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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Cristina Montagner
ATIVIDADES ANTIFÚNGICA, CITOTÓXICA (CÉLULAS
TUMORAIS HUMANAS) E HEMOLÍTICA DE
CUMARINAS NATURAIS E SEMI-SINTÉTICAS
FLORIANÓPOLIS
2007
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Cristina Montagner
ATIVIDADES ANTIFÚNGICA, CITOTÓXICA (CÉLULAS
TUMORAIS HUMANAS) E HEMOLÍTICA DE
CUMARINAS NATURAIS E SEMI-SINTÉTICAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós–Graduação em Biotecnologia da
Universidade Federal de Santa Catarina
como requisito parcial para obtenção do grau
de Mestre em Biotecnologia.
Área de concentração: Saúde.
Orientadores: Prof
o
. Dr. Artur Smânia Júnior
Prof
a
. Dra. Elza F. A. Smânia.
FLORIANÓPOLIS
2007
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MONTAGNER, Cristina
Atividade Antifúngica e Citotóxica de Cumarinas Naturais e Semi-
sintéticas / Cristina Montagner. – Florianópolis/SC, 2005. 125 f., enc.
Orientador: Artur Smânia Júnior.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Santa Catarina.
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, 2005.
Bibliografia: f. 102-125
1. Cumarinas; 2. Atividade Antifúngica; 3. Atividade Citotóxica; 4.
Atividade Hemolítica.
Dedico este trabalho a Deus, razão de tudo na minha vida.
Aos meus pais Miro e Lídia, ao meu irmão Mateus
e ao meu marido Dino, pelo amor incondicional
que sempre me dedicaram em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Artur Smânia Júnior, pela orientação, apoio, confiança e incentivo e pela
preciosa oportunidade de realizar este trabalho.
À Professora Elza Albino Smânia, pela orientação, amizade, paciência, valiosa ajuda em
todos os momentos e por ter sempre uma palavra de carinho e estímulo.
Aos meus pais Miro e Lídia pelo amor, carinho, compreensão, pelos esforços sem limites que
dedicaram aos meus estudos e por me ensinarem que o bem é sempre o melhor caminho.
Ao meu irmão Mateus, quem me deu o exemplo que derrotas são passos sublimes na vida.
Ao meu marido, companheiro e amigo Dino, uma das melhores pessoas que conheci que em
todos os momentos me deu apoio, carinho, amor, e que foi sem dúvidas, uma pessoa
imprescindível para a realização deste trabalho.
À professora Cláudia Maria Oliveira Simões, pela grande oportunidade de realizar uma parte
deste trabalho em seu laboratório e principalmente pelo aprendizado adquirido, pela
orientação, confiança e exemplo de dedicação, competência e profissionalismo.
À professora Margherita Anna Barraco por sua inestimável colaboração nesse trabalho, pelas
valiosas sugestões e ensinamentos, pelo carinho, estímulo e pelo exemplo de dedicação,
entusiasmo, competência e verdadeiro amor à ciência.
Ao professor Sydney Hartz Alves por todos os ensinamentos desde a graduação, pelo
exemplo de dedicação, honestidade, esforço e competência, pela atenção e pelas importantes e
valiosas sugestões para este trabalho.
À Professora Iraci Tosin pelo apoio, carinho, conselhos e pela maravilha convivência.
Ao Professor Ricardo Nunes pela preciosa contribuição na análise química, pela disposição,
atenção, paciência e simpatia.
Ao Professor Mário Steindel, pelas sugestões, pelos ensinamentos, pela dedicação e atenção.
Ao Professor Carlos Pinto pelo auxílio na análise estatística, pelos ensinamentos, dedicação,
simpatia e por estar sempre disposto a ajudar.
As Professoras Sandra Trevisan Beck, Yarema Rodrigues, Rosmari Hörner e Carmem
Dickown pelo apoio, incentivo, carinho e amizade.
Professora Clarice Loguercio Leite pela disposição e prestativa ajuda sempre que precisei.
A todos os professores do curso de Pós-Graduação em biotecnologia que sempre estiveram
dispostos a ajudar em especial aos professores Carlos Roberto Zanetti, Vetúria Lopes de
Oliveira e Célia Regina Monte Barardi pelos ensinamentos, atenção e agradável convivência.
À Cláudia Groposo, uma pessoa simplesmente maravilhosa, inteligente e dedicada, que tive o
imenso prazer de conhecer, trabalhar na bancada e me tornar amiga, um verdadeiro exemplo
de persistência, coragem, competência, dedicação e simplicidade; agradeço por tudo que me
ajudou e ensinou.
A uma amiga muito especial e maravilhosa que Deus colocou em minha vida e nunca mediu
esforços em me ajudar em todos os sentidos: Gisela Dalcin (Gisa), obrigada por todos os
momentos, os estudos, as conversas, os almoços, as hospedagens e principalmente pela
amizade sincera.
À Joana D’arc Costa e Jane Drech Rech duas pessoas muito especiais e importantes na minha
vida, que estiveram sempre presentes, em particular nos momentos mais difíceis, e me
ajudaram a entender que tudo passa; e Deus sempre dá as forças para aquilo que se pede.
À querida amiga Jesuana Cássias Valério pela ajuda imprescindível, pela acolhida em sua
casa, por todos os momentos juntas, pelo exemplo de amor ao próximo, alegria, simplicidade,
delicadeza, radicalidade e dedicação.
À Roberta Paulert, uma pessoa que teve participação muito importante no meu trabalho,
agradeço de coração pela preciosa ajuda em muitos momentos, pela atenção, carinho e
amizade.
Ao Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz pela
doação das espécies fúngicas utilizadas neste trabalho.
Ao Professor Franco Delle Monache pela provisão das cumarinas.
À estimada farmacêutica Simone Vieira Costa, minha amiga, sempre pronta para ajudar em
tudo que foi preciso, com atenção e carinho.
À Carla Maísa Campestrini, pelo incentivo, apoio em todos os momentos, pela disposição em
ajudar sempre e pela amizade, alegria e carinho.
Ao amigo Luís Afonso Borges, pelo apoio, incentivo, dedicação e amizade.
À amiga Beti Tosato, pelo incentivo, apoio, carinho e prestativa ajuda em todos os momentos.
À Susana Johan pela atenção e importantes informações para realização das análises deste
trabalho.
À Vanessa Muller pela simpatia e alegre convivência sempre que nos encontrávamos, e por
todo apoio.
As queridas colegas Débora Trichez, Lia Kubelka Fernandes de Carlos Back e Sara Emelie
Löfgren pelas palavras, sorrisos e pela disposição em ajudar sempre.
Aos colegas Roberto Torquato Rocha, Rafael Diego da Rosa, Thiago Bruce Rodrigues,
Marcelo Goulart Dário, Cleo Rodrigo Bressan e Luciano Henrique Campestrini, pelos bons
momentos que passamos juntos nas aulas e por todos os auxílios.
À secretaria do programa de Pós-Graduação em biotecnologia, especialmente a Joice Ferrari,
sempre disposta a ajudar com paciência e carinho, e a Lígia por toda atenção.
À Luciane Savi pela dedicação, paciência, carinho e atenção com que me auxiliou em todos
os detalhes no laboratório e a todos os alunos do LVA, Deise, Débora, Carol, Cristiane,
Franciele, Tiago, Jadel, Adriana, Cristiane e Jonas por todos os auxílios.
Aos colegas do laboratório Marcelo Quint e Simone Machado pela valiosa ajuda em muitos
momentos.
À farmacêutica Karina Bettega, pela preciosa ajuda na realização de alguns testes.
A todos os autores que atenciosamente enviaram seus artigos para minha pesquisa.
A Farmácia e ao setor de Quimioterapia do Hospital Universitário e ao CEPON pela doação
dos fármacos e em especial as enfermeiras do Hospital Universitário: Nair Terezinha Grando
da Silva e Léia Emília May e as farmacêuticas do CEPON: Rita Franz Vieira e Estela Olívio
Savi, pela prestativa e valiosa ajuda.
A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente no desenvolvimento desse
trabalho.
E principalmente a DEUS por iluminar o meu caminho e possibilitar o agradecimento a todas
essas pessoas especiais.
Cristina
“Há duas formas de viver sua vida:
Uma é acreditar que não existe milagre.
E a outra é acreditar que todas as coisas são um milagre”
Albert Einstein
RESUMO
As atividades antifúngica, citotóxica e hemolítica de 40 cumarinas foram avaliadas frente
às espécies fúngicas: Candida albicans, Aspergillus fumigatus e Fusarium solani, três
linhagens de células tumorais humanas: Caco-2 (adenocarcinoma colo retal), HCT-8
(adenocarcinoma ileocecal) e HEp-2 (carcinoma epidermóide de laringe) e eritrócitos
humanos do grupo sangüíneo “O” Rh positivo. Entre os compostos cumarínicos estudados,
encontram-se as cumarinas simples (monossubstituídas, dissubstituídas e trissubstituídas), as
cumarinas preniladas, as furano e piranocumarinas. Para cada uma destas cumarinas foram
determinadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) pelo método de microdiluição em
caldo, a CC
50
, ou seja, a concentração de cada amostra que reduziu em 50% a viabilidade
celular, pelo ensaio colorimétrico com sal de tetrazolium (MTT) e a porcentagem de
hemólise. Os resultados foram expressos em mM. As atividades antifúngica, citotóxica e
hemolítica das cumarinas monossubstituídas estudadas não dependeram dos padrões de
substituição no núcleo cumarínico, nem mesmo das características dos grupos substituintes.
Entre as cumarinas monossubstituídas, a 6-nitrocumarina evidenciou a melhor atividade
antifúngica, com CIM de 0,65 mM para Fusarium solani; em relação à atividade citotóxica
destacou-se, dentre as cumarinas monossubstituídas, a 6-hidroxicumarina inibindo o
crescimento da linhagem celular HCT-8 (CC
50
: 0,58 mM). As cumarinas di e trissubstituídas
não apresentaram atividades antifúngica, citotóxica e hemolítica relevantes. O ostenol foi a
cumarina que apresentou a melhor atividade antifúngica dentre todos os compostos testados,
com CIM de 0,54 mM para Fusarium solani e 1,08 mM para Candida albicans e Aspergillus
fumigatus. A piranocumarina 3α,α di-metil-xantiletina demonstrou a atividade citotóxica mais
expressiva dentre todos os compostos estudados, com CC
50
de 0,34 mM, 0,93 mM e 0,58 mM
para as células HEp-2, Caco-2 e HCT-8 respectivamente. A única cumarina que desenvolveu
atividade hemolítica foi a balsamiferona, com porcentagem de hemólise de 8,87%.
Palavras-chave: Cumarinas, Atividade Antifúngica, Atividade Citotóxica, Atividade
Hemolítica.
ABSTRACT
The antifungal, cytotoxic and hemolytic activities of 40 coumarins were tested against the
fungal species: Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Fusarium solani, against three
lines of human tumor cell: Caco-2 (colorectal adenocarcinoma), HCT-8 (ileocecal
adenocarcinoma) and HEp-2 (epidermoid carcinoma of larynx) and human erythrocytes of
group “O” Rh-positive. Among the compounds studied are found simple coumarins
(monosubstituted, disubstituted and trisubstituted), prenylated coumarins, furano and
pyranocoumarins. The minimal inhibitory concentration (MIC) was determined for each one
of these coumarins using the broth microdilution method; CC
50
, the concentration of each
sample that reduced in 50% the cellular viability, using colorimetric assay with tetrazolium
salt (MTT) and the hemolysis percentage was calculated. The results were expressed in mM.
The antifungal, cytotoxic and hemolytic activities of the monosubstituted coumarins studied
did not depend on the substitution patterns in the coumarin nucleus, not even on the
characteristics of the substituting groups. Among the monosubstituted coumarins, the 6-
nitrocoumarin presented the best antifungal activity, the MIC was 0,65 mM against F. solani;
in relation to cytotoxic activity, the main effect was observed, among the monosubstituted
coumarin, with the 6-hydroxycoumarin inhibiting the growth of the cell line HCT-8 (CC
50
:
0,58 mM). The di and trissubstituted coumarins did not show relevant antifungal, cytotoxic
and hemolytic activities. The osthenol was the coumarin that showed the best antifungal
activity among all tested compounds, with a MIC of 0,54 mM for F. solani and 1,08 mM for
C. albicans and A. fumigatus. The pyranocoumarin 3α,α di-methyl-xanthyletin demonstrated
the most expressive cytotoxic activity among all compounds studied with CC
50
of 0,34 mM,
0,93 mM and 0,58 mM for the cells HEp-2, Caco-2 and HCT-8 respectively. The only
coumarin that presented hemolytic activity was the balsamiferone, with a hemolysis
percentage of 8,87%.
Keywords: Coumarins, Antifungal Activity, Cytotoxic Activity, Hemolytic Activity
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Coumarouna odorata (fava-tonca)...........................................................................18
Figura 2 - Trevo-doce (Melilotus officinalis Lam.)..................................................................19
Figura 3 - Ciclo biossintético dos metabólitos secundários......................................................21
Figura 4 - Origem biossintética de cumarinas e derivados.......................................................23
Figura 5 - Diferentes estruturas das cumarinas.........................................................................25
Figura 6 - Vias do metabolismo da cumarina...........................................................................32
Figura 7 - Ilustração dos compostos chapelina (I), safrol (II) e 3α,α-dimetil xantiletina
(III)...........................................................................................................................97
LISTA DE TABELAS
1 - Propriedades e Aplicações das Cumarinas..........................................................................28
2 - Origem de 40 cumarinas incluídas no estudo das atividades antifúngica, citotóxica (células
tumorais humanas) e hemolítica.........................................................................................59
3 - Derivados cumarínicos simples...........................................................................................60
4 - Derivados cumarínicos complexos......................................................................................61
5 - Concentrações inibitórias mínimas dos fármacos utilizados como controles positivos em
relação aos dados da literatura............................................................................................75
6 - Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das cumarinas
simples monossubstituídas..................................................................................................75
7 - Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das cumarinas di e
trissubstituídas.....................................................................................................................79
8 - Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das cumarinas
preniladas............................................................................................................................81
9 - Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das furanocumarinas
lineares e angulares.............................................................................................................82
10 - Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das
piranocumarinas lineares e angulares..............................................................................83
11 - Atividade citotóxica dos fármacos utilizados como controles positivos em relação aos
dados da literatura............................................................................................................87
12 - Atividade citotóxica das cumarinas simples monossubstituídas.......................................88
13 - Atividade citotóxica das cumarinas di e trissubstituídas...................................................92
14 - Atividade citotóxica das cumarinas preniladas..................................................................93
15 - Atividade citotóxica das furanocumarinas lineares e angular...........................................94
16 - Atividade citotóxica das piranocumarinas.........................................................................95
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC: American Type Culture Collection
CIM: Concentração Inibitória Mínima
CRC: Companhia Britânica de Pesquisa do Câncer
CYP: Citocromo P450
DMSO: Dimetilsulfóxido
D.O.: Densidade óptica
EDTA: Ácido etilenodiaminatetracético
EGFR: Receptor do fator de crescimento epidérmico
EORTC: Organização Européia para Pesquisa e Tratamento do Câncer
FDA: Food and Drug Administration
MEM: Minimal Essential Medium
MOPS: ácido 3-[N-morfolino]propanosulfônico
MRSA: Staphylococcus aureus meticilina resistente
MTT: [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil brometo de tetrazolium]
NAPRALERT: Natural PRoducts ALERT
NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCI: National Cancer Institute
NTP: National Toxicology Program
PBS: Tampão salina fosfato
RMN: Ressonância Magnética Nuclear
RPMI: Roswell Park Memorial Institute
SOAD: Escritório Sul Americano para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer
TNF: Fator de Necrose Tumoral
UFC: Unidades Formadoras de Colônias
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................18
2.1 Cumarinas..........................................................................................................................18
2.1.1 Considerações históricas.................................................................................................18
2.1.2 Biossíntese......................................................................................................................20
2.1.3 Estrutura e Classificação.................................................................................................24
2.1.4 Ocorrência e Distribuição...............................................................................................26
2.1.5 Propriedades....................................................................................................................26
2.1.5.1 Propriedades físico-químicas.......................................................................................26
2.1.5.2 Propriedades industriais...............................................................................................27
2.1.5.3 Propriedades alelopáticas.............................................................................................29
2.1.6 Extração, Caracterização.................................................................................................29
2.1.7 Farmacocinética..............................................................................................................30
2.1.7.1 Absorção......................................................................................................................30
2.1.7.2 Distribuição..................................................................................................................30
2.1.7.3 Excreção.......................................................................................................................33
2.1.8 Toxicidade.......................................................................................................................33
2.1.8.1 Genotoxicidade............................................................................................................36
2.1.8.2 Fototoxicidade .............................................................................................................37
2.1.9 Atividades Biológicas.....................................................................................................38
2.1.9.1 Vasorrelaxante.............................................................................................................39
2.1.9.2 Antioxidante.................................................................................................................40
2.1.9.3 Antiinflamatória...........................................................................................................42
2.1.9.4 Antiparasitária..............................................................................................................42
2.1.9.5 Antiviral.......................................................................................................................43
2.1.9.6 Antibacteriana..............................................................................................................44
2.1.9.7 Antifúngica...................................................................................................................46
2.1.9.8 Citotóxica e Antitumoral..............................................................................................48
2.2 Considerações sobre as infecções fúngicas........................................................................52
2.3 Considerações sobre neoplasias.........................................................................................55
3 OBJETIVOS........................................................................................................................57
3.1 Objetivo Geral....................................................................................................................57
3.2 Objetivos Específicos ........................................................................................................57
4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................58
4.1 Cumarinas..........................................................................................................................58
4.1.1 Origem das cumarinas.....................................................................................................58
4.2 Avaliação da atividade antifúngica....................................................................................65
4.2.1 Fungos.............................................................................................................................65
4.2.2 Meios de cultura e reagentes...........................................................................................65
4.2.3 Preparo da solução estoque do meio RPMI-1640...........................................................66
4.2.4 Dissolução e Diluição das cumarinas..............................................................................66
4.2.5 Preparo do inóculo..........................................................................................................66
4.2.5.1 Inóculo dos fungos filamentosos..................................................................................66
4.2.5.2 Inóculo dos fungos leveduriformes..............................................................................67
4.2.6 Controles positivos..........................................................................................................67
4.2.7 Determinação da concentração inibitória mínima..........................................................68
4.3 Avaliação da atividade citotóxica......................................................................................69
4.3.1 Células.............................................................................................................................69
4.3.2 Meios de cultura e reagentes...........................................................................................69
4.3.3 Preparação das soluções estoques das cumarinas...........................................................70
4.3.4 Controles positivos..........................................................................................................70
4.3.5 Avaliação da viabilidade celular pelo ensaio colorimétrico com sal de tetrazolium
(MTT)........................................................................................................................................70
4.4 Avaliação da atividade hemolítica.....................................................................................72
4.4.1 Reagentes........................................................................................................................72
4.4.2 Dissolução e diluição das cumarinas..............................................................................72
4.4.3 Ensaio hemolítico............................................................................................................72
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................74
5.1 Avaliação da atividade antifúngica....................................................................................74
5.1.1 Atividade antifúngica das cumarinas simples monossubstituídas..................................75
5.1.2 Atividade antifúngica das cumarinas di e trissubstituídas..............................................79
5.1.3 Atividade antifúngica das cumarinas preniladas.............................................................81
5.1.4 Atividade antifúngica das furanocumarinas....................................................................82
5.1.5 Atividade antifúngica das piranocumarinas....................................................................83
5.2 Avaliação da atividade citotóxica......................................................................................84
5.2.1 Avaliação da atividade citotóxica das cumarinas simples monossubstituídas................88
5.2.2 Avaliação da atividade citotóxica das cumarinas di e trissubstituídas............................91
5.2.3 Avaliação da atividade citotóxica das cumarinas preniladas..........................................93
5.2.4 Avaliação da atividade citotóxica das furanocumarinas.................................................94
5.2.5 Avaliação da atividade citotóxica das piranocumarinas.................................................95
5.3 Avaliação da atividade hemolítica.....................................................................................99
6 CONCLUSÕES.................................................................................................................100
REFERÊNCIAS....................................................................................................................102
1 INTRODUÇÃO
O conhecimento e a utilização de plantas medicinais têm revelado, desde a
Antiguidade, seu amplo potencial no tratamento de doenças (BANERJI, 1992;
NASCIMENTO et al., 2000; PINTO et al., 2002) representando, muitas vezes, o único
recurso terapêutico de comunidades e grupos étnicos (MACIEL et al., 2002).
Apesar da diversidade molecular e da importância farmacológica do reino vegetal
serem incalculáveis, apenas uma pequena porcentagem dos compostos naturais com essas
propriedades é conhecida até o presente (SHU, 1998; HARVEY, 2000; DOMINGO; LÓPEZ-
BREA, 2003). Recentemente, a estrutura e o papel desses compostos nas interações biológicas
dos organismos e nos seus ecossistemas vêm sendo mais estudados (BANERJI, 1992). Essas
substâncias podem ser utilizadas diretamente ou servir de modelos para a síntese de novos
princípios bioativos (DOMINGO; LÓPEZ-BREA, 2003).
A busca de novos compostos farmacologicamente ativos, através da triagem de
produtos naturais e as inovações tecnológicas, para gerar propriedades terapêuticas superiores
com menor toxicidade, vêm conduzindo à descoberta de muitos fármacos que desempenham
importante função no tratamento de doenças (NISBET; MOORE, 1997; SHU, 1998).
As plantas possuem capacidade ilimitada de sintetizar metabólitos primários e
secundários (OJALA, 2001). Os metabólitos secundários, na maioria relacionados com o
fenol e seus derivados, são produtos de baixo peso molecular, que se diferenciam dos
primários por não serem essenciais à vida da planta (DOMINGO; LÓPEZ-BREA, 2003).
