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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Caracterização do comportamento alimentar de Bucephalogonia xanthophis
(Berg) (Hemiptera: Cicadellidae) em citros e suas implicações na transmissão
de Xylella fastidiosa
Marcelo Pedreira de Miranda
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Ciências. Área de concentração:
Entomologia
Piracicaba
2008
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4
Marcelo Pedreira de Miranda
Engenheiro Agrônomo
Caracterização do comportamento alimentar de Bucephalogonia xanthophis (Berg)
(Hemiptera: Cicadellidae) em citros e suas implicações na transmissão de Xylella fastidiosa
Orientador:
Prof. Dr. JOÃO ROBERTO SPOTTI LOPES
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Ciências. Área de concentração:
Entomologia
Piracicaba
2008
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Dedico
Aos meus Pais, Artur e Lia,
Por me ensinarem o caminho da honestidade, responsabilidade e
sobretudo pelo amor e constante apoio
Ofereço
Aos meus irmãos Leonardo e Felipe
4
AGRADECIMENTOS
À Deus, por sempre estar ao meu lado iluminando e guiando o meu caminho.
Ao Prof. Dr. João Roberto Spotti Lopes, pela orientação, amizade, e confiança,
demonstrados durante seis anos de pó-graduação, fatores estes que seguramente foram
imprescindíveis para a concretização deste trabalho e para minha formação profissional.
Ao Dr. Alberto Fereres (ICA/CSIC, Madrid), pela amizade, receptividade e ensinamentos,
os quais foram fundamentais para a realização deste trabalho.
Ao Dr. Ernesto Prado, pelas sugestões e auxílios, essenciais para implantação e
desenvolvimento deste trabalho.
À Profa. Dra. Beatriz Appezzato-da-Glória, pela orientação e por disponibilizar seu
laboratório para realização dos estudos histológicos.
Aos professores do Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da
ESALQ/USP, pelos ensinamentos transmitidos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
concessão da bolsa de estudos e apoio financeiro para realização deste trabalho.
Aos amigos de República: Edmilson S. Silva, Laércio A. de Carvalho, Genelício R.
Cruzoé, Geraldo J. N. de Vasconcelos, Rodrigo N. Marques, Fernando S. Rodrigues, Eduardo V.
Primiano, Daniel F. Ferreira, Alberto D.G. Alvarado, John J. S. Ausique e Samuel Roggia pelos
momentos de descontração, sugestões e auxílio durante o curso.
5
Ao casal de amigos e irmãos Edmilson S. Silva e Jurema R. Q. Silva pelo carinho
demonstrado durante os quatro anos de convivência em Piracicaba.
Aos “tios” Pacheco, Vera, Altamiro, Glorinha e “primos” Cyntia, Verena, Cristiane, Mario
e Gabriel pelos raros, porém bons momentos de descontração durante estes anos em São Paulo.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Insetos Vetores: Alexandre, Cristiane, Cristiane
Lima, Danilo, Daniele, Érica, Fernanda, Fernando, Eduardo, Flávio, Joyce, Lucas, Maria Teresa,
Patrick, Rodrigo, Simone, Teresinha, e Rudiney pela convivência harmoniosa que foram
imprescindíveis para a concretização deste trabalho.
Aos amigos da boa terra: Bruno, Melissa, Tales, Amâncio, Taís, Rose, Alex, Suane pela
amizade, ajuda e momentos de descontração.
Aos colegas e amigos do ICA/CSIC, Madri: Ainoa, Assusena, Beatriz, Elisa, Emilio, Javi,
Juan, Mônica, Nacho, Mar, Maria, Marina, Saioa, Poti e Victor, pela receptividade, ajuda na
condução dos trabalhos e amizade.
Às bibliotecárias Silvia M. Zinsly e Eliana M. Garcia, pela colaboração na correção das
referências bibliográficas e normas da tese.
Aos amigos da Pós-graduação em Entomologia, pelo companheirismo e momentos de
descontração.
Aos funcionários do Setor de Entomologia da ESALQ/USP, pela amizade e apoio na
condução dos trabalhos.
.
6
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................................... 8
ABSTRACT................................................................................................................................ 9
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................................
10
Referências.................................................................................................................................. 14
2 LOCAIS E PERÍODO DE ALIMENTAÇÃO DA CIGARRINHA VETORA DE Xylella
fastidiosa, Bucephalogonia xanthophis (BERG) (HEMIPTERA: CICADELLIDAE), EM
MUDAS CÍTRICAS................................................................................................................... 17
Resumo........................................................................................................................................ 17
Abstract....................................................................................................................................... 17
2.1 Introdução............................................................................................................................. 18
2.2 Desenvolvimento................................................................................................................... 19
2.2.1 Material e Métodos.............................................................................................................
20
2.2.2 Resultados e Discussão...................................................................................................... 21
2.3 Conclusão.............................................................................................................................. 26
Referências.................................................................................................................................. 26
3 CARACTERIZAÇÃO DOS PADRÕES DE “ELECTRICAL PENETRATION GRAPHS”
(EPG) DE Bucephalogonia xanthophis (BERG) (HEMIPTERA: CICADELLIDAE),
VETOR DE Xylella fastidiosa EM CITROS..............................................................................
30
Resumo........................................................................................................................................ 30
Abstract....................................................................................................................................... 30
3.1 Introdução..............................................................................................................................
31
3.2 Desenvolvimento................................................................................................................... 32
3.2.1 Material e Métodos.............................................................................................................
32
3.2.2 Resultados.......................................................................................................................... 35
3.2.3 Discussão........................................................................................................................... 38
Referências.................................................................................................................................. 49
4 ASSOCIAÇÃO DE ATIVIDADES ESTILETARES DA CIGARRINHA Bucephalogonia
xanthophis (Berg) (Hemiptera: Cicadellidae) COM A TRANSMISSÃO DE Xylella
fastidiosa EM CITROS............................................................................................................... 54
Resumo........................................................................................................................................ 54
7
Abstract....................................................................................................................................... 54
4.1 Introdução..............................................................................................................................
55
4.2 Desenvolvimento................................................................................................................... 57
4.2.1 Material e Métodos.............................................................................................................
57
4.2.2 Resultados e Discussão...................................................................................................... 60
Referências.................................................................................................................................. 65
5 INFLUENCIA DE PLANTAS CÍTRICAS INFECTADAS COM Xylella fastidiosa
SOBRE A PENETRAÇÃO ESTILETAR DE Bucephalogonia xanthophis (BERG)
(HEMIPTERA: CICADELLIDAE) 72
Resumo........................................................................................................................................ 72
Abstract....................................................................................................................................... 72
5.1 Introdução..............................................................................................................................
73
5.2 Desenvolvimento................................................................................................................... 75
5.2.1 Material e Métodos.............................................................................................................
75
5.2.2 Resultados.......................................................................................................................... 77
5.2.3 Discussão............................................................................................................................
78
Referências.................................................................................................................................. 84
8
RESUMO
Caracterização do comportamento alimentar de Bucephalogonia xanthophis (Berg)
(Hemiptera: Cicadellidae) em citros e suas implicações na transmissão de Xylella fastidosa
Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema de plantas, sendo transmitida
principalmente por cigarrinhas da subfamília Cicadellinae (Hemiptera: Cicadellidae). No Brasil, é
o agente causal da Clorose variegada dos citros (CVC), doença que afeta laranja-doce [Citrus
sinensis (L.) Osbeck]. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o comportamento alimentar da
cicadelíneo vetor Bucephalogonia xanthophis (Berg) em citros e correlacionar suas atividades
estiletares com a transmissão de X. fastidiosa. Inicialmente, testes de escolha e análises de
excreção de honeydew foram realizadas para determinar os locais e períodos preferidos para
alimentação em mudas de citros. B. xanthophis preferiu a haste dos ramos novos, na parte superior
da muda. Esta cigarrinha ingeriu seiva do xilema e apresentou maior volume médio de excreção e
maior percentual de indivíduos que excretaram durante a fotofase. Assim, estudou-se a penetração
estiletar do vetor na haste de brotações cítricas, durante a fotofase, pela técnica de “Electrical
Penetration Graph” (EPG, sistema DC). Os principais padrões de EPG foram correlacionados com
análises histológicas e de “honeydew” para determinação da posição exata dos estiletes no tecido
vegetal e atividades envolvidas. Seis padrões foram descritos: (S) secreção de bainha salivar e
caminhamento dos estiletes através de células da epiderme ou parênquima; (R) estiletes inseridos
na planta, porém sem nenhuma atividade aparente; (X) contato dos estiletes com os vasos do
xilema; (Xi) ingestão ativa no xilema; (I) breve interrupção durante X ou Xi; (W) retirada dos
estiletes da planta. Durante uma prova, a seqüência de eventos com maior probabilidade de
ocorrência foi penetração estiletar através da epiderme e parênquima (S) (100% dos insetos),
seguida de contato com o xilema (X) (67,6%). Entre os indivíduos que exibem o padrão X, 88,3%
passam para Xi. Os vasos do xilema foram localizados pelo inseto após uma média de 2,2 provas.
O tempo médio para atingir o xilema (X) e iniciar ingestão (Xi) após o início da primeira prova
foi 27.8 min e 34,2 min, respectivamente. Entretanto, verificou-se ingestão prolongada no xilema
(Xi > 5 min) somente após 39,8 min, em média. Em um outro estudo, investigou-se a relação dos
padrões S, X e Xi com os processos de aquisição e inoculação de X. fastidiosa em citros. B.
xanthophis adquiriu X. fastidiosa somente no padrão Xi. Após 1 h de ingestão no xilema, esta
cigarrinha transmitiu a bactéria para plantas-teste com uma eficiência de 7,7%. A inoculação
ocorreu durante os padrões S, S+X e S+X+Xi, com eficiência de 3,5; 7,1 e 7,4%, respectivamente.
Um fato intrigante foi a ocorrência de inoculação de X. fastidiosa pelo inseto antes de atingir os
vasos do xilema, durante o padrão S. Contudo, as maiores taxas de transmissão ocorreram após o
contato com o xilema (S+X ou S+X+Xi). Por fim, estudou-se o efeito da infecção sintomática e
assintomática por X. fastidiosa em plantas cítricas sobre a penetração estiletar de B. xanthophis. O
comportamento alimentar foi semelhante em plantas sadias e infectadas sem sintomas. A infecção
sintomática não afetou a capacidade de B. xanthophis localizar os vasos do xilema, mas reduziu o
tempo gasto por este inseto ingerindo seiva dos mesmos. Estes resultados sugerem que a aquisição
de X. fastidiosa pode ser mais eficiente em plantas infectadas assintomáticas do que em plantas
com sintomas severos de CVC. As informações sobre penetração estiletar do vetor B. xanthophis
em citros são importantes para estudos mais avançados de mecanismos de transmissão de X.
fastidiosa, bem como para estabelecer estratégias que visem interferir neste processo.
Palavras-chave: CVC, bactéria fitopatogênica, inseto vetor, comportamento alimentar
9
ABSTRACT
Characterization of feeding behavior of Bucephalogonia xanthophis (Berg) (Hemiptera:
Cicadellidae) in citrus and its implications for transmission of Xylella fastidiosa
Xylella fastidiosa is a xylem-limited bacterium transmitted mainly by leafhoppers
(Hemiptera: Cicadellidae) in the subfamily Cicadellinae. In Brazil, it is the causal agent of Citrus
variegated chlorosis, a disease that affects sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. The goal of
this research was to characterize the feeding behavior of the cicadeline vector Bucephalogonia
xanthophis (Berg) in citrus and correlate its feeding activities with transmission of X. fastidiosa.
Initially, choice tests and honeydew excretion analyses were carried out to determine preferred
feeding sites and periods on citrus nursery trees. B. xanthophis preferred the stems of young
shoots, in the upper part of the plant. This species ingested sap from the xylem vessels and
showed larger excretion volume and higher proportion of excreting individuals during the day.
Thus, vector stylet penetration was studied on the stem of citrus shoots in the photophase, by
using the Electrical Penetration Graph (EPG, DC system) technique. The main EPG waveforms
were correlated with histological and honeydew excretion analyses to determine the precise stylet
position in the plant tissue and feeding activities. Six waveforms and proposed activities are
described: (S) secretion of salivary sheath and intracellular pathway; (R) stylets inserted into the
plant, without any apparent activity; (X) contact of stylets with xylem vessels; (Xi) active xylem
ingestion; (I) interruption between X and Xi; and (W) stylet withdrawal from the plant. During a
probe, the most likely sequence of events is stylet pathway (S) through epidermal and
parenchymal cells (all individuals), followed by contact with xylem (X) (67.6% of all individuals)
and then active ingestion (Xi) (88.3% of those that exhibit waveform X). The xylem was reached
after an average of 2.2 probes. The mean time to contact the xylem (X) and initiate ingestion (Xi)
after onset of the first probe was 27.8 and 34.2 min, respectively. However, sustained xylem
ingestion (Xi > 5 min) was established only after 39.8 min, on average. In a second study, the
waveforms S, X and Xi were correlated with X. fastidiosa acquisition and inoculation in citrus.
Acquisition of X. fastidiosa from infected plants occurred only after onset of the pathogen to 7.7%
of test plants. In healthy plants, inoculation took place during waveform Xi (xylem ingestion); but
with just 1 h in Xi, B. xanthophis subsequently transmitted waveforms S (salivary sheath
formation and stylet pathway), S+X (X= first xylem contact by stylets) and S+X+X1, with
efficiencies of 3.5, 7.1 and 7.4%, respectively. Although higher transmission rates were recorded
after the first contact with xylem (S+X and S+X+Xi), it is intriguing the fact that inoculation of
this xylem-limited bacterium also occurred before that (during S). Finally, the effect of X.
fastidiosa infection on the feeding behavior of B. xanthophis was studied by comparing stylet
penetration on: a) healthy citrus; b) symptomless infected citrus; c) infected citrus with CVC
symptoms. Based on the analysis of 26 EPG parameters, no significant differences were found in
stylet penetration on healthy versus asymptomatic infected citrus. Symptomatic infection did not
affect the ability of B. xanthophis to locate xylem vessels, but reduced the time spend by this
vector ingesting xylem sap. These results suggest that X. fastidiosa acquisition may be more
efficient on symptomless infected plants than on citrus with severe CVC symptoms. Information
on vector feeding behavior is basic for future studies on transmission mechanisms of X. fastidiosa
and to establish control strategies aimed to interfere with this process.
Key words: CVC, phytopathogenic bacterium, insect vector, feeding behavior
10
1 INTRODUÇÃO
A citricultura no Brasil exerce um papel de grande importância econômica e social,
gerando empregos, renda, ocupação de terra e desenvolvimento de outros setores da economia. Na
safra de 2006, o Brasil obteve uma produção de 17.868.175 toneladas de frutos destacando-se
como maior produtor mundial, sendo o Estado de São Paulo o maior produtor nacional com
80,50% (FNP, 2007).
O crescimento da citricultura é afetado por várias doenças, sendo que uma delas tornou-
se um dos mais sérios problemas no Brasil a partir de sua descoberta no final da década de 80.
Devido aos sintomas de clorose na face superior das folhas, esta doença foi chamada de Clorose
Variegada dos Citros (CVC) (ROSSETTI et al., 1990), sendo causada por uma bactéria gram-
negativa, limitada aos vasos do xilema das plantas, com forma de bastonete e parede celular
enrugada, denominada Xylella fastidiosa Wells et al. (LEE et al., 1993). As plantas atacadas
apresentam sintomas foliares, nas quais são observadas manchas cloróticas na face superior,
correspondendo a bolhosidades cor de palha na face inferior (ROSSETTI et al., 1991). Com a
evolução da doença, os ramos mais afetados apresentam frutos de tamanho reduzido, com a casca
endurecida, amarelecimento precoce e um elevado teor de açúcar (LEE et al., 1993). A CVC está
presente nas principais regiões citrícolas do Brasil. Apenas no Estado de São Paulo, afeta 43% das
plantas de laranja doce, ocasionando perdas de produção estimadas em US$ 100 milhões por ano
(LOPES et al., 2004). Por esta razão, atualmente esta doença é considerada um dos principais
problemas da citricultura paulista.
Essa bactéria, que também infecta videira, ameixeira, pessegueiro, amendoeira, cafeeiro,
entre outras plantas cultivadas, é transmitida por cigarrinhas das famílias Cicadellidae (subfamília
Cicadellinae) e Cercopidae que necessariamente alimentam-se nos vasos do xilema. Estudos de
transmissão identificaram até o momento 12 espécies de cigarrinhas vetoras da bactéria em citros
(REDAK, 2004; YAMAMOTO et al., 2007). Entre estas, Bucephalogonia xanthophis (Berg)
destaca-se por ser freqüentemente observada em pomares cítricos em formação (YAMAMOTO et
al., 2001).
A disseminação da CVC nos pomares tem ocorrido principalmente pela ação dos insetos
vetores a partir de mudas ou árvores cítricas infectadas (LOPES, 1999). O controle químico das
cigarrinhas vem sendo utilizado visando a redução da população dos vetores e com isso diminuir a
11
dispersão da doença em viveiros e pomares cítricos (GRAVENA et al., 1997). A utilização de
inseticidas sistêmicos, aplicados via tronco, vem sendo estudada e mostra-se uma opção eficiente
e seletiva para o controle de cigarrinhas (YAMAMOTO et al., 2000). Entretanto, grande parte do
controle ainda é realizado através de pulverizações sistemáticas de inseticidas de amplo espectro
de ação, colocando em risco o manejo integrado de pragas de citros. Este tipo de controle tem sido
dificultado, devido ao reaparecimento das cigarrinhas em pomares cítricos poucos dias ou
semanas após as pulverizações com inseticidas (ROBERTO et al., 2000).
Por meio de estudos de microscopia ótica e eletrônica, verificou-se que as células de X.
fastidiosa concentram-se em placas em alguns locais específicos. Em Graphocephala
atropunctata (Signoret), a bactéria foi observada aderida ao forro cuticular do cibário (câmara de
sucção) e na porção anterior do esôfago (PURCELL et al., 1979). Contudo, as bactérias que
efetivamente são inoculadas na planta durante alimentação são as que estão localizadas no canal
do precibário (ALMEIDA; PURCELL, 2006). O mecanismo de inoculação de X. fastidiosa por
cigarrinhas ainda não foi completamente desvendado, embora existam algumas hipóteses que
tentam explicar este mecanismo (LOPES, 1999). Uma hipótese é que a tensão negativa no xilema
seria capaz de deslocar células da bactéria presente no canal alimentar do vetor em direção a
planta (PURCELL, 1989). Entretanto, Almeida et al. (2005) observaram que Homalodisca
coagulata (Say) é capaz de inocular X. fastidiosa em plantas dormentes de videira com pressão
positiva no xilema, sugerindo que este fato representa uma evidência indireta da existência de um
comportamento alimentar do vetor que promove ativamente o deslocamento da bactéria do
estomodeu do inseto para planta. Sabe-se que a eficiência de um vetor pode variar dependendo de
sua afinidade com a planta hospedeira. G. atropunctata, apesar de ser um eficiente vetor em
videira, transmite X. fastidiosa (PD) com baixa eficiência para hospedeiros herbáceos como
alfafa, por ter preferência por plantas perenes arbóreas (PURCELL, 1979). A eficiência de um
vetor parece depender, pelo menos parcialmente, da freqüência com que o inseto atinge o xilema
em diferentes espécies de plantas, bem como do tempo gasto e modo de alimentação nos tecidos
suscetíveis. O local preferido de alimentação na planta cítrica (ramos ou folhas) pode influenciar a
eficiência com que diferentes espécies de cigarrinhas adquirem ou inoculam X. fastidiosa
(LOPES, 1996; MARUCCI et al., 2004). O nível de infecção por X. fastidiosa também influencia
a preferência hospedeira e a taxa de ingestão de líquidos por cigarrinhas vetoras, podendo,
12
portanto, ter efeitos sobre a eficiência de aquisição e/ou inoculação da bactéria (MARUCCI et al.,
2005).
