ads:
Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Estudo da interação entre fitocromo e hormônios
vegetais no controle do desenvolvimento
Rogério Falleiros Carvalho
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Ciências. Área de concentração:
Fisiologia e Bioquímica de Plantas
Piracicaba
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
Rogé
rio Falleiros Carvalho
Biólogo
Estudo da interação entre fitocromo e hormônios
vegetais no controle do desenvolvimento
Orientador:
Prof. Dr. Lázaro Eustáquio Pereira Peres
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Ciências. Área de concentração:
Fisiologia e Bioquímica de Plantas
Piracicaba
2007
ads:
Dados
Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Carvalho, Rogério Falleiros
Estudo da interação entre fitocromo e hormônios vegetais no controle do
desenvolvimento / Rogério Falleiros Carvalho. - - Piracicaba, 2007.
106 p. : il.
Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2007.
Bibliografia.
1. Desenvolvimento vegetal 2. Fitoquímica 3. Hormônios vegetais
4. Morfogênese vegetal 5. Mutação genética 6. Pigmentos vegetais
7. Tomate I. Título
CDD 635.642
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Aos meus pais
Pérsio
&
Maria Amélia
Com todo meu amor
OFEREÇO
Ao meu irmão Guilherme, aos
meus sobrinhos Mariana e
Rafael, e aos meus avós Dié,
Fina, Zito e Lála
DEDICO
4
Agradecimentos
“Se eu pudesse deixar algum presente a você, deixaria aceso o sentimento de
amor à vida dos seres humanos. A consciência de aprender tudo o que nos foi ensinado
ao longo do tempo. Lembraria os erros que foram cometidos, como sinais para que não
mais se repetissem. A capacidade de escolher novos rumos. Deixaria, se pudesse, o
respeito àquilo que é indispensável, além do pão, o trabalho e a ação. E, quando tudo
mais faltasse, a você eu deixaria, se pudesse, um segredo, o de buscar no interior de si
mesmo a resposta para encontrar a saída”. - Mahatma Ghandi
Àqueles que fizeram parte dessa jornada, mesmo que de forma indireta, quero
agradecer incondicionalmente. São eles:
Professor Dr. Lázaro Peres, pela digna orientação, ensinamentos, amizade e
paciência.
Professor Dr. Ricardo Kluge, pelos equipamentos laboratoriais utilizados e
também pela amizade.
Professor Dr. Massanori Takaki, do Instituto de Biociências da Unesp Rio Claro,
pelos ensinamentos e também pela amizade.
Professor Dr. Basso e sua equipe, Ademir, Alemão, Cometa e Thiago, pelos
equipamentos laboratoriais utilizados e também pela amizade.
Professores Drs. do Programa de Pós-Graduação em Fisiologia e Bioquímica de
Plantas, Beatriz Appezzato, Luiz Antônio Gallo, Murilo Melo, Paulo de Castro e Ricardo
Ferraz, pelo incentivo, ensinamentos e amizade.
Solizete, que além de ser uma excelente profissional, eu a agradeço pela sincera
amizade ao longo de tantos anos.
Denise, que em tão pouco tempo creditou todos os seus sonhos aos meus “Te
amo”.
Membros do Laboratório do Controle Hormonal do Desenvolvimento, Angélica,
Clarissa, Lilian, Fernando, Guillermo, Juliana, Marcelo, Mariana, Simone, Tati, Rafael e
Ricardo. Obrigado, pessoal. Serei eternamente grato pela presteza, confiança, paciência
5
e, sobretudo, a amizade.
Romeu e Miranda, pelo tempo dedicado ao desenvolvimento deste trabalho, e
também, claro, pela sincera amizade.
Todos os alunos do Programa de Pós-Graduação em Fisiologia e Bioquímica de
Plantas, por compartilhar os encantamentos que a ciência nos promove.
Também a Luciane, secretária do Programa de Pós-Graduação em Fitotecnia,
pela amizade e bom humor constante.....valeu Lú.
Amigas indescritíveis, Carol”e”; Carol Vitti, Diu, Gi, Maitê e Táta por rechear
minha vida com a mais pura e sincera amizade. Amo muito vocês.
Flavinha, que além de mãe da Vitória, minha sobrinha linda, e esposa do Ademir
“Finazzi” fez muito pelo PPG Fisiologia e Bioquímica de Plantas.
Moradores, ex-moradores e agregados da república Blue House; Ana, Boi, CPI,
Carole (Xexe), Cal (in memoriam), Clô, Dani, Dênis (FDP), Douglas, Farol”e”, Fininho,
Gi, Hernesto (in memoriam), Maicon, Minimi, Morruga, Nei, Pelé, Presidente, Ricardinho,
Sandal”e”, Serjão, Severino, Simão, por tornar minha passagem por Piracicaba mais do
que uma questão profissional, permitir que eu fizesse parte desta família.
Pessoal do futebol.....não vou citar nomes pois foram muitos que passaram pelo
gramado do Parque “São Jorge” durante esses anos rss.
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pelos
recursos concedidos para a realização do trabalho.
6
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................ 9
ABSTRACT............................................................................................................ 11
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 13
Referências........................................................................................................... 16
2 OBTENÇÃO DE MUTANTES FOTOMORFOGENÉTICOS E HORMONAIS EM
UMA ÚNICA CULTIVAR DE TOMATEIRO (Lycopersicon esculentum MILL.
CV MICRO-TOM): UM MODELO PARA ESTUDAR O CONTROLE
MULTIFATORIAL DO DESENVOLVIMENTO....................................................... 18
Resumo ................................................................................................................. 18
Abstract................................................................................................................. 19
2.1Introdução........................................................................................................ 20
2.2 Desenvolvimento............................................................................................ 23
2.2.1 Material e Métodos ...................................................................................... 23
2.2.1.1 Cultivo e cruzamentos ............................................................................. 23
2.2.1.2 Tratamento com luz.................................................................................. 26
2.2.1.3 Análises do desenvolvimento vegetativo .............................................. 26
2.2.1.4 Área de células epidérmicas ................................................................... 27
2.2.1.5 Aspectos reprodutivos ............................................................................ 27
2.2.1.6 Análise estatística .................................................................................... 27
2.2.2 Resultados e Discussão ............................................................................. 28
2.2.2.1 Obtenção e observação de fenótipo recombinante de mutações
hormonais e fotomorfogenéticas no background Micro-Tom.......................... 28
2.2.2.2 Efeito das mutações hormonais e fotomorfogenéticas na germinação
de sementes e no crescimento de plântulas de Micro-Tom na luz e no
escuro ................................................................................................................... 34
2.2.2.2.1 Germinação de sementes..................................................................... 34
2.2.2.2.2 Alongamento do hipocótilo .................................................................. 35
2.2.2.2.3 Alongamento da raiz ............................................................................. 36
7
2.2.2.3 Efeito das mutações hormonais e fotomorfogenéticas no
crescimento vegetativo de plantas adultas de Micro-Tom crescidas em casa
de vegetação......................................................................................................... 40
2.2.2.3.1 Altura do caule principal e matéria seca de caules e raízes.............. 40
2.2.2.3.2 Dominância apical................................................................................. 41
2.2.2.3.3 Área foliar e de células epidérmicas.................................................... 44
2.2.2.4 Efeito das mutações hormonais e fotomorfogenéticas no
crescimento reprodutivo de plantas adultas de Micro-Tom crescidas em
casa de vegetação................................................................................................ 46
2.2.2.5 Limitações e novas perspectivas para o uso de MT como modelo..... 50
2.3 Conclusão....................................................................................................... 53
Referências........................................................................................................... 53
3 ALONGAMENTO E ACÚMULO DE ANTOCIANINAS EM HIPOCÓTILOS DE
TOMATEIRO COMO UMA RESPOSTA HORMONAL E/OU
FOTOMORFOGENÉTICA. ESTUDOS COM MUTANTES E DUPLOS
MUTANTES EM CINCO CLASSES HORMONAIS E FITOCROMO ..................... 66
Resumo ................................................................................................................. 66
Abstract................................................................................................................. 68
3.1 Introdução....................................................................................................... 69
3.2 Desenvolvimento............................................................................................ 71
3.2.1 Material e Métodos ...................................................................................... 71
3.2.1.1 Material vegetal ........................................................................................ 71
3.2.1.2 Cultivo e construção de duplos mutantes ............................................. 71
3.2.1.3 Determinação de antocianinas e medidas do comprimento do
hipocótilo .............................................................................................................. 72
3.2.1.4 Tratamentos com luz................................................................................ 72
3.2.2 Resultados................................................................................................... 72
3.2.2.1 Obtenção e fenótipo dos duplos mutantes hormonais-
fotomorfogenéticos.............................................................................................. 72
3.2.2.2 Acúmulo de antocianinas em mutantes hormonais.............................. 75
3.2.2.3 Acúmulo de antocianinas em mutantes fotomorfogenéticos na
presença de hormônios exógenos ..................................................................... 77
8
3.2.2.4 Interação entre luz e hormônios no acúmulo de antocianinas ............ 81
3.2.2.5 Alongamento do hipocótilo dos mutantes fotomorfogenéticos na
presença de hormônios exógenos ..................................................................... 82
3.2.2.6 Alongamento do hipocótilo de mutantes fotomorfogenéticos,
hormonais e duplos mutantes ............................................................................ 85
3.2.3 Discussão .................................................................................................... 89
3.2.3.1 CK e ABA promovem e GA inibe o acúmulo de antocianinas em
hipocótilos de tomateiro...................................................................................... 89
3.2.3.2 Controle hormonal do alongamento do hipocótilo de tomateiro na luz
e escuro................................................................................................................. 91
3.2.3.3 AUX, ET, GA e ABA possuem vias distintas de phy no controle do
acúmulo de antocianinas e alongamento do hipocótilo de tomateiro
enquanto phy e CK podem partilhar uma mesma via nessas respostas ........ 93
3.3 Conclusão....................................................................................................... 96
Referências........................................................................................................... 96
9
RESUMO
ESTUDO DA INTERAÇÃO ENTRE FITOCROMO E HORMÔNIOS VEGETAIS
NO CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO
Muitas respostas moduladas pela luz durante o desenvolvimento das plantas
também são reguladas por hormônios vegetais, levando à hipótese da interação entre
ambos os fatores. Uma ferramenta valiosa para testar tal interação seria o uso de
mutantes fotomorfogenéticos e hormonais, bem como duplos mutantes combinando
ambos. Em tomateiro, embora sejam disponíveis mutantes com alterações na
biossíntese de fotorreceptores e/ou na transdução do sinal da luz, bem como mutantes
no metabolismo e/ou sensibilidade hormonal, esses estão presentes em cultivares
diferentes, o que pode limitar seu uso de modo integrado e a construção de duplos
mutantes. No presente trabalho, foram introgredidas em uma única cultivar de tomateiro,
Micro-Tom (cv. MT), dezenove mutações afetando a biossíntese ou a resposta a
fitocromo, bem como aos hormônios auxina (AUX), citocinina (CK), giberelina (GA),
ácido abscísico (ABA), etileno (ET) e brassinoesteróides (BR). Tomando-se vantagem
de tal coleção, duas respostas notadamente controladas tanto pela luz quanto por
hormônios foram estudadas: alongamento e acúmulo de antocianinas em hipocótilos.
Para tal, foram utilizadas as seguintes abordagens: i) tratamentos exógenos de
diferentes classes hormonais em mutantes fotomorfogenéticos, ii) observação de
hipocótilos de mutantes hormonais crescidos na luz e no escuro, iii) observação de
duplos mutantes combinando mutações hormonais e fotomorfogenéticas. Assim, o
acúmulo de antocianinas foi promovido pela CK e ABA e inibido pela GA, concordando
com a redução no mutante deficiente em ABA (notabilis ou not) e no mutante
hipersensível à GA (procera ou pro). Apesar do mutante com baixa sensibilidade à AUX
(diageotropica ou dgt) acumular exageradamente antocianinas, a aplicação exógena
não evidenciou o papel da AUX, sendo, porém, coerente com a sugestão de que esse
mutante possui um balanço AUX/CK voltado para CK. Tanto a aplicação exógena
quanto a avaliação nos mutantes epinastic (epi), super produção de ET, e Never ripe
(Nr), baixa sensibilidade ao ET, sugerem uma função limitada desse hormônio na
biossíntese de antocianinas. Na luz e no escuro, AUX, CK, ABA e ET exógenos
resultaram na inibição do alongamento do hipocótilo, sendo coerente com a promoção
em dgt (luz), promoção em sit (luz), inibição em epi (luz e escuro). Por outro lado, GA
promoveu o alongamento corroborando a promoção em pro. Contrariando o efeito
exógeno da CK, brt reduziu o alongamento na luz e no escuro. No escuro, o único
mutante que apresentou alongamento do hipocótilo superior a MT foi o mutante
deficiente na biossíntese do phy (aurea ou au). A utilização de duplos mutantes
combinando phy
-
e alterações hormonais mostrou uma interação aditiva (au epi, au Nr,
au dgt e au sit), sinergística (au pro) e epinástica (au brt) no acúmulo de antocianinas e
alongamento do hipocótilo na luz, porém nessa última resposta, au dgt e au sit
indicaram uma interação sinergística. Juntos, esses resultados indicam que, embora phy
possui vias distintas da AUX, ET, ABA e GA no controle do acúmulo de antocianinas e
10
alongamento do hipocótilo, parece que esse fotorreceptor partilha vias comuns com CK
em ambas as respostas.
Palavras-chave: Cultivar Micro-Tom; Mutantes; Fitocromo; Hormônios; Alongamento do
hipocótilo; Acúmulo de antocianinas.
11
ABSTRACT
ANALYSIS OF THE INTERACTIONS BETWEEN PHYTOCHROME AND PLANT
HORMONES IN PLANT DEVELOPMENT
Many responses regulated by light during plant development are also regulated by
plant hormones, suggesting an interaction between these factors. One important
approach to test this hypothesis is the use of photomorphogenic and hormonal mutants
and double mutant analysis. Mutants with altered photoreceptor biosynthesis, light signal
transduction, hormonal metabolism and hormonal sensitivity are available in tomato.
However, since they are in different cultivars, this can be a limitation for their use in a
comprehensive study, as well as, for the construction of double mutants. In this work we
performed the introgression of nineteen mutations in a single cultivar of tomato, Micro-
Tom (cv. MT). These mutations affect biosynthesis or response to phytochrome (phy),
auxin (AUX), cytokinin (CK), gibberellin (GA), abscisic acid (ABA), ethylene (ET) and
brassinosteroid (BR). Using this collection of hormone mutants, we studied two
responses which are controlled by light and hormones: elongation and anthocyanin
accumulation in hypocotyls. For this purpose, we used three approaches: i) hormonal
treatment in the photomorphogenic mutants, ii) measurement of hypocotyl lengths from
hormonal mutants grown under light and dark conditions and iii) double mutant
(photomorphogenic-hormonal) analysis. Anthocyanin accumulation was promoted by CK
and ABA and inhibited by GA. This is in accordance with the reduction of anthocyanin
accumulation in the ABA deficient mutant (not) and in the GA hypersensitive mutant
(pro). Although the diageotropica (dgt), auxin-insensitive mutant, showed a high
anthocyanin accumulation, the addition of auxin did not supported a role for this hormone
in anthocyanin accumulation. On the other hand, this could be due to a low auxin-to-
cytokinin ratio presented by dgt. Data from mutants with altered metabolism and
sensitivity of ethylene, epinastic (epi) and Never ripe (Nr) respectively, and from plants
treated with this hormone suggest a limited role of ethylene in the anthocyanin
biosynthesis. Exogenous AUX, CK, ABA and ET inhibited the hypocotyl elongation. This
is coherent with the promotion of hypocotyl elongation in dgt and sit mutants under light
conditions and inhibition of hypocotyl elongation in the epi mutant in the light and dark.
On the other hand, GA promoted the hypocotyl elongation corroborating the same effect
seen in pro. The brt mutant showed a reduced hypocotyl elongation in light and dark
conditions, which contradicts the effect of exogenous cytokinin. The phytochrome-
deficient aurea (au) mutant was the only one to show an enhanced hypocotyl elongation
in the dark compared to the wild type (MT). The combination between photomorphogenic
and hormonal mutants (double mutants) showed additive (au epi, au Nr, au dgt e au sit),
synergistic (au pro) and epistatic (au brt) interactions considering the anthocyanin
accumulation and hypocotyl elongation. Synergistic interaction was observed in the
elongation hypocotyl of the au dgt and au sit double mutants. These results indicate that
phy and CK may share some signaling/metabolic pathways in the control of anthocyanin
accumulation and hypocotyl elongation. On the other hand, our data do not support an
12
interaction between phy and the hormones AUX, ET, ABA and GA in the control of
hypocotyls elongation or anthocyanin accumulation.
Keywords: cultivar Micro-Tom, mutants, phytochrome, hormones, hypocotyl elongation,
anthocyanin accumulation.
13
1 Introdução
Desde a germinação até a frutificação, a luz percebida por diferentes
fotorreceptores controla o desenvolvimento vegetal de maneira dependente de sua
intensidade e qualidade (NEFF et al., 1999). Dessa forma, numerosos trabalhos têm
avaliado a atividade de fotorreceptores em diferentes processos desenvolvimentais, tais
como a germinação de sementes, inibição do alongamento dos caules, acúmulo de
pigmentos e reservas bem como indução floral (MANCINELLI; BORTHWICK;
HENDRICKS, 1966; MANCINELLI; RABINO, 1975; CASAL; WHITELAM; SMITH, 1990;
IZAWA et al., 2002; BOCCALANDRO et al., 2003). Existem pelo menos três sistemas de
fotorreceptores: fitocromos, os quais absorvem predominantemente o comprimento de
onda do vermelho (V) e vermelho-extremo (VE), fotorreceptores que absorvem a luz
azul (criptocromos e fototropinas) / UV-A (criptocromos) e aqueles que absorvem o UV-
B. Desses, os fitocromos, os quais são mais bem caracterizados, existem em duas
formas foto-interconversíveis, uma que absorve o V (phyv) e torna-se uma molécula
ativa (phyve), e outra que absorve VE (phyve), revertendo-se a uma forma inativa
(phyv). O processo de reversão de inativo para ativo se dá também pela absorção do
azul, porém menos efetivamente. Além disso, phyve pode ser revertido a phyv em
condição de escuro (Figura 1) (Kendrick & Kronenberg 1994).
Os fitocromos consistem em um polipeptídio (apoproteína) carregando um
cromóforo, a fitocromobilina, a qual é um tetrapirrol linear. A reação de conversão da
forma inativa de fitocromo (phyv) em forma ativa (phyve) é uma reação de isomerização.
Desse modo, a absorção do vermelho pelo phyv resulta na mudança do anel D da forma
cis (inativa) para forma trans (ativa) característica do phyve. Mudanças na propriedade
protéica também contribuem para a alteração entre as duas formas do fitocromo
(LAGARIAS; LAGARIAS, 1989). Em Arabidopsis, há diferentes tipos de apoproteínas
codificadas por uma família gênica, PHYA, PHYB, PHYC, PHYD e PHYE, que formam
as apoproteínas PHYA, PHYB, PHYC, PHYD e PHYE, as quais, após se ligarem ao
cromóforo, formam os fitocromos phyA, phyB, phyC, phyD e phyE, respectivamente. Em
tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) também foram encontrados cinco genes para
apoproteínas PHYA, PHYB1, PHYB2, PHYE e PHYF (PRATT et al., 1997).
14
Efeitos similares à atividade da luz em várias etapas do desenvolvimento podem
ser observados devido à ação das cinco principais classes hormonais: auxina (AUX),
citocinina (CK), giberelina (GA), ácido abscísico (ABA) e etileno (ET). De fato, por longa
data se sabe que hormônios controlam a germinação (principalmente ABA e GA),
alongamento dos caules (principalmente AUX e GA), acúmulo de pigmentos e reservas
(CK, GA e ABA), e indução floral (GA, CK e ET, dependendo da espécie vegetal)
(JONES, 1987; DEIKMAN; HAMMER, 1995; JENSEN; HANGARTER; ESTELLE, 1998;
FELLNER et al., 2001; SEO et al., 2006). Essa constatação levanta a questão de que
os hormônios vegetais poderiam fazer parte da via de transdução de sinal da luz na
fotomorfogênese (NEMHAUSER; CHORY, 2004). Uma maneira de se testar tal hipótese
seria através do uso de mutantes com alterações tanto no fitocromo quanto em
diferentes classes hormonais (Figura 1). A observação de mutantes hormonais em
diferentes condições luminosas e de mutantes fotomorfogenéticos sob o efeito exógeno
das várias classes hormonais, bem como combinações de duplos mutantes
fotomorfogenéticos-hormonais, permitiriam então estabelecer se uma determinada
classe hormonal afeta um processo fotomorfogenético e se esse efeito envolve a
interação com fotorreceptores.
15
Figura 1 – Hipótese para um controle de eventos fotomorfogenéticos (ex. alongamento
e acúmulo de antocianinas em hipocótilos) em tomateiro pelo fitocromo ativo
e por diferentes classes hormonais. Os mutantes fri e tri são defeituosos
para a fabricação de apoproteínas PHYA e PHYB1, respectivamente. As
mutações au e yg-2 possuem alterações na via de biossíntese do
cromóforo. Apesar dos genes necessários para biossíntese do cromóforo
estarem no núcleo, sua molécula é montada nos plastídios. As alterações
fotomorfogenéticas nos mutantes Ip, hp1, dg (hp2) e atv ocorrem na via de
transdução de sinal do fitocromo. Enquanto as mutações Ip, hp1, hp2 e atv
levam a uma maior inibição do alongamento e promoção do acúmulo de
antocianinas nos hipocótilos, as mutações au, yg2 produzem o fenótipo
inverso, mesmo em plântulas crescidas na luz. Os hormônios também
possuem um forte controle desses processos. A giberelina (GA) é
considerada um promotor do alongamento na luz e inibidora do acúmulo de
antocianina. A auxina (AUX) possui efeito semelhante ao de GA,
estimulando o alongamento do hipocótilo, porém no escuro. O etileno (ET)
inibe o alongamento do hipocótilo tanto no claro quanto no escuro. O ácido
abscísico (ABA) e a citocinina (CK) são considerados promotores do
acúmulo de antocianinas. Os mutantes dgt, brt e Nr são pouco sensíveis aos
hormônios AUX, CK e ET, respectivamente. O mutante pro é supersensível
a GA e o mutante epi é super produtor de ET. Os mutantes sit e gib são
deficientes em ABA e GA, respectivamente. (Parte desse esquema foi
adaptada de Kendrick et al., 1997)
16
Para um estudo amplo empregando a abordagem proposta acima, seriam
necessários não só mutantes em diferentes classes hormonais e fotomorfogenéticos,
mas a presença de todos eles em um só background genético (e.g. uma única cultivar).
No presente trabalho, adotamos o tomateiro como modelo genético e utilizando uma
cultivar de porte reduzido e ciclo rápido (cv Micro-Tom) obtivemos dezenove mutantes
hormonais e fotomorfogenéticos em um só background genético (linhagens quase
isogênicas). Tanto a obtenção dessa coleção, quanto o teste se a mesma é adequada
para estudos desenvolvimentais, são apresentados no Capítulo 1. De posse de tal
coleção, no Capítulo 2 foi analisado a interação entre luz e hormônios vegetais
utilizando duas respostas bastante influenciadas por esses fatores, o alongamento do
hipocótilo e o acúmulo de antocianinas nesses. Para tal, foram utilizados não só estudos
extensivos em cada classe de mutantes, bem como combinações de duplos mutantes
fotomorfogenéticos-hormonais.
Referências
BOCCALANDRO, H.; PLOSCHUK, E.; YANOVSKY, M.; GATZ, C.; SÁNCHEZ, R.;
CASAL, J. Increased phytochrome B alleviates density effects on tuber yield of field
potato crops. Plant Physiology, Rockville, v. 133, p. 1-8, 2003.
CASAL, J.J.; WHITELAM, G.C.; SMITH, H. Phytochrome effects on the relationship
between chlorophyll and steady-state levels of thylakoid polypeptides in light-grown
tobacco. Plant Physiology, Rockville, v. 94, p. 370-374, 1990.
DEIKMAN, J.; HAMMER P. E. Induction of anthocyanin accumulation by cytokinins in
Arabidopsis thaliana. Plant Physiology, Rockville, v. 108, p. 47-57, 1995.
FELLNER, M.; ZHANG, R.; PHARIS, R. P.; SAWHNEY, V. K. Reduced de-etiolation of
hypocotyl growth in a tomato mutant is associated with hypersensitivity to, and high
endogenous levels of, abscisic acid. Journal of Experimental Botany, Oxford. v. 52, p.
725-738, 2001.
IZAWA, T.; OIKAWA, T.; SUGIYAMA, N.; TANISAKA, T.; YANO, M.; SHIMAMOTO, K.
Phytochrome mediates the external light signal to repress FT orthologs in photoperiodic
flowering of rice. Genes and Development, New York, v. 16, p. 2006–2020, 2002.
JENSEN, P.J.; HANGARTER, R.P.; ESTELLE, M. Auxin transport is required for
hypocotyl elongation in light-grown but not dark-grown Arabidopsis. Plant Physiology,
Rockville, v. 116, p. 455–462, 1998.
17
JONES, M.G. Gibberellins and the procera mutant of tomato. Planta, Berlin, v. 172, p.
280–284, 1987.
KENDRICK, R.E; KRONENBERG, G.H.M. (Eds.): Photomorphogenesis in Plants - 2nd
Edition. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 828 (1994).
KENDRICK, R.E.; KERCKHOFFS, L.H.; VAN TUINEN, A.; KOORNEEF, M.
Photomorphogenic mutants of tomato. Plant, Cell Environment, Oxford, v. 20, p. 746-
751, 1997.
LAGARIAS, J.C.; LAGARIAS, D.M. Self-assembly of synthetic phytochrome holoprotein
in vitro. Proceedings of the National Academy of Science, Washington, v. 86, p.
5778-5780, 1989.
MANCINELLI, A.L.; BORTHWICK, H.A.; HENDRICKS, S.B. Phytochrome action in
tomato-seed germination. Botanical Gazette, Chicago, v. 127, p. 1–5, 1966.
MANCINELLI, A.L.; RABINO, I. Photocontrol of anthocyanin synthesis. IV. Dose
dependence and reciprocity relationship. Plant Physiology, Rockville, v. 56, p. 351–355,
1975.
NEFF, M.M.; NGUYEN, S.M.; MALANCHARUVIL, E.J.; FUJIOKA, S.; NOGUCHI, T.;
SETO H.; TSUBUKI, M.; HONDA, T.; TAKATSUTO, S.; YOSHIDA, S.; CHORY, J. BAS1:
a gene regulating brassinosteroid levels and light responsiveness in Arabidopsis.
Proceedings of the National Academy of Science, Washington, v. 96, p. 15316-
15323, 1999.
NEMHAUSER, J.; J. CHORY. BRing it on: new insights into the mechanism of
brassinosteroid action. Journal of Experimental Botany, Oxford, 55, n. 395, p. 265-
270, 2004.
PRATT, L.H.; CORDONNIER-PRATT, M.M.; KELMENSON, P.M.; LAZAROVA, G.I.;
KUBOTA, T.; ALBA, R.M. The phytochrome gene family in tomato (Solanum
lycopersicon L.). Plant, Cell Environment, Oxford, v. 20, p. 672-677, 1997.
SEO, M.; HANADA, A.; KUWAHARA, A.; ENDO, A.; OKAMOTO, M.; YAMAUCHI, Y.;
NORTH, H.; MARION-POLL, A.; SUN, T.P.; KOSHIBA, T.; KAMIYA, Y.; YAMAGUCHI,
S.; NAMBARA, E. Regulation of hormone metabolism in Arabidopsis seeds:
Phytochrome-regulation of abscisic acid metabolism and abscisic acid-regulation of
gibberellin metabolism. The Plant Journal, Oxford, v. 48, p. 354-366, 2006.
