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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ANÁLISE COMPARATIVA DAS SEQUÊNCIAS DE GENES DA
ILHA SIMBIÓTICA ENTRE Bradyrhizobium elkanii E
Bradyrhizobium japonicum
Luciano Takeshi Kishi
Orietandora: Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Dezembro de 2007
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de
Jaboticabal, como parte das exigências para
obtenção do título de Doutor em Microbiologia
Agropecuária.
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ii
Kishi, Luciano Takeshi
K61a Análise comparativa das sequências de genes da ilha simbiótica
entre Bradyrhizobium elkanii e Bradyrhizobium japonicum /
Luciano Takeshi Kishi. – – Jaboticabal, 2007
viii, 75 f. ; 28 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, 2007
Orientadora: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos
Banca examinadora: Maria José Valarini, Haroldo Alves Pereira
Junior, Lucia Maria Carareto Alves, Maria Inês Tiraboschi Ferro
Bibliografia
1. Rizóbio. 2. Genoma 3. Fixação de nitrogênio. 4. Ilha simbiótica
I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 631.461.5
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço
Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
Email: luciano.kishi@gmail.com
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iii
Dados Curriculares do Autor
LUCIANO TAKESHI KISHI – nascido aos 9 dias do mês de março de 1976, em
São José do Rio Preto, SP, é licenciado e bacharel em Ciências Biológicas pelas
Faculdades Integradas Riopretense - FIRP, São José do Rio Preto, SP, em janeiro de
1998, Especialista em Bioinformática pelo Laboratório Nacional de Computacional
Científica – LNCC, Petrópolis, RJ, em 2002 e mestre em Microbiologia pela
Universidade Estadual Paulista, Faculdades de Ciências Agrárias e Veterinárias –
FCAVJ, Jaboticabal em abril de 2002.
iv
NOVO TEMPO
Um novo mundo,
Um novo sonho vamos encontrar.
Uma nova era,
Numa nova esperança a realizar.
Um novo tempo em um novo momento,
Vamos nos transformar.
Novas lembranças com saudade
Vamos deixar e levar.
Novos luares vão nos guiar
Em novas montanhas a passar.
Novos desejos com novos anseios
Vamos lutar.
Venceremos essa passagem
E com a felicidade
Iremos encontrar.
Novas lágrimas cairão
No novo tempo com o novo sonho,
Em um novo momento...
Patrícia Yoshie Kishi
v
Aos meus pais Toiti Kishi e
Aquica Cano Kishi,
meus irmão Celso e Patrícia,
minha avó Taki.
Dedico
vi
Agradecimentos
Aos meus pais Toiti e Aquica pela compreensão, confiança e dedicação aos
meus estudos.
Aos meus irmãos Marcelo (in memoriam), Celso e Patrícia.
Aos meus avós que sempre me incentivaram.
À toda minha família que me apioaram.
À Rosangela meus profundos agradecimentos pela paciência e convivência
pessoal.
À minha orientadora Profa. Dra. Eliana G. M. Lemos pela competência ética e
profissional na minha orientação nos trabalhos científicos e profissionais, e por acreditar
no meu desenvolvimento profissional.
À Profa. Dra. Lúcia M. C. Alves que sempre me ajudou apoiando moralmente,
mesmo em situações impossíveis.
Ao Dr. João Carlos que além de químico, técnico, amigo e profundo conhecedor
de conceitos microbiológicos, meus agradecimentos pelos conhecimentos prestados.
Ao Prof. Dr. Manoel Victor Lemos pelo companheirismo e amizade.
Aos meus amigos da graduação Érico e Irlan pela nossa grande amizade.
À Dra. Maria J. Valarini, Dr. Haroldo A. Pereira, Dra. Lúcia M. C. Alves e Dra.
Maria I. T. Ferro pelas sugestões e correções da tese.
Aos meus amigos e amigas do LBMP, pela amizade, carinho, dúvidas resolvidas
e prestadas durante o período que estive em Jaboticabal.
Aos amigos e colegas de trabalho do Departamento de Tecnologia e Biologia
Aplicada.
Aos professores da FCAVJ, pelos ensinamentos.
Aos funcionários da Universidade, pelos serviços prestados.
Ao pessoal da seção de Pós-Graduação pelos esclarecimentos fornecidos.
Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
desta tese.
Muito Obrigado!
i
Sumário
Lista de Figuras iv
Lista deTabelas vi
Resumo vii
Summary viii
I. Introdução 1
II. Revisão de Literatura 3
III. Material e Métodos 6
III.1. Cultivo de bactérias B. elkanii SEMIA 587
6
III.2. Extração de DNA Genômico
6
III.3. Quantificação do DNA genômico 7
III.3.1. Por espectrofotômetro 7
III.3.2. Em gel de agarose 8
III. 4. Construção da biblioteca de fosmídeo BE587 8
III.4.1. Reparo das extremidades dos fragmentos para clonagem em vetor
fosmídeo
8
III. 4.2. Seleção do tamanho dos insertos 9
III. 4.3. Eluição dos fragmentos reparados do gel 9
III. 4.4. Clonagem dos insertos em vetor fosmídeo 10
III. 4.5. Reação de Ligação 10
III. 4. 6. Reação de empacotamento 11
III. 4. 7. Estocagem das células EPI100-T1
R
11
III. 4. 8. Preparo do inóculo de células EPI100-T1
R
12
III. 4. 9. Transfecção das células EPI100-T1
R
12
III. 4. 10. Coleta e Estoque dos clones de fosmídeos 13
III. 5. Cultivo dos fosmídeos BE587 em “Conjunto” 13
III. 5.1. Extração de DNA do Conjunto de clones de fosmídeo BE587 13
III. 6. Reação de Cadeia da Polimerase com os primers nifA, nifH, nodM e
14
ii
fixN
III. 7. Construção da sub-biblioteca de fosmídeo em vetor pUC19 15
III. 7.1. Cultivo do fosmídeo selecionado
15
III. 7.2. Extração de DNA de fosmídeo
15
III. 7.3. Fragmentação por quebra física
15
III. 7. 4. Precipitação do DNA 15
III. 7. 5. Reparo dos terminais dos fragmentos 16
III. 7. 6. Reação com Kinase 16
III. 7. 7. Obtenção dos fragmentos a partir do gel 17
III. 7. 8. Eluição dos fragmentos reparados e fosforilados do gel 17
III. 7. 9. Clonagem dos fragmentos de DNA nebulizados 18
III. 7.10. Transformação de células 18
III. 7. 11. Seleção dos clones transformados 19
III. 7.12. Cultivo dos clones da sub-biblioteca de fosmídeos 20
III.7.13. Extração de DNA em placa 20
III. 7.14. Quantificação do DNA em placa 21
III. 8. Construção da sub-biblioteca de fosmídeo em vetor pUC18 21
III. 8. 1. Fragmentação por digestão enzimática 21
III. 8. 2. Obtenção dos fragmentos em gel de agarose com baixo ponto de
fusão
21
III. 8. 3. Eluição dos fragmentos do gel por kit 22
III. 8.4. Clonagem dos fragmentos de DNA nebulizados ou digeridos 22
III. 8.5. Transformação de células 22
III. 8.6. Seleção dos clones transformados 23
III. 9. Reação de Cadeia da Polimerase para seqüenciamento 23
III. 10. Preparo das amostras e seqüenciamento 25
III. 11. Análise do sequenciamento 25
IV. Resultados e discussão 26
IV. 1. Biblioteca plasmidial BE587 26
IV. 2. Biblioteca de fosmídeos BE587 26
iii
IV. 3. PCR nos conjuntos de fosmídeos 27
IV. 4. PCR nas placas de fosmídeos 27
IV. 5. Sequenciamento das pontas de fosmídeos 29
IV. 6. Sequenciamento dos fosmídeos 30
IV. 7. Análise dos dados de sequenciamento 31
IV. 8. Comparação filogenética 33
IV. 9. Genes da Ilha simbiótica 35
IV. 10. Genes relacionados à fixação simbiótica do nitrogênio 41
V. Conclusão 44
VI. Referências 59
iv
Lista de Figuras
Figura 1 Esquema ilustrativo apresentando características do vetor
pCC1FOS-TNC
TM
(EPICENTRE)
11
Figura 2 Esquema ilustrativo apresentando características do vetor
pUC19DNA/Sma I (FERMENTAS).
18
Figura 3 Perfil eletroforético dos produtos de amplificação de fosmídeos,
A: DNA de fosmídeos da placa 4 com o “primer” nifA gerando
um produto de 450 pb; B: DNA de fosmídeos da placa 3 com o
“primer” nifH gerando um produto de 223 pb; C: DNA de
fosmídeos da placa 8 com o “primer” nodM gerando um produto
de 945 pb; D: DNA de fosmídeos da placa 10 com o “primer”
fixN gerando um produto de 553 pb. 1kb: padão de tamanho
molecular (Fermentas). Círculos indicam os fosmídeos
escolhidos para sequenciamento.
28
Figura 4 Perfil eletroforético de gel em campo pulsado, em agarose 1%
e TBE 0,5 X. 1: padrão tamanho molecular 1Kb; 2: padrão de
tamanho molecular 37 kb; 3 fosmídeo 03F09 não digerido;
fosmídeo 03F09 digerido com HindIIII (4) e BamHI (5);
fosmídeo 04H04 digerido com HindIIII (6) e BamHI (7);
fosmídeo 08C01 digerido com HindIIII (8) e BamHI (9);
fosmídeo 10C07 digerido com HindIIII (10) e BamHI (11).
29
Figura 5 Gráfico representando as categorias das ORFs de BE587
seguindo as normas do banco Rhizobase.
33
Figura 6 Relacionamento filogenético entre diferentes rizóbios em
diferentes genes. A: 16S rDNA; B: fixA; C: nifA; D: nifH e E:
nodZ. Os números internos representam o valor de bootstrap.
XF: Xylella fastidosa; Mesorhizobium loti (MAFF303099);
Bradyrhizobium japonicum (USDA110); Sinorhizobium meliloti
(1021); Rhizobium etli (CFN42); Rhizobium leguminosarum
(biovar viciae 3841); Rhizobium sp. (pNGR234ab);
Mesorhizobium loti R7A; Bradyrhizobium sp BTAi1;
v
Bradyrhizobium sp ORS278; Azorhizobium caulinodans
ORS571; Rhodopseudomonas palustris CGA0009.
34
Figura 7 Gráfico representando as categorias das ORFs da região da
Ilha Simbiotica de B. japonicum e das ORFs de B. elkanii.
38
vi
Lista de Tabelas
Tabela 1
Seqüência dos “primers” para nifA, nifH, nodM e fixN e
tamanho do produto de amplificação
14
Tabela 2
Condições de amplificação da PCR, utilizando os “primers”
nifA, nifH, nodM e fixN e ciclagem.
14
Tabela 3
Seqüência dos “primers” para seqüenciamento e pontas de
fosmídeo
24
Tabela 4 Condições de amplificação da PCR seqüenciamento de ponta
de fosmídeos e clones da sub-biblioteca
24
Tabela 5
Esquema das reações de PCR com os primers utilizados com
os conjuntos de DNA dos fosmídeos. “+” indica reação positiva
e “-“ indica reação negativa
27
Tabela 6 Relação com dados gerais gerados pelo projeto genoma
parcial de Bradyrhizobium elkanii SEMIA587.
32
Tabela 7 Genes relacionados com nodulação e fixação de nitrogênio
entre B. japonicum e B. elkanii, * indica o número de genes
encontrados.
38
Tabela 8
Relação das ORFs de B. elkanii SEMIA 587 relacionados as
ORFs da Ilha Simbiótica de B. japonicum
44
Tabela 9
Relação das ORFs da Ilha Simbiótica de B.japonicum.
51
vii
Resumo: Bactérias simbiontes conhecidos como rizóbios interagem com raízes de
leguminosas e induzem a formação de nódulos fixadores de nitrogênio. Em rizóbios,
genes essenciais para simbiose são compartimentalizados em ilhas simbióticas ou em
ilhas no cromossoma. Para o entendimento da estrutura e evolução dessas ilhas
simbióticas, é necessário analisar seu contexto genético e sua organização. O genoma
parcial de B. elkanii SEMIA 587 apresenta hoje um total de 5.821.111 pb seqüenciados
contendo 62,6 % de GC em 3941 Contigs, onde foram identificados 5381 ORFs. Uma
suposta ilha simbiótica foi localizada através da identificação de genes relacionados à
fixação e nodulação em comparação à ilha simbiótica de B. japonicum, encontrando
267 ORFs em B. elkanii, onde 17 ORFs foram identificadas como transposases. Assim,
através destes resultados parciais pode ser possível averiguar que B. elkanii
provavelmente sofreu um rearranjo genético no cromossoma, já que ele apresenta um
tamanho menor que B. japonicum em relação ao tamanho do genoma.
Palavras chave: Rizóbio, genoma, fixação de nitrogênio, ilha simbiótica.
viii
SUMMARY - Symbiont bacteria, commonly known as rhizobia interact with root legume
and induce the formation of Nitrogen-fixing nodules. Among rhizobia, essential genes for
symbioses are compartmentalized either in symbiotic islands or in chromosomal islands.
For better understanding of the structure and evolution of these symbiotic islands, it is
necessary to analyze their genetic context and organization. The work had as objective
to analyze genes related to the symbiotic island in the partial genoma of the B. elkanii
strain 587 has 5.821.111 bp sequenced, containing 62,6 % of GC in 3941 Contigs, been
identified 5381 ORFs. A purported symbiotic island was localized through of the
identification of related genes of fixing nitrogen and nodulation in comparison with the
symbiotic island of B. japonicum, founding 267 ORFs in B. elkanii, where 17 ORFs were
identified as transposases. So through these partial results could be possible to infer
that B. elkanii probably shows a symbiotic island with genetic rearrange into
chromosome, because it showed lower genome size than B. japonicum.
Key words: rhizobia, genome, nitrogen-fixing, symbiotic islands.
1
I. INTRODUÇÃO
No Brasil os solos de Cerrado, que representam porção considerável da área de
cultivo para soja, não possuem populações nativas de rizóbios capazes de nodular esta
cultura. Por isso, a inoculação com essas bactérias é imprescindível para o bom
desempenho da lavoura (VARGAS et al., 1992; MENDES e HUNGRIA, 2001). Assim,
desde 1979, as estirpes de Bradyrhizobium elkanii, SEMIA 5019 e SEMIA 587, e depois
de 1992, as de Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079 e a SEMIA 5080, foram
incluídas na recomendação oficial de inoculantes comerciais para a cultura da soja.
Bactérias com capacidade de promover simbiose, como rizóbios, têm
oportunidade de sobreviver em dois nichos: na rizosfera e na planta hospedeira.
Crescimento na rizosfera oferece freqüentes oportunidades para troca de informações
genéticas com outras bactérias do solo, porém isso requer um alto grau de
competitividade. Há crescentes evidências que a diversidade genômica é alta entre
rizóbios como resultado da aquisição de DNA exógeno como também de freqüentes
eventos de recombinação no genoma. Isto reflete adaptações na vida no solo e na
rizosfera, que requer um alto nível de versatilidade metabólica. Estas bactérias, em
contato com uma gama de outros microorganismos, acessam um conjunto de genes por
via horizontal, resultando no desenvolvimento do complexo celular associado com
simbiose (DOBRINDT et al., 2004). Os processos de nodulação, diferenciação em
bacteróide e fixação do nitrogênio envolvem então a expressão de genes do hospedeiro
e do simbionte (KEEN, 1988; OKE e LONG, 1999).
