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CELSO GRIGOLETTI
ASSOCIAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS NO CONTROLE DE FUNGOS EM
GRÃOS DE MILHO ARMAZENADOS
Tese apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Agronomia, Área de
Concentração Produção Vegetal,
Departamento de Fitotecnia e
Fitossanitarismo, Setor de Ciências
Agrárias, Universidade Federal do Paraná,
como parte das exigências para a
obtenção do título de Doutor em Ciências
Agrárias.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi
Co-Orientadores: Prof. Dr. Edilberto
Possamai e Prof. Dr. José Luciano
Andriguetto
CURITIBA - 2007
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CELSO GRIGOLETTI
ASSOCIAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS NO CONTROLE DE FUNGOS EM
GRÃOS DE MILHO ARMAZENADOS
Tese apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Agronomia, Área de
Concentração Produção Vegetal,
Departamento de Fitotecnia e
Fitossanitarismo, Setor de Ciências
Agrárias, Universidade Federal do Paraná,
como parte das exigências para a
obtenção do título de Doutor em Ciências
Agrárias.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi
Co-Orientadores: Prof. Dr. Edilberto
Possamai e Prof. Dr. José Luciano
Andriguetto
CURITIBA - 2007
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ii
iii
DEDICATÓRIA
A Deus, todo poderoso, que ilumina
todos os caminhos,
Ao meu irmão, Renato Grigoletti, in
memorian.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao curso de Pós Graduação, Produção Vegetal, da
Universidade Federal do Paraná por permitir ingressar no curso de Doutorado.
Ao amigo e orientador Professor Ph.D, Engenheiro Agrônomo, Edilberto
Possamai por me aceitar como seu orientado no trabalho que nos propusemos
desenvolver e que foi sempre solícito em todos os momentos de nossa pesquisa.
Ao orientador Professor Doutor, Engenheiro Agrônomo, Luiz Antonio
Biasi, pela valiosa colaboração.
Ao Professor Co – Orientador Ph.D, Medico Veterinário, José Luciano
Andriguetto, pelo coleguismo de muitos anos e que aceitou prontamente o nosso
convite.
Ao Professor Doutor João Carlos Possamai, Engenheiro Agrônomo, pela
orientação e dedicação na realização da estatística do trabalho.
Ao Professor Doutor Waldir Silva, Médico Veterinário, em contribuir com
as fotografias do desenvolvimento de fungos do trabalho e também na parte de
patologia da atividade fungica.
Ao Marcelo França, Médico Veterinário e Hair Ferrarini, Químico, que
abriram as portas do Laboratório de Nutrição Animal do Departamento de
Zootécnica da Universidade Federal do Paraná, sempre que foi preciso utilizar
equipamentos do laboratório necessário a nossa pesquisa.
À Louise Cândido da Silva, Técnica do Laboratório de Ornitopatologia da
Universidade Federal do Paraná, pelo auxilio precioso e sempre solícito nos
exames que foram necessários para a elaboração do material necessário para o
desenvolvimento de nossa pesquisa.
Ao Laboratório de Ornitopatologia da Universidade Federal do Paraná,
no uso do equipamento necessário a nossa pesquisa.
A todos os colegas da Pós Graduação pelo tempo que convivemos
juntos e pela troca de experiências.
A secretaria do curso de Pós Graduação, Lucimara Antunes, que
sempre estava pronta para esclarecimentos com relação ao curso.
A todos que me abriram as portas quando precisei de alguma
orientação.
Minhas desculpas às pessoas que pensaram em alguma descortesia de
minha parte.
A empresa ALLTECH, pelo patrocínio integral de nossa pesquisa e a
todos os componentes que me auxiliaram em nossos pedidos, em especial a
Andréa Malaguido, Engenheira Agrônoma, que não mediu esforços desde o
nosso primeiro contato para desenvolver o teste.
Em 2004 ingressamos no curso de Doutorado, novos companheiros
conquistamos, novos aprendizados foram importantes, dedicação e preocupações
não faltaram, e por minha satisfação pessoal não vimos ou sentimos a presença
de obstáculos que pudessem impedir os nossos objetivos no curso.
v
BIOGRAFIA DO AUTOR
Celso Grigoletti, Médico Veterinário, formado pela Universidade Federal
do Paraná em 1974, com especialização em Avicultura (manejo, produção e
doenças de aves); 32 anos de experiência profissional, gerente técnico do
Departamento de Aves da Cooperativa Central de Laticínios do Paraná (Produtos
Batavo);
Curso de Patologia de Aves na Holanda em 1978, produção e doenças
de aves na Arbor Acres Farms (EEUU) em 1988;
Participante de vários cursos em Avicultura em nível nacional;
Mestrado em Ciências Veterinárias, concluído em março de 2002, com a
dissertação Sacharomyces cerevisae na Alimentação de Frangos de Corte;
Professor substituto da Universidade Federal do Paraná administrando
aulas de Doenças de Aves no período de 2003 a 2005;
Aluno do curso de Pós Graduação Doutorado em Agronomia em 2004,
com a pesquisa Associação de acidos orgânicos no controle da contaminação de
fungos em grãos de milho armazenados.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS...........................................................................................................
vii
LISTA DE FIGURAS............................................................................................................
ix
LISTA DE ANEXOS.............................................................................................................
x
RESUMO.............................................................................................................................
xi
ABSTRACT
.....................................................................................................
xii
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................
1
2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................
4
2.1 O MILHO E A PRODUÇAO DE RAÇÕES............................................................... 5
2.2 ASPECTOS SOBRE A ARMAZENAGEM DO GRÃO DE MILHO...........................
6
2.3 ALTERAÇÕES NO VALOR NUTRICIONAL DO MILHO......................................... 7
2.4 AÇÃO DAS MICOTOXINAS.....................................................................................
7
2.5 AÇÃO DAS AFLATOXINAS.....................................................................................
13
2.6 CONTROLE DAS MICOTOXINAS...........................................................................
14
2.7 UTILIZAÇÃO DOS ACIDOS ORGÂNICOS NO CONTROLE DE FUNGOS............
17
3 METODOLOGIA......................................................................................................
19
3.1 LOCAL DE PESQUISA............................................................................................
19
3.2 MATERIAL UTILIZADO NA PESQUISA .................................................................
19
3.3 ANÁLISE INICIAL DA AMOSTRA............................................................................
19
3.3.1 Análise bromatológica..............................................................................................
19
3.3.2 Análise para detecção de fungos e concentração de micotoxinas.......................... 19
3.4 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE GRÃO DE MILHO.......................................
20
3.5 DETECÇÃO DE FUNGOS NOS GRÃOS DE MILHO..............................................
22
3.6 ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE AFLATOXINAS............................................ 22
3.7 TRATAMENTOS E AVALIAÇÃO............................................................................. 22
3.8 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA............................ 24
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................
25
4.1 EXAME BROMATOLÓGICO ENVOLVENDO UMIDADE, PROTEÍNA BRUTA E
EXTRATO ETÉREO.................................................................................................
25
4.1.1 Umidade...................................................................................................................
25
4.1.2 Proteína bruta.......................................................................................................... 27
4.1.3 Extrato etéreo...........................................................................................................
27
4.2 DETECÇÃO E DESENVOLVIMENTO DE FUNGOS...............................................
29
4.3 ANÁLISE DO CRESCIMENTO DE FUNGOS DAS ESPÉCIES OBSERVADAS.....
31
4.4
ANÁLISE DA ESPÉCIE Aspergillus.........................................................................
32
4.5
IDENTIFICAÇÃO DO FUNGO Aspergillus ssp........................................................
34
4.6 ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE AFLATOXINAS.............................................
34
CONCLUSÃO.....................................................................................................................
37
REFERÊNCIAS...................................................................................................................
38
ANEXOS.............................................................................................................................
46
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Distribuição do mercado de alimentos no Brasil por espécie animal............
4
TABELA 2 Características desejadas para controle de qualidade dos grãos de milho
esperadas pelas análises efetuadas em uma fábrica de
ração.............................................................................................................
6
TABELA 3 Teores de umidade recomendados para colheita e armazenagem de
grãos sem risco de deterioração em qualquer condição
climática........................................................................................................
7
TABELA 4 Micotoxinas e microorganismos encontrados em grãos de
milho.............................................................................................................
8
TABELA 5 Teor de umidade mínimo em equilíbrio com diferentes níveis de umidade
relativa para a sobrevivência das principais espécies de fungos de
depósitos......................................................................................................
9
TABELA 6 Efeito do armazenamento do milho em diferentes condições sobre o
conteúdo de gordura do próprio grão e da dieta em que foi
incorporado...................................................................................................
11
TABELA 7 Níveis adequados e recomendados de produtos inibidores de fungos a
base de ácido propiônico (>60% de concentração) para milho
armazenado em silos..................................................................................
18
TABELA 8 Valores médios da porcentagem da umidade de grãos de milho
submetidos às diferentes concentrações da associação de ácidos
orgânicos nos períodos de armazenamentos e os períodos de
armazenamento em relação às concentrações da associação de ácidos
orgânicos (A.A.O. L.t
-1
).................................................................................
26
TABELA 9 Valores médios da porcentagem da porcentagem da proteína bruta de
grãos de milho submetidos ao tratamento com diferentes concentrações
da associação de ácidos orgânicos (A.A.O. L.t
-1
) em relação aos três
períodos de armazenamento (2, 4 e 6 meses).............................................
27
TABELA 10 Valores médios do extrato etéreo de grãos de milho nas diferentes
concentrações da associação de ácidos orgânicos em relação aos
períodos de armazenamento e os períodos de armazenamento diante de
cada concentração da associação de ácidos orgânicos (A.A.O.L.t
-
1
)....................................................................................................................
28
TABELA 11 Valores médios da porcentagem de todas as espécies de fungos
encontradas no milho, Aspergillus ssp., Penicilium ssp.,Fusarium ssp., em
três períodos de armazenamento submetidos ao tratamento com
diferentes concentrações da associação de ácidos orgânicos e as
concentrações da associação de ácidos orgânicos (A.A.O. L.t
-1
) diante
dos períodos de armazenamento.................................................................
32
TABELA 12 Valores médios da porcentagem de grãos de milho infectados pelo fungo
do gênero Aspergillus submetidos ao tratamento às diferentes
concentrações da associação de ácidos orgânicos (A.A.O. L.t
-1
)...............
33
TABELA 13 Valores médios da porcentagem dos grãos de milho infectados pelo fungo
Aspergillus nos três períodos de armazenamento, 2, 4 e 6 meses, em
relação as concentrações da associação de ácidos orgânicos utilizadas
(0, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 L.t
-1
).............................................................................
33
viii
TABELA 14 Valores médios da concentração de aflatoxinas em grãos de milho
infectados nos três períodos de armazenamento.........................................
34
TABELA 15 Valores médios da concentração de aflatoxinas nos três períodos de
armazenamento em grãos de milho submetidas ao tratamento com
diferentes concentrações da associação de ácidos orgânicos (A.A.O.L.t
-1
)
35
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01 Câmara de acondicionamento das amostras de milho e visualização do
termo higrômetro de máxima e mínima........................................................
