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CONTROLE DO ERRO TIPO I EM UM
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS COM
EUCALIPTO
RENATO NUNES PEREIRA
2008
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Pereira, Renato Nunes.
Controle do erro tipo I em um experimento de microarrays com eucalipto /
Renato Nunes Pereira. – Lavras: UFLA, 2008.
56 p. : il.
Dissertação (Mestrado)- Universidade Federal de Lavras, 2008.
Orientador: Júlio Sílvio de Sousa Bueno Filho.
Bibliografia.
1. Eucalipto. 2. FDR 3. Microarrays. 4.transformação Box-Cox. I.
Universidade Federal de Lavras. II.Título.
CDD - 519.538
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RENATO NUNES PEREIRA
CONTROLE DO ERRO TIPO I EM UM EXPERIMENTO DE
MICROARRAYS COM EUCALIPTO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras, como parte das exigências do Programa
de Pós-graduação em Estatística e Experimentação
Agropecuária, para obtenção do título de "Mestre".
APROVADA em 15 de fevereiro de 2008.
Prof
a
. Dra. Luzia Aparecida Trinca UNESP
Prof. Dr. Paulo César Lima UFLA
Prof. Dr. Júlio Sílvio de Sousa Bueno Filho
UFLA
(Orientador)
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos ao professor Júlio Sílvio de Sousa Bueno Filho,
pela paciência com que me orientou, disponibilidade em auxiliar-me a qualquer
momento, pelas críticas e sugestões.
Aos meus pais, José e Santa, pela confiança, compreensão, carinho e apoio.
Aos meus irmãos, pelo carinho, compreensão e torcida em todos os momentos.
A todos os colegas de mestrado e doutorado em Estatística, especialmente a
Natascha, pela amizade e por ter sido minha grande companheira de estudo, e a
Dorival, Popó, Ricardo e Tiago, pelo apoio, amizade e por terem sido a minha
família aqui em Lavras.
Ao meu amigo Udi Florião que tem demonstrado muito carinho e preocupação
comigo. Obrigado pela força e disposição em sempre me ajudar.
À Dona Terezinha, por ter cuidado tão bem de mim aqui em Lavras.
Aos funcionários do Departamento de Ciências Exatas: Edila, Josi, Joyce,
Maria, Selminha e Vânia, pela simpatia e boa vontade no atendimento.
Aos professores do Departamento de Ciências Exatas, pelos ensinamentos
prestados.
À Universidade Federal de Lavras e ao Departamento de Ciências Exatas, pela
oportunidade da realização deste curso.
À CAPES, pela bolsa de estudos, essencial para a realização deste trabalho.
Aos demais que, direta ou indiretamente, contribuíram para a elaboração deste
trabalho.
E a Deus, por ter me dado tudo que eu sempre precisei, para que eu pudesse
tornar cada sonho em realidade.
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i
LISTA DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ii
RESUMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii
ABSTRACT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iv
1 INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2 REFERENCIAL TEÓRICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.1 A técnica dos microarrays de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.2 Normalização . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3 Análise de variância e transformação de dados . . . . . . . . . . . . . 8
2.4 Tipos de erro e testes múltiplos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.5 False discovery rate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3 MATERIAL E MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.1 Material experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.2 Modelo de análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.3 Aplicação do critério FDR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
4.1 Análise considerando os dados sem a transformação de Box-Cox . . . . 21
4.2 Análise considerando os dados com a transformação de Box-Cox . . . 28
4.3 Número de sondas combinando as duas análises . . . . . . . . . . . . . 34
5 CONCLUSÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
LISTA DE TABELAS
2.1 Número de erros cometidos ao se tratarem m hipóteses . . . . . . 12
3.1 Estrutura de fatores para o experimento com microarray. . . . . . 16
3.2 Esquema da análise de variância com os componentes de variância 19
4.1 Quadro-resumo da análise de variância referente à sonda de nú-
mero 4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
4.2 A Lista dos valores p observados, ordenados do menor para o
maior. A quarta coluna é o procedimento de controle do Benja-
mini & Hochberg (1995). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
4.3 Número de sondas com contrastes significativos a 1% dentre as 40. 27
4.4 Quadro-resumo da análise de variância referente à sonda de nú-
mero 4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.5 A lista dos valores p observados, ordenados do menor para o maior.
A quarta coluna é o procedimento de controle do Benjamini & Ho-
chberg (1995). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.6 Número de sondas com contrastes significativos, a 1% de signifi-
cância, dentre as 52 com efeito de tratamento significativo. . . . . 34
i
LISTA DE FIGURAS
2.1 Esquema da técnica de microarrays para arrays de duas cores e
uma cor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.2 Nível de significância conjunto em função do número de testes re-
alizados (m), considerando um nível de significância individual de
0,05. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3.1 Croqui da estrutura experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.1 Histograma de densidade dos 21413 valores p referente às sondas
analisadas com α = 5% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4.2 Histograma de densidade dos valores p que consideram diferenças
significaticas no experimento, após a aplicação do FDR com α
∗
=
5%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4.3 Histograma de densidade dos 21.413 valores p referentes às sondas
analisadas, com α = 5% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.4 Histograma de densidade dos valores p que consideram diferenças
significaticas no experimento após a aplicação do FDR, com α
∗
=
5%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.5 Estatística de Shapiro-Wilk para os dados não transformados (a) e
os dados transformados (b) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
ii
RESUMO
Pereira, Renato Nunes. Controle do erro tipo I em um experimento de micro-
arrays com eucalipto. 2008. 56 p. Dissertação (Mestrado em Agronomia/ Esta-
tística e Experimentação Agropecuária) - Universidade Federal de Lavras, Lavras,
MG.
*
No projeto Genolyptus, que busca identificar aspectos da genômica funcional do
eucalipto, foi instalado um experimento inicial utilizando 10 microarrays mono-
cromáticos da plataforma Nimblegen. Neste tipo de experimento são realizados
milhares de testes simultâneos para diferentes variáveis-resposta na mesma estru-
tura de unidades experimentais. No presente trabalho, estudaram-se as consequên-
cias da utilização da taxa de falsos positivos (FDR,Benjamini & Hochberg,1995)
na definição de sondas com maior potencial de manifestar expressão diferencial
em uma estrutura de tratamentos que representa altos e baixos teores de lignina.
Os cinco tratamentos utilizados nas primeiras unidades experimentais foram: T1:
Eucaliptus grandis, clone 1, amostra de folha; T2: Eucaliptus grandis, clone 1,
amostra de tronco; T3: Eucaliptus grandis, clone 2, amostra de folha; T4: Eu-
caliptus globulos, clone 3, amostra de folha e T5: Eucaliptus globulos, clone 4,
amostra de folha. Foram utilizadas repetições biológicas (um clone diferente) para
cada tratamento, nas demais unidades experimentais. No caso dos dados não trans-
formados, verificou-se, pelo teste de Shapiro-Wilk, que os resíduos da análise dos
dados de 1113 sondas não atendiam à pressuposição de normalidade. A trans-
formação de Box-Cox corrigiu o problema da não normalidade para 801 dessas
sondas, tendo sido detectada significância em 12 das 801 análises, para o efeito
de tratamentos. Para as demais sondas em que a análise resultou em resíduos
aproximadamente normais, 40 revelaram significância para o efeito de tratamen-
tos, perfazendo um total de 52 sondas a serem investigadas para os contrastes de
maior interesse. Usando o FDR e concluindo pelo teste "t"de Student, a 1% de
significância, foram significativas para o contraste Folha x Xilema em E.grandis
33 sondas; para o contraste E.grandis x E.globulos, foram significativas 43 sondas;
para o contraste entre clones dentro da E.grandis, foram significativas 36 sondas e,
para o contraste entre clones dentro de E.globulos, foram significativas 13 sondas.
O uso do procedimento FDR e a transformação Box-Cox apresentaram resultados
satisfatórios em reduzir o número de sondas, tornando possível montar estudos
posteriores sobre o potencial de expressão diferencial e de validação.
Palavras-chave: eucalipto, FDR, microarrays, transformação Box-Cox.
*
Comitê Orientador: Júlio Sílvio de Sousa Bueno Filho - UFLA. (Orientador)
iii
ABSTRACT
Pereira, Renato Nunes. Type I error rate control in a microarrays experiment
with eucalyptus. 2008. 56 p. Dissertation (Master in Agronomy /Statistics and
Agricultural Experimentation ) Federal University of Lavras, Lavras, MG.
*
Genolyptus project aims to identify features of functional genomics of Eucaly-
ptus sp. Within this project a microarray experiment using 10 Nimblegen platform
(monochromatic) slides was performed. In this type of experiment thousands of
simultaneous tests for different response variables are carried out in the same ex-
perimental units. In this work we investigate the consequences of applying False
discovery rates (FDR, Benjamini & Hochberg, 1995) to identify probes with gre-
atest potential of differential expression. The treatment structure comprises high
and low lignin content. Five treatments were established, namely: T1: Eucalip-
tus grandis, clone 1, leaf sample; T2: Eucaliptus grandis, clone 1, stem sample;
T3: Eucaliptus grandis, clone 2, leaf sample; T4: Eucaliptus globulos, clone 3,
leaf sample; T5: Eucaliptus globulos, clone 4, leaf sample. An extra biological
sample (a different clone) was established for each treatment combination. 1113
non-transformed response variables did not pass Shappiro-Wilk normality test and
were then transformed according to Box-Cox procedure. From the 801 normally
distributed response variables, after transformation, 12 showed significance of tre-
atment effects. For the remaining probes that passed normality test, 40 have shown
significance of treatment effects, resulting 52 probes to be investigated on specific
contrasts and further testing. Using FDR and "t" test at 1% significance level, for
the contrast E.grandis x E.globulos there where 43 significant probes. There were
33 significant contrasts between leaves and stems; 36 among clones of E.grandis
and 13 significant contrasts among clones of E.globulos. FDR procedure and Box-
Cox transformation had shown satisfactory results in reducing the number of pro-
bes to a number that can be handled in further validation studies of differential
expression.
Key-words: Box-Cox Transformation, Eucalyptus, FDR, Microarrays.
*
Guindance Committee: Júlio Sílvio de Sousa Bueno Filho - UFLA. (Adviser)
iv
1 INTRODUÇÃO
Experimentos para a detecção de genes com potencial de expressão diferen-
cial entre tecidos e órgãos para variáveis de importância econômica ou fisiológica
podem ser realizados com o auxílio de microarrays(microarranjos) de DNA. Nos
experimentos de microarrays são realizados milhares de testes de hipóteses simul-
tâneos para diferentes variáveis-resposta na mesma estrutura de unidades experi-
mentais.
Na análise de qualquer situação experimental, dois erros podem ser cometidos.
