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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO - NÍVEL MESTRADO
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA
ÊNFASE EM RADIOLOGIA
ESTUDO COMPARATIVO DE PERDA E REPARAÇÃO ÓSSEA
ALVEOLAR EM CAMUNDONGOS SUBMETIDOS A
DESCOLAMENTO MUCOPERIOSTAL EXPOSTOS E NÃO
EXPOSTOS À RADIAÇÃO X
Cláudio Affonso Lermen
Porto Alegre, Outubro de 2007.
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Cláudio Affonso Lermen
ESTUDO COMPARATIVO DE PERDA E REPARAÇÃO ÓSSEA
ALVEOLAR EM CAMUNDONGOS SUBMETIDOS A
DESCOLAMENTO MUCOPERIOSTAL EXPOSTOS E NÃO
EXPOSTOS À RADIAÇÃO X
Linha de Pesquisa: Diagnóstico das Afecções Buco-Faciais
Dissertação realizada como parte
dos pré-requisitos para obtenção do
título de Mestre em Clínica
Odontológica, ênfase em Radiologia.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Heloísa Dias
da Silveira
Porto Alegre, Outubro de 2007.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a todas as pessoas que direta, ou indiretamente, fizeram parte de
minha vida neste período de desenvolvimento e conclusão desta dissertação:
À Luciane Bertotto, minha noiva e futura esposa, pelo estímulo, paciência e
amor a mim dedicado;
Ao meu pai, Paulo Affonso Lermen, exemplo de caráter, conselheiro em todas
as horas e inspiração na busca por meus objetivos;
À minha mãe, Martha Gonçalves Cogno, que apesar da distância está sempre
presente em minha vida e cumpriu papel fundamental na minha educação;
À minha irmã Paula Cogno Lermen, pela amizade e pela revisão deste texto;
Ao Professor Reni Dalla-Bona, com quem aprendi inúmeras lições da rotina de
um Cirurgião-Dentista;
Aos colegas Heraldo Dias da Silveira e Gabriela Liedke, pelas parcerias e
ajudas mútuas;
Ao C.D. Roger Genesini, pelas extensas horas de convívio no desenvolvimento
de atividades laboratoriais;
Às Professoras Dalva Padilha e Ana Fossati, pela disponibilidade em auxiliar
sempre que solicitadas;
À Isabel da Silva Lauxen, do Laboratório de Patologia da UFRGS, por
colaborar através da inclusão e armazenamento das peças;
As bibliotecárias Norma e Heloísa, pela presteza e eficácia na obtenção de
dados necessários a esta pesquisa;
À todos os professores do Programa de Pós-Graduação e a coordenadoria do
PPGO.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
A Profa. Heloísa Dias da Silveira, pela dedicação com que trata todo e qualquer
assunto relacionado a esta instituição. Por contribuir significativamente na
minha formação profissional e acadêmica e solidificar meus primeiros passos
no campo da pesquisa científica.
RESUMO
Esta pesquisa teve como objetivo estudar o efeito da radiação X, em baixas
doses, nos processos de perda e reparação óssea alveolar em camundongos
submetidos à cirurgia de retalho mucoperiostal. O processo de perda óssea
alveolar é um fenômeno comum em todos os indivíduos, entretanto, sabe-se
que o descolamento da mucosa nesta região estimula tal fenômeno. Sabendo
dos efeitos biológicos da radiação X sobre os tecidos, procurou-se analisar a
possível interferência de ação da mesma como agente adicional a este
processo. Foram utilizados 72 camundongos CF 1 Mus Domesticus divididos
em grupo teste (expostos à quatro doses semanais de 0,002C/Kg de radiação)
e controle (não expostos à radiação). Os resultados mostraram, segundo
análises estatísticas, utilizando o teste Kruskal Wallis e teste U de Mann-
Whitney, que não houve diferença significativa, considerando p= 0,05, em
relação a perda e reparação óssea alveolar entre o grupo teste e controle.
Pôde-se concluir que dose de radiação compatível com exames de
investigação por imagem, por um período de quatro semanas, não altera os
padrões de reabsorção e reparação óssea alveolar em camundongos
submetidos à cirurgia de retalho mucoperiostal.
Palavras Chave: Radiação X, Perda Óssea Alveolar, Retalho Mucoperiostal.
ABSTRACT (CORRIGIR)
This research aims to study the effects of x-radiation, in low doses, to the
alveolar bone loss and repair processes in mice submitted to chirurgical
mucoperistal flap. Alveolar bone loss is common to all individuals, but it is
known that the displacement of the mucosa stimulates the phenomenon. In
order to analyze x-radiation as an additional agent to this process of loss and
repair, 72 CF 1 Mus Domesticus mice were divided into experimental group
(exposed to radiation) and test group (not exposed to radiation) at a dose of
0,002C/Kg. The results showed no significant difference in alveolar bone loss
and repair comparing the experimental and the test groups, considering p =
0,05. It is possible to conclude, therefore, that low doses of radiation during a
period of four weeks does not alter the patterns of alveolar bone loss and repair
in mice submitted to chirurgical mucoperistal flap.
Key Words: X Ratiation, Alveolar Bone Loss, Mucoperiostal Flap.
LISTA DE ABREVIATURAS
C – Coulomb
cm – Centímetro
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
g – Gramas
Gy – Gray
Kg – Quilograma
kVp – Quilovoltagem
mA – Miliamperes
mGy - Miligray
ml – Mililitro
mm - Milímetro
R – Röentgen
RNA – Ácido Ribonucléico
SUMÁRIO
1. ANTECEDENTES E JUSTIFICATIVA 9
1.1. RADIAÇÃO X 9
1.2. REABSORÇÃO ÓSSEA INDUZIDA NO OSSO ALVEOLAR 15
1.3. ROEDORES COMO MODELOS DE ESTUDO 18
2. OBJETIVOS 20
2.1. OBJETIVO GERAL 20
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 20
3. METODOLOGIA 21
3.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 21
3.2. AMOSTRA 21
3.3. EXPERIMENTO 22
3.4. CALIBRAGEM E CEGAMENTO 27
3.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA 28
3.7. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 28
4. RESULTADOS 29
5. DISCUSSÃO 33
6. CONCLUSÃO 38
REFERÊNCIAS 39
ANEXOS 44
1. ANTECEDENTES E JUSTIFICATIVAS
1.1. RADIAÇÃO X
Os efeitos biológicos da radiação X têm sido exaustivamente estudados,
e os resultados comprovam os efeitos deletérios, temporários ou não, deste
tipo de radiação sobre os tecidos.
