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Nádia das Dores Moreira
Cinética da Migração Celular Intradérmica em Hamsters Sensibilizados
com Diferentes Constituintes Antigênicos de duas Vacinas Contra
Leishmaniose Visceral Canina
OURO PRETO, MG
2008
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NÁDIA DAS DORES MOREIRA
Cinética da Migração Celular Intradérmica em Hamsters Sensibilizados
com Diferentes Constituintes Antigênicos de duas Vacinas Contra
Leishmaniose Visceral Canina
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre.
Orientador: Professor Alexandre Barbosa Reis- Laboratório de Imunopatologia Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas NUPEB/UFOP. Professor de Parasitologia Clínica do
Departamento de Análises Clínicas da Escola de Farmácia da UFOP
Co-Orientadora: Professora Cláudia Martins Carneiro - Laboratório de Imunopatologia Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas NUPEB/UFOP. Professora de Citologia Clínica do
Departamento de Análises Clínicas da Escola de Farmácia da UFOP
OURO PRETO, MG
2008
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Catalogação: [email protected]
M839c Moreira, Nádia das Dores.
Cinética da migração celular intradérmica em hamsters sensibilizados
com diferentes constituintes antigênicos de duas vacinas contra leishmaniose
visceral canina [manuscrito] / Nádia das Dores Moreira. – 2008.
xiii, 95 f.: il., color; graf.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Barbosa Reis.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto
de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.
1. Hamster - Teses. 2. Leishmaniose - Teses. 3. Vacinação de animais -
Teses. 4. Cães - Doenças - Vacinação - Teses. I. Universidade Federal de Ouro
Preto. II. Título.
i
Colaboradores
Dr. Luiz Cosme Cotta Malaquias – Laboratório de Imunologia/UNIVALE
Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti – Laboratório de Imunopatologia/NUPEB/UFOP
Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira – Laboratório de Imunologia Celular e Molecular/Instituto de
Pesquisas René Rachou FIOCRUZ/MG
Mestranda Juliana Vitoriano de Souza - Laboratório de Imunopatologia/NUPEB/UFOP
Iniciação Científica Bruno Mendes Roatt - Laboratório de Imunopatologia/NUPEB/UFOP
Suporte Financeiro
FAPEMIG/CNPq: PRONEX 2007
UFOP – Universidade Federal de Ouro Preto
ii
"Deus nos fez perfeitos e não escolhe os capacitados,
capacita os escolhidos.
Fazer ou não fazer é algo que só depende de nossa
vontade e perseverança".
Albert Einstein
MOREIRA, N. D. Dedicatória
iii
Aos meus pais, Manoel e Maria
Gertrudes, pela minha formação
pessoal e pelo exemplo de
perseverança e dignidade;
À minha irmã Meire, meu cunhado Eduardo e meu sobrinho Gustavo pelo amor e carinho
que sempre tiveram por mim...
MOREIRA, N. D. Agradecimentos
iv
A Deus, em primeiro lugar, razão de toda a minha história, pelo dom da vida e pela
oportunidade de realizar este trabalho, dando-me forças nos momentos mais difíceis.
Obrigada Senhor!
Ao Dr. Alexandre, pela orientação, incentivo profissional, confiança, paciência, amizade e
principalmente, pelas preciosas oportunidades de desenvolvimento profissional e pessoal.
Palavras não conseguem exprimir todo o meu agradecimento, mas tenha a certeza, que lhe
devoto uma grande admiração e profunda gratidão.
À Drª. Cláudia Martins Carneiro, pela co-orientação, contribuição imensurável em meu
crescimento científico na área de patologia, estímulo, sugestões na reelaboração desta
dissertação e pelo convívio diário agradável.
Ao Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti pela paciência e disposição em compartilhar suas
experiências profissionais, as quais foram, e sempre serão de grande importância para a
conquista das minhas.
Ao Dr. Luiz Cosme Cotta Malaquias pelo auxílio na dosagem de óxido nítrico.
A Ms. Jerusa Arantes pelo convívio agradável, paciência e carinho. Jamais vou esquecer o
que fez por mim. A você minha eterna gratidão.
Ao Ms. Wendel, pelo gesto de amizade, presteza e agradável convívio diário,
principalmente, nos momentos difíceis.
À Maria Chaves pelos ensinamentos das técnicas, paciência, amizade, pelas palavras de
conforto nos momentos de aflição e pela forma carinhosa que sempre me tratou dentro e
fora do laboratório fazendo-me sentir em casa, tornando menos dolorosa a minha saudade
de casa, da minha mãe... A você Maria minha eterna gratidão.
À Juliana minha companheira de bancada que esteve presente em cada etapa deste trabalho
dando-me força e apoio necessário. Uma pessoa de muita fibra e por quem tenho uma
grande admiração. Só tenho a agradecê-la por tudo que tem me proporcionado até hoje.
MOREIRA, N. D. Agradecimentos
v
Vou sempre me lembrar do “huuuu Neidinha”, ou o “bom dia Nádia” cheio de entusiasmo.
Jú a você MUITO OBRIGADA!!!
Ao Bruno Mendes Roatt pela convivência agradável e imensurável apoio durante todo o
mestrado. A você minha eterna gratidão.
Às Ms. Paula Melo e Amanda Francisco pelo apoio incondicional, amizade, palavras de
conforto e brincadeiras nos intervalos de cada etapa realizada. Adoro vocês!
À Raquel pela amizade, palavras de conforto e por ser tão paciente comigo.
Ana, Carol, Kátia, Rodrigo, Henrique, Samuel, Sheler, e Rafael pela agradávél convivência
e colaboração em todos os momentos.
À Cida pelo pela presteza e precisão nos serviços da secretaria.
Aos funcionários do biotério, em especial à Selma e ao Cláudio pelo carinho que sempre
tiveram comigo nos momentos em que precisei.
Aos docentes e colegas do Curso de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas, pelos ensinamentos e convivência.
À Lúcia Ângelo Machado pela maravilhosa convivência nos tempos da iniciação... sinto
saudades!
Às Belladonas: Kátia, Jeanne e Helaine pela agradável convivência, amizade e acolhida em
Ouro Preto. A Fabiana, Luciana e Rosana pela compreensão durante o desenvolvimento
deste trabalho.
As minhas duas amigas desde os tempos da graduação, Marcela e Érika. Pessoas que
sempre torceram por mim e, principalmente, as grandes incentivadoras de tudo. Vocês me
ensinaram o valor de uma verdadeira amizade. Amo vocês!
MOREIRA, N. D. Agradecimentos
vi
À amiga Márcia pelo incentivo e ajuda. Mesmo estando longe, nunca me esqueci de seus
conselhos.
Ao Danilo pelas palavras de incentivo, seu gesto de compreensão, sua atitude de
segurança, mesmo nos períodos de desânimo. Obrigada por caminhar ao meu lado.
Obrigada pelo amor, pela paciência e pelo companheirismo. Te amo!
Ao meu cunhado Eduardo, minha irmã Meire e meu sobrinho Gustavo. Família: eu AMO
VOCÊS!!! Obrigada por tudo que tem me proporcionado... a vocês minha eterna gratidão.
Aos meus queridos irmãos Leninha, Sheila, Lael e Marcone pelo apoio e confiança em
mim depositada.
À minha cunhada Elaine por estar sempre perto da minha mãe, fazendo por ela o que eu
não posso fazer, por estar tão distante.
Ao Papai e Mamãe pessoas que mais amo nesta vida e que fazem de tudo pela minha
felicidade, realizando todos os meus sonhos. Só tenho a agradecer a Deus todos os dias por
tudo que fazem por mim. Obrigada pela compreensão em suportar pacientemente uma filha
distante da vida familiar durante seis anos. No entanto, são vocês a razão disto tudo, e é a
vocês que ofereço esta conquista. Papai e Mamãe AMO VOCES!!!
MOREIRA, N. D. Sumário
vii
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................... 1
1.1 - DESENVOLVIMENTO DE VACINAS .......................................................................................................... 5
1.2 - ADJUVANTES VACINAIS ......................................................................................................................... 8
1.3 - MODELOS EXPERIMENTAIS NA LEISHMANIOSE VISCERAL E EM VACINAS CONTRA LV E LVC ............. 10
1.4 - ASPECTOS GERAIS DA INFLAMAÇÃO E RECRUTAMENTO CELULAR ..................................................... 13
1.5 - ÓXIDO NÍTRICO E A EXPRESSÃO DE INOS ........................................................................................... 16
2. JUSTIFICATIVA...................................................................................................................................... 20
3. OBJETIVOS.............................................................................................................................................. 22
3.1 - OBJETIVO GERAL ................................................................................................................................23
3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................................................... 23
4. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................................................... 24
4.1- ANIMAIS............................................................................................................................................... 25
4.2 - GRUPOS EXPERIMENTAIS ..................................................................................................................... 26
4.3 - ANTÍGENOS VACINAIS E APLICAÇÃO DOS INÓCULOS............................................................................ 26
4.4 - COLETA DAS AMOSTRAS...................................................................................................................... 27
4.5 - NECROPSIA DOS ANIMAIS E OBTENÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO....................................................... 27
4.6 - PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO DOS TECIDOS E COLORAÇÕES EMPREGADAS ...................................... 28
4.7 - IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA A DETECÇÃO DA EXPRESSÃO DE INOS ................................................... 28
4.8 - QUANTIFICAÇÃO DA INFLAMAÇÃO NA DERME..................................................................................... 30
4.9 - ANÁLISE QUANTITATIVA DA EXPRESSÃO DE INOS .............................................................................. 30
4.9.1 - Contagem Diferencial: leucócitos circulantes e células teciduais ............................................. 31
4.9.2 - Avaliação do perfil de Óxido Nítrico.......................................................................................... 31
4.10 - ANÁLISES ESTATÍSTICAS ................................................................................................................... 32
5. RESULTADOS.......................................................................................................................................... 33
5.1 - PERFIS CELULARES DE LEUCÓCITOS NO SANGUE PERIFÉRICO DE HAMSTERS INOCULADOS COM
DIFERENTES ANTÍGENOS VACINAIS
.............................................................................................................. 34
5.1.1 - Percentual de Neutrófilos........................................................................................................... 34
5.1.2 - Percentual de Eosinófilos........................................................................................................... 36
5.1.3 - Percentual de Monócitos............................................................................................................ 38
5.1.4 - Percentual de Linfócitos............................................................................................................. 40
5.2 - DOSAGEM DOS NÍVEIS DE NITRATO (NO
-3
) +NITRITO (NO
-2
) CIRCULANTES........................................ 43
5.3 - PERFIS CELULARES DE POLIMORFONUCLEARES E MONONUCLEARES NA DERME DE HAMSTERS
INOCULADOS COM DIFERENTES ANTÍGENOS VACINAIS
................................................................................. 45
5.3.1- Percentual de Neutrófilos............................................................................................................ 45
5.3.2 - Percentual de Eosinófilos........................................................................................................... 47
5.3.3 - Percentual de Macrófagos.......................................................................................................... 49
5.3.4 - Percentual de Linfócitos............................................................................................................. 52
5.4 – ANÁLISES DE CORRELAÇÕES ENTRE AS POPULAÇÕES CELULARES (POLIMORFONUCLEARES E
MONONUCLEARES
) NA DERME E NO SANGUE PERIFÉRICO ............................................................................ 54
5.5 - AVALIAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA ................................................................................................... 55
5.6 - EXPRESSÃO DE INOS NA DERME ......................................................................................................... 60
5.7
– ANÁLISE DE CORRELAÇÃO ENTRE A ÁREA IMUNOMARCADA PARA INOS E AS POPULAÇÕES CELULARES
DE POLIMORFONUCLEARES E MONONUCLEARES NA DERME
......................................................................... 63
6. DISCUSSÃO.............................................................................................................................................. 65
7. CONCLUSÕES ......................................................................................................................................... 79
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................................... 82
MOREIRA, N. D. Lista de Abreviaturas
viii
APCs Células Apresentadoras de Antígeno
BCG
Bacillus Calmette-Guérin
nNOS Óxido Nítrico Sintase Neuronal
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
eNOS Óxido Nítrico Sintase Endotelial
FML Fucose Manose Ligante
H
2
O
2
Peróxido
de Hidrogênio
H
3
PO
4
Ácido fosfórico
IFI Reação de Imunofluorescência Indireta
IFN-γ
Interferon Gama
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL Interleucina
iNOS Óxido Nítrico Sintase Induzida
LPS Lipopolissacarídio
LV Leishmaniose Visceral
mRNA RNA Mensageiro
NaNO
2
Nitrito de Sódio
NO Óxido Nítrico
NO
2-
Nitrito
NO
3
-
Nitrato
NOS Óxido Nítrico Sintase
PBS Salina Tamponada com Fosfato
PCR Reação em Cadeia de Polimerase
RFC Reação de Fixação de Complemento
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
SFM Sistema Fagocítico Mononuclear
TGF-β Fator de Transformação do Crescimento Βeta
Th1 Células TCD4 Secretoras do Padrão 1 de Citocinas
TM Intradermorreação de Montenegro
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
ZnSO
4
Sulfato de Zinco
MOREIRA, N. D. Lista de Gráficos
ix
Gráfico 1: Percentual de neutrófilos no sangue periférico de hamsters inoculados com
diferentes estímulos ............................................................................................................ 35
Gráfico 2: Cinética do percentual de neutrófilos no sangue periférico de hamsters
submetidos a diferentes inóculos......................................................................................... 36
Gráfico 3: Percentual de eosinófilos no sangue periférico de hamsters inoculados com
diferentes estímulos ............................................................................................................ 37
Gráfico 4: Cinética do percentual de eosinófilos no sangue periférico de hamsters
submetidos a diferentes inóculos......................................................................................... 37
Gráfico 5: Percentual de monócitos no sangue periférico de inoculados com diferentes
estímulos ............................................................................................................................. 39
Gráfico 6: Cinética do percentual de monócitos no sangue periférico de hamsters
submetidos a diferentes inóculos......................................................................................... 39
Gráfico 7: Percentual de linfócitos no sangue periférico de hamsters inoculados com
diferentes estímulos............................................................................................................. 42
Gráfico 8: Cinética do percentual de linfócitos no sangue periférico de hamsters
submetidos a diferentes inóculos......................................................................................... 42
Gráfico 9: Dosagem dos níveis séricos de NO em hamsters inoculados com diferentes
estímulos.............................................................................................................................. 44
Gráfico 10: Cinética dos níveis séricos de NO em hamsters submetidos a diferentes
inóculos................................................................................................................................ 44
Gráfico 11: Percentual de neutrófilos na derme de hamsters inoculados com diferentes
estímulos.............................................................................................................................. 46
Gráfico 12: Cinética do percentual de neutrófilos na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos............................................................................................................... 46
Gráfico 13: Percentual de eosinófilos na derme de hamsters inoculados com diferentes
estímulos.............................................................................................................................. 48
Gráfico 14: Cinética do percentual de eosinófilos na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos............................................................................................................... 48
Gráfico 15: Percentual de macrófagos na derme de hamsters inoculados com diferentes
estímulos.............................................................................................................................. 51
Gráfico 16: Cinética do percentual de macrófagos na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos............................................................................................................... 51
Gráfico 17: Percentual de linfócitos na derme de hamsters inoculados com diferentes
estímulos.............................................................................................................................. 53
MOREIRA, N. D. Lista de Gráficos
x
Gráfico 18: Cinética do percentual de linfócitos na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos............................................................................................................... 53
Gráfico 19: Análise de correlação entre percentual de células na derme e o percentual de
leucócitos no sangue periférico.. ......................................................................................... 54
Gráfico 20: Análise morfométrica do infiltrado inflamatório na derme de hamsters
inoculados com diferentes estímulos................................................................................... 57
Gráfico 21: Cinética do infiltrado inflamatório dérmico em hamsters submetidos a
diferentes inóculos............................................................................................................... 57
Gráfico 22: Análise morfométrica da área expressando iNOS na derme de hamsters
inoculados com diferentes estímulos................................................................................... 61
Gráfico 23: Cinética da área expressando iNOS na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos............................................................................................................... 61
Gráfico 24: Análise da correlação entre a área imunomarcada para iNOS na derme e o
percentual de neutrófilos, de linfócitos e de macrófagos na derme de hamsters do grupo
LB........................................................................................................................................ 63
Gráfico 25: Análise da correlação entre a área imunomarcada para iNOS na derme e o
percentual de células na derme do grupo LEISHMUNE
®
. ................................................. 64
MOREIRA, N. D. Lista de Figuras
xi
Figura 1 - Delineamento experimental................................................................................ 25
Figura 2: Fotomicrografias do infiltrado inflamatório na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos e avaliados nos tempos de 1, 12 e 24 horas após o inóculo ................. 58
Figura 3: Fotomicrografias do infiltrado inflamatório na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos e avaliados nos tempos de 48, 96 e 168 horas após o inóculo. ........... 59
Figura 4: Fotomicrografias da área positiva para a expresão de iNOS na derme de hamsters
submetidos a diferentes inóculos e avaliados nos tempos de 48, 96 e 168 horas após o
inóculo..................................................................................... ............................................62
MOREIRA, N. D. Resumo
xii
A imunoprofilaxia da leishmaniose visceral canina (LVC) representa uma importante medida
de controle da infecção por Leishmania possibilitando a redução de casos caninos e
conseqüentemente da incidência da doença no homem. Embora uma vacina eficaz contra LV
humana e canina ainda não esteja disponível, muitos esforços têm sido dispendidos nesta área
nos últimos anos e vários candidatos a antígenos vacinais têm sido estudados em cães. Assim,
este estudo teve como objetivo central avaliar a cinética de migração celular e os níveis de
óxido nítrico (NO) no modelo hamster após inóculo das vacinas LEISHMUNE
®
e LBSap, bem
como do adjuvante saponina e do antígeno vacinal de L. braziliensis isoladamente. Cento e
vinte hamsters foram alocados em cinco grupos experimentais, com 24 hamsters por grupo,
entre os quais: (i) grupo SALINA que recebeu inóculo com solução salina estéril 0,85%; (ii)
grupo SAPONINA inoculado com 100 µg do adjuvante saponina; (iii) grupo LB inoculado
com 60 µg do antígeno de L. braziliensis; (iv) grupo LBSap que recebeu 60 µg do antígeno de
L. braziliensis associado a 100 µg do adjuvante saponina; (v) grupo LEISHMUNE
®
inoculado
com 150 µg do antígeno FML liofilizado associado a 100 µg de saponina. Os diferentes
estímulos foram preparados em solução salina estéril 0,85%, sendo inoculados 200 µL por via
intradérmica na região abdominal. Os resultados obtidos neste trabalho nos permitem afirmar
que o Hamster (Mesocricetus auratus) é um bom modelo para avaliar a resposta imune inata
possibilitando um melhor entendimento dos eventos celulares desencadeados in situ pelo
processo de inoculação e podem contribuir no direcionamento de uma resposta imune protetora
em vacinas. O estudo de cinética de migração celular contribui de forma marcante para a
seleção prévia de antígenos vacinais e adjuvantes, antes mesmo de serem testados em cães,
sobretudo no que diz respeito aos aspectos relacionados à inocuidade e imunogenidade,
auxiliando na bioprospecção de novos potenciais candidatos vacinais contra LVC. As discretas
reações locais verificadas pós-sensibilização com o adjuvante saponina nos permitem indicar
seu emprego em outros modelos experimentais. A SAPONINA é capaz de promover aumento
de neutrófilos e redução de linfócitos circulantes no período precoce, enquanto LB, LBSap e
LEISHMUNE
®
promoveram aumento de neutrófilos no período tardio indicando uma
mobilização destas células em nível sistêmico logo após a sensibilização pela SAPONINA e
uma regulação deste fenômeno devido à associação com antígenos de Leishmania sp.. Além
disto, a SAPONINA é capaz de promover redução de linfócitos circulantes no período precoce,
enquanto a LBSap promove redução tardia, e a LEISHMUNE
®
promove redução desta célula
durante toda cinética, indicando que a SAPONINA auxilia na mobilização desta população que
esta sendo recrutada juntamente com neutrófilos a migrarem para o local do inóculo. No sítio
do inóculo ocorre redução tardia de neutrófilos no processo inflamatório em animais
inoculados com SAPONINA, LBSap e LB com tendência a manutenção desta população grupo
LEISHMUNE
®
, indicando a participação de neutrófilos na resposta imune inata após
sensibilização com antígenos e adjuvantes vacinais. No grupo LB observou-se redução precoce
de linfócitos na derme enquanto que nos grupos SAPONINA e LBSap um recrutamento tardio,
indicando o papel desta no recrutamento de células apresentadoras de antígeno com a indução
da migração de linfócitos até mesmo no período tardio. A SAPONINA promove um
recrutamento precoce e persistente de macrófagos enquanto as vacinas LBSap e
LEISHMUNE
®
apresentam uma tendência da manutenção desta população na derme,
indicando que a associação do adjuvante aos antígenos parece influenciar na queda da
migração de monócitos in situ. O aumento dos níveis de NO sérico nos grupos LEISHMUNE
®
e LBSap indica a participação de citocinas do tipo 1, como IFN-γ, que podem ser fundamentais
na polarização da resposta imune adquirida protetora durante o processo vacinal.