18
2 OBTENÇÃO DE MUTANTES FOTOMORFOGENÉTICOS E HORMONAIS EM UMA
ÚNICA CULTIVAR DE TOMATEIRO (Lycopersicon esculentum MILL. CV MICRO-
TOM): UM MODELO PARA ESTUDAR O CONTROLE MULTIFATORIAL DO
DESENVOLVIMENTO
Resumo
Mutantes hormonais e em moléculas receptoras/transdutoras de sinais
ambientais têm se tornado uma ferramenta útil para estudos integrados do
desenvolvimento e sua interação com o ambiente. Tal abordagem exige que as
mutações investigadas estejam em um mesmo background genético, para que
comparações e combinações entre elas sejam feitas. No presente estudo, dezenove
mutações afetando a biossíntese ou a resposta aos hormônios auxina (AUX), citocinina
(CK), giberelina (GA), ácido abscísico (ABA), etileno (ET) e brassinoesteróides (BR) e
ao fitocromo foram colocadas em um único background genético de tomateiro, cv Micro-
Tom (MT), que possui algumas das vantagens do modelo Arabidopsis, ou seja, porte
reduzido e ciclo de vida curto. Apesar do porte reduzido de MT ser em parte devido à
mutação dwarf, que reduz a biossíntese de BR, mutações afetando a biossíntese ou
sensibilidade a esse hormônio (cu3 e dpy), bem como a GA (gib1, gib2, gib3 e pro)
apresentaram fenótipo aditivo no background MT. Essas observações evidenciam que
nem BR e nem GA explicam totalmente o tamanho miniatura de MT e que alterações
nessas e em outras classes hormonais podem ser estudas no background MT, o qual
passa a ser considerado “wild type”. O pequeno tamanho e a deficiência de BR em MT
também não impediram que essa cultivar estiolasse no escuro e que mutantes
deficientes em fitocromo (au e yg2) mostrassem a resposta descrita anteriormente para
outras cultivares, ou seja, aspecto estiolado mesmo na luz. Desse modo, vários
aspectos do desenvolvimento vegetativo (germinação e alongamento do hipocótilo na
luz e no escuro, além de crescimento de plantas adultas) e reprodutivo (floração,
frutificação e amadurecimento) foram estudados. Os mutantes no background MT
mostraram respostas coerentes com os efeitos esperados para cada classe hormonal ou
alteração no fitocromo. Além disso, a facilidade de manipulação de MT nos permitiu
observar fenótipos que sugerem efeitos gênicos ainda não descritos para algumas
classes hormonais ou mutações estudadas. Entre as novas respostas observadas,
algumas são de interesse direto para o melhoramento de tomateiro, como o aumento do
número de flores na inflorescência do mutante com deficiência em fitocromo, no peso do
fruto no mutante superprodutor de ET e no teor de sólidos solúveis no mutante
supersensível a GA.
Palavras-chave: Cultivar Micro-Tom; Mutantes; Modelo de estudo; Fotomorfogênese;
Hormônios.
19
2 HORMONE AND PHYTOCHROME MUTANTS IN A SINGLE TOMATO GENETIC
BACKGROUND (Lycopersicon esculentum MILL. CV MICRO-TOM): A MODEL TO
STUDY THE ENDOGENOUS CONTROL OF PLANT DEVELOPMENT.
Abstract
Mutants related to hormone or other receptor/signaling molecules (such as
phytochrome) are a powerful tool to study the integration of environmental and
endogenous signals in the control of plant development. A crucial yet often overlooked
aspect of this approach is the use of mutants in a single genetic background to allow for
comparisons between each mutant and multiple mutant combinations against a single
wild type/control. In this work, 19 different mutations affecting either biosynthesis or
signaling in phytochrome, auxin (AUX), cytokinin (CK), gibberellin (GA), abscisic acid
(ABA), ethylene (ET) and brassinosteroid (BR), were introgressed (through successive
backcrosses) into the tomato miniature cultivar Micro-Tom (MT). MT presents some of
the advantages of Arabidopsis, such as reduced size and short life cycle. In spite of the
miniature habit of MT being partly due to a reduced BR content conferred by the dwarf
mutation, other mutations affecting biosynthesis or sensitivity to BR (cu3 and dumpy) and
GA (gib1, gib2, gib3 and pro) showed an additive phenotype in the MT background. This
suggests that neither BR nor GA can fully account for the small size of this cultivar, which
thus can be considered the true control (wild type) in studies involving these and other
hormone classes. Moreover, MT’s small size did not preclude it from etiolating when
grown in the dark, and phytochrome deficient mutants (au and yg2) in this background
showed the characteristic etiolation response when grown in normal light. In the same
fashion, many aspects of vegetative and reproductive development where studied and
the different mutants showed responses coherent with the expected and known effects of
the respective hormone classes. These results prove that the developmental alterations
already present in MT (e. g. dwarfism) are not a drawback to study plant development.
Furthermore, a series of hitherto unknown phenotypes were observed for some of the
mutations and are described here. Among these, some are of direct interest for tomato
breeding, such as increased number of flowers per inflorescence, increased fleshy fruit
weight and increased soluble solids content. Besides the study of developmental
processes not present in Arabidopsis, especially those linked to tomato breeding, we
also propose the use of the mutant collection presented here as an inexpensive
didactical tool for plant physiology.
Keywords: Cultivar Micro-Tom; Mutants; Study model; Photomorphogenesis; Hormones.
20
2.1 Introdução
O desenvolvimento vegetal é regulado pela interação de fatores ambientais e
endógenos (e.g. hormônios). A luz, um dos principais moduladores externos do
desenvolvimento (CHORY et al., 1996; NEFF et al., 2000), pode interagir com
hormônios em várias respostas, tais como germinação (KUCERA; CHON; LEUBNER-
METZGER, 2005), alongamento caulinar (VANDENBUSSCHE et al., 2005), dominância
apical (KEBROM; BURSON; FINLAYSON, 2006), florescimento (OKAMURO et al.,
1997) e senescência (QUILES; CUELLO; SABATER, 1990). Considerando-se a
existência de pelo menos seis classes hormonais com forte impacto no
desenvolvimento, e que interagem entre si; auxina (AUX), citocinina (CK), giberelina
(GA), ácido abscísico (ABA), etileno (ET) e brassinoesteróide (BR), bem como a gama
de fatores ambientais que podem afetar uma planta, pode se vislumbrar a complexidade
das interações ambiente-hormônios-desenvolvimento.
O uso de mutantes na fisiologia vegetal (KOORNNEEF; ALONSO-BLANCO;
PEETERS, 1997) é uma alternativa simples para abordar questões complexas, como o
estudo do controle multifatorial do desenvolvimento. O modelo vegetal onde mutantes
são mais conhecidos é Arabidopsis thaliana, embora também existam representantes
em espécies de interesse agronômico direto como o arroz (Oryza sativa L.), milho (Zea
mays L.), ervilha (Pisum sativum L.) e tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill. Syn.
Solanum lycopersicum L.). O tomateiro é talvez uma das espécies de importância
econômica em que se conhece o maior número de mutantes e variações genéticas
naturais (STEVENS; RICK, 1986). Essa espécie constitui-se também em um modelo
complementar, já que, além do interesse agronômico, possui uma série de
características desenvolvimentais não presentes em Arabidopsis, tais como ausência de
crescimento em roseta, florescimento simpodial e independente do fotoperíodo, bem
como a presença de frutos carnosos e climatéricos.
Já foram descritos em tomateiro mutantes afetando o metabolismo e/ou
sensibilidade à auxina (HICKS; RAYLE; LOMAX, 1989; KELLY; BRADFORD, 1986; OH
et al., 2006), citocinina (PINO-NUNES, 2005), ácido abscísico (TAYLOR; BURBIDGE;
THOMPSON, 2000; BURBIDGE et al., 1999), giberelinas (JONES 1987; BENSEN;
ZEEVAART, 1990; KOORNNEEF et al., 1990), etileno (FUJINO et al., 1988;
21
WILKINSON et al., 1995), brassinoesteróides (BISHOP et al., 1999; KOKA et al., 2000;
MONTOYA et al., 2002) e ácido jasmônico (HOWE et al 1996; HOWE; RYAN, 1999; LI;
LI; HOWE, 2001), além de vários mutantes fotomorfogenéticos (KENDRICK et al.,
1997). A função gênica de muitas dessas mutações hormonais e fotomorfogenéticas já é
conhecida (Tabelas 1 e 2) e há a perspectiva de um incremento nessas descobertas já
que o genoma dessa solanácea está sendo sequenciado por um consórcio entre 10
países (MUELLER et al. 2005).
A análise funcional das mutações é altamente dependente da influência do
genoma em que está inserida, sendo que a validade das conclusões destes estudos
pode ser comprometida pela comparação entre mutantes em background genéticos
distintos. A exemplo disso, mutantes hormonais e fotomorfogenéticos que se conhecem
hoje em tomateiro estão presentes em diferentes cultivares (Tabelas 1 e 2), além de
alguns genótipos os quais representam mutações (cu3) ou variações genéticas naturais
(Ip e atv) descobertas em espécies selvagens e cujo processo de introgressão
(retrocruzamentos sucessivos) no tomateiro cultivado permanece incompleto. Uma das
alternativas para se colocar todas essas mutações em um mesmo background genético
seria sua introgressão em uma só cultivar, tal qual foi realizado para algumas mutações
na cv Ailsa Craig (MAXON-SMITH; RICHIE, 1982). Alternativamente, mutagênese em
larga escala de uma só cultivar, como por exemplo M82 (MENDA et al., 2004), também
poderá gerar alelos das mutações aqui consideradas, embora tais alelos possam ter
efeitos diferentes daqueles já bem descritos na literatura.
Um outro fator limitante para o uso extensivo de mutações em tomateiro é o fato
do seu porte e ciclo de vida não permitirem o cultivo em condições de estrutura mínima,
como se consegue com Arabidopsis. Uma alternativa para isso tem sido a cv Micro-Tom
(MT), uma planta ornamental de porte muito reduzido (SCOTT; HARBAUGH, 1989),
capaz de completar seu ciclo em apenas 70-90 dias, sendo cultivada em vasos com
capacidade menor que 100 mL de substrato. Desde a proposta dessa cultivar como
modelo genético por Meissner et al., 1997, ela vem sendo utilizado em um número
crescente de estudos genético-fisiológicos (DAVID-SCHWARTZ et al., 2001; LI; LI;
HOWE, 2001; TIEMAN et al., 2001; ISAACSON et al., 2002; VOGG et al., 2004; WANG
et al., 2005; SERRANI et al., 2007a; SERRANI et al., 2007b). A principal abordagem
22
utilizada em tais estudos tem sido a mutagênese e a transformação genética
(MEISSNER et al., 1997; MEISSNER et al., 2000; EMMANUEL; LEVY, 2002; LIU;
SCHIFF; DINESH-KUMAR, 2002; MATHEWS et al., 2003; WATANABE et al., 2007;
MATSUKURA et al., 2007). Desse modo, há hoje coleções de mutantes e plantas
transgênicas em MT (MEISSNER et al., 1997; MATHEWS et al., 2003; WATANABE et
al., 2007), além de bibliotecas de ESTs terem sido construídas para essa cultivar
(YAMAMOTO et al., 2005).
Embora as mutações induzidas em MT sejam úteis para estudos genômicos
(EMMANUEL; LEVY, 2002), elas possuem a desvantagem de carecerem de
informações quanto ao efeito e a função gênica dos possíveis novos mutantes
hormonais ou fotomorfogenéticos que por ventura tenham sido obtidos. Além disso, para
aqueles genes onde MT já possui alelos nulos, a mutagênese não gerará variações,
sendo essas somente conseguidas se forem introgredidas variações naturais vindas de
outras cultivares ou espécies selvagens, tal qual proposto para Arabidopsis (ALONSO-
BLANCO; KOORNNEEF, 2000).
No presente estudo, dezenove mutações e variações naturais afetando a
biossíntese ou resposta a fitocromo e a seis classes hormonais foram introgredidas no
background MT para um estudo do controle hormonal múltiplo de várias respostas
desenvolvimentais. Apesar de MT possuir algumas mutações que podem interferir no
estudo do desenvolvimento (MEISSNER et al., 1997; LIMA et al., 2004; MARTÍ et al.,
2006), tais como dwarf (d), que reduz a biossíntese de BR (BISHOP et al., 1999), e
selfpruning (sp) que controla o padrão de florescimento (PNUELI et al., 1998), todas as
respostas desenvolvimentais estudadas foram coerentes com os efeitos esperados para
cada classe hormonal ou fotomorfogenética. Além disso, a facilidade de manipulação de
MT nos permitiu observar fenótipos que sugerem efeitos gênicos ainda não descritos
para algumas classes hormonais ou mutações estudadas.
23
2.2 Desenvolvimento
2.2.1 Material e Métodos
2.2.1.1 Cultivo e cruzamentos
O cultivo de plantas adultas tanto para realização de cruzamentos quanto para
avaliar crescimento vegetativo (Figuras 4, 6, 7 e 8) e reprodutivo (Tabela 3) foi realizado
em uma casa de vegetação com irrigação automática (4 vezes ao dia), temperatura
média anual de 28
o
C, fotoperíodo de 11,5 h (inverno) e 13 h (verão) e radiação de 250
a 350 µmol.m
-2
.s
-1
PAR, conseguido através da diminuição da radiação natural com o
uso de malha refletora 50%. Sementes dos mutantes hormonais e fotomorfogenéticos
foram semeadas em bandejas contendo uma mistura na proporção de 1:1 de substrato
comercial (Plantmax HT, Eucatex) com vermiculita expandida, suplementado com 1g/L
de NPK 10:10:10 e 4 g/L de calcário. Após 10 dias, as plantas foram transferidas para
vasos com capacidade para 150 mL (Micro-Tom), ou para 10 L (mutantes parentais),
com as mesmas misturas para substrato. Após os cruzamentos entre os mutantes
parentais e a cv MT e obtenção de porte micro em gerações posteriores, os mutantes
também foram transplantados para vasos com capacidade para 150 mL. Em cada
cruzamento os frutos maduros foram colhidos e a polpa contendo as sementes foi
fermentada durante 12 horas adicionando-se um pouco de água e levedura
(Saccharomyces cerevisae) liofilizada, utilizada para panificação (Fermix).
Posteriormente, as sementes foram lavadas e secas em ambiente ventilado e
sombreado.
O processo de introgressão de uma mutação ou variação natural usando um
parental recorrente (cv Micro-Tom) consiste em uma série de cruzamentos e
retrocruzamentos (Figura 1). Em cada cruzamento, pólens foram retirados dos mutantes
parentais e postos para polinizar flores emasculadas de MT. O primeiro cruzamento
entre MT e os mutantes produziu plantas F1. A partir desta geração, permitiu-se que
houvesse autofecundação para obtenção de plantas F2, na qual houve a primeira
seleção para porte pequeno e presença de mutações. Após a seleção, houve
retrocruzamento com MT até a sexta geração (BC6), permitindo a cada duas gerações
que houvesse autofecundação para serem visualizados as mutações em homozigose.
Após alcançar a geração BC6F2, os genótipos foram considerados linhagens quase
24
isogênicas (REID, 1993). Para mutantes dominantes, como Nr, a autofecundação não
foi necessária entre os cruzamentos, mas testes de progênie foram realizados em
BC6F2 para identificar plantas homozigotas. Além disso, frutos de Nr foram colhidos
antes da maturação completa, já que a pouca sensibilidade ao etileno não permite que o
fruto amadureça completamente. Também de maneira precoce foram colhidos os frutos
dos mutantes deficientes na biossíntese de ABA (sit, flc e not) para evitar a germinação
no interior dos frutos maduros. Mutantes deficientes na biossíntese de GA (gib1, 2 e 3)
não germinam na ausência desse hormônio exógeno. Portanto, para seleção deste
genótipo, inicialmente as sementes foram postas para germinar em papel umedecido
com água, sendo descartadas as que germinaram primeiro. As sementes restantes
foram tratadas com GA (100 µM) e as que germinaram foram aclimatadas em casa de
vegetação, sendo o fenótipo deficiente em GA observado após o término do efeito
residual dessa substância. Após a observação do fenótipo, os mutantes voltaram a ser
tratados com 100 µM de GA a cada 15 dias para facilitar a produção de flores e
desenvolvimento dos frutos (KOORNNEEF et al., 1990).
25
Figura 1 - Representação esquemática do processo de introgressão. Mutantes hormonais, como
representado aqui por notabilis (not), foram introgredidos no background Micro-Tom (MT)
através de seis retrocruzamentos (BCs) e autopolinizações (BCnF2). (1) Porcentagem
teórica do genoma de MT em cada geração. (2) Tempo em meses para alcançar cada
geração. (3) Nomenclatura de cada geração representando cruzamentos e
retrocruzamentos (F1 e BCn) e autopolinizações (F2, BCnF2). As autopolinizações foram
necessárias para visualização do fenótipo de mutações recessivas (ex. not), sendo que o
processo de introgressão tem duração teórica de 29 meses. No caso de mutantes
dominantes (ex. Nr) o processo de introgressão tem duração teórica de 24 meses. Em F2,
sementes foram semeadas em alta densidade e plântulas com 14 dias de idade foram
selecionadas para porte MT, sendo a proporção de 1:27 (3,5%). Nas plantas resultantes,
selecionou-se aquelas com tendência ao murchamento (not/not) e posteriormente aquelas
com crescimento determinado (sp/sp), sendo a proporção 1:3 (25%) em cada triagem.
Desse modo, a proporção final de plantas selecionadas em F2 é de 1:47 (0,2%). Nos BCs
subsequentes, o porte anão e o crescimento determinado ficaram fixados, não havendo
mais necessidade de seleção, já que o parental recorrente (MT) também tem essas
características. Desse modo, no resto do processo de introgressão bastou selecionar not
em BC2F2, BC4F2 e BC6F2, sendo a proporção de 1:7 (12,5%)
26
2.2.1.2 Tratamento com luz
Para avaliar o tempo de germinação, o comprimento do hipocótilo e raiz em
condições de escuro, sementes foram postas em caixas plástica pretas (gerbox)
contendo papel de filtro umedecido com água destilada. O tempo de germinação foi
avaliado durante cinco dias utilizando-se 3 repetições de 50 sementes. A contagem foi
realizada em uma sala escura com luz verde de segurança. Foram consideradas
germinadas sementes que apresentaram a protrusão da radícula. O comprimento do
hipocótilo e da raiz foi medido após 10 dias em 20 plântulas de cada genótipo. Para
tratamentos com luz, a germinação de sementes foi avaliada em incubadora para B.O.D.
Para o comprimento do hipocótilo e raiz, plântulas foram crescidas em uma sala de
crescimento utilizada para cultivo de plantas in vitro. Tanto na B.O.D quanto na sala de
crescimento, as condições ambientais foram mantidas em torno de 25
o
C e fotoperíodo
de 16 horas (55 µmol.m
-2
.s
-1
PAR).
2.2.1.3 Análises do desenvolvimento vegetativo
Durante 56 dias foi medida, em intervalos de 7 dias, a altura das plantas com uma
régua, sendo considerada a base da planta até o ápice. A matéria seca da raiz e do
caule foi pesada em plantas com 60 dias, após serem postas para secar a 60
o
C durante
7 dias em uma estufa. O índice de ramificação foi calculado considerando a proporção
entre a soma do comprimento das ramificações laterais e o comprimento do eixo
principal, segundo Morris et al. (2001). A área foliar foi medida utilizando um planímetro
eletrônico (Li-3000A, Li-Cor) em plantas com 60 dias crescidas em casa de vegetação.
A avaliação da área foliar para os mutantes hormonais foi feita utilizando-se folhas mais
velhas (3
o
) e mais jovens (6
o
) totalmente expandidas. Os folíolos foram medidos
separadamente e depois somados para evitar a sobreposição dos mesmos durante a
medição. A média dos valores da área foliar foi obtida utilizando-se 4 repetições. Para
os mutantes fotomorfogenéticos, foi avaliada a área foliar total, e para repetições foram
utilizadas 10 plantas.
27
2.2.1.4 Área de células epidérmicas
Para medidas de área celular, foram utilizadas células epidérmicas foliares como
referência. Para observá-las, foram retiradas “impressões” das superfícies adaxial e
abaxial de folhas totalmente expandidas. Tais impressões foram retiradas utilizando uma
mistura de resinas odontológicas (Xantopren VL Plus + Activator Universal/optosil-
xantopren) segundo o método descrito por Weyers; Johansen (1985) e Poole et al.,
(1996). Após isso, os “imprints” reversos foram retirados do material impresso na resina,
recobrindo-se a mesma com uma fina camada de esmalte de unha. As impressões
foram então observadas em microscópio ótico (20x), sendo a análise das dimensões
celulares feita com auxílio do software QUANT (VALE, F.X.R; FERNANDES FILHO;
LIBERATO, 2001) em imagens capturadas e digitalizadas.
2.2.1.5 Aspectos reprodutivos
A primeira inflorescência formada foi utilizada para a contagem do número de
flores, em avaliações de 10 repetições. O peso e o número de frutos por planta foram
obtidos utilizando-se 12 repetições, e para o número de lóculos por fruto foram utilizadas
10 repetições. O tempo para o amadurecimento do fruto foi avaliado utilizando-se 15
plantas, onde se observou, a partir da antese, um fruto por planta, o qual foi mantido na
planta. O peso das sementes foi calculado utilizando-se 10 repetições de 100 sementes.
Sólidos solúveis totais (SST) foram medidos em frutos frescos completamente maduros,
utilizando um refratômetro digital (Atago PR-101). A avaliação foi realizada em 12
repetições para cada genótipo, utilizando um fruto por planta.
2.2.1.6 Análise estatística
Médias e erro padrão dos parâmetros foram estimados e, quando necessário, foi
realizado teste “t” Student para comparação de médias.
28
2.2.2 Resultados e Discussão
2.2.2.1 Obtenção e observação de fenótipo recombinante de mutações hormonais
e fotomorfogenéticas no background Micro-Tom
Estudos comparativos utilizando mutantes podem ser limitados pela diferença
entre backgrounds genéticos, visto que uma mesma função gênica pode ter efeitos
diferentes dependendo das interações epistáticas com outros genes (TONSOR;
ALONSO-BLANCO; KOORNNEEF, 2005). Visando à obtenção de mutações em seis
classes hormonais e em dois tipos diferentes de respostas fotomorfogenéticas (Tabelas
1 e 2) em uma única cultivar de tomateiro, retrocruzamentos sucessivos (introgressão)
foram realizados utilizando MT como parental recorrente (Figura 1). Foi assim possível
em pouco tempo e utilizando uma estrutura mínima, a obtenção de 19 novos mutantes
no background MT. Uma abordagem alternativa para montagem de uma coleção
equivalente seria a indução de mutações em MT (MEISSNER et al., 1997; WATANABE,
et al., 2007; MATSUKURA et al., 2007). Contudo, o número de plantas a ser analisado e
a estrutura requerida teria que ser expressivamente maior, e ainda assim não se teria
garantia de que alelos com os mesmos efeitos daqueles já bem caracterizados na
literatura (Tabelas 1 e 2) seriam encontrados. Além disso, para alguns locos, sobretudo
aqueles onde o modelo escolhido já possui alelos nulos, a introgressão seria a maneira
mais eficiente de se obter variações alélicas perceptíveis (ALONSO-BLANCO;
KOORNNEEF, 2000). No caso de MT, a introgressão não só permite incorporar nesse
modelo variações alélicas presentes em outras cultivares, como também a rica variação
genética natural das espécies selvagens de Lycopersicon (RICK, 1973; TAYLOR, 1986).
Exemplos disso são Ip e atv, provenientes respectivamente de L. chmielewski e L.
cheesmanii e introgredidos em MT no presente trabalho (Tabela 2), além do loco Rg1
que aumenta a capacidade de regeneração in vitro proveniente de L. peruvianum
(KOORNNEEF et al., 1993) e introgredido em MT em projetos anteriores (LIMA et al.,
2004).
29
Tabela 1
- Mutantes hormonais introgredidos na cultivar Micro-Tom
Mutantes
Classe
hormonal
1
Efeito/ função gênica Referência
diageotropica (dgt)
Auxina
Baixa sensibilidade. Gene defectivo
para biossíntese de uma ciclofilina,
um possível componente da via
transdução de sinal
(1)
LA1093
cv VFN8
Bushy root (brt)
Citocinina
Baixa sensibilidade. Função gênica
desconhecida
(2)
LA2816
cv desconhecida
Never ripe (Nr)
Etileno
Baixa sensibilidade. Defectivo para
receptor de etileno
(3)
LA0162
cv Pearson
epinastic (epi)
Etileno
Alta produção de etileno. Função
gênica desconhecida
(4)
LA2089
cv VFN8
sitiens (sit)
ABA
Baixa produção de ABA. Defectivo
para ABA-aldeído oxidase
(5)
LA0574
cv Rheinlands
Ruhm
flacca (flc)
ABA
Baixa produção de ABA. Defectivo
para maturação do cofator Mo para
ABA-aldeído oxidase
(6)
LA0673
cv Rheinlands
Ruhm
notabilis (not)
ABA
Baixa produção de ABA. Defectivo
para a enzima NCED a qual cliva
carotenóides
(7)
LA0617
cv Lukulus
gibberellin
deficient1 (gib1)
GA
Baixa produção de GA. Defectivo
para conversão de GGDP a CDP
(8)
LA2893
cv Moneymaker
gibberellin
deficient2 (gib2)
GA
Baixa produção de GA. Defectivo
para conversão de ácido ent-7α-
hidroxicaurenóico a GA12-aldeído
(9)
LA2894
cv Moneymaker
gibberellin
deficient3 (gib3)
GA
Baixa produção de GA. Defectivo
na conversão de CDP a ent-
caurene
(10)
LA2895
cv Moneymaker
procera (pro)
GA
Alta sensibilidade. Função gênica
desconhecida
(11)
LA0565
cv Condine Red
Curl3 (cu3)
BR
Baixa sensibilidade. Gene defectivo
para receptor de BR (LeBRI1),
homólogo ao BRI1 de Arabidopsis
(12)
LA2398
dumpy (dpy)
BR
Baixa produção de BR.
