( PDF ) Caracterização estrutral de alguns polissacarídeos presentes na basidioma de Pleurotus pulmonarius e aplicações

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FHERNANDA RIBEIRO SMIDERLE

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE ALGUNS POLISSACARÍDEOS

PRESENTES NO BASIDIOMA DE Pleurotus pulmonarius E APLICAÇÕES

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

graduação em Ciências (Bioquímica) do

Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular, do Setor de Ciências

Biológicas, da Universidade Federal do

Paraná, como requisito parcial para a

obtenção do título de Mestre em

Bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. Marcello Iacomini

Co-orientador: Dra. Elaine R. Carbonero

CURITIBA

2008

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FHERNANDA RIBEIRO SMIDERLE

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE ALGUNS POLISSACARÍDEOS

PRESENTES NO BASIDIOMA DE Pleurotus pulmonarius E APLICAÇÕES

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

graduação em Ciências (Bioquímica) do

Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular, do Setor de Ciências

Biológicas, da Universidade Federal do

Paraná, como requisito parcial para a

obtenção do título de Mestre em

Bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. Marcello Iacomini

Co-orientador: Dra. Elaine R. Carbonero

CURITIBA

2008

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Aos meus pais Iry e Elma.

Ao meu irmão Filipe.

Pelo carinho, apoio e compreensão.

Mas, principalmente, por estarem

presentes na minha vida,

Como uma família da qual eu me

orgulho de fazer parte!

Amo muito vocês!

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a todos que participaram, de alguma forma, da

elaboração deste trabalho, em especial:

A Deus, por estar sempre ao meu lado e por permitir que esse sonho se

realizasse;

Aos meus pais, por me proporcionarem a oportunidade de me dedicar

aos estudos e também por sempre torcerem por minhas vitórias;

Aos meus orientadores, Prof. Dr. Marcello Iacomini e Dra. Elaine R.

Carbonero, pela orientação, pelos ensinamentos, dedicação, correções e pelas

cobranças que me fizeram ser uma pesquisadora mais dedicada e esforçada;

Aos professores Dr. Guilherme L. Sassaki e Dr. Philip A. J. Gorin pelas

conversas (científicas e descontraídas!), pelos ensinamentos e sugestões;

À aluna de iniciação científica, Lorena, por aceitar fazer um trabalho em

conjunto, pela dedicação, esforço, por estar sempre atenta aos nossos

ensinamentos e pelas conversas amigas;

Ao Filipe e Isabele, querido irmão e cunhada preferida e única, pelas

palavras amigas, sempre me incentivando e não me deixando desistir;

Ao Leonardo, meu namorado, pelo amor, companheirismo, pelas longas

conversas de incentivo e por tentar entender a bioquímica para poder

acompanhar meu raciocínio e minhas explicações;

Às amigas Ana Helena, Andréa, Dirce, Fernanda Simas e Caroline

Mellinger, grandes companheiras nos congressos, nos momentos alegres e

também nos momentos de desespero!;

Ao amigo Ricardo Wagner, pela disposição em me ajudar sempre que

precisei, pelos ensinamentos, pelo carinho, pelo bom humor e pelos abraços

apertados e reconfortantes;

A todos os meus amigos do laboratório E1, 247, 252 e laboratórios

anexos, pela amizade, pelos churrascos animados, pelas brincadeiras e

palavras de conforto;

A minha turma de mestrado, da qual sempre lembrarei com carinho de

todos os momentos bons e momentos difíceis que passamos;

Aos amigos Larissa Comarella, Lúcia Cristina e João Francisco Bento,

pela amizade sincera e pelas rápidas conversas no corredor, mas que sempre

me traziam alegrias;

Ao produtor de cogumelos Renato A. Yamasita, por ceder o material de

estudo;

Ao Prof. Adair R. S. dos Santos da UFSC e seus alunos, pelos ensaios

biológicos e pela prontidão para solucionar minhas dúvidas;

À Profa. Dra. Patrícia Stuelp Campelo, por me abrir as portas para

trabalhar com a pesquisa no laboratório de Carboidratos;

Ao Dr. Fábio R. Rosado, pelos ensinamentos sobre cultivo de cogumelos

(mesmo que eu não tenha conseguido cultivá-los!)

À Dra. Elaine R. Carbonero, Dr. Guilherme L. Sassaki e Dr. Miguel D.

Noseda, pelas análises de RMN;

À Rosane, Lauro e Andréia, pelas análises de GC-MS e GPC;

Aos coordenadores do curso de Pós-Graduação em Bioquímica e

Biologia Molecular e funcionários do Departamento;

A CAPES e Fundação Araucária, pelo apoio financeiro;

E a todos que me ajudaram de alguma forma, para que esta caminhada

chegasse ao seu destino. Obrigada!

A coisa mais importante neste mundo,

Não é onde nós nos encontramos,

Mas em que direção caminhamos.

Goethe

RESUMO

O presente trabalho teve por objetivo elucidar a estrutura química de alguns

polissacarídeos presentes no basidioma de Pleurotus pulmonarius, bem como

verificar os efeitos antinociceptivos e antiinflamatórios de uma manogalactana

isolada e, analisar alguns parâmetros nutricionais. O corpo de frutificação do

basidiomiceto seco, moído e deslipidificado foi submetido a extrações aquosas

(a frio e a quente) e alcalina (KOH 1%). Os extratos aquosos foram

primeiramente submetidos à precipitação com etanol, enquanto o extrato

alcalino foi submetido a adição de ácido acético até pH 5,0. Os extratos

polissacarídicos obtidos foram submetidos aos processos de purificação por

congelamento e degelo, precipitação com solução de Fehling, ultrafiltração e

diálise por membranas de diferentes porosidades, de maneira sequencial. A

partir destes processos foram purificadas e caracterizadas diferentes

estruturas. A fração MG obtida pela extração aquosa a frio apresentou-se pura

e composta por manose, galactose e O-metil-galactose. Análises

espectroscópicas e de metilação sugerem que essa molécula apresenta cadeia

principal constituída de 3-O-Me-α-

-Galp e α-

-Galp ligadas (1→6), sendo que

ambas as unidades podem estar substituídas em O-2 por terminais não

redutores de β-

-Manp. Esse polissacarídeo apresentou um efeito analgésico,

porém não demonstrou atividade antiinflamatória, quando avaliado em teste de

contração muscular induzida por ácido acético em camundongos. A fração

PHW obtida pela extração aquosa a quente, após tratamento com NaOH

apresentou glucose como principal componente monossacarídico. Os

espectros de RMN-

C e HMQC dessa fração apresentaram sinais

característicos de uma β-glucana-(1→3), substituída em O-6 por β-Glcp,

semelhante à lentinana. O extrato alcalino obtido foi tratado com solução de

Fehling, originando uma fração sobrenadante (SF-GLC) e uma fração

precipitada (PF-GLC) neste reagente. Ambas apresentaram espectros de

RMN-

C semelhantes e característicos de β-glucanas. Entretanto, a análise de

metilação mostrou que SF-GLC é composta por alto teor de ligações (1→3) e

(1→6), enquanto PF-GLC é composta principalmente por ligações (1→6). A

análise dos parâmetros nutricionais desse cogumelo mostrou que este é rico

em proteínas e aminoácidos essenciais apresentando baixos teores de lipídios.

Além disso, é uma boa fonte de minerais apresentando cálcio, magnésio,

cobre, zinco e manganês em sua composição.

Palavras-chave: Pleurotus pulmonarius, manogalactana, β-glucana e atividade

antinociceptiva.

ABSTRACT

The present object work is an elucidation of chemical structures of some

polysaccharides extracted from the fruiting bodies of Pleurotus pulmonarius,

besides their biological applications and nutritional value. The dried and milled

basidiomycete was submitted to aqueous extraction (cold and hot), and alkaline

extraction (1% KOH). The aqueous extracts were firstly submitted to ethanol

precipitation, and the alkaline extract was neutralized with acetic acid. The

resulting polysaccharide extracts were submitted successively to a freeze-

thawing process, precipitation with Fehling solution, ultrafiltration and dialysis

with membranes of different M

cut-offs. After these processes different

polysaccharides were characterized. Fraction MG, obtained from the cold water

extraction, was homogeneous and was composed of mannose, galactose and

O-methyl-galactose. Spectroscopic and methylation analysis suggest that this

molecule has a main chain composed of 3-O-Me-α-

-Galp e α-

-Galp (1→6)-

linked units, with both substituted at O-2 by β-

-Manp non-reducing end units.

This polysaccharide presented an analgesic effect, independently of an

inflammatory response, when analyzed by a test of abdominal constriction

induced by acetic acid in mice. Fraction PHW obtained via hot water extraction,

after treatment with NaOH, had glucose as its principal monosaccharide

component. The

C-NMR and HMQC spectra of this fraction contained signals

characteristic of a (1→3)-linked-β-glucan, substituted at O-6 by β-Glcp, similar

to lentinan. The alkaline extract was treated with Fehling solution giving rise to a

soluble (SF-GLC) and precipitated fraction (PF-GLC). Both fractions had similar

C-NMR spectra and they were characteristic of β-glucans. Although

methylation data showed that SF-GLC was composed of a high proportion of

(1→3) and (1→6) linkages, and PF-GLC was composed mostly of (1→6)

linkages. Analysis of the nutritional value of this mushroom showed that it is rich

in protein and essential amino acids, besides containing lower levels of lipids. In

addition, it is a good source of minerals such as calcium, magnesium, copper,

zinc and manganese.

Keywords: Pleurotus pulmonarius, mannogalactan, β-glucan and

antinociceptive effect.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Desenho esquemático das principais estruturas dos

cogumelos.......................................................................................

FIGURA 2 - Esquema do ciclo de vida dos basidiomicetos............................... 13

FIGURA 3 -

Esquema da estrutura da glucana isolada de Lentinus edodes

denominada lentinana.....................................................................

FIGURA 4 -

Esquema da estrutura de uma glucana isolada de Agaricus

brasiliensis (= Agaricus blazei).......................................................

FIGURA 5 -

Esquema da estrutura de uma fucoxilomanana isolada de Fomes

annosus e Polyporus pinicola.........................................................

FIGURA 6 - Esquema de fragmentos de manofucogalactanas extraídas de

basidiomicetos................................................................................

FIGURA 7 -

Fotos do basidioma de Pleurotus pulmonarius...............................

FIGURA 8 - Esquema geral das extrações do basidioma liofilizado de

Pleurotus pulmonarius....................................................................

FIGURA 9 - Esquema geral das etapas de purificação por congelamento e

degelo dos extratos obtidos de Pleurotus pulmonarius..................

FIGURA 10 - Perfil de eluição das frações PF-SCW e MG (solubilizadas em

nitrito de sódio 0,1 mol/l, contendo azida sódica) obtido por

HPSEC-MALLS...............................................................................

FIGURA 11 - Espectro de RMN-

C (A) da fração MG e RMN-

C (B) da fração

MG após hidrólise parcial com H

(em D

O a 70 ºC) obtida

de P. pulmonarius...........................................................................

FIGURA 12 - Região anomérica dos espectros de RMN-

H (A) e HSQC (B) da

fração MG (em D

O a 70 ºC) obtida de P. pulmonarius.................

FIGURA 13 - Esquema Representativo da degradação de Smith (modificada)

realizada na amostra MG................................................................

FIGURA 14 - Derivados obtidos da degradação de Smith (modificada)

realizada na amostra MG................................................................

FIGURA 15 -

Espectro de RMN-

C da fração S-PHW (em Me

SO-d

a 70 ºC)

obtida de P. pulmonarius................................................................

FIGURA 16 - Espectro de HMQC da fração S-PHW (em D

O a 70 ºC) obtida

de P. pulmonarius...........................................................................

FIGURA 17 -

Estrutura da glucana obtida de P. pulmonarius..............................

FIGURA 18 - Perfil de eluição das frações SF-SK1, 30SF-SK1 e SF-GLC

(solubilizadas em nitrito de sódio 0,1 mol/l, contendo azida

sódica) obtido por HPSEC-MALLS.................................................

FIGURA 19 - Espectro de RMN-

C das frações SF-GLC (A) e PF-GLC (B)

(em D

O a 70 ºC) obtidas do basidioma de P. pulmonarius, após

extração alcalina.............................................................................

FIGURA 20 - Espectro de HMQC da fração SF-GLC (em D

O a 70 ºC) obtida

do basidioma de P. pulmonarius, após extração alcalina...............

FIGURA 21 - Efeito pela administração i.p. de MG (3-100 mg/kg) em contração

abdominal induzida por ácido acético (A), infiltração de leucócitos

(B) e extravasamento de Evans Blue (C) em camundongos..........

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 -

Estruturas de homopolissacarídeos extraídos do corpo de

frutificação de basidiomicetos..........................................................

TABELA 2 - Estruturas de heteropolissacarídeos extraídos do corpo de

frutificação de basidiomicetos..........................................................

TABELA 3 - Dados técnicos para análise de elementos minerais em

equipamento de absorção atômica..................................................

TABELA 4 -

Relação dos rendimentos das frações obtidas do basidioma de P.

pulmonarius.....................................................................................

TABELA 5 - Análise de metilação das frações MG e SM-MG obtidas do

basidioma de P. pulmonarius..........................................................

TABELA 6 - Análise da composição monossacarídica das frações bruta (SF-

SK1) e após ultrafiltrações...............................................................

TABELA 7 - Análise de metilação das frações SF-GLC e PF-GLC obtidas do

basidioma de P. pulmonarius, após extração alcalina.....................

TABELA 8 - Estruturas de diferentes glucanas isoladas de basidiomicetos....... 52

TABELA 9 -

Análise dos parâmetros nutricionais de P. pulmonarius..................

TABELA 10 -

Análise do conteúdo de minerais presentes em P. pulmonarius.....

TABELA 11 -

Análise do conteúdo de aminoácidos presentes em P.

pulmonarius.....................................................................................

LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E SIGLAS

α - Alfa

β - Beta

µl - Microlitro

~ - Aproximadamente

C - Carbono treze

3-O-MeGal - 3-O-metil-galactose

O - Anidrido acético

AcOH - Ácido acético

I - Iodeto de metila

CHCl

- Clorofórmio

cm - Centímetro

CuSO

- Sulfato de cobre

O - Óxido de deutério

DEPT - Distiortionless enhancement by polarization transfer

DMS - Dimetilsulfato

Fuc - Fucose

g - Grama

Gal - Galactose

GC-MS - Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de

massa

Glc - Glucose

h - Hora

HCl - Ácido clorídrico

HMQC - Heteronuclear multiple quantum correlation spectroscopy

O - Água

HSQC - Heteronuclear single quantum coherence

- Ácido sulfúrico

HPSEC-MALLS - Cromatografia de exclusão estérica acoplada à detecção

por índice de refração e espalhamento de luz

Hz - Hertz

i.p. - Intraperitoneal

IR - Índice de refração

J - Constante de acoplamento

kDa - Quilodaltons

kg - Quilograma

KOH - Hidróxido de potássio

M - Molar

Man - Manose

Me - Metil

SO-d

- Dimetilsulfóxido deuterado

MeOH - Metanol

mg - Miligrama

min - Minuto

ml - Mililitros

mm - Milímetros

NaBH

- Borohidreto de sódio

NaB

- Borohidreto de sódio deuterado

NaIO

- Periodato de sódio

NaN

- Azida de sódio

NaNO

- Nitrito de sódio

NaOH - Hidróxido de sódio

nm - Nanômetro

p - Piranose

p/v - Peso/volume

pH - Potencial hidrogeniônico

ppm - Partes por milhão

RMN - Ressonância Magnética Nuclear

r.p.m. - Rotações por minuto

s.c. - Sub-cutânea

TFA - Ácido trifluoracético

v/v - Volume/volume

Xyl - Xilose

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................11

1.1 REINO FUNGI.......................................................................................................11

1.1.2 BASIDIOMICETOS E SUAS CARACTERÍSTICAS............................................11

1.2 IMPORTÂNCIA COMERCIAL E ALIMENTAR DOS BASIDIOMICETOS..............14

1.3 GÊNERO PLEUROTUS........................................................................................15

1.4 POLISSACARÍDEOS DE BASIDIOMICETOS.......................................................16

1.4.1 Homopolissacarídeos.........................................................................................16

1.4.2 Heteropolissacarídeos........................................................................................19

1.4.3 Polissacarídeos de Basidiomicetos com Atividade Biológica.............................21

1.4.3.1 Atividade Antiinflamatória................................................................................23

1.4.3.2 Atividade Antinociceptiva.................................................................................24

2 OBJETIVOS............................................................................................................24

2.1 OBJETIVO GERAL ...............................................................................................24

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................25

3 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................25

3.1 BASIDIOMICETO..................................................................................................25

3.2 PROCEDIMENTOS GERAIS DE EXTRAÇÃO......................................................26

3.2.1 Extração com Clorofórmio-Metanol....................................................................26

3.2.2 Extração Aquosa à Temperatura Ambiente........................................................26

3.2.3 Extração Aquosa a Quente ................................................................................27

3.2.4 Extração Alcalina................................................................................................27

3.3 PURIFICAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS..........................................................27

3.3.1 Separação dos Polissacarídeos por Congelamento e Degelo ...........................27

3.3.2 Purificação por Precipitação com Solução de Fehling .......................................28

3.3.3 Purificação dos Polissacarídeos por Ultrafiltração ou Diálise.............................28

3.4 ANÁLISE ESTRUTURAL DOS POLISSACARÍDEOS...........................................29

3.4.1 Hidrólise Ácida Total...........................................................................................29

3.4.2 Redução e Acetilação dos Produtos de Hidrólise...............................................29

3.4.3 Análise de Metilação dos Polissacarídeos .........................................................29

3.4.4 Degradação Controlada de Smith......................................................................30

3.4.5 Hidrólise Ácida Parcial do Heteropolissacarídeo................................................31

3.5 MÉTODOS ANALÍTICOS......................................................................................31

3.5.1 Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massa (GC-MS)............31

3.5.2 Determinação da Homogeneidade por Cromatografia de Exclusão

Estérica Acoplada à Detecção por Índice de Refração e Espalhamento de Luz

(HPSEC-MALLS) ........................................................................................................31

3.5.3 Ressonância Magnética Nuclear........................................................................32

3.6 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS NUTRICIONAIS.............................................32

3.6.1 Análise de Aminoácidos.....................................................................................32

3.6.2 Determinação de Cinzas....................................................................................33

3.6.3 Análise dos Elementos Minerais ........................................................................33

3.6.4 Determinação das Proteínas..............................................................................34

3.6.5 Determinação de Lipídeos..................................................................................34

3.6.6 Determinação dos Carboidratos Totais..............................................................34

3.7 ENSAIOS BIOLÓGICOS: ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E

ANTIINFLAMATÓRIA in vivo.......................................................................................35

3.7.1 Animais...............................................................................................................35

3.7.2 Constrição Abdominal, Permeabilidade Capilar Peritoneal e Infiltração de

Leucócitos Causada por Injeção de Solução de Ácido Acético 0,6%..........................35

3.7.3 Análises Estatísticas ..........................................................................................36

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................37

4.1 EXTRATO AQUOSO À TEMPERATURA AMBIENTE..........................................39

4.2 EXTRATO AQUOSO A QUENTE .........................................................................46

4.3 EXTRATO ALCALINO...........................................................................................48

4.4 PARÂMETROS NUTRICIONAIS...........................................................................53

4.5 ENSAIO BIOLÓGICO DA MANOGALACTANA ISOLADA DE P.

pulmonarius.................................................................................................................56

5 CONCLUSÕES.......................................................................................................58

REFERÊNCIAS...........................................................................................................59

1 INTRODUÇÃO

1.1 REINO FUNGI

O reino dos fungos é um grupo bastante heterogêneo, sendo que os seus

representantes são encontrados em todos os ambientes. Eles são conhecidos

popularmente como bolores, mofos, cogumelos comestíveis e alucinógenos. São

seres eucarióticos, podendo apresentar-se sob a forma levuriforme, formar um

pseudomicélio ou constituir hifas, formando um micélio verdadeiro (ESPOSITO;

AZEVEDO, 2004).

Os fungos são os agentes mais importantes de degradação na Terra, visto

que degradam celulose e lignina com alta eficiência. A produção de biomassa em

um ecossistema florestal é, em grande parte, controlada por esses decompositores,

que determinam a taxa de nutrientes liberados e devolvidos para o meio

(ESPOSITO; AZEVEDO, 2004).

Esse reino é dividido em grupos menores, sendo que o filo Basidiomycota

agrupa os seus representantes mais desenvolvidos.

1.1.2 Basidiomicetos e suas Características

Os fungos pertencentes ao filo Basidiomycota, comumente conhecidos como

basidiomicetos, constituem um grupo bastante diverso, sendo os cogumelos e

orelhas-de-pau, as formas mais conhecidas. Eles apresentam, em sua maioria, uma

frutificação macroscópica, constituída por hifas modificadas que formam

pseudotecidos, os quais se diferenciam em píleo, estipe, lamelas, anel e volva

(Figura 1) (PUTZKE; PUTZKE, 1998).

Figura 1 – Desenho esquemático das principais estruturas dos cogumelos

O pseudotecido desses seres vivos é conhecido como micélio, o qual consiste

de hifas septadas, bem desenvolvidas e microscópicas, mas que podem ser

facilmente observadas quando formam a massa micelial. Há três tipos de micélio:

primário, secundário e terciário. O primeiro caracteriza-se pela germinação dos

esporos, formando hifas haplóides (Figura 2). O crescimento e encontro dessas hifas

geram uma hifa com dois núcleos separados, caracterizando o micélio secundário.

Inicia-se então um crescimento ordenado para formação do sistema reprodutor,

basidiocarpo, o qual ainda apresenta estruturas estéreis. Neste estágio, o micélio, já

denominado terciário, inicia a formação de basídios, onde ocorre a cariogamia,

formando um único núcleo diplóide. Este núcleo sofre meiose gerando 4 núcleos

haplóides, os quais migram até o ápice de estruturas conhecidas como esterigmas

para formar os esporos e recomeçar o ciclo (PUTZKE; PUTZKE, 1998).

Figura 2 – Esquema do ciclo de vida dos basidiomicetos

FONTE:http://biosonialopes.editorasaraiva.com.br/navitacontent_/userFiles/File/SoniaLopes_

Powerpoints/Fungos.pps#261,6,Slide 6, acessado em: 12/12/2007.

O número de espécies de cogumelos existentes, deduzido pelo Dictionary of

the Fungi, totaliza pelo menos 14.000, sendo que esse valor pode ser superior

considerando que muitas espécies ainda não foram descritas. Além disso,

espécimes semelhantes morfologicamente estão reunidos em um mesmo grupo,

quando deveriam estar classificados como espécies biológicas diferentes. Estudos

de compatibilidade e seqüências moleculares entre esses fungos mostram que uma

única “espécie” pode agrupar 20 espécies distintas (WASSER, 2002). A partir

desses estudos, estima-se que existam 140.000 espécies de cogumelos no mundo,

das quais apenas 10% foram classificadas. Em relação a esse percentual, cerca de

2.000 espécies são comestíveis e 700 são conhecidas por possuírem significativas

propriedades farmacológicas, tais como atividade antitumoral, antiinflamatória,

antiviral, ativadora do sistema imune, entre outras (WASSER; WEIS, 1999). Esses

dados apontam o potencial apresentado pelos basidiomicetos tanto para fins

alimentícios quanto terapêuticos, sendo que ainda há um vasto campo a ser

estudado.

1.2 IMPORTÂNCIA COMERCIAL E ALIMENTAR DOS BASIDIOMICETOS

A importância atribuída a esse grupo está relacionada à utilização de seus

representantes na alimentação e medicina popular desde tempos remotos

(ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996; WASSER, 2002). No entanto, alguns

espécimes são considerados venenosos, fator que impediu, por vários anos, o

consumo de cogumelos em geral por populações com menor conhecimento sobre

fungos comestíveis (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996).

A familiarização com o consumo de basidiomicetos tornou-se evidente

quando se iniciou o cultivo de espécies como Lentinus edodes (= Lentinula edodes)

e Volvariella volvacea na China. Desde então, houve um crescimento no consumo

dessas iguarias e, consequentemente iniciou-se a produção comercial de algumas

espécies em países da Europa e nos Estados Unidos (ANKE, 1997). Japão, Taiwan

e Coréia são grandes produtores de cogumelos, entretanto, a China lidera a

produção, exportação e consumo desde 1978. As espécies mais cultivadas são:

Agaricus bisporus (Champignon), Lentinus edodes (Shiitake), Pleurotus spp.

(Shimeji), Auricularia spp., Tremella spp. e Flammulina velutipes (Enoki)

(CHANG, 2005). A espécie mais produzida nos Estados Unidos, Austrália e em

alguns países da Europa e Ásia é o Agaricus bisporus (ANKE, 1997), possuindo a

tecnologia de cultivo mais avançada, que mantém locais com temperatura, umidade

e ventilação controlados (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996). O Agaricus

brasiliensis (= Agaricus blazei), popularmente conhecido como cogumelo-do-sol, é

nativo do Brasil e foi exportado para o Japão pela primeira vez em 1965. Desde

então, esse basidiomiceto tem sido cultivado em larga escala neste país e na

Indonésia (MIZUNO et al., 1990a).

Estudos têm comprovado que o valor nutritivo dos cogumelos, apesar da

variabilidade apresentada entre as espécies estudadas, é considerado de qualidade

para uma dieta balanceada (MANZI et al., 1999). Altos teores de proteínas e fibras,

em conjunto com baixas taxas de lipídios tornam os cogumelos alimentos saudáveis,

podendo ser consumidos mesmo em dietas restritas, como para obesos ou pessoas

com hipercolesterolemia. Além disso, a presença de altos teores de potássio,

juntamente com baixos níveis de sódio, torna esses alimentos apropriados para

pessoas com hipertensão (MANZI et al., 1999; AGRAHAR-MURUGKAR;

SUBBULAKSHMI, 2005). Cálcio, ferro, zinco, magnésio e fósforo também foram

observados em quantidades significativas em Lentinus edodes e Pleurotus spp.

(ÇAGLARIRMAK, 2007). Mdachi e colaboradores (2004) observaram que de 10

espécies de cogumelos estudados, 5 (Agaricus sp., Boletus pruinatus, Lactarius sp.,

Pleurotus sajor-caju e Boletinus cavipes) apresentaram de 2 a 7 aminoácidos

essenciais. Vitaminas do complexo B, ácido ascórbico e ácido fólico também já

foram observadas em variedades de L. edodes, P. ostreatus e P. sajor-caju

(ÇAGLARIRMAK, 2007).

Outra importância atribuída aos basidiomicetos refere-se à capacidade

desses fungos em degradar celulose e lignina. Materiais orgânicos desperdiçados,

como subprodutos agrícolas e resíduos animais, são utilizados como substrato para

o cultivo de fungos, produzindo alimentos de boa qualidade, podendo ser

consumidos pelos humanos. Dessa maneira, os nutrientes são reciclados e retornam

para a cadeia alimentar (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996; ANKE, 1997).

1.3 GÊNERO PLEUROTUS

Os representantes do gênero Pleurotus pertencem à ordem Agaricales, a qual

é conhecida pela grande variedade na morfologia dos indivíduos e por reunir os

cogumelos propriamente ditos. Os termos cogumelo, basidioma e basidiocarpo são

sinônimos e referem-se à estrutura de reprodução dos indivíduos desse grupo

(LOPES, 1999). As hifas estão altamente organizadas na formação dos

basidiocarpos, os quais podem apresentar consistência membranosa até carnosa

(PUTZKE; PUTZKE, 1998). Os espécimes do gênero Pleurotus apresentam o

basidiocarpo em forma de conchas de ostras crescendo em camadas e, são

encontrados em troncos de árvores vivas. Eles dificilmente apresentam estipe e

quando apresentam, a mesma é diminuta. São facilmente encontrados no meio

ambiente, sendo que muitas espécies desse gênero são comestíveis

(ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996).

Entre os trabalhos publicados sobre cogumelos do gênero Pleurotus,

encontram-se dados sobre valores nutricionais (ÇAGLARIRMAK, 2007; GUO; LIN;

LIN, 2007) e também sobre polissacarídeos extraídos dos mesmos. Essas moléculas

estão apresentando maior importância devido a algumas propriedades biológicas, as

quais serão descritas a seguir.

