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CHRISTINE HAUER PIEKARZ
EXPRESSÃO DA E-CADERINA NO PROGNÓSTICO
DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS EM CADELAS
CURITIBA
2007
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CHRISTINE HAUER PIEKARZ
EXPRESSÃO DA E-CADERINA NO PROGNÓSTICO
DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS EM CADELAS
Dissertação apresentada como requisito parcial
à obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias, Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias, Universidade Federal do
Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Alexander Welker Biondo
CURITIBA
2007
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i
A criação prossegue incessantemente por meio
do homem, mas o homem não cria, apenas
descobre.
(Antonio Gaudi)
ii
Dedico este trabalho aos meus pais, que sempre me incentivaram,
apoiaram e aconselharam cada passo e decisão que tive que
tomar na minha vida.
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus por estar sempre ao meu lado me protegendo e guiando pelo caminho certo.
Ao meu querido namorado Ivan, pela pessoa maravilhosa que é e por todo apoio,
carinho, paciência e incentivo dedicado em cada passo e decisão que precisei tomar.
Ao Professor Alexander Welker Biondo, por ter aceitado esta orientação e por toda
paciência, orientação e compreensão dedicada.
À Professora Renée Laufer Amorim, por todo incentivo, paciência e por ter aberto as
portas da UNESP-campus Botucatu tornando possível a realização deste projeto.
À Professora Suely Rodaski pela amizade, paciência e ensinamento dedicado ao longo
da minha vida acadêmica.
Ao Professor Pedro R. Werner que aceitou tão prontamente ao convite para a
participação da avaliação desse estudo.
Ao Professor Felipe Wouk por toda ajuda, conselhos e ensinamentos que proporcionou
durante a minha vida acadêmica.
À Professora Juliana Werner pela paciência e cooperação que foi fundamental ao
desenvolvimento deste projeto.
À Professora Tilde R. Froes Paiva que tanto cooperou para realização do projeto com
seu reconhecível conhecimento em diagnóstico por imagem.
Ao Professor Antônio Waldir da Silva por ter cooperado com o desenvolvimento deste
projeto.
iv
Ao amigo Andrigo por ter proporcionado a oportunidade de realização deste projeto e
por toda ajuda e paciência dedicada.
Ao funcionário do serviço de Patologia do HV-UFPR Olair pela cooperação para o
desenvolvimento deste projeto.
Ao Professor Rogério Lange, diretor do HV-UFPR, e a todos os professores e
funcionários do Departamento de Medicina Veterinária da UFPR que estiveram
presentes e participaram do meu desenvolvimento durante estes anos.
A todos os professores e pós-graduandos da UNESP-Botucatu pela excelente recepção
e por terem tornado possível a realização deste projeto, principalmente ao pós-
graduando Pedro Pinczowski que tanto colaborou para o desenvolvimento do
experimento.
Aos meus pais, Roque e Ingrid, pela confiança e incentivo ao longo de todos esses
anos.
Ao meu irmão Andreas pela enorme paciência cooperando com o desenvolvimento de
todo este trabalho.
Ao meu irmão Ronie por toda ajuda e apoio dedicado.
Aos meus avós Lory, Acyr e Cleomar pelas pessoas maravilhosas que são e por todo
apoio e credibilidade que depositam em mim.
A todas as pessoas, amigos, colegas, que estiveram presentes durante esta fase
sempre estimulando, apoiando e cooperando com o meu desenvolvimento.
v
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS .....................................................................................................VI
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................................VII
LISTA DE TABELAS.................................................................................................................IX
SINÓPSE...................................................................................................................................XI
ABSTRACT .............................................................................................................................XIII
1
INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
2
REVISÃO DE LITERATURA............................................................................................... 3
2.1
A
GLÂNDULA
MAMÁRIA
NAS
CADELAS................................................................................. 3
2.2
NEOPLASIAS
MAMÁRIAS ......................................................................................................... 4
2.2.1
Neoplasias mamárias em cadelas........................................................................................... 7
2.3
CADERINAS .............................................................................................................................. 12
2.3.1
Fisiopatologia das Caderinas................................................................................................. 13
2.3.2
O Complexo E-caderina-Cateninas ....................................................................................... 16
2.3.3
E-caderina como Indicadora de Prognóstico......................................................................... 18
3
MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................. 23
3.1
SELEÇÃO
DOS
CASOS............................................................................................................ 23
3.2
IMUNOISTOQUÍMICA ............................................................................................................... 26
3.3
LEITURA
DA
EXPRESSÃO
DA
E-CADERINA ......................................................................... 26
4
RESULTADOS.................................................................................................................. 33
4.1
DADOS
DE
FREQÜÊNCIA
DE
ACORDO
COM
OS
GRUPOS
HISTOPATOLÓGICOS........... 33
4.1.1
Adenoma................................................................................................................................ 34
4.1.2
Carcinomas com prognóstico bom ........................................................................................ 35
4.1.3
Carcinomas com prognóstico ruim ........................................................................................ 35
4.1.4
Carcinomas com metástase pulmonar e Carcinomas inflamatórios ..................................... 38
4.2
ESTADIAMENTO
CLÍNICO ....................................................................................................... 38
4.3
IMUNOISTOQUÍMICA ............................................................................................................... 40
5
DISCUSSÃO..................................................................................................................... 52
6
CONCLUSÕES................................................................................................................. 61
7
PERSPECTIVAS FUTURAS............................................................................................. 62
8
REFERÊNCIAS................................................................................................................. 63
9
ANEXOS ........................................................................................................................... 70
9.1
ANEXO
1.................................................................................................................................... 70
9.2
ANEXO
2.................................................................................................................................... 71
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT Alaninaminotransferase
Caderinas E-Caderina: Caderina epitelial
N-Caderina: Caderina neural
P-Caderina: Caderina placentária
CAM Molécula de Adesão Celular
DAB Diaminobenzidina
FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
HV Hospital Veterinário
NR Não realizado
OMS Organização Mundial de Saúde
SRD Sem Raça Definida
TNM Tumor/ Linfonodo/ Metástase
UFPR Universidade Federal do Paraná
UNESP Universidade Estadual Paulista
vii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Representação esquemática da interação do complexo E-caderina-
cateninas. A figura “A” representa a união de três células ligadas pela
E-caderina. Em maior aumento, na figura “B” está esquematizado a
importância das cateninas alfa, beta e p120 na ligação da E-caderina ao
citoesqueleto de actina da célula para a formação de adesão
intercelular. ...................................................................................................17
FIGURA 2 – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica para ilustrar o
controle positivo da expressão da proteína. Observar a marcação para
a atividade da E-caderina entre células epiteliais de um folículo piloso.
Carcinoma mamário em cadela. Aumento: 400 vezes. UNESP –
Botucatu, SP, 2006.......................................................................................28
FIGURA 3 – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica. Observar a
marcação de E-caderina entre as células epiteliais normais da
epiderme. Controle positivo da expressão da E-caderina na lâmina de
um carcinoma inflamatório mamário em cadela que não expressou a
proteína. Aumento: 400 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006.....................28
FIGURA 4 – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de tecido mamário
normal (++++) de cadela. Observar a marcação normal para a atividade
da E-caderina entre células epiteliais da glândula mamária. Aumento:
400 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006. ...................................................29
FIGURA 5 – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um adenoma
mamário em cadela. Observar a marcação normal (++++) para a
atividade da E-caderina entre células epiteliais da glândula mamária de
tecido neoplásico. Aumento: 400 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006. .....29
FIGURA 6 - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um carcinoma
mamário em cadela. Observar a marcação mediana (+++) para a
atividade da E-caderina entre células epiteliais da glândula mamária de
tecido neoplásico. Aumento: 200 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006. .....30
FIGURA 7 - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de metástase
pulmonar de um carcinoma mamário em cadela. Observar a marcação
muito fraca (+) para a atividade da E-caderina entre células epiteliais do
tecido neoplásico metastático. Aumento: 400 vezes. UNESP –
Botucatu, SP, 2006.......................................................................................30
FIGURA 8 - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um carcinoma
inflamatório mamário em cadela. Observar marcação muito baixa (+)
para a atividade da E-caderina entre células epiteliais da glândula
mamária do tecido neoplásico. Aumento: 400 vezes. UNESP –
Botucatu, SP, 2006.......................................................................................31
viii
FIGURA 9 - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de metástase
pulmonar de um carcinoma mamário em cadela. Observar a ausência
de marcação (-) para a atividade da E-caderina entre células epiteliais
do tecido neoplásico metastático. Aumento: 400 vezes. UNESP –
Botucatu, SP, 2006.......................................................................................31
FIGURA 10 – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um carcinoma
inflamatório mamário em cadela. Observar a ausência de marcação (-)
para a atividade da E-caderina entre células epiteliais da glândula
mamária do tecido neoplásico, mostrando apenas marcações
inespecíficas (flecha). Aumento: 400 vezes. UNESP – Botucatu, SP,
2006..............................................................................................................32
FIGURA 11 – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um carcinoma
inflamatório mamário em cadela com ausência de expressão da E-
caderina. Observar o êmbolo neoplásico formado, indicado pela flecha.
Aumento: 400 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006. ...................................32
FIGURA 12 – Freqüência de neoplasias mamárias, distribuídas conforme a raça,
em cadelas atendidas junto ao Hospital Veterinário da UFPR, campus
de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.................33
FIGURA 15 – Grau de expressão da E-caderina, distribuída de acordo com os
grupos estudados (Adenoma, Carcinoma com prognóstico bom,
Carcinoma com prognóstico ruim, Carcinoma com metástase pulmonar
– tecido mamário, Carcinoma com metástase pulmonar – tecido
pulmonar, Carcinoma Inflamatório e Controle). ............................................42
ix
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Grupos utilizados no presente estudo segundo a classificação
histológica de acordo com MOULTON (1990) e as características
clínicas da neoplasia mamária......................................................................24
TABELA 2 – Prevalência de neoplasias mamárias, distribuídas conforme a idade,
em cadelas atendidas junto ao Hospital Veterinário da UFPR, campus
de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.................34
TABELA 3 – Informações relativas ao histórico (gestação, anticoncepcional,
pseudociese e ovariosalpingoisterectomia) e dados clínicos das cadelas
com neoplasia mamária atendidas no Hospital Veterinário da UFPR,
campus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de
2004..............................................................................................................36
TABELA 4 – Estágio clínico das cadelas portadoras de adenomas mamários
seguindo o Sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/ Metástase) proposto pela
OMS (OWEN, 1980). ....................................................................................39
TABELA 5 – Estágio clínico das cadelas portadoras de carcinoma mamário com
prognóstico bom seguindo o Sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/
Metástase) proposto pela OMS (OWEN, 1980)............................................39
TABELA 6 – Estágio clínico das cadelas portadoras de carcinoma mamário com
prognóstico ruim seguindo o Sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/
Metástase) proposto pela OMS (OWEN, 1980)............................................40
TABELA 7 – Porcentagem de expressão da E-caderina por categoria tumoral nas
neoplasias mamárias de cadelas atendidas no Hospital Veterinário da
UFPR, campus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro
de 2004.........................................................................................................41
TABELA 8 – Expressão da E-caderina de acordo com as variáveis clínicas
tamanho do tumor, ulceração e sobrevida dos grupos Adenoma,
Carcinoma com prognóstico bom e Carcinoma com prognóstico ruim e
estadiamento dos grupos Adenoma, Carcinoma com prognóstico bom,
Carcinoma com prognóstico ruim, Carcinoma com metástase pulmonar
e Carcinoma inflamatório..............................................................................45
TABELA 9 – Expressão da E-caderina nos Adenomas de cadelas atendidas no
Hospital Veterinário da UFPR, campus de Curitiba, no período de
janeiro de 2002 a dezembro de 2004. ..........................................................47
x
TABELA 10 – Expressão da E-caderina nos Carcinomas com prognóstico bom de
tecido mamário de cadelas atendidas no Hospital Veterinário da UFPR,
campus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de
2004..............................................................................................................48
TABELA 11 – Expressão da E-caderina nos Carcinomas com prognóstico ruim de
cadelas atendidas no Hospital Veterinário da UFPR, campus de
Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004......................49
TABELA 12 – Expressão da E-caderina nos Carcinomas com metástase pulmonar
de cadelas recebidas pelo Serviço de Patologia Veterinária do Hospital
Veterinário da UFPR, campus de Curitiba....................................................50
TABELA 13 – Expressão da E-caderina nos Carcinomas Inflamatórios de cadelas
recebidas pelo Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, campus de Botucatu.............51
xi
SINÓPSE
EXPRESSÃO DA E-CADERINA NO PROGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
MAMÁRIAS EM CADELAS
Autora: Christine Hauer Piekarz
Orientador: Alexander Welker Biondo
As neoplasias mamárias são os tumores mais comuns nas cadelas não
castradas. Embora a avaliação microscópica do nódulo defina o seu diagnóstico,
marcadores protéicos que caracterizem o risco no desenvolvimento de metástases têm
sido propostos como ferramenta auxiliar na determinação do seu prognóstico. A e-
caderina (caderina epitelial) é um membro da família das caderinas conhecida pelo
importante papel na regulação da adesão intercelular em tecidos epiteliais. Em tumores
mamários caninos parece existir uma significativa correlação entre a perda de
expressão da e-caderina e outros indicadores de prognóstico ruim, como o tamanho do
tumor, ulceração, tipo histológico, tipo de crescimento, metástase em linfonodos e
necrose, indicando que a perda da expressão da e-caderina pode ter um valor
prognóstico em neoplasias mamárias caninas.