MOREIRA, N. D. Abstract
xiii
Dogs represent the most important domestic reservoirs of L. chagasi, and a vaccine against canine
visceral leishmaniasis (CVL) would be an important tool in the control of human VL by decreasing
dramatically the infection pressure of L. chagasi/L. infantum. Although, an effective vaccine
against human and CVL is not yet available, much effort has been expended in this area in recent
years and several candidate vaccine antigens have been studied in dogs. In this context, hamsters
have been used as a model for understanding the mechanisms of immunogenicity for vaccines
against CVL. In order to gain a better understanding of how the antigens and vaccine adjuvants
interact with the innate immune response, we test two vaccines schedules: a commercial
LEISHMUNE
®
vaccine and a killed Leishmania braziliensis antigen plus saponin (LBSap). The
main objective of the present study was to assess the kinetics of cell migration in the skin of
hamsters and the levels of nitric oxide after inoculation with distinct antigenic components of the
LBSap and LEISHMUNE
®
vaccines. Dermal inflammatory infiltrate profiles, circulating
leukocytes and the role of NO/iNOS during intradermal injections in abdominal area were assessed
at different times (1, 12, 24, 48, 96 and 168 hours) were assessed. In the current study, 120
hamsters were inoculated in the abdominal region by intradermal via and were subdivided within
five experimental groups, with 24 hamsters each: (i) SALINA group (S), which received inoculum
with sterile saline 0.85%; (ii) SAPONINA group (Sap), inoculated with 100 µg of saponin
adjuvant; (iii) L. braziliensis group (LB), inoculated with 60 mg/protein of L. braziliensis, (iv)
LBSap group that received 60 µg of L. braziliensis antigen plus 100 µg of saponin; and (v)
LEISHMUNE
®
group, which received 150 µg of FML lyophilized antigen associated with 100 µg
of saponin. After 1, 12, 24, 48, 96 and 168 hours; skin biopsies were performed. The results
obtained in this study highlighted the hamster (Mesocricetus auratus) as a good model to assess the
innate immune response enabling a better understanding of the in situ cellular events triggered after
inoculation. The study of kinetics of cell migration contributes in the selection of vaccine antigens
and adjuvants even before the test in dogs, especially with regard to issues related to the safety and
immunogenicity. Therefore, it supports the search of the new potential vaccines candidates against
CVL. The discrete local reactions recorded after inoculation with SAPONIN allow us to
recommend its use for dogs. The SAPONIN was able to promote an increase in the circulations of
neutrophils and an early reduction of lymphocytes, while LB, LBSap and LEISHMUNE
®
promoted
an increase in neutrophils in the later period indicating a mobilization of these cells in systemic
levels soon after the saponin inoculations and the regulation of this phenomenon due to the
association with the Leishmania sp antigens. Furthermore, the SAPONIN reduced the number of
circulating lymphocytes in the early period, while LBSap caused a late reduction; LEISHMUNE
®
induced a persistent reduction of these cell populations throughout all points of the kinetics. This
data showed that the SAPONIN facilitate in the mobilization of lymphocytes that has been
recruited along with neutrophils to migrate into the inoculum site. We also observed a late
reduction of neutrophils in the inflammatory focus in animals inoculated with SAPONIN, LBSap,
and LB whereas the LEISHIMUNE
®
group showed a inclination to the maintenance of this
population, indicating the participation of neutrophils in innate immune responses after inoculation
with antigens plus vaccine adjuvants. The L. braziliensis antigen was able to cause an early
reduction of lymphocytes in the dermis while SAPONIN and LBSap triggered a late recruitment,
suggesting the role of SAPONIN in the traffic of antigen presenting cells and also induction of the
lymphocyte migration even in the late period. The SAPONIN carried out an early and persistent
recruitment of macrophages while LBSap and LEISHMUNE
®
vaccines showed a tendency to
maintain the levels of this population in the dermis, suggesting that the association of adjuvant and
antigens may influence the decrease of the monocytes migration. The increase of seric NO levels in
LEISHMUNE
®
and LBSap groups indicates the involvement of the type 1 cytokines such as IFN-γ,
which can be essential in the polarization of the protective acquired immune response during the
vaccination process.
1. INTRODUÇÃO
MOREIRA, N.D Introdução
2
As Leishmanioses são um complexo de doenças causadas por protozoários da
ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e do gênero Leishmania (Ross, 1903;
Laison & Shaw, 1987). Este complexo de doenças apresenta amplo espectro de formas
clínicas dependentes de vários aspectos: espécie do parasito, fatores eco-epidemiológicos,
imunidade, genética do hospedeiro e fatores nutricionais (McMahon-Pratt & Alexander,
2004). Existem diversas classificações clínicas das leishmanioses, entretanto a
Organização Mundial de Saúde (OMS) considera apenas quatro formas clínicas: cutânea,
mucosa, difusa e visceral. Atualmente as leishmanioses afetam cerca de 12 milhões de
pessoas em 88 países, estimando-se que 350 milhões encontrem-se em áreas de risco,
sendo a incidência anual de 500.000 novos casos para leishmaniose visceral (LV) e 1,5
milhões para leishmanioses cutâneas (WHO, 2004). Assim, como em outras doenças
tropicais, as leishmanioses estão relacionadas às mudanças ambientais de caráter
antroponótico que promovem o contato entre hospedeiros vertebrados e invertebrados.
Embora as leishmanioses sejam consideradas doenças tipicamente rurais, a recente
emergência e reemergência em várias cidades as posicionam como um grave problema de
saúde pública (Ashford, 2000).
A LV
apresenta ampla distribuição geográfica ocorrendo na Ásia, Europa, Oriente
Médio, África e nas Américas (Alencar, 1983). Na América Latina a doença já foi descrita
em pelo menos 12 países. No Brasil registra-se o maior número de casos, cerca de 90% do
total notificados em todo o continente e, em sua maioria, principalmente na região
Nordeste (Monteiro et al., 1994; Ministério da Saúde, 2003; Desjeux et al., 2004). O
agente etiológico da LV no velho mundo (Índia e Leste da África) é a Leishmania
(Leishmania) donovani; na China, Ásia Central, Sudeste da Europa e Mediterrâneo é a
Leishmania (L.) infantum e no novo mundo (América Latina) é a Leishmania (L.) chagasi
(Lainson & Shaw, 1987). Recentes estudos têm proposto que L. chagasi e L. infantum
MOREIRA, N.D Introdução
3
sejam a mesma espécie em função de suas características bioquímicas e genéticas serem
muito semelhantes (Mauricio et al., 2000; Lukes et al., 2007). Estes autores propõem que
estas espécies possam ser apenas uma, e que teria sido introduzida em nosso continente
pelos colonizadores europeus (Maurício et al., 2000).
A principal forma de transmissão do parasito ocorre por meio da picada de
fêmeas de dípteros da família Psychodidae, subfamília Phebotominae, sendo a Lutzomyia
longipalpis a principal espécie transmissora da L. chagasi no Brasil (Santos et al., 1998). O
ciclo biológico da L. (L.) chagasi é do tipo heteroxênico, envolvendo duas formas, uma
flagelada ou promastigota, encontrada no trato digestivo dos hospedeiros invertebrados e
outra aflagelada ou amastigota, que é intracelular obrigatória, sendo encontrada nas células
do sistema fagocítico mononuclear (SFM) do hospedeiro vertebrado (Bastien et al., 1992).
Os cães são considerados o principal reservatório do parasito, apresentando uma
posição de destaque na cadeia epidemiológica devido à sua proximidade com o homem
seja no ambiente doméstico ou peridoméstico, bem como ao elevado parasitismo cutâneo
observado até mesmo nos animais assintomáticos (Tesh, 1995; Giunchetti et al., 2006).
Este hospedeiro apresenta uma série de manifestações da doença, variando desde animais
aparentemente sadios (assintomáticos) passando por uma fase de sinais moderados como
pequena perda de peso, adenopatia linfóide e pêlo opaco (oligossintomáticos), podendo
atingir estágios graves da doença, com intenso parasitismo cutâneo (alopecia, dermatite
furfurácia, úlceras e hiperqueratose) ceratoconjuntivite, onicogrifose, paresia dos membros
posteriores, emagrecimento e caquexia (Abranches et al., 1991; Costa et al., 1999; Deane
& Deane, 1955; Reis, 2001; Reis et al., 2006a-2006b; Giunchetti et al., 2006; Reis et al.,
2008). Além disto, tem sido observado que o agravamento dos sinais clínicos no cão tem
relação direta com a carga parasitária em diferentes tecidos (Reis, 2001; Giunchetti, 2004;
Reis et al., 2006a; Reis et al., 2006b; Reis et al., 2006c; Giunchetti et al., 2006; Giunchetti
MOREIRA, N.D Introdução
4
et al. 2008a; Giunchetti et al. 2008b; Giunchetti et al. 2008). Sendo assim, o cão representa
uma abundante fonte de infecção para os hospedeiros invertebrados, confirmando a sua
importância na manutenção da transmissão da infecção para o homem, sendo encontrado
em todos os focos da doença humana, caracterizando o principal elo na cadeia de
transmissão da LV (Deplazes et al., 1995).
Na avaliação diagnóstica da LVC, são empregadas diferentes abordagens,
destacando-se: o diagnóstico clínico-epidemiológico e o diagnóstico clínico-laboratorial.
No diagnóstico clínico-laboratorial podem ser empregados métodos diretos por meio de
pesquisa parasitológica, em esfregaços da pele, medula óssea, baço, fígado e linfonodo
corados pelo método de Giemsa, dentre outros examinados ao microscópio óptico ou pelo
isolamento em meios de cultivo apropriados ou ainda pela inoculação em hamsters (Santa
Rosa & Oliveira, 1997; Aggarwal et al., 1999; Feitosa et al., 2000). Entretanto os métodos
indiretos, representados pelas técnicas imunodiagnósticas, são mais amplamente utilizados
na LVC. Dentre os testes destacam-se a Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), a
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), testes imunocromatográficos e o teste de
aglutinação (Santa Rosa & Oliveira, 1997; Sundar & Rai, 2002). Recentemente, métodos
moleculares utilizando a reação em cadeia de Polimerase (PCR) também vêm sendo
empregados devido à precisão no diagnóstico que muitas vezes pode ser espécie-
específico, como a RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Noli, 1999;
Solano-Gallego et al., 2001; De Andrade et al., 2006) que apresenta boa sensibilidade e
especificidade.
Até o momento o controle da LV baseia-se no tripé de ações que envolvem o
tratamento de casos humanos, o combate ao vetor e a eutanásia de cães soropositivos
(Tesh, 1995; Ministério da Saúde, 2003). O tratamento da LVC não é recomendado pela
OMS e não é permitido pelo Ministério da Saúde (Ministério da Saúde, 2003) em função
MOREIRA, N.D Introdução
5
da ineficácia das drogas convencionais em cães naturalmente infectados por L. chagasi.
Atualmente existe um consenso entre órgãos oficiais tais como a OMS e o Ministério da
Saúde e de diversos grupos de pesquisa de que uma vacina capaz de proteger cães
possibilitaria grandes benefícios ao programa de controle, pois poderia levar a diminuição
na incidência da doença humana e canina (Marzochi et al., 1985; Genaro, 1993; Mayrink
et al., 1996; Handman, 2001; Gradoni, 2001; Palatinik et al., 2001; Ministério da Saúde,
2003; Fujiwara et al., 2005; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008; Reis et al.,
2008).
1.1 - Desenvolvimento de vacinas
Diversas preparações vacinais têm sido estudadas em camundongos e/ou cães
contra a infecção por Leishmania spp., incluindo formas promastigotas mortas,
promastigotas vivas atenuadas ou irradiadas (Handman, 2001). Estudos recentes têm
empregado antígenos purificados, na forma de proteínas nativas ou recombinantes, seja em
vetores de expressão em eucariotos (vacinas de DNA) ou em sistemas de expressão de
antígenos em bactérias e vírus e por peptídeos sintéticos. Dentre os antígenos que têm sido
avaliados, pode-se citar a proteína homóloga a receptores da proteína quinase C em
Leishmania LACK, cisteíno-proteases e antígenos provenientes de formas promastigotas
como o ligante fucose manose-FML (Borja-Cabrera et al., 2002; Melby et al., 2001; Rafati
et al., 2005).
O desenvolvimento de uma vacina contra leishmanioses tem sido o principal foco
de muitos grupos de pesquisas nas últimas décadas (Dunan et al., 1989; Mayrink et al.,
1996; Mohebali et al., 1998; Ramiro et al., 2003; Lemesre et al., 2005; Saldarriaga et al.,
2006). Estudos empregando candidatos a vacinas de primeira geração contra a LVC foram
realizados por Ogunkolade et al. (1988) na França com resultados pouco satisfatórios e no
Brasil por Mayrink et al. (1996). Embora tenham sido observados alguns resultados
MOREIRA, N.D Introdução
6
importantes na vacina desenvolvida por Maryrink et al. (1996), estudos de campo duplo
cego randomizado realizados em Montes Claros/MG mostraram que este imunógeno
constituído por antígeno heterólogo de L. braziliensis associado a BCG (Bacillus Calmette-
Guérin) não foi capaz de controlar a infecção contra L. chagasi (Genaro et al., 1996;
Genaro et al., 1998).
Vários estudos estão em andamento visando identificar o melhor candidato vacinal
capaz de proteger cães contra LVC (Gradoni, 2001). Neste cenário de candidatos a
antígenos vacinais destaca-se a vacina de segunda geração composta por uma glicoproteína
de Fucose Manose Ligante de 36KDa (FML) desenvolvida pelo grupo de pesquisa
coordenado pela Profa. Clarissa Beatriz Palatnik de Sousa da Universidade Federal do Rio
de Janeiro (UFRJ). Recentemente, o laboratório Fort Dodge, adquiriu a patente desta
vacina, conhecida por LEISHMUNE
®
, atualmente licenciada pelo Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e disponível para comercialização. A
vacina LEISHMUNE
®
é composta pelo antígeno complexo glicoprotéico ligante de fucose
e manose (FML) de L. donovani e do adjuvante saponina. O antígeno de FML foi descrito
em 1989; isolado de promastigotas de L. donovani, esta fração glicoprotéica contém fucose
e manose e trata-se de um complexo que inibe fortemente a penetração de promastigotas e
amastigotas em macrófagos murinos in vitro de forma espécie-específica (Palatnik et al.,
1994a; Da Silva et al., 2001; Palatnik et al., 1989; Palatnik et al., 1993). O FML está
presente na superfície da Leishmania durante todo seu ciclo e é comum a todas as espécies
do complexo Donovani, ou seja, é específico para as espécies que causam LV.
Os primeiros estudos buscando avaliar o potencial protetor do FML como vacina,
em associação ao adjuvante saponina, foram testados em camundongos Balb/c, Swiss e
hamsters (Santos et al., 1999; Palatnik et al., 1994a; Palatnik et al., 1994b). Resultados
obtidos nestes estudos mostraram um aumento de anticorpos anti-FML, proliferação de
MOREIRA, N.D Introdução
7
esplenócitos in vitro e uma redução da carga parasitária no fígado e baço em todos os
modelos avaliados, sendo que em hamster a redução da carga parasitária no fígado e no
baço foi de 90% (Palatnik et al., 1994a). Estes estudos estimularam a realização de ensaios
de fase III para verificar a eficácia da vacina LEISHMUNE
®
, sendo iniciados em 1996 em
uma área endêmica de São Gonçalo do Amaranto - RN. Após dois anos do estudo, foi
observado que 33% dos animais controle desenvolveram sinais clínicos da doença,
enquanto apenas 8% dos cães vacinados mostraram sinais moderados da enfermidade sem
nenhum registro de óbito neste grupo. Esses resultados demonstraram 92% de proteção
contra a LVC no grupo vacinado, o que correspondeu a 76% de eficácia vacinal (Da Silva
et al., 2001).
Apesar dos importantes resultados obtidos pela avaliação da LEISHMUNE
®
, o
Ministério da Saúde não preconiza o uso desta vacina como medida de controle da LV no
Brasil, pois considera que ainda não há evidências científicas sobre sua utilização. O
posicionamento do Ministério da Saúde está baseado na falta de comprovação da
prevenção da infecção e infectividade do cão vacinado para o vetor, na impossibilidade de
diferenciar a infecção natural da vacinação, dificultando assim, as ações de vigilância e
controle do Programa de Vigilância e Controle da LV e na incerteza da real capacidade em
se reduzir casos humanos em áreas endêmicas para LV (Ministério da Saúde, 2005;
Ministério da Saúde 2003). Desta forma, o Ministério da Saúde reforça a não indicação da
vacinação animal com a LEISHMUNE
®
para o controle da LV assim como mantém a
indicação de eutanásia de animais sororreagentes, mesmo vacinados, que porventura sejam
encontrados nas áreas de transmissão por inquéritos soroepidemiológicos caninos
(Ministério da Saúde, 2005).