21
FIGURA 02 Placas de Petri mostrando o desenvolvimento de fungos em grãos de
milho nas concentrações 01 = testemunha (0,0 L.t
-1
), 02 (1,0 L.t
-1
), 03 (1,5
L.t
-1
), 04 (2,0 L.t
-1
) e 05 (2,5 L.t
-1
)da associação de ácidos orgânicos aos
2,4 e 6 meses de armazenamento.........................................................
30
FIGURA 03
Visualização em microscópio óptico, aumento 40 x do fungo Aspergillus
ssp. ..............................................................................................................
34
x
LISTA DE ANEXOS
ANEXO I Dados relativos à temperatura média, máxima e mínima, umidade relativa
média, máxima e mínima durante o armazenamento do milho na câmara
de amostras..................................................................................................
47
ANEXO II Valores médios da umidade, proteína bruta e extrato etéreo em amostras
de milho em três períodos de armazenamento (2, 4 e 6 meses).................
48
ANEXO III Análise de variância da porcentagem de umidade.......................................
48
ANEXO IV Análise de variância da proteína bruta......................................................... 48
ANEXO V Análise de variância do estrato etéreo..........................................................
48
ANEXO VI Análise de variância da porcentagem de fungos..........................................
49
ANEXO VII Análise de variância da porcentagem do aspergillus....................................
49
ANEXO VIII Análise de variância da concentração de aflatoxinas...................................
49
xi
RESUMO
O crescimento de fungos com a conseqüente produção de micotoxinas tem
ocasionado sérios prejuízos no desenvolvimento dos animais pela contaminação
da alimentação. Pesquisas com o intuito de minimizar as reações adversas têm
sido realizadas. O milho, que faz parte da nutrição animal em uma porcentagem
de 60%, é sensível ao desenvolvimento de fungos dependendo das condições
que é cultivado e armazenado. Há um decréscimo dos valores nutritivos contidos
no milho devido à contaminação por fungos. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar
a eficácia do tratamento com uma associação de ácidos orgânicos no controle do
desenvolvimento de fungos em um período de seis meses em nível de laboratório.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Os tratamentos
representaram o arranjo fatorial 5 x 3, sendo 5 concentrações da associação de
ácidos orgânicos (0; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 L.t
-1
) e 3 tempos de armazenamento do
milho (2, 4 e 6 meses) e 4 repetições em um total de 60 amostras. Os resultados
demonstraram que a associação de ácidos orgânicos foi eficiente em diminuir o
número de colônias fúngicas encontradas infectando os grãos de milho
armazenados. A concentração de 2,5 L.t
-1
proporcionou maior controle no
desenvolvimento de fungos com 2 e 4 meses de armazenamento. Nos 3 períodos
de armazenamento, 2, 4 e 6 meses, não houve alteração na concentração de
aflatoxinas independente da concentração da associação de ácidos orgânicos.
Aos 2 meses de armazenamento, na concentração de 2,5 L.t
-1
da associação de
ácidos orgânicos, o extrato etéreo teve uma conservação melhor.
Palavras – chave: aditivos, micotoxinas, nutrição animal.
xii
ABSTRACT
The growth of fungus with the consequent production of micotoxins has
caused serious damages in the development of the animals for the contamination
of the feeding. Research with intention to minimize the adverse reactions has been
carried through. The corn, that is part of the animal nutrition in a 60% percentage,
is sensible to the development of fungus depending on the conditions that is
cultivated and stored. It has a decrease of the nutritional values contained in the
maize due the contamination for fungus. The objective of this research was to
evaluate the effectiveness of the treatment with an association of organic acid in
the control of the development of fungus in a period of six months in laboratory
level. The experimental delineation entirely was random. The treatments had
represented factorial arrangement 5 x 3, being 5 organic acid concentration of the
association of (0; 1,0; 1,5; 2,0 and 2,5 L.t
-1
) and 3 times of storage of the corn (2, 4
and 6 months) and 4 repetitions in a total de 60 samples. The acid results had
demonstrated that the association of organic acid in diminishing the number of
fungus colonies found infected the stored grains of corn. The concentration of 2,5
L.t
-1
provided greater has controlled in the development of fungus with 2 and 4
months of storage. In the 3 periods of storage, 2, 4 and 6 months, did not have
alteration in the aflatoxin the independent concentration of the acid concentration
of the association of organic. To the 2 months of storage, in the concentration of
2,5 L.t
-1
of the association of organic acid, the etereo extract had better
conservation.
Key words: additives, mycotoxins, animal nutrition.
INTRODUÇÃO
Na exploração econômica das aves procura-se dentro dos ingredientes que
compõe as rações, assegurar a inclusão de determinadas matérias primas, em
específico o milho em grãos, que proporcionou resultados satisfatórios na
alimentação destes animais e obtenção de elevados resultados zootécnicos.
O fator qualidade da matéria prima é essencial para se formular uma ração
de alta qualidade, permitindo o máximo da expressão de desempenho das aves,
tanto na produção de ovos como de carne.
Para a avicultura, o milho assume papel de vital importância na
alimentação pelo fato de compor cerca de 60% de uma dieta inicial para frangos
de corte e aproximadamente 65% da energia metabolizável da ração, e cerca de
20% de proteína em rações iniciais (DALE & JACKSON, 1994).
O milho é um dos grãos que ocupa grande espaço nos armazéns e silos
no Brasil e um dos grandes problemas na armazenagem destes grãos está
relacionado com a presença de micotoxinas.
Segundo Dal Borgo (1980), apesar de se falar muito de aflatoxina, toxina
produzida pelo fungo Aspergillus flavus, esta representa apenas uma dentre os
diferentes tipos de toxinas produzidas por fungos presentes no meio ambiente,
que podem chegar em torno de 300 micotoxinas (SABINO, 1995).
Dal Borgo (1980) enfatiza que a importância destas toxinas para a
indústria animal se baseia principalmente nos efeitos que provocam nos animais
bem como nos resíduos tóxicos serem consumidos pelo homem nos produtos
originados dos animais contaminados.
Segundo Keshavarz (1987), se a contaminação por micotoxinas já estiver
presente, o uso de produtos inibidores para o controle do desenvolvimento de
fungos produtores das micotoxinas, não terão a devida atuação na destruição das
toxinas produzidas.
Fonseca (1980) cita que a principais micotoxinas que contaminam os grãos
de milho são a aflatoxina, zearalenona (F-2), ocratoxina e dois tricotecenos, a
2
toxina T-2 e o deoxinivalenol, sendo os três primeiros mais freqüentemente
encontrados.
As aflatoxinas são rotineiramente encontradas nos grãos de milho e
também são as que têm causado mais prejuízos comprovados na produção
animal.
A importância na compra, recebimento, secagem, armazenamento e
industrialização do milho são importantes, uma vez que a qualidade desta matéria
prima irá influenciar a formulação da ração animal.
Um dos fatores de qualidade é o teor de umidade do milho, uma vez que
esta condição não se apresenta de maneira constante, desde sua colheita até o
seu processamento (LAZZARI, 1997).
O milho deve possuir 12% a 15% de teor de umidade, para ser eficaz a sua
administração para os animais, com relação à segurança principalmente no que
diz respeito ao desenvolvimento e contaminação dos grãos pelas micotoxinas.
Quando presentes influenciam significativamente no desempenho da ave, se sua
presença é observada de maneira constante, seja em pequena ou grande
quantidade.
Um fator freqüentemente encontrado em todas as fábricas de ração é a
falta de uniformidade dos grãos recebidos, independente de sua origem. Por outro
lado, a qualidade dos grãos é variável em relação às suas características
nutritivas e à quantidade de contaminação física, química e microbiológica.
A qualidade do milho é influenciada por fatores que iniciam no campo, uma
vez que quando o milho é colhido, a presença de grãos quebrados irá exacerbar
ainda mais o desenvolvimento de fungos e micotoxinas. Outro ponto importante é
a questão das variedades de milho encontradas (duro, semi-duro e mole) e seu
relacionamento com o desenvolvimento dos fungos e micotoxinas.
Na literatura encontram-se trabalhos técnicos que demonstram estudos
realizados sobre a origem, caracterização química, toxicidade e efeitos das
micotoxinas sobre a saúde e desempenho dos animais (LAZZARI, 1997, LESSON
et al., 1995). Alguns deles focam o problema das micotoxinas sobre o ponto de
vista das fábricas de ração, relatando como proceder diante do aparecimento de
grãos de milho contaminados, evitando, desta forma, os malefícios que tais
ingredientes podem ocasionar nos animais.
3
De acordo com as considerações apresentadas, procurou-se desenvolver
uma pesquisa preventiva no grão de milho através de um produto que inibisse o
crescimento de fungos produtores de micotoxinas.
O produto escolhido foi uma associação de ácidos orgânicos.
Partiu-se da hipótese que se a aplicação da associação de ácidos
orgânicos, no armazenamento de grãos de milho, possa inibir o desenvolvimento
de fungos nestes grãos, durante um determinado período, haverá menor
porcentagem de grãos contaminados neste período e consequentemente
menores concentrações de aflatoxinas.
O objetivo geral foi avaliar a associação de ácidos orgânicos no controle de
fungos em grãos de milho armazenado, no período de 6 meses.
Os objetivos específicos foram:
Avaliar o desenvolvimento dos fungos em grãos de milho diante das
diferentes concentrações da associação de ácidos orgânicos e períodos de
armazenamento;
Avaliar a concentração de aflatoxinas nas diferentes concentrações de
ácidos orgânicos e períodos de armazenamento.
4
2 REVISÃO DE LITERATURA
Albuquerque (1994) enfatizou a grande importância do setor avícola no
Brasil através de relatos do consumo de rações das diversas espécies domésticas
(Tabela 1) utilizando-se milho e soja.
TABELA 1 – Distribuição do mercado de alimentos no Brasil por espécie animal
ATIVIDADE PORCENTAGEM
Indústria Avícola – frangos de corte 49,0
Indústria Suinícola 24,0
Indústria Avícola –Poedeiras Comerciais 14,0
Indústria Leiteira 8,0
Criação de Cavalos 2,0
Rações de animais de Companhia (mascotes) 2,0
Outras 1,0
Fonte: Albuquerque (1994)
Além do consumo acentuado de milho pela indústria avícola, pode ser
salientada a grande dependência deste grão ao mercado interno de seus insumos
(fertilizantes, sementes, etc.), o que confere uma instabilidade de suprimento no
Brasil, além da menor qualidade comprada de outros países de agricultura mais
evoluída.
Schang (1992) apresentou a participação de cada setor de produção
animal na América Latina e Caribe, e destacou o Brasil como um mercado
crescente e importante na produção de carne e ovos, sendo o setor responsável
por cêrca de 25,4% da produção total de rações na região.
Com relação ao apresentado anteriormente (Tabela 1), pode-se observar
que o setor avícola tem grande participação no consumo de milho, que é um
ingrediente básico para compor as rações. Esta dependência cria uma
necessidade de controle da qualidade deste grão para rações, ponto essencial
para o sucesso da produção.