O erro tipo I, ou falso positivo, e o erro tipo II. Quando muitas hipóteses estão
sendo testadas, a chance de cometer o erro tipo I aumenta rapidamente com o
número de hipóteses, necessitando assim, de um procedimento de testes múltiplos
que controle a taxa do erro tipo I.
Uma estratégia que tem sido encontrada na literatura é a utilização de um pro-
cedimento proposto por Benjamini & Hochberg (1995), que controla a taxa de
falsos positivos (FDR, do inglês False discovery rate). A FDR é definida como a
proporção esperada de falsos positivos entre todas as hipóteses nulas rejeitadas.
O procedimento FDR tem sido aplicado em áreas diversas, como por exemplo
em análise de microarrays de DNA. Os microarrays são utilizados em experimen-
tos para a detecção de genes com potencial de expressão diferencial entre tecidos
e órgãos para variáveis de importância econômica ou fisiológica.
Em um projeto que buscou identificar aspectos da genômica funcional do eu-
calipto, projeto Genolyptus, foi instalado um experimento inicial utilizando 10
microarrays monocromáticos da plataforma Nimblegen. O objetivo central era
determinar espécies, tecidos e órgãos com expressão diferencial para o teor de
lignina. O teor de lignina é um caráter de importância tecnológica no aproveita-
1
mento do eucalipto, seja para a diminuição dos teores na polpa de celulose para a
indústria de papel ou para o aumento dos teores em madeira de corte e energia.
Este trabalho foi realizado com o objetivo de analisar um experimento com
10 slides do programa de genética funcional de eucalipto (Genolyptus) e verificar
em que a medida transformação de dados e o uso de FDR melhoram os resultados
deste experimento.
2
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 A técnica dos microarrays de DNA
Os microarrays de DNA constituem uma tecnologia muito recente e, atual-
mente, apresentam-se como sendo a de maior potencial na solução de problemas
para a biologia, sendo amplamente utilizada para analisar o padrão de expressão
gênica, uma vez que permite a verificação da manifestação de milhares de genes
simultaneamente. Atualmente, os microarrays podem ser usados para distintos
tipos de análises, como por exempo, em análise de expressão gênica, detecção
de polimorfismos, re-sequenciação genética, genotipagem e escalagem genômica
(Schena et al., 1996).
O primeiro microarray de DNA com 45 sondas de cDNA (ácido desoxirribo-
nucléico complementar, seqüência de um determinado gene) foi introduzido por
Schena et al. (1995). O progresso tecnológico dos microarrays de DNA foi ex-
tremamente rápido; em 1996, publicações com 1.000 sondas de arrays já haviam
sido apresentadas (Schena et al.; Shalon et al.) Hoje, são comuns arrays com deze-
nas de milhares de sondas. A empresa pioneira no campo foi a Affymetrix (Santa
Clara, CA, E.U.A.), que trabalhou com a metodologia de microarrays de uma só
cor ou canal.
Na tecnologia de microarrays com lâminas(slides) de vidro, diversas seqüên-
cias de DNA conhecidas (produtos de PCR, polymerase chain reaction, ou reação
em cadeia por polimerase, oligonucleotídeos), as chamadas sondas, é impressa em
uma lâmina. A partir do RNA de duas condições distintas é preparado o cDNA,
em que são incorporados nucleotídeos marcados com fluorescência distinta Cy3
(verde) e Cy5 (vermelho). No caso da metodologia de microarray de duas cores,
há duas populações de cDNA marcados que são submetidas, simultaneamente, à
3
hibridização com a lâmina contendo as sondas de interesse, permitindo que os al-
vos presentes em solução sejam pareados e assim possam revelar a expressão dos
genes. Haverá competição entre as duas populações de cDNA pelas sondas e a
resposta final é um resultado relativo de expressão entre as duas populações.
No caso de microarrays de uma só cor, uma população de cDNA é hibridizada
às sondas de um slide. Para a preparação dos microarrays, utilizam-se robôs alta-
mente precisos, que aplicam as diferentes amostras de DNA em diminutos pontos
(spots) no centro dos slides, com densidade aproximada de 10.000 pontos/cm
2
.
Microarray de
duas cores
Microarray de
uma cor
Células ou
Tecidos
Células ou
Tecidos
Total de
RNA
extraído
Total de
RNA
extraído
Síntese de
cDNA de fita
dupla
cDNA marcado
com
fluorescentes
distintos
(Cy5 / Cy3)
Hibridação das
amostras
cRNA marcado
com biotina
Imagem do array
das amostras
hibridizadas
competitivamente
Imagens dos
arrays das
amostras
hibridizadas
individualmente
FIGURA 2.1: Esquema da técnica de microarrays para arrays de duas cores e uma
cor .
4
Segundo Kokko (2006), nos arrays de duas cores, duas amostras de RNA são
submetidas a reações de transcrição reversa em paralelo, cada uma recebendo um
corante diferente Cy3 ou Cy5 . As duas amostras são purificadas, desnaturadas e
colocadas, simultaneamente para hibridizar com a lâmina contendo os clones de
interesse. Após as devidas lavagens, o slide é lido em um scanner, a imagem é
interpretada por um software específico e os dados são analisados por ferramentas
estatísticas.
Nos arrays de uma cor, um procedimento de transcrição reversa é usado para
produzir cDNA de fita dupla, que é transcrito e amplificado in vitro para cRNA
marcado com biotina. O cRNA biotinizado é, então, fragmentado e hibridizado
no chip. Após a hibridização, o cRNA não hibridizado é removido do array e o
chip é submetido a uma série de lavagens e etapas de coloração, em que o corante
fluorescente streptavidin-phycoerythrin (SAPE) liga com a biotina do cRNA mar-
cado. Finalmente, o array é digitalizado usando-se um laser que excita o corante
fluorescente. O processo de leitura da imagem é o mesmo que o de arrays de duas
cores.
A síntese de microarray usando a tecnologia do sistema Nimblegen, usado na
obtenção dos dados analisados neste trabalho, é muito similar à tradicional síntese
de "Short oligos"da Affymetrix, com algumas exceções importantes. A técnica de
impressão é diferente, pois não usa agulhas, jato de tintas e nem máscaras fotoli-
gráficas, mas microespelhos especialmente desenvolvidos para minimizar artefatos
de revelação.
Segundo Cristo (2003), existem outros tipos de substratos que podem ser u-
sados para a fixação dos cDNAs, como é o caso das membranas de náilon (que
apresentam certas diferenças em relação às lâminas de vidro). As membranas são
fisicamente maiores, assim como seus "spots"(ou pontos de impressão) e a dis-
5
tância entre eles (plataforma conhecida na literatura por cDNA Array, em vez de
microarray); a quantidade de "spots "é, em geral, menor e as superfícies são poro-
sas, ao contrário das lâminas de vidro que são completamente lisas (rígidas). Este
último detalhe é importante, pois o material fixado não fica exposto diretamente,
como no vidro. Nas membranas de náilon não existe marcação com fluorescência,
sendo utilizado um marcador radioativo. Por essa razão, esse tipo de experimento
também é conhecido como microarray de um canal, dado que somente uma amos-
tra de mRNA pode ser testada por experimento.
O maior mérito da técnica de microarrays está na possibilidade de observar o
padrão de expressão de um grande número de genes em um único ensaio. Lâminas
de oligonucleotídeos de alta densidade chegam a conter representantes de todo o
genoma de um organismo em uma única lâmina.
A enorme quantidade de dados gerada por esta técnica e a complexidade envol-
vida dificultam a comparação dos dados encontrados por diferentes grupos. Dados
de microarrays , geralmente, não se apresentam em valores absolutos, mas em dife-
renças relativas. O contexto no qual cada ensaio é realizado, o organismo ou o tipo
celular utilizado, as diferentes plataformas de microarray e as formas diversas de
extração de imagem e normalização de dados numéricos estão entre os principais
fatores que dificultam a comparação e a interpretação dos resultados de experi-
mentos diferentes. Um problema que, em geral, ocorre nestes experimentos é que,
devido ao alto custo, em geral, há poucos arrays disponíveis, o que resulta em um
experimento com muitas variáveis resposta e poucas unidades experimentais.
Com a intenção de organizar os dados gerados, um grupo de especialistas se
reuniu para elaborar o MIAME, ou minimum information about a microarray ex-
periment (Brazma et al., 2001). No MIAME, são reunidas sugestões a respeito de
informações sobre delineamento do experimento, desenho do chip de DNA, trata-
6
mentos e obtenção das amostras de RNA, parâmetros de hibridização, medidas de
imagens, formas de normalização e até mesmo vocabulário empregado. O objetivo
é disponibilizar, de forma ordenada, informações que tornem mais fácil a interpre-
tação correta dos dados gerados em cada experimento. Atualmente, já existem
alguns bancos de dados de expressão gênica que permitem a busca e a comparação
entre os resultados obtidos (Gene Expression Omnibus − NCBI ; ArrayExpress −
EBI ; DNA data base of Japan).
2.2 Normalização
A razão de expressão dos experimentos deveria variar apenas em função da
questão biológica, e não da tecnologia empregada, no entanto, como qualquer ou-
tra tecnologia, os microarrays têm problemas experimentais, que fazem com que
pessoas que os lêem cometam alguns erros, que podem mascarar ou alterar o resul-
tado da análise final. Isto é bastante agravado por se observar um número grande
de variáveis respostas. Alguns exemplos de fatores que podem gerar erros são
as diferenças na eficiência de incorporação e de brilho dos dois fluoróforos usa-
dos, a posição do spot no slide, a intensidade do spot, a qualidade do spotter, a
iluminação de fundo, as variações do scanner, as variações entre experimentos e
outros. Estes erros experimentais são particularmente problemáticos quando são
feitas buscas por variações sutis, quando é possível ocorrer o mascaramento ou,
mesmo, a sobreposição do erro sobre a leitura, causando erros de análise. É evi-
dente que a normalização, bem como a análise estatística dos dados, é um passo
determinante em ensaios de microarrays.
Para o microarray de duas cores, a razão de expressão costuma ser expressa
em escala logarítmica. Ao chamar um dos canais de R (red, ou vermelho, cor
associada ao corante Cy5) e o outro de G (green, ou verde, cor associada ao corante
7
Cy3), é possível dizer que a razão de expressão entre os dois canais (M) é:
M = log
2
R − log
2
G = log
2
(
R
G
). (2.1)
A intensidade dos spots costuma ser expressa pela equação, representada por A:
A = (log
2
R + log
2
G)/2, ou seja, a média dos logs das intensidades.
Para o microarray de uma cor, a normalização é simplesmente log da intensi-
dade luminosa(Y), como na expressão 2.2.
B = log
2
Y (2.2)
Não existe um método ideal para a normalização dos dados de microarrays,
mas diferentes métodos que são eficientes em condições específicas.