Sabendo-se disso, cada vez mais se tem
dado ênfase ao uso racional de doses de radiação, evitando assim a exposição
desnecessária de indivíduos à radiação.
A possibilidade do uso da radiação X
provocar efeitos deletérios nos organismos vivos verificou-se quase que
imediatamente após a sua descoberta. Por outro lado, intensificou-se o
emprego das radiações em diferentes campos, como radiodiagnóstico,
radioterapia, na pesquisa científica, na indústria, criando então um dilema: “Os
benefícios justificariam os riscos?” Pode-se responder afirmativamente, desde
que se possa minimizar as doses de exposição aos pacientes, sem deixar de
obter a informação diagnóstica. Relacionando a dose ao ritmo de aplicação,
pode-se classificar as doses de radiações em agudas e crônicas. Exposições
agudas representariam grandes doses aplicadas em um curto espaço de
tempo, enquanto as exposições crônicas seriam pequenas quantidades de
radiação distribuídas por um longo período (FREITAS, ROSA e SOUZA,
2004).
Os efeitos biológicos deletérios da radiação ionizante podem atingir tanto
o material genético como estruturas do citoplasma. Tais efeitos podem envolver
tanto células germinativas como somáticas. No primeiro caso, o indivíduo
poderá transmitir o dano à sua descendência. Já no caso das células
somáticas o clone resultante das mitoses da célula danificada carregarão a
alteração (LANGLAND e LANGLAND, 2002).
Os danos estocásticos dos raios X são aqueles causados pela
casualidade dos acontecimentos que sucedem aos processos primários de
reparação, caracterizados pelo fato de que a dose crescente não aumenta o
grau do malefício, mas a freqüência de seu aparecimento. Um único processo
de ionização pode ser suficiente para danificar irreparavelmente uma célula.
Enquanto o dano não estocástico é provocado a partir de uma dose de valor
limítrofe que suplanta a fronteira da capacidade de reparação de um tecido, a
amplitude do dano aumenta com o valor da dose em que, naturalmente,
também cresce o risco de dano adicional pela casualidade. No território celular,
os danos não-estocásticos e estocásticos, devido às radiações, praticamente
se sobrepõem e só podem ser diferenciados um do outro teoricamente. O
tecido indiferenciado é significativamente mais sensível aos raios X do que o
diferenciado, e o mesmo raciocínio é válido para células que têm alta atividade
mitótica. Células com atividade e diferenciação diversas mostram, segundo a
lei de Bergonié e Tribondeau, uma sensibilidade variável aos raios X (PASLER
e VISSER, 2001).
A radiossensibilidade pode ser modificada por outros fatores além da
atividade mitótica e grau de diferenciação celular. Dentre estes fatores, pode-se
destacar o metabolismo celular e a vascularização. Células com alta atividade
metabólica necessitam maior suprimento de oxigênio, o que, para as radiações
ionizantes pode significar um aumento de radiossensibilidade de até três vezes.
Com o aumento da vascularização, ocorrerá uma superoxigenação, que poderá
tornar o tecido mais sensível, devido à presença de radicais oxidantes
(FREITAS, ROSA e SOUZA, 2004).
Os efeitos das radiações ionizantes sobre o organismo podem ser
físicos e químicos, resultando em modificação da morfologia e função. Torna-
se fácil o entendimento de tais efeitos se raciocinarmos em função da molécula
de água, até porque esta compõe 80% do organismo, sendo, portanto mais
afetada. Quando uma molécula recebe o impacto de um fóton de raios X, ela
pode perder um elétron de um de seus átomos e tornar-se um íon H
2
0
+
instável. O elétron livre pode ser anexado a outra molécula de H
2
O resultando
em outro íon instável H
2
O
-
. Ambos esses íons instáveis são transformados em
inúmeros radicais altamente reativos. Todo esse processo de reações ocorre
em frações de segundo e continuam rapidamente, com os radicais reagindo
entre si ou com outras moléculas, isto é, proteínas, lipídios, carboidratos,
hormônios, ácidos nucléicos (RNA e DNA), etc. Este processo pode ser
dividido teoricamente em três fases: a fase física refere-se à fase em que o
impacto dos fótons leva à formação de íons instáveis; a fase físico-química
seria aquela da formação dos radicais livres; e a última fase seria puramente
química, na qual os radicais reagem entre si com outras moléculas (ALVARES
e TAVANO, 1998).
Frente à radiação, as células podem sofrer alterações morfológicas ou
funcionais. As alterações morfológicas sofridas pelo núcleo celular são:
picnose, vacuolização e fragmentação dos cromossomos. Já no citoplasma,
podemos observar vacuolização, desintegração das mitocôndrias e do
complexo de Golgi. Entre as alterações funcionais, pode-se encontrar:
distúrbios de motilidade, de metabolismo e reprodução celular, podendo estas
alterações ser do tipo reversível, condicional ou irreversível (FREITAS, ROSA e
SOUZA, 2004).
O exame ao microscópio de células recentemente irradiadas não revela
alterações morfológicas importantes, as quais se tornam evidenciáveis com o
aumento do tempo transcorrido entre a irradiação e o exame. Assim, a
absorção da energia veiculada pela radiação conduz a uma série de reações
químicas, em cadeia, sendo o primeiro degrau uma alteração molecular, e, o
último, a exteriorização da lesão, resultando, por exemplo, na supressão de
uma função celular ou na morte desta célula (MAURIELLO, OVERMAN e
PLATIN, 1995).
Experimentalmente não tem sido possível estabelecer uma dose de
segurança (dose abaixo da qual os efeitos estocásticos não se desenvolvem).
Dessa forma, assume-se que não existe uma dose limiar, e que cada
exposição à radiação ionizante leva à possibilidade de induzir um efeito
estocástico. Quanto menor a dose de radiação, menor a probabilidade de dano
celular (WHAITES, 2003).
Com base no princípio ALARA (“As low as reasonably achievable”) o
American Dental Association Council on Scientific Affairs (2006) indica que os
cirurgiões-dentistas devem desenvolver e implementar programas de proteção
radiológica, com permanentes atualizações, possibilitando a diminuição das
doses de exposição de seus pacientes à radiação X.
