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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE CEPAS
DE Saccharomyces cerevisiae UTILIZADAS NA FABRICAÇÃO DA
CACHAÇA DE ALAMBIQUE
AUTORA: MARISTELA DE ARAÚJO VICENTE
ORIENTADOR: PROF. Dr. ROGELIO LOPES BRANDÃO
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas do
Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Ouro Preto, como parte integrante dos
requisitos para a obtenção do Título de
Doutor em Ciências Biológicas, área de
concentração: Biologia Molecular.
OURO PRETO
2007
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Catalogação: [email protected]
V633c Vicente, Maristela de Araújo.
Caracterização molecular e bioquímica de cepas de Saccharomyces
cerevisiae utilizadas na fabricação de cachaça de alambique [manuscrito] /
Maristela de Araújo Vicente. - 2007.
xvi, 124 f.: il., color; graf.; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Rogelio Lopes Brandão.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas.
Área de concentração: Biologia molecular.
1. Saccharomyces cerevisiae - Teses. 2. Cachaça - Teses. 3. Bebidas
fermentadas - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU:
663.51
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II
Trabalho desenvolvido no laboratório de Biologia Celular e Molecular do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, sob a
orientação do Prof. Dr. Rogelio Lopes Brandão, com auxílio financeiro da Universidade
Federal de Ouro Preto (UFOP) e apoio da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de
Pessoal do Ensino Superior (CAPES) e da Universidade Federal do Espírito Santo
(UFES).
Dedicatória
III
“O primeiro passo na busca da
felicidade é o aprendizado”
Sua Santidade, o Dalai Lama
Dedico este trabalho aos meus pais,
Vital e Maria, e meus irmãos Claudio, Vania,
Silvana (In memorian), Patrícia e André, e
sobrinhos, Claudio Junio, Carla Cristina,
Marcelo e Vitor.
Homenagem
IV
HOMENAGEM
Minas não é palavra montanhosa.
É palavra abissal. Minas é dentro
e fundo.
As montanhas escondem o que é Minas.
No alto mais celeste, subterrânea,
é galeria vertical varando o ferro
para chegar ninguém sabe onde.
Ninguém sabe Minas. A pedra
o buriti
a carranca
o nevoeiro
o raio
selam a verdade primeira, sepultada
sem eras geológicas de sonho.
Só mineiros sabem. E não dizem
nem a si mesmos o irrevelável segredo
chamado Minas
“A Palavra Minas”
Carlos Drummond de Andrade
À Ouro Preto por sua beleza e mistérios que nos convidam a aprender sobre nós
mesmos. Ouro Preto é para poucos. Para olhares atentos, existe sempre algo de novo a
descobrir em suas ladeiras e fascinantes casas mineiras.
Agradecimentos
V
Agradecimentos
Agradeço a Deus pela presença constante em minha vida, pelo amor
incondicional, e oportunidade de aprender a cada novo dia.
A Universidade Federal de Ouro Preto – UFOP por minha formação acadêmica
e pessoal.
Ao Dr Rogelio Brandão, pelo exemplo de pesquisador, por seu rigor científico,
persistência e por esta oportunidade.
Ao Dr Mauricio Coutrim, não somente pela dedicação e estímulo, mas pela
amizade e apoio que muito contribuíram para minha formação; pelo exemplo de caráter
e profissionalismo que tanto admiro e respeito.
Ao Dr Luciano Fietto por toda ajuda, apoio e incentivo.
Ao Dr Ieso de Castro pelo apoio e pelos ensinamentos diários.
Ao Dr Jacques R. Nicoli pelo apoio, incentivo e sábias palavras.
A Dra Juliana Fietto pelas longas harmoniosas e educativas horas de trabalho,
pela palavra sempre sincera, equilibrada e indispensável em todos os momentos; e pela
amizade e apoio.
Ao Dr Marcelo e Dra Lucinha Pedrosa pelo apoio e amizade, deliciosos
momentos de aprendizagem, pelo exemplo de família, profissionalismo e caráter. Meus
sinceros agradecimentos e admiração.
Aos amigos Geisa, Rogério, Claudia Dias, Cristina, Renata, Fernanda, Totola,
Juliana Boechat, Gil, Kátia, Val, Jaila, Anamaria e Lisvane, pelo exemplo de garra,
determinação, humildade, amizade sincera e valiosa, pelo apoio em todos os momentos
desta caminhada.
Agradecimentos
VI
A minha querida e estimada amiga Nilza e família, uma verdadeira companheira
de longas jornadas, “nas alegrias e nas tristezas”, me ensinando a ser uma pessoa
melhor. Obrigada por todos os maravilhosos encontros e despedidas que tivemos nos
últimos tempos.
A minha querida amiga Cida pelo apoio incondicional, palavra amiga,
sensibilidade de estar presente nos momentos mais importantes, amizade e sorriso que
fizeram minha estadia no NUPEB uma alegria.
A todos os amigos do laboratório LBCM pela harmoniosa convivência,
aprendizado diário, amizade, apoio e carinho; a todos minha admiração e respeito.
Aos professores do NUPEB, Luis Carlos, Milton, Renata Guerra, Marta,
Teresinha, Elísio, Deo, Claudia, Babá, Simone, Alexandre e George, por todo apoio e
atenção, carinho, amizade, exemplo, palavra amiga e sincera que muito contribuíram
para minha formação.
Aos técnicos e funcionários da UFOP que muito contribuíram direta e
indiretamente para este trabalho. Aos ouropretanos pela generosa acolhida.
A Universidade Federal do Espírito Santo – UFES pela oportunidade e apoio
para a realização desse trabalho. Aos técnicos e funcionários da UFES que muito
contribuíram direta e indiretamente para este trabalho.
Ao Dr Carlos Redins, Dr Eustáquio Vinicius R. Castro e Dra Edna Medeiros
pelo apoio, exemplo, incentivo e oportunidade.
Ao Msc. Julio César Magalhães Dias pelo incentivo, oportunidade e
importantíssimo apoio.
Agradecimentos
VII
Agradecimento especial
A Vania Vicente por todo carinho, apoio, gestos de solidariedade, exemplo,
amizade e incentivo, fundamentais para que esta obra fosse realizada.
A Pedro Fortes por todo incentivo, indispensável apoio e amizade e por acreditar
que esse sonho pudesse ser realizado.
A Sra. Edwiges, Fatinha, Zezé e família, pela acolhida sempre fraterna, pelas
longas horas de apoio desde o início desta caminhada “nas alegrias e nas tristezas”; pelo
incentivo, amizade e aprendizado. “Amigos não vão embora, se ausentam!”
Resumo
VIII
Resumo
Com o objetivo de caracterizar molecularmente a cepa Saccharomyces cerevisiae
LBCM 427, selecionada a partir de dornas de fermentação de cachaça, utilizaram-se várias
metodologias de análise de polimorfismo de DNA para permitir a discriminação entre esta e as
cepas presentes no local de origem. Os resultados demonstraram que RAPD-PCR, mtDNA, e
PCR utilizando primers complementares a região do gene COXI não foram suficientes para uma
boa diferenciação entre a cepa LBCM 427 e cepas isoladas na mesma dorna de fermentação. Por
outro lado, o uso da cariotipagem para diferenciação com base no perfil cromossomal permitiu
uma nítida distinção entre o grupo de cepas analisadas. Estes resultados demonstram que o uso
de cepas iniciadoras requer um acompanhamento com o uso combinado de métodos
bioquímicos e moleculares. A cepa parenteral LBCM 427, foi segregada e as tétrades analisadas
quanto a estabilidade fisiológica e bioquímica em passagens sucessivas. Avaliaram-se os
seguintes parâmetros floculação, não produção de H
2
S, resistência a 5,5´,5´´-trifluoro-DL-
leucina (TFL) e cerulenina, crescimento em diferentes condições de pressão osmótica e de
temperatura. Os resultados demonstraram que nenhuma cepa segregante reuniu todas as
características da cepa parental. Diante disto, foi selecionada uma cepa segregante que atendia
ao critério de resistência a TFL e cerulenina para analisar o comportamento em uma
fermentação em caldo de cana e possíveis mutações no gene LEU4 que transcreve para a α-
isopropilmalato sintase. Esta segregante não foi afetada na presença de altas concentrações de
L-leucina (20 mM) e, apresentou mutações no gene LEU4 ainda não descritas pela literatura. A
cepa LBCM 427 e segregante foram avaliadas quanto à produção de cachaça em escala piloto.
Os parâmetros analisados foram: o perfil químico da bebida produzida e a adaptação das cepas
em condições similares às encontradas na fabricação artesanal da cachaça. Por cromatografia
gasosa, quantificaram-se os compostos voláteis sendo estes o acetaldeído, acetato de etila,
metanol, n-propanol, isobutanol, álcool isoamílico, e furfural. Verificou-se que as cepas LBCM
427 e segregante produzem elevados teores de álcool isoamílico e álcool isobutílico quando
comparadas a uma cepa Saccharomyces cerevisiae comercial utilizada como controle. Outra
cepa utilizada como controle do processo, a cepa nativa LBCM 422, sensível a ambos
compostos, produziu quantidades semelhantes de álcool isoamílico quando comparada às cepas
LBCM 427 e segregante, resistentes
a TFL e cerulenina. Os resultados apresentados oferecem
uma importante contribuição para o desenvolvimento de novas estratégias de seleção de cepas
selvagem com características específicas, levando a produção da cachaça com maior produção
de compostos flavorizantes.
Abstract
IX
Abstract
Aiming the molecular characterization of Saccharomyces cerevisiae LBCM 427
strain, selected from fermentations vats of a cachaça distillery, several analysis using
polymorphism analysis of DNA for the characterization/discrimination of this and the
selvagem strains present in the origin place was used. Results showed that RAPD-PCR,
mtDNA, and PCR using complementary primers COXI gene region were not sufficient
for distinguishing among them. On the other hand, the chromosomal pattern profile of
kariotyping showed to be useful to discriminate the strains studied. These results
showed that use of starting strains requires the combined use of biochemical and
molecular methods for monitoring start strains. The parental strain LBCM 427, was
sporulated and its tetrads were analyzed for physiologic and biochemical stability
through successive generations. We selected the strains for: capacity flocculation, no
H
2
S production, 5, 5´,5´´-trifluoro-DL-leucine (TFL) and cerulenin resistance and
ability to adapt to stress conditions during fermentation of the sugarcane juice such as
high osmotic concentration and temperature. No single segregant was found that kept
entirely all the characteristics of the parental strain. In view of this result, a segregant
keeping the characteristic of resistance to TFL and cerulenin compounds was selected
for analysis of fermentation of sugar cane juice and probable mutation in the LEU4 gene
that encodes for alpha isopropylmalate synthase (alpha-IPM). This segregant showed
that alpha-IPM activity was not affected by the presence of increasing leucine
concentrations (20 mM), and showed a new mutation in the LEU4 gene which has not
been previously described in the literature. LBCM 427 and segregant strains were
submitted to a small-scale distillation for cachaça production. The parameters analysed
were the chemical profile of the product as well as strain ability to adapt to stress
conditions during fermentation of the sugarcane juice in artisanal cachaça`s factory.
Volatile compounds such as acetaldehyde, ethyl acetate, methanol, n-propanol, isobutyl
alcohol, isoamyl alcohol and furfural were quantified by gas chromatography assays. It
was found that LBCM 427 and segregant strains produced higher level of isoamyl
alcohol and isobutyl alcohol compared with control S. cerevisie strains of the process.
Another strain, LBCM 422 native S. cerevisiae strain, sensitive to both TFL and
cerulenin, a control strain for the fermentation process, produced similar levels of
isoamyl alcohol in relation to both LBCM 427 and TFL and cerulenin resistant
segregant strain. The results offer an important contribution for the development of a
strategy for strains selection from fermentation vats of cachaça distillery, showing
higher production capacity of flavouring substances..
Índice
X
ÍNDICE
RESUMO…………………………….…………………………………. VIII
ABSTRACT…………………………………………………………….. IX
LISTA DE TABELAS……………………………………………….….
XIV
LISTA DE FIGURAS……………………………………………….…. XV
LISTA DE ABREVIAÇOES…………………………………………... XVII
1
INTRODUÇAO……………………………………………………….... 18
1.1 A CACHAÇA............................................................................................ 19
1.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DA CACHAÇA.................................. 19
1.3 LEGISLAÇÃO VIGENTE........................................................................ 20
1.4 FABRICAÇÃO DA CACHAÇA ARTESANAL...................................... 21
1.5 PADRÕES DE IDENTIDADE.................................................................. 23
1.6 PONTOS CRÍTICOS DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DA
CACHAÇA................................................................................................
26
1.7 A BUSCA POR QUALIDADE NAS BEBIDAS...................................... 27
1.8 IMPORTÂNCIA DA LEVEDURA NO PROCESSO DE
FERMENTAÇÃO......................................................................................
29
1.8.1 Constituição genética da Saccharomyces cerevisiae............................. 29
1.8.2 Melhoramento genético de leveduras..................................................... 30
1.8.3 Técnicas para análise genética de leveduras..........................................
32
1.8.4 Biossíntese de álcoois superiores e ésteres..............................................
35
1.8.5 Estratégias para aumentar a produção de ésteres................................ 40
1.8.6
Metodologia para aumentar a produção de compostos
aromatizantes da cachaça........................................................................ 42
2
OBJETIVOS.............................................................................................
46
2.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................. 47
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................... 47
3
MATERIAL E METODOS.....................................................................
48
3.1 LINHAGENS UTILIZADAS.................................................................... 49
3.1.2 Manutenção das leveduras...................................................................... 49
3.2 MEIOS DE CULTURA............................................................................. 50
Índice
XI
3.2.1 Meio YP..................................................................................................... 50
3.2.2 Meio YP caldo de cana 10% agar........................................................... 50
3.2.3 Meio Mínimo.............................................................................................
50
3.2.4 Meio Yeast Carbon Base (DIFCO Laboratories)……………………. 50
3.2.5 Meio Bismuth Sulfite Agar (DIFCO Laboratories).............................. 50
3.2.6
Meio YEPD-MB (Yeast Extract Peptone Dextrose – Methylene
Blue)…………………………………………………………………….. 50
3.3 ISOLAMENTO DAS LEVEDURAS NA DESTILARIA.........................
51
3.4 TESTE DE SELEÇÃO PARA AS CEPAS SEGREGANTES.................. 51
3.4.1 Testes de Floculação.................................................................................
51
3.4.2 Medida da produção de H
2
S....................................................................
52
3.4.3 Medida da produção e resistência a micocinas......................................
52
3.4.4 Tolerância ao estresse.............................................................................. 52
3.4.5 Tolerância à temperatura........................................................................ 53
3.4.6
Teste de resistência a 5,5’,5”-trifluoro-DL-leucina (TFL) e
Cerulenina.................................................................................................
53
3.4.6.1 Teste de sensibilidade natural a TFL..........................................................
53
3.4.6.2 Teste de sensibilidade natural a Cerulenina............................................... 53
3.5 ENSAIOS ENZIMÁTICOS....................................................................... 54
3.5.1 Determinação da atividade enzimática da invertase.............................
54
3.5.1.1 Inoculação e crescimento das células......................................................... 54
3.5.1.2 Preparo de extratos celulares para determinação da atividade enzimática
da invertase.................................................................................................
54
3.5.1.3 Dosagem da enzima invertase.................................................................... 55
3.5.2
Dosagem da atividade enzimática da α
αα
α-Isopropilmalato Sintase........
55
3.5.2.1 Preparo do inóculo e crescimento celular.................................................. 55
3.5.2.2
Preparo de extrato para determinação da atividade enzimática da α-
isopropilmalato Sintase ............................................................................. 55
3.5.2.3
Dosagem da α-Isopropilmalato Sintase.....................................................
56
3.5.3 Dosagem de Proteínas.............................................................................. 57
3.6 FERMENTAÇÃO EM ESCALA PILOTO DAS LEVEDURAS
SELECIONADAS NESTE ESTUDO....................................................... 57
3.6.1 Preparo do Inoculo...................................................................................
57
Índice
XII
3.6.2 Determinação do grau alcoólico.............................................................. 57
3.6.3 Determinação de sacarose....................................................................... 59
3.6.4
Coleta de amostras para o acompanhamento das leveduras durante
o processo fermentativo...........................................................................
59
3.6.5 Destilação em alambique de cobre..........................................................
59
3.6.6 Determinação dos compostos voláteis na cachaça ................................
60
3.6.6.1 Reagentes e Padrões para cromatografia....................................................
60
3.6.6.2 Identificação e quantificação dos compostos voláteis................................
60
3.6.7 Análise sensorial da cachaça................................................................... 60
3.7 REPRODUTIVIDADE DOS RESULTADOS.......................................... 61
3.8 IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DO POLIMORFISMO MOLECULAR
DAS CEPAS..............................................................................................
62
3.8.1 Preparação do DNA Genômico de leveduras........................................ 62
3.8.2 Método de Identificação por RAPD – PCR........................................... 63
3.8.3 Método de Identificação por mtDNA-RFLP......................................... 63
3.8.3.1 Preparação do DNA mitocondrial..............................................................
63
3.8.3.2 Digestão com enzimas de restrição............................................................ 64
3.8.4 Método de Identificação por COX – PCR............................................. 65
3.8.4.1 Condições do COX-PCR........................................................................... 65
3.8.5 Método de Cariotipagem......................................................................... 65
3.9 ISOLAMENTO E ANÁLISE POR SEQÜÊNCIAMENTO DO GENE
DA α-ISOPROPILMALATE SINTASE...................................................
66
3.9.1 Dosagem do DNA..................................................................................... 66
3.9.2 Amplificação pela PCR............................................................................ 66
3.9.3 Purificação do produto de PCR.............................................................. 66
3.9.4
Ligação do fragmento amplificado ao vetor plasmidial TOPO TA
Cloning...................................................................................................... 67
3.9.5 Preparação de bactérias competentes................................................... 67
3.9.6 Transformação de bactérias.................................................................... 68
3.9.7 Extração de DNA Plasmidial...................................................................
68
3.9.8
Reação de digestão do DNA utilizando a enzima de restrição Kpn I e
EcoR I........................................................................................................
69
3.9.9 Sequenciamento automático de DNA..................................................... 69
Índice
XIII
4
RESULTADOS.........................................................................................
70
4.1 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE LEVEDURAS............................ 71
4.1.1 Análise do Polimorfismo molecular das cepas – RAPD – PCR........... 71
4.1.2 Método de Identificação por mtDNA-RFLP......................................... 76
4.1.3 Método de Identificação por COX – PCR............................................. 78
4.1.4 Método de Cariotipagem......................................................................... 80
4.2 SEGREGANTES DA CEPA PARENTAL LBCM 427 ........................... 82
4.2.1 Estudo das cepas segregantes.................................................................. 82
4.2.2
Atividade da enzima α
αα
α-Isopropilmalate Sintase....................................
89
4.2.3
Análise da seqüência nucleotídica dos genes codificantes da α
αα
α-
Isopropilmalato Sintase........................................................................... 89
4.3 FERMENTAÇÃO EM ESCALA PILOTO DAS LEVEDURAS
SELECIONADAS......................................................................................
101
4.3.1
Avaliação da fermentação em escala piloto das leveduras
selecionadas...............................................................................................
101
4.3.2 Determinação do consumo de sacarose.................................................. 101
4.3.3 Determinação do etanol........................................................................... 101
4.3.4 Acompanhamento das leveduras durante o processo fermentativo.... 103
4.3.5 Determinação dos componentes voláteis da cachaça............................ 105
4.3.6
Avaliação sensorial de cachaças produzidas com cepas selecionadas
como iniciadoras.......................................................................................
107
5 DISCUSSÃO...................................................................................
111
5.1 ANÁLISE DO POLIMORFISMO MOLECULAR DAS CEPAS............ 112
5.2 ANÁLISE DAS SEGREGANTES DA CEPA PARENTAL LBCM 427. 116
5.3 CEPAS DE LEVEDURAS SELECIONADAS USADAS NA
PRODUÇÃO DE CACHAÇA...................................................................
119
5.3.1 Análise dos componentes voláteis........................................................... 120
5.3.2
Avaliação sensorial de cachaças produzidas com cepas selecionadas
como iniciadoras....................................................................................... 123
6 CONCLUSÕES...............................................................................
125
7 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..............................................
128
Lista de Tabelas
XIV
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Comparação dos teores de álcoois superiores e ésteres em
diferentes bebidas..............................................................................
26
Tabela 2
Perfil de resistência a TFL e Cerulenina das cepas coletadas em
2001 e 2003.......................................................................................
73
Tabela 3
Perfil de Resistência da TFL e Cerulenina das cepas selecionadas
para analise do perfil molecular........................................................
74
Tabela 4
Resultado da segregação da cepa parental LBCM427...................... 83
Tabela 5
Avaliação bioquímica e fisiológica das cepas segregantes............... 85
Tabela 6
Concentração de etanol (%v/v) e compostos voláteis (mg/100 ml
de álcool anidro) em cachaças obtidas com diferentes cepas de
leveduras............................................................................................
106
Tabela 7
Notas de avaliações sensoriais cachaças obtidas com diferentes
cepas de leveduras e em fermentações sucessivas Notas de
avaliação............................................................................................ 108
Lista de Figuras
XV
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Mecanismo de Ehrlich....................................................................... 36
Figura 2
Biossíntese de L-leucina e formação de álcool isoamílico e acetato
de isoamila......................................................................................... 37
Figura 3
Biosíntese de ácido graxo em leveduras........................................... 43
Figura 4
Estratégia para seleção de leveduras produtoras de maiores teores de
compostos aromatizantes.....................................................................
45
Figura 5
Estratégia para fermentação e produção de cachaça, em escala
piloto, das leveduras selecionadas.......................................................
58
Figura 6
RAPD-PCR das cepas Saccharomyces cerevisiae isoladas de uma
destilaria artesanal de cachaça em 2001(linhas 3 – 6) e leveduras
isoladas em 2003 (linhas 7-10)............................................................ 75
Figura 7
Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, e
visualizado sob luz UV, mostrando o perfil de mtDNA-RFLP
(mitocondrial DNA Restriction Fragment Length Polymorphism) de
cepas LBCM 427, LBCM 422 e outras leveduras do gênero
Saccharomyces.................................................................................. 77
Figura 8
COX-PCR das cepas S. cerevisiae isoladas de uma destilaria
artesanal de cachaça em 2001(linhas 3 – 6) e 2003 (linhas 7-
10)...................................................................................................... 79
Figura 9
Eletroforese em gel de agarose 1 % corado com brometo de etídioe
visualizado sob luz UV,utilizando sistema TAFE(transverse
alternating field electrophoresis), mostrando o perfil do cariótipo de
diferentes espécies S. cerevisiae, S. paradoxus e S.
kluyveri.............................................................................................. 81
Figura 10
Análise de Componentes Princiapis (PCA) correspondendo a
respostas das cepas segregantes quanto à estabilidade fisiológica.... 88
Figura 11
Atividade da enzima α-IPM nas cepas de Saccharomyces cerevisiae
LBCM 427, LBCM 422, RB 8B e RB 23A ....................................... 90
Lista de Figuras
XVI
Figura 12
Análise comparativa, feita através do programa BLAST, da
seqüência amplificada pelos iniciadores M13, IPM1F, IPM3F,
IM6R, IPM8R, IPM9R e IPM10R da cepa RB 23A, com a
seqüência do gene LEU4 descrita no Saccharomyces cerevisiae
Genome Database............................................................................. 92
Figura 13
Tradução da seqüência amplificada pelos iniciadores M13, IPM1F,
IPM3F, IM6R, IPM8R, IPM9R e IPM10R da cepa RB 23A, feita
através do programa BLAST e comparada com a seqüência do gene
LEU4 descrita no Saccharomyces cerevisiae Genome
Database............................................................................................ 95
Figura 14
Análise comparativa, feita através do programa BLAST, da
seqüência amplificada pelos iniciadores M13, IPM1F, IPM3F,
IM6R, IPM8R, IPM9R e IPM10R da cepa RB 8B, com a seqüência
do gene LEU4 descrita no Saccharomyces cerevisiae Genome
Database.............................................................................................. 97
Figura 15
Tradução da seqüência amplificada pelos iniciadores M13, IPM1F,
IPM3F, IM6R, IPM8R, IPM9R e IPM10R da cepa RB 8B, feita
através do programa BLAST e comparada com a seqüência do gene
LEU4 descrita no Saccharomyces cerevisiae Genome
Database.............................................................................................. 100
Figura 16
Determinação do consumo de sacarose e formação de etanol.......... 102
Figura 17
Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio,
mostrando o perfil do mtDNA-RFLP (mitocondrial DNA
Restriction Fragment Length Polymorphism
) de cepas LBCM 427,
LBCM 422 e RB 23A......................................................................... 104
Figura 18
Análise de Componentes Principais correspondendo a respostas das
cepas LBCM 422, LBCM 427, RB 23A e comercial, quanto aos
compostos voláteis e análise sensorial da
cachaça.................................................................................................
110
Lista de Abreviaturas
XVII
LISTA DE ABREVIATURAS
α-IPM α-isopropilmalato sintase
β-IPM desidrogenase β-isopropilmalato desidrogenase
α-IPM isomerase α-isopropilmalato isomerase
Acetil CoA Acetil Coenzima A
AFLP
Amplified fragment length polymorphism
BAT1 Gene que codifica para aminoácido transferases
citosólicas
BAT2 Gene que codifica para aminoácido transferases
mitocondriais
DO
600nm
Densidade ótica
DGGE
Denaturing gradient gel electrophoresis
DTNB 5,5´-ditiobis-(2-nitrobenzoato)
EDTA Etilenodiaminotetracético
FAS2
Gene responsável pela resistência a cerulenina
HPLC “High Performance Liquid Chromatography”
LEU1
Gene que codifica para α-IPM isomerase
LEU2
Gene que codifica para β-IPM desidrogenase
LEU4
Gene que codifica para α- IPM
mt-DNA-RFLP
Restriction fragment length polymorphism
analysis ofmitochondrial DNA
NAD
+
Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido
PCA
Principal Component Analysis
PCR
Polymerase chain reaction
SEM Etilmetanosulfonato
TFL 5,5´, 5´´-trifluoro-DL-leucina
Introdução
18
1 - INTRODUÇÃO
Introdução
19
1. – A Cachaça
A cachaça é uma bebida destilada tipicamente brasileira e que tem a seguinte
definição legal: “Cachaça é a denominação típica e exclusiva da Aguardente de Cana
produzida no Brasil, com graduação alcoólica de 38 % v/v a 48% v/v a 20º C, obtida
pela destilação do mosto fermentado do caldo de cana-de-açúcar com características
sensoriais peculiares, podendo ser adicionada de açúcares até 6g/L, expressos em
sacarose” (Brasil, 2005).
1.2 – Importância econômica da cachaça
Dados do Serviço de Apoio às Micro e Pequenas Empresas de Minas Gerais
(SEBRAE-MG) de 2002 mostraram que a produção da cachaça no Estado de Minas
Gerais é da ordem de 230 milhões de litros/safra, representando cerca de 18% da
produção nacional de aguardentes. Neste estudo, o Estado contabilizava cerca de 8.466
estabelecimentos produtores, que associando a produção da cachaça às atividades
agropecuárias, empregavam direta e indiretamente, aproximadamente 240.000 pessoas,
gerando uma renda anual estimada de R$ 1,5 bilhão. Os estudos do SEBRAE-MG
indicaram ainda que apenas 15% dos estabelecimentos produtores estão regularmente
registrados e 85% operam de forma clandestina, sendo que 43% da cachaça produzida
provém de estabelecimentos registrados e 57% dos clandestinos. (SEBRAE, 2002)
As exportações brasileiras de cachaça ganharam forte impulso nos últimos anos.
Em 2003 e 2004, somados, foram negociados 17,251 milhões de litros com o exterior
gerando uma renda de aproximadamente U$ 20 milhões. Apenas nos 8 primeiros meses
de 2005 o volume de negócios chegou a 6,953milhões de litros. O Brasil exporta este
produto para 45 paises, mas essas vendas não atingem 1% da produção nacional que
varia de 1,3 bilhão a 2 bilhões de litros. Apesar desses números, o Brasil exporta pouco
e de forma inadequada, pois estima-se que um terço do produto é vendido a granel, o
que torna difícil o controle de origem e a agregação de valor ao produto. Os principais
clientes da cachaça no mercado internacional são: Alemanha, Paraguai, Uruguai,
Portugal, Angola, Estados Unidos, Argentina, Itália, Bélgica, Espanha, Chile, França e
Holanda. A Alemanha é nosso principal importador de destilado com 2,292 milhões de
litros em 2004 (Rosa e cols., 2005).
