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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB
“Avaliação da Imunogenicidade de Dois Novos
Imunobiológicos Candidatos a Vacina Contra
Leishmaniose Visceral Canina”
RODOLFO CORDEIRO GIUNCHETTI
Ouro Preto – MG
Novembro – 2007
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
RODOLFO CORDEIRO GIUNCHETTI
“Avaliação da Imunogenicidade de Dois Novos
Imunobiológicos Candidatos a Vacina Contra
Leishmaniose Visceral Canina”
Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis – Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto
Co-orientador: Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira – Laboratório de Imunologia Celular e
Molecular, Instituto René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz
Tese Apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas do
Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Ouro Preto como Parte Integrante dos
Requisitos para Obtenção do Título de
Doutor em Ciências Biológicas. Área de
Concentração: Imunobiologia de
Protozoários.
Ouro Preto – MG
Novembro – 2007
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Colaboradores
Dra. Marta Lana
I
Dr. Olindo Assis Martins Filho
II
Dra. Andréa Teixeira Carvalho
II
Dr. Nelder Figueiredo Gontijo
III
Dr. Luiz Cosme Cotta Malaquias
IV
Dra. Cláudia Brodskyn
V
I – Laboratório de Doença de Chagas, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais.
II – Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração, Instituto René
Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, Minas Gerais.
III – Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos, Departamento de Parasitologia,
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte, Minas Gerais.
IV – Núcleo de Pesquisa em Imunologia, Universidade Vale do Rio Doce, Governador
Valadares, Minas Gerais.
V – Laboratório de Imunoparasitologia, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação
Oswaldo Cruz, Salvador, Bahia.
Suporte Financeiro
FAPEMIG – Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais – Projeto N
o
2222/2002
CBB
PAPES IIIB – Programa de Apoio a Pesquisa em Saúde, FIOCRUZ/RJ – Projeto
Convênio CPqRR/UFOP/FEOP/Canil de Experimentação em Leishmanioses.
CAPES – Capacitação de Ensino Superior – Bolsa de Doutorado.
A memória de meus pais, Roberto Giunchetti Filho e
Fátima Francisca Cordeiro Giunchetti e a memória de
meus avós, Roberto Giunchetti e Benvinda da Penha
Loureiro Giunchetti, que orientaram minha formação
ética e moral possibilitando assim todos os meus
avanços e vitórias;
A minha esposa Denise da Silveira Lemos Giunchetti
pelo eterno companheirismo, dedicação, carinho e amor.
“O Homem não nasceu para a
morte. Ele nasceu para a vida, para
a imortalidade”
(Ariano Suassuna)
Agradecimentos
A Deus pela oportunidade da vida;
À minha esposa Denise da Silveira Lemos Giunchetti pela presença, incentivo,
entusiasmo e carinho sempre constantes. Você soube compreender as inúmeras vezes
que precisei deixá-la ou mesmo em momentos quando ainda presente não consegui te
dar atenção merecida. Obrigado pelo companheirismo e pelo seu amor que tornaram
minha vida mais feliz além de garantir a conclusão deste trabalho de forma mais
agradável e tranqüila.
Aos meus pais Roberto Giunchetti Filho (in memoriam) e Fátima Francisca Cordeiro
Giunchetti (in memoriam) e aos meus avós Roberto Giunchetti (in memoriam) e
Benvinda da Penha Loureiro Giunchetti (in memoriam) pelos exemplos de vida e pela
imensa contribuição no meu processo de formação pessoal que permitiu com que eu
superasse limites garantindo conquistas aparentemente impossíveis.
Aos meus irmãos Danilo Cordeiro Giunchetti e Marcela Cordeiro Giunchetti por
fazerem parte da minha vida.
A minha tia Fátima Loureiro Giunchetti de Oliveira, ao seu esposo Luizinho e aos meus
primos Rafaela e Gustavo pela presença marcante em muitos momentos, apoio e
carinho que foram fundamentais para eu a chegar até aqui.
A minha avó Lourdes pelo exemplo de vida e dedicação à família.
Ao meu sogro Sr. Fernando Antônio Maia Lemos e sogra Sra. Maria da Penha G. S.
Lemos e aos irmãos da Denise (Renata, Gisele e Luiz Fernando) pelo carinho, apoio e
agradável convivência.
Ao meu orientador Alexandre Barbosa Reis, companheiro de longa jornada e amigo de
todos os momentos, a quem eu devo grande parte do conhecimento adquirido em
leishmanioses. Obrigado pela confiança depositada em mim para que pudesse te auxiliar
na consolidação da linha de pesquisa em leishmaniose visceral canina na UFOP.
Certamente, este foi um dos desafios mais instigante e recompensador que tive até hoje.
Formamos um grupo de pesquisa que atualmente ganha projeção internacional, abrindo
inúmeras oportunidades. Sua contribuição na formação científica de seus alunos tem
sido evidente. Além disto, seu apoio constante e exemplo de dedicação ao ambiente
acadêmico-científico nos estimulam na difícil jornada da carreira científica. Muito
obrigado.
Ao Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira, pela co-orientação deste trabalho e pelo apoio e
estímulo que vem sendo fundamentais ao crescimento e amadurecimento de nossa linha
de pesquisa. Uma grande parte dos resultados deste trabalho foi obtida em seu
laboratório que sempre esteve aberto para nós. Além disto, você tem nos incentivado
muito na ampliação de nossa rede de interações científicas, que começa a originar os
primeiros frutos.
À Profa. Marta de Lana que teve papel determinante no estabelecimento da linha de
pesquisa em leishmaniose visceral canina na UFOP. Obrigado por conceder sua
orientação oficial no programa de pós-graduação, permitindo com que eu desenvolvesse
este trabalho, até que o Alexandre pudesse assumi-la oficialmente. Além da sustentação
política e administrativa para que as obras no canil de experimentação em leishmanioses
pudessem ser realizadas visando atender aos interesses deste projeto, seu apoio foi
fundamental para transpormos todas as adversidades que surgiram no transcorrer deste
processo. Além disto, sou grato pelos momentos sempre agradáveis de convivência e
pelo exemplo tão forte de ética, rigor e dedicação à pesquisa tão importante para nós
que estamos iniciando a carreira científica.
Ao Dr. Olindo Assis Martins Filho pela grande contribuição no processo de
amadurecimento dos resultados obtidos neste trabalho. Sua participação no meu
processo de formação teve grande importância, pois me estimulou a olhar nossos
resultados sob diferentes formas e utilizando diferentes ferramentas investigativas.
Além disto, sua contribuição tem sido importante para ganharmos maior qualidade e
velocidade nas publicações do nosso grupo. Seu exemplo de dedicação à pesquisa e
brilhantismo científico nos contagia e estimula sempre no difícil caminho da carreira
científica.
À Dra. Andréa Teixeira Carvalho que nos auxiliou muito desde os experimentos na
bancada, análise, sugestões e entendimento dos resultados. Muito obrigado pela
disponibilidade e ajuda em diferentes momentos deste trabalho, nas sugestões e
correções desde a versão da qualificação até a tese apresentada a banca examinadora.
Sua contribuição tem sido determinante para mantermos a qualidade de nossas
publicações e seu exemplo de dedicação à ciência nos inspira na continuidade desta
jornada.
Ao Dr. Nelder Figueiredo Gontijo pela colaboração no fornecimento das glândulas de
flebotomíneos que foram utilizadas na vacinação dos cães.
Ao Dr. Luiz Cosme Cotta Malaquias que nos ajudou a ampliar as investigações de
imunogenicidade, possibilitando o estabelecimento da metodologia de dosagem de
óxido nítrico em nosso laboratório.
À Dra. Cláudia Brodskyn pela colaboração que possibilitou a avaliação da reatividade
sérica anti-saliva de flebotomíneos.
À Profa. Cláudia Martins Carneiro por ter me recebido no laboratório de
Imunopatologia/NUPEB, sempre me estimulando e contribuindo de forma crítica nos
momentos de discussão dos resultados que auxiliaram na redação da tese final. Além
disto, tive a oportunidade de amadurecer muito com você que é exemplo de equilíbrio,
objetividade, rigor e ética na atividade científica.
Aos alunos de iniciação científica do Laboratório de Imunopatologia/NUPEB que
tiveram a oportunidade de dar uma grande contribuição para implantação da colônia de
cães destinados à experimentação, a elaboração dos antígenos vacinais e realização dos
diferentes experimentos. Certamente sem a grande dedicação de vocês o projeto não
teria como ser realizado da forma como foi proposto. Desta forma, vocês
desempenharam um excelente trabalho e contribuíram muito na consolidação desta
linha de pesquisa na UFOP. Gostaria de agradecer ao Alberto, Lorena e a Simone, ex-
alunos de nosso laboratório; aos alunos Bruno M. Roatt, Rodrigo O. Aguiar-Soares; à
Nadia das D. Moreira, Juliana V. de Souza e que agora são colegas de pós-graduação.
Aos alunos de iniciação científica que mais recentemente iniciaram suas atividades em
nosso laboratório e que também tiveram grande dedicação ao trabalho: Henrique G. Ker
e Samuel L. Braga.
Aos alunos de aperfeiçoamento e agora colegas de pós-graduação Wendel Coura Vital
pelo grande auxílio nas avaliações do hemograma e ELISA anti-Leishmania e a Raquel
T. de Abreu pelo apoio logístico no canil.
Aos demais estudantes do Laboratório de Imunopatologia/NUPEB pela agradável
convivência: Vitor, Jerusa, Sheler, Amanda, Paula, Nívea, Fabiana.
À funcionária do Laboratório de Imunopatologia/NUPEB, Maria Chaves dos Santos
pela preciosa ajuda na manutenção das atividades diárias de nosso laboratório
possibilitando seu funcionamento adequado e a realização de inúmeros trabalhos.
Aos amigos do Laboratório de Doença de Chagas, Profa. Terezinha Bahia, Prof. André
Talvani, Vanja Maria Veloso, Helen, Girley, Jaila, Marcela, pela agradável convivência.
Aos funcionários do Biotério da UFOP, Cristina, Érica, Marcos e Jorge, pela grande
dedicação na manutenção diária dos animais em experimentação.
À Maria Aparecida Reis Trópia (Cida), secretária do programa de pós-graduação do
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, pela presteza e grande sensibilidade que
torna a resolução dos problemas burocráticos mais simples e com grande agilidade.
Obrigado pelo carinho, estímulo e eficiência que caracteristicamente sempre atende a
todos nós, tornando nossa vida acadêmica mais fácil e prazerosa.
Ao coordenador da pós-graduação Prof. Deoclécio Alves Chianca Jr, em nome do
programa de pós-graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB,
pela oportunidade de realizar este trabalho e pela formação intelectual adquirida neste
período.
À Pro-Reitoria de Pesquisa de Pós-Graduação da UFOP em nome do Prof. Tanus Jorge
Nagem e do Prof. André Barros Cota e da Dra. Izabel Cristina da Silva, pelo grande
apoio à nossa linha de pesquisa e presteza na solicitação da patente deste trabalho.
À Clari Lopes Gandra Martins, secretária do Laboratório de Imunologia Celular e
Molecular/IRR, pela grande contribuição que transcende as atividades burocráticas do
cotidiano. Você é dotada de uma grande sensibilidade, carisma e perspicácia, que além
de tornar o ambiente de trabalho mais agradável, identifica dificuldades por “trás dos
olhos de cada um”. Esta característica proporciona a todos que trabalham neste
laboratório o desenvolvimento das atividades com a certeza de poder contar com o seu
afeto acolhedor e a presteza de resolver muito dos nossos problemas. Além disto, sua
incrível capacidade conciliadora e neutralizadora de “interferências” fazem com que
você tenha um papel estratégico dentro desta instituição, porque sabemos que não é fácil
conviver com as diferenças de cada um, e nós somos muitos... O mais intrigante é que
você faz isto pelo simples prazer em ajudar as pessoas. Não sei como te agradecer pelo
que fez e vêm fazendo por nós. Muito obrigado.
Às alunas do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular/IRR, Leila A. Campos,
ex-aluna de iniciação científica e, Luanda L. Guerra, hoje colega de pós-graduação, pelo
auxílio nos experimentos de citometria de fluxo e convivência sempre agradável.
À Luciana L. Mota e Castro pela agradável convivência e pelo grande apoio na
realização dos experimentos de cultivo celular que tornou nosso trabalho muito mais
agradável.
À Tiza pela disponibilidade e presteza na leitura dos experimentos em citometria de
fluxo, garantindo uma rigorosa qualidade de todos os nossos experimentos de
imunofenotipagem.
À Iramaya Rodrigues Caldas, vice-chefe do Laboratório de Imunologia Celular e
Molecular/IRR, pela contribuição na manutenção da qualidade de todos os
experimentos realizados neste laboratório.
Ao corpo técnico do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular/IRR, Ana Maria
Pacheco de Araújo, Daniela Peralva, Eliane A. Léo Moreira, Lorena Junia de Souza
Santos, Ricardo Ribeiro de Andrade, Rita de Cássia, Wallison Silva Gonçalves, pela
agradável convivência e grande importância na manutenção das atividades diárias
fundamentais para atender a todos os colaboradores deste laboratório.
Aos demais componentes do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular/IRR,
muitos dos quais ex-alunos, pela agradável convivência: Ana Carolina Campi Azevedo,
Ana Thereza Chaves, Andréa Rizia de Souza Carmo Guimarães, Andréia Maria Molica,
Daniel Menezes Souza, Fernanda Fortes de Araújo, Jacqueline Araujo Fiúza, Juliana de
Assis Silva Gomes Estanislau, Pedro Matheus Fernandes Costa e Silva, Pedro Henrique
Gazzinelli Guimarães, Pollyanna Castro e Silva, Ramon Silva Lage, Ricardo Toshio
Fujiwara, Roberta Oliveira Prado, Solange Cristina Uber Busek, Stefan Michael Geiger,
Vladimir Martins Pinheiro.
À Roberta Félix Campos, secretária do Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e
Monitoração/IRR, pela presteza e grande atenção e aos estudantes pela convivência
sempre muito agradável.
Aos motoristas do IRR/FIOCRUZ, Toninho e Cláudio, pelo apoio no transporte de
amostras biológicas entre a UFOP e a FIOCRUZ.
Aos funcionários do IRR/FIOCRUZ Solange (portaria) e Segemar (biblioteca) pela
presteza, dedicação e atenção dedicadas a todos os usuários desta instituição.
I
Índice
Lista de Tabelas....................................................................................................................................... IV
Lista de Diagramas....................................................................................................................................V
Lista de Figuras ....................................................................................................................................... VI
Lista de abreviaturas e siglas............................................................................................................... VIII
Resumo .......................................................................................................................................................X
Abstract...................................................................................................................................................XII
1. Introdução...............................................................................................................................................1
1.1 - Aspectos gerais relacionados à Leishmania e as leishmanioses ......................................................2
2. Revisão da Literatura.............................................................................................................................6
2.1 - Aspectos imunopatológicos da leishmaniose visceral canina..........................................................7
2.2 - Utilização de imunomoduladores em estratégias vacinais ............................................................12
2.3 - Novas estratégias imunoprofiláticas anti-Leishmania utilizando saliva de flebotomíneos............15
2.4 – Estudos utilizando antígenos brutos vacinais contra leishmaniose tegumentar americana que
estimularam o desenvolvimento de imunobiológicos anti-LVC............................................................18
2.5 - Estudos preliminares realizados na UFOP que subsidiaram a elaboração de uma vacina contra
leishmaniose visceral canina..................................................................................................................20
2.6 – Avaliações de diferentes vacinas de antígeno bruto contra leishmaniose visceral canina realizadas
no Brasil.................................................................................................................................................22
3. Justificativa ...........................................................................................................................................26
4. Objetivos ...............................................................................................................................................28
5. Materiais e Métodos .............................................................................................................................31
5.1 - Estabelecimento da colônia de cães no canil de experimentação em leishmanioses/UFOP..........32
5.1.1 – Manejo sanitário das matrizes e filhotes ..............................................................................32
5.2 – Produção do antígeno vacinal .......................................................................................................33
5.3 – Imunomoduladores: adjuvante saponina e saliva de Lu. longipalpis............................................35
5.3.1 – Preparo do adjuvante Saponina ...........................................................................................35
5.3.2 – Obtenção de glândulas salivares de Lutzomyia longipalpis .................................................35
5.4 – Desenho experimental...................................................................................................................35
5.5 – Estratégias de avaliação utilizando-se diferentes protocolos vacinais ..........................................39
5.5.1 – Avaliação dos aspectos relacionados à inocuidade e toxicidade .........................................39
5.5.2 – Obtenção de amostras de sangue periférico .........................................................................39
5.5.3 – Leucograma ..........................................................................................................................40
5.5.4 – Avaliação da resposta imune humoral anti-Leishmania.......................................................40
5.5.5 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo ...........................................................................42
5.5.6 – Avaliação da resposta celular no contexto in vitro...............................................................53
5.5.7 – Avaliação dos níveis de óxido nítrico no soro e em sobrenadante de culturas estimuladas
com VSA ou SLcA .............................................................................................................................57
5.6 – Análise estatística dos dados.........................................................................................................58
6. Resultados .............................................................................................................................................59
6.1 – Capítulo I .....................................................................................................................................61
Aspectos relacionados a inocuidade e toxicidade pós-vacinais em diferentes estratégias
imunoprofiláticas ...................................................................................................................................61
6.1.1 – Avaliação dos aspectos relacionados a inocuidade e toxicidade: análise da temperatura
retal (
o
C) e alterações locais pós-vacinais em cães submetidos a diferentes protocolos de
imunizações.......................................................................................................................................62
II
6.2 – Capítulo II ....................................................................................................................................64
Avaliação da imunogenicidade de uma nova vacina constituída por antígenos brutos de Leishmania
braziliensis associada ao adjuvante saponina ........................................................................................64
6.2.1 – Análise da reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no soro de cães controle
e submetidos ao inóculo com saponina, imunizações com vacina de L. braziliensis, e vacina de L.
braziliensis associada à saponina.....................................................................................................66
6.2.2 – Leucograma de cães controle e submetidos ao inóculo com saponina, imunizações com
vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada à saponina ....................................68
6.2.3 – Análise do número de linfócitos sanguíneos e do perfil fenotípico de células T (CD5
+
, CD4
+
e CD8
+
) e células B (CD21
+
) circulantes no sangue periférico de cães controle e submetidos ao
inóculo com saponina, imunizações com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis
associada à saponina........................................................................................................................70
6.2.4 – Avaliação da atividade linfoproliferativa e do perfil imunofenotípico de linfócitos (CD5
+
,
CD4
+
, CD8
+
, CD21
+
) submetidos a estimulação antigênica com antígeno solúvel vacinal (VSA) e
antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de cães controle e submetidos ao inóculo com
saponina, imunizações com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada à
saponina............................................................................................................................................72
6.2.5 – Análise de correlações entre a atividade linfoproliferativa e o perfil imunofenotípico de
linfócitos (CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
) submetidos a estimulação antigênica com antígeno solúvel vacinal
(VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de cães controle e submetidos ao inóculo
com saponina, imunizações com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada à
saponina............................................................................................................................................75
6.2.6 – Avaliação do número de monócitos CD14
+
sanguíneos, do perfil de ativação linfocitária
pela expressão de CD80 e MHC-I e do possível papel de monócitos CD14
+
e linfócitos B CD21
+
como potenciais células apresentadoras de antígenos em cães controle e submetidos ao inóculo
com saponina, imunizações com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada à
saponina............................................................................................................................................77
6.2.7 – Avaliação dos níveis de óxido nítrico (NO) no soro e em sobrenadante de cultura de células
mononucleares do sangue periférico estimuladas in vitro em cães controle e submetidos ao inóculo
com saponina, imunizações com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada à
saponina............................................................................................................................................80
6.3 – Capítulo III ..................................................................................................................................70
Imunogenicidade de uma nova vacina constituída por antígenos brutos de Leishmania braziliensis
associada à saliva de Lutzomyia longipalpis e ao adjuvante saponina...................................................70
6.3.1 – Análise da reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-saliva no soro de cães controle e
submetidos ao inóculo com saliva, imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva de
Lu. longipalpis e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis ......83
6.3.2 – Avaliação por western blot do perfil de proteínas anti-saliva no soro de cães controle e
submetidos ao inóculo com saliva, imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva de
Lu. longipalpis e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis ......84
6.3.3 – Análise da reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no soro de cães controle
e submetidos ao inóculo com saliva, imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva
de Lu. longipalpis e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis .86
6.3.4 – Leucograma de cães controle e submetidos ao inóculo com saliva, imunizações com vacina
de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e vacina de L. braziliensis associada à
saponina e à saliva de Lu. longipalpis..............................................................................................88
6.3.5 – Análise do número de linfócitos sanguíneos e do perfil fenotípico de células T (CD5
+
, CD4
+
e CD8
+
) e células B (CD21
+
) circulantes no sangue periférico de cães controle e submetidos ao
inóculo com saliva, imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis
e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis ...............................90
6.3.6 – Avaliação da atividade linfoproliferativa e do perfil imunofenotípico de linfócitos (CD5
+
,
CD4
+
, CD8
+
, CD21
+
) submetidos a estimulação antigênica com antígeno solúvel vacinal (VSA) e
antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de cães controle e submetidos ao inóculo com
saliva, imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e vacina de
L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis ..................................................92
6.3.7 – Análise de correlações entre a atividade linfoproliferativa e o perfil imunofenotípico de
linfócitos (CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
) submetidos a estimulação antigênica com antígeno solúvel vacinal
(VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em células de cães controle e submetidos ao inóculo
com saliva, imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e
vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis ..................................94
III
6.3.8 – Avaliação do número de monócitos CD14
+
sanguíneos, do perfil de ativação linfocitária
pela expressão de CD80 e MHC-I e do possível papel de monócitos CD14
+
e linfócitos B CD21
+
como potenciais células apresentadoras de antígenos em cães controle e submetidos ao inóculo
com saliva, imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e
vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis ..................................96
6.3.9 – Avaliação dos níveis de óxido nítrico (NO) no soro e em sobrenadante de cultura de células
mononucleares do sangue periférico estimuladas in vitro em cães controle e submetidos ao inóculo
com saliva, imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e
vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis ..................................99
6.4 – Resumo de Resultados ...............................................................................................................100
7. Discussão .............................................................................................................................................105
8. Conclusão ............................................................................................................................................123
9. Perspectivas.........................................................................................................................................125
10. Bibliografia........................................................................................................................................127
11. Anexos ...............................................................................................................................................145
IV
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Painel de anticorpos monoclonais utilizados na imunofenotipagem de leucócitos ...................44
Tabela 2 – Distribuição do painel de anticorpos anti-marcadores de superfície celular de leucócitos do
sangue periférico ou de células mononucleares do sangue periférico estimuladas in vitro para fenotipagem
em microplaca de 96 orifícios ....................................................................................................................48
Tabela 3 – Distribuição do painel de anticorpos anti-marcadores de superfície celular de leucócitos do
sangue periférico para fenotipagem em tubos ............................................................................................49
Tabela 4 – Alterações no local do inóculo (edema/nódulo) em cães controle e submetidos a diferentes
protocolos vacinais.....................................................................................................................................64
Tabela 5 – Leucograma de cães controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais...........................69
Tabela 6 – Leucograma de cães controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais...........................89
V
Lista de Diagramas
Diagrama 1: Esquema do desenho experimental utilizado na avaliação de cães submetidos a diferentes
protocolos vacinais: controle (C), saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB), vacina de L. braziliensis
associado à saponina (LBSap), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva
de Lu. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associado à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
(LBSapSal) .................................................................................................................................................38
Diagrama 2: Resumos dos principais resultados observados em cães submetidos a diferentes protocolos
vacinais: saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB), vacina de L. braziliensis associada à saponina
(LBSap), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis
(LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal). ......104
VI
Lista de Figuras
Figura 1: Seqüência de procedimentos utilizados para avaliação da qualidade do perfil celular e
ocorrência de reações inespecífica durante a imunofenotipagem em células de cães submetidos a
diferentes protocolos vacinais ....................................................................................................................51
Figura 2: Seqüência de procedimentos utilizados para determinar o percentual de linfócitos CD5
+
, CD4
+
,
CD8
+
e CD21
+
e para quantificar o canal médio de fluorescência (CMF) de MHC-I e CD80 em linfócitos
do sangue periférico de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais.................................................52
Figura 3: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de monócitos no sangue
periférico de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais..................................................................53
Figura 4: Valor médio da temperatura retal (
o
C) de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais:
controle (C), saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB), vacina de L. braziliensis associada à
saponina (LBSap), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu.
longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
(LBSapSal) .................................................................................................................................................62
Figura 5: Reatividade humoral anti-Leishmania em soros de cães submetidos a diferentes protocolos
vacinais: controle (C), saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB) e vacina de L. braziliensis associada
à saponina (LBSap).. ..................................................................................................................................67
Figura 6: Perfil celular de linfócitos circulantes em cães submetidos a diferentes protocolos vacinais:
controle (C), saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB) e vacina de L. braziliensis associada à
saponina (LBSap).......................................................................................................................................71
Figura 7: Índice de proliferação médio e desvio padrão de células mononucleares do sangue periférico
(PBMC) obtido pela análise em contagens por minutos (CPM) em linfócitos de cães submetidos a
diferentes protocolos vacinais, após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA; painel superior
esquerdo) e estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel superior direito)........................74
Figura 8: Correlação entre proliferação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) em
contagens por minutos (CPM) e as freqüências de linfócitos T (LT) CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
, considerando
resultados obtidos em T0 (antes da primeira imunização) e T3 (15 dias após a terceira imunização), após
estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA) e estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA)....76
Figura 9: Células apresentadoras de antígenos em potencial e perfil de ativação linfocitária em cães
submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C), saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB) e
vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap).............................................................................79
Figura 10: Avaliação dos níveis de óxido nítrico (NO) sérico e de sobrenadante de cultura em cães
submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C), saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB) e
vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap).............................................................................81
Figura 11: Reatividade humoral anti-extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis em soros de cães
submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L.
braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina
e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal) ...................................................................................................85
Figura 12: Reatividade humoral anti-Leishmania em soros de cães submetidos a diferentes protocolos
vacinais: controle (C), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu.
longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
(LBSapSal) .................................................................................................................................................87
Figura 13: Perfil celular de linfócitos circulantes em cães submetidos a diferentes protocolos vacinais:
controle (C), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis
(LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal) .........91
VII
Figura 14: Índice de proliferação médio e desvio padrão de células mononucleares do sangue periférico
obtido pela análise em contagens por minutos em linfócitos de cães submetidos a diferentes protocolos
vacinais, após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA) e estímulo com antígeno solúvel de L.
chagasi (SLcA)...........................................................................................................................................93
Figura 15: Correlação entre proliferação de células mononucleares do sangue periférico em contagens por
minutos e as freqüências de linfócitos T (LT) CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
, considerando resultados obtidos em T0
(antes da primeira imunização) e T3 (15 dias após a terceira imunização), após estímulo com antígeno
solúvel vacinal (VSA) e estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA).........................................95
Figura 16: Células apresentadoras de antígenos em potencial e perfil de ativação linfocitária em cães
submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L.
braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina
e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal) ...................................................................................................98
Figura 17: Avaliação dos níveis de óxido nítrico (NO) sérico e de sobrenadante de cultura em cães
submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L.
braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina
e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal) .................................................................................................100
VIII
Lista de abreviaturas e siglas
% - percentual
ºC - graus Celsius
Ac - Anticorpo
Acm - Anticorpo monoclonal
Ag - Antígeno
APC - Células apresentadoras de antígeno
BCG - Bacillus Calmette-Guérin
CA - Cães Assintomáticos
CBA - camundongos resistentes à infecção
por L. major
C57BL/6 - camundongos resistentes à
infecção por L. major
CCZ - Centro de controle de zoonoses
CD – Cluster of differentiation
CD5 - Marcador de superfície celular de
linfócitos T
CD4 - Marcador de superfície celular da
subpopulação de linfócitos T
auxiliares/indutores
CD8 - Marcador de superfície celular da
subpopulação de linfócitos T
citotóxicos/supressores
CD14 - Marcador de superfície celular de
monócitos e granulócitos
CD21 - Marcador de superfície celular de
linfócitos B
CD80 - Marcador de superfície celular de
monócitos
CGRP - Peptídeo Relacionado ao Gene da
Calcitonina
IRR – Instituto René Rachou - Belo
Horizonte - Minas Gerais
CMBlast - Meio de cultura celular
CO - Cães Oligossintomáticos
CPM - Contagem por minutos
CS - Cães Sintomáticos
CMF - Canal médio de fluorescência
Con-A - Concavalina A
BALB/c - camundongos susceptíveis à
infecção por L. major
ED - via endovenosa de inoculação
EDTA - Anticoagulante quelante de
cálcio
ELISA - Enzyme linked immunosorbent
assay
FACS - Fluorescence Activated Cell
Sorter
FACSdil - Solução diluente de
anticorpos
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz -
Rio de Janeiro - RJ
FL1 - Fluorescência do tipo 1 -
Isoticianato de Fluroceína
FL2 - Fluorescência do tipo 2 -
Ficoeritrina
FL3 - Fluorescência do tipo 3 - Cy-5
FITC - Isotiocianato de fluoresceína
FSC - Forward Scatter (Tamanho
celular)
gp – glicoproteína
HRPO – Horsedarish Peroxidase
ICB - Instituto de Ciências Biológicas
(UFMG)
ID - via intradérmica de inoculação
Ig - Imunoglobulina
IgA- Imunoglobulina da classe A
IgE- Imunoglobulina da classe E
IgG - Imunoglobulina da classe G
IgG1- Imunoglobulina da subclasse G1
IgG2- Imunoglobulina da subclasse G2
IgM- Imunoglobulina da classe M
IFN-γ - Interferon-gama
IL-2 - Interleucina 2
IL-4 - Interleucina 4
IL-10 - Interleucina 10
IL-12 – Interleucina 12
LB - linfócitos B
IX
Leishvacin® - Vacina anti-LTA
SGE – sand fly gland extract (Lutzomyia
longipalpis)
LIT - Liver Infusion Tryptose
LT - linfócitos T
LTA - Leishmaniose Tegumentar
Americana
LV - Leishmaniose Visceral
LVC - Leishmaniose Visceral Canina
MHC-I – complexo de
histocompatibilidade principal de classe I
MHC-II - complexo de
histocompatibilidade principal de classe II
NNN - Nicole, Novy & Neal (Meio de
cultivo bifásico)
NO - óxido nítrico
OMS - Organização Mundial de Saúde
PBMC – Peripheral blood mononuclear
cells
PBS - Phosphate buffer saline
pH - Potencial hidrogeniônico
PHA – mitógeno fitohemaglutinina A
RIFI - Reação de Imunofluorescência
Indireta
RPMI 1640 – Roswell Park Memory
Institute (Meio de Cultivo Celular)
rpm - rotação por minuto
SFB - Soro Fetal Bovino
SRBC - Sheep Red Blood Cells
SRN - Soro de rato normal
SSC - Side Scatter (Granulosidade celular)
Th - Células T helper
Th1 - Células T CD4+ secretoras do padrão
1 de citocinas (IL-2 e IFN-γ)
Th2 - Células T CD4+ secretoras do padrão
2 de citocinas (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10)
TM - Teste de Montenegro
TNF- α - Fator de Necrose Tumoral tipo α
UFMG - Universidade Federal de Minas
Gerais
UFOP – Universidade Federal de Ouro
Preto
WHO - World Health Organization
µL - microlitro
µg – micrograma
X
Resumo
Considerando a importância de estratégias imunoprofiláticas para o controle da
leishmaniose visceral, a inexistência de drogas capazes de curar cães infectados e o
aumento de casos de resistência aos antimoniais pentavalentes, o presente trabalho
buscou avaliar a imunogenicidade de dois novos imunobiológicos candidatos a vacina
contra leishmaniose visceral canina (LVC). Observa-se uma lacuna em estudos que
buscam avaliar a imunogenicidade pós-vacinal de imunobiológicos anti-LVC. Assim, o
presente estudo propôs uma análise detalhada da imunogenicidade considerando
diversos biomarcadores da resposta imune celular e humoral após as três doses das
diferentes estratégias vacinais. Trinta e cinco cães sem raça definida foram subdivididos
em sete grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle C (n = 10) que recebeu
1 mL de salina estéril a 0,9%; (ii) grupo LB (n = 5) que recebeu 600 µg de proteína de
Leishmania braziliensis em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iii) grupo Sap (n = 5) que
recebeu 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iv) grupo LBSap (n = 5)
que recebeu 600 µg de proteína de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina em 1
mL de salina estéril a 0,9%; (v) grupo Sal (n = 5) que recebeu extrato de glândula
salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) equivalente ao conteúdo de 5 ácinos da
glândula salivar em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vi) grupo LBSal (n = 5) que recebeu
600 µg de promastigotas de L. braziliensis associado ao SGE em 1 mL de salina estéril
a 0,9%; (vii) grupo LBSapSal (n = 5) que recebeu 600 µg de promastigotas de L.
braziliensis associado a 1 mg de saponina e ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%.
Cada animal recebeu três aplicações subcutâneas no flanco esquerdo em intervalos de
quatro semanas. Os resultados indicam que a saponina quando presente (Sap, LBSap,
LBSapSal) induziu em alguns cães a formação de edema ou de pequeno nódulo local,
sem apresentar lesões ulceradas ou outras alterações adversas. A avaliação da
inocuidade e toxicidade das diferentes vacinas não revelou contra-indicações para
utilização. A avaliação da resposta humoral revelou que os grupos LBSap e LBSapSal
apresentaram aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania, sugerindo
um perfil de resposta imune misto Th1/Th2. De forma semelhante, no grupo LBSapSal
foi observado aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-SGE, que tem sido
previamente relacionado ao estabelecimento de uma resposta imune protetora anti-
Leishmania. Além disto, experimentos utilizando Western blot para avaliar a reatividade
de anticorpos caninos anti-proteínas do SGE evidenciaram o predomínio de proteínas
com peso molecular de 35, 45 e 75 KDa, particularmente no grupo LBSapSal, sendo
relacionado a um padrão de resistência contra infecção por Leishmania. A avaliação da
resposta celular contou com o estudo imunofenotípico de células mononucleares do
sangue periférico (PBMC) e revelou aumento do número de linfócitos B CD21
+
,
linfócitos T CD5
+
e das subpopulações T (CD4
+
e T CD8
+
), indicando o
estabelecimento de imunidade protetora contra infecção por Leishmania como
previamente relatado na LVC. Além disto, foi observada pela análise in vitro redução
do índice de proliferação utilizando VSA (vaccine soluble antigen) ou SLcA (soluble
Leishmania chagasi antigen) nos grupos LB e Sal, enquanto os grupos LBSap e
LBSapSal apresentaram aumento da atividade linfoproliferativa na presença de ambos
os estímulos. De forma interessante, foi demonstrado no grupo Sal correlação negativa
entre a atividade linfoproliferativa e linfócitos T CD4
+
ou monócitos CD14
+
. Estes
resultados permitem especular que a imunização realizada no grupo Sal poderia inibir a
atividade de monócitos CD14
+
em ativar linfócitos T CD4
+
e assim reduzir a atividade
linfoproliferativa. Por outro lado, PBMC cultivados in vitro com SLcA do grupo LBSap
e com VSA ou SLcA no grupo LBSapSal apresentaram aumento da atividade
XI
linfoproliferativa acompanhada pela indução de linfócitos T CD8
+
antígeno-específicos.