Provavelmente, defectivo na
conversão de
6-deoxocatasterona a 6-
deoxoteasterona
(13)
LA0811
cv desconhecida
1
ABA = ácido abscísico ; GA = giberelina; BR = brassinoesteroide. (1) Oh et al., 2006; (2)
Pino-Nunes 2005; (3) Wilkinson et al., 1995; (4) Fujino et al., 1988; (5 e 6) Taylor et al., 2000;
(7) Burbidge et al., 1999; (8, 9 e 10) Bensen e Zeevaart, 1990; (11) Jones, 1987; (12) Montoya
et al., 2002; (13) Koka et al., 2000
30
Tabela 2
-
Mutantes fotomorfogenéticos introgredidos na cultivar Micro-Tom
Mutantes Tipo de mutação Função gênica Referência
aurea (au)
Deficiência na
biossíntese do
cromóforo do
fitocromo
Defectivo para o gene da
fitocromobilina sintase
(1)
LA3280
cv Condine
Red
Yellow green2
(yg2)
Deficiência na
biossíntese do
cromóforo do
fitocromo
Provavelmente defectivo para o
gene da heme oxigenase
(2)
LA2514
cv
desconhecida
high pigment1
(hp1)
Respostas
exageradas à luz
Defectivo para o gene homólogo
ao gene DDB1A de Arabidopsis, o
qual codifica uma proteína que
interage com DET1 (HP2), um
repressor da fotomorfogênese
(3)
LA3004
cv Webb
Special
high pigment2
(hp2)
Respostas
exageradas à luz
Defectivo para o gene homólogo a
DET1 de Arabidopsis, um
repressor negativo da
fotomorfogênese
(4)
LA2451
cv Manapal
atroviolacea (atv)
Respostas
exageradas à luz
Trata-se uma variação natural
vinda de L. cheesmanii, sendo
provavelmente um alelo não
funcional de um regulador negativo
da fotomorfogênese
(5)
LA0797
Intense pigment
(Ip)
Respostas
exageradas à luz
Trata-se de uma variação natural
vinda de L. chmielewski, sendo
provavelmente um regulador
positivo da resposta à luz, cujo
alelo presente em tomateiro não é
funcional
(6)
LA1563
(1) Muramoto et al., 2005; (2) Terry e Kendrick, 1999; (3) Liu et al., 2004; (4) Mustilli et al.,
1999; (5 e 6) Kendrick et al., 1997
Nos novos genótipos criados, o porte reduzido de MT mostrou ser aditivo a todos
os fenótipos característicos das mutações hormonais ou fotomorfogenéticas (Figuras 2 e
3). Entre os vários fenótipos aditivos observados, destaca-se o extremo nanismo de
mutantes deficientes em GA (e. g. gib2) ou insensíveis/deficientes a BR (cu3 e dpy) no
background MT (Figura 2A e B). No caso de cu3 foram obtidas plantas adultas e férteis
com menos de 3 cm de altura, sendo provavelmente um recorde na redução de
tamanho em tomateiro. Já foi demonstrado que o fenótipo anão de MT é causado por
pelo menos duas mutações recessivas, sendo uma delas alélica à mutação dwarf (LIMA
et al., 2004; MARTÍ et al., 2006). Atualmente, sabe-se que a mutação dwarf é em um
componente da via biossintética de brassinoesteróides (BISHOP et al., 1999). Isso
implica que MT possui níveis reduzidos de brassinoesteróides, embora não seja uma
mutação drástica como ocorre em dpy (Figura 1A; KOKA et al., 2000). O fenótipo aditivo
das mutações cu3 e dpy em MT sugere que a segunda mutação que confere o nanismo
31
em MT não esteja seja relacionada a BR. Por outro lado, tanto a redução do tamanho de
MT através da introgressão de mutações que levam à deficiência de GA, quanto o
aumento proporcional desse, mas não o reestabelecimento da altura normal ao se
introgredir a mutação pro (Figura 2C) de hipersensibilidade a GA, confirmam sugestão
prévia de que o nanismo de MT não está relacionado primariamente com essa classe
hormonal (MARTÍ et al., 2006). Além disso, ao contrário dos mutantes deficientes em
GA em tomateiro (KOORNNEEF et al., 1990), MT apresenta porcentagem de
germinação de sementes considerada normal para a espécie (Figura 4A e B).
Utilizando plantas na geração BC6Fn, consideradas linhagens quase isogênicas
(NILs) à MT, vários aspectos do desenvolvimento vegetativo e reprodutivo, bem como
parâmetros agronômicos, foram avaliados. Um dos objetivos do presente estudo foi
verificar se o background MT, apesar de por si só ser considerado um mutante que afeta
o desenvolvimento, é adequado para estudos de respostas desenvolvimentais
reconhecidamente controladas pela luz e por hormônios.
32
Figura 2 - Fenótipo dos mutantes hormonais introgredidos na cv Micro-Tom (MT). A)
Plântulas com 15 dias cultivadas em casa de vegetação. Note o
gravitropismo negativo em raízes de dgt, excessiva ramificação em raízes de
brt e epi, maior comprimento das raízes de not, maior e menor comprimento
dos hipocótilos em pro e dpy, respectivamente e menor e maior espessura
dos hipocótilos em not e epi, respectivamente. B) Fenótipo do mutante cu3
(esquerda-acima) e gib3 (esquerda-abaixo), os quais possuem uma severa
redução no tamanho e inibição da expansão foliar, quando comparados com
MT. C) Fenótipo do mutante pro, o qual apresenta um maior alongamento do
caule. D-H) aspecto da folha de MT (D), dgt (E), epi (F), pro (G) e dpy (H).
Note a presença de hiponastia (E), epinastia (F e H) e margens pouco
recortadas (G) quando comparados ao controle MT (D). I) formação de
“umbigo” em frutos de pro. J) Germinação precoce (viviparidade) de
sementes de sit no interior do fruto. K) Mutante epi apresentando folhas
epinásticas e espessamento do caule. Note também que o efeito da mutação
parece ser mais severo para as últimas folhas formadas. Uma descrição das
alterações hormonais envolvidas em cada mutante encontra-se na tabela 1
33
Figura 3
-
Fenótipo dos mutantes fotomorfogenéticos introgredidos na cv Micro-Tom (MT).
A
-
J)
Aspectos fenotípicos do mutante au e yg2, os quais são deficientes na percepção à luz, e
dos mutantes hp1 e 2, Ip e atv, os quais respondem exageradamente à luz. A) Plântulas
de au, MT e hp1 crescidas no escuro (esquerda) e luz (direita). No escuro, os três
genótipos não diferem no comprimento do hipocótilo, porém, na luz, au apresenta-se
estiolado e hp1 possui um desestiolamento evidente comparado ao de MT. B) Porte
reduzido e mais ramificado em hp1. O porte reduzido de hp1 reflete o menor comprimento
de seu caule desde a formação do hipocótilo visto em A. C) O estiolamento de au mesmo
na luz produz plantas mais altas, cloróticas e menos ramificadas. D) Um acúmulo de
antocianinas, além da pigmentação verde escuro, pode ser observada nas folhas de hp2.
E) Acúmulo de antocianinas no hipocótilo de hp1 germinado na luz, o qual tende a
germinar primeiro que MT nessa condição, mas não no escuro (ver Figura 4). F) Maior
pigmentação nos frutos de Ip. G) Maior pigmentação nas folhas de hp1, o qual em geral
não mostra acúmulo visível de antocianinas nesse órgão como visto em hp2. H) Frutos
com maior pigmentação em hp1, sendo um efeito mais pronunciado que em Ip visto em
F. I) Acúmulo de antocianinas nos caules de atv. J) O acúmulo de antocianinas nos
caules adultos dos mutantes hp1 e hp2 não difere visualmente de MT, visto aqui. K) A
menor diferenciação de cloroplastos e acúmulo de clorofila tanto em au quanto em yg2
faz com que o duplo au yg2 seja praticamente albino, o qual curiosamente não completa
o ciclo. A descrição dos mutantes fotomorfogenéticos e funções gênicas alteradas
encontram-se na tabela 2
34
2.2.2.2 Efeito das mutações hormonais e fotomorfogenéticas na germinação de
sementes e no crescimento de plântulas de Micro-Tom na luz e no escuro.
2.2.2.2.1 Germinação de sementes
Embora virtualmente todas as classes hormonais já tenham sido associadas à
germinação de sementes (MATILLA, 2000; LEUBNER-METZGER, 2001; RAMPEY et
al., 2004; KUCERA; CHON; LEUBNER-METZGER, 2005), os hormônios mais evidentes
associados a esse evento são GA e ABA (BRADY; MCCOURT, 2003). Além disso, na
percepção da luz para a germinação, o fitocromo é o mais conhecido fotorreceptor
controlando essa resposta (EISENSTADT; MANCINELLI, 1974). Conforme esperado, o
mutante deficiente em ABA, not, mostrou uma evidente redução no tempo necessário
para a germinação de 50% das sementes, tanto na luz quanto no escuro quando
comparado ao MT (Figuras 4A e B). Um reflexo disso é que em casos extremos de
deficiência de ABA, como ocorre em sit, pode haver viviparidade (Figura 2J), ou seja,
germinação de sementes no tecido materno (frutos). Ao contrário de ABA, GA é
considerado o principal estimulador da germinação, sendo coerente a constatação de
que o mutante supersensível a essa classe hormonal (pro) apresenta germinação rápida
tanto na luz quanto no escuro (Fig. 4A e B). Um outro hormônio associado à germinação
é o etileno (MATILLA, 2000; KUCERA et al. 2005). O adiantamento da germinação de
Nr no background MT, tanto na presença quanto na ausência da luz, demonstrou
comportamento similar ao relatado em tomateiro ou em mutantes equivalentes em
Arabidopsis (SIRIWITAYAWAN; GENEVE; DOWNIE, 2003), apesar de epi não ter
diferido estatisticamente de MT (Figuras 4A e B). Embora já seja relatado que CKs
possuem um papel na germinação de algumas espécies (BLACK; BEWLEY;
FOUNTAIN,1974; STIRK et al., 2005; NIKOLIĆ et al., 2006), o atraso e a diminuição na
porcentagem final de germinação de brt (Figuras 4A e B) podem ser indiretamente
devido à escassez de reservas dessas sementes, já que apresentam tamanho e peso
reduzidos (Figura 5, Tabela 3). Apesar do papel das auxinas durante embriogênese ser
bem conhecido, pouco é sabido a respeito da atividade desse hormônio na germinação
de sementes (KUCERA; CHON; LEUBNER-METZGER, 2005). O mutante pouco
sensível à auxina, dgt, apresentou um adiantamento da germinação somente na luz
(Figuras 4A e B), sugerindo interação com fitocromo ou outros receptores. De modo
35
oposto, a mutação que causa deficiência em BR, dpy, levou a um atraso na germinação
muito mais proeminente na luz do que no escuro (Figuras 4A e B). Assim como para a
maioria das mutações hormonais, o background MT manteve as respostas esperadas
para mutantes fotomorfogenéticos, sendo que nossos resultados (Figura 4) deixaram
evidentes o já bem documentado efeito de au no atraso da germinação (KOORNNEEF
et al., 1985; GEORGHIOU; KENDRICK, 1991; LERCARI; LIPUCCI DI PAOLA, 1991) e a
não alteração de resposta em hp1 (THOMPSON, 1962; KERR, 1965; RICK, 1974;
KERCKHOFFS et al., 1997).
2.2.2.2.2 Alongamento do hipocótilo
Apesar de ser um órgão simples sob o ponto de vista morfológico, os fatores que
controlam o alongamento do hipocótilo ainda permanecem pouco elucidados. O efeito
da luz na inibição do alongamento é o resultado de uma via de transdução de sinais que
começa com os fotorreceptores, mas que a partir deles ainda há muitos componentes a
serem desvendados (SCHEPENS; DUEK; FANKHAUSER, 2004). Hormônios vegetais
são os prováveis fatores que participam dessa via (HALLIDAY; FANKHAUSER, 2003),
já que são bem conhecidos os efeitos desses na promoção ou inibição do alongamento
do hipocótilo (COLLET; HARBERD; LEYSER, 2000; VANDENBUSSCHE et al., 2005;
VANDENBUSSCHE et al., 2007). No presente estudo, o comprimento do hipocótilo de
mutantes fotomorfogenéticos e hormonais foi medido após dez dias de cultivo no escuro
ou em fotoperíodo de 16 horas. A razão entre o comprimento do hipocótilo na luz e no
escuro facilita a identificação, por exemplo, de mutações com menor capacidade de
estiolamento no escuro ou desestiolamento na luz (razão representada por frações mais
próximas de 1,0). O mutante au, deficiente em fitocromo, é um desses casos, já que a
falta de percepção da luz fez com que seu alongamento seja pouco inibido na luz
(Figuras 4C e 3A). De modo inverso, o mutante com resposta exagerada à luz, hp1,
teve o menor valor dessa razão devido à maior inibição do alongamento do hipocótilo na
luz (Figuras 4C e 3A). Esses resultados estão de acordo com o esperado para esses
mutantes (KOORNNEEF et al., 1985; PETERS et al., 1989; VAN TUINEN et al., 1996;
KERCKHOFFS et al., 1997) e evidenciam que o nanismo de MT e a redução dos níveis
endógenos de BR devido à mutação dwarf em nada impedem que esse background seja
36
um modelo para o estudo da fotomorfogênese. Além disso, o fenótipo de todos os
mutantes fotomorfogenéticos aqui introgredidos em MT reproduziram as características
presentes nos parentais, como as alterações no acúmulo de antocianinas em hipocótilos
e caules, no acúmulo de clorofila em folhas e frutos, além do alongamento dos caules
(Figura 3).
Quanto aos mutantes hormonais, dgt, pro, epi e dpy apresentaram maior razão
entre o comprimento do hipocótilo na luz e no escuro. O valor mais próximo de 1,0, no
caso do mutante hipersensível à GA (pro), pode ser atribuída ao fato desse genótipo ter
um crescimento proeminente do hipocótilo na luz (Figuras 4C e 5A). Ao contrário de pro,
a diminuição da diferença entre luz e escuro em dgt, epi e dpy pode ser atribuída
preferencialmente à inibição do alongamento no escuro, embora epi e dpy tenham
apresentado redução do crescimento também sob luz (Figuras 4C e 5A). A associação
entre AUX (dgt) e GA (pro) com o alongamento no escuro e na luz, respectivamente, foi
sugerido anteriormente para tomateiro e outros modelos vegetais (KIM et al., 1996;
COWLING; HARBERD, 1999; KRAEPIEL et al., 2001). Do mesmo modo, a resposta
observada em epi está de acordo com a conhecida atividade inibitória do etileno no
alongamento do hipocótilo (BINDER et al., 2004; COLLET; HARBERD; LEYSER, 2000;
BARRY et al., 2001). Além do papel inerente à cada classe hormonal no alongamento
do hipocótilo, os resultados parecem indicar que a luz tem um papel fundamental na
regulação da atividade dos hormônios e de suas vias de sinalização. Um mutante que
teve seu hipocótilo bastante inibido no escuro foi o deficiente em BR (dpy), o que
coincide com as observações de que mutantes equivalentes em Arabidopsis são
desestiolados no escuro (CHORY et al., 1989; LI; CHORY, 1997).
2.2.2.2.3 Alongamento da raiz
Além das raízes serem comparativamente um órgão pouco estudado,
praticamente inexistem trabalhos onde se compara seu crescimento nas condições de
luz e escuro. Ao realizarmos a análise sistemática do alongamento da raiz, constatamos
que para a maioria dos genótipos o comportamento desse órgão é exatamente o oposto
ao hipocótilo, ou seja, há um maior alongamento da raiz primária na luz do que no
escuro (Figura 4D). Considerando que a resposta à luz é primariamente nos caules, já
37
que esses são órgãos normalmente expostos a esse fator ambiental, pode se
conjecturar que a reposta das raízes é indireta, sendo regida pela força do dreno
estabelecido no hipocótilo durante seu estiolamento ou desestiolamento (DROZDOVA et
al., 2001). Contudo, as diferenças no comprimento das raízes também podem ser o
efeito direto da luz, visto que esses órgãos expressam os genes para os principais
fotorreceptores (PRATT et al., 1997; MOLAS; KISS; CORRELL, 2006). Independente de
qual for o mecanismo que explica o maior alongamento da raiz na luz (resposta
fotomorfogenética direta, relação fonte-dreno, ou ambos), tal comportamento parece
favorecer a evitação da luz nas raízes, algo oposto e ao mesmo tempo complementar à
conhecida evitação do escuro (estiolamento) dos caules.
38
Figura 4 - Germinação de sementes e crescimento de plântulas dos mutantes hormonais e
fotomorfogenéticos. Tempo (dias) para germinação de 50% das sementes em
condições de luz (A) e escuro (B). Os números entre parênteses representam a
porcentagem final de germinação. Foram consideradas germinadas sementes que
apresentaram protrusão da radícula. C e D) comprimento do hipocótilo e da raiz,
respectivamente, em plântulas crescidas na luz (barras brancas) e no escuro (barras
escuras) durante 10 dias. Os números entre parênteses representam a razão entre o
comprimento do hipocótilo na luz e no escuro. As linhas verticais em cada barra
indicam o erro padrão das médias (n = 3x50 para germinação e n = 20 para
comprimento do hipocótilo e da raiz)
39
Figura 5 - Fenótipos adicionais dos mutantes hormonais na cultivar MT. A) A alta sensibilidade ao GA no
mutante pro não promove um maior alongamento do hipocótilo no escuro comparado ao MT,
embora ele seja mais alongado na luz. É possível também observar a exagerada inibição do
alongamento do hipocótilo dos mutantes superprodutores de ET (epi) e deficiente em BR
(dpy) tanto no escuro quanto no claro. B) O amadurecimento incompleto dos frutos do
mutante pouco sensível a ET (Nr) gera frutos de cor amarela. C) A deficiência na biossíntese
de ABA no mutante not provoca murchamento da planta nas horas mais quentes do dia. D) A
mutação sit, de deficiência de ABA, continua produzindo plantas murchas e de porte reduzido,
mesmo em combinação com mutação que reduz sensibilidade a ET (Nr). E) Morfologia das
flores em alguns mutantes. Em brt ocorre uma redução no tamanho das sépalas, o que
lembra sua reduzida área foliar (Figura 7C). O mutante epi apresenta um aumento no número
de pétalas além das mesmas apresentarem-se mais fundidas. Em pro, ocorre um
alongamento e estreitamento das pétalas, semelhante ao efeito dessa mutação no
alongamento de caules (Figura 2G). Em dpy há uma severa redução em todos os verticilos,
incluindo estames e pistilos (não mostrado). F) A baixa sensibilidade às citocininas em brt
reduz o tamanho das sementes
40
2.2.2.3 Efeito das mutações hormonais e fotomorfogenéticas no crescimento
vegetativo de plantas adultas de Micro-Tom crescidas em casa de vegetação
2.2.2.3.1 Altura do caule principal e matéria seca de caules e raízes
Mutantes hormonais apresentaram consideráveis diferenças quanto à altura do
caule e acúmulo de matéria seca após 56 dias de cultivo em casa de vegetação (Figura
6). Se considerarmos que AUX, CK e GA são importantes para processos celulares
básicos de crescimento, como divisão e expansão (JONES et al., 1998; JONES, 1980;
RIOU-KHAMLICHI et al., 1999), não é surpresa que o mutante dgt, pouco sensível à
AUX, e brt, pouco sensível à CK, tenham apresentado menor acúmulo de matéria seca
em caules e raízes (Figura 6B) e que pro, hipersensível à GA, tenha formado plantas
mais altas em comparação às plantas de MT (Figura 6A). A deficiência de ABA em not
levou a uma redução do comprimento do caule principal, a qual só foi superior ao
extremo nanismo apresentado pelo mutante deficiente em BR, dpy (Figura 6A). O
acúmulo de matéria seca nos mutantes not e dpy também foi bastante reduzido tanto
nos caules quanto nas raízes (Figura 6B). Entre os fatores que podem contribuir para a
redução do crescimento de mutantes deficientes em ABA está a constante perda de
turgor devido à não regulação estomática e consequente murchamento (Figura 5C).
Contudo, já foi demonstrado que a deficiência em ABA causa uma elevação nos níveis
endógenos de etileno, o que por sua vez poderia contribuir para a redução do
crescimento nesses mutantes independentemente da perda de turgor (TAL et al., 1979;
SHARP et al., 2000). Em nossas análises, o mutante com elevado nível endógeno de
etileno, epi, não diferiu de MT quanto ao comprimento do caule principal (Figura 6A),
além de apresentar um proeminente acúmulo de matéria seca tanto nos caules quanto
nas raízes (Figura 6B). Uma das perspectivas de se ter mutantes em um mesmo
background genético é a possibilidade de análise de duplos mutantes. Um dos vários
duplos mutantes que estão sendo produzidos em nosso laboratório combina a
deficiência em ABA, presente em sit, com baixa sensibilidade ao ET, de Nr (Figura 5D).
O fenótipo de sit Nr não só confirma a sugestão de que o etileno não explica totalmente
a redução do crescimento em mutantes deficientes em ABA (SHARP et al., 2000), como
também coloca em evidência que o papel do etileno é complexo, podendo ser repressor
41
(ABELES; MORGAN; SALTVEIT, 1992) ou estimulador (SATLER; KENDE, 1985) do
crescimento.
2.2.2.3.2 Dominância apical
Cinco tipos de mutações levaram a um aumento significativo no alongamento de
ramificações laterais em comparação ao MT (Figura 6C): deficiência de ABA (not e sit),
baixa sensibilidade à auxina (dgt), citocinina (brt) e etileno (Nr), além de aumento na
resposta a fitocromo (hp1). Por outro lado, o excesso de etileno em epi e a deficiência
de fitocromo em au levaram a uma diminuição no alongamento de ramificações laterais
(Figura 6C, 2K e 3C). Tal diversidade de mutantes afetando um mesmo processo
evidencia claramente que o crescimento de ramificações laterais ou, de modo inverso, a
dominância apical é um evento multifatorial, embora uma ênfase muito grande tem sido
dada ao hormônio auxina, além da luz ser considerada como modulador da resposta e
não efetor principal.
As alterações no padrão de ramificação dos mutantes fotomorfogenéticos, au e
hp1 (Figuras 6C, 3B e 3C), não são surpresas se considerarmos que o crescimento
relativo de órgãos ocorre em função da relação fonte-dreno, a qual não só é controlada
pela disponibilidade de nutrientes quanto de luz (GOLOVKO; DYMOVA;
TABALENKOVA, 2004; PERES et al., 2005). O processo de dominância apical é
dependente do efeito da auxina na inibição de gemas laterais (MCSTEEN; LEYSER,
2005), as quais costumam reassumir o crescimento se as citocininas, um importante
estabelecedor de drenos (ROITSCH; EHNEß, 2000), acumulam em tais gemas (LI et al.
1995). Sendo assim, embora seja coerente que dgt tenha baixa dominância apical, é
surpreendente que brt também possua. Uma inesperada perda de dominância apical
também foi observado recentemente em plantas transgênicas e combinações de
mutantes de Arabidopsis com reduzido nível endógeno ou sensibilidade a CKs
(WERNER et al., 2003; RIEFLER et al., 2006). Esses resultados somados à informação
de que plantas transgênicas ou mutantes com superprodução de citocininas também
possuem reduzida dominância (CHAUDHURY et al., 1993; RUPP et al., 1999) sugerem
que o que há de comum nesses genótipos é a falha no estabelecimento de gradientes
de CKs e drenos preferências.
42
As respostas dos mutantes em ABA (sit e not) e ET (Nr e epi) podem refletir o
efeito desses hormônios na dormência de gemas laterais (GALOCH; ZELINSKA;
BURKACKA-LAUKAITYS, 1998; LE BRIS et al., 1999). Além do ABA e ET, hoje é
conhecida a ocorrência de um inibidor derivado de carotenóides e diferente de ABA
(BOOKER et al., 2004). Como tal inibidor é translocável por enxertia (BOOKER et al.,
2004), tanto a disponibilidade de mutantes hormonais (Tabelas 1 e 2) e na biossíntese
de carotenóides (ISAACSON et al., 2002), quanto às facilidades de se fazer enxertia
podem tornar o tomateiro, e mais especificamente MT, um modelo atraente para o
estudo das ramificações laterais.
43
Figura 6 - Crescimento de plantas adultas de mutantes hormonais no
background MT sob condições de casa de vegetação. A) curvas
de crescimento dos mutantes hormonais obtidas através de
medições periódicas durante 56 dias. B) massa da matéria seca
dos caules (barras brancas) e raízes (barras escuras) de plantas
com 60 dias de idade (n = 7). C) Índice de ramificação caulinar
calculado pela razão entre o comprimento do caule principal e a
somatória dos comprimentos dos ramos laterais (n = 7)
44
2.2.2.3.3 Área foliar e de células epidérmicas
Para avaliar a área foliar dos mutantes hormonais (Figura 7) foram utilizadas
folhas mais velhas (3
a
) e jovens (6
a
) totalmente expandidas (Figura 8) de plantas com 60
dias. Quatro mutações afetaram mais severamente a área foliar: baixa sensibilidade à
AUX (dgt) e CK (brt) e deficiência de ABA (not) e BR (dpy). Esses resultados estão de
acordo com o papel de AUX e CK na divisão e expansão celular (CLELAND, 1991;
RAYLE; NOWBAR; CLELAND, 1991, RIOU-KHAMLICHI et al., 1999), o que parece se
refletir na pequena área das células epidérmicas dos mutantes dgt e brt (Figura 7C).
Deficiência em ABA também pode causar redução na área celular, como pode ser
evidenciado em flc (Figura 7C). Isso poderá ser o efeito da perda de turgor para
expansão ou do acúmulo de etileno relatado para esse tipo de mutação (TAL et al. 1979;
SHARP et al., 2000). De fato, o mutante superprodutor de etileno, epi, apresentou uma
redução na área celular. Contudo, como não há diferenças entre as áreas foliares de epi
e MT (Figura 7A), sugere-se que essa mutação causa uma maior proliferação das
células da folha. Um efeito oposto deve ser atribuído à deficiência de BR ou
insensibilidade a esse esteróide vegetal, pois apesar de dpy apresentar uma severa
redução da área foliar, a área celular de cu3, uma mutação com efeito equivalente,
significativamente da área celular em MT. A alta sensibilidade a GA em pro também
parece levar a uma menor proliferação de células da folha, já que apesar desse mutante
possuir células epidérmicas maiores que as de MT, sua área foliar não é maior.
Apesar da evidente modulação da expansão foliar em resposta à luz, pouca
diferença foi encontrada ao se comparar a área foliar total de MT à dos mutantes
fotomorfogenéticos au e hp1 (Figura 7B). Contudo, chama a atenção o aspecto clorótico
das folhas do mutante deficiente em fitocromo (Figura 3C) e o verde escuro do mutante
com aumento de resposta a esse fotorreceptor (Figura 3G), demonstrando que o
fotorreceptor controla preferencialmente as vias de transdução de sinal que levam ao
desenvolvimento de cloroplastos, tendo uma função secundária no controle da
expansão da área foliar. Alterações morfológicas também foram observadas em folhas
dos mutantes hormonais, como ocorrência de hiponastia em dgt (Figura 2E), epinastia
em epi e dpy (Figuras 2F, H e K) e a simplificação da arquitetura foliar em pro com a
tendência à redução no número de folíolos e ocorrência de bordos menos serrilhados
45
(Figura 2C e G). Esses efeitos, embora pouco relatados, são coerentes com o papel
dessas classes hormonais (HAYES, 1978; GRAY, 1957; HAY; CRAFT; TSIANTIS,
2004).
Figura 7 - Efeito de mutações hormonais e fotomorfogenéticas no
crescimento das folhas. A) Área foliar da 3º e 6º folhas (ver
diagrama na Figura 8), as quais encontravam-se totalmente
expandidas em plantas com 60 dias de idade (n = 4). B)
área foliar total dos mutantes fotomorfogenéticos medida
em plantas com 60 dias (n = 10 plantas). C) área celular da
epiderme foliar abaxial
46
2.2.2.4 Efeito das mutações hormonais e fotomorfogenéticas no crescimento
reprodutivo de plantas adultas de Micro-Tom crescidas em casa de vegetação.
O tomateiro é um modelo complementar para o estudo do crescimento
reprodutivo, já que possui uma série de características desenvolvimentais não presentes
em Arabidopsis, tais como ausência de crescimento em roseta e formação de escapo
floral, florescimento simpodial e ausência de resposta ao fotoperíodo e presença de
frutos carnosos e climatéricos. Além disso, os conhecimentos adquiridos nesse modelo
possuem interesse agronômico direto.
No presente trabalho, vários parâmetros do desenvolvimento reprodutivo foram
analisados nos mutantes hormonais e fotomorfogenéticos (Figura 8 e Tabela 3).
Algumas das alterações do crescimento reprodutivo apresentadas pelos mutantes
hormonais parecem ser derivações da mesma ação hormonal, porem em órgãos
diferentes. Um exemplo disso é a morfologia floral de alguns mutantes (Figura 5E).