Recentemente, nosso grupo de pesquisa tem avaliado outras vacinas sendo uma
composta por antígenos Leishmania (Viannia) braziliensis associada à saponina (LBSap) e
MOREIRA, N.D Introdução
8
a outra apresentando a mesma composição vacinal acrescida de extrato salivar de glândula
de Lu. longipalpis (LBSapSal) (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al.,
2008). Estas vacinas têm demonstrado forte imunogenicidade em cães, tanto no âmbito da
resposta celular quanto humoral, sendo atualmente consideradas como fortes candidatos
vacinais contra LVC (Giunchetti, 2007; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008).
Estudos realizados por Giunchetti et al. (2007) mostraram que a LBSap induz intensa
reação imunogênica, caracterizada por elevados níveis de anticorpos IgG total e das
subclasses (IgG1 e IgG2) anti-Leishmania, expansão de linfócitos TCD8
+
circulantes bem
como aumento de linfócitos TCD8
+
antígeno-específicos, além de uma intensa atividade
linfoproliferativa e elevada produção de óxido nítrico (NO) in vitro.
1.2 - Adjuvantes vacinais
Na era da vacinologia moderna, que passou a empregar vacinas de segunda e
terceira geração, surge a necessidade de adjuvantes que proporcionem maior poder de
imunogenicidade/antigenicidade e proteção (Wack et al., 2007). Um imunomodulador é
qualquer material ou substância que altere o tipo, a velocidade, a intensidade ou a duração
da resposta imune (Dzierzbicka et al., 2006; Petrovsky et al., 2004). Os adjuvantes
exercem importante eficácia nas vacinas à medida que os antígenos tornam-se mais
purificados.
A palavra adjuvante é derivada do latim adjuvare que significa ajudar. Gaston
Ramon, veterinário francês, descobriu durante a década de 20, que combinar o toxóide do
tétano ou o toxóide da difteria com uma variedade de substâncias (inclusive tapioca,
lecitina, óleo, saponina ou até mesmo farelo de pão) aumentava a resposta das antitoxinas
(anticorpos) em magnitude e duração. De acordo com Vogel (1998) adjuvante é qualquer
substância que quando incorporada a uma formulação, age geralmente para acelerar,
prolongar ou realçar a qualidade da resposta imune ao antígeno vacinal. O uso de
MOREIRA, N.D Introdução
9
adjuvantes pode ser explicado devido a uma série de fatores: aumentar a imunogenicidade
de antígenos recombinantes e altamente purificados; reduzir a quantidade de antígenos ou
o número de imunizações necessárias; melhorar a entrega de antígenos às células
apresentadoras, assim como processamento e apresentação para APCs e induzir a produção
de citocinas imunomodulatórias (Vogel, 1998).
O antígeno, a espécie animal a ser vacinada, a via de administração e a
probabilidade de efeitos colaterais são características que estão envolvidas na seleção de
adjuvantes (Byars, 1990). Um adjuvante ideal deveria ser estável, ter meia vida longa,
biodegradável, barato, inócuo, promover e ativar o sistema imune celular ou humoral,
dependendo do requerimento para proteção (Edelman, 1980). A redução da toxicidade
permanece como principal desafio na busca de adjuvantes (Edelman, 1980). Muitos efeitos
adversos são relatados em função do uso de adjuvantes tais quais reações locais, que
incluem: dor, inflamação, inchaço, necrose no sítio de injeção, linfadenopatia, granulomas,
úlceras e geração de abscessos e reações sistêmicas (náuseas, febre, uveíte, eosinofilia
alergia, anafilaxia, toxicidade específica e imunotoxicidade) (Kensil, 1996).
Até recentemente os únicos adjuvantes aprovados para uso eram os sais de alumínio
em humanos e os sais de alumínio e óleos na medicina veterinária. Embora estes
adjuvantes sejam considerados bons estimuladores da produção de anticorpos, são,
entretanto, fracos estimuladores da resposta mediada por células (Men et al., 1996).
Neste sentido, a saponina vem sendo empregada como adjuvante na tentativa de se
induzir forte resposta celular. É importante ressaltar que a saponina faz parte de um grupo
de esteróis glicosídeos ou triterpenóides encontrados em plantas selvagens ou cultivados
empregando-se pequenos animais marinhos ou algumas bactérias (Yoshiki et al., 1998;
Skene et al., 2006). As saponinas contêm um núcleo hidrofóbico de estrutura triterpenóide
ligado a uma cadeia de carboidrato (Kensil, 1996; Allison et al., 1991). Experimentos
MOREIRA, N.D Introdução
10
demonstrando as propriedades fisiológicas, imunológicas e farmacológicas das saponinas
têm promovido consideravelmente o interesse clínico por estas substâncias (Francis et al.,
2002). As saponinas têm habilidade para modular a resposta imune mediada por células
assim como realçar a produção de anticorpos (Oda et al., 2000), bem como estimular a
resposta imune ao antígeno promovendo o aumento na síntese de IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10
(Cox & Couter, 1997). A saponina é estimuladora de linfócitos B in vitro, e in vivo existem
evidências de seu efeito imunoestimulador inespecífico. Quanto a seu modo de ação, Bar et
al. (1998) descreveram que a saponina poderia ter a capacidade de liberar o imunógeno
para as células efetoras, geralmente via APCs, favorecendo a indução de resposta T
citotóxica. Além disto, são capazes de promover maior retenção do antígeno no local do
inóculo e apresentam uma grande capacidade inflamatória (Scott et al., 1985).
1.3 - Modelos experimentais na leishmaniose visceral e em vacinas contra LV e LVC
Vários modelos experimentais têm sido utilizados no estudo da LV, dentre eles
destacam-se: cães, camundongos e hamsters (Hommel et al., 1995; Garg & Dube, 2006). O
progresso no conhecimento da LVC poderia ajudar a controlar a doença em humanos
(Reis, 2001; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c; Giunchetti et al., 2008c).
Neste sentido, infecções experimentais em cães têm sido realizadas desde o começo do
século XX quando o papel do cão como reservatório foi sugerido por Nicolle & Comte
(1908). Considerando o fato que a LV humana e canina compartilham sintomas/sinais
clínicos similares, os cães representam um apropriado modelo experimental para LV
humana (Genaro, 1993; Moreno & Alvar, 2002; Alvar et al., 2004; Reis et al., 2006; Reis
et al, 2008). Certamente, diversos relatos com leishmaniose canina experimental têm
ocorrido demonstrando a utilidade deste modelo para a determinação de vários de
parâmetros imunológicos e clínicos causados pela infecção com L. infantum (Abranches et
MOREIRA, N.D Introdução
11
al., 1991; Pinelli et al., 1994). Entretanto, o alto custo de manutenção de uma colônia de
cães, associado à falta de marcadores imunológicos e reagentes para este modelo, limita
seu uso, dificultando o progresso da imunologia canina em detrimento dos estudos em
humanos e camundongos (Moreno & Alvar, 2002). Mais recentemente o uso de cães
naturalmente infectados com L. chagasi/L. infantum vem ampliando o emprego deste
modelo em estudos relacionados às abordagens imunológicas e imunopatológicas (Reis,
2001; Reis et al., 2006a, Reis et al., 2006b, Reis et al., 2006c; Lage et al., 2007;
Giunchetti, 2004; Giunchetti et al., 2006; Giunchetti et al., 2008a, Giunchetti et al., 2008b;
Reis et al., 2008).
Camundongos infectados com L. donovani têm sido amplamente estudados, mas
não reproduzem as características da LV humana ativa. Neste modelo experimental
observa-se geralmente um aumento inicial na carga parasitária, seguido por auto-resolução
do parasitismo tecidual em um período de quatro a oito semanas, possivelmente, devido a
uma resposta do tipo 1 que é montada após o inóculo experimental, mediada por uma
produção de IFN-γ pelas células T esplênicas (Murray et al., 1982) e previamente
estimuladas por uma produção elevada de IL-12 (Murray, 1997). A geração de óxido
nítrico sintase induzida (iNOS) por IFN-γ é um mecanismo efetor crítico envolvido no
controle da replicação do parasito (Green et al., 1990; Stenger et al.,1994). Sendo assim, o
modelo murino de infecção por L. donovani é considerado um bom modelo de replicação
inicial do parasito, seguido por controle imunológico e infecção subclínica, mas não é um
bom modelo para a progressão da doença capaz de reproduzir a história natural da LV
ativa e suas formas clínicas.
O hamster (Mesocricetus auratus) é considerado um bom modelo experimental
para o estudo da LV, embora apresente limitado uso pela falta de reagentes disponíveis
para estudos imunológicos (Melby et al., 1998). Sua utilização é decorrente da descoberta
MOREIRA, N.D Introdução
12
da susceptibilidade à infecção por L. donovani, fato observado inicialmente por Yong et al.
(1919). Um estudo sistematizado do hamster em relação a outros animais foi publicado em
1958 por Stauber. Neste estudo, o hamster foi considerado, ao lado do chinchila (Chinchila
laniger), como extremamente susceptível à infecção por Leishmania, ao contrário de ratos
brancos e coelhos, que são resistentes a infecção (Stauber et al., 1958).
Em contraste ao modelo camundongo, o hamster apresenta características clínico-
patológicas da LV que imita a doença humana ativa. A infecção sistêmica do hamster com
L. donovani resulta em aumento na carga parasitária tecidual (baço e fígado), caquexia,
hepatoesplenomegalia, pancitopenia, hipergamaglobulinemia e conseqüente morte
(Pearson et al., 1996). Estudos realizados por Melby et al. (2001) mostraram aumento da
carga parasitária em órgãos viscerais de hamsters após infecção com promastigotas de L.
donovani. Embora detectada uma forte expressão de citocinas Th1 (IL-2 e IFN-γ) no
fígado, baço e medula óssea, a replicação de parasitos nestes sítios levaram a uma doença
progressiva, onde não foi detectada expressão de mRNA para iNOS. Além disto, foi
observada produção substancial de TGF-β e IL-10, que possivelmente estão agindo na
inibição dos macrófagos na geração de NO, possibilitando a evolução da doença neste
modelo experimental (Melby et al., 2001).
Desta forma, estudos avaliando a cinética histopatológica na pele de hamsters
infectados por L. donovani foram importantes para a melhor compreensão da celularidade
nos eventos iniciais da infecção. Neste sentido, Wilson et al. (1987) observaram que a
inoculação de promastigotas de L. donovani em hamster por via intradérmica, proporciona
a ocorrência de um infiltrado inflamatório caracterizado por presença de fagócitos
mononucleares e polimorfonucleares após 24 horas do inóculo, com uma modificação 48
horas após o inóculo, passando a observar então predomínio de células mononucleares
(Wilson et al., 1987). A formação do granuloma é observada entre a quarta e sexta
MOREIRA, N.D Introdução
13
semanas após a infecção, com predomínio de células gigantes, células epitelióides,
eosinófilos e parasitos no interior de macrófagos levando a ocorrência de necrose (Wilson
et al., 1987). Este perfil do infiltrado inflamatório dérmico seria compatível com a
multiplicação de L. donovani no local do inóculo, com subseqüente visceralização do
parasito e evolução da doença no modelo hamster.
1.4 - Aspectos Gerais da Inflamação e Recrutamento Celular
A inflamação é uma reação local dos tecidos vascularizados agredidos, sendo
caracterizada por alterações do sistema vascular, dos componentes líquidos e celulares,
bem como por adaptações do tecido conjuntivo vizinho. Constitui um mecanismo de
defesa local, exclusivo de tecidos mesenquimais lesados. As modificações morfofuncionais
do tecido inflamado visam destruir, diluir ou isolar o agente lesivo, sendo, portanto, uma
reação de defesa e de reparação do dano tecidual (Montenegro & Fecchio, 1999). Os
elementos sanguíneos envolvidos nesta resposta inflamatória são os neutrófilos, monócitos,
eosinófilos, linfócitos, basófilos e plaquetas, ao passo que no tecido conjuntivo podemos
encontrar os mastócitos, fibroblastos e macrófagos residentes.
É importante ressaltar que o processo de exsudação celular em direção do tecido
inflamado envolve aumento dos níveis de TNF-α, que estimula a expressão sequencial de
diferentes moléculas de adesão no endotélio, envolvidas no recrutamento de leucócitos do
sangue para o espaço intersticial. É um processo que envolve uma seqüência de etapas
orquestradas por moléculas de adesão, fatores de ativação e quimiocinas (Piccio et al.,
2002). O recrutamento de leucócitos circulantes envolve todos os eventos que mobilizam a
saída destas células para o tecido inflamado. As etapas da migração celular ocorrem
geralmente nas vênulas pós-capilares e consistem de um contato inicial com a parede do
vaso, rolamento ao longo do endotélio, seguido de firme adesão e migração transendotelial
MOREIRA, N.D Introdução
14
(Piccio et al., 2002). De acordo com Ley (2001) o bloqueio de qualquer um dos passos
envolvidos, interromperia o processo de extravasamento e impediria o recrutamento de
leucócitos para interagir em tecidos circundantes.
O início e a manutenção da inflamação dependem de diversas famílias de
moléculas, tais como prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, aminas vasoativas,
citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas. Estas moléculas agem sobre o endotélio,
tornando-o permissivo à migração de células inflamatórias (Springer, 1995).
Durante o processo inflamatório ocorre influxo de células, acúmulo de mediadores
inflamatórios, como as citocinas, e aumento na deposição da matriz extracelular. Citocinas
regulam tanto a iniciação quanto a manutenção ou resolução da resposta imune
inflamatória (Homey et al., 2006).
A dinâmica do processo inflamatório envolve em um primeiro momento, a exemplo
da infecção aguda por diferentes patógenos, um rápido recrutamento de neutrófilos que são
estimulados a migrarem para o local de inflamação, participando desta maneira do influxo
inicial de leucócitos. A migração inicial de neutrófilos para os diferentes tecidos durante o
processo inicial de infecção os torna ideais para controlar o recrutamento de outros tipos
celulares in situ, tais como células T, monócitos, macrófagos e células dendríticas imaturas
(Van Gisbergen et al., 2005). Mais tarde, monócitos/macrófagos substituem a população
dominante de neutrófilos, sugerindo um padrão de recrutamento bimodal envolvendo a
troca de neutrófilos por monócitos/macrófagos (Ryan et al., 1997). Os monócitos
recrutados para o local lesado transformam-se em macrófagos fagocíticos, população de
células predominante na fase mais tardia da infecção (Li et al., 2007).
Outros autores sugerem a participação de neutrófilos na polarização da resposta
tipo 1. Embora produzam IL-12 e possam migrar em direção as células T nos linfonodos,
essa interação é ineficiente. Todavia, a comunicação de neutrófilos com células
MOREIRA, N.D Introdução
15
dendríticas, que potencialmente interagem com células T, poderia direcionar para essa
resposta de maneira indireta, uma vez que algumas evidências indicam que antígenos
fagocitados e processados por neutrófilos são transferidos para células dendríticas para
apresentação para células T (Potter et al., 2001).
Estudos sobre o papel de neutrófilos no início da infecção por L. major
demonstraram expressão de mRNA para citocinas e quimiocinas Th1 em camundongos
resistentes, não sendo observado esse padrão em camundongos susceptíveis. Entretanto,
observou-se que a depleção de neutrófilos resultou em exacerbação das lesões em
camundongos BALB/c infectados por L. major, sugerindo a função protetora de neutrófilos
(Chen et al., 2005). Contrário a esses trabalhos existe uma outra linha de pesquisadores
que defendem o papel de neutrófilos através da sua manutenção no local da infecção, como
reservatórios para uma tardia liberação de Leishmania (Aga et al. 2002; Beil et al., 1992).
Desse modo, neutrófilos participariam do início da infecção, permitindo a sobrevivência
desses parasitos até a chegada de macrófagos, onde então seria fagocitados sem ativar os
mecanismos microbicidas, instalando desse modo a infecção (Aga et al. 2002).
Os macrófagos podem ser descritos como formas evolutivas dos monócitos
circulantes que migraram em direção aos tecidos. Seu papel relaciona-se a destruição dos
fatores etiológicos da inflamação ou complementam a função dos neutrófilos na resposta
aguda através da produção de citocinas (Parham, 2001). Entretanto, sua ação principal fica
evidente nas inflamações crônicas atuando como células apresentadoras de antígeno
(APCs) aos linfócitos T. Uma vez ativados, os macrófagos liberam uma variedade de
citocinas, que possuem funções importantes na imunidade inata e ao mesmo tempo na
preparação do cenário para o desenvolvimento da resposta imune adaptativa (Egan et al,
1996; Terui et al, 2000).
MOREIRA, N.D Introdução
16
Os eosinófilos são também recrutados para os sítios inflamatórios principalmente
em resposta a estímulos alérgicos do trato respiratório, trato gastrintestinal e pele e,
geralmente estão relacionados a infecções helmínticas (Terui et al., 2000). Em estudos
realizados por Paranhos et al. (1993) foi demonstrado que a inoculação intradérmica de
promastigotas de L. chagasi e lisados de glândula salivar em cães induziram
significativamente eosinofilia em relação aos cães inoculados apenas com L. chagasi ou
lisado de glândula salivar.
É importante ressaltar que entre as células que participam do processo que envolve
a resistência a infecção por Leishmania, estão os linfócitos T CD4
+
, além dos linfócitos T
CD8
+
que são requeridos durante o controle primário da infecção por L. major na pele
(Belkaid et al., 2002). Embora seja descrito que a principal função protetora dessas células
seria a liberação de IFN-γ
no sítio da infecção, elas poderiam também participar na citólise
das células infectadas no local (Tsagozis et al., 2003).
Visto que a imunidade contra agentes infecciosos requer a ação coordenada entre
componentes da imunidade inata e adaptativa, o estudo do recrutamento celular torna-se
relevante no âmbito da avaliação de antígenos vacinais e sua conecção com o
desenvolvimento da resposta imune adquirida pós-vacinal.
1.5 - Óxido Nítrico e a expressão de iNOS
Considerando a pele como um órgão extremamente susceptível a infecções, a
produção de NO neste local parece ser um elemento chave particularmente no controle in
situ de patógenos intracelulares (Bogdan, 2001). A síntese de NO na pele é responsável por
um papel chave na modulação da resposta a estímulos externos tais como calor, raios
ultravioletas, resposta a infecção e cicatrização, bem como no desenvolvimento de certas
condições patológicas (Cals-Grierson & Ormerod, 2004).