No presente estudo retrospectivo foi utilizado 50 casos clínicos de neoplasias
mamárias em cadelas, selecionados a partir do diagnóstico histopatológico, divididas
em cinco grupos de 10 animais cada de acordo com a classificação histopatológica e
característica clínica do tumor. A anamnese, a ficha de identificação e a necropsia dos
pacientes foram registradas, quando possível, tendo por base as fichas clínicas de
atendimento. Os tecidos neoplásicos de todos os animais foram fixados em formol 10%,
e avaliados para expressão da E-caderina nos tecidos pela técnica de
imunoistoquímica.
xii
Foi observada, neste estudo, uma variação da expressão da E-caderina entre os
diferentes grupos histológicos das neoplasias mamárias, mostrando que a expressão da
E-caderina parece estar relacionada às diferentes classificações histológicas e
comportamento biológico do tumor, tendo sido encontrado menor expressão nas
neoplasias malignas. Ainda que tenha sido observado, também, uma expressão normal
da E-caderina nos carcinomas inflamatórios, a maioria apresentou menor expressão em
comparação aos outros grupos.
Dentre as pacientes portadoras de carcinoma com metástase pulmonar, 30%
apresentaram a mesma expressão nos nódulos primários e metastáticos (pulmão),
sugerindo que ocorram alterações dinâmicas reversíveis da expressão da E-caderina
durante a progressão do carcinoma e o processo de metástase.
Não foi observada uma relação direta da expressão da E-caderina com o
tamanho do tumor sugerindo que esta característica deve ser associada ao tipo
histológico do tumor quando se analisa o grau de expressão da proteína.
Observando-se a grande dinâmica na alteração da expressão da E-caderina e
comparando-a separadamente com variáveis de prognóstico, percebe-se que esta
proteína não deve ser utilizada como um fator de prognóstico independente, mas pode
ser sim um marcador no qual a sua ausência indica maior malignidade da neoplasia
principalmente correlacionando-a aos carcinomas inflamatórios.
xiii
ABSTRACT
EXPRESSION OF E-CADHERIN IN THE PROGNOSIS OF MAMMARY
NEOPLASIAS IN BITCHES
Author: Christine Hauer Piekarz
Adviser: Alexander Welker Biondo
The mammary tumors are the most common in intact bitches. Although the
microscopic evaluation of the nodule defines its diagnostic, proteins markers that
characterize the risk in the development of metastases have been proposed as auxiliary
tools in the determination of its prognostic. The E-cadherin (epithelial cadherin) is a
member of the cadherins families known for having important role in the regulation of
intercellular junction. It seems to exist a significant relation between the loss of the e-
cadherin and other indicators of poor prognostic in the canine mammary tumors, such as
tumor size, ulceration, histological type, growing type, lymph nodes metastases and
necrosis, indicating that the loss of expression of the E-cadherin may have a prognostic
value in these tumors.
Fifty clinic cases of bitch mammary neoplasms were used in the current
retrospective study, selected from the histopathological diagnostic and divided in 5
groups of 10 animals each, according to the histopathological classification and clinic
characteristic of the tumor. The anamnesis, the identification card and the patient
necropsy were registered when it was possible, based on the consultation clinic cards.
The neoplasic tissues from all animals were fixed in 10% formalin and evaluated for the
E-cadherin expression in tissues by immunohistochemical methods.
A variation of the E-cadherin expression in the different histological groups of the
mammary neoplasias was observed in this study, showing that the E-cadherin
xiv
expression seems probably to be related to the different histological type and biological
behavior of tumors, finding a minor expression in the most malignant tumors. Even if a
normal expression of the E-cadherin in the Inflammatory Carcinomas has also been
observed, the majority showed minor expression comparing to the other groups.
Only 30% of the patients with lung metastase carcinoma showed the same
expression of the primary and metastatic nodes, suggesting that reversible dynamics
alterations of the E-cadherin expression occur during the carcinoma progression and
metastasis development.
A straight relation of the E-cadherin expression with the tumor size was not
verified suggesting that this characteristic must be associated to the histological type of
tumor when is analyzed the degree of the protein expression.
By observing the grade dynamic in the alteration of the E-cadherin expression
and comparing it apart with prognostic variables, it is understandable that this protein
can not be used as a factor of independent prognostic, but it sure can be a marker in
which its absence indicates a major malignant of the neoplasm, relating it mainly to the
inflammatory carcinomas.
1
1 INTRODUÇÃO
As neoplasias mamárias são os tumores mais comuns nas cadelas não
castradas (RUTTEMAN et al., 2001; SORENMO, 2003). Estas afecções acometem,
com maior freqüência, fêmeas entre nove e doze anos de idade, e as raças nas quais
se observa maior incidência dos tumores de mama são os Poodles, os Pastores
Alemães e os Cockers Spaniel, além dos animais sem raça definida (RUTTEMAN et al.,
2001).
O diagnóstico definitivo para tumores mamários é determinado pelo exame
histopatológico. O exame microscópico das células tumorais e da cadeia linfática
fornece informações importantes sobre a natureza, o tipo histológico e a extensão
microscópica da lesão (CAVALCANTI e CASSALI, 2006).
Embora a avaliação microscópica do nódulo defina o seu diagnóstico,
marcadores protéicos que caracterizem o risco no desenvolvimento de metástases têm
sido propostos como ferramenta auxiliar na determinação do seu prognóstico
(WEIGELT et al., 2005). As proteínas de superfície celular responsáveis pela junção
celular ou CAMs (moléculas de adesão celular) foram descritas como potenciais
marcadores, sendo suas cinco principais classes as caderinas, imunoglobulinas,
selectinas, mucinas e integrinas (LODISH et al., 2000).
Dentre as proteínas de junção celular, as caderinas parecem ser as mais
promissoras como indicadores de prognóstico nas neoplasias mamárias. Além de
atuarem na junção intercelular estão também envolvidas na regulação de processos
observados no desenvolvimento tumoral como o crescimento celular desordenado, a
diferenciação celular defeituosa e a organização tecidual modificada. Deste modo, é
2
esperado que estas moléculas afetem também a gênese do tumor e o comportamento
das células neoplásicas (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
A E-caderina (caderina epitelial) é um membro da família das caderinas
conhecida por desempenhar um papel importante na regulação da adesão intercelular
em tecidos epiteliais. É considerada o principal componente na junção de aderência
transmembranosa de células epiteliais de todos os órgãos, como as células epiteliais
luminais mamárias (TAKEICHI, 1991). Como a maioria dos tumores de mama, tanto na
mulher como na cadela, são de origem epitelial, a E-caderina tem sido intensamente
estudada em relação à sua função na gênese destes tumores (MATOS et al., 2006).
O uso da imunoistoquímica no estudo de marcadores prognósticos dos tumores
de mama em cadelas constitui importante ferramenta de trabalho na rotina e pesquisa
diagnósticas (KANDIOLER-ECKERSBERGER et al., 2000). A utilização de anticorpos
monoclonais contra antígenos específicos associados aos tumores de mama permite
um melhor conhecimento da biologia tumoral, permitindo, com isso, um diagnóstico,
prognóstico e tratamento mais direcionados para o controle destas neoplasias
(MOTTOLLESE et al., 1994).
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A GLÂNDULA MAMÁRIA NAS CADELAS
Nas cadelas as glândulas mamárias apresentam-se sob a forma de linhas
mamárias subepidermais (DYCE et al., 1996), consideradas glândulas secretoras
especializadas resultantes da invaginação da epiderme durante a embriogênese,
gerando uma série de ductos que se conectam ao ambiente externo (KNUDSEN e
WHEELOCK, 2005). Seu desenvolvimento inicia-se na fase embrionária e continua
lentamente até o período pré-puberdade (CAVALCANTI e CASSALI, 2006). O
desenvolvimento da glândula mamária só é efetivado na presença dos hormônios da
gestação e da lactação, que induzirão a ramificação e estimularão a proliferação de
células germinativas finais e a diferenciação em alvéolos glandulares que produzirão o
leite. Após o desmame, o alvéolo regride por apoptose e as estruturas ductais são
mantidas (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
A mama é composta pelos ductos ou alvéolos que são componentes epiteliais,
pelo produto de secreção (na fase de lactação) e pelo estroma (SILVERMAN, 1997). O
lume dos ductos e alvéolos mamários é revestido internamente por células epiteliais
(BOUSSADIA et al., 2002) e externamente pelas células mioepiteliais (RADICE et al.,
1997) que estão relacionadas com o reflexo de ejeção do leite (SILVERMAN, 1997).
Nos cães, as mamas são tipicamente dispostas em alinhamento bilateral que se
estendem desde a região torácica ventral à inguinal. O número médio de glândulas é de
10, distribuídas da seguinte forma: quatro torácicas de tamanho menor, quatro
abdominais de tamanho médio e duas inguinais ou púbicas de maior tamanho (DYCE et
al., 1996).
4
2.2 NEOPLASIAS MAMÁRIAS
O desenvolvimento de uma neoplasia resulta do somatório de uma série de
fatores originando células que não respondem aos mecanismos naturais de controle
(RUTTEMAN et al., 2001). Apesar das neoplasias terem origem em diferentes tecidos e
seu desenvolvimento ser induzido por diversos agentes, como vírus, produtos químicos
mutagênicos e radiações, o dano no genoma celular é um ponto em comum para todas
as neoplasias, porém, apesar de geralmente inconseqüente, este dano genético
produzido por um carcinógeno parece ser corriqueiro (CULLEN et al. 2002). O processo
de formação de um tumor é dividido em etapas distintas, como iniciação, promoção,
progressão e manifestação clínica (RUTTEMAN et al., 2001).
Os tumores mamários apresentam-se freqüentemente como nódulos que podem
apresentar tipos histológicos diversos e ocorrer em uma ou mais glândulas mamárias
de forma sincrônica (MISDORP, 2002; CAVALCANTI e CASSALI, 2006). Nestes casos
em que as lesões da mama surgem de maneira multicêntrica, o tumor de pior
prognóstico é o que determinará a evolução clínica do paciente (CAVALCANTI e
CASSALI, 2006). O câncer de mama é uma doença clinicamente heterogênea, ou seja,
se expressa de forma muito variada em cada paciente, e esta natureza heterogênea
acarreta numa dificuldade não somente para definir a cura da doença, mas também
para determinar fatores de risco para o desenvolvimento de metástases (WEIGELT et
al., 2005).
A determinação do grau de malignidade dos tumores é baseada em uma série de
características de avaliação, entre elas a diferenciação celular, índice de mitose,
pleomorfismo celular ou nuclear, presença de necrose, invasividade, reação estromal e
resposta linfóide inflamatória. A determinação deste grau pode estar associada à
5
sobrevida, índice de metástase, intervalo livre da doença, ou com a freqüência e/ou
intervalo de tempo de recorrência local (POWERS, 2001).
A maioria das neoplasias malignas é classificada como tumores epiteliais
malignos, ou carcinomas. Os carcinomas são classificados em 4 graus histológicos,
divididos pelas lesões em: (a) os não infiltrativos, como o carcinoma in situ (grau 0); (b)
os com invasão do estroma adjacente, mas sem invasão vascular ou linfática detectável
(grau I); (c) os com invasão vascular ou linfática e/ou metástase para linfonodos
regionais (grau II); e (d) os com evidências de metástases distantes (grau III). Além
disso, estes tumores foram classificados baseados em seu grau de diferenciação
celular (pouco diferenciado, moderadamente diferenciado e bem diferenciado). Ambas
as classificações são relatadas como tendo importante relação à agressividade tumoral
(RUTTEMAN et al., 2001).
Baseado nisso, a diferenciação histopatológica dos tumores epiteliais de
glândulas mamárias tem um impacto no prognóstico, com este sendo inversamente
proporcional à perda da diferenciação. Por exemplo, os carcinomas in situ e os
adenocarcinomas têm melhor prognóstico que os carcinomas anaplásicos e
inflamatórios (SORENMO, 2003). Os carcinomas inflamatórios apresentam uma
designação específica reservada, pois, histologicamente, constituem um tipo nítido de
carcinoma pobremente diferenciado com grande evidência de células inflamatórias
mono e polinucleares infiltradas. Clinicamente, este neoplasma cresce e provoca
metástases com grande velocidade, além de invadir vasos linfáticos da pele resultando
em acentuado edema e inflamação (RUTTEMAN et al., 2001).
A avaliação clínica das neoplasias mamárias requer a determinação dos
seguintes fatores: (1) condições gerais do animal; (2) sinais clínicos; (3) durações dos
6
sinais; (4) velocidade de crescimento tumoral; (5) localização; (6) tamanho; (7)
consistência do tumor; (8) número de glândulas envolvidas; (9) forma de crescimento;
(10) ulceração; (11) aderência em tecidos adjacentes; (12) aumento dos linfonodos
regionais; (13) linfedema de extremidades; (14) deformidade da mama; (15) recorrência
e, (16) presença de metástase à distância. Os fatores 6, 10, 11, 12 e 16 contribuem
para a determinação do estágio clínico da doença tumoral de acordo com o sistema
TNM (Tumor/Linfonodo/Metástase) da Organização Mundial de Saúde (MISDORP,
2002).
O melhor meio de se obter um diagnóstico definitivo é por meio do exame
histológico da biópsia excisional (RUTTEMAN et al., 2001). O exame histopatológico é o
método de eleição para identificar as características de uma neoplasia (MOTA e
OLIVEIRA, 1999). Quando, após avaliação física, suspeita-se de metástase no
linfonodo, este deve ser avaliado pela análise citológica realizada por meio de aspirado
por agulha fina. Este exame também pode ser útil para o diagnóstico do carcinoma
inflamatório (RUTTEMAN et al., 2001), mas nas demais neoplasias mamárias a
citologia é útil apenas como um diagnóstico presuntivo, e não definitivo, como utilizado
no diagnóstico de processos benignos, como cistos ou abscessos e para massas
neoplásicas como o mastocitoma e outros tumores de células redondas (CULLEN et al.,
2002).