Estes resultados sustentam a hipótese de que a vacinação com LBSap e LBSapSal
estimularia o desenvolvimento de mecanismos imunoprotetores relacionados ao
controle do parasitismo por Leishmania considerando a indução de linfócitos T CD8
+
antígeno-específicos para proteínas relacionadas ao agente etiológico da LVC. A
avaliação de potenciais células apresentadoras de antígenos (APC) revelou aumento do
número de monócitos CD14
+
circulantes nos grupos LBSap e LBSapSal. Além disto,
altas contagens de APC foram associadas ao aumento da expressão de linfócitos MHC-I
no grupo LBSap e de linfócitos CD80 e MHC-I no grupo LBSapSal, sugerindo que esta
associação poderia representar a interação entre as respostas imunes inata e adaptativa,
refletindo no aumento do perfil de ativação durante as imunizações. Os resultados
obtidos pelas análises dos níveis de óxido nítrico (NO) pela avaliação dos níveis de
nitrito no sobrenadante de cultura estimuladas com SLcA no grupo LBSap e no soro do
grupo LBSapSal confirmam a hipótese de que estas vacinas induzem um perfil
associado a resistência contra a infecção por Leishmania. Os resultados obtidos neste
trabalho indicam que o potencial imunoprotetor induzido pelas vacinas LBSap e
LBSapSal são compatíveis com o controle do agente etiológico da LVC.
XII
Abstract
Considering the importance of immunoprophylactic strategies for the control of visceral
leishmaniasis, and the lack of studies concerning the cellular and humoral events that
occur during vaccination in dogs, we have attempted to evaluate the immune response
of a promising new vaccines candidate against canine visceral leishmaniasis (CVL).
Thirty five mongrel dogs were treated within seven experimental groups as follow: (i)
control group C (n = 10) received 1 ml of sterile 0.9% saline; (ii) LB group (n = 5)
received 600 µg of Leishmania braziliensis promastigote protein in 1 ml sterile 0.9%
saline; (iii) Sap group (n = 5) received 1 mg of saponin in 1 ml sterile 0.9% saline; (iv)
LBSap group (n = 5) received 600 µg of L. braziliensis promastigote protein and 1 mg
of saponin in 1 ml sterile 0.9% saline; (v) Sal group (n = 5) received sand fly gland
extract (SGE) prepared from 5 acini of salivary glands of Lutzomyia longipalpis in 1
mL sterile 0.9% saline; (vi) LBSal group (n = 5) received 600 µg of L. braziliensis
promastigote protein plus SGE in 1 mL sterile 0.9% saline; and (vii) the LBSapSal
group (n = 5) received 600 µg of L. braziliensis promastigote protein plus 1 mg of
saponin together with SGE in 1 mL sterile 0.9% saline. Each animal received three
subcutaneous injections in the right flank at intervals of 4 weeks. The results obtained
indicate that some dogs exhibit local swelling or mild local induration reactions, but no
ulcerated lesions or other adverse reactions, after receiving saponin as an adjuvant (Sap,
LBSap or LBSapSal groups). The overall tolerance of the candidate vaccines in dogs
appeared to be adequate. The evaluation of immunogenicity revealed that animals
treated with LBSap and LBSapSal presented higher (P < 0.05) amounts of anti-
Leishmania total IgG that were associated with increased (P < 0.05) levels of IgG1 and
IgG2, suggesting a mixed Th1/Th2 immune response. Likewise, LBSapSal elicited the
production of elevated levels of anti-SGE total IgG, IgG1 and IgG2, that was previously
associated in establishing an anti-immune L. chagasi response in human. Additionally,
anti-SGE Western blot experiments showed predominance in the recognition of seric
proteins with molecular weights of 35, 45 and 71 kDa, particularly following LBSapSal
vaccination, and were related to the resistance pattern against Leishmania infection. The
immunophenotypic evaluation in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) reveal in
the LBSap and LBSapSal increased (P < 0.05) counts of circulating CD21
+
B-cells,
CD5
+
T-cells and CD4
+
and CD8
+
T-cell subset, suggesting protective immunity against
Leishmania infection as has been suggested previously for CVL. Whilst lower
stimulation index by either VSA (vaccine soluble antigen) or SLcA (soluble Leishmania
chagasi antigen) were recorded for the LB and Sal groups, higher cell reactivities in the
presence of both stumuli were related to LBSap and LBSapSal groups. Interestingly, a
negative association was demonstrated between cell reactivity and CD4
+
T-lymphocytes
or CD14
+
monocytes following in vitro stimulation in the Sal group. These data support
the hypothesis that Sal treatment inhibits CD14
+
monocytes in the promotion of CD4
+
T-lymphocyte activation and the induction of cell proliferation. In contrast, when in
vitro cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated with
SLcA in the LBSap treatment and VSA or SLcA in the LBSapSal group, increased
lymphoproliferation activity was accompanied by a higher frequency of antigen-specific
CD8
+
T-cells. These results support the hypothesis that induction of CD8
+
T-cells may
play a protective role in the mechanism of control of parasitism by Leishmania after
LBSap and LBSapSal treatment associated with the antigen-specific immune response
to antigens from the etiological agent of CVL. The evaluation of potential antigen
presenting cells (APC) revealed increased numbers of circulating CD14
+
monocytes in
the LBSap and LBSapSal groups. Furthermore, the largest APC counts were associated
XIII
with the highest expression of MHC-I in lymphocytes in the LBSap and CD80 and
MHC-I in lymphocytes in the LBSapSal, suggesting that this association could
represent interaction between the innate and adaptive immune responses, reflecting an
improvement in activation status during immunization. The results obtained from the
analysis of nitric oxide (NO) levels (determined as nitrite) in culture supernatants
stimulated by SLcA in the LBSap and in the serum of the LBSapSal confirmed the
hypothesis that these vaccines induce a potential resistance profile against Leishmania
infection. Our data suggested that the potential resistance profile elicited by LBSap and
LBSapSal were compatible with effective control of the etiological agent of CVL.
1. Introdução
Introdução
2
1.1 - Aspectos gerais relacionados à Leishmania e as leishmanioses
O gênero Leishmania foi descrito há mais de um século por Ross, 1903. Este
parasito é definido como um protozoário digenético da Ordem Kinetoplastida, Família
Trypanosomatidae, apresentando formas promastigotas e paramastigotas, que se
desenvolvem no tubo digestivo do inseto vetor, bem como formas amastigotas, que
permanecem e multiplicam no sistema monocítico fagocitário do hospedeiro vertebrado.
Sua multiplicação, seja ela no hospedeiro vertebrado ou invertebrado, ocorre por divisão
binária (Bastien et al., 1992).
Estimativas indicam que cerca de 350 a 400 milhões de pessoas distribuídas ao
redor do mundo estão em risco de contrair leishmaniose, e aproximadamente 12 a 14
milhões estão infectadas (WHO, 1995, Ashford, 1996, Desjeux, 2004). A leishmaniose
visceral (LV) possui característica endêmica em 88 países, destes 72 países em
desenvolvimento, chamando a atenção para a ocorrência desta enfermidade em regiões
mais pobres do mundo (Desjeux, 2004). Cerca de 90% dos casos de LV notificados no
mundo ocorrem em Bangladesh, Brasil, Índia e Sudão. O Brasil é responsável por 90%
dos registros de LV que ocorrem no continente americano (Arias et al., 1996, Desjeux,
2004).
A leishmaniose é um conjunto de síndromes complexas e multifacetadas,
causadas por espécies distintas do gênero Leishmania, sendo transmitida por
hospedeiros invertebrados, capazes de infectar desde o homem até animais silvestres e
domésticos, estando distribuída por diversas partes do mundo, exceto na Oceania e
Antártida (Desjeux, 2004). A Organização Mundial de Saúde (OMS) divide as
leishmanioses em 4 grupos clínicos: cutânea, mucocutânea, cutâneo-difusa e visceral. A
leishmaniose cutânea é uma doença de baixa gravidade, já a forma mucocutânea pode
causar lesões extremamente mutilantes no maciço facial, enquanto a forma cutâneo-
difusa, além de ser um grande desafio terapêutico, apresenta-se com o estigmatizante
aspecto hanseniforme. A forma visceral (LV) acompanha-se de elevada mortalidade
quando não tratada (WHO, 1990, Desjeux, 2004). A LV humana, considerada a mais
grave de todas as formas clínicas, caracteriza-se por febre irregular de longa duração,
perda de peso, esplenomegalia, hepatomegalia, linfadenopatia, anemia, leucopenia,
edema, epistaxe, hipergamaglobulinemia, hematêmese, emagrecimento e debilidade
progressiva. Geralmente evolui ao óbito, quando não tratada a tempo, em conseqüência
do estado clínico do paciente (Alencar & Neves, 1982).
Introdução
3
Os hospedeiros invertebrados relacionados à transmissão da leishmaniose
visceral, limitam-se às espécies de flebotomíneos hematófagos (Diptera: Psychodidae,
Phlebotominae), entre as quais a espécie Lutzomyia longipalpis no Novo Mundo e ao
gênero Phlebotomus, no Velho Mundo, compreendendo diversas espécies neste gênero
(Lainson & Shaw, 1987). Entre os hospedeiros vertebrados considerados como
reservatórios se destacam em importância mamíferos da família Canidae (Deane, 1956).
Atualmente admitem-se três espécies de Leishmania que causam LV e que
foram incluídas no subgênero Leishmania por Lainson & Shaw (1987). Essas espécies
encontram-se agrupadas no complexo denominado “Donovani”. Entre as espécies que
fazem parte deste complexo está a Leishmania (Leishmania) donovani (Laveran &
Mesnil, 1903) que pode provocar além da forma visceral clássica, a leishmaniose
dérmica pós-calazar em áreas restritas da Índia, Sudão, Paquistão, Nepal e regiões do
leste da China. Na Índia a LV assume um caráter antroponótico pois o homem é o único
hospedeiro mamífero encontrado infectado até o presente momento e a infecção ocorre
de homem para homem através da picada do vetor. O vetor da região indiana é o
Phlebotomus argentipes e na região chinesa o P. alexandri (Lainson & Shaw, 1987).
A Leishmania (L.) infantum (Nicolle, 1908) tem ampla distribuição geográfica
no Velho Mundo, distribuída pelos continentes asiático, africano e europeu. Como
hospedeiro doméstico, o cão, Canis familiaris, é o principal reservatório da infecção
para o homem em áreas rurais próximas aos centros urbanos. São citados vários animais
como hospedeiros silvestres, tais como: o chacal (Canis aureus), o lobo (Canis lupus) e
a raposa (Vulpes vulpes), encontrados em áreas rurais. Entre as espécies de
flebotomíneos incriminadas como vetores, se destacam: P. ariasi, P. perniciosus,
P. major, P. alexandri, P. chinensis, P. tobbi, P. longicuspis, P. kandelaki,
P. mongolensis e P. transcaucasicus (Martins et al., 1978).
A Leishmania (L.) chagasi (Cunha & Chagas, 1937) apresenta ampla
distribuição geográfica no Novo Mundo, ocorrendo na Argentina, Bolívia, Brasil,
Colômbia, El Salvador, Guatemala, Guadalupe, Honduras, Martinica, México, Paraguai
e Venezuela. Em função das características bioquímicas e moleculares serem muito
semelhantes entre L. infantum e L. chagasi Mauricio et al. (1999) e Mauricio et al.
(2000) propõem que estas espécies possam ser apenas uma, ou seja, que L. chagasi é na
verdade L. infantum, introduzida na América por colonizadores europeus que trouxeram
para cá cães infectados com L. infantum. Desta forma, em nosso continente este parasito
Introdução
4
teria encontrado condições ecogeográficas ideais para se adaptarem. No presente estudo,
será utilizado a denominação de L. chagasi para o agente etiológico da LV no Brasil.
Flebotomíneos da espécie Lu. longipalpis têm sido incriminado como único
vetor da L. chagasi no Novo Mundo, embora recentemente tenha sido demonstrada a
possibilidade de outras espécies de Lutzomyia tais como, a Lu. evansi e Lu. cruzi
estarem agindo como vetores (Travi et al., 1996, Galati et al., 1997).
É importante salientar que no Brasil um dos primeiros estudos epidemiológicos
data de 1938. Nessa época, Chagas, Ferreira, Deane & Guimarães realizaram um
exaustivo inquérito epidemiológico na região de Abaeté, localizado no estado do Pará, e
relataram incidência de 1,48% de infecção no homem, e 4,49% de infecção canina.
Posteriormente, Deane (1956) e Deane (1961), forneceram grande contribuição para o
entendimento de aspectos relacionados à epidemiologia da L. chagasi, em que ficou
documentada a participação do cão como reservatório doméstico, e da raposa (Dusicyon
vetulus), como reservatório silvestre do parasito.
Estes estudos subsidiaram o desenvolvimento de estratégias para o controle da
LV, as quais estão baseadas em um tripé de ações que preconiza o tratamento de
pessoas doentes, aspersões de inseticida com efeito residual em domicílio e
peridomicílio, além de sacrifício do reservatório urbano do calazar, o cão (Deane,
1956). Entretanto, em função da crescente mudança da relação homem-cão na
sociedade, em que esses animais se tornam verdadeiros “membros” da família, o
sacrifício de cães com sorologia anti-Leishmania positiva, muitas vezes sem qualquer
sinal clínico da infecção torna-se cada vez mais questionável e difícil (Desjeux, 2004).
Apesar das leishmanioses serem consideradas tipicamente rurais, e os princípios
fundamentais da epidemiologia da LV, bem como as medidas de controle sejam bem
conhecidos, tem se observado uma crescente urbanização do calazar em diferentes
regiões do mundo (Ashford, 2000, Desjeux, 2004). Dados epidemiológicos dos últimos
dez anos no Brasil revelam a periurbanização e a urbanização da LV, destacando-se os
surtos ocorridos no Rio de Janeiro-RJ, Belo Horizonte-MG, Montes Claros-MG,
Governador Valadares-MG, Araçatuba-SP, Santarém-PA, Corumbá-MS, Teresina-PI,
Natal-RN, São Luís-MA, Fortaleza-CE, Camaçari-BA e mais recentemente as
epidemias ocorridas nos municípios de Três Lagoas-MS, Campo Grande-MS e Palmas-
TO (Franca-Silva et al., 2003, Ministério da Saúde, 2003, Malaquias et al., 2007). Neste
contexto, a notificação de casos de leishmaniose visceral passou de seis municípios na
Introdução
5
região metropolitana de Belo Horizonte no período de 1994/1995 para 15 municípios no
período de 1998/1999 (Profeta da Luz et al., 2001).
Diante as dificuldades do controle da LV (Desjeux, 2004), entre as quais se
destacam a identificação e eliminação de reservatórios no ambiente urbano, têm sido
avaliadas diferentes estratégias buscando o tratamento de cães, no sentido de alcançar
cura parasitológica e assim tornar desnecessária a realização da eutanásia.
Lamentavelmente, até o momento não há qualquer esquema terapêutico capaz de
promover a cura parasitológica dos cães (Neogy et al., 1994, Moreno et al., 1999,
Rhalem et al., 1999, Baneth & Shaw, 2002, Nieto et al., 2003, Noli & Auxilia, 2005,
Saridomichelakis et al., 2005, Pasa et al., 2005, Vouldoukis et al., 2006). Neste
contexto, considerando que o tratamento para a leishmaniose visceral canina (LVC) não
impede a transmissão do parasito a flebotomíneos, além de haver possibilidade de se
selecionar cepas resistentes às drogas utilizadas para o tratamento humano, o emprego
da terapêutica anti-LVC tem sido contra indicada ou proibida quando se tratar da
utilização de antimoniais pentavalentes (Ministério da Saúde, 2003, Ministério da
Saúde, 2004). Entretanto, é comum em áreas endêmicas, como em Belo Horizonte-MG,
a prática terapêutica da LVC como rotina da clínica veterinária de pequenos animais.
Este tipo de conduta coloca em risco os programas de controle da LV, expondo a
população humana e canina ao risco de infecção.
Considerando que a quimioterapia em cães ainda não proporciona cura
parasitológica, o desenvolvimento de uma vacina anti-LVC seria a melhor alternativa
para combater a crescente expansão da LV podendo contribuir de forma efetiva nos
programas de controle da LV (Marzochi et al., 1985, Genaro, 1993, Hommel et al.,
1995, Genaro et al., 1996a, Gradoni, 2001, Handman, 2001, Mauel, 2002, Brodskyn et
al., 2003, Desjeux, 2004, Ravindran & Ali, 2004, Requena et al., 2004). Neste sentido,
no presente trabalho buscou-se avaliar duas vacinas, sendo a primeira constituída por
antígenos de Leishmania associado ao adjuvante saponina e, a segunda, apresentando a
mesma composição acrescida de extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis (SGE) no
intuito de ampliar a capacidade de promover imunogenicidade favorável a indução de
proteção em uma nova composição vacinal anti-LVC.
2. Revisão da Literatura
Revisão da Literatura
7
2.1 - Aspectos imunopatológicos da leishmaniose visceral canina
Um dos aspectos mais intrigantes no estudo da história natural da LVC são os
fatores relacionados ao desenvolvimento de sinais clínicos polares (Mancianti et al.,
1988). A doença no cão evolui de uma forma clínica assintomática, comumente
relacionada ao controle do parasitismo, passando por uma forma intermediária
oligossintomática, podendo evoluir até uma forma clínica debilitante, sintomática,
relacionada ao comprometimento do controle do parasitismo ocasionado pelo
exacerbado grau de imunossupressão (Pinelli et al., 1994b, Pinelli et al., 1995, Reis,
2001, Giunchetti et al., 2006, Reis et al., 2006a, Reis et al., 2006b, Reis et al., 2006c,
Giunchetti et al., 2008a, Giunchetti et al., 2008b). Entre os sinais clínicos mais
comumente observados na LVC destaca-se a presença de alterações dermatológicas
(opacificação, queda de pêlos, úlceras de pele, dermatites localizada ou generalizada),
perda de peso, onicogrifose, hepatoesplenomegalia, ceratoconjuntivite, ceratite com
opacificação de córnea e paresia dos membros posteriores, que geralmente completam o
quadro clínico evolutivo nesta forma clínica (Genaro, 1993, Giunchetti et al., 2006,
Reis, 2001).
A compreensão dos fatores relacionados à evolução clínica, bem como o
estabelecimento e manutenção de lesões cutâneas e viscerais na LVC, tem sido alvo de
recentes estudos visando o entendimento dos mecanismos imunológicos relacionados ao
controle do parasitismo e ao estabelecimento de formas clínicas polares. Estes estudos
possibilitaram o entendimento de importantes parâmetros imunopatológicos
relacionados a progressão ou resistência da infecção por L. chagasi no modelo canino,
fundamentais ao entendimento de estudos que se propõe avaliar novas estratégias
quimioterápicas ou vacinais anti-LVC.
Neste sentido, estudos avaliando a LVC natural e/ou experimental relatam a
ocorrência de ativação policlonal de linfócitos B com conseqüente elevação na
produção de imunoglobulinas (Abranches et al., 1991, Genaro, 1993, Martinez-Moreno
et al., 1993, Reis, 2001, Reis et al., 2006a,c, Giunchetti et al., 2008a). Embora ainda
não haja um consenso na literatura a respeito da associação entre um padrão de resposta
humoral anti-Leishmania associada a resistência ou susceptibilidade na LVC (Day,
2007), nosso grupo de pesquisa relata em cães assintomáticos, menores títulos de
anticorpos circulantes, com presença predominante de IgG1 associada a uma menor
freqüência de intensidade parasitária em diversos tecidos (Reis et al., 2006a,c). Por
Revisão da Literatura
8
outro lado, cães sintomáticos apresentaram elevada produção de imunoglobulinas de
diversas classes e subclasses (IgG2, IgA, IgM e IgE) (Reis et al., 2006a,c). A presença
marcante de IgG2 e IgE na forma clínica sintomática indicaria uma possível associação
dessa forma clínica com a resposta imune do tipo 2 (Reis et al., 2006c). De fato, isto
pode ser marcante na LVC, e os estudos realizados por (Lage et al., 2007) mostraram
que existe uma associação entre IL-10 com alta carga parasitária e evolução clínica na
LVC por L. chagasi.
Paralelamente as alterações sorológicas, o hemograma de cães sintomáticos
apresenta marcada anemia com queda no número absoluto de leucócitos em relação aos
cães assintomáticos (Reis et al., 2006a). Resultados semelhantes são observados em
cães agrupados de acordo com a carga parasitária da medula óssea, sendo observado
anemia, linfocitopenia e monocitopenia em cães com alta carga parasitária quando
comparados aos cães não infectados e com baixa carga parasitária (Reis et al., 2006b).
Estes resultados indicam que a progressão clínica da LVC, bem como o aumento do
parasitismo na medula óssea induz a um grave quadro hematológico de repercussão
sistêmica levando a imunossupressão celular.
Apesar da grande maioria dos trabalhos que tratam da avaliação dos aspectos
patológicos da leishmaniose visceral concentrar seus esforços na descrição das
alterações teciduais (Meleney, 1925, Tryphonas et al., 1977, Binhazim et al., 1993,
Genaro, 1993, El Hag et al., 1994, Tafuri, 1995, Tafuri et al., 1996, Tafuri et al., 2001)
recentemente, nosso grupo de pesquisa realizou estudos associando a presença e a
intensidade destas alterações com as manifestações clínicas e a carga parasitária
observada na LVC (Reis, 2001, Giunchetti, 2004, Giunchetti et al., 2006, Reis et al.,
2006a,b,c, Giunchetti et al., 2008a, Giunchetti et al., 2008b). Neste contexto, na
avaliação histológica do fígado de animais com LVC observa-se maior intensidade de
inflamação portal e congestão em cães sintomáticos, e maior intensidade de inflamação
da cápsula, hipertrofia e hiperplasia de células de Küpffer e granulomas intralobulares,
comparados a cães não infectados. De forma interessante, o parasitismo hepático
apresentou maior freqüência em cães sintomáticos comparados aos cães assintomáticos
(Giunchetti, 2004, Giunchetti et al., 2008a). Além disto, cães sintomáticos apresentam
menor concentração de albumina sérica e maior concentração de globulina plasmática,
quando comparados aos cães assintomáticos e não infectados (Giunchetti et al., 2008a,
Reis, 2001). Os resultados da avaliação esplênica na LVC indicam maior intensidade de
inflamação da cápsula em cães com manifestações clínicas (oligo e sintomáticos) em
Revisão da Literatura
9
relação aos cães assintomáticos e não infectados. De forma semelhante, a avaliação do
parasitismo esplênico mostrou que cães com comprometimento clínico (oligo e
sintomáticos) são mais frequentemente parasitados quando comparados aos
assintomáticos (Giunchetti, 2004). A avaliação de um outro compartimento linfóide na
LVC, o linfonodo poplíteo, revelou redução da celularidade na região cortical (nódulos
linfóides) de cães sintomáticos em relação aos cães assinto e oligossintomáticos. Além
disto, a região medular (cordões e seios linfáticos) mostra maior celularidade em cães
assinto e oligossintomáticos quando comparados aos cães não infectados (Giunchetti,
2004, Giunchetti et al., 2008a).
Desta forma, estudos abordando os aspectos histopatológicos em diferentes
compartimentos linfóides de cães naturalmente infectados por L. chagasi, portadores de
diferentes formas clínicas apontam para relação entre progressão da sintomatologia
acompanhada pelo aumento do parasitismo e da intensidade das alterações histológicas
(Giunchetti, 2004, Giunchetti et al., 2006, Giunchetti et al., 2008a, Giunchetti et al.,
2008b). A busca por biomarcadores de resistência e suscetibilidade em ambientes
sistêmicos e teciduais na LVC é um dos grandes pilares das linhas de pesquisa de nosso
grupo buscando o entendimento da história natural da LVC. Além disto, é importante o
conhecimento da doença no cão para empregar estes estudos no desenvolvimento de
testes de drogas e vacinas. Desta forma diversos trabalhos foram e vem sendo realizados
no intuito de ampliar as abordagens investigativas no âmbito dos aspectos
imunopatológicos da infecção experimental e natural por L. chagasi.
A avaliação das alterações histológicas e parasitológicas na pele vem sendo
estudada buscando ampliar a compreensão tanto da história natural da LVC quanto em
função da importância deste sítio no contexto epidemiológico como fonte primária de
infecção para os insetos vetores. Neste contexto, foi observado aumento da inflamação
crônica na pele de cães sintomáticos em relação aos não infectados e assintomáticos.
Além disto, o número de linfócitos T CD4
+
do sangue periférico foi correlacionado
positivamente com a intensidade da inflamação dérmica. A avaliação da carga
parasitária nos cães sintomáticos apresenta-se maior em relação aos assintomáticos
(Giunchetti et al., 2006). Assim, foi demonstrada uma relação direta entre as alterações
cutâneas e o grau de comprometimento clínico na LVC, e a importância de cães
assintomáticos, que mesmo apresentando carga parasitária cutânea reduzida,
representariam um risco eminente de infecção para flebotomíneos, possibilitando a
manutenção da transmissão do parasito no ambiente urbano (Giunchetti et al., 2006). De
Revisão da Literatura
10
forma interessante, outros autores, mostram uma associação entre queda de linfócitos T
CD4
+
no sangue periférico e aumento da infecção para Lu. longipalpis em cães
naturalmente infectados com L. chagasi (Guarga et al., 2000).
Outros estudos, focalizando na resposta imune celular e produção de citocinas
tem avaliado aspectos imunológicos nas diferentes formas clínicas da LVC, no intuito
de se investigar um padrão de resposta que pudesse estar relacionado com resistência ou
susceptibilidade a infecção por Leishmania, como já descrito no modelo murino
(Mosmann et al., 1986).
Estudos pioneiros desenvolvidos por Pinelli et al. (1994a), Pinelli et al. (1994b)
e Pinelli et al. (1995) trouxeram grandes avanços para um melhor entendimento da
resposta imune celular na LVC. Nestes trabalhos, ficou evidenciada a relação entre o
grau de comprometimento clínico e a alteração da resposta imune celular. Além disto,
estes trabalhos permitiram estabelecer associação entre um perfil de resposta
relacionado à resistência em cães assintomáticos, caracterizado pela produção de
citocinas como IL-2 e TNF-α. Posteriormente Bourdoiseau et al. (1997b) avaliaram o
fenótipo celular do sangue periférico em cães naturalmente infectados por L. infantum
verificaram que cães sintomáticos apresentavam queda no percentual de linfócitos T
CD4
+
e linfócitos B CD21
+
circulantes em relação aos animais assintomáticos.
Mais recentemente, alguns pesquisadores relatam que células mononucleares do
sangue periférico de cães assintomáticos, após estímulo específico in vitro por antígeno
de L. infantum, apresentam ativação de linfócitos T. Este fenômeno tem como resultado
a produção de IFN-γ induzindo a atividade citotóxica de linfócitos T CD8
+
e
promovendo a lise de macrófagos infectados (Ruitenberg et al., 2001). Já em cães
sintomáticos estes autores relataram um tipo de resposta imune envolvida na
susceptibilidade à doença, caracterizada principalmente pela queda na população de
linfócitos T CD4
+
e linfócitos B CD21
+
, e marcada redução na resposta
linfoproliferativa in vitro frente ao estímulo antigênico-específico, sem produção
significativa de IFN-γ e conseqüentemente, menor capacidade da lise de macrófagos
infectados por linfócitos T CD8
+
(Ruitenberg et al., 2001).
De forma semelhante, em um recente estudo publicado por nosso grupo de
pesquisa, avaliando o fenótipo de leucócitos do sangue periférico na LVC (Reis et al.,
2006b), evidenciou aumento de linfócitos T CD5
+
e das subpopulações de linfócitos T
(CD4
+
e CD8
+
) em cães assintomáticos em relação aos cães sintomáticos. Além disto,
Revisão da Literatura
11
foi observada queda na população de linfócitos B CD21
+
nos animais sintomáticos
quando comparados aos cães não infectados e assintomáticos. Quando os mesmos
animais foram reagrupados levando-se em conta a carga parasitária da medula óssea,
resultados semelhantes foram observados, com aumento de linfócitos T CD5
+
e da
subpopulação de linfócitos T CD8
+
nos grupos com baixo e médio parasitismo quando
comparados ao grupo com alto parasitismo. Além disto, o grupo com alto parasitismo
apresentou queda na população de linfócitos B CD21
+
e monócitos CD14
+
em relação
ao grupo com médio parasitismo. A avaliação de marcadores de ativação de leucócitos
evidenciou aumento da expressão de MHC-II em linfócitos de cães assintomáticos
comparados aos cães não infectados, oligossintomáticos e sintomáticos. Assim, foi
demonstrado que o aumento tanto das populações e subpopulações de linfócitos T bem
como da expressão de MHC-II em linfócitos do sangue periférico estão diretamente
relacionados com a modulação do sistema imune no sentido de controlar o parasitismo,
conduzindo a um melhor prognóstico clínico na LVC (Reis et al., 2006b).
Apesar da imunossupressão induzida pelo parasitismo na LVC ativa não permita
a determinação do perfil de citocinas específicas em células estimuladas por antígenos
solúveis de Leishmania (Santos-Gomes & Abranches, 1996), tudo indica que os
antígenos solúveis de L. chagasi/L. infantum possam suprimir a proliferação de
linfócitos em humanos e cães com a doença ativa (Carvalho et al., 1989, Pinelli et al.,
1994a, Reis, 2001). A queda ou ausência de uma resposta proliferativa in vitro parece
estar relacionada à inibição de IL-2 ou pela menor expressão do receptor de IL-2,
importante para estimular a divisão celular.
Recentemente Lage et al. (2007) estudou o perfil de citocinas expressas por
esplenócitos durante o processo de infecção natural por L. chagasi em diferentes formas
clínicas e em cães com diferentes graus de parasitismo esplênico. Foi observado em
cães com alta carga parasitária aumento da expressão de IL-10 comparados aos cães
com baixo e médio parasitismo. Além disto, a expressão de IL-10 foi correlacionada
positivamente com a progressão clínica da LVC. Interessantemente, o aumento do
parasitismo foi correlacionado com a expressão tanto de IL-10 como de IFN-γ. Desta
forma, foi observado que a LVC é marcada por uma produção balanceada de citocinas
do tipo 1 e 2, com expressão predominante de mRNA de IL-10 e IFN-γ que estão
relacionados à intensidade parasitária e a progressão clínica (Lage et al., 2007).
Considerando a complexidade da relação parasito-hospedeiro durante a infecção
por L. chagasi/L. infantum em cães e a limitação imposta pelo restrito número de
Revisão da Literatura
12
reagentes para se avaliar o sistema imune canino, o estudo dos aspectos
imunopatológicos ainda é um dos grandes desafios para os pesquisadores na busca do
entendimento da história natural da LVC. Além disso, o entendimento dos eventos
relacionados à resposta imune celular e humoral é de fundamental importância,
fornecendo subsídios para o entendimento de mecanismos envolvidos na
resistência/susceptibilidade à infecção. Assim, os estudos anteriores foram muito
importantes porque além da contribuição para a compreensão da história natural da
LVC, atualmente suas abordagens metodológicas são incorporados nos atuais trabalhos
que visam avaliar a imunogenicidade de novas vacinas ou a resposta imune frente a
quimioterápicos anti-LVC.
2.2 - Utilização de imunomoduladores em estratégias vacinais
A imunoprofilaxia é considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS)
como a melhor estratégia para o controle de doenças infecciosas, contribuindo para
somar aos instrumentos de prevenção, por meio de: eliminação do agente infeccioso e
seus produtos tóxicos e ativação do sistema imune (expansão de linfócitos T e B)
atuando especificamente após exposição pelo patógeno (O'Hagan & Valiante, 2003).
É importante salientar que a apresentação antigênica para linfócitos T virgens,
geralmente ocorre nos linfonodos. Neste contexto, a interação de moléculas de
superfície celular entre linfócitos T e células apresentadoras de antígenos (APC)
desencadeia uma cascata de eventos de sinalização intracelular estimulando a
proliferação e expansão clonal de linfócitos T e B de memória, com diferentes fenótipos
funcionais. Estes eventos apresentariam um importante papel no estabelecimento da
imunidade contra agentes infecciosos (Meeusen, 1998), podendo também desempenhar
papel de destaque no estabelecimento de uma resposta imune eficaz após imunização
contra estes agentes.
A indução de uma resposta imune protetora contra diferentes patógenos é obtida
graças à integração entre a resposta imune inata e a resposta antígeno-específica
(adaptativa). Desta forma, interação entre a resposta inata e a resposta adaptativa
desencadeia o estabelecimento de memória imunológica por linfócitos B e linfócitos T
que podem ser capazes de controlar a infecção. Assim, os adjuvantes têm um papel
fundamental cujo principal modo de ação é estimular a captação de antígenos por APC
responsáveis pela indução da resposta imune (O’Hagan & Valiante, 2003). Neste
Revisão da Literatura
13
sentido, os adjuvantes (do latim adjuvare significa ajudar, aumentar) têm a capacidade
de aumentar a imunogenicidade de diferentes antígenos comparado a aplicação do
antígeno isoladamente, reduzindo o número de imunizações e a quantidade do
imunógeno, refletindo no aumento da eficácia vacinal (Aguilar & Rodriguez, 2007,
Rajput et al., 2007). Adicionalmente, tem sido mostrado que a utilização de adjuvantes
determina a produção, duração, título e a subclasse de imunoglobulina produzida pela
resposta imune humoral, além de estimular a imunidade celular (Rajput et al., 2007).
Um dos primeiros imunomoduladores estudados foi o adjuvante contendo
alumínio (alúmen) (Glenny et al., 1926). Neste caso, o imunógeno é ligado por
interação eletrostática ao gel pré-formado ou durante a formação do gel in situ (Cox &
Coulter, 1997). Apresentado sob a composição de hidróxido de alumínio e fosfato de
alumínio, tem sido empregado amplamente em vacinas humanas (bilhões de pessoas
vacinadas), desencadeando aumento na produção de anticorpos, mas com baixa indução
na imunidade mediada por células (Kenney et al., 2002). Desta forma, este adjuvante
apresenta indução significativa de resposta do tipo 2 (Th2), com grande produção de
IgE e baixa indução de imunidade celular, particularmente de linfócitos T CD8
+
(Cox &
Coulter, 1997). Embora seja muito seguro e de formulação simples, seu uso tem sido
implicado com a re-emergência de miopatia inflamatória (miofacite macrofágica) (Cox
& Coulter, 1997, Ravindran & Ali, 2004).
O BCG (Bacillus Calmette-Guérin) apresenta propriedades
imunopotencializadoras, sendo utilizado particularmente na imunoterapia tumoral.
Inúmeros estudos vêm sendo conduzidos utilizando o BCG como adjuvante vacinal
contra leishmaniose (Mauel, 2002, Ravindran & Ali, 2004). Neste contexto, alguns
resultados demonstram habilidade na proteção utilizando antígenos brutos de
Leishmania spp. contra leishmaniose tegumentar americana – LTA (Mayrink et al.,
1979) e na LVC (Mayrink et al., 1996). Entretanto, outros ensaios vacinais falharam em
mostrar proteção em cães após o desafio experimental com L. chagasi (Fujiwara, 2003),
mas auxiliaram efetivamente em ensaios imunoquimioterápicos na LTA humana, com
redução da dose de antimônio e do tempo de tratamento (Genaro et al., 1996a, Toledo et
al., 2001). Além disto, o BCG tem sido o adjuvante de escolha nos ensaios clínicos
vacinais utilizando-se parasitos mortos (Mauel, 2002, Brodskyn et al., 2003, Ravindran
& Ali, 2004).