5
2.1 O MILHO E A PRODUÇÃO DE RAÇÕES
Um dos grandes pontos a serem considerados por um bom produtor
avícola é a qualidade das rações oferecidas no mercado. Saxena (1985) observa
que para se obter uma boa eficiência nas operações de produção de rações,
alguns pontos devem ser considerados: escolha correta dos ingredientes,
formulações de baixo custo, granulometria dos ingredientes e da ração final,
processo de mistura, controle de qualidade e desempenho do plantel.
Os ingredientes para rações como produtos agrícolas podem sofrer
grandes alterações em sua uniformidade e também em sua qualidade desde a
colheita até o processamento (LAZZARI, 1992).
Lazzari (1997) citou que alguns fatores como o teor de umidade, presença
de grãos danificados por fungos (grãos embolorados, mofados, gérmen
danificado, sem cor, aquecidos, fermentados ou ardidos), grãos quebrados,
matérias estranhas, impurezas, presença de micotoxinas, teores de óleo e níveis
de proteína, podem informar com certa precisão a qualidade de um lote de grãos.
De acordo com Pinto e Pastore (1995), o milho se caracteriza como uma
excelente fonte energética e de pigmentos para aves, mas uma série de
problemas deve ser levada em conta em uma fábrica de rações, dentre os quais:
excesso de umidade, presença de altos teores de grãos quebrados, ardidos e
podres, presença de sementes de plantas invasoras da cultura, presença de
material estranho e mofado, presença de micotoxinas.
Os autores reiteram ainda que nas análises para recebimento do milho na
fábrica, 90% dos problemas podem ser detectados e sugerem um padrão de
qualidade para os grãos a serem aceitos (Tabela 02).
6
TABELA 2 - Características desejadas para controle de qualidade dos grãos de
milho, esperadas pelas análises efetuadas em uma fábrica de
rações.
Análise de recebimento Padrões
Ardidos, mofados e (%) 3, 6 e 10%
Carunchados, chochos e queimados (%) 3, 6 e 10%
Impurezas e quebrados (%) 1,5, 2 e 3%
Sementes de invasoras e/ou tóxicas (%) zero
Grãos tratados com pesticidas zero
Análise química recomendada
Umidade (%) < 14
Xantofila (ppm) 20 a 30
Aflatoxina (ppb) < 20 ppb
Proteína bruta (%) 7 - 10%
Fonte: Pinto e Pastore (1995).
2.2 ASPECTOS SOBRE A ARMAZENAGEM DO GRÃO DE MILHO
O teor de umidade dos grãos é o principal fator que governa as qualidades
do produto armazenado, sendo extremamente importante se conhecer o teor de
umidade na colheita visando não permitir a ocorrência de consideráveis perdas
(PUZZI,1986).
Gerage et al. (1982), informam que normalmente quando da maturação dos
grãos de milho, sua umidade gira em torno de 25% para a colheita mecânica,
necessitando posteriormente de secagem para reduzir a umidade dos grãos ao
nível ideal de armazenagem que é de 12 a 13%. Os autores salientam que em
sistemas de secagem a campo, ou seja, na própria planta, para posteriormente se
proceder a colheita e debulha manual, há grande possibilidade de alteração na
qualidade do produto pela ação de fatores climáticos, pragas e doenças que
comprometem o produto grão a armazenar.
Existem variações quanto ao tempo e variações de perdas de umidade dos
grãos e sementes de acordo com as condições climáticas antes e depois da
colheita e também por características particulares de diversas variedades
genéticas (LAZZARI, 1997).
Os principais fatores físicos que afetam a colheita e o armazenamento dos
grãos são a temperatura, a umidade e danos mecânicos aos grãos (PUZZI, 1986).
Na Tabela 3 são apresentados os dados compilados por Lazzari (1997) em
relação aos teores de umidade para colheita e armazenagem seguras de diversos
tipos de grãos.
7
TABELA 3 – Teores de umidade recomendados para colheita e armazenagem de
grãos sem risco de deterioração em qualquer condição climática.
Produto Tempo de armazenagem
Colheita Até 1 ano Mais que 1 ano
Aveia 15-20 12-13 11
Cevada 18-20 13 12
Girassol 15-18 8-9 7,5
Milho 24-32 13-14 12
Soja 15-18 12-13 11
Sorgo 28-32 12-13 11
Trigo 18-20 13-14 12
Fonte: Lazzari (1997)
Os danos mecânicos nos grãos ocorrem no transporte, limpeza, secagem e
colheita e dão origem à produção de grãos quebrados, partidos e trincados que
aumentam quanto menores forem os teores de umidade dos grãos (PUZZI, 1986).
2.3 ALTERAÇÕES NO VALOR NUTRICIONAL DO MILHO
O alto conteúdo em carboidratos, principalmente o amido, e de outros
componentes como proteínas e ácidos graxos, fazem do milho um importante
produto comercial e em condições inadequadas de armazenamento, esse grão
pode sofrer perdas no valor quantitativo e qualitativo devido principalmente ao
ataque de pragas desde o campo até a época de consumo (LOPES et al. 1988).
Rostagno (1993) ressaltou que o grão de má qualidade tem o valor nutritivo
prejudicado em relação ao grão normal de várias maneiras: por alteração da
composição química, por diminuição da biodisponibilidade de alguns nutrientes,
pela presença de fatores antinutricionais, pela proliferação de fungos com ou sem
a produção de micotoxinas.
2.4 AÇÃO DAS MICOTOXINAS
Micotoxinas são substâncias tóxicas formadas durante o crescimento dos
fungos.
Os fungos são seres vivos e, portanto, precisam se alimentar. Em
condições de armazenamento, os nutrientes necessários para seu
desenvolvimento são extraídos dos grãos ou rações. O principal alvo dos fungos é
a gordura ou extrato etéreo dos alimentos, uma vez que esta porção apresenta
8
níveis elevados de energia. Alimentos contaminados por fungos apresentam um
substancial empobrecimento energético (KRABBE et al., 1995).
Existem aproximadamente 300.000 diferentes espécies de fungos que
podem estar presentes em toda parte, crescendo em vários tipos de substratos.
Um dos grandes problemas na armazenagem dos grãos e
conseqüentemente do preparo das rações está relacionado com a presença de
micotoxinas. Um aspecto importante relacionado com a presença de fungos em
grãos é a perda nutricional ocasionada pelo desenvolvimento fúngico, de maneira
que em condições reais, as micotoxinas estão associadas com grãos de menor
qualidade bromatológica.
Os fungos são a principal causa de deterioração e as perdas são
imperceptíveis a olho nu, ou com o uso de lupas e os prejuízos de sua ação só
são visíveis em nível de conseqüência econômica (PUZZI, 1986).
Lazzari (1997) apresentou os principais grupos capazes de invadir e
danificar sementes, grãos, fibras naturais e seus subprodutos, sendo divididos
como fungos de campo, fungos intermediários e fungos de armazenamento.
Nazareno (1982) apresentou as principais micotoxinas identificadas como
contaminantes do milho (Tabela 4).
TABELA 4 – Micotoxinas e microorganismos encontrados nos grãos de milho.
TOXINA MICROORGANISMOS
Aflatoxina B1, B2, G1, G2
Aspergillus flavus e A. parasiticus
Ochratoxinas (Nefrotoxinas)
A. ochraceus e Penicillium viridicattum
Sterigmatocistina
A. nidulans e A. versicolor
Toxina termogênica
A. flavus, P. cyclopium, P. palitans
Patulina
P. urticae, P. expansum, P. claviforme, A. clavatus.
Rubratoxina
P. rubrum
Citrinina
P. citrinum
Vomitoxina (deoxynivalenol)
Fusarium roseum f. sp. cerealis (Giberella zeae)
Tricotecenos(T-20)diatoxyscirpenol
monoacetoxyscirpenol,)
F. tricinctum, F. roseum, F. equiseti e F. lateritium
Zearalenona e zearalenol
F. roseum, F. tricinctum, F. moniliforme
Fonte: Adaptado de Nazareno (1982)
Segundo Dal Borgo (1980), apesar de se falar muito da aflatoxina, toxina
produzida pelo fungo Aspergillus flavus, esta representa apenas uma dos 100
diferentes tipos toxinas produzidas por fungos presentes no meio ambiente. O
autor ressaltou que a importância destas toxinas para a indústria animal, se
baseia principalmente verificando seus efeitos nos animais e na possibilidade dos
9
resíduos tóxicos serem absorvidos na carne dos animais e consumidos pelo
homem.
De acordo com Puzzi (1986), os fungos de campo, cujas espécies
principais são do gênero Alternaria, Cladosporium, Fusarium e Helmintosporium,
podem alterar a aparência dos grãos e conseqüentemente o valor comercial do
produto. O autor apresentou como fungos de armazenamento ou de depósito,
aqueles do gênero Aspergillus e Penicillium, que são os mais freqüentes, e seu
desenvolvimento se dá nos níveis de umidade dos grãos e do ar apresentados
(Tabela 5).
TABELA 5 – Teor de umidade mínimo em equilíbrio com diferentes níveis de
umidade relativa para a sobrevivência das principais espécies de
fungos de depósito.
Grãos Aspergillus Penicillium
A.restrictus A.ochraceus A.candidus A.flavus
Diversas espécies
70%UR 73%UR 80%UR 85%UR 80-90%UR
Milho 13,5-14,5 14-14,5 15-15,5 18-18,5 16,5-19
Trigo 13,5-14,5 14-14,5 15-15,5 18-18,5 16,5-19
Sorgo 14,0-14,5 14,5-15 16-16,5 19-19,5 17-19,5
Soja 12,0-12,5 12,5-13 14,5-15 17-17,5 16-18,5
Fonte: Puzzi (1986)
Sabe-se que as aflatoxinas têm sido freqüentemente identificadas em
alimentos e rações para animais produzidos no Brasil. Isto se deve a
contaminação que ocorre nos armazéns e em alguns casos a contaminação já
vem do campo. As aflatoxinas mais observadas no milho são a B1, B2, G1 e G2
(LAZZARI,1997). O autor observou que essas substâncias provocam sérios
prejuízos aos animais domésticos.
Apesar dos problemas conhecidos com aflatoxinas, a sua incidência em
níveis mais altos é bastante variável, o que demonstrou Sabino (1995) analisando
a coleta de 165 amostras da região sul e 163 amostras da região sudeste,
observou apenas 30 e 14 amostras positivas, respectivamente, para aflatoxina B1
e destas somente uma estava contaminada com níveis superiores a 500 ppb.
Isto pode representar perdas consideráveis para produtores de grande e
médio porte, como demonstraram Jones et al. (1982), onde ressaltando que
quando os níveis de aflatoxina encontrados no milho, aumentaram de 1,2 para 8,8
ppb, verificaram em uma integração de aves que a porcentagem de condenação
10
em nível de abate aumentou de 1,39 para 1,73, e o índice de mortalidade teve
acréscimo de 4,02 para 7,22%.
Hamilton (1977) relatou que os efeitos da aflatoxina são bastante variáveis,
estando relacionados principalmente aos dados de desempenho produtivo e
reprodutivo.
