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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Aloe barbadensis Miller: ANÁLISE DO PERFIL METABÓLICO E ESTUDOS DOS
EFEITOS VASCULOGÊNICOS E ANGIOGÊNICOS DO EXTRATO DO
PARÊNQUIMA DE RESERVA, DA FRAÇÃO POLISSACARÍDICA (FP) E DA
ACEMANANA.
Luciano Henrique Campestrini
Florianópolis
Março de 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Aloe barbadensis Miller: ANÁLISE DO PERFIL METABÓLICO E ESTUDOS DOS
EFEITOS VASCULOGÊNICOS E ANGIOGÊNICOS DO EXTRATO DO
PARÊNQUIMA DE RESERVA, DA FRAÇÃO POLISSACARÍDICA (FP) E DA
ACEMANANA.
Luciano Henrique Campestrini
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia, da Universidade
Federal de Santa Catarina, como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Maraschin
Co-orientadores: Prof
a
. Dr
a
. Ana Maria Viana
Prof. Dr. Paulo Fernando Dias
Florianópolis
Março de 2007
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Breve História da Medicina
500 d.C. Venha até aqui e coma esta raiz.
1000 d.C. Esta raiz é coisa de ateu, faça esta oração ao Deus que
está no céu.
1792 d.C. O Deus não está no céu, quem reina é a razão. Venha até
aqui e tome esta poção.
1917 d.C. Esta poção é para enganar o oprimido, sugiro que você
tome este comprimido.
1960 d.C. Este comprimido é antigo e exótico. Chegou o momento
de tomar antibiótico.
1998 d.C. Antibiótico te deixa fraco e infeliz. Eis um novo
tratamento: coma esta raiz.
(Autor Desconhecido)
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao mestre que
generosamente compartilhou mais que o seu
saber; partilhou exemplos! A você Prof. Marcelo
Maraschin.
AGRADECIMENTOS
À minha mãe Helena e meu irmão Sérgio, pelo apoio, carinho e amor.
Ao Professor Dr. Paulo Fernando Dias, pelo seu apoio, amizade e pela
orientação na parte biológica, que tornaram o trabalho possível.
À Professora Ana Viana, pelo apoio durante a execução do projeto.
Agradeço ao Professor João de Deus Medeiros e alunos pelo auxílio com os
cortes e à identificação das estruturas histológicas.
Ao Professor Antonio Gilberto Ferreira, do Laboratório de Ressonância
Magnética Nuclear (Universidade Federal de São Carlos – UFSCar), pela imensa
ajuda na obtenção dos espectros de
13
C-RMN.
A Empresa Macedo Koerich na pessoa do Sr. Wilson Bevilac, pela cessão
dos ovos para os experimentos da parte biológica.
Agradeço à Professora Dr
a
. Ivonne Delgadillo e à mestranda BSc química
Maria Beatriz da Rocha Veleirinho da Universidade de Aveiro – Portugal, pela
contribuição na obtenção dos espectros de FT-IR.
Às grandes amigas Shirley e Priscilla, pelas idéias e pela amizade
demonstrada ao longo desses anos, pelos momentos de diversão e por terem me
apresentado ao grande universo da MPB – Viva a Rádio UDESC FM!!!
Aos colegas do Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal (LMBV),
Marcelo, Olavo, Shana, Carol, Alan, Prof. Aparecido, Prof. Enio e Afonso pela
convivência agradável e pelos queijos e vinhos que participamos juntos.
Especialmente aos colegas Wagner, Vanessa e Fernanda. Agradeço por
terem sido mais que colegas no laboratório!
Ao técnico do LMBV Luis Pacheco, por seu espírito sempre prestativo, ao
técnico Francisco Wagner do Laboratório de Solos e a amiga Maria Luisa Peixoto do
Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal, pelo grande
auxílio com as imagens dos vasos da vesícula vitelínica e por sua paciência ao
longo destes anos de aprendizagem.
À Renata Ávila Ozório e ao Luciano pela imensa ajuda na liofilização dos
materiais!
Às funcionárias Ligia e Joice, da secretaria da Pós em Biotecnologia, por
terem sempre a disponibilidade de “salvar nossa pele”. Obrigado!!!!!
Agradecimento ao colega Fábio Pit que tanto auxiliou durante a fase tão
difícil das coletas de material.
Não poderia deixar de agradecer ao Henrique e a Marian e Aline, meus
grandes estagiários, que me permitiram ensinar-lhes o tão pouco que conheço!
Aos amigos que passaram pelo laboratório e que fizeram parte desse grupo
ao qual tive a honra de pertencer: Denílson, Josiane, Liana, Luciana, Taysa, Daniela
e Liana. Obrigado por sua amizade!
A amiga Carla Maísa Camelini (Carla Cogumelos) pela “sessões” de troca
de idéias e pelo empréstimo da resina para a realização da cromatografia de gel
permeação.
Aos meus mais que amigos, meus irmãos Eleani, Gilmar, Robson, Jacks,
Vanderlei, Paulo e Marta que estavam sempre ao meu lado e foram meu porto
seguro!
Especialmente ao Sr. Dionísio e a Sra. Cacilda, pelo fornecimento do
material de estudo sem o qual teria sido impraticável a realização do trabalho e por
acreditarem sempre que a babosa ainda tem muito que oferecer!
Ao Professor Marcelo Maraschin, ao qual devo muito da minha formação
como aluno e como ser humano. Por ter aberto generosamente as portas e ter
permitido que eu adentrasse e conhecesse um pouco mais do vasto universo da
ciência!
Ao CNPq, pelo apoio financeiro.
i
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 –
(A) Aloe barbadensis em estágio de floração. (B) Detalhe da
inflorescência. (C) Micrografia da secção transversal da folha
a fresco, corada com vermelho do Congo e verde malaquita,
obtida sob luz polarizada e contraste por interferência
diferencial de Normasky. Barra = 100µm..................................
5
FIGURA 2 –
Fórmula molecular de componentes majoritários do extrato do
parênquima clorofiliano de babosa.............................................
8
FIGURA 3 –
Biossíntese das antraquinonas através da via do ácido
chiquímico..................................................................................
11
FIGURA 4 –
Detalhe da estrutura química da acemanana derivada de Aloe
barbadensis, comercialmente denominada Carrysin™..............
14
FIGURA 5 –
Fluxograma de produção, coleta e processamento de plantas
de Aloe barbadensis Miller.........................................................
21
FIGURA 6 –
Concentração de aloína A em amostras de plantas distintas e
em mesmas plantas, coletadas no período de maio de 2005 a
março de 2006 e julho de 2005 a maio de 2006,
respectivamente. PC = Plantas produzidas em campo; PM =
Plantas micropropagadas, aclimatizadas e transferidas para o
campo.........................................................................................
31
FIGURA 7 –
Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para
amostras de plantas distintas, em relação ao fator insolação
total, no período de maio de 2005 a março de
2006...........................................................................................
35
FIGURA 8 –
Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para
amostras de plantas distintas, em relação ao fator temperatura
média diária bimestral, no período de maio de 2005 a março
de 2006......................................................................................
36
FIGURA 9 –
Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para
amostras de mesmas plantas, consoante à insolação total do
período de maio de 2005 a março de
2006............................................................................................
37
FIGURA 10 –
Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para
amostras de mesmas plantas, consoante à temperatura média
diária bimestral do período de maio de 2005 a março de
2006...........................................................................................
38
ii
FIGURA 11 –
Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para
amostras de plantas distintas, segundo os valores de
precipitação pluviométrica bimestral (mm), no período de julho
de 2005 a maio de 2006.............................................................
40
FIGURA 12 –
Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para
amostras de plantas distintas, segundo os valores de umidade
relativa diária mensal (%), no período de julho de 2005 a maio
de 2006.......................................................................................
41
FIGURA 13 –
Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, de amostras
de mesmas plantas, de acordo com a precipitação
pluviométrica bimestral (mm), no período de julho de 2005 a
maio de 2006..............................................................................
42
FIGURA 14 –
Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, de amostras
de mesmas plantas, de acordo com a umidade relativa diária
mensal (%), no período de julho de 2005 a maio de
2006...........................................................................................
43
FIGURA 15 –
Rendimento (g%) da fração polissacarídica em relação ao
peso fresco do parênquima de reserva, em plantas distintas e
em mesmas plantas, coletadas no período de maio de 2005 a
março de 2006 e julho de 2005 a maio de 2006,
respectivamente.........................................................................
45
FIGURA 16 –
Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC,
para amostras de plantas distintas, consoante às condições
de insolação total, observados no período de maio de 2005 a
março de 2006............................................................................
49
FIGURA 17 –
Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC,
para amostras de plantas distintas, consoante às condições
de temperatura média diária mensal, para o período de maio
de 2005 a março de 2006...........................................................
50
FIGURA 18 –
Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC,
para amostras de mesmas plantas, segundo o fator climático
insolação total, no período de julho de 2005 a maio de
2006............................................................................................
51
FIGURA 19 –
Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC,
para amostras de mesmas plantas, segundo o fator climático
temperatura média diária mensal, no período de julho de 2005
a março de 2006.......................................................................
52
iii
FIGURA 20 –
Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC,
de amostras de plantas distintas, de acordo com a condição
de precipitação pluviométrica bimestral (mm), no período de
maio de 2005 a março de 2006.................................................
54
FIGURA 21 –
Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC,
de amostras de plantas distintas, de acordo com a condição de
umidade relativa diária mensal (%), no período de maio de
2005 a março de 2006...............................................................
55
FIGURA 22 –
Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC,
para as amostras de mesmas plantas, segundo a precipitação
pluviométrica bimestral (mm), no período de julho de 2005 a
maio de 2006.............................................................................
56
FIGURA 23 –
Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC,
para amostras de mesmas plantas, segundo a umidade
relativa diária mensal (%), no período de julho de 2005 a maio
de 2006.......................................................................................
57
FIGURA 24 –
Perfil cromatográfico dos padrões de açúcares: Ramnose (Rf
= 0,59), fucose (Rf =0,52), frutose (Rf = 0,43), arabinose (Rf =
0,45), galactose (Rf = 0,42), ácido glucurônico (Rf = 0,40),
manose (Rf = 0,47), glucose (Rf = 0,46), da mistura de
padrões (mix). Amostras (1-8) e da mistura de padrões
(P)..............................................................................................
66
FIGURA 25 –
Espectros de FT-IR (600 a 3400 onda.cm
-1
) representativos da
FP de plantas micropropagadas (PM). As bandas de maior
intensidade são mostradas em destaque...................................
68
FIGURA 26 –
Espectros de FT-IR (600 a 3400 onda.cm
-1
) representativos da
FP de plantas produzidas no campo (PC), com destaque para
as bandas de maior intensidade................................................
69
FIGURA 27 –
Espectros de FT-IR (600 a 3400 onda.cm
-1
) representativos do
padrão comercial de acemanana e da acemanana obtida via
cromatografia de gel permeação da FPD.................................
71
FIGURA 28 –
Distribuição fatorial (PCA) de PC1 e PC2, das amostras da
FP referentes às mesmas plantas (1 – PM, 2 – PC) e plantas
distintas (3 – PM, 4 – PC). Os grupos circulados em vermelho
fora da grande elipse indicam amostras consideradas outliers
e a seta dentro da elipse indica a amostra de acemanana
(A)..............................................................................................
73
iv
FIGURA 29 –
Contribuição fatorial de PC1 e PC2 das amostras da FP,
referentes às mesmas plantas e plantas distintas, obtidas a
partir dos dados espectrais de FT-IR (600-3400
onda.cm
1
)................................................................................
75
FIGURA 30 –
Distribuição fatorial (PCA) dos componentes principais 1
(PC1) e 2 (PC2) para os dados espectrais de FT-IR (600-
3400 onda.cm
-1
) das amostras da FPD, referentes às
mesmas plantas (1 – PM, 2 – PC) e plantas distintas (3 – PM,
4 – PC). A seta destaca a amostra de acemanana..................
76
FIGURA 31 –
Contribuição fatorial de PC1 das amostras da FPD, referentes
às mesmas plantas e plantas distintas, para os dados
espectrais de FT-IR (600-3400 onda.cm
-1
)............................
77
FIGURA 32 –
Distribuição fatorial (PC1 e PC2) dos dados espectrais (FT-IR,
900-1300 onda.cm
-1
)
das amostras da FP, referentes às
mesmas plantas (1 – PM, 2 – PC) e plantas distintas (3 – PM,
4 – PC). A seta dentro da elipse indica a amotra de
acemanana e a externa uma amostra outlier. O grupo
circulado em vermelho representa a amostra de padrão
comercial...............................
78
FIGURA 33 –
Distribuição fatorial (PCA) de PC1 e PC2 dos dados
espectrais de FT-IR (600-3400 onda.cm
-1
) das amostras da FP
(3 – PM e 4 – PC círculo menor em PC1 positivo) e FPD (1 –
PM e 2 – PC círculo menor em PC1 negativo) de plantas
distintas, juntamente com a acemanana (seta) e a amostra de
padrão comercial (grupo circulado em vermelho).....................
79
FIGURA 34 –
Distribuição fatorial (PCA) de PC1 e PC2 dos dados
espectrais de FT-IR (600-3400 onda.cm
-1
) das amostras da FP
(3 – PM e 4 – PC círculo menor em PC1 positivo) e FPD (1 –
PM e 2 – PC círculo menor em PC1 negativo) de plantas
distintas, juntamente com a acemanana (seta) e a amostra de
padrão comercial (grupo circulado em vermelho) ....................
80
FIGURA 35 –
Distribuição fatorial (PCA) de eixos PC1 vs PC2, das
amostras referenteas à FP (3 – PM e 4 – PC círculo menor) e
FPD (1 – PM e 2 – PC) de plantas distintas, excluída a
acemanana e a amostra de padrão comercial, do espectro de
FT-IR (600-3400 onda.cm
-1
).....................................................
81
FIGURA 36 –
Espectros de
13
C-RMN (9,4 Tesla) de amostras da FPD de
plantas distintas (PM), representativos das quatro estações do
ano, em ordem cronológica crescente........................................
83
v
FIGURA 37 –
Espectros de 13C-RMN (9,4 Tesla) de amostras da FPD de
plantas distintas (PC), representativos das quatro estações do
ano, em ordem cronológica crescente.......................................
84
FIGURA 38 –
Detalhe da estrutura química do constituinte básico da
acemanana isolada da FP de Aloe barbadensis, com as
indicações dos respectivos valores de deslocamentos
químicos (
13
C-RMN, 9,4 Tesla)...................................................
86
FIGURA 39 –
Espectro de
13
C-RMN (9,4Tesla) de amostra da FPD
evidenciando os sinais de deslocamentos químicos (δ
ppm
)
referentes à estrutura polissacarídica encontrada em A.
barbadensis................................................................................
91
FIGURA 40 –
Espectro de
13
C-RMN (9,4 Tesla) da amostra de acemanana
isolada da FPD e de amostra de padrão comercial proveniente
de A. barbadensis.......................................................................
93
FIGURA 41 –
Distribuição fatorial (PCA) de PC1 e PC2 calculada a partir
dos dados espectrais de
13
C-RMN das amostras da FPD,
referentes a amostras de plantas distintas. A seta em (2)
indica o padrão comercial, enquanto a seta em (9) a amostra
de PC coletada em março/2006.................................................
94
FIGURA 42 –
Contribuição fatorial (PC1) dos dados espectrais de
13
C-RMN
das amostras da FPD (PC e PM)...............................................
95
FIGURA 43 –
(A) Percentagem de vasos observados na vesícula vitelínica
nos tratamentos com 10, 30 e 90 µg do extrato do parênquima
de reserva e da heparina (HP, controle positivo), em
comparação ao controle (água destilada). (B) Percentagem de
comprimento cefálico (medida do eixo mesencéfalo-cervical).
(C) Comprimento total. Cada barra vertical representa a média
± EPM de 8 embriões e os asteriscos denotam diferença
estatisticamente significativa ao nível de p<0,05 em relação ao
controle (ANOVA, seguida do teste de Tukey).........................
126
FIGURA 44 –
(A) Percentagem de vasos observados na vesícula vitelínica
nos tratamentos com 10, 30 e 90 µg da FP e da com heparina
(HP, controle positivo), em comparação ao controle (água
destilada). (B) Percentagem de comprimento cefálico (medida
do eixo mesencéfalo-cervical). (C) Comprimento total. Cada
barra vertical representa a média ± EPM de 8 embriões e os
asteriscos denotam diferença estatisticamente significativa ao
nível de p<0,05 em relação ao controle (ANOVA, seguida do
teste de Tukey)...........................................................................
127
vi
FIGURA 45 –
(A) Percentagem de vasos observados na vesícula vitelínica
nos tratamentos com 10, 30 e 90 µg da acemanana e da
heparina (HP, controle positivo), em comparação ao controle
(água destilada). (B) Percentagem de comprimento cefálico
(medida do eixo mesencéfalo-cervical). (C) Comprimento total.
Cada barra vertical representa a média ± EPM de 8 embriões
e os asteriscos denotam diferença estatisticamente
significativa ao nível de p<0,05 em relação ao controle
(ANOVA, seguida do teste de Tukey).........................................
130
FIGURA 46 –
Seqüência de microfotografias onde são observados os
efeitos da administração do extrato do parênquima de reserva
sobre a vascularização da vesícula vitelínica de embriões de
G. domesticus no 6º dia de desenvolvimento. Em (A)
tratamento controle, (B) tratamento com heparina 50 UI, (C)
tratamento com 30 µg do extrato e (D) tratamento com 90 µg
do extrato. A seta em (A) indica vestígios do disco de
metilcelulose e água destilada e a seta em (C) indica um
capilar sangüíneo em processo de remodelagem. Barra = 1
mm..........................................................................................
133
FIGURA 47 –
Seqüência de microfotografias onde são observados os
efeitos da administração da FP sobre a vascularização da
vesícula vitelínica de embriões de G. domesticus no 6º dia de
desenvolvimento. Em (A) tratamento controle, (B) tratamento
com heparina 50 UI, (C) tratamento com 30 µg da FP e (D)
tratamento com 90 µg da FP. A seta em (A) indica vestígios
do disco de metilcelulose e água destilada. Barra = 1 mm ....
134
FIGURA 48 –
Seqüência de microfotografias onde são observdos os efeitos
da administração da acemanana sobre a vascularização da
vesícula vitelínica de embriões de G. domesticus no 6º dia de
desenvolvimento. Em (A) tratamento controle, (B) tratamento
com heparina 50 UI, (C) tratamento com 30 µg da acemanana
e (D) tratamento com 90 µg da acemanana. As setas indicam
vestígios do disco de metilcelulose. Barra = 1 mm ..................
135
FIGURA 49 –
Percentagem de vasos nos limites do disco implantados na
membrana corioalantóica nos tratamentos com as
concentrações de 10 µg, 30
µg e 90 µg do extrato do
parênquima de reserva (A), da fração polissacarídica (FP) (B)
e com a acemanana (C), em relação ao controle (água
destilada). 50 U.I. de heparina (HP), foi utilizada como
controle positivo. Cada barra vertical representa a média ±
EPM de 8 embriões e os asteriscos denotam diferença
estatisticamente significativa ao nível de p<0,05 em relação
ao controle (água destilada) (ANOVA, seguida do teste de
Tukey)........................................................................................
136
vii
FIGURA 50 –
Modelo de mecanismo de ação da inibição da formação de
novos vasos sangüíneos pela ação de polifenóis nas células
da musculatura lisa vascular.....................................................
139
FIGURA 51 –
Modelo esquemático da via de sinalização envolvendo a ativação
de macrófagos por polissacarídeos de plantas. A partir da ativação
dos receptores de membrana dos macrófagos, desencadeia-se a
transdução deste sinal estimulatório para o interior da célula,
levando à reações síntese dos fatores de transcrição .........
...........
140
viii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 –
Concentração de aloína (µg/mL
± DP) em plantas
micropropagadas (PM) e em plantas produzidas no
campo (PC) para coletas de mesmas plantas (MP) e
plantas distintas (PD), ao longo do período maio/2005 a
maio/2006............................................................................
32
TABELA 2 –
Rendimento da FP (%, p/p) de amostras de plantas
micropropagadas (PM) e plantas produzidas no campo
(PC), para coletas de mesmas plantas (MP) e plantas
distintas (PD), ao longo do período maio/2005 a
maio/2006............................................................................
46
TABELA 3 – Parâmetros físico-químicos de amostras de folhas e do
extrato do parênquima de reserva de Aloe barbadensis
Miller, cultivada em Paulo Lopes, SC, coletadas em
setembro/2006....................................................................
60
TABELA 4 – Parâmetros bioquímicos referentes ao extrato do
parênquima de reserva de Aloe barbadensis Miller,
cultivadas em Paulo Lopes (SC), coletadas em
setembro/2006.....................................................................
61
TABELA 5 – Parâmetros bioquímicos da FP e FPD de Aloe
barbadensis, referentes às plantas distintas de PM e PC,
coletadas no período de maio de 2005 a março de
2006.....................................................................................
62
TABELA 6 – Parâmetros bioquímicos da FP e FPD de Aloe
barbadensis, referentes a mesmas plantas de PM e PC,
coletadas no período de julho de 2005 a maio de
2006.....................................................................................
63
TABELA 7 –
Deslocamentos químicos (δ ppm) de
13
C-RMN da FPD de
coletas de plantas distintas de PM e PC .............................
87
TABELA 8 –
Patentes de produtos e processos industriais obtidos a
partir de Aloe barbadensis, registrados na Europa no
período de 1984 a 2001 ......................................................
107
TABELA 9 –
Compostos presentes em Aloe barbadensis Miller e suas
atividades biológicas ...........................................................
111
TABELA 10 –
Promotores e inibidores da angiogênese, produtos
comercializados ou que se encontram em fase de testes
clínicos ................................................................................
115
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
aFGF
Fator de crescimento de fibroblastos ácido
ANG
Angiopoietina
bFGF
Fator de crescimento de fibroblastos básico
CCD
Cromatografia de Camada Delgada
COX-2
Ciclooxigenase-2
dec
Décimos
EGF
Fator de crescimento epidérmico
FGF
Fator de crescimento de fibroblastos
FP
Fração polissacarídica
FPD
Fração polissacarídica dialisada
FID
Free Induction Decay – Decaimento de Indutância Livre
FIV
Vírus da imunodeficiência felina
FT-IR
Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
G-CSF
Fator de estimulação de granulócitos-colônia
HGF
Fator de crescimento de hepatócitos
h
Horas
HP
Heparina
IGF
Fator de crescimento tipo insulina
IL-8
Interleucina 8
IL-2
Interleucina 2
IL-1
Interleucina 1
INF- α, β, χ Interferon α, β, χ
iNOS
Óxido nítrico sintase induzida
LOX
Lipooxigenase
MCP-1
Proteína quimioatrativa de macrófagos
MMPs
Metaloproteinases da matriz
MP
Mesmas plantas
NOS
Óxido nítrico sintase
PAI-1
Inibidor do ativador de plasminogênio-1
PC
Plantas produzidas em campo
x
PCA
Análise de componentes principais
PD
Plantas distintas
PDGF-BB
Fator de crescimento de plaquetas – BB
PEDF
Fator derivado do pigmento de epitélio
PF 4
Fator plaquetário 4
PGF
Fator de crescimento placentário
PKC
Proteína quinase C
PM
Plantas micropropagadas, aclimatizadas e transferidas para o campo
TIMPs
Inibidor de metaloproteinase tecidual
TGF α, β Fator de crescimento transformante α, β
TNF
Fator de necrose tumoral
TSP-1
Trombospondina – 1
VEGF
Fator de crescimento vascular endotelial
13
C-RMN
Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de carbono 13
xi
RESUMO
Aloe barbadensis Miller, planta também conhecida como Aloe vera L., uma
espécie originária do Continente Africano, possui diversas propriedades medicinais
determinadas por metabólitos encontrados no extrato do parênquima clorofiliano e
no parênquima de reserva. Este último, é rico em polissacarídeos, principalmente
polimananas do tipo β(1Æ4). Neste trabalho, foram estudadas as influências de
fatores climáticos (temperatura média diária mensal, insolação, precipitação
pluviométrica bimestral e umidade relativa diária bimestral) sobre a biossíntese de
aloína (antraquinona majoritária) e da fração polissacarídica do extrato do
parênquima de reserva ao longo do período de maio/2005 a maio/2006. Para tal,
foram utilizadas amostras de população de plantas obtidas via micropropagação, de
plantas produzidas no campo e também de folhas coletadas de mesmas plantas e
de plantas distintas. A precipitação pluviométrica bimestral foi o fator de maior
influência na biossíntese de aloína A, enquanto a fração polissacarídica mostrou-se
mais afetada pelos efeitos da insolação e da precipitação pluviométrica bimestral. As
análises realizadas na determinação das características físico-químicas e
bioquímicas do extrato do parênquima de reserva mostraram teores de glicídios e
proteínas proeminentes. Adicionalmente, a FP demonstrou uma pequena variação
de conteúdos protéico e glicídico inter-coletas. Entretanto, na FPD o grau de
variância foi maior, o que demonstrou a importância da diálise das amostras. A
composição monomérica da FPD, utilizando CCD, revelou a presença de manose,
glucose e galactose. A utilização das espectroscopias de FT-IR e
13
C-RMN permitiu
determinar de forma inequívoca a estrutura molecular da acemanana presente nas
amostras em estudo, do padrão comercial e da acemanana isolada da fração
xii
polissacarídica. A análise quimiométrica (PCAs) viabilizou o estabelecimento de um
padrão de distribuição fatorial das amostras de acordo com sua composição química
e demonstrou que os efeitos de época de coleta e de diálise das amostras foram
significativos para o perfil de agrupamentos observados. Os contaminantes
presentes nas amostras e a intensidade de sinais nos espectros de FT-IR foram os
principais responsáveis pela dispersão observada das amostras. A
13
C-RMN
mostrou que a purificação da acemanana não foi suficiente para garantir seu grau de
pureza, no entanto, ficou acima do padrão usado comercialmente. Os ensaios de
vascularização realizados na vesícula vitelínica e na membrana córioalantóica de
Gallus domesticus produziram um efeito anti-vasculogênico e anti-angiogênico, sem
comprometer a morfogênese embrionária, nos tratamentos com extrato do
parênquima de reserva, da FP e de acemanana, nas concentrações de 10, 30 e
90µg/ovo.
xiii
ABSTRACT
Aloe barbadensis Miller, also referred to as Aloe vera L., is a native plant to the
African Continent, having a great diversity of medicinal properties owing to their
secondary metabolites found in the extract of both chlorophyllian and storage
parenchyma. The latter is rich in polysaccharides mainly β(1Æ4) polymannans. In
this work, the influences of environmental factors (mean temperature, insolation,
rainfall, and relative humidity) on aloin and polysaccharide biosynthesis (the major
anthraquinone) throughout one year has been studied, in collections of
micropropagated plants and plants produced on field, by collecting leave samples
from same plants and distinct plants. The rainfall was the main climatic factor
influencing aloin content as the irradiation and rainfall had meaningful effect on the
biosynthesis and accumulation of polysaccharide fraction. Physico-chemical analysis
of storage parenchyma revealed prominent amounts of glycides and proteins. The
monomeric composition of DPF determined by TLC showed the presence of manose,
glucose and galactose. Spectroscopic analysis (FT-IR and
13
C-NMR) allowed to
determine unequivocally the molecular structure of the polysaccharide fractions in
study, the commercial acemannan standard and the isolated acemannan of the
polysaccharide fraction. Spectral data showed that contaminants such as proteins,
lipids and phenolics compounds are bound to the polysaccharide structure. The
chemometric analysis allowed to group polysaccharide samples according their
spectral (FT-IR) profile as well as to demonstrate the effect of sampling time and
dialysis on the separation observed. The
13
C-NMR disclosed that the protocol for
purification of acemannan was not enough to guarantee high degree of pureness (~
99%), but was superior as compared to the commercially available standard. The
xiv
biological assays revealed an anti-vasculogenic and anti-angiogenic effects in the
yolk sac and the corioalantoic membrane of Gallus domesticus embryos, without
intervening with their growth, as treated with storage parenchyma extract,
polysaccharide fraction and acemannan (10, 30 and 90µg/egg).
xv
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................... i
LISTA DE TABELAS........................................................................................... viii
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... ix
RESUMO............................................................................................................ xi
ABSTRACT......................................................................................................... xiii
Introdução...........................................................................................................
CAPÍTULO 1 – CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA
1
1 Revisão Bibliográfica ...................................................................................... 4
1.1 Matéria-prima vegetal.................................................................................. 4
1.1.1 Descrição botânica da espécie Aloe barbadensis Miller......................... 4
1.1.2 Nomenclatura científica e família botânica.............................................. 6
1.1.3 Sinonímia científica...................................................
................................... 6
1.1.4 Nomenclatura vernácula............................................................................ 6
1.1.5 Origem e distribuição geográfica.............................................................. 7
1.2 Composição química do gênero Aloe.......................................................... 7
1.2.1 Compostos do extrato do parênquima clorofiliano................................... 7
1.2.2 Biossíntese de antraquinonas................................................................. 9
1.2.3 Compostos do extrato do parênquima de reserva................................... 12
1.2.4 Outros componentes................................................................................. 15
1.3 Análise da composição química por espectroscopia de infravermelho (FT-
IR),
13
C-RMN e análise quimiométrica.........................................................