A importância e a freqüência do uso da radiação X na Odontologia é
evidente uma vez que esta é responsável por, aproximadamente, 20% do total
de exames radiográficos realizados no Brasil e cerca de 22% em escala
mundial (PASLER e VISSER, 2001; YANCOVENCO, 2001).
Pacientes irradiados terapeuticamente para doenças de cabeça e
pescoço, bem como pacientes expostos à radiação em níveis de diagnóstico
tem a incidência de tumores de glândulas salivares aumentada, principalmente
em pacientes que se submeteram a exames dentários completos antes dos 20
anos. Estudos epidemiológicos realizados nos Estados Unidos no final da
década de 80 demonstraram que 85% da exposição da glândula parótida à
radiação provém de exames radiográficos odontológicos, e aproximadamente
15% dos casos de câncer nessas glândulas estão relacionados a doses de
radiação utilizadas com fins diagnósticos (PRESTON-MARTIN e WHITE,
1990).
Hujoel et al. (2004), em estudo populacional, utilizando informações
contidas em prontuários médicos, no estado de Washington- E.U.A., entre os
anos de 1993 e 2000 procurou estabelecer uma relação entre a radiação X, em
doses utilizadas regularmente na prática odontológica, e o nascimento de
crianças de baixo. Relacionou tal fato à radiação que incide sobre a tireóide, da
mãe, órgão sabidamente radiossensível.
Hujoel et al. (2006) levantaram dados de 325 crianças em tratamento
ortodôntico há um ano ou mais e descobriram que foram realizadas em média
7 radiografias extra-bucais e 20 intra-bucais, sendo que pouco mais de 10%
apresentavam uma real justificativa para serem solicitadas, como por exemplo,
radiografias pré-cirúrgicas.
Lamers et al (2005), estudando o efeito da radiação em pequenas
doses, sobre os filamentos de actina das glândulas parótidas em ratos, realizou
um experimento expondo um grupo de animais a 12 R, e outro a 36 R, sendo
um terceiro grupo não irradiado. Os animais foram sacrificados 4, 8 e 24 horas
após a irradiação, sendo que os efeitos desta já puderam ser observados no
momento 4 horas. A exposição de 36 R aparentemente desorganizou os
filamentos de actina das células acinares, aumentando o volume celular,
enquanto a exposição de 12 R teve pouco efeito sobre o citoesqueleto de
actina. Os autores concluem que a radiação X, mesmo em doses muito abaixo
das terapêuticas, pode resultar em danos nas glândulas parótidas.
Nas fases precoces da remodelação de implantes dentários
osseointegrados, procedimentos radiográficos são pouco indicadas devido aos
efeitos adversos da radiação ionizante na cicatrização e remodelação óssea
(VON KRAMMER, 1994).
Dalla-Bona (2005), estudando o efeito da radiação X ao longo do
envelhecimento em camundongos observou que a radiação X em doses baixas
e periódicas diminui o crescimento mandibular e o índice de sobrevida destes
animais.
Bóscolo et al (2000) avaliando o efeito de baixas doses de radiação X na
cicatrização de feridas cirúrgicas suturadas e não suturadas no dorso de ratos,
perceberam que no grupo irradiado houve um retardo no processo de
cicatrização.
Em seres humanos, a maior parte dos estudos é realizada em
populações que receberam altas doses de radiação, por exemplo, cidadãos
japoneses das cidades bombardeadas pelas bombas atômicas (WHITE, 1992).
Casos de altas doses de radiação, como as utilizadas em radioterapias
também tem recebido atenção especial. O fenômeno da osseointegração, em
mandíbulas de cães irradiados foi observado com dose total de 43 Gy, e os
autores concluíram que em casos de radioterapia os implantes devem ser
colocados posteriormente à irradiação (BRASSEUR et al., 2006).
Estudos celulares e moleculares monitorando os efeitos da radiação em
doses abaixo de 1 Gy são pouco freqüentes (DARE et al., 1997).
1.2. REABSORÇÃO ÓSSEA INDUZIDA NO OSSO ALVEOLAR
O processo de perda óssea alveolar em ratos é um fenômeno rotineiro,
observado em diversos estudos, ao longo do envelhecimento do animal
(BELTING, 1953; MESSER, 1980).
Diversas maneiras de promover e estudar a reabsorção óssea alveolar e
formas de controlá-la ou tratá-la, são realizadas por diferentes pesquisadores.
Dentre estas, estão procedimentos cirúrgicos como retalho e descolamento
mucoperiostal (YAFFE, FINE e BINDERMAN, 1994; YAFFE et al., 2000;
BINDERMAN, ADUT e YAFFE, 2000; BINDERMAN et al., 2001).
Em um estudo utilizando 60 ratos Wistar com o objetivo de observar o
fenômeno da reabsorção óssea alveolar após a realização de cirurgia de
descolamento do retalho mucoperiósteo na região de molares na mandíbula,
Yaffe, Fine e Binderman (1994) observaram que a maior parte da atividade de
reabsorção ocorre durante a primeira semana, pois ocorre uma perda de
retenção do cálcio na ordem de 22%para corrente sangüínea, o que acarreta
em posterior perda da matriz óssea. Tanto no aspecto histológico quanto nas
micro-radiografias ocorreu o fenômeno de reabsorção acelerada e esta
reabsorção foi mais acentuada, no grupo experimental no qual o descolamento
mucoperiósteo foi realizado nas regiões vestibular e lingual. O mesmo estudo
demonstrou que o osso alveolar do grupo teste, após 120 dias da realização do
procedimento cirúrgico, atingiu os mesmos níveis observados no grupo
controle. Os autores concluíram que o fenômeno de reabsorção acelerada
após o procedimento de descolamento enfatiza a extensão da atividade de
reabsorção em uma fase primária.
Ao realizar-se o descolamento do retalho mucoperiostal, durante o
procedimento de dissecção, os tecidos moles da papila gengival, incluindo os
feixes de fibras colágenas, são incisados e o periósteo é separado do osso
alveolar, particularmente na área de união gengival, estendendo-se à área da
junção mucogengival (YAFFE et al., 2000).
