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Rafael Gonçalves Teixeira Neto
“ESTUDO DAS RELAÇÕES ENTRE
IMUNIDADE HUMORAL E CARGA
PARASITÁRIA EM CÃES
NATURALMENTE INFECTADOS POR
Leishmania (Leishmania) infantum chagasi”
Ouro Preto – MG
Universidade Federal de Ouro Preto
Fevereiro – 2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Rafael Gonçalves Teixeira Neto
“ESTUDO DAS RELAÇÕES ENTRE IMUNIDADE
HUMORAL E CARGA PARASITÁRIA EM
CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR
Leishmania (Leishmania) infantum chagasi”
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como requisito
parcial para a obtenção do título de
Mestre em Ciências – Área de
Concentração em Imunoparasitologia.
Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis
Laboratório de Imunopatologia
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas / UFOP
Co-orientadora: Dra. Célia Maria Ferreira Gontijo
Laboratório de Leishmanioses
Instituto René Rachou / FIOCRUZ
Ouro Preto-MG
Fevereiro – 2008
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Catalogação: [email protected]
T266e Teixeira Neto, Rafael Gonçalves.
Estudo das relações entre imunidade humoral e carga parasitária em cães
naturalmente infectados por Leishmania infantum chagasi [manuscrito] / Rafael
Gonçalves Teixeira Neto. - 2008.
x, 101 f.: il., color; graf., tabs.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Barbosa Reis.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de
Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.
1. Leishmaniose - Teses. 2. Imunoglobinas - Teses. 3. Carga parasitária -
Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 616.993.161
Colaboradores
DRA. CLÁUDIA MARTINS CARNEIRO
I
DR. RICARDO WAGNER DE ALMEIDA VITOR
II
DR. RODOLFO CORDEIRO GIUNCHETTI
I
MS. WENDEL COURA VITAL
II
MS. PATRÍCIA FLÁVIA QUARESMA
III
IC HENRIQUE GAMA KER
I
IC
SHELER MARTINS DE SOUZA
I
I
– LABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA – NÚCLEO DE PESQUISAS EM
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - NUPEB/UFOP
II – DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA - INSTITUTO DE CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS - UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS – ICB/UFMG
III – LABORATÓRIO DE LEISHMANIOSES – INSTITUTO RENÉ RACHOU –
FIOCRUZ/MG
Apoio
UFOP – Universidade Federal de Ouro Preto
IRR – Instituto René Rachou
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais
CCZ-BH – Centro de Controle de Zoonoses de Belo Horizonte
Aos meus Pais
Romeu e Eliana
Aos meus irmãos
Vanessa, Janaína e Victor
A minha “vida”
Grazielly
“As falhas entram na composição das
virtudes, como os venenos na composição
dos remédios”
La Rochefoucauld
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Alexandre Barbosa Reis, meu orientador, por ter me
acolhido em seu laboratório, pela amizade construída durante o
mestrado, agradeço os conselhos e ensinamentos. Você soube me
incentivar e me frear nos momentos certos e me mostrou a
importância de sempre desenvolver um trabalho sério. Meus sinceros
agradecimentos.
À Prof. Dra. Célia Maria Ferreira Gontijo, minha orientadora, você que
nunca deixou de acreditar na minha capacidade, seu espírito materno
demonstra o carinho que tem pelos seus alunos. Agradeço
sinceramente por tudo e espero que possamos trabalhar juntos por
muitos anos.
À Prof. Dra. Cláudia Martins Carneiro, pela amizade e paciência.
Obrigado pelo apoio em muitos momentos difíceis, seus conselhos
foram essenciais e me ajudaram a manter a calma.
Ao Prof. Dr. Ricardo Wagner de Almeida Vitor e à Rosa, obrigado pelo
auxílio indispensável para realização dos testes de avidez. A ajuda de
vocês engrandeceu muito este trabalho.
Ao amigo e colaborador Rodolfo, obrigado pela ajuda nos trabalhos de
campo e na construção do artigo.
Ao amigo Wendel, agradeço pela aula pratica de ELISA, sua
experiência ajudou muito na realização do projeto.
À Patrícia, agradeço pelas dicas indispensáveis nos procedimentos de
biologia molecular e pela grande amizade construída durante estes
anos.
Aos alunos de IC Henrique e Sheler, obrigado pelo tempo que
disponibilizaram para a realização deste projeto, a ajuda de vocês foi
indispensável.
Ao Prof. Dr. Eduardo Sérgio da Silva, por ter me encaminhado na
carreira de pesquisador.
À coordenação do curso de Mestrado em Ciências Biológicas (NUPEB-
UFOP/MG) e a todos os professores que fazem parte deste programa
pela oportunidade e pelo conhecimento transmitido.
Ao Instituto René Rachou pela oportunidade de desenvolver o
presente trabalho e ao Dr. Edelberto Santos Dias pelas boas
conversas.
Aos amigos do Laboratório de Patologia da UFOP: Amanda, Paula,
Raquel, Nádia, Jú, Rodolfo, Rodrigo, Bruno, Samuel, Wendel,
Henrique, Ana, Sheler, Carol e Jerusa. Obrigado pela amizade e pelos
bons momentos juntos. Um abraço especial para Paula e Nádia por
me acolherem quando precisei.
Aos amigos de Laboratório de Leishmanioses de IRR: Dani, Karla,
Érika, Gustavo Paz, Gustavo Mayr, Ricardo, Leco, Shara, Jú, Lú muito
obrigado pela amizade de todos vocês.
Obrigado especialmente aos amigos da “salinha”: Eduardo, Paty, Tina,
Cynthia, Filipe e Luti. Espero que nossa amizade dure por toda a vida.
À Dona Alda Lima Falcão, pelas boas conversas e pelo exemplo de
vida.
Às secretárias do NUPEB e do Laboratório de Leishmanioses do René,
Cida e Lú. Obrigado pela amizade e pelo apoio em todos os momentos
que precisei de vocês.
À Maria, técnica do Laboratório de Imunopatologia agradeço pela
atenção e ajuda indispensável para a realização deste projeto.
Aos funcionários do Centro de Controle de Zoonoses da Prefeitura de
Belo Horizonte: Maria do Carmo, Adamastor e Kólia obrigado por
disponibilizar o seu estabelecimento, tempo e funcionários, e pelos
animais doentes que foram a fonte de estudo para o desenvolvimento
deste trabalho.
Aos motoristas do IRR, por seus serviços prestados durante o período
de coleta do material de campo.
Aos amigos e colegas do mestrado com quem vivi momentos de
estudo e descontração. Muito obrigado a todos.
À Anna Carolina Lustosa Lima pela ajuda na análise estatística dos
dados.
Aos cães que foram sacrificados para o desenvolvimento deste
trabalho.
Aos amigos Bruno Barros, Jean, Júlio, Heder e Bruno Silva e a todos
os outros amigos aqui não citados, obrigado pela convivência e por
entenderem meus momentos de ausência ou impaciência.
À Cleusa, Wilson, Thiago e Mara, pessoas importantes que nunca
deixaram de acreditar na minha capacidade. Obrigado pela amizade.
Aos Tios, Tias, Primos, Primas e minha avó que torceram pelo bom
desenvolvimento deste trabalho e pelo meu sucesso.
Aos meus Pais, Romeu e Eliana e aos meus irmãos Vanessa, Janaína e
Victor, pelo amor, compreensão e apoio incondicional, vocês são os
pilares que me sustentam. Tenho orgulho de fazer parte desta família.
À Grazielly, exemplo de dedicação e amor incondicional. Você me
completa. Te amo.
A Deus, que colocou em minha vida pessoas maravilhosas como todos
vocês. Obrigado por estarem sempre presente nos momentos bons ou
ruins.
Enfim, a todos aqueles que de alguma forma fazem parte da minha
vida. Meu sincero obrigado.
I
SUMÁRIO
Lista de Tabelas ________________________________ IV
Lista de Figuras _________________________________ V
Lista de Abreviaturas ____________________________VII
Resumo_______________________________________ IX
Abstract _______________________________________ X
Introdução______________________________________ XI
1. Leishmaniose visceral _________________________ 2
2. Leishmaniose Visceral Canina (LVC) ______________
7
2.1. Aspectos Imunopatológicos na LVC _________________
11
2.2. Teste de Avidez na LVC __________________________ 15
2.3. Densidade parasitária e resposta imune na LVC. _______ 15
Justificativa _____________________________________ 17
Objetivos _______________________________________ 19
1. Objetivo Geral ______________________________ 20
2. Objetivos específicos _________________________ 20
Materiais e Métodos_______________________________ 21
1. Animais ___________________________________ 22
2. Caracterização Clínica dos Animais ______________ 22
3. Coleta Das Amostras Biológicas. ________________ 23
4. Extração de DNA das amostras biológicas _________ 24
4.1. Sangue periférico total e medula óssea ______________
25
4.2. Amostras de Fígado e Baço _______________________ 25
4.3. Amostras de Pele e Linfonodo______________________
26
5. Dosagem das amostras de DNA _________________ 27
6. Diagnóstico molecular e caracterização espécie-
específica._____________________________________ 27
6.1. PCR para o gênero Leishmania_____________________ 27
6.2. PCR-RFLP _____________________________________ 28
7. Técnica de quantificação da carga parasitária______ 29
8. ELISA isotipos e ELISA avidez __________________ 31
8.1. Pesquisa de anticorpos através do teste imunoenzimático
(ELISA)___________________________________________ 31
8.2. Teste de Avidez de IgG através da técnica de ELISA ____ 32
9. Análise Estatística ___________________________ 33
Resultados ______________________________________ 35
II
1. Classificação Clínica dos animais________________ 36
2. Dosagem do DNA ____________________________ 37
3. Confirmação da infecção por L. infantum chagasi através
da PCR-RFLP___________________________________ 37
4. PCR para o gênero Leishmania _________________ 39
4.1. Positividade da PCR de acordo com a forma clínica _____ 40
4.2. Comparação entre a PCR e método parasitológico
convencional ______________________________________ 43
5. Quantificação da densidade parasitária através da
técnica Leishman Donovan Units (LDU) ______________ 44
6. Avaliação dos perfis de imunoglobulinas em cães
naturalmente infectados por leishmania infantum chagasi 47
6.1. Reatividade de IgG, IgG
1
e IgG
2
em relação a forma clínica
47
6.2. Carga parasitária X reatividade de IgG, IgG
1
e IgG
2
____ 48
6.3. Análise da correlação entre reatividade de imunoglobulinas e
carga parasitária nos diferentes grupos de cães ___________ 51
7. Avaliação da avidez de IgG
total
em relação à forma
clínica e à carga parasitária _______________________ 52
7.1. Avidez de IgG
em relação à forma clínica apresentada pelo
cão 52
7.2. Carga parasitária X avidez de IgG __________________ 54
Discussão_______________________________________ 56
1. Aspectos Clínicos da LVC ______________________ 60
2. Identificação da espécie de Leishmania através da PCR-
RFLP _________________________________________ 62
3. A PCR como Ferramenta de diagnóstico na LVC_____ 64
4. Avaliação da carga parasitária na pele e no baço de cães
naturalmente infectados _________________________ 67
5. Avaliação do perfil das subclasses de IgG (IgG
1
e IgG
2
)
na LVC _______________________________________ 69
6. Avaliação da avidez de IgG na LVC ______________ 72
Conclusões______________________________________ 74
Apêndice _______________________________________ 77
1. Soluções para ELISA convencional e avidez. _______ 78
1.1. PBS pH 7,5 ____________________________________ 78
1.2. Tampão carbonato pH 9,6 (“Coatting Buffer”) _________ 78
1.3. Solução de Lavagem_____________________________ 78
1.4. Solução de Ácido Cítrico (tampão substrato) pH 5,0 ____
78
1.5. PBS/Tween ____________________________________
78
1.6. Solução de Substrato ____________________________
79
III
1.7. Solução de PBS/Tween com uréia 6M________________ 79
Anexo__________________________________________ 80
1. Ficha clínica epidemiológica canina ______________ 81
2. Padronização da técnica de ELISA _______________ 82
3. Esboço da divisão da placa de ELISA para realização do
teste de avidez _________________________________ 83
4. Correlação entre a reatividade de Ig e a LDU no baço e
na pele _______________________________________ 84
Bibliografia _____________________________________ 85
IV
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Enzimas de restrição e tamanho dos fragmentos obtidos
após a digestão do kDNA das espécies L. amazonensis, L. braziliensis
e L. infantum chagasi.___________________________________ 28
Tabela 2: Painel de anticorpos anti-Ig de cão utilizados no protocolo
de ELISA Isotipos. ______________________________________ 31
Tabela 3: Identificação da espécie de Leishmania através da PCR-
RFLP em amostras de diferentes tecidos de cães naturalmente
infectados.____________________________________________ 38
Tabela 4: Resultados da PCR em diferentes tecidos de cães
naturalmente infectados por L. i. chagasi portadores das formas
clínicas polares da LVC.__________________________________ 39
Tabela 5: Comparação do resultado da PCR entre as diferentes
amostras clínicas dos 40 cães naturalmente infectados por L.
infantum chagasi. ______________________________________ 40
Tabela 6: Número de tecidos positivos na PCR para o gênero
Leishmania de acordo com a forma clínica apresentada pelo animal.
____________________________________________________ 41
Tabela 7: Comparação do resultado da PCR entre as diferentes
amostras clínicas dos cães assintomáticos.___________________ 42
Tabela 8: Comparação do resultado da PCR entre as diferentes
amostras clínicas dos cães sintomáticos com sorologia positiva para
L. infantum chagasi. ____________________________________
43
Tabela 9: Comparação da sensibilidade do método parasitológico
direto e da PCR em amostras de cães assintomáticos e sintomáticos.
____________________________________________________
44
Tabela 10: Densidade parasitária no baço e na pele dos animais com
diferentes formas clínicas.________________________________
45
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Perfil de digestão do fragmento de 120pb do kDNA de
Leishmania spp pelas enzimas Hae III (A) e APA LI (B). ________ 29
Figura 2: Fotografia de lâmina de pele (ponta de orelha) realizada
por aposição corada por GIEMSA. Campo apresentando macrófagos
densamente parasitados (aumento 1500X). __________________ 31
Figura 3: Sinais clínicos observados nos cães provenientes do CCZ-
BH.__________________________________________________ 37
Figura 4: Perfis de bandas gerados após a digestão do produto
amplificado utilizando a enzima Apa LI na PCR-RFLP. __________
38
Figura 5: Porcentagem de cães positivos na PCR para o gênero
Leishmania de acordo com os diversos tecidos avaliados. _______ 40
Figura 6: Porcentagem de cães positivos na PCR para o gênero
Leishmania de acordo com os diversos tecidos avaliados em cães
assintomáticos. ________________________________________ 42
Figura 7: Porcentagem de cães positivos na PCR para o gênero
Leishmania de acordo com os diversos tecidos avaliados em cães
sintomáticos. __________________________________________ 43
Figura 8: Comparação entre a carga parasitária no baço (A) e na
pele (B) de animais com as formas clínicas polares da LVC. _____
46
Figura 9: Distribuição de cães com as formas clínicas polares da LVC
de acordo com a carga parasitária nas amostras de Pele (A)
(p=0,006) e Baço (B) (p = 0,102)._________________________ 46
Figura 10: Presença de IgG (A), IgG
1
(B) e IgG
2
(C) em soros de
cães naturalmente infectados por L. infantum chagasi em relação aos
animais não infectados.__________________________________ 47
Figura 11: Presença de IgG (A), IgG
1
(B) e IgG
2
(C) em soros de
cães naturalmente infectados por L. infantum chagasi e portadores de
diferentes formas clínicas.________________________________ 48
Figura 12: Reatividade de IgG, IgG
1
e IgG
2
no soro de cães
naturalmente infectados por L. infantum chagasi com diferentes
cargas parasitárias avaliadas pelo LDU nas amostras de pele e baço.