16
1.4 Objetivos.......................................................................................................
19
1.4.1 Objetivo Geral............................................................................................ 19
1.4.2 Objetivos Específicos................................................................................. 19
1.5 Material e Métodos........................................................................................
20
xvi
1.5.1 Produção de plantas no campo (PC) e de plantas micropropagadas,
aclimatizadas e transferidas para o campo (PM)......................................
20
1.5.2 Caracterização química do extrato do parênquima de reserva, da FP e
da FPD......................................................................................................
21
1.5.2.1 Dosagem de proteínas no parênquima de reserva, da FP e da FPD.... 21
1.5.2.2 Determinação dos carboidratos totais no parênquima de reserva, da
FP e da FPD .........................................................................................
22
1.5.2.3 Determinação do conteúdo de açúcares redutores no parênquima de
reserva, da FP e da FPD .......................................................................
23
1.5.2.4 Quantificação de glucose (método da glucose oxidase) na FP ............ 23
1.5.3 Caracterização físico-química do extrato do parênquima de reserva........ 24
1.5.4 Análise de aloína por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)...... 24
1.5.5 Análise quantitativa de polissacarídeos – Fração polissacarídica (FP) e
fração polissacarídica dialisada (FPD)......................................................
25
1.5.6 Hidrólise da FPD e cromatografia de camada delgada (CCD).................. 26
1.5.7 Isolamento e análise de acemanana......................................................... 27
1.5.8 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR)... 28
1.5.9 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de
13
C............ 28
1.5.10 Quimiometria............................................................................................
29
1.6 Resultados e Discussão................................................................................ 30
1.6.1 Análise quantitativa da aloína por CLAE e relação da sua produção in
campo com fatores climáticos...................................................................
30
1.6.2 Análise quantitativa da FP e sua relação com fatores climáticos.............. 44
1.6.3 Caracterização físico-química do extrato do parênquima de reserva da
FP e FPD...................................................................................................
59
1.6.4 Determinação da composição monomérica dos polissacarídeos da FPD. 65
1.6.5 Caracterização estrutural da FP, FPD e acemanana por espectroscopia
vibracional de infravermelho (FT-IR), seguida de análise
quimiométrica............................................................................................
67
xvii
1.6.6 Caracterização estrutural da FPD e de acemanana por espectroscopia
de ressonância magnética nuclear de
13
C (
13
C-RMN), seguida de
análise quimiométrica................................................................................
82
1.7 Conclusões................................................................................................... 97
CAPÍTULO 2 – ATIVIDADES BIOLÓGICAS
2 Revisão bibliográfica........................................................................................ 99
2.1 Aspectos históricos e etnofarmacológicos ................................................... 99
2.2 Atividades farmacológicas do gênero Aloe................................................... 101
2.2.1 Atividades farmacológicas dos compostos químicos do extrato do
parênquima clorofiliano............................................................................
2.2.2 Atividades farmacológicas dos compostos químicos do parênquima de
reserva.....................................................................................................
101
104
2.3 Características dos processos de formação de vasos sangüíneos.............. 112
2.4 Modelos de estudo de vascularização e morfogênese embrionária
voltados à investigação das propriedades farmacológicas de A.
barbadensis..................................................................................................
117
2.5 Objetivos....................................................................................................... 120
2.5.1 Objetivo Geral............................................................................................ 120
2.5.2 Objetivo Específico.................................................................................... 120
2.6 Material e métodos........................................................................................ 121
2.6.1 Modelo biológico – Embriões de Gallus domesticus – Linnaeus, 1758..... 121
2.6.2 Vasculogênese em vesícula vitelínica....................................................... 121
2.6.3 Angiogênese em membrana córioalantóica............................................... 122
2.6.4 Medidas da morfogênese embrionária na vasculogênese....................... 123
2.6.5 Análise estatística dos dados .................................................................. 124
2.7 Resultados e discussão................................................................................ 125
2.7.1 Tratamentos realizados na vesícula vitelínica........................................... 125
2.7.2 Tratamentos realizados na membrana córioalantóica............................... 136
2.8 Conclusões................................................................................................... 143
xviii
3 Referências....................................................................................................
144
ANEXOS
165
1
INTRODUÇÃO
Numerosas plantas têm sido tradicionalmente usadas por populações de
todos os continentes no controle de diversas doenças e pragas. A Organização
Mundial da Saúde estima que mais de 80% da população mundial em países em
desenvolvimento dependem primariamente de plantas medicinais para o
atendimento básico de saúde, além do que, o uso de plantas medicinais em países
desenvolvidos é crescente, recentemente, verificou-se que 25% da população do
Reino Unido utilizam plantas medicinais regularmente (CANTER et al., 2005).
Simões et al. (1996) relatam que o uso das plantas medicinais não se restringe
somente às zonas rurais ou regiões desprovidas de assistência médica e
farmacêutica, mas que também são utilizadas intensamente no meio urbano como
forma alternativa ou complementar aos medicamentos quimiossintéticos.
A vantagem terapêutica específica do uso das plantas medicinais é o elevado
grau de confiança que amplos segmentos da população têm nos fitomedicamentos,
dentre os quais se encontra a babosa, cujo uso se estende também a diversas áreas
da indústria.
Existe um crescente interesse comercial relacionado ao uso da babosa, tanto
no setor cosmético como no farmacêutico. Como exemplo disto, diversos estudos
têm demonstrado a utilização de babosa como fonte de compostos com atividades
farmacológicas, tais como as antraquinonas, metabólitos secundários encontrados
principalmente no extrato do parênquima clorofiliano foliar, tendo a aloína como
constituinte majoritário, e também os polissacarídeos do extrato do parênquima, com
destaque para a acemanana. A acemanana, comercialmente conhecida como
Carrysin
®
, Hidrogel
®
(NI et al.,2004), foi aprovada pelo FDA (Food and Drug
2
Administration) para aplicação em ferimentos desde a década passada e, mais
recentemente, para tratamento da osteíte alveolar (TALMADGE et al., 2004). A
despeito dessas indicações, os mecanismos de ação desta macromolécula no
organismo humano permanecem não completamente elucidados, carecendo,
portanto, de maiores estudos.
Um dos aspectos que sucita maior interesse é o fato de que, por apresentar
atividade imunomodulatória, este composto poderia atuar como um agente
antitumoral. No contexto da investigação pré-clínica da acemanana, os estudos
relacionados à vasculogênese e angiogênese são uma importante ferramenta no
que concerne à elucidação dos efeitos desse polissacarídeo e de outros compostos
isolados da babosa na geração ou inibição da formação de vasos.
Devido à gama de aplicações na área da saúde humana, os produtos
derivados de babosa vêm apresentando forte expansão nos mercados nacional e
internacional. Esse fato determina uma maior demanda por matérias-primas de
qualidade e o aumento da oferta da biomassa de babosa pressupõe o incremento na
produtividade e/ou expansão da área dos cultivos. Neste último caso, a implantação
de cultivos com alto rendimento tem como premissa básica a utilização de mudas de
qualidade genética e sanitária.
Recentemente, essa demanda motivou a parceria entre a empresa Naturama
Sucos Integrais de Brasil
®
(Paulo Lopes, SC) e o Laboratório de Morfogênese e
Bioquímica Vegetal da Universidade Federal de Santa Catarina, voltada ao
desenvolvimento de um projeto de seleção e multiplicação in vitro da espécie
(ARAÚJO et al. 2002; CAMPESTRINI et al., 2006), com o objetivo de agregar valor
aos produtos derivados. Outras empresas nacionais e estrangeiras têm se mostrado
interessadas em investir na melhoria de suas linhas de produção, através da
3
aquisição de matéria-prima vegetal com características fitossanitárias e genéticas
superiores, bem como empresas de tecnologia da região da Grande Florianópolis
projetam a criação de produtos de interesse biomédico, utilizando métodos
desenvolvidos em parte no trabalho aqui apresentado.
4
CAPÍTULO 1 – CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 MATÉRIA-PRIMA VEGETAL
1.1.1 DESCRIÇÃO BOTÂNICA DA ESPÉCIE Aloe barbadensis Miller
A espécie Aloe barbadensis Miller é uma planta arbustiva, dióica, suculenta,
mucilaginosa, rizomatosa, entouceirada, de caule curto, perene, com 0,50 a 1,20m
de altura. Suas flores são tubulosas, com 2 a 4cm de comprimento, de cor
amarelada, pendentes, com pedicelos menores que as brácteas, dispostas em
racemos terminais densos, de 30 a 40cm de comprimento, sobre uma haste simples
ou ramificada. O fruto é uma cápsula triangular reunindo várias sementes escuras.
As folhas são dispostas em roseta, reunindo até 20 unidades, sendo ensiformes,
com 50 a 60cm de comprimento, 6 a 9cm de largura e 3cm de espessura na base;
densas, lanceoladas, côncavas em sua face superior e convexa na face inferior;
glauco-esverdeadas uniformes, sinuoso-serradas, carnosas, com pintas ou manchas
brancas quando jovens, marginadas por espinhos triangulares, amarelos, curtos e
espaçados. As folhas jovens são retas e agudas. O corte transversal das folhas
revela, externamente, uma camada de células epidérmicas de consistência elástica
e impermeável que reveste uma segunda camada, o mesófilo, o qual contém canais
condutores de extrato do parênquima clorofiliano. Mais internamente, encontra-se o
parênquima tissular (parênquima reserva), de aspecto vítreo, que se relaciona à
condição xerófita da babosa, conservando a umidade do tecido por longo período de
tempo. O extrato do parênquima clorofiliano é um líquido de consistência leitosa,
5
coloração amarela-ocre, sabor amargo e aroma rançoso, sendo produzido por
células excretoras do mesófilo. O florescimento ocorre de agosto a setembro, sendo
a fecundação cruzada, através de insetos e pássaros, principalmente (Figura 1)
(SILVA JÚNIOR, 2003).
A
B
C
Figura 1 - (A) Aloe barbadensis em estágio de floração. (B) Detalhe da inflorescência. (C)
Micrografia da secção transversal da folha a fresco, corada com vermelho do
Congo e verde malaquita, obtida sob luz polarizada e contraste por
interferência diferencial de Normasky. Barra = 100µm
Fonte: Fotos do autor.
6
1.2 NOMENCLATURA CIENTÍFICA E FAMÍLIA BOTÂNICA
A espécie Aloe barbadensis Miller pertence à família Asphodelaceae
(WICHTL, 2004). Esta nomenclatura é referenciada pela Organização Mundial de
Saúde, assim como a Aloe vera (L.) Burm. f. (WHO, 1999).
1.3 SINONÍMIA CIENTÍFICA
Aloe vera (L.) Burm. f. (WICHTL, 2004) , A. chinensis Bak., A. elongata
Murray, A. indica Royle, A. officinalis Forsk., A. perfoliata L., A. rubescens DC, A.
vera L. var. littoralis Köning ex Bark., A. vera L. var. chinensis Berger, A. vulgaris
Lam. (WHO, 1999), A. perfoliata vera L., A. humilis Blanco, A. vera L. var. officinalis
Baker (SILVA JÚNIOR, 2003).
1.4 NOMENCLATURA VERNÁCULA
A planta popularmente denominada babosa é também conhecida como
kanyasara, ghrita kumari na medicina Ayurvédica (Índia), lu hui ye (China), aloe, aloe
de Barbados (Espanha), aloés de Curaçao (Inglaterra), aloés (França), aloés de
Curaçao (Alemanha), babosa (WICHTL, 2004) babosa-medicinal, erva-babosa, erva-
de-azebre, caraguatá e caraguatá-de-jardim (SILVA JÚNIOR, 2003).
7
1.5 ORIGEM E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA
A espécie é nativa do sudeste ou leste da África e foi subseqüentemente
introduzida no norte da África, península arábica, China, Gibraltar, países
mediterrâneos, Índias Orientais (WHO, 1999) e Américas (WICHTL, 2004). É
subespontânea nas ilhas Canárias e Madeira, no Mediterrâneo e nas margens do
Mar Vermelho, crescendo em áreas semi-desérticas e em locais pedregosos e semi-
áridos. Está amplamente adaptada no Brasil (SILVA JÚNIOR, 2003).
1.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO GÊNERO Aloe.
1.2.1 COMPOSTOS DO EXTRATO DO PARÊNQUIMA CLOROFILIANO
Os principais metabólitos secundários descritos para as espécies de babosa
são os compostos fenólicos do tipo antronas, cromonas e fenil-pirronas (ESTEBAN-
CARRASCO et al., 2001). A parte líquida (extrato do parênquima clorofiliano),
extraída das folhas, possui cerca de 80 constituintes, muitos deles ainda não
identificados. Dentre os derivados antracênicos, as antraquinonas são as mais
estáveis; antronas e diantronas são relativamente estáveis em soluções aquosas
acidificadas, mas na presença de álcalis são rapidamente oxidadas a antraquinonas
(FALKENBERG, 2004).
A aloína é uma antrona C-glicosilada, que é uma mistura de dois
diasterisômeros: aloína A (configuração C
10
, C
1
: S,S) e aloína B (configuração C
10
,
C
1
: R,S) (Figura 2). Os demais componentes que ocorrem neste extrato são a
aloesina e aloeresina, entretanto, muitos outros compostos são citados, tais como
aloe-emodina, homonataloína, nataloe-emodina, aloinosídeo A e B, aloenina A e B,
8
4-hidroxialoína e 5-hidroxialoína (ZONTA et al., 1995; KOCH, 1996; ALVES et al.,
2004).
O
OH
OH
OH
OH
8
5
7
6
9
10
1
2
4
3
OH O OH
CH
2
OR
1
H
R
3
R
2
CONFIGURAÇÃO
R
1
R
2
R
3
C
10
C
1
Aloína A
H H H S S
Aloína B
H H H R S
4-hidroxialoína
H OH H
5-hidroxialoína
H H OH R S
Aloinosídeo A
α-L-Ramnosil
H H S S
Aloinosídeo B
α-L-Ramnosil
H H R S
Figura 2
– Fórmula molecular de componentes majoritários do extrato do parênquima
clorofiliano de babosa (ZONTA et al., 1995)
Okamura et al. (1996), isolaram do extrato do parênquima clorofiliano de
Aloe barbadensis novas cromonas: 8-C–glucosil-7-O-metil-(S)-aloesol, isoaloerisina
D e aloeresina. No ano seguinte, Saleem et al. (1997), isolaram das raízes da planta
uma nova antrona denominada aloe barbendol, ao mesmo tempo em que outros três
compostos derivados do extrato do parênquima clorofiliano foram encontrados:
emodina, aloe crisona e barbaloína A. Seguidamente, em 1998, Okamura et al.,
9
apresentaram a estrutura química de cinco outras cromonas isoladas do extrato do
parênquima de reserva das folhas: 8-C-glucosil-noreugenina, 4’-O-glucosil-
isoaloeresina DI, 4’-O-glucosil-isoaloeresina DII, 8-C-glucosil-(2’-O-cinamoil)-7-O-
metilaloediol A, 8-C-glucosil-(2’-O-cinamoil)-7-O-metilaloediol B.
Durì et al. (2004) relataram a descoberta de dois novos compostos isolados
de uma espécie de babosa do Kenia: 10-O-β-D-glucopiranosil aloenina e 8-C-β-D-
glucopiranosil-7-O-metil-(R)-aloesol. Também foram identificados nessa espécie
aloenina, aloenina 2’-p-cumaroil éster e aloenina aglicona.
1.2.2 BIOSSÍNTESE DE ANTRAQUINONAS
Para o grupo de substâncias denominadas genericamente antraquinonas
encontram-se na literatura também outras denominações, tais como antranóides,
derivados antracênicos ou derivados hidroxiantracênicos. Os derivados
antraquinônicos contidos nas drogas vegetais secas apresentam um grau de
oxidação superior, comparativamente aos compostos originalmente encontrados na
planta fresca. As antraquinonas propriamente ditas são mais estáveis, em relação às
antronas livres que as dão origem por auto-oxidação ou por ação enzimática
(FALKENBERG, 2004).
As antraquinonas, com dois grupamentos cetônicos nas posições C9 e C10,
ocorrem naturalmente em plantas (YEN et al., 2000). Têm como precursores o ácido
chiquímico e o acetato, ou apenas o acetato (acilpolimalonato), sendo que no
primeiro caso, o ácido chiquímico reage com o ácido α-cetoglutárico, proveniente da
desaminação do ácido glutâmico ou do ciclo do ácido cítrico, produzindo o ácido o-
succinilbenzóico. O ácido 1,4-dihidróxi-2-naftóico (produto da redução do ácido o-
10
succinilbenzóico) combina-se com o ácido mevalônico (proveniente do acetato),
originando uma antraquinona (Figura 3) (WIJNSMA, 1986; SANTOS, 2004).
Muito do que se conhece acerca das vias metabólicas das antraquinonas
advém de estudos realizados em fungos (ELSWORTH et al., 2000, TANG et al.,
2004), sendo que em vegetais superiores, estudos prévios revelaram que a
biossíntese acontece através da via do chiquimato-mevalonato (WIJNSMA, 1986),
como observado em espécies da família das rubiáceas.
11
OH
OH
OH
COOH
OH
O
COOH
COOH
CH
2
HOOC
COOH
O
TPP
COOH
OH
O
COOH
COOH
CH
2
OH
+
COOH
OH
O
COOH
COOH
O
COOH
OH
OH
COOH
OH
COOH
OH
+
OH
OH
COOH
CH
3
CH
3
O
O
OH
CH
3
Ácido
α
-cetoglutárico
Ácido chiquímico
Ácido corísmico
Ácido isocorísmico
Ácido o-succinilbenzóico
Ácido mevalônico
Ácido 1,4-dihidróxi-2-naftóico
Antraquinona
Ácido 1,4-dihidróxi-3-prenil-2-naftóico
Figura 3 – Biossíntese das antraquinonas através da via do ácido chiquímico. (WIJNSMA,
1986; SANTOS, 2004).
12
1.2.3 COMPOSTOS DO EXTRATO DO PARÊNQUIMA DE RESERVA
Uma diversidade de substâncias está presente no parênquima de reserva
de espécies do gênero Aloe, sendo os polissacarídeos os compostos majoritários,
havendo teores proeminentes de glucose e ácido málico (DIEHL, TEICHMULLER,
1998).
Uma característica de interesse do parênquima de reserva da Aloe
barbadensis refere-se ao seu alto conteúdo de água, i.e., cerca de 98,5% a 99,5%
do peso fresco. Mais de 60% do remanescente sólido é constituído por
polissacarídeos (FEMENIA et al., 1999), enquanto os monossacarídeos manose e
glucose perfazem aproximadamente 70% dos açúcares totais (NI et al., 2004b).
Segundo Femenia et al. (1999), a análise da composição de açúcares encontrados
no resíduo insolúvel em álcool preparado a partir do parênquima de reserva das
folhas revelou a existência de oito monossacarídeos: arabinose, galactose, glucose,
manose, ramnose, xilose, fucose e ácido urônico, com destaque para os valores de
concentração de manose e glucose (~73% em peso seco), sendo a razão de
ocorrência de glucose/manose de 1:1,7. Gowda et al. (1980) foram os primeiros a
citar que a razão entre manose e glucose era cerca de 19:1, porém, o trabalho de
Chow et al. (2005), corrigiu este índice para 15:1 e definiu também que as
ramificações ocorriam por substituição nas hidroxilas do C-2, C-3 e C-6.
O primeiro trabalho sobre a determinação de estruturas de polissacarídeo
do gênero Aloe foi publicado em 1948, por Roboz e Haagen-Smith, que
descreveram a composição do que denominaram látex seco de Aloe vera. Utilizando
hidrólise total da fração polissacarídica, os autores identificaram quantidades
13
equimoleculares de manose e glucose e 2,73% em peso seco de ácidos urônicos
(SANTA RITA, 1984).
Waller et al. (1978) isolaram de Aloe barbadensis um composto cuja
estrutura básica era formada por resíduos de D-manose e D-glucose. No ano
seguinte, Gouda et al. (1979) isolaram quatro polissacarídeos que foram
identificados como glucomananas acetiladas, com diferentes proporções entre os
resíduos de glucose e manose e grupamentos acetílicos. Posteriormente, Gaurhari e
Das (1980, 1980b) determinaram a estrutura de dois polissacarídeos em Aloe
barbadensis, sendo um deles identificado como uma β-D-galactana ramificada. O
segundo polissacarídeo foi caracterizado como uma β-D-glucomanana, acetilada na
posição C
6
dos resíduos de manose.
As glucomananas são os principais polissacarídeos de Aloe, com destaque
para a acemanana, o constituinte mais estudado. A acemanana é um polímero
misto de mananas acetiladas, com cadeias de tamanhos variávies, formadas por
resíduos de manose e glucose unidos por ligações do tipo β-(1→4) e com peso
molecular de aproximadamente 1000 KDa (TURNER et al., 2004; LEE, et al., 2001 -
Figura 4). Em média, cada manose possui um grupamento acetil em uma das três
posições do anel (DIEHL, TEICHMULLER, 1998), característica esta que corrobora
para a denominação acemanana (ZHANG, TIZARD, 1996; NI et al., 2004).
14
2/3/6-OAc
2/3/6-OAc
α-
(
1,6
)
-Gal
---
[
β
-1,4-Man
]
x
---
[
β
-1,4-Glc
x
---
[
β
-1,4-Man
]
y
---
[
β
-1,4-Man
]
--
Figura 4 – Detalhe da estrutura química da acemanana derivada de Aloe barbadensis,
comercialmente denominada Carrysin™
(TURNER et al. 2004).
Vários polissacarídeos têm sido isolados do extrato do parênquima de
reserva de folhas de Aloe barbadensis, incluindo mananas, galactanas, arabinanas,
arabinoramnogalactanas, substâncias pécticas e ácido glicurônico. As polimananas
foram identificadas como o tipo de polissacarídeo majoritário do extrato do
parênquima reserva cuja concentração pode ser muito variável. (REYNOLDS,
DWECK, 1999). A razão para esta variação é atribuída às mudanças sazonais e/ou
ao efeito da localização geográfica dos cultivos (NI et al., 2004). Mais recentemente,
Esua et al. (2006) isolaram do extrato do parênquima de reserva de folhas de Aloe
barbadensis três novas maloil-glucanas denominadas de veracilglucanas A, B e C.
Reynolds e Dweck (1999) e Rodrigues et al. (2005) relataram a existência
de seis tipos de polissacarídeos no extrato do parênquima reserva de Aloe
barbadensis: (1) glucomananas com diferentes pesos moleculares; (2)
glucomananas acetiladas; (3) galactogalacturanas; (4) glucogalactomananas; (5)
galactoglucoarabinomananas e (6) mananas acetiladas, com diferentes composições
e pesos moleculares.
15
1.2.4 OUTROS COMPONENTES
Além dos componentes anteriormente mencionados, compostos de baixo
peso molecular, tais como dietilhexilftalato, vitaminas A, C, D, do complexo B,
saponinas, ácido salicílico e esteróides (lupeol, campesterol, β-sitosterol) e enzimas
também estão presentes na planta (MOON et al., 1999; ARAÚJO et al., 2002; CHOI
e CHUNG, 2003).
Comum em plantas, o β-sitosterol é encontrado nas folhas de babosa,
juntamente com pequena quantidade de colesterol, campesterol e lupeol. Também
foi observado um número não identificado de substâncias voláteis, detectados por
cromatografia de camada delgada (REYNOLDS, 2004).
No extrato do parênquima de reserva são encontrados cerca de 200
compostos, incluindo muitas vitaminas, minerais, ácidos orgânicos, todos
funcionando de maneira sinergística de forma a exibir os efeitos biológicos. Também
são relatados esteróis e ácidos carbônicos aromáticos (ESUA et. al., 2006).
16
1.3 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA POR ESPECTROSCOPIA DE
INFRAVERMELHO (FT-IR),
13
C-RMN E ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA.
A chamada radiação infravermelha (IR) corresponde aproximadamente à
região do espectro eletromagnético situada entre as regiões do visível e das
microondas. O segmento da janela espectral de utilidade para a análise de
compostos orgânicos situa-se entre 4000 e 400 cm
-1
, sendo que as regiões do
infravermelho próximo (14290 – 4000 cm
-1
) e do infravermelho distante (700 – 200
cm
-1
) também têm atraído a atenção (SILVERSTEIN, WEBSTER, 2000).
A espectroscopia de infravermelho é considerada um método de análise
rápido e não destrutivo da amostra, que necessita o mínimo de preparação do
material amostral e que encontra as mais diversas aplicações, desde fármacos até a
indústria do petróleo, passando pela aplicação na área de alimentos e no auxílio a
diagnósticos em medicina. Mais recentemente, trabalhos publicados revelam o uso
da espectroscopia de infravermelho na distinção entre plantas transgênicas e até
mesmo entre plantas clonadas e não clonadas (PETIBOIS et al., 2001; PURCELL et
al., 2006; SMALL, 2006; VLACHOS et al., 2006; XIE et al., 2006).
Tendo surgido na década de 30, a técnica de espectroscopia vibracional de
infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) ganhou maior interesse somente
durante a Segunda Guerra Mundial, onde teve papel decisivo em dois grandes
projetos, a síntese da penicilina e o desenvolvimento da borracha sintética (KATON,
1996). O FT-IR tem se mostrado um método goblamente aceito devida à sua alta
reprodutibilidade físico-química, permitindo a análise estrutural de biomoléculas em
função de suas características peculiares e únicas, que são exibidas no espectro de
17
FT-IR e que constituem a impressão digital do composto em análise (DÉLÉRIS,
PETIBOIS, 2003).
Atualmente, a espectroscopia vibracional tem encontrado importantes
aplicações na indústria alimentícia, principalmente no que se refere à análise e
identificação de propriedades físicas e interações entre carboidratos, no estudo de
óleos e gorduras comestíveis e no controle de qualidade de produtos
industrializados, como sucos e refrigerantes (FERREIRA et al., 2002; ČERNÁ et al.,
2003; VLACHOS et al., 2006).
Com a crescente sofisticação das técnicas instrumentais de análise química,
como o FT-IR, a ressonância magnética nuclear de
13
C e
1
H, impulsionada pelo
avanço da tecnologia computacional, tem havido um aumento da necessidade de
utilização de técnicas de tratamento de dados mais complexas do ponto de vista
matemático. Nas últimas décadas, a análise multivariada foi introduzida no
tratamento de dados químicos e vem, rapidamente, ganhando popularidade, dando
origem a uma nova disciplina denominada quimiometria, uma área especificamente
destinada à análise de dados químicos de natureza multivariada. Os métodos
multivariados consideram a correlação entre muitas variáveis analisadas
simultaneamente, permitindo a extração de uma quantidade maior de informações,
muitas vezes impossível de ser obtida, quando analisadas variável a variável
(FERREIRA et al., 1999; SENA et al., 2000; FERREIRA et al., 2002; CHOI et al.,
2004).
Recentemente têm-se enfatizado os sistemas de análise multivariados, com
destaque para a análise de componentes principais (PCA), que consiste em uma
manipulação de uma matriz de dados com o objetivo de representar as variações
presentes em diversas variáveis, através do menor número de “fatores”. Trata-se de
18
um método utilizado para projetar dados n-dimensionais em um espaço de menor
dimensão. Isso é feito através do cálculo de componentes principais e de
combinações lineares das variáveis originais. PCA é um método exploratório, porque
auxilia na elaboração de hipóteses gerais a partir dos dados coletados, contrastando
com estudos direcionados nos quais hipóteses prévias são testadas. É também
capaz de separar informações importantes das redundantes e aleatórias (FERREIRA
et al., 1999; FERREIRA et al., 2002).
A combinação de PCA e
1
H-RMN ou
13
C-RMN, permite, por exemplo,
realizar estudos de metabolômica vegetal e análises de misturas complexas, como
em alimentos, onde existe a possibilidade de discriminar a variedade dos frutos que
dão origem a sucos e estabelecer seus parâmetros de qualidade, por exemplo
(BELTON et al., 1998; LE GALL et al., 2001; CHOI et al., 2004).
19
1.4 OBJETIVOS
1.4.1 OBJETIVO GERAL
Determinar os teores de aloína e de polissacarídeos em folhas de plantas
produzidas no campo (PC), micropropagadas (PM) e caracterizar a fração
polissacarídica (FP) utilizando-se métodos químicos e bioquímicos.