A partir de 1964, com a introdução da técnica de monitoramento eletrônico do
comportamento alimentar (MCLEAN; KINSEY, 1964), muitas questões relacionadas à
alimentação de insetos fitófagos sugadores foram melhor compreendidas. O sistema original
desenvolvido por McLean e Kinsey utilizava corrente alternada (AC). Posteriormente, Tjallingii
(1978) desenvolveu um sistema usando corrente direta (DC) e criou o termo “Electrical
Penetration Graph” (EPG). Ambos os sistemas (AC e DC) medem a mudança de condutibilidade
elétrica ou componente de resistência (R), entretanto, o sistema DC além de aferir a resistência
também mede as mudanças de voltagem geradas na interação inseto-planta (força eletromotriz -
emf). Basicamente a técnica consiste em estabelecer um circuito elétrico no qual o inseto e a
planta fazem parte. Uma voltagem constante é aplicada no sistema e o circuito é fechado quando o
inseto introduz os estiletes na planta. Em função das atividades estiletares realizadas, ocorrem
alterações na voltagem do sistema devido a componentes de resistência (R) e de força eletromotriz
(emf). Os sinais elétricos gerados (ondas) são amplificados e registrados em um gráfico.
Atividades estiletares específicas (salivação, ingestão, penetração de protoplasma, etc) podem ser
relacionadas com padrões de onda característicos (freqüência e amplitude) (Tjalingii, 1988).
Através desta técnica, pôde-se caracterizar o comportamento alimentar de mais de 50
espécies de hemípteros (BACKUS, 1994). Os afídeos, por serem pragas de diversas culturas de
importância econômica, foram escolhidos como os pioneiros nos estudos onde se empregou a
técnica de EPG (McLEAN; KINSEY, 1964). A utilização de padrões de EPG, correlacionando
com cortes histológicos do local de alimentação (visualização da bainha salivar) e análise do
“honeydew” (ANDERSEN; BRODBECK; MIZEL, 1989; BACKUS; HUNTER; ARNE, 1988)
possibilitou grandes avanços nos estudos de comportamento alimentar de insetos sugadores.
Em Auchenorrhyncha, os estudos com EPG estão mais avançados com cigarrinhas que se
alimentam preferencialmente no floema. Neste grupo, muitas espécies já tiveram seu
comportamento alimentar caracterizado, e as informações obtidas utilizadas em trabalhos de
resistência de plantas à insetos (RAPUSAS; HEINRICHS, 1990; CALDERON; BACKUS, 1992;
MESFIN; HOLLANDER; MARKHAM, 1995) e transmissão de vírus (WAYADANDE;
NAULT, 1993). Estes autores estudaram um grupo de 10 espécies de cigarrinhas (Hemiptera:
Deltocephalinae) composto por espécies vetoras e não vetoras de “maize chlorotic dwarf vírus”.
13
Todas estas espécies, durante sua alimentação, apresentam um padrão denominado de “x-
waveform”. Entre as espécies vetoras este padrão foi semelhante, porém diferente do observado
para as não vetoras. Isto mostra que, mesmo em grupos próximos (mesma sub-família), uma
pequena diferença no comportamento alimentar pode capacitar ou não espécies a transmitirem
vírus.
Nesta última década, os estudos de comportamento alimentar com cigarrinhas que se
alimentam preferencialmente no xilema (Cicadellinae) receberam uma maior ênfase. Isto se deve
ao aumento da importância de doenças causadas por X. fastidiosa em plantas cultivadas,
principalmente em videira (USA) e citros (Brasil) (HOPKINS; PURCELL, 2002). Entretanto,
estes estudos ainda são bastante limitados, e apenas duas espécies de cigarrinhas vetoras de X.
fastidiosa em videira, tiveram seu comportamento alimentar caracterizado através da técnica de
EPG (ALMEIDA; BACKUS, 2004; BACKUS et al., 2005). Nestes estudos, os padrões de
alimentação foram descritos usando o sistema AC e são importantes para a compreensão dos
mecanismos de transmissão de X. fastidiosa em videira.
Apesar da relevância das cigarrinhas como vetoras de X. fastidiosa, pouco se sabe sobre
seu comportamento alimentar em citros e atividades estiletares necessárias para a aquisição e
inoculação da bactéria. E conseqüentemente, a eficácia de inseticidas sistêmicos para impedir a
transmissão da bactéria não é bem conhecida, pois não se sabe ao certo quanto tempo é necessário
para que o inseto atinja o sistema vascular e inocule a bactéria. Portanto, este trabalho tem como
objetivos: caracterizar o comportamento alimentar de B. xanthophis, determinando seus principais
padrões de EPG sistema DC e a relação destes com a localização dos estiletes dentro do tecido da
planta; correlacionar a atividade estiletar do vetor com os processos de aquisição e inoculação de
X. fastidiosa em plantas de citros e conhecer o comportamento deste vetor em plantas cítricas
infectadas com a bactéria.
14
Referências
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(Signoret) (Hemiptera, Cicadellidae): EPG waveform characterization and quantification. Annals
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17
2 LOCAIS E PERÍODO DE ALIMENTAÇÃO DA CIGARRINHA VETORA DE Xylella
fastidiosa, Bucephalogonia xanthophis (BERG) (HEMIPTERA: CICADELLIDAE), EM
MUDAS CÍTRICAS
Resumo
O estudo do comportamento alimentar de cigarrinhas vetoras da bactéria Xylella fastidiosa
é necessário para entender o processo de transmissão deste patógeno em citros. Este trabalho teve
como objetivo identificar o local preferido de alimentação e o período de maior atividade
alimentar em mudas de laranja-doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] pelo vetor Bucephalogonia
xanthophis (Berg) (Hemíptera: Cicadellidae). O local de alimentação foi estudado em ensaio de
livre escolha, no qual 30 insetos adultos foram liberados em câmaras de observação (n = 10)
contendo uma muda cítrica. Após 1, 15, 21, 25, 39, 45, e 49 h da liberação, registrou-se o número
de insetos na parte superior (formada por três ramos secundários em brotações) e inferior (haste
principal com ≈40 cm de altura) da muda cítica. Nos ramos da parte superior, avaliou-se a
preferência entre a haste, pecíolo e limbo foliar. Em um segundo ensaio, 10 machos e 10 fêmeas
de B. xanthophis foram confinados individualmente sobre a haste de brotações de mudas cítricas
para determinar os períodos de alimentação, quantificando-se a excreção de “honeydew” (medida
indireta da ingestão) em períodos sucessivos de dia e noite, durante 48 h. B. xanthophis mostrou
preferência pela haste dos ramos novos, na parte superior da muda cítrica. Esta cigarrinha ingeriu
seiva do xilema e apresentou maior volume médio de excreção e maior percentual de indivíduos
que excretaram durante a fotofase, não havendo diferença entre sexos. Assim, estudos detalhados
de comportamento alimentar de B. xanthophis em relação à transmissão de X. fastidiosa devem
ser realizados na haste de brotações cítricas, durante a fotofase. Sugere-se, ainda, que a inspeção
visual desta cigarrinha em pomares novos, para fins de manejo, seja feito na haste dos ramos em
brotação.
Palavra-chave: Cicadellinae; Comportamento alimentar; Clorose variegada dos citros
Abstract
The study of feeding behavior of Xylella fastidiosa vectors is necessary to understand
transmission of this pathogen in citrus. This study was aimed to identify preferred feeding sites
and periods of the sharpshooter vector, Bucephalogonia xanthophis (Berg) (Hemiptera:
Cicadellidae), on sweet orange nursery trees [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. The feeding sites were
determined in a choice experiment, in which 30 adults were released inside observation chambers
(n = 10) containing a citrus plant. At 1, 15, 21, 25, 39, 45, e 49 h after the release, the number of
insects on the upper (secondary stems and leaves) and bottom (primary stem, up to 40 cm above
soil) parts of the plant was recorded. To determine the feeding periods, 10 males and 10 females
of B. xanthophis were individually confined on the secondary stems of citrus plants, and the
honeydew excretion (indirect measure of ingestion) was quantified for 48 h, during periods of
light and dark. Most individuals (91%) of B. xanthophis were observed on the upper part of the
plant, mainly on the secondary stems (62%). A larger volume of honeydew excretion and higher
proportion of excreting individuals were observed during the photophase for both males and
18
females, indicating that daytime is a preferred feeding period for this vector. Excretion rates did
not vary between sexes. These results indicate that visual inspections for monitoring B.
xanthophis in citrus groves as well as advanced studies on its feeding behavior in relation to
transmission of X. fastidiosa should be done on the stems of secondary stems, during the
phophase.
Keywords: Cicadellinae; Feeding behavior; Citrus variegated chlorosis
2.1 Introdução
X. fastidiosa é uma bactéria que se multiplica no xilema de plantas, causando
doenças em diversas culturas de importância econômica (PURCELL e HOPKINS, 1996). No
Brasil, é o agente causal da Clorose variegada dos citros (CVC), doença que afeta laranja-doce
[Citrus sinensis (L.) Osbeck] e que se caracteriza por sintomas de clorose na face superior das
folhas e drástica redução no tamanho dos frutos (ROSSETTI et al., 1990; LEE et al., 1993). Este
patógeno é transmitido por cigarrinhas das famílias Cicadellidae (subfamília Cicadellinae) e
Cercopidae, que têm sua alimentação localizada no xilema das plantas (PURCELL, 1989). Em
citros já foram identificadas várias espécies de cigarrinhas vetoras, sendo todas representantes de
Cicadellinae (REDAK et al., 2004).
A disseminação da CVC nos pomares tem ocorrido principalmente pela ação dos insetos
vetores a partir de mudas ou árvores cítricas infectadas (LOPES, 1999). Dentre as cigarrinhas
identificadas como vetoras, Bucephalogonia xanthophis (Berg) destaca-se por ser freqüentemente
observada em viveiros abertos (ROBERTO et al., 2000) e pomares cítricos em formação
(YAMAMOTO et al., 2001).
As cigarrinhas vetoras de X. fastidiosa em citros apresentam uma baixa eficiência de
transmissão quando comparadas aos vetores da estirpe de videira (LOPES, 1999). Este fato pode
estar relacionado com uma baixa concentração da bactéria em citros (ALMEIDA et al., 2001) e
uma irregular distribuição de X. fastidiosa nas plantas hospedeiras (MIZUBUTI et al., 1994), o
que pode reduzir a eficiência de aquisição pelas cigarrinhas. Alternativamente, pode ocorrer uma
baixa taxa de sobrevivência de infecções iniciais de X. fastidiosa em citros, após sua inoculação
por vetores (LOPES, 1999).
Aspectos relacionados à interação inseto-planta também podem influenciar na eficiência
de transmissão. O local de alimentação na planta (LOPES, 1996), a baixa taxa de ingestão
19
observada em citros em relação a outras plantas hospedeiras (MILANEZ et al., 2003) e as
condições hídricas do solo que influenciam na sobrevivência e alimentação da cigarrinha na
planta hospedeira (PEREIRA et al., 2005), possivelmente afetam a eficiência com que diferentes
espécies de cigarrinhas adquirem ou inoculam X. fastidiosa.
Como a distribuição de X. fastidiosa é desuniforme na planta cítrica (QUEIROZ-
VOLTAN; PARADELA FILHO, 1999), o local de alimentação do vetor é uma dos principais
fatores que podem influenciar a probabilidade de aquisição ou inoculação do patógeno. Cada
espécie vetora tem preferência por determinadas partes da planta cítrica (GRAVENA et al., 1997).
Para algumas espécies, o local de preferência e a atividade alimentar podem variar de acordo com
o período do dia (MARUCCI et al., 2004; MONTESINO et al., 2006).
Conhecer as características do comportamento alimentar de cigarrinhas vetoras de X.
fastidiosa em citros é importante para melhor compreender o processo de transmissão deste
patógeno e definir táticas de controle mais eficientes que possam ser implementadas no manejo
da CVC. Devido à ausência destas informações para B. xanthophis, este trabalho teve como
objetivo determinar o local preferido de alimentação e o período de maior atividade alimentar
desta cigarrinha em mudas cítricas.
2.2 Desenvolvimento
2.2.1 Material e Métodos
Obtenção de cigarrinhas e plantas teste
A cigarrinha B. xanthophis foi criada em plantas de Vernonia condensata Baker conforme
descrito por Marucci et al (2003), de modo a obter adultos sadios e com idade padronizada. Para o
estudo de seleção do local de alimentação, usaram-se mudas padrão comercial de laranja-doce
[Citrus sinensis (L.) Osbeck], cv. Pêra, enxertadas sobre citrumelo Swingle [Citrus paradisi Macf.
x Poncirus trifoliata (L.) Raf.]. No estudo de horário de alimentação, utilizaram-se “seedlings” de
laranja-doce, cv. Pêra, obtidas a partir de sementes. Os dois tipos de mudas foram produzidas em
viveiros telados, em vasos de 4 L com substrato comercial Plantmax® sendo adubadas
periodicamente com o fertilizante de liberação lenta Osmocoat® (22-04-08).
20
Seleção do local de alimentação na planta cítrica
Em um experimento de livre escolha, avaliou-se a preferência da cigarrinha por duas
partes principais da muda cítrica: a) superior (ou copa), formada por três ramos secundários
(brotações) com cerca de 20 cm cada; e b) inferior, constituída pela haste principal (enxerto +
porta-enxerto) com, aproximadamente, 40 cm de altura. Nos ramos da parte superior da muda,
avaliou-se a preferência entre a haste, pecíolos e limbos foliares. Utilizaram-se câmaras de
observação (base de 63x63 cm e 120 cm de altura) com estrutura de madeira e revestidas com
acrílico transparente e tela antiafídica, descritas por Marucci et al. (2004). O experimento foi
composto por 10 repetições, sendo cada uma constituída por uma câmara de observação contendo
uma muda cítrica, no interior da qual foram liberadas 30 cigarrinhas adultas (machos e fêmeas)
com 7-14 dias de idade. A liberação dos insetos foi feita no final da tarde (17:00 h) e as avaliações
foram realizadas após 1 (18:00 h), 15 (8:00 h), 21 (14:00 h), 25 (18:00 h), 39 (8:00 h), 45 (14:00
h) e 49 (18:00 h) h, registrando-se o número de insetos em cada parte da planta.
Determinação do período de maior atividade alimentar
A atividade alimentar de B. xanthophis foi avaliada nos períodos diurno (fotofase) e
noturno (escotofase), por meio da quantificação e análise da excreção de “honeydew”. O volume
de ‘honeydew’ excretado por unidade de tempo foi usado como medida indireta da taxa de
ingestão. Neste ensaio utilizaram-se adultos (machos e fêmeas) com idade de 5-8 dias após
emergência, sendo os mesmos retirados da criação e colocados para aclimatação em plantas
cítricas por 24 h. Vinte cigarrinhas de cada sexo foram confinadas individualmente sobre ramos
das mudas cítricas (1 cigarrinha/planta), utilizando-se uma gaiola plástica (tubo Falcon de 50 mL)
acoplada a um reservatório graduado na parte inferior (tubo Falcon de 15 mL) (Andersen et al.,
1992). As gaiolas foram posicionadas sobre o ramo de modo a favorecer o escoamento do líquido
para o recipiente graduado, permitindo a quantificação direta da excreção. O ensaio foi instalado
no final da tarde (18:00 h) em uma sala climatizada (25 ± 2ºC; fotofase de 12 h) e avaliado em
períodos de 12 h até completar 48 h, registrando-se o volume excretado em cada período.
Baseando-se na análise química do “honeydew” (aminoácidos ou pH) de insetos
sugadores, pode-se inferir o local (floema ou xilema) de alimentação dos mesmos (Walker, 2000).
Assim, para determinar o tecido de alimentação de B. xanthophis na fotofase e escotofase,
amostras do “honeydew” de 5 machos e 5 fêmeas por período foram submetidas à análise de pH
21
em papel indicador (Universalindikator pH, Merck) e de presença de aminoácidos em teste de
reação com nihidrina (0,1%).
Análise dos dados
No experimento de seleção dos locais de alimentação, utilizaram-se os testes não
paramétricos de Mann-Whitney e Behrens-Fisher para verificar a preferência dos indivíduos entre
as partes superior e inferior da planta e entre partes dos ramos superiores (haste x pecíolo x limbo
foliar), respectivamente. Considerou-se, como variável, o número acumulado de indivíduos
registrados em todas as avaliações. Realizaram-se, também, análises de regressão para verificar a
relação entre posição dos insetos na planta e tempo após a liberação na câmara de observação.
Para detectar diferenças no número dos insetos presentes em certas partes da planta entre períodos
de avaliação, utilizou-se o teste de Steel.
No experimento de excreção de “honeydew”, comparou-se o volume médio excretado
pelas cigarrinhas entre os períodos de fotofase e escotofase pelo teste não paramétrico de sinais de
Wilcoxon, e entre machos e fêmeas pelo teste de Wilcoxon. Os testes de McNemar e de Qui-
Quadrado foram usados para comparar a proporção de insetos que excretam na fotofase versus
escotofase e entre machos e fêmeas, respectivamente. Todas as análises foram realizadas com o
programa R (http://www.R-project.org).
2.2.2 Resultados e Discussão
Os resultados deste trabalho mostram que a cigarrinha B. xanthophis apresenta um local e
período preferido para alimentação em mudas cítricas, comportamento este que possivelmente
influencia a eficiência de transmissão de X. fastidiosa e tem implicações no manejo deste inseto
vetor em pomares cítricos. No estudo de seleção do local de alimentação, B. xanthophis mostrou
nítida preferência pela parte superior da muda cítrica (P < 0,01) (Figura 1A), que é composta por
ramos novos. Neste local da planta, houve diferença significativa na ocorrência de indivíduos
entre as partes do ramos (P < 0,01), com predominância na haste (62%) seguida pelo limbo foliar
(28%) e pecíolos (10%) (Figura 1B).