Por muitos anos, o papel dos metabólitos secundários foi negligenciado pela ciência,
julgando-os como desperdício, sem aparente função (VERPOORTE, 1998). Entretanto, sua
importância aumentou devido ao potencial para aplicações como medicamentos, cosméticos,
alimentos e agroquímicos (PINTO et al., 2002). Em 1988 o banco de dados NAPRALERT
(Natural PRoducts ALERT) já registrava um número superior a 88.000 metabólitos
secundários catalogados, e todos os anos são informados mais 4.000 novos compostos
(VERPOORTE, 1998).
Os metabólitos secundários são úteis na defesa da própria espécie vegetal (OJALA,
2001) protegendo-a de outras plantas, de insetos, de herbívoros predadores e de
microrganismos causadores de infecções. Por isso podem ser chamados de fitotoxinas ou
aleloquímicos (PINTO et al., 2002).
Dentre as fitotoxinas estão as fitoalexinas, que são substâncias com propriedades
antimicrobianas produzidas pelas plantas quando estas são infectadas por microrganismos
patogênicos (vírus, bactérias, fungos), ou produzidas sob condições de estresse, como clima
árido, frio, ação de luz ultravioleta, dentre outros. As fitoalexinas aparecem, geralmente, em
altas concentrações em resposta à infecção, desempenhando nos vegetais, um papel
semelhante ao dos anticorpos nos animais (PINTO et al., 2002).
Destacam-se entre as fitoalexinas, o grupo das cumarinas, devido às diferentes
bioatividades atribuídas a alguns de seus membros (DOMINGO; LÓPEZ-BREA, 2003; AL-
BARWANI; ELTAYEB, 2004). As cumarinas são metabólitos secundários de plantas, mas
também podem ser encontradas em bactérias e fungos (MURRAY, 1989) e estão despertando
interesse na indústria farmacêutica, por mostrarem propriedades farmacológicas diversas e
relevantes, associadas à baixa toxicidade, a sua presença na dieta alimentar e ao custo
relativamente reduzido (HOULT; PAYÁ, 1996).
17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cumarinas
As cumarinas constituem uma classe de metabólitos secundários derivados do
metabolismo da fenilalanina (KUSTER; ROCHA, 2003). O primeiro e mais simples
representante é a cumarina per se (1,2-benzopirona), isolada em 1820, da espécie
Coumarouna odorata (popularmente conhecida como fava tonca), por Vogel, membro da
Royal Academy of Science of Munich. Vogel associou o odor doce e agradável das sementes
do cumaru (Coumarouna odorata), ao cheiro das flores do trevo (Melilotus officinalis), e
conseguiu isolar, em ambos, a cumarina, em forma de cristais brancos. (MURRAY, 1978)
(Figura 1).
FIGURA 1 - Coumarouna odorata (fava tonca)
Fonte: http: //www.da-academy.org
2.1.1 Consideraçãoes históricas
De acordo com uma revisão realizada por Egan et al. (1990), a cumarina per se, após
ter sido isolada por Vogel, foi sintetizada por Perkin em 1868.
Na década de 1920 uma doença hemorrágica inexplicável acometeu o gado das
pradarias de Dakota do Norte nos Estados Unidos, e em Alberta, Canadá. Naquela ocasião, os
cientistas associaram esta doença à alimentação do gado por trevo-doce ou trevo de cheiro
amarelo (Melilotus officinalis Lam.) (Figura 2), plantado nessas regiões como um substituto
para o milho (GUSTAFSSON et al., 2004). Em 1939, Karl Paul Link e colaboradores
isolaram uma cumarina dimérica, o dicumarol (derivado da 4-hidroxicumarina), como agente
causador dessa doença hemorrágica, cuja síntese foi concluída em 1940. Após um ano,
reportava-se a sua ação em seres humanos e, em 1942, foram publicadas as primeiras
experiências clínicas do dicumarol como fármaco anticoagulante (ALLEN; BARKER;
WAUGH, 1942; LEHMANN, 1942; WRIGHT; PRANDONI, 1942).
FIGURA 2 - Trevo-doce (Melilotus officinalis Lam.)
Fonte: http: //www.spectrum.troy.edu
Subseqüentemente, no laboratório de Link, foi sintetizada uma série de 4-
hidroxicumarinas substituídas, entre elas a warfarina, inicialmente usada como rodenticida.
Porém, após uma tentativa de suicídio, procurou-se direcionar as pesquisas para seu uso como
um anticoagulante (LINK, 1958).
19
A warfarina é atualmente a principal representante das cumarinas (GUSTAFSSON,
2004), e vem sendo empregada com sucesso na terapia anticoagulante (HELGELAND, 1980).
Em 1954 a agência americana Food and Drug Administration – FDA, baseando-se em
dados sobre a toxicidade hepática da cumarina per se, verificada em ratos, a classificou como
substância tóxica, banindo seu uso, o que posteriormente também ocorreu na Europa
(KUSTER; ROCHA, 2003).
Em junho de 1988, o Conselho das Comunidades Européias determinou o limite
máximo permitido de cumarinas em gêneros alimentícios, bebidas e gomas de mascar
(COUNCIL DIRECTIVE, 1988).
A partir da década de 1990, um número significante de trabalhos passaram a ser
publicados, relacionando inúmeras atividades biológicas às cumarinas, tais como:
antimicrobiana (SARDARI et al., 1999; OJALA, 2000), imunossupressora (TADA et al.,
2002), anti-HIV (MAO et al., 2002), antimelanogênica (LEI et al., 2002), citostática
(JIMÉNEZ-OROSCO et al., 2001; LIU et al., 2001), entre outras.
2.1.2 Biossíntese
A origem de todos os metabólitos secundários dos vegetais deriva do metabolismo da
glicose, via dois intermediários principais, o ácido chiquímico e o acetato. O ácido chiquímico
que é formado pela condensação aldólica de dois metabólitos da glicose: o fosfoenolpiruvato
e a eritrose-4-fosfato, origina os aminoácidos: fenilalanina, triptofano e tirosina, que são
precursores da maioria dos metabólitos secundários aromáticos, entre eles, os alcalóides, as
lignanas, as ligninas e as cumarinas (SANTOS, 2003) (Figura 3).
20
GLICOSE
polissacarídeos
heterosídeos
acetil-CoA ácido chiquímico
fenilalanina/
tirosina
ácido gálicotriptofano
alcalóides
indólicos e
quinolínicos
taninos
hidrolisáveis
antraquinonas
flavonóides
taninos condensados
protoalcalóides
alcalóides
isoquinolínicos e
benzilisoquinolínicos
ácido
cinâmico
fenilpropanóides
lignanas e ligninas
cumarinas
ciclo do
ácido
cítrico
ornitina
lisina
alcalóides
pirrolidínicos,
tropânicos,
pirrolizidínicos,
piperidínicos e
quinolizidínicos
via
mevalonato
condensação
isoprenóides
terpenóides e
esteróis
ácidos graxos
acetogeninas
FIGURA 3 - Ciclo biossintético dos metabólitos secundários
Fonte: Santos, 2003, p. 411.
A desaminação enzimática da fenilalanina, pela ação da enzima fenilalanina
amonialiase, origina o ácido cinâmico, precursor da maioria dos compostos classificados
como fenilpropanóides (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997).
As cumarinas, como outros fenilpropanóides, são derivadas do metabolismo da
fenilalanina via ácido p-hidroxicinâmico que é hidroxilado na posição C-2’(orto-
hidroxilação), o derivado o-hidroxilado sofre isomerização fotocalisada trans para cis da
ligação dupla da cadeia lateral, resultando no fechamento do anel entre o grupo orto-hidroxila
e o grupo carboxila da cadeia lateral (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997; KUSTER;
ROCHA, 2003), originando o ácido cis-o-hidroxicinâmico; que em virtude de sua constituição
21
espacial, não se encontra no estado livre, pois lactoniza-se espontaneamente, produzindo a
umbeliferona (7-hidroxicumarina) (COSTA, 1994).
A formação de di- e trihidroxicumarinas (6,7-di-hidroxiladas e 6,7,8-tri-hidroxiladas) e
seus éteres envolvem a hidroxilação da umbeliferona (7-hidroxicumarina), e os grupos
hidroxilas podem ser metilados ou glicosilados (BRUNETON, 1995). A prenilação do anel
benzênico nas posições 6 ou 8 da mesma é o passo inicial na biogênese das furano- e
piranocumarinas (KUSTER; ROCHA, 2003). A prenilação na posição 6 origina furano- e
piranocumarinas lineares e na posição 8 homólogos angulares (BRUNETON, 1995) (Figura
4).
A ciclização dos derivados 6- ou 8-isoprenilcumarina ocorre por ataque nucleofílico
do grupo hidroxila em C-7 ao epóxido formado pela oxidação dupla do resíduo isopentenila.
Dependendo da orientação do ataque nucleofílico, o produto será o hidroxi-iso-propil-di-
hidrofuranocumarina ou o hidroxi-dimetil-di-hidropiranocumarina (KUSTER; ROCHA,
2003).
22
CH
2
CHNH
2
COOH
COOH
COOH
OH
COOH
OHOH
OHOO
6
OHOO
6
8
COOH
OHOH
OHOO
O
OHOO
O
OO
OH
O
O
OO
OH
OOO
OH
OO
O
OH
OOO
O
OO
OOO
OO
O
FIGURA 4 - Origem biossintética de cumarinas e derivados
Fonte: Kuster e Rocha, 2003, p. 540.
L-fenilalanina ácido cinâmi c o ácido p – hidroxicinâmico
orto-hidroxilação
fotoisomerização
da ligação dupla
E → Z
lactonização
espontânea
DMAPP
epoxidação
piranocumarinas
angulares
furanocumarinas
lineares
piranocumarinas
lineares
furanocumarinas
angulares
seselina
psoraleno angelicina xantiletina
23
2.1.3 Estrutura e Classificação
O núcleo básico de todas as cumarinas é resultante da fusão dos anéis benzeno e 1,2-
pirona (o primeiro átomo numerado do ciclo é o de oxigênio sem dupla ligação) (COSTA,
1994).
As cumarinas podem ser classificadas em: cumarinas simples, furanocumarinas,
piranocumarinas, cumarinas com substituintes no anel pirona e cumarinas miscelâneas
(MURRAY, 1978; BRUNETON, 1995) (Figura 5).
As cumarinas simples são compostos derivados da cumarina per se podendo conter
grupos substituintes como: hidroxi, alcóxi, acetóxi, alquil, entre outros. Excetuando-se raros
casos, incluindo a cumarina per se, todas as cumarinas são substituídas por um grupo
hidroxila na posição 7. A 7-hidroxicumarina, também conhecida como umbeliferona, é a
precursora das cumarinas 6,7-dihidroxiladas e 6,7,8-trihidroxiladas. Esses grupos hidroxilas
podem ser metilados ou glicosilados (BRUNETON, 1995).
As furanocumarinas possuem um anel furano condensado ao núcleo cumarínico,
enquanto as piranocumarinas apresentam um anel pirano, ambas subdividem-se em lineares e
angulares (MURRAY, 1989).
As cumarinas que possuem substituintes na posição 3 e 4 são cumarinas com
substituintes no anel pirona (BRUNETON, 1995). E as cumarinas miscelâneas compreendem
as biscumarinas, cumarinas diméricas como, por exempo, o dicumarol e as isocumarinas, que
possuem o átomo de oxigênio e o carbono ligado ao oxigênio por dupla ligação em posições
invertidas da cumarina per se (MURRAY, 1989).
24
Cumarinas simples
O
O
OH
O
O
CH
3
O
O
Cumairna per se 7-hidroxicumarina 6-metilcumarina
Furanocumarinas
O
O
O
O
OO
O
Furanocumarina linear (Imperatorina) Furanocumarina angular (Angelicina)
Piranocumarinas
OOO
O
O
O
O
CH
3
Piranocumarina linear (Xantiletina) Piranocumarina angular (Aloxantoxiletina)
Cumarinas com substituintes no anel pirona
CH
3
CH
3
OO
3,6 dimetilcumarina
Cumarinas miscelâneas
OH
O
OH
OOO
O
OH
O
Cumarina dimérica (dicumarol) Isocumarina (4-hidromeleína)
FIGURA 5 - Diferentes estruturas das cumarinas
25
2.1.4 Ocorrência e Distribuição
Mais de 3.400 cumarinas encontram-se naturalmente distribuídas em,
aproximadamente, 160 famílias de plantas (BOOTH et al., 2004).
As cumarinas encontram-se distribuídas predominantemente nas angiospermas, em
diferentes famílias de dicotiledôneas, como: Apiaceae, Araliaceae, Asteraceae, Fabaceae,
Moraceae, Oleaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Solanaceae, Thymeleaceae, Urticaceae
encontradas livres ou como heterosídeos (OJALA, 2001; RIBEIRO; KAPLAN, 2002). Na
família Apiaceae, as cumarinas são encontradas na cenoura, no aipo, na salsa e na chicória.
Na família Rutaceae, em algumas frutas como a toranja (grapefruit). Outras fontes desses
derivados ainda incluem o chá verde e a canela, fazendo parte, portanto, da dieta do ser
humano e de outros animais (LAKE, 1999).
Os compostos cumarínicos são especialmente isolados de plantas verdes, mas também
podem ser produzidas por fungos e bactérias (HOULT; PAYÁ, 1996). Embora sintetizadas
principalmente nas folhas, também estão presentes em elevados níveis nas frutas, seguidas
pelas raízes e talos. Além disso, as mudanças sazonais, as condições ambientais ou estresses
provocados por interação com microrganismos, podem afetar a ocorrência em diversas partes
da planta (OJALA, 2001; TORRES et al., 2004; TRANI et al., 2004; KAI et al., 2006;
MAES; DEBENEDETTI; DE KIMPE, 2006).
2.1.5 Propriedades
2.1.5.1 Propriedades físico-químicas
A cumarina per se apresenta-se como cristais brancos à temperatura ambiente, possui
peso molecular de 146,15 g/mol, ponto de fusão entre 68-70° C , ponto de ebulição de 303°C
e densidade de 0,94 (EGAN et al., 1990). Quando em estado livre, são solúveis em álcool e
26
outros solventes orgânicos como éter e solventes clorados (BRUNETON, 1995), sendo pouco
solúveis em água (ROJAHN, 1956).
As cumarinas possuem um espectro ultravioleta - UV característico, o qual é
fortemente influenciado pela natureza e posição dos grupos substituintes; deste modo são
facilmente visualizadas por cromatografia em camada delgada, onde as manchas sob ação da
luz UV aparecem em diversas cores, como azul, amarela e roxa (KUSTER; ROCHA, 2003).
Também exibem forte fluorescência na região visível, podendo ser usadas como corantes
(KOVAC; NOVAC, 2002).
2.1.5.2 Propriedades industriais
As cumarinas possuem uma ampla aplicação na indústria, principalmente as cumarinas
simples, por possuírem odor característico e acentuado (EGAN et al., 1990). São encontradas
em muitos extratos aromáticos de plantas, porém, algumas vezes encontram-se sob a forma de
combinações inodoras, de heterosídeos, que somente após ação hidrolisante, adquirem aroma
agradável (COSTA, 1994).
A cumarina per se se destaca entre as substâncias aromáticas, por ser amplamente
utilizada como aromatizante em alimentos industrializados, como a manteiga, o tabaco, várias
bebidas, numerosos medicamentos e perfumes (ROJAHN, 1956; KUSTER; ROCHA, 2003).
No entanto, com base em dados sobre a sua toxicidade hepática em ratos, a FDA a classificou
como substância tóxica, passando a considerar sua adição em alimentos como adulteração.
Posteriormente o Conselho Europeu estabeleceu o limite geral permitido do uso de cumarinas
em alimentos e bebidas não alcoólicas de até 2 mg/kg. Para bebidas alcoólicas, e alguns
doces, balas ou chocolates de caramelo foi permitido até 10 mg/kg e nas gomas de mascar 50
mg/kg (EGAN et al., 1990).
27
Devido a seu aroma acentuado, estabilidade e custo reduzido é bastante utilizada nas
indústrias de produtos de limpeza e cosméticos (KUSTER; ROCHA, 2003): em desodorantes
e perfumes como agente fixador ou para ressaltar a fragrância, spray de cabelo, xampus,
sabonetes, pasta de dentes, detergentes, bem como em borrachas, materiais plásticos e tintas
com a finalidade de mascarar odores de solventes orgânicos (EGAN et al., 1990).
Também se atribuiu à cumarina a capacidade de reduzir a porosidade e aumentar o
brilho de minerais, como o níquel; de ser usada como aditivo em soluções aquosas de
eletrodeposição (EGAN et al., 1990); e de apresentar resultados positivos no aumento da
resistência à corrosão do zinco (MOUANGA et al., 2006).
Desde a síntese da primeira cumarina, inúmeras informações sobre as suas
propriedades e aplicações vêm sendo descritas (Tabela 1).
Tabela 1 - Propriedades e Aplicações das Cumarinas
Composto Aplicação
Cumarina adoçante, condimento, aromatizante
4-Hidroxicumarina produção do dicumarol e warfarina
Warfarina rodenticida
3,4-Dihidrocumarina perfume industrial
6-Metilcumarina melhora o aroma
7-Hidroxicumarina protetor solar
Aminometil cumarina rótulo fluorescente
4-Metilumbeliferona corante a laser
Fonte: Egan et al., 1990, p. 506.
28
2.1.5.3 Propriedades alelopáticas
Alelopatia é qualquer efeito direto ou indireto, danoso ou benéfico, que uma planta
exerce sobre a outra pela ação de compostos químicos liberados no ambiente, sendo estes
compostos denominados de aleloquímicos (FERREIRA; AQUILA, 2000).
As cumarinas e lactonas podem ter sua síntese aumentada pelo contato das plantas
com fungos patogênicos. Essas substâncias podem ser liberadas no meio e agir como
aleloquímicos, inibindo a ação de predadores, insetos, microrganismos ou de plantas
infestantes (FERREIRA; AQUILA, 2000).
Um exemplo é a escopoletina, composto alelopático presente na exsudação radicular
da aveia. Constatou-se que esse composto pode controlar o crescimento de plantas infestantes,
por apresentar maior fitotoxicidade para a planta invasora do que para a planta cultivada
(JACOBI; FLECK, 2000). Mata et al. (1998), também observaram propriedades alelopáticas
na cumarina imperatorina.
2.1.6 Extração e Caracterização
As cumarinas, pelo fato de possuírem um anel lactônico, podem ser extraídas em meio
ácido ou alcalino. Em meio alcalino, ocorre a abertura do anel, proporcionando a obtenção das
substâncias na forma de sais solúveis em água. Enquanto que a acidificação em meio aquoso
torna possível a relactonização do anel, recuperando-as por extração com solventes orgânicos
(MURRAY, 1978). Porém, com o avanço dos métodos de extração e isolamento, na maioria
das vezes, é desnecessário submeter extratos vegetais a tratamentos químicos preliminares
(KUSTER; ROCHA, 2003).
O desenvolvimento de diversas fases estacionárias para cromatografia em coluna e em
camada delgada, contribuiu para a separação de misturas de cumarinas sensíveis a
adsorventes. Além disso, técnicas cromatográficas mais rápidas como cromatografia líquida
29
de alta eficiência - CLAE, cromatografia líquida de média - CLMP e baixa pressão - CLBP e
cromatografia a vácuo, possibilitaram separações em menor tempo e com resoluções
superiores aos métodos em coluna aberta (KUSTER; ROCHA, 2003).
A quantificação de cumarinas é comumente realizada por métodos cromatográficos
como: a cromatografia gasosa em colunas capilares e a cromatografia líquida de alta
eficiência (HAGE; TWEED, 1997). Através de métodos espectroscópicos de análise, é
realizada a determinação estrutural das cumarinas, entre os quais: a Ressonância Magnética
Nuclear - RMN, a Espectrometria de Massa – EM e o Infravermelho - IV (MURRAY, 1978).
2.1.7 Farmacocinética
2.1.7.1 Absorção
A cumarina, em estudos in vitro, é absorvida rápida e extensivamente pela pele
humana, de ratos e camundongos, sem sofrer biotransformações por enzimas cutâneas. A
absorção pode chegar a 45% em camundongos e 50% em humanos e ratos. Valores
comparáveis aos encontrados nos testes in vivo com ratos, que apresentaram 66% de absorção
da dose aplicada topicamente (BECKLEY-KARTEY; HOTCHKISS; CAPEL, 1997). Quando
aplicada topicamente em emulsão óleo/água, a cumarina apresentou extensa absorção em
ratos e humanos, alcançando concentrações superiores a 75% e 95%, respectivamente
(YOURICK; BRONAUGH, 1997). A administração por via oral da cumarina em humanos,
tem mostrado rápida absorção no trato intestinal (RITSCHEL et al., 1977).
2.1.7.2 Distribuição
Após administração oral em seres humanos, a cumarina é rápida e completamente
absorvida no trato gastrintestinal, extensamente metabolizada pelo fígado, submetida ao
metabolismo de primeiro passo e distribuída pelo organismo (LAKE, 1999).
30
Aproximadamente 3,4% da dose são encontradas na circulação sistêmica inalterada
(RITSCHEL et al., 1977).
O metabolismo é iniciado por enzimas específicas do sistema citocromo P450 (CYP),
formando metabólitos hidroxilados, produtos da Fase I e seus conjugados glicuronídeos da
Fase II (EGAN et al., 1990; BECKLEY-KARTEY; HOTCHKISS; CAPEL, 1997). Este
processo pode ocorrer por diversas vias, como: a 3,4-epoxidação, a 3-hidroxilação, a 4-
hidroxilação, a 5-hidroxilação, a 6-hidroxilação e a 7-hidroxilação (LEWIS; ITO; LAKE,
2006). A distinção de cada via metabólica da cumarina se deve a alguns fatores, como
espécie, raça e sexo (BECKLEY-KARTEY; HOTCHKISS; CAPEL, 1997).