O rompimento das fibras colágenas
do periósteo marginal desencadeia a atuação dos fibroblastos, que residem
nas fibras, a iniciarem a cascata de eventos e interações celulares,
promovendo a reabsorção óssea alveolar. Considerável quantidade de
atividade osteoclástica é evidenciada junto a toda extensão de osso alveolar e
por toda a superfície do ligamento periodontal (YAFFE, FINE e BINDERMAN,
1994; BINDERMAN et al., 2001). Uma significante perda óssea é iniciada no
ligamento periodontal quando a gengiva marginal é cortada e o retalho
mucoperiósteo é separado pelo acesso coronal (BINDERMAN et al., 2001).
Esta atividade de reabsorção ocorre no osso adjacente aos dentes da
mandíbula do rato nos 21 dias seguintes à cirurgia de descolamento do retalho
mucoperiostal (YAFFE, FINE e BINDERMAN, 1994; BINDERMAN, ADUT e
YAFFE, 2000).
O aspecto da reabsorção óssea em resposta a separação do retalho
mucoperiostal do osso alveolar revela uma reabsorção interna do osso
alveolar, opondo-se as superfícies radiculares, podendo progredir para perda
total ou parcial das superfícies vestibular ou lingual do osso alveolar (YAFFE et
al., 2000).
Esta cirurgia periodontal estimula a atividade osteoclástica com vários
valores de perda da crista óssea alveolar. Fatores locais como infecção, trauma
oclusal e geometria óssea podem afetar quantitativamente o estágio de perda
óssea bem como o estágio de regeneração óssea (YAFFE, FINE e
BINDERMAN, 1994).
Binderman et al (2001) realizaram estudos com 18 ratos Wistar, 9 ratos
foram submetidos a cirurgias com acesso coronal e descolamento
mucoperiósteo nas faces vestibular e lingual, e outros 9 a cirurgias com acesso
apical e descolamento mucoperiósteo nas faces vestibular e lingual. Foram
realizadas microrradiografias com raios X de alta resolução no sentido mésio-
distal e análises histológicas. Os resultados revelaram que não houve
significativa perda óssea alveolar com acesso apical, mas que nas análises
histológicas revelou-se uma formação de novo osso trabecular. Ao contrário do
que foi observado na cirurgia com acesso coronal, onde se revelou uma
extensa fase de reabsorção. Os autores concluíram que o acesso apical ao
osso alveolar e às superfícies radiculares pelo descolamento mucoperiósteo
apical promove uma perda óssea mínima do osso alveolar.
Rivaldo et al (2005) realizaram um estudo com 72 camundongos CF1
Mus domesticus. Estes animais foram divididos em três grupos: machos,
fêmeas virgens e fêmeas com parições e cada grupo era formado por 24
animais (3, 6, 9 e 12 meses). Foi realizado descolamento mucoperiósteo
apenas na face vestibular na região dos molares do lado esquerdo e após 21
dias os camundongos foram sacrificados e as mandíbulas divididas. Estas
hemi-mandíbulas foram posicionadas de acordo com uma posição plana (as
cúspides vestibular e lingual foram alinhadas entre si em uma posição
perpendicular ao longo eixo do foco do estereomicroscópio) e fotografadas e
avaliadas para perda óssea alveolar. Os resultados indicaram que o
camundongo CF1 sofre perda óssea alveolar em um processo independente do
status reprodutivo, quando submetido ao procedimento cirúrgico de
descolamento mucoperiósteo. Como o objetivo do estudo foi validar um modelo
animal para avaliação da perda óssea alveolar, e a área de exposição radicular
medida demonstrou um padrão semelhante de reabsorção nos animais de 3 e
12 meses, os autores concluíram que o camundongo CF1 de três meses de
idade é um modelo ideal para estudos de perda óssea alveolar durante o
envelhecimento.
1.3. ROEDORES COMO MODELOS DE ESTUDO
A ocorrência de perda óssea com o passar do tempo, em camundongos,
na ausência de qualquer estímulo externo possibilita que este tipo de animal
seja utilizado a fim de estudar o mecanismo de perda óssea alveolar, bem
como fatores capazes de interferir neste processo (MESSER, 1980).
Belting et al (1953), já afirmava que modificações periodontais, dentre
elas a perda óssea alveolar, aconteciam com o envelhecimento dos
camundongos, entretanto, conforme a espécie do animal a progressão da
doença ocorre de forma distinta.
A utilização de roedores como modelo experimental está consolidada na
literatura científica mundial. Entretanto, a extrapolação para equivalência em
tempo de vida com relação ao homem é motivo freqüente de dúvidas, até
porque o animal não pode ser avaliado como um ser humano em miniatura. É
necessário que se leve em consideração nos cálculos as diferentes fases da
vida- recém-nascido, desmame, reprodutiva, adulto, adulto tardio e velho- pois
o ritmo fisiológico difere entre elas (QUINN, 2005).
Sabe-se da capacidade da radiação X provocar efeitos sobre os tecidos,
o objetivo do presente estudo é avaliar o comportamento do osso alveolar
submetido a esta radiação, associado ao processo inflamatório causado pelo
descolamento mucoperiostal em camundongos.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a influência ou não da radiação X sobre a perda e reparação
óssea alveolar em camundongos submetidos à cirurgia de descolamento
mucoperiostal.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Mensurar a área de perda óssea alveolar, segundo protocolo existente
na literatura em camundongos submetidos à cirurgia de descolamento
mucoperiostal:
Expostos à radiação X;
Não expostos à radiação X;
Comparar os resultados entre grupo exposto e não-exposto em relação
à perda óssea;
Mensurar o reparo ósseo ocorrido em ambos grupos e compará-los, a
partir de 21 dias.
3. METODOLOGIA
3.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O presente estudo caracteriza-se por ter um delineamento do tipo
experimental, de caso-controle.
3.2. AMOSTRA
Foram utilizados no experimento, 72 camundongos CF1 Mus domesticus
clinicamente livres de qualquer patologia e que iniciaram o estudo com três meses
de vida. A dieta sólida ad libitum foi constituída de ração Nuvilab CR1, composta
por carbonato de cálcio, farelo de milho, farelo de soja, farelo de trigo, farinha de
carne e ossos, cloreto de sódio, premix mineral vitamínico, aminoácidos e farinha
de peixe. Os animais foram mantidos em cativeiro na Divisão de Produção e
Experimentação Animais da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em
Saúde/RS (FEPPS).
A amostra foi baseada no estudo de Rivaldo et al.(2005), sendo composta
por 72 camundongos. O grupo teste foi composto por 36 animais, e outros 36
formaram o grupo controle.