Avanços na manipulação do DNA e seqüenciamento têm mudado drasticamente
as estratégias para estudo da genética, fisiologia e bioquímica de vários organismos de
vida livre, principalmente bactérias. Seqüenciamento de genomas no intuito de
investigar funções de genes tem seu grau efetivo, porém a estrutura completa de um
genoma tem seu alto grau de complicação.
2
Seqüenciamento completo de genomas é importante não só pela grande
quantidade de informações que possibilita, necessárias para predizer uma análise
funcional dos genes, mas também para realizar novos estudos do funcionamento de
novos genes, evolução genética e genômica através da comparação dos genes bem
como sua organização entre as espécies.
A fixação simbiótica do nitrogênio atmosférico é um processo vital no ciclo de
nitrogênio global e para as práticas na agricultura. O estabelecimento da simbiose
planta-rizóbio requer a criação e desenvolvimento de técnicas funcionais. O foco
principal dos estudos, tem sido o entendimento dos mecanismos que inclui simbiose,
fisiologia, ecologia e genética de rizóbios
Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar a presença de uma ilha simbiótica (IS)
em Bradyrhizobium elkanii em uma análise comparativa com o genoma de
Bradyrhizobium japonicum, previamente seqüenciado. Para isto os seguintes objetivos
específicos foram buscados:
1. Construção de uma biblioteca genômica de fosmídeos de B. elkanii;
2. Seleção de fosmídeos que contivessem os genes relacionados à fixação e
nodulação, por PCR;
3. Sequenciamento de pontas de fosmídeos para seleção daqueles que se
encontrassem na região da Ilha Simbiótica de B. japonicum através de
análises por bioinformática;
4. Construção e sequenciarmento de sub-bibliotecas selecionadas;
5. Identificação e anotação das possíveis ORFs (Open Read Frame);
6. Organização dos dados de seqüenciamento em bancos de dados e criação
de interfaces para a realização das análises por bioinformática.
3
II. REVISÃO DE LITERATURA
B. japonicum USDA110 foi seqüenciado por KANEKO e colaboradores (2002a,
2002b),os quais descrevem uma bactéria com cromossomo circular único de 9,1Mb
contendo 64,1% de GC e ausência de plasmídeos. O cromossomo compreende 8.317
genes potencialmente funcionais, um conjunto de genes rRNA e 50 genes tRNA, sendo
que 54% dos genes funcionais mostraram homologia a genes de função conhecida,
30% foram hipotéticos e o restante (18%) não apresentaram similaridade com genes
reportados.
Em B. japonicum, 34% dos genes mostraram similaridade aos reportados em
Mesorhizobium loti e em Sinorhizobium meliloti já seqüenciados, enquanto que 23%
dos genes do B. japonicum foram únicos para essa espécie (GÖTTFERT et al., 2001).
Uma ilha simbiótica (IS) de 681kb, também foi identificada em B. japonicum, revelando
655 genes putativos codificadores de proteínas, e as funções de 301 genes, incluindo
aqueles relacionados à fixação simbiótica do nitrogênio. Na bactéria B. japonicum
também foram identificados 167 genes que codificavam transposases, onde 100 desses
genes localizam-se na possível ilha simbiótica. Segmentos específicos de DNA de 4 a
97kb inseridos em genes de tRNA foram encontrados em 14 locais do genoma,
gerando duplicações parciais desses genes. Estas observações sugerem a plasticidade
do genoma de B. japonicum, devida ao complexo rearranjo genômico bem como à
transferência horizontal, inserção de elementos de DNA e recombinação homóloga.
O mapa genético físico parcial do genoma de B. japonicum estabelecido mostra
que os genes nod e nif estão agrupados em uma região cromossômica de 400 kb
(KÜNDING et al., 1993). Posteriormente, esta porção cromossômica teve sua
seqüência de nucleotídeos revelada confirmando que nela estavam contidos todos os
genes para nodulação e fixação de nitrogênio. Nesta região, 388 ORFs foram
selecionadas como regiões codificadoras de proteínas, das quais 35% mostraram
similaridade com proteínas comuns de rizóbios. Genes que codificam sistemas de
transporte de citrato férrico, molibdato e fontes de carbono, além de proteínas externas
4
de membrana, sistemas de secreção do tipo IIII e enzimas modificadoras da parede
celular também foram encontrados (GÖTTFERT et al., 2001).
Em S. meliloti, mapas físicos do cromossomo (3,7Mb) e de dois plasmídeos
simbióticos (1,7Mb e 1,4Mb) já foram elaborados por Capela e colaboradores (2001).
Segundo KUNDING colaboradores (1993), em Bradyrhizobium e em Mesorhizobium a
maioria dos genes está presente no cromossomo. Por outro lado, Kaneko e
colaboradores (2000) relatam a presença de um único cromossomo (7Mb) e dois
plasmídeos designados como pMLa (350kb) e pMLb (208kb) no genoma de M. loti
(estirpe MAFF303099). O cromossomo contém 6752 prováveis genes funcionais, dois
conjuntos de genes de rRNA e 50 genes de tRNA, representando 47 espécies de tRNA.
Dos genes funcionais, encontrados em M. loti, 54% mostraram similaridade com genes
de função conhecida, 21% a genes hipotéticos e o restante (25%) não apresentou
similaridade aparente a nenhum gene relatado. Um segmento de DNA de 611kb,
provavelmente uma ilha simbiótica, foi identificado, sendo que 30 genes para fixação de
nitrogênio e 24 para nodulação foram encontrados nesta região.
A finalização do seqüenciamento de S. meliloti destacou a presença de três
replicons no genoma dessa bactéria, a saber: um cromossomo de 3,7Mb (com 3 cópias
de rDNA) e dois megaplasmídeos conhecidos como pSymA (1,4Mb) e pSymB (1,7Mb).
O plasmídeo pSymA contém a maioria dos genes relacionados a nodulação e fixação
do nitrogênio, conferindo a capacidade para a bactéria colonizar ambientes de baixa
tensão de oxigênio e metabolizar uma variedade de formas químicas de nitrogênio,
principalemte a forma molecular N
2
(GALIBERT et al. 2001).
Do mesmo modo em bactérias do gênero Rhizobium, o plasmídeo Sym contém a
maioria dos genes responsáveis pela fixação do nitrogênio. Este plasmídeo contém um
“operon” de três genes, nod ABC, cuja expressão é regulada pelo gene nodD induzido
por flavonóides (DAZZO, 1984; REDMOND et al., 1986). O seqüenciamento do
plasmídeo simbiótico de Rhizobium sp. NGR234 identificou a presença de 416 genes
funcionais, incluindo 26 genes para nodulação e 26 genes para fixação do nitrogênio
(FREIBERG et al., 1997).
A comparação entre os genomas de S. meliloti e M. loti, da região cromossomal
de 410 Kb de B. japonicum e do plasmídeo simbiótico de Rhizobium sp. Permitiu
5
algumas conclusões, a saber: 1) 35% dos genes de M. loti não apresentam
equivalentes em S. meliloti; 2) as informações genéticas carregadas nos plasmídeos
pSymA e pSymB de S. meliloti encontram-se dispersas no genoma de M. loti; 3) M. loti
contém ilhas simbióticas, além dos genes de nodulação e fixação de nitrogênio, que
não têm equivalente em S. meliloti; 4) S. meliloti não apresenta um sistema de secreção
do tipo IIII, comum aos outros gêneros; e 5) 54% dos genes do plasmídeo simbiótico de
Rhizobium sp. não apresentam equivalentes em S. melioti. Tomadas juntas, estas
observações indicam que rizóbios diferem significativamente quanto ao conteúdo e
organização gênica, independente de suas relações taxonômicas e hábitos simbióticos
(GALIBERT et al., 2001).
A identificação de genes e a elucidação de mecanismos envolvendo os
processos de infecção e nodulação por rizóbios, a diferenciação em bacteróide e
fixação biológica de nitrogênio têm grande interesse agronômico. Este conhecimento
gera uma perspectiva excitante para o aproveitamento de plantas refratárias à
nodulação, através da engenharia genética e transformação de plantas.
6
III. MATERIAL E MÉTODOS
III.1. Cultivo de bactérias B. elkanii SEMIA 587
O cultivo de B. elkanii SEMIA 587 foi realizado em meio triptona-levedura (TY,
pH 6,8) (BERINGER, 1974) constituído por triptona, extrato de levedura e cloreto de
cálcio, em concentração de 8,0; 5,0 e 2,5g/L, mantidas a 28
o
C, sob agitação constante
(180 rpm) por 96 horas.
III.2. Extração de DNA Genômico
As células de B. elkanii SEMIA 587 cultivadas foram centrifugadas a 12000 xg
por 30 minutos a 4
o
C, sendo a seguir, ressuspendidas em 1 mL de solução salina
(0,85% NaCl). As suspensões foram transferidas para tubos eppendorf e centrifugadas
a 15600 xg por 5 minutos. Esta operação foi repetida mais uma vez para a remoção de
resíduos do meio de cultivo.
Os peletes de células foram ressuspendidos em 1 mL de solução salina-EDTA
(0,01M EDTA, 0,15 M NaCl, pH 8) e incubados a 37
o
C durante 10 minutos, em tubos
Córex para centrífuga. Após esse período, adicionaram-se 500 µl de lisozima (5mg/mL)
preparada em tampão Tris-EDTA-dextrose (10 mM EDTA, 24 mM Tris-HCl 50 mM
Dextrose, pH 8), procedendo-se então uma nova incubação a 37
o
C por 30 minutos.
Posteriormente, adicionaram-se 500 µl de solução de SDS (duodecil sulfato de sódio) a
20%, e novamente realizou-se uma incubação a 56
o
C durante 20 minutos.
Decorrido o tempo de incubação, foram adicionados à suspensão, 500 µl de
solução de perclorato de sódio 5M, gota a gota com agitação suave. Em seguida,
adicionaram-se 2 mL de solução de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1, v:v:v),
deixando-se por 1 hora em agitação orbital a 220 rpm a 8
o
C (banho de gelo). Após esse
período de incubação, centrifugou-se o material a 12000 xg, por 20 minutos, a 4
o
C.
Coletou-se então, com auxílio de uma pipeta, a fase superior transferindo-a para tubos
Corex limpos.
7
Adicionou-se à fase recuperada, 2 mL de solução clorofórmio-álcool isoamílico
(24:1 v:v), procedendo-se à uma agitação orbital por 20 minutos em 220 rpm a 8
o
C. O
material foi centrifugado a 5860 xg por 20 minutos a 4
o
C, e após esse passo, procedeu-
se à coleta da fase superior, a qual foi transferida novamente para tubos limpos. Mais
uma vez adicionou-se 2 mL de clorofórmio-álcool isoamílico, repetindo toda essa
marcha, até a recuperação e transferência da fase superior para tubos limpos, aos
quais foram adicionados 2 volumes de etanol 95% (gelado), agitando-se manualmente
e incubando-se a –20
o
C por 12 horas.
Após esse período, centrifugou-se o material a 5860 xg por 20 minutos a 4
o
C,
descartando-se então o sobrenadante. O precipitado foi lavado rapidamente (para evitar
a perda do DNA) por duas vezes com 1 mL de etanol 70% (gelado).
Os tubos foram então invertidos sobre papel absorvente para eliminar o
excesso de etanol. Adicionou-se 1 mL de tampão TE 10:1 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH
7,5) (gelado) para a ressuspensão do DNA, o qual foi transferido para tubos tipo
eppendorf estocados a –20
o
C. O DNA foi quantificado em espectrofotômetro com uma
absorbância de 260 nm.
III.3. Quantificação do DNA genômico
III.3.1. Por espectrofotômetro
Para a quantificação do DNA genômico fez-se uma diluição de 10X do DNA em
água milli-Q. A leitura da absorbância foi realizada em um espectrofotômetro
Beckmann-Du 640-B, onde se utilizou o comprimento de onda 280 nm para se
determinar possíveis contaminações do mesmo com proteína e/ou fenol. Otimizou-se o
DNA quando a leitura da absorbância da relação 260/280 nm se apresentou na faixa
entre 1,7 e 2,0. Para os cálculos da concentração do DNA, considerou-se o padrão de
que uma unidade de absorbância a 260 nm equivalente a 50µg de DNA por mL de
solução (SAMBROOK, et al,1989).
8
III.3.2. Em gel de agarose
A concentração do DNA foi avaliada através da comparação visual com a
intensidade das bandas de pGEM (Applied Biosystems) contendo concentrações
conhecidas de DNA e com padrão de tamanho molecular 1 Kb (Fermentas), por meio
de eletroforese em gel de agarose 1% em cuba horizontal contendo tampão TBE 1X
(Tris 89mM, Ácido Bórico 89mM e EDTA 2,5mM; pH 8,3) com brometo de etídio (5
µg/ml), conduzidas à voltagem constante de 90 V, por 1 hora. As imagens foram
registradas pelo sistema de documentação de géis GEL DOC1000 BioRad através da
incidência de luz ultravioleta.
III.4. Construção da biblioteca de fosmídeo BE587
III.4.1. Reparo das extremidades dos fragmentos para clonagem em vetor
fosmídeo
A biblioteca de fosmídeo foi construída usando o kit CopyControl Fosmid Library
(Epicentre – pCCFOS110). A reação de reparo das extremidades do DNA BE587 (~ 20
µg) foi realizada para que este pudesse ser ligado ao vetor. Como o vetor está aberto
no sítio de restrição da enzima SmaI, cujo corte gera extremidade abrupta, foi
necessário realizar o reparo das extremidades do inserto.
Uma combinação das enzimas T4 DNA polimerase (bacteriófago T4) e Klenow
DNA polimerase (E. coli) foi utilizada para o preenchimento de terminais nos fragmentos
de DNA, através da incorporação de nucleotídeos complementares livres em terminais
3’ da dupla fita de DNA. Adicionalmente, a atividade exonucleásica 3’ 5’ da T4 DNA
polimerase degrada extremidades protuberantes nos terminais 3’.
Para cada amostra contendo até 15 µg de DNA BE587, em um volume de 52 µL,
foram acrescentados 8 µL de 10X “end repair buffer” (EPICENTRE), 8 µL de uma
mistura de dNTPs, 8 µL de ATP 10 mM e 4 µL de “end repair enzyme” (EPICENTRE). A
reação foi mantida à temperatura ambiente por 45 minutos e em seguida a 75ºC, por 20
minutos, para inativação das enzimas. Os tubos foram estocados a 4ºC até serem
utilizados.
9
III. 4.2. Seleção do tamanho dos insertos
Uma vez que os fragmentos de DNA BE587 foram reparados, os mesmos foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose para separação das bandas e posterior
recuperação dos insertos de tamanho desejado.
