( PDF ) Caracterização estrutural e funcional da proteína HFQ de Herbaspirillum seropedicae

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FUNCIONAL DA PROTEÍNA HFQ DE

Herbaspirillum seropedicae

CURITIBA

2008

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MARCO ANTONIO SEIKI KADOWAKI

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FUNCIONAL DA PROTEÍNA HFQ DE

Herbaspirillum seropedicae

Dissertação apresentada como

requisito parcial para a obtenção do

grau de mestre, pelo Programa de

Pós-Graduação em Ciências - Área

Bioquímica, do Setor de Ciências

Biológicas da Universidade Federal

do Paraná.

Orientadoras:

Profª. Drª. Maria Berenice R. Steffens

Profª. Drª. Rose Adele Monteiro

CURITIBA

2008

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Aos meus avós Shigehiro e Matsuno

Kadowaki.

III

AGRADECIMENTOS

Deixo aqui registrado meu especial agradecimento às minhas orientadoras e

incentivadoras professora Maria Berenice Reynaud Steffens e professora Rose Adele

Monteiro pela orientação, paciência e confiança que recebi desde meus primeiros

passos na iniciação científica.

Ao Professor Fábio de Oliveira Pedrosa pelo apoio e incentivo depositados nas

minhas viagens dedicadas à cristalização da proteína Hfq.

A professora Leda Satie Chubatsu e ao professor Emanuel Maltempi de Souza

pelas opiniões, apoio e por terem me proporcionado amadurecer a minha pobre idéia

do que é e do que significa Ciência.

A todos os professores do Núcleo de Fixação de Nitrogênio.

A Dona Marilza e a coordenação do Curso de Pós-Graduação em Ciências-

Bioquímica.

Ao Programa GENOPAR pela sequência do gene hfq utilizada neste trabalho.

Aos queridos colegas da sala 279, pela amizade, discussões e excelente

ambiente de trabalho: Alexandre, André, Giovana, Halisson, Juliana Osaki, Larissa

Comarella, Larissa Tonelli e Marco Aurélio.

A Lilian Noindorf um especial agradecimento pela paciência, disponibilidade e

por ter renovado meu olhar sobre biologia molecular.

Aos colegas do Núcleo de Fixação de Nitrogênio: Ana Claudia, Andressa, Anelis,

Arnaldo, Camila, Daniela, Eduardo, Stefânia, Fabiane, Fernanda Pacheco, Geraldo,

Giovani, Gustavo, Helisson, Juliana Inaba, Kerlly, Letícia, Luciano, Magda, Márcia,

Marcelo Miller, Michelle Tadra, Michelle Torres, Patilene, Rafael Ioris, Rafael Eto,

Renato, Tuca e Viviane.

Ao Valter pela dedicação aos problemas do laboratório e pelos momentos de

descontração.

A Dona Ju e Roseli pelo imutável cuidado e carinho dedicado a todas as

gerações de alunos que passaram pelo Núcleo de Fixação de Nitrogênio.

Ao Dr. João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa por ter aberto as portas do

Laboratório Nacional de Luz Síncrontron a tão inexperiente estudante e ter me passado

os seus conhecimentos sobre cristalização de proteínas.

A Andréia, Celisa, Camila e Jadson, pesquisadores do LNLS, pela amizade e

apoio durante as minhas estadias em Campinas.

Ao Dr. Jorge Iulek, Drª Carolina Galvão, Rosana e Viviane pela amizade,

hospitalidade e paciência nas minhas idas à UEPG.

Ao Dr. Lease da Johns Hopkins University pela gentileza em prontamente

conceder alguns plasmídeos utilizados neste trabalho.

Aos meus pais Jacira e Taizoo Kadowaki.

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................VII

LISTA DE TABELAS......................................................................................................X

LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................... XI

RESUMO......................................................................................................................XIII

ABSTRACT..................................................................................................................XIV

JUSTIFICATIVA............................................................................................................XV

1 INTRODUÇÃO..............................................................................................................1

1.1 A FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO NITROGÊNIO............................................................. 1

1.2 Herbaspirillum seropedicae....................................................................................... 2

1.3 sRNA......................................................................................................................... 3

1.4 PROTEÍNA HFQ .......................................................................................................7

1.5 FUNÇÃO DE CHAPERONA DA PROTEÍNA HFQ.................................................. 12

1.6 EFEITO PLEIOTRÓPICO DE Hfq E ENVOLVIMENTO NA FIXAÇÃO DE

NITROGÊNIO............................................................................................................ 15

2 OBJETIVOS...............................................................................................................18

2.1 OBJETIVOS GERAIS.............................................................................................. 18

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 18

3. MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................................19

3.1 ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DO GENE hfq DE H. seropedicae............................... 19

3.2 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS ................................................................................ 20

3.3 MEIOS DE CULTURA, CONDIÇÕES DE CULTIVO E ESTOQUE DOS

MICRORGANISMOS.................................................................................................

3.4 ANTIBIÓTICOS ....................................................................................................... 24

3.5 MANIPULAÇÃO DE DNA.........................................................................................24

3.5.1 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE H. seropedicae ... 24

3.5.2 REAÇÃO EM CADEIA DA DNA POLIMERASE (PCR)................................. 25

3.5.3 CLONAGEM EM VETOR DE EXPRESSÃO ................................................. 25

3.5.4 MINIPREPARAÇÃO DE PLASMÍDEO POR LISE ALCALINA ...................... 26

3.5.5 SEQUENCIAMENTO DE DNA...................................................................... 26

3.5.6 CLIVAGEM DO DNA COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO............................... 27

3.5.7 LIGAÇÃO DNA INSERTO AO VETOR ......................................................... 27

3.6 PREPARO DE CÉLULAS ELETROCOMPETENTES DE E. coli ..................... 27

3.7 DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA Hfq........ 28

3.8 ANÁLISE DE PROTEÍNAS POR ELETROFORESE EM GEL DE

POLIACRILAMIDA.....................................................................................................

3.9 DETERMINAÇÃO DO GRAU DE PUREZA DA PROTEÍNA HFQ......................... 29

3.10 CONFIRMAÇÃO DA IDENTIDADE DA PROTEÍNA Hfq POR ANÁLISE

ESPECTROMETRICA DE MASSA PELO MÉTODO MALDI-TOF/MS...................... 30

3.10.1 DIGESTÃO DAS PROTEÍNAS E EXTRAÇÃO DE PEPTÍDEOS ............... 30

3.10.2 ANÁLISE DOS PEPTÍDEOS POR MALDI-TOF/MS.................................... 31

3.10.3 IDENTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA ............................................................... 31

3.11 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq DE H. seropedicae ....................................... 31

3.11.1 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA .............................................. 32

3.11.1.1 CROMATOGRAFIA EM BUTIL-SEPHAROSE....................................... 32

3.11.1.2 CROMATOGRAFIA EM DEAE-SEPHAROSE ....................................... 33

3.11.2 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq CONTENDO CAUDA DE

HISTIDINAS........................................................................................................... 33

3.11.2.1 CROMATOGRAFIA EM HI-TRAP CHELATING Ni

.............................. 33

3.12 ESTOCAGEM DAS PROTEÍNAS ......................................................................... 34

3.13 ESTIMATIVA DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA ................................................ 34

3.14 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq A RNA ..... 35

3.15 ENSAIO DE TRANSCRIÇÃO in vitro DE RNA...................................................... 36

3.16 ENSAIO DE RETARDAMENTO DE BANDA EM GEL .......................................... 37

3.17 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA Hfq DE H. seropedicae...... 37

3.17.1 ANÁLISE in silico DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA ................................... 37

3.17.2 ANÁLISE DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA POR DICROISMO

CIRCULAR............................................................................................................. 38

3.18 DETERMINAÇÃO DO ESTADO DE OLIGOMERIZAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq .... 39

3.18.1 GEL FILTRAÇÃO........................................................................................ 39

3.18.2 ESPALHAMENTO DE LUZ DINÂMICO (DLS)............................................ 40

3.19 CRISTALIZAÇÃO DA PROTEINA Hfq NATIVA .................................................... 40

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................43

4.1 ANÁLISE in silico DO GENE hfq............................................................................. 43

4.2 ANÁLISE in silico DA PROTEÍNA Hfq..................................................................... 50

4.3 ANÁLISE FUNCIONAL DA PROTEÍNA Hfq............................................................ 55

4.3.1 CLONAGEM DO GENE hfq EM VETORES DE EXPRESSÃO..................... 55

4.3.2 EXPRESSÃO DA PROTEÍNA Hfq ................................................................ 60

4.3.3 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA FUSIONADA A CAUDA DE HISTIDINAS... 67

4.3.4 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA ................................................ 70

4.3.4.1 PURIFICAÇÃO POR INTERAÇÃO HIDROFÓBICA E TROCA IÔNICA .. 70

4.3.5 ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq A PEQUENOS RNAS ......... 77

4.4 DETERMINAÇÃO DO ESTADO DE OLIGOMERIZAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq ...... 82

4.5 ANÁLISE DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DA PROTEÍNA Hfq ............................ 85

4.6 ANÁLISE CRISTALOGRÁFICA DA PROTEÍNA Hfq............................................... 89

5. CONCLUSÕES..........................................................................................................96

6. PERSPECTIVAS........................................................................................................97

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................98

VII

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DOS sRNAS ..............5

FIGURA 2 – MONÔMERO DA PROTEÍNA Hfq DE S. aureus.......................................10

FIGURA 3 – ESTRUTURA DA PROTEÍNA Hfq DE E. coli ............................................11

FIGURA 4 – FORMAS DE INTERAÇÃO ENTRE mRNA E SRNA PROMOVIDAS PELA

PROTEÍNA Hfq...........................................................................................................13

FIGURA 5 – ESQUEMA DAS REGIÕES DE INTERAÇÃO ENTRE O sRNA DsrA E O

mRNA RpoS DE E. coli...............................................................................................14

FIGURA 6 – OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES UTILIZADOS PARA A

AMPLIFICAÇÃO DO GENE hfq..................................................................................26

FIGURA 7 – PLACA PARA CRISTALIZAÇÃO EM GOTA SENTADA............................41

FIGURA 8 – EQUIPAMENTO PARA CRISTALIZAÇÃO AUTOMATIZADA ...................42

FIGURA 9 – SEQUÊNCIA DE BASES DA REGIÃO CODIFICADORA DO GENE hfq DE

H. seropedicae............................................................................................................44

FIGURA 10 – SEQUÊNCIA DA REGIÃO CODIFICADORA DO PROVÁVEL OPERON

hfqhflXhflKhflC............................................................................................................45

FIGURA 11 – PREDIÇÃO DO PROVÁVEL TERMINADOR DO OPERON

hfqhflXhflKhflC............................................................................................................48

FIGURA 12 – ORGANIZAÇÃO DOS GENES VIZINHOS A hfq NO GENOMA DE

DIFERENTES MICRORGANISMOS ..........................................................................

FIGURA 13 – ALINHAMENTO INDIVIDUAL DAS SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS

DAS PROTEÍNAS Hfq ................................................................................................51

FIGURA 14 – ALINHAMENTO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS PROTEÍNAS

Hfq ..............................................................................................................................

FIGURA 15 – ÁRVORE DE SIMILARIDADE ENTRE AS PROTEÍNAS Hfq...................54

FIGURA 16 – AMPLIFICAÇÃO DO GENE hfq POR PCR COM GRADIENTE DE

TEMPERATURA.........................................................................................................56

FIGURA 17 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE CLONE pCR2.1 :: hfq .........................57

FIGURA 18 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE RESTRIÇÃO DO CLONE pKADO0....58

FIGURA 19 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE RESTRIÇÃO DO PLASMÍDEO pKADO1

....................................................................................................................................

VIII

FIGURA 20 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE RESTRIÇÃO DO PLASMÍDEO pKADO2

....................................................................................................................................60

FIGURA 21 – ELETROFORESE DO EXTRATO BRUTO DA PROTEÍNA Hfq ..............61

FIGURA 22 – ESPECTRO DA RELAÇÃO m/z DA PROTEÍNA Hfq NATIVA.................62

FIGURA 23 – RESULTADO DA SUBMISSÃO DAS RELAÇÕES m/z DA PROTEÍNA Hfq

NATIVA.......................................................................................................................62

FIGURA 24 – ESPECTRO DA RELAÇÃO m/z DA PROTEÍNA Hfq FUSIONADA A

CAUDA DE HISTIDINAS ............................................................................................63

FIGURA 25 – RESULTADO DA SUBMISSÃO DAS RELAÇÕES m/z DA PROTEÍNA Hfq

FUSIONADA À CAUDA DE HISTIDINAS...................................................................64

FIGURA 26 – PERFIL ELETROFORÉTICO DO TESTE DE EXPRESSÃO COM A

PROTEÍNA Hfq NATIVA.............................................................................................65

FIGURA 27 – PERFIL ELETROFORÉTICO DO TESTE DE EXPRESSÃO COM A

PROTEÍNA Hfq FUSIONADA A CAUDA DE HISTIDINAS .........................................66

FIGURA 28 – PERFIL DE ELUIÇÃO REFERENTE À PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA

Hfq FUSIONADA A CAUDA DE HISTIDINAS ............................................................68

FIGURA 29 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE AMOSTRAS DA PROTEÍNA Hfq

FUSIONADA A CAUDA DE HISTIDINAS...................................................................69

FIGURA 30 – PERFIL DE ELUIÇÃO DA PURIFICAÇÃO EM BUTIL-SEPHAROSE .....72

FIGURA 31 – ELETROFORESE DA PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA.......73

FIGURA 32 – CROMATOGRAMA DA PURIFICAÇÃO EM DEAE-SEPHAROSE..........74

FIGURA 33 – ELETROFORESE DA PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA.......75

FIGURA 34 – ELETROFORESE DA PROTEÍNA Hfq NATIVA APÓS CONCENTRAÇÃO

....................................................................................................................................76

FIGURA 35 – TRANSCRIÇÃO IN VITRO DO SRNA DSRA E DO mRNA RpoS PELO

MÉTODO RUN-OFF...................................................................................................79

FIGURA 36 – ENSAIO DE RETARDAMENTO DE BANDA PELA INTERAÇÃO Hfq-DsrA

(sRNA)........................................................................................................................80

FIGURA 37 – MODELO DA INTERFERÊNCIA ESTRUTURAL CAUSADA PELA

PRESENÇA DA CAUDA DE HISTIDINAS..................................................................

FIGURA 38 – DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR DE Hfq POR

CROMATOGRAFIA DE GEL FILTRAÇÃO.................................................................

FIGURA 39 – ENSAIO DE DLS DA PROTEÍNA Hfq......................................................84

FIGURA 40 – PREDIÇÃO DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DA PROTEÍNA Hfq .........86

FIGURA 41 – ESPECTRO DE DICROÍSMO CIRCULAR (CD) DA PROTEÍNA Hfq......87

FIGURA 42 – ENOVELAMENTO E VARIAÇÃO DA TEMPERATURA ..........................87

FIGURA 43 – PORCENTAGEM DE ESTRUTURA ESCUNDÁRIA AO LONGO DA

VARIAÇÃO DE TEMPERATURA ...............................................................................88

FIGURA 44 – SCREENING INICIAL DE CRISTALIZAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq...........90

FIGURA 45 – PADRÕES DE DIFRAÇÃO DOS CRISTAIS DA PROTEÍNA Hfq............92

FIGURA 46 – DIFRAÇÃO DA PROTEÍNA HFQ A 2.7Å DE RESOLUÇÃO ...................95

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – PEQUENOS RNAs DE E. coli .....................................................................6

TABELA 2 – PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE Hfq EM DIFERENTES FILOS

BACTERIANOS ............................................................................................................9

TABELA 3 – LISTA DE ESTIRPES DE BACTÉRIAS UTILIZADAS ...............................20

TABELA 4 – LISTA DE PLASMÍDEOS UTILIZADOS ....................................................21

TABELA 5 – PASSOS DE PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA.......................71

TABELA 6 – LEVANTAMENTO DA PORCENTAGEM DE GOTAS LÍMPIDAS

REGISTRADAS NO SCREENING INICIAL................................................................89

TABELA 7 – COMPOSIÇÃO DAS SOLUÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DOS CRISTAIS

PROTÉICOS...............................................................................................................94

LISTA DE ABREVIATURAS

ATP: 5’ trifosfato de 2’ desoxiadenosina

ATPase: Adenosina trifosfatase

BSA: Soro albumina bovina

CD : Dicroísmo Circular

DEAE : Dietilaminoetil

G : Variação de energia livre

DEPC : Dietilpirocarbonato

DLS : Dynamic Light Scattering

dNTPs : 5’ trifosfato de 2’ desoxinucleotídeo

D.O. : Densidade óptica

EDTA : Ácido etilenodiamino-tetra-acético

GTPase : Guanosina trifosfatase

IPTG : β-D-isopropil-tiogalactopiranosídeo

: Constante de partição

Kb : Kilopares de base

kDa : Kilo Daltons

kΩ : Kilo Ohms

kV : Kilo Volts

L : Litro

LSm : Sm like

m/z : Razão massa por carga

MALDI-TOF/MS : Matrix Assisted Light Desorption Ionization-Time of Flight/ Mass

Spectroscopy

MES : Ácido 2-[N-Morfolino]-etanosulfônico

μF : Micro Faraday

MMT : MES / Ácido L-Malico

/ TRIS

mRNA : RNA mensageiro

MW : Molecular weight

PAGE : Polyacrilamide Gel Electrophoresis

XII

PAPI : Poli(A) Polimerase I

pb : Pares de base

PCB : Propionato de sódio / Cacodilato trihidratado de sódio / Bis-Tris propano

PCR : Polimerase Chain Reaction

PEG : Polietilenoglicol

PNP : Polinucleotídeo fosforilase

PMSF : Fluoreto de fenilmetilsulfonil

ppm : Partes por milhão

PSIPRED: Position Specific Iterated Prediction

RBS : Ribossome binding site

RNA : Ácido ribonucleico

RNAse : Ribonuclease

rpm : Rotações por minuto

SDS : Dodecilsulfato de sódio

SPG : Ácido succínico / Dihidrogeno fosfato monohidratado de sódio /Glicina

sRNA : Small RNA

TBE : Tris / Borato / EDTA

TFA : Ácido Trifluoro-acético

Tm : Melting point

Tris : Tris(hidroximetil)-aminometano

UV : Ultra violeta

w/v : Razão massa por volume

VC : Volumes de Coluna

XIII

RESUMO

A proteína Hfq, considerada pleiotrópica e com função de chaperona de RNA,

tem sido amplamente estudada devido a sua importância na regulação pós-

transcricional em várias bactérias. Neste trabalho foram caracterizados o gene e a

proteína Hfq de Herbaspirillum seropedicae, uma bactéria diazotrófica que se associa a

importantes culturas agrícolas. O gene hfq foi amplificado a partir do DNA genômico de

H. seropedicae e clonado nos vetores de expressão pT7-7 e pET28(a), resultando nos

plasmídeos pKADO1 e pKADO2 que permitiram expressar a proteína nas suas formas

nativa e fusionada a cauda de histidinas respectivamente. A proteína Hfq foi purificada

por cromatografia de afinidade (forma fusionada) usando a coluna Hitrap-chelating Ni

-2

ou pelas cromatografias de interação hidrofóbica e troca aniônica (forma nativa) usando

as colunas butil-Sepharose e DEAE-Sepharose respectivamente. A proteína Hfq-His foi

purificada com 90 % de pureza final e a nativa alcançou 99 % de pureza. As duas

formas da proteína Hfq apresentaram atividade de ligação ao sRNA DsrA de

Escherichia coli quando analisadas em ensaios de retardamento de banda. A proteína

nativa apresentou uma maior afinidade pelo sRNA do que a forma fusionada, sugerindo

uma possível alteração da conformação do oligômero devido a presença da cauda de

histidinas. Hfq foi também analisada através das técnicas de dicroísmo circular (CD) e

espalhamento de luz dinâmico (DLS). O espectro de CD na região de UV distante

indicou a predominância de fitas beta em relação aos demais tipos de estrutura

secundária como já reportado na literatura para a Hfq de outros microrganismos. O

experimento de DLS mostrou uma amostra monodispersa com 48 kDa, dado indicativo

de uma conformação hexamérica final que foi confirmada por experimentos de gel-

filtração. Ensaios de cristalização automatizada por difusão de vapor em gota sentada

resultaram na formação de cristais em diversas condições, após três dias. A difração

por raios-X, utilizando um gerador de raios-X Rigaku, confirmou a presença de vários

cristais constituídos de proteínas. Uma das condições de cristalização, 100 mM de PCB

pH 7,0 e 25 % (w/v) PEG1500, permitiu a formação de um cristal que difratou a uma

resolução de 2.7 Å.

XIV

ABSTRACT

Hfq, an RNA chaperone and pleiotropic protein, is recognized as an important

protein involved in the post-transcriptional regulation in several bacteria. In this work, we

analyzed the hfq gene and its product from Herbaspirillum seropedicae, a diazotrophic

bacterium found associated to important agricultural crops. The H. seropedicae hfq gene

was amplified from genomic DNA and cloned into the expression vectors pT7-7 and

pET28(a), yielding plasmids pKADO1 and pKADO2. These allowed the over-expression

of the Hfq protein in its native and His-tagged forms, respectively. The Hfq protein was

purified either by affinity chromatography (His-tag Hfq) using HiTrap-Chelating -Ni

column or by hydrophobic interaction and anion exchange chromatography (native Hfq)

using a Butil-Sepharose and DEAE-Sheparose columns respectively. The His-tag

protein was purified to 90 % purity and the native form reached 99 % purity. The purified

proteins were shown to bind to DsrA sRNA from E. coli in band-shift assay. Interestingly,

the native protein seems to have more affinity for sRNA than his-tagged protein. Hfq was

analyzed by circular dichroism (CD) spectroscopy and dynamic light scattering (DLS).

The far-UV CD spectrum profile of Hfq protein indicated the predominance of beta-sheet

secondary structure as reported in the literature. The DLS experiment showed a

monodisperse sample with 48 kDa of molecular mass indicating a hexameric final

conformation in accordance with gel-filtration experiments. Automated crystallization

trials by sitting drop vapor diffusion method resulted in crystals in different conditions

after three days. X-ray diffraction, using an in-house X-ray generator from Rigaku,

confirmed that most of the crystals were indeed protein crystals. One of this

crystallization conditions, 100mM PCB pH 7.0 and 25% (w/v) PEG1500, yielded a

crystal that diffracted to 2.7 Å of resolution.

JUSTIFICATIVA

O diazotrofo Herbaspirillum seropedicae é um importante alvo de estudo por ser

um potencial biofertilizante a ser empregado na agricultura. Este potencial resume-se

na capacidade deste microrganismo de converter o nitrogênio gasoso em amônia que

poderia ser disponibilizada para as plantas como uma das fontes de nitrogênio. Esta

oferta de uma fonte extra de nitrogênio, aliada à produção de fitohormônio por H.

seropedicae, incrementaria o crescimento vegetal. Em função disto, esta bactéria vem

sendo estudada pelo Núcleo de Fixação de Nitrogênio desde 1984, tendo o seu

genoma seqüenciado e anotado pelo projeto GENOPAR (www.genopar.org). No

momento, estão em andamento projetos de caracterização funcional e estrutural dos

principais genes que participam do processo de fixação de nitrogênio e da interação

microrganismo-planta.

A proteína Hfq, identificada durante a anotação do genoma de H. seropedicae, é

um regulador pós-transcricional que interage com dois tipos de RNAs: um mensageiro e

outro com função regulatória (MOLLER et al., 2002). Em E. coli foi constatado que

quando não há expressão desta proteína, o microrganismo passa a apresentar um

fenótipo pleiotrópico (TSUI et al., 1994). Este fato ressalta a importância desta proteína

em vários processos celulares. Dentre estes processos está provavelmente o

envolvimento desta proteína na fixação biológica de nitrogênio (KAMINSKI et al., 1994;

DREPPER et al., 2002). Os microrganismos que fixam nitrogênio, comumente

denominados diazotrofos, são dotados de uma via metabólica específica para a

conversão do nitrogênio gasoso em amônia e outros produtos nitrogenados. Estudando

o microrganismo diazotrofo Azorhizobium caulinodans, Kaminski e colaboradores

(1994) observaram que quando não havia expressão de uma proteína homóloga a Hfq,

também não ocorria a expressão do gene nifA. No microrganismo Rhodobacter

capsulatus foi também constatada a influência da proteína Hfq sobre a expressão dos

genes nifA1, nifA2 e anfA (DREPPER et al., 2002). Desta forma o processo de fixação

de nitrogênio parece ser estreitamente regulado não só por proteínas regulatórias

específicas, mas também pela proteína Hfq. Esta regulação pode estar ocorrendo pela

estabilização dos RNAs dos genes envolvidos na fixação de nitrogênio ou pela

XVI

promoção do encontro de seus produtos com pequenos RNAs regulatórios específicos

para este processo, sugerindo etapas de regulação a nível pós-transcricional no

metabolismo do nitrogênio.