Vários fatores têm sido relacionados ao prognóstico, entre eles o tamanho do
tumor, envolvimento de linfonodos, presença de metástases distantes, tipo histológico,
grau de malignidade, grau de diferenciação celular, evidência de infiltrado mononuclear
adjacente ao tumor, atividade do receptor do hormônio esteróide e índice de mitose
(RUTTEMAN et al., 2001). As características histopatológicas indicativas de um
7
prognóstico reservado são: anisocariose, presença de necrose tumoral, ocorrência de
invasão de vasos linfáticos e/ou sangüíneos e observação de metástases em linfonodos
satélites (PHILIBERT et al., 2003). O tamanho do tumor é considerado como um fator
de prognóstico independente, pois tumores menores que 3 cm de diâmetro estão
associados com um prognóstico significativamente melhor que os tumores maiores que
esta medida (SORENMO, 2003). Sabe-se que o risco de desenvolvimento de
metástase aumenta com a presença de células neoplásicas em linfonodos, com o maior
tamanho do tumor primário e com a perda da diferenciação histopatológica (WEIGELT
et al., 2005), e que o enfraquecimento dos mecanismos de adesão celular, que envolve
alterações na adesão celular e interações das células com a matriz extracelular no
tumor primário, é um pré-requisito para a ocorrência de metástase (BUSSEMAKERS e
SCHALKEN, 1996).
A imunoistoquímica pode ser utilizada como um auxílio na classificação de
diversos tumores em medicina veterinária, com emprego crescente na rotina da
medicina humana (POWERS, 2001). A aplicação da imunoistoquímica tem trazido
informações úteis (MISDORP, 2002), pois permite determinar com maior precisão a
presença de marcadores hormonais, a taxa de proliferação celular, a angiogênese e a
presença de produtos de proto-oncogenes e de genes supressores tumorais
(CAVALCANTI e CASSALI, 2006).
2.2.1 Neoplasias mamárias em cadelas
As neoplasias mamárias são os tumores mais comuns nas cadelas não
castradas, sendo, portanto, claramente hormônio dependentes (RUTTEMAN et al.,
2001; SORENMO, 2003). Em conseqüência, o risco de ocorrência de neoplasias
8
malignas em cadelas castradas antes do primeiro estro é baixo, em torno de 0,05%.
Este risco aumenta para 8,0% depois do primeiro estro e para cerca de 26,0% se
submetida à ovariosalpingoisterectomia após o segundo estro, quando comparadas
com cadelas intactas. Depois disso a castração não interfere mais na oncogênese das
neoplasias malignas. Porém, a chance de desenvolver tumores benignos parece ser
reduzida pela castração em qualquer idade (RUTTEMAN et al., 2001; SORENMO,
2003).
Os tumores de mama representam aproximadamente 52% de todas as
neoplasias na cadela, sendo que 50% delas são malignas (RUTTEMAN et al., 2001). E,
dentre as malignas, cerca de 50% são os carcinomas. A classificação pode ser
realizada de acordo com a origem tecidual (tecido epitelial, miopetelial ou
mesenquimal), os aspectos morfológicos e o prognóstico (SORENMO, 2003).
A metodologia para a classificação os tumores varia consideravelmente, porém
há um consenso geral para as seguintes categorias: adenomas, carcinomas e tumores
mistos benignos e malignos (MOULTON, 1990). A Organização Mundial da Saúde
classifica os tumores de mama da cadela em tumores malignos, benignos, não
classificados e hiperplasias ou displasias mamárias. As neoplasias malignas são: o
carcinoma in situ, carcinoma complexo, carcinoma simples com os subtipos
tubulopapilar, sólido, e anaplásico; tipos especiais de carcinoma, que agrupam o
carcinoma de células fusiformes, o de células escamosas, o mucinoso e o rico em
lipídio; sarcomas tais como fibrossarcoma, osteossarcoma e outros sarcomas
(MISDORP et al., 1999).
Nos tumores benignos estão agrupados os adenomas simples, complexo e
basalóide, os fibroadenomas de baixa e alta celularidade, o tumor misto benigno e o
9
papiloma ductal. As hiperplasias ou displasias mamárias na cadela são classificadas
como hiperplasia ductal, hiperplasia lobular podendo ser epitelial ou adenose, cistos,
ectasia ductal, fibrose local e ginecomastia (MISDORP et al., 1999).
O diagnóstico da neoplasia mamária em medicina veterinária deve incluir o
exame físico detalhado, baseado na idade, no histórico reprodutivo e nos sinais clínicos,
como a presença de nódulos mamários e aumento de volume de linfonodos regionais.
Sinais sistêmicos como tosse, dispnéia e claudicação, que podem ocorrer devido ao
desenvolvimento de metástases, merecem especial atenção. Deve ser considerado na
primeira avaliação se o local da região da doença permite ou não uma completa
ressecção (CAVALCANTI e CASSALI, 2006).
O estadiamento das neoplasias mamárias em cadelas deve ser voltado para a
avaliação da fase de evolução tumoral, bem como as possibilidades de progressão do
tumor, no seu sítio de origem e em outros territórios (metástases). Este estadiamento
pode ser feito segundo o sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/ Metástase) proposto pela
Organização Mundial de Saúde (MOULTON, 1990).
A radiografia ainda é o principal método para avaliação de metástases
pulmonares em animais (SORENMO, 2003). Portanto, nos casos em que a malignidade
não pode ser excluída, deve-se realizar radiografia torácica dos planos laterais direito e
esquerdo e ventrodorsal, para avaliar possíveis metástases em pulmão e linfonodos
esternais do animal, uma vez que todos os tumores mamários malignos têm um
potencial metastático (RUTTEMAN et al., 2001). Este risco de disseminação está
correlacionado ao tipo tumoral, diferenciação histológica e vários fatores clínicos de
prognóstico. Em geral, os tumores epiteliais provocam metástases pela circulação
linfática para linfonodos regionais e pulmões, enquanto os tumores mesenquimais se
10
disseminam pela via hematógena diretamente para o pulmão (SORENMO, 2003).
Portanto, os principais órgãos acometidos pelas lesões metastáticas são: linfonodos
regionais (inguinais e axilares) e pulmão e com, menor freqüência, rins, fígado, baço,
pele, adrenais, encéfalo, olhos e esqueleto (KITCHELL, 1995; CAVALCANTI e
CASSALI, 2006).
Em medicina veterinária, o diagnóstico histopatológico deve ser realizado em
todos os casos de neoplasia mamária submetidas à exérese cirúrgica. A exérese
cirúrgica é o tratamento de escolha para todos os cães com tumores de glândula
mamária, com exceção do carcinoma inflamatório ou na presença de metástases
distantes (RUTTEMAN et al, 2001; MISDORP, 2002). Realizada com ampla margem de
segurança é a modalidade de tratamento mais efetiva para o controle local do tumor e
que confere maior sobrevida para cadelas com câncer de mama (BIRCHARD, 1995;
MISDORP, 2002). O tipo de cirurgia dependerá da extensão da doença (RUTTEMAN et
al., 2001), do tamanho, localização, número e grau de infiltração dos tumores, além da
condição dos linfonodos regionais, idade do animal e
perspectiva do proprietário
(MISDORP, 2002).
A quimioterapia é realizada em todas as mulheres com câncer de mama com
risco de desenvolver metástase distante. No entanto, em cães com tumores mamários
de alto risco, ainda são necessários estudos prospectivos para avaliar a eficácia da
quimioterapia e quais drogas e protocolos são mais eficazes (SORENMO, 2003).
Em medicina veterinária, o aumento na casuística e a complexidade na evolução
clínica dos tumores de mama nas cadelas têm despertado interesse especial no estudo
dos fatores de prognóstico. Mas determinar o prognóstico do paciente canino com
neoplasia mamária pode ser difícil, já que o comportamento biológico desses tumores
11
varia consideravelmente (KURZMAN e GILBERTSON, 1986). Clinicamente, o câncer de
mama é uma doença heterogênea, ou seja, se expressa de forma muito variada em
cada paciente, e esta natureza heterogênea acarreta numa dificuldade não somente
para definir a cura da doença, mas também para determinar fatores de risco para o
desenvolvimento de metástases (WEIGELT et al., 2005). Dessa forma, a definição de
subpopulações de pacientes caninos com evoluções distintas de sobrevida facilitaria
não apenas a determinação do prognóstico, como também as melhores condutas
terapêuticas a serem adotadas (KURZMAN e GILBERTSON, 1986).
Estudos utilizando culturas celulares e modelos animais sugeriram que a E-
caderina é uma molécula supressora de tumor e de invasão neoplásica (KNUDSEN e
WHEELOCK, 2005). Isto também foi observado com o estudo da prevalência da perda
desta molécula em lesões precursoras não invasivas conhecidas como carcinomas
lobulares in situ (COWIN et al., 2005).
Em tumores mamários caninos parece existir uma significativa correlação entre a
perda de expressão da E-caderina e outros indicadores conhecidos de prognóstico
ruim, tais como tamanho do tumor, ulceração, tipo histológico, tipo de crescimento,
metástase em linfonodos e necrose, indicando que a perda da expressão da E-caderina
pode ter um valor prognóstico em neoplasias mamárias caninas (MATOS et al., 2006).
Baseando-se nessas evidências, parecer ser importante a influência que as
caderinas exercem no desenvolvimento da neoplasia e de suas metástases, com
especial atenção à E-caderina, pois é uma molécula responsável pela adesão das
células epiteliais, das quais a maioria dos tumores é derivada.
12
2.3 CADERINAS
As caderinas são proteínas transmembranosas (BERX e VAN ROY, 2001;
KNUDSEN e WHEELOCK, 2005), cálcio dependentes (LODISH et al., 2000; MATOS et
al., 2006), com função de promover adesão intercelular (KNUDSEN e WHEELOCK,
2005). São moléculas que promovem a manutenção da arquitetura tecidual normal
(MATOS et al., 2006). Existem mais de 40 caderinas diferentes conhecidas (LODISH et
al., 2000). As caderinas mais estudadas são as caderinas E (epitelial), P (placentária) e
N (neural), conhecidas como caderinas clássicas (ROWLANDS et al., 2000).
Os ductos e alvéolos mamários que se formam ainda na embriogênese são
duplamente revestidos por células epiteliais. Estas células se aderem umas às outras
pela E-caderina (BOUSSADIA et al., 2002). As células mioepiteliais, que envolvem a
camada luminal externa, se aderem umas às outras pela P-caderina (RADICE et al.,
1997). Sabe-se que a expressão da P-caderina é restrita ao mioepitélio nas glândulas
mamárias normais não lactantes de mulheres, porém tem sido observada em muitos
carcinomas ductais (SOLER et al., 2002). Esta observação pode ser um indicativo de
que as células tumorais têm características de células mioepiteliais ou de revestimento
(RADICE et al., 2003). Sabe-se também que a perda de expressão da P-caderina
resulta em uma alteração fenotípica da glândula mamária, levando a um
desenvolvimento precoce da glândula e diferenciação de células epiteliais (KNUDSEN e
WHEELOCK, 2005).
A E-caderina é um elemento da família das caderinas conhecida por
desempenhar um papel importante na regulação da adesão intercelular em tecidos
epiteliais (TAKEICHI, 1991; MATOS et al., 2006). É considerada a principal componente
na junção de aderência transmembranosa de células epiteliais de todos os órgãos,
13
como as células epiteliais luminais mamárias (TAKEICHI, 1991). Como a maioria dos
tumores de mama, tanto do homem como do cão, são de origem epitelial, a E-caderina
tem sido intensamente estudada em relação à sua função na gênese do tumor (MATOS
et al., 2006). Esta molécula parece também ser essencial para a diferenciação e
sobrevivência da célula epitelial alveolar, bem como para a função da glândula, pois foi
observado que a destruição da E-caderina do epitélio mamário em lactação resulta em
acentuada apoptose com concomitante perda da produção de leite (BOUSSADIA et al.,
2002).
2.3.1 Fisiopatologia das Caderinas
As E-caderinas possuem como principal função a união entre as células
epiteliais, e as P-caderinas a das células mioepiteliais. Esta expressão diferenciada da
E-caderina e P-caderinas produz dois compartimentos na glândula mamária, com
células epiteliais revestindo o lume e células mioepiteliais encobrindo a membrana
basal. Mas as caderinas clássicas não estão envolvidas em ligações entre as células
epiteliais e mioepiteliais. Esta função é realizada por uma subfamília de caderinas, as
caderinas desmossomais, as quais são componentes transmembranosas dos
desmossomos (PITELKA et al., 1973).
Os desmossomos unem as células epiteliais, as células mioepiteliais e os dois
tipos de células umas as outras, sendo essenciais para o estabelecimento do arranjo de
dupla camada (RUNSWICK et al., 2001). Suas uniões, localização celular e atividade
funcional são reguladas, em parte, pelos complexos clássicos de adesão das caderinas
(KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
14
Devido às suas interações homofílicas e expressão específica com o tipo celular,
as caderinas clássicas iniciam a adesão celular e promovem a seleção da célula,
enquanto que as caderinas desmossomais produzem resistência adicional para
interações celulares (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005), portanto, a perda da forte
adesão que os desmossomos promovem pode desencadear importante atuação na
disseminação das células tumorais, ou seja, a presença de desmossomos íntegros
também pode prevenir as metástases (COWIN et al., 2005; KNUDSEN e WHEELOCK,
2005).
Sabe-se que as células epiteliais normais expressam E-caderina. Entretanto
células tumorais que passam por transição de epitelial para mesenquimal podem iniciar
uma expressão inapropriada de N-caderina, uma proteína expressa normalmente em
tecidos de origem não epitelial que tem sido encontrada em células tumorais mamárias
(NIEMAN et al., 1999; CAVALLARO et al., 2002). A expressão da N-caderina leva a um
aumento da migração e invasão celular, estando a E-caderina presente ou não
(NIEMAN et al., 1999). A redução da E-caderina e o aumento da N-caderina alteram o
ambiente celular, mas não a morfologia que acompanha a transição de epitelial para
mesenquimal (MAEDA et al., 2005).
