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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ATIVIDADE PATOGÊNICA DOS FUNGOS Metarhizium
anisopliae, Beauveria bassiana E Paecilomyces fumosoroseus
PARA Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera:
Calliphoridae)
Luciana Yoshida
Zootecnista
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
2007
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIA VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ATIVIDADE PATOGÊNICA DOS FUNGOS Metarhizium
anisopliae, Beauveria bassiana E Paecilomyces fumosoroseus
PARA Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera:
Calliphoridae)
Luciana Yoshida
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Monteiro
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias
e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte
das exigências para a obtenção do título de Mestre em
Microbiologia Agropecuária.
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Julho de 2007
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Yoshida, Luciana
Y64a Atividade patogênica dos fungos Metarhizium anisopliae,
Beauveria bassiana e Paecilomyces fumosoroseus para Chrysomya
putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera: Calliphoridae)/ Luciana Yoshida.
– – Jaboticabal, 2007
xii, 84 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2001
Orientador: Antônio Carlos Monteiro
Banca examinadora: Giane Serafim da Silva, Érika Barbosa
Neves Graminha
Bibliografia
1. Controle biológico. 2. Controle microbiano. 3. Fungos
entomopatogênicos. 4. Chrysomya putoria. I. Título. II. Jaboticabal-
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 576.8595.733.4
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
DADOS CURRICULARES DA AUTORA
LUCIANA YOSHIDA - Filha de Julio Yoshida e Helena Yoshida, nasceu em 02
de janeiro de 1975, em São Paulo. Em 1999 concluiu o curso de Zootecnia na
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista,
Campus de Jaboticabal, recebendo o título de Zootecnista. Durante a graduação,
estagiou em diversas áreas junto aos departamentos de tecnologia, nutrição de não-
ruminantes, engenharia rural e CPPAR, todos pertencentes a Unesp – Jaboticabal. No
período de 1999 a 2004, atuou como coordenadora de projetos de pesquisas
mercadológicas, junto ao mercado de sementes e defensivos agrícolas. Em 2005
ingressou no curso de Pós-graduação em Microbiologia, área de concentração em
Microbiologia Agrícola, no Departamento de Produção Vegetal da Universidade
Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal. Durante o curso de Mestrado participou de
congressos e fóruns publicando trabalhos na área de entomopatógenos.
A meu amor, companheiro e amigo..... Marco
A meu amor, companheiro e amigo..... MarcoA meu amor, companheiro e amigo..... Marco
A meu amor, companheiro e amigo..... Marco
Por acreditar e lutar pelos meus sonhos, como se fossem seus.
Por acreditar em mim, nos momentos em que nem mesmo eu acreditava.
Eu te amo!
DEDICO
DEDICODEDICO
DEDICO
Aos meus pais
Aos meus paisAos meus pais
Aos meus pais
Julio e Helena
Julio e Helena Julio e Helena
Julio e Helena -
--
-
pelo carinho, incentivo e dedicação.
OFEREÇO
OFEREÇOOFEREÇO
OFEREÇO
A DEUS
DEUS DEUS
DEUS - pelo dom da vida e oportunidade de estar aqui.
A Espiritualidade maior
Espiritualidade maiorEspiritualidade maior
Espiritualidade maior - pela presença constante nos momentos de alegria e
nas horas mais difíceis.
AGRADEÇO
AGRADEÇOAGRADEÇO
AGRADEÇO
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Monteiro - pela oportunidade, confiança, amizade,
orientação e principalmente pelo exemplo de caráter de justiça.
A CAPES - pela bolsa de mestrado, que permitiu minha total dedicação a este
trabalho.
Aos Prof. Dr. José Carlos Barbosa, Dr. Gener Tadeu Pereira e ao Dr. Vando
Edésio Soares - pelo auxílio na realização das análises estatísticas.
Ao Prof. Dr. Wesley Augusto Conde Godoy - pela identificação da espécie da
mosca.
Ao Prof. Dr. Ely Nahas e ao Prof. Dr. Fernando A. Ávila, pelas importantes
sujestões científicas no exame de qualificação.
A Dr
a
. Erika Barbosa Neves Graminha e a Dr
a
. Giane Serafim da Silva, pela
participação da banca examinadora da defesa e correções tão importantes.
Ao bibliotecário Fabio Assis Pinho - pelo auxílio nas correções da bibliografia
citada.
As minhas grandes amigas, Dinalva, Ana Carolina e Claudia Demétrio – pelo
apoio técnico, moral, psicológico em todas etapas, tornando todos os momentos únicos
e agradáveis.
Aos colegas do Laboratório de Microbiologia, Thaís, Carina, Manuela e Lucas e
Carime
pelo apoio nos experimentos realizados.
Aos amigos do Laboratório de Microbiologia, Marquinhos, Nancy e Mara – pela
amizade, incentivo e companheirismo.
A Edna, secretária do Laboratório de microbiologia, por estar sempre pronta a
ajudar, sendo prestativa em todos os momentos.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho.
i
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................
iv
LISTA DE TABELAS ................................................................................................
vii
APÊNDICE ................................................................................................................
82
RESUMO ...................................................................................................................
xi
ABSTRACT
...............................................................................................................
xii
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS ...........................................................
1
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................
1
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................
2
2.1 Moscas sinantrópicas ..................................................................................
2
2. 2
Fungos entomopatogênicos .......................................................................
4
2. 3 Controle biológico .......................................................................................
6
3. REFERÊNCIAS...................................................................................................
7
CAPÍTULO 2 – EFICIÊNCIA DE Metarhizium anisopliae
NO CONTROLE DA
MOSCA VAREJEIRA Chrysomya putoria.................................................................
14
RESUMO
....................................................................................................................
14
SUMARY ................................................................................................................................
15
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................
16
2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................
17
2.1 Fungo...........................................................................................................
17
2.2
Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria ...................................
18
2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de C. putoria ...................................
18
2.4 Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de C. putoria ............................
19
2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de C. putoria .................................
20
2.6 Patogenicidade dos fungos para adultos de C. putoria................................
20
2.7
Análise estatística ........................................................................................
21
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .........................................................................
21
3.1 Patogenicidade para ovos de C. putoria......................................................
21
3. 2 Patogenicidade para larvas L2 de C. putoria..............................................
23
ii
Página
3. 3
Patogenicidade para pupas de C. putoria ..................................................
26
3. 4 Patogenicidade para adultos de C. putoria ................................................
29
4. CONCLUSÕES ..................................................................................................
32
5. REFERÊNCIAS...................................................................................................
32
CAPÍTULO 3 - SUSCEPTIBILIDADE DE Chrysomya putoria
(Diptera:
Calliphoridae)
A AÇÃO PATOGÊNICA DO FUNGO
Beauveria bassiana ...............
37
RESUMO ...................................................................................................................
37
SUMARY....................................................................................................................
38
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................
39
2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................
40
2.1
Fungo ..........................................................................................................
40
2.2 Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria ...................................
41
2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de C. putoria ...................................
41
2.4 Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de C. putoria ............................
42
2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de C. putoria .................................
43
2.6
Patogenicidade dos fungos para adultos de C. putoria ...............................
43
2.7 Análise estatística ........................................................................................
44
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .........................................................................
44
3.1 Patogenicidade para ovos de C. putoria .....................................................
44
3.2 Patogenicidade para larvas L2 de C. putoria ..............................................
46
3.3
Patogenicidade para pupas de C. putoria ...................................................
49
3.4 Patogenicidade para adultos de C. putoria .................................................
52
4.CONCLUSÕES ...................................................................................................
55
5. REFERÊNCIAS ..................................................................................................
55
CAPÍTULO 4- PATOGENICIDADE DE Paecilomyces fumosoroseus
PARA A
MOSCA SINANTRÓPICA DE AVIÁRIO
Chrysomya putoria
(Diptera:
Calliphoridae) ...........................................................................................................
60
RESUMO ...................................................................................................................
60
SUMARY ...................................................................................................................
61
iii
Página
1. INTRODUÇÃO
...................................................................................................
62
2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................
63
2.1 Fungo ..........................................................................................................
63
2.2 Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria ...................................
64
2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de C. putoria ...................................
64
2.4
Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de C. putoria ............................
65
2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de C. putoria .................................
66
2.6 Patogenicidade dos fungos para adultos de C. putoria ...............................
66
2.7 Análise estatística ........................................................................................
66
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .........................................................................
67
3.1
Patogenicidade para ovos de C. putoria .....................................................
67
3.2 Patogenicidade para larvas L2 de C. putoria ..............................................
69
3.3 Patogenicidade para pupas de C. putoria ...................................................
72
3.4 Patogenicidade para adultos de C. putoria .................................................
75
4.CONCLUSÕES ...................................................................................................
77
5. REFERÊNCIAS
...................................................................................................
77
CAPÍTULO 5 – IMPLICAÇÕES.................................................................................
81
iv
LISTA DE FIGURAS
Página
Capítulo 2
Figura 1. Larvas mortas de Chrysomya putoria
apresentando extrusão de
Metarhizium anisopliae..........................................................................
23
Figura 2.
Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria
tratadas com
suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de
Metarhizium
anisopliae, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle,
nos primeiros 15 dias após o tratamento...............................................
25
Figura 3. Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria
emergidos de pupas
tratadas com suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9
de M. anisopliae, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e
controle, até o 23° dia após tratamento.................................................
27
Figura 4. Pupa de Crysomya putoria
morta apresentando extrusão de
Metarhizium anisopliae..........................................................................
28
Figura 5.
Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria pulve
rizados com
suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de
Metarhizium
anisopliae, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle,
até o 23° dia após tratamento................................................................
30
Figura 6. Adultos de Chrysomya putoria mortos pelo fungo
Metarhizium
anisopliae exibindo a extrusão do patógeno.........................................
31
v
Capítulo 3
Figura 1. Larvas de Chrysomya putoria morta pelo fungo Beauveria bassiana
exibindo a extrusão do patógeno.............................................................
46
Figura 2. Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria
tratadas com
suspensões de conídios dos isolados AM 09 e JAB 07 de
Beauveria
bassiana, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, nos
primeiros 15 dias após o tratamento.......................................................
48
Figura 3. Pupas de Chrysomya putoria morta pelo fungo Beauveria bassiana
. A:
Crescimento hifálico do patógeno sobre o cadáver
da pupa; B: pupa
exibindo a extrusão do patógeno na fase de conidiogênese...................
49
Figura 4.
Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria
emergidos de pupas
tratadas com suspensões de conídios dos isolados AM 09 e JAB 07
de Beauveria bassiana, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e
controle, até o 23° dia após tratamento...................................................
51
Figura 5. Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria
pulverizados com
suspensões de conídios dos isolados AM 09 e JAB 07 de
Beauveria
bassiana, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, até
o 23° dia após tratamento........................................................................
54
Figura 6. Moscas adultas de Crysomya putoria mortas pelo fungo B. bassiana
exibindo a extrusão do patógeno.............................................................
55
vi
Capítulo 4
Figura 1. Larvas de C. putoria mortas pelo fungo P. fumosoroseus
. A:
visualização de uma das c
âmaras úmidas para verificação da extrusão
do patógeno; B: Larva apresentando extrusão do fungo.........................
69
Figura 2.
Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria
tratadas com
suspensões de conídios dos isolados IBCB 133 e IBCB 75 de
P.
fumosoroseus, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e
controle, nos primeiros 15 dias após o tratamento..................................
71
Figura 3. Pupas mortas pelo fungo Paecilomyces fumosoroseus. A:
pupa
colonizada pelo fungo na fase hifálica. B:
Mosca emergindo da pupa
colonizada pela fungo na fase de esporulação
...........................................
73
Figura 4. Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria
emergidos de pupas
tratadas com suspensões de conídios dos isolados
IBCB 133 e IBCB
75 de P. fumosoroseus, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL
e controle, até o 23° dia após tratamento................................................
74
Figura 5.
Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria
pulverizados com
suspensões de conídios dos isolados IBCB 133 e IBCB 75 de
P.
fumosoroseus, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e
controle, até o 23° dia após tratamento...................................................
76
vii
LISTA DE TABELAS
Página
Capítulo 2
Tabela 1.
Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade
larval, tempo médio de empupação, tempo médio de vida das pupas
e emergência de adultos de Chrysomya putoria
após tratamento de
ovos com suspensões de conídios dos isolados de
Metarhizium
anisopliae...............................................................................................
22
Tabela 2.
Valores médios e análise de variância
do tempo médio de vida em
dias de larvas L2 de Chrysomya putoria, após tratamento com
suspensões de conídios dos isolados de Metarhizium anisopliae,
avaliadas diariamente até 15 dias após tratamento..............................
24
Tabela 3.
Valores médios e análise de variância da emergência de adultos,
tempo médio de vi
da de adultos e mortalidade total obtidas de pupas
de Chrysomya putoria
tratadas com suspensões de conídios de
isolados de Metarhizium anisopliae
. Avaliação conduzida até 20 dias
após o início da emergência de adultos.................................................
26
Tabela 4.
Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida de
adultos e mortalidade total obtidas de adultos de Chrysomya putoria
tratados com suspensões de conídios de isolados de
Metarhizium
anisopliae. Avaliação conduzida
até 20 dias após o início da
emergência de adultos...........................................................................
29
viii
Capítulo 3
Tabela 1.
Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade
larval, tempo m
édio de empupação, tempo médio de vida das pupas
e emergência de adultos de Chrysomya putoria
após tratamento de
ovos com suspensões de conídios dos isolados de
Beauveria
bassiana ................................................................................................
45
Tabela 2.
Valores médios e análise de variância
do tempo médio de vida em
dias de larvas, pupas e adultos oriundos de larvas L2 de Chrysomya
putoria, após tratamento com suspensões de conídios dos isolados
de Beauveria bassiana, avaliadas diariamente pelo período 30
dias........................................................................................................
47
Tabela 3.
Valores médios e análise de variância da emergência de adultos,
tempo médio de vida de ad
ultos e mortalidade total obtidas de pupas
de Chrysomya putoria
tratadas com suspensões de conídios de
isolados de Beauveria bassiana
. Avaliação conduzida até 20 dias
após o início da emergência de adultos.................................................
50
Tabela 4.
Valores médios e análise de variância da emergência de adultos,
tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de
adultos de Chrysomya putoria
tratados com suspensões de conídios
de isolados de Beauveria bassiana. Avaliação con
duzida até 20 dias
após o início da emergência de adultos.................................................
53
ix
Capítulo 4
Tabela 1.
Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade
larval, tempo médio de empupação, tempo médio de vida das pupas e
emergência de adultos de Chrysomya putoria após tratamento de
ovos com suspensões de conídios dos isolados de Paecilomyces
fumorosoroseus.......................................................................................
68
Tabela 2.
Valores médios e análise de variância
do tempo médio de vida em
dias de larvas, pupas e adultos oriundos de larvas L2 de Chrysomya
putoria, após tratamento com suspensões de conídios dos isolados de
Paecilomyces fumorosoroseus, avaliadas diariamente pelo período 30
dias .........................................................................................................
70
Tabela 3.
Valores médios e análise de variância da emergência de adultos,
tempo médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de pupas
de Chrysomya putoria tratadas com suspensões de conídios de
isolados de Paecilomyces fumosoroseus. Avaliação conduzida até 20
dias após o início da emergência de adultos..........................................
72
Tabela 4.
Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida de
adultos e mortalidade total obtidas de adultos de Chrysomya putoria
tratados com suspensões de conídios de isolados de Paecilomyces
fumosoroseus. Avaliação conduzida até 20 dias após o início da
emergência de adultos............................................................................
75
x
APÊNDICE
Página
Figura 1.
Caixas de criação das moscas. A: Vista lateral; B: Vista
superior......................................................................................................
83
Figura 2.
Ovos acondicionados sobre papel de filtro e este sob dieta de carne
bovina; A: ovos tratados antes da eclosão; B: ovos eclodidos após 12
horas de inoculação..................................................................................
83
Figura 3.
Visualização de uma câmara úmida e os recipientes plásticos
interligados e vedados com tecido voile
, onde os grupos de ovos e
larvas foram mantidos durante a fase larval.............................................
84
Figura 4.
Caixa de isopor adaptada para manutenção das moscas durante a fase
adulta de todos ensaios............................................................................
84
Figura 5.
Sachês co
ntendo a ração que compunha a dieta para ensaio das larvas
de Chrysomya putoria...............................................................................
85
Figura 6.
Câmara úmida composta de duas placas de Petri e algodão umedecido
para verificação da extrusão do patógeno................................................
85
Figura 7. Visualização das caixas de isopor em que os adultos de Chrysomya
putoria foram acondicionados...................................................................
85
xi
ATIVIDEDE PATOGÊNICA DOS FUNGOS Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana
E
Paecilomyces fumosoroseus
PARA
Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera:
Calliphoridae)
RESUMO - O presente estudo investigou, em condições de laboratório, a atividade
patogênica de diferentes isolados dos fungos Metarhizium anisopliae, Beauveria
bassiana e Paecilomyces fumosoroseus, aplicados nas concentrações de 1x10
6
e 1x10
8
conídios/mL nos estágios de ovo, larva L2, pupa e adulto de Chrysomya putoria.