A seleção do tamanho do DNA foi feita através de eletroforese preparativa em
gel de agarose de baixo ponto de fusão (Low Melt Preparative Grade – Biorad) 1% (p/v)
em tampão TAE 1X (40 mM Tris-Acetato, 1 mM EDTA), isento de brometo de etídio. A
cuba de eletroforese foi previamente descontaminada com hipoclorito de sódio 4%
(v/v).
Uma alíquota de 20 µL de DNA BE587 foi aplicada no gel e ao lado 100 ng do
marcador de 36 Kb T7 control DNA (EPICENTRE). Foi deixada uma canaleta e na
próxima foi aplicado todo o DNA. A amostra foi aplicada em um poço largo do gel. A
eletroforese foi conduzida em tampão TAE 1X (40 mM Tris-Acetato, 1 mM EDTA) isento
de brometo de etídio, a voltagem constante 30 V por 8 horas.
Após a eletroforese descrita, foi realizado um corte vertical no gel de agarose
resultando duas porções de gel, uma contendo os insertos a serem recuperados e outra
com o marcador e a amostra comparativa para corar. A porção do gel que continha o
marcador foi corada com brometo de etídio e observada sob um transiluminador. O
padrão de bandeamento serviu como guia para obtenção dos insertos na porção não
corada do gel, colocando as duas partes do gel lado a lado. A região do gel contendo
insertos de tamanho desejado foi marcada e cortada com o auxílio de uma lamínula,
guardando em tubos tipo eppendorf de 1,5 ml, aproximadamente 400 mg de gel/tubo.
Os pedaços de agarose que continham o DNA de tamanho selecionado foram
armazenados a 4 ºC até o momento do uso. O restante do gel foi corado, visualizado
em luz UV e documentado em fotodocumentador (BIO RAD – GEL DOC 1000), através
do programa Quantity OneR (BIO RAD
TM
, HERCULES, CA, USA).
Foram realizados experimentos para recuperação de fragmentos de DNA entre
30 e 45 Kb, aproximadamente.
III. 4.3. Eluição dos fragmentos reparados do gel
Os tubos contendo os fragmentos de gel de agarose foram incubados em banho
10
a 65°C durante 15 minutos. Cada amostra teve seu volume igualado a 500 µL,
completando o volume com TE (10:1) pH 8,0, quando necessário. O tampão da enzima
gelase (10 µL) e a enzima gelase (3 µL) (EPICENTRE) foram adicionados aos tubos,
que foram bem agitados e centrifugados rapidamente. As amostras foram incubadas em
banho-maria a 45ºC por 1 hora. Em seguida, a reação foi transferida para banho-maria
a 70ºC por 15 minutos para inativação da enzima. Igual volume de acetato de amônio 5
M foi adicionado, e em seguida o material foi centrifugado a 14.000 xg por 10 minutos
para precipitação do material insolúvel.
Cuidadosamente, foram transferidos 95% (v/v) do sobrenadante para um tubo
novo. O DNA foi precipitado pela adição de 2 volumes de etanol absoluto, e recuperado
por centrifugação a 14.000 x g por 30 minutos a 4ºC. Em seguida, foi lavado com 1 mL
de etanol 70% (v/v) e centrifugado 14.000 xg por 15 minutos a 4ºC. O DNA precipitado
foi ressuspendido num volume total de 40 µL e quantificado em gel de agarose 1%
(p/v), contendo brometo de etídio (0,5 µg/mL). A eletroforese foi conduzida em tampão
TBE 1X (Tris 89mM, Ácido Bórico 89mM e EDTA 2,5mM; pH 8,3), a voltagem constante
de 90 V por 1 hora.
III. 4.4. Clonagem dos insertos em vetor fosmídeo
Para a construção da biblioteca BE587 foi utilizado o vetor pCC1FOS
TM
(EPICENTRE), que possui 8.139 pares de bases (Figura 1). Entre as características
especificas deste vetor, podemos citar: origem de replicação oriV e fator-F para
crescimento em E. coli; resistência a cloranfenicol, sítio cos de bacteriófago lambda
para empacotamento, T7 Promoter flanqueando o sítio de clonagem.
III.4.5. Reação de Ligação
A ligação foi realizada mantendo uma relação de concentração de insertos de
DNA BE587 com DNA vetor na proporção molar [1:10], relação esta exigida pelo kit.
A reação foi executada em um volume de 20 µL contendo 2 µL de inserto DNA
BE587 (±0,2 µg), 1 µL de vetor pCC1FOS-TNC (0,5 ug/uL), 2 µL de tampão “fast-link
ligation buffer” 10X (EPICENTRE), 1 µL de ATP 10 mM, 1 µL da enzima “fast link” DNA
ligase (EPICENTRE) e 13 µL de H
2
O Milli-Q estéril. A reação foi mantida a temperatura
11
ambiente (25°C) por 3 horas e depois a 70ºC por 10 minutos para inativação da enzima.
Os fosmídeos ligados ao inserto foram armazenados a –20 ºC.
Figura 1. Esquema ilustrativo apresentando características do vetor pCC1FOS-TNC
TM
(EPICENTRE).
III. 4. 6. Reação de empacotamento
Um tubo de extrato de empacotamento MAXPLAX (EPICENTRE) com 50µL foi
retirado do freezer –80 ºC, para descongelar no gelo. Em cada tubo contendo os
fosmídeos ligados ao inserto foi adicionado 25 µL de extrato de empacotamento. As
amostras foram agitadas cuidadosamente e centrifugadas rapidamente, e depois
incubadas em banho-maria a 30ºC por 90 minutos. Passado esse período, foram
adicionados mais 25 µL de extrato de empacotamento em cada tubo e as amostras
foram novamente incubadas a 30ºC por mais 90 minutos. Em seguida foi adicionado
500 µL de tampão de diluição de fagos [10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM NaCl, 10 mM
MgCl
2
] e 25 µL de clorofórmio. Os tubos foram agitados por inversão e estocados a 4ºC.
III. 4. 7. Estocagem das células EPI100-T1
R
Tubos de estoque de células contendo 150 µL de glicerina-USP foram
12
autoclavados. Colônias isoladas foram obtidas através do cultivo em placas de petri
com meio de cultura LB suplementado com 10 mM MgSO
4
. Para reativação das células,
50 mL de caldo LB suplementado foi inoculado com uma colônia isolada, e as células
foram cultivadas durante a noite a 37ºC com agitação de 300 rpm. Na seqüência, 50 mL
de caldo LB suplementado foi inoculado com 5 mL das células cultivadas durante a
noite e cultivado sob a mesma agitação e período a 37ºC. Após o crescimento, foi
adicionado dentro do fluxo laminar 850 µL da cultura em cada tubo contendo glicerina.
Os tubos foram agitados e congelados rapidamente com nitrogênio líquido, e em
seguida estocados em freezer –80ºC.
III. 4. 8. Preparo do inóculo de células EPI100-T1
R
Colônias isoladas foram obtidas através do cultivo em placas de petri com meio
de cultura LB suplementado com 10 mM MgSO
4
. No dia anterior a realização da reação
de empacotamento, foram inoculados 50 mL de caldo LB suplementado com uma
colônia isolada de células EPI100-T1
R
. No dia da reação de empacotamento, 50 mL de
caldo LB suplementado foi inoculado com 5 mL das células cultivadas durante 14 horas
sob agitação a 37 ºC até atingir a densidade ótica a 600 nm entre 0,8 e 1,0. A
densidade óptica foi determinada no Biophotometer (EPPENDORF). As amostras foram
mantidas a 4°C até o momento do uso.
III. 4. 9. Transfecção das células EPI100-T1
R
Cada 10 µL da solução com os fosmídeos empacotados foi misturado, em
condições estéreis, a uma alíquota de 100 µL de células EPI100-T1
R
. Os tubos foram
gentilmente agitados e incubados em estufa a 37ºC, por 20 minutos. Após esse
período, os 110 µL de cada um dos tubos foram aplicados em placa de petri contendo
meio de cultura LB com cloranfenicol (12,5 µg/mL). As placas foram incubadas durante
a noite em estufa a 37ºC. Como controle positivo, células EPI100-T1
R
sem vetor foram
cultivadas em meio sem antibiótico, e como controle negativo as células EPI100-T1
R
sem vetor foram colocadas em placas de petri contendo meio LB com 12,5 µg/mL
cloranfenicol .
13
III. 4. 10. Coleta e Estoque dos clones de fosmídeos
Os clones transformados foram repicados com palitos de madeira esterilizados
para placas estéreis de poliestireno (96 “well assay plate”, 250 µL) contendo 125 µL de
meio CG acrescido de 12,5 µg/mL de cloranfenicol. As placas foram incubadas em
estufa BOD (Biological Oxygen Demand) por 24 horas. Após esse período, foram
adicionados 125 µL de solução de glicerol 40% (v/v) e estocadas à –80
o
C.
Alguns fosmídeos foram escolhidos para determinar o tamanho médio dos
insertos através de enzimas de restrição (BamHI e HindIIII), visualizados em gel de
eletroforese de campo pulsado (PFGE). O tamanho dos insertos foi calculado utilizando
o programa DNAFrag 3.03 (SCHAFFER and SEDEROFF, 1981).
III.5. Cultivo dos fosmídeos BE587 em “Conjunto”
Para cada placa de fosmídeo, foram inoculados em placas “deep-well” contendo
1,2 mL do meio “Circle Grow” (BIO 101, Inc; Cat. No. 3000-142) mais cloranfenicol (12,5
µg/mL) e incubadas com agitação (280 rpm), a 37
o
C, por 22 horas.
Após a incubação, os clones de cada placa foram homogeneizados em uma
única amostra e centrifugados a 12000 xg por 15 minutos a 4
o
C, dividindo no final o
sedimento em 4 tubos tipo eppendorf, obtendo assim um Conjunto de clones para cada
placa de fosmídeos BE587, estocados a -20 ºC.
III.5.1. Extração de DNA do Conjunto de clones de fosmídeo BE587
Um tubo tipo eppendorf contendo o Conjunto de clones de fosmídeo BE587 foi
submetido à extração de DNA por lise alcalina (SAMBROOK et al., 1989). O pelete
celular foi suspendido em tubos córex em 1,7 mL de GTE (50 mM Glicose, 25 mM Tris,
10 mM EDTA, pH 8) agitando em vórtex, adicionando em seguida 3,4 mL de SDS (0,2
N NaOH, 1 % SDS) agitando os tubos gentilmente por inversão e incubando por 5
minutos. Em seguida foi adicionado 2,5 mL de Acetato de Potássio 3M (pH 4,8),
agitando gentilmente e incubando por mais 5 minutos, centrifugando em seguida por
12000 xg por 5 minutos a 4 ºC (SORVAL). O sobrenadante foi transferido para outro
tubo, e o DNA precipitado com 0,1 volume de Acetato de Sódio 3M (pH 5,2) e 2,5
volumes de etanol absoluto. Esse material foi incubado a –80 ºC por 20 minutos,
14
centrifugado por 12000 xg por 20 minutos a 4 ºC, lavado com 1 mL de etanol 70%, seco
e ressuspendido em 200 µL de TE 10:1 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5).
O material foi devidamente quantificado como no item III.3.2.
III. 6. Reação de Cadeia da Polimerase com os primers nifA, nifH, nodM e fixN
Nas reações de amplificação com DNA do Conjunto de fosmídeo BE587 foram
utilizados “primers” específicos para os genes nifA, nifH, nodM e fixN sintetizados pela
BIOSYNTHESIS, para identificar regiões relacionadas aos genes de fixação e
nodulação. As seqüências dos “primers” estão descritas na tabela 1, as condições da
reação de PCR estão descritas na tabela 2 e os produtos da PCR foram visualizados
em gel de agarose 1% (item III.3.1.2).
Tabela 1: Seqüência dos “primers” para nifA, nifH, nodM e fixN e tamanho do produto
de amplificação
Primer
Seqüência Produto
NifAF CCC CGT TCC AGG CTA AGT T ~ 450 pb
NifAR TAC TTT TCC ACA GCA TCG C
NifHF TCC TTG TAG CCG ACC TTC A ~ 223 pb
NifHR TAC GGA AAA GGC GGC ATC G
NodMF CGT CCG TCC CCA TAA CCA C ~ 945 pb
NodMR GCC GCT CAC ACT ACC GTT C
FixNF GCC GAC CGA ACT ACA ATC T ~ 553 pb
FixNR CGA ACC GAA CAC CGA TAC C
Tabela 2: Condições de amplificação da PCR, utilizando os “primers” nifA, nifH, nodM e
fixN e ciclagem.
REAGENTES
CONCENTRAÇÃO
FINAL (CLONE)
CONCENTRAÇÃO
FINAL (POOL)
DNA ~ 60 ng ~ 300 ng
Tampão da enzima 1X 1X
MgCl
2
1,5 mM 1,5 mM
DNTPs 200 µM 350 µM
Taq DNA polimerase 1,25 U 2,5 U
primers
10 pmol 60 pmol
Volume final (água MilliQ) 20 µL 20 µL
15
Programas utilizados no Termociclador:
nifA – nifH - fixN nodM
1) 94 ºC – 5 min.;
2) 94 ºC – 1 min.;
3) 58 ºC – 1 min. 30seg.;
4) 72 ºC – 2 min.;
5) 40 ciclos etapas 02 a 04;
6) 72 ºC – 5 min.;
7) 4 ºC por tempo inderteminado.
1) 94 ºC – 5 min.;
2) 94 ºC – 1 min.;
3) 62 ºC – 1 min. 30seg.;
4) 72 ºC – 2 min.;
5) 40 ciclos etapas 02 a 04;
6) 72 ºC – 5 min.;
7) 4 ºC por tempo inderteminado.
III. 7. Construção da sub-biblioteca de fosmídeo em vetor pUC19
III.7.1. Cultivo do fosmídeo selecionado
O cultivo do fosmídeo selecionado foi realizado em 25 mL de meio “Cirvle Grow”
contendo cloranfenicol (12,5 µg/mL) mais 25 µL da solução de indução, e incubadas
com agitação (280 rpm), a 37
o
C, por 16 horas.
III.7.2. Extração de DNA de fosmídeo
A extração de DNA de fosmídeo foi realizada como no item III.5.1, e
quantificadas como no item III.3.2.
III. 7.3. Fragmentação por quebra física
Foi utilizado em torno de 50 µg de DNA fosmidial em um nebulizador contendo
tampão Tris-HCl (1M pH 8,0), MgCl
2
(1M), glicerol esterilizado (50%), água filtrada e
esterilizada (q.s.p. 2 mL). A nebulização foi realizada por 25 segundos a 3kgf/cm
2
com
nitrogênio. As amostras foram centrifugadas a 4
o
C, por 2 minutos, a 12.000 xg para
concentrar o material no fundo do nebulizador.
III. 7. 4. Precipitação do DNA
O DNA fragmentado foi separado em tubos tipo eppendorf de 1,5mL (máximo de
400 µL de DNA). Foi acrescentado 0,1 volume de Acetato de sódio 3M, pH 5,2
16
misturando levemente, adicionando em seguida 2,5 volumes de etanol 95%
(temperatura ambiente). Os tubos foram incubados a –80
o
C por 20 minutos,
procedendo a uma centrifugação a 15.294 xg, por 30 minutos a 4
o
C. O sobrenadante foi
descartado, lavando as amostras com 1 mL de etanol 70% gelado. Uma nova
centrifugação foi realizada a 15.294 xg por 15 minutos a 4
o
C. O sobrenadante foi
novamente descartado por inversão secando a temperatura ambiente. A amostra foi
ressuspendida em 44 µL de tampão TE.