____________________________________________________ 50
VI
Figura 13: Correlação entre os valores de LDU no baço e a
reatividade de IgG (A) e IgG
2
(B) no soro de cães assintomáticos
naturalmente infectados por L. infantum chagasi. _____________ 51
Figura 14: Correlação entre os valores de LDU no baço e a
reatividade de IgG (A) e IgG
2
(B) no soro do grupo total de cães
naturalmente infectados por L. infantum chagasi. _____________ 51
Figura 15: Correlação entre os valores de LDU no baço e a
reatividade de IgG
1
no soro de cães naturalmente infectados por L.
infantum chagasi. ______________________________________ 52
Figura 16: Avidez de IgG no soro de cães experimentalmente
infectados por L. infantum chagasi com diferentes tempos de
infecção. _____________________________________________
53
Figura 17: Índice de Avidez de IgG em soros de cães assintomáticos
e sintomáticos. ________________________________________ 53
Figura 18: Avidez de IgG em soros de cães com diferentes graus de
parasitismo no Baço (A) e na Pele (B). ______________________ 54
Figura 19: Correlação entre o Indice de Avidez (IA) de IgG e os
valores de densidade óptica das sub-classes de IgG (IgG
1
e IgG
2
). 55
VII
LISTA DE ABREVIATURAS
µg - Micrograma
µl - Microlitro
AP - Alto Parasitismo
Apa LI - Enzima de restrição utilizado na PRC-RFLP
BP - Baixo Parasitismo
CA - Cães Assintomáticos
CC - Cães controle
CCZ-BH - Centro de Controle de Zoonoses de Belo Horizonte
CD4
+
- Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T
auxiliar
CD8
+
- Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T
citotóxico
CR1 - Receptor 1 do complemento
CR3 - Receptor 3 do complemento
CS - Cães Sintomáticos
DAT - Teste de aglutinação direta
DNA - Ácido Desoxirribonucléico
DO - Densidade Óptica
ELISA - Enzime Lynked Immunosorbent Assay
fg - Fentograma
gp 63 - Glicoproteína de 63 KD
Hae III - Enzima de restrição utilizado na PRC-RFLP
IA - Índice de Avidez
Ig - Imunoglobulina
IgA - Imunoglobulina da classe A
IgE - Imunoglobulina da classe E
IgG - Imunoglobulina da classe G
IgG1 - Imunoglobulina da subclasse G1
IgG2 - Imunoglobulina da subclasse G2
IgM - Imunoglobulina da classe M
IL-10 - Interleucina 10
IL-2 - Interleucina 2
IL-4 - Interleucina 4
VIII
IL-5 - Interleucina 5
INF-γ - Interferon gama
kDNA - DNA de Cinetoplasto
LDU - Leishman Donovam Units
LPG - Lipofosfoglicano
LTA - Leishmaniose Tegumentar Americana
LV - Leishmaniose Visceral
LVC - Leishmaniose Visceral Canina
M - Molar
mg - Miligrama
mL - Mililitro
mm - Milimetro
mM - Milimolar
MP - Médio Parasitismo
n - Número de cães por amostra
ng - Nanograma
nm - Nanômetro
NNN - Meio de cultura Novy-McNeal-Nicole
NO - Não Observado
pb - Pares de Base
PCR – Polymerase chain reaction
PCR-RFLP - Polymerase chain reaction - Restriction Fragment Length
Polymorphism
pH - Potencial Hidrogeniônico
PM - Peso Molecular
RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta
rpm - Rotação por minuto
SMF - Sistema Mononuclear Fagocitário
SRD - Sem raça definida
Th1 - Células TCD4
+
secretoras de citocinas do padrão 1 (IL-2 e INF-
γ)
Th2 - Células TCD4
+
secretoras de citocinas do padrão 2 (IL-4, IL-
5,IL-6 e IL-10)
TNF-α - Fator de necrose tumoral α
U - Unidade
IX
RESUMO
No presente estudo foi avaliado um grupo de 45 cães composto de
animais não infectados e naturalmente infectados por L. infantum
chagasi (identificação através da PCR-RFLP). Após avaliação clínica os
animais foram divididos em três grupos: Cães controle (CC), cães
assintomáticos (CA) e cães sintomáticos (CS). Foi avaliada a carga
parasitária nas amostras de pele e baço destes animais através da
técnica de quantificação “Leishman Donovan Units” (LDU). De acordo
com densidade parasitária separamos os animais nos seguintes grupos:
baixo parasitismo (BP), médio parasitismo (MP) e alto parasitismo (AP).
Neste contexto estudamos o índice de positividade da PCR em diferentes
amostras clínicas, o perfil da resposta humoral (IgG e suas subclasses
IgG
1
e IgG
2
) e a avidez de IgG
total
com relação à forma clínica e ao
parasitismo apresentado pelo cão. A análise dos resultados da PCR
mostrou que não houve diferença estatística na positividade da reação
entre os grupos com diferentes formas clínicas. Os animais foram
positivos em pelo menos dois tecidos avaliados e as amostras clínicas
com melhor desempenho seguiram a seguinte ordem: baço, linfonodo,
pele, medula óssea, fígado e sangue. Com relação ao parasitismo
tecidual foi observada diferença estatística significante na carga
parasitária das amostras de pele ao compararmos os grupos CA e CS
(p=0,0011). Em ambos tecidos onde foi avaliada a carga parasitária
observou-se que no grupo CA houve um maior número de animais com
baixo parasitismo, já no grupo CS a maioria dos animais apresentava
alto parasitismo. A avaliação do perfil de Ig mostrou que os níveis
séricos de IgG
1
apresentavam-se mais elevados nos animais
assintomáticos, sugerindo uma possível associação com mecanismos
imunoprotetores da infecção, por outro lado os níveis séricos de IgG
2
parecem estar associados com a presença de sintomas na LVC.
Correlacionando o perfil de Ig com a carga parasitária, foi constatado
que à medida que aumentava a intensidade parasitária (baço e pele) os
valores de IgG e IgG
2
também subiam. Observamos também uma
correlação negativa entre os valores de IgG
1
e a densidade parasitária
no baço. O índice de avidez (IA) de IgG
total
nos animais sintomáticos foi
mais alto quando comparado ao IA dos animais assintomáticos. Além
disso, animais mais parasitados tanto no baço quanto na pele possuem
maior IA que os animais com baixo parasitismo. Com base nestes
achados sugerimos que a LVC se inicia a partir de uma forma clínica
assintomática, com baixo parasitismo, alta produção de IgG
1
e baixa
afinidade das moléculas de IgG
total
evoluindo para uma forma clínica
sintomática, com maior densidade parasitária, níveis de IgG
2
mais
elevados e alta afinidade de IgG
total
. Além disso, confirmamos a eficácia
da PCR como ferramenta no diagnóstico da LVC ressaltando sua
importância do ponto de vista epidemiológico devido à sua capacidade
na detecção de animais assintomáticos.
X
ABSTRACT
In the present study, a group of 45 dogs composed of uninfected and
naturally infected animals with L. infantum chagasi (identification by
means of PCR-RFLP) was evaluated. Following clinical evaluation, the
animals were divided into three groups: Uninfected dogs (UD),
asymptomatic dogs (AD), and symptomatic dogs (SD). The parasitary
burden was assessed taken into account samples of the skin and spleen
of those animals, by using the quantification technique “Leishman
Donovan Units” (LDU). According to the parasitary burden, the animals
were separated into the following groups: low parasitism (LP), median
parasitism (MP), and high parasitism (HP). In this context, we studied
the positivity index of PCR using different clinical samples, the profile of
the humoral response (IgG and its sub-classes IgG
1
and IgG
2
), as well as
the IgG
total
avidity in relation to the clinical form and the parasitism
presented by the dog. Analysis of the results obtained by means of PCR
showed that there was no significant statistical difference related to the
reaction positivity among the groups with different clinical forms. The
animals were found to be positive in at least two of the evaluated
tissues, and the clinical samples showing the best results were as
follows: spleen, lymph node, skin, bone marrow, liver and blood,
respectively. In relation to the tecidual parasitism, a significant
statistical difference could be observed in the parasitary burden of the
skin samples, when the groups AD and SD were compared (p = 0.0011).
In both tissues used to evaluate the parasitary burden, it could be
observed that in the group AD there was a higher number of animals
with low parasitism, whereas in the group SD the great majority of the
animals presented high parasitism. Evaluation of the Ig profile showed
that the seric levels of IgG
1
were higher in the asymptomatic animals,
suggesting a possible association with immunoprotector mechanisms of
the infection. On the other hand, the seric levels of IgG
2
seem to be
associated with the presence of symptoms in the Canine Visceral
Leishmaniasis (CVL). Correlating the Ig profile with the parasitary
burden, it was observed that the more intense the parasitary burden
was (spleen and skin), higher were the IgG and IgG
2
values too. We
also observed a negative correlation between the IgG
1
values and the
parasitary density in the spleen as well. The avidity index (AI) of IgG
total
in the symptomatic animals was higher, when compared with the AI of
the asymptomatic animals. Moreover, the animals with a higher
parasitary burden either in the spleen or skin showed a higher avidity
index than the animals with lower parasitism. Based on these findings,
we suggest that CVL commences with an asymptomatic clinical form
with low parasitism, high production of IgG
1
and low affinity of the
IgG
total
molecules, evolving to a symptomatic clinical form, with higher
parasitism intensity, higher IgG
2
levels, and high affinity of IgG
total
.
Furthermore, we confirmed the efficacy of PCR as a tool for the CVL
diagnosis, emphasizing its importance under the epidemiological
viewpoint, due to its performance concerning the detection of
asymptomatic animals.
Introdução
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
2
1. LEISHMANIOSE VISCERAL
A leishmaniose visceral (LV) possui uma grande importância em
saúde pública devido a sua ampla distribuição e alta letalidade,
principalmente em crianças desnutridas, idosos, pacientes portadores
de co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e em
pacientes não tratados (HOMMEL et al., 1995; GUERIN et al., 2002;
WHO, 2004).
É uma doença zoonótica e antroponótica de grande significância
médica e veterinária causada por protozoários tripanossomatídeos do
gênero Leishmania (ROSS, 1903), pertencentes ao complexo
Leishmania (Leishmania) donovani (LAINSON & SHAW, 1987). Neste
complexo agrupam-se três espécies: Leishmania (Leishmania)
donovani (LAVERAN & MESNIL, 1903), que é o agente causador de
antroponose na Índia e regiões da África; L. (L.) infantum (NICOLE,
1908) encontrada em áreas do continente asiático, africano e
europeu, e a Leishmania (L.) chagasi (CUNHA & CHAGAS, 1937) que é o
agente etiológico da zoonose no Novo Mundo.
A inclusão da L. chagasi no complexo L. (L.) donovani é
amplamente aceita embora sua identificação taxonômica e origem no
novo mundo sejam uma questão polêmica e muito discutida desde
seu descobrimento em 1937 por CUNHA & CHAGAS, que caracterizaram
a Leishmania (L.) chagasi como uma nova espécie responsável pela
doença nas Américas. Existem controvérsias se o agente etiológico da
LVA foi recentemente introduzido no Novo Mundo na época da
colonização européia - e neste caso deveria ser classificado como L.
infantum - ou se ele tem uma origem antiga, tendo sido introduzido
juntamente com os canídeos na América do Sul há milhões de anos e
deveria ser classificado como L. chagasi.
Técnicas bioquímicas (isoenzimas), sorológicas (anticorpos
monoclonais) e técnicas de biologia molecular, têm mostrado que L.
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
3
chagasi e L. infantum são muito semelhantes, e por esta razão alguns
autores acreditam que os parasitos são de uma única espécie com
origem recente nas Américas (KILLICK-KENDRICK et al., 1985; GRIMALDI
JR. et al., 1987; RIOUX et al., 1990; MAURÍCIO et al., 2000). LAINSON E
RANGEL, (2005) baseados em diferenças observadas nas técnicas de
RFLP e kDNA (JACKSON et al.; 1984, 1986) têm usado a nomenclatura
L. L. infantum infantum e L. L. infantum chagasi, sugerindo que a
separação taxonômica dos parasitos poderia ser no nível
subespecífico. Por outro lado, DANTAS-TORRES, (2006) acredita que L.
chagasi e L. infantum devem ser consideradas espécies sinônimas
sem que haja mudança no nome no nível de subespécie, pois isso
implicaria em toda uma reclassificação do gênero Leishmania.
Contudo, SHAW, (2006) comenta que de acordo com o código da
Comissão Internacional de Nomenclatura em zoologia, os nomes L. L.
infantum infantum e L. L. infantum chagasi seriam absolutamente
corretos. Neste estudo iremos seguir a nomenclatura Leishmania
(Leishmania) infantum chagasi sugerida por LAINSON & RANGEL, (2005)
para tratar do agente etiológico da leishmaniose visceral no Novo
Mundo.
Estes protozoários são parasitos intracelulares obrigatórios do
sistema mononuclear fagocitário (SMF) dos hospedeiros vertebrados
(onde são encontradas formas arredondadas, denominadas
amastigotas) e do tubo digestivo do inseto vetor (onde são
observadas as formas flageladas denominadas promastigotas) (WHO,
2004).
As espécies causadoras da LV possuem um forte tropismo
tecidual, estabelecendo-se primariamente, em órgãos viscerais como
o fígado, baço, e medula óssea. A lesão primária na pele é raramente
observada e uma porcentagem substancial das infecções parece ser
assintomática ou auto-resolutiva (J
AFFE & GREENBLAT, 1991). Já a
doença ativa, conhecida como leishmaniose visceral clássica, quando
não tratada, pode levar ao óbito. Em geral, pacientes portadores da
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
4
LV clássica apresentam febre, hepatoesplenomegalia, perda de peso,
linfoadenopatia, anemia e leucopenia (BADARÓ et al., 1986).
A leishmaniose visceral (LV) é a mais devastadora entre as
formas clínicas de leishmaniose, estimam-se 500.000 novos casos da
doença e 59.000 mortes todos os anos (DESJEUX, 2004; WHO 2004).
A LV possui um amplo espectro epidemiológico podendo ocorrer em
regiões de clima tropical, subtropical e temperado, (DEANE & DEANE.,
1962; ALVAR et al., 2004). É endêmica em 87 países sendo 66 no
velho mundo e 21 no novo mundo. Porém, aproximadamente 90%
dos casos notificados ocorrem na Índia, Sudão, Bangladesh, Nepal e
no Brasil (WHO, 2005).
Nas Américas, a LV humana ocorre desde o sul do México até o
norte da Argentina sendo o Brasil responsável por 90% dos casos
ocorridos no continente americano (MONTEIRO et al., 1994). Observa-
se que 19 das 27 unidades federativas já registraram casos da
doença com aproximadamente 1.600 municípios apresentando
transmissão autóctone. A LV atinge as cinco regiões brasileiras e sua
maior incidência encontra-se no Nordeste, com aproximadamente
70% do total de casos notificados, seguido pela região Sudeste,
Norte, e, finalmente, a região Centro-Oeste. No Brasil, registra-se em
média cerca de 3.500 casos de LV/ano e a incidência é de 20,4
casos/100.000 habitantes, em algumas localidades de estados
nordestinos, como Piauí, Maranhão e Bahia (Manual de LV, MS,
2007).
Embora a L. infantum chagasi possa acometer indivíduos de
qualquer faixa etária, a doença é mais freqüente em crianças
menores de 10 anos (54,4%). O sexo masculino é proporcionalmente
o mais afetado (60%), e a letalidade está em torno de 10%
(Ministério da Saúde - MS, 2005). No Brasil a ocorrência da LV
apresentava inicialmente um caráter tipicamente rural e mais
recentemente a doença expandiu para áreas urbanas, com o aumento
expressivo do número de casos nos grandes centros e em suas
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
5
periferias. Assim, observou-se no início da década de 80 um surto
epidêmico em Teresina (PI) e, de lá para cá, já foram diagnosticados
casos autóctones em São Luís (MA), Fortaleza (CE), Natal (RN),
Aracajú (SE), Belo Horizonte (MG), Santarém (PA), Corumbá (MS),
Campo Grande (MS), Palmas (TO) e Araçatuba (SP). A região
metropolitana de Belo Horizonte é um bom exemplo desse processo
de urbanização, onde o grande crescimento populacional, a
susceptibilidade da população à infecção e a adaptação do vetor ao
ambiente urbano levaram a um crescimento no número de municípios
com notificações de LV, indicando uma ampliação da taxa de
transmissão da doença nestas áreas nos últimos anos (CUNHA et al.,
1995; PROFETA DA LUZ et al., 2001; SILVA et al., 2001ª; GONTIJO &
MELO, 2004).
A transmissão do agente etiológico da LV junto ao hospedeiro
vertebrado ocorre através da picada de fêmeas de flebotomíneos
(Díptera: Psychodidae; Phlebotominae) pertencentes ao gênero
Phlebotomus no velho mundo e Lutzomyia no novo mundo (KILLICK-
KENDRICK, 1999). A infecção do inseto vetor ocorre no momento do
repasto sanguíneo. Ao picarem um animal infectado, estes insetos
sugam juntamente com o sangue formas amastigotas que após
atingirem o tubo digestivo se transformam em promastigotas e se
multiplicam intensamente. Em seguida, as formas promastigotas
migram para as partes anteriores do tubo digestivo possibilitando que
ao realizar um novo repasto o vetor possa regurgitar as formas
promastigotas metacíclicas infectantes. Estas são internalizadas por
células do SMF, principalmente os macrófagos. Este processo envolve
a ligação de moléculas de superfície dos parasitos como o
lipofosfoglicano (LPG) e a glicoproteína de 63 KD (gp 63), a
receptores expressos na superfície de macrófagos, incluindo os
receptores 1 e 3 do complemento (CR1 e CR3), receptor manose-
fucose e receptor de fibronectina (GREEN et al., 1994; BRITTINGHARM et
al., 1995). No interior dos macrófagos os parasitos perdem o flagelo,
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
6
tornando-se arredondados ou ovóides e então passam a ser
denominados de amastigotas, formas que residem no interior dos
fagolisossomos, onde sobrevivem e se multiplicam.
Alguns macrófagos infectados se rompem e liberam as
amastigotas, que são então internalizadas por macrófagos vizinhos.
Durante um novo repasto sangüíneo, o inseto vetor ingere
macrófagos infectados com amastigotas de Leishmania, reiniciando
assim, o ciclo no hospedeiro invertebrado.
No Brasil a principal espécie de flebótomo incriminada na
transmissão da LV é a Lutzomyia longipalpis, cuja distribuição se
superpõe às áreas endêmicas da doença (LAINSON & RANGEL, 2005).
Animais silvestres principalmente as raposas Dusicyon vetulus e
Cerdocyon thous são considerados os principais reservatórios e os
responsáveis pela manutenção do parasito no ambiente silvestre
(LAINSON & SHAW, 1987). Já o cão doméstico (Canis familiares) é
considerado o principal reservatório do parasito no ciclo rural e
urbano e sua importância tem sido apontada, principalmente por
estudos realizados em algumas cidades brasileiras, como responsável
pelo aumento no número de casos humanos, já que estes se
correlacionam com a ampliação da ocorrência de casos de LVC
(B
EVILAQUA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2001).
O controle da LV está diretamente associado à redução dos
casos humanos e caninos, e consiste basicamente no tratamento de
todos os humanos infectados, na eliminação dos reservatórios
domésticos (o que resulta na quebra do elo de transmissão), no
combate ao vetor e, numa rigorosa vigilância epidemiológica (D
EANE &
DEANE, 1955; MAGALHÃES et al., 1980; Ministério da Saúde - MS,
2005).
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
7
2. LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA (LVC)
O cão representa um importante elo no ciclo de transmissão da
LV, e fatores como a presença de intenso parasitismo cutâneo
facilitam a infecção do flebotomíneo (DEANE & DEANE, 1954; MOLINA et
al., 1994; GIUNCHETTI et al., 2006). Além disto, MOLINA et al. (1994)
demonstraram que mesmo cães assintomáticos podem ser fontes
ativas de infecção para os vetores. Observa-se ainda que a maioria
dos focos de LV humana no Brasil está intimamente relacionada às
áreas onde se encontram altos índices de soroprevalência canina.