Grupos de 30 ovos, 20 larvas L2 e 20 pupas foram banhados com as suspensões de
conídios e no ensaio com adultos, grupos de 30 moscas, foram pulverizados com as
mesmas suspensões. Em todos os ensaios, utilizaram-se quatro repetições por
tratamento. Os três fungos e seus respectivos isolados apresentaram baixa atividade
patogênica para a fase de ovo. Os isolados de B. bassiana e M. anisopliae, aplicados
na concentração de 10
8
conídios/mL, promoveram 100% de mortalidade de larvas de C.
putoria. O tratamento de pupas com o isolado JAB 07 de B. bassiana, na concentração
de 10
8
conídios/mL, reduziu significativamente a emergência de adultos. O efeito dose-
resposta foi melhor evidenciado no ensaio com adultos, pois os isolados de M.
anisopliae e B. bassiana dimimuiram a sobrevivência somente quando aplicados na
concentração de 10
8
conídios/mL. Todos os fungos se mostraram patogênicos para C.
putoria, havendo diferença entre os isolados quanto a ação patogênica. Os isolados de
B. bassiana e M. anisopliae foram mais eficientes, atuando principalmente nas fases de
larva e adulto. P. fumosoroseus evidenciou menor atividade patogênica, apenas
reduzindo a sobrevivência de adultos emergidos a partir de pupas inoculadas. A
eficiência do controle foi influenciada pela concentração de conídios, obtendo-se os
melhores resultados com as suspensões mais concentradas.
Palavras-chave: Controle biológico, controle microbiano, fungo entomopatogênico,
avicultura de postura, mosca sinantrópica.
xii
PATHOGENIC ACTIVITY OF Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana AND
Paecilomyces fumosoroseus
AGAINST
Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830)
(Diptera: Calliphoridae)
ABSTRACT - The present study investigated, in laboratory conditions, the
pathogenic activity of different isolates of the fungi Metarhizium anisopliae, Beauveria
bassiana and Paecilomyces fumosoroseus, applied in the concentrations of 1x10
6
and
1x10
8
conidia/ml in the stages of egg, L2 larvae, pupa and adult of Chrysomya putoria.
Groups of 30 eggs, 20 L2 larvae e 20 pupae were bathed with the conidia suspensions
and in the assay with adult, groups of 30 flies were pulverized with the same
suspensions. In all the assays there were used four replicates per treatment. The three
fungus and their respective isolates presented low pathogenic activity for the egg stage.
The isolates B. bassiana and M. anisopliae, applied in the concentration of 10
8
conidia/ml, promoted a 100% of C. putoria larvae mortality. The pupae treatment with
the isolate JAB 07 of B. bassiana, in the concentration of 10
8
conidia/ml, decreased
significantly adult emergence. The dose-response effect was better evidenced in the
assay with adults, because the isolates of M. anisopliae and B. bassiana only reduced
the survival when applied in the concentration of 10
8
conidia/ml. All fungus
demonstrated to be pathogenic to C. putoria, although there is a difference between the
isolates in their pathogenic activity. The isolates of B. bassiana and M. anisopliae were
more efficient, mainly acting in the larva and adult stages. P. fumosoroseus evidenced
lower pathogenic activity, decreasing the survival of emerged adult only through
inoculated pupae. The control efficiency was influenced by the conidia concentration,
obtaining the best results with the most concentrated suspension.
Key words: biologic control; microbial control; entomopathogenic fungus and poultry,
synonthropic fly.
1
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1. INTRODUÇÃO
O controle de moscas representa um dos principais problemas para a indústria
avícola de postura, apresentando custos diretos estimados em 13 centavos de dólar por
ave ao ano nos EUA (AXTELL, 1986). Atualmente, existem várias alternativas de
controle destes dípteros em aviários. Entretanto, o uso indiscriminado de inseticidas nas
granjas promove a ocorrência de resistência aos produtos químicos, eleva os riscos de
poluição ambiental e aparecimento de resíduos nos ovos e carnes das aves, além de
possibilitar o desequilíbrio da fauna de inimigos naturais das moscas (BRUNO et al.,
1993). Outro aspecto relevante é a contaminação dos dejetos, pois em algumas
granjas, a produção de esterco é da ordem de 2000 toneladas mensais, sendo
comercializado como adubo orgânico, uma atividade econômica de grande importância
para o setor (GUIMARÃES, 1988).
As práticas adequadas de manejo para os estercos, associados à atividade de
predadores naturais, os chamados manejos integrados, são bastante eficientes no
controle das moscas, porém requerem maior freqüência de coleta, processamento e
armazenamento do mesmo, tornando a atividade onerosa (AXTELL, 1986).
A identificação de competitividade entre organismos em um ecossistema
específico representa, neste contexto, uma perspectiva promissora para o tratamento
de inúmeras enfermidades. No caso das moscas sinantrópicas, o controle biológico
utilizando agentes microbianos, especialmente fungos entomopatogênicos como o M.
anisopliae e B.bassiana, apresenta significativo potencial profilático, tendo em vista que
estes microrganismos exercem atividade patogênica para uma grande variedade de
artrópodes, pois invadem o hospedeiro através da cutícula, auxiliado pela ação
simultânea hidrolítica de enzimas como proteases, quitinases e lípases
(BITTENCOURT et al., 1999). No entanto, pouco se sabe da patogenicidade destes
fungos sobre estágios larvares de dípteros sinantrópicos presentes nos excrementos
das aves.
2
A Chrysomya putoria (Wiedemann, 1830) (Diptera: Calliphoridae) é uma espécie
de mosca de grande importância médico sanitária, pois atua como vetor mecânico e/ou
biológico de diversos agentes patogênicos, incluindo parasitos do homem e de animais
domésticos. O stress causado por infestações de C.putoria causam sérios problemas
em criações de animais, interferindo no ganho de peso como agente causador de
estresse, podendo afetar a postura em aves, resultando assim em perdas econômicas
significativas. Em sistemas de produção avícola de postura comercial, as galinhas
poedeiras são alojadas em gaiolas suspensas, em condições de alta densidade, com
conseqüente acúmulo de esterco, excelente substrato para o desenvolvimento de
moscas sinantrópicas (SILVA et al., 2000).
Tendo em vista a escassa literatura envolvendo a competição entre os fungos M.
anisopliae, B. bassiana, P. fumosoroseus e os dípteros sinantrópicos, associado ao
desafio que representa estabelecer programas profiláticos eficazes contra estes
vetores, há necessidade de conduzir trabalhos que investiguem a potencialidade do uso
destes agentes no controle de moscas sinantrópicas.
O presente estudo propõe investigar, em condições de laboratório, a atividade
entomopatogênica dos fungos Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana e
Paecilomyces fumosoroseus aplicados nas concentrações de 1x10
6
e 1x10
8
conídios/mL, para os estágios de ovo, larva L2, pupa e adulto de Chrysomya putoria,
em experimentos realizados em condições laboratoriais.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Moscas Sinantrópicas
Os dípteros muscóides das famílias Calliphoridae, Fanniidae, Muscidae e
Sarcophagidae apresentam elevado potencial como vetores mecânicos de agentes
etiológicos como vírus, bactérias, cistos de protozoários e ovos de helmintos. Estes
artrópodes são de grande interesse médico-sanitário pelo índice de ocorrência,
3
distribuição e predominância em áreas metropolitanas (MARICONI et al.,1999).
Segundo D’ALMEIDA & ALMEIDA (1996), a adaptação destes dípteros às condições
ambientais modificadas pelo homem intensificou o convívio entre ambos, aumentando a
probabilidade de ocorrência na transmissão de patógenos, permitindo a classificação
destes vetores como moscas sinantrópicas.
Estudos de prevalência em fazendas avícolas identificaram as principais
espécies de moscas sinantrópicas presentes em aviários no Brasil. A Musca domestica
(Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) é a espécie de maior interesse sanitário devido a
seu caráter sinantrópico, sua endofilia, abundância na região urbana, capacidade de se
desenvolver em vários tipos de substrato, alto poder reprodutivo e por ser apontada
como veiculadora de patógenos ao homem e a animais (MENDES & LINHARES, 1993;
NEVES, 2000). GREENBERG (1971) relatou a importância da mosca doméstica como
vetor dos causadores da febre tifóide, desinteria, cólera, bouba, carbúnculo e algumas
formas de conjuntivite. Outros estudos descrevem esta espécie como a mais prevalente
em aviários comerciais (ANDERSON & POORBAUGH, 1964; BRUNO et al., 1993),
representando mais de 90% do total das espécies que se desenvolvem em tais
ambientes (GUIMARÃES, 1988).
Outra espécie de mosca sinantrópica é a mosca varejeira do gênero Chrysomya
que se constitui em problema no ambiente rural e nas grandes cidades do mundo, onde
locais com infra-estrutura inadequada de água, esgoto e acúmulo de material orgânico
em decomposição, como no caso dos aviários de postura comercial do Brasil, tornam-
se criadouros naturais destes insetos, com conseqüente transmissão de patógenos e
propagação de doenças (CARVALHO et al., 2005). Sua tolerância às variações
climáticas como temperatura, umidade relativa e luminosidade, pode ser considerada
como um dos fatores determinantes da alta capacidade adaptativa verificada nas
regiões invadidas, facilitando assim sua expansão geográfica (PARALUPPI &
CASTELLÓN, 1993). A Chrysoma putoria (Wiedemann) – “Mosca Africana”,
pertencente à família Calliphoridae, apresenta origem africana, foi introduzida no Brasil
em meados de 1970.
4
Os adultos apresentam coloração verde metálica com reflexos azulados e
espiráculos brancos. O ciclo biológico total evolui num processo de transformação de 4
etapas :ovo (12 a 24 horas), larva (5 a 7 dias), pupa (7 a 9 dias) e adulto (até 2 meses),
dependendo da temperatura e umidade.
Essa espécie se cria com freqüência nos
aviários, em fezes liquefeitas, ovos quebrados ou carcaças de aves. (GUIMARÃES,
1984).
2.2 Fungos entomopatogênicos
O controle de insetos usando agentes biológicos, tais como, fungos
entomopatogênicos, com o objetivo de evitar aplicação de produtos químicos sintéticos
e para aumentar a segurança ambiental, apresenta expectativas promissoras na
profilaxia de vetores (AHMED & LEATHER, 1994).
A grande variabilidade genética dos fungos entomopatogênicos pode ser
considerada uma das principais vantagens no controle microbiano de artrópodes.
ALVES (1998) relatou que é possível, por meio de técnicas apropriadas, selecionar
isolados de fungos altamente virulentos, específicos ou não, com características
adequadas para serem utilizados como inseticidas microbianos.
Entre os fungos entomopatogênicos mais empregados no controle de pragas
estão B. bassiana (Vuillemin, 1912), M. anisopliae (Metsch.) Sorokin e Paecilomyces
fumosoroseus (Wise) (Holm ex SF Gray). Tal fato se deve provavelmente à sua ampla
distribuição geográfica, à variedade de hospedeiros e às condições naturais, enzoóticas
ou epizoóticas em que são encontrados (ALVES, 1998).
M. anisopliae é um deuteromiceto amplamente distribuído na natureza e pode ser
encontrado facilmente nos solos, onde sobrevive por longos períodos (ALVES et al.,
1998). Considerado patogênico para um grande número de espécies de artrópodes, foi
o primeiro microrganismo a ser reconhecido pela sua importância para controle de
pestes na agricultura (FRAZZON et al., 2000).
5
Infecta mais de 300 espécies de insetos das diferentes ordens (ALVES, 1998).
Alguns de seus hospedeiros são pragas na agricultura, como a cigarrinha da cana-de-
açúcar (Mahanarva posticata), a cigarrinha das pastagens (Deois sp e Zulia sp), a
lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), Ceratitis capitata (MOCHI et al., 2006) a
formiga saúva (Atta sexdens) e os térmitas subterrâneos (Isoptera: Rhinotermitidae).
Sua patogenicidade tem sido ainda demonstrada para carrapatos de diferentes gêneros
e espécies (MONTEIRO et al, 1998; GARCIA et al, 2004; BASSO et al, 2005; PRETTE
et al, 2005).
REINECKE et al. (1990) e KURAMOTO & SHIMAZU, (1992) descreveram a
atividade patogênica do M. anisopliae para moscas domésticas adultas. Outro estudo
relatou elevado índice de mortalidade de moscas domésticas adultas submetidas ao
tratamento com dieta contendo o metabólito, destruxina E, deste deuteromiceto
(BARSON et al., 1994).
BARSON et al. (1994) demonstraram em seu estudo a elevada virulência do
fungo entomopatogênico M. anisopliae para o terceiro instar larval de Musca domestica,
pois o tratamento com o deuteromiceto na concentração de 1X10
5
conídios/mL preveniu
100% da emergência de moscas. Estes inóculos apresentaram também excelente
atividade para indivíduos adultos que morreram seis dias após o desafio com o fungo.
B. bassiana é um fungo entomopatogênico de distribuição cosmopolita,
amplamente aplicado no controle de pragas (BELL & HAMALLE, 1970) e recentemente
nos carrapatos (PAIÃO et al, 2001). Causador de epizootia, se caracteriza pela alta taxa
de crescimento, produção elevada de unidades infectivas, capacidade de sobrevivência
no ambiente, facilidade de penetração pelo tegumento e alcançar a hemolinfa do
hospedeiro, reafirmando sua alta patogenicidade (FUXA, 1987).
STEINKRAUS et al. (1990) e GEDEN et al. (1995) relataram casos de moscas
domésticas com infecções naturais pelo fungo B. bassiana, sendo cerca de 85% das
ocorrências constatadas no final do verão. Estudos no laboratório utilizando estes
isolados demonstram excelente atividade patogênica sobre larvas de terceiro instar e
pupas de M. domestica em desafios in vitro.
6
B. bassiana apresenta excelente potencial como agente biocontrolador de
Stomoxys calcitrans (WATSON & PETERSEN, 1993) e Musca domestica (BARSON et
al., 1994; RENN et al., 1999). GEDEN et al. (1995) verificaram alta mortalidade de
Muscidifurax raptor após desafio com o este hifomiceto. No entanto, pouco se sabe da
atividade deste fungo sobre os estágios larvares de outras moscas sinantrópicas.
P. fumosoroseus é comumente encontrado no solo, sendo também isolado a
partir de uma diversidade de insetos em todo o mundo (CANTONE & VANDENBERG,
1998). Por causa da sua capacidade de promover epizootias em diferentes regiões do
mundo, começa a ser explorado e desenvolvido como um possível agente
biocontrolador (JACKSON et al., 1997), sendo uma espécie de fungo muito estudado e
produzido para controlar a mosca branca (JACKSON et al., 2004). CASTILLO et al.
(2000) demonstraram os efeitos patogênicos de M. anisopliae e P. fumusoroseus em
Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae), os graus diminuíram a fecundidade e fertilidade
das fêmeas desafiadas com os fungos.
2.3 Controle Biológico
Observações epizoóticas da ação patogênica natural de microrganismos em
populações de artrópodes encorajaram intenso número de estudos para aplicação de
fungos entomopatogênicos no controle biológico (FENG et al., 1994; SMITH et al.,
2000). A maioria dos fungos patogênica ataca artrópodes após contato externo com o
hospedeiro promovendo penetração pela cutícula debilitando e matando o hospedeiro
(SMITH et al., 2000).
Segundo BARSON et al. (1994), o desenvolvimento de resistência à maioria dos
inseticidas químicos evidencia a necessidade da adoção de novos métodos para
controle das moscas sinantrópicas. Neste contexto, LIU & YUE (2000) verificaram a
ocorrência de resistência cruzada de moscas (diptera-muscidae) aos inseticidas do
grupo dos piretróides. A análise do fipronil mostrou resultados semelhantes na ativação
destes mesmos mecanismos. No entanto, a atividade pesticida dos organofosforados
7
não apresentou o desenvolvimento de resistência por ativação destes ciclos
metabólicos. Tais prerrogativas ressaltam a importância na determinação de
procedimentos alternativos para controle de vetores em aviários de postura.
Outro aspecto relevante para o sucesso em programas de controle biológico
envolve a identificação de características semelhantes nas condições ambientais que
favoreçam o desenvolvimento do ciclo biológico tanto do parasito quanto do hospedeiro.
SMITH & RUTZ (1991) avaliaram o efeito das condições ambientais na incidência de
ovos, larvas, pupas e adultos de várias moscas da família muscidae em fazendas no
Estado de Nova York. Entre os parâmetros avaliados neste estudo, a umidade presente
nos alimentos e excrementos dos animais apresentou maior influência no ciclo biológico
destes artrópodes, ocorrendo reduções significativas nas populações de moscas
quando submetidas a ambientes secos ou com baixa umidade relativa. BRUNO et al.