A preferência de B. xanthophis pela parte superior da planta se deve provalvemente à
ocorrência de ramos novos. Marucci et al. (2004) mostraram que duas outras cigarrinhas vetoras
em citros, Dilobopterus costalimai Young e Oncometopia facialis (Signoret), têm uma nítida
preferência por brotações. Árvores cítricas jovens apresentam brotações mais vigorosas, maiores
22
concentrações de aminoácidos na seiva do xilema e maior abundância da cigarrinha Homalodisca
vitripennis(Germar) em relação a árvores mais velhas (BI et al., 2007). Os níveis de aminoácidos
presentes na seiva do xilema representam um dos principais fatores que influenciam na seleção de
plantas hospedeiras por cigarrinhas (BRODBECK et al., 1990; ANDERSEN et al., 2005).
Assim, o fato de B. xanthophis preferir os ramos novos em mudas cítricas explicaria pelo menos
em parte sua abundância em viveiros cítricos abertos (ROBERTO et al., 2000) e pomares em
formação (YAMAMOTO et al., 2001), que geralmente apresentam maior fluxo de crescimento.
Embora haja uma preferência das cigarrinhas por ramos novos na planta cítrica, existe
variabilidade entre as espécies com relação aos locais de alimentação nas brotações. Observações
em campo indicaram que a espécie Acrogonia terminalis Young, por exemplo, prefere alimentar-
se nas folhas novas, enquanto que D. costalimai prefere a haste das brotações novas e
Oncometopia sp. é observada na haste de brotações mais desenvolvidas, principalmente naquelas
que o ramo estão em posição vertical (GRAVENA et al., 1997). Em ensaios de livre escolha
realizados em laboratório, Marucci et al. (2004) observaram que a maioria dos adultos de D.
costalimai inicialmente pousa sobre as folhas de mudas cítricas, passando posteriormente para a
haste dos ramos secundários (brotações). Para O. facialis (Signoret) não há diferença na
preferência para pouso entre folhas e hastes, sendo o local de alimentação variável de acordo com
o horário do dia (MARUCCI et al., 2004).
No presente estudo, observou-se que maioria dos indivíduos de B. xanthophis
encontravam-se nas folhas (limbo foliar e pecíolos) da parte superior da planta na primeira
avaliação, com apenas 1 h após a liberação (Figura 2). Entretanto, ao longo do tempo observou-se
uma tendência crescente na porcentagem de cigarrinhas na haste dos ramos (R
2
= 0,77),
coincidindo com uma tendência inversa para os que estavam nas folhas (R
2
= 0,77) (Figura 2). A
partir da terceira avaliação (21 h após a liberação), observou-se um aumento significativo (teste de
Steel; P=0,0097) na porcentagem de cigarrinhas na haste, em relação às duas primeiras avaliações
do ensaio. Após 25 h, a maioria dos indivíduos (≈70%) já estavam localizados na haste (Figura
2). Este comportamento de pouso inicial sobre as folhas e posterior movimentação para a haste
dos ramos novos da planta cítrica é semelhante ao relatado para a cigarrinha D. costalimai
(MARUCCI et al., 2004). Entretanto, no caso de D. costalimai, Marucci et al. (2004) constataram
que a nervura secundária das folhas foi o local preferido de permanência (seguido da haste dos
23
ramos) ao longo de 48 h de observações, em um ensaio de livre escolha semelhante ao realizado
na presente pesquisa.
Tem sido postulado que a eficiência de aquisição de X. fastidiosa possa estar
condicionada ao local de preferência de alimentação do vetor na planta infectada, sendo maior em
locais de maior concentração da bactéria (LOPES, 1996; MARUCCI et al., 2004). Estudando a
distribuição de X. fastidiosa em citros, Queiroz-Voltan & Paradella Filho (1999) observaram que
a obstrução dos vasos do xilema diminui das folhas para a haste, o que sugere uma maior
concentração bacteriana nas folhas cítricas. O fato de D. costalimai permanecer por mais tempo
sobre folhas cítricas do que O. facialis foi apontado por Marucci et al. (2004) como um dos
possíveis fatores explicando a maior eficiência de transmissão do patógeno pela primeira espécie
de cigarrinha. Entretanto, um estudo recente mostrou não haver diferença significativa em
eficiência de transmissão entre D. costalimai e B. xanthophis em citros (MARUCCI, 2003), a
despeito da segunda espécie ter preferência pela haste da planta cítrica. Assim, embora a haste
apresente uma menor porcentagem de vasos colonizados por X. fastidiosa do que as folhas em
citros (QUEIROZ-VOLTAN E PARADELLA FILHO, 1999), ela provavelmente representa um
importante local de aquisição e/ou inoculação desta bactéria por B. xanthophis.
No experimento de excreção de “honeydew”, machos e fêmeas de B. xanthophis não
diferiram estatisticamente entre si quanto ao volume médio excretado (P = 0,76) e porcentagem de
indivíduos que excretaram (χ
2
=1,11; P = 0,29). Para ambos os sexos, verificou-se um maior
volume de excreção (P = 0,002) e maior porcentagem de insetos excretando durante o dia em
relação à noite (χ
2
=10,8; P = 0,001) (Figura 3). Estes resultados são semelhantes aos relatados
por Montesino et al. (2006) para as cigarrinhas D. costalimai e O. facialis, que também
apresentaram maior taxa de excreção durante o dia em ramos de laranjeiras ‘Pêra’ e ‘Valência’.
Cigarrinhas da subfamília Cicadellinae podem sincronizar sua atividade alimentar de
acordo com a flutuação química da seiva do xilema. H. coagulata, Holamodisca insolita (Wlk.) e
Cuerna costalis (F.) se alimentam mais ativamente sobre Catharanthus roseus (L.) durante a
noite, quando a concentração de aminoácidos na seiva do xilema é 1,9 vezes maior que durante o
dia (BRODBECK et al., 1993). Entretanto, em Lagerstroemia indica L. estas mesmas espécies se
alimentam quase que exclusivamente durante o dia, período no qual a concentração de
aminoácidos na seiva do xilema é 2,5 vezes maior em relação à noite (BRODBECK ET AL.,
1993). Para citros, não há informações sobre variação diurna nos níveis de aminoácidos no
24
xilema, porém, baseando-se nos dados de taxa de excreção por cigarrinhas em diferentes períodos
obtidos no presente estudo e por Montesino et al. (2006), é provável que a concentração de
aminoácidos seja maior durante o dia. Contudo, seria necessária uma análise química detalhada da
seiva do xilema de citros na fotofase e escotofase para comprovar esta hipótese.
Baseando-se nas análises de pH e de presença de aminoácidos, não houve diferenças no
“honeydew” excretado por machos e fêmeas na fotofase e escotofase. Em todos as amostras
examinadas, este apresentou um pH inferior a 7 e não ocorreu reação com nihidrina, indicando
que apresenta baixa concentração ou ausência de aminoácidos. O pH abaixo de 7 e a falta de
níveis detectáveis de aminoácidos no “honeydew” são indicativos de ingestão no xilema, que
apresenta pH entre 5,4-6,5 e baixa concentração de açúcares e aminoácidos (ANDERSEN et al.,
1989; WALKER, 2000). Em contraste, o floema tem um pH entre 7,2-8,4 e é rico em compostos
orgânicos (WALKER, 2000). Assim, estes resultados sugerem que adultos de B. xanthophis
ingerem predominantemente conteúdos do xilema, independente do sexo ou período. Entretanto,
para determinar precisamente os sítios de alimentação no interior da planta, são necessários
estudos detalhados de atividade estiletar utilizando-se a técnica de “Electrical Penetration Graph”
(EPG) (TJALLINGII, 1978), bem como análises histológicas do local da planta onde ocorreu a
penetração estiletar.
Os resultados deste trabalho mostram que adultos de B. xanthophis preferem se alimentar
na haste de ramos novos em mudas cítricas, não variando de local ao longo do dia. Assim, em
pomares cítricos recém-implantados ou replantas, a inspeção e medidas de controle desta
cigarrinha, devem ser direcionadas neste local da planta. Como a taxa de excreção representa uma
medida indireta da ingestão de seiva, os resultados do experimento de excreção de “honeydew”
demonstram uma maior atividade alimentar durante o dia para ambos os sexos de B. xanthophis.
Estas informações também serão úteis para aprofundar os estudos de comportamento alimentar
associados à transmissão de X. fastidiosa. Novos ensaios utilizando a técnica de EPG estão sendo
conduzidos para caracterizar as atividades estiletares de B. xanthophis na haste de brotações
cítricas durante o dia, e determinar sua relação com a aquisição e inoculação da bactéria.
25
Figura 1 - Distribuição de adultos de Bucephalogonia xanthophis em mudas de Citrus sinensis, em ensaio de livre
escolha. A) Parte superior e inferior da planta; B) Ramo, limbo foliar e pecíolo de ramos da parte superior
da planta. Porcentagens seguidas da mesma letra, em um mesmo gráfico, não diferem entre si pelos testes
de Mann-Whitney (A) e de Behrens-Fisher (B) (P < 0,05)
Figura 2 - Curvas de regressão logarítmica obtidas para a relação entre a porcentagem média de adultos de
Bucephalogonia xanthophis na haste ou nas folhas (limbo foliar + pecíolo) de ramos de Citrus sinensis e
o tempo após a liberação dos insetos, em ensaio de livre escolha
A
B
y = 31,4Ln(x) + 18,9
R
2
= 0,77
y = -31,4Ln(x) + 81,0
R
2
= 0,77
0
20
40
60
80
100
1 15 21 25 39 45 49
Tempo (h) após a liberação
% média de cigarrinhas
Haste Folha
62% (a)
28% (b)
10% (c)
Ramo Limbo foliar Pecíolo
91% (a)
9% (b)
Parte superior Parte inferior
26
Figura 3 - Volume médio de excreção (linha) e porcentagem de indivíduos (colunas) de Bucephalogonia xanthophis
que excretaram “honeydew” em períodos sucessivos de noite (12 h) e dia (12 h) sob confinamento em
mudas de Citrus sinensis. Barras sobre a linha e colunas representam o erro padrão das médias, as quais
foram calculadas agrupando-se os dados de machos e fêmeas
2.3 Conclusões
De acordo com os resultados deste trabalho:
1 - Adultos de B. xanthophis preferem se alimentar na haste de ramos novos em mudas cítricas.
2 - Machos e fêmeas não diferem quanto à taxa de ingestão de seiva do xilema.
3 - Ambos os sexos apresentam maior atividade alimentar durante o dia.
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0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
noite dia noite dia
Volume médio excretado (ml)
0
20
40
60
80
100
% de indivíduos que excretaram
27
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30
3 CARACTERIZAÇÃO DOS PADRÕES DE “ELECTRICAL PENETRATION GRAPHS”
(EPG) DE Bucephalogonia xanthophis (BERG) (HEMIPTERA: CICADELLIDAE),
VETOR DE Xylella fastidiosa EM CITROS
Resumo
A cigarrinha Bucephalogonia xanthophis (Berg) é vetora da bactéria Xylella fastidiosa,
agente causal da Clorose Variegada dos Citros (CVC). Apesar da grande importância da CVC, o
comportamento alimentar de seus vetores e suas implicações na transmissão de X. fastidiosa, não
foi estudado. Neste trabalho o comportamento alimentar de B. xanthophis foi estudado por meio
da técnica de “Electrical Penetration Graph” (EPG), sistema DC, sobre mudas cítricas [Citrus
sinensis (L.) Osbeck] cv. ‘Pêra’. Os padrões foram descritos de acordo com suas características
de morfologia da onda, amplitude, freqüência, nível de voltagem e origem elétrica. Os principais
padrões foram correlacionados com técnicas de histologia e análise do honeydew para
determinação da posição dos estiletes no tecido vegetal e significado biológico. Seis padrões
foram descritos: (S) formação da bainha salivar e caminhamento intracelular; (R) estiletes
inseridos na planta, porém aparentemente sem atividades; (X) contato dos estiletes com vasos do
xilema; (Xi) ingestão ativa no xilema; (I) breve interrupção que ocorre durante X e Xi; (W)
retirada dos estiletes da planta. B. xanthophis gasta 91.8% do tempo de prova em atividades no
xilema, sendo a principal ingestão (Xi; 97.5%). Durante uma prova, a seqüência de eventos com
maior probabilidade de ocorrência foi: fase de caminhamento (S) através de células da epiderme e
parênquima (100% dos indivíduos), seguido do contato com xilema (X) (67,6% de todos os
indivíduos) e então ingestão ativa (Xi) (88,3% dos indivíduos que exibem o padrão X). O xilema
foi encontrado após uma media de 2,2 provas, entretanto 50% dos indivíduos chegaram a este
tecido logo na primeira prova. O tempo médio para encontrar o xilema (X) e começar a ingerir
(Xi) foi de 27,8 e 34,2 min, respectivamente. Contudo, a ingestão contínua no xilema (Xi > 5 min)
foi estabelecida após com um tempo médio de 39.8 min. Os resultados deste trabalho servirão de
base para estudos de transmissão de Xylella fastidiosa em citros e desenvolvimento de táticas de
manejo que possam interferir na transmissão desta bactéria.
Palavra-chave: Cicadellinae; Cigarrinhas vetoras;Comportamento alimentar; Clorose variegada
dos citros
Abstract
The sharpshooter Bucephalogonia xanthophis (Berg) is a vector of the xylem-limited
bacterium, Xylella fastidiosa, which causes citrus variegated chlorosis (CVC). Despite the
importance of CVC, the feeding behavior of vectors on citrus and its implications on transmission
of X. fastidiosa have not been studied. In this research we studied electrical penetration graph
(EPG-DC system) wafevorms performed by B. xanthophis on seedlings of Citrus sinensis (L.)
Osbeck, and their relationships with stylet activities and xylem feeding. EPG waveforms were
described based on amplitude, frequency, voltage level and electrical origin of the observed
patterns during stylet penetration on plant tissues. The main waveforms observed during stylet
penetration were correlated with histological observations of salivary sheaths in plant tissues and
honeydew excretion analysis, in order to determine stylet activities and their precise position. Six
waveforms and proposed activities are described: (S) secretion of salivary sheath and intracellular
31
pathway; (R) stylets inserted into the plant, without any apparent activity; (X) contact of stylets
with xylem vessels; (Xi) active xylem ingestion; (I) interruption between X and Xi; and (W) stylet
withdrawal from the plant. B. xanthophis spent 91.8% of its probing time in the xylem, where the
main activity was ingestion (Xi; 97.5%). During a probe, the most likely sequence of events is
stylet pathway (S) through epidermal and parenchymal cells (all individuals), followed by contact
with xylem (X) (67.6% of all individuals) and then active ingestion (Xi) (88.3% of those that
exhibit waveform X). The xylem was reached after an average of 2.2 probes, although 50% of the
individuals contacted this tissue in their first probe. The mean time to contact the xylem (X) and
initiate ingestion (Xi) after onset of the first probe was 27.8 and 34.2 min, respectively. However,
sustained xylem ingestion (Xi > 5 min) was established only after 39.8 min, on average. This
information is basic for future studies on the transmission mechanisms of X. fastidiosa and to
establish control strategies aimed to interfere with this process.
Keywords: Cicadellinae; Sharpshooter vector; Feeding behavior; Citrus variegated chlorosis
3.1 Introdução
A Clorose Variegada dos Citros (CVC) é uma doença causada por uma bactéria gram-
negativa, limitada aos vasos do xilema das plantas, denominada Xylella fastidiosa Wells et al.
(LEE et al., 1993), transmitida por cigarrinhas da família Cicadellidae (subfamília Cicadellinae)
que se alimentam nos vasos do xilema. No Estado de São Paulo principal produtor de citros do
Brasil, esta doença afeta 43% das plantas de laranja doce, ocasionando perdas de produção
estimadas em US$ 100 milhões por ano (LOPES et al., 2004). Estudos de transmissão
identificaram até o momento 12 espécies de cigarrinhas vetoras de X. fastidiosa em citros
(REDAK, 2004; YAMAMOTO et al., 2007). Entre estas, Bucephalogonia xanthophis (Berg) é
considerada vetor chave na disseminação da bactéria, destacando-se por ser freqüentemente
observada em pomares cítricos em formação (YAMAMOTO et al., 2001). Apesar da grande
importância das cigarrinhas como vetoras, pouco se conhece sobre seu comportamento alimentar
e mecanismo de transmissão de X. fastidiosa em citros.
Com o desenvolvimento da técnica de “Electrical Penetration Graph” (EPG) muitas
questões relacionadas à alimentação de insetos fitófagos sugadores foram melhor compreendidas.
Esta foi originalmente desenvolvida por McLean & Kinsey (1964), utilizando um sistema de
corrente alternada (AC). Posteriormente, Tjallingii (1978) desenvolveu um sistema usando
corrente direta (DC), que registra as variações geradas por componentes de resistência (R) e força
eletromotriz (emf). Com a utilização ambos os sistemas de EPG, pôde-se caracterizar o
comportamento alimentar de mais de 50 espécies de hemípteros (BACKUS, 1994). Sendo
32
utilizada para estudos de resistência de plantas à insetos sugadores (ULLMAN et al., 1988; Garzo
et al., 2002; ALVAREZ et al., 2006), avaliação de plantas transgênicas (Liu et al., 2005), ação de
inseticidas (NISBET et al., 1993; HARREWIJN; KAYSER, 1997) e identificação do
comportamento necessário para transmissão de fitopatógenos (PRADO; TJALLINGII 1994;
MARTIN et al., 1997; COLLAR; FERERES, 1998).
Em Auchenorrhyncha, a maioria dos estudos com EPG foram realizados com cigarrinhas
das famílias Delphacidae e Cicadellidae (subfamílias Deltocephalinae e Typhlocybinae). Nestes
grupos muitas espécies já tiveram seu comportamento alimentar caracterizado e as informações
obtidas utilizadas em trabalhos de resistência de plantas à insetos (RAPUSAS; HEINRICHS,
1990; KIMMIS, 1989; CALDERON; BACKUS, 1992; MESFIN et al., 1995) e transmissão de
viroses (WAYADANDE; NAULT, 1993). Recentemente, os estudos de comportamento alimentar
de cigarrinhas que se alimentam preferencialmente no xilema (Cicadellinae) receberam uma maior
atenção. Isto se deve ao aumento da importância de doenças causadas por X. fastidiosa em plantas
cultivadas, principalmente em videira (USA) e citros (Brasil) (HOPKINS; PURCELL, 2002).
Entretanto, os estudos de EPG foram realizados apenas com duas espécies vetoras desta bactéria
em videira, Graphocephala atropunctata (Signoret) e Homalodisca coagulata (Say) (ALMEIDA;
BACKUS, 2004; BACKUS et al., 2005). Os padrões associados a penetração estiletar de ambas
as espécies, foram caracterizados com sistema AC, e estão sendo importantes para a compreensão
dos mecanismos de transmissão de X. fastidiosa em videira.