Desse modo, o tamanho diminuto das sépalas de brt reproduz a redução de sua área
foliar (Figura 7A). O mesmo paralelismo pode ser traçado entre o alongamento caulinar
de pro (Figura 6A) e a presença de pétalas longas nesse mutante. De modo oposto,
pode se observar o tamanho reduzido tanto das plantas (Figura 2A) quanto das flores
(Figura 5E) do mutante dpy (Figura 2A). O mutante epi apresentou folhas com pétalas
mais largas e em maior número, o que segue a tendência de crescimento lateral nesse
mutante (Figura 2A e 2K).
Nas condições de casa de vegetação (ver Material e Métodos), todos os mutantes
estudados, com exceção de au, tiveram um atraso na antese quando comparados ao
MT (Figura 8). O atraso na antese pode ser devido a um crescimento vegetativo lento
ou, alternativamente, a um prolongamento desse, o que pode ser evidenciado pela
formação de um maior número de folhas até a primeira inflorescência. Com exceção dos
mutantes dgt e hp1, os mutantes que atrasaram a antese prolongaram seu crescimento
vegetativo formando de 10 a 13 folhas antes do florescimento, contra 9 de MT. Desse
modo, deficiência de BR (dpy), hipersensibilidade a GA (pro), deficiência de ABA (not),
excesso de etileno (epi) e baixa sensibilidade a citocininas (brt) estenderam o
crescimento vegetativo. Os resultados aqui apresentados sugerem um papel dessas
classes hormonais na transição entre o crescimento vegetativo e reprodutivo de
47
tomateiro, o que precisa ser melhor investigado em estudos futuros. O fato do mutante
deficiente em fitocromo, au, ter tido uma antese adiantada em aproximadamente sete
dias e uma redução consistente no número de folhas até esse evento, sugere também
um papel do fitocromo na floração de tomateiro, mesmo que essa espécie possua pouca
reposta a fotoperíodo. Interessantemente, a análise de caracteres quantitativos (QTL-
quantitative trait locus) responsáveis pelo controle da transição para o desenvolvimento
reprodutivo em uma população de mapeamento F2 entre Lycopersicon esculentum e o
parente selvagem Lycopersicon chmielewskii, de florescimento tardio, identificou PHYB2
como um dos QTLs que controla o tempo para o florescimento (Jiménez-Goméz et al.,
2007). Os autores sugerem que durante a domesticação do tomateiro, PHYB2 tenha
sido alvo de intensa pressão de seleção para materiais com ausência de resposta
fotoperiódicas.
A partir da antese até o amadurecimento do fruto, várias respostas consideradas
de importância agronômica foram verificadas nos mutantes. Entre as alterações
observadas, pode se destacar: i) aumento no número de flores por inflorescência em au
e diminuição em pro, ii) tendência da maioria dos mutantes em formar 2 lóculos por
fruto, em oposição aos 3 de MT, bem como o aumento do número de lóculos por fruto
em pro, iii) expressiva diminuição no número de sementes por fruto em not, epi e dpy,
iv) aumento do peso da semente em epi, pro, hp1 e a diminuição em brt e gib3, v)
aumento do peso do fruto em epi e hp1 e a diminuição em todos os demais, com
exceção de au, vi) elevada produtividade (peso total dos frutos por planta) em Nr; vii)
diminuição do tempo para o amadurecimento em epi e au e extensão desse em quase
todos os demais mutantes, principalmente em Nr e brt, viii) aumento dos sólidos
solúveis totais em pro.
Além de muitas das respostas aqui apresentadas serem inéditas e merecerem
estudos futuros, outras tantas coincidem com aquelas já reportadas para as mesmas
mutações em outros backgrounds ou são coerentes com o efeito esperado para a
molécula mutada. Um exemplo disso é o aumento no tempo de amadurecimento
observado no mutante pouco sensível a etileno, Nr (Figura 5B), e a diminuição desse no
mutante superprodutor, epi, dessa classe hormonal. Entre as repostas divergentes ou
inéditas por nós encontradas está a diminuição do tamanho das sementes do mutante
48
pouco sensível a CKs, o que é oposto ao encontrado em Arabidopsis tanto na
deficiência quanto na redução da sensibilidade a essa classe hormonal (WERNER et al.,
2003; RIEFLER et al., 2006). Esses resultados podem refletir as diferenças no
estabelecimento das sementes como drenos em frutos secos e carnosos.
Em termos agronômicos, o resultado mais expressivo foi a constatação que tanto
frutos partenocárpicos quanto polinizados de pro apresentaram um elevado teor de SST
(Tabela 3). Além da partenocarpia, esse mutante também apresentou uma tendência
para o desenvolvimento de frutos com “umbigo” (Figura 2l), algo nunca reportado para
esse mutante, mas que coincide, por exemplo, com o fenótipo apresentado por
variedades de laranjas partenocárpicas (DAVIES, 1986). O efeito de alterações
hormonais no teor de SST em tomateiro havia sido documentado anteriormente para
plantas transgênicas com superprodução de CKs nos ovários (MARTINEAU et al.,
1995), mas não para mutações afetando GA.
Os resultados acima apontam para o potencial da exploração de mutações
hormonais para o melhoramento genético do tomateiro, o que já vem sendo feito em
outras espécies. Desse modo, mutações que causam redução na biossíntese de GA em
arroz (SASAKI et al., 2002), na sensibilidade a GA em trigo (PENG et al., 1999) e na
atividade de transportadores de auxina em milho e sorgo (MULTANI et al., 2003)
provaram ser úteis no melhoramento que objetiva a redução no porte das plantas,
consequentemente aumentando o índice de colheita e resistência ao acamamento
(BORLAUG, 1983). A perda de função de uma citocinina oxidase em arroz também
provou ser o responsável por um loco que causa um aumento na produtividade através
da formação de um maior número de grãos por panícula (ASHIKARI et al., 2005). No
caso de espécies de frutos carnosos, como o tomateiro, aparentemente o maior impacto
de mutações hormonais ou fotomorfogenéticas seja sobre a qualidade do fruto ao invés
da produtividade. A exemplo disso, apesar do desenvolvimento vegetativo de mutantes
fotomorfogenéticos de tomateiro apresentar aspectos deletérios, como o estiolamento
na luz em au (Figura 3C) e o nanismo em hp1 (Figura 3B), já foram demonstradas
melhorias na qualidade dos frutos desse tipo de mutante. Desse modo, os frutos de
mutantes com deficiência de fitocromo B podem ter maiores teores de SST (ALBA et al.,
1999), além dos frutos dos mutantes com excesso de resposta a luz tenderem a possuir
49
mais antioxidantes do tipo carotenóides, flavonóides e vitamina C e E (YEN et al., 1997;
COOKSON et al., 2003; ANDREWS; FAHY; FOYER, 2004; BINO et al., 2005; TORRES
et al., 2006). No presente estudo, a mutação pro levou também a uma diminuição da
produtividade, porém seu incremento no teor de SST é em média de 60%. Algumas
espécies do gênero Lycopersicon possuem teor de SST duas vezes superior ao do
tomateiro (TAYLOR, 1986). Porém, sua herança é poligênica e o máximo incremento
conseguido com os genes de maior efeito oriundos de tais espécies é de 20%
(FRIDMAN et al., 2004). A combinação da mutação pro, descoberta aqui como uma
maneira de incrementar o grau brix de tomateiro, com outras mutações que possam
corrigir seus aspectos deletérios pode gerar genótipos de alto interesse para o
melhoramento.
Figura 8 - Representação esquemática de uma planta de MT com 60 dias de idade. Barras em
forma de “T” representam folhas com 5 folíolos (com exceção das folhas 1 e 2, as
quais tendem a ter 3 folíolos) e pequenas esferas representam inflorescências com
7 flores. A folha número 9 foi circulada por ser a hospedeira da primeira
inflorescência em MT. A folha hospedeira varia para cada mutante, sendo seu
número mais freqüente representado na tabela ao lado e a freqüência colocada
entre parênteses. Esse parâmetro, assim como o tempo para antese de 50% das
plantas é indicativo de modificações desenvolvimentais que podem aumentar ou
diminuir o crescimento vegetativo em oposição ao florescimento. Notar que MT
possui crescimento determinado (formação de duas inflorescências consecutivas)
devido à presença da mutação selfpruning (sp). Nenhum dos mutantes hormonais
ou fotomorfogenéticos alterou esse hábito de crescimento no background MT
50
Table 3
- Parâmetros analisados em flores e frutos de mutantes hormonais
e fotomorfo
genéticos na cultivar Micro
-
Tom
Flores por
inflorescência
Lóculos
por fruto
Sementes
por fruto
Peso da
semente
(g)
Peso do
fruto (g)
MT
7.2±0.6 3(70%) 41.3±5.5 2.3±0.04 5.1±0.3
dgt
8.5±0.9 2(55%) 36.5±4.6 2.2±0.02 3.4±0.3
brt
7.8±0.5 3(70%) 33.3±2.6 1.6±0.02 3.8±0.4
not
7.1±0.5 2(70%) 20.4±2.0 2.5±0.03 3.7±0.2
Nr
7.6±0.7 2(80%) 39.1±5.6 2.2±0.02 2.6±0.5
epi
7.2±0.9 2(70%) 26.3±3.9 3.0±0.02 11.8±0.5
pro
1
4.6±0.4 4(85%) - - 3.4±0.2
pro
2
- - - 2.7±0.03 -
gib3
- - - 2.0±0.03 -
dpy
6.1±0.2 2(70%) 22.4±3.8 2.3±0.01 4.0±0.4
au
10.8±0,5 2 (70%) 41±2.1 2.2±0.01 5.1±0.3
hp1
8±0,6 2 (80%) 31.1±1.8 2.7±0.02 9.4±0.4
Peso total
de frutos
por planta
(g)
Tempo (Dias) para
amadurecimento do
fruto
SST1 SST2 SST3
MT
43.4±1.9 53.4±1,3 5.3±0.1 5.1±0.0 4.6±0.1
dgt
28.6±1.8 57.2±1,4 5.8±0.2 5.6±0.2 -
brt
41.9±3.4 59.5±1,5 5.4±0.1 5.4±0.1 -
not
22.2±2.6 56±0,7 6.0±0.1 6.0±0.1 -
Nr
59.3±3.1 63.3±1,4 5.2±0.1 4.9±0.1 -
epi
33.6±4.8 42.1±1,0 - 4.6±0.1 -
pro
1
45.4±2.5 54.8±2,3 9.1±0.5 7.5±0.5 -
pro
2
- - 8.1±0.2 - -
gib3
- - - - -
dpy
12.4±1.5 58.7±2,6 4.9±0.0 4.8±0.1 -
au
40±0.8 48.6±1.0 - - 5.0±0.1
hp1
44.5±1.1 58±2.0 - - 5.4±0.1
1
Frutos partenocárpicos,
2
Frutos formados a partir de polinizações artificiais,
SST1 = total de sólido solúveis (Brix) realizado no inverno de 2005, SST2 =
realizado no verão de 2006 e SST3 = realizado no outono de 2007
2.2.2.5 Limitações e novas perspectivas para o uso de MT como modelo
No presente trabalho, evidenciamos que os genes conferem o nanismo, como por
exemplo dwarf (d), de MT não impedem que respostas desenvolvimentais controladas
por hormônios ou por fitocromo sejam estudadas. Além dos genes de nanismo, MT é
portador dos alelos recessivos selfpruning (sp), o qual causa um crescimento
51
determinado, e uniform ripening (u), que provoca ausência de ombro verde nos frutos.
Essas variações alélicas também são presentes em outras cultivares de tomateiro, as
quais inclusive vêm sendo propostas como modelo para o estudo integrado de um
grande número de mutações (MENDA et al., 2004). Faz se necessário considerar que
uma vez que se use o controle adequado, a presença de outras mutações ou variações
alélicas em uma cultivar não impedem seu uso para o estudo do efeito de mutações
específicas. Contudo, se o evento estudado é influenciado pela referida mutação, o ideal
é que se tenha NILs portadoras do alelo selvagem como controle. Desse modo,
utilizando a abordagem de introgressão aqui considerada, NILs contendo os alelos
selvagens para U e Sp, além de D, no background MT também foram produzidas
(Figura 9).
Figura 9 - Linhagens isogênicas a MT carregando alelos selvagens para os genes
DWARF (D), SELFPRUNING (SP) e UNIFORM RIPENING (U). A) A
planta portando alelo D continua com porte reduzido, mas possui folhas
não rugosas e é expressivamente maior que MT. B) O alelo selvagem SP
no background MT produz plantas com porte um pouco maior, devido ao
crescimento extendido de seus ápices vegetativos. Notar a presença de
folhas entre uma inflorescência e outra em SP. C) Plantas portando o alelo
U possuem frutos com “ombro” verde. A cor pálida e brilhante dos frutos
de MT é o resultado não só da mutação u como também de uniform gray-
green (ug)
52
O pequeno porte e ciclo de vida rápido de MT tornaram esse modelo atraente
para pesquisa básica desde sua proposta inicial (MEISSNER et al., 1997). A abordagem
de introgressão, sobretudo de variações genéticas naturais aqui apresentadas, além de
incrementar em muito as possibilidades de pesquisas básicas que poderão ser
realizadas com esse modelo, abre a perspectiva de explorar MT também no
melhoramento de tomateiro. Desse modo, se considerarmos que MT difere das
cultivares comerciais em poucas mutações recessivas, há a perspectiva de seu uso para
facilitar a piramidação de caracteres monogênicos e dominantes, já que isso exige a
triagem de um grande número de plantas durante várias gerações. Exemplo de genes
dominantes vindos de espécies selvagens de Lycopersicon que poderiam ser
piramidados em uma só cultivar são os que conferem resistência a diferentes patógenos
(ARIE et al., 2007). A introgressão de tais genes em um mesmo background e a
piramidação em um único genótipo anão geraria material que, ao ser cruzado com
variedades elites, produziria híbridos F1 de porte normal e comerciais. A mesma
abordagem também poderia ser utilizada para mutações recessivas, as quais poderiam
ser estudas com economia de espaço e tempo em MT, e aquelas que provarem ser
atraentes seriam introgredidas em variedades de porte normal, fazendo o caminho
inverso do que foi apresentado neste trabalho. Finalmente, no caso específico da
introgressão das mutações hormonais e fotomorfogenéticas, uma última perspectiva,
mas não menos importante, seria o emprego de MT em aulas práticas de fisiologia
vegetal e genética do desenvolvimento. Desse modo, o ciclo de vida e a estrutura
mínima requerida por MT possibilitariam seu cultivo e observação em salas de aula
durante o semestre letivo. Adicionalmente, o emprego de mutantes hormonais e
fotomorfogenéticos para o estudo desses eventos pode substituir com vantagem a
necessidade de adquirir hormônios para aplicações exógenas e de criar condições
artificiais de luz, o que impossibilita aulas práticas onde há limitações de orçamento.
53
2.3 Conclusão
A partir da introgressão das mutações fotomorfogenéticas e hormonais na cultivar
Micro-Tom, o fenótipo das plantas bem como as análises desenvolvimentais realizadas
permitem concluir que, apesar das mutações já presentes as quais conferem o nanismo
em MT, essa cultivar é uma ferramenta passível de estudos de respostas controladas
por fitocromo ou por hormônios.
Referências
ABELES, F.B.; MORGAN, P.W.; SALTVEIT, M.E. Ethylene in plant biology, 2. ed. San
Diego: San Diego Academic Press, 1992. 414 p.
ALBA, R.; VALENZANO, C.J.; KAYS, S.J.; CORDONNIER-PRATT, M-M.; PRATT, L.H.
Genetic manipulation of phytochromes in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.): a
novel approach to crop improvement. Acta Horticulturae, The Hague, v. 487, p. 93-98,
1999.
ALONSO-BLANCO, C.; KOORNNEEF, M. Naturally occurring variation in Arabidopsis:
an underexploited resource for plant genetics. Trends in Plant Science, Kidlington, v. 5,
p. 22-29, 2000.
ANDREWS, P.K.; FAHY, D.A.; FOYER, C.H. Relationships between fruit exocarp
antioxidants in the tomato (Lycopersicon esculentum) high pigment-1 mutant during
development. Physiologia Plantarum, Kobenhavn, v. 120, p. 519–528, 2004.
ARIE, T.; TAKAHASHI, H.; KODAMA, M.; TERAOKA, T. Tomato as a model plant for
plant-pathogen interactions. Plant Biotechnology, v. 24, p.135–147, 2007.
ASHIKARI, M.; SAKAKIBARA, H.; LIN, S.; YAMAMOTO, T.; TAKASHI, T.; NISHIMURA,
A.; ANGELES, E. R.; QIAN, Q.; KITAMO, H.; MATSUOKA, M. Cytokinin oxidase
regulates rice grain production. Science, Washington, v. 309, p. 741-745, 2005.
BARRY, C.S.; FOX, E.A.; YEN, HC.; LEE, S.H.; YING, T.J.; GRIERSON, D.;
GIOVANNONI, J.J. Analysis of the ethylene response in the epinastic mutant of tomato.
Plant Physiology, Rockville, v. 127, p. 58–66, 2001.
BENSEN, R.J.; ZEEVAART, J.A.D. Comparison of ent-kaurene synthetase A and B
activities in cell-free extracts from young tomato fruits of wild-type and gib1, gib2 and
gib3 tomato plants. Journal of Plant Growth Regulation, New York, v. 9, p. 237-242,
1990.
BINDER, B.M.; O'MALLEY, R.; WANG, W.C.; MOORE, J.M.; PARKS, B.M.; SPALDING,
E.P.; BLEECKER, A.B. Arabidopsis seedling growth response and recovery to ethylene.
A kinetic analysis. Plant Physiology, Rockville, v. 136, p. 2913-2920, 2004.
54
BINO, R.J.; DE VOS, C.H.R.; LIEBERMAN, M.; HALL, R.D.; BOVY, A.; JONKER, H.H.;
TIKUNOV, Y.; LOMMEN, A.; MOCO, S.; LEVIN, I. The light-hyperresponsive high
pigment-2
dg
mutation of tomato: alterations in the fruit metabolome. New Phytologist,
London, v. 166, p. 427–438, 2005.
BISHOP, G.J.; NOMURA, T.; YOKOTA, T.; HARRISON, K.; NOGUCHI, T.; FUJIOKA, S.;
TAKATSUTO, S.; JONES, J.D.G.; KAMIYA, Y. The tomato DWARF enzyme catalyses C-
6 oxidation in brassinosteroid biosynthesis. Proceedings of the National Academy of
Sciences, Washington, v. 96, p. 1761–1766, 1999.
BLACK, M.; BEWLEY, J.D.; FOUNTAIN, D. Lettuce seed germination and cytokinins:
Their entry and formation. Planta, Berlin, v. 117, p. 145-152, 1974.
BOOKER.; J; AULDRIDGE, M.; WILLS, S.; MCCARTY, D.; KLEE, H.; LEYSER, O.
MAX3/CCD7 is a carotenoid cleavage dioxygenase required for synthesis of a novel
plant signaling molecule. Current Biology, London, v. 14, p. 1232-1238, 2004.
BORLAUG, N.E. Contributions of conventional plant breeding to food production.
Science, Washington, v. 219, p. 689–693, 1983.
BRADY, S.M.; MCCOURT.; P. Hormone cross-talk in seed dormancy. Journal of Plant
Growth Regulation, New York, v. 22, p. 25–31, 2003.
BURBIDGE, A.; GRIEVE, T.M.; JACKSON, A.; THOMPSON, A.; MCCARTY, DR.;
TAYLOR, I.B. Characterization of the ABA-deficient tomato mutant notabilis and its
relationship with maize Vp14. The Plant Journal, Oxford, v. 17, p. 427-431, 1999.
CHAUDHURY, A.M.; LETHAM, S.; CRAIG, S.; DENNIS, E.S. amp1 - A mutant with high
cytokinin levels and altered embryonic pattern, faster vegetative growth, constitutive
photomorphogenesis and precocious flowering. The Plant Journal, Oxford, v. 4, n.
6, p. 907-916, 1993.
CHORY, J.; CHATTERJEE, M.; COOK, R.K.; ELICH, T.; FANKHAUSER, C.; LI, J.;
NAGPAL, P.; NEFF, M.; PEPPER, A.; POOLE, D.; REED, J.; AND VITART, V. From
seed germination to flowering, light controls plant development via the pigment
phytochrome. Proceedings of the National Academy of Sciences, Washington, v. 93,
n. 22, p. 12066–12071, 1996.
CHORY, J.; PETO, C.A.; FEINBAUM, R.; PRATT, L.; AUSUBEL, F. Arabidopsis thaliana
mutant that develops as a light-grown plant in the absence of light. Cell, v. 58, p. 991-
999, 1989.
CLELAND, R.E. The outer epidermis of Avena and maize coleoptiles in not a unique
target for auxin in elongation growth. Planta, Berlin, v. 186 p. 75– 80, 1991.
55
COLLET, C.E.; HARBERD, N.P.; LEYSER, O. Hormonal interactions in the control of
Arabidopsis hypocotyl elongation. Plant Physiology, Rockville, v. 124, p. 553-562,
2000.
COOKSON, P.J.; KIANO, J.; FRASER, P.D.; ROMER, S.; SHIPTON, C.A.; SCHUCH,
W.; BRAMLEY, P.M.; PYKE, K.A. Increases in cell elongation, plastid compartment size
andtranslational control of carotenoid gene expression underly the phenotype of the high
pigment1 mutant of tomato. Planta, Berlin, v. 217, p. 896–903, 2003.
COWLING, R.J.; HARBERD, N.P. Gibberellins control Arabidopsis hypocotyl growth via
regulation of cellular elongation. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 50, p.
1351-1357.
DAVID-SCHWARTZ, R.; BADANI, H.; SMADAR, W.; LEVY, A.A.; GALILI, G.;
KAPULNIK, Y. Identification of a novel genetically controlled step in mycorrhizal
colonization: plant resistance to infection by fungal spores but not extra-radical hyphae.
The Plant Journal, Oxford, v.. 27, p. 561-569, 2001.
DAVIES, F. S. The navel orange. Horticultural Reviews, Westport, v. 8, p.129-180,
1986.
DROZDOVA, I.S.; BONDAR, V.V.; BUKHOV, N.G.; KOTOV, A.; KOTOVA,
L.M.; MAEVSKAYA, S.N.; MOKRONOSOV, A.T. Effects of light spectral quality on
morphogenesis and source–sink relations in radish plants Russian Journal of Plant
Physiology, New York, v. 48, n. 4, p. 415-420, 2001.
EISENSTADT, F.A.; MANCINELLI, A.L. Phytochrome and seed germination: VI.
Phytochrome and temperature tnteraction in the control of cucumber seed germination.
Plant Physiology, Rockville, v. 53, p. 114-117, 1974.
EMMANUEL, E.; LEVY, A.A. Tomato mutants as tools for functional genomics. Current
Opinion in Plant Biology, London, v. 5, p. 112-117, 2002.
FRIDMAN, E.; CARRARI, F.; LIU Y.S.; FERNIE, A.R.; ZAMIR, D.; Zooming in on a
quantitative trait for tomato yield using interspecific introgressions. Science,
Washington, v. 305: 1786-1789, 2004.
FUJINO, D.W.; BURGER, D.W.; YANG, S.F.; BRADFORD, K.J. Characterization of an
ethylene overproducing mutant of tomato (Lycopersicon esculentum Mill. cultivar VFN8).
Plant Physiology, Rockville, v. 88, p. 774-779, 1988.
GALOCH, E.; ZELINSKA, M.; BURKACKA-LAUKAJTYS, E. The effect of decapitation on
the levels of IAA and ABA in the lateral buds of Betula pedula Roth. Acta physiologiae
plantarum, Berlim, v. 20, p. 399-403, 1998.
56
GEORGHIOU, K.; KENDRICK, R.E. The germination characteristics of phytochrome-
deficient aurea mutant tomato seeds. Physiologia Plantarum, Kobenhavn, v. 82, 127–
133, 1991.
GOLOVKO, T.K.; DYMOVA, O.V.; TABALENKOVA, G.N. The effect of light regime on
source–sink relations in the shade-enduring Ajuga reptans. Russian Journal of Plant
Physiology, New York, v. 51, p. 604-608, 2004.
GRAY, R.A. Alteration of leaf size and shape and other changes caused by gibberellins
in plants, American Journal of Botany, New York, v. 44, p. 674-682, 1957.
Halliday, K.J.; Fankhauser, C. Phytochrome-hormonal signalling networks. New
Phytologist, London, v. 157, n. 3, p. 449-463, 2003.
HAY, A.; CRAFT, J.; TSIANTIS, M. Plant hormones and homeoboxes: bridging the gap?
Bioessay, New York, v. 26, p. 395-404, 2004.
HAYES, A.B. Auxin-cytokinin effects in leaf blade hyponasty. Botanical Gazette,
Chicago, v. 139, n. 4, p. 385-389, 1978.
HICKS, G.R.; RAYLE, D.L.; LOMAX, T.L. The diageotropica mutant of tomato lacks high
specific activity auxin binding sites. Science, Washington, v. 254, p. 52–54, 1989.
HOWE, G.A.; RYAN, C.A. Suppressors of systemin signaling identify genes in the
tomato wound response pathway. Genetics, Bethesda, v. 153, p. 1411-1421, 1999.
HOWE, G.A.; LIGHTNER, J.; BROWSE, J.; RYAN, C.A.; An octadecanoid pathway
mutant (JL5) of tomato is compromised in signaling for defense against insect attack.
The Plant Cell, Baltimore, v. 8, p. 2067-2077, 1996.
ISAACSON, T.; RONEN, G.; ZAMIR, D.; HIRSCHBERG, J. Cloning of tangerine from
tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production of β-carotene and
xanthophylls in plants. The Plant Cell, Baltimore, v. 14, p. 333-34, 2002.
JIMENEZ-GOMEZ, J.M.; ALONSO-BLANCO, C.; BORJA, A.; ANASTASIO, G.;
ANGOSTO, T.; LOZANO, R.; MARTINEZ-ZAPATER, J.M. Quantitative genetic analysis
of flowering time in tomato. Genome, Ottawa, v. 50, n. 3, p. 303-15, 2007.
JONES, A.M.; IM, K.; SAVKA., M.A.; WU, M.; DEWITT, N.G.; SHILLITO, R.; BINNS, A.N.
Auxin-dependent cell expansion mediated by overexpressed auxin-binding protein 1.
Science, Washington, v. 282, n. 5391, p. 1114 – 1117. 1998.
JONES, M.G. Gibberellins and the procera mutant of tomato. Planta, Berlin, v. 172, p.
280-284, 1987.
JONES, R.L. The physiology of gibberellin-induced elongation, Plant Growth
Substances, New York, p. 188 - 195, 1979.
57
KEBROM, T.H.; BURSON, B.L.; FINLAYSON, S.A. Phytochrome B represses Teosinte
Branched1 expression and induces sorghum axillary bud outgrowth in response to light
signals. Plant Physiology, Rockville, v. 140, n, 3, p. 1109-1117, 2006.
KELLY, M.O.; BRADFORD, K.J. Insensitivity of the diageotropica tomato mutant to
auxin. Plant Physiology, Rockville, v. 82, p. 713–717, 1986.
KENDRICK, R.E.; KERCKHOFFS, L.H.; VAN TUINEN, A.; KOORNEEF, M.
Photomorphogenic mutants of tomato. Plant, Cell Environment, Oxford, v. 20, p. 746-
751, 1997.
KERCKHOFFS, L.H.J.; DE GROOT N.A.M.A.; VAN TUINEN A.; SCHREUDER M.E.L.;
NAGATANI, A.; KOORNNEEF, M.; KENDRICK, R.E. Physiological characterization of
exaggerated-photoresponse mutants of tomato. Journal of Plant Physiology, Stuttgart,
v. 150, p. 578–587, 1997.
KERR, E.A. Identification of high-pigment, hp, tomatoes in the seedling stage. Canadian
Journal of Plant Science Ottawa, v. 45, 104–105, 1965.