(1993) estudaram a relação entre a umidade do esterco de aves e o desenvolvimento
larval de moscas sinantrópicas em amostra coletadas no Estado de São Paulo. Os
achados desta investigação demonstraram que as larvas dos dípteros requerem
elevados níveis de umidade, variando entre 45 e 80%, condições ambientais
consideradas satisfatórias para o cultivo e crescimento dos fungos M. anisopliae e B.
bassiana (BARSON et al., 1994 e FERRON, 1977, respectivamente).
Outro aspecto relevante no emprego do controle biológico são os programas de
biossegurança adotados na avicultura, cada vez mais exigentes pelos consumidores
internos e externos, quanto à presença de resíduos em produtos, além da
comercialização do esterco dos aviários, destinados à adubações em produções
agrícolas e da preservação do meio ambiente.
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14
CAPÍTULO 2 – EFICIÊNCIA DE Metarhizium anisopliae NO CONTROLE DA MOSCA
VAREJEIRA
Chrysomya putoria
RESUMO - Este estudo avaliou a eficiência dos isolados E 9 e IBCB 425 de
Metarhizium anisopliae, para o controle das diferentes fases do desenvolvimento da
mosca sinantrópica varejeira Chrysomya putoria (Diptera: Calliphoridae). As
suspensões dos isolados foram testadas nas concentrações de 1x10
6
e 1x10
8
conídios/mL, nos estágios de ovo, larva (L2), pupa e adulto de C. putoria. Grupos de 30
ovos, 20 larvas e 20 pupas foram banhados em suspensões de conídios, sendo a
mortalidade avaliada diariamente, considerando-se as respectivas fases subseqüentes
do ciclo da mosca, até o 20
o
dia da fase adulta. No ensaio com adultos, grupos de 30
moscas foram pulverizados com 1 mL das suspensões de conídios, mantidos em
gaiolas para avaliação diária da mortalidade, durante 20 dias. Larvas, pupas e adultos
mortos foram acondicionados em câmaras úmidas para observação de extrusão do
patógeno. Os isolados E 9 e IBCB 425 promoveram um aumento significativo (P<0,05)
no tempo médio de empupação e tempo médio de vida da pupa, respectivamente
quando aplicados na concentração de 1x10
8
conídios/mL na fase de ovo. Ambos os
isolados causaram 100% de mortalidade no tratamento de larvas (L2), submetidas às
concentrações de 1x10
6
e 1x10
8
conídios/mL. Nos ensaios com pupas e adultos,
verificou-se significativa mortalidade (P<0,05) após a administração de inóculos com
1x10
8
conídios/mL dos isolados IBCB 425 e E 9. Os resultados indicam que o isolado
E9 de M. anisopliae, na concentração de 10
8
conídios/mL, é patogênico para as fases
de larva, pupa e adulto de C. putoria, apresentando perspectivas promissoras para o
uso em programas de controle biológico da mosca.
Palavras-chave: Controle biológico, controle microbiano, fungo entomopatogênico,
avicultura de postura, mosca sinantrópica.
15
CHAPTER 2- EFICIENCY OF Metarhizium anisopliae IN THE CONTROL OF
BLOWFLY
Chrysomya putoria
ABSTRACT - This study evaluated the efficiency of the isolates E 9 and IBCB
425 of Metarhizium anisopliae applied to the different development stages of
Chrysomya putoria (Diptera: Calliphoridae), a kind of synantropic blowfly. The fungi
suspensions were tested in the concentrations of 1x10
6
and 1x10
8
conidia/ml, on egg’s
stage, larval L2, pupae and adult of C. putoria. Groups of 30 eggs, 20 larvae and 20
pupae were bathed in conidia suspension, being mortality daily evaluated, and
considered the respective subsequent stages of the fly cycle, until the 20
th
day of the
adult stage. For the adults, groups of 30 flies were pulverized with 1ml of the conidia
suspensions and maintained for 20 days in cages for daily mortality examination.
Deceased larvae, pupa and adults were transferred to humid cameras to verify the
pathogen extrusion. The isolates E 9 and IBCB 425 promoted a significant increase
(P<0,05) in the average time of the pupa’s process and pupa’s average life time,
respectively, when submitted to 1x10
8
conidia/ml on egg stage. Both isolates caused
100% of the mortality on larvae L2 treatment with 1x10
6
and 1x10
8
conidia/ml. In the
assays with pupa and adults, it was observed significant mortality (P<0,05), after to be
challenged with 1x10
8
conidia/ml of IBCB 425 and E 9 isolates. The results indicated
that the isolate E 9 of M. anisopliae, in the concentration of 10
8
conidia/ml, is pathogenic
to larva, pupa and adults stages of C. putoria, showing satisfactory potential for
biological control of this blowfly.
Key words: Biological control, microbial control, entomopathogenic fungus,
poultry, synantropic fly.
16
1. INTRODUÇÃO
A alta densidade de aves adotada em granjas causa grande acúmulo de esterco,
excelente substrato para a proliferação de moscas. Dentre os principais califorídeos que
ocorrem nesse meio, está a mosca varejeira Chrysomya putoria, podendo causar
diversos danos aos aviários, deixando manchas nos equipamentos da granja, as quais
podem causar redução na intensidade de iluminação (BICHO et al., 2004). Estes
insetos podem ainda veicular patógenos, principalmente quando pousam em ovos
recém-colocados, pois por meio do seu corpo, trato digestivo ou até mesmo das suas
fezes, podem ser transmissoras de diversos microrganismos tanto para o homem como
para as aves (AXTELL & ARENDS, 1990).
O uso indiscriminado de inseticidas químicos para controle destes dípteros nas
granjas propicia a seleção de biótipos resistentes aos produtos (SCOTT et al., 2000),
aumenta os riscos de poluição ambiental e aparecimento de resíduos químicos nos
ovos e carnes das aves, além de possibilitar o desequilíbrio na população de outros
artrópodes inimigos naturais das moscas (BRUNO et al., 1993).
Os fungos entomopatogênicos são responsáveis por 80% das doenças causadas
em insetos e possui a vantagem de ter uma grande variabilidade genética, o que evita
possíveis problemas de resistência de pragas a este patógeno (ALVES, 1998).
Entre os entomopatógenos, Metarhizium anisopliae Metsh. (Sorokin) tem se
destacado como um importante agente de controle microbiano (ALVES, 1998), sua
aplicação apresenta significativo potencial profilático, tendo em vista que este
microrganismo exerce atividade patogênica para uma grande variedade de artrópodes
(DIMBI et al., 2003; BASSO et al., 2005; MOCHI et al., 2006; BRIGGS et al., 2006;
CABRAL et al., 2007).
A infecção de insetos adultos pelo M. anisopliae, ocorre por penetração pela
cutícula, por uma combinação entre a barreira físico-química e a degradação enzimática
(HAJEK e ST. LEGER, 1994). Com um mecanismo de infecção especializado, alguns
fungos podem infectar diferentes estágios de desenvolvimento dos hospedeiros
(MCCOY e MILANI-TIGANO, 1992).
17
Na literatura existem vários trabalhos envolvendo a atividade do fungo M.
anisopliae no controle de moscas sinantrópicas como a Musca domestica (WATSON et
al., 1996; CRESPO et al., 1998), a Stomoxys calcitrans (WATSON et al., 1995) e a
Haemathobia irritans (ANGEL-SAHAGÚN et al., 2005). Entretanto há carência de
estudos envolvendo moscas do gênero Chrysomya.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a patogenicidade de M.
anisopliae, em condições laboratoriais, nas concentrações de 1x10
6
e 1x10
8
conídios/mL, para os estágios de ovo, larva L2, pupa e adulto de Chrysomya putoria.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Fungos
Foram utilizados os isolados IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae, pertencentes à
coleção do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Produção Vegetal da
FCAV/Unesp. Os isolados foram mantidos em tubos de ensaio contendo 5 mL de
meio BDA (batata, dextrose e ágar) inclinado, estocados a 4ºC. Para utilização nos
ensaios foram cultivados em placas de Petri contendo meio BDA, acondicionadas em
estufa a 27 ± 0,5ºC, durante 15 dias, com ausência de iluminação. A viabilidade dos
isolados, determinada pelo método descrito por MARQUES et al.(2004), nos ensaios
de ovo, larva, pupa e adulto os resultados observados de viabilidade foram
respectivamente, de: IBCB 425 (99, 98, 98, e 97%) e E 9 (100, 100, 100, 100%).
Para a produção dos inóculos, os esporos da parte superficial de colônias jovens
do fungo foram transferidos para tubos contendo 20 mL de solução Tween 80
®
(0,1%
v/v) esterilizada. Após vigorosa agitação em agitador elétrico de tubos, as suspensões
foram padronizadas em 1 x 10
6
e 1 x 10
8
conídios/mL, com auxílio da câmara de
Neubauer.
18
2.2 Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria.
Amostras de excrementos contendo larvas de C. putoria, coletadas em aviários
de galinhas de postura, pertencentes à FCAV/Unesp, foram acondicionadas em caixas
isopor de 15 litros adaptados de BELO (1991) (Figura 1 do Apêndice) adaptadas para
implantação e manutenção da colônia utilizada durante os bioensaios com os diferentes
estágios de desenvolvimento da mosca.
Os adultos provenientes dessas larvas foram confinados nas caixas de isopor e
para sua manutenção utilizou-se uma mistura de leite em pó e açúcar (1:1) e água
destilada oferecida ad libitum em algodão saturado. A ovipostura foi estimulada
oferecendo carne bovina in natura. Em seguida, os ovos foram transportados para
copos plásticos (60 mm de diâmetro x 70 mm de altura) vedados com tecido voile e
contendo uma dieta artificial composta de farelo de trigo (18%), farelo de milho (17%),
farelo de soja (51%), farelo de arroz (14%) e água em quantidade suficiente para
proporcionar consistência pastosa. Após a eclosão, as larvas permaneceram nos
mesmos recipientes até atingirem o terceiro ínstar, quando foram colocadas nas caixas
de manutenção de moscas para a empupação e emergência de adultos, todos mantidos
à temperatura ambiente. A cada 30 dias novas larvas da mosca eram colhidas no
ambiente natural e introduzidas na colônia para minimizar o efeito endogâmico.
2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de
C. putoria
Grupos de 30 ovos com até quatro horas de idade, foram banhados por 30
segundos com as suspensões de conídios obtidas como já descrito e os grupos
controle foram banhados apenas no veículo da suspensão. Em seguida, foram
colocados sobre papel de filtro esterilizado o qual foi depositado sobre 5 g de carne
bovina moída e em processo inicial de decomposição que serviu de dieta para as larvas
eclodidas (Figura 2 do Apêndice). Esta preparação foi acondicionada em recipiente de
plástico (30 mm de diâmetro x 50 mm de altura) interligado a outro idêntico por um
A
19
orifício no intuito de oferecer um ambiente mais seco para a empupação. Os recipientes
foram vedados com malha fina de nylon e acondicionados em câmaras úmidas (Figura
3 do Apêndice) à 27 ± 0,5 ºC, umidade relativa do ar entre 60 e 70% e fotoperíodo de
14 horas.
A avaliação de eclosão foi realizada a partir de 12 horas após a inoculação do fungo.
No estádio larval, os imagos foram inspecionados diariamente para verificação da
empupação e as pupas formadas foram separadas e acondicionadas em placas de
Petri com algodão umedecido. As moscas adultas emergidas foram transferidas para
caixas de isopor (2 litros), adaptadas de acordo com BELO (1991) (Figura 4 do
apêndice), mantidas à temperatura ambiente, oferecendo, ad libitum, dieta composta
por uma mistura de leite em pó e açúcar refinado (1:1), e água em algodão saturado,
durante o período de 20 dias, para avaliação diária da longevidade. A extrusão do
patógeno em pupas e adultos foi observada como um dado complementar para
verificação da atividade patogênica.
2.4 Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de
C. putoria
Grupos de 20 larvas (L2), com 72 horas de idade, foram imersos durante 30
segundos nas suspensões de conídios ou veículo das suspensões (controle), como
descrito anteriormente, e em seguida, mantidos em dois recipientes de plástico. Para
evitar a remoção de conídios do tegumento, as larvas foram deixadas por 24 horas nos
recipientes de plástico e em seguida foram alimentadas com a dieta artificial usada para
manutenção de larvas, autoclavada, oferecida na forma de sachês (Figura 5 do
apêndice). A montagem, finalidade e manutenção dos recipientes plásticos foram
realizadas conforme descrito no ensaio anterior.
A inspeção das larvas foi efetuada diariamente por 30 dias para verificação da
mortalidade e empupação. As pupas foram transferidas para caixas de isopor (2 litros)
adaptadas conforme descrito por BELO (1991) (Figura 4 do apêndice), para observação
da emergência e do tempo de vida dos adultos. Larvas, pupas e adultos mortos foram
20
transferidos para câmaras úmidas mantidas a 27
o
C para verificação da extrusão do
patógeno (Figura 6 do apêndice).
2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de C. putoria
Grupos de 20 pupas com um a dois dias de idade, com quatro repetições, foram
imersos durante 30 segundos nos veículos ou nas suspensões de conídios já referidas
e mantidos à temperatura ambiente, em caixas de isopor, como descrito no item 2.3,
ensaio com ovos. As caixas foram inspecionadas diariamente para observação de
emergência e mortalidade de adultos, durante 20 dias após o 3° dia de incubação,
ocasião em que ocorreu a primeira emergência. As pupas que não geraram adultos até
o quinto dia após o tratamento, foram consideradas mortas. Pupas e adultos mortos
foram transferidos para câmaras úmidas mantidas a 27
o
C para verificação da extrusão
do patógeno.
2.6 Patogenicidade dos fungos para adultos de C. putoria
Grupos de 30 moscas adultas, com um a cinco dias de idade, foram separados em
recipientes de plástico, cobertos com tecido voile e mantidos a temperatura de 0°C até
a completa imobilização das moscas. Com auxílio de um pequeno aspersor manual,
foram pulverizados com 1 mL das suspensões de conídios e mantidos em temperatura
ambiente, sendo oferecido água em algodão saturado. Os grupos controles foram
pulverizados apenas com o veículo das suspensões. Após 12 horas, as moscas foram
transferidas e mantidas durante 20 dias em caixas de isopor, como anteriormente
descrito, para avaliação diária da longevidade dos adultos (Figura 7 do apêndice). Os
adultos mortos foram transferidos para câmaras úmidas mantidas a 27
o
C para
verificação da extrusão do patógeno (Figura 6 do apêndice).
21
2.7 Análise estatística
Todos os ensaios foram conduzidos com quatro repetições. Para análise dos
dados utilizou-se o programa SAS, versão 8.2 (SAS, 1999). Inicialmente, todas as
variáveis foram estudadas de maneira descritiva, pelo cálculo da média, desvio padrão
e mediana. Em seguida os valores percentuais de mortalidade foram transformados em
Arco seno =
(
)
[
]
π
/180100% ×emortalidad
, e o tempo médio de vida (TMV) foi
calculado pela média ponderada da mortalidade e o tempo em dias TMV = (dias x
sobreviventes)/sobreviventes. Todas as médias dos dados foram analisadas em um
delineamento inteiramente casualizado (ANOVA) e as comparações múltiplas foram
aferidas pelo teste de Tukey (P0,05).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Patogenicidade para ovos de C. putoria
A aplicação dos isolados de IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae em ovos de C.
putoria não apresentou efeito significativo (P>0,05) sobre o percentual de eclosão
(Tabela 1). O tempo médio de eclosão de larvas de C. putoria ocorreu a partir de 12
horas da ovipostura. Em ensaios de viabilidade, a germinação dos isolados IBCB 425 e
E 9, após 12 horas de incubação, foi de 78 e 75%, respectivamente. Como os conídios
foram inoculados nos ovos quatro horas após a postura, provavelmente a eclosão das
larvas ocorreu antes da germinação e penetração do fungo no ovo, o que justifica a
baixa atividade patogênica para este estágio de desenvolvimento da C. putoria. A
eficiência do controle biológico depende do sincronismo na relação parasito-hospedeiro,
fato não observado na fase de ovo do ciclo da mosca. Desta forma, os resultados
observados sugerem que os isolados IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae não apresentam
potencial patogênico para ovos de C. putoria, contrariamente às observações de
22
ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005) que verificaram, após tratar os ovos de Haematobia
irritans com inóculos contendo 10
6
conídios/mL, redução significativa na porcentagem
de emergência de adultos em quatro de 11 isolados de M. anisopliae estudados.
TABELA 1 -
Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade larval,
tempo médio de empupação, tempo médio de vida das pupas e emergência de adultos
de Chrysomya putoria
após tratamento de ovos com suspensões de conídios dos
isolados de Metarhizium anisopliae.
