
o material pode ser observado, à semelhança dos subcomponentes nucleolares,
Artigo 3 101
dissolvendo-se no nucleoplasma, movendo-se para fora do núcleo ou ainda associado às
regiões pericromossomais.
Em P. lineatus as observações foram semelhantes às de C. perspicillata, onde as
espermatogônias apresentaram uma única marcação fluorescente central (Fig. 8I), os
espermatócitos primários (leptóteno) apresentaram pontos indicativos de concentração de
RNA (Fig. 8J) que, no decorrer da compactação cromossômica vão se desorganizando e as
marcações passam a ser observadas na periferia nuclear, assim como associados a certas
porções dos cromossomos (Figs. 8K – 8N), desaparecendo na metáfase (Fig. 8O). Nas
espermátides a marcação fluorescente central é novamente observada (Fig. 8P).
Nas preparações de A. lituratus e A. planirostris as espermatogônias apresentaram
uma a três marcações fluorescentes (Fig. 9A), os espermatócitos primários iniciais
(leptóteno) apresentaram pontos de concentração de RNA (Fig. 9B) que, à semelhança do
observado nas espécies anteriores, no decorrer da compactação cromossômica vão se
desorganizando e as marcações de RNA podem ser observadas na periferia nuclear, assim
como associados a certas porções dos cromossomos (Figs. 9C – 9E), desaparecendo no
diplóteno (Fig. 9F) e em metáfase (Fig. 9G). Nas espermátides uma a três marcações
fluorescentes são observadas (Fig. 9H).
Em Myotis nigricans as espermatogônias apresentaram uma a três marcações
fluorescentes distintas ou marcações difusas, que ocuparam grande parte do núcleo (Fig.
9I), os espermatócitos primários iniciais (leptóteno) apresentaram pontos de concentração
de RNA (Fig. 9J) que, no decorrer da compactação cromossômica se desorganizam e as
marcações sugestivas de RNA são, então, observadas na periferia nuclear, assim como
associadas a certas porções dos cromossomos (Figs. 9K – 9O). Uma a três marcações
fluorescentes distintas ou marcações difusas foram observadas nas espermátides (Fig. 9P).
Artigo 3 102
Discussão
A utilização do nitrato de prata na análise de estruturas nucleolares e de regiões
organizadoras nucleolares é uma metodologia citogenética básica já utilizada por muitos
autores. Por sua constituição química, a molécula combina-se às proteínas não histônicas e
aos componentes ácidos que estão associados às RONs, de forma que, após aquecimento,
esses podem ser seletivamente visualizados por métodos cito-histológicos rotineiros
(Howell 1982).
A utilização da prata nas células meióticas das cinco espécies de morcegos
analisadas evidenciou a presença do nucléolo nas diferentes células, bem como o ciclo de
eventos ao longo da divisão celular. O nucléolo começa a sua desorganização quando as
espermatogônias entram em meiose e, a semelhança do observado por Schwarzacher e
Wachtler (1993) e González-García e Rufas (1995), o material nucleolar se comportou de
duas ou três maneiras. Parte dele permaneceu associado às RONs durante toda a divisão,
outra parte ficou associado as regiões pericromossomais e uma terceira parte dissolveu-se
no nucleoplasma comum.
Para muitos autores (Roussel et al. 1993, 1996; Sirri et al. 1999), quando ocorre a
repressão da transcrição de DNAr durante a prófase tardia, a maquinaria de transcrição do
DNAr permanece associada com o DNAr nas RONs, e esse material pode ser visualizado
nas metáfases marcadas pela prata. Contudo, os componentes da maquinaria de
processamento dos pré-RNAr se dissociam do nucléolo ficando parcialmente distribuídos
na superfície de todos os cromossomos (Gautier et al. 1992; Hernandez-Verdun et al.
1993).
Wachtler e Sthal (1993) evidenciaram que nos espermatócitos os genes ribossomais
permanecem ativos durante a prófase I – leptóteno, zigóteno e início de paquíteno, ficando
sua maquinaria transcricional – RNA polimerase I e seus fatores de transcrição, associados
as RONs (Weisenberger & Scheer, 1995, Jordan et al. 1996, Roussel et al. 1996). Essa
Artigo 3 103
associação foi observada nas células de morcegos pela presença da marcação das RONs ao
longo de toda a meiose.
Estes resultados contrariam os achados de Hofgärtner e colaboradores (1979) que
ao estudarem a espermatogênese de quatro espécies de mamíferos (Homo sapiens, Mus
musculus, Rattus novergicus e Cavia cobaya), verificaram que estas espécies apresentavam
um padrão muito similar de atividade das RONs durante os vários estágios da
espermatogênese. Eles detectaram precipitados de prata nas espermatogônias em
crescimento e até o estágio de paquíteno da prófase meiótica. Observaram que durante as
metáfases I e II e durante a intercinese a coloração pela prata desaparecia completamente.
O ressurgimento da impregnação pela prata ocorria somente nas espermátides iniciais de
forma arredondada indicando uma reativação pós-mitótica de RONs. Esse ressurgimento
da impregnação nas espermátides iniciais e o seu desaparecimento ao longo do processo de
espermiação, também foi observado nas células de morcegos.