As saponinas, outra classe de adjuvantes, pertencem a um grupo de glicosídeos
triterpenos, obtidos da casca de árvores da espécie Quillaja saponaria, encontradas na
Revisão da Literatura
14
América do Sul (nativa dos Andes), apresentando propriedades farmacológicas, sendo
utilizado como fitoterápico e na indústria de cosméticos (Cox & Coulter, 1997, Sparg et
al., 2004). A saponina pode ser utilizada na forma de extrato cru ou parcialmente
purificada denominada de Quil A e a QS-21 que é a forma mais purificada da Quil A. A
maioria das espécies Quillaja são aciladas. Este radical acil parece ser responsável por
uma intensa indução de resposta imune do tipo 1 (Th1) (citotoxicidade mediada por LT
CD8
+
e produção de IgG2a) bem como indução de resposta Th2 (Liu et al., 2002),
sendo utilizada com freqüência como adjuvante veterinário (Cox & Coulter, 1997). Até
o momento, as saponinas vêm sendo utilizadas combinadamente com antígenos
solúveis, com emulsões ou ainda com sais minerais associados (Cox & Coulter, 1997).
Possivelmente, as saponinas são os adjuvantes ideais para serem utilizadas em ensaios
vacinais contra Leishmania spp (Ravindran & Ali, 2004). Apresentam baixo custo,
formulação simples e geralmente são consideradas seguras (Cox & Coulter, 1997).
Novos adjuvantes vêm sendo propostos em diferentes ensaios clínicos vacinais
(Kenney et al., 2002, Pink & Kieny, 2004). Entre eles destacam-se o MF59
(componente da vacina de influenza administrada em mais de 500.000 pessoas na
Europa), indutor de imunidade humoral e celular, com capacidade indutora da produção
de IFN-γ, IL-4 e IL-2 em modelo murino e da expansão de linfócitos T CD8
+
em
primatas. Além disto, uma nova classe de adjuvantes sintéticos (fosfato de aminoacil
glicosamina) denominados de MPL e Detox foram recentemente aprovados para uso
em uma vacina contra melanoma (Corixa’s Melacine) no Canadá. Lamentavelmente,
ensaios vacinais utilizando o MPL como adjuvante associado aos antígenos
recombinantes MAPS/TSA e LmSTI1 não foi capaz de induzir proteção em cães
vacinados e desafiados com L. chagasi (Fujiwara, 2003). Outro adjuvante promissor é o
AS02 (emulsão contendo MPL e a fração purificada QS-21 da saponina), embora os
testes realizados avaliando este adjuvante com antígeno RTS,S, contra malária, não
tenham demonstrado eficácia e com antígenos L2E2, contra papiloma vírus humano,
não tenha conferido imunidade duradoura, este adjuvante parece ser um candidato
promissor para ser associado a vacinas contra LVC (Ravindran & Ali, 2004).
Finalmente a partícula ISCOMS (complexo de saponina Quil A, colesterol e
fosfolipídios, formando estrutura de 40 nm de diâmetro) vem sendo utilizada em ensaios
com doenças provocadas por vírus, bactérias, parasitos e câncer, por via parenteral,
nasal ou oral (Rajput et al., 2007). Este adjuvante induz forte resposta mediada por
Revisão da Literatura
15
células e induz a atividade de linfócitos T CD8
+
por até 48 semanas. Desta forma, tem
sido proposta sua utilização para imunoterapia contra o câncer e em doenças infecciosas
de curso crônico. Este adjuvante também parece ser promissor podendo ser um forte
candidato futuro a ser empregado em vacinas contra leishmanioses.
2.3 - Novas estratégias imunoprofiláticas anti-Leishmania utilizando saliva de
flebotomíneos
A partir do estudo pioneiro realizado por Titus & Ribeiro (1988) as atenções na
busca de novas estratégias para o desenvolvimento de uma vacina anti-Leishmania
passaram a considerar a utilização de proteínas da saliva de flebotomíneos como
potencial componente do repertório antigênico vacinal.
Assim, quando foram utilizados camundongos resistentes (CBA) e susceptíveis
(BALB/c) a infecção por L. major, inoculados com extrato de glândula salivar (SGE) de
Lu. longipalpis associado a promastigotas metacíclicas de L. major, observou-se
exacerbação da lesão em relação aos animais controles. Além disto, a evolução de
lesões cutâneas nos animais que receberam menor número de promastigotas associado
ao SGE foi mais exacerbada, com lesões de 5 a 10 vezes maiores em relação aos
animais controles que receberam apenas o inóculo de promastigotas. Torna-se
importante ressaltar que a carga parasitária foi superior nos animais que receberam o
SGE associado à promastigotas de L. major, particularmente quando o inóculo do
parasito era menor. Desta forma, foi observado que componentes do SGE eram
característicos da saliva de Lu. longipalpis, apresentando papel importante na infecção e
na proteção contra o parasito uma vez que a saliva de outros artrópodes hematófagos
(Aedes aegypti, Rhodnius prolixus, Ixodes dammini) utilizada nas mesmas condições
experimentais não promoveram alterações de susceptibilidade no estabelecimento da
infecção por L. major (Titus & Ribeiro, 1988). Estes resultados levaram ao grupo de
pesquisadores coordenados pelo Dr. José Marcos Ribeiro do laboratório de entomologia
médica do National Institutes of Healthy - NIH (Washington DC, EUA) a concentrarem
esforços na pesquisa do papel da saliva na infecção e na proteção por Leishmania spp.
Neste contexto, foi realizado um outro experimento que avaliou o efeito do SGE
de Lu. longipalpis e P. papatasi sobre a infecção por L. major e L. amazonensis em
camundongos (Theodos et al., 1991). Este estudo possibilitou a observação de que SGE
de Lu. longipalpis favorecia a infecção de L. amazonensis e o SGE de P. papatasi
Revisão da Literatura
16
aumentava a infecção por L. major. Resultados semelhantes foram obtidos por
Samuelson et al. (1991), sendo observado exacerbação das lesões cutâneas e da carga
parasitária em camundongos BALB/c desafiados com L. braziliensis associado ao SGE
de Lu. longipalpis.
Ribeiro et al. (1986) e Lerner et al. (1991) isolaram e identificaram um peptídeo
vasodilatador, denominado de maxadilan, obtido de SGE de Lu. longipalpis, com
potência superior a 500 vezes em relação ao vasodilatador comercial mais potente até
aquele momento (peptídeo relacionado ao gene da calcitonina - CGRP). Estes estudos
pioneiros foram considerados um divisor de águas na área de infecção experimental por
Leishmania spp, estabelecendo o papel da saliva neste processo e abrindo um campo de
investigação mais sofisticada com o intuído de identificar novas moléculas constituintes
da saliva e suas funções no contexto da infecção.
Para se compreender melhor qual seria o papel da saliva sobre o sistema imune,
um novo experimento foi conduzido por Titus (1998). Assim, foi avaliada a capacidade
de proliferação em esplenócitos de camundongos BALB/c e C57BL/6 imunizados com
antígeno de eritrócitos de ovelha (sheep red blood cells - SRBC) e SGE de Lu.
longipalpis. Uma semana após a imunização foi realizada a cultura de esplenócitos
destes animais sendo observado redução significativa da proliferação antígeno-
específica das células estimuladas com antígeno de SRBC, no grupo imunizado com
SRBC associado ao SGE em relação ao grupo imunizado apenas com SRBC. Além
disto, resultados similares foram observados nas culturas de esplenócitos de
camundongos normais estimuladas com mitógeno inespecífico, concavalina A (Con-A),
na presença ou ausência do SGE. Neste contexto, ficou demonstrada redução
significativa da capacidade de proliferação que foi associada a atividade supressora
inespecífica. Assim, foi observado um efeito imunossupressor da saliva atuando na
inibição da proliferação de linfócitos T CD4
+
antígeno-específicos ou na presença de
um potente mitógeno inespecífico. Num contexto evolutivo, este efeito imunossupressor
poderia estar relacionado a uma estratégia desenvolvida por artrópodes, pela atividade
imunossupressora de proteínas que constituem a saliva, para prevenir a sensibilização de
seus hospedeiros contra proteínas vasomoduladoras importantes para o repasto
sanguíneo (Titus, 1998).
Além disto, o efeito imunomodulador da saliva foi investigado utilizando
sobrenadante de cultura de células de linfonodo de camundongos BALB/c inoculados
com L. braziliensis associado ou não a SGE de Lu. longipalpis. Neste estudo, foi
Revisão da Literatura
17
observado aumento de IL-4, mas não de IL-10, quando comparado ao sobrenadante de
cultura proveniente de células de camundongos inoculados apenas com L. braziliensis.
A presença de IL-4 foi relacionada à exacerbação da infecção na presença do SGE
(Lima & Titus, 1996).
Os estudos de Kamhawi et al. (2000) deram maior visibilidade da importância
da saliva de flebotomíneos como estratégia para o desenvolvimento de uma vacina anti-
Leishmania. Neste sentido, foi observado que camundongos previamente submetidos a
10-15 picadas por P. papatasi em cada orelha e posteriormente desafiados com 10
picadas em cada orelha de P. papatasi infectados com L. major apresentaram redução
do tamanho da lesão, bem como redução na ordem de 1.000 vezes da carga parasitária
no local do inóculo, quando comparados aos camundongos não expostos a picadas de
flebotomíneos.
É importante salientar que outros estudos vêm contribuindo para o entendimento
do papel da saliva sobre a modulação do sistema imune, no sentido de favorecer o
estabelecimento da infecção do parasito. Neste contexto, na presença de SGE de
Lu. longipalpis, macrófagos são incapazes de participar do processo de apresentação
antigênica, sendo refratários a ativação por IFN-γ e incapazes de produzir peróxido de
hidrogênio ou óxido nítrico (NO), fundamentais para o controle do parasitismo (Hall &
Titus, 1995). Um dos principais componentes identificados na saliva de Lu. longipalpis,
responsável pela modulação do sistema imune é o maxadilan. Desta forma, tem sido
relatado que o maxadilan inibe tanto a proliferação de linfócitos T como o
estabelecimento de reação hipersensibilidade retardada quando inoculado na presença
de antígeno de Leishmania (Qureshi et al., 1996), além de inibir a expressão de TNF-α
em macrófagos e aumentar a produção de IL-10 (Bozza et al., 1998, Soares et al.,
1998).
Estudos conduzidos em área endêmica para LV mostraram a presença de IgG
anti-SGE de Lu. longipalpis no soro de crianças, apresentando correlação com o
estabelecimento de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) anti-Leishmania (Barral et
al., 2000, Gomes et al., 2002). Estes achados suportam a hipótese de que a indução de
resposta humoral anti-SGE de Lu. longipalpis poderia facilitar a indução de uma
resposta protetora contra Leishmania (Andrade et al., 2007). Adicionalmente, a
avaliação do reconhecimento de proteínas de SGE de Lu. longipalpis por IgG total no
soro de crianças residentes em áreas endêmica para LV e indivíduos ou camundongos
expostos em laboratório ao repasto sanguíneo por Lu. longipalpis apresentaram um
Revisão da Literatura
18
padrão de proteínas com peso molecular de 45, 44, 43, 35, 27 e 16 kDa (Andrade et al.,
2007). Estas proteínas associadas às de Leishmania poderiam auxiliar no
desenvolvimento de uma vacina com maior capacidade de promover imunidade
protetora (Andrade et al., 2007).
Recentemente, nosso grupo de pesquisa mostrou em soros de cães naturalmente
infectados por L. chagasi, o reconhecimento sérico de dois antígenos constituintes de
SGE de Lu. longipalpis, a LuLo-D7 (28.6 kDa) e a Lulo Yellow (47,3kDa) (Bahia et al.,
2007). Estas proteínas foram isoladas, identificadas e caracterizadas por espectrometria
de massa e por bioinformática. Atualmente estamos trabalhando na expressão destas
proteínas para compor uma futura vacina recombinante.
Estes resultados apontam para a importância da saliva de flebotomíneo como
componente adicional do repertório antigênico utilizado para o desenvolvimento de
novas estratégias vacinais anti-Leishmania. Assim, o principal objetivo seria prévia
sensibilização com componentes da saliva de Lu. longipalpis para induzir a produção de
anticorpos capazes de neutralizar o papel da saliva nos eventos iniciais do
estabelecimento da infecção.
2.4 – Estudos utilizando antígenos brutos vacinais contra leishmaniose tegumentar
americana que estimularam o desenvolvimento de imunobiológicos anti-LVC
A idéia de se proteger de doenças pela exposição ao agente etiológico, mesmo
que empiricamente, tem sido relatada há alguns séculos, mesmo antes da descoberta por
Koch, Lister, Pasteur, entre outros, da relação entre doença e seu respectivo agente
infeccioso. Relatos de auto-inoculação de lesões crostosas provenientes de indivíduos
com varíola foram utilizados em indivíduos saudáveis para induzir resistência à
epidemia que se observava na China, Índia e Europa, entre os séculos XVII e XVIII
(Bazin, 2003). De forma similar, sociedades tribais Bedouin ou Kurdistani expunham
crianças a picadas de flebotomíneos no intuito de se evitar lesões faciais causadas
possivelmente por espécies de Leishmania dermatotrópicas (Handman, 2001).
Um marco para o desenvolvimento científico na elaboração de uma vacina
composta de promastigotas vivas de Leishmania, certamente foi o estabelecimento de
condições para o cultivo in vitro destes parasitos por Nicolle (1908). Estes estudos
possibilitaram a realização de inúmeros ensaios imunoprofiláticos, contra espécies de
Leishmania dermatotrópicas, a exemplo das vacinações em massa, realizadas nas
Revisão da Literatura
19
décadas de 60 e 70 na ex-União Soviética e Israel (Greenblatt, 1980, Kellina et al.,
1981) e mais recentemente no Irã, sendo denominado por leishmanização (Genaro et al.,
1996a, Mauel, 2002). O sucesso desta estratégia vacinal dependia da viabilidade e
infectividade dos parasitos inoculados, apresentando diversos efeitos indesejáveis como
desenvolvimento de lesões cutâneas de crescimento incontrolado, exacerbação de
doenças cutâneas como a psoríase e imunossupressão (Handman, 2001). A opção de se
utilizar esta abordagem como estratégia vacinal possivelmente esteve relacionada à
incredibilidade na utilização de vacinas mortas em função da falha vacinal observada no
estudo realizado por Berberian (1944). Os efeitos indesejáveis advindos da utilização de
vacinas com promastigotas virulentas vivas culminou com a interrupção desta estratégia
vacinal (Mauel, 2002).
De forma semelhante, estudos foram desenvolvidos no Brasil, buscando o
desenvolvimento de uma vacina composta por antígenos brutos de Leishmania. Os
primeiros ensaios focalizaram na utilização de extrato de promastigotas de Leishmania
dermatotrópicas mortas em fenol, em pacientes com LTA (leishmaniose tegumentar
americana) (Salles-Gomes, 1939). Este estudo permitiu a identificação da redução das
lesões cutâneas à medida que o tratamento avançava. Desta forma, Salles-Gomes propôs
a utilização do extrato de promastigotas de Leishmania mortas como forma de
prevenção da LTA.
No ano seguinte, Pessoa desenvolveu uma vacina, constituídas por 18 cepas
dermatotrópicas de Leishmania, provenientes de seis localidades do estado de São
Paulo. Este estudo marcou a literatura científica como o primeiro ensaio clínico vacinal
realizado em humanos utilizando uma vacina anti-LTA (Pessoa & Pestana, 1940,
Pessoa, 1941a, Pessoa, 1941b). Após 20 meses de acompanhamento, foi observado que
18% do grupo controle e 3,2% do grupo vacinado adquiriram infecção, representando
uma redução de 80% da doença no grupo vacinado.
Posteriormente, Mayrink & colaboradores retomaram estes estudos modificando
a composição do extrato vacinal. Desta forma, foram conduzidos quatro ensaios clínicos
vacinais (Mayrink et al., 1979, Mayrink et al., 1985, Antunes et al., 1986, Mayrink et
al., 1986) para avaliação do imunobiológico anti-LTA, no intuito de elucidar diferentes
aspectos relacionados a este imunógeno. Neste sentido, foi observado que a vacina não
induzia efeitos colaterais significativos; era capaz de induzir resposta celular, como
mostrado pelas avaliações realizadas através do TM (teste de Montenegro); a proteção
de indivíduos que convertiam o TM para positivo era significativamente maior quando
Revisão da Literatura
20
comparados ao grupo controle e a vacina apresentava excelente estabilidade quando
conservada refrigerada a 4
o
C, conforme observado pelos indivíduos vacinados com
conversão do TM e pela taxa de proteção apresentada.
Buscando atender as novas exigências da OMS, ficou estabelecido que a vacina
fosse composta por uma única cepa (L. amazonensis) e que a Biobrás S.A. seria
responsável pela produção do antígeno vacinal para novos ensaios clínicos. Um estudo
para se avaliar comparativamente a imunogenicidade entre as diferentes cepas de
Leishmania da vacina original descrita por Mayrink et al. (1979), agora denominada
como Leishvacin, foi realizado utilizando diferentes vacinas monovalentes (L.
amazonensis, cepa PH8; L. guyanensis, cepa M1176). Todos os indivíduos vacinados
apresentaram conversão do TM para positivo, aumento da atividade linfoproliferativa in
vitro, aumento da produção de IFN-γ por células mononucleares do sangue periférico
estimuladas in vitro com diferentes preparações de antígeno de Leishmania, sem haver
diferença entre os diferentes imunobiológicos avaliados (Genaro et al., 1996a). Estes
dados indicaram que as diferentes preparações vacinais poderiam induzir proteção
contra infecção por Leishmania (Genaro et al., 1996a). Desta forma o grupo do Prof.
Mayrink passou a trabalhar com a vacina utilizando uma única cepa de L. amazonensis
em função do fácil cultivo desta espécie e considerando os resultados anteriores de
imunogenicidade.
Avaliações da imunogenicidade de indivíduos submetidos a imunização com a
Leishvacin (L. amazonensis) revelou aumento da produção de IFN-γ pós-vacinal,
correlação positiva entre a produção de IFN-γ e proliferação celular (Mendonça et al.,
1995) e predominância de linfócitos T (LT) CD8
+
Leishmania-antígeno específicos
(Mendonça et al., 1995, De Luca et al., 1999).
Mais recentemente, a Biobrás S. A. produziu uma nova partida da Leishvacin,
para um ensaio clínico vacinal de Fase I em militares, TM negativo (Marzochi et al.,
1998), cuja composição apresentava apenas a cepa PH8 de L. amazonensis. A principal
conclusão deste trabalho foi que a Leishvacin poderia ser aplicada na população
humana, sem causar efeitos colaterais significativos.
2.5 - Estudos preliminares realizados na UFOP que subsidiaram a elaboração de uma
vacina contra leishmaniose visceral canina
Revisão da Literatura
21
Com a inserção do Prof. Odair Genaro (in memoriam) no grupo coordenado pelo
Prof. Mayrink no final da década de 80 houve um grande interesse no desenvolvimento
de vacinas contra leishmaniose visceral canina (LVC). Durante o processo de
desenvolvimento de estratégias imunoprofiláticas contra leishmaniose, foi avaliada uma
vacina contra LTA composta de promastigotas de L. braziliensis
(MHOM/BR/75/M2903) e L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), visando à proteção de
cães (Mayrink et al., 1990). Os cães foram divididos em três grupos experimentais,
inoculados com promastigotas de L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) e L.
amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) associados ao BCG (Bacillus Calmette-Guérin),
apenas BCG ou solução salina, todos administrados por via intradérmica (ID), em dose
única. Após 30 dias da imunização, os resultados apresentados pelo TM não revelaram
reação celular induzida pela vacinação, como observado em humanos (Melo et al.,
1977). Os animais foram então desafiados com 10
5
promastigotas de L. braziliensis
(MCAN/BR/82/BH348), por via ID, sendo demonstrado proteção parcial nos cães
vacinados com este imunoprofilático (Mayrink et al., 1990).
Simultaneamente a estes estudos, a avaliação da infecção experimental de cepas
dermatotrópicas em cães foi realizada no canil da UFOP por Genaro et al. (1993),
utilizando inóculos de L. amazonensis (MROD/BR/92/AK008 e IFLA/BR/67/PH8), L.
naiffi (MHOM/BR/86/IM2736) e L. guyanensis (MHOM/BR/70/M1176). Após cinco
meses dos inóculos das cepas dermatotrópicas, todos os cães foram desafiados com L.
braziliensis (MCAN/BR/72/C348) sendo observado a presença de nódulos e úlceras em
todos os grupos. A principal conclusão deste estudo foi que a resposta imune celular
contras as cepas dermatotrópicas utilizadas causaram infecção abortiva em cães, sem
induzir proteção cruzada.
Uma vez que os estudos que avaliaram diferentes antígenos vacinais contra
leishmaniose tegumentar canina não apresentaram avanços significativos (Mayrink et
al., 1990, Genaro et al., 1993), o grupo de pesquisa passou a focalizar esforços para o
desenvolvimento de uma vacina que protegesse cães contra LVC. Para que se pudesse
avaliar uma vacina contra LVC, em experimentos controlados de Fase I e Fase II, foi
fundamental o entendimento do curso da doença em caráter experimental. Esta
abordagem daria importantes informações para o estabelecimento da LVC experimental,
particularmente no que diz respeito à padronização do inóculo para o desafio de cães
com L. chagasi que seriam utilizados em futuros ensaios clínicos vacinais.
Revisão da Literatura
22
Neste sentido, a infecção experimental em cães por L. chagasi, foi realizada no
canil de experimentação da UFOP, por Genaro, no início da década de 90, sob
orientação do Prof. Mayrink (Genaro et al., 1992, Genaro, 1993). O protocolo
experimental incluiu diferentes concentrações dos inóculos (10
4
, 10
5
, 10
6
, 10
7
) de
promastigotas em fase estacionária de L. chagasi (cepa MHOM/BR/70/BH46), por
meio de diferentes vias (endovenoso – EV e intradérmico – ID). Este estudo foi um
marco na infecção experimental em cães com L. chagasi subsidiando os futuros ensaios
vacinais (Genaro, 1993).
É importante ressaltar que tanto os ensaios de estabelecimento do modelo canino
para estudo da leishmaniose visceral como da leishmaniose tegumentar faziam parte da
estratégia de desenvolvimento de vacinas que pudessem atuar controlando ambas as
doenças neste modelo, e possivelmente, por conseqüência, reduzindo a incidência no
homem. Neste contexto, a experiência acumulada de forma pioneira no país no final dos
anos 80 e início dos anos 90, utilizando ensaios conduzidos no canil de experimentação
da UFOP, permitiu a identificação de antígenos de Leishmania indutores ou inibidores
da atividade linfoproliferativa in vitro de células caninas (Genaro, dados não
publicados). Foi observado por Genaro que células de cães com LV quando estimuladas
in vitro com antígenos de L. chagasi apresentavam atividade linfoproliferativa inibida,
enquanto ao se utilizar antígenos de Leishmania proveniente de cepas dermatotrópicas,
a atividade linfoproliferativa aumentava significativamente.
Paralelamente a estes estudos de Genaro, entre no final da década de 80 foi
testada na Europa uma vacina que protegeu camundongos contra um desafio com L.
mexicana e L. major (Monjour et al., 1985, Frommel et al., 1988). Ogunkolade et al.
(1988) ao testar esta vacina experimentalmente em cães, verificou a ocorrência de
anticorpos neutralizantes do parasito embora não tenha logrado êxito na proteção dos
animais.
2.6 – Avaliações de diferentes vacinas de antígeno bruto contra leishmaniose visceral
canina realizadas no Brasil
Com base nas observações de Genaro (1993), foi realizado um ensaio clínico
vacinal de fase I e fase II, em cães sem raça definida, sendo proposta uma vacina
constituída por uma cepa dermatotrópica visando à proteção dos animais contra o
desenvolvimento da LVC (Mayrink et al., 1996). Neste sentido, a composição vacinal
Revisão da Literatura
23
compreendia antígenos brutos de promastigotas de L. braziliensis (MCAN/BR/72/C348)
associada ao BCG (Bacillus Calmette-Guérin) como adjuvante, aplicada por via ID, em
três doses, com intervalo de 21. Os resultados mostraram que esta vacina se apresentava
segura pelas avaliações de inocuidade e toxicidade e quando combinada com BCG,
apresenta indução na resposta imune celular, conferindo proteção de 90% nos cães
desafiados com L. chagasi (Mayrink et al., 1996).
Considerando os promissores resultados obtidos pelos estudos de fase I e fase II,
um novo ensaio clínico vacinal duplo-cego randomizado (fase III) foi realizado em cães
do município de Montes Claros-MG, onde a LV é endêmica (Genaro et al., 1996b).
Nesse estudo de campo foi observado, através de ensaios in vitro de linfoproliferação,
que alguns animais foram capazes de elaborar uma resposta celular em conseqüência da
vacinação. Foi também verificado que cães que desenvolveram a doença apresentavam
uma inabilidade de montar uma resposta linfoproliferativa in vitro induzida por
antígenos de Leishmania. Os resultados do teste de eficácia de vacinação não
demonstraram o estabelecimento de mecanismos protetores contra a infecção por
L. chagasi na população vacinada em relação ao grupo controle.
Diante os resultados promissores utilizando-se uma vacina de antígeno bruto
composta por promastigotas de Leishmania dermatotrópicas e com o estabelecimento de
novas metodologias por nosso grupo, que possibilitaram uma avaliação mais acurada do
sistema imune canino e conseqüentemente da história natural da LVC (Giunchetti,
2004, Giunchetti et al., 2006, Reis, 2001, Reis et al., 2005, Reis et al., 2006a, Reis et
al., 2006b, Reis et al., 2006c), foi proposta a realização de novos estudos vacinais que
pudessem incorporar estratégias de análise da resposta imune de forma mais detalhada.
Neste contexto, a crescente experiência do grupo liderado pelo Prof. Genaro no
estudo da LVC e de ensaios vacinais, ganhava projeção internacional, culminando com
o estabelecimento de uma colaboração com a Heska Corporation, Corixa Corporation e
pelo Infectious Disease Research Center (IDRI) – Seattle – USA, com objetivo de se
testar uma nova vacina composta por antígenos recombinantes contra LVC. É
importante ressaltar que a partir de então, a avaliação dos próximos ensaios vacinais
seriam realizados através de uma das abordagens mais modernas para avaliação da
resposta imune celular e humoral, realizado por imunofenotipagem de leucócitos
caninos, que tinha sido padronizada no final da década de 90 e publicada mais tarde por
Fujiwara et al. (2005) e Reis et al. (2005).
Revisão da Literatura
24
Assim, o ensaio vacinal foi realizado em 40 cães da raça Beagle, conduzido no
canil do laboratório de Leishmanioses do Instituto de Ciências Biológicas/UFMG sob
supervisão do Prof. Genaro. Este estudo avaliou uma vacina desenvolvida pelo Prof.
Mayrink e Prof. Genaro, sendo constituída por extrato bruto de cepas de L. amazonensis
(IFLA/BR/1967/PH8) e L. braziliensis (MCAN/BR/1972/C348) associado ao BCG
como adjuvante. Além disto, proteínas recombinantes de L. major, como a MAPS/TSA,
a LmSTI1 e a LeIF, cedidas pela Heska Co., Corixa Co. e Infectious Disease Research
Center (IDRI) – Seattle – EUA, foram avaliadas em associação com os adjuvantes
AdjuPrime® Immune Modulator (Pierce Chemical Co., EUA) ou MPL-SE
(Monophosphoril Lipid A – Squalene, Corixa Co., Seattle, EUA). Trinta dias após a
terceira dose da vacina os animais foram desafiados com 10
6
promastigotas de L.
chagasi (MHOM/BR/1972/BH46), por via endovenosa. Tanto a vacina de antígeno
bruto quanto somente o adjuvante BCG, da mesma forma que para as vacinas
constituídas por antígenos recombinantes, não conferiram proteção aos animais
imunizados, mas aumentaram o período pré-patente de 9 para 11 meses (Fujiwara,
2003).
Apesar do estudo realizado por Fujiwara (2003) apresentar resultados
contraditórios aos observados anteriormente, é importante ressaltar que quando se
observou 90% de proteção contra desafio por L. chagasi (Mayrink et al., 1996), a
vacina utilizada era monovalente, constituída por antígenos brutos de L. braziliensis.
Esta nova vacina bivalente era constituída pela combinação das cepas de L.
amazonensis e L. braziliensis (Fujiwara, 2003). A modificação na composição
antigênica da vacina inicialmente desenvolvida contra LVC poderia ter contribuído para
o insucesso observado pela taxa de infecção por L. chagasi pós-desafio.
No sentido de se avaliar o impacto da mudança do antígeno vacinal estudado por
Fujiwara (2003), um outro experimento foi realizado em cães da raça Pastor Alemão, no
canil da Polícia Militar de Belo Horizonte-MG (Araújo, 2006). Neste contexto, uma
outra vacina constituída por L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) associado ao BCG
como adjuvante foi avaliada. Em paralelo, outro grupo composto pela vacina
Leishmune (Fort Dodge) foi avaliado. Embora os cães não tenham sido desafiados
experimentalmente, este trabalho possibilitou a compreensão de importantes eventos
envolvidos na resposta imune pós-vacinal. Neste contexto, foi observado que o grupo
vacinado com a Leishmune apresentou uma resposta imune com envolvimento tardio
preferencialmente de linfócitos T (CD4
+
e CD8
+
), com aumento específico da produção
Revisão da Literatura
25
de citocina intracitoplasmática IFN-γ em células mononucleares do sangue periférico
submetidas à cultura com antígeno de L. chagasi. Já a vacina constituída por antígeno
bruto de L. amazonensis induziu alterações imunofenotípicas, com envolvimento
precoce de linfócitos T CD4
+
e tardio de linfócitos T CD8
+
. Além disto, esta vacina
apresentou um perfil misto na produção de citocinas intracitoplasmáticas de células
mononucleares do sangue periférico submetidas à cultura com antígeno de L. chagasi,
com aumento da síntese de IFN-γ e IL-4. Desta forma, foi observado em ambos
imunógenos o envolvimento de linfócitos T CD8
+
, que recentemente vem sendo
associado a mecanismos imunoprotetores na LVC (Reis et al., 2006b).
Estes resultados estimulam a utilização de antígenos brutos como potenciais
candidatos a vacina contra LVC, considerando que são capazes de promover resposta
imune celular e reduzir a taxa de infecção (Mayrink et al., 1996) ou mesmo estimular a
modulação do sistema imune, desencadeando uma resposta celular com envolvimento
de linfócitos T CD8
+
(Araújo, 2006), importantes para resistência à infecção por L.
chagasi (Reis et al., 2006b).
Um ponto chave para a modulação do sistema imune durante o desenvolvimento
de novas vacinas está relacionado a escolha e administração de antígenos e adjuvantes
capazes de induzir resposta celular efetiva contra leishmaniose visceral. Neste sentido,
propomos neste estudo um novo imunobiológico composto por antígenos brutos de L.
braziliensis associado a um potente adjuvante indutor da resposta imune celular
(saponina) e outro potencial imunoprofilático apresentando a mesma composição
vacinal associado ao extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis, reconhecidamente
capaz de atuar nos eventos iniciais do estabelecimento da infecção por L. chagasi.
No presente trabalho, pela primeira vez foi testada a capacidade destes
constituintes vacinais, com destaque para saponina e para saliva de Lu. longipalpis
isoladamente ou combinada a antígenos de Leishmania braziliensis. Além disso, o
presente trabalho poderá subsidiar novos estudos possibilitando a seleção de antígenos
com maior capacidade indutora de imunogenicidade e, desta forma, viabilizar uma nova
vacina capaz de proteger cães contra infecção por L. chagasi.
3. Justificativa
Justificativa
27
Nos últimos anos, tem se observado uma crescente emergência e re-emergência
da leishmaniose visceral em diferentes regiões do país (Belo Horizonte-MG, Montes
Claros-MG, Governador Valadares-MG, Araçatuba-SP, Santarém-PA, Corumbá-MS,
Teresina-PI, Natal-RN, São Luís-MA, Fortaleza-CE, Camaçari-BA, Três Lagoas-MS,
Campo Grande-MS e Palmas-TO) apresentando evidente urbanização. Considerando a
importância do cão como reservatório do parasito e, portanto mantenedor da
transmissão da LV, torna-se fundamental o desenvolvimento de novas estratégias de
controle que impeçam o avanço da doença para regiões ainda indenes, bem como
interrompam o crescimento exacerbado do número de cães positivos e de casos
humanos.
A atual medida de controle está baseada no tripé de ações que preconiza o
combate ao vetor, o tratamento de casos humanos e a eutanásia de cães infectados.
Entretanto, a eliminação de cães soropositivos causa profundo desconforto não apenas a
comunidade científica, mas principalmente aos proprietários destes animais. Tais fatos
estimulam as práticas de tratamento da LVC, que diante a impossibilidade de cura
parasitológica com os esquemas terapêuticos desenvolvidos até o momento, agravam a
situação epidemiológica destes centros urbanos, pondo em risco os programas de
controle da LV.
Considerando a forte imunogenicidade relacionada a vacinas anti-Leishmania
compostas por antígenos brutos, bem como a facilidade de produção e baixo custo em
relação aos antígenos recombinantes, uma nova vacina anti-LVC foi desenvolvida por
pesquisadores do Laboratório de Imunopatologia/NUPEB/UFOP em colaboração com o
Laboratório de Imunologia Celular e Molecular/IRR/FIOCRUZ. Este imunobiológico
foi recentemente patenteado, apresentando em sua composição antígenos de L.
braziliensis associados ao adjuvante saponina. Além disto, também foi avaliado um
outro imunobiológico apresentando esta composição vacinal associado ao extrato de
glândula salivar de Lu. longipalpis. Desta forma, este trabalho buscou contribuir para o
desenvolvimento de uma vacina com potencial imunoprotetor contra a LVC.
4. Objetivos
Objetivos
29
4.1- Objetivo Geral
Avaliar a inocuidade e imunogenicidade de duas novas vacinas e de seus
constituintes isoladamente ou combinados em um ensaio clínico vacinal contra
leishmaniose visceral canina.
4.2- Objetivos Específicos
Avaliar separadamente dois imunobiológicos, sendo o primeiro constituído por
antígenos de L. braziliensis associado ao adjuvante saponina e, o segundo, apresentando
a mesma composição acrescida de extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis (SGE),
considerando seus constituintes associados ou não, antes (T0) e após 15 dias de cada
dose da imunização (T1, T2, T3) ou antes (T0) e após a terceira imunização (T3),
considerando os seguintes parâmetros:
4.2.1 - Inocuidade e toxicidade (temperatura retal (
o
C) e alterações clínicas);
4.2.2 - Reatividade sérica anti-Leishmania (IgG total, IgG1 e IgG2);
4.2.3 - Reatividade sérica anti-SGE (IgG total, IgG1, IgG2 e identificação de
proteínas anti-saliva no soro de cães controle e imunizados com SGE);
4.2.4 - Leucograma (global de leucócitos, neutrófilos totais, eosinófilos, linfócitos
e monócitos);
4.2.5 – Número de linfócitos T (CD5
+
, CD4
+
e CD8
+
) e linfócitos B (CD21
+
)
circulantes;
4.2.6 - Atividade linfoproliferativa e freqüência imunofenotípica de linfócitos
(CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
, CD21
+
) submetidos a estimulação antigênica com antígeno
solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA);
4.2.7 - Correlações entre a atividade linfoproliferativa e o perfil da freqüência
imunofenotípica de linfócitos (CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
) submetidos a estimulação
antigênica com VSA e SLcA;
Objetivos
30
4.2.8 - Número de monócitos CD14
+
circulantes, perfil de ativação linfocitária
(CD80 e MHC-I) e do papel de monócitos CD14
+
e linfócitos B CD21
+
como
potenciais células apresentadoras de antígenos;
4.2.9 - Níveis de óxido nítrico no soro e em sobrenadante de cultura de células
mononucleares do sangue periférico estimuladas com VSA e SLcA.