Tratamento
a
Eclosão (%) Mortalidade
larval
TME
b
(dias)
TMVP
c
(dias)
Emergência
(%)
IBCB 425 10
6
90,84
±
5,0
A
1,50
±
1,3
A
7,26
±
0,3
AB
3,83
±
0,1
AB
94,98
±
4,0
A
IBCB 425 10
8
95,83
±
3,2
A
1,00
±
1,4
A
7,60
±
0,5
A
3,87
±
0,3
AB
93,54
±
7,5
A
E9 10
6
87,50
±
3,2
A
1,00
±
2,0
A
7,38
±
0,4
AB
3,83
±
0,1
AB
98,15
±
3,7
A
E9 10
8
95,00
±
3,3
A
2,25
±
1,0
A
7,12
±
0,1
AB
3,90
±
0,1
A
99,07
±
1,9
A
Controle
d
87,50
±
5,0
A
2,00
±
1,8
A
6,82
±
0,1
B
3,58
±
0,1
B
96,83
±
4,0
A
Valor de F 2,44
NS
0,71
NS
4,39* 1,59
NS
0,75
NS
Pr>F
e
0,0918 0,5996 0,0151 0,2272 0,5750
C.V. (%)
f
8,09 97,76 3,84 7,46 14,04
DMS (Tukey)
g
15,67 5,76 0,61 0,63 28,56
Médias seguidas por pelo menos por uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si
pelo teste de
Tukey (P>0,05). NS não significativo; *significativo a 5% de probabilidade.
a
isolado, seguido da concentração de conídios/mL usada.
b
TME: Tempo médio de empupação;
c
TMVP: Tempo médio de vida das pupas.
d
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
e
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
f
C.V.: Coeficiente de variação
g
DMS: Diferença mínima significativa.
CASTILLO et al. (2000) descreveram a atividade patogênica de cepas deste
fungo sobre a fertilidade de ovos de Ceratitis capitata, observando redução significativa
de 40 a 50% no percentual de eclosão após tratamento de fêmeas adultas com inóculos
de 10
6
conídios do isolado CECT 2952 de M. anisopliae. No presente estudo não houve
aumento significativo (P>0,05) na mortalidade de larvas de C. putoria provenientes dos
ovos tratados com inóculos de 10
6
e 10
8
conídios/mL de ambos os isolados (Tabela 1).
Porém, se observa aumento no tempo médio de empupação das larvas quando
23
comparadas ao grupo controle, sendo estatisticamente significativo (P<0,05) apenas
para os ovos tratados com 10
8
conídios do isolado IBCB 425 de M. anisopliae.
Na análise do tempo médio de vida da pupa, o isolado E 9 na concentração de
10
8
conídios/mL apresentou aumento significativo (Tabela 1), corroborando a ausência
da atividade do fungo para esta fase do ciclo biológico da mosca, pois o fungo não
afetou a emergência de adultos após o tratamento dos ovos com as suspensões, sendo
confirmada pela completa ausência da extrusão do patógeno observado em pupas e
adultos mortos, reafirmando a pequena atividade patogênica do fungo para ovos de C.
putoria.
3.2 Patogenicidade para larvas L2 de C. putoria
No bioensaio realizado com larvas (L2), avaliou-se o efeito patogênico dos
tratamentos fúngicos por meio do estudo do tempo médio de vida das larvas de C.
putoria. Verificou-se redução significativa (P<0,01) do tempo médio de vida das larvas e
total nos tratamentos com os isolados E 9 e IBCB 425 de M. anisopliae nas duas
concentrações de conídios testadas quando comparadas ao controle (Tabela 2),
apresentando 100% de mortalidade nesta fase do ciclo, confirmada pela presença de
extrusão do fungo em larvas mortas (Figura 1). Tal fato evidencia que estes isolados
apresentam acentuada atividade patogênica para larvas de C. putoria. Como
conseqüência, não se observou atividade patogênica residual para pupas e adultos.
Figura 1.
Larvas mortas de Chrysomya putoria apresentando extrusão de
Metarhizium anisopliae.
24
Analisando graficamente a sobrevivência larval observou-se que as larvas de C.
putoria tratadas com os isolados E 9 e IBCB 425 de M. anisopliae, apresentaram 100%
de mortalidade no 8° e 9° dias, respectivamente, após tratamento com a concentração
de 10
8
conídios/mL. No entanto, o efeito da concentração de conídios ficou menos
evidente visto que o isolado E 9 aplicado na concentração de 10
6
conídios/mL, também
promoveu 100% de mortalidade de larvas no 8° dia após tratamento (Figura 2).
TABELA 2 - Valores médios e análise de variância
do tempo médio de vida em dias de
larvas L2 de Chrysomya putoria, após tratamento com suspensõe
s de conídios dos
isolados de Metarhizium anisopliae, avaliadas diariamente até 15 dias após tratamento.
Tempo médio de vida (dias)
Tratamento
a
Larva Total
IBCB 425 10
6
3,07
±
0,1
B
3,07
±
0,1
B
IBCB 425 10
8
3,00
±
0,1
B
3,00
±
0,1
B
E9 10
6
3,44
±
0,2
B
3,44
±
0,2
B
E9 10
8
2,96
±
0,1
B
2,96
±
0,1
B
Controle
d
5,62
±
0,7
A
8,42
±
0,7
A
Valor de F
47,49
**
199,29
**
Pr>F
c
<0,0001 <0,0001
C.V. (%)
d
9,10 8,07
DMS (Tukey)
e
0,72 0,74
Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na c
oluna, não diferem entre si pelo teste de
Tukey (P>0,05). **Significativo a 1% de probabilidade.
a
Isolado e concentração de conídios/mL.
b
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
c
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
d
CV: Coeficiente de variação
e
DMS: Diferença mínima significativa.
Tais achados estão em concordância com o descrito por BARSON et al. (1994)
que constataram significativa redução na porcentagem de emergência de adultos de
mosca doméstica após tratar larvas de terceiro ínstar com o isolado 27585 de M.
anisopliae na concentração de 10
6
conídios/mL, quando comparado ao tratamento com
10
4
conídios/mL. No entanto, o resultado do tratamento com 10
6
conídios/mL não diferiu
25
do obtido na concentração de 10
8
conídios/mL, achado congruente com o verificado
neste trabalho para as concentrações de 10
6
e 10
8
conídio/mL do isolado E 9.
Figura 2: Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria tratadas com suspensões de
conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de Metarhizium anisopliae, nas concentrações de
10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, nos primeiros 15 dias após o tratamento.
Recentemente, BERNARDI et al. (2006) e MOCHI et al. (2006) relataram
aumento significativo na mortalidade de pupas de M. domestica e na emergência de
adultos de Ceratitis capitata, respectivamente, após tratarem larvas destes dípteros com
inóculos maiores que 10
6
conídios/mL dos isolados CG 34 e E 9 de M. anisopliae,
respectivamente.
Os dados observados neste estudo confirmam a patogenicidade do fungo M.
anisopliae pelos isolados IBCB 425 e E 9 para larvas de segundo ínstar de C. putoria
quando aplicado na concentração de 10
6
e 10
8
conídios/mL.
10
6
10
6
10
8
10
8
26
3.3 Patogenicidade para pupas de C. putoria
Para o estudo da atividade patogênica dos isolados durante a fase pupal de C.
putoria foram analisados a emergência de adultos, o tempo médio de vida dos adultos e
mortalidade total. Pela análise da emergência de adultos, não foi observado efeito
significativo (p>0,05) (Tabela 3), Tal resultado é, provavelmente, conseqüências de
características fisico-químicas específicas da pupa dos artrópodes, que favorecem sua
defesa contra a ação lesiva de patógenos. BIDOCHKA e KHACHATOURIANS (1992)
verificaram que proteínas cuticulares influenciaram diretamente na germinação e
crescimento de B. bassiana em Melanoplus sanquinipes, enquanto MARMARA et al.
(1993) mostraram que proteínas presentes na cutícula de C. capitata foram
responsáveis pelo reconhecimento e eliminação de bactérias infectantes.
TABELA 3 - Valores médi
os e análise de variância da emergência de adultos, tempo
médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de pupas de C. putoria
tratadas com
suspensões de conídios de isolados de Metarhizium anisopliae
. Avaliação conduzida até
20 dias após o início da emergência de adultos.
Tratamento
a
Emergência (%)
b
TMV
c
Mortalidade total
IBCB 425 10
6
11,50
±
2,38
A
10,30
±
0,17
A
10,00
±
1,83
CB
IBCB 425 10
8
9,25
±
2,50
A
10,22
±
0,26
A
12,00
±
2,00
AB
E 9 10
6
12,00
±
2,45
A
10,40
±
0,09
A
8,75
±
2,06
CB
E 9 10
8
10,00
±
1,83
A
9,39
±
0,73
B
14,25
±
1,71
A
Controle
d
13,50
±
0,58
A
10,36
±
0,16
A
7,50
±
1,00
C
Valor de F
2,61
NS
5,23
**
9,23
**
Pr>F
e
0,0779 0,0077 0,0006
C.V. (%)
f
18,47 3,62 16,77
DMS (Tukey)
g
4,54 0,80 3,84
Méd
ias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(P>0,05). NS não significativo; **significativo a 1% de probabilidade.
a
Isolado e concentração de conídios/mL.
b
Media das porcentagens dos valores observados transformados em arco seno;
c
TMV: Tempo médio de vida dos adultos (em dias).
d
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
e
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
f
CV: Coeficiente de variação
g
DMS: Diferença mínima significativa.
27
A análise do tempo médio de vida dos adultos que emergiram a partir das pupas
tratadas, mostrou que somente o tratamento com o isolado E 9 de M. anisopliae, na
concentração de 10
8
conídios/mL, reduziu significativamente (P<0,01) a sobrevivência
das moscas, quando comparado ao controle. Na avaliação da mortalidade total de
pupas de C. putoria, se observou aumento significativo (P<0,01) na mortalidade dos
grupos banhados com suspensões dos isolados IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae, na
concentração de 10
8
conídios/mL (Tabela 3). Resultados similares aos descritos por
ANGEL-SAHAGUN (2005), aplicando M. anisopliae em pupas de H. irritans com
mortalidade de 50%.
Analisando graficamente a sobrevivência de moscas emergidas de pupas
tratadas com as suspensões de conídios de IBCB 425 e E 9 de M anisopliae se
observou acentuada mortalidade de adultos emergidos (Figura 3).
Figura 3: Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria emergidos de pupas tratadas
com suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de M. anisopliae, nas
concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, até o 23° dia após tratamento.
10
6
10
6
10
8
10
8
28
Outro aspecto importante a ser considerado é a redução na sobrevivência de
adultos provocada pelo aumento da concentração dos inóculos, sendo mais evidente a
atividade dose-resposta para o isolado E 9 de M. anisopliae (Figura 3). A redução na
longevidade dos adultos emergidos de pupas tratadas com isolado IBCB 425 e E 9 de
M. anisopliae é importante para o controle de C. putoria, diminuindo a duração da fase
reprodutiva da mosca, como em estudos com adultos de C. capitata, que apresentaram
menor longevidade após o tratamento das pupas com diferentes isolados de M.
anisopliae (BISOLLI, 2004).
Os resultados obtidos no bioensaio com pupas de C. putoria demonstraram a
atividade patogênica do M. anisopliae, confirmada pela presença de extrusão do
patógeno em pupas (Figura 4) e adultos, causando aumento da mortalidade de adultos
na aplicação dos isolados IBCB 425 e E 9 na concentração de 10
8
conídios/mL, sendo
mais evidente pelo isolado E 9, promovendo diminuição no tempo médio de vida das
moscas provenientes de pupas tratadas com suspensões de 10
8
conídios/mL.
Figura 4: Pupa de Crysomya putoria
morta apresentando extrusão do isolado
E9 de Metarhizium anisopliae.
29
3.4 Patogenicidade para adultos de C. putoria
Na análise comparativa da atividade patogênica dos isolados aplicados
diretamente sobre adultos de C. putoria, se observou resultados significativos (P<0,01)
na redução do tempo médio de vida e no aumento da mortalidade das moscas tratadas
com suspensões de 10
8
conídios/mL de M. anisopliae (Tabela 4).
Adultos de C. putoria tratados com suspensões 10
8
conídios/mL dos isolados
IBCB 425 e E9 de M. anisopliae apresentaram percentuais de mortalidade de 64,16 e
61,70 respectivamente, durante o período de 20 dias, sendo cerca de 50% maiores do
TABELA 4 -
Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida de adultos e
mortalidade total obtidas de adultos de
Chrysomya putoria
tratados com suspensões de
conídios de isolados de Metarhizium anisopliae
. Avaliação conduzida até 20 dias após o
início da emergência de adultos.
Tratamentos
a
TMV
b
Mortalidade (%)
c
IBCB 425 10
6
9,75
±
0,17
A
39,71
±
1,87
BC
IBCB 425 10
8
7,58
±
0,47
B
64,16
±
3,50
A
E9 10
6
9,56
±
0,13
A
42,60
±
3,28
B
E9 10
8
7,70
±
0,10
B
61,70
±
1,16
A
Controle
d
9,86
±
0,41
A
32,89
±
8,29
C
Valor de F
58,94** 40,17**
Pr>F
e
<0,0001 <0,0001
C.V. (%)
f
3,36 9,11
DMS (Tukey)
g
0,65 9,59
Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo
teste de Tukey
(P>0,05). **Significativo a 1% de probabilidade;
a
Isolado e concentração de conídios/mL.
b
TMV: Tempo médio de vida dos adultos (em dias).
c
Media das porcentagens dos valores observados transformados em arco seno;
d
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
e
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
f
CV: Coeficiente de variação
g
DMS: Diferença mínima significativa.
30
que os valores observados no controle (Tabela 4). Tais achados estão em
concordância com os descritos por WRIGHT et al. (2004) que verificaram mortalidade
de 64% de adultos da varejeira Lucilia sericata após o tratamento com suspensões de
10
7
conídios/mL de M. anisopliae, e por e LOHMEEYER & MILLER (2006), pelas
mortalidades de 43,5 e 73% após tratamento de adultos de H. irritans com elevada
concentração de conídios (10
9
conídios/g). ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005), avaliando a
patogenicidade do M. anisopliae em adultos de H. irritans, com suspensões de 10
8
conídios/mL, obtiveram de 50 a 100% de mortalidade em 8 dos 11 isolados testados.
O efeito dose-resposta para estes isolados ficou evidente nesta análise, pois os
adultos tratados com suspensões de 10
6
conídios/mL apresentaram mortalidades
estatisticamente similares ao grupo controle (Tabela 4). Esse efeito foi descrito em
outros estudos com dípteros por BARSON et al. (1994) e BERNARDI et al. (2006) que
mostraram o efeito dose-resposta para a ação patogênica de isolados de M. anisopliae
no controle de adultos de mosca doméstica, e em C. capitata por CASTILLO et al.
(2000).
Analisando graficamente a sobrevivência de adultos de C. putoria durante o
período de 20 dias, observa-se o efeito dose-resposta, verificando acentuada
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Dias após tratamento
Nº de adultos sobreviventes
M.a.IBCB425 10
6
M.a.E9 10
6
Controle
M.a.IBCB425 10
8
M.a.E9 10
8
Figura 5: Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria
pulverizados com
suspensões de conídios dos isolados IBCB 425 e E 9 de Metarhizium anisopliae
, nas
concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, até o 20° dia após tratamento.
31
mortalidade das moscas a partir do sexto e 14° dias, respectivamente após o
tratamento com os isolados de M. anisopliae (Figura 5) na concentração de 10
8
conídios/mL.
Neste contexto, podemos afirmar que adultos de C. putoria são susceptíveis aos
isolados E 9 e IBCB 425 de M. anisopliae, sendo mais eficiente na concentração de 10
8
conídios/mL, dados confirmados pelas observações de extrusão do fungo nos
exemplares mortos deste ensaio (Figura 6).
Como C. putoria habitualmente se alimenta e reproduz em excretas de aves,
uma das estratégias seria a pulverização de suspensão de conídios sobre os mesmos,
o que possibilitaria a atuação direta sobre larvas e indireta sobre adultos. De acordo
com WRIGHT et al. (2004), o contato do tarso de adultos de varejeira L. sericata, com
inóculos de 10
7
conídios/mL de M. anisopliae resultou em 64% de infecções das
moscas. É necessário estabelecer estratégias que permitam a utilização de M.
anisopliae como alternativa aos tratamentos convencionais com pesticidas químicos,
atualmente empregados no manejo sanitário de aviários de postura, mais estudos neste
sentido devem ser conduzidos.
Figura 6. Adultos de Chrysomya putoria mortos pelo fungo Metarhizium anisopliae
exibindo a extrusão do patógeno.
32
4. CONCLUSÕES
1. O fungo M. anisopliae é eficiente no controle de C. putoria.
2. A mosca C. putoria é mais susceptível ao fungo nas fases de larva e adulto.
3. Os isolados IBCB 425 e E9 são patogênicos para C. putoria, sendo mais efetivos
quando aplicados na concentração de 10
8
conídios/mL.
4. O isolado E 9 de M. anisopliae na concentração de 10
8
conídios/mL. é indicado para
o controle de C. putoria, foi capaz de agredir as fases de larvas, pupas e adultos.
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37
CAPÍTULO 3 - SUSCEPTIBILIDADE DE Chrysomya putoria (Diptera: Calliphoridae) A
AÇÃO PATOGÊNICA DE
Beauveria bassiana.