Mello (1995) encontrou corpos semelhantes a nucléolos associados aos
cromossomos ou livres no citoplasma, durante a mitose, em células MCF-10A, sugerindo
que estes representavam a persistência do nucléolo durante a mitose dessas células.
Dessa forma, assim como Mello (1995) hipotetizou a respeito dos nucléolos de
células em mitose, podemos dizer que a persistência de corpos semelhantes a nucléolos
durante a meiose dá suporte a idéia que o material nucleolar não se desorganiza
completamente durante a metáfase e anáfase, tendo um significado funcional ainda não
muito claro. Assim pode ser hipotetizado que estes corpos carregam um primeiro ou novo
material ou represente uma fonte de RNA nucleolar para as células filhas enquanto o novo
nucléolo está sendo organizado.
No presente estudo, a persistência do nucléolo durante a meiose espermatogênica
foi verificada pela observação de corpos semelhantes a nucléolos associados aos
Artigo 3 104
cromossomos das diferentes células ao longo do ciclo do epitélio seminífero, com
marcações sendo evidenciadas desde as espermatogônias até as espermátides.
Estudos envolvendo análises imunocitoquímicas e ultraestruturais tem hipotetizado
que, durante a divisão celular, as proteínas nucleolares estão homogeneamente distribuídas
ao redor dos cromossomos, as proteínas do processamento se concentram em alguns
pontos específicos designados de corpúsculos pré-nucleolares (PNBs) e partículas grandes
empacotam-se e se deslocam para o citoplasma. Durante a telófase há uma translocação
das proteínas da periferia dos cromossomos e dos PNBs para os sítios de transcrição e com
a reativação desses sítios, essas proteínas servem de material para a formação do novo
nucléolo (Dundr et al. 2000; Savino et al. 2001; Angelier et al. 2005)
O número de nucléolos observados nas células foi variável entre as espécies, sendo
que as que apresentam maior número de RONs, ou seja, M. nigricans, A. lituratus e A.
planirostris, apresentaram um maior número de nucléolos por célula interfásica, assim
como uma maior quantidade de material nucleolar nas células em divisão. Contudo, os
nucléolos observados não correspondem ao número de RONs nas diferentes fases das
células meióticas. É bem estabelecido que o número total de RONs que uma espécie
apresenta corresponde ao número máximo de nucléolos que podem ser encontrados em
suas células interfásicas, todavia, o número de RONs que são ativas em cada célula pode
variar e, portanto, o número de nucléolos pode ou não corresponder ao número total de
RONs. A ativação diferencial de RONs conduz a uma variação no número e tamanho dos
nucléolos, o que pode explicar a variação intra-específica no número de nucléolos
observados nas espermatogônias e espermátides das espécies analisadas.
As RONs fazem parte do centro fibrilar e, portanto, são indispensáveis à formação
do nucléolo (Carmo-Fonseca et al. 2000). Não só em Chiroptera, mas em vários outros
grupos de organismos, o número e a posição das RONs varia amplamente entre as espécies
e essa variação vai desde um par como o observado em P. lineatus, Molossus rufus e
Artigo 3 105
Lasiurus ega, até cinco pares como nas espécies Cynomops abrasus e M. nigricans
(Morielle & Varella-Garcia, 1988; Souza & Araújo, 1990; Morielle-Versute et al. 1996;
Marchesin, 2002). Além disso, as RONs podem ser encontradas tanto nas porções
terminais dos braços curtos de cromossomo autossômicos, como em regiões de constrição
secundária e intersticial. No caso específico da espécie C. perspicillata, a RON está
localizada na região intersticial do cromossomo X, que é único nos machos (Morielle &
Varella-Garcia, 1988). Toda essa variação pode, possivelmente, ter acarretado mudanças
significativas na nucleologênese das espécies de morcegos, explicando também parte da
variação interespecífica.
A hibridização in situ fluorescente (FISH) é uma técnica citoquímica com
sensibilidade para detectar seqüências específicas de ácidos nucléicos (DNA e RNA) em
estruturas biológicas conservadas. Seu princípio é baseado na complementariedade das
seqüências dos ácidos nucléicos ao invés da similaridade visual, ou seja, é o processo pelo
qual as bases de uma cadeia simples de ácido nucléico ligam-se por pontes de hidrogênio
com bases complementares de outra seqüência de ácido nucléico, para produzir uma
molécula híbrida de cadeia dupla. Portanto, esta técnica permite a visualização citológica
de seqüências específicas de DNA ou RNA e identificação segura de seguimentos
cromossômicos.
As marcações encontradas no FISH realizado nas suspensões testiculares das
espécies analisadas corroboram alguns estudos de citogenética convencional (Morielle &
Varella-Garcia 1988; Souza & Araújo 1990), confirmando o número de locos de DNAr
(RONs) observados após coloração pela prata, ou seja, apenas um sítio de DNAr em C.
perspicillata, dois em P. lineatus, seis em A. lituratus e A. planirostris e dez em M.
nigricans.