Wyatt (1985) observou que a aflatoxina estava relacionada com a
Síndrome de Má Absorção em aves, devido sua característica similar com esta
infecção viral.
As micotoxinas, das quais a aflatoxina é a principal, podem determinar
queda na produção de ovos, no peso dos ovos e provocar produção de uma
casca mais fina (ITO, 1994).
Fiorentin et al. (1987), analisando a contaminação de milho em granjas,
fábricas de ração e armazéns de cooperativas de Santa Catarina, observaram
que os maiores índices de contaminação com aflatoxinas ocorreram no período
de seis meses de armazenamento, coincidindo com a época de maiores
temperaturas e umidade na região.
Beasley et al. (1980) observaram queda de desempenho em frangos de
corte durante o período de produção alimentado com milho contaminado por
Penicillium lanosum, onde as aves apresentaram sintomas como diarréia, nefrite
tóxica e erosão de moela.
Nas pesquisas realizadas em granjas de frangos de corte nos Estados
Unidos, Jones et al. (1982) verificaram que dependendo da fonte de coleta de
milho para análise, havia variação nos níveis de contaminação com aflatoxinas de
acordo com o local de coleta, conforme o tempo entre a fabricação e a
alimentação das aves.
Stringhini et al. (1993) utilizaram rações formuladas com milho contaminado
com micotoxinas para frangos de corte, e não observaram alterações nos pesos
relativos de fígado, pâncreas e Bursa de Fabricius com 20 a 40% de
contaminação de grãos de milho, porém foram observadas lesões em nível de
intestino delgado e fígado.
Bartov et al. (1982), estudando o efeito da contaminação fúngica sobre o
valor nutricional e desempenho de frangos de corte, observaram que havia
11
redução nos níveis de gordura do milho armazenado em dois teores de umidade
diferentes (13 e 15,1%) e sob duas condições, grão inteiro e triturado (Tabela 6).
TABELA 6 – Efeito do armazenamento do milho em diferentes condições sobre o
conteúdo de gordura do próprio grão e da dieta em que foi
incorporado.
CONDIÇÕES DE
ARMAZENAGEM
Conteúdo de
Rações
Armazenamento Nivel de
Umidade (%)
Duração
(dias)
Gordura
no grão (%)
Conteúdo de gordura (%)
INICIAL FINAL
Milho inteiro 13,0 96 3,9 3,5 3,6
Milho inteiro 15,1 96 3,9 3,8 3,6
Milho triturado 13,0 96 3,8 3,7 3,6
Milho triturado 15,1 96 2,4 2,9 2,7
Milho triturado 12,7 63 3,4 3,7 3,4
Milho triturado 15,0 63 1,5 2,4 1,9
Fonte: Adaptado de Bartov et al. (1982).
Smith et al. (1992), estudando os efeitos individuais da aflatoxina e da sua
associação com o ácido ciclopiazônico, micotoxina produzida por Aspergillus
flavus e Pennicillium cyclopium, observaram efeitos de decréscimo no ganho de
peso, com aumento relativo do peso dos rins e concentração no soro aumentada
para nitrogênio ureático e reduzida para proteína, albumina, colesterol, fósforo e
atividade de lactato desidrogenase.
A ação do uso conjugado de aflatoxina e ácido ciclopiazônico mostrou
aumento de peso relativo de fígado, rins, pâncreas e proventrículo, reduzido para
Bursa de Fabricius, enquanto as concentrações séricas foram reproduzidas para
albumina e fósforo e aumentada para transaminase glutamato-oxalacetato e
nitrogênio ureático.
Rostagno (1993) observou que rações produzidas com grãos contendo
micotoxinas, provocaram redução nos valores de energia metabolizável da
matéria seca e dos aminoácidos, como também prejuízos na produção de
enzimas pancreáticas (tripsina, amilase e lipase) com redução nas taxas de
utilização de nutrientes lipossolúveis, em virtude de afetar principalmente fígado e
rins.
Os principais métodos de controle para evitar a ação de fungos nos grãos
armazenados consistem em manter o teor de umidade, temperatura e taxas de
oxigênio a níveis desfavoráveis para seu desenvolvimento. O autor sugere a
secagem rápida e eficiente (logo após a colheita), para atingir os níveis de
12
umidade desejados, o controle de impurezas nos grãos e aeração da massa
armazenada para manter a uniformidade de temperatura e umidade. O uso de
ácido orgânico e adsorvente de micotoxinas se constitui em alternativas para o
controle do desenvolvimento dos fungos ou de redução dos efeitos negativos das
micotoxinas (PUZZI, 1986).
Alguns autores estudaram correções nutricionais a realizar quando a ração
ou o milho estivesse contaminado por micotoxinas. Bartov et al. (1982) verificaram
que suplementação com gordura para rações formuladas a base de milho com
crescimento fúngico pode corrigir o desempenho, desde que o nível de
micotoxinas dos grãos esteja abaixo dos níveis tóxicos.
Rogers et al. (1991) estudaram as relações entre níveis de triptofano e de
aflatoxina e seus efeitos sobre o acúmulo de gordura e sua associação com
efeitos da aflatoxicose em poedeiras brancas. Os autores basearam-se no fato
que o triptofano pode contribuir para reduzir os níveis de gordura hepática nas
aves, e no experimento acima se observou essa redução, porém a associação
triptofano-aflatoxina, resultou em menor taxa de produção de ovos e um aumento
das lesões ocasionadas por aflatoxina.
As toxinas produzidas por Fusarium moniliforme podem ter efeitos
deletérios. Rotter et al. (1992) observaram efeitos de redução no ganho de peso,
consumo de ração e piora a eficiência alimentar, principalmente com a presença
de deoxinivalenol nas rações de suínos em crescimento.
Marijanovic et al. (1991) observaram em machos Leghorn, pesos relativos
da Bursa de Fabricius, baço, timo, bem como efeitos imunodepressores, e
concluíram que o uso de alimento contaminado por Fusarium moniliforme pode
produzir deficiências no sistema imune das aves.
Outras micotoxinas são produzidas por Fusarium moniliforme, e todas com
efeitos negativos sobre o desempenho. Friend et al. (1992) observaram reduzido
ganho de peso para leitões até cinco semanas, bem como menor consumo de
ração e aumento das lesões na região esofagiana em estudos com deoxinivalenol
associado a toxina T-2. Giroir et al. (1991) observaram que não existem
diferenças em termos da eliminação metabólica da toxina T-2 em galinhas e
marrecos de Pequim, e que a toxina não foi detectável no sangue, cérebro ou
gordura, mas acumulou-se nos ossos, músculos e moela.
13
Outro grupo de micotoxinas produzidas por fungos do gênero Fusarium, os
scerpentrióis, podem causar lesões bucais em frangos (ADEMOYERO, 1991) e
empenamento anormal (PARKHURST et al., 1992).
As ocratoxinas, produzidas por Aspergillus e Penicillium são descritas como
causadoras de problemas com pior desempenho produtivo e supressão da
resposta imune em suínos (LIPPOLD et al., 1992 e HARVEY et al., 1992), sendo
também descritos casos de mau desempenho em frangos de corte (RUIZ e
CAMARGO, 1992).
Outro metabólito produzido por Fusarium, a zearalenona, causa o
hiperestrogenismo, e os suínos são os animais mais sensíveis (LAZZARI, 1997).
Alguns relatos para aves sugerem problemas relacionados com a queda de
postura observada em poedeiras que receberam milhos contaminados.
2.5 AÇÃO DAS AFLATOXINAS
Os estudos sobre as aflatoxinas iniciaram quando houve na Inglaterra uma
mortalidade de aproximadamente 100.000 perus devido à ingestão de farelo de
amendoim contaminado com aflatoxinas (LANCASTER et al., 1961) A partir desta
data, muitas outras micotoxinas foram descobertas ocasionando prejuízo nos
animais e sempre relacionado com grãos e cereais contaminados.
As aflatoxinas não são produzidas somente pelos fungos da espécie
Aspergillus flavus, produtor das aflatoxinas B1 e G1 e Aspergillus parasiticus,
produtor das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2. Outras espécies de Aspergillus,
Penicillium e Rhizopus spp. pode produzir a micotoxina aflatoxina.
No Brasil, um estudo realizado por Castro et al. (1995) demonstrou que os
fungos mais comumente encontrados em grãos e cereais são Fusarium spp.,
Penicillium spp. e Aspergillus spp, entre outros, a partir deste estudo, dezenas de
micotoxinas já foram detectadas em cereais destinados ao consumo animal.
A produção de aflatoxinas pelos fungos está relacionada a fatores
ambientais, biológicos e químicos, possibilitando que mais de uma toxina possa
ser encontrada num mesmo substrato. Entretanto, é importante considerar que a
presença de fungos em cereais não assegura a presença de aflatoxina, bem
como sua ausência não garante a não existência da aflatoxina, uma vez que esta
pode persistir após a eliminação do agente. Cada espécie fúngica pode produzir
14
mais de uma toxina, da mesma forma que uma micotoxina pode ser produzida por
mais de um tipo de fungo.
De acordo com Ramos e Hernandez (1996), a absorção de aflatoxinas
ocorre por difusão passiva através do intestino, difundindo-se rapidamente por
todo o organismo de maneira que três horas após alimentação, aflatoxinas B1 e
B2 podem ser encontradas em todos os tecidos, principalmente fígado e moela
das aves.
A exposição às aflatoxinas pode ser aguda ou crônica dependendo da dose
da micotoxina ingerida, tempo de exposição, e do estado de saúde do animal.
A biossíntese de aflatoxinas ocorre em ambientes com temperaturas entre
8
o
C e 42
o
C, sendo que a temperatura ideal ocorre em torno de 27
o
C, em
substratos com elevada umidade, em plantas sob estresse por temperaturas
altas, grãos com danos mecânicos provocados pela manifestação de insetos, ou
como resultado na falta de orientação na colheita, o que facilita a entrada de
microorganismos (GOURAMA e BULLERMAN, 1995; BOSQUE 1996).
No Brasil, a legislação permite o limite máximo de 50 ppb para aflatoxinas
B1 e G1 ou a soma das duas, para utilização de produtos e subprodutos agrícolas
(SCUSSEL, 1998).
2.6 CONTROLE DAS MICOTOXINAS
A melhor maneira de impedir o desenvolvimento de micotoxinas e seus
efeitos nocivos é realizada quando é controlado o crescimento de fungos. Todas
as medidas empregadas para diminuir a manifestação fúngica como alta umidade
(65 a 70%) durante a armazenagem, presença de insetos nas culturas de grãos,
má conservação de grãos, temperatura entre outras, evitam problemas com
micotoxinas e perdas nutricionais nos grãos.
Neste aspecto, existem controles que podem ser realizados evitando o
crescimento de fungos com a presença ou não de micotoxinas, e metodologias
que atuam via aparelho digestório do animal quando as micotoxinas estão
presentes.
No primeiro controle mencionado, aparecem os ácidos orgânicos com
poder eficiente no controle do desenvolvimento dos fungos nos grãos
15
armazenados, pois agem diminuindo o pH do meio, tornando-o impróprio para o
crescimento dos fungos (KRABBE et al., 1994a).