1.4 POLISSACARÍDEOS DE BASIDIOMICETOS

Polissacarídeos são polímeros de média a alta massa molecular, constituídos

por monossacarídeos conectados por ligações glicosídicas. Esses polímeros

diferenciam-se, principalmente, pelos monômeros constituintes, tipo de ligação,

comprimento da cadeia e número de ramificações (FREIMUND et al., 2003). Essas

macromoléculas, sintetizadas pelos seres vivos em geral, exercem diversas funções

no organismo como: armazenamento de energia (amido e glicogênio), estruturação

(celulose, quitina e peptideoglicano), além de atuarem como portadores de

informações, servindo como indicadores de endereçamento para algumas proteínas

e como mediadores para interações específicas entre as células e/ou matriz

extracelular (LEHNINGER; NELSON; COX, 2002).

Diversos polissacarídeos já foram isolados de basidiomicetos, como glucanas,

heterogalactanas, heteromananas, entre outras (SCHEPETKIN; QUINN, 2006).

Essas moléculas são divididas em dois grupos: os homopolissacarídeos e os

heteropolissacarídeos. Os primeiros são polímeros formados apenas por um tipo de

monossacarídeo, enquanto os últimos são formados por mais de um tipo.

1.4.1 Homopolissacarídeos

Dentre os principais homopolissacarídeos isolados estão as glucanas, que

apresentam cadeias principais formadas por unidades de α- e/ou β-Glcp ligadas

(1→3), (1→6) e/ou (1→4). Sendo frequentemente encontradas β-glucanas com

cadeias ligadas (1→3), substituídas em O-6 por terminais não-redutores de

β-

-Glcp, diferenciando-se apenas na proporção das substituições (Figuras 3).

Essas glucanas já foram descritas para Pleurotus ostreatus (YOSHIOKA et al.,

1985), Boletus erythropus (CHAUVEAU et al., 1996), Pleurotus eryngii,

Pleurotus ostreatoroseus (CARBONERO et al., 2006) e Flammulina velutipes

(SMIDERLE et al., 2006). Também já foram isoladas glucanas lineares do corpo de

frutificação de Armillaria mellea (FRASER; LINDBERG, 1967), contendo ligações

β-(1→3), e também β-glucanas ligadas (1→6) do basidioma de Agaricus brasiliensis

(MIZUNO et al., 1990b). Deste basidiomiceto também foi isolada uma glucana com

cadeia linear formada por unidades de β-Glcp alternando ligações (1→6) e (1→3)

(MIZUNO et al., 1990a) e estruturas com cadeias principais ligadas (1→6), e com

ramificações laterais, como representada na figura 4 (DONG et al., 2002). Diversas

outras estruturas similares às citadas já foram isoladas de vários basidiomicetos,

sendo que esses polissacarídeos diferenciam-se apenas em relação ao

comprimento das cadeias laterais e massa molecular (ZHANG et al., 2007).

Figura 3 – Esquema da estrutura da glucana isolada de Lentinus edodes denominada lentinana

Figura 4 – Esquema da estrutura de uma glucana isolada de Agaricus brasiliensis (= Agaricus blazei)

Um polissacarídeo incomum foi descrito para Ganoderma resinaceum, o qual

apresentou uma β-glucana com ligações (1→3), parcialmente substituída em O-6 por

cadeias laterais de β-

-Glcp substituídas em O-4 a cada dois resíduos da cadeia

principal (AMARAL et al., 2008).

Além das glucanas, outros homopolissacarídeos já foram isolados e

caracterizados por Rosado e colaboradores (2002) que descreveram para Pleurotus

ostreatoroseus, um exopolissacarídeo caracterizado como α-manana, com ligações

(1→6) e substituída em O-2, por cadeias laterais de diferentes tamanhos, as quais

podem apresentar substituições em O-2 ou O-3. Os mesmos autores também

isolaram outro exopolissacarídeo denominado α-galactana (1→4)-ligada,

parcialmente metilada na posição O-3, na proporção de 2:1. Uma galactana linear,

também metilada em O-3, contendo ligações (1→6), foi extraída do corpo de

frutificação de P. eryngii e P. ostreatoroseus (CARBONERO et al., 2007), sendo a

proporção de α-Gal e α-Me-Gal igual a 3:1. Os exemplos citados corroboram com a

→

3)-

-Glcp-(1

→

3)-

-Glcp-(1

→

3)-

-Glcp-(1

→

↑

β-

-Glcp

→

6)-

-Glcp-(1

→

6)-

-Glcp-(1

→

6)-

-Glcp-(1

→

↑

β-

-Glcp-(1→3)-β-

-Glcp

diversidade de homopolissacarídeos existentes, extraídos de basidiomicetos. A

tabela 1 apresenta um resumo das estruturas mencionadas.

Tabela 1 – Estruturas de homopolissacarídeos extraídos do corpo de frutificação de basidiomicetos

ESPÉCIE CADEIA PRINCIPAL OBSERVAÇÕES REFERÊNCIA

β-

-Glcp-(1→6)(1→3)

Estrutura não detalhada

MIZUNO et al.,

1990a

Agaricus brasiliensis

(= Agaricus blazei)

β-

-Glcp-(1→6)

Substituída em O-3 por

dissacarídeos de β-

-Glcp-

(1→3)-ligados

DONG et al., 2002

Armillaria mellea

β-

-Glcp-(1→3)

Linear

FRASER;

LINDBERG, 1967

Boletus erythropus

β-

-Glcp-(1→3)

Substituída em O-6 por β-

Glcp a cada 3 unidades da

cadeia principal

CHAUVEAU et al.,

1996

Flammulina

velutipes

β-

-Glcp-(1→3)

Similar a Lentinana

SMIDERLE et al.,

2006

Fomes annosus

β-

-Glcp-(1→3)(1→6)

Estrutura não detalhada

AXELSSON et al.,

1971

Ganoderma

resinaceum

β-

-Glcp-(1→3)

Substituída em O-6 por

cadeias de β-

-Glcp ligadas

(1→4)

AMARAL et al.,

2008

Laetiporus

sulphureus

β-

-Glcp-(1→3)

Linear

ALQUINI et al.,

2004

Lentinus edodes

α-

-Glcp-(1→3)

Linear

ZHANG; ZHANG;

CHENG, 2000

β-

-Glcp-(1→3)

Substituída em O-6 por β-

Glcp a cada 3 unidades da

cadeia principal

CARBONERO et

al., 2006

Pleurotus eryngii

α-

-Galp-(1→6)

Parcialmente metilada em

O-3

CARBONERO et

al., 2007

β-

-Glcp-(1→3)

Substituída em O-6 por β-

Glcp a cada 3 unidades da

cadeia principal

CARBONERO et

al., 2006

α-

-Galp-(1→6)

Parcialmente metilada em

O-3

CARBONERO et

al., 2007

α-

-Galp-(1→4)

Parcialmente metilada em

O-3 (Exopolissacarídeo)

Pleurotus

ostreatoroseus

α-

-Manp-(1→6)

Substituída por cadeias de

α-

-Manp ligadas (1→2) ou

(1→3) (Exopolissacarídeo)

ROSADO et al.,

2002

Pleurotus ostreatus

β-

-Glcp-(1→3)

Similar a Lentinana

YOSHIOKA et al.,

1985

α-

-Glcp-(1→3)(1→6)

Proporção das ligações

(1→3) e (1→6) = 2,5:1

Termitomyces

eurhizus

α-

-Glcp-(1→6)

Linear

MONDAL et al.,

2004

1.4.2 Heteropolissacarídeos

Devido ao grande interesse em polissacarídeos bioativos como as β-glucanas,

há poucos relatos sobre heteropolissacarídeos de basidiomicetos. Entretanto

podem-se citar alguns exemplos de estruturas variadas.

Já foram extraídas fucoxilomananas de basidiomas de Ganoderma lucidum,

Fomes annosus e Polyporus pinicola, sendo que o polímero isolado de G. lucidum

apresenta uma cadeia formada por unidades de

-Manp ligadas (1→4), sendo

totalmente substituída em O-3 por grupos de 4-O-

-Fucp-

-Xylp (MIYAZAKI;

NISHIJIMA, 1982). Os polissacarídeos descritos para as outras duas espécies

apresentam cadeia de β-

-Manp-(1→3), totalmente substituída em O-4 pelo grupo

2-O-α-

-Fucp-β-

-Xylp (AXELSSON et al., 1971; AXELSSON; BJÖRNDAL;

LINDBERG, 1969), como demonstrado na figura 5.

Figura 5 – Esquema da estrutura de uma fucoxilomanana isolada de Fomes annosus e Polyporus

pinicola

Polissacarídeos contendo apenas xilose e manose foram caracterizados para

as espécies Armillaria mellea e Flammulina velutipes, sendo que ambos são

constituídos de uma cadeia de α-

-Manp-(1→3). Em A. mellea as unidades da

cadeia principal estão substituídas em O-4 por grupos de

α-

-Xylp (1→4)-ligados (BOUVENG; FRASER; LINDBERG, 1967), enquanto para

F. velutipes, há substituições em O-4 a cada dois segmentos da cadeia principal, por

terminais não-redutores de β-

-Xylp, di- ou trissacarídeos de β-

-Xylp (1→3)-ligadas

(SMIDERLE et al., 2006).

→

3)-

-Manp-(1

→

3)-

-Manp-(1

→

3)-

-Manp-(1

→

3)-

-Manp-(1

→

3)-

-Manp-(1

→

4 4 4

↑ ↑ ↑

1 1 1

β-

Xylp β-

Xylp

2 2 2

↑ ↑ ↑

1 1 1

α-

Fucp α-

Fucp

Fucogalactanas de Ganoderma applanatum (USUI; IWASAKI; MIZUNO,

1981) e Fomes annosus (AXELSSON et al., 1971) apresentam cadeias principais de

α-

-Galp-(1→6), substituídas em O-2 por terminais não-redutores de α-

-Fucp, em

diferentes proporções.

Polissacarídeos contendo galactose, manose e fucose também foram

caracterizados para Ganoderma applanatum (USUI; IWASAKI; MIZUNO, 1981),

Fomitella fraxinea (CHO et al., 1998), Laetiporus sulphureus (ALQUINI et al., 2004) e

Flammulina velutipes (SMIDERLE et al., 2008). Esses polímeros apresentavam uma

cadeia principal constituída por unidades de α-

-Galp (1→6)-ligadas, substituídas

em O-2 pelo grupo 3-O-

-Manp-

-Fucp ou, em alguns casos, por terminais

não-redutores de α-

-Fucp e/ou α-

-Manp. A figura 6 ilustra fragmentos das

estruturas citadas para cada uma das espécies.

Figura 6 – Esquema de fragmentos de manofucogalactanas extraídas de basidiomicetos

Alguns polissacarídeos podem ser característicos de determinados grupos de

basidiomicetos. Como exemplos, podem ser citados homo e heteropolissacarídeos

naturalmente metilados presentes em cogumelos do gênero Pleurotus

(JAKOVLJEVIC et al., 1998; ROSADO et al., 2002; CARBONERO et al., 2007). Uma

manogalactana parcialmente O-metilada foi descrita por Rosado e colaboradores

(2003), presente em P. ostreatus e P. ostreatoroseus. A mesma é constituída por

unidades de α-

-Galp e 3-O-Me-α-

-Galp ligadas (1→6), sendo parcialmente

substituídas em O-2 por resíduos de β-

-Manp. Os heteropolissacarídeos citados

estão reunidos na tabela 2.

Apesar de haver poucos trabalhos sobre a caracterização de

heteropolissacarídeos, recentemente o interesse por essas moléculas tem

→

6)-

-Galp-(1

→

6)-

-Galp-(1

→

6)-

-Galp-(1

→

2 2 2

↑ ↑ ↑

1 1 1

α-

Fucp α-

-Manp α-

Fucp

↑

α-

Fucp

aumentado devido a algumas propriedades que estas têm demonstrado.

Polissacarídeos contendo manose, glucose e galactose têm se apresentado

bioativos (ZHANG et al., 2007), sendo suas propriedades descritas mais

detalhadamente no item 1.4.3.

Tabela 2 – Estruturas de heteropolissacarídeos extraídos do corpo de frutificação de basidiomicetos

1.4.3 Polissacarídeos de Basidiomicetos com Atividade Biológica

O dado mais antigo sobre a utilização de fungos como medicamentos é um

tratado médico indiano datado de 3.000 a.C. (ROWAN; SMITH; SULLIVAN, 2003).

Países como China e Japão utilizam principalmente Ganoderma lucidum e

Lentinus edodes há muitos anos, tanto para o consumo quanto para finalidades

ESPÉCIE CADEIA PRINCIPAL OBSERVAÇÕES REFERÊNCIA

Armillaria mellea

α-

-Manp-(1→3)

Substituição em O-4 pelo

dissacarídeo 4-O-α-

-Xylp-α-

Xylp

BOUVENG;

FRASER;

LINDBERG, 1967

α-

-Galp-(1→6)

Substituição em O-2 por unidades

de α-

-Fucp, α-

-Manp ou pelo

dissacarídeo 3-O-α-

-Manp-α-

Fucp

SMIDERLE et al.,

2007

Flammulina velutipes

α-

-Manp-(1→3)

Substituição em O-4 por unidades

de β-

-Xylp, di ou trissacarídeos

de β-

-Xylp-(1→3)

SMIDERLE et al.,

2006

α-

-Galp-(1→6)

Substituição em O-2 por unidades

de α-

-Fucp

Fomes annosus

β-

-Manp-(1→3)

Substituição em O-4 pelo

dissacarídeo 2-O-α-

-Fucp-β-

Xylp

AXELSSON et

al., 1971

Fomitella fraxinea

-Galp-(1→6)

Substituição em O-2 pelo

dissacarídeo 3-O-

-Manp-

-Fucp

CHO et al., 1998

α-

-Galp-(1→6)

Substituição em O-2 pelo

dissacarídeo 3-O-α-

-Manp-α-

Fucp

Ganoderma

applanatum

α-

-Galp-(1→6)

Substituição em O-2 por unidades

de α-

-Fucp

USUI; IWASAKI;

MIZUNO, 1981

Ganoderma lucidum

-Manp-(1→4)

Substituição em O-3 pelo

dissacarídeo 4-O-

-Fucp-

-Xylp

MIYAZAKI;

NISHIJIMA, 1982

Laetiporus sulphureus

α-

-Galp-(1→6)

Substituição em O-2 por unidades

de α-

-Fucp, α-

-Manp ou pelo

dissacarídeo 3-O-α-

-Manp-α-

Fucp

ALQUINI et al.,

2004

Pleurotus

ostreatoroseus e

Pleurotus ostreatus

3-O-Me-α-

-Galp e

α-

-Galp-(1→6)

Substituição em O-2 por unidades

de β-

-Manp

ROSADO et al.,

2003

Polyporus pinicola

β-

-Manp-(1→3)

Substituição em O-4 pelo

dissacarídeo 2-O-α-

-Fucp-β-

Xylp

AXELSSON;

BJÖRNDAL;

LINDBERG, 1969

medicinais. Após a descoberta da penicilina, em 1929, os fungos se tornaram

conhecidos mundialmente como fontes ricas em antibióticos e outros compostos

bioativos (MORADALI et al., 2007; ZHANG et al., 2007). Em 1957, Lucas e

colaboradores isolaram uma molécula de Boletus edulis que apresentou significativo

efeito inibitório do crescimento de células tumorais de sarcoma S-180 (LUCAS et al.,

1957). A partir dessa data, outros autores publicaram trabalhos relatando atividades

de substâncias extraídas de basidiomicetos como inibidoras de adenocarcinoma 755

e leucemia L-1210 (ZHANG et al., 2007).