III. 7. 5. Reparo dos terminais dos fragmentos
Para cada amostra contendo 44 µL de DNA, foi acrescentado 50 mM MgCl
2
, 0,5
mM de dNTP e 9 U de DNA polimerase bacteriófago T4 (Biolabs). O material foi
Incubado em temperatura ambiente por 15 minutos, e foi adicionado em seguida 2µL
(10U) de fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli. Procedeu-se outra
incubação em temperatura ambiente por mais 15 minutos, adicionando 40 µL de água e
100 µL de uma solução 1:1 (v:v) de fenol/clorofórmio à temperatura ambiente (fenol
saturado com 0,1 M Tris-HCl, pH 8). A mistura foi agitada em “vortex” por 1 minuto,
centrifugada a 15.294 xg por 2 minutos a 4
o
C. A fase aquosa foi transferida para um
outro tubo tipo eppendorf de 1,5 mL, adicionando-se 0,1 volume de 1M NaCl e 2,5
volumes de etanol absoluto, o mterial foi misturado por inversão, e em seguida a
amostra foi deixada em freezer –80
o
C por 30 min. O material foi novamente
centrifugado a 12.000 xg por 30 minutos a 4
o
C, o sobrenadante foi descartado e o
sedimento foi lavado com 1 mL de etanol 70% gelado. O material foi novamente
centrifugado a 12.000 xg, por 15 minutos, em temperatura ambiente, o sobrenadante foi
descartado deixando o resíduo seco. O material foi ressuspendido em 46 µL de água
filtrada e esterilizada.
III. 7. 6. Reação com Kinase
O DNA reparado foi adicionado 20 mM ribo ATP, 10U de polinucleotídeo Kinase
do bacteriófago T4, tampão polinucleotídeo Kinase do bacteriófago T4 (Biolabs) e 100
mM de DTT. As amostras foram incubadas a 37
o
C por 30 minutos. A reação foi
inativada por tratamento com calor a 65
o
C, por 5 minutos. Em seguida foi adicionado 2
17
µL de tampão de corrida (40% de glicerol e 0,02% de azul de bromofenol) para cada 20
µL de DNA) procedendo a uma eletroforese por 2 horas a 90 V em gel de agarose de
baixo ponto de fusão (Agarose Prep – Pharmacia Biotech) a 0,8% em tampão TBE 1X
(Tris 89mM, Ácido Bórico 89mM e EDTA 2,5mM; pH 8,3) sem brometo de etídio.
III. 7. 7. Obtenção dos fragmentos a partir do gel
Um corte vertical foi realizado entre os poços que continham o marcador de
tamanho molecular e uma pequena amostra do material nebulizado, resultando dois
fragmentos de gel, uma com o material fragmentado e outra com o marcador e amostra
para visualizar. A porção do gel que continha o marcador foi corada com brometo de
etídio, e sob um transiluminador, foi marcada com pequenos cortes a região do
tamanho de fragmento desejado (de 1000 a 3000 pb). O gel corado foi colocado ao lado
do gel com o material reparado, e com auxílio de uma lamínula foi cortada a região que
continha o material reparado na região do tamanho de interesse, colocando o gel
cortado em tubos tipo “eppendorf” (aproximadamente 400 mg de gel/tubo).
III. 7. 8. Eluição dos fragmentos reparados e fosforilados do gel
Os tubos contendo os fragmentos de gel de agarose foram incubados em banho
a 65°C durante 15 minutos. Cada amostra teve seu volume igualado a 500 µL,
completando o volume com TE (10:1) pH 8,0, quando necessário. Foram realizadas
extrações sucessivas com um volume de fenol (saturado com 0.1 M Tris-HCl pH8),
posteriormente com fenol saturado com 0,1 MTris-HCl pH8:clorofórmio (1:1,v:v) e outra
com clorofórmio. Cada mistura foi agitada em “vórtex” por 1 minuto e centrifugada por 5
minutos a 15294 xg, à temperatura ambiente, para recuperação da fase aquosa. Os
insertos foram precipitados com 0,1 volume de acetato de sodio 3 M, pH 5,2, e 2
volumes de etanol absoluto gelado. A amostra foi incubada durante a noite a –20°C. O
tubo contendo o DNA precipitado foi centrifugado a 15294 xg por 30 minutos, a 4
o
C. Em
seguida, foi acrescentado 1 mL de etanol 70% (v/v) gelado para limpeza do precipitado,
sendo efetuada uma nova centrifugação a 15294 xg por 15 minutos a 4
o
C. O pellet
obtido foi seco à temperatura ambiente, e ressuspendido em 10 µL de água Milli-Q
esterilizada. O DNA obtido foi analisado em gel de agarose 1,0% (p/v) para checagem
18
do tamanho dos fragmentos obtidos e quantificação, na presença de pGEM (APPLIED
BIOSYSTEMS).
III. 7. 9. Clonagem dos fragmentos de DNA nebulizados
Os fragmentos de DNA nebulizado foram clonados em vetor pUC19/SmaI
(Fermentas)(Figura 2), conforme as instruções do fabricante. A reação de ligação dos
fragmentos ao vetor foi realizada com 1 µL de T4 DNA ligase (3U/µL), 2 µL de tampão
de T4 ligase (Biolabs), 100 ng do vetor e aproximadamente 400 ng de DNA, para uma
reação com volume final de 20 µL. A reação foi incubada a 16 ºC aproximadamente 12
horas.
Figura 2. Esquema ilustrativo apresentando características do vetor pUC19DNA/Sma I
(FERMENTAS).
III. 7.10. Transformação de células
As células competentes de Escherichia coli DH5α utilizadas para transformção
foram gentilmente fornecidas pelo Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia
Aplicada (LGBBA), do Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, FCAV-
Jaboticabal.
Para reação de ligação foram preparadas placas de petri de 14 cm contendo
meio LB/Ampicilina/IPTG/X-GAL. O meio LB (Triptona 10 g/L, Extrato de Levedura 5 g/L
19
e NaCl 10 g/L, ágar 15 g/L, pH 7,5) foi autoclavado a 120ºC, durante 20 minutos e, após
resfriamento foi adicionado ampicilina (50 mg/mL) para uma concentração final de (50
ug/mL) e este foi acondicionado nas placas de petri. Após a solidificação do meio, 100
uL de IPTG (0,24 g dissolvidos em 5 mL de água) esterilizado por filtração e 100 uL de
X-GAL (0,05 g dissolvidos em 1 mL de N’N’ dimetil formamida) foram espalhados sobre
o meio com o auxílio de uma alça de “Drigalski” esterilizada. As placas foram mantidas
a 37ºC até o momento do uso.
Em tubos do tipo "Falcon", de 15 mL, foi adicionado 10 µL de DNA ligado com o
vetor. Nesse momento, as células competentes (E. coli DH5α) foram removidas da
temperatura -85ºC e colocadas em banho frio por 5 minutos, misturando-se gentilmente.
As células foram adicionadas (200 µL) aos tubos com DNA misturando-se gentilmente e
incubadas em banho de gelo por 20 minutos. Os tubos foram levados ao banho-maria a
42
o
C sem agitação, por 1 minuto e 30 segundos. Após esse período, os tubos foram
retornados ao gelo, por 2 minutos, adicionando, após isso, 1 mL de meio SOC [Triptona
(20g/L), Extrato de Levedura (5g/L), NaCl (0,5g/L), KCl 1M, MgCl
2
1M e Glicose 1M] no
tubo. Os tubos foram incubados a 37
o
C, com agitação de 150 xg, durante 2 horas.
Após o cultivo das células, 100 µL da cultura transformada foram plaqueadas,
espalhadas com o auxílio de uma alça de Drigalski esterilizada. As placas foram
incubadas a 37
o
C por 20 horas e, após este período, as placas foram mantidas a 4
o
C
para facilitar a visualização e a seleção de colônias.
III. 7. 11. Seleção dos clones transformados
Após o período de incubação, foram selecionadas as colônias de coloração
branca. A inserção do fragmento de DNA se dá na região do gene lacZ, responsável
pela síntese de β-galactosidase que quebra o subastrato X-gal, originando coloração
azul. Portanto, as células que receberam o inserto formam colônias brancas e as que
não receberam, formam colônias azuis. Os clones transformados foram transferidos
com palitos de madeira (autoclavados) para placas estéreis de poliestireno para cultivo
de bactérias (96 “well assay plate” de 150 µL cada poço) contendo 150 µL de meio
“Circle Grow” com ampicilina (50mg/mL). As placas foram incubadas em estufa BOD
(Biological Oxygen Demand) por 24 horas. Após esse período, foi adicionado 100 µL de
20
solução de glicerol 40%. Constituindo o estoque da sub-biblioteca de clones, mantidas
a –85
o
C para posterior extração de DNA plasmidial, quantificação e seqüenciamento
dos clones.
III.7.12. Cultivo dos clones da sub-biblioteca de fosmídeos
Para cada placa de fosmídeo foram inoculadas em placas “deep-well” contendo
1,2 mL do meio “Circle Grow” mais ampicilina (50 mg/mL). As placas foram incubadas
com agitação (280 rpm), a 37
o
C, por 22 horas.
III.7.13. Extração de DNA em placa
Após a incubação, as placas foram centrifugadas por 5 minutos e o pelete foi
ressuspendido em 240 µL de solução GTE [Glicose 50mM; Tris-HCl 23mM (pH 8,0);
EDTA 10mM], agitando em “vortex” até que as células estivessem em suspensão. O
material obtido das 3 placas de cultivo foi reunido por centrifugação a 3220 xg por 8
minutos e 30 segundos.
Em seguida, foi adicionado 80 µL de solução de GTE contendo 5 µg de
ribonuclease A. As placas foram agitadas em “vórtex” e um volume de 60 µL de cada
amostra, foi transferido para microplacas de polipropileno de fundo redondo. Às
amostras foram misturadas 60 µL de solução de lise (NaOH 0,2N/ SDS 1%)
procedendo-se de, incubação por 10 minutos em temperatura ambiente, 80 µL de
acetato de potássio 3M foram adicionados e novo período de incubação foi realizado
por 10 minutos, em temperatura ambiente, em seguida as placas foram mantidas por 30
minutos a 90
o
C. As placas foram resfriadas em gelo, por 5 minutos e centrifugadas por
8 minutos e 30 segundos a 3220 xg, a 20°C. Todo o material foi removido para placas
de filtro Millipore e acopladas em placas de polipropileno novas sendo esse conjuntos
de placas forma centrifugadas por 5 minutos a 3220 xg, a 20
o
C. Ao material filtrado foi
adicionado 100 µL de isopropanol absoluto. O material foi misturado 30 vezes por
inversão e as placas foram centrifugadas a 3220 xg por 45 minutos, à 20
o
C. O
sobrenadante foi descartado e o DNA precipitado foi lavado com 200 µL de etanol 70%
gelado. As placas foram centrifugadas por 5 minutos nas mesmas condições de rotação
e temperatura já descritas. Após esse procedimento, o sobrenadante foi descartado e o
21
resíduo seco em temperatura ambiente por 30 minutos. O DNA foi suspendido em 30
µL de água MilliQ autoclavada e estocado a –20
o
C.
III.7.14. Quantificação do DNA em placa
O material resultante da extração de DNA em placa foi quantificado como no item
III.3.2.
III. 8. Construção da sub-biblioteca de fosmídeo em vetor pUC18
III. 8. 1. Fragmentação por digestão enzimática
O DNA do fosmídeo selecionado e quantificado foi realizado uma reação de
digestão contendo cerca de 1 ug de DNA, 5 unidades de Sau3AI (Jena Bioscience) com
respectivo tampão em um volume final de 20 uL, encubando a uma temperatura de
37ºC por 10 minutos. Inativando em seguida a 65ºC por 10 minutos.
III. 8. 2. Obtenção dos fragmentos em gel de agarose com baixo ponto de
fusão
Foi adicionado 2 µL de tampão de corrida (40% de glicerol e 0,02% de azul de
bromofenol) para cada 20 µL de DNA) procedendo a uma eletroforese por 2 horas a 90
V em gel de agarose de baixo ponto de fusão (Agarose Prep – Pharmacia Biotech) a
0,8% em tampão TBE 1X (Tris 89mM, Ácido Bórico 89mM e EDTA 2,5mM; pH 8,3) sem
brometo de etídio.
Um corte vertical foi realizado entre os poços que continham o marcador de
tamanho molecular e uma pequena amostra do material digerido, resultando dois
fragmentos de gel, uma com o material digerido e outra com o marcador e amostra para
visualizar. A porção do gel que continha o marcador foi corado com brometo de etídio, e
sob um transiluminador, foi marcada com pequenos cortes a região do tamanho de
fragmento desejado (de 1000 a 3000 pb). O material corado foi colocado ao lado do gel
com o material reparado e com auxílio de uma lamínula foi cortada a região que
continha o material reparado na região de interesse, colocando o gel cortado em tubos
tipo eppendorf (aproximadamente 400 mg de gel/tubo).
22
III. 8. 3. Eluição dos fragmentos do gel por kit
Foi utilizado o kit Perfectprep Gel Cleanup (Eppendorf) para eluir os fragmentos
contidos nos bloquinhos de gel de agarose de baixo ponto de fusão. O DNA obtido foi
analisado em gel de agarose 1,0% (p/v) para checagem do tamanho dos fragmentos
obtidos e quantificação, na presença de pGEM (APPLIED BIOSYSTEMS).
III. 8.4. Clonagem dos fragmentos de DNA nebulizados ou digeridos
Os fragmentos de DNA digerido com enzima foram clonados em vetor
pUC18/BamHI (Amersham Pharmacia). A reação de ligação dos fragmentos ao vetor foi
realizada com 1 µL de T4 DNA ligase (3U/µL), 2 µL de tampão de T4 ligase (Biolabs),
100 ng do vetor e aproximadamente 400 ng de DNA, para uma reação com volume final
de 20 µL. A reação foi incubada a 16 ºC aproximadamente 12 horas.
III. 8.5. Transformação de células
As células competentes de Escherichia coli DH5α utilizadas para transformção
foram gentilmente fornecidas pelo Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia
Aplicada (LGBBA), do Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, FCAV-
Jaboticabal.
Para reação de ligação foram preparadas placas de petri de 14 cm contendo
meio LB/Ampicilina/IPTG/X-GAL. O meio LB (Triptona 10 g/L, Extrato de Levedura 5 g/L
e NaCl 10 g/L, ágar 15 g/L, pH 7,5) foi autoclavado a 120ºC, durante 20 minutos e, após
resfriamento foi adicionado ampicilina (50 mg/mL) para uma concentração final de (50
ug/mL) e este foi acondicionado nas placas de petri. Após a solidificação do meio, 100
uL de IPTG (0,24 g dissolvidos em 5 mL de água) esterilizado por filtração e 100 uL de
X-GAL (0,05 g dissolvidos em 1 mL de N’N’ dimetil formamida) foram espalhados sobre
o meio com o auxílio de uma alça de “Drigalski” esterilizada. As placas foram mantidas
a 37ºC até o momento do uso.