Apesar da grande importância da CVC, o comportamento alimentar de seus vetores e suas
implicações na transmissão de X. fastidiosa, não foram estudados em citros. Portanto, o objetivo
deste trabalho foi descrever os padrões de EPG sistema DC realizados por B. xanthophis em citros
e investigar suas relações com as atividades estiletares e alimentação no xilema, baseando-se em
correlações com estudos de excreção de “honeydew” e histologia do local de alimentação.
3.2 Desenvolvimento
3.2.1 Material e Métodos
33
Insetos e Plantas
Uma colônia de B. xanthophis foi mantida sobre plantas de Vernonia condensata Baker,
utilizando o sistema de criação descrito por Marucci (2003), que permite a produção de insetos
livres de X. fastidiosa. Para o estudo com EPG, ninfas de 4º e 5º instar foram retiradas da colônia
de manutenção e colocadas sobre “seedlings” de laranja-doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cv.
Pêra em sala climatizada (25 ± 2 °C com fotofase de 14 h) para completar o seu desenvolvimento.
Apenas insetos adultos fêmeas com idade entre 5 a 8 dias após sua emergência, foram usados no
estudo. As plantas teste usadas nos registros de EPG foram mudas de laranja-doce, de mesma
altura (20 - 25 cm) e cultivar usada para criar os adultos. Estas foram produzidas em vasos
plásticos (500 ml), contendo solo, esterco e areia (3:1:1) e mantidas em viveiros telados contra o
acesso de insetos vetores.
Electrical Penetration Graph (EPG)
Os registros de EPG foram obtidos usando o sistema DC modelo GIGA-8 (Wageningen
University) Tjallingii (1978; 1988), ajustados com “ganância” de 75x. O sinal analógico foi
convertido a digital mediante uma placa Di-710 (Dataq
®
Instruments), acoplado a um
computador Pentium4
®
para aquisição e armazenagem dos dados, por meio do programa Probe
3.0 (Laboratory of Entomology, Wageningen University).
As cigarrinhas foram anestesiadas com CO
2
durante 3 segundos e imediatamente
imobilizadas com auxilio de uma bomba de vácuo, semelhante a descrita por Van Helden e
Tjallingii (2000), sob um microscópio esteroscópio. Um fio de ouro (Sigmund Cohn) de 37 µm
de diâmetro e 3 cm de comprimento foi colocado sobre o pronoto do inseto e fixado com tintura
de prata (Ted Pella Inc. no:16034 Pelco
®
Collodia Silver). Antes de ser instalado no inseto, a
outra ponta do fio de ouro, foi fixada a um eletrodo de cobre 3 cm comprimento x 1 mm de
diâmetro. Este eletrodo foi acoplados ao amplificador de sinais e o inseto colocado sobre a haste
da planta cítrica. Outro eletrodo de cobre (10 cm de comprimento x 2 mm diâmetro) foi inserido
no solo, do vaso o qual estava a planta teste. O processo de monitoramento foi realizado dentro de
uma gaiola de Faraday em sala climatizada (25 ± 2 °C) com iluminação natural e artificial.
Cada cigarrinha foi monitorada por 8 horas e os dados de 20 indivíduos foram analisados
com o auxilio do programa Probe 3.0. Os padrões de EPG foram descritos com base nas
características da morfologia da onda, análise de espectro de amplitude (máxima e mínima),
freqüência (Hertz), nível de voltagem (extra ou intracelular) e origem elétrica (resistência - R ou
34
força eletromotriz – emf). Para esta ultima característica realizaram-se ajustes no nível de
voltagem para positivo e negativo em diferentes períodos de cada padrão. A amplitude e
freqüência foram estimadas usando a média de 60 valores observados em distintos pontos para
cada padrão (3 observações por inseto).
Com os padrões típicos definidos, alguns parâmetros de EPG foram calculados com a
finalidade de descrever as características da penetração estiletar de B. xanthophis na haste de
citrus durante um período de 8 h: (1) número de indivíduos que produzem um padrão específico
(NPP); (2) número de vezes que um padrão foi produzido por indivíduo (NPI); (3) duração do
padrão por indivíduo (DPI); (4) tempo para 1º contato com xilema, a partir da 1ª prova; (5) tempo
para 1ª ingestão no xilema, a partir da 1ª prova; (6) tempo para 1ª ingestão no xilema > 5min
(prova com êxito), a partir da 1ª prova; (7) tempo para 1º contato com xilema, a partir da 1ª prova
com êxito; (8) tempo para 1ª ingestão no xilema, a partir da 1ª prova com êxito.
Estudou-se também a seqüência típica de eventos que ocorrem durante a penetração
estiletar, por meio do calculo da probabilidade de um determinado padrão ser seguido por um
outro padrão. Neste estudo foram consideradas somente as probabilidades maiores que 2%
(WAYADANDE; NALT, 1996; ALMEIDA; BACKUS, 2004).
Histologia do tecido da planta
Para correlacionar os padrões de EPG com a posição dos estiletes na planta, cigarrinhas
foram monitoradas sobre mudas de laranja doce e para cada padrão de interesse, a alimentação foi
interrompida retirando-se o inseto da planta. Neste local o tecido da planta foi cortado e imerso
em de fucsina ácida (1%) por 3 min, para facilitar a visualização da camada de saliva produzida
no inicio da penetração estiletar. Em seguida o material vegetal foi lavada com água destilada,
secado com papel-filtro, fixado em solução Karnovsky (KARNOVSKY, 1965) e desidratado à
temperatura ambiente em uma série etílica crescente (10% a 100%). Para infiltração e
emblocagem, se utilizou o kit Historesina (hidroxietilmetacrilato, Leica, Heidelberg).
Posteriormente, realizaram-se cortes seriados transversais com espessura de 10 µm, estes foram
corados com azul de toluidina (SAKAI, 1973) e montados em resina sintética “Entellan” para
realização de fotomicrografias em fotomicroscópio (Leica DM LB / DC 300 F).
Análise de “Honeydew”
Observações da excreção de “honeydew” foram realizadas simultaneamente aos registros
de EPG de cigarrinhas em mudas de laranja doce, para detectar a ingestão durante um
35
determinado padrão. A freqüência de excreção e análise química (pH ou concentração de
aminoácidos) do “honeydew” durante os registros com EPG, são úteis para identificar os locais de
ingestão (floema ou xilema) (WALKER, 2000).
A excreção de “honeydew” foi registrada através de um sistema de vídeo (Sony DCR-
HC21) e posteriormente as imagens foram analisadas para contagem do número de gotas
excretadas por minuto. O “honeydew” foi coletado através de Parafilm
®
colocada abaixo do local
onde o inseto estava se alimentação. Avaliou-se o pH e a presença de aminoácidos através de
papel indicador de pH (Universalindikator pH, Merck) e teste de reação com niidrina (0,1%) em
papel filtro. Em alguns casos os insetos excretaram diretamente sobre o papel filtro.
3.2.2 Resultados
Electrical Penetration Graphs
B. xanthophis produziu seis padrões de ondas em C. sinensis, sendo estes distintos dos
descritos para outras espécies de cicadelídeos. Estes padrões foram nomeados com letras que
representam a atividade ou local na planta onde ocorrem: S; R; X; Xi; I e W (Figura 1A–G). As
principais características observadas nos padrões e suas correlações estão sumarizadas na tabela 1.
Não foram observados mudanças nas características dos padrões quando o sinal foi ajustado para
positivo ou negativo, mostrando que o componente principal é a força eletromotriz (emf). Durante
os registros foi observado um padrão irregular semelhante a um ruído elétrico, porém com maior
amplitude, que foi correlacionado através de observação visual e vídeo, com a movimentação do
inseto sobre a planta. Por não representar uma atividade alimentar, este padrão não foi
considerado no estudo.
Em 8 h de registro B. xanthophis realizou em média 5,65±0,69 (n= 20) provas, com
duração média de 71,39± 10,29 (n= 113) min/prova. O padrão S (Figura 1 B) foi sempre o
primeiro a ser observado na penetração estiletar. Este padrão foi caracterizado por apresentar um
traço irregular, com alta oscilação na freqüência e amplitude (0,1 – 1,5 V), e um nível de
voltagem intracelular (Tabela 1). Este esteve presente em todas as provas, com duração média < 2
min (Tabela 2). O padrão R (Figura 1 C) geralmente ocorreu entre dois padrões S, e apresentou
um traço regular com forma plana e amplitude e freqüência muito baixas. Este foi observado em
75% dos registros, com duração media >5 min (Tabela 2).
36
O padrão X (Figura 1 D) comumente ocorre entre os padrões S e Xi, e foi caracterizado
por um traço regular, com uma amplitude alta (0,5 – 2 V), quando comparado aos outros padrões,
principalmente no início do padrão. Este padrão apresenta um nível de voltagem extracelular, e foi
observado em 100% dos registros, com duração média <1 min (Tabela 2). O padrão Xi (Figura 1
E) também esteve presente em 100% dos registros, ocorrendo sempre após o padrão X, com
duração media >30 min (Tabela 2). Apresenta um traço geralmente regular, porém pode variar de
acordo com a flutuação da freqüência que normalmente é menor no início do padrão (0,4 – 0,5
Hertz), entretanto tem uma tendência de aumentar ao longo do tempo (0,8 – 1,3 Hertz). A
amplitude é a segunda maior entre os padrões descritos e o nível de voltagem indica atividade
extracelular (Tabela 1).
O padrão I (Figura 1 F) representa uma queda de potencial que ocorre dentro dos padrões
X e Xi, contudo com maior freqüência em Xi. Este foi observado em 100% dos registros com
duração média <6 s (Tabela 2). O nível de voltagem geralmente foi extracelular, entretanto em
alguns casos pode ser negativo. Apresenta uma alta oscilação na freqüência, a amplitude no inicio
normalmente é baixa (0,1 – 0,4 V), porém podem ocorrer picos maiores no período final deste
padrão (0,7 – 1 V).
O padrão W (Figura 1 G) esteve presente em 90% dos registros, com duração média <10 s
(Tabela 2). Este foi associado com a retirada dos estiletes da planta, pois sempre foi seguido por
uma não penetração (Np). Este padrão e caracterizado por um traço irregular, com alta oscilação
na freqüência e amplitude.
Correlações entre padrões de EPG e posição dos estiletes na planta
B. xanthophis primeiramente secreta uma pequena quantidade de saliva gelatinosa sobre a
superfície da haste marcando o local da prova, posteriormente inicia a penetração estiletar através
de células da epiderme (mais freqüente) ou por meio dos estômatos. Após atravessar a epiderme,
os estiletes seguem intracelularmente através do parênquima (clorofiliano e cortical), floema e
finalmente encontram os vasos do xilema (Figura 2A). Em algumas amostras, bainhas salivares
também foram observadas, passando pelo meio das fibras pericíclicas, estruturas lignificadas que
ocorrem dispersas em pequenos grupos junto ao floema. Lise celular e claramente observada
durante a rota dos estiletes (Figura 2B).
Durante os registros de EPG os padrões S, R, X e Xi foram interropidos para determinação
da posição dos estiletes no tecido vegetal. As bainhas produzidas durante o padrão S (n= 4) e R
37
(n=3) sempre terminaram em células do parênquima (Figuras 2C e 2D, respectivamente),
enquanto que bainhas produzidas durante o padrão X (n= 4) e Xi (n= 6) terminaram nos vasos do
xilema secundário (Figuras 2E e 2F, respectivamente). Entre as bainha que terminam no xilema, 7
não foram ramificadas e 3 apresentaram ramificações no xilema, podendo-se observar a presença
de bainha salivar dentro do vaso (Figura 2F).
Correlações entre padrões de EPG e excreção de honeydew
Entre os padrões descritos a excreção de “honeydew” foi observada somente em Xi, com
freqüência média de 24,54± 1,26 gotas/min (n=11). Porém, esta apenas ocorreu 3 - 5 minutos após
o inicio deste padrão. Não existe uma correlação direta entre o número de picos realizados durante
Xi com o número de gotas excretadas. Entretanto, observa-se que um aumento na freqüência
deste padrão, resulta em uma maior freqüência de excreção. Durante este processo verificou-se
uma movimentação regular dos últimos segmentos abdominais, e para cada movimento realizado
observou-se a liberação de uma gota. Constatou-se que o “honeydew” excretado apresenta pH
inferior a 7 (n=10) e não ocorre reação com niidrina, indicando que este apresenta uma baixa
concentração ou ausência de aminoácidos.
Características e seqüência de eventos que ocorrem durante a penetração estiletar
Em 160 horas de registros, B. xanthophis permaneceu 15% deste tempo em não prova
(Np), 7% em atividades fora do xilema (S, R, W) e 78% em atividades no xilema (X e Xi). Assim,
este inseto gasta a maioria do seu tempo de prova (91,8%) no xilema, onde a principal atividade
foi ingestão ( Xi 97,5%). Esta cigarrinha realiza em média 2,15±0,37 (n= 20) provas para atingir
o xilema, contudo, 50% das cigarrinhas encontram este tecido logo na primeira prova. O tempo
médio para o primeiro contato com o xilema (X) e início da ingestão (Xi) a partir da primeira
prova foi de 27,81±6,57 (n= 20) e 34,16±6,89 (n=20) min, respectivamente. Entretanto, o tempo
médio para ocorrência de ingestão contínua (Xi > 5 min) foi de 39,75±7,46min (n=20). Quando se
considera somente as provas que contenham ingestão contínua, os tempos para ocorrência de X e
Xi se tornam menores (Tabela 3).
Um diagrama com as seqüências de eventos que ocorrem durante uma prova de B.
xanthophis em citros, foi estabelecido (Figura 3). O padrão I não foi representado por ocorrer
dentro de X e Xi. Todos os insetos iniciam a penetração com o padrão S, destes 18% retornam a
não prova (Np), 13% iniciam o padrão R e 67,6% passam para o padrão X. Já no padrão X, alguns
insetos podem retornar a S, porém a maioria (88,3%) inicia Xi. Entre os indivíduos que exibem o
38
padrão Xi, 40,6% podem iniciar novamente X, 38,8% retornam as atividades estiletares fora do
xilema (S e R) e 20,3% retiram os estiletes da planta (W). Desta forma, durante uma prova a
seqüência de eventos com maior probabilidade de ocorrência foi o inicio da penetração com o
padrão S, seguido de X e então Xi, onde B. xanthophis permanece a maior parte do seu tempo de
prova.
3.2.3 Discussão
O comportamento alimentar da cigarrinha B. xanthophis, um importante vetor de X.
fastidiosa, foi estudado em plantas de citros utilizando a técnica de EPG (sistema DC), associada
a estudos de histologia do local de alimentação, vídeo observações e análise do “honeydew”
excretado. Este foi o primeiro trabalho de EPG-DC com cigarrinhas da subfamília Cicadellinae.
Por meio de modificações anatômicas, com clípeo bem desenvolvido e com forte musculatura,
este grupo de Auchenorrhyncha, se tornou especializado em se alimentar da seiva do xilema
(NIELSEN, 1985). Estas adaptações provavelmente explicam a diferença dos padrões EPG-DC
descritos para B. xanthophis em relação aos relatados para os demais grupos de Auchenorrhyncha
que se alimentam preferencialmente do floema, tais como, fulgoróides (KIMMINS, 1989;
BUDUCA et al., 1996) e cicadelídeos da subfamília Deltocephalinae (LETT et al., 2001).
Padrões de EPG e suas correlações
Padrão S
Este padrão representa a fase de caminhamento dos estiletes, sendo a formação da bainha
salivar e a inserção dos estiletes no tecido vegetal as principais atividades realizadas. Por meio de
estudos de histológicos, observou-se que a forma de penetração estiletar é intracelular e
semelhante a outras espécies de Auchenorrhyncha (CHANG, 1978; SPILLER, 1990; RAPUSAS;
HEINRICHS, 1990; BUDUCA et al., 1996; BACKUS et al., 2005). Sempre que S foi
interrompido as bainhas salivares terminaram no parênquima. Entretanto, este padrão também
ocorre em outros tecidos, pois é observado durante toda a rota dos estiletes até o primeiro contato
com o xilema.
O padrão S é caracterizado por uma queda de potencial, permanecendo em um nível de
voltagem a baixo de 0 até o inicio do próximo padrão (R ou X). Quedas de potencial foram bem
caracterizadas durante a fase de caminhamento de afideos, moscas brancas e cochonilhas
39
(TJALLINGII, 1978; JANSSEN et al., 1989; CALATAYUD et al., 1994) e representam a
inserção dos estiletes em uma célula viva, sem danificar a integridade da membrana celular. Em
fulgoróides da família Delphacidae, curtas quedas de potencial foram observadas durante a fase de
caminhamento de Nilaparvata lugens (Stal) e no inicio da penetração estiletar de Peregrinus
maidis (Ashmead) (SPILLER, 1990; BUDUCA et al., 1996). Nestes fulgoróides observouse que o
potencial de membrana é destruído após a punctura. Com base nos resultados de histologia,
observase que B. xanthophis também afeta a integridade da membrana celular durante o padrão S.
A cigarrinha Cicadulina mbila Naudé (Deltocephalinae) não apresentou quedas de
potencial durante os padrões de caminhamento, entretanto, observou-se um padrão de ingestão
ativa em tecidos não vasculares (LETT et al., 2001). Para B. xanthophis padrões com estas
características não foram observados durante a fase de caminhamento. Segundo Backus et al
(2005), diferenças entre a penetração estiletar de Cicadellinae e Deltocephalinae são esperadas, já
que a maioria das cigarrinhas deste último grupo ingerem pouco do xilema e geralmente não
realizam provas em tecidos mais lenhos. Em Auchenorrhyncha quimiosencilas com função de
gustação são encontradas na região do precibario (BACKUS; MCLEAN, 1984). Assim, é possível
que durante o padrão S ocorram tomadas de pequenas quantidades de fluidos por B. xanthophis,
para avaliar a qualidade da planta hospedeira ou para ajudar na localização dos vasos do xilema.
Em alguns casos entre uma Np (não prova) e S observou-se um padrão positivo irregular,
causado pelo contado e movimentação do inseto na planta antes da penetração estiletar.
Provavelmente isto ocorre devido às características morfológicas de B. xanthophis, que apresenta
um corpo robusto com comprimento de 5,1 mm (MARUCCI; CAVICHIOLI; ZUCCHI, 2002).
Em Cicadellinae padrões relacionados com a formação da bainha salivar e inserção dos
estiletes foram caracterizados para as espécies G. atropunctata e H. coagulata em videira
(ALMEIDA; BACKUS, 2004; BACKUS et al., 2005). Entretanto, por terem sido registrados
usado o sistema AC, não podem ser diretamente comparados com os padrões obtidos para B.
xanthophis neste estudo.