2.3 Análise de variância e transformação de dados
Segundo Cox & Reid (2000), a análise de variância é uma técnica desenvolvida
por Fisher entre 1920 e 1930 para análise e interpretação de dados experimentais.
Para a utilização dessa técnica, algumas pressuposições básicas devem ser satis-
feitas, entre elas a independência e a normalidade dos erros.
Em técnicas de análise em grande escala, como microarrays, em que a quan-
tidade de dados gerada é muito grande, o tratamento e a análise dos dados são
etapas muito trabalhosas e sujeitas a erros. Em ensaios de microarrays, a variável
que se deseja analisar é a razão da hibridização entre duas amostras de cDNA que
competem por um mesmo sítio, o que é obtido pela intensidade de fluorescência
emitida por cada uma das amostras. O que torna a análise ainda mais complexa é
a comparação de diversas amostras entre si, uma vez que os ensaios, neste caso,
são feitos aos pares. Para tanto, há que se fazer um plano experimental cuidadoso,
8
levando-se em consideração a disponibilidade de material e a precisão do resultado
final.
O uso de tranformações não lineares é uma das possíveis formas de contornar
o problema de dados que não obedecem aos pressupostos da análise de variância.
Box & Cox (1964) sugeriram uma família de transformações baseada em uma fun-
ção de verossimilhança, para a escolha de transformações adequadas que tornam
o modelo linear, homocedástico e normal, conforme a seguinte expressão:
Y
λ
=
Y
λ
− 1
λ
se λ = 0
log(Y ) se λ = 0,
em que: log(Y ) é o logaritmo neperiano e esta família é válida para Y > 0. O pro-
cedimento de Box-Cox utiliza o método de máxima verossimilhança para estimar
λ. Uma vez obtido o valor de λ, encontram-se os valores dos dados transforma-
dos conforme a equação acima e utilizam-se estes dados para efetuar a análise de
variância.
2.4 Tipos de erro e testes múltiplos
Segundo Mood et al. (1974), o erro tipo I é definido como o erro que se
comete ao rejeitar a hipótese nula, quando esta é verdadeira (α) e o erro tipo II,
como o erro que se comete ao não rejeitar a hipótese nula, quando na verdade ela
é falsa (β). O poder de um teste é definido também, pelos mesmos autores, como
a probabilidade de rejeitar a hipótese nula H
0
, quando ela é falsa (1 − β).
Freqüentemente, a preocupação em controlar o erro tipo I ocorre em experi-
mentos em que há muitos tratamentos e contrastes de interesse não ortogonais. O
grande número de hipóteses a ser testada simultaneamente gera o problema dos
9
chamados testes de comparações múltiplas.
Quando trabalhamos neste tipo de pesquisas, surge o problema que se refere
ao nível de significância conjunto da análise e, conseqüentemente, o seu poder,
pois o nível de significância conjunto aumenta à medida que aumenta o número de
testes realizados. Adotando-se um nível de significância (α) para cada teste, tem-
se o nível de significância conjunto do teste(α
∗
). Considerando-se os m testes
independentes será:
α
∗
= probabilidade de rejeitar a hipótese nula verdadeira em pelo menos um
teste, ou seja,
α
∗
= 1− probabilidade de não rejeitar hipótese nula verdadeira em nenhum
teste, isto é,
α
∗
=1 − (1 − α)
m
Suponha que 10 hipóteses estão sendo testadas com α = 5% (assumindo testes
independentes). A probabilidade de se rejeitar a hipótese nula verdadeira em um
teste é de 0,05, mas a probabilidade de se rejeitar hipótese nula verdadeira em
pelo menos um teste é de 0,401. Se forem executados 20 testes de hipóteses, a
probabilidade aumenta para 0,642. Pelo gráfico da Figura 2.2, observa-se como
se comporta o nível de significância, à medida que aumenta o número de testes
realizados.
10
FIGURA 2.2: Nível de significância conjunto em função do número de testes rea-
lizados (m), considerando um nível de significância individual de 0,05.
Benjamini & Hochberg (1995) sugeriram um novo ponto de vista para o pro-
blema dos testes múltiplos. Eles propuseram controlar a FDR, em casos quando
todos os m testes são independentes e por Benjamini & Yekutieli (2001) quando
os testes são positivamente correlacionados.
2.5 False discovery rate
Segundo Silva (2001), para contornar alguns dos problemas encontrados nos
testes de comparações multiplas, Benjamini & Hochberg (1995) propuseram con-
trolar a FDR, definida como sendo a proporção de hipóteses nulas H
0
verdadeiras,
entre as hipóteses nulas rejeitadas, ou seja, a proporção de erros devido à rejeição
errônea de H
0
verdadeiras, também chamada proporção de falsos positivos.
11
TABELA 2.1: Número de erros cometidos ao se tratarem m hipóteses
Não rejeitadas Rejeitadas Total
H
0
verdadeira U V m
0
H
0
F alsas W S m − m
0
Total m − R R m
Para melhor compreensão desse procedimento, considere-se que sejam testa-
das m hipóteses (H
0
), das quais um determinado número m
0
seja verdadeira e
que R das m hipóteses foram rejeitadas. Os dados da Tabela 2.1 resumem a situa-
ção apresentada. R e m são variáveis observaveis e U, V, S, W e m
0
são variáveis
aleatórias não observáveis. Em termos dessas variáveis aleatórias, o nível de signi-
ficância global, ou FWER, ou familywise error rate, como definido pelos autores,
é P (V ≥ 1).
A proporção de erros devido à falsa rejeição é dada pela variável aleatória
Q =
V
V +S
=
V
R
; naturalmente, define-se Q = 0 quando R = 0. Q é uma variável
aleatória não observável. Assim, define-se a FDR, Q
e
; como sendo a esperança
matemática de Q, isto é, Q
e
= E
V
V +S
= E
V
R
.
De acordo com Benjamini & Hochberg (1995), duas propriedades dessa razão
de erros decorrem imediatamente:
1. se todas as hipóteses (H
0
) forem verdadeiras, a FDR é equivalente a FWER.
Neste caso, S = 0 e V = R. Portanto, se V = 0 ⇒ Q = 0 e V ≥ 0 ⇒ Q = 1,
P (V ≥ 1) = E(Q) = Q
e
. Desse modo, controlar a FDR implica, grosso modo,
em controlar a FWER;
2. quando m
0
≤ m, a FDR é menor que ou igual a FWER; nesse caso, se V
> 0, decorre que
V
R
≤ 1 e tem-se: P (V≥ 1)≥ Q
e
. Resulta daí que qualquer
procedimento que controle a FWER também controla FDR. No entanto, se um
procedimento controlar apenas a FDR, ele poderá ser menos restrito e um ganho
em poder deverá ser esperado. Em particular, quanto maior o número de hipóteses
12
falsas, maior tende a ser S e, conseqüentemente, a diferença entre as razões de
erros (FDR e FWER). Decorre, pois, que o potencial de aumento do poder é tanto
maior quando maior for o número de hipóteses falsas.
Controlar a variável aleatória Q em cada teste é muito desejável. Porém, isso é
impossível, pois, se m
0
= m e se ao menos uma hipótese for rejeitada,
V
R
= 1 e Q
não poderá ser controlada. Controlar
V
R
|R > 0 apresenta o mesmo problema, ou
seja, é igual a um, na mesma situação; consequentemente, E(
V
R
|R > 0) não pode
ser controlada. A FDR é, então P (R > 0)E(
V
R
|R > 0), que pode ser controlado,
como demonstrado por Benjamini & Hochberg (1995).
O procedimento para determinar o ponto de corte em testes múltiplos, contro-
lando a FDR, pode ser realizado do seguinte modo (Benjamini & Hochberg, 1995):
para cada uma das hipóteses a serem testadas H
0
1
, H
0
2
, ..., H
0
m
, obter o valor da
estatística teste e o correspondente valor p (probabilidade sob a hipótese H
0
, de
obter um valor ou igual ou superior ao obtido para estatística teste), P
1
, P
2
, ...,-
P
m
.
Em seguida, ordenar os valores P
i
. Seja P
(1)
, P
(2)
, ..., P
(m)
os valores de P or-
denados e H
0
i
a hipótese correspondente. Definindo q =
mP
i
i
, a FDR pode ser
controlada em um nível q
∗
, determinando-se o maior i, para o qual:
q
∗
≥
mP
i
i
.
Para melhor compreensão do procedimento, considere-se o exemplo apresen-
tado por Benjamini & Hochberg (1995), em que foram realizados 15 testes de
hipóteses, e que os P
(i)
s, ordenados, tenham sido:
0, 0001; 0, 0004; 0, 0019; 0, 0095; 0, 0201; 0, 0278 0, 0298; 0, 0344; 0, 0495;
0, 3240; 0, 4262; 0, 5719; 0, 6528 0, 7590; 1, 0000. Considere-se, ainda, que se
deseje obter um nível de significância conjunto, α
∗
= 0, 05, que se equivale a um
13
FDR de 5%. Caso todas as hipóteses sejam verdadeiras, tem-se que
0, 05 ≥
15P
(i)
i
Assim, para P
(4)
= 0, 0095 ⇒0, 05 ≥ 0, 0356;P
(5)
= 0, 0201⇒0, 05 ≤ 0, 0603,
portanto, deve-se rejeitar todas as hipóteses com valores p menores ou iguais a
0,0095.
O procedimento FDR tem sido aplicado em áreas diversas, quanto à análise de
microarrays, para encontrar genes co-expressados (Tusher et al., 2001; Efron et al.,
2001; Efron & Tibshirani, 2002; Dudoit et al., 2003) e nas aplicações psicológicas
(Keselman et al., 1999), além de outras aplicações. A técnica da FDR vem sendo
empregada com sucesso em microarrays, não porque haja muitos tratamentos, mas
porque há muitas variáveis respostas, o que leva à necessidade de reduzir o número
de conclusão de falsos positivos para poder manejar, em experimentos posteriores,
apenas as variáveis mais promissoras.
14
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material experimental
Os dados foram gentilmente cedidos pelo professor Alexandre Siqueira Gue-
des Coelho da Universidade Federal de Goiás-UFG e referem-se a estudos iniciais
do projeto genoma funcional do eucalipto (Genolyptus). O objetivo deste estudo
usando microarrays foi determinar o controle das vias genéticas da produção de
lignina, que é uma substância que confere características estruturais à madeira.
As sondas de 21413 cDNAs produzidas pelo programa foram montadas em uma
plataforma Nimblegen.
Para o presente estudo, utilizaram -se dados de Eucaliptos em um experimento
de microarrays, que visava entender melhor a variabilidade natural dos genes de
eucaliptos, como por exemplo as diferenças entre espécies, diferenças entre clones
dentro de espécies e diferenças entre indivíduos no mesmo tratamento.