Devido a estes fatores, a LVC torna-se do ponto de vista
epidemiológico tão ou mais importante que a própria doença humana,
pois o controle eficaz destes animais reduz de forma considerável o
número de reservatórios e, conseqüentemente, a taxa de infecção em
humanos. Entretanto, as dificuldades operacionais e políticas
impedem a execução das medidas de controle que deveriam ser
executadas nas inúmeras áreas endêmicas de todo o país.
Com relação ao diagnóstico clínico os cães podem ser
classificados em três diferentes grupos (MANCIANTE et al., 1988): cães
assintomáticos (CA), animais que não apresentam nenhum sinal
clínico sugestivo da infecção por Leishmania; cães oligossintomáticos
(CO), são aqueles que possuem no máximo três sinais clínicos da
doença entre eles opacificação das córneas, perda moderada de peso,
alopecia localizada e ou adenopatia linfóide; e cães sintomáticos
(CS), animais com três ou mais sinais clínicos característicos da LVC
como lesões cutâneas, perda severa de peso, onicogrifose,
ceratoconjuntivite, apatia, paresia dos membros posteriores, entre
outros. Neste trabalho optou-se por usar somente as formas polares
da classificação clínica descrita por M
ANCIANTE et al. 1988 para a LVC
(assintomáticos e sintomáticos).
Como a LVC possui uma gama de manifestações clínicas, o
diagnóstico clínico torna-se uma tarefa difícil, e a utilização de
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
8
métodos laboratoriais para a confirmação da infecção torna-se
altamente necessária. Os métodos utilizados no diagnóstico podem
ser divididos da seguinte forma: isolamento do parasito, métodos
moleculares de detecção do DNA do parasito e técnicas de
imunodiagnóstico (GONTIJO & MELO, 2004).
Dentre os métodos diretos de detecção do parasito encontram-
se: a pesquisa de amastigotas de Leishmania em lâminas, contendo
esfregaços ou imprints de tecidos corados pelas técnicas de Giemsa
ou Leishmam (DEANE & DEANE, 1955; FERRER, 2002) e o isolamento de
promastigotas em meios de culturas como o NNN (Novy-McNeal-
Nicole) ou em modelos experimentais como o Hamster auratus
mesocricetus. Estas técnicas são consideradas padrão ouro para o
diagnóstico da LVC, já que a observação direta do parasito não deixa
dúvidas sobre a infecção. Entretanto, mesmo sendo técnicas de
certeza possuem algumas desvantagens, dentre elas encontram-se:
punções ou coletas de amostras clínicas que são procedimentos
invasivos, a cultura é laboriosa, lenta e apresenta baixa sensibilidade,
o que a torna inadequada para o diagnóstico de rotina laboratorial
além de necessitar de pessoal treinado e acompanhamento
sistemático (FERRER, 1997). Já no diagnóstico microscópico em
lâminas coradas por Giemsa ou Leishmam a observação das formas
amastigotas torna-se mais difícil em animais com baixa carga
parasitária e a leitura completa da lâmina exige tempo e treinamento
adequado (ASHFORD et al., 1995; FERRER, 1997). Outro método
parasitológico que pode ser realizado é a inoculação experimental em
mamíferos susceptíveis e o xenodiagnóstico, entretanto estes
métodos são extremamente laboriosos, demorados e devem ser
realizados com extrema cautela, por isso, ficando restrita a realização
em centros de referência (ALVAR et al., 2004).
Podemos citar ainda outra técnica de detecção do parasito, a
imunohistoquímica seja pelo método de revelação da
imunoperoxidase e/ou imunofluorescência direta em tecidos (FERRER
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
9
et al., 1988; BOURDOISEAU et al., 1997; TAFURI et al., 2004). Esta
técnica facilita a visualização de formas amastigotas nos tecidos,
devido à utilização de anticorpos específicos marcados que se ligam
com especificidade ao antígeno presente nos cortes histológicos.
Técnicas de imunodiagnóstico são métodos indiretos que
buscam demonstrar a presença de infecção através da detecção de
alterações no sistema imune. Como a resposta imune hurmoral
presente na LVC é muito intensa e os níveis de Ig anti-Leishmania
são altos, a utilização das técnicas de imunodiagnóstico tornam-se
ferramentas indispensáveis no diagnóstico da LVC (ALVAR et al.,
2004).
Atualmente, diversos testes vêm sendo aplicados no
diagnóstico da LVC em todo o mundo, dentre eles podemos citar a
Reação de Imunofluorecência Indireta (RIFI), o Teste
Imunoenzimático ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), o
Teste de Aglutinação Direta (DAT), o dot-ELISA, o Western Blotting e
os testes de imunocromatografia (TRALd, Dipstick) (SUNDAR & RAI,
2002). Entretanto, os mais aplicados na rotina soroepidemiológica
são a RIFI e ELISA (GRADONI, 2002). Estas duas técnicas sorológicas
são recomendadas pelo Ministério da Saúde do Brasil para avaliação
da soroprevalência em inquéritos caninos amostrais e censitários
(Manual de LV, 2006). O ELISA é recomendado para triagem de cães
e a RIFI para a confirmação dos cães sororreagentes ao teste ELISA
ou como técnica diagnóstica de rotina. Isto se baseia no fato da RIFI
ser uma técnica de baixo custo, simples e com níveis de sensibilidade
considerados altos quando comparados aos das técnicas
parasitológicas diretas (MANCIANTE et al., 1996). Apesar das
vantagens apontadas, a RIFI pode apresentar limitações tais como a
subjetividade na leitura, principalmente quando os títulos são baixos,
e apresentar baixa sensibilidade ao ser relacionada à ELISA (G
RADONI,
2002). Por outro lado, o ELISA é uma técnica muito sensível, porém
com algumas limitações como níveis de especificidade relativamente
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
10
baixos, problema este que já tem diminuído com a pesquisa de novos
antígenos solúveis e recombinantes (RAJ et al., 1999).
O teste DAT é uma técnica de diagnóstico baseada na detecção
de anticorpos anti-Leishmania em soros caninos com a utilização de
antígeno estável e liofilizado (HARITH et al., 1988). Os resultados
apresentados por OSKAM et al. (1996) mostraram sensibilidade e
especificidade elevadas, 100% de 98,8% respectivamente. Em
estudo recentemente publicado pelo nosso grupo, FERREIRA et al.
(2007) demonstrou que a técnica do DAT se compara à técnica de
ELISA em índices de sensibilidade e especificidade demonstrando
superioridade no diagnóstico quando comparada à RIFI. Outra grande
vantagem da utilização desta técnica é a facilidade de execução o que
a torna um método muito promissor no diagnóstico da LVC.
Porém, a técnica de diagnóstico da LVC mais utilizada
atualmente por diversos grupos de pesquisa em todo mundo é a
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (MULLIS & FALOOMO, 1987).
Trata-se de uma técnica molecular extremamente sensível e
específica que visa a amplificação de fragmentos de DNA do
cinetoplasto (kDNA) de Leishmania. Sua sensibilidade e especificidade
estão relacionadas a diversos fatores como os iniciadores utilizados,
número de ciclos, métodos de extração e escolha dos tecidos para
realização da técnica. Apesar de todas estas variáveis, diversos
estudos mostraram que a sensibilidade desta técnica gira entre 89 e
100% (ASHFORD et al., 1995; BERRAHAL et al., 1996; SILVA et al.,
2001b; SOLANO-GALLEGO et al., 2001a). As vantagens da utilização da
PCR como ferramenta de diagnóstico em inquéritos caninos advém do
fato de que esta técnica é rápida e extremamente sensível, pois
teoricamente é capaz de detectar a presença de DNA de 0,01
parasito, ou seja, a quantidade de DNA necessária para detecção
através da PCR é menor que a presente em apenas um parasito
(CRUZ et al., 2002). Outro fator que faz da PCR uma ferramenta
importante em estudos epidemiológicos é a sua alta sensibilidade na
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
11
detecção de cães assintomáticos (BERRAHAL et al., 1996), já que estes
animais são extremamente relevantes na manutenção da doença.
2.1. ASPECTOS IMUNOPATOLÓGICOS NA LVC
O papel do cão como principal reservatório doméstico de
Leishmania leva a um crescente interesse de pesquisadores que
tentam entender melhor quais fatores seriam responsáveis pela sua
resistência ou susceptibilidade à infecção. Assim, alguns grupos de
pesquisa vêm concentrando esforços no sentido de melhor
compreender os mecanismos imunopatológicos envolvidos com a
história natural da doença no cão, buscando correlacionar clínica com
a resposta imune celular e humoral (PINELLI et al., 1994; PINELLI et al.,
1995; BOURDOISEAU et al., 1997b; SOLANO-GALLEGO et al., 2001b;
CORDEIRO DA-SILVA et al., 2003; QUINNEL et al., 2003; ALMEIDA et al.,
2005; GIUNCHETTI et al., 2006; REIS et al., 2006a; REIS et al., 2006b;
REIS et al., 2006c). Em relação à imunidade protetora e aos processos
imunopatológicos, durante a infecção por parasitos do gênero
Leishmania, evidências experimentais demonstram que os aspectos
referentes ao parasito e ao hospedeiro podem influenciar de maneira
crucial na infecção. A incapacidade do hospedeiro em controlar a
infecção pode estar relacionada a dois fatores principais: o
estabelecimento de um perfil de imunidade celular e humoral pelo
hospedeiro vertebrado capaz de favorecer a formação de um
microambiente apropriado para a instalação do parasito; e a
habilidade de algumas cepas de Leishmania resistirem aos efeitos
microbicidas ocorridos durante os processos de imunidade inata e
adaptativa do hospedeiro (GRIMALDI & TESH, 1993).
Uma observação relevante referente à resposta imune na
infecção por Leishmania é que, durante a infecção, o organismo do
hospedeiro fica exposto a uma série de antígenos pertencentes ao
parasito, respondendo a estes estímulos através de mecanismos da
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
12
imunidade celular e humoral. Neste contexto, a leishmaniose torna-se
uma disfunção imunológica específica resultante do parasitismo do
SMF por Leishmania, produzindo um grande número de
manifestações clínicas e imunológicas, reversíveis com o tratamento
específico ou espontaneamente nos indivíduos imunologicamente
competentes. Assim, a leishmaniose apresenta-se como um bom
modelo para estudo da resposta imune humoral e da imunidade
mediada por células nos hospedeiros infectados.
Devido a estes fatores a leishmaniose tem sido amplamente
investigada, permitindo o entendimento da imunidade protetora bem
como dos mecanismos imunopatológicos desencadeados por este
patógeno. Em determinados modelos murinos parecia ocorrer uma
dicotomia na resposta imune, sendo dividida inicialmente em Th1 e
Th2 (COFFMAM & MOSMANN, 1989). Atualmente, a resistência do
hospedeiro tem sido associada com a ativação seletiva e
diferenciação de um padrão de imunidade do tipo 1, no qual,
citocinas como o INF-γ, e TNF-α são de fundamental importância para
o estabelecimento de mecanismos de proteção. Por outro lado, a
infecção progressiva e fatal está relacionada a uma resposta
predominantemente do tipo 2, com participação de citocinas como a
IL-4, IL-5 e IL-10 (COFFMAM & MOSMANN, 1989; HEINZEL et al., 1991;
ERB et al., 1996; MIRALLES et al., 1994; SACKS & TRAUTH, 2002).
Entretanto, no modelo canino os estudos realizados até o
momento ainda são insuficientes para estabelecer um padrão de
resposta imune do tipo resistência versus suscetibilidade em cães
naturalmente e/ou experimentalmente infectados por Leishmania
spp. (BARBIERI, 2006; REIS et al., 2008). Estudos pioneiros indicam
que a resistência está associada a baixos níveis de anticorpos
específicos e a presença de uma forte resposta mediada por células
levando a produção de IL-2, INF-γ e TNF-α (PINELLI et al., 1994). Tais
citocinas são responsáveis por estimular diretamente a atividade
leishmanicida dos macrófagos o que corresponderia a uma provável
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
13
resposta tipo 1 (PINELLI et al., 1995; VOULDOUKIS et al., 1996). Já a
susceptibilidade estaria correlacionada a altos níveis de anticorpos e a
ausência de uma resposta mediada por células, correspondente a
uma resposta tipo 2 (ALVAR et al., 2004), como observada em
modelos murinos.
Mais recentemente nosso grupo de pesquisa somou
informações interessantes a respeito da resposta imune na LVC. Em
estudo realizado em cães naturalmente infectados com L. infantum
chagasi, (REIS, 2001; REIS et al., 2006c) observaram uma elevação no
percentual de linfócitos T CD8
+
em culturas in vitro estimuladas com
antígenos de L. infantum chagasi, em relação a culturas controle, no
grupo de cães assintomáticos. O detrimento da habilidade de cães
sintomáticos em recrutar células T CD8
+
antígeno-específicas estaria
comprometendo o estabelecimento de mecanismos imunoprotetores.
Estes autores também mostraram que animais sintomáticos
apresentavam predomínio de linfócitos T CD8
+
circulantes, quando
comparados aos animais sintomáticos. A razão (CD4
+
/CD8
+
) na
população de esplenócitos totais apresentou-se diminuída apenas no
grupo de cães assintomáticos, devido a um aumento seletivo da sub-
população de esplenócitos T CD8
+
(REIS, 2001; REIS et al., 2006c).
Estes dados reforçam o papel protetor de células T CD8
+
na LVC,
sugerindo ainda que uma migração preferencial dessas células para o
baço possa ocorrer com o objetivo de promover a lise de macrófagos
infectados. Consistente com esta hipótese, R
EIS et al. (2006c)
demonstraram a existência de um menor parasitismo esplênico em
cães assintomáticos.
Em estudo pioneiro de histopatologia da LVC KEENAN et al.
(1984) preconizaram que a presença de anticorpos específicos anti-
Leishmania não seria suficiente para promover a proteção da doença,
mas que a proteção também não aconteceria na ausência de
anticorpos. Com isto diversas pesquisas têm focado nas correlações
existentes entre o perfil das classes e subclasses de Ig com o tipo de
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
14
resposta produzida durante o processo de infecção no hospedeiro
(BOURDOISEAU et al., 1997; SOLANO-GALLEGO et al., 2001b; CORDEIRO
DA-SILVA et al., 2003; QUINNEL et al., 2003; ALMEIDA et al., 2005; REIS
et al., 2006a).
Inicialmente, DEPLAZES et al. (1995), observaram a presença de
maiores níveis de IgG
2
em cães assintomáticos enquanto que em
animais sintomáticos os níveis mais elevados seriam de IgG
1
. A partir
daí diversos estudos passaram a sugerir novos perfis de classes e
subclasses de Ig como biomarcadores de resistência versus
susceptibilidade em relação ao status clínico na LVC. Alguns
pesquisadores demonstraram que os níveis de IgG anti-Leishmania
eram maiores em cães que apresentavam características clínicas da
LVC (SOLANO-GALLEGO et al., 2001b; ALMEIDA et al., 2005; INIESTA et
al., 2005; REIS et al., 2006a). Além disso, foi relatado que altos níveis
de IgG específica anti-Leishmania estavam correlacionados com baixa
imunidade celular específica (PINELLI et al., 1994; MARTINEZ-MORENO et
al., 1995; RHALEM et al., 1999; FERNANDEZ-PEREZ et al., 2003). Estudos
recentes demonstraram que os níveis de IgE estão diretamente
correlacionados com a susceptibilidade do animal à L. infantum
(ALMEIDA et al., 2005; INIESTA et al., 2005; REIS et al., 2006). Níveis
elevados de IgM foram detectados em cães sintomáticos infectados
por L. infantum no Brasil e na Espanha (RYAN et al., 2002; RODRIGUEZ
et al., 2006), porém REIS et al. (2006ª) não encontraram relação
entre status clínico e níveis de IgM.
Podemos dizer que a infecção em animais sintomáticos está
correlacionada a altos títulos de imunoglobulinas anti-Leishmania das
classes IgG, IgE e IgA (INIESTA et al., 2005; REIS et al., 2006a),
porém, a utilização de classes e subclasses de Ig como marcador de
resistência e suscetibilidade ainda é considerada controversa na
literatura, pois não se tem um padrão claro de comportamento deste
marcador frente à infecção por Leishmania sp. em cães.
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
15
Resumindo, os estudos referentes aos eventos imunológicos
associados à imunoproteção e patologia na LVC mostram, até o
momento, que os padrões de imunidade protetora em cães infectados
por Leishmania são semelhantes àqueles observados em modelos
murinos e em humanos. Este padrão de imunoproteção requer o
estabelecimento de uma resposta imune celular, antígeno-específica,
com a produção de um padrão específico de citocinas e de
imunoglobulina antígeno-específica.
2.2. TESTE DE AVIDEZ NA LVC
A técnica de avidez de IgG vem sendo amplamente empregada
para diferenciar a fase aguda da fase crônica em doenças como a
toxoplasmose. A avidez de IgG é mensurada pela resistência da
ligação do complexo antígeno-anticorpo que é testada através da
adição de uréia 6M. Recentemente REDHU et al. (2006) conseguiram
demonstrar que o grau de avidez da imunoglobulina G ao antígeno de
Leishmania era capaz de predizer o “tempo” de infecção em pacientes
com leishmaniose visceral. Esta afinidade foi capaz de diferenciar os
pacientes com infecção recente (< 6 meses) daqueles com infecção
crônica (> 6 meses).
Entretanto, até o momento, ainda não foi investigada o
desempenho diagnóstico e prognóstico da reação de avidez no
sentido de correlacionar o grau de afinidade de IgG com a forma
clínica e grau de parasitismo em cães naturalmente infectados.
2.3. DENSIDADE PARASITÁRIA E RESPOSTA IMUNE NA LVC.
Uma nova abordagem altamente relevante para o entendimento
dos aspectos imunopatológicos na LVC encontra-se nos recentes
Teixeira - Neto, R.G. Introdução
16
estudos que buscam uma associação da densidade parasitária com a
clínica e com a resposta imune. Neste sentido REIS et al. (2006a)
demonstraram que a pele e o baço foram os órgãos mais
intensamente parasitados independente da forma clínica. Além disso,
cães com alta densidade parasitária medida pelo LDU – “Leishman
Donovan Units” apresentam maior expressão de IL-10 quando
comparados aos cães com baixa densidade parasitária (LAGE et al.,
2007).