Dentre os compostos bioativos isolados de macrofungos, encontram-se

terpenóides, ácidos graxos, proteínas, lectinas, mas principalmente polissacarídeos

e proteínas glicosiladas. β-glucanas, comuns em basidiomicetos, apresentam

atividade imuno-estimulatória (grifolana), antitumoral (lentinana), antiviral e

antimicrobiana (esquizofilana), sendo essas moléculas isoladas, primeiramente de

Grifola frondosa, Lentinus edodes e Schizophyllum commune, respectivamente.

Polissacarídeos complexados a peptídeos (PSP) ou a proteínas (PSK - krestin)

também apresentam os mesmos efeitos, sendo ambos isolados de Trametes

versicolor (= Coriolus versicolor). As moléculas citadas já estão sendo

comercializadas e utilizadas em terapias contra o câncer (SCHEPETKIN; QUINN,

2006; MORADALI et al., 2007; ZHANG et al., 2007).

A atividade antitumoral de polissacarídeos de basidiomicetos estende-se

também aos heteropolissacarídeos como as heteromananas e heteroglucanas,

sendo que as diferenças encontradas na atividade são extremamente dependentes

da solubilidade, tamanho, ramificações e forma das moléculas utilizadas

(SHAH et al., 2007). Estudos demonstraram que lentinana e esquizofilana, ambas

com alta massa molecular, são eficientes apenas quando administradas via

intravenosa e intraperitoneal. A administração intravenosa de β-glucana-(1→6)

extraída de Agaricus brasiliensis demonstra atividade antitumoral mais eficaz do que

quando aplicada oralmente. Entretanto, após hidrólise branda da mesma molécula,

formando fragmentos com massa molecular de 10 kDa, o efeito antitumoral torna-se

significativo, quando administrado via oral (SMITH; SULLIVAN; ROWAN, 2003).

Percebe-se que há diversos trabalhos relacionando a estrutura polissacarídica

com a sua atividade antitumoral (WASSER; WEIS, 1999; MORADALI et al., 2007;

ZHANG et al., 2007), em contra partida alguns estudos têm mostrado que essas

moléculas extraídas de basidiomicetos podem apresentar outros efeitos, tais como

atividade antiinflamatória e antinociceptiva (PARK et al., 2005). Entretanto, ainda se

sabe pouco sobre esses efeitos e a maioria dos trabalhos são realizados com

extratos polissacarídicos, ignorando qual molécula está sendo responsável pela

atividade (LIN et al., 2006; DORE et al., 2007).

1.4.3.1 Atividade Antiinflamatória

Os organismos vivos possuem mecanismos adaptativos para responder a

estímulos agressivos no sentido de manter o equilíbrio homeostático. Nos

vertebrados, esta resposta inclui uma série de alterações bioquímicas, fisiológicas e

imunológicas, as quais são denominadas inflamação. Lesões aos tecidos desses

animais estimulam a liberação de mediadores químicos conhecidos como citocinas

pró-inflamatórias, as quais desencadeiam o processo inflamatório no sentido de

restringir as conseqüências e a extensão do dano tecidual. As conseqüências

podem ser locais ou generalizadas, sendo o aumento da permeabilidade capilar e a

migração de leucócitos para os tecidos, os efeitos mais observados (VOLTARELLI,

1994).

Em experimentos biológicos realizados com camundongos, pode-se induzir o

processo inflamatório causando injúria aos tecidos, seguido de avaliação do

aumento da permeabilidade dos vasos sanguíneos e da migração dos leucócitos. A

administração de drogas como dexametasona e indometacina, anteriormente a

essas lesões, diminui esse efeitos mostrando uma atividade antiinflamatória

(VINEGAR et al., 1979).

Extratos ricos em β-glucanas e outros polissacarídeos obtidos de Geastrum

saccatum (DORE et al., 2007) e Ganoderma tsugae (LIN et al., 2006) apresentaram

efeito antiinflamatório, reduzindo a migração de leucócitos e a liberação de

mediadores pró-inflamatórios. Esses estudos fornecem informações importantes de

como essas moléculas podem ser utilizadas para outros tratamentos, entretanto

faltam informações sobre a estrutura e o mecanismo de ação desses

polissacarídeos.

1.4.3.2 Atividade Antinociceptiva

Outro efeito que pode ser avaliado pelo modelo de experimentação biológica

citado acima é a atividade antinociceptiva. A liberação de alguns mediadores pró-

inflamatórios como prostaglandinas e bradicininas provoca uma resposta sensorial

dolorosa denominada hiperalgesia. Isso ocorre porque, na presença desses

mediadores, os nociceptores (receptores específicos para dor) são sensibilizados,

causando sensações dolorosas mesmo com estímulos de mínima intensidade.

Como essas sensações não podem ser diretamente examinadas em animais, as

respostas observadas após os estímulos são dadas pelo comportamento dos

mesmos (QUINN, 2002).

Um método comumente empregado em função de sua simplicidade para

execução e sensibilidade, tanto para avaliação dos efeitos antiinflamatórios como

antinociceptivos é a reação de contração muscular induzida por ácido acético em

camundongos. Esse experimento foi descrito como modelo típico para processos

que envolvem dor e inflamação. As drogas capazes de inibir a liberação de

prostaglandinas, como indometacina, por exemplo, podem atuar como analgésicas,

sendo utilizadas como controle em testes de avaliação dos efeitos antinociceptivos

de outras moléculas (VINEGAR et al., 1979; BRUNTON, 2001; TJØLSEN; HOLE,

1997).

Estudos mostraram que o extrato metanólico obtido de Inonotus obliquus

(PARK et al., 2005) e que o polissacarídeo PSP isolado de Trametes versicolor

(CHAN; YEUNG, 2006) apresentaram efeito analgésico quando avaliados pelo teste

de contração muscular induzida por ácido acético. Entretanto não há muitas

informações sobre esse efeito e sobre as moléculas envolvidas na atividade

analgésica.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar estruturalmente

polissacarídeos extraídos do basidioma de Pleurotus pulmonarius e verificar

possíveis atividades biológicas relacionadas a essas estruturas, bem como avaliar

as características nutricionais desse cogumelo.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Para alcançar o objetivo geral, as seguintes estratégias foram propostas:

a) Obter os polissacarídeos do basidioma através de extrações aquosas e

alcalina;

b) Purificar as frações polissacarídicas obtidas, utilizando diferentes

metodologias;

c) Caracterizar estruturalmente os principais polissacarídeos isolados,

utilizando métodos químicos e técnicas analíticas de RMN e GC-MS;

d) Avaliar os parâmetros nutricionais do cogumelo em estudo como o teor de

cinzas e minerais, carboidratos, lipídeos, proteína e aminoácidos;

e) Avaliar possíveis efeitos antiinflamatórios e antinociceptivos dos

polissacarídeos isolados.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 BASIDIOMICETO

O corpo de frutificação de Pleurotus pulmonarius (Figura 7), fornecido pelo

produtor Renato A. Yamasita, foi cultivado na Fazenda Bom Jesus das Araucárias,

município de Reserva, Paraná. Este município localiza-se na região dos Campos

Gerais a uma altitude de 850 metros (24°39'05'' Sul ; 50°50'40'' W-GR), apresentando

clima subtropical úmido mesotérmico, com verões frescos (média de 22 ºC) e

invernos com geadas freqüentes (< 18 ºC) (PORTAL DE SERVIÇOS E

INFORMAÇÕES DO GOVERNO DO PARANÁ, 1995).

Figura 7 – Fotos do basidioma de Pleurotus pulmonarius

FONTE: http://www.naturfoto.cz/hliva-plicni-fotografie-6322.html, acessado em: 12/12/2007.

3.2 PROCEDIMENTOS GERAIS DE EXTRAÇÃO

3.2.1 Extração com Clorofórmio-Metanol

O material fresco (~2 kg) foi limpo e liofilizado, gerando 200 g em massa, que

após trituração em moinho (granulação entre 0,1-20 mm), foi deslipidificado em

Soxhlet, com uma solução de clorofórmio-metanol (4:1, v/v), a 60 ºC, durante

3 horas, por 3 vezes (MACHADO et al., 1994). Esse procedimento forneceu um

extrato de compostos apolares e um resíduo I que passou por processos

seqüenciais de extração descritos a seguir.

3.2.2 Extração Aquosa à Temperatura Ambiente

O resíduo I originado da deslipidificação foi submetido a extrações aquosas

(x7, 3.000 ml cada) à temperatura ambiente, sob agitação mecânica, por 6 horas.

Após cada etapa, o material foi centrifugado (8.500 r.p.m., 15 min, 25 ºC) para

separação do extrato aquoso (extrato aquoso I) e do material residual (resíduo II).

Os extratos obtidos foram reunidos e concentrados sob pressão reduzida até

pequeno volume e precipitados com etanol (3:1, v/v). O precipitado etanólico (CW),

após centrifugação (8.500 r.p.m., 20 min, 10 ºC), foi dialisado (12-14 kDa) contra

água corrente por 20 horas e liofilizado.

3.2.3 Extração Aquosa a Quente

O resíduo II foi submetido a extrações aquosas sob refluxo em banho de água

fervente, por 6 horas (x7, 3.000 ml cada). O material obtido a cada extração foi

filtrado e reunido, gerando um extrato aquoso II e um resíduo III. Esse extrato foi

concentrado, sob pressão reduzida até pequeno volume e precipitado com etanol

(3:1, v/v). A fração polissacarídica (HW) foi recuperada através de centrifugação

(8.500 r.p.m., 20 min, 10 ºC), dialisada (12-14 kDa) contra água corrente por 20

horas e liofilizada.

3.2.4 Extração Alcalina

O resíduo III foi tratado com solução de hidróxido de potássio a 1%

(KOH 1%), sob refluxo em banho com água fervente, na presença de borohidreto de

sódio (NaBH

) para evitar degradação das cadeias polissacarídicas (x7, 1.000 ml

cada). O extrato alcalino obtido foi filtrado e após adição de ácido acético (AcOH) até

pH 5,0, verificou-se a formação de um precipitado. Essa fração foi separada por

centrifugação (8.500 r.p.m., 15 min, 25 ºC) e ambas as frações: insolúvel

(I5-K1) e solúvel (S5-K1) em pH 5,0 foram dialisadas (12-14 kDa) contra água

corrente, por 48 horas, e liofilizadas. O extrato alcalino propriamente dito é a soma

dessas frações, entretanto, a fração I5-K1 não foi utilizada no presente trabalho e,

para facilitar o entendimento, a fração S5-K1 será denominada K1.

3.3 PURIFICAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS

3.3.1 Separação dos Polissacarídeos por Congelamento e Degelo

Os extratos aquosos (CW e HW) e a fração solúvel em pH 5,0 (K1) foram,

separadamente, solubilizados em água destilada e submetidos ao processo de

congelamento, seguido por descongelamento à temperatura ambiente, repetidas

vezes. As frações solúveis em água fria (SCW, SHW e SK1, respectivamente) foram

separadas das frações insolúveis (PCW, PHW e PK1, respectivamente) por

centrifugação (8.500 r.p.m., 30 min, 4 ºC). Esse processo foi repetido até que o

sobrenadante aquoso não apresentasse mais precipitado por congelamento e

degelo (GORIN; IACOMINI, 1984).

3.3.2 Purificação por Precipitação com Solução de Fehling

As frações solúveis em água fria, obtidas da extração aquosa a frio e da

extração alcalina (SCW e SK1, respectivamente) foram submetidas à precipitação

com solução de Fehling (JONES; STOODLEY, 1965). Esta solução consiste em

duas soluções (A e B), sendo a solução A composta por tartarato de sódio e

potássio e KOH (173,0 g + 125,0 g / H

O q.s.p. 500 ml, respectivamente), enquanto

B consiste de sulfato de cobre 5.H

O (CuSO

) (55,7 g / H

O q.s.p. 500 ml).

As frações submetidas a este procedimento foram solubilizadas

primeiramente na solução A (30 – 50 ml), seguida da adição de igual volume da

solução B. Após intensa agitação, o material foi mantido sob refrigeração por

12 horas.

O precipitado formado foi separado por centrifugação (8.500 r.p.m., 15 min,

25 ºC). As frações obtidas (precipitado e sobrenadante) foram neutralizadas com

AcOH concentrado, dialisadas contra água corrente (~48 horas; 12-14 kDa) e

deionizadas por resina Dowex na forma catiônica. Em seguida, todas as frações

foram dialisadas (~24 horas; 12-14 kDa) e liofilizadas.

3.3.3 Purificação dos Polissacarídeos por Ultrafiltração ou Diálise

As frações PF-SCW e SF-SK1, após apresentarem perfil heterogêneo por

HPSEC (item 3.5.2), foram submetidas à ultrafiltração em membranas de

polietersulfona com limites de exclusão de 500 kDa, 30 kDa e/ou 10 kDa (Millipore

As ultrafiltrações foram realizadas por um sistema de filtração (modelo 16249,

Sartorius) acoplado a um cilindro de ar comprimido (CARBONERO, 2005). Também

foram utilizadas membranas de diálise com limite de exclusão de 16 kDa, em diálise

fechada contra água destilada.

3.4 ANÁLISE ESTRUTURAL DOS POLISSACARÍDEOS

3.4.1 Hidrólise Ácida Total

Uma alíquota de cada fração (~1,0 mg) foi tratada com 1,0 ml de TFA (ácido

trifluoracético) 2 M, durante 8 horas, a 100 ºC, ou TFA 1 M a 100 ºC, overnight

(12-15 h) (CORRADI DA SILVA et al., 1993). Decorrido o tempo de hidrólise, o ácido

foi eliminado das amostras por evaporação até secura à temperatura ambiente. Os

produtos hidrolisados foram reduzidos e acetilados, conforme o item 3.4.2.