Muitos estudos têm demonstrado que em ratos e na maioria das espécies de
camundongos a cumarina é submetida à via 3,4-epoxidação. Nesta via o metabólito instável
3,4-epóxido é gerado, resultando na abertura do anel lactônico, e na formação de metabólitos
de anel aberto, como: o ácido hidroxifenilacético (o-HPAA), o o-hidroxifenilacetaldeído (o-
HPA) e o o-hidroxifeniletanol (o-HPE) (EGAN et al., 1990).
O metabólito 3,4-epóxido pode ser convertido a o-HPA, através de um rearranjo
espontâneo, perdendo uma molécula de dióxido de carbono (LAKE, 1999), ou pode conjugar-
se à glutationa - GSH. Este aldeído (o-HPA) é hepatotóxico e é detoxificado por oxidação a o-
HPAA ou reduzido a o-HPE (BORN; HU; LEHMAN-MCKEEMAN, 2000).
Ao contrário do metabolismo de ratos e camundongos, em humanos e babuínos a 7-
hidroxilação é a principal via (68-92%), tanto em estudos in vivo como in vitro (LAKE,
1999), dando origem a 7-hidroxicumarina, e seus conjugados glicuronídeos (EGAN et al.,
1990) (Figura 6).
31
OO
O
OO
OH
CH
2
CH
O
OH
CH
2
COOH
OHOO
OO
OH
CH
2
CH
2
HO
FIGURA 6 - Vias do metabolismo da cumarina.
Fonte: Adaptado de Lake et al., 2002, p. 810.
A 7-hidroxilação em humanos é catalizada pela enzima da família do citocromo P450,
a CYP2A6 enquanto que a 3-4 epoxidação em ratos é mediada pelas enzimas CYP1A e
CYP2B. Isto pode sugerir que a 7-hidroxilação representa uma via de detoxificação, e a 3,4-
epoxidação uma via de ativação, que resulta na ligação covalente da cumarina a proteínas
microssomais. Os metabólitos desta via (3,4-epóxido e o-hidroxifenilacetaldeído) sugerem a
melhor hipótese da diferença de hepatotoxicidade entre espécies e raças (BECKLEY-
KARTEY; HOTCHKISS; CAPEL, 1997).
Estudos recentes informam que a 3,4-epoxidação também ocorre em humanos. As
enzimas do citocromo P450 envolvidas nesta via são: CYP1A1, CYP1A2, CYP2B6, CYP2E1
e CYP3A4 (LEWIS; ITO; LAKE, 2006) e o principal metabólito da detoxificação é o o-
HPAA (90%) (VASSALO et al., 2004 a), sendo este o metabólito urinário menos freqüente
em seres humanos (LEWIS; ITO; LAKE, 2006), confirmando que a 7-hidroxilação é a
principal via do metabolismo da cumarina nesta espécie.
CYP1A e 2B
[O]
C O
2
cumarina cumarina 3
,
4-e
p
óxido
[
o-HPA
]
[
o-HPAA
]
7-hidroxicumarina outras hidroxicumarinas
[
o-HPE
]
UDP
g
licuronosiltransferase
metabólitos cumarínicos GSH
conjugados
conjugado glicuronídeos
OH
32
CYP2A6
2.1.7.3 Excreção
A meia vida de eliminação da cumarina é, geralmente, similar em todas as espécies,
sendo por volta de uma a duas horas em humanos e entre uma e quatro horas em outras
espécies (camundongos, ratos, hamsters siberianos, coelhos, babuínos) (LAKE, 1999).
A excreção renal é a principal via de eliminação da cumarina na maioria das espécies,
sendo superior a 80% em humanos (EGAN et al., 1990). Em ratos ocorre extensiva excreção
biliar, resultando na presença de cumarinas nas fezes (LAKE, 1999).
Em humanos a 7-hidroxicumarina, e seus conjugados sulfatados e glicuronídeos
constituem 40-97% dos metabólitos excretados na urina e o o-HPAA é o metabólito
encontrado em menor quantidade (BORN et al., 2000).
Dos derivados da 3,4-epoxidação da cumarina, apenas o ácido o-HPAA é detectado na
urina de ratos e camundongos (BORN et al., 2003).
2.1.8 Toxicidade
Em 1954 a FDA baniu o uso da cumarina, pois resultados preliminares indicaram-na
como agente hepatotóxico. Esta decisão foi baseada, principalmente, em conclusões obtidas
de estudos realizados em ratos (EGAN et al, 1990). No entanto camundongos, hamsters e
babuínos parecem ser modelos melhores para serem comparados com humanos do que o rato
(LAKE; GRASSO, 1996; LAKE et al., 2002). Fentem e Fry (1992) apontaram o pequeno
roedor gerbil como modelo animal mais apropriado para o homem, no que diz respeito aos
estudos de metabolismo e hepatotoxicidade de cumarinas.
A toxicidade da 3,4-Dihidroxicumarina e da cumarina per se foram avaliadas pela
FDA e pelo National Toxicology Program dos EUA - NTP, devido ao amplo emprego desses
metabólitos em condimentos, bebidas, gelatinas, pudins, perfumes e cosméticos. Ambas
apresentaram evidências de carcinogênese em ratos machos, com base na incidência
33
aumentada de adenocarcinomas nos túbulos renais. Apenas a cumarina per se apresentou
evidência de atividade carcinogênica em camundongos considerando o aumento da incidência
de carcinoma brônquio-alveolar e adenoma hepatocelular nestes animais (NTP n° 91-64-5,
1993; NTP n° 119-84-6, 1993). Born et al. (1998; 1999) apontaram a cumarina como um
agente carcinogênico de pulmão em camundongos, causando necrose em células Clara
(células não ciliadas do epitélio bronquiolar), após administração aguda. Este resultado não
foi observado em humanos (BORN et al. 1999).
Em cachorros, uma dose oral de 100mg/kg de cumarina, administrada em um período
de 8 a 22 dias, demonstrou ser hepatotóxica e nefrotóxica (LAKE et al., 1999).
Os estudos de Lake e Grasso (1996) mostraram que a cumarina apresenta diferentes
níveis de toxicidade entre as espécies. Enquanto o desenvolvimento do tumor no fígado de
ratos foi associado à hepatotoxicidade crônica da cumarina, este resultado não foi observado
em camundongos (CD-1) e em hamsters sírios.
A diferença de susceptibilidade entre as espécies decorre da disparidade de seus
processos metabólicos (BORN et al., 1997) e acredita-se, que a toxicidade não se deve ao
composto per se, mas ao intermediário reativo, possivelmente o 3,4-epóxido, o qual pode
ligar-se a proteínas do fígado e por esta razão causar danos ao tecido (BECKLEY-KARTEY;
HOTCHKISS; CAPEL, 1997; BORN; HU; LEHMAN-MCKEEMAN, 2000). Esta hipótese
também foi relatada por Vassallo et al. (2004 b); os autores observaram que a toxicidade da
cumarina em células Clara de pulmão de camundongos, resultou da formação local do
metabólito 3,4-epóxido.
Ao contrário do que ocorre com ratos e camundongos, onde altas doses de cumarina
podem produzir toxicidade e carcinogenicidade, há pouca evidência de toxicidade induzida
pela cumarina em seres humanos, quando são administradas doses de até 1900 vezes àquelas
obtidas de fontes dietéticas ou de produtos cosméticos (LAKE et al., 1999).
34
Em humanos a cumarina é convertida ao metabólito não tóxico 7- hidroxicumarina,
enquanto que em roedores (principalmente em ratos) a principal via metabólica é a 3,4-
epoxidação, gerando o metabólito instável 3,4-epóxido que é convertido a o-HPA, pela perda
de uma molécula de dióxido de carbono (LAKE, 1999). Sendo este último o principal
metabólito encontrado em microssomos hepáticos de ratos (BORN et al., 1997; BORN; HU;
LEHMAN-MCKEEMAN, 2000).
Além disso, a cinética da formação in vitro do composto o-HPA, e a grande
quantidade de cumarina requerida para a sua produção em microssomos hepáticos humanos,
sugere fortemente, que os humanos são incapazes de produzir relevantes concentrações
tóxicas deste metabólito, quando expostos a uma concentração reduzida de cumarina (BORN
et al., 2000), como a concentração de exposição diária, em torno de 0,02 a 0,06 mg/kg
(LAKE, 1999).
Alguns efeitos adversos foram descritos em humanos submetidos a tratamentos com
cumarinas. Miyamotto et al. (2004) relataram um caso de necrose de mama bilateral em
paciente tratada com o anticoagulante warfarina o que é considerado uma complicação rara na
terapia com anticoagulantes. Dois casos de hepatite aguda foram relatados em pacientes
tratados com cumarina por um período de cinco meses (KOCH et al., 1997). Todavia, estudos
realizados por Cox, O’Kennedy e Thornes (1989), num período de aproximadamente dez
anos, delinearam um percentual de toxicidade hepática de apenas 0,37%, e concluíram que
esta atividade parece ser dose independente, visto que, a condição imunológica do paciente
interfere, em maior proporção, do que a quantidade de droga administrada.
Ainda é importante considerar, que algumas cumarinas, sintetizadas por fungos, são
tóxicas, entre as quais, as aflatoxinas que são produzidas por diversas espécies de Aspergillus
(BRUNETON, 1995) e a citrinina, subproduto metabólico de origem cumarínica oriundo do
crescimento de fungos dos gêneros Penicillium e Aspergillus. Estas micotoxinas são
35
produzidas durante o desenvolvimento fúngico em grãos, alimentos processados e produtos
alimentícios durante a estocagem, e sua ingestão está relacionada a intoxicações agudas ou
crônicas (CARVALHO; FERNANDES; FREIRE, 2005).
2.1.8.1 Genotoxicidade
Diversos estudos avaliaram a genotoxicidade da cumarina e os dados sugerem que este
composto não é um agente genotóxico, não havendo evidências de indução de genotoxicidade
em estudos in vivo (Drosophila melanogaster e teste de micronúcleos em camundongos) e in
vitro (em cultura de fígado humano). Porém, testes in vitro com altas doses de cumarina
resultaram em genotoxicidade (LAKE, 1999).
Os metabólitos 3,4-dihidroxicumarina e 7-hidroxicumarina, não induziram mutação
genética em diferentes cepas de Salmonella tiphymurium. Já a 7-hidroxicumarina apresentou
resultados positivos para Klebsiella pneumoniae. Enquanto que, a 3,4-dihidroxicumarina
induziu a troca das cromátides irmãs em cultura celular de ovário de hamster chinês (NTP n°
91-64-5, 1993; NTP n° 119-84-6, 1993).
Estudos realizados por Pillai et al. (1999) demostraram que a 7-hidroxicumarina
(umbeliferona) e alguns análogos possuem elevado potencial em prevenir mutações e
sugeriram que esta atividade pode estar relacionada com propriedades antioxidantes, também
observadas nestes derivados cumarínicos.
Novas isocumarinas foram isoladas de uma planta nativa do Brasil (Paepalanthus
vellozioides), a paepalantina, a qual demonstrou ser, através de diferentes testes, mutagênica,
clastogênica e citotóxica (VARANDA et al., 1997). A paepalantina-9-O-β-D-glicopiranosíde
apresentou mutagenicidade inferior a paepalantina, quando o H da posição 9 foi substituído
por uma molécula de glicose (VARANDA et al., 2004).
36
2.1.8.2 Fototoxicidade
As furanocumarinas ou psoralenos são compostos planares, tricíclicos, constituídos de
um anel furano ligado ao núcleo cumarínico. Como a maioria das cumarinas, são substâncias
que absorvem fortemente a energia na região ultravioleta e, por isso, são altamente reativas
sob incidência de luz (BETHEA et al., 1999).
A ação de furanocumarinas sobre a pele, quando esta é submetida à ação de raios
ultravioleta, pode ser utilizada para o tratamento de enfermidades cutâneas como a psoríase,
vitiligo, micoses, eczemas e outras desordens dermatológicas, através da fotoquimioterapia
denominada PUVA (psoralenos + UVA) (SCHMITT; CHIMENTI; GASPARRO, 1995;
GRUNDMANN-KOLLMANN et al., 2002).
O tratamento consiste da administração via oral da furanocumarina (20 a 40 mg em
dose única), seguido de duas horas de exposição à luz solar ou a radiação UVA (320-400nm),
como forma de induzir a repigmentação da pele (BRUNETON, 1995). As furanocumarinas
mais utilizadas no tratamento PUVA são a xantotoxina (8-metoxipsoraleno, 8-MOP),
bergapteno (5-metoxipsoraleno, 5-MOP) e o 4,5’, 8-trimetilpsoralen (TMP) (SAÏD et al.,
1997; MATSUDA et al., 2005).
A terapia pode ter alguns efeitos adversos: desordens gastrintestinais, catarata, e em
longo prazo pode causar câncer. Estudos têm demonstrado o aumento da incidência de câncer
de pele e de pulmão nos pacientes (KUSTER; ROCHA, 2003). Também foram observados
eritema e náuseas em alguns pacientes após administração oral de 8-MOP, enquanto o 5-MOP
foi melhor tolerado (SAÏD et al., 1997).
A eficácia da PUVA é atribuída à formação de fotoadutos entre psoralenos e o DNA,
bem como com outros componentes celulares. Algumas investigações têm demonstrado que o
psoraleno fotoativado pode modificar proteínas e suas atividades (SCHMITT; CHIMENTI;
GASPARRO, 1995).
37
As moléculas de psoralenos exibem estruturas tricíclicas planares, hidrofóbicas com
dois sítios fotorreativos (3,4-pirona e 4’,5’-dupla ligação furano), o que possibilita se
intercalar com as bases do DNA. Os danos causados no DNA pelo 8-MOP, em doses
subletais, e pela radiação UVA, podem induzir reparos no DNA (BETHEA et al., 1999).
A manifestação mais comum, em mamíferos, da toxicidade das furanocumarinas é a
fitofotodermatite, uma reação epidérmica caracterizada por erupções bolhosas,
hiperpigmentação, eritema e formação de vesículas, devido ao contato direto com vegetais
que contenham furanocumarinas como, por exemplo, as frutas cítricas, ou por ingestão
(KUSTER; ROCHA, 2003).
2.1.9 Atividades Biológicas
Diversas atividades biológicas foram atribuídas às cumarinas, entre as quais:
tratamento de dislipidemias (MADHAVAN et al., 2003), atividade antidepressiva (SINGH et
al., 1992), hepatoprotetora (OKAMOTO et al., 2001; PARK et al., 2004), antiinflamatória
(IVANOVSKA et al., 1994), antihistamínica (TAKEUCHI et al., 1991; MATSUDA;
SHIMODA; YOSHIKAWA, 1999), anti-prurídica (MATSUDA et al., 2002), acaricida
(GLEYE et al., 2003), antiulcerogênica (BIGHETTI et al., 2005), antimelanogênica
(YAMAMURA; ONISHI; NISHIYAMA, 2002) e uma cumarina simples, a escoparona,
exerce ação no organismo, como bloqueadora dos canais de cálcio (BOOTH et al., 2004).
É importante ressaltar a propriedade anticoagulante de algumas cumarinas como a 4-
hidroxicumarina, a escopoletina e o dicumarol (BOOTH et al., 2004), este último foi o
primeiro medicamento com ação anticoagulante via oral, e constituiu o modelo para o
desenvolvimento de uma classe de anticoagulantes, do qual derivam importantes fármacos
entre os quais a warfarina (3-fenilacetiletil, 4-hidroxicumarina) (MUELLER, 2004), cuja
38
administração oral está também associada à prevenção do tromboembolismo venoso (PINEO;
HULL, 2003).
Observa-se a presença de cumarinas em outros medicamentos amplamente utilizados
na prática clínica, como exemplo o antivaricoso Venocur triplex. Entre seus componentes se
encontra a Castanha da Índia, que é empregada no tratamento de enfermidades venosas; seus
princípios ativos consistem em uma mistura de saponina (escina), um glicosídeo de
hidroxicumarina (esculina) ou de seu aglucônio (esculetina) (PR-vade-mécum, 2000).
Qin et al. (2003), em estudos com ratas ovariectomizadas, observaram que as
cumarinas totais dos frutos de Cnidium monnieri, uma importante planta da medicina chinesa,
possuem efeitos antiosteoporóticos, pois inibiram e reverteram a perda óssea.
A anseculina (KA-672, 7-metoxi-6-[3-[4-(2-metoxifenil)-1-piperazinil]propoxi]-3,4-
di-metil-2H-1-benzopiran-2-ona) é um derivado cumarínico com promissoras propriedades de
melhora da função cognitiva (KNAUBER; MÜLLER, 2003). Outra cumarina com atividade
no sistema nervoso é o decursinol, a administração em longo prazo deste composto em
camundongos preveniu a deficiência de memória induzida pelo peptídeo β-amilóide, principal
componente das placas senis presentes na doença de Alzheimer (YAN, 2004).
2.1.9.1
Vasorrelaxante
Campos-Toimil et al. (2002) sintetizaram derivados cumarínicos e furanocumarínicos
e avaliaram a atividade vasorrelaxante destes compostos em anéis pré-contraídos da aorta de
ratos com noradrenalina ou por despolarização com cloreto de potássio - KCl. Os resultados
mostraram potencial ação vasodilatadora destes novos compostos, indicando serem
promissores agentes anti-hipertensivos. A cumarina α-metileno-γ-butirolactona sintetizada por
Chen et al. (2005), exibiu ação vasorelaxante em artéria aorta porcina, tendo sido contraída
por KCl.
39
Uma das substâncias ativas isoladas da Angelica pubescens Maxim. (Apiaceae), usada
na medicina chinesa, é o ostol (7 metóxi-8-[3-metilpent-2-enil]cumarina). Extratos desta
planta, contendo a substância citada, provocaram uma resposta hipotensora de curta duração
após a injeção intramuscular em cães. Além disso, os extratos também apresentaram in vitro a
propriedade de inibir a agregação plaquetária e relaxar as musculaturas lisa e cardíaca,
possivelmente devido à inibição das enzimas cAMP e cGMP-fosfodiesterases e do influxo de
cálcio (HOULT; PAYÁ, 1996).
Alguns estudos investigaram a associação do tratamento com cumarinas e a redução
da freqüência e da severidade das crises de enxaqueca. O mecanismo deste efeito positivo
ainda é desconhecido, mas sugere-se que as cumarinas interfiram na agregação plaquetária
(RAHIMTOOLA, 2001).
2.1.9.2 Antioxidante
As cumarinas são importantes antioxidantes naturais, todavia a relação estrutura-
atividade não está bem elucidada, sabe-se apenas, que o anel 1,2-pirona exerce pouca
influência na atividade antioxidante, sendo, portanto o grupo orto catecol e seus substituintes
os principais responsáveis por esta ação (ZHANG; WANG, 2004). Kaneko, Baba e Matsuo
(2003) também concluíram ser um fator determinante, a participação do grupo orto catecol, na
proteção contra citotoxicidade induzida por hidroperóxidos de ácido linoleico em células
endoteliais venosas de cordão umbilical humano em cultura.
A importância do grupo hidroxila no núcleo cumarínico foi salientada por Ng, Liu e
Wang (2000) que observaram uma potente atividade antioxidante do xantotoxol em testes de
inibição da peroxidação de lipídeos (utilizando-se cérebro e homogeneizados de rim de ratos)
e inibição da hemólise em eritrócitos de ratos.
40
Kabeya et al. (2000) realizaram estudo sobre o efeito da cumarina (1,2-benzopirona) e
de três de seus derivados (7-hidroxicumarina, 7-acetoxicumarina e 7-aliloxicumarina) sobre o
metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelhos estimulados. Os autores observaram que a
cumarina não afeta a produção de radicais superóxidos, no entanto seus derivados
apresentaram efeitos inibitórios dose-dependente sugerindo que a presença de radicais
substituintes na posição 7 do anel benzopirona é importante para a atividade inibitória da
produção de radicais superóxido.
A fraxina (7-hidroxi-6-metoxi-8-O-glicosilcumarina) exibiu ação protetora contra
stress oxidativo mediado pelo peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) recuperando a viabilidade de
células endoteliais venosas de cordão umbilical humano em cultura (WHANG et al., 2005).
Molina-Jimenez, Sanchez-Reus e Benedi (2003) associaram os efeitos neuroprotetores da
fraxetina com sua atividade antioxidante em estudos com células de neuroblastoma humano
(SH-SY5Y), induzidas à apoptose pela rotenona (pesticida derivado de plantas, inibidor do
complexo mitocondrial I).
Estudos recentes mostraram que a substituição de um dos grupos hidroxila por grupo
amina (orto hidroxi-aminocumarinas) resulta em compostos com eficaz ação antioxidante na
peroxidação de lipídeos in vitro, e conseqüentemente superiores as do α-tocoferol (TYAGI et
al., 2005).
As pesquisas por antioxidantes cumarínicos extraídos de plantas são promissoras.
Duas cumarinas isoladas da planta Weigela subsessilis (Caprifoliaceae) - a escopoletina e a
cleomiscosina A - inibiram a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) induzida por
íons cobre e pelo composto AAPH (2,2’-azobis-(2-amidinopropano) dihidroclorida)
(THUONG et al., 2005).
41
2.1.9.3 Antiinflamatória
As cumarinas possuem propriedades antiinflamatórias, provavelmente em
conseqüência de sua atividade antioxidante como, por exemplo, a capacidade da fraxetina e da
7,8-di-hidroxicumarina em seqüestrarem radicais superóxidos oriundos de neutrófilos
fagocíticos ativados, envolvidos em vários processos inflamatórios (PAYÁ et al., 1994).