Além do potencial papel desta proteína no processo de fixação de nitrogênio, ela

pode ser utilizada ainda como um importante instrumento para a identificação de novos

sRNAs regulatórios. Como não há nenhuma espécie relacionada a H. seropedicae onde

os sRNAs já tenham sido estudados com maior profundidade, este microrganismo pode

ser uma importante fonte de novos RNAs regulatórios ainda não caracterizados.

1 INTRODUÇÃO

1.1 A FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO NITROGÊNIO

O nitrogênio é um importante componente do metabolismo dos seres vivos,

principalmente no que diz respeito à síntese de proteínas e ácidos nucleicos. A

metabolização deste elemento é relevante na área agrícola principalmente para o

desenvolvimento de plantas como milho, arroz e trigo, os quais constituem a principal

fonte de alimento da população mundial.

A fixação do nitrogênio pode ser feita através de diversos processos, por

exemplo, os fatores abióticos (descargas elétricas naturais, combustão e ação

vulcânica) ou por ação biótica (bactérias diazotróficas). A capacidade de fixar nitrogênio

é encontrada em muitos grupos de bactérias, incluindo: Firmibactérias, Actinomicetos,

Cyanobactérias, bactérias verdes sulfurosas e nas subdivisões de Proteobactérias

(DIXON & KAHN, 2004). Entre as proteobactérias pode-se citar os microrganismos

fixadores Bradyrhizobium japonicum, Herbaspirillum seropedicae, Rhodobacter

capsulatus e Sinorhizobium meliloti. A capacidade destes organismos de fixar o

nitrogênio atmosférico depende dos níveis de oxigênio e energia (DIXON & KAHN,

2004). A redução de nitrogênio gasoso a amônia requer grande investimento energético

por parte do microrganismo e, na natureza, somente um pequeno número de

procariotos é capaz de realizar esta atividade. A redução do nitrogênio a amônia é

catalizada pelo complexo enzimático da nitrogenase e sua estequiometria está descrita

abaixo (SIMPSON & BURRIS, 1984):

+ 8 H

+ 8 e

+ 16 ATP.Mg → 2 NH

+ H

+ 16 ADP.Mg + 16 Pi

Esta reação também pode ser realizada em escala industrial através de um

processo químico, desenvolvido por Fritz Haber e Carl Bosch (1918), que requerer altas

temperaturas e elevada pressão.

A utilização de microrganismos fixadores de nitrogênio para o cultivo de plantas

em larga escala revela-se, do ponto de vista biológico e econômico, uma importante e

viável alternativa para uma agricultura sustentável, pois se estima que os fertilizantes

nitrogenados contribuam com uma grande porcentagem no custo total da produção

agrícola, além de serem as maiores fontes de poluição ambiental (MACHADO &

MAGNAVACA, 1991). Portanto, vários grupos de pesquisa têm buscado desenvolver

tecnologias para a produção de inoculantes contendo diferentes microrganismos. Tem-

se por objetivo aumentar a produtividade agrícola com fontes alternativas de nitrogênio

e evitar, desta forma, a agressão ao meio ambiente, como os causados pelas fontes

inorgânicas comumente empregadas, diminuindo a degradação ambiental em função

da expansão agrícola. Além disso, pode-se também destacar a economia gerada pela

restrição do uso de fertilizante industrial.

Estes fatores têm sido os principais motivadores ao desenvolvimento de

pesquisas que ampliem a compreensão da genética e fisiologia dos microrganismos

fixadores de nitrogênio.

1.2 Herbaspirillum seropedicae

Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria diazotrófica, gram-negativa,

geralmente vibróide, com dois flagelos em um ou em ambos os pólos, membro da

subdivisão β das Protobactérias (BALDANI et al., 1986). Segundo a etimologia das

palavras: Herbaspirillum corresponde a uma pequena bactéria em formato espiral

presente em sementes de plantas herbáceas e seropedicae refere-se à cidade de

Seropédica/Rio de Janeiro/Brasil, onde o organismo foi primeiramente isolado

(BALDANI et al., 1986).

Estudos da interação entre H. seropedicae e gramíneas demonstraram o seu

grande potencial como biofertilizante nitrogenado, além da capacidade de produzir

fitohormônios que estimulam o crescimento vegetal (OLIVARES et al., 1997). Bactérias

do gênero Herbaspirillum spp. têm sido encontradas dentro de raízes e tecidos aéreos

de cana-de-açúcar sugerindo o caráter endofítico da infecção desse diazotrofo

(BODDEY et al.,1995).

Esta bactéria tem sido alvo de estudo do Núcleo de Fixação de Nitrogênio-UFPR

e diversos genes envolvidos na fixação de nitrogênio já foram caracterizados a nível

estrutural e/ou funcional: nifA (SOUZA et al., 1991a; SOUZA et al., 1991b), nifHDK

(MACHADO et al., 1996), glnB (BENELLI et al., 1997), glnAntrBC (PEDROSA et al,

2001), nifENXorf1orf2, nifQmodABC, fixXC (KLASSEN et al., 1999), nifB (REGO et al.,

2006), modE (VOIGT et al., 2000) e orf1glnKamtB (NOINDORF et al., 2006).

Com o Programa Genoma do Paraná (GENOPAR – www.genopar.org), iniciado

em 2001, foi possível realizar o seqüenciamento e a anotação do genoma deste

microrganismo e desta forma identificar/mapear outros genes envolvidos na fixação

biológica de nitrogênio, assim como inferir a provável função de seus produtos. O perfil

de expressão protéica de mutantes resultantes do knock-out de genes envolvidos na

fixação está sendo estudado no Programa Proteoma do Paraná (PROTEOPAR).

Atualmente, o foco das pesquisas está voltado para a necessidade de

compreender os mecanismos pelos quais ocorre a interação entre H. seropedicae e a

planta hospedeira assim como entender melhor os mecanismos de regulação desta

função biológica. O propósito futuro consiste em estimular, controlar e potencializar a

disponibilização de amônia a planta.

1.3 sRNA

RNA (Ácido Ribonucléico) é a biomolécula que transporta a informação contida

no DNA. Apresenta-se geralmente na forma de simples fita, composta de

ribonucleotídeos (adenosina, guanosina, citosina e uracila), podendo assumir estruturas

secundárias mais complexas que o próprio DNA e, desta forma, outras funções

(LEWIN,1999). Tradicionalmente os RNAs do tipo mensageiro, transportador e

ribossômico são os mais citados, devido à participação direta que estas biomoléculas

exercem durante o processo de tradução.

Nos últimos anos tem sido caracterizado um novo grupo de RNAs de 40-400

pares de base que não codificam proteínas via mRNA e não correspondem a tRNA ou

rRNA (STORZ et al., 2004). Devido ao seu pequeno tamanho são comumente

chamados de RNAs pequenos (sRNA - Small RNAs) ou RNAs não-codificadores

(ncRNA - Noncoding RNAs). Os sRNAs não puderam ser encontrados por ensaios de

mutação e nem pelo processo de anotação dos genomas por não possuírem as

características de uma ORF (Open Reading Frame). Os primeiros sRNAs foram

descobertos em estudos que envolviam o fenótipo resultante de plasmídeos de

múltiplas cópias e também pela detecção de seqüências referentes a estes RNAs

quando estudava-se um operon específico (GOTTESMAN, 2004).

Várias técnicas têm sido desenvolvidas a fim de encontrar novos sRNAs, devido

à sua importância como reguladores pós-transcricionais. Estratégias como análise de

bioinformática, detecção por microarranjo, clonagem por shot-gun (RNomics), co-

purificação com a proteína Hfq e estudos de genética funcional e marcação de RNA

(VOGEL & SHARMA, 2005) tem sido utilizadas. Apesar da lista de sRNAs ser cada vez

maior, devido a novas descobertas, a função fisiológica detalhada da maioria ainda

permanece desconhecida.

Os sRNAs são freqüentemente conservados entre espécies relacionadas e suas

seqüências comumente encontram-se em regiões intergênicas dentro de operons

(figura 1) (GOTTESMAN, 2004; MAJDALANI et al., 2005). Sua seqüência codificadora

possui um terminador independente da proteína Rho e, freqüentemente, contém

estruturas internas na forma de grampos e loops (GOTTESMAN, 2004).

FIGURA 1 – PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DOS sRNAs

Localização da região codificadora dos sRNAs com seus componentes estruturais. Figura modificada de

LIVNY et al., 2005.

Assim como as proteínas, a diversidade estrutural que os sRNAs podem assumir

lhes confere a capacidade de desempenhar diferentes funções e eles podem ser

enquadrados em duas principais classes: aqueles que atuam por pareamento de bases

com mRNA e aqueles que atuam por interação direta com proteínas, sendo que a

maioria dos integrantes da primeira classe necessita da proteína Hfq como chaperona

(MAJDALANI et al., 2005). Alguns sRNAs de E. coli cuja função e categoria já foram

definidos estão listados na tabela 1.

Os RNAs curtos afetam a tradução e a estabilidade de mRNAs adicionando

complexidade aos mecanismos moleculares da célula que respondem às mudanças

ambientais (ALTUVIA, 2004). Esta característica permite classificar os sRNAs como

reguladores da expressão gênica a nível pós-transcricional que atuam de acordo com

três mecanismos gerais: funcionando como parte integral de complexos protéicos, como

o RNA 4.5S que é um componente da RNAseP; mimetizando a estrutura de outros

ácidos nucléicos; como o RNA 6S que se liga a σ

-RNA polimerase holoenzima; ou

realizando o pareamento de base com outros RNAs (STORZ et al., 2004). Esta última

função será abordada com mais detalhes por ser a classe funcional cujos integrantes

interagem com a proteína Hfq.

TABELA 1 – PEQUENOS RNAS DE E. coli

CATEGORIA sRNA TAMANHO (pb) FUNÇÃO

Estrutural/enzimática 4.5S 114 Secreção

RNAseP 377 Ribozima, processamento

Controle de Qualidade TmRNA 363

Controle de qualidade da

tradução

Proteínas Inibitórias 6S 184 Inibe a RNA polimerase

CsrB 360 Inibe CsrA

CsrC 270 Inibe CsrA

Antisense (ação em cis) SokA 55 HokA antitoxina

RdlD 66 LdrD antitoxina

Interação com Hfq,

antisense DsrA 85 Estimula rpoS

Inibe hns

RprA 105 Estimula rpoS

OxyS 109 Anti-rpoS, fhlA

RyhB/SraI 90 Anti-sdh, sod

Spot 42 109 Anti-galK

MicF 93 Anti-ompF

MicC 108 Anti-ompC

DicF 56 Anti-ftsZ

Antisense RyhA/SraC 275 Anti-ryeB

Modificado de GOTTESMAN, 2004.

A maioria dos sRNAs que realizam pareamento de base desempenham sua

função ao formar pequenas regiões híbridas e descontínuas com seu mRNA alvo.

Devido a forma rápida pela qual estes híbridos podem ser formados, um sRNA pode

interagir com mais de um mRNA através de diferentes regiões (ALTUVIA, 2004). Pode-

se inferir que a interação rápida e o pequeno tamanho do sRNA possibilita uma

resposta muito mais rápida do que aquela oferecida por proteínas reguladoras

(GOTTESMAN, 2004).

Este pareamento pode resultar na ativação ou inibição da tradução ou ainda, na

ativação ou inibição da degradação do mRNA (MAJDALANI et al., 2005). A primeira

situação ocorre quando o pareamento do sRNA com o mRNA libera o sítio de ligação

do ribossomo, que estava ocluído por um grampo interno, ativando a tradução; ou o

sRNA pode ocluir o sítio de ligação inibindo a tradução. As atividades referentes à

ativação ou inativação da tradução realizadas indiretamente por estas biomoléculas são

mediadas pela proteína Hfq (MAJDALANI et al., 2005). Na segunda situação o

pareamento pode estabilizar o mRNA ou torná-lo mais vulnerável à ação de RNAses

(MASSE et al., 2003; GOTTESMAN, 2004).

1.4 PROTEÍNA HFQ

A proteína Hfq foi primeiramente identificada como um fator do hospedeiro

necessário para a replicação da fita (+) do bacteriófago Qβ RNA (FERNANDEZ et al.,

1968). As siglas Hfq provêm então de Host Factor Q. A maquinaria para a replicação

deste retrovirus é composta de uma proteína codificada pelo material genético do

próprio fago (subunidade β) e três proteínas codificadas pelo hospedeiro: a proteína

ribossomal 30S (subunidade α), um fator de elongação EF-Ts (subunidade γ)

(BLUMENTHAL & CARMICHAEL, 1979) e a proteína Hfq também referida como HF-I

(KAJITANI et al., 1994). A proteína Hfq está envolvida no reconhecimento do RNA viral

facilitando o acesso da replicase à região 3’ do molde (ORTÍN & PARRA, 2006). Hfq faz

com que o complexo da replicase ligue-se mais fortemente ao RNA (BLUMENTHAL &

CARMICHAEL, 1979).

Atualmente, é consenso que esta proteína atua como um regulador da expressão

de muitos genes através da interação com RNAs (MUFFLER et al., 1997) e, por este

motivo, ela é considerada um regulador global do metabolismo bacteriano.

De acordo com dados disponíveis, a proteína Hfq está ausente em três clados

bacterianos: Chlamidia-Spirochaetes, Actinomycetes-Deinococcus e Cytophagales

(bactérias verdes sulforosas) (SUN et al., 2002). Contudo, está presente em todas as

proteobactérias (α, β e γ) com exceção das bactérias que sofreram grande redução de

seus genomas devido a um estilo de vida parasitário (SUN et al., 2002). As informações

acima descritas estão resumidas na tabela 2. Em E. coli, o gene hfq encontra-se no

minuto 94,8 do cromossomo (KAJITANI & ISHIHAMA, 1991), em um operon que

compreende os genes: amiB e miaA (envolvidos na modificação de RNA); e os genes

hflXKC (reguladores da protease FtsH). Neste organismo mais de 30% dos sRNAs

conhecidos interagem com a proteína Hfq (ZHANG et al., 2003) dado que reforça a

importância desta proteína no processo de regulação da expressão gênica.

Esta proteína é altamente conservada e termoestável (VALISSILIEVA et al.,

2002). Hfq pertence à família de proteínas denominada Sm-like proteins, que se

caracterizam por interagir com moléculas de RNA gerando complexos que participam

dos spliceossomos (WILL et al., 2001). Os seus membros possuem duas regiões

conservadas (Sm1 e Sm2) separadas por uma região variada em tamanho e seqüência

(HERMANN et al., 1995). O motivo Sm é constituído de uma α-hélice N-terminal

seguida de cinco fitas β (KAMBACH et al., 1999). A conformação da proteína Hfq de E.

coli está ilustrada na figura 2.

TABELA 2 – PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE HFQ EM DIFERENTES FILOS

BACTERIANOS

Relação de espécies onde a proteína Hfq está presente ou ausente. Espécies que possuem duas cópias

do gene hfq (2). (SUN et al., 2002)

Filo

Espécies com Hfq Espécies sem Hfq

Gram-positivo (baixo GC)

FIGURA 2 – MONÔMERO DA PROTEÍNA Hfq DE S. aureus

O monômero da proteína Hfq apresenta conformação composta de uma α-hélice N-terminal seguido de

cinco fitas β C-terminal. Estrutura determinada por análise cristalográfica. SCHUMACHER et al., 2002.

As proteínas Hfq de vários organismos apresentam um núcleo constituído de 7 a

66 aminoácidos bastante conservados e uma região C-terminal variável (SAUTER et al.,

2003; SUN & WARTELL, 2006). Sonnleitner e colaboradores (2004) demonstraram que

os 65 primeiros aminoácidos da proteína Hfq de E. coli são suficientes para a formação

do hexâmero e para a ligação ao sRNA DsrA. Quanto a região C-terminal, Vecerek e

colaboradores (2007) relataram a importância da mesma na ligação a mRNA, uma vez

que Hfq de E. coli destituída desta região perde esta propriedade de ligação.

A conservação na seqüência de aminoácidos justifica a conservação estrutural

observada para esta proteína. As estruturas cristalográficas das proteínas Hfq de

Staphylococcus aureus (SCHUMACHER et al., 2002), E. coli (SAUTER et al., 2003),

Pseudomonas aeroginosa (NICULIN et al., 2005) e Methanococcus jannaschii

(NIELSEN et al., 2007) já foram determinadas e foi possível observar que, em sua

forma ativa, as proteínas Hfq apresentam estrutura quaternária em anel composto por

seis a sete monômeros. Em E. coli, Hfq encontra-se na forma de um hexâmero onde

cada monômero possui uma massa molecular de 11,7 KDa (KAJITANI & ISHIHAMA,

1991) (figura 3).

FIGURA 3 – ESTRUTURA DA PROTEÍNA HFQ DE E. coli

Estrutura cristalográfica da proteína Hfq de E. coli. Em vermelho e azul os componentes estruturais de

um monômero da proteína no contexto do oligômero. SAUTER et al., 2003.

Além da atividade de ligação a RNAs, tem-se evidenciado que a proteína Hfq

possui atividade de ATPase (SUKHODOLETS & GARGES, 2003; ARLUISON et al.;

2007). Mas, até o momento, não se sabe qual reação bioquímica está acoplada à

hidrólise de ATP realizada por Hfq. Sukhodolets e Garges (2003) demonstraram a

atividade de hidrólise de ATP por Hfq, além de observarem que a região N-terminal da

proteína em E. coli apresentava homologia a uma região de ClpB. Esta proteína de

choque-térmico foi identificada como uma ATPase, sendo que esta região homóloga

incluía o motivo Walker A, característico das proteínas com esta atividade.

Posteriormente Arluison e colaboradores (2007) demonstraram que a ligação a ATP

promove desestabilização do complexo proteína-RNA e a liberação do RNA. Contudo

não está claro se esta atividade é latente ou se está acoplada a uma atividade relevante

in vivo.

Sendo a proteína Hfq um riboregulador, espera-se sua interação com proteínas

do ribossomo, degradossomo de RNA e outras proteínas envolvidas no metabolismo do

RNA (BRENNAN & LINK, 2007). Tem sido reportada a interação da proteína Hfq com:

proteína ribossomal S1 (SUKHODOLETS & GARGES, 2003), proteínas PNP e PAPI

componentes do degradossomo (MOHANTY et al., 2004), RNAseE (MORITA et al.,

2005, AIBA, 2007) e proteína CCA, que adiciona a seqüência CCA à região 3’ de todos

os tRNAs (SCHEIBE et al., 2007).

A atividade de ligação ao sRNA SgrS e ao mRNA ptsG tem sido descrita na

literatura como um mecanismo de silenciamento gênico (KAWAMOTO et al., 2006;

AIBA, 2007). Esta desestabilização do mRNA ocorre via RNAseE, resultando na

degradação do mesmo. Este complexo pode futuramente ser explorado como um

modelo de RNA de interferência em procariotos e ser utilizado nas pesquisas para o

silenciamento gênico.

1.5 FUNÇÃO DE CHAPERONA DA PROTEÍNA HFQ

A proteína Hfq apresenta função de chaperona ao promover a interação entre o

pequeno RNA regulatório (sRNA) e o RNA mensageiro (mRNA) alvo, facilitando a

formação do duplex sRNA-mRNA (figura 4) (MOLLER et al., 2002; ZHANG et al., 2002,

2003; GEISSMANN & TOUATI, 2004; RASMUSSEN et al., 2005). Esta função tem sido

reportada, por exemplo, na estimulação do anelamento intermolecular entre o sRNA

DsrA e o mRNA rpoS que codifica para o fator de transcrição do estado estacionário

sigma S (σ

) (figura 5) (REPOILA et al., 2003). Este fator sigma está envolvido na

transcrição de genes durante o estado de estresse osmótico, o crescimento em meios

de cultura com pH baixo, falta de oxigênio, choque térmico e transição para a fase

estacionária do crescimento celular (HENGGE- ARONIS, 1993).

FIGURA 4 – FORMAS DE INTERAÇÃO ENTRE mRNA e sRNA PROMOVIDAS PELA

PROTEÍNA HFQ

STORZ et al., 2004.

Além do controle estabelecido por este fator, vários sRNA também são transcritos em

resposta às condições ambientais (WASSARMAN, 2002).

Sugere-se que a interação da proteína Hfq com o RNA aumente a concentração

local desta biomolécula, fornecendo assim um local para a interação entre os RNAs.

Desta forma, sRNADsrA e Hfq estimulam a tradução da proteína RpoS através da

abertura da estrutura secundária do seu mRNA, liberando o acesso do ribossomo ao

seu sítio de ligação (LEASE et al., 2004). Tem sido também demonstrado que em

alguns casos a participação da proteína Hfq é dispensável após a formação da

interação sRNA-mRNA (LEASE et al., 2004).

Além de regular positivamente a transcrição do mRNA, a interação entre sRNA-

mRNA pode também causar o bloqueio da seqüência de Shine-Dalgarno ou

desencadear a degradação do duplex (figura 5) (MASSE & GOTTESMAN, 2002).

FIGURA 5 – ESQUEMA DAS REGIÕES DE INTERAÇÃO ENTRE O sRNA DsrA E O

mRNA rpoS DE E. coli

SD: Seqüência Shine-Dalgarno. LEASE et al., 2004.

Em E. coli, a regulação pós-transcricional ocorre também sob a própria

expressão de Hfq (autoregulação), onde o excesso de proteína acarreta na

instabilidade de seu mRNA de uma forma dependente de RNaseE (TSUI et al., 1997).

Outra forma de autoregulação descrita por Vecerek e colaboradores (2006), consiste na

competição entre Hfq e a subunidade 30S do ribossomo pelo mRNA de hfq, o que

levaria à inibição da formação do complexo de início de tradução. Esta repressão

consiste num controle fino realizado por Hfq sob sua própria expressão.

A interação entre a proteína Hfq e os RNAs ocorre preferencialmente em

seqüências ricas em adeninas e uracilas (HASETH & UHLENBECK, 1980). Como

exemplo pode-se citar a ligação da proteína Hfq ao sítio 5’ AAUUAAUAAUAAA 3’ do

mRNA sodB que codifica para uma das proteínas da superóxido dismutase

(GEISSMANN & TOUATI, 2004). O sítio de ligação é similar à seqüência de clivagem

reconhecida pela RNAseE e desta forma sugere-se que a proteína Hfq bloqueia e evita

a clivagem (MOLL et al., 2003; STORZ et al., 2004), exercendo desta forma um efeito

estabilizador sobre o RNA.

Esta interação de Hfq com RNAs levaram a estudos da localização subcelular da

proteína revelando que a maior parte encontra-se associada com o aparato traducional

e uma menor parte associada ao nucleóide (KAJITANI et al., 1994). A associação ao

nucleóide pode ser explicada pela ligação não específica da proteína Hfq ao DNA

(AZAM & ISHIHAMA, 1999).

1.6 EFEITO PLEIOTRÓPICO DE Hfq E ENVOLVIMENTO NA FIXAÇÃO DE

NITROGÊNIO

Estudos com o mutante hfq

–

de E.coli mostraram uma diminuição na taxa de

crescimento, aumento no tamanho celular, sensibilidade osmótica e aumento na

sensibilidade à radiação ultravioleta (UV) (TSUI et al., 1994). Muitos destes fenótipos

coincidiram com o fenótipo rpoS

(HENGGE-ARONIS, 2002). O aumento na

sensibilidade ao UV pode ser justificado pela ação desestabilizadora da proteína Hfq

sob o mRNA do gene mutS que participa do mecanismo de reparo do DNA (TSUI et al.,

1997). Todas essas características do mutante sugerem a importante atuação da

proteína Hfq no controle da expressão de genes envolvidos em mais de uma via

metabólica, apresentando então um efeito pleiotrópico.