KIM, B.C.; SOH, M.C.; KANG, B.J.; FURUYA, M.; NAM, H.G. Two dominant
photomorphogenic mutations of Arabidopsis thaliana identified as suppressor mutations
of hy2. The Plant Journal, Oxford, v. 9, p. 441–456, 1996.
KOKA, C. V.; CERNY, R. E.; GARDNER, R. G.; NOGUCHI, T.; FUJIOKA, S.;
TAKATSUTO, S.; YOSCHIDA S.; CLOUSE, S. D. A putative role for the tomato genes
DUMPY and CURL-3 in brassinosteroid biosynthesis and response. Plant Physiology,
Rockville, v. 122, p. 85-98, 2000.
KOORNNEEF, M.; ALONSO-BLANCO, C.; PEETERS, A.J.M. Genetic approaches in
plant physiology. New Phytologist, London, v. 137, p. 1-8, 1997.
KOORNNEEF, M.; BOSMA, T.D.G.; HANHART, C.J.; VAN DER VEEN, J.H.; ZEEVART.
J.A.D. The isolation and characterization of gibberellin-deficient mutants in tomato.
Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 80, p. 852–857, 1990.
KOORNNEEF, M.; BADE, J.; HANHART, C. J.; HORSMAN, K.; SCHEL, J.; SOPPE, W.;
VERKEK, R.; ZABEL, P. Characterization and mapping of a gene controlling shoot
regeneration in tomato. The Plant Journal, Oxford, v. 3, p. 131-141. 1993.
KOORNNEEF, M.; CONE, J.W.; DEKENS, R.G.; O’HERNE-ROBERS, E.G.; SPRUIT,
C.J.P.; KENDRICK, R.E. Photomorphogenenic response of long-hypocotyl mutants of
tomato. Journal of Plant Physiology, Stuttgart, v. 120, p. 153-165. 1985.
KRAEPIEL, Y.; AGNÈS, C.; THIERY, L.; MALDINEY, R.; MIGINIAC, E.; DELARUE, M.
The growth of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) hypocotyls in the light and in
darkness differentially involves auxin. Plant Science, Amsterdam, v. 161, p.1067-1074 ,
2001.
58
KUCERA, B.; CHON, M.A.; LEUBNER-METZGER, G. Plant hormone interactions during
seed dormancy release and germination. Seed Science Research, Wallingford, v. 15, p.
281-307, 2005.
LE BRIS, M.; MICHAUX-FERRIERE, N.; JACOB, Y.; POUPET, A.; BARTHE, P.;
GUIGONIS, J.M.; LE PAGE-DEGIVRY, M.T. Regulation of bud dormancy by
manipulation of ABA in isolated buds of rosa hybrida cultured in vitro. Australian
Journal of Plant Physiology, Melbourne, v. 26, p. 273–281, 1999.
LERCARI, B.; LIPUCCI DI PAOLA, M. Photoregulation of seed germination of wild-type
and of an aurea-mutant. of tomato. Physiologia Plantarum, Kobenhavn, v. 83, p. 256-
268, 1991.
LEUBNER-METZGER, G. Brassinosteroids and gibberellins promote tobacco seed
germination by distinct pathways. Planta, Berlin, v. 213, p. 758-763, 2001.
LI, C.J.; GUEVARA, E.; HERRERA, J.; BANGERTH, F. Effect of apex excision and
replacement by 1-naphthylacetic acid on cytokinin concentration and apical dominance in
pea plants. Physiologia Plantarum, Kobenhavn, v. 94, p. 465–469,1995.
LI, J.; CHORY, J. A putative leucine-rich receptor kinase involved in brassinosteroid
signal transduction. Cell, Cambridge, v. 90, p. 929-938, 1997.
LI, L.; LI, C.; HOWE, G.A. Genetic analysis of wound signaling in tomato. Evidence for a
dual role of jasmonic acid in defense and female fertility. Plant Physiology, Rockville, v,
127, p. 1414–1417, 2001.
LIMA, J.E.; CARVALHO, R.F.; TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A.; PERES, L.E. P.
Micro-MsK: a tomato genotype with miniature size, short life cycle and improved in vitro
shoot regeneration. Plant Science, Amsterdam, v. 167, p. 753-757, 2004.
LIU, Y.; SCHIFF, M.; DINESH-KUMAR, S.P. Virus-induced gene silencing in tomato. The
Plant Journal, Oxford, v. 31, p. 777-786, 2002.
LIU, Y.; ROOF, S.; YE, Z.; BARRY, C.; VAN TUINEN, A.; VREBALOV, J.; BOWLER, C.;
GIOVANNONI, J. Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit
nutritional quality in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences,
Washington, v. 101, p. 9897–9902, 2004.
MARTÍ, E.; GISBERT, C.; BISHOP, G.J.; Dixon, M.S.; Garcia-Martinez, J.L. Genetic and
physiological characterization of tomato cv. Micro-Tom. Journal Experimental Botany,
Oxford, v. 57, p. 2037 – 2047, 2006.
MARTINEAU, B.; SUMMERFELT, K.R.; ADAMS, D.F.; DEVERNA, J.W. Production of
high solids tomatoes through molecular modification of levels of the plant growth
regulator cytokinin. Biotechnology, New York, v. 13, p. 250-254, 1995.
59
MATHEWS, H.; CLENDENNEN, S.K.; CALDWELL, C.G.; LIU, X.L.; CONNORS, K.;
MATHEIS, N.; SCHUSTER, D.K.; MENASCO, D.J.; WAGONER, W.; LIGHTNER, J.;
WAGNER, D.R. Activation tagging in tomato identifies a transcriptional regulator of
anthocyanin biosynthesis, modification, and transport. The Plant Cell, Baltimore, v. 15,
p. 1689-1703, 2003.
MATILLA, A.J. Ethylene in seed formation and germination. Seed Science Research,
Wallingford, v. 10, p. 111-126, 2000.
MATSUKURA, C.; YAMAGUCHI, I.; INAMURA, M.; BAN, Y.; KOBAYASHI, Y.; YIN, Y.;
SAITO, T.; KUWATA, C.; IMANISHI, S.; NISHIMURA, S. Generation of gamma
irradiation-induced mutant lines of the miniature tomato (Solanum lycopersium L.) Micro-
Tom. Plant Biotechnology, v. 24, p. 39-44, 2007.
MAXON-SMITH, J.W.; RITCHIE, D.B. A collection of near isogenic lines of tomato.
Research tool of the future? Plant Molecular Biology, Dordrecht, v. 3, p. 20–25, 1982.
MCSTEEN, P.; LEYSER, O. Shoot branching. Annual Review of Plant Biology, Palo
Alto, v. 56, p. 353–374, 2005.
MEISSNER, R.; CHAGUE, V.; ZHU, Q.; EMMANUEL, E.; ELKIND, V.; LEVY, A.A. A high
throughput system for transposon tagging and promoter trapping in tomato. The Plant
Journal, Oxford, v. 22, p. 265-274, 2000.
MEISSNER, R.; JACOBSON, Y.; MELAMED, S.; LEVYATUV, S.; SHALEV, G.; ASHRI,
A.; ELKIND, Y.; LEVY, A. A new model system for tomato genetics. The Plant Journal,
Oxford, v. 12, p. 1465-1472, 1997.
MENDA, N.; SEMEL, Y.; PELED, D.; ESHED, Y.; ZAMIR, D. In silico screening of a
saturated mutation library of tomato. The Plant Journal, Oxford, v. 38, p. 861-872, 2004.
MOLAS, M.L; KISS, J.Z.; CORRELL,
M.J. Gene profiling of the red light signalling
pathways in roots. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 57, n. 12, p. 3217-3229.
2006.
MONTOYA, T.; NOMURA, T.; FARRAR, K.; KANETA, T.; YOKOTA, T.; BISHOP, G.J.
Cloning the tomato Curl3 gene highlights the putative dual role of the leucine-rich repeat
receptor kinase tBRI1/SR160 in plant steroid hormone and peptide hormone signaling.
The Plant Cell, Boltimore, v. 14, p. 3163–3176, 2002.
MORRIS, S.E.; TURNBULL, C.G.N.; MURFET, I.C.; BEVERIDGE, C.A. Mutational
analysis of branching in pea. Evidence that Rms1 and Rms5 regulate the same novel
signal. Plant Physiology, Rockville, v. 126, p. 1205–1213, 2001.
60
MUELLER, L.A.; SOLOW, T.H.; TAYLOR, N.; SKWARECKI, B.; BUELS R.; BINNS, J.;
LIN, C.W.; WRIGHT, M.H.; AHRENS, R.; WANG, Y.; HERBST, E.V.; KEYDER, E.R.;
MENDA, N.; ZAMIR, D.; TANKSLEY, S.D. The SOL Genomics Network. A comparative
resource for Solanaceae biology and beyond, Plant Physiology, Rockville, v. 138, p.
1310-1317, 2005.
MULTANI, D.S.; BRIGGS, S.P.; CHAMBERLIN, M.A.; BLAKESLEE, J.J.; MURPHY,
A.S.; JOHAL, G.S. Loss of an MDR transporter in compact stalks of maize br2 and
sorghum dw3 mutants. Science, Washington, v. 302, p. 81–84, 2003.
Muramoto, T.; Kami, C.; Kataoka, H.; Iwata, N.; Linley, P.J.; Mukougawa, K.; Yokota, A.;
Kohchi, T. The tomato photomorphogenetic mutant, aurea, is deficient in
phytochromobilin synthase for phytochrome chromophore biosynthesis. Plant and Cell
Physiology, Tokyo, v. 46, p. 661–665, 2005.
MUSTILLI, A.C.; FENZI, F.; CILIENTO, R.; ALFANO, F.; AND BOWLER, C. Phenotype
of the tomato high pigment-2 mutant is caused by a mutation in the tomato homolog of
DEETIOLATED1. The Plant Cell, Baltimore, v. 11, p. 145–157, 1999.
NEFF, M.M.; FANKHAUSER, C.; CHORY, J. Light: an indicator of time and place.
Genes and Development, New York, v. 14, n, 3, p. 257-71, 2000.
NIKOLIĆ, R.; MITIĆ, N.; MILETIĆ, R.; NEŠKOVIĆ. M. Effects of cytokinins on in vitro
seed germination and early seedling morphogenesis in Lotus corniculatus L. Journal of
Plant Growth Regulation, New York, v. 25, n. 3, p. 187-194, 2006.
OH, K.; IVANCHENKO, M.G.; WHITE, T.J.; LOMAX, T.L. The diageotropica gene of
tomato encodes a cyclophilin: a novel player in auxin signaling. Planta, Berlin, v. 224, n.
1, p. 133-144, 2006.
OKAMURO, J.K.; SZETO, W.; LOTYS-PRASS, C.; JOFUKU, K.D. Photo and hormonal
control of meristem identity in the Arabidopsis flower mutants apetala2 and apetala1.
The Plant Cell, Baltimore, v. 9, p. 37–47, 1997.
PENG, J. R.; RICHARDS, D. E.; HARTLEY, N. M.; MURPHY, G. P.; DEVOS, K. M.;
FLINTHAM, J. E.; BEALES, J.; FISH, L. J.; WORLAND, A. J.; PELICA, F.; SUDHAKAR,
D.; CHRISTOU, P.; SNAPE, J. W.; GALE, M. D.; HARBERD, N. P. "Green revolution"
genes encode mutant gibberellin response modulators. Nature, London, v. 400, v. 256–
261, 1999.
PERES, L.E.P.; CARVALHO, R.F.; ZSÖGÖN, A.; BERMÚDEZ-ZAMBRANO, O. D.;
ROBLES, W.G.R.; TAVARES, S. Grafting of tomato mutants onto potato rootstocks: an
approach to study leaf-derived signaling on tuberization. Plant Science, Amsterdam, v.
169, p. 680-688, 2005.
61
PETERS, J.L.; VAN TUINEN, A.; ADAMSE, P.; KENDRICK, R.E.; KOORNNEEF, M.
High pigment mutants of tomato exhibit high sensitivity for phytochrome action. Journal
of Plant Physiology, Stuttgart, v. 134, p. 661-666, 1989.
PINO-NUNES, L.E. Obtenção e uso de mutantes com alterações no balanço
auxina/citocinina no estudo da competência organogênica em micro-tomateiro
(Lycopersicon esculentum cv Micro-Tom). 2005. 73p. Dissertação (Mestrado em
Fisiologia e Bioquímica de Plantas) Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Pauo, 2005.
PNUELI, L.; CARMEL-GOREN, L.; HAREVEN, D.; GUTFINGER, T.; ALVAREZ, J.;
GANAL, M.; ZAMIR, D.; LIFSCHITZ, E. The SELF-PRUNING gene of tomato regulates
vegetative to reproductive switching of sympodial meristems and is the ortholog of CEN
and TFL1. Development, Washington, v. 125, p. 1979–1989, 1998.
POOLE, I.; WEYERS, J.D.B.; LAWSON, T.; RAVEN, J.A. Variations in stomatal density
and index: Implications for paleoclimatic reconstructions, Plant, Cell and Environment,
Oxford, v. 19, p.705– 712, 1996.
PRATT, L.H.; CORDONNIER-PRATT, M.M.; KELMENSON, P.M.; LAZAROVA, G.I.;
KUBOTA, T.; ALBA, R.M. The phytochrome gene family in tomato (Solanum
lycopersicon L.). Plant, Cell Environment, Oxford. v. 20, p. 672-677, 1997.
QUILES, M.J.; CUELLO, J.; SABATER, B. Phytochrome and hormone control of
polypeptides synthesized by chloroplasts of senescent barley leaves. Revista Española
de Fisiologia, Barcelona, v. 46, n. 3, p. 279-282, 1990.
RAMPEY, R.A.; LECLERE, S.; KOWALCZYK, M.; LJUNG, K.; SANDBERG, G.;
BARTEL, B. A family of auxin-conjugate hydrolases that contribute to free indole-3-acetic
acid levels during Arabidopsis germination. Plant Physiology, Rockville, v. 135, p. 978-
988, 2004.
RAYLE, D.L.; NOWBAR, S.; CLELAND, R.E. The epidermis of the pea epicotyl is not a
unique target for auxin-induced growth. Plant Physiology, Rockville, v. 97, p. 449– 451,
1999.
REID, J.B. Plant hormone mutants. Journal of Plant Growth Regulation, New York,
v.12, p. 207-226, 1993.
RICK, C.M. High soluble-solids content in large-fruited tomato lines derived from a wild
green-fruited species. Hilgardia, Berkeley, v. 42, p. 493-510, 1974.
RICK, C.M. (1973) Potential genetic resources in tomato species: clues from
observations in native habitats. In: Hollaender, A; Srb, A. (Ed.). Genes, Enzymes, and
Populations. New York: Plenum, 1973. p. 255-269.
62
RIEFLER, M.; NOVAK, O.; STRNAD, M.; SCHMÜLLING, T. Arabidopsis cytokinin
receptor mutants reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size,
germination, root development, and cytokinin metabolism. The Plant Cell, Baltimore, v.
18, p. 40–54, 2006.
RIOU-KHAMLICHI, C.; HUNTLEY, R.; JACQMARD, A.; MURRAY, J.A.H. Cytokinin
activation of Arabidopsis cell division through a D-type cyclin. Science, Washington, v.
283, p. 1541-1544, 1999.
ROITSCH, T.; EHNEß, R. Regulation of source/sink relations by cytokinins. Plant
Growth Regulation, Dordrecht, v. 32, p. 359-267, 2000.
RUPP, H-M.; FRANK, M.; WERNER, T.; STRNARD, M.; SCHMÜLLING, T. Increased
steady state mRNA levels of the STM and KNAT1 homeobox genes in cytokinin
overproducing Arabidopsis thaliana indicate a role for cytokinins in the shoot apical
meristem. The Plant Journal, Oxford, v. 18, p. 557-563, 1999.
SASAKI, A.; ASHIKARI, M.; UEGUCHI-TANAKA, M.; ITOH, H., NISHIMURA, A.;
SWAPAN, D.; ISHIYAMA, K.; SAITO, T.; KOBAYASHI, M.; KHUSH, G.S.; KITANO, H.;
MATSUOKA, M. Green revolution: A mutant gibberellin-synthesis gene in rice: New
insight into the rice variant that helped to avert famine over thirty years ago. Nature,
London, v. 416, p. 701–702, 2002.
SATLER, S.O.; KENDE H. Ethylene and the growth of rice seedlings. Plant Physiology,
Rockville, v. 79, p. 194–198, 1985.
SCHEPENS, P.; DUEK, C.; FANKHAUSER, C. Phytochrome-mediated light signalling in
Arabidopsis, Current Opinion in Plant Biology, London, v. 7, p. 564–569, 2004.
SCOTT, J.W.; HARBAUGH, B.K. Micro-Tom. A miniature dwarf tomato. Florida
Agricultural Experiment Station, Circular S-370, v. 370, p. 1-6, 1989.
SERRANI, J.C.; SANJUÁN, R.; RUIZ-RIVERO, O.; FOS, M.; GARCÍA-MARTÍNEZ, J.L.
GIBBERELLIN Regulation of Fruit-Set and Growth in Tomato. Plant Physiology,
Rockville, v.145, n. 1, p. 246-57, 2007a.
SERRANI, J.C.; FOS, M.; GARCÍA-MARTÍNEZ, J.L. Effect of Gibberellin and Auxin on
Parthenocarpic Fruit Growth Induction in the cv Micro-Tom of Tomato. Plant Growth
Regulation, Dordrecht, v. p. 211-221, 2007b.
SHARP, R.E.; LENOBLE, M.E.; ELSE, M.A.; THORNE, E.T.; GHERARDI, F.
Endogenous ABA maintains shoot growth in tomato independently of effects on plant
water balance: evidence for an interaction with ethylene. Journal of Experimental
Botany, Oxford, v. 51, p. 1575–1584, 2000.
63
SIRIWITAYAWAN, G.; GENEVE R.L.; DOWNIE, A.B. Seed germination of ethylene
perception mutants of tomato and Arabidopsis. Seed Science Research, Wallingford, v.
13, n. 4, p. 303-314, 2003.
STEVENS, M.A.; RICK, C.M. Genetic and breeding In: Atherton, J.G.; Rudich, J. (Ed.).
The tomato crop: a scientific basis for improvement. London: Chapman and Hall, 1986,
p. 35-109.
STIRK, W.A.; GOLD, J.D.; NOVÁK, O.; STRNAD, M.; VAN STADEN, J. Changes in
endogenous cytokinins during germination and seedlings establishment of Tagetes
minuta. Plant Growth Regulation, Dordrecht, v. 47; p. 1-7, 2005.
TAL, M.; IMBER, D.; EREZ, A.; EPSTEIN, E. Abnormal stomatal behavior and hormonal
imbalance in flacca, a wilty mutant of tomato: V. Effect of abscisic acid on indoleacetic
acid metabolism and ethylene evolution. Plant Physiology, Rockville, v. 63, p. 1044–
1048, 1979.
TAYLOR, I. B. Biosystematics of the tomato. In: Atherton, J.G.; Rudich, J. (Eds.) The
tomato crop: a scientific basis for improvement. London: Chapman and Hall, 1986. p. 1-
34.
TAYLOR, I.B.; BURBIDGE, A. THOMPSON, A.J. Control of abscisic acid synthesis.
Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 51, p. 1563-1574, 2000.
TERRY, M.J.; KENDRICK, R.E. Feedback inhibition of chlorophyll synthesis in the
phytochrome chromophore-deficient aurea and yellow-green-2 mutants of tomato. Plant
Physiology, Rockville, v. 119, p. 143-152, 1999.
THOMPSON, A.E. A comparision of fruit quality constituents of normal and high pigment
tomatoes. Proceedings of American Society for Horticultural Science, Geneva, v.
78, p. 464–473, 1962.
TIEMAN, D.M.; CIARDI, J.A.; TAYLOR, M.G.; KLEE, H.J. Members of the tomato LeEIL
(EIN3-like) gene family are functionally redundant and regulate ethylene responses
throughout plant development. The Plant Journal, Oxford, v. 26, p. 47–58, 2001.
TONSOR, S.J.; ALONSO-BLANCO, C.; KOORNNEEF M. Gene function beyond the
single trait: natural variation, gene effects, and evolutionary ecology in Arabidopsis
thaliana. Plant, Cell & Environment, Oxford, v. 28, p. 2–20, 2005.
TORRES, C.A.; ANDREWS, P.K.; DAVIES, N.M. Physiological and biochemical
responses of fruit exocarp of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) mutants to natural
photo-oxidative conditions. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 57, n. 9,
p.1933-1947, 2006.
VALE, F.X.R.; FERNANDES FILHO, E.I.; LIBERATO, J.R. QUANT. A software for
plant disease severity assessment. In: 8th International Congress of Plant Pathology,
2003, Christchurch, New Zealand, 2003. p. 105.
64
VAN TUINEN, A.; HANHART, C.J.; KERCKHOFFS, L.H.J.; NAGATANI, A.; BOYLAN,
MT.; QUAIL, P.H.; KENDRICK, R.E.; KOORNNEEF, M. Analysis of Phytochrome-
deficient yellow-green-2 and aurea mutants tomato. The Plant Journal, Oxford, v. 9, p.
173-182, 1996.
VANDENBUSSCHE, F.; PIERIK, R.; MILLENAAR, F. F.; VOESENEK, L.A.; VAN DER
STRAETEN, D. Reaching out of the shade. Current Opinion in Plant Biology, London,
v. 8, p. 462–468, 2005.
VANDENBUSSCHE, F.; HABRICOT, Y.; CONDIFF, A.S.; MALDINEY, R.; STRAETEN,
D.V.; AHMAD, M. HY5 is a point of convergence between cryptochrome and cytokinin
signalling pathways in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, Oxford, v. 49, n. 3, p.
428-41, 2007.
VOGG, G.; FISCHER, S.; LEIDE, J.; EMMANUEL, E.; JETTER, R.; LEVY, A.A.;
RIEDERER, M. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier
properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid
beta-ketoacyl-CoA synthase. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 55, n. 401, p.
1401-1410, 2004.
WANG, H.; JONES, B.; LI Z, FRASSE, P.; DELALANDE, C.; REGAD, F.; CHAABOUNI,
S.; LATCHE, A.; PECH, J.C.; BOUZAYEN, M. The tomato Aux/IAA transcription factor
IAA9 is involved in fruit development and leaf morphogenesis. The Plant Cell, Baltimore,
v. 17, p. 2676-2692, 2005.
WATANABE, C.; MIZOGUCHI, T.; AOKI, K.; KUBO, Y.; MORI, H.; IMANISHI, S.;
YAMAZAKI, Y.; SHIBATA, D.; EZURA, H. Ethylmethanesulfonate (EMS) mutagenesis of
Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom for large-scale mutant scrrens. Plant
Biotechnology, v. 24, p. 33-38, 2007.
WERNER, T.; MOTYKA, V.; LAUCOU, V.; SMETS, R.; VAN ONCKELEN, H.; AND
SCHMÜLLING, T. Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple
developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in regulating shoot
and root meristem activity. The Plant Cell, Baltimore, v. 15, p. 2532–2550, 2003.
WEYERS, J.D.B.; JOHANSEN L.G. Accurate estimation of stomatal aperture from
silicone rubber impressions. New Phytologist, London, v. 101, p. 109–115, 1985.
WILKINSON, J.Q.; LANAHAN, M.B.; YEN, H.C.; GIOVANNONI, J.J.; KLEE, H.J. An
ethylene-inducible component of signal transduction encoded by Never-ripe. Science,
Washington, v. 270, p. 1807-1809, 1995.
YAMAMOTO, N.; TSUGANE, T.; WATANABE, M.; YANO, K.; MAEDA, F.; KUWATA, C.;
TORKI, M.; BAN, Y.; NISHIMURA, S.; SHIBATA, D. Expressed sequence tags from the
laboratory-grown miniature tomato (Lycopersicon esculentum) cultivar Micro-Tom and
mining for single nucleotide polymorphisms and insertions/deletions in tomato cultivars.
Gene, Amsterdam, v. 356, p. 127–134, 2005.
65
YEN, H.; SHELTON, A.; HOWARD, L.; VREBALOV, J.; AND GIOVANNONI, J. The
tomato high-pigment (hp) locus maps to chromosome 2 and influences plastome copy
number and fruit quality. Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 95, p. 1069-
1079, 1997.
66
3 ALONGAMENTO E ACÚMULO DE ANTOCIANINAS EM HIPOCÓTILOS DE
TOMATEIRO COMO UMA RESPOSTA HORMONAL E/OU FOTOMORFOGENÉTICA.
ESTUDOS COM MUTANTES E DUPLOS MUTANTES EM CINCO CLASSES
HORMONAIS E FITOCROMO.
Resumo
No presente trabalho foram analisados o alongamento e o acúmulo de
antocianinas em hipocótilos de mutantes de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill. cv
Micro-Tom) com alterações na biossíntese ou resposta a fitocromo (phy), bem como
auxina (AUX), citocinina (CK), ácido abscísico (ABA), etileno (ET) e giberelina (GA). As
interações entre hormônios e luz foram testadas via tratamentos exógenos em mutantes
fotomorfogenéticos e observação de mutantes hormonais variando a condição de luz,
além de análises utilizando duplos mutantes combinando mutações hormonais e
fotomorfogenéticas. Nos tratamentos exógenos, o acúmulo de antocianinas no hipocótilo
foi promovido por CK e ABA e bastante inibido por GA. Coerentemente, houve uma
redução no acúmulo de antocianinas no mutante deficiente em ABA (notabilis ou not) e
uma redução muito acentuada no mutante hipersensível à GA (procera ou pro). Foi
observado um grande acúmulo de antocianinas no mutante pouco sensível à AUX
(diageotropica ou dgt), o que não teve relação com os tratamentos exógenos, mas que é
coerente com a sugestão de que esse mutante possui uma resposta ao balanço
AUX/CK voltado para CK. Aplicação de ET também mostrou ser inibitório, mas somente
no mutante phy
+
(high pigment1 ou hp1), o qual normalmente possui um elevado
conteúdo de antocianinas nos hipocótilos. Todas as classes hormonais utilizadas
exogenamente inibiram, com exceção de GA, o alongamento do hipocótilo no escuro.
Embora os tratamentos exógenos tenham tido pouco efeito na luz, mutantes afetando
diferentes classes hormonais promoveram ou inibiram o alongamento do hipocótilo
nessa condição. Entre tais mutantes, as maiores inibições na luz foram observadas no
superprodutor de ET (epinastic ou epi) e no pouco sensível à CK (bushy root ou brt), e
as maiores promoções no hipersensível à GA e no deficiente em ABA (sitiens ou sit). No
escuro, o único mutante que apresentou alongamento do hipocótilo superior a MT foi o
mutante deficiente na biossíntese de phy
(phy
-
) (aurea ou au). Os mutantes que mais
inibiram o alongamento no escuro foram o superprodutor de ET e os pouco sensíveis à
AUX ou CK. Os duplos mutantes combinado phy
-
com alterações em AUX, GA, ET e
ABA mostraram um fenótipo aditivo ou sinergístico, o que indica vias paralelas na
sinalização, tanto no acúmulo de antocianinas quanto no alongamento do hipocótilo.
Contudo, no caso da mutação afetando sensibilidade à CK houve relação de epistasia,
sendo essa epistática a phy
-
no alongamento do hipocótilo, embora tenha sofrido
epistasia de phy
-
no acúmulo de antocianinas. Em conjunto, esses resultados sugerem
que, embora a maioria das classes hormonais testadas possa afetar o alongamento do
hipocótilo e o acúmulo de antocianinas, seus efeitos, com exceção da CK,
provavelmente são gerados por uma via de transdução de sinal diferente do sinal
luminoso.
67
Palavras-chave: Fitocromo; Hormônios; Alongamento do hipocótilo; Acúmulo de
antocianinas.