1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
- Determinar os teores de aloína e de polissacarídeos totais em PC e em PM,
utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e análise gravimétrica,
respectivamente, em amostras coletadas bimestralmente, ao longo de um período
experimental de 12 meses;
- Correlacionar a produção de aloína e da FP com fatores climáticos;
- Determinar a estrutura química de amostras da FP, da fração polissacarídica
dialisada (FPD) e de acemanana de PC e PM, coletadas nas 4 estações do ano,
por espectroscopia de infravermelho e por ressonância magnética nuclear de
13
C
(
13
C-RMN);
- Analisar os dados espectrais de infravermelho das amostras da FP e da FPD
através de técnicas quimiométricas, i.e., análise de componentes principais (PCA);
20
1.5 MATERIAL E MÉTODOS
1.5.1 PRODUÇÃO DE PLANTAS NO CAMPO (PC) E DE PLANTAS
MICROPROPAGADAS, ACLIMATIZADAS E TRANSFERIDAS PARA O
CAMPO (PM)
As plantas de Aloe barbadensis Miller, oriundas do Paraná, foram adquiridas
pela empresa Naturama Sucos Integrais do Brasil Ltda
®
no ano de 2000, tendo
estas, idade de cerca de dois anos, e foram plantadas no Município de Paulo Lopes,
sendo que algumas destas plantas foram selecionadas por suas características
fenotípicas para a micropropagação, executada em 2002 no Laboratório de
Morfogênese e Bioquímica Vegetal da UFSC conforme a metodologia descrita por
Araújo et al. (2002). Todos os passos descritos neste e nos itens seguintes, são
mostrados no fluxograma a seguir (Figura 5).
21
PC
Figura 5 – Fluxograma de produção, coleta e processamento de plantas de Aloe
barbadensis Miller
1.5.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO EXTRATO DO PARÊNQUIMA DE
RESERVA, DA FP E DA FPD
1.5.2.1 DOSAGEM DE PROTEÍNAS NO EXTRATO DO PARÊNQUIMA DE
RESERVA, DA FP E DA FPD
A determinação de proteínas totais foi feita pelo método de Bradford (1976)
para amostras de extrato do parênquima de reserva, FP e FPD. A quantidade total
de proteínas nas amostras foi calculada a partir de uma curva-padrão (0,5; 1,0; 5,0;
Micropropagação
Determinação do Teor
de Aloína no Extrato do
parênquima clorofiliano
Aclimatização
Transferência
Para o Campo
Repicagem
Extração do
Extrato do
Parênquima de
reserva.
A
nálise
Quantitativa-FP
A
nálise
Quantitativa-FP
Extração do
Extrato do
Parênquima de
reserva.
V
asculogênese
An
g
io
g
ênese
Isolamento da
A
cemanana
V
asculogênese
An
g
io
g
ênese
V
asculogênese
An
g
io
g
ênese
Determinação do Teor
de Aloína no Extrato do
parênquima clorofiliano
22
10,0; 15,0 e 20,0 µg/mL), utilizando albumina de soro bovino (100 µg/mL em NaCl
0,15M – Sigma/St Louis – MO, USA). A média dos valores de três leituras da
absorbância (595 ηm, Shimadzu UV-1203) para cada concentração de albumina de
soro bovino foi utilizada para a elaboração da curva padrão (r
2
= 0,9949 e y =
6,027x).
A quantificação das proteínas das amostras do parênquima de reserva
utilizou o extrato aquoso bruto daquela biomassa, enquanto para as amostras da FP
e da FPD foram feitas soluções-estoque de 1mg/mL. Os valores apresentados
representam a média de três leituras da absorbância.
1.5.2.2 DETERMINAÇÃO DOS CARBOIDRATOS TOTAIS NO EXTRATO DO
PARÊNQUIMA DE RESERVA, DA FP E DA FPD
A análise de carboidratos totais seguiu a metodologia de Dubois et al.
(1956), utilizando microplacas de 96 cavidades e leitor de ELISA modelo EL800 (Bio-
tek Instruments INC) para determinação dos valores de absorbância (492ηm). A
concentração de carboidratos totais utilizou uma curva-padrão de glucose (Sigma/St
Louis – MO, USA), considerando um intervalo de concentrações de 0,02; 0,05; 0,1;
0,15; 0,20 e 0,25mg/mL (r
2
=0,9948 e y = 2,371x). Os valores apresentados foram
calculados utilizando-se a média de três leituras seqüênciais da absorbância. Para
as amostras do extrato do parênquima de reserva houve a necessidade de realizar-
se uma diluição de 15 vezes, enquanto para as amostras de FP e FPD uma solução
estoque de 0,5mg/mL foi elaborada.
23
1.5.2.3 DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE AÇÚCARES REDUTORES NO
EXTRATO DO PARÊNQUIMA DE RESERVA, DA FP E DA FPD
O método do ácido 3,5-dinitrossalicílico, descrito por Miller (1959), foi utilizado
para esta determinação da variável em estudo. Os teores de açúcares totais foram
calculados com o auxílio de uma curva-padrão (r
2
=0,9974 e y = 0,5646x) de glucose
(0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 e 1,4mg/mL), através da leitura da absorbância (540 ηm) das
amostras em espectrofotômetro Shimadzu UV-1203. Alíquotas do extrato aquoso
bruto do parênquima de reserva foram utilizadas nos ensaios quantitativos, enquanto
uma solução-estoque das amostras de FP e FPD foi elaborada previamente à
análise. Os valores apresentados correspondem ao valor médio de três leituras de
absorbância/amostra.
1.5.2.4 QUANTIFICAÇÃO DE GLUCOSE (MÉTODO DA GLUCOSE OXIDASE) NA
FP
As análises do teor de glucose pelo método enzimático foram efetuadas
somente em amostras da fração FP com a utilização de um kit comercial (Labtest
®
.
Lote 6001/2006 – Lagoa Santa, MG). O protocolo de análise baseou-se nas
orientações do frabricante do kit e, para efeitos de cálculo do teor de glucose, uma
curva-padrão daquele monossacarídeo (Sigma/St Louis – MO, USA) foi elaborada
(0,005; 0,01; 0,02; 0,05; 0,07 e 0,1 mg/mL – r
2
=0,9985 e y = 2,9388x). As leituras da
absorbância (505 ηm) das amostras foram realizadas em triplicatas, em
espectrofotômetro Shimadzu (UV-1203).
24
1.5.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO EXTRATO DO PARÊNQUIMA DE
RESERVA
A caracterização físico-química das amostras do extrato do parênquima de
reserva considerou os seguintes parâmetros: comprimento médio das folhas (cm),
massa fresca média das folhas (g), pH, umidade (%), cinzas totais (mg) e teor de
sólidos solúveis (ºBrix).
Para determinação dos valores de pH, foram adotadas as recomendações
da AOAC (1995), enquanto os teores de umidade e cinzas seguiram os protocolos
descritos na Farmacopéia Brasileira IV (1988). O conteúdo de sólidos solúveis totais
foi realizado por refratometria, com o auxílio de refratômetro manual de Abbé (Carl-
Zeiss-Jena), sendo os resultados expressos em °Brix (PREGNOLATO e
PREGNOLATO,1985).
1.5.4 ANÁLISE DE ALOÍNA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA (CLAE)
Aproximadamente 2mL do extrato do parênquima clorofiliano foliar de
plantas crescidas no campo foram coletadas bimestralmente e armazenadas em
frascos de vidro âmbar (5mL), com a atmosfera interna de N
2
, a -20ºC.
Subsequentemente, as amostras foram liofilizadas e mantidas sob refrigeração
(-20ºC).
A análise quantitativa de aloína seguiu o protocolo estabelecido pela
empresa alemã Spectral Service, com adaptações, conforme, descrito a seguir: Uma
massa de 1mg, foi ressuspensa em 10mL de MeOH p.a., seguido de agitação e
25
filtração (0,22µm). Alíquotas (10µL) foram analisadas por cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), em cromatógrafo Shimadzu LC-10A, equipado com coluna de
fase reversa C
18
(Shim-Pack CLC-ODS, 25cm x 4,6mm ∅) e pré-coluna C
18
Shim-
pack CLC-ODS com diâmetro de partícula de 5 µm e diâmetro interno de 4,6 mm.
Como fase móvel, utilizou-se uma solução de MeOH/H
2
O 1:1, com um fluxo de 1,0
mL/min. A detecção espectrofotométrica (Shimadzu SPD-10A, UV-visível) dos
compostos de interesse foi realizada em comprimento de onda de 356 ηm. A
identificação da aloína foi efetuada com base no tempo de retenção de uma amostra
padrão (Fluka – 200µg/mL), analisada sob as mesmas condições cromatográficas.
Para efeitos de quantificação da aloína, construiu-se uma curva-padrão de aloína
(Fluka, r
2
= 0,9992 e y = 214,56x), foi elaborada, considerando-se a altura do pico
correspondente para efeito de cálculo com as concentrações de 10, 20, 50, 100, 120
e 200 µg/mL.
1.5.5 ANALISE QUANTITATIVA DE POLISSACARÍDEOS – FRAÇÃO
POLISSACARÍDICA (FP) E FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DIALISADA
(FPD)
As amostras de folhas coletadas de PC e PM foram lavadas imediatamente
após a chegada ao laboratório, seguido da remoção de suas extremidades basal (~
1cm) e apical (~ 10cm) e determinação do comprimento (cm) do material amostral
remanescente. A epiderme desta biomassa foi cuidadosamente retirada, produzindo
o extrato do parênquima de reserva, o qual foi subsequentemente pesado.
Para a obtenção do resíduo insolúvel em álcool a partir das amostras do
extrato do parênquima de reserva, utilizou-se o método descrito por Femenia et al.
26
(2003), com adaptações. O extrato do parênquima de reserva foi triturado em
aparelho multimixer (Walita
®
- modelo Billy RI 1340) e extensivamente filtrado sob
vácuo, em filtro de poliéster, para remoção do material fibroso. O volume final
coletado foi determinado em proveta, seguido da adição de 6 volumes de etanol
92ºGL, sendo a mistura final mantida a 4ºC/24h, para a floculação da fração
polissacarídica de alto peso molecular, doravante denominada fração polissacarídica
insolúvel em álcool (FP).
A FP obtida foi depositada em pesa-filtros, previamente limpos e tarados, e
seca em estufa a 55ºC (FEMENIA et al., 2003), até peso constante. O peso seco da
FP foi utilizado para fins de cálculo de rendimento de extração, considerando a
relação dos valores percentuais de FP e da massa do extrato do parênquima
reserva.
Foram pesados 200mg da FP de cada amostra e dissolvidos em 20mL de
água destilada, seguido da diálise da solução contra água destilada-deionizada
(membrana de acetato de celulose, cut-off 10.000-12.000 MW, Sigma), por um
período de 36 horas. O material dialisado foi coletado e liofilizado, denominando-se
fração polissacarídica dialisada (FPD).
1.5.6 HIDRÓLISE DA FPD E CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA (CCD)
Alíquotas (20mg peso seco/amostra) foram transferidas para microtubos de
centrífuga e adicionadas de 1mL de ácido trifluoroacético (TFA) 1N, seguido de
aquecimento em banho-maria (100ºC, 3h). Após esse período, os tubos foram
coletados, resfriados e centrifugados (5000 rpm/15 min). O sobrenadante (600µL) foi
coletado, transferido para microtubo e mantido sob fluxo de ar até a evaporação da
27
solução ácida. Ao final do processo, as amostras foram ressuspensas em 100µL de
água destilada-deionizada e armazenadas a -20ºC.
A determinação da composição monossacarídica nas amostras hidrolisadas
da FPD utilizou a cromatografia de camada delgada (CCD). Previamente à CCD, as
amostras em estudo diluídas em água destilada-deionizada (10x), seguido da coleta
de uma alíquota de 2µL/amostra, a qual foi aplicada em placa de alumínio recoberta
com sílica gel UV254 (10 x 7cm, Sorbent Tecnologies). A eluição utilizou como fase
móvel uma solução de n-butanol: ácido acético: éter etílico: água (9:6:3:1) e como
revelador anisaldeído sulfúrico, seguido do aquecimento da placa cromatográfica em
estufa a 120ºC/10 minutos (IKAN, 1991).
Os Rf das amostras e as intensidades de cores foram comparadas com
aqueles observados para padrões de açúcares (2 mg/mL, Sigma, St. Louis – MO), a
saber:
ramnose (Rf = 0,59), fucose (Rf = 0,52), frutose (Rf = 0,43), arabinose (Rf =
0,45), galactose (Rf = 0,42), ácido glucurônico (Rf = 0,40), manose (Rf = 0,47) e
glucose (Rf = 0,46).
1.5.7 ISOLAMENTO E ANÁLISE DA ACEMANANA.
O isolamento da acemanana, componente majoritário da fração
polissacarídica, seguiu a metodologia descrita por Camelini (2005), com adaptações.
Uma amostra de 200mg da FPD foi dissolvida em 40mL de água destilada,
seguido da aplicação de frações (2mL) deste material em coluna cromatográfica
(35cm de comprimento x 1,5cm de ∅ interno), contendo 35mL de resina Toyopear
HW-65F (Tosoh, Japan) como fase estacionária. As amostras foram eluídas com
uma solução de NaCl 0,2M, desprezando-se 12 mL de volume morto (Blue Dextran –
28
Sigma, St Louis – MO/USA) e coletando os primeiros 10 mL para obtenção da fração
polissacarídica de maior peso molecular.
Os eluatos obtidos foram reunidos, dialisados em membrana de acetato de
celulose (cut-off de 12.000 KDa, Sigma, St Louis – MO/USA) contra água destilada-
deionizada e posteriormente liofilizados. O perfil espectrométrico dos polissacarídeos
foi determinado por FT-IR e
13
C-RMN, conforme descrito a seguir.
1.5.8 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE
FOURIER (FT-IR)
As análises espectroscópicas de infravermelho foram executadas no
Departamento de Química da Universidade de Aveiro – Portugal. Amostras de FP,
FPD e de acemanana isolada foram analisadas em equipamento Bruker IFS 55,
operando em janela espectral de 500 a 4000 ondas.cm
-1
, com 128
varreduras/amostra e resolução de 4 ondas.cm
-1
. Foram adquiridos sequencialmente
cinco espectros por amostra, os quais foram processados e analisados com auxílio
do programa Opus
®
(Bruker, Rheinsteten, Germany).
1.5.9 ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)
DE
13
C
As análises de ressonância magnética nuclear (RMN) das amostras em
estudo foram realizadas no Laboratório de RMN (Departamento de Química,
Universidade Federal de São Carlos – São Paulo).
29
Foram obtidas as medidas de
13
C-RMN das amostras de FPD de PC, para
os períodos amostrais de julho e novembro/2005 e janeiro e março/2006.
Adicionalmente, foram obtidos os espectros referentes à acemanana isolada (item
4.7). Para tal, as amostras foram obtidas em sonda multinuclear de detecção direta
de 10mm, onde 60mg de amostra (peso seco), foram dissolvidas em 2,0mL de
DMSO-δ
6
com o auxílio de um sonicador. O tempo de máquina utilizado em cada
experimento foi de aproximadamente 24 horas usando aproximadamente 2,0 mL de
DMSO-d
6
.
Os espectros de
13
C RMN foram coletados em equipamento VARIAN Unit-
Plus, operando em 9,4 Tesla (400 MHz de frequência de ressonância de
13
C), com
janela espectral de 248,54 ppm, tempo de aquisição de 0,65s, número de pontos de
32 K, resolução digital de 1,52 Hz/ponto. Ácido trimetil silil propiônico (TMS) foi
utilizado como padrão interno e, para a obtenção dos espectros de
13
C RMN, os
FIDs (Free Induction Decay – Decaimento de Indutância Livre) coletados foram
submetidos ao processamento com função de janela exponencial multiplicativa com
alargamento de linha de 0,30 Hz e delay de 6µs. Os FIDs foram processados com o
auxílio do programa Topspin 1.3 - Bruker
®
.
1.5.10 QUIMIOMETRIA
Os espectros de FT-IR das amostras da FP e das FPD após processamento
foram submetidos à análise estatística multivariada (quimiometria), assim como uma
amostra representativa de cada estação do ano, analisadas por
13
C-RMN, via
determinação dos componentes principais (PCA), utilizando-se os dados
pertencentes à janela espectral compreendida entre 600 a 3400 ondas.cm
-1
.
30
Posteriormente, utilizou-se somente a região específica de polissacarídeos (900-
1200 ondas.cm
-1
), onde foram calculadas as distribuições e contribuições fatoriais, a
fim de determinar as bandas de relevância para a dispersão das amostras.
1.6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
1.6.1 ANÁLISE QUANTITATIVA DA ALOÍNA POR CLAE E RELAÇÃO DA SUA
PRODUÇÃO IN CAMPO COM FATORES CLIMÁTICOS.
A figura 6 mostra as variações na concentração de aloína no período
estudado.
Em coleta de plantas distintas, a maior concentração de aloína A foi
detectada no período referente ao mês de julho/2005, independente da população
em análise, i.e., PC (63,35µg/mL) e PM (63,42µg/mL). Nos meses de setembro e
novembro/2005, os teores da antraquinona na população PC apresentaram uma
redução (53,09µg/mL e 48,59µg/mL, respectivamente), elevando-se em janeiro
(49,34µg/mL) e março/2006 (53,55µg/mL). Em PM este padrão não foi observado,
tendo sido constatadas reduções constantes a partir do mês de maior produção
(julho/2005), atingindo o menor valor observado no experimento em março/2006
(43,86µg/mL). Os menores teores de aloína A para as populações em estudo (PC,
48,59µg/mL - novembro/2005 e PM, 43,86µg/mL - março/2006) foram 1,29 e 1,42
respectivamente superiores em relação à maior concentração observada ao longo
de todo período experimental (julho/2005).
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Mes es
Aloína A- ug.mL
-1
PC
PM
Mesmas
Plantas
Figura 6 – Concentração de aloína A em amostras de plantas distintas e em mesmas
plantas, coletadas no período de maio de 2005 a março de 2006 e julho de
2005 a maio de 2006, respectivamente. PC = Plantas produzidas em
campo; PM = Plantas micropropagadas, aclimatizadas e transferidas para
o campo.
32
As análises de aloína A em amostras de mesmas plantas revelaram a
ocorrência dos maiores valores nos meses de julho/2005 para PM (62,69µg/mL) e
setembro/2005 para PC (60,01µg/mL). As menores concentrações para plantas PC
e PM foram encontradas em março/2006, sendo 1,28 e 1,37 vez menores,
comparativamente aos maiores valores observados para as respectivas populações.
Nas plantas PM, reduções no conteúdo deste metabólito foram detectadas nos
meses de setembro e novembro/2005, com subseqüente aumento no mês de
janeiro/2006(56,49µg/mL).
Ao longo do período estudado, observou-se que as amostras de mesmas
plantas (MP) apresentaram menores diferenças de concentração (Tabela 1).
Diferenças significativas (P<0,05) foram encontradas entre as coletas de julho/2005
e março/2006 para plantas PM e entre as coletas de julho, setembro/2005 e
março/2006.
Tabela 1 – Concentração de aloína (µg/mL
± DP) em plantas micropropagadas (PM)
e em plantas produzidas no campo (PC) para coletas de mesmas
plantas (MP) e plantas distintas (PD), ao longo do período maio/2005 a
maio/2006.
MP PD
MESES PM* PC* PM* PC*
Maio/05
59,73±9,29
a
57,14±6,00
Julho/05
62,69±15,78
a
59,59±8,12
a
63,42±15,03 63,35±11,18
a
Setembro/05
52,66±6,40 60,01±9,30
b
48,41±7,36 53,09±6,70
b
Novembro/05
49,50±2,50 54,40±6,88
e
46,50±10,94
b
48,59±10,50
Janeiro/06
56,49±9,98 52,47±8,85
e
44,11±4,70
c
49,34±3,80
c
Março/06
45,61±10,97
b
46,68±7,09
c
43,86±5,47
d
53,55±5,07
Maio/06
54,93±5,03 48,72±3,52
e
* Os resultados referem-se às médias ± DP (n=7), realizadas em triplicata. Letras distintas nas
colunas denotam diferenças significativas (Tukey, p<0,05).
33
Diferenças quantitativas foram encontradas em coletas de plantas distintas,
nas PC nos períodos de coleta de julho/2005, setembro/2005 e janeiro/2006.
Entretanto, a maior variação foi observada nas amostras de PM.
As espécies vegetais apresentam épocas específicas, onde determinados
metabólitos encontram-se em maior concentração nos tecidos. Esta variação pode
ocorrer tanto ao longo do dia como entre as estações do ano (FALKENBERG et al.,
2004).
A variação sazonal resulta de um conjunto de fatores que alteram o
metabolismo vegetal, como a temperatura ao longo do ano, que provoca mudanças
nas rotas biossintéticas no vegetal, implicando em diferentes tipos e quantidades de
certas substâncias (SILVA, 2004). Neste contexto, buscou-se estabelecer o perfil de
variação do conteúdo de aloína A em amostras de extrato do parênquima clorofiliano
das populações em estudo, consoante às flutuações dos fatores climáticos insolação
total, precipitação pluviométrica bimestral, temperatura média diária bimestral e
umidade relativa diária bimestral, ao longo do período experimental.
A concentração da antraquinona em amostras de plantas distintas (Figura 7)
evidenciou um perfil similar ao observado para o fator climático insolação para PM e
PC, durante o período amostral maio-setembro/2005. Para o período subseqüente
(novembro/2005-março/2006), a concentração de aloína A manteve-se estável, não
apresentando, portanto, nenhuma relação com as variações observadas para a
insolação. Comportamento semelhante foi detectado para as amostras de mesmas
plantas, conforme demonstrado na figura 9, sugerindo que a diferenciação amostral
utilizada neste estudo (plantas distintas x mesmas plantas) não se mostrou
influenciada pelo fator climático em estudo.
34
Paez et al (2000) estudando plantas de babosa expostas a níveis de
irradiação concluíram que a aloína encontrava-se presente no extrato do
parênquima clorofiliano de todas as folhas, não sendo sua concentração influenciada
pela quantidade de irradiação a que foram expostas. No presente trabalho,
constatou-se que as variações da taxa de irradiação ao longo do período
experimental não afetaram significativamente a concentração de aloína A, sendo
que em todos os tratamentos detectou-se a presença deste composto. De forma
semelhante ao observado para a insolação, a variação sazonal do conteúdo de
aloína A não foi influenciada pela temperatura, tanto em amostras de plantas
distintas como de mesmas plantas (Figura 8 e 10).
Beppu et al. (2004), estudando a concentração de metabólitos em Aloe
arborecens em relação a variações de temperatura, no período de um ano,
observaram que os teores de aloína A foram superiores no verão em relação ao
inverno, diferindo do observado neste estudo. Em diversas espécies vegetais, como
Rosmarinus officinalis, por exemplo, estudos acerca da produção de óleos voláteis
em localidades distintas e com diferentes regimes térmicos mostraram a clara
influência deste fator na produção destes metabólitos, onde em regiões com maiores
temperaturas médias a produção foi favorecida (CELIKTAS, et al, 2007).
35
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Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
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Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Insolação (h e dec)
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Aloína A (ug/mL)
Insolação
Aloína A-PC
Figura 7 – Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para amostras de plantas
distintas, em relação ao fator insolação total, no período de maio de 2005 a
março de 2006.
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Aloína A (ug/mL)
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Aloína A-PC
Figura 8 – Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para amostras de
plantas distintas, em relação ao fator temperatura média diária
bimestral, no período de maio de 2005 a março de 2006.
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Aloína A (ug/mL)
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Aloína A-PC
Figura 9 – Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para amostras de
mesmas plantas, consoante à insolação total do período de maio de
2005 a março de 2006.
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Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
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Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Figura 10 – Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para amostras de
mesmas plantas, consoante à temperatura média diária bimestral do
período de maio de 2005 a março de 2006.
T mé bi st oC
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Aloína A (ug/mL)
)ral (meáriadia diT m
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39
O fator sazonal que teve maior influência sobre a produção de Aloína A foi a
precipitação pluviométrica (Figura 11). Os dados referentes ao fator precipitação
evidenciaram que os meses de junho-julho foram os mais secos dentre os períodos
estudados e que nesse período encontrou-se a maior concentração de aloína A. No
período subseqüente, o nível de chuvas aumentou de 107mm para 470mm, o que
resultou na diminuição da concentração desse metabólito. A umidade relativa
apresentou um aumento de 1% e não foi um fator significativo na biossíntese do
metabólito nos grupos estudados (Figuras 12 e 14).
O segundo período mais seco estudado para coletas de plantas distintas foi
o mês de fevereiro, o qual apresentou também a menor umidade relativa, sendo que
a associação destes fatores determinou nas plantas PC um aumento da
concentração de aloína A. De forma semelhante, em amostras de mesmas plantas
(Figura 13) o mês de maio foi marcado por uma precipitação pluviométrica de
apenas 117mm de chuva (Figura 13), uma condição que induziu elevação nas
concentrações daquele metabólito.
Os resultados obtidos reforçam a idéia de que a produção de aloína A por A.
barbadensis está diretamente relacionadas à pluviosidade bimestral, uma vez que se
trata de uma planta de característica predominantemente xerófita.
O fator pluviosidade é marcante para o aumento ou diminuição da produção
de metabólitos em algumas espécies, entretanto, estudos realizados por Southwell e
Bourke (2001) com Hypericum perfolatum mostraram que a pluviosidade não foi um
fator primordial na produção de hipericina.
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Aloína-PM
Figura 11 – Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para amostras de
plantas distintas, segundo os valores de precipitação pluviométrica
bimestral (mm) no período de julho de 2005 a maio de 2006.
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Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
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Aloína A (ug/mL)
Umidade Relativa
Aloína A-PM
Figura 12 – Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, para amostras de
plantas distintas, segundo os valores de umidade relativa diária mensal
(%) no período de julho de 2005 a maio de 2006.
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Aloína A (ug/mL)
ppt pluviométrica
Aloína A-PC
Figura 13 – Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, de amostras de
mesmas plantas, de acordo com a precipitação pluviométrica
bimestral (mm) no período de julho de 2005 a maio de 2006.
43
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Umidade Relativa diária
bimestral (%)
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Aloína A (ug/mL)
Umidade Relativa
Aloína A-PC
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Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Umidade Relativa diária
bimestral (%)
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Aloína A (ug/mL)
Umidade Relativa
Aloína A-PM
Figura 14 – Concentração de aloína A (µg/mL) em PM e PC, de amostras de
mesmas plantas, de acordo com a umidade relativa diária mensal (%)
no período de julho de 2005 a maio de 2006.
44
Em outras espécies, o estresse hídrico influenciou positivamente o acúmulo
de precursores do(s) metabólito(s) de interesse, como observado para Isatis tinctoria
L. e Polygonum tinctorium Ait. Nestas espécies, o composto isatan B, precursor do
índigo, teve sua síntese e acúmulo aumentados sob condições de déficit hídrico
(CAMPEOL, 2006). Em plantas típicas de florestas, o período de chuvas regula a
produção de metabólitos, tal como em Virola surinamensis. Nesta espécie, as
concentrações de monoterpenos foram maiores do que a concentração de
sesquiterpenos na estação chuvosa (LOPES et al., 1997).
1.6.2 ANÁLISE QUANTITATIVA DA FP E SUA RELAÇÃO COM FATORES
CLIMÁTICOS
Na figura 15 é demonstrada a variação do rendimento (g%) da fração
polissacarídica em relação ao peso fresco do parênquima de reserva de Aloe
barbadensis. Padrões distintos foram observados para as amostras de plantas
distintas e de mesmas plantas, ao longo do período experimental.
Conforme observado na figura 15, as amostras de plantas distintas (PC e
PM) apresentaram um perfil semelhante, quando comparadas entre si, a exceção do
mês de janeiro/2006 que marcou o maior pico de produção de polissacarídeos nas
PM, o que não foi observado em PC.
Para as coletas de mesmas plantas, os perfis não foram concordantes entre
si ao longo do período estudado.
45
Plantas
Distintas
Mesmas
Plantas
0,00
0,09
0,18
0,27
0,36
0,45
0,54
M
a
io/2
0
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Jul
h
o/
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0
5
S
et
em
b
ro
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N
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m
br
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200
5
Jane
ir
o/
20
06
Março/2006
Mes es
Rendimento da FP (g%)
PC
PM
0,00
0,09
0,18
0,27
0,36
0,45
0,54
J
u
lho/2005
Set
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Novembro/2
005
J
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0
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Ma
r
ço/
2006
Mai
o
/2006
Mes es
Rendimento da FP(g%)
PC
PM
Plantas
Distintas
Mesmas
Plantas
0,00
0,09
0,18
0,27
0,36
0,45
0,54
M
a
io/2
0
05
Jul
h
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20
0
5
S
et
em
b
ro
/20
05
N
ove
m
br
o/
200
5
Jane
ir
o/
20
06
Março/2006
Mes es
Rendimento da FP (g%)
PC
PM
0,00
0,09
0,18
0,27
0,36
0,45
0,54
J
u
lho/2005
Set
e
mb
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/
200
5
Novembro/2
005
J
an
e
ir
o
/20
0
6
Ma
r
ço/
2006
Mai
o
/2006
Mes es
Rendimento da FP(g%)
PC
PM
Figura 15 – Rendimento (g%) da fração polissacarídica em relação ao peso fresco do
parênquima de reserva, em plantas distintas e em mesmas plantas,
coletadas no período de maio de 2005 a março de 2006 e julho de 2005
a maio de 2006, respectivamente.