Introdução
20
1.3 – Legislação Vigente
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) publicou em junho
de 2005 a Instrução Normativa n°13 que reitera a definição de cachaça e de aguardente
e estabelece novas classificações para o produto envelhecido. A Premium deve conter
100% de cachaça, ou aguardente, envelhecida por um período não inferior a um ano. Já
a Extrapremium também deve conter 100% de cachaça, ou aguardente, mas com
envelhecimento mínimo de três anos. A terceira categoria é a Envelhecida, que contem
pelo menos 50% de cachaça reservada por um período não inferior a um ano. As normas
exigem controle sobre contaminantes como carbamato de etila, acroleina, álcool séc-
butílico, álcool n-butílico, chumbo, arsênio, cobre e metanol (Brasil, 2005).
No dia 21 de dezembro de 2001, o então Presidente da República Fernando
Henrique Cardoso, assinou um decreto 4.062 reconhecendo a exclusividade de uso da
indicação geográfica “cachaça” por parte do Brasil. Essa medida impõe patente sobre a
expressão “cachaça”, preservando o produto nacional. Outra medida tomada pelo
governo federal foi proteger a identidade da bebida no país regulamentando uma
definição legal para a “cachaça” estabelecida no Decreto Federal n° 4.072 de janeiro de
2002. Agora o Brasil aguarda a definição da Organização Mundial das Aduanas (OMA)
para solicitação de um código de enquadramento da cachaça ou da aguardente, sendo
este diferente do rum.
Na última década algumas leis foram regulamentadas para padronizar as
condições técnicas e higiênicas de trabalho para a produção da bebida, bem como dar
caráter empresarial ao setor. A Lei Federal nº 8.918, de 14.07.94, dispõe sobre
padronização, registro, inspeção, produção e fiscalização de todas as bebidas alcoólicas,
inclusive a cachaça, além de sucos produzidos no Brasil. Esta lei, regulamentada pelo
Decreto Federal nº 2.314, de 04.09.1997, traz indicações de características técnicas e
responsabilidades de fiscalização de bebidas em geral. O licenciamento do produto para
comércio está a cargo do Ministério da Agricultura e do Abastecimento, por intermédio
da Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária – (SDA). A Instrução Normativa
N°13/2005 dispõe sobre os padrões de identidade e qualidade da cachaça, mencionando
especificamente os seguintes itens: grau alcoólico e teores de açúcares totais, acidez
volátil em ácido acético, álcoois superiores (expressos pela soma do álcool n-propílico,
Introdução
21
álcool isobutílico e álcoois isoamílicos), furfural somado a hidroximetilfurfural,
aldeídos em acetaldeido e ésteres totais em acetato de etila.
Em Minas Gerais a cachaça também foi regulamentada com a edição da Lei da
Cachaça de Minas, Lei Estadual nº 11.949, de 11/07/2001 que estabelece o padrão de
identidade e as características do processo de elaboração da “Cachaça de Minas”. Com
esta lei, o produtor pode vislumbrar a profissionalização e a remodelagem dos
estabelecimentos tradicionais, maiores facilidades de comercialização do produto e
legitimação dos padrões de identidade e qualidade da cachaça mineira (SEBRAE,
2002).
Uma outra iniciativa adotada pelo governo mineiro foi a criação do Programa
Mineiro de Incentivo à Produção de Aguardentes de Qualidade (Pró-Cachaça), Lei nº
10.853/92, regulamentada pelo Decreto Estadual nº 34.645/93, que estimulou a
organização e mobilização dos produtores de cachaça em entidades ou cooperativas.
Esta medida proporcionou aos pequenos produtores algumas facilidades de
comercialização do produto e de difusão de conhecimentos para melhorar e/ou
aprimorar a qualidade do destilado produzido.
1.4 – Fabricação da cachaça artesanal
A fabricação da cachaça artesanal inicia-se na colheita de cana-de-açúcar que é
cortada manualmente, despalhada e transportada para uma instalação onde passará pelo
processo de moagem. Utilizando-se moendas elétricas, a cana-de-açúcar é moída inteira
ou previamente picada, e o caldo extraído é recolhido em reservatório onde permanece
com objetivo de deixar decantar as impurezas do liquido (pequenos fragmentos da cana-
de-açúcar – bagacilho; fragmentos de solo; outras impurezas). Após a decantação, o
caldo é filtrado e encaminhado, por tubulações, em geral de PVC, até as dornas de
fermentação.
A cachaça de alambique mais tradicional utiliza o “pé-de-cuba” ou “pé-de-
fermentação”, normalmente preparado no próprio local de produção da bebida, que tem
como agente da fermentação uma mistura de leveduras presentes no ambiente. Cada
produtor tem uma fórmula segundo as tradições locais, mas geralmente, o “pé-de-cuba”
tem como componentes o farelo de arroz, fubá de milho, caldo de limão, etc. Uma das
várias maneiras descritas para a preparação do “pé-de-cuba” sugere que os componentes
Introdução
22
sejam misturados em quantidade suficiente para formar uma pasta e deixado em repouso
por 12 a 24 horas. Adiciona-se o caldo de cana-de-açúcar diluído (1:1) até que o
material fique submerso e deixa-se em repouso por mais 24 horas. Uma nova
quantidade de caldo diluído é adicionada quando ocorre desprendimento de dióxido de
carbono (CO
2
) o que indica atividade fermentativa; uma vez mais, a mistura é deixada
em repouso por 24 horas. Repete-se este procedimento até que seja obtido um volume
correspondente a 20% do volume do mosto a ser fermentado na dorna.
Alternativamente, o fermento de panificação prensado pode ser usado como inóculo; no
entanto, este tipo de fermento foi desenvolvido para atender as características da
indústria de panificação.
As dornas geralmente cilíndricas são produzidas em madeira, aço inoxidável e
aço-carbono com um volume total de acordo com a capacidade do aparelho de
destilação. O processo fermentativo da cana-de-açúcar em mosto pode levar até 24
horas. A dorna é abastecida lentamente pelo caldo de cana-de-açúcar, podendo estar
pré-aquecido ou não, de acordo com o clima da região. Ao término da fermentação,
aguarda-se a decantação do fermento e o vinho sobrenadante é encaminhado, por
tubulações, para destilação e um novo processo de fermentação é iniciado. O mesmo
fermento é usado sucessivamente caracterizando um processo fermentativo
semicontínuo.
A destilação do mosto é realizada em alambiques de cobre. O mosto é aquecido
por fornalha ou caldeira, até que a mistura entre em ebulição e seja iniciada a emissão
de vapores. A condensação dos vapores ocorre em uma serpentina de resfriamento, e o
líquido formado (destilado) é então recolhido. O destilado é dividido em três partes
referidas popularmente como: “cabeça”, “coração” e “cauda”. A primeira fração é
descartada por conter grande quantidade de metanol. A “cauda” é desprezada ou
redestilada por conter grande quantidade de água e produtos menos voláteis. O
“coração”, que corresponde a cachaça, é encaminhada para o envase ou para o
envelhecimento.
O produtor determina o tempo de envelhecimento e o tipo de madeira
empregada nos barris. Ao término desta etapa, amostras do destilado são encaminhadas
para análise dos Padrões de Identidade e Qualidade que se aprovadas pelos parâmetros
instituídos na legislação, permitem que a bebida seja engarrafada e comercializada. A
Introdução
23
comercialização do produto é regulamentada por lei e o produto deve seguir normas e
estar registrado nos órgãos competentes (Cardoso, 2001; Gravata, 1999).
1.5 – Padrões de Identidade
A cachaça tem sua identidade e qualidade regulamentada pela INSTRUÇÃO
NORMATIVA Nº 13, DE 29 DE JUNHO DE 2005, tendo sido estabelecidos os
seguintes padrões: graduação alcoólica de 38% a 48% em volume a 20° C, obtida pela
destilação do mosto fermentado do caldo de cana-de-açúcar com características
sensoriais peculiares, podendo ser adicionada de açúcares até 6g/L, expressos em
sacarose. Segundo a Instrução, cachaça deve apresentar os seguintes teores máximos de
componentes do Coeficiente de Congêneres:
Acidez volátil, em acido acético...............................
150 mg/100mL de álcool anidro
Ésteres totais, em acetato de etila.............................
200 mg/100mL de álcool anidro
Aldeídos totais, em acetaldeído................................
30 mg/100mL de álcool anidro
Furfural somado a hidroximetilfurfural................... 5 mg/100mL de álcool anidro
Álcoois superiores, soma de álcoois isobutílico,
isoamilico e n-propilico............................................
360 mg/100mL de álcool anidro
O Coeficiente de Congêneres para os produtos não poderá ser inferior a 200mg
por 100mL e não poderá ser superior a 650 mg por 100mL de álcool anidro.
É permitido um teor máximo de 25 mg de metanol /100mL de álcool anidro e o
conteúdo de cobre não pode ultrapassar a 5 mg/L do produto. Contaminantes
inorgânicos como chumbo e arsênio não podem estar em quantidade superior a 200
µg/L e 100 µg/L respectivamente. Enquanto contaminantes orgânicos como o
carbamato de etila e acroleína (2-propenal) não podem estar em quantidade superior a
150 µg/Le 5 mg/100mL respectivamente.
Os métodos adotados pelo Ministério de Agricultura para quantificar os aldeídos
e ácidos totais não oferecem resultados confiáveis em amostras coloridas e não
permitem a especificação dos compostos. Esta limitação constitui uma desvantagem,
Introdução
24
pois as propriedades químicas e toxicológicas não são as mesmas para todos os
membros de uma série homóloga (Nascimento e cols., 1998).
Boscolo e cols (2000) investigaram o conteúdo de álcoois e ésteres de cachaça
de diversas regiões produtoras e demonstraram que os valores de álcoois superiores
estão próximos aos limites estabelecidos por lei, enquanto o éster está aproximadamente
dez vezes inferior ao limite (Tabela 1). A quantidade de metanol na cachaça se encontra
dentro dos limites legais, e é semelhante ao encontrado nas amostras de rum, entretanto,
muito inferior à encontrada no vinho. O acetato de etila, um éster encontrado em
bebidas, apresenta um teor três vezes menor na cachaça quando comparado ao uísque
. A
quantidade de álcool isoamílico da cachaça é menor que a encontrada no uísque. O fato
da quantidade de ésteres na cachaça ser baixa em relação a outras bebidas pode
influenciar no aroma e na qualidade, uma vez que o teor destes compostos está ligado a
essas características (Cardoso e cols., 2004; Nobrega, 2003; Nonato e cols., 2001).
Introdução
25
Tabela 1 – Comparação dos teores de álcoois superiores e ésteres em diferentes bebidas
Composto
Legislação
Brasileira
Cachaça Rum Uísque Vinho
Metanol 25 5,7 6,6 - 22
Álcool isoamílico - 136 104 250 230
isobutanol - 63 162 90 136
n-propanol - 46 38 31 44
Álcoois totais 360 263 314 468 410
Ésteres totais 200 24,4 69,7 74,1 -
Resultados em mg/100mL de álcool anidro.
Fonte: Boscolo e cols (2000)
Introdução
26
1.6 – Pontos críticos do processo de produção da cachaça.
O processo de fabricação tem seu início na colheita da cana-de-açúcar e hoje o
agricultor dispõe de variedades de cana-de-açúcar que se adaptam a diversos tipos de
solos e a variados climas, podendo ser colhidas em diferentes épocas do ano. Deve-se
escolher uma variedade de cana-de-açúcar que proporcione a obtenção de um produto
final de qualidade e que contribua para manter a continuidade da safra, cujo período se
estende de maio a novembro (Cardoso, 2001; Gravata, 1999).
A qualidade do caldo de cana-de-açúcar que chega as dornas de fermentação
contribui para o resultado final do produto. Cuidados inerentes a higiene no local de
moagem da cana-de-açúcar, bem como onde o caldo de cana é filtrado e/ou aquecido,
são de fundamental importância. A fermentação é ponto chave de todo o processo de
fabricação de cachaça, sendo considerados fatores fundamentais: a escolha do inóculo,
com cepas de qualidade, e do local, que deve ser apropriado para ocorrer o processo
fermentativo. É comum na produção artesanal da cachaça o uso de dorna manufaturada
com material impróprio, como por exemplo, a madeira. Materiais porosos e de difícil
limpeza contribuem para a contaminação com microrganismos indesejáveis
comprometendo assim a fermentação. Outro aspecto importante é a fermentação com
temperatura controlada. A fermentação, na maioria dos alambiques, ocorre em sistema
aberto, desprovido de manutenção da temperatura adequada para o processo.
A incorporação de cepas selecionadas que contribuam para a manutenção da
identidade e da qualidade da cachaça produzida pode se constituir em etapa importante
para o processo. Segundo Pataro e cols. (1998), durante uma safra, diferentes cepas de
Saccharomyces cerevisiae estão presentes na fermentação, e isto pode ser uma das
causas que proporciona a irregularidade do destilado, em termos de composição química
e de caracterização organoléptica. Também por esta razão, safras distintas podem
produzir cachaças com composição e características diferentes. O estabelecimento de
parâmetros que levem a escolha de cepas que se adaptem às condições de produção, e
que contribuam para manter ou melhorar a qualidade da cachaça é um tema ainda pouco
explorado e merecedor de muitos estudos.
O envelhecimento da cachaça ocorre geralmente em barris de carvalho (Quercus
Alba L), também utilizado no envelhecimento de vinhos e uísque. De origem
estrangeira, o carvalho também se encontra em extinção, sendo difícil sua aquisição no
Introdução
27
mercado; desta forma, possui um alto valor no mercado. Como alternativa, têm-se
estudado madeiras nativas para serem empregadas nesta atividade, tais como:
amendoim (Pterogyne nitens), amburana (Amburana cearensis) e jequitibá (Cariniana
estrellensis). As condições das adegas são as mais diversas. Na maioria dos casos,
certas condições, tais como o controle de temperatura, de umidade, de luminosidade e
de outros fatores que podem influir no envelhecimento não é levado em consideração.
Diversas reações químicas acontecem durante este processo de envelhecimento, entre
elas podem ser citadas: evaporação de compostos voláteis através da madeira do barril;
formação de complexos moleculares estáveis a partir dos compostos secundários; e
reações dos componentes da madeira com os componentes originais do destilado
(Cardello & Faria, 1998; Cerdan e cols., 2004; Dias e cols., 1998; Escalona e cols.,
2002; Mori e cols., 2003).
Após um período de envelhecimento em barris, a bebida adquire odor, cor e
sabor típicos da madeira na qual foi acondicionada. É necessário conhecer bem as
propriedades da madeira empregada na confecção do barril para se utilizar destas
características para o aprimoramento do sabor e do aroma da bebida (Cardello & Faria,
1998; Cardoso, 2001; Mori e cols., 2003).
O engarrafamento e a comercialização da cachaça constituem a parte final do
processo. Nem sempre as garrafas utilizadas no envase são fabricadas para este fim;
muitos produtores ainda utilizam garrafas recicladas sem padronização de tipo, cor e
material. Esta característica desqualifica o produto frente ao consumidor. A utilização
de vasilhame que diferencie e sofistique o produto pode ser um fator capaz agregar
valor à bebida (SEBRAE, 2002).
1.7 – A busca por qualidade nas bebidas.
O aumento do consumo interno e a busca por espaço no mercado internacional
são fatores que reforçam a necessidade de se melhorar e ou de se garantir a qualidade da
cachaça produzida. Entretanto, em função de reduzido número de trabalhos publicados
e/ou literatura especializada disponível é difícil estabelecer um padrão de qualidade para
a cachaça.
Para que um tecnólogo de bebidas possa modificar as características e/ou
controlar a qualidade de um produto é necessário que se conheça a composição química
Introdução
28
do produto final. A cachaça é muito apreciada por possuir aroma e sabor característicos;
segundo Nonato e cols. (2001), sua composição pode ser descrita como uma solução
aquosa complexa, constituída de água, etanol, álcoois superiores, etil ésteres, aldeídos,
cetonas e ácidos orgânicos. Apesar de representar menos de 1% do total, os ésteres e os
álcoois superiores são importantes para as características organolépticas da bebida,
sendo seu aroma atribuído principalmente aos álcoois superiores e ésteres presentes
(Boscolo e cols., 2000; Boza & Horii, 1998; Cardello & Faria, 1998; Cardoso e cols.,
2004). Conhecer os compostos que atribuem identidade a uma bebida (por exemplo, o
acetato de isoamila confere aroma característico do vinho tinto preparado com a
variedade de uva Pinotage) é fator de avanço tecnológico para melhorar sua qualidade
(Falqué e cols., 2001; Fraile e cols., 2000; Hernandez-Orte e cols., 2002).
Os compostos que proporcionam sabor e aroma ao vinho são formados durante a
fermentação alcoólica e sua produção depende principalmente da espécie de levedura
usada e das condições de fermentação(Pretorius, 2000). Na fabricação moderna de
vinhos, cepas da levedura S. cerevisiae, usadas na fermentação alcoólica, produzem
quantidades diferentes de compostos voláteis na bebida. Estudos demonstraram que a
inoculação de cepas selecionadas contribui para as características do vinho, assim é
importante conhecer os diferentes potenciais de produção de compostos voláteis das
cepas de S. cerevisiae para escolher a melhor cepa para a produção de um vinho com
mais qualidade (Cardoso e cols., 2004; Fraile e cols., 2000; Hernandez-Orte e cols.,
2002; Ostergaard e cols., 2000; Patel & Shibamoto, 2002; Pretorius & Bauer, 2002;
Pretorius & Hoj, 2005; Vianna & Ebeler, 2001).
A produtividade e a eficiência de fermentação, a tolerância ao etanol e à
temperatura, a resistência a altas concentrações de açúcar, a habilidade de flocular, e a
de produzir certos componentes do aroma da bebida, são algumas características
desejáveis às linhagens de leveduras selecionadas para o processo de produção de
bebidas. De modo contrário, a produção de sulfeto de hidrogênio é indesejável nas
bebidas alcoólicas, devido a seu odor repugnante e ao baixo limite de detecção
(Ostergaard e cols., 2000; Pretorius, 2000; Ribeiro & Horii, 2004). Devido à
importância da levedura no processo de fermentação e ás conseqüentes características
organolépticas das bebidas fermentadas, a seguir descreveremos detalhadamente os
aspectos relacionados à este microrganismo.
Introdução
29
1.8 – Importância da levedura no processo de fermentação
1.8.1 – Constituição genética de Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae é um microorganismo leveduriforme que possui geralmente uma
forma elipsoidal. Em condições ótimas de cultura e nutrição, sua biomassa é dobrada a
cada 90 minutos Esta levedura se reproduz de forma assexuada através de brotos
(divisão mitótica) ou sexuada por esporulação (meiose, segregação e formação de
haploides) e cruzamento com formação de diploides “mating” (Pretorius, 2000).
O genoma da cepa de laboratório de S. cerevisie (linhagem BY4742) foi
completamente seqüenciado apresentando-se relativamente pequeno, com grande
numero de cromossomos, baixa ocorrência de DNA repetitivo e de “introns”. Cepas
haplóides contêm aproximadamente 12 a 13 megabases de DNA nuclear distribuídos ao
longo de 16 cromossomos lineares e cerca de 6000 genes que transcrevem para
proteínas. O genoma possui aproximadamente 35 a 55 cópias de retrotransposons
(elementos Ty). Esses elementos móveis transportam-se de uma posição para outra no
genoma por meio de um intermediário de RNA, provavelmente usando transcriptase
reversa para fazer uma cópia de DNA partir de RNA, seguido pela integração num novo
sítio. S. cerevisiae possui um DNA mitocondrial de 75Kb, rico em adenina e timina
(Pretorius, 2000; Pretorius, 2003).
O fenômeno “Killer” observado em linhagens produtoras de micocinas que no
processo fermentativo eliminam linhagens sensíveis, nesta levedura está associado a
determinantes genéticos não-Mendelianos que ocorrem em fitas duplas de RNA e
associadas a partículas virais (Vírus-like Particles – VLP) não infecciosas. As VLPs são
de 2 tipos de RNA de dupla fita: o genoma L e M. O genoma L transcreve para um
RNA-dependente de RNA polimerase e uma capa viral que encapsula ambos os
genomas. O genoma M trasncreve para uma micocina e fator de imunidade. A micocina
secretada é letal para cepas sensíveis de leveduras. As micocinas diferem entre espécies
ou cepas mostrando uma diversidade de tamanho molecular, maturação de estrutura e
imunidade (Marquina e cols., 2002; Pretorius, 2000; Pretorius & Hoj, 2005).
Introdução
30
1.8.2 – Melhoramento genético de leveduras
O uso de inoculo a partir de uma cultura pura selecionada de levedura no
processo industrial de fermentação de vinho e cerveja data de aproximadamente dois
séculos (Pretorius, 2000). Desde então a busca por leveduras que melhorem as
características do processo ou produto final tem sido o objetivo de muitas pesquisas. De
um modo geral, o melhoramento genético das propriedades dos microorganismos
usados no processo fermentativo é limitado pelo conhecimento do controle dos
processos metabólicos que ocorrem dentro da célula.
As modificações genéticas das cepas de leveduras industriais são
tradicionalmente realizadas com técnicas clássicas como a mutagênese, hibridização e
fusão de protoblastos. A técnica de hibridização consiste no cruzamento de células
haplóides de tipos de acasalamentos diferentes (“Mating type”) produzindo novos
diploides heterozigotos, porém a maioria das cepas industriais esporulam pobremente
dificultando a ampla aplicação do método. Outra técnica de hibridização, a fusão de
protoblastos, utiliza a fusão de células de diferentes ploidias e ou espécies. Esta técnica
apresenta resultados instáveis uma vez que pode não ocorrer uma completa fusão
genética entre as cepas parentais. A técnica da mutagênese consiste em submeter as
leveduras a diferentes dosagens de UV e isolamento em meio sólido seletivo. Após o
emprego de uma dessas técnicas, as leveduras são selecionadas por características como
a capacidade de fermentação, tolerância a etanol, ausência de produção de compostos de
odor desagradável, osmotolerância, floculação e utilização de carboidratos. Uma
desvantagem do uso destas técnicas clássicas é a dificuldade de adicionar ou remover
características das cepas sem alterar a desempenho para a obtenção do produto final
(Pretorius, 2000).
Nos últimos vinte anos, o grande progresso no desenvolvimento de novas
técnicas moleculares para S. crevisiae e aplicados com sucesso em cepas industriais
permitiu o desenvolvimento de cepas especializadas. Um exemplo importante é a
melhora significativa da qualidade organoleptica de produtos como o vinho (Pretorius &
Hoj, 2005).
A levedura S. cerevisiae é um microorganismo modelo muito popular e
importante na indústria alimentícia. A maioria das cepas comerciais usadas na indústria
do vinho, por exemplo, são da espécie S. cerevisiae. Essas cepas são
Introdução
31
predominantemente homotálicas, diplóides e com baixa capacidade de esporulação,
quando comparadas com cepas de laboratório, elas exibem rearranjos e polimorfismo ao
longo do cromossomo. Outro ponto importante é que as cepas padrão normalmente
usadas em laboratórios são descendentes de isolados naturais, haplóides ou diplóides e
tem o tamanho do cromossomo definido (Perez-Ortin e cols., 2002; Puig e cols., 2000).
A ploidia em leveduras pode conferir a vantagem de adaptação as variáveis do
meio externo. As leveduras do vinho têm a habilidade de reorganização dos
cromossosmos durante o crescimento mitótico, capacidade observada ou não em cepas
haplóides de laboratório. Devido a essa capacidade exacerbada de mudanças, em
contraste com cepas de laboratório, parece não manter a uniformidade genética. A razão
para isso é a habilidade natural de mudança no “mating type” quando haplóides
(homotalismo). Usando esta capacidade, as células podem evoluir em três etapas:
esporulação (que produz células haplóides através da redução mitótica), mudança de
“mating type” das células filhas e conjugação com alguma outra célula da mesma
colônia. Este mecanismo pode produzir cepas altamente homozigotas que eliminam
mutações deletérias pela seleção natural. Existem ainda outros caminhos que as
leveduras podem seguir para mudar suas características ao longo do tempo como, por
exemplo, as mutações espontâneas, transposons Ty e adaptação ao meio ambiente(Dunn
e cols., 2005; Poggeler, 2001; Pretorius & Hoj, 2005).
Desde a década de 1970, a inoculação de culturas puras selecionada de leveduras
no mosto de vinho ou cerveja, tem melhorado a qualidade do produto. Durante a
primeira metade do século vinte, as leveduras do vinho, por exemplo, eram selecionadas
de forma quase empírica utilizando os métodos de genética clássica. A evolução da
engenharia genética trouxe a possibilidade de mudanças nas características das
leveduras com grande precisão e estabilidade fenotípica. As técnicas de DNA
recombinante proporcionaram um grande avanço no campo da genética molecular,
fisiologia e biotecnologia, possibilitando a construção de cepas comerciais alternando a
expressão de genes (super-expressão ou deleção) (Dunn e cols., 2005; Pretorius, 2000;
Pretorius & Hoj, 2005).
Atualmente muitas estratégias para que linhagens apresentem determinadas
características podem ser utilizadas para aperfeiçoar uma cepa de levedura. Inicialmente
pode-se isolar uma cepa da fermentação espontânea por de critérios tecnológicos que
Introdução
32
contribuam para melhorar a qualidade do produto final. Em seguida, modificar genes
que codificam para enzimas ou outras atividades celulares que possam direta ou
indiretamente contribuir para a aquisição de características desejáveis (Gimren-Alcaniz
& Matallana, 2001).
1.8.3 – Técnicas para análise genética de leveduras
Atualmente sabe-se que, pelo menos para o vinho, uma bebida muito estudada, a
linhagem de levedura presente no processo de fermentação é de crucial importância para
as características do produto final. Especialmente importante para a manutenção da
qualidade do produto é que este seja o resultado de uma fermentação de uma cepa capaz
de predominar no processo. Para a cachaça este processo é ainda mais sensível, visto
que o mesmo é feito em sistema aberto. No sentido de acompanhar a ou as leveduras
presentes no processo, utilizam-se atualmente se tem utilizado várias técnicas de análise
genética.
As cepas de S. cerevisiae diferem significativamente em seu desempenho,
contribuição no sabor e qualidade de vinhos e destilados. Esta razão levou ao
desenvolvimento de métodos de identificação moleculares para diferenciação de cepas
de leveduras, permitindo assim o estudo da relação dessas diferenças com características
que contribuam favoravelmente para a qualidade da bebida (Lambrechts & Pretorius,
2000; Pretorius & Bauer, 2002; Pretorius & Hoj, 2005).
Durante o processo artesanal de fermentação do caldo de cana, existe uma
sucessão de espécies de leveduras sendo S. cerevisiae prevalente no final do processo
fermentativo. Estudos observaram que em uma população de leveduras de diferentes
destilarias, algumas espécies são específicas de cada local e que as cepas estudadas
apresentam alto polimorfismo genético (Guerra e cols., 2001; Morais e cols., 1997;
Pataro e cols., 2000). Este fato aponta para a necessidade de técnicas que acompanhem
a presença de leveduras S. cerevisiae iniciadoras em um processo fermentativo para
garantir agilidade em possíveis intervenções com vistas a melhorar a qualidade do
produto final (Lopez e cols., 2001; Schuller e cols., 2004; Valero e cols., 2005).
Leveduras usadas na indústria de bebidas alcoólicas são caracterizadas
morfologicamente, fisiologicamente e por critérios bioquímicos. Entretanto essas
técnicas não são suficientes para diferenciar cepas da mesma espécie. Por essa razão, o
Introdução
33
uso de técnicas que possibilitem a distinção da cepa inoculada das restantes da
microbiota natural presente no processo fermentativo tem incentivado o
desenvolvimento de novas tecnologias. Nos últimos anos, novas metodologias baseadas
no polimorfismo de DNA foram desenvolvidas para discriminar entre cepas próximas,
especialmente para a indústria do vinho. A seguir serão citadas resumidamente as
técnicas até então empregadas.
- Cariotipagem – A separação cromossômica realizada por um campo de
eletroforese revelou considerável variabilidade na constituição cromossomal de cepas
comerciais de leveduras utilizadas na indústria do vinho, sendo então um importante
método para identificação de espécies de leveduras. Porém, a cariotipagem
cromossômica tem como desvantagem a sua elevada complexidade, cara, laboriosa e
demorada, o que impede sua utilização para um grande numero de isolados (Fernandez-
Espinar e cols., 2001; Querol e cols., 1992b; Schuller e cols., 2004).
- mt-DNA-RFLP (Restriction fragment length polymorphism analysis of
mitochondrial DNA - O polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) é uma técnica
largamente utilizada para caracterizar leveduras utilizadas na indústria da cerveja e do
vinho. Esta técnica tem obtido muito sucesso na diferenciação tanto de gênero quanto da
espécie de S. cerevisiae. É um método simples e rápido que utilizando a digestão do
DNA mitocondrial por enzimas de restrição (exemplo a HinfI ou RsaI) associado ao alto
polimorfismo genético, tem sido usada para estudar a autenticidade de cepas comerciais
de leveduras(Guillamon e cols., 1994; Lopez e cols., 2001; Querol e cols., 1992b;
Querol & Barrio, 1990).