A atividade das caderinas é regulada por múltiplos mecanismos, incluindo a
interação com as cateninas, eventos de fosforilação e derramamento de conteúdo
extracelular (SOLER et al., 2002). Muitos estudos mostraram que hormônios esteróides
também regulam as caderinas. Sabendo-se que uma alteração na expressão do
estrógeno pode estar envolvida no aumento da transcrição da E-caderina, a relação
deste hormônio com a expressão da N- e da E-caderina tem sido bastante pesquisada
(ROWLANDS et al., 2000). Devido a essa repressão da E-caderina pelo estrógeno,
15
pode-se dizer que este hormônio também é responsável pela manutenção da
arquitetura epitelial (COWIN et al., 2005).
Além de expressarem a E-caderina, as células epiteliais que delineiam o lume
dos ductos e alvéolos expressam também as cateninas associadas α-, β-pacoglobinas
e p120 (DANIEL et al., 1995). A E-caderina é expressa na superfície basolateral destas
células epiteliais, no local de contato célula-célula (BRUNETTI et al., 2003). O complexo
caderina-catenina desempenha um importante papel na morfogênese e arquitetura
tecidual e na progressão do câncer. Esses complexos são conhecidos por influenciar as
metástases e a invasão das células neoplásicas por um processo envolvendo a perda
da adesão celular (YOSHIDA et al., 2001).
Os estudos recentes sobre a função da E-caderina mostraram importância desta
molécula também na redução da proliferação celular. Dois mecanismos de redução pela
E-caderina são conhecidos. No primeiro a E-caderina inibe a mitose, utilizando o
receptor do fator de crescimento epidermal, o qual regula o nível de p27 nas células.
P27 é uma proteína da família dos inibidores das quinases dependentes de ciclina que
medeia a interrupção do ciclo celular bloqueando a transição da fase G1 para a S
(TOYOSHIMA e HUNTER, 1994). O segundo mecanismo é mediado pela β-catenina,
que quando livre atua na transcrição celular. A quantidade desta catenina livre pode ser
originada da redução de expressão da E-caderina ou da mutação de genes (BRUNETTI
et al., 2005). A β-catenina tem uma função importante na organogênese e no câncer em
seres humanos devido à sua dupla função, pois atua tanto no complexo de adesividade
como na regulação de transdução ou transcrição (HATSELL et al., 2003).
Em lesões
mamárias caninas, a ausência ou baixa expressão de E-caderina foi associada com a
perda da expressão de β-catenina (BRUNETTI et al., 2005).
16
2.3.2 O Complexo E-caderina-Cateninas
A adesão celular mediada pela E-caderina requer, além da disponibilidade de
íons cálcio na superfície celular, da presença adequada de outras proteínas, como as
chamadas α-, β- e γ-cateninas, presentes no lado citoplasmático da membrana
plasmática, que ancoram a E-caderina ao citoesqueleto de actina (TAKEICHI, 1991).
Estas associações das caderinas clássicas com suas cateninas formam estruturas
identificadas pela microscopia como junções de aderências (KNUDSEN e WHEELOCK,
2005).
Estudos recentes têm fornecido importantes critérios de mecanismos a respeito
das expressões das caderinas e cateninas em cânceres de mama (COWIN et al.,
2005), existindo fortes evidências de que desempenham um papel vital nesta glândula
(KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
As cateninas α-, β- e p120 formam um complexo com a E-caderina em células
epiteliais mamárias (FIGURA 1). Em geral, a expressão e localização celular das
cateninas em cânceres mamários parecem corresponder com a presença ou ausência
da E-caderina (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
A presença da E-caderina nos tumores mamários só será funcional se formar um
complexo com as cateninas (HATSELL et al., 2003; KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
Quando o nível de E-caderina está normal no tumor, mas as cateninas estão ausentes
ou não estão interagindo com a caderina, a E-caderina não será efetiva na função de
adesão intercelular no tumor primário (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
A expressão de cateninas pode ser perdida em cânceres de mama com ausência
de expressão da caderina e, alterações na fosforilação da catenina podem
comprometer a adesão celular em cânceres caderina-positivos (COWIN et al., 2005).
17
Portanto, a simples presença de cateninas não é suficiente para mostrar que a E-
caderina é completamente funcional, já que aquelas podem ser alteradas após a
tradução para modificar as funções das caderinas (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
FIGURA 1 – Representação esquemática da interação do complexo E-caderina-
cateninas. A figura “A” representa a união de três células ligadas pela E-caderina. Em
maior aumento, na figura “B” está esquematizado a importância das cateninas alfa, beta
e p120 na ligação da E-caderina ao citoesqueleto de actina da célula para a formação
de adesão intercelular.
Fonte: Christine Hauer Piekarz, 2006.
Além de facilitar a adesão, as cateninas têm também função importante em vias
de sinalização celular transmembranosas (HATSELL et al., 2003). Como exemplo,
temos a dupla função das β-cateninas já citada anteriormente.
O entendimento das funções das caderinas e de suas cateninas associadas na
glândula mamária ainda não é completo. Sabe-se que elas atuam no desenvolvimento e
A
B
18
função da glândula mamária normal e que parecem influenciar o câncer de mama e sua
evolução clínica. Contudo, novos trabalhos são necessários para se compreender o uso
destas proteínas como indicadores de prognósticos no auxílio aos oncologistas para
delinear e selecionar a terapia mais efetiva e apropriada (KNUDSEN e WHEELOCK,
2005).
2.3.3 E-caderina como Indicadora de Prognóstico
Em medicina veterinária, o aumento na casuística e a complexidade na evolução
clínica dos tumores de mama nas cadelas têm despertado especial interesse no estudo
dos fatores de prognóstico. Determinar o prognóstico preciso do paciente canino
portador de neoplasia mamária pode ser difícil, uma vez que o comportamento biológico
desses tumores varia consideravelmente. Dessa forma, em animais, a definição de
subpopulações de pacientes com evoluções distintas de sobrevida facilitaria não
apenas a escolha das melhores condutas terapêuticas a serem adotadas, mas,
também, a determinação do prognóstico (KURZMAN e GILBERTSON, 1986).
A E-caderina, como mediadora de adesão intercelular, impede que as células de
um tumor primário se soltem e invadam locais próximos ou distantes (KNUDSEN e
WHEELOCK, 2005). Portanto, é a redução da expressão dessas moléculas um fator
facilitador da disseminação das células tumorais (BRUNETTI et al., 2003; KNUDSEN e
WHEELOCK, 2005), baseando-se nisso, é sugerido que a redução ou a ausência de
expressão da E-caderina nos tumores pode servir como um indicador de prognóstico
ruim. No entanto, trabalhos publicados mostram que há divergências a respeito da
expressão das E-caderinas como fator prognóstico (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
19
A perda de expressão da E-caderina parece ser um pré-requisito para a
ocorrência da disseminação de células tumorais, e pode ser causada por um
decréscimo transitório na expressão da molécula durante a fase inicial do
desenvolvimento da metástase ou pela emergência de clones celulares em tumores
primários com alterações genéticas levando à reduzida expressão da proteína (VAN
DER WURFF et al, 1994). Esta redução de expressão é causada pelo silenciamento
epigenético através da repressão de promotores da hipermetilação ou transcrição.
Porém, a complexidade das vias intracelulares que regulam o desempenho das
caderinas ainda não está completamente entendida, mas fatores chave da transcrição
com significativa ação no câncer de mama têm sido identificados (COWIN et al., 2005).
Em seres humanos a associação entre a perda ou redução da atividade de E-
caderina e a progressão de cânceres mamários esporádicos têm sido bastante
documentadas (COWIN et al., 2005). A expressão da E-caderina possui correlação, em
tumores mamários humanos, com o tipo histológico, fração de crescimento, e
expressão de p53, gene supressor de tumor capaz de ativar proteínas reparadoras do
DNA quando este é danificado, reconhecendo o local de dano do DNA na fase G1/S do
ciclo celular, e promovendo apoptose da célula danificada quando esta não pode ser
reparada (CHARPIN et al., 1997). No entanto, parece não haver correlação da
expressão da proteína com fatores clínicos como idade do paciente, menopausa e
tamanho do tumor (GURIEC et al., 1996). Segundo estes estudos, ainda é controversa
a associação da E-caderina com a presença de metástase nos linfonodos, o grau de
diferenciação, condição dos receptores hormonais e expressão de c-erbB-2 (uma
oncoproteína com alta expressão em vários adenocarcinomas requerida como indicador
20
de prognóstico ruim) (MATOS et al., 2006). Entretanto, em outros trabalhos, níveis
reduzidos de E-caderina têm indicado alto grau de malignidade (HEIMANN et al., 2000).
Geralmente, a expressão da E-caderina corresponde inversamente ao grau
histológico e, consequentemente, à diferenciação celular, porém não parece estar bem
correlacionada com a sobrevida (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005). Entretanto, outros
dois estudos, em seres humanos, indicaram que a redução na expressão de E-caderina
em carcinomas ductais infiltrativos de grau I e em carcinomas mamários de grau III foi
associada à baixa sobrevida da paciente (TAN et al., 1999; GILLETT et al., 2001).
Em metástases, tanto a E-caderina positiva quanto negativa têm sido relatadas.
Os estudos realizados com pacientes que apresentaram marcação negativa da E-
caderina nos linfonodos mostraram que a redução na expressão desta proteína está
correlacionada com menor período livre de metástases e com prognóstico ruim. Outros
relatos indicaram que a simples presença heterogênea da molécula na neoplasia já é
indicador de mau prognóstico. Já se observou que células das mais agressivas formas
de câncer de mama, câncer de mama inflamatório e carcinoma micropapilar invasivo,
muitas vezes apresentam uma expressão aumentada da E-caderina (KNUDSEN e
WHEELOCK, 2005). A expressão mais intensa da E-caderina nas metástases pode ser
devido à fixação das células no novo ambiente, para que possa estabelecer uma
arquitetura. Portanto, a re-expressão dessa molécula de adesão por células
neoplásicas, depois da liberação do local primário, pode ser necessária para a reunião
entre as células num órgão distante (BRUNETTI et al., 2003).
Um estudo em seres humanos sugere que os tumores com parcial ou total perda
da expressão de E-caderina são mais infiltrativos, de maior grau de malignidade e mais
prováveis de apresentarem disseminação para linfonodos (HEIMANN et al., 2000). Mas,
21
apesar de estudos anteriores terem correlacionado à baixa expressão de E-caderina
com propriedades invasivas, outras investigações têm observado que níveis de N-
caderina e caderina-11 aumentados são mais intimamente associados com a invasão,
motilidade e metástases de células do câncer de mama (NIEMAN et al, 1999). A N-
caderina pode facilitar a invasão e metástase por promover uma afinidade da célula
tumoral pelas células estromais e endoteliais (COWIN et al., 2005).
Duas pesquisas com tumores mamários caninos encontraram associação entre a
expressão da E-caderina e o tipo e a diferenciação tumoral (RESTUCCI et al., 1997;
REIS et al., 2003). Outro trabalho realizado com 60 casos de tumores mamários
caninos malignos, baseado na função da E-caderina e da β-catenina na invasão e
proliferação tumoral, foi observado que a redução destas duas moléculas parece
ocorrer paralelamente à ocorrência de invasividade, mas não indica correlação com a
proliferação celular. Além disso, estas proteínas pareceram ser indicadores de
prognóstico ruim no concernente à sobrevida (BRUNETTI et al., 2005).
Existe uma significativa associação entre a presença de necrose tumoral e perda
da expressão da E-caderina. Em cânceres mamários em seres humanos, a necrose
tumoral é associada à baixa sobrevida e rápida recorrência (MATOS et al., 2006).
Também foi encontrada uma importante associação entre tumores grandes (> 5 cm) e
perda da expressão de E-caderina. A redução na expressão também foi associada por
estes autores à ulceração tumoral, que frequentemente ocorre em tumores malignos
mais agressivos (RUTTEMAN et al., 2001).
Em um estudo realizado com 77 tumores mamários malignos e 131 linfonodos
locais e regionais de 45 fêmeas caninas, demonstrou-se que 48% dos tumores
apresentaram redução na expressão da E-caderina. A redução da expressão foi
22
significativamente relacionada ao tamanho do tumor e à presença de ulceração, mas
não à ocorrência de aderência em tecidos adjacentes. Os tumores com diâmetro menor
que 3 centímetros diferenciaram-se dos maiores por apresentarem uma expressão
significativamente maior de E-caderina. As neoplasias com ulcerações apresentaram
menor expressão que os não ulcerados. Importante redução de expressão também foi
associada com a presença de metástase para linfonodos e presença de necrose
(MATOS et al., 2006). No entanto, em cães, a associação das E-caderinas com
metástases ainda é controversa, pois em um estudo com cães acometidos por
carcinomas mamários com metástase para linfonodos regionais, os resultados
mostraram imunomarcação da E-caderina tanto nos tumores primários como nos
linfonodos com metástases (BRUNETTI et al., 2003).
Cânceres caracterizados por crescimento infiltrativo apresentaram expressão
significativamente mais baixa que os de crescimento ordenado. Invasão vascular
também foi associada com baixa expressão de E-caderina quando comparada com
crescimento expansivo ou crescimento infiltrativo sem invasão vascular (MATOS et al.,
2006), porém, essa associação em seres humanos entre a expressão de E-caderina e
invasão vascular de tumores mamários ainda é contraditória (PARKER et al., 2001;
GUPTA et al., 2003). Outros dois estudos indicaram que os tumores bem diferenciados
(grau I) apresentaram maior expressão de E-caderina que os menos diferenciados
(graus II e III). Deste modo foi encontrada importante relação na expressão da E-
caderina com o tipo histológico de neoplasias mamárias caninas, indicando que existe
diferença significativa de expressão entre um grupo de tumores menos diferenciados e
um grupo de tumores moderadamente e bem diferenciados (REIS et al., 2003; MATOS
et al., 2006).