As marcações fluorescentes variaram em intensidade nas diferentes espécies
analisadas. Essa variação pode ser devida a não especificidade da sonda utilizada que pode
Artigo 3 106
ter resultado em uma baixa hibridização, ou ainda, a saída desta durante a lavagem pós-
hibridização. Entretanto, não pode ser descartada a diferença no número dos locos de
DNAr que certamente as espécies apresentam. A espécie que apresentou a maior marcação
fluorescente foi C. perspicillata, sugerindo que, apesar de apresentar uma única RON, o
número de seqüências repetitivas de DNAr não é necessariamente inferior ao das outras
espécies. Os rearranjos cromossômicos ocorridos na diferenciação das espécies de
morcegos e a localização variável das RONs evidenciam a participação desses nos eventos,
contudo o papel essencial dessas regiões têm sido garantido.
Situação inversa foi observada para as outras espécies analisadas, ou seja, quanto
maior o número de RONs menor foi a intensidade das marcações fluorescentes. Assim, as
marcações de P. lineatus apresentaram maior intensidade que as de A. lituratus e A.
planirostris e, essas, maiores que as observadas em M. nigricans.
Outro aspecto interessante das RONs em Chiroptera é a taxa elevada de fusão
nucleolar, onde devido a mudanças cíclicas da morfologia e fisiologia durante o ciclo
celular, e ao movimento, crescimento e aproximação, duas ou mais RONs podem se unir
formando um único nucléolo (Volleth 1987; Morielle & Varella-Garcia 1988). Essa fusão
também foi observada nas células meióticas e foi mais evidente nas espécies com maior
número de RONs, ou seja, A. lituratus, A. planirostris e M. nigricans.
O alaranjado de acridina pode ser usado como um marcador metacromático seletivo
de ácidos nucléicos, interagindo com DNA por intercalação e com RNA por atração
eletrostática. Essa interação pode ocorrer em células intactas ou em material desnaturado.
Sobre certas condições, o alaranjado de acridina intercala no DNA fluorescendo em verde
(525 nm) e liga-se eletrostaticamente ao RNA fluorescendo em vermelho (> 630 nm). Essa
capacidade nos permite distinguir células quiescentes de células ativadas, células
proliferativas, e também pode propiciar a detecção de múltiplos compartimentos em
células em G
1
.
Artigo 3 107
Segundo Kosower e colaboradores (1992), sobre certas condições, o DNA é
vulnerável a desnaturação e, a coloração pelo alaranjado de acridina nesse DNA
desnaturado foge à coloração normal, emitindo fluorescência vermelha. Isso explica a
coloração encontrada no presente trabalho, onde a dualidade verde/vermelho não foi
encontrada usualmente, mas sim em apenas alguns núcleos. Assim, os núcleos interfásicos
apresentaram DNA corado em vermelho e pontos de RNA em amarelo, e as células em
divisão meiótica apresentaram o DNA em tons verde/amarelos e o RNA em vermelho.
No presente estudo observamos que as células interfásicas (espermatogônias e
espermátides) apresentaram uma maior marcação fluorescente que as células em divisão, e
isso pode ser devido a inativação dos genes ribossomais e a degradação dos RNAs durante
o processo de divisão celular que, segundo Dundr e colaboradores (2000), na mitose é
interrompida no início da fase M (mitose) e os transcritos de pré-RNAr são liberados do
componente fibrilar denso, associados com os componentes do processamento. No entanto,
observamos que, à semelhança do que Wachtler e Sthal (1993) observaram, a atividade
transcricional das células em divisão meiótica é reprimida gradativamente, onde os genes
ribossomais permanecem ativos durante a prófase I – leptóteno, zigóteno e início do
paquíteno, podendo ser observada como marcações fluorescentes fortemente associadas a
certas regiões cromossômicas, só sendo interrompida no paquíteno tardio.
Corroborando com os achados de Mirre e Knibiehler (1985), que encontraram
variações ultraestruturais e funcionais nas espermátides, durante a espermiogênese de
camundongo, o presente trabalho também observou que as RONs reassumem sua atividade
nessas células, logo após as duas divisões meióticas, durante a fase de diferenciação da
espermátide. Esta atividade cai com a entrada das espermátides nas fases iniciais da
diferenciação espermiogênica e nenhuma transcrição nucleolar é visível durante as fases
posteriores.
Artigo 3 108
Os dados do presente trabalho evidenciam que a atividade diferencial de RONs e
fusão nucleolar são eventos que também ocorrem nas células meióticas de morcegos e que
os componentes nucleolares podem se comportar de até três formas durante a divisão
meiótica, como o observado para outros mamíferos.
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Fig. 1 Células testiculares de Artibeus lituratus submetidas a impregnação por nitrato de
prata. A. Espermatogônia. B. Espermatócito primário em leptóteno. C. Espermatócitos
primário em início de paquíteno. D - F. Espermatócitos primário em paquíteno. G - I.
Espermatócitos primário em diplóteno. J. Metáfase I, com seis cromossomos marcados
(setas). K. Metáfase II, com um único cromossomo marcado (seta). L. Espermátides.
Barras = 10 µm.