46
Em coletas feitas em mesmas plantas, as diferenças significativas (P<0,05;
Tabela 2) observadas nas plantas micropropagadas (PM) foram entre as coletas do
mês de julho/2005 e setembro/2005. As demais coletas não apresentaram
diferenças. Já as plantas produzidas em campo (PC) apresentaram diferenças
significativas entre si ao longo dos períodos amostrais.
Em amostras de plantas distintas as diferenças significativas em plantas
micropropagadas (PM) foram observadas para as coletas dos mêses de maio/2005 e
novembro/2005. As plantas produzidas em campo (PC) diferiram significativamente
nos períodos de maio/2005, setembro/2005, novembro/2005, janeiro/2006 e
março/2006 (tabela 2).
Tabela 2 – Rendimento da FP (%, p/p) de amostras de plantas micropropagadas
(MP) e plantas produzidas no campo (PC), para coletas de mesmas
plantas (MP) e plantas distintas (PD) ao longo do período maio/2005 a
maio/2006.
MP PD
MESES PM* PC* PM* PC*
Maio/05
0,13±0,03
a
0,17±0,07
a
Julho/05
0,20±0,03
a
0,23±0,06
a
0,20±0,03 0,23±0,06
Setembro/05
0,33±0,06
b
0,40±0,05
b
0,21±0,06 0,25±0,05
Novembro/05
0,31±0,05 0,33±0,05 0,23±0,06
b
0,29±0,06
b
Janeiro/06
0,30±0,15 0,22±0,08
c
0,37±0,08 0,27±0,05
c
Março/06
0,22±0,08 0,20±0,09
d
0,24±0,06 0,20±0,09
d
Maio/06
0,22±0,10 0,24±0,06
* Os resultados referem-se às médias ± DP (n=8), realizadas em triplicata. Letras distintas nas
colunas denotam diferenças significativas (Tukey, p<0,05).
Observou-se que as diferenças significativas foram maiores em PC para os
dois tipos de coletas, evidenciando que as plantas micropropagadas (PM)
47
mantiveram constante a produção de polissacarídeo durante todo o período
experimental. Contrariamente, a maior variância encontrada nas plantas produzidas
em campo (PC) pode ser atribuída a uma resposta fisiológica mais rápida, ante ao
estímulo da retirada da folha. Este fato, aliado aos fatores ambientais, somado à
idade das plantas e sua variabilidade genética são os mais prováveis elementos que
contribuíram para a variância.
De forma similar ao realizado para a análise de aloína A, foi estabelecido o
perfil de variação do conteúdo da FP das populações em estudo, consoante às
flutuações dos fatores climáticos insolação total, precipitação pluviométrica
bimestral, temperatura média diária bimestral e umidade relativa diária bimenstral ao
longo do período experimental. Os resultados são mostrados nas figuras 16, 17, 18
e 19.
Destaca-se que o maior valor de rendimento da FP (0,37%) de PM em
coletas de plantas distintas ocorreu no período de (dezembro/2005-janeiro/2006),
coincidindo com o período de maior insolação (Figura 16 - 426,4 h e dec). Já as
plantas PC apresentaram maior percentual da FP (0,29%) no período outubro-
novembro/2005, no final da primavera, momento de elevação da taxa de insolação.
A precipitação pluviométrica (Figura 22) para o período de maior produção
da FP em PM (0,37%) foi de 273,8mm (dezembro/2005-janeiro/2006), não
coincidindo com a época de maior intensidade de chuvas (470,7mm de chuva –
agosto/2005-setembro-2005). Analisando o comportamento da população de PC,
verificou-se que o rendimento da FP no período de maior precipitação pluviométrica
foi de 0,25% e que a maior produção aconteceu no período outubro-novembro/2005.
Novamente, não se verificou a relação entre precipitação pluviométrica e o
rendimento da FP.
48
A maior temperatura média para os períodos de coleta foi registrada no
período fevereiro-março/2006 (25,3ºC) para PM, referente à coleta de mesmas
plantas, ao mesmo tempo em que a maior concentração de polissacarídeos foi
observada no período de dezembro/2005-janeiro/2006. Nas coletas de plantas PC, o
pico de rendimento deu-se no período outubro-novembro/2006, período no qual a
temperatura encontrava-se em ascensão após o final do inverno.
Nas coletas em mesmas plantas não foi observado um padrão de
comportamento diante do fator insolação para as PM e PC. O pico de maior
rendimento da FP de PM foi observado no período de dezembro/2005-janeiro/2006,
período no qual se registrou a maior taxa de insolação total. Para as amostras de
PC, o período outubro-novembro/2005 foi o período de maior produção de
polissacarídeos, não apresentando relação com a insolação total.
No período de menor precipitação pluviométrica (junho-julho/2005; 107,2mm
de chuva) foi detectado o menor rendimento da FP para as amostras de PM de
coleta de mesmas plantas (Figura 20). No período seguinte (agosto-setembro/2005),
registrou-se o pico de maior rendimento da FP, consoante à precipitação
pluviométrica mais elevada do período experimental. Similarmente, em relação às
amostras da FP das plantas PC, o período de menor precipitação registrou a menor
concentração daquela macromolécula (junho-julho/2005), enquanto o período de
maior precipitação apresentou os maiores valores de rendimento (agosto-
setembro/2005).
49
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Insolação (h e dec)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
Insolação
Polissacarídeos-PM
0
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150
200
250
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Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Insolação (h e dec)
0
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0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rendimento da FP (g%)
Insolação
Polissacarídeos-PC
0
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200
250
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Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Insolação (h e dec)
0
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0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
Insolação
Polissacarídeos-PM
0
50
100
150
200
250
300
350
400
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Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Insolação (h e dec)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rendimento da FP (g%)
Insolação
Polissacarídeos-PC
Figura 16 – Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC, para
amostras de plantas distintas, consoante às condições de insolação
total observados no período de maio de 2005 a março de 2006.
50
0
5
10
15
20
25
30
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
T média diária bimestral (oC)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP (g%)
Temperatura Média
Polissacarídeos-PM
0
5
10
15
20
25
30
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
T média diária bimestral (oC)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rendimento da FP (g%)
Temperatura Média
Polissacarídeos-PC
0
5
10
15
20
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30
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
T média diária bimestral (oC)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP (g%)
Temperatura Média
Polissacarídeos-PM
0
5
10
15
20
25
30
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
T média diária bimestral (oC)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rendimento da FP (g%)
Temperatura Média
Polissacarídeos-PC
Figura 17 – Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC, para
amostras de plantas distintas, consoante às condições de temperatura
média diária mensal observadas no período de maio de 2005 a março
de 2006.
51
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Insolação (h e dec)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rendimento da FP (g%)
Insolação
Polissacarídeos-PM
0
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100
150
200
250
300
350
400
450
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Insolação (h e dec)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
Insolação
Polissacarídeos-PC
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Insolação (h e dec)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rendimento da FP (g%)
Insolação
Polissacarídeos-PM
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Insolação (h e dec)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
Insolação
Polissacarídeos-PC
Figura 18 – Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC, para
amostras de mesmas plantas, segundo o fator climático insolação total,
no período de julho de 2005 a maio de 2006.
52
0
5
10
15
20
25
30
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
T média diária bimestral (oC)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP (g%)
Temperatura Média
Polissacarídeos-PM
0
5
10
15
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30
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
T média diária bimestral (oC)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP(g%)
Temperatura Média
Polissacarídeos-PC
0
5
10
15
20
25
30
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
T média diária bimestral (oC)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP (g%)
Temperatura Média
Polissacarídeos-PM
0
5
10
15
20
25
30
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
T média diária bimestral (oC)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP(g%)
Temperatura Média
Polissacarídeos-PC
Figura 19 – Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC, para
amostras de mesmas plantas, segundo o fator climático temperatura
média diária mensal, no período de julho de 2005 a março de 2006.
53
O efeito da umidade relativa em PC e PM (Figuras 21 e 23) para as
amostras de plantas distintas e de mesmas plantas não mostrou uma relação direta
com a produção da FP.
No que concerne ao efeito da temperatura média sobre as amostras de
mesmas plantas (PM), uma relação inversa foi detectada para este fator e o
rendimento da FP (Figura 19). Assim, para o período com maior temperatura (25,3ºC
em fevereiro-março/2006) foi registrado o menor rendimento da FP (0,22g%). Para
as amostras de PC, o período de menor temperatura média (17,9ºC; agosto-
setembro/2005), apresentou o maior rendimento da FP (0,41g%). Entretanto, em
amostras de plantas distintas (Figura 17), a variação da temperatura média em PC e
PM não apresentou um efeito aparente sobre a concentração da FP.
Os fatores ambientais controlam a concentração e a produção de
metabólitos secundários como a biossíntese de terpenos, que é diretamente afetada
pela temperatura, irradiância, sazonalidade e disponibilidade de água. A redução da
fotossíntese, devido ao stress hídrico, reduz consideravelmente a biossíntese de
terpenos (DELFINE et al., 2005), sendo considerada o fator de maior restrição ao
crescimento das plantas via redução da assimilação de carbono (CORREIA et al.,
2006).
O fator hídrico interferiu de forma preponderante no acúmulo de
polissacarídeos nas folhas de babosa, principalmente em amostras de mesmas
plantas. A baixa pluviosidade registrada no período junho-julho/2005 coincidiu com o
momento de menor rendimento da FP, possivelmente em conseqüência da própria
característica xerofítica da planta.
54
0
50
100
Figura 20 – Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC, de
amostras de plantas distintas, de acordo com a condição de precipitação
pluviométrica bimestral (mm), no período de maio de 2005 a março de
2006.
150
200
350
450
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Ppt pluviométrica bimestral (mm)
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
250
300
400
500
ppt pluviométrica
Polissacarídeos-PM
0
50
150
250
400
500
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Ppt pluviométrica bimestral (mm)
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
450
100
200
300
350
ppt pluviométrica
Polissacarídeos-PC
0
50
100
200
350
450
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Ppt pluviométrica bimestral (mm)
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
150
250
300
400
500
ppt pluviométrica
Polissacarídeos-PM
0
50
150
250
400
500
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Ppt pluviométrica bimestral (mm)
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
450
350
300
200
100
ppt pluviométrica
Polissacarídeos-PC
55
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Umidade Relativa diária
bimestral (%)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP (g%)
Umidade Relativa
Polissacarídeo-PM
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Umidade Relativa diária
bimestral (%)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP(g%)
Umidade Relativa
Polissacarídeos-PC
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Umidade Relativa diária
bimestral (%)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP (g%)
Umidade Relativa
Polissacarídeo-PM
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar Abr-Mai
Umidade Relativa diária
bimestral (%)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP(g%)
Umidade Relativa
Polissacarídeos-PC
Figura 21 – Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC, de
amostras de plantas distintas, de acordo com a condição de umidade
relativa diária mensal (%), no período de maio de 2005 a março de 2006.
56
0
50
Figura 22 – Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC, para as
amostras de mesmas plantas, segundo a precipitação pluviométrica
bimestral (mm), no período de julho de 2005 a maio de 2006.
100
150
400
500
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Ppt pluviométrica bimestral (mm)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rendimento da FP (g%)
450
200
250
300
350
ppt pluviométrica
Polissacarídeos-PC
0
50
200
300
400
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
ppt pluviométrica bimestral (mm )
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
100
150
250
350
450
500
ppt pluviométrica
Polissacarídeos-PM
0
50
150
400
500
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Ppt pluviométrica bimestral (mm)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rendimento da FP (g%)
450
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250
300
200
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ppt pluviométrica
Polissacarídeos-PC
0
50
200
300
400
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
ppt pluviométrica bimestral (mm )
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Rendimento da FP (g%)
500
450
350
250
150
100
ppt pluviométrica
Polissacarídeos-PM
57
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Umidade Relativa diária
bimestral (%)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rentimento da FP (g%)
Umidade Relativa
Polissacarídeos-PC
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Umidade Relativa diária
bimestral (%)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP (g%)
Umidade Relativa
Polissacarídeos-PM
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Umidade Relativa diária
bimestral (%)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Rentimento da FP (g%)
Umidade Relativa
Polissacarídeos-PC
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Abr-Mai Jun-Jul Ago-Set Out-Nov Dez-Jan Fev-Mar
Umidade Relativa diária
bimestral (%)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Rendimento da FP (g%)
Umidade Relativa
Polissacarídeos-PM
Figura 23 – Rendimento (g%) da fração polissacarídica (FP) em PM e PC, para as
amostras de mesmas plantas, segundo a umidade relativa diária mensal
(%), no período de julho de 2005 a maio de 2006.
58
A elevada irradiação luminosa é frequentemente associada a elevadas
taxas assimilatórias e apresenta influência sobre a fotossíntese (MONNEVEUX et
al., 2003). Em indivíduos de babosa expostos a níveis diferentes de irradiação foi
constatado que em plantas parcialmente sombreadas (420-670 µmol.m
-2
.s
-1
) a
alocação de carbono para as raízes e a quantidade de massa seca de tecido foliar
sofreram restrições. Somente a concentração de carboidratos solúveis não foi
afetada negativamente, sendo que seu conteúdo foi maior no extrato do parênquima
de reserva em relação ao extrato do parênquima clorofiliano. Estes resultados
sugerem uma indução ao aumento da concentração de glucose no parênquima de
reserva foliar sob condições de maior irradiância. Já em Heliantus annuus L.
observou-se que plantas submetidas a estresse hídrico e sob elevada irradiância,
tiveram suas concentrações de carboidratos totais não estruturais igualmente
aumentadas (CORREIA et al., 2006).
Nos resultados encontrados em plantas distintas, o fator irradiância teve
forte influência sobre a produção dos polissacarídeos, principalmente em PM. Uma
vez que a irradiância é geralmente associada à temperatura, assume-se que estes
fatores colaboraram em alguma extensão para os valores de rendimento
observados, a exemplo do que é descrito que para algumas culturas, como em
aspargos, onde a concentração de açúcares solúveis é maior em meses mais frios e
maior na estação quente (SHOU et al., 2007). No que concerne especificamente à
babosa, poucos são os dados disponíveis na literatura acerca do efeito de fatores
climáticos sobre o comportamento metabólico desta espécie, i.e., biossíntese,
acúmulo e mobilização dos polissacarídeos de reserva. Alguns estudos referem-se
a cultivos experimentais em ambientes controlados e não em cultivos estabelecidos
em campo (BEPPU et al., 2004), ou utilizam um pequeno número de indivíduos
59
cultivados em jardins botânicos (GUTTERMAN et al., 2000), condições estas que
mais dificilmente poderão refletir o comportamento de populações de plantas
cultivadas em escala comercial. Em função disto, as comparações de resultados de
estudos neste contexto deverão ser feitas com a devida cautela.
1.6.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO EXTRATO DO PARÊNQUIMA DE
RESERVA, DA FP E DA FPD
Os parâmetros físico-químicos avaliados para o extrato do parênquima de
reserva estão mostrados na tabela 3.
Observou-se a existência de diferenças não proeminentes entre os tipos de
amostras em estudo, exceção feita ao teor de sólidos solúveis, os quais no caso
específico de A. barbadensis são representados principalmente pela glucose e em
menores concentrações frutose e galactose (PAEZ, et al., 2000).
Alguns dos resultados i.e. pH e percentagem de polpa, encontrados neste
experimento assemelham-se ao descrito na literatura (Waller et al., 2004), que
avaliaram as características de extratos de parênquima de reserva em amostras
oriundas de três propriedades no Texas (EUA), ao longo de um período de cultivo de
112 semanas. Os autores descreveram que a percentagem de polpa encontrada foi
de 0,11g%, pH de 4,56, apresentando, portanto, valores bastante próximos aos
encontrados no presente estudo. De forma similar, Femenia et al. (1999 e 2003)
descreveram valores de conteúdo de água (umidade %) em plantas de babosa de 4
anos de idade, cultivadas nas Ilhas Baleares (Espanha), variando de 98,5% a
99,55%.
60
TABELA 3 – Parâmetros físico-químicos de amostras de folhas e do extrato do
parênquima de reserva de Aloe barbadensis Miller, cultivada em Paulo
Lopes, SC, coletadas em setembro/2006.
Amostras do Extrato do Parênquima de
Reserva Foliar
Parâmetros
PM PC
Comprimento (cm)*
41,00 ± 4,99 46,00 ± 1,77
Massa (g)*
208,86 ± 33,01 239,80 ± 32,34
% polpa*
0,16 ± 0,02 0,17 ± 0,04
pH*
4,66 ± 0,15 4,75 ± 0,09
Umidade (%)**
99,03 ± 0,11 99,09 ± 0,14
Cinzas (mg)**
0,15 ± 0,02 0,12 ± 0,01
Sólidos Solúveis Totais (
o
Brix)*
1,10±0,08 2,31±0,41
*As amostras referem-se às médias ± DP (n=8)
** As análises compreenderam a reunião de 8 amostras e foram realizadas em triplicata
Em um estudo realizado por estes pesquisadores com plantas cultivadas
nas Ilhas Baleares (Espanha), conteúdos de cinzas, proteínas e açúcares solúveis,
no extrato do parênquima de reserva, foram 23,61%, 8,92% e 26,81%,
respectivamente, demonstrando a influência de fatores agronômicos e de ambiente
sobre os parâmetros estudados.
Na tabela 4 são mostrados os valores de concentração de carboidratos
totais (mg.mL
-1
), açúcares redutores (mg.mL
-1
) e proteínas totais (mg.mL
-1
)
em
amostras do extrato do parênquima de reserva de plantas de babosa.
61
TABELA 4 – Parâmetros bioquímicos referentes ao extrato do parênquima de
reserva de Aloe barbadensis Miller, cultivadas em Paulo Lopes (SC),
coletadas em setembro/2006.
Amostras do Extrato do Parênquima de
Reserva Foliar
Parâmetros
PM PC
Carboidratos Totais (mg.mL
-1
)*
4,00±0,23 4,74±0,27
Açúcares Redutores (mg.mL
-1
)*
3,09±0,40 3,44±0,95
Proteínas Totais (mg.mL
-1
)*
0,09±0,01 0,10±0,02
* As amostras compreenderam a reunião de oito indivíduos, as análises foram realizadas em
triplicata e os valores expressam a média ± DP.
Verifica-se que o extrato possui um alto conteúdo glicídico, devido,
principalmente, à presença de mono e polissacarídeos. Em menor escala,
encontrou-se a fração protéica, que representa em termos percentuais cerca de 9%
do peso seco do extrato, um dado semelhante ao descrito por Femenia et al. (1999)
para uma população de plantas de babosa cultivada na Espanha.
A partir do extrato do parênquima de reserva obtiveram-se as FP e FPD, a
partir de amostras de mesmas plantas (MP) de plantas distintas (PD). Similarmente,
ao estudo realizado para o extrato do parênquima de reserva, alguns parâmetros
bioquímicos foram analisados, sendo os resultados descritos nas tabelas 5 e 6.
62
TABELA 5 – Parâmetros bioquímicos da FP e FPD de Aloe barbadensis, referentes às plantas distintas de PM e PC,
coletadas no período de maio de 2005 a março de 2006.
FP FPD
Coletas
Carboidratos
totais (mg/mL)
Açúcares
redutores
(mg/mL)
Glucose
(ug/mL)
Proteínas totais
(mg/mL)
Carboidratos
totais (mg/mL)
Proteínas totais
(mg/mL)
PC mai/05*
0,152±0,053
a
0,048±0,003
a
31,57±1,34ª 0,021±0,001
c
0,152±0,011
a
0,019±0,002
c
PC jul/05*
0,172±0,037
a
0,068±0,015
a
31,54±1,16ª 0,024±0,005
b
0,120±0,016
a
0,020±0,001
b
PC set/05*
0,157±0,031
a
0,059±0,005
a
16,35±5,35
be
0,011±0,003
a
0,154±0,005
a
0,007±0,001
a
PC nov/05*
0,164±0,026
a
0,062±0,003
a
17,52±1,16
ce
0,016±0,004
a
0,166±0,030
a
0,016±0,001
d
PC jan/06*
0,166±0,044
a
0,060±0,009
a
14,40±2,69
df
0,016±0,002
a
0,108±0,022
a
0,014±0,001
e
PC mar/06*
0,159±0,040
a
0,052±0,007
a
12,85±1,16
ef
0,015±0,004
a
0,156±0,016
a
0,014±0,003
f
PM mai/05*
0,141±0,016
a
0,074±0,015
a
43,61±0,67
bg
0,013±0,001
a
0,140±0,007
a
0,012±0,003
c
PM jul/05*
0,175±0,053
a
0,062±0,014
a
32,04±0,69
ch
0,018±0,005
a
0,171±0,029
a
0,017±0,001
b
PM set/05*
0,147±0,012
a
0,067±0,006
a
47,50±1,78
dg
0,012±0,002
a
0,148±0,004
c
0,007±0,002
a
PM nov/05*
0,165±0,051
a
0,060±0,011
a
27,25±1,78
eh
0,021±0,001
a
0,157±0,043
d
0,011±0,001
d
PM jan/06*
0,179±0,045
a
0,056±0,004
a
15,57±1,78ª 0,012±0,001
a
0,082±0,005
e
0,010±0,001
e
PM mar/06*
0,116±0,016
a
0,065±0,009
a
40,88±3,09
fg
0,020±0,002
a
0,115±0,009
b
0,012±0,001
f
* As amostras referem-se a triplicatas, expressando as médias ± DP. O teste de separação de médias foi efetuado utilizando o teste de Tukey
com p<0,05. Letras diferentes nas mesmas colunas e por coleta, indicam diferenças significativas.
63
TABELA 6 – Parâmetros bioquímicos da FP e FPD de Aloe barbadensis, referentes a mesmas plantas de PM e PC,
coletadas no período de julho de 2005 a maio de 2006
* As amostras referem-se a triplicatas, expressando as médias ± DP. O teste de separação de médias foi efetuado utilizando o teste de Tukey
com p<0,05. Letras diferentes nas mesmas colunas e por coleta, indicam diferenças significativas.
FP FPD
Coletas
Carboidratos
totais (mg/mL)
Açúcares
redutores
(mg/mL)
Glucose
(ug/mL)
Proteínas totais
(mg/mL)
Carboidratos
totais (mg/mL)
Proteínas totais
(mg/mL)
PC jul/05*
0,172±0,037
a
Nd
31,93±0,67
a
0,023±0,005
a
0,152±0,011
d
0,020±0,001
a
PC set/05*
0,126±0,022
a
Nd
26,48±4,10
a
0,021±0,009
a
0,120±0,016
b
0,018±0,001
b
PC nov/05*
0,193±0,030
a
Nd
38,16±4,42
a
0,012±0,002
a
0,194±0,005
a
0,010±0,002
c
PC jan/06*
0,178±0,030
a
Nd
39,33±1,78
a
0,016±0,003
a
0,166±0,030
d
0,012±0,001
d
PC mar/06*
0,200±0,016
a
Nd
19,86±3,50
a
0,015±0,000
a
0,108±0,022
c
0,014±0,001
e
PC mai/06*
0,159±0,026
a
Nd
26,48±1,35
a
0,018±0,002
a
0,141±0,016
d
0,010±0,001
c
PM jul/05*
0,175±0,053
a
Nd
31,93±0,67
b
0,018±0,005
a
0,137±0,007
a
0,017±0,001
c
PM set/05*
0,153±0,015
a
Nd
26,47±4,10
c
0,013±0,008
a
0,149±0,154
a
0,015±0,001
d
PM nov/05*
0,183±0,044
a
Nd
38,16±4,42
b
0,020±0,006
a
0,145±0,004
a
0,014±0,001
e
PM jan/06*
0,157±0,028
a
Nd
39,33±1,78
b
0,022±0,005
a
0,155±0,045
a
0,010±0,001
a
PM mar/06*
0,173±0,021
a
Nd
19,85±3,50
a
0,026±0,008
a
0,169±0,002
a
0,010±0,001
a
PM mai/06*
0,150±0,009
a
Nd
26,47±1,34
d
0,019±0,009
a
0,148±0,010
a
0,016±0,001
b
64
Em ambas as coletas foi observada uma flutuação nas concentrações dos
carboidratos totais e proteínas, porém não foram detectadas diferenças significativas
para estes parâmetros ao longo do período experimental. Ao mesmo tempo, não foi
detectada variação de interesse (p<0,05) na concentração dos metabólitos em
questão, quando da diálise das amostras. As moléculas de alto peso (> cut-off)
como as proteínas e polissacarídeos não são eliminadas pelos poros da membrana
utilizada. No entanto, as concentrações de carboidratos totais obtidas após a diálise,
em geral, são menores que as de amostras não dialisadas, possivelmente pela
eliminação de açúcares solúveis de baixo peso molecular (< cut-off).
Fica evidente o efeito da técnica de diálise quando se compara a FP e FPD
entre as coletas. A FPD apresenta uma grande variância dos dados, o que não
acontece com a FP. A glucose foi o constituinte que apresentou a maior variância de
dados entre as coletas, evidenciando a grande variação existente deste açúcar nas
amostras, apesar de apresentarem-se em baixa concentração.
65
1.6.4 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MONOMÉRICA DOS
POLISSACARÍDEOS DA FPD.
Os cromatogramas da FPD hidrolisada são mostrados na figura 24.
Considerando que todas as amostras cromatografadas apresentaram um perfil
composicional monossacarídico semelhante, os resultados apresentados na figura
16 foram considerados representativos da variabilidade química de interesse, para o
material em estudo. A partir dos valores de Rf e dos padrões de cor dos açúcares,
caracterizou-se a composição monomérica da FPD, sendo esta composta
principalmente por manose e, em menor proporção, por glucose e galactose. Outros
monossacarídeos eventualmente presentes em menores concentrações, i.e.,
arabinose, ramnose, xilose e ácidos urônicos (WALLER et al., 1978; FEMENIA et al.,
1999; FEMENIA et al., 2003;) não foram detectados pela metodologia empregada.
Estudos realizados por Femenia et al. (2003), via cromatografia gasosa,
demonstraram que a FPD de A. barbadensis é composta principalmente por manose
e glucose, com menores concentrações de ramnose, fucose, arabinose, xilose e
ácidos urônicos.
A predominância de monômeros de manose no hidrolisado da FPD
corrobora com os resultados de Reynolds (2004), contudo, a razão manose/glucose
mostrou-se variável entre indivíduos de A. barbadensis, bem como entre espécies
daquele gênero.
66
Amostras
Padrões
Figura 24 – Perfil cromatográfico dos padrões de açúcares: Ramnose (Rf = 0,59), fucose
(Rf =0,52), frutose (Rf = 0,43), arabinose (Rf = 0,45), galactose (Rf = 0,42),
ácido glucurônico (Rf = 0,40), manose (Rf = 0,47), glucose (Rf = 0,46), da
mistura de padrões (mix). Amostras (1-8) e da mistura de padrões (P).
Os dados da CCD apresentados revelaram a composição monossacarídica
das amostras em estudo de forma qualitativa, sendo uma ferramenta útil à
determinação primária da autenticidade da matéria-prima provinda desta espécie
vegetal, uma vez que contaminantes de natureza glicídica poderiam ser detectados
por esta técnica. Estudos de caráter quantitativo, via densitometria ótica, encontram-
se em andamento.
Ram
Ara Gal
Man
Fru Fuc
Glu
Ac.
glu
Mix
.
.
.
.. .
.
.
. ..
. . .
. .
. .
1 2 3 5
4 6 7
8 P
67
1.6.5 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA FP, DA FPD E DA ACEMANANA
POR ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL DE INFRAVERMELHO (FT-IR)
SEGUIDA DE ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA.
As amostras da FP e da FPD foram analisadas com o objetivo de
caracterizar os grupamentos funcionais presentes na estrutura daqueles
biopolímeros. A região estudada compreendeu as bandas localizadas na janela
espectral compreendida entre 600 e 3400 ondas.cm
-1
.
A figura 25 mostra o perfil do espectro de infravermelho de amostras da FP
de plantas micropropagadas (PM) e a figura 26 refere-se à FP de plantas produzidas
no campo (PC).
O estiramento assimétrico da ligação C–H nos grupos –CH
3
e –CH
2
– em
compostos alifáticos estão representados nas bandas em 2930-2888 ondas.cm
-1
.
Estes grupamentos podem estar associados a ésteres ou ácidos graxos (LAMBERT
et al., 1998; PETIBOIS et al., 2001; YANG et al., 2005).
Bandas características do estiramento de ligação C=O foram detectadas na
região de 1730 ondas.cm
-1
e representam grupos aldeídos ou grupamento acetil
(LAMBERT et al., 1998; PRASHANTH et al., 2006).
68
PM – março/2006 PM – janeiro/2006
Figura 25 – Espectros de FT-IR (600 a 3400 ondas.cm
-1
) representativos da FP de plantas
micropropagadas (PM). As bandas de maior intensidade são mostradas em
destaque.