5. Materiais e Métodos
Materiais e Métodos
32
5.1 - Estabelecimento da colônia de cães no canil de experimentação em
leishmanioses/UFOP
A colônia de cães para experimentação em leishmanioses foi estabelecida na
UFOP para subsidiar a linha de pesquisa do laboratório de Imunopatologia/NUPEB em
imunoprofilaxia e tratamento da leishmaniose visceral canina. Foram utilizadas 8
cadelas prenhez (matrizes) sem raça definida, obtidas como doação do Centro de
Controle de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte/MG (CCZ-BH). A
triagem inicial para identificação das matrizes envolveu minucioso exame clínico
realizado no CCZ-BH por médico veterinário, no intuito de se selecionar animais
aparentemente saudáveis e com gestação em curso. Todas as matrizes selecionadas
foram provenientes da captura de cães errantes pela carrocinha do CCZ-BH, como
medida de controle da população canina. Após triagem clínica, as matrizes selecionadas
foram vacinadas contra raiva no CCZ-BH e então, transportadas até o canil de
experimentação em leishmanioses da UFOP.
5.1.1 – Manejo sanitário das matrizes e filhotes
Assim que as matrizes chegaram ao canil de experimentação, foram novamente
avaliadas por minucioso exame clínico (avaliação das mucosas, linfonodos, pele, olhos,
cavidade oral, orelhas, genitália, palpação abdominal, avaliação da temperatura retal)
para estimativa da idade e do tempo de gestação, bem como do estado clínico geral.
Subseqüentemente, foi realizada a identificação de cada matriz, por meio de resenha
descritiva das características fenotípicas e numeração e identificação por tatuagem. Em
seguida, foi realizada coleta de 5mL sangue periférico por venopunção da jugular ou
radial para exame sorológico anti-Leishmania pela reação de imunofluorescência
indireta (RIFI) (Kit Biomanguinhos/FIOCRUZ/RJ), fornecido medicação anti-
helmíntica (Chemital plus
, Chemitec Agro-Veterinária LTDA., Brasil) e anti-
ectoparasitária (Frontline
, Merial, Inc, EUA). Todas as matrizes apresentaram
resultados sorológicos anti-Leishmania negativos.
O parto de todas as matrizes foi realizado sem intervenção cirúrgica, com média
de nascimento de sete filhotes por matriz e viabilidade neonatal de 80%. Quando
possível, o parto foi acompanhado para garantir que o neonato se alimentasse
rapidamente com o colostro e permanecesse aquecido junto a matriz. As matrizes
Materiais e Métodos
33
receberam ração de filhote (Faro
, Guabi, São Paulo, Brasil) suplementado com ração
em lata (Faro
, Guabi, São Paulo, Brasil), para estimular a ingestão de alimento durante
a gestação, bem como no período de amamentação.
Torna-se importante salientar que em cada baia foi instalada uma lâmpada de
aquecimento infravermelha de 250 Watts para garantir conforto térmico aos animais
durante o período noturno e em dias frios. Além disto, foi realizada vistoria no canil
duas vezes ao dia para identificar matrizes em trabalho de parto e acompanhar os
neonatos. Este acompanhamento foi fundamental para minimizar mortes por falta de
habilidade materna e estimular ingestão de alimento, através do fornecimento de ração
em lata misturada à ração comercial para garantir a produção de leite a toda ninhada.
A medicação vermífuga foi fornecida aos filhotes a partir de 21 dias de idade,
juntamente com as matrizes, três vezes inicialmente, com intervalo de 21 dias, seguido
de outras três doses, com intervalo de três meses, quando os filhotes chegaram à idade
de um ano.
A vacinação contra cinomose, adenovírus tipo 2, coronavírus, parainfluenza,
parvovírus e leptospirose canina (Vanguard
®
HTLP 5/CV-L, Pfizer) foi iniciada quando
os animais atingiram idade de 45 dias, totalizando três aplicações, conforme
recomendação do fabricante. A vacinação anti-rábica (Vacina anti-rábica fuenzalida
modificada, Tecpar) foi fornecida em dose única quando os filhotes completaram
quatro meses de idade.
Os experimentos deste estudo, utilizando diferentes estratégias imunoprofiláticas
contra LVC, foram iniciados quando os cães atingiram idade média de sete meses. A
diferença máxima de idade entre os cães foi de aproximadamente 45 dias. Além disto, é
importante ressaltar que os animais em experimentação foram mantidos em canil
totalmente telado, para impedir a entrada de flebotomíneos, apesar da região ser
considerada área indene para leishmaniose visceral. Todas as instalações do canil foram
submetidas a borrifação com inseticida piretróide, a cada três meses, como medida
auxiliar de combate a insetos.
5.2 – Produção do antígeno vacinal
O imunobiológico desenvolvido para este trabalho foi elaborado a partir de
cultura da cepa padrão de Leishmania (Viannia) braziliensis (MHOM/BR/75/M2903)
Materiais e Métodos
34
cultivada em meio de cultura ágar-sangue, Nicolle-Novy-Neal (NNN), associado ao
Liver Infusion Tryptose (LIT) em Erlenmeyers de 250 mL. As culturas foram
armazenadas em estufa biológica refrigerada BOD (FANEM
modelo 347), à
temperatura de 23°C ± 1°C, sendo homogeneizadas diariamente.
Para obtenção do antígeno vacinal, a cultura foi expandida a partir de um
inóculo inicial de 10 mL de meio LIT contendo entre 10
7
a 10
8
promastigotas/mL de L.
braziliensis em crescimento logarítmico, adicionadas a 40 mL de meio de cultura
NNN/LIT, distribuído sob condições estéreis em capela de fluxo laminar (Veco,
Campinas, São Paulo, Brasil), sendo acondicionado em seguida a temperatura de 23°C
± 1°C. Após 7 dias do inóculo inicial, foi realizado o primeiro repique, depois de
constatadas a viabilidade e ausência de agentes contaminantes, com auxílio do
microscópio óptico, e distribuídos os 50 mL de cultura em 5 novos Erlenmeyers, nas
mesmas condições do inóculo inicial (10 mL de cultura em 40 mL de meio NNN/LIT).
Ao término dos 7 dias, foram obtidos 250 mL da cultura, na concentração de 10
7
a 10
8
promastigotas/mL. A partir desta etapa, foi realizado o segundo repique, após
constatadas novamente a viabilidade e ausência de agentes contaminantes, nas mesmas
condições do inóculo inicial. Assim, foram preparados novos 25 Erlenmeyers, que após
o período de 7 dias, deram origem a 1.250 mL de cultura, que foram utilizados no
terceiro repique após constatadas a viabilidade e ausência de agentes contaminantes. Em
seguida, foram distribuídos em novos 100 Erlenmeyers, da mesma maneira que o
inóculo inicial, exceto o meio de cultura, que foi substituído apenas por LIT, para
minimizar a contaminação da cultura vacinal por hemácias, de forma que ao final de 10
dias, foram obtidos 5.000 mL de cultura de promastigotas, predominantemente
metacíclicas (conforme curva de crescimento previamente estabelecida para esta espécie
e cepa em nosso laboratório), na concentração aproximada de 10
8
promastigotas/mL. A
cultura foi removida em capela de fluxo laminar e transferida para tubos estéreis de
polipropileno de 50 mL (Falcon
, Becton Dickinson, EUA), que foram submetidos à
centrifugação a 900 x g durante 15 minutos a 4°C. Após descartar o sobrenadante, o
sedimento de promastigotas foi homogeneizado em solução salina estéril (NaCl 0,85%),
e em seguida foi realizada a centrifugação na mesma condição. Este procedimento de
lavagem foi repetido por mais duas vezes.
Após as etapas de lavagem, realizou-se o rompimento das promastigotas em
ultra-som (Sonifier Cell Disruptor
®
- Brason Sonic Power Co. – EUA), por um minuto a
Materiais e Métodos
35
40 Watts em banho de gelo. Após este procedimento, o antígeno vacinal foi aliquotado
e congelado a -70°C (Forma Scientific, EUA). A concentração protéica foi dosada pelo
método de Lowry et al. (1951). A concentração do antígeno utilizada em cada dose foi
de 600 µg/mL em solução salina estéril.
Este imunobiológico foi recentemente patenteado pela UFOP em parceria com
pesquisadores do Instituto René Rachou - FIOCRUZ/MG estando inscrito no Instituto
Nacional da Propriedade Industrial (INPI) com a identificação PI 0601225-6; 17 de
fevereiro de 2006.
5.3 – Imunomoduladores: adjuvante saponina e saliva de Lu. longipalpis
5.3.1 – Preparo do adjuvante Saponina
A saponina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) utilizada neste estudo como
adjuvante foi diluída em solução salina estéril 0,85% no momento do inóculo (1
mg/dose), para evitar perda na estabilidade.
5.3.2 – Obtenção de glândulas salivares de Lutzomyia longipalpis
O extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis (SGE) utilizado neste estudo
como componente antigênico vacinal foi cedido pelo Laboratório de Fisiologia de
Insetos Hematófagos/ICB/UFMG, a partir da colônia de Lu. longipalpis proveniente de
Teresina (Piauí) e Abaetetuba (Pará) e obtidas conforme protocolo estabelecido por
Cavalcante et al. (2003). As glândulas salivares de fêmeas de Lu. longipalpis, não
alimentadas, com idade de quatro dias, foram dissecadas em solução salina levemente
hipotônica não tamponada a 0,8%. Após a coleta, as glândulas foram rompidas em
sonicador por 10 segundos e centrifugadas a 10.000 g por 2 minutos. O sobrenadante foi
coletado e armazenado em freezer -70
o
C até o uso.
5.4 – Desenho experimental
Materiais e Métodos
36
Para compor este estudo, foram utilizados um total de 40 cães sem raça definida,
com idade média de sete meses, de ambos os sexos, distribuídos aleatoriamente entre os
diferentes grupos avaliados. Os cães foram distribuídos nos seguintes grupos:
• Grupo controle (C): composto por 10 cães (seis machos e quatro fêmeas),
que receberam três aplicações de 1 mL de solução salina estéril a 0,85% por via
subcutânea, em intervalos de 30 dias;
• Grupo imunizado com antígeno vacinal de L. braziliensis (LB): formado
por cinco cães (três machos e duas fêmeas). Cada cão recebeu três aplicações
subcutâneas de 600 µg do antígeno/dose, diluído em 1 mL de solução salina estéril a
0,85%, em intervalos de 30 dias;
• Grupo imunizado com adjuvante saponina (Sap): composto por cinco
cães (dois machos e três fêmeas). Cada cão recebeu três aplicações subcutâneas de 1 mg
de saponina/dose, diluída em 1 mL de solução salina estéril a 0,85%, em intervalos de
30 dias;
• Grupo imunizado com antígeno vacinal de L. braziliensis (LB) associado
ao adjuvante saponina (LBSap): composto por cinco cães (três machos e duas
fêmeas). Cada cão recebeu três aplicações subcutâneas de 600 µg do antígeno/dose
associado ao adjuvante, com 1 mg de saponina/dose, diluídos em 1 mL de solução
salina estéril a 0,85%, em intervalos de 30 dias;
• Grupo imunizado com saliva de Lu. longipalpis (Sal): formado por cinco
cães (dois machos e três fêmeas). Cada cão recebeu três aplicações subcutâneas de cinco
ácinos de extrato de glândula salivar/dose, diluídos em 1 mL de solução salina estéril a
0,85%, em intervalos de 30 dias;
• Grupo imunizado com antígeno vacinal de L. braziliensis associado à
saliva de Lu. longipalpis (LBSal): formado por cinco cães (dois machos e três fêmeas).
Cada cão recebeu três aplicações subcutâneas de 600 µg do antígeno/dose associado a
cinco ácinos de extrato de glândula salivar/dose, diluídos em 1 mL de solução salina
estéril a 0,85%, em intervalos de 30 dias;
• Grupo imunizado com antígeno vacinal de L. braziliensis associado ao
adjuvante saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal): formado por cinco cães
(dois machos e três fêmeas). Cada cão recebeu três aplicações subcutâneas de 600 µg do
antígeno/dose associado ao adjuvante, com 1 mg de saponina/dose, e cinco ácinos de
Materiais e Métodos
37
extrato de glândula salivar/dose, diluídos em 1 mL de solução salina estéril a 0,85%, em
intervalos de 30 dias.
Todo o protocolo de vacinação foi realizado no mesmo dia, para todos os grupos
avaliados. Para facilitar o entendimento das avaliações pré e pós-vacinais, os intervalos
entre as doses foram divididos em quatro tempos distintos: T0 (avaliação antes da
primeira dose), T1 (avaliação após 15 dias da primeira dose), T2 (avaliação após 15 dias
da segunda dose), T3 (avaliação após 15 dias da terceira dose).
O Diagrama 1, apresentado a seguir, ilustra o delineamento experimental
utilizado neste estudo.
Materiais e Métodos
38
Diagrama 1: Esquema do desenho experimental utilizado na avaliação de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C), saponina (Sap), vacina de
L. braziliensis (LB), vacina de L. braziliensis associado à saponina (LBSap), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis
(LBSal) e vacina de L. braziliensis associado à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal). T0 = Antes da primeira imunização, T1 = 15 dias após a primeira
imunização; T2 = 15 dias após a segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira imunização.
Materiais e Métodos
39
5.5 – Estratégias de avaliação utilizando-se diferentes protocolos vacinais
5.5.1 – Avaliação dos aspectos relacionados à inocuidade e toxicidade
A repercussão sistêmica da inocuidade e toxicidade foi avaliada pelo
acompanhamento da temperatura retal, a cada 24 h após cada dose dos inóculos, durante
um período de até 72 h.
As alterações locais foram avaliadas clinicamente, pela presença de edema no
local do inóculo. Além disto, quando constatado a formação de nódulo no local do
inóculo, suas dimensões foram medidas e anotadas. Estas avaliações foram realizadas
após 72 h de cada inóculo. Alterações clínico-toxicológicas do tipo: vômitos, diarréia,
tremores e alterações comportamentais foram avaliadas e anotadas em fichas
individuais.
5.5.2 – Obtenção de amostras de sangue periférico
As amostras de sangue periférico foram coletadas em seringas descartáveis
estéreis de 20 mL, através de punção da veia jugular ou radial. Em seguida, foram
transferidos 5 mL de sangue para um tubo contendo EDTA (na proporção de 1mg/mL)
destinados à realização do leucograma e da imunofenotipagem ex vivo por citometria de
fluxo, enquanto 10 mL foram transferidos para dois tubos sem anti-coagulante,
destinados à realização dos testes sorológicos. Os dois últimos tubos foram
imediatamente centrifugados a 450 x g por 10 minutos para obtenção das amostras de
soro, que foram, então, aliquotadas e congeladas à – 20ºC até o momento do uso para
avaliações sorológicas pelo método de ELISA.
Para realização dos testes de avaliação da resposta imune após estimulação in
vitro, 30 mL de sangue foram coletados em duas seringas descartáveis estéreis
heparinizadas de 20 mL. O sangue permaneceu em temperatura ambiente, por até 3
horas, até o momento do uso.
Materiais e Métodos
40
5.5.3 – Leucograma
Para a avaliação do quadro leucocitário foi utilizada a técnica convencional de
contagem de leucócitos (Dacie & Lewis, 1984) em contador automático de células
(Cobas Micros 60, ABX, França), por ocasião da coleta de sangue. O leucograma foi
determinado pelo número de leucócitos/mm
3
e a contagem diferencial de células com
determinação do número absoluto de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos foi
realizada em esfregaços corados pelo corante panótico rápido (Instant-Prov, Pinhais,
PR, Brasil) e avaliada por microscopia óptica em objetiva de imersão, por meio da
contagem de 100 leucócitos/lâmina.
5.5.4 – Avaliação da resposta imune humoral anti-Leishmania
5.5.4.1 – Obtenção do antígeno para a reação imunoenzimática anti-
Leishmania
Para os testes de ELISA, foi utilizado antígeno solúvel de promastigotas de L.
chagasi (MHOM/BR/1972/BH46), cultivados por sete dias no meio LIT. Os parasitos
foram lavados 3 vezes em solução tampão fosfato pH 7,2 por centrifugação em 600 x g
por 10 minutos. Em seguida, os parasitos foram rompidos com três ciclos durante 1
minuto a 40 Watts em ultra-som (Sonifier Cell Disruptor
- Brason Sonic Power Co.,
EUA) em banho de gelo. Posteriormente, o material sonicado foi centrifugado a 37.000
x g por 1 hora e 30 minutos, a 4°C. O sobrenadante foi dializado contra PBS pH 7,2,
durante 24 horas, a 4°C sob agitação. Por fim, o material remanescente no saco de
diálise foi filtrado em filtros estéreis descartáveis, de 0,22 µm (Millipore Co,
Massachusetts, EUA), em condições estéreis e uma alíquota retirada para dosagem de
proteína pelo método de Lowry et al. (1951), sendo ajustada a concentração para
1.000µg/mL. Amostras do antígeno foram aliquotadas e congeladas em freezer à -70°C
até o momento do uso. Para os testes de ELISA, 2µg/poço do antígeno solúvel de
promastigotas de L. chagasi (SLcA) foram utilizados para sensibilização das placas de
96 poços (MaxiSorp™, Nalge Nunc Intl., Rochester, NY, USA).
Materiais e Métodos
41
5.5.4.2 – Pesquisa de anticorpos anti-Leishmania
Amostras de soros dos diferentes grupos de cães avaliados foram submetidas ao
teste imunoenzimático (ELISA), conforme técnica descrita por Voller (1978) e segundo
protocolo descrito por Reis et al. (2006c), empregando-se conjugados HRPO
específicos para cão, anti-IgG total (com afinidade para molécula total de IgG), anti-
IgG1 e anti-IgG2 (com afinidade para cadeia pesada) (Bethyl laboratories, Inc
Montgomery – Texas, EUA). A diluição ótima dos conjugados foi determinada por
titulação, empregando-se soros padrões positivos e negativos, obtendo-se a diluição
padrão de 1:16.000 (IgG total e IgG2) e 1:1.000 (IgG1). O ponto de corte discriminante
negativo/positivo foi determinado, utilizando-se 40 soros-padrão da soroteca do
Laboratório de Imunopatologia (NUPEB-UFOP) de cães negativos pela reação de
imunofluorescência indireta (RIFI). Assim, foram obtidos o ponto de corte
discriminante negativo/positivo, avaliados por densidade óptica, para as reações
realizadas pela análise comparativa entre os grupos C, Sap, LB e LBSap (IgG total:
0,12; IgG1: 0,10; IgG2: 0,04). Considerando que as reações para pesquisa de anticorpos
anti-Leishmania da análise comparativa entre os grupos C, Sal, LBSal e LBSapSal
foram realizadas em dias diferentes da primeira padronização, novos pontos de corte
discriminantes negativo/positivo, avaliados por densidade óptica, foram obtidos (IgG:
0,12; IgG1: 0,17; IgG2: 0,09). As amostras de soro foram testadas na diluição de 1:80.
A leitura foi realizada em leitor automático de microplaca Multiskan® MCC 340
(Labsystems, Helsinki, Finland), utilizando o comprimento de onda de 492 nm. Os
resultados foram expressos pela média da densidade óptica de cada grupo em T0, T1,
T2 e T3.
5.5.4.3 – Pesquisa de anticorpos anti-saliva
A avaliação de anticorpos anti-extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis
(SGE) foi realizada no soro de cães que receberam SGE como componente vacinal (Sal,
LBSal e LBSapSal), bem como em cães do grupo controle (C). Para esta avaliação,
foram empregados os mesmos conjugados HRPO específicos para cão, anti-IgG total,
IgG1 e IgG2, utilizados na mesma diluição conforme descritos no item “5.5.4.2 –
Pesquisa de anticorpos anti-Leishmania”. Foram utilizados o conteúdo de um par de
glândula salivar de Lu. longipalpis/poço para sensibilização das placas de 96 poços
Materiais e Métodos
42
(MaxiSorp™, Nalge Nunc Intl., Rochester, NY, USA), e os soros dos cães foram
avaliados na diluição de 1:100, conforme técnica modificada descrita por Barral et al.
(2000). A leitura foi realizada em leitor automático de microplaca Multiskan® MCC
340 (Labsystems, Helsinki, Finland) utilizando o comprimento de onda de 405 nm. Os
resultados foram expressos pela média ± desvio padrão da densidade óptica de cada
grupo nos tempos T0 e T3.
5.5.4.4 – Western blot para identificação de anticorpos anti-saliva
Western blot de extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis (SGE) foi
realizado conforme descrito por Belkaid et al. (1998) e Barral et al. (2000). O
equivalente a 40 pares de glândulas de Lu. longipalpis/caneleta foram submetidos a
eletroforese em gel Bis-Tris (4-12%, 1.0 mm x 2D; Invitrogen Co., Carlsbad, CA,
USA). Após eletroforese do SGE, as proteínas presentes no gel foram transferidas para
uma membrana de nitrocelulose (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), lavada em
solução tampão de bloqueio (Tris-HCl pH 8.0, NaCl 150 mM em 5% de leite
desnatado) e submetidas a incubação com soro dos cães (diluído 1:50) controles e
inoculados com saliva de Lu. longipalpis como componente vacinal. Subsequentemente,
as membranas foram incubadas com anticorpo secundário IgG anti-cão marcado com
fosfatase alcalina diluído 1:8.000 (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). A revelação
foi realizada com NBT/BCIP (Nitro Blue Tetrazolium/5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil
Fosfato) (Promega Co., Madison, WI, USA). É importante ressaltar que as análises
referentes à avaliação da resposta humoral e Western blot anti-saliva, foram realizadas
em colaboração com o Laboratório de Imunoparasitologia do Centro de Pesquisas
Gonçalo Moniz - FIOCRUZ, Salvador, Bahia, sob supervisão da Dr
a
. Cláudia Ida
Brodskyn.
5.5.5 – Imunofenotipagem por citometria de fluxo
5.5.5.1 – Citometria de Fluxo
A citometria de fluxo é uma técnica de análise celular automatizada, que permite
a avaliação simultânea de múltiplas propriedades biofísicas individuais de uma célula
suspensa em meio líquido. Esta caracterização inclui a análise básica de três parâmetros
Materiais e Métodos
43
celulares: tamanho (determinado pela difração do raio laser – Forward scatter - FSC),
granulosidade ou complexidade interna (determinada pela refração e reflexão do raio
laser – Side Scatter – SSC) e intensidade relativa de fluorescências. Estes parâmetros
são detectados em um sistema óptico-eletrônico acoplados, emitindo sinais que podem
ser medidos e armazenados, para posterior análise.
A análise multiparamétrica de diferentes componentes celulares pode ser
realizada empregando-se além da análise morfométrica das células, reações contendo
fluorocromos distintos, tais como o isotiocianato de fluoresceína (FITC - emite
fluorescência verde ou tipo 1 - FL1), ficoeritrina (PE - emite fluorescência laranja ou
tipo 2 - FL2) e a ficoeritrina conjugada à cianina 5 (PE-CY5 - emite fluorescência
vermelha ou tipo 3 - FL3). Neste contexto, para a realização dos ensaios de
imunofenotipagem das células obtidas a partir do sangue periférico, foram utilizados
anticorpos monoclonais específicos anti-receptores de células caninas (Tabela 1).
Alguns dos anticorpos monoclonais utilizados na fenotipagem de leucócitos do sangue
periférico foram adquiridos já marcados com fluorocromos, entre eles, o anti-CD21
FITC, anti-MHC-I R-PE, anti-CD80 R-PE e o anti-CD14 PE-Cy-5. Os demais
anticorpos são puros, não sendo marcados com fluorocromos. Neste caso, foi
empregado anticorpo secundário anti-rato marcado com FITC (Tabela 1) para revelação
da marcação.
Para aquisição, armazenamento e análise dos dados referentes à resposta celular
foi empregado o citômetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Diego, EUA),
equipado com um sistema de computador contendo o software Cell Quest, fornecido
pelo fabricante do equipamento.
Materiais e Métodos
44
Tabela 1 - Painel de anticorpos monoclonais utilizados na imunofenotipagem de leucócitos
Anticorpos Monoclonais
∗
∗∗
∗
Hospedeiro Clone Isotipo Fluorocromo
Diluição final Célula alvo/Atuação
Anti-CD5 Rato YKIX322.3 IgG2a FITC 1:800 Linfócitos T
Anti-CD4 Rato YKIX302.9 IgG2a - 1:1.000 LT auxiliares
Anti-CD8 Rato YCATE55.9 IgG1 - 1:200 LT citotóxicos/supressores
Anti-CD21 Camundongo IOB1a IgG1 FITC 1:100 Linfócitos B
Anti-CD14 Camundongo TÜK4 IgG2a R-PE-Cy5 1:200 Monócitos
Anti-CD80 Camundongo 16-10A1 IgG2 R-PE Não diluído Molécula co-estimuladora
Anti-MHC-I Camundongo 2G5 IgG2b R-PE 1:10 Células Nucleadas
Anti-rato IgG Ovelha Policlonal Rat IgG - FITC 1:400 Controle de conjugado
Todos os anticorpos monoclonais foram produzidos pela SEROTEC Ltd (Oxford, Inglaterra), exceto anti-CD80 (BD Pharmingen, San Jose, EUA)
Materiais e Métodos
45
5.5.5.2 – Obtenção e preparo da suspensão de leucócitos do sangue periférico
para imunofenotipagem ex vivo
O preparo da suspensão leucocitária, bem como o ensaio de imunofenotipagem foi
realizado de acordo com protocolo descrito por Reis et al. (2005). Da amostra de sangue
colhido em EDTA, foram retirados 3,5 mL e transferidos para um tubo de 50 mL (Falcon
,
Becton Dickinson, San Jose, EUA), completando-se o volume com solução PBS pH 7,2/10%
SFB (Soro Fetal Bovino - GIBCO, Grand Island, New York, USA). A amostra foi
homogeneizada e submetida a centrifugação a 450 x g, por 10 minutos, em temperatura
ambiente. Em seguida, o sobrenadante foi aspirado cuidadosamente com auxílio de pipeta
Pasteur. Posteriormente, foram adicionados 45 mL de solução de lise (Facs lysing solution -
Becton Dickinson, San Jose, EUA) e, imediatamente, o material foi submetido a agitação
manual por 10 segundos. O material foi incubado em repouso por 10 minutos a temperatura
ambiente e, em seguida, centrifugado a 450 x g, por 10 minutos na mesma temperatura. O
sobrenadante foi desprezado de uma só vez, vertendo-se o tubo, e a suspensão celular
ressuspendida em 40 mL de PBS pH 7,2, homogeneizada. Novamente o material foi submetido
à centrifugação a 450 x g, por 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi
desprezado e o sedimento homogeneizado e ressuspendido em 30 mL de PBS pH 7,2/10% SFB
para a última lavagem, centrifugando-se o material a 450 x g, por 10 minutos em temperatura
ambiente. Posteriormente, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi ressuspendido em 2
mL de solução de PBS pH 7,2/10%SFB.
Antes de iniciar o protocolo de imunofenotipagem, foi realizado um teste de controle de
qualidade da suspensão celular: em 30 µL da suspensão foram adicionados 200 µL de solução
fixadora para citometria - MaxFacsFix (10,0 g/L de paraformaldeído, 10,2 g/L de cacodilato de
sódio e 6,65 g/L de cloreto de sódio, pH 7,2), em um tubo de poliestireno de 5mL (Falcon
2054, Becton Dickinson, San Jose, EUA), específico para leitura no citômetro de fluxo
(FACScan - Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). O teste permitiu avaliar antecipadamente
a qualidade do perfil celular da amostra após a lise, com relação às propriedades de tamanho e
granulosidade celular e a existência de autofluorescência.
Materiais e Métodos
46
5.5.5.3 – Ensaio de imunofenotipagem celular em leucócitos do sangue periférico
no contexto ex vivo e in vitro utilizando microplacas
Os anticorpos monoclonais foram preparados na diluição previamente estabelecida por
titulação (Tabela 1). As diluições foram realizadas em solução de PBS pH 7,2/20% SFB
(FACS dil) e os anticorpos distribuídos em microplacas de 96 orifícios, fundo em "U"
(LIMBRO, INC Biomedicals, Inc. Aurora, Ohio, EUA). As placas foram preparadas uma
semana antes dos experimentos de fenotipagem e armazenadas em freezer à -20ºC (Cônsul, São
Paulo, Brasil). Em cada orifício, foram colocados 30 µL dos anticorpos anti-CD5, anti-CD4,
anti-CD8 e anti-CD21, diluídos previamente, conforme ilustrado na Tabela 2. Cada fileira
horizontal de uma placa (12 orifícios) compreendia a marcação fenotípica das células de um
único cão para os anticorpos citados anteriormente. Os orifícios 1, 2 e 3 representavam os
controles de qualidade da reação os quais permitiam avaliar a ocorrência de possíveis reações
inespecíficas. Os anticorpos empregados foram das subclasses IgG1 ou IgG2, conforme
mostrado na Tabela 1. No orifício 1 foi adicionado apenas PBS pH 7,2/20% SFB (Facs dil)
junto à suspensão celular. No orifício 2 foi empregada uma mistura de soros de rato normal
(SRN), diluído 1:6.000 em solução de PBS pH 7,2/20% SFB, e no orifício 3 uma mistura de
soros de camundongo normal (SCN), diluído 1:6.000 em solução PBS pH 7,2/20% SFB,
servindo de controles isotípicos das reações. Já o orifício 4 foi utilizado para verificar a
ocorrência de ligação inespecífica dos anticorpos secundários anti-rato. Reações apresentando
resultados de freqüência de fluorescência superiores a 2% nos orifícios acima citados foram
desconsideradas e repetidas em uma nova coleta de material.A Tabela 2 ilustra a quantidade e
diluição dos anticorpos utilizados para fenotipagem em leucócitos do sangue periférico,
utilizando-se microplacas.
O ensaio de imunofenotipagem de leucócitos em microplacas foi realizado adicionando-
se em cada orifício 30 µL da suspensão celular e, após a adição das células, a placa foi
submetida à agitação, cuidadosa e lenta, em Vórtex (Fisher, Vortex Genie 2, Bohemia, NY,
EUA), e deixada sob incubação por 30 minutos, ao abrigo da luz e à temperatura ambiente. Em
seguida, foram adicionados 140 µL de PBS 1X/pH 7,2, para remoção do excesso de anticorpos
livres, que não ligaram durante o processo de incubação. Após a centrifugação a 600 x g por 10
minutos em temperatura ambiente, o sobrenadante foi desprezado de uma só vez, e a placa
vertida sobre papel toalha absorvente para eliminação do sobrenadante residual. O sedimento
celular foi ressuspenso agitando-se a placa em vórtex e, foram adicionados aos orifícios sobre a
suspensão celular, 60 µL do anticorpo secundário, exceto no primeiro e oitavo orifícios, que
Materiais e Métodos
47
receberam 60 µL da solução FACS dil. A placa foi submetida à agitação lenta no vórtex, para
homogeneizar o material, sendo deixada em incubação por 30 minutos, ao abrigo da luz à
temperatura ambiente. Em seguida as células foram lavadas por 2 vezes com 140 µL de PBS
1X/pH 7,2, submetidas a centrifugação a 600 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. O
sobrenadante foi desprezado de uma só vez e a placa vertida sobre papel toalha absorvente para
eliminação do sobrenadante residual. As células foram ressuspensas utilizando-se vórtex para
então serem adicionados 170 µL da solução fixadora (MaxFacsFix). Com o auxílio de uma
pipeta multicanal, as células foram transferidas para uma estante contendo tubos de 500 µl
(Thomas Laboratory Specialities, EUA.). Após 30 minutos, foi realizada a leitura do material
no citômetro de fluxo (FACScan – Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA), com aquisição de
20.000 eventos/tubo.
Materiais e Métodos
48
Tabela 2 – Distribuição do painel de anticorpos anti-marcadores de superfície celular de
leucócitos do sangue periférico ou de células mononucleares do sangue periférico
estimuladas in vitro para fenotipagem em microplaca de 96 orifícios
Orifícios Anticorpo 1
ário
/diluição Anticorpo 2
ário
/diluição
1
30 µL FACS dil 60 µL FACS dil
2
30 µL SRN (1:6.000) 60 µL anti-rato (1:400)
3
30 µL SCN (1:6.000) 60 µL anti-camundongo (1:600)
4
30 µL FACS dil 60 µL anti-rato (1:400)
5
30 µL anti-CD5 (1:800) 60 µL anti-rato (1:400)
6
30 µL anti-CD4 (1:1.000) 60 µL anti-rato (1:400)
7
30 µL anti-CD8 (1:200) 60 µL anti-rato (1:400)
8
30 µL anti-CD21
∗
(1:100) 60 µL FACS dil
FACS dil: PBS pH 7,2/20% SFB; SRN: Soro de Rato Normal: SCN: Soro de Camundongo Normal.
∗
Para o anticorpo anti-CD21, foram adicionados 60 µL de FACS dil, na etapa de revelação pelo conjugado,
já que foi o único anticorpo já marcado (FITC) utilizado na fenotipagem em microplacas.
5.5.5.4 – Ensaio de imunofenotipagem celular em leucócitos do sangue periférico
no contexto ex vivo utilizando tubos
Esta segunda metodologia para fenotipagem celular foi realizada empregando-se um
processo simples de marcação primária em quatro tubos de poliestireno de 5 mL (Falcon
2054, Becton Dickinson, San Diego, EUA), utilizando-se anticorpos monoclonais em
quantidades e diluições descritas na Tabela 3. Os tubos foram preparados uma semana antes
dos experimentos de fenotipagem e armazenados em freezer à -20ºC. Em tubos contendo 50 µL
de FACS dil (controle da suspensão celular), 50 µL dos anticorpos anti-CD14 R-PE-Cy5, 5 µL
de anti-MHC-I R-PE ou 1 µL de anti-CD80 R-PE, foram adicionados 50 µL de sangue colhido
em EDTA. As células foram, então, misturadas ao anticorpo com o auxílio de um vórtex e
incubadas por 30 minutos ao abrigo da luz, em temperatura ambiente. Para lise dos eritrócitos,
foram adicionados 2 mL de solução de lise (Facs lysing solution - Becton Dickinson, San Jose,
EUA) sob agitação no vórtex, incubando-se por 10 minutos em temperatura ambiente e ao
abrigo da luz. Logo após esta etapa, foi adicionado 1 mL de PBS 1X/pH 7,2, sendo o material
homogeneizado no vórtex e centrifugado a 450 x g por 10 minutos, em temperatura ambiente.
O sobrenadante foi desprezado de uma só vez, vertendo-se o tubo, e o sedimento ressuspenso
manualmente, sendo adicionados 2 mL de PBS 1X/pH 7,2, seguindo-se homogeneização no
vórtex e centrifugação a 450 x g por 10 minutos, em temperatura ambiente. O sobrenadante foi
Materiais e Métodos
49
desprezado como anteriormente e o sedimento ressuspendido em 200 µL de solução fixadora
(MaxFacsFix), para então, realizar-se a leitura no citômetro de fluxo (FACScan – Becton
Dickinson, San Jose, CA, EUA), com aquisição de 20.000 eventos/tubo.
Tabela 3 – Distribuição do painel de anticorpos anti-marcadores de superfície celular
de leucócitos do sangue periférico para fenotipagem em tubos
FACS dil: PBS pH 7,2/20% SFB.
5.5.5.5 – Obtenção e análise dos dados por citometria de fluxo
O primeiro passo para a obtenção dos dados por citometria de fluxo consistiu na
identificação da população celular de interesse (R1), após ajustes de ganho de tamanho (FSC) e
granulosidade (SSC) e/ou fluorescências (FL1, FL2 e FL3) (Figura 1). Após a seleção da região
de interesse (R1), tanto para as amostras de leucócitos periféricos que não foram fixadas antes
da imunofenotipagem (Figuras 1 A, C, E e G), quanto para aquelas que foram submetidas à
fixação anteriormente à imunofenotipagem (Figuras 1 B, D, F e H), foi realizada a análise dos
aspectos imunofenotípicos. Em todos os experimentos foram analisados para cada amostra os
controles das reações, que são importantes para avaliação da qualidade do perfil celular e
ocorrência de reações inespecíficas, como exemplificado na Figura 1.