MOREIRA, N.D Introdução
17
O NO é uma molécula gasosa simples, habitualmente encontrada no ar atmosférico
em pequenas quantidades, tóxica devido à presença de radical livre que a torna um agente
químico altamente reativo (Snyder & Bredt, 1992). A síntese de NO resulta da oxidação de
um dos dois nitrogênios guanidino do L-arginina, que é convertida em L-citrulina, sendo
catalizada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) (Moncada, 1991; Marletta, 1993).
Existem três isoformas da enzima NOS sendo duas constitutivas, a eNOS (NOS
endotelial) e nNOS (NOS neuronal) e uma isoforma induzível, a iNOS (NOS induzível),
que é expressa em macrófagos, neutrófilos, fibroblastos, músculo liso vascular e células
endoteliais. Sua ativação é independente de cálcio e é regulada por ativação transcricional
em resposta a citocinas (IFN-γ, TNF-α e/ou IL-1) bem como por lipopolissacarídio (LPS)
(Heba et al., 2001; Stuehr et al., 1991). Dependendo da citocina, do estímulo microbiano e
do tipo celular, diferentes caminhos de sinalização poderiam promover ou inibir a
expressão de iNOS (Kristof et al., 2001). A regulação e ativação da NOS constitutiva
(eNOS e nNOS) é dependente da concentração de cálcio e da ligação cálcio calmodulina
(Marletta, 1994).
O NO está envolvido em numerosos processos homeostáticos como regulação do
tônus vascular, modulação da citotoxidade por macrófagos ativados, regulação da
proliferação celular, regulação da migração celular, ativação de fatores de transcrição,
indução de genes sítio protetores, modulação da produção de citocinas tóxicas e
neurotransmissão no sistema nervoso central e periférico (Nathan et al., 1992; Kendall et
al., 2001). O NO também atua na resposta de defesa contra fungos, bactérias, protozoários,
bem como células tumorais. Essa molécula pode causar dano ao DNA e morte celular via
apoptose, induzindo fragmentação do DNA (Moncada et al., 2002). O NO também age
diminuindo a agregação e aderência de plaquetas e serve como regulador do recrutamento
de leucócitos. O bloqueio da produção de NO sob condições normais provoca rolagem e
MOREIRA, N.D Introdução
18
aderência de leucócitos nas vênulas pós-capilares e a administração de NO exógeno reduz
o recrutamento de leucócitos em processos inflamatórios agudos. Neste sentido, a
produção excessiva de NO por neurônios específicos seria um mecanismo endógeno
compensatório que reduziria o recrutamento de leucócitos nas respostas inflamatórias
(Assreuy et al., 1993). Segundo Salvemini et al. (1996) o NO mostra-se como um potente
vasodilatador e seu envolvimento na resposta inflamatória pode ter relação com sua
habilidade em aumentar a permeabilidade vascular e o edema através de mudanças no
fluxo sangüíneo local e no aumento da produção de prostaglandinas pró-inflamatórias.
A síntese de NO tem sido observada em macrófagos, neutrófilos, linfócitos T
helper, fibroblastos, células epiteliais, osteoclastos, osteoblastos, condrócitos, células
endoteliais, células de Langerhans e, recentemente, em mastócitos (Flora Filho et al.,
2000), podendo ter vários efeitos, dependendo do tipo de célula que o produz, do sítio de
liberação e da concentração produzida (Moncada et al., 1993). As funções do NO até hoje
descobertas são complexas e antagônicas, podendo ser benéfica ou potencialmente tóxica
conforme a concentração ou depuração tecidual (Bogdan, 2001).
Considerando a importância do NO como mecanismo de controle de patógenos
intracelulares, aliado ao fato de ser induzido por citocinas chaves que auxiliam na
manutenção do microambiente de uma resposta do tipo 1, a exemplo do IFN-γ, a avaliação
deste mediador na forma da iNOS torna-se altamente relevante para se predizer o potencial
imunoprotetor in locu. Neste sentido, o perfil de expressão da iNOS poderia indicar a
capacidade de diferentes estímulos teciduais em induzir uma resposta imune tipo 1,
importante para imunobiológicos candidatos a vacinas contra patógenos intracelulares.
É importante ressaltar que a utilização da saponina como adjuvante, bem como do
candidato vacinal LBSap, apesar de terem sido considerados seguros para administração
em cães, demonstraram uma capacidade indutora de alterações no local do inóculo, como a
MOREIRA, N.D Introdução
19
presença de edema e/ou nódulos não ulcerados circunscritos (Giunchetti, 2007; Giunchetti
et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c). Desta maneira, novos estudos buscando o
estabelecimento e a avaliação de biomarcadores adicionais relacionados à segurança
(inocuidade) do imunobiológico são importantes para a validação da utilização da saponina
como adjuvante e da vacina LBSap.
Neste sentido, considerando o importante papel do hamster (Mesocricetus auratus)
como modelo experimental para LV (Garg and Dube, 2006) devido à fácil manipulação,
acondicionamento e baixo custo, propomos no presente trabalho avaliar os eventos
relacionados à cinética da migração celular, as alterações histopatológicas e a participação
do óxido nítrico sérico e da iNOS desencadeados pelas vacinas LBSap e LEISHMUNE
®
,
pelo adjuvante saponina isoladamente e pelo antígeno vacinal de L. braziliensis, visando
uma melhor compreensão dos eventos imunológicos induzidos por estes imunobiológicos
após a inoculação intradérmica. Neste sentido, a avaliação de estudos pré-clínicos
buscando a análise de biomarcadores para avaliação de candidatos vacinais consiste em
uma importante etapa para o controle de qualidade que deve nortear o desenvolvimento e
os testes de imunobiológicos com alcance em ensaios clínicos vacinais de campo
(Sesardic, 2006).
2. JUSTIFICATIVA
MOREIRA, N.D. Justificativa
21
O processo de expansão geográfica e urbanização da LV no Brasil chamam a
atenção para a necessidade de aprimoramento de medidas mais eficazes de controle e
profilaxia. As atuais medidas de controle da LV preconizam o tratamento dos casos
humanos, combate ao vetor e eutanásia dos cães com LV. No entanto, a dificuldade de se
realizar a eutanásia nestes animais, associada ao tratamento da LVC nos centros urbanos,
põe em risco os programas de controle da LV, e a saúde da população humana. Neste
contexto, considerando que a quimioterapia na LVC ainda não proporciona cura
parasitológica, o desenvolvimento de vacinas anti-LVC seria a melhor alternativa para os
programas de controle da LV. Também, considerando a importância da imunoprofilaxia
contra LVC, surge a necessidade de novas metodologias que incremente a avaliação de
candidatos vacinais, na triagem de imunobiológicos que sejam efetivos contra o agente
etiológico da LV. Além disto, até o momento, não havia estudos que buscassem o
entendimento de eventos celulares no local do inóculo dos antígenos vacinais. Tais eventos
são importantes no entendimento de mecanismos imunomodulatórios pós-vacinais que
direcionam a resposta imune e coordenam a imunogenicidade das vacinas, além de serem
fundamentais nas avaliações das alterações locais advindas do processo vacinal. Neste
contexto, no presente estudo foi avaliada a cinética da migração celular, um dos principais
eventos que caracterizam o processo inflamatório induzido pelo inóculo de antígenos e
adjuvantes de duas vacinas (LEISHMUNE
®
e LBSap).
3. OBJETIVOS
MOREIRA, N.D. Objetivos
23
3.1 - Objetivo Geral
¾ Avaliar a cinética da migração celular e os níveis de óxido nítrico após inóculo de
duas vacinas anti-LVC: LEISHMUNE
®
e LBSap bem como do adjuvante saponina
e do antígeno vacinal de L. braziliensis isoladamente nos tempos de 1, 12, 24, 48,
96 e 168 horas.
3.2 - Objetivos Específicos
Avaliar inóculos intradérmicos em hamsters inoculados com as vacinas LEISHMUNE
®
e LBSap, bem como por seus diferentes componentes vacinais nos tempos de 1, 12, 24, 48,
96 e 168 horas, considerando os parâmetros abaixo listados:
¾ Quantificar o percentual das populações de polimorfonucleares (neutrófilos e
eosinófilos) e de mononucleares (linfócitos e monócitos) em esfregaços sanguíneos
e em cortes histológicos da derme;
¾ Quantificar os níveis séricos de óxido nítrico;
¾ Quantificar a intensidade da reação inflamatória em cortes histológicos da derme;
¾ Quantificar a expressão da enzima iNOS no infiltrado inflamatório da derme.
4. MATERIAL E MÉTODOS
MOREIRA, N.D. Material e Métodos
25
4.1- Animais
No presente trabalho foi traçado um delineamento experimental utilizando 120
hamsters sírios dourados (Mesocricetus auratus), sendo 72 machos e 48 fêmeas com um
peso corporal médio de 120 gramas e idade de oito semanas. Os animais foram gentilmente
cedidos pelo biotério de criação de animais de experimentação do Instituto de Pesquisas
René Rachou-/FIOCRUZ/MG e mantidos no Biotério de experimentação da Universidade
Federal de Ouro Preto durante a realização dos experimentos. Os animais foram mantidos
em temperatura entre 21 a 24°C, e alojados em gaiolas apropriadas para esta espécie,
forradas com serragem sendo oferecidos água e ração comercial ad libitum diariamente. A
Figura 01 ilustra, de forma esquemática, o delineamento experimental utilizado neste
trabalho.
Figura 1 - Delineamento experimental
(*) Hamsters por tempo (horas): n = 4
120 hamsters Mesocricetus auratus
LB
n=24
SALINA
n=24
SAPONINA
n=24
LBSap
n=24
LEISHMUNE
®
n=24
Punção Intracardíaca
Esfregaço
Contagem Diferencial
NO Sérico
Pele
Necropsia
Histopatologia
(HE)
PMN
Neutrófilo
Eosinófilo
Mononucleares
Linfócito e
Monócito
1 12 24 48 96 168
Horas
*
Imuno-
histoquímica
(iNOS)
Contagem
Diferencial
120 hamsters Mesocricetus auratus
LB
n=24
SALINA
n=24
SAPONINA
n=24
LBSap
n=24
LEISHMUNE
®
n=24
Punção Intracardíaca
Esfregaço
Contagem Diferencial
NO Sérico
Pele
Necropsia
Histopatologia
(HE)
PMN
Neutrófilo
Eosinófilo
Mononucleares
Linfócito e
Monócito
1 12 24 48 96 168
Horas
*
Imuno-
histoquímica
(iNOS)
Contagem
Diferencial
MOREIRA, N.D. Material e Métodos
26
4.2 - Grupos experimentais
Os animais foram subdivididos em cinco grupos experimentais:
(i) GRUPO SALINA - Animais que receberam inóculo de solução salina estéril
0,85% (diluente dos componentes vacinais e adjuvantes);
(ii) GRUPO SAPONINA - Animais que receberam inóculo de 100 µg do adjuvante
saponina (Sigma Chemical Co., St. Louis, U.S.A.);
(iii) GRUPO LB - Animais que receberam inóculo composto de 60 µg do antígeno
vacinal de L. braziliensis;
(iv) GRUPO LBSap - Animais que receberam 60 µg de antígeno de L. braziliensis
(LB) associado a 100 µg de saponina;
(v) GRUPO LEISHMUNE
®
- A LEISHMUNE
®
foi reconstituída em 2 mL com
solução salina estéril 0,85% e inoculada nos animais na quantidade de 200 µL contendo
150 µg de antígeno FML associado a 100 µg de saponina.
É importante ressaltar que os diferentes inóculos foram diluídos em solução salina
estéril 0,85% e aplicados nos diferentes grupos um volume total de 200 µL.
4.3 - Antígenos vacinais e aplicação dos inóculos
Foram avaliados os tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas pós inóculo para cada
estímulo avaliado (Figura 1). Para melhor compreensão dos resultados foi denominado de
período precoce os tempos de 1, 12 e 24 horas e de período tardio os tempos de 48, 96 e
168 horas, durante os diferentes períodos avaliados.
Foi usado o imunobiológico preparado a partir de antígeno de L. braziliensis (cepa
padrão – MHOM/BR/75/M2903) acrescido do adjuvante saponina, recentemente
patenteado pela UFOP em parceria com o Instituto René Rachou/FIOCRUZ/MG
(PI0601225-6, 17 de Fevereiro de 2006).
MOREIRA, N.D. Material e Métodos
27
Também foi usada a vacina FML, de nome comercial LEISHMUNE
®
,
desenvolvida pela Dr
a
Clarissa Palatnik e colaboradores da UFRJ e atualmente
comercializada pela Fort Dodge (Campinas- SP/ Brasil). A vacina foi gentilmente cedida
pela Fort Dodge para o desenvolvimento deste trabalho.
Os antígenos foram inoculados na região abdominal dos hamsters. Os inóculos
foram realizados através de injeções intradérmicas e após o procedimento, o local do
inóculo foi demarcado com caneta (Sigma) para delimitar a área de biópsia.
4.4 - Coleta das amostras
Previamente ao procedimento da necrópsia dos animais para obtenção dos
fragmentos de tecidos, foi coletado sangue por punção intracardíaca com seringas plásticas
estéreis, descartáveis de 1 mL. A coleta foi realizada após administração de anestésico
(tiopental sódico) na dose de 30 mg/kg via intraperitoneal. Foi coletado um volume
aproximado de 1ml de sangue sendo que uma pequena alíquota foi retirada para a
realização dos esfregaços para contagem diferencial das populações de polimorfonucleares
(neutrófilos e eosinófilos) e mononucleares (monócitos e linfócitos) e o restante então
transferido para eppendorf de 1,5 mL (Hamburgo, Alemanha). O sangue foi então
centrifugado a 1.500 rpm e o soro separado. As amostras foram devidamente identificadas
e estocadas a -70°C até o processamento para avaliação dos níveis de NO sérico.
4.5 - Necropsia dos animais e obtenção do material biológico
Os hamsters submetidos aos diferentes inóculos foram necropsiados nos tempos de
1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas após eutanásia com tiopental sódico. Confirmada a morte, os
animais foram colocados em decúbito dorsal e a cavidade abdominal aberta com auxílio de
uma tesoura cirúrgica. Fragmentos de pele da área inoculada com os antígenos e salina e
fragmentos de pele da área sem nenhum estímulo, foram coletados e em seguida fixados
MOREIRA, N.D. Material e Métodos
28
em formol a 10% tamponado (pH 7,2). Fragmentos foram também retirados e embebidos
em OCT (Optimal Cutting Temperature Médium, Tissue Tek Leica Microsystem Nussloch
Gmbh Wehrheim, Germany) e armazenados no -70ºC para realização de trabalhos futuros.
4.6 - Processamento histológico dos tecidos e colorações empregadas
Fragmentos de pele submetidos aos diferentes inóculos e fragmentos não
submetidos ao inóculo e fixados em formol 10% tamponado pH 7,2 foram processados
rotineiramente e embebidos em parafina. Sobre lâminas de vidro, previamente
gelatinizadas, foram colocados cortes histológicos com espessura de cinco µm. Estes
procedimentos operacionais são padrões do laboratório de Imunopatologia do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB/UFOP), seguindo as normas de controle de
qualidade do laboratório.
Das duas lâminas obtidas, a primeira foi corada pelo método de Hematoxilina-
Eosina (HE) para análise rotineira das alterações histopatológicas e a segunda, foi utilizada
para realização da reação imuno-histoquímica para detecção da expressão de iNOS.
4.7 - Imuno-histoquímica para a detecção da expressão de iNOS
Os cortes histológicos da pele, obtidos por microtomia foram inicialmente
desparafinizados em duas lavagens de xilol (15 minutos cada) e hidratados em
concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) e finalmente em água corrente
por cinco minutos. Posteriormente, foram mergulhados em uma solução de peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) a 4% em metanol por 30 minutos para o bloqueio da peroxidase
endógena. Seguiram-se três lavagens em PBS (cinco minutos cada). A recuperação
antigênica foi feita utilizando 15 mL de uma solução recuperadora antigênica (Antigen
Unmasking Solution: H-3300; Vector Laboratories Inc; Burlingame, CA, USA) diluída em
1,6 L de água. As secções foram então colocadas em uma panela de pressão de microondas
MOREIRA, N.D. Material e Métodos
29
imersas na solução e levadas ao forno de microondas por 13 minutos com a panela semi-
aberta e em seguida foram retiradas e com a panela fechada voltava para o forno por mais
10 minutos, com a intenção de promover a recuperação dos sítios antigênicos,
intensificando assim a marcação imuno-histoquímica. Após esta etapa, as lâminas foram
deixadas a temperatura ambiente, por 30 minutos, ainda imersas na solução seguido por
três lavagens em PBS (cinco minutos cada).
Para o bloqueio de sítios antigênicos inespecíficos foi utilizado o soro de cavalo
(Kit Vector RTU- Universal Elite ABC KIT, Burlingame, CA, USA) e em seguida
incubado em câmera úmida na estufa a 37°C por 30 minutos. Foi utilizado o anticorpo
primário policlonal IgG de coelho anti-iNOS (Rabbit anti-Mouse iNOS, SC-651, Santa
Cruz, CA, USA) na diluição 1:200, ficando as lâminas incubadas por 12 a 18 horas a 4ºC
em câmara úmida.
Após a incubação com o anticorpo primário as lâminas foram colocadas a
temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, ocorreram à lavagem em PBS,
procedendo três banhos de cinco minutos cada. As lâminas foram então incubadas com o
anticorpo biotinilado (Kit Vector RTU- Universal Elite ABC KIT, CA USA) por 30
minutos a 37ºC. Após a incubação com o anticorpo biotinilado (RTU- Universal Elite ABC
KIT, CA, USA) realizou-se a lavagem dos cortes com três banhos de PBS de cinco
minutos cada. Posteriormente ocorreu a incubação com o complexo ABC (Kit vector RTU-
Universal Elite ABC KIT, CA, USA) por 30 minutos a 37ºC. Após a incubação com o
complexo avidina-biotina, foi realizada a lavagem dos cortes em PBS, através de três
banhos de cinco minutos cada.
A reação foi revelada mergulhando-se os cortes em uma solução de DAB (50 mg
de Diaminobenzidina em 250 mL de PBS e 500 µL de Peróxido de Hidrogênio 30%)
durante 5 minutos a temperatura ambiente. Após a revelação, os cortes foram lavados em
MOREIRA, N.D. Material e Métodos
30
água corrente. Para realizar a contra-coloração, utilizou-se Hematoxilina de Harris por 10
segundos a temperatura ambiente, seguido pela lavagem dos cortes por 5 minutos em água
corrente. O material foi então desidratado em álcool absoluto e colocado para secar em
estufa a 56°C. As lâminas foram montadas com Entellan
(Merk
107961.0100 -
Darmstadt, Alemanha) e lamínula para a posterior avaliação. Estes procedimentos
operacionais são padrões do laboratório de imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas (NUPEB/UFOP), seguindo as normas do controle de qualidade deste
laboratório.