- PCR (Polymerase chain reaction) - O desenvolvimento da técnica de PCR
abriu novas possibilidades de identificação de cepas. Essa técnica tem sido aplicada
usando iniciadores randômicos ou específicos. O genoma do S. cerevisiae contém
seqüências repetitivas de DNA tal como as seqüências δ que são frequentemente
associadas aos elementos transposons Ty1. O número desses elementos e sua
localização têm variabilidade intra-específica e podem ser usados como identidade
genética. A reação de PCR utilizando a seqüência δ tem bons resultados para
discriminação entre cepas comerciais, porém não apresenta boa resolução para
discriminar entre cepas selvagens. Uma extensiva pesquisa no programa BLAST
Introdução
34
possibilitou aperfeiçoar estes primers e como resultado encontrar alto perfil polimórfico
nas cepas comerciais estudadas (De Barros e cols., 1996; Legras & Karst, 2003;
Schuller e cols., 2004). Outro método utilizando PCR é o RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA). ). Esta técnica se baseia na amplificação de regiões randômicas
usando iniciadores “específicos ou não”. Um exemplo bem descrito para S. cerevisiae é
a utilização dos iniciadores EI1 e LA que contém seqüências complementares ao sítio
de splicing dos introns. Uma vez que os introns não são essenciais para as funções
gênicas, eles apresentam seqüências não conservadas e variáveis que podem ser usadas
para identificação de espécie e intra-espécie. A vantagem dessa técnica é de analisar
muitas amostras rapidamente permitindo monitorar a propagação das leveduras no
processo fermentativo (Guerra e cols., 2001; Pataro e cols., 2000).
- AFLP (Amplified fragment length polymorphism) - A investigação da variação
genética possibilitou o desenvolvimento de outro método para diferenciação de cepas e
espécies de leveduras: Esta técnica baseia-se na amplificação por PCR de fragmentos de
DNA específicos seguida de digestão por enzimas de restrição e análise dos fragmentos
gerados. Apesar de ser uma importante técnica para diferenciar cepas de S. cereviae, sua
aplicação na rotina do controle de qualidade industrial pode ser inviabilizada pelo longo
tempo exigido para emissão do resultado (De Barros e cols., 1999; Fernandez-Espinar e
cols., 2001).
Variação do número e posição dos introns no gene mitocondrial COXI - Ainda
utilizando o método de PCR, outro protocolo foi desenvolvido: A variação no intron
COXI tem sido observada entre cepas e entre espécies permitindo a diferenciação de
cepas de S. cerevisiae. Uma reação de PCR multiplex com quatro primers selecionados
mostrou-se muito efetivo na análise de polimorfismo de leveduras selvagens e
comerciais para uso na fermentação do vinho (Lopez e cols., 2003).
- O PCR-DGGE (DGGE - Denaturing gradient gel electrophoresis) – esta é uma
técnica baseada na amplificação por PCR de uma seqüência específica alvo no DNA e
seguida pela separação dos fragmentos gerados em gel de poliacrilamida contendo um
gradiente linear desnaturante. Neste processo, diferenças mínimas de números de bases
são detectadas e utilizadas como parâmetro de comparação Utilizando os iniciadores
Schaf/Schar foi possível identificar cepas de leveduras usadas como iniciadoras em
Introdução
35
processo industrial e em estudos ecológicos de fermentação de vinho e cerveja
(Manzano e cols., 2004)
- Análise de microsatélites - Microsatelites são seqüências de DNA de pequenos
motivos repetidos (1-10 nucleotídeos) dispostos lado a lado dispersos por genoma e que
mostram variação no número de repetições entre diferentes espécies ou intra-espécie.
Essas seqüências estão presentes no genoma de eucariotos, procariotos e vírus e são
usados como marcadores genéticos para estudo de mapeamento genético de populações.
Apesar de ser uma técnica muito promissora para a diferenciação de cepas de S.
cerevisiae, do ponto de vista da aplicação industrial, tem a desvantagem de utilizar
equipamentos muito caros e apresentar demora em emitir laudos (Howell e cols., 2004;
Legras e cols., 2005; Marinangeli e cols., 2004; Perez e cols., 2001)
1.8.4 – Biossíntese de álcoois superiores e ésteres
Em um modelo de processo fermentativo com S. cerevisiae, partindo de um
inoculo com 22 a 24% de açúcar, 95% é convertido a etanol e dióxido de carbono, 1% é
convertido em material celular e o restante é convertido em outros produtos como
glicerol, álcoois superiores e ésteres (Lambrechts & Pretorius, 2000).
Os álcoois superiores são produzidos pelas leveduras durante a fermentação e
contribuem para as características organolépticas das bebidas alcoólicas. Os álcoois
superiores são derivados geralmente da transaminação de α-cetoácidos intermediários
das vias biossintéticas de aminoácidos, tais como a valina, leucina, isoleucina, treonina
e fenilalanina. O α-cetoisovalerato pode ser convertido no álcool isobutílico e o α-
cetoisocaproato em álcool isoamílico (Pretorius, 2000).
A síntese de álcool isoamílico, por exemplo, pode ser realizada por dois
caminhos: pelo mecanismo de Ehrlich, onde ocorre a descarboxilação e redução de α-
cetoácidos (Figura 1); ou a partir do α-cetoisocaproato, um precursor do álcool
isoamílico sintetizado na via de síntese de L-leucina a partir de glicose (Figura 2). No
mecanismo de Ehrlich, os aminoácidos extracelulares são absorvidos pelas leveduras,
via transportadores (por exemplo; aminoácidos permease, Gap1p; transportadores
específicos de alta e baixa afinidade para aminoácidos, Bap2p e Bap3p), e
transaminados para formar os α-cetoácidos, os quais são
Introdução
36
Figura 1 – Mecanismo de Ehrlich. A formação de álcoois superiores ocorre com a
descarboxilação e redução de α-cetoácidos.
Fonte: (Hazelwood e cols., 2006; Vuralhan e cols., 2005) (Adaptado)
Pdr12pPdr12p
R1
RCOO
-
NH
3
+
R1
RCOO
-
NH
3
+
R1
RCOOH
NH
2
R1
RCOOH
NH
2
R1
RCOOH
NH
2
R1
RCOOH
NH
2
R1
RCOO
-
NH
4
+
R1
RCOO
-
NH
4
+
α-cetoácido
AMINOÁCIDO (2)
R1 C COO
-
O
R1 C COO
-
O
R1 C H
O
R1 C H
O
R1 C O
-
O
R1 C O
-
O
R1 C O
-
O
R1 C O
-
O
R1 C OH
O
R1 C OH
O
R1 CH
2
OHR1 CH
2
OH
R1 CH
2
OHR1 CH
2
OH
Álcool superior
Aro10p
Transaminase
Descarboxilase
+
CO
2
Aminoácido (1)
α-cetoácido (1) Aldeído (1)
Álcool desidrogenase
NADH + H
+
NAD
+
Introdução
37
Figura 2 – Biossíntese de L-leucina e formação de álcool isoamílico e acetato de
isoamila. O α-cetoisocaproato é convertido em L-leucina ou álcool isoamílico. A α-
IPM sintase é a enzima chave no controle desta via sintética. O acúmulo de L-leucina
inibe a atividade da α-IPM.
Fonte: (Ashida e cols., 1987; Kohlhaw, 2003; Oba e cols., 2006) (Adaptado)
L-Leucina
L-Leucina
BAP2,3 GAP1BAP2,3 GAP1
Glicose
α
αα
α−
−−
−Cetoisovalerato
α
αα
α-Isopropilmalato
α
αα
α-Cetoisocaproato
α
αα
α−
−−
−IPM
L-Valina
L-Valina
Álcool
isobutílico
Esterase
Álcool isoamílico
Álcool acetil
transferase
Acetato de isoamila
β
ββ
β-Isopropilmalato
BAT12
LEU2
LEU1
LEU4
Leu3p
ATF1,2IAH1
Isovaleraldeído
Introdução
38
descarboxilados e reduzidos à álcoois superiores como o n-propanol, álcool isobutílico e
álcool isoamílico. O primeiro passo no catabolismo de aminoácidos é a transaminação
do respectivo α-cetoácido, reação catalisada por aminoácido transferases citosólicas e
mitocondriais, codificadas pelos genes BAT1 e BAT2 respectivamente. Ambas as
isoenzimas resultantes permitem a catálise de transferência de reação do grupo amino da
L-Leucina para o 2-oxoglutarato, produzindo o oxoácido. No segundo passo ocorre a
conversão do correspondente α-cetoácidos para função de aldeído via reação de
descarboxilação pela enzima piruvato descarboxilase. Estes aldeídos são reduzidos a
álcoois superiores pela álcool desidrogenase (Ashida e cols., 1987; Casalone e cols.,
1997; Eden e cols., 2001; Lilly e cols., 2000; Pretorius, 2000; Schoondermark-Stolk e
cols., 2005; Swiegers e cols., 2005; Van Der Sluis e cols., 2002; Yoshikawa e cols.,
1995; Yoshizawa, 1999).
A síntese de álcool isoamílico via biossíntese de L-leucina ocorre a partir da
descarboxilação seguida de redução do α-cetoisocaproato resultando em isovaleraldeído
(Figura 2). A biossíntese de L-leucina a partir de glicose via α-isopropilmalato, é
catalisada seqüencialmente pela α-IPM sintase (gene LEU4), α-IPM isomerase (gene
LEU1), e β-IPM desidrogenase (gene LEU2) e tem como substrado o α-cetoisovalerato,
α-isopropilmalato e β-isopropilmalato respectivamente. O α-cetoisocaproato é
convertido em L-leucina ou álcool isoamílico. A α-IPM sintase é a enzima chave no
controle desta via sintética e isto é feito pelo produto final, ou seja, o acúmulo de L-
leucina inibe a atividade da α-IPM. A transcrição dos genes LEU4, LEU1 e LEU2 são
induzidos pelo fator transcricional Leup3. Este fator atua como um repressor na
ausência e ativador na presença de α-IPM (Kohlhaw, 2003; Oba e cols., 2006).
Por outro lado, os ésteres encontrados em bebidas alcoólicas são produzidos
durante a fermentação como produtos secundários do metabolismo de açúcares e
constituem um importante grupo de componentes que afetam o sabor e aroma do
produto. Os ésteres de bebidas alcoólicas podem ser classificados por diferentes
parâmetros como pelo ponto de ebulição (baixo, médio e alto), pelo odor (flores e frutas
etc) e polaridade (polar e apolar) (Lambrechts & Pretorius, 2000).
Os ésteres são geralmente formados intracelularmente pela reação de
condensação entre acetil coenzima A e etanol ou álcoois superiores produzidos no
Introdução
39
metabolismo de aminoácidos. A sintese de ésteres por S. cerevisiae é catalizada por um
grupo de enzimas chamadas álcool O-acetiltransferases (AATs) que utilizam os álcoois
e acetil coenzima A como substratos. Foram descritas quatro diferentes álcool
acetiltransferases: Atf1p, Lg-Atf1p, Atf2p e Eht1p (etanol hexanoil transferase). Esta
possivelmente responsável pela conversão de etanol e hexanoil coenzima A em caproato
de etila (Fujii e cols., 1996; Fujiwara e cols., 1999; Fukuda e cols., 1998; Fukuda e
cols., 2000; Lilly e cols., 2000; Lyness e cols., 1997; Mason & Dufour, 2000;
Verstrepen e cols., 2003c; Verstrepen e cols., 2003a; Verstrepen e cols., 2004;
Yoshikawa e cols., 1995; Yoshizawa, 1999).
A álcool acetiltransferase I, Atf1p, tem sido apontada como a principal
responsável pela formação da maior parte de compostos de ésteres pela fermentação
com cepas de S. cerevisiae (Lilly e cols., 2000; Verstrepen e cols., 2003c). Alguns
ésteres como acetato de isoamila e acetato de etila, são compostos importantes para o
aroma do vinho, cerveja e outras bebidas. Esta enzima está localizada em partículas
lipídicas da levedura sugerindo que a Atf1p tem um papel específico no metabolismo de
lipídeos e/ou esterol (Verstrepen e cols., 2004).
A Atf1p é codificada pelo gene ATF1 e consiste de 525 aminoácidos com massa
molecular de 61kDa. Atf1p é apontada como responsável por 80% da formação de
acetato de isoamila e 40% do acetato de etila em vinho. Este dado é reforçado por
experimentos de superexpressão de Atf1 que resultaram em um aumento de 100 vezes
na concentração de acetato de isoamila e acetado de etila. O gene ATF1 é reprimido por
traços de oxigênio, ausência de fontes de nitrogênio e carbono e ácidos graxos
insaturados de cadeia média (Fujii e cols., 1997; Lilly e cols., 2000; Mason & Dufour,
2000).
A produção de maiores teores dos ésteres acetato de isoamila e caproato de etila
dependem da disponibilidade dos precursores e do controle das atividades das enzimas
envolvidas na síntese e na hidrólise destes compostos. Os genes ATF1, ATF2 e IAH1
foram clonados e superexpressos em leveduras do vinho. Executando-se uma
fermentação com estes transformantes comparou-se a concentração de ésteres no vinho
e no destilado. A superexpressao dos genes ATF1 e ATF2 resultou no aumento da
concentração de acetato de isoamila e de acetato de etila enquanto para o gene IAH1
mostrou uma significativa diminuição desses ésteres. Resultado semelhante foi
Introdução
40
observado em leveduras de Saccharomyces cerevisiae usadas na fabricação de sakê.
(Fukuda e cols., 1996; Fukuda e cols., 1998; Lilly e cols., 2000; Mason & Dufour,
2000; Swiegers e cols., 2005). Recentemente foi descrito que a investigação e
manipulação dos aspectos que estão envolvidos na produção de ésteres pelas leveduras
pode resultar em desenvolvimento de estratégias para uma maior produção desse
composto (Pretorius & Hoj, 2005).
1.8.5 – Estratégias para aumentar a produção de ésteres
O aroma e o sabor são características que diferenciam, identificam e oferecem
qualidade a alimentos e a bebidas fermentadas. Vários são os fatores que influenciam
nestas características. Neste sentido, aproximadamente 100 compostos foram
identificados no vinho e cerca de 300 no saquê. Em vinhos e “brandies”, foi
demonstrado que os ésteres e álcoois superiores produzidos durante o processo
fermentativo das leveduras contribuem para o aroma destas bebidas. O aroma de frutas
presente no vinho, “brandy”, saquê e em outras bebidas é atribuído a compostos como o
caproato de etila (maçã), acetato de isoamila (banana), caprilato de etila (maçã) e
acetato de 2-feniletil (frutas, flores e mel) (Yoshizawa, 1999; Lilly et al., 2000; Nonato
et al., 2001; Falqué et al., 2001).
Estudos sobre a produção de compostos aromatizantes pelas leveduras utilizadas
na produção do saquê têm tido grande impulso nos últimos anos, como uma estratégia
de melhoria da qualidade desta bebida. Isto também se explica pelo fato de que o
consumo da cerveja e do vinho tem aumentado, causando um declínio do consumo do
saquê. Como conseqüência, o consumo de saquê de melhor qualidade tem aumentado
sensivelmente. A criação do “National Research Institute of Brewing” no Japão,
possibilitou a sistematização do processo de fabricação da bebida e melhorou a
qualidade e variedade do saquê (Yoshizawa, 1999).
O desenvolvimento de leveduras de referência contribuiu significativamente
para a microbiologia e biotecnologia industrial (Yoshizawa, 1999).Várias leveduras
foram desenvolvidas para aumentar a concentração de compostos que conferem aroma
no saquê. Para isso, cepas mutantes induzidas foram selecionadas e passaram a ser
usadas no processo de fabricação da bebida. Muitas destas cepas têm inoperante o
sistema de inibição por “feedback” da síntese de alguns aminoácidos. Alguns mutantes
Introdução
41
foram obtidos por exposição a irradiação UV ou a agentes químicos como o
etilmetanosulfonato (SEM) e selecionadas usando um análogo da L-leucina, o 5,5´,5´´-
trifluoro-DL-leucina (TFL) no meio seletivo. Os mutantes resistentes a TFL não são
retroinibidos por L-leucina o que possibilita o acúmulo de álcool isoamílico (Ashida e
cols., 1987). Cepas com habilidade de formação e acúmulo de ácido capróico foram
obtidas com mutantes resistentes a cerulenina, uma droga que inibe a síntese de ácidos
graxos (Yoshizawa, 1999).
Como abordamos anteriormente (Figura 2), a biossíntese de L-leucina a partir de
glicose via α-isopropilmalato, é catalisada por várias enzimas como, por exemplo, a α-
IPM sintase. A α-IPM sintase é a enzima chave no controle desta via sintética e isto é
feito pelo produto final, ou seja, o acúmulo de L-leucina inibe a atividade da α-IPM
(Figura 2). Cepas mutantes que apresentam a α-IPM insensível a inibição por
“feedback” por L-leucina, apresentam uma superprodução de L-leucina e resistência a
TFL (Ashida e cols., 1987; Bendoni e cols., 1999; Casalone e cols., 1997;
Satyanarayana e cols., 1968; Ulm e cols., 1972).
Segundo Yoshizawa (1999), cepas selvagens em presença de TFL promovem a
incorporação deste análogo em proteínas. Como estas proteínas terão suas atividades
afetadas, a síntese de L-leucina é inibida e a célula não sobrevive a exposição a este
composto em meios de cultivo. Mutantes resistentes a TFL não apresentam a inibição
por L-leucina, desta forma, a célula não somente sobrevive como produz grandes
quantidades de álcool isoamílico e de L-leucina.
Por outro lado, o caproato de etila é um importante componente do saquê,
conferindo sabor de maçã a bebida. Este composto é sintetizado pela enzima álcool
aciltransferase, usando como precursores o etanol e o caproil coenzima A (caproil-
CoA). O caproato de etila também pode ser convertido por uma esterase, sendo que
neste caso os produtos são o ácido capróico e o etanol (Yoshizawa, 1999).
Na busca pelo desenvolvimento de leveduras que produzam elevados teores
desse éster, Ichikawa e cols. (1991) isoloram mutantes resistentes a cerulenina que
produziam maiores quantidades de etil caproato no processo de produção do sake
quando comparados às cepas originais e sugeriram que o ácido capróico tem relação
com a síntese de ácidos graxos. A síntese de ácidos graxos na levedura é catalisada por
Introdução
42
uma enzima multifuncional com sete sítios catalíticos, a ácido graxo sintetase (Figura 3)
Mudanças na atividade catalítica da enzima ácido graxo sintetase tem como resultado a
alteração do comprimento de ácidos graxos formados. A cerulenina é um inibidor
específico da ácido graxo sintetase. A análise de cepas mutantes resistentes a cerulenina
indicou que mutação no gene FAS2 pode ser responsável por essa resistência e alta
produção de caproato de etila (Akada e cols., 1999; Akada e cols., 2001; Arikawa e
cols., 2000; Aritomi e cols., 2004; Asano e cols., 2000; Ashida e cols., 1987; Ichikawa e
cols., 1991).
1.8.6 – Metodologia para aumentar a produção de compostos
aromatizantes da cachaça.
O Laboratório de Biologia Celular e Molecular - LBCM – do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB, desenvolveu uma metodologia para o
isolamento de cepas de S. cerevisiae, a partir de amostras de fermentação em dornas de
produção da cachaça, com maiores teores de compostos aromatizantes como álcoois
superiores e ésteres (Figura 4). As cepas foram selecionadas seguindo critérios
relevantes para a produção da bebida, como: não produção de H
2
S, floculação,
capacidade fermentativa, tolerância a etanol e a temperaturas elevadas. As leveduras
selecionadas foram expostas ao TFL e cerulenina como parte de uma estratégia para
identificar aquelas maiores produtoras de álcoois superiores e ésteres. Selecionaram-se
duas cepas, LBCM 427 e LBCM 422, naturalmente resistente a TFL e cerulenina e
naturalmente sensível a estes compostos, respectivamente. Por cromatografia gasosa,
quantificou-se a produção de álcool isoamílico e acido capóico e verificou-se que a cepa
resistente a TFL e cerulenina produz elevados teores de ambos os compostos (Vicente e
cols., 2003; Vicente, 2003). Os resultados em conjunto encontrados neste trabalho
permitiram vislumbrar a investigação de outros aspectos como avaliar a capacidade
destas leveduras adaptarem-se no processo fermentativo do caldo de cana-de-açúcar,
qualidade sensorial da cachaça produzida, assim como estudar as diferenças genéticas
das leveduras selecionadas que podem diferenciar e ou melhorar a qualidade do produto
Introdução
43
Figura 3 - Biosíntese de ácidos graxos em leveduras. A síntese de ácidos graxos na
levedura é catalisada por uma enzima multifuncional, a ácido graxo sintetase. Mudanças
na atividade catalítica da ácido graxo sintetase tem como resultado a alteração do
comprimento dos ácidos graxos formados. O metabolismo de formação de éster pode
ser um processo de desintoxicação da levedura, uma vez que ácidos graxos de cadeias
entre C
8
e C
14
são tóxicos para a célula. A cerulenina é um inibidor específico da ácido
graxo sintetase.
Fonte:(Beltran e cols., 2006; Ichikawa e cols., 1991).
Glicose
Glicólise
Piruvato
α-cetoácidos
aminoácidos
aldeídos
Álcool superiores
Acetil-CoA
Ácidos graxos-CoA
Ácidos graxos
Acetaldeídos
Etanol
Acil graxo ésteres
BAT1,2
Ácido Graxo Sintetase
Ésteres
ATF1,2
Álcool superiores
IAH1
Introdução
44
final. Este trabalho permitiu ainda conjecturar a introdução de métodos de isolamento
e/ou geração de mutantes que apresentem perfis com características mais adequadas
para contribuir para a produção de teores mais elevados de compostos aromatizantes.
Introdução
45
Figura 4 – Estratégia para seleção de leveduras produtoras de maiores teores de
compostos aromatizantes. A seleção da levedura é dividida em três fases: identificação,
seleção e dosagem dos compostos.
Fase I
(Identificação)
Exclusão por fontes de
carbono
Coleta de Amostras
Meio de cultura seletivo
Testes de pressão seletiva
Outras Fontes de carbono
Fontes de Nitrogênio
Escolha aleatória de um
grupo representativo
Identificação da espécie
Fase II
(Seleção)
Características para seleção
não produção de H
2
S
Floculante
Tolerância a Etanol e elevadas temperaturas
Dosagens enzimáticas
TFL
α-IPM
Invertase
Cerulenina
Fase III
(Dosagem
dos compostos)
Confirmação molecular da
identificação
Parâmetros
fermentativos
Dosagens dos compostos
flavorizantes
Álcoois
superiores
Ésteres
Cepa selecionada
Objetivos
46
2 - OBJETIVOS
Objetivos
47
2.1 – Objetivo Geral
Caracterização molecular de cepas utilizadas na produção de cachaça de
alambique com ênfase nos mecanismos de produção de compostos aromatizantes.
2.2 – Objetivos Específicos
Avaliar métodos de identificação molecular quanto a capacidade de
discriminar leveduras selecionadas das cepas nativas presentes no processo
fermentativo da produção de cachaça de alambique do local onde foi isolada;
Obter cepas segregantes de leveduras selecionadas para avaliar a estabilidade
fisiológica e eventuais mutações no gene que codifica para a enzima α-
isopropilmalato sintase;
Selecionar cepas segregantes resistentes a TFL e a cerulenina com
características apropriadas para atender as condições empregadas no
processo artesanal de produção da cachaça;
Validar o método de seleção das leveduras por produção da cachaça em
alambique de cobre, em escala piloto;
Determinar os níveis de compostos voláteis e analisar sensorialmente o
destilado produzido durante o processo fermentativo utilizando as cepas
selecionadas.
Material e Métodos
48
3 - MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
49
3.1 – Linhagens utilizadas
Cepas Descrição
LBCM 427 Cepa Saccharomyces cerevisiae resistente a
TFL e Cerulenina (Vicente e cols., 2006)
LBCM 422 Cepa Saccharomyces cerevisiae sensível a
TFL e Cerulenina (Vicente e cols., 2006)
RB 23A Cepa segregante da cepa parental LBCM 427
resistente a TFL e Cerulenina
R 300 a R 330 Cepas isoladas de caldo fermentado da safra
2003 de uma destilaria de cachaça da região de
Ouro Preto - MG
RB1, RB5, RB7, RB8, RB10, RB14,
RB18, RB19, RB23, RB26, RB27,
RB31, RB35, RB36
Cepas segregantes da cepa parenteral LBCM
427 (indicação de resistência a drogas ver
Tabela 5)
Saccharomyces paradoxus
Cepa selvagem de laboratório
Saccharomyces kluveri
Cepa selvagem de laboratório
S. cerevisiae var. boulardii
Cepa selvagem de laboratório
S. cerevisiae (W303) Cepa selvagem de laboratório
Cândida glabrata NCYC 388 Cepa produtora de micocina
S. cerevisiae NCYC 1006 Cepa sensível a micocina
S. cerevisiae Comercial Cepa comercial usada na produção de vinho
3.1.2 – Manutenção das leveduras
As cepas de leveduras foram mantidas em Meio YP dextrose 2% e estocadas em
geladeira a cerca 4°C. As leveduras também foram armazenadas junto a coleção do
laboratório em Meio YP dextrose 2%, acrescido de glicerol 10% em freezer –80°C.
Material e Métodos
50
3.2 – Meios de Cultura
3.2.1 – Meio YP
O meio YP (Yeast Peptone) é composto por extrato de levedura 10g/l, peptona 20g/l
e agar 20g/l (para meio sólido) e fonte de carbono. Nos experimentos foram utilizadas
diferentes fontes de carbono (Por exemplo, glicose, etanol, sacarose) em diferentes
concentrações conforme indicado nas figuras e tabelas.
3.2.2 – Meio YP caldo de cana 10% agar
O meio YP caldo de cana é composto por caldo de cana recém colhido, extrato de
levedura 10g/l, bacto-peptona 20g/l e agar 2g/l. O caldo de cana não sofreu nenhum
processo de esterilização. No momento do plaqueamento adicionou-se 100 µg/mL do
antibiótico cloranfenicol para prevenir contaminação por bactérias (Pataro e cols., 2000).
3.2.3 – Meio Mínimo
O Meio Mínimo é composto por 6,7 g/l de base nitrogenada sem aminoácidos e sem
suplementar com aminoácidos, glicose 2%, agar (1,5%) para meio sólido, pH 6,5.
3.2.4 – Meio Yeast Carbon Base (DIFCO Laboratories)
O meio Yeast Carbon Base (DIFCO Laboratories) foi preparado conforme indicado
pelo fabricante. As fontes de nitrogênio utilizadas foram: nitrato de potássio e lisina.
3.2.5 – Meio Bismuth Sulfite Agar (DIFCO Laboratories)
O meio Bismuth Sulfite Agar (DIFCO Laboratories) foi preparado conforme
indicado pelo fabricante.
3.2.6 – Meio YEPD-MB (Yeast Extract Peptone Dextrose – Methylene Blue)
O MeioYEPD-B é composto por extrato de leveduras (1%), peptona (2%), glicose
(2%) e agar (3%) em tampão citrato-fosfato 0,1M, pH 4,5. No momento de plaqueamento
adiciona-se 0,01% de azul de metileno (Morais e cols., 1997; Pataro e cols., 1998).
Material e Métodos
51
3.3 – Isolamento das leveduras na destilaria
Para verificar a presença das cepas LBCM422 e LBCM427 na destilaria, coletamos
novas amostras de mosto fermentado dois anos após o primeiro estudo. As amostras de
mosto foram coletadas no ano de 2003, nas dornas da destilaria localizada no distrito de
Santo Antônio do Leite, Município de Ouro Preto – MG no início da safra de produção de
cachaça (10 dias de produção) e com quatro horas de fermentação. As amostras foram
coletas em frascos estéreis previamente identificados, mergulhando-os nas dornas e
coletando cerca de 150 mL de mosto fermentado. Os frascos foram acondicionados em gelo
e transportados ao laboratório e processados em até uma hora após a coleta. Essas amostras
foram submetidas à diluição seriada em água estéril (1:10; 1:100 e 1:1000) e alíquotas de
100 µl foram inoculadas, em triplicata, em placas contendo meio YP caldo de cana
cloranfenicol 100µg/mL e incubadas a 30° C por 72 horas. Todas as colônias de leveduras
crescidas nestes meios de cultura foram repicadas para meio YPD 2% e incubadas a 30° C
por 72 horas (Pataro e cols., 2000). Foram obtidas 358 leveduras das quais 35 foram
aleatóriamente escolhidas para testes de resistência a TFL e cerulenina.