RESUMO - O presente estudo investigou, em condições de laboratório, a
atividade patogênica dos isolados JAB 07 e AM 9 de Beauveria bassiana, aplicados nas
concentrações de 1x10
6
e 1x10
8
conídios/mL, nos estágios de ovo, larva L2, pupa e
adulto de Chrysomya putoria. Nos bioensaios, grupos com 30 ovos, 20 pupas e 20
larvas, foram banhados em suspensões de conídios e no ensaio com adultos, foram
pulverizados grupos de 30 moscas com 1 mL das mesmas suspensões. Em todos os
ensaios, utilizaram-se quatro repetições por tratamento e o grupo controle tratado com o
veículo das suspensões. O tratamento dos ovos com os isolados de B. bassiana
apenas apresentaram efeito sobre o aumento do tempo médio de vida das pupas
quando aplicados nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL. Os isolados de B.
bassiana, aplicados nas duas concentrações promoveram significativa mortalidade
(P<0,05) quando aplicados em larvas de C. putoria. O tratamento de pupas com o
isolado JAB 07 de B. bassiana, na concentração de 10
6
e 10
8
conídios/mL, reduziu
significativamente (P<0,05) a emergência de adultos. O efeito dose-resposta foi melhor
evidenciado no ensaio com adultos, pois os isolados de B. bassiana dimimuiram a
sobrevivência somente quando aplicados na concentração de 10
8
conídios/mL. Ambos
os isolados foram eficientes no controle de C. putoria, porém o isolado JAB 07 se
destacou por atuar na maioria das fases de vida do ciclo da mosca.
Palavras-chave: Controle biológico, controle microbiano, fungo entomopatogênico,
mosca varejeira, avicultura de postura.
38
CHAPTER 3 - SUSCEPTIBILITY OF Chrysomya putoria (Diptera: Calliphoridae) TO
THE PATHOGENIC ACTION OF THE FUNGUS
Beauveria bassiana.
ABSTRACT - The present study investigated, in laboratory conditions, the
pathogenic action of the isolates JAB 07 and AM 9 of Beauveria bassiana, applied in the
concentrations of 1x10
6
and 1x10
8
conidia/mL, in the stages of egg, L2 larvae, pupae
and adult of Chrysomya putoria. In the bioassays, groups with 30 eggs, 20 pupae and
20 L2 larvae were bathed with conidia suspensions. For adults, groups of 30 flies were
pulverized with 1mL of the same suspensions. All biossay were performed using four
replicates per treatment and the control groups were treated with solution tween. Eggs
treatment with B. bassiana showed an effect in the average pupa’s life time when
submitted to 10
6
and 10
8
conidia/mL. The B. bassiana isolates applied in both
concentrations promoted significant (P<0,05) mortality in C. putoria larvae treatment.
The pupae bioassay with the isolate JAB 07 of B. bassiana, in the concentration of 10
6
and 10
8
conidia/mL, reduced significantly (P<0,05) the adult emergence. The dose-
response effect was more evident in the adult study, because the isolates of B. bassiana
decreased the survival only when applied in the concentration of 10
8
conidia/mL. Both of
the isolates were efficient on the control of C. putoria, although JAB 07 isolate
demonstrated better results by acting in most stages of the fly’s cycle.
Key words: Biological control, microbial control, entomopathogenic fungus,
blowfly, poultry.
39
1. INTRODUÇÃO
No confinamento de animais domésticos, especialmente em aviários de postura,
existe uma produção significativa de esterco, que atua como substrato para o
desenvolvimento de inúmeras espécies de artrópodes, principalmente moscas
sinantrópicas. Dentre os dípteros sinantrópicos, destacam-se as moscas do gênero
Chrysomya, causando prejuízos econômicos diretos e indiretos para o avicultor, pois os
ovos são freqüentemente contaminados por estes dípteros (AXTELL, 1999), além de
constituírem uma ameaça à saúde pública, pois veiculam agentes etiológicos de
enfermidades como enteroviroses, enterobacterioses, oocistos de protozoários e ovos
de helmintos (CABRAL et al., 2007). As espécies de Chrysomya apresentam grande
capacidade de adaptação a diferentes tipos de ambientes e notável habilidade
competitiva, capaz de deslocar espécies nativas (MARCHIORI et.al., 2000).
Atualmente a alternativa de controle mais utilizada em aviários são os inseticidas
químicos, resultando em vários efeitos negativos ao ambiente. A mídia, a facilidade de
aquisição, e também os efeitos obtidos, quase que imediatos, colaboraram para a
utilização indiscriminada e descontrolada de tais produtos, gerando desequilíbrio, pois o
complexo biótico da natureza pode ser alterado, afetando plantas, animais e o próprio
homem.
O uso de fungos entomopatogênicos como bioinseticidas já vem sendo praticado
a alguns anos a partir de populações naturais e melhoradas (ALVES,1998). Estes
microorganismos ocorrem naturalmente em mais de 300 espécies de insetos, em seus
vários estágios de desenvolvimento, ocupando um lugar relevante na manutenção do
equilíbrio ecológico. De acordo com ALVES (1998), os fungos entomopatogênicos
englobam cerca de 90 gêneros e 700 espécies, estando Beauveria, Metarhizium,
Paecilomyces entre os mais comumente utilizados no controle de pragas.
Na literatura encontram-se vários trabalhos sobre a atividade do fungo B.
bassiana em diversas espécies de dípteros como mosca-branca, Bemisia argentifolii
(WRAIGHT et al., 1998), Ceratitis capitata (KONSTANTOPOULOU e MAZOMENOS,
2005; DIMBI et al., 2003), Haematobia irritans (LOHMEYER e MILLER, 2006; ANGEL-
40
SAHAGÚN et al., 2005), Cochliomya macellaria (MACIEL et al., 2005), Stomoxys
calcitrans (WATSON et al, 1995), sendo Musca domestica a mais estudada (LECUONA
et al., 2005; WATSON et al., 1996; SIRI et al., 2005; BERNARDI et al., 2006). Em um
estudo de campo, KAUFMAN et al. (2005) verificaram que a aplicação de B. bassiana
resultou em controle mais eficaz de moscas de aviário quando comparado ao
tratamento com inseticida à base de piretróides.
Neste contexto, evidenciando a necessidade de estudos alternativos de controle
e o grande potencial do fungo entomopatogênico B. bassiana como um possível agente
controlador de diversas espécies de moscas, o presente estudo investigou, em
condições de laboratório, a patogenicidade dos isolados JAB 07 e AM 9 do fungo B.
bassiana, aplicado nas concentrações de 1x10
6
e 1x10
8
conídios/mL, nos estágios de
ovo, larva (L2), pupa e adulto de C. putoria.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Fungo
Foram utilizados os isolados AM 9 e JAB 07 de B. bassiana,
pertencentes à
coleção do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Produção Vegetal da
FCAV/Unesp. Os isolados foram mantidos em tubos de ensaio contendo 5 mL de
meio BDA (batata, dextrose e ágar) inclinado, estocados a 4ºC. Para utilização nos
ensaios foram cultivados em placas de Petri contendo meio BDA, acondicionadas em
estufa a 27 ± 0,5ºC, durante 15 dias, com ausência de iluminação. A viabilidade dos
isolados foram conduzidos seguindo metodologia descrita por MARQUES et al.(2004).
Nos ensaios de ovo, larva, pupa e adulto os resultados observados de viabilidade
foram respectivamente, de: AM 09 (98, 95, 90 e 95%), JAB 07 (98, 94, 98 e 98%).
Para a produção dos inóculos, os esporos da parte superficial de colônias jovens
do fungo foram transferidos, para tubos contendo 20 mL de solução Tween 80
®
(0,1%
v/v) esterilizada. Após vigorosa agitação em agitador elétrico de tubos, as suspensões
41
foram padronizadas em 1 x 10
6
e 1 x 10
8
conídios/mL, com auxílio da câmara de
Neubauer.
2.2 Obtenção e manutenção das colônias de C. putoria.
Amostras de excrementos contendo larvas de C. putoria, coletadas em aviários
de galinhas de postura, pertencentes a FCAV/Unesp, foram acondicionadas em caixas
de
isopor de 15 litros (BELO, 1991) (Figura 1 do apêndice) adaptadas para implantação
e manutenção da colônia utilizada durante os bioensaios com os diferentes estágios de
desenvolvimento da mosca.
Os adultos provenientes dessas larvas foram confinados nas caixas de isopor e
para sua manutenção utilizou-se uma mistura de leite em pó e açúcar (1:1) e água
destilada oferecida ad libitum em algodão saturado. A ovipostura foi estimulada
oferecendo carne bovina in natura. Em seguida, os ovos foram transportados para
copos de plástico (60 mm de diâmetro x 70 mm de altura) vedados com tecido voile e
contendo uma dieta artificial composta de farelo de trigo (18%), farelo de milho (17%),
farelo de soja (51%), farelo de arroz (14%) e água em quantidade suficiente para
proporcionar consistência pastosa. Após a eclosão, as larvas permaneceram nos
mesmos recipientes até atingirem o terceiro ínstar, quando foram colocadas nas caixas
de manutenção de moscas para a empupação e emergência de adultos, todos mantidos
à temperatura ambiente. A cada 30 dias novas larvas da mosca foram coletadas no
ambiente natural e introduzidas na colônia para minimizar o efeito endogâmico.
2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de C. putoria
Grupos de 30 ovos com até quatro horas de idade, foram banhados com as
suspensões de conídios obtidas como já descrito e os grupos controle foram banhados
apenas no veículo da suspensão. Em seguida foram colocados sobre papel de filtro
42
esterilizado o qual foi depositado sobre 5 g de carne bovina moída e em processo inicial
de decomposição que serviu de dieta para as larvas eclodidas (Figura 2 do apêndice).
Esta preparação foi acondicionada em recipiente de plástico (30 mm de diâmetro x 50
mm de altura) interligado a outro idêntico por um orifício no intuito de oferecer um
ambiente mais seco para a empupação. Os recipientes foram vedados com malha fina
de nylon e acondicionados em câmaras úmidas (Figura 3 do apêndice) à 27 ± 0,5 ºC,
umidade relativa do ar entre 60 e 70% e fotoperíodo de 14 horas.
A avaliação de eclosão foi realizada a partir de 12 horas após a inoculação do
fungo. No estádio larval, os imagos foram inspecionados diariamente para verificação
da empupação e as pupas formadas foram separadas e acondicionadas em placas de
Petri com algodão umedecido. As moscas adultas emergidas foram transferidas para
caixas de isopor (2 litros) (Figura 4 do apêndice), adaptadas de acordo com BELO
(1991), mantidas à temperatura ambiente, oferecendo, ad libitum, dieta composta por
uma mistura de leite em pó e açúcar refinado (1:1), e água em algodão saturado,
durante o período de 20 dias, para avaliação diária da longevidade. A extrusão do
patógeno em pupas e adultos foi observada como um dado complementar para
verificação da atividade patogênica.
2.4 Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de C. putoria
Grupos de 20 larvas (L2), com 72 horas de idade, foram imersos durante 30
segundos nas suspensões de conídios ou veículo das suspensões (controle), como
descrito anteriormente, e em seguida, mantidos em dois recipientes de plástico. Para
evitar a remoção de conídios do tegumento, as larvas foram deixadas por 24 horas nos
recipientes de plástico e em seguida foram alimentadas com a dieta artificial usada para
manutenção de larvas, autoclavada, oferecida na forma de sachês (Figura 5 do
apêndice). A montagem, finalidade e manutenção dos recipientes plásticos foram
realizadas conforme descrito no ensaio anterior.
43
A inspeção das câmaras foi realizada diariamente por 30 dias para verificação da
mortalidade de larvas e empupação. As pupas foram transferidas para caixas de isopor
(2 litros) (Figura 4 do apêndice) adaptadas conforme descrito por BELO (1991), para
observação da emergência e do tempo de vida dos adultos.
2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de
C. putoria
Grupos de 20 pupas com um a dois dias de idade, com quatro repetições, foram
imersos durante 30 segundos nos veículos ou nas suspensões de conídios já referidas
e mantidos à temperatura ambiente, em caixas de isopor, como descrito no ensaio com
ovos (Figura 4 do apêndice). As caixas foram inspecionadas diariamente para
observação de emergência e mortalidade de adultos, durante 20 dias após o 3° dia de
incubação, ocasião em que ocorreu a primeira emergência. As pupas que não geraram
adultos até o quinto dia após o tratamento, foram consideradas mortas. Pupas e adultos
mortos foram transferidos para câmaras úmidas mantidas a 27
o
C para verificação da
extrusão do patógeno (Figura 6 do apêndice).
2.6 Patogenicidade dos fungos para adultos de C. putoria
Grupos de 30 moscas adultas, com um a cinco dias de idade, foram separados em
recipientes de plástico, cobertos com tecido voile e mantidos a temperatura de 0°C até
a completa imobilização das moscas. Com auxílio de um pequeno aspersor manual,
foram pulverizados com 1 mL das suspensões de conídios e mantidos em temperatura
ambiente, sendo oferecido água em algodão saturado. Os grupos controles foram
pulverizados apenas com o veículo das suspensões. Após 12 horas, as moscas foram
transferidas e mantidas durante 20 dias em caixas de isopor, como anteriormente
descrito, para avaliação diária da longevidade dos adultos (Figura 7 do apêndice). Os
44
adultos mortos foram transferidos para câmaras úmidas mantidas a 27
o
C para
verificação da extrusão do patógeno (Figura 6 do apêndice).
2.7 Análise estatística
Para análise dos dados utilizou-se o programa SAS, versão 8.2 (SAS, 1999).
Inicialmente, todas as variáveis foram estudadas de maneira descritiva, pelo cálculo da
média, desvio padrão e mediana. Em seguida os valores percentuais de mortalidade
foram transformados em Arco seno =
(
)
[
]
π
/180100% ×emortalidad
,
e o tempo
médio de vida (TMV) foi calculado pela média ponderada da mortalidade e o tempo em
dias TMV = (dias x sobreviventes)/sobreviventes. Todas as médias dos dados foram
analisadas em um delineamento inteiramente casualizado (ANOVA) e as comparações
múltiplas foram aferidas pelo teste de Tukey (P0,05).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Patogenicidade para ovos de C. putoria
A aplicação dos isolados AM 09 e JAB 07 de B. bassiana em ovos de C. putoria
não apresentaram efeito significativo (P>0,05) sobre o percentual de eclosão (Tabela
1). O tempo médio de eclosão de larvas de C. putoria foi de 12 horas, e a germinação
dos isolados AM 09 e JAB 07, após 12 horas de incubação, foi de 45 e 61%,
respectivamente (dados não mostrados). Devido ao tempo necessário para
manipulação, os conídios foram inoculados em ovos obtidos até quatro horas após a
postura. Provavelmente este fato possibilitou a eclosão das larvas ocorreu antes da
germinação e penetração do fungo no ovo, o que justifica a baixa atividade patogênica
para este estágio de C. putoria. Na relação parasito-hospedeiro, o sucesso de controle
45
biológico resulta da efetiva interação entre os ciclos biológicos de ambas as espécies, o
que não ocorreu nesta fase do ciclo da mosca.
Os isolados AM 09 e JAB 07 de B. bassiana não foram patogênicos para ovos de
C. putoria por apresentarem somente um aumento no tempo médio de vida das pupas,
dentre todos os outros parâmetros avaliados de eclosão, mortalidade larval, tempo
médio de empupação e emergência. Estes resultados são contrários aos obtidos por
ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005) que, após tratarem ovos de Haematobia irritans com
inóculos contendo 10
6
conídios/mL de 2 isolados de B. bassiana, verificaram redução
significativa na porcentagem de emergência de adultos para apenas um dos isolados.
Outro aspecto interessante constatado na análise do tratamento dos ovos referem-se a
TABELA 1
-
Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade larval,
tempo médio de empupação, tempo médio de vida das pupas e emergência de adu
ltos
de Chrysomya putoria
após tratamento de ovos com suspensões de conídios dos
isolados de Beauveria bassiana.
Tratamento
a
Eclosão (%) Mortalidade
larval
TME
b
(dias)
TMVP
c
(dias)
Emergência
(%)
AM 09, 10
6
94,17
±
5,7
A
5,75
±
7,5
A
7,11
±
0,1
A
3,92
±
0,1
BC
99,00
±
1,9
A
AM 09, 10
8
93,33
±
8,2
A
0,50
±
1,0
A
7,14
±
0,3
A
3,78
±
0,1
C
99,00
±
2,0
A
JAB 07, 10
6
80,84
±
21,0
A
4,00
±
3,7
A
7,25
±
0,2
A
3,79
±
0,1
B
94,50
±
6,3
A
JAB 07, 10
8
85,00
±
8,8
A
1,75
±
1,7
A
7,28
±
0,3
A
3,81
±
0,2
BC
94,25
±
8,4
A
Controle
d
87,50
±
5,0
A
2,00
±
1,8
A
6,82
±
0,1
A
3,58
±
0,1
A
97,00
±
4,0
A
Valor de F
0,99
NS
1,11
NS
2,70
NS
3,20
*
0,79
NS
Pr>F
e
0,4434 0,3889 0,0709 0,0435 0,5490
C.V. (%)
f
12,85 140,61 3,14 3,69 5,39
DMS (Tukey)
g
24,74 8,60 0,49 0,30 11,38
Médias seguidas por pelo menos por uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de
Tukey (P>0,05). NS não significativo; *significativo a 5% de probabilidade.
a
isolado, seguido da concentração de conídios/mL usada.
b
TME: Tempo médio de empupação;
c
TMVP: Tempo médio de vida das pupas.
d
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
e
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
f
C.V.: Coeficiente de variação
g
DMS: Diferença mínima significativa.