Os dados obtidos através da imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico dos
cães submetidos a diferentes protocolos de imunizações foram analisados utilizando-se
estratégias específicas dependendo do fenótipo celular investigado, empregando-se os recursos
de análise de dados disponíveis no programa CellQuest
TM
(Becton Dickinson, San Jose, EUA).
Para as análises imunofenotípicas, foram consideradas duas abordagens distintas, sendo
a primeira, através do percentual de células positivas (freqüência), expresso em gráficos do tipo
histogramas, equivalente à população positiva para cada marcador avaliado em escala log. Esse
tipo de análise consistiu na seleção da população celular de interesse, baseada em aspectos
morfométricos, através de gráficos de densidade de tamanho (FSC) versus granulosidade
(SSC). Após a seleção da região de interesse (R1, conforme ilustrado pela Figura 1 A)
Tubos
Anticorpo/diluição
1
50 µL FACS dil
2
50 µL anti-CD14 R-PE-Cy5 (1:200)
3
5 µL anti-MHC-I R-PE (1:10)
4
1 µL de anti-CD80 R-PE (puro)
Materiais e Métodos
50
contendo células de fenótipo FSC
Low
SSC
Low
, o percentual de subpopulações celulares
fluorescentes, dentro da população selecionada, foi obtido em gráficos do tipo histograma,
considerando-se CD5-FITC/FL1, CD4-FITC/FL1, CD8-FITC/FL1 e CD21-FITC/FL1 versus
número de células. Estas estratégias de análise foram realizadas conforme exemplo inserido na
Figura 2 A, que ilustra a análise do percentual de linfócitos T CD4
+
.
Na segunda abordagem, foi avaliado o canal médio de fluorescência (CMF),
equivalente à densidade de expressão de um determinado marcador fenotípico, em gráficos do
tipo histograma em escala linear (Figura 2 B). Para esta análise foi avaliada a expressão das
moléculas MHC-I e CD80 na população de linfócitos a partir da seleção da região de interesse
(R1, conforme ilustrado pela Figura 1 B), baseada em aspectos morfométricos em gráficos de
densidade de Tamanho (FSC) versus Granulosidade (SSC). Após a seleção da região de
interesse (R1), contendo o fenótipo FSC
Low
SSC
Low
, o canal médio de fluorescência (CMF) das
populações celulares fluorescentes, dentro da população selecionada, foi avaliado, através de
gráficos do tipo histogramas de MHC-I/FL2 e CD80/FL2 versus número de células, para
determinar o CMF de células MHC-I
+
e CD80
+
dentro da população de linfócitos, previamente
selecionada em R1. Estas estratégias de análise foram realizadas conforme exemplo da Figura 2
B, que mostra a avaliação da expressão de linfócitos MHC-I
+
.
Materiais e Métodos
51
C
R2
Freqüência= 0,05%
FL1
Número de células
C
R2
Freqüência= 0,05%
FL1
C
R2
Freqüência= 0,05%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
C
R2
Freqüência= 0,05%
FL1
C
R2
Freqüência= 0,05%
FL1
Número de células
C
R2
Freqüência= 0,05%
FL1
C
R2
Freqüência= 0,05%
FL1
Número de célulasNúmero de células
C
R2
Freqüência= 0,05%
FL1
C
R2
Freqüência= 0,05%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
D
R2
Freqüência= 0,03%
FL1
Número de células
A
R1
Sangue não fixado
Tamanho
Granulosidade
Sangue não fixadoSangue não fixado
A
R1
Tamanho
Granulosidade
A
R1
Tamanho
Granulosidade
A
R1
Sangue não fixado
Tamanho
Granulosidade
A
R1
Sangue não fixado
Tamanho
Granulosidade
Sangue não fixadoSangue não fixado
A
R1
Tamanho
Granulosidade
A
R1
Tamanho
Granulosidade
A
R1
Tamanho
Granulosidade
A
R1
Tamanho
Granulosidade
B
R1
Sangue fixado
Tamanho
Granulosidade
B
R1
Sangue fixado
Tamanho
Granulosidade
B
R1
Sangue fixado
Tamanho
Granulosidade
B
R1
Sangue fixado
Tamanho
Granulosidade
B
R1
Sangue fixado
Tamanho
Granulosidade
B
R1
Sangue fixado
Tamanho
Granulosidade
B
R1
Sangue fixado
Tamanho
Granulosidade
E
R2
Freqüência= 0,57%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
E
R2
Freqüência= 0,57%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
E
R2
Freqüência= 0,57%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
E
R2
Freqüência= 0,57%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
E
R2
Freqüência= 0,57%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
E
R2
Freqüência= 0,57%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
F
R2
Freqüência= 0,44%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
F
R2
Freqüência= 0,44%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
F
R2
Freqüência= 0,44%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
F
R2
Freqüência= 0,44%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
F
R2
Freqüência= 0,44%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
F
R2
Freqüência= 0,44%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
F
R2
Freqüência= 0,44%
Anti-rato IgG - FITC
Número de células
G
R2
Freqüência= 0,54%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
G
R2
Freqüência= 0,54%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
G
R2
Freqüência= 0,54%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
G
R2
Freqüência= 0,54%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
G
R2
Freqüência= 0,54%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
G
R2
Freqüência= 0,54%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
H
R2
Freqüência= 0,67%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
H
R2
Freqüência= 0,67%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
H
R2
Freqüência= 0,67%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
H
R2
Freqüência= 0,67%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
H
R2
Freqüência= 0,67%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
H
R2
Freqüência= 0,67%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
H
R2
Freqüência= 0,67%
Anti-camundongo IgG - FITC
Número de células
Figura 1: Seqüência de procedimentos utilizados para avaliação da qualidade do perfil celular e ocorrência de
reações inespecífica durante a imunofenotipagem em células de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais.
(A e B) Gráfico de densidade Tamanho versus Granulosidade, indicando o perfil das subpopulações de leucócitos
em sangue periférico não fixado e previamente fixado, respectivamente. (C, E e G) Histograma de freqüência de
células FL1
+
na população de linfócitos, verificada após as reações com os controles da imunofenotipagem em
leucócitos do sangue periférico não previamente fixado. (D, F e H) Histograma de freqüência de células FL1
+
na
população de linfócitos, verificada após as reações com os controles da imunofenotipagem em leucócitos do
sangue periférico previamente fixados. Os valores de freqüência destacados nas figuras indicam exemplos
representativos dos valores encontrados para sangue não fixado e fixado, respectivamente.
Materiais e Métodos
52
Figura 2: Seqüência de procedimentos utilizados para determinar o percentual de linfócitos CD5
+
, CD4
+
,
CD8
+
e CD21
+
e para quantificar o canal médio de fluorescência (CMF) de MHC-I e CD80 em linfócitos
do sangue periférico de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais. (A) Histograma de freqüência
de células CD4
+
versus número de células, contendo as células selecionadas na região R1, empregado
para quantificar a freqüência de linfócitos T CD4
+
identificada pela região R2, indicando exemplo
representativo dos valores desse fenótipo. (B) Histograma de CMF de MHC-I versus número de células
selecionadas dentro da população de linfócitos, identificado na região R2, indicando um exemplo
representativo dos valores de CMF para esse fenótipo.
A avaliação da população de monócitos foi realizada pela análise dos aspectos
fenotípicos relacionados à freqüência (%) de monócitos CD14
+High
. Esse tipo de análise
consistiu na seleção da população celular de interesse, baseada em aspectos imunofenotípicos,
através de gráficos de densidade de CD14-PE-Cy5/FL3 versus FL2, para a identificação da
população de monócitos, como células CD14
+High
, dentro da população de leucócitos totais,
minimizando assim a contaminação da região selecionada por linfócitos e neutrófilos (Figura
3). O percentual de monócitos foi obtido em gráficos bidimensionais de densidade de
fluorescência, considerando-se os valores correspondentes ao quadrante superior esquerdo,
como exemplificado na Figura 3 B. A Figura 3 A indica o posicionamento da população de
monócitos em gráfico de densidade de tamanho (FSC) x granulosidade (SSC).
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
A
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
A
Número de célulasNúmero de células
MHC-I-PE
R2
CMF= 206,8
B
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
A
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
A
Número de célulasNúmero de células
MHC-I-PE
R2
CMF= 206,8
B
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
A
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
A
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
A
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
R2
Freqüência= 41,6%
Número de células
CD4-FITC
A
Número de célulasNúmero de células
MHC-I-PE
R2
CMF= 206,8
B
Número de célulasNúmero de células
MHC-I-PE
R2
CMF= 206,8
B
Materiais e Métodos
53
A
B
11,4
6,0
82,6 0,0
Sangue não fixado
Granulosidade
Tamanho
FL2
CD14-PE-Cy5
Monócitos
A
B
11,4
6,0
82,6 0,0
Sangue não fixado
Granulosidade
Tamanho
FL2
CD14-PE-Cy5
Monócitos
A
B
11,4
6,0
82,6 0,0
Sangue não fixado
Granulosidade
Tamanho
FL2
CD14-PE-Cy5
Monócitos
Figura 3: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de monócitos no sangue
periférico de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais. (A) Gráfico de densidade de tamanho (FSC)
versus granulosidade (SSC), indicando o posicionamento da população de monócitos. (B) Gráfico de
densidade de CD14-PE-Cy5/FL3 versus FL2, empregado para quantificar o percentual de monócitos
CD14
+High
. No quadrante superior à direita está indicado um exemplo representativo das freqüências (%)
correspondentes a cada quadrante dos gráficos bidimensionais de fluorescência.
5.5.6 – Avaliação da resposta celular no contexto in vitro
Buscando ampliar as análises de imunogenicidade foram realizados testes in vitro para
avaliar as freqüências imunofenotípicas de linfócitos (CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
, CD21
+
) e a
capacidade linfoproliferativa antígeno-específica nos grupos de cães submetidos a diferentes
protocolos vacinais. É importante ressaltar que os ensaios para avaliação do perfil
imunofenotípico após estimulação antígeno-específica foram realizados conforme descrito na
metodologia de imunofenotipagem em microplacas, conforme descrito no item: “5.5.5.3 –
Ensaio de imunofenotipagem celular em leucócitos do sangue periférico no contexto ex vivo e
in vitro utilizando microplacas”. Portanto, nesta parte, serão descritas a forma de cultivo bem
como a obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) destinadas a
avaliação da capacidade linfoproliferativa e imunofenotipagem das PBMC antígeno-
específicas. Estes ensaios possibilitam uma avaliação funcional da resposta celular frente ao
antígeno vacinal ou antígeno relacionado ao agente etiológico da LVC (L. chagasi). Neste
contexto, propomos esta segunda estratégia para avaliação da imunogenicidade utilizando
como ferramentas a avaliação da atividade linfoproliferativa antes (T0) e após as três doses
(T3) das imunizações, bem como a análise da freqüência imunofenotípica realizada pela
Materiais e Métodos
54
comparação entre as culturas das PBMC estimuladas com antígeno em relação às culturas
controles não estimuladas, após as três doses vacinais (T3), nos diferentes grupos em estudo.
5.5.6.1 – Obtenção do antígeno solúvel vacinal (VSA) de L. braziliensis e do
antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) para os ensaios in vitro
Para os ensaios de cultivo celular (linfoproliferação e imunofenotipagem de linfócitos)
foi utilizado antígeno solúvel vacinal (VSA), constituído por L. braziliensis
(MHOM/BR/75/M2903), da mesma partida do cultivo descrito no item “5.2 – Produção do
antígeno vacinal”, além de antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) (MHOM/BR/1972/BH46).
Após obtenção da massa de promastigotas, os parasitos foram submetidos a três ciclos de
congelamento e descongelamento e posteriormente, a três ciclos de rompimento mecânico em
homogeneizador elétrico com pistão de teflon (Virtis, Holanda) por 1 minuto com intervalos de
30 segundos. Em seguida, o material antigênico foi centrifugado a 37.000 x g, durante 90
minutos à 4°C. Subsequentemente o material foi distribuído em sacos de diálise e dializado
contra PBS 1X/pH 7,2 à 4°C, sob agitação por 72 horas. O material foi recolhido, filtrado em
membrana de 0,22 µm, e uma alíquota foi separada para dosagem da concentração de proteínas
pelo método de Lowry et al. (1951). O material antigênico foi ressuspenso para uma
concentração final protéica de 1 mg/mL. O material foi aliquotado e conservado em freezer à -
70°C (Forma Scientific, EUA) até o momento do uso.
5.5.6.2 – Obtenção de células mononucleares do sangue periférico destinadas aos
ensaios in vitro
As seringas heparinizadas de coleta do sangue destinadas aos ensaios de cultivo celular
foram descontaminadas com álcool 70% e encaminhadas à capela de fluxo laminar (Veco,
Campinas, São Paulo, Brasil), para dar início ao processamento do material. Logo em seguida,
os 30 mL de sangue coletados foram diluídos em RPMI 1640 (Invitrogen Co., Grand Island,
NY, USA), em dois tubos de polipropileno de 50 mL (Falcon
, Becton Dickinson, San Jose,
EUA), contendo cada um 15 mL de sangue e 15 mL de RPMI 1640. Posteriormente, o sangue
foi centrifugado a 450 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Este procedimento de
lavagem foi importante para retirada do excesso de plasma. Em seguida, no interior da capela
de fluxo laminar (Veco, Campinas, São Paulo, Brasil), o sobrenadante foi retirado com auxílio
de pipeta Pasteur, e foi adicionado novamente RPMI 1640, até completar o volume final para
Materiais e Métodos
55
30 mL em cada tubo. Subsequentemente, 30 mL de sangue diluídos foram aplicados
lentamente sobre 10 ml de Ficoll-hypaque (Histopaque® 1.077 - Sigma Co., E.U.A) gelado
(4
o
C) em tubos de 50 mL de polipropileno (Falcon
, Becton Dickinson, San Jose, EUA), os
quais foram centrifugados a 450 x g por 40 minutos em temperatura ambiente. Após este
procedimento, foi removido o anel celular contendo células mononucleares do sangue
periférico (PBMC), com auxílio de pipeta Pasteur, e as células foram lavadas com RPMI 1640
heparinizado [30 µL de heparina 5.000 UI/mL (Heparin
, Cristália) para cada 100 mL de
RPMI] por duas vezes, seguido de uma lavagem final em RPMI 1640, ambas em centrifugação
a 450 x g por 10 minutos à 4º C. Ao final, as células foram ressuspensas em 1 ou 2 mL em
RPMI 1640 conforme a quantidade de sedimento obtido. Para a contagem, foi utilizada a
câmara hematocitométrica de Neubauer (Boeco, Germany). Para tanto, foram utilizados 10 µL
da suspensão celular diluídos em 190 µL de solução de Azul de Trypan (Sigma Co., E.U.A)
(diluição 1:20) para a realização da contagem de células mononucleares e da análise de
viabilidade celular. O valor obtido foi multiplicado pelo volume ressuspendido e o fator de
diluição. Assim, o volume final foi ajustado para conter 1x10
7
células/mL.
5.5.6.3 – Ensaios de proliferação linfocitária e obtenção das PBMC pós-cultivo
para imunofenotipagem
O ensaio de proliferação linfocitária foi realizado para cada cão utilizando culturas em
triplicatas, em placas de 96 orifícios (Nunc, Naperville, EUA), na presença do antígeno solúvel
vacinal (VSA), de antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA), do mitógeno fitohemaglutinina A
(PHA, Difco, Detroit, Michigan) e na ausência de qualquer estímulo (cultura controle não
estimulada). É importante ressaltar que esta avaliação foi realizada pela análise comparativa
entre os períodos T0 e T3. Foram utilizados 150 µL de meio para cultivo de células caninas
(10% Soro fetal bovino/1% de Estreptavidina/Penicilina, 2 mM L-glutamina e 0,1% β-
mercaptoetanol, em RPMI 1640) em cada um dos orifícios avaliados. Para isto, foram
adicionados 25 µL da suspensão de linfócitos contendo 10
7
células/mL, ou seja, 250.000
células/orifício nos poços que correspondem ao controle, ao mitógeno PHA e nas culturas com
a presença dos estímulos VSA ou SLcA. Foram adicionados 25 µL dos estímulos (VSA ou
SLcA) diluídos em meio de RPMI 1640, na concentração final de 25 µg/poço de cada antígeno.
Do agente mitogênico PHA, foram adicionados 25 µL da solução de uso diluída em RPMI
1640 nos respectivos orifícios da placa (concentração final de 2,5 µg/poço), destinados à
avaliação do controle de viabilidade funcional celular e da capacidade linfoproliferativa. Como
Materiais e Métodos
56
controle de proliferação, as células também foram cultivadas na ausência de qualquer estímulo
(antígenos ou PHA). As células foram estimuladas com PHA por 3 dias e com os antígenos por
5 dias, e mantidas à 37°C em estufa incubadora (Forma Scientific, EUA) com 5% de CO
2
. Foi
adicionado 1 µCi de [
3
H] timidina (Sigma Chemical Co., EUA) em cada orifício, nas últimas 6
horas de incubação. As células foram isoladas em papel de fibra de vidro (modelo 943-AH-
Wathman, EUA), através de um coletor automático de células (Titertek Cell Harvester, Flow
Laboratories, Irvine, Scotland, UK), e a incorporação de [
3
H] timidina foi determinada por
contagem em líquido de cintilação em um contador automático de cintilação (Beckman
Coulter, Fullerton, CA, EUA). As contagens foram expressas em contagens por minuto e
descritas nos resultados na forma de índice de proliferação, obtida pela divisão entre a média
das contagens por minuto da linfoproliferação das culturas estimuladas por VSA ou SLcA,
dividido pela média das contagens por minuto da linfoproliferação das culturas controles não
estimuladas.
A suspensão celular destinada a reação de imunofenotipagem após cultivo com VSA ou
SLcA foi obtida em condições semelhantes à descrita anteriormente. Neste sentido, as PBMC
foram cultivadas em triplicata em placas de 48 orifícios (Costar, Cambridge, MA, USA)
contendo 650 µL de meio de cultivo para células caninas. Foram adicionados 50 µL de PBMC
em cada orifício (5,0 x 10
5
células/orifício), 100 µL de VSA (25 µg/mL) ou 100 µL de SLcA
(25 µg/mL). As culturas controles foram preparadas da mesma forma, adicionando-se 100 µL
de RPMI 1640 no lugar dos estímulos antigênicos. A incubação foi realizada à 37°C em estufa
incubadora (Forma Scientific, EUA) com 5% de CO
2
por 5 dias.
Após este período, as placas foram centrifugadas a 450 x g, em temperatura de 18
o
C por
10 minutos. Posteriormente, o sobrenadante foi coletado para avaliação dos níveis de óxido
nítrico e imediatamente congelado a -70
o
C. As células destinadas a imunofenotipagem foram
removidas em tubos de poliestireno (Falcon
2054, Becton Dickinson, San Diego, EUA) com 3
ml de RPMI para subseqüente centrifugação a 450 x g em temperatura de 18
o
C por 10 minutos.
Posteriormente, os tubos foram vertidos e as células fixadas com 2 mL de solução de lise (Facs
lysing solution - Becton Dickinson, San Jose, EUA), homogeneizadas e após 10 minutos de
incubação, foram submetidas a centrifugação a 450 x g em temperatura de 18
o
C por 10
minutos. O sobrenadante foi descartado e adicionado 300 µL de PBS 1X/pH 7,2. Desta forma,
as células estavam prontas para serem submetidas ao protocolo de imunofenotipagem pela
metodologia de microplacas, que foi descrito no item: “5.5.5.3 – Ensaio de imunofenotipagem
celular em leucócitos do sangue periférico no contexto ex vivo e in vitro utilizando
Materiais e Métodos
57
microplacas”. É importante ressaltar que estes resultados serão apresentados através do valor
médio e desvio padrão da freqüência de linfócitos T (LT) CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
e de linfócitos B
CD21
+
, pela comparação entre as culturas estimuladas com os diferentes estímulos (VSA ou
SLcA) em relação às culturas controle não estimuladas, após a terceira dose vacinal (T3).
5.5.7 – Avaliação dos níveis de óxido nítrico no soro e em sobrenadante de culturas
estimuladas com VSA ou SLcA
O estudo da produção de óxido nítrico (NO) foi realizado por uma análise indireta,
utilizando-se a avaliação dos níveis de nitrito, pela reação de Griess (Green et al., 1982,
Gutman & Hollywood, 1992). Para avaliação dos níveis séricos de NO, em 100 µL de soro
diluído 1:2 em água destilada foi adicionado 10 µL de nitrato redutase (1U/mL) (Sigma-
Aldrich Co., St Louis, MO, USA), 10 µL de NADPH (6mM) (Sigma-Aldrich Co., St Louis,
MO, USA) e 10 µL de FAD (200 mM) (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA). Este
procedimento é necessário para reduzir todo nitrato (NO
3
-
) em nitrito. Após incubação por 12
horas a 37
o
C, as amostras foram submetidas ao tratamento com 1/20 de sulfato de zinco
(300g/L) (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA). Subseqüentemente, as amostras foram
centrifugadas a 10.000g por 15 minutos. Após centrifugação, 100 µL de cada amostra foi
adicionada em duplicada às placas de 96 poços de fundo plano (Nunc, Naperville, EUA).
Posteriormente, foram adicionados 100 µL de reagente de Griess (0.1% N-(1-
Nafitil)etilenodiamina, 1% sulfanilamida, 5% ácido fosfórico) (Sigma-Aldrich Co., St Louis,
MO, USA) às amostras processadas de soro, bem como a 100 µL das amostras provenientes do
sobrenadante de culturas. Após incubação no escuro por 10 minutos, as amostras foram
analisadas em leitor automático de microplacas (Multiskan® MCC 340; Labsystems, Helsinki,
Finland) e a absorbância foi avaliada no comprimento de onda de 540 nm. A concentração de
nitrito das amostras foi determinada pela interpolação de uma curva padrão de diluição da
solução de nitrito de sódio (com variação linear de 0,78-100 µmol/L). Os resultados (em
µmol/L) foram expressos como média da concentração de NO no soro em cada tempo avaliado
(T0, T1, T2 e T3) ou como índice de produção de NO, obtido pela divisão entre os valores do
sobrenadante das culturas estimuladas (VSA ou SLcA) e os valores obtidos do sobrenadante de
culturas controles não estimuladas. O índice de produção de NO foi avaliado pela comparação
entre os resultados de T0 e T3 nos diferentes estímulos antigênicos (VSA e SLcA).
Materiais e Métodos
58
5.6 – Análise estatística dos dados
Os testes estatísticos foram realizados com o apoio instrumental dos softwares Minitab
13.20 para Windows (Minitab Inc., Pennsylvania, USA) e GraphPad Prism 4.03 (Prism
Software, Irvine, CA, USA). A normalidade dos dados foi demonstrada pelo teste
Kolmogorov-Smirnoff. Os testes de análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste de
comparações múltiplas de Tukey foram empregados para avaliação entre os grupos vacinais
relacionados aos resultados da resposta humoral anti-Leishmania, bem como das análises
imunofenotípicas. O Teste T pareado foi utilizado nas avaliações dos resultados da resposta
humoral anti-saliva, bem como nas avaliações da resposta imune in vitro. Foram empregadas
correlações de Pearson (r) para as avaliações entre o perfil imunofenotípico de leucócitos
circulantes ou entre o perfil imunofenotípico e os resultados da linfoproliferação. Os dados
obtidos foram considerados estatisticamente significativos quando o valor de P foi <0,05. Toda
a análise estatística dos dados deste estudo foi definida e avaliada com o acompanhamento da
assessora de análises bioestatística do Instituto René Rachou - FIOCRUZ, Ms. Ana Carolina
Lustosa Basquez.
6. Resultados
Resultados
60
Apresentação dos resultados
O presente trabalho traz como resultados um conjunto de dados que poderá
orientar futuras pesquisas no campo da imunoprofilaxia da LVC, tais como: avaliações
de toxicidade/inocuidade, imunogenicidade, seleção de potenciais antígenos e
estratégias vacinais e escolha de adjuvantes. Pela primeira vez foi testado em cães o
potencial do adjuvante saponina associado à vacina de L. braziliensis. Além disso,
buscando responder uma importante pergunta que havia na comunidade científica, foi
criada uma estratégia para avaliar o impacto de antígenos constituintes da saliva de Lu.
longipalpis como componente vacinal sob o sistema imune de cães.
Para facilitar o entendimento dos dados gerados no presente estudo, os
resultados serão descritos sob três capítulos. Inicialmente serão descritos os resultados
relacionados a avaliação de aspectos ligados inocuidade e toxicidade pós-vacinal,
considerando todas as estratégias vacinais avaliadas neste estudo. No segundo capítulo,
serão descritos os resultados da imunogenicidade abordando a análise comparativa entre
o grupo controle (C), inoculado com saponina (Sap), grupo imunizado com a vacina de
L. braziliensis (LB) e imunizados com vacina de L. braziliensis associada à saponina
(estes resultados deram origem ao primeiro manuscrito publicado). No terceiro capítulo,
serão descritos os resultados da imunogenicidade relacionados à análise comparativa
utilizando a saliva como componente adicional no esquema vacinal. Neste sentido,
serão avaliados comparativamente os grupos controle (C), imunizado com saliva de Lu.
longipalpis (Sal), imunizado com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu.
longipalpis (LBSal) e imunizado com a vacina de L. braziliensis associada à saponina e
à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal) (estes resultados deram origem ao segundo
manuscrito publicado).
6.1 – Capítulo I
Aspectos relacionados a inocuidade e toxicidade pós-
vacinais em diferentes estratégias imunoprofiláticas
Resultados
62
6.1.1 – Avaliação dos aspectos relacionados a inocuidade e toxicidade: análise
da temperatura retal (
o
C) e alterações locais pós-vacinais em cães submetidos a
diferentes protocolos de imunizações
Os resultados relacionados à avaliação da temperatura retal estão apresentados
comparativamente entre todos os grupos de cães submetidos a diferentes protocolos de
imunizações (Figura 4). Os dados mostram a temperatura média obtida após 72 horas de
cada uma das três doses. Todos os grupos avaliados apresentaram variação da
temperatura dentro da faixa considerada como normal (até 39,5
o
C) para cães. A
avaliação individual da temperatura retal encontra-se descrita no Anexo 1. Embora
tenha sido observado aumento da temperatura retal (temperatura >39,5
o
C) de forma
individual e esporádica, este achado foi atribuído a hiperatividade do cão no momento
da avaliação.
Figura 4: Valor médio da temperatura retal (
o
C) de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais:
controle (C), saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB), vacina de L. braziliensis associada à
saponina (LBSap), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu.
longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
(LBSapSal). T1 = até 72 h após a primeira imunização; T2 = até 72 h após a segunda imunização; T3
= até 72 h após a terceira imunização. A linha pontilhada representa a temperatura limiar considerada
como início de hipertermia (39,5
o
C).
A avaliação das alterações no local das imunizações esteve restrita aos grupos
em que foi utilizada a saponina, seja isoladamente, associada ao antígeno de
L. braziliensis ou ainda quando foi associada ao antígeno de L. braziliensis e à saliva de
Lu. longipalpis. Entre as alterações locais identificadas, foi observado edema no local
Resultados
63
do inóculo (inchaço local que cedia a compressão digital), classificado como leve, uma
vez que atingiu extensão inferior a 3 cm. Em algumas situações, foi possível identificar
presença de nódulos não ulcerados, de consistência firme, com dimensões variáveis
(Tabela 4). Neste sentido, alguns cães inoculados com saponina isoladamente ou
associada à vacina de L. braziliensis ou à vacina de L. braziliensis e à saliva
apresentaram alterações ora de edema leve, ora de nódulos pontuais no local do inóculo.
Os grupos que receberam imunização apenas com saliva ou vacina de L. braziliensis
associada à saliva, além do grupo controle, não apresentaram alteração no local do
inóculo.
Além disto, em todas as observações clínicas realizadas após cada dose das
diferentes estratégias vacinais não foram detectadas alterações toxicológicas, como por
exemplo: vômitos, diarréia, tremores e alterações comportamentais. Entretanto, foi
comum observar dor durante o momento do inóculo dos antígenos e dor ao toque no
local dos nódulos em cães imunizados com saponina isoladamente e/ou quando
associada à saliva e ao antígeno de L. braziliensis.
Resultados
64
Tabela 4 – Alterações no local do inóculo (edema/nódulo) em cães controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais
Alterações observadas no local do inóculo, após cada dose de inóculo, em diferentes grupos: Sap = saponina; LBSap = vacina de L. braziliensis associada à
saponina; LBSapSal = grupo vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis.
Alterações no local do inóculo (Após 72 horas de cada dose)
Após 1ª dose Após 2ª dose Após 3ª dose
Código do cão Edema leve Nódulo (Tamanho) Edema leve Nódulo (Tamanho) Edema leve Nódulo (Tamanho)
Grupo Sap C03
- - - - - -
C05
- 2,5 X 1, 5 cm - 4,0 X 4,5 cm - -
C14
- - - - - -
C20
- - - 2,0 X 3,0 cm - 2,0 X 2,0 cm
C27
- - - - - -
Grupo LBSap C04
- - - 2,0 X 2,0 cm - -
C30
- - - - - -
C36
- - - - - -
C12
Presente - - - - 5,0 X 4,0 cm
C19
- - - - - -
Grupo LBSapSal C31
- 2,3 X 1,8 cm - - Presente -
C38
- - - - - -
C18
- - - - - -
C23
Presente - - - - 1,0 X 1,0 cm
C28
- - - - - -
6.2 – Capítulo II
Avaliação da imunogenicidade de uma nova vacina
constituída por antígenos brutos de Leishmania
braziliensis associada ao adjuvante saponina
Resultados
66
6.2.1 – Análise da reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no
soro de cães controle e submetidos ao inóculo com saponina, imunizações com
vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada à saponina
A avaliação inicial da imunogenicidade desta nova vacina composta por
antígeno bruto de L. braziliensis contou com a análise comparativa da resposta imune
humoral anti-Leishmania entre os grupos C, Sap, LB e LBSap, como representada pela
Figura 5. A avaliação da reatividade de IgG total revelou aumento significativo
(P<0,05) da média dos valores de densidade óptica no grupo LBSap, apresentando
valores acima do limiar de positividade, em T2 (0,342 ± 0,084) e T3 (0,309 ± 0,074) em
relação aos grupos C (T2: 0,073 ± 0,029; T3: 0,074 ± 0,018), Sap (T2: 0,055 ± 0,010;
T3: 0,070 ± 0,012) e LB (T2: 0,094 ± 0,038; T3: 0,109 ± 0,041). De forma semelhante,
o grupo LBSap apresentou aumento significativo (P<0,05) dos valores médios de
densidade ótica, com valores acima do limiar de positividade, tanto para IgG1 como
para IgG2 em T2 (IgG1: 0,171 ± 0,012; IgG2: 0,137 ± 0,034) e T3 (IgG1: 0,180 ±
0,029; IgG2: 0,110 ± 0,031) quando comparado aos grupos C (IgG1- T2: 0,022 ± 0,009,
T3: 0,022 ± 0,007; IgG2- T2: 0,022 ± 0,008, T3: 0,022 ± 0,007), Sap (IgG1- T2: 0,018
± 0,005, T3: 0,018 ± 0,005; IgG2- T2: 0,020 ± 0,004, T3: 0,020 ± 0,002) e LB (IgG1-
T2: 0,051 ± 0,030, T3: 0,073 ± 0,058; IgG2- T2: 0,038 ± 0,019, T3: 0,035 ± 0,014). O
aumento da reatividade para IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no grupo LBSap contribuiu
na identificação da correlação positiva entre estas imunoglobulinas
(P<0,0001/r=0,8149) considerando todos os tempos avaliados (T0 + T1 + T2 + T3).
Resultados
67
Figura 5: Reatividade humoral anti-Leishmania em soros de cães submetidos a diferentes
protocolos vacinais: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB;
) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). Painéis superiores e inferior
esquerdo ilustram a reatividade de IgG total anti-Leishmania, IgG1 anti-Leishmania e IgG2 anti-
Leishmania. O eixo x ilustra os tempos avaliados: T0 = antes da primeira imunização, T1 = 15 dias
após a primeira imunização; T2 = 15 dias após a segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira
imunização. O eixo y representa os valores médios de absorbância pela técnica de ELISA
utilizando-se soros diluídos 1:80 [cut-off = 0,12 (IgG total); 0,10 (IgG1); 0,04 (IgG2)]. As
diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras a, b, c, relacionadas aos grupos
C, Sap, LB, respectivamente. O painel inferior direito ilustra a correlação de Pearson (r) em P<0,05
no grupo LBSap ( ) considerando a avaliação entre os isotipos IgG1 e IgG2.
Resultados
68
6.2.2 – Leucograma de cães controle e submetidos ao inóculo com saponina,
imunizações com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada
à saponina
A avaliação inicial focalizando na resposta celular foi realizada pela análise do
leucograma nos diferentes grupos vacinais. Os valores absolutos das populações de
neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, monócitos bem como da global de leucócitos
encontram-se na Tabela 5.
As principais alterações no leucograma foram observadas após a primeira dose
vacinal. Assim, foi avaliada inicialmente a média global de leucócitos, sendo observada
redução significativa (P<0,05) no grupo Sap (8.250±1.377) em relação ao grupo C
(11.111±1.503) em T1. Por outro lado, no mesmo período (T1), o grupo LBSap
(12.100±1.367) apresentou aumento significativo (P<0,05) do número global de
leucócitos quando comparado ao grupo Sap (8.250±1.377). A análise subseqüente
focalizou na contagem diferencial da série branca, obtendo-se os valores absolutos de
neutrófilos, que revelou aumento significativo (P<0,05) no grupo LB (8.375±3.734) em
relação ao grupo C (5.253±1.877) em T1. Além disto, quando foi avaliado o número de
linfócitos (Tabela 5; Figura 6 painel superior), observou-se em T1 que enquanto os
grupos LB (3.059±205) e Sap (2.845±962) apresentaram redução significativa (P<0,05)
do número desta população celular em relação ao grupo C (3.965±749), o grupo LBSap
(4.699±1.815) apresentou aumento (P<0,05) do número de linfócitos em relação ao
grupo Sap (2.845±962) no mesmo período.
A análise do número absoluto de eosinófilos no grupo LBSap evidenciou
aumento significativo (P<0,05) (1.235±329) em relação ao grupo Sap (485±214) em T2,
enquanto no grupo LB (775±447) foi demonstrado aumento significativo (P<0,05) em
relação ao grupo C (318±111) em T3.
Resultados
69
Tabela 5 – Leucograma de cães controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais
Leucograma
T0
C LB Sap
LBSap
Global de Leucócitos
11.260±2.571 11.880±2.993 11.940±2.847 12.080±2.457
Neutrófilos Totais 5.920±2.569 6.451±2.030 5.811±1.973 7.387±1.396
Eosinófilos 599±418 1.086±1.084 800±446 401±329
Linfócitos 3.754±719 3.762±1.338 3.801±1283 3.717±1.479
Monócitos 466±249 582±160 489±247 498±173
T1
Global de Leucócitos
11.111±1.503 12.480±3.445
8.250±1.377
a
12.100±1.367
c
Neutrófilos Totais 5.253±1.877
8.375±3.734
a
5.974±2.277 6.116±2.085
Eosinófilos 638±463 505±313 415±310 911±460
Linfócitos 3.965±749
3.059±205
a
2.845±962
a
4.699±1.815
c
Monócitos 449±254 292±97 366±111 374±213
T2
Global de Leucócitos
10.470±2.532 11.680±2.158 9.880±3.070 10.660±1.139
Neutrófilos Totais 6.389±1.576 7.331±1.806 6.419±1.914 6.368±796
Eosinófilos 817±301 773±324 485±214
1.235±329
c
Linfócitos 3.181±946 3.267±1.528 2.660±1.547 2.859±350
Monócitos 382±234 284±162 316±128 386±122
T3
Global de Leucócitos
10.643±2.231 10.340±1.579 8.780±2.086 9.480±1.699
Neutrófilos Totais 5.610±1.407 6.169±1.951 5.682±1.363 6.161±2.147
Eosinófilos 318±111
775±447
a
481±213 526±265
Linfócitos 3.526±1.396 3.172±1.041 2.387±818 2.465±904
Monócitos 270±138 207±111 230±106 328±157
Valores absolutos (média±desvio padrão) do leucograma de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais:
controle (C), saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB) e vacina de L. braziliensis associada à saponina
(LBSap). T0 = antes da primeira imunização, T1 = 15 dias após a primeira imunização; T2 = 15 dias após a
segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira imunização. As diferenças significativas (P<0,05) estão
representadas pelas letras a, c, relacionadas aos grupos C, Sap, respectivamente.