Padrão R
Este padrão foi associado com parênquima e apresenta uma forma plana, com duração
média superior a 5 minutos, sem excreção de honeydew. Assim, R provavelmente representa uma
fase de descanso com os estiletes dentro da planta. Comportamento similar a este foi observado
40
para a cigarrinha Nephotettix virescens (Distant) (Deltocephalinae) (RAPUSAS; HEINRICHS,
1990).
Padrão X
Devido a não existência de um potencial de membrana no xilema, os padrões (EPG-DC)
registrados neste tecido, ocorrem em um nível extracelular (SPILLER, 1990) . Para B. xanthophis,
o padrão X sempre foi observado em nível extracelular e todas as bainhas salivares interrupidas
durante este terminaram no xilema. Portanto, X representa claramente o primeiro contato dos
estiletes com este tecido vascular.
Cigarrinhas que se alimentam preferencialmente no floema quando em um hospedeiro
adequado, eventualmente realizam ingestão ativa no xilema. As cigarrinhas P. maidis e N. lugens
(ambas Delphacidae) apresentam padrões EPG-DC no xilema, que são similares em amplitude e
freqüência (KIMMINS, 1989; BUDUCA et al., 1996). Contudo, o padrão X realizado por B.
xanthophis não foi similar aos produzidos por estes delfacídeos.
Assim, é possível que X represente uma atividade em resposta a um estimulo mecânico ou
químico decorrente do contato com xilema antes de iniciar a ingestão. A excreção de
“honeydew” não foi observada durante este curto padrão, cuja duração foi frequentemente
inferior a um minuto. Em estudos de EPG usando o sistema AC, padrões xilemáticos prévios ao
padrão C (ingestão ativa) não foram observados para G. atropunctata e H. coagulata (ALMEIDA;
BACKUS, 2004; BACKUS et al., 2005). Porém, o padrão B1 que representa a última etapa da
fase de caminhamento em H. coagulata, foi algumas vezes correlacionado com contato com
xilema (BACKUS et al., 2005). Dessa forma, o padrão X observado para B. xanthophis pode
representar alguma atividade em Cicadellinae que não é detectada com sistema AC. Futuros
estudos serão importantes para esclarecer as atividades biologias que ocorrem durante este padrão.
Padrão Xi
Xi foi sempre precedido por X, permanecendo em um similar nível de voltagem. Por
meio de histologia, observou-se que todas as bainhas salivares interrupidas durante este padrão
terminam no xilema. Este geralmente foi observado por longos períodos de tempo e
frequentemente associado à excreção de “honeydew”. Considerando que a pressão do xilema é
negativa (TAIZ; ZEIGER, 2004), Xi representa ingestão ativa nos vasos do xilema, decorrente da
atividade da bomba cibarial.
41
Semelhante ao que ocorre com X, em Xi as características de amplitude e freqüência são
diferentes das observadas nos padrões de ingestão ativa no xilema em Delphacidae. Para B.
xanthophis, a gama de freqüência observada em Xi, esta situada entre 0,2 – 2,5 Hz em quanto que
em P. maidis e N. lugens a freqüência observada durante os padrões de ingestão ativa, esta ao
redor de 3-7 Hz (KIMMINS, 1989; BUDUCA et al., 1996). As diferença nos padrões EPG-DC
observados durante a ingestão no xilema entre B. xanthophis e estes fulgoróides, possivelmente
esta relacionada a uma questão filogenética, anatômica e comportamental, uma vez que
Cicadellinae e Delphacidae são relatados como grupos distantes dentro de Auchenorrhyncha.
Cigarrinhas de Cicadellinae geralmente são maiores e se alimentam preferencialmente no xilema,
em quanto que delpacídeos preferem floema (NIELSON, 1985; SOGAWA, 1982).
Cigarrinhas que se alimentam da seiva do xilema desenvolveram adaptações que as
permitiram sobreviver nesta fonte de alimento nutricionalmente pobre. Estes insetos apresentam
uma alta eficiência na conversão de quase todos os componentes orgânicos (>98%) e ingerem
altas quantidades de seiva (100-300 vezes o peso seco do corpo / dia) (BRODBECK et al., 1993).
O “honeydew” produzido durante Xi não apresentou aminoácidos por meio do teste de niidrina e
a freqüência de excreção foi de ≈ 24 gotas/min. A alta taxa de excreção e a falta de níveis
detectáveis de aminoácidos no “honeydew” são indicativos de ingestão no xilema, que apresentam
baixas concentrações de componentes orgânicos (ANDERSEN, 1989).
Padrão I
O padrão I representa uma breve interrupição (≈ 5 s) dentro dos padrões de xilema. Este
ocorreu principalmente durante o padrão Xi e eventualmente em X ou na interfase entre estes
dois. Para cigarrinha H. coagulada usando o sistema AC, foram observados dois padrões que
representam uma interrupção durante C (ingestão no xilema). “N nonpathway”, que representa
provavelmente salivação aquosa no xilema e “N Pathway-like”, semelhante aos padrões de
caminhamento, porém, neste caso os insetos possivelmente estão buscando um novo vaso do
xilema para se alimentar (BACKUS et al., 2005).
Em B. xanthophis os padrões X e Xi ocasionalmente são interropindos por um curto
padrão S, sendo seguido novamente de atividades no xilema. Este comportamento pode representa
uma troca de vaso, o que é corroborado com a observação de bainhas com duas ramificações
terminando no xilema (Figura 2F). Assim, este curto S poderia ser semelhante a “N Pathway-like”
observado em H. coagulata, em quanto que, o padrão I similar a “N nonpathway”. Correlações
42
usando os dois sistemas (AC e DC) com uma mesma espécie de cigarrinha e planta hospedeira,
seriam necessárias para confirmar a similaridade entre tais padrões.
Padrão W
Este curto e irregular padrão, somente foi observado quando o inseto retira os estiletes
naturalmente da planta, ocorrendo o preenchimento da bainha salivar com saliva gelatinosa.
Cigarrinhas quando tem sua alimentação interronpida artificialmente, retiram os estiletes sem o
preenchimento da bainha salivar (Chang, 1978; Lett et al., 2001; Backus et al., 2005). Este
comportamento também foi observado para B. xanthophis durante os estudos de correlação
histológica, onde as provas interrompidas apresentaram bainhas vazias.
Características da penetração estiletar em citros
Estudos usando probabilidade condicional foram realizados com o objetivo de
compreender a seqüência de eventos que ocorrem durante a penetração estiletar de hemípteros
(ULLMAN; MCLEAN, 1988; WAYADANDE; NAULT, 1996; ALMEIDA; BACKUS, 2004).
Em cigarrinhas da subfamília Deltocephalinae, observou-se que a seleção do tecido para
alimentação não ocorre ocasionalmente, e existe um padrão de sucessivos comportamentos que
levam a ingestão no floema (WAYADANDE; NAULT, 1996). Para B. xanthophis, também foi
verificado uma se seqüência de eventos com maior probabilidade de ocorrência durante uma
prova, que conduz a uma ingestão de seiva no xilema. A seqüência de eventos mais provável foi:
fase de caminhamento dos estiletes através de células da epiderme e parênquima (padrão S),
seguido de contato (X) e ingestão (Xi) nos vasos do xilema, onde este inseto gasta a maior parte
do seu tempo de prova (97,5%).
Normalmente B. xanthophis realiza poucas provas antes de chegar no xilema, com um
tempo médio de aproximadamente 30 min para iniciar a ingestão. Contudo, quando foram
consideradas somente as provas com ingestão contínua no xilema, este tempo caiu pela metade e
foi inferior a 4 min para vários indivíduos. Durante algumas provas o inseto pode realizar uma
pequena ingestão (Xi < 5min) ou somente iniciar o padrão X. Provavelmente isto ocorre, pois o
vaso não apresenta uma condição satisfatória para que este permaneça se alimentado. Deste modo,
a cigarrinha começa uma nova fase de caminhamento ou retira os estiletes da planta. Provas com
curtos períodos de ingestão no xilema também foram observados para G. atropunctata e H.
coagulata (ALMEIDA; BACKUS, 2004; BACKUS et al., 2005).
43
Embora cigarrinhas possam ingerir de vários tecidos de plantas, geralmente, apresentam
uma preferência por um em específico (WAYADANDE; NAULT, 1996). Backus et al (2005)
observou que H. coagulata ingere quase que exclusivamente de xilema (93%), porém,
eventualmente o padrão C foi correlacionado com floema. Padrões de EPG-DC em floema são
bem característicos e relativamente semelhantes em diferentes grupos de insetos sugadores.
Padrões floemáticos caracterizados para cigarrinha C. mbila, são considerados análogos aos de
afídeos (LETT et al., 2001). Durante a fase de caminhamento (padrão S) os estiletes passam pelo
floema antes de atingir o xilema, entretanto, atividades de ingestão neste tecido não foram
observadas para B. xanthophis neste trabalho.
As informações obtidas sobre a penetração estiletar de B. xanthophis em citros, servirão de
base para futuros estudos do mecanismo de transmissão de X. fastidiosa e desenvolvimento de
táticas mais efetivas que possam interferir neste processo e reduzir a dispersão da doença em
pomares cítricos. Neste trabalho, foram descritos os principais padrões relacionados com a fase de
caminhamento e atividades no xilema, onde supostamente ocorrem aquisição e inoculação de X.
fastidiosa. Verificou-se que B. xanthophis pode encontrar o xilema e iniciar ingestão em períodos
relativamente rápidos (3 a 100 min após o início da primeira prova), sugerindo que aquisição e
inoculação possam ocorrer em um curto período de tempo. Futuros estudos serão realizados para
determinar quais padrões de EPG estão envolvidos com aquisição e inoculação de X. fastidiosa,
bem como o tempo limite para que estes ocorram.
44
Tabela 1 - Sumário das principais características e correlações dos padrões de EPG-DC descritos para Bucephalogonia xanthophis em
Citrus sinensis
Características dos padrões Correlações
Padrões EPG
Amplitude
1
(%)
Freqüência
(Hertz)
Nível
2
Voltagem
Origem do
sinal
elétrico
Local do estilete na
planta
Excreção Atividade
S 12.82 Mescla
3
i emf Todos os tecidos Não Secreção da
bainha salivar
/ penetração
intracelular
R - 0.1 – 0.2 e emf Parênquima Não Não
determinado
X 24.5 0.6 – 1.8 e emf Xilema Não egestão (?)
Xi 15.72 0.2 – 2.5 e emf Xilema Sim Ingestão ativa
I 7.2 Mescla e/i emf Xilema (?) Não Não
determinado
W - Mescla e/i Não
determinado
Todos os tecidos Não Retirada dos
estiletes
1
Amplitude média; 5 V = 100% amplitude
2
e: extracelular; i: intracelular
3
Alta oscilação de freqüência
45
Tabela 2 - Parâmetros de EPG usados no estudo do comportamento alimentar de
Bucephalogonia xanthophis sobre Citrus sinensis durante um período de 8 h
Padrão NPP
a
(n=20)
NPI
b
média±EP (min-max)
(n=20)
DPI
c
média±EP (n) (min - max)
Np 20 6 + 0,71 (1-13) 11,54+ 1,64 (120) (0,03 – 100,06)
S 20 11,65 + 1,59 (2-28) 1,58+ 0,2 (233) (0,05 – 19,23)
R 15 2,3 + 0,58 (0-9) 6,57+ 0,91 (46) (0,44 – 25,95)
X 20 12,3 + 1,35 (3-24) 0,54+ 0,04 (246) (0,05 – 4,97)
Xi 20 10,8 + 1,1 (3-21) 33,18 + 2,79 (216) (0,23 – 245,76)
Xi < 5 min 15 2,45 + 0,56 (0-8) 2,8+ 0,17 (49) (0,23 – 4,83)
Xi > 5 min 20 8,35 + 0,73 (3-13) 42,1+ 3,31 (167) (5,52 – 245,76)
I 20 13,15 + 1,76 (2-29) 0,09+ 0,001 (263) (0,05 – 0,20)
W 18 2,6 + 0,42 (0-7) 0,14+ 0,01 (52) (0,03 – 0,55)
a
Número de indivíduos que produzem um padrão específico
b
número de vezes que um padrão foi produzido por indivíduo
c
Duração do padrão por indivíduo (min)
46
Tabela 3 - Parâmetros seqüenciais de EPG usados no estudo do comportamento alimentar de
Bucephalogonia xanthophis sobre Citrus sinensis durante um período de 8 h
Parâmetros média± EP (min) / (Min. –Max.)
a
Tempo para 1
o
X a partir do inicio da 1
a
prova 27,81 ± 6,57 / (2,49 – 99,98)
Tempo para 1
o
Xi a partir do inicio da 1
a
prova 34,16 ± 6,89 / (3,49 – 101,93)
Tempo para 1
o
Xi > 5min. a partir do inicio da 1
a
prova 39,75 ± 7,46 / (3,49 – 101,93)
Tempo para 1
o
X a partir do inicio da 1
a
prova êxito
b
8,81 ± 2,39 / (0,28 – 40,40)
Tempo para 1
o
Xi a partir do inicio da 1
a
prova êxito 15,71 ± 3,21 / (3,49 – 53,48)
a
Baseado em dados de 20 indivíduos
b
Prova com êxito é a que apresenta um período de ingestão no xilema > 5min
47
0
10
0
-1
-2
15
5
B
0
10
0
-1
-2
15
5
B
0
10
15
5
0
-1
1.5
C
0
10
15
5
0
-1
1.5
C
0
10 15
5
0
-1
1.5
D
0
10 15
5
0
-1
1.5
D
0
10 15
5
0
-1
1.5
E
0
10 15
5
0
-1
1.5
E
0
10 15
5
0
-1
1.5
G
Np
W
0
10 15
5
0
-1
1.5
G
Np
W
Amplitude (Volt)
Time (s)
100s
A
Np
S
X
Xi
I
30 min
100s
A
Np
S
X
Xi
I
30 min
0
10 15
5
0
-1
1.5
F
I
0
10 15
5
0
-1
1.5
F
I
Figura 1 - Padrões de EPG produzidos por Bucephalogonia xanthophis sobre a haste de Citrus sinensis. (A)*
Esquema dos principais padrões de EPG registrados, (B) padrão S, (C) padrão R, (D) padrão X, (E)
padrão Xi, (F) padrão I produzido dentro de Xi e (G) padrão W. * Os padrões R e W não são mostrados
no esquema geral, pois estes nem sempre são realizados
48
Figura 2 – Cortes transversais da haste de Citrus sinensis contendo bainhas salivares de Bucephalogonia xanthophis.
(A) Bainha salivar terminando no xilema durante o padrão X (40x). (B) Detalhe da lise celular provocada
pela passagem dos estiletes (100x). (C e D) Bainha salivar terminando no parênquima durante os padrões S e
R, respectivamente (100x). (E) Bainha salivar terminando no xilema durante o padrão X (100x). (F) Duas
ramificações da bainha salivar terminando no xilema durante o padrão Xi (100x). E: epiderme; P:
parênquima; F: fibras pericíclicas; Fl: floema; X: xilema. Setas indicam o local onde as bainhas salivares
terminam
P
E
C
10µm
E
P
D
10µm
F
Fl
X
10µm
A
F
X
Fl
P
E
20µm
B
Fl
F
10µm
P
X
Fl
E
10µm
P
49
Figura 3 - Seqüência de eventos para Bucephalogonia xanthophis sobre mudas de Citrus sinensis. Os valores
próximos da cabeça da seta correspondem a probabilidade de um determinado padrão ser seguido por um
outro tipo de padrão. Probabilidades <2% não são mostradas. O padrão I não esta representado no
diagrama, pois ocorre dentro dos padrões X e Xi
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NP
S
R
X W
Xi
100
18
13
67,6
15,2
6,510,9
67,4
100
9,1
88,3
34,8
3,9
20,3
40,6
NP
S
R
X W
Xi
100
18
13
67,6
15,2
6,510,9
67,4
100
9,1
88,3
34,8
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40,6
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54
4 ASSOCIAÇÃO DE ATIVIDADES ESTILETARES DA CIGARRINHA Bucephalogonia
xanthophis (Berg) (Hemiptera: Cicadellidae) COM A TRANSMISSÃO DE Xylella fastidiosa
EM CITROS
Resumo
Xylella fastidiosa, agente causal da clorose variegada dos citros, é uma bactéria que
coloniza os vasos do xilema de plantas, sendo transmitida por cigarrinhas (Hemiptera:
Cicadellidae) especializadas em alimentação neste tecido vegetal (subfamilia Cicadellinae). Esta
pesquisa teve por objetivo identificar atividades estiletares da cigarrinha vetora Bucephalogonia
xanthophis (Berg) associadas à aquisição e inoculação de X. fastidiosa em mudas de laranja-doce
[Citrus sinensis (L.) Osbeck], utilizando-se a técnica de “electrical penetration graph” (EPG), que
permite a observação em tempo real de padrões de onda relacionados às atividades estiletares.
Insetos sadios e infectivos acoplados ao sistema de EPG foram submetidos à alimentação em
plantas cítricas infectadas e sadias, respectivamente, sendo interrompidos em diferentes fases da
penetração estiletar. Verificou-se que a aquisição de X. fastidiosa em plantas infectadas ocorre
somente após o inicio do padrão Xi (ingestão no xilema); porém, com apenas 1 h de atividades
neste padrão, B. xanthophis subseqüentemente transmitiu a bactéria para plantas-teste com uma
eficiência de 7,7%. Em plantas sadias, a inoculação ocorreu durante os padrões S (formação da
bainha salivar e caminhamento intracelular), S+X (X=primeiro contato dos estiletes com xilema)
e S+X+Xi, com eficiência de 3,5; 7,1 e 7,4%, respectivamente. Embora as maiores taxas de
transmissão tenham sido registradas após o contato com o xilema, é intrigante a ocorrência de
inoculação de X. fastidiosa durante a fase pré-xilemática (padrão S), considerando-se que esta
bactéria é supostamente restrita ao xilema. A capacidade de B. xanthophis transmitir X. fastidiosa
em breves períodos de acesso à inoculação em plantas sadias, é discutida em termos de manejo da
CVC.
Palavra-chave: Clorose Variegada dos Citros; Cigarrrinhas vetoras; Comportamento alimentar;
EPG
Abstract
Xylella fastidiosa, the causal agent of citrus variegated chlorosis, is a xylem-inhabiting
bacterium transmitted by leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) specialized on xylem feeding
(subfamily Cicadellinae). The goal of this study was to identify vector stylet activities associated
with acquisition and inoculation of X. fastidiosa in Citrus sinensis (L.) Osbeck, by using the
electrical penetration graph (EPG) technique, which allows real time observations of waveforms
related to feeding activities in the plant. Healthy and infective adults of the leafhopper vector
Bucephalogonia xanthophis (Berg) were interrupted after different phases of stylet penetration on
source and healthy (test) plants, respectively, while being monitored by EPG. Acquisition of X.
fastidiosa from infected plants occurred only after onset of waveform Xi (xylem ingestion); but
with just 1 h in Xi, B. xanthophis subsequently transmitted the pathogen to 7.7% of test plants. In
healthy plants, inoculation took place during waveforms S (salivary sheath formation and stylet
pathway), S+X (X= first xylem contact by stylets) and S+X+X1, with efficiencies of 3.5, 7.1 and
7.4%, respectively. Although higher transmission rates were recorded after the first contact with
55
xylem (S+X and S+X+Xi), it is intriguing the fact that inoculation of this xylem-limited bacterium
also occurred before that (during S). The ability of B. xanthophis to transmit X. fastidiosa after
short inoculation access periods is discussed in relation to CVC management strategies.