Considerando que o objetivo principal do experimento não é estudar as
características da população, mas sim verificar diferenças na perda e
reparação óssea alveolar em animais submetidos à cirurgia de retalho
mucoperiostal expostos e não-expostos à radiação X optou-se por uma
amostragem não-probabilística por conveniência (BARBETTA, 1999).
3.3. EXPERIMENTO
Os animais foram divididos em dois grupos, teste e controle. Os animais
de ambos os grupos, iniciaram o estudo com 3 meses de vida, e nesta data,
ambos os grupos foram submetidos à cirurgia de descolamento da mucosa
vestibular e periósteo na mandíbula nas regiões dos molares no lado esquerdo.
O lado direito de cada animal foi preservado integralmente.
O grupo teste foi submetido à radiação X imediatamente após a cirurgia
(dia 01), e, posteriormente, nos dias 07, 14 e 21, totalizando uma dose semanal
de exposição de 0,002 C/Kg.
Para manter os animais imóveis durante as exposições, estes foram
introduzidos no interior de uma seringa plástica de 60 ml (Injex®), segundo
protocolo proposto por Dalla-Bona (2005), posicionada de forma que o
cabeçote do aparelho ficasse em uma posição na qual o raio central do feixe de
raios X estivesse direcionado para o lado esquerdo da mandíbula dos
camundongos. A seringa foi externamente recoberta por uma manta de
chumbo de 2 mm de espessura, de forma que apenas a área de interesse
ficasse exposta. A distância foco-animal foi de 20 cm. O grupo controle foi
submetido à mesma situação, entretanto, não recebeu a irradiação.
Foi utilizado um aparelho de Rx odontológico da marca Gnatus
®
Timex-
70 com 70 kVp e 9 mA.
Doze animais de cada grupo, foram sacrificados para análise de perda
óssea alveolar aos 21 dias após a realização do procedimento cirúrgico,
período descrito como de máxima reabsorção óssea alveolar (YAFFE, FINE e
BINDERMAN, 1994; YAFFE et al., 2000; BINDERMAN, ADUT e YAFFE, 2000;
BINDERMAN et al., 2001). Outros 12 animais de cada grupo, foram
sacrificados 60 dias após a cirurgia, a fim de avaliar possíveis diferenças em
relação ao tempo de reparação do tecido ósseo alveolar. O restante dos
animais, 12 de cada grupo, foi sacrificado 120 dias após a cirurgia, período no
qual os níveis de perda óssea alveolar dos grupos teste e controle encontram-
se bastante semelhantes (YAFFE, FINE e BINDERMAN, 1994). Desta forma,
assim ficou dividido o grupo amostral:
G0= grupo controle (36 animais)
G0
1
= 12 animais (sacrifício 21 dias após cirurgia)
G0
2
= 12 animais (sacrifício 60 dias após cirurgia)
G0
3
= 12 animais (sacrifício 120 dias após cirurgia)
G1= grupo teste (36 animais)
G1
1
= 12 animais (sacrifício 21 dias após cirurgia)
G1
2
= 12 animais (sacrifício 60 dias após cirurgia)
G1
3
= 12 animais (sacrifício 120 dias após cirurgia)
Para anestesia e posterior realização da cirurgia de descolamento do
retalho mucoperiósteo, os animais receberam um composto de Cloridrato de
Xilazina (Anesadan, Vetbrands) na proporção de 0,05 ml/Kg e Cloridrato de
Ketamina (Dopalen, Vetbrands) 1,0 ml/Kg intra-muscular. A cirurgia foi
realizada apenas na face vestibular da região dos primeiros e segundos
molares mandibulares esquerdos. A mucosa foi separada do tecido ósseo de
suporte após incisão da gengiva marginal. Para incisão foi utilizada uma lâmina
de bisturi número 11, montada em um cabo de bisturi número 3. A lâmina foi
posicionada paralelamente ao longo eixo dos dentes dos animais. O retalho
mucoperiostal foi afastado, utilizando-se para tanto uma estátula 3SS como
descolador gengival. A mucosa foi então imediatamente reposicionada, sem
realização de sutura (YAFFE, FINE e BINDERMAN, 1994; BINDERMAN, ADUT
e YAFFE, 2000; YAFFE et al., 2000; BINDERMAN et al., 2001). A realização do
procedimento cirúrgico levou em média de 30 a 40 segundos.
Passados os primeiros 21 dias, a eutanásia do primeiro grupo de
animais foi realizada por meio de deslocamento cervical. Na seqüência foi
realizada a remoção cirúrgica das mandíbulas, utilizando-se para tanto
tesouras cirúrgicas e lâminas de bisturi número 11 e 15 montadas em cabo de
bisturi número 3. As mandíbulas foram seccionadas na linha média, com auxílio
de uma lâmina de micrótomo, mantendo o tecido mole e acondicionadas em
frascos contendo formalina tamponada a 10% de concentração, com
identificação do grupo ao qual pertenciam (teste e controle) bem como a época
do sacrifício (21, 60, 120 dias). O mesmo procedimento foi repetido com o
restante da amostra, após 60 e 120 dias respectivamente.
Sob um estereomicroscópio, as mandíbulas foram totalmente
dissecadas, e todo tecido mole foi completamente removido. A zona do rebordo
alveolar mandibular correspondente à zona de intervenção cirúrgica e perda
induzida foi submetida à limpeza dos remanescentes de tecido mole com o
auxílio de hipoclorito de sódio e microbrush.
Após a completa remoção de tecido mole as mandíbulas foram coradas
com azul de toluidina 1% para facilitar a visualização e delimitação da área de
exposição radicular, limites do esmalte, cemento e osso. Após a coloração as
mandíbulas foram fotografadas com uma câmera fotográfica digital Sony
Cybershot W1 com definição de 5.1 megapixel, devidamente acoplada ao
estereomicroscópio, em uma posição padronizada, utilizando como referência
um paquímetro digital com abertura fixa e pré-determinada de 1 mm (Figura 1).
Figura 1 - Fotografia da calibragem prévia às medidas utilizando paquímetro
digital com abertura fixa e pré-determinada de 1 mm.