3.4 – Teste de seleção para as cepas segregantes
A levedura LBCM 427 foi inoculada em meio YPD 2% e incubadas a 30° C
“overnight” e transferida para o meio de esporulação (Acetato de sódio 1,5%, Agar 2%). Os
ascos foram dessecados utilizando micromanipulador e os esporos foram germinados em
meio YPD Agar. Este experimento foi realizado no laboratório do doutor Johan M.
Thevelein no Centre for Malting and Brewing Science, Department of Food and Microbial
Technology, K.U. Leuven, Belgium.
3.4.1 - Testes de Floculação
As leveduras foram inoculadas em placas de Petri contendo meio YPD 2% e
incubadas a 30° C durante 72 horas. Em seguida foram feitos inóculos em tubos de ensaio
contendo 4 mL de meio YPD 2%. Esses tubos foram incubados por 24 horas, a 28° C, sob
agitação a 200 rpm (Incubador Rotatório New Brunswick Model G25). Após esse período,
uma alíquota de 50 µl da amostra em estudo e 950 µl de meio YPD 2% foi transferida
Material e Métodos
52
assepticamente para uma cubeta e medido a DO
600nm
em um espectrofotômetro (Beckman
Modelo DU-68). A amostra era incubada até atingir uma DO
600nm
igual a uma unidade e a
floculação foi observada visualmente (D'Hautcourt & Smart, 1999; Jin & Speers, 2000; Jin
& Speers, 1998; Powell e cols., 2003; Verstrepen e cols., 2001; Verstrepen e cols., 2003b).
3.4.2 – Medida da produção de H
2
S
As leveduras foram crescidas em placas de Petri contendo meio YPD 2% e
incubadas a 30° C durante 72 horas. Após este período, as leveduras foram inoculadas em
meio Bismuth Sulfite Agar (DIFCO Laboratories) e incubadas a 30° C durante 72 horas. As
colônias que apresentavam coloração negra após o término do tempo de incubação foram
consideradas produtoras de H
2
S (Jiranek e cols., 1995b; Jiranek e cols., 1995a).
3.4.3 – Medida da produção e resistência a micocinas
As cepas segregantes, Cândida glabrata NCYC 388 e Saccharomyces cerevisiae
NCYC 1006 foram crescidas separadamente em placas contendo YPD e incubadas a 30º C
por 48 horas. Após o crescimento as colônias de leveduras foram submetidas a diluição em
1mL de solução salina (0,9% de NaCl) sendo que 100 µL de solução contendo a levedura
Cândida glabrata NCYC 388 ou Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006, foram inoculados
no meio MeioYEPD-B com o auxílio de uma alça de Drigalski. Estas cepas foram
utilizadas como cepas sensível e produtora de micocinas, respectivamente Em seguida
aplicou-se 5 µL da levedura teste em pontos previamente identificados. As placas foram
então incubadas a 25º C durante 7 dias para verificar a produção e a resistência ou
sensibilidade a micocinas. As cepas foram identificadas como produtoras de micocinas pela
formação de um halo azul escuro próximo à colônia teste (Morais e cols., 1997; Pataro e
cols., 1998).
3.4.4 – Tolerância ao estresse
A maioria das linhagens de leveduras isoladas em alambiques artesanais mostra-se
bem adaptada às condições ambientais observadas nas dornas de fermentação. Elas são
capazes de crescer em condições de estresse extremo como a 37° C, em meio contendo
25% de glicose e 8% etanol (Pataro e cols., 2000).
Material e Métodos
53
As segregantes da cepa LBCM 427 foram submetidas a diferentes meios de cultura
e temperatura para simular os parâmetros de estresse encontrados nas dornas e selecionar
aquelas que sejam resistentes ou mais adaptadas. Para isso, primeiramente as cepas foram
crescidas em meio YPD 2% e incubadas a 30° C por 72 horas. As cepas então foram
submetidas aos seguintes meios e condições: YP glicose 20%, YP sacarose 20%, YP etanol
10% a 30°C e 37°C por 72 horas.
3.4.5 – Tolerância à temperatura
As leveduras foram inoculadas em placas de Petri contendo meio YPD 2% e
incubadas a 30° C durante 72 horas. Posteriormente, as leveduras foram transferidas para
YP galactose 2%, YP maltose 2%, YP glicose 2%, YP glicose 20%, YP sacarose 20%, YP
etanol 10%, e incubadas a 30° C e 37° C por 72 horas.
3.4.6 – Teste de resistência a 5,5’,5”-trifluoro-DL-leucina (TFL) e Cerulenina
3.4.6.1 – Teste de sensibilidade natural a TFL
As leveduras foram inoculadas em placas de Petri contendo meio YPD 2% e
incubadas a 30° C durante 72 horas; após o crescimento foram transferidas por “replica
plating” para placas de Petri contendo meio mínimo com glicose (2%) como fonte de
carbono, suplementadas e não com 1 mM de TFL. Estas placas foram incubadas a 30° C
por 72 horas. As cepas de levedura que crescem em tais condições são consideradas
resistentes a TFL (Ashida e cols., 1987; Bendoni e cols., 1999; Casalone e cols., 1997;
Cavalieri e cols., 1999).
3.4.6.2 - Teste de sensibilidade natural a Cerulenina
As leveduras foram inoculadas em placas contendo meio YPD 2% e incubadas a
30°C durante 72 horas. Em seguida, as leveduras foram transferidas por “replica plating”
para meio mínimo contendo glicose (2%), suplementadas e não com 25 µM de cerulenina.
Estas placas foram incubadas a 30° C por 72 horas. As cepas de levedura que crescem em
tais condições são consideradas resistentes a cerulenina (Arikawa e cols., 2000; Ichikawa e
cols., 1991)
Material e Métodos
54
3.5 - Ensaios enzimáticos
3.5.1 – Determinação da atividade enzimática da invertase
3.5.1.1 – Inoculação e crescimento das células.
As leveduras foram inoculadas em placas de Petri contendo meio YPD 2% e
incubadas a 30° C durante 72 horas. Após este período, as leveduras foram crescidas em 5
mL de meio YPD 4% e de meio YP Rafinose 2% 24 horas, a 28° C, sob agitação
(Incubador Rotatório New Brunswick Model G25).
Após este procedimento, uma alíquota de 50 µl da amostra em estudo e 950 µl de
meio YPD 2% foi transferida assepticamente para uma cubeta para medir a DO
600nm
em
espectrofotômetro (Beckman Model DU-68). Prosseguiu-se o crescimento das leveduras até
que a DO
600nm
atingisse uma unidade (Salgado e cols., 2002).
3.5.1.2 – Preparo de extratos celulares para determinação da atividade
enzimática da invertase
Após atingir a DO
600nm
de uma unidade, a cultura foi centrifugada por 5 minutos, 4°
C, 1000 g. Após o descarte do sobrenadante, o sedimento celular foi ressuspenso em 3 mL
de água destilada gelada. A amostra foi novamente centrifugada; o sobrenadante foi
descartado e o sedimento celular ressuspenso em 3mL de tampão imidazol 200 mM
(Imidazol 200 mM, MgCl
2
40 mM, KCl 400 mM, pH 7) e centrifugado nas mesmas
condições. Após o último descarte do sobrenadante, adicionou-se 1 mL de tampão imidazol
50 mM (Imidazol 50 mM, MgCl
2
40 mM, KCl 400 mM, pH 7) e 0,5 g de pérola de vidro
em cada tubo. As células foram rompidas por agitação em vortex (3 X 60 segundos) com
repouso em gelo nos intervalos de agitação. Após esse procedimento, adicionou-se 2,5 µl
de 100 mM PMSF (Phenylmetyl Sulphonyl Fluoride). O sobrenadante foi transferido para
um tubo de microcentrifuga tipo eppendorf 1,8 ml e centrifugado por 5 minutos, a 3500
rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13). O sobrenadante foi coletado e acondicionado em
tubos de amostra do aparelho de dosagem bioquímica (COBAS-FARA Roche). O extrato
livre de células foi estocado em temperatura de –20° C até o momento da dosagem
(Salgado e cols., 2002).
Material e Métodos
55
3.5.1.3 – Dosagem da enzima invertase
A dosagem da enzima invertase foi realizada em um aparelho de dosagens
bioquímica (COBAS-FARA Roche). Foi utilizado como substrato para a reação uma
solução de sacarose 0,3 M em acetato de potássio 100 mM, pH 5,1. Após 5 minutos de
incubação a 30° C, a reação era interrompida pela adição de NaOH 1 M e em seguida
adicionado igual volume de HCl 1 M para neutralizar o pH da reação. Após esse
procedimento, a glicose liberada foi determinada pela reação clássica de glicose-
oxidase/peroxidase, tendo a ortodianisidina como reativo de cor e a leitura da absorbância
feita a 546 nm. A atividade da enzima invertase foi expressa em nmoles de glicose.min
-
1
.mg proteína
-1
(Celenza & Carlson, 1989; Goldstein & Lampen, 1975).
3.5.2 – Dosagem da atividade enzimática da α
αα
α-Isopropilmalato Sintase
3.5.2.1– Preparo do inóculo e crescimento celular
As leveduras foram inoculadas em placas de Petri contendo meio YPD 2% e
incubadas a 30° C durante 72 horas. Após o crescimento das leveduras em placas,
inoculou-se 5 ml de meio YPD 2% e meio mínimo (SD) contendo glicose (2%)
suplementado com 2 mM de L-Leucina. Esses tubos foram incubados por 24 horas, a 28°
C, sob agitação a 200 rpm (Incubador rotatório New Brunswick Model G25). Após esse
período, uma alíquota de 50 µl da amostra em estudo e 950 µl de meio YPD 2% foi
transferida assepticamente para um cubeta de plástico para medir a DO
600nm
em
espectrofotômetro (Beckman Model DU-68). As amostras foram crescidas até atingir-se
uma DO de 2 unidades(Satyanarayana e cols., 1968; Ulm e cols., 1972).
3.5.2.2 – Preparo de extrato para determinação da atividade enzimática da α
αα
α-
Isopropilmalato Sintase
Após atingir a DO
600nm
2, o volume total de cada amostra foi centrifugado por 5
minutos, a 4º C, 1000 g. O sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas com 3
mL de água destilada gelada. A amostra foi novamente centrifugada e o sobrenadante
descartado; as células foram ressuspensas em 3 mL de Tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 e
novamente centrifugado. Após o descarte do sobrenadante, foram adicionados 1 mL de
Material e Métodos
56
Tampão Tris-HCl 50 mM pH 7 e 0,5 gramas de pérolas de vidro em cada tubo. As células
foram rompidas por agitação em vortex (3 X 60 segundos) com repouso em gelo nos
intervalos de agitação. Após esse procedimento foi adicionado 2,5 µl de PMSF 100 mM; o
sobrenadante transferido para um tubo de 1,8 mL de microcentrífuga tipo eppendorf e então
centrifugado 20 minutos, a 4° C a 3.500 rpm (centrífuga Heraeus Sepatech, Biofuge 13). O
sobrenadante foi coletado e acondicionado em tubos de amostra do aparelho de dosagens
bioquímicas (COBAS-FARA Roche). O extrato livre de células foi estocado em
temperatura de –20° C até o momento da dosagem (Ashida e cols., 1987; Kohlhaw e cols.,
1969; Satyanarayana e cols., 1968; Ulm e cols., 1972; Webster & Gross, 1965).
3.5.2.3 – Dosagem da α
αα
α-Isopropilmalato sintase.
A atividade da α-Isopropilmalato Sintase foi medida pela determinação da
concentração de Coenzima A (CoA) liberada em um determinado período de tempo
utilizando o 5,5´-ditiobis-(2-nitrobenzoato) (DNTB) como reativo de cor. Uma mistura de
incubação de volume final de 50 µl, de tampão Tris-HCl 50 µmoles pH 8,5 contendo 20
µmoles de KCl; 0,2 µmol de acetil-Coenzima A (acetil CoA); 1 µmol de α-cetoisovalerato;
e extrato celular suficiente para leitura da absorbância variar entre 0,02 a 0,2. Para verificar
a retro-inibição da enzima, adicionamos à mistura de incubação 1, 2, 4, 10 e 20 mM de L-
Leucina.
Após incubação a 30° C, durante 10 minutos, a reação foi interrompida com 750 µl
de etanol PA. Em seguida, foi adicionado 500·µl de DTNB (DTNB 1 mM em tampão Tris-
HCl 20 mM pH 8). Uma alíquota foi transferida para uma cubeta de vidro e realizada a
leitura em espectrofotômetro (Beckman Model DU-68) no comprimento de onda de 412
nm. A reação se mostrou linear por 15 minutos. Dos valores obtidos subtraiu-se o valor da
absorbância de uma amostra sem o α-cetoisovalerato na mistura reacional. A atividade da
enzima α-Isopropilmalato sintase assim determinada foi expressa em nmoles de α-
Isopropilmalato.min
-1
.mg proteína
-1
(Ashida e cols., 1987; Satyanarayana e cols., 1968;
Ulm e cols., 1972).
Material e Métodos
57
3.5.3 – Dosagem de Proteínas
A dosagem da proteína das amostras foi realizada segundo método de Lowry
(Lowry e cols., 1951), usando-se soroalbumina bovina como padrão.
3.6 – Fermentação em escala piloto das leveduras selecionadas neste estudo
3.6.1 – Preparo do Inóculo
As leveduras foram inoculadas em placas de Petri contendo meio YPD 2% e
incubadas a 30° C durante 72 horas. Após o crescimento, as leveduras foram inoculadas em
20 mL de caldo de cana diluído a 8 °Brix, e previamente esterilizado, e incubadas a 28° C
por 24 horas, sem agitação mecânica. Após esse período, a alíquota foi inoculada em 100
mL de caldo de cana previamente esterilizado e diluído a 12 °Brix, e incubado a 28°C por
24 horas, sem agitação. Esta alíquota foi transferida para 1000 mL de caldo de cana
previamente esterilizado, diluído a 15 °Brix, e incubado a 28° C por 24 horas sem agitação.
Esta pré-cultura foi inoculada em dornas de aço inox com capacidade para 20 litros e
contendo 12 litros de caldo de cana recém colhido, diluído a 15° Brix. Os parâmetros de
fermentação foram acompanhados conforme pode ser observado nas figuras. Ao termino da
primeira fermentação, a dorna foi novamente preenchida com 12 litros de caldo de cana
recém colhido, diluído a 15 °Brix. Finalizado a fermentação, a dorna foi preenchida uma
terceira e ultima vez com caldo de cana recém colhido e diluído a 15 °Brix (Figura 5). Este
experimento foi realizado no Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade
Federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais, pelo doutor Paulo Henrique Alves da Silva.
3.6.2 - Determinação do grau alcoólico.
A cada 0, 24, 48 e 72 horas, alíquotas de 100 mL foram coletadas do caldo
fermentado e destilado (Distillatore Elettronico Enochimico Gibertini). O grau alcoólico foi
determinado pelo método de densitometria em picnometro de vidro, com capacidade para
20mL. Os picnometros foram calibrados com água destilada e os dados coletados em
triplicata e as analises feitas a 20°C. A partir da densidade determinou-se o grau alcoólico
expresso em °GL por meio de uma tabela de conversão.
Material e Métodos
58
Figura 5 – Estratégia para fermentação e produção de cachaça, em escala piloto, das
leveduras selecionadas.
A seguir, inoculadas em 20mL caldo
cana-de-açúcar 8 °Brix, 28° C, 24 h
• Leveduras crescidas em
meio YPD 2%, 30° C, 72 h
Alíquota inoculada
em 100 mL em caldo
cana-de-açúcar
12°Brix, 28° C, 24 h
Alíquota inoculada em 1000 mL de caldo
cana-de-açúcar 15 °Brix
Alíquota inoculada em 12 L
de caldo de cana-de-açúcar,
15°Brix (dornas de aço (20 L))
Fermentação
ao término da primeira fermentação, a dorna foi novamente
preenchida com 12 L de caldo de cana-de-açúcar 15 °Brix;
Finalizado a fermentação, a dorna foi preenchida pela terceira
e ultima vez com caldo cana-de-açúcar 15° Brix
0, 24, 48 e 72 horas, alíquotas de 100 mL do caldo
fermentado foram coletadas para determinação do grau
alcoólico, sacarose e acompanhamento das leveduras
durante o processo fermentativo
Destilação
O caldo fermentado a 8 °Brix foi encaminhado para
destilação.
o caldo fermentado foi transferido para o alambique de
cobre (20 L), aquecido e mantido a 100°C
o destilado foi divido em
“cabeça”, “coração” e “cauda”
O “coração” foi utilizado para
dosagem dos componentes
voláteis e análise sensorial
Análise dos
resultados
Material e Métodos
59
3.6.3 – Determinação de sacarose
Uma alíquota de 500 µl do caldo fermentado foi retirado a cada 0, 24, 48 e 72 horas
e teor de sacarose era medido em um refratômetro. Quando a concentração do açúcar foi
inferior a 8°Brix o caldo fermentado foi encaminhado para destilação em alambique de
cobre como descrito no item 3.6.5.
3.6.4 – Coleta de amostras para o acompanhamento das leveduras durante o
processo fermentativo
A cada 0, 12, 24, 48 e 72 horas, uma alíquota de 1 mL foi coletada assepticamente
do caldo fermentado das diferentes dornas e transferida para tubos cônicos de polietileno de
1,8 mL, previamente identificados, adicionado de 100µl de glicerol e armazenado a -20°C.
Outra alíquota de aproximadamente 200µl do caldo fermentado foi inoculada em YPD 2%
e incubada a 30°C por 48 horas. Após este período, foram coletadas aleatoriamente 100
colônias de cada placa de petri e inoculada em YPD 2% e incubada a 30°C por 48 horas.
Estas leveduras foram utilizadas para identificação da espécie e avaliação diversidade de
cepas.
3.6.5 – Destilação em alambique de cobre
O alambique de cobre com capacidade para 20 litros foi utilizado para a destilação
do caldo fermentado. O caldo fermentado foi transferido para o alambique, aquecido e
mantido a temperatura interna em torno de 100°C visualizado por um termômetro. A
evolução da destilação em alambique de cobre foi monitorada pela dosagem do grau
alcoólico utilizando um picnometro como descrito anteriormente. A destilação foi dividida
em três partes: a primeira (10% que correspondem a “cabeça”) e a ultima (10% que
correspondem a “cauda”) foram descartadas; a parte intermediaria (80% que correspondem
ao “coração”) foi utilizada para a dosagem dos componentes voláteis da cachaça. ). Este
experimento foi realizado no Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade
Federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais, pelo doutor Paulo Henrique Alves da Silva.
Material e Métodos
60
3.6.6 – Determinação dos compostos voláteis na cachaça
A determinação dos ésteres foi realizada em cromatógrafo a gás Shimadzu 17A,
com detector de ionização em chama, utilizando-se uma coluna capilar de polietileno glicol
(Supelco) de 30 m, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µmm de espessura de filme. As
condições cromatográficas foram as seguintes: temperatura de injetor igual a 180° C,
temperatura do detector igual a 200° C; fluxo de gás de arraste (Helio) 1 mL/min; vazão
dos gases no detector, hidrogênio 30 mL/min e ar sintético 300 mL/min. e taxa de split
igual a 2. A programação de temperatura do forno da coluna durante a análise
cromatográfica: inicialmente a 35° C por 10 minutos e então foi levada a 200° a uma razão
de 10° C/min, permanecendo a 200° C por 5 minuto. Foram feitas injeções de 1,0 µl do
destilado obtido no item 4.13.5 (Boscolo e cols., 2000; Cardoso e cols., 2004; Nonato e
cols., 2001).
3.6.6.1 - Reagentes e Padrões para cromatografia
Foram utilizados os seguintes padrões Merck: acetato de isoamila (grau HPLC),
alcool isoamílico (grau PA), etanol (grau PA), acetato de etila (grau PA), metanol (grau
PA), 1-propanol (grau PA), acetaldeido (grau PA), isobutanol ( grau PA) e furfural (grau
PA). Foi utilizada água do Sistema de Purificação Milli-Q.
3.6.6.2 - Identificação e quantificação dos compostos voláteis
Os compostos foram identificados por comparação com os tempos de retenção dos
padrões. Inicialmente os padrões foram injetados separadamente para determinar o tempo
de retenção e o grau de pureza. A quantificação dos compostos nas amostras foi realizada
pelo método da padronização externa.
Para determinação dos ésteres e álcoois na amostra, foi tomada uma alíquota de 1,0
mL do destilado e a solução analisada no cromatógrafo nas condições descritas
anteriormente (Boscolo e cols., 2000; Nonato e cols., 2001) .
3.6.7 – Análise sensorial da cachaça
Cada destilado recém produzido foi armazenado em frasco de vidro transparente,
mantido em repouso por 1 ano e conservados em temperatura ambiente. Após este período,
Material e Métodos
61
as amostras foram submetidas aos testes sensoriais. As análises sensoriais das cachaças
produzidas foram avaliadas por 19 provadores treinados ou consumidores contumazes. A
avaliação sensorial global realizou-se segundo a escala hedônica de 9 pontos (1-desgostei
extremamente/ 9-gostei extremamente). Este experimento foi realizado no Departamento de
Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais,
pelo doutor Paulo Henrique Alves da Silva.
3.7 – Reprodutividade dos resultados
Todos os experimentos foram realizados no mínimo três vezes. Para todos os
resultados obtidos foram computados os valores médios com seus respectivos desvios-
padrão, conforme mostram as figuras.
Quando necessário foi utilizado a Análise de Componentes Principais (Principal
Component Analysis - PCA). A PCA é uma técnica estatística de análise multivariada que
transforma linearmente um conjunto original de variáveis em um conjunto
substancialmente menor de variáveis não correlacionadas que contem a maior parte de
informação do conjunto original. Em uma análise de componentes principais, o
agrupamento das amostras define a estrutura dos dados através de gráficos de score e
loadings, cujos eixos são componentes principais (PCs) nos quais os dados são projetados.
Os scores fornecem a composição das PCs em relação às amostras, enquanto os loadings
fornecem essa mesma composição em relação às variáveis. Como as PCs são ortogonais, é
possível examinar as relações entre amostras e variáveis através dos gráficos dos scores e
loadings. O estudo conjunto de scores e loadings ainda permite estimar a influência de cada
variável em cada amostra (Ferreira e cols., 1999). Os dados experimentais originais foram
pré-processados pelo método de normalização de forma que todas as variáveis passam a ter
a mesma importância, ou seja, o mesmo peso.
As análises foram realizadas utilizando o programa estatístico MINITAB Release
14 for Windows .
Material e Métodos
62
3.8 - Identificação e análise do Polimorfismo molecular das cepas
3.8.1 – Preparação do DNA Genômico de leveduras
As leveduras foram inoculadas em placas de Petri contendo meio YPD 2% e
incubadas a 30° C durante 72 horas. Após este período, as leveduras foram crescidas em
tubos de ensaio contendo 5 mL de meio YPD 2% até a fase estacionária, a 28° C, sob
agitação de 200 rpm (New Brunswick). O volume total da cultura foi centrifugado por 5
minutos, a 4° C, 1000×g. O sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas com 0,5
mL de água destilada. Após centrifugação a 3750 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13) por
3 minutos, o sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 200 µl
tampão de extração (sorbitol 1M, citrato de Sódio 100 mM, EDTA 60 mM, pH 7). A
seguir, adicionou-se 100 µl de solução Lyticase 1000 U/mL (0,3 mg/mL Lyticase e 8 µl/mL
β-Mercaptoetanol em tampão de extração) e agitou-se ligeiramente. Esse tubo foi incubado
por 3 horas a 37° C. Após este procedimento, adicionou-se 300 µl de tampão de lise (SDS
2% em Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8), agitou-se cuidadosamente, e procedeu-se
uma inubação por 10 minutos a temperatura ambiente. A seguir, adicionou-se 200 µl de
NaCl 5 M e mantendo-se em gelo durante 2 horas. Ao término deste tempo, procedeu-se a
centrifugação por 10 minutos a 13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13). O sobrenadante
foi descartado e o sedimento celular ressuspenso em 300 µl de TE (Tris-HCl 10 mM,
EDTA 1 mM, pH 8). A seguir, adicionou-se ao tubo 400 µl de PCI (fenol/clorofórmio/
álcool isoamílico na proporção 25:24:1) promovendo-se a homogeneização em vortex por 2
minutos. Após este procedimento, o tubo foi novamente centrifugado por 10 minutos a
13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13). Ao término da centrifugação, a camada
superior foi transferida para outro tubo eppendorf previamente identificado, adicionando-se
2 volumes de etanol PA gelado. Este tudo foi deixado a temperatura de –20° C por 12
horas. Ápós o descongelamento, procedeu-se uma centrifugação por 10 minutos a 3500 rpm
(Heraeus Sepatech, Biofuge 13); o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi lavado
com 500 µl de etanol 70% e novamente centrifugado nas mesmas condições. Após a
centrifugação, desprezou-se o sobrenadante o sedimento foi concentrado a vácuo
(“speedvac” Savant AS 290) Após este procedimento, o DNA foi ressuspenso em 60 µl de
água purificada (Sistema Milli-Q Millipore).
Material e Métodos
63
3.8.2 – Método de Identificação por RAPD - PCR
Para o ensaio do RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA), dois
primers foram utilizados: EI1 (CTGGCTTGGTGTATGT) e LA1
(GCGACGGTGTACTAAC) (Pataro e cols., 2000). A reação foi procedida em um volume
final de 50 µl, o qual continha 1 µl de DNA genômico (0,3 ng), 40 pmol de cada primer,
0,2mM de dNTP, 3 µl do tampão 10X e 2,5 U de Taq DNA polimerase. A amplificação
passou por um passo inicial de desnaturação a 95º C por 4 minutos, seguida por 35 ciclos
de desnaturação a 94º C por 1 minuto, anelamento a 44º C por 2 minutos e extensão a 72º C
por 1,5 minutos. Depois do último ciclo houve uma extensão final a 72º C por 5 minutos. A
análise do produto de RAPD-PCR foi conduzida em gel de acrilamida 6%, a 120 volts por
aproximadamente 5 horas. Após a corrida o gel foi corado com prata passando por uma
solução inicial de fixação (etanol 10% e ácido acético 0,5%) durante 3 minutos. Houve uma
lavagem rápida com água, em seguida o gel foi deixado por 5 minutos na etapa de
coloração (etanol 10%, ácido acético 0,5% e nitrato de prata 12 mM). Logo após procedeu-
se nova lavagem com água durante 2 minutos. Por fim, foi utilizada a solução de
desenvolvimento (NaOH 0,75 M e formaldeído 38%) até o aparecimento da cor. O gel
então foi analizado e fotografado. Um marcador de 1KB DNA (Invitrogen) foi usado como
padrão (De Barros e cols., 1996; Pataro e cols., 2000).
3.8.3 – Método de Identificação por mtDNA-RFLP
3.8.3.1-Preparação do DNA mitocondrial
As células foram inoculadas em 5 mL de meio YPD 2% e incubadas até a fase
estacionária, a 28º C, sob agitação de 200 rpm em incubador New Brunswick Model G25.
A cultura foi centrifugada por 5 minutos a 1.000g, o sobrenadante descartado e as células
ressuspensas em 1000 µl de água milli-Q estéril. A amostra foi transferida para um tubo
eppendorf e centrifugada a 5.000 rpm por 5 minutos (Haeraeus Sepatech, Biofuge 13). O
sobrenadante foi novamente descartado e o sedimento celular ressuspenso em 500 µl de
sorbitol 1M, EDTA 0,1M, pH 7, 5, com adição de 20 µl de solução de Lyticase (0,3 mg/mL
de liticase e 8 µl /mL de β-mercaptoetanol em tampão de extração). Os tubos foram então
incubados a 37º C por 3 horas e a formação dos esferoplastos foi monitorada opticamente
em um microscópio. Os esferoplastos foram centrifugados a 5.000g por 5 minutos e o
Material e Métodos
64
precipitado ressuspenso em 500 µl de 50 mM Tris-HCl - 20 mM EDTA, pH 7,4. Em
seguida foram adicionados 13 µl de SDS (Duodecil Sulfato de Sódio) 10%, e a mistura
incubada a 65º C por 15 minutos. Imediatamente depois foram adicionados 200 µl de
acetato de potássio 1M, os tubos foram colocados no gelo por 5 minutos e
subseqüentemente centrifugados a 10.000 rpm por 15 minutos (Haeraeus Sepatech, Biofuge
13) e colocados à temperatura de –20º C por 5 minutos. Este procedimento foi repetido três
vezes. O sobrenadante foi transferido para um tubo eppendorf novo e o DNA foi
precipitado pela adição de um volume de isopropanol. Depois de incubados a temperatura
ambiente por 10 minutos, os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm por 10 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o DNAmt lavado com etanol 70%. Procedeu-se nova
centrifugação a 10.000g por 10 minutos, e o sobrenadante foi descartado e o DNA seco a
68º C durante 10 minutos. Após este procedimento o DNA foi ressuspenso em 30 µl de
água milli-Q estéril (Lopez e cols., 2001; Querol e cols., 1992b; Querol e cols., 1992a;
Querol & Barrio, 1990).