Fig. 2 Células testiculares de Carollia perspicillata submetidas a impregnação por nitrato
de prata. A. Espermatócito primário em leptóteno. B. Espermatócito primário em início de
paquíteno. C e D. Espermatócitos primário em paquíteno. E. Espermatócito primário em
paquíteno-diplóteno. F. Espermatócito primário em diplóteno. G e H. Metáfases II. Notar
um único cromossomo marcado em G (seta). I. Espermátides. Barras = 10 µm.
Fig. 3 Células testiculares de Platyrrhinus lineatus submetidas a impregnação por nitrato
de prata. A. Espermatogônia. B. Espermatócito primário em leptóteno. C. Espermatócito
primário em início de paquíteno. D. Espermatócito primário em paquíteno. E.
Espermatócito primário em leptóteno. F. Espermatócito primário em zigóteno. G. Metáfase
mitótica, com dois cromossomos marcados (setas). H. Metáfase meiótica I, com uma única
marcação (seta). I. Espermátides. Barras = 10 µm.
Fig. 4 Células testiculares de Myotis nigricans submetidas a impregnação por nitrato de
prata. A. Espermatogônia com sete marcações (setas). B. Espermatócito primário em início
de paquíteno. C. Espermatócitos primário em paquíteno. D. Espermatócito primário em
Artigo 3 113
paquíteno-diplóteno. E. Metáfase I, com cinco marcações (pontas de seta). F. Espermátide
com quatro marcações. Barras = 10 µm.
Fig. 5 Células testiculares de Carollia perspicillata (A – H) e de Platyrrhinus lineatus (I –
T) submetidas a hibridização in situ fluorescente (FISH). A. Espermatogônia. B.
Espermatócito primário em leptóteno. C. Espermatócito primário em zigóteno. D.
Espermatócito primário em início de paquíteno. E. Espermatócito primário em paquíteno.
F. Espermatócito primário em paquíteno-diplóteno. G. Espermátide recém formada. H.
Espermátides tardias. I. Célula mióide com duas marcações. J. Espermatogônia com uma
única marcação. K. Espermatogônia com duas marcações (setas). L. Espermatócito
primário em leptóteno com uma única marcação. M. Espermatócito primário em zigóteno.
N. Espermatócito primário em início de paquíteno. O e P. Espermatócitos primário em
paquíteno. Notar as RONs se separando (setas). Q. Espermatócito primário em zigóteno.
Notar as duas RONs já separadas. R. Espermatócito primário em início de paquíteno com
as RONs separadas (pontas de seta). S. Espermatócito primário em paquíteno-diplóteno
com as RONs separadas (setas). T. Espermátide. Barras = 10 µm.
Fig. 6 Células testiculares de Artibeus lituratus submetidas a hibridização in situ
fluorescente (FISH). A. Espermatócito primário em leptóteno com três marcações (setas).
B. Espermatócito primário em zigóteno com as seis RONs separadas (setas). C.
Espermatócito primário em início de paquíteno com apenas três marcações (setas). D.
Espermatócito primário em paquíteno com seis marcações (setas). E. Espermatócito
primário em diplóteno com seis marcações (pontas de seta). F. Metáfase II com três
cromossomos marcados (pontas de seta). G. Espermátide com uma única e grande
marcação. H. Espermátide com três marcações. Barras = 10 µm.
Artigo 3 114
Fig. 7 Células testiculares de Myotis nigricans submetidas a hibridização in situ
fluorescente (FISH). A. Espermatogônia com seis marcações (setas). B. Espermatócito
primário em zigóteno com uma grande marcação (seta). C. Espermatócito primário em
paquíteno. D. Espermatócito primário em paquíteno. E. Espermátide recém formada com
cinco marcações (setas). F. Espermátide tardia com duas marcações. Barras = 10 µm.
Fig. 8 Células testiculares de Carollia perspicillata (A – H) e de Platyrrhinus lineatus (I –
P) coradas com o alaranjado de acridina. A. Espermatogônia. B. Espermatócito primário
em leptóteno. C. Espermatócito primário em zigóteno. D. Espermatócito primário em
início de paquíteno. E. Espermatócito primário em paquíteno. F. Espermatócito primário
em paquíteno-diplóteno. G. Metáfase. H. Espermátides. I. Espermatogônia. J.
Espermatócito primário em leptóteno. K e L. Espermatócitos primário em paquíteno. Notar
a marcação de RNA se desligando dos cromossomos (seta). M e N. Espermatócitos
primário em diplóteno. O. Metáfase I. P. Espermátides. Barras = 10 µm.
Fig. 9 Células testiculares de Artibeus lituratus (A – H) e de Myotis nigricans (I – P)
coradas com o alaranjado de acridina. A. Espermatogônias. B. Espermatócito primário em
zigóteno. C - E. Espermatócitos primário em paquíteno. F. Espermatócito primário em
diplóteno.G. Metáfase II. H. Espermátides. I. Espermatogônias. J e K. Espermatócitos
primário em leptóteno. L. Espermatócito primário em zigóteno. M. Espermatócito primário
em paquíteno-diplóteno. N e O. Espermatócitos primário em diplóteno. P. Espermátides.
Barras = 10 µm.