O estereomicroscópio foi ajustado com ampliação de 2,5 vezes de
aumento para a aquisição das fotografias. O aspecto lingual das mandíbulas foi
fotografado. A posição padronizada da superfície foi obtida pela utilização de
um posicionador plano confeccionado em polivinilsiloxano - silicona de adição
(RIVALDO, 2005) sobre uma base que permitisse pequenas movimentações
corrigindo eventuais falhas no posicionamento das mandíbulas. Para
estabelecimento da posição padrão, as cúspides linguais e vestibulares
deveriam ficar alinhadas entre si (de forma que as cúspides vestibulares não
aparecessem na fotografia) em uma posição perpendicular ao longo eixo do
foco do estereomicroscópio (RIVALDO, 2005; TATAKIS e GUGLIELMONI,
2000). As fotografias obtidas foram repassadas ao computador e para análise
das imagens foi utilizado o software Image Tool versão 3.00 (UTHSCSA).
A mensuração da área de perda óssea alveolar apenas na face lingual
dos primeiros e segundos molares foi proposto por Hilgert et al. (2002),
modificada de Tatakis e Guglielmoni (2000), e definido a partir da união de 12
pontos a saber: mesialmente, pela aresta mesial, ou seja, pela distância da
junção amelo-cementária ao osso alveolar da raiz mesial do primeiro molar;
distalmente, pela aresta distal (junção amelo-cementária ao osso alveolar) da
raiz distal do segundo molar; coronalmente, pelos três pontos marcados em
cada um dos dois dentes molares: dois pontos definidos pela posição da junção
amelo-cementária nas faces mesial e distal do dente e um definido pela
posição mais apical da junção amelo-cementária na superfície do dente; e
apicalmente, pela posição mais apical do osso alveolar nas superfícies da
primeira e segunda raízes de cada dente (Figura 2), sendo os resultados
demonstrados em mm
2
(HILGERT, 2002).
Figura 2 – Fotografia da face lingual dos primeiros e segundos molares,
interligando os 12 pontos entre si, os quais definem a área de perda óssea
alveolar.
3.4. CALIBRAGEM E CEGAMENTO
A fim de garantir a reprodutibilidade dos dados no que tange a marcação
dos pontos que definem a área de perda óssea alveolar e das medidas, o
examinador foi calibrado, realizando as mensurações em 10 animais
escolhidos aleatoriamente e repetindo as medições 10 dias após a primeira
averiguação. Para verificar a existência de diferença significativa entre as duas
medidas obtidas pelo observador, empregou-se o teste de Wilcoxon para duas
amostras relacionadas. Para estimar a reprodutibilidade da medida, foi
calculado o coeficiente de correlação de Spearman. As diferenças entre as
duas medidas foram calculadas e a análise descritiva das diferenças foi
baseada em média, erro padrão da média, variância, desvio padrão e
distribuição de freqüências.
Com base nos resultados do Teste de Wilcoxon (p = 0,259), pode-se
dizer que não foi encontrada diferença significativa entre as duas medidas
feitas pelo observador, ou seja, não foi verificado erro sistemático entre as
repetições.
O coeficiente de correlação de Spearman ficou em 0,915 (p = 0,000),
que corresponde a uma correlação positiva forte. Os valores próximos de 1,
sugerem ausência de erros aleatórios ou pequenos erros aleatórios.
O examinador foi cegado durante todo experimento em relação ao
grupo, experimental ou controle, no qual fez o exame dos pontos para fins de
mensuração da perda óssea.
3.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Como o tamanho da amostra de cada grupo comparado, para cada
tempo, foi menor do que 30 camundongos, optou-se por utilizar testes não-
paramétricos.
O teste Kruskal Wallis, adequado para comparação entre 3 ou mais
amostras independentes quando os dados se apresentam pelo menos em
escala ordinal, foi utilizado para comparar os tempos 21, 60 e 120 dias, para o
grupo teste e para o grupo controle separadamente. O teste U de Mann-
Whitney, adequado para comparação entre 2 amostras independentes quando
os dados se apresentam pelo menos em escala ordinal, foi utilizado para
comparar os grupos teste e controle, para 21, 60 e 120 dias separadamente.
Para todas as análises foi estabelecido p = 0,05.
3.6. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Este trabalho foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
resolução número 18/06, do dia 14 de junho de 2006. (Anexo 1)
4. RESULTADOS
A partir dos resultados obtidos foram elaboradas tabelas para melhor
visualização dos mesmos. As tabelas evidenciam média de perda óssea,
desvio padrão, erro padrão, valores máximos e mínimos para cada grupo. A
análise das mandíbulas, individualmente, encontra-se no Anexo 2.
Tabela 1 - Mostra a média de perda óssea em cada um dos tempos, além do
desvio padrão, erro padrão, valores máximos e mínimos no grupo teste.
Dias N Média Desvio
Padrão
Erro
Padrão
Mínimo Máximo
21 12 0,84 0,14 0,04 0,68 1,19
60 12 0,86 0,22 0,06 0,63 1,35
120 10 0,91 0,23 0,07 0,67 1,37
Total 34 0,87 0,19 0,03 0,63 1,37
Com base nos resultados do Teste Kruskal Wallis (X
2
= 0,418; gl = 2; p=
0,812) pode-se dizer que não existe diferença significativa entre 21, 60 e 120
dias em termos de perda, no grupo teste.
Tabela 2 - Mostra a média de perda óssea em cada um dos tempos, além do
desvio padrão, erro padrão, valores máximos e mínimos no grupo controle.
Dias N Média Desvio
Padrão
Erro
Padrão
Mínimo Máximo
21 12 0,80 0,10 0,03 0,66 1,03
60 12 0,83 0,14 0,04 0,60 1,03
120 12 0,90 0,24 0,07 0,63 1,43
Total 36 0,84 0,17 0,03 0,60 1,43
Com base nos resultados do Teste Kruskal Wallis (X
2
= 0,895; gl = 2; p
= 0,639) pode-se dizer que não existe diferença significativa entre 21, 60 e 120
dias em termos de perda, no grupo controle.
Tabela 3 - A tabela três faz uma comparação entre grupo teste e controle no
tempo de 21 dias após o procedimento cirúrgico, mostrando média, desvio
padrão e erro padrão, além de valores máximos e mínimos.
GRUPO N Média Desvio
Padrão
Erro
Padrão
Média
Mínimo Máximo
Teste
12 0,84 0,14 0,04 0,68 1,19
Controle
12 0,80 0,10 0,03 0,66 1,03
Com base nos resultados do Teste U de Mann-Whitney (U = 63,00; p =
0,603) pode-se dizer que não existe diferença significativa entre os grupos
Teste e Controle em termos de perda óssea alveolar, para 21 dias.