Em tubos do tipo "Falcon", de 15 mL, foi adicionado 10 µL de DNA ligado com o
vetor. Nesse momento, as células competentes (E. coli DH5α) foram removidas da
temperatura -85ºC e colocadas em banho frio por 5 minutos, misturando-se gentilmente.
As células foram adicionadas (200 µL) aos tubos com DNA misturando-se gentilmente e
23
incubadas em banho de gelo por 20 minutos. Os tubos foram levados ao banho-maria a
42
o
C sem agitação, por 1 minuto e 30 segundos. Após esse período, os tubos foram
retornados ao gelo, por 2 minutos, adicionando, após isso, 1 mL de meio SOC [Triptona
(20g/L), Extrato de Levedura (5g/L), NaCl (0,5g/L), KCl 1M, MgCl
2
1M e Glicose 1M] no
tubo. Os tubos foram incubados a 37
o
C, com agitação de 150 xg, durante 2 horas.
Após o cultivo das células, 100 µL da cultura transformada foram plaqueadas,
espalhadas com o auxílio de uma alça de Drigalski esterilizada. As placas foram
incubadas a 37
o
C por 20 horas e, após este período, as placas foram mantidas a 4
o
C
para facilitar a visualização e a seleção das colônias de interesse.
III. 8.6. Seleção dos clones transformados
Após o período de incubação, foram selecionadas as colônias de coloração
branca. A inserção do fragmento de DNA se dá na região do gene lacZ, responsável
pela síntese de β-galactosidase que quebra o subastrato X-gal, originando coloração
azul. Portanto, as células que receberam o inserto formam colônias brancas e as que
não receberam, formam colônias azuis. Os clones transformados foram transferidos
com palitos de madeira (autoclavados) para placas estéreis de poliestireno para cultivo
de bactérias (96 “well assay plate” de 150 µL cada poço) contendo 150 µL de meio
“Circle Grow” com ampicilina (50mg/mL). As placas foram incubadas em estufa BOD
(Biological Oxygen Demand) por 24 horas. Após esse período, foi adicionado 100 µL de
solução de glicerol 40%. Constituindo o estoque da sub-biblioteca de clones, mantidas
a –85
o
C para posterior extração de DNA plasmidial III.7.13, quantificação III.3.2 e
seqüenciamento dos clones.
III. 9. Reação de Cadeia da Polimerase para seqüenciamento
Para o seqüenciamento das pontas de fosmídeo e dos clones da sub-biblioteca
foram utilizados os “primers” descritos na tabela 3 e sob condições de PCR descritas na
tabela 4.
Após a amplificação, o material foi adicionado 80 µL de isopropanol 75%
deixando em temperatura ambiente por 15 minutos. Após este período, as placas foram
centrifugadas durante 45 minutos a 15
o
C, a 3220 x g, e os sobrenadantes descartados.
24
As placas forma invertidas e secas em papel absorvente. Em seguida, 200 µL de etanol
70% foi adicionado em cada amostra e estas centrifugadas por 5 minutos a 15
o
C,a
3220 xg, os sobrenadantes forma descartados e as placas invertidas em papel
absorvente. As placas foram mantidas a temperatura ambiente por 30 minutos, e
aplicadas no seqüenciador.
Tabela 3: Seqüência dos “primers” para seqüenciamento e pontas de fosmídeo.
Primer
Seqüência
M13/pUCF1211
GTAAAACGACGGCCAGT
M13/Pucr1201 AACAGCTATGACCATG
T7 TAATACGACTCACTATAGGG
RP2 TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGA
Tabela 4: Condições de amplificação da PCR seqüenciamento de ponta de fosmídeos
e clones da sub-biblioteca
REAGENTES
CONCENTRAÇÃO
FINAL (CLONE)
CONCENTRAÇÃO
FINAL (PONTA)
DNA ~ 100 ng ~ 2 - 3 µg
Tampão 6 µL 4 µL
Eterminator (GE) 1 µL 4 µL
primers
3,2 pmol 10 pmol
Água MilliQ - -
Volume final 20 µL 20 µL
Programas utilizados no Termociclador:
DYNAMIC (CLONES) GENOMA3 (PONTA)
1) 95 ºC – 20 seg.;
2) 50 ºC – 15 seg.;
3) 60 ºC – 1 min.;
4) 40 ciclos etapas 01 a 03;
1) 96 ºC – 2 min.;
2) 96 ºC – 30 seg.;
3) 52 ºC – 30seg.;
4) 60 ºC – 4 min.;
5) 40 ciclos etapas 02 a 04;
25
III. 10. Preparo das amostras e seqüenciamento
Nas placas a serem seqüenciadas foram adicionados 9 µL de HiDiFormamida
(Applied Biosystems) em cada amostra, estas foram desnaturadas em a 95
o
C por 5
minutos, resfriadas para ser seqüenciado no ABI 3700 (Applied Biosystems).
III. 11. Análise do seqüenciamento
Após o seqüenciamento das amostras os dados foram analisados pelo programa
“Sequencing Analysis 3.4” a montagem das seqüências e a verificação da qualidade
das bases dos eleroferogramas foram realizadas pelo pacote PhredPhrap/Consed
(EWING e GREEN, 1998; GORDON 1998), considerando seqüências com mais que
400 pb e qualidade phred maior ou igual 20. As seqüências obtidas foram comparadas
pelo programa BLAST (ASTSCHUL et al 1997) nos bancos de dados do GenBank e
Rhizobase.
O “software” Módulo de identificação de genes (CANTÃO et al., 2007) foi
utilizado para identificar possíveis ORFs no consenso dos fosmídeos comparando com
o banco de proteínas de Bradyrhizobium japonicum presente no servidor LBMP
(http://lbmp.fcav.unesp.br) onde “scripts” foram utilizados para filtrar os resultados e
organizar em banco MySQL no próprio servidor LBMP, podendo realizar assim uma
pré-anotação e categorização automática das ORFs identificadas nos fosmídeos.
As seqüências do genoma BE587 foram montadas através do pacote Sabiá
(ALMEIDA, et al., 2004) com seqüências de “shotgun” e com os fosmídeos
selecionados para o seqüenciamento (http://lbmp.fcav.unesp.br/be587).
26
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
IV. 1. Biblioteca plasmidial BE587
A partir do DNA genômico de B. elkaii SEMIA587, foram gerados fragmentos de
DNA em condições de nebulização. Sob pressão de 3 Kgf/cm
2
de gás nitrogênio,
durante 25 segundos, foram gerados fragmentos predominantes entre cerca de 506 pb
e 2000 pb clonados em vetor pUC19/SmaI.
O seqüenciamento genômico de B. elkanii SEMIA 587 teve início no Laboratório
de Bioquímica de Microrganismos e Plantas (LBMP) a partir de 2002, quando foram
contabilizados 9024 clones de bibliotecas de “shotgun”, tendo continuidade com o
trabalho de doutorado de SOUZA (2006), onde bibliotecas de “shotgun” BE587 foram
ampliadas em 16070 clones, atingindo um montante de 25094 clones. Estas bibliotecas
foram geradas nos seguintes plasmídeos: pUC18/BamHI, pUC18/SmaI, pUC19/SmaI e
pCR
4Blunt-TOPO, utilizando como hospedeiro E. coli DH5α.
IV. 2. Biblioteca de fosmídeos BE587
A bactéria B. japonicum apresenta genoma com tamanho de 8,5 Mb e a
homologia 16S rDNA com B. elkanii é de 97%. Dados preliminares de eletroforese de
campo pulsado com DNA genômico de B. elkanii SEMIA 587, no LBMP, mostram que
seu genoma varia entre 7 a 8 Mb (KISHI et al., 2005).
Assim a partir do DNA genômico de B. elkanii SEMIA 587 foi obtida uma
biblioteca com 6000 fosmídeos com insertos variando entre 30 – 45 kb, estocadas em
glicerol 40% em placas de 96 pocinhos em freezer a -80 ºC.
IV. 3. PCR nos conjuntos de fosmídeos
O DNA de 24 conjuntos de fosmídeos contendo cada um 96 clones foi
usado para a pesquisa dos genes de interesse através da reação de PCR. Assim
27
os genes nifH, nifA, nodM e fixN foram pesquisados nos conjuntos de DNA
(Tabela 5).
Tabela 5: Esquema das reações de PCR com os “primers” utilizados com os conjuntos
de DNA dos fosmídeos. “+” indica reação positiva e “-“ indica reação negativa.
primer
Conjunto de DNA de fosmídeos
1
2
3 4 5 6 7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
NifA
-
-
-
+
-
-
-
-
-
- - - - - - - - - - - - - - -
NifH
-
-
+
-
+
+
-
-
+
- - - - - - - - - - - - - - -
NodM
-
-
-
-
-
+
-
+
-
+ - - - - - - - - - - - - + +
FixN
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+ - - - - - - - - - - - - - -
A tabela 5 mostra a relação dos conjuntos de fosmídeos que apresentaram
reação de PCR positiva para os genes de interesse quando comparados com a PCR
realizada utilizando-se DNA de B. elkanii. Assim foi selecionado o conjunto da placa 4
para o gene nifA, conjunto da placa 3 para o gene nifH, conjunto da placa 8 para o gene
nodM e o conjunto da placa 10 para o gene fixN.
IV. 4. PCR nas placas de fosmídeos
As placas selecionadas dos conjuntos de DNAs dos fosmídeos foram
recultivados e cada um dos clones foi avaliado por PCR buscando quais teriam os
genes individuais através da presença de uma banda contendo o tamanho esperado de
amplificação para cada primer. (Figura 3).
Para averiguar o tamanho dos insertos, alguns fosmídeos foram digeridos com
BamHI e HindIIII, visualizados em gel de eletroforese em campo pulsado, como mostra
a figura 4.
28
Placa 10
Placa 8
B
Placa 4
Placa 3
C
D
A
1
k
1
k
1
k
1
k
450 pb
223 pb
945 pb
Figura 3: Perfil eletroforético dos produtos de amplificação de
fosmídeos, A: DNA de fosmídeos da placa 4 com o “primer” nifA
gerando um produto de 450 pb; B: DNA de fosmídeos da placa 3 com o
“primer” nifH gerando um produto de 223 pb; C: DNA de fosmídeos da
placa 8 com o “primer” nodM gerando um produto de 945 pb; D: DNA
de fosmídeos da placa 10 com o “primer” fixN gerando um produto de
553 pb. 1kb: padão de tamanho molecular (Fermentas). Círculos
indicam os fosmídeos escolhidos para seqüenciamento.
553 pb
29
Após a identificação destes clones o DNA de 4 fosmídeos individuais
denominados 04H05, 03F09, 08C01 e 10C07 foram escolhidos para o seqüenciamento.
Figura 4: Perfil eletroforético de gel em campo pulsado, em agarose 1% e TBE 0,5 X. 1:
padrão tamanho molecular 1Kb; 2: padrão de tamanho molecular 37 kb; 3 fosmídeo
03F09 não digerido; fosmídeo 03F09 digerido com HindIIII (4) e BamHI (5); fosmídeo
04H04 digerido com HindIIII (6) e BamHI (7); fosmídeo 08C01 digerido com HindIIII (8)
e BamHI (9); fosmídeo 10C07 digerido com HindIIII (10) e BamHI (11).
A digestão com as enzimas de restrição mostrou que os fosmídeos tinham
tamanho molecular entre 30-35 Kb, tamanho esperado para este tipo de construção.
IV. 5. Seqüenciamento das pontas de fosmídeos
Com a extração de DNA de 8 placas da biblioteca BE587 para o seqüenciamento
das pontas dos fosmídeos obteve-se um rendimento de em torno de 80% de
aproveitamento quando analisados seqüências com 400 pb e qualidade phred de 20.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
10
kb
-
>
37
kb
-
>
30
As seqüências das pontas dos fosmídeos foram comparadas por busca de
similaridade na região da ilha simbiótica de B. japonicum, verificando a similaridade dos
clones, quando seqüenciados com o primer “T7” e “RP2” na região, assim foram
selecionados os fosmídeos 02A07, 03A02, 05E08, 15G08, 04G11 e 06G11 para o
seqüenciamento.
IV. 6. Seqüenciamento dos fosmídeos
Selecionados os fosmídeos para seqüenciamento, foi realizada uma tentativa de
minimizar o trabalho e acelerar as etapas de elaboração de uma sub-biblioteca. Com o
DNA de dois fosmídeos (03F09 e 04H05) foi construída uma sub-biblioteca no vetor
pUC19 enquanto que, as 8 sub-bibliotecas dos fosmídeos 08C01, 10C07, 02A07,
03A02, 05E08, 15G08, 04G11 e 06G11 foram realizadas utilizando vetor
pUC18/BamHI.
Após o seqüenciamento de aproximadamente 1536 clones da sub-biblioteca
03F09/04H05, as análises de bioinformática pelo pacote phredPhrap/Consed
mostraram que os respectivos fosmídeos não estavam totalmente seqüenciados, uma
vez que era esperado um consenso em torno de 30-35 kb cada em relação ao tamanho
dos fosmídeos obtidos por eletroforese de campo pulsado (Figura4). O tamanho dos
insertos seqüenciados nesta sub-bibiloteca variaram em torno de 500 – 1000 pb, sendo
que o esperado era em torno de 1000 – 3000 pb, além de disso foi observado um baixo
índice de eficiência de ligação (~45%), apresentando assim uma alta porcentagem de
vetor pUC19 nesta sub-bibiloteca. Por outro lado, o seqüenciamento completo das
outras sub-bibliotecas, 08C01 e 10C07, por exemplo, foi obtido com aproximadamente
576 clones, para cada sub-biblioteca. Estes resultados obtidos com a utilização do vetor
pUC18 apresentaram insertos em torno de 1000 a 3000 pb. A explicação para a
eficiência de clonagem observada com o pUC18 pode estar no fato de que o pUC19
apresenta extremidades abruptas e o pUC18 extremidade coesiva com a enzima
BamHI, assim não é necessário a reação de reparo das extremidades quando esta é
necessária para o pUC19.
31
IV. 7. Análise dos dados de seqüenciamento
A análise filogenética constitui-se em uma ferramenta importante visando
comparações genômicas. Seqüências de genomas completos fornecem informações
necessárias pra futuras análises funcionais, além de referências para desvendar a
função e evolução de genes e genomas, através da comparação de seus componentes
e organização estrutural entre diferentes espécies.
Dados preliminares de eletroforese de campo pulsado com DNA genômico de B.
elkanii SEMIA 587, no LBMP, mostram que seu genoma varia entre 7 a 8 Mb (KISHI et
al., 2005), enquanto o de B. japonicum apresenta tamanho igual a 8,5 Mb. Estes
resultados prévios foram importantes porque corroboram a escolha de B. japonicum
como base para sua primeira compração genômica e serviu como guia para
categorização das seqüências de B. elkanii.