3.8.3.2-Digestão com enzimas de restrição
Após a purificação do DNA como descrito anteriormente, os fragmentos foram
digeridos com as enzimas Hinf I e Rsa I(Gibco BRL Life Technologies). Para tanto, foram
adicionados ao tubo eppendorf de 1,8 mL, 20µl do fragmento obtido pelo método anterior,
2µl de Tampão 10X REACT 2, 1µl da enzima Hinf I. Em outro tubo eppendof de 1,8 mL,
foram adicionados 10µl de fragmento de DNA, 2µl de tampão 10X REACT, 1, µl da
enzima RSA I e 8µl de água Miliq. A digestão com as enzimas de restrição foi conduzida
por 2 horas a 37°C. Ao termino deste tempo, o DNA foi purificado utilizando o método
PCI (fenol/clorofórmio/álcool isoamilico) descrito anteriormente. O produto da digestão foi
submetido a eletroforese em gel de agarose 1% e tampão TAE 1X. Após a revelação com
brometo de etido (0,5µg/mL), o gel foi fotografado usando-se o sistema Sony. (Fernandez-
Espinar e cols., 2001; Lopez e cols., 2001; Querol e cols., 1992b; Querol e cols., 1992a)
Material e Métodos
65
3.8.4 – Método de Identificação por COX – PCR
3.8.4.1 – Condições do COX-PCR
Foi utilizado como molde amostras de DNA mitocondrial extraído de acordo com o
item 3.8.3.1. O gene mitocondrial COXI que codifica a subunidade 1 da citocromo oxidase
foi utilizado para análise devido à variação no número e posição de seus introns (Lopez e
cols., 2003). Os introns do COXI foram amplificados por PCR utilizando os primers 3L
(GCTTTAATTGGWGGWTTTGG), 3R (ATTGTCATACCATTTGTYCTYAT), 4L
(GAAGTAGCAGGWGGWGGWGA) e 5R (GTTAGCTAAGGCWACWCCWGT). O
DNA foi amplificado em um termociclador (Eppendorf-Mastercycler)
. A reação de
amplificação continha 50 pmol de cada primer, 0,2 mM de dNTP, 5 µl do tampão 10X, 2,5
U de Taq DNA polimerase e 5 µl de DNAmt (0,3 ng), em um volume final de 50 µl. Os
parâmetros de amplificação utilizados foram: uma desnaturação inicial a 95º C por 4
minutos; 35 ciclos de desnaturação a 94º C por 1 minuto; anelamento a 51º C por 1 minuto
e extensão a 72º C por 2 minutos, com extensão final a 72º C por 5 minutos. O produto de
PCR foi separado em gel de acrilamida 6%, a 120 volts por aproximadamente 5 horas.
Após a corrida o gel foi corado com prata como descrito anteriormente, visualizado e
fotografado. Um marcador de 1KB DNA (Invitrogen) foi usado como padrão.
3.8.5 – Método de Cariotipagem
As células de levedura foram cultivadas em 5mL de meio YPD por 24 horas a 160
rpm, 28º C. O DNA cromossomal foi isolado como descrito por Lopes e cols (2001);
lavado em tampão TE (EDTA 1 Mm, Tris-HCL 10Mm, pH 8,0) a 50º C durante 30 minutos
e então lavado novamente três vezes com o mesmo tampão a temperatura ambiente, por 30
minutos. Os DNAs foram colocados em um gel de agarose (Seakem® Gold) 1% (w/v) e a
corrida foi conduzida usando um sistema TAFE (transverse alternating field
electrophoresis) Geneline, Beckman. As condições utilizadas foram as seguintes: voltagem
constante de 250 V por 6 horas com 35 segundos pulso de tempo, seguido por 20 horas a
275 V com 55 segundos pulso de tempo a temperatura constante de 14º C (Schuller e cols.,
2004). O tampão utilizado na corrida eletroforética era composto por Tris base 10m M,
EDTA 0,5 mM e ácido acético 4 mM. O gel foi então corado com brometo de etídio,
Material e Métodos
66
visualizado e fotografado. Este experimento foi realizado na Universidade do Minho em
Braga, Portugal, pelas doutoras Dorit Schuller e Margarida Casal.
3.9 – Isolamento e análise por sequenciamento do gene da α
αα
α-isopropilmalato
sintase
3.9.1 - Dosagem do DNA
Uma alíquota de 5 µl da amostra de DNA genômico, preparada conforme o
procedimento descrito no item 3.8.1, foi diluída com 950 µl de água purificada (Sistema
Milli-Q Millipore). A amostra foi transferida para uma cubeta de quartzo e para medir a
absorbância. Sabendo-se que uma absorbância de 1 à 260 nm corresponde a uma solução
contendo 50 µg/mL de DNA calculou-se a concentração do DNA da amostra.
3.9.2 – Amplificação por PCR
A região LEU4 do DNA genômico que corresponde à região da α-isopropilmalato
sintase da levedura foi amplificada pela PCR utilizando-se os iniciadores IPMF (GGG GTA
CCA CAA AAA GAC AAG GAA C) e IPMR (CGG AAT TCG AAT AAG TCC TGA
AAT AC) (White e cols., 1990). Foram utilizadas as seguintes condições de PCR: 20 pmol
de cada iniciador, 0,25 mM de dNTP, 1,5 mM de MgCl
2,
15 ng de DNA genômico e 0,5 U
Taq DNA polimerase em volume final de 50 µl. A mistura foi submetida a desnaturação
inicial de 4 min à 94° C, seguida de 34 ciclos de 94° C por 1min, 48° C por 1 min e 72° C
por 2,20 min. A extensão final foi feita à 72° C por 10 min (Casalone e cols., 1997;
Cavalieri e cols., 1999).
3.9.3 – Purificação do produto de PCR
Uma alíquota de 45 µl do produto da PCR foi transferida para um tubo eppendorf de
1,8mL, previamente identificado, contendo 255 µl de água purificada (Sistema Milli-Q
Millipore) esterilizada. A este tubo foi adicionado 300 µl de PCI (fenol/clorofórmio/ álcool
isoamilico na proporção 25:24:1) e procedendo-se a homogeneização em vortex por 2
minutos. Então, o tubo foi centrifugado por 10 minutos a 13000 rpm (Heraeus Sepatech,
Biofuge 13). Ao término da centrifugação, a camada superior foi transferida para outro tubo
eppendorf previamente identificado, adicionando-se em seguida acetato de sódio 3 M pH
Material e Métodos
67
5,2 (1/10 do volume total). A este tubo foram adicionados também 2 volumes de etanol
absoluto gelado e deixando-se por no mínimo 1 hora a temperatura de –20° C. Ao término
deste tempo, o tubo foi centrifugado por 10 minutos a 13000 rpm (Heraeus Sepatech,
Biofuge 13). O sobrenadante foi descartado e 500 µl de etanol 70% foi adicionado. Após
nova centrifugação, o DNA foi seco a vácuo (“speedvac” Savant AS 290) e ressuspenso em
25 µl de água purificada (Sistema Milli-Q Millipore).
3.9.4 - Ligação do fragmento amplificado ao vetor plasmidial TOPO TA
Cloning
A ligação do fragmento foi feita de acordo com o manual do fabricante do kit
TOPO-TA cloning (Invitrogen).
3.9.5 - Preparação de bactérias competentes
Células de bactérias TOP 10F’ foram crescidas por 24 horas a 37° C em placas de
Petri contendo meio LB-gar suplementado com 15 µg de tetraciclina e 20 µg/µl de
Streptomicina. O meio LB (LURIA-BERTAINI Medium) é composto por bacto-peptona
1%, extrato de levedura 0,5%, cloreto de sódio 0,5% e pH ajustado para 7,5. Após o
crescimento, uma colônia foi inoculada em um tubo de ensaio contendo 4 mL de meio LB e
incubado a 37° C por 16 horas. Após este período de tempo, uma alíquota de 1 mL foi
utilizada para inocular 100 mL de meio LB, sem suplementação de antibiótico, que foi
incubado a 37° C sob agitação constante de 250 rpm (New Brunswick) até atingir um valor
DO
600
(densidade ótica) próximo de 0,8. Após este procedimento, a cultura foi transferida
para um tubo polietileno cônico, com tampa, capacidade de 50 mL, e centrifugada por 10
minutos a 1000 g. O sobrenadante foi descartado e as células foram suspensas em 40 mL de
CaCl
2
0,1 M e deixado em gelo durante 1 hora. Ao final deste tempo, a suspensão de
células foi centrifugada por 10 minutos, a 4° C a 1000 g. O sobrenadante foi descartado e as
células foram ressuspendidas em 1 mL de CaCl
2
0,1 M gelado. Essa suspensão celular foi
aliquotada em tubos eppendorf de 1,8 mL e adicionou-se uma concentração final de
20%(v/v) de glicerol e armazenada em temperatura de –75° C.
Material e Métodos
68
3.9.6 – Transformação de bactérias
Um tubo eppendorff de 1,8mL contendo 100 µl de células de E. coli competentes
(ítem 4.16.4) foi mantido em gelo até o descongelamento da aliquota. Adicionou-se a este
tudo 20 µl da ligação anteriormente descrita e deixada novamente no gelo por 45 minutos.
Ao final deste tempo, o tubo foi colocado a 42° C por 1 minuto e uma vez mais resfriado
em gelo. Adicionou-se 1 mL de meio de cultura LB e este tubo incubado a 37° C por 40
minutos. Após este procedimento, centrifugou-se todo o conteúdo a 6000 rpm por 4
minutos. Desprezou-se o sobrenadante e as células foram ressuspensas em 100 µl de LB. A
suspensão foi plaqueada em placas LBXIA (bacto-peptona 1%, extrato de levedura 0,5%,
cloreto de sódio 0,5%, agar 1,5% em pH 7,5; 100 µg/mL de ampicilina, 1 mM de IPTG e
40 µg/mL de X-Gal) e o plaqueamento foi feito com auxílio de pérolas de vidro estéreis.
Estas placas foram incubadas por 24 horas a 37° C.
3.9.7 – Extração de DNA Plasmidial
As colônias brancas obtidas no procedimento anterior foram analisadas para
confirmar a inserção do fragmento desejado. Para isto, as colônias foram inoculadas em
tubos contendo meio 5 mL de meio LB-ampicilina e incubadas a 37° C por 24 horas. Após
o crescimento, a suspensão de células foi transferida para tubos eppendorf de 1,8 mL e
centrifugadas a 3500 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13) por 3 minutos. O sobrenadante
foi descartado e o sedimento celular foi ressuspenso com 200 µl de STET (sacarose 8%,
TritonX 0,1%, EDTA 50 mM e Tris-HCl 50 mM pH 8), adicionado de 5 µl de lisozima (50
mg/mL) e incubado a temperatura ambiente por 5 minutos. Após esta incubação, o tubo foi
aquecido a 95° C por 1 minuto e em seguida centrifugado a 13000 rpm (Heraeus Sepatech,
Biofuge 13) por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um eppendorf de 1,8 mL
previamente identificado, adicionado de 8 µl de CTAB (Brometo de trimetil amônio 5%) e
centrifugado a 13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13). por 10 minutos. O sobrenadante
foi descartado e o sedimento ressuspenso em 300 µl NaCl 1,2 M e homogeneizado por 1
minuto em vortex. Após este procedimento, foram adicionados 750 µl de etanol PA e o
tubo deixado a temperatura de –20° C por 24 horas. O tubo foi centrifugado por 10 minutos
a 13000 rpm (Heraeus Sepatech, Biofuge 13), o sobrenadante foi descartado e o DNA
plamidial lavado com 800 µl de etanol 70%. Procedeu-se nova centrifugação a 13000 rpm
Material e Métodos
69
por 10 mnutos, o sobrenadante foi descartado e o DNA seco a vácuo (“speedvac” Savant
AS 290). Após este procedimento, o DNA foi ressuspenso em 20 µl de água purificada
(Sistema Milli-Q Millipore).
3.9.8 – Reação de digestão do DNA utilizando a enzima de restrição Kpn I e
EcoR I
Após a purificação do DNA plasmidial, este fragmento foi digerido com a enzima
Kpn I e EcoR. Para tanto, foram adicionados ao tubo eppendorf de 1,8mL, 6 µl do
fragmento obtido pelo método anteriormente descrito, 15 µl de água estéril, 3 µl de BSA,
1µl de RNAase, 3 µl de tampão 10X React 1 (Biolabs) e 1 µl da enzima Kpn I e EcoR
(GIBCO-BRL). Essa digestão foi feita por 3 horas a 37° C. Ao término deste tempo, o
DNA foi purificado utilizando o método PCI (fenol/clorofórmio/álcool isoamílico) como
descrito no ítem 5.16.3. O produto de digestão foi submetido a eletroforese em gel de
agarose 1% e tampão TAE 1X. Após revelação com brometo de etídio, o gel foi visualizado
e fotografado usando-se sistema Sony
3.9.9 – Sequenciamento automático de DNA
As reações de sequenciamento foram conduzidas utilizando-se os primers M13
reverse (GGAAAAGCTATGACCATG), M13 Forward (CGCCAGGGTTTTCCCAGT
CACGAC), IPM1F Forward (CCTTCCTCCAAGTACAAGC), IPM3F Forward
(CGGTGGAAGCATTAACAGG), IPM6R reverse (GTTCAACCACATCTAAGGAC),
IPM8R reverse (TGGTCTTGAACGGCGCTAG), IPM9R reverse (ATCGAC
GATCTGGTGGCCTAC), IPM10R reverse (ATTACGCCTATACGATAG). As amostras
foram corridas em seqüenciador capilar automática ABI PRISM 3100. As seqüências foram
comparadas com a seqüência descrita na Saccharomyces Genome Database (
http://genome-www2.stanford.edu:5555/cq1-bin/blastsgd
) usando o Blast Search (Basic
Local Alignment Search Tool). As seqüências foram alinhadas usando-se o programa
Clustawl (http://ebi.ac.uk/clustawl) e traduzidas usando o programa BlastX. A percentagem
de similaridade das seqüências dos fragmentos clonados com a seqüência descrita na
Database foi calculada através do BLAST (White et al., 1990).
Resultados
70
4 - RESULTADOS
Resultados
71
4.1 - Identificação molecular de leveduras
4.1.1-Análise do Polimorfismo molecular das cepas por RAPD - PCR
Em estudo realizado por nosso grupo, desenvolvemos uma metodologia para isolar
e selecionar leveduras S.cerevisiae para serem utilizadas na produção de cachaça (Vicente e
cols., 2003; Vicente e cols., 2006). De acordo com a estratégia proposta, selecionamos a
cepa LBCM 427 como a que melhor atendia aos critérios adotados: melhor adaptação a
condições encontradas durante o processo de fermentação do caldo de cana, como
resistência à altas concentrações de sacarose, etanol e alta temperatura, capacidade de
floculação, boa capacidade de fermentação e resistência a cerulenina e TFL.
Como já
discutido anteriormente, a resistência a esses compostos seleciona leveduras com alto
potencial de produção de álcool isoamílico e acido capróico, respectivamente. A cepa
LBCM 422, isolada na mesma ocasião, apresenta as mesmas características exceto por
sensibilidade aos compostos e por essa razão utilizada neste estudo como controle negativo
para a cepa LBCM 427. Para acompanhar o comportamento destas cepas como leveduras
iniciadoras na fermentação do caldo de cana no processo de produção de cachaça, se
fizeram necessário avaliar técnicas de biologia molecular que melhor discriminam entre as
leveduras S. cerevisiae e as cepas em estudo coletadas na mesma destilaria.
Em vários estudos a técnica de RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic
DNA) foi utilizada para determinar o grau de polimorfismos entre as cepas de leveduras.
Este método é utilizado para discriminar cepas entre as espécies presentes no processo
fermentativo, bem como estudos epidemiológico e ecológico de leveduras. Tem a vantagem
de ser rápido, confiável e simples permitindo identificar e monitorar a presença de
leveduras iniciadoras durante a fermentação. Baseia-se no uso de primers (EI1 e LA1)
complementares ao sitio de splicing dos introns. Uma vez que os introns não são essenciais
para as funções gênicas, eles apresentam seqüência de motivos conservados, usados nos
iniciadores para direcionamento da ampplificação e altamente variáveis gerando uma
diversidade utilizada como parâmetro de comparação (De Barros e cols., 1996; Guerra e
cols., 2001; Pataro e cols., 2000; Plengvidhya e cols., 2004).
Para avaliar o poder desta técnica de discriminar entre as leveduras LBCM 427,
LBCM 422 e selvagens presentes no processo fermentativo, coletamos em 2003 novas
amostras de mosto no mesmo local de isolamento das cepas em estudo. As leveduras recém
Resultados
72
coletadas e isoladas em meio sólido YP caldo de cana 10% ágar conforme descrito no item
3.3. Após a incubação foram obtidas 358 leveduras das quais foram randomicamente
escolhidas 35 para testes de resistência a TFL e cerulenina. As leveduras não passaram por
testes de identificação, mas apenas quanto a resistência ou sensibilidade a TFL e cerulenina
que foi realizado conforme descrito em 3.4.6. As 35 leveduras foram expostas
primeiramente a TFL para seleção de cepas resistentes a este composto. Deste grupo de
cepas 51,4% é naturalmente resistente ao análogo como pode ser observado na Tabela 2. As
leveduras também foram expostas a cerulenina para verificar resistência a esta droga. Este
teste indicou que 48,5% das leveduras apresentaram resistência natural. (Tabela 2). Quando
comparamos com o perfil de resistência a drogas das cepas coletadas em 2001 com as de
2003 podemos observar que há certa variação entre os dois grupos de cepas.
A partir destes testes foram escolhidas quatro cepas para caracterização molecular:
R304, sensível a ambos compostos; R335, resistente a ambos compostos; R321, resistente a
TFL e sensível a cerulenina; e R329, resistente a cerulenina e sensível a TFL. (Tabela 3).
Para confirmar a capacidade do método RAPD-PCR em diferenciar o gênero
Saccharomyces, utilizamos para controle as cepas S. paradoxus e S. kluyveri. As cepas R
304, R321, R329 e R335 foram utilizadas para representar as cepas atualmente presentes na
destilaria e avaliar quanto à discriminação das cepas LBCM422 e LBCM427. Também
utilizamos as cepas LBCM 423 e LBCM 424 isoladas em 2001 e que apresentam
características distintas quanto a resistência a cerulenina e TFL para avaliar as diferenças de
perfil de bandeamento.
Como podemos observar na Figura 5, o perfil de bandeamento apresentado pelas
espécies S. paradoxus e S. kluyveri se mostraram bastante diferenciados e distintos das
demais cepas. As cepas LBCM422 e LBCM427 apresentaram um perfil de bandeamento
idênticas porém elas diferem quanto à sensibilidade a TFL e cerulenina como é apresentado
na Tabela 2. As cepas LBCM423 e LBCM424 tem perfis de bandeamento muito similares,
entretanto essas mesmas cepas tem perfis completamente diferentes quanto à resistência a
drogas (Tabela 3). Quando comparamos os perfis de banda de cepas coletadas no mesmo
ano não encontramos diferenças de perfis de bandas entre as cepas. O mesmo acontece
quando comparamos o perfil das cepas coletadas em anos diferentes, não encontrando uma
região de bandeamento que possam diferenciá-las.
Resultados
73
Tabela 2 – Perfil de resistência a TFL e Cerulenina das cepas coletadas em 2001 e 2003
Ano de coleta
Perfil de Resistência
2001(%) 2003(%)
Resistente a TFL e Cerulenina 37,5 20,0
Resistente a TFL e sensível a Cerulenina 18,0 31,4
Sensível a TFL e Cerulenina 26,4 25,7
Resistente a Cerulenina e sensível a TFL 18,0 22,8
Total de cepas 72 35
Resultados
74
Tabela 3 – Perfil de Resistência da TFL e Cerulenina das cepas selecionadas para análise
do perfil molecular
Perfil de Resistencia
Ano Levedura Especie
TFL Cerulenina
LBCM 422
S. cerevisiae
_ _
LBCM 423
S. cerevisiae
_ +
LBCM 424
S. cerevisiae
+ _
2001
LBCM 427
S. cerevisiae
+ +
R 304 * _ _
R 321 * _ +
R 329 * + _
2003
R 335 * + +
* - identificação não realizada
- - Sensível
+ - Resistente
Resultados
75
Figura 06 – RAPD-PCR das cepas de leveduras isoladas de uma destilaria
artesanal de cachaça em 2003 (linhas 1 – 4) e leveduras isoladas em 2001 (linhas
5 - 8). Linhas: 1 - R304: 2 - R321; 3 - R329; 4 - R335; 5 - LBCM 422; 6 - LBCM
423; 7 - LBCM 424; 8 - LBCM 427; 9 - S. kluyveri ; 10 - S. paradoxus. PM representa o
padrão de peso molecular (1KB Invitrogen).
246
369
492
615
738
PM
10
9
8
7
6
5
4
3
1
2
Resultados
76
4.1.2 – Método de Identificação por mtDNA-RFLP
Em função dos resultados obtidos com o RAPD, as cepas LBCM 422 e LBCM 427
foram submetidas a outro método moleculares para avaliar o poder de descriminação de
linhagens iniciadoras e cepas selvagens presentes no processo fermentativo do caldo de
cana na produção de cachaça. A técnica de mtDNA-RFLP tem sido muito utilizada para
estudar a autencidade de cepas comerciais de leveduras e por esse motivo foi o próximo
método escolhido.
O método de mtDNA – RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism analysis
of mitocondrial DNA) consiste no isolamento do DNA total da levedura e o uso de
endonucleases de restrição que reconhecem um grande numero de sítios no DNA nuclear
da levedura mas poucos sítios do DNA mitocondrial. Este método é muito utilizado para
diferenciar cepas de leveduras S. cerevisiae além de ser descrito como eficiente para
diferenciar cepas de um mesmo ecossistema (Querol e cols., 1992b). É uma técnica de fácil
uso desde que as condições sejam cuidadosamente padronizadas (Beltran e cols., 2002;
Fernandez-Espinar e cols., 2001; Lopes e cols., 2002; Lopez e cols., 2001; Martinez e cols.,
2004; Pramateftaki e cols., 2000; Querol e cols., 1992b; Querol e cols., 1992a; Sabate e
cols., 1998; Schuller e cols., 2004; Torija e cols., 2001).
A técnica proposta tem obtido sucesso na diferenciação de gênero e espécie de
Saccharomyces. Desta forma, utilizamos as leveduras S. cerevisiae var. boulardii,
S.paradoxus, S. kluyverii e S.cerevisiae W303 para amostra controle de gênero e LBCM422
e LBCM427 para controle de espécie para podermos avaliar assim a capacidade desta
técnica em discriminar entre as cepas.
Na Figura 6 podemos observar o resultado da digestão com a endounuclease de
restrição Hinf I, e verifica-se que as cepas LBCM422 e LBCM427 apresentaram um perfil
idêntico de bandeamento. A cepa S.cerevisiae W303 apresentou um perfil de bandeamento
bem diferenciado das demais leveduras o que pode ser evidenciado pela presença de um
fragmento de 4.0Kb. A cepa da espécie S. cerevisiae var. boulardii apresenta um perfil de
bandeamento bem distinto das demais, como poder ser observado na presença de
fragmentos em 5.0 e 6.5Kb. As cepas S. paradoxus e S.kluyverii apresentam um perfil de
bandeamento completamente diferente das demais e entre elas ocorre apenas um fragmento
coincidente próximo a 3.7Kb.
Resultados
77
Figura 07 – Eletroforese em gel de agarose 1%corado com brometo de etídio e
visualizado sob luz UV, mostrando o perfil de mtDNA-RFLP (mitocondrial DNA
Restriction Fragment Length Polymorphism) das cepas LBCM 427, LBCM 422 e
outras leveduras do gênero Saccharomyces. M representa o padrão de peso
molecular.
Resultados
78
4.1.3 – Método de Identificação por COX – PCR
O sistema COX-PCR foi utilizado como outro método tentativo de
acompanhamento e discriminação de linhagens de leveduras para monitorar a presença ao
longo do processo fermentativo e diferenciar as cepas LBCM422 e LBCM427 entre si e das
demais presentes no meio.
O COX-PCR é um método que basea-se na variação do número e posição dos
introns no gene mitocondrial COXI. Variação no íntron COXI tem sido observada entre
cepas e entre espécies permitindo a diferenciação de cepas de S. cerevisiae. Uma reação de
PCR multiplex com quatro primers selecionados mostrou-se muito efetivo na análise de
polimorfismo de leveduras selvagens e comerciais para uso na fermentação do vinho
(Lopez e cols., 2003).
A Figura 7 mostra o resultado da reação de amplificação com os 4 primers
mencionados em Lopez e cols, 2003. No resultado para a cepa da espécie S. paradoxus
podemos observar a presença de duas bandas, uma de aproximadamente 450 pb e outra
com cerca de 1230 pb e na espécie S.kluyverii, a qual é diferente das demais cepas,
observamos apenas uma banda de aproximadamente 500 pb.
Como podemos observar, a cepa LBCM 422 apresenta três fragmentos de
aproximadamente 370 pb, 480 pb e 740 pb, sendo que esta última parece que a diferencia
das cepas LBCM 423, LBCM 424 e LBCM427. Estas cepas mostraram um perfil de
bandeamento com grande similaridade porem apresentam resultados distintos quando
expostas a TFL e cerulenina (Tabela 3). Quanto às cepas R304, R321, R329 e R335
também apresentaram um perfil de bandeamento muito pouco diferenciado entre si porem
tem perfis de resistência a TFL e cerulenina distintos (Tabela 3). Quando comparamos em
conjunto as cepas coletadas em 2001 e 2003 podemos encontrar fragmentos que as
diferenciam, porem entre elas há grande variedade de comportamento quanto a resistência a
drogas.
Resultados
79
Figura 08 – COX-PCR das cepas de S. cerevisiae isoladas de uma destilaria
artesanal de cachaça em 2001(linhas 3 – 6) e 2003 (linhas 7-10). Linhas: 1 - S.
kluyveri; 2 - S. paradoxus; 3 - LBCM 422; 4 - LBCM 423; 5 - LBCM 424; 6 - LBCM
427; 7 - R304; 8 - R321; 9 - R329; 10 - R335. PM representa o padrão de peso
molecular (1KB Invitrogen)
PM
1 2
3 4 5 6 8 10 9
7
Resultados
80
4.1.4 – Método de Cariotipagem
O método de cariotipagem mostra-se muito eficiente para discriminar entre cepas
geneticamente relacionadas. Tendo sido usado como método de escolha para verificar
rearranjos cromossomais. Além disto, tem sido sendo também muito útil para identificação
de cepas. Entretanto esta técnica é muito laboriosa e complicada para o uso rotineiro na
indústria (Schuller e cols., 2004).
A aplicação desta técnica em nossas cepas de leveduras possibilitou uma clara
diferenciação de cada cepa pelo perfil cromossomal específico. Como mostrado na Figura
8, cada cepa de levedura apresentou um perfil de bandeamento distinto demonstrando que
há uma grande diversidade genética entre as cepas analisadas. Mesmo as cepas utilizadas na
produção de cachaça e selecionadas pelos mesmos critérios bioquímicos, apresentaram
fragmentos de tamanhos diferentes, comprovando que há um grande polimorfismo
molecular entre as cepas utilizadas no processo fermentativo da cachaça.
Resultados
81
Figura 9: Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio e
visualizado sob luz UV, utilizando um sistema TAFE (transverse alternating field
electrophoresis), mostrando o perfil do cariótipo de diferentes espécies S.
cerevisiae (W303 e S. cerevisiae var. boulardii), S. paradoxus e S. kluyveri. Este
experimento foi realizado na Universidade do Minho em Braga, Portugal pelas
doutoras Dorit Schuller e Margarida Casal.
S. boulardii
LBCM422
LBCM427
W303
S. kluyverii
S. paradoxus
Resultados
82
4.2 – Segregantes da cepa parental LBCM 427
4.2 1 – Estudo das cepas segregantes
A manipulação genética de cepas de S. cerevisiae é de grande importância para
elucidar mecanismos moleculares e fisiológicos deste microrganismo, e tem sido usada para
melhorar o desempenho das cepas utilizadas na indústria alimentícia e de bebidas. Para o
melhoramento genético de cepas vários caminhos podem ser seguidos, dentre eles a seleção
de cepas variantes ou mutantes para uma dada característica ou fenótipo. Desta forma,
avaliamos a possibilidade de obter cepas variantes utilizando a técnica de esporulação da
cepa LBCM 427. Esta técnica é muito utilizada para o estudo genético e caracterização de
cepas utilizadas em laboratório (Gimren-Alcaniz & Matallana, 2001).