Além das técnicas de LDU (REIS, 2001), outros métodos de
quantificação da carga parasitária já foram aplicados em diversos
trabalhos, dentre eles: quantitative nucleic acid sequence-based
amplification (QT-NASBA) (VAN DER MAID et al., 2005),
imunohistoquímica (STERNBERGER et al., 1986; TAFURI et al., 2004;
GIUNCHETTI et al., 2006) e PCR em tempo real (qPCR). Esta última
técnica tem sido considerada uma ferramenta muito promissora para
a detecção e quantificação de parasitos e tem sido empregada com
sucesso em infecções por Plasmodium falciparum (BRUÑA-ROMERO et
al., 2001; HERMSEN et al., 2001), Toxoplasma gondii (JAUREGUI et al.,
2001), Neospora caninum (COLLANTES-FERNANANDEZ et al., 2002) e
Leishmania (BRETAGNE et al., 2001; NICOLAS et al., 2002; ROLÃO et al.,
2004; V
ITALE et al., 2004).
Estudar a patogenia e a imunopatologia da LVC é algo
estimulante e fascinante, além de ser altamente relevante
considerando a necessidade de testar a eficácia de novos fármacos e
vacinas para uso imunoprofilático em larga escala. Estudos
relacionados a esta abordagem merecem esforços, pois pouco se
conhece da imunopatologia da LVC sob a ótica da imunologia
moderna.
Justificativa
Teixeira - Neto, R.G. Justificativa
18
Considerando o caráter emergente e re-emergente da
leishmaniose visceral que nos últimos anos tem se urbanizado de
forma crescente, com o registro de grande número de casos humanos
e caninos. O papel do cão como principal reservatório da infecção no
ambiente doméstico e importante elo no ciclo de transmissão da LV,
diversos autores tem juntado esforços com o intuito de compreender
os mecanismos envolvidos na imunopatologia da LVC. Porém, os
estudos envolvendo as relações entre densidade parasitária e
aspectos imunológicos necessitarem de maiores investigações já que
estes são escassos e os trabalhos realizados até então apresentam
resultados muito controversos. Assim, o presente estudo almeja
contribuir para o conhecimento dos mecanismos imunológicos bem
como da densidade parasitária em animais naturalmente infectados
por L. infantum chagasi, avaliando a diferença no perfil de resposta
imune humoral de acordo com a densidade parasitária e a forma
clínica. Estas informações podem auxiliar no entendimento do
prognóstico clínico da doença, e na avaliação da eficácia de
imunoprofiláticos e quimioterápicos em animais naturalmente
infectados.
Objetivos
Teixeira - Neto, R.G. Objetivos
20
1. OBJETIVO GERAL
Estudar as correlações entre carga parasitária, perfil das
imunoglobulinas da classe IgG e subclasses IgG
1
e IgG
2
, avidez
das moléculas de IgG
total
e forma clínica de cães naturalmente
infectados por L. infantum chagasi.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar a eficiência da reação em cadeia da polimerase no
diagnóstico de cães naturalmente infectados por L. infantum
chagasi.
• Avaliar o perfil das imunoglobulinas IgG, IgG
1
e IgG
2
em cães
naturalmente infectados por L. infantum chagasi considerando
o quadro clínico e a carga parasitária.
• Avaliar a avidez de IgG e correlacionar com a reatividade das
subclasses IgG
1
e IgG
2
, o parasitismo na pele e baço e a
sintomatologia de cães naturalmente infectados por L. infantum
chagasi.
Materiais e Métodos
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
22
1. ANIMAIS
O presente trabalho foi realizado com base em uma amostra de
45 cães (Canis familiaris) de ambos os sexos, idades variadas e sem
raça definida (SRD). Destes, 40 animais eram naturalmente
infectados por L. infantum chagasi provenientes do município de Belo
Horizonte e fornecidos pelo Centro de Controle de Zoonoses de Belo
Horizonte (CCZ-BH) e cinco animais não infectados (testes
sorológicos, parasitológicos e moleculares negativos), nascidos e
criados no canil da Universidade Federal de Ouro Preto. O diagnóstico
sorológico dos animais naturalmente infectados foi realizado pelo
laboratório do CCZ-BH aplicando as técnicas de RIFI e ELISA.
2. CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS ANIMAIS
Inicialmente foi realizada uma avaliação clínica detalhada dos
animais por um médico veterinário e os dados clínicos foram
observados e anotados em ficha clínica individual (Anexo 1).
A classificação clínica utilizada foi a descrita por M
ANCIANTI et al.
(1988) que separam os animais nos grupos: cães assintomáticos
(CA), cães oligossintomáticos (CO) e cães sintomáticos (CS),
conforme descrito anteriormente no item introdução.
Foram selecionados 40 cães naturalmente infectados (CI)
classificados em dois grupos: cães assintomáticos (CA) e cães
sintomáticos (CS) sendo cada um composto por 20 animais. Neste
estudo optamos por utilizar somente animais com as formas clínicas
polares da LVC.
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
23
3. COLETA DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS.
Para coleta das amostras de sangue e medula óssea os animais
foram submetidos à indução anestésica com Tiopental Sódico
(Thiopentax®) 1,0g de pó liofilizado diluído em 40 mL de água
destilada, resultando uma concentração de 25mg/mL. Então foram
aplicados 25 mg por Kg de peso via intravenosa na veia radial. Após
a confirmação da indução anestésica foram realizados os
procedimentos de coleta de sangue e medula descritos a seguir.
As amostras de sangue total foram coletadas por via
intravenosa na veia radial, utilizando seringa descartável de 20 mL e
agulha descartável 21 G 25X8. Foram confeccionados dois esfregaços
para diagnóstico parasitológico. Parte do sangue total foi utilizado
para realização das técnicas de biologia molecular e o restante foi
estocado em dois tubos com ativador de coágulo para obtenção do
soro. As amostras de soro foram armazenadas em tubos de
criopreservação de 2 mL estéreis e estocadas a -20ºC para futura
avaliação do perfil das Ig.
As amostras de medula óssea foram coletadas através de
punção da tíbia. Para a coleta a perna do animal foi dobrada de tal
forma que a tíbia ficasse em ângulo de 90º em relação à mesa, uma
agulha 18 G 40X12 era inserida verticalmente sobre a crista da tíbia
utilizando uma seringa descartável de 20mL para aspiração da
medula. Parte do material coletado foi utilizado para confecção de
esfregaços e o restante foi transferido para tubos de criopreservação,
de 2mL para realização dos procedimentos de biologia molecular.
Após a coleta de sangue e medula óssea os animais foram
submetidos à eutanásia através da aplicação de uma injeção letal à
base de cloreto de potássio (KCL) realizada pelo veterinário
responsável do Centro de Controle de Zoonoses de Belo Horizonte
(CCZ-BH) e após atestado o óbito foram iniciados os procedimentos
de necropsia.
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
24
Para a coleta das amostras de pele de ponta de orelha, fígado,
baço e linfonodo poplíteo foi realizado o protocolo descrito a seguir:
Amostras foram coletadas utilizando lâminas de bisturi
descartáveis individuais para que não houvesse o risco de
contaminação entre as diferentes amostras de tecidos. Um fragmento
de cada tecido foi armazenado em tubos de 50 mL contendo formol
10% tamponado para confecção dos cortes histológicos utilizados nos
procedimentos de imunopatologia, outro fragmento foi reservado em
tubos de 2 mL estéreis para realização das técnicas de biologia
molecular e um terceiro fragmento foi imediatamente congelado em
nitrogênio líquido com resina de criopreservação (Tissue Freezing
Médium
®
- JUNG, Nussloch, Germany). Além disso, foram
confeccionados dois esfregaços por aposição para cada um dos
tecidos citados anteriormente, para posterior diagnóstico
parasitológico e avaliação da densidade parasitária pelo LDU no baço
e na pele.
4. EXTRAÇÃO DE DNA DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS
Para extração de DNA dos tecidos coletados foram utilizados
três protocolos diferentes: para as amostras de sangue e medula foi
utilizado o Kit de Cromatografia em Coluna - GFX™ Genomic Blood
DNA Purification (GE
®
, Pittsburgh, Pennsylvania, USA); para as
amostras de pele e linfonodo foi utilizado o Kit Genomic Prep Cells
and Tissue DNA Isolation (GE
®
, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) e para
as amostras de fígado e baço foi utilizado o método do fenol-
clorofórmio.
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
25
4.1. SANGUE PERIFÉRICO TOTAL E MEDULA ÓSSEA
Para a extração de DNA das amostras de sangue periférico e
medula óssea foi utilizado o Kit de Cromatografia em Coluna - GFX™
Genomic Blood DNA Purification (GE
®
, Pittsburgh, Pennsylvania, USA)
seguindo as especificações do fabricante. Resumidamente 300 μl da
amostra foram adicionados a 900 μl da solução de lise RBC (10mM
KHCO
3
, 155mM NH
4
CL, 0,1mM EDTA), após incubado e centrifugado,
descartou-se a solução de lise e o sedimento contendo as células
brancas foi incubado por 5 minutos com a solução de extração. O
material foi então transferido para a coluna GFX e centrifugado.
Posteriormente adicionou-se à coluna solução de lavagem (tampão
Tris-EDTA acrescido de etanol absoluto) e novamente o material foi
centrifugado. Para eluir o DNA da coluna acrescentou-se a esta 200μl
de H
2
O destilada e deionizada aquecida a 70ºC, após eluição o DNA
foi dosado, aliquotado e estocado à -20ºC.
4.2. AMOSTRAS DE FÍGADO E BAÇO
A extração do DNA a partir das amostras de fígado e baço foi
realizada pela técnica do fenol-clorofórmio. Brevemente, as amostras
foram pesadas e fragmentos de 10mg de pele e 5 mg de linfonodo,
foram mergulhados em 600 μl de solução de lise e proteinase K na
concentração de 100 μg/mL. Os tubos foram incubados a 37ºC
“overnight” até a total digestão do material. Após este procedimento,
foi adicionado igual volume de fenol neutralizado pH 8,0 e
homogeneizado por 10 minutos. Em seguida os tubos foram
centrifugados por 10 minutos a 8.000 r.p.m. a fase aquosa foi então
transferida para um novo tubo contendo 0,5 volume de fenol e 0,5
volume de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Os tubos foram
agitados e centrifugados como anteriormente. Novamente retirou-se
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
26
a fase aquosa transferindo-a para um novo tubo (este passo pode ser
repetido para se obter uma amostra mais pura de DNA).
Acrescentou-se à fase aquosa igual volume de clorofórmio álcool
isoamílico, seguido de agitação e centrifugação.
Para a precipitação do DNA foram adicionados 2X o volume da
fase aquosa de etanol 100% gelado e 1/10 do volume de acetato de
sódio 3M pH 5,2. Os tubos foram incubados em freezer -20ºC
“overnight” ou em -70ºc por 1 hora e depois centrifugados por 10
minutos a 4ºC na velocidade de 8.000 r.p.m. Os tubos foram
acondicionados em papel absorvente para evaporação do etanol e
depois de secas as amostras de DNA foram ressuspendidas em H
2
O
destilada e deionizada a 37ºC, após um período de hidratação das
moléculas de DNA na temperatura ambiente estas foram dosadas,
aliquotadas e estocadas à -20ºC.
4.3. AMOSTRAS DE PELE E LINFONODO
A extração do DNA a partir das amostras de pele e linfonodo foi
realizada através da utilização do Kit Genomic Prep Cells and Tissue
DNA Isolation (GE
®
, Pittsburgh, Pennsylvania, USA), segundo o
protocolo descrito pelo fabricante. As amostras de tecidos foram
pesadas (10mg), maceradas e mergulhados em solução de lise
adicionada de proteinase K na concentração de 20μg/mL o material
foi incubado a 55ºC “overnight”. Após a precipitação das proteínas
por centrifugação, o sobrenadante contendo DNA foi transferido para
um novo tubo contendo etanol 100% e centrifugado (6.000 rpm)
para a obtenção de um precipitado branco de DNA. Por fim, o etanol
foi descartado e os tubos secaram por aproximadamente 2 horas. O
DNA foi hidratado com H
2
O destilada e deionizada, dosado,
aliquotado e estocado à -20ºC.
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
27
5. DOSAGEM DAS AMOSTRAS DE DNA
Após os procedimentos de extração as amostras de sangue,
medula, pele, baço, fígado e linfonodo foram submetidas à dosagem
de DNA, esse procedimento foi realizado para confirmar a presença
de DNA nas amostras após o processo de extração, assegurando que
as amostras negativas na PCR para o gênero Leishmania spp
realmente continham DNA.
Para isso alíquotas de 5μl foram diluídas 10X em água Mili-q, o
DNA diluído foi então submetido à leitura em espectrofotômetro com
comprimento de onda de 260nm e 280 nm. A correlação entre as
duas leituras fornecia o valor referente à pureza da amostra de DNA e
a quantidade de moléculas foi expressa em ng/μl.
6. DIAGNÓSTICO MOLECULAR E CARACTERIZAÇÃO ESPÉCIE-ESPECÍFICA.
6.1. PCR PARA O GÊNERO LEISHMANIA
Para realização da PCR foram utilizados iniciadores que
flanqueiam a região conservada do minicírculo de kDNA de
Leishmania: iniciador A:
5’
(C/G)(C/G)(G/C) CC(C/A) CTA T(T/A)T TAC
ACC AAC CCC
3’
e iniciador B:
5’
GGG GAG GGG CGT TCT GCG AA
3’
(D
EGRAVE et al., 1994), que amplifica um fragmento de 120 pb. As
reações foram preparadas para um volume final de 25μl contendo
tampão 1X 1,5mM MgCl
2
, 50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH 8,0), dNTP
200μM, iniciador A1 e A2 a 5pmol e iniciador B a 10pmol, taq-
polymerase a 2,5U e 1μl de DNA. A amplificação foi realizada em
equipamento termociclador automático (Perkin-Elmer-Geneamp PCR
System 2400, New York, New York, USA) empregando o seguinte
programa: 94ºC por 4 minutos, seguido de 30 ciclos de 94ºC por 30
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
28
segundos para desnaturação, 60ºC por 30 segundos para anelamento
e 72ºC por 30 segundos para extensão. A extensão final foi feita a
72ºC por 10 minutos. As amostras foram submetidas à eletroforese
em gel de poliacrilamida 6% corado por nitrato de prata a 0,2%. O
marcador de peso molecular utilizado foi o φx174, digerido por Hae
III, apresentando 11 fragmentos variando de 72 a 1357 pb.
6.2. PCR-RFLP
A PCR-RFLP foi realizada para confirmar a infecção dos animais
selecionados por L. infantum chagasi. Esta ratificação ocorre através
da análise do padrão de digestão nos fragmentos de kDNA
resultantes da amplificação realizada na PCR genérica. Os fragmentos
de restrição obtidos pela digestão do kDNA e seus tamanhos (Tabela
1) foram comparados com o perfil gerado após a digestão de kDNA
de cepas referência de Leishmania (L). infantum chagasi
(MHOM/BR/74/PP75), Leishmania (V). braziliensis
(MHOM/BR/75/M2903) e Leishmania (L). amazonensis
(IFLA/BR/67/PH8).
Tabela 1: Enzimas de restrição e tamanho dos fragmentos obtidos após a digestão
do kDNA das espécies L. amazonensis, L. braziliensis e L. infantum chagasi.
Enzima de Restrição
Hae III ApaL I
Espécie
Tamanho dos fragmentos após a digestão (pb)
L. amazonensis
116 116
L. braziliensis
80, 40 88, 32
L. infantum chagasi
120, 80, 60, 40 120
A PCR-RFLP foi realizada de acordo com protocolo descrito por
VOLPINI et al. (2004). Resumidamente, cinco microlitros do produto
amplificado na PCR genérica foram digeridos através da adição de 1U
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
29
da enzima de restrição e o seu tampão apropriado (1x). Cada
amostra foi incubada com a enzima Hae III (Promega
®
, Madison,
Wisconsin, USA) e Apa LI (GE
®
, Pittsburgh, Pennsylvania, USA). A
mistura foi incubada a 37ºC por 3 horas e os fragmentos de restrição
foram separados através de eletroforese em gel de poliacrilamida
10% e visualizados após coloração por nitrato de prata 0,2% (Figura
1).
Figura 1: Perfil de digestão do fragmento de 120pb do kDNA de Leishmania spp
pelas enzimas Hae III (A) e APA LI (B). PM = Peso Molecular 50 pb. L.a = Controle
de L. amazonensis (PH8). L.b = controle de L. braziliensis (M2903). L.c = Controle
de L. infantum chagasi (PP75). 1 a 4 = amostras clínicas.
7. TÉCNICA DE QUANTIFICAÇÃO DA CARGA PARASITÁRIA
As amostras de pele e baço foram escolhidas para a
quantificação da carga parasitária tecidual utilizando-se a técnica
descrita incialmente por Stauber, 1955 para avaliação da densidade
parasitária em hamster, modificada por Reis, (2001) e Reis et al.
(2006) para avaliação da carga parasitária na LVC (Figura 2). Os
resultados obtidos a partir da análise da densidade parasitária de
animais portadores das formas clínicas polares da LVC foram
posteriormente correlacionados ao perfil da resposta imune humoral.
Após a avaliação da carga parasitária nos tecidos citados, as
Hae III Apa LI
12 3 4
5
PM
118pb
120pb
88pb
32pb
100
150
PM
12
3 4
50
80pb
60pb
40pb
118pb
120pb
L.a L.b L.c
L.a L.b L.c
100
150
50
Hae III Apa LI
12 3 4
5
PM
116pb
120pb
88pb
32pb
100100
150150
PM
12
3 4
50
50
80pb
60pb
40pb
116pb
120pb
L.a L.b L.c
L.a L.b L.c
100
100
150150
5050
A
B
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
30
amostras foram divididas em três grupos que apresentavam baixo
parasitismo (BP), médio parasitismo (MP) ou alto parasitismo (AP).