Como abordado anteriormente, a proteína Hfq é conservada entre as diferentes

espécies de bactérias, possuindo não só um papel no metabolismo geral, mas também

sobre atividades específicas como a virulência de organismos patogênicos e o

metabolismo do nitrogênio. A proteína Hfq tem sido também apresentada como um

importante fator de interferência na virulência de organismos patogênicos como as

bactérias Gram-negativas: Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa, Brucella

abortus, Legionella pneumophila e Vibrio cholerae (NAKAO et al., 2005; ROBERTSON

& ROOP, 1999; SONNLEITNER et al., 2003; DING et al., 2004; McNEALY et al., 2005).

Sonnleitner e colaboradores (2003) demonstraram que o patógeno hfq

Pseudomonas aeruginosa O1 quando administrado a camundongos apresentava uma

virulência diminuída num fator de 1 x 10

em conseqüência da influência na taxa de

crescimento e sobre a expressão do pili do sistema de secreção tipo IV. Estudos

recentes apresentaram a influência da proteína Hfq sobre o efeito do ambiente de

microgravidade na virulência do patógeno Salmonella typhimurium (WILSON et al.,

2007). O crescimento deste patógeno no espaço culminou com o aumento de sua

virulência, formação de agregação celular e modificação da expressão de genes

associados com a utilização de ferro e formação de biofilme (WILSON et al., 2007). Os

mesmos autores sugeriram que a proteína Hfq coordenou a resposta deste

microrganismo a este ambiente uma vez que grande parte dos genes cuja expressão foi

modificada pertencia ao regulon desta proteína.

Hfq, aparentemente, também apresenta papel específico no processo de fixação

de nitrogênio. Em 1994, Kaminski e colaboradores, ao estudar o diazotrofo

Azorhizobium caulinodans, reportaram a presença de uma proteína homóloga a Hfq,

chamada de Nrf, necessária para a expressão da proteína NifA, um ativador

transcricional dos genes nif. Os mesmos pesquisadores relataram a ausência de

expressão do gene nifA no mutante nrfA

(KAMINSKI et al., 1994). Esta proteína atua,

portanto como um regulador positivo e controla a resposta da célula a dois sinais

exógenos ambientais, nitrogênio e oxigênio (KAMINSKI & ELMERICH, 1998). Este

controle ocorre quando a proteína Hfq estabiliza e estende a tradução do mRNA de

nifA, permitindo o desencadeamento da cascata gênica que culmina com a formação do

complexo da nitrogenase.

O microrganismo Rhodobacter capsulatus possui também uma proteína NrfA

similar a de A. caulinodans, entretanto esta não parece influenciar o crescimento do

diazotrofo, mas é necessária para o máximo crescimento quando na presença de N

como única fonte de nitrogênio via nitrogenase dependente de molibdênio ou

nitrogenase alternativa (DREPPER et al., 2002). Neste organismo, a proteína Hfq

estaria regulando o processo de fixação ao nível de tradução dos ativadores

transcricionais NifA1, NifA2 e AnfA.

O indício mais recente de uma provável atuação da proteína Hfq sobre a fixação

biológica de nitrogênio surgiu com o trabalho de Wilson e colaboradores (2007) ao

estudarem a expressão gênica diferencial do microrganismo não diazotrífco Salmonella

typhimurium em resposta a esta proteína em ambiente de microgravidade. Os genes

nifU e fnr foram listados como tendo expressão diminuída neste ambiente. A proteína

NifU é responsável pela formação do cluster Fe-S destinado a maturação da

nitrogenase em microrganismos diazotrofos (SANTOS et al., 2004) e a proteína Fnr é

um ativador transcricional envolvido na sensibilidade ao oxigênio da proteína NifA

(MONTEIRO et al., 2003). Estes dados sugerem a possível influência de Hfq sobre a

expressão de outras proteínas que participam da fixação de nitrogênio.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

O presente trabalho teve por objetivos a caracterização funcional e estrutural da

proteína Hfq de Herbaspirillum seropedicae, visando a posterior investigação do seu

papel no processo de fixação de nitrogênio.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Analisar in silico a região regulatória e estrutural do gene hfq de H.

seropedicae e de seu produto;

• Clonar o gene hfq de H. seropedicae em vetor de expressão e determinar as

condições de superexpressão em Escherichia coli;

• Purificar a proteína Hfq nas formas nativa e fusionada a cauda de histidinas;

• Realizar ensaios de cristalização da proteína Hfq purificada;

• Determinar a sua atividade através da sua ligação a pequenos RNAs de

Escherichia coli;

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DO GENE hfq DE H. seropedicae

A análise da seqüência do gene hfq e das regiões a montante e a jusante deste

foi realizada por programas de Bioinformática disponíveis no site do Núcleo de Fixação

de Nitrogênio - UFPR (NFN, 2005) ou de acesso público na Internet. As análises

realizadas foram: identificação da provável região codificadora da proteína (ORF),

identificação de prováveis promotores, identificação do sítio de ligação de ribossomo

(RBS), identificação dos códons de início e término de transcrição e identificação de

terminador de transcrição independente de proteína Rho.

Os mapas de restrição e a seqüência de aminoácidos traduzidas a partir da

seqüência de pares de base foram obtidas com o programa BioEdit (HALL, 2001).

As seqüências completas de aminoácidos foram alinhadas e comparadas para a

identificação de regiões conservadas através do programa ClustalW (THOMPSON et

al., 1994). As seqüências foram obtidas do banco de dados GeneBank DataBases,

disponível na internet, utilizando o programa Entrez Nucleotide Search, assim como o

programa Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). As buscas foram realizadas

tomando como base as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da proteína Hfq de

H. seropedicae.

3.2 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS

As estirpes de bactérias e plasmídeos que foram utilizados neste trabalho

estão relacionados nas Tabelas 3 e 4, respectivamente.

TABELA 3 – LISTA DE ESTIRPES DE BACTÉRIAS UTILIZADAS

Estirpe

Genótipo ou

Características

Relevantes

Referência/

Fonte

E. coli

TOP10

F- mcrA (mrr-hsdRMS-crBC) 80lacZM15

lacX74 recA1 ara 139 (ara-leu)7697 galU galK

rpsL (Str

) endA1 nupG

Invitrogen Inc.

BL21 (DE3)

Hsd gal (

cIts 857 ind 1 Sam7 nin5

lacUV5-T7 gene 1) (produtora da RNA

polimerase do fago T7).

New England

Biolabs.

H. seropedicae

Smr1

Estirpe selvagem, Sm

NIF

SOUZA, 2000.

TABELA 4 – LISTA DE PLASMÍDEOS UTILIZADOS

Plasmídeos Características Relevantes Referência/

FONTE

pHS17-LV-00-

000-023-D11

Amp

, pUC19 contendo DNA

inserto com o gene hfq de H. seropedicae.

Banco de genes de

H. seropedicae

(GENOPAR).

pCR2.1

lacZ, Amp

, Km

Invitrogen Inc.

pET28(a)

Promotor T7, lacI, Km

, seqüência

codificadora para a cauda de histidinas.

Novagen Inc.

pDK-7

Vetor de expressão com promotor

tac. Cm

KLEINER et al., 1988.

pT7-7

Vetor de expressão/ promotor T7.

Amp

TABOR &

RICHARDSON, 1985

pT7G

DsrA

Amp

, contém o promotor T7 a

montante da seqüência codificadora do

sRNA DsrA de E. coli.

LEASE &

WOODSON, 2004.

pUC-T7RpoS2

Amp

, contém o promotor T7 a

montante da seqüência codificadora do

mRNA RpoS2 de E. coli.

LEASE &

WOODSON, 2004.

pKADO0

Fragmento XbaI/HindIII contendo o

gene hfq do plasmídeo pCR2.1::hfq

clonado no vetor pDK7-7.

Este trabalho

pKADO1

Fragmento NdeI/HindIII contendo o

gene hfq do plasmídeo pKADO0 clonado

no vetor pT7-7.

Este trabalho

pKADO2

Fragmento NdeI/HindIII contendo o

gene hfq do plasmídeo pKADO1 clonado

no vetor pET28-a.

Este trabalho

3.3 MEIOS DE CULTURA, CONDIÇÕES DE CULTIVO E ESTOQUE DOS

MICRORGANISMOS

As estirpes de Escherichia coli foram cultivadas em meio LB (SAMBROOK et al.,

1989) sob agitação (130 rpm) a 37

C ou em estufa a 37 ºC em meio LA.

O meio LB possui a seguinte composição:

Triptona 10 g/L

Extrato de levedura 5 g/L

NaCl 10 g/L

O meio LA é composto de meio LB mais 15 g/L de ágar.

Para o cultivo celular de E.coli com a finalidade de preparar células

eletrocompetentes foi utilizado o meio SOB (Gibco-BRL-Invitrogen) que possui a

seguinte composição:

Bacto Triptona 20 g/L

Extrato de levedura 5 g/L

NaCl 0,584 g/L

KCl 0,186 g/L

Após o processo de transformação por eletroporação as células de E. coli foram

recuperadas em meio SOC (Gibco-BRL-Invitrogen), que possui a seguinte composição:

Triptona 20 g/L

Extrato de levedura 5 g/L

NaCl 0,06 g/L

KCl 0,019 g/L

MgCl

0,094 g/L

MgSO

0,12 g/L

Glucose 0,36 g/L

A estirpe de H. seropedicae SmR1 foi cultivada a 30 °C, sob agitação a 130 rpm,

durante 16 horas em meio NFbHPN (KLASSEN et al., 1997), na presença de

estreptomicina (80 μg/mL). O meio NFb-malato possui a seguinte composição:

MgSO

.7H

O 2 x 10

-1

g/L

NaCl 1 x 10

-1

g/L

CaCl

2 x 10

-2

g/L

Ácido nitrilo-triacético 5,6 x 10

-2

g/L

FeSO

. 7H

O 2 x 10

-2

g/L

Malato de sódio 5 g/L

Biotina 1 x 10

-4

g/L

MoO

.2 H

O 2 x 10

-3

g/L

MnSO

. H

O 2,35 x 10

-3

g/L

2,8 x 10

-3

g/L

CuSO

.5 H

O 8 x 10

-5

g/L

ZnSO

.7 H

O 2,4 x 10

-4

g/L

No momento do uso, o meio NFbHPN foi obtido por adição de 50 mL/L de

solução estéril de fosfatos (159,5 g/L de KH

e 17,8 g/L de K

HPO

) e de 20 mL/L

de cloreto de amônio 1 mol/L ao meio NFb-Malato.

3.4 ANTIBIÓTICOS

Os antibióticos usados nos meios de cultura foram:

Antibiótico Abreviatura

Concentração Final

Organismo

Ampicilina Amp

250 μg/mL

E. coli

Canamicina Km

100 μg/mL

E. coli

1000 μg/mL

H.seropedicae

Cloranfenicol Cm

30 μg/mL

E. coli

100 μg/mL

H.seropedicae

Estreptomicina Sm

80 μg/mL

E. coli e H.seropedicae

Tetraciclina Tc

10 μg/mL

E. coli e H.seropedicae

As soluções estoque foram preparadas e estocadas segundo SAMBROOK et al.,

1989.

3.5 MANIPULAÇÃO DE DNA

3.5.1 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE H. seropedicae

Células de H. seropedicae de cerca de 10 mL de cultura saturada, cultivadas em

meio NFbHPN, foram coletadas, em 2 a 5 tempos de centrifugação a 12.000 g por 1

minuto, em um mesmo tubo de 2 mL. A massa de células foi ressuspendida, por

agitação em “vortex“, em 500 μL de tampão GET (50 mmol/L glicose, 25 mmol/L Tris-

HCl pH 8,0; 10 mmol/L EDTA pH 8,0) e as células foram lisadas por tratamento com

lisozima 100 μg/mL a 37°C por 20 minutos. Em seguida, foi adicionado SDS 1 % ao

material e incubado a temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, o material

foi incubado com Proteinase K 200 μg/mL a 50 °C por 12 horas. A mistura foi

centrifugada e o sobrenadante coletado foi extraído, sequencialmente, uma vez com

fenol equilibrado, uma vez com fenol:clorofórmio (1:1) e duas vezes com clorofórmio:

álcool isoamílico (24:1). O DNA genômico foi precipitado pela adição de 2 volumes de

etanol 96 %, lavado com etanol 80 %, seco e ressuspenso em 100 μL de água ultra

pura estéril.

3.5.2 REAÇÃO EM CADEIA DA DNA POLIMERASE (PCR)

O sistema de reação (20 μL) foi composto de: 1-5 ng/mL de DNA genômico de H.

seropedicae, 0,5 pmol/mL de cada primer (figura 6), 0,2 mmol/L de dNTPs, tampão de

reação (20 mmol/L Tris-HCl pH 8,4 e 50 mmol/L de KCl), 1,5 mmol/L de cloreto de

magnésio e 1 μL de Taq DNA Polimerase. A amplificação foi realizada com o seguinte

programa de 35 ciclos: 30 segundos a 94 ºC, 45 segundos para anelamento e 1 minuto

e 30 segundos de extensão a 72 ºC. A amplificação do gene hfq foi conduzida utilizando

uma curva de temperatura de 45 a 55 ºC para o anelamento dos oligonucleotídeos

iniciadores.

3.5.3 CLONAGEM EM VETOR DE EXPRESSÃO

Para a amplificação do gene hfq de H. seropedicae foi desenhado um par de

oligonucleotídeos mutageneizados (figura 6), tendo como base a seqüência de

nucleotídeos do gene encontrado no banco de dados do Programa Genopar. Foram

utilizados o oligonucleotídeo iniciador 5’ (forward primer) contendo um sítio para a

enzima NdeI e o oligonucleotídeo iniciador 3’ (reverse primer) contendo um sítio para a

enzima HindIII. O produto de amplificação foi clonado no vetor pCR2.1, sendo em

seguida subclonado no vetor pDK-7 e finalmente subclonado nos vetores de expressão

pET28(a) e pT7-7 (tabela 4).

FIGURA 6 – OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES UTILIZADOS PARA A

AMPLIFICAÇÃO DO GENE hfq

Nde l CA TATG

5’- CACCGGAGCTCATATG

AGCAAC- 3’

Hind III A

AGCTT

5’- GGCGTCAAGCTTGCCAGGTAG- 3’

Em vermelho, a posição do sítio de restrição. A seta azul indica o local da clivagem pela enzima de

restrição.

3.5.4 MINIPREPARAÇÃO DE PLASMÍDEO POR LISE ALCALINA

A extração dos plasmídeos das células de E. coli foi realizada pelo método de

lise alcalina (SAMBROOK et al., 1989). Os plasmídeos purificados foram analisados por

eletroforese em gel de agarose (SAMBROOK et al., 1989).

3.5.5 SEQUENCIAMENTO DE DNA

A reação de sequenciamento foi realizada segundo o método de Sanger

(SANGER & COULSON, 1977), em que os dideoxynucleotídeos foram utilizados como

terminadores de cadeia.

O sistema de reação constituiu de aproximadamente 0,5 μg de DNA de fita

dupla, 2 pmol de oligonucleotídeo iniciador, 3 μL de ET terminador mix (Sequencing

Reagent Premix - DYEnamic

ET Dye Terminator Cycle Senquencing Kit, GE

HealthCare) que contém os cromóforos fluorescentes como terminadores de cadeia e

água ultra pura suficiente para 7,5 μL. O sistema foi amplificado em termociclador. A

seguir o produto das reações foi transferido para um novo tubo contendo 2 μL de

acetato de amônio (7,5 mmol/L) e 60 μL de etanol absoluto para a sua purificação. Após

precipitação, a amostra de DNA foi centrifugada a 12.000 g por 20 minutos, lavada duas

vezes com etanol 80 % e secado. O DNA foi ressuspendido em 4 μL de Formamide

Loading Dye (Applied Biosystems), desnaturado por 2 minutos a 96 ºC e aplicado no gel

do seqüenciador automático de DNA ABI-PRISM 377 (Applied Biosystems).

3.5.6 CLIVAGEM DO DNA COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

O sistema de restrição foi composto das enzimas apropriadas, tampão de reação

e DNA purificado, sendo em seguida incubado em temperatura e tempo sugeridos pelo

fabricante.

3.5.7 LIGAÇÃO DNA INSERTO AO VETOR

A reação de ligação foi composta de: 2 μl de vetor (aproximadamente 50 ng/μL);

10 μL de inserto (aproximadamente 100ng/μL); 2 μL de tampão para a enzima T4 DNA

Ligase (10X) e 0,5 U de T4 DNA Ligase, para um volume final de 20 μL. A reação foi

incubada a 4 ºC durante um período de 12 horas.

O produto de ligação foi introduzido por eletroporação na estirpe E. coli TOP10

conforme item 3.6 e os transformantes foram selecionandos pela resistência a

antibiótico(s).

3.6 PREPARO DE CÉLULAS ELETROCOMPETENTES DE E. coli

As células de E. coli foram tornadas eletrocompetentes conforme protocolo do

fabricante do eletroporador Cell-Porator Voltage Booster (Gibco-BRL-Invitrogen), com

modificações. Uma cultura saturada de E. coli foi adicionada a 100 mL de meio SOB na

proporção de 1:100. A cultura foi mantida sob agitação (130 rpm) a 37 ºC até atingir

D.0.

600

de aproximadamente 0,5. A cultura foi mantida então em gelo por 30 minutos.

Em seguida, as células foram coletadas por centrifugação a 5000 g por 5 minutos a 4

ºC. As células foram então lavadas duas vezes com água ultrapura estéril e gelada e

uma vez com glicerol 15 % estéril e gelado. Em seguida foram ressuspendidas em 100

μL de glicerol 15 %, separadas em alíquotas de 35 μL e estocadas a –70 ºC.

Para a eletroporação, 35 μL de células competentes e 1 μL de solução de

plasmídeo (5 ng - 0,5 μg/μL) foram misturados e transferidos para uma cubeta de

eletroporação. O aparelho foi ajustado para a aplicação do choque elétrico numa

diferença de potencial de 16 a 21 Kv/cm e um campo elétrico de 4 kΩ/330 μF à câmara

de eletroporação, com tempo de pulso de 6 a 10 ms. Após a aplicação deste processo,

as células de E. coli foram inoculadas em 1 mL de meio SOC, para recuperação, por 60

minutos a 37 ºC e 130 rpm. Em seguida, foram espalhadas em meio LA (contendo os

antibióticos necessários para a seleção dos clones) e incubadas a 37 ºC durante um

período de 12 horas.

3.7 DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA Hfq

O plasmídeo recombinante (pKADO1 ou pKADO2) obtido foi transformado em E.

coli BL21(DE3) (item 3.6).

Três colônias de E. coli BL21(DE3) transformadas foram inoculadas em 3 mL de

meio LB com os respectivos antibióticos, e cultivadas a 37 ºC por 12 horas a 130 rpm.

Cem microlitros deste cultivo foram re-inoculados em 10 mL de meio LB (proporção

1:100) e incubados a 37 ºC e a 130 rpm, a fim de se obter um cultivo celular com

D.O.

600nm

entre 0,6 e 0,8. Nesta fase foram variadas as condições de expressão quanto

a temperatura (30 e 37 ºC) e tipo indutor (1 mmol/L de IPTG ou 14 mmol/L de Lactose).

A lactose é um indutor alternativo que pode ser utilizado, no lugar do IPTG, para

aumentar a expressão de proteínas na forma solúvel (MONTEIRO et al., 2000). Em

seguida a cultura continuou sendo incubada por mais 3 horas sob uma das condições

descritas acima. O objetivo deste experimento foi determinar a melhor condição de

expressão da proteína Hfq quanto à quantidade de proteína expressa e solubilidade.

Após a expressão, os cultivos foram centrifugados a 7.000 g durante 5 minutos a

4 ºC, o sobrenatante foi descartado, e o pellet celular foi ressuspendido em 400 μL de

tampão de ressuspensão (400 mmol/L de NaCl e 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8,0). Uma

alíquota de 20 μL da fração bruta foi estocada para posterior análise em gel SDS-

PAGE. O restante da fração bruta foi sonicado no aparelho Ultrasonic Processor XL

Heat Systems a fim de romper as células. A sonicação foi realizada em 8 ciclos de 20

segundos, alternando-se iguais períodos de repouso em gelo. Em seguida as amostras

foram centrifugadas a 12.000 g durante 15 minutos para a separação das frações

solúvel e insolúvel. A fração insolúvel foi ressuspendida em tampão de ressuspensão

com igual volume ao da fração solúvel.

3.8 ANÁLISE DE PROTEÍNAS POR ELETROFORESE EM GEL DE

POLIACRILAMIDA

As amostras protéicas foram analisadas através de eletroforese em gel de

poliacrilamida 12 % contendo glicina (SDS-PAGE) (LAEMMLI, 1970) ou em gel de

poliacrilamida 12% contendo Tricina e SDS (SCHAGGER & von JAGOW, 1987), que

permite separar proteínas entre 1 e 100 kDa com maior resolução. As proteínas foram

visualizadas após a coloração por Coomassie Blue (LAEMMLI, 1970), sendo em

seguida foto-documentadas no aparelho UVP-Biolmaging Systems.

3.9 DETERMINAÇÃO DO GRAU DE PUREZA DA PROTEÍNA HFQ

Para avaliar o grau de pureza da proteína Hfq superexpressa e purificada (item

3.11), uma amostra foi submetida à eletroforese SDS-PAGE. O gel foi corado com

Coomassie Blue e submetido à análise densitométrica no aparelho Personal

Densitometer SI – Molecular Dynamics. A imagem do gel foi capturada e armazenada

pelo programa Scan Control. A pureza foi determinada por densitometria pelo programa

ImageQuant

3.10 CONFIRMAÇÃO DA IDENTIDADE DA PROTEÍNA Hfq POR ANÁLISE

ESPECTROMETRICA DE MASSA PELO MÉTODO MALDI-TOF/MS

A confirmação da identidade da proteína Hfq pelo método MALDI-TOF/MS foi

realizada como descrita por Westermeier e Naven (2004) com adaptações.

3.10.1 DIGESTÃO DAS PROTEÍNAS E EXTRAÇÃO DE PEPTÍDEOS

A banda equivalente à proteína Hfq superexpressa foi recortada do gel de

poliacrilamida com um bisturi e armazenada em tubo plástico e em gelo.

Remoção do corante Coomassie Blue: O gel contendo a proteína foi tratado

com solução descolorante (75 mmol/L de bicarbonato de amônio e 40 % de etanol) até

a total remoção do corante. Em seguida, foi lavado com 500 μL de água ultrapura para

a remoção do descolorante e tratado com acetonitrila 100 % até a completa

desidratação e, finalmente, seco em bomba a vácuo.

Digestão das proteínas: O gel desidratado foi transferido para um tubo plástico

contendo 10 μL de Tripsina (10 μg/mL) e incubado a 4 ºC por 20 minutos. A solução C

(40 mmol/L de bicarbonato de amônio e 10 % de acetonitrila) foi adicionada então em

volume suficiente para cobrir o gel e o sistema foi incubado a 37 ºC por 12 h.

Extração dos peptídeos originados da digestão: Após a digestão tríptica os

peptídeos já presentes na solução sobrenadante foram transferidos para um novo tubo

plástico. Para a extração dos demais peptídeos, o gel foi lavado três vezes

consecutivas com 30 μL de solução de extração de peptídeos (50 % de Acetonitrila e

0,1 % de ácido trifluoracético [TFA]), sendo que entre cada lavagem foram recolhidas as

soluções com os peptídeos.

Dessalinização da solução: A solução final, cerca de 200 μL, contendo os

peptídeos foi concentrada em bomba a vácuo até um volume final de 10 μL. Para a

dessalinização foram utilizadas ponteiras contendo mini-colunas Zip-Tip (Millipore Inc.).

3.10.2 ANÁLISE DOS PEPTÍDEOS POR MALDI-TOF/MS

Após a dessalinização, a amostra foi ressuspendida, utilizando a própria ponteira

Zip-Tip, em 2 μL de solução contendo a matriz CHCA (Ácido α-ciano-4-

hidroxicinamímico) e aplicada sobre uma placa metálica. A análise dos peptídeos foi

realizada pelo método MALDI-TOF/MS (Espectrometria de Massas de Ionização a

Laser com Tempo de Vôo) no espectrômetro de massa Bruker Daltonics Inc., no modo

refletor positivo.