Resultados
70
6.2.3 – Análise do número de linfócitos sanguíneos e do perfil fenotípico de
células T (CD5
+
, CD4
+
e CD8
+
) e células B (CD21
+
) circulantes no sangue
periférico de cães controle e submetidos ao inóculo com saponina, imunizações
com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada à saponina
O estudo do perfil celular contou com a avaliação inicial do número absoluto de
linfócitos do sangue periférico nos diferentes grupos vacinais (Tabela 5; Figura 6). O
perfil imunofenotípico destas células foi avaliado buscando-se ampliar o estudo de
possíveis alterações nas populações e subpopulações linfocitárias (Figura 6). Neste
contexto, foi observado aumento significativo (P<0,05) do valor médio absoluto de
linfócitos T (LT) CD5
+
em T1 no grupo LBSap (2.885 ± 722) em relação ao grupo Sap
(1.623 ± 559). Este aumento precoce (T1) em LBSap se refletiu em alterações nas
subpopulações de células T. Desta forma, foi observado no grupo LBSap aumento
significativo (P<0,05) do valor médio absoluto das subpopulações de LT CD4
+
(2.115 ±
495) e LT CD8
+
(1.341 ± 218) em T1 quando comparado aos grupos C (LT CD4
+
:
1.281 ± 31; LT CD8
+
: 810 ± 200) e Sap (LT CD4
+
: 901 ± 183; LT CD8
+
: 500 ± 205).
De forma semelhante aos resultados relatados nas populações de LT, foi observado
aumento significativo (P<0,05) do valor médio absoluto de linfócitos B (LB) CD21
+
em
T1 no grupo LBSap (1.269 ± 295) em relação aos grupos C (688 ± 208) e Sap (569 ±
231).
Considerando as importantes alterações imunofenotípicas relatadas em linfócitos
T e B circulantes, foi empregada uma estratégia de análise estatística que abordou as
correlações entre as populações e subpopulações linfocitárias para se investigar
possíveis relações de cooperação celular durante o protocolo vacinal. Assim, apenas o
grupo LBSap apresentou correlações significativas nesta avaliação quando considerados
os diferentes períodos (T0, T1, T2 e T3). Desta maneira, foi observada uma possível
cooperação T-B evidenciada pela correlação positiva entre LT CD5
+
e LB CD21
+
(P=0,0024/r=0,6395). Além disto, foi demonstrada a contribuição da subpopulação de
LT CD4
+
que foi correlacionada positivamente com LB CD21
+
(P=0,0241/r=0,5148).
Análises adicionais evidenciaram correlações positivas entre a população de LT CD5
+
e
as subpopulações de LT CD4
+
(P=0,0002/r=0,7422) e CD8
+
(P<0,0001/r=0,8420), e
entre as subpopulações LT CD4
+
e LT CD8
+
(P<0,0001/r=0,8533) no grupo LBSap
(Figura 6).
Resultados
71
Figura 6: Perfil celular de linfócitos circulantes em cães submetidos a diferentes protocolos
vacinais. Painel superior ilustra a média e desvio padrão do número de linfócitos circulantes dos
grupos: controle (C;
), saponina (Sap;
), vacina de L. braziliensis (LB;
) e vacina de L.
braziliensis associada à saponina (LBSap;
). O painel intermediário esquerdo ilustra o fenótipo de
linfócitos circulantes dos grupos: controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L.
braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). O eixo x
ilustra os tempos avaliados: T0 = antes da primeira imunização, T1 = 15 dias após a primeira
imunização; T2 = 15 dias após a segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira imunização. O
eixo y representa os valores médios e desvio padrão do número de linfócitos (painel superior) e do
número médio e desvio padrão de linfócitos T (LT) CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
e de linfócitos B (LB)
CD21
+
(painel intermediário esquerdo). As diferenças (P<0,05) entre o grupo LBSap e os grupos C,
Sap estão representadas pelas letras a, b, respectivamente. O painel intermediário direito e inferior
ilustram as correlações de Pearson (r) em P<0,05 entre os linfócitos circulantes do grupo LBSap
( ).
Resultados
72
6.2.4 – Avaliação da atividade linfoproliferativa e do perfil imunofenotípico de
linfócitos (CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
, CD21
+
) submetidos a estimulação antigênica
com antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em
células de cães controle e submetidos ao inóculo com saponina, imunizações
com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada à saponina
Buscando-se avaliar a capacidade linfoproliferativa após o término do protocolo
vacinal, foram empregados dois estímulos distintos, entre os quais, antígeno solúvel
vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) (Figura 7). Esta abordagem
possibilitou a análise da indução de memória imunológica frente ao componente vacinal
(VSA), bem como a avaliação da resposta antígeno-específica frente a antígenos
relacionados ao agente etiológico da LV (SLcA).
Foi observada redução significativa (P<0,05) do índice de proliferação no grupo
LB em T3 em relação a T0, tanto quando se utilizou VSA (T0: 2,1 ± 0,7; T3: 1,1 ± 0,3),
como quando utilizado SLcA (T0: 2,2 ± 0,4; T3: 1,0 ± 0,1) como estímulo antigênico.
De forma interessante, o grupo LBSap reverteu a incapacidade proliferativa antígeno-
específica observada no grupo LB, apresentando aumento significativo (P<0,05) do
índice de proliferação em T3 comparado a T0 quando se utilizou os estímulos VSA (T0:
1,5 ± 0,3; T3: 2,8 ± 0,9) e SLcA (T0: 1,5 ± 0,1; T3: 3,3 ± 1,0). Além disto, quando se
avaliou a atividade linfoproliferativa em T3 entre os diferentes grupos, foi observado
aumento significativo (P<0,05) do índice de proliferação no grupo LBSap (2,8 ± 0,9)
em relação aos grupos C (1,3 ± 0,3), Sap (1,3 ± 0,2) e LB (1,1 ± 0,3) utilizando
estimulação com VSA. Adicionalmente, foi observado no grupo LBSap aumento
significativo (P<0,05) do índice de proliferação em T3 (3,3 ± 1,0) em relação ao grupo
LB (1,0 ± 0,1) quando se utilizou SLcA. É importante ressaltar que a resposta
linfoproliferativa não específica obtida pelo estímulo mitogênico com PHA resultou em
valores médios entre 8 e 15 de índice de proliferação, confirmando a viabilidade da
suspensão celular nos diferentes grupos avaliados.
Uma segunda abordagem da análise in vitro focalizou na avaliação do perfil
imunofenotípico após a terceira dose (T3) pela comparação das culturas controle não
estimuladas (CC) em relação às culturas estimuladas (VSA ou SLcA) (Figura 7). A
avaliação da freqüência de linfócitos T CD5
+
revelou aumento significativo (P<0,05)
nas culturas estimuladas com SLcA do grupo LB (81,3 ± 2,4) em relação às culturas
controle não estimuladas (CC; 77,9 ± 3,3). Este aumento foi refletido pela maior
contribuição da subpopulação de linfócitos T (LT) CD4
+
, que apresentaram maior
Resultados
73
freqüência (P<0,05) na cultura estimulada com SLcA (50 ± 3,7) em relação a CC (46,2
± 3,7) do grupo LB. De forma interessante, as culturas estimuladas com SLcA do grupo
LBSap apresentaram aumento significativo (P<0,05) da freqüência da subpopulação de
LT CD8
+
(28,4 ± 2,7) em relação às CC (23,6 ± 3,2), bem como em relação as culturas
estimulas com o mesmo antígeno no grupo LB (19,4 ± 2,2).
A análise da freqüência de linfócitos B (LB) CD21
+
revelou queda significativa
(P<0,05) no percentual das culturas estimuladas com VSA (15,1 ± 3,2) e SLcA (15,2 ±
3,1) do grupo Sap em relação às CC (17,2 ± 3,5). Além disto, resultado semelhante foi
observado para o grupo LB, com redução significativa (P<0,05) da freqüência de LB
CD21
+
das culturas estimuladas com VSA (7,7 ± 1,7) em relação às CC (12 ± 3). Por
outro lado, embora não tenham sido identificadas diferenças na freqüência de LB
CD21
+
entre CC e CE para o grupo LBSap, esta população celular apresentou aumento
significativo (P<0,05) no percentual das culturas estimuladas com VSA (20,4 ± 4,2) e
SLcA (19,3 ± 3,5) deste grupo em relação às mesmas culturas do grupo LB (VSA: 7,7 ±
1,7; SLcA: 9,8 ± 1,9) (Figura 7).
Resultados
74
Figura 7: Índice de proliferação médio e desvio padrão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtido pela
análise em contagens por minutos (CPM) em linfócitos de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais, após estímulo
com antígeno solúvel vacinal (VSA; painel superior esquerdo) e estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel
superior direito). Os painéis intermediário e inferior ilustram o perfil imunofenotípico de PBMC estimulados in vitro com os
antígenos VSA (painel esquerdo) e SLcA (painel direito) avaliados 15 dias após a terceira dose (T3) nos diferentes grupos:
controle (C;
), saponina (Sap;
), vacina de L. braziliensis (LB;
) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap;
). Os resultados estão expressos como média e desvio padrão das freqüências de linfócitos T (LT) CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
e de
linfócitos B (LB) CD21
+
em culturas controles não estimuladas (CC) e em culturas estimuladas (CE) com VSA ou SLcA. As
linhas conectando T0 e T3 da proliferação celular ou do fenótipo de CC e CE indicam diferenças (P<0,05). As diferenças
estatísticas significativas (P<0,05) 15 dias após a terceira dose (T3) entre o grupo LBSap e os grupos C, Sap, LB estão
representadas pelas letras a, b, c, respectivamente.
Resultados
75
6.2.5 – Análise de correlações entre a atividade linfoproliferativa e o perfil
imunofenotípico de linfócitos (CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
) submetidos a estimulação
antigênica com antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi
(SLcA) em células de cães controle e submetidos ao inóculo com saponina,
imunizações com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada
à saponina
A avaliação da correlação entre a atividade linfoproliferativa e a freqüência do
fenótipo de células submetidas à cultura apresenta-se como uma importante estratégia
para se ampliar as investigações sobre a identificação do perfil imunofenotípico de
células antígeno-específicas de memória, com potencial de imunoproteção pós-vacinal.
Neste sentido, apenas o grupo LBSap apresentou correlações significativas entre
a atividade linfoproliferativa (CPM) e as subpopulações de linfócitos T (LT) (Figura 8).
Desta forma, o percentual de LT CD4
+
foi correlacionado positivamente com a
atividade linfoproliferativa quando utilizados os estímulos VSA (P=0,0291/r=0,6841) e
SLcA (P=0,0469/r=0,6386). De forma similar, o percentual de LT CD8
+
apresentou
correlação positiva com a atividade linfoproliferativa tanto quando empregado estímulo
VSA (P=0,0324/r=0,7091) como quando utilizado o SLcA (P=0,0417/r=0,6504).
Resultados
76
Figura 8: Correlação entre proliferação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)
em contagens por minutos (CPM) e as freqüências de linfócitos T (LT) CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
,
considerando resultados obtidos em T0 (antes da primeira imunização) e T3 (15 dias após a
terceira imunização), após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA) e estímulo com antígeno
solúvel de L. chagasi (SLcA). O painel superior ilustra os resultados obtidos no grupo de cães
submetidos a imunização com vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ). O painel
inferior ilustra os resultados obtidos nos grupos de cães controle (C), saponina (Sap) e vacina de
L. braziliensis (LB). As diferenças estatísticas significativas estão representadas pelas correlações
de Pearson (r) em P<0,05 no grupo LBSap (painel superior).
Resultados
77
6.2.6 – Avaliação do número de monócitos CD14
+
sanguíneos, do perfil de
ativação linfocitária pela expressão de CD80 e MHC-I e do possível papel de
monócitos CD14
+
e linfócitos B CD21
+
como potenciais células apresentadoras
de antígenos em cães controle e submetidos ao inóculo com saponina,
imunizações com vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada
à saponina
A avaliação de células apresentadoras de antígenos em ensaios de
imunoprofilaxia pretende contribuir ao entendimento dos eventos pós-vacinais que estão
diretamente relacionados à ativação da imunidade adaptativa. Assim, nesta parte dos
resultados serão descritos potenciais células apresentadoras de antígenos, representada
por monócitos CD14
+
bem como a relação entre estas células e de linfócitos B CD21
+
com a atividade linfoproliferativa. Além disto, buscando-se ampliar as investigações em
potenciais marcadores para ativação linfocitária em cães, avaliamos a expressão de
linfócitos CD80
+
e linfócitos MHC-I
+
por canal médio de fluorescência. Estas
abordagens estão descritas na Figura 9.
O estudo de monócitos CD14
+
revelou aumento significativo (P<0,05) do valor
médio absoluto em T2 no grupo LBSap (33 ± 8) quando comparado ao grupo Sap (18 ±
7). De forma similar, foi observado no grupo LBSap aumento significativo (P<0,05) do
número desta população celular em T3 (28 ± 11) em relação aos grupos Sap (13 ± 5) e
LB (9 ± 5).
Embora não tenham sido identificadas diferenças na avaliação da expressão de
linfócitos CD80
+
, o estudo da expressão de linfócitos MHC-I
+
evidenciou aumento
significativo (P<0,05) em T2 no grupo LBSap (451,1 ± 58,4) em relação aos grupos C
(347,0 ± 44,0), Sap (332,1 ± 40,1) e LB (326,5 ± 82,3). Além disto, em T3 foi
observado aumento significativo (P<0,05) da expressão deste marcador no grupo
LBSap (402,7 ± 32,6) em relação ao grupo LB (335,3 ± 44,0).
Considerando que importantes alterações no número de monócitos CD14
+
e da
expressão de linfócitos MHC-I
+
foram identificadas no grupo LBSap, e que os eventos
de apresentação antigênica poderiam estar diretamente relacionados a ativação
linfocitária, avaliamos a correlação entre estes parâmetros. De forma interessante, o
grupo LBSap apresentou correlação positiva (P=0,0212/r=0,6075) entre o número de
monócitos CD14
+
e a expressão de linfócitos MHC-I
+
(Figura 9).
Na tentativa de se identificar um padrão de resposta entre potenciais células
apresentadoras de antígenos (monócitos CD14
+
e linfócitos B CD21
+
) e a atividade
Resultados
78
linfoproliferativa utilizando estímulos antigênicos distintos (antígeno solúvel vacinal:
VSA; antígeno solúvel de L. chagasi: SLcA) uma nova estratégia de correlação foi
empregada. Neste caso, a atividade linfoproliferativa utilizando como estímulo o VSA
apresentou correlação positiva com monócitos CD14
+
(P=0,0306/r=0,7541) e negativa
com linfócitos B CD21
+
(P<0,0001/r=–0,8764). Por outro lado, quando foi empregado o
estímulo SLcA para avaliação da atividade linfoproliferativa, foi observado correlação
negativa com monócitos CD14
+
(P=0,0229/r=–0,8924) e correlação positiva com
linfócitos B CD21
+
(P=0,0460/r=0,7630).
Resultados
79
Figura 9: Potenciais células apresentadoras de antígenos e perfil de ativação linfocitária em cães submetidos a diferentes protocolos vacinais:
controle (C; ), saponina (Sap; ), vacina de L. braziliensis (LB; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap;
). No painel superior esquerdo e intermediário estão apresentados os valores médios do número de monócitos CD14
+
circulantes e da
expressão de moléculas de ativação em linfócitos (CD80 e MHC-I) por canal médio de fluorescência (CMF), nos tempos avaliados: T0 = Antes
da primeira imunização, T1 = 15 dias após a primeira imunização; T2 = 15 dias após a segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira
imunização. As diferenças significativas (P<0,05) entre o grupo LBSap e os grupos C, Sap, LB estão representadas pelas letras a, b, c,
respectivamente. O painel superior direito ilustra correlação de Pearson (r) em P<0,05 no grupo LBSap ( ) entre o número de monócitos
CD14
+
e a expressão de linfócitos MHC-I
+
, considerando resultados obtidos em T0, T1, T2 e T3. Os painéis intermediário e inferior ilustram as
correlações de Pearson (r) em P<0,05 no grupo LBSap ( ) entre o número de monócitos CD14
+
ou linfócitos B (LB) CD21
+
e a proliferação de
células mononucleares do sangue periférico (PBMC) em contagens por minutos (CPM), após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA) e
estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA), considerando resultados obtidos em T0 e T3.
Resultados
80
6.2.7 – Avaliação dos níveis de óxido nítrico (NO) no soro e em sobrenadante
de cultura de células mononucleares do sangue periférico estimuladas in vitro
em cães controle e submetidos ao inóculo com saponina, imunizações com
vacina de L. braziliensis, e vacina de L. braziliensis associada à saponina
Considerando a relação de óxido nítrico (NO) com o controle de patógenos
intracelulares, avaliamos indiretamente seus níveis pela análise de nitrito. Desta forma,
sua concentração foi avaliada no soro e em sobrenadante de cultura proveniente de
células mononucleares do sangue periférico estimuladas com antígeno solúvel vacinal
(VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) de cães submetidos a diferentes
protocolos vacinais (Figura 10). É importante ressaltar que a análise in vitro de NO foi
realizado por um índice obtido pela divisão entre as culturas estimuladas com antígenos
(VSA ou SLcA) e as culturas controles não estimuladas. A avaliação de NO sérico não
revelou diferença entre grupos. Entretanto, foi observado aumento significativo
(P<0,05) do índice de NO no grupo LBSap em T3 (0,99 ± 0,22) em relação a T0 (0,48 ±
0,14), nas culturas estimuladas com SLcA.
Resultados
81
Figura 10: Avaliação dos níveis de óxido nítrico (NO) sérico e de sobrenadante de cultura em cães
submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C; ,
), saponina (Sap; ,
), vacina de
L. braziliensis (LB; ,
) e vacina de L. braziliensis associada à saponina (LBSap; ,
). O
painel superior mostra os níveis médios de NO no soro dos diferentes grupos nos tempos: T0 = antes da
primeira imunização, T1 = 15 dias após a primeira imunização; T2 = 15 dias após a segunda
imunização; T3 = 15 dias após a terceira imunização. O painel inferior ilustra o índice médio e desvio
padrão da produção de NO (cultura estimulada com antígeno/cultura controle não estimulada) após
estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA; painel inferior esquerdo) e estímulo com antígeno solúvel
de L. chagasi (SLcA; painel inferior direito). A linha conectando T0 e T3 indica diferença significativa
(P<0,05) no grupo LBSap.
6.3 – Capítulo III
Imunogenicidade de uma nova vacina constituída por
antígenos brutos de Leishmania braziliensis associada à
saliva de Lutzomyia longipalpis e ao adjuvante saponina
Resultados
83
6.3.1 – Análise da reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-saliva no soro de
cães controle e submetidos ao inóculo com saliva, imunizações com vacina de L.
braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e vacina de L. braziliensis
associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
A avaliação da imunogenicidade utilizando a vacina composta por antígenos
brutos de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis contou com o estudo
inicial do perfil da resposta imune humoral anti-extrato de glândula salivar de Lu.
longipalpis (SGE) através da técnica de ELISA. Nesta abordagem, foi utilizada a análise
comparativa entre os grupos C, Sal, LBSal e LBSapSal, como representada pela Figura
11. Desta forma, a avaliação da reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-saliva
demonstrou aumento significativo (P<0,05) da média dos valores de densidade ótica,
acima do limiar de positividade, no grupo LBSapSal em T3 (IgG total: 0,529 ± 0,161;
IgG1: 0,159 ± 0,057; IgG2: 0,618 ± 0,157) quando comparado ao T0 (IgG total: 0,050 ±
0,023; IgG1: 0,023 ± 0,007; IgG2: 0,064 ± 0,030). Além disto, foi observado em T3
aumento significativo (P<0,05) da média dos valores de densidade óptica de IgG total,
IgG1 e IgG2 anti-saliva no grupo LBSapSal quando comparado ao mesmo tempo em
relação aos grupos C (IgG total: 0,053 ± 0,010; IgG1: 0,025 ± 0,012; IgG2: 0,046 ±
0,007), Sal (IgG total: 0,087 ± 0,052; IgG1: 0,039 ± 0,026; IgG2: 0,059 ± 0,031) e
LBSal (IgG total: 0,070 ± 0,025; IgG1: 0,039 ± 0,024; IgG2: 0,053 ± 0,016).
Considerando que as diferenças significativas da avaliação da resposta humoral
anti-saliva apresentaram uma exacerbada reatividade no grupo LBSapSal, uma nova
estratégia de análise foi empregada para se avaliar a correlação entre os isotipos
estudados. Neste sentido, foram realizadas análises de correlações entre os diferentes
grupos vacinais, sendo observado correlações positivas apenas no grupo LBSapSal entre
IgG total e IgG1 (P=0,0244/r=0,6994) bem como entre IgG total e IgG2
(P<0,0001/r=0,9418). De forma similar, IgG1 e IgG2 também apresentaram correlação
significativa (P=0,0174/r=0,7260).
Resultados
84
6.3.2 – Avaliação por western blot do perfil de proteínas anti-saliva no soro de
cães controle e submetidos ao inóculo com saliva, imunizações com vacina de L.
braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e vacina de L. braziliensis
associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
Buscando investigar o reconhecimento de proteínas majoritárias e antigênicas
presentes no extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis e específicas induzidas pela
imunização foram realizados experimentos Western blot, empregando-se extrato de
glândula salivar e soros dos grupos de cães imunizados com saliva (Figura 11). Assim,
foram identificas proteínas presentes apenas quando utilizada a saliva como antígeno
vacinal. Neste sentido, as proteínas que foram reconhecidas apresentaram peso
molecular de 35, 45 e 71 KDa, sendo maior densidade aparente na identificação visual
no grupo LBSapSal. Além disto, aparentemente, apenas o soro proveniente do grupo
LBSal não foi capaz de reconhecer proteínas com peso molecular de 71 KDa.
Resultados
85
Figura 11: Reatividade humoral anti-extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis em soros de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C; ), saliva de
Lu. longipalpis (Sal; ), vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu.
longipalpis (LBSapSal; ). Painel esquerdo ilustra a reatividade de IgG total anti-SGE, IgG1 anti-SGE e IgG2 anti-SGE. O eixo x ilustra os tempos avaliados: T0 = antes da
primeira imunização, T1 = 15 dias após a primeira imunização; T2 = 15 dias após a segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira imunização. O eixo y representa os
valores médios de absorbância pela técnica de ELISA utilizando-se soros diluídos 1:100 [cut-off = 0,10 (IgG total); 0,04 (IgG1); 0,11 (IgG2)]. As diferenças significativas
(P<0,05) estão ilustradas por linhas ligando os valores de T0 e T3. As diferenças significativas (P<0,05) entre os diferentes grupos vacinais considerando T3 estão
representadas pelas letras a, b, c, relacionadas aos grupos C, Sal e LBSal, respectivamente. O painel intermediário ilustra as correlações entre os isotipos anti-saliva (IgG total
X IgG1; IgG total X IgG2 e IgG1 X IgG2) no grupo LBSapSal ( ; r ilustra o índice de correlação de Pearson em P<0,05). O painel direito representa o Western blot anti-SGE
em T3 nos diferentes grupos vacinais. SGE: extrato de glândula salivar de Lu. longipalpis.
Resultados
86
6.3.3 – Análise da reatividade de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania no
soro de cães controle e submetidos ao inóculo com saliva, imunizações com
vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e vacina de L.
braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
Uma outra abordagem buscando-se estudar o perfil da resposta imune humoral
foi realizada pela técnica de ELISA anti-Leishmania. Desta forma, a Figura 12 ilustra os
resultados da avaliação da reatividade sérica de IgG total, IgG1 e IgG2 nos grupos C,
Sal, LBSal e LBSapSal. A avaliação da reatividade de IgG total revelou aumento
significativo (P<0,05) da média dos valores de densidade óptica em T1 no grupo
LBSapsal (0,138 ± 0,078) em relação ao grupo C (0,070 ± 0,017). Além disto, o grupo
LBSapSal apresentou aumento significativo (P<0,05) da média dos valores de
densidade óptica em T2 (0,319 ± 0,051) e T3 (0,329 ± 0,034) em relação aos grupos C
(T2: 0,073 ± 0,029; T3: 0,074 ± 0,018), Sal (T2: 0,065 ± 0,016; T3: 0,077 ± 0,010) e
LBSal (T2: 0,095 ± 0,032; T3: 0,106 ± 0,039). De forma semelhante, o grupo LBSapSal
apresentou aumento significativo (P<0,05) dos valores médios de densidade ótica,
acima do limiar de positividade, tanto para IgG1 como para IgG2 em T2 (IgG1: 0,338 ±
0,106; IgG2: 0,269 ± 0,044) e T3 (IgG1: 0,367 ± 0,081; IgG2: 0,233 ± 0,044) quando
comparado aos mesmos tempos dos grupos C (IgG1- T2: 0,045 ± 0,018, T3: 0,044 ±
0,015; IgG2- T2: 0,044 ± 0,016, T3: 0,043 ± 0,015), Sal (IgG1- T2: 0,086 ± 0,115, T3:
0,086 ± 0,113; IgG2- T2: 0,082 ± 0,067, T3: 0,077 ± 0,060) e LBSal (IgG1- T2: 0,153 ±
0,118, T3: 0,154 ± 0,134; IgG2- T2: 0,070 ± 0,028, T3: 0,061 ± 0,025). Além disto, foi
observado um aumento precoce de IgG2 em T1 no grupo LBSapSal (0,107 ± 0,073) em
relação ao grupo C (0,044 ± 0,018). A análise da razão IgG1/IgG2 revelou aumento
significativo (P<0,05) no grupo LBSal em T1 (1,352 ± 0,240), T2 (1,588 ± 0,561) e T3
(1,801 ± 0,213) quando comparado aos mesmos tempos dos grupos C (T1: 0,945 ±
0,185; T2: 0,961 ± 0,338; T3: 1,057 ± 0,267) e Sal (T1: 0,930 ± 0,239; T2: 0,823 ±
0,373; T3: 0,928 ± 0,447). De forma semelhante, o grupo LBSapSal apresentou
aumento significativo (P<0,05) da razão IgG1/IgG2 em T3 (1,622 ± 0,489) em relação
aos grupos C (1,057 ± 0,267) e Sal (0,928 ± 0,447).
Resultados
87
Figura 12: Reatividade humoral anti-Leishmania em soros de cães submetidos a diferentes
protocolos vacinais: controle (C; ), saliva de Lu. longipalpis (Sal; ), vacina de L.
braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal; ) e vacina de L. braziliensis associada
à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal; ). Painéis superiores e inferior esquerdo
ilustram a reatividade de IgG total anti-Leishmania, IgG1 anti-Leishmania e IgG2 anti-Leishmania.
O eixo x ilustra os tempos avaliados: T0 = antes da primeira imunização, T1 = 15 dias após a
primeira imunização; T2 = 15 dias após a segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira
imunização. O eixo y representa os valores médios de absorbância pela técnica de ELISA
utilizando-se soros diluídos 1:80 [cut-off = 0,12 (IgG total); 0,17 (IgG1); 0,09 (IgG2)]. O painel
inferior direito ilustra a média do índice IgG1/IgG2 nos diferentes grupos vacinais. As diferenças
significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras a, b, c, relacionadas aos grupos C, Sal e
LBSal, respectivamente.
Resultados
88
6.3.4 – Leucograma de cães controle e submetidos ao inóculo com saliva,
imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis
e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
A análise inicial da resposta celular pré e pós-vacinal focalizou na avaliação do
número médio e desvio padrão das populações de neutrófilos totais, eosinófilos,
linfócitos, monócitos bem como a global de leucócitos (Tabela 6).
Desta maneira, a análise inicial demonstrou pela avaliação da média global de
leucócitos aumento significativo (P<0,05) no grupo LBSal (12.100 ± 1.206) em relação
ao grupo Sal (9.200 ± 1.175) em T1. Além disto, neste mesmo período (T1) foi
observado aumento significativo (P<0,05) da média global de leucócitos no grupo
LBSapSal (14.820 ± 2.043) em relação aos grupos C (11.111 ± 1.503), Sal (9.200 ±
1.175) e LBSal (12.100±1.206). Ainda em T1, foi observado aumento significativo
(P<0,05) do número de neutrófilos totais no grupo LBSapSal (7.224 ± 1.727) em
relação ao grupo Sal (4.959 ± 1.162).
Após a segunda dose vacinal (T2) o grupo LBSal (10.700 ± 490) apresentou
aumento significativo (P<0,05) da média da global de leucócitos em relação ao grupo
Sal (9.075 ± 1.115). Além disto, o número absoluto de eosinófilos apresentou-se
significativamente maior (P<0,05) em T2 no grupo LBSal (762 ± 218) em relação ao
grupo Sal (325 ± 167). Adicionalmente, foi observada redução significativa (P<0,05)
desta população celular no grupo Sal (325±167) quando comparada ao grupo C
(817±301) no mesmo período (T2).
Após a terceira dose vacinal (T3) foi observado aumento significativo (P<0,05)
do número de eosinófilos no grupo LBSapSal (733 ± 296) em relação ao grupo C (318 ±
111).
Resultados
89
Tabela 6 – Leucograma de cães controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais
Leucograma
T0
C Sal LBSal LBSapSal
Global de Leucócitos
11.260±2.571 10.700±1.513 14.020±3.104 14.460±3.186
Neutrófilos Totais 5.920±2.569 4.667±1.189 5.900±1.697 6.400±2.691
Eosinófilos 599±418 710±556 655±230 1.119±1.062
Linfócitos 3.754±719 4.442±217 4.110±242 3.625±537
Monócitos 466±249 438±250 536±387 499±172
T1
Global de Leucócitos
11.111±1.503 9.200±1.175
12.100±1.206
b
14.820±2.043
a,b,c
Neutrófilos Totais 5.253±1.877 4.959±1.162 6.268±1.784
7.224±1.727
b
Eosinófilos 638±463 732±300 632±509 1.300±1.125
Linfócitos 3.965±749 3.955±2.523 4.764±2.027 5.291±1.048
Monócitos 449±254 314±164 436±177 511±210
T2
Global de Leucócitos
10.470±2.532 9.075±1.115
10.700±490
b
11.900±2.885
Neutrófilos Totais 6.389±1.576 5.626±866 6.120±664 7.816±2.272
Eosinófilos 817±301
325±167ª 762±218
b
671±329
Linfócitos 3.181±946 3.168±1.362 3.541±1.182 3.178±762
Monócitos 382±234 302±97 277±90 235±85
T3
Global de Leucócitos
10.643±2.231 8.640±2.103 9.680±1.819 10.680±1.112
Neutrófilos Totais 5.610±1.407 5.005±1.125 5.772±1.639 6.168±1.080
Eosinófilos 318±111 393±158 594±585
733±296
a
Linfócitos 3.526±1.396 3.009±1.628 3.062±1.111 3.452±995
Monócitos 270±138 233±158 252±130 326±110
Valores absolutos (média ± desvio padrão) do leucograma de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais:
controle (C), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal)
e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal). T0 = antes da primeira
imunização, T1 = 15 dias após a primeira imunização; T2 = 15 dias após a segunda imunização; T3 = 15 dias após
a terceira imunização. As diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras a, b, c, relacionadas
aos grupos C, Sal, LBSal, respectivamente.
Resultados
90
6.3.5 – Análise do número de linfócitos sanguíneos e do perfil fenotípico de
células T (CD5
+
, CD4
+
e CD8
+
) e células B (CD21
+
) circulantes no sangue
periférico de cães controle e submetidos ao inóculo com saliva, imunizações
com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e vacina de
L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
A análise detalhada do perfil imunofenotípico em linfócitos sanguíneos revelou
importantes alterações relacionadas ao processo vacinal, particularmente no grupo
LBSapSal (Figura 13). Foi observado aumento significativo (P<0,05) do valor médio
absoluto de linfócitos T (LT) CD5
+
em T1 no grupo LBSal (3.450 ± 667) e LBSapSal
(3.924 ± 1283) em relação aos grupos C (2.188 ± 490) e Sal (1.623 ± 559). Além disto,
o grupo LBSal apresentou aumento significativo (P<0,05) desta população celular em
T2 (2.830 ± 547) em relação ao grupo Sal (1.825 ± 1174). O aumento de LT CD5
+
em
T1 no grupo LBSapSal foi representado pela expansão das subpopulações de linfócitos
T no mesmo tempo, com aumento significativo (P<0,05) tanto de LT CD4
+
(1.985 ±
369) em relação aos grupos C (1.281 ± 31), Sal (1.274 ± 456) e LBSal (1.340 ± 449)
como de LT CD8
+
(1.666 ± 609) em relação aos grupos C (810 ± 200) e Sal (1.121 ±
1190). De forma interessante, foi observado aumento significativo (P<0,05) do valor
médio absoluto de linfócitos B (LB) CD21
+
no grupo LBSapSal (1.860 ± 882), no
mesmo tempo (T1) em que foram observadas a maioria das alterações de LT, quando
comparado aos grupos C (688 ± 208), Sal (769 ± 398) e LBSal (668 ± 258). Além disto,
foi observada redução significativa (P<0,05) desta população celular no grupo LBSal
em T2 (337 ± 94) e T3 (416 ± 79) em relação aos mesmos tempos do grupo C (T2: 650
± 191; T3: 615 ± 90).
No intuito de se ampliar as investigações sobre os fenótipos de linfócitos
circulantes, foram realizadas análises de correlações entre as populações e
subpopulações linfocitárias (Figura 13). Neste sentido, apenas o grupo LBSapSal
apresentou correlações significativas para esta avaliação. Assim, foi observada uma
possível cooperação T-B evidenciada pela correlação positiva entre LT CD4
+
e LB
CD21
+
(P=0,0440/r=0,4667). Análises adicionais evidenciaram correlações positivas
entre a população de LT CD5
+
e as subpopulações de LT CD4
+
(P<0,0001/r=0,8376) e
LT CD8
+
(P<0,0001/r=0,9071), e entre as subpopulações LT CD4
+
e LT CD8
+
(P=0,0003/r=0,7229) no grupo LBSapSal.
Resultados
91
Figura 13: Perfil celular de linfócitos circulantes em cães submetidos a diferentes protocolos
vacinais. Painel superior ilustra a média e desvio padrão do número de linfócitos circulantes dos
grupos: controle (C; ), saliva de Lu. longipalpis (Sal; ), vacina de L. braziliensis associada à
saliva de Lu. longipalpis (LBSal; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de
Lu. longipalpis (LBSapSal; ). O painel intermediário esquerdo ilustra o fenótipo de linfócitos
circulantes dos grupos: controle (C; ), saliva de Lu. longipalpis (Sal; ), vacina de L.
braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal; ) e vacina de L. braziliensis
associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal; ). O eixo x ilustra os tempos
avaliados: T0 = antes da primeira imunização, T1 = 15 dias após a primeira imunização; T2 = 15
dias após a segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira imunização. O eixo y representa os
valores médios e desvio padrão do número de linfócitos (painel superior) e do número médio e
desvio padrão de linfócitos T (LT) CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
e de linfócitos B (LB) CD21
+
(painel
intermediário esquerdo). As diferenças significativas (P<0,05) em relação aos grupos C, Sal,
LBSal estão representadas pelas letras a, b, c, respectivamente. O painel intermediário direito e
inferior ilustram as correlações de Pearson (r) em P<0,05 entre os linfócitos circulantes do grupo
LBSapSal.