4.8 - Quantificação da inflamação na derme
As células inflamatórias presentes na derme foram quantificadas em 20 imagens
aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 10
6
µm
2
). As imagens visualizadas pela
objetiva de 40x foram digitalizadas através da microcâmera Leica DM5000B e do
programa Leica Application Suite (Versão 2.4.0 R1 Leica Microsystems-Switzerland Ltd).
Para a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica QWin V3 (Leica
Microsystems-Switzerland Ltd). A escolha pela análise em 20 imagens foi devido a um
estudo piloto no laboratório, onde foi demonstrado que esse número de campos era
suficiente para a obtenção de uma leitura representativa da lâmina inteira.
4.9 - Análise quantitativa da expressão de iNOS
Estudos morfométricos da expressão de iNOS foram realizados através da análise de
imagem (obtidas por uma microcâmera Leica DM5000B e analisadas pelo programa Leica
QWin V3) pela medida da área marcada para iNOS em 20 imagens aleatórias (área total
percorrida igual a 1,5 x 10
6
µm
2
) na derme. Todas as análises foram realizadas nas imagens
digitalizadas na objetiva de 40x.
MOREIRA, N.D. Material e Métodos
31
4.9.1 - Contagem Diferencial: leucócitos circulantes e células teciduais
A contagem diferencial de leucócitos circulantes foi realizada nos esfregaços
sangüíneos, corados por método panótico, e de células inflamatórias teciduais nos cortes
histológicos corados pela hematoxilina e eosina, sendo ambas examinadas em microscopia
óptica através de imersão em óleo utilizando a objetiva de 100X. Para a contagem das
populações celulares em lâmina foram avaliadas 100 células em campos aleatórios,
diferenciando-se os seguintes tipos celulares: polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos)
e mononucleares (monócitos e linfócitos), sendo encontrado, assim, o percentual de cada
tipo celular.
4.9.2 - Avaliação do perfil de Óxido Nítrico
A avaliação das concentrações de NO foi realizada pela medida de nitritos (NO
2
-
) e
nitratos (NO
3
-
) segundo o método de Green et al. (1982) nos soros de hamsters submetidos
aos diferentes inóculos.
As amostras foram descongeladas e alíquotas de 50 µL foram transferidas para
eppendorfs de 500 µL e diluídas em 50 µL de água destilada. Para a conversão de nitratos a
nitritos, foram adicionados às amostras 30 µL de um coquetel contendo 10 µL de FAD
(Sigma- Aldrich Co St. Louis, MO, USA), 10 µL de NADPH (Sigma- Aldrich Co St.
Louis, MO, USA) e 10 µL de Nitrato redutase (Sigma- Aldrich Co St. Louis, MO, USA) a
qual tem uma concentração de 1 U/mL (Sigma- Aldrich Co St. Louis, MO, USA). As
amostras foram incubadas 12 a 18 horas a 37ºC.
Após este período, foi realizada a desproteinização através da adição de 10 µL de
sulfato de zinco (ZnSO
4
) (Sigma- Aldrich Co St. Louis, MO, USA), seguido por cinco
minutos de centrifugação a 5.000 rpm. Após esta etapa, foram adicionadas as placas de 96
orifícios, 50 µL das amostras preparadas e 50µL do reagente de Griess, em duplicata, e
incubados em uma caixa de isopor a temperatura ambiente por 10 minutos. O reagente foi
MOREIRA, N.D. Material e Métodos
32
preparado na hora do uso, misturando partes iguais de duas soluções A e B na proporção
de 1:1. Sendo a solução A de Sulfanilamida 1% em H
3
PO
4
2,5% e a solução B de
Naftilenodiamino 0,7%.
Após a reação, foi determinada a absorbância a 540 nm em leitor de ELISA
(Molecular Devices, E Max, Berkeley, Califórnia, USA). Os resultados expressos em µM
foram determinados após a extrapolação de valores obtidos de uma curva padrão utilizando
nitrito de sódio (NaNO
2
) nas concentrações de 0,78 a 100 µM para cada placa.
4.10 - Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism 4.0 (Prism
Software, Irvine, CA, USA). Depois de demonstrada a normalidade dos dados usando o
teste Kolmogorov-Smirnoff, foi realizada análise de variância (ANOVA one-way) seguida
do teste de Tukey para determinar as diferenças específicas entre os grupos em relação ao
infiltrado celular na derme e contagem diferencial no sangue periférico. Além disto, foram
realizadas correlações entre leucócitos circulantes ou entre iNOS e infiltrado celular na
derme pela análise de correlação de Pearson. Em todas as análises estatísticas as diferenças
foram consideradas significativas quando o valor de P foi menor que 0,05.
5. RESULTADOS
MOREIRA, N.D. Resultados
34
5.1 - Perfis celulares de leucócitos no sangue periférico de hamsters inoculados com
diferentes antígenos vacinais
5.1.1 - Percentual de Neutrófilos
O Gráfico 1 ilustra o percentual de neutrófilos nos diferentes grupos experimentais,
obtido através da contagem diferencial nos esfregaços sangüíneos nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas após a sensibilização com os diferentes antígenos vacinais.
A análise dos dados demonstrou que os hamsters do grupo LEISHMUNE
®
(24,0±5,7) avaliados no tempo de 1 hora após o inóculo apresentaram redução significativa
no percentual de neutrófilos quando comparados aos animais do grupo LB (67,7±18,0).
Os animais do grupo SAPONINA (62,5±14,8), avaliados no tempo de 24 horas
após o inóculo, apresentaram aumento significativo em relação aos animais dos grupos
SALINA (35,3±8,3) e LB (36,8±8,7). Este aumento também foi demonstrado nos animais
dos grupos LB (46,0±8,2), LBSap (55,8±7,5) e LEISHMUNE
®
(50,8±2,1) no tempo de
168 horas, quando comparados aos animais do grupo SALINA (22,3±8,1).
A análise cinética do grupo SALINA (Gráfico 2) demonstrou redução significativa
no percentual de neutrófilos, no tempo de 168 horas (22,3±8,1) quando comparado aos
tempos de 1 (47,7±14,6) e 12 (51,0±2,6) horas após o inóculo. Nos tempos de 48
(53,7±13,6) e 96 (42,5±10,02) horas os animais do grupo LBSap apresentaram redução
significativa em relação ao tempo de 12 horas (69,0±12,5). Os animais do grupo
LEISHMUNE
®
, no tempo de 12 horas, apresentaram aumento significativo (70,3±11,4) no
percentual de neutrófilos quando comparado ao tempo de 1 hora (24,0±5,7). Ainda neste
grupo, verificou-se redução significativa nos tempos de 48 (35,0±7,1) e 96 (34,2±9,8)
horas quando comparados aos tempos de 12 (70,3±11,4) e 24 horas (57,3±6,1), seguido por
aumento significativo no tempo de 168 horas (50,8±2,1) em relação aos tempos de 1
MOREIRA, N.D. Resultados
35
(24,0±5,7) e 96 (34,2±9,8) horas, enquanto uma redução significativa foi observada em
relação ao tempo de 12 horas (70,3±11,4).
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Grupos
Percentual de Neutrófilos
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Grupos
Percentual de Neutrófilos
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
Gráfico 1: Percentual de neutrófilos no sangue periférico de hamsters inoculados com
diferentes estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )] nos tempos
de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média ± desvio
padrão. Diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas linhas.
MOREIRA, N.D. Resultados
36
Gráfico 2: Cinética do percentual de neutrófilos no sangue periférico de hamsters
submetidos a diferentes inóculos: [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L.
braziliensis; ); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )].
Os resultados estão expressos como média. Diferenças significativas (P<0,05) estão
representadas pelas letras a, b, c, d, e em relação aos tempos 1, 12, 24, 48, 96 horas,
respectivamente.
5.1.2 - Percentual de Eosinófilos
O Gráfico 3 mostra o percentual de eosinófilos nos diferentes grupos experimentais,
obtido através da contagem diferencial nos esfregaços sangüíneos nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas após a sensibilização com os diferentes antígenos vacinais.
Não foram observadas diferenças significativas no percentual de eosinófilos na
análise comparativa entre os grupos bem como entre os tempos (Gráfico 4).
a,b,e
0
50
100
1 12244896168
Tempo/Horas
a
a
b,c
b,c
b
b
a,b
Percentual de
Neutrófilos
a,b,e
0
50
100
1 12244896168
Tempo/Horas
a
a
b,c
b,c
b
b
a,b
Percentual de
Neutrófilos
MOREIRA, N.D. Resultados
37
Gráfico 3: Percentual de eosinófilos no sangue periférico de hamsters inoculados com
diferentes estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )] nos tempos
de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média ± desvio
padrão.
0
5
10
1h 12h 24h 48h 96h 168h
Tempo/Hora
Percentual de
Eosinófilos
0
5
10
1h 12h 24h 48h 96h 168h
Tempo/Hora
Percentual de
Eosinófilos
Gráfico 4: Cinética do percentual de eosinófilos no sangue periférico de hamsters
submetidos a diferentes inóculos: [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L.
braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )].
Os resultados estão expressos como média.
96h
12h
1h
48h
Grupos
0
2.5
5.0
0
2.5
5.0
0
2.5
5.0
0
2.5
5.0
24h
0
2.5
5.0
168h
0
2.5
5.0
Percentual de Eosinófilos
96h
12h
1h
48h
Grupos
0
2.5
5.0
0
2.5
5.0
0
2.5
5.0
0
2.5
5.0
0
2.5
5.0
0
2.5
5.0
24h
0
2.5
5.0
24h
0
2.5
5.0
168h
0
2.5
5.0
168h
0
2.5
5.0
Percentual de Eosinófilos
MOREIRA, N.D. Resultados
38
5.1.3 - Percentual de Monócitos
O Gráfico 5 mostra o percentual de monócitos nos diferentes grupos experimentais,
obtido através da contagem diferencial nos esfregaços sangüíneos nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas após a sensibilização com os diferentes antígenos vacinais.
Os animais dos grupos SAPONINA (4,0±1,4), LBSap (4,0±1,0) e LEISHMUNE
®
(2,5±1,3) no tempo de 12 horas apresentaram uma redução significativa no percentual de
monócitos quando comparado aos animais do grupo LB (7,3±0,6).
A análise cinética (Gráfico 6) demonstrou que no tempo de 12 horas (7,3±0,6) os
animais do grupo LB apresentaram aumento significativo no percentual de monócitos
quando comparado ao tempo de 1 hora (3,0±0,0). No tempo de 48 horas (6,7±2,1),
hamsters do grupo LBSap tiveram aumento significativo em relação ao tempo de 24 horas
(3,3±2,2).
MOREIRA, N.D. Resultados
39
Gráfico 5: Percentual de monócitos no sangue periférico de inoculados com diferentes
estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis; ); (LBSap
Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )] nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças
significativas (P<0,05) estão representadas pelas linhas.
0
5
10
1 12244896168
Tempo/Horas
a
c
Percentual de
Monócitos
0
5
10
1 12244896168
Tempo/Horas
a
c
Percentual de
Monócitos
Gráfico 6: Cinética do percentual de monócitos no sangue periférico de hamsters
submetidos a diferentes inóculos: [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L.
braziliensis; ); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )].
Os resultados estão expressos como média. Diferenças significativas (P<0,05) estão
representadas pelas letras a, c em relação aos tempos 1e 24 horas, respectivamente.
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Grupos
0
5
10
0
5
10
0
5
10
0
5
10
0
5
10
0
5
10
Percentual de Monócitos
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Grupos
0
5
10
0
5
10
0
5
10
0
5
10
0
5
10
0
5
10
Percentual de Monócitos
MOREIRA, N.D. Resultados
40
5.1.4 - Percentual de Linfócitos
O Gráfico 7 mostra o percentual de linfócitos nos diferentes grupos experimentais,
obtido através da contagem diferencial nos esfregaços sangüíneos nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas após a sensibilização com os diferentes antígenos vacinais.
Os animais do grupo LEISHMUNE
®
(70,5±6,4) no tempo de 1 hora apresentaram
aumento significativo no percentual de linfócitos quando comparados aos animais do
grupo LB (24,3±19,6). Os animais dos grupos SAPONINA (20,7±5,0) e LEISHMUNE
®
(22,8±11,2) 12 horas após o inóculo mostraram redução significativa no percentual de
linfócitos quando comparados aos animais do grupo SALINA (42,0±2,6). Este padrão de
redução se manteve nestes mesmos grupos no tempo de 24 horas e ainda houve um
aumento significativo de linfócitos no grupo imunizado com LB (52,5±6,1) quando
comparado ao grupo SAPONINA (28,8±10,3). Nos animais dos grupos LB (44,8±9,7),
LBSap (35,0±5,2) e LEISHMUNE
®
(42,3±3,3) observou-se redução significativa no
percentual de linfócitos no tempo de 168 horas quando comparados aos animais do grupo
SALINA (64,5±0,7).
A análise cinética (Gráfico 8) mostra que no tempo de 12 horas (20,7±5,0) animais
do grupo SAPONINA tiveram redução significativa no percentual de linfócitos em relação
ao tempo de 1 hora (40,0±12,5). No tempo de 96 horas (50,7±5,1) os animais deste mesmo
grupo apresentaram um aumento significativo em relação aos tempos de 12 (20,7±5,0) e 24
horas (28,8±10,3). Este grupo ainda mostrou no tempo de 168 horas um aumento
(46,5±4,2) significativo em relação ao tempo de 12 horas (20,7±5,0). Os animais do grupo
LBSap apresentaram aumento significativo no percentual de linfócitos no tempo de 96
horas (55,3±5,5) em relação ao de 12 horas (32,3±7,8). Nos tempos de 12 (22,8±11,2) e 24
MOREIRA, N.D. Resultados
41
horas (36,5±6,8) os animais do grupo LEISHMUNE
®
mostraram redução significativa
quando comparados ao tempo de 1 hora (70,5±6,4) enquanto que nos tempos de 48
(58,0±7,1) e 96 horas (60,0±7,8) verificou-se um aumento significativo se comparado aos
tempos de 12 (22,8±11,2) e 24 horas (36,5±6,8), seguido por redução significativa desta
população no tempo de 168 horas (42,3±3,3) em relação aos tempos de 1 (70,5±6,4) e 96
horas (60,0±7,8).
MOREIRA, N.D. Resultados
42
Gráfico 7: Percentual de linfócitos no sangue periférico de hamsters inoculados com
diferentes estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )] nos tempos
de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média ± desvio
padrão. Diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas linhas.
Gráfico 8: Cinética do percentual de linfócitos no sangue periférico de hamsters
submetidos a diferentes inóculos: [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L.
braziliensis; ); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )].
Os resultados estão expressos como média. Diferenças significativas (P<0,05) estão
representadas pelas letras a, b, c, d, e em relação aos tempos de 1, 12, 24, 48, 96 horas,
respectivamente.
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Grupos
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
Percentual de Linfócitos
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Grupos
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
Percentual de Linfócitos
0
50
100
1 1224 4896168
Tempo/Horas
a
a
a,e
b,c
b,c
b
a
b
b,c
Percentual de
Linfócitos
0
50
100
1 1224 4896168
Tempo/Horas
a
a
a,e
b,c
b,c
b
a
b
b,c
0
50
100
1 1224 4896168
Tempo/Horas
a
a
a,e
b,c
b,c
b
a
b
b,c
Percentual de
Linfócitos
MOREIRA, N.D. Resultados
43
5.2 - Dosagem dos níveis de Nitrato (NO
-3
) +Nitrito (NO
-2
) circulantes
O Gráfico 9 mostra os níveis de nitrato+nitrito nos diferentes grupos experimentais,
obtido através da dosagem sérica de NO nos tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas após a
sensibilização com os diferentes antígenos vacinais.
Os hamsters do grupo LEISHMUNE
®
(131,3±46,1) no tempo de 1 hora após o
inóculo apresentaram aumento significativo de NO quando comparado aos animais do
grupo LBSap (51,8±14,3). Os animais do grupo LBSap (74,9±18,8) 48 horas após o
inóculo apresentaram aumento significativo de NO quando comparados aos do grupo
SALINA (29,8±10,1). Os animais do grupo SAPONINA (67,7±12,2) 96 horas após o
inóculo mostraram um aumento significativo de NO quando comparado aos animais dos
grupos LB (33,7±6,6) e SALINA (24,9±5,2). Neste mesmo tempo os animais do grupo
LBSap (74,1±14,9) apresentaram aumento significativo na produção de NO em relação aos
grupos SALINA (24,9±5,2), LB (33,7±6,6) e LEISHMUNE
®
(35,6±7,0).
A análise cinética (Gráfico 10) revelou que em 96 horas (74,1±14,9) os hamsters do
grupo LBSap apresentaram aumento significativo de NO quando comparados aos animais
no tempo de 12 horas (42,2±24,6). Já os animais do grupo LEISHMUNE
®
apresentaram
redução significativa de NO no tempo de 96 horas (35,6±7,0) quando comparados aos
animais no tempo de 1 hora (131,3±46,1).
MOREIRA, N.D. Resultados
44
Gráfico 9: Dosagem dos níveis séricos de NO em hamsters inoculados com diferentes
estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis; ); (LBSap
Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )] nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças
significativas (P<0,05) estão representadas pelas linhas.
0
100
200
112
24
48 96 168
a
b
Nitrato+Nitrito µM/L
Tempo/Horas
0
100
200
112
24
48 96 168
a
b
Nitrato+Nitrito µM/L
Tempo/Horas
Gráfico 10: Cinética dos níveis séricos de NO em hamsters submetidos a diferentes
inóculos: [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis; ); (LBSap
Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )]. Os resultados estão
expressos como média. Diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas letras
a, b em relação aos tempos de 1e 12 horas, respectivamente.
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Nitrato+Nitrito µM/L
Grupos
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Nitrato+Nitrito µM/L
Grupos
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
MOREIRA, N.D. Resultados
45
5.3 - Perfis celulares de polimorfonucleares e mononucleares na derme de hamsters
inoculados com diferentes antígenos vacinais
5.3.1- Percentual de Neutrófilos
O Gráfico 11 mostra o percentual de neutrófilos nos diferentes grupos
experimentais, obtido através da contagem diferencial em cortes histológicos nos tempos
de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas após sensibilização com os diferentes antígenos vacinais.