Cada dado observado provém de nove réplicas da sonda dentro de um bloco,
dentro do slide. O quadrado médio da fonte de variação T/S (slide dentro de trata-
mento) é considerado como a estimativa do erro experimental para a presença do
efeito de tratamento. Se for tomado o resíduo da análise como a estimativa do erro
experimental, o poder do teste estará superestimado, sendo esta a análise padrão
da maior parte dos softwares estatísticos. A estrutura experimental para cada uma
das variáveis resposta é descrita na Tabela 3.1
15
TABELA 3.1: Estrutura de fatores para o experimento com microarray.
Bloco Tratamento Indivíduo "Slide" Espécie Clone "Ramet" Tecido
1 1 1 1 grandis 1 1 Folha
1 1 1 2 grandis 1 2 Folha
1 2 1 3 grandis 1 1 Xilema
1 2 1 4 grandis 1 2 Xilema
1 3 2 5 grandis 2 3 Xilema
1 3 2 6 grandis 2 4 Xilema
1 4 3 7 globulos 3 5 Xilema
1 4 3 8 globulos 3 6 Xilema
1 5 4 9 globulos 4 7 Xilema
1 5 4 10 globulos 4 8 Xilema
2 1 1 1 grandis 1 1 Folha
2 1 1 2 grandis 1 2 Folha
2 2 1 3 grandis 1 1 Xilema
2 2 1 4 grandis 1 2 Xilema
2 3 2 5 grandis 2 3 Xilema
2 3 2 6 grandis 2 4 Xilema
2 4 3 7 globulos 3 5 Xilema
2 4 3 8 globulos 3 6 Xilema
2 5 4 9 globulos 4 7 Xilema
2 5 4 10 globulos 4 8 Xilema
grandis : Eucalyptus grandis
globulos: Eucalyptus globulos
16
FIGURA 3.1: Croqui da estrutura experimental.
.
.
.
17
3.2 Modelo de análise
Foram feitas análises de variância para cada sonda. Os cinco tratamentos uti-
lizados foram:
T1: Eucaliptus grandis, clone 1, amostra de folha;
T2: Eucaliptus grandis, clone 1, amostra de tronco;
T3: Eucaliptus grandis, clone 2, amostra de folha;
T4: Eucaliptus globulos, clone 3, amostra de folha
T5: Eucaliptus globulos, clone 4, amostra de folha.
o modelo estatístico é y
ijk
= µ + t
i
+ s
(i)j
+ e
ijk
sendo, µ uma constante inerente a todas as observações;
t
i
com i = 1,...5 é o efeito fixo de tratamentos;
s
(i)j
com j = 1,2 é o efeito do slide j dentro do tratamento i;
e
ijk
com k = 1,2 é o erro experimental.
Os dados da Tabela 3.2 indicam que o teste F correto para a presença de efeito
de tratamento é dado pela divisão do quadrado médio de T (tratamento) pelo qua-
drado médio de T/S (slide dentro de tratamento), que é a estimativa do erro expe-
rimental.
Para as sondas que resultaram significativas para efeito de tratamento, foram
investigados os contrastes de interesse.
Contraste1: E.grandis x E.globulos.
2T1 + 2T2 + 2T3 - 3T4 - 3T5
Contraste2: Clone dentro de espécie
2:1 T1 + T2 - 2T3
2:1 T4 - T5
Contraste3: Folha versus xilema em E.grandis
2T1 - T2 - T3
18
TABELA 3.2: Esquema da análise de variância com os componentes de variância
FV G.L. QM E(QM) F
T I Q
1
(σ
2
+ Kσ
2
s
)+ JKσ
2
t
Q
1
/Q
2
T/S I(J-1) Q
2
(σ
2
+ Kσ
2
s
)
Resíduo IJ(k-1) Q
3
σ
2
Segundo Montgomery (2001), a metodologia estatística usada, ANAVA, as-
sume que os dados são normalmentes distribuídos, com variância constante e in-
dependente da média dos dados. Quando os dados não satisfazem tais hipóteses,
é possível que o uso de transformação não lineares da variável resposta resolva o
problema. Inicialmente foi feita uma análise considerando apenas a normalização
original, que é o logaritmo da intensidade luminosa, um procedimento comum em
experimentos de microarrays. Ao verificar através do teste Shapiro-Wilk que os
dados não obedeciam a pressuposição de normalidade, foi feita uma transformação
de Box-Cox e em seguida uma nova análise pôde ser realizada. Para a transfor-
mação de Box-Cox, considerou-se que λ pode variar no intervalo de [−3, 3]. Para
aproximar do valor de λ, este intervalo foi dividido em 100 partes iguais. Como
um experimento de microarrays mede níveis de expressões para milhares de ge-
nes simultaneamente, foi utilizado o critério FDR para garantir um nível global de
0.05 e 0.01.
3.3 Aplicação do critério FDR
A identificação de genes diferencialmente expressos é feita essencialmente por
um teste de hipóteses, aplicado a cada sonda. Para controlar os falsos positivos en-
contrados numa abordagem como esta, que envolve testes simultâneos em 21.413
sondas, foi feita a aplicação do procedimento FDR. Para cada uma das hipóteses
19
H
0
1
, H
0
2
, ..., H
0
21413
, obteve-se o correspondente valor p P
i
, i = 1, 2, ..., 21413
(probabilidade, sob a hipótese H
0
, de obter um valor ou igual ou superior ao ob-
tido para a estatística teste num experimento futuro).
Em seguida, ordenaram-se os valores P
i
. Sejam P
(1)
, P
(2)
, ..., P
(21413)
os valores
p ordenados e H
0
1
, H
0
2
, ..., H
0
21413
, as hipóteses correspondentes. Desejam-se
um nível de significância conjuto α
∗
. Caso todas as hipóteses sejam verdadeiras,
tem-se que
α
∗
≥
21413P
(i)
i
. (3.1)
O mesmo critério foi aplicado aos contrastes de interesse, nos casos em que fo-
ram constatadas diferenças significativas entre os tratamentos e para obter o valor
p corrigido para cada sonda, utiliza-se a equação de 3.1.
Os cálculos foram feitos utilizando-se o software R, versão, 2.3.1 (R Core
Development Team, 2006).
20
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nesta seção encontram-se os resultados que estão organizados da seguinte
forma: inicialmente, os resultados referente à análise em que os dados não fo-
ram transformados, considerando diferentes níveis de significância, com e sem a
aplicação do procedimento FDR. Estes resultados foram apresentados em uma ta-
bela única que, apesar de extensa, permite dar continuidade à seleção das melhores
sondas para trabalhos posteriores. Em seguida, apresenta-se um quadro que dispõe
os resultados referentes a cada contraste de interesse estudado. Por conveniência
prática no estabelecimento de rotinas R que fizessem todas as análises de uma só
vez, os mesmos procedimentos foram usados para os dados não tranformados e
para os transformados. A apresentação dos resultados segue da mesma forma para
os dados transformados e, por último, encontra-se uma figura refente à função de
densidade da estatística de Shapiro-Wilk, aplicada respectivamente aos resíduos
das análises dos dados não transformados e transformados, que permite discutir o
efeito desta transformação.
4.1 Análise considerando os dados sem a transformação de Box-Cox
Para cada uma das 21.413 sondas, foi obtido uma análise de variância como a
da tabela 4.1. Esta análise refere-se à sonda de número 4.
21
TABELA 4.1: Quadro-resumo da análise de variância referente à sonda de número
4.
FV GL SQ QM F
c
Pr>F
T 4 2,3422x10
15
5,8555x10
14
56,9103 0,00023
T/S 5 5,1444x10
13
1,0289x10
13
6,3204
Resíduo 10 1,6279x10
13
1,6279x10
12
Total 19 2,4099x10
15
Nas Figuras 4.1 e 4.2 pode-se observar, inicialmente, o conjunto de todos os
valores p e, a seguir, apenas os valores p significativos após a aplicação do procedi-
mento FDR (α
∗
= 0, 05). A distribuição dos valores p, antes e depois da aplicação
da FDR, indica que a análise não foi excessivamente rigorosa (muito poucos valo-
res p muito baixos). O que se esperaria, neste caso, para a completa aleatoriedade é
a distribuição uniforme dos valores p, (ver por exemplo: Storey, 2002). A pequena
inclinação negativa nos gráficos é, portanto, indício de adequação da análise.
22
FIGURA 4.1: Histograma de densidade dos 21413 valores p referente às sondas
analisadas com α = 5% .
FIGURA 4.2: Histograma de densidade dos valores p que consideram diferenças
significaticas no experimento, após a aplicação do FDR com α
∗
= 5%.
Na terceira coluna da Tabela 4.2 encontram-se os valores p observados no
23
experimento e, na quarta coluna, os valores p corrigidos segundo o procedimento
FDR, para todas as sondas em estudo.
TABELA 4.2: A Lista dos valores p observados, ordenados do menor para o maior.
A quarta coluna é o procedimento de controle do Benjamini & Hochberg (1995).
Sonda Ordem Valor-p observado FDR(BH)Thresholds
07239**
♣
1 3,87x10
−9
8,29x10
−5
16533**
♣
2 4,56x10
−9
4,88x10
−5
07466** 3 5,35x10
−9
3,82x10
−5
07363**
♣
4 3,64x10
−8
0,000195
03823** 5 2,04x10
−7
0,000872
13783**
♣
6 4,63x10
−7
0,001651
03496** 7 4,76x10
−7
0,001456
14908** 8 5,26x10
−7
0,001410
20547** 9 7,96x10
−7
0,001893
13088** 10 8,19x10
−7
0,00175
01304** 11 1,11x10
−6
0,00216
00856** 12 1,12x10
−6
0,00200
07066**
♣
13 2,13x10
−6
0,00351
15348**
♣
14 2,14x10
−6
0,00327
02357** 15 2,22x10
−6
0,00317
11455** 16 2,82x10
−6
0,00377
19119** 17 3,54x10
−6
0,00445
20105**
♣
18 3,69x10
−6
0,00439
00202** 19 3,85x10
−6
0,00434
20778** 20 4,33x10
−6
0,00463
01875** 21 4,67x10
−6
0,00475
08315**
♣
22 4,85x10
−6
0,00472
01345** 23 4,89x10
−6
0,00455
03997**
♣
24 5,47x10
−6
0,00488
20457** 25 6,07x10
−6
0,00519
08562** 26 6,17x10
−6
0,00508
07968** 27 6,53x10
−6
0,00517
15403**
♣
28 6,64x10
−6
0,00508
14059** 29 7,08x10
−6
0,00523
19892**
♣
30 7,12x10
−6
0,00508
04805** 31 7,24x10
−6
0,00500
continua...