A cumarina (1,2 benzopirona) reduziu gradualmente o linfoedema de pacientes com
filariose crônica - elefantíase (HOULT; PAYÁ, 1996). Por outro lado, não foi eficaz no
tratamento de pacientes pós-mastectomisadas (LOPRINZI et al., 1999). Sugere-se que o
mecanismo de ação envolva macrófagos, os quais ativam a proteólise no local da injúria
(EGAN et al., 1990).
Kontogiorgis e Hadjipavlou-Litina (2003) observaram propriedade imunomodulatória
em uma pirocumarina linear, uma vez que ratos tratados com esse composto não
desenvolveram artrite.
No trabalho de Cheng et al. (2004), novos derivados cumarínicos foram sintetizados e
suas atividades como inibidores de TNF-α comprovadas em células mononucleares humanas,
estimuladas por lipopolissacarídeos bacterianos in vitro.
2.1.9.4
Antiparasitária
Baseado na propriedade antiinflamatória da cumarina (1,2-benzopirona) e alguns de
seus derivados sintéticos, Tripathi et al. (2000) verificaram a atividade antifilarial destas
cumarinas, como agentes capazes de eliminar o parasita na fase adulta e concluíram que
podem ser úteis no combate da inflamação e da infecção filarial simultaneamente.
A atividade antimalárica também foi atribuída a 5,7-dimetoxi-8-(3’-hidroxi-3’-metil-
1’-buteno)cumarina isolada da raíz da planta Toddalia asiática, demonstrando potente
atividade antiplasmodial (OKETCH-RABAH et al., 2000). Esta atividade também foi
42
observada na dafnetina (7,8-di-hidroxicumarina) em estudos in vitro e in vivo contra o
Plasmodium falciparum (WANG et al., 2000; MU; WANG; NI, 2002).
Scio et al. (2003) isolaram compostos cumarínicos de uma planta do cerrado
brasileiro, Kielmeyera albopunctata, e testaram a atividade tripanocida destes. A cumarina 4-
(1-metilpropil)-5,7-di-hidroxi-8-(4-hidroxi-3-metilbutiril)-6-(3-metilbut-2-enil)cromen-2-ona
apresentou atividade in vitro contra formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi, matando
80% dos parasitas após 24 h em uma concentração de 125 µg/ml. O psolareno (amotosaleno
HCl) em associação com tratamento fotoquímico UVA mostrou-se efetivo para inativar o
Trypanosoma cruzi em concentrados, de plasma e plaquetas, infectados (VAN VOORHIS et
al., 2003).
2.1.9.5 Antiviral
A atividade antiviral das cumarinas, em especial sobre o vírus HIV, é relatada em
diversos estudos por diferentes mecanismos. Entre os mecanismos mais descritos está a
capacidade dos compostos cumarínicos de inibirem a enzima transcriptase reversa (NG et al.,
1997). Capacidade esta, que foi atribuída por Bourinbaiar, Jirathitikal (2002) ao
anticoagulante cumarínico warfarina, demonstrando que esta droga pode ser considerada um
inibidor da replicação do vírus HIV, uma vez que possui singular propriedade de inibir outras
enzimas, além da transcriptase reversa, como a serino protease, aspartil protease e a integrase,
todas essenciais para replicação viral.
O calanolídeo B isolado de sementes da árvore Calophyllum cerasiferum (SPINO;
DODIER; SOTHEESWARAN, 1998) e os calanolídeos A e B, isolados das folhas de uma
árvore de floresta tropical, Calophyllum lanigenum Miq. var. austrocoriaceum, impediram a
replicação in vitro do HIV-1, demonstrando serem importantes inibidores da enzima
transcriptase reversa (KUSTER; ROCHA, 2003). Fuller et al. (1994) isolaram uma
43
piranocumarina denominada costatolido (inibidora da transcriptase reversa) que apresentou
substancial atividade anti-HIV e foi considerado um composto promissor para as pesquisas
por encontrar-se em elevadas quantidades no látex de árvores do gênero Calophyllum.
Mao et al. (2002) descreveram a síntese de uma série de dímeros cumarínicos
análogos, modificados quimicamente, e sua atividade como inibidores da enzima integrase
HIV-1 (enzima responsável pela integração do DNA viral, reversivelmente transcrito do vírus
HIV-1, no DNA cromossomal de células recém infectadas). Os autores concluíram que
dímeros de cumarinas contendo fração hidrofóbica desenvolvem potente ação inibitória sobre
a enzima integrase HIV-1.
A ação anti-HIV de algumas 4-hidroxicumarinas com substituintes na posição 3 é
atribuída a inibição da enzima protease do vírus (KIRKIACHARIAN et al., 2002).
Uchiumi et al. (2003) obtiveram resultados positivos com a 3-fenilcumarina, a qual
interfere no mecanismo de expressão genética em nível de transcrição.
2.1.9.6 Antibacteriana
A atividade antibacteriana das cumarinas é relatada em diversos trabalhos. O
mecanismo de ação antimicrobiano parece ser mediado pela capacidade das cumarinas de
interagirem com o DNA (DOMINGO; LÓPEZ-BREA, 2003).
Os antibióticos aminocumarínicos novobiocina, coumermicina A
1
e clorobiocina,
foram primeiramente produzidos por espécies do gênero Streptomyces (LANCINI;
LORENZETTI, 1993), com espectro de ação para bactérias Gram-positivas tais como
Staphylococcus aureus (LONG, 2003). Esses antibióticos são potentes inibidores da DNA
girase e da topoisomerase IV bacteriana, enzimas que possuem importante função no processo
de replicação, transcrição, translação e recombinação (LAURIN et al., 1999). Estas drogas
ligam-se a subunidade B da enzima DNA girase bacteriana e inibem a atividade da adenosina
44
trifosfatase (ATPase) (MAXWELL, 1993). Nos últimos anos, várias informações genéticas
foram elucidadas, possibilitando a biossíntese de novos aminocumarínicos com atividade
antimicrobiana, através de diferentes métodos (LI; HEIDE, 2005).
Kawase et al. (2003) observaram a atividade anti-Helicobacter pylori em derivados da
7-hidroxicumarina, concluindo que a presença do grupo hidroxila na posição 6 ou 7 é
essencial para esta função. A 7-hidroxicumarina também apresentou atividade sobre
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterobacter e Klebsiella (RAHMAN; GRAY,
2002).
Em pesquisas realizadas por Souza et al. (2005), visando observar a atividade
antibacteriana de cumarinas naturais e semi-sintéticas, o ostenol foi o composto que
apresentou a melhor atividade antibacteriana contra bactérias Gram-positivas (Staphylococcus
aureus e Bacillus cereus).
A siderina, uma cumarina simples trissubstituída apresentou atividade para Bacillus
cereus, Escherichia coli e Shigella flexneri (CHOWDHURY; HASAN; RASHID, 2003).
Ngwendson et al. (2003) isolaram a imperatorina, o bergapteno e a isopimpinelina de
uma planta medicinal da floresta equatorial africana (Peucedanum zenkeri), os quais inibiram
o crescimento de Mycobacterium intracellulare.
Ensaios usando cumarinas frente ao Staphylococcus aureus meticilina resistente
(MRSA) têm indicado resultados promissores (YASUNAKA et al., 2005). Creaven et al.
(2005; 2006) sintetizaram uma série de novas cumarinas complexadas com a prata (Ag I) e
este complexo exibiu potente atividade antibacteriana, principalmente ao MRSA. O ostol,
uma cumarina prenilada apresentou significante atividade sobre MRSA e Pseudomonas
aeruginosa (TADA et al., 2002).
45
2.1.9.7 Antifúngica
Segundo Cowan (1999), diversos derivados cumarínicos hidroxilados podem
apresentar atividade antifúngica. Kokubun et al. (2003) demostraram que a isocumarina 3,5-
di-metil-8-hidroxi-7-metoxi-3,4-di-hidroisocumarina apresentou atividade para o fungo
Aspergillus niger.
De uma planta selvagem usada como tempero na Grécia, Tordylium apulum, Kofinas
et al. (1998) isolaram oito cumarinas: umbeliferona, isopimpinella, xantotoxina,
isobergapteno, dihidrofurano-cumarina, diacetildihidroangelicina, cnidiadina e
columbianetina. Todas as cumarinas isoladas, com exceção da columbianetina, exibiram
propriedades antifúngicas sobre uma espécie de fungo fitopatógeno Cladosporium
cucumerinum. A germinação de esporos de outras espécies fúngicas fitopatógenas (Botrytis
cinerea, Colletotrichum orbiculare, Alternaria mali, Phytophthora capsici e Pyricularia
oryzae) também foi inibida por novas cumarinas 3,4,7-trissusbtituídas (MOURI et al., 2005).
Testes antifúngicos realizados por Jurd, King e Mihara (1971) em derivados da
umbeliferona (7-hidroxicumarina) mostraram que esta cumarina foi ineficaz para as espécies
de fungos e leveduras testadas: Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus
flavus e Aspergillus niger. Entretanto, a 7-metoxicumarina (herniarina) e a 7-etoxicumarina
inibiram completamente o crescimento destas espécies, demonstrando que a atividade
antifúngica foi resultado de uma simples alquilação do grupo 7-hidroxil. Os autores também
concluíram que a atividade antifúngica é dependente do tamanho da cadeia lateral alquila,
bem como do seu grau de saturação, visto que, os compostos 7-aliloxicumarina, 7-(3-
metilbutil)oxicumarina, 7-(3-metil-butenil)oxicumarina e 7-geraniloxicumarina apresentaram-
se inativos.
A 6,7 di-metoxi cumarina, conhecida como escoparona, foi isolada de cascas de Citrus
limon (limão tahiti), e demonstrou atividade antifúngica (na concentração de 250 µg/ml),
46
inibindo os fungos filamentosos Microsporum canis e Trichophyton mentagrophytes
(JOHANN, 2003).
Godoy et al. (2005) testaram a atividade antifúngica de cumarinas para inibir o
crescimento do fungo Leucoagaricus gongylophorus, mutualista das formigas cortadoras de
folhas (Atta sexdens). A inibição do crescimento deste fungo é uma estratégia alternativa de
controle das formigas, que são consideradas pragas para a agricultura, devido à grande
quantidade de material vegetal utilizado por elas para cultivar o fungo que lhe serve de
alimento e fonte de enzimas. Os resultados da pesquisa foram positivos, as cumarinas:
suberosina, xantoxiletina, isopimpinelina, umbeliferona, xantiletina e 7-hidroxi-3-(1’,1’-di-
metilalil)-8-metoxicumarina inibiram o crescimento do fungo em reduzidas concentrações.
A escopoletina (6-metoxi,7-hidroxicumarina), pode ser encontrada em diversos
vegetais comestíveis e frutas como Avena sativa (aveia), Allium ampeloprasum (alho), Dacus
carota (cenoura), Citrus limon (limão tahiti) e tubérculos de batata (JURD et al., 1971;
CARPINELLA; FERRAYOLI; PALACIOS, 2005). Jurd et al. (1971) observaram que esta
cumarina dissubstituída inibiu a esporulação e o crescimento das hifas de Fusarium solani.
As furanocumarinas imperatorina e oxipeucedanina, isoladas de uma planta medicinal
da Turquia, demonstraram atividade sobre Candida albicans (ULUBELEN et al., 1995). A
furanocumarina angelicina também demonstrou ter atividade frente C. albicans e Aspergillus
niger, e a pseudoisopsoraleno foi ativa para Cryptococcus neoformans e Saccharomyces
cerevisiae (SARDARI et al., 1999).
Stein et al., (2006) fracionaram o extrato em hexano das partes aéreas da planta
Pterocaulon polystachyum e entre os componentes isolados, apenas a mistura das cumarinas
preniladas - preniletina e preniletina-metil-éter – apresentou-se ativa frente os fungos
Cryptococcus neoformans, Microsporum canis, Trichophyton rubrum e Trichophyton
47
mentagrophytes. Outra cumarina prenilada, a 7-isopenteniloxicumarina inibiu o crescimento
do fungo Epidermophyton floccosum na concentração de 10 µg/ml (CURINI et al., 2006).
Cumarinas policíclicas fusionadas sinteticamente, através de uma seqüência de
substituições da 4-bromometilcumarina, inibiram o crescimento de Aspergillus fumigatus na
concentração de 25 µg/ml (KHAN et al., 2005).
Rehman et al. (2005), complexaram derivados cumarínicos com metais (cobalto,
cobre, níquel e zinco) e testaram frente os fungos: Candida albicans, Aspergillus flavus,
Microsporum canis, Fusarium solani e Candida glabrata. A atividade antifúngica obtida foi
superior nestes compostos se comparados às cumarinas não complexadas. Provavelmente este
processo aumentou a natureza lipofílica do átomo central metálico, o que favoreceu a sua
permeabilidade na membrana lipídica dos microrganismos.
2.1.9.8 Citotóxica e Antitumoral
As cumarinas representam uma fonte explorável de novos agentes antitumorais
(KOSTOVA, 2005 a), devido a sua atividade imunomodulatória e a ação direta nas células
cancerígenas (ZLABINGER et al., 1994).
A cumarina per se tem demonstrado atividade em carcinoma de próstata em modelo
animal (MAUCHER; KAGER; VON ANGERER, 1993; MOHLER et al., 1994) e capacidade
de reduzir entre 40 a 50% o número de metástase de pulmão nos animais com tumores de
próstata (VON ANGERER; KAGER; MAUCHER, 1994).
A 7-hidroxicumarina, o principal metabólito da cumarina em humanos, é considerada
um potente inibidor do crescimento tumoral, in vitro (COX; O’KENNEDY; THORNES,
1989). Em linhagens de células de adenocarcinoma pulmonar, causou um efeito inibitório
direto na proliferação destas células (LÓPEZ-GONZÁLEZ et al., 1998; ELINOS-BÁEZ;
LEÓN; SANTOS, 2005) e induziu a suspensão do ciclo celular na fase G
1
(LÓPEZ-
48
GONZÁLEZ et al., 2004). Em células A-427, correspondente também a adenocarcinoma de
pulmão, o mecanismo molecular, da atividade citostática, foi atribuído à ação da 7-
hidroxicumarina em diminuir a porcentagem das células tumorais que expressam ciclina D1
(JIMÉNEZ-OROZCO et al., 2001).
Atribuiu-se também à 7-hidroxicumarina a capacidade de induzir, in vitro, a apoptose
de células de adenocarcinoma pulmonar humano (LÓPEZ-GONZÁLEZ et al., 2004), sendo a
ativação da via apoptótica um mecanismo chave pelo qual as drogas citotóxicas matam as
células tumorais (DEBATIN, 2004). Estudos realizados em animais demostraram que a 7-
hidroxicumarina tem atividade em carcinoma mamário, com efeitos inibitórios comparáveis
aos do quimioterápico tamoxifeno (MAUCHER; VON ANGERER, 1994).
Em células de carcinoma renal (A-498) a 6-nitro-7-hidroxicumarina tem se mostrado
importante agente seletivo e anti-proliferativo, capaz de induzir alterações no ciclo celular e
possibilitar a morte da célula por apoptose (FINN; CREAVEN; EGAN, 2004 c).
Reddy et al. (2005) sintetizaram uma série de cumarinas carboxiamidas e investigaram
sua atividade citotóxica in vitro em células de carcinoma mamário. Os resultados mostraram
que a cumarina 3-carboxiamida inibiu seletivamente as células tumorais que expressavam, em
níveis elevados, o receptor do fator de crescimento epidérmico, a oncoproteína erbB2.
Um composto 5,7-diidroxicumarínico com um grupo fenil na posição 4 e um grupo
prenil (3-metil-1-oxobutil) na posição 8, isolado dos frutos da planta Calophyllum dispar
(Clusiaceae), exibiu significante atividade citotóxica, in vitro, em células de carcinoma de
nasofaringe (KB) (GUILET et al., 2001).
Finn, Creaven e Egan (2004 a) avaliaram o potencial das cumarinas como agentes
capazes de prevenir a reincidência do melanona, devido à capacidade destas substâncias em
mobilizar o sistema imune. Resultados in vitro apontam que as nitro derivadas da 7-
49
hidroxicumarina (6-nitro-7-hidroxicumarina e 3,6,8-trinitro-7-hidroxicumarina) exibem
efeitos anti-proliferativos em linhagens de células de melanona (SK-MEL-31).
A decursina, uma piranocumarina linear, demonstrou atividade citotóxica nas
linhagens de células leucêmicas K562, U937 e TUR (KIM et al., 2005). Outra
piranocumarina, porém angular (4’-O-acetil-3’-O-angeloil-cis-khellactone), extraída da raiz
de uma planta medicinal da China, Peucedanum praeruptorum, apresentou efeito
antileucêmico com capacidade de inibir o crescimento de células HL-60 e induzir a
diferenciação das mesmas (ZHANG et al., 2003). Utilizando estas mesmas células tumorais,
Wang et al. (2002) demonstraram o potencial antiproliferativo da esculetina por diminuição
da fosforilação da proteína restinoblastoma (pRb) e redução dos níveis de CDK4 (enzima
quinase dependente de ciclina).
A angiogênese associada aos tumores sólidos é um processo em que novos capilares
são formados no estroma tumoral a partir de células endoteliais do hospedeiro; evidências
experimentais demonstram que a angiogênese também contribui com o processo metastático
(TARTA et al., 2000). A isocumarina sintética 2-(8-hidroxi-6-metoxi-1-oxo-1H-2-
benzopiran-3-il) ácido propiônico (NM-3) foi considerada uma molécula antiangiogênica,
induzindo a morte de células endoteliais, em concentrações baixas, por mecanismo não
apoptótico; este estudo demostrou que a NM-3 induz a geração de espécies reativas de
oxigênio e inibe o crescimento das células tumorais; esses efeitos podem ser explicados, em
parte, pela ativação do fator supressor de tumores p53 (YIN, et al., 2001). Segundo Salloum et
al. (2000), a associação da isocumarina NM-3 à radioterapia em camundongos reduziu
significantemente o tamanho do tumor e não foi observado aumento da toxicidade sistêmica
ou local depois de realizado o tratamento.
Nam et al. (2002) observaram a atividade antiangiogênica da 4-senecioiloximetil-6,7-
dimetioxicumarina em células endoteliais venosas de cordão umbical humano (HUVEC).
50
Essa mesma atividade também foi descrita por Lee et al. (2006) para uma série de compostos
7-dietilamonicumarinas derivados.
O processo de crescimento tumoral, invasão e metástase envolve também a secreção
de enzimas proteolíticas, entre as quais as serino proteases e as matrix metalloproteinases
(MMPs). A 3-bromofenil,6-acetoximetil-2-oxo-2H-1-benzopiran-3-carboxilada pode ser
considerada uma alternativa de agente antitumoral, pois inibiu a atividade destas enzimas
proteolíticas, tendo demostrado atividade antiinvasiva em ensaios in vitro e atividade
antitumoral em células humanas de fibrosarcoma e adenocarcinoma de mama injetadas em
camundongos (KEMPEN et al., 2003).
A dafnetina (7,8-di-hidroxicumarina) tem mostrado ser um agente antiproliferativo em
células de carcinoma renal humano (A-498) (FINN et al., 2002; FINN; CREAVEN; EGAN,
2004 b) e células de hepatoma humano (HepG2) por inibir as proteína quinases (YANG et al.,
1999). Liu et al. (2001) também comprovaram os efeitos antiproliferativos da escopoletina (6-
metoxi,7-hidroxicumarina) em células de adenocarcinoma de próstata (PC
3
). Manuele et al.
(2006) concluíram que a última pode ser um potente composto antitumoral, pois exibiu efeito
citotóxico e citostático em linfomas de células T e induziu a profiferação de linfócitos T
normais.
Uma cumarina prenilada, a 4-hidroxicumarina ferulenol, pode representar um novo
produto natural capaz de atuar na estabilização de microtúbulos, tendo demonstrado efeito
citotóxico in vitro em várias linhagens de células tumorais humanas: adenocarcinoma de
mama (MCF-7), de cólon (Caco-2), de ovário (SK-OV-3) e células leucêmicas (HL-60)
(BOCCA et al., 2002).
Madari et al. (2003) demonstraram que a cumarina dicumarol, usada como
anticoagulante, apresenta capacidade de estabilizar os microtúbulos. Suas pesquisas
demonstraram inibição da divisão celular em embriões de ouriços marinhos. O dicumarol
51
também inibiu o crescimento de células de tumor pancreático por indução de estresse
oxidativo (LEWIS et al., 2004).
Velasco-Velázquez et al. (2003) determinaram os efeitos da 4-hidroxicumarina em
células de melanoma (B16-F10) e observaram que esta cumarina causa desorganização da
actina no citoesqueleto, dimuindo a adesão das células com a matriz extra celular e também a
adesão entre as células.
As cumarinas possuem capacidade de formar complexos com íons metálicos
(KOSTOVA et al., 2001). Alguns trabalhos têm investigado a atividade citotóxica de
biscumarinas complexadas com metais como o lantânio, o cério, o zircônio e o neodímio, em
células de leucemia mielóide aguda e crônica, e todos os compostos foram considerados
biologicamente ativos, inibindo a proliferação das células tumorais (KOSTOVA;
MANOLOV; MOMEKOV, 2004; KOSTOVA et al., 2005 b; KOSTOVA et al., 2005 c;
KOSTOVA; MOMEKOV, 2006).
2.2 Considerações sobre as infecções fúngicas
Ao longo dos últimos dez anos, a incidência de infecções fúngicas tem aumentado,
apresentando-se principalmente como infecções nosocomiais, devido ao advento das terapias
antibióticas e imunossupressoras, acometendo indivíduos com o sistema imunológico
comprometido, em conseqüência de infecção pelo vírus HIV, transplantes, hemodiálise ou
tratamentos oncológicos (ESPINEL-INGROFF, 1996; TORTORA et al., 2005). Estudos
mostram que o aumento de infecções fúngicas não abrange apenas as unidades de transplantes
e centros oncológicos, mas também unidades clínicas e cirúrgicas, correspondendo a 43% dos
casos (FERNANDES, 2004).