A calibração do aparelho foi realizada utilizando-se uma mistura de padrões de

peptídeos (Bruker Daltonics Inc.). Após a análise de cada amostra foram gerados

espectrogramas que foram visualizados utilizando o programa Flexanalysis (Bruker

Daltonics Inc.).

3.10.3 IDENTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA

A identificação da proteína foi realizada através do programa Aldente

(http://www.expasy.org/tools/aldente/), que utiliza os bancos de dados do Swiss-Prot e

do TrEMBL, e do programa Protein Prospector v. 4.0 (http://prospector.ucsf.edu/) que

utiliza o banco local contendo dados dos peptídeos provenientes da digestão tríptica in

silico das 50.000 ORFs do organismo H. seropedicae (Projeto Proteopar). Foram

utilizados os valores dos picos monoisotópicos referentes a m/z para a submissão nos

bancos de dados.

3.11 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq DE H. seropedicae

Na literatura foram encontradas algumas informações sobre a purificação da

proteína Hfq na sua forma nativa (VASSILIEVA et al., 2002; NIKULIN et al., 2005). Os

pesquisadores citados utilizaram o aquecimento da fração solúvel pós-lise celular por

15 minutos a 80 ºC. O aquecimento teve por objetivo precipitar uma grande quantidade

de proteínas que, diferentemente de Hfq, não possuem estabilidade térmica. O principal

passo cromatográfico utilizado foi o da interação hidrofóbica, mais especificamente, em

uma coluna de Butil-Sepharose (GE HealthCare Inc.). O aquecimento a 80 ºC foi

utilizado também como passo de purificação para a proteína fusionada a cauda de

histidinas.

3.11.1 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA

3.11.1.1 CROMATOGRAFIA EM BUTIL-SEPHAROSE

A coluna Hi-trap Butil-Sepharose (1 mL) (GE HealthCare) é composta de uma

matriz de agarose ligada a (-O-CH

-CH

O-CH

-O-(CH

)

-CH

). Esta coluna permite uma

interação hidrofóbica moderada. A purificação foi realizada no cromatógrafo Äkta Basic

(GE HealthCare).

A fração solúvel do extrato celular (1 mol/L de NaCl e 50 mmol/L de Tris-HCl

pH 8,0) foi aquecida a 80 ºC durante 15 minutos sob constante agitação. A amostra foi

então centrifugada a 14.000 g por 40 minutos. A fração solúvel foi coletada e a ela foi

adicionado lentamente sulfato de amônio na forma de sal até uma concentração final de

1,7 mol/L. Esta solução foi mantida sob agitação até a solubilização total do sal.

Em seguida a solução protéica foi injetada na coluna Butil-Sepharose

equilibrada previamente com 3 VC da solução A (1 mol/L de NaCl; 1,5 mol/L de sulfato

de amônio; 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8,0). Toda a cromatografia foi realizada utilizando

um fluxo de 1 mL/min. Após a injeção da amostra, a coluna foi lavada com 20 VC de

solução A. A proteína foi eluída em um duplo gradiente decrescente de 1 mol/L a 0,1

mol/L de NaCl e de 1,5 mol/L a 0 mol/L de (NH

)

, correspondente a 20 VC.

Amostras das frações contendo a proteína Hfq foram analisadas por eletroforese. As

frações que apresentaram maior pureza foram reunidas e dializadas contra 1L de

solução contendo: 100 mmol/L de NaCl, 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8,0 e 0,1 mmol/L de

PMSF. A diálise foi realizada a temperatura ambiente por 12 horas.

3.11.1.2 CROMATOGRAFIA EM DEAE-SEPHAROSE

A coluna DEAE-Sepharose (GE HealthCare) é composta de uma matriz de

agarose ligada a (-O-CH

-CH

-N

-(C

)

H). Esta coluna age como um trocador fraco

de ânions. A purificação foi realizada no cromatógrafo Äkta Basic (GE HealthCare).

Para este ensaio, foi montada uma coluna de 40 mL de volume, 1,6 cm de diâmetro e

20 cm de altura.

A solução protéica dialisada após a primeira etapa de purificação foi injetada,

num fluxo de 1 mL/min, em uma coluna DEAE-Sepharose (40 mL) previamente

equilibrada com 3 VC de solução A (100 mmol/L de NaCl e 50 mmol/L de Tris-HCl pH

8.0). Em seguida, a coluna foi lavada com 3 VC de Solução A. A proteína Hfq foi eluída,

num fluxo de 3 mL/min, antes do gradiente crescente de NaCl (0,1 a 1,0 mol/L). A

proteína foi coletada em três frações de 20 mL e concentrada por ultrafiltração usando o

sistema Centricon 5K (Millipore) com limite de exclusão para proteínas com massa

molecular superior a 5 kDa.

3.11.2 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq CONTENDO CAUDA DE HISTIDINAS

3.11.2.1 CROMATOGRAFIA EM HI-TRAP CHELATING Ni

A fração solúvel do extrato celular (300 mmol/L de NaCl e 50 mmol/L de Tris-HCl

pH 8,0) foi aquecida a 80 ºC durante 15 minutos sob constante agitação. A amostra foi

então centrifugada a 14.000 g por 40 minutos. A fração solúvel foi coletada e levada à

cromatografia de afinidade.

A purificação foi realizada no cromatógrafo Äkta Basic (GE HealthCare). A coluna

de purificação utilizada foi a Hi-Trap Chelating (GE Health Care), carregada

manualmente com solução de Ni (100 mmol/L de acetato de amônio pH 4,0 e

100mmol/L de cloreto de níquel) e em seguida acoplada ao equipamento.

A solução de proteínas foi injetada, num fluxo de 1mL/min, na coluna Hi-Trap

Chelating (1 mL) equilibrada com 3 VC de tampão A (300 mmol/L de NaCl; 50 mmol/L

de Tris-HCl pH 8,0; 10 mmol/L de imidazol). A proteína Hfq foi eluída utilizando um

gradiente contínuo de 10 a 1000 mmol/L de imidazol equivalente a 20 VC. As amostras

foram coletadas em alíquotas de 1mL. Amostras de 20 μL das frações obtidas e

correspondentes ao pico no cromatograma foram coletadas para análise em gel SDS-

PAGE. As frações que apresentaram maior pureza foram reunidas e dializadas contra 1

L de solução contendo: 150 mmol/L de NaCl e 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8,0. A diálise

foi realizada a temperatura ambiente por 12 horas.

3.12 ESTOCAGEM DAS PROTEÍNAS

As proteínas destinadas aos testes de atividade foram dialisadas contra 1000 mL

de solução contendo 100 mmol/L de NaCl, 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/L

de PMSF e 50 % de glicerol a temperatura ambiente por 12horas. Em seguida, a

solução de proteínas foi dividida em frações de 100 μL que foram estocadas a –80 ºC.

3.13 ESTIMATIVA DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA

A estimativa da concentração protéica foi realizada segundo Bradford (1976) ou

utilizando o coeficiente de extinção molar (PACE et al., 1995) no caso da proteína

purificada.

Pelo método de Bradford, o sistema de reação foi composto de 1 mL de solução

corante (100mg de Coomassie Blue G-250; 50 mL de etanol 95 % e 100mL ácido

fosfórico 85 %) e 100 μL de amostra. Esta solução foi homogeneizada e sua

absorbância a 595nm determinada em espectrofotômetro. A curva padrão foi

determinada utilizando albumina de soro bovino (BSA) como padrão.

Pelo coeficiente de extinção molar, uma alíquota (1 μL) da solução de proteína

foi diluída inicialmente 100X e a sua absorbância a 280nm foi determinada pelo

espectrofotômetro. O valor de absorbância foi aplicado na fórmula (C=A/ε), onde “C”

corresponde à concentração molar protéica, A corresponde a absorção a 280 nm e ε

corresponde ao valor do coeficiente de extinção molar. O valor de ε igual a 4470 foi

obtido pela submissão da seqüência de aminoácidos da proteína Hfq ao programa

Protparam, disponível no site do EXPASY (www.expasy.ch/tools/protparam.html)

Esta função foi utilizada tanto para a determinação da concentração molar

quanto para a determinação da concentração em mg/mL.

3.14 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq A RNA

Para a realização dos ensaios de atividade de ligação a RNA, o primeiro passo

foi a escolha da molécula molde a ser utilizada para os ensaios. O pequeno RNA DsrA

e o mRNA RpoS de E. coli foram selecionados por terem sido extensivamente

estudados na literatura (HENGGE-ARONIS, 2002; BRESCIA et al., 2003; LEASE et al.,

2004; LEASE & WOODSON, 2004). O trabalho com este tipo de biomolécula exigiu

várias precauções no que diz respeito à presença de ribonucleases, pois estas são de

difícil controle e retenção uma vez que são termoestáveis e de difícil inativação. Desta

forma todos os materiais utilizados, assim como a manipulação, necessitaram de

cuidados especiais. Estes cuidados estão detalhados abaixo.

Todos os procedimentos foram realizados utilizando luvas e em espaço

reservado, uma vez que a pele e poeira são grandes fontes de contaminação. A

bancada de trabalho e as pipetas foram limpas com etanol absoluto e em seguida com

o reagente RNAse Away ® (Invitrogen).

Todas as soluções utilizadas foram preparadas com água a 0,01 % de

dietilpirocarbonato (DEPC), sendo em seguida autoclavadas. Este composto inibe

eficientemente nucleases através de modificações covalentes na proteína. Estas

modificações consistem em converter aminas primárias e secundárias em ésteres de

ácido carbâmico (LEONARD et al., 1970). Entretanto a água tratada com DEPC deve

ser inativada por autoclavação antes de ser utilizada no preparo de soluções contendo

Tris, Hepes ou mercaptanas, pois estes compostos podem ser inutilizados pelas

modificações citadas acima.

As cubas de eletroforese assim como seus acessórios foram lavadas com

detergente neutro durante 12 horas, ácido clorídrico 0,1 mol/L por 10 minutos e

enxaguado com água tratada com DEPC.

Além dos cuidados com ribonucleases, há a necessidade de trabalhar com o

material constantemente em gelo. Este cuidado foi tomado no momento da preparação

da reação de transcrição in vitro assim como com as soluções de interação proteína-

RNA. Esta precaução é importante, pois o RNA é uma molécula termodinamicamente

instável onde a hidroxila 2’ do anel de ribose pode promover um ataque hidrofílico sobre

a ligação fosfodiéster formando um fosfato cíclico 2’-3’.

3.15 ENSAIO DE TRANSCRIÇÃO in vitro DE RNA

Os plasmídeos utilizados para o ensaio continham o DNA codificador dos sRNA

DsrA (89pb) ou RpoS (140pb) de E. coli clonados a jusante de um promotor T7. Estes

plasmídeos permitiram a transcrição in vitro em larga escala dos sRNA desejados além

de possibilitarem a marcação do fim de transcrição sem a presença de um grampo

terminador. O término é marcado pelo final da seqüência de DNA formada pela ação de

uma enzima de restrição.

O plasmídeo pT7G

DsrA ou pUC-T7RpoS2 foi linearizado por restrição com a

enzima EcoRI (LEASE & WOODSON, 2004). A mistura de transcrição (50 μL) continha:

1 μg de plasmídeo linearizado, 1X de Tampão 10X (USB), 2 mmol/L de cada

ribonucleotídeo (ATP, UTP, CTP e GTP), 50 U de inibidor de RNAse (RNAseOUT-

Invitrogen) e 30 U de T7 RNA polimerase (USB) como recomendado pelo fabricante.

Em seguida a reação foi incubada a 37 ºC por duas horas e o produto da reação foi

analisado por eletroforese em gel de agarose a 2 %.

3.16 ENSAIO DE RETARDAMENTO DE BANDA EM GEL

Para este ensaio, a proteína Hfq de H. seropedicae foi previamente purificada

como descrito no item 3.11.

As reações de ligação entre a proteína Hfq e os sRNA(s) foram preparadas em

um volume final de 10 μL contendo: 50 nmol/L de sRNA, 2 μL de TE (10 mmol/L Tris-

HCl pH 8,0 e 2,5 mmol/L de EDTA), 2 μL de tampão 5X (50 mmol/L Tris–HCl pH 8,0;

250 mmol/L NaCl, 250 mmol/L KCl e 250 mmol/L NH

Cl) e concentrações variadas da

proteína Hfq. A reação foi incubada por cinco minutos a 4 ºC (LEASE & WOODSON,

2004). As amostras foram analisadas em gel de poliacrilamida em condição nativa 6 %

(acrilamida/ bisacrilamida 29:1 (w/w)) em 0,5 X TBE). A coloração foi realizada com

CYBR Gold (Invitrogen Inc.) durante 20 minutos no escuro. As imagens dos géis foram

capturadas por excitação a 300 nm no aparelho UVP-Biolmaging Systems.

3.17 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA Hfq DE H. seropedicae

3.17.1 ANÁLISE in silico DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA

A análise in silico da estrutura secundária da proteína Hfq foi realizada usando o

programa Psipred (JONES, 1999) disponível no site http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/.

3.17.2 ANÁLISE DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA POR DICROISMO CIRCULAR

A espectroscopia por dicroísmo circular é uma técnica biofísica que permite

determinar experimentalmente as frações de estrutura secundária de uma determinada

proteína. Esta técnica permite ainda observar mudanças estruturais em função da

variação de parâmetros como pH, temperatura e ação de ligantes.

As medidas de dicroísmo circular (CD) foram realizadas no espectropolarímetro

Jasco model J-810, localizado no Laboratório Nacional de Luz Síncrontron (Campinas-

SP), com o auxílio do Dr. João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa e de sua aluna de

doutorado Camila Ramos dos Santos. O espectro UV (200-260 nm) foi coletado

utilizando a proteína Hfq com uma concentração de 0,2 mg/mL em 20 mmol/L de

tampão fosfato pH 8,0 e 100 mmol/L de NaCl, a 25 ºC. As cubetas de quartzo tinham

um caminho óptico de 0,1 cm. Os dados foram coletados com uma resolução de 0,5 nm

e registrados com uma velocidade de 100 nm/min. Cada espectro resultou de uma

média de vinte registros com uma resposta de 1s. Os dados correspondentes ao branco

foram coletados usando somente o tampão da proteína. Cada espectro foi corrigido à

linha de base e normalizado a [θ]

mrw

(graus cm

mol

-1

) de acordo com ADLER et al.,

1973. Os experimentos de desnaturação foram realizados variando-se a temperatura de

15 a 95 ºC acompanhando as mudanças a 222 nm. Estes dados foram utilizados para

se obter a temperatura de melting, ou seja, temperatura na qual a proteína perde

drasticamente a estrutura secundária.

A estimativa das estruturas secundárias foi realizada pela deconvolução do

espectro de CD usando o programa DICROPROT (DELEAGE & GEOURJON, 1993).

3.18 DETERMINAÇÃO DO ESTADO DE OLIGOMERIZAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq

Para a determinação do número de monômeros da proteína Hfq por oligômero,

foram utilizados o método cromatográfico de gel filtração e o método biofísico de

espalhamento de luz dinâmico.

3.18.1 GEL FILTRAÇÃO

A massa molecular do oligômero da proteína Hfq foi estimada por gel filtração na

coluna Superose 12HR 10/30 (GE HealthCare). Esta coluna tem as seguintes

dimensões: 1 cm de diâmetro, 30 cm de altura e 23,52 ml de volume total. A eluição foi

realizada no cromatógrafo ÄKTA Basic System (GE HealthCare). A coluna foi

equilibrada com 3 VC de 50 mmol/L de Tris-HCl (pH 8,0) contendo 100 mmol/L de NaCl

a um fluxo de 0,5 mL/min.

Após a eluição dos padrões blue dextran (2000 kDa), β-amilase (200 kDa), álcool

desidrogenase (150 kDa), BSA (66 kDa), anidrase carbônica (29 kDa) e citocromo C

(12,4 kDa), foram determinados seus volumes de eluição e respectivas constantes de

partição. Com estes dados, foi montado um gráfico constante de partição em função do

log da massa molecular de cada proteína padrão. A determinação da equação de reta

foi realizada por regressão linear usando o programa Excel. A proteína foi eluída com o

mesmo tampão e seu volume de eluição foi registrado. A massa molecular Hfq foi

determinada pela interpolação de sua constante de partição no gráfico preparado

anteriormente.

3.18.2 ESPALHAMENTO DE LUZ DINÂMICO (DLS)

As medidas de DLS da proteína Hfq foram realizadas no Laboratório Nacional de

Luz Síncrontron (Campinas-SP) utilizando o equipamento DYNAPRO (Protein Solutions

Inc.), à temperatura ambiente, com o auxílio do Dr. João Alexandre Ribeiro Gonçalves

Barbosa e de sua aluna de doutorado Camila Ramos dos Santos. A amostra de

proteínas (0,2 mg/mL) foi centrifugada a 14.000 g por 15 minutos antes das medidas de

DLS. A partir da análise dos dados foi obtido o coeficiente de difusão translacional (D

As análises de DLS foram realizadas através do programa DYNAMICS versão

3.0 (Protein Solutions Inc.).

3.19 CRISTALIZAÇÃO DA PROTEINA Hfq NATIVA

Os ensaios de cristalização são baseados em um método fatorial, ou seja, de

tentativa e erro, utilizados para levar a solução protéica a um estado de supersaturação.

A partir deste estado, a proteína pode formar um precipitado amorfo ou organizar-se,

formando um cristal. Este estado pode ser atingido variando-se os componentes e a

concentração da solução precipitante (tampão, sal e agente precipitante) que foram

adicionadas à solução de proteínas. Outros dois importantes fatores para se obter um

cristal são a pureza e a quantidade de proteína. O alto grau de pureza diminui a

possibilidade das impurezas causarem a formação de cristais imperfeitos, devido à

desorganização interna do cristal. A grande quantidade da proteína pode permite a

formação de cristais com tamanho suficiente para os experimentos de difração de raios-

Para o ensaio de screening inicial de cristalização, a proteína Hfq nativa em 100

mmol/L de NaCl e 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8,0, purificada como descrito no item 3.11,

foi concentrada em tubos Centricon 5K (Millipore) até uma concentração final de 13

mg/mL.

Os ensaios foram realizados através do método de difusão de vapor em gota

sentada onde 0,5 μL da solução de proteína a 13 mg/mL e 6,5 mg/mL foi misturada a

0,5 μL da solução do reservatório (80 μL). Foram utilizadas placas 96 Well

CrystalQuick™Plate (Greiner Bio-One) de 96 reservatórios com três poços por

reservatório (figura 7).

FIGURA 7 – PLACA PARA CRISTALIZAÇÃO EM GOTA SENTADA

(A) Figura esquemática da placa 96 Well CrystalQuick™Plate (Greiner Bio-One) utilizada para os ensaios

de cristalização. (B) Figura mostrando em detalhes a estrutura do poço.

Os ensaios iniciais foram realizados através do método da matriz esparsa

(JANCARIK & KIM, 1991; CUDNEY et al., 1994) utilizando as soluções dos Kits: Crystal

Screening (Hampton), Crystal Screening 2 (Hampton), Wizard I (Emerald Biosystems),

Wizard II (Emerald Biosystems), PACT (Nextal/Qiagen), JCSG (Nextal/Qiagen), SaltRx

(Hampton) e Precipitant Synergy (Emerald Biosystems). Estas soluções (544

condições) foram montadas nas placas de forma automatizada utilizando o robô

Honeybee 963 (Genomic Solution®) no Laboratório Nacional de Luz Síncrontron (figura

8).

A B

Após a montagem do experimento as caixas contendo as soluções foram

acondicionadas em sala com temperatura controlada a 18 ºC. O desenvolvimento de

cada gota foi acompanhado durante o período de um mês.

FIGURA 8 – EQUIPAMENTO PARA CRISTALIZAÇÃO AUTOMATIZADA

Robô Honeybee 963 utilizado para o processo de montagem das placas de cristalização.

Os cristais obtidos foram avaliados como sendo de proteína através de difração

de raios-x. Os dados foram coletados usando o Gerador Rigaku UltraX-18HF (anôdo

rotatório de Cu) e o detector Mar345. A coleta de dados foi realizada a 100 K utilizando

o sistema criogênico Oxford Cryosystem 700. Antes da coleta, foram adicionados 10 μL

de glicerol à gota contendo o cristal com o objetivo de crioproteção. Estes experimentos

foram realizados no Laboratório de Apoio GAR do Laboratório Nacional de Luz

Síncrontron.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A proteína Hfq tem sido amplamente estudada, devido à sua função de regulador

global da expressão gênica a nível pós-transcricional. No caso do metabolismo do

nitrogênio, Kaminski e colaboradores (1994) e Drepper e colaboradores (2002)

relataram um possível envolvimento desta proteína no processo a fixação de nitrogênio

via proteína NifA.

O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de contribuir para a

caracterização estrutural e funcional da proteína Hfq da bactéria diazotrófica H.

seropedicae. Desta forma para os ensaios de atividade e cristalização o gene hfq foi

clonado e a proteína foi purificada e caracterizada quanto a sua estrutura secundária e

estado de oligomerização.

4.1 ANÁLISE in silico DO GENE hfq

O gene hfq de H. seropedicae é composto de 240 pares de bases e codifica uma

proteína de 79 aminoácidos. Na região regulatória foi identificado um provável promotor

tipo sigma 70 (figura 9).

No gene hfq E. coli, além do promotor sigma 70, foi identificado um promotor de

heat-shock (CTGGCGA

ACAGTCAGTCTGACCCCTATTT) que está, aparentemente,

envolvido na manutenção dos altos níveis de transcrição em condições de stress (TSUI

et al., 1996). O mesmo promotor (TTGAAA-N

-CCCCATTT) (NONAKA et al., 2006)

não foi identificado na região promotora de hfq em H. seropedicae.

FIGURA 9 – SEQUÊNCIA DE BASES DA REGIÃO CODIFICADORA DO GENE hfq

DE H. seropedicae

ctc cac tgc gta tcg agt tcc gat ccg gca aga atc ctt tca tcc

ggc agg aaa agt aat cga aaa gtt cgc tat tga atc aat gtt ttt

ggc gtt gaa gct aaa atc gtt taa att gaa tag cat aaa att ggt

aaa gca ctt gat att cct tga agt gcc tcc aag tcc taa tca caa

caa cac cgt gga gct gcc ATG agc aac aaa ggg caa ttg tta caa

RBS M S N K G Q L L Q

gac cca ttt ctg aac gca ttg aga aaa gag cac gtt ccc gtc tct

D P F L N A L R K E H V P V S

atc tac ctg gtc aac ggc atc aag ctg caa ggc cat gtg gag tct

I Y L V N G I K L Q G H V E S

ttc gat caa tac gtg gtc ctg ctg cgt aac acc gtt acg caa atg

F D Q Y V V L L R N T V T Q M

gtt tac aaa cac gcc atc tct acc gtc gtg cct gca cgt gcg gtc

V Y K H A I S T V V P A R A V

aac ctc agt ctc gaa tcc tcg tcc gac gaa TAA tgg tct acc tgg

N L S L E S S S D E *

RBS: sítio de ligação do ribossomo. Em vermelho a sequência de bases do gene hfq. Em azul a

sequência de aminoácidos determinada usando o programa BioEdit. Em rosa o provável promotor σ

Através das análises do banco de dados da anotação do genoma de H.

seropedicae (GENOPAR) foi possível determinar que o gene hfq encontra-se no contig

251, juntamente com três genes a jusante hflX, hflK e hflC. Estes aparentemente

compreendem um operon (figura 10 e 12). Esta sugestão baseia-se na análise in silico

das regiões intergênicas onde não foram encontrados promotores clássicos e também

da região a jusante do códon de término de tradução do gene hflC, em que, pela

análise utilizando o programa de bioinformática Mfold (ZUKER, 2003), foi encontrado

um provável grampo com ΔG = -15 kcal/mol seguido de seis uracilas logo após o

término do gene (figura 10 e figura 11). Estas características são típicas de

terminadores independentes da proteína Rho (LEWIN,1999).