24
TABELA 4.2: continuação
Sonda Ordem Valor-p observado FDR(BH)Thresholds
08798** 32 8,29x10
−6
0,00555
18062** 33 8,40x10
−6
0,00545
18913**
♣
34 8,87x10
−6
0,00558
02799** 35 9,72x10
−6
0,00595
20567**
♣
36 1,06x10
−5
0,00630
02842** 37 1,07x10
−5
0,00620
13770** 38 1,08x10
−5
0,00608
13951** 39 1,38x10
−6
0,00758
03979** 40 1,40x10
−5
0,00747
02261**
♣
41 1,42x10
−5
0,00980
06529** 42 1,42x10
−5
0 0,00725
16118** 43 1,59x10
−5
0,00810
11760** 44 1,69x10
−5
0,00826
06333**
♣
45 1,70x10
−5
0,00808
06896** 46 1,79x10
−5
0,00855
03318** 47 1,83x10
−5
0,00853
04441** 48 1,85x10
−5
0,00825
02829** 49 1,94x10
−5
0,00847
19958** 50 1,97x10
−5
0,00843
00370**
♣
51 1,97x10
−5
0,00828
15447** 52 2,15x10
−5
0,00884
15045**
♣
53 2,20x10
−5
0,00890
09001** 54 2,27x10
−5
0,00900
00321** 55 2,29x10
−5
0,00891
20665**
♣
56 2,36x10
−5
0,00902
08062**
♣
57 2,40x10
−5
0,00901
07586** 58 2,66x10
−5
0,00980
02727** 59 2,67x10
−5
0,00971
18733* 60 2,97x10
−5
0.01059
00557* 61 3,07x10
−5
0,01077
02796* 62 3,08x10
−5
0,01063
. . . .
. . . .
. . . .
10397* 970 0,002257 0,04981
continua...
25
TABELA 4.2: continuação
Sonda Ordem Valor-p observado FDR(BH)Thresholds
20606* 971 0,002257 0,04978
06459* 972 0,002259 0,04978
06143* 973 0,002269 0,04994
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12460 974 0,002280 0,05012
16612 975 0,002282 0,05012
00932 976 0,002288 0,05021
. . . .
. . . .
. . . .
01568 2545 0,00997 0,0839
15973 2546 0,00999 0,0840
17695 2547 0,01000 0,0841
00212 2548 0,01001 0,0841
10123 2549 0,01001 0,0841
13185 2550 0,01002 0,0841
14933 2551 0,01002 0,0841
. . . .
. . . .
. . . .
04515 6057 0,04995 0,1766
21125 6058 0,04996 0,1766
07635 6059 0,04999 0,1767
08964 6060 0,04999 0,1767
03325 6061 0,05006 0,1768
18638 6062 0,05006 0,1768
03900 6063 0,05009 0,1769
. . . .
. . . .
. . . .
20130 21411 0,9803 0,9804
00116 21412 0,9864 0,9864
03501 21413 0,9904 0,9904
**significativo para α = 1%.
*significativo para α = 5%.
♣ Não normalidade
26
Observa-se, pelos dados da Tabela 4.2, que das 21.413 hipóteses de nulidade
testadas, 6.060 foram rejeitadas, considerando um nível de significância α = 5%.
Com a aplicação do procedimento FDR, esse número foi reduzido para 973. Como
era de se esperar, houve falsos positivos, segundo a metodologia empregada para
corrigir o problema ocasionado pelo fato de diversas hipóteses estarem sendo tes-
tadas simultaneamente. Com a correção da FDR, foram rejeitadas apenas as hipó-
teses com os p-valores menores ou iguais a 0,002269.
Mesmo com a aplicação do FDR, o número de hipóteses rejeitadas continua
alto para estudos mais específicos para cada sonda. Sendo assim, foi aplicado no-
vamente o procedimento, mas considerando-se um nível de significância conjunto
α
∗
= 1%. Com esta nova consideração, para α
∗
, apenas os valores p menores
ou iguais a 2,67x10
−5
foram rejeitados, num total de 59 sondas com efeito de
tratamento. Destas 59 sondas, apenas 40 foram considerados com efeito de tra-
tamento, pois os dados referentes aos outros 19 não seguiam a pressuposição de
normalidade, segundo o teste de Shapiro-Wilk. Para as 40 sondas com efeito de
tratamento, investigam-se os contrastes de interesse descritos conforme na Tabela
4.3.
Para o contraste E.grandis x E.globulos constatou-se que 31 das 40 hipóteses
testadas foram consideradas significativas.
TABELA 4.3: Número de sondas com contrastes significativos a 1% dentre as 40.
Contrastes Sem o FDR Com o FDR
E.grandis x E.glóbulos 31 31
Clone dentro da E.grandis 24 24
Clone dentro de E.glóbulos 13 12
Folha x Xilema em E.grandis 21 21
Para os contrastes clone dentro da E. grandis e clone dentro de E. globulos
foram, respectivamente 24 e 13 hipóteses consideradas significativas, num total de
27
40 hipóteses testadas. O contraste folha x xilema em E. grandis foi significativo
para 21 sondas em relação ao total testado. Aplicando-se o critério FDR, apenas o
contraste clone dentro da E. grandis teve uma redução de 13 para 12 e os demais
contrastes permaneceram com o mesmo número de valores p.
4.2 Análise considerando os dados com a transformação de Box-Cox
Para cada uma das 21.413 sondas obteve-se uma análise de variância como a
que segue abaixo. Os dados da Tabela 4.4 referem-se à sonda de número 4.
TABELA 4.4: Quadro-resumo da análise de variância referente à sonda de número
4.
FV GL SQ QM F
c
Pr>F
T 4 2,9636 0,7409 86,1512 8,4740x10
−5
T/S 5 0,0431 0,0086 0,0086
Resíduo 10 0,0011 0,0001
Total 19 3,0078
Assim como para os dados não transformados, houve um número muito grande
de sondas (1529) em que o efeito dos tratamentos foi significativo (α
∗
= 0, 05).
Sendo assim, considerou-se também necessário fazer uso do critério FDR e reduzir
o nível de significância para α
∗
= 0, 01.
Nas Figuras 4.3 e 4.4 pode-se observar, inicialmente, o conjunto de todos os
valores p e, a seguir apenas os valores p significativos após a aplicação do proce-
dimento FDR (α
∗
= 0, 05). Estes gráficos também indicam adequação da análise.
28
FIGURA 4.3: Histograma de densidade dos 21.413 valores p referentes às sondas
analisadas, com α = 5% .
FIGURA 4.4: Histograma de densidade dos valores p que consideram diferenças
significaticas no experimento após a aplicação do FDR, com α
∗
= 5%.
Na terceira coluna da Tabela 4.5 encontram-se os valores p observados no
experimento e, na quarta coluna, os valores p segundo o procedimento FDR, refe-
29
rentes às sondas em estudo.
TABELA 4.5: A lista dos valores p observados, ordenados do menor para o maior.
A quarta coluna é o procedimento de controle do Benjamini & Hochberg (1995).
Sonda Ordem Valor-p observado FDR(BH)Thresholds
10700**
♣
1 4,86x10
−12
1,04x10
−7
05757**
♣
2 2,45x10
−11
2,62x10
−7
07819**
♣
3 3,29x10
−9
2,35x10
−5
01926**
♣
4 4,78x10
−9
2,56x10
−5
04748**
♣
5 4,78x10
−9
2,05x10
−5
00125**
♣
6 1,57x10
−8
5,59x10
−5
01325**
♣
7 1,57x10
−8
4,79x10
−5
02127**
♣
8 1,57x10
−8
4,19x10
−5
03581**
♣
9 1,57x10
−8
3,73x10
−5
06338**
♣
10 1,57x10
−8
3,35x10
−5
10624**
♣
11 1,57x10
−8
3,05x10
−5
11557**
♣
12 1,57x10
−8
2,79x10
−5
15389**
♣
13 1,57x10
−8
2,58x10
−5
15543**
♣
14 1,57x10
−8
2,39x10
−5
16382**
♣
15 1,57x10
−8
2,23x10
−5
17698**
♣
16 1,57x10
−8
2,09x10
−5
19119**
♣
17 4,52x10
−8
5,69x10
−5
00566**
♣
18 1,24x10
−7
0,00015
07499**
♣
19 2,33x10
−7
0,00026
08324**
♣
20 2,33x10
−7
0,00025
12043**
♣
21 2,33x10
−7
0,00024
07171**
♣
22 2,45x10
−7
0,00024
12853**
♣
23 2,45x10
−7
0,00023
14908**
♣
24 7,02x10
−7
0.00063
06394**
♣
25 8,51x10
−7
0,00073
04968**
♣
26 1,04x10
−6
0,00085
00856** 27 1,12x10
−6
0.00089
06044**
♣
28 1,69x10
−6
0,00129
06084**
♣
29 1,69x10
−6
0,00125
19992**
♣
30 2,37x10
−6
0,00169
21066**
♣
31 2,37x10
−6
0,00164
continua...
30
TABELA 4.5: continuação
Sonda Ordem Valor-p observado FDR(BH)Thresholds
02538**
♣
32 2,45x10
−6
0,00164
14999**
♣
33 2,47x10
−6
0,00160
07466** 34 3,04x10
−6
0,00189
16533** 35 3,09x10
−6
0,00189
12005**
♣
36 3,12x10
−6
0,00186
07254** 37 3,68x10
−6
0,00213
20778** 38 4,54x10
−6
0,00256
03496** 39 4,83x10
−6
0,00265
01875** 40 4,99x10
−6
0,00267
01595**
♣
41 5,17x10
−6
0,00270
03648** 42 6,02x10
−6
0,00307
14059** 43 6,05x10
−6
0,00301
02702**
♣
44 6,21x10
−6
0,00302
00202** 45 6,68x10
−6
0,00318
08562** 46 7,09x10
−6
0,00330
08262**
♣
47 7,09x10
−6
0,00323
11455** 48 7,88x10
−6
0,00352
07901** 49 8,36x10
−6
0,00365
00201** 50 8,61x10
−6
0,00368
03318** 51 8,84x10
−6
0,00371
00094** 52 9,19x10
−6
0,00378
13951** 53 1,01x10
−5
0,00410
06376**
♣
54 1,05x10
−5
0,00418
03823** 55 1,07x10
−5
0,00418
15120**
♣
56 1,14x10
−5
0,00438
11760** 57 1,16x10
−5
0,00435
14626** 58 1,36x10
−5
0,00504
02842**
♣
59 1,37x10
−5
0,00498
12496* 60 1,48x10
−5
0,00531
16725**
♣
61 1,53x10
−5
0,00537
14656** 62 1,62x10
−5
0,00561
18062** 63 1,70x10
−5
0,00577
04833** 64 1,72x10
−5
0,00575
15427** 65 1,72x10
−5
0,00567
15348** 66 1,72x10
−5
0,00560
continua...