3.4.2 Redução e Acetilação dos Produtos de Hidrólise

Os produtos de hidrólise foram reduzidos com borohidreto de sódio (NaBH

) à

temperatura ambiente, pH 9-10, por 15 horas (WOLFROM; THOMPSON, 1963a).

Após esse período, as amostras reduzidas foram tratadas com resina catiônica

(pH 7,0), filtradas e levadas à secura sob pressão reduzida. O ácido bórico formado

foi eliminado por co-evaporação com metanol, na forma de borato de trimetila.

Os alditóis formados foram acetilados com uma mistura de anidrido acético

(Ac

O)/piridina (1:1, v/v), overnight, à temperatura ambiente (WOLFROM;

THOMPSON, 1963b). Os acetatos de alditóis formados foram extraídos com

clorofórmio e a piridina residual presente neste extrato foi removida através de

sucessivas adições de solução de sulfato de cobre 5% (m/v). Após remoção total da

piridina, a fração clorofórmica foi desidratada com sulfato de sódio anidro e filtrada

por algodão. Após secura, os acetatos de alditóis isolados foram analisados por

cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS).

3.4.3 Metilação dos Polissacarídeos

As frações polissacarídicas purificadas (MG, S-PHW, SF-GLC e PF-GLC; 10 –

20 mg) foram metiladas pelos métodos de Ciucanu e Kerek (1984) ou

Haworth (1915).

No primeiro método, uma alíquota de cada amostra pura (MG; 10 – 20 mg) foi

solubilizada em 1,0 ml de dimetilsulfóxido (Me

SO). Em seguida foi adicionado

hidróxido de sódio (NaOH) seco e triturado (4:1 de carboidrato) e 1,0 ml de iodeto de

metila (CH

I). A amostra foi mantida sob agitação por 30 – 40 min e deixada em

repouso. Após 24 horas, o material foi neutralizado com AcOH concentrado em

banho de gelo e dialisado (8 kDa) contra água corrente, por 48 horas e liofilizado.

Esse procedimento foi repetido para garantir a metilação total dos polissacarídeos.

No segundo método, uma alíquota do material (S-PHW, SF-GLC e PF-GLC;

20 mg) foi solubilizada em água destilada, tratada com NaBH

(~12 h), dialisada

(12-14 kDa) contra água corrente e liofilizada. Em seguida, a amostra foi solubilizada

em uma solução (3,0 ml) de NaOH 40% (p/v), a qual foi mantida sob agitação

constante, sendo adicionado 0,5 ml de dimetilsulfato (DMS), por 6 vezes, a cada 30

min. Após essa etapa, a reação foi mantida sob agitação overnight. Decorrido esse

período, o material foi dialisado (~24 horas; 8 kDa) e liofilizado. O material

remanescente foi solubilizado novamente em NaOH 40% para iniciar um novo ciclo

de metilação. Após o segundo ciclo, a amostra foi metilada pelo método de Ciucanu

e Kerek.

Os polissacarídeos parcialmente O-metilados obtidos foram hidrolisados com

ácido fórmico 45% a 100 ºC, por 10 - 15 horas (STORTZ; CASES; CEREZO, 1997).

O ácido presente na amostra foi removido por liofilização. Em seguida, os resíduos

per-O-metilados formados foram reduzidos com NaB

e acetilados (item 3.4.2)

para serem analisados por GC-MS.

3.4.4 Degradação Controlada de Smith

Alíquotas dos polissacarídeos (MG e S-PHW; 100 - 150 mg) foram

solubilizadas em água e acrescidas de periodato de sódio (NaIO

) até atingir uma

concentração final de 0,05 M. Cada solução foi mantida por 72–96 horas, sob

agitação, na ausência de luz. O material oxidado foi deixado em diálise (12-14 kDa)

contra água corrente durante 24 horas. A solução foi reduzida com NaBH

(pH 9-10)

por 24 horas, neutralizada com ácido acético concentrado e dialisada (8 kDa) contra

água corrente por ~48 horas (ABDEL-AKHER et al., 1952).

Depois de liofilizadas, alíquotas das amostras reduzidas foram submetidas à

hidrólise ácida total (item 3.4.1), metilação (item 3.4.3) e/ou hidrólise ácida parcial.

Para este experimento, a amostra reduzida foi submetida a uma hidrólise branda

com TFA, pH 2,0 a 100 ºC, por 30 min, sob refluxo. A solução foi neutralizada e

dialisada contra água destilada em recipiente fechado, utilizando-se membranas

com limite de exclusão de 2 kDa. O material retido na membrana de diálise foi

analisado por GC-MS e RMN-

C (itens 3.5.1 e 3.5.3).

3.4.5 Hidrólise Ácida Parcial do Heteropolissacarídeo

Uma alíquota da fração MG (200 mg), amostra pura obtida da extração

aquosa à temperatura ambiente, foi tratada com 1,0 ml de H

0,16 M a 100 ºC,

por 3 horas. Em seguida, a amostra foi neutralizada com NaOH 1%, dialisada

(~12 horas; 8 kDa) e liofilizada. A fração resultante foi analisada por RMN-

3.5 MÉTODOS ANALÍTICOS

3.5.1 Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massa (GC-MS)

As análises de GC-MS foram realizadas em cromatógrafo a gás VARIAN,

modelo 3.300 acoplado a um espectrômetro de massa de marca FINNIGAN MAT,

modelo ITD 800 e Varian Saturn 2000R, equipados com colunas capilares de sílica

fundida (30 m x 0,25 mm d. i.) revestidas DB 225. As injeções nas colunas foram

feitas partindo-se de 50 ºC (mantida por 1,0 min), seguindo-se de um aumento

gradual de 40 ºC/min até 215 ºC (acetatos de alditóis parcialmente O-metilados) ou

220 ºC (acetatos de alditóis), sendo mantida isotermicamente até o final da análise.

Hélio ultra puro foi usado como gás de arraste, a um fluxo de 1,0 ml/min.

3.5.2 Determinação da Homogeneidade por Cromatografia de Exclusão Estérica

Acoplada à Detecção por Índice de Refração e Espalhamento de Luz

(HPSEC-MALLS)

Para as análises de homogeneidade, as amostras foram solubilizadas em

uma solução de nitrito de sódio (NaNO

) contendo azida de sódio (NaN

) para uma

concentração final de 1,0 mg/ml. As amostras solúveis foram filtradas em membrana

de acetato de celulose 0,22 µm (Millipore). Estas foram aplicadas em cromatógrafo

de exclusão estérica de alta pressão (HPSEC) Waters equipado com detector de

índice de refração diferencial, modelo Waters 2410, e com detector de espalhamento

de luz em multiângulos WYATT TECHNOLOGY, modelo DAWN DSP-F. Foram

utilizadas, em série, 4 colunas de gel permeação WATERS com limites de exclusão

de 1x10

, 4x10

, 8x10

e 5x10

Da.

3.5.3 Ressonância Magnética Nuclear

Os espectros de RMN-

C, RMN-

C-DEPT,

C HMQC e HSQC foram

realizados em espectrômetro BRUKER, modelo Avance-DRX-400.

As análises foram realizadas a 50 ºC ou 70 ºC, com as amostras de

polissacarídeos (~40 mg), solubilizadas em D

O (óxido de deutério) ou Me

SO-d

(dimetilsulfóxido deuterado), dependendo da solubilidade. Os deslocamentos

químicos das amostras solúveis em D

O foram expressos em ppm (δ) relativos aos

sinais de

C e

H da acetona em δ 30,20 e 2,22, respectivamente, e aos sinais de

SO-d

em δ 39,70 (

C) e 2,40 (

H), para as amostras solúveis no mesmo.

Apenas para a manogalactana, os deslocamentos químicos foram expressos em

ppm (δ) relativos à acetona em δ 32,77 (

C) e 2,21 (

H) de acordo com o DSS

(2,2-Dimetil-2-silapentano-3,3,4,4,5,5-d

-5-sulfonato de sódio; δ = 0,0 para

C e

(IUPAC).

3.6 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS NUTRICIONAIS

Tendo em vista que o cogumelo em estudo é comestível, decidiu-se avaliar

seu conteúdo nutricional, sendo alguns desses experimentos realizados no

laboratório de Química de Carboidratos (análise de aminoácidos) e os demais

resultados, foram obtidos em colaboração com o laboratório de Análises Ambientais

da PUC-PR.

3.6.1 Análise de Aminoácidos

Uma alíquota (1,0 mg) da amostra bruta da extração aquosa (CW) foi

hidrolisada com HCl (200 µl), a 100 ºC, por 20 horas. Após evaporação do ácido, foi

adicionada uma solução de metanol:HCl (1:4, v/v, 200 µl), deixando-se por 20 min, a

100 ºC. Os derivados obtidos foram acetilados com anidrido acético (100 µl),

metanol (50 µl) e piridina (50 µl), por 1 hora, a 100 ºC. Esses derivados foram

analisados por GC-MS, sendo as fragmentações obtidas identificadas por padrões

de aminoácidos.

3.6.2 Determinação de Cinzas

As cinzas foram determinadas pelo método de incineração. Uma alíquota dos

cogumelos liofilizados (3 g) foi adicionada a um cadinho de porcelana, sendo levada

a uma capela para carbonização da amostra em chapa elétrica. Em seguida, a

amostra foi incinerada a 550 ºC, na mufla, até a obtenção de cinzas claras

(2-3 horas). Após essa etapa, a amostra foi pesada, obtendo-se o valor total de

cinzas.

3.6.3 Análise dos Elementos Minerais

A determinação dos elementos minerais Al, Si, Ca, Mg, Cr, Zn, Fe, Mn, Cd,

Ni, Cu (STANDARD METHODS, 1998) foi realizada em espectrofotômetro de

absorção atômica modelo 250 Plus, Varian, com chama de C

e N

O, a partir de

resíduo mineral fixo, digerido com água régia até dissolução total, sendo

posteriormente levado ao aparelho para leitura nas condições técnicas especificadas

na tabela 3.

Tabela 3 – Dados técnicos para análise de elementos minerais em equipamento de absorção atômica

Elemento

Comprimento

de onda (nm)

Largura da

fenda (nm)

Tipo de

chama

Faixa de

Calibração (ppm)

Corrente da

lâmpada (mA)

Supressor de

ionização

Cd 228,8 0,5 C

0,5 – 2,0 6 -

Cr 357,9 0,2 C

0,5 – 2,0 7 -

Cu 324,7 0,5 C

0,5 – 2,0 4 -

Fe 248,3 0,2 C

1,0 – 1,0 5 -

Ni 232,0 0,2 C

0,5 – 2,0 4 -

Zn 213,9 1,0 C

0,5 – 2,0 5 -

Mn 279,5 0,5 C

0,5 – 2,0 5 -

Al 309,3 10,5 N

O 1-10 10 KNO

Ca 422,7 0,5 N

O 1-10 10 SrCl

K 766,5 1,0 C

1-10 5 SrCl

Mg 285,2 0,5 N

O 1-10 4 SrCl

3.6.4 Determinação das Proteínas

Foi utilizado 0,1 g da amostra de cogumelos liofilizados. Inicialmente foi

realizada a digestão da amostra, em balão de digestão, com a adição de 1,0 g da

mistura catalítica (CuSO

e K

) e 5,0 ml de H

concentrado. O balão foi

aquecido de 50 - 400 ºC em um período de 30 min. A mistura foi resfriada e, após

diluição com H

O (10 ml), o balão com a amostra foi conectado ao destilador de

Kjeldahl, sendo adicionada quantidade suficiente de solução de NaOH 50% até

alcalinização completa (cor marrom escura). A destilação foi realizada até obtenção

de 50 ml de solução, a qual foi coletada em um Erlenmeyer contendo ácido bórico

4% (10 ml) e 5 gotas de indicador misto (vermelho de metila + verde de bromo

cresol). Em seguida, foi realizada uma titulação da amostra destilada, utilizando

como agente titulante uma solução de H

0,02 N. O teor de proteína bruta foi

calculado da seguinte maneira:

% de proteína = V* x 2,8 x 10

x fc x Fc x 100

Peso em grama de amostra

V*= Volume gasto na titulação da amostra

fc= Fator de correção da solução de ácido sulfúrico 0,02 N

Fc= Fator de conversão

3.6.5 Determinação de Lipídeos

Essa análise foi realizada com o auxílio de Soxlet, utilizando éter de petróleo

como solvente para 5,0 g de amostra de cogumelos liofilizados. A extração foi

realizada durante 6 horas, seguida de evaporação do solvente em estufa por 30 min

e pesagem do material obtido.

3.6.6 Determinação dos Carboidratos Totais

Os polissacarídeos presentes na amostra de cogumelos liofilizados foram

hidrolisados (5,0 g em 5,0 ml de H

O), pela adição de HCl (5,0 ml), a 100 ºC,

produzindo exclusivamente monossacarídeos redutores. A solução foi neutralizada

com NaOH 30 %. Em um Erlenmeyer, foram adicionados 5,0 ml das duas soluções

de Fehling (A e B) e 50 ml de H

O destilada. Essa mistura foi levada à ebulição

provocando a redução quantitativa dos íons cúpricos da solução de Fehling a óxido

cuproso. Utilizou-se a amostra contendo açúcares redutores como agente titulante

até o aparecimento de um precipitado vermelho como indicador do ponto de

viragem.

3.7 ENSAIOS BIOLÓGICOS: ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-

INFLAMATÓRIA in vivo

Os ensaios biológicos foram realizados pelo professor Adair Roberto Soares

dos Santos e colaboradores, no Departamento de Ciências Fisiológicas, situado no

Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).

3.7.1 Animais

Os camundongos machos Swiss (25-35 g) foram mantidos em sala

climatizada (23 ± 2 ºC) em ciclos de claro-escuro de 12 h, com água e ração

ad libitum. Os animais foram acondicionados no laboratório por, no mínimo, 2 h

antes dos testes e utilizados uma única vez para os experimentos. Os ensaios

tiveram aprovação do Comitê de Ética e foram desenvolvidos de acordo com as

normas vigentes sobre cuidados com animais utilizados em laboratório e sobre ética

em experimentos sobre dor em animais conscientes (ZIMMERMANN, 1983). O

número de animais e intensidade dos estímulos dolorosos utilizados foram o mínimo

necessário para demonstrar efeitos consistentes dos tratamentos testados.