Inicialmente foram feitos “imprints” em duas lâminas de vidro
desengorduradas em éter-álcool de tamanho 26X76 mm e 1,2 mm de
espessura. Para fixação do material as lâminas foram cobertas com
metanol P.A até secarem completamente, posteriormente as lâminas
foram coradas pelo sistema citohematológico Giemsa na proporção de
2 gotas/mL de água destilada, após quinze minutos as lâminas foram
lavadas em água corrente e acondicionadas para secagem. O
processo de quantificação parasitária pela LDU consiste na relação
entre o número de amastigotas para mil células nucleadas.
Para divisão dos animais em grupos de acordo com a
intensidade parasitária, os cães foram distribuídos em uma única
coluna onde o primeiro animal apresentaria o menor valor de
densidade parasitária e o último o maior valor. Após esta distribuição
o grupo total de cães foi dividido em três partes iguais, sendo os
animais com menor intensidade parasitária classificados como grupo
BP (Baixo Parasitismo), os cães do grupo intermediário como MP
(Médio Parasitismo) e os animais com maior número de parasitos
como AP (Alto parasitismo).
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
31
Figura 2: Fotografia de lâmina de pele (ponta de orelha) realizada por aposição
corada por GIEMSA. Campo apresentando macrófagos densamente parasitados
(aumento 1500X). Para realização da LDU deve-se contar o número de células e
relacionar com o número de formas amastigotas.
8. ELISA ISOTIPOS E ELISA AVIDEZ
8.1. PESQUISA DE ANTICORPOS ATRAVÉS DO TESTE IMUNOENZIMÁTICO
(ELISA)
A pesquisa de anticorpos anti-Leishmania da classe IgG e das
subclasses IgG
1
e IgG
2
foi realizada de acordo com técnica descrita
por VOLLER et al. (1979), empregando um painel de conjugados anti-
Ig específicos para cão de acordo com a Tabela 2.
Tabela 2: Painel de anticorpos anti-Ig de cão utilizados no protocolo de ELISA
Isotipos.
Anticorpos específicos anti – Ig – Cão para
avaliação sorológica (ELISA)
Classes e Sub-
classes de
Imunoglobulinas
Conjugado Afinidade Molecular
Anti IgG
total
HRPO Molécula total
Anti IgG
1
HRPO Específico para cadeia pesada
Anti IgG
2
HRPO Específico para cadeia pesada
Fabricante Bethyll Laboratórios.
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
32
Para prática da técnica de ELISA o seguinte protocolo foi
realizado: no dia anterior a realização da técnica as placas (NUNC
®
,
Nova York, EUA) foram sensibilizadas com 2µg/poço de antígeno de
Leishmania (MHOM/BR/1972/BH46) diluído em tampão carbonato pH
9,6 e mantidas por 12 horas (overnight) na geladeira coberta por
papel alumínio. No dia da reação o soro foi diluído em placa de
hemocultura de 96 poços na concentração de uma parte de soro para
40 partes de PBS/Tween. A solução com o antígeno foi desprezada e
a placa lavada por quatro vezes com solução de lavagem. Realizou-se
então o bloqueio da placa com 100µl/poço da solução de bloqueio
durante 45 minutos a 37ºC. O material foi novamente desprezado e a
placa lavada por duas vezes. Então foi aplicado 50µl do soro diluído
anteriormente acrescido de 50µl de PBS/Tween por poço, resultando
em uma concentração final de 1:80. A placa foi incubada a 37ºC
durante 45 minutos e lavada por quatro vezes. Foram aplicados
100µl/poço do conjugado na concentração desejada e a placa foi
novamente incubada a 37ºC por 45 minutos. Novamente as placas
foram lavadas quatro vezes e 100µl/poço do substrato foi aplicado. A
placa foi levada à estufa na temperatura de 37ºC por 10 minutos,
coberta com papel alumínio. A reação foi interrompida com 32µl/poço
de solução de bloqueio e a placa levada para leitura em leitor de
ELISA com filtro para comprimento de onda de 490nm.
A diluição ótima dos conjugados foi determinada por titulação
em bloco (REIS, 2001), empregando-se soros padrões positivos e
negativos (Anexo 2).
8.2. TESTE DE AVIDEZ DE IGG ATRAVÉS DA TÉCNICA DE ELISA
Para realização do teste de avidez de IgG as colunas da placa
de ELISA foram separadas em dois grupos (Anexo 3). Nas colunas da
esquerda (1 a 6) foi seguido o mesmo protocolo utilizado no teste
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
33
convencional de ELISA com uma lavagem extra de PBS/Tween após a
aplicação do soro. Nas colunas da direita (7 a 12) foi realizada uma
lavagem dos poços com solução de PBS/tween e uréia 6M através da
adição de 100µl desta solução sendo a placa encubada a 37ºC por 10
minutos.
A leitura foi realizada em leitor de ELISA com comprimento de
onda de 490nm e os valores expressos em índice de avidez (IA). Este
índice foi determinado pela razão entre os valores de densidade
óptica das amostras tratadas com uréia e a densidade óptica das
amostras não tratadas. Os resultados foram expressos em
porcentagem.
Soros controles positivos com diferentes tempos de infecção
experimental, pertencentes a soroteca do Laboratório de
Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto foram utilizados como padrão do
perfil da avidez de IgG de acordo com o curso da infecção.
9. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para avaliação do índice de positividade na PCR entre os
diferentes tecidos foi utilizado o teste Qui-quadrado (χ2) com a
correção de Bonferroni, que divide o nível de significância global
(α=0,05) pelo número de comparações. Esta metodologia também foi
aplicada para comparar a distribuição da carga parasitária entre os
diferentes grupos clínicos.
O teste t de Student ou o teste não paramétrico de Mann-
Whitney (quando os dados não seguiam a distribuição normal) foram
utilizados para comparar o valor da carga parasitária entre os
diferentes grupos clínicos, para comparar o número de tecidos
positivos na PCR de acordo com a forma clínica do animal, e para
comparar a avidez de IgG com os sintomas clínicos.
Teixeira - Neto, R.G. Materiais e Métodos
34
Para avaliar se havia diferença estatística entre os valores de
densidade óptica, obtidos através do teste de ELISA, com o perfil
clínico apresentado pelos animais naturalmente infectados
juntamente com os animais não infectados foi empregado o teste de
ANOVA, seguido de comparações múltiplas pelo método de Tukey ou
o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido de comparações
múltiplas de Dunn’s. A mesma metodologia foi aplicada para
comparar os valores de ELISA e o índice de avidez com a carga
parasitária apresentada pelo cão.
Todos os testes foram realizados ao nível de 95% de confiança
utilizando os programas estatísticos PRISMA 4.0 e MINITAB 13.
Resultados
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
36
O trabalho foi realizado em duas etapas. Inicialmente, as
amostras coletadas foram submetidas à PCR para o gênero Leishmania
sp. e a infecção por L. i. chagasi foi confirmada através da realização
da PCR-RFLP. Na segunda etapa, as amostras positivas foram
submetidas a métodos de quantificação da carga parasitária e por fim,
foi realizado um estudo do perfil e da afinidade de imunoglobulinas
presentes no soro destes animais. A seguir, serão mostrados os
resultados da caracterização clínica, obtidos no momento da coleta do
material, seguidos pelos resultados da análise diagnóstica molecular
(PCR e PCR-RFLP) e, posteriormente, serão apresentados os resultados
referentes ao perfil de classes e subclasses de Ig (IgG, IgG
1
e IgG
2
),
obtidos pela reação de ELISA e pelo teste de avidez (IgG
total
).
1. CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA DOS ANIMAIS
Entre os animais pertencentes ao grupo CC e CA nenhum sinal
clínico sugestivo da infecção por Leishmania foi observado. Já entre os
animais do grupo CS foram observados diversos sinais sugestivos da
LVC (Figura 3), entre eles podemos citar: alopecia localizada e
onicogrifose (presente em 70% dos cães); emagrecimento acentuado
(50%); dermatite furfurácea (35%); úlceras (30%); emagrecimento
leve, emagrecimento moderado e pelagem opaca (25%); cerato
conjuntivite (20%); alopécia generalizada e opacificação das córneas
(15%).
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
37
Figura 3: Sinais clínicos observados nos cães provenientes do CCZ-BH. 1 –
Emagrecimento acentuado, 2 – Onicogrifose, 3 – Alopécia periorbital no rosto e
orelha, 4 – Lesão de ponta de orelha, 5 – Úlcera de decúbito, 6 – Dermatite
furfurácea.
2. DOSAGEM DO DNA
Após a extração de DNA, as amostras foram submetidas a um
processo de dosagem de moléculas de DNA em espectrofotômetro. Este
procedimento foi necessário para confirmar a presença de DNA em
todas as amostras submetidas à extração.
3. CONFIRMAÇÃO DA INFECÇÃO POR L. INFANTUM CHAGASI ATRAVÉS DA
PCR-RFLP
Belo Horizonte é uma região endêmica para transmissão de L. i.
chagasi e L. braziliensis, além disso, alguns dos sintomas apresentados
por cães com estas infecções são semelhantes, impossibilitando a
confirmação da infecção através do diagnóstico clínico. Devido a estes
fatores realizamos a técnica da PCR-RFLP descrita por V
OLPINI et al.
(2004) para identificar a espécie responsável pelo parasitismo dos
animais. Os resultados mostraram que a digestão do DNA foi
semelhante ao apresentado pela cepa de L. i. chagasi em 100% dos
cães em pelo menos um dos tecidos avaliados, sendo 67,5% das
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
38
amostras de pele e em 97,5% das amostras das vísceras (Tabela 3). É
importante destacar que em quatro animais (4, 29, 46 e 48) observou-
se um padrão de digestão semelhante a uma infecção mista por L. i.
chagasi e L. braziliensis como o apresentado na amostra 4P da Figura
4.
Tabela 3: Identificação da espécie de Leishmania através da PCR-RFLP em amostras
de diferentes tecidos de cães naturalmente infectados.
L. infantum chagasi L. braziliensis
Mista PCR Negativa Total
Pele
27 67,5% 0 0% 4 10% 9 22,5% 40
Linfonodo 26 65% 0 0% 1 2,5% 0 0%
Baço 11 27,5% 1 2,5% 0 0% 0 0%
Fígado 0 0% 0 0% 1 2,5% 0 0%
Víscera
Sub-total 37 92,5% 1 2,5% 2 5% 0 0% 40
Total
Amostras
64 1 6 9 80
Total Cães 36 0 4 0 40
Figura 4: Perfis de bandas gerados após a digestão do produto amplificado utilizando
a enzima Apa LI na PCR-RFLP. (PM = Peso Molecular 50pb; L.a. = Cepa padrão de L.
amazonensis; L.b. = Cepa padrão de L. braziliensis, L.c. = Cepa padrão de L.
infantum chagasi; 1L = Linfonodo cão 1; 2B = baço cão 2; 3L = Linfonodo cão 3; 4L
= Linfonodo cão 4; 5L = Linfonodo cão 5; 1P a 5P = Amostras de pele cães 1 a 5.
Amostra 4p com padrão de digestão semelhante ao apresentado pelos padrões de
L.infantum chagasi e L. braziliensis).
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
39
4. PCR PARA O GÊNERO LEISHMANIA
A Tabela 4 mostra os resultados da PCR de diferentes tecidos de
acordo com a forma clínica dos animais. Com relação ao grupo de
animais naturalmente infectados, houve uma grande diferença no
número de cães positivos de acordo com o tecido avaliado. Dentre os
40 cães soropositivos e naturalmente infectados todos tiveram sua
infecção confirmada através da PCR.
Os cães pertencentes ao grupo controle eram soronegativos e
mostraram-se negativos também para a PCR em todos os tecidos
avaliados.
Tabela 4: Resultados da PCR em diferentes tecidos de cães naturalmente
infectados por L. i. chagasi portadores das formas clínicas polares da LVC.
Forma Clínica
Assintomáticos
(n=20)
Sintomáticos
(n=20)
Amostras
Positivos
Negativos
Positivos
Negativos
Total
Sangue 6 14 7 13
40
Medula 12 8 16 4
40
Fígado 10 10 10 10
40
Pele 16 4 18 2
40
Baço 19 1 20 0
40
Linfonodo
17 3 18 2
40
Total de
Tecidos
80 40 89 31 240
A Figura 05 mostra o percentual de amostras positivas em
relação ao tecido examinado. As amostras de sangue foram as que
apresentaram menor índice de positividade, seguida do fígado, ambas
com 32,5% e 50%, respectivamente. Já nas amostras de medula,
linfonodo, pele e baço foi obtido índice de positividade superior a 70%,
sendo as amostras do baço as que apresentaram melhor desempenho
(97,5%) (Tabela 5).
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
40
67,5
50
30
15
12,5
2,5
32,5
50
70
85
87,5
97,5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Sangue Fígado Medula Pele Linfonodo Baço
Porcentagem (%)
-
+
Figura 5: Porcentagem de cães positivos na PCR para o gênero Leishmania de acordo
com os diversos tecidos avaliados. ( = Amostras positivas para a PCR, = Amostras
negativas para a PCR).
Tabela 5: Comparação do resultado da PCR entre as diferentes amostras clínicas dos
40 cães naturalmente infectados por L. infantum chagasi.
Sangue
Fígado
Medula
Pele
Linfonodo Baço
+ - +
- + - +
-
+ - +
-
PCR
13 27
20
20
28
12
34
6
35 5 39
1
Fígado p valor 0,112 - - - - -
Medula p valor 0,001 0,068 - - - -
Pele p valor 0,000 0,001
0,108 - - -
Linfonodo p valor 0,000 0,000
0,056 0,745
- -
Baço p valor 0,000 0,000
0,001 0,048
0,090 -
Em negrito os resultados com diferença estatística significativa aplicando-se o teste
χ2 com a correção de Bonferroni (α = 0,003).
4.1. POSITIVIDADE DA PCR DE ACORDO COM A FORMA CLÍNICA
A PCR foi positiva em pelo menos duas das seis amostras
biológicas avaliadas nos 40 animais estudados. A comparação entre o
número de tecidos positivos para a PCR e o quadro clínico apresentado
(Tabela 6) não mostrou diferença estatística entre os dois grupos de
animais (p = 0,2082). Nenhuma diferença estatística significativa
(p<0.05) foi observada na avaliação do mesmo tecido em diferentes
grupos clínicos.
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
41
Tabela 6: Número de tecidos positivos na PCR para o gênero Leishmania de acordo
com a forma clínica apresentada pelo animal.
Assintomáticos Sintomáticos
Amostra
Número de
Tecidos Positivos
Amostra
Número de
Tecidos Positivos
22 2 1 3
24 2 31 3
4 3 48 3
14 3 3 4
18 3 5 4
27 3 8 4
35 3 9 4
42 3 26 4
16 4 28 4
29 4 30 4
46 4 47 4
52 4 50 4
53 4 2 5
54 4 10 5
55 4 15 5
19 5 32 5
17 6 34 5
20 6 7 6
33 6 11 6
51 6 25 6
Ao se avaliar o grupo dos cães assintomáticos o índice de
positividade das amostras do sangue foi de 30%, seguido pelo fígado
com 50%, medula (60%), pele (80%), linfonodo (85%) e baço (95%)
(Figura 6). A análise estatística mostrou que o sangue apresentou o
menor índice de positividade em relação a todos os tecidos, com
exceção do fígado. Já o baço, linfonodo, pele e medula foram os tecidos
que mostraram maior efetividade na detecção da infecção (Tabela 7).
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
42
Assintomáticos
70
50
40
20
15
5
30
50
60
80
85
95
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Sangue Fígado Medula Pele Linfonodo Baço
Porcentagem (%)
-
+
Figura 6: Porcentagem de cães positivos na PCR para o gênero Leishmania de acordo
com os diversos tecidos avaliados em cães assintomáticos. ( = Amostras positivas
para a PCR, = Amostras negativas para a PCR).
Tabela 7: Comparação do resultado da PCR entre as diferentes amostras clínicas dos
cães assintomáticos.
Sangue
Fígado
Medula
Pele
Linfonodo Baço
+ - + - + - +
-
+ - +
-
PCR
6 14 10
10
12 8 16
4
17 3 19
1
Fígado 0,197 - - - - -
Medula 0,057 0.525 - - - -
Pele 0,001 0,047 0,168 - - -
Linfonodo 0,000 0,018 0,077 0,677
- -
Baço
p valor
0,000 0,001
0,008 0,151
0,292 -
Em negrito, os resultados com diferença estatística significativa, aplicando-se o teste
χ
2
com a correção de Bonferroni (α = 0,003).
Já entre os cães sintomáticos o índice de positividade na PCR foi
de 35% para as amostras do sangue, seguido pelo fígado (50%),
medula (80%), pele e linfonodo, ambas com 90%, e baço com 100%
de positividade para Leishmania spp. (Figura 7). Neste grupo, a análise
estatística constatou que as amostras de medula foram tão efetivas
quanto pele, linfonodo e baço na detecção da infecção. As amostras do
sangue e fígado se mantiveram como as menos sensíveis no
diagnóstico da LVC (Tabela 8).
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
43
Sintomáticos
65
50
20
10 10
0
35
50
80
90 90
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Sangue Fígado Medula Pele Linfonodo Baço
Porcentagem (%)
-
+
Figura 7: Porcentagem de cães positivos na PCR para o gênero Leishmania de acordo
com os diversos tecidos avaliados em cães sintomáticos. ( = Amostras positivas para
a PCR, = Amostras negativas para a PCR).
Tabela 8: Comparação do resultado da PCR entre as diferentes amostras clínicas dos
cães sintomáticos com sorologia positiva para L. infantum chagasi.