23
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 SELEÇÃO DOS CASOS
No presente estudo foi utilizado casos clínicos em estudo retrospectivo de
neoplasias mamárias em cadelas. Para isso foram selecionados 50 casos de cadelas
com o diagnóstico histopatológico de neoplasia mamária, sendo 30 pacientes
submetidas à cirurgia para exérese neoplásica no período de 1999 a 2004 no Serviço
de Oncologia do Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná (HV-UFPR),
10 pacientes selecionadas no Serviço de Patologia do HV-UFPR e 10 do Serviço de
Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) –
UNESP Campus de Botucatu.
As amostras foram divididas em cinco grupos de 10 animais cada, de acordo
com a classificação histopatológica e característica clínica do tumor de acordo com
MOULTON, 1990. O grupo controle foi formado com 5 amostras de tecido glandular
mamário normal obtidos por necropsia de cadelas com ausência de neoplasias
mamárias (TABELA 1).
A anamnese e ficha de identificação dos pacientes com tumores mamários foram
registradas, quando possível (casos de adenoma, carcinoma com prognóstico bom e
carcinoma com prognóstico ruim), tendo por base as fichas clínicas de atendimento.
Dentre as informações, foram tabulados a raça, idade, o início do desenvolvimento do
tumor, a realização de ovariosalpingoisterectomia prévia, a freqüência da administração
de anticoncepcional, ocorrência de pseudocieses e gestações e a forma de
alimentação. Também foram obtidos, junto à ficha clínica, o exame físico pré-operatório,
24
quanto ao número de tumores encontrados na paciente, tamanho da(s) neoplasia(s), a
ocorrência de ulceração do tumor e a sua localização ao longo da cadeia mamária.
TABELA 1 – Grupos utilizados no presente estudo segundo a classificação histológica
de acordo com MOULTON (1990) e as características clínicas da neoplasia mamária.
GRUPO N°. de CASOS CRITÉRIOS DE SELEÇÃO
Adenoma 10 Animais com laudo histopatológico de Adenoma
Carcinoma com
prognóstico bom
10 Animais que durante o período de
acompanhamento pós-operatório não
apresentaram recidiva e/ou metástase
Carcinoma com
prognóstico ruim
10 Animais que durante o período de
acompanhamento pós-operatório apresentaram
recidiva e/ou metástases
Carcinoma com metástase
pulmonar
10 Animais com laudo necroscópico de Carcinoma
mamário primário e metástase pulmonar
Carcinoma inflamatório 10 Animais com laudo necroscópico de Carcinoma
Inflamatório
Controle 05 Tecido mamário com ausência de neoplasia
TOTAL 55
A anamnese e exame físico das pacientes desses três grupos foram realizados
pelos respectivos serviços clínicos mencionados, e registrados na ficha individual de
cada paciente. A avaliação radiográfica do tórax e ultra-sonográfica do abdome com a
presença ou não de metástases nestas cavidades foram realizadas para o
estadiamento clínico das neoplasias mamárias, segundo o sistema TNM (Tumor/
Linfonodo/ Metástase) proposto pela OMS (OWEN, 1980). Este estadiamento dos
tumores mamários, graduado em quatro estádios – I, II, III e IV – sendo o de grau IV de
25
maior malignidade, é fundamental para avaliar a possibilidade de progressão do tumor
para os principais locais de ocorrência de metástases, como os linfonodos ou pulmão,
portanto, foi importante para determinar a malignidade dos tumores estudados
(KITCHELL, 1995).
Após a realização do estadiamento da doença e análise de todos os resultados
obtidos nas avaliações citadas anteriormente, executou-se o procedimento cirúrgico. A
mastectomia foi realizada com amplas margens de segurança, ressecando-se entre 2 a
3 cm de tecido normal perineoplásico. Quando possível, foi realizada a remoção dos
linfonodos satélites. Após cirurgia adequada para cada caso específico, efetuou-se a
colheita das amostras contendo tecido neoplásico para a classificação da histogênese
tumoral.
A evolução da afecção neoplásica (presença ou ausência de recidiva e/ou
metástase; paciente vivo ou morto) foi avaliada trimestralmente no período pós-
operatório através de exames clínico e complementares no HV-UFPR. Para o presente
estudo, este monitoramento foi finalizado no mês de dezembro de 2006, quando foram
preenchidas fichas de estadiamento clínico para cada animal (ANEXO 1) e calculada a
sobrevida de cada paciente.
As amostras dos animais dos demais grupos foram obtidas através da necropsia
(carcinoma com metástase pulmonar, carcinoma inflamatório e controle). Estes animais
não foram previamente submetidos à anamnese, exame clínico, tratamento cirúrgico ou
acompanhamento para a obtenção de dados clínicos como as pacientes dos grupos
anteriores.
Os tecidos neoplásicos de todos os animais, dos seis grupos, foram fixados em
formol 10% tamponado com fosfato (pH 7,2) imediatamente após a sua extirpação
26
cirúrgica ou na necropsia. Após um período de fixação de aproximadamente oito horas,
o material foi colocado em álcool 80%, seguindo-se procedimentos usuais para inclusão
em parafina. Cortes de cinco micrômetros de espessura corados pela hematoxilina-
eosina foram utilizados para diagnóstico e classificação histológica dos tumores,
seguindo os critérios de MOULTON (1990).
3.2 IMUNOISTOQUÍMICA
As amostras previamente fixadas e embebidas em parafina foram submetidas a
cortes de 4 µm de espessura, e distendidas em lâminas histológicas devidamente
preparadas com Poly-L-Lysine (Sigma P8920), para promover maior aderência dos
cortes às lâminas de vidro. As lâminas foram mantidas em estufa a 60
o
C durante 24
horas até o seu processamento que foi feito segundo o protocolo do Laboratório de
Imunoistoquímica do Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia (FMVZ) – UNESP, Campus de Botucatu, utilizando-se a técnica
de estreptoavidina-biotina-peroxidase
(ANEXO 2).
Para a avaliação da expressão da E-caderina nos tecidos por imunoistoquímica foi
utilizado o anticorpo primário
monoclonal E-caderina de camundongo, clone 36B5,
isotipo IgG1, para tecidos inclusos em parafina (NCL-E-Cad, Novocastra, EUA), e o
anticorpo secundário universal, IgG de coelho e camundongo, Avidina DH e enzima
biotinilada (EP-ABCu, Novocastra-EasyPath, EUA).
3.3 LEITURA DA EXPRESSÃO DA E-CADERINA
Todas as lâminas foram analisadas com o uso de microscópio óptico com maior
atenção à área do epitélio neoplásico.
27
As lâminas foram avaliadas de acordo com a presença ou ausência de
expressão, e quando presente a intensidade da expressão nas células epiteliais,
levando-se em consideração somente o tecido neoplásico. O Grau de expressão da E-
caderina avaliadas em todo o tecido neoplásico presente em cada lâmina,
foi dividido
em 5 grupos de acordo com a intensidade de expressão: negativo (-) quando 0% -
ausência de expressão, e positivos: (+) quando 1-25% - expressão muito baixa, (++)
quando 26-50% - baixa, (+++) quando 50-75% - mediana, e (++++) quando 76-100% -
normal.
Como controle negativo foram feitas duas lâminas substituindo o anticorpo
primário por BSA e imunoglobulina de camundongo.
Na análise das lâminas foram buscadas áreas de tecido epitelial não neoplásico
para se ter um controle positivo em cada amostra (FIGURA 2 e FIGURA 3). Nas
amostras tidas com expressão normal, foi observada a presença de E-caderina entre
mais de 75% das células epiteliais da área neoplásica (FIGURA 4 e FIGURA 5). A
expressão mediana foi constatada quando houve uma expressão da E-caderina em
mais de 50% das células epiteliais neoplásicas, porém pelo menos 15% das células não
expressaram a proteína (FIGURA 6). A marcação muito fraca foi tida quando
pouquíssimas células, no máximo 25%, expressaram a molécula (FIGURA 7 e FIGURA
8). E a marcação negativa quando a expressão não foi encontrada entre as células
epiteliais de toda a área neoplásica (FIGURA 9, FIGURA 10 e FIGURA 11).
28
FIGURA 2 –
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica para ilustrar o controle
positivo da expressão da proteína. Observar a marcação para a atividade da E-caderina
entre células epiteliais de um folículo piloso. Carcinoma mamário em cadela. Aumento:
400 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
FIGURA 3 –
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica. Observar a marcação de
E-caderina entre as células epiteliais normais da epiderme. Controle positivo da
expressão da E-caderina na lâmina de um carcinoma inflamatório mamário em cadela
que não expressou a proteína. Aumento: 400 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
29
FIGURA 4 – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de tecido mamário
normal (++++) de cadela. Observar a marcação normal para a atividade da E-caderina
entre células epiteliais da glândula mamária. Aumento: 400 vezes. UNESP – Botucatu,
SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
FIGURA 5 –
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um adenoma mamário
em cadela. Observar a marcação normal (++++) para a atividade da E-caderina entre
células epiteliais da glândula mamária de tecido neoplásico. Aumento: 400 vezes.
UNESP – Botucatu, SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
30
FIGURA 6 -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um carcinoma
mamário em cadela. Observar a marcação mediana (+++) para a atividade da E-
caderina entre células epiteliais da glândula mamária de tecido neoplásico. Aumento:
200 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
FIGURA 7 -
Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de metástase pulmonar
de um carcinoma mamário em cadela. Observar a marcação muito fraca (+) para a
atividade da E-caderina entre células epiteliais do tecido neoplásico metastático.
Aumento: 400 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
31
FIGURA 8 - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um carcinoma
inflamatório mamário em cadela. Observar marcação muito baixa (+) para a atividade
da E-caderina entre células epiteliais da glândula mamária do tecido neoplásico.
Aumento: 400 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
FIGURA 9 - Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de metástase pulmonar
de um carcinoma mamário em cadela. Observar a ausência de marcação (-) para a
atividade da E-caderina entre células epiteliais do tecido neoplásico metastático.
Aumento: 400 vezes. UNESP – Botucatu, SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
32
FIGURA 10 – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um carcinoma
inflamatório mamário em cadela. Observar a ausência de marcação (-) para a atividade
da E-caderina entre células epiteliais da glândula mamária do tecido neoplásico,
mostrando apenas marcações inespecíficas (flecha). Aumento: 400 vezes. UNESP –
Botucatu, SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
FIGURA 11 – Fotomicrografia de preparação imunoistoquímica de um carcinoma
inflamatório mamário em cadela com ausência de expressão da E-caderina. Observar o
êmbolo neoplásico formado, indicado pela flecha. Aumento: 400 vezes. UNESP –
Botucatu, SP, 2006.
Fonte: Christine Piekarz, 2006
33
4 RESULTADOS
4.1 DADOS DE FREQÜÊNCIA DE ACORDO COM OS GRUPOS
HISTOPATOLÓGICOS
Tendo por base o total de neoplasias mamárias avaliadas no presente estudo,
verificou-se maior ocorrência em cadelas sem raça definida (40%), as raças mais
acometidas foram Poodle (20%) e Pastor Alemão (10%). A prevalência que as raças
incluídas neste estudo apresentaram para o desenvolvimento de neoplasias mamárias
(adenoma, carcinoma com prognóstico bom e carcinoma com prognóstico ruim) está
representada na FIGURA 12.
FIGURA 12 – Freqüência de neoplasias mamárias, distribuídas conforme a raça, em
cadelas atendidas junto ao Hospital Veterinário da UFPR, campus de Curitiba, no
período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
número de animais
Adenoma Carcinoma com
prognóstico bom
Carcinoma com
prognóstico ruim
Raças acometidas nos 3 primeiros grupos
SRD Daschund Beagle Poodle Doberman
Cocker Rottweiler Pastor Alemão Dog Alemão
SRD = Animais Sem Raça Definida
34
A média de idade das cadelas acometidas pelas neoplasias mamárias dos
grupos Adenoma, Carcinoma com prognóstico bom e Carcinoma com prognóstico ruim,
neste estudo, foi de 9,1 anos, com uma variação entre 4 e 15 anos. Os dados
referentes à idade de cada animal estão tabulados na TABELA 2.
TABELA 2 – Prevalência de neoplasias mamárias, distribuídas conforme a idade, em
cadelas atendidas junto ao Hospital Veterinário da UFPR, campus de Curitiba, no
período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.
Adenoma
CA sem recidiva/metástase CA com recidiva/metástase
9 9 13
6 12 7
4 13 15
10 8 5
12 6 12
5 6 10
8 7 10
8 7 11
13 9 12
Idade
das
cadelas
7 15 6
Média
8,2 9,2 10,1
Média geral 9,1
4.1.1 Adenoma
Os animais acometidos apresentaram uma média de 8,2 anos, com variação de 4
a 13 anos. Quanto ao tamanho do tumor, 60% apresentaram nódulos < 3 cm, 30%
entre 3 e 5 cm e 10% > 5 cm. Apenas uma cadela (10%) apresentou ulceração do
tumor. Até o último contato, em dezembro de 2006, 80% das pacientes apresentaram-
se com vida. Das dez cadelas avaliadas, três (30%) apresentaram sinal de recorrência
da doença, sete (70%) nunca tiveram gestação, oito (80%) nunca fizeram o uso de
anticoncepcional, e nenhuma era castrada até o momento da mastectomia. Já quanto à
35
sobrevida, todas (100%) tiveram mais de 24 meses, sendo que 30% apresentaram
sobrevida maior de 36 meses (TABELA 3).
4.1.2 Carcinomas com prognóstico bom
Os animais acometidos apresentaram uma média de 9,2 anos, com variação de
6 a 15 anos. Quanto ao tamanho do tumor, das dez cadelas deste grupo, quatro (40%)
apresentaram nódulos < 3 cm, 20% entre 3 e 5 cm e 40% > 5 cm e três (30%)
apresentaram ulceração do tumor. Até o último contato, em dezembro de 2006, seis
(60%) das pacientes apresentavam-se com vida. Das dez cadelas avaliadas, seis (60%)
gestaram pelo menos uma vez, oito (80%) nunca fizeram o uso de anticoncepcional, e
nenhuma era castrada até o momento da mastectomia. Já quanto à sobrevida, apenas
duas (20%) viveram menos de 24 meses, cinco (50%) apresentaram sobrevida de pelo
menos 24 meses e três (30%) de pelo menos 36 meses (TABELA 3).