Artigo 3 – Figura 1 115
Artigo 3 – Figura 2 116
Artigo 3 – Figura 3 117
Artigo 3 – Figura 4 118
Artigo 3 – Figura 5 119
Artigo 3 – Figura 6 120
Artigo 3 – Figura 7 121
Artigo 3 – Figura 8 122
Artigo 3 – Figura 9 123
Discussão Geral e Conclusões 124
VI. DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÕES
Apesar da espermatogênese ser um processo já bem estudado em várias espécies de
roedores, no ser humano e outros mamíferos, poucos estudos foram feitos em Chiroptera,
uma grande e diversa ordem que apresenta mais de mil espécies distribuídas em vários
hábitats. Devido a grande diversidade de espécies, a ampla distribuição geográfica e a
grande variação dos aspectos biológicos é possível que processos fisiológicos, como os
reprodutivos, apresentem acentuadas diferenças entre essas espécies.
A variação reprodutiva em Chiroptera é ampla, existindo desde espécies tropicais
que se reproduzem durante o ano todo, até espécies de clima temperado que hibernam e se
reproduzem apenas em uma determinada época do ano. Há muitas diferenças também
relativas ao comportamento reprodutivo (forma da cópula, escolha de casais,
estabelecimentos de haréns, etc), tamanho da prole, além de aspectos como a sazonalidade
e o armazenamento e a maturação diferencial de espermatozóides.
Dentro desses aspectos, no presente estudo procuramos analisar diferentes aspectos
relacionados à espermatogênese e também a nucleologênese de algumas espécies de
morcegos, procurando entender melhor esses múltiplos mecanismos que governam a
fisiologia reprodutiva de Chiroptera.
As características morfológicas das células germinativas dos filostomídeos
analisados são conservadas e diferem acentuadamente das de M. nigricans, um
vespertilionídeo, não só em relação à morfologia, mas, principalmente, quanto à cinética e
ao comportamento. Diferente do apresentado pela maioria dos mamíferos e das espécies de
filostomídeos, a espermatogênese de M. nigricans não apresenta um ciclo do epitélio
seminífero totalmente definido, apresentando ciclos indefinidos e sobreposição de fases.
Discussão Geral e Conclusões 125
Essa espécie, possivelmente, apresenta adaptações ao clima tropical, uma vez que já não
apresenta mais a fase hibernante, comum as espécies de clima temperado do seu gênero.
Essas acentuadas diferenças reprodutivas de M. nigricans podem estar ligadas a sua maior
distância filogenética onde, pertencendo a outra família (Vespertilionidae), já divergiu das
outras espécies há um tempo bem maior, podendo assim acumular diferenças significativas.
As características nucleolares das células de Sertoli das espécies de Phyllostomidae
apresentaram um padrão similar a dos molossídeos, C. planirostris e M. rufus, com um
único e bem distinto nucléolo que é formado pela interação de todas as RONs em um único
ponto, esse apresenta um padrão de expressão periférica e a relação de área nuclear/área
nucleolar é proporcional ao número total de RONs que as espécies apresentam. No entanto,
as características dos vespertilionídeos analisados e de M. molossus se diferenciam das dos
demais, tanto qualitativa quanto quantitativamente. Essa diferenciação, possivelmente, se
deve a uma regulação fisiológica exclusiva de M. molossus e a Vespertilionidae ter
divergido a um bom tempo de Phyllostomidae e Molossidae.
Com essas características podemos propor que apesar da importância funcional que
as células de Sertoli apresentam e aos vários mecanismos que regulam, o padrão nucleolar
se diferencia dentro e entre as diferentes famílias de morcegos e que, dentro de uma mesma
família, ele varia de acordo com o número de RONs que as espécies apresentam.
A nucleologênese nas diferentes espécies analisadas ocorre de maneira semelhante
ao observado para muitos mamíferos, onde os componentes nucleolares podem se
comportar de até três formas durante a divisão meiótica, dissolver-se no nucleoplasma,
associar-se às regiões pericromossomais ou ficar ligado às RONs durante toda a divisão.
Por outro lado, diferente do observado na mitose, os genes ribossomais permanecem ativos
durante a prófase I – leptóteno, zigóteno e início de paquíteno e a persistência nucleolar
Discussão Geral e Conclusões 126
também pode ser observada, sendo que o grau de fusão nucleolar aumenta nas espécies com
maior número de RONs.
As variações na intensidade das marcações fluorescentes, após o FISH, podem ser
interpretadas, possivelmente, como uma possível diferença no tamanho dos loci de DNAr
que as espécies apresentam. O número de RONs que as espécies apresentam foi
inversamente relacionado a intensidade das marcações fluorescentes.
A análise conjunta dos resultados evidencia que as características reprodutivas dos
morcegos estudados estão intimamente relacionadas às famílias as quais pertencem e que,
apesar de possuírem um perfil de nucleologênese semelhante, as espécies ainda apresentam
diferenças importantes em relação ao nucléolo. Com esses estudos esclarecemos alguns
aspectos da espermatogênese e da nucleologênese de morcegos, assim como levantamos
dados que podem ser utilizados em análises filogenéticas multifatoriais, para uma melhor
elucidação das relações filogenéticas entre as espécies de morcegos.