Sangue
Fígado
Medula
Pele
Linfonodo Baço
+ - + - + -
+
-
+ - + -
PCR
7 13 10 10
16 4
18
2
18 2 20 0
Fígado 0,337 - - - - -
Medula 0,004 0.525 - - - -
Pele 0,000 0,006 0,376 - - -
Linfonodo 0,000 0,006 0,376 1,000
- -
Baço
p valor
0,000 0,000 0,035 0,147
0,147 -
Em negrito, tecidos com diferenças estatísticas significativas aplicando-se o teste χ
2
com a correção de Bonferroni (α = 0,003).
4.2. C
OMPARAÇÃO ENTRE A PCR E MÉTODO PARASITOLÓGICO
CONVENCIONAL
Foi utilizado como método parasitológico direto o exame de
lâminas confeccionadas por aposição de fragmentos de pele e baço,
coradas pelo Giemsa. Posteriormente estas lâminas foram usadas na
quantificação da carga parasitária. A comparação dos resultados do
exame parasitológico e da PCR utilizando diversos tecidos de cães
assintomáticos e sintomáticos encontram-se apresentados na Tabela 9.
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
44
Tabela 9: Comparação da sensibilidade do método parasitológico direto e da PCR em
amostras de cães assintomáticos e sintomáticos.
PCR
Parasitológico
Sangue Fígado Medula Pele Linfonodo Baço
+ 19 95% 6 30% 10 50% 12 60% 16 80% 17 85% 19 95%
- 1 5% 14 70% 10 50% 8 40% 4 20% 3 15% 1 5%
Assintomático
P valor 0,000 0,001 0,008
0,151 0,292 1
+ 20 100% 7 35% 10 50% 16 80% 18 90% 18 90% 20 100%
- 0 0% 13 65% 10 50% 4 20% 2 10% 2 10% 0 0%
Sintomático
P valor 0,000 0,000
0,035 0,147 0,147 1
Em negrito, amostras com diferença estatística significativa aplicando-se o teste χ
2
com a correção de Bonferroni (α = 0,0083).
No grupo de cães assintomáticos foi detectada diferença
estatística quando analisadas as amostras de sangue (p=0,000), fígado
(p=0,001) e medula (p=0,008). Com relação aos demais tecidos não
houve diferença significativa e os resultados apresentados pelas
amostras de baço foram iguais ao observados no exame parasitológico
direto.
Com relação aos 20 cães sintomáticos a análise estatística
mostrou que o exame parasitológico direto foi diferente da PCR nas
amostras de sangue (p=0,000) e fígado (p=0,000). Nenhuma diferença
significativa foi observada nos demais tecidos
5. QUANTIFICAÇÃO DA DENSIDADE PARASITÁRIA ATRAVÉS DA TÉCNICA
LEISHMAN DONOVAN UNITS (LDU)
A densidade parasitária foi avaliada no baço e na pele dos 40
cães naturalmente infectados por L. infantum chagasi. Os resultados
foram expressos em valores de Número de Parasitos/1.000 células
nucleadas (LDU) (Tabela 10). Para divisão dos grupos em Baixo
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
45
Parasitismo (BP), Médio Parasitismo (MP) e Alto Parasitismo (AP) os
valores da densidade parasitária (LDU) dos 40 cães foram colocados
em ordem crescente e os animais foram divididos em três grupos de
acordo com a intensidade parasitária apresentada.
Tabela 10: Densidade parasitária no baço e na pele dos animais com diferentes
formas clínicas.
Assintomáticos Sintomáticos
Cão
Valor
LDU Pele Cão
Valor
LDU Baço
Cão
Valor
LDU Pele
Cão
Valor
LDU Baço
16 0 55 0 1 0 48 0
17 0 35 1 47 0 34 1
18 0 24 3 30 3 1 4
19 0 4 4 9 6 25 7
24 0 18 4 48 6 3 9
33 0 22 5 50 6 5 9
46 0 46 5 3 8 11 10
55 0 29 6 8 9 47 10
51 3 52 7 25 14 9 19
53 3 53 8 31 15 50 19
29 4 33 11 28 17 31 40
54 4 27 12 2 18 28 78
14 5 19 17 10 33 32 95
22 5 16 25 5 134 8 129
27 5 42 28 15 228 30 132
4 6 51 37 7 291 7 155
42 12 17 58 11 324 2 198
52 14 20 103 26 392 26 425
35 56 54 529 32 530 15 595
20 335 14 828 34 712 10 804
Média 22,6 84,55 137,3 136,95
D. P.
74,57 210,26 208,56 220,18
Em azul animais com Baixo Parasitismo (BP), em vermelho animais com Médio
Parasitismo (MP) e em verde animais com Alto Parasitismo (AP). D.P. = Desvio
Padrão.
A comparação da carga parasitária no baço entre cães
assintomáticos e sintomáticos, expressa em valores de LDU, não
apresentou diferença significativa (Figura 8A). Porém, entre as
amostras de pele os cães sintomáticos mostraram um maior
parasitismo tecidual que os animais assintomáticos (Figura 8B).
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
46
Baço
Assintomáticos Sintomáticos
1
10
100
1000
p=0,1167
A
LDU Log
10
Pele
Assintomáticos Sintomáticos
1
10
100
1000
p=0,0011
B
LDU Log
10
Figura 8: Comparação entre a carga parasitária no baço (A) e na pele (B) de animais
com as formas clínicas polares da LVC.
Indiferente do tecido avaliado, baço ou pele, os animais
assintomáticos apresentaram maior concentração de cães pertencentes
ao grupo BP enquanto que entre os sintomáticos a maioria pertencia ao
grupo AP (Figura 9 A e B).
10
3
8
6
2
11
0
2
4
6
8
10
12
Assintomáticos Sintomáticos
Número de Cãe
s
Baixa Carga Parasitária Média Carga Parasitária Alta Carga Parasitária
9
4
7
6
4
10
0
2
4
6
8
10
12
Assintomáticos Sintomáticos
Número de Cãe
s
Baixa Carga Parasitária Média Carga Parasitária Alta Carga Parasitária
Figura 9: Distribuição de cães com as formas clínicas polares da LVC de acordo com
a carga parasitária nas amostras de Pele (A) (p=0,006) e Baço (B) (p = 0,102).
A
B
Ba
ç
o
Pele
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
47
6. AVALIAÇÃO DOS PERFIS DE IMUNOGLOBULINAS EM CÃES NATURALMENTE
INFECTADOS POR LEISHMANIA INFANTUM CHAGASI
A Figura 10 mostra o perfil de classe e subclasses de
imunoglobulinas (IgG, IgG
1
e IgG
2
) em cães naturalmente infectados,
avaliados pelo método de ELISA. Foi observado que cães infectados
apresentavam valores de densidade óptica para IgG e IgG
2
superiores
(p<0,05) aos observados no grupo de cães controle (CC) (Figura 10 A e
C). Nenhuma diferença significativa (p<0.05) foi observada na análise
da subclasse IgG
1
entre os grupos CI e CC (Figura 10 B).
CC CI
0.0
0.2
0.4
a
D.O. IgG
CC CI
0.0
0.1
0.2
D.O. IgG1
CC CI
0.000
0.125
0.250
a
D.O. IgG2
Figura 10: Presença de IgG (A), IgG
1
(B) e IgG
2
(C) em soros de cães naturalmente
infectados por L. infantum chagasi em relação aos animais não infectados. A
reatividade foi detectada utilizando-se soros diluídos 1:80 e anticorpos monoclonais
específicos conjugados a peroxidase (HRPO); CC = Cães controle, CI = Cães
Infectados. A diferença estatística está representada pela letra a em relação ao grupo
CC.
6.1. REATIVIDADE DE IGG, IGG
1
E IGG
2
EM RELAÇÃO A FORMA CLÍNICA
A análise da reatividade de IgG, IgG
1
e IgG
2
em cães
naturalmente infectados portadores das formas clínicas polares,
assintomáticos (CA) e sintomáticos (CS) foi realizada pelo método
A
B
C
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
48
ELISA. A análise estatística dos dados demonstrou que os níveis de IgG
total (D.O.) tanto do grupo CA (p<0,05) quanto do CS (p<0,001)
foram significativamente maiores em relação ao grupo CC (Figura 11A).
Cães Assintomáticos, apresentaram maiores níveis (p<0,05) de IgG
1
(D.O.) em relação aos grupos CC e CS (Figura 11B). A análise
estatística mostrou que cães dos grupos CA (p<0,01) e CS (p<0,001)
apresentaram elevados níveis de IgG
2
(D.O.) em relação ao grupo
controle CC (Figura 11C).
CC CA CS
0.0
0.2
0.4
a
a
D.O. IgG
CC CA CS
0.0
0.1
0.2
a,c
D.O. IgG1
CC CA CS
0.000
0.125
0.250
a
a
D.O. IgG2
Figura 11: Presença de IgG (A), IgG
1
(B) e IgG
2
(C) em soros de cães naturalmente
infectados por L. infantum chagasi e portadores de diferentes formas clínicas. A
reatividade foi detectada utilizando-se soros diluídos 1:80 e anticorpos monoclonais
específicos conjugados a peroxidase (HRPO); CC = Cães Controle, CA = Cães
Assintomáticos, CS = Cães Sintomáticos. A diferença estatística está representada
pela letra a, b e c em relação ao grupo CC, CA e CS respectivamente.
6.2. CARGA PARASITÁRIA X REATIVIDADE DE IGG, IGG
1
E IGG
2
Os níveis de IgG, IgG
1
e IgG
2
presente no soro dos cães
naturalmente infectados por L. infantum chagasi foi avaliada
considerando a carga parasitária apresentada nas amostras de baço e
A
B
C
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
49
pele. A avaliação da reatividade de IgG
total
mostrou que os animais com
baixo grau de parasitismo no baço foram os que apresentaram o menor
índice quando comparados aos animais com médio e alto parasitismo
(Figura 12A). Para IgG
1
foi observado que quanto maior a carga
parasitária menores foram os valores de densidade óptica refletindo a
baixa reatividade nestes grupos (MP e AP) com diferença significativa
entre os grupos BP e AP (p=0,0232) (Figura 12B). Resultado
semelhante ao apresentado por IgG
total
foi observado para IgG
2
com o
grupo BP apresentando diferença significativa em relação aos grupos de
animais com MP(p<0,05) e AP (p<0,01) (Figura 12C). Nas Figuras 12
D, E e F são mostrados os dados referentes à avaliação do perfil de
imunoglobulinas com relação à carga parasitária nas amostras de pele.
Pode ser observado que o grupo BP onde houve diferença estatística
em relação aos valores apresentados pelos grupos MP (p<0,05) e AP
(p<0,01) para IgG e IgG
2
. Nenhuma diferença significativa foi
observada entre os grupos BP, MP e AP ao compararmos os valores de
IgG
1
.
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
50
A
C
D
E
B
F
Figura 12: Reatividade de IgG, IgG
1
e IgG
2
no soro de cães naturalmente infectados
por L. infantum chagasi com diferentes cargas parasitárias avaliadas pelo LDU nas
amostras de pele e baço. BP = Baixo Parasitismo; MP = Médio Parasitismo; AP = Alto
Parasitismo. Diferenças significativas (p<0,05) encontra-se representada pela letra a
em relação ao grupo com baixo parasitismo.
Carga Parasitária (PELE)
Carga Parasitária (BAÇO)
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
51
A B
A
B
6.3. ANÁLISE DA CORRELAÇÃO ENTRE REATIVIDADE DE
IMUNOGLOBULINAS E CARGA PARASITÁRIA NOS DIFERENTES
GRUPOS DE CÃES
Foi avaliada a correlação entre a reatividade de Ig (densidade
óptica) e o valor de LDU nos grupos com diferentes formas clínicas e no
grupo total de cães. No grupo dos cães assintomáticos foi observada
uma forte correlação entre a reatividade de IgG (Figura 13A) e IgG
2
(Figura 13B) e os índices de LDU no baço.
1 10 100 1000
0.00
0.15
0.30
0.45
r=0,7404
p=0,0002
LDU-log
10
(Baço)
D.O. IgG
1 10 100 1000
0.00
0.15
0.30
0.45
r=0,7791
p<0,0001
LDU-log
10
(Baço)
D.O. IgG
2
Figura 13: Correlação entre os valores de LDU no baço e a reatividade de IgG (A) e
IgG
2
(B) no soro de cães assintomáticos naturalmente infectados por L. infantum
chagasi.
Quando foi avaliado o grupo total de cães infectados foi
observada uma correlação fraca, apesar de valores significativos para
IgG (Figura 14A) e IgG
2
(Figura 14B) em relação a carga parasitária do
baço.
1 10 100 1000
0.00
0.15
0.30
0.45
r=0,4594
p=0,0025
LDU-log
10
(Baço)
D.O. IgG
2
1 10 100 1000
0.00
0.15
0.30
0.45
r=0,3684
p=0,0164
LDU-log
10
(Baço)
D.O. IgG
Figura 14: Correlação entre os valores de LDU no baço e a reatividade de IgG (A) e
IgG
2
(B) no soro do grupo total de cães naturalmente infectados por L. infantum
chagasi.
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
52
Analisando ainda as correlações entre carga parasitária expressa
pelos valores de LDU no baço e a reatividade de IgG
1
foi detectada uma
correlação negativa no grupo dos 40 cães naturalmente infectados
(Figura 15).
1 10 100 1000
0.00
0.15
0.30
0.45
r=-0,3562
p=0,0261
LDU-log
10
(Baço)
Densidade optica
Figura 15: Correlação entre os valores de LDU no baço e a reatividade de IgG
1
no
soro de cães naturalmente infectados por L. infantum chagasi.
Para todas as outras correlações avaliadas não foram observadas
diferenças estatísticas significativas (Anexo 4).
7. AVALIAÇÃO DA AVIDEZ DE IGG
TOTAL
EM RELAÇÃO À FORMA CLÍNICA E À
CARGA PARASITÁRIA
7.1. A
VIDEZ DE IGG
EM RELAÇÃO À FORMA CLÍNICA APRESENTADA PELO
CÃO
Devido a ausência de informações sobre a avidez de IgG em
cães infectados com Leishmania foi necessário traçar um perfil da
afinidade desta Ig durante o desenvolvimento da infecção nesse animal
com o objetivo de se obter parâmetros para comparação. Assim,
amostras de soro de cães experimentalmente infectados com tempo de
infecção variando de 1 a 19 meses foram submetidas ao protocolo de
ELISA modificado para detecção da avidez de IgG
total
.
A Figura 16 mostra que o Índice de Avidez (IA) tende a aumentar
à medida que o tempo de infecção aumenta.
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
53
Avidez de IgG
45
47
49
51
53
55
57
59
61
63
Antes da
Infecção
1 mês
após
infecção
3 meses
após
infecção
5 meses
após
infecção
9 meses
após
infecção
15 meses
após
infecção
19 meses
após
infecção
Porcentagem (%)
Avidez Tendência
Figura 16: Avidez de IgG no soro de cães experimentalmente infectados por L.
infantum chagasi com diferentes tempos de infecção. Valores expressos em
porcentagem referente à média da avidez apresentada pelos quatro animais
estudados.
De posse dos resultados acima avaliamos o IA de IgG nas
amostras de soro dos cães pertencentes aos grupos clínicos polares da
LVC (Figura 17) o grupo controle apresentou valores de absorbância
significativamente inferiores aos apresentados pelo grupo de cães
infectados.
A análise estatística entre os grupos demonstrou que cães
assintomáticos possuem um menor IA de IgG quando comparados aos
animais sintomáticos (p=0,008).
Assintomáticos Sintomáticos
0
50
100
p=0,008
IA de IgG (%)
Figura 17: Índice de Avidez de IgG em soros de cães assintomáticos e sintomáticos.
Os resultados estão expressos em porcentagem.
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
54
7.2. CARGA PARASITÁRIA X AVIDEZ DE IGG
A Figura 18 mostra os resultados referentes à avidez de IgG
nos
grupos de cães com baixa (BP), média (MP) e alta (AP) densidade
parasitária no baço (A) e na pele (B).
A avaliação da densidade parasitária no baço mostrou que os
animais pertencentes ao grupo BP possuem valores menores de IA
quando comparados com os grupos MP e AP (p<0,01) (Figura 18 A). A
reatividade de IgG em relação a carga parasitária na pele apresentou
valores diferentes nos animais do grupo BP apenas em relação aos
animais incluídos no grupo AP (p<0,01) (Figura 18 B).
BP MP AP
0
50
100
a
a
Carga Parasitária (LDU - Baço).
IA de IgG (%)
BP MP AP
0
50
100
a
Carga Parasitária (LDU - Pele).
IA de IgG (%)
Figura 18: Avidez de IgG em soros de cães com diferentes graus de parasitismo no
Baço (A) e na Pele (B). Os resultados estão expressos em porcentagem. BP = Baixo
Parasitismo; MP = Médio Parasitismo; AP = Alto Parasitismo. A letra a representa
diferença estatística em relação ao grupo BP.
Com o intuito de entender melhor qual sub-classe de IgG
influencia mais na avidez, correlacionamos o IA com os valores de
densidade óptica de IgG
1
e IgG
2
. Ao observarmos a Figura 19 podemos
notar que a avidez de IgG está fortemente correlacionada aos valores
de densidade óptica de IgG
2
(Figura 19B), o mesmo não é observado
para IgG
1
(Figura 19A).
A
B
Teixeira - Neto, R.G. Resultados
55
A
B
Figura 19: Correlação entre o Indice de Avidez (IA) de IgG e os valores de densidade
óptica das sub-classes de IgG (IgG
1
e IgG
2
).
Discussão
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
57
A leishmaniose visceral é uma doença que se encontra em
expansão em várias regiões do mundo, inclusive no Brasil, onde
apresentava caráter rural e atualmente ocorre também em grandes
centros urbanos nas regiões Norte, Nordeste, Sudeste e Centro-oeste
(Ministério da Saúde, 2005). Um dos principais fatores responsáveis
por esta urbanização é a presença do reservatório doméstico
susceptível à infecção, o cão, que pode apresentar intenso
parasitismo cutâneo que o torna a principal fonte de infecção para o
flebotomíneo e, consequentemente, para o homem (MORENO & ALVAR,
2002).