4.1.3 Carcinomas com prognóstico ruim
Os animais acometidos apresentaram uma média de 10,1 anos, com variação de
5 a 15 anos. Quanto ao tamanho do tumor, apenas duas (20%), das dez pacientes,
apresentaram nódulos < 3 cm, 30% entre 3 e 5 cm e 50% > 5 cm e quatro cadelas
(40%) apresentaram ulceração do tumor. Até o último contato, em dezembro de 2006,
90% das pacientes já haviam morrido. Das dez cadelas avaliadas, quatro (40%)
gestaram pelo menos uma vez, sete (70%) nunca fizeram o uso de anticoncepcional, e
nenhuma era castrada até o momento da mastectomia. Já quanto à sobrevida, três
(30%) dos animais tiveram sobrevida de menos de 12 meses, quatro (40%) entre 12 e
24 meses e três (30%) entre 24 e 36 meses (TABELA 3).
36
TABELA 3 – Informações relativas ao histórico (gestação, anticoncepcional,
pseudociese e ovariosalpingoisterectomia) e dados clínicos das cadelas com neoplasia
mamária atendidas no Hospital Veterinário da UFPR, campus de Curitiba, no período de
janeiro de 2002 a dezembro de 2004.
DADOS DA PACIENTE ADENOMA
CARCINOMA COM
PROGNÓSTICO
BOM
CARCINOMA COM
PROGNÓSTICO
RUIM
< 3cm 6 4 2
3-5 cm 3 2 3
Tamanho do tumor
> 5cm 1 4 5
TOTAL 10 10 10
ulcerado 1 3 4
Ulceração
não ulcerado 9 7 6
TOTAL 10 10 10
SIM 3 6 4
NÃO 7 3 3
Gestação
não informado 0 1 3
TOTAL 10 10 10
SIM 2 2 2
NÃO 8 6 6
Anticoncepcional
não informado 0 2 2
TOTAL 10 10 10
SIM 6 5 3
Pseudociese
NÃO 4 5 7
TOTAL 10 10 10
SIM 0 0 0
NÃO 6 8 7
Durante mastectomia 3 2 1
Ovariosalpingo-
isterectomia
não informado 1 0 2
TOTAL 10 10 10
VIVO 8 6 1
Condição atual
MORTO 2 4 9
TOTAL 10 10 10
< 12 meses 0 1 3
13-24 meses 3 2 4
25-36 meses 4 5 3
37-48 meses 2 2 0
> 49 meses 1 0 0
Sobrevida geral
não informado 0 0 0
TOTAL 10 10 10
37
A FIGURA 13 ilustra a distribuição dos grupos neoplásicos adenoma,
carcinoma com prognóstico bom e carcinoma com prognóstico ruim de acordo com o
tamanho do tumor e a FIGURA 14 a ocorrência de ulceração nestes mesmos grupos.
0
1
2
3
4
5
6
Número de
animais
< 3cm 3-5 cm > 5cm
Tamanho do tumor
Adenoma
Carcinoma com
prognóstico bom
Carcinoma com
prognóstico ruim
FIGURA
13
–
Freqüência das neoplasias mamárias conforme o tamanho do tumor,
nos
grupos estudados Adenoma, Carcinoma com prognóstico bom e Carcinoma com
prognóstico ruim.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
N úmero
d e animais
ulcerado não ulcerado
Adenoma
Car cinoma com prognóstico bom
Car cinoma com prognóstico r uim
FIGURA
14
-
Freqüência da ocorrência de ulceração nos
grupos estudados Adenoma,
Carcinoma com prognóstico bom e Carcinoma com prognóstico ruim.
38
4.1.4 Carcinomas com metástase pulmonar e Carcinomas inflamatórios
Não foi possível determinar os dados de prevalência destes dois grupos devido à
ausência de ficha clínica, pois estes animais foram encaminhados diretamente ao
serviço de patologia para necropsia. Quanto ao estadiamento clínico, todas as
pacientes ficaram com grau IV, uma vez que todas tinham metástase (MOULTON,
1990).
4.2 ESTADIAMENTO CLÍNICO
Os dados de estadiamento clínico estão apresentados de acordo com a
classificação histopatológica e comportamento clínico das neoplasias. Seis animais
(60%) do grupo adenoma (TABELA 4) apresentavam estágio clínico I, três animais
(30%) estágio clínico II e um animal (10%) estágio clínico III. No grupo de carcinoma
mamário com prognóstico bom (TABELA 5), quatro cadelas (40%) apresentavam
estágio I, duas cadelas (20%) estágio II e quatro cadelas (40%) estágio III. Nos animais
do grupo carcinoma mamário com prognóstico ruim (TABELA 6), dois pacientes (20%)
receberam estágio I, dois pacientes (20%) estágio II, cinco pacientes (50%) estágio III e
um paciente (10%) estágio IV.
39
TABELA 4 – Estágio clínico das cadelas portadoras de adenomas mamários seguindo
o Sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/ Metástase) proposto pela OMS (OWEN, 1980).
TABELA 5 – Estágio clínico das cadelas portadoras de carcinoma mamário com
prognóstico bom seguindo o Sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/ Metástase) proposto pela
OMS (OWEN, 1980).
Exame Tamanho
do tumor
Linfonodo Metástase Estágio
clínico
H05/02 T1 N0 M0 I
03-1492 T1 N0 M0 I
H061/03 T2 N0 M0 II
H121/03 T1 N0 M0 I
H191/03 T1 N0 M0 I
H077/04 T2 N0 M0 II
H075/04 T3 N0 M0 III
H098/04 T1 N0 M0 I
H112/04 T1 N0 M0 I
H137/04 T2 N0 M0 II
Exame Tamanho do
tumor
Linfonodo Metástase Estágio
clínico
H223/02 T3 N0 M0 III
H256/02 T3 N0 M0 III
H179/03 T1 N0 M0 I
H167/03 T1 N0 M0 I
H013/04 T2 N0 M0 II
H059/04 T2 N0 M0 II
H81/04 T1 N0 M0 I
H095/04 T3 N0 M0 III
H111/04 T3 N0 M0 III
H128/04 T1 N0 M0 I
40
TABELA 6 – Estágio clínico das cadelas portadoras de carcinoma mamário com
prognóstico ruim seguindo o Sistema TNM (Tumor/ Linfonodo/ Metástase) proposto pela
OMS (OWEN, 1980).
4.3 IMUNOISTOQUÍMICA
O resultado da avaliação imunoistoquímica de acordo com os grupos estudados e
o grau de expressão da E-caderina está apresentado na TABELA 7. Para melhor
apreciação da referida tabela, os dados estão apresentados também na FIGURA 15.
Exame Tamanho
do tumor
Linfonodo Metástases Estágio
clínico
7436 T2 N1 M0 II
H169/03 T3 N0 M0 III
H-265 T3 N1 M0 III
H34/03 T3 N1 M0 III
H42/03 T3 N0 M0 III
H69/03 T3 N1 M0 III
H174/03 T1 N0 M0 I
H157/03 T1 N0 M0 I
05-0652 T2 N1 M1 IV
H120/04 T2 N0 M0 II
41
TABELA 7 – Porcentagem de expressão da E-caderina por categoria tumoral nas neoplasias mamárias de cadelas
atendidas no Hospital Veterinário da UFPR, campus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.
Número (e porcentagem) de tumores que apresentaram
as diferentes expressões da E-caderina
Tipo histológico
Número de
tumores
0% 1-25% 26-50% 51-75% 76-100%
Adenoma
8 0 0 1 (12,5%)
1 (12,5%)
6 (75%)
Carcinoma com prognóstico bom
8 0 1 (12,5%) 0 4 (50%) 3 (37,5%)
Carcinoma com prognóstico ruim
8 0 0 1 (12,5%)
0 7 (87,5%)
Tecido mamário
10 0 2 (20%) 2 (20%) 1 (10%) 5 (50%) Carcinoma com metástase
pulmonar
Tecido pulmonar
10 2 (20%) 2 (20%) 0 3 (30%) 3 (30%)
Carcinoma inflamatório
10 3 (30%) 2 (20%) 2 (20%) 2 (20%) 1 (10%)
Controle
5 0 0 0 0 5 (100%)
42
FIGURA 15 – Grau de expressão da E-caderina, distribuída de acordo com os grupos
estudados (Adenoma, Carcinoma com prognóstico bom, Carcinoma com prognóstico
ruim, Carcinoma com metástase pulmonar – tecido mamário, Carcinoma com
metástase pulmonar – tecido pulmonar, Carcinoma Inflamatório e Controle).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle Adenoma Carcinoma com
prognóstico bom
Carcinoma com
prognóstico ruim
Carcinoma com
metástase
pulmonar
(mama)
Carcinoma com
metástase
pulmonar
(pulmão)
Carcinoma
Inflamatório
0%
1-25%
26-50%
51-75%
76-100%
A avaliação da expressão da E-caderina de acordo as variáveis clínicas, não
considerando os grupos histológicos, estão descritas na TABELA 8. Das pacientes
portadoras de nódulos menores de 3 cm, 63% apresentaram expressão da E-caderina
entre 76-100%, 60% dos nódulos que se apresentavam entre 3 e 5 cm e maiores que 5
cm expressaram entre 76-100%, estes dados podem ser melhor visualizados na
FIGURA 16. Quanto à ulceração dos tumores, 75% dos nódulos que se apresentaram
ulcerados expressaram a E-caderina entre 76-100%, enquanto 55% dos nódulos não
Porcenta
-
gem de
animais
43
ulcerados expressaram esta porcentagem (FIGURA 17). Das pacientes que
apresentaram sobrevida menor de 24 meses, 55% expressaram a E-caderina entre 76-
100%. As 45% restantes tiveram expressão menor de 50%. No entanto, 65% dos
animais que tiveram sobrevida maior de 24 meses expressaram entre 76-100%, em
contrapartida apenas 5% apresentaram expressão menor de 50%, sendo que 30%
apresentaram expressão entre 51-75%. De acordo com o grau histológico das
neoplasias de cada animal, 80% das pacientes portadores de tumores de grau I
expressaram entre 76-100%, esta mesma expressão foi observada em 33% dos
tumores de grau II, em 60% dos de grau III e 33% dos de grau IV (FIGURA 18).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
1-25% 26-50% 51-75% 76-100%
Tamanho: < 3 cm Tamanho: 3-5 cm Tamanho: > 5 cm
FIGURA
16
–
Freqüência do grau de expressão da E-
caderina, distribuída de acordo
com o tamanho das neoplasias dos grupos estudados
(Adenoma, Carcinoma com
prognóstico bom, Carcinoma com prognóstico ruim).
44
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Porcentagem
de animais
ulcerado não ulcerado
1-25% 26-50% 51-75% 76-100%
FIGURA
17
–
Freqüência do grau de expressão da E-caderina, distribuída de ac
ordo
com a ocorrência de ulceração nas neoplasias dos grupos estudados
(Adenoma,
Carcinoma com prognóstico bom, Carcinoma com prognóstico ruim).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
I II III IV
0% 1-25% 26-50% 51-75% 76-100%
FIGURA
18
–
Grau de expressão da E-
caderina, distribuída de acordo com o grau da
doença (TNM) neoplásica dos grupos estudados (Adenoma, Carcin
oma com
prognóstico bom, Carcinoma com prognóstico ruim, Carcinoma com metástase
pulmonar – tecido mamário e tecido pulmonar e Carcinoma Inflamatório).
45
TABELA 8 – Expressão da E-caderina de acordo com as variáveis clínicas tamanho do
tumor, ulceração e sobrevida dos grupos Adenoma, Carcinoma com prognóstico bom e
Carcinoma com prognóstico ruim e estadiamento dos grupos Adenoma, Carcinoma com
prognóstico bom, Carcinoma com prognóstico ruim, Carcinoma com metástase
pulmonar e Carcinoma inflamatório.
Variável clínica Número de
tumores
Número (e porcentagem) de tumores que
apresentaram as diferentes expressões de E-
caderina
0% 1-25% 26-50%
51-75%
76-100%
Tamanho (cm):
< 3
10 0 1 (10%)
0 2 (20%)
7 (70%)
3-5
5 0 0 2 (40%)
0 3 (60%)
> 5
9 0 0 0 3 (33%)
6 (67%)
Ulceração:
Presente
7 0 0 0 1 (14%)
6 (86%)
Ausente
17 0 1 (6%) 2 (12%)
4 (23%)
10 (59%)
Sobrevida (meses):
até 12
2 0 0 0 0 2 (100%)
de 13 a 24
5 0 0 2 (40%)
0 3 (60%)
pelo menos 24
11 0 1 (9%) 0 2 (18%)
8 (73%)
pelo menos 36
5 0 0 0 3 (60%)
2 (40%)
pelo menos 48
1 0 0 0 0 1 (100%)
Estadiamento (grau):
I
10 0 1 (10%)
0 1 (10%)
8 (80%)
II
3 0 0 2 (67%)
0 1 (33%)
III
10 0 0 1 (10%)
3 (30%)
6 (60%)
IV
21 3 (14%)
4 (19%)
4 (19%)
3 (14%)
7 (33%)
OBS. A expressão registrada nesta tabela do grupo Carcinoma com metástase pulmonar (de grau IV) foi
referente apenas à expressão da E-caderina nos tumores mamários e não nos pulmonares.
46
Não foi possível obter resultado de dois animais dos grupos Adenoma, dois do
Carcinoma com prognóstico bom e dois do Carcinoma com prognóstico ruim devido a
problemas com a amostra tecidual.
Na TABELA 9 estão listados os resultados da expressão da E-caderina no grupo
Adenoma relacionado às variáveis clínicas de cada paciente. A TABELA 10 demonstra
os resultados da expressão da E-caderina no grupo Carcinoma com prognóstico bom. E
a TABELA 11 os resultados da expressão da E-caderina no grupo Carcinoma com
prognóstico ruim.