Assim, são conclusões deste trabalho:
−
de maneira geral, a espermatogênese dos morcegos analisados assemelha-se a dos outros
mamíferos já estudados, apresentando células de Leydig e de Sertoli com características
similares e três tipos principais de espermatogônias (A
d
, A
p
e B).
− a espermiogênese das espécies analisadas, avaliada pela coloração por hematoxilina-
eosina, apresenta diferenças em relação à forma de diferenciação e ao número de passos,
podendo ser subdividida em sete passos.
Discussão Geral e Conclusões 127
−
o ciclo do epitélio seminífero dos filostomídeos analisados pode ser distintamente
separado em oito fases e uma única fase foi observada em cada secção do epitélio
seminífero.
−
Myotis nigricans apresenta uma assincronia no ciclo do epitélio seminífero, apresentado
sobreposição de fases, o que pode ser devido a uma adaptação ao ambiente tropical.
− as freqüências dos estágios do ciclo do epitélio seminífero foram similares para todas as
espécies, com o estágio 5 tendo a mais alta freqüência e o estágio 4 a mais baixa.
−
as freqüências das fases do ciclo do epitélio seminífero também foram similares, com
uma maior freqüência da fase pós-meiótica (mais de 50%) e menor da meiótica (menos de
10%), o que está de acordo com o observado na literatura para outros microquirópteros.
−
as características morfológicas das células germinativas dos filostomídeos são
conservadas entre as suas diferentes espécies e diferem acentuadamente das de M.
nigricans, não só em relação à morfologia, mas, principalmente, quanto à cinética e ao
comportamento.
−
na maioria dos morcegos estudados observamos um único nucléolo central nas células de
Sertoli, no entanto, esse pode ser distinguido em um número variável de subcomponentes,
que variaram de acordo com o número de RONs ativas.
Discussão Geral e Conclusões 128
−
devido possivelmente a menor distancia filogenética, as características nucleolares das
células de Sertoli dos filostomídeos são conservadas entre as suas diferentes espécies e
assemelham-se fortemente as características dos molossídeos analisados, no entanto, essas
diferem acentuadamente das dos vespertilionídeos, por seu maior tempo de divergência, e
de M. molossus, possivelmente, por essa espécie apresentar uma autoapomorfia.
−
as marcações encontradas no FISH corroboram alguns estudos de citogenética
convencional, confirmando o número de loci de DNAr (RONs) observados após coloração
pela prata, ou seja, apenas um sítio de DNAr em Carollia perspicillata, dois em
Platyrrhinus lineatus, seis em Artibeus lituratus e Artibeus planirostris e dez em Myotis
nigricans.
−
o número de RONs que a espécie apresenta está inversamente relacionado a intensidade
das marcações fluorescentes evidenciadas pelo FISH.
−
uma elevada taxa de fusão nucleolar pôde ser observada nos morcegos analisados, sendo
que esta é mais facilmente evidenciada nas células das espécies com maior número de
RONs.
−
a nucleologênese nas diferentes espécies analisadas ocorre de maneira semelhante, onde
os componentes nucleolares podem se comportar de até três formas durante a divisão
meiótica: parte dos componentes se dissocia do nucléolo e dissolve-se no nucleoplasma,
outra parte permanece associada às regiões organizadoras nucleolares (RONs) durante toda
Discussão Geral e Conclusões 129
a divisão celular e a última parte dissocia-se do nucléolo e associa-se as regiões
pericromossomais.
−
a atividade transcricional das células em divisão meiótica é reprimida gradativamente,
onde os genes ribossomais permanecem ativos durante a prófase I – leptóteno, zigóteno e
início do paquíteno
−
as RONs reassumem sua atividade nas espermátides, logo após as duas divisões
meióticas. Esta atividade cai com a entrada das espermátides nas fases iniciais da
diferenciação espermiogênica e nenhuma transcrição nucleolar é visível durante as fases
posteriores.
−
as espécies que apresentam maior número de RONs, apresentaram um maior número de
nucléolos por célula interfásica, assim como uma maior quantidade de material nucleolar
nas células em divisão.
Referências Bibliográficas 130
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Resumo 135
VIII. RESUMO
Beguelini, M.R., Morielle-Versute, E., 2007. Estudo da espermatogênese e
nucleologênese de morcegos. (141f). Dissertação (Mestrado em Genética) – Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, São José do Rio Preto.