Bandas de interesse, associadas à deformação axial do grupamento
funcional C=O e à deformação do grupamento NH
2
de amidas primárias e
secundárias (em 1645, 1636, 1568 e 1524 ondas.cm
-1
, WILLIAMS; FLEMING, 1995;
DÉLERIS, PETIBOIS, 2003) foram encontradas nas amostras. A presença destes
grupamentos sugeriu a existência de compostos protéicos associados à FP, uma vez
que as bandas acima mencionadas ocorrem na região espectral definida para estes
compostos, i.e., 1720-1600 ondas.cm
-1
(estiramento da ligação C=O de amidas
primárias) e 1600-1480 ondas.cm
-1
(deformação axial da ligação N-H de amidas
secundárias) (PETIBOIS et al., 2001; DÉLERIS, PETIBOIS, 2003). Posteriormente, secundárias) (PETIBOIS et al., 2001; DÉLERIS, PETIBOIS, 2003). Posteriormente,
69
esta informação foi confirmada através do doseamento de proteínas nas amostras,
conforme descrito no item 6.1.3.
PC – março/2006 PC – janeiro/2006
Figura 26 – Espectros de FT-IR (600 a 3400 ondas.cm
-1
) representativos da FP de plantas
produzidas no campo (PC), com destaque para as bandas de maior
intensidade.
Dois sinais verificados na região de 1457 e 1431 ondas.cm
-1
foram
atribuídos à deformação axial de grupos CH
3
e a deformação no plano de
grupamentos OH em ácidos carboxílicos, respectivamente (LAMBERT et al., 1998).
As bandas observadas em 1376 e 1377 ondas.cm
-1
, por sua vez, resultam do
estiramento da ligação C–H em compostos alifáticos ou de grupamentos acetil, bem
como de OH fenólicos (BOERIU et al., 2004; PRASHANTH et al., 2006).
Um sinal em 1320 ondas.cm
-1
foi observado em amostras provenientes de
coletas realizadas em mesmas plantas e especificamente em algumas coletas em
70
plantas micropropagadas, atribuindo-se ao estiramento do grupo C–O em anel
siringil (BOERIU et al., 2004; XU et al., 2006).
De forma bastante freqüente, observou-se um sinal na região de 1238 cm
-1
;
referente à região de carboidratos. Porém, a banda característica do polissacarídeo
localiza-se em 1032 cm
-1
e representa o anel de carbono em composto cíclico
(WILLIANS, FLEMING, 1995; LAMBERT et al., 1998). Segundo Kemsley et al.
(1995), os carboidratos geralmente exibem um sinal intenso na região de 900-1300
onda.cm
-1
, região considerada de impressão digital de polissacarídeos. A banda
específica em 1032 onda.cm
-1
foi atribuída por Prashanth et al. (2006) ao
estiramento da ligação C–O quando ligado a grupos C–O–C o que caracteriza para
os autores grupos acetilados. Conjuntamente à região pertencente aos carboidratos,
as bandas de 955 e 958 onda.cm
-1
apareceram como sinal pertencente ao
grupamento =CH fora do plano.
Ainda, os sinais relativos às bandas de 880-881 onda.cm
-1
foram definidos
como pertencentes às ligações HC=CH
2
em grupamentos vinílicos (LAMBERT et al.,
1998) ou à estruturas piranosídicas de β-D-manose e β-D-glucose, segundo Santa
Rita (1984).
Por fim, as bandas registradas em 769 e 677 onda.cm
-1
estariam ligadas
aos sinais característicos de estiramento da ligação CH em anéis aromáticos,
mostrando a presença de possíveis contaminantes de natureza fenólica (WILLIANS,
FLEMING, 1995).
Quando são comparados os espectros de um padrão comercial com o
material obtido da cromatografia de gel permeação (acemanana - Figura 27), nota-se
que muitos dos sinais não são correspondentes.
71
Padrão
Acemanana
Figura 27 – Espectros de FT-IR (600 a 3400 onda.cm
-1
) representativos do padrão
comercial de acemanana e da acemanana obtida via cromatografia de gel
permeação da FPD.
Em relação ao padrão comercial, a acemanana apresenta bandas intensas
nas regiões de 1600 a 1730 onda.cm
-1
, características de grupamentos C=O de
aldeídos e NH
2
de amidas primárias (proteínas), respectivamente, e 1200 onda.cm
-1
que se refere ao estiramento da região C–O–C de carboidratos. Uma vez que essas
bandas continuam presentes após o procedimento cromatográfico, pode-se sugerir
que o polissacarídeo não foi suficientemente purificado, ou mesmo que essas
substâncias contaminantes estejam fortemente ligadas à estrutura polissacarídica.
De interesse, a banda que caracteriza aquele polissacarídeo aparece em diferentes
números de onda nos espectros, uma vez que o padrão comercial apresenta o pico
em 1004 onda.cm
-1
, enquanto a acemanana em 1031 onda.cm
-1
. Em função disto,
pode-se inferir que o polissacarídeo isolado não esteja totalmente purificado ou
72
ainda que o padrão comercial utilizado não seja um padrão adequado. Como
estratégia para elucidar esta questão, análises subseqüentes do perfil estrutural
destes polissacarídeos foram realizadas utilizando-se a
13
C-RMN e os resultados
serão discutidos a posteriori. As regiões subseqüentes, entre 880 a 710 onda.cm
-1
,
foram detectadas em ambas as amostras e indicam, possivelmente, a presença de
compostos fenólicos associados àquelas macromoléculas.
Os resultados encontrados utilizando a técnica de FT-IR são de grande
importância, no que diz respeito à caracterização da fração polissacarídica bruta e
das subseqüentes frações purificadas do extrato do parênquima de reserva de A.
barbadensis. No entanto, a espectroscopia de infravermelho isoladamente não
permite a elucidação completa acerca da estrutura dos polissacarídeos de interesse,
recomendando o uso de técnicas complementares como a
13
C-RMN.
Ainda neste contexto, a utilização de uma abordagem quimiométrica dos
dados espectrais de FT-IR, através da análise de componentes principais (PCA), foi
tomada como ferramenta para estipular o grau de dispersão das amostras entre
plantas de diferentes coletas e entre diferentes épocas.
A figura 28 mostra o gráfico de distribuição fatorial (scores) das amostras
pertencentes à FP extraída de mesmas plantas e de plantas distintas. Analisando a
distribuição das amostras em relação aos eixos PC1 e PC2, verificou-se que aqueles
componentes explicam 67% da variância presente nas amostras. A dispersão
observada pode ser explicada através da análise dos gráficos de contribuição fatorial
(loadings), os quais indicam os grupamentos funcionais que majoritariamente
concorrem para a distribuição amostral observada nos eixos PC1 e PC2.
73
Figura 28 – Distribuição fatorial (PCA) de PC1 e PC2, das amostras da FP referentes às
mesmas plantas (1 – PM, 2 – PC) e plantas distintas (3 – PM, 4 – PC). Os
grupos circulados em vermelho fora da grande elipse indicam amostras
consideradas outliers e a seta dentro da elipse indica a amostra de
acemanana (A).
Uma tendência das amostras provindas de PC agruparem-se ao longo do
eixo PC1 negativo foi detectada, enquanto as amostras de PM mostraram a
tendência de agrupamento em PC2 positivo. As amostras pertencentes ao padrão
comercial de acemanana igualmente não aparecem inseridas no agrupamento
majoritário, demonstrando diferenças quanto à sua composição química
principalmente aos artefatos contaminantes de natureza protéica, lipídica e fenólica.
A acemanana foi dispersa no quadrante PC1 negativo-PC2 negativo.
74
A análise da contribuição fatorial (Figura 29) dos dados espectrais de FT-IR
revelou a presença de sinais de mais alta intensidade na região de 1730 840
onda.cm
-1
e predominantemente no quadrante negativo. As bandas que mais
intensamente contribuíram para o perfil observado na separação foram detectadas
em 3157 onda.cm
-1
, relativa a grupamentos –NH
2
de aminoácidos, em 1371
onda.cm
-1
, relativos à deformação da ligação C–O–H pertencentes a grupos
fenólicos, em 1240 onda.cm
-1
, relativo ao estiramento da ligação C–O–C de éteres e
a banda em 1029 onda.cm
-1
, que se refere à ligação CH
2
–OH de álcoois,
característico de polissacarídeos.
Adicionalmente, amostras coletadas em maio/2006 foram separadas das
demais, possivelmente devido à presença de banda em 1425 onda.cm
-1
, referente à
deformação angular de -OH no plano (a qual pode estar associada a ácidos
fenólicos), bem como à banda em 1320-1325 onda.cm
-1
que sugere resultar de
ligação C–O. Em menor extensão, a banda em 1733 onda.cm
-1
, característica de
carbonila de lipídios ou ésteres, foi um contribuinte à separação observada.
75
Figura 29 – Contribuição fatorial de PC1 e PC2 das amostras da FP, referentes às mesmas
plantas e plantas distintas, obtidas a partir dos dados espectrais de FT-IR
(600-3400 cm
-1
).
Para a FPD, a variância dada em relação aos eixos PC1 e PC2 foi de 74% e
13%, respectivamente, sendo detectada uma grande dispersão amostral ao longo
dos eixos PC1 e PC2 (Figura 30). Um grupo menor com ocorrência em PC1 positivo-
PC2 negativo compreendeu a amostra relativa ao padrão comercial, evidenciando
novamente que este material difere estruturalmente daquele dialisado. De forma
similar ao observado para a amostra da FP, a acemanana permaneceu no grupo
majoritário, i.e., PC1 positivo-PC2 positivo.
76
Figura 30 – Distribuição fatorial (PCA) dos componentes principais 1 (PC1) e 2 (PC2) para
os dados espectrais de FT-IR (600-3400 cm
-1
) das amostras da FPD,
referentes às mesmas plantas (1 – PM, 2 – PC) e plantas distintas (3 – PM, 4 –
PC). A seta destaca a amostra de acemanana.
A análise do gráfico de contribuição fatorial (Figura 31) revela que as
bandas que apresentaram maior contribuição na separação foram detectadas em
2935 onda.cm
-1
, pertencentes a grupamentos CH
3
e –CH
2
–, possivelmente
indicando a presença de lipídeos, enquanto as bandas situadas em 1739 onda.cm
-1
,
1518 onda.cm
-1
e 1228 onda.cm
-1
são relativas ao estiramento da ligação C=O em
ésteres, ao estiramento em ligações em anéis aromáticos e a deformação axial em
ligações C–C–N em aminas.
77
Diante dos resultados encontrados, pode-se sugerir que a separação destes
grupos esteja sendo efetuada principalmente por artefatos como resíduos de
proteínas, lipídios e compostos de natureza fenólica. A intensidade das bandas é
fator a ser considerado na separação.
Figura 31 – Contribuição fatorial de PC1 das amostras da FPD, referentes às mesmas
plantas e plantas distintas, para os dados espectrais de FT-IR (600-3400 cm
-1
).
Quando se restringe a análise dos componentes principais aos dados da
janela espectral de caracterização de polissacarídeos (900 a 1300 onda.cm
-1
- Figura
32), 97% da variância amostral da FP é explicada pelos componentes principais 1
(PC1) e 2 (PC2).
78
Figura 32 – Distribuição fatorial (PC1 e PC2) dos dados espectrais (FT-IR, 900-1300 cm
-1
)
das amostras da FP, referentes às mesmas plantas (1 – PM, 2 – PC) e plantas
distintas (3 – PM, 4 – PC). A seta dentro da elipse indica a amostra de
acemanana e a externa, uma amostra outlier. O grupo circulado em vermelho
representa a amostra de padrão comercial.
As amostras apresentaram uma dispersão proeminente em relação ao eixo
PC1. A amostra C294 que na análise da FP na região de 600-3400 onda.cm
-
,
apresentou-se como outlier, ao se restringir a região de análise, foi enquadrada
dentro do agrupamento principal.
As análises anteriores abordaram o efeito dos tipos de coleta da biomassa
foliar para efeitos de obtenção das frações polissacarídicas. Posteriormente, decidiu-
79
se analisar o efeito da diálise no perfil estrutural de FT-IR das amostras de
polissacarídeos em estudo.
As figuras 33 e 34 apresentam o efeito de diálise quando se comparam as
FP e FPD de coleta de plantas distintas, ao longo do período estudado.
Figura 33 – Distribuição fatorial (PCA) de PC1 e PC2 dos dados espectrais de FT-IR (600-
3400 onda.cm
-1
) das amostras da FP (3 – PM e 4 – PC círculo menor em PC1
positivo) e FPD (1 – PM e 2 – PC círculo menor em PC1 negativo) de plantas
distintas, juntamente com a acemanana (seta) e a amostra de padrão
comercial (grupo circulado em vermelho)
Apresentando uma variância de 71% em PC1 e 12% em PC2, a distribuição
fatorial de mesmas plantas mostrou uma tendência de separação das FP e da FPD
em relação ao eixo PC1, onde as FP localizaram-se em PC1 positivo e as amostras
da FPD em PC1 negativo. A amostra do padrão comercial manteve sua tendência de
80
isolamento do grupo principal, enquanto a acemanana apresentou-se agrupada
juntamente com as amostras dialisadas. Da mesma forma, quando se analisa o
gráfico de plantas distintas (Figura 34), este mostrou também uma separação em
função do eixo PC1. Entretanto, diferentemente dos resultados encontrados para as
amostras de mesmas plantas, o agrupamento da FP deu-se no eixo PC1 negativo e
a FPD no eixo PC1 positivo, predominantemente.
Figura 34 – Distribuição fatorial (PCA) de PC1 e PC2 dos dados espectrais de FT-IR (600-
3400 onda.cm
-1
) das amostras da FP (3 – PM e 4 – PC círculo menor em PC1
positivo) e FPD (1 – PM e 2 – PC círculo menor em PC1 negativo) de plantas
distintas, juntamente com a acemanana (seta) e a amostra de padrão
comercial (grupo circulado em vermelho)
81
Com o propósito de avaliar a interferência da acemanana e do padrão
comercial na distribuição das amostras, foi executada uma análise utilizando as
amostras de plantas distintas, igualmente ao que se observa na figura 34 excluindo-
se a acemanana e o padrão comercial. O resultado desta análise pode ser
visualizado na figura 35.
Figura 35 – Distribuição fatorial (PCA) de eixos PC1 vs. PC2, das amostras referentes às
FP (3 – PM e 4 – PC círculo menor) e FPD (1 – PM e 2 – PC) de plantas
distintas excluída a acemanana e a amostra de padrão comercial, do espectro
de FT-IR da região compreendida entre 600-3400 onda.cm
-1
.
A quimiometria apresentou uma variância de 84% em relação ao eixo PC1 e
9% em relação ao eixo PC2. Predominantemente, as amostras da FP dispersaram-
se no eixo PC1 negativo, enquanto as amostras da FPD dispersaram-se em PC1
82
positivo. Observou-se a que a inserção da acemanana e do padrão comercial no
conjunto amostral determinou um novo padrão de distribuição, principalmente no
que diz respeito à FP, que apresentou uma tendência maior de deslocamento em
relação ao eixo PC1 positivo. Após diálise, as amostras mostraram um perfil de
distribuição bastante diferenciado, revelando que o tratamento influenciou de
maneira significativa no perfil da distribuição fatorial.
1.6.6 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA FPD E DA ACEMANANA POR
ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR de
13
C
(
13
C-RMN) SEGUIDA DE ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA.
Os estudos de
13
C em polissacarídeos permitem obter informações
estruturais úteis. Assim, e considerando que os desvios químicos (δ ppm) são
sensíveis à forma do açúcar, os carbonos anoméricos têm maiores valores de δ
entre 90 e 98 ppm nas piranoses, comparativamente às furanoses, os carbonos
ligados a grupos –OH apresentam ressonâncias típicas em δ = 65-67 ppm, enquanto
os carbonos ligados a grupos –OH axiais têm valores de δ inferiores aqueles ligados
a grupos –OH equatoriais e, finalmente, os átomos de carbono envolvidos em
ligações glicosídicas sofrem desvios consideráveis para alta freqüência, cujos
valores refletem a conformação molecular total (GIL, GERALDES, 2002).
Os espectros de RMN de
13
C da FPD referem-se à coleta de plantas
distintas para amostras de PC e PM. Foram escolhidas amostras representativas de
cada estação do ano a fim de comparar o efeito de época sobre as plantas
estudadas. Assim, amostras coletadas nos meses de julho/2005 e novembro/2005
83
foram consideradas representativas do inverno e primavera, respectivamente,
enquanto as amostras de janeiro/2006 e março/2007 representam as estações do
verão e outono.
Foram coletados dois espectros adicionais, referentes à acemanana isolada
pela coluna de gel filtração e de uma amostra de padrão comercial. Os espectros
referentes às amostras de PM e PC são mostrados nas figuras 36 e 37,
respectivamente.
Figura 36 – Espectros de
13
C-RMN (9,4 Tesla) de amostras da FPD de plantas distintas
(PM), representativos das quatro estações do ano, em ordem cronológica
crescente.
84
Os espectros mostram que ao longo das estações os perfis de sinais
referentes à estrutura dos polissacarídeos, i.e., δ = 20,5 ppm, 60,3-100,6 ppm e
170,2 ppm, referentes ao grupamento CH
3
, aos carbonos da estrutura
polissacarídica e ao grupamento C=O, respectivamente.
Outros sinais que aparecem em 129,8 ppm nas coletas dos meses de
novembro/2005, janeiro/2006 e março/2006 (PM – Figura 36), possivelmente
pertencem a grupos aromáticos de compostos fenólicos contaminantes das
amostras, ligados à estrutura do polissacarídeo (LAMBERT et al., 1998;
SILVERSTEIN, WEBSTER, 2000).
Figura 37 – Espectros de 13C-RMN (
9,4 Tesla) de amostras da FPD de plantas distintas
(PC), representativos das quatro estações do ano, em ordem cronológica
crescente.
85
Conjuntamente, outros sinais, um em 124,6 ppm, apenas observado na
coleta de julho nas PC (Figura 37), foi identificado igualmente como um grupamento
aromático e o outro com δ = 62,9 ppm foi identificado como um resíduo pertencente
a amidas. Nas amostras de julho/2006 em PM e em março/2006 em PC, não foram
observados os sinais δ = 28,8 – 30,6 ppm, relativos à grupamentos metílicos de
grupos acetil (WILLIANS, FLEMING, 1995).
Em se tratando dos deslocamentos químicos relativos à caracterização do
componente polissacarídico especificamente, alguns são considerados
determinantes para a caracterização de sua estrutura, constituindo a impressão
digital da molécula. Assim, os valores de deslocamentos químicos relativos aos
carbonos do anel piranosídico e carbonos ligantes do anel são mostrados nas
figuras 38 e 39, enquanto os valores relativos a cada deslocamento estão listados na
tabela 7.
Os sinais foram atribuídos a carbonos das unidades de manose, sendo que
não foram observados sinais referentes a outros açúcares, sendo as ressonâncias
compreendidas entre 79 ppm a 85 ppm relativos a anéis furanosídicos (PERLIN et
al., 1970 Apud Santa Rita, 1984).
86
O
H
H
OH
H
H
H
O
OH
OH
O
H
O
CH
3
O
CH
3
Figura 38 – Detalhe da estrutura química do constituinte básico da acemanana isolada da
FP de Aloe barbadensis, com as indicações dos respectivos valores de
deslocamentos químicos (
13
C-RMN, 9,4 Tesla).
H
H
OH
H
H
O
OH
O
H
H
OH
H
H
H
OH
OH
OH
20,5
170,2
60,3
100,5
76,8
78,5
97,7
71,0
75,2
n
69,6
O
H
H
OH
H
H
H
O
OH
OH
O
H
O
CH
3
O
CH
3
H
H
OH
H
H
O
OH
O
H
H
OH
H
H
H
OH
OH
OH
20,5
170,2
60,3
100,5
76,8
78,5
97,7
71,0
75,2
n
69,6
87
Tabela 7 – Deslocamentos químicos (δ ppm) de
13
C-RMN da FPD de coletas de plantas distintas de PM e PC
DESLOCAMENTOS QUÍMICOS (ppm)
PC
Jul/2005
PC
Nov/2005
PC
Jan/2006
PC
Mar/2006
PM
Jul/2005
PM
Nov/2005
PM
Jan/2006
PM
Mar/2006
Acemanana
Padrão
Comercial
C=O 170,2 170,2 170,2 170,3 170,2 170,4 170,3 170,3 170,3 171,9
C1 - Livre
100,5 100,4 100,5 100,8 100,6 100,6 100,3 100,5 100,2 100,6
C1- Substituído
97,7 97,4 97,5 98,1 97,7 97,8 97,5 99,7 97,4 97,1
C2 76,8 76,8 76,8 77,2 76,9 77,1 76,9 76,8 76,7 77,0
C3 75,2 75,3 75,1 75,3 75,2 75,2 75,3 75,1 75,0 76,6
C4 Nd Nd Nd 73,1 Nd Nd 78,5 Nd 72,8 72,8
C5 70,9 71,1 71,0 71,3 71,0 71,0 71,8 71,0 70,8 71,8
C6-Livre 60,8 60,3 60,0 60,8 60,3 60,5 60,3 60,4 60,3 60,6
C6 - Substituído 69,6 69,6 69,5 70,0 69,6 69,8 69,6 69,6 69,6 69,8
CH
3
20,5 20,5 20,5 20,9 20,5 20,6 20,5 20,5 20,5 20,9
S1 – – – – – – – – 177,6 –
S2
– – – – – – – – 173,6 –
S3 – – – – – – – – – 177,2
S4 – – – – – – – – – 176,5
S5 – – – – – – – – – 174,5
S6 – – – – – – – – – 172,8
S7 – – – – – – – – – 172,1
S8 – – – – – – – – –
S9 – – – 171,0 – – – – – –
S10 – – – 171,0 – – – – – –
S11 – – – – – – – 170,3 – –
S12 – – – 170,0
– – – – – –
S13 169,8 169,8 – – – – 169,8 169,8 169,8 –
88
S14
– – – – – 169,5 – – 169,5 –
S15 – 169,4 – – 169,4 – 169,4 169,4 – –
S16 169,3 – 169,3 – – – 169,3 – 169,3 –
S17 – – – – – – – – 159,6 –
S18 – – – 137,0 – – – – – –
S19 – 134,3 – – – – – – – –
S20 – – – – – – – – – 132,7
S21 – – – – – – – – – 131,8
S22 129,6 129,6 – – – – 129,6 129,6 – 129,5
S23 – – – – – 129,8 – – – –
S24 – – – – – – – – – 129,3
S25 – – – – – – – – – 128,8
S26 124,6 – – – – 124,7 – – – –
S27 – – – – – – – – – –
S28 – 100,6 – – – 100,7 – – –
S29 – – – 100,4 – – – 100,4 – –
S30 – – – 100,1 – – – 100,1 – –
S31 – – – – – – 99,9 – 99,9 –
S32 – – – – – – – – 99,5 –
S33 – – – – – 99,1 – – – –
S34 – – – – – – – 97,8 – –
S34 97,7 – – – – – – – 97,7 –
S35 – – – – 97,5 – – – – –
S36 – 97,2 – – – – 97,3 – – –
S37 – – – – – – – – – 96,9
S38 96,0 – – – – – – – – –
S39 – – – – – 96,2 – – – –
S40 – – – – – – – – – 92,6
S41 – – – – – – – – – 92,1
S42 – – – 91,6 – – – – – –
S43 – – – – – – – 89,3 – –
S44 – 87,8 – – – – – – – –
S45 – – – 84,2 – – – – – –
S46 – – – – – – – – – 79,1
S47 – – – – – – – – – –
89
S48
– – – – – – 77,1 – – –
S49 – – – – – – – 76,7 – –
S50 – – – – – – – – – –
S51 – – – 73,4 – – – – – –
S52 – – – – – 73,1 – – –
S53 – 72,9 – 72,9 – – – – –
S54 – – 72,8 – – – – – – 72,8
S55 72,7 – – – – – – – – –
S56 – – – 72,3 – – 72,3 – – –
S57 – – – – – – – – 72,2
S58 – – – 72,2 – – – – – –
S59 – 71,9 – – – – – – – –
S60 – – – – – – – – 71,6 –
S61 – – – – – – 71,4 – – –
S62 – – – – – – – 71,1 – –
S63 – – 70,5 – – – – – – –
S64 – – – – – – – – – –
S65 – – – – – – – – – 67,0
S66 – – – – – – – – 66,9 66,8
S67 – – – – – – – 63,6 – –
S68 – – – 63,4 – – – – – –
S69 63,0 – – 63,0 63,1 63,1 – – – –
S70 – – – – – – – – – –
S71 – – – – – – – 63,2 – –
S72 – – – – – – – – 63,0 –
S73 – 62,9 – 62,8 – – 62,9 – 62,9
S74 – – – 62,1 – – – – –
S75 – – – 60,5 – – – – – 60,6
S76 – – – 60,3 – – – – – –
S77 60,1 60,1 – – – – – 60,2 – –
S78 – 59,8 – – – – – 59,7 – –
S79 – – – – – – – – – 53,4
S80 49,0 – – – – – – – –
S81 – – – – – – – – – 44,4
S82 – 30,6 – – – – – – – 30,6
90
S83 – – – – – – – – – –
S84 – – – – – – – – – 29,4
S85 – – – – – – – – – –
S86 – – – – 29,1 – – – –
S87 28,8 – 28,9 – 28,8 – 28,9 28,9 28,8 –
S88 – – – – – – – – – 26,4
S89 – – – – – – – – – 25,0
S90 – – – – – – – – 23,1 23,1
S91 – – – – – – – – 21,4 –
S92 – – – – – – – – – 18,7
S93 – – – – – – – – 13,8 –
S94 10,7 – – – – – – – – –
91
C=O C-1SC-1L
CH
3
C-2 C-3 C-4 C-5
DMSO
d6
C-6S C-6L
TMS
C=O C-1SC-1L
CH
3
C-2 C-3 C-4 C-5
DMSO
d6
C-6S C-6L
TMS
Figura 39 – Espectro de
13
C-RMN (9,4 Tesla) de amostra da FPD evidenciando os sinais de
deslocamentos químicos (δ
ppm
) referentes à estrutura polissacarídica
encontrada em A. barbadensis.
Sinais observados em 100,5 ppm indicam a presença de carbono 1 livre,
enquanto as ressonâncias observadas em 97,7-98,1 ppm informa da existência de
substituição, proveniente da ligação do tipo β-(1Æ4) em unidades manopiranosil.
Trabalhos recentes (LEUNG et al., 2004; CHOW et al., 2005; KARDOŠOVA,
MACHOVÁ, 2006) revelam que para a acemanana de Aloe barbadensis foram
obtidos valores semelhantes para o deslocamento químico do carbono 1 livre e
substituído: 100,6 e 98,1 ppm, respectivamente. Esta molécula possui C6 livre, o
que é assinalado pelo deslocamento em 60,4 ppm, e C6 substituído, marcado pelo
92
sinal em 170,2 e 20,5 ppm, representando os grupamentos C=O e CH
3
do acetil,
respectivamente (Figura 39).
Somente os espectros das amostras de PC de março/2006, PM de
janeiro/2006, da acemanana e do padrão comercial revelaram a existência de um
sinal detectável para carbono 4. A amostra de PC de março/2006 apresentou um
sinal em 73,2 ppm referente a C4, enquanto para as amostras de acemana e do
padrão comercial esta ressonância foi detectada em 72,8 ppm e 72,9 ppm,
respectivamente. Este carbono, devido à característica da ligação glicosídica é de
detecção restrita, por ser um centro quiral. Em Aloe barbadensis, Kardošová e
Machová (2006) mencionam que o sinal de C4 localiza-se em 77,1 ppm, enquanto
outros trabalhos mostram que para espécies do mesmo gênero, a ressonância deste
carbono foi detectada em 78,5 ppm, 72,3 ppm, 71,3 ppm, ou ainda em 79,0 ppm,
sugerindo discrepâncias estruturais entre as amostras analisadas (LEUNG et al.,
2004; YAGI et al., 1986).
É importante ressaltar que o padrão comercial utilizado por empresas
apresentou um perfil espectral mais rico em sinais, comparativamente ao encontrado
na acemanana purificada via cromatografia de gel permeação a partir da FPD
(Figura 40) e também na própria FPD. É importante observar que o sinal em 20,5
ppm, característico do grupamento acetil não foi detectado. Em função disto, sugere-
se que o padrão comercial disponível pode não apresentar um grau de pureza
adequado para ser utilizado de maneira confiável em sistemas de análise, produção
e de controle de qualidade daquela macromolécula ou de produtos derivados de A.
barbadensis.
93
Acemanana
Padrão Comercial
Figura 40 – Espectro de
13
C-RMN (9,4 Tesla) da amostra de acemanana isolada da FPD e
de amostra de padrão comercial proveniente de A. barbadensis.
94
Os dados espectrais de
13
C-RMN das amostras em estudo foram
submetidos à análise dos componentes principais e a distribuição fatorial dos
componentes principais 1 (PC1) e 2 (PC2) é mostrada na figura 41.