3.7.2 Constrição Abdominal, Permeabilidade Capilar Peritoneal e Infiltração de

Leucócitos Causada por Injeção de Solução de Ácido Acético 0,6%

As constrições abdominais foram induzidas de acordo com procedimentos

descritos previamente (LUCENA et al., 2007), resultando em contração do músculo

do abdômen juntamente com distensão dos membros posteriores em resposta à

injeção intraperitoneal (i.p.) de ácido acético (0,6%). Inicialmente, os animais foram

tratados por injeção intravenosa de solução corante Evans Blue 2,5% (10,0 ml/kg),

utilizado como marcador da permeabilidade capilar peritoneal. Após 1,0 h, os

camundongos receberam a amostra a ser testada (3,0-30,0 mg/kg, i.p.) ou

dexametasona (2,0 mg/kg, s.c.) ou indometacina (10,0 mg/kg, i.p.), como controles

positivos. A injeção da solução de ácido acético foi administrada após 30 min para

os animais tratados com a amostra testada e com indometacina e, após 4,0 h para

os animais tratados com dexametasona. Os animais controle negativo receberam

um volume similar de solução salina (10,0 ml/kg, i.p.), usado para diluir a amostra.

Em seguida, os animais foram mantidos individualmente em cilindros de vidro de

20,0 cm de diâmetro e, as constrições abdominais foram contadas cumulativamente

durante um período de 20 min. A atividade antinociceptiva foi expressa como

redução do número de contrações abdominais (por exemplo, a diferença entre o

controle negativo e animais pré-tratados com amostra testada, dexametasona ou

indometacina). Imediatamente após o teste, os camundongos foram sacrificados por

deslocamento cervical e a cavidade peritoneal foi exposta e lavada com 1,0 ml de

salina + heparina estéril (25 IU/ml) e o volume foi coletado com pipetadas

automáticas. A contagem dos leucócitos totais foi realizada com o auxílio de câmara

de Neubauer e microscópio óptico, após diluição do fluido peritoneal coletado com

solução de Türk (1:20). Uma alíquota do fluido coletado (700 µl) foi centrifugada a

1.000 r.p.m. por 10 min e a absorbância do sobrenadante foi lida a 550 nm com

analisador de ELISA. A permeabilidade capilar peritoneal induzida por ácido acético

foi expressa em relação ao extravasamento do corante Evans Blue (µg/ml), de

acordo com a curva padrão obtida por Lucena e colaboradores (2007).

3.7.3 Análises Estatísticas

Os resultados foram expressos como a média ± desvio padrão, exceto os

valores de ID

(por exemplo, a dose de amostra testada reduzindo a constrição

abdominal, permeabilidade capilar peritoneal e respostas da infiltração de leucócitos

por 50%, em relação ao valor do controle), os quais se apresentaram como

significados geométricos acompanhados pelos seus respectivos limites de confiança

de 95%. Os valores de ID

foram determinados por regressão dos experimentos

individuais, com o auxílio do software de regressão linear GraphPad (Graph Pad

software, San Diego, CA, USA). A significância estatística das diferenças entre os

Pleurotus pulmonarius

Seco (200 g)

Compostos

Apolares

Resíduo I

Extrato Alcalino 1%

Extrato Aquoso I

Deslipidificação

CHCl

MeOH 4:1

O fria (3 L, 7x), sob agitação, 6 h

KOH 1%, 100ºC, sob refluxo, 6 h

Resíduo II

O quente (3 L, 7x), sob refluxo, 6 h

Resíduo III

Extrato Aquoso II

Resíduo IV

grupos foi detectada por ANOVA seguida pelo teste de Newman-Keuls. Um valor de

p < 0,05 foi considerado significante.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O corpo de frutificação de Pleurotus pulmonarius (~2,0 kg) foi limpo e

liofilizado, sendo o teor de água presente neste cogumelo igual a, aproximadamente,

91%. Partindo-se de 200 g do material seco, foi realizada uma extração com

clorofórmio-metanol (4:1 v/v), a fim de remover moléculas apolares presentes no

mesmo, sendo o rendimento dessa fração apolar igual a 3,7%. As extrações foram

desenvolvidas conforme descrito anteriormente (Material e Métodos), na seguinte

ordem: extração aquosa à temperatura ambiente, extração aquosa a 100 ºC e

extração alcalina a 100 ºC (Figura 8).

Figura 8 – Esquema geral das extrações do basidioma liofilizado de Pleurotus pulmonarius

Ambos os extratos aquosos foram filtrados em algodão, separadamente,

concentrados em rota-evaporador e precipitados com etanol (3:1 v/v). Os

precipitados etanólicos denominados, respectivamente, por CW e HW foram

liofilizados e fracionados como descrito. O extrato alcalino, após adição de ácido

acético, centrifugação e diálise, foi liofilizado, resultando em duas frações, sendo

que apenas a fração solúvel em pH 5,0 (K1) foi utilizada. Os rendimentos dos

extratos obtidos e das frações seguintes estão relacionados na tabela 4. O alto teor

de polissacarídeos na fração CW em comparação com a fração HW deve-se,

provavelmente às repetidas extrações com água fria, antes de iniciar as extrações a

100 ºC. O maior rendimento para as extrações à temperatura ambiente favorece a

purificação das moléculas isoladas, devido à grande solubilidade das mesmas. A

extração alcalina apresentou maior quantidade de polissacarídeos, pois esta

removeu moléculas mais fortemente aderidas à parede celular do fungo.

Tabela 4 – Relação dos rendimentos das frações obtidas do basidioma de P. pulmonarius

Rendimento

(1)

Fração / Extrato

g %

Compostos apolares

7,4 3,7

CW 13 6,5

SCW 12,1 6,0

SF-SCW 1,6 0,8

PF-SCW 1,6 0,8

PCW 0,5 0,2

HW 7,4 3,7

SHW 5 2,5

PHW 1,2 0,6

K1 26,8 13,5

I5-K1 4,5 2,2

SK1 18,0 9,0

SF-SK1 3,2 1,6

PF-SK1/PF-GLC 0,2 0,1

PK1 4,4 2,2

(1) Baseado no peso seco das frações.

Os extratos polissacarídicos obtidos de cada extração (CW, HW e K1) foram

submetidos ao processo de congelamento e degelo, representado na figura 9, e aos

demais procedimentos de purificação, quando necessários.

Precipitação com EtOH 3:1

Adição AcOH (pH 5,0) e diálise

Extrato Alcalino 1%

Extrato Aquoso I

Extrato Aquoso II

SCW

PCW

SHW

PHW

SK1

PK1

Congelamento e Degelo

Precipitação com Fehling

I5-K1

SF-SCW

PF-SCW

SF-SK1

PF-SK1

Figura 9 – Esquema geral das etapas de purificação por congelamento e degelo dos extratos obtidos

de Pleurotus pulmonarius

4.1 EXTRATO AQUOSO À TEMPERATURA AMBIENTE

A fração resultante da primeira extração aquosa, denominada CW, após o

congelamento e degelo, gerou uma fração solúvel (SCW) e uma fração insolúvel

(PCW) em água fria. Esta última não foi analisada no presente trabalho devido ao

baixo rendimento (Tabela 4).

A fração SCW foi tratada com solução de Fehling separando a mesma em

uma porção solúvel (SF-SCW) e outra insolúvel (PF-SCW) nesta solução. Este

tratamento foi repetido para a fração insolúvel (PF-SCW) para garantir melhor

separação por esse procedimento. Apesar disso, quando analisada por HPSEC-

MALLS e GC-MS, esta fração ainda apresentava-se heterogênea, como pode ser

observado na figura 10, sendo composta por fucose (1,7%), xilose (1,5%), manose

(27,1%), 3-O-metil-galactose (14,9%), galactose (46,9%) e glucose (7,9%). O

derivado 3-O-Me-galactose foi confirmado, por GC-MS, pela presença dos

fragmentos 130 e 190 m/z, após hidrólise, redução com borohidreto de sódio

deuterado (NaB

) e acetilação.

Dessa forma, essa fração foi purificada por ultrafiltração em membranas de

500 kDa e 30 kDa, sendo que o material eluído por ambas as membranas,

denominado MG (0,4%), apresentou um perfil homogêneo por HPSEC (Figura 10),

com uma massa molar de aproximadamente 2,39 x 10

Da.

Figura 10 – Perfil de eluição das frações PF-SCW e MG (solubilizadas em nitrito de sódio 0,1 mol/l,

contendo azida sódica) obtido por HPSEC-MALLS

A fração MG, após analisada por GC-MS, apresentou manose (31,6%),

3-O-Me-galactose (12,9%) e galactose (55,5%), enquanto as análises de metilação

(Tabela 5) deste polímero indicaram um polissacarídeo com cadeia principal

composta por unidades de galactose e 3-O-Me-galactose, unidas por ligações

(1→6), altamente substituídas em O-2 por terminais não redutores de manose.

Tabela 5 – Análise de metilação das frações MG e SM-MG obtidas do basidioma de P. pulmonarius

Mol%

Acetatos de alditóis

parcialmente O-

metilados

(1)

MG SM-MG

Tipo de ligação

(2)

2,3,4,6-Me

-Man

36,0

Manp-(1→

2,3,4-Me

-Gal

28,7

54,0

6→)-Galp-(1→

3,4-Me

-Gal

35,3

46,0

2,6→)-Galp-(1→

(1) Analisado em GC-MS após metilação, hidrólise ácida total, redução (NaB

) e acetilação.

(2) Baseado nos derivados acetilados parcialmente O-metilados.

Essa fração também foi analisada por RMN-

C (Figura 11a),

H (Figura 12a)

e HSQC (Figura 12b). O espectro de HSQC apresentou sinais na região anomérica

em δ 103,9/4,84; 101,0/5,18 e 100,6/5,19; 100,4/5,03, correspondentes aos C1/H1

das unidades de manose, galactose 2,6-di-O-substituída e galactose

6-O-substituída, respectivamente. O experimento de RMN-

C-DEPT apresentou a

SCW

inversão do sinal em δ 69,1, confirmando a presença de CH

ligado (dado não

apresentado).

As configurações glicosídicas foram confirmadas pelos valores de

C e

da constante de acoplamento J

C-1,H-1

, observados no HSQC acoplado. Sendo a

configuração β para as unidades de manose sugerida pelo sinal de H-1 em campo

alto (δ 4,84), estando de acordo com o valor da constante igual a 160 Hz (PERLIN;

CASU, 1969). Os sinais de H-1 em campo baixo (δ 5,19; 5,18 e 5,03) mostram uma

C-1,H-1

igual a 170 Hz, indicando configuração do tipo α para as unidades de Galp e

3-O-Me-Galp, confirmada pelos sinais de C-1 em campo mais alto no RMN-

O sinal observado em δ 79,4 refere-se ao C-2 das unidades de galactose

2,6-di-O-substituídas, confirmando a substituição em O-2 pelos terminais não

redutores de manose. Sinais em δ 58,7/3,48 e 59,0/3,51 confirmam a presença do

grupo metil na molécula, juntamente com o sinal em δ 81,4/3,58 referente ao C3/H3

das unidades de Me-Gal 6-O-substituída. Também foi possível fazer os seguintes

assinalamentos para as unidades de β-

-manp: δ 72,8 (C-2); 75,5 (C-3);

69,4 (C-4); 78,6 (C-5); 63,6 (C-6).

A correlação das áreas na região anomérica do espectro de RMN-

H confirma

a proporção de 1,23 α-

-Galp 6-O-substituída para 1,00 α-

-Galp

2,6-di-O-substituída, estando de acordo com os dados de metilação.

Figura 11 – Espectro de RMN-

C (A) da fração MG e RMN-

C (B) da fração MG após hidrólise

parcial com H

(em D

O a 70 ºC) obtida de P. pulmonarius

100

700

ppm

79,4

81,4

75,5

63,6

59,0

103,9

100,6

100,4

80,6

78,6

101,0

58,7

75,9

72,8

72,0

69,4

69,1

100

700

ppm

79,2

81,4

75,7

63,3

62,6

71,5

58,3

73,0

72,2

71,0

70,5

100,8

103,9

68,4

Figura 11 – Espectro de RMN-

C (A) da fração MG e RMN-

C (B) da fração MG após hidrólise

parcial com H

(em D

O a 70 ºC) obtida de P. pulmonarius (continuação)

Figura 12 – Região anomérica dos espectros de RMN-

H (A) e HSQC (B) da fração MG (em D

O a 70

ºC) obtida de P. pulmonarius

Para obter mais informações sobre a cadeia principal dessa manogalactana,

uma alíquota (200 mg) da amostra MG foi submetida a uma hidrólise parcial

(subitem 3.4.5), que após analisada por RMN-

C apresentou um espectro com

sinais de menor intensidade, referentes às unidades de β-

-Manp e, sinais mais

intensos correspondentes a α-

-Galp e a 3-O-Me-α-

-Galp (Figura 11b). Confirmou-

2,6→

→→

→)-Galp-(1→

→→

→

→→

→

)-Galp-(1

→

→→

→

Manp-(1→

→→

→

ppm

4.8

4.9

5.0

5.1

5.2

ppm

99.0

99.5

100.0

100.5

101.0

101.5

102.0

102.5

103.0

103.5

104.0

104.5

105.0

105.5

106.0

106.5

2,6→

→→

→)-Galp-(1→

→→

→

6→

→→

→)-Me-Galp-(1→

→→

→

Manp-(1

→

→→

→

6→

→→

→)-Galp-(1→

→→

→

se a presença das unidades de manose como terminais não redutores, ligados a

uma cadeia principal composta por galactose e 3-O-Me-Galp.