31
TABELA 4.5: continuação
Sonda Ordem Valor-p observado FDR(BH)Thresholds
02468** 67 1,85x10
−5
0,00592
15419** 68 1,96x10
−5
0,00619
19958** 69 2,01x10
−5
0,00624
07256**
♣
70 2,07x10
−5
0,00635
09515** 71 2,13x10
−5
0,00643
20302** 72 2,14x10
−5
0,00636
05384** 73 2,22x10
−5
0,00650
07372** 74 2,89x10
−5
0,00837
20547** 75 2,94x10
−5
0,00838
06181** 76 3,44x10
−5
0,00970
15086** 77 3,57x10
−5
0,00994
05594** 78 3,62x10
−5
0,00994
00037** 79 3,67x10
−5
0,00995
02727** 80 4,06x10
−5
0,01087
18733* 81 4,29x10
−5
0,01134673
. . . .
. . . .
. . . .
03818* 1527 0,00356 0,04999
03956* 1528 0,00356 0,04997
03289* 1529 0,00357 0,04998
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
07212 1530 0,00358 0,0501
02861 1531 0,00359 0,0502
05006 1532 0,00359 0,0502
. . . .
. . . .
. . . .
04413 2625 0,00997 0,0814
continuação...
32
TABELA 4.5: continuação
Sonda Ordem Valor-p observado FDR(BH)Thresholds
20021 2626 0,00998 0,0814
17298 2627 0,00999 0,0814
21352 2628 0,01001 0,0815
00109 2629 0,01002 0,0816
08792 2630 0,01002 0,0816
. . . .
. . . .
. . . .
18643 5514 0,04994 0,1766
20198 5515 0,04995 0,1766
17814 5516 0,04997 0,1767
06362 5517 0,05000 0,1767
11068 5518 0,05000 0,1768
11579 5519 0,05003 0,1768
03882 5520 0,05004 0,1769
. . . .
. . . .
. . . .
02904 21410 0,9996 0,9997
03009 21411 0,9996 0,9997
03724 21412 0,9996 0,9996
06384 21413 0,9996 0,9996
**significativo para α = 1%.
*significativo para α = 5%.
♣ Não normalidade
Verifica-se, pelos dados da Tabela 4.5, que das 21.413 hipóteses de nulidade
testadas para o efeito de tratamentos, 5.518 foram rejeitadas, a 5% de significância.
Já para α = 1%, houve 2.627 sondas com resultado significativo. Com a aplica-
ção do procedimento FDR, foram rejeitadas apenas as hipóteses com os valores p
menores ou iguais a 0,00357, a 5% de significância. Do total resultante de 1.529
rejeições (α = 5%), apenas 79 foram também significativas com α = 1%.
33
4.3 Número de sondas combinando as duas análises
Apesar de ter sido feita análises com e sem transformação, não convém a com-
paração dos dois resultados, pois o objetivo é combinar as duas análises. A trans-
formação foi aplicada por conveniência a todo o conjunto de dados e não apenas
às variáveis que realmente precisavam, mas para concluir a respeito das sondas
que interferem na expressão diferencial entre os tratamentos, serão combinadas as
40 sondas da análise sem transformação com aquelas dentre as 79 que na análise
inicial não atendiam a pressuposição de normalidade.
Verificou-se, pelo teste de Shapiro-Wilk, que os resíduos da análise dos dados
de 1.113 sondas não atendiam à pressuposição de normalidade. A transforma-
ção de Box-Cox corrigiu o problema da não normalidade para 801 destas sondas,
tendo em apenas 12 das 801 análises sido detectada significância para o efeito de
tratamentos. Na primeira coluna da Tabela 4.5 encontram-se em negrito estas 12
sondas.
Em resumo, combinando as duas análise, tem-se um total de 52 sondas com
expressão diferencial para tratamentos. O número de contrastes significativos para
as 52 sondas que resultaram significativas para efeito de tratamento, são apresen-
tados na Tabela 4.6.
TABELA 4.6: Número de sondas com contrastes significativos, a 1% de signifi-
cância, dentre as 52 com efeito de tratamento significativo.
Contrastes P-Valor Observado FDR(BH)
E. grandis x E. globulos 52 43
Clone dentro de E. grandis 52 36
Clone dentro de E. globulos 52 13
Folha x xilema em E. grandis 52 33
34
Das 52 sondas que interferem na expressão diferencial entre tratamentos, 33
estão relacionadas a diferenças entre folhas e xilema, 43 à diferença interespecí-
fica, 36 entre clones de E. grandis e 13 entre clones de E. globulos.
Combinando-se as diversas análises, observa-se, tanto nos dados transforma-
dos como nos não transformados, que, com a aplicação do procedimento FDR
para corrigir a significância nos testes múltiplos, houve grande redução no número
de sondas em que se detecta diferença significativa para o efeito de tratamento. A
redução do número de sondas mencionada anteriormente é importante, pois a iden-
tificação de genes associados às sondas não podem ser realizados com um número
muito grande de sondas candidatas. Supondo que um laboratório esteja interes-
sado em investigar algumas sondas dentre as 52 com expressão diferencial para
tratamentos, encontram-se em anexo, a análise completa para 15 dessas sondas.
A distribuição da estatística de Shapiro-Wilk revela que houve grande aumento
no número de variáveis com estatística baixa (mais próxima da distribuição nor-
mal), apesar que, aumentou o número de sondas que deixaram de atender a pres-
suposição de normalidade.
FIGURA 4.5: Estatística de Shapiro-Wilk para os dados não transformados (a) e
os dados transformados (b)
35
As 52 sondas com expressão diferencial para tratamentos (resume as sondas
importantes para os contrastes) e as sondas com contrastes significativos a 1%
dentre as 52 com efeito de tratamento significativo estão relacionadas em anexo.
36
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos pelo presente estudo permitem concluir que:
O critério FDR reduziu o número de variáveis em estudo, com segurança de se
concentrar atenção nas mais relevantes.
A transformação de Box-Cox auxiliou a conferir validade para as análises de
variáveis originalmente não transformadas.
37
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BENJAMINI, Y.; HOCHBERG, Y. Controlling the false discovery rate: a prac-
tical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistics
Society, London, v. 57, n. 1, p. 289-300, 1995.
BENJAMINI, Y.; YEKUTIELI, D. On the control of discovery rate in multiple
testing under dependency. The Annals of Statistics. London, v. 29, n. 4, p. 1165-
1188, 2001.
BOX, G. E. P.; COX, D. R. An analyis of transformations. Journal of the Royal
Statistical Society, London, v. 26, n. 2, p. 42-56, 1964.
BRAZMA, A. et al. “Minimum information about a microarray experiment (MI-
AME): toward standards for microarray data". Nature Genetics, New York, v. 29,
n. 4, p. 365-371, Dec. 2001.
CRISTO, E. B. Métodos estatísticos na análise de experimentos de microar-
ray. 2003. 107 p. Dissertação (Mestrado em Estatística)-Instituto de Matemática
e Estatística da Universidade de São Paulo, São Paulo.
COX, D. R.; REID, N. The theory of the design of experiments. London: Chap-
man & Hall, 2000. 340 p.
DUDOIT, S.; SHAFFER, J. C. Multiple hypothesis testing in microarrays experi-
ments. Statistical Science, Berkeley, v. 18, p. 71-103, Aug. 2003.
38
EFRON, B.; TIBSHIRANI, R. Microarrays, empirical bayes methods, and false
discovery rates. Technical Report, Chicago, v. 24, p. 201-217, July 2002.
EFRON, B.; TIBSHIRANI, R.; STOREY, J. D.; TUSHER, V. Empirical bayes
analysis of a microarray experiment. Journal of American Statistical Associa-
tion. New York, v. 96, p. 1151-1160, Dec. 2001.
KESELMAN , H. J.; CRIBBIE ,R.; HOLLAND, B. The pairwise multiple com-
parison multiplicity problem: an alternative approach to familywise and compari-
sonwise type I error control. Psychol Methods. London, v. 18, p. 58-59, Mar.
1999.
KOKKO, A. expression microarray technology as a tool in cancer research.
2006. 73 p. Thesis (Doctoral science in technology) - Institute of Science, Hel-
sinki University of Technology, Espoo, Finland.
MOOD, A. M.; GRAYBILL, F. A.; BOES, D. C. Introduction to the theory of
statistics. New York: J. Wiley, 1974. 564 p.
MONTGOMERY, D. C. Design and analysis of experiments. New York : J. Wi-
ley, 1991. 649 p.
R DEVELOPMENT CORE TEAM. R: a language and environment for statistical
computing. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing. Disponível
em: <http://www.R-project.org>. Acesso em: 20 dez. 2007.
39
SCHENA, M.; SHALON, D.; DAVIS, R. W.; BROWN, P. O. Quantitative monito-
ring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science,
Amsterdam, v. 270, p. 467-470, Dec. 1995.
SCHENA, M.; SHALON, D.; HELLER, R.; CHAI, A.; BROWN, P. O.; DAVIS,
R. W. Parallel human genome analysis: microarray - based expression monitoring
of 1000 genes. Proceedings of the national academy of sciences, New York, v.
93, p. 10614-10619, Mar. 1996.
SHAPIRO, S. S.; WILK, M. B. An Analysis of variance for normality: complete
sample. Biometrika, London, v.52, p. 549-611, Jan. 1965.
STOREY, J. D. False discovery rate theory and applications to DNA microar-
rays. 2002. 114 p. Doctoral Dissertation of philosophy. Stanford university.
SILVA, H. D. Aspectos biométricos da detecção de QTL’S ( “Quantitative
Trait Loci”) em espécies cultivadas. 2001. 166 p. Tese (Doutorado em Agrono-
mia) - Escola Superior de Agronomia Luiz de Queiroz, Piracicaba, SP.
TUSHER, V. G.; TIBSHIRANI, R.; CHU,G. Significance analysis of microarray
applied to the ionizing radiation response.Proceedings of the national academy
of sciences, New York, v. 98, n. 5, p. 116-5121, 2001.
40
ANEXOS
ANEXO A Páginas
TABELA 1A Relação das 52 sondas com expressão diferencial para tratamen-
tos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
TABELA 2A Relação das 43 sondas com o contraste E. grandis x E. globulos
significativos a 1% dentre as 52 com efeito de tratamento signifi-
cativo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
TABELA 3A Relação das 36 sondas com o contraste clone dentro de E. grandis
significativos a 1% dentre as 52 com efeito de tratamento signifi-
cativo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
TABELA 4A Relação das 13 sondas com o contraste clone dentro de E. glo-
bulos significativos a 1% dentre as 52 com efeito de tratamento
significativo.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
TABELA 5A Relação das 33 sondas com o contraste Folha x xilema em E.
grandis a 1% dentre as 52 com efeito de tratamento significativo.