68
3 TOMATO HYPOCOTYL ELONGATION AND ANTHOCYANIN ACCUMULATION AS
A HORMONAL AND/OR PHOTOMORPHOGENIC RESPONSE. ANALYSIS OF
MUTANT AND DOUBLE MUTANTS IN FIVE HORMONAL CLASSES AND
PHYTOCHROME
Abstract
In this work we analysed hypocotyl elongation and anthocyanin accumulation in
tomato mutants (Lycopersicon esculentum Mill. cv Micro-Tom) with altered biosynthesis
or response to phytochrome (phy), auxin (AUX), cytokinin (CK), gibberellin (GA), abscisic
acid (ABA) and ethylene (ET). We used the following approaches: i) exogenous hormone
application in photomorphogenic mutants; ii) cultivation of hormonal mutants under light
and dark conditions; iii) analysis of double mutants (photomorphogenic-hormonal).
Anthocyanin accumulation was promoted by exogenous CK and ABA and inhibited by
GA. This is in accordance with the reduced anthocyanin accumulation in the ABA
deficient mutant (not) and in the GA hypersensitive mutant (pro). Although the
diageotropica (dgt), auxin-insensitive mutant, showed a high anthocyanin accumulation,
exogenous auxin did not supported a role for this hormone in anthocyanin accumulation.
On the other hand, this could be due to a low auxin-to-cytokinin ratio presented by dgt.
Data from mutants with altered metabolism and sensitivity of ethylene, epinastic (epi)
and Never ripe (Nr) respectively, and from plants treated with this hormone suggest a
limited role of ethylene in the anthocyanin biosynthesis. Exogenous AUX, CK, ABA and
ET inhibited the hypocotyl elongation. This is coherent with the promotion of hypocotyl
elongation in dgt and sit mutants under light conditions and inhibition of hypocotyl
elongation in the epi mutant in the light and dark. On the other hand, GA promoted the
hypocotyl elongation corroborating the same effect seen in pro. The brt mutant showed
a reduced hypocotyl elongation in light and dark conditions, which contradicts the effect
of exogenous cytokinin. The phytochrome-deficient aurea (au) mutant was the only one
to show an enhanced hypocotyl elongation in the dark compared to the wild type (MT).
The combination between photomorphogenic and hormonal mutants (double mutants)
showed additive (au epi, au Nr, au dgt e au sit), synergistic (au pro) and epistatic (au brt)
interactions considering the anthocyanin accumulation and hypocotyl elongation.
Synergistic interaction was observed in the elongation hypocotyl of the au dgt and au sit
double mutants. These results indicate that phy and CK may share some
signaling/metabolic pathways in the control of anthocyanin accumulation and hypocotyl
elongation. On the other hand, our data do not support an interaction between phy and
the hormones AUX, ET, ABA and GA in the control of hypocotyls elongation or
anthocyanin accumulation.
Keywords: Phytochrome; Hormones; Hhypocotyl elongation; Anthocyanin accumulation
69
3.1 Introdução
Durante os estágios iniciais do desenvolvimento vegetal, eventos que
desempenham um papel importante para seu estabelecimento no ambiente
(KENDRICK; KRONENBERG, 1994), como o alongamento e o acúmulo de antocianinas
nos hipocótilo, são fortemente controlados pela luz (CHALKER-SCOTT, 1999;
SYMONS; REID, 2003). Dessa forma, numerosos trabalhos têm avaliado a atividade de
fotorreceptores no controle de ambos processos (PETERS et al., 1989; KERCKHOFFS
et al., 1997; NEFF; CHORY, 1998; ALOKAM et al., 2002; HUSAINEID et al., 2007;
VANDENBUSSCHE et al., 2007). Além disso, tratamentos com hormônios vegetais
podem alterar tanto o alongamento do hipocótilo (PEREZ et al., 1974; CARY; LIU;
HOWELL,1995; SU; HOWELL, 1995; COWLING; HARBERD, 1999; COLLET;
HARBERD; LEYSER, 2000) quanto a biossíntese de antocianinas (PEREZ et al. 1974;
DEIKMAN; HAMMER, 1995; VANDENBUSSCHE et al., 2007) de modo semelhante aos
efeitos promovidos pela luz. Sendo assim, hipóteses têm sido levantadas sobre a
interação entre luz e hormônios no controle da fotomorfogênese. Tais hipóteses dizem
respeito à possibilidade dos hormônios fazerem parte da mesma via de transdução de
sinal iniciada pelos fotorreceptores ou, alternativamente, partilharem algumas das
moléculas dessa via. Na tentativa de responder essas questões, o uso de mutantes
com alterações no metabolismo/sensibilidade a fotorreceptores e hormônios vegetais
torna-se uma ferramenta valiosa (VON ARNIM; DENG, 1996). Além disso, interações
entre hormônio e fotomorfogênese podem ser testadas pela observação do fenótipo de
duplos ou combinações múltiplas de mutantes nesses dois tipos de moduladores do
desenvolvimento.
Grande parte dos trabalhos envolvendo o uso de mutantes é realizada em
Arabidopsis thaliana, o modelo genético mais utilizado. Contudo, algumas plantas de
interesse agronômico direto também provaram serem bons modelos genéticos, como o
arroz (Oryza sativa L.), o milho (Zea mays L.), a ervilha (Pisum sativum L.) e o tomateiro
(Lycopersicon esculentum Mill. Syn. Solanum lycopersicum L.). Essa última espécie é
um modelo complementar a Arabidopsis para estudar respostas fotomorfogenéticas,
visto que, por exemplo, a produção de antocianinas em tomateiro ocorre de maneira
estritamente dependente da luz, o que provavelmente não é o caso de Arabidopsis
70
(CHORY et al. 1994). Além disso, enquanto em Arabidopsis a família gênica que
codifica as diferentes apoproteínas do fotorreceptor fitocromo é representada pelos
genes PHYA, PHYB, PHYC, PHYD e PHYE, em tomateiro essa família é composta por
PHYA, PHYB1, PHYB2, PHYE e PHYF (PRATT et al., 1997).
No que diz respeito à disponibilidade de mutantes, esses são descritos em
tomateiro para alterações na via de transdução do sinal da luz (KOORNNEEF et al.,
1985; KENDRICK et al., 1997), bem como no metabolismo/sensibilidade à auxina
(HICKS; RAYLE; LOMAX, 1989; KELLY; BRADFORD, 1986; OH et al., 2006), citocinina
(PINO-NUNES, 2005), ácido abscísico (TAYLOR; BURBIDGE; THOMPSON, 2000;
BURBIDGE et al., 1999), giberelinas (JONES, 1987; BENSEN; ZEEVAART, 1990;
KOORNNEEF et al., 1990), etileno (FUJINO et al., 1988; WILKINSON et al., 1995),
brassinoesteróides (BISHOP et al., 1999; KOKA et al., 2000; MONTOYA et al., 2002) e
ácido jasmônico (HOWE et al., 1996; HOWE; RYAN, 1999; LI; LI; HOWE 2001). Assim
como Arabidopsis, o tomateiro também possui uma série de mutantes afetando o
acúmulo de antocianinas (ATANASSOVA et al., 2001). Um fato interessante, porém, é
que a engenhosa estratégia de se isolar mutantes em antocianinas pela observação da
testa das sementes em Arabidopsis (KOORNNEEF, 1990) não precisou ser realizada
para tomateiro, já que o tamanho de seus hipocótilos facilita sua observação a olho nu,
além de também facilitar a obtenção de material suficiente para dosagens.
Uma das limitações presente em tomateiro, e outros modelos vegetais, para
estudos integrados é o fato dos vários mutantes isolados estarem normalmente
distribuídos em diferentes backgrounds genéticos. Contudo, em um estudo prévio
(Capítulo 1), foram introgredidas mutações em tomateiro correspondentes às principais
classes hormonais bem como mutantes com alterações na via de transdução do sinal da
luz em uma única cultivar, Micro-Tom (MT), a qual tem a vantagem de possuir porte
reduzido e ciclo de vida rápido, 70-90 dias (SCOTT; HARBAUGH, 1989; MEISSNER et
al., 1997). No referido estudo, foi evidenciado que as alterações genéticas que levam ao
porte reduzido e ao ciclo rápido dessa cultivar não impedem seu uso para o estudo de
eventos desenvolvimentais afetados por hormônios e pela luz (Capítulo 1).
No presente trabalho, tomamos vantagem da coleção de mutantes hormonais e
fotomorfogenéticos em um só background genético mencionada acima (Capítulo 1) para
71
o estudo da interação entre hormônios e luz no alongamento e no acúmulo de
antocianinas em hipocótilos de tomateiro. Para tal, três abordagens foram utilizadas: i)
tratamentos exógenos utilizando diferentes classes hormonais em mutantes
fotomorfogenéticos, ii) observação de hipocótilos de mutantes hormonais crescidos na
luz e no escuro, iii) observação de duplos mutantes combinando mutações hormonais e
fotomorfogenéticas.
3.2 Desenvolvimento
3.2.1 Material e Métodos
3.2.1.1 Material vegetal
Foram utilizados 7 mutantes hormonais recessivos e 1 dominante, bem como 2
mutantes fotormorfogenéticos recessivos de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.
syn. Solanum lycopersicum L.) todos no background da cv Micro-Tom (Tabela 1),
obtidos em trabalhos anteriores (Capítulo 1). Tais genótipos foram utilizados para
construção de 6 duplos mutantes fotomorfogenéticos-hormonais (Figuras 1 e 8).
3.2.1.2 Cultivo e construção de duplos mutantes
Sementes dos mutantes hormonais e fotomorfogenéticos foram semeadas em
bandejas contendo uma mistura na proporção de 1:1 de substrato comercial (Plantmax
HT, Eucatex) com vermiculita expandida, suplementado com 1g/L de NPK 10:10:10 e
4g/L de calcário. Após 10 dias, as plantas foram transferidas para vasos com
capacidade para 150mL, com as mesmas misturas para substrato. Após o
florescimento, pólens foram retirados dos mutantes fotomorfogenéticos e postos para
polinizar flores jovens emasculadas dos mutantes hormonais. As sementes geradas (F1)
foram semeadas e as plantas resultantes foram deixadas para se autofecundar e obter a
geração F2, na qual foram triados duplos mutantes. Para o duplo com a mutação
dominante (Nr) foi realizado um teste de progênie para seleção de homozigotos. Para
coleta de sementes, frutos maduros foram colhidos e a polpa contendo as sementes
fermentadas durante 12 horas na presença de um pouco de água e levedura
(Saccharomyces cerevisae) liofilizada (Fermix). Posteriormente, as sementes foram
lavadas e secas em ambiente ventilado e sombreado.
72
3.2.1.3 Determinação de antocianinas e medidas do comprimento do hipocótilo
Sementes foram postas para germinar no escuro em água destilada até a
protrusão da radícula, sendo em seguida transferidas para luz, ou permanecidas no
escuro, e submetidas a tratamentos com soluções hormonais: 10
-7
a 10
-4
M de auxina
(ácido naftalenoacético, ANA, SIGMA), citocinina (Thidiazuron, TDZ, Bayer
CropScience) e ácido abscísico (ABA, SIGMA), 10
-6
a 10
-3
M de giberelina (GA
3
,
ProGibb, SUMITOMO) e 10
-7
a 10
-4
g/L de etileno (ácido cloroetil fosfônico, CEPA ou
Ethrel, Bayer CropScience), além do controle sem hormônios. Após 10 dias de cultivo,
foi medido, com auxílio de um paquímetro digital, o comprimento do hipocótilo na luz e
escuro, utilizando-se 20 plântulas por tratamento. A extração e quantificação de
antocianinas foram realizadas de acordo com a metodologia descrita por Peters et al.,
(1989) em plantas crescidas na luz. Para determinação de antocianinas, utilizaram-se
três repetições de 5 hipocótilos cortados do colo até a base dos cotilédones para cada
tratamento.
3.2.1.4 Tratamentos com luz
O acúmulo de antocianinas e o comprimento do hipocótilo foram avaliados após a
permanência das plântulas durante 10 dias em caixas gerbox transparentes em
fotoperíodo de 16 horas sob 3 lâmpadas fluorescentes (40W - Luz do dia especial - 55
µmol/m
-2
s
-1
PAR) em uma sala de crescimento a uma temperatura de 25
o
C. Para
obtenção do escuro, as plântulas foram crescidas em caixas gerbox preta sob as
mesmas condições de temperatura.
3.2.2 Resultados
3.2.2.1 Obtenção e fenótipo dos duplos mutantes hormonais-fotomorfogenéticos
O cruzamento entre au e os mutantes hormonais geraram em F2 duplos mutantes
carregando ao mesmo tempo deficiência na biossíntese do fitocromo (phy
-
) e alterações
na biossíntese e/ou sensibilidade a hormônios (Figura 1 e Tabela 1). Todos os duplos
mutantes apresentaram um fenótipo aditivo, combinado o aspecto clorótico de au com
aspectos conhecidos de cada mutante hormonal. Por exemplo, em au dgt pode-se
observar a hiponastia cotiledonar (Figura 1C) devido à baixa sensibilidade à AUX de dgt.
73
Em au epi ocorreu inibição do alongamento do hipocótilo (Figura 1B) devido a
superprodução de ET de epi. Em au pro é evidente o alongamento exagerado do
hipocótilo (Figura 1D) devido ao aumento na sensibilidade à GA em pro somado ao
proeminente alongamento já presente em au. Em au Nr observa-se ausência do
encurtamento da raiz na presença de ET (Figura 1A) e atraso severo na maturação do
fruto devido à baixa sensibilidade ao ET de Nr. Em au sit as plantas adultas
apresentaram um murchamento evidente (Figura 1E) devido à deficiência na biossíntese
de ABA de sit. O fenótipo aditivo ou sinergístico (e.g. alongamento do hipocótilo de au
pro) das interações entre hormônio e fitocromo sugere que participem de vias distintas
de transdução de sinais (Figura 8). Contudo, chama atenção o fenótipo bastante
debilitado de plantas adultas de au brt (Figura 1F), além do fato da mutação brt
praticamente suprimir o efeito de au no alongamento do hipocótilo. Essa epistasia de brt
sobre au sugere uma via comum entre CKs e phy. Essas sugestões foram testadas com
a quantificação de antocianinas e medições precisas do alongamento dos hipocótilos
dos simples e duplos mutantes de tomateiro, como se verá adiante.
74
Figura 1 – Fenótipo dos duplos mutantes fotomorfogenéticos-hormonais na cv MT. Note que os
duplos mutantes apresentaram um fenótipo aditivo, ou em alguns casos sinergístico
(Figura 8), combinando o aspecto clorótico da deficiência de fitocromo (au) com aspectos
de cada mutação hormonal. A) Falha do etileno exógeno (100 ppm de Ethrel) em inibir o
alongamento radicular no duplo mutante au Nr, sendo esse um fenótipo típico do mutante
pouco sensível a essa classe hormonal (Nr). B) Plântulas com 15 dias do duplo au epi
combinado o aspecto clorótico de au com a inibição do alongamento do hipocótilo e a
epinastia do cotilédone do mutante superprodutor de etileno (epi). C) Plântulas com 15
dias do duplo mutante au dgt apresentando cotilédones hiponásticos, característico de
baixa sensibilidade à auxina. D) Interação sinergística no alongamento do hipocótilo
devido à soma dos efeitos da mutação au com a hipersensibilidade a giberelina do
mutante pro. E) Fenótipo aditivo do duplo mutante au sit, o qual combina o aspecto
clorótico de au com o aspecto murcho, devido à deficiência de ácido abscísico, de sit. F)
Fenótipo bastante debilitado do duplo mutante au brt, resultado do efeito da deficiência
em phy de au somada a baixa sensibilidade à CK de brt
X
75
Tabela 1
-
Mutantes hormonais e fotomorfogenéticos
utilizados. Todos os mutantes estão no background da cv
Micro-Tom (Capítulo 1)
Mutantes Efeito
diageotropica (dgt)
AUX
-
bushy root (brt)
CK
-
epinastic (epi)
ET
+
Never ripe (Nr)
ET
-
sitiens (sit)
ABA
-
notabilis (not)
ABA
-
procera (pro)
GA
+
aurea (au)
PHY
-
high pigment1 (hp1)
PHY
+
AUX
-
= baixa sensibilida à auxina, CK
-
= baixa sensibilidade
à citocinina, ET
+
= produção exagerada de etileno, ET
-
=
baixa sensibilidade ao etileno, GA
+
= alta sensibilidade à
giberelina, ABA
-
= deficiência na biossíntese de ácido
abscísico, phy
-
= deficiência na biossíntese de fitocromo,
phy
+
= respostas exageradas à luz (phy). A descrição do
fenótipo dos mutantes e a alteração da função gênica estão
descritas no Capítulo 1
3.2.2.2 Acúmulo de antocianinas em mutantes hormonais
Afim de verificar a alteração hormonal que poderia afetar o acúmulo de
antocianinas, plântulas germinadas dos mutantes hormonais (Tabela 1) foram cultivados
durante 10 dias sob condições que levem ao acúmulo desses pigmentos (16 h de
fotoperíodo, 55 µmol/m
-2
s
-1
PAR). Também foram utilizados os mutantes au (deficiente
na percepção da luz) e hp1 (respostas exageradas á luz), os quais são bem conhecidos
por reduzir e aumentar o acúmulo de antocianinas, respectivamente (KOORNNEEF et
al., 1985; PETERS et al. 1989; KENDRICK et al., 1997; Capítulo 1). Entre os mutantes
hormonais testados, o pouco sensível à AUX, dgt, foi o único superior ao controle MT,
embora seu conteúdo de antocianinas tenha sido menor que aquele apresentado por
hp1 (Figura 2). O aumento dos níveis de antocianinas no hipocótilo de dgt foi descrito
inicialmente por Zobel (1972), porém, os fatores envolvidos nessa resposta ainda
permanecem pouco elucidados, bem como o papel da AUX nesse processo.
Três genótipos reduziram mais acentuadamente o conteúdo de antocianinas
quando comparado a MT: not (deficiência na biossíntese de ABA), Nr (pouco sensível
76
ao ET) e pro (muito sensível à GA), embora nenhuma dessas mutações reduziu tão
severamente quanto au (Figura 2). A redução em Nr poderia indicar um importante
papel para o ET no acúmulo, porém, o mutante que apresenta alta produção desse
hormônio, epi, praticamente não diferiu de MT (Figura 2). Esses resultados sugerem que
a atividade do ET na síntese desses pigmentos em tomateiro é pouco expressiva, e que
a diminuição da resposta em Nr pode ser um efeito desenvolvimental indireto.
Entretanto, a redução em not e pro indica a participação do ABA e GA na síntese
desses flavonóides (Figura 2). Em pro, a redução significativa nos níveis de antocianinas
já havia sido observada em folhas jovens por Van Tuinen et al., (1999). O fato da
deficiência de ABA ter o mesmo efeito do excesso de resposta a GA pode indicar que o
acúmulo de antocianinas em tomateiro está sob o controle de um balanço ABA/GA,
como sugerido para a germinação (WHITE et al., 2000).
A pouca diferença entre brt e MT poderia indicar um papel limitado da citocinina
no acúmulo de antocianinas (Figura 2). Porém, além de já ser conhecido o efeito
promotor da CK em tomateiro (MUSTILLI et al. 1999), Pino-Nunes (2005) evidenciou
que a aplicação de CKs em MT e brt provoca um acúmulo de antocianinas proporcional
à dose em MT, não sendo essa resposta observada em brt.
Figura 2 – Acúmulo de antocianinas em hipocótilos dos mutantes hormonais e
fotomorfogenéticos. As dosagens foram realizadas em 3 repetições de
5 hipocótilos retirados de plântulas crescidas durante 10 dias sob luz.
A descrição de cada mutante encontra-se na Tabela 1
77
3.2.2.3 Acúmulo de antocianinas em mutantes fotomorfogenéticos na presença de
hormônios exógenos
Baseado nas respostas observadas nos mutantes hormonais, foram quantificadas
antocianinas em hipocótilos de au e hp1 na presença de hormônios exógenos.
Procurou-se utilizar o genótipo que acumula exageradamente antocianinas na presença
de hormônios que provavelmente possuem efeito oposto. Desta forma, hp1 foi crescido
em soluções de GA, de acordo com a redução em pro (Figura 2), e em AUX, devido ao
exagerado acúmulo em dgt (Figura 2). Por outro lado, o mutante au, o qual reduz
severamente as antocianinas, permaneceu na presença de hormônios que parecem ser
promotores desse pigmento, como ABA, devido ao decréscimo em not (Figura 2), e CK,
devido a informações prévias (MUSTILLI et al. 1999; PINO-NUNES, 2005). Como os
mutantes epi e Nr apresentaram diferenças com relação ao controle (Figura 2), o etileno
exógeno também foi utilizado para hp1 e au.
Em todas as aplicações exógenas, chama a atenção o fato de nenhuma classe
hormonal, e em nenhuma concentração testada, ser capaz de recuperar o fenótipo dos
mutantes au ou hp1, sendo, portanto, todas as curvas de dose-resposta paralelas as de
MT (Figura 3 e 4A e B). Quanto aos resultados específicos, o tratamento de hp1 com
ANA não provocaram redução no acúmulo de antocianinas (Figura 3A), como esperado
pela observação de dgt (Figura 2). Essa reposta sugere que outro fator associado à
atividade da AUX possa modular a biossíntese de antocianinas, como, por exemplo, um
balanço entre esse hormônio e CK. De fato, é sabido que o balanço AUX/CK controla
uma série de respostas nas plantas (COENEN; LOMAX, 1997; ECKARDT, 2003).
Suportando essa proposta está a elevação dos níveis de antocianinas em MT
proporcional ao aumento da concentração de CK, embora o mesmo não tenha sido
observado no mutante au (Figura 3B). Coerentemente com o fato do mutante deficiente
em ABA, not, ter acumulado menos antocianinas (Figura 2), tratamentos de MT com
ABA provocaram acréscimo até 10
-6
M, e se elevou substancialmente em 10
-4
M. Em au,
a elevação nos níveis de antocianinas ocorreu até 10
-6
M, permanecendo constante até
10
-4
M (Figura 3C). A inibição do acúmulo de antocianinas por GA, sugerida pela
observação do mutante pro (Figura 2), fica evidente na curva de dose-resposta
apresentada na figura 3D tanto para MT quanto para hp1.
78
O efeito do ET parece ser inespecífico no acúmulo de antocianinas devido aos
mutantes epi e Nr não possuírem respostas opostas evidentes, quando comparadas
com MT, como seria esperado (Figura 2). É interessante notar, contudo, que em hp1
houve uma redução do acúmulo de antocianinas proporcional ao aumento da
concentração de ET (Figura 4A). Porém, as curvas sem alterações significativas
observadas em MT (Figuras 4A-C) e em au (Figura 4B) indicam que as respostas em
hp1 podem ser devido a efeitos desenvolvimentais indiretos presentes nesse mutante. O
fato do mutante Nr (pouco sensível a ET) possuir uma curva de dose-resposta
semelhante a MT reforça a hipótese de que o ET tem pouca função no acúmulo de
antocianinas (Figura 4C).
79
Figura 3
-
Acúmulo de antocianinas em hipocótilos de MT
(controle) e dos mutantes fotomorfogenéticos (au e
hp1) tratados com hormônios exógenos. A) Aplicação
de auxina, ácido naftaleno acético (ANA). B)
Aplicação de citocinina, thidiazuron (TDZ). C)
Aplicação de ácido abscísico (ABA). D) Aplicação de
giberelina, ácido giberélico (GA
3
). Condições de
medição iguais as da Figura 2
80
Figura 4 - Acúmulo de antocianinas em hipocótilos de MT e
de mutantes fotomorfogenéticos e hormonais
tratados com etileno (Ethrel) exógeno. A)
Aplicação de etileno no mutante com excesso de
resposta à luz (hp1). B) Aplicação de etileno no
mutante com deficiência de fitocromo (au). C)
Aplicação de etileno no mutante insensível a
essa classe hormonal (Nr). Condições de
medição iguais as das Figuras 2 e 3
81
3.2.2.4 Interação entre luz e hormônios no acúmulo de antocianinas
Até aqui, nossos resultados têm mostrado que pelo menos três classes
hormonais podem estar envolvidas no acúmulo de antocianinas no hipocótilo de
tomateiro, GA, ABA e CK. Entretanto, a luz é o fator mais evidente nessa resposta.
Dessa forma, para verificar se fitocromo e hormônios partilham vias comuns na indução
ou repressão da biossíntese de antocianinas, um terceiro experimento foi desenvolvido
utilizando duplos mutantes fotomorfogenéticos-hormonais. A figura 5 mostra que a
presença da mutação phy
-
(au) levou a uma diminuição do nível de antocianinas em
todas as combinações com mutações hormonais. Porém, valores menores que au foram
encontrados apenas em au pro e au brt. Os níveis extremamente reduzidos em au pro
indicam um efeito sinergístico (Figura 8), onde ambas mutações contribuem para uma
diminuição do acúmulo de antocianinas, porém em vias diferentes. Os níveis
intermediários de antocianinas apresentados pelos duplos au dgt, au sit, au Nr e au epi
indicam efeito aditivo (Figura 8), o qual também é interpretado como a somatória de vias
independentes de sinalização. No caso específico do duplo au brt, como o mutante
simples brt não levou a diminuição nos níveis dessa substância, a extrema redução
apresentada pelo duplo mutante não pode ser considerada como efeito sinergístico e
sim aditivo ou epistático (Figura). Se considerarmos que CK exógena leva ao acúmulo
de antocianinas em MT, mas praticamente não tem efeito no mutante au (Figura 3B), o
fenótipo do duplo mutante au brt pode indicar que as vias de transdução de sinal de phy
e CK são interdependentes. Nesse caso, a CK seria incapaz de estimular o acúmulo de
antocianinas se há pouca percepção da luz e a combinação de deficiência de ambos
levaria a um fenótipo sinergístico de extrema deficiência de antocianinas, ainda que a
relação provavelmente seja de epistasia.
82
Figura 5 - Acúmulo de antocianinas em hipocótilos dos duplos mutantes
fotomorfogenéticos-hormonais. Condições de medição iguais as das
Figuras 2. Notar que, embora sejam experimentos independentes, os
valores para os mutantes simples são bastante próximos ou estão na
mesma ordem de magnitude daqueles apresentados na figura 2
3.2.2.5 Alongamento do hipocótilo dos mutantes fotomorfogenéticos na presença
de hormônios exógenos
Os tratamentos utilizados para quantificar antocianinas foram os mesmos para
avaliação do alongamento do hipocótilo. Foi medido o comprimento do hipocótilo após a
permanência das plântulas em fotoperíodo de 16 horas durante 10 dias. Todos os
hormônios exógenos, com exceção de GA, levaram a uma inibição do alongamento do
hipocótilo no escuro e praticamente não afetaram o alongamento na luz (Figura 6). No
caso de GA, esse estimulou o alongamento do hipocótilo na luz, sendo esse efeito
menos pronunciado em hp1 (Figura 6C). No escuro, GA somente estimulou o
alongamento do hipocótilo em dose muito elevada (10
-4
M). Essa constatação, corrobora
sugestão prévia de que tecidos crescidos no escuro possuem alta concentração
endógena de GA, o que limita o efeito de tratamentos exógenos (COWLING;
HARBERD, 1999). Chama a atenção o fato da CK exógena ser capaz de inibir o
alongamento na luz em MT, como já reportado por Mustilli et al. (1999) para outros
cultivares, mas não efetivamente em au (Figura 6B). Esses resultados sugerem uma
interação entre CK e phy no controle do alongamento do hipocótilo de tomateiro, o que
83
pode ser melhor verificado com o uso de duplos mutantes fotomorfogenéticos-
hormonais.