Considerando que as substituições podem estar ocorrendo tanto nas

unidades de galactose, como 3-O-Me-Galp, uma alíquota da amostra MG (150 mg)

foi submetida a uma oxidação com periodato de sódio (NaIO

), seguida de redução

com borohidreto de sódio (NaBH

). Esse procedimento, quando seguido de uma

hidrólise branda, degrada moléculas que apresentam hidroxilas vicinais, como é o

caso de polissacarídeos com ligações (1→2), (1→4) e (1→6). Entretanto, a molécula

em estudo apresenta, em sua cadeia principal, algumas unidades de galactose

substituída por um grupo metil na posição O-3, sendo esse fragmento resistente à

oxidação com NaIO

(Figura 13 e 14). Verificando-se essa propriedade, optou-se por

fazer uma metilação e derivatização em uma alíquota (20 mg) da amostra oxidada e

reduzida (SM-MG) para análise em GC-MS (DONG et al., 2002). Esse procedimento

permitiu observar que algumas unidades de 3-O-Me-Galp estavam substituídas em

O-2 por terminais não redutores de manose na proporção de 1,2:1,0 (Me-Gal não

substituída:Me-Gal substituída). Esse resultado também mostrou que, de acordo

com a quantidade de manose presente na molécula (31,6%), apenas ~6% está

substituindo as unidades de Me-Gal, enquanto 26% está ligado às unidades de

galactose. Esses dados podem ser melhor observados na figura 13. Os resultados

observados corroboram para uma manogalactana com uma cadeia principal

composta por unidades de 3-O-Me-α-

-Galp e α-

-Galp (1→6)-ligadas, sendo que

ambas as unidades podem estar substituídas em O-2 por terminais não redutores de

β-

-Manp.

Figura 13 – Esquema Representativo da Degradação de Smith (modificada) realizada na amostra MG

HOH

C O

HOH

C O

HOH

C O

HOH

C O

HOH

C O

HOH

OHC O

OHC

OHC O

OHC

OHC O

OHC

OHC O

OHC

OHC O

OHC

−

NaBH

Metilação

Hidrólise, Redução e Acetilação

Derivados de acetatos de alditóis

parcialmente O-metilados

Figura 14 – Derivados obtidos da Degradação de Smith (modificada) realizada na amostra MG

Estruturas semelhantes foram descritas para Pleurotus ostreatus e Pleurotus

ostreatoroseus (JAKOVLJEVIC et al., 1998; ROSADO et al., 2003). A presença do

grupo metil ligado aos polissacarídeos parece ser característica do gênero

Pleurotus, observando que α-galactanas parcialmente metiladas com cadeias

lineares similares à cadeia principal do polímero caracterizado no presente trabalho

também foram isoladas de P. eryngii e P. ostreatoroseus (CARBONERO et al.,

2007). Este último, quando cultivado em meio líquido, produz α-galactanas lineares

e, parcialmente metiladas, sendo as unidades (1→4)-ligadas (ROSADO et al., 2002).

Heteropolissacarídeos com a mesma cadeia principal, porém sem substituição por

grupos metil e com diferentes componentes nas cadeias laterais, foram isolados de

Armillaria mellea, Flammulina velutipes e Laetiporus sulphureus (FRASER;

LINDBERG, 1967; SMIDERLE et al., 2007; ALQUINI et al., 2004). Também foi

descrita uma heterogalactana parcialmente metilada para a espécie

Armillaria mellea. Entretanto, a estrutura desse polímero não é detalhada

(BOUVENG; FRASER; LINDBERG, 1967).

Derivados originados

do fragmento 1

Derivados originados

dos fragmentos 2 e 6

Derivado originado do

fragmento 3

Derivados originados

do fragmento 4

Derivado originado do

fragmento 5

OMe

CHOAc

OMe

CHOAc

OMe

OAc

CHOAc

OMe

CHOAc

OMe

OAc

CHOAc

OMe

CHOAc

OMe

CHOAc

CHOMe

CHOAc

OAc

CHOAc

CHOMe

CHOAc

OAc

4.2 EXTRATO AQUOSO A QUENTE

A fração polissacarídica (HW) originada da extração aquosa a quente foi

fracionada pelo processo de congelamento e degelo originando duas novas frações:

solúvel (SHW) e insolúvel (PHW) em água fria.

A fração PHW, composta por xilose (2,4%), manose (4,6%), galactose (3,2%)

e glucose (89,8%), apresentava consistência de gel, sendo, portanto, realizado um

tratamento com hidróxido de sódio 2% (NaOH), a 80 ºC, por 2-3 horas. Esse

procedimento facilita a re-solubilização da amostra em água, devido a uma provável

descomplexação das moléculas presentes na mesma. Após neutralização com ácido

acético e diálise (~12 horas; 12-14 kDa), o material foi submetido novamente ao

processo de congelamento e degelo originando uma fração sobrenadante

S-PHW (0,4%) e uma fração precipitada P-PHW (0,04%). A fração S-PHW

apresentou glucose como principal componente monossacarídico, e a análise de

metilação apresentou os seguintes derivados metilados: 2,3,4,6-Me

-Glc (20%),

2,4,6-Me

-Glc (58%) e 2,4-Me

-Glc (22%). Esses resultados sugerem a presença de

uma glucana ramificada, a qual apresenta ligações (1→3) e (1→6).

Foram realizados experimentos de RMN-

C e HMQC (Figura 15 e 16,

respectivamente), cujos espectros mostraram sinais referentes aos de uma

β-glucana. O espectro de HMQC apresentou sinais na região anomérica em

δ 103,0/4,44 e 103,0/4,15 referentes às unidades de β-

-Glcp-(1→3)-ligadas e

β-

-Glcp 3,6-di-O-substituídas, respectivamente. A configuração β das unidades de

glucose é dada pelos sinais de C-1 em campo baixo, característicos das β-glucanas.

Os sinais em δ 86,0; 86,2 e 86,5 correspondem ao C-3 ligado das unidades da

cadeia principal. Sinais de -CH

livre (δ 60,8; 60,9; 61,2) e -CH

substituído (δ 68,3)

também foram observados, confirmando os dados de metilação quanto à presença

de substituição em O-6. Tendo como objetivo elucidar a cadeia principal dessa

molécula, a fração S-PHW (150 mg) foi submetida ao procedimento de degradação

controlada de Smith. Foi realizado um RMN-

C do material resistente, o qual

apresentou apenas seis sinais referentes à cadeia principal: δ 102,9 (C-1);

86,2 (C-3); 76,4 (C-5); 72,9 (C-2); 68,5 (C-4) e 61,0 (C-6). Os resultados observados

sugerem a presença de uma β-glucana com cadeia principal ligada (1→3), sendo as

unidades de β-

-Glcp substituídas em O-6, a cada três unidades da cadeia principal,

por terminais não redutores de β-

-Glcp, caracterizando um polissacarídeo similar a

lentinana (Figura 17).

Figura 15 – Espectro de RMN-

C da fração S-PHW (em Me

SO-d

a 70 ºC) obtida de P. pulmonarius

Figura 16 – Espectro de HMQC da fração S-PHW (em D

O a 70 ºC) obtida de P. pulmonarius

86,5

86,2

86,0

76,6

76,4

76,1

74,8

73,6

72,8

61,2

60,8

103,0

72,6

60,9

70,3

68,5

103,0/4,15

103,0/4,44

86,5;86,2/3,41

76,4/3,19

76,6/3,05

74,8/3,42

72,6/3,24

73,6/3,00

70,3/3,04

68,5/3,20

68,3/3,98

68,3/3,48

60,9/3,62

60,9/3,40

Figura 17 – Estrutura da β-glucana obtida do basidioma de P. pulmonarius

β-Glucanas são comumente encontradas em basidiomicetos. Estruturas muito

semelhantes a esta foram descritas para Flammulina velutipes (SMIDERLE et al.,

2006) e Pleurotus ostreatus (YOSHIOKA et al., 1985). Polissacarídeos com a

mesma cadeia principal, mas substituídos em O-6 por terminais não redutores de

β-

-Glcp, a cada duas unidades da cadeia principal, também foram extraídos de

Boletus erythropus (CHAUVEAU et al., 1996), P. eryngii e P. ostreatoroseus

(CARBONERO et al., 2006). Lentinana é um polissacarídeo constituinte da parede

celular do basidioma e do micélio de fungos. É uma molécula com alta massa

molecular, solúvel em água, resistente ao calor e a pH ácido, mas lábil em pH

básico. Sua conformação em tripla-hélice sugere que este é um fator importante

para seu efeito bioativo (ROWAN; SMITH; SULLIVAN, 2003). Pesquisadores têm

observado que esse polímero demonstra um efeito antitumoral, mas não age

diretamente sobre as células cancerígenas. Ao contrário de outras moléculas

bioativas, a lentinana ativa diferentes tipos de resposta do sistema imune do

hospedeiro, provocando a diminuição de tumores (WASSER; WEIS, 1999; ROWAN;

SMITH; SULLIVAN, 2003; ZHANG et al., 2007).

4.3 EXTRATO ALCALINO

A fração K1 obtida da extração alcalina (KOH 1%) foi submetida ao

procedimento de congelamento e degelo, obtendo-se uma fração solúvel (SK1) e

uma fração insolúvel (PK1) em água fria. Ambas apresentaram-se compostas por

aproximadamente 90,0% de glucose, sendo SK1 escolhida para a purificação,

devido a maior solubilidade em H

O. Iniciou-se o tratamento com solução de Fehling,

o qual foi repetido por 3 vezes para garantir que houvesse total separação das

frações sobrenadante (SF-SK1) e precipitado (PF-SK1) de Fehling.

A fração SF-SK1 apresentou um perfil heterogêneo quando analisada por

HPSEC-MALLS, sendo, portanto, submetida ao processo de ultrafiltração por

membranas de 300 kDa, 30 kDa e 10 kDa, sequencialmente. A amostra eluída

(SF-GLC) pelas três membranas foi dialisada em membrana de 16 kDa e apresentou

perfil de eluição homogêneo por HPSEC-MALLS. A figura 19 apresenta o perfil de

eluição da amostra SF-SK1, da amostra eluída pela membrana de 30 kDa

(30SF-SK1) e da amostra purificada (SF-GLC). Análises de GC-MS (Tabela 6),

HPSEC-MALLS (Figura 18) e RMN-

C (Figura 19A) sugerem que a fração SF-SK1

é composta por glucanas com estruturas similares, as quais apresentam massas

molares diferentes.

Figura 18 – Perfil de eluição das frações SF-SK1, 30SF-SK1 e SF-GLC (solubilizadas em nitrito de

sódio 0,1 mol/l, contendo azida sódica) obtido por HPSEC-MALLS

Tabela 6 – Análise da composição monossacarídica das frações bruta (SF-SK1) e após ultrafiltrações

Composição Monossacarídica (%)

(1)

Frações Rendimento %

Xyl Man Gal Glc

SF-SK1 1,6 Tr.

(4)

3,3 Tr.

(4)

96,0

30SF-SK1

(2)

0,6 Tr.

(4)

4,0 2,0 93,0

10SF-SK1

(3)

0,2 - Tr.

(4)

Tr.

(4)

97,0

(1) Analisado em GC-MS após hidrólise ácida total, redução e acetilação.

(2) Fração SF-SK1 eluída pela membrana de 30 kDa.

(3) Fração 30SF-SK1 eluída pela membrana de 10 kDa.

(4) Traços.

SF-SK1

30SF-SK1

SF-GLC

A fração PF-SK1 mostrou-se composta por 90,0% de glucose, sendo

posteriormente denominada PF-GLC. Devido ao seu baixo rendimento (Tabela 4),

PF-GLC não foi submetida a novos processos de purificação.

Analisando os espectros de RMN-

C das frações SF-GLC e PF-GLC é

possível notar que ambos apresentam os mesmos sinais (Figura 20), sugere-se,

entretanto, que são moléculas diferentes considerando que apenas PF-GLC

precipita quando tratada com solução de Fehling. Pode-se observar que ambas são

constituídas por ligações (1→3) e (1→6), devido à presença dos sinais em δ 84,8 e

84,6 e sinais em δ 68,9 e 68,7, respectivamente.

Figura 19 – Espectro de RMN-

C das frações SF-GLC (A) e PF-GLC (B) (em D

O a 70 ºC) obtidas do

basidioma de P. pulmonarius, após extração alcalina

84,8

75,0

75,8

73,1

72,7

60,9

69,8

102,9

73,6

68,9

68,3

84,7

74,8

75,6

73,0

72,5

60,7

68,7

102,7

73,4

69,7

68,2

Os sinais em δ 102,9 e 102,7, referentes ao C1 das unidades de glucose,

sugerem configuração do tipo β. O espectro de HMQC (Figura 20) da fração SF-GLC

confirmou esses dados, além de mostrar a sobreposição de sinais na região

anomérica (102,5/4,78; 102,5/4,56; 102,9/4,73 e 102,9/4,53), caracterizando uma

molécula ramificada. Os sinais de CH

livre (δ 60,8/3,93; 60,8/3,76) e

(δ 68,9/3,87) substituído também foram assinalados.

Figura 20 – Espectro de HMQC da fração SF-GLC (em D

O a 70 ºC) obtida do basidioma de P.

pulmonarius, após extração alcalina

Foi realizada análise de metilação (Tabela 7) das frações SF-GLC e PF-GLC,

tornando possível uma comparação mais detalhada sobre a estrutura dessas

moléculas. A glucana presente na fração SF-GLC apresentou maior proporção de

ligações (1→3) que a glucana presente em PF-GLC, demonstrado pela presença

dos derivados 2,4,6-Me

-Glc e 2,4-Me

-Glc. Além disso, PF-GLC contém mais

ligações (1→6), sendo parte dessas unidades substituídas também em O-2,

O-3 ou O-4. Sendo assim, esta fração deixa mais expostas as hidroxilas vicinais

102,5/4,78

102,5/4,56

102,9/4,73

102,9/4,53

84,9/3,76

73,2/3,37

75,6/3,53

74,9/3,64

72,9/3,64

69,8/3,47

68,2/3,56

69,8/3,63

60,8/3,76

60,8/3,93

68,9/3,87

presentes nas unidades monossacarídicas (1→6)-ligadas, facilitando a formação de

complexos com o cobre.

Tabela 7 – Análise de metilação das frações SF-GLC e PF-GLC obtidas do basidioma P.

pulmonarius, após extração alcalina

Mol%

Acetatos de alditóis

parcialmente O-

metilados

(1)

SF-GLC PF-GLC

Tipo de ligação

(2)

2,3,4,6-Me

-Glc

Glcp-(1→

2,4,6-Me

-Glc

3→)-Glcp-(1→

2,3,4-Me

-Glc

6→)-Glcp-(1→

2,4-Me

-Glc

3,6→)-Glcp-(1→

3,4-Me

-Glc

2,6→)-Glcp-(1→

2,3-Me

-Glc

4,6→)-Glcp-(1→

(1) Analisado em GC-MS após metilação, hidrólise ácida total, redução e acetilação.

(2) Baseado nos derivados acetilados parcialmente O-metilados.