Tabela 4 -
A tabela quatro faz uma comparação entre grupo teste e controle no
tempo de 60 dias após o procedimento cirúrgico, mostrando média, desvio
padrão e erro padrão, além de valores máximos e mínimos.
GRUPO N Média Desvio
Padrão
Erro
Padrão
Média
Mínimo Máximo
Teste
12 0,86 0,22 0,06 0,63 1,35
Controle
12 0,83 0,14 0,04 0,60 1,03
Com base nos resultados do Teste U de Mann-Whitney (U = 70,50; p =
0,931) pode-se dizer que não existe diferença significativa entre os grupos
teste e controle em termos de perda óssea alveolar, para 60 dias.
Tabela 5 - A tabela cinco faz uma comparação entre grupo teste e controle no
tempo de 120 dias após o procedimento cirúrgico, mostrando média, desvio
padrão e erro padrão, além de valores máximos e mínimos.
GRUPO N Média Desvio
Padrão
Erro
Padrão
Média
Mínimo Máximo
Teste
10 0,91 0,23 0,07 0,67 1,37
Controle
12 0,90 0,24 0,07 0,63 1,43
Com base nos resultados do Teste U de Mann-Whitney (U = 59,00; p =
0,947) pode-se dizer que não existe diferença significativa entre os grupos
teste e controle em termos de perda óssea alveolar, para 120 dias.
Em relação às médias de peso, não houve diferença significativa nos
grupos teste e controle no início e na conclusão do estudo.
U
Figura 3 – Área de perda óssea alveolar nos grupos teste (esquerda) e
controle (direita) no período de 21 dias.
Figura 4 - Área de perda óssea alveolar nos grupos teste (esquerda) e controle
(direita) no período de 60 dias.
Figura 5 - Área de perda óssea alveolar nos grupos teste (esquerda) e controle
(direita) no período de 120 dias.
5. DISCUSSÃO
A importância da imagem radiográfica para a formulação de diagnóstico
em odontologia é imensurável, independentemente da área. Entretanto,
devemos ter em mente que a radiação X tem um caráter cumulativo, podendo
não causar dano instantâneo, mas muito tempo depois. Preocupado com esta
questão o American Dental Association Council on Scientific Affairs (2006)
regularmente sugere e atualiza a implementação de procedimentos para
controlar o uso e minimizar as doses as quais os pacientes são expostos.
Assim, a utilização indiscriminada da radiação X deve ser evitada. Hujoel
et al. (2006) evidenciaram que apenas 10% das radiografias realizadas por
pacientes em tratamento ortodôntico apresentavam uma real justificativa de
solicitação. Isto demonstra uma dupla falha do cirurgião-dentista, o descaso
com os efeitos biológicos da radiação X e a falta de critérios na solicitação dos
exames radiográficos, levando o paciente a ser submetido a incidências
desnecessárias.
Da amostra inicial de 72 camundongos, dois destes foram perdidos ao
longo do experimento, ambos pertencentes ao grupo teste, 120 dias. Um dos
animais foi encontrado morto e outro teve de ser descartado em função de
fratura do primeiro molar, o que impediu a análise de perda óssea alveolar nos
parâmetros utilizados neste trabalho.
A perda de somente um dos animais evidencia o fato de que ambos os
grupos apresentaram mesmo índice de sobrevida, ou seja, que a dose de
radiação utilizada no experimento não interferiu na longevidade dos mesmos.
Em relação ao peso, os animais do grupo controle apresentaram média de
35,74g no momento do início do estudo e de 38,73g no final do experimento.
No grupo teste os valores foram de 38,08g e 40,33g. Como os animais foram
submetidos exatamente às mesmas condições de alimentação, iluminação e
estresse, e por não ter havido diferença significativa entre as médias de pesos
dos animais entre os grupos, pode-se afirmar que a radiação X, não teve
influência no peso dos mesmos.
Com base nos resultados encontrados, pode-se notar que existe um
aumento gradual na perda óssea alveolar após o procedimento cirúrgico para
ambos os grupos. No grupo teste, a média de perda sobe progressivamente de
0,84 mm
2
no grupo 21 dias, para 0,86 mm
2
no grupo 60 dias, para 0,91 mm
2
no
grupo 120 dias. No grupo controle a perda é de 0,80 mm
2
no período de 21
dias, sobe para 0,83 mm
2
no período de 60 dias, chegando a 0,90 mm
2
nos
120 dias. Entretanto, não existe diferença significativa, no que tange a perda
óssea alveolar, entre os grupos teste e controle nos diferentes períodos pós-
cirúrgicos e nem entre os diversos tempos no mesmo grupo.
Os valores apresentados na análise da perda óssea alveolar ficaram
dentro da média natural do processo de perda óssea alveolar de camundongos
submetidos à cirurgia de retalho mucoperiostal, quando comparados ao estudo
de Rivaldo et al. (2005).
Sabe-se que altas doses de radiação X podem levar a alterações
estruturais das células em diversos tipos de tecidos (DARE et al, 1997;
(WHAITES, 2003; FREITAS, ROSA e SOUZA, 2004). Doses relativamente
baixas podem ocasionar danos sobre estruturas do corpo, tais como
encontrados por Lamers et al. (2005) estudando filamentos de actina das
glândulas parótidas, utilizando 12 e 36 R. Entretanto, utilizando-se a dose
semanal de 0,002 C/Kg (8 R), não foi possível notar diferença significativa no
processo de perda e reparação óssea, o que poderia ser explicado pelo fato da
dose ser mais baixa e o tecido ósseo ser mais radioresistente.
Bóscolo et al (2000) estudando o efeito das radiações X na cicatrização
de feridas cirúrgicas suturadas e não suturadas no dorso de ratos, perceberam
que utilizando doses de 0,074 Gy houve apenas um retardo no processo de
cicatrização, sem comprometimento das estruturas teciduais. A dose utilizada
foi praticamente a mesma deste estudo (0,002 C/Kg 0,08 Gy), que também
não encontrou diferença significativa, levando-se em consideração todas as
diferenças presentes em relação aos tecidos estudados.
Dalla-Bona (2005), acompanhando o envelhecimento de camundongos,
detectou que o grupo de animais expostos à radiação X teve crescimento
mandibular inferior ao grupo não exposto à radiação, apesar de ter utilizado
uma dose relativamente baixa, 12 R. No entanto, foi uma dose
significativamente superior à utilizada neste experimento, e por um período de
tempo mais longo, o que poderia explicar a ocorrência do fenômeno observado.