Os ácidos orgânicos inibem o crescimento dos microorganismos através de
sua entrada nas células e dissociação no interior destas. Tal processo é
responsável pela acidificação do citoplasma das células, resultando na inibição do
transporte de nutrientes. O consumo de energia dos fungos aumenta na tentativa
de manter o pH homeostático. Devido ao processo de sobrevivência, ocorre um
estreitamento da faixa de pH, promovendo a morte ou a inibição da célula. Isto
ocorrendo, o fungo perde a capacidade de desenvolvimento.
Entre os ácidos orgânicos, há o ácido propiônico que inibe o crescimento
fúngico, mas por outro lado ocasiona efeitos não satisfatórios como corrosão de
equipamentos e produção de vapores cáusticos e adstringentes.
Devido às circunstâncias negativas oriundas deste ácido orgânico, foi
necessário à utilização, para uma melhor efetividade, de uma mistura de ácidos
orgânicos, que além de incluir o propiônico, possuir mais o ácido acético, o
benzóico e o sórbico, resultando na formação de um complexo com capacidade
tamponante muito maior que a do sistema convencional sal/ácido de
tamponamento.
O complexo tamponado dissocia-se na presença de umidade, liberando
ácido propiônico, o qual promove a inibição fúngica (KRABBE et al., 1995).
Verifica-se uma atividade satisfatória da mistura dos ácidos descritos
acima no controle primário para impedir o desenvolvimento de fungos como
também preserva os teores de gordura e qualidade dos grãos (KRABBE et al.,
1995).
Lazzari (1997) apresentou alguns métodos químicos como o uso de ozônio,
peróxido de hidrogênio, hipoclorito de sódio, formaldeído, hidróxido de cálcio e
amônia líquida ou em gás, que atacam a aflatoxina. Foram citados também
agentes sequestrantes como os aluminossilicatos de sódio e cálcio hidratados
que tem forte atração eletroquímica pelas aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, podendo
ser utilizados nas dosagens de 0,1 a 0,5% por tonelada métrica de produto.
Quando as micotoxinas já estão presentes, qualquer medida aplicada com
o intuito de reduzir os efeitos nocivos destas substâncias torna-se difícil e
onerosa.
16
No geral, o controle de micotoxinas pode estar dividido em métodos
químicos, biológicos e físicos.
Como métodos químicos consistem em degradar ou inativar as
micotoxinas, com o uso de ácidos, bases, aldeídos, agentes oxidantes e vários
gases dentre os quais se podem destacar a amonização como uma forma de
detoxificação para fumonisinas (NORRED, 1993). Estes métodos por sua vez têm
sido considerados não práticos, ineficazes ou inseguros para grandes
quantidades de grãos, alem de diminuir os níveis nutricionais e o paladar do
alimento (PARK et al., 1988).
A caracterização dos métodos biológicos inclui a utilização de
microorganismos, como leveduras, bolores e bactérias, para modificar e ou
inativar as micotoxinas. Stanley et al. (1993) descreve o Saccharomyces
cerevisae atenuando os efeitos de aflatoxinas.
Para os controles físicos das micotoxinas cita-se a inativação térmica,
irradiação gama, segregação por densidade, extração por solventes e adsorção
por várias substâncias.
O uso de adsorventes nas rações tem sido utilizado devido a praticidade de
sua colocação e não requerer nenhum equipamento especial. Vários minerais
contendo sílica, os chamados aluminossilicatos, são indicados como adsorventes
de micotoxinas (SCHEIDELER,1993; BAILEY et al.,1999; TAYLOR, 1999).
O mecanismo de ação dos adsorventes está baseado na troca de cargas
entre eles e as micotoxinas. Entretanto, as estruturas das micotoxinas são
diferentes e a atividade dos adsorventes não é igual para todas as micotoxinas
dos fungos. Kubena et al. (1991) demonstraram que estes minerais possuem uma
boa atividade tanto em in vitro como in vivo em reduzir os efeitos das aflatoxinas.
Brown et al. (1992); Huff et al. (1992); Ramos e Hernandez (1996); Kubena et al.
(1998); Santin (2000) verificaram que os adsorventes parecem não ter uma boa
efetividade contra outras mocotoxinas como fumonisinas, DON, T-2 e ocratoxinas.
Existe também uma variação entre os aluminossilicatos, alterando a capacidade
de adsorção.
Outra observação com relação a estes minerais é que eles possuem a
capacidade de adsorver minerais, vitaminas, promotores de crescimento e
17
coccidiostáticos que fazem parte da formulação de rações, fazendo com que os
animais fiquem mais susceptíveis a doenças infecciosas (SHRYOCK et al. 1994).
As micotoxinas apresentam relevância como uma das fontes fornecedoras
de prejuízos com relação ao desempenho dos animais.
Wyatt (1994) apresentou alguns pontos para diminuir a contaminação por
micotoxinas: examinar as matérias primas especialmente os grãos de cereais e
leguminosas; ventilar os grãos armazenados; examinar a umidade do local do
armazenamento; verificar a presença de micotoxinas na propriedade produtora;
limpar periodicamente os equipamentos e silos da fábrica de ração; limpar os silos
das propriedades produtoras; reduzir o tempo de armazenamento das matérias
primas e rações; adicionar aditivos na dieta em caso de suspeita; não usar
produtos contaminados para os animais e controlar os insetos.
Existem métodos para avaliar a concentração de micotoxinas que são
chamados métodos cromatográficos. Entre eles se destaca a Cromatografia em
Camada Delgada (TLC), Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (HPLC) e a
Cromatografia Gasosa (GC). A cromatografia líquida de fase reversa, como
técnica de separação, determinação e análise de micotoxinas em alimentos tem
aumentado consideravelmente nos últimos anos (FRISVAD e THRANE, 1993;
SCOTT, 1995).
O Teste de ELISA é outra metodologia para determinação e analise das
micotoxinas.
2.7 UTILIZAÇÃO DOS ÁCIDOS ORGÂNICOS NO CONTROLE DE FUNGOS
O uso dos ácidos orgânicos parece inibir o desenvolvimento de fungos e
potencializar a disponibilidade de nutrientes de matérias primas e rações (PENZ
JR. et al., 1993). De acordo com Santurio (1995), a maioria dos microorganismos
cresce dentro de um enorme gradiente de pH, pois eles têm a capacidade de
estabilizar o pH interno. O autor reitera que ácidos fracos com baixo potencial de
ionização são potentes inibidores do transporte de aminoácidos por parte da
célula fúngica, pela ionização interna do citoplasma e acidificação do conteúdo
celular, impedindo a sobrevivência do microorganismo.
Krabbe et al. (1994a) em experimentos com milho armazenado em nível de
14 e 18% de umidade utilizando 0,5% de ácido propiônico aplicado no milho
18
úmido, observaram efeito positivo no controle do desenvolvimento de fungos após
62 dias de armazenagem, e as testemunhas contaminadas, tiveram redução em
seus níveis de gordura bruta. Krabbe et al. (1994b) ofereceram rações formuladas
com milho armazenado com 14 a 18% de umidade e estes últimos tiveram
aplicação de 0,5% de ácido propiônico no primeiro e 62º dia de armazenamento, e
não verificaram alterações de desempenho de frangos até 19 dias de idade,
criados em bateria, apesar da presença das aflatoxinas.
Na Tabela 7, apresenta-se a quantidade de ácidos orgânicos que deve ser
incluída para o milho armazenado em silos relacionado aos teores de umidade
(SANTURIO, 1995).
TABELA 7 - Níveis adequados e recomendados de produtos inibidores de fungos
a base de ácido propiônico (>60% de concentração) para milho
armazenado em silos.
Umidade média dos grãos
armazenados
Quantidade de ácidos
orgânicos (%)
Quantidade de ácidos
orgânicos (l/ton grãos)
11-12 0,10 1,0
13-14 0,20 2,0
15 0,25 2,5
16 0,30 3,0
17 0,40 4,0
18 0,50 5,0
Fonte: Santurio (1995)
Pela exposição apresentada na revisão de literatura, fazem-se necessários
mais estudos com relação ao controle de fungos no grão de milho, com produtos
realmente seguros, eficazes e econômicos que não causem resíduos indesejáveis
para consumo e que justifique sua aplicação no milho dando a esta cultivar
prevenção efetiva contra os fungos procurando diminuir a produção da substancia
tóxica produzida por estes microorganismos.
Trabalhos com produtos, os chamados adsorventes, que atuam no interior
do aparelho digestório das aves, tem se colocado de maneira constante no
mercado com o objetivo de eliminar para fora do organismo das aves as
micotoxinas produzidas pelos fungos, quando estas estão presentes.
O mais importante, porém, para controle de fungos em grãos de milho, é
que os trabalhos se direcionem efetivamente de forma preventiva nesta espécie
impedindo que haja o crescimento de colônias fúngicas e como resultado positivo
a diminuição das micotoxinas formadas durante o seu desenvolvimento.
19
3 METODOLOGIA
3.1 LOCAL DA PESQUISA
A pesquisa foi desenvolvida nas dependências do Laboratório de Patologia
de Sementes do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo do Setor de
Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná, no período de 19.04.2006
a 20.10.2006.
3.2 MATERIAL UTILIZADO NA PESQUISA
Para condução do experimento, utilizou-se uma amostra de milho oriundo
da cidade de Arapoti – PR, coletada em uma fábrica de ração dos Produtos
Cancela, localizada em Araucária – PR.
3.3 ANÁLISE INICIAL DA .AMOSTRA
Foi realizado exame bromatológico na amostra de grãos de milho para
verificar a umidade, proteína e extrato etéreo antes do armazenamento.
Para certificar que a amostra de grãos de milho antes do armazenamento
estava infectada por fungos e micotoxinas, foi realizada análise laboratorial para
verificação.
3.3.1 Análise bromatológica
Os resultados apresentaram para a umidade, proteína bruta e extrato
etéreo valores de 12,1%, 7,87% e 4,91 % respectivamente, antes do
armazenamento.
3.3.2 Análise para detecção de fungos e concentração de micotoxinas
A amostra de grãos de milho antes de iniciar o experimento, foi submetida
a exame de UFC (Unidade Formadora de Colônias) com a finalidade de observar
se a amostra estava infectada por colônias de fungos.
20
Para a realização desta etapa da pesquisa, os grãos de milho foram
colocados em placas de Petri com meio Sabouraud e depositados em estufa na
temperatura de 28
o
C durante o tempo de quatro dias.
A amostra de milho inicial (período zero), revelou que os grãos estavam
contaminados por Aspergillus ssp., Fusarium ssp. e Penicillium ssp., de acordo
com o crescimento das colônias de fungos vizualizadas nas placas de ensaio
enriquecidas em meio Sabouraud.
No segmento procurou-se também saber se a amostra de grãos de milho
possuía a presença de micotoxinas, principalmente as aflatoxinas que são
produzidas pela espécie Aspergillus.