46
completa ausência da extrusão do patógeno em pupas e adultos de C. putoria,
confirmando a hipótese da baixa atividade patogênica do fungo nas condições
experimentais deste bioensaio.
3.2 Patogenicidade para larvas L2 de C. putoria
No bioensaio realizado com larvas L2, avaliou-se o efeito patogênico dos
tratamentos fúngicos por meio do estudo do tempo médio de vida de C. putoria,
considerando-se as larvas de segundo instar e seus subseqüentes estágios de pupa e
adultos. Verificou-se redução significativa (P<0,01) do tempo médio de vida das larvas e
total nos tratamentos com os isolados JAB 07 e AM 09 de B. bassiana, nas duas
concentrações de conídios testadas, quando comparadas ao controle (Tabela 2). Tal
fato evidencia que estes fungos apresentam acentuada atividade patogênica para
larvas de C. putoria. Como conseqüência, não se observou atividade patogênica
residual para pupas e adultos, com exceção do isolado AM 09 de B. bassiana, que, na
concentração de 10
6
conídios/mL, reduziu (P<0,01) o tempo médio de vida das pupas.
Figura 1 – Larvas de Chrysomya putoria morta pelo fungo
Beauveria bassiana
exibindo a extrusão do patógeno.
47
A atividade entomopatogênica desse fungo para o estágio larval de outras
moscas sinantrópicas, também foram descritos por outros autores. WATSON et al.
(1995) avaliaram o efeito do tratamento do estagio larval de Musca domestica com
inóculos em meio líquido contendo diferentes concentrações de conídios, observando
mortalidade de 56 e 48% das larvas tratadas com 10
10
conídios/mL do isolados L90 e
P89 de B. bassiana, respectivamente. STEINKRAUS et al. (1990) relataram
mortalidades de 52 a 73% em larvas de terceiro ínstar de M. domestica desafiadas com
este fungo. Contudo em estudo recente, LECUONA et al. (2005), não observaram
significativa mortalidade de larvas L3 de M. domestica tratadas com cinco isolados de
B. bassiana. Segundo estes autores, o efeito contraditório observado nas suas análises
pode ser conseqüência da diferença de virulência entre cepas.
TABELA 2 - Valores médios e análise de variância
do tempo médio de vida em dias de
larvas, pupas e adultos oriundos de larvas L2 de Chrysomya putoria
, após tratamento
com suspensões de conídios dos isolados de Beauveria bassiana
, avaliadas
diariamente pelo período 30 dias.
Tempo médio de vida (dias)
Tratamento
a
Larva Pupa Total
AM 09, 10
6
3,00
±
0,2
B
2,50
±
5,0
B
3,42
±
0,9
BC
AM 09, 10
8
2,06
±
0,1
C
−
2,18
±
0,2
C
JAB 07, 10
6
3,64
±
0,6
B
−
3,64
±
0,6
B
JAB 07, 10
8
3,04
±
0,3
B
−
3,04
±
0,3
BC
Controle
b
5,62
±
0,7
A
13,43
±
1,2
A
8,42
±
0,7
A
Valor de F
38,03** 18,04** 70,2**
Pr>F
c
<0,0001 0,0054 <0,0001
C.V. (%)
d
12,39 45,69 14,18
DMS (Tukey)
e
0,94 6,30 1,28
Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de
Tukey (P>0,05). NS não significativo; **significativo a 1% d
e probabilidade; *significativo a 5% de
probabilidade.
a
Isolado e concentração de conídios/mL.
b
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
c
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
d
CV: Coeficiente de variação
e
DMS: Diferença mínima significativa.
48
A análise do tempo médio de vida total das larvas tratadas com os isolados de B.
bassiana não evidenciou efeito das concentrações de conídios usadas. Contudo,
observando-se a Figura 2, verifica-se que os isolados AM 09 e JAB 07 promoveram
100% de mortalidade de larvas até o 5° e 9° dias, respectivamente, após o tratamento
com 10
8
conídios/ mL, sendo confirmado pela verificação da extrusão do patógeno nas
larvas mortas (Figura 1). No entanto, igual efeito, somente foi obtido com a
concentração de 10
6
conídios/mL, para o isolado JAB 07 a partir do 14° dia após
tratamento, embora corroborem com os dados apresentados por BARSON, et al.
(1994), apresentando 40% de mortalidade após 14 dias do tratamento larval de M.
domestica com suspensões de 10
7
conídios/mL. Este fato sugere que maiores
Figura 2: Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria
tratadas com
suspensões de conídios dos isolados AM 09 e JAB 07 de Beauveria bassiana
, nas
concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, nos primeiros 15 dias após o
tratamento
10
6
10
8
10
6
10
8
49
concentrações de conídios possam promover maior mortalidade de larvas em menor
tempo, efeito também observado por MACIEL et al. (2005) no aumento gradativo das
fases pré-pupal e pupal após tratamento larvas de C. macellaria com inóculos de 10
5
até 10
8
conídio/mL.
3.3 Patogenicidade para pupas de
C. putoria
Para o estudo da atividade patogênica dos diferentes isolados durante a fase
pupal de C. putoria foram analisados a emergência de adultos, o tempo médio de vida
dos adultos e mortalidade total. Apenas o isolado JAB 07 de B. bassiana, nas duas
concentrações testadas, reduziu significativamente (P<0,01) a emergência de adultos
de C. putoria quando comparado ao controle (Tabela 3), mostrando-se mais efetivo na
concentração de 10
8
conídios/mL, aumentando 50% a mortalidade quando comparados
ao controle (Tabela 3), causando a extrusão do patógenos pelas pupas mortas (Figura
3), concordando com os relatos de ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005) que observaram
44% de mortalidade, após tratamento de pupas de H. irritans com suspensões de 10
8
conídios/mL de B. bassiana.
Figura 3 – Pupas de Chrysomya putoria morta pelo fungo Beauveria bassiana. A
:
Crescimento hifálico do patógeno sobre o cadáver da pupa; B
: pupa exibindo a
extrusão do patógeno na fase de conidiogênese.
A
B
50
Por outro lado, LEUCONA et al. (2005) e BERNARDI et al. (2006) observaram
pequena ou nenhuma mortalidade de pupas de moscas domésticas após o tratamento
com diferentes cepas de B. bassiana. Possivelmente, tais resultados sejam
conseqüência de características fisico-químicas específicas da pupa dos artrópodes,
que favorecem sua defesa contra a ação lesiva de patógenos. BIDOCHKA &
KHACHATOURIANS (1992) verificaram que proteínas cuticulares influenciaram
diretamente na germinação e crescimento de B. bassiana em Melanoplus sanquinipes,
enquanto MARMARAS et al. (1993) mostraram que proteínas presentes na cutícula de
C. capitata foram responsáveis pelo reconhecimento e eliminação de bactérias
infectantes. Para WATSON et al. (1995) estas características cuticulares podem ser a
possível justificativa para a diferença de susceptibilidade apresentada por M. domestica
e S. calcitrans quando tratadas com B. bassiana.
TABELA 3 -
Valores médios e análise de variância da emergência de adultos, tempo
médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de pupas de Chrysomya putoria
tratadas com suspensões de conídios de isolados de Beauveria bassiana
. Avaliação
conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos.
Tratamento
a
Emergência (%)
b
TMV
c
Mortalidade total
AM 09, 10
6
13,50
±
1,3
A
10,12
±
0,2
A
9,50
±
1,7
B
AM 09, 10
8
13,00
±
3,6
AB
9,89
±
0,5
A
11,25
±
4,1
AB
JAB 07, 10
6
8,50
±
2,9
CB
10,34
±
0,3
A
12,50
±
3,7
AB
JAB 07, 10
8
5,50
±
1,7
C
10,16
±
0,4
A
15,50
±
1,3
A
Controle
d
13,50
±
0,6
A
10,36
±
0,2
A
7,50
±
1,0
B
Valor de F 10,15
**
1,31
NS
5,07
**
Pr>F
e
0,0003 0,3108 0,0087
C.V. (%)
f
21,11 3,29 23,93
DMS (Tukey)
g
4,98 0,73 5,88
Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de
Tukey (P>0,05). NS não significativo; **significativo a 1% de probabilidade.
a
Isolado e concentração de conídios/mL.
b
Media das porcentagens dos valores observados transformados em arco seno;
c
TMV: Tempo médio de vida dos adultos (em dias).
d
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
e
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
f
CV: Coeficiente de variação
g
DMS: Diferença mínima significativa.
51
Na avaliação da mortalidade total de pupas de C. putoria, observou-se aumento
significativo (P<0,01) na mortalidade dos grupos banhados com suspensões dos
isolados JAB 07 (10
8
conídios/mL) de B. bassiana (Tabela 3).
Analisando graficamente a sobrevivência de moscas emergidas de pupas
tratadas com os diferentes fungos, se observa que no tratamento com o isolado JAB 07
de B. bassiana houve pequena emergência de adultos e, também pequena mortalidade
nesta fase (Figura 4), pois a maior parte das mortes ocorreu na fase de pupa. Para o
isolado AM 09 de B. bassiana se observou acentuada mortalidade de adultos
emergidos (Figura 4).
Outro aspecto importante a ser considerado é a redução na sobrevivência de
adultos provocada pelo aumento da concentração dos inóculos, sendo mais evidente a
10
6
10
6
10
8
10
8
Figura 4: Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria
emergidos de pupas
tratadas com suspensões de conídios dos isolados AM 09 e JAB 07 de
Beauveria
bassiana, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, até o 23° dia após
tratamento.
52
atividade dose-resposta para o isolado JAB 07 de B. bassiana (Figura 4), apesar da
análise estatística não ter acusado diferença no tempo médio de vida das moscas
tratadas com 10
6
ou 10
8
conídios/mL.
A redução na longevidade dos adultos emergidos de pupas tratadas é importante
para o controle de C. putoria, diminuindo a duração da fase reprodutiva da mosca. Após
inocularem pupas da mariposa Phthorimaea operculella com B. bassiana, HAFEZ et al.
(1997) obtiveram significativo decréscimo na emergência e longevidade de adultos, e
postura e viabilidade dos ovos. Adultos de C. capitata apresentaram menor longevidade
após o tratamento das pupas com diferentes isolados de M. anisopliae (BISSOLLI,
2004).
Os resultados obtidos no bioensaio com pupas de C. putoria demonstraram
maior atividade patogênica do isolado JAB 07 de B. bassiana, quando aplicado na
concentração de 10
8
conídios/mL.
3.4 Patogenicidade para adultos de C. putoria
Na análise comparativa da atividade patogênica dos isolados de B. bassiana
aplicados diretamente sobre adultos de C. putoria, observou-se resultados significativos
(P<0,05) na redução do tempo médio de vida (isolado JAB 07) e no aumento da
mortalidade, em ambos os isolados, das moscas tratadas com suspensões de 10
8
conídios/mL, confirmado pelo presença de extrusão do patógeno nos cadáveres das
moscas (Figura 6). O efeito dose-resposta para estes isolados ficou evidente nesta
análise, pois os adultos tratados com suspensões de 10
6
conídios/mL apresentaram
mortalidades estatisticamente similares ao grupo controle (Tabela 4). Esses resultados
estão congruentes com os obtidos por WATSON et al. (1995) e BERNARDI et al. (2006)
que mostraram o efeito dose-resposta para a ação patogênica de isolados de B.
bassiana no controle de adultos de moscas sinantrópicas.
Adultos de C. putoria tratados com suspensões 10
8
conídios/mL dos isolados AM
09 e JAB 07 de B. bassiana apresentaram percentuais de mortalidade de 59,9 e 60,6
53
respectivamente, durante o período de 20 dias, sendo cerca de 50% maiores do que os
valores observados no controle (Tabela 4).
Tais achados estão em concordância com estudos de M. domestica os descritos
por LECUONA et al. (2005) que verificaram mortalidade acima de 85% de adultos após
o tratamento com suspensões de 10
8
conídios/mL de seis de um total de 19 isolalos B.
Bassiana e por SIRI et al. (2005) com 94% de mortalidade após 14 dias do desafio com
inóculos de 10
7
conídios/mL do mesmo fungo. Dados também observados com H.
irritans relatados por ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005) com mortalidades de 73,8 e 40%
para dois isolados testados na concentração de 10
8
conídios/mL e LOHMEYER &
MILLER (2006) com 98,4 e 100% de mortalidade no 4° e 7° dia respectivamente, após
inoculação de B. bassiana à 10
8
conídios/mL.
TABELA 4 -
Valores médios e análise de variância da emergência de adultos, tempo
médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de adultos de Chrysomya putoria
tratados com suspensões de conídios de isolados de Beauveria bassiana
. Avaliação
conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos.
Tratamentos
a
TMV
b
Mortalidade (%)
c
AM 09, 10
6
9,43
±
0,4
AB
43,99
±
11,2
AB
AM 09, 10
8
8,69
±
0,2
AB
59,92
±
11,0
A
JAB 07, 10
6
9,61
±
0,2
AB
39,67
±
5,1
AB
JAB 07, 10
8
8,41
±
1,1
B
60,58
±
19,7
A
Controle
d
9,86
±
0,4
A
32,89
±
8,3
B
Valor de F
4,79* 4,2*
Pr>F
e
0,0109 0,0177
C.V. (%)
f
6,16 25,47
DMS (Tukey)
g
1,24 26,37
Médias seguidas por pelo menos uma letr
a em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de
Tukey (P>0,05). NS não significativo; *significativo a 5% de probabilidade.
a
Isolado e concentração de conídios/mL.
b
TMV: Tempo médio de vida dos adultos (em dias).
c
Media das porcentagens dos valores observados transformados em arco seno;
d
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
e
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
f
CV: Coeficiente de variação
g
DMS: Diferença mínima significativa.
54
Pela visualização gráfica da sobrevivência de adultos de C. putoria durante o
período de 20 dias, verificou-se acentuada mortalidade das moscas a partir do 14° dia,
após o tratamento com os isolados de B. bassiana (Figura 5), na concentração de 10
8
conídios/mL, contrapondo-se ao estudo realizado por BARSON et al. (1994) que obteve
100% de mortalidade de moscas domésticas adultas, quatro a seis dias após o
tratamento com suspensões aquosas de 10
5
conídios/mL de B. bassiana. A
discrepância observada entre os resultados destes autores e os relatados neste estudo
pode ser conseqüência de fatores como a susceptibilidade dos diferentes dípteros
sinantrópicos e a patogenicidade das cepas utilizadas, dentre outros.
Figura 5: Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria
pulverizados com
suspensões de conídios dos isolados AM 09 e JAB 07 de Beauveria bassiana
,
nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, até o 20° dia após
tratamento.
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Dias após tratamento
Nº de adultos sobreviventes
B.b. JAB 07 10
6
B.b. AM 09 10
6
Controle
B.b. JAB 07 10
8
B.b. AM 09 10
8
55
4. CONCLUSÕES
1. O fungo B. Bassiana possui atividade patogênica para C. putoria.
2. A fase larval de C. putoria é mais susceptível a B. Bassiana.
3. Ambos os isolados de B. Bassiana, larvas e adultos de C. putoria, com destaque
para o isolado JAB 07 de B. bassiana que também foi eficaz no controle de pupas.
4. O fungo apresenta maior atividade quando aplicado na concentração de 10
8
conídios/mL.
5. REFERÊNCIAS
ALVES, S. B.
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Figura 6 –
Moscas adultas de Chrysomya putoria mortas pelo fungo
B. bassiana
exibindo a extrusão do patógeno.