Keywords: Citrus variegated chlorosis; Sharpshooter vector, Feeding behavior; EPG
4.1 Introdução
A Clorose Variegada dos Citros (CVC), doença que representa atualmente um dos
problemas fitossanitários de maior relevância para a citricultura brasileira é causada por uma
bactéria gram-negativa, limitada aos vasos do xilema das plantas, denominada Xylella fastidiosa
Wells et al. (LEE et al., 1993). Relatada pela primeira vez em 1987 no Estado de São Paulo (DE
NEGRI, 1990), a CVC atualmente encontra-se disseminada nas principais regiões citrícolas do
Brasil (TUBELIS et al., 1993; LEITE JÚNIOR et al., 1996; SANTOS FILHO et al., 1999) e
América do Sul (BRLANSKY et al., 1991). A bactéria pode ser transmitida em citros por enxertia
de borbulhas e raízes (MACHADO et al., 1994; HE et al., 2000) entretanto, sua disseminação
natural no campo ocorre principalmente por meio de insetos vetores (LOPES, 1999).
Os insetos relatados como vetores de X. fastidiosa em citros são cigarrinhas pertencentes a
família Cicadellidae (subfamília Cidacellinae) (REDAK et al., 2004). Antes do surgimento da
CVC, estas cigarrinhas não causavam danos diretos aos pomares cítricos. Entretanto, por serem
sugadores da seiva do xilema, passaram a ter uma maior importância em razão da capacidade de
transmitir a bactéria (PURCELL, 1994). Entre os vetores, Bucephalogonia xanthophis (Berg) se
destaca por se comumente encontrada em viveiros abertos e pomares cítricos em formação
(ROBERTO et al., 2000; YAMAMOTO et al., 2001).
Grande parte das informações sobre as características de transmissão de X. fastidiosa pelos
seus vetores é proveniente de estudos com as cigarrinhas Graphocephala atropuctata (Signoret) e
Homalodisca coagulata (Say), associadas à doença de Pierce (“Pierce’s disease” - PD) em
videiras nos Estados Unidos. Para ambas as espécies, as principais características de transmissão
são semelhantes, tais como a ausência de um período latente no vetor, transmissão por ninfas,
porém com perda da infectividade depois da ecdise, e transmissão persistente por cigarrinhas
adultas, devido à capacidade da bactéria multiplicar-se no vetor (PURCELL; FINLAY 1979;
HILL; PURCELL, 1995; ALMEIDA; PURCELL 2003). Em citros, o modo de transmissão de X.
fastidiosa provavelmente é semelhante ao observado em videira, podendo haver variações em
56
algumas características da transmissão, como por exemplo: tempo necessário para aquisição ou
inoculação, período latente e persistência da bactéria no vetor (LOPES, 1996).
Com o advento da técnica de monitoramento eletrônico do comportamento alimentar,
muitas questões relacionadas à alimentação de insetos fitófagos sugadores foram melhor
compreendidas. Esta técnica foi originalmente desenvolvida por McLean e Kinsey (1964),
utilizando um sistema de corrente alternada (AC). Posteriormente, Tjallingii (1978) a aperfeiçoou
usando um sistema com corrente contínua (DC) e criou o termo “Electrical Penetration Graph”
(EPG). Com a utilização de EPG, pôde-se caracterizar o comportamento alimentar de mais de 50
espécies de hemípteros (BACKUS, 1994), em estudos de resistência de plantas à insetos
sugadores (ULLMAN et al., 1988; KIMMIS, 1989; RAPUSAS; HEINRICHS, 1990;
CALDERON; BACKUS, 1992; GARZO et al., 2002; ALVAREZ et al., 2006), avaliação de
plantas transgênicas (LIU et al., 2005), ação de inseticidas (NISBET et al., 1993; HARREWIJN;
KAYSER, 1997) e identificação do comportamento necessário para transmissão de fitopatógenos
(FERERES et al., 1993; WAYADANDE; NAULT, 1993; PRADO; TJALLINGII, 1994;
MARTIN et al., 1997).
Nesta última década, os estudos de comportamento alimentar de cigarrinhas que se
alimentam preferencialmente no xilema (Cicadellinae) receberam uma maior ênfase. Neste grupo
de insetos, os trabalhos com EPG foram realizados com duas espécies vetoras de X. fastidiosa na
Califórnia, G. atropunctata e H. Coagulata, utilizando-se o sistema AC (ALMEIDA; BACKUS,
2004; BACKUS et al., 2005, JOOST et al., 2006). Com sistema DC, Miranda (2008
1
) descreveu
seis padrões que ocorrem durante a penetração estiletar de B. xanthophis em citros, com destaque
para: padrão S, que representa a formação da bainha salivar e caminhamento intracelular na
epiderme e parênquima; padrão X, primeiro contato dos estiletes com xilema e Xi, ingestão ativa
no xilema. Entretanto, em nenhum destes estudos, a transmissão da bactéria foi avaliada.
Os trabalhos de transmissão com X. fastidiosa em citros, avaliaram somente a
habilidade e/ou eficiência do inseto vetor em transmitir a bactéria, não sendo observada
nenhuma característica deste processo (LOPES et al., 1996; ROBERTO et al., 1996;
KRÜGNER et al., 2000; YAMAMOTO et al., 2002; MARUCCI, 2003). Assim, este trabalho
teve por objetivo determinar qual atividade estiletar de B. xanthophis está relacionada com o
1
Miranda, 2008, p. 30.
57
processo de aquisição e inoculação de X. fastidiosa em plantas de citros, de modo que tal
conhecimento possa ser utilizado para o aperfeiçoamento ou desenvolvimento de táticas de
controle da CVC, baseadas em interferência no processo de transmissão.
4.2 Desenvolvimento
4.2.1 Material e métodos
Insetos e plantas
Adultos de B. xanthophis foram obtidos utilizando o sistema de criação descrito por
Marucci et al. (2003), onde os insetos são criados em plantas de Vernonia condesata Baker,
permitindo a produção de cigarrinhas isentas de X. fastidiosa. Ninfas de 4º e 5º instar foram
retiradas da colônia de manutenção e colocadas sobre “seedlings” de laranja-doce [Citrus sinensis
(L.) Osbeck] cv. Pêra, em sala climatizada (25 ± 2 °C, com fotofase de 14 h), para completar o seu
desenvolvimento. Neste estudo foram utilizados apenas insetos adultos com idade entre 5 a 8 dias
após sua emergência.
As plantas-teste usadas nos ensaios de transmissão foram “seedlings” sadios de laranja-
doce cv. Pêra, com 15 cm de altura, produzidos em sacos plásticos de 500 ml contendo uma
mistura de solo, esterco e areia (3:1:1). As plantas-teste foram constantemente mantidas em
telados protegidos contra o acesso de insetos vetores, sendo adubadas periodicamente.
Como plantas-fonte, utilizaram-se “seedlings” de laranja-doce cv. Pêra com sintomas de
CVC e população bacteriana média de 1,4 x 10
6
unidades formadoras de colônia (UFC). Essas
plantas foram inoculadas por agulha com uma suspensão de 10
8
UFC/ml de tampão PBS
(“phosphate buffer saline”) do isolado CCT 6570 de X. fastidiosa, 12 meses antes do teste de
transmissão. A presença do patógeno nas plantas-fonte foi confirmada pelo teste de “polymerase
chain reaction” (PCR) (MINSAVAGE et al., 1994), sendo que a estimativa da concentração
bacteriana foi feita por isolamento primário em meio de cultura “periwinkle wilt gelrite” (PWG),
conforme descrito por Almeida et al. (2001).
EPG e testes de transmissão de X. fastidiosa
58
A aquisição e a inoculação de X. fastidiosa por B. xanthophis em citros foram avaliadas
durante os padrões S, X, Xi (MIRANDA, 2008
1
), utilizando-se a técnica de EPG-DC. Durante a
alimentação em plantas-fonte ou plantas-teste, as cigarrinhas foram acoplados a um monitor de
EPG modelo GIGA-8 (Wageningen University) (TJALLINGII, 1978; 1988), ajustado para uma
amplificação de 75X, sendo o sinal analógico convertido a digital mediante placa modelo Di-710
(Dataq
®
Instruments). Os registros digitalizados de EPG foram observados em tempo real por
meio de um computador Pentium4
®
, usando-se o programa Probe 3.0 (Laboratory of Entomology,
Wageningen University).
Teste de aquisição da bactéria. Antes do monitoramento, adultos de B. xanthophis
obtidos da criação foram confinados individualmente sobre “seedlings” sadios de C. sinenis por
um período de 48 h, para a confirmar a ausência de X. fastidiosa nas cigarrinhas (pré-teste de
transmissão). A seguir, esses insetos foram acoplados ao sistema de EPG utilizando a metodologia
descrita por Miranda (2008
1
), e posicionados sobre a haste de plantas-fonte de X. fastidiosa (um
indivíduo por planta) para um período de acesso à aquisição (PAA) que variou de acordo com os
seguintes tratamentos: S (1-2 min de caminhamento dos estiletes na epiderme e parênquima), S+X
(padrão S completo, seguido de 20-30 s de contato com o xilema) e S+X+Xi (S+X completos,
seguidos de 1 h de ingestão nos vasos do xilema) (Figura 1). Após o PAA, a alimentação foi
interropida e os insetos retirados das plantas-fonte. Com uma tesoura cirúrgica, o fio de ouro foi
cortado rente ao dorso dos insetos, sendo estes colocados individualmente sobre “seedlings”
sadios de C. sinensis (plantas-teste) para um período de acesso à inoculação (PAI) de 96 h, para
avaliar a infectividade das cigarrinhas. Durante o PAI (e também no pré-teste), os insetos foram
confinados sobre a haste da brotação dos “seedlings”, por meio de gaiolas plásticas transparentes
e retangulares (4 x 7 x 3 cm), contendo aberturas revestidas com tecido vaporoso (“voil”).
Teste de inoculação da bactéria. Grupos de adultos sadios de B. xanthophis foram
confinados sobre plantas-fonte de X. fastidiosa para um período de acesso à aquisição (PAA) de
48 h, no interior de gaiolas retangulares (32 x 32 x 90 cm) com estrutura de alumínio e
revestimento de “voil”. Em seguida, os insetos foram acoplados ao sistema de EPG e mantidos
sobre plantas-teste (um indivíduo por planta) para um período de acesso à inoculação (PAI) com
duração variável, dependendo do tratamento, que foram os mesmos descritos para o teste de
aquisição (S; S+X e S+X+Xi) (Figura 1).
1
Miranda, 2008, p. 30.
59
Nos tratamentos S, S+X e S+X+Xi do teste de inoculação, foram avaliadas 28, 28 e 27
plantas-teste, respectivamente. No teste de aquisição, foram avaliadas 27, 28 e 26 plantas-teste
nos respectivos tratamentos, além de um total de 80 plantas usadas no pré-teste. Como controle
negativo para avaliação de sintomas de CVC e testes de detecção, um grupo de 10 plantas-teste
não foi exposto às cigarrinhas. Como controle positivo, 10 plantas-teste foram inoculadas
mecanicamente por agulha com 5 µl de uma suspensão do isolado CCT 6570 de X. fastidiosa.
com concentração de 2,7 x 10
8
de UFC/ml de PBS.
Detecção de X. fastidiosa
As plantas-testes, pré-testes e controles foram mantidas em estufas isentas de vetores, e,
após 7 e 12 meses da inoculação, realizaram-se testes de PCR para verificar a infecção das
mesmas por X. fastidosa. O DNA total das plantas foi extraído segundo Minsavage et al. (1994),
utilizando-se o pecíolo e parte da nervura central de duas folhas por amostra, retiradas abaixo e
acima do ponto de inoculação. O PCR foi realizado em termociclador PTC-100 (MJ Research,
Inc., Watertown, MA 02172, EUA) com os “primers” RST31 e RST33, adicionando-se 3 µl de
DNA da amostra para um volume final de reação de 25 µl. As condições de amplificação foram
as mesmas descritas por Minsavage et al. (1994). Após a amplificação, 1 µl de corante (0,25%
azul de bromofenol, 40% de sacarose) foi adicionado a cada amostra e os produtos da PCR foram
separados por meio de eletroforese em gel de agarose (1%) em tampão TBE (89 mM Tris; 89 mM
ácido bórico; 2 mM EDTA, pH 8.0) com brometo de etídio (0,5 µg/ml). Os fragmentos de DNA
foram visualizados sob luz ultra violeta em equipamento de documentação de gel modelo Eagle
Eye II (Stratagene, La Jolla, CA 92037, EUA).
60
Figura 1. Representação gráfica dos períodos de acesso à aquisição (PAA) e de acesso à inoculação (PAI) avaliados
nos testes de aquisição e de inoculação de Xylella fastidiosa por Bucephalogonia xanthophis em mudas
cítricas, durante registro de EPG. O quadro maior representa a seqüência típica de padrões EPG-DC que
ocorrem durante uma prova (penetração). Np: não prova, estiletes fora da planta; S: secreção da bainha
salivar e movimentação intracelular dos estiletes na epiderme e parênquima; X: primeiro contato dos
estiletes com o xilema; e Xi: ingestão ativa de seiva do xilema
4.2.2 Resultados e Discussão
As atividades estiletares de B. xanthophis foram correlacionadas com os processos de
aquisição e inoculação de X. fastidiosa em citros usando a técnica de EPG-DC. Esta técnica que já
havia sido utilizada com sucesso para compreender a transmissão de vírus por afideos e moscas-
brancas (COLLAR;FERERES, 1998; JIANG et al., 2000), mostrou ser uma importante
ferramenta também em estudos de transmissão de bactérias vasculares por cigarrinhas.
Pré-teste - 48 hs
PAA (planta fonte) com EPG
Aquisição
PAI (planta teste) com EPG
PAA (planta fonte) - 48 hs
Inoculação
Np
S
X
Xi
S
S + X
S + X + Xi
Np
S
X
Xi
S
S + X
S + X + Xi
PAI (Planta teste) - 96 hs
61
Teste de aquisição
A bactéria X. fastidiosa não foi detectada em nenhuma das plantas do pré-teste,
confirmando a sanidade das cigarrinhas utilizadas neste ensaio de aquisição. Dentre os diferentes
períodos de penetração estiletar do vetor avaliados em plantas-fonte da bactéria, a transmissão
subseqüente para plantas-teste ocorreu apenas no tratamento que incluía o padrão Xi (Tabela 1).
Este resultado indica que a aquisição de X. fastidiosa por B. xanthophis ocorre somente no xilema,
durante Xi. Baseando-se em estudos de histologia do local de alimentação, de freqüência de
excreção e de análise química do “honeydew” excretado, Xi foi descrito como ingestão ativa de
seiva do xilema (MIRANDA, 2008
1
). Assim, o fato de a aquisição deste patógeno, que tem seu
desenvolvimento restrito aos vasos do xilema (PURCELL e HOPKINS, 1996), ocorrer durante o
padrão Xi, é mais uma evidência de tal atividade biológica.
Os resultados do presente trabalho demonstram que B. xanthophis tem a capacidade de
adquirir X. fastidiosa com apenas 1 h de ingestão no xilema de plantas cítricas infectadas. Em
videira com PD, as cigarrinhas G. atropuctata e H. coagulata adquirem esta bactéria durante um
PAA de 1 h (PURCELL; FINLAY 1979; ALMEIDA; PURCELL 2003). Entretanto, nestes
estudos não se utilizou EPG, e provavelmente estes insetos gastaram parte do tempo (1 h) com
não prova e caminhamento dos estiletes dentro da planta-fonte antes de iniciar a ingestão no
xilema. Assim, é possível que para B. xanthophis a aquisição de X. fastidiosa em citros também
possa acontecer em períodos de ingestão inferiores a 1 h; entretanto, seria necessário um estudo
com PAAs mais curtos do que este, para comprovar esta hipótese.
Neste ensaio, B. xanthophis apresentou uma eficiência de transmissão de 7,7% após um
PAA de 1 h de ingestão no xilema de plantas-fonte, seguido de um PAI de 96 h em plantas-teste.
Utilizando-se PAA e PAI com durações de 48 h, Marucci (2003) observou uma eficiência de
transmissão por indivíduo de 5% para esta mesma espécie vetora em citros. Isto sugere que PAA
mais longos que 1 h podem não resultar em aumento na eficiência de aquisição de X. fastidiosa,
no caso deste vetor. No entanto, deve-se salientar que Marucci et al. (2003) utilizaram 3
cigarrinhas por planta-teste durante o PAI, enquanto que na presente pesquisa apenas 1 indivíduo
foi usado. Hill e Purcell (1997) observaram que quando se utiliza grupo de insetos por planta-
teste, a estimativa da probabilidade de um indivíduo transmitir X. fastidiosa se torna mais baixa.
1
Miranda, 2008, p. 30.
62
Teste de inoculação
No ensaio de variação no PAI, a transmissão de X. fastidiosa para plantas cítricas foi
observada em todos os tratamentos (Tabela 1). Um fato surpreendente foi a inoculação da bactéria
durante o padrão S. Segundo Miranda (2007
1
), este padrão representa a fase de caminhamento dos
estiletes, e envolve a secreção da bainha salivar e inserção intracelular no tecido vegetal. Tal
padrão é observado durante toda a rota dos estiletes até o inicio do padrão X, que representa
primeiro contato com o xilema. Backus et al. (2007a; 2007b) detectaram X. fastidiosa na bainha
salivar de H. coagulata produzida durante alimentação em dieta artificial, e postularam que
enzimas secretadas por esta cigarrinha podem facilitar o deslocamento desta bactéria entre as
células da planta. Na presente pesquisa, é possível que a interrupção durante o padrão S tenha
ocorrido quando os estiletes já estavam próximos do xilema; assim, de acordo com a hipótese de
Backus e colaboradores, bactérias secretadas junto com a bainha salivar teriam penetrado neste
tecido com auxílio de enzimas presentes saliva.
Os tratamentos S+X e S+X+Xi resultaram em taxas semelhantes de transmissão (7,1 e
7,4%, respectivamente), e superiores ao tratamento que continha apenas S (3,5%). Embora esta
diferença entre os tratamentos com ou sem etapas no xilema não seja marcante, isto sugere que
maiores probabilidades de sucesso na transmissão ocorrem a partir do momento que os estiletes
entram em contato com xilema.