O resultado da expressão de cada animal dos grupos Carcinoma com metástase
pulmonar e Carcinoma inflamatório estão registrados na TABELA 12 e TABELA 13,
respectivamente.
47
TABELA 9 – Expressão da E-caderina nos Adenomas de cadelas atendidas no Hospital Veterinário da UFPR, campus de
Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.
Dados do Animal
Dados do Tumor
Marcação
Registro Idade (anos) Sobrevida (meses) Tamanho (cm) Ulceração Recidiva Grau E-Caderina
H 112/04 13 > 24 < 3 Não Não I ++++
H 121/03 10 > 39 < 3 Não Sim I +++
H 137/04 7 > 20 3-5 Não Não II ++
H 61/03 4 > 43 3-5 Não Não II ++++
H 98/04 8 > 24 < 3 Não Sim I ++++
H 75/04 8 > 24 > 5 Sim Não III ++++
3-1492 6 24 < 3 Não Não I ++++
H05/02 9 > 55 < 3 Não Não I ++++
H 191/03 12 20 < 3 Não Não I NR
H 77/04 5 > 24 3-5 Não Sim II NR
NR= não realizado
48
TABELA 10 – Expressão da E-caderina nos Carcinomas com prognóstico bom de tecido mamário de cadelas atendidas
no Hospital Veterinário da UFPR, campus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.
Dados do Animal
Dados do Tumor
Marcação
Registro Idade (anos)
Sobrevida (meses) Tamanho (cm) Ulceração Recidiva Grau E-Caderina
H 81/04 7 > 24 < 3 Não Não I +
H 256/02 12 > 37 > 5 Sim Não III +++
H 179/03 8 20 < 3 Não Não I ++++
H 95/04 7 > 24 > 5 Sim Não III ++++
H 111/04 9 > 20 > 5 Não Não III +++
H 167/03 6 29 3-5 Sim Não I ++++
H 013/04 6 30 < 3 Não Não II +++
H 223/02 9 38 > 5 Não Não III +++
H 59/04 13 > 25 3-5 Não Não II NR
H 128/04 15 10 < 3 Não Não I NR
NR = não realizado
49
TABELA 11 – Expressão da E-caderina nos Carcinomas com prognóstico ruim de cadelas atendidas no Hospital
Veterinário da UFPR, campus de Curitiba, no período de janeiro de 2002 a dezembro de 2004.
Dados do Animal
Dados do Tumor
Marcação
Registro Idade (anos)
Sobrevida (meses) Tamanho (cm) Ulceração Recidiva
Grau E-Caderina
7436
13 14 3-5 Não II ++
H 69/03
10 5 > 5 Sim Sim III ++++
H 265/02
15 36 > 5 Não Não III ++++
H 157/03
12 19 < 3 Não Sim I ++++
05-0652
12 3 3-5 Não Não IV ++++
H 174/03
11 14 < 3 Não Sim I ++++
H 34/03
5 28 > 5 Sim Sim III ++++
H 169/03
7 32 > 5 Sim Sim III ++++
H 120/04
6 > 22 3-5 Sim Sim II NR
H 42/03
10 6 > 5 Sim Sim III NR
NR = não realizado
50
TABELA 12 –
Expressão da E-caderina nos Carcinomas com metástase pulmonar de
cadelas recebidas pelo Serviço de Patologia Veterinária do Hospital Veterinário da
UFPR, campus de Curitiba.
Registro
Tecido Grau Marcação
19.240 Mamas IV ++++
19.240 Pulmão IV +++
6923 Mama IV ++++
6923 Pulmão IV ++++
7728 Mama IV +++
7728 Pulmão IV +
6747 Mama IV ++++
6747 Pulmão IV +
H 291/02
Mama IV +
H 291/02
Pulmão IV -
7067 Mama IV ++
7067 Pulmão IV +++
18.201 Mama IV ++++
18.201 Pulmão IV ++++
24.041 Mama IV ++++
24.041 Pulmão IV ++++
21.256 Mama IV +
21.256 Pulmão IV +++
20.474 Mama IV ++
20.474 Pulmão IV -
51
TABELA 13 – Expressão da E-caderina nos Carcinomas Inflamatórios de cadelas
recebidas pelo Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da UNESP, campus de Botucatu.
Registro Tecido Grau Marcação
E 10.043 Mama IV +
PV 30.712 Mama IV -
E 6347 Mama IV ++
E 6479 Mama IV -
E 9216 Mama IV +
E 7053 Mama IV -
E 10.365 Mama IV ++++
E 9761 Mama IV +++
E 11.323 Mama IV +++
E 10.516 Mama IV ++
52
5 DISCUSSÃO
As cadelas portadoras de neoplasias mamárias que prevaleceram neste estudo
eram sem raça definida (SRD), correspondendo a 40% dos animais. As raças Poodle e
Pastor Alemão corresponderam a 20% e 10%, respectivamente, dos animais
estudados. Estes dados são semelhantes aos de RUTTEMAN et al. (2001) que
indicaram o Poodle, o Pastor Alemão, o Cocker Spaniel e o sem raça definida como as
raças mais acometidas pelas neoplasias mamárias. Porém, a variação que ocorre no
Brasil, do grande número de animais sem raça definida, provavelmente se deve à
existência de um grande número de cadelas SRD não submetidas à
ovariosalpingoisterectomia, o que pode diferenciá-lo dos dados de outros países. Pois
como é sabido, o risco de ocorrência de neoplasias malignas em cadelas castradas
antes do primeiro estro é praticamente nulo (RUTTEMAN et al., 2001).
A média de idade das cadelas acometidas pelas neoplasias mamárias
encontrada foi de 9,1 anos, com uma variação entre 4 e 15 anos, correspondendo aos
dados citados na literatura que refere uma média de 10 anos, com rara ocorrência em
cadelas com menos de 4 anos (RUTTEMAN et al. 2001).
Foi observada, neste estudo, uma tendência de relação direta do tamanho do
tumor com o seu grau de malignidade (ANEXO 3). Um maior número de pacientes com
neoplasias benignas (adenomas) apresentou tumores menores de três centímetros
comparando-se às neoplasias malignas (carcinomas), portanto, como relataram
KURZMAN e GILBERTOSON (1986), MISDORP (2002) e SORENMO (2003), o
53
tamanho do tumor é um fator de prognóstico importante na avaliação das neoplasias
mamárias.
A presença de ulceração tumoral, também associada à malignidade da neoplasia
(MISDORP, 2002), foi observada no presente estudo, com uma maior ocorrência nos
carcinomas com bom prognóstico (30%) e nos carcinomas com mau prognóstico (40%),
sendo notado ainda uma nítida relação entre ulceração e tamanho tumoral, uma vez
que apenas as neoplasias maiores de 3 cm apresentaram ulceração e 77% desses
eram maiores que 5 cm. Mas a ulceração pode estar relacionada a fatores como,
isquemia da pele, traumatismo local ou infecção, sendo, portanto, difícil de associá-la
individualmente à malignidade do tumor (RUTTEMAN et al., 2001).
Outro dado avaliado neste estudo foi com relação à ocorrência de gestação,
antes da cirurgia das pacientes acometidas pelas neoplasias mamárias. Dentre as
portadoras de adenoma, 70% nunca tiveram filhotes. Enquanto, das portadoras de
carcinoma com prognóstico bom e carcinoma com prognóstico ruim, esses valores
foram, respectivamente, 40% e 60%. A partir desses dados pode-se presumir que as
cadelas que não tiveram filhotes talvez tenham maior probabilidade de desenvolver
neoplasias benignas do que as que já gestaram, porém não se pode fazer a mesma
correlação às malignas, que parecem não ter relação com a nuliparidade da cadela.
Deste modo há concordância com os resultados encontrados por TAYLOR et al. (1976),
que afirmaram não haver qualquer modificação na incidência de neoplasias malignas
em cadelas nulíparas, apesar destes autores não terem relacionado a ocorrência de
gestação ao desenvolvimento de neoplasias benignas.
Não foi encontrada relação do uso de anticoncepcional (hormônio) com o
desenvolvimento das neoplasias, já demonstrado anteriormente por outros autores
54
(RUTTEMAN et al., 2001; MISDORP, 2002). Dos três grupos avaliados no presente
estudo (Adenoma, Carcinoma com prognóstico bom e Carcinoma com prognóstico
ruim), cerca de 70 a 80% das pacientes nunca havia sido submetidas a este tratamento.
Das pacientes estudadas, nenhuma havia sofrido ovariosalpingoisterectomia
previamente ao surgimento da neoplasia, sendo, portanto, possível sustentar a idéia de
que a não realização deste procedimento precocemente nas cadelas criadas no Brasil,
é um importante fator do grande número de neoplasias mamárias aqui encontradas
(RUTTEMAN et al., 2001; MISDORP, 2002).
Analisando-se os resultados é plausível afirmar, que o estudo histológico da
neoplasia é um grande fator de prognóstico como MISDORP (2002) e SORENMO
(2003) relataram, uma vez que 100% das pacientes, que apresentaram neoplasia
benigna (adenoma), tiveram sobrevida maior de 24 meses. Dentre as pacientes que
apresentaram carcinoma com prognóstico bom, 80% viveram mais de 24 meses e das
que apresentaram carcinoma com prognóstico ruim apenas 30% sobreviveram mais
que 24 meses.
O estadiamento dos tumores mamários realizados de acordo como sistema TNM
(Tumor/Linfonodo/Metástase) proposto pela Organização Mundial de Saúde (OWEN,
1980) foi fundamental para avaliar, neste estudo, a possibilidade de progressão do
tumor para os principais locais de ocorrência de metástases, como os linfonodos ou
pulmão, portanto, foi importante para determinar a malignidade dos tumores estudados
(KITCHELL, 1995). Os tumores mamários possuem apresentações variadas, podendo
ser móveis ou fixos, terem aspecto sólido, cístico ou ainda terem como característica,
extrema rapidez de crescimento e invasão, como nos casos de carcinomas
inflamatórios (RUTTEMAN et al., 2001; WEIGELT et al., 2005). No grupo dos
55
Adenomas, mais da metade das neoplasias eram de grau I (que tem um melhor
prognóstico), e apenas 10% de grau III. Já no grupo Carcinoma com prognóstico bom,
pouco menos da metade era de grau I e 40% de grau III. Enquanto no grupo Carcinoma
com prognóstico ruim apenas 20% apresentou grau I, 50% grau III e ainda 10% grau IV.
Para completar, 100% dos Carcinomas com metástase pulmonar e Carcinomas
Inflamatórios eram de grau IV (o de pior prognóstico). Observando estes resultados, fica
evidente a relação direta do grau do tumor com o grau de malignidade, o que mostra
que o grau do tumor pode ser utilizado como um avaliador do prognóstico (POWERS,
2001; MISDORP, 2002).
No presente estudo, as cinco amostras de tecido mamário normal (ausência de
neoplasia) do grupo controle apresentaram expressão de E-caderina entre 76-100%.
Baseando-se nisso, todos os animais pesquisados que apresentaram essa marcação
foram considerados com expressão “normal”.
Neste estudo 75% das pacientes portadoras de neoplasias benignas (adenoma)
apresentaram expressão normal, e nenhuma expressou menos de 25%, indicando uma
tendência de se manter a expressão da proteína nas neoplasias benignas. Apesar de
não ter sido encontrado estudos avaliando a expressão de E-caderinas nos adenomas,
BRUNETTI et al. (2003) e MATOS et al. (2006) relataram correlação na manutenção da
ocorrência da E-caderina nos carcinomas de menor malignidade, sugerindo uma
manutenção da marcação nas neoplasias de melhor prognóstico.
No geral, foi observada uma evidente variação da expressão da E-caderina nos
diferentes grupos divididos de acordo com o tipo histológico e a característica clínica,
mostrando que esta expressão parece estar relacionada às diferentes variações
histológicas do tumor. Assim sendo, 37,5% das pacientes com carcinoma de bom
56
prognóstico apresentaram expressão normal, 50% expressaram entre 51-75%
(mediana) e 12,5% entre 1-25% (muito baixa). Já entre as pacientes portadoras de
carcinoma com prognóstico ruim, 87,5% apresentaram expressão normal e 12,5% entre
26-50% (baixa). Em estudo semelhante realizado por MATOS et al., 2006, 100% dos
carcinomas de maior malignidade (como o carcinoma anaplásico) apresentaram a
menor expressão (<25%) enquanto 100% dos menos malignos (carcinoma in situ)
apresentaram a maior expressão da E-caderinas (>75%), apesar disso, tipos de
carcinomas de malignidade intermediária mostraram expressões variáveis desta
proteína. A partir desses resultados observamos uma grande diferença de expressão
dentro do grupo que engloba todos os carcinomas. Talvez a dinâmica que ocorra na
expressão da E-caderina possa ser maior em neoplasias de maior agressividade, o que
justificaria a constatação de menos marcações nos grupos de carcinoma com
metástase pulmonar e carcinoma inflamatório ao mesmo tempo em que foi constatada a
ocorrência de tecidos fortemente marcados nestes mesmos grupos. Em trabalho com
neoplasias mamárias de mulheres, QUERESHI et al., (2006) também constataram uma
significativa diferença na expressão da E-caderina nos diferentes tipos histológicos de
carcinomas, uma vez que carcinomas ductais invasivos apresentaram em 97% dos
casos expressão alta, enquanto dos carcinomas lobulares invasivos apenas 4% teve
esta mesma expressão. Porém, esta classificação de carcinomas lobulares e ductais
não é utilizada em medicina veterinária.
No presente estudo, 30% das pacientes portadoras de carcinoma com metástase
pulmonar apresentaram a mesma expressão dos nódulos primário e metastático
(pulmão), sugerindo que ocorram alterações dinâmicas e reversíveis na expressão da
E-caderina durante a progressão do carcinoma. Isto parece compatível com a idéia de
57
BRUNETTI et al., (2003) e COWIN et al., (2005) de que a expressão reduzida
favoreceria a disseminação, e a expressão recuperada a sobrevivência e reunião das
células metastáticas.