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60
CAPÍTULO 4 - PATOGENICIDADE DE
Paecilomyces fumosoroseus
PARA A MOSCA
SINANTRÓPICA DE AVIÁRIO
Chrysomya putoria
(DÍPTERA: CALLIPHORIDAE)
RESUMO
- O presente estudo investigou, em condições de laboratório, a
atividade patogênica dos isolados IBCB 75 e IBCB 133 de Paecilomyces fumosoroseus,
aplicados nas concentrações de 1x10
6
e 1x10
8
conídios/mL, nos estágios de ovo, larva
L2, pupa e adulto de Chrysomya putoria. Nos bioensaios com ovos, larvas e pupas,
grupos de 30, 20 e 20 ímagos, respectivamente, foram banhados com as suspensões
de conídios e no ensaio com adultos, grupos de 30 moscas, foram pulverizadas com as
mesmas suspensões. Em todos os ensaios, utilizaram-se quatro repetições por
tratamento e os grupos controle foram tratados com o veículo das suspensões. O
tratamento de ovos com os isolados IBCB 75 e IBCB 133 de P. fumosoroseus não
afetou o percentual de eclosão e mortalidade de larvas, e o tempo médio de vida e
emergência de adultos de C. putoria. Ambos os isolados foram eficientes no controle da
fase larval de C. putoria quando aplicados na concentração de 10
8
conídios/mL. A
aplicação do fungo em pupas da mosca reduziu a emergência de adultos e aumentou a
mortalidade total. A maior atividade patogênica foi mostrada pelo isolado IBCB 133 que
promoveu significativa mortalidade de larvas e aumentou a mortalidade total de adultos,
nos ensaios com larvas e pupas, respectivamente. O fungo não atuou na fase adulta do
ciclo da mosca, pois não reduziu o tempo médio de vida e a mortalidade. Os resultados
permitiram concluir que P. fumosoroseus é patogênico para C. putoria. O isolado IBCB
133 é patogênico para larvas e pupas, enquanto IBCB 75 é patogênico apenas para
pupa, mas ambos não têm atividade patogênica para as fases de ovo e adulto. A
eficiência do controle é influenciada pela concentração de conídios da suspensão
usada, sendo a concentração de 10
8
conídios/mL a mais efetiva.
Palavras - chave:
controle biológico, controle microbiano, fungo
entomopatogênico, avicultura de postura, bioensaios.
61
CHAPTER 4 - PATHOGENICITY OF
Paecilomyces fumosoroseus
FOR
SYNANTHROPIC FLIES OF AVIARY
Chrysomya putoria (DIPTERA:
CALLIPHORIDAE)
SUMMARY
- The present study investigated, in laboratory conditions, the
pathogenic activity of the IBCB 75 and IBCB 133 isolates of Paecilomyces
fumosoroseus, applied in concentrations of 1x10
6
and 1x10
8
conidia/ml, in the stages of
egg, L2 larvae, pupa and adult of Chrysomya putoria. In the bioassays with eggs, larvae
and pupae, groups of 30, 20 and 20 imagos or adult forms, respectively, were bathed
with conidia suspension and in the essay with the adults, groups of 30 flies, were
pulverized with the same suspensions. In all assays, there were used four replicates per
treatment and control groups were treated with tween 80 solution (1%). The treatment of
the eggs with IBCB 75 and IBCB 133 isolates of P. fumosoroseus did not affect
emergence percentage and larvae mortality and average life time and emergence of C.
putoria adults. Both isolates were effective on the control of C. putoria when applied in
the concentration of 10
8
conidia/ml in the larvae stage. The fungus application in pupae
stage of the fly reduced adult emergence and increased total mortality. The major
pathogenic activity was shown by the isolate IBCB 133, which promoted significant
larvae mortality and raised total adult mortality, in assays with larvae and pupae,
respectively. The fungus did not actuate in the adult stage of the fly’s cycle, because it
did not reduce the average life time and mortality. The present results permit to conclude
that P. fumosoroseus is pathogenic to C. putoria. The isolate IBCB 133 is efficient for the
control of larvae and pupa stages while IBCB 75 only affect the pupa stage, but both
isolates do not show pathogenic activity for egg and adult stages. The efficiency of the
control is influenced by the concentration of the conidia suspension, pointing as the most
efficient, the concentration of 10
8
conidia/ml.
Key words
: biological control, microbial control, entomopathogenic fungus, poultry,
bioassays.
62
1. INTRODUÇÃO
As moscas do gênero Chrysomya representam um sério problema sanitário para
a indústria avícola de postura (AVANCINI & SILVEIRA, 2000), pois as galinhas são
alojadas em gaiolas suspensas, em alta densidade, com conseqüente acúmulo de
excrementos, excelente substrato para o desenvolvimento de moscas sinantrópicas
(SILVA et al., 2000). Estes artrópodes causam prejuízos econômicos diretos e indiretos
para o avicultor, pois os ovos são freqüentemente contaminados por estes dípteros
(AXTELL, 1999), além de constituírem uma ameaça à saúde pública veiculando
agentes etiológicos de enfermidades como enteroviroses, enterobacterioses, oocistos
de protozoários e ovos de helmintos (CABRAL et al., 2007).
Existem várias alternativas de controle destes dípteros em aviários, mas o uso
indiscriminado de inseticidas químicos, que constitui a prática mais utilizada nas
granjas, propicia a seleção de biótipos resistentes (SCOTT et al., 2000), aumenta os
riscos de poluição ambiental e aparecimento de resíduos nos ovos e carnes das aves, e
favorecendo o desequilíbrio na população de outros artrópodes inimigos naturais das
moscas (BRUNO et al., 1993).
A identificação da relação parasito-hospedeiro em um ecossistema específico,
representa, neste contexto, uma perspectiva promissora para o tratamento de inúmeras
pragas (BASSO et al., 2005). O controle biológico utilizando agentes microbianos,
especialmente fungos como Paecilomyces fumosoroseus
apresenta significativo
potencial profilático, tendo em vista que estes microrganismos exercem atividade
patogênica para uma grande variedade de artrópodes (WRAIGHT et al., 2000;
CASTILLO et al., 2000; SKOVAGARD & STEENBERG, 2002; ANGEL-SAHAGÚN et al.,
2005; INGLIS e TIGANO, 2006). A maioria dos estudos referentes ao controle de
moscas sinantrópicas por fungos foram realizados em condições de laboratório,
envolvendo outras espécies como Musca domestica (GEDEN et al, 1995; LECUONA et
al., 2005; SIRI et al., 2005), a mosca varejeira Lucilia sericata (WRIGHT et al, 2004) e a
mosca de estábulo
Stomoxys calcitrans
(WATSON et al., 1995).
63
Tendo em vista que não há na literatura estudos envolvendo a atividade de
fungos para o controle de moscas do gênero Chrysomya, associado ao desafio que
representa estabelecer programas profiláticos eficazes contra estes vetores, o presente
trabalho teve por finalidade investigar, em condições de laboratório, a atividade
entomopatogênica de P. fumosoroseus, aplicado nas concentrações de 1x10
6
e 1x10
8
conídios/mL, para os estágios de ovo, larva (L2), pupa e adulto de Chrysomya putoria.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Fungo
Foram utilizados os isolados IBCB133 e IBCB75 de P. fumosoroseus,
pertencentes à coleção do Laboratório de Microbiologia do Departamento de
Produção Vegetal da FCAV/Unesp. Os isolados foram mantidos em tubos de ensaio
contendo 5 mL de meio BDA (batata, dextrose e ágar) inclinado, estocados a 4ºC.
Para utilização nos ensaios foram cultivados em placas de Petri contendo meio BDA,
acondicionadas em estufa a 27 ± 0,5ºC, durante 15 dias, com ausência de iluminação.
A viabilidade dos isolados, determinada seguindo metodologia descrita por
MARQUES et al.(2004), nos ensaios de ovo, larva, pupa e adulto os resultados
observados de viabilidade foram respectivamente, de: IBCB 133 (100, 97, 99 e 99%)
e IBCB 75 (98, 98, 99 e 93%).
Para a produção dos inóculos, os esporos da parte superficial de colônias jovens
do fungo foram transferidos, para tubos contendo 20 mL de solução Tween 80
®
(0,1%
v/v) esterilizada. Após vigorosa agitação em agitador elétrico de tubos, as suspensões
foram padronizadas em 1 x 10
6
e 1 x 10
8
conídios/mL, com auxílio da câmara de
Neubauer.
64
2.2 Obtenção e manutenção das colônias de
C. putoria.
Amostras de excrementos contendo larvas de C. putoria, coletadas em aviários
de galinhas de postura, pertencentes a FCAV/Unesp, foram acondicionadas em caixas
de isopor de 15 litros (BELO, 1991) (Figura 1 do apêndice) adaptadas para implantação
e manutenção da colônia utilizada durante os bioensaios com os diferentes estágios de
desenvolvimento da mosca.
Os adultos provenientes dessas larvas foram confinados nas caixas de isopor e
para sua manutenção utilizou-se uma mistura de leite em pó e açúcar (1:1) e água
destilada oferecida ad libitum em algodão saturado. A ovipostura foi estimulada
oferecendo carne bovina in natura. Em seguida, os ovos foram transportados para
copos de plástico (60 mm de diâmetro x 70 mm de altura) vedados com tecido voile e
contendo dieta artificial composta de farelos de trigo (18%), de milho (17%), de soja
(51%), de arroz (14%) e água em quantidade suficiente para proporcionar consistência
pastosa. Após a eclosão, as larvas permaneceram nos mesmos recipientes até
atingirem o terceiro ínstar, quando foram colocadas nas caixas de manutenção de
moscas para a empupação e emergência de adultos, todos mantidos à temperatura
ambiente. A cada 30 dias novas larvas da mosca foram coletadas no ambiente natural e
introduzidas na colônia para minimizar o efeito endogâmico.
2.3 Patogenicidade dos fungos para ovos de
C. putoria
Grupos de 30 ovos com até quatro horas de idade, foram banhados com as
suspensões de conídios obtidas como já descrito e os grupos controle foram banhados
apenas no veículo da suspensão. Em seguida, foram colocados sobre papel de filtro
esterilizado o qual foi depositado sobre 5 g de carne bovina moída em processo inicial
de decomposição que serviu de dieta para as larvas eclodidas (Figura 2 do apêndice).
Esta preparação foi acondicionada em recipiente de plástico (30 mm de diâmetro x 50
mm de altura) interligado a outro idêntico por um orifício no intuito de oferecer um
65
ambiente mais seco para a empupação. Os recipientes foram vedados com malha fina
de nylon e acondicionados em câmaras úmidas à 27 ± 0,5 ºC, umidade relativa do ar
entre 60 e 70% e fotoperíodo de 14 horas. A avaliação de eclosão foi realizada a partir
de 12 horas após a inoculação do fungo.
No estágio larval, os ímagos foram inspecionados diariamente para verificação da
empupação e as pupas formadas foram separadas e acondicionadas em placas de
Petri com algodão umedecido. As moscas adultas emergidas foram transferidas para
caixas de isopor (2 litros), adaptadas de acordo com BELO (1991), mantidas à
temperatura ambiente, oferecendo, ad libitum, dieta composta por uma mistura de leite
em pó e açúcar refinado (1:1), e água em algodão saturado, durante o período de 20
dias para avaliação diária da longevidade. A extrusão do patógeno em pupas e adultos
foi observada como um dado complementar para verificação da atividade patogênica.
2.4 Patogenicidade dos fungos para larvas L2 de
C. putoria
Grupos de 20 larvas (L2), com 72 horas de idade, foram imersos durante 30
segundos nas suspensões de conídios ou veículo das suspensões (controle), como
descrito anteriormente, e em seguida, mantidos em dois recipientes de plástico. Para
evitar a remoção de conídios do tegumento, as larvas foram deixadas por 24 horas nos
recipientes de plástico e em seguida foram alimentadas com a dieta artificial usada para
manutenção de larvas, autoclavada, oferecida na forma de sachês (Figura 5 do
apêndice). A montagem, finalidade e manutenção dos recipientes plásticos foram
realizadas conforme descrito no ensaio anterior.
A inspeção das larvas foi efetuada diariamente por 30 dias para verificação da
mortalidade e empupação. As pupas foram transferidas para caixas de isopor (2 litros)
adaptadas conforme descrito por BELO (1991) (Figura 4 do apêndice), para observação
da emergência e do tempo de vida dos adultos. Larvas, pupas e adultos mortos foram
transferidos para câmaras úmidas mantidas (Figura 6 do apêndice) a 27
o
C para
verificação da extrusão do patógeno.
B
66
2.5 Patogenicidade dos fungos para pupas de
C. putoria
Grupos de 20 pupas com um a dois dias de idade, com quatro repetições, foram
imersos durante 30 segundos nos veículos ou nas suspensões de conídios já referidas
e mantidos à temperatura ambiente, em caixas de isopor, como descrito no ensaio com
ovos. As caixas foram inspecionadas diariamente para observação de emergência e
mortalidade de adultos, durante 20 dias após o 3° dia de incubação, ocasião em que
ocorreu a primeira emergência. As pupas que não geraram adultos até o 5º dia após o
tratamento, foram consideradas mortas. Pupas e adultos mortos foram transferidos para
câmaras úmidas mantidas a 27
o
C para verificação da extrusão do patógeno.
2.6 Patogenicidade dos fungos para adultos de
C. putoria
Grupos de 30 moscas adultas, com um a cinco dias de idade, foram separados em
recipientes de plástico, cobertos com tecido voile e mantidos a temperatura de 0°C até
a completa imobilização das moscas. Com auxílio de um pequeno aspersor manual,
foram pulverizados com 1 mL das suspensões de conídios e mantidos em temperatura
ambiente, sendo oferecido água em algodão saturado. Os grupos controles foram
pulverizados apenas com o veículo das suspensões. Após 12 horas, as moscas foram
transferidas e mantidas durante 20 dias em caixas de isopor, como anteriormente
descrito, para avaliação diária da longevidade dos adultos (Figura 7 do apêndice). Os
adultos mortos foram transferidos para câmaras úmidas mantidas a 27
o
C para
verificação da extrusão do patógeno (Figura 6 do apêndice).
2.7 Análise estatística
Todos os ensaios foram conduzidos com quatro repetições. Para análise dos
dados utilizou-se o programa SAS, versão 8.2 (SAS, 1999). Inicialmente, todas as
67
variáveis foram estudadas de maneira descritiva, pelo cálculo da média, desvio padrão
e mediana. Em seguida os valores percentuais de mortalidade foram transformados em
Arc seno =
(
)
[
]
π
/180100% ×emortalidad
, e o tempo médio de vida (TMV) foi
calculado pela média ponderada da mortalidade e o tempo em dias TMV = (dias x
sobreviventes)/sobreviventes. Todas as médias dos dados foram analisadas em um
delineamento inteiramente casualizado (ANOVA) e as comparações múltiplas foram
aferidas pelo teste de Tukey (P0,05).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Patogenicidade para ovos de
C. putoria
A aplicação dos isolados IBCB 75 e IBCB 133 de P. fumosoroseus em ovos de
C. putoria não apresentou efeito significativo (P>0,05) sobre o percentual de eclosão
(Tabela 1). O tempo médio de eclosão de larvas de C. putoria foi de 12 horas, e a
germinação dos isolados IBCB 75 e IBCB 133, após 12 horas de incubação, foi de 90 e
82%, respectivamente (dados não mostrados). Como, devido ao tempo necessário para
manipulação, os conídios foram inoculados em ovos obtidos até quatro horas após a
postura, provavelmente a eclosão das larvas ocorreu antes da germinação e
penetração do fungo no ovo, o que justifica a baixa atividade patogênica para este
estágio de C. putoria.
Na relação parasito-hospedeiro, o sucesso de controle biológico resulta da
efetiva interação entre os ciclos biológicos de ambas as espécies, o que não ocorreu
nesta fase do ciclo da mosca. Os isolados IBCB 75 e IBCB 133 de P. fumosoroseus não
foram patogênicos para ovos de C. putoria. Este resultado é semelhante ao obtido por
ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005) que, após tratarem ovos de Haematobia irritans com
inóculos contendo 10
6
conídios/mL de 12 isolados de P. fumosoroseus, verificaram
redução significativa na porcentagem de emergência de adultos para apenas dois
68
isolados. A atividade patogênica na fertilidade de ovos de Ceratitis capitata foi descrita
por CASTILLO et al. (2000), que observaram redução significativa no percentual de
eclosão após tratamento de fêmeas adultas com inóculos de 10
6
conídios dos isolados
CG 260 e CECT 2705 de P. fumosoroseus. No presente estudo não houve aumento
significativo na mortalidade de larvas de C. putoria provenientes dos ovos tratados com
inóculos de 10
6
e 10
8
conídios/mL de ambos os isolados (Tabela1). Porém, se observa
aumento no tempo médio de empupação das larvas quando comparadas ao grupo
controle, sendo estatisticamente significativo apenas para os ovos tratados com 10
6
conídios/mL do isolado IBCB 133 de P. fumosoroseus. ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005)
relataram aumento no tempo de empupação de larvas de H. irritans tratadas com 10
6
conídios/mL de diferentes isolados deste deuteromiceto.
TABELA 1
-
Valores médios e análise de variância para a eclosão, mortalidade larval,
tempo médio de empupação, tempo médio de vida das pup
as e emergência de adultos
de Chrysomya putoria
após tratamento de ovos com suspensões de conídios dos
isolados de Paecilomyces fumorosoroseus.