Resultados
92
6.3.6 – Avaliação da atividade linfoproliferativa e do perfil imunofenotípico de
linfócitos (CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
, CD21
+
) submetidos a estimulação antigênica
com antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) em
células de cães controle e submetidos ao inóculo com saliva, imunizações com
vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e vacina de L.
braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
A avaliação da capacidade linfoproliferativa antígeno-específica foi realizada
após o término do protocolo vacinal (T3) em relação ao período inicial (T0) e avaliada
utilizando dois estímulos antigênicos distintos: antígeno solúvel vacinal (VSA) e
antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) (Figura 14).
Foi observada redução significativa (P<0,05) do índice de proliferação no grupo
Sal em T3 em relação a T0, tanto quando se utilizou VSA (T0: 1,6 ± 0,2; T3: 1,1 ± 0,2),
como quando utilizado SLcA (T0: 1,9 ± 0,8; T3: 0,9 ± 0,3) como estímulo antigênico.
Adicionalmente, o grupo Sal apresentou redução significativa (P<0,05) da atividade
linfoproliferativa em T3 (0,9 ± 0,3) para as culturas estimuladas com SLcA, quando
comparado ao mesmo tempo e estímulo do grupo C (1,8 ± 0,7). Por outro lado, o grupo
LBSapSal apresentou aumento significativo (P<0,05) do índice de proliferação em T3
comparado a T0 quando se utilizou os estímulos VSA (T0: 1,4 ± 0,1; T3: 1,7 ± 0,2) e
SLcA (T0: 1,7 ± 0,5; T3: 3,1 ± 1,2). Adicionalmente, quando se avaliou a atividade
linfoproliferativa em T3 entre os diferentes grupos, foi observado aumento significativo
(P<0,05) do índice de proliferação no grupo LBSapSal (1,7 ± 0,2) em relação aos
grupos Sal (1,1 ± 0,2) e LBSal (1,0 ± 0,2) utilizando estimulação com VSA. Além disto,
a atividade linfoproliferativa utilizando estimulação com SLcA apresentou índice de
proliferação significativamente maior (P<0,05) em T3 para o grupo LBSapSal (3,1 ±
1,2) quando comparado aos grupos C (1,8 ± 0,7), Sal (0,9 ± 0,3) e LBSal (1,0 ± 0,6). É
importante ressaltar que a resposta linfoproliferativa não específica obtida pelo estímulo
mitogênico com PHA resultou em valores médios entre 8 e 15 de índice de proliferação,
confirmando a viabilidade da suspensão celular nos diferentes grupos avaliados.
A avaliação do perfil imunofenotípico de PBMC estimuladas in vitro após a
terceira dose (T3) foi realizada pela análise comparativa entre as culturas controle não
estimuladas (CC) e às culturas estimuladas (VSA ou SLcA) (Figura 14). Foi observado
no grupo LBSapSal aumento significativo (P<0,05) na freqüência da subpopulação de
linfócitos T CD8
+
das culturas estimuladas tanto com VSA (26,3 ± 1,9) como por SLcA
(27,6 ± 2) em relação às CC (22,9 ± 2,7).
Resultados
93
Figura 14: Índice de proliferação médio e desvio padrão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtido pela análise em contagens por minutos (CPM) em
linfócitos de cães submetidos a diferentes protocolos vacinais, após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA; painel superior esquerdo) e estímulo com antígeno solúvel
de L. chagasi (SLcA; painel superior direito). Os painéis intermediário e inferior ilustram o perfil imunofenotípico de PBMC estimulados in vitro com os antígenos VSA
(painel esquerdo) e SLcA (painel direito) avaliados 15 dias após a terceira dose (T3) nos diferentes grupos: controle (C;
), saliva de Lu. longipalpis (Sal; ), vacina de L.
braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal; ). Os resultados estão
expressos como média e desvio padrão das freqüências de linfócitos T (LT) CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
e de linfócitos B (LB) CD21
+
em culturas controles não estimuladas (CC) e
em culturas estimuladas (CE) com VSA ou SLcA. As linhas conectando T0 e T3 da proliferação celular ou do fenótipo de CC e CE indicam diferenças significativas
(P<0,05). As diferenças estatísticas significativas (P<0,05) 15 dias após a terceira dose (T3) entre o grupo LBSapSal e os grupos C, Sal, LBSal estão representadas pelas letras
a, b, c, respectivamente.
Resultados
94
6.3.7 – Análise de correlações entre a atividade linfoproliferativa e o perfil
imunofenotípico de linfócitos (CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
) submetidos a estimulação
antigênica com antígeno solúvel vacinal (VSA) e antígeno solúvel de L. chagasi
(SLcA) em células de cães controle e submetidos ao inóculo com saliva,
imunizações com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis
e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
A avaliação da correlação entre a atividade linfoproliferativa (CPM) e a
freqüência do fenótipo de células submetidas à cultura revelou diferença apenas nos
grupos Sal e LBSapSal (Figura 15). Desta forma, o percentual de LT CD4
+
do grupo Sal
apresentou correlação negativa com a atividade linfoproliferativa quando utilizados os
estímulos VSA (P=0,0117/r=–0,7878) e SLcA (P=0,0301/r=–0,7157). Por outro lado, o
percentual de LT CD8
+
do grupo LBSapSal apresentou correlação positiva com a
atividade linfoproliferativa tanto quando empregado estímulo VSA
(P=0,0417/r=0,6527) como quando utilizado o SLcA (P=0,0460/r=0,7042).
Resultados
95
Figura 15: Correlação entre proliferação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) em contagens por minutos (CPM) e as freqüências de linfócitos T (LT)
CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
, considerando resultados obtidos em T0 (antes da primeira imunização) e T3 (15 dias após a terceira imunização), após estímulo com antígeno solúvel
vacinal (VSA) e estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA). Os painéis superior e intermediário ilustram os resultados obtidos nos grupos de cães submetidos a
imunização com saliva de Lu. longipalpis (Sal; ) e vacina de L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal; ), respectivamente. O painel
inferior ilustra os resultados obtidos no grupo vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal). As diferenças estatísticas significativas estão
representadas pelas correlações de Pearson (r) em P<0,05 nos grupos Sal (painel superior) e LBSapSal (painel intermediário).
Resultados
96
6.3.8 – Avaliação do número de monócitos CD14
+
sanguíneos, do perfil de
ativação linfocitária pela expressão de CD80 e MHC-I e do possível papel de
monócitos CD14
+
e linfócitos B CD21
+
como potenciais células apresentadoras
de antígenos em cães controle e submetidos ao inóculo com saliva, imunizações
com vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e vacina de
L. braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
Buscando-se avaliar o perfil de potenciais células apresentadoras de antígenos, o
número de monócitos CD14
+
foi estudado em diferentes grupos vacinais (Figura 16).
Desta forma, foi observado aumento significativo (P<0,05) do valor médio absoluto de
monócitos CD14
+
no grupo LBSapSal em T1 (41 ± 11) quando comparado ao grupo Sal
(19 ± 12). Subsequentemente, em T2, foi observado pela avaliação de marcadores de
ativação linfocitária, por canal médio de fluorescência, aumento da expressão de
linfócitos CD80
+
no grupo LBSapSal (169,8 ± 116,5) em relação aos grupos C (19,5 ±
9,8) e Sal (13,7 ± 4,9). Posteriormente, em T3, o grupo LBSapSal apresentou aumento
da expressão de linfócitos MHC-I
+
(112,8 ± 63,4) quando comparado ao grupo C (57,3
± 20,2). Além disto, foi observado redução na expressão deste marcador no grupo
LBSal (38,1 ± 8,4) em relação aos grupos C (56,5 ± 14,4) e Sal (65,2 ± 14,6) em T1.
Considerando que os principais eventos relacionados ao aumento da população
de monócitos CD14
+
, aumento da expressão de linfócitos CD80
+
e de linfócitos MHC-I
+
ocorreram no grupo LBSapSal, nos períodos de T1, T2 e T3, respectivamente, uma
nova abordagem focalizando a correlação entre estes marcadores foi avaliada. Esta
estratégia buscou avaliar a relação entre aumento de potenciais células apresentadoras
de antígenos (monócitos CD14
+
) e a subseqüente ativação linfocitária (pela expressão
de CD80 e MHC-I) nos tempos em que foram observadas diferenças significativas.
Assim, foi demonstrado no grupo LBSapSal correlação positiva entre o aumento do
número de monócitos CD14
+
em T1 com a expressão de linfócitos CD80
+
em T2
(P=0,0252/r=0,9748) e com a expressão de linfócitos MHC-I
+
em T3
(P=0,0241/r=0,9759). Além disto, a expressão de linfócitos CD80
+
em T2 apresentou
correlação positiva com a expressão de linfócitos MHC-I
+
em T3 (P=0,0063/r=0,9937).
Assim, ficou demonstrado no grupo LBSapSal cães com maiores contagens do número
de monócitos CD14
+
em T1 também apresentam aumento da expressão de linfócitos
CD80
+
em T2 e da expressão de linfócitos MHC-I
+
em T3 de forma proporcional
(Figura 16, painel intermediário direito).
Resultados
97
O estudo da relação entre potenciais células apresentadoras de antígenos
(monócitos CD14
+
e linfócitos B CD21
+
) e a atividade linfoproliferativa com estímulos
antigênicos distintos (antígeno solúvel vacinal: VSA; antígeno solúvel de L. chagasi:
SLcA) foi avaliada (Figura 16). Foram observadas diferenças apenas nos grupos Sal e
LBSapSal. Desta forma, no grupo Sal, o número de monócitos CD14
+
apresentou
correlação negativa com a atividade linfoproliferativa quando utilizados os estímulos
VSA (P=0,0368/r=–0,7619) e SLcA (P=0,0341/r=–0,8214). Por outro lado, no grupo
LBSapSal foi demonstrado correlação positiva entre o número de monócitos CD14
+
e a
atividade linfoproliferativa quando utilizado SLcA (P=0,0262/r=0,7280).
Resultados
98
Figura 16: Potenciais células apresentadoras de antígenos e perfil de ativação linfocitária em cães
submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C; ), saliva de Lu. longipalpis (Sal; ),
vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal; ) e vacina de L. braziliensis
associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal; ). No painel superior estão
apresentados os valores médios do número de monócitos CD14
+
circulantes e da expressão de moléculas
de ativação em linfócitos (CD80 e MHC-I) por canal médio de fluorescência (CMF), nos tempos
avaliados: T0 = antes da primeira imunização, T1 = 15 dias após a primeira imunização; T2 = 15 dias
após a segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira imunização. As diferenças significativas
(P<0,05) entre o grupo LBSapSal e os grupos C, Sal estão representadas pelas letras a, b,
respectivamente. O painel intermediário ilustra as correlações de Pearson (r) em P<0,05 no grupo
LBSapSal ( ) entre o número de monócitos CD14
+
em T1 e a expressão de linfócitos CD80
+
em T2 e
MHC-I
+
em T3. O painel intermediário direito mostra a relação entre o número de monócitos CD14
+
e a
expressão de moléculas de ativação celular em linfócitos (CD80 e MHC-I). O painel inferior ilustra as
correlações de Pearson (r) nos grupos Sal ( ) e LBSapSal ( ) entre o número de monócitos CD14
+
ou
linfócitos B (LB) CD21
+
e a proliferação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) em
contagens por minutos (CPM), após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA) e estímulo com
antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA), considerando resultados obtidos em T0 (antes da primeira
imunização) e T3 (15 dias após a terceira imunização).
Resultados
99
6.3.9 – Avaliação dos níveis de óxido nítrico (NO) no soro e em sobrenadante
de cultura de células mononucleares do sangue periférico estimuladas in vitro
em cães controle e submetidos ao inóculo com saliva, imunizações com vacina
de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis e vacina de L.
braziliensis associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis
O estudo de óxido nítrico (NO) foi realizado de forma indireta pela avaliação
dos níveis de nitrito no soro e em sobrenadante de cultura proveniente de células
mononucleares do sangue periférico estimuladas com antígeno solúvel vacinal (VSA) e
antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA) de cães submetidos a diferentes protocolos
vacinais (Figura 17). O grupo LBSapSal apresentou níveis séricos de NO
significativamente crescentes (P<0,05) em T1 (26,75 ± 12,81) e T2 (28,94 ± 1,38) em
relação aos mesmos tempos do grupo C (T1: 16,66 ± 4,75; T2: 17,56 ± 8,33). De forma
interessante, em T3 foi observado aumento dos níveis séricos de NO nos grupos
LBSapSal (38,14 ± 5,15) e LBSal (39,65 ± 13,77) em relação aos grupos C (18,01 ±
3,43) e Sal (19,91 ± 9,03). Embora tenha sido observado tendência de aumento do
índice de NO no grupo LBSapSal no sobrenadante de culturas estimuladas com VSA e
SLcA em T3 em relação a T0, este aumento não apresentou diferença significativa
(P<0,05).
Resultados
100
Figura 17: Avaliação dos níveis de óxido nítrico (NO) sérico e de sobrenadante de cultura em cães
submetidos a diferentes protocolos vacinais: controle (C; ,
), saliva de Lu. longipalpis (Sal; , ),
vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal; , ) e vacina de L. braziliensis
associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal; , ). O painel superior mostra os níveis
médios de NO no soro dos diferentes grupos nos tempos: T0 = antes da primeira imunização, T1 = 15 dias
após a primeira imunização; T2 = 15 dias após a segunda imunização; T3 = 15 dias após a terceira
imunização. As diferenças significativas (P<0,05) em relação aos grupos C, Sal estão representadas pelas
letras a, b, respectivamente. O painel inferior ilustra o índice médio e desvio padrão da produção de NO
(cultura estimulada com antígeno/cultura controle não estimulada) após estímulo com antígeno solúvel
vacinal (VSA; painel inferior esquerdo) e estímulo com antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA; painel
inferior direito).
6.4 – Resumo de Resultados
Resumo de Resultados
102
No Diagrama 2 estão ilustrados os principais resultados obtidos pela análise das
diferentes estratégias vacinais. Desta forma, no quadro leucocitário do grupo LB foi
observado aumento do número de neutrófilos totais e eosinófilos além de diminuição de
linfócitos. Adicionalmente, foi observada redução da atividade linfoproliferativa VSA-
e SLcA-específicas, aumento da freqüência de linfócitos T CD5
+
e CD4
+
SLcA-
específicos e diminuição tanto da freqüência de linfócitos B CD21
+
VSA-específicos
como do número de monócitos CD14
+
.
No grupo Sap foi observado queda do número global de leucócitos e de
linfócitos avaliados pelo leucograma, bem como redução da freqüência de linfócitos B
CD21
+
VSA- e SLcA-específicos e do número de monócitos CD14
+
.
Foi relatado no grupo Sal a presença de proteínas séricas anti-SGE com peso
molecular de 35, 45 e 71 KDa e redução da atividade linfoproliferativa VSA- e SLcA-
específicas.
De forma similar, no grupo LBSal foi constatada a presença de proteínas séricas
anti-SGE com peso molecular de 35 e 45 KDa. A avaliação celular pelo quadro
leucocitário revelou diminuição do número de eosinófilos. Adicionalmente, o fenótipo
do sangue apresentou aumento do número de linfócitos T CD5
+
e diminuição tanto do
número de linfócitos B CD21
+
como da expressão da molécula de ativação celular
MHC-I em linfócitos. Foi observado também aumento dos níveis de NO (óxido nítrico)
sérico neste grupo.
No grupo LBSap foi observado pela análise do leucograma aumento do número
de linfócitos. Adicionalmente, foi relatado aumento da freqüência de linfócitos T CD21
+
VSA- e SLcA-específicos e aumento dos níveis de NO avaliados no sobrenadante de
cultura estimulada com SLcA.
Aumento da reatividade sérica de IgG total, IgG1, IgG2 anti-SGE, foi relatado
no grupo LBSapSal, sendo identificadas proteínas séricas anti-SGE com peso molecular
de 35, 45 e 71 KDa. Além disto, foi observado pela avaliação celular aumento do
número de neutrófilos totais e aumento da expressão da molécula de ativação
linfocitária CD80. Além disto, foi observado também aumento dos níveis de NO sérico
neste grupo.
De forma interessante, os grupos LBSap e LBSapSal compartilharam um
conjunto de alterações do sistema imune induzidos pelo processo vacinal. Desta forma,
foi observado aumento da reatividade sérica de IgG total, IgG1, IgG2 anti-Leishmania.
Foi relatado também pela avaliação do quadro leucocitário aumento do número global
Resumo de Resultados
103
de leucócitos e de eosinófilos. Além disto, foi observado pelas análises
imunofenotípicas aumento do número de linfócitos T (CD5
+
, CD4
+
e CD8
+
) e B
(CD21
+
). Foi relatado aumento da atividade linfoproliferativa VSA e SLcA-específicas
e aumento da freqüência de linfócitos T CD8
+
VSA- e SLcA-específicos pelas
avaliações in vitro. Adicionalmente, foi observado aumento do número de monócitos
CD14
+
e da expressão da molécula de ativação linfocitária MHC-I pelos grupos LBSap
e LBSapSal.
Resumo de Resultados
104
Diagrama 2: Resumos dos principais resultados observados em cães submetidos a diferentes protocolos vacinais: saponina (Sap), vacina de L. braziliensis (LB), vacina de L.
braziliensis associada à saponina (LBSap), saliva de Lu. longipalpis (Sal), vacina de L. braziliensis associada à saliva de Lu. longipalpis (LBSal) e vacina de L. braziliensis
associada à saponina e à saliva de Lu. longipalpis (LBSapSal).
7. Discussão
Discussão
106
A crescente expansão da leishmaniose visceral (LV) no Brasil (Ministério da
Saúde, 2003) e no mundo (Desjeux, 2004) aponta para a complexidade do controle
deste parasito, mesmo se conhecendo os principais pontos críticos que norteiam as
medidas de controle. Neste sentido, o controle de LV tem sido baseado em um “tripé”
de ações buscando a redução dos casos de LV humana e canina (Alencar, 1961,
Magalhães et al., 1980, Ministério da Saúde, 2003) pelo tratamento de casos humanos,
eliminação dos reservatórios domésticos (cães infectados), e combate ao vetor,
utilizando-se inseticidas residuais aspergidos no domicílio e peridomicílio. De forma
interessante, alguns estudos propõem que a eutanásia de cães com LV apresenta-se
como uma medida de baixo impacto na incidência de casos caninos e humanos (Dye,
1996, Dietze et al., 1997), tornando ainda mais polêmica e questionável a eutanásia de
cães com LV. Entretanto, estes estudos vêm sendo criticados, seja pelo uso de modelos
matemáticos que poderiam não refletir a realidade da área endêmica ou ainda por não
relatarem o número de cães em estudo, a prevalência e incidência da LV humana e
canina (Palatnik-de-Sousa et al., 2001). Desta forma, a importância do cão como
reservatório do parasito, como já demonstrado por Deane (1956) e Deane (1961), parece
ser coerente, considerando que a eutanásia de cães com LV está associada à redução da
incidência da doença (Ashford et al., 1993, Braga et al., 1998, Jerônimo et al., 2000).
Considerando a importância do cão como mantenedor da LV no ambiente
urbano (Deane, 1961, Palatnik-de-Sousa et al., 2001) e a resistência de proprietários de
cães soropositivos submeterem seus animais a eutanásia (França-Silva et al., 2003,
Palatnik-de-Sousa et al., 2001) torna-se importante a investigação de alternativas para o
controle da LV como o desenvolvimento de estratégias vacinais contra a leishmaniose
visceral canina (LVC). Neste sentido, o desenvolvimento de uma vacina anti-LVC
poderia ser a estratégia mais prática e efetiva para se reduzir a incidência tanto da LV
humana como canina, além de possibilitar o desenvolvimento de uma vacina similar
para o homem (Abranches et al., 1991, Hommel et al., 1995, Gradoni, 2001, Mauel,
2002).
No intuito de se desenvolver uma vacina contra LV, um grande esforço tem sido
realizado para se identificar potenciais antígenos vacinais utilizando-se subunidades
protéicas molecularmente bem definidas (ou vacinas de segunda geração) em modelo
murino (Modabber, 1995, Wilson et al., 1995, Webb et al., 1996, Webb et al., 1998,
Dole et al., 2000, Dumonteil et al., 2001, Gradoni, 2001, Handman, 2001, Mauel, 2002,
Brodskyn et al., 2003, Ravindran e Ali, 2004, Requena et al., 2004, Khamesipour et al.,
Discussão
107
2006). Entretanto, a triagem de antígenos vacinais utilizando este modelo não pode ser
necessariamente extrapolada a outras espécies (Gradoni, 2001), ilustrando a
complexidade da relação Leishmania-hospedeiro. Um exemplo clássico deste fato pode
ser ilustrado pelos estudos do imunobiológico avaliado por Monjour et al. (1988) que se
apresentou efetivo em modelo murino, mas sem oferecer proteção quando testado em
cães (Dunan et al., 1989). Neste sentido, a melhor estratégia para triagem de potenciais
antígenos candidatos a vacina anti-LVC seria a avaliação utilizando o próprio cão como
modelo experimental (Gradoni, 2001, Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c,
Giunchetti et al., 2008d). Além disto, buscando ampliar o alcance de um
imunoprofilático desenvolvido para atuar contra LVC e que também seja efetivo contra
LV humana, o modelo canino possibilitaria uma vantagem adicional para teste de
vacinas considerando a proximidade genética com o homem (Kirkness et al., 2003,
Starkey et al., 2005).
É importante ressaltar que a avaliação do sistema imune canino, utilizando
ferramentas metodológicas capazes de oferecer maior acurácia nos estudos de
imunogenicidade vem sendo desenvolvida recentemente. Neste sentido, uma importante
contribuição foi dada pela padronização da metodologia de citometria de fluxo para
imunofenotipagem de leucócitos caninos (Fujiwara et al., 2005, Reis et al., 2005). O
estabelecimento desta metodologia no Brasil favoreceu os estudos da história natural da
LVC, buscando associar um perfil de resposta imunofenotípica ligado a resistência ou
susceptibilidade a infecção por L. chagasi, até então não muito clara em cães (Reis,
2001, Reis et al., 2006c, Giunchetti et al., 2008a). Estes trabalhos e outros que
avaliaram as alterações imunopatológicas na LVC (Bourdoiseau et al., 1997b,
Giunchetti, 2004, Chamizo et al., 2005, Giunchetti et al., 2006, Giunchetti et al., 2008b,
Lage et al., 2007) favoreceram a identificação de biomarcadores estratégicos para
avaliações prognósticas de novos esquemas quimioterápicos bem como em testes de
imunogenicidade de vacinas anti-LVC.
As avaliações de vacinas anti-LVC utilizando subunidades protéicas com
antígenos recombinantes ainda são escassas. Os poucos estudos descritos em cães
relatam que proteínas recombinantes obtidas de L. major (MAPS/TSA, LmSTI1, LeIF;
Fujiwara, 2003) ou de L. infantum (H1 e HASPB1; Moreno et al., 2007) não têm
apresentado resultados satisfatórios de eficácia. De forma similar, vacinas de DNA
também apresentam resultados ainda muito incipientes no que diz respeito ao
desenvolvimento de resposta imune associada a proteção contra LVC (Ramiro et al.,
Discussão
108
2003, Rafati et al., 2005, Poot et al., 2006, Saldarriaga et al., 2006, Rodriguez-Cortes et
al., 2007), apesar de já serem amplamente utilizadas como imunoprofiláticos contra
vírus caninos (Jiang et al., 1998, Osorio et al., 1999, Cherpillod et al., 2000).
Provavelmente, a dificuldade em se obter um imunobiológico utilizando antígenos
recombinantes ou vacinas de DNA contra protozoários, capaz de proteger o cão contra a
infecção por L. chagasi esteja associada a grande diversidade do repertório antigênico
expresso pelo parasito.
Buscando desenvolver um imunobiológico capaz de ativar um maior repertório
de linfócitos T Leishmania-específicos, o estudo de uma vacina a partir de proteínas
secretadas e excretadas de promastigotas de L. infantum denominado de LiESAp, vem
sendo realizado por um grupo francês liderado pelo Dr. Papierok, apresentando indução
da resposta imune em cães compatível com proteção (Holzmuller et al., 2005, Lemesre
et al., 2005, Lemesre et al., 2007). Este imunoprofilático foi testado em um ensaio
clínico vacinal de fase III na França, mostrando forte resposta celular e eficácia de 92%
em cães vacinados com LiESAp (Lemesre et al., 2007). Lamentavelmente, a produção
desta vacina apresenta dificuldades tanto na obtenção das proteínas como na
estabilidade antigênica (Papierok, comunicação pessoal), dificultando sua produção em
escala industrial.
Recentemente foi descrito um imunoprofilático anti-LVC utilizando o complexo
glicoprotéico purificado a partir de promastigotas de L. donovani, denominado por FML
(fucose mannose ligand). Este imunobiológico foi descrito pelo grupo da Profa.
Palatnik-de-Sousa da Universidade Federal do Rio de Janeiro sendo avaliado em
ensaios clínicos vacinais de fase III (da Silva et al., 2000, Borja-Cabrera et al., 2002).
Nestes estudos ficou demonstrada uma forte imunidade protetora, atingindo taxas de
proteção de 92% após dois anos de avaliação (da Silva et al., 2000). Em outro estudo de
fase III foram relatados 95% de proteção e 80% de eficácia nos cães vacinados com
FML (Borja-Cabrera et al., 2002).
Considerando estes promissores resultados, a Fort Dodge Saúde Animal Ltda.
recentemente comprou o direito de produção deste imunobiológico, registrando o
produto em 2003 no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) que
passou a se chamar Leishmune®, estando atualmente disponível no mercado de
produtos veterinários para vacinação de cães residentes em áreas endêmicas para LV no
Brasil. Entretanto, a Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde sendo o
órgão público federal responsável pela normatização das ações do Programa de
Discussão
109
Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral (PVCLV) no país, não reconhece esta
vacina, pois considera que ainda não há evidências científicas sobre sua utilização. O
posicionamento do Ministério da Saúde está baseado na falta de comprovação da
prevenção da infecção e infectividade do cão vacinado para o vetor, na impossibilidade
de diferenciar a infecção natural da vacinação, dificultando assim, as ações de vigilância
e controle do PVCLV e na incerteza da real capacidade em se reduzir casos humanos
em áreas endêmicas para LV (Ministério da Saúde, 2005). Desta forma, o Ministério da
Saúde reforça a não indicação da vacinação animal com a Leishmune® para o controle
da LV assim como mantém a indicação de eutanásia de animais sororreagentes, mesmo
vacinados, que porventura sejam encontrados nas áreas de transmissão por inquéritos
soroepidemiológicos caninos (Ministério da Saúde, 2005).
Apesar do grande esforço na tentativa de identificação de antígenos
recombinantes candidatos a vacinas, em função de serem subunidades protéicas bem
definidas que apresentariam maior facilidade de padronização do produto final, os
resultados ainda pouco expressivos empregando esta abordagem estimulam o avanço da
utilização de vacinas compostas por antígenos semi-purificados (da Silva et al., 2000,
Borja-Cabrera et al., 2002) ou secretados e excretados (Holzmuller et al., 2005,
Lemesre et al., 2005, Lemesre et al., 2007) ou ainda utilizando antígenos brutos
(Mayrink et al., 1996, Lasri et al., 1999, Panaro et al., 2001, Araújo, 2006, Giunchetti et
al., 2007, Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al., 2008d). Provavelmente estes
antígenos apresentam maiores chances de sucesso no desenvolvimento de vacinas
contra protozoários já que contemplam múltiplas subunidades antigênicas com
capacidade de ativação de um maior repertório de linfócitos T (Giunchetti et al., 2007,
Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al., 2008d). Além disto, apresentam maior
estabilidade e segurança em relação às subunidades purificadas ou vacinas de DNA, que
necessitam de tecnologia mais sofisticada de produção, muitas vezes inacessível a
países em desenvolvimento (Khamesipour et al., 2006, Giunchetti et al., 2007,
Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al., 2008d). As vacinas de antígenos brutos
apresentam ainda uma vantagem adicional relacionada a menor necessidade de se
realizar testes para se chegar a um produto final, minimizando os custos de produção
(Khamesipour et al., 2006).
Neste sentido, vacinas de antígenos brutos ainda são consideradas atrativas e
apresentam resultados muito promissores para o controle da infecção na LVC (Mayrink
et al., 1996, Lasri et al., 1999, Panaro et al., 2001, Araújo, 2006, Giunchetti et al., 2007,
Discussão
110
Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al., 2008d) e por este motivo foram
desenvolvidas e avaliadas neste trabalho.
O início da caracterização dos imunobiológicos avaliados neste estudo contou
com a descrição de importantes parâmetros relacionados a segurança biológica
conferida durante as imunizações. Neste sentido, o estudo de aspectos relacionados a
inocuidade e toxicidade focalizando na avaliação de novos imunobiológicos se
apresenta como uma etapa fundamental pois possibilita a identificação de alterações
incompatíveis com a administração do produto testado. Uma vez estabelecidas estas
avaliações o imunobiológico estará pronto para os ensaios de imunogenicidade e
eficácia.
As avaliações da inocuidade e toxicidade realizadas neste trabalho não
identificaram alterações clínicas que comprometessem a saúde dos animais imunizados
com as diferentes estratégias vacinais. Entretanto, foram observadas alterações no local
do inóculo na presença do adjuvante saponina, quando utilizada de forma isolada (Sap)
ou associada às diferentes vacinas (LBSap e LBSapSal). Estas alterações foram muito
discretas, uma vez que foram observados em alguns animais a presença de edema ou
nódulos circunscritos. Mayrink et al. (1996) relatam a presença de nódulos ulcerados na
região do inóculo quando se utilizou BCG como adjuvante. Outros estudos empregando
saponina como adjuvante relatam a presença de efeitos adversos, entre os quais, perda
de pêlos no local do inóculo, anorexia, apatia, vômito e diarréia (Santos et al., 2002,
Parra et al., 2007, Rajput et al., 2007). Entretanto, a saponina apresenta-se como um
excelente adjuvante indutor de resposta celular (Cox & Coulter, 1997, Rajput et al.,
2007), estimulando a indução de linfócitos T CD8
+
(Kensil, 1996), sendo utilizado
amplamente em vacinas veterinárias (Rajput et al., 2007). Desta forma, considerando a
dificuldade na identificação de adjuvantes indutores de resposta celular, compatível com
perfil Th1 que favoreçam sua utilização em vacinas contra protozoários, nossos
resultados apontam para mínimos efeitos colaterais possibilitando a utilização da
saponina como adjuvante nas vacinas LBSap e LBSapSal (Giunchetti et al., 2007,
Giunchetti et al., 2008c).
A resposta imune humoral anti-Leishmania na LVC é caracterizada por elevados
níveis de IgG total, IgG1 ou IgG2, que não impedem a evolução da doença (Deplazes et
al., 1995, Morales et al., 1997, Bourdoiseau et al., 1997a, Cavaliero et al., 1999, Nieto
et al., 1999, Boceta et al., 2000, Solano-Gallego et al., 2000, Leandro et al., 2001,
Solano-Gallego et al., 2001, Fernandez-Perez et al., 2003, Oliveira-Mendes et al., 2003,
Discussão
111
Quinnell et al., 2003, Almeida et al., 2005, Iniesta et al., 2005, Reis et al., 2006a, Reis
et al., 2006c, Cardoso et al., 2007, de Andrade et al., 2007, Day, 2007). Ainda é
controverso na literatura a associação de IgG1 ou IgG2 com um perfil que possa ser
relacionado a resistência ou susceptibilidade a infecção na LVC (Day, 2007).
No presente estudo foi observado aumento significativo (P<0,05) dos níveis de
IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania nos grupos LBSap e LBSapSal. A reatividade
sérica utilizando SLcA indica o reconhecimento antigênico para L. chagasi, sugerindo a
potencial utilização dos diferentes imunobiológicos avaliados neste estudo (LBSap e
LBSapSal) contra o agente etiológico da LVC. Adicionalmente, Rosario et al. (2005)
demonstrou que antígenos provenientes de cepas de Leishmania dermatotrópicas
apresentam reatividade cruzada quando utilizados em análises sorológicas de cães
naturalmente infectados por L. chagasi, demonstrando o reconhecimento de um
repertório antigênico comum entre diferentes espécies de Leishmania. Segundo
Oliveira-Mendes et al. (2003) avaliando a resposta sérica na LVC e em animais
vacinados com FML, a razão IgG1/IgG2≥1 estaria associada a progressão da LVC
enquanto a razão IgG1/IgG2≤1 indicaria que animais vacinados (FML) estariam
protegidos contra uma possível infecção pelo parasito. Os dados apresentados no
presente estudo apontam para resultados diferentes, uma vez que foi observado aumento
progressivo da razão IgG1/IgG2 conforme as sucessivas imunizações com as vacinas
LBSal ou LBSapSal, assemelhando-se desta forma aos resultados obtidos por Fujiwara
(2003) utilizando vacina de antígenos brutos de L amazonensis e L. braziliensis. Apesar
de ainda não estar claro a subclasse de imunoglobulina que estaria associada a um
padrão de resistência na LVC, o aumento de IgG1 e IgG2 parece caracterizar um perfil
misto de resposta imune do tipo 1 e 2, como previamente descrito em cães utilizando
imunoprofiláticos desenvolvidos com antígenos brutos de Leishmania spp. (Fujiwara,
2003, Araújo, 2006, Giunchetti et al., 2007, Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al.,
2008d). De fato, a avaliação de citocinas intracitoplasmáticas em linfócitos estimulados
in vitro com SLcA, demonstrou que a imunização com antígenos brutos de L.
amazonensis associado ao BCG como adjuvante estimula um perfil misto de resposta
imune, caracterizado pelo aumento simultâneo de IFN-γ e IL-4 em linfócitos T
estimulados in vitro (Araújo, 2006).
A avaliação da reatividade sérica de IgG anti-SGE tem sido relatada em áreas
endêmicas para LV, entre as quais, crianças residentes em São Luiz-Maranhão (Barral
et al., 2000, Gomes et al., 2002) e raposas (Cerdocyon thous), cães e indivíduos
Discussão
112
residentes em Teresina-Piauí (Gomes et al., 2007). Entretanto, o presente estudo
descreve pela primeira vez a presença de anticorpos IgG anti-SGE em cães submetidos
a vacinação experimental com saliva de Lu. longipalpis. Neste sentido, foi observado
aumento significativo (P<0,05) dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-SGE no grupo
LBSapSal. Provavelmente, o fato de se utilizar saponina como adjuvante nesta
estratégia vacinal possibilitou uma resposta anti-SGE mais exacerbada em relação aos
demais grupos (C, Sal e LBSal). Tem sido proposto que a simultânea presença da
reatividade sérica anti-SGE bem como a hipersensibilidade do tipo tardia medida pela
intradermoreação (DTH) anti-Leishmania em crianças residentes em área endêmica para
LV, poderia favorecer a indução de resposta imune contra saliva de flebotomíneos
levando ao desenvolvimento de uma resposta imune protetora contra a LV (Barral et al.,
2000, Gomes et al., 2002, Andrade et al., 2007). Além disto, a presença simultânea de
IgG1 e IgG2 anti-SGE observada no soro do grupo LBSapSal sugere uma resposta
imune mista do tipo 1 e 2 contra os componentes da saliva. De fato, Gomes et al. (2002)
avaliando a resposta anti-SGE no soro de indivíduos residentes em área endêmica para
LV, relata a presença de resposta mista associada ao padrão Th1 e Th2, associando este
padrão de resposta a um perfil relacionado a proteção contra infecção por L. chagasi.