Para isto, foi necessário triturar 5 gramas da amostra de grãos de milho
em um moinho de faca, peneira 1 mm, marca Willey Mill, para se obter o extrato
do grão de milho para detectar as aflatoxinas e a amostra foi pesada em uma
balança digital, com capacidade máxima de 2 kg e precisão de 0,5 g.
Com relação à presença de micotoxinas (aflatoxinas) foi utilizado o teste de
ELISA qualitativo através do aparelho marca Lionheart Diagnostics, modelo EL x
800, Universal Microplate Reader que revelou a presença de aflatoxinas não
superior a 20 ppb, nível máximo permitido.
3.4 PREPARAÇAO DAS AMOSTRAS DE GRÃOS DE MILHO.
A pesquisa iniciou no dia 19 do mês de abril e as observações como exame
bromatológico, detecção do numero de colônias fúngicas e avaliação da presença
de micotoxinas por amostra de milho foram realizadas a cada 2 meses de
armazenamento, e o primeiro período de armazenamento observado foi em 18 de
junho de 2006. O segundo e terceiro períodos de armazenamento foram
observados respectivamente em 17 de agosto e 20 de outubro.
Utilizou-se uma câmara para acondicionamento das amostras de milho,
dividida em quatro repartições, colocada em temperatura ambiente, onde foram
colocados 20 frascos com 1,5 kg de milho por frasco, cinco frascos por repartição,
os quais foram protegidos com tule preso com elástico na boca do frasco para
impedir a entrada de insetos (Figura 01).
21
FIGURA 01 – Câmara de acondicionamento das amostras de milho e visualização
do termo higrômetro de máxima e mínima.
No período de coletas das amostras de milho, foi utilizada uma balança
para pesagem marca Filizola com capacidade máxima de 2 kg e sacos plásticos
com etiquetas para coletas e identificação das amostras respectivamente.
A temperatura e umidade relativa do ar foram registradas através de um
termo higrômetro digital de máxima e mínima colocado dentro da câmara de
acondicionamento das amostras.
Todas as amostras de milho foram submetidas ao exame bromatológico
para verificar porcentagens de umidade, proteína e extrato etéreo, como também
análises micológicas e verificação de micotoxinas em relação ao início do
experimento.
O objetivo principal da pesquisa foi testar um produto para controlar o
desenvolvimento de fungos e foi eleito uma associação de ácidos orgânicos,
administrado nas amostras de milho através de uma seringa descartável de 3 ml
em camadas, onde em cada camada de milho, o frasco era fortemente agitado,
após a aplicação do produto, para se conseguir uma boa homogeneização das
amostras.
Foram realizados cinco tratamentos da associação de ácidos orgânicos
nas amostras de grãos de milho para verificar sua real efetividade no controle
fúngico.
22
3.5 DETECÇÃO DE FUNGOS NOS GRÃOS DE MILHO
A metodologia empregada para esterilizar o milho e inoculação fúngica foi
adaptada de uma técnica laboratorial (PITT et al. 1992).
A esterilização da superfície dos grãos de milho foi realizada através da
imersão das amostras em solução de hipoclorito de sódio a 2% por três vezes
seguidas de três enxágües em água esterilizada, empregando-se essa forma de
esterilização para minimizar a interferência de contaminação do milho.
A quantificação do numero de grãos de milho infectados foi realizado
adaptando a metodologia preconizada por Samson et al. (1996) na qual foi
colocada 10 grãos de milho no meio de Agar Sabouraud Dextrose 4%
suplementado com tetraciclina (100 mg/litro) em placa de Petri, contendo 10 grãos
de milho cada, e cada amostra teve cinco repetições.
O período de incubação foi de quatro dias a 28
o
C. Após o período de
incubação, as colônias fúngicas foram identificadas e o numero de grãos de milho
infectados foram contabilizados em nível de gênero baseando-se na morfologia
das colônias e identificação
microscópicas das estruturas de frutificação.
3.6 ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE AFLATOXINAS
Para se conseguir o extrato do milho e realizar o teste de ELISA para
verificação da presença de micotoxinas, especificamente as aflatoxinas, foram
necessárias 5 gramas por amostra de milho triturado colocada em frasco onde foi
adicionado 25 ml de metanol a 70%.
Após o frasco foi agitado vigorosamente por três minutos e em seguida o
extrato obtido foi filtrado em filtro Whatmann n
o
1.
Para realização do teste para micotoxinas foram utilizados 50 µL do
filtrado obtido.
3.7 TRATAMENTOS E AVALIAÇÃO.
A associação de ácidos orgânicos utilizada foi de um produto pronto da
empresa Allthec para uso sem necessidade de qualquer diluição e pouco volátil
(5%). O produto possuía ácido propiônico (grande atividade antifúngica), o ácido
acético (mais efetivo contra leveduras e bactérias e menos para os fungos), o
23
ácido benzóico (mais efetivo no controle de leveduras e bactérias e menos para
os fungos) e o ácido sórbico (com ação contra leveduras e fungos e pouco ativo
contra bactérias).
Todos estes ácidos encontram-se tamponados na forma de sais de amônio
na formulação do produto.
As amostras de milho foram tratadas segundo a recomendação do
fabricante da associação de ácidos orgânicos relacionando as concentrações
crescentes.
As concentrações administradas da associação de ácidos orgânicos em
uma única aplicação seguiram a seguinte ordem: 0,0 Litros por tonelada de milho
(L.t
–1
);
1,0 Litros por tonelada de milho (L.t
-1
); 1,5 Litros por tonelada de milho
(L.t
-1
); 2,0 Litros por tonelada de milho (L.t
-1
)e 2,5 Litros por tonelada de milho (L.
t
-1
).
Estas concentrações foram aplicadas no milho armazenado e as
avaliações da eficiência da associação de ácidos orgânicos foram realizadas nos
períodos de 2, 4 e 6 meses de armazenamento.
A cada 2 meses foram realizadas coletas para o exame bromatológico,
micológico e analise de micotoxinas. Foram coletadas 5 amostras de milho de
cada tratamento totalizando 20 amostras, sendo retirado 60 gramas por amostra
de milho.
24
3.8 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Os tratamentos
representaram o arranjo fatorial 5 x 3 sendo 5 concentrações da associação de
ácidos orgânicos utilizados (0,0; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 L.t
-1
do milho armazenado) e 3
periodos de armazenamento do milho (2, 4 e 6 meses) e 4 repetições em um total
de 60 amostras.
Para a quantificação do numero de grãos de milho infectados, o
delineamento experimental foi inteiramente casualizado, no total de 20 amostras,
onde cada amostra teve 5 placas de Petri como repetição.
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste LSD (Least Significant Difference
Test), utilizando o Programa MSTAT, Michigan Statistics.
Os dados obtidos da concentração de aflatoxinas foram transformados em
raiz quadrada multiplicado por 10 para a separação de médias.
25
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 EXAME BROMATOLÓGICO ENVOLVENDO UMIDADE, PROTEÍNA BRUTA
E EXTRATO ETÉREO
Foram analisadas as variações de umidade, proteína bruta e extrato etéreo
para ser verificado o efeito dos tratamentos realizados de acordo com os períodos
de armazenamento, 2, 4 e 6 meses (Anexo II).
4.1.1 Umidade
Houve interação significativa entre os fatores testados para a variável
umidade (Anexo III).
Nas diferentes concentrações da associação ácidos orgânicos observou-se
que aos 2 e 4 meses as concentrações da associação de ácidos orgânicos 0,0 e
1,0 L.t
-1
diferenciaram do armazenamento aos 6 meses. Nas concentrações de
1,5, 2,0 e 2,5 L.t
-1
os valores médios da porcentagem de umidade aos 4 meses
diferenciaram dos valores médios da porcentagem de umidade aos 2 e 6 meses.
Nos tempos de armazenamento em relação às diferentes concentrações da
associação de ácidos orgânicos, se observou que aos 2 meses o valor médio da
porcentagem de umidade na concentração de 1,5 da associação de ácidos
orgânicos diferenciou das concentrações de 0,0, 1,0 e 2,5 L.t
-1
. Aos 4 e 6 meses
não houve diferença significativa entre os valores médios da porcentagem de
umidade (Tabela 8).
26
TABELA 8 – Valores médios da porcentagem da umidade de grãos de milho
submetidos às diferentes concentrações da associação de ácidos
orgânicos nos períodos de armazenamento e os períodos de
armazenamento em relação às concentrações da associação de
ácidos orgânicos (A.A.O. L.t
-1
).
PERÍODOS DE ARMAZENAMENTO (meses)
A.A.O (L.t
-1
) 2 4 6
0,0 12,4 bc B 11,3 a B 12,9 a A
1,0 12,1 c B 11,3 a B 12,8 a A
1,5 13,1 a A 11,8 a B 12,6 a A
2,0 12,6 ab A 11,2 a B 12,9 a A
2,5 12,5 bc A 11,4 a B 12,7 a A
CV (%) = 2,88
Médias com letras minúsculas iguais, na mesma coluna, e letras maiúsculas iguais na mesma linha, não
foram estatisticamente diferentes pelo Teste LSD (P<0,05)
No experimento realizado, observou-se que os teores de umidade do grão
de milho não tiveram na maioria das medias observadas uma elevação acima de
13% durante os 3 períodos de armazenamento diante das diferentes
concentrações da associação de ácidos orgânicos, o que faz com que o grão de
milho tenha um desenvolvimento de fungos menos acentuado .
O teor de umidade dos grãos de milho é o principal fator que direciona as
qualidades do produto armazenado, sendo de relevante importância se conhecer
o teor de umidade na colheita visando não permitir a ocorrência de consideráveis
perdas (PUZZI, 1986). A umidade quando os grãos de milho chegam ao estado
de maturação, gira em torno de 18 a 25% para colheita mecânica, e após
secagem a umidade dos grãos em nível ideal de armazenamento é de 12 a 13%
(GERAGE et al., 1982).
As colônias fúngicas precisam para crescer valores de umidade
normalmente acima de 13% e quando ocorre o desenvolvimento dos fungos nos
grãos de milho armazenados, há uma redução no valor energético do milho,
compromete os níveis de vitaminas e ocasiona prejuízos aos níveis de proteínas e
aminoácidos. (TINDALL, 1983)
Um dos fatores relevantes para evitar a contaminação por fungos é a
umidade do milho, uma vez que esta condição não se apresenta de maneira
constante, desde sua colheita até o seu processamento (LAZZARI, 1997).
Experimentos com milho armazenado em nível de 14 e 18% de umidade
utilizando 0,5% de ácido propiônico aplicado no milho úmido foi observado efeito
27
positivo no controle do desenvolvimento de fungos após 62 dias de
armazenagem, e as testemunhas contaminadas, tiveram redução em seus níveis
de gordura bruta (KRABBE et al., 1995).
4.1.2 Proteína bruta
Com relação ao tratamento com diferentes concentrações da associação
de ácidos orgânicos, foi observado que não houve diferença significativa (Anexo
IV) com relação às médias da porcentagem da proteína bruta (Tabela 9).