Os animais dos grupos LB (51,7±5,5), LBSap (51,0±3,5) e SAPONINA (16,3±4,0)
no tempo de 168 horas após o inóculo apresentaram redução significativa no percentual de
neutrófilos quando comparados aos animais do grupo SALINA (67,3±4,2). Neste mesmo
tempo, os animais do grupo SAPONINA (16,3±4,0) também demonstraram redução
significativa em relação aos animais dos grupos LB (51,7±5,5); LBSap (51,0±3,5) e
LEISHMUNE
®
(67,0±2,8). Ainda observou-se aumento significativo no grupo
LEISHMUNE
®
(67,0±2,8) quando comparado aos grupos LB (51,7±5,5) e LBSap
(51,0±3,5).
A análise cinética (Gráfico 12) mostrou que nos tempos de 96 (49,3±7,8) e 168
horas (51,7±5,5) os hamsters do grupo LB apresentaram redução significativa no
percentual de neutrófilos quando comparados aos animais nos tempos de 1 (74,5±5,3); 12
(74,0±3,9) e 48 horas (69,8±4,1). No tempo de 168 horas (16,3±4,0) os animais do grupo
SAPONINA mostraram redução significativa em relação aos animais nos tempos de 1
(60,8±23,8), 12 (68,3±12,1), 24 (63,3±15,7) e 48 horas (70,0±13,5). No tempo de 12 horas
(83,5±2,4) os animais do grupo LBSap apresentaram aumento significativo no percentual
de neutrófilos quando comparados aos tempos de 1 (62,3±8,7) e 96 horas (55,7±14,2). Em
96 (55,7±14,2) horas houve uma redução significativa desta população celular quando
comparado tempo de 12 horas (83,5±2,4).
MOREIRA, N.D. Resultados
46
Gráfico 11: Percentual de neutrófilos na derme de hamsters inoculados com diferentes
estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis; ); (LBSap
Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )] nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças
significativas (P<0,05) estão representadas pelas linhas.
0
50
100
1 12 24 48 96 168
Tempo/Horas
a,b,d
a,b,d
b
a,b,c,d
a,e
Percentual de
Neutrófilos
0
50
100
1 12 24 48 96 168
Tempo/Horas
a,b,d
a,b,d
b
a,b,c,d
a,e
Percentual de
Neutrófilos
Gráfico 12: Cinética do percentual de neutrófilos na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos: [(SALINA;
); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )]. Os
resultados estão expressos como média. Diferenças significativas (P<0,05) estão
representadas pelas letras a, b, c, d, e em relação aos tempos de 1, 12, 24, 48, 96 horas,
respectivamente.
12h
24h
1h
168h
96h
48h
Grupos
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
Percentual de Neutrófilos
12h
24h
1h
168h
96h
48h
Grupos
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
Percentual de Neutrófilos
MOREIRA, N.D. Resultados
47
5.3.2 - Percentual de Eosinófilos
O Gráfico 13 mostra o percentual de eosinófilos nos diferentes grupos
experimentais, obtido através da contagem diferencial em cortes histológicos nos tempos
de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas após sensibilização com os diferentes antígenos vacinais.
Não foram observadas diferenças significativas (P<0,05) na análise comparativa
entre os grupos bem como entre os tempos (Gráfico14).
MOREIRA, N.D. Resultados
48
Gráfico 13: Percentual de eosinófilos na derme de hamsters inoculados com diferentes
estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis; ); (LBSap
Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )] nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão.
0
5
10
1 12244896168
Tempo/Horas
Percentual de
Eosinófilos
0
5
10
1 12244896168
Tempo/Horas
0
5
10
1 12244896168
Tempo/Horas
Percentual de
Eosinófilos
Gráfico 14: Cinética do percentual de eosinófilos na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos: [(SALINA;
); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )]. Os
resultados estão expressos como média.
168h
96h
12h 24h1h
48h
Grupos
0
6
12
0
6
12
0
6
12
0
6
12
0
6
12
0
6
12
Percentual de Eosinófilos
168h
96h
12h 24h1h
48h
Grupos
0
6
12
0
6
12
0
6
12
0
6
12
0
6
12
0
6
12
Percentual de Eosinófilos
MOREIRA, N.D. Resultados
49
5.3.3 - Percentual de Macrófagos
O Gráfico 15 mostra o percentual de macrófagos nos diferentes grupos
experimentais, obtido através da contagem diferencial em cortes histológicos nos tempos
de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas após sensibilização com os diferentes antígenos vacinais
Os animais do grupo SAPONINA (31,0±11,8) no tempo de 1 hora após o inóculo
apresentaram aumento significativo no percentual de macrófagos em relação aos animais
do grupo SALINA (8,3±1,5), LB (7,8±0,5), LBSap (8,5±1,9) e LEISHMUNE
®
(9,8±2,5).
Verificou-se um aumento significativo nos animais do grupo SAPONINA (20,3±9,3) no
tempo de 12 horas quando comparado aos animais do grupo SALINA (7,7±2,1) Neste
mesmo tempo observou-se redução significativa nos animais do grupo LBSap (4,3±0,5)
quando comparados aos animais do grupo SALINA (7,7±2,1). Ainda verificou-se que os
animais dos grupos LB (8,5±0,6), LBSap (4,3±0,5) e LEISHMUNE
®
(5,8±1,0)
apresentaram redução significativa em relação a SAPONINA (7,7±2,1). Também
observou-se redução significativa de macrófagos nos animais do grupo LBSap (4,3±0,5) e
LEISHMUNE
®
(5,8±1,0) quando comparado aos animais do grupo LB (8,5±0,6). Os
animais do grupo SAPONINA (20,3±9,3) no tempo de 24 horas apresentaram um aumento
significativo quando comparados aos do grupo SALINA (4,0±1,4). Os animais do grupo
SAPONINA (34,0±14,9) no tempo de 168 horas apresentaram aumento significativo de
macrófagos quando comparados aos animais dos grupos SALINA (6,7±2,1), LB
(12,7±3,5), LBSap (15,8±4,0) e LEISHMUNE
®
(11,3±2,4).
A análise cinética (Gráfico 16) mostra que no tempo de 24 horas (12,8±2,5) os
animais do grupo LB apresentaram aumento significativo no percentual de macrófagos em
relação aos animais dos tempos de 1 (7,8±0,5) e 12 horas (8,5±0,6), seguido de redução
significativa no tempo de 48 horas (7,5±1,3) quando comparado ao tempo de 24 horas
(12,8±2,5). No tempo de 96 horas (13,5±1,7) verificou-se aumento significativo quando
MOREIRA, N.D. Resultados
50
comparado aos tempos de 1 (7,8±0,5), 12 (8,5±0,6) e 48 horas (7,5±1,3). Ainda neste
grupo observa-se, no tempo de 168 horas (12,7±3,5), aumento significativo quando
comparado aos tempos de 1 (7,8±0,5) e 48 horas (7,5±1,3). Nos tempos de 96 (16,0±4,4) e
168 horas (15,8±4,0) os animais do grupo LBSap apresentaram aumento significativo
quando comparados aos animais do tempo de 12 horas (4,3±0,5).
MOREIRA, N.D. Resultados
51
Gráfico 15: Percentual de macrófagos na derme de hamsters inoculados com diferentes
estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis; ); (LBSap
Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )] nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças
significativas (P<0,05) estão representadas pelas linhas.
0
25
50
1 12244896168
Tempo/Horas
a,b
a,b,d
a,d
c
b
b
Percentual de
Macrófagos
c
0
25
50
1 12244896168
Tempo/Horas
a,b
a,b,d
a,d
c
b
b
Percentual de
Macrófagos
c
Gráfico 16: Cinética do percentual de macrófagos na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos: [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )]. Os
resultados estão expressos como média. Diferenças significativas (P<0,05) estão
representadas pelas letras a, b, c, d em relação aos tempos de 1, 12, 24, 48 horas,
respectivamente.
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Grupos
0
25
50
0
25
50
0
25
50
0
25
50
0
25
50
0
25
50
Percentual de Macrófagos
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Grupos
0
25
50
0
25
50
0
25
50
0
25
50
0
25
50
0
25
50
Percentual de Macrófagos
MOREIRA, N.D. Resultados
52
5.3.4 - Percentual de Linfócitos
O Gráfico 17 mostra o percentual de linfócitos nos diferentes grupos experimentais,
obtido através da contagem diferencial em cortes histológicos nos tempos de 1, 12, 24, 48,
96 e 168 horas após sensibilização com os diferentes antígenos vacinais.
Os animais do grupo LB (13,8±3,1) no tempo de 1 hora após o inóculo
apresentaram redução significativa no percentual de linfócitos quando comparados aos
animais do grupo estimulado com SALINA (32,7±1,5). Os animais do grupo SAPONINA
no tempo de 168 após o inóculo apresentaram aumento significativo (49,0±16,7) quando
comparados aos animais dos grupos SALINA (25,7±3,2) e LEISHMUNE
®
(20,3±2,4).
O Gráfico 18 mostra que no tempo de 96 horas (35,5±7,3) os hamsters do grupo
LB apresentaram um aumento significativo no percentual de linfócitos quando comparados
aos tempos de 1 (13,8±3,1), 12 (15,3±2,1), 24 (23,3±7,7) e 48 horas (19,0±1,4). No tempo
de 168 horas (34,0±3,5) os animais do grupo LB mostraram aumento significativo em
relação aos tempos de 1 (13,8±3,1), 12 (15,3±2,1) e 48 horas (19,0±1,4). No tempo de 168
horas (33,5±2,9) os animais do grupo LBSap apresentaram aumento significativo quando
comparados aos animais do tempo de 12 horas (11,8±2,5).
MOREIRA, N.D. Resultados
53
Gráfico 17: Percentual de linfócitos na derme de hamsters inoculados com diferentes
estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis; ); (LBSap
Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )] nos tempos de 1, 12, 24,
48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Diferenças
significativas (P<0,05) estão representadas pelas linhas.
a,b,d
0
50
100
1 12 24 48 96 168
Tempo/Horas
a,b,c,d
b
Percentual de
Linfócitos
a,b,d
0
50
100
1 12 24 48 96 168
Tempo/Horas
a,b,c,d
b
a,b,d
0
50
100
1 12 24 48 96 168
Tempo/Horas
a,b,c,d
b
0
50
100
1 12 24 48 96 168
Tempo/Horas
a,b,c,d
b
Percentual de
Linfócitos
Gráfico 18: Cinética do percentual de linfócitos na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos: [(SALINA;
); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )]. Os
resultados estão expressos como média. Diferenças significativas (P<0,05) estão
representadas pelas letras a, b, c, d em relação aos tempos de 1, 12, 24, 48 horas,
respectivamente.
168h
96h
12h
24h1h
48h
Grupos
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
Percentual de Linfócitos
168h
96h
12h
24h1h
48h
Grupos
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
0
45
90
Percentual de Linfócitos
MOREIRA, N.D. Resultados
54
5.4 – Análises de correlações entre as populações celulares (polimorfonucleares e
mononucleares) na derme e no sangue periférico
O Gráfico 19 (A, B e C) mostra as análises de correlação entre o percentual de
leucócitos do sangue periférico e o percentual de células inflamatórias quantificadas na
derme de hamsters sensibilizados com os diferentes antígenos vacinais.
A análise dos dados mostrou uma correlação positiva (P=0,0476; r=04370) entre o
percentual de linfócitos no sangue periférico e o percentual de linfócitos na derme dos
hamsters do grupo LBSap. Os animais do grupo LEISHMUNE
®
apresentaram uma
correlação positiva entre os percentuais de neutrófilos (P=0,0222;r=0,5079) e linfócitos
(P=0,0150; r=0,5352) no sangue periférico e o percentual de linfócitos na derme. Não foi
observada nenhuma correlação nos grupos LB e SAPONINA.
Gráfico 19: Análise de correlação entre percentual de células na derme e o percentual de
leucócitos no sangue periférico. Em (A) correlação positiva entre o percentual de linfócitos
na derme e o percentual de linfócitos no sangue periférico do grupo LBSap; (B) correlação
positiva entre o percentual de neutrófilos na derme e o percentual de neutrófilos do sangue
periférico do grupo LEISHMUNE
®
; (C) correlação positiva entre o percentual de linfócitos
na derme e o percentual de linfócitos do sangue periférico do grupo LEISHMUNE
®
.
P = 0,0476 ; r = 0,4370
LBSap
0 20 40
0
50
100
A
P = 0,0150 ; r = 0,5352
LEISHMUNE
®
0 25 50
0
50
100
C
LEISHMUNE
®
0 45 90
0
50
100
P = 0,0222; r = 0,5079
B
Linfócito Derme
Neutrófilo Derme
Linfócito Derme
Linfócitos Sangue
Periférico
Linfócitos Sangue
Periférico
Neutrófilos Sangue
Periférico
P = 0,0476 ; r = 0,4370
LBSap
0 20 40
0
50
100
A
P = 0,0150 ; r = 0,5352
LEISHMUNE
®
0 25 50
0
50
100
C
LEISHMUNE
®
0 45 90
0
50
100
P = 0,0222; r = 0,5079
B
Linfócito Derme
Neutrófilo Derme
Linfócito Derme
Linfócitos Sangue
Periférico
Linfócitos Sangue
Periférico
Neutrófilos Sangue
Periférico
P = 0,0476 ; r = 0,4370
LBSap
0 20 40
0
50
100
A
P = 0,0150 ; r = 0,5352
LEISHMUNE
®
0 25 50
0
50
100
C
LEISHMUNE
®
0 45 90
0
50
100
P = 0,0222; r = 0,5079
B
Linfócito Derme
Neutrófilo Derme
Linfócito Derme
Linfócitos Sangue
Periférico
Linfócitos Sangue
Periférico
Neutrófilos Sangue
Periférico
MOREIRA, N.D. Resultados
55
5.5 - Avaliação anatomopatológica
A avaliação macroscópica mostrou nos grupos inoculados com saponina
(SAPONINA, LBSap, LEISHMUNE
®
) edema discreto no local do inóculo.
No Gráfico 20 está representada a quantificação de células nos diferentes grupos
experimentais nos tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas após sensibilização com os
diferentes antígenos vacinais. Os grupos foram comparados entre si, sendo definido o
processo inflamatório quando a quantidade de células foi estatisticamente maior que o
observado no grupo controle.
A análise dos dados mostrou um aumento significativo no número de células no
grupo SAPONINA 48 (268,8±112,8), 96 (215,8±60,6) e 168 horas (177,9±59,6) após o
inóculo quando comparado aos animais do grupo SALINA (80,3±9,7) (68,1±12,3) e
(67,4±5,7), respectivamente. Observou-se um aumento significativo no número de células
nos animais do grupo LEISHMUNE
®
nos tempos de 96 (223,3±62,5) e 168 horas
(207,1±26,2) quando comparados aos animais dos grupos SALINA (68,1±12,3 e
67,4±5,7), nestes mesmos tempos. Ainda observamos um aumento significativo nos
animais do grupo LEISHMUNE
®
(207,1±26,2) no tempo de 168 horas após o inóculo,
quando comparados aos animais do grupo LBSap (118,4±22,9).
O Gráfico 21 mostra que no tempo de 12 horas (215,5±5,3) os hamsters do grupo
LB mostraram um aumento significativo no número de células no foco inflamatório
quando comparados aos animais no tempo de uma 1 hora (143,0±35,9).
Nas Figuras 1 e 2 estão apresentadas as fotomicrografias do aspecto histopatológico
da derme dos hamsters dos grupos LBSap, SAPONINA E LEISHMUNE® no período
precoce (1, 12, 24 horas) e no período tardio (24, 48, 96 horas) após o inoculo,
respectivamente.
MOREIRA, N.D. Resultados
56
Na Figura 1 observa-se que o grupo LBSap mostrou um processo inflamatório
moderado e difuso (Figura 1 A e B) nos tempos de 1 e 12 horas, respectivamente e um
infiltrado discreto (Figura 1 C) no tempo de 24 horas. O grupo SAPONINA exibiu um
processo inflamatório discreto focal (Figura 1 D) no tempo de 1 hora; intenso e difuso
(Figura 1E) no tempo de 12 horas e discreto (Figura 1F) no tempo de 24 horas. O grupo
LEISHMUNE
®
apresentou um infiltrado inflamatório moderado e difuso (Figura 1G) no
tempo de 1 hora; intenso e difuso (Figura 1H) no tempo de 12 horas e discreto (Figura 1I)
em 24 horas.
Na Figura 2 observa-se que o grupo LBSap apresentou infiltrado inflamatório
discreto (Figura 2 J e L) nos tempos de 48 e 168 horas, respectivamente. No tempo de 96
horas foi observado infiltrado moderado, com algumas áreas hemorrágicas (Figura 2K). O
grupo SAPONINA exibiu um processo inflamatório intenso e difuso também com áreas
hemorrágicas (Figura 2M) no tempo de 48 horas; infiltrado moderado e difuso (Figura 2N
e O) nos tempos de 96 horas e 168 horas. Já no grupo LEISHMUNE
®
verificou-se um
infiltrado discreto (Figura 2P) no tempo de 48 horas, intenso e difuso com áreas
hemorrágicas (Figura 2Q) no tempo de 96 horas enquanto no tempo de 168 horas após o
inoculo foi intenso e focal (Figura R).
MOREIRA, N.D. Resultados
57
Gráfico 20: Análise morfométrica do infiltrado inflamatório na derme de hamsters
inoculados com diferentes estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de
L. braziliensis; ); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
;
)] nos tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média
± desvio padrão. Diferenças significativas (P<0,05) estão representadas pelas linhas.
Gráfico 21: Cinética do infiltrado inflamatório dérmico em hamsters submetidos a
diferentes inóculos: [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )]. Os
resultados estão expressos como média. Diferenças significativas (P<0,05) estão
representadas pela letra a em relação ao tempo de 1 hora.
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Número de Células /1,5 x10
6
( µm
2
)
Grupos
0
200
400
0
200
400
0
200
400
0
200
400
0
200
400
0
200
400
168h
96h
12h
24h
1h
48h
Número de Células /1,5 x10
6
( µm
2
)
Grupos
0
200
400
0
200
400
0
200
400
0
200
400
0
200
400
0
200
400
0
150
300
1h 12h 24h 48h 96h 168h
Tempo/Horas
a
Número Células /1,5 x10
6
( µm
2
)
0
150
300
1h 12h 24h 48h 96h 168h
Tempo/Horas
a
Número Células /1,5 x10
6
( µm
2
)
MOREIRA, N.D. Resultados
58
Figura 2: Fotomicrografias do infiltrado inflamatório na derme de hamsters inoculados com
diferentes estímulos - [(SAPONINA); (LBSap - Antígeno de Leishmania braziliensis +
saponina); (LEISHMUNE
®
)] e avaliados nos tempos de 1, 12 e 24 horas após o inóculo.
Coloração: Hematoxilina-Eosina, Barra=50µm
50 µm
LBSap
1 h
12 h 24 h
LEISHMUNE
®
SAPONINA
B CA
E FD
H IG
Figura 2: Fotomicrografias do infiltrado inflamatório na derme de hamsters inoculados com
diferentes estímulos - [(SAPONINA); (LBSap - Antígeno de Leishmania braziliensis +
saponina); (LEISHMUNE
®
)] e avaliados nos tempos de 1, 12 e 24 horas após o inóculo.