FIGURA 10 – SEQUÊNCIA DA REGIÃO CODIFICADORA DO PROVÁVEL OPERON

hfqhflXhflKhflC

AAGTCCATCGATTCCGCCTACGCCGCGGCCATGGCCAAGCTGAGCACGCCGCGCCTGACCCGCGC

GCTGGAAGAGGCGCTGGAGCACCAGCAGCCGCGCCGCAAGGGTTCGATCCGTCCCAAGCTGCGCT

ATGCGCACCAGGGTGGCCAGAATCCGCCGGTGGTGGTCATCCACGGAAATGCCCTCGAAGCCATC

GATGACAACTACAAACGCTATCTGGAAAAGCACTTCCGGGAAACTTTCTCCCTGGTCGGCACTCC

ACTGCGTATCGAGTTCCGATCCGGCAAGAATCCTTTCATCCGGCAGGAAAAGTAATCGAAAAGTT

CGCTATTGAATCAATGTTTTTGGCGTTGAAGCTAAAATCGTTTAAATTGAATAGCATAAAATTGG

TAAAGCACTTGATATTCCTTGAAGTGCCTCCAAGTCCTAATCACAACAACACCGTGGAGCTGCCA

TGAGCAACAAAGGGCAATTGTTACAAGACCCATTTCTGAACGCATTGAGAAAAGAGCACGTTCCC

GTCTCTATCTACCTGGTCAACGGCATCAAGCTGCAAGGCCATGTGGAGTCTTTCGATCAATACGT

GGTCCTGCTGCGTAACACCGTTACGCAAATGGTTTACAAACACGCCATCTCTACCGTCGTGCCTG

CACGTGCGGTCAACCTCAGTCTCGAATCCTCGTCCGACGAATAATGGTCTACCTGGCCGGCTTGA

CGCCGTGGGCATTCTGACATGCGTGCCGCGTTAGTCGGCCTGGACTTCGGCAAGAACGATTTTGC

CGCTAGTCTGGATGAGCTGTATCTGTTGGCGAAATCCGCTGGCGCTGAACCCGTGATCACCATCA

CCGGTCGCCGCGCCAGTCCGGATGCCGCTCTCTTCATCGGTACCGGCAAGGCCCAGGAAGTGGCC

GACGCCGTCGCTGATCTCCAGCTTGAGCTGGTCATCTTCAATCACGCACTGTCCCCGGCCCAGCA

ACGTAACCTGGAGCGTCTGCTCAAGGTGCGCGTGCTCGACCGTACCAGCCTGATCCTGGATATCT

TCGCGCAGCGCGCCAAGAGCCACGAGGGCAAGGTGCAGGTCGAACTGGCGCAGTTGCAGCACCTG

TCTACCCGCCTCATCCGCGGCTGGACTCACCTGGAACGGCAAAAGGGCGGTATCGGCCTGCGCGG

CCCGGGTGAAACGCAGCTCGAAACCGACCGCCGCCTGCTGGGCGAGCGCGTCAAGGCCTTGCGTG

CGGTGCTGGCCAAGCTGCGCCGGCAACACGCCACCCAGCGTCGTGCGCGGGGGCGCAACGAGACG

TTCTCGGTGTCGCTGGTGGGGTATACCAACGCCGGCAAATCAACCATCTTCAATGCGCTGGCCAA

GGCCGGCGTGTATGCTGCGAACCAGCTCTTCGCTACGCTGGATACGACCTCCCGTCGCGTCTACC

TGGGTGAAGTAGGGCATGTGGTGATCTCCGACACCGTCGGTTTCATCCGCGAACTGCCCCACCAG

CTGGTGGAAGCCTTCCGCGCCACGCTGGAAGAAACCATCCATGCCGACCTCCTGTTGCACGTGGT

CGATGCCGCCAGCCCGGTGCGCATGGAGCAGATCGAGGAGGTCAACCTGGTCCTCAAGGAAATCG

GCGCCGACCACGTGCCGCAGATCCTGGTCTGGAACAAGATCGACGCTGCCGGCCTGGAGCCGACG

GTCGAGTATGACGAGTATGGTAAAATCCAGCGGGTTTTCGTCAGTGCCAAGTCTGGTGCTGGCCT

GGATCTGCTGCGCGAAGCGATCGCCGCTTCGCTCAAGGCCGCCTTGGAGGCCAGGGGTCGCAGCC

GTTCCGAGCCAGTCGATTCCGTAGACATGCACGCCTGAGCCGTTCGAGGGGACGGCATTTCGCCC

GTTCCTGGCGCGCATTCCTCCTAGATTCTCTTAATCCATCACTACAGCCGGATCGCAAACGCATG

CTTGTGTCTTTATTCAGGAAAATCGGTGTCAAGTTTTCGTTGAACGACCCCCAATGGGGACGTGG

TTCGCAAAACGACAACCGGGACAATCAGAATAACGGAAATAACGGCGACAAACGGGCAGAAAAAC

CGTCCGGGCACAATGACGGTCCGCCTGATCTCGACCAGCTCTGGCGCGACTTCAATCAGCGTCTG

TCCGCCCTGTTCGCCCGCAAGGGCGGTGGCGGTTCGTCCGATGGCGGCAATGGCGGCGGCTTCAA

CCGTGGCGACGTCAAGGGCGCCGGTATCGGCGTGGGCGTCATTGCGGTCATCGTGCCCTTCCTCT

GGCTGGCCAGCGGCTTCTTCATCGTGCAGGAAGGCCAGACCGCGGTCGTGACCACCTTCGGCCGC

TACAGCCATACCACGCTGCCAGGCTTCAACTGGCGCTGGCCATATCCCATCCAGGGCCATGAGAT

CGTCAACATGTCCCAGGTGCGGACCGCCGAGATCGGCTATCGCGGCAACGTGCGCAACAAGCAGC

TCAAGGAATCGCTGATGCTCACCGATGATGAGAACATCATCGACATCCAGTTTGCCGTCCAGTAC

AAGCTCAAGAACGCCGCCGAATGGCTGTTCAACAACCGCGACCCGGATGACTCCGTGCGCCAGGT

CGCCGAGACCGCCATCCGCGAGATCGTCGGCCGCAGCAAGATGGACTTCGTCCTCTATGAAGGCC

GCGAAAAGGTCGCCCTCGACGTCAGCCAGCGCATGCAGCAGATCCTGGACCGCTACAAGTCGGGC

GTGCAGATCACCAACGTGACCATGCAGGGCGTGCAACCGCCTGAGCAGGTGCAGGCCGCCTTCGA

TGACGCCGTCAAGGCCGGCCAGGACCGCGAACGCCTCAAGAACGAAGGCCAGGCCTACGCCAACG

ACGTGATTCCGCGCGCTTCCGGCGCCGCCTCGCGCCTGCTGGAAGAAGCCGAAGCCTACCGCTCG

CGCGTAGTGGCCAACGCCGAAGGTGACGCCTCGCGCTTCACCCAGGTGCAAGAAGCCTATGCCAA

GGCCCCGGCCGTCACCCGCGACCGCATGTATATCGAAACCATGCAGCAGATCTTCGCCAACACCA

CCAAGGTCATGGTCGATGCCAAGTCCGGCAGCAACCTGCTGTACCTGCCGCTGGACAAGCTGATC

CAGCAGACCGGCCCCGAAGCCGCTGCGGCGGGCAAGCCGGCCGCCTCGGCTGCGGCCCCGGCCGC

CAGCGCTGCGAATCCCGCGTCGAATGCGGGCAATGACACTGTGTATTCTTCCGAGCTGATGCGTG

ACATGAGAAACCGCGATCCGCGCGAATCGCGCGAAAGGGAGGTGCGCTGATGGGCCGCCTCGTTA

CTTCCGTCATCGTCGCCGTGGTGGCGATCTGGCTGGCCTCGTCCACGATCTTCGTGGTCGACCAG

CGTTCCTCGGCCATCGTCTTCGCCCTGGGTGAAGTCAAGCAGGTCATCACCGAACCCGGCCTGCA

TTTCAAGCTGCCGCCGCCGTTCCAGAACGTGATGTACCTGGACAAGCGCATCCAGACCCTGGATA

CGCCGGACGCCGACCGCTTCATCACCGCCGAGAAGATGAACGTGCTGGTCGATGCCTACGTCAAG

TGGCGCATCGTCGATCCGCGCCTGTACTTCGTCAGCTTCGGCGCCGACGAACGCCGCACCCAGGA

CCGCCTCTCGCAGATCGTCAAGGCTGCGCTCAACGACGAGATCACCAAGCGCACCGTGCGCGAAG

TCATCTCCAGCCAGCGCAACAACGTCATGGACGCCATCCAGGCGCGCGTGGCCAACGAAGCCAAG

CAGATCGGCGTGGAAGTCATCGACGTGCGTCTGCGTCGCGTGGACTATGTTGACCAGATCAACAA

TTCCGTCTTCGAACGCATGAAGTCCGAGCGCGTGCGCGTGGCCAACGAGCTGCGTTCCACCGGTG

CGGCAGAATCCGAGAAGATCCGCGCCGACGCCGACCGCCAGCGCGTGGTGATCCTGGCCGAAGCC

TATCGCGAATCCGAAAAGATCCGTGGCGCTGGCGACTCCAAGGCGTCGCAGATCTACGCCCAGGC

CTTCGGCCAGAACCCTGAGTTCTTCAAGTTCTACCGCAGCCTGGAAGCCTACCGCGCCAGCTTCA

AGAACCGCCACGATGTCATGGTGGTGGACCCGAGCTCGGAATTCTTCAAGTATTTCAAGGGCATC

GGCGCAGGCAGCGCCAGCACTTCCAAGAAGTAAAATTCCGCTGAACAAGCGATAATGTGAATATG

TCCGCCCCGCCAGCCTGGCTGGAGGGGAGGGCGAACAGGACGGATGCCGCTGGTAGAGGGCATCT

TTCCTTTTTTTGTGACGCAGAATGTTCCGGTGTGCAATTTTCCCGGAATGTGAGACGAGGGGCGG

CAGGTTTTCCCGGACCGCCCCGGTTTTTCGTCTGGCGGACCTGTTTGTCGCAACCTGTACCTGGG

CTTGTCCTTGGTGTTGGCTGCTACGCCTGGTTTCGCAATGCATGCAAGCCCCGCAATTCGTTACG

CAAACCGTTTTTTCTGCTTTCACTCTTGTTTATGCCTAACTGGCTTCTTCCCGAAAACATCGCCG

Seqüência de bases analisada pelo programa FramePlot (ISHIKAWA & HOTTA, 1999). Em vermelho a

seqüência do gene hfq, em azul a seqüência do gene hflX, em verde a seqüência do gene hflK, em rosa

a seqüência do gene hflC, em amarelo os sítios de ligação do ribossomo. Setas em laranja indicam as

regiões formadoras do provável grampo de terminação. A seqüência de seis timinas está destacada em

cinza.

FIGURA 11 – PREDIÇÃO DO PROVÁVEL TERMINADOR DO OPERON

hfqhflXhflKhflC

GGGAGGGCGAACAGGACGGATGCCGCTGGTAGAGGGCATCTTTCCTTTTTTTGTGACGCAG

A predição do terminador do operon hfqhflXKC foi realizada pelo programa Mfold. Na porção superior da

figura a localização da sequência formadora do terminador. Na porção inferior estrutura secundária do

provável terminador.

Os genes hflX, hflK e hflC fazem parte da vizinhança gênica de hfq nas γ e β-

Protobactérias (figura 12). O gene hflX codifica uma GTPase envolvida na proteólise do

repressor CII do fago lambda, enquanto que os genes hflK e hflC codificam proteínas

integrais de membrana (NOBLE et al., 1993) e podem compor duas formas gerais de

organização gênica dentre as bactérias: hfqhflXKC presente nas β-Proteobactérias e o

cluster amiBmiaAmutLhfqhflXKC presente nas γ-Proteobactérias (figura 12). No caso

deste último, é comum a presença de um gene codificador para uma proteína hipotética

a montante do gene amiB (figura 12). Kajitani e Ishihara (1991) descreveram em E. coli

o operon amiBmiaAmutLhfqhflXKC onde se encontra o gene hfq. Em H seropedicae, no

contig 251 foi encontrado somente a seqüência de genes hfqhflXhflKhflC,

concordando, portanto, com a organização gênica observada para as β-Protobactérias.

FIGURA 12 – ORGANIZAÇÃO DOS GENES VIZINHOS A hfq NO GENOMA DE

DIFERENTES MICRORGANISMOS

Comparação das vizinhanças gênicas do gene hfq em diferentes organismos realizada pelo programa

String (

http://string.embl.de). À esquerda a árvore filogenética dos grupos analisados e à direita o contexto

genômico do gene hfq indicado por uma seta vermelha. O quadrado vermelho indica a organização

gênica no grupo das β-Proteobactérias. Em destaque, a organização gênica presente em H. seropedicae.

4.2 ANÁLISE IN SILICO DA PROTEÍNA Hfq

A seqüência de aminoácidos da proteína Hfq de H. seropedicae apresentou

alta identidade com as proteínas Hfq de Burkholderia xenovorans LB400 (90%),

Ralstonia eutropha JMP134 (88%), Nitrosomonas eutropha C91 (76%), Escherichia coli

(72%), Pseudomonas aeruginosa (68%), quando analisadas pelo programa BlastP.

Contudo apresentou baixa identidade quando comparada com as proteínas Hfq de

Staphilococcus aureus (30%), Methanobacterium thermoautotrophicum (24%) e

Methanococcus jannaschii (20%), estas com estrutura cristalográfica já resolvida. Estas

relações de identidade podem ser observadas pelos alinhamentos individuais da

seqüência de aminoácidos da proteína Hfq de H. seropedicae com as seqüências das

proteínas dos organismos acima sitados (figura 13).

Com o alinhamento dos aminoácidos das proteínas Hfq de treze organismos

diferentes pertencentes ao grupo das γ e β-Protobactérias foi possível observar a

presença de aminoácidos conservados na região N-terminal e central (figura 14). Estes

dados concordam com o que já foi observado por Sauter e colaboradores (2003) que

relataram ser o núcleo da proteína Hfq uma região comum a todas as proteínas Hfq. É

possível também observar que as seqüências variam entre si principalmente quanto ao

tamanho e composição de aminoácidos da região C-terminal (figura 14). As regiões N-

terminal e central da proteína Hfq são responsáveis pela formação do hexâmero e

ligação a sRNA (SONNLEITNER et al., 2004), enquanto que a região C-terminal parece

ser responsável pela ligação ao mRNA (VECEREK et al., 2007).

Ainda quanto ao alinhamento de aminoácidos, é importante notar que o motivo

YKHAI encontra-se totalmente conservado em todas as seqüências analisadas. Ao

estudarem a estrutura cristalográfica do complexo Hfq-RNA de Staphilococcus aureus

Schumacher e colaboradores (2002) relataram para este motivo que os aminoácidos

lisina (K) e histidina (H) interagem com RNA, além da tirosina 43.

FIGURA 13 – ALINHAMENTO INDIVIDUAL DAS SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS

DAS PROTEÍNAS Hfq

(A)

Herbaspirillum MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGHVESFDQYVVLLRNTVTQMVYKHAI 60

Burkholderia MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGNIESFDQYVVLLRNTVTQMVYKHAI 60

***********************************::***********************

Herbaspirillum STVVPARAVNLSLESSSDE 79

Burkholderia STVVPARPVNFHPDSEQS- 78

*******.**: :*...

(B)

Herbaspirillum MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGHVESFDQYVVLLRNTVTQMVYKHAI 60

Ralstonia MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGNIESFDQYVVLLRNTVTQMVYKHAI 60

***********************************::***********************

Herbaspirillum STVVPARAVNLSLESSSDE 79

Ralstonia STVVPARAVNFRVDDSAEG 79

**********: ::.*::

(C)

Herbaspirillum MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGHVESFDQYVVLLRNTVTQMVYKHAI 60

Nitrosomonas MGVKGQLLQDPFLNVLRKEHIPVSIYLVNGIKLQGHIDSFDQYVVLLRNSVTQMVYKHAI 60

*. ***********.*****:***************::***********:**********

Herbaspirillum STVVPARAVNLSLESSS-DE 79

Nitrosomonas STIVPGKAVSIPVPAETLPE 80

**:**.:**.:.: :.: *

(D)

Herbaspirillum MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGHVESFDQYVVLLRNTVTQMVYKHAI 60

Escherichia MA-KGQSLQDPFLNALRRERVPVSIYLVNGIKLQGQIESFDQFVILLKNTVSQMVYKHAI 59

*: *** **********:*:***************::*****:*:**:***:********

Herbaspirillum STVVPAR----------------------AVNLSLESSSDE-- 79

Escherichia STVVPSRPVSHHSNNAGGGTSSNYHHGSSAQNTSAQQDSEETE 102

*****:* * * * :..*:*

(E)

Herbaspirillum MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGHVESFDQYVVLLRNTVTQMVYKHAI 60

PSEAE MS-KGHSLQDPYLNTLRKERVPVSIYLVNGIKLQGQIESFDQFVILLKNTVSQMVYKHAI 59

** **: ****:**:****:***************::*****:*:**:***:********

Herbaspirillum STVVPARAVNLSLESSSDE---- 79

PSEAE STVVPSRPVRLPSGDQPAEPGNA 82

*****:*.*.*. ... *

(F)

Herbaspirillum -MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGHVESFDQYVVLLRN-TVTQMVYKH 58

Staphylococcus MIANEN--IQDKALENFKANQTEVTVFFLNGFQMKGVIEEYDKYVVSLNSQGKQHLIYKH 58

::*:. :** *: :: ::. *:::::**::::* :*.:*:*** *.. :::***

Herbaspirillum AISTVVPARAVNLSLESSSDE 79

Staphylococcus AISTYTVETEGQASTESEE-- 77

**** . : * **..

(G)

Herbaspirillum -----MSNKGQLLQDPFLNALR-KEHVPVSIYLVNGIKLQGHVESFDQYVVLLRNTVTQM 54

M.therm GSVIDVSSQRVNVQRP-LDALGNSLNSPVIIKLKGDREFRGVLKSFDLHMNLVLNDAEEL 59

:*.: :* * *:** . : ** * * .. :::* ::*** :: *: * . ::

Herbaspirillum VYKHAISTV--VPARAVNLSLESSSDE 79

M.therm EDGEVTRRLGTVLIRGDNIVYISP--- 83

.. : * *. *: *.

(H)

Herbaspirillum -----MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGHVESFDQYVVLLRN-TVTQM 54

Methanococcus MNKPVKKQQPKKVIPNFEYARRLNGKKVKIFLRNGEVLDAEVTGVSNYEIMVKVGDRNLL 60

.:: : : * * * : *.*:* ** *:..* ...:* :::: . :

Herbaspirillum VYKHAISTVVPARAVNLSLESSSDE 79

Methanococcus VFKHAIDYIEY-------------- 71

*:****. :

Os dados do alinhamento foram obtidos com a utilização do programa ClustalW (THOMPSON et al.,

1994). (*) Aminoácidos idênticos; (:) Aminoácidos de alta similaridade; (.) Aminoácidos de baixa

similaridade. (A) H. seropedicae e Burkholderia xenovorans LB400; (B) H. seropedicae e Ralstonia

eutropha JMP134; (C) H. seropedicae e Nitrosomonas eutropha C91; (D) H. seropedicae e Escherichia

coli; (E) H. seropedicae e Pseudomonas aeruginosa; (F) H. seropedicae e Staphilococcus aureus; (G) H.

seropedicae e Methanobacterium thermoautotrophicum; (H) H. seropedicae e Methanococcus jannaschii.

Até o momento foram determinadas as estruturas cristalográficas das proteínas

Hfq de E. coli, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus jannaschii,

Pseudomonas aeroginosa e Staphilococcus aureus (SAUTER et al., 2003; COLLINS et

al., 2002; NIELSEN et al., 2007; NICULIN et al., 2005; SCHUMACHER et al., 2002). Na

árvore de similaridade de aminoácidos para a proteína Hfq de H. seropedicae e

organismos com estrutura cristalográfica da proteína Hfq já resolvida (figura 15) fica

evidente a presença de aminoácidos que diferencia a proteína Hfq de H. seropedicae

das demais. Estas diferenças podem ser irrelevantes ou, podem contribuir para uma

diferenciação estrutural e, portanto funcional.

FIGURA 14 – ALINHAMENTO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS PROTEÍNAS Hfq

Os dados do alinhamento foram obtidos com a utilização do programa ClustalW (THOMPSON et al., 1994). (*) Aminoácidos idênticos; (:)

Aminoácidos de alta similaridade; (.) Aminoácidos de baixa similaridade. 1 Pseudomonas (Pseudomonas aeruginosa PAO1), 2 Pseudomonas

(Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000), 1Yersinia (Yersinia enterocolitica), 2 Yersinia (Yersinia pestis CO92), Erwinia (Erwinia

carotovora subsp. atroseptica SCRI1043), Haemophilus (Haemophilus influenzae Rd KW20), Pasteurella (Pasteurella multocida), Vibrio (Vibrio

cholerae), Herbaspirillum (Herbaspirillum seropedicae), Neisseria (Neisseria meningitidis serogroup A), Ralstonia (Ralstonia solanacerum),

Pasteurella (Pasteurella multocida), , 1 Xanthomonas (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria str. 85-10), 2 Xanthomonas (Xanthomonas oryzae

pv. oryzae KACC10331), Xylella (Xylella fastidiosa). O motivo YKHAI está destacado por um quadrado vermelho.

FIGURA 15 – ÁRVORE DE SIMILARIDADE ENTRE AS PROTEÍNAS Hfq

Árvor

e de similaridade de aminoácidos entre a proteína Hfq de H. seropedicae e de organismos com estrutura

cristalográfica da proteína Hfq já resolvida. O programa utilizado foi o ClustalW (THOMPSON et al.,

1994).

Usando o programa ProtParam disponível no site EXPASY

(www.expasy.ch/tools/protparam.html), foi possível também determinar algumas

características bioquímicas teóricas da proteína Hfq nativa e fusionada à cauda de

histidinas de H. seropedicae:

Proteína Nativa:

Número de Aminoácidos: 79

Massa Molecular: 8838,1 Da

pI Teórico: 6,82

Proteína Fusionada a Cauda de Histidinas:

Número de Aminoácidos: 99

Massa Molecular: 11001,4 Da

pI Teórico: 8,22

As análises in silico realizadas permitiram observar a significativa conservação

da proteína Hfq de H. seropedicae assim como obter dados bioquímicos teóricos que

foram levados em consideração nos passos de purificação e análise estrutural.

4.3 ANÁLISE FUNCIONAL DA PROTEÍNA Hfq

A fim de estudar a proteína Hfq de H. seropedicae, a seqüência codificadora foi

amplificada e clonada em vetores de supexpressão que foram posteriormente

transformados em E. coli BL21(DE3). Estes passos foram desenvolvidos visando a

purificação da proteína para os ensaios de ligação ao sRNA DsrA e cristalização.

4.3.1 CLONAGEM DO GENE hfq EM VETORES DE EXPRESSÃO

Para a clonagem do gene hfq de H. seropedicae em vetor de expressão,

primeiramente o mesmo foi amplificado utilizando um par de oligonucleotídeos

iniciadores contendo os sítio de restrição para as enzima NdeI e HindIII. O DNA

genômico de H. seropedicae extraído conforme o ítem 4.5.3 foi utilizado como molde e

a reação de PCR foi realizada em gradiente de temperatura (45-55ºC) de anelamento,

devido à dificuldade inicial em se obter o amplificado utilizando a temperatura de

anelamento calculado teoricamente. Como resultado, houve a formação de um

amplificado de aproximadamente 250pb em todas as temperaturas selecionadas para o

anelamento do oligonucleotídeo. Os amplificados produzidos estão mostrados na figura

16.

FIGURA 16 – AMPLIFICAÇÃO DO GENE hfq POR PCR COM GRADIENTE DE

TEMPERATURA

Perfil eletroforético em gel de agarose 1,5 %. MW: padrão de massa molecular 1 Kb Ladder. Linhas de 2

a 13: produtos de PCR obtidos com o gradiente térmico de 45 a 55ºC.

Em seguida, o fragmento contendo o gene hfq amplificado foi subclonado no

vetor pCR2.1 (3,9 Kb) que possui resistência aos antibióticos ampicilina e canamicina,

dois sítios para a enzima de restrição EcoRI que permitem a liberação do inserto e

confirmação da clonagem, gene lacZ e uma timina em cada ponta 3’. A presença de

timina permite a clonagem do produto de PCR, uma vez que a Taq DNA polimerase

caracteriza-se por adicionar uma adenina às pontas 3’ do amplificado. Após a

transformação das células de E. coli TOP10, doze transformantes que não

apresentaram atividade de β-galactosidase, ou seja, doze colônias de cor branca,

tiveram os seus plasmídeos extraídos e analisados por eletroforese após restrição com

a enzima EcoRI. Após a confirmação da clonagem por restrição, um dos clones

contendo o gene hfq (figura 17) teve a seqüência de pares de base do inserto

confirmado por seqüenciamento (item 3.5.4).