Os polissacarídeos mais isolados de basidiomicetos são β-glucanas com

ligações (1→3) e (1→6), podendo apresentar alternância entre essas ligações ou se

diferenciar de acordo com a cadeia principal (1→3) ou (1→6)-ligadas. Glucanas em

configuração α também já foram descritas embora as primeiras sejam as mais

estudadas. As massas moleculares também podem variar, mostrando que há grande

diversidade com relação ao tamanho e conformação desses polissacarídeos

(ZHANG et al., 2007). A tabela 8 descreve as características de algumas glucanas

isoladas.

Tabela 8 – Estruturas de diferentes glucanas isoladas de basidiomicetos

(1)

BASIDIOMICETO CADEIA PRINCIPAL RAMIFICAÇÃO

Lentinus edodes

(1→3)-β-

-glucana (1→6)-β-

5 x 10

Pleurotus tuber-regium

(1→3)-β-

-glucana (1→6)-β-

2 x 10

Auricularia aurícula

(1→3)-β-

-glucana

Linear -

Armillariella tabescens

(1→6)-β-

-glucana

Linear -

Poria cocos

(1→3)-β-

-glucana (1→6)-β-

1 x 10

Poria cocos

(1→3)-β-

-glucana (1→2)-β-

1 x 10

Armillariella tabescens

(1→3)-α-

-glucana

Linear -

Amanita muscaria

(1→6)-α-

-glucana (1→4)-α-

Agaricus blazei

(1→6)-β-

-glucana (1→4)-α-

Agaricus blazei

(1→3)-α-

-glucana (1→6)-β-

(1) Dados retirados de ZHANG et al., 2007.

Os dados obtidos para as frações estudadas (SF-GLC e PF-GLC) sugerem

que ambas apresentam unidades de β-

-Glcp ligadas (1→3) e (1→6), em diferentes

proporções. Sugere-se que a fração PF-GLC apresenta uma conformação que deixa

mais expostas as hidroxilas vicinais das unidades de β-

-Glcp-(1→6)-ligadas,

permitindo a precipitação com solução de Fehling. A fração SF-GLC é constituída

por uma β-glucana com alto teor de ligações (1→3), sugerido pela presença dos

derivados 2,4,6-Me

-Glc (23%) e 2,4-Me

-Glc (23%).

4.4 PARÂMETROS NUTRICIONAIS

Tendo em vista que P. pulmonarius é um cogumelo comestível, seu conteúdo

nutricional foi avaliado (IAL, 2005), revelando que esse basidiomiceto apresenta

teores de carboidratos, proteínas e cinzas em altas concentrações, sendo esses

valores semelhantes aos resultados obtidos por Manzi e colaboradores (1999). Além

disso, o baixo teor de lipídeos faz dos cogumelos em geral, alimentos mais

saudáveis (Tabela 9). Esses resultados estão de acordo quando comparados com

outras espécies de Pleurotus (GUO; LIN; LIN, 2007).

Tabela 9 – Análise dos parâmetros nutricionais de P. pulmonarius

Quantidade em %

Nutriente

P. pulmonarius Pleurotus spp.

(2)

Carboidratos Totais

(1)

54 46-59

Proteínas

(1)

14,7 15-30

Lipídeos

(1)

1,8 2-7

Cinzas

(1)

6,3 4-6

Umidade 91 82-91

(1) Quantificação baseada no peso seco.

(2) Baseado em GUO; LIN; LIN, 2007.

O alto teor de cinzas na amostra sugere a presença de minerais, os quais

foram analisados e estão descritos na tabela 10.

Tabela 10 – Análise do conteúdo de minerais presentes em P. pulmonarius

Elemento mineral Quantidade (mg/kg)

(1)

Cálcio

6,24 ± 0,4

Cobre

0,22 ± 0,111

Magnésio

13,15 ±1,46

Manganês

0,14 ± 0,111

Zinco

0,91 ± 1,111

Silício

0,55 ± 0,4

Alumínio

< 0,50 ± 0,151

Cromo < 0,20

Ferro < 0,29

Cádmio < 0,50

Niquel < 0,10

(1) Analisado por absorção atômica, STHANDARD METHODS, 1998.

Alguns dos minerais encontrados destacam-se pela importância e quantidade

observada. Dentre eles podem ser citados, principalmente, cálcio e magnésio. O

cálcio, além de principal constituinte do esqueleto, exerce importantes ações

fisiológicas, sendo essencial para a integridade funcional dos sistemas nervoso e

muscular. O cálcio é necessário para a transmissão nervosa e a função cardíaca

normal. As contrações rítmicas e o relaxamento do miocárdio dependem das

concentrações apropriadas de cálcio, sódio, potássio e magnésio no fluido

extracelular. Também está associado a algumas proteínas presentes no

citoesqueleto, estrutura de grande importância para a manutenção da forma e

movimentos celulares (ANGELIS, 1979; BRODY, 1994).

A quantidade diária de magnésio necessária ao corpo humano é 4,5 mg/Kg.

Este é o mais abundante dos cátions bivalentes intracelulares. O magnésio ativa

várias enzimas, tais como a fosfatase alcalina e enzimas que utilizam ATP, sendo

necessário a mais de 300 processos biológicos, incluindo a contração muscular,

transporte através de membranas, ativação de aminoácidos, geração e transmissão

dos impulsos nervosos, entre outros (ANGELIS, 1979).

Outros minerais encontrados, apesar de presentes em pequenas

quantidades, são essenciais ao organismo, como zinco que, no organismo, está

associado à anidrase carbônica, enzima que mantém o equilíbrio entre gás

carbônico e ácido carbônico nos eritrócitos; cobre, que por sua vez intervêm na

síntese do heme e na atividade de enzimas ferro-porfirino-protéicas, no metabolismo

da glicose e da liberação de energia, na formação de fosfolipídios para a

mielinização das paredes dos nervos, na manutenção da pigmentação e na

formação da elastina do tecido conectivo (ANGELIS, 1979).

O teor de proteínas desse basidiomiceto mostrou-se alto, portanto foi

realizada análise para determinação dos aminoácidos constituintes dessas proteínas

(Tabela 11). A partir desses resultados, foi possível observar a presença de seis

aminoácidos essenciais: isoleucina, leucina, lisina, fenilalanina, treonina e valina. A

ingestão desses aminoácidos torna-se importante, uma vez que eles não são

sintetizados pelo organismo nem armazenados como tais, mas são metabolizados

ou incorporados em proteínas que apresentam diversas funções no organismo

(ANGELIS, 1979).

Tabela 11 – Análise do conteúdo de aminoácidos presentes em P. pulmonarius

Aminoácido Mol %

(1)

Alanina 9,3

Glicina 3,7

Valina 5,0

Isoleucina 0,8

Leucina 12,7

Treonina 6,6

Prolina 8,6

Asparagina/ Aspartato

(2)

27,6

Glutamina / Glutamato

(2)

15,3

Fenilalanina 9,6

Tirosina 0,6

Lisina 0,3

(1) Hidrolisado e acetilado para análise em GC-MS.

(2) Valores detectados em conjunto.

Os nutrientes analisados podem variar conforme o substrato utilizado para o

cultivo do cogumelo. Bonatti e colaboradores (2004) observaram que tanto para

P. ostreatus quanto para P. sajor-caju houve diferenças em alguns dos parâmetros

nutricionais avaliados, quando o cultivo ocorreu em arroz ou em banana como

substratos. Quando cultivados em banana, o teor protéico de ambos os cogumelos

aumentou de 13 para, aproximadamente, 17 g/%. A quantidade de cinzas também

variou, apresentando maior quando o cultivo foi realizado em arroz

(+ 0,45-0,55). A taxa de lipídios diminuiu para P. ostreatus (− 0,35) e aumentou para

P. sajor-caju (+ 0,27) quando cultivados em banana. Esses dados mostram que o

valor nutricional dos basidiomicetos pode variar de acordo com o substrato utilizado,

sendo de grande importância levar em consideração as condições de cultivo quando

se deseja avaliar parâmetros nutricionais ou utilizar este basidiomiceto para

complementação ou fonte nutricional.

4.5 ENSAIO BIOLÓGICO DA MANOGALACTANA ISOLADA DE P. pulmonarius

Considerando que os polissacarídeos isolados de basidiomicetos estão sendo

bastante estudados com relação às suas propriedades antitumorais e que há outros

efeitos que podem ser atribuídos a essas moléculas, como citado anteriormente

(item 1.4.3), optou-se por avaliar as propriedades antinociceptiva e antiinflamatória

da manogalactana isolada no presente trabalho. Para isso, foi utilizado o método de

reação de contração muscular induzida por ácido acético, com o qual é possível

verificar ambos os efeitos.

Esse método consiste na administração de ácido acético (0,6% i.p.) aos

camundongos, causando lesão aos tecidos e desenvolvimento de uma resposta

inflamatória e dolorosa. A sensação dolorosa é observada através das contrações

abdominais exercidas pelos camundongos logo após a injeção de ácido. Sendo que

o efeito analgésico nos animais tratados é dado pela diminuição do número dessas

contrações durante um período de 20 min.

A resposta inflamatória é avaliada tanto pelo aumento na permeabilidade

capilar peritoneal, quanto pela migração de leucócitos à cavidade peritoneal. Após o

experimento, os animais foram sacrificados e a cavidade peritoneal foi exposta a fim

de observar o extravasamento do corante e fazer a contagem de leucócitos

presentes no tecido.

A administração da amostra de polissacarídeos MG (3-30 mg/kg, i.p.) 30 min

antes da injeção de ácido acético, causou uma inibição dose-dependente à resposta

nociceptiva induzida pelo ácido. A dose necessária para inibir 50% das contrações

(Dose efetiva 50 – ID

) foi de 16,2 (14,7-17,7) mg/kg, sendo a inibição de 93 % para

uma dose de 30 mg/kg. Os controles positivos dexametasona (2 mg/kg, s.c.) e

indometacina (10 mg/kg, i.p.) inibiram o número de contrações em 30 e 92 %,

respectivamente (Figura 21a). Pode-se observar que a maior dose de MG inibiu

maior quantidade de contrações que a indometacina.

Com relação à atividade antiinflamatória, MG (3-30 mg/kg) e indometacina

(10 mg/kg, i.p.) não inibiram a infiltração de leucócitos (migração de células totais)

induzida pelo ácido administrado, sendo que a dexametasona (2 mg/kg, s.c.) reduziu

a migração em 92 % (Figura 21b). A manogalactana testada e a dexametasona

também não reduziram a permeabilidade capilar peritoneal (extravasamento de

Evans Blue), enquanto a indometacina a inibiu em 82 % (Figura 21c). Esses

resultados são coerentes, sabendo-se que a dexametasona inibe a liberação de

citocinas pró-inflamatórias que podem atrair leucócitos para os tecidos

(quimiocinese) e, a indometacina inibe a produção de prostaglandinas, as quais

aumentam a permeabilidade capilar (VINEGAR et al., 1979).

Figura 21 – Efeito pela administração i.p. de MG (3-100 mg/kg) em contração abdominal induzida por

ácido acético (A), infiltração de leucócitos (B) e extravasamento de Evans Blue (C) em camundongos

Sal C Dexa Indo 3 10 30

MG-PP mg/kg, i.p.

Acetic Acid (0.6%, 450 µ

µµ

µl, i.p.)

***

Number of Writhes

Sal C Dexa Indo 3 10 30

MG-PP mg/kg, i.p.

Acetic Acid (0.6%, 450 µ

µµ

µl, i.p.)

***

Total Leukocytes (x 10

)

Sal C Dexa Indo 3 10 30

0.0

2.5

5.0

7.5

Acetic Acid (0.6%, 450 µ

µµ

µl, i.p.)

MG-PP mg/kg, i.p.

Evan's Blue Dye (

g/ml)

***

Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão; n = 6-8 animais por grupo. **P < 0.01,

***P < 0.001 vs. controle (C), e

P < 0.001 vs. salina (Sal), ANOVA seguido por Teste de Newman-

Keuls.

Esses dados indicam que o tratamento intraperitoneal com a manogalactana

isolada de P. pulmonarius promoveu inibição acentuada e dose-dependente da

resposta nociceptiva induzida pela administração de ácido acético, ou seja, o

polissacarídeo obtido apresentou efeito analgésico, porém não induziu resposta

antiinflamatória. Ainda não se sabe qual o mecanismo de ação do polissacarídeo

testado, entretanto sugere-se que seja diferente dos mecanismos de ação da

dexametasona e da indometacina, pois estas atuam sobre os mediadores

pró-inflamatórios, o que não foi observado para a manogalactana.

Há poucos relatos sobre polissacarídeos com atividade antiinflamatória e

analgésica, entretanto, deve-se considerar a diversidade de estruturas

Nº. de Contrações

Leucócitos Totais

(x10

)

Evans Blue (

g/ml)

Ácido Acético

(0,6%, 450

l, i.p.)

Ácido Acético

(0,6%, 450

l, i.p.)

Ácido Acético

(

0,6%, 450

l, i.p.)

polissacarídicas existentes em basidiomicetos e, que muitas delas apresentam

efeitos biológicos diversos (ZHANG et al., 2007), podendo-se ampliar o estudo sobre

as aplicações dessas moléculas.

5 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos para os extratos aquosos I e II e extrato alcalino

provenientes do basidioma de Pleurotus pulmonarius sugerem as seguintes

estruturas para os polissacarídeos isolados:

a) Manogalactana com uma cadeia principal composta por unidades de

3-O-Me-α-

-Galp e α-

-Galp (1→6)-ligadas, sendo que ambas as

unidades podem estar substituídas em O-2 por terminais não redutores de

β-

-Manp.

b) β-glucana com cadeia principal ligada (1→3), sendo as unidades de

β-

-Glcp substituídas em O-6, a cada três unidades da cadeia principal,

por terminais não redutores de β-

-Glcp.

c) Duas β-glucanas com diferentes proporções de ligações (1→3) e (1→6),

sendo que ambas apresentam o mesmo espectro de RMN-

C, mas

reagem diferentemente à precipitação com solução de Fehling.

A avaliação nutricional realizada mostra que esse cogumelo é uma fonte de

nutrientes de boa qualidade, considerando o alto teor de proteínas e aminoácidos

essenciais e, minerais como cálcio e magnésio, além de baixas taxas de lipídios.

Por fim, a manogalactana isolada no presente trabalho apresentou um efeito

analgésico, mas não apresenta resposta antiinflamatória, quando avaliada em teste

de contração muscular induzida por ácido acético.

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