Figura 41 – Distribuição fatorial (PCA) de PC1 e PC2 calculada a partir dos dados
espectrais de
13
C-RMN das amostras da FPD, referentes a amostras de
plantas distintas. A seta em (2) indica o padrão comercial, enquanto a seta
em (9) a amostra de PC coletada em março/2006
A contribuição de PC1 e PC2 corrobora na elucidação de 86% da variância
das amostras em estudo. Observou-se claramente o predomínio das amostras em
PC1 negativo e PC2 negativo. De forma semelhante ao observado na análise por
espectroscopia vibracional de infravermelho (FT-IR) associada à quimiometria, o
padrão comercial de acemanana evidenciou um perfil espectral de
13
C-RMN
discrepante (PC1 + e PC2 -) em relação às demais amostras em estudo. Tal fato
95
subsidia a crítica relativa à qualidade da amostra comercial, como composto de
referência para análises mais detalhadas, no âmbito de sistemas produtivos ou
analíticos.
A amostra 9 (PC, março/2006) apresentou um comportamento diferenciado
em relação às demais (PC1 + e PC2 +), um fato atribuído, em alguma extensão, à
ausência de um sinal característico em 29 ppm, referente ao grupamento metílico,
comparativamente às demais amostras.
Figura 42 – Contribuição fatorial (PC1) dos dados espectrais de
13
C-RMN das amostras da
FPD (PC e PM).
96
A análise da contribuição fatorial de PC1 (Figura 42) apresentou sinais de
interesse, notadamente no quadrante positivo, com destaque para as ressonâncias
em 160 ppm (proteínas), 118-120 ppm (compostos fenólicos) e 71 ppm (carbono 5
do anel manopiranosídico) no quadrante positivo. De interesse em PC1 negativo,
apenas o sinal em 72 ppm atribuído ao C4 foi um contribuinte importante na
separação das amostras estudadas.
Esses sinais atribuídos aos carbonos do anel e grupamentos a eles
associados, como o grupamento acetil (δ=170 e 20 ppm) são sinais intensos e em
parte responsáveis pelo padrão de distribuição das amostras uma vez que a
presença de um sinal intenso deste grupo demonstra o grau de degradação do
polissacarídeo.
Por outro lado, moléculas contaminantes como proteínas (δ=62 ppm),
formam outra fonte importante no que concerne à distribuição amostral.
97
1.7 CONCLUSÕES
Em coletas de plantas distintas, o maior pico de produção de aloína A foi
detectado em julho/2005 para as duas populações (PM e PC).
Os fatores climáticos insolação e temperatura média diária bimestral não
afetaram os conteúdos de aloína A nas amostras em estudo, enquanto a
precipitação pluviométrica bimestral influenciou de forma significativa a concentração
deste metabólito.
Em amostras de PD, a irradiação e a precipitação pluviométrica bimestral
foram os fatores climáticos de efeito proeminente sobre a biossíntese de
polissacarídeos do parênquima de reserva.
A diálise das amostras da fração polissacarídica mostrou-se como um pré-
tratamento com efeito sobre as concentrações de carboidratos totais e proteínas
totais, ao longo do período experimental.
O perfil cromatográfico da FPD hidrolisada revelou a predominância de
manose, glucose e galactose como açúcares principais que a compõe.
Os espectros de FT-IR revelaram sinais de grupamentos funcionais de
proteínas, lipídios e, em menor concentração, de compostos fenólicos, nas amostras
da FP e da FPD, sugerindo a ligação destes à estrutura dos polissacarídeos em
estudo.
A análise quimiométrica dos dados espectrais de FT-IR mostrou claramente
o efeito de coleta, quando se comparam amostras dialisadas e não dialisadas.
A distribuição quimiométrica das amostras foi influenciada principalmente
pela presença de sinais de grupamentos funcionais de compostos contaminantes da
fração polissacarídica, i.e., proteínas, lipídeos e compostos fenólicos.
98
As amostras de acemanana e do padrão comercial influenciam na
separação quimiométrica obtida a partir dos dados espectrais (FT-IR) do conjunto
total de amostras, sendo o padrão comercial de acemanana um outlier.
O perfil espectral de
13
C-RMN das amostras não apresentou variações de
interesse durante o período experimental, sugerindo uniformidade estrutural da
composição polissacarídica.
A análise dos dados espectrais de
13
C-RMN demonstrou que a acemanana
obtida neste estudo apresentou um grau de pureza superior em relação ao padrão
comercial utilizado na indústria como referência, sugerindo que o controle de
qualidade efetuado para este polissacarídeo deve ser otimizado no âmbito de sua
produção em larga escala.
A análise quimiométrica (PCA) dos dados de
13
C-RMN das amostras
sazonais da FPD revelou a existência de similaridades estruturais, exceção feita ao
padrão comercial de acemanana, cuja separação em relação às amostras da FPD
foi determinada principalmente pelas ressonâncias de C1, C2, C3, C4, C5, C6 do
anel piranosídico, bem como do grupamento acetil.
99
CAPÍTULO 2 – ATIVIDADES BIOLÓGICAS
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 ASPECTOS HISTÓRICOS E ETNOFARMACOLÓGICOS
O conhecimento acerca das babosas remonta a antiguidade. Em meados do
século 16, segundo comentários de Mattioli e Laguna sobre o capítulo 23 do Livro III
da obra de Dioscórides, a planta chamada aloe era comum em grande parte da
Itália, sendo cultivada em jardins e vasos (QUER, 1982).
Evidências históricas indicam a origem africana das babosas, havendo
registros de espécies cultivadas no Egito há milhares de anos, assim como sua
utilização pelos povos do Mediterrâneo que remontam ao ano de 400 a.C. (ARAÚJO
et al., 2002). As babosas têm sido usadas terapeuticamente desde o período de
dominação romana (REYNOLDS, DWECK, 1999; TURNER et al., 2004). O extrato
do parênquima clorofiliano seco é usado como catártico, enquanto o extrato do
parênquima de reserva é amplamente aceito, desde o século 4 a.C., como um
remédio para o alívio de dores e tratamento de uma variedade de doenças (CHOW
et al., 2005).
Os chineses têm utilizado há milênios as babosas no tratamento da
constipação intestinal (CHUNG et al., 1996; TIAN, HUA, 2005) e como fortificante do
estômago (CHUNG et al., 1996). As babosas são utilizadas na medicina tradicional
mexicana e em outros países com finalidades medicamentosas e cosméticas
(VÁSQUEZ et al., 1996; QUI et al., 2000; BAUTISTA-PÉREZ et al., 2004;
RODRÍGUEZ et al., 2005).
100
Embora existam mais de 250 espécies do gênero Aloe, somente três ou
quatro dessas apresentam propriedades medicinais, sendo Aloe barbadensis a de
maior interesse terapêutico e nutricional (ARAÚJO et al., 2002). As babosas são
plantas importantes, largamente utilizadas na medicina popular, devido aos seus
efeitos benéficos, tais como, calmante da pele, no tratamento de queimaduras, em
diabetes, hepatite, obesidade e no controle das taxas de lipídios no sangue
(DANHOF, McANALLEY, 1983; GRINDLAY, REYNOLDS, 1986; SYDISKIS et al.,
1991; McANALLEY et al., 1995; AVILA et al. 1997; OKAY et al., 2001) e ainda como
agente cicatrizante, antiulcerativo, antineoplásico e antiviral (SAKAI, 1989;
KOBAYASHI et al., 1993; MAEDA et al., 1998; KIM et al., 1999; PAEZ et al., 2000).
Da mesma forma, Simões et al. (1996) citam o uso popular do suco das
folhas de Aloe arborescens Miller, no Rio Grande do Sul como laxante, emenagogo,
antifebril e ainda como abortivo. Em aplicações tópicas, o suco é utilizado como
emoliente, revulsivo, cicatrizante e para aliviar as dores de queimaduras (TYLER et
al., 1971; NATH et al., 1992; CHITRA et al., 1998).
Uma prática usual do povo Ioruba, do sudoeste da Nigéria, é a confecção de
sabonetes manufaturados localmente utilizando extratos vegetais, com utilização em
ferimentos, úlceras e outras afecções da pele. Aloe barbadensis e Ageratum
conyzoides são, por exemplo, incorporados a estes sabonetes pelos curandeiros
tradicionais para o tratamento de furúnculos, micoses, ferimentos e odores corporais
(MOODY et al., 2004).
101
2.2 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DO GÊNERO Aloe
2.2.1 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DOS COMPOSTOS QUÍMICOS DO
EXTRATO DO PARÊNQUIMA CLOROFILIANO
A aloe-emodina é a aglicona responsável pelo forte efeito laxativo, sendo
seu mecanismo creditado à influência na motilidade do intestino grosso, um
fenômeno associado à inibição da bomba de Na
+
/K
+
, ou dos canais de Cl
-
na
membrana colônica, resultando em acelerado trânsito do bolo fecal através do cólon.
Adicionalmente, aquele metabólito secundário estimula a secreção de muco e de
cloretos que determinam um aumento do conteúdo de fluidos na luz intestinal,
determinando um efeito laxativo (CAPASSO et al., 1983; ISHII et al., 1990; ESCOP,
2003). Uma outra antraquinona, a isobarbaloína é decomposta em aloe-emodina-9-
antrona e barbaloína, quando administrada oralmente (ISHII et al., 1990).
Atenção considerável vem sendo dada à possibilidade de uso da aloe-
emodina como fármaco na quimioterapêutica para o tratamento de vários tipos de
câncer. Tem sido relatado que a aloe-emodina apresentou atividade antitumoral em
câncer de origem neuroectodérmico (PECERE et al., 2000), em neuroblastoma,
carcinoma de pulmão, hepatoma celular e em linhagens de células leucêmicas,
células promieloleucêmicas HL-60 e em células de carcinoma de Merkel (LEE et al.,
2001; LEE et al., 2001b; CHEN et al., 2002; WASSERMAN et al., 2002; CHUNG et
al., 2003).
O mecanismo de ação da aloe-emodina envolve possivelmente o processo
de apoptose, em razão da fragmentação do DNA e das características morfológicas
apresentada pelas células, assim como das evidências de modulação das famílias
102
de proteínas Bcl-2, Bax e Faz e do aumento na concentração das proteínas
apoptóticas p53 e p21. O mecanismo de indução à apoptose de aloe-emodina
parece envolver a proteína quinase C (PKC). Os agentes que inibem as isozimas de
PKC podem bloquear a progressão de alguns tipos de tumores. Informações dos
efeitos da aloe-emodina na proliferação celular e sobre isozimas de PKC são de
interesse, considerando que a superprodução de PKC está relacionada ao rápido
crescimento de gliomas em ratos (KUO et al., 2002). Evidências bioquímicas para a
ação apoptótica da aloe-emodina indicam que células da linhagem CH27, tratadas
com aloe-emodina, mostram ativação de caspases e um aumento na concentração
relativa de citocromos C, na fração citosólica. O aumento na concentração de
citocromo C resulta em depleção mitocondrial e finalmente na morte apoptótica das
células CH27 (LEE et al., 2001).
A emodina é uma antraquinona que tem sido mencionada por exibir
propriedades anti-inflamatórias, pela redução da produção de citocinas em linfócitos-
T humanos e células endoteliais (KUMAR et al, 1998; KUO et al., 2001). Ela
demonstra também efeitos antiproliferativos em várias linhagens celulares de câncer
ao promover a apoptose via caspases (SRINIVAS et al., 2003), ou ainda por meio da
inibição da proteína tirosina quinase (CHAN et al., 1993). Os efeitos antibacterianos
da emodina em Escherichia coli são explicados em razão deste interferir na
respiração e também no transporte de solutos nas membranas. Outras
antraquinonas derivadas de Aloe barbadensis, como a aloe-emodina, têm também
mostrado efetiva atividade antibacteriana em concentrações micromolares,
especialmente para bactérias gram-positivas (CHAN et al., 1993; KUMAR et al.,
1998; KUO et al., 2001; SRINIVAS et al., 2003).
103
Várias antraquinonas, entre as quais a emodina, têm mostrado atividade
antiviral e/ou virucida contra vírus envelopados (COHEN et al., 1996; ANDERSEN et
al., 1991). O extrato glicerínico de babosa e aloe-emodina isolada exerceram efeito
virucida em vírus envelopados como herpes vírus simples, vírus da varicela-zoster,
pseudorabies e influenza vírus, mais provavelmente pelo rompimento causado ao
envelope viral (SYRDISKIS et al., 1991).
As antraquinonas, além de atuarem como antioxidantes e como captadoras
de radicais livres, podem exibir atividade antiprotozoária. É também citada sua
atividade inibitória sobre o crescimento de Helicobacter pylori, uma bactéria
associada ao surgimento de câncer gástrico (WANG et al., 1998; CAMACHO et al.,
2000).
Ácido crisofânico (1,8-dihidróxi-3-metilantraquinona) tem mostrado inibir a
evolução dos estágios do ciclo de replicação de vírus não envelopados como o
poliovírus (Picornaviridae) (SEMPLE et al., 2001). Outras antraquinonas, como a
reína, alizarina e quinalizarina exibiram atividade antiviral não virucida contra
citomegalovírus humano (BARNARD et al., 1992).
Somando-se aos bem documentados efeitos positivos sobre a saúde
humana, existem também os efeitos negativos destas antraquinonas que têm sido
descritos, uma vez que um grande número de antraquinonas pode causar desde
irritação da pele e eritrema até o aumento da proliferação celular (WINTERS et al.,
1981; DANHOF, McANALLY, 1983). Quinonas podem elicitar esses efeitos ao
induzir reações com grupos tióis de proteínas, ou ainda a produção de espécies
reativas de oxigênio. O efeito tóxico relatado para células normais humanas e
células tumorais in vitro do extrato do parênquima reserva de Aloe barbadensis
poderia estar relacionado com a geração de antraquinonas, como a aloína, formadas
104
pela oxidação de compostos de baixo peso molecular (O’BRIEN, 1991; CHAPMAN,
1995).
2.2.2 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DOS COMPOSTOS QUÍMICOS DO
PARÊNQUIMA DE RESERVA
Muitos dos constituintes químicos do extrato do parênquima reserva de
babosa são responsáveis por suas propriedades cicatrizantes e imunoestimulantes,
a exemplo da glicoproteína aloctina A, que é descrita por suas propriedades anti-
ulcerativa e antitumoral (IMANISHI, 1993) e de outra glicoproteína de 29 KDa, que
têm sido relacionada ao aumento da proliferação de células da derme humana
(YAGI et al., 1997)
Além disso, muitos outros compostos com propriedades imunomodulatórias
tipo lectina têm sido isolados do extrato do parênquima de reserva de Aloe
barbadensis (VÁZQUEZ et al., 1996; BAUTISTA-PÉREZ et al., 2004). Im et al.
(2005), estudando uma fração polissacarídica de Aloe barbadensis tratada com
celulase, mostraram que a atividade imunomodulatória ótima foi conseguida com a
aplicação de polissacarídeos de peso molecular entre 5 e 400 KDa e que frações de
pesos moleculares acima ou abaixo destes valores mostravam atividade inferior.
Foi documentado a utilização bem sucedida do extrato do parênquima de
reserva em doenças do aparelho digestivo, como agente virucida, bactericida e
fungicida (FEMENIA et al., 1999). Sampedro et al. (2004) relatam as mesmas
propriedades para a espécie Aloe saponaria que também é citada por apresentar
atividade hemoaglutinante e por promover o crescimento de células humanas
105
normais em cultura, ao mesmo tempo em que inibe o crescimento de células
tumorais.
A acemanana tem sido incluída em produtos cicatrizantes disponíveis
comercialmente e indicados para tratamento de ferimentos crônicos, aftas e na
redução da cavidade bucal associada ao local da extração do terceiro molar, por
exemplo. Além disso, o polissacarídeo purificado apresentou atividade
imunoestimulante, demonstrando um efeito adjuvante na produção de anticorpos
específicos e no aumento da liberação de interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6),
fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interferon-γ (INF-γ). A liberação destas
citocinas determinou um aumento de 300% na replicação dos fibroblastos em cultura
de tecidos, além de estimular a atividade fagocítica dos macrófagos. A proliferação
dos fibroblastos é significativa em processos de restauração tissular decorrente de
queimaduras e úlceras, bem como em outros tipos de ferimentos da pele e do
revestimento gastrointestinal (McANALLEY, 1990; KAHLON et al., 1991; SHAND et
al., 1999).
O extrato do parênquima de reserva das folhas frescas de A. barbadensis é
utilizado em uma variedade de estados patológicos, como queimaduras, artrite,
gota, acne, dermatites e úlceras pépticas e redução do risco de infecções
(GRINDLAY, REYNOLDS, 1986; JOSHI, 1998; MORTON, 1961; DIEZ-MARTINEZ,
1981). Além disto, é utilizado como protetor da pele e como agente amaciante e
suavizante em indústrias cosméticas e farmacêuticas e ainda como suplemento
dietético em algumas bebidas (BAUDO, 1992; SACCÙ et al., 2001). É também
citado que o extrato do parênquima de reserva de A. barbadensis possui
propriedades anti-diabéticas (OKAY et al., 2001). Sugere-se, entretanto, que o
extrato do parênquima de reserva de A. barbadensis exerça atividades terapêuticas
106
por meio da interação sinergística de seus constituíntes (FEMENIA et al., 1999),
incluindo alcalóides, saponinas, ácidos graxos, glicoproteínas, resinas, esteróis,
geloninas, minerais, vitaminas (A, C e E), amino-ácidos, enzimas e outras pequenas
moléculas (YUSUF et al., 2004). Por outro lado, há relatos de que os polissacarídeos
exercem atividade anti-tumoral sem qualquer ação sinergística com outros
componentes (FEMENIA et al., 1999).
Simultaneamente, os polissacarídeos de babosa mostraram efeito inibitório
na formação in vivo e in vitro do aducto de DNA-benzo[α]pireno. Contudo, os
mecanismos responsáveis por essa ação quimiopreventiva ainda são pouco
entendidos (KIM, LEE, 1997).
Pesquisas em caráter clínico utilizando componentes de A. barbadensis
resultaram em um produto comercial com base no extrato do parênquima de reserva
denominado Acemannan Immunostimulant™, que foi aprovado para tratamento de
fibrosarcoma em gatos e cães (KENT, 1993; MANNA, McANELLEY, 1993; NI et al.,
2004), via administração parenteral (HARRYS et al., 1991; KING et al., 1995; LEE et
al., 2001; SAMPEDRO et al., 2004). Muitos dos processos industriais relativos à
obtenção de produtos oriundos de babosa têm sido alvo de patentes, despertando
grande interesse por parte das indústrias alimentícia e farmacêutica, conforme
demonstrado na Tabela 8.
Adicionalmente, atividades antiviral, antibacteriana, imunoestimulante e
redutora de reações induzidas por radiação sobre a pele (FEMENIA et al., 1999),
bem como a aceleração da cura de ferimentos têm sido relatadas para outra
manana, a Acemannan Hydrogel™, uma manana polidispersa acetilada, encontrada
no extrato do parênquima de reserva. (TURNER et al., 2004).
107
Estudos in vitro indicam que a acemanana tem limitada atividade antiviral
contra herpes, sarampo e o vírus da imunodeficiência humana, inibindo sua
replicação in vitro. Além disso, na forma injetável, encontrou-se uma ação benéfica
em gatos infectados por FIV (Vírus da Imunodeficiência Felina) (YATES et al., 1992),
porém os mecanismos envolvidos neste processo são desconhecidos até o presente
momento.
Tabela 8 – Patentes de produtos e processos industriais obtidos a partir de Aloe
barbadensis registrados na Europa entre 1984 e 2001
Número da
Patente
Detentor Inventor Título Data
US4446131 Aloe vera of
América INC
(US)
Maughan
Rex G (US)
Controlled temperature process
for manufacturing of improved
stabilized Aloe vera
(Controle da temperatura no
processo para melhorar a
fabricação de Aloe vera
estabilizado)
1984
US4735935 McAnalley
Sterelization by γ or microwave
radiation (Esterilização por
radiação γ ou microondas)
1988
US5356811
Coats Oxidation+membrane filtration
(Oxidação+membrana de
filtração)
1994
CN1216232 Huang
Xiaozhou
(CN)
Huang
Xiaozhou
(CN)
Extraction of Aloe
polysaccharide
(Extração do polissacarídeo de
babosa)
1999
CN1216232 Huang
Xiaozhou
(CN)
Huang
Xiaozhou
(CN)
Extraction of Aloe extract
(Extração do extrato de
babosa)
1999
EP1091970 Steba Beheer
N V (NL)
Cohen
Avraham (IL)
Method for preparing aloin by
extraction
(Método para a preparação de
aloína por extração)
2001
Fonte: www.sbrt.ibict.br. Serviço Brasileiro de Respostas Técnicas (TECPAR- Instiuto de
Tecnologia do Paraná, 2006; Waller et al., 2004)
108
Dada à ampla diversidade de atividades biológicas (Tabela 9), sugere-se
que um mecanismo comum possa envolver a ativação de macrófagos mediado pela
acemanana (ZHANG; TIZARD, 1996), porém essa molécula não é a única com a
habilidade de elicitar as atividades farmacológicas citadas. Uma variedade de
glicanas são capazes de exercer as atividades antiviral, antitumoral, ativadoras de
macrófagos, de células T, entre outras (McANALLEY et al., 1990; KOLENDER et al.,
1995; SHAND et al., 1999). Schepetkin e Quinn (2006) apresentaram um modelo de
mecanismo pelo qual polissacarídeos oriundos de plantas atuariam na via de
ativação de macrófagos.
Algumas das atividades imunoestimulantes da acemanana parecem ser
mediadas através da ativação de macrófagos, inclusive durante o processo de
cicatrização, onde estes atuam como fagócitos e agentes debridantes produzindo
fatores que influenciam a angiogênese e o processo de reparação dos ferimentos
(CHITHRA, 1998b). Lee et al. (2001) relatam que as acemananas estimularam os
macrófagos a produzir citocinas inflamatórias como IL-1, IL-2 e TNF-α e que a
acemanana em presença de IFN-γ, também levou ao aumento na produção de óxido
nítrico (KARACA et al., 1995). A acemanana pode manifestar estas atividades
imunomodulatórias via ligação da manose com receptores presentes nos
macrófagos, produção de óxido nítrico e estímulo das células T. Células dendríticas
são importantes células acessórias para a ativação de células T-virgens e a geração
de respostas em células T primárias. Em razão de as células dendríticas possuírem
receptores de manose, as acemananas podem supostamente ligar-se a elas
resultando na atividade imunomodulatória, através da ativação dos receptores de
manose., entretanto altas concentrações de acemanana (200 a 2000µg/mL) são
requeridas para provocar uma modesta ativação dos macrófagos (KARACA et al.,
109
1995). A acemanana mostrou aumento na resposta linfocitária a aloantígenos in
vitro, exibiu atividade adjuvante em vacinas contra vírus e aumenta a taxa de
sobrevivência em animais vírus-infectados (LEE et al., 2001).
Foi demonstrada a atividade anti-inflamatória do extrato do parênquima de
reserva de babosa associada à atividade inibitória das ciclooxigenases, com a
conseqüente inibição da síntese de prostaglandinas, um dos principais mediadores
do processo inflamatório (DAVIS et al., 1984).
Efeitos positivos do extrato aquoso de Aloe barbadensis têm sido relatados
durante o tratamento de lesões em ratos diabéticos. Além disso, um potente
antioxidante foi isolado do extrato metanólico de Aloe barbadensis Miller, que
demonstrou atividade in vitro, semelhante a do α-tocoferol (CHITHRA et al., 1998;
SINGH et al., 2000).
Kar e colaboradores (2002), ao estudarem o efeito dos extratos de Bacopa
monnieri, Aegle marmelos Linnè e Aloe barbadensis na eficácia da regulação da
função da tireóide, concluíram que A. barbadensis diminuíu a concentração de
hormônios T3 e T4, em 25% e 13% respectivamente. Estes resultados indicam que
o extrato desta planta é menos efetivo na redução da concentração destes
hormônios se comparada, por exemplo, à B. monnieri que apresentou redução de
62% da concentração de T3. Porém, os autores citam que o extrato de babosa
poderia ser utilizado no tratamento em casos de hipertiroidismo suave, por não
haver apresentado efeito hepatotóxico.
Saks, Barkai-Golan (1995), estudaram a atividade anti-fúngica do extrato do
parênquima de reserva de A. barbadensis nas concentrações de 1 – 10
5
µL.L
-1
sobre
quatro fungos de pós-colheita de frutos: Penicillum digitatum, Penicilum expansum,
Botrytis cinerea e Alternaria alternata. Foi constatado que o efeito inibitório ocorria
110
pela supressão da germinação e do crescimento micelial. Estes autores também
demonstraram que o retardamento da colonização da lesão nos frutos de toranja in
vivo por Penicillum digitatum, dependia da concentração do extrato.
De forma similar, Rodriguez e colaboradores (2005) testaram o extrato do
parênquima de reserva e uma fração líquida do parênquima clorofiliano de A.
barbadensis contra fungos fitopatogênicos: Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum
e Colletotrichum coccodes, isolados de culturas de batata. Testando concentrações
de 0 a 10
5
µL.L
-1
do extrato do parênquima de reserva, os autores concluíram que
houve eficácia na inibição do crescimento dos patógenos testados. O extrato do
parênquima de reserva demonstrou maior atividade antifúngica contra F. oxysporum
e a fração líquida sobre todos os três fitopatógenos. Desta forma, ambos poderiam
ser uma alternativa natural para o controle de fungos em plantações comerciais, em
relação à aplicação de fungicidas químicos.
111
Tabela 9 – Compostos presentes em Aloe barbadensis Miller e suas atividades
biológicas (
Adaptado de CHOI e CHUNG, 2003).
Classe Composto Atividades biológicas
Antraquinonas Aloe-emodina, emodina, aloína,
barbaloína, ácido aloético, antranol
e isobarbaloína
Purgativa, proliferação celular,
antitumoral, antiprotozoário,
antibacteriana, antioxidante,
antifúngica,genotóxicas,
mutagênicas.
Carboidratos Celulose
Glucose
Manose
Aldopentose
Manana acetilada (acemanana)
Glucomanana
Glucomanana acetilada
Glucogalactomanana
Galactoglucoarabinomanana
Imunomodulatória, antimicrobiana,
antitumoral, antiinflamatória,
antiviral, antifúngica, antioxidante,
hipoglicemiante, cicatrizante
munomoduladoria, antitumoral,
proliferação celular, cicatrizante
Imunomoduladoria, antitumoral
Imunomoduladoria, antitumoral
Vitaminas B1
B2
B6
C
β-caroteno
Colina
Ácido fólico
α-tocoferol
Antioxidante
Enzimas Amilase
Carboxipeptidase
Catalase
Ciclooxidase
Lípase
Oxidase
Substâncias de
baixo peso
molecular
Ácido araquidônico
Giberilina
Substâncias tipo lectina
Lignina
Ácido salicílico
Esteróides
Triglicérides
Ácido úrico
β-sitosterol
Aloesina
Antiinflamatório, pró-angiogênico
Aumento da proliferação celular,
inibição da síntese de melanina
112
2.3 CARACTERÍSTICAS DOS PROCESSOS DE FORMAÇÃO DE VASOS
SANGÜÍNEOS.
A formação de vasos sangüíneos envolve os mecanismos celulares de
proliferação, migração e diferenciação. Entre os diversos processos de
vascularização, vasculogênese e angiogênese apresentam entre si importantes
similaridades e diferenças (RISAU et al., 1988; RIBATTI et al., 2001)
A vasculogênese é um processo definido como o desenvolvimento de vasos
sangüíneos a partir da diferenciação in situ de células mesodérmicas, progenitoras
de células endoteliais (angioblastos e hemangioblastos). Estas células precursoras
são recrutadas de áreas de mesoderma adjacentes ao embrião e/ou, originadas por
divisão celular local, organizando ilhotas sangüíneas e estabelecendo um plexo
vascular primordial (RUITER et al., 1992).
Durante a embriogênese inicial, a vascularização se processa por
vasculogênese. Subseqüentemente, através da angiogênese, a rede de vasos
primários apresenta uma remodelagem, combinando eventos de morte e regressão
vascular com a ramificação de capilares a partir de vasos preexistentes, os quais
proliferam para viabilizar o crescimento do corpo (FOLKMAN, 1971). No embrião, os
dois processos de formação de vasos coexistem; por exemplo, o desenvolvimento
do coração e dos grandes vasos ocorre por vasculogênese, enquanto órgãos que
requerem invasão de vasos sangüíneos para o desenvolvimento (cérebro, pulmões
e fígado) são supridos por angiogênese (RISAU et al., 1988).