Coloração: Hematoxilina-Eosina, Barra=50µm
50 µm
LBSap
1 h
12 h 24 h
LEISHMUNE
®
SAPONINA
B CA
E FD
H IG
LBSap
1 h
12 h 24 h
LEISHMUNE
®
SAPONINA
BB CCAA
EE FFDD
HH IIGG
MOREIRA, N.D. Resultados
59
LBSap
48 h
96 h 168 h
LEISHMUNE
®
SAPONINA
K LJ
N OM
Q RP
Figura 3: Fotomicrografias do infiltrado inflamatório na derme de hamsters inoculados com
diferentes estímulos - [(SAPONINA); (LBSap - Antígeno de Leishmania braziliensis +
saponina); (LEISHMUNE
®
)] e avaliados nos tempos de 48, 96 e 168 horas após o inóculo.
Coloração: Hematoxilina-Eosina, Barra=50µm.
50 µm
LBSap
48 h
96 h 168 h
LEISHMUNE
®
SAPONINA
KK LLJJ
NN OOMM
QQ RRPP
Figura 3: Fotomicrografias do infiltrado inflamatório na derme de hamsters inoculados com
diferentes estímulos - [(SAPONINA); (LBSap - Antígeno de Leishmania braziliensis +
saponina); (LEISHMUNE
®
)] e avaliados nos tempos de 48, 96 e 168 horas após o inóculo.
Coloração: Hematoxilina-Eosina, Barra=50µm.
50 µm
MOREIRA, N.D. Resultados
60
5.6 - Expressão de iNOS na derme
O Gráfico 22 ilustra os resultados da expressão de iNOS na derme de hamsters em
1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas após sensibilização com diferentes antígenos vacinais.
Não foram observadas diferenças significativas na análise comparativa entre os
grupos.
No tempo de 96 horas hamsters sensibilizados com LBSap (Gráfico 23)
apresentaram ausência de marcação para iNOS quando comparado ao tempo de 12 horas
(3711400±2914400).
Na Figura 4 estão apresentadas as fotomicrografias da expressão de iNOS na derme
dos hamsters dos grupos SAPONINA e LEISHMUNE
®
no período tardio (48, 96, 168
horas) após o inóculo.
Verificou-se uma marcação intensa e difusa nos grupos SAPONINA (Figura 4 A, B
e C, em 48, 96 e 168 horas após o inoculo, respectivamente) e LEISHMUNE
®
(Figura 4 E
e F, em 96 e 168 horas após o inoculo, respectivamente). Em 48 horas após o inóculo a
marcação foi discreta (Figura 4D) no grupo LEISHMUNE
®
.
MOREIRA, N.D. Resultados
61
Gráfico 22: Análise morfométrica da área expressando iNOS na derme de hamsters
inoculados com diferentes estímulos [(SALINA; ); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de
L. braziliensis; ); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
;
)] nos tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas. Os resultados estão expressos como média
± desvio padrão.
Tempo/Horas
0
50
100
1 12 24 48 96 168
Área (µ
2
) x10
5
b
e
Tempo/Horas
0
50
100
1 12 24 48 96 168
Área (µ
2
) x10
5
b
e
Gráfico 23: Cinética da área expressando iNOS na derme de hamsters submetidos a
diferentes inóculos: [(SALINA;
); (SAPONINA; ); (LB Antígeno de L. braziliensis;
); (LBSap Antígeno de L. braziliensis+saponina; ); (LEISHMUNE
®
; )]. Os
resultados estão expressos como média. Diferenças significativas (P<0,05) estão
representadas pelas letras b, e em relação aos tempos de 12, 96 horas, respectivamente.
Àrea ( µm
2
)x 10
5
Grupos
168h
96h
12h
24h
1h
48h
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
Àrea ( µm
2
)x 10
5
Grupos
168h
96h
12h
24h
1h
48h
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
0
100
200
MOREIRA, N.D. Resultados
62
48 h
96 h 168 h
LEISHMUNE
®
SAPONINA
B CA
E FD
Figura 4: Fotomicrografias da área positiva para a expresão de iNOS na derme de hamsters
submetidos a diferentes inóculos - [(SAPONINA); (LEISHMUNE
®
)] e avaliados nos tempos
de 48, 96 e 168 horas após o inóculo. Barra=50µm.
50 µm
48 h
96 h 168 h
LEISHMUNE
®
SAPONINA
BB CCAA
EE FFDD
Figura 4: Fotomicrografias da área positiva para a expresão de iNOS na derme de hamsters
submetidos a diferentes inóculos - [(SAPONINA); (LEISHMUNE
®
)] e avaliados nos tempos
de 48, 96 e 168 horas após o inóculo. Barra=50µm.
50 µm
MOREIRA, N.D. Resultados
63
5.7 – Análise de correlação entre a área imunomarcada para iNOS e as populações
celulares de polimorfonucleares e mononucleares na derme
Foi realizada uma análise de correlação entre a populações celulares na derme e a
expressão da iNOS em hamsters sensibilizados com diferentes antígenos vacinais nos
tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas. O grupo LB (Gráfico 24 A, B e C) apresentou
correlação negativa (P= 0, 0382; r= -0,4918) entre a população de neutrófilos na derme e a
expressão de iNOs. Este grupo apresentou ainda uma correlação positiva com linfócitos
(P= 0, 0371; r= 0, 4941) e macrófagos (P= 0, 0236; r= 0,5303) em relação a expressão de
iNOS. Não foi observada nenhuma correlação nos grupos SAPONINA e LBSap.
Gráfico 24: Análise da correlação entre a área imunomarcada para iNOS na derme e o
percentual de neutrófilos (A), de linfócitos (B) e de macrófagos (C) na derme de hamsters
do grupo LB.
LB
P = 0,0371; r = 0,4941
0
375 750
0
9
18
B
LB
P = 0,0382; r = -0,4918
0 375 750
0
50
100
A
LB
P = 0,0236; r = 0,5303
0 375 750
0
10
20
C
iNOS (µm
2
)x10
4
Neutrófilos
Derme ( %)
Linfócitos
Derme ( %)
Macrófagos
Derme ( %)
LB
P = 0,0371; r = 0,4941
0
375 750
0
9
18
B
LB
P = 0,0382; r = -0,4918
0 375 750
0
50
100
A
LB
P = 0,0236; r = 0,5303
0 375 750
0
10
20
C
iNOS (µm
2
)x10
4
Neutrófilos
Derme ( %)
Linfócitos
Derme ( %)
Macrófagos
Derme ( %)
LB
P = 0,0371; r = 0,4941
0
375 750
0
9
18
B
LB
P = 0,0382; r = -0,4918
0 375 750
0
50
100
A
LB
P = 0,0236; r = 0,5303
0 375 750
0
10
20
C
iNOS (µm
2
)x10
4
Neutrófilos
Derme ( %)
Linfócitos
Derme ( %)
Macrófagos
Derme ( %)
MOREIRA, N.D. Resultados
64
Os animais sensibilizados com LEISHMUNE
®
(Gráfico 25) apresentaram um
resultado semelhante aos sensibilizados do grupo LB em relação à população de
neutrófilos, com uma correlação negativa (P= 0,0483; r= -0,4852) nesta população celular
e a expressão de iNOS.
Gráfico 25: Análise da correlação entre a área imunomarcada para iNOS na derme e o
percentual de células na derme do grupo LEISHMUNE
®
.
P = 0,0483; r = - 0,4852
LEISHMUNE
®
0 75
150
0
50
100
iNOS(µm
2
)x10
5
Neutrófilos
Derme ( %)
P = 0,0483; r = - 0,4852
LEISHMUNE
®
0 75
150
0
50
100
iNOS(µm
2
)x10
5
Neutrófilos
Derme ( %)
6. Discussão
MOREIRA, N.D. Discussão
66
A LV é uma das mais relevante e emergente doença, com aproximadamente 98%
de mortalidade dos casos humanos não tratados, apresentando-se como uma importante
zoonose distribuída em áreas tropicais e subtropicais do globo (Tesh, 1995, Desjeux,
2004). Além disto, os cães são considerados o principal reservatório da L. chagasi/L.
infantum na América Latina e Europa (Deane & Deane, 1962). Assim, considerando que a
quimioterapia em cães ainda não proporciona cura parasitológica, o emprego de vacinas
anti-LVC é considerada a melhor alternativa no combate a crescente expansão e
urbanização da doença e poderá contribuir efetivamente nos programas de controle da LV
(Abranches et al.,1991, Genaro, 1993; Mayrink et al., 1996; Palatinik et al., 2001;
Gradoni, 2001; Handman, 2001; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c; Reis et
al., 2008). Muitos estudos com candidatos a vacinas para a imunoprofilaxia da LVC
descrevem a utilização de diferentes antígenos, apresentando resultados estimulantes e
indicando que o desenvolvimento de uma vacina efetiva contra LVC é possível (Mayrink
et al., 1996, Lemesre et al., 2005; Giunchetti et al., 2007a,b; Gradoni, 2001; Palatnik et al.,
1994a;Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008).
Considerando a importância dos imunobiológicos (LEISHMUNE
®
e LBSap) na
imunoprofilaxia da LVC, o papel do hamster como modelo experimental para LV e mais
recentemente em estudos de vacinas (Garg and Dube, 2006), torna-se fundamental a busca
de conhecimentos dos processos relacionados à resposta imune inicial desencadeada logo
após as sensibilizações utilizando estas vacinas e de seus componentes isoladamente.
Assim, no presente trabalho, foram avaliadas as alterações induzidas pela utilização dos
diferentes inóculos, utilizando como estratégia a avaliação das alterações histopatológicas,
do perfil celular no sangue periférico e da participação do NO sérico e da iNOS presente na
região do inóculo dérmico. Para melhor compreensão dos resultados obtidos neste
MOREIRA, N.D. Discussão
67
trabalho, optamos para denominar de período precoce os tempos de 1, 12 e 24 horas e de
período tardio os tempos de 48, 96 e 168 horas, durante a cinética avaliada.
Na literatura ainda são escassos os trabalhos que têm avaliado especificamente a
cinética da migração celular, após sensibilizações, utilizando diferentes formulações de
vacinas e adjuvantes. O caráter inovador deste trabalho se propõe a buscar ferramentas e
modelos experimentais de estudos contribuindo assim na seleção de potenciais antígenos e
adjuvantes vacinais. Neste sentido, a avaliação das alterações no local do inóculo vacinal,
seja pelo estudo histopatológico ou de NO, representariam biomarcadores importantes para
análise da inocuidade vacinal, pela compreensão das alterações in situ, para propor
potenciais candidatos vacinais em ensaios clínicos de campo. Desta forma, Sesardic (2006)
propõe a avaliação de estudos pré-clínicos para a identificação da melhor composição
vacinal, que se apresente inócua e segura, como controle de qualidade adicional para o
desenvolvimento de candidatos vacinais.
Em uma primeira abordagem foi avaliado o impacto no sangue periférico de
hamsters sensibilizados com as vacinas LBSap e LEISHMUNE
®
, o adjuvante saponina e o
antígeno de L. braziliensis isoladamente (LB). Os resultados obtidos a partir da contagem
de leucócitos nos esfregaços do sangue periférico em diferentes momentos da cinética
demonstraram que houve redução precoce de neutrófilos no grupo LEISHMUNE
®
(1 hora)
em relação ao grupo LB e aumento precoce no grupo SAPONINA (24 horas) comparado
ao antígeno LB e SALINA. Além disto, foi observado uma participação tardia (168 horas)
desta população celular nos grupos LEISHMUNE
®
, LBSap e LB em relação ao grupo
SALINA. Giunchetti (2007) avaliou aspectos da resposta celular em cães submetidos ao
inóculo com saponina, antígeno de L. braziliensis, a vacina LBSap. Neste estudo, foi
demonstrado aumento de neutrófilos circulantes no grupo LB em relação ao grupo controle
15 dias após a primeira imunização. Estes resultados sugerem a participação da resposta
MOREIRA, N.D. Discussão
68
imune inata, com ênfase na população de neutrófilos, nos eventos iniciais após o inóculo
vacinal utilizando o imunobiológico LBSap.
Além disto, é importante ressaltar que os neutrófilos representam a primeira linha
de defesa na resposta imune em processos inflamatórios frente à infecção por patógenos
intracelulares (Montenegro & Fecchio, 1999; Van Gisbergen et al., 2005; Ribeiro-Gomes
et al., 2004). No sítio inflamatório, estas células liberam enzimas e mediadores que alteram
a matriz extracelular e atraem outras células inflamatórias tais como eosinófilos,
monócitos, linfócitos T, linfócitos B, células NK, células dendríticas (Ribeiro-Gomes et
al., 2004). Recentes estudos realizados no modelo murino demonstraram o papel dos
neutrófilos no controle da infecção por L. donovani. Nestes estudos, foi observado em
camundongos com depleção de neutrófilos, aumento do número de parasitos no baço e
medula óssea, associado a elevados níveis de IL-4 e IL-10 e redução de IFN-γ por células
CD4
+
e CD8
+
direcionando a uma resposta do tipo 2 (McFarlame et al. 2007; Murray &
Nathan, 1999). Neste contexto, os neutrófilos assumem um papel fundamental na resposta
protetora inicial contra L. donovani. De forma similar, a análise dos resultados relacionada
ao aumento do percentual de neutrófilos demonstrado no grupo SAPONINA em 24 horas,
sugere a participação desta célula no contexto da imunidade inata, logo após a
sensibilização com este adjuvante. Esta migração de neutrófilos em direção ao inóculo,
estimulada pelo adjuvante saponina, poderia favorecer o estabelecimento de uma resposta
imune do tipo 1, fundamental para vacinas contra patógenos intracelulares.
Neste trabalho não observamos nenhuma diferença na população de eosinófilos no
sangue periférico durante a cinética avaliada. Entretanto, Giunchetti (2007) demonstrou
que cães imunizados com a vacina LBSap apresentaram aumento do número de eosinófilos
(15 dias após a segunda imunização) em relação aos cães imunizados com saponina. Além
disto, foi observado em cães do grupo LB aumento de eosinófilos em relação ao grupo
MOREIRA, N.D. Discussão
69
controle (15 dias após a terceira imunização) (Giunchetti, 2007). A ausência de alterações
na população de eosinófilo circulantes neste trabalho poderia ser explicada pelos distintos
modelos avaliados, ou ainda em função da diferença dos tempos avaliados após os
inóculos, uma vez que no estudo de Giunchetti (2007) as alterações hematológicas foram
avaliadas 15 dias após cada dose da vacina, indicando que esta população tem uma
mobilização sistêmica mais tardia.
O antígeno de L. braziliensis (LB) demonstrou uma precocidade (12 horas) na
mobilização de monócitos circulantes em relação aos hamsters inoculados com
SAPONINA e as vacinas LBSap e LEISHMUNE
®
. Estes resultados parecem indicar a
capacidade em induzir um recrutamento mais rápido de monócitos, favorecendo assim os
eventos de apresentação antigênica no local do inóculo. Giunchetti (2007) e Giunchetti et
al. (2007) mostraram por meio de imunofenotipagem por citometria de fluxo que cães
imunizados com a vacina LBSap apresentam aumento no número de monócitos CD14
+
circulantes 15 dias após a segunda imunização e também 15 dias após a terceira
imunização. Estudos têm demonstrado que o recrutamento seletivo de monócitos apresenta
um papel importante na resposta imune contra infecção por L. major, ao verificar que as
células dendríticas diferenciadas de monócitos no sítio de infecção foram as responsáveis
pela indução de uma resposta imune protetora (Leon et al., 2005; Leon et al., 2007).
Na análise de linfócitos circulantes observamos que o antígeno de L. braziliensis
promove uma redução precoce (1 hora) destas células no sangue periférico em relação à
vacina LEISHMUNE
®
, sugerindo que houve uma reatividade imunológica sistêmica após
a imunização. Nos tempos precoces (12 e 24 horas) observamos uma redução de linfócitos
circulantes nos grupos SAPONINA e na vacina LEISHMUNE
®
, e este padrão se repete no
período tardio (168 horas) para as duas vacinas LEISHMUNE
®
e LBSap e ainda no grupo
LB. Esta redução precoce de linfócitos na vacina LEISHMUNE
®
, e tardia em LBSap e
MOREIRA, N.D. Discussão
70
LEISHMUNE
®
, pode ser explicada por uma mobilização desta população que esta sendo
recrutada, juntamente com neutrófilos, a migrarem seletivamente para o local do inóculo.
Giunchetti (2007) ao avaliar o número de linfócitos observou redução em 15 dias após a
primeira imunização em cães do grupo inoculado apenas com LB e SAPONINA em
relação ao grupo controle. Além disto, Giunchetti (2007) observou no grupo LBSap
aumento do número de linfócitos em relação ao grupo saponina no mesmo período. Neste
sentido, as alterações hematológicas observadas persistem por até 15 dias após a
vacinação. Estas alterações parecem ser fundamentais e devem implicar de forma direta na
resposta local da região onde foi realizado o inóculo vacinal.
Neste contexto, o presente estudo buscou também avaliar a cinética de migração
celular para a derme dos hamsters inoculados com as vacinas LBSap e LEISHMUNE
®
e
seus constituintes vacinais (antígenos e adjuvantes) isoladamente. Após avaliar o
percentual de células inflamatórias na derme, foi observado uma redução de neutrófilos
durante o período tardio (168 horas) nos hamsters inoculados com LBSap, SAPONINA e
LB comparado ao grupo SALINA. Por outro lado os animais que foram inoculados com a
vacina LEISHMUNE
®
, apresentaram uma manutenção do percentual de neutrófilos na
derme, demonstrando desta forma uma correlação positiva entre o percentual de neutrófilos
no sangue periférico e na derme.
Estudos conduzidos em nosso laboratório por Vitoriano-Souza (2008) buscaram
avaliar a cinética de migração celular em cães sensibilizados com diferentes vacinas e
adjuvantes, incluindo, LBSap, SAPONINA e antígeno de L. braziliensis. Neste trabalho,
foi verificado em diferentes compartimentos da derme um aumento de neutrófilos no
período precoce no grupo SAPONINA. Estes resultados corroboram com os observados
neste trabalho, uma vez que foi demonstrada uma tendência de aumento no percentual de
MOREIRA, N.D. Discussão
71
neutrófilos na derme de hamsters inoculados com SAPONINA no tempo precoce
comparado ao tardio.