500pb

55ºC

45ºC

750pb

Gene

250pb

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

FIGURA 17 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE CLONE pCR2.1 :: hfq

Eletroforese em gel de agarose 1,5 %. O clone obtido foi clivado com a enzima de restrição EcoRI.MW:

padrão de massa molecular 1 Kb Ladder. 1: amplificado intacto do gene hfq. 2: vetor pCR2.1. 3: clone.

Como o plasmídeo pCR2.1 apresenta resistência aos antibióticos ampicilina e

canamicina, foi necessário realizar um passo intermediário de clonagem no vetor pDK-

7, que possui resistência ao antibiótico cloranfenicol, para então transferir o DNA inserto

para os plasmídeos pET28(a) e pT7-7. Esta estratégia teve como objetivo facilitar a

seleção dos subclones para a expressão de Hfq, uma vez que o vetor pET28(a) possui

resistência a canamicina e o vetor pT7-7 possui resistência a ampicilina.

Os vetores pCR2.1::hfq e pDK7 foram clivados com as enzimas XbaI e HindIII e

um fragmento de 360pb contendo o gene hfq foi subclonado no vetor pDK7 originando o

plasmídeo pKADO0 (figura 18).

3500pb

1 2 3

250pb

500pb

750pb

Vetor pCR2.1

Gene hfq

5000pb

FIGURA 18 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE RESTRIÇÃO DO CLONE pKADO0

Eletroforese em gel de agarose 1,5 %. O clone obtido foi clivado com as enzima de restrição XbaI e

HindIII. MW: padrão de massa molecular 1 Kb Ladder. 1: vetor pDK-7. 2: pKADO0.

O vetor pT7-7 foi o primeiro a ser utilizado para a clonagem do gene hfq com o

objetivo de superexpressão do produto. Este se caracteriza por fornecer resistência ao

antibiótico ampicilina, possuir promotor T7, possuir sítio de ligação ao ribossomo próprio

e possibilitar a superexpressão da proteína na forma nativa. Os plasmídeos pKADO0 e

pT7-7 foram clivados com as enzimas NdeI e HindIII e o inserto de 250pb contendo o

gene hfq foi clonado no vetor pT7-7 originando o plasmídeo pKADO1. A eficiência da

ligação foi confirmada por restrição do clone com as enzimas XbaI e HindIII e obtenção

de um fragmento de 300pb (figura 19).

Gene hfq

1 2

pDK-7

250pb

500pb

4000pb

FIGURA 19 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE RESTRIÇÃO DO PLASMÍDEO

pKADO1

Eletroforese em gel de agarose 1,5 %. O clone obtido foi clivado com as enzima de restrição XbaI e

HindIII. MW: padrão de massa molecular 1 Kb Ladder. 1: amplificado do gene hfq. 2: vetor pT7-7 clivado

com as enzimas XbaI e HindIII. 3: plasmídeo pKADO1 clivado com as enzimas XbaI e HindIII.

O último passo de clonagem consistiu na transferência do gene hfq do clone

pKADO1 para o vetor pET28(a). Este vetor se caracteriza por fornecer resistência ao

antibiótico canamicina, possuir promotor T7, possuir sítio de ligação ao ribossomo

próprio e possibilitar a superexpressão da proteína fusionada a uma cauda composta de

seis resíduos de histidina na região N-terminal. Os plasmídeos pKADO1 e pET28(a)

foram clivados com as enzimas NdeI e HindIII e em seguida o DNA inserto contendo o

gene hfq foi clonado no vetor pET28(a) originando o plasmídeo pKADO2. O sucesso da

ligação foi confirmado por restrição do clone com as enzimas XbaI e HindIII e obtenção

de um fragmento de 300pb (figura 20).

Gene hfq

pT7-7

250pb

500pb

2000pb

2500pb

FIGURA 20 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE RESTRIÇÃO DO PLASMÍDEO

pKADO2

Eletroforese em gel de agarose 1,5 %. O clone obtido foi clivado com as enzima de restrição XbaI e

HindIII. MW: padrão de massa molecular 1 Kb Ladder. 1: DNA amplificado intacto do gene hfq. 2:

pKADO2.

4.3.2 EXPRESSÃO DA PROTEÍNA Hfq

Para uma análise inicial de expressão da proteína Hfq, os plasmídeos pKADO1 e

pKADO2 foram introduzidos por eletroporação em E. coli estirpe BL21 (DE3), células

transformantes foram inoculadas em meio LB e induzidas com IPTG (1mmol/L) durante

3 horas (3.7). Os perfis de expressão das frações brutas estão mostrados na figura 21.

Nota-se que a superexpressão foi satisfatória e que ambas proteínas migraram da

forma esperada.

250pb

500pb

Gene hfq

pET28(a)

4000pb

FIGURA 21 – ELETROFORESE DO EXTRATO BRUTO DA PROTEÍNA Hfq

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) 12 % do extrato bruto da proteína Hfq expressa na

forma nativa ou fusionada a uma cauda de histidinas. MW: padrão de massa molecular (kDa). Linhas

1,2.3 e 4: extrato bruto das células de E. coli BL21(DE3) contendo: pT7-7 [1], pKADO1 [2], pET28(a) [3] e

pKADO2 [4]. O gel foi corado com azul de Coomassie.

As bandas correspondentes às proteínas superexpressas foram retiradas do gel

e analisadas por MALDI-TOF/MS conforme descrito no item 3.10.

A banda correspondente à proteína nativa foi identificada como sendo a proteína

Hfq de H. seropedicae quando as relações m/z obtidas (1484,755; 1612,832; 1813,891

e 1902,906) foram submetidas ao programa Protein Prospector (3.10). O espectro

contendo as m/z está ilustrado na figura 22. Das quatro relações m/z, duas (1484,755 e

1612,832) contribuíram para a identificação da proteína. A porcentagem de cobertura

dos peptídeos analisados foi de 37 % (figura 23) assumindo-se um desvio de 209 ppm.

1 2 3 4

Proteína Hfq fusionada

à cauda de histidinas.

Proteína Hfq.

30,0

20,0

14,4

FIGURA 22 – ESPECTRO DA RELAÇÃO m/z DA PROTEÍNA Hfq NATIVA.

Os picos representam as massas dos peptídeos originados da digestão da proteína com tripsina. Análise

feita pelo MALDI -TOF/MS. Picos cuja informação possibilitou a cobertura da sequëncia de aminoácidos

da proteína identificada estão indicados por setas.

FIGURA 23 – RESULTADO DA SUBMISSÃO DAS RELAÇÕES m/z DA PROTEÍNA

Hfq NATIVA

Os resultados mostram: o número da ORF do genoma de H. seropedicae encontrada, as características

teóricas (MW, pI) da proteína anotada, as m/z que coincidiram as razões m/z obtidas com a digestão in

silico da seqüência de aminoácidos da proteína anotada e porcentagem de cobertura.

m/z

A banda correspondente à proteína fusionada a cauda de histidinas também foi

identificada como sendo a proteína Hfq de H. seropedicae quando as relações m/z

obtidas (1484,464; 1567,480; 1612,540; 1768,437 e 1902,537) foram submetidas ao

programa Protein Prospector (3.10). O espectro contendo as m/z está ilustrado na figura

24. Das cinco relações m/z, quatro (1484,464; 1567,480; 1612,540 e 1902,537)

contribuiu para a identificação da proteína. A porcentagem de cobertura dos peptídeos

analisados foi de 55 % (figura 25) assumindo-se um desvio de 209 ppm.

FIGURA 24 – ESPECTRO DA RELAÇÃO m/z DA PROTEÍNA Hfq FUSIONADA A

CAUDA DE HISTIDINAS

Os picos representam as massas dos peptídeos originados da digestão tríptica da proteína. Análise feita

pelo MALDI -TOF/MS. Picos cuja informação possibilitou a cobertura da seqüência de aminoácidos da

proteína identificada estão indicados por setas.

m/z

FIGURA 25 – RESULTADO DA SUBMISSÃO DAS RELAÇÕES m/z DA PROTEÍNA

Hfq FUSIONADA À CAUDA DE HISTIDINAS

Os resultados mostram: o número da ORF do genoma de H. seropedicae encontrada, as características

teóricas (MW, pI) da proteína anotada, as m/z que coincidiram as razões m/z obtidas com a digestão in

silico da seqüência de aminoácidos da proteína anotada e porcentagem de cobertura.

Uma vez que o material obtido para a análise por MALD-TOF/MS foi extraído de

extrato bruto e não de uma amostra contendo proteína purificada, os valores de

porcentagens de cobertura para ambas as amostras podem ser considerados baixos.

Contudo, eles estão acima dos 20 % normalmente aceitáveis e as razões m/z obtidas

foram suficientes para obter match contra o banco de dados de H. seropedicae e

confirmar a identidade da proteína Hfq.

Confirmada a identidade da proteína, foram realizados testes de expressão em

que se procurou determinar a melhor condição para a obtenção de proteína solúvel e

em quantidade suficiente para os ensaios de atividade e de cristalização (figuras 26 e

27). Inicialmente, a expressão foi induzida por IPTG e na temperatura de 37 ºC, sendo

em seguida analisada através de eletroforese em gel de poliacrilamida. Nesta condição,

a proteína Hfq foi obtida, em sua maior parte, na fração solúvel (figuras 26 e 27 - linhas

8 e 9). Quando estes parâmetros foram modificados (IPTG foi substituído por lactose

0,5 % e a temperatura de indução foi reduzida para 30 ºC) percebeu-se que a alteração

do agente indutor não provocou aumento da expressão protéica. Os ensaios de

expressão foram realizados tanto com a proteína nativa quanto com a fusionada (3.7) e

os resultados estão mostrados nas figuras 26 e 27. Conclui-se que a melhor

temperatura de indução foi 37 ºC e nesta temperatura os dois tipos de indutor

aparentemente resultaram em um mesmo rendimento, quando se leva em consideração

a quantidade de proteína expressa na fração solúvel.

FIGURA 26 – PERFIL ELETROFORÉTICO DO TESTE DE EXPRESSÃO COM A

PROTEÍNA Hfq NATIVA

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida/Tricina 12 % do Teste de Expressão com a Proteína Hfq Nativa. As

linhas não possuem a mesma quantidade de proteína. MW: padrão de massa molecular (kDa). linha 1:

extrato bruto (pT7-7). linhas 3-10: amostras (pKADO1). linhas 3-6: indução a 30 ºC. linhas 7-10: indução

a 37 ºC. P: fração de proteínas insolúveis após sonicação. S: fração de proteínas solúveis após

sonicação. Lactose: indução com 0,5% de lactose. IPTG: indução com 1mmol/L de IPTG. As proteínas

foram coradas com azul de Coomassie.

Hfq

FIGURA 27 – PERFIL ELETROFORÉTICO DO TESTE DE EXPRESSÃO COM A

PROTEÍNA Hfq FUSIONADA A CAUDA DE HISTIDINAS

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida/Tricina 12 % do Teste de Expressão com a Proteína Hfq Nativa. As

linhas não possuem a mesma quantidade de proteína. MW: padrão de massa molecular (kDa). linha 1:

extrato bruto (pT7-7). linhas 3-10: amostras (pKADO1). linhas 3-6: indução a 30 ºC. linhas 7-10: indução

a 37 ºC. P: fração de proteínas insolúveis após sonicação. S: fração de proteínas solúveis após

sonicação. Lactose: indução com 0,5% de lactose. IPTG: indução com 1mmol/L de IPTG. As proteínas

foram coradas com azul de Coomassie

Hfq

4.3.3 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA FUSIONADA A CAUDA DE HISTIDINAS

A proteína Hfq fusionada a uma cauda de histidinas foi purificada a um grau de

pureza de aproximadamente 90 % utilizando uma coluna Hi-trap chelating carregada

com níquel (3.11.2.1). Antes de aplicar a fração solúvel na coluna, esta foi aquecida a

80 ºC por 15 minutos. Este aquecimento já possibilitou a eliminação de várias proteínas

contaminantes que ficaram na fração insolúvel (figura 29A - linhas 4 e 5). Após a

purificação, as amostras compreendidas no pico cromatográfico observado no

cromatograma da figura 28 foram analisadas por gel de poliacrilamida/tricina (figura 29).

A proteína Hfq fusionada a cauda de histidinas foi eluída com 434 mmol/L de imidazol.

Após a análise do gel (figura 29A), as amostras de 4 a 9 foram reunidas,

resultando em um volume final de aproximadamente 9 mL. Este volume foi dividido em

duas amostras de 4,5 mL. Uma fração foi dialisada a 4 ºC por 12 horas em tampão A

(200 mmol/L de NaCl; 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8,0 e 50 % de glicerol) para ser

estocada e utilizada para a análise funcional. Após a diálise a concentração protéica da

amostra foi estimada pelo método de Bradford (item 3.13), resultando em 4,9 mg/mL de

proteína com 90,0 % de pureza.

FIGURA 28 – PERFIL DE ELUIÇÃO REFERENTE À PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA

Hfq FUSIONADA A CAUDA DE HISTIDINAS

A purificação foi realizada utilizando uma coluna Hi-trap chelating (1 mL). A solução de proteínas foi

injetada, num fluxo de 1 mL/min. Após injeção a coluna foi lavada com 10 CV de tampão (300 mmol/L de

NaCl; 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8.0; 10 mmol/L de imidazol). A proteína Hfq foi eluída utilizando um

gradiente contínuo de 10 a 1000 mmol/L de imidazol equivalente a 20 VC. As amostras foram coletadas

em alíquotas de 1mL. No eixo y, porcentagem de tampão B (300 mmol/L de NaCl; 50 mmol/L de Tris-HCl

pH 8.0; 1000 mmol/L de imidazol). No eixo x, volume de eluição em mL. Em azul, leitura da absorção a

280 nm. Em verde, gradiente de imidazol. As delimitações em vermelho indicam as amostras coletadas.

Waste: frações descartadas. A concentração de imidazol onde a proteína Hfq foi eluída está destacada

no quadrado vermelho.

FIGURA 29 – PERFIL ELETROFORÉTICO DE AMOSTRAS DA PROTEÍNA Hfq

FUSIONADA A CAUDA DE HISTIDINAS

(A)

(B)

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida/Tricina 12%. MW: padrão de massa molecular (kDa). EB: extrato

bruto de células induzidas e preparadas conforme item 13.11.2.1. P: fração de proteínas insolúveis do

extrato bruto (EB) ou após aquecimento a 80 ºC. S: fração de proteínas solúveis do extrato bruto (EB) ou

após aquecimento a 80 ºC. FT: fração de proteínas não adsorvidas na coluna Hi-trap Chelating Ni

. L:

fração de proteínas eluídas com a lavagem da coluna após injeção da amostra. 1-10: frações eluídas com

o gradiente de imidazol. A seta indica a proteína Hfq fusionada a cauda de histidinas. As proteínas foram

coradas com azul de Coomassie.

80 ºC

EB P S

P S FT

43,0

14,4

20,0

30,0

67,0

94,0

EB 3 4

5 6 7

43,0

14,4

20,0

30,0

67,0

94,0

Hfq

4.3.4 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA

4.3.4.1 PURIFICAÇÃO POR INTERAÇÃO HIDROFÓBICA E TROCA IÔNICA

Para os ensaios de cristalização e atividade in vitro foi necessário obter a

proteína Hfq com alta pureza e concentração, uma vez que estes experimentos são

sensíveis à presença de contaminantes. As etapas cromatográficas foram selecionadas

com base em relatos de VASSILIEVA et al. (2002) e NIKULIN et al. (2005) que

descreveram a utilização das resinas DEAE-Sepharose (troca iônica) e Butil-Sepharose

(interação hidrofóbica) na purificação da proteína Hfq nativa. Esta informação levou à

verificação do índice teórico de hidropaticidade da proteína Hfq de H. seropedicae que

revelou um valor numérico alto, o que indica uma grande hidrofobicidade da proteína

(4.2) justificando o uso desta resina. Desta forma a coluna Butil-Sepharose foi utilizada

para a purificação da proteína Hfq de H. seropedicae. A matriz desta coluna é composta

da cadeia lateral (-O-CH

-CH(OH)-CH

-O-(CH

)

-CH

A primeira etapa para a purificação da proteína Hfq nativa também foi o

aquecimento da fração solúvel a 80ºC por 15 minutos (item 3.11). Em seguida, foi

adicionado a fração solúvel, após centrifugação, (NH

)

na forma de sal até uma

concentração final de 1,7mol/L. Este aumento na força iônica da solução favorece as

interações hidrofóbicas entre a proteína e a resina. A solução protéica foi eluída em um

duplo gradiente contínuo decrescente de NaCl (1,0 - 0,1mol/L) e de (NH

)

(1,5 -

0mol/L). A proteína foi eluída com aproximadamente 290mmol/L de NaCl e 435mmol/L

de (NH

)

. Após a purificação as amostras que compreendiam o pico

cromatográfico observado no cromatograma (figura 30) foram analisadas por gel de

poliacrilamida/tricina (figura 31).

As frações com menos impurezas (figura 31 – linhas 5 a 9) foram reunidas e

dialisadas por 12 horas a temperatura ambiente.

A concentração da proteína e a sua pureza foram analisadas após a diálise e

revelaram um aumento expressivo de 78 % na pureza. Este passo cromatográfico

possibilitou também a concentração da proteína Hfq (tabela 5).

Em seguida, a solução protéica foi injetada na coluna DEAE-Sepharose como

descrito no item 3.11.1.3. A proteína não adsorveu na coluna e foi eluída e coletada em

6 frações com volumes de 10 e 20 mL (figura 32 – linhas 2 a 7) antes do gradiente

crescente de NaCl (0,1 a 1,0 mol/L) (figura 32).

As frações com maior grau de pureza e mais concentradas, amostras 4 a 6 da

figura 33, foram reunidas e concentradas por ultrafiltração a uma concentração final de

1,2mg/mL para ensaios de atividade e 13mg/mL para experimentos de cristalografia.

TABELA 5 – PASSOS DE PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA

Passos de purificação da proteína Hfq nativa. A pureza foi determinada por análise densitométrica de gel

Poliacrilamida/Tricina.

A pureza final alcançada foi de 99% como pode ser observado na figura 34. A

proteína Hfq nativa foi obtida com pureza e concentração adequadas para a realização

dos experimentos de atividade assim como para a cristalização.

FIGURA 30 – PERFIL DE ELUIÇÃO DA PURIFICAÇÃO EM BUTIL-SEPHAROSE

Cromatograma mostrando o perfil de eluição da proteína Hfq nativa. Toda a cromatografia foi realizada

utilizando um fluxo de 1 mL/min. Após a injeção da amostra, a coluna foi lavada com 20 VC de solução

contendo 1 mol/L de NaCl; 1,5 mol/L de sulfato de amônio e 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8,0. As amostras

foram coletadas em alíquotas de 1mL. No eixo y, porcentagem de tampão B (1000 mmol/L de NaCl; 1,5

mol/L de (NH

)

; 50 mmol/L de Tris-HCl pH 8.0). No eixo x, volume de eluição em mL. Em azul,

leitura da absorção a 280 nm. Em verde, gradiente decrescente de NaCl (1,0 - 0,1 mol/L) e de (NH

)

(1,5 – 0 mol/L). As delimitações em vermelho indicam as amostras coletadas. Waste: frações

descartadas. A concentração de NaCl e (NH

)

. onde a proteína Hfq foi eluída está destacada no

quadrado vermelho.

FIGURA 31 – ELETROFORESE DA PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida/Tricina 12%. As linhas de 1 a 10 indicam as frações protéicas

correspondentes às amostras de 10 a 19 indicadas no pico cromatográfico da figura acima. A seta azul

indica a posição da proteína Hfq. As proteínas foram coradas com azul de Coomassie.

FIGURA 32 – CROMATOGRAMA DA PURIFICAÇÃO EM DEAE-SEPHAROSE

Cromatograma mostrando o perfil de eluição da proteína Hfq nativa na coluna DEAE-Sepharose. A

cromatografia foi realizada utilizando um fluxo de 3 mL/min. As amostras foram coletadas em 3 volumes

de 10mL e 3 volumes de 20 mL, e estão representadas pelos números de 1 a 6 no cormatograma. Em

azul, leitura da absorção a 280nm. Em verde, gradiente crescente de NaCl (0,1 - 1,0mol/L). A seta em

vermelho indica a região do cromatograma referente ás frações coletadas.

FIGURA 33 – ELETROFORESE DA PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq NATIVA

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida/Tricina 12%. MW: padrão de massa molecular (kDa). PD: Solução

de proteínas após diálise. 1 a 3: frações de 10mL eluídas antes do gradiente de NaCl (0,1 - 1,0mol/L). 4 a

6: frações de 20mL eluídas antes do gradiente de NaCl (0,1 - 1,0mol/L). A seta indica a proteína Hfq. As

proteínas foram coradas com azul de Coomassie.

Hfq

FIGURA 34 – ELETROFORESE DA PROTEÍNA Hfq NATIVA APÓS

CONCENTRAÇÃO

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida/Tricina 12%. MW: padrão de massa molecular (kDa). 1: 13μg de

proteína aplicada. 2: 6,5μg de proteína aplicado. 3: 0,6μg de proteína aplicado. 4: 0,3μg de proteína

aplicado. 5: 0,1μg de proteína aplicado. A seta indica a proteína Hfq. As proteínas foram coradas com

azul de Coomassie.

Hfq

4.3.5 ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq A PEQUENOS RNAS

Para se investigar se a proteína Hfq de H. seropedicae, assim como a de E. coli,

possui a atividade de ligação a pequenos RNAs, foram selecionados para o ensaio de

ligação o sRNA DsrA e o mRNA RpoS de E. coli cujo mecanismo de ligação a Hfq foi

amplamente estudado (LEASE & WOODSON, 2004; MIKULECKY et al., 2004).

Os RNAs curtos foram sintetizados in vitro (3.15) a partir dos plasmídeos

pT7G

DsrA ou pUC-T7RpoS2 linearizados ( 3.15) e a integridade do produto de

transcrição foi avaliado através de eletroforese em gel de agarose 2% (figura 35).

Observou-se que o produto de transcrição referente ao sRNA DsrA apresentou duas

bandas (88 e ~160 bases) enquanto que o produto de transcrição do mRNA RpoS que

apresentou uma única banda com 140 bases. Este fato pode estar relacionado à

presença de MgCl

que pode provocar a dimerização do DsrA (176pb-dímero) (LEASE

& WOODSON, 2004), à conformação secundária do sRNA ou ainda estar relacionado à

presença de plasmídeo não digerido completamente. Esta última hipótese é a menos

provável, pois o plasmídeo geraria um RNA com no mínimo 350 bases e uma banda

com este tamanho não foi observada no gel. Foi observado uma banda de 88 bases

equivalente a uma molécula de DsrA e uma banda com mais de 140 bases.

Somente o sRNA DsrA foi utilizado para os ensaios de ligação, uma vez que este

foi obtido em maior rendimento: 23 μg/mlL para DsrA e 14 μg/mL para RpoS. A

presença de duas bandas referentes ao RNA transcrito, assim como a presença do

DNA molde, não atrapalhou a análise e interpretação da interação proteína-RNA.

O resultado do ensaio de capacidade de ligação da proteína Hfq ao DsrA está

mostrado na figura 36. O comportamento de ligação da proteína Hfq nativa é similar ao

reportado por Lease e Woodson (2004) para E. coli. Para este organismo foi descrita

uma estequiometria de hexâmero ligado a DsrA de 2:1. Na figura 36, nota-se dois

padrões de atraso de banda sendo que o segundo inicia-se com 0,5 μM de Hfq. Este

resultado sugere também uma estequiometria de 2:1 para a proteína Hfq de H.

seropedicae.

A diferença de afinidade entre a proteína Hfq nativa e fusionada a cauda de

histidinas é claramente visível. Tomando-se o valor 0,2 μM de proteína como ponto de

comparação, pode-se inferir que a proteína na sua forma nativa possui maior afinidade

pelo RNA em estudo uma vez que nesta concentração a mesma já provocou retardo de

migração da banda. Entretanto, no ensaio com a proteína fusionada a cauda de

histidinas, na concentração de 0,2 μM não se observou retardo de migração.