Cigarrinhas vetoras do Maize clorotic dwarf vírus (MCDV), pertencentes à subfamília
Deltocephalinae (Hemiptera: Cicadellidae), apresentaram um padrão característico denominado
X, quando monitoradas pelo sistema AC de EPG (WAYADANDE; NAULT, 1993). Por
observarem inoculação de MCDV durante X, e este vírus ser restrito ao floema de plantas de
milho, estes autores postularam que tal padrão estaria associado a um comportamento de egestão
de líquidos e de partículas de vírus presentes no estomodeu do vetor, durante o contato dos
estiletes com os vasos do floema das plantas. Em estudos preliminares, Backus et al. (2007a)
observaram a existência de um padrão X para H. coagulata, que possivelmente estaria relacionado
com a inoculação de X. fastidiosa no xilema.
Uma das hipóteses sobre o mecanismo de inoculação de X. fastidiosa, é que a tensão
negativa no xilema seria capaz de deslocar células da bactéria presentes no canal alimentar ou
estomodéu do vetor em direção à planta (PURCELL, 1989). Entretanto, Almeida et al. (2005)
observaram que H. coagulata é capaz de inocular de X. fastidiosa em plantas dormentes de
63
videira, as quais apresentam tensão positiva nos vasos do xilema. Estes autores sugeriram que tal
fato representa uma evidência indireta da existência de um comportamento alimentar do vetor que
promove ativamente o deslocamento da bactéria do estomodeu do inseto para planta. Portanto, é
plausível que o padrão X observado em B. xanthophis represente tal comportamento necessário
para de inoculação de X. fastidiosa em citros. Entretanto, o processo de inoculação também pode
ser realizado por meio da bainha salivar, já que este foi observado também durante o padrão S.
Em geral, baixas eficiências de transmissão foram observadas neste trabalho, sobretudo no
padrão S. Este fato também foi relatado em outros trabalhos de transmissão de X. fastidiosa em
citros por cigarrinhas (MARUCCI, 2003; YAMAMOTO et al., 2002; DAMSTEEGT et al., 2006)
e pode estar relacionado com diversos fatores, tais como: distribuição irregular de X. fastidiosa
nas plantas hospedeiras (MIZUBUTI et al., 1994), não preferência e baixa taxa de ingestão em
plantas de citros com CVC em relação a sadias (MARUCCI et al., 2005; MONTESINO et al.,
2006), dificuldade de sobrevivência de infecções iniciais de X. fastidiosa na planta hospedeira
(PURCELL, 1981) e baixa concentração da bactéria em citros (ALMEIDA et al., 2001).
Em ambos os ensaios (aquisição e inoculação) as plantas-testes que tiveram a presença de
X. fastidiosa detectada por PCR não apresentaram sintomas. As amostras retiradas desta plantas
foram folhas próximas ao ponto de inoculação (haste), mostrando que ocorreu movimentação da
bactéria na planta. Nos controles negativos, em nenhuma planta se detectou X. fastidiosa; já nos
controles positivos, que foram inoculados mecanicamente, 6 plantas tiveram a presença da
bactéria confirmada e destas, 3 apresentaram sintomas.
Implicações destes resultados para manejo da CVC
Os resultados deste trabalho mostram que B. xanthophis pode adquirir X. fastidiosa com 1
h de ingestão no xilema e inocular durante um breve período de penetração estiletar, com ou sem
contato com o xilema ou ingestão de seiva deste tecido. Deve-se salientar, no entanto, que a
maioria das inoculações bem sucedidas ocorreram a partir do momento que os estiletes entraram
em contato com xilema. Miranda (2008
1
) observou que o tempo mínimo necessário a partir da
primeira prova, para B. xanthophis encontrar os vasos do xilema e iniciar uma ingestão continua,
foi de 2,5 e 3,5 min, respectivamente. Portanto, para que ocorra sucesso na transmissão de X.
1
Miranda, 2008, p. 30.
64
fastidiosa por B. xanthophis em citros, não são necessários longos períodos de alimentação como
se propôs em trabalhos prévios de transmissão por vetores (MARUCCI, 2003).
O controle químico das cigarrinhas vem sendo utilizado visando à redução da população
dos vetores e com isso diminuir a disseminação da CVC em pomares cítricos (GRAVENA et al.,
1997). Em citros esta tática é possível, devido principalmente à baixa eficiência de transmissão
pelas cigarrinhas vetoras (LOPES, 1999). Entretanto, o fato de B. xanthophis apresentar a
capacidade de inocular X. fastidiosa rapidamente, sugere que inseticidas podem não impedir a
transmissão deste patógeno pelas cigarrinhas. Bethke; Blua e Redak (2001) não observaram
transmissão de X. fastidiosa por H. coagulata em oleandro (Nerium oleander L.) após o
tratamento via solo com acetamiprid, imidacloprid e thiamethoxam; porém, a pulverização de
fenpropathrin e thiamethoxam não impediu que 25% das plantas testadas fossem infectadas. Já em
videira, observou-se uma maior taxa de transmissão por H. coagulata em plantas tratadas com
pimetrozina via solo do que em plantas não tratadas (BEXTINE et al., 2004). Na citricultura,
diversos inseticidas foram testados e apresentaram eficiência satisfatória no controle de
cigarrinhas (YAMAMOTO et al., 2000; 2001; 2002).
Entretanto, mesmo com controle dos vetores, a CVC encontra-se disseminada em 43,3%
dos pomares cítricos de São Paulo e Triangulo Mineiro (FUNDECITRUS, 2006). As
características de transmissão observada neste trabalho poderiam explicar em parte esta alta
incidência da doença em campo. É possível que alguns inseticidas usados no controle de
cigarrinhas não sejam eficientes em impedir a transmissão de X. fastidiosa. Portanto, seriam
necessários estudos para verificar a efetividade destes inseticidas na redução ou bloqueio da
transmissão de X. fastidiosa por seus vetores em citros e selecionar os mais adequados a serem
utilizados no manejo da CVC.
65
Tabela 1 - Detecção de Xylella fastidiosa em plantas de Citrus sinensis inoculadas por
Bucephalogonia xanthophis, em função de diferentes períodos de acesso à aquisição
(PAA) e de acesso à inoculação (PAI)
Proporção de plantas infectadas
1
Tratamentos*
7 meses 12 meses Total
PAA em plantas-fonte
S 0/27 0/27 0/27
S + X 0/28 0/27 0/28
S + X + Xi 2/26 1/24 2/26
PAI em plantas-teste
S 1/28 1/27 1/28
S + X 1/28 2/26 2/28
S + X + Xi 1/27 2/25 2/27
Pré-teste
S 0/27 0/27 0/27
X 0/27 0/27 0/27
Xi 0/26 0/24 0/24
Controle positivo
2
6/10 6/10 6/10
Controle negativo
3
0/10 0/10 0/10
1
Proporção de plantas positivas para X. fastidiosa pelo teste de PCR sobre o total de plantas avaliadas, aos 7 e 12
meses após a inoculação.
2
Plantas-teste inoculadas mecanicamente por agulha com uma suspensão de células de X. fastidiosa;
3
Plantas-teste não inoculadas.
*S (1-2 min de caminhamento dos estiletes na epiderme e parênquima), S+X (padrão S completo, seguido de 20-30 s
de contato com o xilema) e S+X+Xi (S+X completos, seguidos de 1 h de ingestão nos vasos do xilema)
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72
5 INFLUÊNCIA DE PLANTAS CÍTRICAS INFECTADAS COM Xylella fastidiosa SOBRE
A PENETRAÇÃO ESTILETAR DE Bucephalogonia xanthophis (BERG) (HEMIPTERA:
CICADELLIDAE)
Resumo
A infecção por Xylella fastidiosa no xilema de plantas cítricas gera modificações
fisiológicas, bioquímicas e morfológicas nas mesmas, que podem influenciar o comportamento
alimentar de seus insetos vetores e, consequentemente, sua disseminação em campo. Utilizando-se
a técnica de “electrical penetration graph” (EPG), comparou-se a penetração estiletar da cigarrinha
vetora, Bucephalogonia xanthophis (Berg) (Hemiptera: Cicadellidae) em mudas cítricas [Citrus
sinensis (L.) Osbeck] cv. ‘Pêra, infectadas com X. fastidiosa, com e sem sintomas de Clorose
Variegada dos Citros (CVC), em relação a plantas sadias. Por meio da análise de 26 parâmetros
de EPG, verificou-se que o comportamento de alimentar desta cigarrinha foi semelhante entre
plantas sadias e infectadas sem sintomas. Entretanto, em plantas sintomáticas houve redução
significativa no tempo gasto por B. xanthophis com ingestão no xilema (padrão Xi), e as
cigarrinhas permaneceram por mais tempo com os estiletes fora da planta. O tempo médio para
contato com o xilema e ingestão de seiva após o início da 1º. prova foi semelhante entre os três
tratamentos avaliados. Entretanto, o tempo para ocorrência de uma ingestão contínua (> 5 min) no
xilema foi maior em plantas com sintomas de CVC. Estes resultados indicam que as alterações em
plantas cítricas provocadas pela infecção sintomática de X. fastidiosa não afetam a capacidade de
B. xanthophis localizar os vasos do xilema, mas reduzem significativamente o tempo gasto por
este inseto ingerindo seiva dos mesmos. Estas informações sobre penetração estiletar apoiam a
hipótese de que a disseminação de CVC em pomares ocorre principalmente a partir de plantas-
fonte assintomáticas ou com sintomas iniciais da doença.
Palavra-chave: Clorose Variegada dos Citros; Cigarrrinhas vetoras; Comportamento alimentar;
EPG
Abstract
The xylem colonization by Xylella fastidiosa promotes physiological, biochemichal and
morphological alterations in citrus plants that might influence the feeding behavior of vectors of
this bacterial pathogen and its spread in citrus groves. By using the “electrical penetration graph”
(EPG) technique, we compared the stylet penetration by the sharpshooter vector, Bucephalogonia
xanthophis (Berg) (Hemiptera: Cicadellidae), on healthy versus infected sweet orange seedlings
[Citrus sinensis (L.) Osbeck, cv. Pêra]. Two categories of infected plants were tested: with and
without symptoms of Citrus variegated chlorosis (CVC). The stylet penetration by B. xanthophis
on healthy versus symptomless infected citrus was similar based on the analysis of 26 EPG
parameters. However, this sharpshooter spent more time non-probing and less time ingesting from
the xylem on symptomatic infected plants. The time period needed to contact xylem and start
ingestion after the onset of the 1
st
probe was similar among the treatments. However, average time
elapsed between onset of the 1
st
probe and beginning of sustained xylem ingestion (>5 min) was
longer on plants with CVC symptoms. These results indicate that symptomatic infection by X.
fastidiosa in citrus do not affect the ability of B. xanthophis to locate xylem vessels, but
73
significantly reduce time spent by this insect ingesting xylem sap. They also support the
hypothesis that symptomless infected citrus trees or trees with early disease symptoms may be
more important as sources for CVC spread than severely diseased ones.
Keywords: citrus variegated chlorosis; sharpshooter vector; feeding behavior; EPG
5.1 Introdução
Xylella fastidiosa se desenvolve no xilema de uma ampla gama de plantas hospedeiras
(HOPKINS, 1989) e pode provocar sérios danos em diversas culturas de importância econômica
(PURCELL e HOPKINS, 1996). Em citros esta bactéria é agente causal da Clorose Variegada dos
Citros (CVC) (LEE et al., 1993). Plantas atacadas por esta enfermidade apresentam sintomas
iniciais nas folhas, sendo observadas manchas cloróticas na face superior, correspondendo a
bolhosidades cor de palha na fase inferior (ROSSETTI et al., 1991). Com a evolução da doença,
observa-se frutos de tamanho reduzido e endurecidos (LEE et al., 1993), podendo ocorre
desfolhamento e morte dos ramos ponteiros (ROSSETTI; DE NEGRI, 1990). Os insetos relatados
como vetores de X. fastidiosa em citros e responsáveis pela sua disseminação natural em campo,
são cigarrinhas pertencentes à família Cicadellidae, subfamília Cicadellinae (LOPES, 1999;
REDAK et al., 2004).
Estudar o comportamento alimentar de insetos sugadores, sempre foi complexo, devido as
atividades alimentares ocorrerem dentro do tecido vegetal. Entretanto, a partir de 1964, com a
introdução da técnica de monitoramento eletrônico do comportamento alimentar (MCLEAN;
KINSEY, 1964), muitas questões relacionadas à alimentação de insetos fitófagos sugadores foram
melhor compreendidas. O sistema original desenvolvido por McLean e Kinsey utilizava corrente
alternada (AC). Tjallingii (1978) desenvolveu um sistema usando corrente direta (DC) e criou o
termo “Electrical Penetration Graph” (EPG). Com a utilização destas técnicas, pôde-se
caracterizar o comportamento alimentar de mais de 50 espécies de hemípteras (BACKUS, 1994).
Estas também foram utilizadas com sucesso para estudar alterações no comportamento alimentar
de afídeos em plantas infectadas por vírus (FERERES et al., 1990; ALVAREZ et al., 2007).
Nos últimos anos, estudos de comportamento alimentar com cigarrinhas vetoras de X.
fastidiosa receberam uma maior ênfase. Isto se deve ao aumento da importância de doenças
causadas por esta bactéria em plantas cultivadas (HOPKINS; PURCELL, 2002). Os trabalhos de
EPG com Cicadellinae foram mais concentrados com as espécies Graphocephala atropuctata
74
(Signoret) e Homalodisca coagulata (Say) utilizando o sistema AC (ALMEIDA; BACKUS, 2004;
BACKUS et al., 2005; JOOST et al., 2006). Recentemente, Miranda (2007
1
), usando o sistema
DC, descreveu seis padrões que ocorrem durante a penetração estiletar de Bucephalogonia
xanthophis (Berg) em citros.
Interações envolvendo planta hospedeira, patógeno e inseto vetor geralmente são
complexas. A presença do patógeno gera modificações fisiológicas, bioquímicas e morfológicas
nestas plantas, que podem ser vantajosas ou não para o inseto vetor. BLUA et al., (1994)
observaram que Aphis gossypii Glover quando se desenvolve em abóbora infectada com Zucchini
yellow mosaic vírus (ZYMV) apresenta maior longevidade e capacidade reprodutiva. Plantas de
batata infectadas com Potato leafroll virus (PLRV) emitem voláteis que as tornam mais atrativas a
Myzus persicae (Sulzer), quando comparadas a sadias (EIGENBRODE et at., 2002). Entretanto, a
presença de Barley yellow dwarf vírus (BYDV) em trigo, reduz a concentração de aminoácidos
totais no floema, o que leva a uma menor eficiência de assimilação e quantidade de honeydew
excretado por Sitobion avenae (F.) (FIEBIG et al., 2004).
O mecanismo de patogenicidade de doenças causadas por X. fastidiosa, todavia não foi
totalmente compreendido. Segundo Hopkins (1989) este poderia ser causado por um desbalanço
de reguladores de crescimento, produção de fitotoxinas e disfunção do sistema de condução de
água. Entretanto, tem-se sugerido que esta ultima hipótese seja o principal mecanismo de
patogênese, ocasionado pela obstrucçao dos vasos do xilema por agregados de células bactérianas,
deposição de gomas, pectina e formação de tiloses pelo hospedeiro (FRY; MILHOLLAND, 1990;
MOLLENHAUER; HOPKINS, 1976; QUEIZOZ-VOLTAN; PARADELLA FILHO, 1999). Em
plantas com CVC foram observadas diversas disfunções fisiológicas, tais como: diminuição no
fluxo de seiva, na assimilação de CO
2
, fotossíntese e transpiração (MACHADO et al., 1994;
HABERMANN et al., 2003). Plantas afetadas por esta doença também podem apresentar
alterações anatômicas e bioquímicas como resposta de defesa à presença deste patógeno
(MARTINS et al., 1999; QUEIZOZ-VOLTAN; PARADELLA FILHO, 1999).
Mizell e French (1987) observaram que a ocorrência e sobrevivência da cigarrinha H.
coagulata em pêssego infectado com X. fastidiosa e com sintomas da doença Redução do Porte
do Pessegueiro, é menor que, quando comparado com plantas sadias. Em testes de livre escolha as
cigarrinhas Dilobopterus costalimai Young e Oncometopia facialis (Signoret), preferem plantas
cítricas sadias, em relação à com sintomas de CVC (MARUCCI et al., 2005). Estas cigarrinhas
75
também apresentaram uma menor taxa de excreção quando confinadas em plantas com sintomas
desta doença (MONTESINO et al., 2006). Deste modo, modificações provocadas por X. fastidiosa
em seu hospedeiro, podem influenciar no comportamento alimentar de seus insetos vetores.
Entretanto, nenhum estudo aprofundado foi realizado para identificar, quais atividades alimentares
dentro da planta são afetadas pela presença deste patógeno. Assim, esse trabalho tem por objetivo,
avaliar o comportamento alimentar de B. xanthophis em plantas cítricas infectadas com X.
fastidiosa, com e sem sintomas de CVC, em relação a plantas sadias, utilizando a técnica de EPG.
5.2 Desenvolvimento
5.2.1 Material e métodos
Insetos
Adultos de B. xanthophis foram criados em plantas de Vernonia condesata Baker,
utilizando o sistema de criação descrito por Marucci et al. (2003), que permite a obtenção de
cigarrinhas sadias e com idade padronizada. Fêmeas adultas com 2 a 3 dias após a emergência,
foram retiradas da colônia de manutenção e colocadas sobre “seedlings” de laranja-doce [Citrus
sinensis (L.) Osbeck] cv. Pêra, em sala climatizada (25 ± 2 °C com fotofase de 14 h) para um
período de aclimatação de 48 h e posteriormente utilizadas no ensaio de comportamento
alimentar.
Plantas
As plantas teste usadas neste ensaio foram “seedlings” de laranja-doce cv. ‘Pêras com 30 -
40 cm de altura, em vasos plásticos de 4 L contendo solo, esterco e areia (3:1:1). Estas foram
distribuídas em três tratamentos: 1) plantas sadias; 2 e 3) plantas infectadas com X. fastidiosa,
inoculadas mecanicamente a 6 e 12 meses, sem e com sintomas de CVC, respectivamente. Em
todos os tratamentos retiraram-se amostras foliares próxima ao local onde os insetos foram
colocados para alimentação, e realizaram-se os testes diagnósticos de “polymerase chain reaction”
(PCR) (MINSAVAGE et al., 1994), sendo que a estimativa da concentração bacteriana foi feita
por isolamento primário em meio de cultura “periwinkle wilt gelrite” (PWG), conforme descrito
por Almeida et al. (2001). Com estes resultados, quatro plantas por tratamento foram
selecionadas, para serem utilizadas no ensaio com EPG. No tratamento 1, nenhuma planta
76
selecionada estava infectada com X. fastidiosa e nos tratamentos 2 e 3 as plantas apresentavam
uma população bacteriana média de 2,5 x 10
5
e 1,4 x 10
6
unidades formadoras de colônia (UFC)
do isolado CCT 6570/ g de tecido de folha, respectivamente.