Após o seqüenciamento dos clones plasmidiais e dos fosmídeos, estes foram
inseridos na montagem do genoma BE587, onde até o dia 19 de novembro de 2007
haviam sido depositados 55439 seqüências, sendo que dstas 36,258 seqüências
apresentavam qualidade phred maior ou igual 20. A montagem congelada gerou 3941
Contigs (Tabela 6) com uma cobertura genômica em torno de 64%
(http://lbmp.fcav.unesp.br/be587/reportShotgun.htm), esse número de genes quando
comparado aos 8317 genes de B. japonicum (KANEKO et al., 2002), correspondem a
uma média de 64% de genes identificados em B. elkanii, em relação ao tamanho
esperado de 8 Mb do genoma de B. elkanii (Kishi et al, 2005). A assim o genoma
parcial de BE587 foi submetido à análises por bioinformática para realizar os processos
de identificação de ORFs e anotação das mesmas.
Os fastas dos Contigs foram comparado com o GenBank através do programa
BLAST, filtrando o resultado e armazenando em banco de dados no servidor LBMP.
Módulos de anotação foram utilizados para identificar ORFs nos consensos dos Contigs
e depositados no servidor LBMP.
32
Tabela 6: Relação com dados gerais gerados pelo projeto genoma parcial de
Bradyrhizobium elkanii SEMIA587.
Bradyrhizobium elkanii SEMIA587
número
nucleotídeos
seqüenciados
% GC
cobertura
do genoma
Contigs
3941 5.821.111 62,6 /
Singlets
3825 /
Total
/ 64%
seqüências
forward e reverse
55.439 / / /
ORFs
5381 / / /
tRNA
31 / / /
Bradyrhizobium japonicum USDA110
tamanho do
genoma
/ 9105828 64,1 100%
ORFs
8317 / / /
tRNA
44 / / /
Bradyrhizobium elkanii X Bradyrhizobium japonicum
ORFs comuns
4052
ORFs exclusivas BE
693
Um total de 5381 ORFs foram identificadas através dos “scripts” para o módulo
de anotação, onde foram anotadas automaticamente 4745 ORFs utilizando “scripts”
para filtrar os resultados de comparação com os bancos de dados do GenBank e
Rhizobase. Todas ORFs anotadas foram categorizadas seguindo o padrão do banco
Rhizobase (figura 5). Uma representação de todas as 4745 ORFs anotadas e
comparadas com B. japonicum pode ser visualizado em
http://lbmp.fcav.unesp.br/be587/mapa.
Todas as ORFs foram identificadas em categorias, sendo que a categoria de
genes hipotéticos foi a que mais se destacou (Figura 5). Esta categoria engloba genes
qua não apresentaram similaridade com nenhum gene de função conhecida. Este
resultado é importante por refletir a possível identificação de genes novos, o que vem
33
corroborar a necessidade de continuidade do sequenciamento de DNA genômico de B.
elkanii.
Figura 5: Gráfico representando as categorias das ORFs de BE587 seguindo as normas
do banco Rhizobase.
IV. 8. Comparação filogenética
O grau de similaridade existente entre B. elkanii a partir das seqüências neste
trabalho e B. japonicum foi analisado pela comparação filogenética de diferentes
genes. A similaridade avaliada pelo gene 16S rDNA de B. elkanii com os 16S rDNA de
diferentes rizóbios que constam do banco de dados Rhizobase mostrou 97% de
similaridade com o B. japonicum, o bradirrizóbio utilizado nos estudos comparativos
deste trabalho (Figura 6A). Quando a análise comparativa é realizada utilizando
diferentes seqüências de genes fixA (Figura 6B) e nifA (Figura 6C) relacionados a
fixação do nitrogênio esta similaridade com o B. japonicum fica em torno de 91%, 94 %
para nifH (Figura 6D) e 90% para nodZ (Figura 6E)
34
Figura 6: Relacionamento filogenético entre diferentes rizóbios em diferentes genes. A:
16S rDNA; B: fixA; C: nifA; D: nifH e E: nodZ. Os números internos representam o valor
de bootstrap. XF: Xylella fastidosa; Mesorhizobium loti (MAFF303099); Bradyrhizobium
A
B
C
D
E
35
japonicum (USDA110); Sinorhizobium meliloti (1021); Rhizobium etli (CFN42);
Rhizobium leguminosarum (biovar viciae 3841); Rhizobium sp. (pNGR234ab);
Mesorhizobium loti R7A; Bradyrhizobium sp BTAi1; Bradyrhizobium sp ORS278;
Azorhizobium caulinodans ORS571; Rhodopseudomonas palustris CGA0009.
Estes índices diferentes de similaridade entre dois organismos avaliados por
seqüências gênicas mostram como a análise de um gene pode influenciar a
interpretação da relação filogenética, uma vez que genes mais conservados
apresentam menos variações entre os organismos estudados. Esse viés conservador
ocorre em todos os organismos de maneira equivalente e, portanto, não irá influenciar
em uma análise filogenética para um lado ou outro (RUSSO, 2001). Estas observações
indicam que rizóbios diferem significativamente quanto ao conteúdo e organização
gênicas, independente de suas relações taxonômicas e hábitos simbióticos (GALIBERT
et al., 2001).
IV. 9. Genes da Ilha simbiótica
Uma ilha ou região simbiótica corresponde a um agrupamento de genes
simbióticos que se integraram no genoma após transferência horizontal de genes a
partir de linhagens diferentes. Regiões simbióticas são primariamente passíveis da
ocorrência de rearranjos de DNA. Contudo, evolutivamente, na ausência de rearranjos
genômicos, esta região acabou por conter a maior quantidade de genes envolvidos na
simbiose em diferentes rizóbios (GÖTTFERT et al., 2001; KANEKO et al., 2000).
A ilha simbiótica em rizóbio foi primeiramente identificada em M. loti ICMP3153,
como um segmento de DNA transmissível de aproximadamente 500 Kb em
comprimento, inserido dentro de um gene phe-tRNA. A maioria dos genes para
noculação e fixação do nitrogênio foram localizados dentro da ilha simbiótica
cromossomal, embora o genoma de M. loti seja tripartido (cromossomo, pMLa e pMLb)
(KANEKO et al., 2000). Já em S. meliloti, outro rizóbio que apresenta genoma tripartido,
a maioria dos genes para nodulação e fixação do nitrogênio foram encontrados no
megaplasmídeo pSymA, embora os três elementos genômicos (cromossomo, pSymA e
pSymB) contribuem em graus variados para a simbiose (GALIBERT et al., 2001).
36
Por outro lado, em B. japonicum, uma ilha simbiótica de 680 Kb identificada no
cromossoma, após o seqüenciamento do genoma total de B. japonicum inclui uma
porção de 410 Kb de um segmento de DNA contendo o conjunto de genes para a
nodulação e fixação simbiótica do nitrogênio da ilha previamente descrita por Göttfert e
colaboradores (2001). A ampliação no tamanho desta região simbiótica para B.
japonicum baseou-se no conteúdo GC mais baixo (59,4%), comparado a outras
porções do cromossomo. Adicionalmente, esta região expandida englobou outros
genes previamente não encontrados na região de 410Kb, como o gene nodM (KANEKO
et al., 2002).
A ilha simbiótica de B. japonicum contém 645 genes codificadores de proteínas,
dos quais 301 tiveram suas funções deduzidas por similaridade com genes de função
conhecida, incluindo aqueles relacionados à fixação simbiótica do nitrogênio. Esta ilha
simbiótica está restrita às coordenadas 1.8678.486-2.289.058 no mapa de B. japonicum
(KANEKO et al., 2002).
As tabelas 8 e 9 mostram apenas os genes nod, nol, noe ,nif e fix comuns aos
genomas de B. japonicum e B. elkanni. Embora o genoma deste último ainda não
tenha sido completamente seqüenciado, tentativamente os 267 (88%) possíveis genes
que codificam proteínas foram colocados em uma provável ilha simbiótica de B. elkanii
(figura7), (http://lbmp.fcav.unesp.br/be587/mapa). Este incluem os genes nifDKENX
(BE1685, BE797, BE2242, BE2169 e BE2241, BE2168 genes respectivamente), nifS
(BE192 e BE5377); nifB (BE166); nifH (BE167, BE191, BE1452 e BE5375).fixBCX, 3
cópias para fixB (BE168, BE193 e BE5378), 3 cópias para fixC (BE169, BE194 e
BE5379), 3 cópias para fixX (BE155, BE181 e BE5364) que estão em arranjo similar ao
da ilha de B. japonicum. Em B. japonicum um “cluster” coordenado à este é composto
pelos genes nolZY-nolA-nodD2-nodD1YABCSUIJ-nolMNO-nodZ-fixR-nifA-fixA. Em B.
elkanii ainda não foi possível localizar todos os genes, mas existe forte evidência de
que um mesmo tipo de “cluster” exista uma vez que os genes nolY (BE4219), nolA
(BE4651), nodC (BE2287), nolO (BE22), nodZ (BE29), fixR (BE27), nifA (BE35), fixA
(BE26) foram ai encontrados.
37
Por outro lado, esta ilha simbiótica de B. elkanii não deve ser totalmente similar à
de B. japonicum. Isto pode ser inferido pelo fato de os genes trbLFGI, envolvidos na
transferência conjugal de proteínas que em B. japonicum encontram-se dentro da IS
nas coordenadas 1,773,989-1,794,230 em B. elkanii esta cópia não foi encontrada na
IS, até o momento. Entretanto outra região do mapa de B. japonicum um operon
contendo os genes trbIGFLJECBD nas ordenadas 9069292-9075942 é coincidente ao
operon trbIGFLJECDB (BE740, BE1444, BEBE1443, BE322, BE880, BE337, BE2361,
BE1060 e BE1061) de B. elkanii.
Outra característica importante consiste nos genes para possíveis transposases.
De um total de 101 genes para possíveis transposases localizado em B. elkanii, apenas
17 foram encontradas na ilha simbiótica, contrastando com os 167 que foram
encontradas em B. japonicum onde apenas 63 genes se encontram na ilha simbiótica.
As características estruturais e funcionais distintivas entre as ilhas simbióticas de B.
japonicum e B. elkanii podem ser interpretadas como conseqüência de sua emergência
evolutiva. Adicionalmente, em B. elkanii, um número de genes parece ser duplicado,
incluindo vários genes simbióticos (Tabela 7).
Na figura abaixo (Figura 7) comparamos as duas ilha simbiótica. Todas as
categorias dos genes observados na IS de B. japonicum também o foram na de B.
elkanii. Embora este último tenha um seqüenciamento ainda parcial algumas
semelhanças e diferenças podem ser observadas. Assim, na categoria biossíntese de
aminoácidos e biossíntese de cofatores, 5 genes foram encontrados em B. elkanii
contra os 6 de B. japonicum. Uma análise visual desta figura mostra as diferenças entre
as diversas categorias, entretanto, um destaque deve ser dado à “Outras categorias” na
qual estão incluídos os genes relacionados à fixação simbiótica do nitrogênio (Tabela 8
e 9 ) que estão presentes em B. elkanii em maior número (115) do que em B. japonicum
(87). A análise cuidadosa destes genes relacionados á FBN mostrada na tabela 7
revela que muitos genes têm número de cópias diferentes nas duas ilhas analisadas.
Se isto tem haver com o fato de o B. elkanii ser mais competitivo e eficiente na fixação
do nitrogênio é uma hipótese que vem sendo pesquisada no LBMP com o auxílio de
técnicas de expressão gênicas como os microarranjos de DNA e PCR em tempo real.
38
Figura 7: Gráfico representando o número de genes obsevados nas categorias
funcionais da região da Ilha Simbiótica de B. elkanii e das ORFs de B. japonicum.
Tabela 7: Genes relacionados com nodulação e fixação de nitrogênio entre B.
japonicum e B. elkanii, * indica o número de genes encontrados.
gene produto BJ BE
nodA Aciltransferase * *
nodB De-N-acetilase *
nodC Quitina sintase *
nodD Ativador transcricional da família LysR * *
nodE Beta-cetoacil sintase
nodF Proteína Acil carreadora
nodG Beta-cetoacil redutase *
nodH Sulfotransferase
nodI Transporte de fatores Nod * *
nodI Transporte de fatores Nod *
nodJ Proteína de secreção de polissacarídeo capsular *
nodK Desconhecida/Similar a nodY
nodL O-Acetiltransferase
nodM D-glicosamina sintase * *
nodM D-glicosamina sintase * *
nodN Desconhecida/Síntese de fator Nod *
nodO Hemolisina/Proteína formadora de poro
nodP ATP-sulfurilase/APS-quinse
39
nodQ ATP-sulfurilase/APS-quinse * * *
nodR Desconhecida
nodS Metiltransferase *
nodT Proteína de membrana/Transporte de fatores Nod?
nodU O-Carbamoiltransferase * * *
nodV Sensor, família regulatória de dois componentes * * * *
nodW Regulador, família regulatória de dois componentes * * * * *
nodX Exopolissacarídeo acídico codificado por exoZ
nodY Desconhecida * *
nodZ Fucosiltransferase * * *
nolA Regulador positivo da família MerR * *
nolB Sistema de secreção? * *
nolC Nodulação
nolD Regulador?
nolE Proteína periplasmática
nolF Transporte
nolG Transporte
nolH Transporte
nolI Transporte
nolJ Desconhecida
nolK Epimerase/Desidrogenase? * *
nolL O-Acetiltransferase
nolM Atuação com nodZ *
nolN Desconhecida *
nolO O-Carbamoiltransferase * * * * *
nolP Desconhecida
nolQ O-Carbamoiltransferase
nolR Repressor de genes nod
nolS Desconhecida
nolT Sistema de secreção?
nolU Sistema de secreção? * *
nolV Sistema de secreção? * *
nolW Sistema de secreção?
nolX Sistema de secreção? * *
nolY Desconhecida *
nolZ Nodulação normal
noeA Metil-transferase?
noeB Desconhecida
noeC Arabinosilação
noeD Desconhecida *
noeE Sulfatação de fucose *
noeE Sulfatação de fucose *
noeF Desconhecida
noeI O-Metiltransferase * *
noeJ Guanililtransferase
noeL Desidratase * * *
noeK Fosfomanomutase
40
nifA Regulador positivos dos genes nif, fix e outros * *
nifB Envolvido a biossíntese do FeMo-cofator * *
nifD Subunidade alfa da MoFe-proteína da nitrogenase * *
nifE Envolvido a biossíntese do FeMo-cofator * *
nifH Fe-proteína da nitrogenase * * * *
nifK Subunidade beta da MoFe-proteína da nitrogenase * *
nifN Envolvido a biossíntese do FeMo-cofator * * *
nifQ Processamento de molibdênio * * * *
nifS Cisteína desulfurase * * *
nifS Cisteína desulfurase * *
nifS Cisteína desulfurase * * * *
nifU Desconhecida
nifV Homocitrato sintase
nifW
Desconhecida; requerido para completa atividade da
Fe-Mo-proteína * * * *
nifX Desconhecida * *
nifZ Envolvido a biossíntese do FeS-cofator * * * * *
fixA Requerido para atividade nitrogenase; * * *
fixB Requerido para atividade nitrogenase; * * * *
fixC Requerido para atividade nitrogenase; * * * *
fixX
Requerido para atividade nitrogenase; similiaridade
com ferredoxinas * * * *
fixN
Induzido microaerobicamente; citocromo oxidase
ligada a membrana * * * *
fixO
Induzido microaerobicamente; citocromo oxidase
ligada a membrana *
fixQ
Induzido microaerobicamente; citocromo oxidase
ligada a membrana *
fixP
Induzido microaerobicamente; citocromo oxidase
ligada a membrana * *
fixG Processo redox acoplado a bomba de cátion *
fixH Processo redox acoplado a bomba de cátion
fixI Processo redox acoplado a bomba de cátion * * * *
fixS Processo redox acoplado a bomba de cátion *
fixL
Sistema regulatório de dois componentes sensível ao
oxigênio * * * *
fixJ
Sistema regulatório de dois componentes sensível ao
oxigênio * * * *
fixK Regulador transcricional
fixK2 Regulador transcricional * * * *
Rm
fixK' Cópia funcional de fixK
Bj
fixK1 Homólogo fiK de função desconhecida
fixR
Desconhecida e não essencial para fixação do
nitrogênio * *
fixR Desconhecida e não essencial para fixação do * * *
41
nitrogênio
ngrA Regulação de nifA
fixT Regulador transcricional
fixU Desconhedica
IV. 10. Genes relacionados à fixação simbiótica do nitrogênio
Genes relacionados a vários passos na fixação simbiótica do nitrogênio foram
idenficados no genoma de B. elkanii, listados em categorias de acordo com o
Rhizobase. A ausência de genes ainda não idetificados, ou não presentes, na ilha
simbiótica, foi muito maior para os genes relacionados à nodulação do que aqueles
envolvidos na fixação do nitrogênio. Alguns dos genes localizados na ilha simbiótica em
B. japonicum encontram-se aparentemente fora de uma possível ilha em B. elkanii. Por
exemplo, os genes nodB (BE2286) e nodC (BE2287), não identificados na suposta
região da ilha, foram encontrados numa outra região do genoma de B. elkanii.