No Brasil o primeiro caso de LV em cão foi relatado no Ceará
por CHAGAS et al. (1938). Mais tarde DEANE & DEANE, (1955) nos seus
estudos pioneiros, também no Ceará, confirmaram o papel do cão
como reservatório domiciliar.
Embora a LVC seja uma doença de evolução crônica, que
acomete principalmente regiões víscero-cutâneas, um grande número
de animais não apresenta os sintomas. Em um estudo recente
realizado em região endêmica para LV (CABRAL et al., 1998) foi
observado que um elevado número de cães (60-80%), que embora
apresentassem anticorpos específicos e até mesmo resposta imune
celular específica, não manifestaram nenhum sinal sugestivo da
infecção por Leishmania. Estes animais assintomáticos são
extremamente importantes no contexto epidemiológico da LV, já que
possuem um papel ativo na transmissão da doença (GRADONI, 2001).
Devido a esses fatores, a LVC torna-se, do ponto de vista
epidemiológico, tão ou mais importante que a própria doença humana
e a busca por um método de diagnóstico mais sensível é importante,
principalmente para a detecção dos animais assintomáticos.
As medidas profiláticas variam nas diversas doenças
parasitárias, devido às diferenças nas condições epidemiológicas que
as mesmas se desenvolvem. Na LV, as principais ações preconizadas
pelo Ministério da Saúde são: o controle eficaz das espécies vetoras
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
58
através da borrifação do intra e peridomicílio, o tratamento de
humanos doentes e o sacrifício de cães positivos. Porém, a eutanásia
destes animais leva a um grande impacto junto à sociedade, devido
ao papel que o animal representa para os proprietários. Uma
alternativa para evitar o sacrifício de cães infectados seria o
tratamento eficaz, seja através de imunoprofiláticos ou
quimioterápicos. O uso de quimioterápicos em cães ainda não é tão
eficiente como o observado em humanos, além disso, o Ministério da
Saúde proíbe o uso rotineiro de algumas drogas no tratamento de
cães, já que sua aplicação poderia levar a seleção de cepas
resistentes às drogas. Assim, o tratamento da LVC através da
aplicação de quimioterápicos ainda constitui um desafio para a
ciência, estimulando diversos grupos de pesquisa nesta área de
estudo.
No âmbito da imunoprofilaxia encontrar uma vacina capaz de
impedir a infecção por L. infantum chagasi torna-se a melhor opção
para o controle da LVC. Até o momento não existe vacina de uso
veterinário para a leishmaniose aprovada pelo Ministério da Saúde.
No Brasil podemos destacar os trabalhos desenvolvidos pelo grupo de
pesquisas da UFMG, coordenado pelo professor Wilson Mayrink
voltado para o desenvolvimento de uma vacina de primeira geração
(LEISHVACIN) e mais recentemente, um grupo de pesquisa da UFRJ,
coordenado pela professora Clarisa Palatnik que desenvolveu uma
vacina de segunda geração, denominada LEISHMUNE
®
. Após sua
aprovação pelo Ministério da Agricultura do Brasil, a LEISHMUNE
®
passou a representar uma ferramenta imunoprofilática promissora
para aplicação em campanhas de controle da LVC, porém ainda são
escassos os estudos acerca das bases celulares e moleculares da
imunidade protetora pós-vacinal.
A aplicação eficaz de uma medida profilática irá favorecer
indiretamente a proteção humana, e diminuir de forma considerável
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
59
os gastos com as medidas de controle, além de impedir o sacrifício de
cães, o que é muito traumático para os proprietários.
Um passo importante para a confirmação da eficácia do
tratamento no cão é a busca por marcadores biológicos capazes de
informar se a infecção está realmente sendo controlada. Diversos
pesquisadores têm focado sua atenção para as correlações existentes
entre os tipos de Ig e o perfil de reposta do hospedeiro, buscando
marcadores referentes à susceptibilidade e/ou resistência para que
estes possam ser empregados em diferentes estudos (BOURDOISEAU et
al., 1997; SOLANO-GALLEGO et al., 2001b; CORDEIRO DA-SILVA et al.,
2003; QUINNEL et al., 2003; ALMEIDA et al., 2005; REIS et al., 2006a).
O presente estudo nos permitiu avaliar e correlacionar os
parâmetros relacionados à resposta imune humoral, carga parasitária
e status clínico em um grupo de 45 cães sem raça definida, composto
de animais não infectados (controle) e de animais naturalmente
infectados por Leishmania infantum chagasi. Foi também avaliada a
PCR no diagnóstico dos cães naturalmente infectados em diferentes
amostras clínicas.
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
60
1. ASPECTOS CLÍNICOS DA LVC
Durante este estudo avaliamos a clínica de 40 cães
naturalmente infectados por L.infantum chagasi de acordo com
MANCIANTE et al. (1988), porém optamos por utilizar somente animais
com as formas polares da LVC.
Dentre os sintomas mais observados encontramos a alopecia
localizada e a onicogrifose (70%), o emagrecimento acentuado
(50%), a dermatite furfurácea (35%), além da presença de úlceras
localizadas, opacificação das córneas, dentre outros. Os sinais clínicos
na LVC são alvos de discussão na literatura e vêm sendo observados
tanto em infecções naturais quanto em modelos de infecção
experimental (GENARO 1993; REIS 2001; POOT et al., 2005; RODRIGUEZ-
CORTEZ et al., 2006). Acredita-se que a doença evolui de um quadro
normal, sem sintomas, para um estado grave e terminal apresentado
pelos animais sintomáticos.
Em um estudo de infecção experimental realizado recentemente
POOT et al. (2005) desafiaram cães com cepas de L. infantum via
intravenosa e notaram o aparecimento dos primeiros sinais
sugestivos da infecção entre 15 e 20 semanas. Porém, os sinais mais
sérios da infecção só tornaram-se evidentes após 35 a 40 semanas
após a infecção. Sabe-se que este período de incubação pode variar
muito, desde poucos meses até vários anos (CUNHA 1938; RIOUX et
al., 1979;
GENARO 1993).
Diversos fatores podem estar relacionados com a forma clínica
apresentada pelo cão durante a infecção por Leishmania infantum
chagasi. Muitos animais apresentam-se susceptíveis e desenvolvem
uma doença ativa, enquanto outros se mostram resistentes à
infecção e permanecem assintomáticos, além disso, o estado
nutricional do animal pode influenciar diretamente no
desenvolvimento da doença.
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
61
A apresentação clínica da LV em cães é conseqüência de
interações complexas entre o parasito e a resposta imune do
hospedeiro (SANTOS-GOMES et al., 2002).
Podemos constatar que cães infectados por Leishmania
infantum chagasi apresentam características que sugerem uma
evolução gradual da infecção que inicialmente é ausente de sintomas,
e, posteriormente, inicia-se o aparecimento de sinais clínicos menos
graves e por fim evolui para uma forma clássica, característica, com
inúmeros sinais clínicos da infecção que provavelmente desencadeará
a morte do animal. A variação das manifestações clínicas tornou
possível avaliar e correlacionar parâmetros imunológicos e
parasitológicos com a forma clínica apresentada pelo animal.
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
62
2. IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE DE LEISHMANIA ATRAVÉS DA PCR-RFLP
É extremamente importante identificar as espécies de
Leishmania que circulam em um determinado foco de transmissão,
principalmente quando o alvo do estudo é a epidemiologia da doença.
Entretanto, em estudos que envolvem aspectos imunopatológicos da
infecção é também de suma importância a identificação precisa do
agente etiológico causador da infecção.
Sabe-se que a espécie responsável pela LV no novo mundo é a
Leishmania infantum chagasi, porém diversas regiões do Brasil são
áreas endêmicas para a Leishmaniose Tegumentar (LT) e LV
(S
CHALLIG & OSKAM, 2002). No Brasil, em diversas regiões ocorre a
transmissão simultânea destas doenças, inclusive na região
metropolitana de Belo Horizonte, de onde os animais deste estudo
foram provenientes.
É amplamente aceito o papel fundamental do cão como
reservatório doméstico na LV, porém sua função como reservatório
na LT ainda é questionável, apesar da participação destes animais
como hospedeiros de Leishmania braziliensis no ambiente doméstico
e peridoméstico (G
ONTIJO et al., 2002). O primeiro caso de infecção
mista por L. infantum chagasi e L. braziliensis foi descrito em 1990
(EVANS et al. 1990), e posteriormente por MADEIRA et al.(2005), onde
o autor detectou a presença de L. braziliensis em isolados de lesões
cutâneas e de L. infantum chagasi em isolados de sangue e linfonodo.
Segundo a Organização Mundial de Saúde o método ouro na
identificação de espécies de Leishmania é a eletroforese de
isoenzimas (CUPOLILLO et al., 1994). Porém, outras técnicas já se
mostraram eficientes na identificação espécie-especifíca de
Leishmania, dentre elas, a utilização de anticorpos monoclonais, a
PCR associada à hibridização molecular com marcadores
quimioluminescentes (BASTRENTA et al., 2002) ou radioativos (SILVA et
al., 2004), PCRs específicas para as regiões variáveis de cada espécie
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
63
(ERESH et al., 1994; CORTES et al., 2004; GOMES et al., 2006) e a PCR-
RFLP (Volpini et al., 2004).
Neste trabalho optamos pela utilização da PCR-RFLP, já que
esta técnica se mostrou rápida e segura na identificação de espécies
de Leishmania a partir de amostras biológicas de cães (DE ANDRADE et
al., 2006).
Todas as amostras de pele positivas e as amostras de um
tecido visceral escolhido a partir do melhor resultado na PCR
convencional foram submetidas a PCR-RFLP. Devido à sobreposição
das bandas para L.infantum chagasi e L. braziliensis ao utilizar a
enzima de restrição Hae III, foi utilizada a enzima ApaLI. Os perfis de
restrição da região conservada dos minicírculos do kDNA mostraram
ser muito adequados para a identificação da espécie de Leishmania.
Foi possível confirmar a infecção por L. i. chagasi em pelo
menos um dos tecidos avaliados em 100% dos cães naturalmente
infectados (Tabela 3). Porém é importante destacar que em quatro
animais observou-se um padrão de digestão semelhante a infecção
mista por L. i. chagasi e L. braziliensis (Figura 4). Em três amostras
de pele não conseguimos caracterizar a espécie de Leishmania,
provavelmente devido à insuficiência de DNA, porém foi possível
caracterizar a infecção por L. i. chagasi nas amostras de baço destes
mesmos animais.
A caracterização da espécie responsável pela infecção é de
extrema importância, visto que diferentes respostas imunopatológicas
podem ocorrer em animais infectados por espécies diferentes. Neste
trabalho a identificação específica do agente etiológico de todos os
animais estudados nos dá a segurança de que os fenômenos
observados são decorrentes da infecção por L. i. chagasi.
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
64
3. A PCR COMO FERRAMENTA DE DIAGNÓSTICO NA LVC
A PCR é um método molecular de diagnóstico amplamente
utilizado por diversos grupos de pesquisa em todo o mundo, pois é
uma técnica que alia altas especificidade e sensibilidade à facilidade
de execução e rápida visualização. Devido a estes fatores, vários
ensaios com diferentes alvos de amplificação têm sido desenvolvidos
para o diagnóstico das leishmanioses. Diversos fatores influenciam
diretamente na sensibilidade desta técnica como os iniciadores
utilizados, número de ciclos, métodos de extração do DNA e escolha
dos tecidos para realização da PCR. Apesar de todas estas variáveis,
diferentes estudos mostraram que a sensibilidade da técnica está
entre 89 e 100% (ASHFORD et al., 1995; BERRAHAL et al., 1996; SILVA
et al., 2001b; SOLANO-GALLEGO et al., 2001c).
O protocolo aplicado neste estudo é capaz de detectar a
presença de kDNA de Leishmania até a concentração de 0,1 fg/μl
(QUARESMA, 2007). A alta sensibilidade deve-se principalmente à
escolha do alvo que se encontra na região conservada dos
minicírculos do kDNA. Esta região contém aproximadamente 10.000
cópias de DNA por cinetoplasto, o que a torna um alvo ideal para as
reações de PCR (GOMES et al., 2006). Outro fator responsável pelo
aumento da sensibilidade da técnica é a escolha do gel de
poliacrilamida corado pela prata como método de visualização do
produto amplificado na PCR. Este gel aumenta a capacidade de
visualização de bandas fracas quando comparado ao gel de agarose
corado pelo brometo de etídio.
Alguns cuidados devem ser tomados durante a realização da
PCR, como a utilização de salas separadas para a extração do DNA,
preparo das reações e amplificação e/ou visualização de produtos
amplificados, além disso, devem ser incluídos controles positivos e
negativos em todas as reações inclusive nos procedimentos de
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
65
extração de DNA utilizando amostras clínicas de animais não
infectados por Leishmania.
Não são muitos os trabalhos que comparam a eficácia do
diagnóstico através da PCR em diferentes amostras clínicas de
animais naturalmente infectados por Leishmania. Neste estudo
avaliamos a PCR nas amostras de sangue, medula, pele, baço, fígado
e linfonodo de 40 cães naturalmente infectados e observamos que a
amostra de baço com 97,5% de positividade foi o melhor tecido
avaliado seguido do linfonodo (87,5%), pele (85%), medula (70%),
fígado (50%) e sangue (32,5%). Resultados semelhantes foram
observados por outros autores que também utilizaram amostras
biológicas de cães como fonte de DNA para a PCR: QUARESMA (2007)
ressaltou que amostras de pele e medula foram melhores que
amostras de sangue na detecção de Leishmania; MANNA et al. (2004)
observaram que a pele, independente da presença de lesões
cutâneas, foi melhor que sangue e linfonodo para detectar DNA de
Leishmania e SOLANO-GALLEGO et al. (2001c) encontraram 51% de
positividade em amostras de pele, 32% em conjuntiva e 18% em
medula óssea.
Apesar do alto índice de positividade, a utilização do baço como
fonte de DNA para a realização da PCR é extremamente invasiva e
torna-se praticamente impossível sua utilização principalmente em
levantamentos epidemiológicos de larga escala. Devido a isto,
acreditamos que a punção de linfonodo ou a biópsia de pequenos
fragmentos de pele são métodos menos invasivos e ambos os tecidos
provaram ser extremamente eficazes como fontes de DNA de
Leishmania em cães naturalmente infectados. Portanto, baseando-se
nos resultados deste estudo sugere-se a utilização de amostras de
pele e/ou linfonodo como material de escolha em inquéritos para
detecção de Leishmania.
Avaliamos também o desempenho da PCR em diferentes tecidos
de acordo com o quadro clínico (assintomático ou sintomático)
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
66
apresentado pelo animal e nenhuma diferença estatística significativa
foi observada. Isto reforça que a idéia de que a PCR é uma excelente
ferramenta de diagnóstico independente da forma clínica apresentada
pelo animal. O mesmo não é observado quando se utilizam métodos
sorológicos e parasitológicos para o diagnóstico, provavelmente
devido a uma maior produção de imunoglobulinas como também uma
multiplicação mais intensa do parasito observada nos animais
sintomáticos. DYE et al. (1993) mostraram que a RIFI foi menos
sensível em animais assintomáticos; QUARESMA (2007) observou uma
menor proporção de positividade em animais assintomáticos
utilizando testes sorológicos e parasitológicos convencionais; REIS
(2001) observou uma variação nos títulos de anticorpos tanto na RIFI
quanto na ELISA-extrato em animais assintomáticos. Provavelmente,
a menor sensibilidade na detecção de animais assintomáticos em
testes sorológicos ocorre devido a uma maior imunidade mediada por
células e uma menor resposta imune humoral (IgG) nestes animais
(BORDOISSEAU et al., 1997b; CABRAL et al., 1998; REIS, 2001).
Devido a estes fatores a PCR passa a ser um importante aliado
no diagnóstico da LVC principalmente se considerarmos as limitações
dos métodos sorológicos e parasitológicos convencionais na detecção
de animais com a forma clínica inaparente da LVC.
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
67
4. AVALIAÇÃO DA CARGA PARASITÁRIA NA PELE E NO BAÇO DE CÃES
NATURALMENTE INFECTADOS
Uma nova abordagem que tem auxiliado muito no
entendimento dos aspectos imunopatológicos na LVC é a associação
da carga parasitária com a clínica e a resposta imune. Diversas
técnicas vêm sendo aplicadas com o intuito de quantificar o
parasitismo tecidual em animais portadores da LVC, entre elas
podemos citar: a LDU – “Leishman Donovan Units” (Reis et al.,
2006ª), quantitative nucleic acid sequence-based amplification (QT-
NASBA) (V
AN DER MAID et al., 2005), imunohistoquímica (STERNBERGER
et al., 1986; T
AFURI et al., 2004; GIUNCHETTI et al., 2006) e a PCR em
tempo real (qPCR) (BRETAGNE et al., 2001; NICOLAS et al., 2002; ROLÃO
et al., 2004; VITALE et al., 2004; QUARESMA, 2007). Apesar de muitos
autores buscarem meios de quantificar a carga parasitária, são
poucos os estudos que correlacionam esta variável com as alterações
imunopatológicas em animais naturalmente ou experimentalmente
infectados.
Segundo CARDOSO & CABRAL (1998), após a infecção, a partir do
sítio de inoculação na pele, os parasitos se disseminam para os
linfonodos, medula óssea, baço, fígado, rins, pulmões e trato
gastrintestinal, mas raramente são detectados nas vias sanguíneas.
Os autores relatam ainda que o nível de infecção do tecido é
extremamente importante para o diagnóstico que, obviamente, é
mais fácil em casos onde a carga parasitária se encontra elevada.
Neste estudo optamos por realizar a técnica do LDU em
amostras de pele e baço de cães naturalmente infectados com o
intuito de correlacionar estes parâmetros com a clínica e com a
resposta imune humoral. Esta escolha surgiu após estudo realizado
por REIS et al. (2006ª), no qual ficou demonstrado que a pele e o
baço são os órgãos mais densamente parasitados independente da
forma clínica apresentada pelos cães.