Em países desenvolvidos, 10% das infecções nosocomiais são causadas por fungos; o
gênero Candida é responsável por cerca de 80% das infecções fúngicas no ambiente
52
hospitalar e constitui causa relevante de infecções disseminadas. Nos EUA, este gênero é o 4°
maior causador deste tipo de infecção (PFALLER et al., 1998). No Brasil, o gênero Candida
ocupa o terceiro lugar na lista dos responsáveis pelas infecções hospitalares (LAPCHIK,
2004).
O espectro das candidíases é bastante extenso, desde colonização das mucosas, até
quadros sistêmicos (SIDRIM; ROCHA, 2004), o que depende, em grande parte, das
condições e susceptibilidade do paciente (NUCCI; COLOMBO, 2002). A mortalidade geral
causada pelas fungemias por Candida spp. é da ordem de 40 a 60% (COLOMBO;
GUIMARÃES, 2003).
Uma pesquisa realizada em hospitais da América Latina, em isolados de hemoculturas,
revelou que das espécies de Candida isoladas, C. albicans aparece com maior freqüência
(42%), porém o surgimento de episódios de candidemia por espécies não-albicans também é
preocupante (GODOY et al., 2003).
A colonização e infecção por C. albicans é freqüente em pacientes com câncer de
cabeça e pescoço, recebendo radioterapia (REDDING, 1999) bem como, em pacientes com
AIDS, onde as infecções oportunistas ocorrem em 80 a 95% dos casos. Estudos realizados em
seis centros universitários brasileiros apontaram a prevalência da espécie C. albicans (91%)
em isolados de cavidade oral de pacientes com AIDS (SANT’ANA et al., 2002). É importante
ainda considerar, a candidíase vulvovaginal, uma vez que esta é a infecção do trato genital
mais prevalente em pacientes do sexo feminino imunocompetentes não hospitalizadas
(RIBEIRO et al., 2000).
As infecções por fungos filamentosos invasores ocorrem, quase exclusivamente, em
pacientes imunodeprimidos. A aspergilose invasiva representa 75% das infecções por fungos
filamentosos invasores em pacientes com doenças hematológicas e 85% nas micoses
invasivas em transplantes de medula óssea (TELLES, 2004). O gênero Aspergillus tem
53
distribuição ubíqua na natureza, podendo ser encontrado no ar, no solo, em plantas, em
superfícies inertes e em alimentos. As espécies de maior relevância clínica são A. fumigatus,
A. flavus e A. niger (SIDRIM; CORDEIRO; ROCHA, 2004). A porta de entrada destas
infecções é a inalação de propágulos infectantes com colonização de vias aéreas superiores do
hospedeiro, que podem progredir até as vias aéreas inferiores, instalando-se ao nível de
alvéolos e desencadeando foco infeccioso pulmonar (TELLES, 2004).
Os fungos do gênero Fusarium são encontrados como sapróbios no solo, água e
plantas, podendo, neste último ser considerados como fitopatógenos. Em humanos a
apresentação clínica da fusariose é inespecífica, podendo ser observada desde acometimentos
superficiais (SIDRIM; CORDEIRO; ROCHA, 2004), ceratomicoses (VARGAS; PILTZ;
ALVES, 2004), até doenças angioinvasivas (TELLES, 2004). A via de entrada é incerta,
podendo ser através das vias respiratórias e posteriormente disseminar-se pela corrente
sangüínea, ou através de cateteres (GODOY; COLOMBO, 2004). As espécies mais
envolvidas em infecções são F. solani, F. oxysporum e F. moniliforme (SIDRIM;
CORDEIRO; ROCHA, 2004).
Em função do sucesso da profilaxia e tratamento de doenças virais e bacterianas,
observa-se a emergência das infecções fúngicas como causa de mortalidade relacionada à
infecção nos transplantados de órgãos (MONTEJO, 2002). As infecções mais documentadas
no período pós-transplante (recente) incluem quadros de candidíase, particularmente
candidíase oral, esofágica e candidúria. Na etapa intermediária ocorrem maiores riscos de
infecções fúngicas oportunistas, predominando quadros de aspergilose e mucormicose
(COLOMBO; SILVA, 2005).
A epidemiologia de infecções fúngicas em pacientes que receberam transplante de
medula óssea tem mudado na última década. Com a introdução do tratamento profilático com
triazóis reduziu o número de infecções por espécies de Candida e aumentou a incidência de
54
aspergilose invasiva e outras infecções, entre as quais, a fusariose, que se apresenta em
aproximadamente 6,18 casos em 1000 pacientes transplantados no Brasil, e 5,89 casos em
1000 pacientes transplantados nos EUA (OLIVEIRA et al., 2002; NUCCI et al., 2004).
No que se refere ao tratamento das infecções fúngicas, diversas pesquisas estão sendo
realizadas com o objetivo de descrever os mecanismos de resistência dos fungos às drogas, o
que vem se tornando um problema emergente (COLOMBO et al., 2003; FERREIRA et al.,
2004; GOLDMAN et al., 2004; FERREIRA et al., 2005).
2.3 Considerações sobre neoplasias
O câncer, atualmente, é considerado uma doença relativamente comum no mundo,
atingindo cerca de 20 milhões de pessoas e já assumiu, em alguns países, a principal causa de
óbito na população (WÜNSCH; MONCAU, 2002).
O desenvolvimento tumoral é um processo de múltiplas etapas durante o qual eventos
genéticos e epigenéticos determinam a transição da célula normal ao estado maligno e para a
maioria dos tumores, a progressão é conseqüência de vários circuitos regulatórios alterados
(COMPAGNI; CHRISTOFORI, 2000).
A busca de novas moléculas com atividade antitumoral a partir de produtos naturais
tem se tornado um campo promissor (CORDELL, 2000; MANS; ROCHA;
SCHWARTSMANN, 2000). A utilização das plantas no tratamento do câncer iniciou-se com
a medicina popular a mais de 3.500 anos, porém, se intensificou na década de 1950 com o
descobrimento e desenvolvimento dos alcalóides da vinca (CRAGG; NEWMAN, 2005) e
com avaliações do potencial antiproliferativo dos extratos brutos de plantas. Desde então,
mais de 120.000 extratos já foram testados. Alguns destes provaram ser clinicamente úteis,
outros serviram como ferramentas para descobertas dos mecanismos bioquímicos envolvidos
55
no crescimento e regulamento de tumores (MANS; ROCHA; SCHWARTSMANN, 2000;
CHEN et al., 2006).
Desde o ano de 1950 o National Cancer Institute - NCI dos EUA tem dedicado
extensivos recursos para a descoberta e devenvolvimento de terapias clínicas e pré-clinicas
para o tratameto do câncer (TAKIMOTO, 2003).
Cragg, Newman e Snader (1997) relataram que, em um estudo publicado pelo NCI,
39% dos 520 novos medicamentos aprovados pelo FDA, entre 1983 e 1994, eram produtos
naturais ou derivados desses. E aproxidamente 60% de todas as drogas antitumorais
disponíveis comercialmente ou que se encontravam nos últimos estágios de avaliação clínica,
tinham origem natural (GRAGG; NEWMAN, 2000).
Encontra-se, com sede no Brasil, o Escritório Sul Americano para Desenvolvimento
de Drogas Anti-Câncer - SOAD, que opera em colaboração com o Instituto Nacional do
Câncer dos Estados Unidos, com a Organização Européia para Pesquisa e Tratamento do
Câncer - EORTC e com a Companhia Britânica de Pesquisa do Câncer - CRC;
implementando um amplo programa de coleção e pesquisas anti-câncer com espécies de
plantas sul americanas (MANS; ROCHA; SCHWARTSMANN, 2000).
Considerando o amplo espectro de atividade das cumarinas, já foi realizada no
Laboratório de Antibióticos da Universidade Federal de Santa Catarina a atividade
antibacteriana de compostos cumarínicos naturais e semi-sintéticos (SOUZA et al., 2005).
Com o intuito de contribuir na ampliação do conhecimento de suas propriedades biológicas
foram avaliadas neste trabalho as atividades antifúngica, citotóxica (para células tumorais
humanas) e hemolítica destes mesmos compostos.
56
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
- Estudar a atividade antifúngica, citotóxica (para células tumorais humanas) e
hemolítica de cumarinas naturais e semi-sintéticas.
3.2 Objetivos Específicos
- Avaliar a atividade antifúngica através da determinação das concentrações inibitórias
mínimas - CIM pelo método de microdiluição em caldo;
- Correlacionar os substituintes do anel básico cumarínico com a atividade antifúngica;
- Comparar a atividade antifúngica das cumarinas entre os fungos filamentosos e
leveduriformes;
- Avaliar a atividade citotóxica das cumarinas em células tumorais humanas (Caco-2,
HEp-2 e HCT-8), através da determinação da viabilidade celular, usando o ensaio
colorimétrico com o sal de tetrazolium;
- Comparar a atividade citotóxica das cumarinas nas diferentes linhagens de células
tumorais humanas;
- Correlacionar os substituintes do anel básico cumarínico com a atividade citotóxica;
- Avaliar a atividade hemolítica das cumarinas em estudo.
- Comparar a atividade hemolítica entre as cumarinas testadas e correlacionar com os
substituintes do anel básico.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Cumarinas
4.1.1 Origem das cumarinas
Os derivados cumarínicos foram fornecidos pelo Professor Franco Delle Monache do
Instituto di Chimica, Università Cattolica Del Sacro Cuore (Roma-Itália).
Estas substâncias foram obtidas principalmente por fito-extração, modificações
químicas (Di-metoxi-esculetina e Di-metoxi-dafnetina são derivados metilados da esculetina e
dafnetina, respectivamente) e por aquisição comercial (herniarina e fraxetina foram adquiridas
comercialmente da Sarsynthese Co., Genay, França e a esculetina adquirida da Fluka, Buchs,
Suíça).
As estruturas dos derivados cumarínicos foram elucidadas por comparação de seus
dados espectroscópicos com a literatura.
Na Tabela 2 estão representadas as origens dos derivados cumarínicos. As estruturas
químicas destes compostos, seus pesos moleculares e o valor de seus log P (parâmetro usado
como medida quantitativa da lipofilicidade) estão apresentados nas Tabelas 3 (cumarinas
simples) e 4 (derivados cumarínicos complexos).
Tabela 2 - Origem de 40 cumarinas incluídas no estudo das atividades antifúngica, citotóxica
(células tumorais humanas) e hemolítica
Cumarinas Referências
Aurapteno DELLE-MONACHE et al., 1995.
Bergapteno COMPAGNONE; RODRIGUES; DELLE-MONACHE, 1993
3 α,α-Dimetil-Xantiletina DELLE-MONACHE et al., 1976.
Hortilina DELLE-MONACHE et al., 1976.
3 α,α-Dimetil-Psoraleno DELLE-MONACHE et al., 1976.
Isoangenomalina DELLE-MONACHE et al., 1977.
Marmesina DELLE-MONACHE et al., 1989.
Oroselona MURRAY, 1978.
Febalosina CUCA-SUAREZ; DELLE-MONACHE, 1991.
Escopoletina TORRES et al., 1979.
Xantiletina DELLE-MONACHE et al., 1976.
Xantotoxina COMPAGNONE; RODRIGUES; DELLE-MONACHE, 1993.
Columbianetina CUCA-SUAREZ; MARTINEZ; DELLE-MONACHE, 1998.
Di-Metoxi-Esculetina
(6,7-D-Metoxi-cumarina) Metilação da esculetina.
Di-Metoxi-Dafnetina
(7,8-Di-Metoxi-cumarina) Metilação da dafnetina.
Esculetina
(6,7-Di-Hidroxi-cumarina) Fluka.
Fraxetina
(7,8-Di-Hidroxi-6-Hidroxi-cumarina) Sarsynthese.
Herniarin
(7-Metoxi-cumarina) Sarsynthese.
7-O-Geranil-Esculetina
(6-Metoxi-7-geraniloxi-cumarina) TORRES et al., 1979.
Ostenol CUCA-SUAREZ; MARTINEZ; DELLE-MONACHE, 1998.
Aloxantoxiletina CUCA-SUAREZ; MENICHINI; DELLE-MONACHE, 2002.
Imperatorina TRANI et al., 1997.
Isopimpinelina TRANI et al., 2004.
Cumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
7-Metilcumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
7-O-Acetilcumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
7-Clorocumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
7-Nitrocumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Metilcumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Hidroxicumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-O-Acetilcumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Metoxicumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Clorocumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Iodocumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Aminocumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Carboxicumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Cianocumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Aldeidocumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
6-Nitrocumarina GOTTLIEB; ALVES DE LIMA; DELLE-MONACHE, 1979.
Balsamiferona CUCA-SUAREZ (informação verbal).
59
Tabela 3 - Derivados cumarínicos simples
7
6
8
5
4
3
2
O
1
R
3
OR
2
R
1
Cumarinas simples R
1
R
2
R
3
PM* log P
MONOSSUBSTITUÍDAS
(1) Cumarina H H H 146,1 1,49
(2) 6-Metilcumarina CH
3
H H 160,2 1,95
(3) 6-Hidroxicumarina OH H H 162,1 1,20
(4) 6-O-Acetilcumarina O-C
2
H
3
O H H 204,2 0,98
(5) 6-Metoxicumarina O-CH
3
H H 176,2 1,23
(6) 6-Clorocumarina Cl H H 180,6 2,00
(7) 6-Iodocumarina I H H 272,0 2,74
(8) 6-Aminocumarina NH
2
H H 161,1 0,70
(9) 6-Carboxicumarina COOH H H 190,1 1,18
(10) 6-Cianocumarina CN H H 171,1 1,52
(11) 6-Aldeidocumarina CHO H H 174,1 1,16
(12) 6-Nitrocumarina NO
2
H H 191,1 -0,49
(13) 7-Metoxicumarina (Herniarina) H O-CH
3
H 176,2 1,23
(14) 7-Metilcumarina H CH
3
H 160,2 1,95
(15) 7-O-Acetilcumarina H O-C
2
H
3
O H 204,2 0,98
(16) 7-Clorocumarina H Cl H 180,6 2,00
(17) 7-Nitrocumarina H NO
2
H 191,1 -0,49
DISSUBSTITUÍDAS
(18) 6-Metoxi, 7-Hidroxicumarina (Escopoletina) O-CH
3
OH H 192,2 0,95
(19) 6,7 di-hidroxicumarina (Esculetina) OH OH H 178,1 0,92
(20) 6,7-Di-Metoxi-Cumarina (Di-Metoxi-Esculetina) O-CH
3
O-CH
3
H 206,2 0,98
(21) 7,8-Di-Metoxi-Cumarina (Di-Metoxi-Dafnetina) H O-CH
3
O-CH
3
206,2 0,98
TRISSUBSTITUÍDA
(22) 6-Metoxi-7,8 Di-Hidroxicumarina (Fraxetina) O-CH
3
OH OH 208,2 0,66
* Resultados expressos em g/mol.
60
Tabela 4 - Derivados cumarínicos complexos
Cumarinas Preniladas R
R
1
R
2
PM* log P
OORO
(23) Aurapteno
298,4 3,96
OORO
O
(24) Febalosina CH
3
258,3 1,83
R
1
R
2
OORO
(25) Balsamiferona H
298,4 4,30
OO
HO
(26) Ostenol 230,2 2,75
61
(Continua)
Tabela 4 - Derivados cumarínicos complexos
Cumarinas Preniladas R
R
1
R
2
PM* log P
OORO
CH
3
O
(27) 7-O-Geranil-Esculetina
328,4 2,70
Furanocumarinas Lineares R R
1
R
2
PM* log P
O
O
R
2
O
R
1
(28) Bergapteno O-CH
3
H 200,2 1,18
(29) Xantotoxina H O-CH
3
200,2 1,18
(30) Isopimpinelina O-CH
3
O-CH
3
230,2 0,93
O
O
O
O
(31) Imperatorina 270,3 2,43
O
O
O
R
(32) 3α,α Di-Metil-Psoraleno
254,3 3,24
62
(Continua)
Tabela 4 - Derivados cumarínicos complexos
Furanocumarinas Lineares R R
1
R
2
PM* log P
O
O
O
R
OH
(33) Marmesina H 246,2 0,84
O
OO
(34) Isoangelomalina 228,2 2,18
Furanocumarinas Angulares R
R
1
R
2
PM* log P
OO
O
(35) Oroselone 226,2 1,85
OO
O
OH
(36) Columbianetina 246,2 1,16
63
(Continua)
Tabela 4 - Derivados cumarínicos complexos
Piranocumarinas R
R
1
R
2
PM* log P
O
O
O
O
(37) Hortilina 310,3 2,49
O
O
O
O
CH
3
(38) Aloxantoxiletina 258,3 1,73
OO
R
O
(39) Xantiletina H 228,3 1,99
(40) 3α,α Di-Metil-Xantiletina
296,4 3,79
* Resultados expressos em g/mol.
64
(Conclusão)
4.2 Avaliação da atividade antifúngica
Os testes antifúngicos foram realizados segundo a metodologia proposta pelo National
Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS, EUA.
Para os testes com fungos filamentosos seguiu-se a norma M38-A: Método de
Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da Sensibilidade a Terapia
Antifúngica dos Fungos Filamentosos (Norma Aprovada) (NCCLS, 2002 a).
Para os testes com fungos leveduriformes seguiu-se a norma M27-A2: Método de
Referência para Testes de Diluição em Caldo para Determinação da Sensibilidade de
Leveduras à Terapia Antifúngica (Norma Aprovada) (NCCLS, 2002 b).
4.2.1 Fungos
Os experimentos foram realizados com as seguintes espécies: Candida albicans ATCC
14053, Aspergillus fumigatus ATCC 16913 e Fusarium solani ATCC 36031, cedidos pelo
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz.
4.2.2 Meios de cultura e reagentes
Meios de cultura: O meio de cultura utilizado para o cultivo dos fungos filamentosos e
leveduriformes foi o ágar batata-dextroxe (Oxoid); para a avaliação da atividade antifúngica
foi utilizado o meio RPMI-1640, pH 7, com glutamina, sem bicarbonato e com indicador de
pH vermelho de fenol (Cultilab). O ágar sangue foi utilizado para verificação da pureza das
culturas fúngicas (NCCLS, 2002 a; NCCLS, 2002 b).
Tampão: Foi utilizado o tampão MOPS (ácido 3-[N-morfolino]propanosulfônico) (Fischer
Scientific), na concentração final de 0,165 mol/l para obtanção de pH 7 (NCCLS, 2002 a;
NCCLS, 2002 b).
65
4.2.3 Preparo da solução estoque do meio RPMI-1640
Foi solubilizada a quantidade exata de 10,4 g do meio de RPMI-1640 em 900 ml de água
destilada, acrescentando-se o tampão MOPS (0,165mol/l) e, posteriormente, foi ajustado o pH
para 7,0 a 25°C, usando-se hidróxido de sódio 1 mol/l. Foi acrescentado água destilada para
obtenção do volume final de 1 l. O meio foi filtrado em condições assépticas utilizando-se
filtro (Millipore) de 0,22 µm. Em seguida, o meio foi mantido sob refrigeração a 4ºC e
protegido da luz até seu uso (NCCLS, 2002 a; NCCLS, 2002 b).
4.2.4 Dissolução e Diluição das cumarinas
Foram pesadas 2000 µg de cada cumarina e dissolvidas em frascos estéreis com
dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck), na concentração final de 1%; os volumes foram
completados com meio RPMI 1640; e a concentração final de cada solução foi de 2000 µg/ml,
a qual foi diluída 1:1 quando colocadas na placa de 96 cavidades (Kartell), iniciando os testes
na concentração de 1000 µg/ml.
4.2.5 Preparo do inóculo
4.2.5.1 Inóculo dos fungos filamentosos
Para induzir a formação de conídios e esporangiosporos, os fungos filamentosos foram
cultivados em ágar batata dextrose durante sete dias a 35°C (a espécie Fusarium solani foi
incubada durante 48 a 72 h a 35°C, e depois, até o sétimo dia, à temperatura de 25 - 28°C).
Após sete dias foi adicionado sobre as colônias aproximadamente 1mL de solução salina
0,85% estéril, agitando-se delicadamente para preparar uma suspensão. Essa mistura de
conídios e fragmentos de hifas foi transferida para um tubo de ensaio estéril. Após três a
quatro minutos, quando as partículas mais pesadas se depositaram no fundo, a suspensão
homogênea superior foi transferida para um tubo estéril com tampa e homogeneizada em
vórtex por 15 segundos. A densidade óptica das suspensões foi lida em espectrofotômetro
66
(comprimento de onda de 530 nm) e ajustada com solução salina estéril 0,85%, para obtenção
de absorbância entre 0,09 a 0,11 para Aspergillus fumigatus e entre 0,15 a 0,17 para Fusarium
solani. Posteriormente essas suspensões foram diluídas 1:50 em meio RPMI, o que
corresponde a duas vezes a densidade necessária de 0,4 x 10
4
a 5 x 10
4
UFC/ml (unidades
formadoras de colônia por ml).
O ajuste final foi obtido no momento da distribuição deste inóculo (100 µl) aos
diferentes orifícios da placa de 96 cavidades, contendo o volume de 100 µl do meio de RPMI
1640 tamponado (COLOMBO; ALVES, 2004).