Em uma visão ortodoxa, considerava-se que a vasculogênese está limitada
à embriogênese inicial, não ocorrendo no adulto, enquanto a angiogênese ocorre em
ambos os períodos. Entretanto, observações recentes indicam que essa distinção
113
não é absoluta, visto que ambos os processos requerem proliferação e migração de
células endoteliais, bem como a reorganização qualitativa e quantitativa
(remodelagem) dos vasos recém-formados (RIBATTI et al, 2001). Além disso,
evidenciando que a vasculogênese não estaria restrita à embriogênese, células
precursoras vasculares, podem em determinadas condições, ser incorporados aos
vasos sangüíneos, que se formam a partir da vascularização pré-existente, em
adultos, tanto em patologias vasculares, como fisiologicamente (ZAMMARETTIA,
ZISCH, 2005).
Os eventos teciduais que se sobrepõem nos processos de vasculogênese e
angiogênese incluem a perda de adesão das células vizinhas, proteólise da matriz
extracelular proximal, migração e proliferação celulares, formação do tubo vascular
(tubulogênese) e deposição da membrana basal (D’AMORE, THOMPSON, 1987;
TOBELEM, 1990; GUMBINER, 1996; KALLURI, 2003).
Segundo Risau et al. (1998), os processos de vasculogênese e
angiogênese são regulados de maneira distinta, entretanto, de acordo com Rafii et
al. (2002) e Bergers e Benjamim (2003), fatores que estimulam a angiogênese, tais
como VEGFA (Vascular Endotheliar Growth Factor – A), PGF (Placental Growth
Factor) e ANG1 (Angiopoietin-1), são conhecidos também por estimular o processo
de vasculogênese, sendo que a formação de capilares a partir de vasos
preexistentes (angiogênese) é usualmente desprezível após ter sido alcançada a
estatura do adulto (FOLKMAN, 1971; FOLKMAN, SHING, 1992). Porém, ao longo da
vida esse processo continua desempenhando um papel fundamental em inúmeros
processos fisiológicos, por exemplo, no ciclo reprodutivo feminino e na cicatrização
(FOLKMAN et al., 1988; BERGERS, BENJAMIN, 2003). Além disso, a angiogênese
é um processo estritamente regulado, que pode ser rapidamente estimulado ou
114
inibido (HANAHAN, FOLKMAN, 1996). Nos últimos anos, os mecanismos básicos
deste processo têm sido cada vez mais compreendidos e têm sido demonstrado que
ele é fortemente controlado pelo balanço da síntese de numerosos fatores pró e anti-
angiogênicos (TUETTEMBERG et al., 2006).
A angiogênese é, na maioria das vezes, mediada pelo fator de crescimento
vascular endotelial (VEGF), que em condições de hipóxia ou hiperóxia contribui para
a progressão de tumores, por exemplo. Baixo pH intratumoral, hipoglicemia, stress e
inflamação induzidos pelo aumento da massa tumoral, também promovem a
angiogênese (FAYETTE, 2005), sendo essencial para o crescimento de tumores
primários e as metástases subseqüentes (PANDYA et al., 2006). A lista de
reguladores inclui ainda as citocininas, hormônios e fatores de crescimento,
componentes da matriz extracelular como a laminina e fibronectina e seus
receptores: integrinas alfa V, metaloproteinases da matriz e seus inibidores nos
tecidos, outras proteases (i.e., urokinases e ativadores de plasminogênio, uPA, tPA),
fibrina, células inflamatórias e pericitos (Tabela 10) (ZYGMUNT et al., 2003).
Tabela 10 – Promotores e inibidores da angiogênese, produtos comercializados ou que se encontram em fase de testes clínicos.
Promotores Inibidores Fatores angiostáticos (terapêuticos) ou
inibidores em desenvolvimento
VEGF – A, B, C, D Angostatina Talidomida
Angiopoietina-1 Anti-angiogêninco anti-trombina III CM 101 (polissacarídeo bacteriano de GBS)*
β-Estradiol, estrógenos
Constatina
Fumagilina (de Aspergillus fumigatus)
aFGF, Bfgf Endostatina (fragmentos de colageno XII and
XVIII)
TNP – 470 (derivado da fumagilina)*
IL-8 Fragmentos de Fibronectina RU-486*
Leptina Heparinases Esteróides (?)
MCP-1, IGF
INF-α, β, χ, Vasostatina (fragmento de
calreticulina)
Neo vastat**
MMPs IL4, IL12, IL18 Angiozyme**
NOS PAI-1 Endostatin**
PDGF-BB PEDF Bevacizumab**
TNF-α
Prolactina – fragmento 16 kDa ZD6474*
Angiogenina TSP-1 SU 6668*
TGF α, β
Retinóides PTK 787/vatalanib**
HGF/scattered factor Carotenóides BMS-275291*
EGF Trompospondina COL-3*
PGF Troponina 1 WX-UK1, WK293*
G-CSF Angiopoietina 2 Avastin**
Pleiotrofina PF 4 ZD6474, SU6668, NM3*
115
Proliferina
Suramina Gleevec**
Enzimas – catepsina B, D, uroquinase,
metaloproteinases, COX-2, LOX 1, 2,
proteases, farnesiltransferase
2 – Metoxiestradiol Angiostatina
Dopamina
Fucoidanas, sarg (sargassanas) e outros
polissacarídeos sulfatados.
Polissacarídeos de parede Celular (de
fungos)
* Produtos em fase de testes clínicos
** Nomes comerciais dos produtos
(CRISTOFANILLI et al., 2002; LOSSO, 2003; ZYGMUNT et al., 2003; COLLINSON, DONELLY, 2004; FAYETTE et al., 2005; DIAS, 2005;
DIAS, 2007)
116
117
Muitas técnicas in vivo e in vitro têm sido desenvolvidas para o estudo das
respostas angiogênicas. Dentre os modelos de estudo in vivo, Byrd e Grabel (2004)
utilizaram a técnica de estudo em vasos axilares de zebra-fish e em saco vitelínico
de embriões e indivíduos adultos de camundongo. Zygmunt et al (2003) lista ainda
como métodos in vivo, a microcirurgia corneal e os ensaios de membrana
corioalantóica em embriões de aves.
2.4 MODELOS DE ESTUDO DE VASCULARIZAÇÃO E MORFOGÊNESE
EMBRIONÁRIA VOLTADOS À INVESTIGAÇÀO DAS PROPRIEDADES
FARMACOLÓGICAS DE A. barbadensis.
No âmbito dos estudos de vascularização, através dos ensaios de vesícula
vitelínica e de membrana corioalantóica, a utilização de ovos de galinha fertilizados
traz algumas vantagens aos laboratórios. A rotina de incubação em estufas é
simples, econômica e oferece a possibilidade de manipulação de um número
racional de unidades amostrais (SCHOENWOLF, 1994).
A fisiologia, a genética e a embriologia da espécie Gallus domesticus estão
extensamente documentadas e apresentam significativa similaridade com o
correspondente no organismo humano. Além disso, cada embrião desenvolve-se em
um ambiente próprio, livre da influência materna ou placentária, e o acesso aos
vasos sangüíneos e ao embrião é facilitado, podendo os tratamentos ser realizados
precocemente, com menos de 20 h de incubação (MOURY, SCHOENWOLF, 1995).
O primeiro indício da presença de vasos sangüíneos nos ovos de G.
domesticus é observado após 24 h de incubação (EYAL-GILADI, 1991). Na área
118
vasculosa localizada nas bordas do blastodermo (camada germinativa de
desenvolvimento do embrião) são evidenciadas as ilhotas sangüíneas. Tais
estruturas consistem em agregados de células endoteliais que têm origem na
camada germinativa intermediária do embrião – o mesoderma extra-embrionário.
Entre 26 e 29 h de desenvolvimento (estádio 8). As ilhotas sangüíneas
anastomosam-se e adquirem uma luz vascular, formando os primeiros vasos
sangüíneos (HAMBURGER, HAMILTON, 1951; AREY, 1974).
No período de 33 h de incubação, estabelece-se uma rede vascular,
limitada pelo vaso sino terminal. Esse plexo vascular, associado ao endoderma
subjacente, envolve parcialmente o vitelo do ovo, organizando a vesícula vitelínica
em anexo ao embrião. Nesse anexo embrionário, as artérias e veias
onfalomesentéricas, originadas no coração estabelecem uma circulação vitelínica
(PATTEN, 1951; HOUILLON, 1972).
No período de 40 h de incubação os movimentos de dobramento do coração
e o processo de formação de novos vasos a partir das ilhotas sangüíneas têm
seqüência. As células localizadas internamente formam os hemocitoblastos, dos
quais derivam os tipos celulares das diferentes linhagens sangüíneas (AREY, 1974;
SWEENEY, 1998).
No decorrer do terceiro dia de incubação, verifica-se o surgimento de outro
componente da vascularização extraembrionária: os vasos alantóicos. O alantóide –
um divertículo da parede ventral do intestino posterior – aumenta de volume a partir
do 4º dia de incubação, devido à deposição de produtos da excreção, e interpõe-se
entre dois anexos pré-existentes: o âmnio e o cório. A associação do mesoderma
somático dos dois anexos com o mesoderma angiogênico do alantóide resulta na
membrana corioalantóica. No 8º dia de incubação, a membrana corioalantóica
119
consiste numa vesícula achatada, vascularizada, que recobre o embrião e o saco
vitelínico (HUETTNER, 1949; PATTEN, 1951).
Um crescente corpo de evidências vem sendo obtido e estabelece relações
funcionais entre princípios moduladores da formação de vasos sangüíneos e
indutores endógenos da forma do corpo do embrião (PRINCIVALLE, AGOSTINI,
2002; AYBAR, MAYOR, 2002).
No tecido vascular e em outros tipos de tecidos, moléculas de
proteoglicanas e outros componentes de matriz extracelular ligam-se a múltiplas
espécies de fatores de crescimento, como também a morfógenos, a exemplo do
bFGF.(basic Fibroblasts Growth Factor). Este peptídeo é um indutor de angiogênese
bem conhecido, que está envolvido também na especificação dos limites do tubo
neural, durante a etapa final da indução da crista neural. Esta estrutura acompanha
o crescimento embrionário ao longo dos domínios cefálico - caudal (DHOOT et al.,
2001). Além disso, um morfógeno referido como NOTCH, tem sido estudado devido
à sua habilidade de orientar a diferenciação de células endoteliais nas redes
vasculares (GRIDLEY, 2001).
No embrião de galinha, os primórdios da topografia e os diversos sistemas
estabelecem-se rapidamente (em menos de 96 h de incubação), provendo ainda
uma base razoável para estimativas de toxicidade e teratogenicidade (BUPP et
al.,1998) e estudos relacionados ao desenvolvimento vascular, particularmente nos
processos de vasculogênese e angiogênese.
120
2.5 OBJETIVOS
2.5.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o efeito do extrato do parênquima de reserva, da fração
polissacarídica (FP) e da acemanana, obtidos de A. barbadensis sobre a formação
de vasos sangüíneos em embriões de Gallus domesticus
2.5.2 OBJETIVO ESPECÍFICO:
- Determinar a atividade do extrato do parênquima de reserva, da fração
polissacarídica (FP) e da acemanana isolada da FP no processo de vasculogênese
na vesícula vitelínica, dos embriões no período de 2 a 4 dias.
- Determinar a atividade do extrato do parênquima de reserva, da fração
polissacarídica (FP) e da acemanana isolada da FP no processo de angiogênese
da membrana corioalantóica, dos embriões no período de 6 a 8 dias.
- Avaliar os efeitos da administração do extrato do parênquima de reserva, da fração
polissacarídica (FP) e da acemanana sobre o crescimento (comprimento total) e a
morfogênese com base na proporção do comprimento da cabeça em relação ao
comprimento total, dos embriões, nas idades de 2 a 4 dias.
121
2.6 MATERIAL E MÉTODOS
2.6.1 MODELO BIOLÓGICO - EMBRIÕES DE Gallus domesticus - Linnaeus,
1758
Ovos de galinha da linhagem Ross, de tamanho padrão médio
(aproximadamente 55g), fertilizados e livres de patógenos específicos, foram
fornecidos pela indústria do setor aviário de corte (Macedo Koerich
®
; SC, Brasil), em
um período de até 12h após a postura. No laboratório, esse material foi estocado (19
- 20ºC), por 48h, até o início da incubação.
Os experimentos descritos a seguir enfocaram os processos de
vasculogênese a angiogênese de embriões de Gallus domesticus e foram realizados
de acordo com os procedimentos descritos em protocolo PP00069/2006 aprovado
pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFSC, Florianópolis, SC).
2.6.2 VASCULOGÊNESE EM VESÍCULA VITELÍNICA
Ovos de galinha foram preliminarmente mantidos em estufa incubadora
(Gera-Petersime) equipada com ventilação forçada, controle digitalizado de umidade
(33%) e temperatura (37,5ºC), por um período de 48h.
Após 48h de incubação, os ovos foram removidos da incubadora e uma janela
(10mm de diâmetro) foi aberta na casca, posição que se encontra o embrião.
Embriões não-viáveis foram descartados.
Os tratamentos in ovo (n = 8) foram realizados por meio de suportes de
metilcelulose em forma de disco (2mm de diâmetro, 1 disco/embrião), implantados
122
sobre ilhotas sangüíneas da membrana vasculosa da vesícula vitelínica próximas ao
embrião, na idade de 2 dias.
Amostras de extrato do parênquima de reserva, da FP e da acemanana foram
adsorvidas em metilcelulose, considerando-se os valores de concentração de 10, 30
e 90 µg/ovo. Uma solução-mãe para cada composto em estudo foi preparada
(concentração final = 0,45% (P/V) foi seca ao ar em câmara de fluxo laminar, sobre
superfície de Teflon
®
. Como controle foram utilizados discos de metilcelulose
contendo apenas água destilada e deionizada (veículo) e discos de metilcelulose
contendo heparina 50 UI (Unidades Internacionais).
Após os tratamentos, as aberturas nas cascas foram fechadas com filme de
celofane preto e os ovos retornaram à incubadora, para continuarem o
desenvolvimento por mais 48h, até a idade embrionária de 4 dias. A zona
circunvizinha ao disco de metilcelulose foi analisada quanto ao número de vasos
sanguíneos com auxílio de um microscópio estereoscópico (Olympus modelo SZ40),
com aumento de 3,5 vezes. A quantificação dos vasos sangüíneos da vesícula
vitelínica que interceptavam o limite do disco de metilcelulose foi expressa em
percentagem em relação ao número de vasos do controle (água) .
2.6.3 ANGIOGÊNESE EM MEMBRANA CORIOALANTÓICA
Para a avaliação do processo de angiogênese, foi realizado o ensaio in vivo
da membrana corialantóica, de acordo com os mesmos procedimentos previamente
descritos para a vasculogênese.
A fim de evitar a aderência dos embriões nas membranas ovulares, após as
48h iniciais de incubação, fez-se uma abertura (10mm ∅) na casca dos ovos, em
123
posição imediatamente acima do embrião. Embriões não-viáveis foram descartados.
Estas aberturas na casca foram ocluídas com filme de celofane preto e os ovos
foram re-incubados até o 6º dia (total de 144 h de incubação no período preliminar
aos tratamentos). Após esse período, as coberturas de celofane removidas, sendo
os tratamentos in ovo (n = 8) foram realizados por meio de suportes de metilcelulose
em forma de disco (2mm de diâmetro, 1 disco/embrião), implantados sobre os vasos
sanguíneos, no terço externo da membrana corioalantóica. Para aplicação dos
tratamentos, os compostos em estudo foram dissolvidos na solução de metilcelulose
e volumes de 5 µL foram secos em fluxo laminar sobre superfície de Teflon
®
,
obtendo-se com a polimerização um filme em forma de disco.
Imediatamente após os tratamentos, as aberturas na casca foram fechadas
com filme de celofane preto e os ovos, re-incubados (37,5ºC/48 h).
Subsequentemente, os ovos foram retirados da estufa e a região contígua ao disco
de metilcelulose foi examinada, com o auxílio de um microscópio estereoscópico a
fim de observar os vasos. A inibição da angiogênese foi determinada considerando-
se a redução do número de vasos que interceptavam o disco de metilcelulose
(aspecto de uma zona avascular), sendo os valores expressos em percentagem em
relação à 100%, representados pelo número vasos do controle (discos de
metilcelulose e água).
2.6.4. MEDIDAS DA MORFOGÊNESE EMBRIONÁRIA NA VASCULOGÊNESE
A morfogênese embrionária foi expressa como a percentagem de
comprimento cefálico e determinada através de medidas de comprimento corporal
nos segmentos definidos como eixos entre as flexuras cefálica-cervical-caudal. Os
eixos de comprimento entre as flexuras cefálica-cervical (CCV) e as flexuras
124
cervical-caudal (CVC), juntamente com a somatória destes dois segmentos
embrionários (CCC), foram relacionadas por meio da percentagem de comprimento
cefálico (CCV/CCC), i.e., o comprimento da região cefálica em relação ao
comprimento total do embrião, calculada através da seguinte expressão:
CCV/CCC=[CCV÷(CCV+CVC)]X100.
Quando a percentagem do comprimento cefálico (CCV/CCC) nos grupos
tratados resultou significativamente (P<0,05) maior, ou menor que o valor
correspondente ao controle, verificou-se que a taxa de crescimento no segmento da
cabeça foi alterada e isto foi considerado no presente estudo, um indicativo de
modificação no padrão de morfogênese embrionária.
2.6.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS
Todos os resultados foram expressos como média e erro padrão da média e
comparados através da análise de variância (ANOVA). Foi realizada a análise dos
desvios, utilizando-se o teste “post hoc” de Tukey, sendo que valores de P<0,05
foram considerados estatisticamente significativos. Foi utilizado o programa
STATISTICA 6.0, e para confecção dos gráficos, o programa PRISMA GRAPH 3.
125
2.7 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.7.1 TRATAMENTOS REALIZADOS NA VESÍCULA VITELÍNICA.
As avaliações foram efetuadas a partir da quantificação dos vasos
sangüíneos da vesícula vitelínica que interceptaram os suportes de metilcelulose e
da biometria dos embriões com base no comprimento cefálico, correspondente ao
eixo mesencefálico-cervical (CCV), em relação ao comprimento total relativo aos
eixos mesencéfalo-cervical-caudal (CCC), expresso em percentagem, ao final do 4º
dia de incubação.
A avaliação dos efeitos dos tratamentos com o extrato do parênquima de
reserva são mostrados na Figura 43. A análise do número de vasos mostrou que
não houve diferença significativa (p<0,05) nos tratamentos com as concentrações de
10 e 30 µg, em relação ao grupo controle, contudo, foi detectado um efeito anti-
vasculogênico de cerca de 23% de inibição da formação de vasos, na concentração
de 90 µg (Figura 43 A) enquanto a heparina mostrou uma diminuição do número de
vasos de 77% em relação ao controle.
A avaliação da biometria mostra que nenhum dos tratamentos apresentou
diferenças significativas na percentagem de comprimento cefálico, o que implica
dizer que não houve modificações na morfogênese embrionária (Figura 43 B).
Somente os embriões tratados com a heparina apresentaram modificação na
morfogênese evidenciada por um aumento do comprimento cefálico em relação ao
controle. A relação entre a percentagem do comprimento cefálico e o comprimento
total foi causada pela mudança no comprimento cefálico-caudal. Observou-se que
as concentrações de 10 e 30 µg modificaram o padrão de crescimento, sendo que
126
os valores de comprimento total apresentaram-se superiores ao verificado no grupo
controle. Diferentemente do ocorrido com o número de vasos, a concentração de 90
µg (Figura 43 C) não interferiu no padrão de crescimento em relação ao controle.
Os embriões tratados com heparina apresentaram redução no comprimento total
em relação ao controle.
controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
*
µg
Tratamentos
*
Percentagem de vasos
A
B
C
Controle 10 30 90 HP
0
5
10
15
20
µg
Tratamentos
*
*
*
Comprimento total (mm)
Controle 10 30 90 HP
0
10
20
30
40
50
60
µg
Tratamentos
*
Percentagem de
Comprimento Cefálico
controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
*
µg
Tratamentos
*
Percentagem de vasos
A
B
C
Controle 10 30 90 HP
0
5
10
15
20
µg
Tratamentos
*
*
*
Comprimento total (mm)
Controle 10 30 90 HP
0
10
20
30
40
50
60
µg
Tratamentos
*
Percentagem de
Comprimento Cefálico
Figura 43 – (A) Percentagem de vasos observados na vesícula vitelínica nos tratamentos
com 10, 30 e 90 µg do extrato do parênquima de reserva e da heparina (HP,
controle positivo), em comparação ao controle (água destilada). (B)
Percentagem de comprimento cefálico (medida do eixo mesencéfalo-cervical).
(C) Comprimento total. Cada barra vertical representa a média ± EPM de 8
embriões e os asteriscos denotam diferença estatisticamente significativa ao
nível de p<0,05 em relação ao controle (ANOVA, seguida do teste de Tukey).
Os tratamentos com a Fração Polissacarídica (FP) (Figura 44)
apresentaram uma inibição da formação de vasos sangüíneos, de um modo
127
dependente da dose, nas três concentrações testadas em relação ao grupo controle,
assim como a heparina, o que para as concentrações testadas evidencia um efeito
anti-vasculogênico (Figura 44).
As vesículas vitelínicas tratadas com a concentração de 90 µg
apresentaram o maior efeito inibitório quando comparado ao grupo controle
(aproximadamente 50% de redução do número de vasos capilares).
Controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
µg
Tratamentos
*
*
*
*
Percentagem de vasos
A
B
C
Controle 10 30 90 HP
0
10
20
30
40
50
60
µg
Tratamentos
*
Percentagem de
Comprimento Cefálico
Controle 10 30 90 HP
0
5
10
15
20
µg
Tratamentos
*
Comprimento total (mm)
Controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
µg
Tratamentos
*
*
*
*
Percentagem de vasos
A
B
C
Controle 10 30 90 HP
0
10
20
30
40
50
60
µg
Tratamentos
*
Percentagem de
Comprimento Cefálico
Controle 10 30 90 HP
0
5
10
15
20
µg
Tratamentos
*
Comprimento total (mm)
Figura 44 – (A) Percentagem de vasos observados na vesícula vitelínica nos tratamentos
com 10, 30 e 90 µg da FP e da com heparina (HP, controle positivo), em
comparação ao controle (água destilada). (B) Percentagem de comprimento
cefálico (medida do eixo mesencéfalo-cervical). (C) Comprimento total. Cada
barra vertical representa a média ± EPM de 8 embriões e os asteriscos
denotam diferença estatisticamente significativa ao nível de p<0,05 em relação
ao controle (ANOVA, seguida do teste de Tukey).
128
A avaliação das medidas de comprimento, mostraram que os tratamentos
com a FP também não alteraram o crescimento embrionário, quando comparados
com o controle, como ocorreu no tratamento com a heparina, em que o comprimento
total foi inferior aos demais. Da mesma forma, a morfogênese, com base na
percentagem de comprimento cefálico, também não foi afetada, exceto nos
embriões tratados com heparina. Desta forma, podemos inferir que o efeito da FP
dá-se somente sobre a formação dos vasos sangüíneos, não afetando
negativamente o desenvolvimento embrionário.
A acemanana (Figura 45), não exerceu efeito sobre a vasculogênese na
concentração de 10 µg, quando comparada com o grupo controle. Entretanto, as
concentrações de 30 e 90 µg, inibiram a formação de vasos capilares em cerca de
48% e 69%, respectivamente, os quais apresentaram o menor número de vasos
dentre todas as substâncias testadas (Figura 45 A).
Da mesma forma que o verificado nos ensaios com a FP, os embriões
submetidos ao tratamento com acemanana não apresentaram mudanças no padrão
do comprimento total nem na morfogênese embrionária. Entretanto, na avaliação da
percentagem do comprimento cefálico, apenas os embriões tratados com heparina
mostraram alteração nesta característica.
Os resultados do presente estudo mostraram que quando as amostras de
extrato do parênquima de reserva, da FP e da acemanana foram administradas,
estes tratamentos promoveram um importante efeito anti-vasculogênico na vesícula
vitelínica, evidenciado pela diminuição do número de vasos.
Como hipóteses para os possíveis alvos da ação anti-vasculogênica
desencadeada pelas substâncias estudadas, principalmente da FP e da acemanana,
esta ação poderia ser atribuída à modulação de moléculas reguladoras, como o
129
bFGF e o VEGF, que são sabidamente mitógenos altamente específicos para
células endoteliais (DRAKE et al., 2000; ZYGMUNT et al., 2003). Estudos
demonstram que os receptores de VEGF são capazes de ativar eventos de
sobrevivência, proliferação e migração celular, sendo que, somente os receptores
VEGFR-2 e 3 são capazes de transduzirem sinais para a formação de túbulos de
vasos (tubulogênese), a diferenciação de vasos sangüíneos (artérias e veias) e de
células endoteliais linfáticas (SHIBUYA, 2006).
Além do VEGF, outras moléculas como as angiopoietinas Ang-1 e Ang-2,
também atuam diretamente no processo de vasculogênese, sendo que elas estão
envolvidas no processo de estabilização e remodelagem da rede vascular primária
(ZYGMUNT et al.,2003).
Esses fatores de crescimento são também, responsáveis pela regulação da
concentração de macrófagos (SPRINGER et al., 1998).
Segundo Zygmunt (2003), os receptores de VEGF apresentam diferenças
na sua taxa de expressão, dependendo das condições do endotélio vascular. Por
exemplo, o VEGFR-2 tem sua expressão aumentada em tumores e outras condições
patológicas e o VEGFR-1 atua como um regulador negativo das ações do VEGF no
endotélio vascular, competindo antagonisticamente pelo seu ligante
(YANCOPOULOS et al., 1998; ZYGMUNT, 2003; SHIBUYA, 2006). Springer et al.
(1998), estudando eventos vasculogênicos em tecido muscular de indivíduos
adultos, concluíram que o VEGF pode induzir a vasculogênese, de um modo dose-
dependente.
130
A
B
C
Controle 10 30 90 HP
0
5
10
15
20
µg
Tratamentos
Comprimento total (mm)
Controle 10 30 90 HP
0
10
20
30
40
50
60
µg
Tratamentos
*
Percentagem de
Comprimento Cefálico
controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
µg
Tratamento
Percentagem de vasos
A
B
C
Controle 10 30 90 HP
0
5
10
15
20
µg
Tratamentos
Comprimento total (mm)
Controle 10 30 90 HP
0
10
20
30
40
50
60
µg
Tratamentos
*
Percentagem de
Comprimento Cefálico
controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
µg
Tratamento
Percentagem de vasos
Figura 45 – (A) Percentagem de vasos observados na vesícula vitelínica nos tratamentos
com 10, 30 e 90 µg da acemanana e da heparina (HP, controle positivo), em
comparação ao controle (água destilada). (B) Percentagem de comprimento
cefálico (medida do eixo mesencéfalo-cervical). (C) Comprimento total. Cada
barra vertical representa a média ± EPM de 8 embriões e os asteriscos
denotam diferença estatisticamente significativa ao nível de p<0,05 em relação
ao controle (ANOVA, seguida do teste de Tukey).
É possível sugerir que as substâncias polissacarídicas derivadas da babosa,
possam atuar inibindo a vasculogênese em razão do bloqueio da expressão do
VEGF ou pelo aumento da expressão do VEGFR-1. Uma possibilidade, neste caso,
é de que os polissacarídeos em estudo teriam a capacidade de se ligarem a sítios
de receptores específicos nas membranas celulares de macrófagos, por exemplo.
Além disso, de acordo com Schepetkin, Quinn (2006), polissacarídeos isolados de
espécies vegetais podem se ligar a diferentes receptores, como o TLR4, CD14,
CR3, dectina 1 e receptores de manose, a partir do que, ativariam cascatas de
131
sinalização intracelular que resultam na produção de moléculas como as citocinas
pró-inflamatórias, modulando a ação de fatores de crescimento endotelial.
De fato, diversos polissacarídeos possuem a capacidade de desencadear
respostas anti-vasculogênicas. Sarg, um polissacarídeo isolado da alga marinha da
espécie Sargassum stenophilum, mostrou efeitos inibitórios na ordem de 26 a 100%
sobre a vascularização de anexos embrionários de G. domesticus. Além disso, esse
polissacarídeo foi capaz de reverter os efeitos pró-vasculogênicos e pró-
angiogênicos do bFGF (DIAS, 2005; DIAS, 2007). No entanto, outros
polissacarídeos, podem ativar respostas pró-vasculogênicas, a exemplo de β-D-
glucanas isoladas do fungo da espécie Agaricus brasiliensis, as quais mostraram um
aumento de vasos da ordem de 30% em vesículas vitelínicas de embriões de
galinha (CAMELINI et al, 2006).