Analisando a estrutura da proteína Hfq de E. coli é possível notar que os

aminoácidos da região N-terminal encontram-se na porção superior da proteína e

próximos ao poro (figura 37). Desta forma a menor afinidade apresentada pela proteína

Hfq-his tag de H. seropedicae poderia estar relacionada à presença da cauda de

histidinas na região N-terminal da proteína, o que poderia dificultar o acesso do RNA a

região central (poro).

FIGURA 35 – TRANSCRIÇÃO IN VITRO DO sRNA DsrA E DO mRNA RpoS PELO

MÉTODO RUN-OFF

Eletroforese em gel de agarose 2,0% em tampão TBE (1X). A: gel de referência com os DNAs moldes

linearizados com a enzima EcoRI. B: gel com os produtos de transcrição: DsrA e RpoS indicados por

seta.

(A) (B)

FIGURA 36 – ENSAIO DE RETARDAMENTO DE BANDA PELA INTERAÇÃO Hfq-

DSRA (sRNA)

Eletroforese em gel de acrilamida 6,0% em tampão TBE (0,5X) corados com CYBR Gold (Invitrogen). A

figura a esquerda mostra o experimento de retardamento de banda realizado com a proteína Hfq

fusionada a cauda de histidinas enquanto que a figura a direita apresenta o resultado obtido com a

proteína nativa. Foram utilizados 50nmol/L do sRNA DsrA para cada reação. As concentrações em

termos de μM de hexâmero de proteína utilizadas estão indicadas na parte superior de cada figura.

FIGURA 37 – MODELO DA INTERFERÊNCIA ESTRUTURAL CAUSADA PELA

PRESENÇA DA CAUDA DE HISTIDINAS

O modelo acima mostra a possível posição das caudas de histidinas na proteína Hfq de H. seropedicae.

A estrutura da proteína Hfq de E. coli (SAUTER et al., 2003) foi utilizada para a construção deste modelo.

A esquerda encontra-se a proteína Hfq (visão lateral). Na parte superior da mesma figura está

representada a cauda de histidinas. A direita, visão latera da proteína Hfq nativa.

A análise dos géis da figura 36 permitiu observar, além da capacidade de ligação

a RNA, uma discreta ligação da proteína Hfq ao DNA molde (figura 37). Esta

associação não específica foi observada também por Azam e Ishihama (1999). Estes

autores relataram a presença da proteína Hfq de E. coli associada a DNA plasmidial

além de realizarem ensaios de retardo de banda devido a ligação de Hfq a dois tipos de

DNA diferentes (DNA de fago λ e plasmídeo pCM959).

O ensaio de retardo de banda permitiu confirmar a atividade in vitro de ligação da

proteína Hfq de H. seropedicae ao sRNA DsrA de E. coli. Foi também observado que a

adição de aminoácidos na região N-terminal aparentemente dificultaria o acesso do

sRNA ao poro do hexâmero.

4.4 DETERMINAÇÃO DO ESTADO DE OLIGOMERIZAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq

Proteínas pertencentes à família LSm caracterizam-se por ter o formato de um

doughtnut. Em eucariotos, estas macromoléculas são heteroheptaméricas enquanto

que em procariotos a maioria é homohexamérica (WILUSZ & WILUSZ, 2005). Uma das

exceções é o microrganismo Methanobacterium thermoautotrophicum que possui uma

proteína Hfq homoheptamérica cuja estrutura foi recentemente depositada no banco de

dados PDB (Protein Data Bank). No caso de H. seropedicae, o estado de

oligomerização da proteína Hfq foi determinado por gel filtração e espalhamento de luz

dinâmico (DLS).

Na cromatografia de gel-filtração, foi possível observar a eluição de uma

população homogênea de proteínas (figura 38A). A massa molecular da proteína Hfq foi

calculada (3.18.1). Com base nos dados de eluição dos padrões, foram realizadas a

regressão linear e a determinação da equação de reta (K

= - 0,1979 x log [MW] +

1,2313) (figura 38B). A proteína Hfq foi eluída em um volume de 11,58mL e um K

0,29. Através da equação indicada acima foi possível determinar uma massa de 54 kDa

para a macromolécula. Calculando a razão entre massa molecular do oligômero e

massa molecular teórica do monômero foi possível concluir que a macromolécula é

formada por cerca de 6 monômeros, ou seja, a organização é homohexamérica.

FIGURA 38 – DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR DE Hfq POR

CROMATOGRAFIA DE GEL FILTRAÇÃO

(A) Cromatograma por gel filtração em coluna Superose 12 HR 10/30 referente a eluição da proteína Hfq

(linha vermelha) e das proteínas padrão (linhas tracejadas). Na ordenada, absorbância a 280nm. Na

abscissa, volume de eluição em mL. Acima de cada pico está indicado o nome da proteína padrão assim

como o seu volume de eluição. (B) Curva padrão K

por log [MW] mostrando a relação linear entre o log

da massa molecular e a constante de partição das proteínas padrão. O ponto vermelho indica o K

e o

log [MW] referente a proteína Hfq.

Com o experimento de DLS não foi possível chegar a um valor tão exato quanto

na cromatografia de gel filtração, contudo os resultados foram compatíveis para uma

macromolécula homohexamérica. Como pode ser observada na figura 39A, a amostra

apresentou-se monodispersa, ou seja, não foi evidenciado o aparecimento de estruturas

intermediárias como dí, tri, tetra ou pentâmeros, assim como agregados protéicos.

FIGURA 39 – ENSAIO DE DLS DA PROTEÍNA Hfq

O ensaio de DLS foi realizado conforme o ítem 3.18.2.(A) Monodispersividade da amostra protéica em

função do raio hidrodinâmico. (B) O resultado final do experimento de DLS. Peak 2 : dados referentes a

proteína Hfq. R: raio hidrodinâmico, %Pd: polidispersividade, MW-R: massa molecular relativa, %Int:

porcentagem da intensidade, %Mass: porcentagem da massa.

Esta população monodispersa possui um raio hidrodinâmico médio de 3,1nm que

equivale a uma macromolécula de 48kDa (figura 39-b). Calculando a razão entre

massa molecular determinada por DLS e a massa molecular teórica do monômero foi

possível chegar a uma relação de 5,4 monômeros por macromolécula.

Os resultados destes dois experimentos permitem inferir que a proteína Hfq de H.

seropedicae realmente é um homohexâmero.

4.5 ANÁLISE DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DA PROTEÍNA Hfq

A estrutura secundária da proteína Hfq foi investigada usando o método de

dicroísmo circular (3.17.2) assim como por estudos de predição de estrutura através do

programa de bioinformática PSIPRED.

A figura 40 mostra a predição que se baseia no alinhamento estrutural entre a

seqüência de aminoácidos da proteína Hfq com a seqüência de aminoácidos de

proteínas cuja estrutura foi determinada experimentalmente. O resultado da predição foi

uma proteína com 5 fitas β e 1 α-hélice N-terminal.

No espectro de dicroísmo circular (CD) a 15 ºC aparece claramente uma banda

negativa em 216 nm que é característica da presença, em maior porcentagem, de fitas

β (figura 41). Os dados referentes a este espectro foram submetidos ao programa

DICROPROT (Delèage & Geourjon, 1993) para a determinação das proporções de

cada estrutura secundária obtida a partir de dados experimentais. O resultado obtido foi:

47 % de fitas β, 6 % de α hélices, 7 % de alças e 39 % de outras estruturas

(conformações não ordenadas).

FIGURA 40 – PREDIÇÃO DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DA PROTEÍNA Hfq

Predição da estrutura secundária usando o programa PSIPRED. Pred: estrutura secundária predita. “C”:

aminoácidos que contribuem para a formação de estrutura em alça. “E”: aminoácidos que contribuem

para a formação de fita β. “H”: aminoácidos que contribuem para a formação de α-hélice. O cilindro verde

corresponde a α-hélice. As setas amarelas correspondem a fitas β. Abaixo das figuras encontra-se a

seqüência de aminoácidos da proteína (AA). Conf: grau de confiabilidade calculado pelo programa

Psipred para a estrutura secundária predita.

As mudanças estruturais sofridas ao longo da variação de temperatura (15 a

95ºC) também foram investigadas. Para cada temperatura foi registrado um espectro de

CD e estes foram sobrepostos em um mesmo gráfico (figura 42-a). O perfil global obtido

indica uma grande variação estrutural com a variação de temperatura e esta mudança

pode ser melhor percebida quando plota-se a porcentagem dos diversos tipos

estruturais em função da temperatura (figura 43). Observa-se claramente a perda de

estrutura em fitas β com o aumento de temperatura, uma vez que a porcentagem desta

estrutura secundária diminuiu abruptamente a partir de 20ºC. Aparentemente, quando

comparado à variação sofrida por β, a α hélice não sofreu efeito significativo da

variação de temperatura.

FIGURA 41 – ESPECTRO DE DICROÍSMO CIRCULAR (CD) DA PROTEÍNA Hfq

Espectro de CD de 200 a 260nm da proteína Hfq nativa (0,2mg/mL) a 15ºC. Na ordenada, a elipticidade

molar. Na abscissa o comprimento de onda em nm.

FIGURA 42 – ENOVELAMENTO E VARIAÇÃO DA TEMPERATURA

(A) Sobreposição dos espectros de CD de 200 a 260nm referente à variação de temperatura. O espectro

referente a cada temperatura está representado em cores diferentes. (B) O gráfico mostra a relação entre

elipticidade a 222nm e a variação de temperatura. Na figura está indicada a temperatura de melting ou

desenovelamento.

-7000

-6000

-5000

-4000

-3000

-2000

-1000

1000

2000

195 205 215 225 235 245 255 265 275

Comprimento de onda (nm)

Graus cm2 dmol-1

FIGURA 43 – PORCENTAGEM DE ESTRUTURA ESCUNDÁRIA AO LONGO DA

VARIAÇÃO DE TEMPERATURA

Variação de porcentagem de cada estrutura secundária (α-hélice, fitas β e alças) em função da variação

de temperatura.

Uma vez que a temperatura foi um importante parâmetro que afetou a estrutura

secundária da proteína Hfq, foi determinada a temperatura crítica a partir da qual há um

grande desenovelamento protéico. Este estudo foi realizado variando-se a temperatura

(15 a 95ºC) e monitorando a mudança estrutural a 222nm. Este comprimento de onda

permite observar mudanças sofridas pelas α hélices. A relação elipticidade (222nm) em

função da temperatura pode ser observada no gráfico da figura 42B. O ponto médio da

inflexão determinou a temperatura de 38,3ºC como a temperatura a partir da qual a

proteína perde drasticamente a estrutura secundária.

Estes resultados permitem inferir que a proteína Hfq não possui uma grande

estabilidade térmica, mas sim um re-enovelamento eficiente. Esta hipótese poderia

justificar a permanência da atividade de ligação ao RNA da proteína Hfq mesmo após

seu aquecimento a 80ºC no passo inicial de purificação.

0 10203040506070809010

Temperatura (ºC)

Porcentagem (%)

Alfa

Beta

Turn

Outros

4.6 ANÁLISE CRISTALOGRÁFICA DA PROTEÍNA Hfq

A proteína Hfq de H. seropedicae foi submetida à cristalização com a finalidade de

determinar sua estrutura tridimencional e conseqüentemente utilizar seu modelo

estrutural para realizar estudos de similaridade estrutural, funcional e evolutivo e assim

como mapear o sítio de ligação para ATP.

A cristalização foi realizada pelo método de difusão de vapor em gota sentada

(3.19). Após a montagem automatizada das placas, todas as 544 condições foram

acompanhadas periodicamente e as características das gotas anotadas. No primeiro dia

de observação apareceram cristais em diversas condições e o seu desenvolvimento foi

acompanhado por 14 dias. Estes cristais apresentaram-se de diversas formas: agulhas,

microcristais ou placas (figura 44).

No quinto dia de observação foi contabilizada a quantidade de gotas límpidas (sem

alteração de fase) por kit de cristalização testado. Este resultado está representado na

tabela 6.

TABELA 6 – LEVANTAMENTO DA PORCENTAGEM DE GOTAS LÍMPIDAS

REGISTRADAS NO SCREENING INICIAL

KIT % de Gotas Límpidas

Crystal Screen e Crystal Screen II (Hampton Research) 56

Wizard I e Wizard II (Emerald BioSystems) 65

PACT (Nextal / Qiagen) 54

JSCG+ (Nextal / Qiagen) 51

SaltRx (Hampton Research) 85

Precipitant Synergy (Emerald BioSystems) 56

FIGURA 44 – SCREENING INICIAL DE CRISTALIZAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq

Ensaio de cristalização da proteína Hfq utilizando o método de difusão de vapor em gota sentada. O

screening inicial da proteína Hfq apresentou cristais em diversas condições de cristalização assim como

várias formas. (A) Forma microcristalina. (B) Forma de placas. (C) Forma de agulha na presença de

precipitado protéico. (D) Forma de agulhas.

Observou-se que em todos os kits testados mais de 50% das condições não

possuíram alteração de fase nos primeiros cinco dias, ou seja, não foi observado cristal

ou proteína precipitada amorfa. Goulging e Perry (2003) relataram que quando

aproximadamente 50% das condições apresentarem-se como proteína solúvel,

considera-se a concentração protéica apropriada para mais ensaios. Esta afirmativa

sugere que a concentração protéica era inadequada aos ensaios, pois mais de 50% das

condições, em todos os Kits, apresentaram-se como gotas limpas. Contudo assume-se

que este fato tenha sido um reflexo da solubilidade da proteína nas várias condições de

cristalização e não um efeito da baixa concentração de proteína utilizada, uma vez que

a concentração protéica medida anteriormente foi superior a 10mg/mL quando

determinada pelos métodos de Bradford e coeficiente de extinção molar.

Os cristais com tamanho superior a 0,1mm foram submetidos à difração de raios-x

com o objetivo de identificar as condições que propiciaram a formação de cristais

constituídos de proteína e não de sal. Na figura 45 estão ilustrados alguns padrões de

difração obtidos. Os padrões de difração podem ser comparados, pelo leitor, com os

padrões de difração controles, como cristal de sal e cristal de lisozima, para uma melhor

diferenciação (figura 45).

Um cristal salino (figura 45A) possui poucos pontos difratados, inclusive na região

de alta resolução (região mais distante do centro do difratograma), enquanto que os

constituídos de proteína possuem vários pontos inclusive na região de baixa resolução

(figura 45B).

Para a proteína Hfq, dentre quinze cristais escolhidos aleatoriamente catorze

foram caracterizados como cristais pouco organizados (figura 45 - C a E) e um como

cristal bem formado (figura 45F). A composição das soluções de precipitação nas quais

estes cristais formaram-se está listada na tabela 7. Destaca-se o efeito de PEG na

cristalização da proteína Hfq, uma vez que este agente precipitante está presente na

grande maioria das condições. O cristal bem formado foi obtido na condição número 10

(tabela 7) e este ao ser difratado apresentou uma resolução máxima de 2.7 Å (figura

46).

FIGURA 45 – PADRÕES DE DIFRAÇÃO DOS CRISTAIS DA PROTEÍNA Hfq

Os cristais obtidos no screen inicial foram submetidos a difração de raios-x conforme item 3.19.Os

padrões de difração digitalizados obtidos com o detector Mar345 estão representados acima. (A) Sal. (B)

Lisozima. (C-E) Cristais mal-formados da proteína Hfq. (F) Cristal bem-formado da proteína

Hfq.

Futuramente a condição número 10 da tabela 7 será refinada para a obtenção de

cristais maiores e melhor organizados, para a coleta completa dos dados necessários

para a construção de um modelo estrutural em alta resolução. A melhor condição será

utilizada também para ensaios de co-cristalização com RNA e ATP. O objetivo desta

última abordagem será o mapeamento da posição da molécula de ATP na proteína,

assim como o efeito da mesma na sua conformação final.

Assim, os resultados obtidos levaram à indicação de várias condições de

cristalização para a proteína Hfq de H. seropedicae, sendo que uma das condições é

considerada momentaneamente a mais promissora. Isto demonstra que o processo de

purificação para proteína atendeu às exigências de pureza e quantidade necessárias

para se obter o cristal.

TABELA 7 – COMPOSIÇÃO DAS SOLUÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DOS CRISTAIS

PROTÉICOS

Nº TAMPÃO PRECIPITANTE SAL

1 --------------------------------------------

10% (w/v)

PEG1000 ----------------------------------

2 100mM HEPES de sódio/HCl pH 7,5

20% (w/v)

PEG4000 ----------------------------------

10% (v/v)

Isopropanol

100mM Ácido Cacodílico/HCl pH 6,5

20% (w/v)

PEG8000

200mM Acetado de

magnésio

100mM Tris/HCl pH 7,0

30% (w/v)

PEG3000 200mM Cloreto de Sódio

--------------------------------------------

20% (w/v)

PEG3350 200mM Nitrato de Sódio

100mM SPG/SPG pH 6,0

25% (w/v)

PEG1500 ----------------------------------

--------------------------------------------

20% (w/v)

PEG3350 200mM Acetato de Sódio

100mM MES/NaOH pH 6,0

20% (w/v)

PEG6000 200mM Cloreto de Sódio

9 100mM PCB/PCB pH 6,0

25% (w/v)

PEG1500 ----------------------------------

10 100mM PCB/PCB pH 7,0

25% (w/v)

PEG1500 ----------------------------------

11 100mM MMT/MMT pH 8,0

25% (w/v)

PEG1500 ----------------------------------

12 100mM Cloreto de Amônio pH 6,3

20% (w/v)

PEG3350 ----------------------------------

13 --------------------------------------------

20% (w/v)

PEG3350

200mM Nitrato de Amônio

pH 6,3

14 100mM Imidazol/HCl pH 8,0

10% (w/v)

PEG8000 ----------------------------------

15 100mM Bis-Tris/HCl pH 5,5

25% (w/v)

PEG3350

200mM Cloreto de

Magnésio

FIGURA 46 – DIFRAÇÃO DA PROTEÍNA Hfq A 2.7Å DE RESOLUÇÃO

Padrão de difração da proteína Hfq utilizando o cristal obtido na condição de precipitação número 10

(tabela 7). Os círculos representam as faixas de resolução. Em destaque os pontos de difração na região

de maior resolução.

5. CONCLUSÕES

♦ O gene hfq de H. seropedicae provavelmente forma uma unidade transcricional com

os genes hflXKC, concordando com a organização gênica observada para as β-

proteobactérias;

♦ O gene hfq codifica uma proteína solúvel de 8,8 kDa com alta identidade com as

proteínas Hfq de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa;

♦ A proteína Hfq foi superexpressa em E. coli nas formas nativa e fusionada a cauda

de histidinas. Ambas as proteínas foram purificadas e apresentaram uma pureza

final de 99 e 90 %, respectivamente;

♦ A proteína Hfq possui atividade de ligação ao sRNA DsrA, sendo que a forma

fusionada a cauda de histidinas possui menor afinidade quando comparada a nativa;

♦ Hfq possui estrutura secundária característica das proteínas pertencentes à família

Sm like proteins;

♦ Hfq é um homohexâmero;

♦ A proteína Hfq foi cristalizada na condição 100 mM de PCB pH 7,0 e 25 % (w/v)

PEG1500. Esta condição gerou um cristal com padrão de difração com uma

resolução de 2,7 Å.

6. PERSPECTIVAS

No presente trabalho foi apresentada a clonagem, expressão e purificação da

proteína Hfq de H. seropedicae nas formas nativa e fusionada a cauda de histidinas. Foi

demonstrado também a capacidade de ligação da proteína Hfq a ao sRNA DsrA. Uma

condição de cristalização promissora foi encontrada a partir de um screen inicial de 544

diferentes condições.

Os resultados aqui expostos abrem oportunidade para o desenvolvimento de

mais pesquisas no campo estrutural e no estudo do controle da expressão gênica

fornecendo ponto de partida para:

1. Identificação de novos sRNAs regulatório;

2. Determinação do modelo estrutural da proteína Hfq de H. seropedicae;

3. Estudo da interação de ligantes, interação proteína-proteína e dinâmica

molecular;

4. Estudo do fenótipo hfq

em H. seropedicae e investigação de um provável

papel desta proteína no processo de fixação biológica de nitrogênio.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ADLER, A. J.; GREENFIELD, N. J.; FASMAN, G. D. Met. Enzymol., London and New

York: Academic Press, vol. XXVII D, pp. 675, 1973.

AIBA, H. Mechanism of RNA silencing by Hfq-binding small RNAs. Curr. Opin.

Microbiol., v. 10, p. 134-139, 2007.

ALTUVIA, S. Regulatory Small RNAs: the Key to Coordinating Global Regulatory

Circuits. J. Bacteriol., v. 186, p. 6679-6680, 2004.

ARLUISON, V.; MUTYAM, S.K.; MURA, C.; MARCO, S.; SUKHODOLETS, M.V. Sm-like

protein Hfq: Location of the ATP-binding site and the effect of ATP on Hfq-RNA

complexes. Prot. Science, v. 16, p. 1-12, 2007.

AZAM, T.A; ISHIHAMA, A. Twelve species of the nucleoid-associated protein from

Escherichia coli. Sequence recognition specificity and DNA binding affinity. J. Biol.

Chem., v. 274, p. 33105-33113, 1999.

BALDANI, J.I.; BALDANI, V.L.D.; SELDIN, L.; DÖBEREINER, J. Characterization of

Herbaspirillum seropedicae gen. nov., sp. nov., a new root-associated nitrogen-fixing

bacterium. Intl. J. Sys. Bact., n. 36, p. 86-93, 1986.

BENELLI, E.M. Análise funcional e estrutural da proteína PII, controladora da fixação de

nitrogênio em Herbapirillum seropedicae. Tese de Doutorado, Departamento de

Bioquímica, Universidade Federal do Paraná, Brazil, 200p., 1997.

BLUMENTHAL, T.; CARMICHAEL, G. G. RNA replication: function and structure of Qβ

replicase. Annu. Rev. Biochem., v. 48, p. 525-548, 1979.

BODDEY, R. M.; OLIVEIRA, O. C.; URQUIAGA, S.; REIS, V. M.; OLIVARES,

F. L.; BALDANI, V. L. D.; DÖBEREINER, J. Biological nitrogen fixation associated with

sugar cane and rice: Contributions and prospects for improvement. Plant and Soil, v.

174, p. 195-209, 1995.

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilization: the principle of protein-dye binding. Anal. Bichem., v. 72,

p. 248-254, 1976.

BRENNAN, R.G.; LINK, T.M. Hfq structure, function and ligand binding. Curr. Opin.

Microbiol., v. 10, p. 1-9, 2007.

BRESCIA, C.C.; MIKULECKY, P.J.; FEIG, A.L.; SLEDJESKI, D.D. Identification of the

Hfq-binding site on DsrA RNA: Hfq binds without altering DsrA secondary structure.

RNA, v. 9, p. 33-43, 2003.

Cell-Porator Voltage Booster – Instruction Manual – Life Tecnologies, Inc. 1991.

COLLINS, B.M.; NAIDOO, N.; HARROP, S.J.; CURMI, P.M.G.; MABBUTT, B.C.

Refined Structure of Sm-Like Protein Heptamer from Methanobacterium

thermoautotrophicum. (Fonte: PDB - a ser publicado).

CUDNEY, R.; PATEL,S.; WEISGRABER, K.; NEWHOUSE, Y.; McPHERSON, A.

Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Cryst.,

D50, p. 414-423, 1994.

DELEAGE, G., GEOURJON, C. An interactive graphic program for calculating the

secondary structure content of proteins from circular dichroism spectrum. Comput.

Appl. Biosci., v.2, p.197-199, 1993.

100

DING, Y.; DAVIS, B. M.; WALDOR, M. K. Hfq is essencial for Vibrio cholerae virulence

and dowregulates sigma expression. Mol. Microbiol., v. 53, p. 345-354, 2004.

DIXON, RAY; KAHN, DANIEL. Genetic Regulation of Biological Nitrogen Fixation.

Nature Rev., v. 2, p. 621-631, 2004.