4.2.5.2 Inóculo dos fungos leveduriformes
Candida albicans foi cultivada em ágar batata dextrose por 24 h a 35°C, com
realização do teste de pureza em meio ágar sangue, após as primeiras 8 h de incubação. O
inóculo foi preparado diluindo-se cinco colônias com diâmetro de aproximadamente 1 mm em
5 ml de solução salina estéril 0,85%, agitando-se em vórtex por 15 segundos e ajustando-se a
densidade celular em espectrofotômetro (comprimento de onda 530 nm), para se obter a
absorbância equivalente à solução-padrão da escala 0,5 de McFarland em meio RPMI-1640;
obteve-se um inóculo concentrado duas vezes (1 x 10
3
a 5 x 10
3
UFC/ml), que foi diluído 1:1
quando inoculado na placa de 96 cavidades, chegando-se à concentração final desejada de 0,5
x 10
3
a 2,5 x 10
3
UFC/ml (NCCLS, 2002 b).
4.2.6 Controles positivos
Foi utilizado como controle positivo para os testes com fungos filamentosos a
anfotericina B (Cristália), e para os testes com C. albicans o fluconazol.
Estes fármacos foram dissolvidos em DMSO (concentração final 1%) e diluídas em
RPMI-1640, resultando em uma concentração final de 2000 µg/ml (diluída 1:1, quando
colocadas na placa de 96 cavidades, iniciando os testes na concentração de 1000 µg/ml)
67
4.2.7 Determinação da concentração inibitória mínima
A atividade antifúngica foi avaliada através da determinação da concentração
inibitória mínima pelo método de microdiluição em caldo. As soluções de cumarinas
previamente diluídas foram distribuídas no volume de 100 µl nos primeiros orifícios da placa
de 96 cavidades, posteriormente realizou-se diluições seriadas com o meio de RPMI-1640,
para obtenção de concentrações que variaram de 1000 µg/ml a 15,6 µg/ml.
A seguir era adicionado 100 µl da suspensão do inóculo em cada orifício (nesta etapa
ocorre a diluição 1:1 do inóculo e da concentração das cumarinas). Os poços de controle do
crescimento foram inoculados com 100 µl do meio de RPMI-1640 adicionados do inóculo
fúngico, sem a presença das substâncias testes.
Para o controle de esterilidade foi utilizada a última diluição da cumarina, sem a
adição do inóculo fúngico. Os fármacos controle foram diluídos (diluição seriada) partindo da
concentração 1000 µg/ml até 0,00047 µg/ml.
As placas contendo fungos filamentosos foram incubadas a 35°C por 46 a 50 h. As
placas com testes para C. albicans foram incubadas a 35°C por 24 h. Todos os experimentos
foram realizados em duplicata.
A leitura da menor concentração da substância que inibia o crescimento fúngico foi
detectada visualmente, comparando-se com o controle de crescimento, recebendo um escore
numérico da seguinte forma: 4= nenhuma redução do crescimento; 3= ligeira redução do
crescimento (aproximadamente 75%); 2= redução proeminente do crescimento
(aproximadamente 50%); 1= ligeiro crescimento ou aproximadamente 25%; 0= opticamente
claro ou ausência de crescimento.
Foi considerada a concentração inibitória mínima - CIM para os testes realizados a
concentração que obteve escore zero; isto é, ausência de crescimento.
68
A leitura da CIM dos controles positivos foi realizada seguindo as normas do NCCLS:
para a anfotericina B a CIM é a menor concentração da droga que impedir qualquer
crescimento fúngico (escore zero) e para o fluconazol é a concentração capaz de inibir 50%
do crescimento fúngico (escore 2) (NCCLS, 2002 a; NCCLS, 2002 b).
4.3 Avaliação da atividade citotóxica
4.3.1 Células
Foram utilizadas as células: Caco-2 (ATCC: HTB-37, de adenocarcinoma colo retal
humano); HCT-8 (ATCC: CCL-244, de adenocarcinoma ileocecal humano) e HEp-2
(carcinoma epidermóide de laringe humana, adquirida do Banco de células da UFRJ). Todas
as células foram utilizadas antes da 20
a
passagem.
4.3.2 Meios de cultura e reagentes
Meios de cultura: o meio utilizado para manutenção e crescimento das células Caco-2
e HEp-2 foi o Meio MEM (Minimal Essential Médium) (Cultilab), adicionado de 2,2 g de
bicarbonato de sódio (5,6%) por litro de meio pH 7,2 a 7,4.
Para manutenção e crescimento das células HCT-8 foi utilizado o meio RPMI-1640
(Cultilab) com piruvato de sódio (1 mM) (ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2003).
Soro Fetal Bovino - SFB: foi adicionado aos respectivos meios de cultura 10% de
SFB (Cultilab) para promoção do crescimento e 5 % para manutenção da linhagem celular
Antibióticos e antifúngico: Uma solução de antibióticos e um antifúngico (Cultilab:
10.000 U de penicilina, 10.000 µg de estreptomicina, 25 µg de anfotericina B) foi adicionada
aos meios de cultura correpondentes, na proporção de 1%.
Tripsina: essa enzima proteolítica (tripsina de pâncreas de porco 1:250 (Sigma)
preparada em solução de EDTA a 0,25% ) foi o agente de dispersão celular.
69
4.3.3 Preparação das soluções-estoque das cumarinas
As cumarinas foram pesadas e dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck) na
concentração final de 1%, as soluções foram mantidas sob refrigeração a 4°C e protegidas da
luz até o uso; quando foram dissolvidas em meio de cultura nas concentrações desejadas.
4.3.4 Controles positivos
Foram utilizados como controles positivos os seguintes fármacos antineoplásicos:
cloridrato de doxorrubicina (Meizler), cloridrato de daunorrubicina (Meizler) e paclitaxel
(Zodiac).
4.3.5 Avaliação da viabilidade celular pelo ensaio colorimétrico com sal de tetrazolium
(MTT)
No ensaio do MTT, o sal de tetrazolium [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil brometo
de tetrazolium] é um composto hidrossolúvel, que em solução apresenta coloração amarelo-
pálido e é facilmente incorporado por células viáveis, que reduzem este composto em suas
mitocôndrias pelas desidrogenases. Ao ser reduzido, o MTT é convertido em um composto
formazana, de coloração roxo-azulado, insolúvel em água, que fica armazenado no citoplasma
celular, sendo posteriormente solubilizado e quantificado colorimetricamente, através de
espectrofotometria, sendo o valor da absorbância proporcional ao número de células viáveis
(MOSMANN, 1983; DENIZOT; LANG, 1986).
Procedimento: As células HEp-2, Caco-2 e HCT-8 foram cultivadas em placas de 96
cavidades (TPP) (100 µl por cavidade) nas seguintes densidades celulares: 2,0 x 10
5
; 6,0 x 10
5
e 6,0 x 10
5
células/ml
respectivamente, até confluência (24 h), nos meios de culturas
adequados. Após 24 h, o meio foi retirado por aspiração e foram adicionados 200 µl das
70
soluções de cumarinas diluídas na razão de 1:2, a partir da concentração de 500 µg/ml até a
concentração 7,8 µg/ml.
Paralelamente, foram realizados controles celulares (200 µl de meio/cavidade) e um
branco (100 µl de DMSO/cavidade). Em seguida, as placas foram incubadas a 37°C e 5%CO
2
por 72 h. Posteriormente, foi aspirado todo o meio e adicionaram-se 50 µl da solução de MTT
(Sigma) a 1 mg/ml em meio de cultura, e as placas foram incubadas por mais 4 h, nas mesmas
condições. Após o período de incubação, foi retirado cuidadosamente o meio contendo MTT
de cada cavidade, e adicionaram-se 100 µl de DMSO/cavidade com a finalidade de solubilizar
os sais de formazana. A placa foi agitada, levemente, a temperatura ambiente, por 10 minutos,
para solubilização de toda formazana e a absorbância foi medida a 540 nm num
espectrofotômetro (Bio-Tek®, Elx 800) (MOSMANN, 1983; ANDRIGHETTI-FRÖHNER et
al., 2003).
Os valores da absorbância medidos para cada concentração de cada material teste (DO
amostra) foram transformados em porcentagem (x%) em relação ao controle celular (DO
controle celular), o qual é considerado 100% viável, através da seguinte fórmula:
X% = DO (amostra) X 100
DO (controle celular)
Em seguida, foram calculados os valores de CC
50
, ou seja, a concentração de cada
amostra que reduziu em 50% a viabilidade celular. Os valores de CC
50
calculados representam
à média de dois experimentos independentes ± erro padrão da média e com intervalo de
confiança de 95% .
71
4.4 Avaliação da atividade hemolítica
O ensaio de atividade hemolítica foi desenvolvido segundo metodologia descrita por
Hubert, Cooper e Roch (1997) e Shin et al. (2001), utilizando-se eritrócitos humanos do grupo
sangüíneo “O” Rh positivo.
4.4.1 Reagentes
Foi utilizado para este ensaio o tampão salina fosfato (PBS) (pH 7,2-7,4), água Mili Q
e o anticoagulante heparina.
4.4.2 Dissolução e Diluição das cumarinas
As cumarinas foram pesadas e então dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO) na
concentração de 1%, os volumes completados com água Mili Q. Posteriormente, foram
diluídas seriadamente, em concentrações variando de 1000 µg/ml a 15,6 µg/ml.
4.4.3 Ensaio hemolítico
O sangue foi coletado em heparina e centrifugado para obter a fração correspondente
aos eritrócitos. Os eritrócitos foram, então, lavados três vezes em PBS por centrifugação
(1000 g/5 min, a temperatura ambiente). Posteriormente foi realizada a diluição para a
obtenção da concentração de 4%.
Volumes de 200 µl da solução de eritrócitos + 160 µl de PBS + 40 µl das diferentes
diluições das amostras de cumarina, foram incubados a 37°C por 1 h e então centrifugados a
1000 g/5 min, a temperatura ambiente. O sobrenadante (100 µl) foi retirado, cuidadosamente,
e colocado em placa de 96 cavidades. A lise celular foi determinada pela medida da
concentração de hemoglobina livre. A leitura realizada em espectrofotômetro (Bio-Tek®, Elx
72
800), comprimento de onda de 540 nm, e o grau de hemólise determinado de acordo com a
equação:
% hemólise = 100 x Absorbância (teste) - Absorbância (controle negativo)
Absorbância (controle positivo) - Absorbância (controle negativo)
Onde, o controle positivo representa 100% de hemólise, preparado com 200 µl da
solução de eritrócitos + 200 µl de água Mili Q; o controle negativo preparado com 200 µl da
solução de eritrócitos + 160 µl do tampão PBS + 40 µl de água Mili Q com 1% de DMSO. Os
controles foram também incubados a 37°C por 1 h e, posteriormente, centrifugados a 1000 g/5
min, a temperatura ambiente.
73
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliação da atividade antifúngica
Com o aumento na incidência das infecções fúngicas sistêmicas e o número crescente
de agentes antifúngicos, aumentou também o interesse em métodos laboratoriais para orientar
a seleção da terapia antifúngica. O Comitê da Área de Microbiologia do National Committee
for Clinical Laboratory Standards - NCCLS estabeleceu o subcomitê para testes de
Sensibilidade a Agentes Antifúngicos e publicou as normas M38-A e M27-A2 que são
métodos de referência para testar a suscetibilidade de fungos filamentosos e leveduriformes
respectivamente, que causam infecções fúngicas invasivas (NCCLS, 2002 a; NCCLS, 2002
b).
Os testes antifúngicos realizados neste trabalho seguiram essa metodologia proposta
pelo NCCLS, conforme descrito no item 4.2. Os resultados das atividades antifúngicas,
representados pela concentração inibitória mínima (CIM), serão apresentados e discutidos
posteriormente e foram expressos na unidade milimolar (mM). Os resultados expressos em
µg/ml foram acrescentados entre parênteses nas tabelas com o objetivo de facilitar a
compreensão na correlação com os dados da literatura, também expressos em µg/ml. De
acordo com Stein et al. (2006), compostos com valores da Concentração Inibitória Mínima
(CIM) superiores a 250 µg/ml não apresentam atividade antifúngica.
Foram utilizados como controles positivos os seguintes fármacos antifúngicos: a
anfotericina B para os fungos filamentosos e o fluconazol para fungos leveduriformes. Os
resultados dos testes realizados para os controles, em comparação com os dados da literatura
estão expressos na Tabela 5. Pôde-se observar que houve correlação entre os resultados dos
antifúngicos utilizados como controles positivos com os dados encontrados na literatura.
Tabela 5 - Concentrações inibitórias mínimas dos fármacos utilizados como controles
positivos em relação aos dados da literatura
Fungos Antifúngicos MIC (mM) Referências
Teste Literatura
C. albicans
Fluconazol 0,00078 0,0008 - 0,032 NCCLC, 2002 b.
A. fumigatus
Anfotericina B 0,00051 0,0054 -0,0021 NCCLC, 2002 a.
F. solani
Anfotericina B 0,00097 0,001 - 0,0021 Espinel-Ingroff et al., 1997.
5.1.1 Atividade antifúngica das cumarinas simples monossubstituídas
Os resultados da atividade antifúngica estão apresentados na Tabela 6.
Tabela 6 – Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das
cumarinas simples monossubstituídas
Cumarinas monossubstituídas
Candida
albicans
Aspergillus
fumigatus
Fusarium
solani
(1) Cumarina 3,42* (500)** 6,84 (1000) 3,42 (500)
(2) 6-Metilcumarina 3,12 (500) 6,24 (1000) 3,12 (500)
(3) 6-Hidroxicumarina 3,08 (500) > 6,16 (1000) 3,08 (500)
(4) 6-O-Acetilcumarina 2,44 (500) 2,44 (500) 4,89 (1000)
(5) 6-Metoxicumarina 2,83 (500) > 5,67 (1000) 2,83 (500)
(6) 6-Clorocumarina 2,76 (500) 5,53 (1000) 2,76 (500)
(7) 6-Iodocumarina 1,83 (500) 3,67 (1000) 1,83 (500)
(8) 6-Aminocumarina 3,10 (500) 6,20 (1000) 6,20 (1000)
(9) 6-Carboxicumarina 5,25 (1000) >5,25 (1000) 5,25 (1000)
(10) 6-Cianocumarina 2,92 (500) 5,84 (1000) 1,46 (250)
(11) 6-Aldeidocumarina 2,87 (500) 5,74 (1000) 1,43 (250)
(12) 6-Nitrocumarina 2,61 (500) 2,61 (500) 0,65 (125)
(13) 7-Metoxicumarina (Herniarina) 2,83 (500) 5,67 (1000) 5,67 (1000)
(14) 7-Metilcumarina 6,24 (1000) 6,24 (1000) 3,12 (500)
(15) 7-O-Acetilcumarina 1,22 (250) 2,44 (500) 1,22 (250)
(16) 7-Clorocumarina 2,76 (500) 5,53 (1000) 2,76 (500)
(17) 7-Nitrocumarina 1,33 (250) 1,33 (250) 1,33 (250)
Fluconazol 0,00078 (0,24)
Anfotericina B 0,00051 (0,48) 0,00097 (0,90)
* Resultados expressos em mM.
** Resultados expressos em µg/ml.
75
Como pode ser observado a cumarina per se (composto 1), não exibiu atividade
antifúngica para os fungos testados (Candida albicans, Aspergillus fumigatus e Fusarium
solani). Sardari et al. (1999) também observaram que a cumarina per se não é ativa frente a C.
albicans, apresentando resultados superiores a 6,84 mM (1000 µg/ml), e Ojala et al. (2000)
confirmaram que a cumarina per se não inibe o crescimento dos fungos C. albicans,
Saccharomyces cerevisiae e Aspergillus niger, na concentração de 500 µg/ml.
Stein et al. (2006) concluíram que as propriedades farmacológicas e bioquímicas de
cumarinas simples podem depender do padrão de substituições no núcleo cumarínico. Neste
trabalho observou-se que a inserção de grupos substituintes nas posições C
6
e C
7
modificou a
atividade antifúngica; entretanto, não demonstrou ser muito significativa, visto que, os
resultados da atividade antifúngica dos compostos cumarínicos testados, se comparados com
os controles positivos, apresentaram-se pouco expressivos.
Para alguns compostos, os padrões de substituição não seguiram a mesma analogia, a
inclusão do grupo metil (CH
3
) na posição C
6
(composto 2) não alterou a atividade em relação
a cumarina per se (composto 1); este mesmo grupo adicionado a posição C
7
(composto 14)
resultou em valores menos expressivos para C. albicans e permaneceu inalterado para A.
fumigatus e F. solani. Com o grupo O-acetil (O-C
2
H
3
O) ocorreu o oposto, na posição C
7
a 7-
O-acetilcumarina (composto 15) mostrou-se mais ativa para C. albicans e F. solani do que
seu análogo 6-O-acetilcumarina (composto 4) e para A. fumigatus não houve alteração dos
resultados entre os compostos.
As cumarinas 6-clorocumairna (composto 6) e 7-clorocumarina (composto 16) não
apresentaram nenhuma alteração na atividade antifúngica para as três espécies estudadas. O
mesmo foi observado com a 6-metoxicumarina (composto 5) e a 7-metoxicumarina
(composto 13) para C. albicans; já em relação aos fungos filametosos a 7-metoxicumarina
demonstrou CIM superiores para o F.solani e inferiores para o A. fumigatus.
76
A presença do substituinte halogênico iodo na posição C
6
(composto 7), conferiu
maior atividade para as três espécies, se comparado com a cumarina per se. No entanto, estes
não demostraram ser resultados expressivos. O mesmo pôde ser observado com a 6-
cianocumarina (composto 10) e a 6-aldeidocumarina (composto 11).
Além do padrão de substituição no núcleo, a polaridade e hidrofobicidade dos grupos
inseridos poderiam representar um requisito para a atividade antifúngica entre as cumarinas
monossubstituídas. No entanto, pode-se observar que para as cumarinas estudadas estas
características não foram responsáveis pela atividade antifúngica, não ocorrendo variação
considerável da atividade em decorrência das características dos grupos substituintes.
De acordo com Godoy et al. (2005) não se descarta a hipótese de que a atividade
antifúngica, em alguns casos, pode ser espécie-específica. Isto pôde ser observado em estudos
com diversas cumarinas, na concentração de 200 µg/ml, frente a: Microsporum canis, A.
flavus, F. solani, C. albicans e Candida glabrata. Constatou-se que apenas a cumarina (4-
metil-2-oxo-2H-cromen-7-il)-4-metilbenzenosulfonato foi ativa para C. albicans; nenhuma
cumarina inibiu o crescimento da C. glabrata e a cumarina 4-metil-2-oxo-2H-cromen-7-il-
benzenoato inibiu 80% do crescimento de F. solani, 90% do crescimento de M. canis e 37%
de A. flavus (KHAN et al., 2004). Ojala et al. (2000) também observaram inatividade para C.
albicans e A. niger; no entanto, as mesmas cumarinas inibiam expressivamente Fusarium
culmorum, na concentração de 500 µg/ml.
Sardari et al. (1999) relacionaram a atividade antifúngica com a presença de um grupo
hidroxila (OH) livre na posição C
6
e outros substituintes nas posições C
7
e C
8
. Entretanto, no
presente trabalho, pesquisou-se atividade antifúngica somente com 6-hidroxicumarina
(composto 3) sem outros substituintes e observou-se que esta cumarina não apresentou
atividades expressivas. Estes resultados confirmaram os obtidos por Jurd et al. (1971), onde, a
6-hidroxicumarina foi completamente inativa para todos os fungos testados (Candida
77
tropicalis, S. cerevisiae, A. flavus, A. niger e Alternaria spp.). No entanto, estes últimos
autores observaram que a adição do grupo metoxi (OCH
3
), na posição C
6
, originando a 6-
metoxicumarina conferiu atividade antifúngica, o que não foi constatado no presente estudo.
A 7-hidroxicumarina (umbeliferona) não foi utilizada para os testes deste estudo,
portanto, não foi possível comparar com a atividade da 6-hidroxicumarina. Porém, relatos
prévios mostram que esta cumarina também não exerce inibição do crescimento fúngico, não
apresentando atividade para C. albicans, A. niger e S. cerevisiae, em concentrações de 500
µg/ml (SARDARI et al., 1999; OJALA et al., 2000). Também, segundo Jurd, King e Mihara
(1971) a umbeliferona não foi ativa frente diversas espécies de Saccharomyces e Aspergillus.
Estes mesmos autores verificaram que a substituição por um grupo metoxi, dando origem a 7-
metoxicumarina, conhecida por herniarina, inibiu o crescimento de espécies de Aspergillus.
No presente trabalho a 7-metoxicumarina (composto 13), não foi ativa para os fungos
testados o que corrobora com os estudos de Ojala et al. (2000), que não observaram atividade
antifúngica da herniarina para C. albicans e A. niger e, com Ngwendson et al. (2003) que
consideraram esta cumarina inativa frente C. albicans e A. fumigatus.
Entre as cumarinas monossubstituídas a 6-nitrocumarina (composto 12) apresentou
atividade antifúngica mais expressiva, porém apenas para F. solani, com CIM de 0,65 mM
(125 µg/ml). Este mesmo grupo substituinte na posição C
7
, (7-nitrocumarina) (composto 17),
evidenciou uma reduzida atividade para as três espécies estudadas com CIMs de 1,33 mM
(250 µg/ml). Todavia, não foram encontrados trabalhos relacionando a atividade antifúngica
de cumarinas com o grupo substituinte NO
2
.
Para C. albicans e F. solani a atividade antifúngica mais expressiva foi observada pela
7-O-acetilcumarina (composto 15) (1,22 mM = 250 µg/ml). Estes achados são similares aos
de Jurd, King e Mihara (1971) os quais constataram a atividade antifúngica desta cumarina
frente C. tropicalis, A. niger e A. flavus; atribuíram a atividade antifúngica à alquilação do
78
anel cumarínico. Entretanto a 6-O-acetilcumarina (composto 4) não demonstrou ser ativa para
as espécies de fungos estudadas.
5.1.2 Atividade antifúngica das cumarinas di e trissubstituídas
Na Tabela 7 estão apresentados os valores das concentrações inibitórias mínimas das
cumarinas di e da cumarina trissubstituída fraxetina, pode-se observar que essas substituições
não resultaram em atividades antifúngicas significativas.