44
TABELA 6A Análise de variância referente à sonda 202, com e sem transfor-
mação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
TABELA 7A Análise de variância referente à sonda 856, com e sem transfor-
mação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
TABELA 8A Análise de variância referente à sonda 1875, com e sem transfor-
mação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
TABELA 9A Análise de variância referente à sonda 2842, com e sem transfor-
mação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
TABELA 10A Análise de variância referente à sonda 3496, com e sem transfor-
mação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
TABELA 11A Análise de variância referente à sonda 7466, com e sem transfor-
mação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
41
TABELA 12A Análise de variância referente à sonda 8562, com e sem transfor-
mação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
TABELA 13A Análise de variância referente à sonda 11455, com e sem trans-
formação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
TABELA 14A Análise de variância referente à sonda 11760, com e sem trans-
formação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
TABELA 15A Análise de variância referente à sonda 13951, com e sem trans-
formação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
TABELA 16A Análise de variância referente à sonda 14059, com e sem trans-
formação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
TABELA 17A Análise de variância referente à sonda 18062, com e sem trans-
formação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
TABELA 18A Análise de variância referente à sonda 19958, com e sem trans-
formação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
TABELA 19A Análise de variância referente à sonda 20547, com e sem trans-
formação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
TABELA 20A Análise de variância referente à sonda 20778, com e sem trans-
formação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
42
TABELA 1A: Relação das 52 sondas com expressão diferencial para tratamentos.
07466 03823 03496 14908 20547
13088 01304 00856 02357 11455
19119 00202 20778 01875 01345
20457 08562 07968 14059 04805
08798 18062 02799 02842 13951
03979 06529 16118 11760 06896
03318 04441 02829 19958 15447
09001 00321 07586 02727 13770
07254 07901 00201 00094 12496
04833 15427 02468 15419 07372
06181 16533
TABELA 2A: Relação das 43 sondas com o contraste E. grandis x E. globulos sig-
nificativos a 1% dentre as 52 com efeito de tratamento significativo.
07466 13088 18062 01304 13951
20547 03823 14908 02357 03496
07968 08798 00202 08562 02727
19119 04805 20457 11760 20778
01345 01875 16118 13770 06529
07586 15447 02799 00321 02829
06896 16533 07254 07901 00201
00094 12496 04833 15427 02468
15419 07372 06181
TABELA 3A: Relação das 36 sondas com o contraste clone dentro de E. grandis
significativos a 1% dentre as 52 com efeito de tratamento significa-
tivo.
16533 07466 03823 03496 14908
20547 13088 02357 11455 20778
01345 00202 16118 20457 04805
02799 07586 06529 11760 00321
02829 13770 15447 18062 16533
07254 07901 00201 00094 12496
04833 15427 02468 15419 07372
06181
43
TABELA 4A: Relação das 13 sondas com o contraste clone dentro de E. globulos
significativos a 1% dentre as 52 com efeito de tratamento significa-
tivo.
00856 14059 11455 19958 03979
09001 00441 19119 01875 03318
06896 2829 7254
TABELA 5A: Relação das 33 sondas com o contraste Folha x xilema em E. grandis
a 1% dentre as 52 com efeito de tratamento significativo.
07466 14908 20547 11455 13088
20778 20457 04805 13770 06529
11760 15447 00202 03496 03823
02357 19119 01345 08798 02799
04441 16533 07254 07901 00201
00094 12496 04833 15427 02468
15419 07372 06181
TABELA 6A: Análise de variância referente à sonda 202, com e sem transforma-
ção.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 3,85x10
−6
0,0043 6,68x10
−6
0,0032
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 1,57x10
−7
4,88x10
−7
2,44x10
−7
6,65x10
−7
Clone dentro da E.grandis 1 6,55x10
−7
2,46x10
−6
1,24x10
−6
1,40x10
−5
Clone dentro da E.globulos 1 0.4133 – 0.4028 –
Folha x xilema em E.grandis 1 1,30x10
−8
3,84x10
−8
2,36x10
−8
2,33x10
−7
TABELA 7A: Análise de variância referente à sonda 856, com e sem transforma-
ção.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 1,13x10
−6
0,002 1,13x10
−6
0,001
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 0,999 – 0,999 –
Clone dentro da E.grandis 1 0,999 – 0,999 –
Clone dentro da E.globulos 1 5,56x10
−8
3,28x10
−6
5,56x10
−8
1,46x10
−6
Folha x xilema em E.grandis 1 0,910 – 0,999 –
44
TABELA 8A: Análise de variância referente à sonda 1875, com e sem transforma-
ção.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 4,67x10
−6
0,0047 4,99x10
−6
0,0027
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 5,55x10
−7
1,05x10
−6
9,07x10
−7
2,50x10
−6
Clone dentro da E.grandis 1 0,9999 – 0,9999 –
Clone dentro da E.globulos 1 0,0002 0,0012 0,0001 0,0006
Folha x xilema em E.grandis 1 0,8382 – 0,9999 –
TABELA 9A: Análise de variância referente à sonda 2842, com e sem transforma-
ção.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 1,07x10
−5
0,0062 1,37x10
−5
0,0050
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 0,9999 – 0,9999 –
Clone dentro da E.grandis 1 0,9999 – 0,9999 –
Clone dentro da E.globulos 1 3,78x10
−6
3,72x10
−5
3,20x10
−6
2,53x10
−5
Folha x xilema em E.grandis 1 0,9558 – 0,9999 –
TABELA 10A: Análise de variância referente à sonda 3496, com e sem transfor-
mação.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 4,76x10
−7
0,0015 4,83x10
−6
0,0027
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 8,75x10
−8
3,44x10
−7
1,71x10
−6
3,67x10
−6
Clone dentro da E.grandis 1 3,51x10
−8
3,45x10
−7
3,41x10
−7
8,98x10
−6
Clone dentro da E.globulos 1 0,0632 – 0,01159 –
Folha x Xilema em E.grandis 1 1,07x10
−9
1,05x10
−8
1,01x10
−8
1,98x10
−7
TABELA 11A: Análise de variância referente à sonda 7466, com e sem transfor-
mação.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 5,35x10
−9
3,82x10
−5
3,04x10
−6
0,00189
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 4,84x10
−10
9,52x10
−9
1,09x10
−7
6,15x10
−7
Clone dentro da E.grandis 1 7,07x10
−10
1,39x10
−8
3,04x10
−6
1,41x10
−5
Clone dentro da E.globulos 1 0,0092 0,042 0,0019 0,0083
Folha x xilema em E.grandis 1 1,41x10
−11
2,77x10
−10
1,18x10
−8
2,84x10
−6
45
TABELA 12A: Análise de variância referente à sonda 8562, com e sem transfor-
mação.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 6,17x10
−6
0,0051 7,09x10
−6
0,0033
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 1,70x10
−7
2,18x10
−7
7,09x10
−6
3,11x10
−5
Clone dentro da E.grandis 1 0,9999 – 0,9999 –
Clone dentro da E.globulos 1 0,7184 – 0,7367 –
Folha x xilema em E.grandis 1 0,9999 – 0,9999 –
TABELA 13A: Análise de variância referente à sonda 11455, com e sem transfor-
mação.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 2,82x10
−6
0,0038 7,88x10
−6
0,0035
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 0,9999 – 0,9999 –
Clone dentro da E.grandis 1 3,25x10
−7
1,98x10
−6
6,48x10
−6
2,33x10
−5
Clone dentro da E.globulos 1 1,36x10
−6
2,67x10
−5
4,08x10
−5
2,48x10
−4
Folha x xilema em E.grandis 1 6,75x10
−9
3,62x10
−8
2,85x10
−8
2,05x10
−7
TABELA 14A: Análise de variância referente à sonda 11760, com e sem transfor-
mação.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 1,69x10
−5
0,0083 1,16x10
−5
0,0044
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 4,97x10
−7
1,45x10
−6
5,72x10
−7
2,05x10
−6
Clone dentro da E.grandis 1 2,63x10
−6
5,93x10
−6
1,33x10
−6
1,05x10
−5
Clone dentro da E.globulos 1 0,0171 – 0,0789 –
Folha x xilema em E.grandis 1 6,65x10
−8
1,42x10
−7
3,66x10
−8
2,40x10
−7
TABELA 15A: Análise de variância referente à sonda 13951, com e sem transfor-
mação.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 1,38x10
−5
0,0076 1,02x10
−5
0,0041
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 2,28x10
−8
1,68x10
−7
1,60x10
−8
1,58x10
−7
Clone dentro da E.grandis 1 0,0115 – 0,0645 –
Clone dentro da E.globulos 1 0,0115 – 0,0277 –
Folha x xilema em E.grandis 1 0,9986 – 0,9866
46
TABELA 16A: Análise de variância referente à sonda 14059, com e sem transfor-
mação.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 7,08x10
−6
0,0052 6,05x10
−6
0,0030
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 0,9999 – 0,9999 –
Clone dentro da E.grandis 1 0,9999 – 0,9999 –
Clone dentro da E.globulos 1 1,69x10
−7
4,98x10
−6
2,45x10
−7
3,22x10
−6
Folha x xilema em E.grandis 1 0,9999 – 0,9999 –
TABELA 17A: Análise de variância referente à sonda 18062, com e sem transfor-
mação.
Não Transf. Transf.
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 8,40x10
−6
0,0055 1,70x10
−5
0,0058
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 1,49x10
−8
1,46x10
−7
2,76x10
−8
2,18x10
−7
Clone dentro da E.grandis 1 0,0003 0,0004 0,0090 0,0284
Clone dentro da E.globulos 1 0,9439 – 0,9919 –
Folha x xilema em E.grandis 1 0,9991 – 0,9784 –
TABELA 18A: Análise de variância referente à sonda 19958, com e sem transfor-
mação.
Não Transf. Transf.
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 1,97x10
−5
0,0084 2,01x10
−5
0,00624
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 0,9999 – 0,9999 –
Clone dentro da E.grandis 1 0,9999 – 0,9999 –
Clone dentro da E.globulos 1 2,62x10
−6
3,86x10
−5
2,86x10
−6
2,51x10
−5
Folha x xilema em E.grandis 1 0,9999 – 0,9999 –
TABELA 19A: Análise de variância referente à sonda 20547, com e sem transfor-
mação.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 7,96x10
−7
0,0019 2,94x10
−5
0,0084
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 5,25x10
−8
2,82x10
−7
5,89x10
−7
1,94x10
−6
Clone dentro da E.grandis 1 6,23x10
−8
4,08x10
−7
2,97x10
−6
1,47x10
−5
Clone dentro da E.globulos 1 0,7657 – 0,9065 –
Folha x xilema em E.grandis 1 2,27x10
−9
1,49x10
−8
1,39x10
−7
4,22x10
−7
47
TABELA 20A: Análise de variância referente à sonda 20778, com e sem transfor-
mação.