Os genes relacionados à nodulção codificadores do fator Nod
quitooligosacaridíco (LCO), básico para nodulação foram encontrados (nodABC), assim
como um conjunto de genes codificadores de enzimas envolvidas na modificação deste
fator. Os genes nodI e nodJ parecem estar envolvidos na secreção deste fator, embora
apenas o primeiro tenha sido encontrado no genoma parcial de B. elkanii (BE2572).
Os genes nodABC são suficientes para síntese dos pentâmeros N-acetil-D-
glicosamina que possuem atividade simbiótica nas plantas. Contudo, genes nod
adicionais do tipo hsn permitem modificações químicas nos fatores Nod e contituem-se
no principais determinantes da especificidade ao hospedeiro, além de protegê-los da
degradação durante interação com as plantas (PERRET et al., 2000). As principais
modificações são: adição de ácidos graxos N-ligados ao terminal não-redutor do açúcar
42
(nodEF); 6-O-glicosilação do tipo arabinosilação (noeC) ou fucosilação (nofZ, nolK);
sulfatação (nodH, noeE); acetilação (nolL, nodX, nolL); N metilaçào e carbamoilação
(nodS, nodU, nolO); e 2-O-metilação (noeI). No genoma parcial de B. elkanii e presente
na suposta ilha simbiótica foram identificados as seguintes possíveis modificações nos
fatores Nod: glicosilações, sulfatações, carbomoilações, fucosilações e metilações.
Do cluster contendo os genes exoP (succinoglycan biosynthesis transport), exoZ
(provável exopolysaccharide) e 6 genes similares a glicosil transferase, todos
envolvidos na síntese de exopolissacarídeos apenas a exoP (BE1375) e uma glicosil
transferase (BE408) foi encontrado.
A seqüência para duas ORFs BE4784 e BE5295 apresentou alta similaridade
para 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase, esta enzima é fortemente
envolvida na redução da concentração de etileno durante o processo de formação de
nódulos.
Os genes nolK, noeL, nodM e noeD formam um cluster na IS em B. japonicum,
mas até o momento foi encontrado apenas os genes nolK (BE3328), noeL (BE3222),
nodM (BE5131) e nodQ (BE104).
Das quatro cópias do gene dnaJ em B. japonicum apenas duas foram
encontradas em B. elkanii (BE570 e BE1166), envolvidos na regulação de formação de
nódulos e fixação de nitrogênio.
Foram encontrados dos genes fixK2/fixLJ/fixNOPQ/fixGHIS de B. japonicum as
ORFs BE3825/BE4225, BE345/BE348, _, BE4350, _/BE1075, _, 596, _ para os
respectivos genes, menos para fixO, fixQ, fixH e fixS, que estão relacionadas a uma
cascata de sensibilidade ao oxigênio e alta afinidade ao terminal oxidativo requeridos
para respiração microanaróbica e fixação do nitrogênio nos nódulos.
43
Embora alguns destes genes não tenham sido ainda identificados, o gene fixN
codificador da citocromo oxidase simbiótica teve sua expressão analisada tanto in vitro
como em simbiose (SOUZA, 2006). Assim, é provável que mais de um dos reguladores
baseados na sensibilidade ao oxigênio estejam atuando em B. elkanii, neste caso a
cascata FiLJ-FixK2 e a cascata RegSR-NifA. A ilha simbiótica BE apresente os genes
fixLJ e nifA. Os genes nifHDK que sintetizam as subunidades do complexo enzimático
nitrogenase estão presentes na ilha BE. Os genes nif e fix são organizados em clusters
distintos cujas estrutura e localização genômica são fo tipo espécie-específica
(FISCHER, 1994).
44
V. Conclusão
A técnica de PCR usando “primers” específicos para um determinado gene
usando um conjunto (pool) de DNA é eficiente e agiliza na busca e identificação de um
clone que contém a seqüência alvo.
DNA e vetor de boa qualidade e isento de contaminates é de suma importância
para a construção de uma biblioteca e sequenciamento.
Devido ao grande número de dados de sequenciamento, a bioinformática é
essencial nos processos de análise e organização dos resultados.
O objetivo principal deste trabalho foi o de avaliar se B. elkanii também
apresentava uma ilha simbiótica tal qual o B. japonicum onde os genes relacioandos à
fixação simbiótica do nitrogênio estão localizados. Embora o genoma deste
microorganismo ainda não tenha sido totalmente seqüenciado as análises realizadas
sugerem a presença de uma ilha simbiótica em B. elkanii com semelhanças e
diferenças que a tornam única, uma vez que foram identificadas cerca de 80% dos
genes relacionados à ilha simbiótica em B. elkanii.
Tabela 8: Relação das ORFs de B. elkanii SEMIA 587 relacionados as ORFs da Ilha
Simbiótica de B. japonicum.
ORF id produto categ
BE 197
outer membrane protein 3.1
BE 198
putative peptidase 14.8
BE 200
alkyl hydroperoxide reductase 14.8
BE 201
iron-sulfur cofactor synthesis protein 5.3
BE 202
unknown protein 15.2
BE 208
hypothetical protein 15.1
BE 209
putative glutamine synthetase 1.4
BE 210
hypothetical protein 15.1
BE 211
putative amidotransferase subunit 14.8
BE 212
hypothetical protein 15.1
BE 226
putative transposase 14.6
BE 250
putative transposase 14.6
45
BE 255
putative transposase 14.6
BE 259
ABC transporter permease protein 13
BE 317
putative transposase 14.6
BE 320
10 KD chaperonin 4.3
BE 327
hypothetical protein 15.1
BE 356
C4-dicarboxylate transport protein 13
BE 366
hypothetical protein 15.1
BE 376
putative transposase 14.6
BE 381
putative transposase 14.6
BE 382
two-component response regulator 9
BE 466
two-component response regulator 9
BE 483
RhcT protein 4.6
BE 484
RhcU protein 4.6
BE 594
10 KD chaperonin (protein CPN10) 4.3
BE 595
60 KDA chaperonin 4.3
BE 698
two component regulator 14.7
BE 768
adenine phosphoribosyltransferase 10
BE 853
unknown protein 15.2
BE 859
unknown protein 15.2
BE 866
outer-membrane immunogenic protein precursor 3.1
BE 889
unknown protein 15.2
BE 892
putative amidotransferase subunit 14.8
BE 919
unknown protein 15.2
BE 920
unknown protein 15.2
BE 939
putative transposase 14.6
BE 1001
VirK protein homolog 9
BE 1033
HupD protein 5.6
BE 1053
6-O-carbamoyl transferase 14.7
BE 1054
transcriptional regulatory protein Fis family 9
BE 1273
putative transposase 14.6
BE 1300
hypothetical protein 15.1
BE 1301
hypothetical protein 15.1
BE 1410
hypothetical protein 15.1
BE 1452
dinitrogenase reductase protein 5.3
BE 1463
putative transposase 14.6
BE 1506
putative sugar hydrolase 6.7
BE 1515
putative carbonic anhydrase (EC 4.2.1.1) 5.6
BE 1536
unknown protein 15.2
BE 1553
hypothetical protein 15.1
BE 1630
probable maturase 14.6
BE 1631
putative transposase 14.6
BE 1640
putative transposase 14.6
BE 1685
nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain 5.3
BE 1704
hypothetical zinc protease 12.3
BE 1711
hypothetical protein 15.1
BE 1732
nodulation protein 14.7
BE 1734
nodulation protein 14.7
46
BE 1735
RhcN protein 4.6
BE 1788
coproporphyrinogen IIII dehydrogenase 2.3
BE 1855
putative transposase 14.6
BE 1881
60 KDA chaperonin 4.3
BE 1897
putative transposase 14.6
BE 1937
hypothetical protein 15.1
BE 2021
ABC transporter ATP-binding protein 13
BE 2098
putative transposase 14.6
BE 2134
unknown protein 15.2
BE 2152
alanine dehydrogenase 6.1
BE 2168
iron-molibdenum cofactor processing protein 5.3
BE 2169
nitrogenase molybdenum-cofactor synthesis protein 5.3
BE 2176
host-inducible protein A homolog 14.8
BE 2241
nitrogenase molybdenum-cofactor synthesis protein 5.3
BE 2242
nitrogenase molybdenum-cofactor synthesis protein 5.3
BE 2248
hydrogenase nickel incorporation protein 14.5
BE 2249
HupK protein 5.6
BE 2274
heat shock protein 4.3
BE 2286
nodulation chito-oligosaccharide deacetylase 14.7
BE 2287
chitin synthase 14.7
BE 2298
O-acetylhomoserine sulfhydrylase 1.2
BE 2389
ABC transporter ATP-binding protein 13
BE 2402
putative transposase 14.6
BE 2413
ABC transporter ATP-binding protein 13
BE 2450
putative transposase 14.6
BE 2482
putative acetyltransferase 14.8
BE 2512
similar to pantoate--beta-alanine ligase 6.1
BE 2515
probable pectinesterase 14.8
BE 2518
transcriptional regulatory protein GntR family 9
BE 2519
8-amino-7-oxononanoate synthase 2.1
BE 2520
biotin synthetase 2.1
BE 2527
uptake hydrogenase large subunit homolog 14.5
BE 2529
HupC protein homolog 5.6
BE 2594
unknown protein 15.2
BE 2596
hypothetical protein 15.1
BE 2597
unknown protein 15.2
BE 2612
hypothetical protein 15.1
BE 2626
unknown protein 15.2
BE 2628
unknown protein 15.2
BE 2632
hypothetical protein 15.1
BE 2641
nodulation protein 14.7
BE 2701
unknown protein 15.2
BE 2702
unknown protein 15.2
BE 2713
citrate-proton symporter 6.8
BE 2759
cytochrome P450 family protein 4.5
BE 2809
putative transposase 14.6
BE 2812
hypothetical zinc protease 12.3
47
BE 2845
uptake hydrogenase small subunit precursor homolog 14.5
BE 2873
unknown protein 15.2
BE 2874
unknown protein 15.2
BE 2892
putative transposase 14.6
BE 2893
putative transposase 14.6
BE 2896
unknown protein 15.2
BE 2902
heat shock protein 4.3
BE 2903
hypothetical zinc protease 12.3
BE 2924
hypothetical protein 15.1
BE 2927
C4-dicarboxylate transport protein 13
BE 2945
cold shock protein 4.3
BE 2966
putative transposase 14.6
BE 2989
RhcC2 protein 4.6
BE 2993
hypothetical protein 15.1
BE 2994
RhcN protein 4.6
BE 2995
RhcR protein 4.6
BE 2996
RhcQ protein 4.6
BE 3034
uptake hydrogenase small subunit precursor homolog 14.5
BE 3035
uptake hydrogenase precursor 14.5
BE 3036
uptake hydrogenase large subunit homolog 14.5
BE 3067
putative transposase 14.6
BE 3068
putative transposase 14.6
BE 3083
anthranilate phosphoribosyltransferase 1.1
BE 3101
hypothetical protein 15.1
BE 3102
hypothetical protein 15.1
BE 3134
putative transposase 14.6
BE 3143
molybdenum transport system permease protein 13
BE 3202
hypothetical protein 15.1
BE 3223
putative transposase 14.6
BE 3224
putative transposase 14.6
BE 3282
hypothetical protein 15.1
BE 3291
hypothetical protein 15.1
BE 3309
hypothetical protein 15.1
BE 3319
transcriptional regulatory protein LysR family 14.7
BE 3380
unknown protein 15.2
BE 3381
unknown protein 15.2
BE 3478
two component regulator 14.7
BE 3485
putative DNA-binding protein 14.8
BE 3531
heat shock protein 4.3
BE 3532
heat shock protein 4.3
BE 3583
hypothetical protein 15.1
BE 3644
hypothetical protein 15.1
BE 3645
RhcV protein 4.6
BE 3668
hypothetical protein 15.1
BE 3711
probable cation-transporting ATPase (EC 3.6.3.-) 13
BE 3744
heat shock protein 4.3
BE 3745
heat shock protein 4.3
48
BE 3853
putative transposase 14.6
BE 3877
putative glycosyl hydrolase 6.7
BE 3900
putative transposase 14.6
BE 3922
transcriptional regulatory protein Crp family 9
BE 3945
ferredoxin 6.9
BE 3947
C4-dicarboxylate transport protein 13
BE 3949
ABC transporter permease protein 13
BE 3978
putative transposase 14.6
BE 4023
hypothetical protein 15.1
BE 4025
hypothetical protein 15.1
BE 4058
putative transposase 14.6
BE 4070
putative transposase 14.6
BE 4072
putative transposase 14.6
BE 4078
hypothetical protein 15.1
BE 4091
citrate-proton symporter 6.8
BE 4135
hypothetical protein 15.1
BE 4148
hypothetical protein 15.1
BE 4149
unknown protein 15.2
BE 4159
putative transposase 14.6
BE 4219
NolY protein 14.7
BE 4274
carbonic anhydrase 5.6
BE 4275
hypothetical protein 15.1
BE 4361
putative transposase 14.6
BE 4390
nodulation protein 14.7
BE 4391
RhcC1 protein 4.6
BE 4392
RhcJ protein 4.6
BE 4394
hydrogenase maturation protein 14.5
BE 4404
ABC transporter substrate-binding protein 13
BE 4483
putative transposase 14.6
BE 4513
NodY protein 14.7
BE 4514
transcriptional regulatory protein LysR family 14.7
BE 4515
nodulation chito-oligosaccharide deacetylase 14.7
BE 4516
acyl transferase 14.7
BE 4526
putative transposase 14.6
BE 4528
putative transposase 14.6
BE 4542
putative transposase 14.6
BE 4556
10 KD chaperonin 4.3
BE 4558
60 KDA chaperonin 4.3
BE 4623
unknown protein 15.2
BE 4651
transcriptional regulatory protein MerR family 14.7
BE 4652
ABC transporter substrate-binding protein 13
BE 4664
probable maturase 14.6
BE 4665
unknown protein 15.2
BE 4666
unknown protein 15.2
BE 4667
unknown protein 15.2
BE 4691
putative transposase 14.6
BE 4762
probable polygalacturonase 14.8
49
BE 4777
hypothetical protein 15.1
BE 4778
8-amino-7-oxononanoate synthase 2.1
BE 4793
hypothetical protein 15.1
BE 4794
hypothetical protein 15.1
BE 4805
putative transposase 14.6
BE 4828
RNA polymerase sigma-54 subunit 11.2
BE 4878
hypothetical protein 15.1
BE 4879
hypothetical protein 15.1
BE 4880
unknown protein 15.2
BE 4881
hypothetical protein 15.1
BE 4883
unknown protein 15.2
BE 4884
hypothetical protein 15.1
BE 4885
RhcV protein 4.6
BE 4891
hypothetical protein 15.1
BE 4927
NolO protein 14.7
BE 4928
oxidoreductase 5.3
BE 4929
NolO protein 14.7
BE 4930
NodZ protein 14.7
BE 4952
unknown protein 15.2
BE 4962
unknown protein 15.2
BE 4963
hypothetical protein 15.1
BE 4999
putative transposase 14.6
BE 5028
putative transposase 14.6
BE 5029
putative transposase 14.6
BE 5062
unknown protein 15.2
BE 5063
hypothetical protein 15.1
BE 5064
hypothetical protein 15.1
BE 5065
hypothetical protein 15.1
BE 5072
probable ATP-binding protein 13
BE 5086
unknown protein 15.2
BE 5088
hypothetical protein 15.1
BE 5089
putative transposase 14.6
BE 5091
putative transposase 14.6
BE 5092
putative transposase 14.6
BE 5098
putative transposase 14.6
BE 5108
putative transposase 14.6
BE 5109
putative transposase 14.6
BE 5110
putative transposase 14.6
BE 5113
putative transposase 14.6
BE 5118
chaperonin GroEL 4.3
BE 5129
two-component response regulator 9
BE 5130
two component regulator 14.7
BE 5132
two component regulator 14.7
BE 5149
putative transposase 14.6
BE 5150
putative transposase 14.6
BE 5162
putative transposase 14.6
BE 5171
putative transposase 14.6
50
BE 5214
unknown protein 15.2
BE 5217
putative transposase 14.6
BE 5223
putative transposase 14.6
BE 5244
putative transposase 14.6
BE 5245
putative transposase 14.6
BE 5250
putative transposase 14.6
BE 5252
putative transposase 14.6
BE 5254
putative transposase 14.6
BE 5256
putative transposase 14.6
BE 5257
putative transposase 14.6
BE 5260
putative transposase 14.6
BE 5261
putative transposase 14.6
BE 5268
rtxA homolog 14.8
BE 5269
putative amidotransferase subunit 14.8
BE 5270
rtxA homolog 14.8
BE 5271
hypothetical protein 15.1
BE 5272
putative transposase 14.6
BE 5273
rtxA homolog 14.8
BE 5274
putative dihydrorhizobitoxine desaturase 14.8
BE 5275
hypothetical protein 15.1
BE 5276
putative glutamine synthetase 1.4
BE 5337
putative transposase 14.6
BE 5346
probable peptide synthetase 12.5
BE 5349
putative transposase 14.6
BE 5351
putative transposase 14.6
BE 5354
unknown protein 15.2
BE 5356
unknown protein 15.2
BE 5358
unknown protein 15.2
BE 5359
ferredoxin-like protein 5.3
BE 5360
nitrogen fixation protein 5.3
BE 5362
nitrogenase stabilizing/protective protein 5.3
BE 5363
iron-sulfur cofactor synthesis protein 5.3
BE 5364
probable ferredoxin 5.3
BE 5366
ferredoxin 5.4
BE 5367
hypothetical protein 15.1
BE 5369
alkyl hydroperoxide reductase 14.8
BE 5370
hypothetical protein 15.1
BE 5371
molybdenum processing protein 5.3
BE 5372
outer membrane protein 3.1
BE 5373
alkyl hydroperoxide reductase 14.8
BE 5375
dinitrogenase reductase protein 5.3
BE 5376
hypothetical protein 15.1
BE 5377
nitrogenase metalloclusters biosynthesis protein 5.3
BE 5378
electron transfer flavoprotein alpha chain 5.3
BE 5379
flavoprotein 5.3
BE 5380
FeMo cofactor biosynthesis protein 5.3
BE 5381
putative peptidase 14.8
51
Tabela 9: Relação das ORFs da Ilha Simbiótica de B.japonicum.
ORF id produto categ
BJ_ilha 5382
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5383
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5384
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5385
RhcS protein 4.6
BJ_ilha 5386
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5387
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5388
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5389
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5390
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5391
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5392
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5393
ABC transporter permease protein 13
BJ_ilha 5394
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5395
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5396
NolM protein 14.7
BJ_ilha 5397
putative amidotransferase subunit 14.8
BJ_ilha 5398
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5399
putative pyridoxine kinase (EC 2.7.1.35) 2.1
BJ_ilha 5400
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5401
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5403