A ordem Chiroptera constitui a segunda maior ordem de mamíferos e está classicamente
dividida em duas subordens: Megachiroptera e Microchiroptera. A primeira é encontrada
exclusivamente no Velho Mundo e compreende uma única família (Pteropodidae) com 42
gêneros e 185 espécies, enquanto que a segunda está amplamente distribuída por todo o
globo, envolvendo 17 famílias, 157 gêneros e 928 espécies. Apesar dos morcegos serem
extraordinariamente bem sucedidos, eles permanecem como um dos grupos menos
conhecidos em relação a aspectos como: processos evolutivos, mecanismos reprodutivos e
características nucleolares. Embora o processo de espermatogênese tenha sido objeto de
estudo em muitos mamíferos, pouca atenção tem sido dada a esse estudo em morcegos,
apesar dessa ser uma grande e diversa classe de organismos, que apresenta diferentes
estratégias reprodutivas para ajustar esses animais às várias condições ecológicas e
comportamentais as quais estão submetidos. Da mesma forma, em geral todas as
observações sobre regiões organizadoras nucleolares (RONs) e nucléolos em morcegos
foram feitas a partir da análise de células somáticas. Assim, devido à escassez de
informações referentes à espermatogênese e a nucleologênese em Chiroptera e ao
interessante e vasto campo de conhecimento que esses aspectos representam, o intuito do
presente estudo foi analisar as células dos túbulos seminíferos das espécies de morcegos,
Resumo 136
Artibeus lituratus, Artibeus planirostris, Carollia perspicillata, Platyrrhinus lineatus
(Phyllostomidae) e Myotis nigricans (Vespertilionidae), por diferentes técnicas
histológicas, citoquímicas e moleculares. Três tipos de espermatogônias foram
reconhecidos baseado no grau de condensação da cromatina e morfologia nuclear,
espermatogônias A
d
, A
p
e B. Essas após entrar em meiose, passam por duas divisões
celulares e formam espermátides haplóides, que sofrem diferenciação, compactando seu
DNA, alongando seu núcleo e formando o flagelo e acrossomo, num processo que, em
morcegos, pode ser dividido em sete fases. A exceção de M. nigricans, o ciclo do epitélio
seminífero das cinco espécies de Phyllostomidae é similar ao de outros mamíferos,
possuindo oito estágios que podem ser distintamente delimitados pelo método da
morfologia tubular. M. nigricans apresenta uma assincronia no ciclo, observada na
sobreposição de estágios e ciclos indefinidos. As freqüências encontradas nas três fases do
ciclo foram variáveis, com a fase pós-meiótica apresentando a maior freqüência (mais de
50%) e a fase meiótica a menor (menos de 10%). A forma e expressão do nucléolo das
células de Sertoli de 10 espécies também foram avaliadas. C. perspicillata, C. planirostris,
M. rufus, P. lineatus e P. dislocor apresentaram um padrão semelhante tanto na expressão,
evidenciado pelo alaranjado de acridina como uma única região central, como na
morfologia, proporção e densidade, evidenciadas pela impregnação por nitrato de prata
como um único nucléolo que ocupa aproximadamente 4,75% da área nuclear. A. lituratus e
A. planirostris apresentaram características qualitativas semelhante a essas, somente
possuindo uma proporção de área nucleolar/área nuclear um pouco maior, próximo aos 6%.
Diferindo dos outros molossídeos analisados, M. molossus apresentou três diferentes
padrões, tanto na expressão quanto na morfologia nucleolar além de possuir uma proporção
de área nucleolar/área nuclear um pouco maior (5,72%). Os vespertilionídeos apresentaram
Resumo 137
a maior proporção de área nucleolar (7,12% para H. velatus e 10,75% para M. nigricans),
assim como padrões morfológicos bem distintos. Em H. velatus observamos nucléolos
filamentares e dispersos que apresentam expressão em apenas alguns pontos na sua
periferia, já em M. nigricans encontramos a maior variação morfológica, onde foram
observamos quatro padrões diferenciados de forma e expressão nucleolar. As marcações
encontradas no FISH corroboram estudos de citogenética convencional confirmando o
número de locus de DNAr observados após coloração pela prata, ou seja apenas um sítio de
DNAr em C. perspicillata, dois em P. lineatus, seis em A. lituratus e A. planirostris e dez
em M. nigricans. A análise da nucleologênese em A. lituratus, A. planirostris, C.
perspicillata, P. lineatus e M. nigricans evidenciou que o nucléolo começa sua
desorganização quando as espermatogônias entram em meiose. Com a desorganização, o
material nucleolar pode comportar-se de duas ou três maneiras. Parte dele dissolve-se na
prófase, no nucleoplasma comum e retorna ao nucléolo após sua reorganização na telófase,
outra parte permanece associada as RONs durante toda a divisão meiótica e uma terceira
parte junta-se as regiões pericromossomais e move-se de volta para o núcleo com a
descondensação dos cromossomos na telófase. Também observamos a presença de RNAs
junto ao material nucleolar em desorganização, só não sendo encontrado RNA em
associação as RONs. De maneira geral, as características morfológicas das células
germinativas dos filostomídeos são conservadas entre as suas diferentes espécies e diferem
acentuadamente das de M. nigricans, não só em relação à morfologia, mas, principalmente,
quanto à cinética e ao comportamento. A variação parece estar mais intimamente ligada ao
número de RONs que as espécies apresentam do que ao grau de proximidade filogenética.
Os resultados inéditos sobre alguns aspectos da espermatogênese e da nucleologênese de
morcegos constituem dados que podem ser utilizados em análises filogenéticas
Resumo 138
multifatoriais, para uma melhor elucidação das relações filogenéticas entre as espécies de
morcegos.