Tafuri (1992) e Tafuri et al. (1993) avaliaram as alterações histopatológicas da
intradermoreação de Montenegro (TM) em cães através de uma cinética de reação (6, 12,
24, 48 e 72 horas, 7 e 14 dias) após a inoculação dos antígenos LEISHVACIN
®
e
P10.000G. Neste estudo, foi observado que nas primeiras 24 horas após o inóculo, a reação
inflamatória era composta de neutrófilos; após 48 e 72 horas, o infiltrado apresentou-se
mais intenso e constituído, principalmente de células mononucleares (linfócitos e
monócitos). Após 7 e 14 dias a reação tendia a ser menos intensa. Estes estudos
corroboram com nossos resultados de cinética de migração celular, uma vez que
observamos, aumento de neutrófilos no período precoce em relação ao tempo tardio.
Esses estudos confirmam o papel de neutrófilos como células importantes na
primeira linha de defesa contra infecções (Ribeiro-Gomes et al., 2004), sugerindo mais
recentemente sua participação na proteção induzida por vacinas. A invasão de patógenos
induz os neutrófilos a deixarem a corrente sanguínea e migrarem para o sítio de infecção.
Neste local, estas células são estimuladas a fagocitose, processamento e morte de
patógenos por degranulação de compostos antimicrobianos e produção de radicais de
oxigênio (Witko-Sarsat et al., 2000). Na maioria dos processos de inflamação aguda, os
neutrófilos predominam no infiltrado inflamatório durante as primeiras 24 horas (Collins,
2000), respondendo a diversos estímulos e culminando em sua atividade microbicida. No
presente estudo, mostramos a participação de neutrófilos na resposta imune inata após
sensibilização com antígenos e adjuvantes vacinais.
Durante toda a cinética avaliada, não verificamos nenhuma alteração em relação ao
percentual de eosinófilos na derme. Por outro lado, Vitoriano-Souza (2008) observou
aumento de eosinófilos na derme de cães inoculados com SAPONINA e LBSap nos
MOREIRA, N.D. Discussão
72
tempos tardios, sugerindo que essas células, juntamente com os neutrófilos participariam
efetivamente na resposta inata e no direcionamento da resposta específica no local do
inóculo.
A infiltração de polimorfonucleares, principalmente dos neutrófilos para o foco
inflamatório, é seguida pela migração de monócitos da corrente sanguínea para os tecidos,
onde sofrem transformação em macrófagos. No presente estudo a análise de macrófagos na
derme nos permitiu inferir que a SAPONINA promove um recrutamento precoce e
persistente de monócitos. Além disto, os grupos vacinais (LBSap e LEISHMUNE
®
)
apresentam uma manutenção desta população celular na derme. Este dado é altamente
interessante, pois nos mostra que de alguma forma ocorre uma imunomodulação no
processo de migração celular quando são adicionados antígenos de L. donovani e/ou L.
braziliensis ao adjuvante saponina, como no caso das vacinas aqui testadas LEISHMUNE
®
e LBSap respectivamente. Estes antígenos associados ao adjuvante saponina parecem
influenciar na queda da migração seletiva de monócitos para o local de imunização. Esta
imunomodulação pode ser decorrente de ativação diferencial de algumas quimiocinas cuja
ação não é quimioatraente para monócitos. Por outro lado, a administração isolada do
adjuvante saponina recruta de forma marcante monócitos. Estas hipóteses precisam ser
melhores investigadas e fazem parte de algumas perspectivas a serem alcançadas em breve
por pesquisadores de nosso laboratório. O estudo de quimiocinas e citocinas e receptores
do tipo Toll expressos no local da vacina é uma das etapas futuras que pretendemos
cumprir para o entendimento destes eventos. Além disto, ainda pretendemos investigar a
expressão de moléculas de adesão e de migração na superfície das células e do endotélio
no microambiante que se forma no local do inóculo.
De forma interessante Vitoriano-Souza (2008), ao avaliar a cinética de macrófagos
no local do inóculo de cães sensibilizados por diferentes antígenos vacinais observou uma
MOREIRA, N.D. Discussão
73
redução no percentual de macrófagos nos tempos iniciais nos grupos SAPONINA e
LBSap.
Os macrófagos quando ativados produzem citocinas e várias delas agem de
diferentes maneiras na evolução e resolução da resposta inflamatória, sendo importantes
para o controle e modulação desta resposta. Os macrófagos desempenham importante
papel na resposta imune, seja por atuarem como células apresentadoras de antígenos ou por
produzirem e liberarem mediadores inflamatórios e quimiotáticos (Johnston, 1988; Laskin
et al., 1994). Os macrófagos ativados via IFN-γ são capazes de gerar, IL-2, TNF-α, IL-12 e
NO que aumentam a habilidade dessas células em controlar o desenvolvimento de
patógenos (Brennan et al., 2004). A ativação representa um dos primeiros eventos na
resistência inata à infecção intracelular. A interação de antígenos solúveis de Leishmania
com suas moléculas de superfície assim como os parasitos fagocitados, são considerados
mecanismos importantes no controle da resposta inflamatória e também do crescimento de
parasitos.
No âmbito do recrutamento de linfócitos na derme observamos uma redução
precoce (1hora) desta população celular no grupo LB em relação ao grupo SALINA com
aumento tardio (96 e 168 horas) destas células no grupo LB, LBSap. Em uma análise de
correlação foi possível detectar uma associação positiva entre linfócitos circulantes e
linfócitos na derme de hamsters sensibilizados com LBSap.
Observamos que o grupo SAPONINA promoveu um recrutamento tardio (168
horas) de linfócitos em relação aos grupos SALINA e LEISHMUNE
®
. Além disto, a
análise de correlação mostrou que o grupo LEISHMUNE
®
apresentou uma associação
positiva entre linfócitos circulantes e os linfócitos da derme. Neste estudo, demonstramos
que o adjuvante saponina contribui de forma marcante para o recrutamento de células
apresentadoras de antígenos durante todo o período cinético avaliado com indução da
MOREIRA, N.D. Discussão
74
migração de linfócitos até mesmo no período tardio. O aumento de linfócitos no grupo
SAPONINA e a redução desta população no período tardio após inoculação com
LEISHMUNE
®
sugerem a modulação do infiltrado inflamatório pelo antígeno que compõe
esta vacina (FML), um antígeno purificado de L. donovani, sendo este mais seletivo quanto
à imunogenicidade devido a sua natureza antigênica (um antígeno protéico purificado). Por
outro lado, o repertório antigênico da vacina LBSap é bem amplo compreendendo
antígenos solúveis e fracionados de L. braziliensis que pode levar a um menor
recrutamento seletivo de leucócitos circulantes em alguns dos momentos da cinética. De
fato a vacina LBSap induz recrutamento tardio (168 horas) de linfócitos com envolvimento
precoce de neutrófilos (12 horas). Por outro lado, Vitoriano-Souza, (2008) observou
aumento de linfócitos em cães sensibilizados com saponina e LBSap no período tardio,
sugerindo o papel deste adjuvante no recrutamento de linfócitos e deste modo ampliar e
modular a resposta imune ainda no local do inóculo.
Em um estudo, que avaliou a cinética de migração celular no tecido subcutâneo de
gatos após a administração de diferentes formulações vacinais contendo ou não adjuvantes
mostraram um aumento da reação inflamatória bem como maior efetividade na reparação
tecidual após administração de vacinas desprovidas de adjuvantes em sua composição
(Day et al., 2007).
Os resultados obtidos através da sensibilização de hamsters em nosso trabalho
demonstraram uma reação adversa (edema) muito discreta em alguns animais dos grupos
sensibilizados com saponina e as vacinas LBSap e LEISHMUNE
®
, o que sugere uma
inflamação local em resposta ao adjuvante saponina. De fato, nosso grupo de pesquisa
publicou recentemente um estudo de imunogenicidade onde foram avaliados aspectos de
toxicidade e inocuidade da vacina LBSap em cães (Giunchetti et al., 2007). Neste estudo,
foi verificado que após a administração da vacina LBSap, alguns animais apresentaram
MOREIRA, N.D. Discussão
75
discretas alterações, que não comprometem a saúde dos animais como: edema e/ou
nódulos circunscritos (Giunchetti et al., 2007). Outros estudos que avaliaram os aspectos
da inocuidade e toxicidade da vacina LEISHMUNE
®
relataram a presença de reações
transitórias induzidas pela saponina, tais como: dor local, anorexia, apatia, inchaço,
vômito, alopecia, diarréia e reações alérgicas (prurido) em alguns animais imunizados.
Todos estes eventos adversos em resposta a vacina LEISHMUNE
®
enriquecida com
saponina desapareceram após uma segunda dose da vacina (Santos et al., 2007; Parra et al.,
2007).
No presente estudo, realizamos uma abordagem direcionada a quantificação do
infiltrado inflamatório através de morfometria por análise de imagem. A intensidade do
infiltrado foi medida através da contagem de células no foco inflamatório pela análise
morfométrica. Esta análise mostrou que os hamsters inoculados com SAPONINA e
LEISHMUNE
®
apresentaram maior número de células no foco inflamatório no período
tardio (48, 96 e 168 horas) e (96 e 168 horas), respectivamente. Ainda neste contexto, foi
observado que o grupo sensibilizado com SAPONINA apresentou maior processo
inflamatório em relação a SALINA e os animais inoculados com LEISHMUNE
®
em
relação a SALINA e a vacina LBSap. Estes achados sugerem mais uma vez que a presença
do adjuvante saponina poderia favorecer a migração celular para o local do inóculo,
reforçando seu papel na formação do infiltrado inflamatório e sua aplicação como
adjuvante vacinal. Diversos autores têm demonstrado o papel da saponina como adjuvante
para modular a resposta imune mediada por células, realçar a produção de anticorpos assim
como nas reações imunes não especificas como, no caso da inflamação aguda (Oda et al.,
2000; de Oliveira et al., 2001; Haridas et al., 2001). A ausência de diferença significativa
do infiltrado inflamatório observada na vacina LBSap, poderia indicar uma modulação do
antígeno de L. braziliensis quando associado ao adjuvante saponina em induzir a migração
MOREIRA, N.D. Discussão
76
celular sem causar processo inflamatório exacerbado em praticamente todos os tempos da
cinética.
A capacidade de um imunógeno em induzir a produção de óxido nítrico é
considerada um fator fundamental, pois indica a capacidade de produção de citocinas do
tipo 1, fundamentais no estabelecimento de uma resposta imune contra patógenos
intracelulares. Neste sentido, a produção de NO pela iNOS possibilita a manutenção da
atividade antimicrobiana de macrófagos ativados contra uma variedade de patógenos
intracelulares (Rivera et al., 2002). Brandonísio et al. (2001) associaram um perfil de
proteção na leishmaniose que foi caracterizado pela maior expressão de iNOS e a maiores
níveis de NO. Desta forma no foco inflamatório, os macrófagos são ativados e expressam
iNOS, levando a altos níveis de produção de NO, podendo atuar em mecanismos efetores
em resposta a patógenos intracelulares. Nos últimos anos, alguns autores demonstraram
que a ativação do sistema imune e o estabelecimento de um perfil de caráter inflamatório
estão geralmente associados ao aumento da expressão de iNOS (Panaro et al., 2001; Rivera
et al., 2002). No presente trabalho não observamos nenhuma diferença significativa entre
os grupos em relação à área marcada para iNOS. Por outro lado, foi observada uma
tendência de maior área marcada para iNOS no grupo SAPONINA e este aumento foi
correlacionado positivamente à resposta inflamatória apresentada por este grupo. Assim, é
possível hipotetizar que uma maior expressão de iNOS pelos neutrófilos e macrófagos no
grupo SAPONINA esteja ocorrendo devido ao maior recrutamento destas células para a
derme e após ativação seriam capazes de induzir um microambiente caracterizado por um
perfil de citocinas do tipo 1 (como IFN-γ) resultando na produção de NO.
Quanto ao grupo LB, foi observado correlação positiva entre o número de linfócitos
na derme e a expressão de iNOS, ao passo que foi demonstrado correlação negativa entre
neutrófilos e a expressão de iNOS, e correlação positiva para macrófagos. Estes resultados
MOREIRA, N.D. Discussão
77
sugerem uma maior expressão de iNOS por linfócitos, como já relatado por Taylor-
Robinson et al. (1994) e macrófagos no grupo LB.
Adicionalmente, os animais sensibilizados com a vacina LBSap apresentaram
menor área marcada para iNOS no período tardio (96 horas). De forma interessante, ao
avaliar a produção de NO sérico no grupo LBSap, foi observado aumento significativo
neste mesmo tempo. Ainda não sabemos qual seria o papel biológico do NO sérico logo
após uma sensiblização e em quais níveis exerceria atividade biológica. Giunchetti et al.
(2007) observaram que cães imunizados com LBSap apresentavam aumento significativo
dos níveis de NO sérico em sobrenadante de cultura estimulada com antígeno solúvel de L.
chagasi sugerindo, que as imunizações utilizando esta vacina induzem o estabelecimento
de um perfil de resposta compatível com o controle do agente etiológico da LVC. Além
disto, Araújo (2006) em um estudo avaliando aspectos da resposta celular em cães
imunizados com LEISHMUNE
®
observou aumento significativo de nitrito em
sobrenadantes de cultivo celular representado pela concentração de nitrito/monócitos
adicionados à cultura (dia zero), e que este aumento estava correlacionado ao aumento do
percentual de células mononucleares produtoras de IFN-γ.
No presente estudo verificamos que a vacina LEISHMUNE
®
induz a produção de
NO logo na primeira hora após a imunização. Observamos ainda neste grupo uma
correlação negativa entre neutrófilos na derme e a expressão de iNOS. Neste sentido,
considerando os promissores estudos que avaliaram o antígeno vacinal da LEISHMUNE
®
em hamster (Palatnik et al.,1994a), associados aos resultados obtidos neste estudo, é
possível especular que os neutrófilos apresentariam menor contribuição na produção de
NO in situ, e a produção precoce de NO sérico poderia ser um indicador do
estabelecimento de imunidade protetora contra o agente etiológico da LV. Em estudos
realizados por Panaro et al. (2001) foi verificado aumento de NO em sobrenadantes de
MOREIRA, N.D. Discussão
78
células mononucleares do sangue periférico de cães vacinados antes do desafio. Em
modelo murino é sabido que a produção de NO é induzida ao nível transcricional por
diversas citocinas, em particular IFN-γ, que age sinergicamente com TNF-α e alguns
produtos bacterianos, enquanto IL-10, TGF-β, IL-4 e IL-6 têm um efeito inibitório
(MacMicking et al., 1997).
O perfil diferenciado apresentado nas duas vacinas (LBSap e LEISHMUNE
®
) em
relação aos níveis séricos de NO e o processo inflamatório poderia ser explicado pelos
antígenos que compõem estes dois imunógenos. A vacina LEISHMUNE
®
composta por
antígeno purificado, o FML de L. donovani, com natureza mais seletiva. Por outro lado, a
vacina LBSap composta por antígenos heterólogos de L. braziliensis associado a saponina,
apresenta em sua composição antígeno bruto que exibe grande diversidade no repertório
antigênico.
Os resultados obtidos neste trabalho nos permitiram um melhor entendimento dos
eventos iniciais da resposta imune desencadeada pelo processo de sensibilização no
modelo hamster que podem contribuir no direcionamento de uma resposta imune protetora
em vacinas. Além disto, este modelo de estudo de cinética de migração celular pode vir a
auxiliar na seleção prévia de antígenos vacinais antes mesmo de serem testados em cães,
sobretudo no que diz respeito aos aspectos relacionados à inocuidade do imunobiológico,
levando a busca mais acurada de novos potenciais candidatos vacinais contra LVC. Para
estruturar um modelo ideal pretendemos dar continuidade neste estudo através da avaliação
de diversos outros biomarcadores de modulação e regulação da resposta imune local,
dentre os quais citocinas, quimiocinas e receptores do tipo Toll. A continuidade deste
trabalho é de fundamental importância uma vez que muitas questões ainda precisam ser
esclarecidas para o entendimento da resposta imune no contexto de estudos de
imunogenicidade de vacinas anti-Leishmania.
7. CONCLUSÕES
MOREIRA, N.D. Conclusões
80
A partir da realização deste estudo que avaliou a cinética da migração celular intradérmica
em hamsters sensibilizados com constituintes antigênicos de duas vacinas anti-
Leishmaniose visceral canina, foi possível chegar as seguintes conclusões:
• O estudo de cinética de migração celular contribui de forma marcante na seleção
prévia de antígenos vacinais e adjuvantes antes mesmo de serem testados em cães,
sobretudo no que diz respeito aos aspectos relacionados à inocuidade e
imunogenicidade, auxiliando na bioprospecção de novos potenciais candidatos
vacinais contra LVC.
• As discretas reações locais verificadas pós-sensibilização com o adjuvante saponina
nos permitem indicar seu emprego em outros modelos experimentais.
• A saponina é capaz de promover aumento de neutrófilos, enquanto LB, LBSap e
LEISHMUNE
®
promoveram aumento de neutrófilos no período tardio indicando
uma mobilização destas células em nível sistêmico logo após a sensibilização pela
saponina e uma regulação deste fenômeno devido a associação com antígenos de
Leishmania sp.
• A saponina é capaz de promover redução de linfócitos circulantes no período
precoce, enquanto a LBSap promove redução tardia, e a LEISHMUNE
®
promove
redução desta célula durante toda cinética, indicando que a saponina auxilia na
mobilização desta população que esta sendo recrutada juntamente com neutrófilos a
migrarem para o local do inóculo.
• O antígeno de L. braziliensis inoculado isoladamente foi capaz de mobilizar
monócitos circulantes, levando a um aumento no período precoce o que indica uma
boa capacidade em induzir recrutamento rápido e seletivo de monócitos,
favorecendo os eventos de apresentação antigênica no local do inóculo.
• No sítio do inóculo ocorre redução tardia de neutrófilos no processo inflamatório
em animais inoculados com saponina, LBSap e LB com tendência a manutenção
MOREIRA, N.D. Conclusões
81
desta população grupo LEISHMUNE
®
, indicando a participação de neutrófilos na
resposta imune inata após sensibilização com antígenos e adjuvantes vacinais.
• O antígeno de L. braziliensis foi capaz de promover redução precoce de linfócitos
na derme e a saponina e LBSap promove um recrutamento tardio, indicando o
papel da saponina no recrutamento de células apresentadoras de antígeno com a
indução da migração de linfócitos até mesmo no período tardio.
• A saponina promove um recrutamento precoce e persistente de macrófagos
enquanto as vacinas LBSap e LEISHMUNE
®
apresentam uma tendência da
manutenção desta população na derme, indicando que a associação do adjuvante
aos antígenos parece influenciar na queda da migração de monócitos in situ.
• O aumento dos níveis de NO sérico nos grupos LEISHMUNE
®
e LBSap indica a
participação de citocinas do tipo 1, como IFN-γ, que podem ser fundamentais na
polarização da resposta imune adquirida protetora durante o processo vacinal.
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