Um estudo sobre as atividades farmacológicas da acemanana utilizando
macrófagos da linhagem RAW 264.7, mostrou um aumento na produção de citocinas
como o IL-6 e TNF-α, de forma dose-dependente, sem contudo, modificar a
morfologia celular (ZHANG; TIZARD, 1996). Essa mesma linhagem celular foi
exposta ao tratamento com acemanana por Ramamoorthy et al. (1996), que
observaram que o polissacarídeo, em presença do IFN-γ promoveu a ativação dos
macrófagos, sendo esta ação evidenciada pelo aumento na expressão do mRNA
que codifica a forma induzida da enzima óxido nítrico sintase (iNOS), com
conseqüente aumento dos níveis de óxido nítrico (NO) intracelular. O NO é o
principal mediador citotóxico de células imuno-efetoras e constitui importante
molécula reguladora do sistema imune. Exerce um papel como
mensageiro/modulador em diversos processos biológicos essenciais. Por outro lado
o NO é potencialmente tóxico. A toxicidade se faz presente, particularmente, em
132
situações de estresse oxidativo, geração de intermediários do oxigênio e deficiência
do sistema antioxidante (DUSSE et al., 2003).
Ainda, quando expostos à acemanana, os macrófagos apresentaram-se
apoptóticos, sugerindo que a esse polissacarídeo possa atuar como um agente pró-
apoptótico cujo mecanismo envolveria a inibição da molécula bcl-2
(RAMAMOORTHY, TIZARD, 1998).
Drake et al. (2000), em um estudo comparativo sobre os genes que
codificam para o VEGF entre embriões de aves e camundongos, demonstraram que
a regulação da vasculogênese é um processo altamente conservado entre essas
duas espécies de animais, o que nos permite uma extrapolação para diferentes
espécies.
133
A
B
D
C
A
B
D
C
Figura 46 – Seqüência de microfotografias onde são observados os efeitos da
administração do extrato do parênquima de reserva sobre a vascularização
da vesícula vitelínica de embriões de G. domesticus no 6º dia de
desenvolvimento. Em (A) tratamento controle, (B) tratamento com heparina
50 UI, (C) tratamento com 30 µg do extrato e (D) tratamento com 90 µg do
extrato. A seta em (A) indica vestígios do disco de metilcelulose e água
destilada e a seta em (C) indica um capilar sangüíneo em processo de
remodelagem. Barra = 1 mm
134
A
B
D
C
A
B
D
C
Figura 47 – Seqüência de microfotografias onde são observados os efeitos da
administração da FP sobre a vascularização da vesícula vitelínica de
embriões de G. domesticus no 6º dia de desenvolvimento. Em (A)
tratamento controle, (B) tratamento com heparina 50 UI, (C) tratamento
com 30 µg da FP e (D) tratamento com 90 µg da FP. A seta em (A) indica
vestígios do disco de metilcelulose e água destilada. Barra = 1 mm
135
A
B
C
D
Figura 48 – Seqüência de microfotografias onde são observados os efeitos da
administração da acemanana sobre a vascularização da vesícula vitelínica
de embriões de G. domesticus no 6º dia de desenvolvimento. Em (A)
tratamento controle, (B) tratamento com heparina 50 UI, (C) tratamento com
30 µg da acemanana e (D) tratamento com 90 µg da acemanana. As setas
indicam vestígios do disco de metilcelulose. Barra = 1 mm
136
2.7.2 TRATAMENTOS REALIZADOS NA MEMBRANA CORIOALANTÓICA.
O desenvolvimento de vasos sangüíneos a partir de vasos pré-existentes
(angiogênese) foi avaliado por meio do ensaio da membrana corioalantóica. Os
resultados quanto ao efeito das substâncias em estudo sobre a angiogênese estão
reunidos na figura 49.
Controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
µg
Tratamentos
*
*
*
*
Percentagem de vasos
controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
µg
Tratamentos
*
Percentagem de vasos
Controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
µg
Tratamentos
*
*
*
*
Percentagem de vasos
A
B
C
Extrato do Parênquima de Reserva
Acemanana
Fração Polissacarídica
Controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
µg
Tratamentos
*
*
*
*
Percentagem de vasos
controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
µg
Tratamentos
*
Percentagem de vasos
Controle 10 30 90 HP
0
20
40
60
80
100
120
µg
Tratamentos
*
*
*
*
Percentagem de vasos
A
B
C
Extrato do Parênquima de Reserva
Acemanana
Fração Polissacarídica
Figura 49 – Percentagem de vasos nos limites do disco implantados na membrana
corioalantóica nos tratamentos com as concentrações de 10
µg, 30 µg e 90
µg do extrato do parênquima de reserva (A), da fração polissacarídica
(FP) (B) e com a acemanana (C), em relação ao controle (água
destilada). 50 U.I. de heparina (HP), foi utilizada como controle
positivo.
Cada barra vertical representa a média ± EPM de 8 embriões e os
asteriscos denotam diferença estatisticamente significativa ao nível de
p<0,05 em relação ao controle (água destilada) (ANOVA, seguida do teste
de Tukey).
137
Como mostra a figura 49, em todos os tratamentos houve uma redução
estatisticamente significativa e de modo dose-dependente, do número de vasos
evidenciando o efeito anti-angiogênico das substâncias em estudo.
Nos tratamentos com o extrato do parênquima de reserva o número médio
de vasos na concentração de 10 µg foi de 66 vasos, na concentração de 30 µg, 51 e
na concentração de 90 µg, 31 vasos, o que implica em uma inibição daquele
processo da ordem de 73% em relação ao controle.
A FP inibiu de modo mais efetivo a proliferação de vasos capilares se
comparado com o extrato do parênquima de reserva, principalmente nas
concentrações de 30 µg e de 90 µg, onde o número de capilares no limite do disco
foi de 30 e 19 vasos, respectivamente. O tratamento com a concentração de 90 µg
foi a que provocou a maior inibição da angiogênese, com um percentual de 84% de
redução no processo em relação ao controle (117 vasos).
A heparina (controle positivo) causou 85% de inibição de capilares na
membrana corioalantóica, em relação ao controle (água destilada). Este valor é
idêntico ao observado para a concentração de 90 µg da FP (84%), o que demonstra
a efetividade desta fração.
A angiogênese exerce papel relevante nos processos fisiológicos a exemplo
do ciclo reprodutivo feminino, reparação tecidual além do próprio desenvolvimento
fetal (RIBATTI et al., 2001;PANDYA et al., 2006). Existe uma oposição entre a
atividade dos pró-angiogênicos e anti-angiogênicos. O equilíbrio entre estes dois
tipos de fatores, ou a predominância de atividade pró-angiogênica, estão presentes
em processos patológicos, tais como a psoríase, artrite reumatóide e alguns tipos de
tumores (CARMELIET, 2003; FAYETTE et al., 2005). Os VEGFRs além de estarem
diretamente envolvidos nesses processos fisiopatológicos, também estão
138
relacionados aos processos de formação de ascites, metástases, doenças
inflamatórias como hipertireoidismo e aterosclerose (SHIBUYA et al., 2006).
Entretanto, os mecanismos envolvidos na regulação da angiogênese ainda
não são suficientemente entendidos. Algumas substâncias foram utilizadas como
modelo para elucidar alguns destes mecanismos, a exemplo dos polifenóis
encontrados em vinhos tintos, chás e outros produtos (OAK et al., 2005; HUANG,
ZHENG, 2006). Esses autores descreveram um mecanismo pelo qual os polifenóis
seriam capazes de inibir muitos eventos-chave no processo angiogênico, como a
proliferação e a migração de células do endotélio vascular liso e a expressão de dois
principais fatores pró-angiogênicos, como o VEGF e a metaloproteinase de matriz-2
(Figura 50).
Fatores de crescimento como o PDGF
AB
estimulam fortemente a expresssão
do VEGF pela formação intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs). A
formação de EROS pela NADPH oxidase, media a ativação da via das MAP quinase
p38 redox-sensível, que por sua vez ativa o fator induzido por hipóxia-α (HIF-α), uma
molécula chave na regulação da expressão do VEGF. Os polifenóis podem inibir o
efeito estimulatório do PDGF
AB
por prevenir a formação intracelular de EROs, o que
impede que a MAP quinase p38 redox-sensível seja fosforilada e ative o fator
induzido por hipóxia-α (HIF-α) (OAK et al., 2005; HUANG; ZHENG, 2006).
Schepetkin e Quinn (2006), propuseram outros modelos de mecanismo,
pelos quais polissacarídeos oriundos de plantas, dentre esses as polimananas de
babosa, atuariam na via de ativação de macrófagos (Figura 51).
A acemanana possui a capacidade de estimular macrófagos através de sua
ligação a receptores específicos na membrana sendo que esta ligação resulta não
somente em atividade fagocítica (ZHANG; TIZARD, 1996). Utilizando mananas de
139
outra espécie de babosa, a Aloe saponaria, Sampedro et al. (2004), observaram que
as mananas apresentam efeito inibitório da proliferação, com especificidade de
células tumorais.
PDGF
AB
N
A
D
P
H
O
x
id
a
s
e
EROs
p38
HIF-1α
Núcleo
DNA
VEGF
VEGF
Formação de Novos
Vasos Sangüíneos
Polifenóis
Polifenóis
NAC
Vit C
IDF
Célula Muscular Lisa Vascular
PDGF
AB
PDGF
AB
N
A
D
P
H
O
x
id
a
s
e
EROs
p38
HIF-1α
Núcleo
DNA
VEGF
VEGF
Formação de Novos
Vasos Sangüíneos
Polifenóis
Polifenóis
NAC
Vit C
IDF
Célula Muscular Lisa Vascular
(+)
(–)
(–)
(–)
PDGF
AB
N
A
D
P
H
O
x
id
a
s
e
EROs
p38
HIF-1α
Núcleo
DNA
VEGF
VEGF
Formação de Novos
Vasos Sangüíneos
Polifenóis
Polifenóis
NAC
Vit C
IDF
Célula Muscular Lisa Vascular
PDGF
AB
PDGF
AB
N
A
D
P
H
O
x
id
a
s
e
EROs
p38
HIF-1α
Núcleo
DNA
VEGF
VEGF
Formação de Novos
Vasos Sangüíneos
Polifenóis
Polifenóis
NAC
Vit C
IDF
Célula Muscular Lisa Vascular
(+)
(–)
(–)
(–)
Figura 50 – Modelo de mecanismo de ação da inibição da formação de novos vasos
sangüíneos pela ação de polifenóis nas células da musculatura lisa vascular.
IDF – Iodeto de Difenila, NAC – N-Acetilcisteína, Vit C – Vitamina C (OAK et
al., 2005).
A ativação de macrófagos por polissacarídeos derivados de plantas dar-se-
ia através do reconhecimento desses carboidratos por receptores específicos, que
possuem a capacidade de reconhecer padrões moleculares e ligantes estranhos ao
organismo, durante a fase inicial da imunomodulação. Os polissacarídeos e/ou
glicoproteínas oriundos de plantas poderiam se ligar aos macrófagos através de
receptores tipo-Toll-4 (TLR4), CD14, receptor complemento 3 (CR3, também
140
conhecido como CD11b/CD18, Mc-1 ou Integrina-α
M
β
2
), receptores captadores (SR),
dectina-1 e os próprios receptores de manose (MR) (Figura 51).
Figura 51 – Modelo esquemático da via de sinalização envolvendo a ativação de
macrófagos por polissacarídeos de plantas. A partir da ativação dos
ativação desses receptores desencadearia uma cascata de sinalização
intracelu
Polissacarídeo fixador de
complemento
Polissacarídeo nativo
Mananas
Dectina-1
Reações Oxidativas
Fagocitose
Endocitose
Citoplasma
STAT
Núcleo
receptores de membrana dos macrófagos, desencadeia-se a transdução
deste sinal estimulatório para o interior da célula, levando à reações síntese
dos fatores de transcrição (SCHEPETKIN, QUINN, 2006).
A
lar, resultando na ativação da transcrição de citocininas pró-inflamatórias
como a IL-1, IL-6, IL12 e TNF-α e da iNOS, por exemplo. Outro mecanismo inibitório
seria pela via dependente da endocitose, a partir da qual polissacarídeos de alto
peso molecular, como os encontrados na babosa, seriam endocitados após se
141
ligarem a receptores na superfície celular e não seriam digeridos totalmente pelas
enzimas lisossomais. Desta forma, os oligossacarídeos resultantes serviriam como
um sinal dependente do receptor, adicional, contribuindo para a ativação dos
macrófagos (SCHEPETKIN e QUINN, 2006).
No caso de células tumorais, estudos vêm demonstrando que muitos
desses
de
A. barb
ensis podem ser
consider
tipos celulares têm se tornado resistentes a fármacos antiagiogênicos,
possivelmente por mutações genéticas e associados à própria instabilidade das
células tumorais (PANDYA et al., 2006). Diante desse quadro, têm-se recorrido a
novas substâncias que possam apresentar uma efetiva inibição da angiogênese.
Moon et al. (1999) avaliou o efeito do extrato do parênquima de reserva
adensis e também de sub-frações sobre a membrana corioalantóica e
concluíram que estas substâncias apresentavam propriedades pró-angiogênicas,
que foram atribuídas ao β-sitosterol, principalmente. No entanto, não foram feitos
comentários acerca da fração polissacarídica. Em um trabalho anterior, grupos de
fito-esteróis foram responsáveis pela pronunciada atividade anti-inflamatória
encontrada naquela espécie vegetal (VÁZQUEZ et al., 1996).
Dessa forma, os polissacarídeos de A. barbad
ados como uma opção voltada à uma nova estratégia terapêutica, uma vez
que apresentam uma atividade antiangiogênica pronunciada. No entanto, são
necessários estudos complementares mais aprofundados utilizando a biomassa
dessa planta para obter a caracterização da atividade vasculogênica e angiogênica,
o que remete à avaliação dos possíveis mecanismos de ação, no sentido de
compreender melhor o papel dos polissacarídeos de babosa nos processos
relacionados à formação de vasos sangüíneos.
142
Em suma, podemos considerar que os resultados mostrados pelos ensaios
de vasculogênese e angiogênese revelaram que a concentração de 90 ug foi a mais
efetiva na formação dos vasos sagüíneos para todas as substâncias testadas e que
estas não afetaram negativamente o desenvolvimento embrionário, o que constitui
uma vantagem adicional para um possível candidato à produção de um
medicamento. Os mecanismos responsáveis por essas atividades ainda não estão
esclarecidos, entretanto, três principais alvos podem ser definidos, com fins de futura
elucidação: (1) a ligação entre receptores de membrana i.e. receptores de manose,
o que desencadeia uma série de respostas intracelulares, como a liberação de
citocinas inflamatórias a exemplo de TNF-α e IFN-γ ou (2) a inibição da síntese de
fatores de crescimento como o VEGF ou seus receptores e (3) o mecanismo de
endocitose do polissacarídeo, sua interação com receptores de membrana
intracelulares (pós fagocitose quando se tratar de células fagocíticas), agindo de
forma semelhante à interação com receptores de manose.
143
2.8 CONCLUSÕES
Todas as substâncias testadas quanto ao efeito vasculogênico mostraram-
se eficazes na diminuição do número de vasos no ensaio da vesícula vitelínica,
sendo que o efeito mais potente correspondeu a FP 90 µg e a acemanana 90 µg.
Apesar dos efeitos inibitórios sobre os vasos sangüíneos, não foi observado
alteração na morfogênese embrionária dos grupos tratados, indicando a ausência de
toxicidade relacionada aos tratamentos.
Os embriões tratados com o extrato do parênquima de reserva, no ensaio
da vesícula vitelínica, apresentaram alteração no comprimento total, indicando uma
possível sinergia entre os polissacarídeos e outras substâncias presentes no extrato.
Tanto o extrato do parênquima de reserva como a fração polissacarídica
parecem ter provocado uma desestabilização da rede vascular, mostrando que as
substâncias estudadas interferem significativamente no processo de formação dos
vasos.
Nos ensaios relativos a angiogênese todas as substâncias testadas
apresentaram atividade inibitória pronunciada, sendo que a mais ativa foi a FP na
concentração de 90µg.
Devem ser realizados estudos voltados à elucidação dos mecanismos de
ação relacionados às respostas de inibição sobre a vasculogênese e a angiogênese,
observados no presente estudo.
144
3. REFERÊNCIAS
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ANEXOS
J. Technol. Manag. Innov. 2006, Volume 1, Issue 5
Received December 11, 2006/ Accepted December 18, 2006
CLONING PROTOCOL OF Aloe vera AS A STUDY-CASE FOR “TAILOR-MADE”
BIOTECHNOLOGY TO SMALL FARMERS
ISSN: 0718-2724. (http://www.jotmi.org)
JOURNAL OF TECHNOLOGY MANAGEMENT & INNOVATION © UNIVERSIDAD DE TALCA
76
Campestrini, LH
1
; Kuhnen, S
1
; Lemos, PMM
1
;
Bach, DB
2
; Dias, PF
3
; Maraschin, M
*1
1
Plant Morphogenesis and Biochemistry Laboratory – University Federal of Santa Catarina –
CCA, P.O. Box 476, 88049-900, Phone: 55-48-3331-5328, Florianopolis – SC, Brazil.
2
Naturama Sucos Integrais do Brasil Ltd. Estrada Geral Santa Rita, s/n - Fazenda Cafezal,
88.490-000, Phone: 55-48-3223-3265, Paulo Lopes – SC, Brazil
3
Department of Cell Biology, Embryology and Genetics, CCB -
University Federal of Santa Catarina, Florianopolis – SC, Brazil.
E-mail:
[email protected] *
Abstract
Aloe vera has been used worldwide both for pharmaceutical, food, and cosmetic industries due to the plethora of biological
activities of some of its metabolites. A study case is reported focusing on the development of a cloning protocol of A. vera
to provide propagation material with superior quality to the private sector in southern Brazil, i.e., A. vera juice industry.
Such biotechnological approach afforded ca. 4,300 plantlets from 20 explants, over a 6-month period, overcoming the
drawback of the lack of propagation material. Typically, the results have led to the increase of the cultured area and juice
production of that species coming true the goal of the partnership between the public and private sectors herein involved.
The transference of the resulting technology was successfully performed to the company and a patent covering the
biotechnological process has been recently requested to official organisms on behalf of the partners.
Keywords:
Biotechnological process innovation, Aloe vera, technology transference, university-private sector cooperation.
J. Technol. Manag. Innov. 2006, Volume 1, Issue 5
Introduction
Historical evidences point to Africa as origin
center of Aloe vera Müller, a species already cultured by
Egyptian and Mediterranean people thousands of years B.C.
Phytochemical studies have shown the presence of several
bioactive compounds originated from Aloe vera’s primary
and secondary metabolism pathways, which have been
widely used in formulations (gels and juices, e.g.) in
commercial scale all over the world. As example of those
compounds is worth mentioning enzymes (lipases,
bradykinases and proteases), mono e polysaccharides
(glucomannans), amino acids, vitamins (A, B12, C and D),
anthraquinones (aloine and emodine), saponins, salicilic
acid, lignin and steroids (lupeol, campesterol, and
sitosterol). A number of biological activities have been
claimed to those substances, such as antiseptic [saponins
and anthraquinones], anti-tumoral [mucopolysaccharides],
anti-inflammatory [steroids and salicilic acid], antioxidant
[vitamins], and immune-regulator [glucomannans] effects
(Weiner & Weiner, 1994). Due to the wide spectrum of
application in human health, the products containing A.
vera’s compounds have showed a strong demand in both
national and international markets. Accordingly, an
increasing search for A. vera biomass of high quality can be
envisages in local markets. However, since the biomass
availability in Brazil is restricted, the expansion of this
activity finds its “bottleneck”. In order to overcome this
constraint, high yields should be a goal to be pursued in
conventional cultures systems of Aloe vera, as well as the
enlargement of the cultivated area. For that, a basic
question should be addressed, i.e., the utilization of
propagation material of high genetic and sanitary quality
and its commercial availability.
Aloe vera is usually propagated through lateral
shoots which the donor-plant produces mostly over the
growth season. The number of lateral shoots/donor plant is
low and also variable over time, becoming difficult to plan
in a rational basis a production system in commercial scale
for obtainment of plant propagation material. In general, 3
to 4 lateral shoots/donor plant/year are found in
conventional production systems, what is a time-consuming
and tedious task, as well as an obviously meaningful
drawback for purpose of large scale production of plant
propagation material. In fact, this can be more easily
visualized as one aims at obtaining propagation material to,
for instance, 1 hectare, having a plant density of 12,000 to
16,000 plants/ha, as usually found in commercial
production systems. Additionally, a higher incidence of
diseases is expected to happen due to lesions caused to
donor-plant after withdrawing of the lateral shoots.
This picture points to a significant constraint
concerning the availability of propagation material from A.
vera with superior genetic and sanity qualities, so that the
enlargement of the cultured area is a difficult task.
Accordingly, the production of cosmetics, foods and
pharmaceuticals containing A. vera has experienced a slow
increase due to limited offering of raw material with high
quality.
As a feasible solution for the production of higher
quality propagation material of A. vera in large scale,
biotechnological techniques have been thought of. Such
approach has allowed the in vitro cloning and
multiplication (by means of development of apical
meristems as explants cultured in appropriate basal
medium, for instance) in commercial scale of several plant
species, as well as of superior germoplasms, being
especially important for that recalcitrant species to
conventional propagation techniques (cuttings and grafting,
e.g.).
Over the last years, a micropropagation protocol
for genotypes of A. vera was developed by Plant
Morphogenesis and Biochemistry Laboratory (University
Federal of Santa Catarina PMBL/UFSC) upon request and
on behalf of small farmers, hereafter named Naturama
Sucos Integrais do Brasil Ltd. Naturama is a small scale
industry of A. vera juice in southern Brazil (Paulo Lopes
county, Santa Catarina State), with an increasing
participation in the local market. This partnership found
financial support with the Brazilian Service for Support to
Micro and Small Enterprises (SEBRAE/SC), a private
institution that aims to promote the development of small
producers in both rural and urban areas. Based in such a
study case, some technical subjects are presented and
discussed afterwards, which allowed in a consistent manner
to increase the availability of A. vera’s propagation material
to the partner company, with the consequent enlargement of
the cultured area of that medicinal plant. Furthermore, it
was possible to realize a significant decrease in the
occurrence of diseases in the A. vera population at field
conditions just by replacing of the plant propagation
material obtained through conventional methods (lateral
shoots) for the micropropagated one. The transference of
the developed technology was successfully performed to
the company and a patent for purpose of registration of the
intellectual property has been recently requested to official
organisms. To the best of our knowledge, no previous
report has been published on the transference of a
biotechnological product to the private sector, i.e., A. vera
juice industry, as herein described in Brazil.
ISSN: 0718-2724. (http://www.jotmi.org)
JOURNAL OF TECHNOLOGY MANAGEMENT & INNOVATION © UNIVERSIDAD DE TALCA
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J. Technol. Manag. Innov. 2006, Volume 1, Issue 5
Method
The protocol for micropropagation of Aloe vera
was previously reported (Araújo et al. 2002). Briefly, the
protocol was developed using apical meristems as explants
cultured in basal medium of Murashige and Skoog (1962) –
MS medium, supplemented with sucrose (3g%), agar
(0.7%) and the growth regulators naphthalene acetic acid
(4.03µM) and 6-benzylaminopurine (6.67µM). The in vitro
multiplication rate (number of lateral shoots/explant) of
sixteen A. vera genotypes furnished by small farmers and
originated from Florianopolis and Araquari counties (Santa
Catarina State), Pato Branco, Rolandia, and Colombo
counties (Parana State) and also from Paraguay was
assayed, over a 8 months period. During the experimental
time the cultures were kept in growth chamber at 24±1°C,
85% relative humidity of the air, 14-hour-photoperiod, and
100 ± 5µM photons.m-2.s- (as active photosynthetic
radiation), with a subculture interval of 35 days.
After the in vitro growth stage, plantlets taller than
3cm were transferred to trays containing commercial
substrate (Plantmax®) and kept at growth chamber under
intermittent mist, for seven days. Further, the plantlets were
transferred to plastic containers (~ 200mL internal volume)
containing a mixture of soil and commercial substrate
(Plantmax®, 1:1) and grown in greenhouse with periodic
irrigation (3 days) and leaf manuring (15 and 21 day
intervals, respectively for summer and winter seasons).
After ca. two months growing under greenhouse conditions,
the plantlets were directly transferred to field conditions, at
Paulo Lopes county, and monitored over a 18-month period
as to their agronomic treats (survival rate, phenological
state evolution, resistance to pest and disease, and yield)
and somaclonal variation occurrence (visual analysis of the
phenotypes).
Results
The data obtained for in vitro multiplication of the
lateral shoots showed that experimental conditions induced
a mean rate of new lateral shoots/explant of ca. 1:2.
However, this value was strongly dependent of the
genotype, i.e., the donor-plant, since a multiplication rate of
1:8 was obtained as well. These findings suggest the
existence of distinct morphogenetic potentials among the
genotypes in study. More specifically the genotype
originated from Paraguay showed the highest multiplication
rate, with values ranging from 1:6 to 1:8 and was further
selected to massal multiplication. Similar results have been
reported for the micropropagation of other medicinal
species with high commercial value as Coleus forskohlii,
Camptotheca acuminate, and Valeriana edulis sp. procera,
for instance (Pletsch, 1998).
The protocol used for multiplication of lateral
shoots was also able in inducing the rhizogenesis, but in a
time-dependent way. Thus, in all the cultures older than 35
days were found platelets in different rooting stages, so that
the subculture interval was changed to forty-five days. The
data suggest that rhizogenesis induction is correlated, in any
extension, to depletion of nutrients in culture medium. In
fact, this methodology has allowed the obtainment of whole
plants, i.e., aerial and rooting systems, without the need of
transferring of the plantlets to rooting culture medium.
Furthermore, in vitro rooting strongly influenced the
survival rate of the plantlets over the acclimatization step.
Notably, the rooted plantlets reached survival values of
about 80% to 95%, as lower value was found to non-rooted
plantlets (about 30% of survival). Interestingly, just after
the transplant to commercial substrate, all the A. vera
plantlets presented pronounced root degeneration, followed
by the emission of new primary and secondary roots. In
average, in vitro growth stage of the plantlets lasted for
about 45-50 days, followed by an acclimatization step no
longer than 2 months (spring and summer seasons) or 3
months (autumn and winter seasons) without temperature
control in the greenhouse.
The occurrence of individuals evidencing any
phenotypic variation both in vitro or ex vitro was not
detected over 18 months after transplantation to the field,
except for two young plants which showed albinism and
variegation in leaf tissue during the acclimatization step.
Such findings probably results from somaclonal variation, a
common phenomenon with aleatory occurrence in plant cell
and tissue cultures that leads to the arising of variant
phenotypes with genetic or epigenetic origin. Up to date,
the results indicate that somaclonal variation is not a
meaningful phenomenon as the protocol herein reported is
used for the micropropagation of A. vera genotypes.
Discussion
The described protocol seems to be technologically
suitable for clonal multiplication of A. vera in large scale,
affording propagation material with high genetic and
sanitary quality. Over a 6-month-period, about 4,300
plantlets were obtained in vitro from 20 initial explants,
clearly revealing the potential of such a technological
strategy to overcome the lack of propagation material of
superior quality. Preliminary estimation point to a cost of
ca. US$ 1, 00/plantlet (December - 2006), but it is assumed
that the methodology herein described might be optimized
in any extension, leading to a reduction in that value.
However, comparatively to the conventional propagation
system used to A. vera the results herein shown are
significantly superior. In fact, it was possible to produce a
large number of propagation materials, which are presently
ISSN: 0718-2724. (http://www.jotmi.org)
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J. Technol. Manag. Innov. 2006, Volume 1, Issue 5
in cultivation by the partner company, in a less expensive
and time-consuming way. Additionally, this
biotechnological approach has allowed the increase of the
economic activity of Naturama Sucos Integrais do Brasil
Ltd. as technological improvements in its A. vera juice
production system are claimed and are matter of currently
concerns. In a near future, it is possible to envisage the
complete autonomy of that company property regarding
both the production of A. vera raw material and its
transformation to juices and other derivative products (i.e.,
nutraceuticals).
In a more wide sense, the adoption of this
biotechnological strategy could, in any extension and taking
into account the specific conditions of each enterprise, be
applied as a model (“tailor made”) to increase the incoming
of Aloe-related companies, as a short-term goal, since it
seems to be both technological and economical feasible.
References
Weiner, M., & Weiner, J. A. (1994). Herbs that heal. Mill
Valley: Quantum Books.
Araújo, P. S., Silva, J. M. O., Neckel, C., Ianssen, C.,
Oltramari, A. C., Passos, R., Tiepo, E., Bach, D. B., &
Maraschin, M. (2002). Micropropagação de babosa (Aloe
vera) – Biotecnologia de Plantas Medicinais. Biotecnologia
Ciência e Desenvolvimento, 25, 54-57. Available at
www.biotecnologia.com.br
Murashige, T., & Skoog, D. (1962). A revised medium for
rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.
Physiology Plantarum, 15, 473-497.
Pletsch, M. (1998). Compostos naturais biologicamente
ativos: a aplicação da biotecnologia à produção de
compostos naturais biologicamente ativos. Biotecnologia
Ciência e Desenvolvimento, 4, 12-15.
ISSN: 0718-2724. (http://www.jotmi.org)
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