TABELA 9 - Valores médios da porcentagem da proteína bruta de grãos de milho
submetidos ao tratamento com diferentes concentrações da
associação de ácidos orgânicos (A.A.O. L.t
-1
) em relação aos três
períodos de armazenamento (2, 4 e 6 meses).
PERÍODOS DE ARMAZENAMENTO
A.A.O.
(L. t
-1
)
2 meses 4 meses 6 meses
0,0 7,7 7,8 7,8
1,0 8,1 8,1 7,8
1,5 7,8 8,0 7,8
2,0 7,9 8,2 7,9
2,5 7,9 7,9 8,4
Na pesquisa realizada observou-se que a alteração dos valores da
proteína bruta foi pequena considerando as diferentes concentrações da
associação dos ácidos orgânicos diante dos 3 períodos de armazenamento.
O ácido propiônico tamponado mostrou uma característica positiva evitando
perdas nas porcentagens de proteína bruta (KRABBE et al., 1994a).
4.1.3 Extrato etéreo
O extrato etéreo apresentou uma interação significativa observado no
anexo V.
O extrato etéreo não diferiu entre os tempos de armazenamento na
testemunha e na concentração de 1,5 L.t
-1
, enquanto que nas concentrações de
1,0 e 2,0 L.t
-1
, o extrato etéreo aos 4 meses de armazenamento foi superior
quando comparado aos 2 meses de armazenamento e na concentração de 2,5
L.t
-1
, o extrato etéreo foi superior aos 2 meses de armazenamento quando
comparado com 4 e 6 meses.
28
Aos 2 meses de armazenamento, os valores médios do extrato etéreo na
concentração de 2,5 L.t
-1
foram superiores as demais concentrações. Aos 6
meses de armazenamento, a concentração de 2,5 L.t
-1
foi superior a testemunha
e não diferiu das demais concentrações (Tabela 10).
TABELA 10 – Valores médios da porcentagem do extrato etéreo de grãos de milho
nas diferentes concentrações da associação de ácidos orgânicos
em relação aos períodos de armazenamento e os períodos de
armazenamento diante de cada concentração da associação de
ácidos orgânicos (A.A.O L.t
-1
).
PERÍODOS DE ARMAZENAMENTO (meses)
A.A.O. (L.t
-1
) 2 4 6
0,0 4,7 b A 4,7 c A 4,5 b A
1,0 4,6 b B 5,6 a A 4,9 ab B
1,5 4,8 b A 4,9 bc A 4,9 ab A
2,0 4,7 b B 5,2 ab A 4,9 ab AB
2,5 5,8 a A 4,6 c B 5,0 a B
CV (%) = 4,74
Médias com letras minúsculas iguais, na mesma coluna, e letras maiúsculas iguais na mesma linha, não
foram estatisticamente diferentes pelo Teste LSD (P<0,01)
A pesquisa mostrou que o extrato etéreo em relação aos períodos de
armazenamento em relação a cada concentração da associação de ácidos
orgânicos, teve uma conservação melhor aos 2 meses na concentração de 2,5
L.t
-1
e aos 4 meses nas concentrações de 1,0, 1,5 e 2,0 L.t
-1
da associação de
ácidos orgânicos.
Aos 6 meses de armazenamento, a concentração de 2,5 L.t
-1
da associação
de ácidos orgânicos teve uma conservação melhor do extrato etéreo em relação à
testemunha.
As observações do experimento comprovam os efeitos provocados na
melhor conservação do extrato etéreo quando é administrado no milho produto
contendo acido propiônico segundo pesquisa já realizada (PENZ JR. et al., 1993).
29
O efeito da inclusão do ácido propiônico em milho armazenado por 60 dias
e com alta umidade, no início do período de armazenamento, melhora as
características do milho, condições de aproveitamento da energia metabolizável e
extrato etéreo (KRABBE et al., 1995).
Bartov (1982) observou que quando há desenvolvimento de fungos nos
grãos de milho, há perdas nos valores de extrato etéreo e energia metabolizável,
pois há danos na fração gordurosa do grão ocasionada pelos fungos. Os fungos
como seres vivos necessitam de nutrientes para o seu desenvolvimento.
4.2 DETECÇÃO E DESENVOLVIMENTO DE FUNGOS
O desenvolvimento de fungos teve um comportamento semelhante nos três
períodos avaliados (Figura 02), mostrando um decréscimo de acordo com o
aumento das concentrações da associação de ácidos orgânicos administrados
(0,0 L.t
-1
1,0 L.t
-1
; 1,5 L.t
-1
; 2,0 L.t
-1
; 2,5 L.t
-1
), verificando-se sempre que na
testemunha o numero de grãos de milho infectados por fungos foi maior.
30
01
02
03
04
05
FIGURA 02 – Placas de Petri mostrando o desenvolvimento de fungos em grãos
de milho nas concentrações 01= testemunha (0,0 L.t
-1
), 02 (1,0 L.t
-
1
), 03 (1,5 L.t
-1
), 04 (2,0 L.t
-1
) e 05 (2,5 L.t
-1
) da associação de
ácidos orgânicos aos 2, 4 e 6 meses de armazenamento.
1,5L.t
-1
1,0L.t
-1
2,0L.t
-1
2,5L.t
-1
0,0L.t
-1
31
Os níveis das concentrações estabelecidas como inibidoras para o controle
do crescimento dos fungos já tinham sido pesquisadas em milho armazenado em
silos (SANTURIO, 1995), o que foi comprovado nas observações com as
concentrações da associação de ácidos orgânicos estabelecidas durante o
desenvolvimento da pesquisa.
4.3 ANÁLISE DO CRESCIMENTO DE FUNGOS DAS ESPÉCIES OBSERVADAS
O crescimento de fungos foi avaliado calculando o total da porcentagem de
fungos por grão de milho infectado das espécies que foram observadas,
Aspergillus ssp, Penicilium ssp e Fusarium ssp., sendo que o objetivo da pesquisa
foi específica para o Aspergillus ssp.
Houve interação significativa na porcentagem do crescimento de fungos
analisada (Anexo VI).
Nos tempos de armazenamento, foi observado que a porcentagem de
fungos diante das concentrações da associação de ácidos orgânicos, aos 2
meses de armazenamento, as concentrações 1,0 e 1,5 L.t
-1
não foram diferentes,
mas diferenciaram da testemunha e das concentrações 2,0 e 2,5 L.t
-1
, as quais
apresentaram valores médios da porcentagem do crescimento de fungos
menores.
Aos 4 meses de armazenamento, os valores médios da porcentagem de
fungos na concentração de 2,5 L.t
-1
diferenciaram das demais concentrações da
associação de ácidos orgânicos. Aos 6 meses de armazenamento, a
concentração de 2,5 L.t
-1
foi igual à de 2,0 L.t
-1
, mas diferenciou das demais.
Comparando as concentrações da associação de ácidos orgânicos nos 3
períodos de armazenamento, verificou-se que a testemunha (na concentração de
0,0 L.t
-1
), no período de 2 meses de armazenamento diferenciou dos períodos de
4 e 6 meses. Nos períodos de armazenamento, 2 e 4 meses, foi observado que
nas concentrações de 1,0, 1,5 e 2,0 L.t
-1
da associação de ácidos orgânicos
houve diferença quando foi comparado com o período de 6 meses. Nos 3
períodos de armazenamento, quando foi utilizada a concentração de 2,5 L.t
-1
da
associação de ácidos orgânicos, a porcentagem média do crescimento de fungos
não apresentou diferença significativa (Tabela 11).
32
TABELA 11 - Valores médios da porcentagem de todas as espécies de fungos
encontradas no milho, Aspergillus ssp., Penicilum ssp, Fusarium
ssp. em três períodos de armazenamento submetidos ao
tratamento com diferentes concentrações da associação de ácidos
orgânicos e as concentrações da associação de ácidos orgânicos
(A.A.O. L.t
-1
) diante dos períodos de armazenamento
PERÍODOS DE ARMAZENAMENTO (meses)
A.A.O (L.t
-1
) 2 4 6
0,0 71.57 a B 79,00 a A 80,50 a A
1,0 51.50 b A 51,50 b A 44,50 b B
1,5 50,75 b A 49,75 b A 41,25 b B
2,0 44,75 c A 47,00 b A 34,50 c B
2,5 34,50 d A 32,25 c A 32,25 c A
CV (%) = 5,30
Médias com letras minúsculas iguais na mesma coluna, e letras maiúsculas iguais na mesma linha, não
foram estatisticamente diferentes pelo Teste LSD (P<0,01).
O experimento demonstrou que aumentando as concentrações da
associação dos ácidos orgânicos, a porcentagem do numero de colônias de
fungos infectando os grãos de milho diminuíram comprovando pesquisas
anteriormente realizadas conforme referencias dos autores abaixo mencionados.
O uso dos ácidos orgânicos parece inibir o desenvolvimento de fungos e
potencializar a disponibilidade de nutrientes de matérias primas e rações (PENZ
JR. et al., 1993).
A inclusão do ácido propiônico foi efetiva para manter as características do
milho e reduzir o crescimento dos fungos (KRABBE et al., 1994a).
Os ácidos orgânicos têm-se mostrado eficientes durante a
armazenagem, pois agem diminuindo o pH do conteúdo celular do grão de milho,
tornando-o impróprio para o crescimento fúngico (KRABBE, 1994b).
4.4 ANÁLISE DA ESPÉCIE Aspergillus .
O fungo de interesse do trabalho estudado foi do gênero Aspergillus, que
apareceu sempre em maior quantidade infectando os grãos de milho e pode-se
observar que todas as concentrações da associação de ácidos orgânicos tiveram
atuação na redução da porcentagem do numero das colônias fúngicas do
Aspergillus quando comparadas com a testemunha na concentração 0,0 L.t
-1
(Tabela 12).
33
TABELA 12 - Valores médios da porcentagem de grãos de milho infectados pelo
fungo do gênero Aspergillus submetidos à diferentes
concentrações da associação de ácidos orgânicos (A.A.O L.t
-1
).
A.A.O. (L.t
-1
)
PORCENTAGEM DO Aspergillus
0,0 73 a
1,0 48 b
1,5 52 b
2,0 52 b
2,5 50 b
CV (%) = 13,58
Medias com letras iguais, na coluna, não foram estatisticamente diferentes pelo Teste LSD (P<0,01)
A pesquisa novamente demonstrou que à medida que foi aumentada a
concentração da associação dos ácidos orgânicos a porcentagem do fungo do
gênero Aspergillus diminuiu comprovando que os ácidos orgânicos atuam
diretamente no grão de milho controlando o desenvolvimento de colônias de
fungos existentes (PENZ JR. et al, 1993).
No Brasil, um estudo realizado por Castro et al. (1995) demonstrou que os
fungos mais comumente encontrados em grãos e cereais são Fusarium spp.,
Penicillium ssp. e Aspergillus ssp., entre outros, de maneira que a partir destes,
dezenas de micotoxinas já foram detectadas em cereais destinados ao consumo
animal, o que configurou os resultados encontrados na pesquisa.
Nos períodos de armazenamento não houve diferença nas médias de
porcentagem do crescimento de fungos do gênero Aspergillus diante das
concentrações da associação de ácidos orgânicos estabelecidas, 0, 1,0, 1,5, 2,0 e
2,5 L.t
-1
(Tabela 13).