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
68
Em nosso estudo foram observados resultados muito
semelhantes àqueles relatados por Reis et al. (2006a). Foram
detectados altos índices de positividade nestes tecidos com 60% dos
animais assintomáticos e 90% dos sintomáticos positivos nas
amostras de pele e 95% em ambos os grupos positivos para as
amostras de baço. Nas amostras de pele houve uma diferença
estatística significativa entre os valores de LDU apresentados pelos
dois grupos sendo que nos animais assintomáticos a carga parasitária
foi menor (Figura 8B). Considerando que no desenvolvimento natural
da infecção se espera que o cão evolua do quadro assintomático para
o sintomático pode-se sugerir que o parasitismo cutâneo acompanhe
a evolução das manifestações clínicas. De fato, MOLINA (1997)
reportou que a proporção de flebotomíneos que se infecta ao se
alimentar em cães aumenta com o aparecimento de sinais clínicos
mais severos da doença, provavelmente devido a um maior
parasitismo cutâneo nestes animais. RODRIGUÉZ-CORTEZ et al. (2007)
observaram em estudo de infecção experimental em cães que o perfil
clínico apresentado pelos animais está diretamente correlacionado ao
parasitismo. Contrariamente, SOLANO-GALLEGO et al. (2004)
verificaram que o número de parasitos presentes na pele não é maior
em animais que apresentam sintomas da doença, e destacou a
importância do cão assintomático na manutenção da LVC.
O presente trabalho não teve como objetivo comparar a
importância epidemiológica de animais com diferentes formas
clínicas. Nossa intenção foi ressaltar a necessidade da realização de
novos estudos que tenham como objetivo quantificar as formas
amastigotas presentes em diferentes tecidos, a fim de contribuir em
avaliações terapêuticas como medida de controle no emprego de
drogas leishmanicidas ou para correlacionar o impacto do parasitismo
no desenvolvimento da doença e na resposta apresentada pelo
hospedeiro.
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
69
5. AVALIAÇÃO DO PERFIL DAS SUBCLASSES DE IGG (IGG
1
E IGG
2
) NA
LVC
Com base no estudo de KEENAN et al. (1984) que preconizou
que a presença de anticorpos específicos anti-Leishmania não
produzia proteção ao aparecimento da doença nos cães, as pesquisas
deixaram de focar na avaliação do perfil de resposta humoral como
uma ferramenta de análise prognóstica na LVC. Somente após os
estudos de DEPLAZES et al. (1995) que avaliaram o perfil de resposta
humoral de subclasses de IgG (IgG
1
e IgG
2
) em cães infectados por
L. infantum e de cães infectados por outros parasitos é que houve
uma retomada nas pesquisas tentando associar o perfil da resposta
humoral com a clínica de cães com LV.
Segundo DEPLAZES et al. (1995) os níveis mais altos de IgG
1
estariam relacionados à infecção sintomática enquanto animais
assintomáticos apresentariam maiores níveis de IgG
2
, concluindo que
este perfil poderia indicar uma resposta dicotômica na LVC causada
por L. infantum. Entretanto NIETO et al. (1999) encontraram
resultados completamente distintos onde os índices mais altos de
IgG
2
estavam diretamente associados a uma infecção clínica ativa.
Resultados semelhantes aos descritos por N
IETO et al. (1999) foram
observados por BOCETA et al. (2000), que relatam índices de IgG
2
maiores que IgG
1
em 20 animais sintomáticos na Espanha. Vários
estudos confirmam estes achados ao descreverem o domínio de IgG
2
em animais que apresentavam sinais clínicos da infecção (L
EANDRO et
al.,2001; FERNADEZ-PEREZ et al., 2003; ALMEIDA et al.,2005; REIS et al.,
2006ª; CARDOSO et al., 2007).
De todos os trabalhos realizados nos últimos dez anos somente
os resultados descritos por INIESTA et al. (2005) apresentaram
semelhança ao trabalho de DEPLAZES et al. (1995). Após avaliar o
perfil de Ig no soro de 90 cães pertencentes a regiões endêmicas na
França e Espanha, INIESTA et al. (2005) mostraram que os índices de
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
70
IgG
2
foram maiores que os de IgG
1
em animais assintomáticos e que
os de IgG
1
foram mais elevados em cães portadores de sinais
clínicos.
No presente trabalho foram avaliados os níveis de anticorpos
específicos nos soros de 40 cães naturalmente infectados por L. i.
chagasi com as formas clínicas polares da LVC, buscando uma
possível associação entre o perfil de subclasses de IgG e o
desenvolvimento clínico da doença.
Nossos dados assemelham-se em parte com os descritos por
Bourdouiseau et al. (1997) e Reis et al. (2006ª). Observamos que os
níveis séricos de IgG1 apresentavam-se mais elevados nos animais
pertencentes ao grupo CA, sugerindo uma possível associação com
mecanismos imunoprotetores da infecção canina. Por outro lado os
níveis séricos de IgG2 parecem estar associados com a morbidade da
LVC, já que estes encontraram-se mais elevados em animais que
apresentavam a forma clínica mais grave da doença.
Contrariando os resultados apresentados anteriormente,
Solano-Gallego et al. (2001) em um estudo cross-seccional com 280
animais em diferentes estágios da infecção, não encontraram
correlação entre o status clínico do animal e as subclasses de IgG
secretadas. Q
UINNELL et al. (2003) sugerem que as subclasses de IgG
não são um bom marcador para resistência ou suscetibilidade na
leishmaniose canina.
Na verdade, os mecanismos responsáveis pela proteção ou
suscetibilidade à infecção em cães e o modo pelo qual, diferentes
fatores afetam estes mecanismos ainda são pobremente conhecidos.
Avaliamos também o perfil das subclasses de IgG em relação à
carga parasitária medida pelo índice de LDU. Segundo G
ICHERU et al.
(1995) e NIETO et al. (1999) somente a presença de anticorpos anti-
Leishmania não pode ser considerado um marcador conclusivo de
progressão da doença durante a LVC. Assim, R
EIS et al. (2006ª)
observaram que a reatividade de algumas imunoglobulinas anti-
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
71
Leishmania presentes no soro de cães naturalmente infectados por L.
chagasi poderia ser utilizada como marcador de status clínico e carga
parasitária tecidual, representando um ótimo indicador de morbidade
da doença. Foi observada uma correlação entre os níveis de IgG,
IgG
2
, IgA e IgE e o status clínico do animal e entre os níveis de IgG,
IgG
2
, IgM e IgA com a densidade parasitária. Com base neste estudo
avaliamos a densidade parasitária na pele e no baço e comparamos
os resultados com o índice de reatividade de IgG e suas subclasses
(IgG
1
e IgG
2
), a fim de verificar a existência de alguma correlação
entre estas variáveis.
A análise dos resultados de IgG e suas subclasses mostrou que
o aumento nos valores de reatividade de IgG
total
e IgG
2
estava
diretamente relacionado a uma maior intensidade parasitária no baço
e pele dos animais. Estes resultados são semelhantes aos relatados
por Reis et al. (2006ª) que além destas observações, apontam a
medula óssea como o melhor tecido para se correlacionar carga e
resposta imune humoral. Além das correlações positivas entre IgG,
IgG
2
e aumento da densidade parasitária, observamos uma
correlação negativa entre os valores de IgG
1
e a carga parasitária no
baço (Figura 15). Estes dados reforçam a hipótese de que IgG
1
estaria associada ao mecanismo de imunoproteção durante a infecção
do cão com L. i. chagasi, já que os animais que apresentaram as
maiores concentrações destas imunoglobulinas eram assintomáticos e
com baixo parasitismo e que IgG
2
agiria de forma contrária, pois
foram observados níveis mais elevados em animais com alto
parasitismo e sintomas mais graves da infecção.
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
72
6. AVALIAÇÃO DA AVIDEZ DE IGG NA LVC
O teste de avidez de IgG é uma técnica amplamente aplicada
em diversas doenças parasitárias e tem como objetivo avaliar o
tempo de infecção de acordo com o Índice de Avidez (IA) da amostra
de soro testada (MONTOYA et al., 2004; FRICKER-HIDALGO et al., 2006;
CLEMENTINO et al., 2007; PIETKIEWICZ et al., 2007). A técnica difere da
ELISA convencional em uma única etapa que consiste na aplicação de
Uréia 6M previamente à adição do conjugado. Isto fará com que as
moléculas de IgG que possuem menor afinidade pelo antígeno
tenham sua ligação rompida, mantendo somente àquelas que
possuem a ligação mais forte e portanto pertencentes a um animal
com tempo maior de infecção.
SUÁREZ-ARANDA et al. (2000) demonstrou em seu trabalho que
valores de IA > 50% são indicadores da toxoplasmose crônica,
enquanto que valores menores que 50% indicam que a doença se
encontra na fase aguda. A avidez na toxoplasmose vem sendo
amplamente utilizada e kits comerciais que avaliam a avidez (VIDAS
Toxo – bioMérieux, Marcy l’Etoile, França) têm sido amplamente
empregados já que o diagnóstico preciso da infecção por toxoplasma
aguda ou recente na mulher grávida e no bebê é extremamente
importante para a prescrição do tratamento.
Um dos poucos trabalhos que avaliaram a avidez de IgG em
leishmaniose foi realizado por R
EDHU et al. (2006). Neste estudo foi
possível, através do índice de avidez, diferenciar as infecções
recentes das crônicas em pacientes com LV. O estudo mostrou que,
como em outras infecções, o teste de avidez de IgG pode ser usado
com sucesso para estimar o tempo em que a infecção se estabeleceu
no hospedeiro.
Até o momento nenhum trabalho foi publicado avaliando os
níveis de avidez de IgG na LVC. Portanto não existe ainda um valor
Teixeira - Neto, R.G. Discussão
73
estabelecido do IA capaz de distinguir cães com infecção recente
daqueles com infecção mais antiga.
No presente estudo avaliamos o IA em cães naturalmente
infectados por L. i. chagasi considerando a forma clínica e a carga
parasitária apresentada nas amostras de baço e pele. Nossos
resultados demonstram que animais sintomáticos possuem maiores
IA quando comparados com os animais assintomáticos. Além disso,
animais com elevados índices de LDU tanto no baço quanto na pele
possuem maiores IA’s que os animais com baixo parasitismo. Ao
avaliarmos a correlação entre o IA e as subclasses de IgG
constatamos que os IA mais altos estavam diretamente relacionados
aos perfis de maior reatividade de IgG
2
.
Este conjunto de resultados reforça a hipótese de que cães
infectados por L. i. chagasi apresentam características que sugerem
uma evolução gradual da infecção. Esta inicialmente é ausente de
sintomas, passando por uma fase com o aparecimento de sinais
clínicos menos graves e por fim evoluindo para uma forma clássica,
característica, com a manifestação de inúmeros sinais clínicos da
infecção que provavelmente desencadeará na morte do animal. Ainda
podemos sugerir que animais com níveis mais altos de parasitismo
tecidual em amostras de pele e de baço e maior reatividade para IgG
2
se encontram em um estágio mais tardio de evolução da doença.
Conclusões
Teixeira-Neto, R.G. Conclusões
75
Após a realização deste estudo que avaliou parâmetros clínicos,
parasitológicos e imunológicos da infecção natural por L. infantum
chagasi em cães, estabelecemos as seguintes conclusões:
• A PCR se mostrou uma ferramenta específica, sensível e útil para
a detecção de Leishmania em amostras clínicas de cães
naturalmente infectados, independentemente da forma clínica
apresentada.
• As amostras de baço, linfonodo e pele foram as mais adequadas
para o diagnóstico molecular. Porém, sugerimos o linfonodo e a
pele como amostra de escolha para o diagnóstico da LVC devido
à maior facilidade de coleta do material.
• A PCR-RFLP mostrou ser uma excelente ferramenta na
identificação da espécie de Leishmania a partir de amostras
biológicas de cães naturalmente infectados.
• O teste de avidez de IgG foi utilizado pela primeira vez na LVC e
apresentou resultados promissores para sua utilização como um
marcador de progressão da infecção.
• A análise combinada dos aspectos avaliados nos permitiu
identificar um conjunto de características que qualificam as
formas clínicas da LVC:
I. Os cães classificados como assintomáticos apresentaram
menor parasitismo tecidual principalmente nas amostras de
pele, baixa avidez das moléculas de IgG e resposta imune
humoral com índices elevados de IgG
1
, características da fase
inicial da infecção.
Teixeira-Neto, R.G. Conclusões
76
II. Os cães classificados como sintomáticos apresentaram maior
parasitismo tecidual principalmente nas amostras de pele, alta
avidez das moléculas de IgG, e resposta imune humoral com
elevados índices de IgG
2
, características da fase crônica da
infecção.
Apêndice
Teixeira-Neto, R.G. Apêndice
78
1. SOLUÇÕES PARA ELISA CONVENCIONAL E AVIDEZ.
1.1. PBS PH 7,5
Na
2
HPO
4
.H
2
O ----------------------- 4,136g
NaH
2
PO
4
.H
2
O ----------------------- 0,3215g
NaCl --------------------------------- 21,25g
H2O destilada (q.s.p.) ------------- 2.500mL
Acertar o pH para 7,5 e conservar à 4ºC.
1.2. TAMPÃO CARBONATO PH 9,6 (“COATTING BUFFER”)
Na
2
CO
3
------------------------------ 1,59g
NaHCO
3
----------------------------- 2,93g
H
2
O destilada (q.s.p.) -------------- 1.000mL
Acertar o pH para 7,5 e conservar à 4ºC.
1.3. SOLUÇÃO DE LAVAGEM
NaCl --------------------------------- 9,0g
Tween 20 --------------------------- 0,5mL
H
2
O destilada (q.s.p.) -------------- 1.000mL
Conservar à 4ºC.
1.4. SOLUÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO (TAMPÃO SUBSTRATO) PH 5,0
Na
2
HPO
4
---------------------------- 7,19g
C
6
H
8
O
7
.H
2
O ------------------------- 5,19g
H
2
O destilada (q.s.p.) -------------- 1.000mL
Acertar o pH para 5,0 e conservar à 4ºC.
1.5. PBS/TWEEN
Tween 20 --------------------------- 0,5mL
PBS 1X ------------------------------ 1.000mL
Teixeira-Neto, R.G. Apêndice
79
1.6. SOLUÇÃO DE SUBSTRATO
OPD --------------------------------- 6mg
H
2
O
2
--------------------------------- 4µL
Tampão de Substrato -------------- 10mL
1.7. SOLUÇÃO DE PBS/TWEEN COM URÉIA 6M
CH
4
N
2
O ----------------------------------- 36,03g
PBS/Tween ------------------------------- 100mL
Anexo
Teixeira-Neto, R.G. Anexo
81
1. FICHA CLÍNICA EPIDEMIOLÓGICA CANINA
Teixeira-Neto, R.G. Anexo
82
2. PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE ELISA
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
1:8000 1:16000 1:32000 1:64000
Br
Conj
SN1
SN2
SN3
SN4
SN5
SP1
SP2
SP3
SP4
SP5
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
1:8000 1:16000 1:32000 1:64000
Br
Conj
SN1
SN3
SN4
SN5
SP1
SP2
SP4
SP5
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
1:8000 1:16000 1:32000 1:64000
Br
Conj
SN1
SN2
SN3
SN4
SN5
SP1
SP2
SP3
SP4
SP5
Resultado da padronização para diluição dos conjugados Anti-IgG (A), Anti-IgG
1
(B)
e Anti IgG
2
(C) utilizados na técnica de ELISA Isotipos para as amostras de soros
caninos positivos e negativos. Comprimento de onda 490nm. A seta indica a
diluição utilizada. Eixo X = Diluição do Conjugado; Eixo Y= Absorbância a 490 nm.
A
B
C
Teixeira-Neto, R.G. Anexo
83
3. ESBOÇO DA DIVISÃO DA PLACA DE ELISA PARA REALIZAÇÃO DO TESTE
DE AVIDEZ
Esboço de placa de ELISA. Divisão utilizada para realização do protocolo de
afinidade de IgG. P = Soros positivos, B = Branco, N = Soros Negativos, T = Soros
com diferentes tempos de infecção e AM = Amostras.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A P1 P1 N1 N1 AM1
AM1
P1 P1 N1 N1 AM1 AM1
B P2 P2 N2 N2 AM2
AM2
P2
P2
N2 N2 AM2 AM2
C P3 P3 N3 N3 AM3
AM3
P3 P3 N3 N3 AM3 AM3
D P4 P4 N4 N4 AM4
AM4
P4 P4 N4 N4 AM4 AM4
E B B T1 T1 AM5
AM5
B B T1 T1 AM5 AM5
F B B T2 T2 AM6
AM6
B B T2 T2 AM6 AM6
G B B T3 T3 AM7
AM7
B B T3 T3 AM7 AM7
H B B T4 T4 AM8
AM8
B B T4 T4 AM8 AM8
ELISA convencional Lavagem com adição de uréia 6M
Teixeira-Neto, R.G. Anexo
84
4. CORRELAÇÃO ENTRE A REATIVIDADE DE IG E A LDU NO BAÇO E NA PELE
Valores de p e r para as correlações entre a reatividade de Ig e a LDU no baço e na
pele dos cães com diferentes formas clínicas e no grupo total de cães.
Assintomáticos Sintomáticos Cães Infectados
LDU
Pele Baço Pele Baço Pele Baço
r=0,07631 r=0,7404
r=0,1883 r=-0,1643
r=0,2416 r=0,3684
IgG
p=0,7491 p=0,0002
p=0,4265 p=0,5016 p=0,1332 p=0,0164
r=-0,01713
r=-0,3205 r=-0,1469
r=-0,2280
r=-0,1934 r=-0,3562
IgG
1
p=0,9429 P=0,1682 p=0,5364 p=0,3478 p=0,2382 p=0,0261
r=0,2208 r=0,7791
r=0,1062 r=-0,2996
r=0,2462 r=0,4594
IgG
2
p=0,3494 P<0.0001
p=0,6558 p=0,1994 p=0,1257 p=0,0025
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