Palavras Chaves: Ciclo do Epitélio Seminífero, Espermatogênese, Espermiogênese,
Chiroptera, Nucleologênese, FISH.
Abstract 139
IX. ABSTRACT
Beguelini, M.R., Morielle-Versute, E., 2007. Analysis of the spermatogenesis and the
nucleologenesis of bats. (141p). Dissertation – Instituto de Biociências, Letras e Ciências
Exatas, São Paulo State University, São José do Rio Preto.
The order Chiroptera is the second largest order of mammals and is classically divided into
two suborders: Megachiroptera and Microchiroptera. The first is found exclusively in the
Old World, and contains a single family (Pteropodidae) with 42 genera and 185 species,
while the second is widely distributed around the world, concerning 17 families, 157 genera
and 928 species. Despite of the bats are extraordinarily successful, they remain as one of
the least recognized groups on aspects such as: evolutionary processes, reproductive
patterns and nucleolar characteristics. Although the process of spermatogenesis has been
the subject of study in many mammals, little attention has been given to this study in bats, a
large and diverse class of organisms, which presents different reproductive strategies to
adjust these animals to different ecological and behavioral conditions that they are
submitted. In the same way, in general all studies concerning nucleolar organizer regions
(NORs) and nucleoli in bats were made from the analysis of somatic cells. Thus, due to the
scarcity of information regarding spermatogenesis and nucleologenesis in Chiroptera and
the interesting and vast field of knowledge that these things represent, the purpose of this
study was to analyze the cells of the seminiferous tubules of the species of bats, Artibeus
lituratus, Artibeus planirostris, Carollia perspicillata, Platyrrhinus lineatus
(Phyllostomidae) and Myotis nigricans (Vespertilionidae), by different histological,
molecular and citochemical techniques. Three types of spermatogonia were recognized
Abstract 140
based on the chromatin condensation and nuclear morphology, type A
d
, type A
p
and B.
These, undergo meiosis, passing through the two cellular divisions and forming haploid
spermatids, which undergo differentiation, condensing its DNA, elongating its nuclei and
forming the flagellum and acrossomo, in a process that in bats, can be divided into seven
steps. The exception of M. nigricans, the cycle of the seminiferous epithelium of the five
species of Phyllostomidae is similar to that of other mammals, with eight stages that can be
distinctly defined by the tubular morphology method. M. nigricans presents an asynchrony
in the cycle, observed in the overlapping of stages and undefined cycles. The frequencies
found in the three phases of the cycle were variable, with the post-meiotic phase showing
the higher frequency (over 50%) and the meiotic phase the minor (less than 10%). The
morphology and expression of the nucleolus of Sertoli cells of 10 species were also
evaluated. C. perspicillata, C. planirostris, M. rufus, P. dislocor and P. lineatus showed a
similar pattern in both the expression, evidenced by the coloration with acridine orange as a
single central region, such as morphology, proportion and density, evidenced by silver
impregnation as a single nucleolus which occupies approximately 4.75% of the nuclear
area. A. lituratus and A. planirostris showed similar qualitative characteristics, only having
a slightly larger proportion of nucleolar area / nuclear area, close to 6%. Unlike the other
species of Molossidae analyzed, M. molossus showed three different patterns, both in
expression and in the nucleolar morphology, it also had a slightly larger proportion of
nucleolar area / nuclear area (5.72%). The vespertilionids had the highest proportion of
nucleolar area (7.12% to H. velatus and 10.75% for M. nigricans), as well distinct
morphological patterns. H. velatus presents filamentary and scattered nucleoli that present
expression in only a few points in its periphery, already in M. nigricans we found the
greatest morphological variation, which were found four distinct patterns of form and
Abstract 141
expression. The markings found on FISH corroborate conventional cytogenetic studies
confirming the number of rDNA loci observed after silver staining, a single locus of rDNA
in C. perspicillata, two in P. lineatus, six in A. lituratus and A. planirostris and ten in M.
nigricans. The analysis of nucleologenesis in A. lituratus, A. planirostris, C. perspicillata,
P. lineatus and M. nigricans showed that the nucleolus begins its disorganization when the
spermatogonia come into meiosis. With the disorganization, the nucleolar components can
behave of two or three forms. Part dissolves in the prophase in nucleoplasm and returns to
the nucleolus after its reorganization in telophase, another part remains associated with the
NORs throughout the meiotic division and a third party associates to perichromossomal
regions and move back to the nuclei with the descondensation of the chromosomes in
telophase. We also observe the presence of nucleolar RNAs at the components in
disorganization, but none RNA was found in association with the NORs. The
morphological characteristics of germ cells of phyllostomids are conserved between the
different species and differ markedly from those of M. nigricans, not only in relation to the
morphology, but, mainly, on the kinetics and behavior. The change appears to be more
closely linked to the number of NORs that the species present than the degree of
phylogenetic distance. The new results on some aspects of spermatogenesis and on the
nucleologenesis of bats, are data that can be used in multifactorial phylogenetic analyses,
for a better elucidation of the phylogenetic relationships among different species of bats.
Keywords: Seminiferous epithelium cycle, Spermatogenesis, Spermiogenesis, Chiroptera,
Nucleologenesis, FISH.
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