O fato de não ter havido diferença significativa entre o grupo exposto e
não exposto está, provavelmente, relacionado à baixa dose de radiação X, e
este foi o propósito do presente estudo, avaliar a influência desta nos
processos de mensuração da reabsorção óssea em pacientes sujeitos ao
descolamento mucoperiostal.
Von Krammer (1994), preocupado com a exposição à radiação em áreas
que receberam implantes osseointegrados, indicando inclusive que tais áreas
não fossem expostas, elaborou um dispositivo que evita a radiação sobre as
regiões implantadas. Frente aos resultados encontrados neste estudo e
respeitando-se as diferenças anatômicas entre o osso alveolar que serve de
leito ao implante e a crista óssea próxima à junção amelo-cementária, sugere-
se que tal procedimento não se justifica, pois a radiação X, em doses baixas,
não interferiu no processo de reabsorção óssea.
Brasseur et al. (2006) estudando o efeito de altas doses de radiação em
casos de radioterapia sobre o fenômeno da osseointegração em mandíbulas de
cães observaram que, histologicamente, ocorreram certas diferenças entre
animais do grupo teste, que receberam doses de 43 Gy - sendo dez aplicações
de 4.3 Gy – e do grupo controle, que não foram irradiados. Entretanto,
relataram que com tais doses de radiação pode haver remodelação óssea e
osseointegração. Levando-se em consideração as variáveis presentes no
estudo de Brasseur et al. (2006), em que foi utilizada dose substancialmente
maior, e que mesmo assim não afetou de forma significativa a osseointegração
de implantes, compreende-se que uma dose relativamente baixa (0,002 C/Kg
0,08 Gy), não altere o processo de reabsorção óssea como aconteceu neste
experimento.
Hoje, pode-se afirmar que radiografias trans-operatórias em
implantodontia caíram em desuso, mais por questões técnicas do que
propriamente para proteger o processo de osseointegração, da radiação X.
O acompanhamento dos animais, grupo teste e controle, utilizando o
modelo experimental do retalho mucoperiostal, ao longo do tempo é importante
para a determinação das perdas ósseas que ocorrem em ambos grupos.
Tatakis e Guglielmoni (2000), estudando duas espécies diferentes encontraram
diferença de até 250%, entre animais com a mesma idade, quando de espécies
diferentes. O envelhecimento do animal pode ser considerado um fator
importante para a perda óssea alveolar, tal afirmativa mostra-se concordante
com os resultados obtidos neste estudo, visto que, ambos os grupos
apresentaram aumento da área de perda óssea com o decorrer do
experimento.
Estudos mostram que no período de 120 dias o processo de perda
óssea alveolar em camundongos submetidos e não submetidos à cirurgia de
retalho mucoperiostal é bastante semelhante, uma vez que os dois grupos
apresentam o mesmo grau de reparação. O período no qual acontecem as
diferenças mais significativas é aquele compreendido entre os dias 01 e 21
pós-cirurgia, o que alguns autores classificam como fenômeno da reabsorção
acelerada (YAFFE, FINE e BINDERMAN, 1994; BINDERMAN, ADUT e YAFFE,
2000; TATAKIS e GUGLIELMONI, 2000; YAFFE et al., 2000; BINDERMAN et
al., 2001). No presente estudo, verificou-se uma perda óssea progressiva em
ambos os grupos, entre 21 e 120 dias, entretanto, não significativa. O
fenômeno da reabsorção acelerada não pôde ser mensurado, pois os dois
grupos foram submetidos à cirurgia, mas pode-se sugerir que tenha
acontecido, pois as diferença apresentadas entre 21 e 120 dias foram bastante
reduzidas, o que nos leva a constatação de que a perda mais significativa
ocorreu nas primeiras três semanas pós-cirurgia.
Tendo em vista os resultados encontrados e a metodologia empregada
neste estudo, pode-se dizer que o tecido ósseo alveolar de camundongos, em
relação a sua macroestrutura, não sofre alteração quando exposto a doses
baixas de radiação X, como agente externo, utilizando-se o modelo
experimental de perda óssea a partir do retalho mucoperiostal.
6. CONCLUSÃO
Pode-se concluir que doses de radiação possíveis de serem alcançadas
em exames radiográficos, não interferem nas medidas de perda e reparação
óssea alveolar em camundongos submetidos à cirurgia de descolamento
mucoperiostal, nos diferentes tempos pós-cirúrgicos.
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ANEXOS
Anexo 1 - Aprovação do comitê de ética e pesquisa da UFRGS.
Anexo 2 – Ánalise de perda óssea alveolar em mm
2
, em toda a amostra nos
diferentes grupos e períodos de tempo.
Nº da
peça
Grupo Dias
Área de Perda em
mm2
1 teste 60 0,63
2 teste 120 0,94
3 teste 21 0,85
4 controle 120 0,76
5 teste 120 0,65
6 teste 60 0,73
7 teste 21 0,77
8 controle 21 0,82
9 controle 21 0,75
10 teste 21 0,76
11 teste 120 1,24
12 teste 21 0,94
13 teste 60 0,6
14 teste 120 0,82
15 controle 60 0,97
16 controle 120 0,93
17 teste 21 0,71
18 teste 120 1,37
19 controle 120 0,83
20 teste 60 0,94
21 controle 21 1,03
22 teste 120 0,94
23 controle 21 0,72
24 teste 21 0,68
25 controle 21 0,84
26 controle 21 0,9
27 controle 120 0,88
28 teste 21 1,19
29 teste 120 0,79
30 controle 60 0,63
31 controle 21 0,78
32 controle 21 0,86
33 controle 60 0,8
34 controle 60 0,71
35 teste 21 0,75
36 controle 120 0,87
37 teste 60 1,35
38 teste 21 0,87
39 controle 60 0,85
40 controle 120 1,43
41 teste 120 0,75
42 teste 21 0,9
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44 controle 60 0,83
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46 teste 21 0,68
47 controle 120 0,63
48 controle 21 0,66
49 controle 120 0,69
50 teste 60 1,21
51 FRATURA FRATURA FRATURA
52 controle 60 0,8
53 teste 60 0,87
54 controle 60 0,6
55 teste 60 0,85
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60 controle 120 1,01
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71 teste 60 0,8
72 teste 120 MORTE
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