84
Figura 6
–
Comprimento do hipocótilo de MT (controle) e dos mutantes fotomorfogenéticos (au e hp1)
medido em plântulas de 10 d crescidas na Luz e no escuro na presença de diferentes
classes hormonais. As condições dos tratamentos com hormônios exógenos foram iguais
aos da figura 3. Em cada tratamento, foram utilizados 20 hipocótilos (n = 20)
85
3.2.2.6 Alongamento do hipocótilo de mutantes fotomorfogenéticos, hormonais e
duplos mutantes
Conforme esperado, a deficiência do phy no mutante au promoveu um
estiolamento mesmo na luz (Figura 7A). Porém, no escuro ocorreu pouca diferença
entre esse mutante e MT (Figura 7B). Da mesma maneira, o mutante com alta
sensibilidade à GA, pro, aumentou o alongamento na luz (Figura 7A), corroborando o
efeito promotor desse hormônio exógeno observado nessa condição (Figura 6C).
Entretanto, no escuro, o alongamento do hipocótilo de pro mostrou ser até inferior a MT
(Figura 7B), o que reforça a hipótese de que no escuro GA já está em concentrações
ótimas (COWLING; HARBERD, 1999; VANDENBUSSCHE et al., 2005; Capítulo 1).
Outras mutações que também levaram a um maior alongamento dos hipocótilos na luz
foram a de deficiência de ABA (sit) e as de pouca sensibilidade a AUX (dgt) e ET (Nr).
Entretanto, no escuro nenhuma dessas mutações mostrou alongamento do hipocótilo
superior a MT, sendo dgt inclusive bem inferior a MT. As mutações epi (excesso de ET)
e brt (baixa sensibilidade à CK) mostraram hipocótilos pouco alongados tanto na luz
quanto no escuro (Fig 7A-B).
Se considerada a diferença entre o comprimento do hipocótilo no escuro e na luz
(Figura 7C), todas as mutações estudadas tiveram valores inferiores a MT. Tais valores
são explicados em alguns genótipos mais pelo fato de promoverem o alongamento na
luz (e.g. au, Nr, pro e sit) e em outros por principalmente inibirem o alongamento no
escuro (brt, epi e dgt). Essa divisão em categorias (Figura 7D) confirma sugestões
prévias para um efeito preferencial de AUX (dgt) no escuro (KRAEPIEL et al. 2001) e de
GA (pro) na luz (COWLING; HARBERD, 1999). Além disso, o mutante em ABA (sit)
parece ser similar ao mutante em GA (pro) no sentido de ser mais importante para o
alongamento na luz, o que sugere que o efeito final pode ser um balanço entre essas
duas substâncias, conforme demonstrado para germinação (WHITE et al. 2000) e aqui
sugerido também para antocianinas (Figura 2, Figuras 3C e D). No caso do etileno, sua
importância no alongamento mostrou ser tanto na luz quanto no escuro, evidenciado
aqui pela promoção na luz devido a pouca sensibilidade (Nr) e a inibição no escuro
devido ao excesso (epi).
86
Quanto aos duplos mutantes, a deficiência de phy (au), a qual promove o
alongamento na luz, mostrou ser sinergística (Figura 8) ao efeito de pro, sit, dgt e Nr na
promoção do alongamento do hipocótilo nessa mesma condição (Figura 7A). No escuro,
uma condição onde au tem uma certa promoção no alongamento, mas os mesmos
mutantes hormonais não mostraram ser superiores a MT (Figura 7B), o efeito observado
nos duplos com au foi aditivo (valores intermediários) (Figura 8). Efeitos aditivos também
foram observados na combinação da mutação de alta produção de ET (epi) com au
tanto no claro quanto no escuro. Efeitos aditivos e sinergísticos são similares no sentido
de sugerirem vias independentes de transdução de sinal entre os hormônios GA, ABA,
AUX e ET e o fitocromo no controle do alongamento do hipocótilo tanto na luz quanto no
escuro. No caso do duplo mutante au brt, chama a atenção o fato da inibição provocada
por brt ser epistática à promoção provocada por au na luz (Figura 7A). O fato de no
escuro as diferenças entre au e MT serem menores parece fazer com que o efeito
epistático de brt seja menos visível, contudo, ainda assim, no duplo mutante au brt, o
alongamento do hipocótilo é bem próximo àquele observado no mutante brt. Esses
resultados, somado ao pouco efeito da CK exógena em au na luz (Figura 6B), sugerem
que, ao contrário das demais classes hormonais testadas, a CK pode partilhar com o
phy uma mesma via de transdução de sinal para o alongamento do hipocótilo, conforme
também sugerido aqui para o acumulo de antocianinas (Figuras 3B e 5).
87
Figura 7 - Comprimento do hipocótilo em mutantes e duplos mutantes fotomorfogenéticos-hormonais
crescidos na luz (A) e no escuro (B), bem como a variação (∆) no comprimento do hipocótilo
entre as duas condições (C). Notar que todos os genótipos apresentaram ∆ menor que MT,
o que pode ser explicado pela promoção do alongamento na luz ou pela inibição desse no
escuro, dependendo de cada mutação ou combinação de mutações (D). Condições de
medição iguais as da figura 7
88
Figura 8 – Resumo das interações hormônio-fitocromo no alongamento do hipocótilo e acúmulo de
antocianinas em plântulas de tomateiro crescidas sob luz. As interações foram observadas
em duplos mutantes combinando a deficiência do cromóforo do fitocromo (au) e diferentes
mutantes hormonais (Tabela 1). Interações aditivas (A) e sinergísticas (B) indicam vias
independentes (paralelas) de transdução de sinal ou metabólicas, já que o duplo mutante
apresenta uma combinação dos efeitos (fenótipo intermediário) de cada mutante simples. Se
os dois mutantes simples utilizados possuem efeitos similares (ex.: m1 e m3 em B), o
fenótipo do duplo mutante será sinergístico, acentuando o aspecto superior (ou inferior) ao
tipo não mutado (MT). Se os mutantes simples possuem efeitos opostos (ex.: m1 e m2 em
A) ou em características não relacionadas, o fenótipo do duplo mutante será simplesmente
aditivo, levando a uma média ou observação simultânea dos dois efeitos. Interações
epistáticas (C) indicam a mesma via metabólica ou de transdução de sinal. Nesse caso, o
fenótipo do duplo mutante irá ser igual ao de um dos mutantes simples. No exemplo
proposto, o mutante m4 é epistático a m1 quanto ao seu efeito na inibição do alongamento
do hipocótilo e sofre epistasia de m1, o qual diminui o acúmulo de antocianinas no
hipocótilo. Notar que a interação entre deficiência de fitocromo (phy
-
) e pouca sensibilidade a
citocinina (CK
-
) mostrou ser interdependente (epistática) tanto para o alongamento do
hipocótilo quanto para acumulo de antocianinas. No entanto, enquanto para alongamento,
CK
-
é epistática a phy
-
, para o acumulo de antocianinas ocorre o contrario. A interação
aditiva ou sinergística nos mutantes entre as demais classes hormonais e phy
-
sugere vias
paralelas de sinalização tanto para alongamento quanto para acumulo de antocianinas no
hipocótilo. Todas as interações aqui resumidas foram deduzidas a partir dos resultados
apresentados nas figuras 5 e 7
89
3.2.3 Discussão
3.2.3.1 CK e ABA promovem e GA inibe o acúmulo de antocianinas em hipocótilos
de tomateiro
A importância das CKs para o acúmulo de antocianinas em hipocótilos de
tomateiro foi anteriormente sugerida por Coenen e Lomax (1998) e Mustilli et al. (1999).
Além disso, Pino-Nunes (2005) mostrou que o mutante pouco sensível a CK, brt, não
responde à concentrações crescentes de CK para a biossíntese de antocianinas como
ocorre no controle MT. No presente estudo, aplicação exógena de CK também levou a
um acúmulo de antocianinas em MT, e em menor extensão no mutante deficiente em
fitocromo (Figura 3B). Contudo, o nível basal de antocianinas em brt não provou ser
inferior ao controle MT (Figura 2). Esses resultados sugerem que CK é mais limitante
para um acúmulo extra de antocianinas em resposta a alta luminosidade, e talvez outros
fatores ambientais. Duplos mutantes com excesso de resposta a luz e pouca
sensibilidade a CK, hp1 brt, bem como plantas transgênicas superprodutoras de CK,
estão sendo produzidos no momento e facilitarão o teste de tal hipótese. Na ausência de
plantas com excesso de CKs, o mutante dgt, o qual apresentou um acúmulo
proeminente de antocianinas (Figura 2), pode ser o resultado de uma resposta ao
balanço AUX/CK mais voltado para CKs, conforme sugerido por Coenen et al., (2003).
Uma hipótese alternativa seria de que o excesso de antocianinas nos hipocótilos de dgt
seria uma resposta direta à baixa sensibilidade a AUX. Tal hipótese implicaria em que
AUX seria um inibidor do acúmulo de antocianinas, o que não encontra respaldo nos
resultados de aplicação exógena desse hormônio (Figura 3A).
Um outro promotor do acúmulo de antocianinas em hipocótilo de tomateiro seria o
ABA, o que é suportado tanto pelo fenótipo dos mutantes deficientes not (Figura 2) e sit
(Figura 5), quanto pela aplicação exógena (Figura 3C). A associação entre ABA e
antocianinas, bem como outros flavonóides, já havia sido reportado antes para
diferentes espécies vegetais (WALTON; SONDHEIMER, 1968; PIRIE; MULLINS, 1976;
HUIJSER et al., 2000; NAGIRA et al., 2006). Além disso, há relatos de que mutantes de
tomateiro hipersensíveis a ABA acumulem mais antocianinas nos hipocótilos (FELLNER
et al., 2001, SHEORAN et al., 2006).
90
Enquanto CKs e ABA provaram ter um papel na promoção do acúmulo de
antocianinas nos hipocótilos de tomateiro, a GA parece ser o principal inibidor. Nossos
resultados suportam essa hipótese não só devido ao grande efeito que a aplicação
exógena possui na inibição desse flavonóide (Figura 3D), mas também pelo fato do
mutante hipersensível à GA, pro, possuir níveis muito reduzidos (Figuras 2 e 5). Apesar
de ser bem conhecido o efeito de GA no alongamento do hipocótilo (COWLING;
HARBERD, 1999), poucos trabalhos têm explorado a atividade da GA na produção de
antocianinas nesse órgão. Em tomateiro, o efeito da GA na redução das antocianinas
em hipocótilos foi inicialmente proposto por Perez et al., (1974). Em outras espécies, a
aplicação de GA tem sido mostrada aumentar (WEISS; HALEVY, 1989; WEISS et al.,
1992; WEISS et al., 1995) ou reduzir (FURUYA; THIMAMM, 1964; VINCE, 1968;
GURUPRASAD; LALORAYA, 1980; OZEKI; KOMAMINE, 1986; MIZUKAMI et al., 1988)
o nível de antocianinas, indicando que as respostas à GA para a biossíntese desses
pigmentos dependem da espécie, bem como do órgão e estágio desenvolvimental. O
decréscimo dos níveis de antocianinas já havia sido reportado também para folhas
jovens do mutante pro (VAN TUINEN et al., 1999), o que indica que o efeito de GA não
se restringe ao hipocótilo de tomateiro.
Como CK, ABA e GA também afetam o alongamento do hipocótilo, seria razoável
supor que o efeito no acúmulo de antocianinas poderia ser indireto, concentrando esse
pigmento pela inibição do alongamento (efeito de CK e ABA) ou diluindo-o pelo
crescimento do hipocótilo (efeito de GA). Em nossas medições, os valores de
antocianinas estão expressos por hipocótilo inteiro e não por massa, o que minimiza um
possível efeito de diluição ou concentração por diferenças no alongamento. Além disso,
enquanto aplicação de CKs e ABA promoveram o acúmulo de antocianinas nos
hipocótilos de MT (Figuras 3B e C) cultivados na luz, essas classes hormonais não
tiveram um efeito de igual magnitude na inibição do alongamento do hipocótilo na luz
(Figuras 6B e D). Do mesmo modo, a promoção do alongamento do hipocótilo na luz
devido à aplicação de GA (Figura 6C) é bastante inferior ao proeminente efeito que essa
classe hormonal teve na inibição do acúmulo de antocianinas (Figura 3D).
91
3.2.3.2 Controle hormonal do alongamento do hipocótilo de tomateiro na luz e
escuro
A função da AUX em controlar o alongamento do hipocótilo pode variar entre as
condições de luz e escuro, bem como entre as espécies (VOLMARO et al., 1998;
JENSEN; HANGARTER; ESTELLE, 1998; PARK, 1998; COLLET; HARBERD; LEYSER,
2000; KRAEPIEL et al., 2001; GOLOVATSKAYA; KARNACHUK 2007). Sob nossas
condições, a baixa sensibilidade a AUX do mutante dgt mostrou ser bastante limitante
para o alongamento do hipocótilo no escuro, o que já havia sido demonstrado antes
(KELLY; BRADFORD 1986; KRAEPIEL et al. 2001). Sendo assim, poderia se esperar
que auxina exógena aumentaria o alongamento no escuro, o que não ocorreu (Figura
6A). Um inconveniente para a interpretação de resultados de aplicações exógenas é o
efeito que certas classes hormonais possuem sobre o nível endógeno de outras
(PERES et al., 1999). Desse modo, sugere-se que a forte inibição que a aplicação de
ANA no escuro provocou no comprimento dos hipocótilos seja o conhecido efeito de
auxina sobre o ET endógeno (YOSHII; IMASEKI, 1981; HANSEN; GROSSMANN, 2000;
OHMIYA; HAJI, 2002). De fato, além do ET exógeno ser bastante inibitório para o
alongamento do hipocótilo de tomateiro no escuro (Figura 6E), o mutante superprodutor
desse hormônio foi o que mais inibiu nessa condição (Figura 7B).
Um papel para o ET na inibição dos hipocótilos no escuro já havia sido reportado
para Arabidopsis (CARY; LIU; HOWELL, 1995; COLLET; HARBERD; LEYSER, 2000).
Porém, nessa espécie vegetal foi mostrado que, na luz, o ET pode também agir como
promotor do alongamento, já que o mutante com respostas constitutivas ao ET, ctr1,
apresentou um acréscimo no alongamento na luz comparado ao controle (SMALLE et al.
1997). Um efeito promotor do ET no alongamento do hipocótilo de tomateiro na luz é
pouco provável, considerando se que o mutante epi mostrou ter hipocótilos inibidos na
luz (Figura 7A). Além disso, enquanto o mutante de tomateiro pouco sensível a ET, Nr,
apresentou hipocótilos maiores que MT (Figura 7A), a mutação ein2-1, a qual resulta em
baixa sensibilidade a ET em Arabidopsis, possui efeito oposto (SMETS et al. 2005).
Esses resultados sugerem que, assim como outras respostas desenvolvimentais
controladas por ET, tais como o amadurecimento de frutos (GIOVANNONI, 2001), o
92
papel desse hormônio no alongamento do hipocótilo na luz é bastante diferente entre
Arabidopsis e tomateiro.
A resposta mais óbvia da atividade exógena da CK em plântulas de tomateiro é a
inibição do alongamento do hipocótilo (MUSTILLI, et al. 1999; COENEN et al. 2003).
Esse evento pôde ser bem observado em plântulas de au e MT cultivados em
concentrações crescentes de CK no escuro (Figura 6B). Resultados semelhantes foram
encontrados em plântulas de Arabidopsis, as quais mostram uma inibição proporcional
ao aumento da concentração de CK no escuro (SU; HOWELL, 1995). Considerando a
CK como um inibidor, poderia ser esperado que o mutante de tomateiro pouco sensível
a CK, brt, não apresentasse hipocótilos tão inibidos no escuro (Figura 7B). De igual
modo, embora na luz as CKs tenham mostrado um efeito inibitório em MT (Figura 6B) e
em Arabidopsis (SU; HOWELL, 1995), o mutante brt também apresentou-se inibido
nessa condição (Figura 7A), quando seria esperado o contrário. Além disso, o mutante
amp1 de Arabidopsis (CHAUDHURY, et al., 1993), o qual apresenta níveis elevados de
CK, possui hipocótilos também inibidos (CARY; LIU; HOWELL, 1995). Em conjunto,
esses resultados sugerem que as CKs per se devem ter um papel estimulatório no
alongamento do hipocótilo de tomateiro e Arabidopsis, sendo inibitório seu efeito
exógeno (Figura 6B, SU; HOWELL, 1995) ou endógeno (CARY; LIU; HOWELL, 1995)
mediado pelo ET, como já demonstrado para Arabidopsis (CARY; LIU; HOWELL, 1995).
Como exemplo disso, Smets et al. (2005) demonstraram que CKs podem promover o
alongamento em plântulas de Arabidopsis presentes na luz utilizando um inibidor da
ação do ET.
O maior alongamento na luz do mutante deficiente na biossíntese de ABA, sit
(Figura 7A), corrobora o efeito exógeno desse hormônio (Figura 6D), sugerindo ABA
como inibidor do alongamento nessa condição. Por outro lado, no escuro, a forte
inibição do ABA exógeno em au e MT (Figura 6D) não é respaldado para um maior
crescimento do mutante sit nessa condição (Figura 7B). Esses resultados sugerem que,
embora hipocótilos de tomateiro crescidos no escuro possam ser inibidos por ABA
exógeno, ou por outras classes hormonais induzidas por ele (GHASSEMIAN et al.,
2000; HANSEN; GROSSMANN, 2000), o ABA endógeno provavelmente não se
93
acumula nessa condição, como sugere o padrão de expressão de genes envolvidos com
a biossíntese de ABA em tomateiro (THOMPSON et al., 2000).
O controle do alongamento do hipocótilo por GA é o evento mais bem
caracterizado envolvendo um fator endógeno e o desenvolvimento da plântula
(KRAEPIEL; MIGINIAC, 1997; COWLING; HARBERD 1999). Atualmente sabe-se que o
efeito de GA na promoção do crescimento é na verdade através da repressão de
proteínas inibidoras com domínio DELLA (PENG et al., 1997; Dill; Sun, 2001; KING;
MORITZ; HARBERD, 2001). Entre os vários efeitos de proteínas DELLA, recentemente
se constatou que são reguladoras de fatores de transcrição para fotomorfogênese
(ACHARD et al., 2007). A promoção do alongamento do hipocótilo de tomateiro na luz,
devido a GA exógena (Figura 6C) já foi relatada para tomateiro (PEREZ et al. 1974) e
outras espécies (SRIVASTAVA; SAWHNEY; TAYLOR, 1975; TAYLOR; COSGROVE;
1989; COWLING; HARBERD, 1999). Porém, o efeito da GA no escuro parecer ser
menos evidente, somente havendo promoção em concentrações muito elevadas (10
-4
M) (Figura 6C). Esse resultado parece estar de acordo com a proposta de que no escuro
GA já esteja em níveis ótimos (COWLING; HARBERD, 1999). Uma evidência adicional
de que o GA seja mais importante para o alongamento do hipocótilo na luz que no
escuro é o fato do mutante supersensível à GA, pro, possuir na luz um comprimento do
hipocótilo 43% maior que MT, enquanto no escuro ele apresenta-se menor (Figura 7B).
3.2.3.3 AUX, ET, GA e ABA possuem vias distintas de phy no controle do acúmulo
de antocianinas e alongamento do hipocótilo de tomateiro enquanto phy e CK
podem partilhar uma mesma via nessas respostas
Levando-se em conta a necessidade de fotoproteção e ao mesmo tempo de
evitação à sombra, a luz é o fator mais evidente no estímulo da produção de
antocianinas (FRANCESCHI; GRIMES, 1991; KROL et al., 1995; ATANASSOVA et al.,
2001; STEYN et al., 2002) e na inibição do alongamento do hipocótilo (SYMONS; REID,
2003; VANDENBUSSCHE et al. 2005). Entretanto, a luz e sua percepção por
fotorreceptores é apenas um sinal, o qual precisa ser transduzido por outros
mensageiros químicos (NEFF et al. 2006). Tais mensageiros têm como fortes
candidatos os hormônios, pois esses fatores endógenos claramente podem controlar a
94
biossíntese de antocianinas e o alongamento do hipocótilo. No presente trabalho, a
produção de antocianinas foi promovida por CK e ABA e inibida por GA (Figuras 2, 3, 4
e 5), enquanto o alongamento do hipocótilo foi inibido na luz por ET, AUX, ABA e
promovido por CK e GA (Figuras 6 e 7). A análise de duplos mutantes entre mutantes
em AUX, GA, ET e ABA e a mutação que provoca deficiência de fitocromo mostrou
fenótipos aditivos ou sinergísticos quanto ao alongamento do hipocótilo e acúmulo de
antocianinas (Figura 8). Interações aditivas e sinergísticas (Figura 8) significam rotas
metabólicas distintas ou vias independentes de transdução, descartando a hipótese de
que o fitocromo afeta o alongamento e o acúmulo de antocianinas no hipocótilo de
tomateiro modulando essas classes hormonais. Tomando como exemplo da interação
entre fitocromo e GA, já foi sugerido que o aspecto estiolado de mutantes deficientes em
fitocromo pode refletir um excesso de GA ou de resposta a esse hormônio (PEREZ et al.
1974). Considerando a importância de GA e phy na germinação de sementes
(TOYOMASU et al., 1998; YAMAGUCHI et al., 1998; YAMAGUCHI; KAMIYA, 2002;
SEO et al., 2006), a baixa taxa de germinação do mutante au e o aumento no mutante
pro (KOORNNEEF et al., 1985; Capítulo 1) reforçam nossa hipótese de que, pelo menos
em tomateiro, GA e fitocromo agem em vias independentes.
Apesar de ter sido sugerida a modulação negativa de ABA pelo fitocromo
(KRAEPIEL et al., 1994; WEATHERWAX et al., 1996; SYMONS; REID, 2003, SEO et
al., 2006), nossos resultados mostram interação sinergística no alongamento do
hipocótilo e aditiva no acúmulo de antocianinas para o duplo au sit (Figura 8), o que
sugere que, pelo menos para essas duas respostas, fitocromo e ABA agem em vias
paralelas em tomateiro.
Os trabalhos que tratam da interação entre luz e ET no controle do
desenvolvimento em grande parte abordam o phy como inibidor desse hormônio
(GOESCHL; PRATT; BONNER, 1967; FINLAYSON; LEE; MORGAN, 1998, FINLAYSON
et al., 1999; PIERIK et al., 2003; KUREPIN; WALTON; REID, 2007). Entretanto, em
tomateiro, a interação entre luz e ET mostrou ser sempre aditiva, independente do tipo
de mutação em ET (epi ou Nr), tanto para alongamento do hipocótilo quanto para
acúmulo de antocianinas (Figura 8). Se a falha na capacidade de reduzir o nível
endógeno ET fosse a causa do fenótipo do mutante deficiente em phy, seria de se
95
esperar um efeito epistático da pouca sensibilidade a ET (Nr) sobre a deficiência de phy
(au) no duplo mutante.
De modo diferente do que ocorreu com outras classes hormonais, o duplo
mutante entre CK e phy, au brt, apresentou uma interação epistática tanto no acúmulo
de antocianinas quanto no alongamento do hipocótilo (Figura 8). No acúmulo dos
pigmentos, a redução em au brt a um nível próximo a au mostra uma epistasia de au
sobre brt (Figura 5), e de modo contrário, no alongamento do hipocótilo a redução de au
brt a um nível próximo de brt mostra uma epistasia de brt sobre au (Figura 7). Essas
relações sugerem fortemente que phy e CK podem partilhar uma via comum no controle
da biossíntese de antocianinas e alongamento do hipocótilo, bem como em outras
respostas, pois plantas adultas de au brt são bastante debilitadas (Figura 1F). Su e
Howell (1995) consideraram que CK e phy possuem um efeito independente no controle
do alongamento do hipocótilo de Arabidopsis. Contudo, esses autores se basearam no
efeito exógeno de CKs em hipocótilos mantidos no escuro, o qual somente mostrou o
efeito inibitório dessa classe hormonal, sendo o mesmo mediado por ET (CARY; LIU;
HOWELL,1995). Embora CK exógena também tenha um efeito inibitório em hipocótilos
de tomateiro cultivados no escuro (Figura 6B), o baixo alongamento do hipocótilo do
mutante pouco sensível a CK, brt, tanto no escuro quanto na luz (Figuras 7A e B),
sugere que o efeito endógeno e direto desse hormônio seja na verdade estimulatório.
De fato, Smets et al. (2005) demonstraram que mesmo a CK exógena pode estimular o
alongamento do hipocótilo de Arabidopsis no escuro se a ação do ET é bloqueada.
Desse modo, a epistasia de brt sobre au no alongamento do hipocótilo do duplo au brt
na luz (Figura 7A) sugere que a promoção do alongamento do hipocótilo pela deficiência
de phy é uma resposta dependente da sensibilidade a CKs ou de componentes comuns
às duas vias de sinalização. Suportando tal hipótese está o fato de se saber que o
receptor de CK pode ser uma histidina quinase (YEH; LAGARIAS, 1998), sendo essa
classe de proteínas relacionadas um dos domínios presentes na apoproteína do
fitocromo (KIM et al., 2005). Além disso, pelo menos um dos reguladores de resposta
(ARR4) que fazem parte da via de dois componentes da sinalização das CKs também
fazem parte da transdução de sinal de phy do tipo B (SWEERE et al. 2001).
96
No presente estudo, ficou claro que entre as cinco principais classes hormonais, a
que possui maior probabilidade de interagir diretamente com a fotomorfogênese é a CK,
o que resgata a proposta original de Chory et al. (1991) e que havia sido posteriormente
refutada (SU; HOWELL, 1995). Duplos mutantes combinando resposta exageradas à luz
e baixa sensibilidade à CK, hp1 brt, bem como outras combinações com plantas
transgênicas superprodutoras ou deficientes nesse hormônio (EKLÖF et al., 2000;
WERNER et al., 2001; WERNER et al., 2003) estão sendo construído para um
aprofundamento do estudo dessa possível interação entre phy e CKs no controle do
alongamento do hipocótilo e acúmulo de antocianinas.
3.3 Conclusão
Conclui-se com os resultados obtidos nesse trabalho que os hormônios AUX, ET,
GA e ABA possuem vias distintas do phy no controle do acúmulo de antocianinas e
alongamento do hipocótilo, e com a Ck esse fotorreceptor pode partilhar uma mesma
via.
Referências
ACHARD, P.; LIAO, L.; JIANG, C.; DESNOS, T.; BARTLETT, J.; FU, X.; HARBERD, N.
P. DELLAs Contribute to Plant Photomorphogenesis. Plant Physiology, Rockville, v.
143, n. 3, p. 1163 – 1172, 2007.
ALOKAM, S.; CHINNAPPA, C.C.; REID, D.M. Red/far-red mediated stem elongation
response and anthocyanin accumulation in alpine and prairie ecotypes of Stellaria
longipes. Canadian Journal of Botany, Ottawa, v. 80, p. 72-81, 2002.
ATANASSOVA, B.; DASKALOV, S.; SHTEREVA, L.; BALATCHEVA, E. Anthocyanin
mutations improving tomato and pepper tolerance to adverse climatic conditions.
Euphytica, Wageningen, v. 120, p. 357-365, 2001.
BENSEN, R.J.; ZEEVAART, J.A.D. Comparison of ent-kaurene synthetase A and B
activities in cell-free extracts from young tomato fruits of wild-type and gib1, gib2 and
gib3 tomato plants. Journal of Plant Growth Regulation, New York, v. 9, p. 237-242,
1990.
BISHOP, G.J.; NOMURA, T.; YOKOTA, T.; HARRISON, K.; NOGUCHI, T.; FUJIOKA, S.;
TAKATSUTO, S.; JONES, J.D.G.; KAMIYA, Y. The tomato DWARF enzyme catalyses C-
6 oxidation in brassinosteroid biosynthesis. Proceedings of the National Academy of
Sciences, Washington, v. 96, p. 1761–1766, 1999.