Para analisar uma cepa segregante de S. cerevisiae é necessário considerar a
habilidade de a cepa produzir uma razoável freqüência de ascos e da viabilidade de
ascósporos. A viabilidade é definida como a habilidade do esporo produzir uma colônia
visível dentro de 2 a 5 dias de incubação a 30°C.(Johnston e cols., 2000; Marullo e cols.,
2004; Romano e cols., 1998; Sipiczki e cols., 2004). O índice de esporulação da cepa
parental LBCM427 mostrou-se alto (>50% de ascos viáveis) (Tabela 4). De acordo com
esses resultados, o grupo que apresentou viabilidade de quatro esporos foi escolhido para a
análise da estabilidade e caracterização fisiológica das cepas.
O grupo selecionado de cepas segregantes foi submetido a metodologia de seleção
de leveduras com características apropriadas a produção de cachaça proposto por nosso
laboratório, que teve como objetivo avaliar a estabilidade fisiológica em algumas condições
similares as encontradas nas dornas de fermentação da cachaça como o crescimento a 37°
C, etanol 8% e glicose 50%(Pataro e cols., 2000). As 40 cepas segregantes foram avaliadas
sob os seguintes parâmetros: resistência a TFL e cerulenina; floculação; capacidade de
produção de micocinas (Killer); não produção de H
2
S; crescimento em YPD 2% 30° C, YP
sacarose 20%, YPD 20%, YP galactose 2%, YP maltose 2% e YP etanol 10% incubadas a
30° C e 37° C. Para avaliar a estabilidade fisiológica as cepas segregantes foram crescidas
em meio YPD 2% e incubadas a 30° C e 37° C por 48 horas (então denominada geração
F1). Ao final deste período as cepas foram submetidas aos testes mencionados
anteriormente por réplica plating. As cepas segregantes da geração F1 foram repassadas
para o meio YPD2% nas mesmas condições anteriores originando a geração F2 e assim
Resultados
83
Tabela 4 – Resultado da segregação da cepa parental LBCM427
Viabilidade esporos/ascos
N° ascos
dissecados
4 3 2 1 0
%
viabilidade
Total de
esporos
viáveis
36 10 5 13 7 1 61,1 88
Resultados
84
sucessivamente. A geração F1, F4 e F6 foram submetidas aos testes e os resultados podem
ser observados na Tabela 5.
Como podemos observar na Tabela 5, não encontramos cepa segregante que tenha
reunido todas essas características ao mesmo tempo. O grupo de segregantes apresentou um
comportamento variado de crescimento ao longo dos testes. Apenas o segregante RB 23A
manteve a característica de resistência aos compostos TFL e cerulenina concomitantemente
e por essa razão foi escolhido para os testes de fermentação em caldo de cana.
Para analisar o comportamento das segregantes aos testes de estabilidade, utilizamos
Análise de Componentes Principais (PCA). Como podemos observar na Figura 9, a análise
de PCA reúne as segregantes em três grupos que corresponde as gerações F1, F4 e F6
respectivamente. As duas primeiras componentes explicam juntas 84,77 % da variância dos
dados na análise das segregantes. A análise do grupo de tétrades utilizando como banco de
dados os resultados destas cepas quando expostas a todos os testes revelou uma mudança de
perfil de similaridade de respostas frente aos testes citados (Figura 9). As leveduras da
geração F1, F4 e F6 estão localizadas em diferentes quadrantes o que indica respostas
heterogêneas de geração para geração e similaridade entre as segregantes da mesma
geração. Portanto, essas segregantes demonstram uma tendência a instabilidade fisiológica
frente a um mesmo teste ao longo das gerações.
Na PCA, os vetores indicam a importância de cada variável para explicar as
variações entre as amostras. Vetores com medidas distantes de zero, correspondem a
variações com maior influência sobre o valor do componente, enquanto que, vetores mais
próximos de zero, indicam que correspondem a uma variável com pequena influencia sobre
o componente. Na primeira componente (PC1 73,59%) a variável com menor peso
atribuído foi a YP Galactose 2% 37°C (GAL2F37) e de maior peso a floculação (FLOC).
Na segunda componente (PC2 11,18%), YP glicose 2% 30°C (G2F30) foi a variável com
maior e YP glicose 20% 37°C (GLI20F37) com menor peso.
Resultados
85
Tabela 5 – Avaliação bioquímica e fisiológica das cepas segregantes
F1
F2
F4
F6
F1
F2
F4
F6
F1
F4
F6
RB-5A + - - - 1574 S S S S S R R R + - +
RB-5B + - - - 1563 S S S S S R R R - - +
RB-5C + - - - 1182 S S S S S S R R - - +
RB-5D + + + - 1346 S S S S S R R R - - +
RB-7A + - + - 2742 S S S S S S S S - - +
RB-7B + - + - 16045 S S S S S S S S - - +
RB-7C + - + - 2654 S S S S S S S S - - +
RB-7D + - - - 2927 S S S S S S S S - - +
RB-8A pobre - - - 5468 S S S S S S S S - - -
RB-8B + - + - 1971 R S R R R R R R - - +
RB-8C pobre - - - 8280 R S S R S R R R + - +
RB-8D + - + - 2456 S S S S S S S S + - +
RB-14A + - - - 2065 S S S S R R R R - - -
RB-14B + - + - 1348 S R R R S S S S - - -
RB-14C + - + - 1063 S S S S S S S S - - -
RB-14D + - - - 1598 S S S S S R R R - - -
RB-18A pobre - - - 3122 S S S S S S R S - - -
RB-18B + - - - 4415 S S S S S R R R - - -
RB-18C pobre - - - 7321 S S S S S R S S + - +
RB-18D pobre - - - 26326 S S S S S R R R + - +
RB-23A + - + - 1199 R R R R R R R R - - -
RB-23B pobre - - - 11506 S S S S S S S S + - +
RB-23C + + + - 1618 R S S S R R R R - - -
RB-23D pobre - - - 7340 S S S S S S R R + - +
RB-26A + - + - 1827 R S S S S S R R - - -
RB-26B + - + - 1901 R S S S S S S S - - -
RB-26C + - + - 772 R S S S S S R R + - +
RB-26D
pobre
-
-
-
20730
S
S
S
S
S
S
S
S
+
+
-
RB-27A + - + - 1202 R S S S S R R R - - +
RB-27B + - + - 879 R S S S S S S S + - +
RB-27C + - + - 1403 S S S S S S S S - - +
RB-27D + - + - 1241 R S S S R R R R - - +
RB-31A
pobre
-
-
-
4607
S
S
S
S
S
S
S
R
+
+
+
RB-31B + - + - 1763 R S S S S S S S - - +
RB-31C + + + - 1357 R S S S S S S S + - +
RB-31D
+
+
+
-
1072
S
S
S
S
S
R
R
R
-
-
-
RB-36A + - + - 1795 R S S S S S R R + + -
RB-36B pobre - - - 3289 S S S S S S S R + - +
RB-36C pobre - - - 3472 S S S S S S S S + - +
RB-36D
+
+
+
-
495
R
S
S
S
S
S
S
R
+
-
+
Cepas Crec.
Killer
Resistencia a Cerulenina FLOC YPD2%Resistencia a TFL
C S
Prod
H2S
Atividadade
Invertase
Cresc – crescimento
Floc – Floculação
Killer – produção de micocinas
C - Cândida glabrata NCYC 388
S – S. cerevisiae NCYC 1006
Atividade invertásica - (nmoles glicose.mim
-1
mg proteina
-1
)
Prod H
2
S – produção de H
2
S
F1, F2, F4 e F6 – número de passagens das cepas
R – resistente
S – sensível
- - ausência de crescimento
+ - crescimento
Resultados
86
Tabela 5 – Avaliação da estabilidade fisiológica das cepas segregantes (continuação)
F2, F4 e F6 – número de passagens das cepas
30°C e 37°C – temperatura a que foi submetida a levedura
- - ausência de crescimento
+ - crescimento
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
RB-5A + + + + + - + + + + + - + + + + + -
RB-5B + + + + + - + + + + + - + + + + + -
RB-5C + + + + + - + + + + + - + + + + + -
RB-5D + + + + + - + + + + + - + + - - + -
RB-7A + + + + + - + + + + + - + + - - + -
RB-7B + + + + + - + + + + + - + + - - - -
RB-7C + + + + + - + + + + + - + + - - - -
RB-7D + + + + + - + + + + + - + + + + - -
RB-8A + + + + + - + + + + + - + + + + - -
RB-8B + + + + + - + - + + + - + + - + + -
RB-8C + + + + + - + - + + + - + - - + + -
RB-8D + + + + + - + - - - + - + + - - + -
RB-14A + + + - + - + + + - + - + - + + + -
RB-14B + + + + + - + + + - - - + + + - - -
RB-14C + + + + + - + + + - + - + - - - + -
RB-14D + + + + + - + + + - - - + + - + - -
RB-18A + + + - + - + - - - + - + + - - - -
RB-18B + + + + + - + - + - + - + + - + - -
RB-18C + + + + + - + + + + - - + + + + + -
RB-18D + - + - + - + - - - + - + - - - + -
RB-23A + + + + + - + - + - + - + + - + + -
RB-23B + + + - - - + + - - - - + - - - - -
RB-23C + + + + + - + - + - + - + - + + + -
RB-23D + + + - - - + - - - - - + - - - - -
RB-26A + + + + + - + + + + + - + + - + + -
RB-26B + + + - - - + + - - + - + + - - + -
RB-26C + + + + + - + + + - + - + + - - + -
RB-26D + + + + + - + + + - + - + - - + - -
RB-27A + + + + + - + + + + + - + - - - - -
RB-27B + + + + + - + + + + + - + + + + - -
RB-27C + + + - - - + - - - + - + + - - - -
RB-27D + + + + + - + - + - + - + + + + - -
RB-31A + + + + + - + + + - + - + + + + + -
RB-31B + + + + + - + + + + + - + + + + + -
RB-31C + + + - + - + + + - + - + + - + - -
RB-31D + + + + + - + - + + + - + + - - - -
RB-36A + + + + + - + + + + + - + + - + + -
RB-36B + + + + + - + + + + + - + + + + + -
RB-36C + + + + + - + + + - + - + - + + + -
RB-36D
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
-
+
-
-
-
-
-
F4 F6 F1 F4 F6F6 F1
YP GALACTOSE 2%
YP MALTOSE 2%
YP GLICOSE 2%
Cepas
F1 F4
Resultados
87
Tabela 5 – Avaliação da estabilidade fisiológica das cepas segregantes (continuação)
F2, F4 e F6 – número de passagens das cepas
30°C e 37°C – temperatura a que foi submetida a levedura
- - ausência de crescimento
+ - crescimento
.
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
30ºC
37ºC
RB-5A + + + + + + + + + + + + - - + - + -
RB-5B + + + + + + + + + + + + + - + - + -
RB-5C + + + + + + + + + + + + + - + - + -
RB-5D + + + + + + + + + + + + + - + - + -
RB-7A + + + + + - + + + + + - + - + - + -
RB-7B + + + + + + + + + + + - + - + - + -
RB-7C + + + + + + + + + + + - + - + - + -
RB-7D + + + + + + + + + + + - + - + - + -
RB-8A + + + + + + + + + + + - + - + - + -
RB-8B + + + + + - + + + + + - - - + - + -
RB-8C + - + + + - + - + + + - - - + - + -
RB-8D + + + + + - + + + - + - - - + - - -
RB-14A + - + + + - + - + + + - + - - - - -
RB-14B + - + + + + + - + + + - + - - - + -
RB-14C + - + + + - + - + + + + - - - - - -
RB-14D + + + + + + + - + + + - + - + - + -
RB-18A + - + - + - + - + + + - + - - - + -
RB-18B + - + + + - + - + + + - + - + - + -
RB-18C + - + + + + + - + + + - + - + - + -
RB-18D + - + + + + + - + + + - - - + - + -
RB-23A + - + + + + + - + + + - - - + - + -
RB-23B + + + + + - + + + - + - - - - - - -
RB-23C + + + + + - + - + + + - - - + - + -
RB-23D + + + + + - + + + + + - - - - - - -
RB-26A + + + + + + + + + + + - - - + - + -
RB-26B + + + - + + + - + + + - - - - - - -
RB-26C + - + + + - + - + + + - + - + - + -
RB-26D + + + + + - + + + + + - - - + - + -
RB-27A + + + + + + + - + + + - + - + - + -
RB-27B + - + + + - + - + + + - - - + - + -
RB-27C + + + + + + + + + + + - - - - - - -
RB-27D + + + + + + + + + + + - - - + - + -
RB-31A + + + + + - + + + + + - - - - - + -
RB-31B + - + + + + + - + + + - + - + - + -
RB-31C + - + + + + + - + + + - - - - - + -
RB-31D + + + + + + + + + + + - - - - - + -
RB-36A + + + + + + + - + + + - + - - - + -
RB-36B + + + + + + + + + + + + + - - - + -
RB-36C + + + + + + + + + + + - - - - - + -
RB-36D
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
+
-
-
-
-
-
F4 F6F1 F4 F6 F1 F4
Cepas
F1
YP GLICOSE 20%
YP SACAROSE 20%
YP ETANOL 10%
F6
Resultados
88
A
B
Figura 10 - Análise de Componentes Principais (PCA) correspondendo a
respostas das cepas segregantes quanto à estabilidade fisiológica. Painel A:
Loadings. Painel B: Score: F1, F4 e F6 correspondem as gerações 1, 2 e 3
respectivamente.
PC1
PC2
0,20,10,0-0,1-0,2-0,3-0,4-0,5
0,75
0,50
0,25
0,00
-0,25
-0,50
FLO C
CERU
TFL
ETF30
SAC20F37
GLI20F37
G2F37
G2F30
MA L2F37
MA L2F30
GA L2F37
GA L2F30
PC1 (73,59)
PC2 (11,18)
0,0-0,5-1,0-1,5-2,0-2,5
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
-1,5
RB-36D
RB-36C
RB-36B
RB-36A
RB-31D
RB-31C
RB-31B
RB-31A
RB-27D
RB-27C
RB-27B
RB-27A
RB-26D
RB-26C
RB-26B
RB-26A
RB-23D
RB-23C
RB-23B
RB-23A
RB-18D
RB-18C
RB-18B
RB-18A
RB-14D
RB-14C
RB-14B
RB-14A
RB-8D
RB-8C
RB-8B
RB-8A
RB-7DRB-7CRB-7B
RB-7A
RB-5DRB-5CRB-5BRB-5A
RB-36D
RB-36C
RB-36B
RB-36A
RB-31D
RB-31C
RB-31B
RB-31A
RB-27D
RB-27C
RB-27B
RB-27A
RB-26D
RB-26C
RB-26B
RB-26A
RB-23D
RB-23C
RB-23B
RB-23A
RB-18D
RB-18C
RB-18B
RB-18A
RB-14D
RB-14C
RB-14B
RB-14A
RB-8D
RB-8C
RB-8B
RB-8A
RB-7D
RB-7C
RB-7B
RB-7A
RB-5D
RB-5CRB-5BRB-5A
RB-36D
RB-36C
RB-36B
RB-36A
RB-31D
RB-31C
RB-31B
RB-31A
RB-27D
RB-27C
RB-27B
RB-27A
RB-26D
RB-26C
RB-26B
RB-26A
RB-23D
RB-23C
RB-23B
RB-23A
RB-18D
RB-18C
RB-18B
RB-18A
RB-14D
RB-14C
RB-14B
RB-14A
RB-8D
RB-8C
RB-8B
RB-8ARB-7DRB-7CRB-7BRB-7ARB-5DRB-5CRB-5B
RB-5A
F1
F4
F6
PC1 (73,59)
PC2 (11,18)
0,0-0,5-1,0-1,5-2,0-2,5
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
-1,5
RB-36D
RB-36C
RB-36B
RB-36A
RB-31D
RB-31C
RB-31B
RB-31A
RB-27D
RB-27C
RB-27B
RB-27A
RB-26D
RB-26C
RB-26B
RB-26A
RB-23D
RB-23C
RB-23B
RB-23A
RB-18D
RB-18C
RB-18B
RB-18A
RB-14D
RB-14C
RB-14B
RB-14A
RB-8D
RB-8C
RB-8B
RB-8A
RB-7DRB-7CRB-7B
RB-7A
RB-5DRB-5CRB-5BRB-5A
RB-36D
RB-36C
RB-36B
RB-36A
RB-31D
RB-31C
RB-31B
RB-31A
RB-27D
RB-27C
RB-27B
RB-27A
RB-26D
RB-26C
RB-26B
RB-26A
RB-23D
RB-23C
RB-23B
RB-23A
RB-18D
RB-18C
RB-18B
RB-18A
RB-14D
RB-14C
RB-14B
RB-14A
RB-8D
RB-8C
RB-8B
RB-8A
RB-7D
RB-7C
RB-7B
RB-7A
RB-5D
RB-5CRB-5BRB-5A
RB-36D
RB-36C
RB-36B
RB-36A
RB-31D
RB-31C
RB-31B
RB-31A
RB-27D
RB-27C
RB-27B
RB-27A
RB-26D
RB-26C
RB-26B
RB-26A
RB-23D
RB-23C
RB-23B
RB-23A
RB-18D
RB-18C
RB-18B
RB-18A
RB-14D
RB-14C
RB-14B
RB-14A
RB-8D
RB-8C
RB-8B
RB-8ARB-7DRB-7CRB-7BRB-7ARB-5DRB-5CRB-5B
RB-5A
F1
F4
F6
Resultados
89
4.2.2 – Atividade da enzima α
αα
α-isopropilmalate Sintase
As leveduras resistentes ao análogo da L-leucina apresentam a enzima α-
Isopropilmalato Sintase (α-IPM) insensível a retro-inibição por L-leucina, como
demonstrado por nosso grupo (Vicente e cols., 2006). Assim sendo, foram medidas as
atividades da α-IPM nas cepas LBCM 422, LBCM 427, RB 23A e RB 8C. A segregante
RB 8C apresentou instabilidade quanto a resposta de resistência a TFL e por esta razão foi
incluída no teste.
Como podemos observar na Figura 10, a atividade da α-IPM medida a partir da
cepa LBCM 427, não é inibida por baixas concentrações de L-leucina, e sendo
parcialmente inibida (20%) em altas concentrações de L-leucina (20 mM). Já na levedura
LBCM 422, a enzima apresentou-se insensível até a concentração de 10 mM de L-leucina,
mas na concentração de 20 mM de L-leucina encontra-se inibida (60% de inibição).
A α-IPM encontrada na levedura RB 23A não é inibida por L-leucina. Como
demonstrado na Figura 10, a atividade da α-IPM nesta cepa não é inibida, pelo contrário,
observa-se uma estimulação da atividade em baixas concentrações de L-leucina (2 a 10
mM), e em altas concentrações de L-leucina (20mM) sua atividade está aumentada em 10%
quando comparada com aquela obtida na ausência de L-leucina. Por outro lado, a levedura
RB 8B não é inibida por baixas concentrações de L-leucina, sendo parcialmente inibida
(20%) em altas concentrações de L-leucina (20 mM).
4.2.3 – Análise da seqüência nucleotídica dos genes codificantes da α
αα
α-
Isopropilmalato Sintase
As leveduras resistentes ao análogo do aminoácido L-leucina apresentam a enzima
α-Isopropilmalato Sintase insensível a retro-inibição por L-leucina e isso pode estar
associado a mutações que causam essa perda de sensibilidade. O gene LEU4 codifica para a
Resultados
90
0
25
50
75
100
125
150
175
200
0 4 8 12 16 20
[L-Leucina] mM
% Atividade de
α
α
α
α
-IPM
(mmol/mim/mg)
LBCM 422
LBCM 427
RB 8B
RB 23A
Figura 11 - Atividade da enzima α-IPM nas cepas de S. cerevisiae LBCM 427,
LBCM 422, RB 8B e RB 23A . As células foram crescidas em meio mínimo,
suplementado com glicose (2%) e L-leucina (2 mM), por 24 horas, a 28° C, sob
agitação. A atividade da α-Isopropilmalato sintase foi medida no extrato celular,
determinando-se a concentração de Coenzima A (CoA) liberada em um
determinado período de tempo utilizando o 5,5´-ditiobis-(2-nitrobenzoato) (DNTB)
como reativo de cor. Para verificar a retro-inibição da enzima, adicionamos a
mistura de incubação 1, 2, 4, 10 e 20 mM de L-Leucina.
Resultados
91
enzima α–isopropilmalato sintase que catalisa a conversão de 2-cetoisovalerato em α-
isopropilmalato na via biossintética da leucina. Esse gene codifica uma das duas enzimas
responsáveis pela síntese de α-IPM descritos em S. cerevisiae: α-IPM sintase I e II
responsáveis por 80% e 20% do total de atividade da enzima segundo Kohlhaw,2003.
Segundo Cavalieri e cols., 1999 e Oba e cols., 2005 mutações no gene LEU4 podem
ser responsáveis pela perda da inibição por feedback da leucina. Segundo esses autores,
mutações dos aminoácidos Gly514Asp, Gly516Asp, Ser519Thr, Glu540Lys, His541Pro,
SerSer547/8Ser, Ala552Thr e Asp578Tyr localizadas próximo ao sitio de ligação da enzima
levariam a mudança na conformação dificultando a ligação da leucina.
Para verificar a presença de mutações no gene LEU4 das cepas resistentes a TFL, as
cepas RB 23A e RB 8B foram seqüenciadas para esse gene. Inicialmente os genes foram
amplificados por PCR usando-se primers específicos e os genes foram sequenciados usando
os primers M13 reverse (GGAAAAGCTATGACCATG), M13 Forward
(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), IPM1F Forward (CCTTCCTCCAAG
TACAAGC), IPM3F Forward (CGGTGGAAGCATTAACAGG), IPM6R reverse
(GTTCAACCACATCTAAGGAC), IPM8R reverse (TGGTCTTGAACGGCGCTAG),
IPM9R reverse (ATCGAC GATCTGGTGGCCTAC), IPM10R reverse
(ATTACGCCTATACGATAG).
A análise comparativa da seqüência de nucleotídeos da cepa RB 23A, através do
programa BLAST-N, apresentou 99% de identidade com a seqüência LEU4 como é
observado na Figura 11. Esta seqüência apresentou trocas de nucleotídeos nas posições
441(A→G), 709(T→C), 746(A→G), 865(A→G), 939(G→A), 1230(G→C) e 1826(T→C).
Quando realizamos a tradução desta seqüência e analisamos comparativamente com a
proteína codificada pelo gene LEU4, encontramos identidade de 99% como pode ser
observado na Figura 12. Apenas as mudanças de nucleotídeos nas posições 709, 746 e 1826
resultaram em mutação de aminoácido enquanto as demais não foram observadas alteração
do aminoácido quando comparado a seqüência traduzida de LEU4.
Em conseqüência das mutações encontradas ocorreram mudanças quanto a
característica dos resíduos de aminoácidos. A mutação encontrada na posição 237 do
aminoácido, que corresponde a região 709 de nucleotídeo, observamos a troca de Isoleucina
(I) por Valina (V,Val) que apresentam cadeia lateral alifática, não polar. Em outra mutação,
Resultados
92
Query: 1860 TTATGCAGAGCCAGATGCCGCAGCATTCTTACCTCCGACCTCGGCCAAAGATGGAATGGA 1801
|||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 424897 TTATGCAGAGCCAGATGCCGCAGCATTCTTACCTTCGACCTCGGCCAAAGATGGAATGGA 424956
Query: 1800 CACATCACCAGAATGGATAATATTGTTAATGGTGGCAAAGATGGCTCTCACTGAAGAATC 1741
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 424957 CACATCACCAGAATGGATAATATTGTTAATGGTGGCAAAGATGGCTCTCACTGAAGAATC 425016
Query: 1740 ACCGACATCTTCGGAGACACCTACACCCCATTTGTAGGCCTTTTCGTTGTCGGCATTACG 1681
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Query: 1680 CCTATACGATAGATGGATGTAAGAAGCAGCTTGCGTAGAAGAACCAGAACCTAGAGAATG 1621
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Query: 1560 AGAAGAGATTGGACCATTACCTGTACCTTCAATATCGACGATCTGGTCGCCTACTTTGAC 1501
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Query: 1500 TTGACCAGTGAACACTCTACGTTCAGTGCCGAATTTTTCAACATTATAATTGACTAAACT 1441
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Figura 12 – Análise comparativa, feita através do programa BLAST, da seqüência
amplificada pelos iniciadores M13, IPM1F, IPM3F, IM6R, IPM8R, IPM9R e
IPM10R da cepa RB 23A, com a seqüência do gene LEU4 descrita no
Saccharomyces cerevisiae Genome Database. As substituições nas bases estão
indicadas em negrito.
Resultados
93
Query: 1140 TTGTAAGTTGAAACCCTTCTTAATGGCGTCTTGGTGAGAACCGGAAAAGGCACAAACGAC 1081
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Query: 1080 CAAGTCACCGCCGTATGGTGCTCTTTGCGATACTGGGATCTTATTACAACGCTCAACCAC 1021
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Query: 960 ATTCATAGCAACAGTAACCAAATCCACATTACCTGTACGTTCACCATTACCAAAGAGACA 901
||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Query: 900 TCCTTCTACACGGTCGGCACCTGCAAGCATACCTAGCTCTGTGGCGGCGACACCGCAACC 841
||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 425857 TCCTTCTACACGGTCGGCACCTGCAAGCATACCTAACTCTGTGGCGGCGACACCGCAACC 425916
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 425917 ACGGTCATTGTGACAATGTGTAGAGATGCAAACCTTCTCACGCTCAGTAATATGGGTAGC 425976
Query: 780 GAAGTATTCAATCTGATCAGCATAAACATTTGGAGGGGCAACTTCTACGGTAGCAGGTAA 721
||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 425977 GAAGTATTCAATCTGATCAGCATAAACATTTGGAGAGGCAACTTCTACGGTAGCAGGTAA 426036
Query: 720 GTTGAAAATGACTGGATTTTCCTCGGTAGGTTCCCAAGCCTTCTTAACAGCTTCGCAAAT 661
||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 426037 GTTGAAAATGATTGGATTTTCCTCGGTAGGTTCCCAAGCCTTCTTAACAGCTTCGCAAAT 426096
Query: 660 TTCTACAGCAAATTCACCTGGAGTATCACTGAAACATTCGGGGGAAAACTCATAGGACCA 601
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 426097 TTCTACAGCAAATTCACCTGGAGTATCACTGAAACATTCGGGGGAAAACTCATAGGACCA 426156
Query: 600 ACGAGTGGCTTGTTGGGAAGGGTCATCCTTAGTTAGTTTCCTAACTAGTTTGGTGGCCTC 541
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Query: 540 TACTGCCTTGGAAATAGCTTCCTCTCTAGACATATTAAAAACAATTTCACGGAACATATC 481
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 426217 TACTGCCTTGGAAATAGCTTCCTCTCTAGACATATTAAAAACAATTTCACGGAACATATC 426276
Query: 480 ACTTGTTGCCAAGTAAGTATGTATAGTAGCCTTTTTAGCGCCTGTTAATGCTTCCACCGT 421
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||
Sbjct: 426277 ACTTGTTGCCAAGTAAGTATGTATAGTAGCCTTTTTAGCACCTGTTAATGCTTCCACCGT 426336
Figura 12 – (continuação)
Resultados
94
Query: 420 TCTCTTAATCAAGTGTTCTCTAGATTGGACAAGACATTGAATACTAACATCGTCTGGGGC 361
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 426337 TCTCTTAATCAAGTGTTCTCTAGATTGGACAAGACATTGAATACTAACATCGTCTGGGGC 426396
Query: 360 GTTTTCTACAGCATATCTAGTGAAGTCGAAATCTGTTTGAGATGCAGAGGGGAAGGAAAC 301
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Query: 300 CTCGATTTCTTTGAACCCAATATTGACCAGCTTGTGAAAGTATTCTTTCTTTTGTTCCAC 241
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct: 426517 TGACATGGGATCCGGCAGAGATTGGTTACCATCTCTCAAATCTGTTGATAACCAACGAGG 426576
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 426577 AGCCCTCGTGATCCGGTTATCCGGCCACTTTCTATTAGATAGCTTTGGAGCGTTAAATGG 426636
Query: 120 CTTGTACTTGGAGGAAGGGTCCTTAAGCATATTTTTATAGGCTAGCTTCACTGGAGGAAT 61
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Query: 60 AACTCTTGAGGCTCTGGAGGCCGCATGCTCAGCAAGAGCAATAATACTCTCTTTAACCAT 1
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 426697 AACTCTTGAGGCTCTGGAGGCCGCATGCTCAGCAAGAGCAATAATACTCTCTTTAACCAT 426756
Figura 12 – (continuação)
Resultados
95
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MVKESIIALAEHAASRASRVIPPVKLAYKNMLKDPSSKYKPFNAPKLSNRKWPDNRITRA
Sbjct: 1 MVKESIIALAEHAASRASRVIPPVKLAYKNMLKDPSSKYKPFNAPKLSNRKWPDNRITRA 60
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PRWLSTDLRDGNQSLPDPMSVEQKKEYFHKLVNIGFKEIEVSFPSASQTDFDFTRYAVEN
Sbjct: 61 PRWLSTDLRDGNQSLPDPMSVEQKKEYFHKLVNIGFKEIEVSFPSASQTDFDFTRYAVEN 120
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APDDVSIQCLVQSREHLIKRTVEALTGAKKATIHTYLATSDMFREIVFNMSREEAISKAV
Sbjct: 121 APDDVSIQCLVQSREHLIKRTVEALTGAKKATIHTYLATSDMFREIVFNMSREEAISKAV 180
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EATKLVRKLTKDDPSQQATRWSYEFSPECFSDTPGEFAVEICEAVKKAWEPTEENP+IFN
Sbjct: 181 EATKLVRKLTKDDPSQQATRWSYEFSPECFSDTPGEFAVEICEAVKKAWEPTEENPIIFN 240
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LPATVEVA PNVYADQIEYFATHITEREKVCISTHCHNDRGCGVAATELGMLAGADRVEG
Sbjct: 241 LPATVEVASPNVYADQIEYFATHITEREKVCISTHCHNDRGCGVAATELGMLAGADRVEG 300
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CLFGNGERTGNVDLVTVAMNMYTQGVSPNLDFSDLTSVLDVVERCNKIPVSQRAPYGGDL
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VVCAFSGSHQDAIKKGFNLQNKKRAQGETQWRIPYLPLDPKDIGRDYEAVIRVNSQSGKG
Sbjct: 361 VVCAFSGSHQDAIKKGFNLQNKKRAQGETQWRIPYLPLDPKDIGRDYEAVIRVNSQSGKG 420
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GAAWVILRSLGLDLPRNMQIEFSSAVQDHADSLGRELKSDEISKLFKEAYNYNDEQYQAI
Sbjct: 421 GAAWVILRSLGLDLPRNMQIEFSSAVQDHADSLGRELKSDEISKLFKEAYNYNDEQYQAI 480
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SLVNYNVEKFGTERRVFTGQVKVGDQIVDIEGTGNGPISSLVDALSNLLNVRFAVANYTE
Sbjct: 481 SLVNYNVEKFGTERRVFTGQVKVGDQIVDIEGTGNGPISSLVDALSNLLNVRFAVANYTE 540
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HSLGSGSSTQAASYIHLSYRRNADNEKAYKWGVGVSEDVGDSSVRAIFATINNIIHSGDV
Sbjct: 541 HSLGSGSSTQAASYIHLSYRRNADNEKAYKWGVGVSEDVGDSSVRAIFATINNIIHSGDV 600
Query: 1801 SIPSLAEVGGKNAAASGSA* 1860
SIPSLAEV GKNAAASGSA*
Sbjct: 601 SIPSLAEVEGKNAAASGSA* 620
Figura 13 – Tradução da seqüência amplificada pelos iniciadores M13, IPM1F,
IPM3F, IM6R, IPM8R, IPM9R e IPM10R da cepa RB 23A, feita através do
programa BLAST e comparada com a seqüência do gene LEU4 descrita no
Saccharomyces cerevisiae Genome Database. A mutação do aminoácido é
destacada em negrito.