Tabela 7 - Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das
cumarinas di e trissubstituídas
Cumarinas dissubstituídas
Candida
albicans
Aspergillus
fumigatus
Fusarium
solani
(18) Escopoletina 2,60*(500)** N.T.*** N.T.
(19) Esculetina 2,80 (500) 5,60 (1000) 5,60 (1000)
(20) Di-Metoxi-esculetina 4,84 (1000) 4,84 (1000) 4,84 (1000)
(21) Di-Metoxi-dafnetina 2,42 (500) 4,84 (1000) 4,84 (1000)
Cumarina trissubstituída
Candida
albicans
Aspergillus
fumigatus
Fusarium
solani
(22) Fraxetina 2,40 (500) 4,80 (1000) 4,80 (1000)
* Resultados expressos em mM.
** Resultados expressos em µg/ml.
*** NT: substância não testada por não ter quantidade suficiente.
A escopoletina, 6-metoxi,7-hidroxicumarina (composto 18), apresentou reduzida
atividade antifúngica para C. albicans (2,60 mM = 500 µg/ml); no entanto, Jurd et al. (1971)
observaram que esta cumarina foi inativa frente S. cerevisiae, A. flavus, A. niger e C.
tropicalis.
De acordo com Jurd et al. (1971), a esculetina (6,7-dihidroxicumarina) não apresenta
atividade antifúngica, o que corrobora com os resultados encontrados neste trabalho
(composto 19). Sardari et al. (1999) também observaram inexpressiva atividade da esculetina
79
frente C. albicans, S. cerevisiae e Cryptococcus neoformans, com CIMs superiores a 1000
µg/ml.
A metoxilação nas posições C
6
e C
7
gerando di-metoxi-esculetina (6,7-
dimetoxicumarina, composto 20) resultam em maiores CIMs para C. albicans e F. solani,
quando comparados com a cumarina monossubstituída 6-metoxicumarina (composto 5). A di-
metoxi-dafnetina (7,8-dimetoxicumarina, composto 21) quando comparada com a 7-
metoxicumarina (composto 13) não revela diferenças significativas.
A di-metoxi-esculetina (composto 20) não apresentou atividade antifúngica neste
trabalho, entretando outros autores constataram atividade antifúngica para esta cumarina
frente a A. flavus, A. niger, C. tropicalis (JURD et al., 1971), Microsporum canis e
Trichophyton mentagrophytes (JOHANN, 2003).
Estudos realizados por Sardari et al. (1999) com diversos compostos cumarínicos,
mostraram atividades antifúngicas inexpressivas, para C. albicans, de cumarinas di e
trissubstituídas (nas posições C
6
, C
7
e C
8
), as quais apresentaram CIMs superiores a 250
µg/ml.
80
5.1.3 Atividade antifúngica das cumarinas preniladas
Os compostos 23, 24, 25, 26 e 27 são cumarinas preniladas e os resultados das
respectivas atividades antifúngicas estão apresentados na Tabela 8.
Tabela 8 - Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das
cumarinas preniladas
Cumarinas preniladas
Candida
albicans
Aspergillus
fumigatus
Fusarium
solani
(23) Aurapteno 3,35* (1000)** >3,35 (1000) 3,35 (1000)
(24) Febalosina 1,93 (500) 3,87 (1000) >3,87 (1000)
(25) Balsamiferona 1,67 (500) 3,35 (1000) >3,35 (1000)
(26) Ostenol 1,08 (250) 1,08 (250) 0,54 (125)
(27) 7-O-Geranil-esculetina 1,52 (500) 3,04 (1000) 3,04 (1000)
* Resultados expressos em mM.
** Resultados expressos em µg/ml.
Destacou-se, neste grupo, a atividade antifúngica do ostenol (composto 26)
principalmente frente a F. solani com CIM de 0,54 mM (125 µg/ml); para C. albicans e A.
fumigatus as CIMs foram de 1,08 mM (250 µg/ml).
A atividade antifúngica do ostenol pode ser explicada pela presença da cadeia alquila
na posição C
8
o que sugere uma relação com o aumento da lipofilicidade da molécula,
favorecendo a passagem pela membrana fosfolipídica dos fungos (SARDARI et al., 1999;
REHMAN et al., 2005). Da mesma forma a associação com o grupo hidroxila livre na posição
C
7
apresentou melhores resultados quanto à inibição do crescimento fúngico do que
compostos que possuiam uma hidroxila livre na posição C
6
, sugerindo, que este grupo na
posição C
7
também pode influenciar na atividade antifúngica. (SARDARI et al., 1999).
No entanto, a balsamiferona (composto 25), composto de maior lipofilicidade deste
grupo, também apresenta um grupo OH livre em C
7
, e o mesmo grupo prenil do ostenol,
porém nas posições C
3
e C
6
. É possível que estes dois grupos modifiquem a configuração
81
espacial da molécula e assim diminuam a afinidade pelos transportadores ou sítios de ligação,
o que justificaria a não atividade desta cumarina frente aos fungos testados.
As cumarinas aurapteno (composto 23) e a 7-O-geranil-esculetina (composto 27),
também são compostos lipofílicos, entretando, o grupo prenil se encontra na posição C
7
,
demonstrando a importância da C
8
-prenilação na atividade antifúngica, visto que, estas
cumarinas não foram ativas aos fungos estudados. Porém, a febalosina (composto 24) que
possui um grupo prenil em C
8
, não apresentou atividade antifúngica, podendo-se sugerir que a
oxidação da unidade prenílica e a migração da dupla ligação tornaram-na inativa.
5.1.4 Atividade antifúngica das furanocumarinas
Na Tabela 9 estão representados os resultados da atividade antifúngica das
furanocumarinas lineares e angulares.
Tabela 9 - Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das
furanocumarinas lineares e angulares
Furanocumarinas lineares
Candida
albicans
Aspergillus
fumigatus
Fusarium
solani
(28) Bergapteno 1,24* (250)** 4,99 (1000) N.T.***
(29) Xantotoxina >4,99 (1000) 4,99 (1000) 4,99 (1000)
(30) Isopimpinelina 2,17 (500) >4,34 (1000) 4,34 (1000)
(31) Imperatorina 3,70 (1000) 3,70 (1000) 3,70 (1000)
(32) 3 α,α Di-metil Psoraleno 1,96 (500) >3,93 (1000) 3,93 (1000)
(33) Marmesina 2,03 (500) 4,06 (1000) 4,06 (1000)
(34) Isoangenomalina 2,19 (500) 4,38 (1000) 2,19 (500)
Furanocunarinas angulares
Candida
albicans
Aspergillus
fumigatus
Fusarium
solani
(35) Oroselone 2,21 (500) 4,42 (1000) N.T.
(36) Columbianetina 4,06 (1000) 4,06 (1000) 4,06 (1000)
* Resultados expressos em mM.
** Resultados expressos em µg/ml.
***NT: Substância não testada por não ter quantidade suficiente.
82
O grupo das furanocumarinas lineares e angulares também apresentou atividade
antifúngica pouco significativa, destacando-se apenas a cumarina bergapteno (composto 28).
Este composto, frente a C. albicans, evidenciou CIM de 1,24 mM (250 µg/ml).
Contrariamente, Ojala et al. (2000) não observaram atividade desta cumarina em
concentrações de 500 µg/ml.
Os testes de atividade antifúngica realizados por Ulubelen et al. (1995), utilizando o
método de disco difusão, demostraram que a imperatorina possui atividade para C. albicans,
com CIM de 0,19 mM (54 µg/ml); valores não encontrados neste estudo (composto 31), onde
o método utilizado foi a microdiluição em caldo.
5.1.5 Atividade antifúngica das piranocumarinas
A Tabela 10 representa a atividade antifúngica das piranocumarinas.
Tabela 10 - Atividade antifúngica, expressa em Concentração Inibitória Mínima, das
piranocumarinas angulares e lineares
Piranocumarinas angulares
Candida
albicans
Aspergillus
fumigatus
Fusarium
solani
(37) Hortilina 1,61* (500)** >3,22 (1000) >3,22 (1000)
(38) Aloxantoxiletina 1,93 (500) 3,87 (1000) 3,87 (1000)
Piranocumarinas lineares
Candida
albicans
Aspergillus
fumigatus
Fusarium
solani
(39) Xantiletina 2,19 (500) 4,38 (1000) 4,38 (1000)
(40) 3 α,α-Dimetil Xantiletina 3,37 (1000) 3,37 (1000) 3,37 (1000)
* Resultados expressos em mM.
** Resultados expressos em µg/ml.
No grupo das piranocumarinas não foi obtido nenhum resultado expressivo. Observou-
se apenas, que para C. albicans as piranocumarinas angulares (compostos 37 e 38) foram mais
ativas que as lineares (compostos 39 e 40); estes resultados sugerem que a presença do anel
pirano, condensado ao núcleo cumarínico, não é fator estrutural importante para a atividade
antifúngica.
83
A atividade antifúngica das piranocumarinas, ainda que fraca, foi mais intensa em C.
albicans do que sobre os fungos filamentosos.
5.2 Avaliação da atividade citotóxica
A atividade citotóxica das cumarinas foi realizada frente as células Caco-2
(adenocarcinoma colo retal humana), HCT-8 (adenocarcinoma ileocecal humana) e HEp-2
(carcinoma epidermóide de laringe humana).
O câncer do intestino é o tumor maligno gastrointestinal mais freqüente nos EUA, e o
terceiro mais comumente diagnosticado no mundo em ambos os sexos (PARKIN et al., 2005).
Os principais tratamentos para os cânceres retal e de cólon são a ressecção cirúrgica
curativa e as terapias adjuvantes: a radioterapia, a quimioterapia e a imunoterapia, de acordo
com o estágio de cada caso clínico. Estas terapias têm como objetivo tratar a doença
microscópica residual, provável responsável por futuros implantes macroscópicos
(RANSOM, 2006).
A quimioterapia adjuvante para o câncer de intestino demonstrou melhores resultados
a partir de 1988-1990, sendo a fluoruracila, o primeiro fármaco administrado. Trata-se de uma
uracila fluorada, que possui como efeito antitumoral a inibição da timidilato sintetase, a
enzima catalisadora da transformação do ácido desoxiuridílico a ácido timidílico, impedindo
assim a síntese do DNA (COUTINHO; SAMPAIO, 2003). Posteriormente novos fármacos
foram incorporados no tratamento, o irinotecano, inibidor da topoisomerase I (DOUILLARD
et al., 2000), o oxaliplatina que atua sobre o DNA inibindo sua síntese e a formação de novas
moléculas; o raltitrexato, análogo do folato da quinazolina, inibidor específico da timidilato
sintetase (CUNNINGHAM, 1998); e a capecitabina, agente citostático que é convertido, in
vivo, à fração 5-fluoruracila (SCHMOLL; ARNOLD, 2006).
84
Outros fármacos vêm sendo estudados no tratamento adjuvante, como os anticorpos
monoclonais (edrecolomabe, bevacizumabe, cetuximabe); os inibidores orais de tirosina
cinase (gefitinibe) e os inibidores de ciclo-oxigenase (celecoxibe) (COUTINHO; SAMPAIO,
2003).
O câncer de laringe é um dos mais freqüentes a atingir a região da cabeça e pescoço,
representando cerca de 25% dos tumores malignos que acometem esta área; é responsável por
uma incidência de aproximadamente 159.000 novos casos e de 90.000 mortes por ano no
mundo, representando 2,4% de todos os casos desta doença e 2,1% dos óbitos por câncer
(PARKIN et al., 2005).
O tratamento quimioterápico mais utilizado abrange a associação dos fármacos:
cisplatina, agente antineoplásico alquilante, que estabelece ligação cruzada com a fita de
DNA, e fluoruracila, inibidora da enzima timidilato sintetase (TAGUCHI et al., 2006). Outros
antineoplásicos também são administrados como o paclitaxel (KUHNT et al., 2003), e o
docetaxel, que promovem a estabilização dos microtúbulos, resultado da sua agregação aos
dímeros de tubulina, inibindo a despolimerização (MAEDA et al., 2004).
Os anticorpos monoclonais também representam uma nova estratégia terapêutica para
o câncer de laringe, como o cetuximabe, que bloqueia o receptor do fator de crescimento
epidérmico (EGFR) (MACHIELS et al., 2007).
Com o aumento da incidência de câncer no mundo, a busca de novos agentes eficazes
tem aumentado. As pesquisas iniciam-se com ensaios de triagem in vitro, permitindo avaliar a
atividade citotóxica dos compostos. Portanto, a citotoxicidade é o termo utilizado para
expressar a toxicidade de um composto para células em cultura, o que não prediz nenhum
efeito seletivo entre células tumorais e normais (SUFFNESS; PEZZUTO, 1991). A toxicidade
foi definida por Nardone (1977) como sendo o conjunto de alterações da homeostase celular,
que leva a uma série de modificações, que interferem na capacidade adaptativa das células,
85
bem como na sua sobrevivência, reprodução e realização de suas funções metabólicas. A
intensidade da lesão celular depende de vários fatores, tais como a concentração do material
testado, o tempo de exposição, o tipo de célula, a capacidade do composto em penetrar na
célula, entre outros (HU; HSIUNG, 1989).
Os ensaios de triagem podem ser divididos em dois grupos: ensaios celulares e ensaios
moleculares. Os testes com células utilizam culturas celulares intactas, enquanto os testes
moleculares consideram como parâmetros atividades isoladas como ação de enzimas ou
receptores das células (SUFFNESS; PEZZUTO, 1991).
A utilização dos testes de citotoxicidade in vitro representa uma ferramenta útil e
promissora nas primeiras etapas de seleção de compostos antitumorais (LEÓN et al., 2006), e
tais testes são necessários para definir a citotoxicidade basal, ou seja, a habilidade intrínseca
de um composto em causar alterações e morte celular, como conseqüência de dano das
funções celulares básicas (EISENBRAND et al., 2002).
Pode-se avaliar a citotoxicidade através de alterações da permeabilidade celular, das
funções mitocondriais, da morfologia e da proliferação celulares (EISENBRAND et al.,
2002).
O ensaio do MTT é apropriado para uma variedade de linhagens celulares, que exibem
crescimento exponencial em cultura e alto nível de atividade mitocondrial. Deve-se levar em
consideração que alguns compostos afetam seletivamente as mitocôndrias, resultando em uma
superestimação da toxicidade (SMEE et al., 2002).
Os testes de citotoxicidade foram realizados com células em crescimento e não em
monocamadas com células em fase estacionária, devido a três razões: os efeitos tóxicos no
ciclo celular podem desaparecer; o metabolismo de células estacionárias é geralmente menor;
e a alta densidade celular da monocamada pode influenciar a disponibilidade dos alvos (COS
et al., 2001).
86
A avaliação da citotoxicidade dos compostos cumarínicos frente às linhagens de
células tumorais (HEp-2, Caco-2, HCT-8) foi realizada através da avaliação da viabilidade
celular pelo ensaio colorimétrico com MTT, conforme metodologia descrita no item 5.3.5. Os
resultados obtidos através da análise de regressão serão apresentados e discutidos mais
adiante.
Foram utilizados como controles positivos os seguintes antineoplásicos: cloridrato de
doxorrubicina, cloridrato de daunorrubicina e paclitaxel. Na Tabela 11 pode-se observar a
coerência entre os resultados obtidos com esses fármacos em comparação com os dados da
literatura.
Tabela 11 - Atividade citotóxica dos fármacos utilizados como controles positivos em relação
aos dados da literatura
Células Fármacos CC
50
(mM) Referências
Teste Literatura
HEp-2
Doxorrubicina 0,00051 0,00026 León et al., 2006.
Paclitaxel 0,00009 0,00012 León et al., 2006.
Caco-2
Daunorrubicina 0,072 0,061 Maher; McClean, 2006.
HCT-8
Doxorrubicina 0,00069 0,00068 Costa-Lutofo et al., 2005.
Paclitaxel 0,00008 0,00016 Santos et al., 2003.
87
5.2.1 Avaliação da atividade citotóxica das cumarinas simples monossubstituídas
A Tabela 12 mostra os valores de CC
50
das cumarinas simples monossubstituídas,
avaliadas no presente trabalho.
Tabela 12 - Atividade citotóxica das cumarinas simples monossubstituídas
AMOSTRAS
CC
50
(mM) ± EPM*
(IC 95%)**
Cumarinas
monossubstituídas
HEp-2 Caco-2 HCT-8
(1) Cumarina
3,80 ± 0,93
(2,51-5,09)
7,40 ± 2,9
(3,32-11,49)
8,32 ± 1,43
(6,35-10,29)
(2) 6-Metilcumarina
1,76 ± 0,16
(1,53-1,98)
1,88 ± 0,36
(1,37-2,39)
1,61 ± 0,71
(0,63-2,61)
(3) 6-Hidroxicumarina
3,49 ± 0,56
(2,71-4,26)
2,92 ± 0,58
(2,11-3,73)
0,58 ± 0,04
(0,51-0,64)
(4) 6-O-Acetilcumarina
3,61 ± 0,84
(2,45-4,77)
27,64 ± 6,45
(18,70-36,58)
3,35 ± 0,19
(3,08-3,62)
(5) 6-Metoxicumarina
3,47 ± 2,20
(0,42-6,52)
5,88 ± 1,65
(3,59-8,17)
3,82 ± 0,50
(3,13-4,53)
(6) 6-Clorocumarina
3,67 ± 0,07
(3,56-3,77)
3,76 ± 0,04
(3,71-3,82)
4,09 ± 0,28
(3,69-4,49)
(7) 6-Iodocumarina
2,87 ± 1,19
(1,22-4,52)
3,72 ± 0,64
(2,83-4,60)
1,75 ± 0,15
(1,55-1,97)
(8) 6-Aminocumarina
19,67 ± 2,98
(15,53-23,80)
7,36 ± 1,02
(5,94-8,78)
3,66 ± 0,62
(2,80-4,53)
(9) 6-Carboxicumarina
2,48 ± 0,61
(1,63-3,33)
3,24 ± 0,03
(3,19-3,29)
6,76 ± 2,62
(3,14-10,40)
(10) 6-Cianocumarina
9,77 ± 0,23
(9,45-10,08)
11,03 ± 3,01
(6,86-15,21)
4,59 ± 0,51
(3,89-5,31)
(11) 6-Aldeidocumarina
5,61 ± 0,59
(4,80-6,43)
7,06 ± 0,58
(6,25-7,86)
3,07 ± 0,37
(2,55-3,59)
(12) 6-Nitrocumarina
2,30 ± 0,17
(2,07-2,54)
4,29 ± 0,04
(4,22-4,35)
4,18 ± 0,12
(4,01-4,36)
(13) 7-Metilcumarina
2,67 ± 0,42
(2,09-3,25)
10,62 ± 6,99
(0,93-20,31)
12,96 ± 0,50
(12,25-13,66)
(14) 7-O-Acetilcumarina
2,65 ± 0,47
(1,99-3,31)
8,69 ± 0,83
(7,53-9,84)
7,56 ± 2,03
(4,74-10,39)
(15) 7-Clorocumarina
2,91± 0,58
(2,11-3,72)
9,05 ± 5,96
(0,78-17,33)
5,36 ± 0,76
(4,31-6,43)
* Concentração citotóxica a 50%: os resultados estão expressos em mM e representam a média de dois
experimentos independentes ± erro padrão da média.
** Intervalo de confiança de 95%.
88
No presente estudo a cumarina per se (composto 1) evidenciou reduzida capacidade de
inibir o crescimento das células tumorais testadas (HEp-2, Caco-2 e HCT-8).
Weber, Steffen e Siegers (1998) também pesquisaram a citotoxicidade da cumarina
per se em linhagem de células Caco-2 e obtiveram o valor de CC
50
de 3,57 mM, resultado
inferior ao encontrado neste trabalho (7,40 mM); porém ambos sem atividade citotóxica
expressiva.
Diversas pesquisas demonstraram que a cumarina per se apresenta atividade
diferenciada para cada linhagem de célula tumoral. Finn, Creaven e Egan (2001) obtiveram
valores de CC
50
superiores a 0,5 mM e Jiménez-Orozco et al. (1999) observaram resultados de
1,91 mM, ambos estudando células de melanomas. Nos estudos de López-Gonzáles et al.
(1998), a cumarina per se apresentou CC
50
de 0,54 mM como resultado da ação
antiproliferativa em linhagens de células de adenocarcinoma pulmonar humano (SK-LU-1,
1.3.15, 3A5A). Os resultados de CC
50
encontrados por Weber, Steffen e Siegers (1998) da
cumarina per se para as células linfoblásticas (CCRF CEM), células de hepatoma (Hep G2) e
carcinoma de células gástricas (St 23132) foram de 1,59 mM, 2,14 mM e 2,47 mM
respectivamente.
As pesquisas de Kolodziej et al. (1997) com a cumarina per se demonstraram os
resultados mais significativos de CC
50
sendo para células de carcinoma de pulmão (GLC-4)
de 0,19 mM e de adenocarcinoma coloretal (COLO-320) de 0,13 mM.
A inclusão de um grupo metil (CH
3
) na posição C
6
do núcleo cumarínico originando a
6-metilcumarina (composto 2) resultou em maior inibição do crescimento celular em todas as
células, se comparado com a cumarina per se; porém, quando este grupo encontra-se na
posição C
7
(composto 14) o espectro de ação é reduzido, demonstrando inexpressiva atividade
citotóxica.
89
O composto 3, com grupo hidroxila (OH) localizado na posição C
6
(6-
hidroxicumarina), exibiu melhor atividade antiproliferativa que a cumarina per se para as
linhagens celulares HEp-2 e Caco-2, porém foi menos ativa que o composto 2 (6-
metilcumarina). Entretanto, observou-se que nas células HCT-8, tal composto 3 apresentou a
melhor atividade citotóxica do grupo de cumarinas monossubstituídas com um valor de CC
50
de 0,58 mM. Esta mesma cumarina 6-hidroxilada, em pesquisas realizadas por Jiménez-
Orozco et al. (1999) apresentou para células de melanona (B16-F10), um valor de CC
50
de
0,21mM.