97
BURBIDGE, A.; GRIEVE, T.M.; JACKSON, A.; THOMPSON, A.; MCCARTY, DR.;
TAYLOR, I.B. Characterization of the ABA-deficient tomato mutant notabilis and its
relationship with maize Vp14. The Plant Journal, Oxford, v. 17, p. 427-431, 1999.
CARY, A.J.; LIU, W.; HOWELL, S.S. Cytokinin action is coupled to ethylene in its effects
on the inhibition of root and hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana seedlings. Plant
Physiology, Rockville, v. 107, p. 1075–1082, 1995.
CHALKER-SCOTT, L. Environmental significance of anthocyanins in plant stress
responses. Photochemistry and Photobiology, Oxford, v. 70, p. 1–9, 1999.
CHAUDHURY, A.M.; LETHAM, S.; CRAIG, S.; DENNIS, E.S. amp 1 - A mutant with high
cytokinin levels and altered embryonic pattern, faster vegetative growth, constitutive
photomorphogenesis and precocious flowering. Plant Journal, Oxford, v. 4, n. 6, p. 907-
916, 1993.
CHORY, J.; AGUILAR, N.; PETO, C.A. The phenotype of Arabidopsis thaliana det1
mutants suggests a role for cytokinins in greening. Symposia of the Society for
Experimental Biology, Cambridge, v. 45, p. 21–29, 1991.
CHORY, J, REINECKE, D.; SIM, S.; WASHBURN, T.; BRENNER, M. A role for
cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis det mutants have an altered response to
cytokinins. Plant Physiology, Rockville, v. 104, p. 339–347, 1994.
COENEN, C.; CHRISTIAN, M.; LÜTHEN, H.; LOMAX, T.L. Cytokinin antagonizes auxin
action through inhibiting a subset of DGT-dependent, primary auxin responses in tomato
(Lycopersicon esculentum). Plant Physiology, Rockville, v. 131, p. 1692-1704, 2003.
COENEN, C.; LOMAX, T.L. Auxin-cytokinin
interactions in higher plants: old problems
and new tools Trends in Plant Science, Kidlington, v. 2, p. 351-356, 1997.
COENEN, C.; LOMAX, T.L. The diageotropica gene differentially affects auxin and
cytokinin responses throughout development in tomato. Plant Physiology, Rockville, v.
117, p. 63-72, 1998.
COLLET, C.E.; HARBERD, N.P.; LEYSER, O. Hormonal interactions in the control of
Arabidopsis hypocotyl elongation. Plant Physiology, Rockville, v. 124, p. 553-562,
2000.
COWLING, R.J.; HARBERD, N.P. Gibberellins control Arabidopsis hypocotyl growth via
regulation of cellular elongation. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 50, p.
1351-1357, 1999.
DEIKMAN, J.; HAMMER P. E. Induction of anthocyanin accumulation by cytokinins in
Arabidopsis thaliana. Plant Physiology, Rockville, v. 108, p. 47-57, 1995.
98
DILL, A.; SUN, T-P. Synergistic derepression of gibberellin signaling by removing RGA
and GAI function in Arabidopsis thaliana. Genetics, Bethesda, v. 159, p. 777–785, 2001.
DORTAY, H.; MEHNERT, N.; BURKLE, L.; SCHMULLING, T.; HEYL, A. Analysis of
protein interactions within the cytokinin-signaling pathway of Arabidopsis thaliana.
Federation of European Biochemical Societies journal, Oxford, v. 273, p. 4631-4644,
2006.
ECKARDT, N.A. A new classic of cytokinin Research: Cytokinin-deficient Arabidopsis
plants provide new insights into cytokinin biology. The Plant Cell, Baltimore, v. 15, p.
2489-2492, 2003.
EKLÖF, S.; ÅSTOT, C.; SITBON, F.; MORITZ, T.; OLSSON, O.; SANDBERG, G.
Transgenic tobacco plants co-expressing Agrobacterium iaa and ipt genes have wild-
type hormone levels but display both auxin- and cytokinin-overexpressing phenotypes.
The Plant Journal, Oxford, v. 23, p. 279–284, 2000.
FELLNER, M.; ZHANG, R.; PHARIS, R. P.; SAWHNEY, V. K. Reduced de-etiolation of
hypocotyl growth in a tomato mutant is associated with hypersensitivity to, and high
endogenous levels of, abscisic acid. Journal Experimental Botany, Oxford, v. 52, p.
725-738, 2001.
FINLAYSON ,S.A.; JUNG, I.J.; MULLET, J.E.; MORGAN, P.W. The mechanism of
rhythmic ethylene production in sorghum: the role of phytochrome B and simulated
shading. Plant Physiology, Rockville, v. 119, p. 1083–1089, 1999.
FINLAYSON S.A.; LEE, I.J.; MORGAN, P.W. Phytochrome B and the regulation of
circadian ethylene production in sorghum. Plant Physiology, Rockville, v. 116, p. 17–25,
1998.
FRANCESCHI, V.R.; GRIMES, H.D. Induction of soybean vegetative storage proteins
and anthocyanins by low-level atmospheric methyl jasmonate. Proceedings of the
National Academy of Science of USA, Washington, v. 88, p. 6745−6749, 1991.
FUJINO, D.W.; BURGER, D.W.; YANG, S.F.; BRADFORD, K.J. Characterization of an
ethylene overproducing mutant of tomato (Lycopersicon esculentum Mill. cultivar VFN8).
Plant Physiology, Rockville, v. 88, p. 774-779, 1988.
FURUYA, M.; THIMANN, K.V. The biogenesis of anthocyanins. XI. Effects of gibberellic
acid in two species of Spirodela. Archives of biochemistry and biophysics, New York,
v. 108, p. 109–1016, 1964.
GHASSEMIAN, M.; NAMBARA, E.; CUTLER, S.; KAWAIDE, H.; KAMIYA, Y.;
MCCOURT, P. Regulation of abscisic acid signaling by the ethylene response pathway
in Arabidopsis. The Plant Cell, Baltimore, v. 12, p. 1117–1126, 2000.
99
GIOVANNONI, J. Molecular biology of fruit maturation and ripening. Annual Review of
Plant Physiology and Plant Molecular Biology, Palo Alto, v. 52, p. 725–749, 2001.
GOESCHL, J.D.; PRATT, H.K.; BONNER, B.A. An effect of light on the production of
ethylene and the growth of the plumular portion of etiolated pea seedlings. Plant
Physiology, Rockville, v. 42, n. 8, p.1077–1080, 1967.
GOLOVATSKAYA, I.; KARNACHUK, R. Dynamics of growth and the content of
endogenous phytohormones during kidney bean scoto-and photomorphogenesis.
Russian Journal of Plant Physiology, New York , v. 54, n. 3, p. 407-413, 2007.
GURUPRASAD, K.N. ; LALORAYA, M.M. Dissimilarity in the inhibition of betacyanin
synthesis caused by gibberellic-acid and abscisic-acid. Biochemie Und Physiologie
Der Pflanzen, Berlim, v. 175, p. 582-586, 1980.
HANSEN, H.; GROSSMANN, K. Auxin-induced ethylene triggers abscisic acid
biosynthesis and growth inhibition. Plant Physiology, Rockville, v. 124, p. 1437–1448,
2000.
HICKS, G.R.; RAYLE, D.L.; LOMAX, T.L. The diageotropica mutant of tomato lacks high
specific activity auxin binding sites. Science, Washington, v. 254, p. 52–54, 1989.
HOWE, G.A.; RYAN, C.A. Suppressors of systemin signaling identify genes in the
tomato wound response pathway. Genetics, Bethesda, v. 153, p. 1411-1421, 1999.
HOWE, G.A.; LIGHTNER, J.; BROWSE, J.; RYAN, C.A.; An octadecanoid pathway
mutant (JL5) of tomato is compromised in signaling for defense against insect attack.
The Plant Cell, Baltimore, v. 8, p. 2067-2077, 1996.
HUIJSER, C.; KORTSTEE A.; PEGO, J.; WEISBEEK, P.; WISMAN, E.; SMEEKENS, S.
The Arabidopsis SUCROSE UNCOUPLED-6 gene is identical to ABSCISIC ACID
INSENSITIVE-4: involvement of abscisic acid in sugar responses. The Plant Journal,
Oxford, v. 23, p. 577-585, 2000.
HUSAINEID, S.S.H.; KOK, R.A.; SCHREUDER, M.E.L.; HANUMAPPA, M.;
CORDONNIER-PRATT, M.; PRATT, LH.; VAN DER PLAS, LHW.; VAN DER KROL, AR.
Overexpression of homologous phytochrome genes in tomato: exploring the limits in
photoperception. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 58, n. 3, p. 615-626,
2007.
JENSEN, P.J.; HANGARTER, R.P.; ESTELLE, M. Auxin transport is required for
hypocotyl elongation in light-grown but not dark-grown Arabidopsis. Plant Physiology,
Rockville, v. 116, p. 455–462, 1998.
JONES, M.G. Gibberellins and the procera mutant of tomato. Planta, Berlin, v. 172, p.
280–284, 1987.
100
KELLY, M.O.; BRADFORD, K.J. Insensitivity
of the diageotropica tomato mutant to auxin.
Plant Physiology, Rockville, p. 82, p. 713-717, 1986.
KENDRICK, R.E; KRONENBERG, G.H.M. (Ed). Photomorphogenesis in Plants.
Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, p 828, 1994.
KENDRICK, R.E.; KERCKHOFFS, L.H.; VAN TUINEN, A.; KOORNEEF, M.
Photomorphogenic mutants of tomato. Plant, Cell Environment, Oxford, v. 20, p. 746-
751, 1997.
KERCKHOFFS, L.H.J.; SCHREUDER, M.E.L.; VAN TUINEN, A.; KOORNNEEF, M.;
KENDRICK, R.E. Phytochrome control of anthocyanin biosynthesis in tomato seedlings:
analysis using photomorphogenic mutants. Photochemistry and Photobiology, Oxford,
v. 65, p. 374–381, 1997.
KIM, J-I.; PARK, J-E.; ZARATE, X.; SONG, P-S. Phytochrome phosphorylation in plant
light signaling. Photochemical & Photobiological Sciences, New York, v. 4. p. 681-
687, 2005.
KING, K.; MORITZ, T.; HARBERD, N.P. Gibberellins are not required for normal stem
growth in Arabidopsis thaliana in the absence of GAI and RGA. Genetics, Bethesda, v.
159, p. 767–776, 2001.
KOKA, C.B.; CERNY. R.E.; GARDNER, R.G.; NOGUCHI, T.; FUJIOKA, S.;
TAKATSUTO, S.; YOSHIDA, S.; CLOUSE, S.D. A putative role for the tomato genes
Dumpy and Curl-3 in brassinosteroid biosynthesis and response. Plant Physiology,
Rockville, v. 122, p. 85-98, 2000.
KOORNNEEF, M.; CONE, J.W.; DEKENS, R.G.; O’HERNE-ROBERS, E.G.; SPRUIT,
C.J.P.; KENDRICK, R.E. Photomorphogenenic response of long-hypocotyl mutants of
tomato. Journal of Plant Physiology, Stuttgart, v. 120, p. 153-165. 1985.
KOORNNEEF, M.; BOSMA, T.D.G.; HANHART, C.J.; VAN DER VEEN, J.H.; ZEEVART.
J.A.D. The isolation and characterization of gibberellin-deficient mutants in tomato.
Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 80, p. 852–857, 1990.
KOORNNEEF, M. Mutations affecting the testa colour in Arabidopsis. Arabidopsis
Information Service, New York, v. 27, p. 1-4, 1990.
KRAEPIEL, Y.; AGNES, C.; THIERY, L.; MALDINEY, R.; MIGINIAC, E.; DELARUE, M.
The growth of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) hypocotyls in the light and in
darkness differentially involves auxin. Plant Science, Amsterdam, v. 161, p. 1067-1074,
2001.
101
KRAEPIEL, Y.; ROUSSELIN, P.; SOTTA, B.; KERHOAS, L.; EINHORN, J.; CABOCHE,
M.; MIGINIAC, E. Analysis of phytochrome- and ABA-deficient mutants suggests that
ABA degradation is controlled by light in Nicotiana plumbaginifolia. The Plant Journal,
Oxford, v. 6, p. 665–672, 1994.
KROL, M.; GRAY, G.R.; HURRY, V.M.; ÖQUIST, L.; MALEK, L.; HUNER, N.P.A. Low
temperature stress and photoperiod effect. Canadian Journal of Botany, Ottawa, v. 73,
p. 1119–1127, 1995.
KRAEPIEL, Y.; MIGINIAC, E. Photomorphogenesis and phytohormones. Plant, Cell and
Environment, Oxford, v. 20, p. 807–812, 1997.
KUREPIN, L.V.; WALTON, L.J.; REID, D.M. Interaction of red to far red light ratio and
ethylene in regulating stem elongation of Helianthus annuus. Journal of Plant Growth
Regulation, New York, v. 51, p. 53–61, 2007.
LI, L.; LI, C.; HOWE, G.A. Genetic analysis of wound signaling in tomato. Evidence for a
dual role of jasmonic acid in defense and female fertility. Plant Physiology, Rockville, v,
127, p. 1414–1417, 2001.
MEISSNER, R.; JACOBSON, Y.; MELAMED, S.; LEVYATUV, S.; SHALEV, G.; ASHRI,
A.; ELKIND, Y.; LEVY, A. A new model system for tomato genetics. The Plant Journal,
Oxford, v. 12, p. 1465-1472, 1997.
MIZUKAMI, H.; TOMITA, K.; OHASHI, H.; HIRAOKA, N. Anthocyanin production in
callus cultures of roselle (Hibiscus sabdariffa L.). Plant Cell Reports, New York, v. 7, p.
553-556, 1988.
MONTOYA, T.; NOMURA, T.; FARRAR, K.; KANETA, T.; YOKOTA, T.; BISHOP, G.J.
Cloning the tomato Curl3 gene highlights the putative dual role of the leucine-rich repeat
receptor kinase tBRI1/SR160 in plant steroid hormone and peptide hormone signaling.
The Plant Cell, Boltimore, v. 14, p. 3163–3176, 2002.
MUSTILLI, A.C.; FENZI, F.; CILIENTO, R.; ALFANO, F.; AND BOWLER, C. Phenotype
of the tomato high pigment-2 mutant is caused by a mutation in the tomato homolog of
DEETIOLATED1. The Plant Cell, Baltimore, v. 11, p. 145–157, 1999.
NAGIRA, Y.; IKEGAMI, K.; KOSHIBA, T.; OZEKI, Y. Effect of ABA upon anthocyanin
synthesis in regenerated torenia shoots. Journal of Plant Research, Sendai, v. 119, n.
2, p. 137-144, 2006.
NEFF, M.M.; CHORY, J. Genetic interactions between phytochrome A, phytochrome B,
and cryptochrome 1 during Arabidopsis development. Plant Physiology, Rockville, v.
118, p. 27–36, 1998.
NEFF, M.M.; STREET, I,H.; TURK, E,M.; WARD, J.M. Interaction of light and hormone
signalling to mediate Photomorphogenesis. In: SCHAFER, E.; NAGY, F. (Ed),
102
Photomorphogenesis in Plants and Bacteria. Netherlands: Springer, 2006. chap. 21,
p. 439-473.
OH, K.; IVANCHENKO, M.G.; WHITE, T.J.; LOMAX, T.L. The diageotropica gene of
tomato encodes a cyclophilin: a novel player in auxin signaling. Planta, Berlin, v. 224, n.
1, p. 133-144, 2006.
OHMIYA, A.; HAJI, T. Promotion of ethylene biosynthesis in peach mesocarp discs by
auxin. Plant Growth Regulation, Dordrecht, v, 36, p. 209–214, 2002.
OZEKI,
Y.; KOMAMINE, A. Effects of growth regulators on the induction of anthocyanin
synthesis in carrot suspension cultures. Plant and Cell Physiology, Tokyo, v. 27, n. 7,
p. 1361-1368; 1986.
PARK, W.J. Effect of epibrassinolide on hypocotyl growth of the tomato mutant
diageotropica. Planta, Berlin, v. 207, p. 120–124, 1998.
PENG, J.; CAROL, P.; RICHARDS, D.E.; KING, K.E.; COWLING, R.J.; MURPHY, G.P.;
HARBERD, N.P. The Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively
regulates gibberellin responses. Genes and Development, New York, v. 11, p. 3194–
3205, 1997.
PERES, L. E. P.; AMAR, S.; KERBAUY, G. B; SALATINO, A.; ZAFFARI, G. R. &
MERCIER,H. Effects of auxin, cytokinin and ethylene treatments on the endogenous
ethylene and auxin-to-cytokinin ratio related to direct root tip conversion of Catasetum
fimbriatum Lindl. (Orchidaceae) into buds. Journal of Plant Physiology, Stuttgart, v.
155, p. 551-555, 1999.
PEREZ, ANTONIO T.; MARSH, HERBERT V., JR.; LACHMAN, WILLIAM H. Physiology
of the Yellow-green 6 gene in tomato: A possible interrelationship between the
phenotypic expressions of the yellow-green 6 gene mutation and the gibberellins 12.
Plant Physiology, Rockville, v. 53, n. 2, p. 192–197, 1974.
PETERS, J.L.; VAN TUINEN, A.; ADAMSE, P.; KENDRICK, R.E.; KOORNNEEF, M.
High pigment mutants of tomato exhibit high sensitivity for phytochrome action. Journal
of Plant Physiology, Stuttgart, v. 134, p. 661-666, 1989.
PIERIK, R.; VISSER, E.J.W.; DE KROON, H.; VOESENEK, L.A.C.J. Ethylene is required
in tobacco to successfully compete with proximate neighbours Plant, Cell and
Environment, Oxford, v. 26, p. 1229–1234, 2003.
PINO-NUNES, L.E. Obtenção e uso de mutantes com alterações no balanço
auxina/citocinina no estudo da competência organogênica em micro-tomateiro
(Lycopersicon esculentum cv Micro-Tom). 2005. 73p. Dissertação (Mestrado em
Fisiologia e Bioquímica de Plantas) Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo, 2005.
103
PIRIE, A.; MULLINS, M. Changes in anthocyanin and phenolics content of grapevine leaf
and fruit tissues treated with sucrose, nitrate, and abscisic acid. Plant Physiology,
Rockville, v. 58, p. 468–472, 1976.
SCOTT, J.W.; HARBAUGH, B.K. Micro-Tom. A miniature dwarf tomato. Florida
Agricultural Experiment Station Circular , Gainesville, v. 370, p. 1-6, 1989.
SEO, M.; HANADA, A.; KUWAHARA, A.; ENDO, A.; OKAMOTO, M.; YAMAUCHI, Y.;
NORTH, H.; MARION-POLL, A.; SUN, T.P.; KOSHIBA, T.; KAMIYA, Y.; YAMAGUCHI,
S.; NAMBARA, E. Regulation of hormone metabolism in Arabidopsis seeds:
Phytochrome-regulation of abscisic acid metabolism and abscisic acid-regulation of
gibberellin metabolism. The Plant Journal, Oxford, v. 48, p. 354-366, 2006.
SHEORAN, I,S.; DUMONCEAUX, T.; DATLA, R.; SAWHNEY, VK. Anthocyanin
accumulation in the hypocotyl of an ABA-over producing male-sterile tomato
(Lycopersicon esculentum) mutant. Physiologia Plantarum, Kobenhavn, v. 127, n. 4,
p. 681-689, 2006.
SMALLE, J.; HAEGMAN, M.; KUREPA, J.; VANMONTAGU, M.; VANDERSTRAETEN,
D. Ethylene can stimulate Arabidopsis hypocotyl elongation in the light. Proceedings of
the National Academy of Sciences, Washington, v. 94, p. 2756–2761, 1997.
SMETS, R.; LE, J.; PRINSEN, E.; VERBELEN, J.; VAN ONCKELEN, H. Cytokinin-
induced hypocotyl elongation in light-grown Arabidopsis plants with inhibited ethylene
action or indole-3-acetic acid transport. Planta, Berlin, v. 221, p. 39–47, 2005.
SRIVASTAVA, L.M.; SAWHNEY, V.K.; TAYLOR, I.E.P. Gibberellic-acid-induced cell
elongation in lettuce hypocotyls. Proceedings of the National Academy of Sciences,
Washington, v. 72, n. 3, p. 1107-1111, 1975.
STEYN, W.J.; WAND, S.J.E.; HOLCROFT, D.M.; JACOBS, G. Anthocyanins in
vegetative tissues: a proposed unified function in photoprotection. New Phytologist,
London, v. 155, v. 349–361, 2002.
SU, W.; HOWELL, S.H. The
effects of cytokinin and light on hypocotyl elongation in
Arabidopsis
seedlings are independent and additive. Plant Physiology, Rockville, v.
108, 1423-1430, 1995.
SYMONS, G.M.; REID, J.B. Interactions between light and plant hormones during de-
etiolation. Journal of Plant Growth Regulation, New York, v. 22, p. 3–14, 2003.
SWEERE, U.; EICHENBERG, K.; LOHRMANN, J.; MIRA-RODADO, V.; BAURLE, I.;
KUDLA, J.; NAGY, F.; SCHAFER, E.; HARTER, K. Interaction of the response regulator
ARR4 with phytochrome B in modulating red light signaling. Science, Washington, v.
294, p. 1108-11, 2001.
104
TAYLOR, A.; COSGROVE, D.J. Gibberellic acid stimulation of cucumber hypocotyl
elongation: effects on growth, turgor, osmotic pressure, and cell wall properties. Plant
Physiology, Rockville, v. 90, p. 1335–1340, 1989.
TAYLOR, I.B.; BURBIDGE, A.; THOMPSON, A.J. Control of abscisic acid synthesis.
Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 51, p. 1563-1574, 2000.
THOMPSON, A.J.; JACKSON, A.C.; SYMONDS, R.C.; MULHOLLAND, B.J.;
DADSWELL, A.R.; BLAKE, P.S.; BURBIDGE, A.; TAYLOR, I.B. Ectopic expression of a
tomato 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene causes over-production of abscisic
acid. The Plant Journal, Oxford, v. 23, p. 363–374, 2000.
TOYOMASU, T.; KAWAIDE, H.; MITSUHASHI, W.; INOUE, Y.; KAMIYA, Y.
Phytochrome regulates gibberellin biosynthesis during germination of photoblastic lettuce
seeds. Plant Physiology, Rockville, v. 118, n. 4, 1517 – 1523, 1998.
VAN TUINEN, A.; PETERS-AHL, J.; KENDRICK, R.E.; ZEEVAART, J.A.D.
KOORNNEEF, M. Characterisation of the procera mutant of tomato and the interaction of
gibberellins with end-of-day far-red light treatments. Physiologia Plantarum,
Kobenhavn, v. 106, n. 1, p. 121-128, 1999.
VANDENBUSSCHE, F.; HABRICOT, Y.; CONDIFF, A.S.; MALDINEY, R.; STRAETEN,
D.V.; AHMAD, M. HY5 is a point of convergence between cryptochrome and cytokinin
signalling pathways in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, Oxford, v. 49, n. 3, p.
428-41, 2007.
VANDENBUSSCHE, F.; PIERIK, R.; MILLENAAR, F.F.; VOESENEK, LA.; VAN DER
STRAETEN, D. Reaching out of the shade. Current Opinion in Plant Biology, London,
v. 8, p. 462–468, 2005.
VINCE; D. Growth and anthocyanin synthesis in excised Sorghum internodes. I. Effects
growth regulating substances. Planta, Berlin, v. 82, p. 261-279, 1968.
VON ARNIM, A.; DENG, X.W. Light control of seedling development. Annual Review of
Plant Physiology and Plant Molecular Biology, Palo Alto, v. 47, p.215-243, 1996.
VOLMARO, C.; PONTON, M.; LUNA, V.; BARALDI, R.; BOTTINI, R. Blue light effects on
hypocotyl elongation of etiolated seedlings of Lactuca sativa (L) cv Grand Rapids related
to exogenous growth regulators and endogenous IAA, GA3 and abscissic acid. Plant
Growth Regulation, Dordrecht, v. 26, p. 165-173, 1998.
WALTON, D.C.; SONDHEIMER, E. Effects of abscisin II on phenylalanine ammonia-
lyase activity in excised bean axes. Plant Physiology, Rockville, v. 43, p. 467–469,
1968.
105
WEATHERWAX, S.C.; ONG, M.; DEGENHARDT, J.; BRAY, E.; TOBIN, E.M. The
interaction of light and abscisic acid in the regulation of plant gene expression. Plant
Physiology, Rockville, v. 111, p. 363-370, 1996.
WEISS, D.; HALEVY, A.H. Stamens and gibberellin in the regulation of corolla
pigmentation and growth in Petunia hybrida. Planta, Berlin, v. 179, p. 89–96, 1989.
WEISS, D.; VAN BLOKLAND, R.; KOOTER, J.M.; MOL, J.N.M.; VAN TUNEN, A.
Gibberellic acid regulates chalcone synthase gene transcription in the corolla of Petunia
hybrida. Plant Physiology, Rockville, v. 98, p. 191-197, 1992.
WEISS, D.; VAN DER LUIT, A.; KNEGT, E.; VERMEER, E.; MOL, J. N. M.; KOOTER, J.
M. Identification of endogenous gibberellins in petunia flowers. Induction of anthocyanin
biosynthetic gene expression and the antagonistic effect of abscisic acid Plant
Physiology, Rockville, v. 107, p. 695-702, 1995.
WERNER, T.; MOTYKA, V.; STRNAD, M.; SCHMÜLLING, T. Regulation of plant growth
by cytokinin. Proceedings of the National Academy of Sciences, Washington, v. 98,
p. 10487–10492, 2001.
WERNER, T.; MOTYKA, V.; LAUCOU, V.; SMETS, R.; VAN ONCKELEN, H.;
SCHMÜLLING, T. Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple
developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in regulating shoot
and root meristem activity. The Plant Cell, Baltimore, v. 15, p. 2532-2550, 2003.
WHITE, C.N.; PROEBSTING, W.M.; HEDDEN, P.; RIVIN, C.J. Gibberellins and seed
development in maize. I. Evidence that gibberellin/abscisic acid balance governs
germination versus maturation pathways. Plant Physiology, Rockville, v. 122, p. 1081–
1088, 2000.
WILKINSON, J.Q.; LANAHAN, M.B.; YEN, H.C.; GIOVANNONI, J.J.; KLEE, H.J. An
ethylene-inducible component of signal transduction encoded by Never-ripe. Science,
Washington, v. 270, p. 1807-1809, 1995.
YAMAGUCHI, S.; SMITH, M.W.; BROWN, R.G.S.; KAMIYA, Y.; SUN, T.P. Phytochrome
regulation and differential expression of gibberellin 3ß-hydroxylase genes in germinating
Arabidopsis seeds. The Plant Cell, Baltimore, v. 10, p. 2115–2126, 1998.
YAMAGUCHI, S.; KAMIYA, Y. Gibberellins and light-stimulated seed germination.
Journal of Plant Growth Regulation, New York, v. 20, p. 369–376, 2002.
YEH, K.C.; LAGARIAS, J.C. Eukaryotic Phytochromes: Light-regulated serine/threonine
protein kinases with histidine kinase ancestry. Proceedings of the National Academy
of Sciences, Washington, v. 95, p. 13976-13981, 1998.
106
YOSHII, H.; IMASEKI, H. Biosynthesis of auxin-induced ethylene: effects of indole-3-
acetic acid, benzyladenine and abscisic acid on endogenous levels of 1-
aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) and ACC synthase. Plant and Cell
Physiology, Tokyo, v. 22, p. 369-379,1981.
ZOBEL, R.W. Genetics of the diageotropica mutant
in the tomato. The Journal of
Heredity, Washington, v. 63, p. 91-97, 1972.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