Resultados
96
posição 249 da seqüência de aminoácidos que corresponde a região 746 da sequencia de
nucleotídeos, Serina (S – cadeia lateral sem carga, polar) é substituída por Prolina (P, Pro)
que apresenta cadeia lateral apolar. A terceira mutação, posição 609 da seqüência de
aminoácidos que corresponde a região 1826 da seqüência de nucleotídeos, um resíduo
ácido glutâmico (E – cadeia lateral ácida) é substituído por Glicina (G, Gly) que apresenta
cadeia lateral sem carga e apolar.
A análise de comparação da seqüência traduzida da cepa RB 23A com o
alinhamento de múltiplas seqüências de LEU4, através do site Saccharomyces
cerevisiae Database (http://www.yeastgenome.org), observamos que a mutação de
Val
237
está localizada em uma região altamente conservada, enquanto a Pro
249
está
localizada em uma região medianamente conservada. A mutação Gly
609
está localizada em
uma região de conservação variável.
Como podemos observar na Figura 13, para a cepa RB 8B a análise comparativa,
através do programa BLAST-N, da seqüência de nucleotídeos apresentou 99% de
identidade com a sequencia LEU 4. A seqüência apresentou trocas de bases nas posições
812(C → T), 865 (T→ C), 885(C→T), 938(C→T) e 1230(C→G). Entretanto, estas trocas
não resultaram em mudanças de aminoácidos como podemos observar na Figura 14. A
análise comparativa da seqüência traduzida apresentou 100% de identidade com o gene
LEU4.
Resultados
97
Query: 661 ATTTGCGAAGCTGTTAAGAAGGCTTGGGAACCTACCGAGGAAAATCCAATCATTTTCAAC 720
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 661 ATTTGCGAAGCTGTTAAGAAGGCTTGGGAACCTACCGAGGAAAATCCAATCATTTTCAAC 720
Query: 721 TTACCTGCTACCGTAGAAGTTGCCTCTCCAAATGTTTATGCTGATCAGATTGAATACTTC 780
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Figura 14 – Análise comparativa, feita através do programa BLAST, da seqüência
amplificada pelos iniciadores M13, IPM1F, IPM3F, IM6R, IPM8R, IPM9R e
IPM10R da cepa RB 8B, com a seqüência do gene LEU4 descrita no
Saccharomyces cerevisiae Genome Database. As substituições nas bases estão
indicadas em negrito.
Resultados
98
Query: 1 ATGGTTAAAGAGAGTATTATTGCTCTTGCTGAGCATGCGGCCTCCAGAGCCTCAAGAGTT 60
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Figura 14 – (continuação)
Resultados
99
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Sbjct: 1441 AGTTTAGTCAATTATAATGTTGAAAAATTCGGCACTGAACGTAGAGTGTTCACTGGTCAA 1500
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct: 1801 TCCATTCCATCTTTGGCCGAGGTCGAAGGTAAGAATGCTGCGGCATCTGGCTCTGCATAA 1860
Figura 14 – (continuação)
Resultados
100
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MVKESIIALAEHAASRASRVIPPVKLAYKNMLKDPSSKYKPFNAPKLSNRKWPDNRITRA
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PRWLSTDLRDGNQSLPDPMSVEQKKEYFHKLVNIGFKEIEVSFPSASQTDFDFTRYAVEN
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APDDVSIQCLVQSREHLIKRTVEALTGAKKATIHTYLATSDMFREIVFNMSREEAISKAV
Sbjct: 121 APDDVSIQCLVQSREHLIKRTVEALTGAKKATIHTYLATSDMFREIVFNMSREEAISKAV 180
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EATKLVRKLTKDDPSQQATRWSYEFSPECFSDTPGEFAVEICEAVKKAWEPTEENPIIFN
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LPATVEVASPNVYADQIEYFATHITEREKVCISTHCHNDRGCGVAATELGMLAGADRVEG
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CLFGNGERTGNVDLVTVAMNMYTQGVSPNLDFSDLTSVLDVVERCNKIPVSQRAPYGGDL
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VVCAFSGSHQDAIKKGFNLQNKKRAQGETQWRIPYLPLDPKDIGRDYEAVIRVNSQSGKG
Sbjct: 361 VVCAFSGSHQDAIKKGFNLQNKKRAQGETQWRIPYLPLDPKDIGRDYEAVIRVNSQSGKG 420
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GAAWVILRSLGLDLPRNMQIEFSSAVQDHADSLGRELKSDEISKLFKEAYNYNDEQYQAI
Sbjct: 421 GAAWVILRSLGLDLPRNMQIEFSSAVQDHADSLGRELKSDEISKLFKEAYNYNDEQYQAI 480
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SLVNYNVEKFGTERRVFTGQVKVGDQIVDIEGTGNGPISSLVDALSNLLNVRFAVANYTE
Sbjct: 481 SLVNYNVEKFGTERRVFTGQVKVGDQIVDIEGTGNGPISSLVDALSNLLNVRFAVANYTE 540
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HSLGSGSSTQAASYIHLSYRRNADNEKAYKWGVGVSEDVGDSSVRAIFATINNIIHSGDV
Sbjct: 541 HSLGSGSSTQAASYIHLSYRRNADNEKAYKWGVGVSEDVGDSSVRAIFATINNIIHSGDV 600
Query: 1801 SIPSLAEVEGKNAAASGSA* 1860
SIPSLAEVEGKNAAASGSA*
Sbjct: 601 SIPSLAEVEGKNAAASGSA* 620
Figura 15 – Tradução da seqüência amplificada pelos iniciadores M13, IPM1F,
IPM3F, IM6R, IPM8R, IPM9R e IPM10R da cepa RB 8B, feita através do programa
BLAST e comparada com a seqüência do gene LEU4 descrita no Saccharomyces
cerevisiae Genome Database.
Resultados
101
4.3 - Fermentação em escala piloto das leveduras selecionadas
4.3.1- Avaliação da fermentação em escala piloto das leveduras selecionadas
As cepas LBCM 427, LBCM422, RB 23A foram submetidas a fermentação em
escala piloto, utilizando também uma cepa comercial como controle do processo.
4.3.2 - Determinação do consumo de sacarose
A Figura 15 (Painel A, B e C) mostra o consumo de sacarose em função do tempo.
Podemos observar que na primeira e segunda repetição do processo fermentativo (Painel A
e B), as cepas LBCM 427, LBCM 422 e RB 23A tiveram um consumo total de sacarose em
72 horas de fermentação. A terceira repetição (Painel C), as cepas LBCM 427 e RB 23A
terminaram o processo fermentativo em 48 horas, enquanto a cepa LBCM 422 finalizou a
fermentação em 24 horas. Em todos os casos, quando os níveis de sacarose chegaram a
aproximadamente 8 °Brix o caldo fermentado foi encaminhado para a destilação. A cepa
comercial em nenhuma das repetições teve um completo consumo de sacarose, neste caso
foi padronizado a destilação no mesmo tempo de fermentação das demais cepas.
4.3.3 - Determinação do etanol
A Figura 15 (Painel D, E e F) apresenta o etanol produzido ao longo do crescimento
das leveduras selecionadas neste estudo. Como pode ser observado, ao longo do tempo de
crescimento ocorre um aumento na concentração de etanol do meio, sendo que no tempo 48
e 72 horas a concentração de etanol é máxima. Assim como na sacarose, as leveduras
LBCM 422, LBCM 427 e RB 23A apresentam um perfil semelhante de produção de etanol
quando comparadas no mesmo tempo.
Resultados
102
A D
B E
C F
Figura 16: Determinação do consumo de sacarose e formação de etanol. As
leveduras foram cultivadas em caldo de cana com 15°Brix e uma alíquota foi
coletada a 0, 24, 48 e 72 horas para análise. Painel A, B e C – Consumo de
sacarose no primeiro, segundo e terceiro ciclo de fermentação respectivamente;
D, E e F – Produção de etanol no primeiro, segundo e terceiro ciclo de
fermentação respectivamente.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 24 48 72
Tempo (horas)
Sacarose (°Brix)
e
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 24 48 72
Tempo (horas)
Sacarose (°Brix)
e
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 24 48 72
Tempo (horas)
Sacarose (°Brix)
e
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 24 48 72
Tempo (horas)
Etanol (°GL)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 24 48 72
Tempo (horas)
Etanol (°GL)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 24 48 72
Tempo (horas)
Etanol (°GL)
LBCM 422
LBCM 427
RB 23A Comercial
LBCM 422
LBCM 427
RB 23A Comercial
Resultados
103
4.3.4 – Acompanhamento das leveduras durante o processo fermentativo
O método de mtDNA – RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism analysis
of mitocondrial DNA) foi utilizado para acompanhar as leveduras no processo fermentativo
das cepas LBCM 427, LBCM422, RB 23A. Como descrito no item 3.3, para cada levedura
estudada foram coletados aleatoriamente 100 colônias de leveduras de cada tempo pré-
estabelecido e destas, 30 colônias também escolhidas aleatoriamente, foram utilizadas para
a realização do teste de acompanhamento molecular. O resultado destes testes revelou que
todas as 30 colônias, em todos os tempos coletados apresentaram o mesmo perfil de
bandeamento. Na Figura 16 podemos observar o resultado da digestão de apenas três
colônias para cada tempo inicial e final do experimento e verifica-se que aquelas cepas
apresentaram um perfil idêntico de bandeamento.
Resultados
104
Figura 17: Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio,
mostrando o perfil do mtDNA-RFLP (mitocondrial DNA Restriction Fragment
Length Polymorphism) de cepas LBCM 427, LBCM 422 e RB 23A. São mostradas
3 colônias para cada tempo inicial e final do experimento. Este experimento foi
realizado na Universidade do Minho em Braga, Portugal pelos doutores Dorit
Schüller, Margarida Casal e Luciano Fietto.
M M
RB 23ALBCM 427LBCM 422
0 7 0 07 7M M
RB 23ALBCM 427LBCM 422
0 7 0 07 7
Resultados
105
4.3.5 - Determinação dos componentes voláteis da cachaça
A Tabela 6 apresenta os resultados das dosagens dos teores de álcool isoamílico,
álcool etílico, álcool isobutílico, n-propanol, metanol, acetato de etila, furfural e acetaldeído
produzidos pelo destilado do caldo fermentado pelas cepas LBCM 422, LBCM427, RB
23A e cepa comercial conforme descrito em Material e métodos.
Conforme pode ser observado, a produção de álcool isoamílico foi semelhante nas
cepas LBCM 422, LBCM 427 e RB 23A e mais elevada quando comparada a cepa
Comercial. A análise estatística foi realizada com a análise de variância (ANOVA) de cada
composto e Test t de student para comparação das médias das amostras. Foi observado que
existe diferença estatística significativa na produção de álcool isoamílico entre a cepa
comercial e as demais cepas. Entretanto, não foi observada diferença significativa entre as
cepas LBCM422, LBCM427 e RB 23A quanto a produção de álcool isoamílico.
Por outro lado, a produção de álcool isobutílico foi mais elevada na cepa RB 23A
quando comparada a produção das cepas LBCM422, LBCM 427 e cepa comercial. Foram
observadas diferenças estatísticas significativas quanto a produção de álcool isobutílico
pela cepa RB 23A e as demais cepas. As LBCM 422 e LBCM 427 apresentaram uma
produção semelhante de álcool isobutílico e maior quando comparada a cepa comercial.
Após a aplicação do Test t de student foi observado diferença estatisticamente significativa
entre a cepa comercial, LBCM422 e RB 23A.
A produção de álcool etílico foi semelhante nas cepas LBCM422, LBCM 427 e RB
23A e mais elevada quando comparada a cepa comercial. Foram observadas diferenças
estatísticas quanto a produção de etanol pela cepa comercial e as demais cepas. Os demais
compostos apresentaram resultados semelhantes de produção pelas quatro cepas.
A Tabela 6 apresenta ainda resultados das dosagens dos compostos voláteis da
cachaça produzida no local de origem das leveduras em estudo no ano de 2003 e 2005.
Estes dois lotes de cachaças foram coletados imediatamente após a produção, sem qualquer
tratamento e analisadas por métodos cromatográficos descritos em Material e Métodos.
Como podemos observar, os teores dos compostos apresentam semelhança nos dois anos de
coleta. Quando comparamos os resultados obtidos pelas cepas LBCM 422, LBCM 427 e
RB 23A quanto a produção de álcool isoamílico estas apresentam aproximadamente 4
vezes maior que a cachaça do produtor. O mesmo pode ser observado para a produção de
Resultados
106
Tabela 6 - Concentração de etanol (%v/v) e compostos voláteis (mg/100 mL de álcool anidro) em cachaças obtidas com
diferentes cepas de leveduras
1 – Levedura comercial utilizada como controle do processo.
2 – Resultado da análise de cachaças recém destiladas, coletadas no local de origem das cepas LBCM 422 e LBCM 427 em 2003 e 2005.
a - Valores diferem significativamente entre a Cepa comercial e as demais cepas (ANOVA)
b – Valores diferem significativamente entre a cepa LBCM 427, LBCM 422 e RB 23A (ANOVA)
* - analises não realizadas
cepa Etanol Acetaldeído
Acetato de
Etila
Metanol 1- Propanol
Álcool
Isobutílico
Álcool
Isoamílico
Furfural
LBCM 422 38,72 ± 0,17 69,47 ± 42,37
72,96 ± 61,88 19,88 ± 12,56 25,26 ± 12,56
96,69 ± 11,64 286,42 ± 36,85
0,28 ± 0,28
LBCM 427 35,63 ± 3,31 36,48 ± 15,42
48,36 ± 22,21 10,25 ± 5,98 31,25 ± 5,98 112,24 ± 7,95 284,65 ± 28,40
0,11 ± 0,20
RB 23A 37,07 ± 1,32 51,98 ± 5,78 64,91 ± 23,26 14,18 ± 9,27 26,77 ± 9,27
135,69 ± 10,34
b
333,20 ± 30,89
0,52 ± 0,18
Cepa comercial
1
27,42 ± 3,7
a
54,34 ± 43,60
141,37 ± 81,80 8,13 ± 9,37 24,05 ± 9,37 59,88 ±21,18
a
196,37 ± 31,38
a
0,14 ± 0,24
Produtor 2003
2
42,5 * 18,00 * 19,60 13,10 71,10 *
Produtor 2005
2
47,0 1,91 13,56 19,54 18,20 20,23 69,75 0,01
Resultados
107
álcool isobutílico e acetato de etila. A produção de acetaldeído foi de aproximadamente 50
vezes superior pelas cepas em estudo quando comparada a cachaça do produtor enquanto a
produção de álcool etílico e n-propanol foi semelhante entre as cepas LBCM422, LBCM
427 e RB23 A e esta cachaça.
4.3.6- Avaliação sensorial de cachaças produzidas com cepas selecionadas
como iniciadoras.
A Tabela 7 apresenta os resultados das notas de avaliações sensoriais produzidos
pelo destilado do caldo fermentado pelas cepas LBCM 422, LBCM427, RB 23A e cepa
comercial conforme descrito em Material e métodos. Conforme podemos observar, todas as
cachaças tiveram boa aceitação, com notas de impressão global intermediarias na escala
hedônica de pontos. A análise estatística foi realizada com a análise de variância (ANOVA)
e Test t de student para comparação das médias das amostras. Foi observado que não existe
diferença estatística significativa entre as amostras de cachaça.
Resultados
108
Tabela 7 – Notas de avaliações sensoriais cachaças obtidas com diferentes cepas
de leveduras e em fermentações sucessivas
Notas de
avaliações
sensorial *
1 4,5
2 5,6
3 5,4
5,2
1 5,6
2 4,6
3 4,4
4,9
1 5,2
2 5,2
3 4,5
5,0
1 3,9
2 5,1
3 4
4,3
Médias
Comercial
Cachaças Batelada
LBCM 422
LBCM 427
RB 23 A
* Médias de avaliação sensorial global segundo escala hedônica de 9 pontos ( 1-desgostei extremamente/ 9-
gostei extremamente)
Resultados
109
Para analisar a similaridade entre as cachaças produzidas pelas cepas LBCM 422,
LBCM 427, RB 23A e cepa comercial, utilizamos o método de Análise de Componentes
Principais (PCA). Neste estudo, utilizando as respostas encontradas na Tabela 6 e 7,
construímos a matriz para análise no método PCA considerando os valores de acetaldeído,
acetato de etila, metanol, 1-propanol, álcool isobutílico, álcool isoamilico, furfural, acido
acético e notas sensoriais como variáveis e dispostas em colunas enquanto as cepas, como
amostras, em fileiras. Um pré-processamento dos dados foi necessário para atribuir pesos
equivalentes aos teores dos analítos nas amostras.
Como podemos observar na Figura 17, a variação ocorrida entre as amostras pode
ser explicada pelo Componente Principal 1 (88%) e apenas 11% pelo Componente
Principal 2. Os componentes Principais 1 e 2 explicam juntos 99% da variação ocorrida
entre as amostras. Isto demonstra que os descritores empregados discriminam
satisfatoriamente as amostras analisadas.
A análise conjunta dos gráficos de scores e loadings (Painel A e B) mostra que PC1
separa as amostras em dois grandes grupos e que a análise sensorial contribuiu com maior
peso sobre a variabilidade associada ao primeiro componente. Por outro lado, o acetaldeído
teve maior influência sobre a segunda componente (PC2).
As amostras ficaram bem distintas umas das outras, marcadas pelas localizações
bem definidas de cada uma no gráfico bidimensional (Figura 17). Para a cepa comercial, as
três fermentações sucessivas deram origem a cachaças com características próximas entre si
e diferente quando comparada a LBCM 422, LBCM 427 E RB 23A. Por outro lado, as
amostras de cachaças produzidas pelas cepas LBCM 427 e RB 23A foram reunidas no
mesmo grupo, enquanto as amostras de cachaças da cepa LBCM 422 foram agrupadas
distante das demais.
Resultados
110
A
B
Figura 18 - Análise de Componentes Principais correspondendo a respostas das
cepas LBCM 422, LBCM 427, RB 23A e comercial, quanto aos compostos voláteis
e análise sensorial da cachaça. Painel A: Loadings PCA; Painel B: Score PCA.
Discussão
111
5 – DISCUSSÃO
Discussão
112
5.1 - Análise do Polimorfismo molecular das cepas
A produção de cachaça de alambique é caracterizada pela fermentação do caldo de
cana por uma mistura de leveduras com predomínio da espécie S. cerevisiae. A população
de leveduras presentes neste processo fermentativo está em constante mudança devido a
introdução de novas cepas provenientes do caldo de cana uma vez que este não é
esterilizado e o processo fermentativo é realizado em ambiente aberto(Morais e cols., 1997;
Pataro e cols., 1998).
Vários fatores podem interferir na qualidade de uma bebida destilada como o tempo
de envelhecimento, tipo de madeira usado no armazenamento, processo de destilação,
entretanto as leveduras e as condições de fermentação são de grande importância uma vez
que os compostos aromatizantes são formados durante a fermentação. Este fato denota a
importância do uso de cepas selecionadas com característica importantes ao processo para
melhorar a qualidade do produto final, contribuir para uma fermentação eficiente, e reduzir
as variações de propriedades sensoriais da bebida de ano para ano. Entretanto, apenas a
inoculação de uma cepa selecionada não é suficiente para garantir a permanência desta
levedura por longos períodos no processo fermentativo fazendo-se necessário o
acompanhamento da levedura de interesse ao longo do processo fermentativo (Cardello &
Faria, 1998; Oliveira e cols., 2004; Oliveira e cols., 2005; Querol e cols., 1994).
Nosso laboratório desenvolveu uma metodologia para o isolamento de cepas de
S.cerevisiae para serem usadas na produção da cachaça(Vicente e cols., 2006). A estratégia
propõe a seleção de leveduras com capacidade de adaptação as condições encontradas
durante o processo fermentativo do caldo de cana como: altas concentrações de sacarose e
etanol, além de elevadas temperaturas; capacidade de floculação; alta capacidade
fermentativa e maior potencial de produção de agentes aromatizantes. Para selecionar cepas
com capacidade de maior produção de componentes aromatizantes, avaliamos a resistência
das cepas a TFL e cerulenina que são compostos que foram descritos como capazes de
selecionar leveduras com maior capacidade de produção de substâncias tais como o álcool
isoamílico e ácido capróico respectivamente. Este protocolo busca selecionar leveduras
iniciadoras que melhorem e preservem a qualidade da bebida e que possam ser utilizadas
em qualquer alambique de produção artesanal de cachaça. Como será discutido neste
capítulo, os resultados apresentados neste trabalho permitem validar a metodologia
Discussão
113
proposta uma vez que as leveduras selecionadas apresentaram uma boa adaptação e
capacidade fermentativa no caldo de cana, além de produzirem elevados teores de
compostos voláteis quando comparados ao produzido no alambique de origem.
O uso de técnicas que possibilitem a distinção entre o inóculo de uma determinada
cepa e a microbiota naturalmente presente no processo fermentativo são de grande interesse
para a indústria de bebidas. Nos últimos anos, muitas metodologias têm sido desenvolvidas
para permitir a discriminação entre leveduras de interesse e outras que estejam presentes no
processo. Metodologias baseadas no polimorfismo do DNA têm sido de grande ajuda nesta
tarefa de diferenciação. Estudos mostram que as cepas de S. cerevisiae presentes no
processo fermentativo da cachaça e de outras bebidas apresentam alto grau de polimorfismo
genético entre diferentes destilarias, alta variabilidade genética isoladas em diferentes
estágios de fermentação e uma sucessão de cepas geneticamente diferentes durante o
processo de produção da aguardente (Guerra e cols., 2001; Pataro e cols., 2000; Schuller e
cols., 2004).
As cepas LBCM 422 e LBCM 427 foram submetidas a diferentes métodos
moleculares para avaliar a permanência no processo fermentativo no caldo de cana.
Utilizamos a técnica de RAPD-PCR que se baseia no uso de primers (EI1 e LA1)
complementares ao sítio de splicing dos introns. É uma técnica que não necessita do
isolamento do DNA e por isso permite a análise de muitas amostras em um mesmo dia e já
demonstrou adequada para monitorar a presença de cepas iniciadoras durante o processo de
fermentação (De Barros e cols., 1996).
Para avaliar a capacidade de discriminação do método entre as cepas LBCM 422 e
LBCM 427, isoladas da mesma dorna, realizamos nova coleta de amostra de mosto
fermentado no mesmo local de origem destas leveduras dois anos após a primeira coleta. A
coleta foi realizada com quatro horas de fermentação porque espera-se encontrar leveduras
com diferentes características de adaptação e este fato aumentaria a possibilidade de
diferenciar as cepas LBCM422 e LBCM 427 pelo método proposto (Morais e cols., 1997).
Foram isoladas 358 leveduras e escolhidas aleatoriamente 35, que corresponde a 10% do
grupo, para testes de resistência a TFL e cerulenina a fim de conhecer o comportamento de
resistência aos compostos dois anos após o primeiro estudo. Este novo grupo de leveduras
não foi identificado quanto a espécie, pois tínhamos como objetivo avaliar o perfil de
Discussão
114
bandeamento genético das leveduras selvagens e possivelmente diferenciá-las das cepas
LBCM 422 e LBCM 427, mesmo porque a maior parte das leveduras isoladas são da
espécie S. cerevisiae (Vicente e cols., 2006). Como podemos observar na Tabela 2, o perfil
de resistência aos dois compostos é muito semelhante possivelmente explicado pelo grande
polimorfismo genético no processo fermentativo de produção de cachaça. Diante destes
resultados, selecionamos as cepas R304, R321, R329 e R335 que representam os diferentes
comportamentos de resistência aos compostos para controle no método RAPD-PCR
(Tabela 3).
Como podemos observar na Figura 5, o método de RAPD-PCR não diferenciou a
levedura LBCM 427 das outras cepas avaliadas no teste. O grupo de leveduras coletadas
em 2001 e 2003 apresenta o mesmo perfil de bandeamento, entretanto as leveduras
S.paradoxus e S. kluyveri apresentam perfil de bandeamento distinto das demais cepas o
que demonstra que o método diferencia leveduras do gênero Saccharomyces. O fato do
método não diferenciar estas leveduras, que apresentam características bioquímicas e
fisiológicas diferentes, sugere a existência de mutações pontuais não detectáveis por esta
metodologia. Guerra e col, (2001), estudando a diversidade de cepas S. cerevisie durante o
processo fermentativo da cachaça observaram poucas diferenças de perfil de bandeamento
entre as leveduras isoladas utilizando o método de RAPD-PCR. Este autor atribuiu esta
observação a possibilidade de existência de mutações pontuais ou pequenas
deleções/inserções distribuídas no genoma. Em estudo sobre a dinâmica de leveduras
selvagens e cepas iniciadoras em vinho tipos Riesling e Chardonnay, observou-se que é
possível distinguir algumas cepas selvagens, mas não todas, utilizando diferentes primers
em reações de PCR (Egli e cols., 1998).