Não Transformado Transformado
FV G.L. P>F FDR P>F FDR
T 4 4,33x10
−6
0,0046 4,55x10
−6
0,0026
T/S 5 – – – –
Resíduo 10 – – – –
E.grandis x E.globulos 1 5,15x10
−7
1,05x10
−6
4,18x10
−7
1,57x10
−6
Clone dentro da E.grandis 1 3,60x10
−7
1,52x10
−6
4,52x10
−7
8,93x10
−6
Clone dentro da E.globulos 1 0,7621 – 0,9794 –
Folha x xilema em E.grandis 1 1,07x10
−8
3,95x10
−8
1,20x10
−8
1,58x10
−7
48
ANEXO B Páginas
PROGRAMA 1B Rotina para análise dos dados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
49
PROGRAMA 1B : Rotina para análise dos dados.
#Programa para os dados não transformados
d <- read.table(’’Nimb.design.txt’’, header=TRUE )
dados <- read.table(’’NimbData.txt’’, header=TRUE )
y <- 0
*
rnorm(20)
attach(d)
T <- factor(trat)
Ind <- factor(indiv)
Ram <- factor(ramet)
B <- factor(bloco)
S <- factor(slide)
n <- length(dados[,1])/2
for ( i in 1:n )
{
for ( j in 1:10 )
{
y[j] <- dados[ ( 2
*
(i-1)) +1, (j+2) ]
y[10+j] <- dados[ ( 2
*
(i-1)) +2, (j+2)]
}
modelo <- lm(y ~ T/S)
summary <- summary(modelo)
anova <- anova(modelo)
write(cbind(dados[((2
*
(i-1))+1),1],
anova[1,3]),’’saida.txt’’, append=TRUE)
write(cbind(dados[((2
*
(i-1))+1),1],
anova[2,3]),’’saidaint.txt’’, append=TRUE)
#saida é o QM de T
#saidaint é o QM de T/S
QM <-cbind(saida$V2,saidaint$V2)
F <- QM[,1]/QM[,2]
PV <- 1-pf(F[,1],4,5)
PVord <-sort(PV[,1])
t <- 0
t1 <- 0
j <- 1
PVord1<- read.table(’’PVord.txt’’)
for (i in 1:n) {
if (((21413
*
PVord1[i,1])/i)< = 0.05) {
t[j] <- PVord1[i,1]
50
t1[j] <- i
j <- j+1
}
}
Rotina para contrastes
d <- read.table(’’Nimb.design.txt’’,h=T)
dados <- read.table(’’NimbData.txt’’,h=T)
y <- 0
*
rnorm(20)
QM <-read.table(’’QM.txt’’)
attach(d)
n <- length(dados[,1])/2
a <-c(2,2,2,2,2,2,-3,-3,-3,-3,2,2,2,2,2,2,-3,-3,-3,-3)
b <-c(1,1,1,1,-2,-2,0,0,0,0,1,1,1,1,-2,-2,0,0,0,0)
c <-c(0,0,0,0,0,0,1,1,-1,-1,0,0,0,0,0,0,1,1,-1,-1)
d <-c(2,2,-1,-1,-1,-1,0,0,0,0,2,2,-1,-1,-1,-1,0,0,0,0)
matrix<-cbind(a,b,c,d)
for( i in 1:n)
{
for(j in 1:10)
{
y[j] <- dados[(2
*
(i-1))+1,(j+2)]
y[10+j] <- dados[(2
*
(i-1))+2,(j+2)]
}
if (PV[i,1]<= 0.00226910840747907)
yestim <- t(matrix)%
*
%y
ta <- yestim[1,]/sqrt((sum(a^2)
*
QM[i,2])/4)
tb <- yestim[2,]/sqrt((sum(b^2)
*
QM[i,2])/4)
tc <- yestim[3,]/sqrt((sum(c^2)
*
QM[i,2])/4)
td <- yestim[4,]/sqrt((sum(d^2)
*
QM[i,2])/4)
t <- cbind(ta,tb,tc,td)
write(cbind(dados[((2
*
(i-1))+1),1],t),’’t.txt’’,
append=TRUE)
}
}
Pa <-1-pt(t[,2],5)
Pb <-1-pt(t[,3],5)
Pc <-1-pt(t[,4],5)
Pd <-1-pt(t[,5],5)
Paord <-sort(Pa[,1])
51
Pbord <-sort(Pb[,1])
Pcord <-sort(Pc[,1])
Pdord <-sort(Pd[,1])
#Rotina para determinar o ponto de corte do FDR para (a)
Paord <-read.table(’Paord.txt’)
ta <- 0
ta1 <- 0
j <- 1
Paord1 <- read.table(’’Paord.txt’’)
for (i in 1:n) {
if (((59
*
Paord1[i,1])/i)<=0.01) {
ta[j] <- Paord1[i,1]
ta1[j] <- i
j <- j+1
}
}
52
#Programa para os dados transformados
d <- read.table(’’Nimb.design.txt’’,h=T)"
dados <- read.table(’’NimbData.txt’’,h=T)"
y <- 0
*
rnorm(20)"
attach(d)"
T <- factor(trat)
Ind <- factor(indiv)
Ram <- factor(ramet)
B <- factor(bloco)
S <- factor(slide)
n <- length(dados[,1])/2
for( i in 1:n)
{
for(j in 1:10)
{
y[j] <- dados[(2
*
(i-1))+1,(j+2)]
y[10+j] <- dados[(2
*
(i-1))+2,(j+2)]
}
tr <- boxcox(y ~ T/S, lambda = seq(-3, 3,length=100),
plotit = FALSE)
er <- cbind(tr$y,tr$x)
ind <- which(max(tr$y)==er)
lambda <- er[ind,2]# estimatima do meu lambda
write(lambda,’’lambda.txt’’, append=TRUE)
}
for( i in 1:n)
{
for(j in 1:10)
{
y[j] <- dados[(2
*
(i-1))+1,(j+2)]
y[10+j]<- dados[(2
*
(i-1))+2,(j+2)]
}
if (lambda[i]!=0){
yt <- ((y^lambda[i])-1)/(lambda[i])
} else {
yt <- log(y)
}
modelo <- lm(yt ~ T/S)
summary <- summary(modelo)
53
anova <- anova(modelo)
write(cbind(dados[((2
*
(i-1))+1),1],anova[1,3]),
’’saida.txt’’, append=TRUE)
write(cbind(dados[((2
*
(i-1))+1),1],anova[2,3]),
’’saidaint.txt’’, append=TRUE)
}
#saida é o QM de T
#saidaint é o QM de T/S
QM <-cbind(saida$V2,saidaint$V2)
F <- QM[,1]/QM[,2]
PV <- 1-pf(F[,1],4,5)
PVord <-sort(PV[,1])
t <- 0
t1 <- 0
j <- 1
PVord1<- read.table(’’PVord.txt’’)
for (i in 1:n) {
if (((21413
*
PVord1[i,1])/i)< = 0.05) {
t[j] <- PVord1[i,1]
t1[j] <- i
j <- j+1
}
}
Rotina para contrastes
d <- read.table(’’Nimb.design.txt’’,h=T)
dados <- read.table(’’NimbData.txt’’,h=T)
y <- 0
*
rnorm(20)
fin <-cbind(lambda,PV)
attach(d)
n <- length(dados[,1])/2
a <-c(2,2,2,2,2,2,-3,-3,-3,-3,2,2,2,2,2,2,-3,-3,-3,-3)
b <-c(1,1,1,1,-2,-2,0,0,0,0,1,1,1,1,-2,-2,0,0,0,0)
c <-c(0,0,0,0,0,0,1,1,-1,-1,0,0,0,0,0,0,1,1,-1,-1)
d <-c(2,2,-1,-1,-1,-1,0,0,0,0,2,2,-1,-1,-1,-1,0,0,0,0)
matrix<-cbind(a,b,c,d)
for( i in 1:n)
{
for(j in 1:10)
{
54
y[j] <- dados[(2
*
(i-1))+1,(j+2)]
y[10+j] <- dados[(2
*
(i-1))+2,(j+2)]
}
if (fin[i,2]<=0.00356911344348132) {
if (fin[i,1]!=0) {
yt <- ((y\^fin[i,1])-1)/(fin[i,1])
} else {
yt <- log(y)
}
yestim <- t(matrix)%
*
%yt
ta <- yestim[1,]/sqrt((sum(a^2)
*
QM[i,2])/4)
tb <- yestim[2,]/sqrt((sum(b^2)
*
QM[i,2])/4)
tc <- yestim[3,]/sqrt((sum(c^2)
*
QM[i,2])/4)
td <- yestim[4,]/sqrt((sum(d^2)
*
QM[i,2])/4)
t <- cbind(ta,tb,tc,td)
write(cbind(dados[((2
*
(i-1))+1),1],t),
’’t.txt’’, append=TRUE)
}
}
Pa <- 1-pt(t[,2],5)
Pb <- 1-pt(t[,3],5)
Pc <- 1-pt(t[,4],5)
Pd <- 1-pt(t[,5],5)
Paord <- sort(Pa[,1])
Pbord <- sort(Pb[,1])
Pcord <- sort(Pc[,1])
Pdord <- sort(Pd[,1])
# Rotina para o ponto de corte do FDR para o contraste (a)
Paord <-read.table(’Paord.txt’)
ta <- 0
ta1 <- 0
j <- 1
Paord1 <- read.table(’’Paord.txt’’)
for (i in 1:n) {
if ((79
*
Paord1[i,1])/i)<=0.01) {
ta[j] <- Paord1[i,1]
ta1[j] <- i
j <- j+1
}
55
}
#Rotina para aplicação do teste de Shapiro - Wilk
d <- read.table(’’Nimb.design.txt’’,h=T)
dados <- read.table(’’NimbData.txt’’,h=T)
y <- 0
*
rnorm(20)
attach(d)
T <- factor(trat)
Ind <- factor(indiv)
Ram <- factor(ramet)
B <- factor(bloco)
S <- factor(slide)
n <- length(dados[,1])/2
for( i in 1:n)
{
for(j in 1:10)
{
y[j] <- dados[(2
*
(i-1))+1,(j+2)]
y[10+j] <- dados[(2
*
(i-1))+2,(j+2)]
}
modelo <- lm( y ~ T/S)
norm <- shapiro.test(modelo$residuals)
norm1[i,1] <- norm$p.value
write.table(norm1,’’norm1.txt’’)
}
# o teste de Shapiro - wilk para os dados
transformados segue o mesmo raciocínio.
56
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