Electrical Penetration Graph (EPG)
O monitoramento do comportamento alimentar foi realizado por meio da técnica de EPG-
DC modelo GIGA-8 (Wageningen University) cuja descrição detalhada foi realizada por
Tjallingii (1978; 1988). Os registros foram realizados com “ganância” de 75x e o sinal analógico
convertido a digital mediante uma placa Di-710 (Dataq
®
Instruments). Um computador
Pentium4
®
foi acoplado a este sistema para aquisição e armazenagem dos dados utilizando o
programa Probe 3.0 (Laboratory of Entomology, Wageningen University). O processo de
monitoramento foi realizado em sala climatizada (25 ± 2 °C) com iluminação natural e artificial,
dentro de uma gaiola de Faraday, onde duas plantas teste de cada tratamento foram distribuídas ao
acaso. A cada novo registro estas plantas eram substituídas e uma nova ordem de arranjo era
realizada. Os insetos foram acoplados ao sistema de EPG utilizando a metodologia descrita por
Miranda (2008
1
) e colocados individualmente sobre a haste das plantas testes, tomando-se o
cuidado de padronizar o estagio vegetativo da haste usada nos distintos tratamentos. Os registros
de EPG foram de 4 horas de duração para cada um dos indivíduos avaliados, sendo realizados ao
todo, 20, 20 e 17 registros para os tratamentos 1, 2 e 3, respectivamente.
Posteriormente realizou-se a marcação dos registros com o auxilio do programa Probe 3.0,
com base nos padrões descritos por Miranda (2008
1
), definidos como: (S) formação da bainha
salivar e caminhamento intracelular; (R) estiletes inseridos na planta, porém aparentemente sem
atividades; (X) primeiro contato dos estiletes com xilema; (Xi) ingestão ativa no xilema; (I) breve
interrupção que ocorre durante X e Xi e (W) retirada dos estiletes da planta. Com estes dados,
calcularam-se parâmetros de EPG (VAN HELDEN; TJALLINGII, 2000), com a intenção de
observar, as diferenças existentes no processo de penetração estiletar de B. xanthophis, em plantas
cítricas dos diferentes tratamentos. Estes foram divididos em, não seqüenciais: número de vezes
que um determinado padrão ocorre por registro e duração total do padrão por registro; e
seqüenciais, tempo necessário para que ocorra: 1
a
prova a partir do início do registro, 1
o
X a partir
do início do registro, 1
o
X a partir da 1
a
prova , 1
o
Xi a partir do início do registro, 1
o
Xi a partir da
1
a
prova, 1
o
Xi > 5 min a partir do início do registro, 1
o
Xi > 5 min a partir da 1
a
prova. Os dados
1
Miranda, 2008, p. 30.
77
foram transformados (
1+x
), submetidos a uma análise de variância (ANOVA) e posteriormente
ao teste de comparação de médias de Fisher LSD.
5.2.2 Resultados
Em todos os parâmetros analisados, plantas sadias não diferiram estatisticamente de
plantas infectadas sem sintomas, entretanto, quando estes tratamentos foram comparados a plantas
com sintomas, observaram-se diferenças significativas em alguns parâmetros (Tabela 1).
Os parâmetros não seqüenciais, relativos ao número de vezes que o inseto realiza um
padrão durante um registro, mostraram que em plantas com sintomas, B. xanthophis realiza uma
maior quantidade de Np (não provas) e dos padrões S, e W, indicando que estas cigarrinhas
realizam um maior número de provas netas plantas, em relação a sadias e asintomáticas.
Entretanto, o número de provas que ocorrem antes do primeiro contato com xilema, foi baixo em
todos os tratamentos e não se diferencia entre si (P = 0,702). Diferenças estatísticas, também não
foram observadas nos demais parâmetros relacionados com xilema. Em todos os tratamentos
100% das cigarrinhas conseguiram realizar ingestão contínua (>5min) em vasos do xilema. Com
relação ao número de vezes que ocorre o padrão R, em plantas sadias e asintomáticas, as
cigarrinhas se comportaram de modo semelhante, contudo, diferiram das plantas com sintomas (P
= 0,003).
Nos parâmetros não seqüenciais de duração total, observou-se que em plantas sintomáticas
B. xanthophis permanece um maior tempo em Np, em relação a asintomáticas e sadias (P < 0,01).
Este fato fica bem evidenciado quando se observa a proporção de insetos que realizam um
determinado padrão em diferentes intervalos de tempo ao logo dos registros (Figura 1). O tempo
de permanência durante o padrão S, foi semelhante entre os três tratamentos avaliados (P =
0,126), durante uma prova este padrão representa a maioria das atividades estiletares que ocorrem
fora do xilema. No padrão R, em plantas sadias as cigarrinhas se comportaram de modo
semelhante em relação as infectadas pela bactéria, entretanto, estas últimas diferiram entre si (P =
0,008). Em plantas infectadas, sem e com sintomas de CVC, o tempo gasto no padrão X, não foi
alterado em relação a sadias (P = 0,345). Contudo, o período de ingestão no xilema foi bem
inferior em plantas com sintomas, em relação aos demais tratamentos (P < 0,01), sendo esta
diferença também significativa, mesmo quando se soma ambas as atividades no xilema (X + Xi)
78
(P < 0,01). A duração total dos padrões I e W não diferiram entre os tratamentos analisados (P =
0,631; P = 0,5, respectivamente).
Por meio de parâmetros não seqüenciais, observou-se que o tempo necessário para que B.
xanthophis realize a primeira prova e inicie ingestão no xilema, não diferiu entre as plantas sadias
e infectadas com X. fastidiosa. Contudo o tempo para ocorrência de uma ingestão contínua (> 5
min), foi significante maior em plantas com sintomas de CVC, em relação a sadias ou
asintomáticas (Tabela 1). Os menores tempos observados para que este tipo de ingestão ocorresse,
a partir do inicio do registro foram: 4,26; 11,36 e 10,94 min em plantas sadias, assintomáticas e
sintomáticas, respectivamente.
5.2.3 Discussão
Neste estudo, parâmetros de EPG foram usados para verificar o efeito de plantas cítricas
infectadas com X. fastidiosa sobre a penetração estiletar de B. xanthophis. Plantas sem sintomas
de CVC não interferem no comportamento alimentar deste inseto, quando comparadas a sadias,
entretanto, plantas com sintomas influenciaram negativamente, principalmente nos parâmetros
relacionados com ingestão contínua no xilema (> 5min). Alvarez et al. (2007), também
observaram que o comportamento alimentar de M. persicae em plantas infectadas com Potato
leafroll vírus (PLRV) somente é modificado a partir do momento que as plantas mostram
sintomas visuais. Neste caso, a infecção por este vírus facilita a penetração estiletar, observando-
se um reduzido número de prova e curto período de tempo para o primeiro contato com floema.
Entretanto, nestas plantas o padrão E1 (salivação no floema) ocorre com uma maior freqüência,
em relação a plantas sadias, e E2 (salivação + ingestão) não aumenta significativamente.
O fato do tempo necessário para que B. xanthophis realize a primeira prova, encontre os
vasos do xilema e inicie ingestão, não diferir entre os três tratamentos avaliados, e também, o
número de provas que ocorrem antes do primeiro contato com xilema serem reduzidos e
semelhantes para todos os tratamentos, mostra que ao menos na haste, a presença de X. fastidiosa,
independente do grau de infecção, não interfere na penetração estiletar em tecidos não vasculares.
Segundo Queiroz-Voltan e Paradela Filho, (1999), na haste de ramos com sintomas de CVC, não
são observadas divisões celulares anormais na epiderme e parênquima, como acontece em folhas
com sintoma da doença. Auquenorrincos em geral apresentam sensilas quimio-receptoras no ápice
79
do rostro, estas estruturas quando postas em contato com a superfície da planta, permitem a estes
insetos obter informações sobre o hospedeiro selecionado (BACKUS, 1985). Entretanto, estes
resultados indicam que este comportamento utilizado para seleção hospedeira por auquenorrincos,
não permite B. xanthophis distinguir plantas sadias de infectadas por X. fastidiosa através da
superfície da haste, sendo necessário a realização de provas para que isso ocorra.
Diversos trabalhos relatam os efeitos da oclusão de vasos do xilema, causados pela
presença de X. fastidiosa, sobre a fisiologia de plantas cítricas (MACHADO et al., 1994;
HABERMANN et al., 2003; RIBEIRO; MACHADO; OLIVEIRA, 2004). Machado et al. (2006)
verificaram que o fluxo de seiva no xilema é 1,9 superior em plantas sadias em relação a doentes,
estas também apresentam o potencial da água (Ψ) da folha significativamente menor que o
observado em plantas sadias. Assim, plantas infectadas por esta bactéria apresentam a pressão dos
vasos do xilema mais negativa, de que plantas sadias, e conseqüentemente cigarrinhas que se
alimentam neste tecido vascular necessitam de um esforço maior para sucção da seiva.
Em plantas com sintomas, o tempo gasto por B. xanthophis com ingestão no xilema foi
significativamente reduzido em relação a sadias e assintomáticas. Montesino et al. (2006),
observou que as cigarrinhas O. facialis e D. costalimai excretam reduzidas quantidade de
“honeydew” quando são confinadas em plantas com sintomas severos de CVC em comparação a
sadias. Alves (2003) observou que em plantas cítricas com sintomas foliares leves e intensos de
CVC, a proporção de vasos colonizados por X. fastidiosa no pecíolo foi de 8 e 11,8%,
respectivamente. Entretanto, este autor explana que esta proporção pode ser maior já que os vasos
colonizados não são os mesmos ao logo do pecíolo. Este também observou que durante o processo
de colonização dos vasos do xilema, varias etapas são observadas, desde o momento do
estabelecimento inicial da bactéria com poucas células, até a completa oclusão do lume, com
produção de material fibrilar e goma. Assim, possivelmente em plantas assintomáticas o nível de
comprometimento dos vasos ainda é pequeno, o que explicaria pelo menos em parte, o semelhante
desempenho do comportamento alimentar de B. xanthophis nestas plantas, quando comparado a
sadias.
Em plantas com sintomas de CVC, B. xanthophis permanece mais tempo em Np, do que
com ingestão no xilema e também realiza um maior número vezes o padrão S e Np. Isso
provavelmente aconteceu, uma vez que estes insetos após algumas tentativas sem sucesso de
manter ingestão contínua em vasos do xilema que estavam obstruídos, iniciam a busca de um
80
outro vaso ou acabam retirando os estiletes da planta. Sendo que estas cigarrinhas posteriormente
iniciam uma nova prova, ou permanecem em Np até o final do registro. O fato de B. xanthophis
não diferir na duração total do padrão R em relação a plantas sintomáticas, aparentemente não tem
explicação. Este padrão foi descrito como uma provável fase de descanso, onde os estiletes
permanecem dentro da planta, aparentemente sem atividades (Miranda, 2007
1
). Em um estudo
com Nephotettix virescens (Distant) (Deltocephalinae) usando o sistema AC, um similar
comportamento foi observado, entretanto neste caso, com uma maior duração em plantas de arroz
resistentes a esta cigarrinha, em relação a suscetíveis (RAPUSAS; HEINRICHS,1990).
Em ensaios de livre escolha realizados em laboratório, Marucci et al. (2005) observaram
que mudas cítricas com sintomas de CVC se tornam menos atrativas para as cigarrinhas D.
costalimai e O. facialis em relação a sadias. Sendo que para a primeira espécie, com apenas 1 h
após a liberação, um elevado número de insetos já haviam selecionado as plantas sadias, em
relação a sintomáticas. Contudo, para O. facialis um período mais largos é necessário para que
ocorra a discriminação entre estas plantas. Entretanto, esta cigarrinha não diferencia plantas sadias
de assintomáticas. Assim, estes autores acreditam que plantas sem sintomas de CVC possam ser
fontes de inoculo de X. fastidiosa mais importantes, que as sintomáticas.
No presente estudo, por meio da técnica de EPG, observou-se que B. xanthophis também
não distingui plantas sadias de assintomáticas, contudo, apresenta uma nítida discriminação
quando se compara estas plantas, com sintomáticas. Além disso, os resultados deste trabalho
indicam que, a distinção de plantas sintomáticas das demais, ocorre somente a partir do momento
que esta cigarrinha, não conseguem manter uma ingestão contínua no xilema (>5min). O tempo
mínimo necessário a partir do inicio do registro, para que este tipo ingestão ocorra, foi inferior a
12 min, tanto em plantas assintomáticas como sintomáticas. Assim, possivelmente as espécies
observadas no trabalho de Murucci et al. (2005) também tenham realizado provas e utilizado estas
para discriminar plantas sadias e assintomáticas de sintomáticas. Seria interessante verificar se
nestas provas discriminatórias as cigarrinhas apresentam a capacidade de adquirir X. fastidiosa e
posteriormente inocular em plantas sadias. Miranda (2008
1
) observou que B. xanthophis tem a
habilidade de transmitir esta bactéria, com um período de aquisição prévio, de 1 h de ingestão no
xilema de plantas fontes.
1
Miranda, 2008, p. 54.
81
Com os resultados deste trabalho, pôde-se compreender o que acontece durante a
penetração estiletar de B. xanthophis em plantas cítricas infectadas com a bactéria X. fastidiosa.
Estes corroboram as observações feitas por Marucci et al. (2005), de que plantas assintomáticas
provavelmente sejam fontes de inoculo mais importantes que plantas com sintomas de CVC.
Além disso, a constatação que provas são realizadas para diferenciar plantas sintomáticas, de
sadias e assintomáticas, reforça a importância da disseminação secundária entre plantas nos
pomares cítricos (LARANJEIRA et al., 1998). Os parâmetros de EPG aqui analisados, geralmente
são usados em trabalhos de resistência de plantas a insetos sugadores, entretanto neste estudo,
mostraram-se bastante úteis para apontar as modificações provocadas no comportamento
alimentar de B. xanthophis, quando colocada em plantas infectadas com X. fastidiosa, podendo ser
usados também em futuros trabalhos de preferência de planta hospedeira, efeito de inseticidas
e/ou outros tratamentos, sobre a alimentação deste grupo de insetos vetores.
82
Tabela1 - Parâmetros de EPG (média ± erro padrão) usados no estudo do comportamento alimentar de
Bucephalogonia xanthophis sobre mudas de Citrus sinensis sadias e infectadas com Xylella
fastidiosa, sem sintomas e com sintomas de CVC, durante o período de 4 h
Parâmetros EPG Sadias Sem sintomas Com sintomas
(n=20) (n=20) (n=17) F P
Número de vezes que ocorre
Np (não prova) 2,15 ± 0,28 a
1
2,70 ± 0,32 a 5,18 ± 0,53 b 17,79 0,00
Provas antes de X 1,15 ± 0,22 a 0,95 ± 0,24 a 0,94 ± 0,027 a 0,35 0,702
S 5,20 ± 0,68 a 5,60 ± 0,63 a 12,12 ± 1,63 b 12,47 0,00
R 1,00 ± 0,34 a 0,65 ± 0,33 a 2,29 ± 0,68 b 3,55 0,036
X 5,60 ± 0,56 a 7,20 ± 0,80 a 8,12 ± 1,38 a 1,45 0,242
X não seguido de Xi 0,70 ± 0,16 a 1,15 ± 0,39 a 1,88 ± 0,52 a 2,38 0,101
Xi 4, 95 ± 0,47 a 6,05 ± 0,68 a 6,29 ± 1,07 a 0,65 0,526
Xi > 5minutos 4,00 ± 0,42 a 4,30 ± 0,57 a 2,88 ± 0,64 a 2,53 0,089
I 0,85 ± 0,20 a 0,90 ± 0,25 a 1,24 ± 0,34 a 0,47 0,627
W 0,55 ± 0.18 a 0,90 ± 0,25 a 1,76 ± 0,34 b 6,45 0,003
Duração total
2
Np 46,50 ± 9,99 a 63,03 ± 13,76 a 129,92 ± 14,25 b 11,17 0,00
S 159,13 ± 32,13 a 201,73± 48,49 a 89,21 ± 17,61 a 2,15 0,126
R 7,84 ± 2,45 ab 3,40 ± 1,77 a 22,11 ± 7,01 b 5,26 0,008
X 4,26 ± 0,63 a 5,14 ± 1,26 a 6,29 ± 1,13 a 1,08 0,345
X não seguido de Xi 0,63 ± 0,25 a 0,95 ± 0,43 a 2,14 ± 0,87 a 2,91 0,063
Xi 164,62 ± 11,91 a 149,22 ± 12,61 a 46,59 ± 11,61 b 30,57 0,00
X + Xi 168,25 ± 12,06 a 153,41 ± 12,71 a 50,74 ± 11,77 b 29,20 0,00
I 13,91 ± 5,47 a 6,14 ± 2,62 a 6,33 ± 3,08 a 0,46 0,631
W 0,85 ± 0,79 a 0,14 ± 0,06 a 0,32 ± 0,07 a 0,70 0,500
Tempo até
2
1
a
prova a partir do inicio do registro 12,50 ± 5,00 a 23,53 ± 6,07 a 21,66 ± 5,20 a 1,55 0,221
1
o
X a partir do inicio do registro 39,60 ± 9,08 a 48,47 ± 8,07 a 50,26 ± 7,73 a 1,03 0,364
1
o
X a partir do inicio 1
a
prova 27,10 ± 7,80 a 24,93 ± 5,78 a 28,61± 6,33 a 0,15 0,859
1
o
Xi a partir do inicio do registro 41,61 ± 9,10 a 51,32 ± 8,09 a 55,98 ± 7,76 a 1,36 0,265
1
o
Xi a partir do inicio 1
a
prova 29,11 ± 7,81 a 27,79± 5,81 a 34,32 ± 6,28 a 0,46 0,628
1
o
Xi > 5 min a partir do inicio do registro 46,16 ± 9,65 a 57,15 ± 8,25 a 100,35 ± 18,08 b 5,34 0,00
1
o
Xi > 5 min a partir do inicio 1
a
prova 33,66 ± 8,71 a 33,62 ± 6,28 a 81,51 ± 19,47 b 5,04 0,01
1
Medias seguidas da mesma letra, na mesma linha, não diferem significativamente (P < 0,05) usando o teste de Fisher LSD com
valores transformados x = (
1+x
).
2
Valores em minutos.
83
Figura 1 - Porcentagem de indivíduos de Bucephalogonia xanthophis em diferentes padrões (EPG), em intervalos de
30 minutos, em mudas de Citrus sinensis sadias, infectadas com Xylella fastidiosa, sem e com sintomas
de CVC
Plantas sadias
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Tempo (h)
% de indivíduos / padrão
W
Xi
X
R
S
Np
Plantas assintomáticas
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Tempo (h)
% de indivíduos / padrão
W
Xi
X
R
S
Np
Plantas com sintomas
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Tempo (h)
% de indivíduos / padrão
W
Xi
X
R
S
Np
84
Referências
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