Outro método utilizado, o mtDNA-RFLP que baseia-se no uso de endonucleases de
restrição, foi escolhido por ser muito usado no controle de qualidade industrial de cepas
iniciadoras mas também para o estudo da diversidade de cepas selvagens durante a
produção de bebidas. Como podem ser observados na Figura 06, os perfis de bandeamento
das cepas LBCM 422 e LBCM 427 são idênticos. As demais cepas do gênero
Saccharomyces apresentaram um perfil de bandeamento que a distingue umas das outras.
Para acompanhar uma levedura iniciadora no processo fermentativo rotineiramente
é necessário que o método seja rápido, eficiente e baixo custo financeiro. O método de PCR
Discussão
115
atende a estes requisitos e por isso decidimos avaliar o método COX-PCR. Este método
baseia-se no uso de quatro primers e se mostrou efetivo na análise de polimorfismo de
leveduras selvagens e comerciais para uso na fermentação do vinho (Lopez e cols., 2003).
Como podemos observar na Figura 7, não foi possível diferenciar a cepa LBCM 427 das
cepas LBCM 423 e LBCM 424 que apresentam perfis diferentes de resistência a TFL e
cerulenina. A cepa LBCM 422 apresentou três fragmentos que a diferencia das demais.
Quanto ao grupo de cepas R304, R321, R323 e R335 também apresentaram um perfil de
bandeamento muito similar entre si, porém estas leveduras apresentam perfis de resistência
a TFL e cerulenina distintos. Este método então se mostrou mais efetivo na discriminação
de cepas de levedura isoladas da mesma dorna, porém não foi capaz de distinguir todas as
cepas que sabidamente apresentam características bioquímicas de resistência a drogas
diferenciadas.
O método de cariotipagem é eficiente para discriminar cepas geneticamente
próximas e de escolha para identificar a presença de rearranjos cromossomais. Como
podemos observar na Figura 8, as cepas LBCM422 e LBCM 427 apresentam um perfil do
cariótipo diferente entre si. Este fato sugere que a dificuldade dos métodos anteriores em
não diferenciá-las é possivelmente devido a presença de mutações pontuais ou rearranjos
cromossomais que resultem em leveduras com características fisiológicas distintas.
Conforme os resultados encontrados neste trabalho, uma estratégia para acompanhar a
permanência da cepa iniciadora no processo fermentativo da cachaça é o uso combinado de
métodos moleculares e bioquímicos. Dunn e cols. (2005) utilizando a técnica de
Microarray karyotyping em leveduras de comerciais de vinho observou pequena variação
nos genes entre diferentes leveduras do vinho, mas que são suficientes para identificá-las e
algumas variações estão correlacionadas com a sensibilidade a drogas. Segundo o autor, o
pequeno número de diferenças genéticas entre cepas que tem propriedades fermentativas e
organolépticas diferentes pode ser atribuído a um também pequeno número de mudanças
genéticas, sendo então necessário acrescentarem testes que observem as diferenças
sensoriais no produto final (Antunovics e cols., 2005).
Discussão
116
5.2 - Análise das segregantes da cepa parental LBCM 427
Outra abordagem de nosso trabalho foi o estudo das cepas segregantes da cepa
parental LBCM 427. As cepas S. cerevisiae largamente utilizadas em laboratórios são
haplóides ou diplóides e tem um perfil eletroforético dos cromossomos constante enquanto
cepas selvagens, como por exemplo, as leveduras do vinho, são principalmente diplóides,
ou poliplóides, homotálicas, e com alto nível de polimorfismo nos cromossomos. As cepas
do vinho não parecem ser geneticamente uniformes, apresentando exacerbada capacidade
de reorganização do seu genoma por mecanismos como rearranjos cromossomais, crossing-
over mitótico, conversão gênica e promotores com rápida capacidade de adaptação a
mudanças no meio. A ploidia e o rearranjo cromossomal das leveduras podem conferir
vantagem de adaptação ao meio externo. Outro aspecto é que as leveduras podem fazer
mudanças genômicas no processo de adaptação as condições de laboratório (Dequin, 2001;
Perez-Ortin e cols., 2002; Pretorius, 2000; Pretorius, 2003).
As cepas segregantes foram submetidas aos critérios estabelecidos por nossa
metodologia para selecionar leveduras com características apropriadas a produção da
cachaça. Como podemos observar na Figura 9, as cepas apresentaram uma instabilidade de
resposta ao testes avaliados e não encontramos uma levedura que tenha reunido todas as
características fisiológicas da cepa parental. Além disso, as cepas segregantes apresentam
uma mudança no perfil de resposta aos testes ao longo das passagens em meio de cultura
(Figura 9). Sipiczki e cols. (2001) em estudo da segregação de cepas S. cerevisiae,
observou uma significativa variação na utilização de galactose, maltose; resistência a
diferentes concentrações de dióxido de enxofre, cobre, etanol; e eficiência na produção de
vários compostos como n-propanol, isobutanol, álcool isoamílico, acetaldeído e acetato de
etila. Isto demonstra que a população de S. cerevisiae pode ancorar alelos que causam uma
maciça alteração no padrão global de expressão dos genes (Cavalieri e cols., 2000; Sipiczki
e cols., 2004).
De acordo com nossa metodologia para seleção de leveduras, as resistências a TFL
e cerulenina são importantes parâmetros de inclusão de candidatas a boas cepas iniciadoras.
Desta forma, a segregante RB 23A que apresentou resistência a ambos compostos e
estabilidade de resposta ao longo dos testes de resistência, foi escolhida para os testes de
fermentação em caldo de cana e avaliação da atividade da α-IPM.
Discussão
117
Como abordado anteriormente, a via biossintética da L-leucina tem como ponto de
regulação a enzima α-isopropimalato sintase, que é uma enzima alostérica retro-inibida por
altas concentrações de L-leucina. O análogo da L-leucina, TFL, é um composto que permite
selecionar leveduras que perderam a capacidade de retro-inibição por L-leucina, e como
conseqüência que produzem maiores quantidades de álcool isoamílico e/ou acetato de
isoamila. Por outro lado, a cerulenina é uma droga inibidora da ácido graxo sintetase, e
como já comentado anteriormente, esta droga seleciona leveduras que apresentam
desregulação da biossíntese de ácidos graxos, podendo apresentar maior produção de ácido
capróico e consequentemente, caproato de etila.
Como mostrado na Figura 10, e corroborando os testes de resistência a TFL, a
atividade da α-IPM da cepa LBCM 427 não é retro-inibida por L-leucina até a
concentração de 10 mM. Somente na concentração de 20 mM de L-leucina, a atividade da
α-isopropilmalato sintase tem uma inibição de 20%, o que pode significar que a enzima
ainda tenha o sítio de retro-inibição, porém outros fatores podem estar atuando neste
mecanismo retro-inibição.
Por sua vez, a cepa LBCM 422 mostrou-se insensível até a concentração de 10 mM,
mas com 60% de inibição em 20 mM de L-leucina, sugerindo que a enzima da cepa LBCM
422 é mais sensível a L-leucina confirmando os resultados de resistência ao TFL.
Outro fato importante a considerar é que as leveduras mutantes obtidas a partir de
cepas de S. cerevisiae isoladas da fabricação de vinho e saquê, apresentam uma retro-
inibição em 10 mM enquanto as leveduras isoladas no processo produtivo da cachaça é de
até 20 mM (Casalone e cols., 1997; Cavalieri e cols., 1999; Satyanarayana e cols., 1968;
Ulm e cols., 1972).
A levedura RB 23A, que é uma segregante da cepa parental LBCM 427, não é retro-
inibida por L-leucina, e ao contrário, tem sua atividade aumentada em 10% quando
comparada a ausência de L-leucina. Sugerindo que independente da presença de L-leucina
no meio, a enzima α-isopropilmalato sintase está em maior atividade. Por outro lado, a
segregante RB 8B, que apresentou instabilidade de resistência a TFL (Tabela 5), também
não é retro-inibida por L-leucina em 10 mM, mas em 20 mM de L-leucina apresentou
atividade da α-isopropilmalato sintase com 20% inibição.
Discussão
118
Após a medida da atividade da α-isopropilmalato sintase das segregantes RB 23A e
RB 8B, o gene LEU4 que codifica esta enzima, foi seqüenciado. Estudos mostram que
cepas com mutação no gene LEU4 apresentam resistência a TFL, insensibilidade a
retroinibição por L-leucina e produzem elevados teores de álcool isoamílico. Casalone e
cols. (1997) caracterizaram molecularmente sete mutantes espontâneos resistentes a TFL, e
verificaram mutação no gene LEU4: Gly514Asp, Gly516Asp, Ser519Thr, Glu540Lys,
His541Pro, Ser547/8 Ser e Ala552Thr localizadas na região-R da proteína que está
envolvida na retro-inibição por L-leucina e inativação mediada por Z
+2
e Coenzima A.
Outra importante mutação foi localizada no aminoácido Asp578Tyr e que resultou no
estreitamento do sitio de ligação da L-leucina consequentemente impedindo sua ligação a
proteína (Oba e cols., 2005).
A análise do sequenciamento da segregante RB 23A revelou a presença de três
mutações na seqüência traduzida desta cepa. Conforme podemos observar na Figura 11, a
seqüência de nucleotídeos identificou uma similaridade de 97% com o gene LEU4 e troca
de nucleotídeos em sete posições: 441(A→G), 709(T→C), 746(A→G), 865(A→G),
939(G→A), 1230(G→C) e 1826(T→C). A tradução desta seqüência identificou uma
similaridade de 99% com a proteína codificada pelo gene LEU4 e mutação em apenas três
aminoácidos: I237, S249, E609 que corresponde a região 709,746 e 1826 de nucleotídeos
respectivamente (Figura 12). Quando comparamos esta seqüência com o alinhamento de
múltiplas seqüências de α-IPM conhecidas (ver Saccharomyces cerevisiae Database),
observamos que a mutação na posição 237 está localizada em uma região altamente
conservada, enquanto a 249 está em região medianamente conservada e 609 em uma região
variada.
A mutação na posição 237 da seqüência de aminoácidos onde ocorreu a troca de
isoleucina por valina, aminoácidos de cadeia lateral apolar, em uma região conservada pode
não trazer conseqüências para a estabilidade da estrutura da proteína uma vez que são
semelhantes quimicamente. Entretanto a mutação ocorrida na posição 249, onde ocorreu a
troca de serina por prolina pode comprometer a flexibilidade da estrutura protéica uma vez
que a prolina com seu grupo imino é mantido em uma conformação rígida que reduz a
flexibilidade estrutural no ponto da cadeia protéica. A terceira mutação na posição 609,
onde ocorre a troca de acido glutâmico, cadeia lateral carregada negativamente, por glicina,
Discussão
119
cadeia lateral não polar, mostra uma mudança radical da característica do aminoácido o que
pode por sua vez estar relacionado com alguma mudança estrutural ou funcional na enzima.
Resíduos de aminoácidos carregados costumam ser importantes em sítios ativos
enzimáticos (Cavalieri e cols., 1999; Oba e cols., 2005).
Surpreendentemente, as mutações encontradas não estão localizadas na região
reguladora da proteína descrita pela literatura, porém não podemos afirmar que as mutações
não podem causar alguma mudança estrutural que influencie a atividade enzimática
indiretamente, esta questão poderia ser melhor investigada por análises de modelagem
molecular ou cristalografia de raio-X, porém estas abordagens estão fora do escopo desta
tese. Caso as mutações realmente não afetem a estrutura geral e atividade da enzima podem
existir outros fatores pós-transcricionais (como glicosilação e fosforilação) que levam a não
retro-inibição por L-leucina, ainda que em altas concentrações (20 mM), da cepa RB 23A e
que não são possíveis de serem determinados somente com a avaliação da sequência de
aminoácidos da proteína deduzida.
O sequenciamento da segregante RB 8B indicou uma identidade da seqüência de
nucleotídeos de 99% com a seqüência LEU 4 (Figura 13). A seqüência apresentou trocas de
bases nas posições 812(C → T), 865 (T→ C), 885(C→T), 938(C→T) e 1230(C→G).
Dentre estas trocas, a região 812 e 885 não são comuns entre a segregante RB 8B e RB
23A. Entretanto, estas trocas não resultaram em mudanças de aminoácidos como podemos
observar na Figura 14. Estes resultados sugerem que outros mecanismos podem estar
interagindo para que mesmo leveduras que apresentam resistência a TFL e ausência de
retro-inibição por altas concentrações de L-leucina não apresentem mutações importantes
no sítio de ligação da proteína.
5.3 – Cepas de leveduras selecionadas usadas na produção de cachaça
Outra abordagem neste trabalho foi avaliar o comportamento das cepas LBCM 422,
LBCM 427 e RB 23A como cepas iniciadoras no processo fermentativo do caldo de cana
em escala piloto. Adicionamos como cepa controle, uma cepa comercial para avaliar
comparativamente a capacidadade fermentativa das cepas. A segregante RB 23A foi
escolhida para este teste por apresentar estabilidade de resistência a TFL e cerulenina e alta
atividade da α-IPM. Conforme pode ser observado na Figura 15, as leveduras LBCM 422,
Discussão
120
LBCM 427 e RB 23A apresentaram um perfil semelhante de consumo de sacarose nas duas
primeiras repetições (Painel A, B e C). Entretanto, a terceira repetição do processo a cepa
LBCM 422 finalizou a fermentação em 24 horas enquanto as cepas LBCM 427 e RB 23A
em 48 horas. A cepa comercial não alcançou um consumo completo de sacarose nas
repetições no tempo padronizado. Estes dados em conjunto sugerem que estas cepas
adaptaram-se bem ao meio caldo de cana (15°Brix) e que a cepa LBCM 422 parece ser uma
melhor fermentador do que as demais testadas, ainda que as cepas LBCM 427 e RB 23A
apresentam um comportamento muito similar de consumo de sacarose. Quanto a produção
de etanol, todas as cepas apresentaram um mesmo perfil quando comparadas no mesmo
tempo (Painel D, E e F).
Durante o processo fermentativo, utilizamos o método de mtDNA – RFLP para
acompanhar as leveduras no processo fermentativo das cepas LBCM 427, LBCM422, RB
23A. O resultado destes testes revelou que todas as 30 colônias, em todos os tempos
coletados apresentaram o mesmo perfil de bandeamento (Figura 16). Apesar de este método
não diferenciar entre as leveduras LBCM 422 e LBCM 427, é um bom método para
identificar a presença de cepas do gênero Saccharomyces e cepas da ecologia de
fermentações espontâneas. Além disto, para o objetivo pretendido de verificar se cepas
externas contaminariam e prevaleceriam no sistema durante a fermentação esta técnica foi
satisfatória. Como este teste foi realizado em uma região distante (Viçosa-MG) do local de
origem das leveduras (Ouro Preto-MG), e as condições de fermentação foi adequada, com
inóculo inicial denso, é muito provável que de acordo com os resultados obtidos as
leveduras iniciadoras se mantiveram presentes ao longo do processo fermentativo.
5.3.1-Análise dos componentes voláteis
Os álcoois superiores e ésteres são compostos presentes na cachaça que se
incorporam ao sabor e ao aroma da bebida. Esses compostos estão presentes em pequenas
quantidades, mas o suficiente para oferecer características próprias a cachaça (Boscolo e
cols., 2000; Cardello & Faria, 1998; Nonato e cols., 2001; Oliveira e cols., 2005). Assim,
uma vez caracterizados os perfis de crescimento fermentativo das cepas, em condições
semelhantes as encontradas na produção da cachaça, dosamos as concentrações de álcool
isoamílico; n-propanol; álcool isobutílico; metanol; etanol; acetato de etila; furfural e
Discussão
121
acetaldeído presentes na cachaça produzida pelas leveduras. Conforme pode ser observado
na Tabela 6, a produção de álcool etílico foi semelhante nas cepas LBCM422, LBCM 427 e
RB 23A e estatisticamente significativa mais elevada quando comparada a cepa comercial.
A concentração do álcool isobutílico foi significativamente mais elevada na cepa RB 23A
quando comparada a produção das cepas LBCM422, LBCM 427 e cepa comercial. As
cepas LBCM 422 e LBCM 427 apresentaram uma produção semelhante de álcool
isobutilico e significativamente maior quando comparada a cepa comercial. A produção de
álcool isoamílico foi semelhante entre as cepas LBCM 422, LBCM 427 e RB 23A e
significativamente mais elevada quando comparada a cepa comercial.
Quando comparamos os teores de álcool isoamilico, álcool isobutílico e acetato de
etila encontrados nas cepas LBCM 422, LBCM 427 e RB 23A com os encontrados por
Boscolo e cols (2000), observamos que são de aproximadamente duas vezes superior e o n-
propanol, por sua vez, apresentou aproximadamente metade dos valores encontrados por
aquele autor (Tabela 1). A Tabela 6 apresenta ainda resultados das dosagens dos compostos
voláteis da cachaça produzida no local de origem das leveduras em estudo no ano de 2003 e
2005. Como podemos observar, os teores dos compostos apresentam semelhança nos dois
anos de coleta. Quando comparamos os resultados obtidos pelas cepas LBCM 422, LBCM
427 e RB 23A quanto a produção de álcool isoamílico estas apresentam aproximadamente
4 vezes maior que a cachaça do produtor. O mesmo pode ser observado para a produção de
álcool isobutilico e acetato de etila. A produção de acetaldeído foi de aproximadamente 50
vezes superior pelas cepas em estudo quando comparada a cachaça do produtor enquanto a
produção de álcool etílico e n-propanol foi semelhante entre as cepas LBCM422, LBCM
427 e RB23 A. Outro aspecto a destacar é que aos teores de álcoois totais encontrados nas
cepas LBCM 422, LBCM 427 e RB 23A estão acima do permitido pela Legislação
enquanto ésteres totais estão em acordo com os índices permitidos.
Surpreendentemente, os resultados de produção de álcool isoamílico das cepas
LBCM 422, LBCM 427 e RB 23A não estão em acordo com os resultados obtidos quando
as leveduras foram testadas quanto a sensibilidade a TFL, ou seja, cepas resistentes a TFL
mostram maior resistência a retroinibição da enzima α-IPM por L-leucina, tendo como
conseqüência uma maior produção do álcool isoamílico (Ashida e cols., 1987; Casalone e
cols., 1997; Yoshizawa, 1999). Este resultado, mais uma vez, sugere que outros fatores
Discussão
122
podem estar envolvidos na regulação deste mecanismo de produção de álcool isoamílico
pelo menos durante o processo fermentativo utilizado, ou ainda que o álcool isoamílico
produzido esteja sendo convertido em algum outro composto não analisado nesta tese.
A síntese de álcool isoamílico pode ser realizada a partir do α-cetoisocaproato, este
um precursor na via de síntese de L-leucina a partir de glicose, ou por redução de α-
cetoácidos (via de Ehrlich). Já a sintese de álcool isobutílico pode ser realizada a partir do
α-cetoisovalerato, um precursor da via biossintética da valina. O α-cetoisovalerato é
convertido pelas enzimas α-IPM sintase, α-IPM isomerase, e β-IPM desidrogenase em α-
cetoisocaproato que é convertido em L-leucina ou álcool isoamílico (Figura 2). A α-IPM
sintase é a enzima chave no controle desta via biossintética. Estudos mostram que a adição
de altas concentrações individuais de aminoácidos leva ao aumento da produção do
respectivo álcool superior e ácido, entretanto também ocorre o aumento de outros álcoois
indicando uma maior e complexa interação metabólica (Kodama e cols., 2001; Lilly e cols.,
2006; Yoshimoto e cols., 2002). Outro aspecto a considerar são os genes BAT1 e BAT2
que codificam para a transaminação de α-cetoácidos, primeiro passo na via de Ehrlich, na
mitocôndria e citossol respectivamente. Estudos sugerem que a transcrição dos genes da via
biosintética de L-leucina (LEU) e BAT são co-regulados pela fonte de nitrogênio e em
condições anaeróbicas, Bat1p pode contribuir para a produção de álcool isoamilico. A
superexpressão de BAT2 em leveduras resultou no aumento da assimilação de leucina,
isoleucina e valina ocorrendo o aumento da produção de álcool isoamílico, entretanto não
foi observado o aumento de álcool isobutílico, sugerindo que os mecanismos de produção
de álcoois superiores são distintos e inter-relacionados (Kodama e cols., 2001; Yoshimoto e
cols., 2002). Conforme podemos observar na Tabela 6, as leveduras LBCM 422, LBCM
427 e RB 23A produziram teores mais elevados de álcool isoamílico e álcool isobutílico
quando comparadas à cepa comercial. Este fato, de forma especulativa, sugere que a
presença de maiores quantidades de α-cetoisovalerato na célula sinalizaria para maiores
concentrações da enzima α-IPM. Esta enzima em maiores concentrações exigiria uma
maior concentração de L-leucina para retroinibiçao (20 mM).
Outra abordagem possivelmente explicativa seria quanto a regulação gênica da α-
IPM. A regulação do gene LEU4 e seu importante produto gênico é muito complexa, e
depende de três elementos distantes e um próximo do promotores LEU4. O elemento mais
Discussão
123
distante Leu3p, é ligante na seqüência ativadora a montante (UAS leu). Mutações nesta
região implicam em perda do controle por Leu3p. Os outros dois elementos estão na região
identificada como Gen4p sítio de ligação; mutações nesta região eliminam o controle geral
de LEU4. A ativação transcricional é aditiva, ou seja, os elementos não competem entre si
ou agem sinergicamente. Estudos mostram que as condições do meio de cultivo também
interagem na regulação do gene LEU4 como, por exemplo, a presença de fosfato no meio
de crescimento diminui em 40% a expressão do gene (Kohlhaw, 2003). Por outro lado,
estudos mostram uma nova classe de RNA e que originalmente localizada próximo do
elemento promotor conhecido, não atuam como um mRNA, podendo regular a transcrição a
jusante do mRNA. As RNAs nucleares pequenos (snRNAs) são encontrados em
abundancia no núcleo de muitos eucariotos, variando de tamanho entre 106 a 189
nucleotídeos e são complexados com proteínas nucleares pequenas para formar partículas
conhecidas como ribonucleoproteínas. A produção de RNAs instáveis são propriedades
comuns dos promotores, e que em alguns casos, eles indicam a presença de um promotor
auxiliar que ajuda a preservar o estado de repressão ou ativação transcricional independente
da presença de mRNA(Davis & Jr, 2006). Estas observações em conjunto, demonstram a
complexidade envolvida nos mecanismos de controle e expressão gênica e o número de
variáveis que poderiam explicar a ausência de mutação na região do sítio ligante de L-
leucina no gene LEU4, a ausência de retroinibição em altas dosagens de L-leucina (20 mM)
e resistência a TFL das segregantes RB 23A e RB 8B.
5.3.2- Avaliação sensorial de cachaças produzidas com cepas selecionadas
como iniciadoras.
A avaliação sensorial global das cachaças produzidas por três fermentações
sucessivas das cepas LBCM 422, LBCM 427 e RB 23A demonstraram uma boa aceitação
pelos provadores. Comparando o perfil sensorial das amostras, não foi possível distingui-
las entre si uma vez que apresentam notas de avaliação sensorial intermediária na escala
hedônica.
Cachaças produzidas por diferentes cepas de leveduras apresentam variações de
concentração de compostos voláteis, mas estas variações podem não resultar em diferenças
perceptíveis no aroma e impressão sensorial global da bebida (Oliveira e cols., 2005). As
Discussão
124
variações de quantidades e proporções de compostos voláteis não influenciaram na
aceitação da cachaça produzida pelas cepas LBCM 422, LBCM 427 e RB 23A. A maior
quantidade de álcool isoamílico produzida por estas cepas quando comparada a cepa
comercial não contribuiu negativamente na aceitação da cachaça.
O método de análise exploratória mostrou-se útil para a discriminação dos grupos e
diferenciou as amostras em três grupos distintos: LBCM422: LBCM 427 e RB 23A; e cepa
comercial (Figura 17). O grupo de amostras de cachaças das cepas LBCM 427 e a
segregante RB 23A pode ser explicado por apresentarem características bioquímicas e
genéticas semelhantes. Por sua vez, os grupos de amostras das cepas LBCM 422 e cepa
comercial apresentaram separação espacial sugerindo que elas apresentam caracteristicas
diferentes entre si. Estes dados estão em acordo com os resultados obtidos quando as
leveduras foram testadas quanto a cariotipagem e este método revelou diferenças entre as
cepas LBCM 422 e LBCM 427. Apesar da proximidade genética destas cepas, elas
apresentam características fisiológicas distintas e este fato sugere que uma estratégia para
acompanhar a permanência da cepa iniciadora no processo fermentativo da cachaça é o uso
combinado de métodos moleculares e bioquímicos.
Conclusões
125
6 - CONCLUSÕES
Conclusões
126
Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que é possível selecionar cepas
com indicativo de alta produção de compostos flavorizantes e que esta área é ampla de
possibilidades. Podemos perceber que os fatores genéticos envolvidos nos processos de
produção de agentes aromatizantes são bastante complexos incluindo controle ao nível de
estrutura gênica, quando aparentemente relacionados ao controle da expressão e atividade
do produto gênico. As análises dos segregantes sugerem fortemente que a maioria das
características fenotípicas utilizadas no processo de seleção das cepas parece ser poligênica
e ter segregação independente. Estes dados demonstram que estudos sobre leveduras
utilizadas no processo fermentativo da cachaça ainda são pouco explorados no país, sendo
uma área bastante promissora. A investigação das diferenças genéticas e bioquímicas das
leveduras utilizadas no processo pode contribuir para ressaltar características sensoriais que
diferenciem e ou melhorem a qualidade do produto final. Esses estudos podem determinar
novas estratégias, ou ainda melhorar o método patenteado por nosso grupo para o
isolamento de leveduras que preservem a qualidade organoléptica sem prejuízo da
diversidade de aroma e bouquet peculiar da bebida.
A estratégia desenvolvida por nosso laboratório para o isolamento de cepas de
S.cerevisiae que produzam teores elevados de compostos aromatizantes pode ser
considerada validada, pois foi possível verificar que alguns dos compostos analisados estão
realmente em maiores teores na bebida produzida em escala piloto. As leveduras isoladas
por essa metodologia obtiveram sucesso no processo fermentivo de caldo de cana e
produziram uma cachaça com maiores quantidades de componentes voláteis.
Os métodos de identificação molecular utilizados neste trabalho, exceto a
cariotipagem, foram falhos para diferenciar cepas isoladas da mesma dorna, como entre as
cepas LBCM 422 e LBCM 427. O mesmo ocorreu entre estas e cepas selvagens presentes
no local de origem da coletada dois anos após o primeiro isolamento. Como a cariotipagem
é considerado um método caro e demorado, podemos sugerir como alternativa o uso aliado
de métodos bioquímicos (como a resistência à TFL e cerulenina) e métodos moleculares
para diferenciar cepas de origem selvagem umas das outras. Quando o objetivo é identificar
cepas de diferentes isolados as técnicas de mtDNA-RFLP, COX-PCR e cariotipagem
podem ser utilizadas.
Conclusões
127
As cepas segregantes da cepa parental LBCM 427 demonstraram instabilidade
fisiológica e perda de algumas características fenotípicas. Além disto, estas sub-populações
apresentaram diferentes perfis de respostas frente ao mesmo teste bioquímico ao longo dos
repasses em meio de cultura. Este resultado pode indicar alterações no padrão de expressão
dos genes nas cepas segregantes ou ainda um estado de não haploidia devido à
possibilidade da cepa parental poder ser poliplóide. Certamente os dados obtidos
demonstram a necessidade de um estudo genético para avaliar a natureza dessas alterações.
Outro aspecto é que o método de segregação da cepa LBCM 427 resultou em uma
segregante, RB 23A, que produziu quantidade semelhante de compostos voláteis da cepa
parental. Podemos considerar que a metodologia utilizada para a escolha da cepa foi válida.
Interessante para a continuidade deste estudo poderia ser o cruzamento entre segregantes
para estabilização e somatória das características fenotípicas de interesse.
O sequenciamento do gene LEU4 da cepa RB 23A demonstrou que as mutações
encontradas não estão localizadas na região reguladora da proteína descrita pela literatura,
porém não podemos afirmar que as mutações não podem causar alguma mudança estrutural
que influencie a atividade enzimática indiretamente. Por outro lado, o sequenciamento
deste gene da cepa RB 8B não demonstrou mutações mesmo esta cepa apresentando alta
atividade enzimática na presença de L-leucina (20 mM) e produção de elevados teores de
álcool isoamílico. Estes resultados sugerem que outros mecanismos podem estar
interagindo para que mesmo leveduras que apresentam resistência a TFL e ausência de
retro-inibição por altas concentrações de L-leucina não apresentem mutações importantes
no sítio de ligação da proteína.
Finalmente, este trabalho oferece uma importante contribuição para o
desenvolvimento de novas estratégias de seleção de cepas selvagens com características
específicas, levando à produção de bebidas de maior qualidade.
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128
7 – REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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