TABELA 13 - Valores médios da porcentagem dos grãos de milho infectados pelo
fungo do gênero Aspergillus nos três períodos de armazenamento 2,
4 e 6 meses, em relação as concentrações da associação de ácidos
orgânicos utilizadas (0, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 L.t
-1
).
TEMPOS DE ARMAZENAMENTO (meses)
PORCENTAGEM DO Aspergillus
2 58,9 a
4 60,2 a
6 56,8 a
CV (%) = 13,58
Médias com letras iguais, na coluna, não foram estatisticamente diferentes pelo Teste LSD (P<0,01)
34
Foi verificado no trabalho que a inclusão da associação dos ácidos
orgânicos fez com que o número de grãos de milho infectados pelas colônias do
fungo Aspergillus se mantivesse estável nos três períodos de armazenamento.
4.5 IDENTIFICAÇÃO DO FUNGO Aspergillus ssp
O fungo Aspergillus grupo flavus foi observado isolando a colônia em
lamina corada com lactofenol azul de algodão (Figura 03).
FIGURA 03 – Visualização em microscópio óptico, aumento 40 x do fungo
Aspergillus ssp
.
4.6 ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE AFLATOXINAS
Com relação à concentração média de aflatoxinas produzidas pelo fungo
do gênero Aspergillus, avaliada pela metodologia do Teste de ELISA, foi
observado que o armazenamento por 2 meses foi significativamente superior ao
armazenamento por 4 e 6 meses (Tabela14).
TABELA 14 - Valores médios da concentração de aflatoxinas em grãos de milho
infectados nos três períodos de armazenamento.
TEMPOS DE ARMAZENAMENTO (meses) CONCENTRAÇÃO DE AFLATOXINAS (ppb)
2 3,246 a
4 2,638 b
6 2,706 b
CV (%) = 13,73
Médias com letras iguais, na coluna, não foram estatisticamente diferentes pelo Teste LSD (P<0,01).
35
A concentração de aflatoxinas diante dos tratamentos realizados teve uma
diferença significativa e foi verificado que na dosagem de 2,5 L.t
-1
da
associação
de ácidos orgânicos a concentração desta toxina não foi estatisticamente
diferente ao da testemunha e da concentração 1,0 L.t
-1
, mas a concentração de
2,5 L.t
-1
diferenciou das concentrações de 1,5 e 2,0 L.t
-1
da associação de ácidos
orgânicos (Tabela 15).
TABELA 15 – Valores médios da concentração de aflatoxinas nos três períodos de
armazenamento em grãos de milho submetidas ao tratamento com
diferentes concentrações da associação de ácidos orgânicos
(A.A.O. L.t
-1
).
A.A.O. (L.t
-1
) CONCENTRAÇÃO AFLATOXINAS (ppb)
0,0 3,235 ab
1,0 3,265 ab
1,5 3,295 a
2,0 3,397 a
2,5 3,038 b
CV (%) = 13,73
Médias com letras iguais, na coluna, não foram estatisticamente diferentes pelo Teste LSD (P<0,01)
Foi verificado na pesquisa que o índice médio da concentração de
aflatoxinas nos três períodos de armazenamento foi sempre menor que o nível
máximo permitido (20 ppb).
O trabalho produzido demonstrou que a associação de ácidos orgânicos
utilizados como produto inibidor, fez com que as aflatoxinas não tivessem um
aumento no transcorrer de toda a pesquisa.
A observação acima não concorda com a afirmação de que quando a
contaminação de micotoxinas já estiver presente, o uso de produtos inibidores
para o desenvolvimento de fungos não tem a devida atuação na destruição das
mesmas (KESHAVARZ, 1987).
A mistura de culturas fúngicas pode tanto estimular quanto inibir a
formação de micotoxinas, podendo, até mesmo, determinar a degradação de
algumas micotoxinas formadas (RAMAKRISHNA et al., 1996). Nas observações
do trabalho houve o desenvolvimento de três colônias fungicas.
Na pesquisa realizada, foi observado o desenvolvimento das colônias de
fungos que poderiam estar presentes infectando os grãos de milho da amostra
coletada, estudar especificamente o fungo da espécie Aspergillus e verificar a
36
evolução de suas toxinas, as aflatoxinas, não se preocupando efetivamente se
havia comprometimento das micotoxinas presentes nos animais.
O complemento do trabalho teve como avaliação principal verificar a
eficiência de uma associação de ácidos orgânicos no controle do crescimento de
colônias fúngicas nos grãos de milho infectados.
37
5 CONCLUSÃO
De acordo com as condições em que a pesquisa foi realizada e os
resultados obtidos, conclui-se que:
1) A associação de ácidos orgânicos foi eficiente em diminuir o número
total de colônias fúngicas encontradas infectando os grãos de milho
armazenados.
2) A concentração de 2,5 L.t
-1
proporcionou maior controle do crescimento
de fungos com 2 e 4 meses de armazenamento.
3) Nos 3 períodos de armazenamento, 2, 4 e 6 meses, não houve
alteração na concentração de aflatoxinas, independente da
concentração de ácidos orgânicos.
4) Aos 2 meses de armazenamento, na concentração de 2,5 L.t
-1
da
associação de ácidos orgânicos, o extrato etéreo teve uma
conservação melhor.
38
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46
ANEXOS
47
ANEXO I – Dados relativos à temperatura média, máxima e mínima; umidade
relativa média, máxima e mínima durante o armazenamento do
milho na câmara de amostras.
Data Temperatura média
T.Max. T.Min
Umidade relativa do ar (média)
U.Max U.Min
19.04.05
22,1 26,7 22,1
72 81 59
26.04.05
25,7 29,1 23,2
61 72,1 55,7
03.05.05
16,4 26,7 16,3
79 81 59
10.05.05
18,2 26,7 16,3
79 82 59
17.05.05
21,3 26,7 16,3
72 82 59
20.05.05
21,8 26,7 16,3
79 82 59
27.05.05
16,4 26,4 16,0
76 84 56
31.05.05
16,6 26,7 16,0
82 84 56
08.06.05
18,9 26,7 16,0
78 88 56
15.06.05
16,3 26,5 16,0
77 84 56
22.06.05
16,4 26,7 16,3
78 84 56
28.06.05
16,3 26,7 15,0
80 88 56
05.07.05
19,1 26,7 15,0
77 88 56
20.07.05
13,5 26,7 12,8
72 88 56
29.07.05
15,0 26,7 12,4
84 91 56
05.08.05
16,2 26,5 13,1
82 88 56
16.08.05
19,1 26,7 13,5
77 83 57
19.08.05
19,3 26,7 12,4
78 99 56
26.08.05
19,1 26,4 12,8
77 95 59
01.09.05
16,2 26,7 16,0
82 88 56
06.09.05
13,5 26,4 15,0
78 97 57
14.09.05
13,3 26,7 12,4
82 91 49
22.09.05
13,5 26,7 16,0
77 95 58
28.09.05
20,1 25,8 13,5
89 92 50
05.10.05
19,8 26,7 12,4
90 95 49
11.10.05
20,4 26,7 12,4
83 95 49
20.10.05
20,2 26,7 12,4
75 95 49
25.10.05
21,2 26,7 12,4
77 95 49
03.11.05
19,8 26,4 12,5
77 97 49
10.11.05
21,2 26,7 12,4
77 95 49
48
ANEXO II - Valores médios da umidade, proteína bruta e extrato etéreo em
amostras de milho em três períodos de armazenamento (2, 4 e 6
meses).
UMIDADE PROTEÍNA BRUTA EXTRATO ETÉREO
2 meses
4 meses
6 meses
2 meses
4 meses
6 meses
2 meses
4 meses
6 meses
12,4 11,3 12,9 7,7 7,8 7,8 4,7 4,7 4,5
12,1 11,3 12,9 8,1 8,1 7,8 4,6 5,7 4,9
13,1 11,1 12,6 7,8 8,0 7,8 4,8 4,9 4,9
12,7 11,2 12,9 7,9 8,2 7,9 4,7 5,2 4,9
12,5 11,4 12,7 7,9 7,9 8,4 5,8 4,6 5,0
ANEXO III – Análise de variância da porcentagem de umidade
Valor
K
Fator GL Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
Valor F Probabilidade
2 Tratamentos (A) 4 0.271 0.068 0.5481 ns
4 Tempos de
armazenamento (B)
2 26.785 13.393 108.4833 0.0000
5 AB 8 2.444 0.305 2.4746 0.0258
-7 Erro 45 5.555 0.123
Total 59 35.056
Coeficiente de Variaçao: 2.88%
ANEXO IV – Análise de variância da proteína bruta
Valor
K
Fator GL Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
Valor F Probabilidade
2 Tratamentos (A) 4 0.704 0.176 2.0893 0.0979
4 Tempos de
armazenamento (B)
2 0.192 0.096 1.1381 0.3295
5 AB 8 1.064 0.133 1.5773 0.1586
-7 Erro 45 3.793 7.034
Total 59 5.753
Coeficiente de Variaçao: 3.65%
A
NEXO V – Análise de variância do extrato etéreo
Valor
K
Fator GL Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
Valor F Probabilidade
2 Tratamentos (A) 4 1.661 0.415 7.5457 0.0001
4 Tempos de
armazenamentos (B)
2 0.218 0.109 1.9769 0.1503
5 AB 8 5.120 0.640 11.6313 0.0000
-7 Erro 45 2.476 0.055
Total 59 9.474
Coeficiente de Variaçao: 4.74%
49
ANEXO VI – Análise de variância da porcentagem de fungos
Valor
K
Fator GL Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
Valor F Probabilidade
2 Tratamentos (A) 4 12979.132 3244.783 461.2946 0.0000
4 Tempos de
armazenamento (B)
2 288.172 144.086 20.4840 0.0000
5 AB 8 593.985 74.248 10.5555 0.0000
-7 Erro 45 316.534 7.034
Total 59 14177.823
Coeficiente de Variaçao: 5.30%
ANEXO VII – Análise de variância da porcentagem do Aspergillus
Valor
K
Fator GL Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
Valor F Probabilidade
2 Tratamentos (A) 4 4850.900 1212.725 21.4959 0.0000
4 Tempos de
armazenamento (B)
2 1354.233 677.117 12.0021 0.0001
5 AB 8 839.100 104.888 1.8592 0.0907
-7 Erro 45 2538.750 56.417
Total 59 9582.983
Coeficiente de Variaçao: 13.58%
ANEXO VIII – Análise de variância da concentração de aflatoxinas (dados
transformados pela raiz quadrada*10)
Valor
K
Fator GL Soma dos
Quadrados
Quadrado
Médio
Valor F Probabilidade
2 Tratamentos (A) 4 0.812 0.203 1.3146 0.2790
4 Tempos de
armazenamento (B)
2 4.442 2.221 14.3781 0.0000
5 AB 8 0.961 0.120 0.777 ns
-7 Erro 45 6.951 0.154
Total 59 13.165
Coeficiente de Variaçao: 13.73%
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