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5404
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5405
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5406
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5407
NolZ protein 14.7
BJ_ilha 5408
HupD protein homolog 5.6
BJ_ilha 5409
HupK protein 5.6
BJ_ilha 5410
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5411
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5412
ferredoxin 6.9
BJ_ilha 5413
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5414
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5415
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5416
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5417
probable transcriptional regulator 9
BJ_ilha 5418
RhcR protein 4.6
BJ_ilha 5419
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5420
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5421
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5422
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5423
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5424
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5425
ferredoxin-like protein 5.3
BJ_ilha 5426
putative transposase 14.6
52
BJ_ilha 5427
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5428
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5429
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5430
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5431
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5432
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5433
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5434
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5435
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5436
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5437
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5438
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5439
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5440
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5441
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5442
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5443
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5444
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5445
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5446
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5447
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5448
two-component response regulator 9
BJ_ilha 5449
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5450
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5451
HupF protein homolog 5.6
BJ_ilha 5452
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5453
nitrogenase stabilizing/protective protein 5.3
BJ_ilha 5454
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5455
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5456
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5457
hydrogenase nickel incorporation protein 14.5
BJ_ilha 5458
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5459
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5460
HupC protein homolog 5.6
BJ_ilha 5461
GroES3 chaperonin 4.3
BJ_ilha 5462
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5463
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5464
ferredoxin 5.4
BJ_ilha 5465
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5466
putative bacA 14.7
BJ_ilha 5467
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5468
probable ferredoxin 5.3
BJ_ilha 5469
R. etli iscN homolog 5.3
BJ_ilha 5470
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5471
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5472
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5473
unknown protein 15.2
53
BJ_ilha 5474
NoeE homolog 14.7
BJ_ilha 5475
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5476
aspartate 1-decarboxylase precursor 1.2
BJ_ilha 5477
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5478
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5479
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5480
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5481
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5482
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5483
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5484
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5485
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5486
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5487
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5488
putative cold shock protein 4.3
BJ_ilha 5489
ferredoxin 5.4
BJ_ilha 5490
VirK protein homolog 9
BJ_ilha 5491
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5492
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5493
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5494
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5495
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5496
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5497
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5498
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5499
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5500
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5501
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5502
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5503
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5504
HupD protein homolog 5.6
BJ_ilha 5505
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5506
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5507
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5508
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5509
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5510
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5511
nodulation protein 14.7
BJ_ilha 5512
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5513
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5514
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5515
L-ectoine synthase 14.8
BJ_ilha 5516
two component regulator 14.7
BJ_ilha 5517
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5518
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5519
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5520
hypothetical protein 15.1
54
BJ_ilha 5521
HupK protein homolog 5.6
BJ_ilha 5522
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5523
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5524
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5525
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5526
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5527
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5528
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5529
ABC transporter ATP-binding protein 13
BJ_ilha 5530
alkyl hydroperoxide reductase 14.8
BJ_ilha 5531
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5532
carbonic anhydrase 5.6
BJ_ilha 5533
exonuclease subunit SbcD homolog 10
BJ_ilha 5534
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5535
putative acetyltransferase 14.8
BJ_ilha 5536
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5537
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5539
molybdenum transport system permease protein 13
BJ_ilha 5540
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5541
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5542
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5543
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5544
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5545
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5546
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5548
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5549
iron-sulfur cofactor synthesis protein 5.3
BJ_ilha 5550
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5551
N-methyl transferase 14.7
BJ_ilha 5552
NodY protein 14.7
BJ_ilha 5553
HupH protein homolog 5.6
BJ_ilha 5554
transcriptional regulatory protein MerR family 14.7
BJ_ilha 5555
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5556
transcriptional regulatory protein GntR family 9
BJ_ilha 5557
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5558
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5559
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5560
NoeE homolog 14.7
BJ_ilha 5562
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5563
similar to protease 12.3
BJ_ilha 5564
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5565
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5566
outer membrane protein 3.1
BJ_ilha 5567
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5568
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5569
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5570
nodulation protein 14.7
55
BJ_ilha 5571
transcriptional regulatory protein Crp family 9
BJ_ilha 5572
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5573
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5574
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5575
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5577
nodulation protein 14.7
BJ_ilha 5578
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5579
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5580
two-component response regulator 9
BJ_ilha 5581
nodulation chito-oligosaccharide deacetylase 14.7
BJ_ilha 5582
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5583
similar to zinc protease 12.3
BJ_ilha 5584
RhcC1 protein 4.6
BJ_ilha 5585
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5586
NolY protein 14.7
BJ_ilha 5587
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5588
RhcJ protein 4.6
BJ_ilha 5589
rtxA homolog 14.8
BJ_ilha 5590
RhcT protein 4.6
BJ_ilha 5591
transcriptional regulatory protein LuxR family 9
BJ_ilha 5592
NodJ protein 14.7
BJ_ilha 5593
exonuclease subunit SbcD homolog 10
BJ_ilha 5594
probable phosphotransferase 14.8
BJ_ilha 5595
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5596
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5598
host-inducible protein A homolog 14.8
BJ_ilha 5599
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5600
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5601
electron transfer flavoprotein beta chain 5.3
BJ_ilha 5602
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5603
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5604
putative sugar hydrolase 6.7
BJ_ilha 5605
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5606
ABC transporter permease protein 13
BJ_ilha 5607
similar to zinc protease 12.3
BJ_ilha 5608
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5609
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5610
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5611
molybdenum processing protein 5.3
BJ_ilha 5612
dinitrogenase reductase protein 5.3
BJ_ilha 5613
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5614
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5615
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5616
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5617
oxidoreductase 5.3
BJ_ilha 5618
similar to inosamine-phosphate amidinotransferase
14.8
BJ_ilha 5619
transcriptional regulatory protein LysR family 14.7
56
BJ_ilha 5620
pantoate--beta-alanine ligase 6.1
BJ_ilha 5621
nodulate formation efficiency C protein 14.7
BJ_ilha 5622
transporter of Nod factors 14.7
BJ_ilha 5623
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5624
similar to pantoate--beta-alanine ligase 6.1
BJ_ilha 5625
ribokinase 8.1
BJ_ilha 5626
exonuclease subunit SbcC homolog 10
BJ_ilha 5627
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5629
RhcU protein 4.6
BJ_ilha 5630
hydrogenase expression/formation protein 14.5
BJ_ilha 5631
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5632
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5633
anthranilate phosphoribosyltransferase 1.1
BJ_ilha 5634
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5635
transcriptional regulatory protein LysR family 14.7
BJ_ilha 5636
biotin synthetase 2.1
BJ_ilha 5637
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5638
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5639
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5640
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5641
alanine dehydrogenase 6.1
BJ_ilha 5642
RhcQ protein 4.6
BJ_ilha 5643
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5645
electron transfer flavoprotein alpha chain 5.3
BJ_ilha 5646
probable pectinesterase 14.8
BJ_ilha 5648
8-amino-7-oxononanoate synthase 2.1
BJ_ilha 5649
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5650
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5651
putative dihydrorhizobitoxine desaturase 14.8
BJ_ilha 5652
nitrogenase metalloclusters biosynthesis protein 5.3
BJ_ilha 5653
phenolhydroxylase homolog 14.8
BJ_ilha 5654
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5655
NodZ protein 14.7
BJ_ilha 5656
flavoprotein 5.3
BJ_ilha 5657
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5658
RhcC2 protein 4.6
BJ_ilha 5659
C4-dicarboxylate transport protein 13
BJ_ilha 5660
citrate-proton symporter 6.8
BJ_ilha 5661
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5662
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5663
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5664
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5666
cytochrome P450 family protein 4.5
BJ_ilha 5667
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5668
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5669
coproporphyrinogen IIII dehydrogenase 2.3
BJ_ilha 5670
rtxA homolog 14.8
57
BJ_ilha 5671
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5672
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5673
chitin synthase 14.7
BJ_ilha 5674
RhcN protein 4.6
BJ_ilha 5675
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5676
probable maturase 14.6
BJ_ilha 5677
HipA protein 5.6
BJ_ilha 5678
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5679
para-aminobenzoate synthase component I 1.1
BJ_ilha 5681
GroEL3 chaperonin 4.3
BJ_ilha 5682
putative glutamine synthetase 1.4
BJ_ilha 5683
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5684
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5685
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5687
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5688
ABC transporter substrate-binding protein 13
BJ_ilha 5689
RNA polymerase sigma-54 subunit 11.2
BJ_ilha 5690
probable polygalacturonase 14.8
BJ_ilha 5691
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5692
FeMo cofactor biosynthesis protein 5.3
BJ_ilha 5693
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5694
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5695
nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain 5.3
BJ_ilha 5696
nitrogenase molybdenum-iron protein beta chain 5.3
BJ_ilha 5697
hydrogenase maturation protein 14.5
BJ_ilha 5698
NolO protein 14.7
BJ_ilha 5699
DNA invertase 10
BJ_ilha 5701
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5702
RhcV protein 4.6
BJ_ilha 5703
6-O-carbamoyl transferase 14.7
BJ_ilha 5704
DNA invertase 10
BJ_ilha 5705
nif-specific regulatory protein 5.3
BJ_ilha 5706
putative transposase 14.6
BJ_ilha 5707
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5708
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5709
transcriptional regulatory protein Fis family 9
BJ_ilha 5710
uptake hydrogenase large subunit homolog 14.5
BJ_ilha 5711
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5712
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5713
exonuclease subunit SbcC homolog 10
BJ_ilha 5714
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5715
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5716
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5717
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5718
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5720
putative peptidase 14.8
BJ_ilha 5721
two component regulator 14.7
58
BJ_ilha 5722
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5723
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5724
unknown protein 15.2
BJ_ilha 5725
hypothetical protein 15.1
BJ_ilha 5726
probable peptide synthetase 12.5
59
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