Neste contexto, é possível especular que a imunização utilizando a estratégia LBSapSal
seria capaz de induzir uma resposta imune compatível com um perfil relacionado a
proteção contra o estabelecimento da infecção por L. chagasi em cães.
Três principais proteínas séricas foram identificadas pela Western blot anti-SGE
em cães vacinados utilizando a saliva como componente do repertório antigênico. Estas
proteínas apresentaram pesos moleculares de 35, 45 e 71 KDa, sendo observadas em
todos os grupos imunizados com proteínas do SGE (Sal, LBSal e LBSapSal), exceto o
grupo LBSal que aparentemente não reconheceu proteínas de 71 KDa.
Apesar da proteína de 71 KDa ainda não ter sido descrita no soro de cães ou
indivíduos residentes em área endêmica para LV, ela foi identificada na saliva de Lu.
longipalpis apresentando-se similar a enzima que converte angiotensina presente em
Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster, aves domésticas (frango) e no homem,
mas ainda sem função definida no campo da entomologia (Valenzuela et al., 2004).
Recentemente, a identificação e caracterização da enzima que converte angiotensina,
uma dipeptidilcarboxipeptidase, foi descrita em L. donovani (Goyal et al., 2006). Este
estudo mostrou que a enzima apresenta localização predominantemente
intracitoplasmática, sendo associada a uma atividade proteolítica em amastigotas que
Discussão
113
poderia estar ligada indiretamente à nutrição do parasito e a fatores relacionados a
patogênese. Neste sentido, foi sugerido que esta enzima apresenta-se como potencial
alvo para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas anti-Leishmania (Goyal et al.,
2006).
A proteína de 35 KDa foi descrita como sendo apirase, que apresenta intensa
atividade anti-plaquetária na saliva de Lu. longipalpis e Phlebotomus papatasi (Charlab
et al., 1999, Valenzuela et al., 2001a, Valenzuela et al., 2001b, Anderson et al., 2006,
Kato et al., 2006). A proteína de 45 KDa foi descrita na saliva de Lu. longipalpis, P.
papatasi, P. ariasi, P. argentipes e P. duboscqi e é denominada de proteína salivar
amarela (Charlab et al., 1999, Valenzuela et al., 2001, Anderson et al., 2006, Kato et
al., 2006, Oliveira et al., 2006), sendo considerada uma das proteínas mais abundantes
da saliva de flebotomíneos (Anderson et al., 2006). Esta proteína compartilha
seqüências genômicas similares com a proteína amarela de Drosophila sugerindo que
além de ser um produto de lubrificação do aparato sugador do inseto possa produzir
secreções relacionadas ao catabolismo de catecolaminas vasoconstritoras (Charlab et
al., 1999).
É importante ressaltar que alguns estudos vêm sendo realizados em áreas
endêmicas para LV tentando identificar proteínas anti-SGE no soro. Neste sentido,
Barral et al. (2000) relata a presença de proteínas anti-SGE com peso molecular de 6,
12, 36, e 96 kDa no soro de indivíduos residentes em áreas endêmicas para LV. Outro
estudo demonstrou a presença de diferentes proteínas de SGE que são reconhecidas
usando soro de indivíduos residentes em área endêmica para LV com pesos moleculares
de 16, 27, 35, 43, 44 e 45 e kDa (Gomes et al., 2002). Considerando que as proteínas
com peso molecular de 35 e 45 KDa são as mais frequentemente reconhecidas no soro
destes indivíduos, Gomes et al. (2002) e Brodskyn et al. (2003) propõe a utilização
destas proteínas para compor uma vacina contra L. chagasi.
A avaliação do reconhecimento de proteínas do SGE no soro de cães
naturalmente infectados por L. chagasi foi descrita recentemente por Bahia et al.
(2007). Neste estudo foram identificadas proteínas com peso molecular de 28,6 e 47,3
kDa, relacionadas a proteínas das famílias D7 e amarela, respectivamente, sendo
proposta a utilização destas proteínas como candidatas para compor uma vacina
multicomponente. Gomes et al. (2006) descreveu a presença de proteínas anti-SGE de
44 KDa no soro de raposas, e de 15, 32, 44 e 45 KDa no soro de cães residentes em área
endêmica para LV. Neste sentido, as proteínas séricas anti-SGE de 35 e 45 KDa,
Discussão
114
descritas particularmente no soro de cães vacinados com LBSapSal, estão entre aquelas
relatadas como potenciais antígenos vacinais contra L. chagasi (Gomes et al., 2002,
Brodskyn et al., 2003, Andrade et al., 2006, Bahia et al., 2007) e poderiam ser
marcadores do estabelecimento de mecanismos imunoprotetores contra LVC.
A avaliação da resposta imune celular contou com o estudo inicial do perfil do
leucograma nos diferentes grupos vacinais. Alterações marcantes foram observadas
particularmente após a primeira imunização. Desta maneira, foi observado aumento
significativo (P<0,05) do número global de leucócitos nos grupos LBSap e LBSapSal.
No grupo LBSap, este aumento foi acompanhado pelo aumento do número de
linfócitos, enquanto que no grupo LBSapSal, teve a contribuição da elevação no número
de neutrófilos totais. Além disto, durante o protocolo vacinal estes grupos apresentaram
também aumento do número de eosinófilos. Estes resultados sugerem a participação
concomitante de células da imunidade inata e adaptativa no grupo LBSap, e a
contribuição de células da imunidade inata no grupo LBSapSal, no decorrer das
imunizações. De forma interessante, cães imunizados com uma vacina bivalente
composta por antígenos brutos de L. amazonensis e L. braziliensis apresentaram
redução na população de eosinófilos durante o período de imunização (Fujiwara, 2003).
Entretanto, Araújo (2006) não relata alterações no hemograma de cães submetidos a
imunização por uma vacina monovalente composta por antígeno bruto de L.
amazonensis.
Com o objetivo de ampliar as investigações sobre a resposta imune celular pós-
vacinal, leucócitos do sangue periférico foram submetidos a imunofenotipagem por
citometria de fluxo nos diferentes grupos avaliados neste estudo. É importante ressaltar
que esta abordagem possibilita uma avaliação detalhada dos aspectos relacionados a
imunogenicidade em vacinas anti-LVC, entretanto, ainda são escassas as publicações
nesta área (Giunchetti et al., 2007, Giunchetti et al., 2008c, Giunchetti et al., 2008d). A
avaliação do sistema imune canino por citometria de fluxo tem se mostrado muito
eficiente na identificação de populações e subpopulações celulares associadas ao
prognóstico clínico da LVC (Pinelli et al., 1994a, Pinelli et al., 1994b, Pinelli et al.,
1995, Pinelli, 1997, Bourdoiseau et al., 1997b, Reis, 2001, Giunchetti et al., 2006, Reis
et al., 2006c, Giunchetti et al., 2008a).
Os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento (P<0,05) do número de
linfócitos B CD21
+
circulantes após a primeira imunização. Este aumento precedeu o
pico de produção de imunoglobulinas anti-Leishmania nos grupos LBSap e LBSapSal.
Discussão
115
Adicionalmente, em concordância com estes resultados as análises de correlações
sugerem mecanismos cooperativos entre células T e B em função da correlação positiva
observada entre linfócitos T CD4
+
e linfócitos B CD21
+
. Este evento poderia estar
associado à ativação de linfócitos B e diferenciação em plasmócitos secretores de
imunoglobulinas, justificando a alta produção de anticorpos séricos. Bourdoiseau et al.
(1997b) relatam que ocorre uma imunossupressão nos cães doentes na LVC,
caracterizado por queda de linfócitos B CD21
+
. Além disto, Reis et al. (2006c)
observaram que cães assintomáticos apresentam aumento de linfócitos B CD21
+
associado à queda no parasitismo de medula óssea, relacionando este achado
imunofenotípico a um perfil de resistência contra infecção por L. chagasi. Desta forma,
o aumento de linfócitos B CD21
+
dos grupos LBSap e LBSapSal consistiu no primeiro
indício imunofenotípico associado à proteção contra o agente etiológico da LVC.
As avaliações adicionais relacionadas ao perfil imunofenotípico de linfócitos T
circulantes permitiram a identificação de importantes alterações nos grupos vacinados
com LBSap e LBSapSal. Assim, de forma similar aos resultados relatados para
linfócitos B CD21
+
após a primeira imunização, estes grupos também apresentaram
aumento (P<0,05) do número de linfócitos T CD5
+
do sangue periférico. Este aumento
contou com a contribuição (P<0,05) das subpopulações de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
que também se apresentaram aumentadas. É importante ressaltar que as correlações
observadas entre linfócitos T CD5
+
e linfócitos T CD4
+
ou CD8
+
, bem como as
correlações entre CD4
+
e CD8
+
sugerem uma possível interação entre estas populações
celulares nos grupos LBSap e LBSapSal. Estudos utilizando modelos experimentais e
pacientes humanos abordando infecções com patógenos intracelulares mostram que o
estabelecimento de imunidade protetora está diretamente ligado a presença de linfócitos
T CD8
+
associado ao perfil de resposta Th1 (Seder & Hill, 2000). Neste contexto, tem
sido relatada uma importante participação de linfócitos T CD4
+
para ativação de
linfócitos T CD8
+
em células efetoras nas infecções por protozoários patogênicos
(Wong & Pamer, 2003, Castellino & Germain, 2006). Linfócitos T CD8
+
ativados
apresentam importante papel na proteção contra patógenos intracelulares, pois são
capazes de induzir a lise de células infectadas por duas vias distintas (Berke, 1995): (i)
pela liberação por exocitose de grânulos formadores de poros (perforina) facilitando a
difusão de granzimas A e B (Heusel et al., 1994, Ebnet et al., 1995) ou (ii) pela
expressão de FasL (CD95L), ligando-se ao Fas (CD95) da célula alvo. As duas vias,
Discussão
116
ativadas pela sinalização via TCR, estimulam a cascata das caspases nas células alvos,
direcionando a apoptose de células infectadas (Shresta et al., 1998).
Evidências experimentais em modelo murino e em pacientes humanos indicam
que linfócitos T CD8
+
regulam a expressão de IFN-γ em linfócitos T CD4
+
,
possibilitando maior controle do parasitismo por Leishmania (Modlin et al., 1985, Da-
Cruz et al., 1994, Mary et al., 1999, Herath et al., 2003). De forma interessante, estudos
imunofenotípicos descritos na LVC relatam que o aumento de linfócitos T CD5
+
, bem
como das subpopulações de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
estão relacionadas a um perfil de
resposta imune associada à resistência frente a infecção por L. chagasi (Pinelli et al.,
1994a, Pinelli et al., 1994b, Pinelli, 1997, Reis, 2001, Reis et al., 2006b).
Adicionalmente, o aumento de linfócitos T CD8
+
circulantes em cães vacinados contra
LVC tem sido considerado como um marcador de resistência de uma possível infecção
por Leishmania (Giunchetti et al., 2008a). Neste sentido, os resultados provenientes da
análise do perfil imunofenotípico de linfócitos do sangue periférico possibilitam
especular que as imunizações com as vacinas LBSap e LBSapSal apresentam um perfil
associado a proteção contra infecção por Leishmania.
Em concordância com esta hipótese se destacam os resultados da análise da
atividade linfoproliferativa. Esta avaliação permitiu a identificação de células de
memória antígeno-específicas induzidas pelo processo vacinal utilizando como estímulo
antígeno solúvel vacinal (VSA) ou antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA). Foi
observado aumento (P<0,05) do índice de proliferação nos grupos LBSap e LBSapSal,
quando utilizados os estímulos VSA ou SLcA. Estes resultados indicam o
reconhecimento do componente vacinal (VSA) bem como a identificação de antígenos
(SLcA) relacionados ao agente etiológico da LVC. Desta forma, além do
reconhecimento sérico utilizando SLcA evidenciado por estes grupos vacinais, a
identificação de linfócitos responsivos a estes antígenos poderia estar relacionada a uma
resposta específica contra uma possível infecção por L. chagasi, apoiando assim a
hipótese destas vacinas (LBSap e LBSapSal) induzirem uma resposta imune contra o
agente etiológico da LVC. De forma similar, tem sido mostrado em cães imunizados
com uma vacina bivalente composta por antígenos brutos de Leishmania proveniente de
cepas dermatotrópicas (L. amazonensis e L. braziliensis) associado ao BCG como
adjuvante maior habilidade na capacidade linfoproliferativa em resposta ao estímulo
com antígenos de L. chagasi (Giunchetti et al., 2008a). Por outro lado, tem sido
demonstrado na LVC ativa que na presença de mitógeno inespecífico há redução da
Discussão
117
capacidade proliferativa tanto de linfócitos (De Luna et al., 1999) como de esplenócitos
submetidos a cultivo in vitro (Reis, 2001). Além disto, a habilidade para estimular a
atividade linfoproliferativa utilizando antígenos de Leishmania tem sido associada a um
perfil de resposta imune relacionada à resistência na LVC, sendo característico de
animais assintomáticos (Pinelli et al., 1994a, Pinelli et al., 1994b, Reis, 2001).
De forma interessante, os grupos LB e Sal apresentaram redução significativa
(P<0,05) da atividade linfoproliferativa quando utilizados os diferentes estímulos in
vitro (VSA ou SLcA). Um estudo realizado por Titus (1998) relata que esplenócitos de
camundongos vacinados com antígeno de eritrócitos de ovelha estimulados in vitro
apresentam inibição da atividade proliferativa de linfócitos T CD4
+
antígeno-
específicos. Assim, do ponto de vista evolutivo, a atividade imunossupressora de
proteínas que compõe a saliva de Lu. longipalpis poderia estar associada a prevenção da
sensibilização de hospedeiros vertebrados contra proteínas vasomoduladoras
importantes para o repasto sanguíneo (Titus, 1998). Além disto, a utilização da
imunização descrita para o grupo LB, na ausência de adjuvante, poderia induzir um
perfil imunossupressor. De fato além da redução do número de linfócitos circulantes, o
grupo LB apresentou os menores níveis de monócitos CD14
+
no sangue periférico.
Considerando que estas duas células estão diretamente relacionadas com a atividade de
proliferação celular, a diminuição do número de linfócitos e monócitos CD14
+
circulantes poderia explicar a redução do índice de proliferação observado quando
empregados os diferentes estímulos (VSA ou SLcA).
Análises adicionais, buscando identificar o perfil imunofenotípico de linfócitos
estimulados in vitro foram realizadas utilizando os estímulos VSA ou SLcA. Em
concordância com os dados obtidos no ex vivo, o grupo LBSap apresentou aumento
(P<0,05) da freqüência de linfócitos B CD21
+
VSA- e SLcA-específicos, indicando
uma possível ativação policlonal de células B, justificando assim os altos níveis de
anticorpos séricos observados neste grupo após as imunizações. Por outro lado, foi
observada redução (P<0,05) da freqüência de linfócitos B CD21
+
nos grupos Sap e LB,
quando estimulados com VSA, e no grupo Sap quando estimulado com SLcA,
sugerindo que estas imunizações, quando realizadas de forma isolada, poderiam
favorecer um perfil menos ativado em relação às células B antígeno-específicas. De
forma interessante, apesar do grupo LB apresentar redução (P<0,05) da atividade
linfoproliferativa SLcA-específica, surpreendentemente, foi observado aumento
(P<0,05) das freqüências de linfócitos T CD5
+
e da subpopulação de linfócitos T CD4
+
Discussão
118
quando utilizado o mesmo estímulo antigênico. Este resultado parece indicar que a
célula responsável por limitar a atividade linfoproliferativa no grupo LB seriam os
monócitos CD14
+
circulantes, potenciais APC, que em menor número nas culturas
estimuladas, reduziriam a ativação de linfócitos e consequentemente a atividade
linfoproliferativa.
De forma marcante e similar aos achados imunofenotípicos relatados em
linfócitos do sangue periférico, foi observado aumento (P<0,05) da freqüência de
linfócitos T CD8
+
antígeno-específicos no grupo LBSapSal, quando utilizado como
estímulo VSA, e nos grupos LBSap e LBSapSal, na presença de SLcA. Evidências
experimentais comprovaram que a ativação de células T CD8
+
poderia ocorrer a partir
de antígenos exógenos fagocitados por APC e apresentados via MHC-I, por um
mecanismo denominado de cross-priming (Brossart & Bevan, 1997). Este mecanismo
explicaria a ativação de linfócitos T CD8
+
estimulados in vitro com antígenos solúveis.
Reis (2001) mostra que linfócitos T CD8
+
provenientes do baço de cães
assintomáticos na presença de estimulo antígeno-específico são recrutados em maior
número em relação a cães oligo e sintomáticos, evidenciando a importância desta célula
em mecanismos relacionados à resistência a infecção por L. chagasi em cães.
Adicionalmente, no homem e no cão, a infecção assintomática por L. infantum tem sido
associada à expansão de linfócitos T CD8
+
Leishmania-específicos (Pinelli et al., 1995,
Mary et al., 1999). Neste contexto, nossos resultados reforçam a hipótese de que as
vacinas LBSap e LBSapSal induzem uma resposta contra o agente etiológico da LVC
compatível com o controle do parasito.
Buscando avaliar outros indícios para sustentar a hipótese de que os grupos
LBSap e LBSapSal apresentam um padrão de resposta imune associado a um perfil
compatível com proteção contra L. chagasi, uma nova estratégia foi empregada
utilizando análises de correlação. Desta forma, foi avaliado o perfil imunofenotípico de
células antígeno-específicas relacionadas com a habilidade linfoproliferativa na
presença dos estímulos VSA ou SLcA. Os resultados confirmaram que a habilidade
linfoproliferativa apresenta relação direta com a indução de linfócitos T CD4
+
VSA- e
SLcA-específicos no grupo LBSap, bem como de linfócitos T CD8
+
VSA- e SLcA-
específicos em ambos os grupos, LBSap e LBSapSal. Por outro lado, a relação inversa
entre a atividade linfoproliferativa e a freqüência de linfócitos T CD4
+
observada no
grupo Sal, parece apoiar a hipótese da presença de atividade imunossupressora
Discussão
1
19
desencadeada pela ação da saliva de Lu. longipalpis sobre linfócitos TCD4
+
antígeno-
específicos (Titus, 1998).
Um outro ponto crítico relacionado à atividade linfoproliferativa in vitro, além
do perfil de ativação linfocitária, é a disponibilidade de células apresentadoras de
antígenos (APC). Neste sentido, estudamos o perfil de monócitos CD14
+
circulantes, no
intuito de se avaliar potenciais APC induzidas durante o processo vacinal, buscando
ampliar as investigações dos fatores que poderiam contribuir para a ativação da
imunidade adaptativa. Neste sentido, foi observado aumento (P<0,05) do número de
monócitos CD14
+
circulantes nos grupos LBSap e LBSapSal, sugerindo a capacidade
destas vacinas na indução de potenciais APC. Este resultado estimulou o estudo de
marcadores de ativação linfocitária, bem como a avaliação da relação entre o perfil da
expressão de marcadores de ativação em linfócitos e o número de monócitos CD14
+
.
É importante ressaltar que a avaliação do perfil de ativação linfocitária em cães
ainda é um dos grandes desafios no campo da imunologia veterinária (Cobbold &
Metcalfe, 1994, Williams, 1997). A expressão de isoformas de CD45 é observada em
todas as células de origem hematopoética, com exceção de eritrócitos, sendo conhecida
por antígeno comum de leucócitos (LCA). A falta da expressão da isoforma CD45RA
em cães com infecção de origem fúngica tem sido associada a um fenótipo de memória,
entretanto esta associação ainda é questionável (Williams, 1997). Na LVC foi
demonstrado aumento da expressão de CD45RA em esplenócitos de cães
assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos (Reis, 2001). A avaliação da
expressão de MHC-II, classicamente relacionado à apresentação de antígeno exógeno
por APC (macrófagos e células dendríticas) aos linfócitos T CD4
+
, também tem sido
associado a um perfil de ativação em células da linhagem sinovial de cães com artrite
reumatóide e no epitélio da córnea de cães com problemas oftalmológicos (Williams,
1997), sendo também expressos em linfócitos circulantes de cães com LVC (Reis et al.,
2006b, Giunchetti et al., 2008a). Neste sentido, a avaliação de moléculas de ativação
pela expressão de MHC-II em células de cães com LV apresentou-se aumentada em
linfócitos provenientes do linfonodo poplíteo (Giunchetti et al., 2008a) e em linfócitos
circulantes de cães assintomáticos (Reis, 2001, Reis et al., 2006b). É importante
ressaltar que a expressão de CD45RA e MHC-II em linfócitos de cães apresenta-se
diferente quando comparado cães jovens e adultos (Williams, 1997, Reis et al., 2005).
Desta forma, cães mais jovens apresentaram maior expressão de CD45RA e MHC-II em
relação a cães adultos, que poderiam estar relacionados a mecanismos fisiológicos de
Discussão
120
maturação do sistema imune canino (Williams, 1997, Reis et al., 2005). Araújo (2006)
avaliou a expressão de moléculas de MHC-I em leucócitos caninos, relatando redução
da expressão deste marcador em neutrófilos e monócitos de cães vacinados com
Leishvacin ou Leishmune®. Estes resultados estimulam a continuidade dos estudos de
identificação destas e de novas moléculas de ativação celular em cães na busca de novos
biomarcadores de resistência à infecção..
No presente estudo, propomos a avaliação da expressão de CD80 e MHC-I em
linfócitos circulantes de cães submetidos a diferentes estratégias vacinais, como
potenciais marcadores de ativação celular. Nossos resultados evidenciaram aumento da
expressão de MHC-I em linfócitos circulantes de cães do grupo LBSap. As análises
adicionais revelaram que as imunizações no grupo LBSap foram capazes de induzir o
aumento do número de monócitos CD14
+
circulantes que apresentaram correlação
positiva com a expressão de linfócitos MHC-I
+
. Estes resultados sugerem que o
concomitante aumento do número de monócitos CD14
+
circulantes no grupo LBSap
estariam relacionados a um perfil de ativação celular evidenciado pelo aumento da
expressão de MHC-I. De fato, tem sido relatado que o aumento da expressão de MHC-I
está associado a presença de IFN-γ (Whitley et al., 1995, Radosevich et al., 2003).
Neste sentido, os resultados de ativação celular possibilitam especular que a correlação
observada representaria a interação entre a imunidade inata e adaptativa, refletindo no
aumento do perfil de ativação obtido pelas imunizações realizadas no grupo LBSap.
De forma similar, os resultados observados no grupo LBSapSal apontam para
um perfil de ativação celular relacionado ao processo vacinal. Neste sentido, o grupo
LBSapSal apresentou aumento (P<0,05) da expressão de CD80 e MHC-I em linfócitos
circulantes após a segunda e terceira imunizações, respectivamente. A expressão tanto
de CD80 como de MHC-I em linfócitos apresentaram correlação positiva, apoiando a
hipótese de que estes marcadores poderiam estar relacionados à ativação celular.
Análises adicionais revelaram que ambos marcadores apresentaram correlação positiva
com o número de monócitos CD14
+
circulantes, sugerindo que o aumento de potenciais
APC estaria diretamente relacionado com o perfil de ativação linfocitária no grupo
LBSapSal. De fato, foi observado neste grupo vacinal que os maiores valores de
monócitos CD14
+
circulantes, estão relacionados aos maiores níveis de expressão tanto
de CD80 como de MHC-I em linfócitos circulantes. Este resultado sustenta a hipótese
de que a contagem de potenciais APC, representado pelos elevados níveis de monócitos
CD14
+
circulantes poderiam estimular o estabelecimento de um perfil de ativação em
Discussão
121
linfócitos circulantes do grupo LBSapSal. Considerando que a expressão de MHC-I
seria regulada por IFN-γ (Whitley et al., 1995, Radosevich et al., 2003), estes resultados
permitem especular que o grupo LBSapSal apresentaria um perfil de resposta associado
a proteção contra L. chagasi.
No intuito de se avaliar a relação entre atividade linfoproliferativa e o perfil de
potenciais APC, analises abordando as populações de monócitos CD14
+
e linfócitos B
CD21
+
foram realizadas. Neste sentido, os resultados permitem especular que estas
células apresentam contribuições distintas considerando as imunizações relacionadas
aos grupos LBSap e LBSapSal. Enquanto a população de monócitos CD14
+
do grupo
LBSap apresentam correlação positiva com a atividade linfoproliferativa VSA-
específica, quando utilizado o estímulo SLcA, foram os linfócitos B CD21
+
que
apresentaram relação direta com a proliferação celular. Por outro lado, no grupo
LBSapSal a atividade linfoproliferativa SLcA-específica foi relacionada diretamente
com o número de monócitos CD14
+
. Estes resultados permitem lançar a hipótese de que
os monócitos CD14
+
seriam as potenciais APC na presença do estímulo VSA no grupo
LBSap, enquanto no grupo LBSapSal estas células apresentariam maior importância na
presença do estímulo SLcA. Por outro lado, linfócitos B CD21
+
poderiam ser as
potenciais APC utilizando o estímulo SLcA no grupo LBSap enquanto que no grupo
LBSapSal estas células não apresentariam importância aparente para a atividade
linfoproliferativa. Além disto, na avaliação no grupo Sal apenas os monócitos CD14
+
apresentaram relação inversa com a atividade linfoproliferativa, indicando que estas
células poderiam oferecer menor contribuição para a atividade linfoproliferativa. De
fato, a inibição da ativação de linfócitos T CD4
+
antígenos-específicos previamente
relatada (Titus, 1998) poderia ser mais importante que o número de APC para a
atividade linfoproliferativa no grupo imunizado apenas com saliva de Lu. longipalpis.
O potencial da capacidade microbicida de macrófagos ativados foi avaliado nos
diferentes grupos vacinais pela produção de óxido nítrico (NO) medida através dos
níveis de nitrito. Considerando que o NO é muito instável, apresentando meia vida de 3
a 15 segundos, sua avaliação é realizada indiretamente pelos seus produtos oxidativos
através dos níveis de nitrito ou nitrato presentes no soro e sobrenadante de cultura (Liew
et al., 1997). A identificação da capacidade leishmanicida de macrófagos ativados in
vivo por NO foi demonstrada por Liew et al. (1990). Neste sentido, IFN-γ se apresenta
como citocina chave para promover a transcrição da enzima óxido nítrico sintase
indizível (iNOS), responsável pela produção de NO em macrófagos e desta forma
Discussão
122
possibilitando o controle da infecção por Leishmania (Ding et al., 1988). Além disto, a
citocina TNF-α apresenta efeito sinérgico com IFN-γ na indução de iNOS em
macrófagos possibilitando assim a liberação de NO (Deng et al., 1993). Considerando
que a produção de NO está relacionada ao controle de patógenos intracelulares como
parasitos do gênero Leishmania, estando associado a um perfil de reposta Th1 (Liew et
al., 1997, Awasthi et al., 2004, Olivier et al., 2005), avaliamos sua produção através dos
níveis de nitrito no soro e em sobrenadante de cultura estimuladas com VSA ou SLcA.
Embora os níveis de NO sérico no grupo LBSap tenham se mostrado elevados,
este aumento não foi significativo. Entretanto, a avaliação dos níveis de NO em
sobrenadante de cultura estimulada com SLcA revelou aumento significativo (P<0,05)
neste grupo. Além disto, apesar de ter sido observada tendência de aumento VSA- e
SLcA-antígeno-específicos dos níveis de NO no grupo LBSapSal, este aumento
apresentou diferença significativa (P<0,05) apenas na avaliação sérica. Considerando
que a indução da produção de NO está diretamente relacionada ao controle do
parasitismo por Leishmania, além de ter sua produção induzida por IFN-γ, citocina
associada a um perfil de resposta Th1, estes resultados suportam a hipótese de que as
imunizações utilizando as vacinas LBSap e LBSapSal estimulam o estabelecimento de
um perfil de resposta compatível com o controle do agente etiológico da LVC.
Os resultados apresentados neste trabalho estimulam o estudo de estratégias
vacinais abordando antígenos brutos de Leishmania. Esta estratégia biotecnológica tem
se mostrado interessante considerando os aspectos relacionados à segurança e
estabilidade antigênica, exigindo tecnologia de produção menos sofisticada em relação à
obtenção de proteínas recombinantes e vacinas de DNA. Estes fatores implicam na
realização de menos testes para obtenção de produtos que irão compor o
imunobiológico, reduzindo os custos de produção em relação à obtenção de proteínas
recombinantes. Além disto, a grande diversidade no repertório antigênico de vacinas
utilizando antígenos brutos de Leishmania favorece a ativação de um grande número de
linfócitos T capazes de induzir uma resposta compatível com o controle de parasitos do
gênero Leishmania.
8. Conclusão
Conclusão
124
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a utilização das vacinas LBSap
e LBSapSal não induzem alterações clínicas ou outras alterações adversas que contra-
indicariam seu uso. Desta forma, a utilização destas vacinas foi considerada segura para
ser utilizada como imunoprofilático em cães. Além disto, os resultados da avaliação dos
aspectos relacionados à imunogenicidade obtidos pela vacinação com os
imunobiológicos LBSap e LBSapSal indicam o estabelecimento de mecanismos
imunoprotetores potencialmente capazes de atuarem contra a infecção pelo agente
etiológico da LVC. Esta hipótese é sustentada particularmente pelos resultados
relacionados à: (i) expansão de linfócitos T CD8
+
do sangue periférico; (ii) aumento da
atividade linfoproliferativa utilizando os estímulos VSA e SLcA; (iii) aumento da
freqüência de linfócitos T CD8
+
VSA- e SLcA-específicos; (iv) correlação direta entra a
atividade linfoproliferativa e a da freqüência de linfócitos T CD8
+
VSA- e SLcA-
específicos; (v) aumento do perfil de ativação de linfócitos; (vi) aumento dos níveis de
NO. O conjunto dos resultados obtidos neste estudo indica uma boa capacidade
imunogênica de vacinas de primeira geração.
9. Perspectivas
Perspectivas
126
Este trabalho permitiu a identificação de importantes eventos relacionados à
imunogenicidade pós-vacinais em dois potenciais imunobiológicos contra LVC.
Buscando ampliar o entendimento dos eventos relacionados à imunoproteção o presente
trabalho permite propor as seguintes perspectivas:
• Avaliar o padrão de citocinas (IFN-γ, TNF-α, TGF-β, e IL-10) séricas e
de sobrenadante de cultura de células mononucleadas do sangue
periférico (PBMC) estimuladas in vitro com antígeno solúvel vacinal
(VSA) ou antígeno solúvel de Leishmania chagasi (SLcA);
• Estudar as alterações imunofenotípicas (CD5
+
, CD4
+
, CD8
+
e CD21
+
) de
leucócitos circulantes, bem como em PBMC estimuladas in vitro com
VSA ou SLcA após o desafio por L. chagasi;
• Estudar a eficácia vacinal após o desafio por L. chagasi avaliando o
parasitismo em diferentes tecidos (pele, medula óssea, baço, linfonodo,
fígado), bem como avaliar a infectividade de flebotomíneos alimentados
nos diferentes grupos vacinais.
Estas estratégias permitirão compreender melhor as alterações induzidas no
sistema imune pela administração das vacinas LBSap e LBSapSal, bem como avaliar a
eficácia vacinal. Estas informações apresentam fundamental importância para subsidiar
estudos de campo de fase III utilizando as vacinas LBSap e LBSapSal.
10. Bibliografia
Bibliografia
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11. Anexos
Anexos
150
Análise individual da temperatura retal (
o
C) de cães controle e submetidos a diferentes protocolos de imunizações, após cada uma das 3 doses do inóculo.
Variação na temperatura retal (
o
C)
Após 1ª Dose
Após 2ª Dose
Após 3ª Dose
Código do cão
24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h
Grupo C C01
39.0 38.6 38.5 38.9 39.2 38.6 39.0 38.8
C06
39.0 38.9 38.9 39.2 39.2 39.2 39.3 39.1
C29
39.6 39.3 39.2 39.2 39.5 39.2 39.6 39.2
C33
39.5 39.1 39.3 39.2 39.2 39.1 39.4 39.0
C37
38.7 38.6 39.2 38.9 38.8 39.1 39.0 38.8
C40
38.6 38.7 38.2 38.8 38.9 38.8 38.6 38.6
C10
38.6 38.5 38.6 39.0 38.7 38.7 38.9 38.8
C11
38.9 38.8 38.6 38.9 39.0 38.7 38.7 38.5
C13
39.2 39.0 39.3 39.1 39.2 39.0 39.3 39.1
C26
38.8 39.2 39.3 39.1 38.7 39.2 39.9 39.4
Grupo LB C02
39.5 38.9 39.1 39.4 39.9 39.4 39.6 39.6
C07
39.1 39.0 39.4 39.2 39.0 39.4 39.3 39.2
C35
39.2 39.0 39.2 39.2 39.0 39.3 39.1 39.4
C17
39.4 39.2 39.3 39.1 39.1 38.8 39.4 39.2
C24
39.0 38.7 38.9 38.5 38.4 38.7 39.1 38.6
Grupo Sap C03
39.0 38.8 39.3 39.5 39.6 39.0 39.5 39.2
C05
39.5 38.7 39.0 39.1 39.4 38.9 39.5 39.0
C14
39.0 39.1 39.3 39.3 39.2 39.2 39.2 39.2
C20
39.2 39.0 39.3 38.9 38.9 38.9 39.2 39.0
C27
39.4 39.3 39.6 39.8 39.8 39.5 39.8 39.9
Grupo Sal C08
39.2 39.3 39.1 39.1 39.1 39.2 39.1 39.1
C34
38.5 38.5 38.9 38.8 38.4 38.8 38.6 38.5
C09
38.8 38.7 38.7 38.9 39.0 38.8 38.7 38.5
C15
39.4 39.1 39.2 39.4 39.6 39.4 39.8 39.6
C21
39.2 38.9 39.2 39.1 39.1 39.3 39.4 39.4
Grupo LBSap C04
40.0 39.3 39.3 39.9 39.8 39.5 39.9 39.5
C30
39.9 39.9 39.1 39.5 39.6 39.3 39.6 39.6
C36
38.7 38.6 38.7 39.0 38.7 38.9 38.5 38.9
C12
39.0 38.5 38.5 38.9 39.2 38.4 39.3 39.0
C19
39.7 38.8 38.9 39.5 39.3 39.2 39.9 39.7
Grupo LBSal C32
38.7 38.8 39.5 39.6 39.4 39.0 39.7 39.5
C39
39.4 39.2 38.8 39.2 39.3 39.3 38.8 39.1
C16
39.3 38.8 38.9 38.9 38.9 38.6 39.0 38.5
C22
39.1 39.1 39.1 38.3 38.4 38.5 39.0 38.8
C25
39.0 39.3 38.9 39.5 39.2 39.1 39.4 39.1
Grupo LBSapSal C31
39.8 39.4 38.9 39.0 39.2 39.3 39.4 39.6
C38
39.2 38.8 39.3 39.1 39.0 39.2 39.2 39.4
C18
38.5 38.7 39.1 39.3 39.0 39.2 39.0 38.9
C23
39.6 39.3 39.3 39.5 38.8 39.0 39.5 39.3
C28
38.9 39.6 39.4 40.0 39.2 39.5 39.2 39.9
Anexos
151
Anexos
152
Anexos
153
Anexos
154
Anexos
155
Anexos
156
Anexos
157
Anexos
158
Anexos
159
Anexos
160
Anexos
161
Anexos
162
Anexos
163
Anexos
164
Anexos
16
5
Anexos
166
Anexos
167
Anexos
168
Anexos
169
Anexos
170
Anexos
171
Anexos
172
Anexos
173
Anexos
174
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175
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176
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