DREPPER, T.; RAABE, K.; GIAOURAKIS, D.; GENDRULLIS, M.; MASEPOHL, B.;

KLIPP, W. The Hfq-like protein NrfA of the phototrophic purple bacterium Rhodobacter

capsulatus controls nitrogen fixation via regulation of nifA and anfA expression. FEMS,

215, P. 221-227, 2002.

EXPASY (EXPERT PROTEIN ANALISYS SYSTEM) ALDENTE. Disponível em: <

www.expasy.ch/tools/aldente/ >. Acesso em: 13 mai. 2006.

EXPASY (EXPERT PROTEIN ANALISYS SYSTEM) PROTPARAM. Disponível em: <

www.expasy.ch/tools/protparam.html >. Acesso em: 13 dez. 2006.

FERNANDEZ, M. T. F.; EOYANG, L.; AUGUST, J. T. Factor fraction required for the

synthesis of bacteriophage Qβ-RNA. Nature, v. 219, p. 588-590, 1968.

GEISSMANN, T. A.; TOUATI, D. Hfq, a new chaperoning role: Binding to messenger

RNA determines access for small RNA regulator. EMBO J., v. 23, p. 396-405, 2004.

GOTTESMAN, S. THE SMALL REGULATORS OF ESCHERICHIA COLI: Roles and

Mechanisms. Annu. Rev. Microbiol., v.58, p. 303-328, 2004.

GOULDING, C.W.; PERRY, L.J. Protein production in Escherichia coli for structural

studies by X-ray crystallography. J. Struct. Biol., v. 142, p. 133-143, 2003.

101

HALL, T.A .BioEdit 4.8. Raleigh, 1997-2001. 1 arquivo (11,5 Mb); Disponível em:

<http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html> BioEdit: a userfriendly biological

sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.

HASETH, P. L.; UHLENBECK, O. C. Interaction of Escherichia coli host factor protein

with oligoriboadenylates. Biochem., v.19, p. 6138-6146, 1980.

HENGGE-ARONIS, R. Survival of hunger and stress: The role of rpoS in early stationary

phase gene regulation in E. coli. Cell, v. 72, p. 165-168, 1993.

HENGGE-ARONIS, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in

control of the σ

(RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiol. Mol. Biol. Rev., v. 66,

p.373-395, 2002.

HERMANN, H.; FABRIZIO, P.; RAKER, V.A.; FOULAKI, K.; HORNIG, H.; BRAHMS, H.;

LÜHRMAN, R. snRNP Sm proteins share two evolutionarily conserved sequence motifs

which are involved in Sm protein-protein interactions. EMBO J., v. 14, n. 9, p. 2076-

2088, 1995.

ISHIKAWA, J.; HOTTA, K. FramePlot: a new implementation of the frame analysis for

predicting protein-coding regions in bacterial DNA with a high G + C content. FEMS, v.

174, p. 251-253, 1999.

JANCARIK, J.; KIM, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization

of proteins. J. Appl. Cryst., v. 24, p. 409-411, 1991.

JONES, D.T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring

matrices. J. Mol. Biol., v.292, p.195-202, 1999.

KAJITANI, M.; ISHIHAMA, A. Identification and sequence determination of the host

factor gene for bacteriophage Qβ. Nuc. Acids Res., v. 19, p. 1063-1066, 1991.

102

KAJITANI, M.; KATO, A.; WADA, A.; INOKUCHI, Y.; ISHIHAMA, A. Regulation of the

Escherichia coli hfq Gene Encoding the Host Factor for Phage Qβ. J. Bacteriol., v. 176,

p. 531-534, 1994.

KAMINSKI, P.A., DESNOUES, N.; ELMERICH, C. The expression of nifA Azorhizobium

caulinodans requires a gene product homologous to Escherichia coli HF-I, an RNA-

binding protein involved in the replication of phage Qβ RNA. PNAS, USA, 91, p. 4663-

4667, 1994.

KAMINSKI, P.A., ELMERICH, C. The Control of Azorhizobium caulinodans nifA

expression by oxygen, ammonia and by the HF-I-like protein, NrfA. Mol. Microbiol., 28,

p. 603-13, 1998.

KAMBACH, C.; WALKE, S.; YOUNG, R.; AVIS, J. M.; DE LA FORTELLE, E.; RAKER,

V.A.; LÜHRMANN, R.L.; LI, J.; NAGAI, K. Crystal Structures of Two Sm Protein

Complexes and Their Implications for the Assembly of the Spliceosomal snRNPs. Cell,

v. 96, p. 375-387, 1999.

KAWAMOTO, H.; KOIDE, Y.; MORITA, T.; AIBA, H. Base-pairing requirement for RNA

silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol.

Microbl., v. 61, p. 1013-1022, 2006.

KLASSEN, G; PEDROSA, F.O.; SOUZA, E.M.; FUNAYAMA, S.; RIGO, L.U. Effect of

nitrogen compounds on nitrogenase activity in Herbaspirillum seropedicae strain SMR1.

Can. J. Microbiol. , n. 43, p. 841–846, 1997.

KLASSEN, G. ; PEDROSA, F. O. ; SOUZA, E. M. ; YATES, M. G. ; RIGO, L. U. .

Sequencing and functional analysis of the nifENXorf1orf2 gene cluster of Herbaspirillum

seropedicae. FEMS Microbiol. Lett., v. 181, n. 1, p. 165-170, 1999.

103

KLEINER, D.; PAUL, W.; MERRICK. M.J. Construction of multicopy expression vectors

for regulated over-production of proteins in Klebsiella pneumoniae and other enteric

bacteria. J. Gen. Microbiol., v. 134, p. 1779-1784, 1988.

LAEMMLI, U.K. . Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriaphage T4. Nature, n. 227, p. 680-685, 1970.

LEASE, R. A.; SMITH, D.; McDONOUGH, K.; BELFORT, M. The Small Noncoding DsrA

RNA Is an Acid Resistance Regulator in Escherichia coli. Journal of Bacteriol., v. 186,

n. 18, p. 6179-6185, 2004.

LEASE, R. A.; WOODSON, S. A. Cycling of the Sm-like Protein Hfq on the DsrA Small

Regulatory RNA. J. Mol. Biol., n.344, p. 1211-1223, 2004.

LEWIN, B. GenesVII. 7º ed. Oxford: Oxford University Press, 1999.

LEONARD, N. J.; MCDONALD, J. J.; REICHMANN, M. E. Reaction of Diethyl

Pyrocarbonate with Nucleic Acid Components, I. Adenine*. PNAS, USA, v.67, p. 93-98,

1970.

LIVNY, J.; FOGEL, M. A.; DAVIS, B. M.; WALDOR, M. K. sRNAPredict: an integrative

computacional approach to identify sRNAs in bacterial genomes. Nuc. Acids Res., v.

33, p. 4096-4105, 2005.

MACHADO, A.T.; MAGNAVACA, R. Estresse Ambiental: o milho em perspectiva. Rio

de Janeiro: AS-PTA, 47p, 1991.

MACHADO, I.M.P.; YATES, M.G.; MACHADO, H.B.; SOUZA, E.M.; PEDROSA, F.O.

Braz. J. Med. Biol. Res., Ribeirão Preto, v. 29, p. 1599-1602, 1996.

104

MAJDALANI, N.; VANDERPOOL, C. K.; GOTTESMAN, S. Bacterial Small RNA

Regulators. CRBMB, v. 40, p. 93-113, 2005.

MASSE, E; GOTTESMAN, S. A small RNA regulates the expression of genes involved

in iron metabolism in Escherichia coli. PNAS, USA, v. 99, p. 4620-4625, 2002.

MASSE, E; ESCORCIA, F.E.; GOTTESMAN, S. Coupled degradation of a small

regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev., v. 17, p. 2374-

2383, 2003.

McNEALY, T. L.; FORSBACH-BIRK, V.; SHI, C.; MARRE, R.; The Hfq homolog in

Legionella pneumophila demonstrates regulation by LetA and RpoS and interacts with

the global regulator CsrA. J. Bacterol., v. 187, p. 1527-1532, 2005.

MIKULECKY, P.J.; KAW, M.K.; BRESCIA, C.C.; TAKACH, J.C.; SLEDJESKI, D.D.;

FEIG, A.L. Escherichia coli Hfq has distinct interaction surfaces for DsrA, rpoS and

poly(A) RNAs. Nature Struct. Mol. Biol., v. 11, n. 12, p. 1206-1214, 2004.

MOHANTY, B.K.; MAPLES, V.F.; KUSHNER, S.R. The Sm-like protein Hfq regulates

polyadenilation dependent mRNA decay in Escherichia coli. Mol. Microbiol., v. 54, p.

905-920, 2004.

MOLL, I.; AFONYUSHKIN, T.; VYTVYTSKA, O.; KABERDIN, V. R.; BLASI, U.

Coincident Hfq binding and RNase E cleavage sites on mRNA and small regulatory

RNAs. RNA, v. 9, 2003.

MOLLER, T.; FRANCH, T.; HOJRUP, P.; KEENE, D. R.; BACHINGER, H. P.;

BRENNAN, R.G.; VALENTIN-HANSEN, P. Hfq: A bacterial Sm-like protein that

mediates RNA-RNA interation. Mol. Cell., v. 9, p. 23-30, 2002.

105

MONTEIRO, R. A.; SOUZA, E. M.; YATES, M.G.; PEDROSA, F. O.; CHUBATSU, L.S.

Use of lactose to induce expression of soluble NifA protein domains of Herbaspirillum

seropedicae in Escherichia coli. Can. J. Microbiol., n. 46, p. 1-4, 2000.

MONTEIRO, R. A.; SOUZA, E. M.; YATES, M.G.; PEDROSA, F. O.; CHUBATSU, L.S.

Fnr Is Involved in Oxygen Control of Herbaspirillum seropedicae N-Truncated NifA

Protein Activity in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., v. 69, n. 3, p. 1527-1531,

2003.

MORITA, T.; MAKI, K.; AIBA. H. Rnase E-based ribonucleoprotein complexes:

mechanical basis of mRNA destabilization mediated by bacterial noncoding RNAs.

Genes Dev., v. 19, p. 2176-2186, 2005.

MUFFLER, A.; TRAULSEN, D. D.; FISCHER, D.; LANGE, R.; HENGGE-ARONIS, R.

The RNA-binding protein HF-I plays a global regulatory role which is largely, but not

exclusively, due to its role in expression of the σ

subunit of RNA polymerase in

Escherichia coli. J. Bacteriol., v. 179, p. 297-300, 1997.

NAKAO, H.; WATANABE, H.; NAKAYAMA, S.; TAKEDA T. yst gene expression in

Yersinia enterocolitica is positively regulated by a chromosomal region that is highly

homologous to Escherichia coli host factor 1 gene (hfq). Mol Microbiol., V. 18, p. 859-

865, 2005.

NCBI (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION) BLAST.

Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/> Acesso em: agosto de 2006.

NFN (NÚCLEO DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO-UFPR). Disponível em:

<http://nfn.genopar.org/>. Acesso em: 08 ago. 2006.

106

NIELSEN, J.S.; BøGGILD, A.; ANDERSEN, C.B.; NIELSEN, G.; BOYSEN, A.;

BROSERSEN, D.E.; VALENTIN-HANSEN, P. An Hfq-like protein in archaea: Crystal

structure and functional characterization of the Sm protein from Methanococcus

jannaschii. RNA, 2007.

NIKULIN, A.; STOLBOUSHKINA, E.; PEREDERINA, A.; VASSILIEVA, I.; BLAESI, U.;

MOLL, I.; KACHALOVA, G.; YOKOYAMA, S.; VASSYLYEV, D.; GARBER, M.;

NIKONOV, S. Structure of Pseudomonas aeruginosa Hfq protein. Acta Cryst., v. 61, p.

141-146, 2005.

NOBLE, J.A.; INNIS, M.A.; KOONIN, E.V.; RUDD, K.E.; BANUETT, F.; HERSKOWITZ,

I. The Escherichia coli hflA locus encodes a putative GTP-binding

protein and two membrane proteins, one of which contains a protease-like domain.

PNAS, v. 90, p. 10866-10870, 1993.

NOINDORF, L.; REGO, F. G. M.; BAURA, V. A.; MONTEIRO, R. A.; WASSEM, R.;

CRUZ, L. M.; RIGO, L. U.; SOUZA, E. M.; STEFFENS, M. B. R.; PEDROSA, F. O.;

CHUBATSU, L. S. Characterization of the orf1glnKamtB operon of Herbaspirillum

seropedicae. Arch. Microbiol., v. 185, p. 55-62, 2006.

NONAKA, G.; BLANKSCHIEN, M.; HERMAN, C.; GROSS, RHODIUS, V.A. Regulon

and promoter analysis of the E. coli heat-shock factor, σ

, reveals a multifaceted

cellular response to heat stress. Genes Dev., n. 20, p. 1776-1789, 2006.

OLIVARES, F.L.; JAMES, E.K.; BALDANI, J.I.; DÖBEREINER, J. Infection of mottled

strip disease-susceptible and resistent sugar cane varieties by the endophytic

diazotroph Herbaspirillum. New Phytol., Cambridge, v. 135, p. 723-737, 1997.

ORTÍN, J.; PARRA, F. Structure and Function of RNA Replication. Annu. Rev.

Microbiol. v. 60, p. 305-326, 2006

107

PACE, C.N.; VAJDOS, F.; FEE, L.; GRIMSLEY, G.; GRAY, T. How to mensure and

predict the molar absortion coefficient of a protein. Protein Science, v. 4, p. 2411-2423,

1995.

PEDROSA, F.O.; BENELLI, E.M.; YATES, M.G.; WASSEM, R.; MONTEIRO, R.A.;

KLASSEN, G.; STEFFENS, M.B.R.; SOUZA, E.M.; CHUBATSU, L.S.; RIGO, L.U.

Recent developments in the structural organization and regulation of nitrogen fixation

genes in Herbaspirillum seropedicae. J. Biothecnol., v. 91, p. 189-195, 2001.

ProteinProspector. Disponível em: <http://prospector.ucsf.edu/> Acesso em: agosto de

2006.

Psipred. Disponível em: http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ Acesso em: março de 2007.

RASMUSSEN, A. A.; ERIKSEN, M.; GILANY, K.; UDESEN, C.; FRANCH, T.;

PETERSEN, C.; VALENTIN-HANSEN, P. Regulation of OmpA mRNA stability: The role

of small regulatory RNA in growth phase-dependent control. Mol. Microbiol., v. 58, p.

1421-1429, 2005.

REGO, F. G. M.; CHUBATSU, L. S.; PEDROSA, F. O.; YATES, M. G. ; WASSEM, R.;

STEFFENS, M. B. R.; RIGO, L.; SOUZA, E. M.. The expression of nifB gene from

Herbaspirillum seropedicae is dependent upon the NifA and RpoN proteins. Can. J.

Microbiol., 2006.

REPOILA, F.; MAJDALANI, N.; GOTTESMAN, S. Small non-coding RNAs, co-

ordinators of adaptation processes in Escherichia coli: the RpoS paradigm. Mol.

Microbiol., 48, 855-861, 2003.

ROBERTSON, G.T.; ROOP, R.M. J. The Brucella abortus host factor I (HF-I) protein

contributes to stress resistance during stationary phase and is a major determinant of

virulence in mice. Mol Microbiol., v. 34, p. 690-700, 1999.

108

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular cloning a laboratory

manual. 2 ed. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1989.

SANGER, F.; NICKLEN, S.; COULSON, A. R. DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors. PNAS, USA 74, 5463-5467,1977.

SANTOS, P.C.; SMITH, A.D.; FRAZZON, J.; CASH, V.L.; JOHNSON, M.K.; DEAN, D.R.

Iron-Sulfur Cluster Assembly. NifU-DIRECTED ACTIVATION OF THE NITROGENASE

Fe PROTEIN. J. Biol. Chem., v. 279, p. 19705-19711, 2004.

SAUTER, C.; BASQUIN, J.; SUCK, D. Sm-like proteins in Eubacteria: the crystal

structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucl. Acids Res., v. 31, p. 4091-4098,

2003.

SCHAGGER, H.; von JAGOW, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel

electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal.

Biochem., v. 166, p. 368-379, 1987.

SCHEIBE, M.; BONIN, S.; HAJNSDORF, E.; BETAT, H.; MÖRL, M. Hfq stimulates the

activity of the CCA-adding enzime. BMC, v. 8, p. 1-7, 2007.

SCHUMACHER, M. A.; PEARSON, R. F.; MOLLER, T.; VALENTIN-HANSEN, P.;

BRENNAN, R. G. Structures of the pleiotropic translational regulator Hfq and na Hfq-

RNA complex: a bacterial Sm-like protein. EMBO J., v. 21, p. 3546-3556, 2002.

SIMPSON, F.B.; BURRIS, R.H. A nitrogen pressure of 50 atmospheres does not prevent

evolution of hydrogen by nitrogenase. Science, v. 224, p. 1095-1096, 1984.

109

SONNLEITNER, E.; HAGENS, S.; ROSENAU, F.; WILHELM, S.; HABEL, A.; JÄGER,

K.; BLÄSI, U. Reduced virulence of a hfq mutant of Pseudomonas aeruginosa O1.

Microb. Pathog., v. 35, p. 217-228, 2003.

SONNLEITNER, E.; NAPETSCHNIG, J.; AFONYUSHKIN, T.; ECKER, K.; VECEREK,

B.; MOLL, I.; KABERDIN, V.R. BLÄSI, U. Functional effects of variants of the RNA

chaperone Hfq. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 323, p. 1017-1023, 2004.

SOUZA, E. M.; FUNAYAMA, S.; RIGO L. U.; PEDROSA, F. O. Cloning and

characterization of the nifA gene from Herbaspirillum seropedicae strain Z78. Can. J.

Microbiol., v.37, p. 425-429, 1991a.

SOUZA, E. M.; FUNAYAMA, S.; RIGO, L. U.; YATES, M. G.; PEDROSA, F. O.

Sequence and structural organization of a nifA-like gene and part of a nifB gen from

Herbaspirillum seropedicae strain Z18. J. Gen. Microbiol., v.137, p. 1511-1522, 1991b.

SOUZA, E.M.; PEDROSA, F.O.; RIGO, L.U.; MACHADO, H.B.; YATES, M.G.

Expression of the nifA gene of Herbaspirillum seropedicae: role of NtrC and NifA binding

sites and of the –24/-12 promoter element. Microbiol. v. 146, p. 1407-1418, 2000.

STORZ, G.; OPDYKE, J.A.; ZHANG, A. Controlling mRNA stability and translation with

small, noncoding RNAs. Curr Opin Microbiol, 7, p. 140-144, 2004.

STRING. Disponível em: <http://string.embl.de/> Acesso em: dezembro de 2007.

SUKHODOLETS, M.V.; GARGES, S. Interaction of Escherichia coli RNA Polymerase

with the Ribosomal Protein S1 and Sm-like ATPase Hfq. Biochem., v. 42, p. 8022-8034,

2003.

SUN, X.; ZHULIN, I.; WARTELL, R.M. Predicted structure and phyletic distribution of the

RNA-binding protein Hfq. Nucl. Acids Res., v. 30, n. 17, p. 3662-3671, 2002.

110

SUN, X.; WARTELL,R.M. Escherichia coli Hfq Binds A18 and DsrA Domain II with

Similar 2:1 Hfq6/RNA Stoichiometry Using Different Surface Sites. Biochemistry, v. 45,

p.4875-4887, 2006.

TABOR, S.; RICHARDSON, C.C. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter

system for controlled exclusive expression of specific genes. PNAS, USA, v. 82, p.

1074-1078, 1985.

THOMPSON, J. D.; HIGGINS, D. G.; GIBSON, T. J. Clustal W: improving the sensivity

of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-

specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl. Acids Res., v. 22, p. 4673-4680,

1994.

TSUI, H. C.; LEUNG, H. C. E.; WINKLER, M. E. Characterization of broadly pleiotrophic

phenotypes caused by an Hfq insertion mutation in Escherichia coli K-12. Mol.

Microbiol., v. 13, p. 35-49, 1994.

TSUI, H. C.; FENG, G.; WINKLER, M. E. Transcription of the mutL repair, miaA tRNA

modification, hfq pleiotrophic regulator, and hflA region protease genes of Escherichia

coli K-12 from clustered σ32-specific promoters during heat shock. J. Bacteriol., v. 178,

p. 5719-5931, 1996.

TSUI, H. C.; FENG, G.; WINKLER, M. E. Negative regulation of mutS and mutH repair

gene expression by the Hfq and RpoS global regulators of Escherichia coli K-12. J.

Bacteriol., v. 179, p. 7476-7487, 1997.

WASSARMAN, K. M. Small RNAs in bacteria: diverse regulators of gene expression in

response to environmental changes. Cell, v. 109, p. 141-144, 2002.

111

WESTERMEIER, R.; NAVEN, T. Part III: Course Manual, Step 9: In-gel digestion. In:

WESTERMEIER, R; NAVEN, T. (Ed.). Proteomics in Practice. A laboratory Manual

of Proteome Analysis. Wiley-VCH, p.261, 2004.

WILL, C. L.; LÜHRMANN, R. Spliceosomal UsnRNP biogenesis, structure and function.

Curr. Opin. Cell. Biol., v. 13, p. 290-301, 2001.

WILSON, J.W.; OTT, C.M.; BENTRUP, K.H.; RAMAMURTHY, R.; QUICK, L.;

PORWOLLIK, S.; CHENG, P.; MCCLELLAND, M.; TSAPRAILIS, G.; RADABAUGH, T.;

HUNT, A.; FERNANDEZ, D.; RICHTER, E.; SHAH, M.; KILCOYNE, M.; JOSHI, L.;

NELMAN-GONZALES, M.; HING, S.; PARRA, M.; DUMARS, P.; NORWOOD, K.;

BOBER,R.; DEVICH, J.; RUGGLES, A.; GOULART, C.; RUPERT, M.; STODIECK, L.;

STAFFORD, P.; CATELLA, L.; SCHURR, M.J.; BUCHANAN, K.; MORICI, L.;

MCCRACKEN, J.; ALLEN, P.; BAKER-COLEMAN, C.; HAMMOND, T.; VOGEL, J.;

NELSON, R.; PIERSON, D.L.; STEFANYCHYN-PIPER, H.M.; NICKERSON, C.A.

Space flight alters bacterial gene expression and virulence and reveals a role for global

regulator Hfq. PNAS, v. 104, n. 41, 2007.

WILUSZ, C.J.; WILUSZ, J. Eukaryotic Lsm proteins: lessons from bacteria. Nat. Struct.

Mol. Biol., v. 12, n. 12, p. 1031-1036, 2005.

VASSILIEVA, I. M.; ROUZANOV, M. V.; ZELINSKAYA, N. V.; MOLL, I.; BLÄSI, U.;

GARBER, M. B. Cloning, Purification, and Crystallization of a Bacterial Gene Expression

Regulator – Hfq Protein from Escherichia coli. Biochem., v. 67, p. 1293-1297, 2002.

VECEREK, B.; MOLL, I.; BLASI, U. Translational autocontrol of the Escherichia coli hfq

RNA chaperone gene. RNA J., 11, p. 976-984, 2006.

VECEREK, B.; RAJKOWITSCH, L.; SONNLEITNER, E.; SCHROEDER, R.; BLÄSI, U.

The C-terminal domain of Escherichia coli Hfq is required for regulation. Nucl. Acids

Res., p. 1-11, 2007.

112

VOGEL, J.; SHARMA, C. M. How to find non-coding RNAs in bacteria. Biol. Chem., v.

386, p. 1219-1238, 2005.

VOIGT, E. L. (2000) Identificação e análise estrutural de genes a montante do gene nifA

em Herbaspirillum seropedicae. Tese de Mestrado. Departamento de Bioquímica,

Universidade Federal do Paraná, Brasil, 74p.

ZHANG, A.; WASSARMAN, K. M.; ORTEGA, J.; STEVEN, A. C.; STORZ, G. The Sm-

like Hfq protein increases OxyS RNA interaction with target mRNAs. Mol. Cell, v. 9, p.

1-20, 2002.

ZHANG, A.; WASSARMAN, K. M.; ROSENOW, C.; TJADEN, B. C.; STORZ, G.;

GOTTESMAN, S. Global analysis of small RNA and mRNA targets of Hfq. Molec.

Microbiol., v. 50, 2003.

ZUKER, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucl.

Acids Res., v. 31, n. 13, p. 3406-3415, 2003

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