Apesar de não terem sido testadas neste trabalho outras cumarinas hidroxiladas para
que se pudesse fazer a comparação entre as posições do substituinte hidroxila, relatos prévios
em diversas linhagens celulares mostraram que a presença do grupo OH nas posições C
3
,
C
4
,
C
7
e C
8
resulta em diferentes valores de citotoxicidade.
Nos estudos de Kolodziej et al. (1997), a 7-hidroxicumarina apresentou valores de
CC
50
superiores a 0,2 mM em células de carcinoma de pulmão (GLC4) e de adenocarcinoma
colo retal (COLO-320).
Weber, Steffen e Siegers (1998) demonstraram que esta cumarina 7-hidroxilada
quando testada em células de hepatoma (Hep G2), carcinoma de células gástricas (St 23132) e
carcinoma colo retal (Caco-2) apresentou os valores de CC
50
de 1,01 mM, 1,44 mM e 2,69
mM, respectivamente. Entretanto para células linfoblásticas (CCRF CEM) o valor de CC
50
foi
mais expressivo: 0,68 mM. Pode-se observar que o valor de CC
50
encontrado neste trabalho
para a 6-hidroxicumarina (composto 3: 2,92 mM) frente a linhagem celular Caco-2 é
semelhante ao apresentado por estes autores para o composto 7-hidroxicumarina (2,69 mM),
testando a mesma linhagem celular.
Finn et al. (2002) detectaram valores de CC
50
superiores a 0,5 mM, para a 7-
hidroxicumarina, em células de adenocarcinoma de rim (A-498). Esta mesma cumarina nos
90
testes de Elinos-Báez, León e Santos (2005) inibiu 54% do crescimento das células de
carcinoma de pulmão (A-427) utilizando a concentração de 1,0 mM.
Alguns autores, tais como López-Gonzáles et al. (1998) obtiveram resultados
expressivos com esta cumarina 7-hidroxilada, e os efeitos citostáticos foram obtidos na
concentração de 0,12 mM em células de adenocarcinoma de pulmão (SK-LU-1, 1.3.15,
3A5A). Outros trabalhos indicaram que a adição de um ou mais grupos nitro (NO
2
) a 7-
hidroxicumarina, em diferentes posições, pode gerar aumento significante na inibição do
crescimento de células tumorais (EGAN et al., 1997; FINN; CREAVEN; EGAN, 2001; FINN
et al., 2002; FINN; CREAVEN; EGAN, 2004 a).
Jiménez-Orozco et al. (1999) também testaram a atividade citotóxica de cumarinas
hidroxiladas em células de melanomas e obtiveram os seguintes valores de CC
50
: 3-
hidroxicumarina (1,1 mM), 4-hidroxicumarina (0,67 mM), 7-hidroxicumarina (0,86 mM) e 8-
hidroxicumarina (0,59 mM).
Os demais derivados cumarínicos monossubstituídos nas posições C
6
e C
7
não
apresentaram atividade significativa, demonstrando que as características dos grupos
substituintes nestas cumarinas testadas, tais como polaridade, hidrofobicidade e tamanho do
grupo substituinte não influenciaram no crescimento das células tumorais estudadas.
5.2.2 Avaliação da atividade citotóxica das cumarinas di e trissubstituídas
As cumarinas dissubstituídas testadas não apresentaram atividade citotóxica
expressiva, como pode ser observado na Tabela 13.
91
Tabela 13 - Atividade citotóxica das cumarinas di e trissubstituídas
AMOSTRAS
CC
50
(mM) ± EPM*
(IC 95%)**
Cumarinas
dissubstituídas
HEp-2 Caco-2 HCT-8
(16) Esculetina
3,65 ± 0,10
(3,51-3,78)
3,03 ± 0,02
(2,99-3,06)
3,02 ± 0,26
(2,66-3,38)
(17) Di-Metoxi-esculetina
2,52 ± 0,31
(2,09-2,95)
15,32 ± 3,02
(11,13-19,51)
4,07 ± 0,23
(3,75-4,40)
(18) Di-Metoxi-dafnetina
7,18 ± 4,43
(1,04-13,32)
7,88 ±1,70
(5,51-10,24)
2,75 ± 0,23
(2,43-3,09)
Cumarina trissubstituída HEp-2 Caco-2 HCT-8
(19) Fraxetina
3,18 ± 0,00
(3,18-3,18)
3,32 ± 0,52
(2,59-4,04)
2,47 ± 0,44
(1,86-3,09)
* Concentração citotóxica a 50%: os resultados estão expressos em mM e representam a média de
dois experimentos independentes ± erro padrão da média.
** Intervalo de confiança de 95%.
A 6,7-dihidroxicumarina (esculetina) (composto 16) demonstrou ser mais ativa que as
demais deste grupo, corroborrando com os resultados de Kolodziej et al. (1997), obtidos com
células de carcinoma de pulmão (GLC4) e de adenocarcinoma colo retal (COLO-320), onde
as cumarinas com substituintes orto-hidroxilas apresentaram valores de CC
50
significantes
(todos inferiores a 43,5 µM).
Estas observações também foram confirmadas pelos estudos de Finn et al. (2002), que
obtiveram resultados bastante expressivos (CC
50
= 4,3 µM), para o composto 7,8-di-
hidroxicumarina (dafnetina) em células de adenocarcinoma renal; demonstrando que, para as
cumarinas dissubstituídas a localização e a polaridade dos grupos substituíntes interferem no
potencial citotóxico (KOLODZIEJ et al., 1997; FINN; CREAVEN; EGAN, 2001).
A cumarina fraxetina (6 metoxi-7,8-di-hidroxicumarina) (composto 19) representando
o grupo dos análogos trissubstituídos, não apresentou atividade citotóxica significativa para as
células estudadas.
92
5.2.3 Avaliação da atividade citotóxica das cumarinas preniladas
Cumarinas preniladas são cumarinas com substituíntes prenil no anel cumarínico
básico. A Tabela 14 demonstra a avaliação da atividade citotóxica frente as três linhagens
celulares estudadas.
Tabela 14 - Atividade citotóxica das cumarinas preniladas
AMOSTRAS
CC
50
(mM) ± EPM*
(IC 95%)**
Cumarinas preniladas HEp-2 Caco-2 HCT-8
(20) Aurapteno
2,14 ± 0,05
(2,07-2,22)
3,43 ± 0,189
(3,17-3,70)
2,02 ± 0,259
(1,67-2,39)
(21) Febalosina
2,89 ± ,78
(1,81-3,96)
12,51 ± 1,87
(9,91-15,11)
1,93 ± 0,29
(1,52-2,35)
(22) Balsamiferona
2,18 ± 0,21
(1,90-2,47)
3,66 ± 0,42
(3,07-4,25)
2,45 ± 0,49
(1,78-3,14)
(23) Ostenol
2,17 ± 0,22
(1,86-2,48)
7,58 ± 2,93
(3,51-11,65)
2,07 ± 0,18
(1,82-2,32)
(24) 7-O-Geranil-esculetina
1,60 ± 0,29
(1,20-2,01)
2,88 ± 0,03
(2,84-2,93)
1,78 ± 0,28
(1,39-2,18)
* Concentração citotóxica a 50%: os resultados estão expressos em mM e representam a média de 2
experimentos independentes ± erro padrão da média.
** Intervalo de confiança de 95%.
No presente trabalho, as cumarinas preniladas não foram tóxicas para as células
tumorais testadas. Yang et al. (2003) concluíram que a presença do grupo prenil foi de
fundamental importância para a atividade citotóxica do composto cumarínico ostol em
linhagens de células tumorais humanas: leucêmicas (HL-60), de carcinoma cervical (HeLa) e
de carcinoma colo retal (COLO 205). O ostol não foi testado neste trabalho, apenas a
cumarina ostenol (composto 23), que difere do ostol pelo grupo substituinte da posição C
7
:
uma hidroxila no ostenol e um grupo metoxi no ostol; sugerindo que o grupo O-CH
3
poderia
também influenciar, juntamente com o grupo prenil, na atividade citotóxica. Esta observação
corrobora os resultados deste trabalho, pois apesar das cumarinas preniladas não terem
apresentado atividade expressiva, a que apresentou o menor valor de CC
50
foi a 7-O-geranil-
93
esculetina, sendo a única cumarina prenilada deste grupo que possui como substituintes o
grupo metoxi e um grupo prenil.
5.2.4 Avaliação da atividade citotóxica das furanocumarinas
Na Tabela 15 estão apresentados os resultados obtidos com as furanocumarinas
(lineares e angulares), as quais são caracterizadas pela presença do anel furano condensado ao
anel aromático do núcleo cumarínico.
Tabela 15 - Atividade citotóxica das furanocumarinas lineares e angular
AMOSTRAS
CC
50
(mM) ± EPM*
(IC 95%)**
Furanocumarinas lineares HEp-2 Caco-2 HCT-8
(25) Xantotoxina
4,31 ± 0,71
(3,32-5,30)
17,21 ± 1,18
(15,57-18,85)
4,86 ± 2,32
(1,64-8,08)
(26) Isopimpinelina
2,00 ± 0,26
(1,64-2,36)
30,75 ± 7,88
(19,82-41,67)
7,71 ± 2,79
(3,85-11,58)
(27) Imperatorina
2,18 ± 0,22
(1,88-2,49)
2,72 ± 0,80
(1,61-3,83)
2,07 ± 0,07
(1,98-2,18)
(28) Marmesina
3,12 ± 0,06
(3,04-3,20)
3,36 ± 0,68
(2,42-4,31)
2,55 ± 0,25
(2,19-2,91)
(29) Isoangenomalina
2,92 ± 0,24
(2,59-3,26)
2,28 ± 0,001
(2,28-2,28)
8,37 ± 3,50
(3,51-13,23)
Furanocumarina angular
(30) Columbianetina
3,17 ± 0,70
(2,20-4,13)
4,4 ± 0,86
(3,21-5,60)
2,28 ± 0,11
(2,12-2,44)
* Concentração citotóxica a 50%: os resultados estão expressos em mM e representam a média de dois
experimentos independentes ± erro padrão da média.
** Intervalo de confiança de 95%.
Observa-se que nenhuma das furanocumarinas apresentou citotoxicidade frente às
células testadas, não encontrando-se diferença significativa entre as furanocumarinas com
grupos substituintes no núcleo cumarínico (compostos 25 e 26) e as furanocumarinas com
substituintes no anel furano (compostos 28 e 29) sugerindo que o anel furano não é um fator
estrutural importante para a atividade citotóxica. Resultados inexpressivos também foram
94
observados por Mar, Je e Seo (2001) com as furanocumarinas psoraleno e psoralidina, as
quais foram inativas em linhagens celulares de câncer de pulmão (A541) e hepatoma de
fígado (HEpG2), mas a psoralidina foi citotóxica para as células tumorais de cólon (HT-29) e
de mama (MCF-7), salientando a possibilidade da atividade citotóxica ser específica para cada
célula.
5.2.5 Avaliação da atividade citotóxica das piranocumarinas
As três piranocumarinas estudadas estão apresentadas na Tabela 16; e neste grupo
encontra-se a cumarina 3α,α-dimetil xantiletina (composto 33), cuja atividade citotóxica
representou o resultado mais expressivo entre todos os compostos cumarínicos testados.
Tabela 16 - Atividade citotóxica das piranocumarinas
AMOSTRAS
CC
50
(mM) ± EPM*
(IC 95%)**
Piranocumarinas HEp-2 Caco-2 HCT-8
(31) Hortilina
2,66 ± 0,56
(1,88-3,43)
1,79 ± 0,17
(1,55-2,04)
2,78 ± 0,03
(2,75-2,83)
(32) Xantiletina
4,17 ± 0,19
(3,91-4,44)
13,01 ± 3,22
(8,53-17,48)
5,04 ± 1,23
(3,33-6,75)
(33) 3 α,α-Dimetil Xantiletina
0,34 ± 0,03
(0,30-0,38)
0,93 ± 0,23
(0,61-1,26)
0,58 ± 0,13
(0,39-0,78)
* Concentração citotóxica a 50%: os resultados estão expressos em mM e representam a média de dois
experimentos independentes ± erro padrão da média.
** Intervalo de confiança de 95%.
A xantiletina (composto 32) apresentou atividade citotóxica inferior às demais
cumarinas deste grupo. Lin, Yang e Chou (2003) também relataram que esta piranocumarina
não foi ativa frente a diversas linhagens de células tumorais humanas como células de
leucemia mielóide crônica (K562), células do linfoma de Burkitt (Raji), linfócitos T (leucemia
aguda - Jurkat), células de carcinoma epidermóide de pulmão (Calu-1) e de carcinoma
cervical (HeLa).
95
No presente trabalho, a presença do grupo dimetilalil na posição C3 da xantiletina
originando a 3α,α-dimetil xantiletina (composto 33) aumentou consideravelmente a atividade
citotóxica, possivelmente sendo resultado de um conjunto de fatores, entre eles a estrutura
planar da cumarina, a presença do anel pirano e a adição do grupo dimetilalil na posição C3 do
núcleo cumarínico.
A importância de substituintes na posição C3 foi previamente verificada por alguns
autores; Bocca et al. (2002), que obtiveram resultados expressivos em células tumorais
humanas de mama (MCF-7), de adenocarcinoma colo retal (Caco-2), de ovário (SK-OV-3) e
células leucêmicas (HL-60), com a cumarina prenilada ferulenol, cujo grupo prenila
substituinte foi adicionado na posição C3. Reddy et al. (2005) descreveram a atividade
antiproliferativa de cumarinas com substituintes carboxi (COOH) na posição C3 em linhagens
de células tumorais de mama (SKBR-3 e BT474) e sugeriram que a atividade citotóxica seria
dependente das substituições no anel cumarínico e de receptores específicos nas células
tumorais.
Ensaios de citotoxicidade realizados por Lee et al. (2006) com uma série de 7-
dietilaminocumarinas em diversas células tumorais humanas (glioblastoma-U87MG,
melanoma-B16BL6, fibroblasto-NIH, adenocarcinoma colo retal-DLD-1, carcinoma de
células escamosas da cérvix-SiHa, carcinoma cervical-HeLa) mostraram que os substituintes
na posição C
3 do núcleo cumarínico foram os responsáveis pela atividade citotóxica, e os
grupos funcionais adicionados nesta posição possuíam caráter hidrofóbico, aumentando
assim, a interação de Van der Waals no sítio ativo, o que corrobora com os resultados
encontrados neste trabalho, visto que o grupo dimetilalil também apresenta perfil hidrofóbico.
A relação dos efeitos citotóxicos com os parâmetros hidrofóbicos na região do
substituinte C3 do anel benzopirona também foi salientada por Budzisz et al. (2003).
96
Emerole et al. (1981) relacionaram a estrutura química com a hepatotoxicidade de
algumas cumarinas naturais e concluíram que: o potencial tóxico da chapelina (I) é análogo ao
apresentado pelo safrol (II), e poderia estar relacionado à presença do grupo α,α-dimetilalil
localizado também na posição C3 do núcleo cumarínico, supondo-se então, que o
comportamento citotóxico da cumarina 3α,α-dimetil xantiletina (III) seja semelhante (Figura
7).
No safrol, o principal componente do óleo de sassafrás, o grupo dimetilalil está
presente na unidade C
3 lateral de sua estrutura química. Estudos do metabolismo desta
substância evidenciaram que o grupo dimetilalil é toxicofórico, especialmente devido à fácil
oxidação hepática por ação de enzimas microssomais dependentes do citocromo-P450,
seguido de sulfoconjugação do álcool alílico intermediário, levando à formação de espécies
oxidadas reativas frente à nucleófilos bioorgânicos (BARREIRO; FRAGA, 1999).
OH
CH
3
CH
3
CH
2
CH
3
CH
3
O
O
O
CH
2
O
( I ) ( II )
CH
2
CH
3
CH
3
OOO
CH
3
CH
3
( III )
FIGURA 7 - Ilustração dos compostos chapelina (I), safrol (II) e 3α,α-dimetil xantiletina (III).
97
De acordo com os critérios adotados pelo American National Cancer Institute (EUA),
o valor de CC
50
para o extrato bruto de um produto natural ser considerado promissor para
posterior purificação deve ser inferior a 20 µg/ml e para compostos puros o valor sugerido é
de 4 µg/ml (SUFFNESS; PEZZUTO, 1991).
Neste trabalho, testou-se a atividade citotóxica de 33 compostos sintéticos e semi-
sintéticos derivados de uma classe de metabólitos secundários, cumarinas. A média dos
resultados expressa em µg/ml, foi: para a 6-hidroxicumarina (composto 3), que apresentou a
melhor atividade do grupo das cumarinas monossubstituídas, para as células HCT-8, de 93,44
µg/ml; e, para a 3α,α-dimetil xantiletina (composto 33), que apresentou a melhor atividade
entre as piranocumarinas, a média dos valores foi de 100,56 µg/ml; 277,08 µg/ml e 173,07
µg/ml, para as linhagens HEp-2, Caco-2 e HCT-8 respectivamente. Portanto, os resultados
obtidos são superiores aos parâmetros propostos pelo American National Cancer Institute e
também aos valores de CC
50
dos fármacos antineoplásicos utilizados como controles
positivos; porém os testes realizados fazem parte de um estudo preditivo, onde, de acordo
com Suffness e Pezzuto (1991), os ensaios de triagem para citotoxicidade são executados in
vitro.
De acordo com a revisão realizada por Kostova (2005) que salientou a importância das
cumarinas como agentes citótoxicos; o mecanismo de ação destas nas células tumorais não é
ainda completamente esclarecido e a variabilidade estrutural em decorrência das substituições
no anel básico da cumarina pode influenciar em suas atividades biológicas. No entanto, a
correlação dos resultados das atividades citotóxicas, frente a diversas linhagens de células
tumorais, com as estruturas químicas dos compostos cumarínicos são ainda, em parte,
contraditórias e inconclusivas; corroborando com os resultados encontrados neste trabalho.
98
5.3 Avaliação da atividade hemolítica
A atividade hemolítica foi avaliada através da interação entre os compostos
cumarínicos e os eritrócitos humanos do grupo sangüíneo “O” fator Rh positivo, conforme
descrito no ensaio hemolítico, item 5.4.3.
O teste de hemólise in vitro tem sido utilizado como uma das metodologias de triagem
para diversos agentes tóxicos e para avaliação toxicológica de diferentes plantas (GANDHI;
CHERIAN, 2000).
É relevante considerar a importância da atividade hemolítica das cumarinas em
estudo, uma vez que a propriedade anticoagulante de alguns compostos já foi comprovada
(HELGELAND, 1980) e conseqüências desta ação, foram observadas na década de 1920,
quando o gado alimentado com trevo de cheiro amarelo (planta que contém a cumarina
dicumarol) foi acometido por uma doença hemorrágica (GUSTAFSSON et al., 2004).
Entretanto, na literatura pesquisada, foi encontrado um número reduzido de trabalhos
relacionados à atividade hemolítica de cumarinas.
Estudos realizados por Ng, Liu e Wang (2000) avaliaram a inibição da hemólise em
diversos compostos naturais e observaram que a cumarina xantotoxol possui capacidade de
inibir em 79,85% a hemólise de eritrócitos de ratos.
O resultado da atividade hemolítica das cumarinas testadas neste trabalho demonstrou
que apenas a cumarina balsamiferona apresenta atividade hemolítica, com porcentagem de
hemólise de 8,87%, que corresponde a concentração de 1000 µg/ml dessa cumarina.
Resultado bastante significativo, uma vez que, esta atividade hemolítica é reduzida e
importante para a realização de testes biológicos posteriores.
99
6 CONCLUSÕES
- As atividades antifúngica citotóxica e hemolítica das cumarinas monossubstituídas
estudadas não dependeram dos padrões de substituição no núcleo cumarínico, nem mesmo das
características dos grupos substituintes.
- Entre as cumarinas monossubstituídas, a 6-nitrocumarina apresentou o resultado
mais expressivo da atividade antifúngica para o fungo Fusarium solani.
- A espécie Aspergillus fumigatus foi a mais resistente aos compostos cumarínicos
monossubstituídos testados, sugerindo que a atividade antifúngica pode ser espécie-específica.
- As cumarinas di e trissubstituídas, e as furano e piranocumarinas apresentaram
atividades antifúngicas pouco significativas. Candida albicans mostrou-se mais sensível, para
estes compostos, que os fungos filamentosos.
- Dentre todas as cumarinas estudadas, o ostenol foi o composto cumarínico mais ativo
para todas as espécies de fungos estudadas.
- As cumarinas com estrutura planar mostraram-se mais ativas nas atividades
antifúngica e citotóxica, dentre todas as avaliadas.
- Entre as cumarinas simples monossubstituídas, a 6-hidroxicumarina foi a que
evidenciou atividade citotóxica mais significativa, frente à linhagem celular HCT-8.
- As cumarinas di e trissubstituídas, as preniladas e as furanocumarinas não
evidenciaram atividade citotóxica.
- Dentre todos os compostos estudados, a piranocumarina 3α,α di-metil-xantiletina foi
o composto cumarínico mais citotóxico para as células tumorais testadas.
- Os resultados encontrados para a atividade antifúngica e atividade citotóxica não
podem ser considerados significantes quando comparados com os fármacos antifúngicos e
com os antineoplásicos utilizados como controles positivos. Porém os testes realizados são
preditivos e correspondem a ensaios de triagem dos diversos compostos cumarínicos
estudados.
- A cumarina balsamiferona foi o único composto que apresentou uma leve atividade
hemolítica.
101
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