Deve-se levar em consideração ainda, conforme postulam
KNUDSEN e WHEELOCK (2005), que a imunomarcação da E-caderina, pelo método
de imunohistoquímica, representa um segmento do tumor em um dado momento, sendo
possível que a diminuição temporária ou localizada da E-caderina promova separação
de células da neoplasia primária e invasão para locais próximos. Segundo estes
mesmos autores, a re-expressão de E-caderina pelas células tumorais em um novo
ambiente também parece promover a sobrevivência dessas células nos vasos
sanguíneos ou no sistema linfático, quando são carreadas para um local distante.
Como observado no presente estudo ocorre uma expressão normal da E-
caderina também nos carcinomas inflamatórios, porém a maioria apresenta redução da
marcação. Esta diferença da expressão também ocorre muitas vezes nas metástases
(KOWALSKI et al., 2003),
mas, considerando que a maioria expressa esta caderina
reduzida, correlaciona-se a diminuição com um período livre de metástase menor e um
prognóstico pior para os pacientes que apresentam ausência de expressão nos
linfonodos com metástases (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005)
.
A expressão da E-caderina apresentou-se alta (>75%) em 70% dos animais em
grupos com nódulos menores de 3 cm, em 60% dos com 3-5 cm e em 67% dos com
nódulos maiores de 5 cm. Em estudo semelhante, esta expressão aconteceu em 56%,
60% e 30% dos tumores menores que 3 cm, 3-5 cm e maiores que 5 cm,
respectivamente (MATOS et al., 2006). Embora haja resultados semelhantes nos dois
primeiros grupos entre o estudo destes autores e o presente, observou-se uma
diferença marcante nos tumores maiores que 5 cm (30% e 67%, respectivamente).
58
Assim sendo, não foi observada relação importante da expressão da E-caderina com o
tamanho do tumor, como o observado por estes autores. A causa desta discrepância
pode ser creditada ao número reduzido de amostras, variabilidade nos tipos dos
carcinomas, e ainda a inclusão de Adenomas neste estudo.
A presença de alta expressão (>75%) de E-caderina foi detectada em 85,7% e
59,0% dos nódulos mamários com e sem ulceração, respectivamente. Contrastando
com estes resultados, estudo semelhante de MATOS et al., (2006) demonstrou uma
alta expressão de E-caderinas nos nódulos com e sem ulceração de 54,0% e 22,0%,
respectivamente. Entre as causas de disparidade nos resultados, pode-se supor os
diferentes cuidados que os cães são submetidos nos diversos grupos de animais
estudados nas diferentes regiões e países, visto que a ocorrência de ulceração pode
estar relacionada a diversos fatores de cuidado e manejo como traumatismo ou
infecção.
Avaliando-se a expressão da E-caderina em relação somente à sobrevida das
pacientes, observou-se expressão normal da E-caderina em 71% dos animais que
tiveram sobrevida menor de 24 meses e em 65% das que sobreviveram por mais de 24
meses. Porém, em apenas 6% dos animais que viveram mais de 24 meses foi
observado expressão menor que 50%, enquanto das que viveram menos de 24 meses,
29% expressaram menos de 50%. Em geral, apesar da expressão da E-caderina estar
relacionada inversamente ao grau histológico e, consequentemente, com a
diferenciação, sua expressão não está bem relacionada com a sobrevida (BRUNETTI et
al. 2005; KNUDSEN e WHEELOCK, 2005). Os animais que apresentaram baixa
expressão da molécula tiveram menor sobrevida, porém uma expressão normal não
indicou uma maior sobrevida para a paciente. Portanto, a baixa expressão da E-
59
caderina pode ser um indicativo de baixa sobrevida, mas a expressão normal não é
indicativa de sobrevida maior, uma vez que diversos fatores como acidentes e doenças
não relacionadas podem interferir neste dado. Contudo, com base no presente estudo,
a sobrevida e a expressão da E-caderina não devem ser avaliadas separadamente.
De acordo com o grau de estadiamento clínico foi observada uma significativa
diferença entre as expressões, sendo que 80% das pacientes de grau I tiveram a
expressão normal da E-caderina e apenas 10% apresentaram expressão muito baixa
(1-25%). Já em relação às portadoras de grau II, apenas 33% expressaram a proteína
normalmente, as outras 67% tiveram expressão baixa (26-50%). Portanto é nítido que
existe uma diferença entre as expressões de E-caderina e o grau da doença nestas
duas graduações. Em contrapartida, dentre os animais com o grau III da doença, 60%
apresentaram expressão normal, 30% mediana (51-75%) e apenas 10% baixa (26-
50%). O grupo de grau IV (considerado o grau de pior prognóstico) apresentou uma
maior distribuição dentre as expressões e, diferentemente dos outros grupos, 19%
tiveram expressão muito baixa (1-25%) e ainda 14% não expressaram a E-caderina,
sendo que, destes últimos, todos eram portadores de Carcinoma Inflamatório. Portanto,
a expressão da E-caderina parece variar de acordo com o grau da doença, uma vez
que o grau estabelecido pelo estadiamento clínico se baseia em diversos fatores de
prognóstico, como o tamanho do tumor, presença de metástase em linfonodos e a
existência de metástase à distância, dados que não foram citados por outros autores
desta mesma forma.
Observando-se a grande dinâmica na alteração da expressão da E-caderina e
comparando-a separadamente com variáveis de prognóstico, percebe-se que esta
proteína não deve ser utilizada como um fator de prognóstico independente, mas pode
60
ser sim um marcador no qual a sua ausência indica maior malignidade da neoplasia
principalmente correlacionando-a aos Carcinomas Inflamatórios.
Apesar de no presente estudo terem sido selecionados apenas pacientes que
não foram tratados com quimioterapia, é conveniente ressalvar que a determinação de
melhores marcadores de diagnóstico e prognóstico, genes ou proteínas, parecem
necessários para determinação precisa dos resultados clínicos, e garantir que estes
pacientes não sejam tratados com sub ou sobredoses de quimioterápicos ou outros
tratamentos (KNUDSEN e WHEELOCK, 2005).
Finalmente, a interação entre os patologistas veterinários e clínicos cirurgiões foi
fundamental no estabelecimento da conduta terapêutica e na determinação do
prognóstico e do diagnóstico das neoplasias no presente estudo, pois desta interação
surgiram informações mais exatas sobre o diagnóstico para os clínicos que
determinaram o prognóstico e tratamento mais adequados. Os clínicos, conforme
preconiza POWERS (2001), necessitam de conhecimentos de patologia dos tumores
para entenderem as condições neoplásicas e as limitações das avaliações
histopatológicas no diagnóstico e prognóstico das neoplasias.
61
6 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos no presente estudo, podemos concluir que:
1. Existe uma relação direta da expressão da E-caderina com o tipo histológico e a
característica clínica do tumor, com menor expressão observada, na maioria dos
casos, com a maior malignidade;
2. A redução na expressão da E-caderina deve ser considerada de forma dinâmica,
uma vez que em tumores com alta capacidade de provocar metástases, como o
carcinoma inflamatório, foi observada também a ocorrência de elevada
expressão nos tecidos;
3. As variedades de carcinomas devem ser estudadas separadamente, uma vez
que existe uma grande diferença do grau de malignidade dentro do grupo;
4. A E-caderina é uma molécula cuja ausência pode ser relacionada à malignidade
da neoplasia e ao prognóstico (ocorrência de metástase), porém não deve ser
utilizada na determinação do prognóstico separadamente, e sim, associada a
outros fatores, principalmente, ao tipo histológico do tumor e graduação da
doença.
62
7 PERSPECTIVAS FUTURAS
Com os resultados e conclusões obtidos neste primeiro estudo de moléculas de
adesão celular associadas às neoplasias, pudemos observar vários caminhos a se
trilhar futuramente, entre eles:
1. A realização de estudo prospectivo com tumores mamários em cadelas, de modo
a se trabalhar com um maior número de casos, e amostras mais recentes,
menos sujeitas à degradação;
2. Estudar os diferentes tipos histológicos dos Carcinomas separadamente para
uma melhor determinação da associação da E-caderina ao potencial de
malignidade do tumor;
3. Associar a este estudo a imunoistoquimica de outros marcadores tumorais;
4. Procurar avaliar a relação da terapêutica instalada com o grau de adesão celular
dos tumores frente ao tratamento (recidivas e resistência).
63
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Clínica Médica Veterinária), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias,
Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2001.
70
9 ANEXOS
9.1 ANEXO 1
FICHA DE ESTADIAMENTO CLÍNICO
Paciente:________________________ RG:________/_______ Data:____/____/____
Idade:________________ Peso:___________ Raça:_______________________
Proprietário:___________________________________ Fone:___________________
Alimentação:_____________________________________________________________
Mastectomia anterior: ( ) Não ( ) Sim. Quantas:____________________________
Gestações: ( ) Não ( ) Sim
Quantas:_____
Pseudogestação: ( ) Não ( ) Sim
Quantas:_____
Aborto: ( ) Não ( ) Sim
Quantos:_____
Castrada: ( ) Não ( ) Sim
Em qual idade:_____
Anticoncepcional: ( ) Não ( ) Sim
Quantas vezes:_____
Cios regulares: ( ) Não ( ) Sim
Característica do(s) tumor(es). Marcar com um X o tamanho correspondente:
< 3 cm 3-5 cm > 5cm Ulcerado Invasivo Evolução em
meses:
M1D ( )sim ( )não ( )sim ( )não
M2D ( )sim ( )não ( )sim ( )não
M3D ( )sim ( )não ( )sim ( )não
M4D ( )sim ( )não ( )sim ( )não
M5D ( )sim ( )não ( )sim ( )não
M1E ( )sim ( )não ( )sim ( )não
M2E ( )sim ( )não ( )sim ( )não
M3E ( )sim ( )não ( )sim ( )não
M4E ( )sim ( )não ( )sim ( )não
M5E ( )sim ( )não ( )sim ( )não
Velocidade de crescimento do tumor: ( ) lenta ( ) moderada ( ) rápida
Presença de células neoplásica em linfonodos: ( ) sim ( ) não ( ) não avaliado
Edema em membros: ( ) não ( ) sim. Qual:__________________________________
Presença de metástases a distância: ( ) não ( ) sim ( ) não avaliado
Se sim, em qual(is) órgão(s):_________________________________________________
Procedimento Cirúrgico:____________________________________________________
Classificação histopatológica:________________________________________________
Grau de diferenciação histológica: ( ) Bem ( ) Moderadamente ( ) Pobremente
Intervalo de tempo livre da doença após a cirurgia em meses:______________.
Tempo de sobrevida em meses:_______________.
Condição atual do paciente: ( ) vivo ( ) morto ( ) eutanásia
71
9.2 ANEXO 2
TÉCNICA DE ESTREPTOAVIDINA-BIOTINA-PEROXIDASE
1- Desparafinização:
a. 30 minutos no Xilol I, em temperatura ambiente;
b. 20 minutos no Xilol II, em temperatura ambiente.
2- Hidratação dos cortes:
a. 3 minutos no álcool I;
b. 3 minutos no álcool II;
c. 3 minutos no álcool III;
d. 3 minutos no álcool 95°C;
e. 3 minutos no álcool 85°C.
3- Lavagem em água destilada (10 vezes - passagem)
4- Recuperação antigênica: imersão em CITRATO 10 milimolar, pH 6,0
a. 25 minutos em banho-maria: solução pré-aquecida a 96,5°C
b. Deixar esfriar 20 minutos em temperatura ambiente
5- Passagem em água destilada (10 vezes)
6- Bloqueio da peroxidase endógena: 20 minutos em água oxigenada 10 volumes;
7- Passagem em água destilada (10 vezes)
8- Colocado em TRIS (solução tampão - pH 7,4) para parar a reação da peroxidase:
2 vezes durante 5 minutos
9- Incubação durante 1 hora em BSA 1% (bloqueador inespecífico de proteínas) –
contribui para a redução das marcações inespecíficas (fundo).
10- Incubação com o anticorpo primário
72
a. Diluição do anticorpo primário (NCL-E-Cad) na proporção de 1:100 em
solução de BSA 1%;
b. Aplicação da diluição sobre todo corte;
c. Deixadas as lâminas em câmara úmida a 4°C durante 18 horas
(“overnight”).
11- Lavagem com TRIS (colocando e ao mesmo tempo aspirando)
12- Absorção do excesso de TRIS
13- Incubação com o anticorpo secundário (EP-ABCu):
a. Anticorpo secundário biotinilado (anti-camundongo e anti-coelho), diluído
conforme informações do fabricante. Incubado por 30 minutos, a
temperatura ambiente.
b. Lavar com TRIS por 10 minutos
c. Complexo avidina, biotina, peroxidase: preparada meia hora antes do uso,
de acordo com informações do fabricante. Incubado por 30 minutos a
temperatura ambiente.
d. Lavar com TRIS por 10 minutos
14- Revelação com o substrato cromogênico (Diaminobenzidina – DAB, pronto para
uso – DAKO): deixar 5 minutos em DAB
15- Lavagem com TRIS
16- Passagem em água destilada (10 vezes)
17- Contracoloração com Hematoxilina de Mayer: 3-5 minutos imerso na
hematoxilina
18- Lavagem em água corrente durante 10 minutos
19- Passagem em água destilada uma vez
73
20- Desidratação dos cortes:
a. Álcool 85°C: passagem
b. Álcool 95°C: passagem
c. Álcool absoluto I: 3-5 minutos
d. Álcool absoluto II: 3-5 minutos
e. Álcool absoluto III: 3-5 minutos
f. Xilol I: 3-5 minutos
g. Xilol II: 3-5 minutos
21-
Montagem das lâminas:
a. Resina sintética (Permount)
b. Lamínulas
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