Tratamento
a
Eclosão (%) Mortalidade
larval
TME
b
(dias)
TMVP
c
(dias)
Emergência
(%)
IBCB 133, 10
6
89,17
±
6,9
A
3,75
±
3,9
A
7,33
±
0,3
AB
3,84
±
0,2
A
95,25
±
9,6
A
IBCB 133, 10
8
95,00
±
5,8
A
2,25
±
1,0
A
7,39
±
0,3
AB
3,83
±
0,2
A
88,75
±
10,3
A
IBCB 75, 10
6
80,00
±
12,2
A
1,50
±
2,4
A
7,57
±
0,2
A
4,08
±
0,6
A
85,75
±
25,4
A
IBCB 75, 10
8
91,67
±
1,9
A
4,00
±
3,2
A
7,10
±
0,3
AB
3,91
±
0,1
A
99,00
±
2,1
A
Controle
d
87,50
±
5,0
A
2,00
±
1,8
A
6,82
±
0,1
B
3,58
±
0,1
A
97,00
±
4,0
A
Valor de F 2,44
NS
0,71
NS
4,39* 1,59
NS
0,75
NS
Pr>F
e
0,0918 0,5996 0,0151 0,2272 0,5750
C.V. (%)
f
8,09 97,76 3,84 7,46 14,04
DMS (Tukey)
g
15,67 5,76 0,61 0,63 28,56
Médias seguidas por pelo menos por uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de
Tukey (P>0,05). NS não significativo; *significativo a 5% de probabilidade.
a
isolado, seguido da concentração de conídios/mL usada.
b
TME: Tempo médio de empupação;
c
TMVP: Tempo médio de vida das pupas.
d
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
e
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
f
C.V.: Coeficiente de variação
g
DMS: Diferença mínima significativa.
69
Na análise do tempo médio de vida da pupa, não se verificou diferença
significativa na emergência de adultos de C. putoria após tratar os ovos com os dois
isolados em ambas concentrações de conídios (Tabela 1), corroborando a ausência da
atividade do fungo para esta fase do ciclo biológico da mosca. Outro aspecto
interessante constatado na análise do tratamento dos ovos refere-se à completa
ausência da extrusão do patógeno em pupas e adultos de C. putoria, confirmando a
hipótese da baixa atividade patogênica do fungo nas condições experimentais deste
bioensaio.
3.2 Patogenicidade para larvas L2 de
C. putoria
No bioensaio realizado com larvas (L2), avaliou-se o efeito patogênico dos
tratamentos fúngicos por meio do estudo do tempo médio de vida dos diferentes
estágios de desenvolvimento de C. putoria. Portanto, se considerou as larvas de
segundo ínstar e os estágios de pupa e adultos, obtidos a partir dessas larvas. No final
do ensaio a extrusão do patógeno foi verificada sobre larvas, pupas e adultos mortos
(Figura 1).
B
FIGURA 1.
Larvas de C. putoria mortas pelo fungo P. fumosoroseus.
A
: visualização de
uma das câmaras úmidas para verificação da extrusão do patógeno;
B
: Larva
apresentando extrusão do fungo.
A
70
O isolado IBCB 133 de P. fumosoroseus apresentou alta patogenicidade para
larvas na concentração de 10
8
conídios/mL, mostrando efeito significativo (P<0,01)
sobre o desenvolvimento larval de C. putoria (Tabela 2), promovendo 90% de
mortalidade com 15 dias após o tratamento (Figura 2). No entanto, ambos os isolados
não demonstraram efeito patogênico (P>0,05) para larvas de C. putoria tratadas com
inóculos contendo 10
6
conídios/mL, não reduzindo o tempo médio de vida das larvas
(Tabela 2).
TABELA 2 -
Valores médios e análise de variância
do tempo médio de vida em dias de
larvas, pupas e adultos oriundos de larvas L2 de Chrysomya putoria
, após tratamento
com suspensões de conídios dos isolados de Paecilomyces fumorosoroseus
, avaliadas
diariamente pelo período 30 dias.
Tempo médio de vida (dias)
Tratamento
a
Larva Pupa Adulto Total
IBCB 133, 10
6
5,99
±
0,4
A
13,13
±
2,0
A
20,00
±
3,8
A
8,29
±
0,0
A
IBCB 133, 10
8
3,68
±
0,0
B
11,15
±
0,3
A
14,67
±
10,0
A
6,27
±
1,7
B
IBCB 75, 10
6
5,64
±
0,6
A
13,46
±
1,2
A
19,46
±
1,9
A
8,26
±
0,6
A
IBCB 75, 10
8
4,91
±
0,9
AB
13,32
±
1,7
A
12,11
±
14,9
A
6,98
±
1,4
AB
Controle
b
5,61
±
0,7
A
13,43
±
1,2
A
12,61
±
8,9
A
8,42
±
0,7
A
Valor de F 9,50
**
1,99
NS
0,67
NS
3,34
*
Pr>F
c
0,0005 0,1471 0,6233 0,0381
C.V. (%)
d
11,55 10,83 58,07 13,81
DMS (Tukey)
e
1,30 3,05 20,00 1,90
Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo
teste de
Tukey (P>0,05). NS não significativo;**significativo a 1% de probabilidade; *significativo a 5% de
probabilidade.
a
Isolado e concentração de conídios/mL.
b
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
c
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
d
CV: Coeficiente de variação
e
DMS: Diferença mínima significativa.
B
B
71
FIGURA 2:
Sobrevivência das larvas de Chrysomya putoria tratadas com suspensões
de conídios dos isolados IBCB 133 e IBCB 75 de P. fumosoroseus, nas concentrações
de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, nos primeiros 15 dias após o tratamento.
A análise da mortalidade larval no tempo (Figura 2) demonstrou efeito dose-
dependente para ambos os isolados estudados quando comparados ao grupo controle.
Estes dados estão em concordância aos descritos por CASTILLO et al. (2000) que
verificaram redução significativa dose-dependente na ovipostura, na fertilidade dos ovos
e na longevidade de fêmeas adultas de C. capitata desafiadas com inóculos crescentes
destes fungos.
72
3.3 Patogenicidade para pupas de
C. putoria
Neste ensaio, a extrusão do patógeno foi observada tanto em exemplares de
pupas como de adultos mortos (Figura 3). Os resultados indicaram que houve diferença
na emergência de adultos a partir de pupas tratadas. O menor número de adultos
emergidos ocorreu no tratamento com o isolado IBCB 133, na concentração de 10
6
conídios/mL, que diferiu significativamente dos demais, enquanto no tratamento com o
mesmo isolado, na concentração de 10
8
conídios/mL, a emergência de adultos não
diferiu do controle (Tabela 3).
TABELA 3 -
Valores médios e análise de variância da emergência de adultos, tempo
médio de vida de adultos e mortalidade total obtidas de pupas de Chrysomya putoria
tratadas com suspensões de conídios de isolados de Paecilomyces fumosoroseus
.
Avaliação conduzida até 20 dias após o início da emergência de adultos.
Tratamento
a
Emergência (%)
b
TMV
c
Mortalidade total
IBCB 133, 10
6
44,25 ±
5,5
C
9,64 ±
1,0
A
13,75 ± 3,3
A
IBCB 133, 10
8
45,73 ±
5,9
BC
9,06 ±
1,2
A
15,50 ± 2,4
A
IBCB 75, 10
6
59,41 ±
6,0
A
10,14 ±
0,1
A
7,75 ± 1,7
B
IBCB 75, 10
8
50,08 ±
4,4
ABC
8,80 ±
0,9
A
14,75 ± 3,2
A
Controle
d
55,26 ±
1,8
AB
10,36 ±
0,2
A
7,50 ± 1,0
B
Valor de F 6,6
**
2,65
NS
9,93
**
Pr>F
e
0.0029
0,0746 0,0004
C.V. (%)
f
9,75 8,58 20,93
DMS (Tukey)
g
10,85 1,80 5,41
Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pelo teste de
Tukey (P>0,05). NS não significativo; **significativo a 1% de probabilidade.
a
Isolado e concentração de conídios/mL.
b
Media das porcentagens dos valores observados transformados em arco seno;
c
TMV: Tempo médio de vida dos adultos (em dias).
d
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
e
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
f
CV: Coeficiente de variação
g
DMS: Diferença mínima significativa
73
Na análise do tempo médio de vida dos adultos, emergidos a partir das pupas
tratadas com os isolados IBCB 75 e IBCB 133 de P. fumosoroseus, em ambas as
concentrações de conídios, também não mostrou redução significativa (P>0,05) na
sobrevivência das moscas, quando comparado ao controle (Tabela 3).
O efeito do fungo sobre as pupas foi melhor evidenciado na avaliação da
mortalidade total onde se observou aumento significativo (P<0,01) na mortalidade dos
grupos banhados com 10
8
conídios/mL do isolado IBCB 75 e de ambas as
concentrações do isolado IBCB 133 de P. fumosoroseus. Apenas no tratamento com
10
6
conídios/mL do isolado IBCB 75 não se observou aumento significativo na
mortalidade (Tabela 3). Tais resultados estão em concordância aos descritos por
ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005), em que a aplicação de inóculos com 10
8
conídios/mL
de isolados de P. fumosoroseus em pupas de H. irritans resultou em mortalidades
estatisticamente significativas que alcançaram cerca de 50% dos imagos analisados.
Outro aspecto importante a ser considerado é a redução na sobrevivência de
adultos provocada pelo aumento da concentração dos inóculos. Apesar da análise
estatística não ter acusado diferença no tempo médio de vida das moscas tratadas com
FIGURA 3.
Pupas mortas pelo fungo Paecilomyces fumosoroseus.
A:
pupa colonizada
pelo fungo na fase hifálica.
B:
Mosca emergindo da pupa colonizada pelo fungo na
fase de esporulação
.
A
B
74
10
6
ou 10
8
conídios/mL do isolado IBCB 75 de P. fumosoroseus, o efeito dose-resposta
pode ser verificado na Figura 4, onde se observou acentuada redução na sobrevivência
de adultos na concentração de 10
8
conídios/mL.
Este fenômeno é importante para o controle de C. putoria, pois diminui a duração
da fase reprodutiva da mosca, provavelmente reduzindo a ovipostura. Após inocularem
pupas da mariposa Phthorimaea operculella com B. bassiana, HAFEZ et al. (1997)
obtiveram significativo decréscimo na emergência e longevidade de adultos, postura e
viabilidade dos ovos. Adultos de C. capitata apresentaram menor longevidade após o
tratamento das pupas com diferentes isolados de M. anisopliae (BISSOLLI, 2004).
FIGURA 4:
Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria
emergidos de pupas
tratadas com suspensões de conídios dos isolados IBCB 133 e IBCB 75 de
P.
fumosoroseus, nas concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, até o 23° dia
após tratamento.
75
3.4 Patogenicidade para adultos de
C. putoria
A aplicação de ambos os isolados de P. fumosoroseus sobre adultos de C.
putoria, não mostrou resultados significativos (P>0,05) na redução do tempo médio de
vida e no aumento da mortalidade das moscas tratadas com suspensões de 10
6
e 10
8
conídios/mL (Tabela 4).
TABELA 4 -
Valores médios e análise de variância do tempo médio de vida de adultos
e mortalidade total obtidas de adultos de Chrysomya putoria
tratados com suspensões
de conídios de isolados de Paecilomyces fumosoroseus
. Avaliação conduzida até 20
dias após o início da emergência de adultos.
Tratamentos
a
TMV
b
Mortalidade(%)
c
IBCB 133, 10
6
9,80
±
0,2
A
40,24
±
2,5
A
IBCB 133, 10
8
9,74
±
0,2
A
41,51
±
6,6
A
IBCB 75, 10
6
9,73
±
0,6
A
36,97
±
9,6
A
IBCB 75, 10
8
9,53
±
0,4
A
51,55
±
21,1
A
Controle
e
9,86
±
0,4
A
32,88
±
8,3
A
Valor de F 0,40
NS
1,47
NS
Pr>F
f
0,8069 0,2598
C.V. (%)
g
4,02 28,23
DMS (Tukey)
h
0,85 25,04
Médias seguidas por pelo menos uma letra em comum, na coluna, não diferem entre si pel
o teste de
Tukey (P>0,05). NS não significativo; **significativo a 1% de probabilidade; *significativo a 5% de
probabilidade.
a
Isolado e concentração de conídios/mL.
b
TMV: Tempo médio de vida dos adultos (em dias).
c
Media das porcentagens dos valores observados transformados em arco seno;
d
Tratamento controle: Solução de Tween 80 a 0,1%.
e
Pr>F: Probabilidade de significância associada ao valor de F
f
CV: Coeficiente de variação
g
DMS: Diferença mínima significativa.
A extrusão do patógeno ocorreu em poucos exemplares de adultos mortos. O
efeito dose-resposta para os isolados também não ficou evidente nesta análise, pois os
adultos tratados com suspensões de 10
6
e 10
8
conídios/mL apresentaram mortalidades
estatisticamente similares ao grupo controle (Figura 5). Estes resultados divergem das
76
observações de CASTILLO et al. (2000) e ANGEL-SAHAGÚN et al. (2005) que
verificaram mortalidade significativa de adultos de C. capitata desafiados com inóculos
de 10
6
conídios/mL, e de H. irritans pulverizados com inóculos de 10
8
conídios/mL de
diferentes isolados do P. fumosoroseus, respectivamente.
Figura 5:
Sobrevivência de adultos de Chrysomya putoria pulverizados com
suspensões de conídios dos isolados IBCB 133 e IBCB 75 de P. fumosoroseus, nas
concentrações de 10
6
e 10
8
conídios/mL e controle, até o 20° dia após tratamento.
Alguns autores descreveram a ocorrência de P. fumosoroseus naturalmente
parasitando dípteros, tais como Tachuindae (INGLIS & TIGANO, 2006) e Musca
domestica (SKOVGARD & STEEMBERG, 2002). O fungo demonstrou elevada
patogenicidade para mosca branca, Bemisia argentifolli (WRAIGHT et al., 1998),
apresentando considerável potencial para produção comercial em massa e para o uso
alternativo no controle biológico desta praga (WRAIGHT et al., 2000). A discrepância
observada entre os resultados destes autores e os relatados neste estudo pode ser
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Dias após tratamento
Nº de adultos sobreviventes
P.f. IBCB133 10
6
P.f. IBCB75 10
6
Controle
P.f. IBCB133 10
8
P.f. IBCB75 10
8
77
conseqüência de fatores como a diferença de susceptibilidade entre dípteros e a
patogenicidade das cepas utilizadas, entre outros.
4. CONCLUSÕES
1. O fungo P. fumosoroseus é patogênico para a mosca sinantrópica de aviário C.
putoria.
2. O isolado IBCB 133 é patogênico para os estágios de larva e pupa de C. putoria, e
IBCB 75 apenas para pupa, mas ambos não apresentam atividade patogênica para os
estágios de ovo e adulto.
3. A eficiência do controle é influenciada pela concentração de conídios da suspensão
usada, sendo a concentração de 10
8
conídios/mL a mais eficiente.
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81
CAPÍTULO 5 – CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com base nos resultados obtidos nos ensaios deste trabalho foi possível verificar
que os fungos M. anisopliae, B. bassiana e P. fumosoroseus são patogênicos para C.
putoria, destacando-se B. bassiana e M. anisopliae por serem mais eficientes para o
controle de larvas e adultos da mosca, pois P. Fumosoroseus atuou somente na fase de
pupa. Verificou-se também diferença entre isolados de mesmo fungo, sendo os isolados
E 9 de M. anisopliae, AM 9 de B. bassiana e o IBCB 133 de P. Fumosoroseus, os mais
patogênicos, principalmente quando utilizados na concentração de 10
8
conídios/mL,
que foi a mais adequada para promover a atividade patogênica dos fungos nos vários
estágios do ciclo biológico da mosca. Devido à importância epidemiológica de C. putoria
para saúde pública e animal, é necessário estabelecer estratégias que permitam a
utilização de B. bassiana e M. anisopliae como alternativa aos tratamentos
convencionais com pesticidas químicos, atualmente empregados no manejo sanitário
de aviários de postura. Como C. putoria habitualmente se alimenta e reproduz em
excretas de aves, uma das estratégias seria a pulverização de suspensão de conídios
sobre os mesmos, o que possibilitaria a atuação direta sobre larvas e indireta sobre
adultos. Sendo assim, mais estudos tornam-se necessários para investigação de
metodologias de aplicação e formulações, visando a aplicação efetiva do controle
biológico em aviários.
82
APÊNDICE
Figura
2.
Ovos acondicionados sobre papel de filtro e este sob dieta de carne
bovina; A: Ovos tratados antes da eclosão; B: ovos após eclosão.
B
Figura 1. Caixas de criação das moscas. A: Vista lateral; B: Vista superior.
A
A
B
83
Figura 4.
Caixa de isopor adaptada para manutenção das moscas durante a
fase adulta de todos ensaios.
Figura 3.
Visualização de uma câmara úmida e dos recipientes plásticos
interligados (
→
) e vedados com tecido voile
, onde os grupos de ovos e larvas
foram mantidos durante a fase larval.
84
Figura 5.
Sachês contendo a ração que com a dieta usada nos ensaios das
larvas de C. putoria.
Figura 6. Câma
ra úmida composta de duas placas de Petri e algodão umedecido
para verificação da extrusão do patógeno.
Figura 7. Visualização das caixas de isopor em que os adultos de C. putoria f
oram
acondicionados.
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